Handbuch Validierung in der Analytik

Stavros Kromidas

Handbuch Validierung in der Analytik

Handbuch Validierung in der Analytik Stavros Kromidas mit Beitragen von J. Ermer, K.-P. Gerbling, J. Hauswald, L. Huber, J. Kleiner, S. Kiippers, H.-J. Kuss, J. S. Morkowski, H.-S. Noack, W. Ockels, G. Papke, J. Peters, M. Rieth, R. Staal, M. Ulmschneider

@wI LEYVCH Weinheim . New York . Chichester . Brisbane . Singapore . Toronto

Dr. Stavros Kromidaa NOVIA GmbH Rosenstrak I6 661 25 Saarbrucken Das vorlicgcnde Werk wurde sorgfdtig erarbeitet. Dennoch ubernehmen Autor und Verlag fur die Richtigkcit von Angaben, Hinweisen und Ratschlagen sowie fur eventuelle Druckfehler keine Haltung.

1. Nachdruck 200 1 2. Nachdruck 2003 3 . Nachdruck 2008

Die Deutsche Bihliothek - CIP-Einheitsaufnahme Ein Titeldatensati f'ur diesc Publikation ist bei der Deutschen Bibliothek erhiiltlich. ISBN 978-3-527-2981 1-2

0WILEY-VCH Verlag GmbH, D-69169 Weinheim (Federal Republic of Germany), 2000 Gedruckt auf' saurelreiem Papier. Alle Rcchtc, insbesondere die der Ubersetzung in andere Sprachen, vorbehalten. Kein Teil diescs Buches darf ohne schriftliche Genehmigung des Verlages in irgendeiner Form - durch Photokopie, Mikroverfilmung oder irgendein anderes Verfahren - reproduziert oder in eine von Maschinen, insbesondere von Datenverarheitungsmaschinen, verwendbare Sprache ubertragen oder ubersetzt werden. Die Wiedergabe von Warenbezeichnungen, Handelsnamen oder sonstigen Kennzeichen in diesem Buch berechtigt nicht zu der Annahme, daR diese von jedermann frei benutzt werden durfen. Vielmehr kann es sich auch dann um eingetragene Warenzeichen oder sonstige gesetzlich geschiitzte Kennzeichen handeln, wenn sie nicht eigens als solche markiert sind. All rights reserved (including those of translation into other languages). No part of this book may be reproduced in any form by photoprinting, microfilm, or any other means - nor transmitted or translated into a machine language without written permission from the publishers. Registered names, trademarks, etc. used in this book, even when not specifically marked as such, are not to be considered unprotected by law. Satz: Text- und Software-Service Manuela Treindl, D-93059 Rcgensburg Druck: Strauss Offsetdruck, D-69509 Morlenbach Bindunp: GroBbuchhinderei J. Schaffer, D-67269 Gninstsdt Umschlagge\taltung: Wolfgang Scheftler, D-55 128 Mainz Printed i n the Federal Republic of Gennany.

Vorwort

Wenn man sich intensiv mit dem Thema ,,Validierung" beschaftigt, gerat man leicht in das Philosophische oder aber man diskutiert lange uber Kommastellen. Beides kann wichtig sein - solange das Eine nicht den Blick fur das Andere versperrt. Ich denke, das Hinterfragen von Allem und die klare Zielsetzung machen eine zeitgemaBe Validierung aus. Im vorliegenden Buch wird versucht, sich mit grundsatzlichen Fragen zur Validierung in der Analytik auseinanderzusetzen. Aber im gleichen MaBe geht es auch und vor allem um den Validierungsalltag. So haben wir uns bemuht, moglichst viele Praxisbeispiele, Anregungen und Vorschlage vorzustellen und zu diskutieren. Die Ausfuhrungen sollen Anregung und Hilfe sowohl fur den Praktiker vor Ort sein als auch fur den Planer uber das ,,wieviel" an Validierung. Das Ziel des Buches ist es, einen Beitrag fur eine zweckgerichtete, bezahlbare Validierung zu leisten. Mein Dank gilt den Kollegen, die ihr Wissen und ihre Erfahrung uber die Validierung in Spezialgebieten zur Verfugung gestellt haben. Cornelia Reinemuth, Peter Biel und Steffen Pauly von Wiley-VCH danke ich fur die stete Kooperationsbereitschaft und ihre Flexibilitat. Saarbrucken. Januar 2000

Stavros Kromidas

Verzeichnis der Autoren

Dr. Joachim E m e r Aventis Pharma Deutschland Global Pharmaceutical Development Analytical Sciences Gebaude H 790 Industriepark Hochst 65926 Frankfurt Tel: 069/305- 16574 Fax: 069/305-8392 1 Email: [email protected] Dr. Klaus-Peter Gerbling Schering AG Biological Quality Control 13342 Berlin Tel: 030/468- 12293 Fax: 030/468- I8034 Email: klauspeter.gerbling@ schering.de Joachim Hauswald Bayer AG Abteilung PH-OP-ELB-QW Gebaude 302 42096 Wuppertal-El berfeld Tel: 0202/36-7654 Fax: 0202/36/2633 Email: [email protected] Dr. Ludwig Huber Agilent Technologies Deutschland GmbH Produkt Marketing Hewlett-Packard-Str. 8 76337 Waldbronn Tel: 07243/602-209 Fax: 07243/602-50 1 Email: [email protected]

VIII

Verzeichnis der Autoren

Dr. Joachim Kleiner Perkin Elmer Verkauf und Service Abteilung Technische Schule Rengoldshauser Str. 11 88662 Uberlingen Tel: 075511919-132 Fax: 0755 11919-139 Email: [email protected]

Dr. Stavros Kromidas NOVIA Chromatographie und MeBverfahrens GmbH Rosenstr. 16 661 25 Saarbriicken Tel: 0489719754-0 Fax: 0689719754- 15 Email: [email protected] Dr. Stephan Kuppers Schering AG Abteilung InprozeB-Analytik 13342 Berlin Tel: 0301468- 17819 Fax: 030/468-978 19 Email: [email protected] Dr. Hans-Joachim Kuss

Psychiatrische Universitiitsklinik Neurochemische Abteilung NuBbaumstr. 7 80336Miinchen Tel: 08915 1602731 Fax: 08915 1605853 Email: [email protected] Janusz S. Morkowski Fohrliweg 8 CH-8600 Dubendorf Tel: 0041/1/8211466 Fax: 004 I 11/82 12207 Email: [email protected] ehemals EMPA (EidgenossischeMaterialpriifungs- und Forschungsanstalt),Leiter Qualitatswesen

Verzeichnis drr Autoren

Dr. Siegfried Noack BAM Bundesanstalt fur Materialforschung und -prufung Abteilung I13 Unter den Eichen 87 12205 Berlin Tel: 03018 104-4 I36 Fax: 030/8 104- 1 I 17 Email : s .noack @ bam .de Dr. Werner Ockels Spectral Service Laboratorium fur Auftragsanalytik GmbH Geschaftsleitung Vogelsanger Str. 250 50825 Koln Tel: 022 1/54 147 1 Fax: 0221/541921 Email: [email protected] Dr. Gunter Papke Hessisches Landesamt fur Umwelt und Geologie HLUG Abteilung Umweltanalytik Rheingaustr. 186 65203 Wiesbaden Tel: 061 116939-357 Fax: 061 1/6939-333 Email: [email protected] Dr. Jurgen Peters Schott Gerate GmbH Abteilung AG-Applikation Im Langgewann 5 657 19 Hofheim Tel: 06 I92/209 1- 168 Fax: 06 19212091-222 Email: [email protected]

Ix

Dr. Michael Rieth Merck KGaA Abteilung Pha Prod AL-QB Frankfurter Str. 250 64293 Darmstadt Tel: 06 15 I /72-4448 Fax: 06 1 5 1 /72-65 13 Email: michael .rieth (3merck.de Dipl.-lng. Rolf Staal Aventis Pharma AG Director Process Excellence Industrial Technologies Theodor-Heuss-Allee 2 60486 Frankfurt Tel: 069/305-7943 Fax: 069/305-83882 Email: [email protected] Dr. Michel Ulmschneider Hoffmann - La Roche AG Abteilung POBQ Bau 62, Biiro I25 CH-4070 Basel Tel: 004 I /6 1 /688-8700 Fax: 004 I /6 1/688-3006 Email: [email protected]

Zum Aufbau des Buches

Das Buch besteht aus vier Teilen. Teil A und B sowie der Anhang stellen die aktualisierte und teilweise erweiterte Version von ,,Validierung in der Analytik" dar, das im Juni 1999 im gleichen Verlag erschienen ist. Vor allem die Kapitel ,,Richtigkeit" (Abschnitt 3.4), ,,Linearitat" (Abschnitt 3.7) und ,,Haufige Fragen zur Validierung" (Kap. 4) sind stark erweitert worden. Teil A (Kromidas, Morkowski) umfal3t eine Einfuhrung in die Thematik, einen Schwerpunkt bilden formale Aspekte. Validierung und verwandte Begriffe werden definiert, anhand von Beispielen erlautert und kommentiert. AnschlieBend werden Methoden vorgestellt, wie ,,Validierung" prinzipiell angegangen werden kann. Dieser Teil ist allgemein gehalten, es geht hier um Grundsatzliches und um eine ganzheitliche Betrachtung. Im Teil B (Kromidas) werden wir uns mit der Praxis der Validierung beschaftigen: In den ersten Kapiteln werden die Themen ,,Voraussetzungen der Validierung", ,,Dokumentation" und ,,Qualifizierung von Geraten" behandelt. Die Validierungsparameter werden anschlieBend einzeln erlautert und deren Ermittlung im Detail beschrieben. Dazu werden zahlreiche Beispiele benutzt. Neben den Jdassischen" Validierungsparametem werden auch Aspekte, die erst in letzter Zeit in den Vordergrund rucken, ausfuhrlich besprochen: Methodenfahigkeit, MeBunsicherheit und erweiterte Unsicherheit. SchlieBlich wird auf haufige Fragen zur Validierung und auf typische Fehler eingegangen. Die Chromatographie als haufige analytische Methode wird immer wieder als Beispiel verwendet, um in diesem Teil die Validierungsparameter und den Gang einer Validierung zu erlautem. Teil C ist der Validierung in einzelnen Techniken bzw. in einem bestimmten Umfeld gewidmet. Der Leser findet hier z. T. sehr detaillierte Anweisungen zur Durchfuhrung sowie Hinweise auf Spezifika der Validierung in der Spektroskopie (Ockels), Emissionsspektralanalyse ICP-OES (Noack), Mikrobiologie (Rieth), Titrimetrie (Peters) und bei Computeranwendungen (Huber) sowie Chemometrie (Ulmschneider). Der spezielle Teil wird mit Vorschlagen fur die Validierungspraxis im behordlichen Umfeld und bei Normverfahren (Papke) sowie in der Pharma gemaB den ICH-Richtlinien (Ermer, Hauswald) abgeschlossen. Teil D betrifft die Okonomie bei Validierungen: Notwendiger Umfang, Durchfuhrungsmodus und Ansatze einer ,,intelligenten" Validierung, die ein Minimum an Aufwand moglich machen. Dem einfuhrenden Abschnitt uber Grundsatzliches zur Validierungsokonomie (Kromidas) folgt die Vorstellung zweier Werkzeuge, die als komplementar zu der ,,klassischen" Validierung gelten konnen: Statistische ProzeBkontrolle, SPC (Staal) und Schatzen der MeBunsicherheit (Kuppers). Im Anhang finden sich neben statistischen Tabellen, Register von deutschen und englischen Begriffen und Definitionen weitere Informationen rund um die Validierung. Das Buch mu13 nicht unbedingt linear gelesen werden, man kann problemlos hin und her ,,springen". Dazu wurden die einzelnen Kapitel so verfafit, daB sie abgeschlossene Module

XI1

Zum Aujbau des Buches

darstellen. Damit wurde versucht, dem Charakter des Buches als Nachschlagewerk gerecht zu werden. Verweise geben die Stellen im Buch wieder, wo bestimmte Begriffe noch einma1 und/oder ausfuhrlicher erklart werden. Validierung ist eine individuelle Angelegenheit. Es ist auch gut so. Aus diesem Grunde wurde bewuljt nicht auf ,,Vereinheitlichung" getrimmt, unterschiedliche Auffassungen der Autoren oder gar abweichende Definitionen blieben stehen. Auch wurde manche Wiederholung in Kauf genommen, um die Harmonie im textlichen Kontext nicht zu beeintrachtigen. SchlieDlich werden einige wichtige Begriffe von mehreren Autoren, die naturgemaD unterschiedliche Akzente setzen, diskutiert. So beispielsweise ,,MeBunsicherheit" (Morkowski, Kromidas, Papke, Kuppers), ein Begriff, der - zumindest was die praktische Umsetzung anbelangt - voll im Flulj ist. Der Leser moge davon profitieren.

Inhalt

Teil A Grundlagen Stuvros Kromidas und Janusz S. Morkowski

Vorwort V Verzeichnis der Autoren

VII

Zum Aufbau des Buches

XI I

1

Grundsatze der Validierung in der Analytik und im Prufwesen

1.1 1.2

Einfuhrung 1 Definition, Erlauterung und Kommentierung von Begriffen der Qualitatssicherung 3 Validierung 4 Verifizierung 11 Qualifizierung bzw. Qualifikation 1 1 Charakterisierung 12 Messen, Prufen, Justieren, Kalibrieren, Eichen 13 Grundvoraussetzungen fur die Validierung einer analytischen Methode 15 Die Unsicherheit der Ergebnisse von Messungen, Priifungen und Analysen Methoden zur Charakterisierung von analytischen Methoden 17 Die Charakterisierungsmethoden 18 Erste Charakterisierungsmethode 19 Zweite Charakterisierungsmethode 19 Dritte Charakterisierungsmethode 20 Vierte Charakterisierungsmethode 22 Funfte Charakterisierungsmethode 23 Kombination der funf Charakterisierungsmethoden 26 Weitere Methoden vom Typ B 27

1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 1.2.5 1.3 1.4 1.5 1.5.1 1.5.1.1 1.5.1.2 1.5.1.3 1.5.1.4 1.5.1.5 1.5.1.6 1.5.1.7

16

1.6 1.7 1.8

Charakterisierung (Qualifizierung) von Methoden als letzter Schritt einer Validierungsprozedur 27 Freigabe von Methoden, Dokumentation 28 SchluBbemerkungen 28

2

Vor Beginn der Validierungsarbeiten: Voraussetzungen, Dokumentation, Geratequalifizierung 3 1

2.1 2.2 2.3 2.3.1 2.3.2

Voraussetzungen 3 1 Dokumentation 33 Geratequalifizierung 34 Das ,,V"-Modell 37 Empfehlungen fur die Praxis

40

Teil B Die Praxis der Validierung Stuvros Kmmidus 3

3.1 3.2 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.2.1 3.3.2.2 3.3.2.3 3.3.2.4 3.3.3 3.3.4 3.3.4.1 3.3.4.2 3.3.4.3 3.3.5

Die Validierungsparameter (oder nach IS0 17025: Verfahrensmerkmale)

41

Literaturuberblick 4 1 Die Validierungsparameter einer analytischen Methode 43 Prazision 46 Definitionen und Erlauterungen 46 Prazisionsarten 49 Wiederholprazision, Wiederholbarkeit (friiher: Wiederholgenauigkeit) 49 Vergleichsprazision, Vergleichbarkeit (haufig auch: Reproduzierbarkeit, selten Ubertragbarkeit) 49 Laborprazision oder laborinterne Vergleichsprazision 49 Weitere Prazisionen 50 MeB- und Methodenprlzision 5 1 Rechenbeispiele 52 Vergleich von Mittelwerten und Variationskoeffizienten 52 Vergleich von MeBwertreihen 53 Vergleich von Methoden, die aus stochastisch unabhangigen Schritten bestehen 56 Angaben zur Prazision und deren Deutungsmoglichkeiten 58

lnhalt

3.3.6 3.3.6.1 3.3.6.2 3.3.6.3 3.3.6.4 3.3.6.5 3.3.7 3.3.7.1 3.3.7.2 3.3.7.3 3.4 3.4.1 3.4.2 3.4.2.1 3.4.2.2 3.4.2.3 3.4.2.4 3.4.2.5 3.4.2.6 3.4.3 3.4.4 3.4.5 3.5 3.5.1 3.5.2 3.5.2.1 3.5.2.2 3.5.2.3 3.5.3 3.5.4 3.5.5 3.6 3.6.1 3.6.2 3.6.3 3.6.4 3.6.5 3.6.6 3.7 3.7.1 3.7.2

XV

Umgang mit Zahlen und Moglichkeiten zu deren Beurteilung 60 Ausreinertests oder Verlafilichkeitstests 60 Trendtest nach Neumann 64 Ermittlung der Wiederholgrenze 65 F- und Cochran-Test 65 Zusammenfassung der Tests und abschlierjendes Beispiel 68 Abschlierjende Fragen zur Prazision 71 Welche Prazision kann noch akzeptiert werden? 71 Wie kann ich die Prazision erhohen? 74 Was sind die Vor- und Nachteile bei grol3er Prazision? 75 Richtigkeit 77 Definitionen und Erlauterungen 77 Priifung auf Richtigkeit 78 Vergleich mit einem (oder mehreren) Referenz- oder Arbeitsstandard(s) 78 Vergleich mit einer unabhangigen, moglichst validierten Methode bekannter Richtigkeit 83 Wiederfindungsexperimente nach Zusatz bekannter Menge an Analyt (Referenzsubstanz!) 85 Elementbilanzierung 86 Indirekte Uberpriifung uber Massenbilanzen 86 Plausibilitatsbetrachtung 87 Merjunsicherheit, Ergebnisunsicherheit und Vertrauensbereich 87 Zusammenfassung von Tests zum Vergleich und zur Beurteilung von Zahien und Zahlenreihen 97 Wie sol1 ich nun die Richtigkeit uberpriifen? 99 Robustheit 101 Definition und Erlauterungen 101 Priifung auf Robustheit 102 Methodenrobustheit, Robustheit I: friihes Stadium 102 Verfahrensstabilitat 103 Anwendbarkeit, Robustheit I1 105 Zeitlicher Ablauf der Robustheitstests 107 Kommentare, Hinweise 110 Robustheit in der HPLC 110 Selektivitat und Spezifitat 116 Definitionen und Erlauterungen 116 Grundsatzliches zur Priifung auf Selektivitat 117 Prufung auf Selektivitat von bekannten Proben in der HPLC 1 17 Priifung auf Selektivitiit in der HPLC bei Proben unbekannter Zusammensetzung 118 Uberprufung der Selektivitat in der HPLC - Schnellmethoden 126 Zusammenfassung 131 Linearitat 133 Einleitung und Definitionen 133 Durchfiihrung der Linearitatstests 136

3.7.2.1 3.7.2.2 3.7.2.3 3.7.2.4 3.7.2.5 3.7.2.6 3.7.2.7 3.7.2.8 3.8 3.8.1 3.8.2 3.8.3 3.9 3.9.1 3.9.2 3.9.3 3.9.4 3.10 3.1 1 3.11.1 3.1 1.2 3.11.3 3.1 1.4

Grundsatzliches 136 Priifung auf Linearitat 138 Beurteilung der Ergebnisse 143 Welche MethodenkenndatenAnformationen konnen aus einer linearen Kalibrierfunktion gewonnen werden? 147 FlieBschema zur Kalibrierung und zur Ermittlung der Linearitat 1.57 Beispiel zur Prufung auf Linearitat 163 Eine kritische Betrachtung der Kriterien fur Linearitat 176 Gewichtete lineare Regression 179 Wiederfindung oder Wiederfindungsrate 184 Definitionen und Erlauterungen 184 Ermittlung der Wiederfindungsrate 18.5 Praktische Hinweise und Bemerkungen 186 Nachweis-, Bestimmungs- und Erfassungsgrenze 187 Definitionen und Erlauterungen 188 Ermittlung der Nachweis-, Bestimmungs- und Erfassungsgrenze 189 Kommentare und Hinweise 19 1 AbschluObemerkungen und Empfehlungen 192 Arbeitsbereich 19.5 Prozefi- und Methodenfahigkeit 19.5 Definitionen und Erlauterungen 195 Beispiele 198 Akzeptanzkriterien, Bewertung von Prozessen und Methoden 200 Mafinahmen bei unzureichender Methodenfahigkeit - zu kleine cMK’s 204

4

Haufige Fragen zur Validierung

4.1 4.2

Ermittlung der interessantesten Fragen 20.5 Antworten auf die sieben wichtigsten Fragenkomplexe

5

Haufige Fehler bei der Validierung analytischer Methoden

5.1 5.2

Allgemeine Fehler und Interpretationsfehler 223 Fehler im Zusammenhang mit der praktischen Durchfuhrung der Validierung 230

205 206 223

Znhalt

XVII

Teil C Zur Validierung einzelner Techniken und Gebiete Agilent, Aventis, BAM, Bayel; Hessische Landesanstalt fur Umwelt, HofSmann - La Roche, Merck, Schering, Schott, Spectral Service

6

Techniken und Gebiete 239

6.1

Validierung in der Spektroskopie 239

Werner Ockels, Spectral Service, Koln 6.1.1 6.1.2 6.1.3 6.1.4 6.1.5

Einleitung 239 Infrarot-Spektroskopie 240 UVIVIS-Spektroskopie 240 Massenspektroskopie 240 NMR-Spektroskopie 241

6.2

Validierung von Analysenverfahren mit ICP-OES

245

Siegfried Noack, BAM Berlin 6.2.1 6.2.2 6.2.2.1 6.2.2.2 6.2.2.3 6.2.3 6.2.3.1 6.2.3.2 6.2.3.3

Einleitung 245 Beschreibung methodenbedingter Leistungsmerkmale der ICP-OES 246 Spektrale und nicht spektrale Storungen 246 Untergrundermittlung 247 Kurzzeit- und Langzeitstabilitat (Drift) 247 Optimierung methodenbedingter Leistungsmerkmale der ICP-OES 248 Spektrale und nicht spektrale Storungen 250 Untergrundermittlung 25 1 Kurzzeit- und Langzeitstabilitat (Drift) 252

6.3

Validierungsaspekte bei Arbeiten in mikrobiologischen Labors

254

Michael Rieth, Merck KGaA, Darmstadt Klaus-Peter Gerbling, Schering AG, Berlin 6.3.1 6.3.1.1 6.3.1.2 6.3.1.3 6.3.2

Priifung auf Sterilitat (flussige und filtrierbare Arzneimittel) 254 Validierungsplan fur die Durchfuhrung der Sterilitatspriifung 254 Beschreibung der Durchfuhrung 255 Validierungsbericht 256 Mikrobiologische Dichtigkeitspriifung (Closure Integrity Test) von Primarbehaltern eines aseptisch hergestellten Wirkstoffs unter Worst Case Bedingungen des VerschluBsystems 251 6.3.2.1 Validierungsplan 257 6.3.2.2 Beschreibung der Priifflaschen und Stopfen 258

XVIII

In hult

6.3.2.3 Testmikroorganismus, Herstellung der Tauchsuspension und Keimzahlbestimmung 259 Mikrobiologische Integritatsprufung 259 6.3.3 6.3.3.1 Dichtigkeitspriifung 259 6.3.3.2 Wachstumsprufung nach der Dichtigkeitspriifung 260 6.3.3.3 Ergebnisse 260 Qualifizierung eines Anal ysesystems am Beispiel Mikrotiterplatten6.3.4 photometer 262 6.3.4.1 Qualifizierungsplan fur das computergestutztes System Mikrotiterplattenphotometer 262 6.3.4.2 Betrieb des computergestutzten Systems 263 6.3.4.3 Testprogramme fur die Systemeignung, Qualifizierung und Requalifizierung 265 6.3.4.4 Nachweis der korrekten Installation und Funktionalitat des computergestutzten Systems sowie der umgebenden Raumeinrichtung 267 6.3.4.5 Raumeinrichtungen 268 Qualifizierungsbericht fur das System Mikrotiterplattenphotometer 269 6.3.5 6.4

Validierung einer Titrationsmethode

270

Jiirgen Peters, Schott Gerate GmbH, Hofheim

6.4.1 6.4.2 6.4.3 6.4.4 6.4.5 6.4.6 6.4.7 6.4.8 6.4.9

Einleitung 270 Ubersicht Validierungsmerkmale 270 Voraussetzungen fur eine Titration 270 Prufmitteluberwachung 273 Praktisches Vorgehen 274 Validieren einer Saure-Base-Titration 27.5 Validieren einer Karl Fischer Titration 281 Ubertragen auf andere Titrationen 284 Zusammenfassung 285

6.5

Validierung von Software und computerisierten Analysensystemen

286

Ludwig Huber; Agilenr GrnbH, W ~ ~ d b r o n n

6.5.1 6.5.2 6.5.3 6.5.4 6.5.4.1 6.5.4.2 6.5.4.3 6.5.5 6.5.6

Einleitung 286 Definition von computerisierten Systemen und Softwarekategorien 286 Ubersicht einer Gesamtvalidierung 288 Beitrag des Gerateherstellers bzw. Softwarelieferanten zur Validierung 290 Installation 29 I Testen des Gesamtsystems vor der Inbetriebnahme 292 Ausgeubte Softwarefunktionen und Darstellung der Ergebnisse 292 Automatischer Test des Computersystems ohne Geratehardwaretest 294 Validierung von Anwendungsprogrammen, die vom Benutzer erstellt wurden 296

Inhalt

6.5.7 6.5.8 6.6

XIX

Nachtragliche Untersuchung und Validierung von existierenden Systemen 299 Zusammenfassung 300 Validierung von chemometrischen Methoden am Beispiel multivariater Datenanalyse in der Nah-Infrarot Spektroskopie 302

Michel Ulmschneider; Hofmann - La Roche AG, Basel 6.6.1 6.6.2 6.6.3 6.6.3.1 6.6.3.2 6.6.3.3 6.6.4

Einleitung 302 Allgemeines zur multivariaten Datenanalyse 302 Praktisches Beispiel aus der Nah-Infrarot Spektroskopie 304 Grundlagen 304 Methode 305 Kalibrierung und Validierung 306 Fazit 306

6.7

Basisvalidierung -primary validation verfahren 308

-

in der Normung von Analysen-

Giinter Papke, Hessisches Landesamt fur Umwettschutz, Wiesbaden

6.7.4.4 6.7.4.5

Einleitung 308 MeBunsicherheit in der Normung 3 10 Modelle zur Abschatzung von MeBunsicherheiten 31 1 Unprazisionsangaben aus laborinternen Messungen 3 1 1 Unprazisionsangaben aus Ringversuchsergebnissen 3 1 1 Probleme bei der Anwendung des DIN-Basisvalidierungspapieres 312 Praxisbeispiele zur Ableitung von Schatzwerten fur die MeBunsicherheit aus Prazionswerten 3 12 Praxisbeispiel zur Ableitung von Schatzwerten fur die MeBunsicherheit aus Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenzwerten nach DIN 32645 3 15 Praxisbeispiel zur Ableitung von Schatzwerten fur die MeBunsicherheit aus Prazisionswerten von Kontrollkarten 316 SchluBbemerkungen 3 16 Anhang und Erlauterungen 3 18

6.8

Validierung in der pharmazeutischen Analytik

6.7.1 6.7.2 6.7.3 6.7.3.1 6.7.3.2 6.7.4 6.7.4.1 6.7.4.2 6.7.4.3

320

Joachim Ermer; Aventis, Frankfurt

6.8.1 6.8.2 6.8.2. I 6.8.2.2 6.8.2.3 6.8.2.4 6.8.2.5

Einleitung 320 Regulatorische Anforderungen zur analytischen Validierung 320 Deutschland [84] 321 Europaische Gemeinschaft [85] 32 1 USA 322 Kanada [89] 323 Good Manufacturing Practice [90] 325

xx

Inhalr

6.8.2.6 International Conference on the Harmonization of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) 325 6.8.3 Planung, Durchfiihrung und Bewertung von Validierungsstudien 332 6.8.3.1 Spezifitat 332 6.8.3.2 Linearitat und Arbeitsbereich 339 6.8.3.3 Richtigkeit 347 6.8.3.4 Prazision 348 6.8.3.5 Nachweis- und Bestimmungsgrenze 35 I 6.8.3.6 Robustheit 356 6.8.3.7 Systemeignungstest 356 6.8.3.8 Rationelle Validierung 357 6.8.3.9 Validierungskonzept wahrend der Arzneimittelentwic klung und -herstellung 358 6.8.3.10 Validierung als integraler Teil der Qualitatssicherung 359 6.9

Forderungen der ICH zur Validierung in der Pharmaindustrie am Beispiel der HPLC 360

Joachim Hauswald, Bayer AG, Wuppertal

6.9. I 6.9. .1 6.9. .2 6.9. .3 6.9. .4 6.9. .5 6.9. .6 6.9.1.7 6.9. I .8 6.9.1.9 6.9.2 6.9.3

Praktische Durchfuhrung 360 Spezifitat 360 Linearitat 361 Arbeitsbereich 362 Prazision 362 Richtigkeit 363 Nachweisgrenze 364 Bestimmungsgrenze 364 Robustheit 364 Systemeignungstest (System Suitability Testing) Dokumentation 366 AbschlieBende Bemerkungen 366

365

Teil D Okonomie bei Validierungen Aventis, NOVIA, Schering 7

Umfang, Ablaufschema, zeitlicher Ablauf und Kosten der Validierung 367

Stuvros Kromidus, NOVIA GrnbH, Saarbrucken

7.1 7.1.1 7.1.2 7.1.3 7.2 7.2.1 7.2.2 7.3 7.3.1 7.3.2 7.4 8

Umfang einer Validierung 367 Validierungsumfang in Abhangigkeit von dem Analysenverfahred dem MeBprinzip 369 Validierungsumfang in Abhangigkeit vom Analysenziel 372 Valdierungsumfang abhangig von der Haufigkeit und Wichtigkeit der Probe 375 Vorgehensweise bei der Validierung 376 FlieBschema und zeitlicher Ablauf 376 Kommentare zum FlieBschema 376 Kosten der Validierung und Ansatze fur deren Senkung 384 Senkung der Validierungskosten 384 Fazit 39 1 Wie geht es weiter? 393 Uber die Einsatzmoglichkeit der statistischen ProzeBkontrolle, SPC, in der Analytik 403

Rolf Stual, Aventis, Frankfurt

8.1 8.1.1 8.1.2 8.1.3 8.2 8.3

Validierung - und was kommt danach? 403 Konsequenzen - das Werkzeug statistische ProzeBkontrolle, SPC 405 Vorteile durch die Anwendung der statistischen ProzeBkontrolle 412 Schwierigkeiten bei der Anwendung der statistischen ProzeBkontrolle 413 Analysenergebnisse an Spezifikationsgrenzen 4 15 Die Gefahren der Uberjustierung in der Analytik und deren Beseitigung 4 18

9

Schatzen der MeBunsicherheiVErgebnisunsicherheit 423

Stephan Kuppers, Schering AG, Berlin

9.1 9.2 9.3 9.3.1 9.3.2 9.3.3

Ergebnisunsicherheit - eine Einleitung 423 Grundlagen 424 Beispiele 429 Beispiel aus der Chromatographie 429 Beispiel aus der Spektroskopie 43 1 Beispiel eines physikalischen Messverfahrens (Karl-Fischer-Wassertitration) 433

XXIl 9.4 9.5

Zusarnrnenfassung und Empfehlung Statistische ProzeBkontrolle 436

10

SchluBwort 439

A

Anhang

A1 A2

Abkiirzungen (Auswahl) 441 Definitionen und Erlauterungen von Begriffen aus den Bereichen ,,Validierung" und ,,Qualitatssicherung" 444 Englische Ubersetzung einiger wichtiger Begriffe zurn Kornplex ,,Validierung" (Auswahl) 462 Register der Rechenbeispiele 464 Statistische Tabellen 466 Softwareprograrnrne zur Methodenvalidierung und Qualitatssicherung (Auswahl) 475 Niitzliche Adressen (Auswahl) 479 Publikationen zum Thema Validierung in der Analytik (Auswahl) 483 Weiterbildung 490

A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 Literatur

441

493

Sachwortregister

434

501

Handbuch Validierung in der Analytik Stavros Kromidas Copvriaht 0 2000 WILEY-VCH Verlaa GmbH

Teil A Grundlagen Stavros Kromidas, NOVIA GmbH, Saarbriicken Janusz S. Morkowski, Dubendoe Schweiz

1

Grundsatze der Validierung in der Analytik und im Priifwesen

1.1

Einfuhrung

Validierung bedeutet, auf die Frage zu antworten, ob ein Priifverfahren, eine analytische Methode oder eine MeS-Priifeinrichtung fur die Erfullung einer ganz bestimmten Aufgabe geeignet ist. Um auf diese Frage antworten zu konnen, muS man dreierlei wissen: - Wie lautet die bestimmte Aufgabe, die gelost werden soll? - Durch welche charakteristischen Leistungsmerkmale kann das fur die Losung der Auf-

gabe vorgesehene Verfahren auf Eignung getestet werden? Wie lauten die experimentell ermittelten Werte der ausgesuchten Merkmale?

Somit konnen die von der Aufgabenstellung her geforderten Fahigkeiten des Verfahrenst der Methode/der Prufeinrichtung mit den tatsachlichen Leistungsmerkmalen verglichen werden und die eigentliche Validierungsfrage auf Eignung beantwortet werden. Stellt der Validierer anschlieBend auch noch formal fest, daR das vorgesehene Verfahren tatsachlich imstande ist, die gestellten Forderungen zu erfullen, so sind alle Schritte der Validierungsprozedur normgerecht ausgefuhrt. Bemerkung: Der Einfachheit halber wird im folgenden nicht von dem Verfahren/der Methode/der Priifeinrichtung sondern stellvertretend von der Methode die Rede sein.

2

I Grundsiitze der Validierung in der Analytik und im Prufiesen

Tab. 1-1 Ablauf einer Validierungsprozedur (allgerneines Schema) Der Auftraggeber

Das Labor

benotigt Informationen, damit er eine bestimrnte Aufgabe erfullen oder losen kann. Er uberlegt sich, um welche konkrete Informationen es sich handeln sol1 und beschreibt diese moglichst genau.

bestimrnt eine Methode, mit deren Hilfe es den Auftrag des Aufgabenstellers bearbeiten will. Eventuell wird die Methode vorgegeben. Es definiert samtliche KenngroRen (Leistungsoder Verfahrensmerkmale) der vorgesehenen Methode, deren Prufung zur Losung der Aufgabe erforderlich sind.

Spezifikation

Charakteristische KenngroSen von Methoden sind z. B.

Die fur die Aufgabenlosung benotigten Informationen werden in dem an das Labor vergebenen Auftrag als (Qualitatits-)Forderungen spezifiziert. Genannt werden die zulassigen Werte der charakteristischen KenngroBen des verwendeten Verfahrens; insbesondere die zulassige Gesamtunsicherheit der Ergebnisse der Prufung. Gegebenenfalls werden die Forderungen erst nach klarenden Gesprachen init dem Labor spezifiziert.

-

-

Wiederholbarkeit Vergleichbarkeit Nachweis- und Bestimmungsgrenze Anwendungsbereich Selektivitat Robustheit Linearitat Gesamtunsicherheit der Ergebnisse

Vergleich Im AnschluR an die obigen Schritte werden die (Qualitats-)Forderungen des Aufgabenstellers mit den Werten der charakteristischen KenngroOen der Methode verglichen. ~

7

Qualifizierung der Methode Methode modifizieren bzw. AlternativMethode suchen Aufgabenstellung andern

1 (

nein

d. h. Feststellung der Eignung Die Validierungsprozedur endet mit der formalen Feststellung des Labors, daB die vorgesehene Methode fur die Losung der spezifischen Aufgabe geeignet oder eben nicht geeignet ist, d. h. da13 sie sich qualifiziert hat oder nicht.

ja

1.2 Dejinition, Erlauterung und Kommentierung

3

Zusammenfassend bedeutet das Gesagte folgendes: Methodenvalidierung bedeutet, die Absicht des Auftraggebers zu kennen und anschlieknd herauszufinden, ob eine Methode fur den vorgesehenen Verwendungszweck geeignet ist. Die Validierung betrifft immer zwei Parteien: 1. Der Aufgabensteller Zunachst mu13 jemand da sein, der eine Aufgabe stellt. Die zu losende Aufgabe kann sich auch aus den Interessen der Offentlichkeit ergeben oder sie kann aus den Forderungen von Gesetzen, Verordnungen oder normativen Dokumenten resultieren. Es ist letztlich belanglos, wer die Aufgabe formuliert; dies kann ein externer oder interner Kunde sein, ebenso gut kann das Labor selbst jene Forderungen formulieren, welche die Methode erfullen rnulj.

2. Der Aufgabenloser Der Aufgabensteller benotigt jemanden, der fur ihn die Aufgabe lost, also ein Labor. Um eine vollstandige Validierung durchzufuhren, mu13 das beauftragte Labor nun folgendes tun: - Es mulj die Aufgabe, und allenfalls auch das Problem des Auftraggebers, verstehen und - es mul3 abklaren, ob die fur die Aufgabenlosung vorgesehene Methode imstande ist, Ergebnisse zu liefern, die fur die Aufgabenlosung nutzlich sein werden; oder mit anderen Worten, ob sie fur den vorgesehenen Verwendungszweck geeignet ist. Gegebenenfalls mulj es eine Alternativmethode vorschlagen. - Es wird dem Aufgabensteller mitteilen, dalj es im Stand ist, die gestellte Aufgabe zu losen. - Im Zweifelsfall wird es die Eignung der Methode zu uberprufen haben, d. h. es hat zu priifen, ob die ermittelten Zahlenwerte der Merkmale von einer leistungsfahigen, sprich von einer fur die konkrete Aufgabenstellung geeigneten Methode zeugen. Die Validierungsprozedur laljt sich am besten in einem Ablaufschema darstellen. Dieses zeigt, dalj sowohl der Auftraggeber in seiner Funktion als Aufgabensteller, wie auch das Labor als Auftragnehmer und Aufgabenloser bei der Validierung eine wichtige Rolle zu ubernehmen haben, siehe Tab. 1- 1. In der Praxis kommt es oft vor, dalj das Labor die Fragestellung des Kunden so gut versteht, dalj es sehr wohl im Stand ist, stellvertretend fur den Kunden selbst die geplante Vorgehensweise zu definieren und dann mit ihm abzusprechen.

1.2

Definition, Erlauterung und Kommentierung von Begriffen der Qualitatssicherung

Trotz klarer Vorstellungen bezuglich des Begriffs Validierung, wie sie in der obigen Einfuhrung dargelegt wurde, und trotz vieler Diskussionen daruber, besteht bis heute immer noch eine gewisse Verwinung bezuglich venvandter Begriffe wie Validierung, Zertifizierung,

4

I Grutdtiitze der Wrlidierung in der Antilytik

itnd

inr Pri{tweseti

Charakterisierung, Verifizierung und Qualitizierung. Diese Konfusion hat weit mehr als nur linguistische oder semantische Bedeutung. Die Autoren pliidieren keinesfalls fur die Beibehaltung oder gar zwingende Verwendung all dieser Begriffe. Es zeigt sich jedoch, dal3 dadurch eher Probleme auftreten als daCj deren Verwendung der Klarung dient. Leider existieren sie und werden in der Praxis immer noch in eigenwilliger und zugleich arbitrarer Weise verwendet, was die Verstandigung zwischen den betroffenen Parteien nicht gerade erleichtert: Wollte man die heutige Situation in der Analytik charakterisieren, so durfte folgendes - aul3er in der Pharmaindustrie, wo der Validierungsgedanke sehr weit fortgeschritten und strukturiert ist - wohl haufig zutreffen: Viele der Betroffenen wissen heute ganz genau, was fur sie selbst Validierung, Verifizierung und Qualifizierung bedeutet; nur meinen leider andere Leute unter diesen Begriffen nicht genau das gleiche und manchmal sogar etwas recht Unterschiedliches. Oft werden auch die klaren Auslegungen der Begriffe Validierung, Verifizierung und Qualifizierung aus Regelwerken wie IS0 8402: 1994 und DIN EN IS0 17025:2000, siehe unten, ignoriert. Ein Beispiel: In dem Dokument der ILAC ,,Guideline for validating test methods'' 3rd draft of ILAC WG6: 1994-05- 13 wird der Begriff Validierung, wie in der IS0 8402 definiert, nicht beachtet und fur den eigenen Gebrauch eine Umschreibung verwendet, die gemaB der Norm auf den Begriff Verifizierung zutrifft. Was notwendig ist, ist einerseits eine Verstlndigung unter den Betroffenen bezuglich der Begrifflichkeiten, andererseits sollte eine pragmatische, dem Laboralltag dienende Auslegung angestrebt werden. Diesem Zweck sollen die nachfolgenden Definitionen und Erlauterungen dienen.

1.2.1 Validierung Mit Validierung verbindet jeder Analytiker die Uberprufung einer Methode auf Brauchbarkeit. Der Begriff Validierung taucht offiziell erst in den 70er Jahren auf: 1975 in Europa: 1978 in den USA:

Richtlinie des Rates 75/3 18 (EWG) FDA, im Zusammenhang mit der Produktion von Arzneimittel

Nachfolgend eine Auswahl von Definitionen aus der Literatur. -

-

Dertinger, Giinshirt, Steinigen in ,,GAP Praxisgerechtes Arbeiten in pharmazeutischanalytischen Laboratorien", Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH. Stuttgart 1984: ,,Kilidiesiing ist der Nuchrr~eisund rlie Dokurnentution der Ziivesliissigkeit eirier M e thode.'' H. Bosshardt, F. Schorderet, H. Feltkamp, P. Fuchs und H. Sucker, Pharmazeutische Qualitatskontrolle, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1983: .,Unter klidierirng \iersteht man rlie Gesamtheit aller sich iiber Planung, Aiisfiihriirig wid Dokiirnrritrrtiorr rrstsekkenden MaJnuhmen, die die Giiltigkeit einer ctnulytischen Methotle hewriseri. ller Prilfuujivund richtet sich riuch der Methoclik, der Appircitiir Litid den Ar~forulPriiri~~eri ( i n die Giite des Resulttits."

1.2 Definition, Erluuterung und Kommentierung

5

Chapmann, 1985: ,,Validierung he@ nichts Anderes als gesunder Menschenverstand gut organisiert und gut dokumentiert. '' - FDA, 1986 (im Hinblick auf Produktion): ,,Validierung ist der dokumentierte Nachweis, daJ ein bestimmter ProzeJ mit einem hohen Grad an Sicherheit kontinuierlich ein Produkt erzeugt, dus vorher dejinierte Spezifikationen und Qualitatsmerkmale erfiillt. - Inspectorate for Health Protection, Food Inspection Service, Niederland: ,,Vulidierung ist die Prozedur; die sicherstellt, daJ eine Testmethode so zuverlassig ist wie miiglich. Dieser ProzeJ besteht aus einem (Test)Programm, das zur Beantwortung folgender Fragen fiihrt: ,,Wierichtig ist es? und ,,Wieprazise ist die Methode in den Handen des Routineanwenders? - Rompp Chemie Lexikon, 1992 (ebenfalls auf die Produktion bezogen): ,, Vufidienwg umfaJt (nach dern verbindlichen Code von ,,Good Validation Practices '' in der Pharmazeutischen Industrie, Anm. der Autoren) die systematische Uberpriifung der wesentlichen Arbeitsschritte und Einrichtungen in Entwicklung und Produktion einschlieJlich der Kontrolle von pharmazeutischen Produkten mit dem Ziel, sicherzustellen, daJ die hergestellten Produkte bei Innehaltung der festgelegten Produktions- und Kontrollverfahren zuverlassig und reproduzierbar in der gewiinschten Qualitat hergestellt werden konnen. - USP: ,,Validierung ist der ProzeJ, durch den mittels Laborexperimenten gezeigt wird, daJ die Leistungsmerkmale (Charakteristika) einer Methode den Forderungen fiir eine beabsichtigte Anwendung geniigen. '' - ICH, 1995: ,,Das Ziel bei der Validierung einer analytischen Methode ist zu zeigen, daJ sie f u r den beabsichtigten Zweck geeignet ist - I S 0 8402, 1994 0 2.18: Jestatigen aufgrund einer Untersuchung und durch Bereitstellung eines objektivenNachweises, daJ die besonderen Forderungen f u r einen speziellen beabsichtigten Gebrauch erfiillt worden sind." (objektiver Nachweis: nachweisbare Informationen basierend auf Tatsachen, die man durch Beobachtung, Messung, einen Test oder auf eine andere Art und Weise (other means!) erhalt) -

"

"

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Jungst wurde ein Schritt vollzogen, der Beachtung verdient: Aus dem I S 0 Guide 25 und der EN 45001 (1989) wurde eine neue internationale Norm, die I S 0 17025 (Allgmeine Anfordemngen an die Kompetenz von Pruf- und Kalibrierlaboratorien). Mit der neuen Norm wird dem Vorschlag der DIN Rechnung getragen, eine Gleichstellung der Wertigkeit des ISO-Standards mit der europaischen Norm EN 45001: 1997-06 zu erreichen. Die EN ISO/IEC 17025: 2000 hat den Status einer Deutschen Norm und ist seit Dezember 1999 in Kraft. Seit April 2000 existiert eine dreisprachfige Fassung (deutsch, englisch, franzosisch) (zu beziehen bei: Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin). I S 0 17025 kann als ein wichtiger Bezugspunkt fur analytische Laboratorien (Pruf- und Kalibrierlaboratorien) angesehen werden. Daher lohnt es sich, die fur uns interessanten Textpassagen der Norm im Wortlaut zu verfolgen. Bemerkenswertenveise erscheinen fur die Verfasser die ,,Validierung von Verfahren" und die ,,Schatzung der MeBunsicherheit" gleichwertige Werkzeuge der Qualitatssicherung zu sein. Jedenfalls erhalten im Text beide Verfahren eine gleichwertige Stellung in der Hierarchieebene (Punkt 5.4.5 und 5.4.6).

6

1 Grundsatze der Vulidierung in der Analytik und im Prufiesen

,,5.4.5 Validierung von Verfahren

5.1.5.1 Die Validierung ist die Bestatigung durch Untersuchung und Bereitstellung cines Nachweisec, daR die besonderen Anforderungen fur einen speziellen beabsichtigten Gebrauch erfullt werden. 5.4.5.2 Das Laboratoriurn rnuR nicht in norrnativen Dokurnenten festgelegtc Verfahren, sclbstentwickclte Verfahren, Verfahren nach normativen Dokurnenten, die aufierhalb ihres vorgesehenen Anwendungsbereiches angewendet werden, und Erweiterungen von Verfahren nach norrnaliven Dokurnenten validieren, urn zu bestatigen, daB die Verfahren fur den beabsichtigten Gebrauch geeignet sind. Die Validierung mu8 in dem Umfang durchgcfuhfl werden, der zur Erfullung der Erfordernisse der beabsichtigten Anwendung oder des betreffenden Anwendungsgebiets notwendig ist. Das Laboratoriurn rnuR die erhaltenen Ergebnisse und das fur die Validierung verwendete Verfahren aufzeichnen und festlegen, oh das Vcrfahrcn fur den beabsichtigten Gebrauch geeignet ist. Anmerkung 1: Validierung kann Verfahren fur Probenahrne, Handhabung und Transport urnfassen. Anmerkung 2: Zur Bestirnrnung der Verfahrensrnerkrnale sollte eine der folgenden Methoden oder eine Kombination davon verwendet werden: Kalibrierung rnit Bezugsnormalen oder Referenzrnaterialien; Vergleich rnit Ergebnissen, die rnit anderen Verfahren erzielt wurdcn; - Vergleiche zwischen Laboratorien; systernatische Beurteilung der Faktoren, die das Ergebnis beeinflusscn; Beurteilung der Ergebnisunsicherheit auf der Grundlage wissenschaftlichen Verstehens der theoretischen Grundlagen des Verfahrens und praktischer Erfahrung. Anmerkung 3; Wenn einige Anderungen in den validierten nicht genorrnten Verfahren vorgenomrnen werden, sollte der EinfluR solcher Anderungen dokumentiert werden und, sofern angernessen, sollte eine neue Validierung vorgenornnien werden.

5.4.5.3 Der Bereich und die Genauigkeit der rnit validierten Verfahren erreichbaren Werte (z. B. Ergebnisunsicherheit, Nachweisgrenze, Selektivitat des Verfahrens, Linearitat, Wiederholgrenze und/oder Vergleichsgrenze, Robustheit gegen aufiere Einflusse und/oder Querempfindlichkeit gcgenuber Beeinflussungen durch die von der Matrix der Probe/des Prufgegenstandes), wie sie fur die beabsichtigte Anwendung beurteilt werden, rnussen den Erfordernissen des Kunden entspree hen. Anmerkung I: Validierung schlieBt Beschreibung der Anfordemngen, Bestirnrnung der Verfahrensrnerkrnale, eine Priifung, dab die Anforderungen durch Anwendung der Methode erfiillt werden, und eine Aussage zu ihrer Gultigkeit ein. Anmerkung 2: Bei weiterer Entwicklung des Verfahrens sind regelrnaRige Prufungen erforderlich, die sicherstellen sollen, daR die Erfordernisse des Kunden weiterhin erfullt werden. Jede Anderungen dcr Anforderungen, die Modifizierungen des Entwicklungsprogramrns erfordern, rnussen gepruft und genehrnigt werden. Anmerkung 3: Bei der Validierung sind irnrner die Kosten, Risiken und technischen Moglichkeiten abzuwagen. In viclen Fallen konnen der Bereich und die Unsicherheit der Werte (1.B. fur Genauigkeit, Nachweisgrenze, Selektivitat, Linearitat, Wiedcrholprazision, Reproduzierbarkeit,

1.2 Dejinition, Erliiuterung und Kommentierung

7

Robustheit, Querempfindlichkeit) mangels Information nur in vereinfachter Weise angegeben werden. 5.4.6 Schatzung der MeSunsicherheit 5.4.6. I Ein Kalibrierlaboratorium oder ein Priiflaboratorium, das interne Kalibrierungen durchfuhrt, mu8 uber ein Verfahren zur Schatzung der MeBunsicherheit fur alle Kalibrierungen und alle Arten von Kalibrierungen verfugen und dieses anwenden. 5.4.6.2 Priiflahoratorien mussen uber Verfahren fur die Schatzung der MeBunsicherheit vcrfugen und diese anwenden. In bestimmten Fallen kann die Art der Priifmethode eine strenge metrologische und statistisch gultige Schatzung der MeBunsicherheit ausschlieljen. Das Laboratorium mu8 in solchen Fallen mindestens versuchen, alfe Komponenten der MeRunsicherheit zu ermitteln, und eine vernunftige Schatzung der MeBunsicherheit vornehmen und sicherstellen, daB der Prutbericht keinen falschen Eindruck bezuglich der Unsicherheit erweckt. Eine vernunftige Schatzung mu6 auf der Kenntnis der Durchfuhrung des Verfahrens und auf der Art der Messung basieren und z. B. von vorhergehender Erfahrung und von Validierungsdaten Gebrauch machen. Anmerkung I : Der Grad der Strenge, die bei der Schatzung der MeBunsicherheit erforderlich ist, hangt von Faktoren ah wie z. B. - die Anforderungen der Prufmethode; die Anforderungen des Kunden; das Vorhandensein enger Grenzen fiir die Entscheidung bezuglich der Einhaltung einer Spezifikation. Anmerkung 2: In den Fallen, wo ein bekanntes Priifverfahren die Grenzwerte der Hauptquellen der MeRunsicherheit und die Form der Darlegung des berechneten Ergebnisses festgelegt hat, wird angenommen, daB das Laboratorium diesen Abschnitt der Internationalen Norm durch Befolgen der Festlegungen fur die Priifmethode und die Form des Prufberichtes erfullt hat (siehe 5.10).

5.4.6.3 Bei der Schatzung der MeBunsicherheit mussen alle Unsicherheitskomponenten, die fiir den betreffenden Fall von Bedeutung sind, in Betracht gezogen werden, wobei angemessene Auswertungsverfahren zu verwenden sind. Anmerkung I : Zu den Quellen, die zur Unsicherheit beitragen, gehoren unter anderem die verwendeten Bezugsnormale und das venvendete Referenmmterial, benutzte Verfahren und Einrichtungen, Umgebungsbedingungen, Eigenschaften und Zustand des zu priifenden oder zu kalibrierenden Gegenstandes und das Bedienungspersonal. Anmerkung 2: Das voraussichtliche Langzeitverhalten des zu prufenden undoder zu kalibrierenden Gegenstandes wird ublicherweise bei der Schatzung der MeRunsicherheit nicht berucksichtigt. Anmerkung 3: Weitere Informationen sind in den Normen der Reihe I S 0 5725 und in dem ,,Guide to the expression of uncertainty in measurement" enthalten (siehe Literaturhinweise)." Kommentare zum Entwurf - Die fur diese Textlange relativ haufige Anzahl von Passagen zurn Therna zielgerichtete

Validierung

8

I Griiridsiit,-e der kilidierung in dc,r Antrlytik itrid ini Priifivesen ,, . . . fur einen

speziellen beabsichtigten Gebrauch ..."

,. . .. mussen den Erfordernissen des Kunden entsprechen . .."

., . . . da13 die Erfordernisse des Kunden noch immer erfullt werden

. . ."

zeugen von einer Praxisniihe und einer wesentlich stLkeren Kundenorientierung im Vergleich zu alteren Texten. Das ist eine erfreuliche Entwicklung. Es gilt jetzt diesen Geist im Alltag zu leben. - Folgende, eindeutige Aussage schafft Klarheit: Genormte Verfahren mussen nicht validiert werden. Ob allerdings stets darauf verzichtet werden kann, wenn es tatskhlich um Wahrheitsfindung geht, sollte individuell entschieden werden. - Die Schritte einer Validierung sollten folgende sein: Beschreibung der Anforderungen Findung und Bestimmung von aussagefiihigen Verfahrensmerkmalen Vergleich der Anforderungen mit den erhaltenen Werten der Verfahrensmerkmale JdNein-Aussage uber die Eignung der Methode fur den vorgesehenen Gebrauch. Folgende Passage zeugt von einer Kenntnis der Situation im Labor und kann als Entgegenkommen gegenuber den analytischen Laboratorien bewertet werden: ,,In vielen Fiilen konnen der Bereich und die Unsicherheit der Werte (. . .) mangels Information nur in wreinjuchter Weise angegeben werden." Erfreulicherweise erfahren durch die Erwiihnung erstmals in dieser Norm und in diesem Zusammenhang die Probenahme und der Transport den ihnen gebuhrenden Stellenwert. Die Anforderung, da13 das Laboratorium die Ergebnisse und verwendeten Verfahren aufzeichnen md3, bekraftigt das tatsachliche Ziel bei einer Validierung: Der Validierer mu13 Aussagen machen und nicht lediglich Zahlen/Daten erzeugen. Dem erfahrenen Leser fallt beim Aufzlhlen von erreichbaren Werten zweierlei auf: Die klassischen, wichtigen Elemente ,,Richtigkeit" und ,,Prazision" fehlen, dafur taucht ,,Ergebnisunsicherheit" auf. Hier wird die Auffassung der Verfasser offenkundig: Es ist ein Pliidoyer fur die Ermittlung bzw. Schiitzung der ,,Ergebnisunsicherheit" als ubergeordnetes Merkmal, das geeignet ist, die tatsachliche Streuung von Werten (zufiillige Abweichungen = Prazision, systematische Abweichungen = Richtigkeit) zu beschreiben und einen realen Vertrauensbereich anzugeben (siehe Ausfuhrungen weiter unten und in Abschnitt 3.4.3).Systematische und zufallige Fehler sind nur Beitrage zur Gesamtunsicherheit der Ergebnisse. Eine Unterscheidung in systematischen und zufiilligen Fehlern ist nicht notwendig. Es wird die ,,Nachweisgrenze", nicht jedoch die ,,Bestimmungsgrenze" erwiihnt. Auf Anfrage von S. Kromidas wurde folgendes als plausibler Grund fur den Verzicht genannt: Ein Nicht-Naturwissenschaftler kann mit dem Begriff Nachweisgrenze umgehen, eine klare Abgrenzung zur Bestimmungsgrenze ist nicht trivial. Dies wurde in einer Reihe von juristischen Auseinandersetzungen deutlich. Der Verzicht auf ,,Bestimmungsgrenze" kann fachlich wie folgt begrundet werden: Bestimmungsgrenze ist letzten Endes nichts mehr als eine erweiterte MeBunsicherhheit.

-

I .2 Definition, Erlauterung und Komrnentierung

9

Deswegen ist - ubrigens in Ubereinstimmung mit IS0 1 1843- 1, siehe Abschnitt 3.2. I die Benutzung des Begriffes ,,Bestimmungsgrenze" expressis verbis nicht notwendig. Die Ausfuhrungen im Entwurf von IS0 17025 kommen der Praxis sehr nahe und sind daher praktikabel. Zwei wichtige Forderungen werden leider nicht envahnt: Die Methodenstabilitat und die Methodenfahigkeit. Die Methodenstabilitat beschreibt die Abhangigkeit eines Ergebnisses von der Zeit bei Anwendung der konkreten Methode unter realen Bedingungen. Es geht um die Streuung von Ergebnissen, wenn alle relevanten Faktoren im realen Routinealltag wirksam sind und nicht nur wahrend der relativ kurzen Zeit der Validierungstatigkeit. Die Praxis zeigt immer wieder, dall die Nichtbeachtung dieses Aspektes zu unnotigen Differenzen zwischen Validierer und Routineanwender und zu erheblichen Kosten fuhrt. Das Wort ,,kontinuierlich" aus der FDA-Definition wurde hier schon ausreichen, um die Aufmerksamkeit auf diesen wichtigen Punkt zu lenken. Es ist zu hoffen, daB in einer kommenden Revision die Methodenstabilitat als gleichwertiger Validierungsparameter Zugang in den Normentext findet. Auch die Methodenfahigkeit verdient mehr Beachtung. Nur so besteht die Chance, daB bei der Festlegung von Spezifikationen analytische Realitaten beriicksichtigt werden, s. Abschnitt 3.11 und 5.2. Vor dem Versuch einer Zusammenfassung werden sieben Validierungsthesen fur die Analytik vorgestellt. Diese lehnen sich an die sieben Validierungsthesen fur die Herstellpraxis nach Sucker [ 11 an: -

-

-

Validierung ist ein Arbeitsinstrument zur Qualitatssicherung neben anderen wie z. B. SPC (Statistische ProzeBkontrolle). Validierung ist produkt- und zweckspezifisch auszufuhren. Die Verantwortung uber AusmaB und Art liegt beim Analytiker. Validierung heiBt, das Notwendige zu tun, aber eine Eskalation zu vermeiden. Alle kritischen KenngroBen der Methode mussen validiert werden, aber nicht wahl- und kritiklos alle. Methodenvalidierung beginnt am besten beim Endergebnis und geht im Analysenablauf bis zum ersten Schritt zuruck. Validierung kann nicht durch Abhaken von Resultaten mittels Checkliste erfolgen. Eine fehlerfreie Analytik (,,wahrer Wert") gibt es nicht. Nach Moglichkeit sind die statistische Relevanz und damit die MeBunsicherheit zu ermitteln. Fur validierte Methoden sind Art und Haufigkeit der notwendigen Kontrollen festzulegen mit dem Ziel, den Gesamtanalysenaufwand zu minimieren, aber dennoch die erforderliche Ergebnissicherheit zu erzielen.

Resume' und Kommentar Die Definition der I S 0 Norm 17025: 2000 la& dem Analytiker nahezu alle Freiheiten, wenn er nur erstens weil3, was er will (,,besonderen Forderungen fur einen speziellen, beabsichtigten Gebrauch") und zweitens in der Lage ist, eine fachgerechte Durchfuhrung zu garantieren, d. h. wenn er einen ,,objektiven Nachweis" liefert.

10

I tirirticl.tiit:e di>r Kilidierung in der Anulytik und

itn

Prufwsen

Betnerkung: In der Norm 17025 fehlt im Vergleich zu IS0 8402 das Wort ,,objektiv".

Die drei wichtigen Elemente der ISO-Definition sind: -

Untersuchung: Nachweis: beabsichtigter Gebrauch:

Es sind Fakten gefragt Es geht um nachvollziehbare Kriterien Validierung ist eine zielgerichtete Prufung

Wird n u n die ISO-Definition 8402 bzw. die neue aus der Norm 17025 zu Grunde gelegt, so wird dem Validierer - jedenfalls aus analytischer Sicht - kaum ein grober Fehler unterlaufen, wenn er folgende Voraussetzungen erfiillt: Eindeutig detinieren, was mit der Methode beabsichtigt ist. Festlegen, was und wie gepruft werden SOH. Aus den ermittelten Zahlen Aussagen beziiglich Methodeneignung treffen. - Alle Daten, die zu den gemachten Aussagen fiihren, dokumentieren. -

-

Die Realitat sieht manchmal allerdings so aus, daB der Kontrollierende einer Institution/ Behiirde stur nach einer Validierungs-Checkliste vorgeht. Sind vom Validierer die in der Liste aufgefuhrten Validierungselemente abgearbeitet, so ist die Validierung erfolgt, ansonsten nicht. Zu diesem Handicap siehe Abschnitt 7. Wir schliel3en die Diskussion uber das, was unter Validierung manchmal verstanden wird, mit einigen Zitaten ab. Diese stammen aus Schriften fiihrender Gerltehersteller und zeigen, daB immer wieder meist unwissentlich viillig verzerrte Bilder von der Validierung gegeben werden. I . Aus einer Produktmitteilung eines Geriiteherstellers A: ,,Ein GroJteil der HPLC-Anwendrr ist heute den sogenunnten GLP-Richtlinien untemwfen. Behiirden wie BGA oder FDA verlungen die Vulidierung einer Analysenrnethode. Zusiitzlich miissen ulle Anu!\senrrgehni.s.se permunent uufEi~ihultungder Vufidierungsgrenzen iiherpruft werden. 2. Aus einer Kundenschrift eines Gerateherstellers B: ,,Unter Validierung wird die (regelrnusige) Uherprufurig der Grnauigkrit eines MeJgerates wrstanden ... '* 3. Aus einer Produktmitteilung eines Gerlteherstellers C: ,,Die Beurteilung des Dosiergeriitt1.s ... Nur rrmn ulle clrei Werte innerhalb der fe.stgelegten Bereiche liegen, hut dus Dosiersystetn die Kilidierung erfolgreich hestanden. "

"

Kornrnenture Zu 1 : a) Nur ca. 5 c/o der HPLC-Bestimmungen sind GLP-pflichtig.

b) Validierung ist keine GLP-Forderung. c) Es gibt keine .,Validierungsgrenzen" sondern Spezifikationsgrenzen bzw. Methodenfihigkeitsindices,siehe Abschnitt 3.1 1. Zu 2: Beschriebenes Procedere entspricht nicht einer Validierung sondern (vermutlich) der Uberpriifung der MeBprazision und eventuell einer Kalibrierung. Zu 3: Beim Dosiersystem handelt es sich nicht um Validierung sondern um Verifizierung, siehe unten.

1.2 Definition,Erliiirterunq

irnd

Kotiiriieritir~irr~,q

II

I .2.2 Verifizierung Definition gemaB IS0 8402: 1994, (i 2.17: ,,Bostiitigen uufgrund einer Untersuchung und durch Bereitstc~llungeines obiektiwi Nuchweises. rluJ festgelegte Forderungen erjiiillt worden sind." Die Normenbegriffe fur Validierung und Verifizierung unterscheiden sich nur geringfugig. Die ,,besonderen Forderungen fur einen speziellen beabsichtigten Gebrauch" in der Definition der Vahdierung werden bei der Verifizierung durch die ,,festgelegten Forderungen" ercetzt. Auf diesen Unterschied werden wir weiter unten noch einmal eingehen.

1.2.3 Qualifizierung bzw. Qualifikation Dieser Begriff wird leider fur zwei unterschiedliche Tatbestiinde benutzt: I . Nach dem Deutschen Arzneibuch: DAB 9, Band I , 1992, S. 747-748 ,,Validierung von Sterilisationsprozessen" wird folgende Definition verwendet: Als Qualifikation vvircljener Trilabschnitt der Kilidierirng he=eichtiet, der sich, ohne Beriicksichtigung des Sterilisiergutes. nur mit der Fiinktionstiic.htigkeit des Sterilisutors be$lfit. Hierzu gehiiren w r mlleni Eichung und Koritrolle drrpli~.~ikulischet~ M<Ji'iristrirtnente vvie z. B. Tlierrnorneter; Tlierniofiihler; Matiorneter 11. u. '' und 2. GemiiR IS0 8402,1994, (i 2.13, ,,Qualifizierungsprozess" und IS0 8402, 1994, (i 2.14 ,,Qualifizierung" bzw. ,,qualifiziert: Der Begriff QualifizierungsprozeR gema0 I S 0 8402, 1994, 5 2.13 wird beschrieben als ,,ProzeB zur Darlegung, ob eine Einheit zur Erfullung der festgelegten Qualitltsforderung fiihig ist." Der Begriff Qualifizierung gem80 IS0 8402,1994, (i 2.14 lautet: ,,Stutir.s einer Einh~it, bt*erFriihre Fiihigkeit :ur Eijiillung der-festgelegtm Qiitilitiit.s#~)rderiiiig durgelegt vvirr& ". 1,

Kotnmo i i tu r Im Labor handelt es sich bei der Qualifizierung um die formale Feststehng, daR das f u r eine bestimmte Messung vorgesehene Verfahren voraussichtlich geeignet ist, den Qualitiitsforderungen des Auftraggebers zu genugen. Aus der Sicht der Qualitatssicherung erfolgt der Qualitizierungsprozess im Rahmen der Vertragsprufung. Dieser sol1 dem Auftraggeber bestiitigen, dal3 das Labor uber ein Prufverfahren verfugt und es entsprechend beherrscht und so seine Erwartungen erfullen kann.

Be isp ie Ie Nachfolgend wird versucht, die Begriffe Validierung, Verifizierung und Qualifizierung (nach DAB) am Beispiel der HPLC zu erliiutern: QualifiLierung:

Uberpriifung der Geratespezifikationen - ohne Eluent und Probe Erreicht die Lampenenergie de\ Detektors einen beatimmten Wert? - 1st im gexamten MeBbereich des Siiulenofen\ die vom Hersteller atigegebene Temperaturkonstanz von 0. I ' C erreichbar?

-

Veriti;lierung:

Prufung auf HPLC typische Forderungen Erreicht der Detektor mit MeOH 31s Eluent bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 1 ml/min und einer Detehtionwellenl~ingevon 254 nm ein fur die HPLC ubliches Basislinienrauschen 0.04 inAU? - 1st die Systempriizision, gemessen mit MeOH als Eluent iind eineni unkritischen Testgemisch, kleiner 1 %'? -

Validieriing:

Eignung der vorliegenden HPLC-Methode f u r ein bestiinmtes Trennproblem - Tensidanalytik mit lonenaustauscher: wird mit vet-diinnter SchwefelsYure (eine andere Viskositiit als der fur Geriitetests ubliche Eluent MeOH!) und realen Feuerloschmittel-Proben die geforderte PrYzisio n von 2 5% erreicht'? - Trennung von Phosphorlipiden: welche Nachweisgren/.e wird erreicht bei einer Detektionswellenlange von 200 nm mit einer Diolphase und einem Chloroform/Methanol Eluenten?"

Zusainmenfassend ist festzuhalten, dal3 bei der Veritizieriing die Anlage auf die voin Hersteller angegebenen bzw. von der HPLC-Gemeinschaft erwarteten SpeLitikationen gepruft wird. D. h., es handelt sich um eine Uberprufung einer allgemein formulierten Qualitiitsforderung. Bei der Qualitiyierung (nach DAB) geht es um die Uberprufung technischer Werte. also letrten Endes uin das Ablesen von Widerstinden und Spannungswerten der nicht in Betrieb befi nd I ic hen An 1age. Bei der Validierung liegt der Schwerpunkt auf der Frage. ob eine Trennung init dieser Apparatur den von dein Kunden bzw. der Behiirde festgelegten/erwarteten Q u 1', I 'Ititsmerkmalen entspricht. D. h., hier handelt es sich um eine anwendungsbezogene Prufung. In der Praxis wird oft zwischen Verifizierung und Qualitizierung einer Anlage nicht iinterschieden. eine Tatsache, die sicherlich nicht ins Gewicht fYllt. Ziir Qualifizierung einer Anlage siehe Abschnitt 2.3. DaO die Verwendung mehrerer, iihnlicher Begriffe offensichtlich eher fiir Verwirrung denn fiir KlYrung sorgt x i g t folgende Tatsache: Beim DAR (Deutscher Akkreditierungs Rat) wurde im AusschuB Technische Fragen (ATF) erwogen, den Begriff .,verification" generell ails nllen Punkten zu entfernen, urn MiBverstiindnissen vorzubeugen.

1.2.4 Charakterisierung In der Norm IS0 8402: 1994 wird dieser Begriff nicht genannt. Charakteriaiert wird eine Methode, indem man die Werte fiir ihre charakteristischen Kenngriissen ermittelt. Die Werte dieser Kenngrossen sind die Leistunga- oder Verfahrens~nerkmalswerteder untersuchten Methode. Sie dienen zur AbschYtmng der Unaicherheiten von Ergebnissen. die mit dieser Methode erzielt werden kiinnen. Die Charakterisierung erfal3t allerdings nicht nur die spezifischen Eigenheiten der Methode selber, sondern auch alle wesentlichen spezifischen Eintluase, die in .jeneiii Labor

1.2 Definition, Erliiuterirng und Kommentierrtng

13

wirksam sind und zur Unsicherheit des Ergebnisses beitragen konnen. Diese Einfliisse sind z. B.: Die Eigenheiten jener Personen, welche die Methode im gegebenen Labor anwenden; d. h. die praktische Erfahrung und Fertigkeit dieser Personen im Umgang mit der Methode, ebenso ihr theoretisches Wissen uber die Hintergrunde der Methode, aber auch ,,ihre Tagesform" bei der Durchfuhrung der Arbeiten. - Die aul3eren laborspezifischen Einflusse wie z. B.: Temperatur, Feuchtigkeit, Luftdruck, Erschutterungen. Verunreinigungen von Wasser, Luft und technischen Gasen etc., verursacht durch Partikel, Bakterien, Sporen, Pilze und andere Fremdsubstanzen, elektromagnetische Felder, Strahlungen jeglicher Art, Spannungsschwankungen im elektrischen Versorgungsnetz. - Die inneren fur das Versuchsobjekt spezifischen Einfliisse, d. h. Einflusse der Matrix wie z. B. Kornigkeit und Inhomogenitat, die chemische Zusammensetzung von Gemischen, die physikalisch-chemische Aktivitat von Beimengungen in den untersuchten Proben, z. B. auf die Oberflachenaktivitat. -

Als wesentlich sollten jene Einflusse gelten, welche das Ergebnis der Messung iiber das tolerierbare Ma13 hinaus beeinflussen konnen, insbesondere jene, welche die Unsicherheit der Gesamtergebnisse uber die zulassigen Grenzen des Vertrauensbereiches einer bestimmten Kenngrosse vergroBern kiinnen. Falls sich die Frage stellt, wie reprasentativ die Ergebnisse der im Labor untersuchten Proben fur jene Gesamtheit sind, so mussen bei der Charakterisierung der Methode weitere Einflusse auf das Gesamtergebnis untersucht bzw. abgeschatzt werden, namlich: Die laborexternen Einflusse auf das Gesamtergebnis wie z. B. die Reprasentativitat des Probenahmeortes, des Probenumfangs, der Probenahmedauer, der Probenmenge. Zu berucksichtigen ist ebenfalls die Moglichkeit wesentlicher Probenveranderung wlhrend des Transportes ins Labor. Um eine Methode genau charakterisieren zu konnen, miissen die ermittelten Ergebnisse uber einen llngeren Zeitraum verfolgt werden (Methodenstabil itat).

1.2.5 Messen, Prufen, Justieren, Kalibrieren, Eichen In der analytischen Qualitatssicherung bzw. generell im Priifwesen sind eine Reihe von Tiitigkeiten notwendig. Diese werden vor (Eichen, Justieren, Kalibrieren), wuhrend (Messen) und nuch Ende dervalidierung (Priifen) ausgefuhrt. Tabelle 1-2 gibt die DIN-Definitionen und zur Veranschaulichung je ein Beispiel wieder [ 21.

14

I Grundsatze der Vulidierung in der Anulytik und im Pruffivesen

Tab. 1-2 Grundbegriffe der MeBtechnik. Begriff

Definition nach DIN 13 19 T. 1

Beispiel (Chromatographie)

Messen

Messen ist der experimentelle Vorgang, durch den ein spezieller Wert einer physikalischen GroBe als Vielfaches cincr Einheit oder eincs Bezugswertes ermittclt wird.

Die Retentionszeit eines Peaks wird mit 8 min gemessen.

Prufen

Prufen heiRt feststellen, ob der Priifgegenstand cine oder mehrere vorgcgebene Bedingungcn erfullt.Mit dem Prufen ist daher immer der Vergleich mit vorgcgebenen Bedingungen verbunden. Anmerkung: Prufgegenstund knnn sowohl die Probe a1.y uuc/z dci,y Mejjgeruf sein!

Funktionsprufung des Chromatographen durch Auftrennung ciner Testmischung und Freigabe odcr Sperrung oder

Justieren (Abgleichcn)

Justieren im Bereich der MeBtechnik heiBt. ein MeRgerat so einstellen oder abgleichen, daB die MeBabweichungen moglichst klcin werden oder daR die Betrage der MeBabweichungen die Fehlergrenzen nicht uberschreiten. Das Justieren erfordert also einen Eingriff, der das MeBgerat oder die MaRverkorperung meist bleibend verandert

Abgleichen der FluBrate mittels Potentiometer, so daR die cingestclltc FluBrate mit der gemessenen ubereinstimmt.

Kalibrieren (Einmessen)

im Bereich der MeBtechnik heist, die MeBabweichungen am fertigen MeBgerat feststcllen. Beim Kalibricrcn erfolgt kcin technischer Eingriff am MeBgerat. Anmerkung: Kulibrieren kann sich s o wohl uufdie Festlegung des Mejkusummenhangs als uuch czufdessen Uberpriifung beziehen.

Fcststellen des MeBzusammenhangs zwischen Signal und Konzentration (Aufstellen dcr Kalibrierfunktion)

Das Eichen eines MeBgerates umfaBt die von der zustandigen Eichbehorde nach den Eichvorschriften vorzunehmenden Prufungen und die Stcmpelung. Anmerkung: An die Stelle der Eichbehiirde kunri (iuch eine Stelle treten, der die Eichhefiignis iibertrcigen wurde.

Eichung der fur die Substanzeinwaage verwendeten Analysenwaage

Eichen

Prufung einer Charge auf k e n Wirkstoffgehalt und Vergleich mit Spezifikationsforderungen.

oder Uberprufung, ob der zuvor fcstgclegte MeBzusanimenhang noch gultig ist (Uberprufen dcr Kalibrierfunktion)

1.3 Gritndvoruusset,-rtrlgenf u r die Vrrlidierung einer cinciljtisdien Methock

1.3

15

Grundvoraussetzungen fur die Validierung einer analytischen Methode

Es ist unbestritten, daD nur fachlich kompetente Laboratorien imstande sind, analytische Methoden zu validieren. Wichtig ist dabei, dalj das Verstandnis fur die Validierung, die Auslegung der Normenbegriffe und fur die sich daraus ergebenden Forderungen in der Laborpraxis vereinheitlicht, harmonisiert und pragmatisch angelegt werden. Aus der oben formulierten Auslegung des Begriffes Validierung ergeben sich fur die Laborpraxis folgende Forderungen: 1. Der vom Labor zu erfiillende Auftrag mu13 so weit beschrieben sein, daR sich daraus die an die analytische Methode zu stellenden Leistungsforderungen klar und eindeutig ableiten lassen. 2. Die ublichen Leistungsmerkmalswerte der analytischen Methode mussen als Werte der benotigten charakteristischen KenngroDen bekannt oder zu ermitteln sein. Die Methode mu8 schriftlich fixiert vorliegen; sie sollte neben Angaben wie Methoden- und Einstellparameter, Art und Giite der eingesetzten Chemikalien usw. bei Bedarf auch folgende Angaben enthalten: Probenahme, Probenkonservierung, Probentransport, Probenvorbereitung, Sequenzaufbau bei der Messung, Arbeitsbereich usw. 1st eine der beiden Forderungen nicht erfullt, so ist die Durchfuhrung einer Validierung nicht moglich. 3. In einem Labor mit einem Qualitatsmanagement-System sollte die Erfullung der in den Punkten 1 und 2 genannten Voraussetzungen und die Uberprufung der Machbarkeit zwingender Bestandteil der Vertragsuberprufung sein. Damit die obigen Forderungen erfullt werden konnen, mu8 das Labor zumindest ein fur die Auftragserfullung genugend zahlreiches, fachlich qualifiziertes Personal zur Verfugung stellen, eine Leitung haben, welche die Fuhrungsaufgaben verantwortlich wahrnimmt, uber angemessene Raumlichkeiten, Infrastruktur und Hilfsmittel und uber die benotigten Einrichtungen zur Messung, Analyse undloder Priifung verfugen. Weiterhin mulj es die fur den Auftrag erforderlichen Verfahren und Methoden so weit beherrschen, daB das dem Auftraggeber zugesicherte Qualititsniveau der vereinbarten Dienstleistung sichergestellt ist. Nach bisherigen Erfahrungen ist es uberdies vorteilhaft, wenn das Labor ein zweckmaRiges( !) Qualitltsmanagement und ein angemessenes Qualitatssicherungs-System betreibt, welches gewlhrleistet, daR die Qualifikation des Personals, die Laborausrustung und Verfahrensbeherrschung laufend den jeweiligen Bedingungen angepaBt werden. Fragen der ausreichenden Personalqualifikation undoder der angemessenen und zweckm3Digen Ausrustung von Laboratorien, die bei der Durchfuhrung von Validierungen in jedem Fall bedeutsam sind, werden in diesem Buch weiter nicht behandelt (siehe dazu 13,411.

1.4

Die Unsicherheit der Ergebnisse von Messungen, Prufungen und Analysen

Jeder MeClwert ist mit einer M~~~~rtri.sic.hrrhrit behaftet. Obwohl trivial. werfen wir nun doch einen Blick aufden Unterschied zwischen physikalischen und chemischen Messungen. Bei physikalischen Messungen ist der MeDwert unabhiingig vom MeBobjekt: Ich messe eine Strecke von 2,5 m, egal ob es sich um eine Latte handelt. einen Baum oder die lichte Hiihe in meinem Buro. Die MeBunsicherheit beschriinkt sich auf den Mel.(vorgang/die Messung selbst. Bei chemischen Verfahren stellt die Probe die .,Materialisierung" des analytischen Problems dar. Sie selbst ist die grol3e Unbekannte: Von der Probenahme bis zur Auswertung niit Hilfe von ReferenLen kiinnen eine Reihe MeRunsicherheiten das Ergebnis beeinflussen. Bereits jetzt kiinnen wir folgendes festhalten: -

-

Je mehr ,,Chemie" eine Methode enthiilt, um so aufwendiger ist die Vnlidierung. 1st .,Physik" dominant, reicht oft eine Kalibrierung ;IUS. Es ist eminent wichtig fur ISK (in statistischer Kontrolle) -Prozesse 7 u sorgen, bei denen der unbekannte Anteil der Menunsicherheit xu vernachlassigen ist.

N u n zu den Definitionen: Im I S 0 ,,Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement" (GUM) von 199.3 sowie in der Revision von 1995 heiRt es zur Unsicherheit: ,.Die Unsicherheit des Ergebnisses einer Messung reflektiert den Mangel an einem genauen Wissen uber den Wert der MeRgriiOe. Das Ergebnis einer Messung 1st auch nach der Korrektur einer erkannten systematischen Einwirkung (effect) immer noch eine Schiitmng des Wertes der Mel3groRe infolge der Unsicherheit. die sich aus der Beeintlussung durch zufiillige Einwirkungen und aus der unvollstiindigen Korrektur des Ergebnisses bezuglich der systematischen Einwirkung ergibt.

Hinweis Das Ergebnis einer Messung kann (nach Korrektur) unwissentlich sehr nahe beiin Wert der MeBgriiRe liegen (und dem zufolge einen vernachliissigbaren Fehler beinhalten) und dennoch kann es eine groCje Unsicherheit haben; daher sollte die Unsicherheit einer Messung nicht mit dem verbleibenden Fehler verwechselt werden". Mit .,verbleibender Fehler" ist wohl die verbleibende systematische Abweichung des MePergebnisses gemeint. Im GUM heiMt es weiter:

..In der Praxis sind viele Ursachen der MeRunsicherheit miiglich, dazu gehoren: a ) Fehlerhafte Annahme des Analyten (solvatisiert, Dissoziationsgrad. als Hydrochlorid vorliegend? usw.) b) Cross-Kontamination oder kontaminierte Reagenzien bzw. kontaininierte Leerproben. c) N icht repriisentative Probenahme; d) Ungenugendes Wissen uber die Auswirkungen der Umweltbedingungen auf die Messung oder eine ungenugende Messung der Umweltbedingungen,

1.5 Methoden Zur Chnrrrkterisierung voii cmcilytischen Metliockn

17

e) Ablesefehler einer analogen Anzeige durch die messende Person, f) begrenzte Auflosung oder Nachweisgrenze des Instruments, g) ungenaue Werte der Meastandards und des Referenzmaterials, h ) ungenaue Werte von Konstanten und anderen Parametern, die aus externen Quellen stammen und in den Algorithmen zur MeBwert-Reduktion verwendet wurden, i) Annlherungen und Annahmen, die in die MeBmethode bzw. -prozedur aufgenommen wurden, J ) Schwankungen bei den wiederholten Beobachtungen der MeBgroBe bei scheinbar konstanten Bedingungen. Diese Ursachen sind nicht unbedingt unabhlngig von einander, einige der Ursachen von a) his i ) konnen die Ursache J ) beeinflussen. Eine nicht erkannte systematische Einwirkung kann bei der Abschatzung der Unsicherheit des MeBergebnisses natiirlich nicht berucksichtigt werden, obwohl sie zu dessen Fehler beitriigt". Eine Reihe von Dokumenten (BIPM, IEC/IFCC/ISO/uPAC/IUPAP,OIML) definieren MeRunsicherheit als: ,,Parameter, der die Streuung der Werte kennzeichnet, die eigentlich der MeRgroBe zugeordnet werden konnten.

Anmerkungen I . Der Parameter kann beispielsweise eine Standardabweichung (oder ein gegebenes Vielfaches davon), oder die halbe Weite eines Bereiches sein, der ein festgelegtes Vertrauensniveau hat. 2. MeBunsicherheit enthalt im allgemeinen viele Komponenten. Einige dieser Komponenten konnen aus der statistischen Verteilung der Ergebnisse einer MeBreihe ermittelt und durch empirische Standardabweichungen charakterisiert werden. Die anderen Komponenten, die ebenfalls durch Standardabweichungen charakterisiert werden konnen, werden aus angenommenen Wahrscheinlichkeitsverteilungenermittelt, die sich auf Erfahrung oder andere Informationen grunden. 3. Es wird vorausgesetzt, daB das Meaergebnis der beste Schiitzwert fur den Wert der MeBgroBe ist, und daB alle Komponenten der Unsicherheit zur Streuung beitragen, eingeschlossen diejenigen, welche von systematischen Einwirkungen herriihren, z. B. solche, die von Korrektionen und Bezugsnormalen stammen". Naheres zur Me& und Ergebnisunsicherheit findet sich in Abschnitt 3.4.3.

1.5

Methoden zur Charakterisierung von analytischen Methoden

Die Forderung, dab Laboratorien nur solche Verfahren anwenden durfen, die fur den vorgesehenen Gebrauch tatsachlich geeignet sind, bedeutet, daB der vorgesehene Gebrauch klar

18

I Grundsatze der klidierung in der Analytik und im Prufwesen

beschrieben sein muB und die sich aus der beabsichtigten Anwendung ergebenden besonderen Forderungen spezifizieit sind. Erst an solchen Spezifikationen la& sich ermessen, wie weit die Eignungspriifung (Validiemng) gehen muB, damit der Aufwand in einer zweckmarjigen Relation zu den Bedurfnissen des Auftraggebers steht. Fur die Laborpraxis ist dabei bedeutsam, darj es dem Labor freigestellt bleibt, die fur einen bestimmten Anwendungsbereich typischen Forderungen und Spezifikationen auf Gmnd der eigenen Erkenntnisse und Erfahrungen nach bisherigen Kundenwunschen zu formulieren, womit eine Validierung a priori moglich wird, d. h. schon bevor ein neuer Kunde auftritt. Bei einem solchen Vorgehen bleibt dem Labor die Aufgabe zu uberpriifen, ob das (vorvalidierte) Verfahren auch fur den ganz konkreten Auftrag ebenfalls geeignet ist. Die nachfolgenden Beispiele zeigen, wie die Charakterisierung eines Priif- bzw. Kalibrierverfahrens durchgefiihrt werden kann, sofern die oben genannten Vorbedingungen erfullt sind. Die bei der Charaktersierung eines Pruf- bzw. Kalibrierverfahrens ermittelten Daten sind statistisch zu bearbeiten gemaB den Empfehlungen des I S 0 ,,Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement", second version, 1995. In dieser ISO-Richtlinie wird zwischen zwei Methoden zur Bestimmung der Unsicherheit von Prufergebnissen wie folgt unterschieden: -

-

Methoden des Typs A stutzen sich auf die Schiitzung der Unsicherheit von Messungen mit Hilfe statistischer Verfahren auf der Grundlage experimentell ermittelter Daten. Methoden des Typs B sind Schatzverfahren auf der Grundlage anderweitiger Informationen, 2. B. von Erfahrungswerten.

Die fur die verschiedenen Verfahrensstufen geschatzten MeBunsicherheiten werden gemlB den Regeln des Gesetzes uber die Fehlerfortpflanzung als Varianzen kombiniert. Bei Priifungen darf man erfahrungsgemao in den meisten Flllen die individuellen Beitrage der einzelnen Verfahrensstufen an die Gesamtunsicherheit als unabhlngig voneinander und als normalverteilt betrachten. Nur in Ausnahmefallen. wenn namlich eine Korrelation zwischen zwei oder mehreren Verfahrensstufen vorliegen sollte, ist gemas den Regeln der Kovarianzanalyse zu verfahren.

1.5.1 Die Charakterisierungsmethoden Es lassen sich mehrere Methoden zur Charakterisierung von Pruf- bzw. MeBverfahren anwenden . Sie unterscheiden sich durch die anzuwendende Verfahrensweise, durch die Art (zufallige Abweichungen, systematische Abweichungen, Gesamtabweichungen) und den Erfassungsgrad (Vollstandigkeitsgrad mit dem das Verfahren bei der Schiitzung erfaBt wird) der geschatzten Unsicherheit der Ergebnisse. Alle hier vorgestellten Methoden der Char&terisierung haben ihren praktischen Wert und sollten dem gegebenen Sachverhalt und den Moglichkeiten entsprechend und unter Berucksichtigung der spezifischen Bedurfnisse gewahlt werden.

1.5 Metliodrri ;.ur Chitrctktrri.sirriiri,~1'on iinrilytischcri Mrthoden

19

1.5.1.1 Erste Charakterisierungsmethode Systematische Beurteilung der Faktoren, die das analytische Ergebnis beeinflussen konnen Bei dieser Methode werden alle relevante Parameter (Einfluljgroljen) der Methode systematisch variiert und deren EinfluB auf das Ergebnis quantifiziert. Diese Charaktersisierungsmethode ist immer dann zweckmaljig oder einzig rnoglich, wenn dem Messenden gesicherte Referenzen nicht zur Verfugung stehen. Dies ist oft bei der Analyse von unbekannten Proben und bei der Anwendung von Prufverfahren der Fall. die sich lediglich auf Meljkonventionen (,,Kochrezepte") stutzen. Zu typischen iiuljeren Einflussen, welche analytischen Pruf- bzw. Meljergebnisse beeintlussen konnen, gehoren beispielsweise: Temperatur, Strahlungen, Luftfeuchte, Luftdruck, Luftfremdstoffe, Spannung des elektrischen Stroms, Magnetfelder oder mechanische Erschutterungen. Zu inneren Einflussen gehoren z. B. Inhomogenitlt, bzw. Verunreinigungen des MeRobjekts oder Bestandteile einer untersuchten Substanz, die ein Gemisch aus verschiedenen Stoffen darstellt (Matrixeffekte).

Kommentur Diese Charakterisierungsmethode kann praktisch unbegrenzt, d. h. in allen Bereichen des Priifwesens, verwendet werden und hat insoweit eine nahezu universelle Anwendungsmoglichkeit. Zu den Ergehnissen der ersten Churakterisierungsmethode

Die mit Hilfe der ersten Charakterisierungsmethode erhaltenen Ergebnisse sind Schitzwerte fur die zufiilligen Abweichungen der Unsicherheiten der Ergebnisse von Analysen bzw. Messungen. Sie sind fur das untersuchte analytische Verfahren charakteristisch und sind bei Einhaltung gleichbleibender Wiederholbedingungen als eine VerfahrenskenngriiOe des validierenden Labors anzusehen. Die so ermittelten Kenngroljen besagen indessen nichts uber die Richtigkeit der mit diesem analytischen Verfahren gewonnenen Ergebnisse, d. h. dalj in diesem Fall die systematische Abweichung vom richtigen Ergebnis unbekannt bleibt.

1.5.1.2 Zweite Charakterisierungsmethode Kalibrierung mit Referenznormalen/Referenzmaterialienund gleichzeitige Untersuchung der EinfluRgroljen Wird eine Kalibrierung zugleich zur Charakterisierung eines MeRverfahrens verwendet, so mulj sie durch eine systematische Untersuchung der Einflusse auf das Kalibrier- bzw. Me& ergebnis - gem213 der oben geschilderte ersten Charakterisierungsmethode - erganzt werden. Die zur Kalibrierung verwendeten Referenzen mussen dabei bezuglich Art und Grolje der durch sie dargestellten Merkmalswerte den zu messenden Prufobjekten entsprechen. AuRerdem sind die Werte jener Einflusse systematisch zu untersuchen, welche das Kalibrierbzw. Meljergebnis merklich, d. h. uber das zulassige Ma13 hinaus, beeinflussen konnen.

KonimrritorWi rd beisp ie I s we ise de r Ei n tl u B de r A i i Ren tern peratur fur eine n best i in in ten Te in pera t urbereich untersucht, so sind MeBergebnisse, die bei Temperaturen gewonnen wurden. die auBerhalb dieses Bereichs liegen, als nicht gesichert bzw. nicht vertrauenswurdig zu betrnchten. Aus diesem Crund sollten Ergebnisse von Messungen beispielsweise wie folgt priisentiert werden: ,.Die charakteristischen KenngroBen X, Y, Z dieses MeBverfahrens wurden fur den Temperaturbereich rwischen 18 "C und 24 "C ermittelt".

Er,yd~rri.s.srrider- :n,vitrri Chcir-trX.trrisirrirri~~.sriirthodr Die tnit der zweiten Charakterisierungsmethode erhaltenen Ergebnisse sind zuniichst iihnlich wie bei der ersten Charaktersisierungsmethode - Schatzwerte fur die zufiilligen Abweichungen der Unsicherheiten von MeBergebnissen. Bei Einhaltung gleichbleibender Wiederholbedingungen sind sie als eine VerfahrenskenngroRe des untersuchten MeOverfiihrens anzusehen. Dank der Verwendung gesicherter Referenfen ermiiglicht diese Charakterisierutigsmethode zusiitzlich eine Aussage uber die systematische Abweichung der init diesem MeMverfahren gewonnenen Ergebnisse, also die Uberprufung der Richtigkeit. Die Unsicherheit dieser zweiten Aussage hlngt im wesentlichen n u r noch von der Qualitiit der Referenz - oder genauer genommen von der Unsicherheit derdurch die Refercnz verkijrperten Merkmalswerte ab.

Zii dtw

KomrnentrirDie Unsicherheit der verwendeten Referenzen mu8 den Spezitikationen des MeRverfahrens entsprechen oder besser als die Forderungen sein. Die Unsicherheit der Referenj. sollte dem Gebrauchszweck ebenso angemessen sein, wie der Kostenaufwand fur die Referenz. welcher die Gesamtmessung nicht mehr belasten sollte als unbedingt notig. I 3.1.3 Drittc Charakterisierungsmethode Vergleich der Ergebnisse, die mit einem weiteren Verfahren ermittelt wurden In dieser Charuhterisierungsmethode werden die tnit dein zu charakterisierenden Meljvertahren erhaltenen Ergebnisse mit den Ergebnissen eines (oder mehrerer) underen iiniibhiingigen Me6verI:ihrens (Vergleichs- oder Referenzverfahren) verglichen. Dabei werden in beiden Mei.lvcrfohren die gleichen Me8objekte unter Wicderholbedingungen verwendet. Es kann vorkommen. dal3 das Vergleichsverfahren ein Refcrenmerfiihren ist. d. h. did3 die ni i t i h m e rm i t t e 1ten Erge bn i \ \e au f g es i c hert e Refere n / e ti zii rue kg etii h rt u erde II hii11 tie n . Die drittc Cti~irakterisict-tingsmethodeist dann niitzlich, wenn einerseits keine gcsicherten Referenzcn iinmittelbar verfugbar sind und anderseits dcr Aufwand fiir eine \ystematische Untcrsuchung der Einfliisse aufdie MeBgrijRen mittel\ der er\ten Charakterisieriingsmcthode ;iu\ /citlichen und/oder aus Kostengriinden nicht i n Frage kommt.

1.5 Methoden zur Chariikterisirrurig von iinciljtischrn Mettiodi~n

21

Kommentar Die Wahl des Vergleichsverfahrens sollte dem Verwendungszweck des untersuchten MeRverfahrens entsprechen, insbesondere beziiglich der zulassigen Ergebnisunsicherheit. ebenso sollte bei dessen Wahl beriicksichtigt werden, daR der rnit dem Vergleichsverfahren verbundene Aufwand und die damit verbundenen Kosten in einem akzeptablen Verhiiltnis zu den Bedurfnissen des Auftraggebers stehen. Zu den Ergebnissen der dritten Charakterisierungsmethode

Die Unsicherheit der mit dem zu charakterisierenden MeRverfahren ermittelten Ergebnisse ist unmittelbar davon abhangig, wie groR die Unsicherheit der rnit dem Vergleichsverfahren gefundenen Ergebnisse ist. Je kleiner der Unterschied zwischen den Ergebnissen der verglichenen Verfahren, um so starker die Vermutung, daR sich die charakteristische Unsicherheit des untersuchten MeBverfahrens nur geringfiigig von jener des Vergleichsverfahrens unterscheidet. Wir schlagen vor, den Unterschied zwischen den mit zwei unabhiingigen Meherfahren ermittelten Ergebnissen - bei Einhaltung von Wiederholbedingungen der Ergebnisunsicherheit jedes der beiden Verfahren gleichzusetzen. Verwendet man bei dieser Untersuchung mehrere MeBobjekte rnit unterschiedlichen Werten des gleichen Merkmals, so erhalt man im Resultat eine ganze Reihe von Unsicherheiten, die nach statistischen Regeln bearbeitet werden konnen. Je nach Art des Vergleichsverfahrens sind die Unsicherheiten der rnit der dritten Charakterisierungsmethode ermittelten Ergebnisse charakteristisch fur: 1. die zufilligen Abweichungen der Unsicherheiten, wenn niimlich das Vergleichsverfahren auf eine Referenz nicht zuriickgefuhrt werden kann; 2. die zufalligen Abweichungen der Unsicherheiten, zugleich aber auch fur die systematischen Abweichungen der Unsicherheiten, wenn namlich das Vergleichsverfahren ein Referenzverfahren ist und auf eine gesicherte Referenz zuruckgefiihrt werden kann. Wurde das zum Vergleich verwendete Referenzverfahren gernii0 der zweiten Methode bereits charakterisiert, so liegen Angaben iiber die charakteristische Ergebnisunsicherheit dieses Verfahrens schon vor. In diesem Fall ist auch eine Aussage iiber den Vertrauensgrad der Ergebnisunsicherheit des untersuchten MeBverfahrens moglich.

Kommentar Die Wahl des Vergleichsverfahrens sollte dem Verwendungszweck des untersuchten MeRverfahrens entsprechen, insbesondere bezuglich der zulassigen Ergebnisunsicherheit, ebenso sollte bei dessen Wahl berucksichtigt werden, daB der rnit dem Vergleichsverfahren verbundene Aufwand und die damit verbundenen Kosten in einem akzeptablen Verhiiltnis zu den Bediirfnissen des Auftraggebers stehen.

1.5. I .4 Vierte ChnrakterisierungsInethode

VergleichsrnessungeIi zwischen Laboratorien (Laborvergleichsversuche, Ringversiiche) In dieser Methode wird das untersuchte MeRverfahren mittels der Ergebnisse von Vergleichsmessungen zwischen mehreren Laboratorien charakterisiert. Die am Vergleichsversuch teilnehmenden Laboratorien verwenden alle das gleiche MeBverfahren und Lintersuchen alle die gleichen Priifobjekte unter den fur ihr Labor spezitischen Gegebenheiten (Vergleichsbedingungen). Das untersuchte MeBverfahren wird charakterisiert, indem die Ergebnisse der Vergleichsmessungen mit statistischen Mitteln bearbeitet und dargestellt werden. Kotiiiiiuittir

ZLIVergleichsniecsLingen zwischen rnehreren Laboratorien, deren Zweck die Charakterisieriing eines Meaverfahrens ist', sollten nur solche Laboratorien eingeladen werden. welche das LU charakterisierende Verfahren in vertrauenswurdiger Weise bezuglich Wissen, Erfithrung und Ausrustung beherrschen. Vergleichsmessungen zwischen Laboratorien mussen gut geplant, kompetent begleitet und mit statistischen Mitteln ausgewertet und dargestellt werden. Die Teilnahinebedingungen und der Durchfiihrungsniodus mussen schon im voraus bekannt sein. Das Verfahren selber ist bis ins Detail schriftlich niederzulegen: insbesondere bezuglich solcher Verfahrenselemente, die auf das Endergebnis einen inerklichen Eintlufi haben kiinnen. Eine Vergleichsmessung mu13 von einem besonders kompetenten Labor (Referenzlabor). welches das untersuchte Verfahren hervorragend beherrscht. geleitet und betreut werden. tlcw Ergehriissrri tler lierteti Clicirtikterisirr-irri~~.stiirtliode Mit Hilfe dieser Charnkterisierungsrnethode wird pro Prufobjekt von jedem der teilnehmenden Laboratorien ein (oder mehrere) Ergebnis(se) geliefert. Diese Reihe von Ergebnissen ist die Grundlage fur die Schltzung der zufdligen Abweichung der Unsicherheit des MeOergebnisses fur das gegebene MeOobjekt. Werden i m Vergleichsversuch mehrere Prufobjekte mit verschieden groRen Werten des gleichen Merkmals untersucht, so ergibt sich eine Reihe von Ergebnissen, aus denen fur das untersuchte MeRverfahren die Unsicherheit der Ergebnisse unter Vergleichsbedingungen als eine charakteristische VerfahrenskenngrBRe, die .,Standardunsicherheit" berechnet werden kann. Sie gilt furjenen Bereich, welcher der Spanne der Merkmalswerte der untersuchten Priifobjekte entspricht. Die so ermittelte Kenngrii1.k besagt indessen nichts uber die Richtigkeit der mit diesem Meliverfithren gewonnenen Ergebnisse, d. h. daR die systematische Abweichung vom richtigen Ergebnis weiterhin unbekannt bleibt. Die Vertrauenswurdigkeit der Standardunsicherheit hiingt im wesentlichen von der Vertrauenswurdigkeit der teilnehmenden Laboratorien ab. Je kleiner die Unterschiede zwischen den Ergebnissen der Laboratorien, um so stlrker die Vermutung, dal3 Zir

1

Vcrglcichsverauchc /wisehen Lahoratoricn werden fur vcrschicdene Aulgahcn eingesetlt. n i n lich: .,mr Charaktcriaicrung von McBvcrfahren" odcr ,,mr Charakterisicrung der Eigcnschalicn. d. h. dcr Merkrnalswcrte von Stoflcn" (Marerialzer1ili;ricrung) oder ,,mr Uhcrprufung dcr lcchnischen Leiqtungsfihigkcir von Lahoratorien" (prolicicncy testing)

die rnit dem untersuchten Verfahren erzielen Werte eine verhaltnismiiljig geringe Unsicherheit haben. Fur eine detaillierte Auseinandersetzung rnit dem Thema ,,Ringversuche" siehe G. Gorlitz in [3]. I S.1.5 Funfte Charakterisierungsmethode

Geordnete Schatzung der Ergebnisunsicherheit auf der Grundlage von Wissen und Erfahrung (Ein Schiitzverfahren vom Typ B) Das Vorgehen bei der .,Schatzung" von U, sieht in kurzester Darstellung wie folgt aus: 1. Der gesamte Meovorgang wird Schritt um Schritt, d. h. von der MeRplanung uber die

Festlegung der Probenahmeorte, Probenahmedauer. Probenzahl, der Messung der Hilfsparameter (Temperatur, Wasserdampfgehalt, Zusamniensetzung der Case usw.), der eigentlichen Probenahme und dem Probentransport usw. bis zur allerletzten Auswertung und Berechnung, ohne irgendeine Auslassung einer Verfahrensstufe, aufgelistet. Bei jeder Verfahrensstufe wird abgeschiitzt, welchen Einflul3 die Unsicherheit dieses Schritts (Ui) auf die Unsicherheit des Endergebnisses (U,-Wert) haben konnte. 2. Die so aufgelisteten einzelnen Schritte werden nun zu griifieren Verfahrensmodulen zusammengefaBt, wie z. B. Probenahme, Probentransport, Probenvorbereitung, Anreicherung oder Verdunnung der Probe, Messung der gesuchten Merkmalswerte, Auswertung und Berechnung der Ergebnisse. 3 . Fur jedes Verfahrensmodul wird nun die Unsicherheit des Moduls U, anhand der fur die einzelnen Verfahrensstufe geschatzten Unsicherheiten U, (gemal3 der Regel fur die Fehlerfortpflanzung nach GauB) als prozentualer Beitrag des Moduls an die Gesamtunsicherheit U, berechnet. Aufgrund einer breit abgestutzten Erfahrung wird dabei angenommen, daR sich die Einzelunsicherheiten normal verteilen und daR sie in den allermeisten Fallen untereinander nicht korrelieren. 4. Aus den prozentualen Unsicherheiten der Module U, wird schlieljlich die Gesamtunsicherheit U, des Endergebnisses der Messung (ebenfalls nach GauR) ermittelt. Alle soeben beschriebenen Schatzungen werden fur zwei Situationen gemacht, ngmlich fur: a) Unsicherheiten. die sich bei Standardsituationen (S-Fall) ergeben haben, d. h. bei Situationen, wie sie in der Praxis beim Schiitzenden in etwa 2/3 aller Fiille bei Anwendung des geschiitzten Verfahrens vorgelegen haben; angegeben wird die obere Grenze dieses Streubereichs und b) Unsicherheiten, welche bei Anwendung des geschatzten Verfahrens in ungunstigen Situationen (X-Fall) beim Schiitzenden nur selten angefallen sind, d. h. rnit einer Hiiufigkeit von einmal pro 20 Standardsituationen bis zu einmal pro 100 Standardsituationen (d. h. mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 bis 99 %). Nicht gemeint sind damit die denkbar schlimmsten Fiille iiberhaupt (worst cases), die in der Praxis selten Relevanz haben. Angegeben wird hier die obere Grenze dieses Streubereichs. Das hier beschriebene ,,Verfahren zur geordneten Schiitzung der U,-Werte von Prufungen", das auf einen Vorschlag von J. S. Morkowski 15-71 zuruck geht, wurde in die neue

IS0 Norm 17025 aufgenommen (s. Abschnitt 1.2. I ) . Die bisher mit diesem Schatzverfahren gesammelten Erfahrungen bestiitigen ohne Ausnahme die Vermutung. da8 es Ergebnisse ( U ,.-Werte) liefert, welche den Erwartungen versierter Praktiker sehr nahe kommen.

Vorbedingungen fur die Teilnahme an der Schatzung sind: Ein gutes Verstiindnis des MeBprinzips, insbesondere der wissenschaftlich-theoretischen Hintergrunde, aufdenen es aufbaut, und ein Verstiindnis fur die Bedeutung der miiglichen EinfluUgroBen - ein haufiger und schon liinger dauernder Umgang mit dem betreffenden (oder init einem sehr iihnlichen) MeBverfahren einschliefllich der Fiihigkeit zur Beurteilung der Plausibilitiit der Ergebnisse von Messungen bzw. Analysen und last but not least der Mut, um die vorhandenen Unsicherheiten LU benennen und zu quantifizieren. -

lnfolge der Schiitzung der Unsicherheiten fur zwei verschiedene ..Betriebssituritionen" bei der anwendung des Verfahrens ergeben sich zwei Zahlenreihen. aus denen zwei U,Werte berechnet werden. Der erste U,-Wert (S-Fall) wird einer einfachen Standardunsicherheit gleichgesetzt. Der zweite Wert (X-Fall) betriigt in vielen Bereichen des Prufwesens erfahrungsgemifl das zwei- bis dreifache dieser Standardunsicherheit (bei sehr unsicheren Verfrihren allerdings noch mehr). Die von einzelnen erfahrenen Messenden ( u . U. bei mehreren Personen aus dem gleichen Labor) geschiitzten U,-Werte werden wie die EinAergebnisse aus einer Vergleichsmessung zwischen Laboratorien (Ringversuch) behandelt. Die Anwendung der funften Charakterisierungsmethode bedeutet in der Praxis: -

-

-

Es ist moglich. die charakteristische KenngriiBe U, des Meflvert'ahrens unter Vergleichsbedingungen zu schgtzen. Diese wird ausgedruckt als Grenze des Vertrauensbereichs (mit 2/3 und I/,,,-Wahrscheinlichkeit) fur die Unsicherheit der Einzelwerte. Die Schwachpunkte der Verfahrensstufen, die den groaten Beitrag zur Gesamtunsicherheit des Gesamtverfahrens liefem, konnen identifiziert werden. Es ist dadurch miiglich, das Verfahren hinsichtlich der Gesamtunsicherheit zu verbessern. Insbesondere durch gezielte MalJnahmen zur Verminderung der Unsicherheit jenes Verfahrensschrittes, welcher erkanntermaBen den gro13ten Beitrag an die Gesamunsicherheit liefert. Bei der Berechnung der Gesamtunsicherheit U, des Verfahrens aus den Unsicherheiten der Verfahrensmodule U, istjeweils zu prufen. ob die Module sich hinsichtlich der Unsicherheit gegenseitig beeinflussen, d. h. oh sie miteinander korrelieren.

Erg&iiisseii derfiii!fttw Chcircrktc~ri.sirriiri~.sriirtlioilr Das Ergebnis einer Schatzung init der funften Charakterisierungsmethode kann hvispirlscceise wie folgt angegeben werden: ,.Fur 2/3 aller Fiille betriigt im S-Fall die Standardunsicherheit des Gesamtergebnisses U, dieses Prufverfahrens rund Ki c/r (Sch3t7wert fur Standardsituationen. d. h. bei Anwendung des Verfahrens unter gunstigen bzw. normgerechten Bedingungen). Im X-Fall. d. h. in 95 8 aller Fille ist die Unsicherheit des Gesamtergebnisses U, nicht groBer als ?7 r/o

Zir &ii

1.5 Methoden zur Chrtrukteri.rierungvon unulytisc~henMethodm

25

(Schatzwert fur den Fall, dalj das Verfahren unter ungunstigen Bedingungen durchgefuhrt werden mulj). - Diese Schatzwerte gelten fur Raumtemperaturen zwischen 20 "C und 25 "C und Luftfeuchtigkeiten zwischen 45-55 % r. F. Die Nachweisgrenze dieses Prufverfahrens liegt bei 2 mg Prufsubstanzkg Probe im Trockenzustand." Die Cute der mittels der funften Charakterisierungsmethode gefundenen Schatzergebnisse ist zunachst ein Spiegelbild des Wissens und der Erfahrung des Schiitzers betreffend des geschiitzten Verfahrens. Zugleich sind sie aber auch ein Ausdruck seines Konnens zur realistischen Darstellung jener Fehler, die (scheinbar nur) in seinem Labor schon aufgetreten sind und ein Zeichen seines kritischen Sinnes, der Unsicherheitsquellen erkennt, was den Schatzer uberaus ehrt. Man darf ohne zu zogern vermuten, dalj die Ergebnisse solcher Schatzungen durch wissende, erfahrene und der Wahrheit mutig ins Auge schauende Praktiker nicht schlechter (und nicht schockierender!) sind, als die oft ,,unglaublichen" Ergebnisse von Vergleichsversuchen zwischen Laboratorien (gemalj der vierten Charakterisierungsmethode),bei denen sich die Ergebnisse untereinander oft ganz wesentlich unterscheiden. In beiden Fallen werden die groljen Streuungen der Ergebnisse durch die gleichen Ursachen bewirkt, namlich durch die vielfaltigen und oft bedeutsamen Einflusse auf die einzelnen Schritte des Verfahrens, die in den Laboratorien in unterschiedlicher Weise wirksam werden, die aber in der Laborpraxis allzu oft aus Unwissenheit unbeachtet oder als untergeordnet unerwahnt bleiben. Sind die Problematik und Tucken eines Verfahrensmoduls dem Schiitzenden nicht gut gelaufig, so kann er schwerlich dessen Unsicherheit U, schatzen. Damit ist er auch auljer Stand, die Gesamtunsicherheit U, des Verfahrens zu schatzen. Tut er es dennoch, darf dies nur unter dem Vorbehalt geschehen, dalj die fehlende Erfahrung sobald wie moglich gewonnen und der provisorische Schatzwert allenfalls korrigiert wird. Dies bedeutet, daO das unbekannte Modul so schnell wie nur moglich nach einer der 0. g. vier ersten Methoden charakterisiert wird oder, sofern dies experimentell nicht moglich ist, statt dessen erfahrene Praktiker befragt werden, mit deren Hilfe eine Schitzung der Unsicherheit des besagten Moduls U, durchgefuhrt wird 181. Die Vorteile und die Nutzlichkeit der funften Methode zur Charakterisierung der Unsicherheit der Ergebnisse sind evident. Oft stellt sie die einzige praktikable Moglichkeit dar, um eine erste Abschiitzung der Gesamtunsicherheit U, eines quasi neuen Verfahrens zu erlangen; z. B. dort, wo Priif-, Melj- oder Analysenergebnisse schnellstens benotigt werden und wo das ,,neue" Verfahren aus an sich wohl bekannten, erprobten und gut beherrschten Verfahrensmodulen ad hoe zusammengebaut wird. In einem solchen Fall wird die Gesamtunsicherheit U-, ails den schon von fruher her bekannten Unsicherheiten U, der verwendeten Verfiihrensniodule abgeschatzt. Bei diesem Vorgehen sollte klar sein, daB die verwendeten U,-Werte nach verschiedenen Charakterisierungsmethoden ertnittelt wurden. Die einen kiinnen eine experimentelle Grundlage haben und andere auf der Basis von Erfahrung und dem wissenschaftlichen Verstandnis des verwendeten PrinTips geschiitlt worden sein. Die soeben geschilderte Situation kommt bei F+E-Arbeiten ofter vor. Nicht immer kann hiei- schon im voraus gesagt werden, BUS welchen Verfahrensmodulen das jeweils benotigte Verfahren zusatnmengebaut werden wird. Eine schnelle Schatzung des U,-Wer-

26

I Grundsutze der W i d i e r u n g in der Anulytik und im Priifwesen

tes ist nur ein Notbehelf. dem mit einer systematischen Untersuchung der EinfluBgroBen oder durch Vergleich der Ergebnisse mit einem anderen unabhangigen Verfahren oder dem Vergleich mit anderen Laboratorien so bald wie moglich abgeholfen wird. Diese Charakterisierungsmethode, die quasi eine Alternative zur klassischen Validierung darstellt, gewinnt stets an Bedeutung. So ist sie bereits mehrfach Gegenstand von Publikationen gewesen. GemaB ihrer wachsenden Bedeutung wird in Abschnitt 3.2 und in Kapitel9 ausfuhrlich auf deren praktische Anwendung eingegangen. Es kann vorkommen, daB die schon bestehende Charakterisierung eines Verfahrens oder eines Verfahrensmoduls, welche bereits nach einer Charakterisierungsmethode vom Typ A (d. h. Methoden 1-4) erfolgte, um eine Charakterisierungsmethode vom Typ B erweitert werden muB. Am besten geeignet scheint hierfur die Charakterisierungsmethode 5. 1 .S.1.6 Kombination der funf Charakterisierungsrnethoden

Das Wissen eines Labors um die Unsicherheiten der verschiedenen Verfahrensstufen basiert auf recht unterschiedlichen Erfahrungen. Die das Verfahren anwendende Person mag die eine Verfahrensstufe recht gut im Griff haben; uber eine andere Verfahrensstufe wurde sie gerne etwas mehr wissen; schliefilich weiB sie uber eine weitere Verfahrensstufe nur soviel, daB sie recht unzuverlassig ist und verrnutlich erhebliche Unsicherheiten in sich birgt. Dieses ungenugende Wissen um die Unsicherheit bestimmter Verfahrensstufen spiegelt das realistische Problem wider, rnit dem sich der Validierende oft konfrontiert sieht. Aus diesem Grund setzt sich in der Praxis die Charakterisierung eines komplexen Verfahrens oft aus mehreren Charakterisierungsmethoden zusammen, d. h. daB sie eine Kombination von mehreren der 0. g. funf Charakterisierungsmethoden ist.

Beispiel Basiert eine Verfahrensstufe auf einer Messung mit dem Ziel, physikalische Merkmalswerte eines MeBobjekts festzustellen, so wird man zu dessen Charakterisierung die zweite Charakterisierungsmethode verwenden (Kalibrierung mit systematischer Untersuchung der wesentlichen EinfluBgroBen). Fur die Abschatzung der Unsicherheiten, die sich aus der Probenvorbereitung ergeben konnen, wird man oft die erste Charakterisierungsmethode nehmen (systematische Untersuchung der EinfluBgroBen). Sollen indessen die Unsicherheiten abgeschatzt werden, die sich in einem bestimmten Verfahren bei der Probenahme und dem Probentransport ergeben konnen, so ist eine gute Kenntnis der wissenschaftlichen Zusammenhange und eine ausgiebige praktische Erfahrung im Umgang rnit diesem Verfahren die einzige realistische Grundlage fur die Ermittlung realistischer Werte von U, gemal3 den Regeln der funften Charakterisierungsmethode. Die gesuchte Gesamtunsicherheit des Ergebnisses U, kann in diesern Fall nur dank einer Kombination der 0.g. drei Charakterisierungsmethoden (fur die gesuchten drei U,Werte) ermittelt werden.

1.6 Chrirtiktc.risieriing (Qualififizieruns)von Methodm

27

1.5.1.7 Weitere Methoden vom Typ B

In FHllen, da eine Verwendung einer der 0. g. funf Charakterisierungsmethoden nicht moglich oder nicht zweckmHSig ist, bleibt manchmal die Moglichkeit, eine weitere Charakterisierungsmethode vom Typ B einzusetzen, so 2. B.: 1. Charakterisierung eines Verfahrens durch Sirnulotion, d. h. Untersuchung analoger Prufobjekte mit bekannten Merkmalswerten. Diese Methode ermittelt die zur Charakterisierung des untersuchten Verfahrens bendtigten Informationen (insbesondere den Wert von U,) durch Messung von gut bekannten. d. h. kalibrierten MeSobjekten, welche dem zu prufenden Original bezuglich der maBgebenden Merkmalswerte sehr Hhnlich sind. Zu beachten ist dabei, daf3 das durch Simulation charakterisierte MeSverfahren den Bedurfnissen des Auftraggebers ZLI genugen verrnag. Diese Simulationsmethode konnte man als eine Ableitung der zweiten Charakterisierungsmethode mit einer ..Quasi-Kalibrierung" bezeichnen. 2. Charakterisierung eines Verfahrens durch Ber-echnungen,die sich aufverifizierte Rechenmodelle stutzen.

Diese Charakterisierungsmethodeermittelt die benotigten Informationen (insbesondere den Wert von U,) durch Berechnungen, die von reellen Prufergebnissen ausgehen und diese in ein veritiziertes Rechenmodell einbringen. Dies berucksichtigt zugleich die wissenschaftlichen Zusammenhlnge des untersuchten Verfahrens ebenso wie die anderweits untersuchten Einflusse auf das Gesamtergebnis. Bedingung fur die Verwendung dieser Methode ist einerseits, daR das verwendete Rechenmodell durch plausible Rechenergebnisse verifiziert wurden und dem neuesten Stand der Erkenntnisse/der Technik entspricht und daR es anderseits den Bedurfnissen des Auftraggebers genugt.

1.6

Charakterisierung (Qualifizierung) von Methoden als letzter Schritt einer Validierungsprozedur

Letzter Schritt der Validierungsprozedur ist der Vergleich der gefundenen charakteristischen Merkmalswerte der untersuchten Methode mit den Forderungen, wie sie sich aus einem Auftrag oder aus Spezifikationen ergeben, urn eine bestimmte Aufgabe angemessen losen zu konnen. 1st das Ergebnis des Vergleichs positiv, d. h. dal3 die fur den Auftrag vorgesehene Methode geeignet ist, so hat das Labor dies formell durch eine schriftliche Erkllrung festzustellen. In der Praxis wird man sagen: die Methode ist validiert und fur einen bestimmten Verwendungszweck qualifiziert. Fur Akkreditierstellen stellt sich die Frage, wie diese Forderungen der IS0 17025 praxisnah zu uberprufen sind. Im Sinne des Qualitatsmanagements (ISO-9000 ff.) fordert die Norm vom Labor eine Dienstleistung, die der Aufgabe des Kunden angemessen ist und eine dementsprechende Prufung des Vertrages erfordert. Die fur die Aufgabe vorgesehene Methode ist darauthin zu uberprufen, ob sie fur die Losung des konkreten Kundenpro-

blems tatsiichlich geeignet ist, d. h. daB. die Methode zu validieren ist. 1st die Eignung uberpriift und gewiihrleistet, so hat das Labor diese Tatsache xu bestiitigen. Gemiil!, den vorausgegangenen Ausfuhrungen wird die vorgesehene Methode fur den konkreten Kundenauftrag qualitiriert. Es kann vorkommen, dal!, das Labor irn Vertrag einschrankend feststellen muR, d.'1.I< es einige Forderungen nicht oder nur teilweise erfullen kann (weil es z. B. fur die Messung eines bestiinmten Merkmalswertes nicht eingerichtet ist). SchlieBlich ist zu beachten. dal!, die vollstindige Vertragsprufung nicht nur die Beherrschung des Meaverfahrens behandelt (d. h . Personalqualifikation, Merkmalswerte der Methode, angemessene Einrichtungen u. 2. m.) sondern auch andere Aspekte wie z. B. rechtliche Gesichtspunkte, Terminfragen, die Verfugharkeit von geeignetem Personal und Einrichtungen und nicht zuletzt die Kostenfrage.

1.7

Freigabe von Methoden, Dokumentation

Der Laborleiter ist dnfur verantwortlich, dal3 alle in seinein Labor verwendeten Methoden (vorrangig die nicht genormten) charakterisiert werden in einein Umfang, welcher den1 beabsichtigten Verwendungszweck angemessen ist. Bevor eine Methode in einem Labor routincmiil3ig eingcsetzt wird, muB sie vom Laborleiter fur den Gebrauch ausdrucklich freigegeben werden. Aus Erfahrung wissen wir. dal3 genormte Verfahren oft ohne eine kritische Uberprufung in die laufende Laborpraxis ubernommen werden. Das kann sich riichen, geht es bei der Methode tatsachlich um Wahrheitsfindung und nicht nur um eine formale Konformitlitsprufung. Der Zeitpunkt der Freigabe einer Methode sollte aus deren Dokumentation klar ersichtlich sein. Die init der Anwendung einer Methode betraute Person sollte den Laborleiter dariii~fai~frnerks;iin machen. wenn bei deren Anwcndung Bedingungen von jenen abweichen, die geinliB Dokumentation fur ihrc Charakterisierung mnOgebend waren (definierter Anwendungsbereich). Die Durchfuhrung und die Ergebnisse der Charaktei-isierung einer Methode miissen LILISreichend tiokumentiert und anschlieSend nrchiviert werden, siehe Abschnitt 2.2.

I .8

SchluBbemerkungen

Die ISO-Definition ;itis den1 Juhre I994 iind der nahc/ii woitgleiche Test der IS0 17025:2000 schafl'ten Klarheit be/iiglich des Begriffes Validierung. Es sind gutc Definitionen: Der Analytiker hcwahrt weiterhin seine Frriheit -.jedenfnlls l i i t i t Definition. Die Vcrwirrung. was Validiei-tins sein sollte. diirite somit spiirhar nachl;i\\cn. Es geht ,jet/t iii tlcr Vrilidic.ruiig\praxis tin1 Inhalte. Durchfiihriingsmodiis u n r l den Umg;ing niit Zahlcn. Datiiit \vcrden v,ir tins i n den nichsten Knpiteln heschliftigen. Abhzngig von dci- konkietcn Fr;igestellung abrr auch von dcn :thtiiellcn Mijglichkciten gibt es unterschiedliche Wege. eine Validierung durch/ufuhren.

1.8 Schluj’hernerkungen

29

Einen Ansatz stellen die vorgestellten Charakterisierungsmethoden dar. Deren Anwendungsbereich erstreckt sich uber alle zu validierenden Verfahren. Diese Methoden zeigen dem Labor einen Weg, wie es den Nachweis fuhren kann, daB eine bestimmte Methode fur den vorgesehenen Verwendungszweck geeignet ist, bzw. ob es den Forderungen eines Auftraggebers entspricht. Dem Fachbegutachter einer Akkreditierstelle konnen sie helfen, auf die Frage zu antworten, ob das Labor die Fiihigkeit besitzt, geeignete Verfahren einzusetzen, d. h. solche, die geeignet sind, die vom Auftraggeber gestellten Aufgaben in angemessener Weise zu Iosen.

In der Praxis konnte die Anwendung der einzelnen Charakterisierungsmethoden wie folgt aussehen: Die erste Charakterisierungsmethode ist fur Konventionsmethoden geeignet. Hier ist die Untersuchung der EinfluBprarameter wichtig, es geht um Vergleichbarkeit von Ergebnissen. Kalibrierung ist eine hervorragende Moglichkeit (zweite Charakterisierungsmethode) wenn Normale, zertifizierte Referenzmaterialien oder sehr gut charakterisierte Standards vorhanden sind. Ergebnisvalidierung durch Vergleich ist sicher und schnell. 1st eine der genannten Moglichkeiten nicht gegeben, und ist weiterhin das Wissen um Richtigkeit wichtig, kann man sich der dritten Charakterisierungsmethode bedienen, namlich des Methodenvergleichs.

In der Praxis werden diese drei Methoden oft kombiniert: Kalibrierung mit Standards, gefolgt von der Untersuchung der spezifischen EinfluBparameter auf das Ergebnis oder Prufung auf Richtigkeit durch Methodenvergleich und parallele Untersuchung der EinfluBparameter. Die dritte Charakterisierungsmethode sollte nur bei Mangel an Referenzsubstanzen eingesetzt werden. Die vierte Charakterisierungsmethode (Ringversuche) wird immer seltener zu Validierungszwecken von Methoden eingesetzt. - Das Schiitzen der MeRunsicherheit, funfte Charakterisierungsmethode, sollte in F+EBereichen kunftig mehr eingesetzt werden. Tatsachlich erfreut sie sich einer wachsenden Beliebtheit. -

Eine weitere Charakterisierungsmethode ist die Uberprufung der Mrrhodrnsrubilitiit, d. h. die Verfolgung eines Ergebnissesrnertes in Abhangigkeit von der Zeit mit Hilfe der statistischen ProzeBkontrolle, SPC (s. Kapitel 8 und 9). Die unbestrittenen Erfolge der SPC in der Produktion verschaffte ihr Gehor auch in der Analytik. Ein erster Hinweis dafur: Neuerdings verlangen immer mehr FDA-Inspektoren den Beweis, daB die Prozesse in statistischer Kontrolle, ISK, sind [8]. Die Beweisfuhrung, daR die zu untersuchende Methode einen 1SK-Prozel!,darstellt, wird bereits als eigenstandiger Punkt im Rahmen der Validierung angesehen [9].

Handbuch Validierung in der Analytik Stavros Kromidas Copvriaht 0 2000 WILEY-VCH Verlaa GmbH

2

Vor Beginn der Validierungsarbeiten: Voraussetzungen, Dokumentation, Geratequali fizierung

2.1

Voraussetzungen

Vahdierung ist Nachweis der Qualitiit; Qualitiit bedeutet Eignung fur einen bestimmten Gebrauch, .,fitness for use'' [3]. Folglich ist Validierung eine zweckgebundene Priifung auf Eignung, ein Eignungsnachweis. Und ein Eignungsnnchweis bedarf eines grrigneten Umfeldes. Die Faktoren, die die Qualitiit einer analytischen Tiitigkeit - also auch einer Vahdierung - bestimmen, sind jene bekannten 5 M's: Mensch, Maschine, Methode, Material, Milieu. Man konnte hier ein sechstes ,,M" hinzufugen: Management. Auf die Validierung bezogen bedeutet das folgendes (s. Abb. 2-1): Weiterhin sollte vom Management die Bereitschaft bestehen, mit allen Beteiligten das Validierungsziel gemeinsam zu formulieren oder wenigstens unniiljverstandlich mitzuteilen. Schlieljlich sollten wichtige Daten iiber die Probe, wie Ort, Art und Zeitpunkt der Entnahme, Transport, Konservierung usw. bekannt sein. Das Wissen um die Historie der Probe kann bei spater auftretenden Fragen von entscheidender Bedeutung sein.

Mensch

_ _ _ _ _ ~ ~

+

qualifiziertes Personal, das die Methode beherrscht ~~~

~~

Maschine

+

qualifiziert, kalibriert, robust

Methode

eindeutig charakterisiert, geeignet

Material

+ +

Milieu

+

Das (analytische) Umfeld und mogliche Einflusse sind bekannt, z. B. Feuchtigkeit, Temperatur, Strahlen, Schwingungen

Management

+

Das Labormanagement steht hinter dem Validierer, ausreichende Zeit und notwendige Mittel sind gewahrt, inhaltliche Differenzen uber Urnfang und Modus der Validierung sind zu diesem Zeitpunkt bereits beige-

Qualitat der eingesetzten Materialien bekannt und f u r die konkrete Aufgabe ausreichend

legt. Das hei0t zusammengefa0t: Das Management sorgt f u r eine reibungslose Ausfuhrung der Validierung. ~~

Ahh. 2-1 Faktoren. die die Oualitat von Ergehniswm heeinfluscen

1. Zielsetzung genau definieren, bei Auftragen von auOerhalb des Labors rnit dern Auftraggeber die Ziele unrnil3verstandlichfestlegen (Was will ich/der Kunde wissen und warum?). 2. Daraus abgeleitet: Leistungsrnerkrnale und Akzeptanzkriterien (Was muB ich rnessen/welche Daten brauche ich, urn die gestellte(n) Frage(n) beantworten zu konnen?) 3. Methode, soweit sie nicht festgelegt ist, rnit geeigneten Leistungsrnerkrnalen wahlen (Mit welcher Methode kann ich die benotigten Daten ermitteln?'). 4. Prufer bestirnrnen, evtl. Validierungstearn bilden (Die (der) Verantwortliche verfugt uber

fachliche und soziale Kompetenz). 5. Zusarnrnen rnit dern (der) Prufer(in) bzw. Validierungstearn detaillierten Validierungsplan rnit genauen Anweisungen zu folgenden Punkten erstellen: Art, Durchfuhrungsrnodus und Haufigkeit der Experirnente fur die einzelnen Prufpunkte inkl. statistischer Berechnungen Spezifikationsgrenzen, Arbeitsbereich und MaBnahmen bei Abweichungen (rf - then, Umgang rnit Zahlen, AusreiBertests) Qualitatskriterien und Art der Prufung fur Geratschaften und Reagenzien -

Kontrollen und Plausibilitatsbetrachtungen Vorgehensweise zurn Herausfinden der kritischen Punkte der Methode (siehe auch Robustheit, Abschnitt 3.4)

Die kritischen Punkte der Methode stellen gleichzeitig Kriterien fur einen spateren Systerneignungstest dar. Weiterhin dienen sie als Basis fur zukunftige Entscheidungen, wann eine Revalidierung notwendig ist2. 6. Methode auf Basis der experirnentell errnittelten Ergebnisse und den Anforderungen charakterisieren (Ja, sie ist aufgrund dieser Ergebnisse fur den und den Konzentrationsbereich/fur diese Matridnach den Forderungen der Behorde X usw. geeignet - oder nicht geeignet) . 7. Ernpfehlungen, wie in der Laborroutine rnit dern rninirnalsten Aufwand die relevanten Charakteristika der Methode uberpruft werden sollen, z. B. durch das Fuhren einer Regelkarte rnit einer Qualitatsprobe.

8. Dokurnentation und Archivierung.

2

Es wird auch die Meinung vertreten, dan die Methodenauswahl eigentlich vor der Validierung abgeschlossen 1st In diesem Fall beginnt die Validierung rnit Punkt 4 Der klassische Systemeignungstest - Gfache Messung eines Standards vor und am Ende einer Menserie - kann in vielen Fallen ohne Verlust an Information entfallen bzw in groneren Zeitabstanden erfolgen Voraussetzung dafur 1st ein robustes Gesamtverfahren Dies kann mit Hilfe der SPC uberpruft werden (s Kapitel 8)

Abh. 2-2 Schrirrc cincr Mcthodcnvalidierung

2.2 Dokumentution

33

Sind diese Voraussetzungen gegeben oder konnen sie geschaffen werden, so folgt anschlieRend eine genaue Planung des Vorhabens. Abbildung 2-2 ist als Checkliste gedacht, die fur den eigenen Fall modifiziert werden kann.

2.2

Dokumentation

D i e Validierung wird in der Regel m i t der Erstellung eines Berichtes beendet. Er basiert auf dem Validierungsprotokoll, das wlhrend der Messungen sukzessiv erstellt wird. Wie zu erwarten, gibt es unterschiedliche Auffassungen uber Umfang, Tiefe und Form des Validierungsberichtes. Abbildung 2-3 gibt einen Uberblick uber wesentliche Inhalte eines Validierungsberichtes wieder. In Zusammenhang mit Dokumenten zu Validierung wird auch der Vulidution Muster P l m , VMP, genannt. Dieser kommt aus der Pharmaindustrie und bezieht sich - Shnlich

Kurze Zusammenfassung mit kommentierter Stellungnahme Zielsetzung und Anwendungsbereich der Methode, evtl. Angabe von Spezifikationsgrenzen Prinzip und Charakteristika der Methode, ggf. rnit Literaturangaben und Hinweis auf Standardwerke

-

Genaue Beschreibung der untersuchten Muster mit Angaben uber Probenahme, -konservierung und -transport, Probenvorbereitung, Arbeitsbereich und Matrix Eingesetzte Gerate und Chemikalien inkl. Tests zur Qualitatskontrolle bzw. Hinweis auf Qualitatsdaten (z. B. zertifizierte Referenzmaterialien, Kalibrierung) Detaillierte Beschreibung der Messungen mit Angaben uber samtliche experimentelle Bedingungen. Es ist fur den Leser hilfreich, wenn im Validierungsbericht bei den entsprechenden Validierungsparametern je ein Rechenbeispiel enthalten ist, z. 6. F- und &Test bei der Richtigkeitsprufung durch Methodenvergleich oder Berechnung der V i s bei zwei Konzentrationsniveaus (s. Abschnitt 3.2 und 3.3).

-

Optische Hilfen sind sehr einpragsam: Chromatogramme, Tabellen, Spektren, Kalibrationskurven, Regelkarten usw. Zu den Ergebnissen gehoren neben ermittelten Zahlen auch: - Akzeptanzkriterien Spezifikationsgrenzen Angaben zur Methodenfahigkeit - Angaben zur MeOunsicherheit - Tests fur die Routine und Kriterien fur Revalidierungen Name des Validierers und des Gegenprufers

Abb. 2-3 Miigliche lnhalrc cincs Validicrungsberichtcs.

dem Regelwerk GMP - im wesentlichen auf die Produktion (Herstellung). Die Analytik spielt in diesein Zusammenhang eine untergeordnete Rolle. Daher wird hier nur k u r r darauf eingegangen. VMP ist ein Dokument mit Informationen uber die Firmenphilosophie z u m Validierungsprograrnm der Firina. d. h. wie die Firma ihrc Vtilidierungsaufgabcn erledigt. Die Intention eines VMP ist:

- eine Beschreibung zu besitzen fur: warum, von wem, wie und wann die Validierung zu -

-

erfolgen hat, Infomiationen uber aktiielle Regelwerke, Anordnungen, Hinweise bwiiglich Validierung LLI liefern. sowie die Kompetenz der Firma fur adiiquate Validierungen zu deinonstrirren,

Die Ziele eines VMP in1 Einzelnen sind: in einem GMP-Dokument den Umfang der geplanten Validierungsaktivitiiten zu detinieren, - die einzelnen Aktivitiiten zu strukturieren und zii Prioritiiten/ReiherifoIgen festrulegen, - die ~ ~ I L notwendigen L I Arbeitsgrundlagen festzulegen (z. B. durch Vcrweis auf gultige SOP'S oder interne oder externe Richtlinien). die Verantwortlichkeiteii innerhalb der Aktivitliren dcs VMP abzugrenxn, Pliine uber den notwendigen Zeit- und Kaparitiitsbedarf aufzustellen und damit die Gcsaintkosten der im VMP zusammengefaDten Validierungsprolekte transparent zu machcn. -

~

Die Zielset/iing und Gliederung cines VMP konnen nach Scheidmeir [ I01 wie folgt rusammengefiiDt werden. siehe Abb. 2-4.

2.3

Geratequalifizierung

Eine wichtige Voraussetzung fiir eine korrekte Validierung von instrumentellen Methoden ist ein qiialitij.iertes Geriit. Die Eignungsprufung des Geriites erfolgt durch die Geriitequalifizierung, die auf vertraglich vereinbarten Spezitikationen rwischen Anwender und Hersteller fuOt. Dieses Konzept basiert auf dem sogenannten Lebenszyklus-Model1 und hat seinen Ursprung in der pharmazeutischen Industrie. s o wird es u. a. von der FDA, PMA und PIC (zu den Abkurzungen siehe Anhang) vorgeschlagen. Interessierten Lesern sei auf die detaillierten Ausfuhrungen in [ I 1-13] verwiesen. Die funf Lebenszyklus-Phasen sind: -

.,Tender-Enquiry Phase": ,.Pre-Qualification": ,,Qualification": ,,Validation": ,,On-Going-Evaluation'~:

Lastenheft mit projektbezogenen Forderungen Entscheidung fur ein Design Funktionstest Priifung auf zweckgebundene Eignung Erhaltung des validierten Zustands fur die gesamte Lebensdauer des Geriites

-

Einleitung, Zielsetzung des betreffenden VMP's ~~~~~

.

~

Definieren des Geltungsbereichs Kurzbeschreibung des Umfeldes, in dem die Validierungsprojekte geplant sind, z. B.: Produktionsstatten, Produkte, Anlagen Liste aller Validierungsprojekte, z. B. Betriebsmittel, Prufmittel, Verfahren

-

Validierungsaktivitaten, z. B. Kalibrierung, IQ, OQ (s. Text), Computetvalidierung, Prozek-/Methodenvalidierung, Reinigungsvalidierung Festlegungen zu folgenden Punkten, z. B. Dokumentation und Archivierung, Aktionsplan fur ,,out of spec"-Situationen, Verantwortlichkeiten fur jedes Projekt Zeitplan aller Validierungsaktivitaten und Priorisierung Verweise auf die gultigen Richtlinien und Standardarbeitsanweisungen (SOP'S) zu folgenden Punkten: - Organisation Genehmigungsverfahren - Archivierung - Formatvorlagen - Abweichungs- und Anderungskontrolle (,,change control management") - Anlagen, die bei Bedarf aktualisiert werden - Auflistung aller zitierten Dokumente, hierhin gehoren einzelne SOP's fur Methodenvalidierungen - Auflistung aller zu validierenden Objekte (Einrichtungen, Produkte) rnit den jeweiligen Validierungsverantwortlichen

Abb. 2-4 Glicdcrung eines Validalion-Master-plans (VMP).

Nachfolgend w i r d dieses Konzept auf die Geritequalifizierung bezogen, vorgestellt und kurz erliutert. Allgerneingultige Leistungscharakteristika und MelJbereiche, die fur den Einsatz gefordert werden und durch den Kaufvertrag zwischen Anwender und Lieferant vereinbart werden, (operational spezification, Leistungsspezifikation). fallen unter die W i r d der Forderungskatalog urn fur den konkreten Einsatz (besondere Umweltbedingungen, Ausbildungsstand des Personals) relevante Punkte erweitert, spricht man von einer FS (functional spezijiication, funktionale Spezifikation). D i e allgemeinen Leistungscharakteristika sowie die speziellen Forderungen fuhren zu den schlufiendlichen Anforderungen des Kunden. A u f Basis der funktionalen Spezifikationen werden nun die technischen Spezifikationen festgelegt. Sie werden auch Ausfuhrungs-Spezifikationen genannt. Das so erstellte Lastenheft bildet die Basis fur die Auswahl des Gerites. Dieser Part mit den detaillierten Anforderungen des Kunden w i r d als design qual$iicarion, DQ (,,Designqualifizierung") bezeichnet.

0s

Die oben beschriebenen Aktivitiiten gehoren zeitlich in ein fruhes Stadium, niimlich wiihrend der Entscheidungstindung fur eine Methode bzw. bei den Kaufverhandlungen f u r ein Geriit nachdem die Methode entschieden worden ist (5. ersten Punkt des Lebenszyklus). Es kann an dieser Stelle diskutiert werden, ob solche Festlegungen und Vereinbarungen als Teil der Validierung angesehen werden sollten oder ob Validierung mit dem physischen Eintreffen von Geriit, Probe und Chemikalien im Labor beginnt. Betrachtet man die Validierung vom tiiglichen Geschehen etwas IosgelW so fangen die ersten Gedanken zur Validierung praktisch zeitgleich mit den ersten Losungsansiitzen fur ein analytisches Problem an. ja sie sind ein Teil davon. Andererseits wird der Praktiker vor Ort die Erstellung eines Lastenheftes kauin als Teil einer Validierung auffassen. Der Leser miige diese Frage fur sich entscheiden, das weitere Vorgehen wird davon kaurn beeinfluBt. Nachdeni n u n das Geriit bestellt und geliefert ist. beginnt die Gerstequalifizierung EQ (04~ripmwt~ ~ ~ ~ / ~ ~Das ~ ist ; ~der , ~Prozefi / t ; zur ~ ~Sicherstellung, ~ ? ~ . daO das Geriit fur den

beabsichtigten Gebrauch geeignet ist und dalj es gem20 den zwischen Anwender und Lieferanten vereinbarten Spezifikationen arbeitet. Die Geriitequalifizierung erfolgt in drei Stufen: -

IQ (installation qualification, Installationsqualifizierung)

-

OQ (operational qualification, funktionale Qualifizierung)

-

PQ (performance qualification, Leistungsqualifizierung)

In der Literatur wird die design qualification oft als der erste Schritt der Geriitequalitizierung angesehen. Die Argumentation lautet, dalj eine erste ..Qualifizierung" bereits eine richtige Entccheidung fur Design und Hersteller ist. In diesem Fall stellt Ger~itequali~i~ierung eine nicht ;ius drei, sondern iius vier Stufen bestehende Mafinahme dar: DQ. IQ, OQ, PQ. -

Unmittelbar nach der Lieferung erfolgt die IQ (installation qualification. Installationsqua1i tizierung).

-

Bei der IQ wird festgestellt, ob das Geriit wie bestellt und spezitiziert geliefert wurde und oh es ordnungsgemii0 am fur die vorgesehene Aufgabe geeigneten Ort installiert worden ist. Das ist der formale Abnahmetest des Geriites vor Ort. Dieser beinhaltet den Check aller installierten Teile und Vergleich init den Herstellerspezifikationen bzw. Vereinbarungen z. B. Berucksichtigung der Sicherheitsaspekte,Vollstiindigkeit der Zubehiirteile, korrekte Installation der Anschl e, Vorhandensein aller Handbucher (wenn tereinbart, in Deuthch!). korrekte Anzeige der Dia,onosewerte. An zweiter Stelle erfolgt die OQ (operational qualification, funktionale Qualifizierung). Bei der OQ wird festgestellt, ob das Geriit ,,hier und jetzt" entsprechend den Funktionsspezitikationen ( h w . zusatzlich vereinbarten ,,funktionalen" Spezitikationen) arbeitet. OQ wird direkt nach der IQ durchgefuhrt, aber auch nach grokren Austauschaktionen. Standortwechseln brw. Reparaturarbeiten. Die korrekte Funktion des Geriites kann ggf. init Hilfe von Testmischungen uberpruft werden. Beispiele einer OQ in der HPLC sind Flufirichtigkeit, Mischungsqualitiit beim Gradienten. Wellenliingengenauigkeit,Temperaturkonstanz. Man kann durchaus die Auffassung vertreten, dal.3 die Kalibrierung des Geriites bereits in diesen Schritt gehiirt.

Es sei noch angemerkt, daB bei der OQ gerade die kritischen Gerateparameter identifiziert und uberpruft werden sollten. Das heifit konkret, daR eine OQ erst nach Uberprufung der Funktionsfihigkeit an der unteren und oberen Spezifikationsgrenze also unter ,,worst-case"-Bedingungenerfolgreich beendet ist ! - Als letzter Schritt folgt die PQ (performance quulijcation, Leistungsquuli~~ienrng). Bei der PQ wird mittels einer typischen Applikation die Leistungsfahigkeit des GeAtes fur den vorgeschlagenen Routinegebrauch festgestellt. Diese Uberprufung erfolgt sinnvollerweise unter Verwendung von Anwenderproben, es wird beispielsweise getestet, oh ein gewunschter oder erwarteter Prlzisionswert rnit dem Gerat erreicht wird. Ein bewlhrtes Werkzeug fur die Routine stellen hier die Regelkarten (statistische ProzeBkontrolle, SPC) dar. Um MiRverstiindnisse zwischen den beiden Begriffen ,,Systemtest" und ,,Systemeignungstest" zu vermeiden, sollte man klarstellen, daB der Systemtest (oder Geratetest) rnit einfachen Testmischungen durchgefuhrt wird. Es werden keine individuellen Proben verwendet, weil es ja hier um die Qualifizierung des Gerates und nicht um die der Methode geht; mogliche Fehler durch die Methode (z. B. Proben rnit komplexer Matrix) sollen auBen vor bleiben. Fur den Geriitetest wird haufig der weniger gliickliche Begriff ,,Gerute~~alidierurIg" verwendet. Der Gerltetest ist die Voraussetzung, der erste Schritt, allenfalls ein Teil der Methodenvalidierung. Abhangig von der Art der Anlage konnen naturgema8 Gerltetests sehr unterschiedlich ausfallen [ 14, 151. Der Systemeignungstest (system suitability test, SST) umfaBt Gerlt, Methode, Probe und Rechner als ,,integrales System". Die Durchfuhrung m u j rnit realen Proben erfolgen und zwar dringend. Selbstverstandlich kann man auch den pragmatischen Weg gehen und nur den Systemeignungstest durchfuhren: Wird ein kleiner Wert fur den Variationskoeffizienten V , (s. Kapitel 3) ermittelt, so gewinnt man die Erkenntnis, daB der Fehler (Streuung) durch das Gerat und die Methode unterhalb der vorgegebenen bzw. tolerierten Grenze liegt. Der Nachteil hierbei ist, daB die einzelnen Beitrlge von Gerat und Methode zur Gesamtstreuung im Verborgenen bleiben. Die mogliche Antwort eines Pragmatikers ware: ,,Solange der V , unter den geforderten 1,5 % liegt, interessiert mich nicht, wo der Fehler herkommt." Diese Antwort wlre unter Umstanden auch zu akzeptieren.

2.3.1 Das ,,V"-Model1 Eine ubersichtliche Darstellung der einzelnen Schritte einer Geriitequalifizierung gelingt rnit dem ,,V"-Modell. Der linke Schenkel eines ,,V" reprlsentiert die Aktivitiiten vor der Realisierung eines Projektes, der rechte Schenkel vom ,,V" die Testaktivitaten, d. h. die Prufung nach der Lieferung. Dieser Ansatz sei nachfolgend kurz erlautert. Am Anfang steht die Idee. Daraus ergeben sich Forderungen der Anwender an das Produkt. Es schliel3t sich die Entscheidung fur ein Design entsprechend den Forderungen an. Nun wird bestellt und geliefert. Nach der Lieferung erfolgt der Test, oh technisch alles in Ordnung ist. Der nlchste Schritt ist die Qualifizierung d. h. der Check, ob die Kundenanforderungen erfullt sind. Der Lebenszyklus schlient rnit dem Routineeinsatz, der auch Modifizierungen und Wartung beinhaltet, siehe Abb. 2-5.

Kunde

Lieferant. eventuell zusamrnen mit dern Kunden

Forderung

Qualifizierung

( Design ) KonzeDtion

Abnahmetest

U

V

Realisierung

Abb. 2-5 Das P r i w i p des ..V"-Modclls tur einen Produkt-Lchens/.yklus

Auf die Geriitequalifizierung ubertragen siihe das .,V"-Modell wie folgt aus: Auf der linken Seite stehen die Spezifikationen entsprechend den Wunschen des Anwenders. Nach Auswahl von Geriit und Lieferant erfolgt die Bestellung des Geriites mit dem gewunschten Design, es folgt n u n die Geriitelieferung in der erhofften Ausfuhrung. Ex schlieot sich jetzt die Qualifizierung an, das ist die Uberpriifung, ob die Spezifikationen und/oder Sonderwiinsche i n der gelieferten Ware entsprechend den Vereinbarungen realisiert wurden. Diese Tests machen den rechten Schenkel vom ,,V" aus, siehe Abb. 2-6. Dieses Modell ist allgemein anwendbar. So konnte nach Maldener [ 161 das ,.V"-Modell fur einen Computer wie in Abb. 2-7 dargestellt ausaehen: Der linke Schenkel beschreibt die Aktivitiiten fur die Zeit vor und der rechte Schenkel fur die Zeit nach Lieferung, also die Test ze i t . Ein Ztrhlrrihei.s~iie1sol1 die Notwendigkeit eines strukturierten Vorgehens, wie oben dargestellt, zumindest fur computergestutzte Anlagen unterstreichen [ 171: Es geht um neun Softwareprojekte der US-Regierung aus den 80er Jahren im Wert von 6.750.000 Mio. US-$. Eine Analyse ergab folgendes: Bestellte aber nicht gelieferte Software: Gelieferte aber nie benutzte Software: Nirgends belegbare Software: Software anwendbar erst nach Modifizierung: Software anwendbar wie geliefert:

2.900.000 $ 3.200.000 $ 350.000 9; 200.000 $

IOO.OOO $ (entspricht 2 % des Gesamtwertea)

LeistungsQualifizierung

Leistungsspezifikationen

V

U

Funktionale Spezifikationen

Funktionale Qualifizierung

Technische Spezifikationen

U

lnstallationsqualifizierung

Bestellung und Ausfuhrung

V

Abb. 2-6 Das ,,V"-Modell fur ein Gcriit incl. Geratequalilizicrung.

Lastenheft

Anwendertests

Funktionale Qualifizierung

Pflichtenheft

Installationsqualifizierung

Detailspezifikationen

Definition von Modulen

U

-

Modultest

lmplementierung ( Hard- und Soflware )

Abh. 2-7 Dai, ,.V"-Modell tiir einen Computer, LIMS odcr cine compuicr-isicrte Anlagc.

Die Uberpriifung ergab a l s Grunde fehlende oder miljverstandene Forderungen der Kunden, Unflexibilitiit des Lieferanten, um new bzw. erst spgter verstandene Kundenanforderungen umzusetzen und fehlerhafte oder fehlende Dokuinentation seitens der Kunden. Den Lowenanteil, niirnlich 65 % macht der erstgenannte Grund BUS. niinilich fehlende oder nicht exakt formulierte Forderungen der Kunden. Auch wenn fur diesen konkreten Fall ein Schinunzeln aus europiiischem Munde durchaus verstandlich ist. stellt sich dieses allgemeine Problem nach den Erfahrungen des Autors auch hierzulande nicht rninder wichtig dar.

2.3.2 Empfehlungen fur die Praxis Neben der IQ sollte auch die OQ vemunftigerweise von Mitarbeitern des Lieteranten durchgefuhrt werden. Bei griiljeren und komplexen Installationen, wie LIMS, ist von Vorteil, wenn ein Fachrnann auf Anwenderseite den Tests beiwohnt. OQ-Tests sollten auch und gerade an den Spezitikationsgrenzen des Gerztes durchgefiihrt werden und nicht im mittleren iiblichen Bereich sei es, dal3 diese GI-enzen fur die geplante Anwendung viillig irrelevant sind. Die einzelnen Schritte IQ, OQ, PQ sind als eigenstiindige Schritte LU behandeln. Das bedeutet, es sollen tatsiichlich drei verschiedene Pliine mit genau definiertem Leistungsumfang existieren. Alle Tests inkl. Rohdaten und Testergebnisse sind zu dokumentieren und ZLI archivieren. Uber den Archivierungsumfang von Systerneignungstests in der Routine mu8 konform mit dein bestehenden Qualitlits-Management (QM-System) individuell entschieden werden.

Handbuch Validierung in der Analytik Stavros Kromidas Copvriaht 0 2000 WILEY-VCH Verlaa GmbH

Teil B Die Praxis der Validierung Stavros Kromidas, NOVIA GmbH, Saarbrucken

3

Die Validierungsparameter (oder nach IS0 17025: Verfahrensmerkmale)

3.1

Literaturiiberblick

Es wurde eine Literaturrecherche fur die Jahre vor I990 und 1990-1999 mit den key-words ,,Methode" und ,,Validierung" durchgefuhrt. Das Ziel war, einen Uberblick uber die verschiedenen Facetten der Validierung in der Analytik zu erhalten -jedenfalls was publizistische Aktivitat betrifft. Hier das Ergebnis in Kurze: Die Zahl der Publikationen zum Thema Validierung mit analytischem Hintergrund steigt standig. Die meist untersuchten Parameter sind: Prazision, Richtigkeit und Linearitat. An zweiter Stelle treffen wir auf Nachweis- und Bestimmungsgrenze, Selektivitat und Robustheit. Als Letzte werden Vertrauensbereich, MeOunsicherheit und Methodenfahigkeit genannt. Die wichtigsten Kriterien f u r den Validierungsumfang sind die Art der Probe, Entwicklungsstufe des Produkts und das Ziel der Validierung. Bei biologischen Proben und allgemein bei Proben mit ,,schwieriger" Matrix (Milch, Lebensmittel) wird neben den anderen Parametern erwartungsgemal3 stets die Wiederfindungsrate uberpruft. In solchen Proben wird weiterhin die Sicherheit durch die sogenannte cross- Vulidierung erhoht, im einfachsten Fall durch Vergleich der Kalibrationskurven bei zwei Methoden, z. B . Anwendung von LC-MS, urn eine RIA-Methode zu ,,crossvalidieren" oder Einsatz von GC-MS oder Immunoassay, um eine HPLC-Methode zu ,,crossvalidieren".

Entsprechend ihrer Wichtigkeit wird bei den analytischen Verfahren an erster Stelle von Validieruiigen chromntographischer Methoden berichtet, gefolgt von denen spektroskopischer Methoden. Bei chroinatographischen Verfahren konxntrieren sich die Untersuchungen aiifdie Methode. wiihrend in der Spektroskopie das Testen des Geriites im Vordergrund steht. So geht es bei der ..technical validation" ausschlieBlich iim die Kalibrieriing (AAS. NIR, FTIR, NMR), bei der quantitativen UV-Spektroskopie spielen Priizision. Richtigkeit, Robustheit und Linenritiit ebenfalls eine wichtige Rolle. Die nieisten Publikutionen stammen aus den1 Bereich ..life science" und spexiell ails der Phariiia. S o treffen wir fiir die Zeit vor 1990 prakticch niir auf Publikationen uber Validieriingen chromntogruphischer Methoden von Pharmaka und Wirkstoffsiibstanzen. Neben dem Abchecken der ublichen Validierungsparameter, siehe unten, kann Validierung auch ein sehr spezieller Test sein.

Beispicllo -

-

-

~

~

Vdidierungstests in einer ..strengen" GLP-Umgebung kann gleich bedeutenti sein mit Tests zur Uberprufung der Sicherheit: Richtigkeit des Integrationsalgorithmus. des Kalibrationsmodells, der Berechnungsformel und der exportierten Daten I 1 XI. VLiIidierungsexperirnente zum Regenerierungsgrad von lonenaustauscher aiif Cellulose-Basis 1191. Validierung von toxikologischen Testa 120.2 I I. Validierung von alternativen Methoden xu toxikologischen Tests 1221. Die SpeLifika von bestimmten Substanxklassen bzw. Produkten fiihren d a m . dal.3 i n Greinien Validierungsrichtlinien speziell fur diese Bereiche erarbeitet wcrden: z. B. Europiiisches Diskussionsforum fur die Validierung von Bioaerosolen 1231, Konferenz zum Thema Methodenvalidierung von bioanalytischen Methoden: Bioverfugbarkeit, Bioiquivalenz und Pharmakokinetik 1241, und ICH. i n der Richtlinien iiber die Validierung in der Pharmaindustrie ausgearbeitet werdcn [ 25 I. Im europiiischen Forschungszentrum in Ispra, Italien, existiert schlieDlich seit kurzem ein European Centre for the Validation of Alternative Methods. Seit 1998 hat auch in den USA das Interagency Coordinating Committee o n the Validation o f Alternative Methods (ICCVAM) a l s behordliche Stelle die Arbeit aufgenommen.

Eine aktuelle Recherche kurz vor Fertigstellung des Buches ergab folgende Trends: -

Wenn eine neue Methode oder eine neue Applikation p u b l i k r t wird, gehiirt hlufig inindestens eine ..Mini"-Validierung einfach dazu.

-

Dac tleilJige Abarbeiten eines ,,Validierungskatalogs" wird immer seltencr angetroffen. das Befascen mit den kritischen Schritten einer Methode ruckt mehr i n den Vordergrund. Stark in der Di\ku\sion sind zur Zeit folgende Themen: OOS (Out Of Spec)-Situationen und die Folgen Melhinsicherheit

3.2 Die ~ilidierun~spcrrcinieter riner rrrirrlytisc~henMethoclr

43

Variabilitiit von Analysenmethoden, ,,Adjustment" vs. Revalidierung, Methodentransfer. -

Von den Validierungsparametern genieljen hochste Aufmerksamkeit nach wie vor die Linearitit (eher die ,,Kalibrierfunktion") sowie die Erfassungs- und Bestimmungsgrenze.

- Generell wird eine vorsichtige, Analytik(er)-freundlichere Stiinmung seitens der Be-

horden beobachtet. Diese wird in der neuen ISO-Norm 17025 sichtbar, es folgen einige Beispiele aus dem Pharmabereich, der als stark reglementiert gilt [26, 27 I: ,,Die Mittelwertbildung aus Mehrfachbestimmungen oder Mehrfachinjektionen wird von der FDA voll akzeptiert und nur das aus diesen Mehrfachbestimmungen hervorgehende Analysenresultat mulj gegen die Spezifikation abgeglichen werden. Schon auf der Stufe des Labors ist es moglich, anhand von Checklisten Werte aus fehlerhaften Tests zu eliminieren und diese durch das Ergebnis dann nur einer einzigen Wiederholanalyse zu ersetzen. Folgende Forderungen werden zur Zeit mit guter Aussicht auf Erfolg diskutiert: Verzicht auf die verbindliche Vorgabe, einen zweiten Analytiker mit einem Revalidierungs-Test zu beauftragen, da dies eine weitere Quelle von Variabilitiit darstellen kann und teilweise nicht umzusetzen ist. Einzelwerte von Mehrfachbestimmungen mussen nicht den Spezifikationen entsprechen, sondern nur das aus ihnen abgeleitete Analysenresultat. Verzicht auf die Forderung, schon im Falle von noch spezifikations-konformen, aber eng an den Grenzen liegenden Analysenergebnissen (,,Borderline Results") zusiitzliche Untersuchungen bis hin zu Stabilitatsuntersuchungen der betreffenden Charge vorzugeben. Kann ein Labor belegen, daR die eingesetzten Prozesse ISK (In Statistischere Kontrolle) sind, so kann auf Revalidierung verzichtet werden."

3.2

Die Validierungsparameter einer analytischen Methode

Auflistungen der in Frage kommenden Validierungsparameter (auch: Verfahrensmerkmale, ValidierungskenngroBen, Validierungsmerkmale, Validierungselemente) sind vielfach in Publikationen erschienen. In den einzelnen Literaturzitaten gibt es nur geringe DifferenZen. In Tab. 3- 1 sind diese Validierungsparameter sowie weitere Begriffe aufgefuhrt, die im Rahmen einer Validierung von Relevanz sein konnen.

Knmrnen tcr r Richtigkeit his einschlieRlich Robustheit sind die Priifpunkte, die fast ausnahmslos immer genannt werden, oft auch der Arbeitsbereich. Selten werden Empfindlichkeit und Stabilitat von Losungen als eigenstiindige Validierungselemente aufgefuhrt. Erstere meist im Zusammenhang mit der Linearitat, Letztere im Zusammenhang mit Robustheit. Der Begriff Erfassungsgrenze gewinnt international - allerdings noch sehr zogernd - zu Lasten der Bestimmungsgrenze an Gewicht. Es sind Bestrebungen im Gange, nur noch von

Tab. 3-1 Miigliche Prufpunktc hci cincr Mcthodcnvnlidicrung in dcr Annlytik rung!

~

Maxiinaltordc-

Pru fpu nkt

Englischc Be/cichnung

Aussage uhcr _ . _

Richtigkeil

trucnes, accuracy 0 1 the mean oder einlach: accuracy

systcmatische Fchlcr

precision

zulilligc Fchlcr

Wicdcrholpriizision odcr Wiederholharkeit

repeatability

Priiiision unter Wicdcrholhcdingungcn: I Prohc, 1 Prufcr. I Gcriit. identische Rcagcniien. kur/c Zeilabstiinde

Lnhorprii/ision

intermediate precision

~

Priirision

-

~

~

~~

Einc Probe, sonst rnchrcrc Variablen. B. 2. Prufcr und/odcr 3. Gcriit undloder 2. Tag uhw. L.

-

Vcrglcichsprii/ision odcr Vcrgleichbarkeit

reproducibility

Priiiision unter Vcrglcich4xdingungcn:

I Prohc. 2. Priilcr. 2. (ieriit. 2. Labor (Messung in jcdcm Lahor unter Wiederholhcdingungcn )

Linearitiir

linearity. selten: annlytical response

mathematischer Zusammcnhang Lwischen Mel.lwcrt(Signal) und Konicntration oder Mcngc

Selektivitiir

wlccrivity

Fiihigkcit. allc intcrc\sicrcndc Analytcn nebeneinander ohne gcgenaeitige Stcirung xu bestimmcn

Wiederfindung oder Wiederfindungsratc

recovery

Ausbcute nach allcn Schritten der Analysc

Nachwcisgrenzc oder sclten: Detcktionsgrcnre

limit o f detection, LOD

klcinste nachwcisharc Mcnge (odcr KonLcntration 1

Besliriiniting\grcnie

limit of quantification. LOQ odcr limit of detcrmi nation

klcinste quantifiiicrharc Menge (odcr Konzcntration)

Rohusthcil

robustness/ ruggedness

Stiiranlalligkcit dcs Ergchnisses durch variicrcndc Bcdingungcn

rohustncss

Stiiranlalligkcit durch vcriindcrte Mcthodcnpararnctcr / . B. pH. Temperatur

~

Mcthodcnrohustheit

-

Vcrf~ihrcn\\tahilitat

-

Anwcndharkcit oder scltcn: Uhcrtragbarkcit

Stahilitiit der Ergchni\w fur die Daucr dcr Analyscnscric ruggedness

Stiiranliilligkeit durch Wechwl von Anwcndcr, Lahor. Cicriit

3.2 Die &ilidierungspurumeter einer unulytischen Methodc

45

Priifpunkt

Englische Bczeichnung

Aussage uber . ..

Arhcitshcreich odcr (dynamischer) MeRbcrcich

range

Konzentralionshereich iiir akzcptahlcl hestatigte Angahcn iihcr Richtigkcit, Prazision, Sclektivitiit, Lincaritat und Robustheit

Empfindlichkeit

scnsitivity

Fahigkeit, kleine Kon7~ntration~diflerenzen noch zu hestimmen: Stcigung der Kalibriergerade

Stabilitat

stability

Stabilitat von cingcsctztcn Liisungcn, Chemikalien usw.

Erfassungsgrcnze odcr Entscheidungsgrcnzc

limit of decision

Geringster Gehalt, der hei tatsichlichcr Anwesenhcit identifiziert wcrden kann; liegt zwischen Nachweis- und Bestimmungsgrenzc

Gcnauigkcit

accuracy

systematische und zutllligc Fchlcr, Genauigkeit ist kein eigenstandigcr Priifpunkt sondern sinngciniil!, dcr Oberbegriff fur Richtigkeit und PrYzision

Spezifitiit (wird oft h y n onym mit ,,Sclcktivitat"

spccificity

Fahigkeit, rinr Substanz (odcr Suhstanzklasse) ohne St(irung durch andcrc Komponenten zu hestimmen

Mehnsichcrhci t

uncertainty of the measurcment

Schwankungdw-cich dcs Mcliwcrtc9

Methoden fahigkeit

method capability

Fahigkeit, Ergebnisse xu liclcrn, dic innerhalb der Spezifikationsgrcnzcn liegen

MethodenstabilitSt/ ProzeBstabilitiit

mcthod stability/ process stability

Stabilitat dcs analytischcn Prozcsses/der Methode i n AbhSngigkcit von der Zeit

~~~~

verwendct )

~~

Erwcitertc Unsicherheit

~

Bereich, in dem ein Wert mit eincr gegebenen Wahrscheinlichkeit xu finden sein wird. Dieser wird durch ,,allc" realistischen, zufalligen und systcmatischen Fehler vorgegebcn.

Nachweisgrenze zu sprechen. Die Argumentation: ,,Nachweisgrenze" kann man auch einem Nicht-Naturwissenschaftler erklaren, ,,Bestimmungsgrenze" sei etwas schwieriger. Im Ubrigen ist Bestimmungsgrenzeja nichts Anderes als eine erweiterte MeBunsicherheit, der Zahlenwert ist individuell festzulegen (s. Abschnitt 3.9). Genauigkeit wurde fruher haufig synonym mit Richtigkeit benutzt. Sie urnfafit jedoch sowohl systematische als auch Zufallsfehler und als Oberbegriff fur Richtigkeit und Prlzi-

sion stellt sie keinen eigenstiindigen Prufpunkt dar. Um MiRverstiindnisae 7,u vertneiden. sollte dieser Begriff im Rahmen der Validierung nicht rnehr benutzt werden. Zwischen Selektivitnt und Spezifitiit wird oft kein Unterschied gemacht. Dieser Usus verhindert, daR man sich gerade dem Unterschied zwischen selektiven und spezitischen Messungen bewuBt w i d , siehe Abschnitt 3.6.1. Das Schiitzen der MeBunsicherheit gewinnt in Bereichen, in denen ex schnell uni einen ersten Eindruck von der Methode geht. an Bedeutung, wird allerdings allgemein nicht als Validierungselement angesehen - eher als Alternative zur Validierung. Methodenfihigkeit ist zweifelsohne ein sehr wichtiges Kriterium fur die Eignung einer Methode in der Produktanalytik. Es geht um die biniire Entscheidung: Produkt innerhalb der Spezifikation jdnein? Um so tnehr erstaunt es, daO dieses Element - was ja ein Urteil uber eine Ermittlung von Zahlen hinaus darstellt - relativ selten genannt wird, gerade in Fiillen, in denen Spezifikationsgrenxn vorgegeben sind. Ein weiteres wichtiges Kriterium ist die Stabilitiit des analytischen Prozesses. Das ist die Abhiingigkeit eines Ergebnisses von der Zeit bei Anwendung unter realen Bedingungen. Obwohl dieser Punkt ebenfalls ein erninentes Kriterium fur die Eignung einer Methode ist, wird man erst in jungster Zeit stiirker darauf aufmerksam. In Kapitel 8 und 9 wird auf dieses Kriterium niiher eingegangen. Es ist wichtig, sich ein ganzheitliches Urteil iiber die Eignung einer Methode xu bilden. Aus diesem Grunde werden nachfolgend neben den klassischen Validierungsparamctern auch das Schatmi der MeBunsicherheit und die erweiterte Unsicherheit (5. Abschnitte 4.3. 6.7 und Kapitel 9) sowie die MethodenMhigkeit (s. Abschnitt 3. I 1 ) ausfuhrlich behandelt.

3.3

Prazision

3.3.1

Definitionen und Erlauterungen

Priizision ist das Ma8 fur die Ubereinstimmung unabhiingiger Analysenergebnisse untereinander oder einfach ausgedruckt: das Ma8 fur die Streuung von Analysenergebnissen. Als Streuungsmalj und damit als PriizisionsmaB wird die Standardabweichung .Y. die relative Standardabweichung srCI.die identisch ist mit dem Variationskoeftizient V,, und etwas seltener die Varianz s2, verwendet.

,y

=

(x,

-

I7 -

mit:

-

EinLelwert

.I- Mittelwert

1

TI-

n s V $ s-

Anzahl der Messungen Standardabweichung Vdriationskoeffizient (relative Standardabweichung) . Vananz

Es gelten folgende Analogien: Priizision =

Streuparameter

Statistische GroOe: Standardabweichung Information: Grad der Streuung einzelner Werte um den Mittelwert, die Streuung ist das Ergebnis von zufalligen Fehlern

Richtigkeit =

Lageparameter

Statistische GroBe: Mittelwert Information: Abstand des Mittelwertes vom richtigen (,,wahren") Wert; dieser Abstand wird durch systematische Fehler (bias) bestimmt. Dem Sinne nach sollte er eigentlich ,,Unrichtigkeit" heiOen!

Genauigkeit = Streu- plus Lageparameter

Information: Abstand eines einzelnen Wertes vom richtigen (,,wahren") Wert, hervorgerufen durch systematische plus zufallige Fehler.

In Abb. 3- 1 werden die Unterschiede dieser drei verwandten Begriffe graphisch dargestellt.

Priizision,Streuung einzelner Werte urn den Mittelwert, Man : Standardabweichung

9.

............

richtiger Wert

t

+

Mittelwert Einzelwert Richtigkeit

( dern Sinne nach sollte es eigentlich " Unrichtigkeit " heinen! )

richtiger Wert

4

Einzelwert Genauiakeit des Wertes "x"

4

Abb. 3-1 Graphischc Darstcllung der Begriffe Prazision, Richtigkeit und Gcnauigkeit.

Siimtliche statistische Vergleiche und Ruckschlusse gelten unter der Annuhme einer repriiaentativen Probe. Gegebenenfalls ist diese Annahine ru veritirieren. Eine Standardabweichung kann grundsiitzlich fur jede statistische Verteilung von Werten verwendet werden. Wenn allerdings der Standardabweichung eine Wahrscheinlichkeit zugeordnet werden soll. so inuR von einer Norinalverteilung der Werte ausgegangen werden kiinnen. Zur Prufung auf Normalverteilung eignen sich mehrere Tests wie der Kolmogorov-Test, x'-Anpassungstest, Shapiro-Wiek-Test oder das Eintragen der Werte in ein Wahrscheinlichkeitsnetz. Diese Tests werden in den einschliigigen Buchern uber Statistik beschrieben. Hier wird der Schnelltest auf Normalverteilung nach David vorgestellt, der sich gerade fur eine kleine Stichprobe ( N < 10) eignet. Ein schsrferer Test ist der Chi-Quadrat-Test 12x1: Die Werte sind mit einer vorgegebenen Wahrscheinlichkeit (meist P = 99 %) normalverteilt, wenn der Quotient aus Spannweite R und Standardabweichung .s innerhalb der von David vorgegebenen GrenLwerte befindet. siehe Tabelle nach David, Abschnitt A.6. PG =

GroDter Wert Kleinater Wert Standardabweichung ~

R

- -

,\

Be ispic1 / 281

27 Einxlwerte werden aufAusreil3er bei der Bestinimung des Nitrat-Gehaltea einer Wasserprobe gepruft: Die MeBwerte: 0.5 1

0.5 I

0.49

0.5 1

0.5 I

0.53

0.38

0.5 1

0.43

0.53

0.52

0.48

0.52

0.50

0.53

0.49

0.37

0.53

0.54

0.55

0.52

0.43

0.52

0.5 1

0.52

0.50

0.4v

Sortierung der Daten nach der GroOe: 0.42

0.46

0.47

0.3X

0.48

0.49

0.49

0.40

0.49

0.50

0.50

0.5 I

0.5 I

0,s I

0.5 1

0.5 1

0.5 I

0.52

0.53

0.52

0.52

O,S2

0.52

0,53

0.53

0,53

0,55

Berechnung der PrufgriiBe nach David: Die Spannweite betriigt: R = 0.55

-

,\

= 0.0292

I1

= 27

0-42 = 0.13

3.3 Priizision

pG

R s

=-=

49

0 13 = 4,45 0,0296

Aus der Tabelle nach David werden die folgenden Werte g, und goentnommen ( P = 99 %, P: Signifikanzniveau, Wahrscheinlichkeit, P von propability): Da die Zahl27 in der Tabelle nicht aufgefuhrt wird, werden die nlchst benachbarten Zahlen, ngmlich 25 und 30 zur Prufung herangezogen. g , = 3,15

go = 5.06 (fur n = 25 und P = 99 %)

go = 5,26 gu = 3,27 (fur n = 30 und P = 99 %)

4,39 liegt zwischen der unteren und oberen Grenze. Es kann eine Normalverteilung der MeBwerte angenommen werden. ,.Unabhlngige" Ergebnisse konnen auf unterschiedliche Art und Weise gewonnen werden. Nachfolgend werden die unterschiedlichen Prazisionsarten besprochen.

3.3.2 Prazisionsarten 3.3.2. I Wiederholprazision, Wiederholbarkeit (fruher: Wiederholgenauigkeit) Damit ist die Prazision unter Wiederholbedingungen gemeint. Wiederholbedin~lrrigeii(DIN 5 1848, I S 0 5725) sind Bedingungen, unter denen voneinander unabhangige Ermittlungsergebnisse in kurzen Zeitabstgnden erhalten werden; und zwar mit rlernselben Verfahren. an identischen Objekten (selbe Probe), in dernselhen Labor, durch den selhen Bearbeiter und mit derselhen Gerateausrustung.

3.3.2.2 Vergleichsprazision, Vergleichbarkeit (hlufig auch: Reproduzierbarkeit, selten Ubertragbarkeit) Damit ist die Priizision unter VergleichsbedingunXengemeint. Vergleichsbedingungen (DIN 5 1848, I S 0 5725) sind Bedingungen, unter denen Ermittlungsergebnisse mit rlernselhen Verfahren, an identischern Material (selbe Probe), aber in ivrschiedenen Labors, von verschiedenen Bearbeitern und mit verschiedener Gerateausrustung erhalten werden.

3.3.2.3 Laborprazision oder laborinterne Vergleichsprlzision Man versteht darunter die Prlzision von Ermittlungsergebnissen derselben Probe innerhalb eines Labors bei bewuBter Anderung eines Parameters. Bei der Ermittlung kann beispielsweise ein anderer Bearbeiter und/oder ein anderes GerBt beteiligt sein, die Analyse wird an

unterschiedlichen Tagen durchgefuhrt, eventuell durch EinsatL von Reagenyien anderer Charge usw. Was genau und in welchem Ausmal!, variiert werden sollte, hiingt von der konkreten Fragestellung und der konkreten personellen und apparativen Laborsituation ah. Das bedeutet zweierlei. Zuniichst gilt zu uberlegen, was sich bei der Routineanwendung der betreffenden Methode realistischerweise indern kbnnte. AnschlieRend ist zu prufen, inwieweit diese Variablen das Ergebnis beeinflussen, das he& nichts anderes als die Priizision der Methode unter realen Bedingungen zu bestimmen.

3.3.2.4 Weitere PriiLi sionen Recht selten wird von der ,,Priizision LWZ Srrie ,711 Scrir" (between-run precision oder ,,within day" oder ,,intra day") berichtet. Es handelt sich dabei um die Ubereinstimnung zwischen voneinander unabhiingigen Ermittlungsergebnissen, die mit tferi?.selhrriVerfahren, an ic/e/7ti.~c/7riii Material (selbe Probe). in drnisr//~rn Labor. durch tlerise/brri Bearbeiter. aber in i , e / : ~ ~ . h i r r / eSerien / i ~ r i erhalten werden. Ebenso spricht man auch von einer ,,frii:isio/i im 7ug ; I ( 7iig". .,day to day" oder ,,interday". Das ist nichts Anderes, als die Wiederholpriilision, allerdings nicht ..in liurl.cn Zeitabstiinden" sondern eben an z. B. 6 darauffolgenden Tagen. Die Wiederholpriizision wird praktisch in jedem Labor uberpruft. Eine Prufung aut' Laborpriizision empfiehlt sich immer, sobald die Methode iius irgendeinem Grund als .,kritisch" einzustufen ist: z. B. Methode zur Gehaltsbestiminung, quantitative Bestimmung von Verunreinigungen, neue Methode im Labor. Die Vergleichsprii~isionkann von den ublichen Validierungsarbeiten abgekoppelt betrachtet werden. Deren Uberprufung wird notwendig, wenn mehrere Labors tnit der betreffenden Methode arbeiten sollen. So wird richtigerweise immer wieder angernerkt, daR Vergleichspriizision eigentlich kein Validierungsparameter einer Methode darstellt. Gleichauf ist sie ein wichtiges Kriterium fur die VerliilJlichkeit der Ergebnisse der betreffenden Methode, wenn sie i n verschiedenen Labors eingesetzt wird. So stellen Ringversuche vor allem iin nicht reglementierten Bereich (Pharma), wie Untersuchungsiimter, Auftragslabors, Institute usw. ein wichtiges Werkzeug der Qualitiitssicherung. Priizision gilt generell als quantitatives Ma13 f u r die Robustheit einer Methode, siehe Abb. 3-2 und Abschnitt 3.5.2.3. Bei Vorgabe von Spezifikationsgrenzen (sind sie gerechtfertigt?) ist eine priizise Methode stets eine robuste Methode und damit eine .,gute" Methode. Bei vorgegebenen SpeTifikationsgrenzen wiire in Abb. 3-2 die priizise Methode I fur die Routine vorzuziehen. Auch wenn es zu einer stiirkeren Streuung der Werte durch allerlei Eintlusse kiime, wiirden sich die Werte dennoch innerhalb der Spe7ifikationsgrenzen befi nden.

3.3 Prii:i.sion

e- Spezifikationen

51

--+

A

.4-4

a

Y 0

F 3

:m

I I

Charakteristik

I

Abb. 3-2 Zu Spe~itikarionsgrenzenund Prazision von Methoden. 1 prilzise, 2 weniger prlLise.

3.3.3 Me& und Methodenprazision In der instrumentellen Analytik gibt es prinzipiell zwei unterschiedliche Grunde fur eine Streuung von Ergebnissen, namlich das Analysengerat selbst und die Methode. Die einzelnen Beitrage hangen von dem MeBprinzip und der Komplexitat des Analysengerates ab, sowie der Anzahl und dem Schwierigkeitsgrad der Schritte einer Methode, der Konzentration, der Matrix usw. Somit ist zwischen MeB- und Methodenprazision zu unterschieden. Die MeJprazision (Geriitepruzision, Systemprazision) ist ein Ma13 fur die Schwankungen, die durch das Analysengerat selbst verursacht werden. Erinittlung Ein Standard oder eine stabile, homogene Probe wird sechsfach (manchmal zehnfach) gemessen und der Variationskoeffizient bestimmt. In der HPLC z. B. geschieht dies, indem man eine Standardlosung sechsfach injiziert und den Variationskoeffizienten uber die Peakflachen bestimmt. Die Methodenpra:ision ist ein Ma8 fur die Schwankungen der Ergebnisse, die durch alle Schritte der Methode verursacht werden, z. B. Probenahme, Wiegen, Probenvorbereitung, Extraktion, Filtration, Messung, Auswertung. Ermittlung Sechs unabhangige Einwaagen (bzw. sechs Muster, wenn die Probenahme ein Teil der zu validierenden Methode ist) werden analysiert und der Variationskoeffizient bestimrnt.

3.3.4 Rechenbeispiele 3.3.4.1 Vergleich von Mittelwerten und Variationskoeftiirienten Der ledigliche Vergleich von Mittelwerten liefert ein verxrrtes Bild der Realitlit. Zur Beurteilung eines Ergebnisses gehart auch das Wissen uni die Streuung der Werte. die zu diesem Ergebnis fuhrten.

Brispicl Zwei Labormitarbeiter analysieren den Cehalt eines Wirkstoffs in einer neuen Forniulierung (mg/Kapsel). Die erhaltenen Ergebnisse lauten:

-

1. Anwcnder

2. Anwender

30.3

30.5

30.3

30.4

30.3

30.5

30.2

30.7

30.0

30.2

30.3

29.1 -

= 30,23

.Y

= 30,23

.Y

= 0.12

s

= 0.58

V,,

= 0,40

v,,

= 1,92

.I-

ObwohI der Mittelwert in beiden Mel3aerien identisch ist (30,23),ist die Streuung der Werte im zweiten Fall groBer (VK2 = 1.92 gegenuber V,, = 0.40). Das konnte miiglicherweise a n der Arbeitsweise des zweiten Anwenders oder an deaaen Apparatur oder an einer fehlerhaften Waage liegen.

Bciticrkirii~g: Der Mittelwert und die Standardabweichung kijnnen heute nahezu von jedern Taschenrechner berechnet werden. NichtsdestotrotL sollen Ihnen hier zwei empirische Formeln nicht vorenthalten werden: .\

=

.\

=

griiBter Wert

+ kleinster Wcrt 1

grd3ter Wert

-

.Y

kleinster Wert

3.3 Priizisiori J''

53

ist abhangig von der Anzahl der Werte und kann folgender Tabelle entnommen werden: n

X

2

I ,4

3

I ,9

5 6

2.6

2.1 3,3

10

20

3.9

50

4,h

Fur obige Beispiele erhalten wir:

x

=

30,3 + 30,O 2

=:

30,15

(errechneter Wert: 30,23)

(errechneter Wert: 0.58)

s=

30,3 - 30,O = 0,l 1 2.7

(errechneter Wert: 0,I2)

3.3.4.2 Vergleich von Meljwertreihen Zum Vergleich der Prazision zweier MeBwertreihen eignet sich der Variationskoeffizient (relative Standardabweichung) und nicht die Standardabweichung.

Beispiel Eine HPLC-Methode, die in zwei Labors routinemiiljig Iiiuft, rnacht Problerne. Die Retentionszeiten schwanken stark. Da die Bedingungen in beiden Labors vollig identisch sind (sogar die Charge der stationLen Phase und auch der ,,Packer" der Saule) wurden die Pumpen verdachtigt. Darauthin wurde die Fluljkonstanz der zwei Pumpen uber die Prizision der Retentionszeit verglichen. Bei beiden Pumpen wurde ein s-Wert von 0,12 festgestellt; ausschlieljlich diese Information wurde weitergegeben und diskutiert. Sind also beide Pumpen gleich ,,gut"? Das mu13 nicht sein. Der erste Anwender wollte den Test schnell durchfuhren und verwendete Substanz A, die schnell eluiert. Der zweite Anwender nahm dafur Substanz B, die in der Probe als letzte eluiert. Nach sechsmaliger lnjektion der Substanz A in Anlage A und der Substanz B in Anlage B erhllt man folgende Retentionszeiten [min]:

Anlagc A

Anlage B

2.3

10.1

2.2

9.9

2.3

10.2

2.4

10.0

2.1

I0.0

2.4

9.9

.s

= 0. I2

.P

= 0.12

v,

= 5.26 %

v,

= 1,20 %

Bei gleicher Standardabweichung (hier: s = 0,12) und unterschiedlicher Absolutwerte kann der Variationskoeffizient zweier MeDreihen recht unterschiedlich sein. In diesem Beispiel arbeitet die zweite Pumpe wesentlich priiziser als die erste. Man kann bei einer kleinen Stichprobe ( N < 12) eine Sicherheit einbauen, in dem der Wert der Standardabweichung mit einem sogenannten Vertrauensfaktor multipliziert wird. Die untere V e r t r f i i 4 ~ ~ n . s ~ s r e i ~ ~ ~ ~ fiir die Standardabweichung kann n u n wie folgt berechnet werden:

mit:

.xu

Standardabweichung fur die untere Vertrauensgrenze

K , einseitiger Vertrauensfaktor fur P = 0,95 und f = ti-l

Sein Wert kann fiir eine Anzahl von MeBwerten zwischen 5 und 13 nachfolgender Tabelle en t n o mme n we rde n : ./= I!

-

I

Kf 2.372

2,089 1.915

1,797 X

1.71 I

9

1.645

I0

1.593

II

I .5s I

12

1.515

3.3 Prii:isioii

55

Fur unser Beispiel mit n = 6 Werten ergibt sich: f =6-1=5 K f = 2,089

In der Analytik sind Doppelbestimmungen iiblich. In diesem Fall wird die Standardabweichung wie folgt berechnet:

und in einer MeRreihe mit n-Werten:

mit:

n = Anzahl der Werte

Nehmen wir an, daR beim obigen Beispiel die Retentionszeiten der Substanz A in der Anlage A durch Doppelinjektion ermittelt wurden. 1. Injektion

2. Injektion

Wie grol3 ist nun die resultierende Standardabweichung?

I 2.6

s = &(2.3

~

2,2)*+ (2.2- 2.2)' + (2,3- 2.4)' + (2.4- 2,s)' + (2,l- 2.3)'

+ (2.4- 2,s)'

=

.\

\i

0.0 1 + 0 f 0.0 1 + 0.0 1 + 0.04 + 0.0 I 12

=

0,082

Der Gesamtmittelwert aus I I = 2 . 6 = 12 MeBwerten betragt 2,32. sornit ergibt sich als Variationskoeffkient fiir alle I2 MeRwerte:

v, =-.

2.32

100 = 552

%I

Es inu1.5 individuell entschieden werden, ob der Vorteil der Abnahine des Variationskoeftkienten von 5,26 % auf 3 3 2 % den Mehraufwand durch die Doppelbestirninung ausgleicht (s. auch Abschnitt 3.4.3).

3.3.4.3 Vergleich von Methoden. die aus stochastisch unabhiingigen Schritten bestehen Stoc~Iici.sti,sc~k 1~17uhlziingige Pro:esse sind Prozesse, bei denen die einzelnen Schritte sich gegenseitig nicht beeinflussen. I n der Analytik bedeutet dies, daR ein Fehler, der in Schritt A einer Methode gemacht wurde, den Fehler, der miiglicherweise wiihrend des Schrittes B passiert. nicht beeinflufit. Wenn eine Probe falsch eingewogen wurde, hat dies keinen EintluB auf die Richtigkeit bei der Wellenliingeneinstellung eines Photometers (stochastisch unabhiingiger ProzeB). Ein Fehler bei der Extraktion dagegen kann die Linearitiit und die Selektivitiit in der HPLC beeintriichtigen (stochastisch abhiingiger ProzeD). Bei stochastisch unabhangigen Prozessen, wie sie in der Analytik oft vorkommen, gilt die Additivitat der Varianzen:

rnit:

\lc, Ge5amtvarianz der Methode \f

7

Varianz von Schritt I

5.

Varianz von Schritt 2

5;

Varianz von Schritt 3 u\w.

Was kann ein Anwender n u n in der Praxis mit dieser Aussage anfangen? Betrachten wir ein fiktives Beispiel: Be isp ie 1 Zwei Methoden sollen aus je drei Schritten bestehen; niimlich Einwaage inkl. Aliquotieren. Festphasenextraktion und Messung. Die Streuung der Werte in den einzelnen Schritten (Beitrag zur Gesamtstreuung) ist unterschiedlich. siehe Tab. 3-2. Bei Methode I 1st der Fehler bei den einzelnen Schritten gleich gro0 (.s = 3 ) , bei Methode 2

~

57

3.3 Priizisiori

Tab. 3-2 Vergleich zweier Methoden anhand der Streuung der Wcrte in den einzelnen Tcilachrit-

ten.

Methode 2

Methodc 1 ~~

Einwiegcn incl. Ahquotieren

3

9

6

36

Fcstphasenextraktion

3

9

2

4

Messung

3

9

1

I

Standardabwcichunglvarianz

1 Sge5

=

9

C

sics = 27

1 "ges

=

9

C

sic, = 4 1

ist das Wiegen und Aliquotieren mit einem groRen Fehler (s = 6), dafur aber die Festphasenextraktion und die Messung mit einem kleineren Fehler behaftet (s = 2 und s = 1 ). Welche Methode ist ,,besser"? Methode 1 ist vorteilhafter, denn obwohl die Summe der drei Standardabweichungen in beiden Fallen 9 ergibt, ist die Summe der Varianzen (das Quadrat der Standardabweichung) im ersten Fall 27, im zweiten 41. Durch Wurzelziehen ergibt sich als Gesamtstreuung (Gesamtstandardabweichung) im ersten Fall ein Wert von 5,2, im zweiten Fall ein Wert von 6,4. Das bedeutet, daB Methode 1 priiziser ist. -

Nehmen wir jetzt weiterhin an, dab durch Automatisierung des Extraktionsschrittes mittels eines Roboters die Streuung der Werte bei der zweiten Methode auf einen Wert von 0,5 herabgesetzt wird. Die zweite Methode wird dadurch vielleicht schneller, jedoch nicht praziser als die erste, denn 36 + 0,25 + 1 = 37,25. Und J37,25 = 6.1

ist immer noch groBer als der Wert 5,2 bei der ersten Methode. Als Konsequenzen fur die Praxis ergeben sich erstens, daB es sich lohnt, das Gesamtverfahren genauestens zu analysieren, um die kritischen Schritte ausfindig zu machen. Diese miissen zuerst und ausfuhrlich validiert werden, urn sie gegebenenfalls anschlieBend zu optimieren. In der Praxis wird Schritten, die ohnehin recht unkritisch sind und dazu gehort z. B. der MeBvorgang - oft eine unverhlltnismaBig groBe Aufmerksamkeit geschenkt! Zweitens muB bei Investitionen, die das Ziel haben. eine ,,bessere" Analytik zu ermoglichen, eine kritische Beurteilung des PreisLeistungsverhiiltnisses unerlaBlich sein. Wie soeben gezeigt, ist simple Mathematik dabei hilfreich. -

Noch ein weiteres fiktives Beispiel dazu: Ein HPLC-Verfahren weist eine Standardabweichung aller Schritte bis auf die Messung von s = 2 auf, die MeBprazision des 10 Jahre alten HPLC-Gerates betragt s = 030. Lohnt sich eine Investition von ca. 80.000 DM fur ein HPLC-Gerat der neuesten Generation mit einer MeBprazision von s = 0,15? Wegen der sicherlich exzellenten Prszision bestimmt nicht, der Gewinn ist vernachlassigbar:

Streuung aktuell:

sic\= 2' sgc, =

Streuung zukunftig:

+ 0,SO'

44,250

.sics = 2'

=

+ 0,IS'

=

4.250.

2,062 ! =

4,022,

spe, = 44,022 = 2,006!

Selbstverstandlich stellt ,,Priizision" nicht das einzige Kriterium fur oder gegen eine Neuanschaffung dar. Sol1 allerdings die Prazision verbessert werden, so mu13 man an dem kritischen Schritt ansetzen, im besprochenen Beispiel an dem Geschehen I W der Messung. z. B . Probenvorbereitung: Es gilt, den Term ,,2'" zu verkleinern. ResuriiP Ein Ma13 fur die Streuung eines Mittelwertes ist die S t t i r i r l r i r ~ ~ t i h r r , f / [ , ~ ? i ~ / ~ , s . Fur den Vergleich der Priizision von MeBwertreihen eignet sich der Vtiricitiori.skoc:'~;tfi,-iPnt. Ein Ma8 fur die Streuung der einzelnen Schritte eines Prozesses ist die Vtiritiri: in diesen Schritten. -

3.3.5

Angaben zur Priizision und deren Deutungsmiiglichkeiten

Wiederholtests sind eine Selbstversthndlichkeit in allen Bereichen, in denen Znhlen ermittelt werden. So auch bei der Validierung. Priizision stellt ein wichtiges Verfahrensmerkmal dar. Deren Uberprufung, sowie die Uberprufung der Richtigkeit wird sogar als Minimalvalidierung bezeichnet: 6fach Bestimmung einer Probe und Vergleich mit einem Referen/.standard. Gleichauf ist Priizision neben Robustheit und Linearitat das Vrilidierungselement mit der hochsten Quote an MiOverstSndnissen, wenn es um die praktische Durchfuhrung geht. Das durfte zum einen durch unterschiedliche Interpretation von xu vielen, ungliicklichen oder ungenauen Formulierungen herruhren. Zum Anderen herrscht kein einheitlicher Umgang mit gewonnenen Zahlen. Nachfolgend wird kurz auf die lnterpretationsbandbreite von Angaben eingegangen. AnschlieBend werden wir uns etwas ausfuhrlicher mit dem Urngang mit Zahlen beschhftigen (s. Abschnitt 3.3.6).

Beispiclc 1st ,,Bestimmung" gleich Messung oder umfal3t eine .,BestimmLing" mehr? Zitat aus einer SOP: .,Bestimmung: Einwaage und Aufarbeitung je einer Probe und eines Standards. Doppelinjektion . . .'* Wie ist die Aussage ... .. Die Anzahl der Werte zur Ermittlung der Prii7ision betrug I2 '' LU deuten? 6 Einwaagen. Doppelbestimmung = I 2 Werte 4 Einwaagen, 3fach Bestimmung = 12 Werte 12 Einwaagen. Einfachbestimmung = 12 Werte I 2 Einwaagen. Doppelbestimmung, daraus Mittelwert = 12 Werte Drei Konzentrationen (z. B. 80 %, 100 %. 120 'k des erwarteten Gehaltes). zwei Einwaagen, Doppelbestimmung = 12 Werte. -

3.3 Prii5sion

59

Tab. 3-3 Priizisionsdaten eines HPLC-Experimentesunter Wiederholbedingungen.

RetentionsLeit rminl

-

X Y

VK

Flache

Flache/RetentionsLeit

6,52

4325

663,34

6,49

4290

66 1,02

6,50

4330

666, I5

0,53

4288

656,66

6,49

4335

667,95

6,48

4315

665,90

6,50

43 14

663,50

0,O I9

20,35

4.14

0,29 % !

0,47 %!

0,62 %!

- Wurden Standards vermessen oder reale Proben, wie ist der EinfluR der Matrix? - 1st der Ausgangsstatus der Probe gleich gewesen? z. B.: 1st die Temperatur der Probe zwischen der ersten und der letzten Einwaage kon-

stant gewesen?

- Wurden Verdampfungsprobleme des Losungsmittels berucksichtigt, vor allem, wenn

Probedstandards unterschiedlich lang benutzt wurden? Wurden bei StreRtests die Bedingungen konstant gehalten? - 1st der Zeitabstand zwischen den einzelnen Messungen konstant gewesen? - 1st bekannt, auf welche Konzentration die angegebenen Prlzisionswerte sich beziehen? - Wurde zur Ermittlung des Variationskoeffizienten bei einer chromatographischen Trennung die Absolutfllche der Peaks, der daraus errechnete Gehalt oder womoglich das Verhlltnis aus Flache und Retentionszeit verwendet? (siehe d a m Beispiel in Tab. 3-3). -

Wird nicht eindeutig definiert, welche Zahlen zum Vergleich genommen werden, ist Vergleichbarkeit von Ergebnissen nicht gegeben. Deswegen ist die Aufnahme von Rechenbeispielen in Validierungsberichten und Priifvorschriften eine gute Praxis. Zur Vergleichbarkeit von Ergebnissen siehe auch weiter unten. - Wurden die Messungen mit einer - im Vergleich zum Laboralltag - besonderen Sorgfalt durchgefuhrt? Wurden beispielsweise die verwendeten Hilfsmittel (Waage, Pipetten, Detektor) unmittelbar davor kalibriert? - Handelt es sich bei der angegebenen Standardabweichung um die ,,iibliche" Standardabweichung, z. B. 6 Werte pro MeRserie, 6 MeRserien, also Standardabweichung aus 36 MeRwerten oder vielleicht um die Standardabweichung der Mittelwerte: 6 Mittelwerte aus den 6 MeRserien und Standardabweichung der 6 Mittelwerte?

3 Die ~ilidirncngspar.umeter

60

3.3.6 Umgang mit Zahlen und Moglichkeiten zu deren Beurteilung Es liegt in der Natur der Sache, daB MeBwerte streuen. Das kann man problemlos auch akzeptieren. Man sollte sich allerdings auf objektive Kriterien verstiindigen, wenn es urn die Entscheidung geht, welche Abweichungen nicht mehr akzeptiert werden und wie beim Auftreten eines solchen Falles weiter verfahren werden soll. Gelten keine objektiven Kriterien fur alle rnit der Methode Arbeitenden, so ist eine wichtige Voraussetzung fur eine Vergleichbarkeit von Ergebnissen nicht gegeben. Es ist nahezu zweitrangig welche Kriterien gelten. Sind sie einrnal festgelegt, kann nun deren Einhaltung rnit Hilfe von Tests gepruft werden. Allen Tests gemeinsarn ist die Berechnung bestimmter Zahlen (PrufgroRe oder Prufwert) und anschliefiend der Vergleich rnit Tabellenwerten. Fur diese Berechnung sind sehr einfache rnathernatische Operationen notwendig, benotigt werden lediglich der Mittelwert und die Standardabweichung. Beurteilung von Werten einer MeBserie bedeutet nun die Beantwortung folgender Fragen: 1. Gibt es AusreiRer? 2. Liegt ein Trend vor? 3. 1st in der Routine die Differenz zweier Werte, unter Wiederholbedingungen gewonnen, noch akzeptabel? 4. 1st es statthaft, diese zwei MeBreihen zu vergleichen?

Dazu eignen sich folgende Tests: -

AusreiBertests Trendtest nach Neumann Errnittlung der kritischen Wiederholgrenze F- und Cochran-Test

Fur den Vergleich zweier Werte, z. B. Soll-/Istwert (Richtigkeitsprufung), eignet sich der tTest und der Wilcoxon-Test. Diese werden in Abschnitt 3.4.2.1 besprochen. Nachfolgend werden oben genannte Tests kurz erliiutert. 3.3.6.1 AusreiBertests oder Verlablichkeitstests

Zweck:

Uberprufung, ob es sich bei einem Wert, der von den anderen auffallend stark abweicht, urn einen AusreiBer oder um eine zufdlige Abweichung handelt.

Vorteil:

Die Entscheidungsgrenze wird innerhalb des Labors/Abteilung ,,norrniert", es gelten objektive Entscheidungskriterien.

Nachteil: Es entsteht ein zusitzlicher Aufwand. Wichtig: Es mu6 f u r den Fall einea AusreiRers geklLt sein, wie weiter verfahren wird. In der Literatur herrscht keine allgerneine Meinung vor. Die Moglichkeiten rei-

3.3 Priizision

61

chen von: .,der Wert wird ersatzlos gestrichen" bis ,,der Wert wird durch zwei (drei) neue Werte ersetzt". SchlieBlich gilt ebenfalls zu klaren, ab welcher Haufigkeit und welcher Abweichung welche MaBnahrnen ergriffen werden rnussen. Werden laut SOP Ausreiljer lediglich eliminiert ohne Hiiutigkeit und Anzahl weiterzumelden oder zu dokumentieren, wird von Nichtbeteiligten die Prazision und die Robustheit der Methode uberschatzt. Die zwei bekanntesten Tests sind der Dixon- und der Grubbs-Test. Dixon-Test Vorgehen: Man bilde die GroBe Q nach der Gleichung

mit:

x, ausreifierverdachtiger Wert x2 benachbarter Wert

R Spannweite (Abstand zwischen kleinstem und groBtem Wert)

und vergleiche diese mit einem Tabellenwert, siehe Dixon-Tabelle, Abschnitt A.6. Der Wert gilt als AusreiBer, wenn die berechnete GroBe Q groljer als der entsprechende Tabellenwert bei einem Signifikanzniveau von P = 99 % ist, d. h. wenn die Wahrscheinlichkeit fur die Richtigkeit dieser Aussage 99 % betrlgt.

Beispirl I Es werden folgende Werte ermittelt: 7,0, 7.8, 5,0, 8,3,9,0, 6,9, 14,O ausreiflerverdachtiger Wert: 14

Uberprufung: Q =

~

114-91 5 = - = 036 9 9

0,56 ist kleiner als 0,64, laut Dixon-Test ist der Wert 14 kein AusreiBer. Das bedeutet nicht, daR der Wert richtig ist! Der Test sagt lediglich aus, daB die Wahrscheinlichkeit, daR dieser Wert ein AusreiBer ist, im vorliegenden Fall ,,nur" ca. 94 % betriigt. In der Analytik hat sich eingeburgert, einen Wert als AusreiBer anzusehen, wenn die Wahrscheinlichkeit dafur 99 % betragt.

Begt-iirzdung Aufgrund der in der Regel geringen Anzahl der ermittelten Werte sollten statistische Tests vorsichtig interpretiert und deshalb nur signifikante (99 %) und nicht lediglich wahrschein-

liche (95 %) Unterschiede berucksichtigt werden [29]. Man kann sich naturlich - wenn strengere Kriterien sinnvoll erscheinen - auf ein Wahrscheinlichkeitsniveau von 95 % oder gar 90 c/o verstiindigen.

Beispiel2 Es geht noch einmal um die oben angegebene Reihe mit dem Unterschied, daO der Wert ,,5,0" durch den Wert ,,6,5" ersetzt wird. 7,0, 7 3 , 6,5, 6 3 , 8,3, 9,0, 6,9, 14,O ausreiflerverdiichtigter Wert: 14

Uberprufung: Q

=

~

114-91 7,s

5 73

= -=

0,67

0,67 ist groRer als 0,64, laut Dixon-Test ist der Wert ,,14" ein AusreiOer. Je weniger die Werte in einer Reihe streuen, d. h. je prlziser eine Messung ist, um so eher werden AusreiOer erkannt. Uberspitzt ausgedruckt: Je unprlziser eine Methode ist, urn so geringer ist die Gefahr, auf AusreiOer zu treffen. Oder anders formuliert: Bei einer auf Priizision ,,getrimmten" Methode werden auch kleine Abweichungen als AusreiRer .,entlarvt". Die Anwendung einer solchen Methode in der Routine ist erschwert, s. auch ,,Robustheit", Abschnitt 3.5. Der Test nach Dixon ist generell relativ unscharf, fuhrt jedoch in geringerem MaRe zu falsch positiven Ergebnissen. Dem koinmt der Test nach Grubbs entgegen, da er nur deutlich abweichende Werte erkennt [29]. Grubbs-Test Dieser hat die gleiche Zielsetzung wie der Dixon-Test. Auch hier wird gepruft, ob ein Wert mit einer starken Abweichung ein AusreiOer ist oder nicht. Vorgehen: Man bildet die PrufgriiBe Q nach der Gleichung:

mit:

xI ausreil3erverdachtigter Wert

X Mittelwert s

Standardabweichung

und vergleiche diese mit einem Tabellenwert, siehe Grubbs-Tabelle Abschn. A.6. Der Wert gilt als AusreiBer, wenn die berechnete GroBe Q grol3er ist als der entsprechende Tabellenwert bei einem Signifikanzniveau P = 0,99.

3.3 Priizision

63

Beispiel Bei einer Gehaltbestimmung wurden folgende Werte ermittelt: 50,48, 52,47, 53, 61, X : 51,84, s : 5,04 ausreifierverdiichtiger Wert: 61

Uberprufung: Q =

61 - 5 l,84 5,04

=

1,817

I ,8 I7 ist kleiner als 1,944 ( P : 99 %) und sogar kleiner als 1,822 ( P : 95 %). Laut GrubbsTest kann der Wert ,,6 I nicht als AusreiBer deklariert werden. "

Bei dem Dixon-Test werden fur die Berechnung nur drei Werte benotigt: der ausreiserverdlchtige Wert, der Nachbarwert und der kleinste bzw. groljte Wert der Serie (zur Ermittlung der Spannweite). Die Anzahl der Werte dazwischen ist fur die Berechnung nicht relevant. Je groBer die Anzahl der MeBwerte ist, um so weniger aussagekrlftig wird der DixonTest. Die Empfehlungen in der Literatur fur einen Dixon-Test schwanken zwischen 5 und 8 Werten. Bei dern Grubbs-Test werden durch die Einbeziehung von X und s in die Berechnungsformel alle Werte berucksichtigt. Er eignet sich ab 6 bis 8 Werten. Eine Schwlche des Grubbs-Tests sollte nicht verschwiegen werden: Sind in einer Reihe zwei extreme Werte vorhanden, so heben sie sich gegenseitig auf. Das Ergebnis nach dem Grubbs-Test wurde lauten: ,,kein AusreiBer". Eine Abhilfe bietet der sogenannte ,,paired Grubbs-Test", auf den hier nicht eingegangen wird, siehe dazu [30]. Es folgen nun zwei Tests, die selten erwahnt werden, die aber nicht minder praktikabel sind. Henning-Test Vorgehen: Man bilde die GriiBe Q nach der Gleichung:

Q

= Ix, - XI

und uberpruft, ob

3 s 2. Q ist mit:

x, AusreiBerverdlchtiger Wert

X Mittelwert Ein AusreiBer liegt vor, wenn Q groBer ist als die dreifache Standardabweichung.

Beispiel Eine Kapillar-GC-Methode liefert folgende Retentionszeiten: 14,38, 14,40 , 14,38, 14,36, 14,37, 14,38, 14,38, 14,39, 14,39, 14,38, 14,41 ausreifierverdlchtigter Wert: 14,41

s = 0.01 I IXI -

x-1 = 14.41

-

14,M = 0,030

3 s = 0,033 > 0,030 Ausaage: Der Wert ,,41" ist ein AufJreilJer Mittelwertabweichung Viele Labors gehen einen einfachen pragmatischen Weg: Ein Wert gilt als AusreiOer, wenn er um mehr als *I0 56 von dem Mittelwert abweicht. Der AusreiOertest nach Nalimov pruft den groBten und den kleinsten Wert auf Ausreifler, niiheres s. [2X].

Brmrrkittig Es sei noch einmal betont: In der Analytik geht es u. a. urn Vcrpleichbarkeit. eine Voraussetzung dafiir ist die Existenz objektiver Kriterien. Auch folgende Empfehlung einiger Organisationen (z. B. FDA) entspricht einer objektiven Vorgehensweise - obschon mancher Analytiker evtl. daniit P r o b l e m hiitte: Es gibt prinzipiell keine AuareiBer. es werden siimtliche ermittelte Werte bei den Bercchnungen z. B. von V , beriicksichtigt.

3.3.6.2 Trendtest nach Neumann Zielsetzung: Priifen, ob die MeRwerte im zeitlichen Verlauf fallen oder ansteipen Br ispiele,f l i t - Twt i d s Werte fallen, wenn die Probe sich zersetzt. Werte steigen an bei anfiinglicher Adsorption der Probe an der Oberfliiche einer Stahlkapillare in einem Fliissigkeitastrom und allmiihlicher Siittigung der selbigen. Vorgehen:

mit:

ti

.t-,, \

Man bildet die GriiRe Q nach der Gleichung:

Anrahl der Mel3werte x,,, MeBwerte. Die Werte werden nach ihrer chronologixhen Reihenfolge ge-

ordnet Standardabweichung

3.3 Prii,-i.rion

65

Diese GroBe Q wird mit einem entsprechenden Tabellenwert, siehe Neumann-Tabelle, Abschnitt A.6, bei einem Signifikanzniveau P = 95 % verglichen. 1st Q grol3er als der Tabellenwert, liegt mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 % ein Trend nicht vor. Wiihrend bei den AusreiBertests sich ein Signifikanzniveau von P = 99 % (99 % Wahrscheinlichkeit) eingeburgert hat, ist jenes bei den anderen Tests meist P = 95 %. Der Trendtest nach Neumann wird nicht so oft durchgefuhrt, da eine Drift von Zahlen auch ohne diesen Test leicht erkannt wird. Werden Kontrollkarten gefuhrt, ist das Erkennen einer Drift nicht nur leichter sondern man erhalt noch weitere zusatzliche Informationen. 3.3.6.3 Errnittlung der Wiederholgrenze Bei Anwendung von Routinemethoden lautet im Falle von Doppelbestimmungen eine hiiufige Frage im Alltag: Welche Differenz zwischen den Einzelwerten sollte noch akzeptiert werden? Diese Differenz, die kritische Wiederholdifferenz r; ist

mit:

.s

f

Standardabweichung aus Validierungsdaten empirisch ermittelter Zahlenwert, der von dem gewahlten Signifikanzniveau und der Verteilung der Werte abhangt [30].

Fur ein Signifikanzniveau P = 95 % (s. oben) und unter der Annahme einer Normalverteilung ist der Wert v o n f = 1,96 und somit r r =

1,96. h . s = 2,77 . s

= 2,8 . s

Das heifit, es wird akzeptiert, wenn in 5 Fiillen von 100 (95 %!)die Differenz zweier Einzelwerte bis ca. die dreifache Standardabweichung betragt. Fur ein Signifikanzniveau von 90 % ergibt sich ein Faktor von 2,3 und fur ein Signifikanzniveau von 99 % ein Faktor von 3,65. Der Test Lur Ermittlung der Wiederholgrenze erinnert an den Henning-Test. Ob Henning-Test, kritische Wiederholgrenze oder Methodenf&higkeit (siehe Abschnitt 3.1 1 ), das Prinzip der Gaukistatistik dringt durch. Eine Streuung von +3 s urn einen MeBwert, also eine Spanne von insgesamt 6 s, wird hiiufig als Konvention akzeptiert. Die Wahrscheinlichkeit niimlich, daR der Wert bei der n2chsten Messung sich innerhalb eines Streufensters von 6 s befindet, ist ca. 99,73 %. 3.3.6.4 F- und Cochran-Test

Vorhrrnerkung Sowohl fur den F- (nach dem Autor Fisher) als auch fur den Cochran-Test gelten folgende Voraussetzungen: I . beide Datenreihen sind normalverteilt, 2. beide Datenreihen sind frei von AusreiBern.

F-Test, Test auf Varianzenhomogenitiit Zweck:

Priifen, ob die Standardabweichungen aus zwei unterschiedlichen MeOreihen vergleichbar sind, ob also Varianzenhomogenitat herrscht (Test auf Gleichheit der Varianzen). 1st das der Fall, so stammen die Werte aus einer Grundgesamtheit. Dabei mussen die zwei Meljreihen nicht gleich groB sein.

Vorgehen:

Man bildet die Prufgrolje F nach der Gleichung:

F

t,wobei s I> s2 ist SL

=

.y>

mit: s,,.s2 Standardabweichungen der zwei MeBreihen Der erhaltene Wert wird mit einem Tabellenwert F ( P , f l , f 2 ) siehe , F-Tabelle, Abschnitt A.6 verglichen. Dabei bedeuten: ji Zahl der Freiheitsgerade, es gilt: f = n - 1 n Anzahl der Meljwerte 1st F groljer als der Tabellenwert, so gilt ein Unterschied der Standardabweichungen mit einer vorgegebenen Wahrscheinlichkeit als erwiesen, z. B. fur n , = n2 = 6 und P = 95 % gilt: F = 5,OS; fur n 1 = 6, n2 = 10 und P = 99 % gilt: F = 6,O6

Beispiel Es sollen die Gehalte des Wirkstoffs NOVIALIN aus den Produktionschargen A und B auf Varianzenhomogenitlt getestet werden. 18,3 18,l 18,6 17,9 18,O X = 18,22, s = O , 3 O 24,2 24,0 25,l 23,9 23,8 X = 24,30, s = O,55

Produktionscharge A: Produktionscharge B:

0SS2

F = -= 534 0,302

Aus der Tabelle wird ein Wert F (95 %,fl und f2 = 5 - 1 = 4) von 6,39 entnommen. Weil F < F (95 %, 4, 4) ist, nlmlich 3 3 4 < 6,39, besteht Varianzenhomogenitat (die korrekte Formulierung lautet: ,,Varianzeninhomogenitat kann nicht nachgewiesen werden"). Bitte beachten Sie dabei, daR die Mittelwerte recht unterschiedlich sind. Als zusammengefaljte Standardabweichung ergibt sich: Sgcs

=

s,

+ s, 2

-

0,30 + O,S5 2

=

O,43

3.3 Priizision

67

Brmrrkung: Der Variationskoeffizient ist ein strengeres und aussagekraftigeres Vergleichskriterium fur Prlzision als der F-Test. Letzter stellt lediglich ein grobes MaB fur die Gleichartigkeit von Streuungen dar. Im oberen Beispiel betriigt der V , fur die Produktionscharge A 1,65 c/o, fur die Produktionscharge B 2,26 %. Cochran-Test Zweck:

Priifen, ob Standardabweichungen aus mehreren unterschiedlichen Meljreihen zusammengefaljt werden durfen, ob also Varianzenhomogenitat herrscht.

Im Unterschied zum F-Test gilt der Cochran-Test fur identische Proben und gleich grolje Mefireihen. Vorgehen:

Die Priifgrolje C ist der Quotient aus grol3ter zu vergleichender Varianz und der Summe aller Varianzen.

mit:

grol3te Standardabweichung Zahl der Mefireihen Standardabweichung der i-ten Meljreihe

,,s

k s,

Der erhaltene Wert wird mit einem Tabellenwert C ( P , n, k ) , siehe Cochran-Tabelle, Abschnitt A.6, verglichen. 1st C griiljer als der Tabellenwert, so ist die Standardabweichung C,,, mit der vorgegebenen Wahrscheinlichkeit P unterschiedlich von den ubrigen Standardabweichungen (z. B. fur P = 9.5 c/o, n = 5 und k = 5 gilt: C (9.5,5,.5) = 0,505).

Beispirl Nach betrlchtlichen Bemuhungen kann endlich bei der Valin GmbH das neue Produkt Validol in Produktion gehen. Der Gehalt sol1 von nun an von den drei Mitarbeitern, Herrn Quant, Frau Chrom und Frau Peak-Schmal bestimmt werden. Folgende Zahlen wurden ermittelt: -

2

4

5

6

X

F

93,4

1.0

91.9

92,n

92.20

0.72

0.52

913

92.0

91.5

92,9

91,24

0,84

0.71

91,2

90.2

91.4

91.7

90,76

039

0,3S

1

2

3

Herr Quant:

92,2

91s

Frau Chrom: Frau Peak-Schmal:

91,O

89,9

90.1

90,9

MclJwcrtc

C=

0,842 0,72'

+ 0,844 + 0,59'

-

0,7 1 0 3 + 0,71 + 0 3

=

0,449

Aus der Tabelle wird ein Wert fur C (95 %, 6,6) von 0,445 entnommen. Da C > C (95 %,6, 6) ist, kann nicht von einer Varianzenhomogenitat ausgegangen werden. Aussage:

Die Variabilitgt der Arbeitsweise von Frau Chrom ubersteigt etwas die der anderen Anwender - jedenfalls fur die gegebene Methode und Probe (Frau Chrom Jefert" eine Varianz von 0,7 I , das fuhrt zu 0,449 > 0,445). Bei den strengen Kriterien von P = 95 % sollte ein(e) erfahrene(r) Kollege(in) die Bestimmung ubernehmen, oder Frau Chrom mul3te geschult werden. Sind weniger strenge Kriterien vertretbar ( P = 99 %), so kann Frau Chrom weiterhin im Team arbeiten, denn trotz der gleichen Varianz von 0,7 1 ergibt sich jetzt: 0,449 < 0,520 (C fur 99 96,6, 6 = 0,520), siehe Cochran-Tabelle, Abschnitt A.6.

3.3.6.5 Zusammenfassung der Tests und abschlieoendes Beispiel Wenn i n einein Labor Werte erzeugt werden, sind moglicherweise folgende Fragen von Interesse. Diese Fragen werden um so wichtiger, je weniger bekannt die angewandte Methode ist, siehe nachfolgende Tab. 3-4. In Abb. 3-3 ist die Vorgehensweise bei der Bewertung von MeRreihen als FlieBschema dargestellt. Tab. 3-4 Fragen und Liisungsmiiglichkeiten.

Fragc:

Antwort durch:

Sind die Werte normalverteilt?

David-Test

Gibt es AusrciBcr?

AusreiDertests Trendtest nach Neumann

Streucn sic ,,normal" oder driften sie? Wie groB darl die Differen/ iwischen zwci cinzclnen Werten sein (z. B. bci Doppclbestimmung)'?

Wicdcrholgrenze

Wie gro8 ist die Unsicherheit des Mittclwcrtes (MeBwertes)in Zahlen au5gcdruckt (Erliiutcrung und Berechnung siehe ,,Richtig-

MclJunsicherheit

Wie groB ist der Schwankungsbercicheines Werles, d. h. inncrhalh welcher Grenzen kann der ,,wahrc" Wcrt sich hefinden (Erlauterung und Berechnung siehe ,,Richtigkcit", Ahschnitt 3.4)?

Erweiterle Unsichcrhcit (Vcrtrauensbereich)

kcit", Ahschnitt 3.3)?

Zum Vergleich von Zahlen zweier MeBwertreihen siehe Abschnitt 3.4.4. Eben besprochene Punkte werden im nachfolgenden Beispiel zusammengefaBt.

MeRwertreihe DAVID - Test

I

Werte normal verteilt

NElN

Ursachenforschung

Mittelwertab-

+

I

AusreiRer gefunden '?

JA

AusreiRer mit 2 oder 3

+ neuen Werten ersetzen und Test wiederholen

I

JA

Trendtest oder v

I

Neumann

d

er

Beurteilung

c

ENDE

Abb. 3-3 Tcsts zur Bewertung von Zahlen cincr Mel3wcrtreihe.

Ursachenforschung Dokumentation mit folgenden Angaben: - Mittelwert mit Ergebnisunsicherheit und Vertrauensbereich - Standardabweichung und Variationskoeffizient - Angaben zu den Bedingungen wie: Anzahl der Werte, Doppelbestimmung? Konzentration etc.

Brispiel In der Zentralen Analytik der Valikrom GmbH wurden im Rahmen von Stabilitiitsuntersuchungen des neuen Pflanzenschutzmittels ,,VAL1DAN" folgende Gehalte des Wirkstoffs ,,NOVIALOL" gefunden ( 76): 90,l 91,2 93,l 89,s 89,9 90,2 -

x = 90,67 s

= 132

V , = 1.46 % -

David-Test:

R

pG=-= s

93,l - 89,9 = 2,42 1,32

Fur n = 6 und P = 99 % erhalt man aus der Tabelle die Werte g, = 2,15 und g , = 3,14. Das bedeutet: 2,42 liegt zwischen 2,lS und 3,14. Mit einer Wahrscheinlichkeit von 99 96 sind die Werte normalverteilt. -

AusreiRertest nach Dixon: AusreiRerverdiichtiger Wert: 93,l

Die berechnete PrufgroRe (Q = 0,528) ist niedriger als die aus der Tabelle entnommene (Q = 0,698). Damit ist mit einer Wahrscheinlichkeit von 99 % kein AusreiRer festzustellen. -

Trendtest nach Neumann:

(90,l - 91,2)? + (91,2 -%,I)*

+ (93,l - 893)' + (89.5 (6 - I ) . 1,32*

~

89,9)'

+ (X9,9 - 90,2)'

=

2,07

Die berechnete PrufgroBe (Q = 2,07) ist deutlich groBer als die aus der Tabelle entnommene (Q = 0,89). Deshalb ist rnit einer Wahrscheinlichkeit von 05 5% kein Trend feststel I bar.

3.3 Pruzision -

71

Wiederholgrenze: r = 2.8 . .Y = 2.8 . 1,32 = 3,696 = 3,70 Statistisch gesehen wird die Differenz zwischen zwei gemessenen Werten (ermittelt unter Wiederholbedingungen) nur alle 20 ma1 groBer sein als ca. 3,70. Im vorliegenden Beispiel und den 6 Zahlenwerten betragt die grol3te Differenz 3,6 (93,l - 89,s = 3,6).

Die MeBunsicherheit und der Vertrauensbereich werden ausfuhrlich in Abschnitt 3.4.3 behandelt. Um jedoch vorliegendes Beispiel vollstandig darzustellen, werden auch diese GroBen hier ermittelt.

mit:

Ef

t II

MeBunsicherheit t- oder Studentfaktor (Tabellenwert) Anzahl der MeBwerte

Vertrauensbereich: x + u : Obergrenze und x - II : Untergrenze, d. h.: 90,67 k 1,39, also 90,67 - I ,39 = 89.28 und 90,67 + 1,39 = 92,06 Aussage:

Mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 o/o liegt der ,,wahre" Wert zwischen 89,28 und 92.06.

3.3.7 AbschlieBende Fragen zur Prazision 3.3.7. I Welche Prazision kann noch akzeptiert werden? Hier sollte zuniichst zwischen MeB- und Methodenprazision unterschieden werden. -

MeBprlzision: Nachfolgend sind beispielhaft typische Werte fur die MeBprazision in der instrumentellen Analytik angegeben. Diese Werte sind im Normalfall bei fehlerfreien Instrumenten zu erreichen. VK Fcuchtcmcssung

Ti tration Viskosimctric

10

98,O - 102,O

1-10

97,O - 103,O

0

3.9 Ntrchweis-, Bestimmungs- und Erfir.ssungsgrenze

mit:

193

kleinste Analytkonzentration V,(x) Vertrauensbereich von n

x

Diese Zusammenhange werden in Abb. 3-48 und 3-49 graphisch dargestellt [62]. Die Nachweisgrenze entspricht dem Punkt x in Abb. 3-48, die Erfassungsgrenze ist die zweifache Nachweisgrenze (gestrichelte Linie). Diese Konzentration ist nichts anderes als der zweifache Vertrauensbereich der Analytkonzentration x. Einfach ausgedruckt: Unterhalb dieser Konzentration und bis zur Nachweisgrenze ist man ,,ziemlich" sicher, daB der Analyt wirklich vorhanden ist, Punkt 1, Abb. 3-49. Erst oberhalb dieser Konzentration und zwar fur die Bedingung x - 2 . V e ( x ) > 0 sind quantitative Aussagen erlaubt. Wo Punkt 2 in Abb. 3-49 liegen soll, also was als Bestimmungsgrenze definiert wird, sollte der Analytiker nach der konkreten Fragestellung entscheiden.

I

2* v0

X

Konzentration

Abb. 3-48 Nachweis- und Erfassungsgrenze nach DIN 32645.

Konzentration Abb. 3-49 Erfassungs- und Bestirnrnungsgrenze.

-

Unabhangig vom ausgewahlten Verfahren gebuhrt dem EinfluB der Matrix hochste Aufmerksamkeit. Wenn dieser Konzentrationsbereich tatsachlich von Relevanz ist, sollten vor einer endgultigen Weitergabe der ermittelten NWGBSG ausreichende Robustheitsexperimente durchgefuhrt worden sein. Ohne auf weitere Details einzugehen seien hier einige Fragen aufgefuhrt, die ggf. zu klaren waren: Das Verhaltnis Peakhohe/Peakbreite ist in der HPLC konstant, bei kleiner werdenden Peaks jedoch nimmt es ab. Dieser Effekt ist stark matrix-abhangig. Wird nun die Peakhohe gemessen, gilt zu prufen, ob die BSG tatsachlich als die dreifache NWG angenommen werden darf. Vielleicht ist gerade in diesem Bereich die Krummung der Kalibriergerade starker, obwohl die Varianzenhornogenitat gegeben ist. Kann man damit rechnen, daB das Verhaltnis Matrix/Analyt konstant bleibt? Wenn nicht, sollten eventuell zwei getrennte Verdunnungen erfolgen. In der Chromatographie ist die Kinetik und damit die Peakhohe - durch irreversible Sorption auch die Peakflache - mengenabhangig. Das fuhrt zu einer starken Streuung der Werte in diesem Bereich. Der Vorschlag von Eurachem, die NWG/BSC uber die individuell akzeptierte Streuung der erhaltenen Werte zu ermitteln ist ein praxisnaher Ansatz.

Welches Verfahren ist vorzuziehen? Die Ermittlung uber das PeakRausch-VerhAtnis ist in der Chromatographie sehr verbreitet und es wird von Behorden (noch) akzeptiert. Dennoch sind Ergebnisse aus oben genannten Grunden nicht immer vergleichbar. - Die Blindwert- und Kalibrierwertverfahren werden von vielen Softwareprograrnrnen unterstutzt, sind leicht anwendbar und als ,,offizielle" Verfahren genieBen sie eine hohe Akzeptanz. Das Blindwertverfahren liefert etwas kleinere Werte als das Kalibrierwertverfahren. - Das Verfahren uber den noch akzeptierten V , ist ein gutes Verfahren, denn es werden quasi alle Faktoren, die die NWG/BSG beeinflussen, berucksichtigt. Es kann an die aktuelle Fragestellung angepaat werden. Der Nachteil dabei ist, daB es durch eine evtl. groBe Anzahl von Verdunnungsschritten recht aufwendig ist. Ein ebenso pragmatischer Ansatz ist die Angabe der Bestimmungsgrenze uber den individuell akzeptierten Vertrauensbereich. -

Mit dem Ziel, nicht mehr als notwendig zu tun, kann sich der Aufwand fur die Prufung der aktuellen Notwendigkeit anpassen. Man konnte sich folgende Vorgehensweise beispielhaft vorstellen: Befindet man sich in einem fruhen Stadium der Methode oder geht es um eine ,,quick and dirty" Fragestellung, reicht durchaus, die Nachweisgrenze uber das PeakRauschVerhaltnis oder uber den dreifachen Blindwert zu berechnen. Erst spater, wenn der Bedarf ansteht (der Kunde hat nach den ersten Vorversuchen den Auftrag tatsachlich erteilt und es mu13 ein Validierungsbericht abgegeben werden, die Methode sol1 nun eingereicht werden, der Termin fur die FDA-Inspektion steht fest usw.), sollten statistisch abgesicherte Werte ermittelt werden: Anwendung des Kalibrierwert- oder Leerwertverfahrens.

3.11 ProzeJ- und Merhodenfihigkeit

195

Tab. 3-17 Zielsetzung, Probe und empfohlener Arbeitsbereich fur die Pharmaindustrie (ICHEmpfehlung). Test

Arbeitsbereich

Gehalt (Wirkstoff und Arzneiform)

80- 120 % der Zielkonzentration

Gleichformigkeit des Gehaltes (content uniformity)

70-130 % der Zielkonzentration

Freisetzung

*20 % OSG/USG

Nebenprodukt

Spezifikation - 120 % der Spezifikation

Nebenprodukt, Arzneiform

ab 0,5 % bei Tagesdosis < 1mg ab 0,25 % bei Tagesdosis < 1-10 mg ab 0,l % bei Tagesdosis 10 mg - 1 g ab 0,05 % bei Tagesdosis > 1 g

Gehalt und Reinheit zusammen

Spezifikation Nebenprodukt - 120 % der Gehaltspezifikation

3.10 Arbeitsbereich Der Arbeitsbereich ist der Konzentrationsbereich des Analyten in der Probe (unterelobere Grenze) mit einem akzeptablen MaR an Prazision, Richtigkeit und Linearitat. Dieser kann aus der Linearitat abgeleitet werden. Der Arbeitsbereich hangt direkt von der Prazision der Methode ab: je praziser eine Methode ist, um so strengere Kriterien gelten fur die Linearitat und demnach desto geringer ist der Arbeitsbereich. Die Angabe des Arbeitsbereichs in einem Validierungsbericht ist insofern eminent, als Richtigkeit, Prazision, Selektivitat und Robustheit der Methode von der Konzentration abhangen. Richtigkeits-, Prazisions- und Robustheitsangaben ohne gleichzeitigen Bezug auf eine Konzentration sind nicht brauchbar. Laut ICH, fur den Pharmabereich maagebend, gelten folgende Arbeitsbereiche abhangig vom Testzweck [63], siehe Tab. 3- 17. Da der ,,Gehalt" nur in Bereichen wie Pharma, Pflanzenschutz, Kosmetik, Lebensmittel relevant ist, spielt der Arbeitsbereich nur dort eine Rolle. In anderen Bereichen reicht meist eine Grenzwertangabe aus: Nicht grofierkleiner als ,,x".

3.1 1 ProzeB- und Methodenfahigkeit 3.1 1.1 Definitionen und Erlauterungen ProzeBfahigkeit liegt vor, wenn die Streuung eines (Produktions)Prozesses im Vergleich zu den Spezifikationswerten gering ist. Als MaB werden Fahigkeitsindices verwendet, sie verknupfen die Streuung von Priifergebnissen mit den Forderungen.

Analog spricht man von der Methodenfiihigkeit. Die Methodenfiihigkeit gibt Aufschlufi, in wie weit die durch die Methode verursachte Streuung mit den gestellten Forderungen konform ist. Methodenflhigkeit ist somit das Verhiiltnis der vorgesehenen Spezifikationsgrenzen zu der tatsiichlichen Streuung der Methode. Allgemein gilt:

"p

mit:

~

Toleranzbreite Prozefibreite

-

OSG - USG 6s

ProzeRfahigkeitsindex OSG Obere Spezifikationsgrenze USG Untere Spezifikationsgrenze cp

Fur eine Methode gilt entsprechend cM.Der Fuhigkeifsindexc,,/cMsollte demnach mindestens 1 sein. weil in diesem Fall die Streuung der Produktion/Methode genau zwischen den Spezifikationsgrenzen liegt. Oft ist zwar die Rede von der Methodenfiihigkeit, als Symbol wird aber statt ,,cM",.,cp'' verwendet. Warum ist die Kenntnis von cMwichtig? Es ist von elementarer Bedeutung, die Qualitat von Produkten gem28 Spezifikationen zu beurteilen. Zur Ermittlung der Prozefifiihigkeit z. B. eines Herstellprozesses werden nun Merkmalswerte ermittelt und diese zu den Forderungen in Beziehung gesetzt. Merkmalswerte werden allerdings durch Prufmethoden ermittelt. Die Mefigenauigkeit der Prufmethode beeinflufit folglich die Aussage iiber die ProzelJfiihigkeit. Wenn die Prufmethode zu sehr streut, konnen falsche Ruckschlusse auf die ProzeBfiihigkeit gezogen werden. Auf diese Problematik werden wir weiter unten eingehen. Die ProzeBfahigkeit bezieht sich immer auf eine routinemiifiige Anwendung der Methode. Und sie kann nur ermittelt werden, wenn fur den betrachteten Zeitraum der analytische ProzeB in statistischer Kontrolle (ISK) ist. Die Methodenfiihigkeit (auch .,Methotlrripotential" und in der Fertigungsindustrie ,,Muschinrnfiihih.keit" genannt) wird in einer Kurzzeituntersuchung ermittelt. cMist n u n eine aussagefiihige GriiDe nur fur mittenzentrierte Prozesse. Der korrigierte Fiihigkeitsindes c~~ berucksichtigt dagegen eine Verschiebung des Mittelwertes und ist daher vorzuziehen.

cMK

mit:

=

OSG - X h 3s

oder

C,,

=

.Yh -

USG

3s

.q, Beiugwert, z. B. Mittelwert cMK

ist bei mittenzentrierten Prozessen gleich cM

3. I I Pmzejl- und Methodenfiihigkeit

197

Abbildung 3-50 gibt diese Zusammenhlnge graphisch wieder [64]. Es geht um Bogenschiel3en. In Abb. 3-50 sind Zielscheiben mit Punkten fur die Treffer von 4 Bogenschutzen skizziert. Daneben ist in Form einer Haufigkeitsverteilung dargestellt, wie die entsprechende Verteilung der Treffer, bezogen auf das Ziel, aussieht und welchen Wert die zugehorigen Flhigkeitsindices haben. ProzeRfahigkeit

-X

USG

Bogenschutze 1

OSG

ProzeR 1

USG ?

Bogenschutze2

ProzeR 2

-X

USG

Bogenschutze3

OSG

OSG

ProzeR 3

I

1

I/ Cpk = 0.4

~

USG

Bogenschutze4

USG = Untere Spezifikationsgrenze

ProzeR 4

OSG i

OSG = Obere Spezifikationsgrenze

Abb. 3-50 Zusamnienhang zwischen Streuung, Lage des Mittelwertes. Spezifikationsgrcnzc und Methodenfihigkeit [64], Erlautcrung siche Text.

3.1 1.2 Beispiele Zwei Beispiele sollen n u n der Erlauterung dienen. Zurn Einen geht es um den Zusarnmenhang Spezifikationsgrenze, Standardabweichung und Methodenfahigkeit. Das zweite Beispiel befaljt sich mit dem Unterschied zwischen Methodenfahigkeitsindex und korrigiertem Methodenfahigkeitsindex. Wie soeben dargestellt ist der Fahigkeitsindex cM ein Kriterium fur die Eignung (FBhigkeit) einer Methode. Verkniipft er doch die Streubreite von Ergebnissen mit Spezifikationsforderungen. Nehmen wir an, daR zwei Methoden beispielsweise den gleichen cM-Wert von cM= 1,3 haben. Sind beide Methoden automatisch gleich ,,gut"? Nicht unbedingt. Dazu folgendes Zahlenbeispiel:

a) Die Spezifikationsforderung fur eine Gehaltsbestimmung ist 98 o/o bis 102 %. Bei der ersten Methode betragt die Standardabweichung s = 0,5, dernnach ist CM =

OSG-USG 6s

-

102-98 4 - 1,3 6 . 0.5 3

Die zweite Methode weist die doppelte Standardabweichung auf, niimlich s = I , demnach ist

CM

=

OSG-USG 6s

-

102-98 6.1

-

4 6

-

0,67

Der Vergleich fuhrt zu der Aussage, daR die zweite Methode ungeeignet ist: Die Werte streuen stark, sie ist zu unpriizise. Wenn man die Spezifikationsgrenzen der zweiten Methode auf die Werte 96 o/o bis 104 o/o festlegt, ergibt sich fur die zweite Methode ebenfalls ein cM-Wertvon 1,3.

CM =

OSG-USG 6 .s

-

104-96 6.1

-

8 6

-

1.3

Durch eine harmlos anrnutende ,,Anpassung" oder ,,Optimierung" von Speziiikationsgrenzen kann eine Methode ..fahig"gernacht werden. ... Positiv ausgedriickt: Eine kleine Ausweitung von Spezifikationsgrenzen (durch die die Qualitat des Produktes nicht unbedingt leiden rnuR!) erlaubt, mit dieser Methode weiterhin zu arbeiten, die sonst f u r den vorliegenden Fall als unfiihig zu bezeichnen ware. b) Werden Fiihigkeitsindizes zur Beurteilung einer Methode herangezogen, so eignet sich dafur nur der korrigierte Fahigkeitsindex. Auch hier sol1 ein Zahlenbeispiel der Verdeutlichung dienen:

3. I I ProzeJ- und Methodenfihigkeit

199

Spezifikationsgrenze: 98 % bis 102 %, s = 0,5 Dazu betrachten wir die zwei Falle, daB der Mittelwert in der Mitte der Spezifikationsgrenze (100) liegt und daB er naher an der unteren Spezifikationsgrenze (99) liegt. Irn ersten Fall gilt: CM

=

OSG - USG 6s

CMK =

x,, - U S G

3s

-

102 - 98 - 1,3 und 3

2 - 100-98 - -

3 . 0,5

13

1,45

1

... und irn Zweiten: CM =

CMK

102 - 98 OSG - USG = 1,3 und 6s 3

=

x,, - U S G

3s

-

99-98 - 1 - 0,67 3 . 0,5 1,5

Wahrend der cM-wertin beiden Fallen 1,3 betragt, ist der CMK-Wert im ersten Fall 1,45, irn zweiten Fall nur 0,67; die zweite Methode ist nicht akzeptabel. Bei der zweiten Methode haben wir bei einer Streuung der Werte von k3 s um den Mittelwert folgendes Ergebnis: k3 . 0,5 = +1,5 urn den Wert 99, also von 97,5 bis 100,5.2,28 % der statistischen Werte befinden sich unterhalb der unteren Spezifikationsgrenze von 98 %, das ist irnmerhin ca. jeder 40. Wert. Sornit ist nur der cMK-Werteine aussagefahige KenngroBe, da er irn Gegensatz zum cMWert beriicksichtigt, wenn ein Mittelwert nicht in der Mitte der Spezifikationsgrenzen liegt. Das bedeutet, der CMK-Werterlaubt eine Aussage iiber Streubreite und Lage des Mittelwertes der betrachteten Methode relativ zu der am nachsten liegenden Spezifikationsgrenze. Zur Veranschaulichung siehe Abb. 3-50 und 3-51. Genaueres zur Problematik von Analysenergebnissen in der Nahe der Spezifikationsgrenze siehe [65].

1

OSG

99 98

USG

Abb. 3-51 h e r die VerlaRlichkeit von Daten innerhalb der Spezifikationsgrenze.

3. I 1.3 Akzeptanzkriterien, Bewertung von Prozessen und Methoden Es liegt aufder Hand, dalj Prozesse (oder auch Methoden) mit cp < 1 ungeeignet aind, denn dies bedeutet ja, daB die Streubreite des Prozesses griiljer ist als der Bereich zwischen unterer und oberer Spezifikationsgrenze. cp= 1 bedeutet, dalj der ProzeB zwar innerhalb der Spezifikationsgrenze streut, die ProzeljfBhigkeit ist allerdings eingeschrgnkt. es ist einfach kein ,,Puffer" da. Ein Prozelj wird ab einem c,-Wert von I ,33 als sicher angesehen. Wo kommt die ,,1,33" her? Ein ,,Puffer", eine ..Sicherheitszone" von 1 s zwischen der Streuung des Prozesses und der oberen bzw. unteren Spezitikationsgrenze wird allgemein als ausreichend angesehen. Bei einer konventionell akzeptierten Streuung von +3 s (die Wahrscheinlichkeit ist 99,73 ?h, dal3 der Wert in einem Bereich von 13 s anzutreffen ist) ,,darf' der ProzeR um k4 s streuen. bzw.

-[-)

f 4 . s 8 = 1,33 k3.s 6

Zusammengefaljt heil3t es wie folgt: cp> 1,33 Proze6 sicher (Abb. 3-S2a [65]) I < cp < 1,33 ProzeB ziemlich sicher (Abb. 3-S2b [6S]) CP < 1 Prozelj unsicher (Abb. 3-S2c [6S]) Das alles gilt, es sei erlaubt es noch einmal zu betonen, fur ISK-Prozesse. Wird der Mittelwert verschoben, so ist der ProzeBldie Methode trotz eines Fiihigkeitsindeces von > 1.33 nicht ,,fBhig". Das wird graphisch in Abb. 3-53 demonstriert [28]. Bei einem konstanten c,,Wert von 1,66 (10s : 6s) ergeben sich durch die Mittelwertverschiebung immer kleinere cp,-Werte. Eine stete, leichte Verschiebung des Mittelwertes ist trugerisch und stellt eine grolje Gefahr im Laboralltag dar: Die Standardabweichung bleibt konstant und der gefundene Mittelwert Bhnelt weiterhin dem Referenzwert. Kein Wunder, denn auch der Referenzwert verschiebt sich! Solche und weitere Bhnlich diffizile Situationen kann man mittels Regelkarten erkennen (s. Kapitel 8). Bei solchen ProzessenMethoden ist es eine Glucksache, ob der aktuell ermittelte Wert und der nkhste und der vom nlchsten Tag gerade unterhalb oder oberhalb der Spezifikationsgrenze sich befindet. Das Ergebnis sind unprazise Werte, die nicht nachvollziehbar sind. N u n zuruck zur Methodenfghigkeit. Diese Forderung ist fur die Produktanalytik, d. h. dort, wo Spezifikationsforderungen vorgegeben sind, eminent. Wenn ,,Methodenfiihigkeit" wiirtlich genommen wird, so sollte ein cMvon kleiner ca. 2 nicht akzeptiert werden, solche Werte bedeuten eine nicht akzeptable Streuung der Methode von ca. 50 c70 innerhalb der vorgegebenen Spezitlkationsgrenzen. Erliiuterung Eine analytische Methode in der Produktanalytik hat die Aufgabe, einen ProduktionsprozeR zu uberwachen. Das bedeutet, zu prufen, ob bei ungewollten (oder gewollten) etwaigen Anderungen der Herstellbedingungen - und damit niiiglicherweise verbunden eine Anderung von relevanten Produkteigenschaften - die Spezifikationsforderung immer noch ein-

3. I I ProzeJ- und Methodenfahigkeit

20 1

Stetiqe Qualitatsverbesserung Zuku nft

Stetiae Qualitatsverbesserung Zur Zeit

Spezifi kationen

Spezifikationen

Charakteristik

Charakteristik

Abb. 3-52a Der ProzelJ ist sicher; die schraffierte Flache gibt den ,,Puffer"zwischen Streuung des Prozesses und Spezifikationsgrenze wieder.

*

Abb. 3-52b Der ProzeB ist ziemlich sicher; trotz einer groaeren Streuung des Prozesses sind die Spezifikationsgrenzen ,,weit" genug entfernt.

Stetiae Qualitatsverbesserung Vergangenheit

I---

Spezifikationen +I- 3s

Charakteristik

Abb. 3-52c Der Prozel!, ist unsicher, denn die Streuung ist griiRer a k der Bereich, der der Spezifikationcforderung entspricht.

Prozesfa higkeit

Verteilungskurve

Cpk

cP

+a=

% aui3erh Spez.

< 1.0

Toleranzbreite

1121L

=

l,o

Toleranzbreite

> l,o

Toleranzbreite

USG I,66

0,003

1,33

--

~

USG 1.66

1,o

0,14

0,67

2,28

0.33

16,O

0.0

50,O

USG

1 USG

1.66

1

.~

USG

1

1,66

.-

~

USG

1,66

Abb. 3-53 ProA3fahigkeit und Mitrelwertvrrsc~hiebung.

-0,33

84,O

3. I I Prozej- und Methodenfahigkeit

203

gehalten wird. Um eben eine Streuung des Prozesses uberpriifen zu konnen, darfdie Streuung der Werte durch den MeRvorgang selbst nicht ,,zu" stark sein. 1st es dennoch der Fall, so wurde man streuende Werte einem streuenden ProzeR zuschreiben, die Streuung der Werte jedoch rtihren in Wirklichkeit von der unprazisen Methode her. Die Methodenstreuung sollte hochstens 25 bis 30 % der erwarteten Streuung des (Produktions)Prozesseseinnehmen. Das heiBt, die ProzeRtoleranz (Abstand zwischen USG und OSG des Produktes) sollte ungefahr das vierfache der durch die Methode bedingten Streuung sein: Eine Streuung von +3 s bedeutet eine Gesamtstreuung von 6 s. Wenn nun die Streuung der Methode in etwa 25 bis 30 % der ProzeRtoleranz ausmachen sollte, so miil3te die ProzeBtoleranz 24 s betragen:

Die Streuung eines Wertes um +3 s, also insgesamt 6 s, entspricht 25 % von 24 s.

Beispiel Bei einer Spezifikationsgrenze von 98 bis 102 % und einer Standardabweichung, s,von 0,2 hatten wir: CM =

CM

=

OSG - USG 6s

102-98 4 6 . 0,2 1,2

2

cp = 3,34

Die Streuung von 6 s, gleich 1,2, entspricht 30 % des Spezifikationsbereichs von 4 (98 bis 102). Bei einern s-Wert von 0,3 hatten wir: 102-98 6 . 0,3

CM==--

-

4 1,8

s

CM =

2,2

Die Streuung von 1,8 entspricht ca. 45 % der vorgegebenen Spezifikation von 4 (98 bis 102). Was zeigen diese Beispiele? Es sei noch einmal das anvisierte Ziel wiederholt: Die Streuung einer Methode sollte bis ca. 30 % der vorgegebenen Spezifikationsgrenzen einnehmen (s. auch Abschnitt 5.2). Nur in einem solchen Fall befindet sich der Gesamtpro-

zeR innerhalb der Spezifikationsgrenzen, wenn j a eine eventuelle Streuung der Produktion zu der Streuung der Methode hinzukiime. DaB die Streuung einer Methode im Vergleich zu den Spezifikationsforderungen des Produktes gering sein muB, leuchtet sicherlich ein. Es ist jedoch in der Praxis kaum realisierbar, Methoden mit einer Streuung von s-OJ zu finden, was bei einer Spezifikationsforderung 98 his 102 %, wie im obigen Beispiel dargestellt, notwendig wiire. Patentlasungen fur dieses Dilemma gibt es leider nicht. Man sollte Werte auBerhalb der Spezifikationsgrenze nicht all ,,zu Ernst" nehmen - wir erwarten ja solche bei einer unfiihigen Methode! Arbeitet man mit unprazisen = unfiihigen Methoden, so mu8 man leider hiiufige Wiederholungen und hin und wieder die Bearbeitung von Reklamationen hinnehmen. Nachfolgend werden einige Mafinahmen vorgeschlagen, die ersten zwei sind die Effektivsten, siehe auch Abschnitt 5.2.

3.1 1.4 Mafinahmen bei unzureichender Methodenfahigkeit zu kleine cMK's -

-

-

-

-

-

Wenn dem Labor die Miiglichkeit gegeben wird, sollte es zusammen mit der Produktion/Kontrollbehorde realistische Spezifikationsforderungen formulieren. 1st cMK< cM,handelt es sich um einen NISK (NISK: Nicht In Statistischer Kontro1le)Prozek Hier besteht unbedingt Handlungsbedarf. Ein hervorragendes Werkzeug zur Verfolgung und Optimierung von Prozessen ist die statistische ProzeRkontrolle, SPC. Es sollte noch einmal uberpriift werden, oh der Mittelwert richtig ermittelt wurde. Zufillige Fehler sollen durch Verbesserung der Priizision, beispielsweise durch robustere Methodenbedingungen, minimiert werden oder es ist auf eine andere, priizisere Methode zuruckzugreifen. Es sol1 ein interner Standard verwendet werden; das ist zwar keine ..Losung". erhoht aber die Sicherheit der Aussage bei unpriizisen Methoden. In einem Betriebslabor ist eine OOS-Situation alle 10-20 Chargen durchaus tolerierbar. Tritt bei einer priizisen Methode diese Situation hiiufiger ein, so sollte als erstes gepriift werden, oh die Geriite aus dem Betriebslabor die gleiche Priizision aufweisen wie die Geriite in der Entwicklungsanalytik.

Handbuch Validierung in der Analytik Stavros Kromidas Copvriaht 0 2000 WILEY-VCH Verlaa GmbH

4

Haufige Fragen zur Validierung

4.1

Ermittlung der interessantesten Fragen

Welche Fragen uber Validierung beschaftigen am starksten die Anwender? Diesem Thema ist der Autor nachgegangen: In Seminaren uber Validierung in der Analytik wurden die Teilnehmer nach den fur sie drei, vier wichtigsten Fragen bzw. Themenbereiche befragt, die im Seminar intensiver behandelt werden sollten. Es wurden die Antworten von ca. 340 Teilnehmer ii ca. 3 Fragen, das entspricht ca. 1000 Fragen, aus Veranstaltungen in den Jahren 19961999 ausgewertet. Es erfolgte zunachst eine Zuordnung der Fragen in Themenbereiche und anschlieBend eine Gewichtung nach der Haufigkeit der angegebenen Fragen, siehe Abb. 4- 1. Aus Abb. 4- 1 wird folgendes ersichtlich: Von den unten aufgefuhrten sieben Themenbereiche waren die ersten zwei fur die Befragten mit Abstand die wichtigsten gewesen. Die sieben ermittelten Themenbereiche sind folgende (die Nummerierung entspricht den Ziffern in Abb. 4- 1 ):

loo0 800

I

700

Anzahl der Fragen

600 500

(Mehrfachnennung moglich) 400

300 200 100

0 1

2

3

4

5

6

7

Abb. 4-1 Haufigkeit von Fragen zur Validicrung nach Themen sortiert, Erliuterung siehe Tcxt

1. ,,W-Fragen" aus dem Validierungs-Alltag: z. B. ,,Wer legt den Validierungsumfang fest?" ,,Was ist wirklich notwendig?" ,,Wie oft mu13 ich validieren?" ,,Wann brauche ich uberhaupt Validierung?" usw. 2. Es besteht ein starkes Bedurfnis fur eine genaue Erlauterung der einzelnen Validierungselemente und Tips fur deren Ermittlung z. B. ,,Was ist eigentlich Prazision, Nachweisgrenze, ... und wie bestimme ich sie?" 3 . Problem: Mangelnde Zeit fur Validierungsarbeiten; .,Wie kann ich Zeit sparen?" Geld spielt in diesem Zusammenhang offensichtlich eine untergeordnete Rolle. 4. Behordliche/rechtliche Anforderungen? 5. Gibt es Hilfen fur mich? 6. Zum Teil sehr detaillierte Fragen zum Validierungsumfang abhangig a) vom installierten oder beabsichtigten QM-System b) von der Methode c ) von der analytischen Fragestellung. 7. Sonstiges; hierunter fallen sehr unterschiedliche Fragen zur Dokumentation, MalJnahmen in ,,out of spec"-Fallen, Anzahl der Einwaagen, Grenzen der Validierung usw.

4.2

Antworten auf die sieben wichtigsten Fragenkomplexe

Nachfolgend wird versucht, sehr knapp auf typische, Fragen zu antworten, b7w. es wird auf die entsprechende Stelle im Buch verwiesen. Ein Teil der Antworten stammt von Wolfgang Gottwald, Provadis, und Dr. Joachim Ermer, Aventis. Bei den Fragen handelt es sich um Zitate. 1. a) ,,Was ist der Mindestumfang einer Validierung?"

,,Was ist notwendig festzulegen und was bleibt dem einzelnen Labor als Spielraum?" .,Was rnuP unbedingt gemacht und auf was kann verzichtet werden?" Zu diesen Fragen heiBt es in der I S 0 17025: ,,Die Validierung mu13 in dem Umfang durchgefuhrt werden, der zur Erfullung der Erfordernisse der beabsichtigten Anwendung oder des betreffenden Anwendungsgebiets notwendig ist". Das bedeutet nichts anderes als daB das Labor, ausgehend vom Validierungszweck, selbst Umfang und Vorgehensmodus bestimmen kann und sollte. Soweit zum analytischen Aspekt und zum Geist der IS0 17025. DaR Inspektoren, nationale Behorden und Verbiinde oft den Umfang direkt oder indirekt stark oder ausschliel3lich bestimmen, ist eine hautige Praxis. Auf diese Problematik wird in Kapitel 7 eingegangen. b) ,,Wofur benotige ich die Validierung?" ,,lst Validierung fur meine Arbeit wichtig?"

4.2 Antworten uuf die sieben wichrigsten Frugenkornplexe

207

,,Wie weit ist Validierung fur mich sinnvoll, wenn ich nicht an gesetzliche Vorgaben gebunden bin?" ,,Ich bin heute zwar hier im Seminar, aber wann mu13 ich uberhaupt validieren?' Diese Fragen entsprechen generell der Frage nach dem ,,Wann?' In folgenden Fallen ist Validierung notwendig: - Es wird demnachst rnit einer neuen Methode, z. B. Hausmethode oder Methode, mit der das Labor noch nie konfrontiert war, gearbeitet. Man sollte die Methode durch Ermittlung deren Merkmale naher kennenlernen, d. h. dann, wenn es um die Bewertung einer Methode auf ihre Qualitamignung geht. - Dem Labor steht eine Akkreditierung/Zulassung ins Haus. - Wichtige analytische Fragestellungen sind Grund fur eine Validierung, z. B. wenn ein vielversprechendes Produkt vor der Markteinfuhrung steht, oder ein Produkt rnit einem gesundheitlichem Risikopotential vorliegt usw. - Verkaufschancen sollen erhoht werden, Validierung ist ein wichtiges Argument fur das Labor bei Gesprachen rnit Kunden. - Zu der Frage welche Verfahren validiert werden sollten steht in der IS0 17025: ,,Das Laboratorium mu13 nicht genormte, selbst entwickelte Verfahren, genormte Verfahren, die aurjerhalb ihres vorgesehenen Anwendungsbereiches angewendet werden und Erweiterungen von genormten Verfahren validieren, um zu bestatigen, da13 die Verfahren fur den beabsichtigten Gebrauch geeignet sind." c) ,,Wie oft mu13 ich validieren?" Zu Beginn des Lebenszyklus der Methode; im Routinebetrieb empfiehlt sich das Fuhren von Regelkarten rnit Kontrollproben. d) ,,Wenn die HPLC-Saule verkurzt wurde - mu13 das ganze Verfahren revalidiert werden?" Nein; es sollten die Merkmale der Methode uberpriift werden, die durch die konkrete Anderung beeinfluat werden konnten. Im vorliegenden Fall: - Ja: Auflosung, Linearitat (Uberladung der Saule?), Lebensdauer der Saule (gleiche Packungsqualitat?) - Vielleicht: Nachweis-Bestimmungsgrenze. - Nein: Richtigkeit, Wiederfrndungsrate, Methodenprazision. Beim Wechsel jedoch zu einer vollig anderen Matrix, neue Formulierung, andere Konzentration sollten alle Merkmale noch einmal uberpriift werden - zunachst mit einer kleineren Anzahl an MeBpunkten. Dazu die IS0 17025: ,,Wenn einige Anderungen in den validierten nicht genormten Verfahren vorgenommen werden, sollte der Einflu13 solcher Anderungen dokumentiert werden, und sofern angemessen, sollte eine neue Validierung vorgenommen werden. ''

e ) ..Was inacht in1 Routinebetrieb Sinn?"

So wenig Messungen wie moglich ligente" Systemeignungstests.

-

verstiirkter Einsatz von Regelkarten und ,,intel-

f) .Jst ruckwirkende Validierung uberhaupt Lulassig?"

Teilweise ja. Zeigen die Daten der Vergangenheit durch Verwendung von Regelkarten, daR der ProzeU in statistischer Kontrolle ist, erfihrt man einiges uber Robustheit, Priizision und Methodenfahigkeit. Man erhalt natiirlich keine Information daruber, ob das Ergebnis richtig ist (methodenbedingter systematischer Fehler) und wie die Bestimmungsgrenze der Methode ist. Man unterscheidet wie folgt: Prospektii*e,vorausschauende Vtrlidienrng: AbschluB der Validierung vor Nutzung des Prozesses. Rrtrosprktive, ruckwirkende Vulidierung: Validierung bereits bestehender Prozesse.

g) .,Kann eine ordentliche Kalibrierung die Validierung ersetzen?" Ja, wenn im konkreten Fall - einfach ausgedruckt - der MeRvorgang und nicht die Probe selbst als kritisch anzusehen ist, oder bei ,,El-gebnisvalidierungen", wenn eine geeignete Kalibriersubstanz vorhanden ist. Merkr

Kalibriert werden Instrumente und MeRmittel. Validiert werden Verfahren, Methoden und Prozesse. Dnzu die IS0 17025: ,,Zur Bestinimung der Verfahrensmerkniale kann als Methode eine ,Kalibrierung mit Bezugsnormalen oder Referenzmaterialein ' verwendet werden." h ) ..Was passiert mit Ergebnissen, die auaerhalb der ,,limits" sind?"

Es gibt keine einheitlichen Regelungen: Fur manche Organisationen gibt es prinzipiell keine AusreiRer, es werden alle Werte berucksichtigt. In manchen SOP'S wird vorgeschrieben. daB der Wert wiederholt wird, bei manchen darf der Wert ersatzlos gestrichen werden, usw. Die Vor- und Nachteile der einzelnen Vorgehensweisen liegen auf der Hand: ,,Saubere" Mathematik (,,es gibt keine AusreiBer") auf der einen Seite, Realitiit des Analytikalltags auf der anderen Seite. Durch eine plotzlich auftretende Luftblase in einer HPLC-Pumpe iindert sich der Flu13 und damit die Peakfliiche. der resultierende Gehalt 1st nicht brauchbar. Drei Wiederholwerte erhiihen zwar die Sicherheit, doch ist der Aufwand fur diese Analyse gerechtfertigt? Pragmatisch gesehen ist es unerheblich, wie das Problem geregelt wird, es ist nur wichtig. daB alle Beteiligten mit den Daten nach festgelegten, objektiven Kriterien umgehen.

4.2 Aniwrtrten &'die sieben ivichtigsten Fragenkortipkxe

209

i) ,,Welche Konsequenzen sollen bei ,,out of spec"-Situationen folgen? Auch hier hangen die Konsequenzen von der Fragestellung ab. Folgende Aspekte bestimmen die erforderliche Reaktion: - Sicherheitsaspekte fur Mensch, Tier und Umwelt. - Relevanz der Spezifikationsgrenze (,,Was fordert der Kunde? Was kann wirklich passieren?') - Juristische Aspekte, sonstiger Konflikt denkbar? Empfehlung: Drei Doppelbestimmungen durchfuhren, jeder Mittelwert mu8 innerhalb der Spezifikation liegen. Merke: Generell gilt, daB der Mittelwert bei 00s entscheidend ist. nicht die einzelnen Werte! j) ,,Bestmogliche Methodenabsicherung nach heutigem Standard?" Diese Frage ist in dieser Form aus prinzipiellen Grunden nicht zu beantworten. ,,Bestmoglich" hangt von Geld, Zeit, Wichtigkeit etc. ab, s. auch Kapitel 7. 2. ,,Was ist eigentlich Prazision . . .?'Die Erlauterung der einzelnen Validierungsparameter und deren Ermittlung finden sich ausfuhrlich in Abschnitt 3.3 bis 3.11.

a) ,,Der Korrelationskoeffizient r bzw. das BestimmtheitsmaB r2 sagen nichts uber die mathematische Verteilung aus. Welche Bedeutung hat r2?"

. . . genauso wenig uber die Empfindlichkeit des Verfahrens. Die Bedeutung des ,,BestimmtheitsmaB" ist lediglich die vergroaerte ,,Scharfe" des Indexes ( r = 0,9 entspricht r 2 = 0,8 I ) . b) ,,Ein F-Test sol1 entscheiden helfen, ob unabhangig voneinander berechnete Standardabweichungen s, und s2 aus zwei unterschiedlichen Grundgesamtheiten stammen. Dieser Test stellt somit nur ein ,,Vortest" auf Zuverllssigkeit des t-Testes dar. Inwieweit ist es aus mathematisch/statistischer Sicht zulassig, den F-Test z. B. auch mit a = 0,Ol durchzufuhren, bzw. zu einem anderen Signifikanzniveau als den t-Test'?" Die Signifikanzniveaus 90, 95, 99 und 99,9 % sind stellvertretend fur ,,zufiillige Abweichung"; ,,wahrscheinliche Abweichung, aber nicht signifikant"; ,,signifikante Abweichung" und ,,hochsignifikante Abweichung". Es macht keinen Sinn, bei Fund ?-Test unterschiedliche Signifikanzniveaus anzulegen. c ) ,,Bitte erlautern Sie die Begriffe ,,Kalibrierfunktion des Grundverfahrens" und ,,Reststandardabweichung der Wiederfindungsfunktion". ,,Unter dem Grundverfahren wird in der ,,Wasseranalytik" das Kalibrierungsverfahren des reinen Standards, d. h. ohne Matrixeinflusse und ohne besondere Bearbeitungsschritte verstanden. Es wird die Kalibrierfunktion des Grundverfahrens erhalten.

AnschlieBend werden Standardlosungen der neuen Analysenprozedur mit Matrixeinflussen unterworfen und die Signalhohe rnit der Grundfunktion berechnet. Es ergibt sich der ,,reale" Wert, der gegen den ,,theoretischen" Wert aufgetragen wird. Die Steigung der Wiederfindungsfunktion ist im Idealfall 1,00, der Ordinatenabschnitt a = 0, die Reststandardabweichung der Wiederfindungsfunktion entspricht dann der des ,,Grundverfahrens". Mit Hilfe der Reststandardabweichung der Wiederfindungsfunktion (= Verfahrensstandardabweichung, da Steigung b = 1) und des Grundverfahrens sol1 uber die Varianzen eine Varianzenhomogenitlt nachgewiesen werden. Bei (wahrscheinlichen) Abweichungen wird der Vertrauensbereich VB ( P = 9.5 %) errechnet. Es liegt dann eine konstant systematische Abweichung vor, wenn der Vertrauensbereich des Ordinatenabschnitts b den Wert 0 nicht mit einschlieBt. Es liegt eine proportional-systematische Abweichung vor, wenn der Vertrauensbereich der Steigung den Wert mit 1,0 nicht mit einschlieflt. d) ,,Der Mittelwert-Test (Zwei-Stichproben-t-Test) darf nur dann durchgefuhrt werden, wenn die Nullhypothese CT, = 0,nicht verworfen wurde. Eine Ausweichlosung, wenn der ,,normale t-Test" nicht angewandt werden kann (Nullhypothese fur F-Test verworfen, 0,# 02) ist der modifizierte Zwei-Stichproben-[-Test. 1st solch eine Vorgehensweise bei der statistischen Auswertung in der Pharmazie zulassig?" Das ist eine uralte Streitfrage. Grundsltzlich ist er ein akzeptables Verfahren. Sinnvoller ist es jedoch, sich rnit der Frage zu beschlftigen, warum der ,,normale t-Test" nicht anzuwenden ist: womoglich wegen schlechter Selektivitat. Also sollte letztere verbessert werden, um bei verbesserter Selektivitlt (und geringerer ,,Unrichtigkeit") vielleicht doch noch den ,,normalen [-Test'' anwenden zu konnen. e) ,,Wieviel MeBwerte xi sind fur Nimindestens zu bestimmen? Nach meiner Auffassung mind. fiinf." Vorschlag ICH fur die Prufung auf Richtigkeit aus Aufstockversuchen (Wiederfindung): Maximal 10 Serien mit jeweils SO Werten und 4 Mehrfachbestirnmungen Berechnung als prozentuale Wiederfindung (pro Serie): mittlere Wiederfindung mit 9.5 % Vertrauensbereich - Test des Mittelwertes gegen Sollwert 100 % Varianz, Standardabweichung und Variationskoeffizient - Ausreioertests nach DIXON oder GRUBBS - Test auf Normalverteilung nach DAVID - Trendtest (Test auf eine systematische Zu- oder Abnahme in der eingegebenen Rei henfolge).

4.2 Antworten auf die sieben wichtigsten Fragenkomplexe

2 11

f) ,,Es wird zu den einzelnen Ni eine unterschiedliche Anzahl n fur die MeBwerte xi bestimmt, also z. B. fur 80 %, n = 3 und fur 100 %, n = 7. W f e n hier eventuell fur das Gesamtergebnis Wichtungen vorzunehmen?"

1st durchaus denkbar und sinnvoll. Einen EinfluB auf den ,,gemittelten" Wert hat das Verfahren wahrscheinlich nicht, s. Abschnitt 3.7.2.7, jedoch auf den Vertrauensbereich VB ( N und n ) . Grundsatzlich uber t- und F-Test abgleichen. g) ,,Eine Voraussetzung zur Bestimmung der WFR ist die Signifikanzprufung der Verfahrensstandardabweichungder Kalibrierfunktion (zur Validierung eines Extraktes w f e das der Extrakt selbst) und die Reststandardabweichung der Wiederfindungsfunktion (Extrakt mit LS aufgestockt) notwendig. Diese diirfen sich im F-Test nicht signifikant voneinander unterscheiden. Wie werden diese beiden Standardabweichungen berechnet?" Ganz normal: Einmal s fur die Kalibrierfunktion und einmal fur die Wiederholfunktion.

2

PW=($

h) ,,Welche Verfahrenskenndaten sind grundsatzlich anzugeben und welchen statistischen Priifungen sind diese zu unterziehen? (Stichwort: Linearitatstest, Anpassungstest, Residualanalyse, AusreiBertest, Varianzhomogenitat, Absicherung der unteren Arbeitsbereichsgrenze)." Zunachst wird die Wiederfindungsfunktion durch Aufstockung verschiedener Konzentrationen ermittelt, z. B. durch ungewichtete lineare Regression. Ublicherweise werden dann folgende Angaben gemacht: - Anstieg und Ordinatenschnittpunkt mit 95 % Vertrauensbereichen

relative und absolute Verfahrensstandardabweichung, Korrelationskoeffizient - Test von Anstieg und Ordinatenschnittpunkt gegen Sollwerte (1 und 0) - graphische Darstellung der Werte, der Regressionsgeraden mit den Grenzen des 95 % oder 99 % Prognosebereiches, der Sensivitaten (SignaUKonzentration vs. Konzentration) mit individuell definierbaren Grenzen, der Residuen. -

i) ,,Im Bereich der Phytopharmazie werden zur Gehaltsbestimmung eines nativen Extraktes im Fertigarzneimittel haufig Leitsubstanzen (LS) gewiihlt. Da es aber keine

LS freie Extrakte gibt, ist nach meiner Auffassung die Bestimmung einer konstantaystematischen Abweichung nicht sinnvoll. Demzufolge ist und kann nur auf proportional-systematische Abweichung gepruft werden; d. h. die Steigung h = I mu8 im V Bmit P = 0,95 in zweiseitiger Fragestellung den Wert b = I einschlieBen. Bitte erliiutern Sie den Zusammenhang zwischen h und der WFR." Ihre Auffassung ist richtig: Wird f u r eine Untersuchung eine reale Matrix eingesetzt, die die zu bestimmenende Substanz bereits enthalt, so sind keine Aussagen hinsichtlich einer konstant-systematischen Abweichung mogl ich. Die WFR ermittelt sich aus der Steigung der ,,Wiederfindungsfunktion" und stellt einen Regressionswert (optimierter Wert) dar. Im Gegensatz dam, wird der Mittelwert ublicherweise bei drei Konzentrationsniveaus ermittelt.

j ) .,Sind Kalibrierfunktion und Analysenfunktion das gleiche?" Nein. Die Kalibrierfunktion wird dadurch ermittelt, daB ich fur Losungen bekannter Konzentrationen x die entsprechenden Signale erhalte. Und sie wird zur Analysenfunktion, wenn ich den aktuellen MeBwert meiner Probe in die Gleichung einsetze und somit das entsprechende Analysenergebnis i erhalte. Voraussetzung: Vollkommen gleiche experimentelle Bedingungen bei Kalibrierung und Analyse. k) ,,Nach gr6Bter Anstrengung habe ich so langsam die ,,Verfahrensstandardabweichung" verstanden. Nur, was bringt sie mir wirklich?" Beispiele: I . Sie vergleichen zwei Verfahren identischer Prazision, die Sie gerade kalibriert haben. Das Verfahren (oder als Variable auch Gerat, Detektor, Slule, Matrix usw.) mit der geringeren Verfahrensstandardabweichung ist das empfindlichere Verfahren. 2. Bei einer Gehaltsbestimmung der Hauptkomponente im 90 %-Bereich weisen die Verfahren A und B die gleiche Verfahrensstandardabweichung auf: A ist empfindlicher aber unpraziser, B ist praziser aber unempfindlicher. Verfahren B ist vorzuziehen. Die Forderungen an das Verfahren sind hier: Stabilitat, Prazision, Vergleichbarkeit der Ergebnisse und nicht - zu Lasten dieser! - bei einem Gehalt von 90 % eine gute Empfindlichkeit . 3. Mit Hilfe von Losungen eines Metaboliten im Ratten-Plasma wird eine ,,Kalibrierkurve" aufgenommen. 1st die Verfahrensstandardabweichung einer Kalibrierkurve mit der Matrix ,,Human Plasma" vergleichbar (F-Test bzw. t-Test fur die Zielkonzentration) mit der ersten Kalibrierkurve, kiinnen die Daten der ersten Kalibrierkurve zur Auswertung des zweiten Experiments verwendet werden.

I ) ,,Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze sind ggf. Anforderungen bei der Bestimmung von Restlosungsmitteln. DIN 32 645 gibt zwei Methoden, direkte und indirekte Methode (Leerwert- und Kalibriergeradenmethode) zur Berechnung der Grenzen an.

4.2 Antworten

iiuf

die sieben wichtigsten Frngenkotnplexe

2 13

Wonach richtet sich die verwendete Methode? Welche Verfahrenskenndaten sind zur Bewertung einer Methode grundsiitzlich anzugeben und welchen statistischen Prufungen sind diese zu unterziehen? Sind die in der DIN-Norm angegebenen ,,Schnellschatzungen" zur Uberprufung geeignet und geben sie eine hinreichende Aussagesicherheit?" Blindwertverfahren anwenden,wenn ein meBbarer Blindwert iiberhaupt vorliegt. Nachteil: Blindwertstreuung darf sich nicht von der MeBwertstreuung unterscheiden. Bei sehr schwachen Blindwerten sind MeBwertverfalschungen moglich. Sind die Blindwerte auch normalverteilt? Bitte, uberpriifen. Kalibrierverfahren anwenden, wenn eine Kalibrierung mit verdiinnten Kalibrierlosungen vorliegt. Es werden dabei Streuungen erfaBt, die real sind. Systematische Fehler durch schwache Blindwerte werden dadurch vermieden. Grundsatzlich ist dem Kalibrierverfahren Vorzug zu geben. Anzugebende Verfahrenskenndaten (Wasseranalytik) Kalibrierverfahren: Anzahl der Niveaus Arbeitsbereich Verfahrensstandardabweichung Signifi kanzniveau Abschatzung durch F- und t-Test bei Mehrfachbestimmung k-Wert (Erweiterungsfaktor) Blindwertverfahren: Anzahl der Blindwerte Standardabweichung Empfindlichkeit Signifi kanzniveau Wenn das Verhaltnis von errechneter Nachweisgrenze und hochstem Kalibrierwert den Faktor 10 nicht ubersteigt, wird Varianzhomogenitat angenommen. Nachweis- und Bestimmungsgrenze sind, mehr als die anderen Validierungselemente, Momentaufnahmen und stark vom System, wie auch von der Berechnungsmethode abhangig. Dies hat insbesondere Bedeutung beim Methodentransfer oder bei der Festlegung von Berichtsgrenzen fur Nebenprodukte. Aus diesem Grund sollte die Bestimmungsgrenze des Prufverfahrens unter Berucksichtigung der Anforderungen festgelegt werden. Sie muB mind. 3 Standardabweichungen von der Akzeptanzgrenze entfemt liegen, um eine zuverlassige Quantifizierung zu ermoglichen (Methodenfahigkeit). Als Richtwert (und um die groBere Variabilitat der Streuung in diesem Konzentrationsbereich zu beriicksichtigen) kann die Bestimmungsgrenze auch auf 50 % der Akzeptanzgrenze gesetzt werden, d. h. bei einer Begrenzung des Nebenproduktes auf 0,l ?h sollte die Bestimmungsgrenze mind. 0,05 % betragen. Im Rahmen der Validierung wird dann mit einem der beschriebenen Verfahren uberpruft, oh diese Bestimmungsgrenze zuverlassig eingehalten werden kann. Die Verfahrenskenndaten nach dem Schnelltestverfahren wurden friiher sehr haufig ermittelt, als noch keine brauchbaren Rechenvorschriften fur bestimmte

Iterationsverfahren vorhanden waren. Heute werden sie uberwiegend aus historischen Grunden und zur Vergleichbarkeit zu alten Verfahren durchgefuhrt. Nach den gemachten Erfahrungen unterscheiden sich die Werte nicht grundsltzlich (F-lr-Test) und sind bei der Unschlrfe des Systems durchaus brauchbar. m) ,,Die Durchfuhrung analytischer Validierung mittels Aufstockmethode (Wiederfindungsrate = WFR) zur Belegung der Richtigkeit ist i. a. die Methode der Wahl. I . Die Anzahl der Kalibrierproben wird in der Literatur mit N = 5 angegeben. Die RDN. 903 fordert in der Regel N = 3 (80 %, 100 %, 120 5%). 1st N = 3 noch als ausreichend anzusehen? 2. Zur Bestimrnung der WFR werden die aus denjeweiligen Ni (80 %,90 %, I00 %, I I0 %, I20 %) erhaltenen Mittelwerte X zu einen gemeinsamen x-quer zusammengefaRt. Es ist jedoch bekannt, daB Mittelwerte X weniger streuen als Meljwerte x. Mittelwerte konnen auch dann (nlherungsweise) normalverteilt sein, wenn Meljwerte nicht norrnalverteilt sind (Zentraler Grenzwertsatz). In der Praxis sind dann unabhangig von der Verteilung der MeBwerte Mittelwerte aus Stichproben vom Umfang n > 5 (annihernd) normalverteilt. Muljte nicht zu jedem Ni (80 %, 90 %, 100 %, 1 10 %, 120 %) Normalverteilung nachgewiesen werden? Unter welchen statistischen Voraussetzungen ist es zuIissig, die einzelnen Mittelwerte zusammenzufassen und dann diesen Mittelwert ein V B in zweiseitiger Fragestellung ( P = 0,95) zu berechnen? 3. Wie groB mu13 die Anzahl an Beobachtungen mind. sein, um Normalverteilung voraussetzen zu konnen?" Die Richtigkeit eines analytischen Verfahrens druckt die Ubereinstimmung zwischen dem gefundenen Wert und einem entweder konventionell als wahr akzeptierten Wert oder einem akzeptierten Referenzwert aus. Mangelnde Ubereinstimmung ist ein Hinweis auf systematische Fehler. ICH-Richtlinien: Die Richtigkeit kann geschluBfolgert werden aus den Validierungselementen Spezifitlt, Linearitlt und Prlzision. Bei quantitativen Prozeduren sollten als Minimun neun Bestimmungen uber mindesten drei Konzentrationsniveaus des gesamten Arbeitsbereicher (z. B. 3 x 3) durchgefuhrt werden. Die Ergebnisse werden als Prozent Wiederfindung oder als Differenz zwischen dem Mittelwert und dem Referenzwert sowie den Vertrauensbereichen berichtet. quantitative Richtigkeitsbelege: Arzneistoff I Vergleich der Ergebnisse mit einem etablierten, unabhlngigen Verfahren I I Anwendung des Prufverfahrens auf ein Referenzmaterial Arzneiform I Vergleich der Ergebnisse mit einem etablierten, unabhangigen Verfahren I1 Anwendung des Prufverfahrens auf eine synthetische Mischung aller Komponenten 111 Aufstockung von Analyt zur Arzneiform

4.2 Antworten uujdie sieben wichtigsten Frugenkomplexe

2 15

Nebenprodukte (quantitativ) I Vergleich der Ergebnisse mit einem etablierten, unabhangigen Verfahren II Aufstockung von Nebenprodukt zu Arzneistoff oder -form. Prozedur I. und 11. ist generell einsetzbar, stofit jedoch bei neuen Arzneimitteln naturgemafl auf Grenzen, ebenso II. bei neuen Arzneistoffen. Zu 1: Die hier erwahnte Literatur ist Standard in der ,,Wasseranalytik". Das Verfahren RDN 903 bezieht sich auch Pharmaka. Bei quantitativen Prozeduren sollten nach ICH als Minimum neun Bestimmungen uber mind. drei Konzentrationsniveaus des gesamten Arbeitsbereiches (z. B. 3 x 3) durchgefuhrt werden. Nach den Erfahrungen in der Pharma reicht das aus. Zu 2: Im Prinzip schon. Jedoch kann in der Regel bei der Pharmaanalytik Normalverteilung angenommen werden. Problematisch ist die Priifung auf Normalverteilung bei n = 5. Zulassig ist die Zusammenfassung, wenn die Mittelwerte keine signifikanten Unterschiede (F-/&Test)aufweisen. Zu 3: Realer Nachweis der Normalverteilungje nach Matrix ah etwa 20-15 Tests. ICH schllgt 6 MeBwerte vor.

3. Die Zeitknappheit ,,Moglichkeit der Verkiirzung der Validierung wegen Zeitmangel" ,,Welche ist die kurzeste Vorgehensweise?" ,,Wie fuhre ich eine Validierung durch, wenn ich wenig Zeit zur Verfugung habe?" Dem Problem ,,Zeit" kann man wie folgt begegnen:

- Einen Teil der Validierungsarbeit (Selektivitat, Robustheit) moglichst bei der

Methodenentwicklung mit abdecken

- Validierungsumfang uberdenken und folgende oder ahnliche Fragen stellen: -

-

-

Warum brauche ich diese Kenntnis wirklich? Warum brauche ich 10 statt 6 Werte? Brauche ich fur den ganzen Konzentrationsbereich eine Dreifach-Bestimmung? Warum wird die Nachweisgrenze sowohl nach dem PeaWRausch-Verhiltnis als auch nach dem Blindwertverfahren ermittelt? Sehr wichtig: Der Kalibrier- und damit auch der Zeitaufwand kann mit Hilfe der SPC auf ein Minimum reduziert werden. Methoden vereinheitlichen und Parallelvalidierungen durchfuhren. Bei ,,unwichtigen", einfachen Methoden Schnelltests durchfuhren, gefolgt von Plausibilitatsuberlegungen oder Schatzen der MeBunsicherheit. Wenn Referenzmaterialien vorhanden sind, stets Ergebnisvalidierung anstreben.

4. Behordliche/rechtliche Anforderungen a) ,,Wie vie1 mu8 ich bei einer ,,offiziellen" Methode wie 5 35 LMBG, DAB; DIN usw. validieren?"

Uberhaupt nicht, diese gelten als validiert. Bei Erstanwendung empfiehlt sich jedoch in .jedem Fall, die Anwendbarkeit im eigenen Labor xu uberprufen. Vorausgesetzt wird naturlich. dafi das Labor die Methodik beherrscht. b) ,,GMP-Validierung" Es gibt keine ,,GMP- oder GLP-VulidirnrnX".Wenn Sie in einer GMP-Umgebung arbeiten, mussen Sie laut ,,Regelung der Arzneimittel in der Europiiischen Gemeinschaft", Band IV, S. 56, bei der Priifung ,,validierte analytische Methoden" einsetZen. Wie die Validierung erfolgen soll, entscheiden Sie - jedenfalls h u t GMP. Die Amerikaner sind etwas restriktiver - jedoch mit positiver Tendenz. Im .,Federal Register" (vergleichbar mit dem Bundesgesetzblatt) wurde 1996 ein Vorschlag der FDA abgedruckt mit folgender Forderung fur Qualitiitskontrollabors, die mit cGMP arbeiten, an die Methodenvalidierung: Richtigkeit, Empf'indlichkeit, Spezifitiit und Vergleichbarkeit. c) ,,Validierung - wieviel ist notig, wenn ich vor der Akkreditierung stehe?"

Empfehlung: Uberlegen Sie sich einen Minimalumfang, der aus analytischer Sicht sinnvoll erscheint, wobei es okonomischer ist, Verfahren statt einzelne Methoden zu validieren: z. B. ..Nitrosamine mittels HPLC" statt ,,Nitrosodiethylamin in Haarshampoo". Der endgultige Umfang und Modus sollte beim Vorgesprach mit dem Begutachter der Akkreditierstelle geklart werden, wobei es hier grol3e Unterschiede geben kann, sowohl personenabhangig als auch abhangig von der Philosophie der Akkreditierstelle. d) ,,Welches Gesetz, welche DIN-Kommission, beschiiftigt sich mit dem Thema Validierung?" Validierung ist - z. B. anders als die GLP - kein Geset?! Merke: IS0 und DIN sind ,,Richtlinien", d. h. sie haben einen Empfehlungscharakter. Somit existieren keine branchenubergreifenden, umfassenden und akzeptierte Regelungen und Vorschriften. Das ,,Offiziellste" bezuglich Validierung sind die ISODefinitionen aus den Jahren I994 und 2000, siehe Abschnitt 1.2.1, und die Empfehlungen der Europiiischen Kommission, z. B. Nr. L214/18, Richtlinie 96/46/EG der Kommission vom 16.07.1996 oder DOC 8064/V1/97 rev. 1 vom 09.04.98. Dennoch existieren in den meisten Branchen Richtlinien, die faktisch als bindend und zwingend anzusehen sind, z. B. ,,Erliiuterungen zu Antrag auf Zulassung eines Arzneimittels beim BfArM" 1996. oder Pharmabetriebsverordnugn $ 6 (,,Analyse von Arzneimitteln") oder RichtlinienEmpfehlungen von Akkreditierstellen und FDA. Fur alle ,,Prtif- und Kalibrierlaboratorien" sind die Ausfiihrungen der IS0 17025 mafigebend.

4.2 Antworten aufdie sieben wichtigsterz Frqgenkomplexe

2 17

e) ,,Bis jetzt haben wir keine Validierung gebraucht, aber wir schreiben jetzt ein QMHandbuch. Mussen wir vor Einfuhrung eines QM-Systems unsere Methoden validieren und wenn ja, wie?" Auf die I S 0 17025, GLP und GMP wurde weiter oben eingegangen. In der I S 0 9001 ist die Rede von Designvalidierung (,,urn sichzustellen, daB das Produkt festgelegte Erfordernisse des Kunden erfullt"). Diese bezieht sich auf das Produkt, wobei das ,,Produkt" naturlich eine Dienstleistung sein kann. Bezuglich der Analytik ist bei der I S 0 9001 nur die Rede von der Priifmitteluberwachung (,,bekannte MeBunsicherheit der Priifmittel, die rnit der betreffenden Forderung vereinbar ist"), sowie von der Kalibrierung und Justierung mit zertifizierten Mitteln. Also wird die Validierung im klassischen Sinne von der IS0 9001 expressis verbis nicht gefordert. Fazit: Validierte Methoden in der Analytik werden im geregelten Bereich von der GMP, im ungeregelten Bereich von der Akkreditierung sowie bei der Zulassung eines Arzneimittels gefordert. Nach IS0 17025 sollen in Priif- und Kalibrierlaboratorien alle eingesetzten Verfahren (bis auf Normverfahren) validiert sein. f) ,,Validierung von Analysenmethoden, die geeignet sind, die Zulassung bei der EU bzw. FDA zu erlangen - Unterschiede?"

Ja, naturlich ist die Zielsetzung bei der Validierung in USA und Europa im Prinzip gleich, dennoch gibt es Unterschiede - sowohl inhaltlicher Natur als auch was prinzipielle Auffassungen betrifft. Dazu drei Beispiele: - Sulfatasche: USP: 80OOC und H2S04cone, EuroPharm: 6OO0C und 10 % H2S0, - Euro.Pharm: Gehaltsbestimmung rnit moglichst spezifischen Methoden wie HPLC - FDA: Gehaltsbestimmung rnit rnoglichst unspezifischen Methoden wie UV, Titration Folglich hat die Validierung nach unterschiedlicher Gewichtung zu erfolgen. Dennoch schreitet die Harmonisierung, ein Produkt der Globalisierung, rasch voran. In USA werden generell ,,wasserdichte", allgemeingultige Einheitskonzepte angestrebt, rnit denen ,jeder" arbeiten konnen sollte. In Europa wird eher einer Differenzierung nach analytischen Gesichtspunkten der Vorzug gegeben. 5. Hilfen, Infos

a) ,,Mu13 ich das Gerat validieren oder kann das der Hersteller im Rahmen eines Wartungsvertrages tun?" Ein Gerat wird nicht validiert, sondern qualifiziert, d. h. es wird auf Einhaltung der rnit dem Hersteller vertraglich vereinbarten angegebenen Spezifikationen uberpruft. Und das sollte in der Tat der Hersteller tun, ob bei der Erstinstallation (IQ, OQ),

2 18

4 Hiiufige Frqen :ur Validiclrung

siehe Abschnitt 2.3 oder aber bei der -jedenfalls im pharmazeutisch/medizinischen Bereich - ublichen, alljiihrlichen Geriteuberprufung. Die Validierung - Eignung fur einen .vp~irllrn Gebrauch - ist eine Sache des Anwenders, der ubrigens vor dem Gesetz fur die Analysenergebnisse haftet. b) ,,Kann ich gegen Aufpreis ein validiertes Gerlt kaufen?" Nein. Es gibt kein validiertes Gerat. Merkr Validierung ist keine einmal erlangte und dann immer wlhrende Absolution. Was man machen kann und auch unbedingt sollte, ist fur die Qualifizierung des Gerates zu sorgen, und dies bereits bei den Kaufverhandlungen festlegen. Was man wohl von auBen als Dienstleistung kaufen kann ist die Durchfiihrung einer Validierung. c ) ,,Softwarevulidierung

-

wie machen das die anderen?"

Vermutlich gar nicht. Die Validierung einer Software 1st nicht trivial, siehe dazu Abschnitt 6.5 und ,,Literatur", Abschnitt A. 10. Die folgenden Empfehlungen sind fur Leser bestimmt, die sich nicht exzellent mit source codes, Algorithmenzyklen etc. auskennen, aber auf pragmatische Art und Weise zu einem etwas sichereren ,,Gefuhl" kommen mochten: - Versuchen Sie durch extreme aber praxisrelevante Operationen den Rechner zum ,,Absturz" zu bringen. Installieren Sie die Software an zwei moglichst unterschiedlichen Rechnern (Hardware, Peripherie, Konfiguration, usw.) und uberprufen Sie, ob Sie bei zwei, drei moglichst unterschiedlichen Anwendungen die gleichen Resultate erhalten. - Fuhren Sie einige typische Rechenoperationen zusatzlich mit externen Programmen durch (Taschenrechner, EXCEL) und vergleichen Sie die Ergebnisse. - Der Hersteller sol1 Ihnen nachweisen, ob, wie und von wem die Software validiert wurde, siehe auch ,,Robustheit" in Abschnitt 3.5.2.3. d) ,,Wir bekommen immer wieder validierte Methoden aus ... . Wie kann ich beurteilen, ob die ihren Job richtig machen?" Das ist in der Tat eine auBerst schwierige und brisante Frage . . . Haben Sie eine reale Chance fur eine Einsichtnahme in der Validierungsdokumentation? Wenn nicht, versuchen Sie sich so viele Informationen uber die Methode und die Probe zu verschaffen, daB Sie die kritischen Punkte der Methode fur sich ausfindig machen konnen und uberprufen Sie anschlieBend, ob und wie grundlich diese Punkte in der besagten Methode berucksichtigt wurden. Als zweiten Schritt erstellen Sie einen Fragekatalog, in dem etwa folgende Fragen enthalten sein konnen:

4.2 Antworten uuf die sieben wichtigsten Frugenkomplexe Die Frage

.. .

- Wer fiihrte die Validierung aus?

2 19

... und die Info - Qualifikation des Validierers?

-

Wo fand sie statt?

-

Qualifikation der Einrichtung?

-

Wann erfolgte die Validierung?

-

-

Was wurde genau analysiert?

-

Nur Standards oder reale Proben mit Matrix, mit welcher Matrix, nur mit einer Matrix, nur bei zwei Konzentrationsniveaus? usw.

-

Wie wurde validiert?

-

Genaue Beschreibung der Methode angegeben?

-

Wurden nur Zahlen ermittelt oder wurde auch kommentiert?

-

Wurde an einem Tag griindlich validiert oder ist auch bekannt wie stabil tatsachlich der AnalysenprozeR ist?

Die Sensibilitat z. B. fur Robustheit war in den 70er und 80er Jahren nicht so hoch wie heute.

-

Welches Gerat wurde verwendet?

-

1st das Design geeignet?

-

Welche Rohdaten wurden mitgeliefert?

-

Ein Chromatogramm sagt mehr als 5 Seiten Beschreibung

-

Bei Zweifeln konnen mit den Rohdaten nachtraglich statistische Tests durchgefuhrt werden

-

Audits auf dem kurzen ,,Dienstweg" geben einen Hinweis auf das Qualitatsverstandnis eines Labors.

-

Wurde - und wenn ja von wem - das Ergebnis auf Plausibilitat uberpruft?

e) ,,Wer kann mir auaer meinem Chef beim Validieren helfen, gibt es Validierungsprogramme dazu?" Externe Berater ubernehmen Validierungsarbeiten in Form von Dienstleistungen. - Eine Reihe von Herstellern stellen kostenios Unterlagen oder sogar SOP'S zur ,,Validierung" Ihrer Produkte. Auch hier handelt es sich urn VerifizierungedQualifizierung, dennoch sind diese z. T. ausgezeichneten Unterlagen hilfreich. - Viele Organisationen, wie DACH, FDA usw. offerieren ausfuhrliche Unterlagen uber Validierung, siehe Abschnitt A.8 bis A. 10. - In der Zwischenzeit haben fast alle groaen Instrumentenanbieter in ihre Auswertesoftware Validierungsmodule eingebaut, mit denen man die ublichen statistischen Operationen (Standardabweichung, &Test, Linearitat, Bestimmungsgrenze usw.) durchfuhren kann. Daneben gibt es Validierungssoftwareprogramme, siehe dazu Abschnitt A.7.

-

6. Validierungsumfang als Funktion von Methode, Ziel ,,Urnfang der Validierung unter Berucksichtigung der Prufmethoden?" ,.Wann kann ich den Validierungsanspruch mindern - keine medizinische-, pharmueutische-, Lebensmitteluntersuchungen?" ,,Was ist bei der Validierung der verschiedenen Analysenmethoden zu beachten bzw. unterschiedlich?" Diese Fragen werden in Kapitel 7 behandelt. 7. Sonstiges a) Grund fur 6 Werte bei der Berechnung von V,? Das ist eine Konvention; es herrscht die allgemeine Meinung vor, da13 mit mindestens 6 Werten statistische Berechnungen zu vertreten sind. Ab einer Zahl von etwa ,,gewonnene Information" unverhaltnismll3ig, denn der t-Wert aus 7 wird der Term Aufwand der t-Tabelle lndert sich wenig. Selbstverstandlich gibt es auch andere Empfehlungen: mindestens 5 ICH (USA, EU, Japan): NATA (Australien): 7 DIN 38402 Teil S I : 10 b) ,,Was gehort alles in die Dokumentation?" ,,Dokumentation - was mu13 wie beschrieben werden?'

Die Frage nach dem Dokumentationsurnfang kann nicht generell beantwortet werden. In einem GLP-Labor beispielsweise mu6 im Prinzip aul3er Vorversuchen d l les" dokumentiert und archiviert werden. Auch in nicht reglementierten Bereichen existieren bezuglich Dokumentation meist recht konkrete Vorstellungen. 1st dies nicht der Fall, sollte imVorfeld mit dem Kunden abgeklart werden, welche Daten er wirklich im Validierungsbericht braucht. In jedem Falle empfiehlt sich fur den Validierungsbericht die Visualisierung der Ergebnisse (Chromatogramme, Regressionsgeraden, Kontrollkarten), der Hinweis auf kritische Punkte der Methode sowie eine Kommentierung und schliel3lich eine Aussage/Stellungnahme uber Eignungl Fahigkeit der Methode, siehe auch Abschnitt 2. Dazu I S 0 17025: ,,Das Laboratorium mu13 . . . festlegen, ob das Verfahren fur den beabsichtigten Gebrauch geeignet ist." c ) ,,Wie gelange ich von Validierung zur Zertifizierung einer Methode?'' Anmerkung: Zertifizierung wird hier im Sinne von Evaluierung, Charakterisierung, Beurteilung einer Methode verstanden. Die im Rahmen der Validierung erzeugten Daten werden fur eine kritische Beurteilung der Methode herangezogen. Fur eine ganzheitliche Beurteilung mussen auch die Faktoren Zeit, Kosten, Schwierigkeitsgrad, Geflhrdung usw. berucksichtigt werden.

4.2 Antworten uufdie sieben wichtigsten Frugenkomplexe

22 1

d) ,,Validierung von selbstentwickelten Methoden?" Detinieren Sie welche Schritte kritisch sind und untersuchen Sie diese besonders griindlich. Wenn zwei Anwender an zwei unterschiedlichen Tage zu ahnlichen Ergebnissen kommen, dann sieht es ,,gut" aus. Dazu mu13 man vorher definieren, welche Abweichungen akzeptabel sind. Wenn schlieBlich ein Dritter mit einer unabhangigen Methode die Ergebnisse bestatigt, so liefert die Methode vermutlich richtige, robuste und prPzise Ergebnisse. e) ,,In welchem Umfang kann eine Validierung des Gesamtsystems mit Standards und Qualitatskontrollen die Validierung bzw. Uberpriifung einzelner Komponenten ersetzen?" Voll und ganz.

Handbuch Validierung in der Analytik Stavros Kromidas Copvriaht 0 2000 WILEY-VCH Verlaa GmbH

5

Haufige Fehler bei der Validierung analy ti scher Methoden

Bei der Besprechung der einzelnen Validierungselemente wurde bereits auf kritische Punkte hingewiesen. Hier erfolgt eine Zusammenfassung von typischen Fehlern. Diese stellt eine Auswahl dar und sollte nicht als vollstandige Fehlersammlung verstanden werden. Die moglichen Fehler konnen in zwei Kategorien eingeteilt werden. 1. Allgemeine Fehler und Interpretationsfehler 2. Fehler im Zusammenhang mit der praktischen Durchfuhrung der Validierung

5.1

Allgemeine Fehler und Interpretationsfehler

a) Es wird mit dem Kunden nicht genau geklart, was rnit dem Auftrag ,,Methodenvalidierung" beabsichtigt wird. z. B. - Braucht der Kunde nur einen ,,Persilschein" oder geht es tatsachlich um Uberpriifung der Eignung einer Methode? - Wie prazise mussen die Ergebnisse wirklich sein und warum eigentlich? - 1st es eine einmalige Fragestellung oder ist mit einem langeren Lebenszyklus der Methode zu rechnen? b) Man beschaftigt sich sehr intensiv rnit der Priifung oder sogar ausschlieljlich rnit dem Meljvorgang selbst und laljt evtl. kritische Schritte der Methode auBer Acht. z. B. - Handelt es sich um eine reprasentative Probe? - Wurde die Apparatur vor der Messung kalibriert? - 1st der Einflulj der Probenahme, des -transports, des -behaltnisses, der -lagerung, der -matrix, der -konzentration usw. auf die Stabilitat bekannt? - Beirn Methodenvergleich wird auf die gleiche Matrix, gleiche Konzentration, gleiche Anzahl von Meljwerten usw. geachtet, aber es wird manchmal ubersehen, dalj die Probenvorbereitung fur die zwei Methoden vielleicht unterschiedlich ist. c) Es wird zu wenig oder zu vie1 validiert. z. B. Zu wenig: Lediglich 6-fach-Bestimmung eines Standards und Aufnahme einer Regressionsgerade.

Zu viel: Ein ,,Validierungskatalog" wird stur abgearbeitet. Zu dieser Problematik siehe auch Abschnitt 1.4. 1st ein ProzeR in statistischer Kontrolle (ISK), sollte nicht zu oft kalibriert werden. Das ist nicht nur nicht notig, vielmehr besteht die Gefahr der Uberjustierung. In einem ISK-ProzeR wird durch das Kalibrieren zusatzliche Variabilitiit (= Fehler) von auRen eingefuhrt, die Streuung der einLelnen Werte nimmt 7.u! d) Nach der Erzeugung von Zahlen fehlt das eigentliche Ziel bei einer Validierung, nlmlich eine kommentierte Aussage des Durchfuhrenden, ,,Die Methode ist geeignevist nicht geeignet". e) Anwender, die mit der Methode nicht ausreichend vertraut sind, fuhren Validierungen durch - oft sogar ,.nebenbei" oder umgekehrt: Ein Fachmandeine Fachfrau fuhrt eine Validierung durch. ,,Trivialitaten" erscheinen nicht im Validierungsbericht oder in der SOP. AnschlieBend wenden weniger erfahrene Anwender die Methode in der Routine an. Es ist eine Frage der Zeit, wann die ersten Schwierigkeiten auftreten. f) Der Faktor ,,Zeit" wird nicht gebuhrend bedacht. Dazu zwei Aspekte: Validierung ist eine Momentaufnahme, meist sogar mit einer besonderen Sorgfalt durchgefuhrt. Was jedoch wirklich wichtig ist, ist die Frage nach der Eignung unter Praxisbedingungen und nicht die Ermittlung von ,.Sonntagswei-ten". Also gilt es, die Validierung unter realen Bedingungen durchzufuhren. Alle Faktoren, die das Ergebnis beeinflussen konnen, mussen im Rahmen der Validierung die ,,Chance" bekommen, auf das Ergebnis einzuwirken, denn genau dieses AusmaR gibt Auskunft, ob eine Methode geeignet ist oder nicht. Geschieht es nicht, haben wir die haufige Situation, daB die Standardabweichung in der Routine vielleicht den zweifachen Wert oder mehr aufweist als bei der Validierung ermittelt. Auch fuhrt dies zu haufigen Klagen der Routineanwender im Betrieb iiber die Kollegen in der Analytik, die die Methode entwickelt und validiert haben. Das heiOt fur die Praxis folgendes: Es gilt zu uberlegen, ob der Schwerpunkt bei der Durchfuhrung einer griindlichen Validierung i n einer kurzen Zeit liegen sol1 oder ob es vielleicht besser ist, den EinfluB der Zeit auf den ProzeB zu untersuchen. Denn wenn die Variabilitat von Tag zu Tag wegen allerlei Einflussen griikier ist als die Variabilitlt innerhalb eines Tages - und das ist meist der Fall - fragt man sich, wozu man den Aufwand betreiben sol1 und eine grundliche Validierung an darauffolgenden Tagen durchfuhren soll? Die Verfolgung der Werte uber einen Iangeren Zeitraum mittels einer Regelkarte bringt sicherlich mehr Informationen. Solche Beispiele gibt es zur Genuge. Diese Schwache der Validierung, namlich die Stabilitat eines Prozesses zu reflektieren, ist erkannt worden. Die FDA spricht bereits von der ,,validation at the time of use" und von ,,real time validation". Das alles fuhrt zu folgender These - wobei dies insofern mehr als eine These ist als bereits mehrfach deren Gultigkeit bewiesen wurde: in dem MaBe wie es gelingt, einen ISK-ProzeB zu installieren, im gleichen MaBe nimmt nicht nur der Validierungs - sondern selbst der Analysenbedarf ab, siehe Abb. 5- 1. Es herrscht in vielen Labors die Meinung, mit dem Mittelwert und der Standardabweichung sei die Streuung von Werten zu beschreiben - solange es sich um eine

5. I Allgemeine Fehler und Interpretutionsjehler

4

225

\

Validierungs- und Analysenbedarf

"wenig"

"viel"

Abb. 5-1 Abhangigkeit des Validierungs- und Analysenbedarfs von der Stabilitat d. h. von der Robustheit eines Prozesses (schematisch).

Normalverteilung handelt. Statistisch gesehen ist dies richtig, sobald Zahlen allerdings naturliche Prozesse beschreiben, ist der Parameter Zeit evident, denn wir mussen bei naturlichen Prozessen oft mit einer Schiefe rechnen. 3(X-X") Schiefe =

mit:

x Mittelwert

x" Median s

Standardabweichung

Zwei Prozesse mit gleichem Mittelwert und gleicher Standardabweichung konnen von recht unterschiedlicher Qualitat sein! Das ist in Abb. 5-2 bis 5-4demonstriert [63]. Zwei Verteilungen A und B werden bei vollig identischem Mittelwert X = 83,14 und vollig identischer Standardabweichung, s = 3,34 durch die gleiche GauBkurve (Abb. 5-2) beschrieben. Das bedeutet allerdings nur, dal3 links und rechts vom gleichen Mittelwert (-3 s und +3 s Bereich) sich die gleiche Anzahl von Werten befinden! Abbbildungen 5-3 und 5-4 zeigen die jeweilige Regelkarte. Abgebildet sind die Werte und der dazugehorige Zeitpunkt bei deren Ermittlung. Die zwei Prozesse (Methoden) sind schwerlich als gleichwertig zu bezeichnen - obwohl der Mittelwert und die Standardabweichung gleich sind. Ob ein ProzeB in der Routine in statistischer Kontrolle (ISK) ist oder nicht (leichte Verschiebung des Mittelwertes, Alterung von Reagenzien und Instrumenten, keine Normalverteilung usw.), kann erst durch das Fuhren von Regelkarten erkannt werden. Und gerade die Kenntnis ist ja wichtig, ob ein ProzeB stabil ist. Aktuelle Zahlen zeigen nur einen Ausschnitt der Wahrheit.

226

5 Hiiufige Fehler hei der Vdidierung anulytischer Methoden A

\I B

Abb. 5-2 Gauss-Kurven von Werten, die mit zwei Methoden A und B crmittelt wurden. Die Mittelwerte und die Standardabweichung sind identisch [65].

Mes wert

I I I I I I I I I I I I I I Abb. 5-3 Regelkarte der Werte nach Mcthode A [5X].

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I Abb. 5-4 Regelkarte der Wcrte nach Methode B

[%I.

5.I Allgerneine Fehler und Interpretutionsfehler

227

Dazu folgender Fall: Einmal im Monat wird eine Kontrollprobe sechs ma1 vermessen und der V , berechnet. Bei einem V , < 0,3 % wird die Aussage gemacht: ,,Methode plus Gerat sind in Ordnung, alles bestens". Die SchluBfolgerung ist in dieser Form nicht zulassig. Obiges Ergebnis sagt lediglich aus, daB fur den wahrscheinlich kurzen Zeitraum von 1 oder 2 Stunden MeBzeit die Streuung der Werte gering ist, sonst nichts. Eine Regelkarte jedoch uber einen langeren Zeitraum wurde mehr Informationen liefern: Werden vielleicht im betreffenden Zeitraum verschiedene Mehiveaus, Trends, AusreiBer, zeitabhangige Streuungen usw. beobachtet?

g) Allzu groBe Bereitschaft zur Ubernahme von Geratespezifikationen oder Prazisionsdaten aus Herstellerangaben. Diese Zahlen haben etwas mit derverifizierung zu tun, d. h., mit allgemeinen Forderungen und nicht mit der Validierung. Letztere bezieht sich auf diese Probe und den Komponenten x, y ... in dieser Konzentration, in dieser Matrix usw. h) Keine allgemein akzeptierte bzw. durchgesetzte Nomenklatur, die Begriffe werden teilweise uneinheitlich benutzt. Z. B. - ,,Genauigkeit" gleich ,,Richtigkeit" Genauigkeit: Abstand eines einzigen MeBwertes vom richtigen Wert, zufallige plus systematische Fehler. Richtigkeit: Abstand des Mittelwertes vom richtigen Wert (systematische Fehler), siehe Abb. 3- 1. - Der Inhalt des Begriffes ,,Reproduzierbarkeit" (Vergleichbarkeit) wird im Laboralltag fur ,,Wiederholbarkeit" benutzt: ,,Die Retentionszeit war reproduzierbar". - ,,Erfassungsgrenze" in DIN 55350, Teil34, entspricht der ,,Nachweisgrenze" in DIN 32645. Erfassungsgrenze in DIN 32645 entspricht dem ,,Erfassungsvermogen" in DIN 55350, Teil 34. i) Keine kritische Betrachtung der ermittelten Zahlen, bzw. die Aussagekraft von Zahlen wird unter- oder uberbewertet. Beispiele

- Aus einem Validierungsbericht: . . . ,,Es wurde durch Bestimmung auf Konzentrationsniveaus im Bereich zwischen 0,Ol % und 0,2 % die Linearitat nachgewiesen. Der

gultige Arbeitsbereich lautet: 0,Ol % - 0,2 %. Aus den Daten zur Bestimmung der Linearitat wurde die Nachweis- und Bestimmungsgrenze errechnet. Es ergab sich (P = 95 %) ein Wert von 0,02 % als Nachweisgrenze und ein Wert von 0,04 % als Bestimmungsgrenze ..." Fehlerhafte Aussage! Hier wurden MeBwerte auBerhalb des Arbeitsbereiches ermittelt; quantitative Angaben unterhalb der Bestimmungsgrenze sind nicht erlaubt, siehe auch Abschnitt 3.9. Der gultige Arbeitsbereich lautet richtig: 0,04 % - 0,2 %.

-

Die Spezifikationsgren7en fur den Gehalt cine\ Inhalts5toffej lauten 99 % - 100 %. 30 Routinebehmmungen ergaben folgende Werte. Mittelwert: 99,61 Standardabweichung: 0,23

Alles bestens'? Naturlich nicht, denn die Streubreite der Methode ist zu groB. Die Streubreite betragt Ki s, d. h., 6 . s = 6 . 0,23 = 1,38. Die Streubreite ist um 0,323 griifier als die Spezifikationsbreite von 1 76. Die Konsequenz aus dieser Tatsache heifit zweierlei: Die hohe Streuung der Analysenmethode wird erstens zwangslaufig zu berechtigten Reklamationen fuhren, da ein Analysenwert zwar innerhalb der Spezifikation liegt, die wirkliche Konzentration jedoch moglicherweise aul3erhalb der Spezifikationsgrenzen. Gleichzeitig besteht zweitens ein erhiihtes Risiko, wenn ein Analysenwert auRerhalb der Spezifikationsgrenze liegt, wobei die wirkliche Konzentration innerhalb der Spezitikationsgrenzen liegt. In diesen Fallen werden zusatzliche Kosten anfallen, die Ware zu verbessern, wobei dies gar nicht notig war. Eine Uberarbeitung dieser Methode wiire dringend von Niiten. Aus dem gleichem Grunde muR eine Methode zur Gehaltsbestimmung eines Wirkstoffs mit der Spezifikation 98 % - 102 % und einer Standardabweichung von .s = 0,7 als nicht geeignet bezeichnet werden. 6 . s = 6 . 0,7 = 4,2; Die Streubreite von 4,2 ist gr6Rer als die erlaubten 4 %. Die Prlzision der Methode mul3te aufeinen Wert .s kleiner +3 s verbessert werden 6 s < 4, das heifit s 2 0.65.

Beg rundung Werte konnen streuen. Eine Streuung von k 3 s um den Mittelwert wird allgemein akzeptiert. Dieser Bereich entspricht nach Gauss einer Wahrscheinlichkeit von 99,73 %, daR eben ein x-beliebig gemessener Wert dort anzutreffen ist. Diese Streuung ist die Streuung der Werte, die durch diese Methode ermittelt werden, stellt somit ein Charakteristikum der Methode dar. Wir unterhalten uns also im Moment uber das Validierungselement .,Prlzision". ein Ma13 dafur ist die Standardabweichung. Diese durch die Methode hervorgerufene Streuung muO nun kleiner sein als die durch die Spezifikation vorgegebene, in unserem Beispiel 4 %. Das ist dann der Fall, wenn s gleich oder kleiner (A65 ist: 6 . 0,65 = 3.9 Heist es, dal3 ein Wert beispielsweise von s = 0.4 (daraus folgt: 6 .0,4 = 2. und 2,4 < 4) in Ordnung ist? Nein.

Brgriinduiig Eine Analyse wird selten als Selbstzweck durchgefuhrt. Sie dient eher der Uberprufung eines Wertes z. B. der Uberwachung eines Produktionsprozesses. Die Aufgabe der Analytik ist es, eine Versehiebung des Produktionsprozesses moglichst fruh zu registrieren. Wenn nun im Labor eine Streuung der Werte festgestellt wird, kann jene aus der Produktion oder aus dem MeRvorgang selbst oder - was wahrscheinlich ist - aus beiden herruhren. Bei

5. I Allgemeine Fehler und 1nterpretation.Cfehler

229

stochastisch unabhangigen Prozessen gilt fur die Gesamtstreuung als Resultierende folgendes (siehe auch Ausfuhrungen in Kapitel 8):

mit

V,, Gesamtstreuung VMv Streuung durch den MeBvorgang V,, Streuung durch die Produktion

Je geringer die Streuung der Analytik ist (kleiner VMv-Term),um so eher entspricht die gefundene Streuung der Streuung des Produktionsprozesses, siehe Abb. 5-5. Und Zielsetzung der Analytik ist ja, z. B. die Produktion zu uberwachen. Umgekehrt bedeutet eine starke Streuung der Analytik, dal3 hier falschlicherweise die festgestellte Streuung in der Produktion vermutet wird. Manche Partie wurde schon intumlicherweise vernichtet. Etwas vereinfacht formuliert: Wenn die Analytik eine zu groBe Streuung innerhalb der Spezifikationsgrenzen fur sich in Anspruch nimmt, laBt sie der Produktion kaum Spielraum. Der Anteil der Analytik an der Gesamtstreuung w%e, wie in der Auto- und Elektronikindustrie, mit 10 % optimal, in der Praxis sollte ein Wert von hochstens 30 % - 50 % anvisiert werden. In unserem Beispiel bedeutet bei den Spezifikationsgrenzen von 4 Prozentpunkten (98 % - 102 %) und einem s von 0,4, daB diese Methode (6 s = 6 . 0,4 = 2,4 und 2,4 entspricht 60 % von 4) 60 % der erlaubten Gesamtstreuung fur sich in Anspruch nimmt, was einfach zu vie1 ist. Hier wird eine bekannte Problematik offensichtlich: Haufig werden von behordlicher oder sonstiger offizieller Seite Spezifikationen vorgegeben, ohne analytisch-chemische Gegebenheiten zu beriicksichtigen. 1st man gezwungen, diese Spezifikationen tatsachlich ernst zu nehmen, gelangt man leicht in eine Zwickmuhle, denn die Entwicklung einer HPLC-Methode beispielsweise mit einer Standardabweichung fur reale Proben von s kleiner 0,4 ist nicht gerade die leichteste Aufgabe. Sind - vor einem naturlich begrundeten Hintergrund - in einem Gesprach zwischen Analytik, Produktion und Marketing die Spezifikationsgrenzen nicht ,,korrigierbar", bleibt ein einziger Ausweg ubrig: Auf eine weniger selektive aber dafur prazisere Methode wie z. B. Titrimetrie auszuweichen. MuB im vorliegenden Fall unbedingt mit der HPLC gearbeitet werden, so hat der Autor hier keine allgemeingultige Losung, nur die Empfehlung, ,,out of spec"-Situationen nicht uberzubewerten und haufige Wiederholmessungen in Kauf zu nehmen. Ein Ansatz wiire, im Rahmen des Moglichen zu versuchen, EinfluB auf die Festlegung solcher Vorgaben zu nehmen (s. auch ProzeBfahigkeit, Abschnitt I . I ) . Ziel: Abnahrne von, ,V

1 Abb. 5-5Die gemessene Streuung V,,, in der Analytik resultiert aus der Streuung der Methodc VMv und der Streuung der Probe/des Produktes V,,, Erlauterung s. Text.

230

5 Hiiufige Fehler hei d e r Vrrlidierung ~ i n u l y t i s c h Methoden ~~r

5.2

Fehler im Zusammenhang mit der praktischen Durchfuhrung der Validierung

Prazision a) Die Annahme einer Normalverteilung ist falsch, eine Uberprufung z. B. nach David, siehe Abschnitt 3.2 ist empfehlenswert. b) Statt die Methodenprazision zu bestimmen, wird lediglich die MeBprazision bestimmt. Bei der Methodenprazision werden z. B. sechs u n t e r s c ~ i e ~ Einwaagen ~ ~ ~ h e inkl. samtlicher Schritte wie Extraktion, Filtration usw. vermessen, wahrend bei der MeBpriizision eine (stabile) Probe sechs ma1 vennessen wird.

c) Bei ,,zu priizisen" Methoden werden etwas abweichende Werte irrtumlicherweise als AusreiBer ,,erkannt", siehe auch Abschnitt 3.2. d) MiBverstandnisse durch Begriffe, die von den Beteiligten unterschiedlich interpretiert werden. 2. B. Was heiBt ,,6 unabhiingige Bestimmungen"? Folgende Interpretationen waren denkbar: Sechs Einwaagen mit je einem Anwender - Ein Anwender bearbeitet alle sechs Einwaagen Eine Einwaage, sechs Aliquote - Standardabweichung der sechs Mittelwerte aus sechs MeBserien oder aber Standardabweichung der sechs Werte? - Gibt es zu jeder Bestimmung eine eigene Kalibrierung? e ) Statt realer Proben werden Standards vermessen. Aber gerade die Matrix kann die Prazision - und nicht nur diese - beeinflussen! f)

Ermittelte Zahlen sind gar nicht vergleichbar. z. B. - Zur Ermittlung der MeBprlzision werden sechs Bestimmungen durchgefuhrt (eine Probe wird sechs ma1 vermessen). Die Methodenprazision will man vielleicht etwas grundlicher bestimmen und ermittelt zehn Werte (zehn unterschiedliche Einwaagen). Die VK's sind nun nicht mehr vergleichbar. So kann es vorkommen, daR der V , der Methode kleiner ist, als der V , der Apparatur. 1st die Anzahl der MeBwerte nicht identisch, so bleibt der Beitrag der Apparatur zur Gesamtstreuung unbekannt, weil eben die zwei V , 's nicht vergleichbar sind. - Es werden V,'s verglichen, obwohl die Bestimmungen bei unterschiedlichen Konzentrationsniveaus stattfanden. - Trends in Zahlenreihen werden nicht erkannt, weil ausschlieBlich Zahlen, in diesem Fall V,'s, verglichen werden, siehe Tab. 5- 1 [66].Bei der ersten MeBreihe haben wir

5.2 Fehler im Zusammenhung mit der pruktischen Durchfuhrung

23 1

rnit einer Drift zu tun, die Werte der zweiten MeBreihe streuen um den Mittelwert, beim Fall Nr. 3 haben wir eine gute Methodenprazision der Werte bis zum vierten MeBpunkt, Wert 5 und 6 ,,tanZen vollig aus der Reihe". Tab. 5-1 Zur Vergleichbarkeit von MeRwertreihen rnit identischem Variationskoeffizienten, ErIauterung siehe Text. Probe

Fall 1

Fall 2

Fall 3

I

3,50

3,62

3,63

3,56

334

339

339

3,57

3,61

3,64

3,7 1

3,64

5

3,67

3,66

3,50

6

3,75

3,73

3,75

2,50 76

2,50 %

2,50 %

VK

Richtigkeit a) Die Priifung auf Richtigkeit durch Methodenvergleich wird bei nur einer Konzentration vorgenommen, siehe Abschnitt 3.3. b) Der Gehalt von Referenzmaterialien bleibt uber die Zeit nicht konstant. z. B. - Durch Verdampfung des Losungsmittels bei jeder Entnahme aus dem Flaschchen mit dem Standard andert sich die Dichte und somit schleicht sich ein proportional systematischer Fehler ein. - Andern sich die Aufbewahrungsbedingungen durch auBere Einflusse, kann dadurch auch die Stabilitat beeinflufit werden. c) ,,Verfuhrung" durch willkommene Ergebnisse. z. B. Durch eine gute Prazision und eine ausreichende Linearitat neigt man dazu, Richtigkeit als gegeben anzusehen. Hier kann nur dringend empfohlen werden, wenigstens Wiederfindungsexperimente durchzufuhren. d) Beim Methodenvergleich werden zu ahnliche Methoden verwendet. z. B. RP-HPLC rnit einer C,,-Saule und Normal-Phase-HPLC rnit einer CN-Saule. Je unterschiedlicher jedoch das MeBprinzip bei der Richtigkeitspriifung durch Methodenvergleich ist, um so sicherer ist die Aussage, z. B. Chromatographie und Immunoassay.

Robustheit

a) Unterschiedliche Festlegung von Toleranzbereichen von Anwendern, die rnit der selben Methode arbeiten. b) Der Faktor Zeit wird auch irn ,,kleinen" in seiner Tragweite unterschiitzt, z. B.: - Wiihrend der iiblichen Stabilitatspriifungen iiber einen Iangeren Zeitraurn befinden sich die Proben - bis aufdie MeOzeit - im Kuhlschrank. Was passiert mit den Proben einer Partie, wenn sie sich aus einern bestimmten Grunde liinger als ublich im Probengeber bei Raumtemperatur befanden? - Wie stabil ist eine Probe, wenn sie unterschiedlich lange einer bestirnrnten Ternperatur in Kombination mit einern Feststoffkatalysator - wie es die stationiire Phase einer chromatographischen Siiule nun einmal ist - ausgesetzt ist?

Brispirl Retentionszeit 20 min bei 50 "C und nach Optimierung der Methode: Retentionszeit 8 min bei 50 "C Bleibt die ,,Chemie" konstant oder finden an der Oberfllche der stationiiren Phase im ersten Fall Veriinderungen an bestirnrnten Komponenten der Probe statt?

c) Leicht zu iindernde Parameter werden gerne uberpruft und aufwendigere vernachliissigt.

Beispiel: Robustheit in der HPLC - FluUinderung: Zwar wichtig, aber selten kritisch. - pH-Wert-Anderung: Zwar aufwendig, aber fur ionische Verbindungen sehr kritisch und darnit sehr wichtig. - pH-Messung; Temperatureinflu8 im Alkalischen ist vie1 griiBer als die haufigere Uberprufung im Sauren. Systerneignungstest a) Ahnlich der Robustheit werden manchmal leicht xu ermittelnde GriiBen unnotig iiberpriift. Statt einer Bestirnrnung folgender GroBen Retentionsfaktor (k-Wert) Retentionszeit - Trennbodenzahl Peakbreite - Asyrnmetriefaktor - Tailingfaktor konnen nur - ohne Informationsverlust - die Retentionszeit und die Peakbreite, evtl. auch der Asymmetriefaktor, bestirnmt werden, siehe auch Abschnitt 3.4.

5.2 Fehler im Zusammenhang mit der praktischeri Durchfiihrung

233

b) Die Zielsetzung beim Systemeignungstest wird unterschiedlich gehandhabt. Merke: Einfache Bedingungen wie Methanol/Wasser, C ,,-Saule, Testgernisch: Benzol, Toluol, Ethylbenzol oder die beliebten Parabene bei 254 nrn dienen der Gerateverifizierung. Zur Methodenvalidierung wird ,,Spezifisches" gebraucht, z. B. reale Proben und die dazugehorenden Bedingungen. Linearitat

a) Es werden zu wenig Punkte fur einen groljen Konzentrationsbereich bestimmt. Die Gefahr besteht darin, daB der Rechner beispielsweise zwar ein lineares Regressionsmodell errechnet, daB aber die Streuungen im unteren und im oberen Konzentrationsbereich nicht gleich sind, also keine Varianzenhomogenitat herrscht. b) Die Linearitat wird statt rnit Placebo und zudosierten Mengen oder realen Proben, rnit einem Standard, der nur den Analyten enthalt, bestimrnt (Kalibrierung). Damit wird allerdings die Linearitat des Detektors/MeBprinzips und nicht die der Methode uberpruft ! c) Die Berechnungen sind bei kleinen Differenzen aus groljen Werten rnit groljen Fehlern behaftet. d) Man neigt gerne dazu, die Kalibriergerade durch Extrapolation durch den Nullpunkt zu legen. e) Beispiel aus einern Validiemngsbericht ,,. . . Die Linearitat wurde durch dreifach-Bestimmung auf funf Konzentrationsniveaus irn Bereich 70 % - 130 % der angegebenen Konzentration des Wirkstoffs uberpruft. Die errechnete Regressionsgerade geht durch den Nullpunkt, der Korrelationskoeffizient betragt, 0,996 . . ." Dazu muB man folgende kritische Punkte anmerken: 5 Konzentrationen ergibt 15 Punkte. Zu rnehr Sicherheit - allerdings bei groljerem Verdunnungsaufwand - gelangt man bei folgender Kombination - wenn der gesamte Konzentrationsbereich interessiert: Eine Doppelbestirnmung rnit 8 Konzentrationen und entsprechend 16 Punkten. - Ein Bereich von 80 % bis 120 % fur einen Wirkstoff ist ausreichend. - Der Blindwert soll, wo es moglich ist, gemessen und nicht extrapoliert werden. - Fur die Entscheidung, ob ein lineares Regressionsmodell angernessen ist oder nicht, bedarf es der Kenntnis nicht nur des Korrelationskoeffizienten des linearen sondern auch des quadratischen Regressionsmodells. Vielleicht ergibt sich im vorliegenden Fall fur die quadratische Anpassung ein Korrelationskoeffizient von 0,999? Zu den Kriterien fur Linearitiit uber den Korrelationskoeffizienten hinaus, siehe Abschnitt 3.7. - Eine 3-fach-Bestimmung rnit

234 -

5 Hiiujige Fehler hei der Vulidierung unalytischer Methoden

Eine starke Streuung der Werte, d. h., eine geringe Prazision der Methode, verhilft dem Rechner, leicht eine Gerade mit einem relativ guten Korrelationskoeffizienten zu errechnen . . .

Nachweis- und Bestimmungsgrenze a) Werte werden verglichen, obwohl die Nachweisgrenze nach unterschiedlichen Methoden bestimmt wurde. Das ist nicht zulassig, denn das Peak-/Rausch-Verhaltnis beispielsweise ist von der ,,Tagesform" der HPLC-Apparatur inkl. Lampe abhangig. Weiterhin liefert die Blindwertmethode bekanntlich in der Regel kleinere Werte als die Kalibriermethode. b) Die Anzahl der Werte zur Errechnung des Vertrauensbereichs variiert von Labor zu Labor. c) Ahnlich der Prazision und der Linearitat werden auch hier fur die Bestimmung oft statt einer realen Probe matrixfreie Analytlosungen verwendet. Selektivitat Wie bereits an anderer Stelle erwlhnt, ist die Uberprufung der Selektivitat am aufwendigsten in der Chromatographie. Folglich herrscht hier die groRte Gefahr fur Fehler. Zur Erlluterung wird ein Abschnitt aus einem Validierungsbericht einer HPLC-Methode zitiert: ,,. . . Zwei Belegchromatogramme mit allen Vor-, Neben- und Abbauprodukten liegen vor. Die Selektivitat wird belegt durch Vergleich der Retentionszeiten der Kalibriersubstanzen". Bei der Beurteilung miissen folgende kritische Punkte beachtet werden: a) Ein ,,Beweis" der Selektivitat durch Vergleich von Retentionszeiten ist, vor allem bei rnehreren Peaks in komplexen Proben, eine risikoreiche Angelegenheit. Die Verwendung eines DAD und eine gezielte Anderung von chromatographischen Parametern, siehe Abschnitt 3.5, ist der rninimalste Aufwand, der bei wichtigen Proben unbedingt in Kauf genommen werden muR. Bei unbekannten und/oder komplexen Proben kommt man um eine LC-MS Kopplung - am sichersten im multiple reaction mode, MRM - nicht herum.

b) Bezuglich des Vergleichs von Retentionszeiten sollte an Folgendes gedacht werden: - Handelt es sich bei bei den Chromatogrammen um etwa die gleichen Konzentrationen? Gerade in komplexen Gemischen ist die Saule schnell lokal uberladen, es werden konzentrationsabhangige Retentionszeiten beobachtet. - Sind die bekannten Komponenten einzeln oder als Gemisch injiziert worden? Auch hier kann sich die Retentionszeit einer Komponente andern, je nach dem, ob sie einzeln oder zusammen mit anderen Stoffen durch die Saule wandert. Dieses Verhalten

5.2 Fehler im Zusammenhang mit der prcrktischerr Durchfihrung

235

wird in Abb. 5-6 und 5-7 fur HPLC-Trennungen in der Qualitatskontrolle demonstriert. In Abb. 5-6 ist die Injektion zweier Komponenten als interner Standard, in Abb. 5-7 die Injektion des internen Standards zusammen mit einer Probe gezeigt. Die Retentionszeiten bleiben konstant. Im zweiten Fall gibt Abb. 5-8 die Injektion eines internen Standards zusammen mit der Probe wieder, in Abb. 5-9 wird diese Injektion wiederholt, nachdem die erste Komponente zudosiert wurde. Es wird eine kleine, jedoch eindeutige Retentionszeitverschiebung festgestellt:

3,0 min 3,s min 4,9 min

-+ 2,4 min + 3,2 min + 4,6 min

Je groBer die Anzahl der Peaks urn so groljer die Gefahr fur eine falsche Peakzuordnung.

7.3

5

10

RT (min)

1'0

RT (min)

Abb. 5-6 Inicktion cines internen Standards.

I

7,3

5

Abb. 5-7 lnjcktion dcs internen Standards usammen mit der Probe; die Retentionweiten der zwci Standardkomponenten bleiben konstant (7,3 und 8,1 min).

L

l

l

l

l

l

l

l

l

l

l

r

1

1

1

1

1

1

1

I

I

1

I

I

I

'

Abb. 5-8 Injektion cine9 intcrncn Standards /,usammen mit clcr Prohc.

c ) Sind die bekannten Komponenten als reine Standards injiziert oder einer realen Probe/ Placebo zudosiert worden? 1st der EinfluR der Matrix auf die Retentionszeit bekannt?

d ) 1st das Probeliisungsmittel und Injektionsvolumen in beiden Fiillen identisch? Es liegt in der Natur der Sache, dal3 genannte Punkte eher in komplexen, matrixbelasteten Proben eine Rolle spielen, wlhrend z. B. diese Problematik bei einer Gehaltsbestimrnung in der Pharma-Qualitiitskontrolle mit genauer Kenntnis uber die Probe vermutlich untergeordnet ist. Es wird empfohlen, gemachte und potentiell erkannte Fehler in Form einer open-end Liste als Bestandteil der Prufvorschrift fur die Lebensdauer der Methode zu erstellen. Diese gehort naturlich nicht nur in das Archiv sondern sie sollte ,.leben", ihr PlatL ist beim Anwender im Labor.

5.2 Fehler ini Zusuninienhun,qrnit der praktischen Durchfchrung

237

Abb. 5-9 Wie hci Ahb. 5-8 jedoch nach Zudosierung eincr Komponente; es wird eine leichte Ahnahme der Retcntionszeiten festgestellt.

Handbuch Validierung in der Analytik Stavros Kromidas Copvriaht 0 2000 WILEY-VCH Verlaa GmbH

Teil C Zur Validierung einzelner Techniken und Gebiete Mit Beitragen von:

Agilent, Aventis, BAM,Bayec Hessische Landesanstalt fur Umwelt, Hoffmann - La Roche, Merck, Schering, Schott, Spectral Service

6

Techniken und Gebiete

6.1

Validierung in der Spektroskopie

Werner Ockels, Spectral Service, Koln

6.1.1

Einleitung

Spektroskopie hat verschiedene Anwendungsbereiche, fur die der Validierungsbedarf unterschiedlich ist. Sie wird in ihrer ursprunglichen Form zur Strukturaufkliirung oder Identifizierung von chemischen Substanzen eingesetzt. Der Begriff ,,Spektroskopie" ist aus dem Griechischen abgeleitet und bedeutet soviel wie ,,ein Bild anschauen", und in der Tat will man sich bei der Strukturaufkliirung ,,ein Bild von der Substanz machen". Der Validierungsbedarf ist bei dieser Anwendung eher gering. Spektren sollten in einem gewissen Rahmen reproduzierbar sein, man kennt fur die verschiedenen spektroskopischen Methoden diverse EinfluBgroOen, die das Aussehen eines Spektrums beeinflussen. Den Spektroskopiker interessiert weniger die exakte Reproduzierbarkeit eines Spektrums, sondern vielmehr das ,,Muster" der spektroskopischen Daten, im Englischen als ,,pattern", der Vorgang als ,,pattern recognition" bekannt. Zu einem Spektrum gehoren daher immer die Aufnahmebedingun-

gen und die verwendeten Materialien. Der Fachmann kann dann beurteilen, ob Abweichungen relevant sind oder nur auf unterschiedliche Bedingungen der Aufnahme zuruckzufiihren sind. Im folgenden ist fur die einzelnen Methoden zusammengestellt, welche Parameter kontrolliert und angegeben werden mussen. Prinzipiell sollte zu den Rohdaten immer ein Ausdruck mit den verwendeten MeRparametern gehoren.

6.1.2 Infrarot-Spektroskopie Mit einern geeigneten Referenzmaterial (z. B. Polystyrolfolie) ist regelmiiBig zu prufen, ob die Wellenliingenkalibrierung und die Intensitiit der Banden korrekt ist.

Einem Spektrum sollten folgende Angaben beigefiigt sein: Typ und Hersteller des Instruments, verwendete Software Anzahl der akkumulierten Pulse (nur bei FT-IR) Art der Probe (KBr-PreOling, Flussigkeit in Kuvette, Film, Gas etc.) Probenkonzentration. -

6.1.3 UV/VIS-Spektroskopie Mit geeigneten Referenymaterialien ist regelmal3ig zu prufen. ob die Wellenliingenkalibrierung und die Intensitat der Banden korrekt ist. Das DAB empfiehlt, zur Wellenliingen-Kontrolle eine Holniiumperchloratlisung zu verwenden. Mit einer Kaliumdichromatliisung bectimmter Konzentration wird die molare Extinktion bei festgelegter Wellenliinge kontrolliert. Die Vorgehensweise ist im DAB beschrieben. Einem Spektrum sollten folgende Angaben beigefugt win: Typ und Hersteller des Instruments, verwendete Software Liisungsmittel und Konzentration der Probe Referenzmaterial bei Zweistrahlmessungen Kuvettendaten (Material. Schichtdicke).

-

6.1.4 Massenspektroskopie Bei einem Massenspektrometer m u 8 die Massenzuordnung regelmaOig tnittels einer geeigneten KalibriersubstanL iiberpruft werden; bei Abweichungen muB eine neue Kalibrierung vorgenommen werden. Je nach Geratetyp, Massenbereich und Ionisierungsmethode kotnmen verschiedene Substanzen in Betracht. Elrktrorienstc~~~-lorii.strtioii (+El): Quadrupol-Instrumente init einem Massenbereich bis 650 amu (atomic mass units) werden meistens mit Pertluortributylatnin (Heptacosa, FC4.3) kalibriert, wiihrend man Sektor-

6. I Rilidierung in cier Spektroskopie

24 1

feldgerate mit Perfluorkerosen (PFK) his etwa 900 amu kalibriert. Verschiedene Perfluoralkyltriazine konnen bis 1500 amu eingesetzt werden.

Chemische ionisation (-+Ci): Man benutzt meistens dieselbe Ionenquelle wie bei +El und verlilJt sich daher aufdie +EIKalibrierung. Es gibt fur CI keine Kalibriersubstanzen, die uber den Massenbereich verteilt genugend Stutzpunkte liefern. Man konnte sich eine Mischung iius verschiedenen Substanzen herstellen, jedoch ist die Gefahr einer Kontaminierung des Instruments zu gro13. Fast Atom Bombardment-lonisation(kFAB): Meistens wird CsJ verwendet, welches eine Kalibrierung von 130 amu bis ca. 4000 amu erlaubt. Die Massenstutzpunkte liegen immer 127 bzw. 133 amu auseinander. Falls es erforderlich ist, unterhalb von 130 amu zu kalibrieren, kann man eine Mischung aus N d l RbJ/CsJ einsetzen, die zudem dichter folgende Massenstutzpunkte liefert und daher eine priizisere Massenkalibrierung gewiihrleistet. Thermospray- und Elektrospruy- Ionisierung (kTSP/kESI) hei LC/MS: Der genutzte Massenbereich betragt selten mehr als 2000 amu, geeignet sind verschieden hoch polymerisierte Polyglykole (PEGS), oft als Mischung eingesetzt. Die verschiedenen Typen von Massenspektrometern, die heute gebriiuchlich sind, liefern durchaus von derselben Substanz deutlich unterschiedliche Massenspektren. Deshalb ist der Typ des Massensanalysators (Quadrupol, Ion Trap, Sektorfeld, TOF, FT-MS) grundsitzlich anzugeben. Weiterhin mu13 ein Massenspektrometer regelma13ig feinabgestimmt (Tuning) werden, wobei auf Peakform, Auflosung und Intensitatsverteilung uber den Massenbereich geachtet werden mu13. Empfindlichkeitstests mit einer der Fragestellung angepal3ten Substanz (z. B. Methylstearat, Hexachlorbenzol, Benzophenon, Coffein, Adenosin) sollten ebenfalls regelmaBig durchgefuhrt und dokumentiert werden. Einem Spektrum sollten folgende Angaben beigefugt sein:

- Typ und Hersteller des Instruments, verwendete Software

Ionisierungsmethode (+EI, C I , +FAB, kTSP, +ESI, kAPCI) ProbeneinlaRmethode (Direktprobe, GC/MS, LC/MS usw.) - Verdampfungstemperatur (bei G C M S Trennsiiule und Temperaturprogramm) Scan-Bereich und -Geschwindigkeit - Ionenquellentemperatur. -

6 . I .5

NMR-Spektroskopie

Beim NMR-Spektrometer ist regelmii13ig eine Uberprufung der Auflosung (mit o-Dichlorbenzol) und der Peakform (Hump-Test, CHCI, in Aceton-d6) durchzufuhren. Die Kalibrierung der Chemischen Verschiebung wird bei 'H-NMR und "C-NMR bei jeder Messung durch einen geeigneten internen Standard gewahrleistet (Tetramethylsilan, TMS). Bei

"F-NMR bezieht man sich auf eine Messung von CCI,F, bei "P-NMR auf Phosphorsiiure (externe Kalibrierung). Die Chemische Verschiebung wird durch viele Parameter beeintluBt. Wichtig sind das verwendete Losungsmittel, die Konzentration und der pH-Wert (bei wiiRrigen Systemen). Die Intensitatsverhiiltnisse werden durch die Relaxationszeit beeinfluat. Das Signal/Rauschverhiiltnishiingt aul3er von der Konzentration der Probe von der Anzahl der akkumulierten Pulse ab. Das Aussehen des Spektrurns iindert sich auch durch die mathematische Nachbehandlung der Rohdaten, z. B. GauR-Multiplikation. Einem Spektrurn sollten folgende Angaben beigefugt sein: Typ und Hersteller des Instruments, verwendete Software Art des gemessenen Kerns, MeBfrequenz (z. B. ' H . 300MHz) Relaxationsdelay Anzahl der akkumulierten Pulse Datenpunkte, Frequenzbereich Pulswinkel Angaben zur mathematischen Behandlung (Processing). -

~

Die Durchfiihrung der angegebenen Tests und die Angabe der wesentlichen Parameter gewiihrleisten vergleichbare und reproduzierbare Spektren. die zur Identifizierung. Strukturaufklarung und Charakterisierung von Substanzen eingesetzt werden konnen. Weitere MaBnahrnen zur Validierung sind bei diesen Einsatzgebieten nicht sinnvoll. Spektroskopische Methoden werden aber zunehmend auch zur Quantifizierung eingesetzt. Oft sind sie dann gekoppelt mit chromatographischen Methoden. die Spektrometer fungieren als Detektoren. Hier sind prinzipiell dieselben Anforderungen gestellt wie bei klassischen chromatographischen Methoden, wobei die HPLC-UV- und in zunehmendem MaRe die HPLC-MS(MS)-Kopplung die bekanntesten Beispiele sind. Man mu8 prinzipiell jedoch unterscheiden zwischen zwei verschiedenen Gegebenheiten. Es gibt Methoden, bei denen wesentliche Teile des MeBsystems kontaminiert werden und solche, bei denen dies nicht der Fall ist. Als Extrernfall der ersten Sorte ist das Massenspektrometer zu nennen, ein Beispiel fur den zweiten Fall ist das NMR-Spektrometer. Ein Massenspektrometer iindert seine Eigenschaften von Messung zu Messung. Man beobachtet, dali GC/MS-Messungen nach einer Ruhepause des Geriites deutlich hiihere Peakflachen Leigen als in den direkt folgenden. Dies wird u. a. duroh die Belegung der Ionenquelle mit Wasser, Losungsmitteln oder auch dem Analyten bewirkt. Dies hat einen EinfluB auf die Fokussierung des Ionenstrahls und damit auf das MeBergebnis. In MeRpausen vertluchtigen sich diese Belegungen, man niihert sich wieder den Ausgangsbedingungen. Dies erschwert die Validierung einer Quantifizierungsmethode erheblich und 1st bei der Planung der MeBserien zu berucksichtigen. Die haufig schlechten statistischen Daten von MS-Validierungen sind auf derartige Phiinomene zuruckzufuhren. Eine hohe Anzahl von Qualitatskontrollproben ist erforderlich, um auf Probleme bezuglich der Ernptindlichkeit und Leistung des Instrumentes rechtzeitig aufmerksam zu werden. Weniger anfiillig sind diesbezuglich LC/MS-Methoden. Bei Einzelionenmessung (Single lon Recording (SIR), Single Ion Monitoring (SIM)) wird auch die Massenspektrometrie zur akkumulierenden Methode. Man kann individuell fur jedes gemessene Ionensignal die Zeitspanne festlegen, in der Daten akkumuliert werden (Dwelltime). Bei Validierungen massenspektrometrischer

6. I Validierung in der Spektroskopie

243

Quantifizierungen ist dieser Parameter unbedingt zu beriicksichtigen. Man wird ihn nicht variieren, seine GroBe ist aber zu dokumentieren und wahrend der MeBserie konstant zu halten. Die Dwelltime kann nicht beliebig lang gewlihlt werden, da die Summe der Zeitspannen fur die einzelnen Ionensignale einem ,,Scan" entspricht, sie sollte bei Kapillarsaulen eine Sekunde nicht uberschreiten, da man ansonsten chromatographische Auflosung verliert. Die Massenspektrometrie hat ihren Vorteil in der hohen Spezifitat und hohen Empfindlichkeit. Schwierigkeiten bereitet zuweilen die mangelnde Dynamik. Man beobachtet haufig gute Linearitat bei Proben geringer Konzentration, wahrend hohe Konzentrationen nicht korrekt (zu niedrig) wiedergegeben werden. Bei hohen Konzentrationen werden in der Ionenquelle nicht mehr alle Molekule ionisiert, so daB das resultierende Signal nicht mehr proportional der Konzentration ist. Weitere Fehler konnen durch StoBreaktionen (Chemische Ionisation) und damit Anderung der Fragmentierung und damit des Spektrums entstehen. Theoretisch laBt sich eine Substanz massenselektiv auch dann noch erfassen, wenn das Signal von einer anderen Substanz uberlagert wird. 1stjedoch das Signal der uberlagernden Substanz wesentlich groBer, reagiert die Ionenquelle mit dem beschriebenen nichtlinearen Verhalten. Eine Methodenvalidierung sollte diese Punkte berucksichtigen. Auch in der Gaschromatographie andem sich die Bedingungen von Messung zu Messung. In einer Probe konnen Substanzen enthalten sein, die das Injektor-Insert oder die Trennsaule so verandern, daR bei der folgenden Messung Absorption oder veranderte Peakform zu Problemen fuhren konnen. Bei der Validierung wird man solche Falle nicht einkalkulieren konnen. Die UV-MeBzelle einer HPLC-Anlage ist ebenfalls der Probe ausgesetzt, nicht jedoch die Strahlungsquelle und der Detektor, z. B. ein Diodenarraydetektor. Auch die Trennsaule und das Probenaufgabesystem sind weniger anfallig als in der Gaschromatographie. Bei der IR-Spektroskopie wird das MeBsystem nicht kontaminiert. Reproduzierbarkeitsmessungen zeigen daher exzellente statistische Werte. Eine Ausnahme ist die GC/IR-Kopplung, hier gelten die Einschrankungen der Gaschromatographie, bezuglich der MeBzelle ist die Situation ahnlich wie bei der HPLC-UV-Kopplung. Auch bei der NMR-Spektroskopie wird das MeBsystem nicht kontaminiert. Mehrfache Messungen derselben Probe ergeben praktisch identische Ergebnisse, Unterschiede kann man hochstens im statistischen Rauschen der Basislinie erkennen. Daher ist bei der Validierung einer Methode das Augenmerk weniger auf das Meainstrument zu richten, als auf die Probenvorbereitung. Eigenartig erscheint fur Viele das Problem der variablen Nachweisgrenze in der NMRSpektroskopie. Die Nachweisgrenze wird wie ublich durch Signal/Rausch-Verhaltnis(S/N) definiert, dieses aber hangt wie bei allen akkumulierenden Methoden von der Zahl der akkumulierten Messungen ab. Theoretisch verbessert sich das S/N-Verhaltnis mit der Quadratwurzel aus dem Faktor der Akkumulation. Bei der 4-fachen Anzahl der Pulse wird demnach das S/N-Verhaltnis verdoppelt. Es ist daher problemorientiert zu entscheiden, welches S/N-Verhaltnis benotigt wird, denn sinnlos lange MeBzeiten vergeuden Geld. Bei einer Validierung einer NMR-Methode ist die Anzahl der Pulse einzubeziehen, da uberraschenderweise eine unnotig hoch gewahlte Anzahl das Ergebnis trotz des verbesserten S/N-Verhaltnisses sogar verschlechtem kann. Bei automatischer Integration kann dies durch ungunstig gewahlte Integrationsgrenzen zu fehlerhaften Ergebnissen fuhren.

Die oben genannten HaupteinfluRgroRen auf ein NMR-Spektrum mussen in die Validierung einbezogen werden. Die Losungsmittelzusammensetzung und der pH-Wert der waBrigen Phase sollten unter dem Gesichtspunkt der .,Robustheit" der Methode beriicksichtigt und getestet werden. Auf Qualitatskontrollproben kann weitgehend verzichtet werden, der Bedarf richtet sich nach den Erfordernissen der Probleme bei der Probenvorberei tu ng . Quantifizierungen mit NMR-Spektrometrie zeigen typischerweise exzellente Linearitat uber einen weiten Bereich, bisher konnten nichtlineare Kalibrierungen immer auf Fehlerquellen bei der Probenvorbereitung zuruckgefiihrt werden. Bei der Quantifizierung von Phospholipiden mittels 3 ' P-NMR-Spektroskopie fanden wir bei einer MeSserie niit 32 unabhangigen Einwaagen fur die Hauptkomponente eine prozentuale Standardabweichung von < 0,7 56, fur eine Komponente im Bereich der Nachweisgrenze betrug sie < 4 %.

6.2 Widirrung von Anal~senrwfiihrenniit ICP-OES

6.2

245

Validierung von Analysenverfahren mit ICP-OES

Siegfried Noack, BAM Berlin

6.2.1 Einleitung Die ,,Optkche Emissionsspektralanalyse rnit induktiv gekoppeltem Plasma" (ICP-OES) ist eine kalibrierbedurftige Analysenmethode zur Untersuchung von Losungen der zu bestimmenden Elemente. Haufigstes Ziel einer Probenvorbereitung fur eine ,,ICP-Messung" ist es daher, eine (meist saure) wassrige Probenlosung zu erhalten. Es konnen aber auch organische Losungsmittel (z. B . fur Proben auf organischer Basis) verwendet werden. Bei einer Analyse rnit ICP-OES wird die Probenlosung z. B. rnit Argon zu einem Aerosol zerstaubt und das Aerosol in ein toroidales induktiv gekoppeltes Plasma eingebracht. Im Plasma verdampft das Aerosol, wird atomisiert, teilweise ionisiert und zur Emission seiner elementspezifischen Strahlung angeregt. Die Strahlung gelangt in ein optisches System, in dem diese nach der Wellenlange zerlegt wird. Je nachdem ob es sich um ein simultan oder sequentiell arbeitendes Spektrometer handelt, werden die den verschiedenen Wellenlangen zuzuordnenden Strahlungsanteile gleichzeitig oder in zeitlicher Aufeinanderfolge gemessen. Die Detektion erfolgt uber Photoelektronenvervielfacher(,,Photomultiplier") oder auch uber Flachendetektoren nach dem Prinzip eines CCD-Chips, wie er auch fur Videokameras verwendet wird. Es werden elementspezifische elektrische Signale erzeugt, deren Hohe bzw. Flache abhiingig ist von den Elementkonzentrationen in der Probelosung. ZusammengefaBt beruht das Prinzip der ICP-OES auf folgenden Vorgangen: -

Zerstaubung der Probenlosung unter Schutzgas (z. B. Argon)

- Einbringen des Aerosols in ein induktiv gekoppeltes Hochfrequenzplasma (ICP) - Uberfuhren der Probe in den ,,Plasma-Zustand" durch:

Trocknung Schmelzen Verdampfen Dissoziation in freie Atome Teilweise Ionisation - Anregung der freien Atome bzw. Ionen - Emission elementspezifischer Strahlung - Elementspezifische Detektion der Strahlung nach Wellenlangen und Intensitat.

Wegen der Kalibrierbedurftigkeit sind sowohl die Richtigkeit als auch die Unsicherheit der Ergebnisse einer mit ICP-OES durchgefiihrten Elementbestimmung in hohem MaOe von der Cute der Kalibration ahhiingig. Die Unsicherheit der erhaltenen Analysenergebnisse wird daruberhinaus auch noch von einer Vielzahl weiterer methodenbedingter EinfluOgroDen bestimmt. auf die im Abschnitt ,,Optimierung methodenbedingter Leistungsmerkmale der ICP-OES" eingegangen wird. Bei der Validierung von ICP-OES-Verfahren sind - wie bei anderen Analysenmethoden zwei Kategorien von Leistungsmerkmalen zu unterscheiden:

I . Allgemein ubergeordnete analytischen Leistungsmerkmale 2. Methodenbedingte Leistungsmerkmale. Letztere haben z. T. einen entscheidenen EinfluO auf die Richtigkeit der Ergebnisse. Im folgenden werden die methodenbedingten Leistungsmerkmale beschrieben. Ihre Optimierung wird im Hinblick auf die allgemeinen analytischen Leistungsmerkmale bei der Validierung eines Analysenverfahrens erlautert.

6.2.2

Beschreibung methodenbedingter Leistungsmerkmale der ICPOES

6.2.2.1 Spektrale und nicht spektrale Storungen

Spektrulo Stiirungen diirch Litiieniiherlageruti~~c~ii Spektrale StBrungen durch Linienuberlagerungen konnen in folgende Kategorien eingeteilt werden: Linienuberhppung der Analysenlinie durch eine Link eines anderen Elementes. Kriterien fur das AusmaR der Linienuberlappung sind die physikalische Linienbreite, die praktische Auflosung des Spektrometers, der Abstand zwischen Analysen- und Starlinie und das Intensitatsverhdtnis von Analysen- zu Storlinie. Ein Spezialfall ist die Lage einer Analysenlinie auf der Flanke einer stark emittierenden Linie. Uberlappung einer Molekulbande (z. B. N, und NO zwischen 200 und 240 nm, OH und NH zwischen 300 and 340 nm, CN zwischen 380 and 390 nm) mit der Analysenlinie. Anhebung des Untergrundes durch Rekombination (z. B. Aluminium zwischen 190 und 220 nm). Untergrundanhebung durch Streulicht.

Nicht-spektrule StBrungen Diese Storungen betreffen zwei Bereiche: 1. Zerstiiubung (physikalischer Natur) 2. Plasma (chemischer und physikalischer Natur).

6.2 Vulidierung von Atici!\seizvert~ihrL.n mit ICP-OES

247

Die Prufung der methodenspezifischen Leistungsmerkmale ist notwendig, da gewiihrleistet sein muB, daS sowohl bei der Kalibrierung als auch bei der Messung der Probenlosung der lediglich auf den Analyten zuruckfiihrbare MeBwertanteil korrekt ermittelt wurde. Die Signale sind also auf ,,Storungsfreiheit" zu iiberpriifen (s.Abschnitt ,,Optimierung methodenbedingter Leistungsmerkmale"). Transport-Storungen Unterschiede in der Viskositat, der Oberflachenspannung und der Dichte zwischen Probenund Kalibrierlosungen konnen die zur Analyse gelangende Losungsmenge, die Transportrate und die TropchengroBenverteilung im Aerosol beeinflussen. Damit kann es bei der Messung von Proben- und Kalibrierlosungen trotz gleicher Analytkonzentration zu unterschiedlichen Intensitaten kommen.

-

Storungen durch die Anregungsquelle Bei wechselnder Matrix ist die Folge meist auch eine Anderung der Anregungsbedingungen im Plasma, wodurch sich haufig auch eine Anderung der Selektivitat ergibt. Oft ist die Ursache eine Anderung der Konzentrationen von Elementen, die leicht zu ionisieren sind, z. B. Alkalielemente. Diese fuhren generell zu einem Intensitltsanstieg von Atotnlinieri und eine Reduktion der Intensitiit von lonenlinien.

-

6.2.2.2 Untergrundermittlung Die Untergrundermittlung und eine entsprechende Korrektur des ,,Bruttosignals" ist immer dann notwendig, wenn der lntensitatsbeitrag durch den Untergrund nicht vernachIiissigbar ist bzw. wenn man davon ausgehen muR, daB die Untergrund-Intensitaten bei verschiedenen Losungen unterschiedlich und die Brutto-Signale somit nicht vergleichbar sind. Zudem ist zu beriicksichtigen, daR der Untergrund anderen Schwankungen unterliegt als der reine Intensitatsbeitrag des Analyten. Eine Untergrundkorrektur wird so vorgenommen, daB das simultan oder sequentiell zum Bruttosignal ermittelte Untergrundsignal vom Bruttosignal abgezogen wird (,,Nettosignal"). Es ist jedoch zu bedenken, daR durch eine Untergrundkorrektur zwar die Richtigkeit des Ergebnisse erhoht, die Prazision durch die Fehlerfortpflanzung jedoch verschlechtert wird. Bei sequentiell messenden Geraten kommt noch hinzu, daB die Messungen von Bruttound Untergrundsignal streng genommen nicht vergleichbar sind, da sie nicht zur gleichen Zeit erfolgen.

6.2.2.3 Kurzzeit- und Langzeitstabilitat (Drift) Eine korrekte Ermittlung der MeBwerte im Sinne einer Vergleichbarkeit derart, daB zwischen MeSwertbeitrag des Analyten (,,Netto-Intensitat") und der Analyt-Konzentration eine Proportionalitat besteht, ist nur gewahrleistet, wenn ein und dieselbe Losung stets zu den gleichen MeBwerten fiihrt.

Wiihrend einer Einzelmessung mu13 eine Kurzzeit-Stabilitit gewiihrleistet sein, d. h. da13 zumindest die Gesamtzahl der ,,gesammelten Counts" innerhalb der lntegrationszeit konstant sein muB. Eine Langzeitstabilitiit muB mindestens uber den Zeitraum gewiihrleistet sein. fur den ein und dieselbe Kalibration gultig ist.

6.2.3 Optimierung methodenbedingter Leistungsmerkmale der ICP-OES Im Hinblick auf die allgemeinen Validierungskriterien eines Verfahrens wie 1. GenauigkeitskenngroRen:

Priizision Richtigkeit Ergebnisunsicherheit 2. Bereichsgrenzen: Background Equivalent Concentration (BEC) Nachweisgrenze Erfassungsgrenze Bestimmungsgrenze

3. KenngroBen der Kalibrierfunktion: Linearitiitsbereich Arbeitsbereich Empfindlichkeit 4. Robustheit 5 . Selektivitiit/Spezifitat

sind die in Tab. 6- 1 gezeigten methodenspezifischen Leistungsmerkmale zu optimieren. Als Voraussetzung fur die Optimierung der Leistungsmerkmale bzw. die Robustheit eines ICP-OES-Verfahrens sind zuniichst die folgenden Betriebsparameter einzustellen bzw. folgende Geriiteparameter zu kontrollieren:

Einzusrellrrzde Betriebspururnrtrr: Hochfrequenzleistung Beobachtungshohe - DurchfluD und Eingangsdruck des ,.Zerstiiubergases" - DurchfluB des ,,Plasmagases" - Durchf-luBdes ,,Hilfsgases" - Probendurchsatz (ml/min) - Spulzeit zwischen den Einzelmessungen -

6.2 Vulidierung von Anulysenvrtjiuliren mit ICP-OES

249

Tab. 6-1 Optimierung methodenspezifischer Leistungsmerkmale bei der ICP - OES. Validierungskri terium

Methodenspezifische Leistungsmerkmale

Richtigkeit

-

Prazision

EinstelIung/MaRnahmen -

-

Verhaltnis zwischen Nettound Unter&rund-Si&nal Spektrale Storungen durch Linienuberlagerungen Nicht-spektrale Storungen

-

-

Matrixanpassung, ggf. Verdunnung, ausreichende Spulzeit zwischen den Messungen der Liisungen

-

Stabilitat der Signale

-

-

MeBzeit

Vcrmeidung von Kurz- und Langzeitdriften, ggf. Dirftkorrektur

-

Optimierung der MeBzeit hinsichtlich Kurz- und Langzeitdriften

-

GroBtmGgliches Verhaltnis Messung auf stijrungsfreien Linien, ggf. Korrektur

BEC

-

Verhaltnis zwischen NettoSignal und Untergrund-Signal

-

GrliRtmiigliches Verhaltnis

Nachweisgrenze

-

Verhaltnis zwischen Nettosignalhohe und Untergrundschwankungen

-

Gr(il3tmBgliches Verhaltnis

Linearitat

-

Proportionalitat zwischen Nettosignal und Massenkonzentration

-

Statistischer Linearitatstest

Arbeitsbereich

-

Bereich zwischen unterer und oberer Bestimmungsgrenze

-

Ermittlung der unteren und oberen Bestimmungsgrenze

Robustheit

-

Minimierung des Einflusses von Gerateparametern auf die Signalhohe

-

Einstellung der Gerateparameter nach Angaben des Herstellers

Selektivitav Spezifitat

-

Freiheit von Linienuberlagerungen

-

Messung auf storungsfreien Linien

Zu kontrollierende Gerateparameter:

Gerateparameter

Kontroll-Eigenschaft

Ausrichtung der Quarz-Zylinder der Plasrnafackel untereinander

Konzentrische Anordnung

Ausrichtung der gesamten Plasmafackel gegenuber der Hochfrequenzspule

Konzentrische Anordnung

250

6

T d i i i I k o i i irtitl

G~~hirre

Oberfliichenbeschaffenheit der Fackel

-

Ablagerungsfreiheit Glattheit der Quar7-Zylinder

Justierung des .,Analysenkanals"

Ausrichtung auf die opticche Achse des Systems

Hochfrequenzleistung

Korrekte Abgabe und Stabilitat

Hochfrequenzspule

Korrekte .,Geometric“

Zerstiiubereinrichtung

Blockierfreiheit der Kapillaren

Gasstriime

Korrekte Einstellung und Stabilitat

FSrderputnpe

Stabilitiit der Forderrate

Optischea System

Durchliissigkeit des Systems

Wenn notwendig: Thermostatisierung

Temperaturkonstanz

Wenn notwendig: Wasserkuhlung

Ausreichender und ,,funktionsfiihiger" WasserzufluR (Druck!)

Einstellungen am Detektor

Entsprechend der Geriiteanleitung

6.2.3. I

Spektrale und nicht spektrale Storungen

Sprktrtrlt. StBrungt~r?durcli Liriieiiiiht.t-ltrjier~n~rIi Grundsiitzlich sollte auf Linien gemessen werden, die von den anderen in der Probe enthaltenen Elementen nicht oder nur vernachliissigbar gestiirt werden. Ob eine Linie als ,,st& rungsfrei" anzusehen ist, kann GberschlagsmaOig aus den in der Software meist integrierten Wellenlangentabellen entnommen werden. Man mufi aber davon ausgehen, daB die Wellenliingentabellen nicht alle Storlinien enthalten. Besser ist deshalb die Vorgehensweise, die in Frage kommenden Stiirelemente bei der MeBwellenlange des vermeintlich des gestorten Elementes zu messen. Hierzu verwendet man zweckmiifiigerweise ,,Ein-Element-Losungen" der in Frage kommenden ,,Starer". Voraussetzung fur eine Storungsermittlung ist, daB es sich jeweils um hochreine Losungen der Stiirelemente handelt: Es mu8 sichergestellt werden, daR ein eventuell auftretendes Signal tatsachlich von dem Storelement hervorgerufen wird und nicht von einem Element, mit dem wiederutn die Pruflosung verunreinigt ist. Prinzipiell kommen als Stiirelemente alle Elemente in Frage, die in der Probe enthalten sind. Eine Korrektur kann vorgenommen werden, wenn man ermittelt, welche Konzentration des Stiirelementes welche Analytkonzentration vortauscht. Das Vorhandensein spektraler Storungen bei Verwendung von ,,Multielementlosungen" bei der Kalibration kann erkannt werden, wenn man dafur sorgt, daB das Konzentrationsverhiiltnis der Elemente in den einzelnen Kalibrierliisungen moglichst unterschiedlich ist. Eine spektrale Storung eines Elementes wurde sich dann mit griiRer Wahrscheinlichkeit durch eine Nicht-Linearitiit der Kalibrierfunktion zu erkennen geben.

6.2 Vulidierung von AnnlysenverJithrm mit ICP-OES

25 1

Nicht-spektrale Storungen Eine Minimierung des Einflusses nicht spektraler Storungen ist moglich durch: - Matrixanpassung der Kalibrierlosungen an die Zusammensetzung der Probenlosung - Verdiinnen der Probenlosung -

-

Transport-Storungen Transportstorungen konnen durch Verwendung einer peristaltischen Pumpe reduziert werden. Alle Losungen sollten bei der gleichen Temperatur gemessen werden. Storungen durch die Anregungsquelle Durch die Anregungsbedingungen bedingte Storungen konnen durch folgende MaBnahmen beseitigt bzw. minimiert werden: Optimierung der Plasmabedingungen durch Veranderung der Leistung, des Zerstauber-Gasstroms und der Beobachtungshohe Matrixanpassung oder Verdunnen der Probenlosung Verwenden eines inneren Standards Anwendung der Standard-Additionsmethode.

6.2.3.2 Untergrundermittlung Es ist grundsatzlich darauf zu achten, daB der Untergrund nicht auf einer ,,spektralen Struktur" ermittelt wird, also z. B. auf der Flanke eines weiteren Peaks, sondern daB es sich nach Moglichkeit nur um den ,,natiirlichen" Untergrund (Kontinuum) handelt. In der Regel unterscheidet man drei Falle: a) Gleiche Untergrundhohe auf beiden Seiten der Analytlinie: In diesem Fall ist es statthaft, den Untergrund nur auf einer Seite so nahe wie moglich an derAnalytlinie zu messen. Der Abstand zu einer anderen Linie sollte aber mindesten 2-3 Peak-Halbwertsbreiten betragen. Wenn eine unerwartete Steigung des Untergrundes anzunehmen ist, dann ist es gunstiger, auf beiden Seiten des Peaks zu messen. b) Unterschiedliche Untergrundhohe auf beiden Seiten der Analytlinie - Lineare Zunahme des Untergrunds: In diesem Fall hat der Untergrund eine positive oder negative Steigung und ist auf beiden Seiten des Analysenpeaks zu messen. Der eigentliche Untergrundwert ist dann durch Interpolation zu ermitteln (bei gleichem Abstand der MeBpunkte zum Peakmaximum ist dies die Halfte der Summe beider Meflwerte). c) Unterschiedliche Untergrundhohe auf beiden Seiten der Analytlinie - Nicht-Lineare Zunahme des Untergrunds: In diesem Fall hat der Untergrund einen gekrummten Verlauf und kann nur uber eine mathematische Funktion (z. B. Polynom 2. Ordnung) ermittelt werden, welche den Verlauf beschreibt. Hierzu ist eine entsprechende Regressionsrechnung (funktionaler Zusammenhang zwischen Wellenlange und MeBsignalhohe) durchzufuhren.

In jedem Fall ist darauf zu achten, daB das SignalkJntergrundverhaltnismoglichst groB ist.

252

6 Technikrn und Gebieta

6.2.3.3 Kurzzeit- und Langzeitstabilitat (Drift) Intensitats-Schwankungen, die transportbedingt sind, lassen sich bei simultan messenden Spektrometern mit einem ,,inneren Standard" ausgleichen. Hierfur ist ein Element zu verwenden, das nicht Bestandteil der Probe ist. HBufig wird hierfur Yttrium oder Scandium gewahlt. Es ist jedoch darauf zu achten, daR durch den inneren Standard nicht wiederum andere Elemente ,,eingeschleppt" werden - insbesondere den zu bestimmenden Analyten betreffend. Da der innere Standard nur dann vollstandig ,,wirkt", wenn die Intensitaten der zu bestimmenden Elemente und die Intensitat des inneren Standard sich bei Parameteranderungen absolut gleichsinnig verhalten, konnen durch einen inneren Standard nicht alle Parameterschwankungen ausgeglichen werden. Es ist deshalb - insbesondere bei hohen Anspruchen an die Priizision und Richtigkeit der Ergebnisse - zweckmaBig, einen externen Standard zusatzlich zu verwenden. Hier empfiehlt es sich, das zu bestimmende Element direkt als externen Standard einzusetzen 1671. Spiilzeit zwischen den Messungen van verschiedenen Liisungen Die Spiilzeit zwischen den Messungen zweier Losungen mu13 so gewiihlt werden, daR kein ,,Memory-Effekt" auftritt, d. h. keine MeBwerterhohung durch die vorher gemessene Losung. Aus diesem Grunde ist es zweckmiiRig, vor dem Beginn einer MeRserie eine Losung mit ~ y p i s c h e Zusammensetzung" r so oft zu messen, bis die MeRwerte konstant sind. Der ,,Memory-Effekt" kann wie folgt ermittelt werden: Fur jedes Element sind eine Messung der Losung mit der maximalen Konzentration des Arbeitsbereichs und anschliebend 12 Messungen der ,,Blank-Losung" durchzufuhren. Aus den letzten zehn Messungen der ,,Blank-Losung" ist die Standardabweichung sI0zu berechnen. 1st die Differenz der MeRwerte der ersten beiden MeRwerte der ,,Blank-Losung" (RBI und RB2) groRer als das 4-fache der Standardabweichung sIO,dann liegt ein ,,MemoryEffekt" vor:

In diesem Fall ist die Vorspulzeit zu erhohen und der Test zu wiederholen.

Wahl de r In teg ra tionszeit Ein Heraufsetzen der Integrationszeit verbessert generell die Prazision, erniedrigt die Nachweisgrenzen und reduziert den EinfluCj von Kurzzeit-Schwankungen. Gleichzeitig wird aber der EinfluR von Langzeit-Fluktuationen groRer. Das bedeutet, daR die Interagtionszeit ein KompromiB darstellt. Man kann jedoch davon ausgehen, daR Messungen unterhalb einer Dauer von 1 Sekunde haufig keine hinreichende Prazision liefern. Um einen Uberblick uber Schwankungen wiihrend der MeRzeit ZLIerhalten, ist es zweckmaRig, mindestens 3 Wiederholungsmessungen (Replicates) durchzufuhren.

6.2 Vulidierung w n Anulysenverfiihren mit ICP-OES

253

Insgesamt sollte die relative ,,Mel3-Wiederholstreuung" fur den erhaltenen Mittelwert besser als 1 % sein.

Trennscharfe Selektivitat bzw. Spezifitat konnen nur dann erreicht werden, wenn es gelingt, auf storungsfreien Linien zu messen. Spezifitat ist bei der ICP-OES nur dann gegeben, wenn die Analytlinie durch keine andere Linie der in der Probe noch enthaltenen Elemente gestort wird. Dies durfte eher die Ausnahme sein. Selektivitat bzw. Spezifitat hangen bei der ICP-OES naturgemal3 u. a. von der Autlosung des verwendeten Spektrometers ab.

6.3

Validierungsaspekte bei Arbeiten in mikrobiologischen Labors

Michael Rieth, Merck KGaA, Darmstadt Klaus-Peter Gerbling, Schering AG, Berlin

Als drei verschiedene Beispiele fur Validierungsaufgaben im mikrobiologischen Labor werden die Prufung auf Sterilitiit, die Prufung auf Dichtigkeit (,,closure integrity test") und die Qualifizierung eines Arbeitsgerats (Mikrotiterplattenlesegerat) vorgestellt. Die Sterilitatsprufung ist in allen Pharmakopoen weltweit beschrieben, z. B. im Kapitel 2.6.1 des Europaischen Arzneibuchs. Solche monographierten Methoden werden zwar ublicherweise als validiert angesehen, jedoch mussen Untersuchungsproben, bei denen antimikrobielle Eigenschaften vermutet werden, produktbezogen validiert werden. Weitere Faktoren wie Inkubationszeiten und -temperaturen, unterschiedliche Niihrmedien-Chargen und der physiologische Zustand der Referenzmikroorganismen (Stammsammlung) mussen in die Validierung im eigenen Labor mit einbezogen werden. Zum Dichtigkeitstest finden sich Informationen z. B. im Technical Information Bulletin No. 4 (,,Aspects of ContainerKlosure Integrity"), herausgegeben von der Parenteral Drug Association (PDA). Im Falle eines Messgeriits muss der Anwender seine Anforderungen formulieren und Kriterien fur die Qualifizierung festlegen, eventuell zusammen mit dem Geratehersteller oder einem Fachingenieur. Mit Teilen der Qualifizierung wie IQ und meist auch OQ kann der Hersteller beauftragt werden. Die PQ muss vom Betreiber unter seinen eigenen labortypischen Bedingungen durchgefuhrt werden.

6.3. I

Priifung auf Sterilitat (fliissige und filtrierbare Arzneimittel)

6.3. I . 1 Validierungsphn fur die Durchfuhrung der Sterilitiitsprufung

Zirl drr Vulidierung: Die Validierung sol1 zeigen, daB die Durchfuhrung der Sterilitiitsprufung den Anforderungen der Pharmakopoen Europas (EP), Japans (JP) und der USA (USP) entspricht. Die Anwesenheit des Prufproduktes in den verwendeten Medien sol1 keinen EinfluB auf das Wachstum der eingesetzten Testmikroorganismen haben. Fur jedes der verwendeten Medien sol1 in An- und Abwesenheit des Prufproduktes bzw. Membrantilters eine Wachstumskontrolle durchgefuhrt werden. Falls das Produkt wachstumshemmende Eigenschaften hat, konnen Verdunnungen angelegt oder neutralisierende Agenzien zugesetzt werden. Die Untersuchungen sollen an drei Produktionschargen durchgefuhrt werden.

6.3 Vulidierungsnspekte bei Arbeiten in mikrobiologischen Labors

255

6.3.1.2 Beschreibung der Durchfuhrung Die Validierung wird nach Vorgaben der EP, der JP und der USP unter aseptischen Bedingungen durchgefuhrt. Es werden Membranfiltrationen, z. B. Steritestsystem der Fa. Millipore fur zwei Nahrmedien, angewendet.

Nuhrmedien: 1. Caseinpepton-Sojamehlpepton-Bouillon(CSB-Medium) folgender Zusammensetzung:

Pepton aus Casein Pepton aus Sojamehl Natriumchlorid Di-Kalium hydrogenphosphat D-Glucose monohydrate pH-Wert Destilliertes Wasser

17,0 g

38g 5,0 g 2,5 g 2S 7,2-7,4 ad I L

2. Thioglycolat-Medium (Thio-Medium) folgender Zusammensetzung: Trypton 15,O g Pepton aus Sojamehl 5,O g Natriumchlorid 5,0 g Agar 15.0 g pH-Wert 7,2-7,4 Destilliertes Wasser ad 1 L

3. Pepton Phosphat Medium folgender Zusammensetzung: Di-Natriumhydrogenphosphat 14S g Kaliumdihydrogenphosphat 3sg Natriumchlorid 4,3 g Pepton 1,0 g pH-Wert 6,s-7,2 Destilliertes Wasser ad 1,OL Tween 80 1 ,0 ml Der Behalterinhalt (Anzahl in Abhangigkeit des Abfullvolumens, siehe USP) wird uber zwei Filtriereinheiten (Steritestsystem, Fa. Millipore) verteilt. Jeder Membranfilter wird anschlieaend mit 250 ml Pepton-Phosphat-Polysorbat-Losungnachgewaschen, die zuvor rnit 10- 100 KBE eines Testmikroorganismus entsprechend Tab. 6-2 inokuliert wurde. Danach wird jeder Membranfilter mit 100 ml Medium entsprechend Tab. 6-2 uberschichtet und 5 Tage bebrutet. Die Filtriereinheiten werden taglich visuell auf Klarheiflrubung gepruft. Die Prufung ist valide, wenn nach der Bebrutungszeit von 5 5 Tagen unter den vorgeschriebenen Bedingungen (Tab. 6-2) das Wachstum der Testmikroorganismen bei den rnit Prufprodukt beschickten GefaBen nicht schlechter ist als bei den ohne Produkt beschickten Kontrollgefa8en.

Tab. 6-2 Te~tmikroorganismenund Inkuhationsbedingungcn. Te5torganismus

Medium

Inkuhationsieit (Tage)

Tcmpcratur ("C)

Bedingungen

20-25 30-35

aeroh aeroh

20-25 30-35

aerob aeroh

20-25 30-35

aeroh aeroh

Brrci//ir.c subti I is

ATCC6633

CSB Thio

5

Cmidiclcr albicans

ATCC 1023 I

CSB Thio

5

Stcr/'h?./ot,oc.(.ir.c aureus

ATCC 6538P

CSB Thio

5

5

5 5

Thio

5

30-35

aerob

C/osrrirfirmsporogenes

ATCC 1 I437

Thio

5

30-35

aerob

Asprr,qi/Iii.\ nigcr

ATCC 16404

CSB

5

20-25

aerob

Psc,uciorrioritr.c aerupinoaa ATCC 9027

6.3. I .3 Validierungsbericht

Ergehrzissr Die Ergebnisse der Validierung werden tabellarisch dargestellt (Tab. 6-3). Exemplarisch sind hier nur die Ergebnisse mit 2 Testorganismen dargestellt.

BrwertutzRshrispiel Die Validierung entspricht den Anforderungen der Pharmakopoen der USA, Japans und Europas in Bezug auf das Verfahren zur Sterilitatsprufung. Nach Membranfiltration, Uber-

Tab. 6-3 Visuelle Wachstumspriilung der inokuliertcn Testorganismen in den Steritesteinheiten nach Tcstproduktfiltration und Uberschiehtung mit Medium gem28 Ahschnitt 6.3.1. I . Visuelle Untcrwchung Testorganismus

Tag 2

Tap 1

Medium

Membran-Filtereinheit 1

2

I

2

triib

triih

BcrcI'//ussu hti lis

CSB-Medium ohne Priifprodukt

triih

triib

Boci//ir.s cubti I is

Thio-Medium ohne Priifprodukt

triib

triib

triib

triih

Bticilltrs subti I is

CSB-Medium n i t Priifprodukt

triib

triib

triib

triib

Btrci//ir.r \ti b ti lia

Thio-Medium mit Priifprodukt

triih

triib

triib

triih

Ctrrididu alhicans

CSB-Medium mit Priifprodukt

triib

triih

triib

triih

Cmdidti a I b i c an s

Thio-Medium ohne Priifprodukt

triih

triib

triib

triih

triih

triih

triih

triib

Cundidu albicans

CSB-Medium mit Priifprodukt

triib

triib

Cmdidtr albicans

Thio-Medium rnit Priifprodukt

triih

triih

6.3 Vulidierungsuspekte bei Arbeiten in mikrobinlogischen L.ubor.7

257

schichtung mit Medium und anschliefiender Inkubation fur zwei Tage wurde in An- und Abwesenheit vom Prufprodukt und nach Inokulierung mit Testmikroorganismen gleich gutes Wachstum durch Trubung der Medienbehalter festgestellt. Das Verfahren zur Durchfuhrung der Sterilitatspriifung wird daher als valide betrachtet.

6.3.2 Mikrobiologische Dichtigkeitspriifung (Closure Integrity Test) von Primarbehaltern eines aseptisch hergestellten Wirkstoffs unter Worst Case Bedingungen des VerschluBsystems 6.3.2.1 Validierungsplan

Ziel der Vulidierung: Bei aseptisch hergestellten Praparaten und Losungen mu13 gewahrleistet werden, da13 keine Mikroorganismen von au13en in die Primarbehaltnisse eindringen und zur Unsterilitat des Inhalts fuhren. Auf mikrobiologische Integritat sollen Injektionsflaschen mit Verschlu13system fur die Herstellung eines sterilen Wirkstoffs untersucht werden. Zur Simulierung von ,,Worst Case-Bedingungen" werden Flaschen und Stopfen verwendet, die nahe den minimal (Stopfen) bzw. maximal (Flaschen) zulassigen Fertigungstoleranzen hergestellt wurden. Die Integritat der Prtifflaschen ist nachgewiesen, wenn keine der untersuchten Flaschen nach Durchfuhrung der Dichtigkeitsprufung trubes Medium enthalt. Verantwnrtlichkeiten: Validierungsverantwortlicher:Leiter der Funktion - Freigabe von Validierungsplan- und bericht Validierungsteam: Wissenschaftliche Mitarbeiter Koordination der Validierungsdurchfuhrung Ausfuhrung der mikrobiologischen Integritatsprufung Dokumentation von Plan, Bericht und Rohdaten Ausfuhrung der aseptischen Nahrmediumabfullung - VerschluB und Verbordeln der Prtifflaschen. Beschreihung der Materialien und Durchjiihrung Dokumentation zur Umgebung und zur Qualitat der eingesetzten Materialien und Mikroorganismen; die Rohdaten zur Umgebung und zur Qualitat der Materialienwerden aufgenommen. - Nahrmediumherstellung - Wachstumsprufung von Nahrmedium und Testmikroorganismus - Zertifikate zu Prufflaschen und Stopfen incl. Bewertung der Toleranzen - Mikrobiologische Monitoring aus dem Bereich der aseptischen Abfullung, Verschlu13 und Verbordeln werden als Anlagen zum Validierungsbericht dokumentiert. Generelle Methoden: Sofern nicht anders beschrieben, sollen alle Arbeiten unter aseptischen Bedingungen erfolgen.

258

6 Trchriiken utid G d i e t r

Folgende Methoden werden nach USP durchgefuhrt: Herstellen der Nahrmedien (flussig und in Agar) - Wachstumsprufung der eingesetzten Niihrmedien und des Testorganisinus Inkubationen in Brutschrlnken zur Kultivierung des Testmikroorganismus -

6.3.2.2 Beschreibung der Prufflaschen und Stopfen Fur die Integritiitsprufung sollen Injektionsflaschen verwendet werden, die nahe der Plustoleranz hergestellt wurden (Hersteller mit Chargenangabe) und Injektionsstopfen mit Zapfendurchmesser an der Minimaltoleranz (Hersteller mit Chargenangabe, Flaschenvolumen in diesem Beispiel: 20 ml).

Nahrmrdium f i r die B