Molekulare Zellbiologie

Springer-Lehrbuch

Gerald Karp

Molekulare Zellbiologie Aus dem Amerikanischen çbersetzt von Kurt Beginnen, Sebastian Vogel und Susanne Kuhlmann-Krieg

Mit 789 çberwiegend vierfarbigen Abbildungen und 36 Tabellen

12

1. deutsche Auflage

Gerald Karp, Hollywood

Ûbersetzer

Dr. Kurt Beginnen, Kæln Dr. Sebastian Vogel, Kerpen Susanne Kuhlmann-Krieg, Eppelheim Peter van der Geer Universitåt von San Diego, war maûgeblich verantwortlich fçr die Ûberarbeitung von Kapitel 15

Die vierte Auflage der englischen Originalausgabe Cell and Molecular Biology ± Concepts and Experiments erschien 2005. Copyright ° 1996, 1999, 2002, 2005 John Wiley & Sons, Inc. All rights reserved. Alle Rechte vorbehalten. Autorisierte Ûbersetzung der von John Wiley & Sons, Inc. publizierten englischen Originalausgabe.

ISBN 3-540-23857-3 Springer Berlin Heidelberg New York Bibliografische Information Der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet çber abrufbar. Dieses Werk ist urheberrechtlich geschçtzt. Die dadurch begrçndeten Rechte, insbesondere die der Ûbersetzung, des Nachdrucks, des Vortrags, der Entnahme von Abbildungen und Tabellen, der Funksendung, der Mikroverfilmung oder der Vervielfåltigung auf anderen Wegen und der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen, bleiben, auch bei nur auszugsweiser Verwertung, vorbehalten. Eine Vervielfåltigung dieses Werkes oder von Teilen dieses Werkes ist auch im Einzelfall nur in den Grenzen der gesetzlichen Bestimmungen des Urheberrechtsgesetzes der Bundesrepublik Deutschland vom 9. September 1965 in der jeweils geltenden Fassung zulåssig. Sie ist grundsåtzlich vergçtungspflichtig. Zuwiderhandlungen unterliegen den Strafbestimmungen des Urheberrechtsgesetzes. Springer ist ein Unternehmen von Springer Science+Business Media springer.de ° Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2005 Printed in Germany Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, dass solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und Markenschutz-Gesetzgebung als frei zu betrachten wåren und daher von jedermann benutzt werden dçrften. Produkthaftung: Fçr Angaben çber Dosierungsanweisungen und Applikationsformen kann vom Verlag keine Gewåhr çbernommen werden. Derartige Angaben mçssen vom jeweiligen Anwender im Einzelfall anhand anderer Literaturstellen auf ihre Richtigkeit çberprçft werden. Planung: Iris Lasch-Petersmann, Heidelberg Redaktion: Stefanie Wolf, Heidelberg Herstellung: Karl-Heinz Winter, Heidelberg Satz: K + V Fotosatz GmbH, Beerfelden Einbandgestaltung: deblik Berlin Titelbild: links: Werner A. Mçller, Heidelberg (aus Developmental Biology, Vol. 275, Mçller et al., Totipotent migratory stem cells in a hydroid, pp 215±224, Copyright 2004, mit freundlicher Genehmingung von Elsevier; rechts: Peter Mombaerts, New York (aus Cell, Vol. 117, Feinstein, Mombaerts: A Contextual Model for Axonal Sorting into Glomeruli in the Mouse Olfactory System, pp 817±846, Copyright 2004, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier) Gedruckt auf såurefreiem Papier ± 29/3150WI ± 5 4 3 2 1 0


  



Geleitwort

Der Kærper eines Erwachsenen besteht aus çber 50 000 Milliarden Zellen und ihren Produkten. Was wir physisch zu leisten vermægen, beruht auf Leistungen unserer extrem verschiedenen Zelltypen. Selbst unsere psychischen Fåhigkeiten setzen das Funktionieren der Nervenzellen in unserem komplexen Gehirn voraus. Aber nicht nur bei uns, sondern bei allen Lebewesen, von den kleinsten Einzellern bis zu den aus Millionen von Zellmilliarden aufgebauten Riesen des Tier- und Pflanzenreiches ± çberall fungiert die Zelle als Basiselement. Sie stellt das kleinste, fçr sich lebensfåhige System dar, den Mikrokosmos des Biologen. Ihr obliegt auch die pråzise Vervielfåltigung der in Nucleinsåuremolekçlen digital gespeicherten Erbinformation und ihre Weitergabe an kçnftige Generationen. In jeder einzelnen Zelle laufen die vielen Fåden zusammen von den molekularen Dimensionen herauf bis zu den Signalen aus Umwelt und çbergeordneten Steuerzentren im vielzelligen Organismus. Daher fållt der Zellbiologie im Verein mit Biochemie und Molekularbiologie, Genetik und Bioinformatik zwischen den Themengiganten Entwicklungsbiologie und Physiologie, Evolution und Systematik, Úkologie und Verhaltensbiologie in der Wissenschaft vom Leben eine zentrale Rolle zu. Das spiegelt sich auch in der modernen Medizin: Stichworte wie Krebs und Metastasen, Immunsystem und Killerzellen, Stammzellen, Zellpiraten oder programmierter Zelltod tauchen ståndig in den Medien auf. Schon vor knapp 150 Jahren war der Klassiker ,Cellularpathologie` des Mediziners Rudolf Virchow erschienen. Virchow hatte auch den Satz geprågt:         ± Zellen kænnen nur aus Zellen entstehen. Eineinhalb Jahrzehnte vorher war die allgemeine Verbreitung des zellulåren Baues bei Tieren und Pflanzen bekannt geworden, 20 Jahre vor Darwins      und 60 Jahre vor der Wiederentdeckung der Mendelschen Regeln. Damals also begann die breite Erforschung des mikroskopischen Zellbaues, der Zellteilung und Zellverschmelzung. Bald wurde klar, dass in der

Lebensevolution mit immer gleichen Modulen gespielt wurde ± eben mit Zellen. Allerdings stieû der Fortschritt nach und nach an eine methodische Grenze, nåmlich die Auflæsungsgrenze des Lichtmikroskops. Erst vor etwa 50 Jahren konnte diese dann auf breiter Front çberschritten werden. Neue Geråte wie Elektronenmikroskop und Ultrazentrifuge, neue Methoden wie Zellkultur und Zellfraktionierung, schlieûlich die rasante Entwicklung der Biochemie als zellulåre, subzellulåre und makromolekulare Chemie ermæglichten den Start der modernen Zellbiologie. Ihr Aufstieg hat sich seither immer weiter beschleunigt und zu einer explosiven Vermehrung von Wissen und neuen Einblicken gefçhrt. Diese Medaille hat nun freilich auch ihre Kehrseite. Wer heute Zellbiologie studiert, hat Gewaltiges vor ± viel Faszinierendes, aber eben auch gewaltig vieles. Da ist man auf solide Hilfe angewiesen. Das Buch, das Sie jetzt in der Hand halten, bietet sie Ihnen, bewåhrt und mustergçltig. Es ist klar gegliedert und strukturiert, ausgezeichnet bebildert, Zusammenfassungen, Fragen, Literatur, Weblinks, handliches Register, Erklårung der Fachausdrçcke, dazu immer wieder Ausblicke in medizinische und experimentelle Bereiche . . . und und und. Ûbrigens werden nicht nur den Lernenden, sondern auch den Lehrenden umfangreiche Hilfen geboten çber eine Internet Seite fçr Dozenten. Man spçrt es in jedem Kapitel, dass Gerald Karp seine Lehrtåtigkeit als Professor aufgegeben hat, um sich ganz der Optimierung dieses Buches zu widmen. Vor allem wird man ihm danken, dass er bei voller Aktualitåt den Umfang dieses Werkes durch den beispielhaft klaren und kompakten Text in handlichen Grenzen zu halten vermochte. Ich wçnsche dem Buch die Verbreitung, die es verdient. Und allen seinen Benutzern viel Freude und Erfolg im Zaubergarten der Zellbiologie! Peter Sitte

Vorwort zur 4. Auflage

Bevor ich mit der Arbeit an der ersten Ausgabe dieses Buches begonnen habe, habe ich eine Reihe von Grundregeln aufgestellt, die mein geplantes Buch erfçllen sollte. Mein Buch war als Begleitmaterial zu einem ein Semester oder zwei Halbsemester langen Kurs gedacht, wie ihn Studenten im ersten oder zweiten Jahr belegen. Daher begann ich, einen Text von ungefåhr 800 Seiten zu entwerfen, der diese Studenten weder çberfordern noch entmutigen sollte. In meinem Buch sollten grundlegende Zusammenhånge ausfçhrlich zur Sprache kommen: die Beziehung zwischen Struktur und Funktion im molekularen Bereich, die Dynamik zellulårer Organellen, die Nutzung chemischer Energie fçr die Zellaktivitåten und die korrekte Synthese von Makromolekçlen, die Einheit und Vielfalt auf der Ebene der Makromolekçle und Zellen sowie die Art, wie die Zellaktivitåten reguliert werden. Ich wollte meine Darstellung auf den experimentellen Ûberlegungen aufbauen, mit denen man sich dem jeweiligen Problem genåhert hatte. Die Zell- und Molekularbiologie ist eine experimentelle Wissenschaft, und wie die meisten Dozenten glaube ich, dass Studenten etwas darçber erfahren sollten, wie wir zu unserem Wissen kommen. Daher beschloss ich, dem experimentellen Charakter des Themas auf zweierlei Weise gerecht zu werden. Zum einen fçhre ich in allen Kapiteln gençgend experimentelle Belege an, damit man die zahlreichen Schlussfolgerungen, die gezogen wurden, nachvollziehen kann; dabei hebe ich die entscheidenden Punkte hervor, auf die es bei den wichtigen experimentellen Verfahren ankam. Zum anderen verweise ich die Leser auf eine ausfçhrlichere Erærterung im letzten Kapitel, in dem die Methoden behandelt werden. Kapitel 8 und 9 enthalten beispielsweise einfçhrende Abschnitte çber Techniken, die sich als åuûerst wichtig fçr die Analyse der Cytomembranen beziehungsweise des Cytoskeletts erwiesen haben. Im Hauptteil der jeweiligen Kapitel stelle ich auûerdem kurz ausgewåhlte Experimente vor, die fçr das jeweilige Thema besondere Bedeutung haben, um nochmals die ex-

perimentelle Basis unseres Wissens zu betonen. Die Methoden werden dann im letzten Kapitel ausfçhrlicher beschrieben, weil ich n die Erærterung eines bestimmten Themas nicht durch einen groûen Abschnitt çber Techniken, der das Thema nur am Rande berçhrt, unterbrechen wollte, n festgestellt habe, dass manche Dozenten eine bestimmte Technologie lieber unter verschiedenen Aspekten statt nur in Zusammenhang mit einem Thema erærtern mæchten. Fçr Studenten und Dozenten, die sich intensiver mit den jeweiligen experimentellen Ansåtzen auseinandersetzen mæchten, habe ich am Ende jedes Kapitels als Exkurs die Rubrik ¹Experimentelle Verfahrenª eingefçgt. Darin werden einige entscheidende experimentelle Befunde beschrieben, denen wir unseren aktuellen Wissensstand çber ein bestimmtes, fçr das jeweilige Kapitel relevantes Thema verdanken. Weil sich diese Berichte auf einen begrenzten Bereich konzentrieren, kann der experimentelle Ansatz ausfçhrlicher dargestellt werden. Die Abbildungen und Tabellen in diesen Abschnitten sind oft den Originalarbeiten entnommen. Dadurch hat der Leser die Mæglichkeit, sich die ursprçnglichen Daten anzusehen und davon zu çberzeugen, dass die Analyse diesen Rahmen nicht verlåsst. Die Rubrik ¹Experimentelle Verfahrenª verdeutlicht auûerdem, dass sich wissenschaftliche Erkenntnis schrittweise vollzieht und dass die Untersuchungsergebnisse oft neue Fragen aufwerfen, die dann zu weiteren Untersuchungen fçhren. Mein Buch sollte anregend und lesenswert sein. Um es fçr die Studenten, vor allem die Medizinstudenten, im Einfçhrungskurs attraktiver zu machen, habe ich als weiteren Exkurs die Rubrik ¹Aus der Sicht des Menschenª eingefçhrt. Diese Abschnitte zeigen, dass man praktisch såmtliche menschlichen Krankheiten auf eine Stærung von Aktivitåten auf zellulårer und molekularer Ebene zurçckfçhren kann. Darçber hinaus offenbaren sie, wie wichtig die Grundlagenforschung sowohl fçr das Verståndnis als auch letztlich fçr die Behandlung der meisten




Vorwort zur 4. Auflage

Krankheiten ist. In der Rubrik ¹Aus der Sicht des Menschenª von Kapitel 11 wird beispielsweise beschrieben, wieso kleine synthetische siRNAs zu einem wichtigen neuen Hilfsmittel fçr die Therapie von Krebs- und Virenerkrankungen einschlieûlich Aids werden kænnten. Im selben Kapitel erfåhrt der Leser, dass man aufgrund von Untersuchungen an Nematoden herausgefunden hat, wie solche RNAs wirken. Es wird deutlich, dass man die praktische Bedeutung der zell- und molekularbiologischen Grundlagenforschung nie vorhersagen kann. Darçber hinaus habe ich mich bemçht, çberall im Buch relevante Informationen zur Biologie des Menschen und zu klinischen Anwendungen mit einzubeziehen. Die Illustrationen sollten qualitativ hochwertig sein, damit sich die Studenten die komplexen zellulåren und molekularen Prozesse besser vorstellen kænnen. Dafçr wurden viele Abbildungen aufgeteilt, so dass die Information, die verarbeitet werden muss, strukturiert und çberschaubar ist. Die Ereignisse, die sich bei jedem Schritt abspielen, werden in den Legenden der Abbildungen und/oder im dazu gehærenden Text beschrieben. Ich habe auch versucht, zahlreiche mikroskopische Aufnahmen hereinzunehmen, um den Studenten die meisten erærterten Themen konkret vor Augen zu fçhren. Unter den Photographien sind auch viele Fluoreszenzaufnahmen, auf denen entweder deutlich wird, welche Dynamik Zellen besitzen, oder die eine Mæglichkeit bieten, die Position eines bestimmten Proteins oder einer speziellen Nucleinsåuresequenz zu bestimmen. Wann immer es mæglich war, habe ich versucht, den graphischen Darstellungen die entsprechenden mikroskopischen Aufnahmen gegençber zu stellen, damit die Studenten die idealisierte und die reale Form einer Struktur miteinander vergleichen kænnen. Ich habe mich sehr çber die Zuschriften von Dozenten und Studenten gefreut, welche die ersten drei Auflagen gelobt und kritisiert haben. Bei der Vorbereitung der vierten Auflage habe ich mich von diesen Kommentaren sowie von zahlreichen treffenden Kritiken am aktuellen Manuskript leiten lassen. Die wichtigsten Verånderungen in der vierten Auflage:

Unser Wissen çber die Zell- und Molekularbiologie ist ståndig im Fluss, woraus unser Fachgebiet einen Groûteil seiner Faszination bezieht. Obwohl seit der Veræffentlichung der dritten Auflage nur drei Jahre vergangen sind, wurde fast jedes Thema im Buch mehr oder weniger umgeschrieben, ohne dass allerdings die Kapitel långer geworden sind. Mehrere Exkurse der Rubrik ¹Experimentelle Verfahrenª aus der ersten Auflage sind nicht mehr im Buch vorhanden, wurden aber ins Internet gestellt. Von den 17 ursprçnglichen Exkursen sind noch neun im Buch (Kapitel 1, 2, 4, 8, 11, 14, 16, 17), wåhrend die çbrigen sieben unter www.wiley.com/college/karp im Netz zu finden sind. Letztere sind mit einem Maussymbol markiert, wenn sie im Text erwåhnt werden. Die Texte der Exkurse wurden, soweit es nætig war, auf den neuesten Stand gebracht. Der Exkurs ¹Experimentelle Verfahrenª aus Kapitel 3 çber den Mechanismus der Lysozymkatalyse wurde aufgrund neuer Befunde, die vieles davon als çberholt erscheinen lassen, herausgenommen. Zwei Exkurse aus der Rubrik ¹Aus Sicht des Menschenª aus der dritten Auflage wurden ersetzt. An die Stelle des Exkurses in Kapitel 9 çber Muskeldystrophie trat eine Diskussion çber Krankheiten, die durch eine anomale Cilienfunktion ausgelæst werden, wåhrend der in Kapitel 11 çber den Einsatz von Ribozymen und AntisenseOligonucleotiden durch eine Erærterung der potenziellen Anwendungsmæglichkeiten von siRNAs zur Therapie von Krankheiten ersetzt wurde. Alle Abbildungen der dritten Auflage wurden einer genauen Ûberprçfung unterzogen und viele Illustrationen, die in der vierten Auflage wieder verwendet wurden, wurden, falls erforderlich, modifiziert. Viele Zeichnungen aus der dritten Auflage wurden herausgenommen, um Platz fçr etwa 65 neue zu schaffen. Dozenten haben sich besonders fçr Abbildungen ausgesprochen, in denen Zeichnungen und mikroskopische Aufnahmen nebeneinander gestellt sind; daher findet man in der vierten Auflage håufiger diese Art der Darstellung. Insgesamt enthålt die vierte Auflage etwa 90 neue mikroskopische Aufnahmen und mit dem Computer bearbeitete Bilder, die alle aus den Originalarbeiten stammen.

Ûber den Autor

Gerald C. Karp hat seinen Bachelor-Grad an der UCLA erworben und an der University of Washington promoviert. Er arbeitete als Postdoc am Medical Center der University of Colorado, bevor er begann, an der University of Florida zu lehren. Gerry hat zahlreiche Artikel çber die Zell- und Molekularbiologie der frçhen Entwicklung geschrieben. Zu seinen Forschungsgebieten gehærten die RNA-Synthese frçher Embryonen, die Bewegung mesenchymaler Zellen wåhrend der Gastrulation sowie die Zelldetermination bei Schleimpilzen. Er hat an der University of Flori-

da 13 Jahre lang Kurse in Molekular-, Zell- und Entwicklungsbiologie gegeben. In dieser Zeit schrieb er zusammen mit N. John Berrill ein Buch çber Entwicklungsbiologie und verfasste ein Buch çber Zell- und Molekularbiologie. Da Gerry es schwierig fand, seine Lehrtåtigkeit und die Arbeit als Autor unter einen Hut zu bringen, gab er seine Stellung an der Fakultåt auf und konzentrierte sich ganz auf das Schreiben. Er hofft, alle drei Jahre eine çberarbeitete Fassung dieses Buchs herausbringen zu kænnen.

Fçr die Studenten

Zu der Zeit, als ich auf das College gegangen bin, gehærte Biologie zu den Hauptfåchern, die am wenigsten beliebt waren. Ich schrieb mich in einen Kurs fçr physische Anthropologie ein, um die Anforderungen fçr die Biowissenschaften mit so wenig Aufwand wie mæglich zu erfçllen. In diesem Kurs erfuhr ich zum ersten Mal etwas çber Chromosomen, Mitose und genetische Rekombination und war fasziniert davon, welch komplizierte Prozesse in einem so kleinen Raum wie einer Zelle ablaufen kænnen. Im nåchsten Semester belegte ich die Einfçhrungsvorlesung in die Biologie und begann ernsthaft darçber nachzudenken, Zellbiologe zu werden. Ich erzåhle Ihnen diese trivialen Geschichten aus meinem Leben, damit Sie verstehen, warum ich dieses Buch geschrieben habe, und um Sie vor mæglichen Konsequenzen zu warnen. Obwohl inzwischen viele Jahre vergangen sind, halte ich die Zellbiologie immer noch fçr das faszinierendste Forschungsgebiet und verbringe meine Tage gerne damit, die Forschungsergebnisse meiner Fachkollegen zu studieren. Ein Buch çber Zellbiologie zu schreiben, ist daher fçr mich ein ausgezeichneter Grund und eine gute Gelegenheit, mich in meinem Fachgebiet auf dem Laufenden zu halten. Ich schreibe dieses Buch vor allem deshalb, weil ich in den Studenten das Verståndnis und die Bewunderung fçr die Aktivitåten der riesigen Molekçle und winzigen Strukturen dieser zellulåren Lebenswelt wecken mæchte. Ein weiteres Ziel besteht darin, den Lesern einen Einblick darin zu verschaffen, welche Art Fragen sich Zell- und Molekularbiologen stellen und mit welchen experimentellen Ansåtzen sie nach Antworten suchen. Denken Sie, wenn Sie dieses Buch lesen, wie ein Wissenschaftler! Sehen Sie sich an, welche Beweise pråsentiert werden, suchen Sie nach alternativen Erklårungen, planen Sie Experimente, die zu neuen Hypothesen fçhren kænnten! Sie kænnten etwa damit beginnen, indem sie sich eine der vielen elektronenmikroskopischen Aufnahmen ansehen, die es in diesem Buch gibt. Um diese Aufnahmen zu machen, sitzen Sie in einem kleinen, vællig dunklen Raum vor einem groûen metallischen Apparat mit einer Såule,

die mehrere Meter çber Ihren Kopf hinausragt. Sie blicken durch ein Binokular auf einen belebten hellgrçnen Schirm. Die Teile der Zelle, die Sie untersuchen, erscheinen dunkel und farblos vor dem hellgrçnen Hintergrund. Sie sind dunkel, weil sie mit Schwermetallionen gefårbt wurden, die einen Teil der Elektronen innerhalb eines Strahls ablenken, der durch groûe elektromagnetische Linsen in der Såulenwand auf den Bildschirm zentriert wird. Die Elektronen, die auf den Schirm auftreffen, werden durch das Vakuum in der Såule mit einer Stårke von Zehntausenden von Volt beschleunigt. In der Hand haben Sie vielleicht einen Knopf, mit dem Sie die Vergræûerung der Linsen einstellen kænnen. Durch einfaches Drehen an diesem Knopf kann sich das Bild vor Ihren Augen von einer Gesamtansicht der Zellen zu einem winzigen Teil einer Zelle wie etwa einigen Ribosomen oder einem kleinen Abschnitt einer einzigen Membran verengen. Mit Hilfe anderer Knæpfe kænnen Sie verschiedene Bereiche des Objekts çber den Schirm gleiten sehen, so dass Sie das Gefçhl haben, als wçrden Sie in einer Zelle herumfahren. Wenn Sie eine Struktur gefunden haben, die Sie interessiert, kænnen Sie an einer Kurbel drehen, die den Schirm aus dem Blickfeld klappt, so dass der Elektronenstrahl auf den Film auftrifft und ein photographisches Abbild des Untersuchungsmaterials entsteht. Weil zur Untersuchung der Zellfunktion insgesamt ein betråchtliches Instrumentarium wie beispielsweise das gerade beschriebene Elektronenmikroskop erforderlich ist, hat der Forscher keinen direkten Zugang zu seinem Untersuchungsobjekt. Zellen åhneln stark winzigen Blackboxes. Wir haben zwar viele Mæglichkeiten entwickelt, diese Kåsten zu untersuchen, tappen jedoch immer in einem Bereich herum, der nicht richtig ausgeleuchtet werden kann. Wenn eine Entdeckung gemacht oder eine neue Technik entwickelt wird, dringt ein neuer dçnner Lichtstrahl in den Kasten ein. Weitere Arbeiten vertiefen unser Verståndnis von seinem Aufbau oder einem darin ablaufenden Prozess, stellen uns aber auch immer wieder vor neue Fragen. Wir erarbeiten immer komplexere und raffinier-




Fçr die Studenten

tere Modelle, kænnen aber nie sicher sein, wie weit wir uns mit unserer Vorstellung schon der Realitåt angenåhert haben. In dieser Hinsicht lassen sich die Forschungsarbeiten in der Zellund Molekularbiologie mit der Untersuchung eines Elefanten vergleichen, zu der in einem alten indischen Mårchen sechs blinde Månner antreten. Die sechs besuchen einen in der Nåhe gelegenen Palast, um etwas çber die Natur von Elefanten zu erfahren. Als sie angekommen sind, nåhert sich jeder von ihnen dem Elefanten und beginnt, ihn zu betasten. Der erste Blinde befçhlt die Flanke des Elefanten und kommt zu dem Schluss, dass ein Elefant glatt wie eine Wand ist. Der zweite berçhrt den Rçssel und meint, ein Elefant sei rund wie eine Schlange. Die anderen Mitglieder der Gruppe fassen einen Stoûzahn, ein Bein, ein Ohr beziehungsweise den Schwanz des Elefanten an, und ihre Eindrçcke vom Tier sind jeweils von den eigenen begrenzten Erfahrungen geprågt. Die Erkenntnisse, die Zellbiologen mithilfe einer bestimmten Technik oder eines experimentellen Ansatzes gewinnen kænnen, sind åhnlich beschrånkt. Obwohl jede neue Information unser Wissen erweitert und so zu einer besseren Vorstellung von der untersuchten Aktivitåt fçhrt, bleibt das Gesamtbild jedoch weiterhin undeutlich. Bevor ich diese Einleitung beende, mæchte ich mir die Freiheit nehmen, den Lesern einige Ratschlåge zu geben: Glauben Sie nicht alles, was sie lesen! Man sollte aus mehreren Grçnden skeptisch sein. Dieses Buch enthålt bestimmt Fehler, weil der Autor bestimmte Dinge nicht gewusst oder irgendeinen Aspekt der wissenschaftlichen Literatur falsch gedeutet hat. Wichtiger ist

aber, dass wir uns das Wesen wissenschaftlicher Forschung vor Augen halten. Biologie ist eine empirische Wissenschaft ± nichts ist je exakt bewiesen. Wir sammeln Daten çber ein bestimmtes Zellorganell, eine bestimmte Stoffwechselreaktion, intrazellulåre Bewegung usw. und ziehen daraus unsere Schlçsse. Bei manchen Schlussfolgerungen sind die Beweise stichhaltiger als bei anderen. Aber selbst wenn sich Wissenschaftler çber die ¹Faktenª zu einem bestimmten Phånomen einig sind, kann man diese Daten oft noch unterschiedlich interpretieren. Es werden Hypothesen aufgestellt, die im Allgemeinen zu weiteren Forschungsarbeiten und so zu einer Neubewertung der ursprçnglichen These fçhren. Selbst die meisten Hypothesen, die ihre Gçltigkeit behalten, machen eine Art Evolution durch und sollten, wenn sie im Buch dargestellt werden, nicht als vollkommen richtig oder falsch angesehen werden. Zellbiologie ist ein Gebiet, das sich schnell wandelt, und einige der besten Hypothesen werden oft sehr kontrovers diskutiert. Obwohl das hier ein Lehrbuch ist, von dem man erwartet, dass es nur ausreichend fundiertes Wissen beinhaltet, gibt es doch viele Abschnitte, in denen neue Ideen vorgestellt werden. Diese Ideen werden oft als Modelle bezeichnet. Ich habe solche Modelle mit aufgenommen, weil sie, selbst wenn sie spekulativ sind, widerspiegeln, welche Vorstellungen gerade auf dem entsprechenden Gebiet vorherrschen. Sie verstårken den Eindruck, dass Zellbiologen an vorderster Front der Wissenschaft operieren, einem Gebiet zwischen Bekanntem und Unbekanntem. Bewahren Sie sich also ihre Skepsis!

Danksagung

An der Entstehung dieses Buches waren viele Personen beteiligt. Ich mæchte als erstes Peter van der Geer vom Department of Chemistry and Biochemistry der University of California, San Diego, danken. Peter war so freundlich, die Hauptverantwortung fçr die Ûberarbeitung des Kapitels 15 zu çbernehmen, das dem Thema Zellkommunikation gewidmet ist. Ich danke Geraldine Osnato, die eine auûergewæhnliche Herausgeberin ist. Wir haben das Verfahren fçr diese Ûberarbeitung gemeinsam festgelegt, und auch spåter konnte ich mich immer auf ihr vernçnftiges Urteil verlassen. Vielen Dank, Geraldine, fçr deine Hilfe und Ratschlåge! Zu besonderem Dank verpflichtet bin ich dem Produktionsteam von John Wiley & Sons, das schlicht das beste ist. Barbara Russiello, die fçr die Herstellung verantwortlich war, hat sich schon bei den letzten drei Ausgaben im wahrsten Sinne des Wortes als ¹treibende Kraftª erwiesen. Barbara will immer mæglichst das beste Buch herstellen ± egal, wie viel Zeit und Energie sie dafçr in ein Projekt investieren muss. Hilary Newman und Anna Melhorn waren fçr die Photos beziehungsweise Graphik verantwortlich. Es war ein Glçcksfall fçr mich, bei allen vier Ausgaben des Buches mit Hilary zusammenarbeiten zu kænnen. Hilary ist clever und beharrlich, und ich habe græûtes Zutrauen zu ihrer Fåhigkeit, jedes Bild zu bekommen, um das man sie bittet. Es war auch eine groûe Freude, zum zweiten Mal mit Anna zusammen zu arbeiten. Das Programm fçr die Illustration dieses Buches ist sehr kompliziert, aber Anna hat es wunderbar geschafft, die vielen Einzelheiten im Auge zu behalten und zu koordinieren, die fçr die Fertigstellung erforderlich waren. Ich hatte auch wieder mal das Glçck, dass Harry Nolan fçr die graphische Gestaltung verantwortlich war. Harry hat Dynamik in das Layout der Kapitel gebracht und der Titelseite Eleganz verliehen. Clay Stone war bei der letzten Ausgabe ein phantastischer Marketingdirektor, was mir die Zuversicht gibt, dass er es auch bei der anstehenden Aufgabe sein wird. Ich mæchte auch gerne den Kçnstlern von Imagineering fçr all die neuen Zeichnungen danken. Besonders Kierstan Hong hat eine wich-

tige Rolle bei der Koordination des Kunstprogramms gespielt. Ich war sehr zufrieden mit den auûergewæhnlich guten Graphiken, die das Studio erstellt hat. Mein Dank gilt auch den Professoren David Asai und Ken Robinson von der Purdue University, die zu den Kapiteln 2 und 5 eine Reihe interessanter Fragen zur Selbstçberprçfung beigesteuert haben. Ein spezieller Dank geht an Dana Kasowitz, çber die çberwiegend die redaktionelle Kommunikation lief und die immer eine groûe Hilfe war. Darçber hinaus mæchte ich Brian Rose danken, der das Manuskript lektoriert hat, Steve Ingle, der den Index erstellt hat, sowie Dr. Elizabeth Coolidge-Stolz, die das Glossar verfasst hat. Besonders dankbar bin ich den zahlreichen Biologen, die fçr dieses Buch mikroskopische Aufnahmen zur Verfçgung gestellt haben. Mehr als jedes andere Element sorgen diese Bilder dafçr, dass die Erforschung der Zellbiologie selbst auf gedrucktem Papier lebendig wird. Schlieûlich mæchte ich mich im Voraus fçr såmtliche Fehler im Buch entschuldigen und mein tiefes Bedauern darçber ausdrçcken. Kommentare und Kritik jeglicher Art sind sehr willkommen und kænnen an folgende Adresse geschickt werden: Biology Editor, John Wiley & Sons, 111 River Street, Hoboken, NJ 07030. Bei der Abfassung der Endversion des Manuskripts zur 3. Auflage habe ich zahlreiche Wissenschaftler um Rat gefragt, deren Arbeit ich bewundere. Ich habe diese Personen gebeten, ein oder zwei Kapitel durchzusehen; die meisten von ihnen waren so freundlich, mir bei dem Projekt zu helfen. Folgenden Personen bin ich fçr ihre konstruktive Kritik und guten Ratschlåge dankbar: William E. Balch The Scripps Research Institute Wendy A. Bickmore Medical Research Council, Groûbritannien Sharon K. Bullock Virginia Commonwealth University Roderick A. Capaldi University of Oregon




Danksagung

Gordon G. Carmichael University of Connecticut Health Center

Andrew Newman Cambridge University

Ratna Chakrabarti University of Central Florida

Alan Nighorn University of Arizona

Dennis O. Clegg University of California ± Santa Barbara

Jonathan Nugent University of London

Orna Cohen-Fix National Institute of Health, Laboratory of Molecular and Cellular Biology

Joel L. Rosenbaum Yale University

Philippa D. Darbre University of Reading Roger W. Davenport University of Maryland Barry J. Dickson Research Institute of Molecular Pathology Jennifer A. Doudna Yale University Evan E. Eichler Case Western University School of Medicine Jacek Gaertig University of Georgia Reginald Halaby Montclair State University Robert Helling University of Michigan

Wolfram Saenger Freie Universitåt Berlin E. D. Salmon University of North Carolina ± Chapel Hill Trina Schroer Johns Hopkins University David Schultz University of Louisville Katie Shannon University of North Carolina ± Chapel Hill Joel B. Sheffield Temple University Dennis Shevlin College of New Jersey Harriette Smith-Somerville University of Alabama

Gregory D. D. Hurst University College London

Colleen Talbot California State University

Ken Jacobson University of North Carolina

Giselle Uhibaudeau Mississippi State University

Haig H. Kazazian, Jr. University of Pennsylvania

Jeffrey L. Travis University at Albany ± Suny

Laura R. Keller Florida State University

Paul Twigg University of Nebraska ± Kearney

Nemat O. Keyhani University of Florida

Ajit Varki University of California ± San Diego

Nancy Kleckner Harvard University

Andrew Webber Arizona State University

Robert C. Liddington Burnham Institute

Beverly Wendland Johns Hopkins University

Jeannette M. Loutsch Arizona State University

Eric V. Wong University of Louisville

Charles Mallery University of Miami

Gary Yellen Harvard Medical School

Thomas McKnight Texas A&M University

Masasuke Yoshida Tokyo Institute of Technology

Michelle Moritz University of California ± San Francisco

Robert A. Zimmerman University of Massachusetts


 

                        Linda Amos MRC Laboratory of Molecular Biology Gerald T. Babcock Michigan State University James Barber Imperial College of Science ± Wolfson Laboratories John D. Bell Brigham Young University Daniel Branton Harvard University Thomas R. Breen Southern Illinois University K. H. Andy Choo Royal Children's Hospital ± the Murdoch Institute

Danksagung

Jennifer W. Schuler Wake Forest University Rod Scott Wheaton College Bruce Stillman Cold Springs Harbor Laboratory Nigel Unwin MRC Laboratory of Molecular Biology Chris Watters Middlebury College David J. Asai Purdue University John D. Bell Brigham Young University Barbara Berg University of Puget Sound Niels Bols University of Waterloo, Ontario, Canada

Ronald H. Cooper University of California ± Los Angeles

Thomas R. Breen Southern Illinois University ± Carbondale

Michael Edidin The Johns Hopkins University

David K. Bruck San Jose State University

Robert Fillingame University of Wisconsin Medical School

Mitchell Chernin Bucknell University

Arthur Horwich Yale University School of Medicine

Thomas C. Chiles Boston College

Joel A. Huberman Roswell Park Cancer Institute

Randy W. Cohen California State University ± Northridge

Werner Kçhlbrandt Max-Planck-Institut fçr Biophysik

Dennis O. Clegg University of California ± Santa Barbara

James Lake University of California ± Los Angeles

Guy E. Farish Adams State College

Vishwanath R. Lingappa University of California ± San Francisco

Susannah Gal Suny, Binghamton

Ardythe A. McKracken University of Nevada ± Reno

Francine S. Glazer Kean University

Mike O'Donnell Rockefeller University

Margaret Johnson University of Alabama

Hugh R. B. Pelham MRC Laboratory of Molecular Biology

David Knecht University of Connecticut ± Storrs

Jonathan Pines Wellcome/Crc Institute

Robert N. Leamson University of Massachusetts ± Dartmouth

Randy Schekman University of California ± Berkeley

Esther M. Leise University of North Carolina ± Greensboro

Sandra Schmid The Scripps Research Institute

Alan C. Leonard Florida Institute of Technology







Danksagung

Edward J. Macarak University of Pennsylvania

David Fromson California State University ± Fullerton

Luis A. Materon University of Texas ± Pan American

David S. Gilmour Pennsylvania State University ± University Park

Elizabeth J. Moore Rowan University

R. Jane Hanas University of Central Oklahoma

Dennis G. Searcy University of Massachusetts Diane Shakes College of William and Mary David H. Vickers University of Central Florida Anne E. K. Zayaitz Kutztown University
 

            Robert E. Bast Cleveland State University Catherine P. Chia University of Nebraska ± Lincoln Sherri Clark Eastern New Mexico University

Thomas Kistenmacher Johns Hopkins University Hallie M. Krider The University of Connecticut Mary Lee S. Ledbetter College of the Holy Cross Joel Piperberg Millersville University of Pennsylvania Nancy L. Pruitt Colgate University Thomas M. Roberts Florida State University Robert Seagull Hofstra University Joel Sheffield Temple University Sheldon Shen Iowa State University

Julia Dragolovich University of Maryland

John Tyson Virginia Polytechnic Institute

Karl Drlica Public Health Research Institute

Fred Warner Syracuse University

Terrence G. Frey San Diego State University

Xilin Zhao Public Health Research Institute

Inhaltsçbersicht

1

Einfçhrung in die Zell- und Molekularbiologie

2

Die chemischen Grundlagen des Lebens

41

3

Bioenergetik, Enzyme und Stoffwechsel

109

4

Struktur und Funktion der Plasmamembran

155

5

Die Zellatmung und das Mitochondrium

233

6

Photosynthese und der Chloroplast

277

7

Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihrer Umgebung

309

8

Membransysteme im Cytoplasma: Struktur, Funktion und Membrantransport

353

Cytoskelett und Zellbewegungen

419

10

Gene und Genom

491

11

Die Expression des genetischen Materials: von der Transkription zur Translation

541

12

Der Zellkern und die Steuerung der Genexpression

609

13

DNA-Replikation und DNA-Reparatur

679

14

Fortpflanzung von Zellen

713

15

Zellulåre Signale und Signalçbertragung: Kommunikation zwischen Zellen

771

16

Krebs

829

17

Die Immunantwort

869

18

Techniken der Zell- und Molekularbiologie

911

9

Glossar

1

971

Nobelpreise Zell- und Molekularbiologie seit 1958

1003

Sach- und Personenverzeichnis

1007

Inhaltsverzeichnis

1

Einfçhrung in die Zellund Molekularbiologie

1

1.1

Die Entdeckung der Zellen

2

1.2

Die elementaren Eigenschaften von Zellen 3 Zellen sind hochkomplex und hochorganisiert 4 Zellen besitzen ein genetisches Programm sowie die Mittel, es zu benutzen 6 Zellen kænnen sich selbst vermehren 6 Zellen gewinnen und verbrauchen Energie 6 In Zellen laufen viele verschiedene chemische Reaktionen ab 7 Zellen fçhren zahlreiche mechanische Aktivitåten durch 7 Zellen kænnen auf Reize reagieren 7 Zellen kænnen sich selber regulieren 7 Zellen durchlaufen eine Evolution 8

1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 1.2.5 1.2.6 1.2.7 1.2.8 1.2.9 1.3 1.3.1 1.3.2 1.3.3

1.3.4

1.4 1.4.1

Zwei grundverschiedene Zellarten 9 Merkmale, in denen sich prokaryotische und eukaryotische Zellen unterscheiden 11 Prokaryotische Zelltypen 16 Eukaryotische Zelltypen: Zellspezialisierung 19 Aus Sicht des Menschen: Aussichten einer Zellersatztherapie

Die Græûe der Zellen und ihrer Bestandteile 25 Viren 26 Viroide 30

22

2

Die chemischen Grundlagen des Lebens 41

2.1 2.1.1 2.1.2

Kovalente Bindungen 42 Polare und unpolare Molekçle 44 Ionisierung 44

2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4

Såuren, Basen und Puffer

2.4

Die Eigenschaften biologischer Molekçle 53 Funktionelle Gruppen 54 Eine Klassifizierung biologischer Molekçle aufgrund ihrer Funktion 54

2.4.1 2.4.2 2.5 2.5.1 2.5.2 2.5.3 2.5.5 2.6 2.6.1

Experimentelle Verfahren: Wie sind die eukaryotischen Zellen entstanden? 31

51

Vier Arten von biologischen Molekçlen 56 Kohlenhydrate 56 Lipide 62 Proteine 64

Aus Sicht des Menschen: Proteinfaltung mit tædlichen Folgen

Nucleinsåuren 95

82

Die Bildung komplexer makromolekularer Strukturen 97 Der Aufbau der Partikel und ribosomalen Untereinheiten des Tabakmosaikvirus 98

Experimentelle Verfahren: Chaperone helfen Proteinen, sich richtig zu falten 99

Zusammenfassung 104

Zur Selbstçberprçfung 39 Weiterfçhrende Literatur 40

Nichtkovalente Bindungen 46 Ionenbindungen: Anziehungskråfte zwischen geladenen Atomen 47 Wasserstoffbrçcken 47 Hydrophobe Wechselwirkungen und van-der-Waals-Kråfte 48 Die lebenserhaltenden Eigenschaften des Wassers 49

2.3

Zusammenfassung 38

1.5

Aus Sicht des Menschen: Fçr den Alterungsprozess sind freie Radikale verantwortlich 45

Zur Selbstçberprçfung 106 2.7

Weiterfçhrende Literatur 107





Inhaltsverzeichnis

3

Bioenergetik, Enzyme und Stoffwechsel 109

4.4.2

3.1 3.1.1

Bioenergetik 110 Die Gesetze der Thermodynamik und der Begriff der Entropie 110 Freie Enthalpie 113

4.4.3 4.4.4

3.1.2 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.2.5

3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4

3.4

Enzyme, die biologischen Katalysatoren 120 Die Eigenschaften von Enzymen 121 Ûberwindung der Schwelle der Aktivierungsenergie 122 Das aktive Zentrum und die Spezifitåt der Molekçle 124 Mechanismen der enzymatischen Katalyse 126 Enzymkinetik 129

Aus Sicht des Menschen: Das wachsende Problem der Antibiotikaresistenz 134

Stoffwechsel 137 Ein Ûberblick çber den Stoffwechsel 137 Oxidation und Reduktion ± eine Sache der Elektronen 138 Energiegewinnung und -verbrauch 139 Regulation des Stoffwechsels 145

4.5 4.5.1 4.5.2 4.5.3 4.5.4 4.6 4.6.1 4.6.2 4.6.3 4.7 4.7.1

Zusammenfassung 149

4.7.2

Zur Selbstçberprçfung 151

4.7.3 4.7.4

Weiterfçhrende Literatur 153

4.8

4

Struktur und Funktion der Plasmamembran 155

4.1

Ein Ûberblick çber die Funktionen der Plasmamembran 157

4.2

4.3 4.3.1 4.3.2 4.4 4.4.1

4.8.1 4.8.2 4.8.3 4.8.4

Eine kurze Geschichte der Untersuchungen zur Struktur der Plasmamembran 158

Membranlipide und die Fluiditåt der Membran 175 Die Bedeutung der Fluiditåt einer Membran 176 Die Aufrechterhaltung der Membranfluiditåt 177 Die Asymmetrie der Membranlipide 177 Lipidflæûe 178 Dynamische Prozesse in der Plasmamembran 179 Die Diffusion der Membranproteine nach der Zellfusion 180 Einschrånkungen der Proteinund Lipidmobilitåt 180 Die Struktur der Plasmamembran am Beispiel des roten Blutkærperchens 186 Wie Substanzen Zellmembranen passieren 189 Die Energetik der Bewegung gelæster Stoffe 190 Diffusion von Substanzen durch Membranen 191 Erleichterte Diffusion 201 Aktiver Transport 202

Aus Sicht des Menschen: Eine Erbkrankheit, die durch defekte Ionenkanåle verursacht wird 206

Membranpotenziale und Nervenimpulse 210 Das Ruhepotenzial 211 Das Aktionspotenzial 212 Weiterleitung von Aktionspotenzialen als Impuls 214 Signalçbertragung im Nervensystem: Wie der synaptische Spalt çberbrçckt wird 215 Experimentelle Verfahren: Der Acetylcholinrezeptor 220

Die chemische Zusammensetzung der Membranen 161 Membranlipide 161 Kohlenhydrate in der Membran 165 Struktur und Funktionen von Membranproteinen 167 Integrale Membranproteine 168

Untersuchung der Struktur und Eigenschaften integraler Membranproteine 169 Periphere Membranproteine 174 Im Lipid verankerte Membranproteine 175

Zusammenfassung 226 Zur Selbstçberprçfung 228 4.9

Weitere Literatur 230



5 5.1 5.1.1 5.1.2 5.2 5.2.1 5.2.2

Inhaltsverzeichnis

Die Zellatmung und das Mitochondrium

6.3 6.3.1

Die Lichtabsorption 283 Photosynthetisch aktive Pigmente 283

Struktur und Funktion der Mitochondrien 234 Mitochondrienmembranen 235 Die mitochondriale Matrix 236

6.4

Der oxidative Stoffwechsel in den Mitochondrien 237 Der Citratzyklus 238 Die Bedeutung der reduzierten Coenzyme fçr die ATP-Synthese 242

6.4.2

Photosynthese-Einheiten und Reaktionszentren 285 Sauerstoffbildung: Koordination der Aktionen zweier verschiedener Photosynthesesysteme 286 Unkrautbekåmpfung durch Hemmung des Elektronentransports 293

233

Aus Sicht des Menschen: Die Bedeutung des anaeroben und aeroben Stoffwechsels fçr das kærperliche Training 243

5.3 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.4

5.5 5.5.1 5.5.2 5.5.3

5.6

Die Bedeutung der Mitochondrien fçr die ATP-Produktion 245 Redoxpotenziale 245 Elektronentransport 247 Typen von Elektronencarriern 248

6.4.1

6.5 6.5.1

Photophosphorylierung 294 Nichtzyklische und zyklische Photophosphorylierung 294

6.6

Kohlendioxidfixierung und Kohlenhydratsynthese Kohlenhydratsynthese in C3-Pflanzen 295 Kohlenhydratsynthese in C4-Pflanzen 301 Kohlenhydratsynthese in CAM-Pflanzen 303

6.6.1 6.6.2 6.6.3

Der Protonenfluss und die Erzeugung einer protonenmotorischen Kraft 255 Der Apparat fçr die ATP-Synthese 257 Die Struktur der ATP-Synthase 258 ATP-Synthese durch Bindungswechsel 260 Weitere Aufgaben der protonenmotorischen Kraft neben der ATP-Synthese 266 Peroxisomen 267 Aus Sicht des Menschen: Krankheiten aufgrund defekter Mitochondrien oder Peroxisomen 269

Zusammenfassung 272 Zur Selbstçberprçfung 274 5.7

Zur Selbstçberprçfung 305 6.7

Weitere Literatur 307

7

Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihrer Umgebung 309

7.1 7.1.1

Der extrazellulåre Raum 310 Die extrazellulåre Matrix 311

7.2

Wechselwirkungen zwischen Zellen und extrazellulåren Materialien 320 Integrine 320 Fokalkontakte und Hemidesmosomen verankern Zellen auf ihrer Unterlage 323

7.2.1 7.2.2

Weiterfçhrende Literatur 275

Photosynthese und der Chloroplast

277

6.1

Struktur und Funktion des Chloroplasten 279

6.2

Ein Ûberblick çber den Photosynthesestoffwechsel 281

295

Zusammenfassung 303

7.3

6





7.3.1 7.3.2 7.3.3

7.3.4

Wechselwirkungen zwischen Zellen 327 Selectine 327 Immunglobuline und Integrine 329 Cadherine 330

Aus Sicht des Menschen: Die Rolle der Zelladhåsion bei Entzçndungsprozessen und Metastasenbildung 333

Adhårenzverbindungen und Desmosomen: Verankerung von Zellen an anderen Zellen 335



 7.3.5

7.4 7.5

Inhaltsverzeichnis

Die Rolle von Zell-AdhåsionsRezeptoren bei der transmembranen Signalçbertragung 338 Tight Junctions versiegeln den extrazellulåren Raum 339

7.5.1

Gap Junctions und Plasmodesmen vermitteln bei der intrazellulåren Kommunikation 342 Plasmodesmen 344

7.6

Zellwånde

8.5 8.5.1 8.5.2 8.5.3 8.5.4

345

Zusammenfassung 349

8.6

Weiterfçhrende Literatur 351

8

Membransysteme im Cytoplasma: Struktur, Funktion und Membrantransport 353

8.1

Das Endomembransystem: ein Ûberblick 354

8.2

Untersuchungsverfahren fçr Endomembranen 357 Neue Erkenntnisse durch Autoradiographie 357 Erkenntnisse, gewonnen durch die Verwendung des grçn fluoreszierenden Proteins 358 Erkenntnisse durch biochemische Analyse subzellulårer Fraktionen 358 Erkenntnisse durch Verwendung zellfreier Systeme 360 Erkenntnisse aus der Untersuchung genetischer Mutanten 361

8.2.1 8.2.2 8.2.3 8.2.4 8.2.5 8.3 8.3.1 8.3.2 8.3.3

8.4 8.4.1 8.4.2

Das endoplasmatische Retikulum 363 Das glatte endoplasmatische Retikulum 363 Funktionen des rauen endoplasmatischen Retikulums 365 Vom ER zum Golgi-Apparat: der erste Schritt des Vesikeltransports 376 Der Golgi-Apparat 376 Glycosylierung im Golgi-Apparat 377 Die Wanderung von Substanzen durch den Golgi-Apparat 379

Lysosomen

392

Aus Sicht des Menschen: Krankheiten durch Funktionsstærungen der Lysosomen 394

Zur Selbstçberprçfung 350 7.7

Typen des Vesikeltransports und ihre Funktionen 382 COPII-Coated-Vesicles: Substanztransport vom ER zum Golgi-Apparat 384 COPI-Coated-Vesicles: Rçcktransport entwischter Proteine ins ER 385 Jenseits des Golgi-Apparats: Sortierung der Proteine im TGN 386 Gerichteter Vesikeltransport in bestimmte Kompartimente 388

8.7

Die Vakuole der Pflanzenzellen

8.8

Der Endocytoseweg: Transport von Membranen und Substanzen ins Zellinnere 397 Endocytose 398 Phagocytose 404

8.8.1 8.8.2 8.9

8.9.1 8.9.2 8.9.3

396

Aufnahme fertig synthetisierter Proteine durch Peroxisomen, Mitochondrien und Chloroplasten 406 Aufnahme von Proteinen in Peroxisomen 406 Aufnahme von Proteinen in Mitochondrien 406 Aufnahme von Proteinen in Chloroplasten 408 Experimentelle Verfahren: Rezeptorvermittelte Endocytose

409

Zusammenfassung 414 Zur Selbstçberprçfung 416 8.10

Literatur 417

9

Cytoskelett und Zellbewegungen 419

9.1

Die wichtigsten Funktionen des Cytoskeletts: eine Ûbersicht 420

9.2

Die Untersuchung des Cytoskeletts 422 Fluoreszenzmikroskopie 422 Videomikroskopie und Laserstrahlen im In-vitro-Beweglichkeitsassay 423

9.2.1 9.2.2



Inhaltsverzeichnis

9.2.3

Zellen mit verånderter Genexpression 424

9.3 9.3.1 9.3.2 9.3.3

Mikrotubuli 426 Aufbau und Zusammensetzung 426 Mikrotubuliassoziierte Proteine 427 Mikrotubuli als Strukturgerçst und Organisatoren 427 Mikrotubuli als Hilfsmittel fçr Bewegungen im Zellinneren 429 Motorproteine und ihre Wanderung an den Mikrotubuli des Cytoskeletts 429 Mikrotubuli-Organisationszentren (MTOCs) 435 Die dynamischen Eigenschaften der Mikrotubuli 439

9.3.4 9.3.5 9.3.6 9.3.7

9.3.8 9.3.9 9.4 9.4.1 9.4.2 9.5 9.5.1 9.5.2

Aus Sicht des Menschen: Die Bedeutung der Cilien fçr Entwicklung und Krankheitsentstehung 444

Cilien und Flagellen: Struktur und Funktion 445 Der Aufbau von Cilien und Flagellen 446

Intermediårfilamente 453 Auf- und Abbau der Intermediårfilamente 454 Typen und Funktionen von Intermediårfilamenten 456 Mikrofilamente 457 Auf- und Abbau von Mikrofilamenten 458 Myosin: der molekulare Motor der Actinfilamente 460

9.6 9.6.1

Muskelkontraktion 466 Das Gleitfasermodell der Muskelkontraktion 468

9.7

Bewegungsvorgånge auûerhalb der Muskeln 473 Actin bindende Proteine 473 Beweglichkeit und Kontraktionsfåhigkeit auûerhalb der Muskeln: Beispiele 476

9.7.1 9.7.2

9.8

10

Gene und Genom

10.1

Der Begriff des Gens als Einheit der Vererbung 492

10.2

Chromosomen: die materiellen Tråger der Gene 493 Die Entdeckung der Chromosomen 493 Chromosomen als Tråger der genetischen Information 494 Genetische Analyse bei  496 Crossing over und Rekombination 497 Mutagenese und Riesenchromosomen 498

10.2.1 10.2.2 10.2.3 10.2.4 10.2.5

491

10.3 Die chemische Natur der Gene 500 10.3.1 Die Struktur der DNA 500 10.3.2 Die Idee von Watson und Crick 502 10.4 Der Aufbau des Genoms 508 10.4.1 Die Komplexitåt des Genoms 508

Aus Sicht des Menschen: Krankheiten, die durch Vermehrung von Trinucleotidwiederholungen entstehen 512

10.5 Die Stabilitåt des Genoms 518 10.5.1 Verdoppelung ganzer Genome (Polyploidisierung) 518 10.5.2 Verdoppelung und Verånderung einzelner DNA-Sequenzen 518 10.5.3 ¹Springende Geneª und die dynamischen Eigenschaften des Genoms 521 10.6

Sequenzierung von Genomen: die genetischen Grundlagen des Menschseins 525 10.6.1 Vergleichende Genomanalyse: ¹Was konserviert ist, muss wichtig seinª 527

Aus Sicht des Menschen: Die medizinische Anwendung der Genomanalyse 529 Experimentelle Verfahren: Die chemische Natur der Gene 531

Zusammenfassung 485

Zusammenfassung 537

Zur Selbstçberprçfung 488

Zur Selbstçberprçfung 539

Literatur 490





10.7

Literatur 540





11

Inhaltsverzeichnis

Die Expression des genetischen Materials: von der Transkription zur Translation 541

11.1

Die Beziehung zwischen Genen und Proteinen 542 11.1.1 Informationsfluss in den Zellen: ein Ûberblick 544

11.8 11.8.1 11.8.2 11.8.3 11.8.4

Experimentelle Verfahren: RNA als Katalysator 599

Transkription bei Pro- und Eukaryoten: eine Ûbersicht 546 11.2.1 Transkription bei Prokaryoten 548 11.2.2 Transkription und RNA-Processing bei Eukaryotenzellen 550

Zusammenfassung 603

11.2

11.3 11.3.1 11.3.2 11.3.3 11.3.4 11.4 11.4.1 11.4.2 11.4.3 11.4.4 11.4.5

Synthese und Weiterverarbeitung von ribosomaler RNA und Transfer-RNA 551 Die Synthese des rRNA-Vorlåufers 552 Die Weiterverarbeitung des rRNAVorlåufers 553 Synthese und Processing der 5S-rRNA 558 Transfer-RNA 558 Synthese und Weiterverarbeitung der Messenger-RNA 559 Der Apparat fçr die Transkription der mRNA 560 Gestçckelte Gene: eine unerwartete Entdeckung 563 Das Processing eukaryotischer Messenger-RNA 567 Gestçckelte Gene und RNA-Spleiûen: ihre Bedeutung fçr die Evolution 575 Herstellung neuer Ribozyme im Labor 577

11.5

Kleine nicht codierende RNAs und RNA-Interferenz 578 11.5.1 Mikro-RNAs: Hunderte von RNAs mit unbekannter Funktion 579

Zur Selbstçberprçfung 606 11.9

Literatur 608

12

Der Zellkern und die Steuerung der Genexpression 609

12.1 Der Kern einer Eukaryotenzelle 610 12.1.1 Die Kernhçlle 610 12.1.2 Chromosomen und Chromatin 616 Aus Sicht des Menschen: Chromosomenaberrationen

12.2

Steuerung der Genexpression bei Prokaryoten 638 12.2.1 Das Bakterienoperon 638 12.3

Steuerung der Genexpression bei Eukaryoten 642

12.4

12.4.5

Steuerung auf Transkriptionsebene 644 Die Bedeutung von Transkriptionsfaktoren fçr die Steuerung der Genexpression 648 Die Struktur von Transkriptionsfaktoren 649 Transkriptions-Regulationsstellen auf der DNA 652 Transkriptionsaktivierung: Enhancer, Promotoren und Coaktivatoren 656 Transkriptionsrepression 660

12.5

Steuerung auf Processing-Ebene 664

12.4.1

12.4.3

11.6

Die Codierung der genetischen Information 582 11.6.1 Die Eigenschaften des genetischen Codes 582

12.4.4

12.6

11.7

585

628

12.1.3 Der Zellkern als organisiertes Organell 635

12.4.2

Aus Sicht des Menschen: Potenzielle klinische Anwendungsgebiete der RNA-Interferenz 581

Decodierung der Codons: die Funktion der Transfer-RNA 11.7.1 Die Struktur der tRNA 586

Die Translation der genetischen Information 590 Initiation 590 Elongation 594 Termination 596 mRNA-Ûberwachung: Unsinn wird nicht geduldet 597

Steuerung auf Translationsebene 666 12.6.1 Lokalisierung der mRNA im Cytoplasma 666 12.6.2 Steuerung der Translation 667 12.6.3 Steuerung der mRNA-Stabilitåt 669

 12.7

Inhaltsverzeichnis

Steuerung nach der Translation: Proteinstabilitåt 671

14.3 Meiose 747 14.3.1 Die Stadien der Meiose

749

Aus Sicht des Menschen: Nondisjunction in der Meiose und die Folgen 755

Zusammenfassung 673

14.3.2 Genetische Rekombination in der Meiose 757

Zur Selbstçberprçfung 676 12.8





Experimentelle Verfahren: Die Entdeckung und Charakterisierung des MPF 759

Literatur 677

Zusammenfassung 764

13

DNA-Replikation und DNAReparatur 679

Zur Selbstçberprçfung 767

13.1 13.1.1 13.1.2 13.1.3

DNA-Replikation 680 Semikonservative Replikation 680 Replikation in Bakterienzellen 682 Struktur und Funktion von Polymerasen 691 13.1.4 Replikation in Eukaryotenzellen 695 13.2 13.2.1 13.2.2 13.2.3 13.2.4

DNA-Reparatur 702 Nucleotid-Excisionsreparatur 703 Basen-Excisionsreparatur 704 Fehlpaarungsreparatur 705 Reparatur von Doppelstrangbrçchen 706

13.3

Zwischen Replikation und Reparatur 706 Aus Sicht des Menschen: Defekte der DNA-Reparatur und ihre Folgen 707

Zusammenfassung 709 Zur Selbstçberprçfung 711 13.4

Literatur 712

14

Fortpflanzung von Zellen

14.2.1 14.2.2 14.2.3 14.2.4 14.2.5 14.2.6 14.2.7

Die M-Phase: Mitose und Cytokinese 725 Prophase 726 Prometaphase 733 Metaphase 735 Anaphase 736 Telophase 741 Kråfte fçr die Bewegungen in der Mitose 742 Cytokinese 743

Literatur 768

15

Zellulåre Signale und Signalçbertragung: Kommunikation zwischen Zellen 771

15.1

Grundelemente zellulårer Signalçbertragungssysteme 772

15.2

Eine Ûbersicht çber extrazellulåre Botenstoffe und ihre Rezeptoren 774

15.3

Mit G-Proteinen gekoppelte Rezeptoren und ihre second messengers 775 15.3.1 Signaltransduktion çber G-Protein-gekoppelte Rezeptoren 776

Aus Sicht des Menschen: Krankheiten im Zusammenhang mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren 780

713

14.1 Der Zellzyklus 714 14.1.1 Zellzyklen   715 14.1.2 Die Steuerung des Zellzyklus 716 14.2

14.4

15.3.2 Die Entdeckung eines       : cyclisches AMP 782 15.3.3 Von Lipiden abgeleitete        783 15.3.4 Die Spezifitåt G-Proteingekoppelter Reaktionen 787 15.3.5 Die Regulation des Blutglucosespiegels 788 15.3.6 Die Rolle G-Protein-gekoppelter Rezeptoren bei der sensorischen Wahrnehmung 791 15.4

Die tyrosinspezifische Proteinphosphorylierung als Mechanismus der Signalçbertragung 793 15.4.1 Der Ras-MAPK-Signalweg 798 15.4.2 Die Signalçbertragung im Falle des Insulinrezeptors 802 15.4.3 Signalwege bei Pflanzen 806





Inhaltsverzeichnis

15.5

Calcium als intrazellulårer Botenstoff 807 15.5.1 Die Regulation der Calciumkonzentration in Pflanzenzellen 811 15.6

Konvergenz, Divergenz und Crosstalk zwischen verschiedenen Signalwegen 812 15.6.1 Beispiele fçr Konvergenz, Divergenz und Crosstalk zwischen verschiedenen Signalwegen 813 15.7

Stickstoffmonoxid (NO) als interzellulårer Botenstoff

Apoptose (programmierter Zelltod) 816 15.8.1 Der extrinsische Apoptosesignalweg 818 15.8.2 Der intrinsische Apoptosesignalweg 819 Zusammenfassung 821 Zur Selbstçberprçfung 824 Weiterfçhrende Literatur 826

17.2

Die Theorie der klonalen Selektion bei B-Zellen 873 17.2.1 Impfung 876 17.3

T-Lymphozyten: Aktivierung und Wirkungsmechanismus 877

17.4

Ausgewåhlte Aspekte der zellulåren und molekularen Grundlagen der Immunitåt 881 Die modulare Struktur von Antikærpern 881 DNA-Umordnungen bei den Genen fçr B- und T-Zell-Rezeptoren 884 Membrangebundene AntigenRezeptor-Komplexe 888 Der Haupthistokompatibilitåtskomplex 888 Die Unterscheidung zwischen Kærpereigenem und Kærperfremdem 894 Lymphozyten werden durch Zelloberflåchen-Signale aktiviert 896 Signaltransduktionswege bei der Aktivierung von Lymphozyten 897

17.4.1 17.4.2 17.4.3 17.4.4 17.4.5

17.4.7

Krebs 829

16.1

Grundeigenschaften einer Krebszelle 830

16.2

Krebsursachen

Aus Sicht des Menschen: Autoimmunerkrankungen 899 Experimentelle Verfahren: Die Rolle des Haupthistokompatibilitåtskomplexes fçr die Antigenpråsentation 902

833

Zur Genetik von Krebserkrankungen 834 16.3.1 Tumorsuppressor-Gene und Oncogene: Bremsen und Gaspedale 839

Zusammenfassung 908

16.3

16.4 16.4.1 16.4.2 16.4.3 16.4.4

Neue Strategien der Krebsbehandlung 855 Immuntherapie 855 Gentherapie 857 Hemmung der Aktivitåt krebsfærdernder Proteine 857 Hemmung der Blutgefåûbildung (Angiogenese) 858 Experimentelle Verfahren: Die Entdeckung der Oncogene 859

Zusammenfassung 866 16.5

Literatur 868

869

Ein Ûberblick çber die Immunantwort 870 17.1.1 Angeborene Immunreaktionen 871 17.1.2 Adaptive Immunreaktionen 872

17.4.6

16

Die Immunantwort

17.1

814

15.8

15.9

17

17.5

Literatur 910

18

Techniken der Zellund Molekularbiologie

18.1 18.1.1 18.1.2 18.1.3 18.1.4

911

Das Lichtmikroskop 912 Auflæsung 913 Visibilitåt 914 Phasenkontrastmikroskopie 915 Fluoreszenzmikroskopie und verwandte Techniken 916 18.1.5 Videomikroskopie und Bildverarbeitung 918 18.1.6 Konfokale Raster-Mikroskopie 918 18.1.7 Pråparation von Objekten fçr die Lichtmikroskopie 919

 18.2

Transmissionselektronenmikroskopie 920 18.2.1 Die Pråparation von Objekten fçr die Elektronenmikroskopie 922 18.3

Rasterelektronenmikroskopie 927

18.4

Der Einsatz von Radioisotopen

18.5

Zellkultur

18.6

Die Fraktionierung des Zellinhalts durch differenzielle Zentrifugation 933

929

930

18.7

Isolierung, Aufreinigung und Fraktionierung von Proteinen 934 18.7.1 Die selektive Pråparation 934 18.7.2 Såulenchromatographie 934 18.7.3 Polyacrylamid-Gelelektrophorese 938 18.8






Inhaltsverzeichnis

Strukturbestimmung bei Proteinen 941

18.9

Aufreinigung und Fraktionierung von Nucleinsåuren 942 18.9.1 Auftrennung von DNA durch Elektrophorese 943 18.10 Konzentrationsbestimmung bei Proteinen und Nucleinsåuren 943

18.11 Ultrazentrifugation 944 18.11.1 Das Sedimentationsverhalten von Nucleinsåuren 946 18.12 Nucleinsåurehybridisierung 946 18.13 Techniken der DNA-Rekombination 948 18.13.1 Restriktionsendonucleasen 948 18.13.2 Die Herstellung von rekombinierter DNA 950 18.13.3 Die Klonierung von DNA 950 18.13.4 Chemische Synthese und Oligonucleotidmutagenese 957 18.13.5 Gentransfer in eukaryotische Zellen und Såugerembryos 958 18.13.6 Die enzymatische Amplifikation von DNA mittels PCR 963 18.13.7 Die Sequenzierung von DNA 964 18.14 Der Einsatz von Antikærpern

Glossar

966

971

Nobelpreise Zellund Molekularbiologie seit 1958 Sach- und Personenverzeichnis

1003 1007

Einfçhrung in die Zell- und Molekularbiologie

1

1.1 Die Entdeckung der Zellen 1.2 Die elementaren Eigenschaften von Zellen 1.3 Zwei grundverschiedene Zellarten 1.4 Viren Aus Sicht des Menschen: Aussichten einer Zellersatztherapie Experimentelle Verfahren: Wie sind die eukaryotischen Zellen entstanden?

                               

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Die Zellen und die Strukturen, aus denen sie bestehen, sind zu klein, um sie mit unseren Sinnen direkt wahrnehmen, sehen oder anfassen zu kænnen. Trotz dieses enormen Handikaps erscheinen Jahr fçr Jahr Tausende von Artikeln çber Zellen, in denen nahezu jeder Aspekt der winzigen Zellstrukturen minutiæs untersucht wird. Die zell- und molekularbiologische Forschung verdankt sehr viel der Wissbegierde und Entdeckungslust des Menschen sowie seiner kreativen Intelligenz, mit der er komplexe Instrumente erfindet und Techniken entwickelt, mit denen diese Entdeckungen gemacht werden kænnen. Das bedeutet natçrlich nicht, dass nur Zellbiologen mit diesen speziellen Wesenszçgen ausgestattet wåren. An dem einen Ende des wissenschaftlichen Spektrums suchen Astronomen die åuûeren Rånder des Universums nach schwarzen Læchern und Quasaren ab, deren Eigenschaften fçr uns im Vergleich zu denjenigen,

die bisher auf der Erde bekannt sind, unvorstellbar zu sein scheinen. Am anderen Ende des Spektrums richten Kernphysiker ihre Aufmerksamkeit auf subatomare Partikel, die ebenfalls schwer vorstellbare Eigenschaften haben. Sicher tun sich in unserem Universum immer wieder neue Welten auf, deren Erscheinungsformen allesamt Anlass fçr faszinierende Forschungen sind. Im vorliegenden Buch wird sich immer wieder zeigen, dass die Zell- und Molekularbiologie reduktiv arbeitet; das heiût, sie geht davon aus, dass man das Ganze aufgrund der Kenntnis seiner Teile erklåren kann. Bei diesem Ansatz kann es leicht passieren, dass wir, anstatt uns den Wundern und Mysterien des Lebens anzunåhern, alles so erklåren mçssen, als funktioniere das lebende System praktisch wie eine ¹Maschineª. Dieser emotionale Verlust kann, soweit er eintritt, hoffentlich dadurch wettgemacht werden, dass man genauso von der Schænheit und

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Einfçhrung in die Zell- und Molekularbiologie

Komplexitåt der Mechanismen fasziniert ist, die der zellulåren Aktivitåt zugrunde liegen.

1.1 Die Entdeckung der Zellen Wegen ihrer geringen Græûe kann man die Zellen nur unter einem    betrachten, einem Instrument, mit dem man ein winziges Objekt vergræûern kann. Wir wissen nicht, wann Menschen zum ersten Mal die bemerkenswerte Fåhigkeit gekrçmmter Glasoberflåchen entdeckt haben, das Licht zu beugen und Bilder zu erzeugen. Die ersten Brillen wurden im 13. Jahrhundert in Europa hergestellt und die ersten Lichtmikroskope mit einem Linsensystem gegen Ende des 16. Jahrhunderts gebaut. Bis Mitte des 17. Jahrhunderts war es einer Handvoll wissenschaftlicher Pioniere mit Hilfe ihrer selbst gebauten Mikroskope gelungen, eine Welt zu erschlieûen, die mit dem unbewaffneten Auge niemals entdeckt worden wåre. Die Entdeckung der Zellen (Abb. 1.1 a) wird allgemein Robert Hooke zugeschrieben, einem englischen Mikroskopbauer, der mit 27 Jahren zum Kurator der Royal Society in London, Englands åltester wissenschaftlicher Akademie, ernannt wurde. Eine der vielen Fragen, die Hooke zu beantworten versuchte, war, warum Pfropfen aus Kork, einem Teil der Baumrinde, so gut verhinderten, dass Luft aus einer Flasche entwich. 1665 schrieb er: ¹Ich nahm ein gereinigtes Stçck Kork und schnitt mit einem Federmesser, das so scharf wie ein Rasiermesser war, ein Stçck davon ab. . . Als ich es unter dem Mikroskop untersuchte, schien es mir etwas poræs zu sein . . . etwa wie eine Honigwabe.ª Hooke nannte die Poren ¹Zellenª, weil sie ihn an die Zellen erinnerten, in denen die Mænche in einem Kloster leben. In Wirklichkeit hatte Hooke die Wånde leerer Zellen eines abgestorbenen Pflanzengewebes gesehen, Wånde, die ursprçnglich von den lebenden Zellen gebildet worden waren, die diese Wånde dann umschlossen hatten. Wåhrenddessen verbrachte Anton van Leeuwenhoek, ein Hollånder, der seinen Lebensunterhalt mit dem Verkauf von Kleidern und Knæpfen bestritt, seine Freizeit damit, Linsen zu schleifen und einfache Mikroskope von bemerkenswerter Qualitåt herzustellen (Abb. 1.1 b). 50 Jahre lang sandte er an die Royal Society in London Briefe, in denen er seine mikroskopischen Beobachtungen beschrieb ± zusammen mit ausschweifenden Abhandlungen çber seine tåglichen Gewohnheiten und seine gesundheitliche Verfassung. Leeuwenhoek war der erste, der einen

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b n Abb. 1.1 a, b.        a  ( ;  9   ( !   .    !'  .  )   < 9   (     )   "      '  2 !'    = >   b ?      . "     ( . '         ?         ( $ . "   @*  ' :A0  ( BC      B  ( ' 5"/D l " ' ( !'  ?          +  < ,   8 7 +      55 1 8  1

Tropfen Teichwasser unter dem Mikroskop betrachtete und zu seiner Ûberraschung herausfand, dass er voller mikroskopisch kleiner ¹animalculaª war, die vor seinen Augen hin und her flitzten. Er hat auch als erster verschiedene Bakterienformen beschrieben, die er aus Wasser, in dem er Pfeffer hatte ziehen lassen, sowie aus Belag, den er von seinen Zåhnen abgeschabt hatte, gewonnen hatte. Seine ersten Briefe an die Royal Society, in denen er diese bisher noch unbekannte Welt beschrieb, wurden mit so viel Misstrauen aufgenommen, dass die Gesellschaft ihren Kurator Robert Hooke beauftragte, diese



Die elementaren Eigenschaften von Zellen

Beobachtungen zu beståtigen. Genau das tat Hooke, und Leeuwenhoek war bald eine weltweite Berçhmtheit, die in Holland Peter den Groûen von Russland sowie die englischen Kænigin als Besucher empfing. Erst in den 1830er Jahren erkannte man die groûe Bedeutung der Zellen. 1838 kam Matthias Schleiden, ein deutscher Anwalt, der Botaniker geworden war, zu dem Schluss, dass Pflanzen trotz der Unterschiede in der Struktur der verschiedenen Gewebe aus Zellen bestehen und dass der Pflanzenembryo aus einer einzigen Zelle hervorgeht. 1839 veræffentlichte Theodor Schwann, ein deutscher Zoologe und Kollege Schleidens, einen umfassenden Bericht çber die zellulåre Grundlage des Tierlebens. Schwanns Schlussfolgerung lautete, dass die Zellen von Pflanzen und Tieren åhnliche Strukturen besitzen. Er stellte die beiden folgenden Lehrsåtze der    auf: n Alle Organismen bestehen aus einer oder mehreren Zellen. n Die Zelle ist die strukturelle Einheit des Lebens. Bei der Frage nach dem   der Zellen erwiesen sich die Vorstellungen von Schleiden und Schwann allerdings als nicht ganz so hellsichtig; beide waren çbereinstimmend der Meinung, dass Zellen aus nichtzellulåren Materialien hervorgehen konnten. Aufgrund des Ansehens, das die beiden Wissenschaftler in der wissenschaftlichen Welt genossen, dauerte es eine Reihe von Jahren, bis die Beobachtungen anderer Biologen akzeptiert wurden, die zeigen konnten, dass Zellen genauso wenig auf diese Weise entstehen, wie Organismen spontan gezeugt werden. 1855 lieferte Rudolf Virchow, ein deutscher Pathologe, einen çberzeugenden Beweis fçr den dritten Grundsatz der Zelltheorie:

/

1.2 Die elementaren Eigenschaften von Zellen Genauso, wie Pflanzen und Tiere leben, sind auch Zellen lebendig. Lebendig zu sein, ist sogar die elementarste Eigenschaft von Zellen; sie sind damit die kleinsten Einheiten, die diese Eigenschaft aufweisen. Im Gegensatz zu den Zellteilen, die einfach zugrunde gehen, wenn sie isoliert werden, kænnen ganze Zellen von einer Pflanze oder einem Tier abgelæst und in einem Labor in Kultur genommen werden, wo sie heranwachsen und sich çber långere Zeitråume hinweg vermehren. Wenn sie falsch behandelt werden, kænnen sie allerdings sterben. Man kann den Tod als einen elementaren Bestandteil des Lebens ansehen ± denn nur etwas, was gelebt hat, kann sterben. Bemerkenswerter Weise sterben Zellen innerhalb des Kærpers generell ¹von eigener Handª ± als Opfer eines internen Programms, das dafçr sorgt, dass Zellen sich selbst umbringen, wenn sie nicht mehr benætigt werden oder zu entarten drohen. 1951 hat George Gey von der Johns Hopkins University die erste Kultur menschlicher Zellen angelegt. Die Zellen stammten von einem malignen Tumor ab und wurden nach der Spenderin Henrietta Lacks ¹HeLa-Zellenª genannt. HeLaZellen, die durch Zellteilungen aus dieser ersten Zellprobe hervorgegangen sind, wachsen heute noch immer in Laboratorien çberall auf der Welt (Abb. 1.2). Da Zellen, die   (also in einer

n Zellen kænnen nur durch Teilung aus bereits existierenden Zellen hervorgehen. n Abb. 1.2. 9 .  '         '            "    &   & '   )     ' 7  '       !     ! !    "    .    !       2&B    !  " B      9 .    !     )       '  "        

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6

Einfçhrung in die Zell- und Molekularbiologie

Zellkultur auûerhalb des Kærpers) wachsen, sehr viel leichter zu untersuchen sind als Zellen innerhalb des Kærpers, sind sie zu einem wichtigen Hilfsmittel der Zell- und Molekularbiologen geworden. Viele Befunde, die in diesem Buch erærtert werden, wurden letztlich mithilfe von Zellen erhoben, die in Labors in Zellkulturen gewachsen sind. Die mikroskopische Aufnahme in Abb. 1.2 wurde mit einem hochauflæsenden Mikroskop, einem   , aufgenommen, das es Forschern ermæglicht, die Zelloberflåchen detailliert zu untersuchen. Wie in Kap. 18 erærtert wird, arbeitet man in einem Elektronenmikroskop mit einem gebçndelten Elektronenstrahl, um ein auûerordentlich genaues Abbild der Zelle und der Zellteile zu erzeugen. Mit Hilfe eines anderen Typs von Elektronenmikroskop, des !  

    " gelang es, die innere Zellstruktur in allen Einzelheiten darzustellen. Die in den frçhen 1950er Jahren gemachten transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahmen lieferten den Forschern einen ersten Eindruck von der komplizierten Struktur, die sich innerhalb der Grenzen einer winzigen Zelle verbirgt. Wir beginnen unsere Erkundung der Zellen, indem wir uns zunåchst einigen ihrer elementaren Eigenschaften zuwenden. 1.2.1 Zellen sind hochkomplex und hochorganisiert Komplexitåt ist eine Eigenschaft, die zwar offensichtlich, aber nur schwer zu beschreiben ist. Fçr den Anfang stellen wir uns Komplexitåt vielleicht am besten mit Hilfe der Begriffe Ordnung und Beståndigkeit vor. Je komplexer eine Struktur ist, je mehr Teile an ihrem Platz sein mçssen, desto geringer ist die Toleranz gegençber Fehlern bei der Beschaffenheit und den wechselseitigen Beziehungen ihrer Elemente und umso mehr muss reguliert und kontrolliert werden, um das System zu erhalten. Im weiteren Verlauf dieses Buches werden sich noch æfter Betrachtungen darçber ergeben, wie komplex das Leben auf den verschiedenen Ebenen ist. Wir werden erærtern, wie Atome kleine Molekçle bilden, wie sich diese Molekçle zu riesigen Polymeren zusammenfinden und wie sich die verschiedenen Typen von polymeren Molekçlen zu Komplexen arrangieren, die wiederum in subzellulåren Organellen und letztlich in Zellen organisiert sind. Dabei wird klar werden, dass auf jeder Ebene sehr vieles gleich bleibt. So zeigt jeder Zelltyp unter dem Elektronenmikroskop ein

gleichbleibendes Erscheinungsbild; das heiût, seine Organellen haben bei allen Individuen einer Spezies eine bestimmte Form und Lage. Genauso besteht jeder Typ von Organell immer wieder aus den gleichen Makromolekçlen, deren Anordnung einem bestimmten Schema folgt. Sehen Sie sich nur die Zellen an, die unseren Darm auskleiden und dafçr verantwortlich sind, dass die Nåhrstoffe aus unserem Verdauungstrakt aufgenommen werden (Abb. 1.3). Die Epithelzellen, die den Darm auskleiden, sind so fest miteinander verbunden wie die Ziegel in einer Mauer. Die apikalen Seiten dieser Zellen, die zum Verdauungstrakt hin ausgerichtet sind, haben lange Fortsåtze, die Mikrovilli, welche die Absorption von Nåhrstoffen erleichtern. Die Mikrovilli kænnen aus der apikalen Zelloberflåche herausragen, weil sie in ihrem Innern ein Gerçst aus Filamenten besitzen; diese wiederum bestehen aus Protein(Aktin)-Monomeren, die in einer charakteristischen Anordnung zu Polymeren verbunden sind. An den basalen Enden der Darmzellen befinden sich zahlreiche Mitochondrien, welche die Energie liefern, die fçr die verschiedenen Transportprozesse durch die Membran benætigt wird. Jedes Mitochondrium ist nach einem festen Schema aus internen Membranen aufgebaut, die wiederum aus immer gleich angeordneten Proteinen bestehen; dazu gehært auch ein ATP-synthetisierendes Enzym, das wie eine auf einem Stock befestigte Kugel aus der inneren Membran herausragt. Jede dieser verschiedenen Organisationsebenen wird in den Bildern von Abb. 1.3 veranschaulicht. Zum Glçck fçr die Zell- und Molekularbiologen hat sich die biologische Organisation, mit der sie sich beschåftigen, im Laufe der Evolution nur ganz allmåhlich veråndert. Wåhrend sich etwa ein Mensch und eine Katze in ihrer Anatomie stark unterscheiden, sind die Zellen, aus denen ihre Gewebe bestehen, sowie die Organellen, aus denen ihre Zellen aufgebaut sind, sehr åhnlich. Das in Abb. 1.3. Ausschnitt 3 dargestellte Aktinfilament sowie das ATP-synthetisierende Enzym aus Ausschnitt 6 sind bei so unterschiedlichen Organismen wie Menschen, Schnecken, Hefe und Kçstensequoien annåhernd gleich strukturiert. Håufig kann man die Informationen, die man beim Studium der Zellen eines Organismentyps erhålt, ohne Umschweife bei anderen Lebensformen anwenden. Viele der ganz grundlegenden Prozesse wie die Proteinsynthese, die Erhaltung chemischer Energie oder der Aufbau einer Membran sind bei allen Lebewesen erstaunlich åhnlich.



n Abb. 1.3.      !  &       @         &  % !      %       G 

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Die elementaren Eigenschaften von Zellen

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2.1.1 Polare und unpolare Molekçle Wir wollen uns ein Wassermolekçl ansehen. Das Sauerstoffatom des Wassers zieht sehr viel stårker Elektronen an als die beiden Wasserstoffatome. Daher bezeichnet man die O-H-Bindungen eines Wassermolekçls als   , in dem Sinne, dass eines der Atome partiell negativ und das andere partiell positiv geladen ist. Das deutet man in der Regel folgendermaûen an:

Molekçle wie Wasser, bei denen die Ladung asymmetrisch verteilt ist, bezeichnet man als   Molekçle. Biologisch wichtige polare Molekçle enthalten ein oder mehrere elektronegative Atome, in der Regel O, N, S und/oder P. Molekçle ohne elektronegative Atome oder polarisierte Bindungen, also etwa Molekçle, die nur aus Kohlenstoff- und Wasserstoffatomen bestehen, bezeichnet man als  . Ob stark polarisierte Bindungen vorhanden sind, ist ganz entscheidend fçr die Reaktivitåt von Molekçlen. Groûe unpolare Molekçle wie Wachse und Fette sind håufig inert. Einige der interessanteren biologischen Molekçle wie Proteine und Phospholipide (s. unten) enthalten sowohl polare als auch unpolare Bereiche, die sich jeweils ganz unterschiedlich verhalten.

2.1.2 Ionisierung Einige Atome sind so stark elektronegativ, dass sie wåhrend einer chemischen Reaktion Elektronen von anderen Atomen einfangen kænnen. Wenn man beispielsweise die Elemente Natrium, ein silbriges Metall, und Chlor, ein giftiges Gas, mischt, wandert das einzige Elektron in der åuûeren Schale der Natriumatome jeweils zum Chloratom, dem Elektronen fehlen. Dadurch werden aus diesen beiden Elementen geladene Atome oder Ionen.

Da das Chlor-Ion ein (in Bezug auf die Anzahl der Protonen in seinem Kern) çberschçssiges Elektron besitzt, ist es negativ geladen (Cl±) und wird als   bezeichnet. Das Natriumatom, das ein Elektron verloren hat, wird mit seiner çberzåhligen positiven Ladung (Na+) als    bezeichnet. In kristalliner Form bilden diese beiden Ionen Natriumchlorid, das gewæhnliche Speisesalz. Die oben beschriebenen Na+- und Cl±-Ionen sind relativ stabil, weil ihre åuûeren Schalen maximal gefçllt sind. Eine andere Anordnung der Elektronen innerhalb eines Atoms kann zu einer hochreaktiven Form, einem  

  , fçhren. Die Struktur dieser freien Radikale sowie ihre Bedeutung fçr die Biologie wird im folgenden Exkurs aus der Rubrik ¹Aus Sicht des Menschenª erærtert.



Kovalente Bindungen

Box 2 a

6D

Aus Sicht des Menschen

Fçr den Alterungsprozess sind freie Radikale verantwortlich Warum haben Menschen eine maximale Lebenserwartung von etwa 100 Jahren, wåhrend unsere nahen Verwandten, die Schimpansen, nur etwa halb so lang leben? Viele Biologen glauben, dass wir altern, weil in den Geweben unserer Kærpers allmåhlich immer mehr Schåden auftreten. Am meisten geschådigt wird dabei wahrscheinlich die DNA. Durch die verånderte DNA wird die genetische Botschaft verfålscht und damit werden die Zellen immer stårker beeintråchtigt. Wie kommt es zu diesen Zellschåden und wie kann es sein, dass dieser Prozess bei Schimpansen schneller ablåuft als bei Menschen? Der Grund dafçr liegt mæglicherweise auf der atomaren Ebene. Atome sind stabil, wenn ihre Schalen maximal mit Elektronen besetzt sind. Elektronenschalen bestehen aus Orbitalen, von denen jedes hæchstens zwei Elektronen fasst. Atome oder Molekçle, bei denen ein Orbital nur ein einzelnes ungepaartes Elektron enthålt, sind håufig sehr unstabil ± man bezeichnet sie als     . Freie Radikale kænnen entstehen, wenn eine kovalente Bindung so gelæst wird, dass jeder Teil die Hålfte der gemeinsamen Elektronen erhålt, oder wenn ein Atom oder Molekçl ein einzelnes Elektron aufnimmt, das bei einer Redox-Reaktion çbertragen wurde. So kann man beispielsweise aus Wasser freie Radikale herstellen, indem man es der Sonnenstrahlung aussetzt: H2O ? HO·+ H· Hydroxylradikal (¹·ª ist das Zeichen fçr ein freies Radikal) Freie Radikale sind åuûerst reaktiv und kænnen zahlreiche Molekçle wie Proteine, Nucleinsåuren oder Lipide chemisch veråndern. Die Bildung von Hydroxylradikalen ist wahrscheinlich ein wesentlicher Grund, warum Sonnenlicht so schådlich fçr die Haut ist. 1956 stellte Denham Harman von der University of Nebraska die These auf, dass das Altern durch Gewebeschåden hervorgerufen wird, die von freien Radikalen verursacht werden. Da die Biologen und Ørzte damals mit dem Thema freie Radikale nicht vertraut waren, stieû diese These nicht auf græûeres Interesse. 1969 entdeckten Joe McCord und Irwin

Fridovich von der Duke University das Enzym Superoxiddismutase (SOD), dessen einzige Funktion darin besteht, das Superoxidradikal (O2·±), eine Art von freiem Radikal, das entsteht, wenn molekularer Sauerstoff ein zusåtzliches Elektron aufnimmt, zu zerstæren. SOD katalysiert folgende Reaktion: + ·± O·± 2 + O2 + 2H ? H2O2 + O2 Wasserstoffperoxid

Wasserstoffperoxid ist ebenfalls eine hochreaktives Oxidationsmittel, das daher håufig als Desinfektions- oder Bleichmittel eingesetzt wird. Wenn H2O2 nicht schnell zerstært wird, kann es zu Hydroxylradikalen zerfallen, die in der Zelle Makromolekçle attackieren. In der Zelle wird Wasserstoffperoxid normalerweise durch die Enzyme Katalase oder Glutathionperoxidase abgebaut. Weitere Untersuchungen haben ergeben, dass Superoxidradikale beim normalen oxidativen Zellstoffwechsel entstehen und dass sich eine Superoxiddismutase in den Zellen diverser Organismen von Bakterien bis zum Menschen befindet. Tiere haben drei verschiedene SOD-Varianten (Isoformen): eine cytosolische, eine mitochondriale und eine extrazellulåre. Man schåtzt, dass 1±2 % des Sauerstoffs, der von menschlichen Mitochondrien aufgenommen wird, in Wasserstoffperoxid statt in Wasser, dem normalen Endprodukt der Atmung, umgewandelt werden. Wie wichtig die SOD ist, zeigte sich am deutlichsten bei Untersuchungen an mutierten Bakterien und Hefe, denen das Enzym fehlt. Diese Zellen kænnen in einer sauerstoffhaltigen Umgebung nicht wachsen. Ebenso sterben Måuse, die keine mitochondriale Variante des Enzyms (SOD2) besitzen, spåtestens eine Woche nach der Geburt. Dagegen leben Taufliegen, die genetisch so veråndert wurden, dass sie groûe Mengen SOD bilden, çber 40% långer als unbehandelte Kontrolltiere. Obwohl das Zerstærungspotenzial von freien Radikalen wie Superoxid oder Hydroxylradikalen unbestritten ist, wird die Bedeutung dieser Substanzen fçr den Alterungsprozess nach wie vor kontrovers diskutiert. Aus Harmans Hypothese çber den Zusammenhang zwischen freien Radikalen und dem Altern lassen sich bestimmte Vorhersagen ableiten. So wçrde man beispielsweise erwarten, dass Tiere mit einer græûeren Lebenserwartung weniger freie Radi-

6H

Die chemischen Grundlagen des Lebens

kale produzieren, besser in der Lage sind, freie Radikale abzubauen oder Zellschåden zu beheben, die durch Reaktion mit freien Radikalen entstanden sind. Diese Erwartungen wurden von einer jçngeren Untersuchung beståtigt, in der verglichen wurde, wie Fibroblastenkulturen von Maus und Mensch zum einen unter Standardbedingungen (20 % Sauerstoff), zum anderen unter verringerter Sauerstoffkonzentration (3 % Sauerstoff) wachsen. Die Mausfibroblasten (Bindegewebszellen), die unter reduzierten Sauerstoffbedingungen gehalten wurden, erlitten nur etwa ein Drittel der DNASchåden und durchliefen viel mehr Zellteilungen, bevor sie aufhærten, sich zu teilen, als dieselben Zellen, die man unter normalen Sauerstoffbedingungen wachsen lieû. Mausfibroblasten, die in 20 % O2 kultiviert wurden, zeigten drei Mal so viele Oxidationsschåden in ihrer DNA wie menschliche Fibroblasten, die unter denselben Bedingungen in Kultur genommen wurden. Menschliche Zellen scheinen viel besser als Mauszellen in der Lage zu sein, Oxidationsschåden in der DNA zu verhindern oder zu reparieren. Man kann die Lebensspanne von Såugern erhæhen, indem man die Anzahl der Kalorien in der Nahrung stark reduziert. Wie erstmals in den 1930er Jahren gezeigt wurde, leben Måuse, die auf eine sehr strenge Diåt gesetzt werden, in der Regel 30±40% långer als ihre Geschwister, deren Ernåhrung die normale Kalorienzahl enthålt. Untersuchungen zur Stoffwechselrate dieser Måuse haben widersprçchliche Daten ergeben. Es wird aber allgemein angenommen, dass Tiere mit einer kalorienreduzierten Ernåhrung deutlich weniger O·± 2 und

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H2O2 bilden, was ihre hæhere Lebenserwartung erklåren kænnte. Im Augenblick laufen Langzeitstudien an Affen, in denen untersucht werden soll, ob auch sie långer und gesçnder leben, wenn sie weniger Kalorien erhalten. Obwohl die Untersuchungsdauer noch nicht ausreicht, um sagen zu kænnen, ob sich die maximale Lebenserwartung von normalerweise etwa 40 Jahren bei Rhesusaffen und 28 Jahren bei Totenkopfåffchen erhæht, sprechen vorlåufige Ergebnisse dafçr, dass diese Tiere geringere Konzentrationen an Glucose, Insulin und Triglyceriden im Blut haben, was darauf hindeutet, dass sie weniger zu altersbedingten Krankheiten wie Diabetes oder koronarer Herzkrankheit neigen. Geringere Insulin-Konzentrationen im Blut sind mæglicherweise besonders wichtig fçr ein långeres Leben, da Untersuchung an Nematoden und Taufliegen ergeben haben, dass sich die Lebensspanne dieser Wirbellosen drastisch erhæht, wenn die Aktivitåt der insulinartigen Hormone reduziert wird. Ein verwandtes Forschungsgebiet ist die Untersuchung von Antioxidanzien, die freie Radikale zerstæren kænnen. Zu den gångigen Antioxidanzien, die man im Kærper findet, gehæren Substanzen wie Glutathion, die Vitamine E und C sowie Beta-Carotin ± der orangefarbene Farbstoff in Mæhren und anderen Gemçsesorten. Obwohl sich diese Substanzen in der Nahrung unter Umstånden als sehr vorteilhaft erweisen, weil sie freie Radikale zerstæren kænnen, haben Untersuchung an Ratten und Måusen keine çberzeugenden Belege dafçr ergeben, dass sie den Alterungsprozess aufhalten oder die maximale Lebenserwartung erhæhen.

2.2 Nichtkovalente Bindungen Kovalente Bindungen sind starke Bindungen zwischen den Atomen, aus denen ein Molekçl besteht. Wechselwirkungen zwischen Molekçlen (oder zwischen verschiedenen Teilen eines groûen biologischen Molekçls) hången von einer Vielzahl an schwåcheren Bindungen, so genannten nichtkovalenten Bindungen, ab. )  9   7  beruhen nicht auf gemeinsamen Elektronen, sondern auf Anziehungskråften zwischen gegensåtzlich geladenen Atomen. Einzelne nichtkovalente Bindungen sind schwach (etwa 1±5 kcal/mol) und kænnen daher leicht gelæst und neu gebildet werden. Wie sich im



Nichtkovalente Bindungen

6A

weiteren Verlauf dieses Buches immer wieder zeigen wird, ist diese Eigenschaft der nichtkovalenten Bindungen ausschlaggebend dafçr, dass es zwischen den Zellmolekçlen zu dynamischen Wechselwirkungen kommt. Wåhrend einzelne nichtkovalente Bindungen schwach sind, addieren sich ihre Anziehungskråfte, wenn viele dieser Bindungskråfte wie etwa in den beiden Strången des DNA-Molekçls oder bei verschiedenen Teilen eines groûen Proteins zusammenwirken. Insgesamt gesehen verleihen sie der Struktur eine betråchtliche Stabilitåt. Wir wollen uns mehrere Typen nichtkovalenter Bindungen ansehen, die fçr Zellen wichtig sind. 2.2.1 Ionenbindungen: Anziehungskråfte zwischen geladenen Atomen Im Speisesalz werden die Kristalle jeweils durch elektrostatische Anziehungskråfte zwischen positiv geladenen Na+- und negativ geladenen Cl±Ionen zusammengehalten. Diese Art von Anziehung zwischen geladenen Teilchen bezeichnet man als 6  (oder Salzbrçcke). Ionenbindungen innerhalb eines Salzkristalls kænnen sehr stark sein. Wenn man aber einen Salzkristall in Wasser læst, ist jedes einzelne Ion von Wassermolekçlen umgeben. Dies verhindert, dass sich entgegengesetzt geladene Ionen nahe genug kommen, um eine Ionenbindung eingehen zu kænnen (Abb. 2.2). Weil Zellen çberwiegend aus Wasser bestehen, haben Bindungen zwischen   Ionen kaum eine Bedeutung ± im Gegensatz zu schwachen Ionenbindungen zwischen entgegengesetzt geladenen Gruppen groûer biologischer Molekçle, die sehr wichtig sind. Sind beispielsweise negativ geladene Phosphatatome in einem DNA-Molekçl eng mit positiv geladenen Gruppen auf der Oberflåche eines Proteins assoziiert (Abb. 2.3), dann wird der Komplex durch Ionenbindungen zusammengehalten. Wegen des vorhandenen Wassers sind die Ionenbindungen in einer Zelle generell schwach (etwa 3 kcal/mol), aber tief im Innern eines Proteins, wo es håufig kein Wasser gibt, kann es starke derartige Bindungen geben.

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2.2.2 Wasserstoffbrçcken Wenn ein Wasserstoffatom kovalent an ein elektronegatives Atom, besonders an ein Sauerstoffoder Stickstoffatom, gebunden ist, wird das einzige gemeinsame Elektronenpaar stark zum Kern des elektronegativen Atoms hingezogen, so dass das Wasserstoffatom partiell positiv geladen ist. Das fçhrt dazu, dass sich der bloûe, positiv geladene Kern des Wasserstoffatoms einem Elektronenpaar auf der åuûeren Schale eines zweiten elektronegativen Atoms, das mit keinem anderen Atom geteilt wird, weit genug annåhern kann, um eine Anziehungskraft auf dieses Atom auszuçben (Abb. 2.4). Diese schwache Anziehungskraft bezeichnet man als 

 . Wasserstoffbrçcken bilden sich zwischen den meisten polaren Molekçlen; sie sind besonders wichtig fçr die Struktur und Eigenschaften von Wasser (s. unten). Wasserstoffbrçcken werden auch zwischen polaren Gruppen in groûen biologischen Molekçlen ausgebildet ± etwa zwischen den beiden Strången eines DNA-Molekçls (Abb. 2.3). Die DNA-Doppelhelix mit ihren zahlreichen Wasserstoffbrçcken zwischen den Strången ist sehr stabil, weil sich die Stårke der einzelnen Wasserstoffbrçcken addiert. Weil aber einzelne Wasserstoffbrçcken schwach sind (2±5 kcal/mol), kænnen die beiden Strånge partiell getrennt werden, um Enzymen den Zugang zu einzelnen DNA-Strången zu ermæglichen.

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Die chemischen Grundlagen des Lebens

n 
 Wasserstoffbrçcken bilden sich zwischen einem gebundenen elektronegativen Atom wie Stickstoff oder Sauerstoff mit einer partiell negativen Ladung und einem gebundenen Wasserstoffatom, das eine partiell positive Ladung besitzt. Wasserstoffbrçcken (etwa 0,18 nm) sind etwa doppelt so lang wie die viel stårkeren kovalenten Bindungen



          

n 
 Nichtkovalente Ionenbindungen sind wichtig, um das Proteinmolekçl auf der rechten Seite (gelbe Atome) am DNA-Molekçl auf der linken Seite zu halten. Die Ionenbindungen bilden sich zwischen den positiv geladenen Stickstoffatomen des Proteins und den negativ geladenen Sauerstoffatomen der DNA aus. Das DNA-Molekçl selbst besteht aus zwei verschiedenen Strången, die durch nichtkovalente Wasserstoffbrçcken zusammengehalten werden (Genaueres im folgenden Kap.). Obwohl eine nichtkovalente Bindung relativ schwach und leicht zu læsen ist, sorgt eine Vielzahl dieser Bindungen zwischen zwei Molekçlen wie bei den beiden DNA-Strången dafçr, dass der gesamte Komplex recht stabil ist. (Oberes Bild mit freundlicher Genehmigung von Stephen Harrison)

Polare Molekçle wie Zucker und Aminosåuren (Kap. 2.5.1 und 2.5.3) werden als

 oder ¹Wasser liebendª bezeichnet, weil sie mit Wasser in Wechselwirkungen treten kænnen. Unpolare Molekçle wie Steroide oder Fettmolekçle læsen sich praktisch nicht in Wasser, weil sie keine geladenen Bereiche besitzen, die sie zu den beiden Polen der Wassermolekçle ziehen wçrden. Wenn man unpolare Verbindungen mit Wasser mischt, werden die unpolaren,

  (¹Wasser fçrchtendenª) Molekçle dazu gezwungen, Aggregate zu bilden, in denen sie so wenig wie mæglich ihrer polaren Umgebung ausgesetzt sind (Abb. 2.5). Diese Assoziation unpolarer Molekçle bezeichnet man als




  . Das ist der Grund, warum Træpfchen von Fettmolekçlen schnell wieder als Fettaugen auf der Oberflåche einer Rinder- oder Hçhnersuppe auftauchen, selbst wenn man die Flçssigkeit mit einem Læffel umgerçhrt hat. Das ist auch der Grund, warum sich die unpolaren Gruppen bei den meisten læslichen Proteinen eher im Innern befinden ± mæglichst weit entfernt von den Wassermolekçlen drum herum (Kap. 2.5.3).

 Der eben beschriebene Typ von hydrophoben Wechselwirkungen gehært eigentlich nicht zu den Bindungen, weil er nicht auf einer Anziehungskraft zwischen den hydrophoben Molekçlen beruht.2 Neben dieser Art der Wechselwirkung kænnen hydrophobe Gruppen untereinander auch çber elektrostatische Anziehungskråfte schwache Bindungen eingehen. Polare Molekçle assoziieren, weil die Ladung innerhalb ihrer Strukturen permanent asymmetrisch verteilt ist. Eine genauere Untersuchung der kovalenten Bindungen, aus denen ein unpolares Molekçl (wie etwa H2 oder CH4) besteht, ergibt jedoch, dass auch hier die Elektronen nicht immer symmetrisch verteilt sind. Die Verteilung der Elektronen um das Atom herum zu einem bestimmten Zeitpunkt ist rein statistisch; die Verteilung selbst åndert sich von einem Augenblick zum nåchsten. Infolgedessen kann es vorkommen, dass die Elektronendichte auf einer Seite eines Atoms zu einem bestimmten Zeitpunkt græûer ist, obwohl sich das Atom die Elektronen gleichmåûig mit irgendeinem anderen Atom teilt. Diese vorçbergehenden Asymmetrien in der Elektronenverteilung fçhren zu einer vorçbergehenden Ladungstrennung (Dipole) innerhalb des Molekçls. Kommen sich zwei Molekçle mit vorçbergehendem Dipolcharakter in der richtigen Ausrichtung sehr nahe, entsteht zwischen ihnen eine schwache Anziehungskraft, die 9  

  , welche sie zusammenhålt. Darçber hinaus kann die Ausbildung einer temporåren Ladungstrennung in einem Molekçl eine åhnliche Trennung in einem Nachbarmolekçl auslæsen. Auf diese Weise kænnen zwischen unpolaren Molekçlen weitere Anziehungskråfte entstehen. Eine einzelne van-der-Waals-Kraft ist åuûerst schwach (0,1±0,3 kcal/mol) und hångt stark davon ab, wie weit die beiden Atome voneinander entfernt sind (Abb. 2.6 a). Wie wir allerdings in spåteren Kapiteln noch sehen werden, sind biologische Molekçle, die miteinander wechselwirken, wie etwa ein Antikærper und ein Protein auf der Oberflåche eines Virus, komplementår geformt. Dadurch kommen sich viele 2 Diese Aussage beruht auf der allgemein akzeptierten Hypothese, wonach hydrophobe Wechselwirkungen durch eine Zunahme der Entropie (Unordnung) begçnstigt werden. Wenn eine hydrophobe Gruppe in ein wåssriges Læsungsmittel ragt, ordnen sich die Wassermolekçle wie ein Gitter um die hydrophobe Gruppe herum an. Diese Ordnung der Læsungsmittelmolekçle wird aufgehoben, wenn die hydrophobe Gruppe aus dem umgebenden Læsungsmittel herausgezogen wird. Einer anderen These zufolge kommen hydrophobe Wechselwirkungen durch schwache Bindungen zustande (siehe P. L. Privalov, S. J. Gill, (1989) Pure Appl. Chem. 61:1097; oder G. I. Makhatadze, P. L. Privalov (1995) Adv. Prot. Chem. 47:308).

Nichtkovalente Bindungen

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Atome der beiden Reaktionspartner unter Umstånden sehr nahe (Abb. 2.6 b), weshalb die vander-Waals-Kråfte fçr biologische Wechselwirkungen wichtig sind. 2.2.4 Die lebenserhaltenden Eigenschaften des Wassers Das Leben auf der Erde hångt vollkommen vom Wasser ab. Wasser ist im gesamten Universum eine unabdingbare Voraussetzung dafçr, dass sich Leben entwickelt. Obwohl ein Wassermolekçl nur aus drei Atomen besteht, hat es eine einzigartige Struktur, die ihm auûerordentliche Eigenschaften verleiht.3 Am wichtigsten davon sind folgende:

3

Eine Mæglichkeit, die Struktur des Wassers kennen zu lernen, besteht darin, es mit H2S zu vergleichen. Wie Sauerstoff besitzt auch Schwefel auf seiner åuûeren Schale sechs Elektronen und ist çber zwei Einfachbindungen mit Wasserstoffatomen verbunden. Weil Schwefel aber græûer ist, ist er nicht so elektronegativ wie Sauerstoff und kann daher nicht so gut Wasserstoffbrçcken bilden. Bei Raumtemperatur ist H2S gasfærmig und nicht flçssig. Genauer gesagt muss die Temperatur auf ±86 8C sinken, bis H2S zu einem festen Kærper gefriert.

D0

Die chemischen Grundlagen des Lebens

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n Wasser ist ein stark asymmetrisches Molekçl mit einem O-Atom an dem einen und den beiden H-Atomen am anderen Ende. n Jede der beiden kovalenten Bindungen des Molekçls ist stark polarisiert. n Alle drei Atome eines Wassermolekçls kænnen Wasserstoffbrçcken bilden. Auf diesen Merkmalen beruhen die lebenserhaltenden Eigenschaften des Wassers. Jedes Wassermolekçl kann mit bis zu vier anderen Wassermolekçlen Wasserstoffbrçcken bilden, wodurch ein sehr gut miteinander ver-

knçpftes Netzwerk von Molekçlen entsteht (Abb. 2.7). Eine Wasserstoffbrçcke wird dann ausgebildet, wenn sich ein Wassermolekçl so ausrichtet, dass der partiell positiv geladene Wasserstoff neben ein partiell negativ geladenes Sauerstoffatom eines anderen Wassermolekçls gelangt. Wegen ihrer ausgeprågten Wasserstoffbrçckenbildung zeigen Wassermolekçle eine ungewæhnlich starke Neigung, aneinander zu hången. Dieses Merkmal erkennt man am besten an den thermischen Eigenschaften des Wassers. Wenn beispielsweise Wasser erhitzt wird, wird die meiste thermische Energie dafçr verbraucht, die Wasserstoffbrçcken aufzubrechen, und nicht so sehr, um die Bewegung der Molekçle zu beschleunigen und dadurch die Temperatur zu erhæhen. Das Gleiche gilt fçr die Verdunstung der flçssigen in die gasfærmige Phase; auch hier mçssen erst die Wasserstoffbrçcken aufgehoben werden, welche die Wassermolekçle mit ihren Nachbarn verbinden. Daher erfordert es so viel Energie, Wasser in Dampf zu verwandeln. Såuger nutzen diese Eigenschaft, wenn sie schwitzen, weil die fçr die Verdunstung des Wassers erforderliche Wårme dem Kærper entzogen wird, so dass sich dieser abkçhlt. Das geringe Volumen an wåssriger Flçssigkeit in einer Zelle enthålt eine bemerkenswert komplexe Mischung an   &  $. Tatsåchlich kann Wasser mehr unterschiedliche Substanzen læsen als jedes andere Læsungsmittel. Wasser ist allerdings mehr als nur ein Læsungsmittel, es bestimmt auch, welche Strukturen biologische Molekçle annehmen und welche Art von Wechselwirkungen sie eingehen. Wasser ist



Nicht-kovalente Bindungen

die flçssige Matrix, die vom unlæslichen Zellgefçge umschlossen wird. Es ist darçber hinaus auch das Medium, durch das sich Materialien von einem Zellkompartiment zum anderen bewegen. Es ist in vielen Zellreaktionen entweder Reaktionspartner oder Reaktionsprodukt. Und es schçtzt die Zelle auf vielerlei Weise: vor zu groûer Hitze, vor zu groûer Kålte oder vor schådlicher Strahlung. Wasser ist so ein wichtiger Faktor in einer Zelle, weil es mit so vielen verschiedenartigen chemischen Gruppen schwache Wechselwirkungen eingehen kann. Erinnern Sie sich daran (Kap. 2.2.2), dass Wassermolekçle mit ihren stark polarisierten O-H-Bindungen eine Hçlle um Ionen herum bilden und so die Ionen auseinander drången. In åhnlicher Weise bilden Wassermolekçle mit organischen Molekçlen, die wie Aminosåuren und Zucker polare Gruppen enthalten (Abb. 2.8), sowie mit den groûen Makromolekçlen der Zelle Wasserstoffbrçcken. Da polare Molekçle mit Wasser schwache nichtkovalente Bindungen eingehen kænnen, læsen sie sich in der Zelle.

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2.3 Såuren, Basen und Puffer Protonen befinden sich nicht nur im Atomkern, sondern werden auch immer dann ins Medium abgegeben, wenn ein Wasserstoffatom ein gemeinsames Elektron verliert. So kann etwa Essigsåure, der charakteristische Bestandteil des Essigs, die folgende als 

$   bezeichnete Reaktion durchmachen.

Ein Molekçl, das ein Wasserstoff-Ion abgeben kann, wird als &1 bezeichnet. Das von der Essigsåure in der obigen Reaktion freigesetzte Proton bleibt nicht frei, sondern wird von einem anderen Molekçl aufgenommen. Ein Proton kann an folgenden Reaktionen beteiligt sein: Zusammen mit einem Wassermolekçl bildet es ein Hydronium-Ion (H3O+): H+ + H2O ? H3O+ Zusammen mit einem Hydroxylion (OH±) bildet es ein Wassermolekçl: H+ + OH± ? H2O Zusammen mit einer Aminogruppe (±NH2) eines Proteins bildet es ein geladenes Amin: H+ + ±NH2 ? NH3+ Jedes Molekçl, das ein Proton aufnehmen kann, ist definitionsgemåû eine 7 . Såuren und Basen bilden Paare. Wenn eine Såure ein Proton verliert (wenn beispielsweise die Essigsåure ein Wasserstoff-Ion abgibt), wird sie zu einer Base (in diesem Fall einem Acetat-Ion), die als  ,  7  der Såure bezeichnet wird. Genauso entsteht, wenn eine Base (etwa eine ±NH2-Gruppe) ein Proton aufnimmt, eine Såure (in diesem Fall ±NH3+), die als ,  &1  dieser Base bezeichnet wird. Somit besitzt die Såure immer eine positive Ladung mehr als ihre konjugierte Base. Wasser ist ein Beispiel fçr ein

  , das heiût, eines, das sowohl Såure als auch Base sein kann:

n Abb. 2.8. %        (       G

 

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H3O+ $ H+ + H2O $ OH± + H+ In Kap. 2.5.3 werden wir eine andere wichtige Gruppe amphoterer Molekçle besprechen: die Aminosåuren.

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Die chemischen Grundlagen des Lebens

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Såuren unterscheiden sich sehr stark darin, wie leicht sie ein Proton abgeben. Je leichter das Proton verloren geht, das heiût, je schwåcher die Anziehungskraft einer konjugierten Base fçr ihr Proton ist, desto stårker ist die Såure. Chlorwasserstoff ist eine sehr starke Såure, die ihr Proton leicht an Wassermolekçle abgibt. Die konjugierte Base einer starken Såure wie etwa HCl ist eine schwache Base (Tabelle 2.2). Essigsåure ist dagegen eine relativ schwache Såure, weil sie bei der Læsung in Wasser græûtenteils undissoziiert bleibt. In gewissen Sinn kann man sich den Dissoziationsgrad einer Såure als Maû fçr ihr Abschneiden beim Wettstreit um die Protonen vorstellen, den die einzelnen Bestandteile einer Læsung miteinander austragen. Weil Wasser dabei erfolgreicher, das heiût, eine stårkere Base als ein Chlorid-Ion ist, dissoziiert HCl vollståndig. Dagegen bleibt Essigsåure çberwiegend undissoziiert, weil ein Acetat-Ion eine stårkere Base als Wasser ist. Wie sauer oder basisch eine Læsung ist, bestimmt man anhand der Konzentration an Wasserstoffionen4; sie wird in Form des 2

ausgedrçckt: pH = ±log [H+] wobei [H+] die molare Protonenkonzentration ist. Beispielsweise hat eine Læsung mit einem pH-Wert von 5 eine Wasserstoffionenkonzentration von 10±5 M. Weil die pH-Skala logarithmisch ist, entspricht ein Anstieg um einen pHWert einer zehnfachen Abnahme der H+-Konzentration (oder einen zehnfachen Anstieg der OH±-Konzentration). In der Magensåure (pH 4

1,8) beispielsweise ist die H+-Konzentration fast eine Million Mal græûer als im Blut (pH 7,4). Wenn ein Wassermolekçl in ein Hydroxylion und ein Proton dissoziiert, (H2O ? H+ + OH± oder pråziser 2H2O ? H3O+ + OH±) kann man die Gleichgewichtskonstante fçr diese Reaktion folgendermaûen bestimmen:

In wåssriger Læsungen liegen Protonen nicht frei, sondern als Hydronium-Ionen (H3O+) vor. Der Einfachheit halber bezeichnen wir sie einfach als Protonen oder WasserstoffIonen.

Weil die Konzentration an reinem Wasser immer 55,51 M betrågt, kænnen wir eine neue Kostante KW, das 6t des Wassers einfçhren, KW = [H+][OH±] das bei 25 8C 10±14 betrågt. In reinem Wasser liegen die H+- und OH±-Konzentrationen bei etwa 10±7 M. Der åuûerst geringe Dissoziationswert von Wasser deutet darauf hin, dass es eine sehr schwache Såure ist. In Gegenwart einer Såure steigt die Wasserstoffionenkonzentration an und die Hydroxylionenkonzentration sinkt (weil sie zusammen mit Protonen Wasser bilden), so dass das Ionenprodukt weiter bei 10±14 liegt. Der pH-Wert hat auf die meisten biologischen Prozess groûen Einfluss, weil sich die Verånderungen in der Wasserstoffionenkonzentration auf den Ionisierungsgrad der biologischen Molekçle auswirken. Wenn beispielsweise die Wasserstoffionenkonzentration steigt, wird die ±NH2-Gruppe der Aminosåure Arginin zum ±NH3+ protoniert, das die Proteinaktivitåt insgesamt stæren kann. Selbst geringfçgige Verånderungen des pH-Werts kænnen biologische Reaktionen beeintråchtigen. / schçtzen Organismen und die Zellen, aus denen sie bestehen, vor Schwankungen des pH-Werts; diese Verbindungen fangen durch Reaktionen mit freien Wasserstoff- oder Hydroxylionen Verånderungen des pH-Werts auf. Pufferlæsungen enthalten in der Regel eine schwache Såure sowie ihre konjugierte Base. Blut beispielsweise ist mit Kohlensåure und Bikarbonat-Ionen gepuffert, wodurch der pH-Wert des Blutes normalerweise konstant bei 7,4 liegt. HCO±3 + H+ $ H2CO3 Wenn die Wasserstoffionenkonzentration steigt (etwa, wenn man sich anstrengt), reagieren die Bikarbonat-Ionen mit den çberschçssigen Protonen und entziehen sie der Læsung. Herrscht dagegen ein Ûberschuss an OH±-Ionen vor (etwa, wenn man hyperventiliert), so werden die Ionen durch Protonen aus der Kohlensåure neutrali-



Die Eigenschaften biologischer Molekçle

D/

siert. Der pH-Wert der Flçssigkeit in der Zelle wird auf åhnliche Weise durch ein Phosphatpuffersystem geregelt, das aus H2PO±4 und HPO2± 4 besteht.

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2.4 Die Eigenschaften biologischer Molekçle Organismen bestehen vorwiegend aus Wasser. Wenn das Wasser verdunstet ist, bleiben als Trockengewicht çberwiegend Molekçle zurçck, die Kohlenstoffatome enthalten. Als die kohlenstoffhaltigen Molekçle entdeckt wurden, glaubte man zunåchst, sie kåmen nur in Lebewesen vor, und bezeichnete sie daher als     , um sie von den      zu unterscheiden, die man in der unbelebten Natur findet. Als es den Chemikern gelang, immer mehr dieser kohlenstoffhaltigen Molekçle im Labor zu synthetisieren, verloren die organischen Verbindungen den Anschein des Geheimnisvollen, der mit ihnen verbunden war. Die Verbindungen, die von lebenden Organismen gebildet werden, bezeichnet man jetzt als      &  $. In der Chemie des Lebens dreht sich alles um die Chemie des Kohlenstoffatoms. Diese zentrale Rolle verdankt der Kohlenstoff der Besonderheit, dass er eine enorme Anzahl von Molekçlen bilden kann. Mit seinen vier Elektronen auf der åuûeren Schale kann ein Kohlenstoffatom mit bis zu vier anderen Atomen Bindungen eingehen (Abb. 2.1). Der entscheidende Punkt ist jedoch, dass jedes Kohlenstoffatom an andere Kohlenstoffatome binden kann, so dass Molekçle mit einem langkettigen Gerçst aus Kohlenstoffatomen entstehen kænnen. Solche kohlenstoffhaltigen Grundgerçste kænnen linear, verzweigt oder ringfærmig sein.

 

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Am Cholesterin, dessen Struktur in Abb. 2.9 zu sehen ist, lassen sich diverse Anordnungsmæglichkeiten der Kohlenstoffatome gut erkennen. Aufgrund seiner Græûe und der Anordnung seiner Elektronen eignet sich der Kohlenstoff auf einzigartige Weise dazu, viele verschiedene Molekçle zu bilden ± bisher kennt man mehrere Hunderttausend. Silizium dagegen, das sich im Periodensystem direkt unter dem Kohlenstoff befindet und ebenfalls vier Elektronen auf seiner åuûeren Schale hat (Abb. 2.1), ist zu groû, als dass sein positiv geladener Kern die Elektronen auf der åuûeren Schale benachbarter Atome stark genug anziehen kænnte, um so riesige Molekçle zusammen halten zu kænnen. Um die Eigenschaften biologischer Molekçle kennen zu lernen, beginnt man am besten mit der einfachsten Gruppe organischer Molekçle, den   '

 , die nur aus Kohlenstoff- und Wasserstoffatomen bestehen. Das Molekçl Ethan (C2H6) ist ein einfacher Kohlenwasserstoff,

der aus zwei Atomen Kohlenstoff besteht, die jeweils mit dem anderen Kohlenstoff sowie mit drei Atomen Wasserstoff verbunden sind. Wenn mehr Kohlenstoffatome dazu kommen, wird das Gerçst der organischen Molekçle långer und ihre Strukturen komplexer.

D6

Die chemischen Grundlagen des Lebens

2.4.1 Funktionelle Gruppen Die meisten Organismen besitzen keine nennenswerten Mengen an Kohlenwasserstoffen, obwohl diese den græûten Teil der fossilen Brennstoffe ausmachen, die aus den Ûberresten uralter Pflanzen und Tiere bestehen. Viele biologisch wichtige, organische Molekçle enthalten wie die Kohlenwasserstoffe Ketten von Kohlenstoffatomen, in denen aber bestimmte Wasserstoffatome durch verschiedene   : ersetzt sind. Funktionelle Gruppen sind bestimmte Gruppierungen von Atomen, die oft als Einheit fungieren und organischen Molekçlen ihre physikalischen Eigenschaften, ihr chemisches Reaktionsvermægen sowie ihre Læslichkeit in wåssrigen Læsungen verleihen. Einige funktionelle Gruppen, die håufig vorkommen, sind in Tabelle 2.3 aufgelistet. Zwei der håufigsten Verbindungen zwischen funktionellen Gruppen sind #   , die zwischen Carbonsåuren und Alkoholen, sowie   , die zwischen Carbonsåuren und Aminen gebildet werden.

Die meisten Gruppen in Tabelle 2.3 enthalten ein oder mehrere elektronegative Atome (N, P, O und/oder S), durch die organische Molekçle polarer, besser wasserlæslich und reaktiver werden. Manche dieser funktionellen Gruppen kænnen Ionen bilden und positiv oder negativ geladen werden. Man kann leicht zeigen, wie sich eine Substitution verschiedener funktioneller Gruppen auf die Molekçle auswirkt. Der bereits angesprochene Kohlenwasserstoff Ethan (CH3CH3) ist ein giftiges, entflammbares Gas. Wenn man eines seiner Wasserstoffatome durch eine Hydroxylgruppe (±OH) ersetzt, wird das Molekçl zum wohlschmeckenden Ethylalkohol (CH3CH2OH). Hångt man stattdessen eine Carboxylgruppe

(±COOH) an, entsteht Essigsåure (CH3COOH), der geschmacksintensive Inhaltsstoff des Essigs. Ersetzt man den Wasserstoff durch eine Sulfhydrylgruppe (±SH), hat man Ethylmercaptan (CH3CH2SH) hergestellt, ein starkes, çbelriechendes Mittel, mit dem Biochemiker Enzymreaktionen untersuchen. 2.4.2 Eine Klassifizierung biologischer Molekçle aufgrund ihrer Funktion Die organischen Molekçle, die man håufig in lebenden Zellen findet, kann man entsprechend ihrer Bedeutung im Stoffwechsel folgendermaûen unterteilen: n  . Makromolekçle sind groûe, hochgradig organisierte Molekçle, welche die Strukturen der Zellen bilden und ihre Aktivitåten ausfçhren; die Anzahl ihrer Kohlenstoffatome kann irgendwo zwischen einigen Dutzend bis zu Millionen liegen. Wegen der Græûe und der komplizierten Formen, die Makromolekçle annehmen kænnen, kænnen einige dieser molekularen Giganten sehr pråzise und effizient komplizierte Aufgaben ausfçhren. Mehr als allen anderen Merkmalen verdanken die Organismen besonders diesen Makromolekçlen die Eigenschaften, die das Leben ausmachen; durch sie unterscheiden sie sich chemisch von der unbelebten Welt. Man kann die Makromolekçle in vier groûe Gruppen einteilen: Proteine, Nucleinsåuren, Polysaccharide und bestimmte Lipide. Die ersten drei Gruppen sind /%. Sie werden durch /%

 , einen Vorgang, der dem Ankoppeln von Eisenbahnwagen an einen Zug åhnelt, aus zahlreichen niedermolekularen Bausteinen oder   zusammengesetzt (Abb. 2.10). Die Grundstrukturen und -funktionen all dieser Makromolekçltypen åhneln sich in allen Organismen. Man muss sich die spezifische Reihenfolge der Monomere, aus denen diese verschiedenen Makromolekçle bestehen, schon sehr genau ansehen, um

a

55

Die Eigenschaften biologischer Molekçle

a

b n Abb. 2.10 a, b. Monomere und Polymere ± Polymerisation und Hydrolyse. a Polysaccharide, Proteine und Nucleinsåuren bestehen aus Monomeren (Untereinheiten), die çber kovalente Bindungen miteinander verknçpft sind. Um diese Makromolekçle zu bilden, reicht es nicht aus, dass freie Monomere einfach miteinander reagieren; vielmehr muss jedes Monomer erst aktiviert werden. Dazu wird es

erst an ein Trågermolekçl gekoppelt, das dann das Monomer an das Ende des wachsenden Makromolekçls schleust. b Um ein Makromolekçl abzubauen, werden die Bindungen zwischen den Monomeren hydrolysiert. Bei der Hydrolyse wird eine Bindung mithilfe von Wasser aufgebrochen. All diese Reaktionen werden von spezifischen Enzymen katalysiert

zu erkennen, dass sie je nach Organismus doch sehr vielfåltig sind. n
      . Die meisten Makromolekçle innerhalb einer Zelle existieren im Vergleich zur Zelle nur eine kurze Zeit; mit Ausnahme der ZellDNA werden sie fortwåhrend abgebaut und durch neue Makromolekçle ersetzt. Daher besitzen die meisten Zellen einen Vorrat an niedermolekularen Vorstufen, die bereits so weit fertig sind, dass sie in Makromolekçle eingebaut werden kænnen. Dazu gehæren Zucker, die Vorstufen von Polysacchariden sind, Aminosåuren, die Bausteine von Proteinen, Nucleotide, die Grundelemente der Nucleinsåuren, sowie Fettsåuren, die in Lipide eingebaut werden n         Die Molekçle einer Zelle sind komplizierte chemische Verbindungen, die ausgehend von spezifischen Ausgangsstoffen in einem schrittweisen Verfahren synthetisiert werden mçssen. In der Zelle bezeichnet man jede Abfolge chemischer Reaktion als  . Die Zelle beginnt mit einer Substanz A, die sie in die Substanz B um-

wandelt, dann in die Substanz C und so weiter, bis irgendein Endprodukt wie beispielsweise ein Aminosåurebaustein eines Proteins entstanden ist, den man in anderen Reaktionen verwenden kann. Auf diesen Stoffwechselwegen entstehen bis zum Endprodukt immer wieder Verbindungen, die selbst keine Funktion haben; sie werden als      bezeichnet. n           . Das ist natçrlich ein breites Spektrum an Molekçlen, aber nicht so groû, wie man erwarten kænnte. Den græûten Anteil am Trockengewicht einer Zelle machen Makromolekçle und deren direkte Vorstufen aus. Zu den Molekçlen mit verschiedenartigen Funktionen gehæren solche Substanzen wie die Vitamine, die vor allem Zusatzstoffe von Proteinen sind: bestimmte Steroid- oder Aminosåure-Hormone, Molekçle wie ATP oder Kreatinphosphat, die zur Energiespeicherung dienen, regulatorische Molekçle wie zyklisches AMP sowie Stoffwechselabfallprodukte wie Harnstoff.

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Die chemischen Grundlagen des Lebens

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2.5 Vier Arten von biologischen Molekçlen Man kann die gerade beschriebenen Makromolekçle in vier Typen von organischen Molekçlen einteilen. Kohlenhydrate, Lipide, Proteine und Nucleinsåuren. In welchen Zellstrukturen sich diese Molekçle befinden, zeigt ein Ûberblick in Abb. 2.11. 2.5.1 Kohlenhydrate Zu den   %  gehæren einfache Zucker (oder 

  ) sowie alle græûeren Molekçle, die aus Zuckerbausteinen bestehen. Kohlenhydrate dienen vor allem zur Speicherung

n Abb. 2.11.  P      ,I  (  

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chemischer Energie und als haltbare Baumaterialien fçr biologische Gefçge. Die meisten Zucker haben die allgemeine Formel (CH2O)n. Bei den fçr den Zellstoffwechsel wichtigen Zuckern liegen die Werte fçr n bei 3 bis 7. Zucker mit drei Kohlenstoffatomen nennt man !  , sind es vier Kohlenstoffatome spricht man von !

' bei fçnf Kohlenstoffatomen von / ' bei sechs von 2-  und bei sieben von 2     &      Jedes Zuckermolekçl besteht aus einem Gerçst von Kohlenstoffatomen, die çber einzelne Bindungen linear miteinander verknçpft sind. Jedes Kohlenstoffatom des Gerçsts ist bis auf eines, das eine Carbonylgruppe (C=O) trågt, mit einer einzelnen Hydroxylgruppe verbunden. Wenn sich die Carbonylgruppe im Innern des Molekçls befindet (und so eine Ketogruppe bildet) bezeichnet man den Zucker als  , wie etwa die Fructose aus Abb. 2.12 a. Befindet sich die Carbonylgruppe an einem Ende des Zuckers, bildet sie eine Aldehydgruppe, und man bezeichnet das Molekçl als  ; ein Beispiel dafçr ist die Glucose, die man in Abb. 2.12 b±f sieht. Obwohl sie fçr einen Strukturvergleich verschiedener Zucker gute Dienste leisten, erkennt man an den geradkettigen Darstellungen wie in Abb. 2.12 a, b nicht, dass sich Zucker durch eine intramolekulare Reaktion (Abb. 2.12 c) in ein geschlossenes oder ringfærmiges Molekçl verwandeln. Die Ringformen der Zucker werden in der Regel als flache Strukturen dargestellt (Abb. 2.12 d), die senkrecht aus der Papierebene herausragen, wobei die fettgedruckte Linie dem Leser zugewandt ist. Die H- und OH-Gruppen befinden sich parallel zur Papierebene und ragen oben oder unten aus dem Zuckerring heraus. In Wahrheit ist der Zuckerring nicht eben, sondern hat eine dreidimensionale Konformation, die einem Sessel åhnelt (Abb. 2.12 e, f). &   Wie bereits erwåhnt, kann ein Kohlenstoffatom mit vier anderen Atomen Bindungen eingehen. Die Anordnung der Gruppen um ein Kohlenstoffatom herum kann man wie in Abb. 2.13 a veranschaulichen: Der Kohlenstoff steht im Zentrum eines Tetraeders, wåhrend die gebundenen Gruppen in die vier Ecken hineinragen. Abb. 2.13 b zeigt ein Molekçl Glycerinaldehyd, die einzige Aldotriose, die es gibt. Das zweite Kohlenstoffatom des Glycerinaldehyds ist mit vier verschiedenen Gruppen (±H, OH, ±CHO und ±CH2OH) verbunden. Wenn wie beim Glycerinaldehyd die vier mit einem Kohlenstoffatom ver-



n Abb. 2.12 a-f.  %  (   a           "   )  $ X      " 

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Vier Arten von biologischen Molekçlen

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Die chemischen Grundlagen des Lebens

bundenen Gruppen alle verschieden sind, dann gibt es zwei mægliche Konfigurationen, die man nicht zur Deckung bringen kann. Diese beiden Molekçle, die als &  oder #    bezeichnet werden, haben zwar beide das gleiche chemische Reaktionsvermægen, ihre Strukturen verhalten sich jedoch spiegelbildlich zueinander (åhnlich der rechten und linken Hand des Menschen). Einer Konvention zufolge bezeichnet man das Molekçl, bei dem die Hydroxylgruppe am zweiten Kohlenstoffatom rechts herausragt, als D-Glycerinaldehyd und dasjenige, bei dem es links herausragt, als L-Glycerinaldehyd (Abb. 2.13 c). Weil das zweite Kohlenstoffatom fçr die Stereoisomerie entscheidend ist, bezeichnet man es als %   Kohlenstoffatom. Wenn das Gerçst der Zuckermolekçle långer wird, erhæht sich auch die Anzahl der asymmetrischen Kohlenstoffatome und damit die Anzahl der Stereoisomere. Aldotetrosen haben zwei asymmetrische Kohlenstoffatome und kænnen daher in vier verschiedenen Konfigurationen vorkommen (Abb. 2.14). Ebenso gibt es acht verschiedene Aldopentosen und sechzehn verschiedene Aldohexosen. Die Bezeichnung all dieser Zucker als D oder L basiert konventionsgemåû

auf der Anordnung der Gruppen an dem asymmetrischen Kohlenstoffatom, das am weitesten vom Aldehyd entfernt ist (das Kohlenstoffatom, das mit dem Aldehyd verbunden ist, wird als C1 bezeichnet). Wenn die Hydroxylgruppe dieses Kohlenstoffatoms nach rechts herausragt, ist die Aldose ein D-Zucker, wenn sie links herausragt, ein L-Zucker. Die Enzyme lebender Zellen kænnen zwischen den D- und L-Formen eines Zuckers unterscheiden. In der Regel verwenden Zellen nur eines der Stereoisomere (wie D-Glucose oder L-Fucose). Die interne Reaktion, bei der sich ein Glucosemolekçl mit einer geraden Kette in einen sechsgliedrigen Ring (Pyranose) umwandelt, ist in Abb. 2.12 c dargestellt. Anders als sein Vorlåufer in der offenen Kette trågt C1 im Ring ebenfalls vier verschiedene Gruppen und wird so zu einem neuen Asymmetriezentrum innerhalb des Zuckermolekçls. Wegen dieses zusåtzlichen asymmetrischen Kohlenstoffatoms gibt es von jedem Pyranosetyp
- und -Stereoisomere (Abb. 2.15). Nach der Konvention ist das Molekçl eine
-Pyranose, wenn die OH-Gruppe des ersten Kohlenstoffatoms nach unten aus der Ringebene herausragt, und eine -Pyranose, wenn die Hydroxylgruppe nach oben zeigt. Der Unterschied zwischen den beiden Formen hat entscheidende biologische Folgen und fçhrt beispielsweise dazu, dass Glykogen- und Stårkemolekçle eine kompakte Form haben, wåhrend Cellulose gestreckt ist (s. unten).

n Abb. 2.14.    G     !'   I    )  

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. 9  Zucker kænnen miteinander çber kovalente %     7  zu græûeren Molekçlen verknçpft werden. Glycosidische Bindungen entstehen durch die Reaktion zwischen dem Kohlenstoffatom C1 eines Zuckers und der Hydro-

n Abb. 2.15.    
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Vier Arten von biologischen Molekçlen

xylgruppe eines anderen Zuckers; dabei entsteht zwischen den beiden Zuckern eine ±C-O-C-Bindung. Wie spåter noch erærtert wird (vgl. auch Abb. 2.16 und 2.17), kænnen Zucker çber ganz verschiedene glycosidische Bindungen miteinander verknçpft werden. Molekçle mit nur zwei Zuckereinheiten bezeichnet man als 

    (Abb. 2.16). Disaccharide fungieren vor allem als leicht verfçgbare Energiespeicher. Saccharose oder Rohrzucker ist ein wichtiger Bestandteil des Pflanzensafts, der chemische Energie aus einem Teil der Pflanze in einen anderen transportiert. Die in der Milch der meisten Såuger vorhandene Lactose versorgt neugeborene Såuger mit Energie fçr die ersten Wachstums- und Entwicklungsschritte. Die Lactose in der Nahrung wird durch das Enzym Lactase hydrolysiert, das in den Plasmamembranen der Zellen, die den Darm auskleiden, vorhanden ist. Viele Menschen verlieren dieses Enzym im Verlauf ihrer Kindheit und haben daher Verdauungsprobleme, wenn sie lactosehaltige Nahrungsmittel gegessen haben. Zucker kænnen auch zu kurzkettigen Molekçlen, den ( 

   (griech. ( = wenige), verknçpft sein. Sehr håufig sind solche Ketten kovalent mit Lipiden und Proteinen verbunden, so dass daraus Glycolipide beziehungsweise Glycoproteine werden. Besonders wichtig sind die Oligosaccharide bei den Glycolipiden und Glycoproteinen der Plasmamembran, auf

a

b n Abb. 2.16.    %  .   &       %      

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denen sie dann aus der Zelloberflåche herausragen (Abb. 4.4 c). Weil Oligosaccharide aus vielen verschiedenen Kombinationen von Zuckereinheiten bestehen kænnen, kænnen diese Kohlenhydrate Informationen enthalten; das heiût, durch sie låsst sich ein Zelltyp vom anderen unterscheiden, so dass sie dazu beitragen, spezifische Wechselwirkungen einer Zelle mit ihrer Umgebung zu vermitteln (Erærterung in Kap. 7.1). /%

   Seit Mitte des 19. Jahrhunderts weiû man, dass das Blut von Personen, die an Diabetes leiden, aufgrund einer erhæhten Konzentration an Glucose, dem wichtigsten Zucker im Energiestoffwechsel, sçû schmeckt. Claude Bernard, ein bekannter franzæsischer Physiologe dieser Zeit, suchte nach der Ursache fçr Diabetes, indem er der Frage nachging, woher der Blutzucker stammte. Damals nahm man an, dass jeder Zucker, der in einem Menschen oder Tier vorhanden war, vorher einmal mit der Nahrung aufgenommen werden musste. Bei seiner Arbeit mit Hunden fand Bernard heraus, dass das Blut der Tiere selbst dann eine normale Menge an Glucose aufwies, wenn in ihrer Nahrung keine Kohlenhydrate enthalten waren. Offenbar konnte der Kærper aus andersartigen Verbindungen Glucose herstellen. Nach weiteren Untersuchungen fand Bernard heraus, dass die Glucose çber die Leber in das Blut gelangt. Lebergewebe, erkannte er, enthålt ein unlæsliches Polymer der Glucose, das er :%  nannte. Bernard schloss daraus, dass verschiedene Substanzen aus der Nahrung (wie Proteine) zur Leber transportiert werden, wo sie chemisch in Glucose umgewandelt und in Form von Glycogen gespeichert werden. Wenn dann der Kærper als Brennstoff Zucker benætigt, wird das Glycogen in der Leber in Glucose umgewandelt und dann in das Blut freigesetzt, um Gewebe, die zu wenig Glucose haben, zu versorgen. Bernards Hypothese zufolge war das Gleichgewicht zwischen Glycogensynthese und -abbau in der Leber der entscheidende Faktor dafçr, um die Glucosekonzentration im Blut relativ konstant zu halten (Homæostase). Bernards Hypothese hat sich als richtig erwiesen. Das Molekçl, das er Glycogen nannte, ist eine Art /%

   ± ein Polymer aus Zuckereinheiten, die çber glycosidische Bindungen miteinander verknçpft sind.

H0

Die chemischen Grundlagen des Lebens

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c n Abb. 2.17 a±c.   # I            "   (          

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      #1  Glycogen ist ein verzweigtes Polymer, das nur aus einem Typ von Monomer besteht: Glucose (Abb. 2.17 a). Die meisten Zuckereinheiten eines Glycogenmolekçls sind çber
(1 ? 4)-glycosidische Bindungen (Typ-2-Bindung in Abb. 2.17 a) miteinander verknçpft. Verzweigungspunkte enthalten einen Zucker, der statt mit zwei ± wie in den unverzweigten Abschnitten des Polymers ± mit drei Nachbareinheiten ver-

bunden ist. Der zusåtzliche Nachbar, der fçr die Verzweigung sorgt, wird çber eine
(1 ? 6)-glycosidische Bindung (Typ-1-Bindung in Abb. 2.17 a) angehångt. Glycogen dient bei den meisten Tieren als Speichermolekçl fçr çberschçssige chemische Energie. So enthalten etwa die Skelettmuskeln des Menschen in der Regel Glycogen fçr eine 30-minçtige mittelschwere Beanspruchung. Abhångig von verschiedenen Faktoren hat Glycogen ein Molekulargewicht von 1±4 Millionen Dalton.

 Das in den Zellen gespeicherte Glycogen ist stark konzentriert und erscheint auf elektronenmikroskopischen Aufnahmen in Form von dunkelgefårbten, unregelmåûigen Granula (Abb. 2.17 a, rechts). Die meisten Pflanzen speichern ihre çberschçssige chemische Energie in Form von &1 , die wie Glycogen ein Glucosepolymer ist. Kartoffeln und Getreide beispielsweise bestehen vor allem aus Stårke. Stårke ist eigentlich eine Mischung aus zwei verschiedenen Polymeren, der Amylose und dem Amylopectin. Amylose ist ein unverzweigtes helikales Molekçl, dessen Zucker çber
(1 ? 4)-Bindungen (Abb. 2.17 b) miteinander verbunden sind, wåhrend Amylopectin verzweigt ist. Amylopectin unterscheidet sich von Glycogen jedoch dadurch, dass es viel weniger verzweigt ist und ein unregelmåûiges Verzweigungsmuster aufweist. Stårke wird in Form von dicht gepackten Granula oder Stårkekærnern gespeichert, die innerhalb der Pflanzenzelle in /  , von Membranen umgebenen Organellen, eingeschlossen sind (Abb. 2.17 b). Obwohl Tiere keine Stårke synthetisieren, besitzen sie ein Enzym, die % , mit dem sie Stårkemolekçle leicht hydrolysieren kænnen. + " +    :%

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         9 & Wåhrend einige Polysaccharide leicht abbaubare Energiespeicher bilden, formen andere kråftige, haltbare Strukturmaterialien. Baumwolle und Leinen beispielsweise bestehen çberwiegend aus + , dem Hauptbestandteil von pflanzlichen Zellwånden. Textilien aus Baumwolle verdanken ihre Haltbarkeit den langen unverzweigten Cellulosemolekçlen, die in parallel verlaufenden Verbånden angeordnet sind. Die so entstandenen molekularen Seile (Photo, Abb. 2.17 c) sind wie geschaffen dafçr, um Zugkråfte aufzufangen. Wie Glycogen und Stårke besteht Cellulose ausschlieûlich aus Glucose-Einheiten, unterscheidet sich aber in seinen Eigenschaften erheblich von diesen anderen Polysacchariden, weil die Glucose-Einheiten mehr çber (1 ? 4)-Verbindungen (Bindung 3 in Abb. 2.17 c) als çber
(1 ? 4)-Verbindungen miteinander verknçpft sind. Seltsamerweise besitzen vielzellige Tiere bis auf wenigen Ausnahmen kein Enzym zum Abbau von Cellulose, welche das auf der Erde am weitesten verbreitete organische Material ist und viel chemische Energie enthålt. Tiere wie Termiten und Schafe, die ¹sich damit durchschlagenª, Cellulose zu verdauen, kænnen das, weil sie Bakterien und Protozoen beherbergen, die das erforderliche Enzym, die Cellulase, synthetisieren.

Vier Arten von biologischen Molekçlen

H5

Nicht alle biologischen Polysaccharide bestehen aus Glucose-Einheiten. +   ist ein unverzweigtes Polymer des Zuckers )-Acetylglucosamin, der von der Struktur her der Glucose åhnelt, aber anstelle einer Hydroxylgruppe eine Acetylaminogruppe besitzt, die mit dem zweiten C-Atom des Rings verknçpft ist.

Chitin ist ein unter Wirbellosen weit verbreitetes Strukturmolekçl, das besonders håufig im Auûenskelett von Insekten, Spinnen und Krustentieren vorkommt. Es ist ein strapazierfåhiges, unverwçstliches, aber trotzdem flexibles Material, das etwa bestimmten Kunststoffarten åhnelt. Insekten schulden einen Groûteil ihres Erfolgs diesem åuûerst anpassungsfåhigen Polysaccharid (Abb. 2.18). Eine andere Gruppe von Polysacchariden mit komplexerer Struktur sind die :%

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n Abb. 2.18. 8     9     &!    C      9     + ;   . ? 1

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Die chemischen Grundlagen des Lebens

  (oder :: ). Im Gegensatz zu anderen Polysacchariden haben sie die Struktur ±A±B±A±B±, wobei A und B zwei verschiedene Zucker darstellen. Das am besten untersuchte GAG ist Heparin, das bei einer Gewebeverletzung von Lungen- und anderen Gewebezellen sezerniert wird. Es unterbindet die Blutgerinnung, und verhindert dadurch die Bildung von Thromben, die den Blutfluss zum Herzen oder in die Lungen blockieren kænnen. Das Heparin bringt dieses Kunststçck fertig, indem es einen Hemmstoff (Antithrombin) eines fçr die Blutgerinnung erforderlichen Schlçsselenzyms (Thrombin) aktiviert. Heparin, das normalerweise aus dem Gewebe von Schweinen extrahiert wird, wurde jahrzehntelang dazu benutzt, um bei den Patienten nach græûeren Operationen die Bildung von Blutgerinnseln zu verhindern. Im Gegensatz zum Heparin befinden sich die meisten GAGs in den Zellzwischenråumen; ihre Strukturen und Funktionen werden wir ausfçhrlich in Kap. 7.1 erærtern. Die komplexesten Polysaccharide findet man in den Zellwånden von Pflanzen (Kap. 7.6). 2.5.2 Lipide Lipide sind eine vielseitige Gruppe unpolarer biologischer Molekçle. Alle kænnen jedoch in organischen Læsungsmitteln wie Chloroform oder Benzol gelæst werden und sind wasserunlæslich ± eine Eigenschaft, die viele ihrer verschiedenartigen biologischen Funktionen erklårt. Zu den fçr die Zellfunktion wichtigen Lipiden gehæren Fette, Steroide und Phospholipide.
 Fette bestehen aus einem Glycerinmolekçl, das çber Esterbindungen mit drei Fettsåuren verknçpft ist; das gesamte Molekçl wird als ! % %  bezeichnet (Abb. 2.19 a). Beschåftigen wir uns als erstes mit der Struktur der
 1 . Fettsåuren sind lange, nicht verzweigte Kohlenwasserstoffketten mit einer einzigen Carboxylgruppe an einem Ende (Abb. 2.19 b). Weil die beiden Enden eines Fettsåuremolekçls jeweils vællig anders strukturiert sind, haben sie auch unterschiedliche Eigenschaften. Die Kohlenwasserstoffkette ist hydrophob, die Carboxylgruppe (±COOH), die bei physiologischem pH-Wert eine negative Ladung trågt, dagegen hydrophil. Molekçle, die sowohl hydrophobe als auch hydrophile Bereiche aufweisen, bezeichnet man als

    ; solche Molekçle haben ungewæhnliche, biologisch wichtige Eigenschaften. Welche Eigenschaften Fettsåuren besitzen, wird klar, wenn man sich den Einsatz eines vertrau-

n Abb. 2.19 a±d.      &  a      ,I  I  +   , I          !   '1    I    + 1              8$I        &  (  "    %'&!   &  b %  & "   &   &  5E ) 



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 ten Produkts vor Augen fçhrt: der aus Fettsåuren bestehenden Seife. Fçr die Herstellung von Seifen hat man bis ins letzte Jahrhundert hinein Tierfett in starken Basen (NaOH oder KOH) erhitzt, um die Bindungen zwischen den Fettsåuren und dem Glycerin aufzubrechen. Heutzutage werden die meisten Seifen synthetisch hergestellt. Seifen verdanken ihre Fåhigkeit, Fett zu læsen, der Tatsache, dass ihr hydrophobes Ende in das Fett eindringen und gleichzeitig ihr hydrophiles Ende mit dem umgebenden Wasser reagieren kann. Dadurch werden die Fettsubstanzen in Komplexe (Mizellen) eingeschlossen und in dieser Form so fein im Wasser verteilt, dass sie abgespçlt werden kænnen (Abb. 2.20). Fettsåuren unterscheiden sich in der Långe ihrer Kohlenwasserstoffketten sowie darin, ob sie Doppelbindungen enthalten oder nicht. Die Fettsåuren in den Zellen bestehen aus 14 bis 20 Kohlenstoffatomen. Fettsåuren ohne Doppelbindungen wie Stearinsåure (Abb. 2.19 b) bezeichnet man als  1 , solche mit Doppelbindungen als  1 . Doppelbindungen (in -Konfiguration)

fçhren in die Fettsåurekette Knicke ein. Daher wird es immer schwieriger, diese langen Fettsåuren mæglichst dicht zu packen, je mehr Doppelbindungen sie enthalten. Dadurch sinkt die Temperatur, bei der fettsåurehaltige Lipide schmelzen. Tristearin, dessen Fettsåuren keine Doppelbindungen aufweisen (Abb. 2.19 c), ist ein håufiger Bestandteil tierischer Fette und bleibt auch bei Werten çber der Raumtemperatur noch in festem Zustand. Bei pflanzlichen Fetten ist dagegen ihre Fçlle an Doppelbindungen dafçr verantwortlich, dass diese Fette sowohl in der Pflanzenzelle als auch im Lebensmittelladen flçssig bleiben; diese Fette werden daher auch als ¹vielfach ungesåttigtª bezeichnet. Fette, die bei Raumtemperatur flçssig sind, nennt man ;. Abbildung 2.19 d zeigt die Struktur von Leinsamenæl, einem stark flçchtigen Lipid, das aus Leinsamen extrahiert wird und selbst bei einer sehr viel tieferen Temperatur als Tristearin noch flçssig bleibt. Festes Backfett wie Margarine stellt man her, indem man die Doppelbindungen ungesåttigter Pflanzenæle chemisch mit Wasserstoffatomen reduziert; dieser Prozess wird als

Vier Arten von biologischen Molekçlen

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n Abb. 2.20. %          &     %    %  !            &       " '        "   B  '    " '  '    (     )B        ?!   & " '     G

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2%  bezeichnet. Ein Molekçl Fett kann drei identische Fettsåuren enthalten (Abb. 2.19 c) oder aus verschiedenen Fettsåuretypen zusammengesetzt sein (Abb. 2.19 d). Die meisten natçrlich vorkommenden Fette wie Olivenæl oder Butter sind ein Molekçlgemisch aus verschiedenen Fettsåurearten. Fette enthalten sehr viel chemische Energie. Ein Gramm Fett liefert mehr als doppelt soviel Energie wie ein Gramm Kohlenhydrate (die Grçnde dafçr werden in Kap. 3.1 erærtert). Kohlenhydrate dienen vor allem als kurzzeitige, schnell verfçgbare Energiequellen, wåhrend Fettreserven langfristig Energie speichern. Im Kærper einer Person mittlerer Græûe stehen schåtzungsweise 0,5 kg Kohlenhydrate ± vor allem in Form von Glycogen ± zur Verfçgung. Diese Menge an Kohlenhydraten liefert ungefåhr 2000 kcal Energie. Mit einem Tag anstrengender Arbeit kann man damit praktisch seinen gesamten Kohlenhydratspeicher aufbrauchen. Dem stehen durchschnittlich ungefåhr 16 kg Fett pro Person gegençber, was 144 000 kcal Energie entspricht. Wie wir alle wissen, kann es sehr lange dauern, bis dieser Fettvorrat aufgebraucht ist. Weil Fette keine polaren Gruppen besitzen, læsen sie sich åuûerst schlecht in Wasser und werden in Zellen in Form trockener Fetttræpfen

H6

Die chemischen Grundlagen des Lebens

gespeichert. Da Lipidtræpfchen im Gegensatz zu Glycogengranula kein Wasser enthalten, sind sie eine åuûerst kompakte Speicherform. Viele Tieren speichern Fette in speziellen Zellen,   %, deren Cytoplasma mit einem oder einigen wenigen groûen Lipidtræpfchen angefçllt ist. Adipocyten zeigen die bemerkenswerte Fåhigkeit, ihr Volumen an die unterschiedlichsten, jeweils vorhandenen Fettmengen anpassen zu kænnen. &  Steroide bestehen aus einem charakteristischen Kohlenwasserstoffgerçst mit vier Ringen. Eines der wichtigsten Steroide ist +   , ein Bestandteil der Zellmembranen von Tieren und Grundbaustein fçr die Synthese einer Reihe von Steroidhormonen wie Testosteron, Progesteron und Ústrogen (Abb. 2.21). In Pflanzenzellen findet man kaum Cholesterin, weshalb pflanzliche Úle als ¹cholesterinfreiª bezeichnet werden, Pflanzenzellen kænnen aber groûe Mengen an verwandten Substanzen enthalten. /      In Abb. 2.22 ist die chemische Struktur eines håufigen Phospholipids dargestellt. Das Molekçl åhnelt einem Fett (Triacylglycerin), hat aber nur

n Abb. 2.22.  #   # I   

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zwei statt drei Fettsåureketten und ist daher ein  %% . Die dritte Hydroxylgruppe des Glyceringerçsts ist kovalent an eine Phosphatgruppe gebunden, die, wie man in Abb. 2.22 sieht, wiederum kovalent mit einer kleinen polaren Gruppe wie einem Cholin verknçpft ist. Daher besitzen Phospholipide anders als Fettmolekçle zwei Enden mit ganz unterschiedlichen Eigenschaften: Das Ende mit der Phosphatgruppe hat einen ausgeprågt hydrophilen Charakter, wåhrend das andere Ende mit den zwei Fettsåureenden einen ausgesprochen hydrophoben Charakter besitzt. Da sich Phospholipide vor allem in Zellmembranen befinden und die Eigenschaften der Zellmembranen von ihren Phospholipidbestandteilen abhången, werden wir sie spåter zusammen mit den Zellmembranen in Kap. 4.3 besprechen. 2.5.3 Proteine

n Abb. 2.21.  %   %   %          (  ;  %    4 

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Proteine sind die Makromolekçle, die fçr praktisch såmtliche Zellaktivitåten verantwortlich sind. Sie sind die molekularen Hilfsmittel und Maschinen, die alles in Schwung halten. Man schåtzt, dass die typische Såugerzelle bis zu 10 000 verschiedene Proteine besitzt, die vielfåltige Funktionen erfçllen. So sorgen sie als Enzyme dafçr, dass Stoffwechselreaktionen wesentlich schneller ablaufen, wirken als Seile strukturverstårkend und bieten innerhalb und auûerhalb von Zellen mechanische Unterstçtzung (Abb. 2.23 a), erfçllen als Hormone, Wachstumsfaktoren und Genaktivatoren viele verschiedene re-

 gulatorische Aufgaben, bestimmen als Membranrezeptoren und Transportmolekçle, worauf eine Zelle anspricht und welche Art von Substanzen in eine Zelle eindringen und sie verlassen, und bilden als kontraktile Filamente sowie molekulare Motoren die Maschinerie fçr biologische Bewegungen. Zu ihren weiteren zahlreichen Aufgaben gehært es beispielsweise auch, Antikærper, Giftstoffe und Blutgerinnsel zu bilden, Licht zu absorbieren und zu brechen (Abb. 2.23 b) sowie Substanzen von einem Teil des Kærpers in einen anderen zu transportieren. Wie kann ein Molekçltyp so viele verschiedene Funktionen haben? Die Erklårung dafçr liegt in den praktisch unendlich vielen molekularen Strukturen, welche die Gruppe der Proteine annehmen kann. Jedes Einzelprotein hat allerdings eine einzigartige und hochgradig geordnete Struktur, die es ihm ermæglicht, eine bestimmte Funktion auszufçhren. Besonders wichtig ist dabei, dass Proteine aufgrund ihrer Formen und Oberflåchen gezielt mit anderen Molekçlen in Wechselwirkungen treten kænnen. Mit anderen Worten: Proteine sind hochgradig $   . So kann zum Beispiel ein bestimmtes Enzym, das DNA schneidet, einen DNA-Abschnitt mit einer bestimmten Sequenz von acht Nucleotiden erkennen, wåhrend es alle anderen 65 535 mæglichen Sequenzen mit acht Nucleotiden ignoriert.

a n Abb. 2.23 a, b. '     ( ,    

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Vier Arten von biologischen Molekçlen

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  /     Proteine sind Polymere aus Aminosåure-Monomeren. Jedes Protein hat eine einzigartige Aminosåuresequenz, die dem Molekçl seine spezielle Fåhigkeiten verleiht. Viele dieser Fåhigkeiten werden schon allein dann offensichtlich, wenn man sich die chemischen Eigenschaften der Aminosåuren eines Proteins ansieht. Fçr den Proteinaufbau werden in der Regel 20 verschiedene Aminosåuren genutzt; dies gilt fçr Viren ebenso wie fçr den Menschen. Die Struktur der Aminosåuren låsst sich unter zwei Gesichtspunkten betrachten: man kann zum einen herausstellen, was allen gemeinsam ist, und zum anderen, was jede fçr sich so einzigartig macht. Wir beginnen mit den Gemeinsamkeiten.   &    1 Alle Aminosåuren besitzen eine Carboxyl- und eine Aminogruppe, die durch ein einzelnes Kohlenstoffatom, das
-Kohlenstoffatom, voneinander getrennt sind (Abb. 2.24 a, b). In einer neutralen wåssrigen Læsung verliert die
-Carboxylgruppe ein Proton und ist daher negativ geladen (±COO±), wåhrend die Aminogruppe ein Proton aufnimmt und dadurch positiv geladen ist (±NH+3 ) (Abb. 2.24 b). Wie wir in Kap. 2.5.1 gesehen haben, kænnen Kohlenstoffatome, die mit vier verschiedenen Gruppen verbunden sind, zwei verschiedene     (Stereoisomere) annehmen, die durch Aufeinanderlegen nicht in Ûbereinstimmung zu bringen sind.

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Die chemischen Grundlagen des Lebens

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Bei der Proteinsynthese wird jede Aminosåure mit zwei anderen Aminosåuren zu einem langen, kontinuierlichen unverzweigten Polymer verknçpft, der /% . Die Aminosåuren, aus denen eine Polypeptidkette besteht, werden çber /   aneinandergehångt; dabei wird die Carboxylgruppe einer Aminosåure mit der Aminogruppe ihrer benachbarten Aminosåure unter Eliminierung eines Wassermolekçls verknçpft (Abb. 2.24 c). Eine Polypeptidkette aus einer Reihe von Aminosåuren, die çber Peptidbindungen miteinander verknçpft sind, besteht aus folgendem Grundgerçst: c n Abb. 2.24 a±c.  &  a ) %?  b               (  & "    ;        ;           +  ::H1 c   #   

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Aminosåuren haben ebenfalls asymmetrische Kohlenstoffatome. Mit Ausnahme des Glycins ist das
-Kohlenstoffatom der Aminosåuren mit vier verschiedenen Gruppen verbunden, so dass jede Aminosåure entweder in der D- oder L-Form vorliegt (Abb. 2.25). Fçr die Proteinsynthese am Ribosom werden ausschlieûlich L-Aminosåuren verwendet. Zur ¹Selektionª der L-Aminosåuren muss es bereits sehr frçh in der zellulåren Evolution gekommen sein; daran hat sich çber Milliarden von Jahren nichts veråndert. Mikroorganismen benutzen dagegen D-Aminosåuren, um bestimmte kleine Peptide beispielsweise der Zellwand zu synthetisieren; dazu gehæren auch verschiedene Antibiotika (wie etwa Gramicidin A).

Im Durchschnitt besteht eine Polypeptidkette aus etwa 450 Aminosåuren. Das långste bekannte Polypeptid gibt es im Muskelprotein Titin; es besteht aus çber 30 000 Aminosåuren. Sind die Aminosåuren erst einmal in eine Polypeptidkette eingebaut, nennt man sie  . Den Rest an einem Ende der Kette, dem )!  , bildet eine Aminosåure mit einer freien (ungebundenen)
-Aminogruppe, wåhrend der Rest am entgegengesetzten Ende, dem +!  , eine freie
-Carboxylgruppe aufweist. Ûber die Aminosåuren hinaus gehæren zu vielen Proteinen noch andere Bestandteile, die erst nach der Polypeptidsynthese angehångt werden: etwa Kohlenhydrate (zur Bildung von Glycoproteinen), Gruppen, die Metall enthalten (und Metalloproteine bilden)

 sowie organische Gruppen (beispielsweise Flavoproteine).   #    9 &  Das Grundgerçst oder die Hauptkette des Polypeptids wird aus dem Aminosåureanteil gebildet, der allen Aminosåuren gemeinsam ist. Welche &  oder : (Abb. 2.24) am
-Kohlenstoffatom hångt, ist bei den 20 Bausteinen ganz unterschiedlich, aber gerade dieser Variabilitåt verdanken die Proteine letztlich ihre unterschiedlichen Strukturen und Aktivitåten. Wenn man die verschiedenen Aminosåureseitenketten insgesamt betrachtet, so zeigen sie eine groûe Vielfalt an Strukturmerkmalen, die von vollståndig geladen bis zu hydrophob reichen; auûerdem enthalten sie ein breites Spektrum an kovalenten und nicht kovalenten Bindungen. Wie im folgenden Kapitel erærtert wird, kænnen die Seitenketten der ¹aktiven Zentrenª von Enzymen viele verschiedene organische Reaktion erleichtern (katalysieren). Die verschiedenartigen Eigenschaften der Aminosåureseitenketten sind sowohl fçr die    Wechselwirkungen, die fçr die Struktur und Aktivitåt des Molekçls verantwortlich sind, als auch fçr die    Wechselwirkungen wichtig, von denen die Beziehung eines Polypeptids zu anderen Molekçlen ± mæglicherweise auch anderen Polypeptiden ± abhångt (Kap. 2.5.3). Man unterscheidet die Aminosåuren nach der Beschaffenheit ihrer Seitenketten. Es gibt allgemein vier Gruppen: polar und geladen, polar und ungeladen, unpolar sowie solche mit besonderen Eigenschaften (Abb. 2.26). /    0 Zu den Aminosåuren dieser Gruppe gehæren Asparaginsåure, Glutaminsåure, Lysin und Arginin. Diese vier Aminosåuren besitzen Seitenketten, die vollståndig geladen sind; das heiût, es sind Seitenketten mit relativ starken organischen Såuren und Basen. In Abb. 2.27 sind die Ionisierungsreaktionen der Glutaminsåure und des 8%  skizziert. Bei einem physiologischen pH-Wert befinden sich die Seitenketten dieser Aminosåuren fast immer in einem vollståndig geladenen Zustand. Daher kænnen sie Ionenbindungen mit anderen geladenen Molekçle in der Zelle eingehen. So sind beispielsweise die positiv geladenen Argininreste der Histonproteine çber Ionenbindungen mit den negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA verbunden (Abb. 2.3). 2    wird ebenfalls als polare geladene Aminosåure angesehen, obwohl sie bei einem physiologischen pH-Wert meist nur teilweise geladen ist. Wegen seiner Fåhigkeit, in physiologischem Milieu Protonen an sich zu ziehen oder zu verlieren, ist Histidin tat-

Vier Arten von biologischen Molekçlen

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såchlich ein besonders wichtiger Rest im aktiven Zentrum vieler Proteine (Beispiel in Abb. 3.13). /    0 Weil die Seitenketten dieser Aminosåuren partiell negativ oder positiv geladen sind, kænnen sie mit anderen Molekçlen, unter anderem auch mit Wasser, Wasserstoffbrçcken eingehen. Diese Aminosåuren sind oft sehr reaktiv. Zu dieser Gruppe gehæren       und :   (die Amide der Asparaginsåure und Glutaminsåure, Kap. 2.4.1), !   , &  sowie !% .  0 Die Seitenketten dieser Aminosåuren sind hydrophob und kænnen keine elektrostatischen Bindungen eingehen oder mit Wasser reagieren. Zu dieser Gruppe gehæren die Aminosåuren   , .  , 8 , 6  , !%  , / %    und   . Die Seitenketten dieser unpolaren Aminosåuren enthalten generell keinen Sauerstoff oder Stickstoff. Sie unterscheiden sich vor allem in ihren Græûen und Formen. Deshalb kann die eine oder andere von ihnen in eine bestimmte Lçcke im Innern eines Proteins eingepasst sein, wo die Aminosåuren dann aufgrund von van-der-Waals-Kråften und hydrophoben Wechselwirkungen miteinander assoziiert sind.          1 ± Glycin, Prolin und Cystein ± haben ganz spezielle Eigenschaften, die sie von den anderen unterscheiden. Gerade weil ihre Seitenkette nur aus einem Wasserstoffatom besteht, ist :%  eine sehr wichtige Aminosåure. Wegen dieser fehlenden Seitenkette entsteht durch einen Glycinrest eine Stelle, an der sich die Gerçste von zwei Polypeptiden (oder zwei Abschnitten desselben Polypeptids) sehr nahe kommen kænnen. Darçber hinaus ist Glycin flexibler als andere Aminosåuren; so wird es mæglich, dass sich Teile des Gerçsts bewegen oder ein Scharnier bilden kænnen. Das Besondere an /  ist eine
-Aminogruppe, die zu ei-

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Die chemischen Grundlagen des Lebens

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Vier Arten von biologischen Molekçlen

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nem Ringsystem gehært und es zu einer Iminosåure macht. Prolin ist eine hydrophobe Aminosåure, die nicht ohne weiteres in eine Sekundårstruktur mit regelmåûiger Anordnung ± wie beispielsweise eine
-Helix ± hineinpasst (Kap. 2.5.3). +%  , das eine reaktive Sulfhydrylgruppe (±SH) aufweist, ist håufig çber eine     (±SS±) kovalent an einen anderen Cysteinrest gekoppelt. Disulfidbrçcken entstehen oft zwischen zwei Cysteinen, die innerhalb eines PolypeptidGrundgerçsts weit voneinander entfernt sind

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oder sogar auf zwei unterschiedlichen Polypeptiden liegen. Sie tragen dazu bei, die komplizierten Proteinformen zu stabilisieren, besonders die, welche sich auûerhalb von Zellen befinden und daher zusåtzlichem physikalischem und chemischem Stress ausgesetzt sind. In den Proteinen kommt meist nur eine Auswahl der in diesem Kapitel beschriebenen Aminosåuren vor; auûerdem sind die verschiedenen Aminosåuren nicht gleichmåûig verteilt. In den Proteinen findet man darçber hinaus auch noch einige andere Aminosåuren; sie entstehen durch Abwandlung der Seitenketten der 20 Grundaminosåuren, allerdings erst nach deren Einbau in eine Polypeptidkette. Deswegen bezeichnet man sie auch als           . Sie kænnen die Eigenschaften und Funktionen eines Proteins erheblich veråndern ± vor allem durch Modifikation seiner Wechselwirkungen mit anderen Molekçlen. Aufgrund der posttranslationellen Verånderungen kann aus einem einzelnen Polypeptid eine Reihe unterschiedlicher biologischer Molekçle hervorgehen. Der ionisierte, polare oder unpolare Charakter von Aminosåureseitenketten ist åuûerst wichtig fçr die Struktur und Funktion der Proteine. Bei den meisten læslichen Proteinen ± also solchen, die nicht in Membranen sitzen ± befinden sich die polaren Reste auf der Molekçloberflåche, wo sie mit dem umgebenden Wasser assoziiert sein kænnen und so zur Læslichkeit des Proteins in wåssriger Læsung beitragen (Abb. 2.28 a). Die unpolaren Reste befinden sich dagegen çberwiegend im Zentrum des Proteins (Abb. 2.28 b). Die hydrophoben Reste im Proteininnern liegen håufig dicht an dicht, wodurch sie eine Art dreidimensionales Puzzle bilden, von dem Wassermolekçle generell ausgeschlossen sind. Die hydrophoben Wechselwirkungen zwischen den unpolaren Seitenketten dieser Reste sind ein entscheidender Faktor fçr die Proteinfaltung (Kap. 2.5.3) und tragen wesentlich zur allgemeinen Stabilitåt des Proteins bei. Bei vielen Enzymen ragen reaktive polare Gruppen in das unpolare Innere hinein und ermæglichen so, dass das Enzym katalytisch aktiv ist. So kann etwa eine unpolare Umgebung ionische Wechselwirkungen zwischen geladenen Gruppen verstårken, die in einer wåssrigen Umgebung aufgrund der konkurrierenden Wassermolekçle abgeschwåcht wçrden. Einige Reaktionen, die in Wasser nur unmerklich langsam vorankåmen, laufen innerhalb des Proteins im Bruchteil einer Sekunde ab.   /   Nirgendwo in der Biologie kann man besser zeigen, wie stark die Funktion von der Form ab-

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Die chemischen Grundlagen des Lebens

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hångt, als bei den Proteinen. Proteine sind riesige, komplizierte Molekçle, aber in einem beliebigen vorgegebenen Umfeld sind ihre Strukturen eindeutig definiert und vorhersagbar. Indem jede Aminosåure eines Proteins eine vorbestimmte Position innerhalb dieses riesigen Molekçls einnimmt, erhålt das Protein die Struktur und das Reaktionsvermægen, die es fçr seine jeweilige Aktivitåt benætigt. Man kann die Proteinstruktur auf mehreren Organisationsebenen beschreiben, bei denen jeweils ein anderer Aspekt betont wird und die jeweils von unterschiedlichen Formen der Wechselwirkung abhången. Ûblicherweise unterscheidet man vier solcher Ebenen: die Primår-' Sekundår-, Tertiår- und Quartårstruktur. Die erste, die Primårstruktur, betrifft die Aminosåuresequenz eines Proteins, wåhrend sich die drei anderen Ebenen auf die Organisation des Molekçls im Raum beziehen. Um die Aktionsmechanismen und die biologische Funktion eines Proteins verstehen zu kænnen, muss man unbedingt wissen, wie ein Protein aufgebaut ist.

die Anzahl der Aminosåuren in der Kette ist. Weil die meisten Polypeptide aus çber 100 Aminosåuren bestehen ± einige sogar aus mehreren Tausend ±, sind die Variationsmæglichkeiten an Sequenzen praktisch unbegrenzt. Die Information çber die genaue Anordnung der Aminosåuren in jedem einzelnen Protein, das ein Organismus synthetisieren kann, ist im Genom des entsprechenden Organismus codiert. Wie wir spåter noch sehen werden, steckt in der Aminosåuresequenz die Information, die erforderlich ist, um die dreidimensionale Form des Molekçls und damit seine Funktion festzulegen. Die Abfolge der Aminosåuren ist daher çberaus wichtig, und es kann zu Problemen fçhren, wenn sie aufgrund genetischer Mutationen in der DNA veråndert wird. Das frçheste und am besten untersuchte Beispiel dafçr ist eine Verånderung der Aminosåuresequenz des Håmoglobins, die zur &  $ 1  fçhrt. Zu dieser schweren vererbbaren Form der Anåmie kommt es nur deshalb, weil eine einzige Aminosåure des Håmoglobin-Molekçls ausgetauscht wird: An die Stelle eines geladenen Glutaminsåurerestes tritt ein unpolarer Valinrest. Diese Verånderung in der Håmoglobinstruktur hat dramatische Folgen fçr die Form der roten Blutkærperchen, die statt einer Scheibenform die

/ 1  Die Primårstruktur eines Polypeptids ist die spezifische lineare Aminosåurefolge der Kette. Mit 20 verschiedenen Bausteinen kænnen 20n verschiedene Polypeptide gebildet werden, wobei



Vier Arten von biologischen Molekçlen

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von Hunderten von Organismen einschlieûlich des Menschen ermittelt. Aufgrund dieser Informationen werden Forscher letztlich såmtliche Proteine kennen lernen, die ein Organismus herstellen kann. Nach wie vor ist es allerdings çberaus schwierig, aufgrund der Primårsequenzdaten etwas çber die hæheren Ebenen der Proteinstruktur auszusagen.

n Abb. 2.29. ;             B   (   #  "   %  ! &       %          II    6/5 +?        ( - , ,' "   8   ; 8 .  1

Form einer Sichel annehmen (Abb. 2.29); dadurch kommt es håufiger zu einem Verschluss kleiner Blutgefåûe, was Schmerzen und lebensbedrohliche Krisen verursachen kann. Nicht alle Aminosåureverånderungen haben derart dramatische Konsequenzen, wie man daran erkennen kann, dass ein Protein bei verwandten Organismen unterschiedliche Aminosåuresequenzen haben kann. Inwieweit Verånderungen in der Primårsequenz toleriert werden, hångt davon ab, inwieweit die Proteinform oder die entscheidenden funktionellen Reste veråndert wurden. Anfang der 1950er Jahre haben Frederick Sanger und seine Mitarbeiter an der Cambridge University erstmals die Aminosåuresequenz eines Proteins bestimmt. Sie hatten fçr ihre Untersuchung Rinderinsulin ausgewåhlt, weil dieses leicht verfçgbar war und auûerdem sehr klein ist: Es besteht aus zwei Polypeptidketten von 21 und 30 Aminosåuren. Die &m zweiten Schritt dieser Gesamtreaktion (Schritt 7, Abb. 3.23 und Abb. 3.25 c) wird eine Phosphatgruppe des 1,3-Bisphosphoglycerats auf ADP çbertragen und so ein Molekçl ATP gebildet. Die Reaktion katalysiert das Enzym /    %   . Diese direkte Form der ATPBildung bezeichnet man als &      % , weil dabei eine Phosphatgruppe von einem Substrat (in diesem Fall 1,3-Bisphosphoglycerat) auf ADP çbertragen wird. Die çbrigen Reaktionen der Glycolyse (Schritte 8±10), zu denen noch eine zweite Substratkettenphosphorylierung von ADP (Schritt 10) gehært, sind in Abb. 3.23 zu sehen. Die Substratkettenphosphorylierung von ADP veranschaulicht einen wichtigen Punkt in Bezug auf ATP. Seine Bildung ist nicht  stark endergon. ATP ist also nicht so energiereich, dass es nur unter groûem Aufwand bei Stoffwechselreaktionen gebildet werden kænnte. Bei zahlreichen phosphorylierten Molekçlen weist die Hydrolyse einen stårker negativen D%8'-Wert auf als die von ATP. In Abb. 3.27 sind die D%8'-Werte fçr die Hydrolyse mehrerer phosphorylierter Verbindungen einander gegençbergestellt. Jeder Donor, der weiter oben in der Skala steht, kann ein Molekçl, das weiter unten steht, phosphorylieren; dabei entspricht der D%8'-Wert dieser Reaktion der Differenz zwischen den beiden Werten aus der Abbildung. Beispielsweise liegt der D%8'-Wert fçr den Transfer einer Phosphatgruppe vom 1,3-Bisphosphoglycerat auf ADP unter Bildung von ATP bei ±4,5 kcal/mol (±11,8 kcal/mol+7,3

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kcal/mol). Mit diesem !  $  hat man eine gute Vergleichsmæglichkeit fçr verschiedene Donoren und Akzeptoren ± unabhångig davon, ob Protonen, Elektronen, Sauerstoff oder Phosphatgruppen çbertragen werden. Die Molekçle weiter oben in der Skala, deren Freie Enthalpie græûer ist (græûere ±D%8'-Werte) haben eine geringere Affinitåt fçr die Gruppe, die çbertragen wird, als die, welche weiter unten in der Skala stehen. Je geringer die Affinitåt ist, desto besser eignet sich das Molekçl als Donor. Je græûer die Affinitåt ist, desto besser eignet es sich als Akzeptor. Ein wichtiges Merkmal der Glycolyse ist, dass in ihr auch ohne Sauerstoff eine begrenzte Anzahl von ATP-Molekçlen synthetisiert werden kann. Weder fçr die Substratkettenphosphorylierung des ADP durch 1,3-Bisphosphoglycerat noch fçr eine spåtere durch Phosphoenolpyruvat (Schritt 10, Abb. 3.23) wird Sauerstoff benætigt. Somit kann man die Glycolyse als eine  
 der ATP-Bildung betrachten, d. h. dass in ihr auch ohne molekularen Sauerstoff weiterhin ATP gebildet werden kann. In der Glycolyse entstehen pro Molekçl Glycerinaldehyd-3-phosphat, das zu Pyruvat oxidiert wird, durch Substratkettenphosphorylierung zwei Molekçle ATP. Da aus jedem Molekçl Glucose zwei Molekçle Glycerin-

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Bioenergetik, Enzyme und Stoffwechsel

aldehyd-3-phosphat hervorgehen, werden pro Molekçl Glucose, das zu Pyruvat oxidiert wird, vier ATP-Molekçle produziert. Andererseits mçssen zwei Molekçle ATP hydrolysiert werden, damit die Glycolyse starten kann, so dass die Zelle insgesamt pro oxidierter Glucose zwei Molekçle ATP gewinnt. Die Gesamtreaktion der Glycolyse kann man folgendermaûen formulieren: Glucose+2 ADP +2 Pi+2 NAD+ ? 2 Pyruvat+2 ATP+2 NADH+2 H++2 H2O Pyruvat, das Endprodukt der Glycolyse, ist eine Schlçsselverbindung, weil sie am Ûbergang vom anaeroben (vom Sauerstoff unabhångigen) zum aeroben (vom Sauerstoff abhångigen) Stoffwechselweg steht. Ohne molekularen Sauerstoff wird Pyruvat fermentiert, was im folgenden Abschnitt erærtert wird. Ist jedoch Sauerstoff vorhanden, wird Pyruvat, wie in Kap. 5 beschrieben wird, bei der aeroben Atmung weiter abgebaut.   (-    9 /%9    :1 Wie wir gesehen haben, erhålt die Zelle durch die Glycolyse pro Molekçl Glucose, das in Pyruvat umgewandelt wird, netto eine geringe Anzahl an ATP-Molekçlen. Da die Reaktionen der Glycolyse jedoch sehr schnell ablaufen, kann eine Zelle auf diese Weise recht viel ATP bilden. Eine Reihe von Zellen wie Hefezellen, Tumorzellen und Muskelzellen sind bei der ATP-Bildung sogar weitgehend auf die Glycolyse angewiesen. Dabei gibt es allerdings ein Problem, mit dem diese Zellen fertig werden mçssen. Eines der Produkte der Oxidation von Glycerinaldehyd3-phosphat ist NADH. NADH wird auf Kosten eines der Reaktionsteilnehmer, NAD+, gebildet, von dem in Zellen nur geringe Mengen zur Verfçgung stehen. Da NAD+ ein begehrter Reaktionspartner in dieser wichtigen Glycolysereaktion ist, muss es aus NADH wiedergewonnen werden. Wenn das nicht passiert, kann Glycerinaldehyd-3-phosphat nicht weiter oxidiert werden, und alle weiteren Reaktionen der Glycolyse fallen aus. Ohne Sauerstoff kann NADH allerdings nicht mithilfe der Elektronentransportkette zu NAD+ oxidiert werden, weil Sauerstoff als letzter Elektronenakzeptor in der Kette benætigt wird. Zellen kænnen allerdings NAD+ durch :1 regenerieren, wobei Elektronen von NADH auf Pyruvat, das Endprodukt der Glycolyse, oder auf eine Verbindung çbertragen werden, die vom Pyruvat abstammt (Abb. 3.28). Wie die Glycolyse findet auch die Gårung im Cytosol eukaryotischer Zellen statt. Fçr die meisten von O2 abhångigen Organismen ist die Gårung eine Notlæsung, um auch bei niedriger Sauerstoffkonzentration NAD+

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zu bilden, damit die Glycolyse weiterlaufen und weiter ATP produziert werden kann. Welches Produkt bei der Gårung entsteht, hångt vom Zelltyp oder von der Art des Organismus ab. Wenn sich Muskelzellen immer wieder kontrahieren mçssen, wird die Sauerstoffkonzentration zu gering, um den Anforderungen des Zellstoffwechsels gençgen zu kænnen. Unter diesen Bedingungen regenerieren Skelettmuskelzellen NAD+, indem sie Pyruvat in Lactat umwandeln. Wenn spåter wieder gençgend Sauerstoff zur Verfçgung steht, kann das Lactat erneut in Pyruvat umgewandelt werden, um weiter oxidiert zu werden. Anaerob lebende Hefezellen læsen dieses Problem mit einer anderen Stoffwechselvariante: Sie wandeln, wie Abb. 3.28 zeigt, Pyruvat in Ethanol um. Obwohl die Gårung fçr viele Organismen ein notwendiger Stoffwechselprozess ist und einige anaerobe Organismen ihre Stoffwechselenergie ausschlieûlich daher beziehen, bietet die Gly-

 colyse im Vergleich zur vollståndigen Oxidation der Glucose zu Kohlendoxid und Wasser nur einen bescheidenen Energiegewinn. Wenn ein Mol Glucose vollståndig oxidiert wird, werden 686 Kilokalorien frei. Wenn dagegen dieselbe Menge Glucose unter Standardbedingungen in Ethanol umgewandelt wird, werden nur 57 Kilokalorien freigesetzt, und wenn sie in Lactat umgewandelt wird, sogar nur 47 Kilokalorien. In jedem Fall entstehen durch die Oxidation in Glycolyse und Gårung pro Glucose nur zwei Molekçle ATP; çber 90% der Energie gehen mit dem Fermentationsprodukt verloren ± was sich beispielsweise daran zeigt, dass Ethylalkohol leicht entzçndlich ist. In den ersten Phasen des Lebens auf der Erde, als es noch keinen Sauerstoff gab, waren Glycolyse und Gårung wahrscheinlich die wichtigsten Stoffwechselwege, mit denen primitive prokaryotische Zellen ihre Energie aus Zucker gewonnen haben. Nach dem Auftreten der Cyanobakterien stieg die Sauerstoffkonzentration in der Atmosphåre drastisch an, so dass sich eine aerobe Stoffwechselstrategie entwickeln konnte. Infolgedessen konnten die Reaktionsprodukte der Glycolyse vollståndig oxidiert und viel mehr ATP gewonnen werden. In Kapitel 5 werden wir sehen, wie das mæglich ist, wenn wir die Struktur und Funktion der Mitochondrien erærtern.   1   Die Energie, die erforderlich ist, um komplexe biologische Molekçle wie Proteine, Fette und Nucleinsåuren zu synthetisieren, stammt çberwiegend aus dem ATP, das in der Glycolyse und beim Elektronentransport gebildet wird. Viele dieser Materialien, vor allem Fette und andere Lipide, sind aber stårker reduziert als die Zwischenprodukte, aus denen sie aufgebaut sind. Fçr die Synthese von Fetten mçssen Metabolite reduziert werden; das geschieht durch die Ûbertragung energiereicher Elektronen von NADPH ± einer Verbindung, deren Struktur der von NADH åhnelt, die aber eine zusåtzliche Phosphatgruppe besitzt (Beschreibung in der Legende zu Abb. 3.26). Das NADPH-Reservoir der Zelle bildet seine   1   ± ein wichtiges Maû fçr den Energieanteil der Zelle, der genutzt werden kann. Den Einsatz von NADPH kann man anhand einer Schlçsselreaktion der Photosynthese veranschaulichen:

Stoffwechsel

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In dieser Reaktion wird ein Elektronenpaar (samt einem Proton) von NADPH auf das Substrat 1,3-Bisphosphoglycerat çbertragen, wobei ein Kohlenstoffatom reduziert wird (rot hervorgehoben). Die oxidierte Form von NADPH, NADP+, wird durch folgende Reaktion aus NAD+ gebildet: NAD++ATP ? NADP++ADP NADPH kann durch Reduktion von NADP+ entstehen. Wie NADH ist auch NADPH wegen seines groûen Elektronençbertragungspotenzials eine energiereiche Verbindung. Durch die Ûbertragung von Freier Enthalpie in Form dieser Elektronen gelangt der Akzeptor in einen stårker reduzierten, energiereicheren Zustand. In der Aufteilung des Reduktionsvermægens auf zwei getrennte, aber verwandte Molekçle, NADH und NADPH, spiegelt sich eine Trennung ihrer primåren Funktionen im Stoffwechsel wider. NADH und NADPH werden als Coenzyme von verschiedenen Enzymen erkannt. Enzyme, die auf anabolen Stoffwechselwegen als Reduktionsmittel dienen, erkennen NADPH als ihr Coenzym, wåhrend Enzyme, die in katabolen Stoffwechselwegen als Dehydrogenasen fungieren, NAD+ erkennen. Obwohl sie ganz unterschiedlich eingesetzt werden, kann ein Coenzym das andere durch die folgende Reaktion reduzieren, die vom Enzym !  %  katalysiert wird: NADH+NADP+ ? NAD++NADPH Wenn gençgend Energie vorhanden ist, ist die Bildung von NADPH begçnstigt; dadurch werden Elektronen zur Verfçgung gestellt, die fçr die Biosynthese neuer Makromolekçle, die fçr das Wachstum essentiell sind, benætigt werden. Wenn aber nur wenig Energie zur Verfçgung steht, werden die meisten energiereichen Elektronen des NADH fçr die ATP-Bildung benutzt und nur soviel NADPH gebildet, wie mindestens fçr die Biosynthese erforderlich ist. '' Regulation des Stoffwechsels Die Menge an ATP, die in einer Zelle in einem bestimmten Moment vorhanden ist, ist çberraschend gering. Eine Bakterienzelle enthålt beispielsweise ungefåhr 1 Mio. ATP-Molekçle, deren biologische Halbwertszeit sehr kurz ist (und in der Græûenordnung von ein bis zwei Sekunden liegt). Angesichts dieses begrenzten Vorrats kann das ATP-Molekçl nicht der Hauptenergiespeicher sein. Die Energiereserven einer Zelle werden

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Bioenergetik, Enzyme und Stoffwechsel

vielmehr in Form von Polysacchariden und Fetten gespeichert. Wenn die Konzentration an ATP zu sinken beginnt, werden Reaktionen ausgelæst, die auf Kosten der energiereichen Speicherformen die ATP-Bildung erhæhen. Ebenso werden Reaktionen, die normalerweise zur ATP-Bildung fçhren, bei hohen ATP-Konzentrationen unterbunden. Die Zellen steuern diese wichtigen energiefreisetzenden Reaktionen, indem sie in einer Reihe von Stoffwechselwegen bestimmte Schlçsselenzyme regulieren. Die Funktion eines Proteins ist eng mit seiner Struktur (d. h. Konformation) verbunden. Es ist daher nicht çberraschend, dass Zellen ihre Proteinaktivitåt regulieren, indem sie die Konformation der entscheidenden Proteinmolekçle veråndern. Bei den Enzymen wird die katalytische Aktivitåt durch eine Modifikation der Struktur des aktiven Zentrums gesteuert. Zwei gångige Mechanismen, um die Form des aktiven Zentrums eines Enzyms zu veråndern, sind die 9        und die       , die beide eine wesentliche Rolle bei der Steuerung der Oxidation der Glucose spielen.4 .1  $%     9 1  9       Mitte der 1950er Jahre untersuchten Edmond Fischer und Edwin Krebs von der University of Washington die Phosphorylase, ein Enzym, das man in Muskelzellen entdeckt hatte und das Glycogen in seine Glucoseuntereinheiten spaltet. Es gab eine inaktive und eine aktive Form des Enzyms. Fischer und Krebs stellten einen groben Extrakt aus Muskelzellen her und fanden heraus, dass sie inaktive Enzymmolekçle des Extrakts aktivieren konnten, indem sie dem Reaktionsgefåû einfach ATP zusetzten. Eine weitere Untersuchung ergab, dass ein zweites Enzym im Extrakt vorhanden war ± ein ¹Umwandlungsenzymª, wie sie es nannten ±, das eine Phosphatgruppe vom ATP auf eine der 841 Aminosåuren çbertrug, aus denen die Phosphorylase besteht. Durch die Phosphatgruppe ånderte sich die Form des aktiven Zentrums des Enzyms; auûerdem wurde seine katalytische Aktivitåt erhæht. Weitere Forschungsarbeiten zeigten, dass die 9       von Enzymen, wie man beim Anhången oder Entfernen von Phosphatgruppen sehen kann, ein genereller Mechanismus ist, um die Aktivitåt von Enzymen zu ver4 Der Stoffwechsel wird auch çber die Regulation der Enzymkonzentration gesteuert. Mit welcher relativen Geschwindigkeit Enzyme synthetisiert und abgebaut werden, wird in spåteren Kapiteln erærtert.

åndern. Enzyme, die Phosphatgruppen auf andere Proteine çbertragen, bezeichnet man als Proteinkinasen; sie regulieren so unterschiedliche Funktionen wie die Aktivitåt von Hormonen, die Zellteilung oder die Genexpression. Das ¹Umwandlungsenzymª, das Krebs und Fischer gefunden hatten, wurde spåter Phosphorylase-Kinase genannt; seine Regulation wird in Kap. 15.3 erærtert. Es gibt zwei grundlegend verschiedene Typen von Proteinkinasen: der eine Typ hångt Phosphatgruppen an spezielle Tyrosinreste in einem Substratprotein, der andere an spezielle Serin- oder Threoninreste im Substrat. Wie wichtig Proteinkinasen sind, spiegelt sich in der Tatsache wider, dass etwa 2% aller Gene einer Hefezelle (113 von ungefåhr 6200) Mitglieder dieser Enzymgruppe codieren. G  #$%  9 1         Bei der        wird die Aktivitåt eines Enzyms durch eine Verbindung gehemmt oder angeregt, die an das      bindet, eine Stelle, die vom aktiven Zentrum des Enzyms råumlich getrennt ist. Wie bei einer Reihe von Dominosteinen, die nacheinander umfallen, låuft, sobald eine Verbindung an das allosterische Zentrum gebunden hat, eine ¹Welleª durch das Protein, durch die ± ob auf der gegençberliegenden Seite des Enzyms oder sogar auf einem anderen Polypeptid im Protein ± die Form des aktiven Zentrums definiert geåndert wird. Je nachdem, um welches Enzym und welchen allosterischen Modulator es sich handelt, kann die Formverånderung des aktiven Zentrums seine katalytischen Fåhigkeiten anregen oder hemmen. An der allosterischen Modulation wird deutlich, wie eng die Beziehung zwischen der molekularen Struktur und der Funktion ist. Winzige Verånderungen in der Struktur des Enzyms, die durch den allosterischen Modulator ausgelæst werden, kænnen zu deutlichen Verånderungen in der Enzymaktivitåt fçhren. Zellen sind hocheffiziente Produktionsståtten, in denen weder Energie noch Material zur Herstellung von Verbindungen verschwendet wird, die nicht gebraucht werden. Einer der Hauptmechanismen, wie Zellen anabole Synthesewege abschalten, ist eine Art der allosterischen Modulation, die  . Dabei wird das Enzym, das den ersten Schritt in einem solchen Stoffwechselweg katalysiert, zeitweise inaktiviert, wenn das Endprodukt dieses Stoffwechselwegs ± etwa eine Aminosåure ± eine bestimmte Konzentration erreicht hat. Das kann man sich anhand des einfachen Stoffwechselweges in Abb. 3.29 vor Augen fçhren, in dem zwei



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Substrate, A und B, in das Endprodukt E umgewandelt werden. Wenn die Konzentration des Reaktionsprodukts E steigt, bindet E an das allosterische Zentrum des Enzyms BC und fçhrt zu einer Konformationsånderung seines aktiven Zentrums, durch welche die Enzymaktivitåt sinkt. Durch die Rçckkopplungshemmung wird die biosynthetische Aktivitåt einer Zelle direkt und hochempfindlich gesteuert. !       &' $

 Im Folgenden werden wir kurz auf den anabolen Stoffwechselweg eingehen, der zur Synthese der Glucose (: ) fçhrt; an ihm werden einige wichtige Aspekte der Biosynthese deutlich. Die meisten Zellen kænnen Glucose zur

Stoffwechsel

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gleichen Zeit aus Pyruvat synthetisieren und als ihre wichtigste chemische Energiequelle oxidieren. Wie ist es mæglich, dass Zellen diese beiden gegenlåufigen Stoffwechselwege gleichzeitig einschlagen kænnen? Erst einmal ist wichtig, dass die Reaktionen der Gluconeogenese nicht einfach eine Umkehr der Glycolyseschritte sind, obwohl Enzyme eine Reaktion in beide Richtungen katalysieren kænnen. In der Glycolyse gibt es drei thermodynamisch irreversible Reaktionen (Abb. 3.24), die irgendwie umgangen werden mçssen. Selbst wenn såmtliche Reaktionen der Glycolyse in entgegengesetzter Richtung ablaufen kænnten, wåre das fçr die Zelle nicht unbedingt die beste Art, ihre Stoffwechselaktivitåten zu regeln, weil sie die beiden Stoffwechselwege nicht unabhångig voneinander steuern kænnte. Sie kænnte dann nicht die Synthese der Glucose abschalten, um den Glucose-Abbau anzukurbeln, weil in beiden Richtungen dieselben Enzyme aktiv wåren. Wenn man Abbau und Synthese der Glucose miteinander vergleicht, wird klar, dass einige Reaktionen identisch sind, auch wenn sie in entgegengesetzter Richtung verlaufen, wåhrend andere ganz verschieden sind (Schritte 1±3, Abb. 3.30). Die thermodynamischen und regulatorischen Probleme, welche die Zelle hat, weil sie dieselben Molekçle gleichzeitig synthetisieren und abbauen kann, werden dadurch gelæst, dass bei den zwei entgegengesetzten Stoffwechselwegen jeweils unterschiedliche Schlçsselreaktionen von verschiedenen Enzymen katalysiert werden. Wir kænnen das besser erkennen, wenn wir die entscheidenden Enzyme der Glycolyse und Gluconeogenese nåher betrachten. Wie in Schritt 2 auf Abb. 3.30 deutlich wird, katalysiert die /     , ein Enzym der Glycolyse, folgende Reaktion, Fructose-6-phosphat+ATP ? Fructose-1,6-bisphosphat+ADP die einen DG8'-Wert von ±3,4 kcal/mol hat und daher praktisch irreversibel ist. Die Reaktion hat einen so stark negativen DG8'-Wert, weil sie mit der Hydrolyse von ATP gekoppelt ist. Bei der Gluconeogenese wird die Bildung von Fructose6-phosphat durch das Enzym
 E"B 7      durch eine einfache Hydrolyse katalysiert: Fructose-1,6-bisphosphat+H2O $ Fructose-6-phosphat+Pi DG8' = ±3,9 kcal/mol

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eines Schlçsselenzyms der Gluconeogenese, wird dagegen durch erhæhte AMP-Konzentrationen gehemmt.5 Dank dieser verschiedenen Regulationsmæglichkeiten schwankt die ATP-Konzentration im Allgemeinen nicht, sondern bleibt hoch, auch wenn der Bedarf sehr unterschiedlich ist. Wir haben uns in diesem Kapitel auf die Speicherung der chemischen Energie in Form von ATP und seine Verwendung im Stoffwechsel konzentriert. Die im ATP gespeicherte Energie wird in zahlreichen verschiedenen Prozessen (Beispiel: Abb. 3.6) eingesetzt, von denen viele in diesem Buch besprochen werden. Man sollte hier noch anmerken, dass ATP nicht immer, wie in diesem Kapitel beschrieben wird, dazu benutzt wird, um phosphorylierte Zwischenprodukte wie Glutamylphosphat zu bilden. In einigen Fållen wird das Phosphat auch auf einen Aminosåurerest eines Proteins çbertragen, um ± wie etwa bei der Wanderung der Natrium- und Kaliumionen durch die Plasmamembran ± eine Konformationsånderung auszulæsen (Abb. 4.44).

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 3.30. Vergleich Glycolyse ± Gluconeogenese. Wåhrend die meisten Reaktionen in den beiden Stoffwechselwegen identisch sind, auch wenn sie in entgegengesetzte Richtungen laufen, werden die drei irreversiblen Reaktionen der Glycolyse (hier: Schritte 1±3) in der Gluconeogenese durch andere thermodynamisch vorteilhafte Reaktionen ersetzt

Die speziellen, oben beschriebenen Enzyme der Glycolyse und Gluconeogenese sind entscheidende Regulationsenzyme ihrer jeweiligen Stoffwechselwege. Obwohl ATP ein Substrat der Phosphofructokinase ist, dient es auch als allosterischer Hemmstoff, wåhrend AMP ein allosterischer Aktivator ist. Bei hohen ATP-Konzentrationen wird die Aktivitåt des Enzyms so weit verringert, dass in der Glycolyse kein ATP mehr gebildet wird. Sind dagegen die ADP- und AMPKonzentrationen hoch im Vergleich zur ATPKonzentration, wird die Aktivitåt des Enzyms erhæht und damit die ATP-Synthese angekurbelt. Die Aktivitåt der Fructose-1,6-bisphosphatase,

5 Die Aktivitåten der Phosphofructokinase und Fructose1,6-Bisphosphatase werden auch durch die Verbindung Fructose-2,6-bisphosphat gesteuert, die ein allosterischer Aktivator des ersten und ein kompetitiver Hemmstoff des zweiten Enzyms ist. Somit kann durch Ønderungen in der Konzentration des Fructose-2,6-bisphosphats zwischen den beiden gegenlåufigen Stoffwechselwegen Glycolyse und Gluconeogenese umgeschaltet werden. Man sollte noch erwåhnen, dass Synthese und Abbau von Fructose-2,6-bisphosphat ± zwei eigenståndige Reaktionen ± durch ein Enzym mit zwei verschiedenen Funktionen katalysiert werden; dieses Enzym besitzt in unterschiedlichen Domånen zwei verschiedene aktive Zentren.



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Zusammenfassung

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Zusammenfassung #      "   $ 9  0 Energie kann in unterschiedlicher Form gespeichert werden: in Form von chemischer, mechanischer oder thermischer Energie, Licht oder Elektrizitåt, die alle ineinander umgewandelt werden kænnen. Wenn Energie çbertragen wird, bleibt die Gesamtenergie im Universum immer konstant, wåhrend Freie Enthalpie ± d. h. Energie, mit der weiterhin Arbeit verrichtet werden kann ± verloren geht. Weil im Universum die Zufålligkeit und Unordnung zunimmt, geht nutzbare Energie in Form von Entropie verloren. Lebewesen sind Systeme mit geringer Entropie, die nur deshalb erhalten bleiben, weil sie ståndig von auûen Energie erhalten, die letztlich von der Sonne stammt (Kap. 3.1.1). &1     3-4 #       9  9       D
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    9  . In einer chemischen Reaktion entspricht D% dem Unterschied an Freier Enthalpie zwischen den Reaktionsteilnehmern und den Reaktionsprodukten. Je græûer D% ist, desto weiter ist die Reaktion vom Gleichgewichtszustand entfernt. Mit fortschreitender Reaktion nimmt D% ab, im Gleichgewichtszustand ist D% gleich Null. Um vergleichen zu kænnen, wie stark sich die Energie bei verschiedenen chemischen Reaktionen åndert, bestimmt man die Unterschiede in der Freien Enthalpie zwischen Reaktionsteilnehmern und Reaktionsprodukten fçr eine Reihe von Standardbedingungen und erhålt so

D%8', fçr das folglich gilt: D%8' = ±2,303 -2 ´ log K'eq. Reaktionen, deren Gleichgewichtskonstanten >1 sind, haben negative D%8'-Werte. Man sollte daran denken, dass D%8' ein fester Wert ist, der ausdrçckt, in welcher Richtung eine Reaktion bei Standardbedingungen ablåuft. Mit ihm låsst sich nicht feststellen, in welche Richtung eine Zellreaktion zu einem bestimmten Zeitpunkt ablåuft; dafçr ist der D% -Wert zuståndig, der von den Konzentrationen der Reaktionsteilnehmer und Reaktionsprodukte zu diesem Zeitpunkt abhångt. In der Zelle kænnen auch Reaktionen mit positiven D%8'-Werten (wie die Reaktion, in der Dihydroacetonphosphat in Glycerinaldehyd-3phosphat umgewandelt wird) ablaufen, wenn das Verhåltnis der Reaktionsteilnehmer zu den Reaktionsprodukten græûer bleibt als der Wert, der von 5eq vorgegeben ist (Kap. 3.1.2).            !/ 2%%  3DG8' I *@">  J4      "           '. Wie das geschieht, låsst sich anhand der Glutaminsynthese aus Glutaminsåure und NH3 (D%8' = +3,4 kcal/mol) zeigen. Die Reaktion kann nur erfolgen, weil Glutamylphosphat, ein gemeinsames Zwischenprodukt gebildet wird. In solchen Prozessen kann die ATP-Hydrolyse eine wichtige Rolle spielen, weil das [ATP]/[ADP]-Verhåltnis in der Zelle erhæht ist und weit çber dem des Gleichgewichtszustands liegt, was zeigt, dass die Reaktionen im Zellstoffwechsel nicht unter Gleichgewichtsbedingungen ablaufen. Das heiût nicht, dass

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alle Reaktionen daran gehindert werden, ihren Gleichgewichtszustand zu erreichen. Vielmehr haben bestimmte Schlçsselreaktionen eines Stoffwechselweges stark negative D%-Werte, wodurch sie in der Zelle praktisch irreversibel sind und den gesamten Stoffwechselweg in Gang halten kænnen. Die Konzentrationen der Reaktionsteilnehmer und Reaktionsprodukte kænnen in der Zelle relativ konstant auf Werten gehalten werden, die nicht dem Gleichgewichtszustand entsprechen (Flieûgleichgewicht), weil permanent Material aus dem Medium in die Zelle eingeschleust wird und ståndig Abfallprodukte entfernt werden (Kap. 3.1.2). #$%  / " '    :

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       '  '0 Wie alle echten Katalysatoren sind Enzyme nur in geringen Mengen vorhanden; sie werden im Verlauf der Reaktion nicht irreversibel veråndert und haben keinen Einfluss auf die Thermodynamik der Reaktion. Enzyme kænnen daher weder dafçr sorgen, dass eine Reaktion (mit positivem D%), die von alleine nicht ablaufen wçrde, ablåuft, noch kænnen sie das Verhåltnis von Reaktionsteilnehmern zu Reaktionsprodukten im Gleichgewichtszustand åndern. Als Katalysatoren kænnen Enzyme bei moderater Temperatur und einem pH-Wert, wie man ihn in der Zelle findet, nur die Geschwindigkeit gçnstiger Reaktionen beschleunigen. Charakteristisch fçr Enzyme sind darçber hinaus ihre Spezifitåt fçr ihre Substrate, eine hocheffiziente Katalyse praktisch ohne unerwçnschte Nebenprodukte sowie die Tatsache, dass ihre katalytische Aktivitåt reguliert werden kann (Kap. 3.2.1). #$% ' "      9     3E4   $ *       #  "     "                  $ ' 0 Daher besitzt in Gegenwart eines Enzyms ein viel græûerer Anteil der an der Reaktion beteiligten Molekçle die nætige Energie, um in Reaktionsprodukte verwandelt zu werden. Enzyme verringern A, indem sie einen Enzym-Substrat-Komplex bilden. Der Anteil des Enzyms, der an das Substrat oder die Substrate bindet, das aktive Zentrum, besitzt auch die notwendigen Aminosåureseitenketten und/oder Cofaktoren, um so auf die Substrate einzuwir-

ken, dass ihre chemische Umwandlung erleichtert wird. Zu den Mechanismen, die eine Katalyse erleichtern, gehært, dass Enzyme Reaktionsteilnehmer passend ausrichten kænnen; sie kænnen die Substrate stårker aktivieren, indem sie auf ihre Elektronen einwirken; und sie kænnen im Substrat Spannungen erzeugen, durch die bestimmte Bindungen innerhalb des Substrats geschwåcht werden (Kap. 3.2.2).  &'             "       0 Man kann diese Reaktionen in Stoffwechselwege aufteilen, die aus einer Abfolge von chemischen Reaktionen bestehen, in der jede Reaktion durch ein spezifisches Enzym katalysiert wird. Man unterscheidet grob zwei Arten von Stoffwechselwegen: katabole, in denen Verbindungen gelæst und Energie freigesetzt wird, sowie anabole, in denen mithilfe der in der Zelle gespeicherten Energie komplexere Verbindungen aufgebaut werden. Verschiedene Makromolekçle werden durch katabole Stoffwechselprozesse zu relativ wenigen niedermolekularen Zwischenprodukten abgebaut; diese liefern dann das Rohmaterial, von dem die divergent verlaufenden, anabolen Stoffwechselwege ausgehen. In beiden Arten von Stoffwechselwegen kommen Redoxreaktionen vor, in denen Elektronen von einem Substrat auf ein anderes çbertragen werden, wodurch sie den Reduktionsgrad des Rezipienten und den Oxidationsgrad des Donors erhæhen (Kap. 3.3).              "     $   

            ' "    1   D   #       0 Ein Mol Glucose setzt 686 kcal frei, wenn es vollståndig zu CO2 und H2O oxidiert wird, wåhrend fçr die Umwandlung von einem Mol ADP zu ATP nur 7,3 kcal benætigt werden. Daher kann durch die Oxidation eines Glucosemolekçls gençgend Energie gebildet werden, um eine groûe Anzahl von ATP-Molekçlen herzustellen. Das erste Stadium des Glucoseabbaus ist die Glycolyse, bei der Glucose unter Nettogewinn von zwei Molekçlen ATP und zwei Molekçlen NADH in Pyruvat umgewandelt wird. Die ATP-Molekçle werden durch eine Substratkettenphosphorylierung gebildet, bei der eine Phosphatgruppe von einem Substrat auf ADP çbertragen wird. Die NADHs entstehen durch Oxidation eines Aldehyds zu einer Carbonsåure samt Transfer eines Hydridions (ein Proton und zwei Elektronen) vom Substrat auf NAD+. In Gegenwart von O2 oxidieren die



Zur Selbstçberprçfung

meisten Zellen NADH mithilfe einer Elektronentransportkette und bilden ATP durch aerobe Atmung. Ohne O2 wird NAD+ durch Gårung regeneriert, wobei energiereiche Elektronen vom NADH zur Reduktion von Pyruvat verwendet werden. NAD+ muss regeneriert werden, damit die Glycolyse weiterlaufen kann (Kap. 3.3.3).   $%     9 1 '    '   $'         9                . Um eine kovalente Modifikation einzufçhren, wird meist in einer Reaktion, die von einer Proteinkinase katalysiert wird, eine Phosphatgruppe vom ATP auf eine oder mehrere Serin-, Threonin- oder Tyrosinreste des Enzyms çbertragen. Allosterische Modulatoren binden dagegen nichtkovalent an eine Stelle im Enzym, die vom aktiven Zentrum råumlich getrennt ist. Durch die Bindung des Modulators åndert sich die Konformation des aktiven Zent-

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rums, wodurch die katalytische Aktivitåt des Enzyms erhæht oder verringert wird. Ein gångiges Beispiel fçr eine allosterische Modulation ist die Rçckkopplungshemmung, bei der das Endprodukt eines Stoffwechselwegs allosterisch das erste Enzym hemmt, das fçr diesen Stoffwechselweg charakteristisch ist. Ein und dieselbe Verbindung kann in der Zelle durch einen katabolen Stoffwechselweg abgebaut werden und gleichzeitig das Endprodukt eines Biosyntheseweges sein. Glucose beispielsweise wird in der Glycolyse abgebaut und im Rahmen der Gluconeogenese synthetisiert. Wåhrend die meisten Enzyme in beiden Stoffwechselwegen vorkommen, gibt es jeweils drei Schlçsselenzyme, die nur in einem der beiden Stoffwechselwege vorkommen. Dadurch kann die Zelle beide Stoffwechselweg getrennt voneinander regulieren und Reaktionen, die sonst irreversibel wåren, rçckgångig machen (Kap. 3.3.4).

Zur Selbstçberprçfung 1. Wie wirkt sich eine Verringerung des pHWerts auf eine Reaktion aus, die von Chymotrypsin/von Lysozym katalysiert wird? Wie wirkt sich ein Anstieg des pH-Werts auf die beiden Reaktionen aus? 2. Eine Rçckkopplungshemmung veråndert in der Regel bevorzugt die Aktivitåt des ersten Enzyms eines Stoffwechselweges, nicht die eines spåteren Enzyms. Wieso zeugt das von einer Anpassungsfåhigkeit? 3. Erklåren Sie, nachdem Sie sich die Reaktionen der Glutaminbildung in Kap. 3.1.2 angesehen haben, warum folgende Aussagen zur dritten (Gesamt-)Reaktion jeweils wahr oder falsch sind. a. Wenn die Reaktion in entgegengesetzter Richtung verliefe, wçrde D%8' +3,9 kcal/ mol betragen. b. Wenn alle Reaktionsteilnehmer und Reaktionsprodukte zu Beginn eines Experiments die Standardbedingungen erfçllen wçrden, wçrde nach einer gewissen Zeit das [NH3]/[ADP]-Verhåltnis sinken. c. Wenn die Reaktion weiterlåuft, nåhert sich D%8' Null. d. Im Gleichgewichtszustand halten sich Vor- und Rçckreaktion die Waage und das [ATP]/[ADP]-Verhåltnis ist 1.

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e. In der Zelle kann Glutamin gebildet werden, wenn das [Glutamin]/[Glutaminsåure]-Verhåltnis çber 1 liegt. Sie haben gerade ein neues Enzym isoliert und die Reaktionsgeschwindigkeit bei drei verschiedenen Substratkonzentrationen gemessen. Sie finden heraus, dass pro Zeiteinheit bei allen drei Konzentrationen gleich viel Produkt gebildet wird. Was kann man daraus fçr die Bedingungen im Reaktionsansatz schlieûen? Lysozym ist ein Enzym, das langsam wirkt ± und etwa zwei Sekunden benætigt, um eine einzige Reaktion zu katalysieren. Wie groû ist die Wechselzahl des Lysozyms? Wenn in der Reaktion R „ P ein Mol des Reaktionsprodukts (P) dieselbe Freie Enthalpie besitzt wie ein Mol der Reaktionsteilnehmer (R), wie groû ist dann 5eq dieser Reaktion? Wie groû ist D%8'? Was bedeutet es fçr die Konzentrationsverhåltnisse, wenn man sagt, dass D% fçr die ATP-Hydrolyse in der Zelle bei etwa ±12 kcal/mol liegt, wåhrend D%8' ±7,3 kcal/mol betrågt? In der Zelle werden die Enzyme reguliert, deren Reaktionen in der Regel nicht unter Gleichgewichtsbedingungen ablaufen. Was

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wçrde passieren, wenn ein Enzym allosterisch gehemmt wçrde, dessen Katalyse in der Nåhe des Gleichgewichtszustands erfolgt? Wie groû ist D%8' in der Reaktion A „ B, wenn 5'eq 103 ist? Wie groû ist D%8', wenn 5'eq 10±3 ist? Wie groû ist 5'eq der Hexokinase-Reaktion, die in Abb. 3.23 (Schritt 1) dargestellt ist? Die Reaktion Acetylphosphat+ADP „Acetat+ATP hat ein D%8' von ±2,8 kcal/mol. Acetylphosphat besitzt (mehr, weniger, genauso viel) Freie Enthalpie als/wie ATP gegençber der entsprechenden dephosphorylierten Verbindung; ADP hat im Vergleich zum Acetat (eine hæhere, geringere, gleich groûe) Affinitåt fçr Phosphat. (Kreisen Sie die richtigen Antworten ein.) Kænnte man, wenn die Reaktion XA+Y „ XY+A einen D%8'-Wert von +7,3 kcal/ mol hat, diese Reaktion in der Zelle dadurch ablaufen lassen, dass man sie mit einer ATP-Hydrolyse koppelt? Warum bzw. warum nicht? Man hat herausgefunden, dass bei der Reaktionsfolge A ? B ? C ? D die Gleichgewichtskonstante fçr die zweite Reaktion (B ? C) 0,1 ist. Sie wçrden erwarten, dass die Konzentration von C in einer lebenden Zelle (1) gleich B, (2) ein Zehntel von B, (3) weniger als ein Zehntel von B, (4) das 10Fache von B, (5) mehr als das 10Fache von B betrågt. (Kreisen Sie alle richtigen Antworten ein.) Die Reaktion der Verbindung X mit der Verbindung Y zu einer Verbindung Z ist thermodynamisch nicht begçnstigt (D%8' = + 5 kcal/mol). Zeichnen Sie die chemischen Reaktionen auf, die ablaufen wçrden, wenn man die Reaktion mithilfe von ATP ermæglichen wçrde. ATP hat sich zum zentralen Molekçl des Energiestoffwechsels entwickelt. Kænnte 1,3-Bisphosphoglycerat dieselbe Funktion erfçllen? Warum beziehungsweise warum nicht? Berechnen Sie den D%-Wert fçr eine ATPHydrolyse in einer Zelle, in der das [ATP]/ [ADP]-Verhåltnis auf 100:1 angestiegen ist, wåhrend die Pi-Konzentration weiterhin bei 10 mM liegt. Was wçrde es fçr das [ATP]/[ADP]-Verhåltnis bedeuten, wenn sich die Reaktion im Gleichgewichtszustand befindet und die Pi-Konzentration weiter bei 10 mM liegt. Wie groû wåre D%,

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wenn fçr alle Reaktionsteilnehmer und Reaktionsprodukte Standardbedingungen (1 M) gelten wçrden? Betrachten Sie die Reaktion: Glucose+Pi „ Glucose-6-phosphat +H2O; D%8' = +3 kcal/mol. Wie groû ist die Gleichgewichtskonstante 5'eq fçr diese Reaktion? (Anmerkung: Die Konzentration von Wasser soll vernachlåssigt werden.) Bedeutet der positive Wert von D%8' der obigen Reaktion, dass die Reaktion niemals spontan von links nach rechts verlaufen kann? Unter physiologischen Bedingungen ist [Glucose] = 5 mM, [Glucose-6-Phosphat] = 83 mM und [Pi] = 1 mM. Verlåuft die Reaktion aus Frage 16 unter diesen Bedingungen spontan von links nach rechts? Falls nicht, wie hoch mçsste die GlucoseKonzentration sein, damit die Reaktion von links nach rechts verlaufen kænnte, wenn die Konzentrationen der anderen Reaktionsteilnehmer und Reaktionsprodukte so bleiben, wie es oben angegeben ist? Betrachten Sie die Reaktion: Glutamat +Ammoniak „ Glutamin+H2O; D%8' = + 3,4 kcal/mol. Welches Verhåltnis von Glutamat/Glutamin ist erforderlich, damit die Reaktion spontan bei 25 8C von links nach rechts verlåuft, wenn die AmmoniakKonzentration 10 mM betrågt? Es sollte klar sein, dass Glutamin in einer Zelle nicht in der in Aufgabe 18 beschriebenen Reaktion synthetisiert werden kann. In der tatsåchlich stattfindenden Reaktion ist die Glutamin-Synthese an die ATP-Hydrolyse gekoppelt: Glutamat+Ammoniak +ATP „ Glutamin+ADP+Pi Wie groû ist D%8' bei dieser Reaktion? Nehmen Sie an, dass såmtliche Reaktionsteilnehmer und Reaktionsprodukte auûer Ammoniak in einer Konzentration von 10 mM vorliegen. Welche Ammoniak-Konzentration wåre nætig, damit die Reaktion çberwiegend in Vorwårtsrichtung verlåuft und insgesamt Glutamin gebildet wird? Ein nichtkompetitiver Inhibitor hindert das Enzym nicht daran, an sein Substrat zu binden. Was wçrde passieren, wenn man die Substratkonzentration in Gegenwart eines nichtkompetitiven Inhibitors erhæhen wçrde? Glauben Sie, dass ein nichtkompetitiver Inhibitor ;max oder 5M des Enzyms veråndert? Erklåren Sie das kurz.



Weiterfçhrende Literatur

21. 1926 kam James Sumner zu dem Schluss, dass Urease ein Enzym ist, weil Kristalle des Enzyms positiv bei Reagenzien reagierten, die mit Proteinen reagierten, und negativ bei Reagenzien, die mit Fetten, Kohlenhydraten und anderen Substraten reagierten. Andere Enzymologen, die der

ternetseite www.wiley.com/college/karp Erweitern sie Ihr Verståndnis, indem sie Karps Internetseite ¹Zell- und Molekularbiologieª besuchen. Dort finden Sie '  die gestellten
  $ & ,     , die schwierige Sachverhalte und Begriffe verdeutlichen,   , die Ihnen bei Prçfungsvorbereitungen helfen, sowie 8  zu interessanten Seiten im Netz. Zusåtzlich zu der Literaturliste unten kann man auf der Internetseite auch noch '  8 finden.

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Ansicht waren, dass ihre hochaktiven Enzymlæsungen keine Anzeichen fçr ein Protein zeigten, haben seine Schlussfolgerung angezweifelt. Wie sind diese beiden scheinbar gegensåtzlichen Befunde miteinander in Einklang zu bringen?

3.4 Weiterfçhrende Literatur #  Hammes GG (2000) Thermodynamics and Kinetics for the Biological Sciences Wiley & Sons, New York Harold FM (1986) The Vital Force: A Study of Bioenergetics. Freeman Harris DA (1995) Bioenergetics at a Glance. Blackwell, Oxford

#$%  &'  (siehe auch die in Kapitel 2 aufgefçhrten biochemischen Lehrbçcher)

Benkovic SJ, Hammes-Schiffer S (2003) A perspective on enzyme catalysis. Science 301:1196±1202 Falke JJ (2002) A moving story. Science 295:1480±1481 [dynamische Bewegungen wåhrend der Katalyse] Jencks WP (1997) From chemistry to biochemistry to catalysis to movement. Annu Rev Biochem 66:1±18 Knowles J (2003) Seeing is believing. Science 299:2002±2003 [çber enzymatische Katalyse] Kornberg A (1989) For the Love of Enzymes. Harvard Univ Press, Cambridge/MA Kraut DA et al (2003) Challenges in enzyme mechanism and energetics. Annu Rev Biochem 72:517±571 Kraut J (1988) How do enzymes work? Science 242:533±540 Palmer T (1995) Understanding Enzymes. Prentice-Hall Walsh C et al (2001) Reviews on biocatalysis. Nature 409: 226±268

Struktur und Funktion der Plasmamembran

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4.1 Ein Ûberblick çber die Funktionen der Plasmamembran 4.2 Eine kurze Geschichte der Untersuchungen zur Struktur der Plasmamembran 4.3 Die chemische Zusammensetzung der Membranen 4.4 Struktur und Funktionen von Membranproteinen 4.5 Membranlipide und die Fluiditåt der Membran 4.6 Dynamische Prozesse in der Plasmamembran 4.7 Wie Substanzen Zellmembranen passieren 4.8 Membranpotenziale und Nervenimpulse Aus Sicht des Menschen: Eine Erbkrankheit, die durch defekte Ionenkanåle verursacht wird Experimentelle Verfahren: Der Acetylcholinrezeptor ?   (   I   .   # I     + * '  !'  ?I I  

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Die Auûenwånde eines Hauses oder die Karosserie eines Autos sind stark und fest genug, um die Menschen darin vor der unkalkulierbaren und rauen Auûenwelt zu schçtzen. Man kænnte erwarten, dass die Auûenwand einer lebenden Zelle genauso wiederstandsfåhig und undurchdringlich ist, weil sie ebenfalls einen empfindlichen Inhalt vor einer unbelebten und oft unwirt-

lichen Umgebung schçtzen muss. Zellen sind jedoch durch eine dçnne, fragile Struktur von nur fçnf bis zehn Nanometer Dicke, die /    , von der Auûenwelt getrennt. Man mçsste etwa 5000 Plasmamembranen çbereinander stapeln, um auf die Dicke einer einzigen Seite dieses Buches zu kommen.

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Struktur und Funktion der Plasmamembran

<eil die Plasmamembran so dçnn ist, kann man nichts von ihr entdecken, wenn man sich im Lichtmikroskop einen Zellquerschnitt ansieht. Erst Ende der 1950er Jahre war die Technik der Pråparation und Fårbung von Gewebe so weit fortgeschritten, dass man die Plasmamembran unter dem Elektronenmikroskop erkennen konnte. Die ersten elektronenmikroskopischen Aufnahmen wie die von J. D. Robertson von der Duke University (Abb. 4.1 a) zeigten, dass die Plasmamembran aus drei Schichten besteht: aus zwei dunkel gefårbten åuûeren Schichten und einer hell gefårbten mittleren Schicht. Alle Membranen, die genauer untersucht wurden ± ob es nun Plasma-, Kern- oder cytoplasmatische Membranen (Abb. 4.1 b), Membranen von Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen waren ± wiesen dieselbe Feinstruktur auf. Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen boten jedoch





nicht nur einen optischen Eindruck von dieser elementar wichtigen Zellstruktur, sondern entfachten auûerdem eine heftige Debatte darçber, aus welchen Molekçlen die verschiedenen Membranschichten bestehen, eine Diskussion, die geradewegs zum Thema der Membranstruktur und -funktion fçhrte. Wie wir bald sehen werden, besitzen Zellmembranen eine Lipiddoppelschicht; die beiden dunkel gefårbten Schichten in den elektronenmikroskopischen Aufnahmen von Abb. 4.1 entsprechen der inneren und åuûeren polaren Oberflåche der Doppelschicht (sie sind auf dem Bild zu Beginn des Kapitels gelb gefårbt). Wir werden spåter erneut auf die Membranstruktur zurçckkommen, uns aber erst einmal einen Ûberblick çber einige der wichtigsten Funktionen von Membranen im Leben einer Zelle verschaffen (Abb. 4.2).

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Die Bedeutung der Mitochondrien fçr die ATP-Produktion

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Die Zellatmung und das Mitochondrium

gleich. Den scheinbaren Widerspruch zwischen der asymmetrischen Enzymstruktur und der einheitlichen Katalyse erklårte Boyer mit der Behauptung, dass jedes der drei katalytischen Zentren nacheinander die gleichen L-, E- und O-Konformationen durchlåuft (Abb. 5.27). >0   !/&%   '          $    % " '    !   !/ &%     !   0 Um die aufeinander folgenden Verånderungen in der Konformation der katalytischen Zentren erklåren zu kænnen, postulierte Boyer, dass sich die
- und -Untereinheiten, die im F1-Kopf einen hexagonalen Ring von Untereinheiten bilden (Abb. 5.23), gegençber der zentralen Achse drehen. In diesem als      %  bezeichneten Modell liefert der Protonenfluss durch die Membran, die çber den Kanal in der F0-Basis erfolgt, den Antrieb fçr die Drehung. Die im Protonengradienten gespeicherte elektrische Energie wird dabei in die mechanische Energie der rotierenden Achse umgewandelt, die dann wiederum in die in ATP gespeicherte, chemische Energie çberfçhrt wird. 7" '    2%   9     7  ' 

       %   $ 1994 haben John Walker und seine Mitarbeiter am Medical Research Council in England mit ihrer Veræffentlichung eines detaillierten atomaren Modells des F1-Kopfes beachtliches Beweismaterial zur Unterstçtzung der Hypothese von Boyer geliefert. Zuerst einmal zeigte es die Struktur der verschiedenen katalytischen Zentren im statischen Enzym und beståtigte, dass sie sich in ihrer Konformation und Affinitåt fçr Nucleotide unterscheiden. In den katalytischen Zentren der drei -Untereinheiten wurden Strukturen gefunden, die der L-, E-, und O-Konformation entsprechen. Zweitens zeigte es, dass sich die -Untereinheit des Enzyms genau an der richtigen Stelle in der ATP-Synthase befindet, um Konformationsånderungen vom Membransektor in F0 zu den katalytischen Zentren in F1 zu çbertragen. Die -Untereinheit zieht sich wie ein Wellbaum vom F0-Sektor durch die Achse in eine zentrale Hæhlung in der F1-Kugel (Abb. 5.26 a), wo sie mit jeder der drei -Untereinheiten unterschiedlich in Kontakt kommt (Abb. 5.26 b). Das apikale Ende der -Untereinheit ist stark asymmetrisch. In jedem Augenblick wechselwirken unterschiedliche Seiten der -Untereinheit mit den verschiedenen -Untereinheiten und veranlassen diese dabei, unterschiedliche Konfor-

mationen (L, E und O) anzunehmen. Bei der Drehung interagiert jede Bindungsstelle der -Untereinheit nacheinander mit den drei -Untereinheiten von F1. In einem einzigen katalytischen Zyklus dreht sich die -Untereinheit einmal um die eigene Achse, wodurch jedes katalytische Zentrum nacheinander die L-, E- und O-Konformation durchlåuft. Dieser Mechanismus wird schematisch in Abb. 5.27 dargestellt und in der dazu gehærenden Legende ausfçhrlich besprochen. Wie Abb. 5.27 a zeigt, werden ADP und Pi zu ATP kondensiert, wenn sich die Untereinheit jeweils in der E-Konformation befindet. Wie in Abb. 5.23 b zu sehen ist, ist die -Untereinheit mit dem ¹unterenª Teil der -Untereinheit assoziiert und die beiden Untereinheiten drehen sich zusammen. In vielen verschiedenen Experimenten konnte die Rotation der -Untereinheit gegençber den
-Untereinheiten direkt gezeigt werden. Wenn man nur das glauben kann, was man mit eigenen Augen gesehen hat, dann ist die Arbeit von Masasuke Yoshida und seinen Mitarbeitern vom Tokyo Institut of Technology und der Keio Universitåt in Japan dafçr der beste Beweis. Diese Wissenschaftler entwickelten ein geniales System, um das Enzym bei der Katalyse der Rçckreaktion, die in der Zelle normalerweise nicht vorkommt, beobachten zu kænnen. Zuerst verånderten sie gentechnologisch den funktionellen Bereich der ATP-Synthase mit den 3
- und 3-Untereinheiten und einer -Untereinheit (
33) (Abb. 5.28). Dieser Polypeptidkomplex wurde dann mit dem Kopfteil an ein Deckglas fixiert, wåhrend an das Ende der -Untereinheit, die in das Medium hineinragt, ein kurzes fluoreszenzmarkiertes Actinfilament angehångt wurde (Abb. 5.28). Als man das Pråparat mit ATP inkubiert hatte und unter dem Mikroskop beobachtete, sah man, dass sich die fluoreszierenden Actinfilamente wie mikroskopisch kleine Propeller drehten. Als Antrieb diente die Energie, die freigesetzt wurde, wenn ATP-Molekçle an die katalytischen Zentren der -Untereinheiten gebunden und hydrolysiert wurden. Berechnungen der verbrauchten Energie und der geleisteten Arbeit deuten darauf hin, dass mindestens 90% der bei der ATP-Hydrolyse freigesetzten, chemischen Energie in mechanische Energie umgewandelt werden, durch welche sich dann das angeheftete Actinfilament dreht. Diese Experimente zeigen eindeutig, dass die ATP-Synthase ein åuûerst effizienter Drehmotor ist. In unserer Industriegesellschaft sind Rotationsmaschinen weit verbreitet. Wir benutzen rotierende Turbinen, Bohrer, Råder und Propeller, um nur einige wenige zu nennen. In Lebewesen

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 5.26 a, b. Die strukturellen Grundlagen fçr die Konformation im katalytischen Zentrum. a Ein Schnitt durch den F1-Kopf zeigt, wie seine drei Untereinheiten im Raum angeordnet sind. Die c-Untereinheit besteht aus zwei langgezogenen a-Helices, die zu einer superspiralisierten Helix umeinander gewickelt sind. Diese helicale Achse ragt in die zentrale Hæhlung von F1 hinein und zwischen die aund b-Untereinheiten auf jeder Seite hindurch. Welche Konformation das katalytische Zentrum der b-Untereinheit (links) annimmt, richtet sich nach ihrem Kontakt mit der c-Untereinheit. b Blick von oben auf den F1-Kopf; man erkennt, wie die sechs a- und b-Untereinheiten (rot bzw.

Der Apparat fçr die ATP-Synthese

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b gelb) um die asymmetrische c-Untereinheit (blau) angeordnet sind. Die c-Untereinheit liegt so, dass sie sich gegençber den sie umgebenden Untereinheiten drehen kann. Es ist auch deutlich zu sehen, dass die c-Untereinheit mit jeder der drei b-Untereinheiten auf unterschiedliche Weise in Kontakt kommt und sie so dazu bringt, eine andere Konformation anzunehmen. bE entspricht der O-Konformation, bTP der L-Konformation und bDP der E-Konformation. (Genehmigter Nachdruck aus Abrahams JP et al; mit freundlicher Genehmigung von Walker JE (1994) Nature 370:624, 627. Copyright 1994, Macmillan Magazines)

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b n Abb. 5.27. Bindungswechsel fçr die ATP-Synthese. a Schema der Verånderungen in einem einzelnen katalytischen Zentrum wåhrend eines Katalysezyklus. Zu Beginn des Zyklus befindet sich das Zentrum in einer offenen (O)Konformation, in der die Substrate ADP und Pi in dieses Zentrum gelangen kænnen. In Schritt 1 wird aufgrund des Protonenflusses durch die Membran die lockere (L) Konformation angenommen, in der die Substrate lose gebunden sind. In Schritt 2 nimmt das Enzym nach weiteren Protonenbewegungen die enge (E)-Konformation an, in der die Affinitåt fçr die Substrate zunimmt und diese fest an das katalytische Zentrum gebunden werden. In Schritt 3, fçr den sich die Konformation nicht åndern muss, kondensieren das fest gebundene ADP und Pi spontan zu einem fest gebundenen ATP. In Schritt 4 fçhren weitere Pro-

tonenstræme zu einem Umklappen in die offene (O)-Konformation, in der die Affinitåt fçr ATP stark nachlåsst, so dass das Reaktionsprodukt aus dem Zentrum entlassen werden kann. Sobald sich ATP vom katalytischen Zentrum gelæst hat, kann dieses erneut Substrat binden und der Zyklus von vorne beginnen. b Schema, in dem man gleichzeitig die Verånderungen in den drei katalytischen Zentren des Enzyms verfolgen kann. Der Protonenfluss durch den F0-Anteil des Enzyms fçhrt zu einer Drehung der asymmetrischen c-Untereinheit, die den katalytischen Zentren drei verschiedene Seiten zuwendet. Wenn sich die c-Untereinheit dreht, læst sie in den katalytischen Zentren der b-Untereinheiten Konformationsverånderungen aus, wodurch jedes dieser katalytischen Zentren nacheinander die E-, O- und L-Konformation durchlåuft

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Die Zellatmung und das Mitochondrium

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A   !/&%  1997 hatte man zwar die genaue Funktionsweise des F1-Komplexes geklårt, die Beantwortung wesentlicher Fragen zur Struktur und Funktion des membranståndigen F0-Anteils des Enzyms stand aber noch aus. Zu den wichtigsten Fragen gehærte: Welchen Weg nehmen Protonen, wenn sie durch den F0-Komplex wandern, und wie fçhrt diese Bewegung zur Synthese von ATP? Es war postuliert worden, dass

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Eukaryotenzellen eine vielgestaltige Ansammlung membranumhçllter Strukturen enthålt. In den ersten elektronenmikroskopischen Aufnahmen waren Membranblåschen mit unterschiedlichem Durchmesser zu erkennen, die Material mit jeweils anderer Elektronendichte enthielten, sowie lange, durch Membranen abgegrenzte Kanåle, die im Cytoplasma ein verzweigtes Netz bilden, und Stapel abgeflachter, membranumhçllter Hohlråume, die man als   bezeichnete.

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Membransysteme im Cytoplasma: Struktur, Funktion und Membrantransport

Durch diese ersten elektronenmikroskopischen Untersuchungen und die nachfolgenden biochemischen Studien wurde deutlich, dass das Cytoplasma der Eukaryotenzellen sich in verschiedene Kompartimente gliedert, die durch Membranen gegeneinander abgegrenzt sind. Bei genauer Betrachtung verschiedener Zelltypen stellte sich heraus, dass diese Membrankompartimente im Cytoplasma verschiedene Organellen bilden, die man in den unterschiedlichsten Zellen von der Hefe bis zu den vielzelligen Pflanzen und Tieren immer wieder findet. In welchem Umfang das Cytoplasma einer Eukaryotenzelle von Membranstrukturen durchsetzt ist, zeigt die elektronenmikroskopische Aufnahme einer Maiswurzelzelle in Abb. 8.1. Wie wir auf den nun folgenden Seiten genauer erfahren werden, enthålt jedes derartige Organell eine charakteristische Proteinausstattung und ist auf ganz bestimmte Tåtigkeiten spezialisiert. Wie ein Haus oder ein Restaurant, in dem verschiedene Råume fçr die unterschiedlichsten Tåtigkeiten zur Verfçgung stehen, so gliedert sich auch das Cytoplasma einer Zelle aus analogen Grçnden in verschiedene Membrankompartimente. Beim Betrachten der elektronenmikroskopischen Aufnahmen in diesem Kapitel sollte man allerdings an eines denken: Die Organellen des Cytoplasmas mægen als stabile Strukturen wie die Råume eines Hauses oder Restaurants wirken, in Wirklichkeit sind sie aber als dynamische Gebilde in ståndigem Wandel begriffen.

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In dem vorliegenden Kapitel beschåftigen wir uns mit dem Aufbau des endoplasmatischen Retikulums, des Golgi-Apparates sowie der Endosomen, Lysosomen und Vakuolen. Diese Organellen bilden gemeinsam das #  %  , dessen Einzelbestandteile als koordiniertes Ganzes zusammenwirken. Mehrere andere membranumhçllte Organellen des Cytoplasmas ± Mitochondrien, Peroxisomen und Chloroplasten ± gehæren nicht zu diesem zusammenhångenden System und waren der Gegenstand frçherer Kapitel.

5!  Endomembransystem: ein Ûberblick Die Organellen des Endomembransystems sind Teil eines dynamischen, zusammenhångenden Netzwerkes, durch das Substanzen zwischen den Teilen der Zelle hin und her transportiert werden. Meist erfolgt dieser Transport zwischen den Organellen ± beispielsweise vom Golgi-Apparat zur Plasmamembran ± in kleinen, membranumhçllten !  9 , die sich von einem Ausgangs-Membrankompartiment abschnçren (Abb. 8.2 a).1 Die Transportvesikel wandern zielstrebig durch das Cytoplasma; håufig werden sie dabei von Motorproteinen gezogen, die sich an Schienen aus Mikrotubuli und Mikrofilamenten des Cytoskeletts entlang bewegen (siehe Abb. 9.1 a). Hat ein Vesikel seinen Bestimmungsort erreicht, verschmilzt es mit der Membran des aufnehmenden Kompartiments, das dabei sowohl die læsliche Fracht des Vesikels als auch seine Membranhçlle aufnimmt (Abb. 8.2 a). In einem solchen Kreislauf des Abschnçrens und Verschmelzens pendeln die verschiedensten Substanzen auf zahlreichen Wegen kreuz und quer durch die Zelle. Man hat im Cytoplasma mehrere charakteristische Transportrouten identifiziert, die in Abb. 8.2 b im Ûberblick wiedergegeben sind. Unter anderem kann man einen 7  %  ' erkennen: Proteine werden im endoplasmatischen Retikulum synthetisiert, auf dem Weg durch den Golgi-Apparat abgewandelt und dann an verschiedene Bestimmungsorte gebracht, so zur Plasmamembran, zu den Lysosomen oder zu der 1 Der Begriff ¹Vesikelª låsst an ein kugelfærmiges Transportmittel denken. Die Fracht kann aber auch in unregelmåûig geformten oder ræhrenfærmigen membranumhçllten Hohlråumen transportiert werden. Der Einfachheit halber werden hier alle derartigen Transportblåschen als ¹Vesikelª bezeichnet; man sollte also daran denken, dass sie nicht immer kugelfærmig sind.



Das Endomembransystem: ein Ûberblick

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groûen Vakuole der Pflanzenzellen. Diese Route wird auch als     bezeichnet, denn viele Proteine, die im endoplasmatischen Retikulum synthetisiert werden (und auch viele im Golgi-Apparat gebildete komplexe Polysaccharide, s. Kap. 8.4) sind dazu bestimmt, aus der Zelle ausgeschieden ( $ ) zu werden. Bei der sekretorischen Tåtigkeit der Zelle kann man zwei Typen unterscheiden: die konstitutive und die regulierte Sekretion (Abb. 8.2 b). Bei der    9 &  werden Substanzen in sekretorischen Vesikeln vom Ort ihrer Synthese abtransportiert und ståndig in die Zellumgebung abgegeben. Dieser Vorgang, den die meisten Zellen ausfçhren, trågt nicht nur zur Entstehung der extrazellulåren Matrix bei (Kap. 7.1), sondern auch zur Herstellung der Plasmamembran selbst. Bei der   &  dagegen werden die Substanzen in Form membranum-

hçllter Påckchen gespeichert und nur auf einen geeigneten Reiz hin ausgeschçttet. Regulierte Sekretion gibt es zum Beispiel bei endokrinen Zellen, die Hormone ausschçtten, in den Acinuszellen des Pankreas, die Verdauungsenzyme freisetzen, und in den Nervenzellen, die Neurotransmitter abgeben. In manchen derartigen Zellen wird das Material, das ausgeschieden werden soll, in groûen, dicht gepackten, membranumhçllten    :  gespeichert (Abb. 8.3). Proteine, Lipide und komplexe Polysaccharide werden auf dem Biosyntheseweg oder sekretorischen Weg durch die Zelle transportiert. Im ersten Teil des Kapitels konzentrieren wir uns auf die Synthese und den Transport der Proteine, wie sie in Abb. 8.2 b zusammenfassend dargestellt sind. Dabei befassen wir uns nacheinander mit verschiedenen Proteinklassen: mit læslichen

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Membransysteme im Cytoplasma: Struktur, Funktion und Membrantransport

Coteinen, die aus der Zelle ausgeschieden werden, mit den integralen Proteinen der verschiedenen in Abb. 8.2 b dargestellten Membranen und mit læslichen Proteinen, die in den verschiedenen von Endomembranen eingeschlossenen Kompartimenten angesiedelt sind (z. B. Lysoso-

menenzyme). Wåhrend der sekretorische Weg dazu dient, Substanzen aus der Zelle auszuschleusen, verlåuft der #% ' in umgekehrter Richtung. Ûber ihn gelangt Material von der Zelloberflåche in die Kompartimente im Cytoplasma, beispielsweise in die Endosomen und Lysosomen (Abb. 8.2 b). Die Wanderung der Vesikel und ihres Inhalts entlang der verschiedenen Transportwege in der Zelle hat groûe Øhnlichkeit mit dem Lastwagenverkehr, durch den unterschiedlichste Ladungen çber die Straûen einer Stadt transportiert werden. In beiden Fållen muss durch .    sichergestellt werden, dass das Material genau an die vorgesehene Stelle gelangt. Der Proteinverkehr in einer Speicheldrçsenzelle erfordert z. B., dass die Speichelproteine, die im endoplasmatischen Retikulum entstehen, spezifisch in sekretorische Granula dirigiert werden, wåhrend die Lysosomenenzyme, die ebenfalls im endoplasmatischen Retikulum synthetisiert werden, gezielt in die Lysosomen gelangen. Auûerdem enthalten die einzelnen Organellen unterschiedliche integrale Membranproteine; auch aus diesem Grund mçssen Membranproteine gezielt in bestimmte Organellen wie Lysosom oder Golgi-Apparat gebracht werden. Die verschiedenartigen Ladungen ± sekretorische Proteine, Lysosomenenzyme, Membranproteine ± werden durch spezifische ¹Adressenetikettenª oder &     an ihren Bestimmungsort dirigiert; diese sind entweder in der Aminosåuresequenz oder in den angehefteten Oligosacchariden co-

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Untersuchungsverfahren fçr Endomembranen

diert. Erkannt werden die Sortiersignale von spezifischen Rezeptoren, die in den Membranen abknospender Vesikel liegen (Abb. 8.2 a) und dafçr sorgen, dass das Protein an den richtigen Bestimmungsort gelangt. In der Entschlçsselung der Verkehrsregeln, die in Eukaryotenzellen herrschen, hat man in den letzten dreiûig Jahren groûe Fortschritte erzielt. Man konnte die spezifischen Adressenetiketten und Rezeptoren identifizieren, die den Verkehrsfluss steuern, und man analysierte den Apparat, der in den Zellen fçr die Verteilung der Substanzen auf die richtigen Stellen sorgt. Diese Themen werden wir auf den nåchsten Seiten ausfçhrlich erærtern. Im nåchsten Kapitel befassen wir uns dann mit den Motorproteinen und Cytoskelettelementen, die fçr die Bewegung der Transportvesikel und anderer Endomembranelemente eine Schlçsselrolle spielen. Zu Beginn unserer Untersuchung der Endomembranen betrachten wir einige wichtige experimentelle Verfahren, die viel zu unseren heutigen Kenntnissen çber das Thema beigetragen haben.

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8.2 Untersuchungsverfahren fçr Endomembranen Die ersten elektronenmikroskopischen Untersuchungen lieferten ein genaues Bild vom Aufbau der Zellen, aber çber die Funktionen der beobachteten Bestandteile erfuhr man auf diese Weise kaum etwas. Um festzustellen, welche Aufgaben die Organellen im Cytoplasma erfçllen, musste man neue Verfahren entwickeln und neuartige Experimente machen. Erste Anstrengungen auf diesen Gebieten wurden 1974 mit dem Nobelpreis fçr drei Zellbiologen belohnt; die Preistråger waren Christian De Duve von der Universitåt Louvain in Belgien sowie Albert Claude und George Palade von der Rockefeller University. Die experimentellen Methoden, die auf den folgenden Seiten beschrieben werden, haben sich als besonders nçtzlich erwiesen: Durch sie erwarb man die grundlegenden Kenntnisse, auf denen die Erforschung der Organellen im Cytoplasma heute aufbaut.

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8.2.1 Neue Erkenntnisse durch Autoradiographie Unter den mehreren hundert verschiedenen Zelltypen im Organismus haben die Acinuszellen des Pankreas ein besonders umfangreiches Endomembransystem. Ihre Aufgabe besteht vor allem darin, Verdauungsenzyme zu synthetisieren und auszuscheiden. Nachdem diese Enzyme vom Pankreas abgegeben sind, werden sie çber Gånge in den Dçnndarm transportiert, wo sie die aufgenommene Nahrung abbauen. An welchen Stellen innerhalb der Acinuszellen werden die sekretorischen Proteine synthetisiert, und wie gelangen sie an die Zelloberflåche, wo sie ausgeschçttet werden? Diese Fragen sind schon von ihrem Wesen her schwer zu beantworten, denn alle Schritte des Sekretionsprozesses laufen in der Zelle gleichzeitig ab. Um den Zyklus von Anfang bis Ende ± d. h. von der Synthese eines sekretorischen Proteins bis zu seiner Ausscheidung aus der Zelle ± zu verfolgen, bedienten sich James Jamieson und George Palade des Verfahrens der     . Wie in Kap. 18 noch genauer erærtert wird, ist die Autoradiographie ein gutes Mittel, um biochemische Ablåufe sichtbar zu machen: Mit ihrer Hilfe kann man die Lage radioaktiv markierter Substanzen in einer Zelle erkennen. Dazu beschichtet man Gewebedçnnschnitte, die radioaktive Isotope enthalten, mit einer fotografischen Emulsion, die auf diese Weise der Strahlung der Radioisotope im Gewebe ausgesetzt wird. Stellen in den Zellen, an denen sich Radioaktivitåt befindet, sind dann im Mikroskop an den Silberkærnern in der darçber liegenden fotografischen Emulsion zu erkennen (Abb. 8.3). Um herauszufinden, an welchen Stellen sekretorische Proteine synthetisiert werden, inkubierten Palade und Jamieson Gewebestçcke aus dem Pankreas fçr kurze Zeit in einer Læsung, die radioaktive Aminosåuren enthielt. In dieser Zeit wurden die markierten Aminosåuren von den lebenden Zellen aufgenommen und in die Verdauungsenzyme eingebaut, deren Synthese an den Ribosomen gerade im Gange war. Anschlieûend wurde das Gewebe fixiert, und die Lage der Proteine, die wåhrend der kurzen Inkubation mit radioaktiven Aminosåuren entstanden waren, wurde durch Autoradiographie ermittelt. Mit diesem Verfahren entdeckte man, dass sekretorische Proteine im endoplasmatischen Retikulum synthetisiert werden (Abb. 8.3 a). Um den Weg nachzuzeichnen, den die sekretorischen Proteine vom Ort ihrer Synthese bis zur Ausscheidung zurçcklegen, machten Palade und Jamieson ein weiteres Experiment. Nachdem

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Membransysteme im Cytoplasma: Struktur, Funktion und Membrantransport

sie das Gewebe kurz mit radioaktiven Aminosåuren inkubiert hatten, wuschen sie çberschçssige Mengen der Isotope aus und çberfçhrten das Gewebe dann in ein Medium, das ausschlieûlich unmarkierte Aminosåuren enthielt. Solche Versuche bezeichnet man als ¹  $" E-Experimente.   (Puls) ist dabei die kurze Inkubation mit radioaktiv markierten Aminosåuren, die in die Zellen aufgenommen werden. Als " (Jagd, Verfolgung) wird die Zeit bezeichnet, in der das Gewebe dem unmarkierten Medium ausgesetzt ist, so dass aus nicht radioaktiven Aminosåuren weitere Proteinmolekçle synthetisiert werden. Je långer die " -Phase ist, desto weiter entfernen sich die wåhrend des Pulses markierten Proteine in der Zelle vom Ort ihrer Synthese. Im Idealfall kann man auf diese Weise den Transport neu synthetisierter Molekçle genau verfolgen: Man beobachtet, wie eine Welle radioaktiver Substanzen durch die Organellen im Cytoplasma von einer Stelle zur anderen wandert, bis der ganze Vorgang abgeschlossen ist. Die Ergebnisse solcher Experimente, mit denen man erstmals den biosynthetischen (oder sekretorischen) Weg abgrenzen und eine Reihe scheinbar getrennter membranumhçllter Kompartimente zu einer zusammenhångenden Funktionseinheit verknçpfen konnte, sind in Abb. 8.2 b±d zusammenfassend dargestellt. 5$$ Erkenntnisse, gewonnen durch die Verwendung des grçn fluoreszierenden Proteins Die im vorangegangenen Abschnitt beschriebenen Autoradiographieexperimente erfordern, dass man Dçnnschnitte verschiedener Zellen untersucht, die zu unterschiedlichen Zeiten nach Einbringen einer radioaktiven Markierung fixiert wurden. In den letzten Jahren hat man ein neues Verfahren entwickelt, durch das ein Wissenschaftler mit eigenen Augen die dynamischen Bewegungen ganz bestimmter Proteine beobachten kann, die sich in einer einzelnen lebenden Zelle abspielen. Dazu bedient man sich eines Gens, das aus einer Qualle isoliert wurde und ein kleines Protein namens   $   /  (

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/) codiert. GFP sendet ein grçnes Fluoreszenzlicht aus. DNA, die GFP codiert, wird mit der codierenden DNA fçr das Protein verbunden, das man untersuchen mæchte, und die so entstandene, zusammengesetzte DNA schleust man in Zellen ein, die man im Mikroskop beobachten kann. Innerhalb der Zellen exprimiert die zusammengesetzte DNA ein zusammengesetztes

Protein, in dem GFP mit einem Ende des zum untersuchenden Proteins verknçpft ist. In den meisten Fållen hat das angehångte GFP so gut wie keine Auswirkungen auf Transport oder Funktion dieses Proteins. Zwei Mikroskopaufnahmen von Zellen, die ein solches GFP-Fusionsprotein enthalten, zeigt Abb. 8.4. Die Zellen wurden in diesem Fall mit einem Stamm des Vesicular-Stomatitis-Virus (VSV) infiziert, bei dem ein Virusgen namens VSVG mit dem GFP-Gen verknçpft war. Viren sind fçr derartige Untersuchungen besonders nçtzlich, weil sie die infizierten Zellen zu Fabriken fçr die Produktion eines oder einiger weniger Virusproteine machen. Im endoplasmatischen Retikulum (ER) einer Zelle, die mit VSV infiziert ist, wird das VSVG-Protein in riesigen Mengen produziert. Die VSVG-Molekçle wandern dann durch den Golgi-Apparat und werden zur Plasmamembran der infizierten Zelle transportiert, wo sie in neue Virushçllen verpackt werden. Wie in einem radioaktiven   $" -Experiment, so kann man auch mit Hilfe eines Virus eine relativ einheitliche Welle der Proteinwanderung verfolgen, in diesem Falle in Form einer Welle grçner Fluoreszenz, die kurze Zeit nach der Infektion einsetzt. Wie man den Ablauf noch besser synchronisieren kann, zeigt Abb. 8.4: Man verwendet ein Virus mit einem mutierten VSVGProtein, das nicht aus dem ER ausgeschleust wird, wenn man die Zellen bei erhæhter Temperatur (z. B. 40 8C) wachsen låsst. Senkt man die Temperatur dann auf 32 8C, wandert das fluoreszierende GFP-VSVG-Protein, das sich im ER angesammelt hat (Abb. 8.4 a, c), gleichzeitig zum GolgiApparat (Abb. 8.4 b, c), wo sich verschiedene Weiterverarbeitungsvorgånge abspielen, und dann zur Plasmamembran. Derartige Mutanten, die bei niedriger (permissiver) Temperatur normal funktionieren, nicht aber bei erhæhter (restriktiver oder nichtpermissiver) Temperatur, werden als     9 bezeichnet. 8.2.3 Erkenntnisse durch biochemische Analyse subzellulårer Fraktionen Elektronenmikroskopie, Autoradiographie und Experimente mit GFP liefern Aufschlçsse çber die Struktur und der Funktion der Zellorganellen, aber çber die molekulare Zusammensetzung dieser Strukturen erfåhrt man dabei kaum etwas. Pionierarbeiten beim Aufschlieûen (2  ) der Zellen und bei der Abtrennung der verschiedenen Organellentypen leisteten Albert Claude und Christian de Duve in den fçnfziger und sechziger Jahren des 20. Jahrhun-



Untersuchungsverfahren fçr Endomembranen

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derts. Wenn man eine Zelle aufbricht (homogenisiert), werden die Membranen im Cytoplasma zerstçckelt und die Kanten der Membranfragmente verbinden sich zu kugelfærmigen Blåschen (Vesikeln) mit einem Durchmesser von weniger als 100 nm. Vesikel, die aus verschiedenen Organellen (Zellkern, Mitochondrien, Plasmamembranen, endoplasmatisches Retikulum usw.) entstanden sind, haben unterschiedliche Eigenschaften, anhand derer man sie voneinander trennen kann, ein Verfahren, das als $ 1
    bezeichnet wird. Membranvesikel, die vom Endomembransystem (vorwiegend vom endoplasmatischen Retikulum und vom Golgi-Apparat) abstammen, bilden eine uneinheitliche Sammlung von Vesikeln mit åhnlicher Græûe, die als    bezeichnet werden. Ein schnelles (und grobes) Verfahren zur Abtrennung der Mikrosomenfraktion einer Zelle zeigt Abb. 8.5 a. Die Mikrosomenfraktion kann man mit den Gradientenverfahren, die in Kap. 18.6 genau erærtert werden, in Fraktionen mit glatten und rauen Membranen zerle-

gen (Abb. 8.5 b, c). Nachdem man die verschiedenen Fraktionen getrennt hat, ermittelt man ihre biochemische Zusammensetzung. Mit dieser Methode fand man beispielsweise in Vesikeln, die von unterschiedlichen Teilen des Golgi-Apparats stammten, verschiedene Enzyme, die unterschiedliche Zuckermolekçle an das Ende der wachsenden Kohlenhydratkette eines Glycoproteins oder Glycolipids anheften. Man konnte aus der Mikrosomenfraktion ein ganz bestimmtes Enzym isolieren und dann als Antigen zur Herstellung von Antikærpern gegen dieses Enzym verwenden. Die Antikærper koppelte man beispielsweise an Goldkçgelchen oder andere Substanzen, die man im Elektronenmikroskop sichtbar machen kann. Auf diese Weise konnte man die Lage des Enzyms in dem Membrankompartiment feststellen. Mit derartigen Untersuchungen konnte man im Einzelnen nachzeichnen, wie komplexe Kohlenhydrate im Golgi-Apparat schrittweise zusammengesetzt werden. In den letzten Jahren ist die Identifizierung der Proteine in den einzelnen Zellfraktionen

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Membransysteme im Cytoplasma: Struktur, Funktion und Membrantransport n Abb. 8.5 a±c.       ?     

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aller Organellen zeichnen kann, die sich in relativ reiner Form darstellen lassen. So stellte sich unter anderem heraus, dass ein einfaches Phagosom, in dem sich nur eine aufgenommene Latexperle befindet, mehr als 160 verschiedene Proteine enthålt; viele davon hatte man noch nie zuvor nachgewiesen, oder man wusste nicht, dass sie an der Phagocytose beteiligt sind. 5$ Erkenntnisse durch Verwendung zellfreier Systeme

urch die raffinierten Verfahren der Proteomforschung in ein neues Stadium getreten. Wenn man Organellen eines bestimmten Typs isoliert hat, kann man ihre Proteine gewinnen, voneinander trennen und mit der in Kap. 2 genauer erærterten Methode der Massenspektrometrie identifizieren. Auf diese Weise lassen sich mehrere hundert Proteine gleichzeitig nachweisen, so dass man ein umfassendes molekulares Bild

Sobald man çber Methoden zur Abtrennung der membranumhçllten Organellen verfçgte, ging man daran, die Fåhigkeiten dieser groben subzellulåren Pråparationen genauer zu untersuchen. Dabei stellte sich heraus, dass auch isolierte Teile einer Zelle bemerkenswerte Wirkungen haben kænnen. Diese ersten $  &%   ± die so genannt werden, weil sie keine ganzen Zellen enthalten ± lieferten eine Fçlle neuer Erkenntnisse çber komplizierte Vorgånge, die man an vollståndigen Zellen nicht untersuchen konnte. In den 1960er Jahren wollten beispielsweise George Palade, Philip Siekevitz und ihre Kollegen an der Rockefeller University mehr çber die Eigenschaften der (in Abb. 8.5 c dargestellten) rauen Mikrosomenfraktion in Erfahrung bringen, die vom rauen ER stammt (Kap. 8.3). Dabei stellten sie fest, dass sie die isolierten rauen Mikrosomen von den angehefteten Partikeln befreien konnten, und diese abgetrennten Partikel (Ribosomen) konnten Proteine synthetisieren, wenn man ihnen die erforderlichen Bausteine aus dem Cytosol zur Verfçgung stellte. Unter solchen Bedingungen wurden die neu syn-

 thetisierten Proteine von den Ribosomen einfach in die wåssrige Læsung im Reagenzglas abgegeben. Machten sie das gleiche Experimente jedoch mit vollståndigen rauen Mikrosomen, gelangten die neu synthetisieren Proteine nicht in das Inkubationsmedium, sondern sie wurden im Innenraum der membranumhçllten Vesikel festgehalten. Aus dieser Untersuchung musste man den Schluss ziehen, dass die Mikrosomenmembran fçr den Einbau der Aminosåuren in Protein nicht erforderlich ist, wohl aber dafçr, neu synthetisierte sekretorische Proteine in die ER-Zisterne zu dirigieren. In den letzten Jahrzehnten konnte man mit Hilfe zellfreier Systeme die Funktion vieler Proteine aufklåren, die an den Wanderungen der Membranen beteiligt sind. Abb. 8.6 zeigt ein Liposom, von dessen Oberflåche sich Vesikel abschnçren (Pfeile). Wie in Kap. 4.3.2 genauer erærtert wird, handelt es sich bei Liposomen um Vesikel aus einer kçnstlichen Molekçldoppelschicht, die man im Labor aus gereinigten Phospholipiden hergestellt hat. Die abgeschnçrten Blåschen und Vesikel in Abb. 8.6 entstanden, nachdem man die Liposomenpråparation mit gereinigten Proteinen inkubiert hatte, die in der Zelle normalerweise eine Schicht auf der dem Cytosol zugewandten Oberflåche von Transportvesikeln bilden. Ohne diese Hçllproteine kænnen sich keine Vesikel abschnçren. Mit derartigen

n Abb. 8.6.    ( 8       ! 

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Untersuchungsverfahren fçr Endomembranen

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experimentellen Verfahren konnte man die Proteine untersuchen, die an die Membranen binden und damit die Bildung von Vesikeln in Gang setzen, aber auch solche, die fçr die Auswahl der ¹Frachtª zuståndig sind, und andere, die das Vesikel von seiner Ursprungsmembran trennen. 5$. Erkenntnisse aus der Untersuchung genetischer Mutanten Als Mutante bezeichnet man ein Lebewesen (oder eine Gewebekulturzelle), in dessen Chromosomen ein Gen (oder auch mehrere) anormale Proteine codieren. Kann ein Protein, das von einem solchen mutierten Gen codiert wird, seine normale Aufgabe nicht mehr erfçllen, ist an der entsprechenden Zelle eine charakteristische Stærung zu erkennen. Wenn man genau untersucht, worin die Stærung besteht, kann man Aufschlçsse çber die Funktion des normalen Proteins gewinnen. Die genetischen Grundlagen der Sekretion wurden vorwiegend an Hefezellen erforscht, und zwar vor allem von Randy Schekman und seinen Kollegen an der University of California in Berkeley. Hefezellen eignen sich fçr genetische Unersuchungen besonders gut: Sie haben eine geringere Zahl von Genen als viele andere Eukaryoten, lassen sich als kleine Einzeller leicht zçchten und befinden sich wåhrend des græûten Teils ihres Lebenszyklus im haploiden Zustand. In einer haploiden Zelle hat eine Mutation in einem einzelnen Gen erkennbare Auswirkungen, weil die Zelle keine zweite Kopie des Gens besitzt, so dass die Anomalie nicht verschleiert wird. Wie in allen Eukaryotenzellen, so schnçren sich auch in der Hefe Vesikel vom ER ab und wandern zum Golgi-Apparat, mit dessen Zisternen sie verschmelzen (Abb. 8.7 a). Will man Gene identifizieren, deren zugehærige Proteine an diesem Teil des sekretorischen Weges beteiligt sind (wie beispielsweise die "-Gene), sucht man nach mutierten Zellen mit einer anormalen Verteilung der Membranen im Cytoplasma. Abb. 8.7 b zeigt die elektronenmikroskopische Aufnahme einer Wildtyp-Hefezelle. Die Zelle in Abb. 8.7 c dagegen trågt eine Mutation in einem Gen, dessen zugehæriges Protein an der Bildung der Vesikel an der ER-Membran mitwirkt (Abb. 8.7 a, Schritt 1). In den mutierten Zellen bilden sich keine Vesikel mehr und das endoplasmatische Retikulum nimmt ungewæhnlich groûe Ausmaûe an. Dagegen trågt die Zelle in Abb. 8.7 d eine Mutation in einem Gen, dessen Protein an der Verschmelzung von Vesikeln beteiligt ist (Abb. 8.7 a, Schritt 2). Ist dieses Protein defekt,

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Membransysteme im Cytoplasma: Struktur, Funktion und Membrantransport n Abb. 8.7 a±d. 4     %    9       ?  a          G      9   '    % '   &      b        

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( 1 ,   B    '      Y +  < )  8  %  ; +5JJ01 8 H50   .      0 Irgendwann im Vorfeld der Vesikelverschmelzung kommt es zu Wechselwirkungen zwischen den ins Cytosol ragenden Abschnitten integraler Proteine der beiden Membranen, und das fçhrt zu einem engen Kontakt zwischen Vesikel und Zielkompartiment. Die entscheidenden Proteine, die an diesen Wechselwirkungen beteiligt sind, bezeichnet man als &) # ; sie bilden eine Familie von mehr als 35 Membranproteinen, die jeweils in ganz bestimmten Zellkompartimenten lokalisiert sind.

Typen des Vesikeltransports und ihre Funktionen

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Zwischen den einzelnen SNAREs gibt es in Struktur und Græûe betråchtliche Unterschiede, alle enthalten jedoch in ihrer zum Cytosol weisenden Domåne das &) # 9" einen Abschnitt aus 60 bis 70 Aminosåuren, der mit einem zweiten SNARE-Motiv eine superspiralisierte Helix (Kap. 2.5.3) bilden kann. Bei den SNAREs unterscheidet man zwei Untergruppen: 9&) # werden beim Abschnçren in die Membran der Transportvesikel aufgenommen, &) # dagegen liegen in den Membranen der Zielkompartimente (Abb.

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Membransysteme im Cytoplasma: Struktur, Funktion und Membrantransport

8.31 b). Am besten sind jene SNAREs untersucht, die bei der regulierten Ausschçttung von Neurotransmittern (Kap. 4.8.4) fçr die Anheftung der synaptischen Vesikel an die pråsynaptische Membran sorgen. In diesem Fall enthålt die Plasmamembran der Nervenzelle zwei SNAREs, Syntaxin und SNAP-25; in der Membran der synaptischen Vesikel dagegen liegt ein einziges v-SNARE, das Synaptobrevin. Wenn das synaptische Vesikel sich der pråsynaptischen Membran nåhert, bilden die SNARE-Motive der gegençber stehenden tund v-SNAREs die in Abb. 8.32 a gezeigten vierstrångigen Bçndel. Jedes Bçndel besteht aus vier
-Helices; zwei davon steuert das SNAP-25 bei, die beiden anderen stammen vom Syntaxin und Synaptobrevin. Gemeinsam

bilden diese vier parallelen
-Helices eine dicht verdrillte superspiralisierte Helix, welche die beiden gegençber liegenden Lipiddoppelschichten in sehr enge Verbindung bringt (Abb. 8.31 b, 8.32 a). Øhnliche vierstrångige Helixbçndel bilden andere SNAREs auch çberall in der Zelle an allen Stellen, wo Membranen verschmelzen sollen. Interessanterweise dienen die SNAREs von synaptischen Vesikeln und pråsynaptischer Membran als Ansatzpunkt fçr das Botulismus- und das Tetanustoxin, zwei der stårksten bakteriellen Giftstoffe. Diese tædlichen Toxine sind Proteasen: Sie spalten spezifisch bestimmte SNAREs und blockieren auf diese Weise die Ausschçttung von Neurotransmittern.

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Zweiergruppe. Im Schritt 2 machen die Dyneinmolekçle eine Konformationsånderung durch, die als Kraftschlag dafçr sorgt, dass die untere Zweiergruppe sich in Richtung des basalen Endes der oberen Zweiergruppe verschiebt. Diese Konformationsånderung in einer schweren Dyneinkette ist in Abb. 9.36 b±d dargestellt. Im Schritt 3 haben sich die Dyneinarme vom B-Tubulus der oberen Zweiergruppe gelæst, und im Schritt 4 haben sie sich erneut angeheftet, so dass der nåchste Zyklus beginnen kann. (Eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines Querschnitts durch ein Cilium mit Dyneinarmen, die von einer Zweiergruppe ausgehen und an der nåchsten angeheftet sind, zeigt Abb. 18.18.) Die Gleitvorgånge auf den beiden Seiten des Axonems wechseln sich ab; das hat zur Folge, dass das Cilium oder die Flagelle sich erst in die eine und dann in die andere Richtung biegt (Abb. 9.38). Dies setzt voraus, dass zu jedem Zeitpunkt die Dyneinarme auf einer Seite des

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Cytoskelett und Zellbewegungen

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Axonems aktiv und auf der anderen inaktiv sind. Wegen dieser unterschiedlichen Aktivitåt des Dyneins ragen die Dyneinarme auf der Innenseite der Biegung (oben und unten in Abb. 9.38) weiter heraus als die auf der anderen Seite des Axonems. Im Laufe der Zeit kamen immer neue Befunde hinzu, die fçr diese Mikrotubuli-Gleitfasertheorie und die beschriebene Funktion der Dyneinarme sprechen. In den Axonemen schlagender Flagellen konnte man den Gleitvorgang unmittelbar sichtbar machen; er ist auf den Fotos in Abb. 9.39 zu erkennen. In diesem Experiment wurden isolierte Axoneme mit winzigen Goldperlen inkubiert, die sich an die Auûenseite der peripheren Zweiergruppen anhefteten. Die Perlen dienten dann als feste Markierungen fçr bestimmte Stellen auf den Zweiergruppen. Anschlieûend wurden die Axoneme durch Zugabe von ATP zum Schlagen angeregt, und man beobachtete die relative Lage der Perlen. Als die Axoneme hin und her schlugen, wurden die Abstånde zwischen den Perlen an verschiedenen Zweiergruppen abwechselnd græûer und kleiner (Abb. 9.39). Genau das erwartet man, wenn benachbarte Zweiergruppen aneinander hin und her gleiten.       +   
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Intermediårfilamente

diniert, dass Tausende von Cilien im gleichen Takt schlagen. Offensichtlich muss hier also eine pråzise Steuerung stattfinden. Die Regulation der Cilien- und Flagellenbewegung beginnt mit der Aktivitåtssteuerung der Dyneinarme. Wie bereits erwåhnt wurde, sind nicht alle Arme zur gleichen Zeit aktiv; wåre das der Fall, wçrde das Organell in einem ¹eingefrorenenª, gelåhmten Zustand verharren. Nach heutiger Kenntnis bestimmen das zentrale Mikrotubulipaar und die Radialspeichen darçber, welche Dyneinarme zum jeweiligen Zeitpunkt aktiv sind. Bei mehreren biologischen Arten, die man untersucht hat, rotiert das zentrale Paar wåhrend des Cilienoder Flagellenschlages. Dabei streift es in regelmåûigen Abstånden jede Radialspeiche (siehe Abb. 9.30 b), wobei es offensichtlich ein Signal çber die Speiche zum Dyneinarm des zugehærigen A-Tubulus sendet und auf diese Weise den Arm zu seiner Schwungbewegung anregt. Untersuchungen legen die Vermutung nahe, dass die Aktivierung oder Inaktivierung des Dyneinarmes durch die Entfernung oder Anheftung von Phosphatgruppen erfolgt, die sich an einer oder mehreren Polypeptidketten des riesigen Motorproteins befinden.

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3ederholung

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Beispiel Neuronen, Muskelzellen und den Epithelzellen in der inneren Auskleidung der Kærperhæhlen ± mechanische Festigkeit. IFs erstrecken sich durch das Cytoplasma der verschiedensten Tierzellen und sind håufig çber dçnne, fadenartige Querverbindungen mit anderen Cytoskelettelementen verknçpft (Abb. 9.40). In vielen Zellen bestehen diese Querverbindungen aus den riesigen, långlichen Molekçlen des Proteins / , das in mehreren Isoformen vorkommt. Jedes Plectinmolekçl besitzt an einem Ende eine Bindungsstelle fçr ein Intermediårfilament und am anderen je nach der Isoform eine Bindungsstelle fçr ein Intermediårfilament, ein Mikrofilament oder einen Mikrotubulus. Im Gegensatz zu Mikrofilamenten und Mikrotubuli sind die Intermediårfilamente chemisch uneinheitliche Strukturen, deren Bestandteile beim Menschen in mehr als 60 Genen codiert sind. Diese Polypeptiduntereinheiten der IFs kann man nach ihrer Gewebeverteilung (Tabelle 9.2), aber auch nach biochemischen, genetischen und immunologischen Kriterien in sechs Gruppen einteilen. Die meisten oder sogar alle derartigen Polypeptide enthalten eine åhnliche Anordnung von Domånen und bilden deshalb åhnlich aussehende Filamente. Auffållig ist vor allem eine zentrale, ståbchenfærmige Domåne mit
-Helix-Struktur, die bei allen IF-Polypeptiden

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9.4 Intermediårfilamente Den zweiten der drei Haupttypen von Cytoskelettelementen erkennt man im Elektronenmikroskop als feste, unverzeigte Fasern mit einem Durchmesser von etwa 10 nm. Diese 6  1   (6
) wurden bis heute nur in Tierzellen mit Sicherheit nachgewiesen. Es handelt sich um kråftige, seilartige Fasern; sie verleihen Zellen, die unter Spannung stehen ± zum

n Abb. 9.40.  8I           #   (           !         ,  

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Cytoskelett und Zellbewegungen

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Hier sei darauf hingewiesen, dass manche derartigen Proteine in Abhångigkeit von ihrer Konzentration und den Umgebungsbedingungen (zum Beispiel Ca2+- und H+-Konzentration) mehrere Funktionen aus der Liste erfçllen. Meist werden solche Proteine   untersucht, aber dann ist es vielfach schwierig, die Ergebnisse auf die Ablåufe in der Zelle zu çbertragen.

 gelten aber nicht als ¹echteª Mitglieder dieser Familie. Ein Arp2/3-Komplex besteht aus zwei Arps (Arp2 und Arp3) sowie fçnf anderen Proteinen. Gereinigte Arp2/3-Komplexe sind nur schwach oder gar nicht als Filamentkeim aktiv; zu diesem Zweck mçssen sie durch die Wechselwirkungen mit anderen Proteinen aktiviert werden (Kap. 9.7.2). Durch die Aktivierung åndert sich nach heutiger Kenntnis die Konformation des ganzen Komplexes so, dass er eine Art Matrize bildet; an diese kænnen sich dann die Actinmonomere anlagern, ganz åhnlich wie beim -Tubulin, das vermutlich als Matrize fçr den Aufbau der Mikrotubuli dient (Abb. 9.21). .    0 Die Proteine aus der Gruppe der Thymosine (zum Beispiel das Thymosin 4) binden an Actinmonomere mit gebundenem ATP (die oft auch als %$! bezeichnet werden) und verhindern ihre Polymerisation. Proteine mit dieser Aktivitåt werden als Actinmonomer-Vereinnahmungsproteine (  $  $ 6      ) bezeichnet. Sie sind vermutlich der Grund, warum G-Actin in Zellen auûerhalb der Muskeln in relativ hoher Konzentration (50±200 mM) vorliegt. Ohne MonomerVereinnahmungsproteine wçrden die Verhåltnisse im Cytoplasma die fast vollståndige Polymerisation aller Monomere zu Filamenten begçnstigen. Da sie aber G-Actin binden und den Monomervorrat stabilisieren, kann sich durch eine Verånderung in Konzentration oder Aktivitåt der Monomer-Vereinnahmungsproteine auch das Gleichgewicht zwischen Monomeren und Polymeren in einer bestimmten Region der Zelle verschieben, so dass zu dem jeweiligen Zeitpunkt entweder die Polymerisation oder die Depolymerisation begçnstigt wird. #7    3capping/ 40 Die Proteine dieser Gruppe steuern die Långe der Actinfilamente, indem sie an ein Ende des Filaments binden und dort eine ¹Kappeª () bilden. Ist das schnell wachsende stumpfe Ende eines Filaments mit einer solchen Kappe versehen, kann die Depolymerisation sich am anderen Ende fortsetzen, so dass das Filament sich auflæst. Ist das spitze Ende ebenfalls blockiert, kommt die Depolymerisation zum Stillstand. Die dçnnen Filamente der quergestreiften Muskulatur sind am stumpfen Ende an der Z-Linie des Sarcomers durch das Protein capZ und am spitzen Ende durch das Protein Tropomodulin abgedeckt. Zerstært man die Tropomodulinkappe durch Mikroinjektion von Antikærpern in eine Muskelzelle, lagern sich an dem freigelegten spitzen Ende der Filamente neue Untereinheiten an, und es kommt in der Mitte des Sarcomers zu einer deutlichen Verlångerung.

Bewegungsvorgånge auûerhalb der Muskeln

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   0 Profilin ist ein kleines Protein, das an derselben Stelle an ein Actinmonomer bindet wie das Thymosin. Aber Profilin hemmt die Polymerisation nicht, sondern begçnstigt nach heutiger Kenntnis das Wachstum der Actinfilamente. Zu diesem Zweck heftet es sich an ein Actinmonomer und katalysiert die Dissoziation des gebundenen ATP, das dann sehr schnell durch ATP ersetzt wird. Das Actinmonomer mit gebundenem ATP und Profilin kann sich dann an das freie stumpfe Ende eines wachsenden Actinfilaments anlagern, wobei das Profilin wieder freigesetzt wird.    %

    Die Proteine aus der Familie der Cofiline (Cofilin, ADF und Depactin) binden an Actin-ADP-Untereinheiten und an das spitze Ende von Actinfilamenten. Cofilin hat offenbar zwei Aktivitåten: Es kann Actinfilamente zerstçckeln und am spitzen Ende ihre Depolymerisation begçnstigen. Diese Proteine sind von Bedeutung fçr den schnellen Umsatz der Actinfilamente an Stellen, wo sich der Aufbau des Cytoskeletts dynamisch wandelt. Fçr die Fortbewegung der Zellen sowie fçr Phagocytose und Cytokinese sind sie unentbehrlich. =9$  0 Die Proteine dieser Gruppe veråndern die råumliche Organisation einer Population von Actinfilamenten. Jedes derartige Protein besitzt mindestens zwei Bindungsstellen fçr Actin und kann deshalb zwei oder mehrere Actinfilamente verknçpfen. Manche Proteine dieses Typs (z. B. das Filamin) sind wie lange, flexible Ståbe geformt und begçnstigen die Entstehung eines lockeren Filamentgeflechts, in dem die Filamente nahezu rechtwinklig verbunden sind (wie in Abb. 9.65). Cytoplasmabereiche, in denen sich ein solches Geflecht befindet, haben die Eigenschaften eines elastischen Gels und leisten Widerstand gegen lokalen mechanischen Druck. Andere Quervernetzungsproteine (zum Beispiel Villin und Fimbrin) haben eine globulåre Form und vereinigen die Actinfilamente in paralleler Anordnung zu dichten Bçndeln. Solche Anordnungen findet man in den Mikrovilli, die aus bestimmten Epithelzellen herausragen (Abb. 9.67), und in den haaråhnlichen &   (Abb. 9.54) auf den Rezeptorzellen des Innenohres. Zu Bçndeln zusammengefasst, sind die Filamente steifer, so dass sie fçr solche Cytoplasmafortsåtze als inneres Stçtzskelett dienen kænnen.
    0 Die Proteine dieser Klasse sind in der Lage, sich seitlich an ein Filament anzuheften und es zu durchtrennen. Zerstærungsproteine wie das Gelsolin begçnstigen wahrscheinlich auch den Einbau von Actinmonomeren, weil sie zusåtzliche freie Enden

476

Cytoskelett und Zellbewegungen

auch das Dystrophin gehært, das fçr die Muskeldystrophie verantwortlich ist). 9.7.2 Beweglichkeit und Kontraktionsfåhigkeit auûerhalb der Muskeln: Beispiele

n Abb. 9.67. Actinfilamente und Actin bindende Proteine in einem Mikrovillus. Die Mikrovilli auf der apikalen Oberflåche der Epithelzellen dienen beispielsweise in Darm und Nierenkanålchen der Absorption gelæster Substanzen. Jeder Mikrovillus enthålt etwa 25 Actinfilamente, die durch die Proteine Villin und Fimbrin in einer genau geordneten Anordnung festgehalten werden. Die Funktion des Myosins I, das sich zwischen der Plasmamembran des Mikrovillus und den peripheren Actinfilamenten befindet, ist bisher nicht genau geklårt

schaffen oder die von ihnen erzeugten Enden mit Kappen versehen. Wie man in Abb. 9.72 erkennt, kann auch Coflin Fragmente zerschneiden.
      In Zellen auûerhalb der Muskeln liegt der Bewegungsapparat zum græûten Teil unmittelbar unter der Plasmamembran. Bei vielen Aktivitåten wirken die von den kontraktilen Proteinen erzeugten Kråfte auf die Plasmamembran, die sich dann entweder nach auûen wælbt (beispielsweise bei der Fortbewegung von Zellen) oder sich nach innen einstçlpt (beispielsweise bei Phagocytose oder Cytokinese). Solche Vorgånge werden in der Regel dadurch begçnstigt, dass die Actinfilamente sich çber periphere Membranproteine indirekt mit der Plasmamembran verbinden. In vorangegangenen Kapiteln wurden zwei Beispiele beschrieben: die Aufnahme kurzer Actinpolymere in das Membranskelett der Erythrocyten (Abb. 4.31 d) und die Membrankopplung von Actinfilamenten an den Fokalkontakten und Adhårenzverbindungen (Abb. 7.17 und 7.26). Zu den Proteinen, die Actinfilamente an Membranen ankoppeln kænnen, gehæren Vinculin, die Mitglieder der ERM-Familie (Ezrin, Radixin und Moesin) und die Proteine der Spectrinfamilie (zu der

Actinfilamente sind ± håufig im Zusammenwirken mit Myosinmotoren ± auch in Zellen auûerhalb der Muskeln fçr verschiedene dynamische Vorgånge verantwortlich, so unter anderem fçr Cytokinese, Phagocytose, Cytoplasmastræmung (die gerichtete Bewegung groûer Cytoplasmamengen in manchen umfangreichen Pflanzenzellen), Vesikeltransport, Blutplåttchenaktivierung, die seitliche Bewegung integraler Membranproteine, Wechselwirkungen zwischen Zelle und Untergrund, Fortbewegung von Zellen, Axonwachstum und Formverånderungen der Zellen. Einige Beispiele fçr solche Beweglichkeit und Kontraktionsfåhigkeit auûerhalb der Muskelzellen sollen im Folgenden beschrieben werden.      Manche Zellbewegungen entstehen ausschlieûlich durch die Polymerisierung von Actin, ohne dass Myosin dabei tåtig wçrde. Ein Beispiel findet man bei Listeria monocytogenes, einem Bakterium, das Makrophagen infiziert und Enzephalitis oder Lebensmittelvergiftungen hervorruft. Listeria schieût wie eine Rakete durch das Cytoplasma einer infizierten Zelle, weil unmittelbar hinter dem Bakterium Actinmonomere polymerisieren (Abb. 9.68). Wie kann die Bakterienzelle an einer bestimmten Stelle auf ihrer Oberflåche die Bildung von Actinfilamenten in Gang setzen? Fragen nach råumlichen Verhåltnissen sind der bei der Untersuchung aller Bewegungsvorgånge von groûer Bedeutung, denn diese sind davon abhångig, dass eine Zelle den notwendigen Apparat zu einem ganz bestimmten Zeitpunkt an einer ganz bestimmten Stelle zusammensetzen kann. Listeria ist dazu in der Lage, weil es das Protein ActA enthålt, das nur an einem Ende der Bakterienzelle vorkommt. Wird ActA dem Cytoplasma der Wirtszelle ausgesetzt, zieht es mehrere Proteine dieser Zelle heran und aktiviert sie, darunter auch den Arp2/3-Komplex, der spåter noch genauer beschrieben wird. Diese Proteine steuern durch ihr Zusammenwirken die Polymerisierung des Actins. Man konnte die Fortbewegung von Listeria in vitro nachvollziehen und damit schlçssig beweisen, dass allein die Polymerisierung von Actin die notwendige Bewegungskraft zur Verfçgung stellen kann, oh-



Bewegungsvorgånge auûerhalb der Muskeln

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ne dass Myosinmotoren dabei mitwirken mçssten. Die gleichen Vorgånge, die ,  zur Fortbewegung dienen, laufen auch bei normaler Tåtigkeit in der Zelle ab, vom Transport der Vesikel und Organellen in Cytoplasma bis hin zu Bewegungen der ganzen Zelle, mit denen sich der folgende Abschnitt beschåftigt.
' 9  Die Fortbewegung von Zellen ist im Organismus hæherer Wirbeltiere fçr viele Vorgånge unentbehrlich, so fçr die Entwicklung von Geweben und Organen, fçr die Entstehung der Blutgefåûe, fçr das Wachstum von Axonen, fçr die Wundheilung und fçr den Infektionsschutz. Ebenso ist die Fortbewegung von Zellen die Ursache fçr die Ausbreitung bæsartiger Tumore. Im Folgenden werden wir uns auf Untersuchungen an Gewebekulturzellen konzentrieren, die sich çber einen flachen (d. h. zweidimensionalen) Untergrund bewegen, denn solche Versuchsbedingungen haben dieses Forschungsgebiet geprågt. Man sollte aber daran denken, dass die Zellen sich im Organismus nicht çber einen leeren, flachen Untergrund bewegen, denn mittlerweile deuten immer mehr Indizien darauf hin, dass manche Ergebnisse derartiger Untersuchungen mæglicherweise nicht auf Zellen zutreffen, die komplizierteres Gelånde durchqueren. In jçngster Zeit hat man kompliziertere Untergrçnde entwickelt, darunter verschiedene dreidimensionale, extrazellulåre Matrices; die mit ihnen gewonnenen Befunde kænnten dazu fçhren, dass manche der im Folgenden beschriebenen Fortbewegungsmechanismen neu çberdacht werden mçssen. Abbildung 9.69 zeigt einen einzelnen Fibroblasten, der sich gerade auf dem Weg in die rechte untere Ecke des Gesichtsfeldes befand, als er fçr die mikroskopische Untersuchung pråpariert wurde. Die Fortbewegung von Zellen, wie man sie an dem Fibroblasten in Abb. 9.69 erkennt, hat in mancher Hinsicht die gleichen Eigenschaften wie andere Arten der Fortbewegung, beispielsweise das Gehen. Wenn wir gehen, wiederholt unser Kærper ståndig eine Reihe von Tåtigkeiten: Zun 

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Arp2/3-Komplexe an den spitzen Enden, die sich an den Verzweigungsstellen befinden. Gleichzeitig wird das Wachstum der stumpfen Enden ålterer Filamente durch die Anheftung von Proteinkappen blockiert (Schritt 5). An die stumpfen Enden spåter gebildeter Filamente in dem Geflechts lagern sich dagegen weitere Actinuntereinheiten an und schieben die Membran des Lamellipodiums in Richtung des Reizes nach auûen (Schritte 5 und 6). Wåhrend neuere Filamente durch Anheftung von Untereinheiten an das stumpfe Ende weiter wachsen, læsen sich die ålteren, mit einer Kappe versehenen Filamente vom spitzen Ende her auf (Schritt 6). Begçnstigt wird dieser Abbau durch Cofilin, das an die Actin-ADP-Untereinheiten in den Filamenten bindet (Schritt 6). Die Untereinheiten aus Actin und ADP, die beim Abbau der Filamente freigesetzt werden, werden durch Umwandlung in Profilin-ATP-Actin-Monomere wieder ¹aufgeladenª und kænnen dann an der Vorderkante der Zelle erneut zum Aufbau der Actinfilamente verwendet werden. Einige wichtige Strukturmerkmale bei der Fortbewegung von Zellen zeigt Abb. 9.73. In der

elektronenmikroskopischen Aufnahme erkennt man das verzweigte Geflecht aus verknçpften Actinfilamenten, das sich wåhrend der Vorwårtsbewegung unmittelbar unter der Plasmamembran des Lamellipodiums befindet. In den kleinen Kreisen erkennt man eine Abfolge kurzer Verzweigungen der Actinfilamente, wobei die Arp2/3-Komplexe durch Immungoldmarkierung hervorgehoben wurden. Wie man hier sieht, befinden sich diese Komplexe an den Y-færmigen Verbindungsstellen, an denen die gerade polymerisierten Filamente von ålteren Filamenten abzweigen. Die Fortbewegung mit Hilfe der Lamellipodien ist ein dynamischer Ablauf. Wåhrend die Polymerisierung der Actinfilamente und die Verzweigung sich ganz am vorderen Ende des Lamellipodiums fortsetzen, depolymerisieren die Filamente im hinteren Teil (Abb. 9.72, Schritt 6). Insgesamt betrachtet, durchlåuft also auch die Anordnung aus Actinfilamenten eine Art Tretmçhlzyklus (Kap. 9.5.2): An die stumpfen Enden der Anordnung am Vorderende werden Actinuntereinheiten angefçgt, an den spitzen Enden auf der Rçckseite læsen sie sich wieder.

 >n dem in Abb. 9.70 dargestellten Ablauf stçlpt sich zunåchst die Vorderkante aus, und dann bewegt sich der Hauptteil der Zelle in die gleiche Richtung. Die wichtigsten Kråfte fçr die Fortbewegung entstehen also an den Anheftungsstellen, die notwendig sind, damit der Hauptteil der Zelle sich vorwårts ziehen kann (Abb. 9.70, Schritt 3). Håufig spricht man hier von ¹Zugkråftenª, weil sie an Stellen auftreten, wo die Zelle sich am Untergrund festhålt. Låsst man die Zellen çber ein dçnnes Blatt aus einem elastischen Material wandern, ist ihre Fortbewegung von einer Verformung der Unterlage begleitet (Abb. 7.18). Wie groû die Zugkråfte an verschiedenen Stellen im Inneren einer lebenden, wandernden Zelle sind, kann man aus der dynamisch wechselnden Verformung des Untergrundes errechnen und wie in Abb. 9.74 wiedergeben. Wie man bei genauer Betrachtung dieses digitalisierten Bildes eines wandernden Fibroblasten erkennt, entstehen die græûten Zugkråfte unmittelbar hinter der Vorderkante an den Stellen, wo die Zelle fest am Untergrund haftet.7 Der Hauptteil der Zelle haftet weniger stark an der Unterlage, so dass er wie eine verpackte Fracht vorwårts gezogen werden kann. Zahlreichen Befunden zufolge sorgt die Actinpolymerisierung dafçr, dass die Vorderkante der Zelle nach auûen gedrçckt wird (Abb. 9.70, Schritt 1), wåhrend Myosin (in Verbindung mit Actinfilamenten) dafçr zuståndig ist, den Rest der Zelle nach vorn zu ziehen (Abb. 9.70, Schritt 3). Am besten erkennt man die unterschiedlichen Funktionen von Actin und Myosin an den Fisch-Keratocyten; diese Zellen stammen aus der Epidermis auf den Schuppen der Fische. Die Keratocyten sind ein beliebtes System fçr die Untersuchung der Zellbewegung, weil sie ihre schnelle Gleitbewegung mit Hilfe eines sehr breiten, dçnnen Lamellipodiums vollziehen. Abbildung 9.75 zeigt einen wandernden Keratocyten, der fixiert und mit einem spezifischen Farbstoff fçr Actin (Abb. 9.75 a) bzw. fçr Myosin (Abb. 9.75 b) angefårbt wurde. Wie nach der vorangegangenen Beschreibung nicht anders zu erwarten, ist die Vorderkante des Lamellipodiums 7 In der Frage, wie diese Anheftungsstellen im Einzelnen aussehen, gab es betråchtliche Meinungsverschiedenheiten. Håufig werden sie im Unterschied zu den græûeren, komplizierter gebauten Fokalkontakten (Abb. 7.17) als Fokalkomplexe bezeichnet. Fokalkomplexe und Fokalkontakte enthalten vielfach die gleichen Proteine (Integrine, Vinculin, Talin, Actin), letztere dienen aber der stabilen Befestigung von Zellen und nicht der vorçbergehenden Anhaftung wåhrend der Fortbewegung. Wenn eine Zelle die Fortbewegung einstellt und sesshaft wird, verwandeln sich die Fokalkomplexe wahrscheinlich in Fokalkontakte.

Bewegungsvorgånge auûerhalb der Muskeln

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Cytoskelett und Zellbewegungen

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!+' Die chemische Natur der Gene ,ie klassischen Genetiker entdeckten, welche Gesetzmåûigkeiten fçr die Weitergabe erblicher Eigenschaften gelten und welche Beziehung zwischen Genen und Chromosomen besteht. In seiner Nobelpreisrede stellte T. H. Morgan 1934 fest: ¹Beim derzeitigen Stand der genetischen Experimente spielt es nicht die geringste Rolle, ob das Gen ein hypothetisches Gebilde oder ein materielles Teilchen ist.ª In den vierziger Jahren jedoch wurden neue Fragen aufgeworfen, und die wichtigste lautete: ¹Wie sieht ein Gen chemisch aus?ª Die Experimente, mit denen man diese Frage beantwortete, werden in der Box ¹Experimentelle Verfahrenª genauer beschrieben. Als man wusste, dass Gene aus DNA bestehen, standen die Biologen wiederum vor einer Fçlle neuer Fragen. Diese werden uns in den verbleibenden Abschnitten des Kapitels beschåftigen. 10.3.1 Die Struktur der DNA Wenn man verstehen will, wie ein komplexes Makromolekçl ± Protein, Polysaccharid, Lipid oder Nucleinsåure ± funktioniert, muss man zunåchst einmal wissen, wie es aufgebaut ist. Anfang der fçnfziger Jahre des 20. Jahrhunderts beschåftigten sich mehrere Institute in den Vereinigten Staaten und Groûbritannien mit dem Geheimnis der DNA-Struktur. Im Jahre 1953 wurde das Råtsel schlieûlich von James Watson und Francis Crick an der Universitåt Cambridge gelæst. Bevor wir die von ihnen vorgeschlagene Struktur betrachten, wollen wir uns ansehen, was man zu ihrer Zeit bereits wusste. 7 $

 $ Der Grundbaustein der DNA war bekannt: das )  (Abb. 10.9 a, b); es besteht aus einem Zucker mit fçnf Kohlenstoffatomen, der  -%   , an deren 5'-Position çber eine Esterbindung eine Phosphatgruppe gebunden ist, wåhrend an der 1'-Position eine stickstoffhaltige Ba-

se steht.2 In den Nucleinsåuren kommen zwei Typen stickstoffhaltiger Basen vor: die /%     mit einem Molekçlring und die /  mit zwei Ringen (Abb. 10.9 c) Die DNA enthålt die beiden Pyrimidine ! %  3!4 und +%  3+) sowie die beiden Purine :   3:4 und   34. Auûerdem wusste man, dass die Nucleotide als unverzweigtes Polymer oder &  hintereinander gekoppelt sind, wobei abwechselnd angeordnete, durch /       verknçpfte Zucker- und Phosphatgruppen das Rçckgrat bilden (Abb. 10.9 c). Die an die Zuckergruppen angehefteten Basen sollten nach der damaligen Vorstellung aus dem Rçckgrat herausragen wie eine Reihe versetzt angeordneter Regalbretter. Nucleotide sind polar aufgebaut: Das Ende mit der Phosphatgruppe wird als ?'# (ausgesprochen ¹Fçnf-Strich-Endeª) bezeichnet, das andere ist das >'# (Abb. 10.9 b). Da alle hintereinander aufgereihten Nucleotide in einem Strang gleich orientiert sind, hat auch der ganze Strang eine Polaritåt mit einem 3'- und einem 5'-Ende (Abb. 10.9 c). Aus Ræntgenstrukturanalysen wusste man, dass die Nucleotide in dem Stapel 0,34 nm voneinander entfernt sind, und vieles deutete auf groûe, sich wiederholende Strukturen in Abstånden von 3,4 nm hin. Wie in der Box ¹Experimentelle Verfahrenª noch genauer erlåutert wird, glaubte man viele Jahre lang, die DNA bestehe aus einfachen, sich ståndig wiederholenden Tetranucleotiden (zum Beispiel -ATGCATGCATGC-) und kænne deshalb nicht als informationstragendes Makromolekçl dienen. Im Jahr 1950 jedoch berichtete Erwin Chargaff von der Columbia University çber einen wichtigen Befund, der das Ende der Tetranucleo2

An dieser Stelle ist es hilfreich, sich ein wenig mit der Terminologie vertraut zu machen. Ein Molekçl, das nur aus einer der vier in Abb. 10.9 dargestellten stickstoffhaltigen Basen und dem Fçnferzucker besteht, bezeichnet man als Nucleosid. Handelt es sich bei dem Zucker um Desoxyribose, spricht man von einem Desoxyribonucleosid. Es gibt vier wichtige Desoxyribonucleoside, die sich durch ihre Basen unterscheiden: Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxythymidin und Desoxycytosin. Ist an das Nucleosid mindestens eine Phosphatgruppe angeheftet (meist in der 5'-, manchmal aber auch an der 3'-Position), handelt es sich bei dem Molekçl um ein Nucleotid. Je nach der Zahl der Phosphatgruppen im Molekçl gibt es Nucleosid-5'-monophosphate, Nucleosid-5'-diphosphate und Nucleosid-5'-triphosphate, wie beispielsweise Desoxyadenosin-5'-monophosphat (dAMP), Desoxyguanosin-5'-diphosphat (dGDP) und Desoxycytidin-5'-triphosphat (dCTP). Eine åhnliche Gruppe von Nucleosiden und Nucleotiden ist auch am RNA-Stoffwechsel beteiligt, diese enthalten als Zucker aber nicht Desoxyribose, sondern Ribose. Die Nucleotide, die fçr den Energiestoffwechsel eine groûe Rolle spielen, wie das Adenosintriphosphat (ATP), enthalten Ribose.



Die chemische Natur der Gene

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Die Expression des genetischen Materials: von der Transkription zur Translation

merasen lassen sich kaum untersuchen, wenn die angewandten biochemischen Methoden die Unterschiede zwischen einzelnen Proteinmolekçlen als Durchschnittswerte einebnen. Deshalb hat man Verfahren entwickelt, mit denen man die Tåtigkeit einzelner RNA-Polymerasemolekçle verfolgen kann, ganz åhnlich wie bei der Untersuchung von Motorproteinen des Cytoskeletts. Zwei Beispiele fçr solche Untersuchungen zeigt Abb. 11.5. Hier ist in beiden Fållen eine einzelne RNA-Polymerase an ein Deckglas gekoppelt. Man låsst sie dann ein DNA-Molekçl transkribieren, an dessen eines Ende kovalent eine fluoreszierende Perle gekoppelt ist. Die Bewegung des fluoreszierenden Kçgelchens kann man dann im Fluoreszenzmikroskop verfolgen.

n Abb. 11.5 a, b.  $      "        ,&  !   ;2 %# I    (      a     ?     

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!!. Kleine nicht codierende RNAs und RNA-Interferenz Anfang der neunziger Jahre des 20. Jahrhunderts fand man bei Pflanzen und spåter auch in Untersuchungen an Fadenwçrmern und Taufliegen ein erstaunliches Phånomen, das unter dem Namen )6$ 3 ) 4 bekannt wurde. Kurz gesagt, stellte sich heraus, dass doppelstrångige RNA-Molekçle (dsRNAs) in Zellen aufgenommen werden und dort eine Reaktion in Gang setzen, die zur selektiven Zerstærung von mRNA-Molekçlen fçhrt, welche die gleiche Sequenz wie die zugesetzte dsRNA besitzen. Angenommen, man will beispielsweise in den Zellen eines Fadenwurmes die Produktion des Enzyms Phosphorylase unterbinden, um dann die Auswirkungen des Enzymmangels auf den Phånotyp des Wurmes zu untersuchen. Man kann dieses Ziel erreichen, indem man den Wurm einfach in eine Læsung von dsRNA setzt, welche die gleiche Sequenz hat wie die mRNA, auf die man zielt. Ein åhnliches Experiment zeigt Abb. 11.38. In der Wirkung handelt es sich dabei trotz des gånzlich andersartigen Mechanismus um einen åhnlichen Effekt wie bei der Herstellung von Knockout-Måusen, denen das Gen fçr ein ganz bestimmtes Protein fehlt. Dieses Phånomen der dsRNA-vermittelten Interferenz (RNAi), das Andrew Fire vom Washingtoner Carnegie Institute und Craig Mello von der University of Massachusetts erstmals 1998 bei Fadenwçrmern fanden, wurde seither bei vielen Eukaryoten nachgewiesen. Nach unserer heutigen Vorstellung hat sich die RNAi in der Evolution als eine Art ¹genetisches Immunsystemª entwickelt, das die Lebewesen vor fremdem oder unerwçnschtem genetischem Material schçtzt. Genauer gesagt, entstand die RNAi vermutlich als Mechanismus, der die Vermehrung von Viren verhindert und/oder die Wanderung von Transposons im Genom unterdrçckt, zwei Vorgånge, die gefåhrlich werden kænnen und die Bildung doppelstrångiger RNA-Zwischenstufen einschlieûen. Eine dsRNA kann als ¹unerwçnschtª erkannt werden, weil solche Molekçle im Rahmen der normalen genetischen Ablåufe in einer Zelle nicht entstehen.

n Abb. 11.38 a, b. ;2    ! a   '        #    +) E::1"   !

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Wie kann eine dsRNA in einer Zelle die Synthese eines bestimmten Proteins verhindern? Die Antwort fand man bei Untersuchungen der RNA-Interferenz an zellfreien Extrakten. Den Ablauf der RNAi mit seinen einzelnen Schritten zeigt Abb. 11.39 a. Die doppelstrångige RNA, welche die Reaktion in Gang setzt, wird zunåchst von einer besonderen, als Dicer bezeichneten Ribonuclease in kleine, doppelstrångige Fragmente von 21 bis 23 Nucleotiden gespalten, die man     ) (  $     -)!' ) ) nennt. Dann werden die beiden Strånge der einzelnen siRNAs auseinander gewunden und getrennt. Einer davon, der Anti-Sinn-Strang, geht in einen Proteinkomplex namens RISC ein, der das winzige RNA-Molekçl zu einer mRNA mit komplementårer Sequenz (also zu einem Sinn-Strang) dirigiert. Sobald es dort gebunden ist, wird die mRNA von einer assoziierten Ribonuclease an einer spezifischen Stelle gespalten. Die siRNA dient also als Fçhrer und lenkt den Komplex zu einer komplementåren RNA, die dann zerstært wird. Jedes siRNAMolekçl kann die Zerstærung zahlreicher Kopien einer mRNA in Gang setzen und so die Synthese des zugehærigen Proteins blockieren. Bis 2001 konnte man die RNA-Interferenz nur bei Zellen, die nicht von Såugetieren stammten, zuverlåssig nachweisen. Wenn man Såugerzellen in der Gewebekultur eine dsRNA zusetzt oder diese einem Tier unmittelbar injiziert, bringt sie in der Regel nicht die Translation eines    /  zum Erliegen, sondern sie setzt eine allgemeine Reaktion in Gang, die generell zu einer Hemmung der Proteinsynthese fçhrt. Diese globale Verminderung der Proteinsynthese (die in Kap. 17.1 genauer erærtert wird) hat sich nach heutiger Kenntnis im Frçhstadium der Såugetier-

 evolution entwickelt, um die Zellen vor Virusinfektionen zu schçtzen. Um die umfassende, globale Reaktion zu umgehen, hatte man mittlerweile aber auch sehr kleine dsRNAs eingesetzt. Wie sich dabei herausstellte, fçhrt die Behandlung von Såugerzellen mit dsRNA aus 21 Nucleotiden (also in der Långe jener siRNAs, die bei anderen Lebewesen als Zwischenstufe der RNA-Interferenz entstehen) nicht zu einer   Hemmung der Proteinsynthese. Solche dsRNAs sind vielmehr zur RNAi in der Lage, d. h. sie hemmen die Synthese eines bestimmten Proteins, das von einer mRNA mit passender Nucleotidsequenz codiert wird. Proteine, deren mRNAs eine andere Sequenz haben, waren in diesen Experimenten nicht betroffen. Mit Hilfe von dsRNAs in der Græûe der Molekçle, die bei der RNAi von der Ribonuclease erzeugt werden, konnte man also auch bei Såugerzellen den Abbau einzelner mRNAs in Gang setzen. Das Verfahren wurde mittlerweile zu einem wichtigen experimentellen Hilfsmittel, wenn man etwas çber die Funktionen neu identifizierter Gene in Erfahrung bringen mæchte. Man zerstært mit dsRNA die an diesem Gen gebildete mRNA, blockiert (oder vermindert) damit seine Aktivitåt und untersucht die Zellen auf Anomalien, die durch das Fehlen des zugehærigen Proteins entstehen (Abb. 18.47). Der Schutz vor unerwçnschter dsRNA ist mæglicherweise nur eine von vielen bisher unbekannten Aufgaben, die der RNAi-Apparat der Zellen erfçllt. Bisher gibt es noch nicht einmal einen eindeutigen Beleg dafçr, dass Såugerzellen sich tatsåchlich mit Hilfe von siRNAs vor Viren oder Transposons schçtzen. Allerdings haben Untersuchungen aus neuerer Zeit gezeigt, dass Såugerzellkerne ein bemerkenswert breites Spektrum von dsRNAs enthalten. Diese Beobachtung legt die Vermutung nahe, dass viele Gene an beiden DNA-Strången in RNA umgeschrieben werden, ganz im Gegensatz zu der bisherigen Annahme, dass jeweils nur ein Strang eines Gens nutzbare genetische Information enthålt. Wie man in Abb. 12.17 erkennt, haben manche dieser dsRNAs im Zellkern anscheinend die Aufgabe, die Genexpression zu unterbinden; weitere wichtige Funktionen wird man wahrscheinlich noch entdecken. Potenzielle medizinische Einsatzgebiete der RNAi werden in der Box ¹Aus Sicht des Menschenª erærtert. !!.! Mikro-RNAs: Hunderte von RNAs mit unbekannter Funktion Im Jahr 1993 entdeckte man bei dem Fadenwurm "    eine kleine RNA, die nahezu

Kleine nicht codierende RNAs und RNA-Interferenz

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komplementår zu Abschnitten im nicht translatierten Bereich am 3'-Ende einer spezifischen, von diesem Lebewesen produzierten mRNA war. Diese kleine RNA bindet wåhrend der Larvenentwicklung an die komplementåre mRNA, blockiert ihre Translation und læst so den Ûbergang ins nåchste Entwicklungsstadium aus. Bis man die umfassende Bedeutung dieses Befundes richtig einschåtzen konnte, vergingen noch mehrere Jahre. Erst 2000 stellte sich heraus, dass die Sequenz dieser kleinen RNA aus dem Wurm ± sie wird let-7 genannt und besteht aus 21 Nucleotiden ± wåhrend der gesamten Evolution sehr konstant geblieben ist. Im menschlichen Genom beispielsweise sind mehrere RNAs codiert, die mit let-7 nahezu oder vollståndig identisch sind. Wie sich in den letzten Jahren herausgestellt hat, produzieren sowohl Pflanzen als auch Tiere Hunderte von winzigen RNA-Molekçlen. Diese   ) 3 ) 4 waren wegen ihrer geringen Græûe jahrzehntelang unbemerkt geblieben. Das lag nicht daran, dass man technisch nicht in der Lage gewesen wåre, RNA-Molekçle dieser Græûe nachzuweisen, sondern man sah einfach keinen Anlass, den ¹RNA-Abfallª am unteren Ende eines Gels oder oben auf einem Saccharosegradienten, wo sich solche winzigen RNAs verstecken, genauer anzusehen. Nach der Entdeckung der miRNAs ånderte sich diese Haltung sehr schnell. Die kleinen Molekçle werden wie bei den Fadenwçrmern wåhrend bestimmter Entwicklungsphasen oder in einzelnen Geweben einer Pflanze oder eines Tieres produziert und haben vermutlich Regulationsfunktionen. Mit ihrer Græûe von rund 20 bis 25 Nucleotiden liegen sie im gleichen Långenbereich wie die siRNAs, die an der RNAi beteiligt sind. Das ist kein Zufall: Die Mikro-RNAs werden von dem gleichen Weiterverarbeitungsapparat erzeugt wie die siRNAs. Wie man in Abb. 11.39 b erkennt, wird jede miRNA aus einem doppelstrångigen, in sich gefalteten RNA-Vorlåufer herausgeschnitten, der als Substrat fçr die Dicer-Ribonuclease dient. Ein wichtiger Unterschied besteht aber darin, dass die siRNA sich von dem doppelstrångigen Produkt eines Virus oder transponierbaren Elements (oder einer von Wissenschaftlern zugesetzten dsRNA) ableitet, wåhrend die miRNA in einem ganz gewæhnlichen Genomabschnitt codiert ist. Bei der Pflanze ! fçhren Mutationen in einem der  -Gene zu einem ganzen Spektrum anormaler Phånotypen; man kann also vermuten, dass die miRNAs wåhrend der Entwicklung am Ein- und/oder Ausschalten von Genen mitwirken. Vermutlich hemmen viele miRNAs genau wie jene, die man ursprçnglich bei Fadenwçrmern entdeckte, die Translation.

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Die Expression des genetischen Materials: von der Transkription zur Translation

n Abb. 11.39 a, b.     G   

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Andere binden offensichtlich an mRNA-Molekçle und sorgen fçr deren Spaltung, was an die Wirkung der siRNAs erinnert. Andere Untersuchungen lieferten Anhaltspunkte, wonach miRNAs ein breites Spektrum von Funktionen haben kænnten, darunter die Unterdrçckung der Transkription von Genen und die Mitwirkung bei Genomumordnungen. Je weiter das Fachgebiet der Zell- und Molekularbiologie heranreifte, desto besser konnte man die bemerkenswerte Struktur- und Funktionsvielfalt der RNA-Molekçle einschåtzen. Heute richtet sich die Aufmerksamkeit immer stårker auf nicht codierende RNA-Molekçle, die fçr die Steuerung der vielschichtigen Genexpressionssysteme eine Schlçsselrolle spielen dçrften. In jçngster Zeit legte eine umfassende Analyse

der RNA-Typen aus einem breiten Spektrum von Mausgeweben die Vermutung nahe, dass diese Tiere mehrere tausend verschiedene, nicht codierende RNAs produzieren. Schon angesichts der Zahl dieser Transkripte und unserer vælligen Unkenntnis hinsichtlich ihrer Funktionen ist damit zu rechnen, dass die Untersuchung nicht codierender RNA in den kommenden Jahren zu einem wichtigen Forschungsgebiet werden wird.

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Kleine nicht codierende RNAs und RNA-Interferenz

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us Sicht des Menschen

Potenzielle medizinische Anwendungsgebiete der RNA-Interferenz In der medizinischen Wissenschaft sucht man ståndig nach ¹magischen Kugelnª, Arzneiwirkstoffen, die einzelne Krankheiten sehr spezifisch und ohne schådliche Nebenwirkungen bekåmpfen. Zwei Gruppen von Krankheiten ± die Virusinfektionen und Krebs ± sind mittlerweile zum Ziel von molekularen ¹magischen Kugelnª eines ganz neuen Typs geworden. Viren zerstæren eine infizierte Zelle durch die Synthese von Messenger-RNA fçr Virusproteine, die dann die Ablåufe in der Zelle beeintråchtigen. Wenn Zellen krebsartig entarten, tragen sie meist Mutationen in bestimmten Genen (den Onkogenen), und die daran gebildeten mRNAs werden in anormale Formen zelleigener Proteine translatiert. Ûberlegen wir einmal, was geschehen wçrde, wenn man Patienten mit einer solchen Krankheit ein Medikament verabreichen kænnte, das die am Virusgenom oder am mutierten Krebsgen synthetisierten mRNAs gezielt zerstært, gleichzeitig aber alle anderen mRNAs in der Zelle unbehelligt låsst. Man hat in den letzten Jahren mehrere Strategien entwickelt, um dieses Ziel zu erreichen. Die neueste davon nutzt das Phånomen der RNA-Interferenz aus. Wie bereits erwåhnt wurde, kann man in Såugerzellen die RNAi ± einen Vorgang, der zum gezielten Abbau ganz bestimmter mRNAs fçhrt ± in Gang setzen, indem man in die Zellen eine doppelstrångige siRNA einschleust, die zu der mRNA, auf die man zielen mæchte, komplementår ist. Zellen, die man mit einer siRNA aus 21 bis 23 Nucleotiden inkubiert, nehmen die Molekçle auf und bauen sie in einen RNA-spaltenden Ribonucleoproteinkomplex ein (wie in Abb. 11.39 a), der sich an die komplementåre mRNA anheftet. Man kann die RNAi aber auch in Såugerzellen induzieren, die man gentechnisch so veråndert hat, dass sie ein Gen mit invertierten Sequenzwiederholungen enthalten. Wird dieses Gen transkribiert, faltet sich das RNA-Produkt in sich selbst und bildet einen haarnadelfærmigen (d. h. doppelstrångigen) siRNA-Vorlåufer (åhnlich dem in Abb. 11.39 b), der dann zur aktiven siRNA weiterverarbeitet wird. Diese neue RNAi-Technologie hat man an einem breiten Spektrum von Gewebekulturzellen mit krankheitserzeugenden Genen erprobt. Die Ergebnis-

se waren ausgesprochen viel versprechend. Wie bereits erwåhnt, tragen Krebszellen in der Regel ein oder mehrere mutierte Gene, und die in diesen Genen codierten anormalen Proteine rufen den krebsartigen Phånotyp hervor. Eine Form der Leukåmie wird beispielsweise durch das Gen &"-$!&, ausgelæst, das durch die Verschmelzung von zwei normalen Genen entsteht. Wie sich herausstellte, kann eine siRNA gegen die mRNA des &"-$!&,-Fusionsgens bei Gewebekulturzellen fçr die Rçckkehr zum normalen Phånotyp sorgen. Øhnliche Ergebnisse erzielte man auch mit einer siRNA gegen ein Gen, das einen langen CAG-Abschnitt enthielt ± solche Gene erzeugen die Huntington-Krankheit (Kap. 10). Man konnte nachweisen, dass sie die Produktion des anormalen Proteins unterbindet. Die meisten Studien, in denen der therapeutische Nutzen von siRNAs untersucht wurde, beschåftigten sich mit virusinfizierten Zellen. So hat man in Gewebekulturzellen zum Beispiel siRNAs erzeugt, die sich gegen Sequenzen von HIV oder Polioviren richten. Diese siRNAs sorgen fçr den Abbau der VirusRNA und schçtzen die Zellen vor einer Infektion. Im Zusammenhang mit AIDS verfolgt man das Ziel, Stammzellen aus einem Patienten zu isolieren, diese Zellen mit Hilfe eines Vektors mit einer siRNA gegen die Virus-mRNA zu transfizieren und die so behandelten Zellen wieder ins Blut des Patienten zu bringen. Solche Zellen wåren theoretisch in der Lage, mehr oder weniger ununterbrochen siRNA zu produzieren, so dass sie ± und ihre Nachkommen ± resistent gegen die Zerstærung durch das Virus wåren. Aber bisher stehen der therapeutischen Anwendung von siRNAs noch Hindernisse entgegen. Das besondere Kennzeichen der siRNA ist ihre auûerordentlich spezifische Sequenz, und die kann nicht nur ein Segen, sondern auch ein Nachteil sein. Mæglicherweise werden sich siRNAs gegen Virusinfektionen letztlich als unwirksam erweisen, weil die Erreger meist schnell mutieren. Mutationen sind Ønderungen in der Sequenz des Genoms und fçhren zur Produktion von mRNAs, die zu einer therapeutischen siRNA nicht mehr vollståndig komplementår sind. Wie bei anderen Formen der Gentherapie, so liegt eine wichtige Hçrde auch fçr die Anwendung der RNAi zur Behandlung von Infektionen und anderen Krankheiten in der

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Die Expression des genetischen Materials: von der Transkription zur Translation

Schwierigkeit, die siRNAs (oder die Vektoren, in denen sie codiert sind) in das richtige Kærpergewebe zu bringen. Der erste wichtige Versuch, siRNAs innerhalb des Organismus in ein bestimmtes Organ einzuschleusen ± in diesem Fall in die Leber einer Maus ± gelang erstaunlich gut (Abb. 1). Die akute Hepatitis, eine entzçndliche Erkrankung bei Personen mit Hepatitisvirusinfektionen und anderen Erkrankungen, fçhrt zum Leberversagen. Den Untersuchungen an diesen Måusen zufolge wird der Tod der Leberzellen durch einen Zelloberflåchenrezeptor namens Fas ausgelæst. Injiziert man den Måusen intravenæs eine siRNA, die sich gegen
-mRNA richtet und sie zerstært, werden die Tiere relativ unempfindlich gegen die akute Hepatitis, und zwar selbst dann, wenn man ihnen die siRNA erst nach dem Erreger verabreicht. Diese Beobachtung låsst darauf schlieûen, dass der Krankheitsverlauf auch dann noch zum Stillstand kommen kann, wenn die Schådigung der Leber bereits begonnen hat. Die Verabreichung der siRNA çber das Blut (anstelle des Einschleusens çber einen DNA-Vektor) hat unter anderem den Vorteil, dass die RNA nur vorçbergehend ± meist einige Wochen ± wirksam bleibt. Dies ist in dem beschriebenen Fall besonders wichtig, denn ein dauerhafter Mangel an Fas kann zu schweren Beeintråchtigungen der Immunfunktion fçhren. In einer zweiten Versuchsreihe mit Måusen wurde nachgewiesen, dass eine Infusion mit siRNAs, die sich gegen das Hepatitis-C-Virus

!!/ Die Codierung der genetischen Information @achdem man 1953 die Struktur der DNA aufgeklårt hatte, war klar, dass die Sequenz der Aminosåuren in einem Polypeptid von der Sequenz der Nucleotide in der DNA des zugehærigen Gens festgelegt wird. Dass die DNA selbst unmittelbar als Matrize fçr den Zusammenbau eines Proteins dienen konnte, erschien jedoch unwahrscheinlich. Vielmehr ging man davon aus, dass die Information in der Nucleotidsequenz auf dem Weg çber irgendeinen  

  + gespeichert war. Mit der Entdeckung der Messenger-RNA als Zwischenstufe im Informationsfluss von der DNA zum Protein wandte sich die Aufmerksamkeit der Frage zu, wie eine Sequenz, die im ¹Alphabetª der Ribonucleotide


 


 

n Abb. 11.1 a, b. ;2    !      %   a  &           .     ?     9     '            2  '     !     b  (         '    ? "        ' '  ,   a" ! &!     *   ;2      

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Sobald die Initiator-tRNA an das AUG-Codon gebunden hat und IF3 verdrångt ist, kommt die groûe Untereinheit zu dem Komplex dazu, und das an IF2 gebundene GTP wird hydrolysiert (Schritt 3 in Abb. 11.47). Die GTP-Hydrolyse setzt vermutlich im Ribosom eine Konformationsånderung in Gang, die fçr die Freisetzung von IF2 mit seinem gebundenen GDP erforderlich ist. 6     !      # % Eukaryotenzellen benætigen mindestens zwælf Initiationsfaktoren, die insgesamt aus mehr als 25 Polypeptidketten bestehen. Wie man in Abb. 11.48 erkennt, binden einige dieser eIFs (zum Beispiel eIF1, eIF'1A und eIF3) an die 40S-Untereinheit und bereiten sie damit auf die Bindung

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Die Expression des genetischen Materials: von der Transkription zur Translation

AUG-Initiationscodon enthålt. Sobald der 43S-Komplex ein geeignetes AUG-Codon erreicht, wird eIF2-GTP hydrolysiert, eIF2-GDP und andere assoziierte eIFs werden freigesetzt. Wenn nun die groûe (60S-) Untereinheit zu dem Komplex hinzukommt, ist die Initiation abgeschlossen.10 n 

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an die mRNA vor. Die an ein Methionin gekoppelte Initiator-tRNA bindet ebenfalls an die 40S-Untereinheit, bevor diese mit der mRNA in Wechselwirkung tritt. Dabei gelangt die Initiator-tRNA in Verbindung mit eIF2-GTP an die P-Stelle der Untereinheit. Nachdem diese Vorgånge abgelaufen sind, steht die kleine Ribosomenuntereinheit mit den assoziierten Initiationsfaktoren und der beladenen tRNA (die alle zusammen einen Pråinitiationskomplex von 43S bilden) bereit, um das 5'-Ende der mRNA mit dem 5'-Methylguanosin-Cap (Kap. 11.4.3) zu finden. An die mRNA herangezogen wird der 43S-Komplex ursprçnglich mit Hilfe einer Gruppe von Initiationsfaktoren, die bereits an die mRNA gebunden sind (Abb. 11.48). Dazu gehæren: n eIF4, der an die Cap-Struktur am 5'-Ende der Eukaryoten-mRNA bindet; n eIF1A, der sich am 5'-Ende der mRNA entlang bewegt und alle doppelstrångigen Regionen entfernt, damit diese die Wanderung des 43S-Komplexes an dem Molekçl nicht behindern; n eIF4G, der als Verbindung zwischen dem 5'-Ende mit seiner Cap-Struktur und dem polyadenylierten 3'-Ende der mRNA dient (Abb. 11.48). EIF4G verwandelt also eigentlich die gestreckte mRNA in ein ringfærmiges Molekçl. Warum die mRNA bei Eukaryoten diese Ringform annimmt, ist nicht vollståndig geklårt. Nachdem der 43S-Komplex an das 5'-Ende der mRNA gebunden hat, sucht er das Molekçl ab, bis er eine erkennbare Nucleotidsequenz (im typischen Fall 5'-CCACCAUGC-3') findet, die das

 
    

Nachdem wir jetzt mit unserer Beschreibung so weit gekommen sind, dass das Ribosom vollståndig zusammengebaut wurde, kænnen wir uns Struktur und Funktion dieses Gebildes mit seinen vielen Untereinheiten genauer ansehen. Ribosomen sind Molekçlmaschinen und åhneln in mancher Hinsicht den molekularen Motoren, die in Kap. 9 beschrieben wurden. Wåhrend der Translation macht das Ribosom einen ståndig wiederholten Kreislauf von mechanischen Verånderungen durch, dessen notwendige Energie durch die Hydrolyse von GTP gewonnen wird. Aber im Gegensatz zu Myosin oder Kinesin, die einfach an einer festen Schiene entlangwandern, bewegt sich das Ribosom an einem ¹Bandª aus mRNA, das codierte Information enthålt. Mit anderen Worten: Ribosomen sind      Maschinen. Die in der mRNA gespeicherte Information bestimmt darçber, in welcher Reihenfolge das Ribosom die Aminoacyl-tRNAs wåhrend der Translation akzeptiert. Ein weiteres Merkmal, das die Ribosomen von vielen anderen ¹Maschinenª in der Zelle unterscheidet, ist die groûe Bedeutung der in ihnen enthaltenen RNAs. Die ribosomalen RNAs spielen eine wichtige Rolle fçr die Auswahl der tRNAs, die Pråzision der Translation, die Bindung von Proteinfaktoren und die Polymerisierung der Aminosåuren (die in der Box ¹Experimentelle Verfahrenª am Ende des Kapitels genauer erærtert wird). In den letzten Jahren haben wir mit unseren Kenntnissen çber den Aufbau von Bakterienribosomen groûe Fortschritte gemacht. In frçheren Untersuchungen verwendete man kryoelektronenmikroskopische Bildgebungsverfahren (Kap. 18.8) und stellte auf diese Weise fest, dass das Ribosom ein sehr unregelmåûig geformtes Gebilde mit Wælbungen, Lappen, Kanålen und 10

Nicht alle mRNAs werden nach der Anheftung der kleinen Ribosomenuntereinheit an ihr 5'-Ende translatiert. Viele Virus-mRNAs und auch eine relativ geringe Zahl zelleigener mRNAs ± insbesondere solche, die wåhrend der Mitose oder in Stresssituationen genutzt werden ± werden translatiert, nachdem das Ribosom sich an einer internen RibosomenEintrittsstelle (       ' IRES) angeheftet hat, die unter Umstånden recht weit vom 5'-Ende entfernt ist.



Die Translation der genetischen Information

Brçcken ist (Abb. 2.55). Darçber hinaus lieferten diese Studien auch Hinweise, wonach es wåhrend der Translation sowohl in der kleinen als auch in der groûen Untereinheit zu tief greifenden Konformationsånderungen kommt. In den 1990er Jahren erzielte man dann groûe Fortschritte bei der Kristallisierung von Ribosomen und gegen Ende dieses Jahrzehnts erschienen erste Berichte çber die Ræntgenstrukturanalyse von Bakterienribosomen. Die Abb. 11.49 a und b zeigt den ræntgenstrukturanalytisch aufgeklårten Aufbau der beiden Untereinheiten eines Prokaryotenribosoms. Jedes Ribosom besitzt drei Stellen fçr die Anlagerung von tRNA-Molekçlen. Sie werden als   % oder , / % oder / und #-  oder #& bezeichnet und nehmen jedes tRNA-Molekçl wåhrend der aufeinander folgenden Schritte des im folgenden Abschnitt beschriebenen Elongationszyklus nacheinander auf. Die Lage der tRNAs, die an die A-, P- und E-Stelle der groûen Ribosomenuntereinheit gebunden sind, zeigt Abb. 11.49 a und b. Die tRNAs binden an diese Stellen und çberbrçcken die Lçcke zwischen den beiden Untereinheiten (Abb. 11.49 c). Die Anticodonenden der gebundenen tRNAs stehen in Kontakt mit der kleinen Untereinheit, die fçr die Entschlçsselung der Information in der mRNA eine Schlçsselrolle spielt. Dagegen befinden sich die Enden der gebundenen tRNAs, an denen die Aminosåuren angeheftet sind, an der groûen Untereinheit, denn diese ist entscheidend daran beteiligt, die Ausbildung der Peptidbindungen zu katalysieren. Darçber hinaus erbrachte die hochauflæsende Strukturaufklårung unter anderem folgende Erkenntnisse: n An der Berçhrungsstelle zwischen groûer und kleiner Untereinheit befindet sich ein relativ geråumiger Hohlraum (Abb. 11.49 c), der fast ausschlieûlich von RNA ausgekleidet ist. Die zu dem Hohlraum weisende Seite der kleinen Untereinheit ist auf ihrer ganzen Långe mit einer einzigen, ununterbrochenen, doppelstrångigen RNA-Helix bedeckt. Diese Helix ist in der zweidimensional wiedergegebenen Struktur der 16S-rRNA in Abb. 11.3 farbig unterlegt. Die einander gegençberstehenden Oberflåchen der beiden Untereinheiten enthalten die Bindungsstellen fçr die mRNA sowie fçr die neu hinzukommenden tRNAs und sind demnach fçr die Funktion des Ribosoms von entscheiden-

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 1 8    "    !    +2<    "  ? +:00/1 2 6:5n seinem relativ lockeren Zustand in der Interphasezelle begçnstigt das Chromatin die in dieser Zeit notwendigen Ablåufe wie Replikation und Transkription. In der Mitosezelle dagegen liegt das Chromatin so dicht wie mæglich kondensiert vor, was die Weitergabe eines vollståndigen ¹DNA-Paketsª an die Tochterzellen vereinfacht. Auch in der biologischen und medizinischen Wissenschaft haben sich Mitosechromosomen als nçtzlich erwiesen, denn sie enthalten

das vollståndige genetische Material einer Zelle und lassen sich mit einfachen Methoden sichtbar machen. Wenn ein Chromosom in der Prophase der Mitose immer kompakter wird, nimmt es eine charakteristische, vorhersagbare Form an, die von der Långe des DNA-Molekçls in diesem Chromosom und der Lage des Centromers (von dem spåter noch die Rede sein wird) abhångt. Die Mitosechromosomen einer in Teilung begriffenen Zelle kann man mit dem in Abb. 12.18 a wiedergegebenen Verfahren sichtbar machen. Die Zelle wird aufgebrochen, und die Mitosechromosomen aus ihrem Zellkern heften sich auf einem sehr kleinen Abschnitt eines Objekttrågers fest (Abb. 12.18). Die in Abb. 12.18 b gezeigten Chromosomen wurden mit einer Fårbemethode behandelt, bei der man das Chromosomenpråparat mit mehrfarbigen, fluoreszierenden DNA-Sonden inkubiert, die spezifisch an bestimmte Chromosomen binden. Mittels verschiedener Kombinationen von DNA-Sonden und computergestçtzten Bildgebungsverfahren kann man kann man jedes Chromosom mit einer anderen virtuellen Farbe ¹bemalenª, so dass es mit geçbtem Blick leicht zu identifizieren ist. Das Verfahren liefert nicht nur ein farbenpråchtiges Bild, sondern es gestattet auch eine hervorragende Auflæsung, so dass der medizinische Genetiker daran auch Chromosomenaberrationen erkennen kann, die man sonst çbersehen wçrde (Abb. 2 in der Box ¹Aus Sicht des Menschenª). Schneidet man aus einem Foto wie dem in Abb. 12.18 b die einzelnen Chromosomen aus,



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Der Kern einer Eukaryotenzelle

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nen steigt jedoch die Wahrscheinlichkeit, dass die Zelle bæsartig wird. Das bestuntersuchte Beispiel ist das Philadelphia-Chromosom, das man in den bæsartigen (nicht aber in den normalen) Zellen von Personen mit bestimmten Formen der Leukåmie findet. Dieses Chromosom ± der Name erinnert an die Stadt, in der es 1960 entdeckt wurde ± ist eine verkçrzte Version des menschlichen Chromosoms Nummer 22. Jahrelang glaubte man, der fehlende Abschnitt sei eine einfache Deletion, mit verbesserten Methoden der Chromosomenuntersuchung stellte man dann jedoch fest, dass der fragliche Abschnitt auf ein anderes Chromosom (Nummer 9) transloziert wurde. Auf dem Chromosom Nummer 9 liegt ein Gen namens !&,; es codiert eine Proteinkinase, die an der Steuerung der Zellvermehrung mitwirkt. Durch die Translokation ist ein kleiner Abschnitt am Ende die-

ses Proteins gegen eine Kette aus 600 zusåtzlichen Aminosåuren ausgetauscht, die von dem Gen &"- auf dem translozierten Stçck des Chromosoms 22 codiert werden. Dieses neue ¹Fusionsproteinª besitzt noch die Katalysatoraktivitåt des ursprçnglichen Proteins Abl, unterliegt aber nicht mehr den normalen Regulationsmechanismen der Zelle. Deshalb wird die betroffene Zelle bæsartig und ruft die chronische myeloische Leukåmie (CML) hervor. Wie Inversionen, so fçhren auch Translokationen in der Meiose zu Problemen. Ein Chromosom, das durch eine Translokation veråndert ist, hat einen anderen genetischen Inhalt als sein homologes Gegenstçck. Deshalb tragen die in der Meiose entstandenen Gameten entweder çberzåhlige Genkopien, oder bestimmte Gene fehlen. Wie man nachweisen konnte, spielen Translokationen in der Evolution eine wichtige Rolle: Sie erzeugen umfangreiche Verånderungen, die sich bei der Abspaltung eigenståndiger Entwicklungslinien von einem gemeinsamen Vorfahren als entscheidend erweisen kænnen. Ein solcher genetischer ¹Unfallª ereignete sich wahrscheinlich auch wåhrend unserer eigenen jçngeren Entwicklungsgeschichte. Beim Vergleich der 23 Chromosomenpaare

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Der Zellkern und die Steuerung der Genexpression

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  Translokation und Evolution. Verbindet man in Gedanken die beiden einzigen Menschenaffenchromosomen, zu denen es beim Menschen keine Entsprechung

gibt, gleichen sie Bande fçr Bande dem menschlichen Chromosom Nummer 2

menschlicher Zellen mit den 24 Paaren in Zellen von Schimpansen, Gorillas und Orang-Utans erkennt man eine verblçffende Øhnlichkeit. Bei genauerer Betrachtung der beiden Menschenaffenchromosomen, zu denen es beim Menschen keine Entsprechung gibt, stellt man fest, dass sie Bande fçr Bande dem menschlichen Chromosom Nummer 2 entsprechen (Abb. 3). Irgendwann in der Evolution des Menschen wurde offenbar ein ganzes Chromosom auf ein anderes transloziert, sodass ein einziges verschmolzenes Chromosom entstand und die haploide Zahl von 24 auf 23 zurçckging. n     Eine Deletion entsteht, wenn ein Chromosomenabschnitt fehlt. Wie bereits erwåhnt, bilden sich Zygoten mit einer Chromosomendeletion, wenn eine Gamete das Produkt einer anormalen Meiose ist. Mit einem Chromosomenabschnitt gehen håufig auch wichtige Gene verloren, was selbst dann schwer wiegende Folgen hat, wenn das homologe Chromosom normal ist. Beim Menschen schlieûen Embryonen mit nennenswerten Deletionen ihre Entwicklung meist nicht ab. Wenn es trotzdem geschieht, entstehen betråchtliche Fehlbildungen. Erst-

mals entdeckt wurde ein solcher Zusammenhang zwischen einer Krankheit und einer Chromosomendeletion 1963 von dem franzæsischen Genetiker Jerome Lejeune, der zuvor bereits die genetischen Ursachen des Down-Syndroms aufgeklårt hatte. Bei einem Baby, das mit verschiedenen Gesichtsfehlbildungen geboren worden war, entdeckte Lejeune eine Deletion auf dem Chromosom 5. Wegen einer Fehlbildung im Kehlkopf erinnerte das Weinen des Babys an den Schrei einer leidenden Katze. Deshalb wurde die Krankheit als Cris-du-chat-Syndrom (¹Katzenschreisyndromª) bezeichnet. n       Von einer Duplikation spricht man, wenn ein Chromosomenteil zweimal vorhanden ist. Die Bedeutung der Duplikationen fçr die Entstehung von Genfamilien wurde in Kapitel 10.5 erærtert. Umfangreichere Chromosomenduplikationen fçhren dazu, dass mehrere Gene nicht mit den çblichen zwei, sondern mit drei Exemplaren vorliegen (ein Zustand, den man als

 
   bezeichnet. Da die Ablåufe in den Zellen sehr empfindlich auf die Zahl der Genkopien reagieren, kænnen çberzåhlige Gene sich sehr schådlich auswirken.

T Jedes Chromosom enthålt ein einziges, ununterbrochenes, doppelstrångiges DNA-Molekçl. An jeder Spitze dieses Molekçls liegt ein
, ein ungewæhnlicher Abschnitt aus mehrfach wiederholten Sequenzen, der am Ende des Chromo-

soms eine Art Kappe bildet. Beim Menschen handelt es sich dabei um die Sequenz

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sich 500- bis 5000-mal wiederholt (Abb. 12.19 a). Im Gegensatz zu den meisten anderen wiederhol-



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ten Sequenzen, die sich von einer biologischen Art zu anderen erheblich unterscheiden, findet man bei allen Wirbeltieren die gleiche Telomersequenz, auch bei fast allen anderen Lebewesen ist sie sehr åhnlich. Diese Sequenzçbereinstimmung

Der Kern einer Eukaryotenzelle

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låsst darauf schlieûen, dass die Telomere bei ganz unterschiedlichen Lebewesen immer die gleiche Funktion ausçben. Man konnte mehrere DNAbindende Proteine nachweisen, die sich spezifisch an die Sequenz der Telomere heften und fçr ihre Funktion unentbehrlich sind. Das Protein, das in Abb. 12.19 b an die Chromosomen gebunden ist, wirkt bei der Hefe an der Steuerung der Telomerlånge mit. Wie in Kap. 13 noch genauer erærtert wird, setzen die DNA-Polymerasen, die fçr die Replikation der DNA sorgen, selbst nicht die Synthese von DNA-Strången in Gang, sondern sie fçgen nur Nucleotide an das 3'-Ende eines vorhandenen Stranges an. Die Replikation beginnt am 5'-Ende jedes neuen Stranges damit, dass ein kurzer RNA-Primer synthetisiert wird, den die Zelle spåter wieder beseitigt (grçner Abschnitt in Abb. 12.20 a). Wegen dieses Mechanismus fehlt am 5'-Ende jedes neu synthetisierten Stranges ein kurzer DNA-Abschnitt, der am 3'-Ende des komplementåren Matrizenstranges vorhanden ist. Der Strang mit dem 3'-Ende ragt also ein wenig çber den mit dem 5'-Ende hinaus. Dieses çberhångende Stçck liegt aber nicht als ungeschçtztes, einzelstrångiges Strangende vor, sondern es ist im doppelstrångigen Abschnitt des Telomers ¹festgestecktª und bildet eine Schlaufe (Abb. 12.20 b). Diese Konformation des Telomers schçtzt nach heutiger Kenntnis die Enden der DNA. Kænnte eine Zelle die Enden ihrer DNA nicht replizieren, mçsste man damit rechnen, dass die Chromosomen mit jedem Zellteilungszyklus kçrzer werden (Abb. 12.20 a). Dieses Dilemma hat man als ¹Endreplikationsproblemª bezeichnet. Der wichtigste Mechanismus, mit dem die Lebewesen dieses Problem gelæst haben, wurde 1984 aufgeklårt: Damals entdeckten Elizabeth Blackburn und Carol Greider von der University of California in Berkeley die ! , ein neuartiges Enzym, das neue Wiederholungseinheiten an das 3'-Ende des çberstehenden Stranges anfçgen kann (Abb. 12.20 c). Die Telomerase wird an den 3'-Enden vermutlich in einem Stadium tåtig, in dem sich dort keine Schleife befindet. Nachdem das 3'-Ende des Stranges verlångert ist, kann eine konventionelle DNA-Polymerase den neu synthetisierten 3'-Strang als Matrize benutzen und die 5'-Enden des komplementåren Stranges wieder auf ihre ursprçngliche Långe bringen. Die Telomerase ist eine Reverse Transkriptase: Sie synthetisiert DNA an einer RNA-Matrize. Im Gegensatz zu den meisten anderen Enzymen dieses Typs enthålt sie aber selbst die RNA, die ihr als Matrize dient (Abb. 12.20 c).

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Der Zellkern und die Steuerung der Genexpression

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schwierig; anscheinend wirkt sie an der DNAReplikation im Zellkern mit, denn Zellen, denen das Enzym fehlt, kænnen diesen Vorgang nicht abschlieûen. Andererseits ist die Polymerase e jedoch   fçr die Replikation von SV40-DNA nicht erforderlich. Mehrere weitere DNA-Polymerasen (darunter g und j) erfçllen spezialisierte Funktionen und ermæglichen es den Zellen, auch beschådigte DNA zu replizieren, wie es in Kap. 13.3 beschrieben wird. Wie die Polymerase der Prokaryoten, so verlångern auch alle eukaryotischen Enzyme den DNA-Strang in 5'?3'-Richtung, indem sie Nucleotide an eine 3'-Hydroxylgruppe anfçgen. Keines von ihnen kann ohne Primer mit der Synthese einer DNA-Kette beginnen. Die Polymerasen ,  und  enthalten eine 3'?5'-Exonuclease, die mit ihrer Korrekturleseaktivitåt dafçr sorgt, dass die Replikation mit sehr hoher Genauigkeit ablåuft.

Befunden zufolge ist der Replikationsapparat eng mit der Kernmatrix (Kap. 12.1.3) assoziiert. Markiert man Zellen mit einem kurzen Puls radioaktiver DNA-Bausteine, findet man mehr als 80% der aufgenommenen Markierung in Verbindung mit der Kernmatrix. Wenn man die Zellen nicht sofort nach einer solchen Pulsmarkierung fixiert, sondern ihnen noch ungefåhr eine Stunde die Aufnahme unmarkierter DNA-Vorlåufer gestattet, wandert die Radioaktivitåt zum græûten Teil von der Matrix in die umgebenden DNA-Schleifen. Dies låsst darauf schlieûen, dass die DNA wåhrend der Replikation nicht unbeweglich bleibt, sondern sich eher wie ein Færderband an einem unbeweglichen Replikationsapparat entlangbewegt (Abb. 13.22). Anderen Untersuchungen zufolge verteilen sich die Replikationsgabeln, die zu einem bestimmten Zeitpunkt aktiv sind, nicht nach dem Zufallsprinzip çber den Zellkern, sondern sie konzentrieren sich auf 50±250 Stellen, die man als      bezeichnet (Abb. 13.23). Jeder hellrote Bereich in Abb. 13.23 enthålt schåtzungsweise ungefåhr 40 Replikationsgabeln, die parallel arbeiten und Nucleotide in DNA-Strånge einbauen. Diese Håufung der Replikationsgabeln dçrfte ein Mechanismus sein, durch den auf einzelnen Chromosomen die Replikation benachbarter Replikons koordiniert wird

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In dem Bild, das in diesem Kapitel bisher von der Replikation gezeichnet wurde, bewegt sich die Polymerase wie eine Lokomotive çber ein unbewegliches DNA-Gleis. Aber der Replikationsapparat ist ein riesiger Proteinkomplex, der in den engen Grenzen eines geordnet aufgebauten Zellkerns tåtig werden muss. Zahlreichen



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DNA-Replikation und DNA-Reparatur

(wie in Abb. 13.19). Entfernt man aus Zellen durch geeignete Behandlung einen groûen Teil des Chromatins, bleiben die Replikationsbrennpunkte an die Kernmatrix angeheftet. +          In den Chromosomen der Eukaryotenzellen ist die DNA in einem engen Komplex an regelmåûige Anordnungen aus Histonproteinen gebunden. Untersucht man ein DNA-Molekçl wåhrend der Replikation mit dem Elektronenmikroskop, so erkennt man Nucleosomen an beiden Tochterdoppelstrången sehr nahe an der Replikationsgabel (Abb. 13.24 a); man kann also annehmen, dass die Nucleosomen sich an der DNA sehr schnell neu bilden. Wie in Kap. 12.1.2 erlåutert wurde, besteht das Octamer des Histonkerns aus einem Tetramer mit der Struktur (H3H4)2 und zwei Dimeren der Form H2A/H2B. B $-Untersuchungen lassen darauf schlieûen, dass die vor der Replikation vorhandenen (H3H4)2-Tetramere unversehrt bleiben und sich nach dem Zufallsprinzip auf die beiden Tochtermolekçle verteilen. Deshalb trågt jedes der beiden neuen DNA-Molekçle eine Mischung aus alten und neuen (H3H4)2-Tetrameren (Abb. 13.24 b). Dagegen bleiben die beiden H2A/H2B-Dimere der ursprçnglichen Nucleosomen nicht zusammen, wenn die Replikationsgabel durch das Chromatin wandert. Sie trennen sich vielmehr und binden dann anscheinend nach dem Zufallsprinzip an alte und neue (H3H4)2-Tetramere, die sich bereits an den Tochterdoppelstrången befinden (Abb. 13.24 b). Der schrittweise Aufbau der Nucleosomen und die Einhaltung regelmåûiger Abstånde bei ihrer Bindung an die DNA werden durch ein System von Hilfsproteinen erleichtert.

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13.2 DNA-Reparatur Die Lebewesen sind auf der Erde den verschiedensten Zerstærungskråften ausgesetzt, die ihren Ursprung sowohl im Inneren eines Organismus als auch in seiner Umwelt haben. Unter allen Molekçlen in einer Zelle ist die DNA den græûten Gefahren ausgesetzt. Auf der einen Seite ist es unbedingt erforderlich, dass die genetische Information praktisch unveråndert von Zelle zu Zelle und von einem Individuum zum Nåchsten weitergegeben wird. Auf der anderen gehært die DNA jedoch zu den Molekçlen, die besonders empfindlich gegençber schådlichen Einflçssen sind. Wird sie von ionisierender Strahlung getroffen, bricht in vielen Fållen das Rçckgrat des DNA-Molekçls; reaktionsfåhige chemische Verbindungen, von denen manche im Stoffwechsel der Zelle selbst entstehen, kænnen die Struktur der Basen in einem DNA-Molekçl veråndern; unter dem Einfluss ultravioletter Strahlung treten benachbarte Pyrimidine eines DNA-Stranges bevorzugt in Wechselwirkung und bilden einen Komplex, d. h. ein Dimer (Abb. 13.25). Schon die Wårmeenergie aus dem Stoffwechsel reicht aus, um Adenin- und Guaninbasen von den Zu-



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ckergruppen des DNA-Rçckgrats zu læsen. Wie håufig solche spontanen Verånderungen vorkommen, erkennt man an einer Schåtzung, wonach jede Zelle eines warmblçtigen Såugetieres ungefåhr 10 000 Basen pro Tag verliert! Werden solche Schåden nicht repariert, kommt es in der DNA zu dauerhaften Verånderungen, d. h. zu Mutationen. Ereignet sich die Mutation in einer Zelle, aus der spåter eine Gamete hervorgeht, gelangt die Verånderung unter Umstånden in die nåchste Generation. Mutationen wirken sich aber auch auf somatische Zellen aus, d. h. auf Zellen, die nicht zur Keimbahn gehæren: Sie kænnen Transkription und Replikation beeintråchtigen, die bæsartige Verånderung einer Zelle in Gang setzen oder die Alterungsvorgånge in einem Organismus beschleunigen. Angesichts der Tatsache, dass Verånderungen der DNA-Molekçle weit reichende Folgen haben kænnen und gleichzeitig so håufig vorkommen, mçssen die Zellen unbedingt çber Mechanismen verfçgen, mit denen sie Schåden der DNA reparieren kænnen. Tatsåchlich besitzen sie eine verwirrende Vielfalt von Reparatursystemen, die praktisch alle nur denkbaren Schåden eines DNA-Molekçls korrigieren kænnen. Nach Schåtzungen entgeht noch nicht einmal eine von 1000 Basenverånderungen den zelleigenen Reparaturmechanismen. Diese Mechanismen sind auch ein ausgezeichnetes Beispiel dafçr, wie die Homæostase in den Zellen auf molekularer Ebene aufrechterhalten wird. Die groûe Bedeutung der DNA-Reparatur kann man einschåtzen, wenn

DNA-Reparatur

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man sich ansieht, wie Defekte der entsprechenden Systeme sich beim Menschen auswirken; mit diesem Thema beschåftigt sich die Box ¹Aus Sicht des Menschenª des vorliegenden Kapitels. Sowohl Pro- als auch Eukaryotenzellen besitzen verschiedene Proteine, die an der DNA patrouillieren und nach Verånderungen oder Verformungen suchen. In manchen Fållen werden solche Schåden dann sofort repariert. In menschlichen Zellen gibt es beispielsweise Enzyme fçr die unmittelbare Reparatur von Schåden, die von Krebs erregenden alkylierenden Agenzien angerichtet werden. Die meisten Reparatursysteme setzen jedoch voraus, dass ein geschådigter DNA-Abschnitt ausgeschnitten und gezielt entfernt wird. Es gehært zu den groûen Vorteilen des DNA-Doppelstranges, dass jeder Strang die Informationen zum Aufbau seines Partners enthålt. Werden deshalb aus einem Strang ein oder mehrere Nucleotide entfernt, kann der Komplementårstrang als Matrize zur Wiederherstellung des Doppelstranges dienen. Wie in der nachfolgenden Beschreibung deutlich werden wird, haben DNA-Replikation und DNA-Reparatur viele gemeinsame Eigenschaften. Vielfach sind daran die gleichen ¹Ersatzteile und Dienstleistungenª beteiligt. !'$! Nucleotid-Excisionsreparatur Die ) #-     3)# 4 ist ein Mechanismus mit Ausschneiden und Einfçgen. Sie dient der Reparatur verschiedener sperriger Schadstellen wie Pyrimidindimere oder Nucleotide, an die verschiedene chemische Gruppen gebunden sind. Man kann zwei Wege der NER unterscheiden: n Beim        werden bevorzugt die Matrizenstrånge aktiv transkribierter Gene repariert. Eine solche Reparatur des Matrizenstranges findet statt, wåhrend die DNA transkribiert wird; dabei gibt vermutlich eine ¹stecken gebliebeneª RNA-Polymerase das Signal. Dieser bevorzugte Reparaturmechanismus gewåhrleistet, dass die wichtigsten Gene der Zelle ± nåmlich diejenigen, die aktiv transkribiert werden ± auf der ¹Reparaturlisteª ganz oben stehen. n In den çbrigen Teilen des Genoms werden die DNA-Strånge auf einem langsameren, weniger effizienteren    repariert.

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DNA-Replikation und DNA-Reparatur

Içr die Erkennung des Schadens sind zwar vermutlich auf den beiden Wegen der NER unterschiedliche Proteine verantwortlich (Schritt 1 in Abb. 13.26), bei der eigentlichen Reparatur laufen aber nach heutiger Kenntnis sehr åhnliche Vorgånge ab (Abb. 13.26, Schritte 2 bis 6). Ein entscheidender Bestandteil des NER-Apparats ist TFIIH, ein riesiges Protein, das auch an der Initiation der Transkription mitwirkt. Mit der Entdeckung, dass TFIIH beteiligt ist, hatte man eine wichtige Verbindung zwischen Transkription und DNA-Reparatur hergestellt, zwei Vorgången, die man zuvor fçr unabhångig voneinander gehalten hatte (Nåheres in dem Abschnitt ¹Experimental Pathwaysª unter www.wiley.com/college/ karp). Unter den verschiedenen Untereinheiten von TFIIH sind zwei (XPB und XPD), die eine Helikaseaktivitåt besitzen; diese Enzyme trennen die Strånge der Doppelhelix (Abb. 13.26, Schritt 2) und bereiten damit die Entfernung der Schadstelle vor. Anschlieûend wird der geschådigte Strang beiderseits des Schadens von zwei Endonucleasen durchtrennt (Schritt 3) und der zwischen den Schnitten liegende DNA-Abschnitt freigesetzt (Schritt 4). Die so entstandene Lçcke wird von einer DNA-Polymerase aufgefçllt (Schritt 5), schlieûlich stellt eine DNA-Ligase den ununterbrochenen Strang wieder her (Schritt 6). !'$$ Basen-Excisionsreparatur Ein anderes Excisions-Reparatursystem entfernt verånderte Nucleotide, die durch reaktionsfåhige Chemikalien aus Nahrung oder Stoffwechsel erzeugt wurden. Die Tåtigkeit dieses eukaryotischen Reparatursystems, das als 7 #-      37# 4 bezeichnet wird, zeigt Abb. 13.27. In Gang gesetzt wird die BER durch eine ) :% % , welche die Verånderung erkennt (Schritt 1 in Abb. 13.27) und die Base durch Spaltung der glycosidischen Bindung zwischen Base und Desoxyribose heraustrennt (Schritt 2). Man hat eine Reihe verschiedener DNA-Glycosylasen nachgewiesen, die jeweils mehr oder weniger spezifisch fçr einen ganz bestimmten Typ verånderter Basen sind, beispielsweise fçr Uracil (das durch hydrolytische Abspaltung der Aminogruppe aus Cytosin entsteht), 8-Oxo-guanin (entstanden durch schådliche freie Sauerstoffradikale, s. Kap. 2) und 3-Methyladenin (das durch Ûbertragung einer Methylgruppe von einem Methyldonor entsteht, Kap. 11.3.2). Nachdem das verånderte Purin oder Pyrimidin ausgeschnitten ist, entfernen eine spezialisierte ¹AP-Endonucleaseª und eine DNA-Polymerase gemeinsam das an dieser Stelle verbliebene ¹gekæpfteª Desoxyribosephos-

n Abb. 13.26. 2 $       %            9  $     & < +51       %          ?   
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phat. Die AP-Endonuclease spaltet das Rçckgrat der DNA (Schritt 3), und eine Phosphodiesteraseaktivitåt der Polymerase  entfernt das Ûberbleibsel aus Zucker und Phosphat, an dem die ausgeschnittene Base gebunden war (Schritt 4). Anschlieûend fçllt die Polymerase  die Lçcke, indem sie ein zum unbeschådigten Strang komplementåres Nucleotid einfçgt (Schritt 5). Die DNALigase III schlieût den Strang (Schritt 6).



DNA-Reparatur

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>n der Tatsache, dass Cytosin sich in Uracil verwandeln kann, liegt mæglicherweise auch die Erklårung dafçr, warum die natçrliche Selektion nicht Uracil, sondern Thymin als Base in der DNA bevorzugte, obwohl Uracil vermutlich ein Bestandteil der RNA war, als diese in der Frçhzeit der Evolution als genetisches Material diente (Kap. 11.4.4). Wåre das Uracil auch in der DNA als Base erhalten geblieben, håtten die Reparatursysteme kaum unterscheiden kænnen, ob ein Uracil ¹zu Rechtª an einer bestimmten Stelle stand oder ob es durch Verånderung von Cytosin entstanden war. Interessanterweise gehært eine Uracil-DNA-Glycosylase zu den Enzymen, die von   bis zum Menschen am stårksten konserviert sind: Beide Enzyme haben 56% ihrer Aminosåuresequenz gemeinsam. Wie man aus Strukturuntersuchungen weiû, bindet das Enzym an die DNA und veranlasst das Uracil, aus der Helix in das aktive Zentrum des Enzyms çberzuspringen, wo es dann entfernt wird. !'$' ehlpaarungsreparatur

n Abb. 13.27.  $     !   % '    9 $     ?        ;     ?   7                      G 

Wie zuvor bereits erlåutert wurde, kænnen die Zellen falsch gepaarte Basen entfernen, die von der DNA-Polymerase eingebaut wurden und der Korrekturlese-Exonuclease des Enzyms entgangen sind. Dieser Vorgang wird als
 

     bezeichnet. Falsch gepaarte Basen verursachen in der Geometrie der Doppelhelix eine Verformung, die von einem Reparaturenzym erkannt werden kann. Aber wie ¹erkenntª das Enzym, auf welcher Seite eines solchen Paares das falsch gepaarte Nucleotid steht? Wçrde das Nucleotid nach dem Zufallsprinzip entfernt, wåren die Entscheidungen in 50% der Fålle falsch und an den betreffenden Stellen wçrden dauerhafte Mutationen entstehen. Damit eine falsche Paarung entfernt werden kann, nachdem die DNAPolymerase die betreffende Stelle bereits passiert hat, muss das Reparatursystem zwischen dem neu synthetisierten Strang, der das falsche Nucleotid enthålt, und dem Ausgangsstrang mit dem richtigen Nucleotid unterscheiden kænnen. Bei   unterscheiden sich die Strånge durch die angehefteten beziehungsweise fehlenden Methylgruppen. In dem ursprçnglichen Strang sind Methylgruppen an bestimmte Adenosinreste gebunden, der neu synthetisierte Strang dagegen bleibt nach der Replikation noch eine gewisse Zeit lang unmethyliert. Bevor die Methylierung stattfindet, sucht das Reparatursystem die DNA ab; erkennt es eine Fehlpaarung, entfernen und ersetzen die Enzyme stets Nucleotide aus dem unmethylierten Strang. Damit ist gewåhrleistet,

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DNA-Replikation und DNA-Reparatur

dass das ursprçngliche Basenpaar wiederhergestellt wird. Das Fehlpaarungsreparatursystem der Eukaryoten nutzt offenbar nicht die DNAMethylierung; wie hier der neu synthetisierte Strang erkannt wird, ist bisher nicht geklårt. !'$ Reparatur von Doppelstrangbrçchen Ræntgenstrahlen, Gammastrahlen und die von radioaktiven Atomen freigesetzten Teilchen werden als   &  bezeichnet, weil sie beim Durchgang durch Materie die Ionen entstehen lassen. In jeder Minute dringen Millionen von Gammastrahlen durch unseren Kærper. Trifft diese Strahlung auf die empfindlichen DNA-Molekçle, brechen håufig beide Strånge der Doppelhelix. Solche     3&7 4 werden auch von bestimmten chemischen Substanzen verursacht, unter anderem von mehreren Wirkstoffen (zum Beispiel Bleomycin), die zur Chemotherapie von Krebs verwendet werden, und von freien Radikalen, die beim normalen Zellstoffwechsel entstehen (Kap. 2). Auch bei der Replikation geschådigter DNA entstehen Doppelstrangbrçche. Diese kænnen zu schwerwiegenden Chromosomenanomalien fçhren und sich fçr eine Zelle letztlich als tædlich erweisen. Die Reparatur von DSBs kann auf mehreren Wegen erfolgen. Den Mechanismus, den Såugerzellen vorwiegend nutzen, nennt man .      # (     "                     )   !       +  < -  +5JJ01 ?    8 4( #

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der SC fçr die Rekombination nicht erforderlich ist. Einerseits bildet er sich erst, nachdem die Rekombination bereits begonnen hat, andererseits låuft der Austausch genetischer Information zwischen den Chromosomen auch in mutierten Hefezellen ab, die keinen SC mehr ausbilden kænnen. Nach heutiger Kenntnis dient der SC vor allem als Gerçst, das fçr die Chromatiden die Mæglichkeit schafft, ihre Crossing-over-Tåtigkeit abzuschlieûen (s. unten). Den Komplex aus zwei in der Synapsis vereinigten homologen Chromosomen bezeichnet man als 7 9  oder ! . In dem ersten Begriff spiegelt sich die Tatsache wider, dass der Komplex zwei homologe Chromosomen enthålt, der zweite lenkt die Aufmerksamkeit auf die vier Chromatiden. Mit der Vollendung der Synapsis ist auch das Zygotån zu Ende; nun beginnt das nåchste Stadium der Prophase I, das /  %1, das durch den vollståndig ausgebildeten synaptischen Komplex gekennzeichnet ist. Im Pachytån werden die homologen Chromosomen vom SC auf ihrer ganzen Långe lose zusammengehalten und die DNA der Schwesterchromatiden liegt ausgebreitet in parallelen Schleifen (Abb. 14.44). Unter dem Elektronenmikroskop erkennt man in

n 

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 ( 1    (   '      !'     2 %     8          8    +< ?        ( %  - +5JE01 8  E5n welcher Hinsicht ist die Zellteilung ein Bindeglied zwischen dem Menschen und den ersten Eukaryotenzellen? 2. Mit welchen Synthesevorgången rechnen Sie in der G1-, aber nicht in der G2-Phase? 3. Angenommen, Sie markieren eine Population asynchron wachsender Zellen mit [3H]Thymidin. Die G1-Phase ist sechs Stunden lang, die S-Phase ebenfalls sechs Stunden, die G2-Phase fçnf Stunden und die M-Phase eine Stunde. Welcher Prozentsatz der Zellen ist nach einem Markierungspuls von 15 Minuten radioaktiv? Welcher Prozentsatz der Mitosezellen ist nach einem solchen Puls markiert? Wie lange muss im Anschluss an die Markierung die Chase-Phase sein, bevor Sie die ersten markierten Mitosechromosomen beobachten? Welcher Anteil der Zellen hat nach einer Chase-Phase von 18 Stunden markierte Mitosechromosomen? 4. Angenommen, Sie nehmen eine Kultur derselben Zellen wie in Frage 3, aber statt einer Pulsmarkierung mit [3H]-Thymidin markieren Sie die Kultur ununterbrochen 20 Stunden lang. Zeichnen Sie in einem Diagramm ein, welcher Anteil an radioaktiver DNA in der Kultur im Laufe dieser 20 Stunden vorhanden ist. Wie viel Zeit muss mindestens vergehen, bis in diesem Experiment alle Zellen etwas von der Markierung aufgenommen haben? Wie kænnten Sie an dieser Kultur die Långe des Zellzyklus feststellen, ohne radioaktive Markierungen zu verwenden? 5. Nach der Fusion von Zellen in der G1- und S-Phase erhålt man andere Ergebnisse als wenn man Zellen aus G2- und S-Phase verschmilzt. Worin dçrfte dieser Unterschied Ihrer Ansicht nach bestehen, wie ist er zu erklåren? 6. In Abb. 14.6 erkennt man, wie sich Mutationen in den Genen fçr Wee1 und Cdc25 auf den Zellzyklus auswirken. Die Kinase CAK wurde nicht genetisch (d. h. durch Isolierung mutierter Zellen), sondern biochemisch nachgewiesen. Mit welchem Phånotyp rechnen Sie bei einer Hefezelle, die eine temperatursensitive Mutation von CAK trågt, wenn Sie die Temperatur des Kulturmediums im Frçhstadium der G1-Phase erhæhen? Oder spåt in der G2-Phase? Warum ist er unterschiedlich, je nachdem, in welchem Stadium die Temperatur erhæht wurde?

7. Nennen Sie vier verschiedene Mechanismen fçr die Inaktivierung einer Cdk. 8. Als Syncytium bezeichnet man eine ¹Zelleª, die mehrere Zellkerne enthålt, wie beispielsweise eine Skelettmuskelfaser oder ein Fliegenembryo im Blastulastadium. Diese beiden Arten von Syncytien entstehen auf ganz unterschiedlichen Wegen. Welche beiden Mechanismen fçr die Bildung solcher Syncytien kænnen Sie sich vorstellen? Welche Schlçsse kænnen Sie daraus çber den Zusammenhang zwischen Mitose und Cytokinese ziehen? 9. Wie kænnen Sie experimentell feststellen, ob die polaren Mikrotubuli sich wåhrend der Anaphase in einem Zustand dynamischer Fluktuation befinden? Mit was fçr Beobachtungen rechnen Sie vor dem Hintergrund Ihrer Kenntnisse çber dieses Stadium? 10. Angenommen, Sie haben einer Zelle wåhrend der Replikation (S-Phase) unmittelbar vor Beginn der Meiose [3H]-Thymidin zugesetzt. Welcher Anteil der Chromosomen in den Gameten ist anschlieûend markiert? Wenn eine dieser Gameten (eine Samenzelle) eine unmarkierte Eizelle befruchtet: Welcher Anteil der Chromosomen ist im Zweizellstadium markiert? 11. Beim Menschen besteht der haploide Chromosomensatz aus 23 Chromosomen, und die Menge der DNA im Zellkern einer Samenzelle betrågt 1C. Wie viele Chromosomen enthålt eine menschliche Zelle in folgenden Stadien: Metaphase der Mitose; Prophase I der Meiose; Anaphase I der Meiose; Prophase II der Meiose; Anaphase II der Meiose. Wie viel Chromatin besitzt die Zelle in diesen Stadien? Wie viel DNA (in Vielfachen von C) ist in der Zelle jeweils vorhanden? 12. Zeichnen Sie ein Diagramm mit der DNAMenge im Zellkern eines Spermatogoniums von der G1-Phase vor der ersten Meioseteilung bis zum Abschluss der Meiose. Kennzeichnen Sie in dem Diagramm die wichtigsten Phasen des Zellzyklus und der Meiose. 13. Wie viele Centriolen besitzt eine Zelle in der Metaphase der Mitose? 14. Angenommen, jemand erzåhlt Ihnen, Trisomien seien in den meisten Fållen darauf zurçckzufçhren, dass eine Eizelle im Eilei-

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Fortpflanzung von Zellen

ter zu lange auf die Befruchtung gewartet hat und gealtert ist. Wie kænnten Sie durch die Untersuchung von Feten aus spontanen Fehlgeburten einen Beleg gewinnen, der diesen Gedanken beståtigt? Wie wçrde dies zu den bereits vorhandenen Daten passen? 15. Angenommen, Sie inkubieren eine Meiosezelle zwischen Leptotån und Zygotån mit [3H]-Thymidin, fixieren die Zellen dann im Pachytån und stellen ein Autoradiogramm her. Dabei stellt sich heraus, dass sich an den Chiasmata gehåufte Silberkærner befinden. Welche Erkenntnis kænnen Sie daraus çber den Mechanismus der Rekombination ableiten? 16. In Kap. 14.2.4 war davon die Rede, dass man zweierlei Signale mit der hemmenden Wirkung des Metaphase-Kontrollpunktes in Verbindung bringen konnte. Vor diesem Hintergrund betrachten wir die Ergebnisse eines Experiments aus jçngerer Zeit, in dem man das nicht verankerte Kinetochor eines nur einseitig befestigten Chromosoms mit einem Laserstrahl zerstærte. Die Zelle trat dennoch in die Anaphase ein, obwohl dieses Chromosom sich in der Metaphaseplatte nicht ordnungsgemåû angeordnet hatte. Wie interpretieren Sie dieses Experiment im Hinblick auf die Signale, die in dem vorliegenden Kapitel beschrieben wurden? 17. Nehmen wir einmal an, es gåbe kein Crossing over. Wçrden Sie dann der Behauptung zustimmen, Sie håtten von jedem Elternteil die Hålfte Ihrer Chromosomen geerbt? Glauben Sie, dass sie ein Viertel Ihrer Chromosomen von jedem Elternteil geerbt haben? Wçrden Sie diese Fragen anders beantworten, wenn Sie davon aus-

ternetseite www.wiley.com/college/karp .weitern sie Ihr Verståndnis, indem sie Karps Internetseite ¹Zell- und Molekularbiologieª besuchen. Dort finden Sie '  die gestellten
  $ & ,     , die schwierige Sachverhalte und Begriffe verdeutlichen,   , die Ihnen bei Prçfungsvorbereitungen helfen, sowie 8  zu interessanten Stellen im Netz. Zusåtzlich zu der Literaturliste unten kann man auf der Internetseite auch noch '  8 finden.

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gehen, dass Crossing over stattgefunden hat? In Kap. 14.1.2 wurde dargelegt, dass man Zellen in der G2-Phase nicht durch eine Fusion mit Zellen in der S-Phase zur Replikation anregen kann. Kænnen Sie diese Beobachtung anhand der Informationen in Abb. 13.20 erklåren? Was fçr einen Phånotyp erwarten Sie bei einer Spalthefe, in deren Cdk-Untereinheit entweder die Aminosåure Tyr 15 oder die Aminosåure Thr 161 auf Grund einer Mutation fehlt? In Kap. 14.2.1 war davon die Rede, dass sowohl die Verdoppelung der Centrosomen als auch die DNA-Synthese durch den Komplex aus Cyclin E und Cdk2 in Gang gesetzt wird, der seine Tåtigkeit am Ende der G1-Phase aufnimmt. In einer Untersuchung, çber die kçrzlich berichtet wurde, aktivierte man den Cyclin E-Cdk2Komplex in einem frçheren Stadium, beispielsweise zu Beginn der G1-Phase; in diesem Fall beginnt nach der Aktivierung sofort die Verdoppelung der Centrosomen, die DNA-Replikation kommt aber erst zu dem Zeitpunkt in Gang, zu dem die S-Phase normalerweise beginnt. Formulieren Sie eine Hypothese, um zu erklåren, warum nicht auch die DNA-Synthese frçher einsetzt. Anhaltspunkte finden Sie in Abb. 13.20. Mit was fçr einem Phånotyp rechnen Sie bei einer Zelle, deren Cdc20-Polypeptid auf Grund einer Mutation (1) Mad2 nicht binden kann oder (2) die anderen Untereinheiten des APC nicht binden kann oder (3) sich am Ende der Anaphase nicht vom APC læst?

14.4 Literatur $%

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ellulåre Signale und Signalçbertragung: Kommunikation zwischen Zellen

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15.1 Grundelemente zellulårer Signalçbertragungssysteme 15.2 Eine Ûbersicht çber extrazellulåre Botenstoffe und ihre Rezeptoren 15.3 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und ihre second messengers 15.4 Die tyrosinspezifische Phosphorylierung als Mechanismus der Signaltransduktion 15.5 Calcium als intrazellulårer Botenstoff 15.6 Konvergenz, Divergenz und Austausch (Crosstalk) zwischen verschiedenen Signalwegen 15.7 NO (Stickstoffmonoxid) als interzellulårer Botenstoff 15.8 Apoptose (Programmierter Zelltod) Aus Sicht des Menschen: Krankheiten, die durch das Versagen G-Protein-gekoppelter Rezeptoren zustande kommen     % ( ; "        #     %&    ;  ;   B !      ( ; !  "        
9      ,  &     +   I     1    $!  & %        %  8I      ;  ' ( "      ( ;   +  1  #        !    )  &   # "    #        ?   &    ' +?

       ( 8    "      1

Der englische Dichter John Donne brachte seine Ûberzeugung, derzufolge alle Menschen voneinander abhångig sind, einst auf die Formel: ¹Niemand ist eine Insel.ª Dasselbe låsst sich von den Zellen sagen, aus denen ein komplexer viel-

zelliger Organismus besteht. Die meisten pflanzlichen und tierischen Zellen sind darauf spezialisiert, eine oder mehrere Spezialaufgaben zu erfçllen. Viele biologische Vorgånge aber erfordern die Zusammenarbeit vieler Zellen, die ihre

AA:

Zellulåre Signale und Signalçbertragung: Kommunikation zwischen Zellen

Aktivitåt dementsprechend koordinieren mçssen. Damit dies mæglich wird, mçssen Zellen miteinander kommunizieren, und zwar çber einen Prozess, den man als &    bezeichnet. Die zellulåre Signalçbertragung erlaubt Zellen die Kommunikation untereinander und låsst den Organismus als kohårentes System funktionieren. Die zellulåre Signalçbertragung beeinflusst mehr oder weniger jeden Aspekt von Zellstruktur und Funktion, und das ist einer der Hauptgrçnde dafçr, dass dieses Kapitel gegen Ende dieses Buches zu finden ist: Zum einen weil man bereits einiges çber andere zellulåre Aktivitåten wissen muss, wenn man die Prozesse der Signalçbertragung verstehen will, zum anderen, weil sich durch den Einblick in diese Prozesse eine Vielzahl scheinbar unzusammenhångender zellulårer Ablåufe ineinander fçgt. Die zellulåre Signalçbertragung ist zudem eng verknçpft mit der Regulation von Zellwachstum und Zellteilung. Damit ist das Verstehen der Signalçbertragungswege von vitaler Bedeutung fçr die Beantwortung der Frage, wie eine Zelle die Fåhigkeit zur Kontrolle der Zellteilung verlieren und zu einem bæsartigen Tumor entarten kann.

!.! Grundelemente zellulårer Signalçbertragungssysteme Vielleicht ist es hilfreich, die Diskussion dieses komplexen Themas mit der Erærterung einiger allgemeiner Merkmale zu beginnen, die fast allen Signalçbertragungswegen gemeinsam sind. Eine Ûbersicht çber diese Eigenschaften bietet Abb. 15.1. Zellen kommunizieren untereinander in der Regel çber - $1 7. Die zellulåre Signalçbertragung beginnt mit der Freisetzung eines Botenmolekçls durch die signalgebende Zelle (Abb. 15.1, Schritt 1). In manchen Fållen muss das Botenmolekçl nur einen schmalen Spalt zwischen zwei Zellen passieren oder durch eine winzige Blutkapillare diffundieren, bis die Botschaft die passende Empfångerzelle erreicht. In anderen Fållen muss ein Botenmolekçl womæglich durch den ganzen Kærper zirkulieren, bevor es in seiner Zielzelle anlangt. Zellen kænnen auf eine extrazellulåre Botschaft nur antworten, wenn sie $ exprimieren, die das jeweilige Botenmolekçl erkennen und binden (Schritt 2). In den meisten Fållen bindet das Botenmolekçl oder sein Ligand an einen Rezeptor auf der åuûeren Zelloberflåche. Diese Interaktion bewirkt, dass ein Signal durch die Membran hindurch an die cytoplasmatische

n Abb. 15.1. % '  "    $!  &  



  !  & ;    '  B     !  !'  (       ( %  '  <  "       % '      

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Domåne des Rezeptors weitergeleitet wird (Schritt 3). Wenn dieses an der inneren Oberflåche der Plasmamembran angekommen ist, gibt es zwei Hauptwege, çber die das Signal ins Zellinnere weitergeleitet werden kann. Welcher dieser beiden Wege beschritten wird, hångt von der Art des aktivierten Rezeptors ab. n Eine Sorte von Rezeptoren (Kap. 15.3) çbermittelt ein Signal von seiner cytoplasmatischen Domåne an ein benachbartes Enzym (Schritt 4), das einen second messenger (einen intrazellulåren ¹zweiten Bo-



Grundelemente zellulårer Signalçbertragungssysteme

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tenstoffª) entstehen låsst (Schritt 5). Da es mit der Erzeugung dieses     $    die zellulåre Reaktion in Gang setzt, bezeichnet man ein solches Enzym in der Regel als Effektor.      $   sind kleine Molekçle, die im typischen Fall bestimmte Proteine aktivieren oder inaktivieren. Je nach seiner chemischen Struktur kann ein        durchs Cytosol diffundieren oder in der Lipiddoppelschicht der Membran verbleiben. n Ein anderer Rezeptortyp (Kap. 15.4) leitet ein Signal weiter, indem er seine cytoplasmatische Domåne in eine Andockstation fçr zellulåre Signalproteine umwandelt (Schritt 4a). Unabhångig jedoch davon, ob ein Signal çber einen        direkt oder durch die Mitwirkung anderer Proteine weitervermittelt wird, das Ergebnis ist ganz åhnlich: Es wird ein Protein aktiviert, das an der Spitze eines intrazellulåren &    ' steht (Abb. 15.1, Schritt 6). Signalçbertragungswege sind die Informationsautobahnen der Zelle. Jeder Ûbertragungsweg besteht aus einer Reihe einzelner Proteine, die nacheinander zum Einsatz kommen (Schritt 7). In der Regel bewirkt jedes Protein in diesem Ûbertragungsweg beim nachgeschalteten Protein der Reihe (¹+  ª) eine Konformationsånderung, durch die letzteres aktiviert oder inhibiert wird (Abb. 15.2). Nach dem, was bis hierher bereits çber andere Ablåufe in der Zellbiologie gesagt wurde, sollte es nicht çberraschen, dass Konformationsånderungen bei Signalproteinen håufig durch Proteinkinasen oder Proteinphosphatasen bewirkt werden, die anderen Proteinen Phosphatgruppen hinzufçgen oder diese entfernen (Abb. 15.2). Das menschliche Genom codiert çber 500 verschiedene Proteinkinasen und çber 100 verschiedene Proteinphosphatasen. Manche unter diesen Kinasen und Phosphatasen sind læsliche cytoplasmatische Proteine, andere sind integrale Membranproteine. Manche von ihnen haben mehrere Proteine zum Substrat, andere phosphorylieren oder dephosphorylieren nur ein einziges Proteinsubstrat. Viele der Proteinsubstrate dieser Enzyme sind ebenfalls Enzyme ± andere Kinasen oder Phosphatasen zumeist ± aber zu den Substraten gehæren auch Ionenkanåle, Transkriptionsfaktoren und verschiedene Arten von regulatorischen Proteinen. Man schåtzt, dass etwa ein Drittel der Proteine einer Zelle der Phosphory-

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lierung unterworfen sind. Die Phosphorylierung eines Proteins kann dessen Verhalten auf mehrere Weisen veråndern: Ein Enzym kann durch Phosphorylierung aktiviert oder inaktiviert werden, die Wechselwirkung zwischen Proteinen kann durch sie verstårkt oder geschwåcht werden, Proteinphosphorylierung kann ein Protein dazu veranlassen, von einem Zellkompartiment zum anderen zu wandern, oder auch als Signal zur Degradierung von Proteinen wirken. Am Ende erreichen Signale, die çber einen solchen Signalçbertragungsweg weitergeleitet wurden, ihre jeweiligen    (Abb. 15.1, Schritt 8), die an grundlegenden zellulåren Prozessen beteiligt sind (Abb. 15.1, Schritt 9). Je nach Art der Zelle und der çbermittelten Botschaft kann die durch das Zielprotein ausgelæste Antwort der Zelle zum Beispiel in einer Verånderung der Genexpression bestehen, in der verånderten Aktivitåt bestimmter Stoffwechselenzyme, einem Umbau des Cytoskeletts, erhæhter oder verminderter Zellmotilitåt, einer verånderten Ionenpermeabilitåt, einer Aktivierung der DNA-Synthese oder auch im Absterben der Zel-

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Zellulåre Signale und Signalçbertragung: Kommunikation zwischen Zellen

le. Nahezu jede zellulåre Aktivitåt wird durch Signale reguliert, die von der Zelloberflåche kommen. In seiner Gesamtheit bezeichnet man diesen Prozess der Umsetzung von Information, die durch extrazellulåre Botenmolekçle an eine Zelle heran getragen worden ist, in Verånderungen im Inneren der Zelle als &     . Zum Schluss muss der Prozess der Signalçbertragung beendet werden. Das ist wichtig, denn Zellen mçssen fçr mæglicherweise eintreffende weitere Botschaften empfånglich bleiben. Hierbei besteht der erste Punkt auf der Tagesordnung darin, das extrazellulåre Botenmolekçl aus dem Verkehr zu ziehen. Zu diesem Zweck produzieren manche Zellen extrazellulåre Enzyme, die bestimmte extrazellulåre Botenstoffe abbauen. In anderen Fållen werden aktivierte Rezeptoren internalisiert (Kap. 8.8.1). Sobald der Rezeptor ins Zellinnere gelangt ist, wird er entweder zusammen mit seinem Liganden degradiert, wodurch die Zelle unter Umstånden eine Zeitlang fçr weitere eintreffende Stimuli weniger empfånglich wird, oder Rezeptor und Ligand werden im Inneren eines Endosoms voneinander getrennt, der Ligand wird im Anschluss daran abgebaut, wåhrend der Rezeptor an die Zelloberflåche zurçckgefçhrt wird. Und schlieûlich enthalten Zellen Enzyme, die zellulåre Signalproteine wieder in den Ruhestand zurçckfçhren. In manchen Fållen werden aktivierte Signalproteine zum Abbau freigegeben und neue synthetisiert, um die Signalçbertragung aufrechtzuerhalten.

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15.2 Eine Ûbersicht çber extrazellulåre Botenstoffe und ihre Rezeptoren Es gibt eine Fçlle von Molekçlen, die als -  $1 6   1 wirken kænnen. Darunter: n Kleine Molekçle wie   1 und   1 9 . Beispiele hierfçr sind Glutamat, Glycin, Acetylcholin, Adrenalin, Dopamin und Thyroidhormone.

Diese Molekçle wirken als Neurotransmitter und Hormone. n & , vom Cholesterin hergeleitete Verbindungen. Steroidhormone regulieren die sexuelle Differenzierung und Schwangerschaft, den Kohlenhydratstoffwechsel und die Ausscheidung von Natrium- und Kaliumionen. n # 

 , unpolare Molekçle aus 20 Kohlenstoffatomen, die aus einer Fettsåure, der Arachidonsåure, hervorgehen. Eicosanoide regulieren ein breites Spektrum an biologischen Prozessen, unter anderem Schmerz, Entzçndung, Blutdruck und Blutgerinnung. Verschiedene frei verkåufliche Medikamente zur Behandlung von Kopfschmerzen und Entzçndungen inhibieren die Eicosanoidsynthese. n Eine groûe Palette an /%  und / . Manche darunter finden sich als Membranproteine auf der Oberflåche einer anderen Zelle (s. die Box ¹Aus Sicht des Menschenª in Kap. 7). Andere sind Teil der Extrazellulårmatrix oder mit dieser assoziiert. Schlieûlich gibt es eine groûe Zahl an Proteinen, die in die extrazellulåre Umgebung ausgeschçttet werden und dort an der Regulation von Prozessen wie Zellteilung, Differenzierung, Immunantwort, Zelltod und Ûberleben einer Zelle beteiligt sind. Extrazellulåre Signalmolekçle werden in der Regel ± wenn auch nicht immer ± von spezifischen Rezeptormolekçlen erkannt, die sich auf der Oberflåche der Empfångerzelle befinden. Wie in Abb. 15.1 dargestellt, binden Rezeptoren ihre Signalmolekçle mit hoher Affinitåt und setzen die Interaktion auf der åuûeren Zelloberflåche in Verånderungen im Zellinneren um. Welche Rezeptoren sich zur Ûbermittlung von Signalen im Laufe der Evolution entwickelt haben, ist im Folgenden aufgelistet. n :/  $ 3:/+ 4 bilden eine riesige Familie von Rezeptoren, die jeweils sieben die Membran durchspannende
-Helices enthalten. Diese Rezeptoren setzen die Bindung eines extrazellulåren Botenmolekçls in die Aktivierung von GTP-bindenden Proteinen um. GTP-bindende Proteine oder G-Proteine sind uns bereits in Kap. 8 im Zusammenhang mit der Abschnçrung und



Mit G-Proteinen gekoppelte Rezeptoren und ihre       

Iusion von Vesikeln, in Kap. 9 im Zusammenhang mit der Dynamik von Mikrotubuli, in Kap. 8 und 11 im Rahmen der Proteinsynthese und in Kap. 12 beim nucleocytoplasmatischen Transport begegnet. In diesem Kapitel wollen wir ihre Rolle bei der Ûbermittlung von Botschaften im Rahmen zellulårer ¹Informationsschaltkreiseª untersuchen. n $    !%     9 1 (Rezeptor-Tyrosinkinasen, RTK) bilden eine zweite Rezeptorenklasse, die sich im Laufe der Evolution zur Umsetzung von Signalen, die durch extrazellulåre Botenstoffe çbermittelt werden, in Verånderungen im Zellinneren entwickelt hat. Die Bindung eines spezifischen extrazellulåren Liganden an eine Rezeptor-Tyrosinkinase resultiert gewæhnlich in einer Dimerisierung des Rezeptorproteins, gefolgt von einer Aktivierung der mit dem cytoplasmatischen Teil des Molekçls assoziierten Proteinkinase-Domåne des Rezeptors. Im aktivierten Zustand phosphorylieren diese Proteinkinasen bestimmte Substratproteine im Cytoplasma, die daraufhin ebenfalls ihren Aktivitåtszustand, ihre Lokalisation innerhalb der Zelle oder ihre Fåhigkeit zur Interaktion mit anderen Proteinen in der Zelle åndern. Die meisten Proteinkinasen çbertragen Phosphatgruppen auf Serin- oder Threoninreste ihrer Substratproteine, aber, wie ihr Name schon vermuten låsst, phosphorylieren Rezeptor-Tyrosinkinasen Tyrosinreste. Rezeptor-Tyrosinkinasen sind vor allem an der Regulation von Zellteilung und Differenzierung beteiligt. n 8    1   1 bilden eine dritte Klasse von Zelloberflåchenrezeptoren zur Bindung extrazellulårer Liganden. Die Fåhigkeit dieser Proteine, einen Ionenfluss durch die Plasmamembran zu ermæglichen, wird durch die Bindung des Liganden direkt reguliert. Ein solcher Ionenfluss kann eine vorçbergehende Verånderung des Membranpotenzials bewirken, welche die Aktivitåt anderer Proteine beeinflusst, unter anderem die von spannungsabhångigen Kanålen. Diese Folge von Ereignissen ist die Basis fçr die Bildung eines Nervenimpulses (Kap. 4.8.4). Auûerdem vermag der Einstrom bestimmter Ionen wie Ca2+ die Aktivitåt gewisser cytoplasmatischer Enzyme zu veråndern.

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Wie in Kap. 4.8 ausgefçhrt, fungieren ligandengesteuerte Kanåle als Rezeptoren fçr Neurotransmitter. n &   $ wirken als ligandengesteuerte Transkriptionsfaktoren. Steroidhormone diffundieren durch die Plasmamembran und binden an ihre jeweiligen Rezeptoren im Cytoplasma. Die Bindung des Hormonmolekçls fçhrt zu einer Konformationsånderung, die es dem Hormon-Rezeptorkomplex ermæglicht, in den Kern zu wandern und an Elemente der Promoter- oder Enhancerregionen von hormonsensitiven Genen zu binden (Abb. 12.44). Durch diese Interaktion erhæht oder vermindert sich die Geschwindigkeit der Gentranskription. n Schlieûlich gibt es 9   $ %, die çber einzigartige Mechanismen wirken. Manche darunter ± beispielsweise die Rezeptoren von B- und T-Zellen, die an der Reaktion auf Fremdantigene beteiligt sind ± assoziieren mit bekannten Molekçlen der Signaltransduktionskaskade wie den cytoplasmatischen Tyrosinkinasen. Bei anderen ist der Mechanismus der Signalçbertragung bislang unbekannt.

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 #-oteinen gekoppelte Rezeptoren und ihre second messengers G-Protein-gekoppelte Rezeptoren tragen ihren Namen, weil sie, wie unten im Einzelnen erlåutert wird, mit G-Proteinen wechselwirken. Man bezeichnet die Mitglieder dieser Proteinfamilie auch als Sieben-Helix-Transmembranrezeptoren (7TM-Rezeptoren), weil sie sieben die Membran durchspannende Helices enthalten (Abb. 15.3). Man kennt aus verschiedenen Organismen, angefangen von der Båckerhefe çber Blçtenpflanzen bis hin zu den Såugetieren, hunderte verschiedener GPCRs, die zusammengenommen ein unglaubliches Spektrum an zellulåren Prozessen regulieren. Ja, die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren bilden tatsåchlich die græûte Proteinçberfamilie tierischer Genome. Der Nematode " $

    beispielsweise, dessen Genom aus ungefåhr 19 000 Genen besteht, codiert etwa 1000 verschiedene GPCRs. Zu den natçrlichen Liganden, die an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren binden, gehært eine hæchst unterschiedliche Palette an Hormonen, Neurotransmittern, Opiumderivaten und Lockstoffen (Molekçlen,

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Zellulåre Signale und Signalçbertragung: Kommunikation zwischen Zellen n Abb. 15.3 a, b.        ! %     ( %  9 $,   !         #  a ; !    ,I "      "         "        ?     9   %     ; !    .     " 

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Offensichtlich vermag eine Vielfalt an Agenzien, unter anderem Hormone, Neurotransmitter und sensorische Reize, bei der Informationsçbermittlung durch die Plasmamembran çber den Kontakt zu GPCRs und heterotrimere G-Proteine zu wirken und so eine Vielfalt an zellulåren Reaktionen auszulæsen. Das heiût freilich nicht, dass all die verschiedenen Teile des Signalçbertragungsapparats in allen Zellarten dieselben sind. Der Rezeptor fçr einen bestimmten Liganden kann in mehreren verschiedenen Ausfçhrungen (Isoformen) existieren. So haben Wissenschaftler zum Beispiel 9 verschiedene Isoformen des adrenergen ± Adrenalin bindenden ± Rezeptors nachgewiesen. Den Rezeptor fçr Serotonin, einen hoch wirksamen Neurotransmitter, der in Gehirnregionen, die fçr die Verarbeitung von Emotionen verantwortlich sind, von Nervenzellen ausgeschçttet wird, gibt es in 15 verschiedenen Isoformen. Verschiedene Isoformen eines Rezeptors besitzen oftmals eine unterschiedliche Affinitåt fçr den Liganden oder interagieren mit verschiedenen Arten von G-Proteinen. Solche Isoformen kænnen in ein und derselben Membran koexistieren, oder aber auf verschiedene Arten von Zielzellmembranen verteilt sein. Auch die heterotrimeren G-Proteine, die Signale vom Rezeptor zum Effektor weiterleiten, kænnen in verschiedenen Formen vorliegen, ebenso viele von den Effektoren. Man hat inzwischen mindestens 20 verschiedene G
-Untereinheiten, 5 verschiedene G-Untereinheiten und 11 verschiedene G-Untereinheiten nachgewiesen, dazu 9 Isoformen des Effektors Adenylylcyclase. Verschiedene Kombinationen spezieller Untereinheiten lassen G-Proteine mit unterschiedlichen Reaktionseigenschaften gegençber Rezeptoren und Effektoren entstehen. Wie in Kap. 15.3.1 bereits erwåhnt, bewirken manche G-Proteine auch die Hemmung ihrer Effektoren. Ein und derselbe Reiz kann in einer Zelle ein stimulatorisches G-Protein (eines mit einer G
s-Untereinheit) aktivieren, in einer anderen hingegen ein inhibitorisches (eines mit einer G
i-Untereinheit). Bindet Adrenalin beispielsweise an einen -adrenergen Rezeptor auf der Zelloberflåche einer Herzmuskelzelle, wird ein G-Protein mit einer G
s-Untereinheit aktiviert, das die

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Zellulåre Signale und Signalçbertragung: Kommunikation zwischen Zellen

ATP-Produktion stimuliert und so eine Erhæhung der Kontraktionsgeschwindigkeit und -intensitåt bewirkt. Bindet Adrenalin hingegen an einen -adrenergen Rezeptor im Darm, wird ein G-Protein mit einer G
i-Untereinheit aktiviert, das die cAMP-Produktion inhibiert und zu einer Relaxation der Muskelzellen fçhrt. Manche adrenergen Rezeptoren schlieûlich aktivieren G
qUntereinheiten, die zu einer Aktivierung von PLC fçhren. Derselbe extrazellulåre Botenstoff kann also in unterschiedlichen Zellen eine Vielzahl an Signalçbertragungswegen aktivieren. !.'. Die Regulation des Blutglucosespiegels Von allen Zellarten, die in unserem Kærper vorkommen, kann Glucose als Energiequelle herangezogen werden. Im Rahmen von Glycolyse und Citratzyklus wird sie zu CO2 und Wasser oxidiert; die dabei freiwerdende Energie wird den Zellen dann in Form von ATP fçr energieverbrauchende Reaktionen zur Verfçgung gestellt. Wie in Kap. 2 bereits erærtert, wird Glucose in tierischen Zellen als Glycogen gespeichert, ein groûes verzweigtes Polymer aus Glucosemonomeren, die çber Glycosidbindungen miteinander verknçpft sind. Der Abbau von Glycogen in seine energiereichen Bausteine wird bei Vertebraten durch eine Reihe von Hormonen angeregt, die bekanntesten darunter sind Glucagon und Adrenalin. Glucagon wird beim Absinken des Blutglucosespiegels von den
-Zellen der Bauchspeicheldrçse produziert, Adrenalin in Stresssituationen von den Nebennieren. Ein erhæhter Blutglucosespiegel liefert dem Kærper die nætigen Energiereserven, um sich mit der anstehenden Situation auseinander zu setzen. Beide Hormone binden an spezifische Rezeptoren, die in der Plasmamembran der Zielzellen verankert sind. Bei beiden Hormonen læst die Bindung an den Rezeptor eine Reihe von Reaktionen aus, die schlieûlich zur Aktivierung des Enzyms Glycogen-Phosphorylase fçhren, das die Abspaltung von Glucose-1-phosphat aus Glycogen katalysiert (Abb. 15.9). Auûerdem fçhrt die Bindung an den Rezeptor bei beiden Hormonen zu einer Hemmung des Enzyms Glycogen-Synthase, das die umgekehrte Reaktion katalysiert, nåmlich das Anfçgen von Glucose-Einheiten an wachsende Glycogen-Molekçle. Damit induzieren zwei verschiedene Stimuli (Glucagon, Adrenalin), die von unterschiedlichen Rezeptoren erkannt werden, in ein und derselben Zielzelle dieselbe Reaktion. Im folgenden Abschnitt werden wir sehen, wie dieses gewåhrleistet wird.

n Abb. 15.9.  ;  "  ! %   !' ?    (      (&      % 

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 $  :     :/   $0 Glucagon ist ein kleines Protein aus 29 Aminosåuren, Adrenalin hingegen ein kleines Molekçl, das sich von der Aminosåure Tyrosin ableitet. Von der Struktur her gesehen haben die beiden Molekçle nichts gemein, trotzdem sorgen beide im Falle einer Bindung an einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor fçr den Abbau von Glycogen zu Glucose1-phosphat. Die beiden Rezeptoren unterscheiden sich voneinander hauptsåchlich in der Struktur der Ligandenbindungstasche an der extrazellulåren Zelloberflåche, die fçr das jeweilige Hormon spezifisch ist. Im Anschluss an die Aktivierung durch ihre jeweiligen Liganden aktivieren sie dieselbe Art an heterotrimerem G-Protein, das dann den ATP-Spiegel erhæht. :      7      /9     Cyclisches AMP wird durch %%%  synthetisiert, ein integrales Membranprotein, dessen katalytische Domåne sich auf der Innen-



Mit G-Proteinen gekoppelte Rezeptoren und ihre       

seite der Plasmamembran befindet (Abb. 15.10). Cyclisches AMP stæût eine Kette von Reaktionen an, çber die es schlieûlich, wie in Abb. 15.11 dargestellt, zur Freisetzung von Glucose ins Blut kommt. Der erste Schritt in dieser        ist die Bindung des Hormons an seinen Rezeptor und die dadurch ausgelæste Aktivierung einer G
s-Untereinheit, die ihrerseits eine Adenylylcyclase als Effektor aktiviert. Das aktivierte Enzym katalysiert die Bildung von cAMP (Abb. 15.11, Schritte 1 und 2). Die frisch gebildeten cAMP-Molekçle diffundieren ins Cytoplasma, wo sie an das allosterische Zentrum der regulatorischen Untereinheit einer cAMP-abhångigen Proteinkinase (/    " /) binden (Abb. 15.11, Schritt 3). In seiner inaktiven Form ist PKA ein Heterotetramer aus zwei regulatorischen (R) und zwei katalytischen (C) Untereinheiten. Normalerweise inhibieren die regulatorischen Untereinheiten die katalytische Aktivitåt des Enzyms. Die Bindung von cAMP fçhrt zur Dissoziation der inhibierenden Untereinheiten, d. h. es werden zwei katalytisch aktive Untereinheiten freigesetzt. In einer Leberzelle gehæren zu den Zielsubstraten der PKA zwei

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Enzyme, die eine entscheidend wichtige Rolle im Glucosestoffwechsel einnehmen, die GlycogenSynthase und die Phosphorylase-Kinase (Schritte 4 und 5). Die Phosphorylierung von GlycogenSynthase inhibiert deren katalytische Aktivitåt und verhindert so die Umwandlung von Glucose in Glycogen. Die Phosphorylierung von Phosphorylase-Kinase hingegen veranlasst dieses Enzym dazu, Glycogen-Phosphorylase mit Phosphatgruppen zu versehen. Krebs und Fischer entdeckten einst, dass das Anhången einer einzelnen Phosphatgruppe an einen bestimmten Serinrest in der Aminosåuresequenz der Glycogen-Phosphorylase dieses Enzym aktiviert (Schritt 6) und damit den Abbau von Glycogen veranlasst (Schritt 7). Das im Verlauf der Reaktion gebildete Glucose-1-phosphat wird in Glucose umgewandelt, die dann in die Blutbahn diffundiert und so andere Gewebe des Kærpers erreichen kann (Schritt 8). Die Bindung eines einzelnen Hormonmolekçls auf der Zelloberflåche vermag eine ganze Reihe von Adenylylcyclase-Molekçlen zu aktivieren, die binnen kurzer Zeit eine groûe Zahl von cAMPBotenstoffen erzeugen kænnen. Der Einsatz eines        stellt damit einen Mechanismus dar, çber den sich das durch die ursprçngliche Botschaft ausgelæste Signal um ein Vielfaches verstårken (amplifizieren) låsst. Viele der in der Reaktionskaskade von Abb. 15.11 dargestellten Reaktionsschritte haben eine Verstårkung des Signals zur Folge (diese Schritte sind mit blauen Pfeilen markiert). Cyclisches AMP aktiviert PKA. Jede katalytisch wirksame PKA-Untereinheit phosphoryliert eine groûe Zahl an Phosphorylase-KinaseMolekçlen, die ihrerseits eine noch græûere Zahl an Glycogen-Phosphorylase-Molekçlen phosphorylieren, welche schlieûlich die Bildung einer noch weit hæheren Zahl von Glucosephosphatmolekçlen katalysieren kænnen. Was also als kaum wahrnehmbarer Stimulus auf der Zelloberflåche begann, wåchst sich innerhalb der Zelle rasch zu einer groû angelegten Glucose-Mobilisierungsaktion aus.    /9  &    ' Obschon die raschesten und am besten untersuchten Wirkungen von cAMP im Cytoplasma zu beobachten sind, sind der Kern und seine Gene an der Reaktion trotzdem nicht unbeteiligt. Ein Teil der aktivierten PKA-Molekçle wird in den Kern verfrachtet und phosphoryliert dort wichtige Kernproteine (Abb. 15.11, Schritt 9), insbesondere einen Transkriptionsfaktor namens + #7 (cAMP response element binding protein, zu deutsch: /'#   /  ). Die phosphorylierte Form von CREB bindet

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Zellulåre Signale und Signalçbertragung: Kommunikation zwischen Zellen

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als Dimer an DNA-Regionen (Abb. 15.11, Schritt 10), die eine bestimmte Nucleotidsequenz (TGACGTCA) enthalten, die auch unter dem Namen /'# (+ #, von cAMP response element) gelåufig ist. Man erinnere sich aus Kap. 12.4.3 an die Tatsache, dass Antwort-Elemente-Bindungsstellen auf der DNA sind, an die Transkriptionsfaktoren binden und die Transkription von DNA initiieren ± beziehungsweise die Transkriptionsrate erhæhen ± kænnen. CRE befindet sich in regulatorischen Genregionen, die eine Rolle bei der Reaktion auf cAMP spielen. In Leberzellen beispielsweise sind etliche der Enzyme, die an der Gluconeogenese ± dem Stoffwechselweg çber den aus den Zwischenprodukten der Glycolyse Glucose hergestellt wird (Abb. 3.30) ± beteiligt sind, von Genen codiert, in deren Nachbarschaft CREs angesiedelt sind. Adrenalin und Glucagon aktivieren somit nicht nur die katabolen Enzyme des Glycogenabbaus, sondern færdern gleichzeitig auch die Synthese anaboler Enzyme, wie sie zur Synthese von Glucose aus kleineren Vorlåufermolekçlen notwendig sind.

Wie man vielleicht erwartet, muss es auch einen Mechanismus geben, der die oben angefçhrten Schritte rçckgångig macht, andernfalls wçrde die Zelle endlos im aktivierten Zustand verharren. Leberzellen enthalten Phosphatasen, welche die von den Kinasen angefçgten Phosphatgruppen wieder abspalten. Ein spezielles Mitglied dieser Enzym-Familie, die Phosphatase-1, vermag die Phosphatgruppen von såmtlichen phosphorylierten Enzymen aus Abb. 15.11 wieder zu entfernen: von Phosphorylase-Kinase, Glycogen-Synthase und Glycogen-Phosphorylase. Der Abbau der in der Zelle vorhandenen cAMPMolekçle wird durch das Enzym cAMP-Phosphodiesterase bewerkstelligt, das so ebenfalls zur Beendigung der Reaktion beitrågt. Cyclisches AMP wird in vielen Zellen gebildet und vermittelt die Reaktion auf ein breites Spektrum an Liganden (    , wenn man so will). Einige der von cAMP vermittelten hormonellen Reaktionen sind in Tabelle 15.4 aufgelistet. Die Stoffwechselwege von cAMP sind auch an zellulåren Ablåufen im Nervensystem



Mit G-Proteinen gekoppelte Rezeptoren und ihre       

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eteiligt, unter anderem an Prozessen wie dem Lernen, der Gedåchtnisbildung und der Entstehung von Drogenabhångigkeit. Der chronische Missbrauch von Opiaten beispielsweise fçhrt zu einer Erhæhung des PKA- und Adenylylcyclasespiegels, die mæglicherweise zum Teil fçr die physiologischen Reaktionen wåhrend des Drogenentzugs verantwortlich sind. Ein anderes cyclisches Nucleotid, cyclisches GMP, wirkt, wie die in Kap. 15.7 erærterte induzierte Relaxation in glatten Muskelzellen zeigt, in manchen Zellen ebenfalls als       . Ûberdies spielt cGMP eine Schlçsselrolle beim Signalçbertragungsweg des Sehvorgangs. Da cAMP in den allermeisten Fållen çber die Aktivierung von PKA wirkt, låsst sich die Reaktion einer beliebigen Zelle auf cAMP im Regelfalle aus den jeweils durch die zelltypspezifische Kinase phosphorylierten Proteinen vorhersagen (Abb. 15.2 und Tabelle 15.5). Wåhrend die adrenalinvermittelte Aktivierung von PKA in Leberzellen zum Abbau von Glycogen fçhrt, hat die vasopressinvermittelte Aktivierung desselben Enzyms in Zellen der Nierentubuli eine Erhæhung der Membranpermeabilitåt fçr Wasser zur Folge, die Enzymreaktion als Antwort auf die Bindung von TSH in Schilddrçsenzellen hingegen die Ausschçttung von Thyroidhormonen. Die Reaktion auf die Aktivierung von PKA hångt unter anderem von den in der Zelle jeweils exprimierten Kinasesubstraten ab. !.'/ Die Rolle G-Protein-gekoppelter Rezeptoren bei der sensorischen Wahrnehmung Unsere Fåhigkeiten zu sehen, zu schmecken und zu riechen grçnden sich græûtenteils auf G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Bereits erwåhnt wur-



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de, dass Rhodopsin, dessen Struktur den Auftakt zu diesem Kapitel bildet, ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor ist. Rhodopsin ist ein lichtempfindliches Protein in den Ståbchen unserer Retina ± Photorezeptorzellen, die auf geringe Lichtintensitåten reagieren und uns bei Nacht oder in

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Zellulåre Signale und Signalçbertragung: Kommunikation zwischen Zellen

n 9abelle 15.5.   #) %  ?   I  I +51 # I  )
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  -" 4  +5JJ:1 2  J   3/6>4 besteht aus zwei Untereinheiten, eine davon enthålt zwei SH2-Domånen, die andere die katalytische Domåne (Abb. 15.21 b). PI-3-Kinase selbst wird, sobald ihre SH2-Untereinheiten an die Phosphorylierungsstellen gebunden haben, direkt aktiviert, und phosphoryliert ihrerseits Phosphoinositide an Position 3 des Inositolrings (Abb. 15.21 c). Die Produkte dieses Enzyms, darunter Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) und Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat (PIP3) verbleiben in der cytosolischen Schicht der Plasmamembran und bilden die Bindungsstellen fçr PH-Domånen enthaltende Signalproteine wie die Serin-Threonin-Kinasen PKB und PDK1. Die Verbindung von PDK1 mit der Plasmamembran, und dies in nåchster Nåhe zu PKB, schafft eine Situation, in der PDK1 PKB phosphorylieren und aktivieren kann (Abb. 15.21 c). Mæglicherweise ist eine zweite Kinase an der Aktivierung von PKB beteiligt, doch welche das ist, muss noch geklårt werden.  :    PKB greift in die Regulation des Glucosetransports und der Glycogensynthese direkt ein. Das fçr den insulinabhångigen Glucosetransport verantwortliche Molekçl ist der Glucosetransporter GLUT4 (Kap. 4.7.3). Ist kein Insulin vorhanden, liegt GLUT4 im Cytoplasma insulinsensitiver Zellen in Membranvesikeln vor (Abb. 15.22). Diese Vesikel fusionieren in Reaktion auf die Gegenwart von Insulin mit der Plasmamembran, man nennt diesen Vorgang GLUT4-Translokation. Die Zunahmen an Glucosetransportern in der Plasmamembran fçhrt zu einer vermehrten Glucoseaufnahme (Abb. 15.22). Man hat gezeigt, dass die Translokation von GLUT4 von der Aktivierung der PKB abhångt, denn die Ûberexpression von PKB fçhrt auch ohne Insulin zur Translokation von GLUT4. Der Weg von der PKB-Aktivierung zur GLUT4-Translokation muss allerdings noch erforscht werden. In Muskel- und Leberzellen wird zuviel aufgenommene, çberschçssige Glucose in Form von Glycogen gespeichert. Die Synthese des Glycogens wird bewerkstelligt von Glycogen-Synthase, einem Enzym, das durch die Phosphorylierung von Serin- und Threoninresten abgeschaltet

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wird. Glycogen-Synthase-Kinase 3 (GSK-3) selbst wird ebenfalls durch Phosphorylierung inaktiviert, in diesem Falle durch PKB. Die Aktivierung des PI-3-Kinase-PKB-Wegs in Reaktion auf Insulin fçhrt demnach zu einer Abnahme der GSK-3-Aktivitåt und somit zu einer erhæhten Aktivitåt der Glycogen-Synthase (Abb. 15.21 c). Die Aktivierung von Phosphatase 1, einem Enzym, von dem man weiû, dass es Glycogen-Synthase dephosphoryliert, ist ein weiteres Mittel zur Aktivierung von Glycogen-Synthase.    

Bevor wir das Thema Signaltransduktion çber den Insulinrezeptor verlassen, sollte noch erwåhnt werden, dass eine der verbreitetesten Krankheiten des Menschen, Diabetes mellitus, durch einen Defekt im Insulin-Signalweg bedingt ist. Es gibt zwei Formen von Diabetes: Typ 1, der etwa 5 bis 10% aller Fålle ausmacht, und Typ 2, der fçr die çbrigen 90 bis 95% verantwortlich ist. Diabetes Typ 1 beruht auf der mangelnden Fåhigkeit, Insulin zu produzieren und wird in der Box ¹Aus Sicht des Menschenª in Kap. 17 behandelt. Typ-2-Diabetes ist eine komplexere Krankheit, deren Håufigkeit weltweit mit alarmierender Geschwindigkeit zunimmt. Diese

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Zellulåre Signale und Signalçbertragung: Kommunikation zwischen Zellen

Zunahme ist mit groûer Wahrscheinlichkeit durch die verånderten Lebens- und Essgewohnheiten zu erklåren. Man hålt das Zusammenspiel von kalorienreicher Ernåhrung und sitzender Lebensweise fçr die Ursache dieses chronischen Anstiegs der Insulinsekretion. Ein ståndig erhæhter Insulinspiegel çberstimuliert die Zielzellen in der Leber und andernorts im Kærper und fçhrt damit einen Zustand herbei, den man als 6   $ (oder 6       ) bezeichnet, d. h. diese Zellen reagieren auf die Gegenwart des Hormons nicht mehr. Man hat dies durch genetische Experimente an Måusen untermauert: Mutationen im Gen fçr den Insulin-Rezeptor oder fçr IRS-2, die Zellen die Fåhigkeit nehmen, auf Insulin zu reagieren, lassen bei den Måusen Diabetes entstehen. In der menschlichen Population sind diese Mutationen allerdings extrem selten, so dass die Frage nach der tatsåchlichen Ursache fçr die Entstehung der Insulinresistenz noch nicht abschlieûend zu beantworten ist. Unabhångig davon, welcher Mechanismus zur Insulinresistenz fçhrt, die Folge ist in jedem Fall ein erhæhter Blutglucosespiegel, weil die Zellen des Kærpers nicht imstande sind, den Zucker hinreichend effizient aus dem Blut zu entfernen. Ein erhæhter Blutzuckerspiegel aber stimuliert die Bauchspeicheldrçse zusåtzlich zur Sekretion von Insulin, weil der Kærper versucht, die Glucoseaufnahme in den Geweben der Peripherie zu erhæhen. Dieser Teufelskreis aus peripherer Insulinresistenz und einer verstårkten Insulinsekretion kann zu einer Zerstærung der -Zellen der Bauchspeicheldrçse fçhren. Eine der Strategien zur Behandlung von Diabetes besteht darin, die Insulinresistenz zu verhindern, d. h. die Zellen wieder fçr Insulin zu sensibilisieren. Måuse, denen die Negativregulatoren des Insulin-Signalwegs fehlen, z. B. die Proteintyrosinphosphatase 1B (PTP-1B), zeigen einen deutlichen Anstieg ihrer Insulinsensitivitåt. Daraus ergibt sich die Chance, dass Proteine, die im Insulin-Signalweg eine Rolle spielen, als Angriffsziel von Antidiabetika genutzt werden kænnten. Anschaulich wird dies an folgendem Beispiel: Die Phosphatase PTP-1B entfernt, so nimmt man an, Phosphatgruppen von Tyrosinresten am Insulinrezeptor, inaktiviert diesen dadurch und beendet so die Hormonreaktion. Måuse, die man mit stark fetthaltiger Nahrung fçttert, entwickeln in der Regel eine Insulinresistenz, wie man sie vom Diabetes Typ 2 kennt, und werden çbergewichtig. Måuse hingegen, denen PTP-1B fehlt (PTP-1B-Knockout-Måuse zum Beispiel), behalten, wenn man sie mit einer fettreichen Diåt hålt, ihre Insulinsensitivitåt und einen nor-

malen Blutglucosespiegel. Man nimmt an, dass das Fehlen der Phosphatase PTP-1B die Rezeptorinaktivierung verhindert und so die Insulinsensitivitåt der Tiere erhæht. Aus diesen Untersuchungen ergibt sich demnach, dass Diabetes behandelbar sein mçsste durch Medikamente, welche die menschliche Variante von PTP-1B spezifisch inhibieren. Man untersucht PTP-1B daher gegenwårtig auf ihre Eignung als Angriffsziel fçr die Behandlung von Diabetes und Ûbergewicht. !.' Signalwege bei Pflanzen Pflanzen und Tiere haben bestimmte grundlegende Signalmechanismen gemeinsam, unter anderem den Einsatz von Ca2+ und Phosphoinositiden als Botenstoff, andere Mechanismen hingegen sind jedem der beiden Reiche allein vorbehalten. Cyclische Nucleotide zum Beispiel, die am weitesten verbreiteten Botenstoffe bei Tieren, scheinen bei Pflanzensignalwegen so gut wie keine Rolle zu spielen. Auch Rezeptor-Tyrosinkinasen fehlen in Pflanzenzellen. Andererseits enthalten Pflanzen, wie im Folgenden erlåutert wird, eine Art von Proteinkinase, die Tierzellen fehlt. Man weiû seit langem, dass Bakterienzellen eine Proteinkinase enthalten, die Histidinreste phosphoryliert und auf diese Weise die zellulåre Reaktion auf ein breites Spektrum an Umweltsignalen vermittelt. Bis zum Jahre 1993 war man der Ansicht, dass diese Enzyme Bakterienzellen allein vorbehalten seien, doch dann wurden sie sowohl in Hefen als auch in Blçtenpflanzen nachgewiesen. Bei beiden Arten von Eukaryoten sind diese Enzyme Transmembranproteine mit einer extrazellulåren Domåne, die als Rezeptor fçr externe Stimuli fungiert, und einer cytoplasmatischen Histidinkinase-Domåne, die Signale ins Cytoplasma çbermittelt. Eines der am besten untersuchten unter diesen Pflanzenproteinen wird von dem Gen . codiert. Das Produkt dieses Gens ist ein Rezeptor fçr das Reifegas Ethylen (C2H4), ein Pflanzenhormon, das ein breites Spektrum an Entwicklungsprozessen reguliert, unter anderem die Samenreifung, die Blçtenbildung und die Fruchtreifung. Die Bindung von Ethylen an seinen Rezeptor læst die Signalweiterleitung çber einen Weg aus, der dem des MAPK-Signalwegs der Hefe- und Tierzellen çberaus åhnlich ist. Wie bei den anderen Eukaryoten sind die nachgeschalteten Empfånger des MAPK-Signalwegs bei Pflanzen Transkriptionsfaktoren, welche die Expression bestimmter, fçr die Reaktion auf den extrazellulåren Botenstoff



Calcium als intrazellulårer Botenstoff

notwendiger, Gene in Proteine aktivieren. Die gegenwårtige Analyse der riesigen Datenmengen aus der Sequenzierung des Genoms von !$  und anderen Pflanzen wird die Øhnlichkeiten und Unterschiede zwischen pflanzlichen und tierischen Signalwegen deutlicher herausarbeiten.

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15.5 Calcium als intrazellulårer Botenstoff Calciumionen spielen bei einer bemerkenswerten Bandbreite zellulårer Aktivitåten eine bedeutsame Rolle, dies gilt unter anderem fçr die Muskelkontraktion und die Zellteilung, die Sekretion, die Befruchtung, die zellulåre Motilitåt und die synaptische Signalçbertragung. In jedem dieser Fålle wird auf der Zelloberflåche eine extrazellulåre Botschaft empfangen, die zu einem dramatischen Anstieg der Calciumionen-Konzentration im Cytosol fçhrt. Die Calciumkonzentration einzelner Zellkompartimente wird kontrolliert durch die balancierte Aktivitåt von Calciumpumpen und Calciumionenkanålen, die in die Membran um das jeweilige Kompartiment eingebettet sind. Die Calciumionen-Konzentration im Cytosol einer ruhenden Zelle wird auf åuûerst geringem Niveau gehalten, in der Regel bei um die 10±7M. Im Extrazellulårraum hingegen, im Lumen des endoplasmatischen Reticulums oder in der Vacuole einer Pflanzenzelle ist die Konzentration im Normalfall 10 000-mal hæher als im Cytosol. Der cytosolische Calciumspiegel ist deshalb so niedrig, weil Ca2+-Ionenkanåle so-

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wohl in der Plasmamembran als auch in den Membranen des ER normalerweise geschlossen gehalten werden, so dass die Membran fçr dieses Ion nahezu impermeabel ist, und weil die ATP-gespeisten Ca2+-Transportsysteme der Plasma- und ER-Membranen Calcium aus dem Cytosol herauspumpen.4 Auf den vorhergehenden Seiten wurden zwei Haupttypen von Signalrezeptoren beschrieben, G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und RezeptorTyrosinkinasen. In Kap. 15.3.3 wurde festgestellt, dass die Interaktion eines extrazellulåren Botenstoffmolekçls mit einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor zur Aktivierung des Enzyms Phospholipase C- fçhren kann, die das Phosphoinositid PIP2 so spaltet, dass IP3 freigesetzt wird, welches Calcium-Kanåle in der ER-Membran æffnet und so ein Anstieg der cytosolischen Ca2+-Ionenkonzentration bewirkt. Extrazellulåre Botenstoffe, die ihr Signal çber RTKs vermitteln, kænnen eine åhnliche Reaktion auslæsen. Der Hauptunterschied besteht darin, dass RTKs Vertreter der Phospholipase-C--Subfamilie aktivieren, die eine SH2-Domåne besitzen, die es ihnen ermæglicht, an die aktivierte phosphorylierte RTK zu binden. PLC- und PLC-C- katalysieren dieselbe Reaktion, Endprodukt beider ist IP3. Noch eine dritte Hauptroute fçhrt zur Erhæhung des cytosolischen Ca2+-Spiegels, wir sind ihr bei unserer Beschreibung der synaptischen Ûbertragung in Kap. 4.8.4 bereits begegnet. In diesem Falle ist es ein Nervenimpuls, der zu einer Depolarisierung der Plasmamembran fçhrt, die Úffnung eines spannungsgesteuerten Calciumkanals veranlasst und so den Einstrom von Ca2+-Ionen ermæglicht. Unser Wissen um die Rolle von Ca2+-Ionen im Rahmen zellulårer Reaktionen hat sich in hohem Maûe erweitert, seit man Indikatormolekçle entwickelt hat, die in Gegenwart von freiem Calcium Licht emittieren. Anfang der 1990er Jahre wurden neue, hoch empfindliche fluoreszierende, calciumbindende Verbindungen (z. B.  F) gefunden. Diese Verbindungen werden in einer Form synthetisiert, die per Diffusion durch die Plasmamembran ins Zellinnere gelangen kann. Einmal im Inneren angelangt, wird die Verbindung so modifiziert, dass sie die Zelle nicht mehr verlassen kann. Mit Hilfe dieser Substanzen låsst sich die Konzentration an freien Calciumionen in den verschiedenen Teilen einer lebenden Zelle zu verschiedenen Zeiten bestim4 Mitochondrien spielen fçr die Ausschçttung und Freisetzung von Ca2+-Ionen ebenfalls eine wichtige Rolle, aber diese ist noch nicht gut genug verstanden und soll hier nicht diskutiert werden.

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Zellulåre Signale und Signalçbertragung: Kommunikation zwischen Zellen

men, indem man das emittierte Licht mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie und computerassistierter bildgebender Verfahren misst. Der Einsatz von calciumsensitiven, Licht emittierenden Molekçlen hat uns aufregende Portråts von den komplexen råumlichen und zeitlichen Verånderungen der Konzentrationen an freiem Calcium im Cytosol einer Zelle in Reaktion auf die unterschiedlichsten Stimuli pråsentiert. Dies ist einer der Vorteile bei der Untersuchung calciumvermittelter Reaktionen im Vergleich zu denen anderer Arten von Botenstoffen, deren Lokalisation in der Zelle man weit weniger leicht sichtbar machen kann. Je nach Art der reagierenden Zelle kann ein bestimmter Auûenreiz repetitive Oszillationen der Calciumionen-Konzentration hervorrufen, wie sie in Abb. 15.8 dargestellt sind, eine Welle der Calciumfreisetzung in Gang setzen, die sich von einem Ende der Zelle zum anderen hin fortpflanzt (Abb. 15.25), oder vorçbergehend eine lokale Calciumfreisetzung in einem Teil der Zelle auslæsen. Abbildung 15.23 zeigt eine Purkinjezelle, eine bestimmte Art von Neuron im Kleinhirn von Såugetieren, die çber ein delikates Netz von postsynaptischen Dendriten Kontakte zu tausenden anderer Zellen unterhålt. Die mikroskopische Aufnahme in Abb. 15.23 zeigt die Freisetzung von freiem Calcium in einer bestimmten Region des ¹Dendritenbaumsª einer Purkinjezelle in Reaktion auf eine synaptische Aktivierung. Die schlagartige Calciumfreisetzung bleibt auf diese Zellregion beschrånkt. Die zuvor beschriebenen IP3-Rezeptoren sind einer der beiden Haupttypen von Calciumionenkanålen in der ER-Membran. Der andere Rezeptortyp wird als %   $ ( % ) bezeichnet, weil er das toxische Pflanzenalkaloid Ryanodin bindet. Ryanodin-Rezeptoren finden sich in erster Linie in erregbaren Zellen und sind am besten untersucht in Skelett- und Herzmuskelzellen, wo sie den Anstieg der Calciumionen-Konzentration nach dem Eintreffen eines Aktionspotenzials vermitteln (Abb. 9.65). Mutationen in der herzspezifischen RyR-Isoform sieht man heutzutage in Zusammenhang mit dem plætzlichen Herztod wåhrend der Ausçbung von Sport. Je nach Art der Zelle, in der sie vorkommen, kænnen RyRs durch ganz unterschiedliche Agenzien, darunter auch durch Calcium selbst geæffnet werden. Der Influx einer begrenzten Menge an Calcium durch geæffnete Kanåle in der Plasmamembran induziert die Úffnung von Ryanodinrezeptoren in der Membran des endoplasmatischen Reticulums und damit die Freisetzung von Calcium ins Cytosol (Abb. 15.24). Man bezeichnet dieses Phånomen als    

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langt (Abb. 15.36). Das ist deshalb wichtig, weil das Freisetzen von Zelltrçmmern eine Entzçndungsreaktion hervorrufen wçrde, die betråchtliche Gewebeschåden nach sich ziehen kænnte. Genauso wie es Signale gibt, die eine Zelle der Selbstzerstærung anheim geben, gibt es auf der anderen Seite auch Signale, die das zellulåre Ûberleben sichern. Ja, die Interaktion zwischen

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TNF und seinem Rezeptor çbermittelt in vielen Fållen zwei entgegengesetzte Signale an das Zellinnere: eines, das die Apoptose stimuliert, und eines, welches das Ûberleben der Zelle sichert. Die Folge davon ist, dass die meisten Zellen, die einen TNF-Rezeptor auf der Zelloberflåche tragen, bei Behandlung mit TNF keine Apoptose durchlaufen. Dieser Befund war insofern eine Enttåuschung, als man ursprçnglich gehofft hatte, dass TNF als Agens zur Eliminierung von Tumorzellen wirken kænnte. Das Ûberleben von Zellen wird im typischen Falle durch die Aktivierung eines wichtigen Transkriptionsfaktors namens NF-jB vermittelt, der die Expression von Genen færdert, die çberlebenswichtige Zellproteine codieren. Es sieht danach aus, als hinge das Schicksal einer Zelle ± Ûberleben oder Tod ± von der richtigen Balance zwischen proapoptotischen und antiapoptotischen Signalen ab.

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Zusammenfassung   $1 &       / 1 "   6      /           

     ' 0 Zur zellulåren Signalçbertragung gehært im Regelfall die Erkennung eines extrazellulåren Stimulus auf der Zelloberflåche und die Ûbermittlung des Signals durch die Plasmamembran ins Zellinnere, wo es dann eine Reaktion auslæst. Eine Reaktion kann unter anderem in einer verånderten Genexpression bestehen, einer verånderten Aktivitåt metabolischer Enzyme, einem Umbau des Cytoskeletts, einer Verånderung der Ionenpermeabilitåt, einer Aktivierung der Synthese von DNA oder dem Tod der Zelle. Man bezeichnet diesen Prozess oft auch als Signaltransduktion.

Innerhalb der Zelle wird Information entlang verschiedener Signalwege weitervermittelt, die in vielen Fållen Proteinkinasen und Proteinphosphatasen einschlieûen, die ihre Substrate durch Konformationsånderungen aktivieren oder inhibieren. Ein weiteres auffallendes Merkmal der Signalwege ist die Beteiligung GTP-bindender Proteine, die als Schalter fungieren, um einen Signalweg an- oder abzuschalten (Kap. 15.1). .  - $1 &  3first messengers)            6

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Kellulåre Signale und Signalçbertragung: Kommunikation zwischen Zellen

Bindung an Rezeptoren, die integrale Membranproteine mit sieben membrandurchspannenden
-Helices sind (GPCRs). Das Signal wird vom Rezeptor zum Effektor çber ein heterotrimeres G-Protein çbermittelt. Man bezeichnet diese Proteine als heterotrimer, weil sie aus drei Untereinheiten (
,  und ) bestehen. Und als G-Proteine, weil sie Guaninnucleotide ± GDP oder GTP ± binden. Jedes G-Protein kann in zwei Zustånden vorliegen: im aktiven, d. h. mit gebundenem GTP, und im inaktiven mit gebundenem GDP. Man kennt hunderte verschiedener G-Protein-gekoppelter Rezeptoren, die auf eine breite Palette an Stimuli reagieren. All diese Rezeptoren wirken çber einen åhnlichen Mechanismus. Die Bindung des Liganden an dessen spezifischen Rezeptor bewirkt eine Konformationsånderung des Rezeptors, durch den sich dessen Affinitåt fçr das G-Protein erhæht. Daraufhin bindet der Rezeptor an das G-Protein und veranlasst dieses, das gebundene GDP freizusetzen und durch GTP zu ersetzen und sich so in seinen aktiven Zustand umzuwandeln. Der Austausch der Guaninnucleotide veråndert die Konformation der G
-Untereinheit und fçhrt so zu deren Dissoziation von den beiden anderen Untereinheiten, die als G-Komplex vereinigt bleiben. Jede dissoziierte G
-Untereinheit mit gebundenem GTP vermag bestimmte Effektormolekçle, beispielsweise Adenylylcyclase, spezifisch zu aktivieren. Die dissoziierte G
-Untereinheit verfçgt auûerdem çber GTPase-Aktivitåt und kann gebundenes GTP zu GDP hydrolysieren und damit gleichzeitig die eigene Fåhigkeit zur Aktivierung weiterer Effektormolekçle abschalten. Im Anschluss daran findet sich G
GDP mit dem G-Komplex erneut zum Trimer zusammen und versetzt das System erneut in den Ruhezustand. Jede der drei Untereinheiten im heterotrimeren G-Protein kann in verschiedenen Isoformen vorliegen. Verschiedene Kombinationen der einzelnen Untereinheiten lassen G-Proteine mit ganz unterschiedlichen Interaktionseigenschaften fçr Rezeptoren und Effektoren entstehen (Kap. 15.3.1).   )$    9 :  '     &  '  "       9  :/+  0 Der Abbau von Glycogen zu Glucose wird durch die Hormone Adrenalin und Glucagon stimuliert, die beide als      wirken und an ihre jeweiligen Rezeptoren auf der Oberflåche von Zielzellen binden. Die Bindung dieser Hormone aktiviert einen Effektor, die Adenylylcycla-

se, auf der inneren Membranoberflåche, und stæût damit die Produktion des diffusiblen  $       cAMP an. Cyclisches AMP bindet an die regulatorischen Untereinheiten einer cAMP-abhångigen Proteinkinase namens PKA, die daraufhin Phosphorylase-Kinase und Glycogen-Synthase phosphoryliert und so erstere aktiviert, letztere hingegen inhibiert. Die aktivierte Phosphorylase-Kinase versieht nun das Enzym Glycogen-Synthase mit Phosphatgruppen und aktiviert diese zum Abbau von Glycogen zu Glucose-1-Phosphat, das nunmehr zu Glucose umgewandelt wird. Am Ende dieser Reaktionskaskade ist die ursprçngliche Botschaft ± die durch die Bindung des Hormons auf der Zelloberflåche vermittelt wurde ± um ein Vielfaches verstårkt und die Reaktionszeit massiv verkçrzt worden. Solche Reaktionskaskaden bieten neben allem anderen auch verschiedene Angriffsstellen fçr regulatorische Prozesse. Dem Hinzufçgen von Phosphatgruppen durch Kinasen steht die Reaktion der Phosphatasen entgegen, die Phosphatgruppen entfernen. In vielen Zellen wird in Reaktion auf ein breites Spektrum an    $   cAMP produziert. Welchen Lauf die Ereignisse nehmen, hångt von den Proteinen ab, die durch die cAMP-abhångige Kinase jeweils phosphoryliert werden (Kap. 15.3.2). /      +    '  '    #   61   /    "     :/    9  '  0 /6/      +   /    %  P"?     3/6/F4  $' 9   second messengers 6  E"P"?     36/>4  E"F %% 3:40 DAG verbleibt in der Plasmamembran und aktiviert dort das Enzym Proteinkinase C, das bei einer ganzen Reihe von Proteinen Serinund Threoninreste phosphoryliert. Die konstitutive Aktivierung von Proteinkinase C fçhrt zu einem Verlust der Wachstumskontrolle. IP3 ist ein kleines wasserlæsliches Molekçl, das ins Cytoplasma diffundieren kann, wo es an IP3-Rezeptoren auf der Oberflåche des glatten endoplasmatischen Retikulums bindet. IP3-Rezeptoren sind tetramere Calciumionenkanåle und die Bindung von IP3 fçhrt zu einer Úffnung dieser Kanåle und dem Einstrom von Calcium ins Cytosol (Kap. 15.3.4). .  - $1 &       $1       7     - $1 1   $!%     3 !4"      9    !%    1"    & $   6



Zusammenfassung

   /    0 ?TKs regulieren die unterschiedlichsten Zellfunktionen: Zellwachstum und -teilung, den Verlauf der Zelldifferenzierung, die Aufnahme fremder Partikel und das Ûberleben der Zelle. Die bestuntersuchten wachstumsfærdernden Liganden wie PDGF, EGF und FGF aktivieren als Signalweg die MAPK-Kaskade, zu der unter anderem ein kleines monomeres G-Protein namens Ras gehært. Wie viele andere G-Proteine pendelt auch Ras zwischen einer inaktiven Form, in der es GDP, und einer aktiven, in der es GTP gebunden hat. In seiner aktiven Form stimuliert Ras nachgeschaltete Effektoren des Signalwegs. Wie andere G-Proteine besitzt auch Ras GTPase-Aktivitåt (die durch ein GAP stimuliert wird), die das gebundene GTP zu GDP hydrolysiert und sich auf diese Weise selbst abschaltet. Bindet ein Ligand an die RTK, kommt es zur Trans-Autophosphorylierung der cytoplasmatischen Domåne des Rezeptors und damit an der inneren Membranoberflåche zur Rekrutierung von Sos, einem Ras-Aktivator. Sos katalysiert den Austausch von GDP gegen GTP und damit die Aktivierung von Ras. Aktiviertes Ras besitzt eine erhæhte Affinitåt fçr ein weiteres Protein namens Raf, das ebenfalls an die Plasmamembran geholt und dort zu einer aktiven Proteinkinase wird, die, wie in Abb. 15.18 dargestellt, eine geordnete Folge von Phosphorylierungsreaktionen in Gang setzt. Schlieûlich sind das Ziel der MAPK-Kaskade Transkriptionsfaktoren, welche die Expression von Genen stimulieren, deren Produkte eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung des Zellzyklus spielen und zur Initiation von DNA-Synthese und Zellteilung fçhren. Die MAPK-Kaskade findet sich in allen Eukaryoten von der Hefe bis zum Såugetier, hat sich im Laufe der Evolution jedoch in unterschiedlichen Zellarten so entwickelt, dass sie unterschiedlichen Bedçrfnissen gerecht wird und daher unterschiedliche Reaktionen hervorruft (Kap. 15.3.6). 6   9    :D         $    $!%

  "  6  $0 Die aktivierte Kinase fçgt an Tyrosinreste des Rezeptors und rezeptorassoziierter Andockproteine wie der Insulinrezeptorsubstrate (IRS) Phosphatgruppen an. Die phosphorylierten Tyrosinreste der Insulinrezeptorsubstrate fungieren als Andockstellen fçr Proteine mit SH2-Domånen, die nach der Bindung an IRS aktiviert werden. Durch die Bindung unterschiedlicher Signalproteine an die phosphorylierten IRS kænnen unter-

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schiedliche Signalwege aktiviert werden. Einer der Signalwege vermag DNA-Synthese und Zellteilung zu stimulieren, ein anderer die Verlagerung von Glucosetransportern in die Zellmembran, wieder ein anderer Transkriptionsfaktoren, welche die Expression insulinspezifischer Gene anstoûen (Kap. 15.4.2).      #    %    +    $   '    1   9"      ; 9 6 1       +%     /    $$  "     &  $1   0 Die Konzentration der Ca2+-Ionen im Cytosol wird durch Ca2+-Pumpen in der Plasmamembran und der Membran des glatten ER in der Regel bei 10±7M gehalten. Die unterschiedlichsten Stimuli ± angefangen vom Spermium beim Befruchtungsvorgang bis hin zu einem Nervenimpuls, der eine Muskelzelle erreicht ± verursachen einen plætzlichen Anstieg der cytosolischen Calciumionen-Konzentration, dem unter Umstånden die Úffnung der Ca2+-Ionenkanåle in der Plasmamembran, der IP3-Rezeptoren oder der Ryanodinrezeptoren ± zwei anderen Arten von Ca2+-Kanålen in der Membran des glatten ER ± folgt. Je nach Zelltyp werden Ryanodinrezeptoren durch Aktionspotenziale zur Úffnung veranlasst oder durch den Einstrom geringer Ca2+-Mengen durch die Plasmamembran. Eine erhæhte Ca2+-Konzentration im Cytoplasma kann zur Aktivierung oder Inhibierung verschiedener Enzyme und Transportsysteme fçhren, zur Fusion von Membranen, zu Verånderungen des Cytoskeletts oder der kontraktilen Eigenschaften. Calcium wirkt auf diese unterschiedlichen Angriffsziele nicht in seiner Form als freies Ion, sondern es bindet an eine Reihe von kleinen calciumbindenden Proteinen, welche die Reaktion in Gang setzen. Das meistverbreitete unter diesen Proteinen ist Calmodulin, ein Protein mit vier Calciumbindungsstellen. Auch in Pflanzenzellen ist das Calciumion ein wichtiger intrazellulårer Botenstoff und vermittelt dort die Reaktion auf eine Vielfalt an Auûenreizen wie Verånderungen der Licht- und Druckverhåltnisse, die Schwerkraft und die Konzentration an Pflanzenhormonen wie Abcisinsåure (Kap. 15.4.3). .   &  '         9. Signale von unterschiedlichen Liganden kænnen konvergieren und sich bei einem gemeinsamen Effektor vereinen, und Signale kænnen zwischen verschiedenen

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Kellulåre Signale und Signalçbertragung: Kommunikation zwischen Zellen

Ûbertragungswegen hin und her gesendet werden (Crosstalk) (Kap. 15.6). &  -  3)(4 '   $1 7 "           $     0 Zu den vielen çber NO vermittelten Aktivitåten gehært die Relaxation der glatten Muskelzellen, welche die Blutgefåûe auskleiden. Stickstoffoxid wird von dem Enzym Nitridoxidase produziert, dessen Substrat Arginin ist. NO wirkt oftmals çber die Aktivierung von Guanylylcyclase, die dann den  $       cGMP produziert (Kap. 15.7). &  '      "     " 0 Zu den Beispielen fçr das Wirken der Apoptose gehært das Absterben çberschçssiger Nervenzellen, der Tod von T-Lymphocyten, die kærpereigene Gewebe angreifen, und der Tod potentieller

Krebszellen. Der Zelltod durch Apoptose ist charakterisiert durch die Komprimierung der Zelle und ihres Kerns, sowie des sauberen Zerschneidens von Chromatin durch spezielle Endonucleasen. Die Apoptose wird durch proteolytische Enzyme vermittelt, die Caspasen, die wichtige Proteinsubstrate durch die Entfernung eines Teils der Polypeptidkette aktivieren bzw. deaktivieren. Man kennt zwei verschiedene Apoptosewege, einen, der durch extrazellulåre Stimuli ausgelæst und çber Todesrezeptoren wie TNFR1 wirksam wird, und einen, der durch internen zellulåren Stress ausgelæst wird ± beispielsweise durch die Freisetzung von Cytochrom c aus dem Intermembranraum der Mitochondrien und die Aktivierung proapoptotischer Vertreter der Bcl-2-Proteinfamilie (Kap. 15.8).

Zur Selbstçberprçfung 1. Das Thema zellulåre Signalçbertragung wurde an den Schluss dieses Buchs gesetzt, weil es so viele verschiedene Aspekte der Biologie miteinander verknçpft. Wçrden Sie, nun, da Sie das Kapitel gelesen haben, diesem Standpunkt beipflichten, oder nicht? Untermauern Sie Ihre Sicht durch Beispiele. 2. Angenommen, der Signalweg in Abb. 15.2 wçrde zur Aktivierung eines Gens fçhren, das eine cyclinabhångige Kinase inhibiert, die dafçr verantwortlich ist, eine Zelle in die S-Phase des Zellzyklus zu manævrieren. Wie wçrde eine Mutation, welche die Phosphatase 2 ausschaltet, das Zellwachstum beeinflussen? Und wie eine åhnliche Mutation in der Proteinkinase 3? 3. Wie wçrde die Leberfunktion durch eine Mutation im Gen fçr eine cAMP-Phosphodiesterase beeinflusst? Wie durch eine Mutation im Gen fçr einen Glucagonrezeptor? Was håtte Mutation im Gen fçr Phosphorylase-Kinase zur Folge? Und was eine Mutation, die das aktive Zentrum der GTPase einer G
-Untereinheit veråndert? (Gehen Sie in allen Fållen davon aus, dass die Mutationen zum Funktionsverlust des Genprodukts fçhren.) 4. Ca2+, IP3 und cAMP sind allesamt als  $       beschrieben worden. In welcher Hinsicht åhneln sich ihre Wirkmechanismen? Und worin unterscheiden sie sich?

5. Welche Schritte fçhren in der in Abb. 15.18 dargestellten Reaktionskaskade zur Verstårkung eines Signals und welche nicht? 6. Angenommen, Adrenalin und Noradrenalin vermæchten in einer bestimmten Zelle eine åhnliche Reaktion auszulæsen. Wie kænnten Sie herausfinden, ob die beiden Verbindungen çber die Bindung an denselben Oberflåchenrezeptor wirken? 7. Eines der Schlçsselexperimente zum Nachweis dessen, dass % <   (Kap. 7.5) den Durchtritt kleiner Molekçle gestatten, wurde mit Herzmuskelzellen (die auf Noradrenalin mit Kontraktion reagieren) durchgefçhrt, die man mit Granulosazellen der Eierstæcke (die auf FSH mit verschiedenen metabolischen Verånderungen reagieren) % <   bilden lieû. Die Forscher fçgten der Mischzellkultur FSH hinzu und konnten die Kontraktion der Herzmuskelzellen beobachten. Wie ist es mæglich, dass Muskelzellen auf FSH reagieren, und was sagt Ihnen das çber die Struktur und Funktion von % <  ? 8. Auf welche Weise wçrde Ihrer Meinung nach ein GTP-Analog, das die Zelle nicht zu hydrolysieren vermag (ein nicht hydrolysierbares Analog) die Ereignisse der zellulåren Signalçbertragung wåhrend der Stimulation einer Leberzelle durch Gluca-



Zur Selbstçberprçfung

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gon beeinflussen? Welche Wirkung håtte dasselbe Analog auf die Signaltransduktion einer Epithelzelle nach der Einwirkung von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF)? Und wie nehmen sich diese Effekte im Vergleich mit denen von Choleratoxin (Kap. 15.3.1) auf diese Zellen aus? Sie haben den Verdacht, dass Phosphatidylcholin als Vorlåufer fçr einen        dienen kænnte, der in der Population von endokrinen Zellen, die Sie untersuchen, die Ausschçttung eines Hormons bewirkt. Auûerdem nehmen Sie an, dass der von der Plasmamembran in Reaktion auf den Stimulus freigesetzte        Cholinphosphat ist. Was fçr ein Experiment wçrden Sie durchfçhren, um Ihre Hypothese zu verifizieren? Abbildung 15.23 zeigt die lokalen Verånderungen der Calciumionen-Konzentration im Dendritenbaum einer Purkinjezelle. Calciumionen sind kleine, rasch diffundierende Agenzien. Wie bringt eine Zelle es fertig, in verschiedenen Regionen ihres Cytosols unterschiedliche Calciumionenkonzentrationen aufrechtzuerhalten? Was, glauben Sie, wçrde geschehen, wenn Sie eine kleine Menge Calciumchlorid-Læsung in eine Zellregion injizierten, in die Sie vorher eine fluoreszierende Substanz zum Calciumnachweis injiziert haben? Formulieren Sie eine Hypothese, die erklåren kænnte, auf welche Weise der Kontakt der åuûeren Eihçlle mit einem befruchtenden Spermium eine Welle der Calciumfreisetzung verursachen kann, die sich, wie in Abb. 15.25 gezeigt, çber das ganze Ei ausbreitet. Da Calmodulin viele unterschiedliche Effektoren aktiviert (Proteinkinasen, Phosphodiesterasen, Calciumtransportproteine), muss ein Calmodulin-Molekçl viele unterschiedliche Bindungsstellen auf seiner Oberflåche vereinigen. Wçrden Sie dieser Aussage zustimmen? Warum oder warum nicht? Diabetes mellitus ist eine Krankheit, die durch eine Reihe unterschiedlicher Stærungen zustande kommen kann, welche die Funktion von Insulin in irgendeiner Weise beeintråchtigen. Beschreiben Sie drei verschiedene molekulare Anomalien einer Leberzelle, die bei verschiedenen Patienten dasselbe Krankheitsbild, z. B. eine erhæhte Glucosekonzentration in Blut und Urin, hervorrufen kænnen.

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14. Wçrden Sie erwarten, dass die Reaktion einer Zelle auf EGF stårker von den jeweils herrschenden Flieûeigenschaften der Plasmamembran abhångt als die auf Insulin? Warum bzw. warum nicht? 15. Wçrden Sie erwarten, dass eine Mutation in Ras als Krebsursache dominant oder rezessiv wirkt? Warum? (Eine dominante Mutation zeigt auch Wirkung, wenn nur eines der homologen Allele mutiert ist, bei einer rezessiven mçssen beide Kopien des Gens mutiert sein.) 16. Stellen Sie Vermutungen an çber einen mæglichen Mechanismus, welcher der Apoptose eine entscheidende Rolle als Gegenspieler bei der Tumorentstehung verschaffen wçrde, ein Punkt, der im folgenden Kapitel diskutiert wird. 17. Sie arbeiten mit einer Fibroblastenart, die auf den epidermalen Wachstumsfaktor normalerweise mit einer Zunahme der Wachstums- und Teilungsgeschwindigkeit reagiert, auf Adrenalin hingegen mit einer Verlangsamung von beiden. Sie haben herausgefunden, dass beide Reaktionen çber den MAPK-Signalweg verlaufen und dass EGF çber eine Rezeptor-Tyrosinkinase wirkt, Adrenalin çber einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor. Nehmen Sie an, Sie stoûen auf einen mutierten Zellstamm, der zwar noch auf EGF reagiert, durch Adrenalin aber nicht mehr gehemmt wird. Sie vermuten, dass die Mutation den Crosstalk zwischen beiden Signalwegen (Abb. 15.30) betrifft. Welche der Bestandteile dieser Abbildung kænnten durch eine solche Mutation betroffen sein? 18. In welcher Hinsicht åhnelt die Calciumwelle, die bei der Befruchtung auftritt, einem Nervenimpuls, der ein Neuron entlang geleitet wird? 19. Warum, glauben Sie, da Sie nun den Abschnitt çber Geschmacksrezeptoren gelesen haben, war es so schwierig, effiziente Rattengifte zu entwickeln? 20. Eines der Gene des Kuhpockenvirus codiert ein Protein namens CrmA, einen hoch wirksamen Caspase-Inhibitor. Welche Wirkungen wird dieser Inhibitor Ihrer Meinung nach auf eine infizierte Zelle haben? Warum ist dies fçr das infizierende Virus von Vorteil? 21. Die meisten Rezeptor-Tyrosinkinasen wirken unmittelbar auf die ihnen nachgeschalteten Effektoren, die Insulinrezeptor-

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Zellulåre Signale und Signalçbertragung: Kommunikation zwischen Zellen

Tyrosinkinase hingegen wirkt durch ein zwischengeschaltetes Andockprotein, ein Insulinrezeptor-Substrat (IRS). Ergeben sich durch diese Zwischenstufen irgendwelche Vorteile fçr die zellulåre Signalçbertragung? 22. Wissenschaftler haben berichtet, dass (1) die meisten physiologischen Effekte des Insulins auf seine Zielzellen durch die Behandlung der Zellen mit Wortmannin, einer Verbindung, die das Enzym PI3K spezifisch inhibiert, unterbunden werden kænnen und dass (2) Zellen, die man zur Ûberexpression einer konstitutiv aktiven Form von PKB (d. h. einer Form des Enzyms, die unabhångig von den Umstånden kontinuierlich aktiv ist) veranlasst, eine

ternetseite www.wiley.com/college/karp .weitern sie Ihr Verståndnis, indem sie Karps Internetseite ¹Zell- und Molekularbiologieª besuchen. Dort finden Sie '  die gestellten
  $ & ,     , die schwierige Sachverhalte und Begriffe verdeutlichen,   , die Ihnen bei Prçfungsvorbereitungen helfen, sowie 8  zu interessanten Stellen im Netz. Zusåtzlich zu der Literaturliste unten kann man auf der Internetseite auch noch '  8 finden.

15.9 Weiterfçhrende Literatur   &     :/     Amrein H, Bray S (2003) Bitter-sweet solution in taste transduction. Cell 112:283±284 Beavo JA, Brunton LL (2002) Cyclic nucleotide research ± Still expanding after half a century. Nature Revs Mol Cell Biol 3:710±718 Cohen P (2002) The origins of protein phosphorylation. Nature Cell Biol 4:E127±E130 Lewcock JW, Reed RR (2001) Sweet successes. Neuron 31:515±517 (zur Wahrnehmung der Geschmacksqualitåt ¹sçûª) Lowell BB, Bachmann ES (2003) -adrenergic receptors, diet-induced thermogenesis, and obesity. J Biol Chem 278:29385±29388 Matsunami H, Amrein H (2004) Taste perception: How to make a gourmet mouse. Curr Biol 14:R118±R120 Perry SJ, Lefkowitz RJ (2002) Arresting developments in heptahelical receptor signaling and regulation. Trends Cell Biol 12:130±138 (zur Desensibilisierung G-Proteingekoppelter Rezeptoren) Pierce KL et al (2002) Seven-transmembrane receptors. Nature Revs Mol Cell Biol 3:639±650

Reaktion zeigen, die mit der auf die Zugabe von Insulin praktisch identisch ist. Håtten Sie, wenn Sie Abb. 15.21 betrachten, diese Beobachtungen vorhergesehen? Warum bzw. warum nicht? 23. Knockout-Måuse, die nicht in der Lage sind, Caspase-9 zu bilden, sterben frçh und weisen eine ganze Reihe von Defekten auf, besonders auffallend darunter: ein stark vergræûertes Gehirn. Warum haben diese Måuse einen solchen Phånotyp? Wie stellen Sie sich im Vergleich den Phånotyp einer Cytochrom-c-Knockout-Maus dazu vor? 24. Warum glauben Sie, empfinden manche Menschen eine Verbindung namens PROP als bitter, wåhrend andere nichts dergleichen berichten?

Smith DV, Margolskee RF (2001) Making sense of taste. Sci Am 32±39 (Mårz)

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16

=ebs

16.1 Grundeigenschaften einer Krebszelle 16.2 Krebsursachen 16.3 Zur Genetik von Krebserkrankungen 16.4 Neue Strategien der Krebsbehandlung Experimentelle Verfahren: Die Entdeckung der Oncogene

%&    +   " 5EED"   ? "   FK  ;  " 2[1

Krebs ist insofern eine genetisch bedingte Erkrankung, als er sich auf Verånderungen in bestimmten Genen zurçckfçhren låsst, in den meisten Fållen ist er allerdings keine erbliche Krankheit. Bei einer Erbkrankheit ist der genetische Fehler in den Chromosomen mindestens eines Elternteils vorhanden und geht in die Zygote ein. Die genetischen Verånderungen hingegen, aus denen die meisten Tumoren entstehen, passieren wåhrend der Lebensspanne des betreffenden Organismus in der DNA einer somatischen Zelle. Diese genetischen Verånderungen fçhren dazu, dass Zellen unkontrolliert wachsen und maligne Tumoren produzieren, die oftmals in das umlie-

gende gesunde Gewebe einwandern (Abb. 16.1). Solange das Wachstum des Tumors lokalisiert bleibt, låsst sich die Krankheit in der Regel durch die chirurgische Entfernung des Tumors behandeln und heilen. Maligne Tumoren aber haben die Tendenz zu   , d. h. Zellen hervorzubringen, die sich von der Tumormasse absondern, ins Lymph- oder Blutgefåûsystem einwandern und sich auf entlegene Kærperregionen ausbreiten, wo aus ihnen tædliche Sekundårtumoren (  ) hervorgehen, die dem chirurgischen Zugriff nicht mehr zugånglich sind. Wegen seiner schweren Folgen fçr die menschliche Gesundheit und aus der Hoffnung

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Krebs

Nebenwirkungen dieser Therapien zeigen, immer auch andere Zellen in Mitleidenschaft. Infolgedessen kann man Krebspatienten in aller Regel nicht mit hinreichend hohen Strahlenoder Chemikaliendosen behandeln, um såmtliche Tumorzellen im Kærper abzutæten. Seit vielen Jahren sind Krebsforscher daher bemçht, effizientere und weniger schådliche Behandlungsmethoden zu entwickeln. Einige dieser neuen Strategien werden am Ende dieses Kapitels besprochen. n Abb. 16.1. (      '   , !         .  

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heraus, dass sich irgendwann Heilung erzielen låsst, steht Krebs seit Jahrzehnten im Mittelpunkt intensiver Forschungsbemçhungen. Zwar haben diese Untersuchungen unserem Verståndnis von den zellulåren und molekularen Grundlagen zu bemerkenswerten Durchbrçchen verholfen, doch auf die Erfolge bei der Krebspråvention oder auf die Ûberlebenschancen bei den meisten Tumorarten haben sie bislang noch immer zu wenig Einfluss. Die Håufigkeiten fçr verschiedene Tumorarten in den Vereinigten Staaten und die zugehærige Sterblichkeit sind in Abb. 16.2 wiedergegeben. Neueren Behandlungsmethoden wie der Strahlen- und der Chemotherapie mangelt es an der nætigen Spezifitåt fçr Krebszellen und so ziehen sie, wie die schweren

!/! Grundeigenschaften einer Krebszelle Das Verhalten von Krebszellen låsst sich am leichtesten untersuchen, wenn diese in Kultur wachsen. Krebszellen erhålt man, indem man das Gewebe eines malignen Tumors zu Einzelzellen dissoziiert und diese   kultiviert. Mit den Jahren hat man in Zellbanken viele verschiedene Tumorzelllinien ± die ursprçnglich jeweils aus menschlichen Tumoren gewonnen wurden ± zusammengetragen, die nun fçr Untersuchungen zur Verfçgung stehen. Eine andere Mæglichkeit ist die Umwandlung normaler Zellen zu Tumorzellen durch die Behandlung mit karzinogenen Chemikalien, Strahlen oder tumorerzeugenden Viren. Zellen, die durch Chemikalien oder Viren   transformiert worden sind, entwickeln sich, wenn man sie in ein Wirtstier einbringt, im Allgemeinen zu Tumoren. Von einer Krebszelle zur anderen gibt es, was die individuellen Zelleigenschaften betrifft, groûe Unterschiede, doch zur selben Zeit teilen

n Abb. 16.2.  &! !     ) 

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&         %  5JJA     2 8   


alle Krebszellen auch unabhångig von dem Gewebe, dem sie entstammen, eine Reihe von gemeinsamen Grundeigenschaften. Das wichtigste Charakteristikum einer Krebszelle auf zellulårer Ebene ± unabhångig davon, ob sie nun im Kærper wåchst oder in einer Kulturschale ± ist der Verlust der Wachstumskontrolle. Teilungs- und Wachstumskapazitåt unterscheiden sich zwischen Krebszellen und normalen Zellen nicht besonders dramatisch. Låsst man normale Zellen unter gçnstigen Wachstums- und Teilungsbedingungen in Kultur wachsen, wachsen sie und teilen sich mit einer Geschwindigkeit, die sich von der ihrer malignen Gegenstçcke nicht wesentlich unterscheidet. Wenn normale Zellen sich jedoch so lange geteilt haben, bis sie den Boden der Kulturschale bedecken, nimmt ihre Teilungsrate deutlich ab und es bleibt in der Regel bei einer einschichtigen Zelllage (einem Monolayer) (Abb. 16.3 a, b). Die Wachstumsrate sinkt, weil normale Zellen auf inhibitorische Einflçsse aus ihrer Umgebung reagieren. Solche wachstumsinhibierenden Einflçsse kænnen durch die Abnahme von Wachstumsfaktoren im Medium bedingt sein, oder durch den Kontakt mit anderen Zellen auf dem Boden der Kulturschale. Hålt man hingegen maligne Zellen unter denselben Bedingungen, wachsen sie weiter, håufen sich zu Klumpen çbereinander (Abb. 16.3 c, d). Es ist offensichtlich, dass maligne Zellen auf die Art von Signalen, die normalen Zellen signalisieren, dass es

Grundeigenschaften einer Krebszelle

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an der Zeit ist, aufzuhæren zu wachsen und sich zu teilen, nicht reagieren. Krebszellen ignorieren aber nicht nur inhibierende Wachstumssignale, sondern sind sogar in der Lage, ohne die stimulierenden Signale auszukommen, die normale Zellen zum Wachsen brauchen. Normale Zellen in Kultur sind auf Wachstumsfaktoren wie den epidermalen Wachstumsfaktor und Insulin angewiesen, die in dem Serum (der flçssigen Fraktion des Blutes) vorhanden sind, das normalerweise Bestandteil des Kulturmediums ist (Abb. 16.4). Tumorzellen kænnen ohne Serum proliferieren, weil ihr Zellzyklus nicht von Signalen gesteuert wird, die çber Rezeptoren fçr Wachstumsfaktoren auf der Zelloberflåche (vgl. Kap. 15.4) an die Zelle herangetragen werden mçssen. Normale Zellen, die in Kultur wachsen, weisen eine beschrånkte Teilungskapazitåt auf. Nach einer begrenzten Zahl von mitotischen Teilungen unterliegen sie einem Alterungsprozess, der sie unfåhig macht, weiter zu wachsen und sich zu teilen (Kap. 12, ¹Aus Sicht des Menschenª). Krebszellen hingegen sind unsterblich, denn sie teilen sich endlos weiter. Dieser Unterschied im Wachstumspotenzial wird håufig der in Tumorzellen vorhandenen Telomerase zugeschrieben, die sich in entarteten Zellen findet, in normalen Zellen hingegen nicht. Man erinnere sich aus Kap. 12, ¹Aus Sicht des Menschenª, dass die Telomerase ein Enzym ist, das die Långe der Telomere an den Chromosomenenden garantiert, da-

n
 16.3 a±d. Wachstumsverhalten von normalen und kanzerogen verånderten Zellen. Normale Zellen wachsen in einer Kulturschale typischerweise, bis sie deren Flåche als Einzelzellschicht (Monolayer) bedecken (a, b). Zellen hingegen, die durch Viren oder karzinogene Substanzen transformiert sind (oder auch maligne Zellen aus einem Tumor, die man in Kultur genommen hat), wachsen typischerweise in Klumpen aus vielen Zelllagen oder Foci (c, d). (b und d: Mit freundlicher Genehmigung von G Steven Martin)

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Krebs

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mit Zellen sich weiter teilen kænnen. Man nimmt an, dass das Fehlen der Telomerase in den meisten normalen Zellen den Hauptmechanismus des Kærpers zum Schutz vor Tumorwachstum darstellt. Die auffålligsten Verånderungen im Kern transformierter Zellen betreffen die Chromosomen. Normale Zellen behalten ihre diploide Chromosomenausstattung   und   auch wåhrend des Zellwachstums und der Zellteilung. Krebszellen aber zeigen oftmals eine vællig gestærte Chromosomenverteilung, man bezeichnet diesen Zustand auch als    (Abb. 16.5).1 Klar ist, dass das Wachstum von Krebszellen weit weniger von der diploiden chromosomalen Standardausstattung abhångt als das Wachstum normaler Zellen. Wird die Chromosomenausstattung einer normalen Zelle gestært, wird in der Regel ein Signalweg aktiviert, der zur Selbstzerstærung (Apoptose) der

1 Es herrscht Uneinigkeit darçber, ob es zur Entwicklung der Aneuploidie bereits in einem frçhen Stadium der Tumorentwicklung kommt und ob diese der Grund fçr die genetische Instabilitåt ist, durch die Krebszellen sich auszeichnen, oder ob diese ein eher spåtes Ereignis ist und lediglich die Folge der abnormen Wachstumsprozesse bei der Tumorentstehung.



Krebsursachen

Kelle fçhrt. Krebszellen hingegen reagieren charakteristischerweise nie apoptotisch, sei ihre Chromosomenausstattung auch noch so durcheinandergeraten. Die Unfåhigkeit zur Apoptose ist ein weiteres wichtiges Merkmal, das Krebszellen von normalen Zellen unterscheidet. Neben ihrer Tendenz, sich an anderen Orten im Kærper auszubreiten, stellen genau die Eigenschaften von Krebszellen, die sich   demonstrieren lassen, eine solche Bedrohung fçr den Organismus als Ganzes dar.

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16.2 Krebsursachen Im Jahre 1775 stellte der britische Chirurg Percival Pott zum ersten Mal den Zusammenhang zwischen einem Umweltagens und der Entstehung von Krebs her. Pott kam zu dem Schluss, dass das hohe Aufkommen an Tumoren der Nasenhæhle und der Skrotumhaut bei Kaminfegern auf deren ståndigen Kontakt mit Teer zurçckzufçhren sei. Im Laufe der vergangenen Jahrzehnte sind die karzinogenen Substanzen aus Teer isoliert und charakterisiert worden, dazu hunderte anderer Verbindungen, von denen man zeigen konnte, dass sie bei Labortieren Tumoren erzeugen. Neben der Vielfalt an chemischen Verbindungen gibt es noch eine Reihe anderer Agenzien, von denen man weiû, dass sie karzinogen sind, unter anderem ionisierende Strahlung sowie eine lange Reihe von DNA- und RNA-Viren. All diese Agenzien haben eines gemeinsam: Sie veråndern das Genom. Karzinogenen Chemikalien wie jenen im Teer und im Zigarettenrauch kann man fast ausnahmslos nachweisen, dass sie entweder selbst mutagen wirken oder aber durch zellulåre Enzyme in eine mutagene Verbindung umgewandelt werden. Auch ultraviolette Strahlung, die fçhrende Ursache fçr die Entstehung von Hautkrebs, ist stark mutagen. Eine Reihe von Viren vermag Såugerzellen, die in Kultur wachsen, zu infizieren und zu Krebszellen zu transformieren. Man unterteilt diese Viren je nach Art der im reifen Viruspartikel vertretenen Nucleinsåure in zwei groûe Gruppen: )!9  und )!9 

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. Zu den transformierenden DNA-Viren gehæren Polyomaviren, SV 40 ( ;  40), Adenoviren und herpesåhnliche Viren. RNA-Tumorviren oder Retroviren, åhneln ihrer Struktur nach HIV (vgl. Abb. 1.21 b) und sind Thema der Box ¹Experimentelle Verfahrenª am Ende des Kapitels. Tumorviren kænnen Zellen transformieren, weil sie Gene besitzen, deren Produkte in die normalen wachstumsregulierenden Vorgånge einer Zelle eingreifen. Obwohl Tumorviren Forschern ein unschåtzbares Werkzeug bei der Identifikation zahlreicher an der Tumorentstehung beteiligter Gene gewesen sind, spielen Viren nur bei einem sehr kleinen Teil der menschlichen Krebserkrankungen eine Rolle. In den meisten Fållen erhæhen solche Viren lediglich das Risiko, an Krebs zu erkranken, und stellen nicht die alleinige Krebsursache dar. Diese Beziehung zwischen Virusinfektion und Krebs gilt zum Beispiel fçr das menschliche Papillomvirus HPV (    ), das durch sexuellen Kontakt çbertragen wird und an Håufigkeit in der Bevælkerung zunimmt. Obwohl das Virus bei nahezu 90% aller Gebårmutterhalstumoren zu finden ist ± was fçr seine Bedeutung bei der Krankheitsentstehung sprechen wçrde ± entwickelt die çberwiegende Mehrheit der infizierten Frauen diesen Tumor nie. Gegenwårtig wird ein Impfstoff gegen dieses Virus getestet. Zu den anderen Viren, die im Zusammenhang mit Tumorerkrankungen beim Menschen zu nennen sind, gehæren das mit der Entstehung von Leberkarzinomen assoziierte Hepatitis-B-Virus, das Epstein-Barr-Virus, das sich in BurkittLymphomen findet, und ein Herpesvirus (HHV 8), das in Kaposisarkomen vorkommt. Es gibt Hinweise darauf, dass SV40 an der Entstehung von Mesotheliomen beteiligt ist, seltenen Tumoren des Lungenepithels, bei denen man als ursåchliches Agens Asbest vermutet. Der Zusammenhang zwischen SV40 und Tumorerkrankungen beim Menschen war lange ein hæchst brisantes Thema, denn die frçhen Polioimpfstoffe, die vor 1963 verabreicht wurden, wiesen als Verunreinigung dieses Virus auf. Bestimmte Magenlymphome stehen in Beziehung zu einer chronischen Infektion mit dem magenbewohnenden Bakterium 3   , das auch fçr Magengeschwçre verantwortlich ist. Im Unterschied zu allen anderen Krebserkrankungen reicht hier eine Behandlung mit einem Antibiotikum, das die Bakterien abtætet, um die Patienten vor einem Lymphom zu bewahren. Die Ursachen verschiedener Arten von Krebs herauszufinden, fållt in das Arbeitsgebiet der #  . Bei vielen Krebserkrankungen liegen die Ursachen auf der Hand: Rauchen

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Krebs

fçhrt zu Lungenkrebs, zu viel ultraviolette Strahlung zu Hautkrebs. Doch trotz der groûen Anzahl an Untersuchungen tappen wir çber die Ursachen der meisten Tumoren noch mehr oder weniger im Dunkeln. Menschen leben in einer komplexen Umgebung und sind unablåssig zahllosen potenziellen Karzinogenen ausgesetzt, deren Kombination und Menge sich çber die Jahrzehnte ståndig veråndern. Aus einem Berg an statistischen Daten, die man aus den Antworten bei groû angelegten Erhebungen und Befragungen gewonnen hat, Schlussfolgerungen çber die Ursachen von Krebs herauszudestillieren hat sich als ungemein schwierig erwiesen. Die Bedeutung von Umweltfaktoren wie der Ernåhrung wird sehr deutlich aus Untersuchungen an Kindern von Paaren, die von Asien in die Vereinigten Staaten oder nach Europa gezogen sind. Bei diesen Personen sinkt die Håufigkeit von Magenkrebs, wie sie fçr Asien typisch ist, dafçr steigt das Aufkommen an Darm- und Brustkrebs, einem Charakteristikum der westlichen Lånder. Unter den Epidemiologen ist allgemein unbestritten, dass manche Bestandteile der Ernåhrung, tierisches Fett zum Beispiel oder Alkohol das Risiko fçr die Entstehung von Krebs erhæhen kænnen, wohingegen andere Verbindungen wie man sie in Obst, Tee und Gemçse findet, das Risiko verringern helfen. Die langfristige Einnahme nichtsteroidaler Entzçndungshemmer wie Aspirin und Indomethazin senkt nachweislich das Risiko, an Darmkrebs zu erkranken. Man nimmt an, dass dies darauf zurçckzufçhren ist, dass sie das Enzym COX-2 (Kap. 2, ¹Aus Sicht des Menschenª) hemmen, das die Synthese der hormonåhnlichen Prostaglandine katalysiert, welche das Wachstum von Darmpolypen anregen. Reservatrol, eine Verbindung, die sich in Trauben (und Wein) findet, inhibiert diese Cyclooxigenase ebenfalls und wirkt antikanzerogen. Genauere Informationen zu den Ursachen verschiedener Tumoren gewinnt man aus der Analyse der Arten von Mutationen, die von bestimmten Karzinogenen verursacht werden. Beispiele fçr verschiedene durch Karzinogene verursachte Nucleotidaustausche sind in Abb. 16.6 dargestellt. Aflatoxin B1 zum Beispiel, ein von bestimmten Schimmelpilzen produziertes Pilzgift, ist maûgeblich fçr das hohe Leberkrebsaufkommen in Asien verantwortlich, wo Nçsse und Getreide håufig unter Bedingungen lagern, die das Wachstum von Schimmel færdern. Aflatoxin B1 bewirkt im Codon 249 des Gens fçr den Tumorsuppressorfaktor TP53 den Austausch von G gegen T (Abb. 16.6). Mit dieser Erkenntnis konnten Epidemiologen gewisse Aussagen çber die Wirkung dieses Karzinogens in der Gesamt-

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 16.19. DNA-Schådigung aktiviert eine Reihe von Proteinen, die von Tumorsuppressor-Genen und Oncogenen codiert werden. In dieser Darstellung besteht die DNASchådigung in Doppelstrangbrçchen der DNA (Schritt 1), die von einem Multiproteinkomplex repariert werden, zu dem auch BRCA1 und BRCA2 gehæren (Schritt 2 a). Mutationen in jedem der beiden Gene, welche diese Proteine codieren, kænnen den Reparaturprozess blockieren (Schritt 2 b). Wenn der DNA-Schaden nicht repariert wird, kommt es zur Aktivierung eines ¹Kontrollpostensª, die zu einem Anstieg der p53-Aktivitåt fçhrt (Schritt 3 a). Normalerweise wird das p53-Protein durch die Wechselwirkung mit dem Protein MDM2 inhibiert (Schritt 3 b). p53 ist ein Transkriptionsfaktor, der die Aktivierung von entweder (1) des p21-Gens (Schritt 4 a), dessen Produkt (p21) den Zellzyklus anhålt, oder (2) des BAX-Gens (Schritt 4 b), dessen Produkt (Bax) die Apoptose einleitet. (Nach: Brugarolas J, Jacks T (1997) Nature Med 3:721. ° 1997. Abdruck mit freundlicher Genehmigung von Macmillan Magazines)

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Zur Genetik von Krebserkrankungen

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2   -? +5JJ51 8 H64   !       9      $  9 0 Bei einem seiner Wirkmechanismen agiert p53 als Transkriptionsfaktor, der fçr die Expression eines Proteins (p21) sorgt, das die cyclinabhångige Kinase inhibiert, die eine Zelle durch den Zellzyklus dirigiert. Durch eine Schådigung der DNA wird die Phosphorylierung und Stabilisierung von p53 in Gang gesetzt, und dies wiederum fçhrt zum Anhalten des Zellzyklus, bis der Schaden repariert ist. Auûerdem kann p53 Zellen, die sich auf dem Weg in die Malignitåt befinden, auf einen alternativen Weg umlenken, der zum programmierten Zelltod, der Apoptose, fçhrt. 2HJ-Knockout-Måuse fangen wenige Wochen nach der Geburt an, Tumoren zu entwickeln. Weitere Tumorsuppressor-Gene sind unter anderem !", dessen Mutation den Betreffenden fçr Dickdarmkrebs prådisponiert, und &-"!. und &-"!/, die eine Frau im Falle einer Mutation fçr Brustkrebs prådisponieren (Kap. 16.3.1).        (  

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    - $1     "      "  0 Man hat eine Reihe von Oncogenen identifiziert, die Wachstumsfaktoren codieren, unter anderem den Blutplåttchen-Wachstumsfaktor PDGF und den epidermalen Wachstumsfaktor EGF. Maligne Zellen enthalten unter Umstånden in ihrer Plasmamembran eine weit græûere Zahl an Wachstumsfaktorrezeptoren als normale Zellen. Die çberschçssigen Rezeptoren lassen die Zellen fçr niedrigere Wachstumsfaktorkonzentrationen ansprechbar werden als normale Zellen, so dass sie sich bereits unter Bedingungen teilen, auf die normale Zellen nicht reagieren wçrden. Zur Liste der Oncogene gehært eine Reihe von cytoplasmatischen Proteinkinasen ± Serin/Threoninkinasen ebenso wie Tyrosinkinasen ± darunter -!
, das eine Proteinkinase des MAPK-Signalwegs codiert. Zu den håufigsten Oncogenen bei menschlichen Tumoren gehært mutiertes -!. Wie in Kap. 15 beschrieben, aktiviert Ras die Proteinkinaseaktivitåt von Raf. Bleibt Raf im aktivierten Zustand, sendet es unablåssig Signale den MAPK-Signalweg entlang und veranlasst damit eine kontinuierliche Stimulierung der Zellpro-

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liferation. Eine Reihe von Oncogenen, unter anderem #*", codiert Proteine, die als Transkriptionsfaktoren wirken. Myc gehært normalerweise zu den ersten Proteinen, die auf der Bildflåche erscheinen, wenn eine Zelle dazu angeregt wird, aus der stummen G0-Phase wieder in den Zellzyklus einzutreten. Eine Ûberexpression von #*" kann Zellen unter Umstånden dazu bringen, die inhibitorischen Einflçsse zu ignorieren, welche die Produkte der Tumorsuppressor-Gene auf sie ausçben, und zu proliferieren. Eine weitere Gruppe von Oncogenen, unter anderem &",$/, codiert Proteine, die an der Apoptose beteiligt sind. Eine Ûberexpression des &",$/-Gens fçhrt zu einer Unterdrçckung der Apoptose in den Lymphgeweben und ermæglicht so abnormen Zellen die Proliferation zu lymphoiden Tumoren (Kap. 16.3.1).  :"   /   "        9 )    "         $    

  0 Das Genom von Patienten mit der çberaus håufigen ererbten Form von Dickdarmkrebs namens HNPCC (hereditåres nicht polypæses colorektales Karzinom) enthålt Mikrosatelliten-Sequenzen mit abnorm verånderter Nucleotidzahl. Verånderungen bezçglich der Långe einer Mikrosatellitensequenz entstehen als Replikationsfehler und werden normalerweise von Fehlpaarungsreparaturenzymen behoben. Ein Fehler in diesen Fehlererkennungssystemen kænnte demnach ebenfalls fçr die Tumorentstehung verantwortlich sein. Gestçtzt wird diese Ûberlegung durch Beobachtungen, denen zufolge Extrakte aus HNPCC-Tumorzellen DNA-Reparaturdefekte aufweisen. Zellen mit solchen Defekten sollten eine stark erhæhte Mutationsrate bei ihren Tumorsuppressor-Genen und Oncogenen aufweisen, die das Risiko einer malignen Entartung um ein Vielfaches erhæhen (Kap. 16.3.1). :'1  '         +  " +   &      0 #     7          /  , unter anderem Immuntherapie, Gentherapie, die Inhibition der Proteine, die von Oncogenen codiert werden und die Inhibition der Angiogenese. Im Augenblick ist der græûte Erfolg bei Patienten mit chronischer myeloischer Leukåmie zu vermelden, und zwar durch die Entwicklung eines Inhibitors fçr die Abl-Kinase. Eine zweite Erfolgsgeschichte war die Entwicklung humanisierter Antikærper, die an ein

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Krebs

Protein auf der Zelloberflåche maligner B-Zellen von Patienten mit Non-Hodgkin-Lymphom binden. Die Strategien der Antiangiogenese sind darauf ausgelegt, die Bildung solider Tumoren zu unterbinden, indem sie die Bildung neuer Blutgefåûe verhindern, welche die Tu-

ternetseite www.wiley.com/college/karp .weitern sie Ihr Verståndnis, indem sie Karps Internetseite ¹Zell- und Molekularbiologieª besuchen. Dort finden Sie '  die gestellten
  $ & ,     , die schwierige Sachverhalte und Begriffe verdeutlichen,   , die Ihnen bei Prçfungsvorbereitungen helfen, sowie 8  zu interessanten Stellen im Netz. Zusåtzlich zu der Literaturliste unten kann man auf der Internetseite auch noch '  8 finden.

16.5 Literatur Bergers G, Benjamin LE (2003) Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nature Revs Cancer 3:401±410 Berinstein N (ed) (2003) Cancer vaccines: are they here yet? Sem Oncol vol 30, Nr 3, Suppl 8 Borg A et al (2003) Predicting the future of breast cancer. Nature Med 9:16±18 Couzin J (2003) Tracing the steps of metastasis, cancer's menacing ballet. Science 299:1002±1006 Dancey J, Sausville EA (2003) Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment. Nature Revs Drug Disc 2:296±313 Downward J (2003) Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Revs Cancer 3:11±22 Garber K (2004) Gene expression tests foretell breast cancer's future. Science 303:1754±1755 Gibbs WW (2003) Roots of cancer. Sci Am 56±65. [Juli] [abweichende Ansichten zur genetischen Grundlage der Tumorentstehung]

morzellen mit Nåhrstoffen und anderen Materialien versorgen. Man kennt inzwischen eine Reihe von Agenzien, welche die Angiogenese bei Måusen hemmen und in klinischen Studien erste, vorsichtig zu bewertende Erfolge erzielt haben.

Gura T (2002) Magic bullets hit the target. Nature 417: 584-586 Hahn WC, Weinberg RA (2002) Modelling the molecular circuitry of cancer. Nature Revs Cancer 2:331±341 Hanahan D, Weinberg RA (2000) The hallmarks of cancer. Cell 100:57±70 Hursting SD et al (2003) Calorie restriction, aging, and cancer prevention. Annu Rev Med 54:131±152 Kallioniemi O (2004) Profile of a tumour. Nature 428:379± 382 Lane DP, Fischer PM (2004) Turning the key on p53. Nature 427:789±790 Marx J (2003) Mutant stem cells may seed cancer. Science 301:1308±1310 McCarty MF (2003) Promises and pitfalls of anti-angiogenic therapy in clinical trials. Trends Mol. Med 9:53±58 O'Dwyer ME et al (2002) Recent advances in the treatment of chronic myelogenous leukemia. Annu Rev Med 53: 369±381 Reichert JM, Paquette C (2002) Therapeutic cancer vaccines on trial. Nature Biotech 20:659±663 Sherr CJ (2004) Principles of tumor suppression. Cell 116: 235±346 Smyth MJ et al (2001) A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy. Nature Immunol 2:293± 299 Staudt LM (2002) Gene expression profiling of lymphoid malignancies. Annu Rev Med 53:303±318 Storchova Z, Pellmann D (2004) From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer. Nature Revs Mol Cell Biol 5:45±54 Tutt A, Ashworth A (2002) The relationship between the roles of BRCA genes in DNA repair and cancer predisposition. Trends Mol Med 8:571±576 Van Dyke T et al (2002) Reviews on cancer. Cell 108:135-182 Von Mehren M et al (2003) Monoclonal antibody therapy for cancer. Annu Rev Med 54:343±369 Workman P et al (2002) A Trends guide to cancer therapeutics. Trends Mol Med Bd 8, Ergånzungsband Nr 4

Die Immunantwort

17

17.1 Ein Ûberblick çber die Immunantwort 17.2 Die Theorie der klonalen Selektion bei B-Zellen 17.3 T-Lymphozyten: Aktivierung und Wirkungsmechanismus 17.4 Ausgewåhlte Aspekte der zellulåren und molekularen Grundlagen der Immunitåt Aus Sicht des Menschen: Autoimmunerkrankungen Experimentelle Verfahren: Die Rolle des Haupthistokompatibilitåtskomplexes bei der Antigenpråsentation

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17.2 Die Theorie der klonalen Selektion bei B-Zellen Wenn sich jemand mit einem Virus infiziert oder eine andere Fremdsubstanz in seinen Kærper gelangt, wird sein Blut binnen kurzer Zeit hohe Konzentrationen an Antikærpern enthalten, die imstande sind, mit dieser Fremdsubstanz zu reagieren, die man in diesem Zusammenhang auch als   bezeichnet. Die meisten Antigene bestehen aus Proteinen oder Polysacchariden, doch auch Lipide und Nucleinsåuren kænnen diese Eigenschaft haben. Wie kann ein Kærper Antikærper produzieren, die $    mit einem Antigen reagieren, das er eben erst kontaktiert hat? Mit anderen Worten: Wie induziert das Antigen die adaptive Immunantwort? Ûber viele Jahre hinweg war man der Ansicht, das Antigen wçrde die Lymphozyten irgendwie instruieren, komplementåre Antikærper herzustellen. Man mutmaûte, dass das Antigen den Antikærper womæglich umgeben und aktiv so formen kænnte, dass er in die Lage versetzt wçrde, sich mit diesem speziellen Antigen zu

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Die Immunantwort

verbinden. Bei diesem ¹instruktivenª Modell erreicht der Lymphozyt erst nach dem Kontakt mit dem Antigen die Fåhigkeit, einen bestimmten Antikærper zu produzieren. Im Jahre 1955 schlug der dånische Immunologe Niels Jerne einen radikal anderen Mechanismus vor: Jernes Hypothese zufolge sollte der Kærper auch ohne die Anwesenheit eines Antigens unablåssig geringe Mengen an Antikærpern von zufallsbestimmter Struktur produzieren. Diese Antikærper insgesamt sollten imstande sein, jedem beliebigen Antigen gerecht zu werden, dem ein Mensch irgendwann in seinem Leben ausgesetzt sein wçrde. Wenn ein Mensch einem Antigen ausgesetzt ist, wçrde Jernes Modell zufolge das Antigen an den fçr ihn spezifischen Antikærper binden, und dies sollte irgendwie dazu fçhren, dass dieses spezielle Antikærpermolekçl in groûen Mengen hergestellt wçrde. In Jernes Modell

  demnach das Antigen aus den bereits vorhandenen Antikærpern solche, die imstande sind, an es zu binden. Im Jahre 1957 wurde das Konzept der Antikærperselektion durch den australischen Immunologen F. MacFarlane Burnet zu einem umfassenden Modell weiterentwickelt. Burnets !      &  erreichte rasch weit verbreitete Anerkennung. Eine Ûbersicht çber die Schritte, die wåhrend der klonalen Selektion von B-Zellen passieren, gibt Abb. 17.5. Eine detailliertere Diskussion dieser Ereignisse folgt weiter unten in diesem Kapitel. Die klonale Selektion von T-Zellen wird im fol-

genden Abschnitt behandelt; zunåchst die Hauptpunkte der klonalen Selektion von B-Zellen: n N 7        /     & 9  0 B-Zellen entstehen aus einer Population von undifferenzierten und ununterscheidbaren Vorlåuferzellen. Im Laufe ihrer Differenzierung wird eine B-Zelle durch DNAUmlagerungen (Abb. 17.15) dazu gebracht, nur eine bestimmte Sorte von Antikærpermolekçlen zu produzieren (Abb. 17.5, Schritt 1). Dabei sind tausende verschiedener DNA-Rearrangements mæglich, so dass verschiedene B-Zellen verschiedene Antikærpermolekçle produzieren. So åhnlich B-Zellen unter dem Mikroskop auch aussehen mægen, durch die von ihnen produzierten Antikærper unterscheiden sie sich deutlich. n 7 '  '                  0 Das gesamte Repertoire antikærperproduzierender Zellen, die ein Mensch je in seinem Leben besitzen wird, ist in den Lymphgeweben bereits vor der Stimulation durch ein Antigen vorhanden und vom Vorhandensein von Fremdsubstanzen unabhångig. Jede B-Zelle pråsentiert ihren speziellen Antikærper auf der

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Die Theorie der klonalen Selektion bei B-Zellen

Kelloberflåche, wobei der Teil, der mit dem Antigen reagiert, nach auûen gewandt ist. Solchermaûen ist die Zelle mit Antigenrezeptoren bestçckt, die spezifisch an ein Antigen binden kænnen, das zu ihnen komplementår ist. Obwohl die meisten lymphoiden Zellen im Leben eines Menschen nie benætigt werden, ist das Immunsystem darauf ausgelegt, auf jedes Antigen, mit dem der Betreffende in Kontakt tritt, sofort zu reagieren. Das Vorhandensein von Zellen mit unterschiedlichen Antikærpern in der Membran låsst sich experimentell wie in Abb. 17.6 gezeigt nachweisen. n          &  9 7     0 In den meisten Fållen ist zur Aktivierung einer B-Zelle durch ein Antigen die Beteiligung von T-Zellen erforderlich (Genaueres dazu in Kap. 17.4.1 und 17.4.7). Einige wenige Antigene aber, beispielsweise die Polysaccharide in der Bakterienzellwand, aktivieren B-Zellen selbst. Man nennt solche Antigene auch thymusunabhångige Antigene. Aus Grçnden der Einfachheit wollen wir die Diskussion an dieser Stelle auf ein thymusunabhångiges Antigen beschrånken. Angenommen, jemand kommt mit dem Bakterium 3 $     7 in Kontakt, einem bekapselten Bakterium, das eine tædliche Meningitis verursachen kann. Die Kapsel dieses Bakteriums enthålt ein Polysaccharid, das an eine winzige Fraktion der B-Zellen des Kærpers binden kann (Abb. 17.5, Schritt 2). Die B-Zellen, die an das Polysaccharid binden, enthalten membrangebundene Antikærper, deren Bindungsstelle es ihnen ermæglicht, spezifisch mit dem Antigen zu interagieren. Auf diese Weise selektiert ein Antigen Lymphozyten, die Antikærper produzieren, welche imstande sind, mit dem Antigen zu interagieren. Die Bindung des Antigens aktiviert die B-Zelle, veranlasst sie zu proliferieren und eine Population (einen Klon) von Lymphozyten zu grçnden, die allesamt denselben Antikærper produzieren. Einige dieser aktivierten Zellen differenzieren zu kurzlebigen /  $, die groûe Mengen an Antikærpern sezernieren (Abb. 17.5, Schritt 4). Im Unterschied zu ihren B-ZellVorlåufern (Abb. 17.7 a) verfçgen Plasmazellen çber ein ausgedehntes raues endo-

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Die Immunantwort

plasmatisches Retikulum, wie es fçr Zellen, die auf die Produktion und Sekretion groûer Mengen an Proteinen spezialisiert sind, charakteristisch ist (Abb. 17.7 b). n     :1        6 10 Nicht alle B-Lymphozyten, die durch ein Antigen aktiviert werden, differenzieren zu Antikærper sezernierenden Plasmazellen. Manche bleiben als :1  $ in den Lymphgeweben erhalten (Abb. 17.5, Schritt 5), die rasch reagieren kænnen, falls das Antigen zu einem spåteren Zeitpunkt noch einmal auftreten sollte. Wåhrend die Plasmazellen nach dem Ende des antigenen Reizes absterben, kænnen Gedåchtniszellen ein ganzes Menschenleben lang erhalten bleiben. Werden sie durch dasselbe Antigen stimuliert, kænnen manche dieser Gedåchtniszellen sehr rasch zu Plasmazellen proliferieren und so statt im Verlauf von mehreren Tagen, die zur ursprçnglichen Reaktion notwendig waren, binnen Stunden eine sekundåre Immunreaktion bilden (Abb. 17.10). n 6   ! $ 9    /  9       &  $0 Wie im Folgenden erærtert werden soll, kommen Gene, die Antikærper codieren, durch einen Prozess zustande, bei dem DNA-Segmente zufållig kombiniert werden. Das hat zur Folge, dass unweigerlich auch Antikærper entstehen, die mit kærpereigenen Geweben reagieren und zu weitreichender Organzerstærung und schwerer Krankheit fçhren kænnen. Fçr den Kærper besteht ohne Frage hæchstes Interesse daran, die Produktion solcher Proteine ± der    ± zu verhindern. Viele B-Zellen, die Autoantikærper produzieren kænnten, werden bereits wåhrend der Entwicklung zerstært oder inaktiviert. Der Kærper entwickelt somit eine immunologische Toleranz gegen sich selbst. Wie in der Box ¹Aus Sicht des Menschenª erlåutert, kann ein Zusammenbruch dieser Toleranz zur Entstehung schwerer Autoimmunkrankheiten fçhren.

Verschiedene Prinzipien der Theorie der klonalen Selektion lassen sich gut veranschaulichen, indem man sich mit dem Thema Impfung etwas genauer beschåftigt.

n Abb. 17.7 a, b. %(   !'   a     b   #  !   #  ! (         BC   I       

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!2$! Impfung Der Englånder Edward Jenner war praktizierender Landarzt zu einer Zeit, als Pocken zu den håufigsten und meistgefçrchteten Krankheiten zåhlten. Mit den Jahren fiel ihm auf, dass Mågde, die Kçhe versorgten, in der Regel von der Krankheit verschont blieben. Jenner kam zu dem Schluss, dass Milchmågde irgendwie ¹im-



T-Lymphozyten: Aktivierung und Wirkungsmechanismus

munª gegen Pocken sein mussten, weil sie sich bereits in jungen Jahren mit Kuhpocken infizierten, einer harmlosen Krankheit, die sie sich bei ihren Kçhen zuzogen. Kuhpocken fçhren zu Blåschen, die denen der eitergefçllten Pockenblåschen åhneln, wobei die Kuhpockenblåschen lokal begrenzt auftreten und wieder verschwinden, åuûerstenfalls eine Narbe am Ort der Infektion zurçcklassen. Im Jahre 1796 unternahm Jenner eines der berçhmtesten (und riskantesten) Experimente aller Zeiten. Zuerst infizierte er einen achtjåhrigen Jungen mit Kuhpocken und gab ihm Zeit zu genesen. Sechs Wochen spåter infizierte er den Jungen vorsåtzlich mit Pockenviren, indem er ihm Eiter aus Pockenblåschen unter die Haut injizierte. Der Junge zeigte keinerlei Anzeichen der tædlichen Krankheit. Binnen weniger Jahre wurden viele Tausend Menschen immun gegen Pocken, indem sie sich vorsåtzlich einer Kuhpockeninfektion aussetzten. Man nannte diese Methode nach , dem lateinischen Wort fçr Kuh' Vakzination (Impfung). Jenners Experiment verlief erfolgreich, weil die Immunantwort, die der Kærper gegen das Kuhpockenvirus in Gang gesetzt hatte, auch gegen das mit diesem eng verwandte Pockenvirus wirksam war. Die meisten Impfstoffe oder Vakzine enthalten abgeschwåchte Erreger, Pathogene, die zwar imstande sind, die Immunantwort anzustoûen, genetisch aber so weit ¹verkrçppeltª sind, dass sie die Krankheit selbst nicht mehr auslæsen kænnen. Jenners Pockenimpfung erzeugt Immunitåt, indem sie T-Zellen stimuliert, das ist Thema des nåchsten Abschnitts. Die meisten anderen derzeit gebråuchlichen Impfstoffe sind B-Zell-Vakzine, dazu gehært beispielsweise der Tetanusimpfstoff. Tetanus kommt durch Infektion mit dem anaeroben Bodenbakterium "     zustande, das durch eine kleine Stichwunde in den Kærper gelangen kann. Diese Bakterien produzieren ein hoch wirksames Neurotoxin, das die synaptische Ûbertragung an den inhibitorischen Synapsen von Motoneuronen blockiert und so zu anhaltender Muskelkontraktion und schlieûlich zum Erstickungstod fçhrt. Die meisten Kinder werden bereits mit zwei Monaten erstmals gegen Tetanus  , man verwendet dazu eine modifizierte und harmlose Version des Tetanustoxins (ein !- ). Das Tetanustoxoid bindet an die Oberflåche von B-Zellen, deren membrangebundene Antikærper çber eine komplementåre Bindungsstelle verfçgen. Diese B-Zellen teilen sich und bilden einen Zellklon, der Antikærper herstellt, die an das echte Tetanustoxin binden kænnen. Diese erste Reaktion flacht rasch ab,

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aber der Betreffende behålt Gedåchtniszellen, die rasch reagieren kænnen, sollte dem Betreffenden irgendwann spåter eine Clostridieninfektion zustoûen. Im Unterschied zu den meisten Impfungen hålt die Immunitåt gegen das Tetanustoxin nicht das ganze Leben vor, weshalb man etwa alle zehn Jahre eine Auffrischungsimpfung benætigt. Diese Auffrischungsimpfung enthålt das Toxoidprotein und regt die Bildung zusåtzlicher Gedåchtniszellen an. Was geschieht, wenn jemand eine Verletzung hat und sich nicht daran erinnert, jemals eine Auffrischungsimpfung erhalten zu haben? In solchen Fållen verabreicht man den Betroffenen meist eine 

9 6  aus Antikærpern, die an das Tetanustoxin binden kænnen. Passive Immunisierungen sind in der Regel immer nur kurze Zeit wirksam und schçtzen den Empfånger nicht gegen Folgeinfektionen spåter im Leben.

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17.3 T-Lymphozyten: Aktivierung und Wirkungsmechanismus T-Zellen sind genau wie B-Zellen dem Prozess der klonalen Selektion unterworfen. T-Zellen besitzen ein Oberflåchenprotein, einen T-Zell-Rezeptor, der es ihnen ermæglicht, mit einem bestimmten Antigen spezifisch zu interagieren. Genau wie die Antikærpermolekçle, die als B-ZellRezeptoren wirken, bilden auch die Proteine, die als T-Zell-Rezeptoren dienen, eine groûe Molekçlpopulation mit ganz unterschiedlich geformten Bindungsstellen. So wie jede B-Zelle nur eine Sorte von Antikærpern produziert, besitzt jede T-Zelle nur eine einzige Sorte von T-Zell-Rezeptor. Man schåtzt, dass der erwachsene Mensch etwa 1012 T-Zellen besitzt, die zusammengenommen ungefåhr 107 verschiedene Antigenrezeptoren exprimieren. Im Unterschied zu B-Zellen, die durch læsliche intakte Antigene aktiviert werden, werden

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Die Immunantwort

'-Zellen durch Antigen-Fragmente aktiviert, die sich auf der Oberflåche anderer Zellen, der    1    (/+), befinden. Was also geschieht, wenn eine Leber- oder Nierenzelle mit einem Virus infiziert wird: Die infizierte Zelle pråsentiert Teile von Virusproteinen auf der Oberflåche (Abb. 17.21) und ist dadurch in der Lage, an einen entsprechenden T-Zell-Rezeptor zu binden. Durch diesen Kontakt wird das Immunsystem auf das Eindringen dieses speziellen Erregers aufmerksam. Wie die Antigenpråsentation im Einzelnen ablåuft, wird weiter unten ausfçhrlich diskutiert (Kap. 17.4.3) und ist çberdies Inhalt der Box ¹Experimentelle Verfahrenª. Wåhrend jede beliebige infizierte Zelle als Antigen pråsentierende Zelle wirken und T-Zellen aktivieren kann, gibt es bestimmte Sorten von ¹hauptamtlichen, professionellenª APCs, die fçr diese Funktion besondere Fåhigkeiten mitbringen. Zu diesen ¹professionellenª APCs gehæren dendritische Zellen und Makrophagen (Abb. 17.8). Wir wollen uns vor allem auf die dendritischen Zellen (DC) konzentrieren, die oft als ¹Wachpostenª des Immunsystems beschrieben werden. Dendritische Zellen verdienen diesen Namen, weil sie in den peripheren Geweben des Kærpers (z. B. Haut und Atemwegen), bei denen stets die Gefahr besteht, dass Erreger von auûen eindringen, buchståblich ¹Wache stehenª. DC sind besonders geschickt darin, eine adaptive Immunantwort auszulæsen. Bei ihrer Patrouille in den peripheren Geweben erkennen unreife dendritische Zellen Mikroorganismen und andere Fremdmaterialien und nehmen sie durch Phagocytose auf. Sobald ein Mikroorganismus im Zellinneren angelangt ist, muss er bearbeitet werden, bevor seine Bestandteile einer anderen Zelle pråsentiert werden kænnen. Diese ¹Umarbeitungª des Antigens umfasst die enzymatische Zerlegung des aufgenommenen Materials im Cytoplasma und den Transport der Fragmente zur Zelloberflåche (Abb. 17.20). Dendritische Zellen mit bearbeitetem Antigen wandern dann in die nåchstgelegenen Lymphknoten und differenzieren dort zu reifen antigenpråsentierenden Zellen. Im Lymphknoten finden sie çberdies Kontakt zu einem groûen Reservoir an T-Zellen, darunter ein winziger Prozentsatz, der spezifisch an das fragmentierte Antigen binden kann und so die T-Zelle aktiviert. Die aktivierte T-Zelle proliferiert zu einem Klon aus lauter Zellen mit demselben T-Zell-Rezeptor. Man schåtzt, dass eine einzelne aktivierte T-Zelle sich çber mehrere Tage hinweg drei- bis viermal am Tag teilen und so eine riesige Population von T-Zellen entstehen lassen kann, die imstande

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ist, mit dem Fremdantigen zu interagieren. Die massive Proliferation spezifischer T-Lymphozyten in Reaktion auf ein infizierendes Agens schlågt sich håufig im Anschwellen der nåchstgelegenen Lymphknoten nieder. Sobald das Fremdantigen eliminiert ist, stirbt die çberwiegende Mehrzahl der angewachsenen T-Zell-Population durch Apoptose; çbrig bleibt eine relativ geringe Population von Gedåchtniszellen mit der Fåhigkeit, im Falle eines spåteren Kontakts mit demselben Pathogen sehr rasch zu reagieren. Im Unterschied zu B-Zellen, die Antikærper sezernieren, fçhren T-Zellen die ihnen zugewie-



T-Lymphozyten: Aktivierung und Wirkungsmechanismus

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sene Funktion durch die direkte Interaktion mit anderen Zellen, unter anderem mit B-Zellen, anderen T-Zellen sowie anderen im ganzen Kærper verteilten Zellen aus. Diese Zell-Zell-Interaktion kann zur Aktivierung, Inaktivierung oder zum Tod der anderen Zelle fçhren. Auûer durch direkten Zellkontakt werden viele T-Zell-Interaktionen auch durch hoch aktive chemische Botenstoffe vermittelt, die +% , die schon in sehr geringen Konzentrationen wirken. Cytokine sind kleine Proteine, die von einer groûen Bandbreite an Zellen produziert werden, zu ihnen zåhlen die Interferone (IFNs), Interleukine (ILs) und Tumornekrosefaktoren (TNFs). Cytokine binden an spezifische Rezeptoren auf der Oberflåche entsprechend reaktiver Zellen und læsen damit ein internes Signal aus, das die Aktivitåt der Zelle veråndert. Manche Zellen teilen sich in Reaktion auf die Bindung eines Cytokins, andere differenzieren sich oder sezernieren ihre eigenen Cytokine. Eine Familie kleiner Cytokine, die der +  , wirkt vor allem als chemische Lockstoffe und stimuliert Lymphozyten, in entzçndetes Gewebe einzuwandern. Etliche Arten von Lymphozyten und Phagozyten besitzen Rezeptoren fçr verschiedene Chemokine, so dass sich ihr Wanderungsverhalten separat kontrollieren låsst. Eine Liste verschiedener Cytokine liefert Tabelle 17.1. Anhand der Proteine auf ihrer Oberflåche und ihrer biologischen Funktionen lassen sich zwei groûe Unterklassen von T-Zellen unterscheiden.1 1

Eine dritte Klasse, die Suppressor-T-Zellen oder regulatorischen T-Zellen, werden hier nicht behandelt, man nimmt an, dass sie T-Zellen kontrollieren, die eine Autoimmunreaktion auslæsen kænnten.

n +%-   !8% $% (+!8 ) çberprçfen unablåssig die Zellen des Kærpers auf Anomalien. Gesunde Zellen werden durch CTLs normalerweise nicht behelligt, aber gealterte oder infizierte und mæglicherweise maligne Zellen werden angegriffen und getætet. CTLs tæten ihre Zielzellen, indem sie sie zur Apoptose veranlassen. Man hat in diesem Zusammenhang zwei verschiedene Wege entdeckt. Bei dem einen setzen CTLs Perforine und Granzyme in den Raum zwischen den Zellen frei. /  sind Proteine, die sich in der Membran der Zielzellen zu Transmembrankanålen zusammenfinden. : $% sind proteolytische Enzyme, die durch die Perforin-Kanåle in die Zelle eindringen und Caspasen aktivieren, jene proteolytischen Enzyme, welche die Apoptose einlåuten (Kap. 15.8.1). Bei dem zweiten Weg binden CTLs an einen Rezeptor auf der Zelloberflåche und aktivieren einen Selbstmordzyklus åhnlich dem in Abb. 15.33. Dadurch dass sie infizierte Zellen abtæten eliminieren CTLs Viren, Bakterien, Hefen, Protozoen und Parasiten, die bereits den Weg in die Zellen gefunden haben und zirkulierenden Antikærpern daher nicht mehr zugånglich sind. CTLs besitzen das Oberflåchenprotein CD8 (      G) und werden daher als CD8+-Zellen bezeichnet. n 2! (!2) sind regulatorische Zellen, keine Killerzellen. Sie unterscheiden sich von CTLs dadurch, dass sie auf ihrer Oberflåche das Protein CD4 statt

880

Die Immunantwort

CD8+ tragen.2 TH-Zellen werden durch ¹professionelleª Antigen pråsentierende Zellen wie dendritische Zellen und Makrophagen aktiviert (Abb. 17.9). Dies ist einer der ersten und wichtigsten Schritte zur Auslæsung einer adaptiven Immunantwort. Einmal aktiviert regulieren TH-Zellen die weitere Immunreaktion, indem sie andere Lymphozyten, die fçr dasselbe Antigen spezifisch sind, erkennen und aktivieren. Nahezu alle B-Zellen benætigen die Hilfe von TH-Zellen, damit sie reifen und zu Antikærper sezernierenden Plasmazellen differenzieren kænnen.3 Wie in Abb. 17.9 (und detaillierter in Abb. 17.24) gezeigt, werden B-Zellen durch direkte Interaktion mit einer TH-Zelle aktiviert. Die Bildung von Antikærpern setzt daher die Aktivierung sowohl von T-Zellen als auch von B-Zellen voraus, die mit dem fraglichen Antigen spezifisch reagieren kænnen. Wie wichtig TH-Zellen sind, wird deutlich, wenn man sich die verheerenden Folgen einer HIV-Infektion ± AIDS ± vor Augen hålt. Hauptangriffsziel dieses Virus sind TH-Zellen. Die meisten HIV-infizierten Menschen bleiben symptomfrei, solange ihre TH-Zellzahl relativ hoch bleibt ± bei çber 500 Zellen/lL (die normale Zahl liegt bei 1000 Zellen/lL). Sobald die Zahl sinkt und unter 200 Zellen/lL fållt, entwickelt der Betreffende eine manifeste AIDS-Erkrankung und wird anfållig fçr alle mæglichen viralen und zellulåren Pathogene.

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  Stark vereinfachte schematische Darstellung der Rolle von TH-Zellen bei der Antikærpersynthese. In Schritt 1 interagiert der Makrophage mit dem komplexen Antigen. Das Antigen wird in die Zelle aufgenommen und in Fragmente gespalten, die dann auf der Zelloberflåche pråsentiert werden. In Schritt 2 interagiert der Makrophage mit einer TH-Zelle, deren TCR an eines der pråsentierten Antigenfragmente gebunden hat (das grçne Membranprotein ist ein MHC-Molekçl, Kap. 17.4.4). Diese Interaktion aktiviert die T-Zelle. In Schritt 3 interagiert die aktivierte T-Zelle mit einer B-Zelle, deren Antigenrezeptor an ein intaktes, læsliches Antigen gebunden hat. Die B-Zell-Aktivierung wird durch Cytokine (z. B. IL-4, IL-5 und IL-6) stimuliert, die von der T-Zelle in den Zwischenraum abgegeben werden, der sie von der B-Zelle trennt. Die Wechselwirkung mit der TH-Zelle aktiviert die B-Zelle, die daraufhin proliferiert (Schritt 4). Die Nachkommen der aktivierten B-Zelle differenzieren zu Plasmazellen; diese produzieren Antikærper, die an das Antigen binden kænnen (Schritt 5)

2

Es gibt zwei Hauptklassen von T-Helfer-Zellen, TH1- und TH2-Zellen, die sich anhand der von ihnen sezernierten Cytokine und ihrer jeweiligen Grundfunktionen unterscheiden lassen. TH1-Zellen produzieren IFN-c und schçtzen den Kærper, indem sie Makrophagen aktivieren, eventuell vorhandene Bakterien im Zellinneren abzutæten (Kap. 8.9). TH2-Zellen produzieren IL-4 und schçtzen gegen extrazellulåre Pathogene, indem sie B-Zellen zur Antikærperproduktion anregen. Die beiden Arten von TH-Zellen gehen aus einer gemeinsamen Vorlåuferzelle hervor, ihre Differenzierung wird durch unterschiedliche Stimuli angeregt. 3 Wie bereits oben angemerkt, sind einige wenige Antigene in der Lage, B-Zellen ohne die Beteiligung von T-Zellen zur Antikærperproduktion anzuregen. Zu diesen ¹thymusunabhångigenª Antigenen gehæren groûe polymere Molekçle mit sich wiederholenden Substrukturen, beispielsweise Lipopolysaccharide, ein Bestandteil von Bakterienzellwånden.

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Wiederholung 1. Wie signalisiert eine infizierte Zelle im Organismus einer T-Zelle ihren Zustand? Worin besteht die Reaktion der T-Zelle? 2. Was ist eine APC? Welche Arten von Zellen kænnen als APC wirken? 3. Vergleichen Sie die Eigenschaften und Funktionen einer TH-Zelle und eines CTL.



Ausgewåhlte Aspekte der zellulåren und molekularen Grundlagen der Immunitåt

!2 usgewåhlte Aspekte der zellulåren und molekularen Grundlagen der Immunitåt 17.4.1 Die modulare Struktur von Antikærpern Antikærper sind Proteine, die von B-Zellen und deren Abkæmmlingen (Plasmazellen) produziert werden. B-Zellen bauen Antikærpermolekçle in ihre Plasmamembran ein, wo sie als Antigen-Rezeptoren dienen, Plasmazellen hingegen sezernieren Antikærper ins Blut oder in andere Kærperflçssigkeiten, und diese gesellen sich dort zum çbrigen molekularen Arsenal des Kærpers im Kampf gegen eindringende Pathogene. Die Interaktion zwischen Antikærpern im Blut und Antigenen auf der Oberflåche eines Virus oder einer Bakterienzelle kann die Fåhigkeit eines Erregers, eine Wirtszelle zu infizieren, unterlaufen und die Ingestion und Zerstærung des Erregers durch zirkulierende Phagozyten erleichtern. Das Immunsystem produziert Millionen verschiedener Antikærpermolekçle, die in ihrer Gesamtheit mehr oder minder jede Fremdsubstanz binden kænnen, mit der ein Kærper in Kontakt kommen kænnte. Zwar legt das Immunsystem durch die Antikærper, die es produziert, eine groûe Vielfalt an den Tag, doch der einzelne Antikærper vermag jeweils nur mit einer einzigen oder ein paar nahe mit dieser verwandten Strukturen zu reagieren. Antikærper sind globulåre Proteine, die man auch als 6  bezeichnet. Immunglobuline bestehen aus zwei Arten von Polypeptidketten, den græûeren  '  (Molekulargewicht zwischen 50 000 und 70 000) und den kleineren     (Molekulargewicht 23 000). Beide Ketten sind miteinander durch Disulfidbrçcken zu Paaren verknçpft. Man kennt fçnf verschiedene Klassen von Immunglobulinen (6, 6, 6#, 6: und 6). Die verschiedenen

Immunglobulinklassen treten zu verschiedenen Zeiten nach dem Kontakt mit einer Fremdsubstanz auf den Plan und haben unterschiedliche biologische Funktionen (Tabelle 17.2). IgM-Molekçle sind die ersten Antikærper, die B-Zellen nach der Stimulierung durch ein Antigen sezernieren, sie sind bereits nach wenigen Tagen nachweisbar (Abb. 17.10). IgM-Molekçle haben eine relativ kurze Halbwertszeit (etwa 5 Tage) und ihrem Erscheinen folgt die Sekretion der langlebigeren IgG- oder IgE-Molekçle. IgG-Molekçle sind im Rahmen einer sekundåren Immunantwort auf die meisten Antigene die vorherrschende Antikærperklasse in Blut und Lymphe (Abb. 17.10). IgE-Antikærper werden in Reaktion auf viele Parasiteninfektionen in groûen Mengen produziert. Sie binden auch mit hoher Affinitåt an die Oberflåche von Mastzellen, wo sie die Freisetzung von Histamin steuern, durch die es zu Entzçndungen und den Symptomen ei-

n Abb. 17.10. #&  & B    #&'"   B        )     "  !&  ! # B   ??  "  ! %I (  B  '     )                B        ,        !   &          @   "  ! % &   4    ! #&          # (  + ?1" !    '  B   B        !   !      !B 

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Die Immunantwort

ner Allergie kommt. IgA ist die in Sekreten von Atemwegen, Verdauungs- und Urogenitaltrakt vorherrschende Antikærperspezies. Die Funktion von IgD ist bislang nicht geklårt. Es gibt zwei Typen von leichten Ketten: Kappa-Ketten (j-Ketten) und Lambda-Ketten (k-Ketten), beide kommen in den Immunglobulinen aller fçnf Klassen vor. Was die schweren Ketten dagegen betrifft, so hat jede Immunglobulinklasse ihre eigene unverwechselbare Kette, durch die sie definiert ist (Tabelle 17.2).4 Wir wollen uns im Wesentlichen auf die Struktur von IgGs konzentrieren. Ein IgG-Molekçl besteht aus zwei identischen leichten Ketten und zwei identischen schweren Ketten, die zusammen wie in Abb. 17.11 a gezeigt und im Folgenden beschrieben, ein Y-færmiges Molekçl bilden. Um den Grundlagen der Antikærperspezifitåt auf die Spur zu kommen, war es zunåchst notwendig, die Aminosåuresequenz einer Reihe von spezifischen Antikærpern zu bestimmen. Normalerweise besteht der erste Schritt bei der Sequenzierung der Aminosåuren in der Aufreinigung des fraglichen Proteins. Unter normalen Bedingungen aber ist es unmæglich, von einem bestimmten Antikærper eine aufgereinigte Pråparation aus dem Blut herzustellen, weil jeder Mensch eine groûe Zahl an unterschiedlichen Antikærpern produziert, die sich in ihrer Struktur untereinander viel zu sehr åhneln, als dass sie sich auftrennen lieûen. Dieses Problem konnte jedoch umgangen werden, als man herausfand, dass sich im Blut von Patienten, die an einer bestimmten Form von Tumoren des Lymphsystems, dem Plasmozytom oder multiplen Myelom, erkrankt waren, groûe Mengen von ein und derselben Sorte Antikærper finden. Wie in Kap. 16 beschrieben, ist Krebs eine monoklonale Erkrankung, d. h. die Zellen eines Tumors entspringen einer einzelnen entarteten Zelle. Da ein einzelner Lymphozyt normalerweise nur eine einzige Sorte von Antikærpern synthetisiert, produzieren Menschen mit multiplem Myelom riesige Mengen des einen Antikærpers, den die Ursprungszelle des Tumors sezerniert hat. Jeder Patient hat daher groûe Antikærpermengen im Blut, aber jeder von einem anderen Antikærper. Infolgedessen konnten Wissenschaftler betråchtliche Mengen verschiedener Antikærper aufreinigen und deren Aminosåuresequenz bestimmen. Schon bald zeigte sich eine 4

Genau genommen gibt es beim menschlichen IgG vier miteinander eng verwandte schwere Ketten (es gibt demnach IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4) und beim IgA zwei ebenfalls eng miteinander verwandte schwere Ketten (IgA1 und IgA2) (Abb. 17.16). Diese Unterschiede sollen in der folgenden Diskussion allerdings unerwåhnt bleiben.

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wichtige Gemeinsamkeit: Man stellte fest, dass die Hålfte jeder leichten j-Kette (110 Aminosåuren am Ende des Peptids) bei allen j-Ketten eine konstante Aminosåuresequenz hat, wåhrend die andere Hålfte von einem Patienten zum anderen variiert. Ein åhnlicher Vergleich der Amino-



Ausgewåhlte Aspekte der zellulåren und molekularen Grundlagen der Immunitåt

såuresequenzen verschiedener k-Ketten ergab, dass auch sie aus einem Abschnitt mit konstanter Sequenz bestanden und einem Abschnitt, dessen Sequenz von einem Immunglobulin zum anderen variiert. Auch die schweren Ketten gereinigter IgGs weisen einen Abschnitt von konstanter Sequenz auf und einen, dessen Sequenz von einem Immunglobulin zum nåchsten variiert. Die schweren Ketten der gereinigten IgGs enthalten ebenfalls einen variablen (V)- und einen konstanten (C)-Anteil. Eine schematische Darstellung eines dieser IgG-Molekçle ist in Abb. 17.11 b gezeigt. Auûerdem fand man heraus, dass die variable Sequenz bei den leichten Ketten (VL) etwa die Hålfte der Struktur ausmacht, dass sich bei den schweren Ketten jedoch nur etwa ein Viertel (VH) der Sequenz von einem Patienten zum anderen unterscheidet. Die çbrigen drei Viertel der schweren Kette (CH) sind bei allen IgGs gleich. Der konstante Anteil der schweren Kette låsst sich in drei Abschnitte von etwa gleicher Långe unterteilen, die eindeutig homolog zueinander sind. Diese homologen Ig-Untereinheiten sind in Abb. 17.11 b mit CH1, CH2 und CH3 bezeichnet. Offenbar sind die drei Abschnitte des konstanten Teils der schweren IgG-Kette (ebenso wie jene der schweren Ketten anderer Ig-Klassen) im Verlauf der Evolution durch die Duplikation eines Ur-Gens entstanden, das eine Ig-Untereinheit von etwa 110 Aminosåuren codiert hatte. Auch die variablen Regionen VH oder VL sind, so nimmt man an, aus dieser ursprçnglichen IgEinheit hervorgegangen. Strukturanalysen lassen darauf schlieûen, dass jede der homologen IgEinheiten sich unabhångig von den anderen zu einer kompakten Domåne faltet, die durch Disulfidbrçcken zusammengehalten wird (Abb. 17.12). In einem intakten IgG-Molekçl findet sich, wie in Abb. 17.11 a, b gezeigt, jede leichte Kette mit einer schweren zusammen. Genetische Analysen zeigen, dass jede Domåne von ihrem eigenen Exon codiert wird. Die Spezifitåt eines Antikærpers wird bestimmt durch die Aminosåuresequenz der Antigen bindenden Domåne am Ende der beiden Arme des Y-færmigen Antikærpermolekçls (Abb. 17.11). Die beiden Erkennungsstellen eines IgG-Molekçls sind identisch und bestehen jeweils aus dem Zusammenschluss des variablen Teils der leichten Kette mit dem variablen Teil der schweren Kette (Abb. 17.11). Dieses Arrangement aus verschiedenen Kombinationen von leichten und schweren Ketten macht es mæglich, dass ein Mensch aus einer vergleichsweise maûvollen Zahl an Polypeptiden eine ungeheure Vielfalt an Antikærpern herstellen kann (Kap. 17.4.2).

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noch çber 2000 Nucleotide vom Cj-Gen entfernt. Bis zur Transkription erfolgt nun keine weitere Umordnung mehr, die gesamte Region wird in ein groûes Primårtranskript çberschrieben (Schritt 4), aus dem die Introns schlieûlich herausgespleiût werden (Schritt 5). Die DNA-Umlagerung beginnt mit einem Schnitt durch den Doppelstrang zwischen einem V-Gen und einem J-Gen. Dieser Schnitt wird durch ein Proteinpaar katalysiert ± RAG1 und RAG2 ±, das Teil der V(D)J-Rekombinase ist. Die vier so entstandenen freien Enden werden anschlieûend so vereinigt, dass die codierenden Abschnitte der V- und J-Segmente zu einem Exon verbunden werden, das die variable Region der Polypeptidkette codiert, wåhrend die beiden Enden der intervenierenden DNA-Sequenzen zu einer kleinen zirkulåren DNA verbunden werden, die aus dem Chromosom herausgeschnitten wird (Abb. 17.15, Schritt 3). Die Vereinigung der unterbrochenen DNA-Enden kommt durch denselben in Abb. 13.28 dargestellten Prozess zustande, der auch die Reparatur von DNAStrangbrçchen leistet. Fçr den Lymphozyten hat die Umlagerung der DNA-Sequenzen fçr ein Immunglobulin wichtige Konsequenzen. Sobald eine spezielle Vj-Sequenz mit einer Jj-Sequenz vereinigt ist, kann diese Zelle keine andere Art von j-Kette mehr synthetisieren. Man schåtzt, dass die DNA menschlicher Keimzellen etwa 40 funktionsfåhige Vj-Gene enthålt. Wenn wir daher annehmen, dass sich jede beliebige V-Sequenz mit jeder beliebigen J-Sequenz verbinden kann, mçssen wir davon ausgehen, dass ein Mensch ungefåhr 200 verschiedene j-Ketten zu synthetisieren imstande ist (5 Jj-Segmente 40 Vj-Gene). Damit aber sind die Mæglichkeiten zur Schaffung von Vielfalt bei diesen Polypeptiden noch nicht erschæpft. Die Stelle, an der eine J-Sequenz mit einer V-Sequenz verknçpft wird, kann von einem Arrangement zum anderen variieren, so dass bei zwei verschiedenen Zellen dieselben Vjund Jj-Gene so aneinandergefçgt sein kænnen, dass die entstehenden leichten j-Ketten unterschiedliche Aminosåuresequenzen erhalten. Zusåtzliche Variabilitåt wird erreicht durch das Enzym Desoxynucleotidyltransferase, das dort, wo es zu Strangbrçchen gekommen ist, Nucleotide einfçgt. Diese zusåtzlichen Mæglichkeiten, Variabilitåt zu erzeugen, erhæhen die Vielfalt bei den j-Ketten noch einmal um das Zehnfache, d. h. auf mindestens 2000 Arten. Der Ort, an dem Vund J-Ketten verbunden sind, ist Teil der hypervariablen Region der Antikærper-Polypeptide (Abb. 17.12). Winzige Unterschiede an dieser Verbindungsstelle kænnen daher groûe Auswir-



Ausgewåhlte Aspekte der zellulåren und molekularen Grundlagen der Immunitåt

kungen auf die Antikærper-Antigen-Interaktion haben. Wir haben unsere Diskussion aus Grçnden der Vereinfachung auf die leichten j-Ketten beschrånkt. Zu ganz åhnlichen DNA-Umlagerungen kommt es, wenn eine Zelle sich der Synthese einer bestimmten leichten k-Kette und einer speziellen schweren Kette widmet. Wåhrend die variablen Regionen leichter Ketten aus zwei unterschiedlichen Segmenten (V- und J-Segmenten) bestehen, werden die variablen Regionen der schweren Ketten in åhnlichen Umlagerungsaktionen aus drei verschiedenen Segmenten (V, D und J) gebildet. Das menschliche Genom enthålt 51 funktionsfåhige VH-Segmente, 25 DHSegmente und 6 JH-Segmente. In Anbetracht der durch die Variabilitåt der VH-DH-Verbindung und der DH-JH-Verbindung bereits bestehenden Variabilitåt kommt ein Mensch damit auf die Mæglichkeit mindestens 100 000 verschiedene Ketten zu synthetisieren. Auch die Antigenrezeptoren von T-Zellen (TCRs) bestehen aus schweren und leichten Ketten, die durch åhnliche DNA-Umlagerungen miteinander verknçpft werden. Die Bildung von Antikærper-Genen durch DNA-Umlagerungen macht anschaulich, welches Potenzial dem Genom im Rahmen dynamischer Prozesse zukommt. Dank dieses Umordnungsmechanismus vermag eine Handvoll DNA-Sequenzen aus der Keimbahn eine bemerkenswerte Palette an Genprodukten hervorzubringen. Wie oben bereits erlåutert, synthetisiert ein Mensch grob 2000 verschiedene Arten von leichten Ketten und 100 000 verschiedene Arten von schweren Ketten. Wenn sich jede leichte Kette mit jeder beliebigen schweren Kette zusammentun kann, kann ein Mensch aus wenigen hundert genetischen Elementen in seiner Keimbahn theoretisch çber 200 Mio. unterschiedliche Antikærperarten hervorbringen.5 Wir haben gesehen, dass sich die Antikærpervielfalt ergibt aus n dem Vorhandensein multipler V-, J- und D-Exons in der DNA der Keimbahn, n der Variabilitåt der V-J- und der V-D-JVerknçpfung, n der enzymatischen Insertion von Nucleotiden.

5 Eine in etwa vergleichbare Zahl gilt fçr Antikærper mit k-Ketten.

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Ein weiterer Mechanismus, der die Variabilitåt von Antikærpern garantiert, wird als     2%   bezeichnet und findet lange nach Beendigung der DNA-Umlagerungen statt. Wenn ein spezifisches Antigen nach einer gewissen Zeit erneut in einem Tier auftaucht, haben die Antikærper, die wåhrend dieser sekundåren Immunantwort produziert werden, eine weitaus græûere Affinitåt fçr das Antigen als diejenigen, die wåhrend der primåren Immunantwort produziert worden waren. Diese erhæhte Affinitåt ist auf kleine Verånderungen der Aminosåuresequenz in den variablen Regionen von leichten und schweren Antikærperketten zurçckzufçhren. Solche Sequenzånderungen ergeben sich aus Mutationen in den Genen, welche diese Polypeptide codieren. Man schåtzt, dass umgelagerte DNA-Elemente, die V-Regionen von Antikærpern codieren, eine Mutationsrate aufweisen, die 105-mal græûer ist als die anderer Genloci derselben Zelle. Der Mechanismus, der fçr diese erhæhte Mutationsrate der V-Region verantwortlich ist, stand in den letzten Jahren im Mittelpunkt zahlreicher interessanter Studien. Teil dieses Mechanismus ist ein Enzym ± eine Cytosindesaminase ± das in der DNA Cytosin zu Uracil umwandelt, und eine oder mehrere TranslåsionsDNA-Polymerasen (Kap. 13.3), die den Hang haben, Fehler zu machen, wenn sie DNA kopieren oder reparieren mçssen, die Uracil enthålt. Nach erneuter Antigenexposition werden BZellen, deren Gene Ig-Molekçle mit græûerer Antigen-Affinitåt produzieren, bevorzugt selektiert. Solchermaûen selektierte Zellen proliferieren zu Klonen, die weitere Runden der somatischen Mutation und Selektion durchlaufen, wåhrend nicht selektierte Zellen, die Igs mit geringer Affinitåt produzieren, der Apoptose unterliegen. Auf diese Weise verbessert sich die Antikærperreaktion auf wiederkehrende oder chronische Infektionen mit der Zeit betråchtlich. Sobald eine Zelle im Dienst der Produktion eines spezifischen Antikærpers steht, kann sie die Immunglobulinklasse der von ihr produzierten Antikærper wechseln (beispielsweise von IgM nach IgG), indem sie eine andere schwere Kette produziert. Dieser Vorgang, den man als    oder 6 

'  ( + ) bezeichnet, låuft ab, ohne dass sich an der Antigenbindungsstelle der synthetisierten Antikærper etwas åndert. Man erinnere sich, dass es fçnf verschiedene Typen von schweren Ketten gibt, die sich in ihren konstanten Regionen unterscheiden. Gene, welche die konstanten Regionen (CH-Regionen) von schweren Ketten codieren, håufen sich, wie in Abb. 17.16 dargestellt, in einem Komplex. Der Klas-

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Die Immunantwort

n Abb. 17.16.    8    (       '   )     ?      ?    '    '   )   ( ?"    (    !     "  (     ( (    (  ( !'  (         +C 61

senwechsel wird dadurch bewerkstelligt, dass ein anderes CH-Gen in die Nåhe des VDJ-Gens verlagert wird, das zuvor durch DNA-Umlagerungen gebildet worden war. Der Klassenwechsel erfolgt unter dem Dirigat von Cytokinen, die T-Helferzellen im Verlauf ihrer Interaktion mit Antikærper produzierenden B-Zellen ausschçtten. Eine T-Helferzelle zum Beispiel, die IFN- ausschçttet, induziert in der ihr benachbarten B-Zelle einen Wechsel von der Produktion von IgM zur Synthese einer der anderen IgG-Klassen. Der Klassenwechsel ermæglicht es einer B-Zelllinie, weiterhin Antikærper mit derselben Spezifitåt zu produzieren, die unterschiedliche Effektorfunktionen haben (Kap. 17.4.2). !2' Membrangebundene Antigen-Rezeptor-Komplexe Sowohl bei B-Zellen als auch bei T-Zellen erfolgt die Erkennung des Antigens an der Zelloberflåche. Ein Antigenrezeptor auf der Oberflåche einer B-Zelle (ein B-Zellrezeptor oder BCR) besteht aus einem membrangebundenen Immunglobulin, das selektiv an eine bestimmte Region eines intakten Antigens bindet (an das Epitop) (Abb. 17.17 a). Der Antigenrezeptor auf der Oberflåche einer T-Zelle hingegen (ein T-Zellrezeptor oder TCR, Abb. 17.17 b) erkennt und bindet kleine Fragmente eines Antigens, in der Regel ein Peptid von etwa 7 bis 25 Aminosåuren Långe, das auf der Oberflåche einer anderen Zelle gebunden ist (s. unten). Beide Arten von Antigenrezeptoren sind Teil eines groûen membrangebundenen Proteinkomplexes, der (wie in Abb. 17.17 dargestellt) auch nicht-variable Proteine enthålt. Die mit BCRs und TCRs assoziierten nicht-variablen Polypeptide spielen bei B- und T-Zellen eine Schlçsselrolle bei der Ûbermittlung von aktivitåtsåndernden Signalen ins Zellinnere. Jede TCR-Untereinheit enthålt zwei Ig-åhnliche Domånen, die darauf schlieûen lassen, dass sie mit den BCRs ein gemeinsames Erbe haben. Genau wie Immunglobuline schwere und leichte Ketten in sich vereinigen, besitzt auch eine der Ig-åhnlichen Domånen des T-Zell-Rezeptors eine

n Abb. 17.17 a, b. %     !         ,  a   8;                  

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variable Aminosåuresequenz, wåhrend die andere Domåne von konstanter Aminosåuresequenz ist (Abb. 17.17). Ræntgenkristallographische Untersuchungen haben gezeigt, dass die beiden Arten von Antigenrezeptoren sich auch in ihrer dreidimensionalen Form åhneln. 17.4.4 Der Haupthistokompatibilitåtskomplex Wåhrend der ersten Hålfte des 20. Jahrhunderts entdeckten klinische Forscher, dass es mæglich ist, per Transfusion Blutzellen von einer Person zur anderen zu çbertragen, solange die Betreffenden nach dem AB0-Blutgruppensystem miteinander kompatibel waren. Der Erfolg der Bluttransfusionen fçhrte zu der Ûberlegung, dass sich auch Haut von einer Person zur nåchsten çbertragen lassen mçsste. Wåhrend des Zweiten Weltkriegs erfuhr diese Idee eine grçndliche Ûberprçfung, als man versuchte, Piloten und anderem Militårpersonal mit schweren Verbrennungen Hauttransplantate zu verpflanzen. Die Transplantate wurden samt und sonders binnen kçrzester Zeit vollståndig abgestoûen. Nach dem Krieg machten sich Wissenschaftler daran, den



Ausgewåhlte Aspekte der zellulåren und molekularen Grundlagen der Immunitåt

Grund fçr die Gewebeabstoûung herauszufinden. Man beobachtete, dass Haut sich zwischen Måusen desselben durch Inzucht vermehrten Stammes durchaus erfolgreich verpflanzen lieû, zwischen Måusen aus unterschiedlichen Ståmmen aber sofort abgestoûen wurde. Måuse aus demselben Inzuchtstamm sind so etwas wie identische Zwillinge, sie sind genetisch identisch. Folgestudien ergaben, dass die Gene, welche die Gewebeabstoûung steuerten, in einer Genomregion zusammengedrångt waren, der man den Namen 2      1 - ($  ?98 (   '   +% D1 8  $  , # 

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wobei  der minimale Abstand ist, den zwei Punkte haben kænnen, damit sie noch aufgelæst werden kænnen,  die Wellenlånge des Lichtes (527 nm fçr weiûes Licht) und der Brechungsindex des Mediums zwischen Pråparat und Objektiv. Wie in Abb. 18.2 ersichtlich, ist
der halbe Úffnungswinkel des Lichtkegels, der ins Objektiv einfållt. Alpha ist ein direktes Maû fçr die Fåhigkeit der Linse, Licht zu bçndeln, und steht in direkter Relation zu dessen Apertur. Der Nenner in der eben vorgestellten Gleichung wird auch als     bezeichnet. Die numerische Apertur ist fçr jede Linse eine Konstante, ein Maû fçr deren lichtbçndelnde Qualitåt. Bei einem Objektiv, das fçr den Einsatz in Luft vorgesehen ist, ist die maximal mægliche numerische Apertur 1, weil der Sinus des maximal mæglichen Winkels von 908 1 betrågt und der Brechungsindex von Luft ebenfalls 1 ist. Ein Immersionsobjektiv, das mit Úl verwendet wird, hat eine maximale numerische Apertur von 1,5. Ûber den Daumen kann

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Techniken der Zell- und Molekularbiologie

man sagen, dass die maximale færderliche Vergræûerung eines Mikroskops bei dem 500- bis 1000fachen der numerischen Apertur des verwendeten Objektivs liegt. Versuche, das Bild çber diesen Punkt hinaus zu vergræûern, bringen allenfalls eine Leervergræûerung und verschlechtern die Qualitåt des Bildes. Eine hohe numerische Apertur wird durch den Einsatz von Linsen mit kurzer Brennweite erreicht, weil sich diese sehr nahe an das Objekt heranbringen lassen. Wenn wir die kçrzestmægliche Wellenlånge der Beleuchtung und die græûtmægliche numerische Apertur in die Gleichung einsetzen, kænnen wir die Auflæsungsgrenze eines Lichtmikroskops errechnen. Man erhålt mit diesen Zahlen einen Wert von etwas weniger als 0,2 lm (oder 200 nm), das gençgt, um græûere Zellorganellen wie Kern und Mitochondrien unterscheiden zu kænnen. Die Auflæsungsgrenze des bloûen Auges dagegen, dessen numerische Apertur bei etwa 0,004 liegt, betrågt in etwa 0,1 mm. Auûer durch diese theoretischen Faktoren wird das Auflæsungsvermægen auch durch optische Fehler oder Aberrationen bestimmt. Es gibt sieben wichtige Aberrationen, und dieses Hindernis muss ein Linsenhersteller çberwinden, um Objektivlinsen herstellen zu kænnen, deren tatsåchliches Auflæsungsvermægen an die theoretischen Grenzen heranreicht. Objektivlinsen bestehen daher statt aus einer einzelnen Linse aus einer komplexen Kombination von Einzellinsen, um diese Aberrationen so gering wie mæglich zu halten. In der Regel leistet eine der Linsen die erforderliche Vergræûerung wåhrend die anderen die Fehler der ersten Linse kompensieren, um ein wirklichkeitsgetreues Gesamtbild zu gewåhrleisten. !5!$ Visibilitåt Auf der eher praktischen Seite der Mikroskopie steht die Frage der Sichtbarkeit eines Gegenstands, bei der es um die Faktoren geht, die es çberhaupt erst ermæglichen, ein Objekt zu sehen. Das mag reichlich trivial scheinen: Wenn ein Objekt da ist, sollte man es sehen kænnen. Denken Sie einmal an eine durchsichtige Glasperle. Unter den meisten Bedingungen und gegen die meisten Hintergrçnde betrachtet ist die Perle klar sichtbar. Legen Sie die Perle aber in ein Glas mit Immersionsæl vom selben Brechungsindex wie Glas, entzieht sich die Perle Ihrer Sicht, weil sie Licht nicht mehr in erkennbar anderer Art und Weise beeinflusst als ihre Hintergrundflçssigkeit. Jeder, der einmal seine Zeit damit zugebracht hat, eine Amæbe zu suchen,

kann das Problem der Sichtbarkeit beim Lichtmikroskop nachvollziehen. Was wir durch ein Fenster oder ein Mikroskop sehen, sind Gegenstånde, die das Licht in anderer Art und Weise beeinflussen als ihr Hintergrund. Ein anderer Ausdruck fçr Visibilitåt in diesem Sinne ist der Begriff  , will sagen, die unterschiedliche Erscheinungsform benachbarter Teile eines Objekts oder eines Objekts und seines Hintergrunds. Wie notwendig Kontrast ist, låsst sich ermessen, wenn man an einen Sternenhimmel denkt. Wåhrend ein klarer Nachthimmel von Sternen nur so prangt, scheint demselben Himmel wåhrend des Tages jeder Himmelskærper abzugehen. Die Sterne haben sich unserem Blick entzogen, aber sie sind nicht vom Himmel verschwunden. Gegen den hellen Hintergrund sind sie einfach unsichtbar geworden. In der makroskopischen Welt betrachten wir Gegenstånde, auf die Licht fållt, und wir sehen das Licht, das von ihnen auf unsere Augen zurçckreflektiert wird. Wenn wir hingegen ein Mikroskop verwenden, platzieren wir das Objekt zwischen die Lichtquelle und unsere Augen und betrachten Licht, das durch das Objekt hindurchtritt (oder, genauer, das vom Objekt gebeugt wird). Wenn Sie sich mit einem Objekt in einen Raum mit einer einzigen Lichtquelle begeben und den Gegenstand zwischen diese Lichtquelle und ihre Augen halten, werden Sie einen Teil der Schwierigkeiten verstehen, die eine solche Art der Beleuchtung mit sich bringt. Das Ganze setzt voraus, dass Ihr Gegenstand nahezu transparent, im wahrsten Sinne des Wortes durchsichtig ist. Und da liegt auch schon die andere Hålfte des Problems: Gegenstånde die ¹nahezu transparentª sind, kænnen sehr schwer zu sehen sein. Eine der besten Mæglichkeiten, ein dçnnes, durchsichtiges Pråparat unter dem Mikroskop sichtbar zu machen, besteht in der Fårbung mit einem Farbstoff, der nur Licht bestimmter Wellenlången des sichtbaren Spektrums absorbiert. Die nicht absorbierten Wellenlången werden ans Auge weitergeleitet und lassen das gefårbte Objekt bunt erscheinen. Verschiedene Farbstoffe binden an verschiedene Arten von biologischen Molekçlen, daher erhæhen Fårbeverfahren nicht nur die Sichtbarkeit eines Pråparats, sondern geben auch Aufschluss darçber, wo sich in Zellen oder Geweben bestimmte Arten von Substanzen finden. Ein gutes Beispiel hierfçr ist die Feulgen-Fårbung, eine DNA-spezifische Fårbung, die Chromosomen unter dem Mikroskop farbig erscheinen låsst (Abb. 18.5). Ein Problem bei Fårbungen ist die Tatsache, dass sie grundsåtzlich nicht bei lebenden Zellen zu verwenden sind. Meist sind sie selbst oder die Fårbebedingungen



Das Lichtmikroskop

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n Abb. 18.5.     & ?   " 

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toxisch, oder die Farbstoffe kænnen die Plasmamembran einer lebenden Zelle nicht durchdringen. Bei der Feulgen-Fårbung muss das Gewebe zum Beispiel zunåchst in Såure hydrolysiert werden, bevor man den Farbstoff anwenden kann. Unterschiedliche Arten von Lichtmikroskopen verwenden unterschiedliche Arten von Beleuchtung. Bei einem 2   sieht man den Lichtkegel, der das Pråparat durchleuchtet, als hellen Hintergrund, gegen den man das Bild des Pråparats sichtbar machen muss. Hellfeldmikroskopie ist in idealer Weise fçr kontrastreiche Pråparate geeignet ± beispielsweise fçr gefårbte Gewebeschnitte, fçr andere Pråparate bietet sie hingegen nicht unbedingt die optimale Sichtbarkeit. In den folgenden Abschnitten wollen wir daher andere Mittel betrachten, mit denen sich Objekte im Lichtmikroskop besser sichtbar machen lassen. !5!' Phasenkontrastmikroskopie Kleine ungefårbte Objekte wie lebende Zellen kænnen im Hellfeldmikroskop extrem schwer zu sehen sein (Abb. 18.6 a). Das /      macht hoch transparente Objekte besser sichtbar (Abb. 18.6 b). Wir kænnen verschiedene Teile des Pråparats voneinander unterscheiden, weil sie Licht unterschiedlich reflektieren. Eines der Fundamente fçr solche Unterschiede ist der Brechungsindex. Zellorganellen bestehen aus verschiedenen Anteilen an verschiedenen Molekçlen:

n Abb. 18.6 a±c.     !'   (          ,   .        8   a  9  " b  #

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DNA, RNA, Protein, Lipid, Kohlenhydrat, Salzen und Wasser. Regionen von unterschiedlicher Zusammensetzung werden daher unterschiedliche Brechungsindices aufweisen. Wir kænnen solche Unterschiede normalerweise nicht mit unseren Augen wahrnehmen. Das Phasenkontrastmikroskop aber setzt Unterschiede im Brechungsindex in Intensitåtsunterschiede um (relative Helligkeit), die fçr unser Auge sichtbar sind. Die Phasenkontrastmikroskopie erreicht dies, indem sie

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Techniken der Zell- und Molekularbiologie

das direkte Licht, das ins Objektiv einfållt, von dem gebeugten Licht trennt, das durch das Pråparat hindurch tritt, und zudem Lichtstrahlen aus diesen beiden Quellen dazu bringt, miteinander zu interferieren. Die relative Helligkeit jedes Objektteils reflektiert die Art und Weise, wie das Licht aus dem Teil des Pråparates mit dem direkten Licht interferiert. Die Phasenkontrastmikroskopie ist çberaus nçtzlich, wenn es darum geht, intrazellulåre Komponenten lebender Zellen bei relativ hoher Auflæsung zu untersuchen. Die Dynamik und Beweglichkeit von Mitochondrien, Mitose-Chromosomen und Vacuolen låsst sich mit dieser Optik beobachten und filmen. Allein zu beobachten, wie die winzigen zellulåren Partikel und Vacuolen in einer lebenden Zelle geschåftig und scheinbar ziellos hin und her geschoben werden vermittelt einen aufregenden Eindruck von Leben, der durch gefårbte tote Zellen niemals erreicht werden kann. Der græûte Nutzen aus der Erfindung des Phasenkontrastmikroskops liegt nicht in der Entdeckung neuer Strukturen, sondern in seinem tagtåglichen Einsatz in Forschung und Lehre, der eine hæchst aufschlussreiche Beobachtung von Zellen ermæglicht. Das Phasenkontrastmikroskop hat optische Mångel, die seine Auflæsung mindern, das Bild leidet unter Lichtbrechungshæfen und stærendem Schattenwurf an Stellen, wo groûe Differenzen im Brechungsindex vorkommen. Es ist eine Art von 6$  . Andere Arten von Interferenzmikroskopen minimieren diese optischen Artefakte durch eine vollståndige Trennung von direktem und gebeugtem Strahl mithilfe komplexer Lichtwege und Prismen. Ein weiteres Interferenzsystem, der     $  (6+), manchmal auch nach seinem Erfinder Nomarski-Interferenzkontrast genannt, liefert ein Bild, das dreidimensional scheint (Abb. 18.6 c). Der Kontrast beim DIC hångt von den Unterschieden ab, die der Brechungsindex innerhalb eines Objekts aufweist. Aus diesem Grund heben sich die Umrisse von Strukturen, an denen sich der Brechungsindex innerhalb einer relativ kurzen Strecke sehr stark veråndert, besonders kontrastreich ab. !5! luoreszenzmikroskopie und verwandte Techniken Bestimmte Verbindungen (
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  oder
 ) absorbieren unsichtbare ultraviolette Strahlung und setzen einen Teil der Energie in långeren sichtbaren Wellenlången frei. Dieses Phånomen bezeichnet

man als
 $$. Das Vorhandensein von Fluorochromen innerhalb einer Zelle beobachtet man mit einem
 $$  . Die Lichtquelle dieses Mikroskops produziert einen ultravioletten Lichtstrahl, der ein Filter passiert, das såmtliche Wellenlången herausfiltert mit Ausnahme derjenigen, die den Fluoreszenzfarbstoff anregt. Dieser monochromatische Lichtstrahl wird auf das Objekt fokussiert, das den Fluoreszenzfarbstoff enthålt, und regt diesen an, Licht sichtbarer Wellenlånge zu emittieren. Dieses Licht wird im Objektiv zu einem Abbild gebçndelt, das der Betrachter sehen kann. Da die Lichtquelle nur ultraviolettes (schwarzes) Licht aussendet, erscheinen die mit einem Fluorochrom gefårbten Objekte hell leuchtend vor schwarzem stark kontrastierendem Hintergrund. Bei einer der håufigsten Anwendungen der Fluoreszenzmikroskopie wird ein Fluoreszenzfarbstoff (z. B. Rhodamin oder Fluorescein) kovalent an einen Antikærper gebunden; mit diesem fluoreszierenden Antikærper låsst sich dann die Lokalisation eines bestimmten Proteins innerhalb einer Zelle bestimmen. Man bezeichnet diese Technik als 6 $$, dargestellt ist sie in Abb. 9.29 a. Nåheres zur Immunfluoreszenz findet sich in Kap. 18.14. Fluoreszenzfarbstoffe lassen sich auch dazu verwenden, DNAund RNA-Molekçle zu lokalisieren, die wie in Kap. 10.4.1 beschrieben und in Abb. 10.21 gezeigt, spezifische Nucleotidsequenzen enthalten. In anderen Fållen hat man Fluorochrome verwendet, um die Græûe von Molekçlen zu bestimmen, die von einer Zelle zur anderen ausgetauscht werden kænnen (Abb. 7.33), als Indikatoren des Transmembranpotenzials (Abb. 5.20) oder als Sonden zur Bestimmung der Konzentration an freiem Calcium im Cytosol (Abb. 15.25). Die Verwendung von calciumsensitiven Fluoreszenzfarbstoffen wird in Kap. 15.5 erærtert. Fluoreszenzmarkierte Proteine kænnen çberdies dazu verwendet werden, dynamische Prozesse zu verfolgen, die in einer lebenden Zelle ablaufen. So kann zum Beispiel ein bestimmter Fluoreszenzfarbstoff an ein zellulåres Protein wie Aktin oder Tubulin gekoppelt und dann (wie in Abb. 9.4) in eine lebende Zelle injiziert werden. In den letzten Jahren hat ein nicht-invasiver Ansatz Furore gemacht, bei dem ein fluoreszierendes Protein (

      , GFP) aus der Qualle ! 6    verwendet wird (vgl. das Eingangsphoto zu diesem Kapitel). Bei den meisten Untersuchungen dieser Art wird eine rekombinierte DNA hergestellt, bei der die codierende Region von GFP an die codierende Region des zu untersuchenden Proteins gekoppelt wird. Diese rekombinierte DNA wird dann ver-

 wendet, um Zellen zu transfizieren, die dann ein chimåres Protein herstellen, bei dem das fluoreszierende GFP an das zu untersuchende Protein gekoppelt ist. In Kap. 8.2 wird der Einsatz von GFP bei der Untersuchung der Dynamik von Membranen erærtert. Bei all diesen Untersuchungen sind die markierten Proteine an den normalen Aktivitåten einer Zelle beteiligt, und ihre Lokalisation låsst sich mikroskopisch verfolgen, so dass die dynamischen Ablåufe, an denen ein Protein teilhat, sichtbar werden (Abb. 8.4). Oftmals lassen sich Studien informativer gestalten, indem man verschiedene GFP-Varianten mit verschiedenen Spektraleigenschaften gleichzeitig einsetzt. Durch gezielte Mutagenese des GFP-Gens hat man GFP-Varianten hergestellt, die in Blau- (BFP), Gelb- (YFP) und Cyanschattierungen (CFP) changieren. Auûerdem hat man ein entfernt verwandtes fluoreszierendes Protein (DsRed) aus einer Seeanemone isoliert. Welche Informationen man durch den Einsatz verschiedener GFP-Varianten gewinnen kann, wird durch eine Untersuchung aus jçngster Zeit deutlich, in der Wissenschaftler Måuseståmme geschaffen haben, deren Neurone fluoreszierende Proteine in unterschiedlichen Farben enthalten (Abb. 18.7). Legt man bei diesen Måusen chirurgisch einen Muskel frei, kann man die dynamischen Interaktionen zwischen den verschiedenenartig gefårbten Neuronen und den von ihnen innervierten neuromuskulåren Endplatten verfolgen (eine Zeichnung dieser Art von neuronaler Verknçpfung findet sich in Abb. 4.54). Die Wissenschaftler beobachteten zum Beispiel, wie die Fortsåtze eines CFP-gefårbten Neurons mit denen eines YFP-gefårbten um den synaptischen Kontakt mit dem Muskelgewebe konkurrierten. In allen Fållen stellten sie fest, dass jedes Mal, wenn zwei Neurone um die Innervation verschiedener Muskelfasern konkurrierten, såmtliche ¹Gewinnerfortsåtzeª zu dem einen Neuron gehærten und såmtliche ¹Verliererfortsåtzeª zu dem anderen (Abb. 18.7 b). GFP-Varianten haben sich auch bei einer Methode als nçtzlich erwiesen, die unter dem Namen
 $$   $ !   (FRET) låuft und mit deren Hilfe man die Entfernung zwischen zwei Teilen eines Proteins messen kann (oder zwischen zwei Einzelproteinen innerhalb einer græûeren Struktur). Diese Methode låsst sich verwenden, um Verånderungen zu untersuchen, wie sie   oder innerhalb einer lebenden Zelle vorkommen. FRET basiert auf der Tatsache, dass die Anregungsenergie von einer fluoreszierenden Gruppe (dem Donator) auf eine andere (den Akzeptor) çbertragen werden kann, sofern die beiden Gruppen sich in nåchster Nåhe zuei-

Das Lichtmikroskop

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bindende Domåne und eine Aktivierungsdomåne (Abb. 18.27). Die DNA-bindende Domåne vermittelt die Bindung an den Promotor, die ak-

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Techniken der Zell- und Molekularbiologie

tivierende Domåne vermittelt die Interaktion mit anderen Proteinen, die an der Aktivierung der Genexpression beteiligt sind. Damit es zur Transkription kommt, mçssen beide Domånen vorhanden sein. Bei dieser Methode werden daher zwei verschiedene rekombinierte DNA-Molekçle pråpariert. Eines davon enthålt ein DNASegment, das die DNA bindende Domåne des Transkriptionsfaktors enthålt, verknçpft mit einem DNA-Segment, welches das ¹Kæderª-Protein codiert. Das Kæderprotein ist das von Ihnen charakterisierte, fçr das Sie mægliche Interaktionspartner suchen. Exprimiert man die rekombinierte DNA in einer Hefezelle, so stellt diese wie in Abb. 18.27 b gezeigt ein Hybridprotein her. Das andere DNA-Molekçl enthålt den Teil des Transkriptionsfaktors, der die aktivierende Domåne enthålt, verknçpft mit einer DNA fçr das unbekannte Protein Y. Solche DNAs, oder genauer cDNAs, werden (wie in Kap. 18.13.3 beschrieben) aus mRNAs hergestellt, die man mithilfe der Reversen Transkriptase in DNA umschreibt. Angenommen, Y ist ein Protein, das an das Kæderprotein binden kann. Wird in der Hefezelle rekombinierte DNA exprimiert, die Y enthålt, produziert die Zelle wie in Abb. 18.27 c dargestellt ein Hybridprotein. Weder das X noch das Y enthaltende Hybridprotein ist fçr sich genommen imstande, die Transkription des Gens C zu aktivieren (Abb. 18.27 b,c). Werden jedoch diese beiden Proteine in dieselbe Hefezelle eingebracht (wie in Abb. 18.27 d), kænnen das Xund das Y-Protein miteinander wechselwirken und rekonstituieren so einen funktionsfåhigen Transkriptionsfaktor. Dass das geschehen ist, erkennt man dann daran, dass die Zelle nunmehr imstande ist, -Galactosidase zu produzieren. Mithilfe dieser Technik kann man also nach Proteinen ¹angelnª, die von unbekannten Genen codiert werden und in der Lage sind, mit dem Kæderprotein zu interagieren. Den Einsatz dieser Technik bei der Proteomforschung haben wir in Kap. 2.5.3 bereits besprochen. !52' -olyacrylamid-Gelelektrophorese Eine weitere weit verbreitete, sehr wirkungsvolle Methode zur Auftrennung von Proteinen ist die Elektrophorese. Diese Technik macht sich die Tatsache zunutze, dass geladene Molekçle in einem elektrischen Feld wandern. Die elektrophoretische Auftrennung von Proteinen geschieht in der Regel mit der Methode der /% %   :   3/:#4, bei der die Proteine durch eine von auûen angelegte Spannung durch eine Gelmatrix bewegt werden. Die Matrix besteht

aus einem Polymer von kleinen organischen Molekçlen (Acrylamid), die zu einem Molekularsieb quervernetzt werden. Ein Polyacrylamid-Gel kann entweder als dçnne Schicht zwischen zwei Glasplatten gegossen werden (Flachgel) oder als Zylinder in ein Glasræhrchen. Das polymerisierte Gel wird zwischen zwei mit Puffern gefçllten Kammern eingespannt, in denen die beiden Elektroden entgegengesetzter Ladung angebracht sind. Bei einem Flachgel wird die proteinhaltige Probe in konzentrierter Form wie in Schritt 1 von Abb. 18.28 gezeigt, in kleine Taschen an der Oberkante des Gels aufgetragen. Man versieht die Probe dabei mit Sucrose oder Glycerin, um ihre Dichte zu erhæhen, damit sie sich nicht mit dem Puffer in der oberen Kammer mischt. Schlieûlich wird zwischen den beiden Kammern eine Spannung angelegt, und entlang des Gels flieût ein Strom, der die Proteine dazu veranlasst, zur entgegengesetzt geladenen Elektrode zu wandern (Schritt 2). Die Auftrennung wird in der Regel in alkalischer Pufferlæsung vorgenommen, in der die Proteine eine negative Ladung haben, so dass sie zur positiv geladenen Anode am anderen Ende des Gels hin wandern. Im Anschluss an die Elektrophorese wird das Gel von den Glasplatten entfernt und gefårbt (Schritt 3). Die relative Beweglichkeit von Proteinen im Polyacrylamid-Gel hångt ab von ihrer 8      (Ladung pro Masseneinheit). Je græûer die Ladungsdichte, um so stårker die Kraft, die das Protein durch das Gel treibt und um so rascher seine Wanderungsrate. Doch die Ladungsdichte ist nur einer der wichtigen Faktoren der Auftrennung via PAGE. Auch Græûe und Form spielen eine Rolle. Polyacrylamid ist ein vernetztes Molekularsieb, in dem sich die Proteine, die das Gel passieren, verfangen. Je græûer das Protein, um so stårker wird es dadurch auf seinem Weg aufgehalten werden, und um so langsamer wird es wandern. Auch die Form ist ein Faktor, denn ein kompaktes globulåres Protein wandert rascher als ein langgestrecktes fibræses von vergleichbarem Molekulargewicht. Die Konzentration an Acrylamid (und dem zugehærigen quervernetzenden Agens) bei der Herstellung des Gels ist nicht minder wichtig. Je geringer die Konzentration an Acrylamid, um so weniger stark wird das Gel vernetzt und um so rascher wandert das aufgetragene Protein. Ein Gel, das 5% Acrylamid enthålt, kann sehr nçtzlich sein, um Proteine mit einem MG von 50 000 bis 250 000 aufzutrennen, ein Gel mit 15% Acrylamid hingegen eignet sich eher fçr Proteine mit einem MG von 10 000 bis 50 000. Den Fortgang der Elektrophorese verfolgt man anhand der Wanderung eines
 



Isolierung, Aufreinigung und Fraktionierung von Proteinen

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und das Gel aus seinem Behåltnis entfernt. Meist fårbt man die Gele mit Coomassie-Blau oder Silber, um die Lage der einzelnen Proteine sehen zu kænnen. Hat man die Proteine zuvor radioaktiv markiert, låsst sich ihre Position nachweisen, indem man das Gel auf einen Ræntgenfilm legt und ein Autoradiogramm davon macht. Oder man kann das Gel auch in kleine Fraktionen zerschneiden, aus denen man die einzelnen Proteine isoliert. Alternativ kann man das Gel auch mithilfe einer zweiten Elektrophorese auf eine Nitrocellulosemembran çbertragen (¹blottenª) (Kap. 18.12). Die Proteine werden von der Membran in derselben Position absorbiert, die sie auch im Gel hatten. Bei einem   7 werden die Proteine auf der Membran mit Antikærpern sichtbar gemacht.

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  , der gerade ein wenig rascher wandert als die schnellsten Proteine (Abb. 18.28, Schritt 2). Sobald der Farbstoff an der gewçnschten Position angelangt ist, wird der Strom abgeschaltet

&&/:# In aller Regel fçhrt man die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) in Gegenwart des negativ geladenen Detergens Natriumdodecylsulfat ($      , SDS) durch, das bereitwilligst an alle mæglichen Proteinmolekçle bindet. Die elektrostatische Abstoûung zwischen den gebundenen SDS-Molekçlen bringt jedes Protein dazu, sich zu einer åhnlichen ståbchenåhnlichen Form zu entfalten und schafft so die Form-Unterschiede als Auftrennungsfaktor aus der Welt. Die Zahl der SDS-Molekçle, die an ein Protein binden, ist mehr oder weniger proportional zu dessen Molekulargewicht (d. h. 1,4 g SDS/g Protein). Infolgedessen erhålt jede Proteinart unabhångig von ihrer Græûe eine åhnliche Ladungsdichte und steht unter demselben Kråfteeinfluss, der sie durch das Gel wandern låsst. Dennoch werden, da Polyacrylamid so stark vernetzt ist, græûere Proteine långer im Gel zurçckgehalten als kleinere, so dass Proteine durch die SDS-PAGE letztlich nur nach einer einzigen Eigenschaft aufgetrennt werden: nach ihrem Molekulargewicht. Die SDS-PAGE låsst sich auûer zum Auftrennen von Proteinen in einem Gemisch auch dazu verwenden, die Molekulargewichte einzelner Proteine zu bestimmen, indem man ihre Position im Gel mit der von Proteinen bekannter Masse vergleicht. Beispiele fçr die SDS-PAGE finden sich in Kap. 4.6.3 und Kap. 4, ¹Experimentelle Verfahrenª. '     :   Im Jahre 1975 wurde von Patrick O'Farrell von der University of California in San Francisco eine Technik entwickelt, der man den Namen $'     :   gab und bei der sich komplexe Proteingemische auf der Basis zweier verschiedener Eigenschaften der

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Techniken der Zell- und Molekularbiologie

Molekçle auftrennen lassen. Zuerst trennt man Proteine in einem Ræhrchen-Gel nach ihrem isoelektrischen Punkt auf, man bezeichnet diesen Schritt auch als   


. Nach der Auftrennung wird das Gel entfernt, an die Oberkante eines mit SDS gesåttigten Polyacrylamid-Gels gelegt und der SDS-PAGE unterzogen. Die Proteine wandern in das Flachgel ein und werden nun noch einmal entsprechend ihrem Molekulargewicht aufgetrennt (Abb. 18.29). Die aufgetrennten Proteine kænnen dann aus dem Gel entfernt und zu Peptidfragmenten verdaut werden, die man dann mithilfe der Massenspektrometrie analysieren kann. Die Auflæsung dieser Methode ist so groû, dass sich die meisten Proteine in einer Zelle voneinander unterscheiden lassen. Aufgrund ihres enormen Auflæsungsvermægens ist die zweidimensionale Gelelektrophorese in idealer Weise dazu geeignet, Verånderungen an zellulåren Proteinen unter verschiedenen Bedingungen, in verschiedenen Stadien in der Entwicklung, im Zellzyklus oder bei verschiedenen Organismen zu verfolgen (Abb. 2.47). Allerdings eignet sich die Technik nicht zur Unterscheidung von Proteinen mit hohem Molekulargewicht, stark hydrophoben Proteinen oder solchen, die in sehr geringer Kopienzahl in einer Zelle vorhanden sind. 

   Wie in Kap. 2, ¹Aus Sicht des Menschenª bereits besprochen, ist das noch junge Gebiet der Pro-

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Ultrazentrifugation

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sen die Ræhrchen in feste Bohrungen und werden wåhrend der Zentrifugation in einem bestimmten Winkel zur Zentrifugalkraft (zwischen 148 und 408) gehalten. Festwinkelrotoren eignen sich, wenn man Partikel am Boden des Zentrifugenræhrchens sedimentieren lassen will.

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Techniken der Zell- und Molekularbiologie

!5!!!  edimentationsverhalten von Nucleinsåuren ,@A- und RNA-Molekçle werden mit Methoden der Ultrazentrifugation untersucht. In unserem Zusammenhang wollen wir zwei der gebråuchlichsten Zentrifugationstechniken zur Untersuchung von Nucleinsåuren beleuchten; sie sind in Abb. 18.34 dargestellt. Bei der Geschwindigkeitssedimentation oder Zonensedimentation werden die Nucleinsåuren nach der Långe ihrer Nucleotidsequenz aufgetrennt. Die Probe mit der Nucleinsåuremischung wird vorsichtig auf eine Læsung mit zunehmender Konzentration an Sucrose oder einer anderen Substanz geschichtet. Dieser vorgelegte Gradient nimmt von der Oberflåche zum Boden des Ræhrchens an Dichte (und Viskositåt) zu. Die Wanderungsgeschwindigkeit der Molekçle unter dem Einfluss hoher Zentrifugalkråfte wird durch ihren Sedimentationskoeffizienten bestimmt. Je græûer der Sedimentationskoeffizient, umso weiter wandert das Molekçl in einer bestimmten Zentrifugationsdauer. Da die Dichte des Mediums selbst am Boden des Ræhrchens unter der der Nucleinsåuremolekçle liegt (bei etwa 1,2 g/mL fçr die Sucroselæsung und bei 1,7 g/mL fçr die Nucleinsåure), sedimentieren diese Molekçle, solange die Zentrifuge låuft. Mit anderen Worten: Die Zentrifugation erreicht nie ein Gleichgewicht. Nach einer vorgegebenen Zentrifugationsdauer wird das Ræhrchen aus der Zentrifuge genommen (Abb. 18.34 c) und die relativen Positionen der verschiedenen Molekçle werden bestimmt. Die hoch viskose Sucrose verhindert, dass sich der Ræhrcheninhalt durch Konvektion oder durch die Handhabung wåhrend des Experiments vermischt, so dass Molekçle mit identischem S-Wert als Bande an ihrem Platz verbleiben. Sind auch Markermolekçle mit bekanntem Sedimentationskoeffizienten in der Pråparation vorhanden, lassen sich auch die S-Werte unbekannter Verbindungen bestimmen. Versuchsergebnisse aus Auftrennungen im Sucrose-Dichtegradienten sind in Abb. 11.13 und 11.17 dargestellt. Bei einer anderen Art von Zentrifugationstechnik, der :  '   $    oder  %      , werden Nucleinsåuren auf der Basis ihrer Schwebedichte aufgetrennt. Bei diesem Verfahren verwendet man in der Regel eine hochkonzentrierte Læsung der Schwermetallsalze Cåsiumchlorid oder Cåsiumsulfat. Zu Beginn der Untersuchung mischt man die DNA mit einem der Cåsiumsalze, gibt sie in ein Zentrifugenræhrchen und zentrifugiert dieses fçr zwei bis drei Tage bei hoher Geschwindigkeit. Durch

die Zentrifugalkraft bewegen sich die schweren Cåsiumionen allmåhlich zum Boden des Zentrifugenræhrchens und lassen dabei entlang des Ræhrchens einen kontinuierlichen Dichtegradienten entstehen. Nach einer gewissen Zeit wirkt dem Bestreben der Ionen, am Boden des Ræhrchens zu sedimentieren, als Gegenkraft der Hang zur Diffusion entgegen und der Gradient stabilisiert sich. Wåhrend sich der Cåsiumchloridgradient bildet, wandern einzelne DNA-Molekçle ebenfalls in Richtung Ræhrchenboden oder schweben irgendwo im Ræhrchen, bis sie eine Position erreicht haben, an der die Dichte des Gradienten ihrer eigenen entspricht, und sie zu wandern aufhæren. Molekçle mit gleicher Dichte bilden innerhalb des Ræhrchens dçnne Banden. Diese Methode ist empfindlich genug, um DNA-Molekçle von unterschiedlicher Basenzusammensetzung aufzutrennen (siehe Abb. 18.34 b) oder Nucleinsåuren, die verschiedene Stickstoffisotope enthalten (15N oder 14N; Abb. 13.3 b).

18.12 Nucleinsåurehybridisierung Auf dem Gebiet der Nucleinsåurehybridisierung gibt es eine ganze Reihe miteinander verwandter Methoden, die alle auf der Tatsache basieren, dass sich zwei einzelstrångige Nucleinsåuremolekçle von komplementårer Basenzusammensetzung zu einem Hybrid-Doppelstrang zusammenfinden kænnen. Stellen Sie sich vor, man hat eine Mischung aus mehreren hundert DNA-Fragmenten von gleicher Långe und Basenzusammensetzung, die sich voneinander einzig durch ihre Sequenz unterscheiden. Nehmen wir beispielsweise an, dass eines der DNA-Fragmente ein Stçck des -Globin-Gens enthålt, alle anderen mit diesem nicht verwandte Genfragmente. Die einzige Mæglichkeit, zwischen dem Fragment, das -Globin codiert, und all den anderen zu unterscheiden, besteht in einem Hybridisierungsexperiment, bei dem sie die komplementåre Sequenz als Sonde einsetzen. In unserem Beispiel wçrde die Inkubation des denaturierten DNA-Gemischs mit einem Ûberschuss an -Globin-mRNA dazu fçhren, dass die Globinfragmente sich zu doppelstrångigen DNARNA-Hybriden zusammentun, wåhrend die anderen DNA-Fragmente einzelstrångig bleiben. Es gibt eine Reihe von Mæglichkeiten, wie sich die DNA-RNA-Hybride von den Einzelstrang-DNAs trennen lassen. Zum Beispiel kann man die Mischung çber eine Såule aus Hydroxylapatit geben und die Ionenbedingungen so wåhlen, dass die Hybride an die Calciumphosphatsalze in der



Nucleinsåurehybridisierung

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Såule binden, wåhrend die nicht hybridisierten DNA-Molekçle durchlaufen. Am Ende wåscht man die Hybride herunter, indem man die Konzentration des Elutionspuffers veråndert. Bei Hybridisierungsexperimenten låsst man zwei Populationen von komplementåren einzelstrångigen Molekçlen unter Bedingungen (Ionenstårke, Temperatur usw.) miteinander reagieren, welche die Bildung von Doppelstrången færdern. Je nach Art des durchgefçhrten Experiments kænnen sich dabei beide Molekçle in Læsung befinden oder man hat eines in Læsung, wåhrend das andere immobilisiert ist, beispielsweise auf einem Chromosom liegt (vergleiche Abb. 10.21). In vielen Fållen befindet sich eine der beiden zur Hybridisierung vorgesehenen einzelstrångigen Nucleinsåuren in einem Gel. Stellen Sie sich eine DNA-Pråparation vor, bei der Sie aus genomischer DNA Fragmente gewonnen und dann mittels Gelelektrophorese fraktioniert haben (Abb. 18.35). Fçr das Hybridisierungsexperiment wird die einzelstrångige DNA aus dem Gel auf eine Nitrocellulosemembran çbertragen und dort durch Erhitzen auf 80 8C im Vakuum fixiert. Die Ûberfçhrung der DNA auf die Membran bezeichnet man als Blotting. Wenn die DNA gebunden ist, wird die Membran mit radioaktiv markierter einzelstrångiger DNA (oder RNA) inkubiert, die zu bestimmten Fragmenten der Probe komplementår ist. Nicht gebundene Radioaktivitåt wird dann

durch Waschen entfernt; die Position der gebundenen Sonde bestimmt man autoradiographisch wie in Abb. 18.35 gezeigt. Das soeben beschriebene Experiment bezeichnet man als &  7 (benannt nach seinem Entwickler Edwin Southern). Mit einem Southern Blot lassen sich in einem Gel einzelne oder wenige DNA-Fragmente unter tausenden nicht verwandter Fragmente identifizieren. Ein Beispiel fçr einen Southern Blot ist in Abb. 10.20 gezeigt. Eine andere Mæglichkeit ist die Auftrennung von RNA vermittels Gelelektrophorese und die anschlieûende Identifizierung mit markierter DNA. Ein Beispiel fçr dieses Verfahren, das den Namen )  7 trågt, findet sich in Abb. 11.36. Radioaktiv markiert werden DNA-Proben in der Regel mit folgendem Verfahren: Eine gereinigte DNA-Pråparation wird mit geringen Mengen Dnase I verdaut, die in einen der Doppelstrånge eine ¹Kerbeª (englisch: ) schneidet. Anschlieûend inkubiert man die Pråparation in Anwesenheit markierter DNA-Precursor mit DNA-Polymerase I, einem Enzym, das sowohl Polymerase- als auch Exonucleaseaktivitåt besitzt (vgl. Kap. 13.1.3). Die Polymerasemolekçle heften sich an die Einschnitte und bearbeiten den angeschnittenen Strang in Richtung 3'-Ende; sie verdauen die vorhandenen Nucleotide und ersetzen sie durch markierte. Man nennt diese Methode ) !    , weil der Einschnitt

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Techniken der Zell- und Molekularbiologie

auf dem DNA-Molekçl wandert, wåhrend die Nucleotide verdaut und ersetzt werden. Die Hybridisierung von Nucleinsåuren vermag auch Aufschluss çber den Grad der Øhnlichkeit zweier DNA-Proben zu geben, die man beispielsweise von zwei verschiedenen Organismen gewonnen hat. Je weiter die beiden Arten in ihrer evolutionåren Verwandtschaft auseinander liegen, umso stårker weichen ihre DNA-Sequenzen voneinander ab. Vermischt man gereinigte DNA der beiden Arten miteinander, denaturiert sie und låsst sie erneut renaturieren, wird ein gewisser Prozentsatz an DNA-Doppelstrången aus der DNA beider Arten bestehen. Da solche Duplices auch Fehlpaarungen enthalten, sind sie weniger stabil als Doppelstrånge aus DNA derselben Art, und diese Instabilitåt schlågt sich in ihrer Schmelztemperatur nieder. Låsst man DNAs unterschiedlicher Arten in verschiedenen Kombinationen renaturieren, so liefert die Schmelztemperatur (Tm, vgl. Kap. 10.4.1) der Hybridkomplexe ein Maû fçr die evolutionåre Verwandtschaft zwischen den Organismen. Zwei weitere wichtige Arten von Nucleinsåurehybridisierungs-Experimenten sind bereits beschrieben worden: die  $ -Hybridisierung (Kap. 10.4.1) und die Hybridisierung an )    % (Kap. 12.4).

!5!' 9echniken der DNA-Rekombination In den vergangenen 25 Jahren wurden bei der Analyse von Eukaryotengenomen unglaubliche Fortschritte gemacht. Angefangen hat diese Entwicklung, als die Molekularbiologen gelernt hatten,    ) herzustellen, Molekçle, die DNA-Sequenzen verschiedener Herkunft enthielten. Es gibt zahllose Mæglichkeiten, rekombinierte DNA einzusetzen. Wir wollen mit einer der wichtigsten Anwendungen beginnen: der Isolierung eines DNA-Fragments, das ein bestimmtes Polypeptid codiert, aus dem Genom eines Organismus. Zuerst ist es dazu aber notwendig, eine Klasse von Enzymen zu beschreiben, ohne deren Entdeckung die Herstellungen rekombinierter DNA-Molekçle unmæglich gewesen wåre. 18.13.1 Restriktionsendonucleasen Wåhrend der siebziger Jahre stellte man fest, dass Bakterien Nucleasen enthielten, die in doppelstrångiger DNA kurze Sequenzabschnitte erkennen und die DNA spezifisch an genau definierten Stellen auf beiden Strången schneiden

kænnen. Man nannte diese Enzyme        oder     $%, weil ihre Funktion bei Bakterien darin besteht, virale DNAs zu zerstæren und so das Viruswachstum zu begrenzen (englisch   ). Das Bakterium schçtzt seine eigene DNA vor enzymatischen Angriffen, indem es Basen an bestimmten Stellen seines Genoms methyliert und so das Enzym am Zugriff hindert. Man hat Enzyme aus mehreren hundert verschiedenen prokaryotischen Organismen isoliert, die zusammengenommen mehr als hundert verschiedene Nucleotidsequenzen erkennen. Von den meisten dieser Enzyme werden Sequenzen mit einer Långe von vier bis sechs Nucleotiden erkannt, denen eine bestimmte Art von innerer Symmetrie eigen ist. Betrachten wir die Schnittstelle, die das Enzym R1 erkennt:

Dieses DNA-Segment verfçgt, wie man sagt, çber eine doppelte Rotationssymmetrie, denn es låsst sich ohne Verånderungen seiner Basensequenz um 1808 rotieren. Wenn man die Sequenz auf beiden Strången in Strangrichtung liest, beobachtet man dieselbe Basenanordnung. Eine Sequenz mit dieser Art von Symmetrie nennt man ein /   . Wenn das Enzym EcoR1 dieses spezielle Palindrom angreift, spaltet es jeden Strang an derselben Stelle in der Sequenz, markiert jeweils durch den Pfeil zwischen den Nucleotiden A und G. Die Markierungen (·) verweisen auf die methylierten Basen in dieser Sequenz, welche die DNA vor einem enzymatischen Angriff schçtzen. Manche Restriktionsenzyme spalten zwei sich genau gegençber liegende Bindungen und erzeugen ¹stumpfeª Enden, andere wie EcoR1 produzieren çberhångende Enden. Die Entdeckung und Aufreinigung von Restriktionsenzymen war von unschåtzbarer Bedeutung fçr die Fortschritte, welche die Molekularbiologie in den letzten Jahren gemacht hat. Da bestimmte Sequenzen von vier bis sechs Nucleotiden Långe allein durch Zufall relativ håufig vorkommen, ist jede beliebige DNA fçr die Zerlegung durch diese Enzyme geeignet. Der Einsatz von Restriktionsenzymen ermæglicht die Zerlegung des menschlichen Genoms ebenso wie das jedes anderen Organismus in ein genau definiertes Ensemble spezifischer Fragmente. Hat man die DNA eines bestimmten Organismus mit einem dieser Enzyme zerlegt, lassen sich die erzeugten Fragmente mittels Gelelektrophorese nach ihrer Långe auftrennen (Abb. 18.36 a). Verschiedene Enzyme spalten



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 "   ?" 8' +5JA61 # 2  % 4% A5n den vorhergehenden Abschnitten haben wir erærtert, wie eukaryotische Gene isoliert, modifiziert und amplifiziert werden kænnen. In diesem Abschnitt wollen wir einige der Mæglichkeiten vorstellen, wie man Gene in Eukaryotenzellen einfçhren kann, in denen sie normalerweise transkribiert und translatiert werden sollten. Eine der gelåufigsten Strategien auf dem Weg zu diesem Ziel ist der Einbau der DNA in das Genom eines nicht replizierenden Virus und die Infektion einer Zelle mit diesem Virus. Den virusvermittelten Gentransfer bezeichnet man als !   . Je nach Art des verwendeten Virus kann das gewçnschte Gen nur vorçbergehend fçr Stunden oder Tage exprimiert oder auf Dauer ins Genom der Wirtszelle integriert werden. Eine stabile Integration erreicht man in der Regel mithilfe modifizierter Retroviren, die ein RNA-Genom enthalten, das im Zellinneren revers transkribiert, d. h. in DNA umgeschrieben wird. Die DNA-Kopie wird dann in die DNA des Wirtschromosoms inseriert. Bei vielen der jçngsten Versuche zur Gentherapie hat man Retroviren verwendet, um bei Patienten, denen ein bestimmtes Gen fehlt, eben dieses Gen in Zellen einbringen zu kænnen. Diese klinischen Erprobungen waren durch die Bank nicht çbermåûig erfolgreich, da die Infektionsquote der derzeit verwendeten viralen Vektoren so gering ist. Es gibt eine Reihe von Verfahren, mit deren Hilfe sich ¹nackteª DNA in Kulturzellen einbringen låsst, man fasst diese Methoden unter dem Begriff !    zusammen. Meistens werden die Zellen dazu entweder mit Calciumphosphat oder DEAE-Dextran behandelt, beide bilden mit der zugefçgten DNA einen Komplex, welcher deren Zelloberflåchenadhåsion begçnstigt. Man schåtzt, dass nur etwa eine von 105 Zellen die DNA aufnimmt und stabil in die Chromosomen integriert. Niemand weiû, warum dieser geringe Anteil an Zellen in der Population sich transfizieren låsst, diejenigen aber, die kompetent sind, nehmen in der Regel mehrere Fragmente auf. Eine Mæglichkeit, die Zellen zu selektionieren, die Fremd-DNA aufgenommen haben, besteht darin, in diese ein Gen zu integrieren, das es den transfizierten Zellen ermæglicht, in einem bestimmten Medium zu wachsen, in dem nicht transfizierte Zellen nicht çberleben kænnen. Da die transfizierten Zellen in der Regel mehr als ein Fragment aufnehmen, muss das Gen, das fçr die Selektion benætigt wird, nicht auf demselben DNA-Fragment lokalisiert sein,

wie das Gen, dessen Rolle man untersuchen will (das !  ). Zwei andere Methoden zur Transfektion von Zellen sind die Elektroporation und die Lipofektion. Bei der #   werden die Zellen in Spezialræhrchen mit DNA inkubiert, in denen sich Elektroden befinden, die einen kurzen Impuls aussenden. Der Stromstoû macht die Plasmamembranen kurzfristig durchlåssig fçr DNAMolekçle, von denen dann einige den Weg in den Kern finden und in die Chromosomen integriert werden. Bei der Lipofektion werden die Zellen mit einer DNA behandelt, die an positiv geladene Lipide gebunden ist (kationische Liposomen), welche mit der Lipiddoppelschicht der Zellmembran verschmelzen kænnen, um die DNA ins Zellinnere zu befærdern. Eine der direktesten Mæglichkeiten, Fremdgene in eine Zelle einzubringen, besteht in der Mikroinjektion von DNA direkt in den Zellkern. Die Kerne von Oozyten und Eizellen sind fçr einen solchen Ansatz besonders geeignet. ?  -Oozyten zum Beispiel werden seit langem benutzt, um die Expression von Fremdgenen zu untersuchen. Der Oozytenkern enthålt den gesamten Apparat fçr die Synthese von RNA. Wenn daher Fremd-DNA in den Kern gelangt, wird sie bereitwillig transkribiert. Hinzukommt, dass die nach den injizierten Vorlagen gebildeten RNAs normal prozessiert und ins Cytoplasma transportiert werden, wo sie in Proteine translatiert werden, die sich immunbiologisch oder dank ihrer spezifischen Aktivitåt nachweisen lassen. Ein anderes beliebtes Ziel fçr die Injektion von DNA ist der Kern eines Mausembryos (Abb. 18.43). Bei diesen Experimenten hat man aller-

n Abb. 18.43. ?*  ( 2    )   

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