Lebensmittel- Und Umweltanalytik Mit Der Hplc Tips Tricks Und Beispiele Fur Die Praxis

Lebensmittel- und Umweltanalytik mit der HPLC: Tips, Tricks und Beispiele für die Praxis

R. Galensa et al.

WILEY-VCH

R. Galensa, U. Engelhardt, M. Bahadir, H. Bohm

Lebensmittelund Umweltanalytik mit der HPLC

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R. Galensa, U. Engelhardt, M. Bahadir, H. Bohm

Lebensmittelund Umweltanalytik mit der HPLC

0 VCH Verlagsgesellschaft mbH, D-69451 Weinheim (Bundesrepublik Deutschland), 1995

Vertrieb: VCH, Postfach 101161, D-69451 Weinheim (Bundesrepublik Deutschland) Schweiz: VCH, Postfach, CH-4020 Basel (Schweiz) United Kingdom und Irland: VCH (UK) Ltd., 8 Wellington Court, Cambridge CB1 lHZ, (England) USA und Canada: VCH, 220 East 23rd Street, New York, NY 10010-4606 (USA) Japan: VCH, Eikow Building, 10-9 Hongo 1-chome, Bunkyo-ku, Tokyo 113, Japan ISBN 3-527-28747-7

R. Galensa, U. Engelhardt, M. Bahadir, H. Bohm

Lebensmittelund Umweltanalytik mit der HPLC Tips, Tricks und Beispiele fur die Praxis

4b

VCH

-

-

Weinheim New York Base1 Cambridge . Tokyo

Prof. Dr. R. Galensa PD Dr. U. Engelhardt Institut fur Lebensmittelchemie TU Braunschweig Schleinitzstr. 20 D-38106 Braunschweig

Prof. Dr. Dr. M. Bahadir Dr. H. Bohm Institut fiir Okologische Chemie und Abfallanalytik TU Braunschweig Hagenring 30 D-38106 Braunschweig

Das vorliegende Werk wurde sorgfaltig erarbeitet. Dennoch iibernehmen Autoren und Verlag fur die Richtigkeit von Angaben, Hinweisen und Ratschlagen sowie fur eventuelle Druckfehler keine Haftung.

Lektorat: Dr. Steffen Pauly Herstellerische Betreuung: Dipl.-Wirt.-Ing. (FH) Bernd Riedel

Die Deutsche Bibliothek - CIP Einheitsaufnahme Lebensmittel-Umweltanalytikmit der HPLC : lips, Tricks und Beispiele fiir die Praxis I R. Galensa ... Weinheim ;NewYork ;Base1 ; Cambridge ;Tokyo : VCH, 1995 ISBN 3-527-28747-7 NE: Galensa Rudolf 0 VCH Verlagsgesellschaft mbH, D-69451 Weinheim (Federal Republic of Germany), 1995

Gedruckt auf saurefreiem und chlorfrei gebleichtem Papier Alle Rechte, insbesondere die der Ubersetzung in andere Sprachen, vorbehalten. Kein Teil dieses Buches darf ohne schriftliche Genehmigung des Verlages in irgendeiner Form - durch Photokopie, Mikroverfilmung oder irgendein anderes Verfahren - reproduziert oder in eine von Maschinen, insbesondere von Datenverarbeitungsmaschinen, verwendbare Sprache ubertragen oder ubersetzt werden. Die Wiedergabe von Warenbezeichnungen, Handelsnamen oder sonstigen Kennzeichen in diesem Buch berechtigt nicht zu der Annahme, daR diese von jedermann frei benutzt werden durfen. Vielmehr kann es sich auch dann um eingetragene Warenzeichen oder sonstige gesetzlich geschutzte Kennzeichen handeln, wenn sie nicht eigens als solche markiert sind. All rights reserved (including those of translation into other languages). No part of this book may be reproduced in any form - by photoprinting, microfilm, or any other means - nor transmitted or translated into a machine language without written permission from the publishers. Registered names, trademarks, etc. used in this book, even when not specifically marked as such, are not to be considered unprotected by law. Satz: Mitterweger Werksatz GmbH, D-68723 Plankstadt Druck: Strauss Offsetdruck GmbH, D-69509 Morlenbach Bindung: Wilh. Osswald GmbH+Co KG, D-67433 NeustadtMreinstr.

vorwort

Die Hochleistungsflussigkeitschromatographiehat sich in den letzten 10 Jahren zur vielleicht verbreitetsten Analysentechnik entwickelt. Abb. 0-1 zeigt die weltweiten Verkaufszahlen bis 1989. Daraus resultiert eine hohe Nachfrage an Schulungskursen und Informationen uber dieses Analyseverfahren. Aus der Zusammenarbeit bei entsprechenden GDCh-Fortbildungskursen zwischen dem Institut fur Lebensmittelchemie und dem Institut fur Okologische Chemie und Abfallanalytik der TU Braunschweig entstand das vorliegende Buch. Es gibt einen Einblick in die Theorie und Praxis der HPLC, wobei bevorzugt der Anwender und Praktiker angesprochen werden soll. Deshalb werden theoretische Grundlagen auf das zum Verstandnis Notwendige reduziert und so einfach wie moglich dargestellt. Wo immer es geht, werden praktische Hinweise gegeben, die aus jahrelangen Erfahrungswerten im ,,Kampf" mit dieser Technik resultieren. Der erste Teil des Buches befast sich mit der chromatographischen Theorie sowie mit den einzelnen Bausteinen und Einsatzmoglichkeiten der HPLC. Ebenfalls wird ein kurzer Uberblick uber komplementare Techniken, wie z. B. die Capillarelektrophorese, gegeben. Im zweiten Abschnitt werden 23 Applikationen aus dem Lebensmittel- und aus dem Umweltbereich vorgestellt. Diese Anwendungen sind erprobt und detailliert beschrieben, damit sie sowohl praktisch, wie auch geistig nachvollMillion S T ,

C

1985

1986

1987

1988

lQ89

Year Abb. 0-1: Angaben iiber den Verkauf analytischer Gerate (aus: Linxheid, M . , Fresenius J . Anal. Chem. 1990,337,648-661).

VI

Vorwort

zogen werden konnen und vielleicht Anregungen zur Losung eigener, ahnlich gelagerter Probleme geben. Die Auswahl sol1 einen weiten Bereich uberstreichen. Es wurden deshalb Beispiele gewahlt , die spezielle apparative, chromatographische und/oder besondere Aufarbeitungsmethoden enthalten. Gerade die Aufarbeitung des Probenmaterials entscheidet oft schon uber den Erfolg oder MiBerfolg einer Analyse, weshalb der Erlauterung der entsprechenden Schritte besondere Aufmerksamkeit gewidmet wurde. Zur Unterstreichung, da13 auch in diesem Bereich der Chemie das Bewuatsein fur die eigene und fur die Gefahrdung der Umwelt gesteigert werden muB, wird ein ausfuhrliches, allgemeingultiges Kapitel uber den Umgang mit gefahrlichen Stoffen vorangestellt. Konsequenterweise werden bei den Applikationen ebenfalls entsprechende Hinweise gegeben. Braunschweig, im September 95

R. Galensa

Danksagung

Die Herausgeber und Autoren danken allen, die zu diesem Buch durch vielfaltige Anregungen und Hilfestellungen beigetragen haben. Besonders hervorzuheben sind Herr Ralf Lippold von der Chemischen Landesuntersuchungsanstalt Freiburg, Herr Dr. Jochen Rosenboom vom Gemeinschaftlichen Chemischen Untersuchungsinstitut fur die Stadte Wuppertal und Solingen und Herr Prof. Dr. Bernd Luckas vom Institut fur Ernahrung und Umwelt der Friedrich Schiller-Universitat Jena, die uns mit einigen interessanten Applikationen versorgt haben. Den Herren Dip1.-Ing. (FH) J. Hamann und B. Rother danken wir fur die Optimierung der IC- und einiger HPLC-Applikationen, sowie Herrn Dr. R. Kreuzig fur wertvolle Ratschlage. Frau Carola Balcke danken wir fur die Anfertigung von zahlreichen Abbildungen.

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Inha1tsverzeichnis

Abkiinungen. Akronyme. Begriffe

1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10

2 2.1

2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.2.1 2.2.2.2 2.2.2.3 2.2.2.4 2.2.3 2.2.4 2.2.5

..................

XI11

Gefahrstoffverordnung UndArbeitssicherheit . . . . . . . . . 1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Gefahrstoffverordnung (GefStoffV) . . . . . . . . . . . . . . 2 Aufbau eines Chemikalienkatasters . . . . . . . . . . . . . . 4 Prufung des Einsatzes alternativer Arbeitsweisen und Ersatzstoffe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Gefahren bei der Untersuchung von Proben . . . . . . . . . . 7 Allgemeine Laboranweisungen . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 MAK.. BAT- und TRK.Werte. Ausloseschwellen . . . . . . . 11 Gefahrensymbole und WS-Satze . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Reduzierung der Schadstoffbelastung in Abwasser und Abluft . 18 VVV (Vermeiden. Vermindern. Verwerten) von Laborabfallen und Losungsmittelruckgewinnung . . . . . . . . . . . . . . . 19 Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 Theoretischer Teil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Anwendungsbezogene theoretische Aspekte der Chromatographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Chromatographische KenngroSen . . . . . . . . . . . . . . . Diffusionseffekte. Bandenverbreiterung . . . . . . . . . . . . Van Deemter-Kurve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bandenverbreiterung aul3erhalb der Trennsaule . . . . . . . . Verschiedene Kombinationsmoglichkeiten in der HPLC . . . . Normalphasen- und Reversed-Phase-HPLC . . . . . . . . . . Ionenchromatographie (IC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ionenaustausch-Chromatographie(HPIC) . . . . . . . . . . . IonenausschluB-Chromatographie (HPICE) . . . . . . . . . . Ionenpaar-Chromatographie (MPIC/RPIPC) . . . . . . . . . . Detektoren fur die Ionenchromatographie . . . . . . . . . . . HPLC-Biosensor(Enzymreaktor)-Kopplungen . . . . . . . . . LC-GC-Kopplungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . HPLC-MS-Kopplungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

23 23 23 26 26 28 29 29 31 31 34 35 36 37 39 41 49

X

lnhaltsverzeichnis

3 3.1 3.2 3.3

Komplementarmethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Automatische Mehrfachentwicklung bei der D C . . . . . . . . Capillar-Elektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Supercritical Fluid Chromatography (SFC) . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

51 51 53 60 63

4 4.1 4.2 4.3 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.4 4.5 4.6 4.6.1 4.6.2 4.6.3 4.6.4 4.6.5 4.7 4.8 4.0

Module . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pumpen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Gradientensysteme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Probenaufgabe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Manuelle Injektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Automatische Injektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Microboretechnik . Praparatives Arbeiten . . . . . . . . . . . Trennsaulen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Phasenmaterialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Detektoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . UV/VIS-Dete k toren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Dioden- Array- Detektoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Brechungsindex-Detektoren (RI-Detektoren) . . . . . . . . . Elektrochemische Detektoren (ELCD) . . . . . . . . . . . . Fluoreszenz-Detektoren (FLD) . . . . . . . . . . . . . . . . . Fittings Verschraubungen. Verbindungsleitungen . . . . . . . FlieBmittel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Datenauswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

65 65 71 74 74 75 76 76 78 80 82 85 88 90 92 95 99 106 107

5

Fehlermoglichkeiten und Fehlerbehebung (Troubleshooting)

109

6 6.1 6.2

. ......................

HPLC-Applikationen 115 Validierung von Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 Probenvorbereitung mittels Festphasenextraktion . . . . . . . 118 Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

7 7.1

HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich . . . . . . 121 Bestimmung von Flavonolglykosiden in Tee und Teeprodukten oder ahnlichen Erzeugnissen . . . . . . . . 121 Bestimmung von Catechinen und Alkaloiden in Tee oder ahnlichen Erzeugnissen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125 Nachweis von Sulfonamiden. N4.Acetylmetaboliten. Chloramphenicol und Nicarbazin in Fleisch und lnnereien . . 129 Bestimmung von Ruckstanden von Oxytetracyclin. Tetracyclin und Chlortetracyclin in Muskulatur und Niere . . . 136

7.2 7.3 7.4

.

lnhaltsverzeichnis

7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 7.10 7.11 7.12

Bestimmung von diarrhetic shellfish poisoning in marinen Lebensmitteln . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bestimmung von Konservierungsstoffen in Lebensmitteln und Kosmetika . . . . . . . . . . . . . . . . Nachweis eines Grapefruitzusatzes zu Orangensaft . . . . . . Bestimmung von schwefliger Saure in Bier und anderen Getranken mittels HPLC-Biosensorkopplung . . . . . Bestimmung von Siirjstoffen . . . . . . . . . . . . . . . . . . Nachweis von Mais und Hirse als Malzersatzstoff in Bier . . . Bestimmung von Kohlenhydraten durch Benzoylierung . . . . HPLC-Untersuchungen iiber Chlorogensaurelactone in Rostkaffee . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

XI 142 146 151 155 159 162 166 171 176

8 8.1 8.2 8.3

Zusammenstellung einiger amtlicher Methoden Amtliche Methodensammlung nach 0 35 LMBG AOAC-Methodensammlung . . . . . . . . . . Schweizerisches Lebensmittelbuch . . . . . . .

........ ........ ........ ........

179 179 180 183

9 9.1 9.2

HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich . . . . . . . . Bestimmungvon Nitrophenolen in Regenwasser . . . . . . . . Bestimmung von Sprengstoff-Ruckstanden in Oberflachengewassern und Grundwasser . . . . . . . . . . Bestimmung von Triazin-Herbiziden in Grund- und Trinkwasser . Bestimmung von Pflanzenschutzmitteln (PSM) in Trinkwasser mittels HPLC-MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bestimmung von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAH) nach Trinkwasserverordnung (TVO) in Grund- und Rohwasser . . . . . . . . . . . . . . . Bestimmung von Anionen in Deponiesickerwassern . . . . . . Bestimmung von Anionentensiden in Klarschlammen . . . . . Bestimmung von Phenylharnstoff-Herbiziden in Eluaten aus Bodenproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bestimmung von 16 polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAH) nach USEPA in Bodenproben . . Bestimmung von Aldehyden und Ketonen in Dieselmotoremissionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bestimmung von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAH) in Dieselmotoremissionen . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

185 185

9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8 9.9 9.10 9.11

........................ ...............................

190 194 198

203 207 211 216 222 228 233 238

Weiterfuhrende Literatur

241

Sachregister

243

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Abkurzungen, Akronyme, Begriffe

Absorption (absorbance) Aufnahme von Licht durch eine Substanz, z. B. in einer Detektorzelle Affininatschromatognphie Trennung von Substanzen aufgrund spezifischer Wechselwirkungen mit der stationaren Phase AMD (Automated Multiple Development) automatische Mehrfachentwicklung bei der Dunnschichtchromatographie APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionisation) Ionisierungstechnik bei der LC-MS-Kopplung Absorption units (Absorptionseinheiten) bei der UV/ AU VIS Detektion Auflosung, chromatographische beschreibt das AusmaB der Trennung zweier Komponenten AusschluRchromatographie (SEC - size exclusion chromatography) Trennung nach abnehmender MolekulgroBe Bandenverbreiterung (Peakverbreiterung) Zunahme der Halbwertsbreite von Peaks wahrend der chromatographischen Trennung CE Capillar-Elektrophorese (capillary electrophoresis): Uberbegriff fur elektrophoretische Techniken, die in englumigen Kapillaren durchgefuhrt werden CFFAB Continuous Flow Fast Atom Bombardment; LC-MSInterface chemisch gebundene Phasen stationare Phasen, die durch chemische Reaktionen einer Substanz mit einem Tragermaterial hergestellt werden DAD Photodiodenarray-Detektor Detektoren Anzeigegerate zum Nachweis der Substanzen am Ende der chromatographischen Trennung Dispersion Peakverbreiterung in der Saule bedingt durch Stofftransportphanomene Drift langfristige Anderung der Basislinie EC elektrochemischer Detektor (HPLC)

XIV ECD

Abkiirzungen, Akronyme, Begriffe

elektrochemischer Detektor (HPLC) Elektroneneinfangdetektor (electron capture detector) in der G C EDDY-Diffusion Term der van Deemter-Gleichung. (Beschreibt die Durchmischung von Substanzen in den Hohlraumen der stationaren Phase) FlieOmittel (= mobile Phase) bei der Chromatographie Eluent Eluotrope Reihe Zusammenstellung von FlieBmitteln, geordnet nach Elutionskraft. Gilt nur fur die spezifizierte Phase, also an A1203anders als bei RP-Material Elutionsprofil Zeitabhangiges Konzentrationsprofil einer Substanz beim Verlassen der Saule Reaktion eines bereits derivatisierten Kieselgels (z. B . Endcapping RP-18) mit kurzkettigen Silanolen. Dadurch wird die Zahl der freien OH-Gruppen und damit die Polaritat vermindert elektroosmotischer FluB EOF electrospray interface ESI fast atom bombardment; Ionisierungsart bei der MassenFAB spektrometrie FID Flammenionisationsdetektor (GC, SFC) Fourier Transformations Infrarot Spektroskopie FTIR Gaschromatographie GC Gradientenelution Arbeitsweise bei der HPLC, bei der die FlieBmittelzusammensetzung geandert wird height equivalent to a theoretical plate; Bodenhohe HETP high performance thin layer chromatography; HochleiHPTLC stungsdunnschichtchromatographie hyphenated methods Ausdruck fiir Kopplungsmethoden (LC-MS, GC-MS etc.) Ionenaustausch-Chromatographie chromatographische Trennung von Ionen an Ionenaustauschern als stationarer Phase Ionenpaar (ion pair) ungeladenes Paar aus einem Anion (A-) und einem Kation (K'), das in organischen Eluenten loslich ist Ionenpaar-Chromatographie chromatographische Trennung von Ionen durch Zusatz von Ionenpaar-Reagenzien zur mobilen Phase isokratisch HPLC-Arbeitstechnik mit konstanter FlieOmittelzusammensetzung

Abkiirzungen, Akronyme, Begriffe

xv

Kapazitatsfaktor (k’-Wert) beschreibt das AusmaB der Retardierung einer Substanz Matrix Medium (Lebensmittel, Wasser, Bodenprobe), aus dem die Analyten isoliert werden miissen moving belt interface; veraltetes Interface zur LC-MSMBI Kopplung MEKC Micellare elektrokinetische Chromatographie NMR Nuclear Magnetic Resonance NP Normalphase; HPLC an Kieselgelphasen Octadecylsilan; stationare Phase in der RP-ChromatoODS graphie, hergestellt durch Derivatisierung von Kieselgel mit C-18-Ketten Particle Beam (PB) Interface zur LC-MS-Kopplung PTFE Polytetrafluorethylen (Teflon) Rauschen (noise) Schwankungen des Detektorsignals: meist bedingt durch elektronische Effekte Wiederherstellen; beschreibt bei Saulen z. B. SpiilvorRegenerieren gange, durch die die ursprungliche Trennleistung wiederhergestellt wird Retentionsvolumen Volumen von der Injektion bis zum Peakmaximum Retentionszeit Zeit von der Injektion bis zum Peakmaximum Reversed Phase Chromatographie (RPC) Chromatographie an Umkehrphasen, d. h. an lipophilen Phasenmaterialien (z. B. silanisierten Kieselgelen oder druckstabilen Polymeren) a. die Fahigkeit eines Phasensystems, zwischen zwei SubSelektivitat stanzen zu unterscheiden, bzw. b. die Fahigkeit eines Detektors, nur bestimmte Substanzen zu detektieren Supercritical Fluid Chromatography: Chromatographie SFC mit iiberkritischen Gasen als mobiler Phase Supercritical Fluid Extraktion; Extraktion mit iiberkritiSFE schen Gasen Solid Phase Extraction = Festphasenextraktion SPE alle Volumina einer HPLC-Anlage nach der ProbenaufTotvolumen gabe, die keine stationare Phase enthalten Zeit, die eine Substanz, die keine Wechselwirkung mit Totzeit der stationaren Phase hat, von der Injektion bis zum Peakmaximum braucht UVNIS-Detektor photometrischer HPLC-Detektor

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1 Gefahrstoffverordnung und Arbeitssicherheit 1.1 Einleitung ,,Die Aufgaben der Analytischen Chemie haben sich in den letzten Jahren stark verandert und erweitert. So ist die Analytische Chemie von einer lediglich retrospektiv betrachtenden zu einer diagnostizierend gestaltenden Wissenschaft geworden und spielt eine immer wichtigere Rolle bei der Charakterisierung und Beschreibung von sich verandernden chemischen und biologischen Systemen. Die Gesellschaft und die ihr dienende Technik benotigt analytische Aussagen in allen Bereichen der Naturwissenschaften, im Umweltschutz, in der Biologie, Medizin, Pharmazie, Pharmakokinetik, in den Geowissenschaften, in der chemischen und biologischen Prozepkontrolle, den Nahrungswissenschaften, der Forensik und den Materialwissenschaften" [ 1-11. Diese umfassende Aufgabenstellung wird in analytischen Laboratorien rnit Hilfe verschiedener Verfahren und unter Einsatz z. T. extrem gefahrlicher bzw. toxischer Substanzen bearbeitet, wenn auch das Gros der Arbeitsvorgange nicht problematischer ist als in anderen chemischen Laboratorien. Die Riickstandsanalytik von phenolischen Verbindungen beispielsweise, wie sie als Metabolite von Pestiziden im Boden vorkommen, erfordert in der Regel eine Derivatisierung rnit Diazomethan zu den entsprechenden Ethern zur Verminderung der Polaritat des Metaboliten, um diesen rnit Hilfe der GC/ MS-Kopplung spezifisch nachweisen zu konnen. Diazomethan wie auch andere Methylierungsmittel sind ebenso extrem reaktiv gegenuber Biomolekiilen (z.B. DNA), was fur ihre mutagenen und cancerogenen Wirkungen verantwortlich ist. Bei Analysen mittels HPLC spielen allerdings die Derivatisierungsreaktionen eine weit untergeordnetere Rolle als in der GC-Technik, was naturgemaD zu einer Erhohung der Arbeitssicherheit beitragt. Es darf jedoch nicht ubersehen werden, daD in keinem analytischen Labor nur das eine oder andere Verfahren zum Einsatz kommt. Der rnit HPLC beschaftigte Analytiker arbeitet zur gleichen Zeit auch mit GC-Methoden, oder im gleichen Laboratorium sind andere Beschaftigte rnit solchen Techniken befafit, so daD die Gefahrenpotentiale auf alle Beschaftigten einwirken konnen. Ein anderes Problem stellen die zu bestimmenden Analyte dar. Die ,,Dioxin-Analytik" ist hier ein herausragendes Beispiel. Fur die Qualitatssicherung des Dioxinnachweises werden die Probenextrakte mit I3C-markierten und an den 2, 3, 7, 8-Positionen halogenierten Dibenzo-p-dioxinen und -furanen als interne Standards dotiert. Nach einem komplizierten Clean-up werden die

2

1 Gefahrstoffverordnung und Arbcitssichcrheit

"C- bzw. "C-markierten Kongenere rnit Hilfe der GUMS (SIM) bestimmt. Hier mu13 der Analytiker besondere Gefahrstoffe in hoheren Konzentrationen (Standards) handhaben: Stoffe, die anderswo wegen ihrer Gefahrlichkeit (Toxizitat) verboten sind. Gleiches gilt etwa bei der Bestimmung von Methylquecksilber, bleiorganischen Verbindungen, Cadmiumchlorid u. a., um diese Beispiele auch auf die anorganische bzw. Elementanalytik auszudehnen. Kann sich der Analytiker beim Umgang rnit gefahrlichen Standards und Reaktanden noch besonders schutzen, indem er die Arbeiten unter eigens dafur ausgelegten Abzugen in speziellen Sicherheitslaboratorien (,,DioxinLabor") ausfuhrt. so wird er in vielen Fallen rnit gefahrlichen Substanzen konfrontiert, ohne da13 er daruber immer Kenntnis erlangt: bei den Proben. Erhalt ein Umweltlabor eine Abfall- oder Altlastenprobe mit dem Auftrag, darin neben einer Reihe von Parametern auch die ,,Dioxine" zu bestimmen, so sind die Mitarbeiter gewarnt. Sie werden die Proben rnit der genugenden Vorsicht behandeln, um sich und ihren Arbeitsplatz vor einer Kontamination zu schutzen. Erhalt das Labor jedoch diese Probe ohne diesen besonderen Zusatzauftrag, so ist zwar dieselbe Menge an ,,Dioxinen" in dieser Probe enthalten, aber sie wird wie jede andere dioxinfreie Probe behandelt. Es ware wahrscheinlich unrealistisch, zu verlangen, jede unbekannte Analysenprobe als dioxinkontaminiert zu behandeln. Die Analysen waren unbezahlbar, und nur wenige Laboratorien konnten die Investitionen tatigen, um sich zu Sicherheitshochburgen aufzurusten. Dennoch zeigt dieses Beispiel, daS immer mit genugender Vor- und Umsicht umgegangen werden muB, damit aus Sorglosigkeit keine toxikologischen und Gesundheitsprobleme entstehen. Neben diesen chemischen Gefahrenpotentialen sind in Abhangigkeit von den durchgefuhrten Analysen bzw. eingesetzten Methoden rnit ionisierenden Strahlen (Rontgenquellen, (13Ni in Elektroneneinfangdetektoren, 'H und "C als offene Strahlungsquellen rnit Inkorporationsmoglichkeit), Enzymen (ELISA, Immunoassays), Mykotoxinen und Mikroorganismen etwa bei Proben aus Sanierungsfallen zu rechnen. Daher kommt der Gefahrstoffverordnung als einer Sammlung zwingend zu befolgender Regeln zum Schutz der Gesundheit der Beschaftigten am analytischen Arbeitsplatz wie auch zum Schutz der Umwelt eine grol3e Bedeutung zu.

1.2 Gefahrstoffverordnung (GefStoffV) Die am 01.11.1993 in Kraft getretene Novelle der Gefahrstoffverordnung gliedert sich in neun Abschnitte und sechs Anhange [l-21:

1.2 Gefahrstoffverordnung(GefStoffV)

3

1. Zweck, Anwendungsbereich und Begriffsbestimmungen 2. Einstufung von Chemikalien 3. Kennzeichnung und Verpackung beim Inverkehrbringen 4, Verbote und Beschrankungen 5. Allgemeine Umgangsvorschriften fur Gefahrstoffe 6. Zusatzliche Vorschriften fur den Umgang mit krebserzeugenden und erbgutverandernden Gefahrstoffen 7. Behordliche Anordnungen und Entscheidungen 8. Straftaten und Ordnungswidrigkeiten 9. SchluSvorschriften Zweck der Gefahrstoffverordnung ist es, durch Regelungen uber die Einstufung, Kennzeichnung und Verpackung von gefahrlichen Stoffen, Zubereitungen und bestimmten Erzeugnissen sowie uber den Umgang mit Gefahrstoffen den Menschen vor arbeitsbedingten und sonstigen Gesundheitsgefahren und die Umwelt vor stoffbedingten Schadigungen zu schutzen, insbesondere die Gefahren erkennbar zu machen, sie abzuwenden und ihrer Entstehung vorzubeugen, soweit nicht in anderen Rechtsvorschriften besondere Regelungen getroffen sind. Wahrend der zweite Abschnitt der GefStoffV kaum Bedeutung fur das analytische Labor hat, ist im dritten Abschnitt die Kennzeichnung (Etikettierung) von Gefahrstoffen wichtig. Der vierte Abschnitt enthalt Herstellungs- und Verwendungsverbote fur verschiedene Chemikalien, funfter und sechster Abschnitt enthalten Vorschriften fur den Umgang mit Gefahrstoffen im allgemeinen sowie mit krebserzeugenden und erbgutverandernden Gefahrstoffen im speziellen. Diese drei Abschnitte sind deshalb von besonderer Bedeutung. Die Regelungen des siebten bis neunten Abschnitts besitzen fur das analytische Labor nur eine geringe Bedeutung. Die GefStoffV umfal3t im dritten bis funften Abschnitt meist abstrakte Begriffe, deren Inhalt bereits in anderen, schon langer existierenden Regeln, Richtlinien und Verordnungen detailliert aufgefuhrt ist. Insbesondere die Pflicht zur regelmal3igen Unterweisung, Angaben uber hygienische MaBnahmen und Vorschriften zur Lagerung von Gefahrstoffen finden wir auch in den Unfallverhutungsvorschriften (UVV), - den Laborrichtlinien, - der Verordnung uber brennbare Flussigkeiten (VbF) und den entsprechenden Technischen Regeln (TRbF), - der Druckbehalterverordnung und den entsprechenden Technischen Regeln (TRG), - den Technischen Regeln uber gefahrliche Arbeitsstoffe (TRgA). -

4

1 Gefahrstoffverordnung und Arbeitssicherheit

Nach der Veroffentlichung der GefStoffV wurden weitere Technische Regeln (Technische Regeln fur Gefahrstoffe, TRGS) erlassen, die zum Teil die TRgA ersetzt haben. Eine dieser Technischen Regeln ist die TRGS 451: ,,Urngang mit Gefahrstoffen im Hochschulbereich", in Instituten also, in denen die Analytik oft einen Arbeitsschwerpunkt darstellt [l-31.

1.3 Aufbau eines Chemikalienkatasters Die GefStoffV schreibt in (5 16 (3a) vor, vorhandene Gefahrstoffe in einem Kataster zu erfassen. Es erweist sich als vorteilhaft, dieses Kataster mit Hilfe der EDV zu fuhren. Das Kataster muB von jeder Chemikalie folgende Daten enthalten:

- Bezeichnung - Kennzeichnung (Gefahrensymbol, WS-Satze) - Menge (zumindest die Groflenordnung) - Arbeitsbereiche, in denen mit dem Gefahrstoff umgegangen wird (z. B. Labornummer) Da grundsatzlich davon auszugehen ist, daB alle venvendeten Chemikalien auch gelagert werden, sind auch die Angaben zur Lager- und Wassergefahrdungsklasse empfehlenswert, um Zusammenlagerungsverbote leicht zu uberblicken. Zum schnelleren Suchen empfiehlt es sich, die CAS-Nummer sowie ggf. die Summenformel mitzuerfassen. Die genannten Daten lassen sich von fast allen Chemikalien schon vor der Bestellung aus den Chemikalienkatalogen der Hersteller entnehmen. Diese Kataloge werden heute teilweise auch auf elektronischen Datentragern (Diskette, CD-ROM) angeboten. Die Vorteile der Datenverwaltung per EDV gegenuber den fruher ublichen Karteikarten liegen auf der Hand: -

-

die Moglichkeit des automatischen Suchens nach verschiedenen Parametern (z. B. Suchen des Chemikaliennamens, insbesondere aber auch Suchen von bestimmten R- und S-Satzen, Gefahrensymbolen etc.) die Moglichkeit des automatischen Sortierens die Moglichkeit des Erstellens von Inventarlisten der verschiedenen Laboratorien

Entscheidend fur die Arbeitssicherheit im Umgang mit Chemikalien ist die richtige Etikettierung der Chemikaliengebinde. Wahrend die GefStoffV nur die Etikettierung von Gefahrstoffgebinden vorschreibt, ist es dringend zu

1.4 Priifung des Einsatzes alternativer Arbeitsweisen

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empfehlen, alle Chemikaliengebinde zu etikettieren. Dabei sind Art und Umfang der Etikettierung von der Aufbewahrungsdauer abhangig. Chemikaliengebinde, die sich im Arbeitsgang befinden, brauchen nicht etikettiert zu werden, wenn die standige Uberwachung durch eine Person gewahrleistet ist. Die Gebinde der Chemikalien, die bereitgestellt werden, mussen mindestens mit dem Chemikaliennamen und dem Gefahrensymbol gekennzeichnet werden. Dabei gilt als Bereitstellung ein Aufbewahrungszeitraum von 24 Stunden, langstens aber bis zum Ende des folgenden Arbeitstages. Alle Chemikaliengebinde, die langer aufbewahrt werden (und das sind fast alle!), mussen mindestens mit dem Chemikaliennamen, den Gefahrensymbolen sowie den R- und S-Satzen (Zahlen und Text) gekennzeichnet werden. Weitere Angaben sind empfehlenswert, wie z. B. Lagerklasse, Wassergefahrdungsklasse, Labornummer. Auf dem Markt werden Etikettierungsprogramme angeboten. Ein hoher Preis sowie teilweise bestimmte Anspriiche an die Hardware stehen der Verbreitung dieser Programme entgegen. Mit geringem Aufwand kann jedoch auch das fur das Chemikalienkataster genutzte Programm zum Drucken von Etiketten umgestaltet und genutzt werden. Anstelle von selbstklebenden Etiketten hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Etiketten auf normales Schreibpapier zu drucken, und sie mit einer Klarsichtfolie auf die Gebinde aufzukleben. So ist gewahrleistet, daB die Schrift nicht durchTropfen und Spritzer, die auf das Etikett gelangen, verwischt wird. AuBerdem lassen sich diese Etiketten ohne groBen Aufwand wieder ablosen, wahrend normale Klebeetiketten oft Klebereste hinterlassen, die nur schwer zu entfernen sind. Die richtige Etikettierung schutzt nicht nur denjenigen, der mit der Chemikalie umgeht, sondern sie erleichtert auch die Entsorgung nicht mehr benotigter Chemikalien.

1.4 Priifung des Einsatzes alternativer Arbeitsweisen und Ersatzstoffe § 16 Abs. 2 und 4 der GefStoffV fordert vom Arbeitgeber, die Moglichkeit des Einsatzes von alternativen Stoffen rnit geringerem gesundheitlichen Risiko zu priifen. In der Analytik bedeutet eine derartige stoffliche Anderung einen gravierenden Eingriff in erprobte oder genormte Analysenverfahren. Da jedoch viele Untersuchungen nach gesetzlich vorgegebenen Analysenvorschriften (z. B. DIN, DEV, DFG u. a.) durchgefuhrt werden mussen, ist es fur das einzelne Laboratorium oft schwierig, Alternativverfahren einzusetzen. Es gibt dennoch Moglichkeiten, diesem gesetzlichen Gebot nachzukommen. In der organischen Ruckstandsanalytik werden z. B. noch haufig chlorierte Losungsmittel bei der Probenaufarbeitung verwendet. Durch vergleichende

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I Gefahrstoffverordnung und Arbeitssicherheit

Untersuchungen konnte gezeigt werden, daS bei der Pflanzenschutzmittelanalytik nach der DFG S19-Methode ein Ersatz von Dichlormethan durch nichtchlorierte Losungsmittel durchaus moglich ist [ 1-4, 1-51. Da das Abweichen von bestehenden und erprobten Analysenverfahren nicht zu Lasten der Analysenqualitat gehen darf, mussen derartige Neuerungen durch aufwendige Arbeiten zur analytischen Qualitatssicherung begleitet werden. Hier sind insbesondere die Gremien gefordert. Analysenvorschriften fur behordliche Uberwachungszwecke zu erarbeiten und auf ihre Zweckma13igkeit hin zu bewerten. Neben dem Bereich der reglementierten Uberwachungsanalytik gibt es jedoch einen weiten Bereich von analytischen Verfahren, die durch den Analytiker im Labor meist in Anlehnung an die Literatur durchgefuhrt werden. Unter Berucksichtigung der hohen Anspruche an die Analytik sollten hier die wichtigsten Forderungen der GefStoffV bei der Entwicklung und Durchfuhrung von Analysenverfahren berucksichtigt werden. Ein wichtiger Grundsatz sollte es sein, den Gesamtumsatz an Chemikalien zu minimieren. Dies bedeutet den verstarkten Einsatz von Mikromethoden, Minichromatographiesaulen und Kartuschen unter Berucksichtigung der Reprasentativitat der Laborprobe. Die Festphasenextraktion wie auch der Einsatz der Microbore-Technik in der HPLC sind Beispiele dafur, wie der Einsatz von Losemitteln minimiert werden kann. Das als ,,Zuricher Modell" an der Universitat Zurich eingefuhrte, praktisch sonderabfallfrei gestaltete Praktikum [ 1-61 kann fur analytisch arbeitende Laboratorien als Vorbild dafur dienen, daS bei konsequenter Uberprufung aller Arbeitsvorschriften im Labor groBe Einsparungspotentiale an Chemikalien, Energie und Wasser vorhanden sind. Gleichzeitig werden damit Probleme der Abfallentsorgung und der Arbeitsplatzhygiene (MAK) entscharft. Sind Arbeiten mit groSeren Losungsmittelmengen nicht zu umgehen, mussen diese in Abzugen durchgefuhrt werden. So konnen Soxhlet-Extraktoren, Siiulen zu Clean-up-Zwecken und komplette Chromatographieanlagen (z. B. Gelpermeationschromatographie, GPC) in Abzugen aufgebaut werden. Tischabzuge stellen eine relativ preisgunstige Alternative dar. Die positiven Auswirkungen auf die Konzentrationen von Schadstoffen am Arbeitsplatz sind beim Einsatz von moglichst geschlossenen Systemen am starksten zu verzeichnen. Der Einsatz von Losungsmitteln in Kalt- oder HeiSextraktoren (z. B. Soxhlet-Extraktor), d. h. in Glasapparaturen mit Schliffverbindungen fuhrt zu Verlusten und damit zu einer Kontamination von Laborraumen. Neben den Problemen der Arbeitsplatzhygiene stellt die Abfallentsorgung der Losungsmittel einen kritischen Bereich dar. Hier kann der Ersatz von Losungsmitteln durch neue, zu evaluierende Extraktionstechniken, wie die uberkritische Fluidextraktion (SFE), einen moglichen Losungsweg darstellen. Uberall dort. wo eine grol3e Probenanzahl mit Hilfe einer uberschaubaren Anzahl von Analysenmethoden untersucht wird, ist es besonders vielver-

1.5 Gefahren bei der Untersuchung von Proben

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sprechend, alternative Arbeitsweisen und Ersatzstoffe einzufuhren. Das weitere Vordringen von Laborrobotern, Automaten und von Computersteuerungen im Bereich ,,automatisch" arbeitender Analysenlaboratorien kann vorteilhaft rnit Vorgaben der GefStoffV in Einklang gebracht werden.

1.5 Gefahren bei der Untersuchung von Proben In analytisch arbeitenden Laboratorien hat man in der Regel rnit vielen unterschiedlichen Arbeitsvorgangen und Methoden zu tun. Je nach inhaltlicher Ausrichtung des Labors werden physikalische, biochemische, anorganischund/oder organisch-chemische Analysenverfahren durchgefuhrt. Bei der oft groBen Anzahl von Untersuchungsparametern, die bei zu bearbeitenden Proben bestimmt werden, liegt das Gefahrdungspotential, das von der Probenbearbeitung durch das Laborpersonal ausgeht, vor allem in der sehr grooen Anzahl verschiedener Arbeitsschritte. Der Unsicherheitsfaktor Mensch spielt deshalb gerade in analytischen Laboratorien auch bei gut ausgebildetem Personal eine nicht zu vernachlassigende Rolle. Die Erstellung von Betriebsanweisungen stellt eine wichtige Maonahme dar, um sicherheitsrelevante Arbeiten rnit Chemikalien im Sinne der GefStoffV fur Arbeitnehmer ungefahrlicher zu gestalten. An dieser Stelle sollte erwahnt werden, dal3 die ,,Gute Labor-Praxis" (GLP) [ 1-71 mit ihrem Konzept der ,,Standard Operation Procedure" (SOP) eine entsprechende Absicht wie die GefStoffV verfolgt. Allerdings steht hier die Analysenqualitat bzw. die Produktqualitat im Vordergrund. Es sollten zumindest folgende ,,Betriebsanweisungen fiir Arbeiten mit Chemikalien " ausgearbeitet werden: - Abfullen von Losungsmitteln (Lagerhaltung, Losungsmittel fur den taglichen Gebrauch) - Handhabung besonders gefahrlicher Losungsmittel (Ersatz von Benzol, Testen von Diethylether auf Peroxide etc.) - Arbeiten rnit Chemikalien unter kritischen Bedingungen (Nutzung elektrischer Heizquellen zusammen rnit Liisungsmitteln, Rotationsverdampfer, Arbeiten rnit offener Flamme, Arbeiten im und auBerhalb des Abzugs etc.) - Herstellung von Standardlosungen (Handhabung von reinen Substanzen wie PSM, PAK und Nitrosaminen) - Aufarbeiten von Reststoffen, Vorbereitung fur die Entsorgung So wie Betriebsanweisungen im Bereich des Umgangs rnit Chemikalien einen Faktor zum sicheren Arbeiten im analytischen Labor darstellen, so konnen Betriebsanweisungen fur die Geratenutzung direkt oder indirekt zur Steige-

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1 Gefahrstoffverordnung und Arbeitssicherheit

rung der Sicherheit beitragen. In diesem Bereich konnen folgende Beispiele fur Betriebsanweisungen aufgezeigt werden:

- Diagnose-/Not-Aus-Anweisungen fur komplizierte Analysensysteme, um bei Abwesenheit des Bedieners eine ,,Notfallbedienung" zu gewahrleisten - Benutzerhandbucher fur verschiedenste technische Gerate (Wartung, Storungen, Reparaturen, Service u. a.) Bei der Bearbeitung von Proben unbekannter Herkunft sind alle jeweils notwendigen Sicherheitsaspekte zu beriicksichtigen, insbesondere das Tragen von Handschuhen beim Umgang mit Abwasserproben (krankheitserregende Bakterien) und Deponieproben (hochtoxische Verbindungen). Gerade in den hoch arbeitsteiligen Untersuchungslaboratorien werden z. B. in Umweltproben eine ganze Reihe von Parametern bestimmt. In diesem Zusammenhang ist durch ein geeignetes Probenbegleitscheinverfahren sicherzustellen, dalS jeder, der mit der Bearbeitung der Proben zu tun hat, uber mogliche, von der Probe ausgehende Gefahren informiert ist. Besondere Gefahrenmomente miissen an den Probenbehaltnissen deutlich gekennzeichnet werden. Zusatzlich kann die Erstellung einer Arbeitsanweisung an das Laborpersonal fur ,,besondere Proben" hilfreich sein. Gefahrstoffe in Proben stellen in Abhangigkeit von den jeweiligen Ruckstandsgehalten einen Problembereich sowohl fur die Probenbearbeitung als auch fur die Entsorgung dar. Besonderer Beriicksichtigung bedurfen: Dioxine und Furane (chloriert und bromiert) chlorierte Umweltchemikalien (z. B. PCB, Chlorphenole, PCP) - pathogene Mikroorganismen - Arzneimittelruckstande - Radioisotope - Pestizide - toxische Elemente -

Im analytischen Labor gibt es eine Reihe spezieller Gefahrenmomente, die zur Freisetzung von Gefahrstoffen fuhren konnen. Fur alle als kritisch zu beurteilenden Arbeitsbereiche sollten detaillierte Betriebsanweisungen geschrieben werden, so da13 sich das Laborpersonal in der taglichen Arbeit an einem schriftlich fixierten ,,Sicherheitsleitfaden" orientieren kann. Hierzu zahlen exemplarisch: -

Glasbruch in elektrisch beheizten Apparaturen mit der Gefahr des Laborbrandes (z. B. bei Soxhlet-Apparaturen) Trockenschranke zur Trockengewichtsbestimmung mit der Gefahr der Freisetzung fluchtiger toxischer Bestandteile (AnschlulS an die Entluftung)

1.6 Allgemeine Laboranweisungen

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- Arbeiten unter vermindertem Druck rnit der Gefahr der Implosion (Glasgerate mit unbeschadigter Oberflache, wirksamer Splitterschutz an Rotationsverdampfern) - Arbeiten mit konzentrierten Sauren und anderen atzenden Stoffen (haufige Gefahrenquelle im analytischen Labor, besonders der Schutz der Augen durch Schutzbrillen oder Gesichtsschilde ist angezeigt) - Transport von Chemikalien und Proben in geeigneten Transportbehaltern (Sicherheitsverpackung bei hochtoxischen Substanzen) - Ansetzen von Standardlosungen und Arbeiten rnit hochtoxischen Verbindungen (halogenierte Dioxine und Furane)

1.6 Allgemeine Laboranweisungen a) Aus Sicherheitsgrunden ist es verboten, im Labor allein zu arbeiten. - Bei einem eventuellen Unfall, Verletzung oder Vergiftung mu13 Erste Hilfe geleistet bzw. Hilfe geholt werden. - Da man rnit anderen zusammenarbeitet, ist man durch deren Unachtsamkeit ebenso gefahrdet, wie die anderen durch die eigene Unachtsamkeit . b) Personliche Indispositionen konnen zu einer Erhohung der Gefahren beitragen. - Krankheiten durch Schwindel, Krampfe, Ohnmacht - Schwangerschaft c) Man arbeitet rnit Chemikalien, die nach GefStoffV als Gefahrstoffe gelten. - Giftigkeit (akut oder chronisch) - Brennbarkeit - Explosivitat - atzende Wirkung d) Man arbeitet rnit verschiedenen Arten von Apparaturen, die zur Erhohung des Gefahrenmomentes beitragen konnen. - elektrische Gerate - Glasgerate - Gasbrenner (offene Flammen) Es ist daher dringend erforderlich, daS die Laborrichl inien fur I ie Arbeitssicherheit unbedingt eingehalten werden. Hierzu gehoren zurnindest:

Verbot der Nahrungsaufnahme und des Rauchens - Im gesamten, genau festzulegenden Laborbereich durfen Nahrungsmittel und Getranke weder aufbewahrt noch verzehrt werden. -

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1 Gcfahrstoffvcrordnungund Arbeitssicherheit

- Die Aufbewahrung von Speisen und Getranken in Chemikalien- oder LaboratoriumsgefaBen ist nicht erlaubt. Insbesondere bei Proben in Getrankeflaschen kann es leicht zu Verwechslungen kommen. - Im analytischen Laboratorium gilt ein absolutes Rauchverbot. - Voraussetzung fur die Unterweisung von Mitarbeitern ist die Kennzeichnung von Raumen (Labor-, MeB- und Buro- bzw. Aufenthaltsraume) rnit einer genauen Definition der Nutzung. -

Einhaltung von Hygienemafinahmen Nach Beendigung der Laborarbeit sind die Hande grundlich rnit Wasser und Seife zu waschen. Labor- und StraBenkleidung mussen getrennt aufbewahrt werden. Da man in den Arbeitsbereichen im Labor immer rnit einer Kontamination von Arbeitsflachen und Geraten rechnen muB, sollten in regelmaBigen Zeitraumen die Arbeitsflachen und Gerate gereinigt werden. Durch Analyse von Wischproben kann der Kontaminationsgrad des Labors kontrolliert werden [l-81.

Benutzung der personlichen und gebaudeseitigen Schutzeinrichtungen Eine Schutzbrille mit Spritzschutz oben und an den Seiten sowie rnit bruchsicheren Glasern ist im Labor grundsatzlich zu tragen. - Laborkittel aus Baumwolle oder anderen schwerentflammbaren Materialien, dazu allgemein Kleidung aus ebenfalls schwerentflammbarem Material, insbesondere rnit geringem Kunstfaseranteil. Der Kittel ist stets geschlossen zu tragen und sollte aul3erhalb der Laboratorien (Sozialraume, Bibliothek etc.) nicht getragen werden. - Tragen von geschlossenen Schuhen rnit rutschfester Sohle (keine Sandalen, Pumps etc.) - Bei Bedarf Benutzung von chemikalienbestandigen Schutzhandschuhen. - wichtig: Schutzhandschuhe sind potentiell immer kontaminiert. Darum durfen damit Gegenstande, wie z. B. Turklinken, Telefone, Treppengelander etc. nicht beruhrt werden, um eine Ubertragung von Kontamination zur ungeschutzten Haut zu vermeiden! - Ein korrekt benutzter Abzug bietet den groBtmoglichen Schutz vor Gefahrdungen. - Vor Beginn der Arbeitsaufnahme sollte sich jeder uber Lage und Funktion der Sicherheitseinrichtungen informieren: - Notausgange, Fluchtwege - Feuermelder, Alarmanlagen, wichtige Telefonanschlusse - Feuerloscher, Loschdecke, Not-Aus-Schalter - Erste-Hilfe-Kasten, Augenspulflaschen, Notduschen -

1.7 MAK-, BAT- und TRK-Werte, Ausloseschwellen

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Richtiger Umgang rnit Chemikalien Die meisten Chemikalien, insbesondere alle unbekannten, sind als Gefahrstoffe anzusehen und entsprechende Sicherheitsmafinahmen einzuhalten. - Es ist verboten, Flussigkeiten rnit dem Mund zu pipettieren. - Hautkontakt mit Chemikalien ist strikt zu vermeiden. - Chemikalien sollten nach Moglichkeit in der Originalverpackung belassen werden, ansonsten durfen sie nur in geeigneten, korrekt beschrifteten Gefafien aufbewahrt werden. Auf keinen Fall diirfen Chemikalien in Behaltern aufbewahrt werden, die ublicherweise zur Aufnahme von Nahrungsmitteln bestimmt sind. - Vorratshaltung von Chemikalien uber die standig benotigte Menge hinaus sollte vermieden werden. - Beim Transport glaserner Chemikalienbehalter ist die Bruchgefahr zu beachten. Flaschen durfen nie am Hals getragen werden. Nach Moglichkeit sollten Chemikalienbehalter in Eimern, Korben etc. transportiert werden. - Entnommene Chemikalien diirfen nicht wieder in das VorratsgefaB zuruckgefullt werden. - Beim Umgang rnit brennbaren Fliissigkeiten sind alle Zundquellen, insbesondere offene Flammen, aus der Umgebung zu entfernen. - Auch kleinere Brande in chemischen Laboratorien konnen gefahrliche Folgereaktionen mit dort gelagerten Chemikalien bewirken. - Die Herstellung von und der Umgang rnit Explosivstoffen im Sinne des Sprengstoffgesetzes (d. h. Initialzunder wie Schwermetallazide etc.) ist verboten. -

1.7 MAK-, BAT- und TRK-Werte, Ausloseschwellen Die Maximale Arbeitsplatzkonzentration (MAK ) ist die Konzentration eines Stoffes als Gas, Dampf oder Schwebstoff in der Luft am Arbeitsplatz, bei der im allgemeinen die Gesundheit der Arbeitnehmer nicht beeintrachtigt wird. Die Technische Richtkonzentration ( T R K ) ist die Konzentration eines gentoxischen Stoffes als Gas, Dampf oder Schwebstoff in der Luft am Arbeitsplatz, die nach dem Stand der Technik erreicht werden kann, die jedoch nichts daruber aussagt, ob dabei die gentoxische Wirkung wirklich auch ausgeschlossen ist. Der Biologische Arbeitsplatztoleranzwert(BAT) ist die Konzentration eines Stoffes oder seines Umwandlungsproduktes im Korper oder die dadurch ausgeloste Abweichung eines biologischen Indikators von seiner Norm, bei der im allgemeinen die Gesundheit der Arbeitnehmer nicht beeintrachtigt wird. Die Ausloseschwelle ist die Konzentration eines Stoffes in der Luft am Arbeitsplatz oder im Sinne des BAT-Wertes im Korper, bei deren Uberschrei-

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1 Gefahrstoffverordnung und Arbeitssicherheit

tung zusatzliche MaBnahmen zum Schutze der Gesundheit erforderlich sind. Der Uberschreitung der Ausloseschwelle steht es gleich, wenn ein unmittelbarer Hautkontakt besteht. Die Unterschreitung der Ausloseschwelle kann in Laboratorien unterstellt werden, wenn alle Arbeiten mit Gefahrstoffen (Abwiegen, Abmessen, Umfullen, Reinigen, Entsorgen, Erfassen von Dampfen) unter einem Abzug rnit moglichst weit geschlossenem Frontschieber durchgefuhrt werden und die erforderliche personliche Schutzausrustung (insbesondere Schutzhandschuhe) getragen wird. Gerade die zahllosen Gerate in vielen analytischen Laboratorien lassen es aber nicht mehr zu, daB alle Arbeiten in Abzugen durchgefuhrt werden konnen. Hier ist es notwendig, alle Geratebereiche, in denen Schadstoffe freigesetzt werden konnen, mit einer separaten Absaugung (z. B. direkte Schlauchverbindung zum Abluftsystem) zu verbinden. Gerade in den analytischen Laboratorien, in denen rnit besonders gefahrlichen Stoffen (z. B. Dioxinen) gearbeitet wird, muB uberlegt werden, ob die vorhandenen Abzuge nicht besser durch neuartige Spezialarbeitsplatze ersetzt werden. Diese ebenfalls abgesaugten, aber zusatzlich mit einem Luftschleier arbeitenden Systeme halten nicht nur die Schadstoffe wesentlich besser zuruck, sondern kommen zugleich mit geringerem Luftbedarf im Vergleich zu Abzugen aus. Dadurch konnen bei gleicher Abluftmenge mehr Arbeitsplatze rnit einer hoheren Arbeitssicherheit ausgerustet werden. Besteht der Verdacht, daB die Ausloseschwelle einer Substanz uberschritten wird, fordert die GefStoffV die Messung der Stoffkonzentration. Da diese Messungen, die nur von Personen oder Firmen durchgefuhrt werden durfen, die die notwendige Fachkunde besitzen, relativ teuer sind, sollte man vor der Messung grundlich uberlegen, ob dieses Geld nicht besser fur moderne Technik ausgegeben werden sollte, um die Uberschreitung der Ausloseschwelle sicher zu vermeiden. 1st nicht sicherzustellen, daB die Ausloseschwelle bestimmter Stoffe und Stoffgruppen uberschritten wird, die im Anhang VI der GefStoffV aufgelistet sind (z. B. Benzol, Benzo(a)pyren, Cadmium oder Blei), mussen die Mitarbeiter einer arztlichen Vorsorgeuntersuchung unterzogen werden. Auch durch diese Untersuchungen entstehen Kosten, die durch den Einsatz modernster Technik zu vermeiden sind. Auf die Einhaltung der Beschaftigungsbeschrankungen fur besondere Personengruppen ist dringend zu achten. Dies betrifft insbesondere

- Schwangere und stillende Frauen, - Frauen im gebaflahigen Alter, - Jugendliche und Auszubildende. Grundsatzlich gilt, dalJ diese Personengruppen keinen Umgang rnit besonders gefahrlichen Chemikalien haben durfen (z. B. explosionsgefahrliche, hochentzundliche, sehr giftige, krebserzeugende und fruchtschadigende Chemika-

1.8 Gefahrensymbole und R/S-Satze

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lien). Ausnahmen bestehen nur, wenn die Ausloseschwelle nicht iiberschritten wird und fur Jugendliche und Auszubildende der Umgang mit bestimmten Gefahrstoffen fur die Ausbildung erforderlich ist.

1.8 Gefahrensymbole und WS-Satze Nach 0 3a ChemG werden gefahrliche Stoffe und gefahrliche Zubereitungen mit bestimmten Gefahrlichkeitsmerkmalen bezeichnet :

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explosionsgefahrlich brandfordernd hochentziindlich leichtentziindlich entziindlich sehr giftig giftig mindergiftig (gesundheitsschadlich) atzend reizend sensibilisierend krebserzeugend fruchtschadigend erbgutverandernd sonstige chronisch schadigende Eigenschaften besitzend umweltgefahrlich

Zur Beschreibung und leichteren Erkennung der Gefahrlichkeit solcher Stoffe und Zubereitungen gibt es europaweit abgestimmte, verbindliche Gefahrensymbole, die in der Abb. 1-1gezeigt werden. Auf die besonderen Gefahren und Empfehlungen im Umgang mit Gefahrstoffen machen neben den Gefahrensymbolen die sogenannten R- und SSatze im Klartext aufmerksam. R-Siitze sind Hinweise auf besondere Gefahren (Risiken), S-Satze die dazu gehorigen Sicherheitsratschlage (Sicherheitsempfehlungen) , bei deren Befolgung die Risiken minimiert werden. Von einern Stofs konnen gleichzeitig mehrere Risiken ausgehen. Diese werden durch eine Anhaufung einschlagiger R-Satze zum Ausdruck gebracht. Es gibt auch die Kombination von R-Satzen, wenn aus einem Verhalten das nachste gefahrliche folgt, wie 2.B. R 14/15 reagiert heftig mit Wasser unter Bildung leicht entzundlicher Gase (Na, LiAlH4 etc.). Gleiches ist naturlich auch bei den S-Satzen gegeben.

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1 Gcfahrstoffverordnung und Arbeitssicherheit

E Explosionsgefahrlich

O m Brandfordernd

Atzend

Reizend

Fm

F + M Hochentziindlich

Leichtentziindlich

T + M Mindergiflig

Gifiig

Radioaktiv

Umweltgefahrlich

Sehr Giftig

Abb. 1-1: Gcfahrensymbolc nach ChemG.

Fur schwangere Frauen und Frauen im gebarfahigen Alter sind von besonderer Bedeutung die R-Satze 45, 46, 47 (kann Krebs, vererbbare Schaden, MiBbildungen verursachen) und die zugehorige Sicherheitsempfehlung S 53 (Exposition vermeiden - vor Gebrauch besondere Anweisung einholen). Eine Auflistung aller R- und S-Satze ist im folgenden wiedergegeben.

Hinweise auf die besonderen Gefahren (R-Sake und deren Kombinationen) R1 In trockenem Zustand explosionsgefahrlich. R2 Durch Schlag, Reibung, Feuer oder andere Zundquellen explosionsgefahrlich. R3 Durch Schlag, Reibung, Feuer oder andere Zundquellen besonders explosionsgefahrlich. R4 Bildet hochempfindliche explosionsgefahrliche Metallverbindungen. R5 Beim Erwarmen explosionsfahig. R6 Mit und ohne Luft explosionsfahig. R7 Kann Brand verursachen. R8 Feuergefahr bei Beruhrung mit brennbaren Stoffen. R9 Explosionsgefahr bei Mischung mit brennbaren Stoffen. R 10 Entzundlich. R 11 Leichtentzundlich. R 12 Hochentzundlich. R 13 Hochentzundliches Flussiggas. R 14 Reagiert heftig mit Wasser. R 15 Reagiert mit Wasser unter Bildung leicht entziindlicher Gase.

1.8 Gefahrensymbole und RIS-Satze

R 16 R 17 R 18 R 19 R 20 R 21 R 22 R 23 R 24 R 25 R 26 R 27 R 28 R 29 R 30 R 31 R 32 R 33 R 34 R 35 R 36 R 37 R 38 R 39 R 40 R 41 R 42 R 43 R 44 R 45 R 46 R 47 R 48 R 14/15

R 15/29 R 20121

R 21/22

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Explosionsgefahrlich in Mischung rnit brandfordernden Stoffen. Selbstentzundlich an der Luft. Bei Gebrauch Bildung explosionsfahigerheichtentzundlicher Dampf-Luftgemische moglich. Kann explosionsfahige Peroxide bilden. Gesundheitsschadlich beim Einatmen. Gesundheitsschadlich bei Beruhrung rnit der Haut. Gesundheitsschadlich beim Verschlucken. Giftig beim Einatmen. Giftig bei Beruhrung rnit der Haut. Giftig beim Verschlucken. Sehr giftig beim Einatmen. Sehr giftig bei Beruhrung rnit der Haut. Sehr giftig beim Verschlucken. Entwickelt bei Beruhrung rnit Wasser giftige Gase. Kann bei Gebrauch leicht entzundlich werden. Entwickelt bei Beruhrung rnit Saure giftige Gase. Entwickelt bei Beruhrung rnit Saure sehr giftige Gase. Gefahr kumulativer Wirkungen. Verursacht Veratzungen. Verursacht schwere Veratzungen. Reizt die Augen . Reizt die Atmungsorgane. Reizt die Haut. Ernste Gefahr irreversiblen Schadens. Irreversibler Schaden moglich. Gefahr ernster Augenschaden. Sensibilisierung durch Einatmen moglich. Sensibilisierung durch Hautkontakt moglich. Explosionsgefahr bei Erhitzen unter EinschluS. Kann Krebs erzeugen. Kann vererbbare Schiiden verursachen. Kann MiSbildungen verursachen. Gefahr ernster Gesundheitsschaden bei langerer Exposition. Reagiert heftig mit Wasser unter Bildung leicht entzundlicher Gase . Reagiert rnit Wasser unter Bildung giftiger und leicht entzundlicher Gase. Gesundheitsschadlich beim Einatmen und bei Beruhrung rnit der Haut. Gesundheitsschadlich bei Beruhrung mit der Haut und beim Verschlucken.

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1 Gefahrstoffverordnungund Arbeitssicherheit

R 20/22 Gesundheitsschadlich beim Einatmen und Verschlucken. R 20/21/22 Gesundheitsschadlich beim Einatmen, Verschlucken und Beruhrung rnit der Haut. R 23/24 Giftig beim Einatmen und bei Beruhrung rnit der Haut. R 24/25 Giftig bei Beruhrung rnit der Haut und beim Verschlucken. R 23/25 Giftig beim Einatmen und Verschlucken. R 23/24/25 Giftig beim Einatmen, Verschlucken und Beruhrung rnit der Haut. R 26/27 Sehr giftig beim Einatmen und bei Beruhrung rnit der Haut. R 27/28 Sehr giftig bei Beruhrung rnit der Haut und beim Verschlucken. R 26/28 Sehr giftig beim Einatmen und Verschlucken. R 26/27/28 Sehr giftig beim Einatmen, Verschlucken und Beruhrung rnit der Haut. R 36/37 Reizt die Augen und die Atmungsorgane. R 37/38 Reizt die Atmungsorgane und die Haut. R 36/38 Reizt die Augen und die Haut. R 36/37/38 Reizt die Augen, Atmungsorgane und die Haut. R 42/43 Sensibilisierung durch Einatmen und Hautkontakt moglich. Sicherheitsratschlage(S-Satze und deren Kombinationen) Unter VerschluB aufbewahren. Sl Darf nicht in die Hande von Kindern gelangen. s2 Kuhl aufbewahren. s3 Von Wohnplatzen fernhalten. s4 Unter ... aufbewahren (geeignete Flussigkeit vom Hersteller s5 anzugeben). Unter ... aufbewahren (inertes Gas vom Hersteller anzugeben). S6 Behalter dicht geschlossen halten. s7 Behalter trocken halten. S8 Behalter an einem gut gelufteten Ort aufbewahren. s9 Behalter nicht gasdicht verschliel3en. s 12 Von Nahrungsmitteln, Getranken und Futtermitteln fernhalten. S 13 Von ... fernhalten (inkompatible Substanzen vom Hersteller S 14 anzugeben). Vor Hitze schutzen. S 15 S 16 Von Zundquellen fernhalten - nicht rauchen. Von brennbaren Stoffen fernhalten. S 17 Behalter rnit Vorsicht offnen und handhaben. S 18 Bei der Arbeit nicht essen und trinken. s 20 Bei der Arbeit nicht rauchen. s 21 Staub nicht einatmen. s 22 GaslRauchlDampWAerosol nicht einatmen (geeignete BezeichS 23 nung(en) vom Hersteller anzugeben).

1.8 Gefahrensyrnbole und R/S-Satze

S 24 S 25 S 26 S 27 S 28 S 29 S 30 s 33 s 34 s 35 S 36 s 37 S 38 s 39 S 40 S 41 S 42

s 43 s 44 s 45 S 46

s 47 S 48

s 49 S 50 S 51 S 52 s 53

s 112 s 31719

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Beriihrung mit der Haut vermeiden. Beriihrung rnit den Augen vermeiden. Bei Beruhrung mit den Augen grundlich rnit Wasser abspulen und Arzt konsultieren. Beschmutzte, getrankte Kleidung sofort ausziehen. Bei Beruhrung rnit der Haut sofort abwaschen rnit vie1 ... (vom Hersteller anzugeben). Nicht in die Kanalisation gelangen lassen. Niemals Wasser hinzugieaen. Maanahmen gegen elektrostatische Aufladungen treffen. Schlag und Reibung vermeiden. Abfalle und Behalter mussen in gesicherter Weise beseitigt werden. Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung tragen. Geeignete Schutzhandschuhe tragen. Bei unzureichender Beluftung Atemschutzgerat anlegen. SchutzbrillelGesichtsschutz tragen. FuBboden und verunreinigte Gegenstande rnit ... reinigen (vom Hersteller anzugeben). Explosions- und Brandgase nicht einatmen. Beim RauchernNerspriihen geeignetes Atemschutzgerat anlegen (geeignete Bezeichnung(en) vom Hersteller anzugeben). Zum Loschen ... (vom Hersteller anzugeben) verwenden (wenn Wasser die Gefahr erhoht, anfugen: Kein Wasser verwenden). Bei Unwohlsein arztlichen Rat einholen (wenn miiglich, dieses Etikett vorzeigen). Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt zuziehen (wenn moglich, dieses Etikett vorzeigen). Bei Verschlucken sofort arztlichen Rat einholen und Verpackung oder Etikett vorzeigen. Nicht bei Temperaturen uber ... "C aufbewahren (vom Hersteller anzugeben). Feucht halten mit ... (geeignetes Mittel vom Hersteller anzugeben) . Nur im Originalbehalter aufbewahren. Nicht mischen mit ... (vom Hersteller anzugeben). Nur in gut gelufteten Bereichen verwenden. Nicht groaflachig fur Wohn- und Aufenthaltsraume zu verwenden. Exposition vermeiden - vor Gebrauch besondere Anweisung einholen . Unter VerschluS und fur Kinder unzuganglich aufbewahren. Behalter dicht geschlossen halten und an einem kuhlen, gut gelufteten Ort aufbewahren.

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1 Cefahrstoffverordnung und Arheitssicherheit

s 3/9

Behalter an einem kuhlen, gut geliifteten Ort aufbewahren. An einem kiihlen Ort entfernt von ... aufbewahren (die Stoffe, mit denen Kontakt vermieden werden mul3, sind vom Hersteller anzugeben). An einem kiihlen, gut geliifteten Ort, entfernt von ... aufbewahS 3/9/14 ren (die Stoffe, mit denen Kontakt vermieden werden mul3, sind vom Hersteller anzugeben). S 3/9/49 Nur im Originalbehalter an einem kuhlen, gut geliifteten Ort aufbewahren. S 3/9/14/49 Nur im Originalbehalter an einem kuhlen, gut geliifteten Ort, entfernt von ... aufbewahren (die Stoffe, mit denen Kontakt vermieden werden muB, sind vom Hersteller anzugeben). s 7/8 Behalter trocken und dicht geschlossen halten. s 7/9 Behalter dicht geschlossen an einem gut gelufteten Ort aufbewahren. S 20/21 Bei der Arbeit nicht essen, trinken, rauchen. S 24/25 Beruhrung rnit den Augen und der Haut vermeiden. S 36/37 Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzkleidung tragen. S 36/39 Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung und Schutzbrille/ Gesichtsschutz tragen. S 37/39 Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzbrille/ Gesichtsschutz tragen. S 36/37/39 Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen. S47/49 Nur im Originalbehalter bei einer Temperatur von nicht iiber ... "C (vom Hersteller anzugeben) aufbewahren. S 3/14

1.9 Reduzierung der Schadstoffbelastung in Abwasser und Abluft Die Abgabe von Schadstoffen an Abluft und Abwasser darf keine MaBnahme der Abfallbeseitigung darstellen, sondern sollte durch eine Anzahl gezielter Verfahren und Handlungskonzepte minimiert werden. Der Luftpfad ist im industriellen Bereich durch die TA-Luft geregelt, wird aber bei Laboratorien nicht uberwacht. Das Abwasser von analytischen Laboratorien, in denen rnit wassergefahrdenden Stoffen gearbeitet wird, unterliegt den abwasserrechtlichen Vorschriften des Wasserhaushaltsgesetzes (WHG). Die Uberwachung der Indirekteinleiter erfolgt durch die Kommunen. Werden Schwellenwerte oder gar Grenzwerte der Indirekteinleiterverordnung von einem Analysen-

1.10 VVV (Vermeiden, Vermindern, Verwerten) von Laborabfallen

19

labor uberschritten, kann es fur die Ursachenfindung nutzlich sein, systematisch die Schadstoffquellen zu bilanzieren, wie dies beispielhaft anhand des Abwassersystems der Chemischen Institute der Technischen Universitat Braunschweig durchgefuhrt wurde [1-91. Zur Ermittlung der Ursachen fur die haufigen Uberschreitungen der damaligen Grenz- (5 m e ) bzw. Schwellenwerte (0.5 mg/L) fur AOX wurde eine rasterformige analytische Bestandsaufnahme des Institutsgebaudes rnit Hilfe der Summenparameter EOX und POX vorgenommen. Die Einzelsubstanzen, die zu diesen Summenparametern beitragen, wurden nach Extraktion des Abwassers rnit GC-ECDFID bzw. Headspace GC/MSD weitestmoglich identifiziert und quantifiziert. Durch MaBnahmen zur Eigenuberwachung konnen so wertvolle Informationen uber Kontaminationspfade gewonnen werden. Die Verminderung der Schadstoffbelastung von Abluft und Abwasser kann danach durch eine Reihe konkreter Maonahmen erfolgen, die jedoch stark vom Arbeitsgebiet des analytischen Labors abhangen:

- Abluftfiltration in der Gaschromatographie (nicht zerstorende Detektoren wie ECD, WLD und MS sowie Split- und Septumspulung) - Benutzung von Abzugen rnit Filtereinrichtungen (z. B. Aktivkohle) fur Arbeiten mit besonders toxischen Stoffen (wie Dioxine, radioaktive Stoffe oder cancerogene Substanzen) - Einsatz von Kuhlfallen (z. B. rnit flussigem Stickstoff) in Abluftstromen von Anlagen wie Rotationsverdampfern zur Ruckgewinnung von Losungsmitteln rnit der Moglichkeit, diese zu recyclen - Elimination von CKW aus der Wasserphase der Extraktion, z.B. durch Strippen oder Adsorption an Aktivkohle (beim Chloroformeinsatz bei der Bestimmung methylenblauaktiver Substanzen (MBAS) nach DIN 38 409 H 23 etc.) - Ersatz von Wasserstrahlpumpen durch Membranpumpen bei Arbeiten rnit fluchtigen Schadstoffen, insbesondere bei halogenierten Losungsmitteln

1.10 VVV (Vermeiden, Vermindern, Verwerten) von Laborabfallen und Losungsmittelriickgewinnung Als Abfalle durfen nur solche Chemikalien gelten, die nicht wiederverwendet werden konnen. Hierbei handelt es sich in erster Linie um Probenreste sowie deren Umsetzungsprodukte. Da gerade die modernen analytischen Methoden rnit nur sehr geringen Probenmengen arbeiten, sollten auch die Abfallmengen relativ klein sein. Jedoch erfordert die Probenvorbereitung oft grooere Losungsmittelmengen, z. B. fur die Extraktion. Nach der Extraktion werden

20

1 Gefahrstoffverordnung und Arbcitssicherheit

die Losungsmittel in der Regel mittels Rotationsverdampfer abdestilliert. Soweit diese Losungsmittel nach dem Abdestillieren den Qualitatsanspruchen genugen, konnen sie wieder fur die Probenvorbereitung oder zur Reinigung von Laborglasgeraten eingesetzt werden. Gerade fur die Spurenanalyse sind die wiedergewonnenen Losungsmittel nicht mehr sauber genug. Soweit durch eine zusatzliche Destillation/Rektifikation nicht die erforderliche Reinheit erzielt wird, konnen die Losungsmittel fur diese Arbeitsschritte nicht mehr verwendet werden. Voraussetzung fur die Weitervenvendung ist jedoch, daB alle Losungsmittelreste getrennt gesammelt werden. Sind Losungsmittel erst einmal vermischt, so gelingt es nur schwer, ausreichende Qualitaten zu erzielen [l-lo]. Die mangelnde Auftrennung in Einzelkomponenten ist oft nicht in einer zu Tab. 1-1: Azcotropc iind Zcotrope hinrrcr Mischungcn ausgewiihltcr Liiscmittcl

LeFende:

0 = Azeotrop

0 @

Zeotrop widerspriichliche Literaturangaben

1.10 VVV (Vermeiden, Vermindern, Verwerten) von Laborabfallen

21

geringen Trennstufenzahl der verwendeten Rektifikationskolonne begrundet, sondern ist durch das Auftreten einer Vielzahl von Azeotropen zu erklaren. Diese sind in Tab. 1-1 dargestellt. Wie eigene Untersuchungen zeigen [l-111, ist dieses Verhalten exemplarisch fur gemischte Losungsmittelabfalle. Bei der Rektifikation mit Wasser vermischten Acetonitrils aus der HPLC wird das zugehorige Azeotrop (84 % Acetonitril 16 % Wasser) erhalten. Fur den Qualitatsvergleich wurde dieselbe Mischung aus frischen Acetonitril und Wasser angesetzt. Das recycelte Azeotrop wies im UV-Spektrum bei

min

Neoponcirin

Absorbance 284 nm

Abb. 7-16 HPLC-Chromatogramm eines Orangensaftes.

Hesperidin

154

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

Zusatzlich zur Retentionszeit 1aBt sich die Identitat des Naringins uber das DAD-Spektrum absichern. Als Vergleich kann direkt das Spektrum des vorher eluierenden Narirutins herangezogen werden. Narirutin mu13 als natiirlicher Bestandteil des Orangensaftes (und auch des Grapefruitsaftes) immer vorhanden sein und ist chemisch ein Isomeres des Naringins. Da der strukturelle Unterschied nur den Zuckerbaustein betrifft (statt Neohesperidose liegt im Narirutin Rutinose vor), sind die UV-Spektren identisch. Identifizierungsprobleme konnen sich vor allem im unteren ppm-Bereich ergeben [7-271. Von einigen Fachleuten [7-281 wird die Ansicht vertreten, daS 5 ppm aus technologischen Grunden (unvollstandige Aussortierung von Grapefruit vor der Orangensaftherstellung) zu tolerieren seien. Je nach DAD-Fabrikat muB bei so geringen Werten eventuell eine Konzentrierung der Probe vorgenommen werden, um auswertbare DAD-Spektren zu erhalten. Sehr hohe Hesperidinwerte geben einen Hinweis auf zu hohen PreSdruck bei der Saftherstellung.

Kalibrierung Fur den Nachweis eines Grapefruitzusatzes geniigt die Absicherung der Identitat des Naringins. Eine Quantifizierung der Glykoside Narirutin, gegebenenfalls Naringin und Hesperidin kann iiber eine externe Standardisierung (Kalibriergeraden) erfolgen. Dazu werden aus einer DMF-Stammlosung mit bekannten Gehalten an Hesperidin, Narirutin undoder Naringin Verdunnungen hergestellt und eingespritzt, die Gehalte von 0,002-0,5 mg/mL enthalten. Fur die Berechnung der Kalibriergeraden werden die vom Datensystem ermittelten Peakflachen bei der Wellenlange 284 nm verwendet. Da Narirutin und Naringin den gleichen molaren Extinktionskoeffizienten besitzen, geniigt eigentlich eine der beiden Verbindungen. Alle drei Glykoside sind kommerziell erhaltlich (z. B. Roth). Naturstoffstandards sind hinsichtlich ihrer Gehaltsangaben aber immer mit Vorsicht zu betrachten. Validierung Bei der beschriebenen Aufarbeitung umfassen die Kalibriergeraden einen Bereich von 8-2000 m g L Glykosid im Orangensaft. Die Wiederfindungsraten liegen uber 95 % mit geringen Variationskoeffizienten (3-5 %). Altemativmethoden In der unter [7-261 beschriebenen Methode wird ein isokratisches System eingesetzt , dessen Trennleistung fur die meisten Falle auch ausreicht . Fruher wurde zur Bestimmung in der Regel eine Reinigung uber Polyamidsaulen durchgefuhrt [7-271. Diese fuhrt zu sehr sauberen Extrakten und die (zuckerfreien) Losungen sind bei Bedarf bei Uberpriifungen im unteren ppm-Bereich einfacher zu konzentrieren. Da die Aufarbeitung im Vergleich zur DMFExtraktion aber wesentlich aufwendiger ist, sollte sie nur noch in Zweifelsfal-

7.8 Bestimmung von schwefliger Siiure in Bier und anderen Getrhken

155

len eingesetzt werden. Die Gaschromatographie ist nicht zur Erfassung der Glykoside geeignet, sondern kann zu falschen Ergebnissen [7-28, siehe 7-26] fiihren.

7.8 Bestimmung von schwefliger Saure in Bier und anderen Getriinken mittels HPLC-Biosensorkopplung Problemstellung Fur Lebensmittel, fur die keine besonderen Regelungen uber den Sulfitgehalt getroffen wurden, sieht das deutsche Lebensmittelrecht einen allgemeinen Grenzwert von 10 mg/L vor [7-291. Dies ist auch beim Bier der Fall. Eine Kontrolle ist notwendig, da wahrend des Brauprozesses durch den Abbau schwefelhaltiger Verbindungen auf naturliche Weise bis zu ca. 15 ppm entstehen konnen. Weiterhin kann Sulfit uber entsprechend behandelte Rohstoffe eingetragen werden, einige auslandische Brauereien setzen es wegen seiner guten konservierenden und antioxidativen Eigenschaften auch direkt dem Bier zu. Bei Traubensaften konnen geringe Restgehalte auf eine vorgenommene Schwefelung hinweisen, selbst wenn die Ware als ,,ungeschwefelt" deklariert wurde. Gerade im Bereich unter 10 ppm liefern die gebrauchlichen Methoden aber keine zuverlassigen Werte.

Prinzip der Bestimmung Die Probe wird verdunnt und isokratisch an einer Aluspher-Saule (mit einer RP-18-Vorsaule) getrennt, hinter die ein Enzymreaktor geschaltet ist (vgl. Abschn. 2.2.3). Dieser ist mit immobilisierter Sulfitoxidase gefullt, durch welche Sulfit zu Sulfat und H202umgesetzt wird: SO2-,

+ H 2 0 + O2Sulfitoxidase so'-,

+

H ~ O ~

Das gebildete Wasserstoffperoxid wird dann bei einem Potential von 0,4 V mit einem elektrochemischen Detektor gemessen. Bei der Aluspher-Saule (Merck) handelt es sich um eine Trennsaule, bei der die stationare Phase aus Aluminiumoxid besteht, welches mit Polybutadien beschichtet ist. Mit ihr hat man die Moglichkeit, die Stellung des Sulfitpeaks im Chromatogramm selektiv zu verandern, ohne dal3 andere elektrochemisch aktive Storpeaks ihre Retentionszeiten wesentlich verandern. Damit kann aus: WeSels, D., v. d. Brelie, A., Gromus, J., Galensa, R., Bruuwksemchufl, 1995, 48, 96-101

156

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

b)

O

5

10 rnin

Abb. 7-17:HPLC-Chromatogramme zur Sulfitbestimmung im Bier (Verdunnung 1:lOO); a) mit 0,OS M Carbonatpuffer als FlieBmittel; b) mit 0,02 M Carbonatpuffer; pH = 9,O.

man den Sulfitpeak, je nach vorhandenen Storstoffen in verschiedenen Getranken, an eine freie Stelle im Chromatogramm plazieren (Abb. 7-17). Der Grund f i r diese Eigenschaft ist ,daB das Aluminiumoxid der Alusphersaule nicht vollstandig mit Polybutadien belegt ist. Da Aluminiumoxid eine Lewissaure (Elektronenpaarakzeptor) und das Sulfit-Ion eine Lewisbase (Elektronenpaardonator) ist, konnen sich an unbelegten Stellen Sulfit-Ionen anlagern, es kommt zu Saure-Base Wechselwirkungen. Das bedeutet, je hoher man die Konzentration des Carbonatpuffers wahlt , desto schlechter kann Sulfit vom Saulenmaterial gebunden werden und desto schneller wird es eluiert . Diesem speziellen Trennmechanismus unterliegen die Storsubstanzen in der Regel nicht, so daB auf sie die Anderung der Pufferkonzentration wenig EinfluB hat. Ein Nachteil der Alusphersaule ist ihr geringes Ruckhaltevermogen gegenuber storenden Inhaltsstoffen im Vergleich zu RP-18-Saulen. Durch den Einsatz einer RP-18-Vorsaule kann aber ein GroBteil dieser Verbindungen entfernt werden. Chemikalien und Hilfsmittel - Wasser, HPLC grade - Natriumsulfit, p. A. - Natriumcarbonat (>99,5 %) - Sulfit-Oxidase (E. C. 1.8.3.1) aus Huhnerleber, kristalline Suspension in 3,2 M (NH4)2S04-Losung,pH = 7,5 (Sigma Chemie) Arbeitsvorschrift a) Probenaufarbeitung Die Getranke werden je nach den zu erwartenden SO2-Gehalten mit Wasser verdunnt (s. Abb. 7-19) und eingespritzt. Die unproblematische und schnelle Vorbereitung ist ein weiterer Vorteil der Methode, Verluste des fluchtigen und oxidationsempfindlichen Sulfits konnen so minimiert werden.

7.8 Bestimmung von schwefliger Siiure in Bier und anderen Getranken

157

b) ImmobTsierung der Sulfitoxidase Als Tragermaterial konnen VA Epoxy (Riedel-de-Haen) oder Eupergit C3ON (Rohm) verwendet werden. Die Bindung des Enzyms erfolgt uber reaktive Oxirangruppen (vgl. Abschn. 2.2.3). Die Immobilisierung ist problemlos im Labor nach [7-301 durchzufuhren. Die erhaltene Suspension wird rnit Hilfe einer Saulenfiillanlage bei einem Druck von 150 bar in Stahlkartuschen (40 X 2,s mm i. D.) gefullt. Die Standzeiten der Reaktoren sind sehr gut, mehrere Monate sind keine Besonderheit . Genaue Angaben konnen nicht gemacht werden, da dies naturlich von der Probenart und Probenanzahl abhangt.

c) Gerate und chromatographische Parameter [Isokratische Anlagen rnit ELCD und Enzymreaktor] Die Originalapplikation wurde auf folgender Anlage erstellt : HPLC-System: System Gold M 116 (Beckman); Degasser 3512 (ERC); Dosierventil 7125 (Rheodyne mit 10 pL-Probenschleife; Auswerteeinheit System Gold (Beckman) bzw. Integrator C-R 6A (Shimadzu); Edelstahlsaule (125 x 4 mm i. D.), Aluspher 60, RP-select B Saule: (Merck) rnit Vorsaule (20 X 4,6 mm i.D.) Spherisorb S 5 PC 18 (CS-Chromatographie); 0,Ol-0,05 M Carbonat-Puffer, pH = 9 Eluent: 0,45 mumin FluBrate: ELCD EP 30 (Biometra) rnit Platin-MeBzelle; ArbeitspoDetektor: tentialO,4 V,Range 50 nA; Enzymreaktor : Stahlkartusche (40 X 2,s mm i. D.); Fullung s. 2.2.3 Ergebnisse und Diskussion Abb. 7-18 zeigt das Chromatogramm einer Bierprobe rnit und ohne Enzymreaktor. Es ist zu erkennen, daB bei der Analyse ohne Enzymreaktor an der Stelle des Sulfits kein Peak auftritt, also keine elektrochemisch aktive Storsubstanz vorliegt . Die Methode wurde ebenfalls bei Traubensaften und Weinen eingesetzt. Bei einigen als ungeschwefelt deklarierten Saften wurden hierbei noch Restmengen von Sulfit im Bereich von 1 ppm nachgewiesen.

Kalibrierung Die Aufnahme der Eichkurve (Abb. 7-19) erfolgte durch Verdunnungsreihen entsprechender Liisungen von Na2S03. Der lineare Bereich erstreckt sich von 0,08-4 mg/L SO2. Da sich die Elektrodenempfindlichkeit und die Aktivitat des Enzyms im Laufe der Zeit verandern, ist die Eichung regelmaBig zu uberpriifen (vgl. Kap. Elektrochemische Detektoren).

158

1:

7 HPLC-Gpplikationen aus dem Lebensmittelbereich

W

a)

-

0

5

10rnin

Abb. 7-18 HPLC-Chromatogramme einer Sulfit-Bestimmung in Bier (Verdunnung 1:50); a) mit Enzymreaktor; b) ohne Enzymreaktor.

"0

1

2

3

4

ms/l

so2

Abb. 7-19: Kalibrierungskurve zur Sulfitbestimmung.

Validierung Die Nachweisgrenze liegt bei funffachem Grundrauschen bei 0,02 mg/L, der Variationskoeffizient bei 2,7 % . Die Wiederfindung bei Bierproben liegt bei Sulfitzusatzen von 2-8 mg/L zwischen 95 und 103% . Zur Uberpriifung wurde ein Methodenvergleich mit einem destillativen Verfahren [7-311 bei Weinproben durchgefuhrt. Es wurde bewuBt ein Lebensmittel mit einem relativ hohen Sulfitgehalt ausgewahlt, da die destillativen Methoden im unteren Bereich keine zuverlassigen Ergebnisse liefern. Es wurden 11Weine mit S02-Gehalten zwischen 34 und 198 m g L untersucht. Die

7.9 Bestimmung von SiiBstoffen

159

Ubereinstimmung kann mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,984 als gut bezeichnet werden.

Alternativmethoden Als DIN-Vorschrift werden demnachst eine Destillationsmethode und eine enzymatische Bestimmung aufgenommen werden. In der amtlichen Sammlung nach 0 35 ist die enzymatische Bestimmung von Beutler et al. enthalten [7-321. Als offizielle AOAC-Methode ist die Destillation nach Monier-Williams [7331 ublich. Im unteren ppm-Bereich sind diese Verfahren aber sehr storungsanfallig und ungenau. Weiterhin wurden Sulfitoxidase-Enzymelektrodenentwickelt, welche entweder den verbrauchten Sauerstoff, z. B. [7-341 oder das gebildete Wasserstoffperoxid [7-351 amperometrisch bestimmen. Chromatographisch 1aBt sich auch die HPLC mit Ionenaustauschersaulen und elektrochemischer Detektion einsetzen, z. B. [7-361.

7.9 Bestimmung von SiiBstoffen Problemstellung Wie bei den Konservierungsstoffen ist auch der Einsatz von Art und Menge an SuBstoffen genau geregelt und mu13 routinemaBig uberpriifbar sein. Die folgende Vorschrift beinhaltet die simultane Analyse von Aspartam, Acesulfam und Saccharin in Lebensmitteln. Formeln der SiiBstoffe

Saccharin

Acesulfam K

Aspartam

Abb. 7-20: Strukturformeln von Aspartam, Acesulfam und Saccharin.

PMzip der Bestimmung Die homogenisierten Proben werden in methanolischer Lasung aufgeschliimmt und einer Klarung nach Carrez unterworfen. Nach Filtration und Zusatz eines inneren Standards (3-Hydroxybenzoesaure) werden sie mittels isokratischer HPLC bei 30 "C analysiert.

160

7 HPLC-Applikationen aus dern Lebensmittelbereich

Chemikalien und Hilfsmittel - Methanol, p. A. und HPLC grade [F, T; R 11-23/25; S 2-7-1624] - Wasser, HPLC grade - Natriumacetat, p. A. - Natriumazid, p.A. [T; R 28-32; S 281 - Tetrabutylammoniumbromid (TBA), p. A. Losungen Cjeweils in 20 %igem Methanol): 100 mg 3-Hydroxybenzoes~ure/lOOmL Interner Standard: Stammlosung SiiBstoffe: je 25 mg Aspartam, Acesulfam und Saccharin in 250 mL MeBkolben einwiegen; nach dem Auffullen eine Spatelspitze Natriumazid zur Konservierung hinzufugen; Kalibrierlosung 1: 4 mL Stammlosung SiiBstoffe und 2 mL ISTD zu 100 mL auffullen (entspricht bei der vorgeschlagenen Aufarbeitung 20 mg SiiBstoff/L (kg) und 100 mg ISTDL (kg)); 50 mL Stammlosung SuBstoffe und 2 mL ISTD zu Kalibrierlosung 2: 100 mL auffiillen (entspricht bei der vorgeschlagenen Aufarbeitung 250 mg SuBstoffn, (kg) und 100 mg ISTD/L (kg)); Losungen I und I1 nach Carrez (waBrig); Gerate und Hilfsmittel: Faltenfilter - Glastrichter, Glasspritze mit Luerlock-AnschluB - Membranfilter (0,2 pm Porendurchmesser) -

Arbeitsvorschrift a) Aufarbeitung 20 g (mL) homogenisiertes Probenmaterial in 100 mL MeBkolben einwiegen, 2 mL ISTD dazupipettieren und rnit ca. 50 mL 20%igem Methanol versetZen. Mit je 15 mL der Liisungen I und I1 nach Carrez klaren, schutteln und rnit 20 %igem Methanol zur Marke auffullen. Mit Faltenfilter und anschlieBend rnit Glasspritze und Membranfilter blank filtrieren. Das Filtrat zur HPLC einsetzen. b) Gerate und chromatographische Parameter [Thermostatisierbare isokratische Anlage rnit UV-Detektor] Die Originalapplikation wurde auf folgender Anlage erstellt: HPLC-System: Pumpe L-6200 rnit Auswerteeinheit D-6000 HPLC Manager (Mercwitachi);

7.9 Bestimmung von SiiSstoffen

Sgiule: Temperatur: Eluent: Fluorate: Detektor :

161

Edelstahlsaule (250 x 2 mm i. D., Macherey und Nagel) mit Nucleosil 120 RP-18, 5 pm; 30 "C MethanoVWasser (23/77, v/v) + 1 g Natriumacetat + 3,4 g TBA; 0,4 mumin L-4250 (Merck/Hitachi); UV 216 mm

Ergebnisse und Diskussion Abb. 7-21 zeigt Chromatogramme der Kalibrierlosung 2 und einer ZigeunersoBenprobe ohne deklarierte SiiBstoffe. Sie enthalt ca. 680 mgkg Saccharin. Die Analyse muS mit einer kleineren Einwaage wiederholt werden, die Gehalte miissen im Bereich der Kalibrierungskurve liegen.

Kalibrierung Die Identifizierung bzw. Zuordnung der Peaks erfolgt mit Hilfe der Kalibrierlosung. Die Berechnung der SiiSstoffgehalte kann automatisch durch einen entsprechend programmierten Integrator oder ein Datensystem erfolgen. Die Berechnungsformel entspricht derjenigen der vorstehenden Applikation uber Konservierungsstoffe (7.6).

I

10

1

20min

Abb. 7-Zl: a) HPLC-Chromatogrammder angegebenen Kalibrierbsung2; b) HPLC-Chromatogramm einer Zigeunersoaenprobe.

162

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

Validierung Die Wiederfindungsraten liegen bei 100 % mit Variationskoeffizienten von 3%. Alternativmethoden Weitere Beispiele sind in [7-371 gegeben. Eine entsprechende Methode ist ebenfalls in der amtlichen Methodensammlung nach 8 35 LMBG beschrieben .

7.10 Nachweis von Mais und Hirse als Malzersatzstoff in Bier4 Problemstellung Das in Deutschland jahrhundertelang geltende Reinheitsgebot ist mittlerweile zwar nicht mehr gultig, die deutschen Brauer haben sich aber verpflichtet, fur den Inlandsmarkt weiterhin nur nach dem Reinheitsgebot gebrautes Bier zu produzieren. Hintergrund ist die Werbewirksamkeit dieser Aussage. Nachweismoglichkeiten von Fremdfruchtzusatzen sind deshalb notwendig, um irrefuhrende Werbungen mit dieser Qualitatsbezeichnung, die zu Wettbewerbsvorteilen fuhren, aufdecken zu konnen. Als Mais- und SorghumhirseIndikator kann das garungsstabile p-Cumaroylglycerol dienen, welches im Gerstenmalz nicht vorkommt [7-38 bis 7-40]. Weiterhin kann uber diese Verbindung ebenfalls eine Maiszumischung zu Curcuma nachgewiesen werden [7-41].1st der verwendete Mais als Referenzmaterial zuganglich, so kann auch eine quantitative Aussage uber den Maisanteil in Futtermittelmischungen getroffen werden. Dies ist fur die Uberprufung von Subventionszahlungen bei Futtermittelimporten von Interesse, die sich nach der Hohe des Maisanteiles richten. Naturlich kann Mais ebenfalls in anderen Lebensmitteln, wie z. B. Snackprodukten, nachgewiesen werden, sofern hier ein Bedarf besteht [7-411.

vgl.: Patzold R., Fenz R., Krause M., Galensa R., Dtsch. Lebensm. Rdrch. 1992,88, 390-391

7.10 Nachweis von Mais und Hirse als Malzersatzstoff in Bier

163

Formel von p-Cumaroylglycerol

CHzOH

200

250

300

350

nm

Abb. 7-22: 1-0-trans-p-Cumaroylglycerol; Strukturformel und DAD-UV-Spektrum.

Prinzip der Bestimmung Es handelt sich um eine zweistufige Festphasenextraktion, wobei RP-18- und Ionenaustauscher-Kartuschen zum Einsatz kommen. Der erhaltene Extrakt wird mit Gradienten-HPLC an einer P-Cyclodextrin-Trennsauleanalysiert. Cyclodextrinsaulen sind nicht nur fur die Analyse von Enantiomeren von Interesse, sondern zeigen vielfaltige chromatographische Besonderheiten. In Abhangigkeit vom FlieBmittel kann man z. B. Trennungen erhalten, die nach einem Normalphasen- oder Umkehrphasen-Mechanismus verlaufen. Abb. 7-23 zeigt die Struktur von P-Cyclodextrin.

HO HO’

Abb. 7-23: Strukturformel von fl-Cyclodextrin.

164

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

Chemikalien und Hilfsmittel Wasser, HPLC grade - Methanol, p. A. und HPLC grade [F, T; R 11-23/25; S 2-7-16-241 - Essigsaure, p.A. [C; R 10-35; S 2-23-26] - n-Hexan, p.A. [F, Xn; R 11-20-48; S 9-16-24/25-29-51] - RP-18-Festphasenkartuschen, Bakerbond spe, 3 mL (Baker) - Ionenaustauscherkartuschen, Bakerbond spe, Quarternary Amine, 3 mL (Baker) - Ultraschallbad - Vergleichssubstanz 1-0-trans-p-Cumaroylglycerol: Diese Verbindung ist nicht kauflich erhaltlich. Sie kann relativ einfach nach [7-381 synthetisiert werden, gunstiger ist der Einsatz eines aufgearbeiteten Maisstandards nach [7-381, wo sie als Hauptkomponente leicht uber die Retentionszeit und das DAD-UV-Spektrum (Abb. 7-22) zu identifizieren ist. -

Arbeitsvorschrift a) Probenaufarbeitung Das zu untersuchende Bier im Ultraschallbad zur Vertreibung des C 0 2 bei Raumtemperatur ca. 10 min lang entgasen, 25 mL zur Festphasenextraktion einsetzen. b) Festphasenextraktion Zum Einsatz kommen RP-18- und N+-Kartuschen. RP-18-Kartuschen rnit zwei Saulenfullungen Methanol (ca. 6 mL) und anschlieaend mit zwei Saulenfiillungen H 2 0 konditionieren (vgl. Abschn. 6.2). N+-Kartuschen nacheinander rnit zwei Saulenfullungen n-Hexan, Methanol und H20 (je ca. 6 mL) konditionieren, ein Trockensaugen ist immer zu vermeiden. 25 mL entgastes Bier langsam (Tropfgeschwindigkeit ca. 8-10 Tropferdmin) durch die RP-18-Kartusche saugen. AnschlieBend rnit funf Saulenfullungen H20 (ca. 15 mL) waschen, um polare Stoffe, wie z. B. Kohlenhydrate, zu entfernen (Waschwasser verwerfen). AnschlieBend rnit 2 mL Methanol eluieren. Den Extrakt ca. 1:1 rnit Wasser verdunnen und auf die N+-Kartusche aufgeben. Hier werden so z. B. freie Phenolcarbonsauren entfernt bzw. ausgetauscht. Die durchgesaugte Flussigkeit auffangen (= Eluat), die Kartusche rnit 1 mL Wasser spulen, rnit dem Eluat vereinigen und auf 5 mL auffullen. Diese Losung fur die HPLC einsetzen, bei geringen Rohfruchtanteilen (ca. > 10 % ) kann vorher noch ein Konzentrierungsschritt erfolgen.

165

7.10 Nachweis von Mais und Hirse als Malzersatzstoff in Bier

c) Gerate und chromatographische Parameter [Gradientengerat mit UV-Detektor, vorzugsweise DAD] Die Originalapplikation wurde auf folgender Anlage erstellt: HPLC-System: Pumpe PU 4100 (Pye Unicam), es handelt sich um ein Gradientensystem, das die FlieDmittel niederdruckseitig dosiert, aber erst hochdruckseitig mischt. Die Gradientenansprechzeit entspricht einem hochdruckseitigen GeratetYP; Einspritzventil: 7125 (Rheodyne mit 20 pL Probensschleife); Edelstahlsaule (250 x 4,6 mm i.D.) mit P-Cyclodextrin Saule: (5 pm, Cyclobond I, Astec); Gradient aus A: Methanol/H20/Essigsaure (10/90/0,5; v/v) Eluent: und B: Methanol; Equilibrierung auf 90 % A und 10 % B, linear in 15 min auf 70 % B, direkt auf 0 % A und 100% B, 10 min 100% B, linear in 5 min zuriick auf 90 % A und 10 % B, 20 min equilibrieren; Ergebnisse und Diskussion Die Chromatogramme in der Abb. 7-24 zeigen ein Bier, das rnit Mais und ein Bier, welches ohne Maiszusatz gebraut wurde. Da p-Cumaroylglycerol kurioserweise gleichfalls als Sorghumhirseindikator dient [7-401, kann so eine Unterscheidung zwischen Hirse und Mais nicht getroffen werden, was bei der vorliegenden Problematik (Reinheitsgebots-

I

0

I

10

I

20 nin

1

I

0

10

I

20 min

Abb. 7-24: HPLC-Chromatogramme; a) Bier ohne Maiszusatz; b) Bier rnit Mais gebraut (70% Gerstenmalz, 30 % Mais); + = 1-0-trans-p-Cumaroylglycerol.

166

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

verifizierung) aber eigentlich ohne Bedeutung ist. Fur den Nachweis eines Reiszusatzes (nach Mais der haufigste Rohfruchtzusatz) wurde bisher noch keine phenolische Verbindung gefunden.

Kalibrierung und Validierung Bei dieser Applikation handelt es sich nur um einen qualitativen ,,entwederoder" Nachweis. Die Wiederfindungsrate fur Cumaroylglycerol liegt uber 90 YO rnit Variationskoeffizienten von 5 YO. In Maisgrits liegt der Ester in der GroBenordnung von 10 mg/kg vor [7-381.

Alternativmethoden Zu erwahnen sind die immunologischen Verfahren, wobei eine Methode bereits in die Sammlung nach $35 LMBG aufgenommen worden ist [7-421. Cumaroylglycerol kann ebenfalls rnit RP-18-Phasen analysiert werden [7-391, wobei aber eine aufwendigere Probenvorbereitung notwendig ist. Maisrohfruchtnachweise bis zu 1% lassen sich bei Einsatz der hier beschriebenen Extrakte rnit einer HPLC-Elektroden-Array-Detektor-Kopplung erbringen [7-431.

7.U Bestimmung von Kohlenhydraten durch Benzoylierung Problemstellung Die hier am Beispiel der Bestimmung von Kohlenhydraten beschriebene Vorsaulenderivatisierung ermoglicht die gleichzeitige Erfassung zahlreicher Verbindungen rnit einer Aufarbeitungsmethode und einem Analysensystem. Die Aufarbeitung ist weitgehend unabhangig von dem zu untersuchenden Probenmaterial. Es konnen flussige wie feste Stoffe fast beliebiger Art eingesetzt werden. Aufgrund der selektiven - aber nicht aufwendigen oder zeitraubenden - Derivatisierung lassen sich Spuren noch neben Hauptbestandteilen nachweisen. Fur die benzoylierten Probenextrakte wurden zur analytischen Absicherung Normal- und Umkehrphasen-HPLC-Systeme rnit isokratischer oder auch rnit Gradientenarbeitsweise entwickelt. Durch die Reaktion erhalten alle Verbindungen ein einheitliches, intensives UV-Maximum bei 230 nm. Fur einige Stoffe kann zusatzlich die Kapillargaschromatographie eingesetzt werden, so daB in fast allen Fallen eindeutige Ergebnisse erhalten werden konnen.

7.11 Bestimmung von Kohlenhydraten durch Benzoylierung

167

Derivatisierungsreaktion CZH50\ //0

o* ,c1

+8

Pyridin/Ultraschall 60 "C/ 1 h

C2H50H

-HC1

-$

Abb. 7-25: Reaktion von Ethanol mit Benzoylchlorid zu Ethylbenzoat.

Prinzip der Bestimmung Das homogenisierte Probenmaterial wird bei gleichzeitiger Extraktion in Pyridin mit Benzoylchlorid im Ultraschallbad derivatisiert. Nach Wasserfallung der gebildeten Benzoate schliel3t sich eine Reinigung des Extraktes uber eine RP-18-Festphasenkartuschean. Die Eluate konnen direkt - oder nach VerdunnungKonzentrierung - fur Normal- und Umkehrphasen-Systeme eingesetzt werden. Chemikalien und Hilfsmittel - Wasser, HPLC grade - Isooctan, HPLC grade und p. A. Ware [F; R 11; S 9-16-23-29-331 - Diethylether, p.A. Ware [F; R 12-19;S 9-16-29-331 - Acetonitril, HPLC grade, p. A. Ware [F, T; R 11-23/25; S 2-7-16-241 - Benzoylchlorid [C;R 34;S 261 - Pyridin, [F, Xn; R 11-20/21/22;S 26-28] - RP-18-Festphasenkartuschen,z. B. RP-181 g Polar Plus (Baker) - Festphasenextraktionsanlage,z. B. Baker - Glasspitzkolben, 50 mL - Ultraschallbad, heizbar auf 60 "C, z. B. RK 510H (Bandelin) - Dispensette - Mikrowaage - Standards: Glucosepentaacetat, z. B. Aldrich Herstellung eigener Standards durch Benzoylierung nach der folgenden Arbeitsvorschrift (Einwaage 10 mg) Arbeitsvorschrift Alle Reagenzien und Bedingungen sind auf eine maximale Einwaage von 50 mg wasserfreier Substanz oder 30 pL flussiger Probe optimiert worden. Das stellt hohe Anforderungen an die Homogenitat und Einwaagegenauigkeit .

168

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

a) Aufarbeitung und Derivatisierung Ca. 30 mg homogenisiertes Lebensmittel genau in einen 50 mL Spitzkolben einwiegen. Nach Zugabe von 4 mL Pyridin (Dispensette) und 0,5 mL Benzoylchlorid (Eppendorfpipette) (nicht schutteln) sofort fur 60 min in ein Ultraschallbad (60 "C) stellen (jeweils nach 15 min umschwenken). Nach dem Herausnehmen sofort 0,5 mL Methanol hinzugeben und schiitteln (Uberschiissiges Benzoylchlorid wird zu Methylbenzoat umgesetzt; Vorsicht, heftige Reaktion moglich). 5 min - oder beliebig langer - reagieren lassen. Mit 50 mL Wasser fallen und ca. 30 min - oder beliebig langer - stehen lassen. Die Losung langsam durch eine RP-18-Kartusche saugen, anschlieBend 4 X rnit 5 mL Wasser pyrindinfrei waschen (jeweils den Derivatisierungskolben ausspulen) und trocken saugen (die RP-18-Kartusche wirkt als ,,Fettfilter"). In einen 50 mL MeBkolben mit 3 X 10 mL und einmal 20 mL Isooctan/Diethylether/ Acetonitril(150/80/20; v/v; p. A. Qualitat) bis zur Marke eluieren (jeweils den Derivatisierungskolben ausspulen, da die meisten Benzoate als oliger Film an der Kolbenwandung haften). Den Extrakt direkt oder nach VerdiinnungKonzentrierung fur das gewahlte Analysensystem verwenden. b) Gerate und chromatographische Parameter [HPLC-Anlage zur isokratischen und/oder zur Gradientenelution rnit UVDetektor] Die Originalapplikation wurde auf folgender Anlage erstellt: HPLC-System: Pumpe LCXPD 100 rnit Niederdruckgradientenmischer (Pye Unicam); Integrator: HP 3390 A; Einspritzventil: 7125 rnit 10 pL Probenschleife (Rheodyne); Glassaule (300 X 3 mm i.D.) rnit LiChrosorb Si 60, 5 pm Saule: (Merck); Isooctan/Diethylether/Acetonitril(150/90/30; v/v) Eluent: Fluorate: 1 mL/min Detektor: LC 3 (Pye Unicam); UV230 nm Ergebnisse und Diskussion Abb. 7-26 zeigt das HPLC-Chromatogramm von 30 mg Sojamehl, welches nach der beschriebenen Aufarbeitungsvorschrift direkt benzoyliert und an einer Kieselgelsaule isokratisch analysiert wurde. Es demonstriert die durch die Derivatisierung erzeugte hohe Nachweisempfindlichkeit mittels UV-Detektion (30 mg/50 mL Eluat). Es sind deshalb aus demselben Extrakt, der sich bei Bedarf sehr leicht konzentrieren la& gleichzeitig Bestimmungen von Minorkomponenten moglich. Abb. 7-27 zeigt dies am Beispiel der Erfassung von 20 ppm Sorbit in einem Fruchtsaft. Diese Untersuchungen waren Teil eines Ringversuches, der sich rnit der Bestim-

7.11 Bestimmung von Kohlenhydraten durch Benzoylierung

I=

0

I

10

I

20

min

169

Abb. 7-26: HPLC-Chromatogrammvon benzoyliertem Sojamehl; Kieselgelsaule.

mung von Sorbit fur Gehalte unter 200 ppm durch gebriluchliche enzymatische Methoden befaate. Es zeigte sich, daB durch die Enzymatik in diesen Bereichen keine zuverlassigen Aussagen mehr getroffen werden konnen. Zur Auftrennung des komplexen Extraktes wurde eine chirale Phase mit Gradientenelution eingesetzt (Parameter s. Abb. 7-27) [7-441. Pirkle-Phasen eignen sich hervorragend fiir die Analyse von Benzoaten und ermoglichen Gradientenbetriebsweise mit normalen Equilibrierungszeiten. Kalibrierung Die Aufnahme der Eichkurven erfolgt durch Verdunnungsreihen entsprechender Liisungen von kauflichem Glucosepentaacetat oder selbst derivatisierten Verbindungen. Eine interessante Moglichkeit ist die exakte Berechnung der quantitativen UV-Parameter fur viele Verbindungen mittels nur eines Standards (z. B. Glucosepentaacetat) [7-451. Validierung Die Nachweisgrenzen liegen je nach Verbindung im Bereich von 1-10 ng, bei Wiederfindungsraten von uber 95 % mit geringen Variationskoeffizienten (fiir Raffinose in Sojamehl z. B. bei 3 %). Ausnahmen sind reduzierende Ketosen,

170

I

0

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

10

20

I

30

I

40

50 nin

Abb. 7-mHPLC-Chromatogramm eines benzoylierten Fruchtsaftes mit 20 ppm Sorbit; Chromatographische Parameter: Edelstahlsaule (250 x 4,6 mm i. D.) mit 5 pm (R)-N-3,5-DNBPG (Baker); 20 pL Dosierschleife (Rheodyne); 0,8 mumin; UV235 nm; FlieBmittel (HPLC grade): v/v); B: entspr. (40/12J48; v/v); GradienA: Isooctan/Acetonitril/tert.Butylmethylether (78/u20; tenprogramm: von 100% A in 30 min linear auf 100% B, dort 10 min belassen, in 5 rnin auf 100 % A zuriick und 20 rnin equilibrieren.

wie die Fructose, bei denen nur ca. 80 % Wiederfindung bei Entstehung einiger Nebenprodukte erzielt werden konnen. Bei reduzierenden Zuckern ist immer das Auftreten von Anomeren zu beachten, die je nach gewahltem System getrennt werden konnen (s. auch [7-45 bis 7-47]). Probleme kann es mit der Reproduzierbarkeit der Festphasenkartuschen geben (vgl. Abschn. 4.5). Zur Zeit werden von uns nur die unter Chemikalien angegebenen eingesetzt.

Alternativmethoden Zahlreiche Variationsmoglichkeiten hinsichtlich der Erfassung unterschiedlichster Verbindungen, hinsichtlich von Aufarbeitungsvarianten, FlieBmittelsystemen etc. werden in [7-45 bis 7-47] beschrieben. Eine neuere Arbeit zeigt Moglichkeiten fur eine Benzoylierung ohne Pyridin auf [7-481.

7.12 HPLC-Untersuchungeniiber Chlorogensaurelactonein Rostkaffee

171

7.l2 HPLC-Untersuchungenuber Chlorogensaurelactone in Rostkaffee5 Das folgende Applikationsbeispiel stammt aus der Forschung und weicht daher im Aufbau etwas von den vorangegangenen Beispielen ab. Es sol1 als Beispiel fur eine Methodenentwicklung mit dem Ziel einer Strukturaufklarung/Strukturzuordnung dienen. Problemstellung Chlorogensauren (QGA) sind weit verbreitete phenolische Sauren mit antioxidativer Wirkung [7-49]; in Kaffee kommen sie in sehr groBer Menge vor (7% im Rohkaffee, 2 % in Rostkaffee).

HOOC

51

OH

Abb. 7-28: Formel von 5-Chlorogensaure.

Bei der Analyse von Chlorogensauren in Kaffee (routinemaBig mit RPHPLC) finden sich neben den Peaks der Chlorogensauren noch einige Minorpeaks, die sich mit einem DAD als chlorogensaureiihnliche Verbindungen zuordnen lassen. Es ist bekannt, daS neben den CGA auch Feruloyl- und Cumaroylchinasauren vorhanden sind [7-49 bis 7-52]. Wahrend die Bestimmung der mengenmuig dominanten Chlorogensauren routinemaBig durchgefuhrt wird, ist iiber die Minorkomponenten relativ wenig bekannt . Prinzip der Bestimmung Die Komponenten werden aus Kaffee durch eine Extraktion mit Methanol bei 80 "C im geschlossenen System isoliert. Aufgrund der Selektivitat der Detektion in dieser Matrix reicht die Vorbereitung fiir quantitative Bestimmungen aus. Zur Strukturaufklarung wurden die interessierenden Verbindungen mittels Polyamid aus dem Kaffeeaufgua angereichert und mit praparativer HPLC gereinigt. Die Fraktionen wurden immer mittels HPLC-DAD und

' vgl. Bennat, C., Engelhardt, U. H., Kiehne, A., Wirries, E-M., Maier, H.-G., Z.Lebensm. Unters. Forsch. 1994,199, S. 17-21.

172

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

TSP-LC-MS auf Reinheit uberpruft und zur endgultigen Strukturaufklarung rnit NMR vorbereitet. Chemikalien und Hilfsmittel Methanol, destilliert [F, T; R 11-23/25; S 2-7-16-241 - Dichlormethan [Xn; R 40; S 23-24/25-36/37] oder vergleichbares Liisungsmittel - Soxhlet-Ex trak tionsvorrich tung - Extraktionshulsen - Polyamid, eisenfrei - Glassaule (14 cm x 2,5 cm i.D.) - Glaswolle - Seesand, gegluht - Membranfilter (0,45 pm) -

Arbeitsvorschrift Proben: Rohkaffee wurde in einem Laborroster behandelt, so daD eine mittlere Roststufe erhalten wurde. AuSerdem wurden Handelsmischungen untersucht. a) Aufarbeitung Extraktion und Entcoffeinierung: 5 g Kaffee rnit 200 mL 70 % Methanol bei 75-80 "C 90 min im Soxhlet extrahieren, am Rotationsverdampfer unter Vakuum einengen (80 mL) und auf 100 mL auffullen. Fur praparative Zwecke wurde eine Abtrennung mittels Polyamid-Saulenchromatographievorgenommen (vgl. Abschn. 7.1) und die Lactone mit Methanol eluiert (die Chlorogensauren werden rnit essigsaurem Methanol eluiert). 50 mL Kaffee-Extrakt werden auf die konditionierte PA-Saule (22 X 3,O cm i. D.; Fullhohe 16 cm) gegeben, mit 750 mL Wasser gewaschen und die Lactone mit 500 mL Methanol eluiert. AnschlieDend wird auf 50 mL eingeengt (Rotationsverdampfer, 40 "C Badtemperatur). Die Extrakte fur HPLCDAD und HPLC-TSP-MS wurden entcoffeiniert (2 X 25 mL CH2C12). Quantitative Bestimmung: 0,25-0,5 g mit 100 mL 70 % Methanol bei 80 "C 1 h unter Ruckflu8 extrahieren und nach Einengen auf 50 mL auffullen. b) Geriite und chromatograpbische Parameter [Isokratische Anlage rnit Dioden-Array-Detektor] Die Originalapplikation wurde rnit folgenden Geraten durchgefuhrt; die kursiv gedruckten Angaben in Klammern beziehen sich auf die praparative HPLC.

7.12 HPLC-Untersuchungen uber Chlorogensiiurelactonein Rostkaffee

173

Pumpe M 116 (Beckman Inst .), Einspritzventil: Altex 210A (Beckman) mit 50-pL (2000 pL.) Schleife, Saule: 250 mm X 4,6 mm i. D. (250 x 8 mm i. D. ) mit ODSHypersil 5 pm (Shandon); PYE UNICAM PU 4021 Detektor mit Datensystem 2 % Essigsaure (aq.)/Methanol(75/25, v/v) Eluent: 1mumin (3,3 rnllmin); Druck 15 mPa (13,5 MPa) FluBrate: Um die di-CQA von der Saule zu entfernen, sollte Wichtig: nach jedem Lauf mit Methanol gespult und anschlieBend aquilibriert werden. HPLC-MS: Anlage wie beschrieben mit folgenden Modifikationen: 1. Eluenten werden uber einen ERC-3512 Degasser gefiihrt 2. Detektor mit druckfester Zelle (Lichrograph L-4OOO/ 4200, Merck Hitachi) Wie oben, bei der Pufferionisierung wird uber eine Eluenten: zweite Pumpe 0,l M Ammoniurnacetatlosung in 10% Methanol zugemischt, Hulkate 0,5 mumin. TSP-1 Interface ( F i i g a n IWXT, Bremen); EinstellunInterface: gen: Vaporizer 80°C (Discharge) bzw. 97°C (Puffer); Quellenblock 280"C; Repeller 50 V. 850 V entsprechend 50 pA. Discharge mode: Massenspektrometer: SSQ 710 mit Thermospray-Ionenquelle und DEC-Station 5000133 (Digital); ICIS-2-software (Finnigan MAT, Bremen). m/z 150-450 bei 2 s pro Scan. Scanbereich: HPLC:

Ergebnisse und Diskussion Um die in Abb. 7-29 gezeigten Chromatogrammezu erhalten, muaten StandardHPLC-Systeme aus der Literatur [7-53,7-541 angepdt werden. Im Ausschnitt des Chromatogramms(Abb. 7-29) konnten aufgrund der Spektren Peak 4 und 9 als p-CumaMurederivate, Peak 7 und 10 als Ferulasaurederivate identikiert werden. Drei Peaks (5,6 und 8) wurden als Kaffeesaurederivate identifiziert. Diese waren besonders interessant, da sie in Rohkaffee nicht, in Rostkaffee aber fast immer auftraten. Es ist bekannt, d& Chlorogensauren wiihrend des Rostens abgebaut werden; als Zerfallsprodukte wurden u.a. Chinaslure und einige Lactone identifiziert. Weiterhin wurden insgesamt vier Chlorogensaurelactone identifiziert (durch GCMS der TMS-Derivate), allerdings ohne d& weitere Informationen uber deren Struktur gegeben wurden. Auch das Lacton einer Feruloylchinasaure wurde beschrieben [7-551. Ziel der hier vorgestellten Studie war, festzustellen, ob Chlorogensaurelactone im Kaffee vorhanden sind und wenn ja,

174

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

Abb. 7-29: HPLC-Trennungvon Chlorogenshren aus Kaffee. A) Rostkaffee, B) Rohkaffee.

diese strukturell aufzuklaren. Dazu wurden TSP-LC-MS-Spektren des interessierenden Bereichs aufgenommen. Abb. 7-30 zeigt das Massenspektrum von Peak 6 und zum Vergleich das der 5-CQA mit Discharge Ionisierung. Der Unterschied der Quasi-Molekulionen betragt 18 Masseneinheiten, was fur die Eliminierung von Wasser typisch ist. Bei den Fragmenten ist das Fehlen von m/z 193 (Quasimolekulion der Chinasaure) und die Anwesenheit von m/e 175 (Quasimolekulion von Chinasaurelacton) in Abb. 7-30 interessant. Die Untersuchungen zeigten, daf3 die Massenspektren von Peak 6 und 8 identisch waren. Beide konnten somit als Caffeoylchinide (Abb. 7-31) zugeordnet werden, was durch Experimente mit Pufferionisierung bestatigt wurde (hierbei traten zusatzlich Ammoniumaddukte der Komponenten bzw. der Bruchstucke auf). Weitere Moglichkeiten bestanden unter den gegebenen apparativen Bedingungen nicht. Um eine endgultige Strukturaufklarung vornehmen zu konnen, wurden die Komponenten isoliert. Dazu wurde der Aufguf3 uber Polyamid gereinigt und anschlieBend mittels praparativer HPLC fraktioniert. Die Reinheit der jeweiligen Fraktionen wurde mit analytischer HPLC-DAD und HPLC-MS uberpruft . Vor der abschlieoenden Gefriertrocknung wurde das Methanol am Rotationsverdampfer entfernt. Wahrend dieser Konzentrierung tritt offenbar eine Isomerisierung ein, d. h. es war nicht moglich, nur eines der beiden Lactone zu erhalten; unter den Versuchsbedingungen wurden Peak 6 und Peak 8 immer im Verhaltnis 60:40 erhalten. Durch FTIRund insbesondere NMR-Spektroskopie gelang eine eindeutige Identifizierung als 3- und 4-y-Chlorogensaurelacton.

7.12 HPLC-Untersuchungen uber Chlorogensaurelactonein Rostkaffee

175

336.9

175.0 163.0 181.0

157*1 137.0

182.1 188.9 207.0 231.0

I.,

.

I

.

I

_I .

272.8

284.9

318.8

I

t i

c 354.8

181.0

320.7

163.0 137.0

213.1 224.9

252.8 272.9

298.9

336.8

i

Abb. 7-30: Thermospray Massenspektren von a) 3-Caffeoylchinid und b) 5-Chlorogensaure (Discharge Ionisierung).

'

OH

Abb. 7-31: Struktur von CCaffeoyl-y-Chinid.

176

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

Kalibrierung Die Kalibrierung erfolgt uber n-Chlorogensaure als externen Standard bei entprechender rechnerischer Korrektur. Validierung Nachweisgrenze: etwa 50 mg/L (Sfaches Grundrauschen).

Literatur [7-11 Harborne, J. B., Flavonoids - advances in research, London: Chapman & Hall, 1988. [7-21 Harborne, J. B., Methods in Plant Biochemistry. Vol. 1: Plant phenolics, London: Academic Press, 1989. [7-31 Harborne, J. B., Mabry, T. J., Mabry, H., The flavonoids, London: Chapman & Hall, 1975. [7-41 Finger, A., Flavonol- und Ffavonglykosidedes Tees; Dissertation, Technische Universitat Braunschweig, 1991. [7-51 Engelhardt, U. H., Finger, A., Herzig, B., Kuhr, S., Deutsche Lebensrnittef-Rundschau 1992,88, 69-73. [7-61 Engelhardt, U. H., Kiehne, A., Wagner-Redeker, W., GIT 1994,8, 831-836. [7-71 Oshima, Y., Nakabayashi, T., J. Agr. Chem. Jup. 1953,26, 754-756. [7-81 Bokuchava, M. A., Ulyanova, M. S., Fenol’nye Soedin. Ikh Biol. funkts., Muter Vses. Simp. 1966, I , 224-228. [7-91 Pietta, P., Mauri, P., Bruno, A., Zini, L., J. Chromatogr. 1993,638, 357-361. [7-101 Pietta, P., Bruno, A., Mauri, P., Rava, A., J. Chromatogr. 1992,593, 165-170. [7-111 Pietta, P., Mauri, P. L., Rava, A., Sabbatini, G., J. Chromatogr. 1991,549, 367-373. [7-121 Conney, A. H., Wang, Z. Y., Ho, C. T., Yang, C. S., Huang, M. T.,in: Phenolic Compounds in Food and their effects on Health 11, ACS SymposiumSeries 507: Huang, M. T., Ho, C. T., Lee, C. Y. (Hrsg.) Washington D.C.: American Chemical Society, 1992, 284-291. [7-131 Laskin, J. D., Heck, D. E., Laskin, D. L., Mitchell, J. M., Huang, M. T., Wang, Z. Y., Yang, C. S., Ho, C. T., Conney, A. H., in: Phenolic Compounds in Food and their effects on Health 11, ACS Symposium Series 507: Hunag, M.T., Ho, C. T., Lee, C. Y. (Hrsg.) Washington D.C.: American Chemical Society, 1992,308-314. [7-141 Fujiki, H., Okuda,T., Drugs ofthe Future, 1992, 17, 462-464. [7-151 Amtsblatt (EG) Nr. L 224 vom 18. 8. 1990, S. 1. [7-161 Amtsblatt (EG) Nr. L 156 vom 23. 6. 1994. [7-171 Malisch, R., Z. Lebensm. Unters. Forsch. 1986,182, 385-399. [7-181 Malisch, R . , Z. Lebensm. Unters. Forsch. 1986,183, 253-266. [7-191 Malisch, R., Z. Lebensm. Unters. Forsch. 1987,184, 467-477. [7-201 Malisch, R., Bourgeois, B., Lippold, R., Dtsch. Lebensm. Rundschau 1992,88, 295-216. [7-211 Farrington, W. H. H.,Tarbin, J., Bygrave, J., Shearer, G., Food Add. Contaminants 1991, 8 ( I ) , 55-64. [7-221 Luckas, B., J. Chrom. 1992,624, 439-456. [7-231 Lee, J . S., Yanagi, T., Kemna, R., Yasumoto, T., Agric. Biol. Chem. 1987,51, 877-881. [7-241 Hummert, C., Luckas, B., Kirschbaum, J., Proceedings ofthe 6th international conference on toxic marine phytoplankton, 18.-22. Oct. 1993, Nantes.

Literatur

177

[7-251 Luckas, B., Hummert, C., Thielert, G., Kirschbaum, J., Boenke, A., BCR Information Chemical Analyses, Bruxelles: Commission of the European Communities, 1994. [7-261 Greiner, G., Wallrauch, S . , Fliissiges Obst 1984,12, 626-628. [7-271 Siewek, F., Galensa, R., Ara, V., Industr. Obst- und Gemiiseverwert. 1985, 70, 11. [7-281 Drawert, F., Pivernetz, H., Leupold, G., Ziegler, A., Chem. Mikrobiol. Technol. Lebensm. 1980,6, 131. [7-291 LMBG, Zusatzstoffzulassungsverordnung: 8 4 Anlage 4, Liste B. [7-301 Pabel, B., Dissertation TU Braunschweig 1993. [7-311 Rebelein, H., Das Weinblatt 1970,39, 658. [7-321 Beutler, H. O., Dtsch. Lebensm. Rundschau 1983, 79, 323-330. [7-331 Hillery, B. R., Elkins, E. R., Warner, C. R., Daniels, D., Fazio, T., J. Assoc. Ofl.Anal. Chem. 1989, 72,470-475. [7-341 Fassnidge, D., Engel, E. V.,ASBC Journal 1989,48, 122-124. [7-351 Nabrahni, N. A., Vaid, R. R., Anal. Let. 1991,24, 55-565. [7-361 Kim, H. J., Park, G. Y.,Kim, Y. K., Food Technology 1987, 73, 7-79. [7-371 GroBpietsch, H., Hackenberg, H., 2.Lebensm. Unters. Forsch. 1980,171, 41. [7-381 Fenz, R.,Emst, L., Galensa, R., 2.Lebensm. Unters. Forsch. 1992,194, 252-258. [7-391 Fenz, R., Galensa, R., Dtsch. Lebensm. Rundschau. 1990,86, 107-111. [7-401 Patzold, R., Fenz, R., Krause, M., Galensa, R., Dtsch. Lebensm. Rundschau. 1992, 88, 390-391. [7-411 Fenz, R., Siewek, E, Galensa, R., Gordian 1991,5, 80-82. [7-421 Amtl. Sammlung von Unters.-verf. nach 8 35 LMBG, L 36.001, 1982. [7-431 Bernwieser, I., Patzold, R., Galensa, R., Sontag, G., 2.Lebensm. Unters. Forsch. 1994, 198, 40-43. [7-441 Meyer, U., WissenschaftlicheAbschluDarbeit zum 1. Staatsexamen fur Lebensmittelchemiker, TU Braunschweig 1991. [7-451 Galensa, R., 2.Lebensm. Unters. Forsch. 1983,176, 417-420. [7-46] Galensa, R., 2.Lebensm. Unters. Forsch. 1984,178, 199-202. [7-47] Galensa, R., 2.Lebensm. Unters. Forsch. 1984,178, 475-478. [7-48] Oehlke, J., Brudel, M.,Blasig, I. E., J. Chromatogr. 1994, 655, 105-111. [7-491 Herrmann, K., Gordian 1993, 93/6, 92-96. [7-SO] Clifford, M. N., Kellard, B., Birch, G. G., Food Chem. 1989,33, 115-123. [7-511 van der Stegen, G. H. D., van Duijn, J., ASIC Colfq.Sci. lnt. Cafe. 1980, 9, 107-112. [7-521 Morishita, H., Iwahashi, K., Kido, R., Phytochemistry 1986,25, 2679-2680. [7-531 Clifford, M. N., Jarvis, T., Food Chem. 1988,29, 291-298. [7-541 Clifford, M. N., Ramirez-Martinez, J. R., Food Chem. 1992,40, 35-42. [7-551 Wynne, K. N., Familari, M., Boublik, J. H., Drummer, 0. H., Rae, D., Funder, J. W., Blin. Exp. Pharmacol. Physiol. 1987,14, 785-790.

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8 Zusammenstellung einiger amtlicher Methoden Einige national oder international relevante Methodensammlungen enthalten HPLC-Methoden, die im folgenden charakterisiert sind. Ausgew< wurden die amtliche Methodensammlung nach 0 35 LMBG, das Schweizerische Lebensmittelbuch und die AOAC-Methoden (Bezug auf 15. Auflage). Diese Sammlungen werden laufend erganzt und enveitert. Viele der derzeit aufgefiihrten Methoden stellen nicht unbedingt den ,,state of the art" der HPLCAnalytik dar, weil sie notgedrungen bereits alteren Datums sind. Weiterhin werden von den Normungsinstituten (DIN, BSI, ISO) auch HPLC-Methoden bearbeitet und als Normen veroffentlicht.

8.1 Amtliche Methodensammlung nach 0 35 LMBG Die amtliche Methodensammlung nach 0 35 LMBG enthiilt Methoden, die in Ringversuchen uberpruft und fur geeignet befunden wurden. Einige dieser Methoden sind Ubernahmen von DIN bzw. I S 0 Methoden. Neuerdings werden auch vermehrt HPLC-Bestimmungen in diese Sammlung aufgenommen. In der amtlichen Methodensammlung nach 0 35 LMBG finden sich derzeit folgende HPLC-Bestimmungsmethoden (bei einigen ist das Prinzip der Bestimmung mit angegeben): 1. Acesulfam K in Lebensmitteln (00.00-28), Joghurteneugnissen (02.022), Fruchtsaftgetriinken (32.00-1) und Marzipan (43.16-2) 2. Biogene Amine in Fischen (10.00-5), Fischemeugnissen (11.00-4), Krusten-, Schalen- und Weichtieren (12.00-4) 3. Aspartam in coffeinhaltigen Brausen (32.13-1) und SuBstoff-Tabletten (57.22.99-4); s. auch Applikation 7.9 4. Benzo(a)pyren in geraucherten Fleischerzeugnissen (07.00-40) 5. Konservierungsmittel in fettarmen (00.00-9), fettreichen (00.00-10) Lebensmitteln und Limonadengrundstoff (32.16-1); s. auch Applikation 7.6 Substanzen: Benzoesaure, Sorbinsaure, p-Hydroxybenzoesauremethyl-, -ethyl- und -propylester. Fettarme Lebensmittel: Prinzip: K. werden mit Ammoniumacetat-Essigsiiure Pufferlosung (in Methanol) im Ultraschallbad extrahiert, ggf. mit Carrez-Usung geklart und filtriert.

180

6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21.

8 Zusammenstellung einiger amtlicher Methoden

HPLC: Isokratisch an RP-8-Saulen rnit NH4CH3CO0 (0.01 M. aq.)Methanol (50 + 40) eingestellt auf pH 4,5-4,6. Detektion im UV bei 235 nm. Fettreiche Lebensmittel: Prinzip: Extraktion auf einer Extraktionssaule (Kieselgur, z. B. Extrelut) rnit (C2H5)20/CH2C12, einengen. HPLC: Isokratisch auf Kieselgelsaule rnit n-Heptan-DiisopropyletherEssigsaure (88/12/0.1). Detektion im UV bei 230 nm. Benzoesaure und Sorbinsaure in Limonadengrundstoff (32.16-1) Farblose organische Bestandteile in Lebensmittelfarbstoffen (57.09-5) Carazolol im Gewebe von Schweinen (06.15-4) Chlorogensauren in Kaffee (46.00-2) Flunixin im Muskelfleisch von Pferden (06.26/27-1) Konservierungsstoffe in Mayonnaise und -erzeugnissen (20.01-1) Konservierungsstoffe in Bier (36.00-9) Nicarbazin, Nitrofuran in Huhnereiern und Produkten aus Huhnereiern (05.01/02-1) Nitrat in Frischgemuse (25.00-2), Gemuseerzeugnissen (26.00-1) und Gemusebrei fur Sauglinge und Kleinkinder (48.03.05-2) Ochratoxin A in Getreide (15.00-1) und Getreideprodukten Propionsaure in Brot (17.00-14) und feinen Backwaren (18.00-11) Saccharin, Sorbinsaure in FlussigtafelsuBe (57.22.99-5) Sorbinsaure in Brot (17.00-10) Tocopherole und Tocotrienole in Speiseolen (13.03/O4-1) Vitamin A in diatetischen Lebensmitteln (49.00-3) Vitamin D in diatetischen Lebensmitteln (49.00-1)

8.2 AOAC-Methodensammlung Eine weitere gute Quelle fur validierte HPLC-Methoden im Lebensmittelbereich ist die AOAC-Methodensammlung (15. Ed., 1990). Neben Methoden fur Lebensmittel finden sich in dieser Sammlung auch solche zur Bestimmung von Stoffen in Tierfutter und Pharmaka sowie von Pestiziden in Formulierungen. Diese Methoden sind hier nicht aufgefuhrt. 1. Aflatoxine in Baumwollsamenprodukten (980.20 Aflatoxins in Cottonseed Products) Prinzip: Das Produkt wird rnit A c e t o Nasser homogenisiert, Storstoffe durch Schwermetallosungen (Pb(OAc),) entfernt und die Aflatoxine rnit CH2C12extrahiert. Weitere Reinigung durch SC an Silicagel-Minisaulen (Elution rnit CHzClz-Aceton,9 1).

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8.2 AOAC-Methodensammlung

181

HPLC: isokratisch an Normalphasen rnit CHC13(wassergesattigt)-Cyclohexan-CH3CN (25/7,5/1), rnit 1,5 % Ethanol oder Isopropanol versetzt. Detektion: Fluoreszenz: Ex. 360-365 nm; Em. 400-410 nm. Bemerkungen: diverse TLC-Methoden rnit aufgefuhrt. 2. Aflatoxine MI und M2 in fliissiger Milch (986.16 Aflatoxins MI and M2 in Fluid Milk). Prinzip: Die beiden Aflatoxine werden auf einer C-18-Kartusche aus Milch isoliert, rnit Ether auf eine Kieselgelsaule eluiert, von dieser wiederum rnit CH2C12-Alkohol.Nach Derivatisierung rnit Trifluoressigsaure erfolgt die Trennung. HPLC: Isokratisch auf einer RP-18-Phase rnit Wasser-IsopropanolCH3CN (80/12/8). Detektion: Fluoreszenz; Ex. 360-365 nm; Em. 400-410 nm. 3. Enantiomere des Amphetamins in Drogen, Sirupen und Kapseln (988.28 Enantiomers of amphetamine in bulk drugs, syrups and capsules) Methode benutzt chirale Phase (Pirkle) zur nennung von L- und DAmphetamin. 4. Antioxidantien in Fetten und Olen (983.15 Antioxidants in oils and fats). RP-Methode rnit Acetonitril-Wasser-Gradient; Probenvorbereitung durch Extraktion der Hexan-Fett-Mischung rnit Acetonitril. 5. Benzoat, Coffein und Saccharin in Erfrischungsgetranken (970.08 Benzoate, caffeine and saccharin in soda beverages). Isokratische RP-18Methode . 6. Glucose, Fructose, Saccharose und Maltose in vorgesiil3ten Getreideprodukten (982.14 Glucose, fructose, sucrose and maltose in presweetened cereals). Isokratische Trennung auf einer Aminosaule mit RI-Detektion; Reinigung durch Entfetten, extrahieren rnit 50 % Ethanol (aq.) und SPE an RP-18-Kartuschen. 7. Zucker in SiiBholz-Extrakten (984.17 Sugars in licorice extracts); ahnlich 982.14; weniger Probenvorbereitung. 8. Glycerrhicinsaure und -salze in SuBholzprodukten (982.19 Glycyrrhizic acid or Glycyrrhizic acid salts in Licorice products). Isokratisch an RP-18 mit UV-Detektion. 9. Cresidinsulfonsaure, Schaeffer's Salz, 4,4'-(Diazo-amino)bis(5-methoxy2-methyl-benzolsulfonsaure) und 6,6'-0xybis(2-naphthalinsulfonsaure) in FD & C Rot Nr. 40. (981.13 Cresidine sulfonic acid, Schaeffer's salt, 4,4'-(Diazo-amino)bis(5-methoxy-2-methyl-benzene sulfonic acid) and 6,6'-0xybis(2-naphthalinesulfonic acid) in FD & C red no. 40. Ionenaustausch HPLC mit Gradientenelution. 10. Zwischen- und Nebenprodukte in FD & C Gelb Nr. 5. (982.28 Intermediates and reaction by-products in FD & C yellow no. 5). Ionenaustausch HPLC mit Gradientenelution.

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8 Zusarnrnenstellungeiniger amtlicher Methoden

11. 4,4'-(Diamino)benzolsulfonsaure in FD & C Gelb Nr. 6. 12. Ruckstande von N-Methylcarbamat-Insektiziden und Metaboliten (985.23 N-Methylcarbamate insectizide and metabolite residues). Methode fur Kartoffeln und Trauben. Substanzen werden rnit Methanol extrahiert, durch Flussig-flussig-Verteilung und Saulenchromatographie gereinigt ,mittels HPLC getrennt und nach Hydrolyse durch Nachsaulenderivatisierung (OPA, 2-Mercaptoethanol) in fluoreszierende Derivate umgesetzt und entsprechend (Ex. 340 nm, Em. 455 nm) detektiert. 13. Hauptzucker in Maissirup (979.23Saccharides (major) in corn sirup). Die verdunnte Liisung wird auf einer Kationenaustauschersaule getrennt und refraktometrisch detektiert . 14. Minorzucker in Maiszucker (983.22Saccharides (minor) in corn sugar). Prinzipiell wie 13. 15. Trennung von Zuckern aus Honig (977.20Separation of sugars in honey). Trennung auf BondapaWCarbohydrat-Saulernit RI-Detektion. 16. Reinheit von Lactose (984.22Purity of lactose). Isokratische Trennung auf Kohlenhydratsaule rnit RI-Detektion. 17. China-, Apfel- und Citronensaure in Cranberrysaft-Cocktail und Apfelsaft (986.13Quinic, malic, and citric acid in cranberry juice cocktail and apple juice). Die Sauren werden uber Einwegkartuschen (RP-18) gereinigt, auf zwei hintereinandergeschalteten RP-Saulen rnit Phosphatpuffer als Eluent getrennt und im UV bei 214 nm detektiert. 18. Vitamin D in angereicherter Milch und Milchpulver (981.17Vitamin D in fortified milk and milkpowder). Nach Verseifung werden die Proben auf einer HPLC-,,Clean-up"-Saule vorgetrennt, die Vitamin D enthaltende Fraktion gesammelt, eingeengt und auf der analytischen Saule getrennt; Eluent jeweils n-Hexan rnit 0,35% Amylalkohol; Detektion UV 254 nm. 19. Vitamin D in Multivitaminzubereitungen (980.26Vitamin D in multivitamin preparations). Im Prinzip wie 18. 20. a-Zearalenol und Zearalenon in Mais. (985.18a-Zearalenol and Zearalenone in corn). Nach Extraktion rnit CHC13 und Reinigung durch flussigl flussig-Verteilung werden die Toxine mittels RP-Chromatographie unter isokratischen Bedingungen getrennt und fluorimetrisch (Ex: 236 nm; Em. 418 nm) detektiert.

8.3 Schweizerisches Lebensrnittelbuch

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8.3 Schweizerisches Lebensmittelbuch Im Schweizerischen Lebensmittelbuch finden sich folgende HPLC-Methoden: 1. Nitrat in Milch (U1.8.2) 2. Bestimmung von Chloramphenicol (1.7.1.1.5) und Sulfonamidriickstanden (1.7.1.2.3) in Milch; hier nur je ein Verweis auf eine Literaturstelle. 3. Coffein und Theobromin in Speiseeis (9/5.2) 4. Bestimmung von Zuckerarten in diatetischen Lebensmitteln (2Y6.2) 5. Bestimmung des Coffeins, Theobromins und Theophyllins in diatetischen Lebensmitteln (22/10.1) 6. Bestimmung des Nitrats und Nitrits in diatetischen Lebensmitteln (22l12.2) 7. Bestimmung von Chlorid, Nitrat und Sulfat (27N4.10) 8. Anthocyanmuster in Frucht- und Gemusesaften mittels HPLC (Provisorische Methode 28A) 9. Zuckerarten und Zuckeralkohole in Frucht- und Gemiisesaften (28N5.3) 10. Sorbit und Mannit in Frucht- und Gemiisesaften (28N6.2) 11. Organische Siuren in Frucht- und Gemusesaften (28M.4) 12. Ascorbinsaure in Frucht- und Gemusesaften (28AD.10.2) 13. Nitrat in Frucht- und Gemusesaften (28N9.1) 14. Freie Aminosauren in Frucht- und Gernusesiiften (28N9.3) 15. Ascorbinsaure in Bier (3U14.1) 16. Zuckerarten in Kakao und -produkten (36AD.1) 17. Bestimmung des Capsaicins in Cayennepfeffer (37AProvis. Methode) 18. Bestimmung des Vanillins in Vanille (37ANanille) 19. Bestimmung von Saccharin und Cyclamat (4U1.1.3 und 2.2) 20. Bestimmung von Acesulfam K (4U1.1.9) 21. Bestimmung von o- und p-Toluolsulfonamid in Saccharin (4U1.3.2) 22. Bestimmung von Aspartam (41/2.6) 23. Farbstoffe fur Lebensmittel (42N2.12) 24. Bestimmung von Konservierungsstoffen (44/4.2) 25. Bestimmung von Pimarizin, Benzoe- und Sorbinsaure in Kaserinde und Kase (44/8) 26. Bestimmung von Natriumazid in Wein (44/11) 27. Bestimmung von 5-Nitro-2-furylacrylsaure in Wein (44D2.1) 28. Bestimmung von Patulin (1154/1.1.3) 29. Bestimmung von biogenen Aminen (3 Varianten 54/2.3) 30. Ruckstandsbestimmung der Sulfonamide in tierischen Produkten (55/ Provisorische Methode) 31. Bestimmung von 12 Sulfonamiden in Fleisch und Nieren (55Provisorische Methode)

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8 Zusammenstellung einiger amtlicher Methoden

32. Nachweis von Benzimidazol in Leber, Niere und Muskel (55Provisorische Methode) 33. Bestimmung 17 verschiedener Sulfonamide in Eiern (55/Provisorische Methode) 34. Bestimmung der Kokzidiostatika Clopidol, Ethopabat, Zoalen und Nicarbazin in Eiern (55Provisorische Methode)

9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich 9.1 Bestimmung von Nitrophenolen in Regenwasser Problemstellung Nitrophenole gehoren zu den toxikologisch bedenklichen Verbindungen. Vor allem Dinitrophenole zeigen eine hohe biologische Aktivitat und Phytotoxizitat (Entkopplung der oxidativen Phosphorylierung in der Atmungskette, Storung des Zellmetabolismus). Die herbizide Wirkung von 2,4-Dinitro-6methylphenol (DNOC) und 2,4-Dinitro-6-sec.-butylphenol(Dinoseb) wird durch deren Anwendung in der Landwirtschaft kommerziell genutzt. Das Vorkommen von Nitrophenolen in Regenwasser wird daher als moglicher Strel3faktor fur Pflanzen im Zusammenhang mit dem anhaltenden Waldsterben diskutiert. Daneben zahlen einige Nitrophenole zu den von der USEPA als ,,priority pollutants" eingestuften Substanzen. Mit der hier vorgestellten Methode lassen sich 14 Nitrophenole chromatographisch erfassen. Formeln der Nitrophenole In Abb. 9-1 sind die Strukturfomeln der Nitrophenole dargestellt. Soweit nicht anders vermerkt ist, gilt: R = H. Mononitrophenole 2-Nitrophenol 3-Nitrophenol 4-Nitrophenol

Rl: NO2 R2: NO2 R3: NO2

Dinitrophenole 2,3-Dinitrophenol 2,4-Dinitrophenol 2 3 -Dinitrophenol 2,ii-Dinitrophenol 3,4-Dinitrophenol

Rl, R2: NO2 Rl, R3: NO2 Rl, R4: NO2 Rl, R.5: NO2 R2, R3: NO2

Methylnitrophenole 2-Methyl-3-nitrophenol 3-Methyl-2-nitrophenol 3-Methyl-4-nitrophenol 4-Methyl-3-nitrophenol 4-Methyl-2-nitrophenol 5-Methyl-2-nitrophenol

R2: NO2 Rl: NO2 R3: NO2 R2: NO, Rl: NO2 Rl: NO2

Rl: CH3 R2: CH3 R2: CH3 R3: CH3 R3: CH3 R4: CH3

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9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich

Prinzip der Bestimmung Die Nitrophenole werden mittels flussig/fliissig-Extraktion aus den Wasserproben isoliert. Zur Abtrennung von den neutralen und basischen Verbindungen werden die Phenole danach mit Kaliumhydroxidlosung als Phenolate in die waBrige Phase iiberfiihrt und nach Ansauern durch eine erneute flussig/ flussig-Verteilung mit Dichlormethan extrahiert . Die Quantifizierung erfolgt mittels HPLC-DAD nach der Methode der externen Standardisierung [9-1,921. Chemikalien und Hilfsmittel Dichlormethan, z. A. [Xn; R 40, S 23.2-24/25-36/37] - Kaliumhydrogenphosphat, z. A. - Kaliumhydroxid, z. A. [C; R 35, S 2-26-37/39] - Methanol, HPLC grade [F, T; R 11-23/25; S 2-7-16-241 - Natriumsulfat, wasserfrei, z. A., gegliiht - ortho-Phosphorsaure, 85 % [C; R 34, S 261 - Salzsaure, rauchend (37 %) [C; R 34-37, S 2-26] - Wasser, HPLC grade oder gleichwertig - Membranfilter (0,2 pm) - silanisierte Glaswolle -

Arbeitsvorschrift a) Probenahme Die Probenahme kann mittels eines Passivsammlers (abgedeckter, quadratischer Edelstahltrichter) , der zu Beginn eines Niederschlagsereignisses manuell geoffnet wird, erfolgen. Die Proben werden in 1 L-Braunglasflaschen rnit Schliff bis zur Analyse gekuhlt bei 4 "C aufbewahrt. Eine weitere Stabilisierung ist nicht erforderlich. b) Probenvorbereitung und -aufarbeitung 0,5 L bis 1 L Probe werden in einem entsprechenden Scheidetrichter dreimal mit jeweils 50 mL Dichlormethan fur 90 Sekunden ausgeschiittelt. Die organischen Extrakte werden in einem 250 mL Scheidetrichter gesammelt und rnit

9.1 Bestimmung von Nitrophenolen in Regenwasser

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10 mL 1 N Kaliumhydroxidlosung fiir zwei Minuten geschuttelt, um die aciden Nitrophenole in die waBrige Phase zu uberfiihren. Die organische Phase kann nach erfolgter Phasentrennung zur Bestimmung polycyclischer aromatischer Kohlenwasserstoffe (PAH) oder von Alkanen weiter aufgearbeitet und nachfolgend gaschromatographisch analysiert werden. Die in einem 100 mL Scheidetrichter aufgefangene wiiBrige Phase wird rnit 40 mL Wasser verdunnt, rnit 6 N Salzsaure (ca. 1,4mL) auf pH