Grundlagen der Molekularen Medizin, 3.Auflage

Herausgeberbeirat

Adriano Aguzzi, Zürich Heinz Bielka, Berlin Falko Herrmann, Greifswald Florian Holsboer, München Stefan H.E. Kaufmann, Berlin Peter C. Scriba, München Günter Stock, Berlin Harald zur Hausen, Heidelberg

Detlev Ganten Klaus Ruckpaul (Hrsg.)

Grundlagen der Molekularen Medizin 3., überarbeitete und erweiterte Auflage

Mit Beiträgen von Stefan Aretz, Andrea Bauer, Olaf Behrsing, Karsten Brand, Karl Kai Breuhahn, Stefan Britsch, Thomas Brümmendorf, Lukas Chavez, Peter Daniel, Volker A. Erdmann, Carl Friedrich Gethmann, Wolfgang Goedecke, Marcel Halbach, Udo Heinemann, Ulrich R. Hengge, Ralf Herwig, Jürgen Hescheler, Jörg D. Hoheisel, Birgit Kersten, Jörg Knäblein, Jens Kurreck, Gabriele Laschinski, Joerg Leers, Hans Lehrach, Heike Mertsching, Urs A. Meyer, Burkhard Micheel, Martina U. Muckenthaler, Yves A. Muller, Jochen Müller-Ehmsen, Heidemarie Neitzel, Roland Penzel, Petra Pfeiffer, Frank Pillekamp, Thomas Preiss, Jens G. Reich, Rainer Renkawitz, Michael Reppel, Ivar Roots, Peter Schirmacher, Steffen Schubert, Johannes Schuchhardt, Sabina Solinas-Toldo, Karl Sperling, Michael Strehle, Felix Thiele, Erich E. Wanker, Bernd Wissinger, Anna M. Wobus

Mit 180 Abbildungen, davon 127 in Farbe und 28 Tabellen

123

Professor Dr. Detlev Ganten Der Vorstandsvorsitzende (CEO) Charité – Universitätsmedizin Berlin Charitéplatz 1 10117 Berlin

Professor Dr. Klaus Ruckpaul Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Robert-Rössle-Straße 10 13125 Berlin-Buch

Legende zur Einbandabbildung: RNA-bindendes Zinkfinger-Protein. Kristallstruktur eines Komplexes eines 3-Finger-Peptids von TIFIIIA und einer verkürzten 5S RNA (Yu Chen, Gabriele Varani, FEBS Journal 272:2088-2097 (2005)) [mit freundlicher Genehmigung des Verlages Blackwell Publishing (Oxford, UK) und der Autoren]

ISBN-13

978-3-540-69412-0 3. Auflage Springer Medizin Verlag Heidelberg

Bibliografische Information der Deutschen Nationalbibliothek Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.d-nb.de abrufbar Dieses Werk ist urheberrechtlich geschützt. Die dadurch begründeten Rechte, insbesondere die der Übersetzung, des Nachdrucks, des Vortrags, der Entnahme von Abbildungen und Tabellen, der Funksendung, der Mikroverfilmung oder der Vervielfältigung auf anderen Wegen und der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen, bleiben, auch bei nur auszugsweiser Verwertung, vorbehalten. Eine Vervielfältigung dieses Werkes oder von Teilen dieses Werkes ist auch im Einzelfall nur in den Grenzen der gesetzlichen Bestimmungen des Urheberrechtsgesetzes der Bundesrepublik Deutschland vom 9. September 1965 in der jeweils geltenden Fassung zulässig. Sie ist grundsätzlich vergütungspflichtig. Zuwiderhandlungen unterliegen den Strafbestimmungen des Urheberrechtsgesetzes. Springer Medizin Verlag springer.de © Springer Medizin Verlag Heidelberg 2008 Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, dass solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und Markenschutzgesetzgebung als frei zu betrachten wären und daher von jedermann benutzt werden dürften. Produkthaftung: Für Angaben über Dosierungsanweisungen und Applikationsformen kann vom Verlag keine Gewähr übernommen werden. Derartige Angaben müssen vom Anwender im Einzelfall anhand anderer Literaturstellen auf ihre Richtigkeit überprüft werden. Planung: Dr. Rolf Lange, Heidelberg Projektmanagement: Hiltrud Wilbertz, Heidelberg Einbandgestaltung: deblik Berlin Satz: Fotosatz-Service Köhler GmbH, Würzburg SPIN: 11527084 Gedruckt auf säurefreiem Papier

19/2119 wi – 5 4 3 2 1 0

V

Vorwort Seit dem Erscheinen der 2. Auflage der ‚Grundlagen der Molekularen Medizin‘ sind 5 Jahre vergangen (2. Auflage 2003). Trotz dieser kurzen Zeitspanne haben Verlag und Herausgeber sich zur Herausgabe einer 3. Auflage entschlossen. Ausschlaggebend für diese Entscheidung waren und sind der ungebrochen dynamische Zuwachs molekularmedizinischer Forschungsergebnisse und deren zunehmende Anwendung in Diagnostik und Therapie. Eine umfassende Darstellung dieser Erkenntnisse und neuen Methoden hätte jedoch den Umfang der 2. Auflage erheblich erweitert und damit den Rahmen eines einbändigen Werkes gesprengt. Deshalb haben wir uns entschieden, ohne Verzicht auf bereits in der 2. Auflage dargestellte Sachverhalte eine Straffung des Textes zu verbinden mit der Darstellung neuester Ergebnisse sowie der Ergänzung durch neue Kapitel wie Pharmakogenetik/Pharmakogenomik, Gentherapie und Biotechnologische Anwendungen. Dabei war es unser besonderes Anliegen, solche Themen neu in die 3. Auflage aufzunehmen, die für die Molekulare Medizin zukünftig von besonderer Bedeutung sein könnten. Um die Orientierung und den Zugriff zu entscheidenden Entwicklungsetappen zu erleichtern, haben wir die Zeittafeln – anders als in der 2. Auflage – unmittelbar an das Ende eines jeden Kapitels gesetzt. Ohne auf alle thematischen Details eingehen zu können, seien einige Bemerkungen zum Inhalt dieses Bandes vorangestellt. Mit der Aufsehen erregenden Veröffentlichung der vollständigen, 3,1 Mrd. umfassenden Basen1 sequenz des menschlichen Genoms wurde ein neues Blatt in der biologischen Grundlagenforschung und der Kenntnis der Bausteine des menschlichen Lebens aufgeschlagen. Eine mit höchster Genauigkeit durchgeführte Sequenzierung aus dem Jahr 2004 (veröffentlicht in: Nature 431, pp. 915, 927, 933 [2004]) ergab 3,08 Mrd. Basenpaare mit 20.000 bis 30.000 Genen. Der etwa 99% umfassende Rest des menschlichen Genoms besteht aus sogenannter junk-DNA mit bisher weitgehend unbekannter Funktion. Neben dem menschlichen Genom und der vollständigen Zuordnung der Gesamtsequenz zu den menschlichen Chromosomen sind die Sequenzen weiterer Pri1 Zeitgleich entschlüsselte und veröffentlichte Genomsequenz durch ein ,International non-commercial project’ (Leitung: Francis Collins) und durch die Gentechnik-Firma Celera Genomics (Leitung: Craig Venter) in der Zeitschrift Science [Science 300, S. 277 ff, Special Section: Building on the DNA Revolution] zum 50. Jahrestag der Entdeckung der Doppelhelix durch James Watson und Francis Crick im April 2003 und in der Zeitschrift Nature [Nature 421, No. 6921, January 2002, Special Issue: The double helix – 50 years].

matengenome wie beispielsweise die von Schimpanse (99% Übereinstimmung mit dem Menschen) sowie Rhesusaffe und einer Reihe weiterer Säugergenome aufgeklärt, wie die von Maus, Ratte, Rind und Hund. Die Summe dieser Einzelergebnisse ermöglicht durch Sequenzvergleich die Zuordnung definierter Gene zu bestimmten Erkrankungen des Menschen und ist daher wesentlicher Bestandteil der Molekularen Medizin. Interessanterweise unterscheidet sich das menschliche Genom von anderen Säugergenomen trotz einer weitgehend ähnlichen Anzahl von Basenpaaren durch die Zahl von Enzymen mit unterschiedlichen Funktionen. Eine entscheidende Ursache dieser Diversifikation des Transkriptoms ist das alternative Spleißen. Aus einem einzigen Primärtranskript werden auf diese Weise unterschiedliche reife RNAs gebildet, die zur Biosynthese von Proteinen mit unterschiedlichen Funktionen führen. So sind für 23.245 Genorte im menschlichen Genom über 43.000 Transkripte bekannt. Die Anzahl alternativer Transkripte bewegt sich zwischen 2 und 40 (vgl. hierzu das Kapitel ‚Analyse von Biochips: Von der Sequenz zum System‘). Die Entschlüsselung der Gesamtsequenz des Genoms ist nur der erste Schritt bei der weitaus schwierigeren Aufgabe, die funktionelle Bedeutung der Sequenzen zu verstehen. Der Phase der Sequenzermittlung schließt sich daher folgerichtig die funktionelle Entschlüsselung an, die funktionelle Genomik. Dabei geht es um die Zuordnung von Teilen der Gesamtsequenz zu definierten Genstrukturen, was in letzter Zeit zu einem erheblichen Erkenntniszuwachs geführt hat. Dies schließt auch ein die Zuordnung von Sequenzen der Introns zu bisher nur teilweise verstandenen Funktionen im Prozess der Regulation der Genexpression und der Kontrolle nachfolgender Schritte bis zur Umsetzung der genetischen Information in Genprodukte (Enzyme, Eiweiße). Die Aufklärung der Genomsequenz hat für zwei die Molekulare Medizin in besonderem Maße prägende Forschungsfelder die molekularen Grundlagen gelegt: die Pharmakogenetik und die Pharmakogenomik. Mit dieser inhaltlichen Erweiterung wird in der vorliegenden 3. Auflage eine Lücke gegenüber der 2. Auflage geschlossen. Die Duplikation (Replikation) von 3 Mrd. Basenpaaren des menschlichen Genoms verläuft zwar mit außerordentlicher Präzision, aber nicht immer fehlerfrei. Derartige Fehler können spontan durch Basenveränderungen verursacht werden oder aber durch Umweltmutagene zustande kommen. Sie können stumm (Degeneriertheit des Codes oder funktionsneutrale Aminosäuren), d.h. ohne Funktionsstörungen, bleiben oder aber die molekulare Ursache von Krankheiten bzw.

VI

Vorwort

von unerwünschten Nebenwirkungen nach Einnahme bestimmter Arzneimittel sein. Solche vertauschten Basen werden ‚single nucleotide polymorphisms‘ oder auch SNPs genannt und können auf der somatischen Ebene wie auch in der Keimbahn ablaufen. Nach jüngsten Angaben gibt es etwa 10 Mio. solcher SNPs. Gut 1 Mio. sind jetzt von einer internationalen Forschungsgruppe (mehr als 200 Wissenschaftler aus Kanada, China, Japan, Nigeria, Großbritannien und den USA) kartiert worden und liegen als sogenannte HAPMAP (Haploid-Karte) vor. Dabei hat sich ergeben, dass die SNPs nicht statistisch über das Genom verteilt sind, sondern in Clustern (sets) auftreten. Durch diese Kartierung wird die Suche nach krankheitsrelevanten Genveränderungen wesentlich erleichtert, da es nicht mehr erforderlich ist, das gesamte Erbgut zu untersuchen, sondern ein Vergleich des SNP-Musters eines Patienten mit der HAPMAP ergibt bereits weitgehende Aufschlüsse. Allerdings werden bei systematischen Untersuchungen nur solche Genvarianten erfasst, die bei mindestens 5 % der DNA-Spender gefunden werden (vgl. hierzu Kapitel ‚Pharmakogenetik und Pharmakogenomik‘). Im Online Mendelian Inheritance in Man-Katalog (OMIM) gibt es mehr als 17.000 Einträge über menschliche Gene und Gendefekte bei insgesamt etwa 30.000 menschlichen Genen. Die sich hieraus ergebenden diagnostischen Möglichkeiten sind bei Berücksichtigung des Entwicklungstempos bemerkenswert und lassen erwarten, dass diese in relativ kurzer Zeit Eingang in die Routinediagnostik gefunden haben. Die methodischen Möglichkeiten hierzu und ihre klinische Anwendung werden im Kapitel ‚Gendiagnostik‘ im Detail dargestellt. Bereits in den 1990er Jahren wurde in Pflanzen und einfachen Organismen das Phänomen einer Abschaltung von Genen entdeckt, ohne die molekulare Struktur dieser Regulatoren zu kennen. Weiterführende Untersuchungen an Fruchtfliegen ergaben jetzt Einzelheiten der molekularen Struktur dieser Moleküle. Es handelt sich um kurze Abschnitte doppelsträngiger RNA, die aus etwa 20 Bausteinen bestehen. Daraus abgeleitet wurde der Name siRNA für small interfering RNA. Diese siRNA-Moleküle vermögen bestimmte BotenRNA zu blockieren und damit z.B. die Information zur Bildung bestimmter Eiweiße zu unterbinden2. Dieses Forschungsfeld wird gegenwärtig wegen zukunftsfähiger pharmakologisch/therapeutischer Therapieansätze intensiv bearbeitet. Die Arbeitsgruppe um Tuschl fand außerdem, 2 Die beiden Biologen Andrew Z. Fire und Craig C. Mello haben im Jahr 2006 für die Entdeckung der RNA-Interferenz und deren Funktionsanalyse (siRNA) den Nobelpreis für Medizin und Physiologie erhalten ebenso wie Roger Kornfeld (Nobelpreis für Chemie, 2006) für seine Arbeiten zur Struktur und Funktion der an diesen Prozessen beteiligten RNA-Polymerase.

dass in Säugerzellen weitere kurze RNAs gebildet werden, die eine RNA-Interferenz auslösen können. Beim Menschen wurden bisher etwa 500 Gene nachgewiesen, die die Bauanleitung für diese als MikroRNA bezeichneten RNA-Sequenzen enthalten. Diese in die Zukunft gerichteten Probleme werden in verschiedenen Kapiteln aus unterschiedlicher Sicht behandelt (vgl. hierzu das Kapitel ‚Antisense-, Ribozym- und RNA-InterferenzStrategien: Methoden des posttranskriptionellen Gene Silencing in der Molekularen Medizin‘). Ähnlich wie bei der Erforschung der Genomsequenz haben Forscher verschiedener Länder zur Lösung der Frage nach der Bedeutung der durch die Gene codierten Enzyme im Jahre 2001 die Human Proteome Organization (HUPO) gegründet. Proteom ist die Gesamtheit aller Eiweiße in einer Zelle. Bei der Größe der Aufgabe erstaunt es nicht, dass das Gesamtprojekt in 5 kleinere Einzelprojekte untergliedert ist (2003): Human Plasma Proteome Project (HPPP), Sweden, USA; Human Liver Proteome Project (HLPP), Canada, China, France; Proteomics Standard Initiative (PSI), all countries; Human Brain Proteome Project (HBPP), Germany; International Mouse and Rat Proteome Project (MRPP), Canada, Germany. Alle Projekte dienen dem Ziel, das funktionelle Netzwerk der Eiweiße im menschlichen Organismus zu entschlüsseln, um Ansatzpunkte für die Behandlung von entsprechenden Erkrankungen zu finden (vgl. hierzu Kapitel ‚Klinische Proteomik‘). Die in die Gentherapie gesetzten Hoffnungen auf eine Umsetzung der Ergebnisse aus der Grundlagenforschung in neuartige gentherapeutische Behandlungsformen haben sich bisher nicht erfüllt. Zu viele Fragen haben sich trotz anfänglicher Erfolge ergeben und die Notwendigkeit der Intensivierung einschlägiger Grundlagenforschung gezeigt. Ein in die vorliegende 3. Auflage aufgenommenes Kapitel beleuchtet den gegenwärtigen Kenntnisstand und setzt sich mit den weiteren Perspektiven aufgrund der durch die Genom- und Proteomforschung erreichten Ergebnisse und Erkenntnisse auseinander (Kapitel ‚Gentherapie‘). Neben den Forschungen an physiologischerweise vorkommenden Stammzellen mit dem Ziel, Regulations- und Entwicklungsprozesse zu verstehen und für eine therapeutische Anwendung zu nutzen, werden auch Krebsstammzellen (1997 von John Dick [Canada] entdeckt) untersucht. Die zunächst bei Leukämiepatienten gefundenen Stammzellen wurden seither auch in Geweben von Brustkrebs, Gehirntumoren (Glioblastom) und Prostatakrebs nachgewiesen. Ziel der noch am Beginn stehenden Forschungen ist es, aus den molekularen Besonderheiten der Stammzellen möglicherweise neue Therapiestrategien abzuleiten, um die Stammzellen gezielt angreifen zu können (Kapitel ‚Medizinische Perspektiven der kardialen Stammzellforschung‘).

VII Vorwort

Die wissenschaftlichen Grundlagen der Molekularen Medizin beruhen zu einem wesentlichen Teil auf der Aufdeckung zell- und molekularbiologischer Prozesse und Mechanismen, deren Transfer in die klinische Praxis sich über eine Anwendung in der klinischen Diagnostik vollzieht. Eine Darstellung des gegenwärtigen Entwicklungsstandes wäre jedoch lückenhaft, würde sie sich nur auf die unmittelbar in der Klinik genutzten Erkenntnisse beschränken. Durch die Anwendung des Methodenpotentials gentechnischer Verfahren werden große Umwälzungen in der Biotechnologie und in der pharmazeutischen Industrie bewirkt, deren Einführung zu einer erheblichen Rationalisierung von Herstellungsprozessen geführt hat. In einigen Fällen ermöglichte sie überhaupt erst die Gewinnung von bisher nicht zugänglichen therapeutisch anwendbaren Wirkstoffen. Dadurch wurden und werden Arzneimittel für eine therapeutische Verwendung erschlossen, deren Herstellungsaufwand auf chemisch synthetischem Wege eine Anwendung bisher unmöglich gemacht hat (Kapitel ‚Gentechnische Grundlagen für biotechnologische Anwendungen‘). Mit insgesamt 22 Kapiteln liegen die ,Grundlagen der Molekularen Medizin‘ jetzt in überarbeiteter und aktualisierter Form vor – ergänzt durch 4 neue Kapitel gegenüber der 2. Auflage. Dies wurde erreicht durch Streichung, Straffung und Zusammenlegung von Kapiteln, so dass im Ergebnis die Zahl der Kapitel gegenüber der 2. Auflage

bei erheblicher Verringerung des Gesamtumfanges unverändert geblieben ist. Der Dank der Herausgeber gilt daher in erster Linie den Autoren, die sich mit großer Disziplin an den vorgegebenen Rahmen gehalten haben, ohne auf inhaltliche Schwerpunkte zu verzichten. Dadurch wurde es möglich, den Preis des Bandes auf einem Niveau zu halten, der allen Interessierten, insbesondere aber auch Studenten nicht nur der Medizin, sondern aller biowissenschaftlichen Disziplinen, den Erwerb ermöglichen soll. Neben dem Dank an die Autoren ist die Herausgabe eines solchen Buches ohne die konstruktive Mitarbeit des Verlages nicht möglich. Deshalb möchten wir an dieser Stelle herzlich danken für die stets förderliche und verständnisvolle Zusammenarbeit mit dem Verlagsleiter, der verständnisvollen Zusammenarbeit mit dem CopyEditing und dem Hersteller sowie all denen, die am Erscheinen dieses Bandes mitgewirkt haben. Herausgeber und Verlag wünschen auch dieser 3. Auflage der ‚Grundlagen der Molekularen Medizin‘ eine wohlwollende Aufnahme durch die Leser, welche die aktuellen Grenzen der Molekularen Medizin kennen lernen wollen, im Interesse einer weiten Verbreitung der Molekularen Medizin zum Nutzen des medizinischen Fortschritts und zum Wohle der Patienten. Berlin, Sommer 2007

Detlev Ganten Klaus Ruckpaul

IX

Inhaltsverzeichnis Vorwort . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Autorenverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Abkürzungen und Erläuterungen . . . . . . . . . . . . 1

Allgemeine Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . .

1.1 Molekulare klinische Zellbiologie . . . . . . . . . Kai Breuhahn und Karsten Brand 1.2 Molekulare Mechanismen von Zell-ZellWechselwirkungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . Thomas Brümmendorf 1.3 Die zytogenetischen Grundlagen der Molekularen Medizin . . . . . . . . . . . . . . Heidemarie Neitzel und Karl Sperling 1.4 Analyse von Biochips: Von der Sequenz zum System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ralf Herwig, Johannes Schuchhardt, Lukas Chavez und Hans Lehrach 1.5 Mitochondriale DNA des Menschen . . . . . . . Bernd Wissinger 1.6 Regulationsmechanismen der Transkription in Eukaryonten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rainer Renkawitz und Joerg Leers 1.7 Mechanismen der Translationskontrolle in Eukaryonten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Martina U. Muckenthaler und Thomas Preiss 1.8 Molekulare Grundlagen der Apoptose . . . . . Peter Daniel

2

V XI XV 1

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3

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21

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41

3

4 . .

63

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. . 139 . . 159

Modelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205

2.1 Tiermodelle in der biomedizinischen Forschung . 207 Michael Strehle und Stefan Britsch 2.2 Zellkulturtechniken, Zellmodelle und Tissue Engineering . . . . . . . . . . . . . . . . . 242 Anna M. Wobus und Heike Mertsching 2.3 Molekülmodelle und Modellmoleküle: Strukturanalyse großer biologischer Moleküle für die Medizin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 275 Yves A. Muller und Udo Heinemann

Diagnostik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 295

3.1 Klinische Proteomik . . . . . . . . . . . . . . . . . Birgit Kersten und Erich E. Wanker 3.2 Pharmakogenetik und Pharmakogenomik . . . Ivar Roots, Gabriele Laschinski und Urs A. Meyer 3.3 Bioinformatik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Jens G. Reich 3.4 Gendiagnostik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Andrea Bauer, Sabina Solinas-Toldo und Jörg D. Hoheisel, Peter Schirmacher und Roland Penzel und Stefan Aretz

. . 297 . . 314 . . 332 . . 346

Therapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 377

4.1 Gentherapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ulrich R. Hengge 4.2 DNA-Reparatur und Mutagenese . . . . . . . . . . . Wolfgang Goedecke und Petra Pfeiffer 4.3 Antisense-, Ribozym- und RNA-InterferenzStrategien: Methoden des posttranskriptionellen Gene Silencing in der Molekularen Medizin . . . . Jens Kurreck, Steffen Schubert und Volker A. Erdmann 4.4 Medizinische Perspektiven der kardialen Stammzellforschung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Marcel Halbach, Michael Reppel, Frank Pillekamp, Jochen Müller-Ehmsen und Jürgen Hescheler 4.5 Monoklonale Antikörper: Grundlagen und ihre Bedeutung in Diagnostik und Therapie . Olaf Behrsing und Burkhard Micheel 4.6 Gentechnische Grundlagen für biotechnologische Anwendungen . . . . . . . . . . . . . . . . Jörg Knäblein 4.7 Ethische Probleme der Molekularen Medizin: Grundlagen und Anwendungen unter Berücksichtigung der rechtlichen Rahmenbedingungen . . . Carl Friedrich Gethmann und Felix Thiele

379 395

410

425

449

476

510

Sachverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 533

XI

Autorenverzeichnis Dr. Stefan Aretz

Lukas Chavez

Institut für Humangenetik Universität Bonn Wilhelmstraße 31 53111 Bonn [email protected]

Max-Planck-Institut für Molekulare Genetik Ihnestraße 73 14195 Berlin

Dr. Andrea Bauer Abteilung Funktionelle Genomanalyse Deutsches Krebsforschungszentrum Im Neuenheimer Feld 580 69120 Heidelberg [email protected]

Prof. Dr. Peter Daniel Klinische und Molekulare Onkologie Charité – Universitätsmedizin Berlin Campus Berlin-Buch Lindenberger Weg 80 13125 Berlin [email protected] Prof. Dr. Volker A. Erdmann

Dr. Olaf Behrsing Biotechnologie Institut für Biochemie und Biologie Universität Potsdam Karl-Liebknecht-Straße 24-25 14476 Golm [email protected] PD Dr. Karsten Brand Institut für Pathologie AG Invasion und Metastasierung Universitätsklinikum Heidelberg Im Neuenheimer Feld 220/221 69120 Heidelberg [email protected] Dr. Karl Kai Breuhahn Institut für Pathologie AG Molekulare Hepato-Pathologie Universitätsklinikum Heidelberg Im Neuenheimer Feld 220/221 69120 Heidelberg [email protected] Professor Dr. Stefan Britsch Zentrum Anatomie Georg-August-Universität Göttingen Kreuzbergring 36 37075 Göttingen [email protected] Dr. Thomas Brümmendorf Novartis Institutes for Biomedical Research 4002 Basel, Schweiz [email protected]

Institut für Chemie und Biochemie Freie Universität Berlin Thielallee 63 14195 Berlin [email protected] Prof. Dr. Carl Friedrich Gethmann Europäische Akademie zur Erforschung von Folgen wissenschaftlich-technischer Entwicklungen Bad Neuenahr-Ahrweiler GmbH Wilhelmstraße 56 53474 Bad Neuenahr-Ahrweiler [email protected] PD Dr. Wolfgang Goedecke Fachbereich Biologie und Geografie Universität Duisburg-Essen Universitätsstraße 5 45117 Essen [email protected] Dr. Marcel Halbach Klinik III für Innere Medizin /Institut für Neurophysiologie Universität zu Köln Robert-Koch-Straße 39 50931 Köln [email protected] Prof. Dr. Udo Heinemann Forschungsgruppe Kristallographie Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Berlin-Buch Robert-Rössle-Straße 10 13125 Berlin [email protected]

XII

Autorenverzeichnis

Prof. Dr. Ulrich R. Hengge

Dr. Joerg Leers

Hautklinik Universitätsklinikum Düsseldorf Moorenstraße 4 40225 Düsseldorf [email protected]

Institut für Genetik Justus-Liebig-Universität Gießen Heinrich-Buff-Ring 58 35392 Gießen [email protected]

Dr. Ralf Herwig

Prof. Dr. Hans Lehrach

Max-Planck-Institut für Molekulare Genetik Ihnestraße 73 14195 Berlin [email protected]

Max-Planck-Institut für Molekulare Genetik Ihnestraße 73 14195 Berlin [email protected]

Prof. Dr. Jürgen Hescheler

Prof. Dr. Heike Mertsching

Institut für Neurophysiologie Universität zu Köln Robert-Koch-Straße 39 50931 Köln [email protected]

Fraunhofer-Institut für Grenzflächenund Bioverfahrenstechnik IGB Nobelstraße 12 70569 Stuttgart [email protected]

Dr. Jörg D. Hoheisel

Prof. Dr. Urs A. Meyer

Abteilung Funktionelle Genomanalyse Deutsches Krebsforschungszentrum Im Neuenheimer Feld 580 69120 Heidelberg [email protected]

Biozentrum der Universität Basel Abteilung Pharmakologie/Neurobiologie Klingelbergstraße 50-–70 4056 Basel, Schweiz [email protected]

Dr. Birgit Kersten

Prof. Dr. Burkhard Micheel

Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie 14424 Potsdam [email protected]

Biotechnologie Institut für Biochemie und Biologie Universität Potsdam Karl-Liebknecht-Straße 24–25 14476 Golm [email protected]

Dr. Jörg Knäblein Mikrobiologische Chemie Bayer Schering Pharma AG Müllerstraße 178 13342 Berlin [email protected] Prof. Dr. Jens Kurreck Institut für Industrielle Genetik Universität Stuttgart Allmandring 31 70569 Stuttgart [email protected] Dr. Gabriele Laschinski Institut für Klinische Pharmakologie und Toxikologie Charité – Universitätsmedizin Berlin Charitéplatz 1 10117 Berlin [email protected]

Prof. Dr. Martina U. Muckenthaler Molekulare Medizin Pädiatrische Onkologie, Hämatologie und Immunologie Universität Heidelberg Im Neuenheimer Feld 153 69120 Heidelberg [email protected] Prof. Dr. Yves A. Muller Lehrstuhl für Biotechnik Institut für Biologie Friedrich-Alexander-Universität – Im IZMP Henkestraße 91 91052 Erlangen [email protected]

XIII Autorenverzeichnis

Dr. Jochen Müller-Ehmsen

Prof. Dr. Rainer Renkawitz

Klinik III für Innere Medizin Universität zu Köln Kerpener Straße 62 50924 Köln [email protected]

Institut für Genetik Justus-Liebig-Universität Gießen Heinrich-Buff-Ring 58 35392 Gießen [email protected]

Prof. Dr. Heidemarie Neitzel

Dr. Michael Reppel

Institut für Humangenetik Charité – Universitätsmedizin Berlin Campus Virchow-Klinikum Augustenburger Platz 1 13353 Berlin [email protected]

Institut für Neurophysiologie Universität zu Köln Robert-Koch-Straße 39 50931 Köln [email protected] Prof. Dr. Ivar Roots

Dr. Roland Penzel Pathologisches Institut Universitätsklinikum Heidelberg Im Neuenheimer Feld 220/221 69120 Heidelberg [email protected]

Institut für Klinische Pharmakologie Charité – Universitätsmedizin Berlin Charité Campus Mitte Charitéplatz 1 10117 Berlin [email protected]

Prof. Dr. Petra Pfeiffer

Prof. Dr. Peter Schirmacher

Institut für Genetik Universität zu Köln Zülpicher Straße 47 50674 Köln [email protected]

Pathologisches Institut Universitätsklinikum Heidelberg Im Neuenheimer Feld 220/221 69120 Heidelberg [email protected]

Dr. Frank Pillekamp

Dr. Steffen Schubert

Institut für Neurophysiologie Universität zu Köln Robert-Koch-Straße 39 50931 Köln [email protected]

Dana-Farber Cancer Institute Department of Cancer Immunology and AIDS 44, Binney St Boston, MA 02115, USA [email protected]

Associate Prof. Thomas Preiss (PhD)

Dr. Johannes Schuchhardt

Molecular Genetics Program Victor Chang Cardiac Research Institute (VCCRI) 384 Victoria Street, Darlinghurst (Sydney) NSW 2010, Australien [email protected]

MicroDiscovery GmbH Marienburger Straße 1 10405 Berlin [email protected] Dr. Sabina Solinas-Toldo

Prof. Dr. Jens G. Reich Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Berlin-Buch Robert-Rössle-Straße 10 13125 Berlin [email protected]

Molekulare Genetik Deutsches Krebsforschungszentrum Im Neuenheimer Feld 580 69120 Heidelberg

XIV

Autorenverzeichnis

Prof. Dr. Karl Sperling

Prof. Dr. Erich E. Wanker

Institut für Humangenetik Charité – Universitätsmedizin Berlin Campus Virchow-Klinikum Augustenburger Platz 1 13353 Berlin [email protected]

Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Berlin-Buch Robert-Rössle-Straße 10 13125 Berlin-Buch [email protected] Dr. Bernd Wissinger

Dr. Michael Strehle Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Berlin-Buch Robert-Rössle-Straße 10 13125 Berlin [email protected]

Molekulargenetisches Labor Forschungsinstitut für Augenheilkunde Universitätsklinikum Tübingen Röntgenweg 11 72076 Tübingen [email protected]

Dr. Felix Thiele

Prof. Dr. Anna M. Wobus

Europäische Akademie zur Erforschung von Folgen wissenschaftlich-technischer Entwicklungen Bad Neuenahr-Ahrweiler GmbH Wilhelmstraße 56 53474 Bad Neuenahr-Ahrweiler [email protected]

Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) Corrensstraße 3 06466 Gatersleben [email protected]

XV

Abkürzungen und Erläuterungen A Aβ Amyloid E AAG 3-MeA-DNA-Glykosylase AAV Adenoassoziiertes Virus ABC-Transporter Klasse von Membranproteinen, die

als gemeinsames Strukturelement eine ATP-bindende Kassette („ATP binding cassette“) haben und spezifische Substrate aktiv über die Zellmembran transportieren; zu dieser Familie gehören die meisten Arzneimitteltransporter ABI Format der Firma Applied Bioscience zur Abspeicherung von Daten aus Sequenzmaschinen ACE-Hemmer Hemmstoffe des Angiotensinkonversionsenzyms I, Einsatz zur Therapie des Bluthochdrucks ACT Autologous chondrocyte transplantation, autologe Chondrozytentransplantation: Gewinnung patienteneigener Knorpelzellen und ihre In-vitro-Vermehrung zur Behandlung von Knorpeldefekten (z. B. Arthrose) im erkrankten Gelenk des Patienten ADA-SCID Adenosindeaminase-Immundefektsyndrom (7 SCID) ADCC Antibody-dependent cellular cytotoxicity, 7 antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität ADCT Autologous disc chondrocyte transplantion: Autologe Bandscheiben-Chondrozytentransplantation Adjuvans Substanz, die die Immunantwort gegen ein Antigen erhöht, ohne selbst eine spezifische Immunantwort zu induzieren Aerobier Lebewesen, welches elementaren Sauerstoff zum Leben benötigt Affinität Maß für die Bindungsstärke zwischen einer Antigenbindungsregion eines Antikörpers und einer monovalenten Antigendeterminante; die Gesamtbindungsstärke zwischen einem Antikörper und einem Antigen, an der mehrere Bindungen beteiligt sind, wird als Avidität bezeichnet; der Begriff Affinität wird im Zusammenhang mit allen nichtkovalenten Bindungen zwischen biologischen Molekülen verwendet AFP α-Fetoprotein, 7 Alphafetoprotein Agglutination Aggregation zwischen partikulären Antigenen und Antikörpern, betrifft z. B. Erythrozyten oder Bakterien; Tests, die auf einer Agglutination beruhen, werden als Agglutinationstests bezeichnet Agglutinationstest 7 Agglutination AICD Automatic implantable cardioverter defibrillator AIDS Acquired immune deficiency syndrome: Durch das HIV (human immunodeficiency virus) ausgelöste Erkrankung, die zum Verlust der T-Helfer-Lymphozyten führt, wodurch eine Immunantwort gegen, auch normalerweise harmlose, Mikroorganismen nicht mehr möglich ist

ALL Akute lymphatische Leukämie: Subform der akuten

Leukämie Alphafetoprotein AFP: Glykoprotein, das während der

Embryonalentwicklung und im adulten Organismus von Tumorzellen der Leber exprimiert wird AMA Antikörper-Mikroarray: beschichteter Objektträger, auf dem verschiedene Antikörper unter Verwendung eines Mikroarrays immobilisiert wurden und damit systematisch, in Spots angeordnet, vorliegen; AMAs werden verwendet, um Proteine/Phosphoproteine in komplexen Gemischen zu detektieren und zu quantizifieren AMG Arzneimittelgesetz AML Akute myeloische Leukämie: Subform der akuten Leukämie Ampicillin Antibiotikum aus der Gruppe der Penicilline Amplifikation Gezielte Vermehrung von DNA-Abschnitten Anämie Blutarmut, unterschiedliche Pathogenese Annotation Anmerkung Anoikis Tod durch „Heimatlosigkeit“ infolge eines Verlusts des physiologischen Mikromilieus, z. B. von Kontakten zu Nachbarzellen oder der Extrazellulärmatrix ANOVA Analysis of variance: Statistische Methoden zur Auswertung von linearen Modellen mit qualitativen Einflussfaktoren Anthrax Milzbrand Antidiabetika, orale Alle Wirkstoffe gegen Diabetes mellitus, die eingenommen werden können – im Gegensatz zu den Insulinen, die gespritzt werden müssen Antigen Stoffe, die potenziell in Wirbeltieren die Bildung von Antikörpern anregen; Fremdsubstanz, die spezifisch von einem Antikörper oder Lymphozyten gebunden wird, im weitesten Sinne auch für Substanzen gebraucht, die nach Kontakt zu einer Immunantwort führen und von Komponenten des Immunsystems gebunden werden (ursprünglich abgeleitet von Antikörper-Generator); s. auch 7 Immunogen Antigenbindungsort 7 Antigenbindungsregion Antigenbindungsregion Der Teil eines Antikörpermoleküls (oder eines T-Zell-Rezeptors), der das Antigen spezifisch bindet Antigendeterminante 7 Epitop Antigenpräsentation Präsentation von Antigenen an der Oberfläche von Zellen in Form von Peptidfragmenten, die an MHC-Moleküle gebunden sind; T-Zellen erkennen Antigene nur in dieser Form Antigenrezeptor Der spezifische antigenbindende Rezeptor auf B- oder T-Lymphozyten; auf B-Lymphozyten handelt es sich um zellständige Immunglobulinmoleküle, auf T-Lymphozyten um T-Zell-Rezeptoren

XVI

Abkürzungen und Erläuterungen

(TcR); Antigenrezeptoren werden von Genen kodiert, die durch somatische Rekombination entstanden sind (V,(D),J-Rekombination) Antikörper Proteine, die in Wirbeltieren gebildet werden, angeregt durch bestimmte eingedrungene Fremdstoffe (Antigene) und zu deren Abwehr dienen; Serumprotein, das als Antwort auf eine Immunisierung von B-Lymphozyten synthetisiert wird und das spezifisch mit dem Antigen reagiert, das zu seiner Bildung geführt hat Antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität Antibodydependent cellular cytotoxicity (ADCC): Effekt, bei dem antikörperbeladene Zellen (Zielzellen, target cells) durch zytotoxische Zellen (wie natürliche Killerzellen) zerstört werden, die Rezeptoren für das Fc-Fragment der Antikörper besitzen und die über diese Rezeptoren an die antikörperbeladenen Zielzellen gebunden werden Antikörperrepertoire Gesamtheit an Antikörperspezifitäten, die durch die B-Lymphozyten eines Organismus gegen ein einzelnes Antigen oder die Gesamtheit aller potenziellen Antigene gebildet werden können Antioxidans Wird in Lebensmitteln und in Kunststoffen eingesetzt, um die Reaktion mit dem Luftsauerstoff oder anderen oxidierenden Chemikalien zu verhindern Antirheumatika, nichtsteroidale Entzündungshemmende Arzneimittel, die keine Glukokortikoide enthalten Antiserum 7 Immunserum APAF-1 Apoptosis associated factor-1: Zytosolisches Adapterprotein, das gemeinsam mit Cytochrom c und Procaspase-9 das mitochondriale Apoptosom bildet APC Adenomatous polyposis coli APE1 Enzym, das das Zuckerphosphatrückgrat an einer AP-Stelle hydrolysiert Apoptose Programmierter Zelltod: Form des physiologischen Zelltods, der von einer biologischen Zelle selbst aktiv durchgeführt wird und durch die Aktivierung von endogenen Mechanismen ausgelöst wird, die zur Fragmentierung der DNA führen; Kunstwort gebildet aus „apoptein“ (vorzeitig herabfallen); charakterisiert eine morphologisch definierte Form des Zelltods, die meist über Caspasen ausgelöst wird und mit charakteristischen biochemischen Veränderungen einhergeht APP Amyloid precursor protein AP-Stelle Position einer fehlenden Purin- oder Pyrimidinbase Ataxia teleangiectatica (AT) Genetisch bedingte Krankheit des Menschen, die zu Chromosomenbrüchen führt ATCC „American Type Culture Collection“: Zellbank zur Sammlung, Aufbewahrung und Verteilung von lebenden Kulturen von Mikroorganismen, Viren, DNA-Proben, menschlichen und tierischen Zellen

Bacterial attachment site Attachment site left Phage attachment site Attachment site right Area under the curve: Fläche unter der Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve eines Wirkstoffs; Maß für die Arzneimittelexposition eines Organismus Auflösung Experimentelle Genauigkeit, mit der eine Röntgenstrukturanalyse durchgeführt wird; vergleichbar mit der Auflösung eines Lichtmikroskops; ab einer Auflösung von 2.8 Å kann ein atomares Modell erstellt werden; Details über einen Reaktionsmechanismus können erst bei einer Auflösung von 2.2 Å oder besser zuverlässlich beschrieben werden Autolog Das eigene Individuum betreffend, z. B. autologe Transplantation Autologes Gewebe Körpereigenes Gewebe, Spender und Empfänger sind identisch Autophagie 7 Autophagozytose Autophagozytose Distinkte Form des Zelltods, die durch Endophagosomen charakterisiert ist, d. h. Lysosomen, die zelluläre Organellen wie ER und Mitochondrien enthalten können; wird durch Wachstumsfaktor- oder Nährstoffmangel ausgelöst und ist reversibel Avidin Aus dem Ei von Vögeln isoliertes Glykoprotein, das mit extrem hoher Affinität an Biotin bindet; aus diesem Grunde für immunologische Nachweisverfahren eingesetzt; das aus Bakterien isolierte Streptavidin zeigt bei gleicher Bindungsstärke für Avidin eine geringere Tendenz zur unspezifischen Bindung attB attL attP attR AUC

B BAC Bacterial artificial chromosome Bakteriophagen (oder einfach: Phagen), bezeichnet eine

Gruppe von Viren, die sich auf Bakterien als Wirtszellen spezialisiert haben Bax Bcl-2 associated x-protein: Proapoptotisches Bcl-2Homolog, das die BH-Domänen 1 bis 3 trägt Bcl-2 B cell lymphoma-2: Bei follikulären Lymphomen entdecktes apoptosehemmendes Gen; trägt alle 4 BH-Domänen (BH1 bis –4) Bcl-2-Familie Genfamilie mit Homologie zu Bcl-2; enthält Bcl-2-homologe antiapoptotische und Baxhomologe proapoptotische Multi-BH-DomänenUntergruppen, sowie die B3-only Proteine BER Basenexzisionsreparatur Berliner Blau Eisen(III)-chlorid wird mit Kaliumhexacyano-ferrat(II) oder Eisen(II)-nitrat mit Kaliumhexacyano-ferrat(III) in Wasser vermischt; es fällt kolloidales „Berliner Blau“ aus BH-Domäne Bcl-2 Homologiedomäne BH3-only Protein Bcl-2-Familienmitglied, das nur die BH3-Signaturdomäne trägt; minimalistisches Todes-

XVII Abkürzungen und Erläuterungen

modul ist die α-helikale BH3-Domäne; benötigt Bax oder Bac für die Auslösung von Apoptose Biotin Vitamin H: Niedermolekulare Substanz mit weiter Verbreitung in verschiedenen Zellen, die an zahlreichen Carboxylierungsreaktionen beteiligt ist; wird aufgrund der extrem hohen Bindung an Avidin für immunologische Nachweisverfahren eingesetzt Biotransformation Ein Vorgang im Stoffwechsel von Lebewesen, bei welchem nicht ausscheidbare Stoffe durch chemische Prozesse in ausscheidbare Stoffe umgewandelt werden BLAST Basic local alignment search tool: Computeralgorithmus zum Nachweis von evolutionärer Sequenzhomologie durch statistische Ähnlichkeitsanalyse BLM Menschliche, metastasierende Melanomzelllinie Blockbuster Medikament, welches einen Umsatz von mindestens einer Mrd. US-Dollar pro Jahr generiert B-Lymphozyt, B-Zelle Eine der beiden Populationen der Lymphozyten, sie sind Vorläufer der antikörperproduzierenden Plasmazellen; sie tragen Immunglobulin auf ihrer Oberfläche; jeder B-Lymphozyt exprimiert nur Immunglobulin einer einzigen Spezifität; nach Aktivierung differenzieren B-Lymphozyten in Plasmazellen, die Antikörper der gleichen Spezifität produzieren; die Reifung der B-Lymphozyten erfolgt im Knochenmark („bone marrow“, daher „b-lymphocyte“) BMP Bone morphogenetic protein, Knochenwachstumsfaktor Bottleneck-Hypothese Populationsgenetisches Modell zur Erklärung der Fixierung mitochondrialer Mutationen und der raschen Entmischung heteroplasmatischer mtDNA-Genotypen in der Generationsfolge; durch eine Reduktion in der Ausgangszahl der Mitochondrien bzw. mtDNA-Moleküle („bottleneck“) in der weiblichen Keimbahn wird genetischer Drift begünstigt, der dazu führt, dass starke Schwankungen im mtDNA-Genotyp der Nachkommenschaft auftreten bp Basenpaar: Maßeinheit für genomische Sequenzen Brute-Force-Methode Methode der rohen Gewalt: Fachbegriff für eine Lösungsmethode schwerer Probleme, die auf dem Ausprobieren aller oder zumindest eines erheblichen Teils der infrage kommenden Varianten beruht BSE Bovine spongiforme Enzephalopathie bulk Massenware (im Gegensatz zu Feinchemikalien) Bulky adduct DNA-Schaden, bei dem es zu einer Verzerrung der DNA-Helix kommt B-Zelle 7 B-Lymphozyt C Cap 7-Methylguanosin-Cap: Das 5’-Ende der reifen

eukaryoten mRNA besitzt eine „Kappe“, bestehend

aus einem 7-Methylguanosin, das über eine 5’-Triphosphat-Verbindung an die mRNA gebunden ist Cap-Bindekomplex Der eIF4F-Proteinkomplex, bestehend aus den Initiationsfaktoren 4E, 4A und 4G, der die Bindung der kleinen Untereinheit in der Nähe der Capstruktur ermöglicht CARD Caspase recruitment domain Caretaker Gen, das die Mutationsrate herabsetzt, insbesondere von DNA-Reparaturgenen Caspase Cysteinyl-Aspartase: Apoptoseexekutierendes Enzym CAT Committee for Advanced Therapies CDK Cyclin-dependent protein kinase; zyklinabhängige Kinase: Familie der CDKs bildet gemeinsam mit den Zyklinen das Kontrollsystem des Zellzyklus in Eukaryonten CD-Marker Zelloberflächenmoleküle auf Leukozyten und Plättchen, die mithilfe von monoklonalen Antikörpern nachweisbar sind und zur Differenzierung von Zellpopulationen genutzt werden (abgeleitet von der engl. Abk. für „cluster of differentiation“; s. auch 7 Differenzierungsantigen) cDNA Complementary DNA: Stabile klonierte Kopie einer mRNS-Sequenz CDR Complementarity-determining region: 7 hypervariable Regionen CEA Karzinoembryonales Antigen: Glykoprotein, das während der Embryonalentwicklung und im adulten Organismus von Tumorzellen epithelialen Ursprungs exprimiert wird CEAs Cultured epithelial autografts: Kultivierte autologe Hautzellen zur Regeneration von Hautgewebe z. B. bei Verbrennungen CFE Colony forming unit; koloniebildende Einheit: Maß der Reproduktionskapazität kultivierter Zellen, insbesondere von hämatopoetischen Zellen CGD Chronische Granulomatose Chaperone Proteine, die neu synthetisierten Proteinen „helfen“, sich korrekt zu falten Checkpoint-Kontrolle Kontrollmechanismen, die die Integrität der DNA bzw. die korrekte Anordnung der Chromosomen in der Metaphase überprüfen und im Falle eines Fehlers zur Arretierung des Zellzyklus führen, bis der Defekt behoben ist Chimäre Mythisches Mischwesen, das Körperteile verschiedener Tiere besitzt; der Ausdruck wird deshalb für Individuen benutzt, die Zellen anderer Individuen enthalten und für Moleküle, die aus Teilen verschiedener Ursprungsmoleküle bestehen Chimäre Antikörper Durch rekombinante DNA-Technik hergestellte Antikörper, die z. B. die konstante Region eines humanen Immunglobulins und die variable Region eines murinen monoklonalen Antikörpers enthalten

XVIII

Abkürzungen und Erläuterungen

Chip-on-Chip Chromatin Immunopräzipitation: Experi-

mentelle Methode zur Detektion von Protein-DNSInteraktionen Cholinesterase Enzym im Blutplasma, das den Neurotransmitter Acetylcholin und andere Cholinester spaltet CHO-Zellen Chinese hamster ovary-cells Chromatin Der Komplex aus DNA und Histonen, die die Erbsubstanz der Eukaryonten darstellt; Chromatin erlaubt eine kompakte Verpackungsform der DNA, die in der Mitose als Mitosechromosom sichtbar wird; während der Arbeitsphase liegt das Chromatin stark entspiralisiert vor, sodass keine Chromosomen im Lichtmikroskop erkennbar sind Chromatin-Modifikationskomplex Multiproteinkomplexe, die durch DNA-gebundene Regulationsfaktoren gebildet werden und benachbartes Chromatin durch Acetylierung, Methylierung und Phosphorylierung modifizieren Chromatin-Remodeling-Komplex Multiproteinkomplexe, die durch DNA-gebundene Regulationsfaktoren rekrutiert werden und benachbarte Nukleosomen verschieben oder öffnen Chromosom Die Organisationsstruktur der DNA mancher eukaryoter Organismen; Träger des Erbmaterials (Chromatin); beim Menschen ist die gesamte Erbinformation auf 46 Chromosomen untergebracht Chromosomenterritorien Beschreibt die Zellkernarchitektur, die während der Arbeitsphase des Zellzyklus einzelne Chromosomen auf räumlich umgrenzte Bereiche des Zellkerns beschränkt CISS Chromosomal in situ suppression hybridisation, chromosomale In-situ-Suppressions-Hybridisierung: Nichtisotopisches Verfahren zur selektiven Hybridisierung und Identifizierung chromosomaler Abschnitte Clearance Entfernung einer Substanz aus einem gegebenen Körpersystem CLSM Confocal laser scanning microscope, konfokales Laserrastermikroskop Compound-Heterozygotie Patienten mit einer autosomal-rezessiven Krankheit, bei denen die beiden Allele des verantwortlichen Gens zwei verschiedene Mutationen tragen COMT Catechol-O-Methyltransferase: Wichtiges Enzym beim Abbau von Catecholaminen Controlled release Kontrollierte (meistens verzögerte) Freisetzung eines Wirkstoffs CpG-Dinukleotid Eine Nukleotidfolge von Cytosin und Guanosin, die potenziell am Cytosin methylierbar ist und zur Genabschaltung führt CR-Domäne Complement regulatory domain oder complement control protein (CCP) domain: In verschiedenen Zelloberflächenproteinen und Proteinen der

Komplementkaskade vorkommende Proteindomäne; besteht aus mehreren E-Strängen Cre DNA-Rekombinase des Bakteriophagen P1 C-Region 7 konstante Region Crossing-over Reziproker Austausch zwischen Segmenten homologer Chromosomen; wird im Kreuzungsexperiment als Faktorenaustausch nachgewiesen; das zytogenetische Korrelat sind die Chiasmata zwischen den homologen Chromosomen in der Meiose CS Cockayne-Syndrome C-Typ-Lektindomäne Kohlenhydratbindende Domäne, die in verschiedenen Lektinen, z. B. in den Selektinen, vorkommt Cy3 Cyanin-Farbstoff, der Licht im Wellenlängenbereich von 510–550 nm (grün) emittiert Cy5 Cyanin-Farbstoff, der Licht im Wellenlängenbereich von 630–660 nm (rot) emittiert Cytochrom P450 Cytochrom P450-Enzyme: Familie von Hämproteinen mit Monooxygenaseaktivität mit großer Bedeutung für den Arzneimittelstoffwechsel; Vorkommen vor allem in der Leber, aber auch in anderen Organen; Komplex mit Kohlenmonoxid weist eine Absorptionsbande bei 450 nm auf Cytochrom-P450-Reduktase Bestandteil des CytochromP450-Enzymsystems, NADPH-abhängiges Flavoprotein Cytokeratin Bestandteil des Cytoskeletts in der Zelle; bestimmte Cytokeratine sind nur in bestimmten Zellpopulationen, wie z. B. Epithelzellen vorhanden D DALI Ein internetbasierter Server, von dem man Vorher-

sagen der Sekundärstruktur von Proteinen bei gegebener Sequenzinformation ableiten kann Darmflora Mikroorganismen im Verdauungstrakt von Mensch und Tier DD Death domain: Konsensuspeptidsequenz im zytosolischen Anteil von Todesrezeptoren, die zur Rekrutierung von Adapterproteinen wie TRADD oder FADD benötigt wird 2DE 2-dimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese: Mit dieser Methode werden Proteine aus komplexen Gemischen in zwei Dimensionen aufgetrennt; 1. Auftrennung durch isoelektrische Fokussierung nach dem isoelektrischen Punkt (Ladung), 2. Auftrennung durch eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach dem Molekulargewicht (Größe) DED Death effector domain: Konsensuspeptidsequenz in FADD, Procaspase-8 und 10, über die diese Proteine miteinander interagieren und den DISC bilden Deletion Verlust eines DNA- oder Chromosomenabschnitts Depurinierung Verlust einer Purinbase; es entsteht eine AP-Stelle

XIX Abkürzungen und Erläuterungen

Depyrimidierung Verlust einer Pyrimidinbase; es ent-

Disulfidbrücke Eine Atombindung zwischen zwei

steht eine AP-Stelle Desaminierung Hydrolyse einer Aminogruppe Designer-Bugs Ausdruck für biotechnologisch entwickelte Mikroorganismen, die sehr spezielle Aufgaben übernehmen bzw. Produkte herstellen können Desoxyribozym, DNA-Enzym DNA-Molekül mit enzymatischer Aktivität Determinante 7 Antigendeterminante D-Gene Diversity: Antikörper-Gensegmente, die die 3. hypervariable Region der Antigenbindungsregion der schweren Kette der meisten Antikörper kodieren; D-Gene werden als multiple Gensegmente über die Keimbahn weitergegeben; zur Kodierung der gesamten variablen Region eines Antikörpers ist die Rekombination (7 V(D)J-Rekombination) mit einem V-Gen und einem J-Gen erforderlich Dicer Eine RNase, die doppelsträngige RNA in Stücke mit einer Länge von 21 Nukleotiden (siRNA) zerlegt Differenzierungsantigen Oberflächenantigen, das nur in bestimmten Differenzierungsstadien bestimmter Zellpopulationen nachweisbar ist und damit als Differenzierungsmarker genutzt werden kann DIGE Differenzielle Gelelektrophorese (difference gel electrophoresis): Zwei Proteinextrakte aus zwei Geweben oder Zellpopulationen werden mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und vor der 2D-Elektrophorese gemischt; die Markierung erfolgt oft mit Cy3 und Cy5 über die primären Amine der Proteine; mit dieser Methode können differenziell exprimierte Proteine aus zwei Zuständen verglichen und quantifiziert werden Dihedralwinkel Beschreibt den Rotationswinkel um eine chemische Bindung; man benötigt vier Atompositionen, um die Rotation um die chemische Bindung zwischen den beiden mittleren Atomen beschreiben zu können Dimer Ein Molekül, das aus zwei Untereinheiten, den Monomeren, besteht Diphtherie Akute, mitunter lebensbedrohliche Infektionskrankheit der oberen Atemwege Dipol Zwei räumlich getrennte entgegengesetzte Ladungen erzeugen einen elektrostatischen Dipol; aufgrund der unterschiedlichen Elektronegativität von Kohlenstoff und Sauerstoff, sowie von Wasserstoff und Stickstoff besitzt die Pepdidbindung zwei parallel ausgerichtete schwache Dipole DISC Death-inducing signaling complex: Wird vorwiegend gebraucht für den Komplex aus Todesrezeptor, FADD und Procaspase 8, der nach Bindung des Todesliganden an den Todesrezeptor gebildet wird Diskontinuierliches Epitop 7 Konformationsepitop

Schwefelatomen, die in Aminosäureseitenketten von zwei Cysteinresten vorkommen 2,5-DKG 2,5-Diketo-D-Gluconsäure DLCL Diffuse large cell lymphoma: DLCL gehört zu einer Gruppe von Krebserkrankungen, die als aggressive Non-Hodgkin-Lymphome zusammengefasst werden. D-Loop Verdrängungsschlaufe, Zwischenprodukt der HRR: Dreisträngige DNA-Struktur, bestehend aus den beiden parentalen mtDNA-Strängen und dem partiell replizierten H-Strang im Bereich der mtDNA; stellt ein stabiles Intermediärprodukt der mtDNA-Replikation dar DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium; Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium: häufig verwendetes Kulturmedium, besonders geeignet für Zellen der Maus DMSO Dimethylsulfoxid: Lösungsmittel, das in der Zellkultur als Differenzierungsinduktor und als Bestandteil des Kryokonservierungsmediums Anwendung findet DNA Desoxyribonukleinsäure, die in der Regel als Doppelhelix im Zellkern vorliegt und als Erbsubstanz dient DNA-Glykosylasen Enzyme, die modifizierte Basen der DNA erkennen und hydrolysieren, es entsteht eine AP-Stelle DNA-Methylasen Enzyme, die CpG-Sequenzen erkennen und am Cytosin methylieren können Domäne Kompaktes Segment einer Immunglobulinkette DSB Doppelstrangbrüche DSBR-Modell Double-Strang-Break-Repair-Model dsRNA Doppelstrang-RNA DTH Delayed-type hypersensitivity-reaction Dysplasie Atypische Zellproliferation im Sinne einer Krebsvorstufe, enthält noch nicht alle Kriterien einer Neoplasie E ECACC European Collection of Animal Cell Cultures:

Europäische Zellbank zur Aufbewahrung, Sammlung und Verteilung von Zellkulturen (Protein Dawn, U. K.) ECC Embryonic carcinoma cells, embryonale Karzinomzellen, EC-Zellen: Permanente Linien pluripotenter maligner Stammzellen aus Teratokarzinomen, bei der Maus experimentell induziert durch Transplantation embryonaler Zellen an extrauterine Orte ECM Extrazellulärmatrix: Netzwerk hochmolekularer Polysaccharide (z. B. Glykosaminoglykane) und Proteine (z. B. Kollagene); dient als Strukturelement der Gewebe; reguliert die Entwicklung und Funktion

XX

Abkürzungen und Erläuterungen

vieler Zelltypen; komplexes Gemisch von Proteinen (z. B. Kollagenen, Fibronektin, Laminin, Proteoglykane), welches die meisten Zellen vielzelliger Tiere umgibt; die ECM bildet ein geordnetes azelluläres Gerüst, in dem Zellen migrieren und kommunizieren können; die ECM zwischen Epithelzellen und Bindegewebe wird als Basalmembran bezeichnet Effektorcaspase Durch Initiatorcaspasen proteolytisch in p10 und p20-Untereinheiten gespaltene und hierdurch aktivierte Caspasen mit typischer kurzer Prodomäne Effektormoleküle Moleküle (in erster Linie Komplement), die eine Zerstörung bzw. Inaktivierung von Pathogenen oder Antigenen bewirken und Antikörpern diese Funktion vermitteln Effektorzellen Zellen, die eine Entfernung von Pathogenen oder Antigenen aus dem Organismus bewirken und Antikörpern diese Funktion vermitteln EGC Embryonic germ cells, embryonale Keimzellen, EG-Zellen: Permanente Linien pluripotenter/totipotenter undifferenzierter Zellen, die aus primordialen Keimzellen von Embryonen isoliert und kultiviert werden können EGF Epithelial growth factor, epithelialer Wachstumsfaktor EGF-Domäne Proteindomäne mit Ähnlichkeit zum epidermalen Wachstumsfaktor, kommt in verschiedenen Zelloberflächenproteinen und ECM-Proteinen vor und enthält 6 konservierte Cysteinreste EHS Engelbreth-Holm-Swarm: Tumor mit einem hohen Gehalt an ECM-Proteinen und Wachstumsfaktoren Einzelkettenantikörper ScAb, single chain antibody, auch scFv, single chain antigen binding fragment: Rekombinante Antikörperfragmente, die aus den variablen Bereichen der leichten und der schweren Kette bestehen und die über ein Peptidfragment zu einer Kette verknüpft sind ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay: Variante eines Enzymimmuntests; 7 Enzymimmuntest EM Extensive metabolizer: Individuum mit erhöhter Metabolisierungskapazität (zwei Wildtypallele) in Bezug auf ein Cytochrom-P450-Enzym (z. B. CYP2E6 oder CYP2C19) Emmerweizen Eine alte Kulturform des Weizens emMLV Ekotrope murine Moloney-Leukämie-Viren Enabling-Technologien Sammelbegriff für neue Technologien wie z. B. kombinatorische Chemie, Bioinformatik, Nanotechnologie etc. Endosymbiontenhypothese Erklärungsmodell zur Herkunft der Mitochondrien (und der Chloroplasten); demnach stammen die Zellorganellen von ursprünglich autonomen Bakterien (bzw. Blaualgen) ab; über die Zwischenstufen einer intrazellulären Symbiose (Endosymbiose) haben sich diese Prokaryonten zu ab-

hängigen Bestandteilen der Eukaryontenzelle entwickelt Enhancer Regulatorische Sequenzen, die zum Teil weit entfernt vom regulierenden Gen vorliegen und nach Bindung von Regulationsfaktoren mit dem Promotor interagieren Entzündung Akute oder chronische Antwort auf eine Infektion oder Gewebsschädigung, gekennzeichnet durch Ansammlung von Leukozyten, Plasmaproteinen und Flüssigkeit Enzymimmuntest Immunologischer Test zum Nachweis von Antigenen oder Antikörpern, bei dem einer der Reaktionspartner mit einem Enzym markiert ist und das Produkt der Enzymreaktion gemessen wird Epidemie Eine unübliche Häufung einer Krankheit innerhalb einer Population Epitop-Antigendeterminante Der Teil eines Antigens, der von einer Antigenbindungsregion spezifisch gebunden wird; s. auch 7 Konformationsepitop und Sequenzepitop Epstein-Barr-Virus Humanes DNA-Virus der Herpesgruppe, das B-Lymphozyten infiziert und eine Proliferation der Zellen (in einigen Fällen auch eine maligne Transformation) hervorruft ER Endoplasmatisches Retikulum Eradikationstherpaie Medikamentöse Therapie zur Beseitigung von Helicobacter pylori, die aus einer Kombination von einem Protonenpumpenhemmer und mindestens zwei Antibiotika besteht ErbB Familie von Rezeptortyrosinkinasen ESC Embryonic stem cells, embryonale Stammzellen, ES-Zellen: Permanente Linien pluripotenter/totipotenter embryonaler undifferenzierter Stammzellen; ES-Zellen bilden die methodische Grundlage für das Gene targeting zur Schaffung von Mäusen mit spezifischen genetischen Defekten Escherichia coli (E. coli) Gramnegatives, stäbchenförmiges und peritrich begeißeltes Colibakterium, das im menschlichen und tierischen Darm vorkommt EschG Embryonenschutzgesetz ESI Elektrospray-Ionisierung: Methode zur Ionisierung von Peptiden in der Massenspektroskopie; durch Anwendung einer hohen Spannung an einen Flüssigkeitsstrom aus einer Kapillare kommt es zum Schrumpfen der hoch geladenen Tropfen, die resultierenden Peptidfragmente werden aufgetrennt und können mit verschiedenen Methoden detektiert werden ESKM Aus embryonalen Stammzellen differenzierte Kardiomyozyten EST Expressed sequence tags: Kurze Sequenzabschnitte, aus Primärtranskripten von Genen gewonnen, die Aussagen erlauben, welche Gene in funktionellen oder pathologischen Zuständen einer Zelle abgerufen werden

XXI Abkürzungen und Erläuterungen

ES-Zellen Embryonale Stammzellen Eukaryot Bezeichnung für Lebewesen mit Zellkern und

Zytoskelett Exo Exonukleasen Exon Bestandteil von Primärtranskripten, der bei deren Prozessierung in der RNA erhalten bleibt; kodierender Abschnitt eines DNS-Sequenzabschnitts im Genom; Sequenzabschnitte der Vorläufer-RNA, die nach erfolgter Prozessierung in der fertigen mRNA wieder zu finden sind Experimentus crucis Schlüsselexperiment, hier zur Erarbeitung „Gentechnischer Grundlagen für biotechnologische Anwendungen“ Extrinsischer Apoptoseweg Der über Todesrezeptoren und deren Todesliganden aktivierte Apoptosesignalweg Ex vivo Bedeutet „aus dem Lebenden“ und charakterisiert Reaktionen bzw. Abläufe, bei denen aus dem Organismus entnommene, lebende Gewebe isoliert unter Laborbedingungen getestet bzw. manipuliert werden F FA Fanconi-Anämie: Kongenital bei Kindern Fab Fragment antigen-binding: Antikörperfragment,

das nur eine Antigenbindungsregion enthält; entsteht durch Spaltung mit Papain F(ab’)2 Antikörperfragment, das zwei Antigenbindungsregionen enthält; entsteht durch Spaltung mit Pepsin; s. auch 7 Fab FACS Fluorescence activated cell sorter, fluoreszenzaktivierter Zellsorter: Gerät zur Zellsortierung mittels Fluoreszenzmarkierung FADD Fas-associated death domain: Zytosolisches Adapterprotein, das gemeinsam mit z. B. dem CD95/FasRezeptor und der Procaspase-8 den DISC bildet; enthält sowohl eine DD als auch eine DED (s. dort) FASTA Algorithmus und Computerprogramm für die Analyse von Protein- und DNS-Sequenzen, zum Auffinden von Homologen und anderen Verwandten Fc Fragment crystallizable: Antikörperfragment ohne Antigenbindungsregion, das die C-terminalen Domänen enthält; entsteht durch Spaltung mit Papain; Fc-Rezeptor FDA Food and Drug Administration: US-amerikanische Genehmigungsbehörde FDG-PET 2-[18F]-fluoro-2’desoxy-glucose, quantitative positron emission tomography FDR False discovery rate: Erwartete Anzahl korrekter Testablehnungen bei statistischen Testentscheidungen Feedback-Hemmung Entsteht, wenn das Produkt einer Reaktionskette auf das Enzym am Anfang dieser Kette hemmend wirkt; dadurch entsteht automatisch ein Regelkreis

Fibrinolyse Bezeichnung für die körpereigene Auflösung

eines Blutgerinnsels (Thrombus) durch das Enzym Plasmin FISH Fluorescence in situ hybridization, Fluoreszenzin-situ-Hybridisierung: Methode zur chromosomalen Lokalisierung von DNA-Proben FITC 7 Fluoresceinisothiocyanat FIV Felines Immundefizienzvirus FKS Fötales Kälberserum: Wichtiger Bestandteil des Mediums zur Kultivierung tierischer Zellen und Gewebe Flp DNA-Rekombinase von S. cerevisiae Fluoresceinisothiocyanat FITC: Fluoreszenzfarbstoff mit gelb-grüner Fluoreszenz, der häufig für die Markierung von Antikörpern und anderen Proteinen genutzt wird Fluoreszenzaktivierter Zellsortierer Fluorescence-activated cell sorter (FACS): Gerät zur Identifizierung und Sortierung von Zellen, an die fluoreszenzfarbstoffmarkierte Antikörper gebunden werden Flybase Datenbank des Genoms der Taufliege Drosophila FNIII-Domäne Fibronektin-Typ-III-Domäne: In Zelladhäsionsmolekülen häufig vorkommende Proteindomäne, die aus zwei E-Faltblättern besteht Fos- und Jun-Proteine Wichtige Transkriptionsfaktoren, die über ihre „Zipper“-Domäne dimerisieren und mit ihrer basischen Domäne an die DNA binden; sie regulieren die Expression einer Vielzahl von Genen, die in Differenzierung, Apoptose und Zellproliferation eingreifen Frameshift Das Einfügen oder Deletieren von Nukleotiden in der kodierenden Region führt zur Verschiebung des Leserasters; dies führt zum Einbau von falschen Aminosäuren und zum Abbruch der Translation, sobald das Ribosom im veränderten Leseraster auf ein Stoppkodon trifft Freundsches komplettes Adjuvans Adjuvans auf Ölbasis, das abgetötete Mykobakterien enthält; nach Mischen mit einem Antigen wird eine Wasser-in-Öl-Emulsion gewonnen, die nach Injektion eine starke Immunreaktion gegen das Antigen hervorruft FRT Erkennungssequenz der Flp-Rekombinase Fusionstranskript Chimäres Transkriptionsprodukt FWER Family wise error rate: Globales Signifikanzniveau bei statistischer Korrektur gegen multiples Testen G β-Gal E-Galaktosidase ist ein Markergen, das immun-

histochemisch, luminometrisch und via FACS-Messung eine qualitative und quantitative Bestimmung der Genexpression auf zellulärer und Gewebeebene erlaubt Gatekeeper Gene, die das Tumorwachstum positiv beeinflussen, insbesondere Protoonkogene und Tumorsuppressorgene

XXII

Abkürzungen und Erläuterungen

GCCP Good cell culture practice: Richtlinien einer guten

Zellkulturpraxis Gelbes Blutlaugensalz Anderer Name für Kaliumhexa-

cyanoferrat Gelenkregion Hinge region: Flexible Region des Anti-

körpermoleküls, die eine Beweglichkeit der Antigenbindungsregionen ermöglicht Genamplifikation Vermehrte Kopienzahl eines Gens innerhalb einer Zelle (häufig bei Onkogenen) Genetische Transformation Umwandlung vom Genotyp eines Mikroorganismus durch den Transfer von Genen aus einem anderen Mikroorganismus in dessen Genotyp bzw. Phänotyp Genkonversion Somatische Genkonversion Genom Gesamtheit der genetischen Information einer Spezies Genomische Marker Spezifische Nukleotidsequenzabschnitte, die das Auffinden eines Gens oder anderer genomischer Elemente in einer Datenbank ermöglichen, ebenso Sequenzabschnitte, die als Startsequenzen in der PCR-Reaktion dienen können Genomkartierung Lineare Darstellung der auf einem Chromosom vorhandenen genomischen Abschnitte Genotyp Erbbild eines Organismus repräsentiert seine exakte genetische Ausstattung (den individuellen Satz von Genen, den er im Zellkern in sich trägt); Kombination der beiden Allele eines Gens GFAP Glial fibrillary acidic protein, gliafibrilläres saures Protein: Bestandteil der Intermediärfilamentproteine des Zytoskeletts von Gliazellen GFP Green fluorescent protein GFR GDNF Family Receptor GGR Global Genome Repair GLP Good laboratory practice: Grundsätze guter experimenteller (Labor-)Praxis Glukagon Blutzuckerhebendes Hormon Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase Enzym im Glukosestoffwechsel, das für die Menge an reduziertem Glutathion in der Zelle mitbestimmend ist; reduziertes Glutathion wirkt als Antioxidans; Mangel an Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase führt zu einer vermehrten Hämolyse GMP Good manufacturing practice: Zertifikat für geprüfte gute Herstellungspraxis GO Gene ontology: Internationales Konsortium zur Annotation und Klassifizierung von Proteinsequenzen GPCR G-protein coupled receptor GPI-Anker Glykosylphosphatidylinositol-Anker: Posttranslationale Modifikation vieler Zelloberflächenproteine, die als Plasmamembrananker dienen; enthält u. a. Mannose, Glucosamin, Myoinositol und Diacylglycerin GPS Global Pharma Specialists GSK Glykogensynthasekinase

H HAART Highly active antiretrovial therapy, hochaktive

antiretrovirale Therapie Halbsynthetische Antibiotika Die natürlichen Bausteine

der Antibiotika werden gewonnen und modifiziert, um die antibiotische Wirksamkeit zu erhöhen und die Resistenzausbildung bei den Krankheitserregern zu verhindern Halophile Proteine Proteine, welche bei hohen Salzkonzentrationen biologisch aktiv sind Hämophilie A Erbkrankheit, bei der die Blutgerinnung gestört ist durch Fehlen des Gerinnungsfaktors VIII; das Blut aus Wunden gerinnt nicht oder nur langsam (es gibt weitere 5 Arten) Haplotyp Kombination von Allelen gekoppelter Genloci auf demselben Chromosom, die unverändert vererbt werden, falls keine Rekombination in der betreffenden Region stattfindet HBV Hepatitis-B-Virus HCV Hepatitis-C-Virus Hdm-2 Humanes Homolog des murinen double-minute-2-(mdm-2-) Gens, das durch seine Bindung an p53 und Aktivität als E3-Ubiquitinligase dessen Aktivität hemmt und proteasomalen Abbau fördert HeLa-Zellen Menschliche Epithelzellen eines Gebärmutterhalskrebses; die ersten menschlichen Zellen, von denen eine permanente Zellkultur etabliert wurde Helicobacter pylori Gramnegatives Bakterium, das im Magen vorkommt und heute für eine Reihe von Magenkrankheiten verantwortlich gemacht wird, bei denen eine verstärkte Sekretion von Magensäure auftritt (Magengeschwüre, Zwölffingerdarmgeschwüre); disponiert für Magenkrebs Helikase Enzymatische Aktivität, die bei der Entwindung doppelsträngiger Nukleinsäuren wichtig ist Hemimethyliert Nur an einem Strang methylierte DNA HER-2 Humaner epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor-2 hES Humane embryonale Stammzellen Heterochromatin Dauerhaft inaktive Chromatinbereiche, die kompakt in der Arbeitsphase des Zellzyklus vorliegen und lichtmikroskopisch erkennbar sind; unter „konstitutivem Heterochromatin“ versteht man eine (vermutlich inaktive) Chromatinfraktion, die in allen Zellen eines Individuums gefunden wird, aus überwiegend oder ausschließlich repetitiver DNS besteht und bei den homologen Chromosomen an identischen Stellen vorkommt; das „fakultative Heterochromatin“ kennzeichnet einen nur vorübergehend inaktiven, stärker färbbaren Chromatinzustand Heterogenie Ein bestimmter Phänotyp kann durch eine Mutation bzw. zwei Mutationen in jeweils einem von insgesamt mehreren möglichen Genen bedingt sein (Locus-Heterogenie); davon unterschieden werden

XXIII Abkürzungen und Erläuterungen

unterschiedliche Mutationen auf den beiden Allelen eines Gens (allelische Heterogenie) Hetero-/Homoplasmie Gemischt-/Reinerbigkeit der mitochondrialen DNA; im Gegensatz zum Kerngenom existieren keine ausgeprägten Regelmechanismen für die Kopienzahl der mtDNA und deren Verteilung auf die Tochtermitochondrien; daher kommt es bei verschiedenen mtDNA-Genotypen (i. e. bei Mutation in einem mtDNA-Molekül) zu graduierten Verhältnisanteilen zwischen den Genotypen Heterozygotentest Untersuchung einer klinisch gesunden Person hinsichtlich einer heterozygoten Anlageträgerschaft für eine autosomal-rezessive oder X-chromosomal-rezessive Erkrankung HGF Hepatocyte growth factor, Hepatozyten-Wachstumsfaktor Histokompatibilität In der Immunologie: Identität in allen Transplantationsantigenen; die entsprechenden Antigene werden vom MHC-Locus kodiert Histon Eine Klasse kleiner, basischer Proteine, die an die saure DNA binden und zum Aufbau der Nukleosomen und des Chromatins beitragen Histonacetyltransferase Eine enzymatische Aktivität der Chromatinmodifikationskomplexe, die zur Acetylierung von Histonen führt Histondeacetylase Eine enzymatische Aktivität der Chromatinmodifikationskomplexe, die zur Deacetylierung von Histonen führt und damit zu einer Inaktivierung des betreffenden Gens Histonkode Beschreibt spezifische Modifikationsmuster der Histone, die zu einer An- oder zu einer Abschaltung von Genaktivität führen Histonmethylase Eine enzymatische Aktivität der Chromatinmodifikationskomplexe, die zu Methylierungen der Histone führt HIV Human immunodeficiency virus, humanes Immunschwächevirus HIV-1 Human immunodeficiency virus type 1 H-Kette 7 schwere Kette HLA Human leukocyte antigens: Der MHC-Komplex des Menschen; 7 MHC HMBA Hexamethylenbisacetimid, wird in der Zellkultur neben Retinsäure und DMSO als Differenzierungsinduktor verwendet HMG-CoA-Reduktase-Hemmer Hydroxymethylglutaryl-CoA-Reduktasehemmer: Schlüsselenzym der Cholesterolsynthese HNPCC Heriditary nonpolyposis colon cancer Holliday-Struktur Überkreuzte Struktur, Zwischenprodukt der HRR Homeobox- (Hox-)Gene Gene mit regulatorischer Funktion, besonders in den frühen Entwicklungsabschnitten mehrzelliger Organismen; die Genprodukte enthalten eine DNA-Bindedomäne (Homeobox), die

über eine helikale Struktur an DNA-Sequenzen binden Homologe Rekombination Strangtausch zwischen homologen DNA-Molekülen Housekeeping-Gen Gen mit relativ konstanter Transkriptionsaktivität in verschiedenen Geweben HRR Homologe Rekombinationsreparatur HSC Hematopoietic stem cells, hämatopoetische Stammzellen HSP/LSP Heavy-/light strand promotor der mitochondrialen DNA im Bereich der mtDNA-Kontrollregion H-Strang/L-Strang Die beiden komplementären DNAStränge der mtDNA werden auch als „heavy“- bzw. „light“-Strang bezeichnet; die Differenzierung ergibt sich aus der unterschiedlichen Dichte der beiden Stränge bei der denaturierenden CäsiumchloridDichtezentrifugation aufgrund der Basenzusammensetzung HSV-TK Herpes-simplex-Thymidinkinase: Enzym, das Prodrugs in transfizierten Zellen und deren Nachbarzellen (sog. Bystander-Effekt) phosphoryliert und dabei in zytotoxische Metabolite überführt; wird in der Suicide-Gentherapie eingesetzt 5-HT3-Antagonisten Hemmstoffe des Serotoninrezeptors, die durch Blockade des Rezeptors antiemetisch wirken HTS High-throughput-Screening Humanisierung Gentechnisches Verfahren, mit dem die Gensegmente, die die hypervariablen Regionen eines spezifischen murinen Antikörpers kodieren, mit humanen Genen kombiniert werden, die den gesamten anderen Teil des Immunglobulinmoleküls kodieren; dadurch entsteht ein Antikörper mit humanen Effektorfunktionen, dessen Spezifität identisch mit der des ursprünglichen Mausantikörpers ist; die Immunogenität des Antikörpers nach Injektion in Menschen ist im Vergleich zum ursprünglichen Mausantikörper reduziert Hybridisierung Identifizierung von DNS- oder RNSAbschnitten durch Bindung an eine vorgefertigte spezifische komplementäre Sequenzstruktur Hybridom Immortalisierte Hybridzelle, die durch Fusion von antikörperproduzierenden B-Lymphozyten mit Myelomzellen entstanden ist; Hybridomzellen vermehren sich unbegrenzt und produzieren kontinuierlich Antikörper ohne zusätzliche Antigenstimulation; sie werden in der Hybridomtechnik zur Produktion monoklonaler Antikörper eingesetzt Hybridomtechnik 7 Hybridom und monoklonale Antikörper Hybris Im aktuellen Sprachgebrauch wird „Hybris“ als ein bildungssprachlicher Ausdruck für Vermessenheit und Selbstüberhebung verwendet, die zu einem schlimmen Ende führen

XXIV

Abkürzungen und Erläuterungen

Hydrophober Kern Das Innere von Proteinen besteht

hauptsächlich aus Aminosäuren mit hydrophoben Seitenketten; die Überführung dieser Aminosäuren aus der wässrigen Phase in eine hydrophobe Umgebung wird als treibende Kraft bei der Proteinfaltung angesehen 8-Hydroxyguanin Oxidationsprodukt des Guanins Hype Unter Medienrummel (engl. „hype“) werden meist kurzlebige, in den Medien aufgebauschte oder übertriebene Nachrichten verstanden Hyperimmunisierung Mehrmalige Immunisierung, in der Regel unter Zusatz von Adjuvanzien, mit dem Ziel einer starken Immunreaktion, z. B. zur Gewinnung großer Mengen von Antikörpern bzw. B-Lymphozyten Hypervariable Regionen CDR, complementarity-determining regions: Teile der leichten und schweren Ketten der Immunglobuline, die bei Vergleich verschiedener Antikörper in ihrer Aminosäuresequenz hochvariabel sind; die hypervariablen Regionen bilden die Antigenbindungsregion des Antikörpermoleküls (und auch der T-Zell-Rezeptoren) I IAP Inhibitor of apoptosis protein: Genfamilie deren

Produkte Caspaseaktivität hemmen; RING-Fingerdomänen-tragende IAPS wirken zudem als E3-Ubiquitin-Ligasen und vermitteln den Abbau aktivierter Caspasen IBC International Bioethics Committee i.c. intrakoronar ICAM-1 Intercellular adhesion molecule-1: Zelladhäsionsmolekül der IgSF, das an der Leukozyten-Endothel-Interaktion beteiligt ist Ig 7 Immunglobulin Ig-Domäne Proteindomäne aus zwei E-Faltblättern, die häufig durch eine Disulfidbrücke stabilisiert werden; wurde ursprünglich in Antikörpermolekülen gefunden, kommt aber in mehreren Varianten in vielen Zelladhäsionsmolekülen vor IgSF Immunglobulin-Superfamilie: Zelloberflächenproteine, die mindestens eine Ig-Domäne enthalten IHF Integration host factor IM Intermediate metabolizer: Individuum mit einem Wildtypallel und einem mutierten Allel in Bezug auf ein Cytochrom-P450-Enzym und einer daraus resultierenden mäßiggradid reduzierten Enzymaktivität, die zwischen der eines homozygoten Wildtypallelträgers und einem Träger zweier defizienter Allele liegt i.m. intramyokardial Immun-Blotting Immunologische Technik zur Identifizierung von Antigenen in einem Gemisch; Antigene, die mit einer Gelelektrophorese getrennt wurden, werden auf einen Flächenträger (z. B. Nitrozellulose)

übertragen, mithilfe markierter spezifischer Antikörper werden die entsprechenden Antigene identifiziert Immundefizienz Immundefekt: Verminderte Immunreaktivität, die aus dem Fehlen bzw. der Inaktivierung bestimmter Komponenten des Immunsystems resultiert Immunglobulin Bezeichnung für die Gesamtheit aller Antikörpermoleküle; jedes Immunglobulinmolekül ist in seiner Grundstruktur aus zwei identischen schweren und zwei identischen leichten Ketten aufgebaut und hat zwei Antigenbindungsregionen Immunglobulinklasse Isotyp: Antikörper, die sich in der Aminosäuresequenz der konstanten Regionen der schweren Klasse voneinander unterscheiden; entscheidend für die Effektorfunktion der Antikörper; den Stopp der Produktion von Antikörpern einer Klasse durch einen B-Lymphozyten und den Beginn der Produktion von Antikörpern einer anderen Klasse mit identischer Antigenbindungsregion bezeichnet man als Klassen-Switch oder Isotyp-Switch; beim Menschen und bei der Maus findet man die Immunglobulinklassen IgM, IgD, IgG, IgE und IgA, einige Klassen werden noch in Subklassen unterteilt Immunglobulinsuperfamilie Proteine, die Funktionen in der zellulären Erkennung und in Zell-Zell-Wechselwirkungen haben und die strukturell und genetisch mit Immunglobulinen verwandt sind Immunität Generelle Bezeichnung für Schutz; in der Biologie Resistenz gegenüber einem Krankheitserreger Immunogen Substanz, die in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren und dann auch mit Komponenten des Immunsystems (wie Antikörpern) zu reagieren; nicht alle Substanzen, die mit Komponenten des Immunsystems reagieren, müssen selbst auch immunogen sein, der Begriff Immunogen wird deshalb oft vom Begriff Antigen unterschieden (s. auch 7 Antigen und Hapten) Immunserum Die flüssige Komponente des Bluts eines immunisierten Individuums, die Antikörper gegen das Antigen enthält, das für die Immunisierung benutzt wurde Imprinting Beschreibt eine genomische Prägung, die darin besteht, dass väterliche und mütterliche Allele unterschiedlich exprimiert werden; wird häufig durch elternspezifische DNA-Methylierung verursacht; Modifikation des Erbguts, die z. B. für die unterschiedliche genetische Aktivität mütterlicher oder väterlicher Erbanlagen in der frühen Embryogenese verantwortlich ist Indexpatient Die betroffene bzw. erkrankte Person, durch die eine Familie mit einer erblichen Krankheit identifiziert wird Individualized medicine Auf eine bestimmte Patientenpopulation maßgeschneidertes Medikament

XXV Abkürzungen und Erläuterungen

Induktion Steigerung der Synthese eines Enzymproteins

und damit Steigerung der Enzymaktivität Inhibition Hemmung der Enzymaktivität Initiatorcaspase In Signalkomplexen aktivierte Caspase, die nachgeschaltete Effektorcaspasen aktiviert (s. dort); typischerweise tragen Initiatorcaspasen lange Prodomänen (DED oder CARD-Domäne), über die eine Bindung an den Signalkomplex erfolgt Initiator-Methionyl-tRNA Met-tRNA: Transfer-RNA, die das Startkodon AUG der kodierenden Region erkennt Insert Gen- oder „Fremd-DNA“ in einem Plasmid (meistens zur Expression eines Proteins) Insertion Einfügen von Nukleotiden oder Chromosomenabschnitten ins Genom Insulin Blutzuckersenkendes Peptidhormon und der Gegenspieler des Glukagons Int Integrase Interleukin Zytokine, die von Zellen sezerniert werden und an Rezeptoren auf der Oberfläche von Zellen binden; sie induzieren eine Signalkaskade, die unter Umständen im Zellkern spezifische Zielgene reguliert Intrabody Intrazellulär exprimiertes rekombinantes Antikörperkonstrukt (s. auch 7 Einzelkettenantikörper) Intrinsisch Von innen her kommend: Intrinsische Eigenschaften gehören zum Gegenstand selbst und machen ihn zu dem, was er ist Intrinsischer Apoptoseweg Der in der Zelle aktivierte Signalweg, der über den mitochondrialen, den ER- und auch einen lysosomalen Weg intrazellulär reguliert und verstärkt wird Intron Bestandteil von Primärtranskripten, der bei deren Prozessierung aus der RNA entfernt wird; nichtkodierender Sequenzabschnitt im Genom; die Sequenzabschnitte von Vorläufer-RNA-Molekülen, die in der fertigen Messenger-RNA fehlen Invertebraten Tiere ohne Wirbelsäule In vitro Lateinisch für „im Glas“; bezeichnet Vorgänge, die außerhalb des lebenden Organismus stattfinden In vivo Lateinisch für „im Lebenden“; bezeichnet Prozesse, die im lebenden Organismus ablaufen Inzuchtlinie 7 Inzuchtstamm Inzuchtstamm Inzuchtlinie: Versuchstiere, in erster Linie Mäuse, die durch kontinuierliche BruderSchwester-Kreuzung gezüchtet werden, genetisch einheitlich sind und die demzufolge Haut- und Organtransplantate aufgrund der identischen MHC-Moleküle nicht abstoßen IRES Internal ribosomal entry site: Ein RNA-Element, welches die direkte Bindung von Ribosomen an interne Bereiche der mRNA erlaubt; in IRES-enthaltenden mRNAs beginnt die Translation unabhängig von der Cap-Struktur IRS Insulin receptor substrate

ISH In-situ-Hybridisierung: Experimentelle Methode

zur Lokalisierung der Genexpression Isolator Regulationselemente im Chromatin, die be-

nachbarte Gene in ihrer Regulation voneinander abgrenzen Isotyp 7 Immunoglobulinklasse J JAM-1 Junctional adhesion molecule: IgSF-Protein der

Tight junctions endothelialer und epithelialer Zellen J-Gene Joining Gene: Antikörper-Gensegmente, die die

J-Segmente in der Antigenbindungsregion der Antikörper kodieren; J-Gene werden als multiple Gensegmente über die Keimbahn weitergegeben K Kartierung Genomische Marker ermöglichen eine Kar-

tierung Keimbahn 7 Keimbahngene Keimbahngene Die Gene der Keimzellen, als Gegensatz

zu den Genen der somatischen Zellen; die für die Synthese der Antikörper (und T-Zell-Rezeptoren) erforderlichen V-, D- und J-Gene werden über die Keimbahn als multiple, nicht rekombinierte Gensegmente an die Nachkommen weitergegeben; sie rekombinieren in somatischen Zellen nach dem Zufallsprinzip zu funktionellen Genen, die die Antikörper und T-ZellRezeptoren kodieren (7 V(D)J-Rekombination) Keimzellmosaik Nur ein Teil der Ei- oder Samenzellen einer Person trägt eine Mutation Kern-Hormonrezeptor Binden lipophile Liganden, wie z. B. Steroide, und wirken im Zellkern als Transkriptionsfaktoren, die direkt an die DNA binden können Killer-T-Zelle T-Lymphozyten mit zytotoxischer Aktivität 2-KLG 2-Keto-L-Gluconsäure KLH Keyhole limpet hemocyanin, ein immunologisches Adjuvans Klonale Selektion Selektion immunologisch reaktiver Zellen aus dem Repertoir vorgebildeter Lymphozyten; durch Antigenkontakt werden Zellen mit den entsprechenden Antigenrezeptoren zur Teilung und Differenzierung angeregt und wachsen zu Klonen aus; das Prinzip wurde als klonale Selektionstheorie zuerst durch Burnet formuliert Klonale Selektionstheorie 7 klonale Selektion Klonalitätsanalyse Bestimmung des klonalen Ursprungs einer Zellpopulation K-means Methode zur statistischen Clusteranalyse, die Daten anhand eines Kriteriums für eine optimale Partition des Datensatzes errechnet Knochenmark Bone marrow: Ort der Hämatopoese; hier werden Erythrozyten, Monozyten, Granulozyten, Plättchen und in Säugern auch B-Lymphozyten gebil-

XXVI

Abkürzungen und Erläuterungen

det; ist in Säugern neben dem Thymus das zweite primäre lymphatische Organ; das Knochenmark enthält pluripotente Stammzellen, aus denen nach ihrer Wanderung in den Thymus auch T-Lymphozyten gebildet werden; das Knochenmark kann demzufolge zur Wiederherstellung sämtlicher Blutzellen, einschließlich der Zellen des Immunsystems, dienen Knockout-Mäuse Mauslinien, bei denen mithilfe transgener Techniken bestimmte Gene inaktiviert werden Koaktivator Faktoren innerhalb der Chromatin-Modifikationskomplexe, die über enzymatische Funktionen benachbarte Nukleosomen so modifizieren, dass eine Genaktivierung möglich ist Kodon Kleinste genetische Informationseinheit, die drei miteinander verbundene Nukleotide bilden Kompartimente Durch Biomembranen abgegrenzte Teilbereiche eukaryoter Zellen Komplement Eine Reihe von Serumproteinen, die an Immunreaktionen als Effektormoleküle beteiligt sind; eine Komplementkaskade, die zur Lyse von Zellen führen kann, wird durch Bakterien bzw. durch Antigen-Antikörper-Komplexe ausgelöst Konditionelle Mutagenese Mutagenese durch die DNARekombinasen Cre und Flp Konduktorin Heterozygote Überträgerin (Anlageträgerin) einer X-chromosomal rezessiven Erkrankung Konformationelle Freiheitsgrade Beschreibt die Summe der möglichen räumlichen Anordnungen einer Polypeptid- oder Nukleinsäurekette; da die Bindungsabstände und Bindungswinkel von chemischen Bindungen feste Werte besitzen, beziehen sich die konformationellen Freiheitsgrade ausschließlich auf die Rotationsmöglichkeiten um Einfachbindungen entlang der Hauptkette und Seitenketten Konformationsepitop Diskontinuierliches Epitop: Epitop auf einem Proteinmolekül, das nur in der Sekundär- bzw. Tertiärstruktur vorhanden ist und von Aminosäuren gebildet wird, die in der Primärstruktur nicht aufeinanderfolgen; Konformationsepitope sind demzufolge nicht auf denaturierten Proteinen nachweisbar Konstante Region Konstanter Teil, C-Region vom engl. „constant region“: Der C-terminale Teil eines Antikörpermoleküls, der innerhalb einer Immunglobulinklasse bzw. -subklasse einer Spezies identisch in seiner Aminosäuresequenz ist Kontinuierliches Epitop 7 Sequenzepitop (vgl. Konformationsepitop) Kopplungsanalyse Indirekte Genotypdiagnostik: Hierbei wird die Vererbung nahe am verantwortlichen Gen liegender polymorpher genetischer Marker untersucht, um Anlageträger für eine bestimmte monogene Erkrankung auch ohne direkten Mutationsnachweis zu identifizieren; die Kopplungsanalyse ist an mehrere Voraussetzungen gebunden (eindeutiger Phänotyp,

keine Locus-Heterogenie, eindeutige Vaterschaft), ihre Interpretation bedarf deshalb einer besonderen Umsicht Kopplungsungleichgewicht Linkage disequilibrium: Marker oder Allele befinden sich im Kopplungsungleichgewicht, wenn sie statistisch häufiger oder seltener als durch den Zufall bei freier Kopplung erklärbar auf einem Chromosom gemeinsam vererbt werden; der Begriff bezieht sich auf eine Population von Chromosomen bzw. Individuen Korepressor Bestandteil von Chromatin-Modifikationskomplexen mit enzymatischer Aktivität; die Modifikation benachbarter Nukleosomen führt zur Abschaltung des betreffenden Gens Kosegregation Vererbung einer Mutation zusammen mit einem definierten Merkmal/Phänotyp innerhalb einer Familie; hilfreich zur Einschätzung der pathogenen Relevanz einer genetischen Variante, deren funktionelle Bedeutung unbekannt ist (vor allem MissenseVarianten) Kraftfeld Ein detailliertes Kraftfeld ermöglicht es, die potenzielle und kinetische Energie jedes einzelnen Atoms innerhalb eines Atomverbandes zu beschreiben; Kraftfelder ermöglichen z.B. Vorhersagen über die energetischen Auswirkungen von Punktmutationen auf die Proteinstruktur Kreuzreaktivität Reaktion eines Antikörpers mit mehreren Antigenen; die Kreuzreaktivität kann ein Maß für die strukturelle Verwandtschaft zwischen Antigenen sein Ku70/Ku80 DNA-Reparaturproteine, bezeichnet nach Autoimmunantikörpern, mit denen diese Proteine bei Säugern entdeckt wurden L LAD-1 Leukozyten-Adhäsionsdefizienz Typ 1: Erb-

krankheit, bei der zelluläre Wechselwirkungen von Leukozyten beeinträchtigt sind; verursacht durch Mutationen in E2-Integrinen (McKusick 116920) LAD-II Leukozyten-Adhäsionsdefizienz Typ II: Seltene Erbkrankheit, bei der zelluläre Wechselwirkungen von Leukozyten beeinträchtigt sind; Ursache ist ein Fehler in der Biosynthese fukosehaltiger Kohlenhydratstrukturen (McKusick 266265) Langsamacetylierer Individuen mit phänotypisch geringer enzymatischer Aktivität von NAT2 (s. dort) L1-CAM Neural cell recognition molecule L1: Zelladhäsionsmolekül der IgSF, das an der Entwicklung des Nervensystems beteiligt ist Leichte Kette L-Kette, light chain: Die kleinere der beiden Ketten, aus denen ein Antikörpermolekül aufgebaut ist Leukämie Unkontrollierte Vermehrung eines maligne transformierten Leukozyten

XXVII Abkürzungen und Erläuterungen

Leukozyten Weiße Blutzellen: Bestehen aus Lympho-

zyten, Monozyten bzw. Makrophagen und polymorphkernigen Leukozyten oder Granulozyten (Neutrophile, Basophile, Eosinophile) LFA-1 Leukozytenintegrin DLE2 (CD11a/CD18): Vermittelt zelluläre Wechselwirkungen von Leukozyten LIF Leukemia inhibitory factor Ligand Ein Molekül oder Teil eines Moleküls, das an einen Rezeptor bindet Lineare Epitope 7 Sequenzepitope Linkage disequilibrium 7 Kopplungsungleichgewicht L-Kette 7 leichte Kette Long-patch Reparaturzweig der BER (s. dort), bei der bis zu 8 Nukleotide eingebaut werden Loss-of-imprinting (LOI) Der Verlust der DNA-Methylierung an Genen mit genetischer Prägung kann bei der Entwicklung erhebliche pathologische Auswirkungen haben LoxP Erkennungssequenz der Cre-Rekombinase LTR Long terminal repeat: Sequenz am 5c- bzw. 3c-Ende des retroviralen Genoms, das den Promoter enthält LVEF Linksventrikuläre Ejektionsfraktion Lymphknoten Sekundäre lymphatische Organe, in denen reife B- und T-Lymphozyten mit freien Antigenen oder mit Antigenen reagieren, die über antigenpräsentierende Zellen mit den Lymphozyten in Kontakt gebracht werden Lymphom Unkontrollierte Vermehrung eines maligne transformierten Lymphozyten Lymphozyten Zelluläre Bestandteile des Bluts, sie gehören zu den sog. „weißen Blutkörperchen“ (Leukozyten); kleine Leukozyten, die spezifische Antigenrezeptoren auf ihrer Oberfläche tragen; sie sind für die spezifische Immunantwort verantwortlich, die durch Unterscheidung von „fremd“ und „selbst“, Spezifität, Diversität, Adaptivität und das immunologische Gedächtnis charakterisiert ist Lyse Der Zerfall einer Zelle durch Schädigung oder Auflösung der äußeren Zellmembran (Zelltod) M Mac-1 Leukozytenintegrin DME2 (CD11b/CD18): Ver-

mittelt zelluläre Wechselwirkungen von Leukozyten MACS Magnetic cell separation, magnetische Zellsortie-

rung MAdCAM-1 Mucosal addressin cell adhesion mole-

cule-1: Zelladhäsionsmolekül der IgSF, das an der Leukozyten-Endothel-Interaktion beteiligt ist MAGE Melanomassoziiertes Antigen aus der CancerTestes-Familie Magnetischer Zellsortierer 7 MACS: Magnetvermittelte Zellsortierung, in Anlehnung an den FACS (7 fluoreszenzaktivierter Zellsortierer) gewählte Bezeichnung für ein Gerät zur Sortierung von Zellen, an die Anti-

körper gebunden wurden, die an magnetisierbare Kügelchen gekoppelt sind Major histocompatibility complex 7 MHC Makrophagen Große phagozytierende Leukozyten aus dem Gewebe; Vorläuferzellen sind Monozyten aus dem Blut MALDI Matrix-assisted laser desorption ionisation: Prozess, bei dem die Ionenformation durch einen kurzen Laserimpuls ausgelöst wird; dazu wird die Probe auf eine spezielle Probenplatte aufgebracht; die Masse des jeweiligen Moleküls wird über die Flugzeit im elektrischen Feld von der Matrix bis zum Detektor bestimmt („time of flight“, TOF) MAPC Multipotent adult progenitor cells: Multipotente adulte Vorläuferzellen aus dem Knochenmark MART Melanomassoziiertes und melanozytenassoziiertes Antigen Maternale Vererbung Ausschließlich über die Keimbahn der Mutter vererbte Merkmale (z. B. mitochondriale DNA) 3MeA 3-Methyladenin Mediator Ein Multiproteinkomplex, der eine Verbindung zwischen DNA-gebundenen Regulationsfaktoren und dem Präinitiationskomplex des Promotors darstellt MEL Mouse erythroleukemia, Maus-ErythroleukämieZellen Melanocortin-I-Rezeptor Rezeptorprotein auf der Oberfläche der Melanozyten, das beim Menschen die Melanogenese und damit die Haut- und Haarfarbe reguliert Mesopotamien Zweistromland zwischen Euphrat und Tigris, der heutige Irak Metabolic engineering Z. B. das Einschleusen eines kompletten Genclusters in einen Mikroorganismus, damit er einen bestimmten Stoff produziert 5-Methylcytosin Methylierungsprodukt des Cytosins MGMT O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase m7GPPP-Cap Struktur Ein an der Base methyliertes GTP, das durch eine „verdrehte“ 5c-5c-Bindung am Kopfende der mRNA angefügt ist; die Cap-Struktur beeinflusst den Transport der mRNA aus dem Zellkern, die Stabilität und die Translation der mRNA MHC Major histocompatibility complex, Haupthistokompatibilitätskomplex: Komplex von Genen, die polymorphe Oberflächenmoleküle kodieren, die für eine Wechselwirkung mit T-Lymphozyten verantwortlich sind; die T-Zell-Rezeptoren der T-Lymphozyten binden an einen Komplex aus MHC-Molekülen und Fremdpeptiden; MHC-Moleküle sind die wichtigsten Transplantationsantigene, die zur Abstoßung transplantierter Gewebe von genetisch differenten Spendern führen

XXVIII Abkürzungen und Erläuterungen

MHC-Moleküle 7 MHC MIA Melanozyteninhibitorische Aktivität Michaelis-Menten-Konstante Konstante in der Enzym-

kinetik, gibt Substratkonzentration an, die bei Halbsättigung vorliegt Milz Größtes sekundäres lymphatisches Organ; enthält neben reifen T- und B-Lymphozyten auch Erythrozyten und Makrophagen Min Multiple intestinal neoplasia Minimal-invasiv Typischer Begriff, um die geringen Unannehmlichkeiten und Risiken bestimmter Verfahren zu kennzeichnen miRNA MikroRNA: Kleine, regulatorische RNA-Moleküle, die mRNA-Moleküle in der Translation blockieren können; MikroRNAs sind nichtkodierende regulatorische RNAs von etwa 21 Nukleotiden Länge; abhängig von der Komplementarität der miRNAs zu ihren spezifischen Ziel-mRNAs ist ihr Wirkmechanismus entweder endonukleolytische Spaltung der ZielmRNA oder Hemmung der Translation Mismatch-Bindungen Nukleotidfehlpaarung Mitochondriales Retikulum Neuere Vorstellung über die Struktur von Mitochondrien als verzweigtes Netzwerk, welches dynamischen Fusions- und Aufspaltungsprozessen unterliegt Mitochondriopathien Durch Mutationen in der mtDNA bzw. in Genen für kernkodierte, mitochondriale Funktionen verursachte Erkrankungen Mitotische Katastrophe Aus der Mitose durch mitotische Checkpunktkontrollgene aktivierter nichtapoptotischer Zelltodsignalweg Mitotische Segregation Verteilung der Mitochondrien bzw. mtDNA bei mitotischen Zellteilungen; die Verteilung erfolgt dabei ungeregelt und weitgehend stochastisch MLH Steht für Mismatch Reparatur Homologes Gen des Menschen, da es Ähnlichkeit zu Mut-Genen von E. coli aufweist MMR Mismatch repair MODY Maturity onset of diabetes in the young Molekulares Mimikry Identität oder Ähnlichkeit von Epitopen unterschiedlichen Ursprungs oder unterschiedlicher chemischer Struktur; kann bei Ähnlichkeit von Antigenen des menschlichen Organismus und Antigenen von Infektionserregern zu immunologischen Reaktionen gegen eigenes Gewebe und damit zu Autoimmunerkrankungen führen Monoklonal Antikörper, bei denen jedes Molekül gleich aufgebaut ist und die gleiche Spezifität für Antigene hat; von einem einzigen Klon, d. h. von einer einzigen biologischen Einheit (z. B. einer Zelle) ausgehend Monoklonale Antikörper Antikörper, die von einem B-Lymphozyten-Klon produziert werden; sie sind demzufolge in ihrer Aminosäuresequenz und damit in

ihren Bindungseigenschaften identisch; da B-Lymphozyten unter natürlichen Bedingungen nur begrenzt lebensfähig sind, können monoklonale Antikörper in größeren Mengen nur nach Immortalisierung der produzierenden Zellen (z. B. mithilfe der Hybridomtechnik) gewonnen werden Monomer Niedermolekulare, reaktionsfähige Einzelmoleküle, die sich zu molekularen Ketten oder Netzen, zu unverzweigten oder verzweigten Polymeren, zusammenschließen können MPG Medizinproduktgesetz MRE Ursprünglich in Hefe isolierte Mutante; MRE bedeutet meiotische Rekombination, da die Zellen einen Defekt in der Meiose aufweisen mRNA Messenger-RNA: Wird als Vorläufer-RNA synthetisiert, nach Prozessierung zu fertigen mRNA ins Zytoplasma transportiert (Messenger-RNA) und dort an den Ribosomen translatiert MRX-Komplex Proteinkomplex aus MRE11, RAD50, XRS2 (bzw. NBS1) MS Massenspektroskopie: Analyse von Peptiden, die aus Protein-Protein-Gemischen gewonnen wurden, oder anderer Proben in Massenspektrometern; aus den gewonnenen Massenspektren lassen sich Aussagen zur Zusammensetzung der Proben machen; das wird normalerweise durch die Ionisierung der Probe und die anschließende Trennung der Ionen verschiedener Massen erreicht; ein typisches Massenspektrometer enthält 3 Hauptteile: eine Ionenquelle, einen Massenanalysator und einen Detektor MSC Mesenchymal stem cells, mesenchymale Stammzellen MSH MutS-homologe Proteine mtDNA Mitochondriale DNA mTERF Mitochondrialer Terminationsfaktor, kernkodiert: Ist für die spezifische Termination der rRNaVorläufertranskripte verantwortlich mtRNAse P Mitochondriale Ribonuklease P, kernkodierter Ribonukleoproteinkomplex: Prozessierung der mitochondrialen Vorläufertranskripte durch Spaltung am 5c-Ende der tRNAs mtTFA Mitochondrialer Transkriptionsfaktor A, kernkodiert: Essenziell für die Transkription der mtDNA und die Initiation der H-Strang-Replikation; Mutationen im Gen für mtTFA führen zu einem Verlust an mtDNA MudPIT Multidimensionale Protein-Identifikationstechnologie (multidimensional protein identification technology): Kombination aus einer Peptidtrennung mittels multidimensionaler Flüssigchromatographie und anschließender Massenspektroskopie; hierbei werden aufeinanderfolgend verschiedene Chromatographiemethoden genutzt; die erste Chromatographie kann z. B. Ionenaustauschchromatographie sein, der

XXIX Abkürzungen und Erläuterungen

eine Auftrennung an einer reversen Phase folgt; die Peptide werden dann von der zweiten Säule direkt in ein Ionenfallen-Massenspektrometer (ion trap mass spectrometer) eluiert, in welchem sie voll automatisch gemessen und identifiziert werden; MudPIT ist eine hervorragende Technik zur Auftrennung komplexer Gemische mit Tausenden von Peptiden Muller’s ratchet Erstmals von Hermann Muller formulierte Hypothese über die schleichende Degeneration von Organismen, die sich rein ungeschlechtlich (asexuell) fortpflanzen; aufgrund von Mutationen kommt es zur Anreicherung „negativer Eigenschaften“, die wegen der fehlenden Rekombination nicht eliminiert werden können Mut Ursprünglich in E. coli isolierte Mutante; Mut weist auf den Mutatorphänotyp der Zellen hin Mutation Vererbbare Änderung der DNA-Sequenz MutHLS-System Mechanismus zur Erkennung und Eliminierung von Basenfehlpaarungen Myelom Plasmozytom: Entstanden aus der unkontrollierten Proliferation einer maligne transformierten Plasmazelle, produziert im Allgemeinen Antikörper einer einzigen Spezifität; Myelomzellen werden in der Hybridomtechnik zur Immortalisierung von B-Lymphozyten eingesetzt N NAT2 Arylamin-N-Acetyltransferase: Fremdstoffmeta-

bolisierendes Enzym der Phase II, koppelt einen Essigsäurerest an das Substrat Natürliche Killerzellen NK-Zellen, abgeleitet vom engl. „natural killer cells“: Große granulozytenähnliche Lymphozyten, die verschiedene virusinfizierte Zellen und Tumorzellen lysieren können; sie spielen eine Rolle als Effektorzellen in der antikörperabhängigen zellulären Zytotoxizität (s. dort); sie stammen, wie B- und T-Lymphozyten, von lymphoiden Vorläuferzellen, reagieren aber im Gegensatz zu B- und T-Lymphozyten nicht antigenspezifisch NBS Nijmwegen-breakage-Syndrom, eine Erbkrankheit des Menschen NCAM Neural cell adhesion molecule: Zelladhäsionsmolekül der IgSF, das an der Entwicklung des Nervensystems beteiligt ist Neo Neomycintransferase-Gen NER Nukleotidexzisionsreparatur Neumutation Beim erstmaligen Auftreten einer autosomal-dominanten Erkrankung in einer Familie ist eine neu aufgetretene Mutation wahrscheinlich; meistens ist die Mutation dann allerdings nicht bei dem Patienten selbst, sondern in den Keimzellen einer seiner gesunden Eltern aufgetreten

Neutralisation Fähigkeit eines Antikörpers, die patho-

genen Effekte eines Virus oder eines Toxins zu inhibieren NFκB Ein DNA-bindender Transkriptionsfaktor mit wichtigen regulatorischen Funktionen in der Abwehr von Infektionskrankheiten und zellulärem Stress; ursprünglich in B-Lymphozyten als Regulator der N-Immunglobulin-Leichtkette identifizierter, nukleärer heterodimerer Transkriptionsfaktor NGF Nerve growth factor, Nervenwachstumsfaktor NHEJ Nonhomologes End-joining Nichtkodierende RNA Eine große Klasse von RNA-Molekülen, die nicht zur Gruppe der mRNA gerechnet werden kann; nichtkodierende RNA wird nicht translatiert und dient wahrscheinlich regulatorischen Funktionen NK-Zelle 7 natürliche Killerzellen NOD Non obese diabetic Nondisjunction Fehlverteilung von Chromosomen in der Meiose bzw. von Schwesterchromatiden in der Meiose Nonresponder Ein Mensch, der auf ein bestimmtes Medikament keine oder nicht die erwartete Wirkung zeigt NRRL Northern Regional Research Laboratory nt Nukleotid: Maßeinheit für Oligonukleotidsequenzen Nu Nude, nackt (haarlos) Nucleosome remodeling and histone deacetylase (NuRD)

Ein Chromatin-Modifikationskomplex mit reprimierender Wirkung auf die Transkription Nukleasen Nukleinsäurespaltende Enzyme Nukleinsäure Biochemische Makromoleküle im Zellkern und Bestandteil des Erbguts Nukleoid Kernäquivalente Struktur des Genoms von Prokaryonten, hier auch: Distinkte mtDNA/ProteinKomplexe in Mitochondrien Nukleosom Die Grundeinheit der DNA-Verpackung bei Eukaryonten; aufgebaut aus zwei Kopien jedes der vier Histon-Typen; um diesen Histon-Oktamer ist die DNA herumgewunden Nukleotid Grundbaustein des genetischen Codes Nukleus Als Zellkern (lat. nucleus, Kern) bezeichnet man ein im Zytoplasma gelegenes, meist rundlich geformtes Organell der eukaryoten Zelle O OATP Organisches anionentransportierendes Poly-

peptid Oberflächenverfahren Mikroorganismen werden auf

der Oberfläche kultiviert und nicht als Flüssig- oder Submerskultur ODN Oligodeoxynukleotide OH/OL Initiationsorte der Replikationssynthese für H- bzw. L-Strang der mtDNA

XXX

Abkürzungen und Erläuterungen

OMIM Online Mendelian Inheritance in Man: Ausführ-

Pharmakokinetik Teilgebiet der Pharmakologie, das

lich annotierte Datenbank von monogen vererbten Merkmalen, Syndromen oder Krankheiten Operon Eine Funktionseinheit auf der DNA, bestehend aus Promotor, Operator und (Struktur-)Genen, die ein oder mehrere Protein(e) kodieren Opioidrezeptor Membranproteine, die endogene und exogene Opioide binden ORFs Open reading frames Organogenese Die Entwicklung bzw. Herstellung ganzer Organe aus Zellen 8-OxoG 8-Hydroxyguanin

sich mit der Kinetik von Prozessen beschäftigt, denen Arzneistoffe im Organismus unterliegen Phasenproblem Zum Berechnen der Elektronendichte aus den einzelnen Streuwellen des Diffraktionsexperimentes benötigt man zuzüglich zu den Amplituden der Streuwellen auch deren Phasen; jedoch im einzelnen Beugungsexperiment können die Phasen nicht direkt gemessen werden; das Phasenproblem muss durch weitere Experimente gelöst werden Phase-I-Reaktionen Enzymvermittelte Reaktionen wie Oxidationen, Reduktionen, Hydrolysen, Dehalogenierungen, Decarboxylierungen im Arzneistoffwechsel, die meist eine polare Gruppe in das Fremdstoffmolekül einführen und überwiegend durch Cytochrom P450 katalysiert werden Phase-II-Reaktionen Konjugationsreaktionen (z. B. mit Essigsäure, Glucuronsäure, Glycin, Glutaminsäure oder Sulfat) Pixel Picture element: Kleinste Einheit zur digitalen Quantifizierung von Farbelementen PLA Polylactat: Trägermaterial im Tissue engineering Plasmid-DNA Nichtviraler Vektor, der die Genexpression unter der Kontrolle eines Promotors steuert Plasmide Kleine, ringförmige DNA-Moleküle, die neben der DNA des „Bakterienchromosoms“ (Kernäquivalent) innerhalb einer Bakterienzelle vorliegen können Plasmozytom 7 Myelom Pluripotent Zellen, die sich zu jedem Zelltyp eines erwachsenen Organismus entwickeln können PM Poor metabolizer: Individuum mit zwei mutierten Allelen in Bezug auf ein Cytochrom-P450-Enzym und einer daraus resultierenden fehlenden Enzymaktivität (z. B. bei CYP2D6 oder CYP2C19) PMA Protein-Mikroarray: Beschichteter Objektträger, auf dem Proteine unter Verwendung eines Mikroarrays immobilisiert wurden und damit systematisch, in Spots angeordnet, vorliegen; oft werden gereinigte rekombinante Proteine zur Herstellung der PMAs verwendet; PMAs mit Proteinantigenen können z. B. zur Detektion bestimmter Antikörper wie Autoantikörper in Patientenseren verwendet werden; PMAs, die gereinigte Proteine in nativer Form enthalten, sind für funktionelle Studien geeignet (z. B. Analyse von Protein-Protein- oder Protein-DNA Wechselwirkungen, Phosphorylierungsstudien mit Proteinkinasen) PMS Ursprünglich in Hefe isolierte Mutante; postmeiotic segregation (PMS) aufgrund des in Hefe gefundenen Phänotyps PNS Peripheres Nervensysten Pol II/Pol III RNA-Polymerasen II und III: Die RNA-Polymerase II transkribiert lange, proteinkodierende Gene, die RNA-Polymerase III synthetisiert kurze RNA-Spezies wie tRNAs und die 5S-rRNA

P p53 Tumorsuppressorgen p53: Homotetramerer Trans-

kriptionsfaktor, der Aktivität zelltodfördernder bzw. zellzyklushemmender Gene induziert Pandemie Länderübergreifende oder sogar weltweite Verbreitung einer Krankheit; eine Pandemie kann die ganze Weltpopulation betreffen und macht nicht an den Grenzen eines Landes oder eines Kontinents Halt Paradigma Beispiel, Vorbild, Muster oder Grundsatz Pathogen Bezeichnet die Eigenschaft eines belebten Agens, als Krankheitserreger zu fungieren PCNA Proliferating-cell-nuclear-Antigen PCR Polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion: Methode zur enzymatischen Amplifizierung von Nukleotidsequenzen PDB Protein Data Bank: Sammlung von kristallographisch oder durch NMR aufgeklärte physikalische Strukturen von Proteinen PDGF Platelet-derived growth factor, Plättchenwachstumsfaktor PE Plating efficiency, Plattierungseffizienz: Maß für das klonale Wachstum einer Zellpopulation Penetranz Anteil der Mutationsträger, bei denen sich eine Mutation phänotypisch auswirkt Penicillin Erstes entdecktes Antibiotikum PEPT Peptidtransporter Peptidpräsentation 7 Antigenpräsentation Periphere Blutlymphozyten Lymphozyten, die aus dem Blut isoliert werden können PGA Polyglycolsäure: Trägermaterial im Tissue engineering PGLA Poly(lactide-co-glycolide): Trägermaterial im Tissue engineering P-Glykoprotein Membranständiger Arzneimitteltransporter, Effluxtransporter: Ist u. a. für die sich in Krebszellen entwickelnde Resistenz gegen Zytostatika verantwortlich Phänokopie Simulation einer genetisch bedingten Krankheit durch exogene Einflüsse Phänotyp Erscheinungsbild: Summe aller äußerlich feststellbaren Merkmale eines Individuums

XXXI Abkürzungen und Erläuterungen

Polkörperdiagnostik Form der Präimplantations- bzw.

Präzipitation Bindungen von löslichen Antigenen und

präkonzeptionellen Diagnostik, bei der die Polkörper von entnommenen Eizellen mit dem gleichen Metzogen (steuert die Chromosomenverteilung bei der Zellteilung) wie bei der PID auf Keimbahnmutationen und/oder Chromosomenstörungen untersucht werden; die beiden Polkörper einer Eizelle entstehen durch die Halbierung des Chromosomensatzes während der Eizellreifung Poly(A)-Schwanz Der Poly(A)-Schwanz wird im Nukleus posttranskriptionell am 3c-Ende der mRNA synthetisiert; wichtig dafür ist die Erkennung des Hexanukleotidmotivs AAUAAA durch Poly(A)-Polymerase; im Zytoplasma kann der Poly(A)-Schwanz durch enzymatische Aktivitäten verkürzt oder verlängert werden Polyadenylierung Der Vorgang beschreibt die Anheftung von mehr als 250 Adenosin-Nukleotiden an das freie 3c-Ende der Vorläufer-RNA Polyklonal Eine Mischung verschiedener Antikörpermoleküle mit unterschiedlicher Spezifität/Affinität Polymerasekettenreaktion Polymerase chain reaction: Methode, die die Amplifikation von definierten DNASequenzen in großen Mengen durch wiederholte Synthesezyklen erlaubt Polymorphismus Auftreten einer Genvariation in einer Population mit einer Häufigkeit t1% Präimplantationsdiagnostik PID oder PGD (prenatal genetic diagnosis): Bei der Präimplantationsdiagnostik (PID) werden ein oder zwei Zellen eines mehrere Tage alten Embryos (meist im 8-Zell-Stadium) vor dessen Implantation in die Gebärmutter hinsichtlich einer bestimmten Mutation (mittels PCR) oder einer Chromosomenstörung (mittels Fluoreszenz-in-situHybridisierung) untersucht; es handelt sich dem Charakter nach um eine prädiktive Diagnostik mit dem Ziel, nur nicht betroffene Embryonen zu übertragen; Voraussetzung ist eine extrakorporale (assistierte) Befruchtung, d. h. die In-vitro-Fertilisation (IVF) oder bevorzugt die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) Präinitiationskomplex Besteht aus mehreren Proteinen, die für die Erkennung des Promotorbereichs auf der DNA zuständig sind; ermöglicht die Initiation der Transkription durch die RNA-Polymerase; vor der Bindung an die mRNA bildet die 40S-ribosomale Untereinheit einen Komplex mit dem Initiationsfaktor 3 und dem ternären Komplex, welcher aus der InitiatorMethionyl-tRNA (tRNAMet), eIF2 und GTP besteht Pränatal Vor der Geburt Prävalenz Ist eine epidemiologische Kennzahl und sagt aus, wie viele Individuen einer bestimmten Population an einer bestimmten Krankheit erkrankt sind; sie ist eine absolute Größe

Antikörpern, die zur Entstehung von unlöslichen Antigen-Antikörper-Komplexen führen und demzufolge als Präzipitate ausfallen; Tests, die auf einer Präzipitation beruhen, werden als Präzipitationstests bezeichnet Präzipitationstest 7 Präzipitation Precursor (inaktives) Vorläufermolekül Primer Ein aus wenigen Nukleotiden aufgebautes Molekül, komplementär zu einer Zielsequenz Procaspase Zymogen, d. h. inaktive Vorstufe der enzymatisch aktiven, durch Proteolyse gereiften Caspase Pro-Drug Wirkstoff, der erst durch Biotransformation im Körper in den aktiven Arzneistoff überführt wird Prokaryonten Auch Monera genannt, sind zelluläre Lebewesen, welche keinen Zellkern besitzen Promotor Eine spezifische DNA-Sequenz, die die Startstelle der Transkription an einem Gen festlegt Proof-reading 3c-5c-Exonukleaseaktivität, die mit DNAPolymerasen assoziiert ist Protein-Engineering Ein Teilgebiet der Biotechnologie, das sich mit der Konstruktion und Herstellung von nutzbaren Proteinen, darunter Enzymen, beschäftigt Proteinfamilie Gruppe von Proteinen mit mindestens 50% Sequenzidentität Proteinsuperfamilie Gruppe von Proteinen mit signifikanter Ähnlichkeit untereinander, aber weniger als 50% Sequenzidentität Proteomik Analyse der Proteinzusammensetzung von Zellen und Geweben in verschiedenen funktionalen oder pathologischen Zuständen Protonenpumpenhemmer Arzneimittelgruppe, die die Produktion von Magensäure durch Hemmung der H+/K+-ATPase in den Belegzellen des Magens hemmt PSA Polysialinsäure: Lineares Polymer aus D2,8-verknüpften Sialinsäureeinheiten; überwiegend beschränkt auf das NCAM-Protein Pseudogen 7 somatische Genkonversion P-Wert Wahrscheinlichkeit, mit der die Signifikanz einer statistischen Testentscheidung bewertet wird R RA Retinoic acid, Retinsäure: Oxidationsprodukt im

Metabolismus von Vitamin A; wird in der Zellkultur als Differenzierungsinduktor verwendet Racemat Optisch inaktives Gemisch, d. h. es dreht die Polarisationsebene von polarisiertem Licht nicht RAD Ursprünglich in Hefe isolierte Mutante; RAD bedeutet Radiation, weil die Zellen sensitiv gegenüber ionisierenden Strahlen sind Radiation-Hybridkarten Radiation hybrid maps: Genomische Karten, die durch Analyse der physikalischen Nachbarschaft von Markern auf durch Bestrah-

XXXII

Abkürzungen und Erläuterungen

lung gewonnenen DNS-Bruchstücken gewonnen werden Radioimmuntest Immunologischer Test zum Nachweis von Antigenen oder Antikörpern, bei dem einer der Reaktionspartner mit einem radioaktiven Isotop markiert ist, wodurch eine Messung der Reaktion möglich wird RB Retinoblastom: Tumor in neuralen Vorläuferzellen der unausgereiften Retina; das Retinoblastomgen wirkt als Tumorsuppressorgen Recombineering Klonierung durch homologe Rekombination in E. coli Reinkulturen Phänotypisch einheitliche Bakterienkulturen Rekombination Bei der Meiose entstehender Austausch von Chromosomenabschnitten zwischen väterlichen und mütterlichen Erbmerkmalen 7 V(D)J-Rekombination Rekombinationswahrscheinlichkeit Häufigkeit des Auftretens einer Rekombination in einem Stammbaum oder in einer Population Repertoire Die Gesamtheit an Antikörper- und T-ZellRezeptor-Spezifitäten, die durch B- und T-Lymphozyten eines Organismus gegen ein einzelnes Antigen oder die Gesamtheit aller potenziellen Antigene gebildet werden können Repressor Ein Protein, das sich an einen bestimmten Bereich der DNA, den Enhancer, anlagert und so den Start der Transkription, also das Ablesen dieses Bereichs hemmt oder vollständig verhindert Responder Patient, der auf ein bestimmtes Arzneimittel wie erwartet anspricht Restriktionsenzyme Enzyme, welche DNA sequenzspezifisch schneiden können Retroviren Enthalten eine einsträngige Virus-RNA, die von einer reversen Transkriptase in eine doppelsträngige DNA-Zwischenstufe transkribiert und als Provirus in das Wirtszellgenom eingebaut wird; vom Provirus aus wird durch reguläre Transkription die Bildung RNA-haltiger Virusnachkommen eingeleitet; Isolierung des ersten infektiösen Retrovirus gelang 1978: HTLV 1 (human T-cell lymphotropic virus type 1); Retroviren verursachen u. a. auch die Immunschwächeerkrankung HIV Rev HIV-Strukturgen, das RNA bindet und dem Export von mRNA aus dem Kern dient Reverse Transkriptase (RT) Auch RNA-abhängige DNAPolymerasen: Enzyme, die die Umschreibung von RNA in DNA katalysieren Rezeptor Transmembranmolekül an der Zelloberfläche, das einen Liganden binden kann; die Bindung führt zu biochemischen Veränderungen in der Zelle, wie z. B. zur Aktivierung bestimmter zellulärer Gene, Proteinoder Proteinkomplexe mit einer spezifischen Bin-

dungsstelle, an die der Agonist (z. B. Arzneistoff) bindet und damit einen biochemischen Signalprozess auslöst Rezeptortyrosinkinase Oberflächenrezeptoren mit enzymatischer Funktion: Binden auf der Außenseite der Zelle einen Liganden und starten auf der Innenseite im Zytoplasma durch Tyrosinphosphorylierung von Zielproteinen eine Signalkaskade R-Faktor Qualitätskriterium für das erhaltene Modell: Beschreibt die Übereinstimmung zwischen dem Modell und den gemessenen Diffraktionsdaten; bei biologischen Makromolekülen sollte dieser Wert unter 20% liegen RF-C Replikationsfaktor C; nötig für die Bildung des PCNA-DNA-Komplexes RFLP Restriction fragment length polymorphism, Restriktionslängenpolymorphismus RGD Tripeptid (Arg-Gly-Asp), das an Integrine (v. a. alphav-Integrin) bindet und zum Vektortargeting eingesetzt wird Ribosom Protein-RNA-Komplexe, die im Zytoplasma der Zellen vorkommen: Komplexe biologische Maschine, die den genetischen Kode der mRNA in Protein übersetzt; ein Ribosom besteht aus einer kleinen (40S) Untereinheit und einer großen (60S) Untereinheit; diese Untereinheiten setzen sich zusammen aus über 50 ribosomalen Proteinen und vier verschiedenen ribosomalen RNA- (rRNA-)Molekülen Ribozym RNA-Molekül mit enzymatischer Aktivität RISC RNA-induced silencing complex: Effektor der RNA-Interferenz, bestehend aus der siRNA sowie mehreren Proteinen; bindet kurze doppelsträngige siRNA und führt zum Abbau von mRNA-Molekülen mit komplementären Sequenzen RITS-Komplex RNA induced transcriptional silencing complex: Proteinkomplex, der repetitive und doppelsträngige RNA bindet und zur Heterochromatisierung von Chromatin führt R-Loop DNA-RNA-Hybridstruktur: bezeichnet in tierischen Mitochondrien die Ausbildung eines spezifischen DNA-RNA-Komplexes im Bereich der mtDNA-Kontrollregion; er ist das Substrat für die RNA-Primer Prozessierung durch die RNAse MRP bei der Initiation der H-Strang-Replikation RNA Ribonukleinsäure, mit vielfältigen Funktionen bei der Proteinsynthese und bei der Regulation der RNA-Mengen RNAi RNS-Interferenz: Experimentelle Methode zur spezifischen Ausschaltung von Genen RNA-Interferenz Ein Regulationsvorgang, der durch doppelsträngige RNA ausgelöst wird und zum Abbau bestimmter mRNA-Moleküle bzw. zur Translationshemmung und auch zur Heterochromatisierung führt

XXXIII Abkürzungen und Erläuterungen

RNA-Polymerase Ein Enzymkomplex, der anhand einer

DNA-Matrize eine RNA-Kopie synthetisiert; die Syntheserichtung erfolgt vom 5c-Ende der RNA zum 3c-Ende RNAse MRP Ribonuklease MRP (mitochondrial RNA processing): Kernkodierter Ribonukleoproteinkomplex, spaltet den RNA-Primer bei der Initiation der H-Strang-Replikation der mtDNA ROC Receiver operating characteristic: Graphische Methode zur Bewertung statistischer Testentscheidungen RPA Replikationsprotein A: Komplex aus mehreren Proteinen zur Stabilisierung einzelsträngiger DNA während der Replikation und Reparatur RPMA Reverser Protein-Mikroarray: Beschichteter Objektträger, auf dem komplexe biologische Proben (Lysate, Serumverdünnung) oder deren Fraktionen immobilisiert wurden; RPMAs werden verwendet, um parallel in vielen Proben, Proteine und deren Modifikationen (bisher Phosphorylierungen) vergleichend zu untersuchen und zu quantifizieren rRNA Eine Klasse von RNA-Molekülen, die für den Aufbau und die Funktion der Ribosomen zuständig sind (ribosomale RNA) RT Reverse Transkriptase RTK Rezeptortyrosinkinase RT-PCR Reverse transcriptase-PCR, Reverse-Transkriptase-PCR: Methode zur Amplifikation von spezifischen RNA-Sequenzen mithilfe reverser Transkriptase zur Messung der Genexpression einzelner Gene S Scanning Laterale Bewegung der 40S-ribosomalen

Untereinheit entlang der 5c-UTR, von der Cap-Struktur zum Initiationskodon Schnellacetylierer Individuen mit phänotypisch hoher enzymatischer Aktivität von NAT2 Schwere Kette H-Kette; heavy chain: Die größere der beiden Ketten, aus denen ein Antikörpermolekül aufgebaut ist SCID Severe combined immune deficiency, schwere kombinierte Immundefizienz: Erkrankung, die auf eine Hemmung der frühen Differenzierung der B- und T-Lymphozyten zurückzuführen ist und zur Areaktivität der spezifischen Immunabwehr führt; SCID-Mäuse werden zu immunologischen Modellversuchen genutzt SCNT Somatic cell nuclear transfer SDSA-Modell Synthesis-dependent-strand-annealingModell SELDI Surface-enhanced laser desorption ionization time of flight: Diese Methode ist eine Kombination aus Chromatographie an einer Oberfläche mit anschließender Analyse des Massenspektrums („timeof-flight“, TOF); hiermit lassen sich sehr gut Proteinprofile komplexer Proben bestimmen und verglei-

chen, was zur Identifizierung von Markerproteinen führen kann Seneszenz Zellalterung: Unterschieden wird die replikative Seneszenz infolge einer Verkürzung der Chromosomentelomere und eine prämature Seneszenz, die z. B. durch Onkogene oder DNA-Schädigung induziert werden kann Sequenzanalyse Aufklärung der Basenabfolge in einem DNS-Abschnitt Sequenzepitop Kontinuierliches Epitop: Epitop auf einem Proteinmolekül, das von Aminosäuren gebildet wird, die in der Primärstruktur aufeinander folgen; Sequenzepitope sind demzufolge auch auf denaturierten Proteinen nachweisbar Sequenzhomologie Ähnlichkeit von DNS-Sequenzen, soweit sie durch evolutionäre Verwandtschaft entstanden ist Serinproteasen Unterform der Peptidasen (Enzyme, welche Proteine und Peptide spalten) Serum Die nach der Blutgerinnung gewonnene, u. a. Antikörper enthaltende Flüssigkeit Short hairpin RNA (shRNA) Selbstkomplementäres RNAMolekül: Besteht aus einer ca. 19 Nucleotide langen Duplex und einem Loop; Short hairpin RNAs können intrazellulär exprimiert werden; sie werden dann zu small interfering RNAs prozessiert und lösen RNAInterferenz aus Short-patch Reparaturzweig der BER, bei der Nukleotide eingebaut werden Shuffling Techniken zur Beschleunigung der genetischen Evolution; dabei werden Gene oder deren Abschnitte mutiert und in neuer Reihenfolge zusammengesetzt Signaltransduktion Signalübertragung: Prozesse, mithilfe derer Zellen extrazelluläre Signale zu ihren zellulären Effektorstrukturen weiterleiten Signaltransduktionskaskade Beschreibt den Signalweg extrazellulärer Signale, die an Oberflächenrezeptoren binden und zu einer Aktivierungskaskade von zytoplasmatischen und von nukleären Proteinen führt; Ziel der Signaltransduktionskaskaden sind häufig regulatorische Faktoren der Genaktivität Signalübertragungskaskade 7 Signaltransduktionskaskade Signifikanz Statistischer Begriff: Ablehnung einer Nullhypothese Silencer Eine regulatorische DNA-Sequenz, die auch aus größerer Entfernung ein Gen abschalten kann Single nucleotide polymorphisms Variationen von einzelnen Basenpaaren in einem DNA-Strang, die bei bestimmten Individuen oder Populationen vorkommen (7 SNP) siRNA Small interfering RNA (short interfering RNA): 21 Nukleotide lange RNA-Abschnitte doppelsträngi-

XXXIV Abkürzungen und Erläuterungen

ger RNA, siRNA führt den RISC-Komplex zu komplementären Sequenzen in mRNA-Molekülen und führt zu deren Abbau bzw. Hemmung Skorbut Infektionskrankheit, hervorgerufen durch Mangel an Vitamin C Smac Second mitochondrial activator of caspases: Neben Cytochrom c (erster identifizierter mitochondrialer Caspaseaktivator) das zweite identifizierte Protein mit dieser Funktion SNP Single nucleotide polymorphism: Variation in einem Basenpaar in einen DNS-Strang snRNP Eine Klasse von Ribonukleoproteinpartikeln, die aus Proteinen und einer oder mehreren kleinen RNAMolekülen (snRNA) bestehen und Funktionen in der Prozessierung von Vorläufer-RNA besitzen SOM Self-organizing maps: Methode zur statistischen Clusteranalyse, die in der Theorie der neuronalen Netze entwickelt wurde Somatische Genkonversion Nichtreziproker Genaustausch: Mechanismus, der unter Nutzung von normalerweise nicht aktiven Pseudogenen in Hühnern zur Entstehung der Antikörpervariabilität auf somatischer Ebene führt; bei Mäusen und Menschen führt die V(D)JRekombination (s. dort) zur Antikörpervariabilität Somatische Hypermutation Nach Antigenstimulation in den variablen Regionen von Antikörpern auftretende Mutationen, die zur Erhöhung der Affinität führen Somatische Rekombination 7 V(D)J-Rekombination SP1 Wichtiger, ubiquitärer Transkriptionsfaktor, der an GC-reiche DNA-Sequenzen bindet Spezifität Grad der Einzigartigkeit einer Bindungsreaktion zwischen zwei Molekülen z. B. einer Antigen-Antikörper-Reaktion Spleißen Beschreibt den Vorgang der Prozessierung von Vorläufer-RNA-Molekülen, deren Intronsequenzen herausgeschnitten werden; alternatives Spleißen ermöglicht das regulierte Herausschneiden von Intronsequenzen oder ihren Verbleib in der fertigen mRNA Startkodon Die kodierende Region der meisten eukaryoten mRNAs beginnt mit einem Kodon der Basenfolge AUG (Startkodon); es wird von der an die 40S-ribosomale Untereinheit gebundenen Initiator r-RNAMet durch Kodon-Antikodon-Basenpaarung erkannt und in ein Methionin translatiert Stoppkodon Treffen Ribosomen auf die Basentripletts UAG, UAA oder UGA (Stoppkodons), dann führt dies zur Dissoziation des Ribosoms in die beiden Untereinheiten und der Freisetzung des fertigen Polypeptids; dieser Vorgang wird katalysiert durch sog. „Releasefaktoren“ Strukturgen Generelle Bezeichnung für Gene, deren Genprodukte keine regulatorischen Aufgaben bei der Genexpression haben

STSGs Split-thickness skin grafts: Künstliche Hautsub-

stitute aus Fibroblasten, extrazellulärer Matrix und Epithelzellen zur Geweberegeneration StZG Stammzellgesetz Subcutan Verabreichung (z. B. von Medikamenten) unter die Haut Submers Als submers (abgetaucht) bezeichnet man Mikroorganismen, die unter der Oberfläche des Mediums wachsen; im Gegensatz zum Oberflächenverfahren Super wobble Erweiterte Kodon-Antikodon-Erkennung bei der Translation in tierischen Mitochondrien; im Gegensatz zur Translation an zytoplasmatischen Ribosomen können alle Kodons eines einheitlichen Kodonquartetts von einer einzelnen Aminoacyl-tRNA erkannt werden Swi/Snf-Komplex Ein Multiproteinkomplex mit Eigenschaften zum Remodeling von Chromatin Syngen Betrifft den Ursprung aus einem genetisch identischen Individuum, z. B. syngene Transplantation zwischen Individuen einer identischen Inzuchtlinie T Tat HIV-Regulatorprotein mit transaktivierender Wir-

kung auf die Virusreplikation TATA-Box Eine TATA-reiche Sequenz im Promotorbe-

reich, die festlegt, dass ca. 30 Nukleotide unterhalb dieser Sequenz ein Transkriptionsstart vorliegt Tautomerie Beschreibung der chemischen Eigenschaften von funktionellen Gruppen anhand von elektronischen Grenzstrukturen; die tautomeren Grenzstrukturen der Peptidbindung erklären deren Doppelbindungscharakter; die freie Rotation um die C-N-Bindung ist nicht möglich T-Body Rekombinantes Antikörperfragment, das auf zytotoxischen T-Lymphozyten exprimiert wird und damit T-Lymphozyten über eine Antigen-AntikörperBindung aktiviert, ohne dass die durch diese Zellen unter natürlichen Bedingungen erforderliche Erkennung eines MHC-Peptid-Komplexes erforderlich ist (7 T-Zell-Rezeptor) TBP TATA-Bindeprotein: Ein zentraler Faktor für die Erkennung von Promotorsequenzen; zusammen mit weiteren Faktoren organisiert TBP den Präinitiationskomplex der Transkription TCR T cell receptor: Der Antigenrezeptor der T-Lymphozyten, der in seiner Struktur dem Fab-Fragment eines Antikörpers ähnelt; T-Zell-Rezeptoren werden von Genen kodiert, die, wie im Falle von Antikörpern, durch somatische Rekombination von V-, D- und J-Gensegmenten entstehen; T-Zell-Rezeptoren erkennen Antigenfragmente (Peptide), die an der Zelloberfläche von MHC-Molekülen präsentiert werden

XXXV Abkürzungen und Erläuterungen

Tc-Zellen Zytotoxische T-Lymphozyten: Die meisten

TNF Tumornekrosefaktor: Zytokin mit einer Vielzahl

zytotoxischen T-Lymphozyten tragen den Oberflächenmarker CD8 Tetanus Wundstarrkrampf Tetracyclin Ein Antibiotikum aus der Gruppe der Tetracycline TF Transkriptionsfaktor TFBS Transkriptionsfaktorbindungsstellen: Kurze Sequenzmotive, an denen spezifisch TF-Proteine an die genomische DNS binden, um die Transkription des dahinter liegenden Gens zu regulieren TFG Transfusionsgesetz TFIID-Komplex Enthält TBP und organisiert den Präinitiationskomplex TFIIH Transkriptionsfaktor, der an der DNA-Reparatur beteiligt ist TGFβ Transforming growth factor E transformierender Wachstumsfaktor E T-Helfer-Lymphozyten TH-Zellen: T-Lymphozyten, die B-Lymphozyten bei der Antikörpersynthese unterstützen (TH2-Zellen) bzw. Makrophagen aktivieren (TH2-Zellen); sie produzieren bestimmte Zytokine, die für die jeweilige Funktion erforderlich sind; tragen den Oberflächenmarker CD4 Therapeutisches Klonen Der Embryo wird nach wenigen Zellteilungen zerstört und die einzelnen Zellen werden in eine Kultur zum weiteren Wachstum gebracht; mithilfe geeigneter chemischer und biologischer Wachstumsfaktoren lässt sich aus diesen Stammzellen möglicherweise jede Gewebeart (vielleicht sogar ganze Organe) züchten, oder die Stammzellen werden direkt in den Körper des Patienten eingebracht Thermostabile Proteine Proteine, welche bei Temperaturen von mehr als 80°C noch biologisch aktiv sind Thymozyten Lymphoide Zellen des Thymus: es handelt sich in erster Linie um verschiedene Reifungsstadien von T-Lymphozyten TK Thymidinkinase TLR Toll-like Rezeptoren sind in der Evolution konservierte intrazelluläre Rezeptoren, die auf Makrophagen und dendritischen Zellen zur Erkennung häufiger Lipoprotein-, Lipopolysaccharid- oder GlykoproteinMuster (sog. Pattern) dienen, die auf gramnegativen und grampositiven Bakterien sowie Viren vorkommen und zur Aktivierung des angeborenen Immunsystems führen TLS Transläsionssynthese: Überspringen eines Schadens einer Replikationsgabel, keine Reparatur T-Lymphozyten T-Zellen: Eine der beiden Populationen der Lymphozyten; sie spielen eine Rolle bei der Regulation der Immunantwort (T-Helfer-Lymphozyten) sowie als zytotoxische Zellen (Tc-Zellen); ihre Reifung erfolgt im Thymus (daher ihre Bezeichnung)

von Funktionen (Aktivierung von Immunzellen, Zerstörung einiger Tumorzellen) Todesligand Mitglied der Familie der TNF-D und CD95/Fas-Ligand-ähnlichen Liganden für Todesrezeptoren Todesrezeptor Mitglied der Supergenfamilie der TNFhomologen Rezeptoren, das durch die Anwesenheit einer Todesdomäne (death domain) charakterisiert ist Toleranz Antigenspezifische Areaktivität von B- oder T-Lymphozyten Totipotent Zellen, die sich zu einem kompletten Organismus entwickeln können TPA Gewebe-Plasminogenaktivator TPG Transplantationsgesetz Trägerprotein Carrier Protein: Immunogenes Protein, an das nichtimmunogene Substanzen (wie z. B. Haptene oder Peptide) gebunden werden, um Antikörper gegen diese nichtimmunogenen Substanzen zu induzieren Transfer- (-t)RNA Adaptermolekül für die Übersetzung eines Nukleotidtripletts in eine Aminosäure; t-RNAs bilden eine typische kleeblattähnliche Sekundärstruktur aus; der Antikodonarm erkennt über Basenpaarung den genetischen Kode der mRNA; an den Aminoacylarm ist diejenige Aminosäure kovalent gekoppelt, die dem Antikodon entspricht Transgene Mäuse Mäuse, in deren Keimbahn eingeschleuste Fremd-DNA stabil integriert ist Transkription Die Übersetzung eines DNA-Strangs in eine RNA-Sequenz; die RNA-Synthese erfolgt vom 5c-Ende der RNA zum 3c-Ende Transkriptionsfaktor DNA-bindende Proteine, die über die Bildung von weiteren Faktoren die RNA-Polymerase zur Transkription anregen oder in der Transkription hemmen und dadurch für die Regulation der Genaktivität (Transkription) mitverantwortlich sind Translation Vorgang, bei dem in der lebenden Zelle aus der durch eine Abfolge von RNA-Nukleotiden kodierten Information ein Protein gebildet wird Translationsfaktoren Darunter versteht man Proteine, die an den drei Abschnitten der Translation beteiligt sind; man unterscheidet Translationsinitiationsfaktoren („eucaryotic initiation factor“, eIF), die eine Rolle bei der Bindung des Ribosoms an die mRNA spielen, Translationselongationsfaktoren (eEF), die für die Ausbildung der Peptidbindungen zuständig sind und Releasefaktoren (eRF), die die Freisetzung des fertigen Peptids katalysieren Translokation Austausch von Chromosomenabschnitten zwischen nichthomologen Chromosomen Transplantation Gewebe- oder Organübertragung von einem Individuum auf ein anderes; führt in der Regel zur Abstoßung aufgrund der immunologischen Reak-

XXXVI Abkürzungen und Erläuterungen

tion gegen Fremdantigene auf den übertragenen Zellen, die durch Immunsuppressiva verhindert werden kann; nur im autologen und syngenen System bzw. zwischen eineiigen Zwillingen ist eine Transplantation ohne Abstoßungsreaktionen möglich Transposon Mobiles genetisches Element, ein DNA-Abschnitt bestimmter Länge auf einem Chromosom, welcher die Möglichkeit hat, seinen Ort im Genom zu verändern (Transposition) tRNA 7 Transfer- (t-)RNA TSE Transmissible spongiforme Enzephalopathie TSS Transcription start site: Spezifisches Sequenzmotiv, das den Start der Transkription anzeigt TTD Trichothiodystrophie Tumorantigene Antigene von Tumorzellen, die vom autologen Immunsystem erkannt werden bzw. mithilfe monoklonaler Antikörper anderer Spezies nachweisbar sind U UM Ultrafast metabolizer: Individuum mit mindestens

drei Wildtypallelen von CYP2D6 und damit stark erhöhter Metabolisierungsaktivität; es liegt eine Genduplikation vor UPD Uniparentale Disomie: Ein Chromosomenverteilungsfehler, der dazu führt, dass ein homologes Chromosomenpaar ersetzt ist durch zwei identische Chromosomen; führt häufig zu einem Loss-of-imprinting USSC Unrestricted somatic stem cells; multipotente Vorläuferzellen im Nabelschnurblut UTR Untranslated region: Die mRNA enthält sowohl 5c- als auch 3c-Sequenzen ihrer kodierenden Region, die nicht translatiert werden; diese Sequenzen enthalten häufig regulatorische Elemente, die die mRNAStabilität, -Lokalisierung oder -Translation beeinflussen

J-Gensegmenten kodiert und unterscheidet sich in ihrer Aminosäuresequenz von einem Antikörper VCAM-1 Vascular cell adhesion molecule-1: Zelladhäsionsmolekül der IgSF, das an der Leukozyten-Endothel-Interaktion beteiligt ist Vektor Gentaxi oder Genfähre, bezeichnet virale oder nichtvirale Nukleinsäuren, die zur Klonierung bzw. Expression des gewünschten therapeutischen Gens benutzt werden V-Gene Vom engl. variable: Gensegmente, die in etwa die ersten 95 Aminosäuren eines Antikörpers kodieren; V-Gene werden als multiple Gensegmente über die Keimbahn weitergegeben; zur Kodierung der gesamten variablen Region eines Antikörpers ist die Rekombination (7 V(D)J-Rekombination) mit einem J-Gen bzw. mit einem J- und einem D-Gen erforderlich Vitamin-K-Epoxidreduktase Schlüsselenzym in der Bildung Vitamin-K-abhängiger Gerinnungsfaktoren und pharmakologischer Rezeptor für Coumarine von-Willebrand-Faktor Ein Protein, das eine wichtige Rolle bei der Blutgerinnung spielt Vorläufer-B-Zellen Zellen der B-Lymphozyten-Reihe, die schon rekombinierte Gene für die schweren Ketten, aber noch keine rekombinierten Gene für die leichten Ketten enthalten und damit noch keinen funktionsfähigen antigenbindenden Rezeptor exprimieren V-Region 7 variable Region W Western blotting 7 Immunblotting WISH Whole-mount in situ hybridisation: Experimen-

telle Methode zur Lokalisierung der Genexpression WNT Signalmolekül X Xenogen Betrifft den Ursprung aus einer anderen Spe-

zies, z. B. xenogene Transplantation

V V(D)J-Rekombination Somatischer Rekombinations-

XenoMaus Transgene Mauslinie mit humanen Immun-

mechanismus, der zur Entstehung der Antigenrezeptoren (Immunglobuline) auf B-Lymphozyten (und auch der T-Zell-Rezeptoren auf T-Lymphozyten) führt; hierbei werden nach dem Zufallsprinzip V-, Dund J-Gensegmente zu einem neuen Gensegment verknüpft, das die variable Region des jeweiligen Antikörpers kodiert Vakzinierung Immunisierung, die zu einem aktiven Schutz gegen einen Infektionserreger führt; abgeleitet von der Pockenimmunisierung mithilfe des weniger virulenten Kuhpockenvirus (Vacciniavirus) Variable Region Variabler Teil, V-Region, variable region: Der N-terminale Teil eines Antikörpermoleküls, der die Antigenbindungsregion enthält; die variable Region wird von den rekombinierten V-, (D-) und

globulingenen, die demzufolge zur Gewinnung humaner Antikörper genutzt werden können Xenotransplantation Die Übertragung von lebens- und funktionstüchtigen Zellen oder Zellverbänden (einschließlich ganzer Organe oder Körperteile) zwischen verschiedenen Spezies XFP Spektrale GFP-Varianten: CFP, GFP, RFP, YFP XistRNA Eine nichtkodierende RNA des X-Chromosoms der Säuger und des Menschen; in weiblichen Individuen führt die Expression dieses Gens dazu, dass ein X-Chromosom inaktiviert wird XML eXtensible Markup Language: Format zur Speicherung und zum Austausch von Informationen; XMLFormate existieren für die meisten experimentellen Datentypen und spezifische Anwendungen

XXXVII Abkürzungen und Erläuterungen

XP Xeroderma pigmentosum XRS Ursprünglich in Hefe isolierte Mutante; XRS be-

deutet X-ray-sensitiv, weil die Zellen empfindlich gegenüber Röntgenstrahlen sind Y YAC Yeast artifical chromosome Y2H Hefe-2-Hybrid-System (Yeast two-hybrid system):

Es handelt sich um eine genetische Methode in Hefen zur Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen; es wird die Wechselwirkung von zwei Hybridproteinen untersucht: einem „bait“ (Fusionsprotein bestehend aus Testprotein 1 und der DNA-bindenden Domäne eines Transkriptionsfaktors) und einem „prey“ (Fusionsprotein bestehend aus Testprotein 2 und der Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsfaktors); bei Wechselwirkung zwischen beiden Proteinen wird ein aktiver Transkriptionsfaktor rekonstruiert; dieser führt zur Transkription eines Repor-

tergens, welches es den Hefen erlaubt, auf selektiven Medien zu wachsen, und/oder zu einem detektierbaren Phänotyp führt, wie z. B. zu einer Blaufärbung auf Indikatormedium Z Zentromer Ansatzstelle für die Spindelfasern in der

Mitose und der Meiose; die zentromerische DNA besteht aus bestimmten repetitiven Sequenzen, an die sich ein Proteinkomplex, das Kinetochor, anlagert, der der Verankerung der Spindelfasern dient Zymogen Sammelbezeichnung für inaktive Enzymvorstufen Zytoplasma Die lebende Substanz der Zelle Zytostatika Medikamente gegen Krebs Zytotoxische Zellen In erster Linie zytotoxische T-Lymphozyten (Tc-Zellen) und natürliche Killerzellen, die andere Zellen zerstören können

1

1 Allgemeine Grundlagen 1.1 Molekulare klinische Zellbiologie Kai Breuhahn und Karsten Brand

1.2 Molekulare Mechanismen von Zell-Zell-Wechselwirkungen Thomas Brümmendorf

1.3 Die zytogenetischen Grundlagen der Molekularen Medizin Heidemarie Neitzel und Karl Sperling

1.4 Analyse von Biochips: Von der Sequenz zum System Ralf Herwig, Johannes Schuchhardt, Lukas Chavez und Hans Lehrach

1.5 Mitochondriale DNA des Menschen Bernd Wissinger

1.6 Regulationsmechanismen der Transkription in Eukaryonten Rainer Renkawitz und Joerg Leers

1.7 Mechanismen der Translationskontrolle in Eukaryonten Martina U. Muckenthaler und Thomas Preiss

1.8 Molekulare Grundlagen der Apoptose Peter Daniel

1.1 1.1 Molekulare klinische Zellbiologie Kai Breuhahn und Karsten Brand

1.1.1

Einleitung

–4

1.1.2

Subzelluläre Prozesse

1.1.2.1 1.1.2.2 1.1.2.3 1.1.2.4

Synthese und Abbau – 4 Energie – 9 Transport – 10 Kommunikation – 12

1.1.3

Zelluläre Prozesse

1.1.3.1 1.1.3.2 1.1.3.3 1.1.3.4 1.1.3.5

Zelluläre Homöostase – 15 Proliferation (Zellteilung/Zellzyklus) – 15 Zelltod (Apoptose/Nekrose) – 16 Positionierung (Adhäsion/Migration) – 16 Spezialfunktionen und Funktionsdifferenzierung

1.1.4

Ausblick

– 17

1.1.5

Literatur

– 18

1.1.6

Zeittafel

– 19

–4

– 14

Literatur zur Zeittafel

– 17

– 20

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

4

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

1.1.1 Einleitung Klinisch relevante Vorgänge im menschlichen Körper haben eine Entsprechung auf zellbiologischer und molekularer Ebene. Die zelluläre Reaktion kann dabei direkt oder auf den ersten Blick nur lose mit der klinischen Situation assoziiert sein. Beim Herzinfarkt beispielsweise kann man das unmittelbar auslösende thromboembolische Ereignis (Verschluss eines Blutgefäßes durch Gerinnsel) auch ohne zellbiologisches Wissen verstehen, aber bereits die Entstehung des Embolus sowie die arteriosklerotische Vorschädigung (Gefäßverkalkung) und die Reaktion des Organismus sind zytopathologisch erklärbar. Der Zytopathologie liegen wiederum subzelluläre, molekulare Prozesse zugrunde, die mehr und mehr bekannt werden. Molekularbiologie und Medizin bewegen sich seit längerem aufeinander zu. In den Lehrbüchern der klassischen molekularen Zellbiologie bemüht man sich zunehmend um die Herstellung klinischer Bezüge; in den entsprechenden klinischen und pathologischen Werken werden vermehrt die molekularen Ursachen von Krankheiten aufgeführt. Im ersten Abschnitt (1.1.2) knüpfen wir an diese Tradition an, indem die molekularen und biochemischen subzellulären Prozesse einführend und übersichtsartig dargestellt werden und beispielhaft klinische Bezügen aufgezeigt werden. Zur Vertiefung verweisen wir auf die großen Standardwerke der (molekularen) Zellbiologie (z. B. Alberts et al. 2002; Lodish et al. 2004; Karp 2005). Im zweiten Abschnitt (1.1.3) beschreiben wir das, was eine einzelne Zelle tun kann – nämlich, mittels ihrer ‚Housekeeping’-Funktionen die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten, im Rahmen der Differenzierung zelluläre Spezialfunktionen zu entwickeln, sich zu teilen, ihre Position durch Migration gegebenenfalls zu verändern sowie im Extremfall mit Zelltod zu reagieren. Wir haben in diesen beiden Unterkapiteln Wert auf systematische Geschlossenheit gelegt. Jeder Abschnitt beschreibt die jeweilige hierarchische Ebene (subzellulär bzw. zellulär) möglichst vollständig und mit geringer Überlappung innerhalb einer hierarchischen Ebene bzw. zu anderen hierarchischen Ebenen. Ziel dieser einführenden Abhandlung kann im Rahmen des verfügbaren Raumes naturgemäß nicht die inhaltliche Vollständigkeit sein. Wir möchten dem Studierenden vielmehr das grundlegende Rüstzeug zum Verständnis der nachfolgenden Kapitel und ihrer konzeptionellen Einordnung an die Hand geben.

1.1.2 Subzelluläre Prozesse Zellen bilden die kleinste, lebende Funktionseinheit höher entwickelter Organismen. Trotz ihrer genetisch iden-

tischen Ausstattung können Zellen jedoch unterschiedlichste biologische Funktionen ausüben. Alle Zellen sind von einer flexiblen Phospholipidmembran umschlossen, in die Proteine eingelagert sind. Diese Proteine vermitteln sowohl Stofftransport (durch Transporter oder Kanäle) als auch die Signalweiterleitung (via Rezeptoren) und Zell-Zell-Kontakte (z. B. mittels Adherens junctions). Im Zytoplasma einer Zelle befinden sich die Organellen, welche für Energiegewinnung (Mitochondrien), Stoffsynthese (endoplasmatisches Retikulum, ER), intrazellulären Transport (Golgi-Apparat) und Stoffabbau (Lysosomen und Peroxisomen) verantwortlich sind. Ferner durchziehen die Zelle verschiedene Strukturelemente des Zytoskeletts, die von zentraler Bedeutung für Bewegung (Aktinfilamente), Morphologie (Intermediärfilamente) und Zellteilung (Mikrotubuli) sind. In dem von zwei Membranschichten umspannten Zellkern (Nukleus) liegt die genetische Information in Form von Chromosomen vor. Basierend auf diesem essenziellen Bauplan aller eukaryoten Zellen, können diese eine definierte Funktion ausüben, mit anderen Zellen interagieren und gegebenenfalls auf exogene Stimuli und Umwelteinflüsse reagieren. Häufig kommt es jedoch zur Störungen der zellulären Homöostase, was mit der Entstehung pathologischer Erscheinungsbilder einhergeht.

1.1.2.1 Synthese und Abbau DNA, Replikation und DNA-Reparatur Die genetische Information ist in Form von Chromosomen im Zellkern organisiert (> Abb. 1.1.1). Jedes Chromosom stellt ein fadenförmiges Makromolekül (Desoxyribonukleinsäure, DNS, engl. DNA) dar, auf dem die Erbanlagen (Gene) durch eine Abfolge unterschiedlicher Desoxyribonukleotide kodiert vorliegen. Komplementäre Wasserstoffbrückenbindungenzwischen den Basenanteilen der Nukleotide zweier DNA-Einzelstränge (Adenin mit Thymin, Guanin mit Cytosin) führen zur Ausbildung der äußerst stabilen Doppelhelix. Durch die Komplexierung der DNA mit basischen Proteinen, den Histonen, entstehen hochgradig kondensierte Chromatinstrukturen, die Nukleosomen. In Abhängigkeit von Modifikationen dieser DNA-assoziierten Histone (z. B. Acetylierung) können unterschiedlich dichte Chromatinabschnitte entstehen, deren Struktur maßgeblichen Einfluss auf die Ablesbarkeit der in dieser Region kodierten Gene hat. So ist die Bildung des hoch kondensierten Heterochromatins mit inaktiven DNARegionen und des weniger kompakten Euchromatins mit aktiven DNA-Regionen verbunden. Das menschliche Genom ist diploid und besteht aus 23 Chromosomenpaaren (einschließlich zweier Geschlechtschromosomen). Bevor sich jedoch eine Zelle

5 1.1 · Molekulare klinische Zellbiologie

1.1

teilen kann (Mitose), muss diese gesamte genetische Information exakt kopiert werden. Dieser Prozess der Replikation beginnt mit der Öffnung der DNA-Doppelhelix an tausenden von Stellen innerhalb des Genoms. Zahlreiche Proteine sind hierbei an der kurzfristigen Entspiralisierung und Öffnung der DNA beteiligt (z. B. Helikasen) und ermöglichen so die Bindung einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase, welche entsprechend der als Matrize dienenden einzelsträngigen DNA je zwei neue Gegenstränge synthetisiert. Durch die nunmehr rasch fortlaufende Polymerisation der neuen DNA-Hälften an die DNA-Vorlage entstehen aus einer Doppelhelix zwei Doppelhelices. Während des Vorgangs der DNA-Synthese können durch schädigende Umwelteinflüsse (z. B. UV-Strahlung und chemische Substanzen) in den für Gene kodierenden Bereichen der DNA Veränderungen in der NukleotidSequenzabfolge entstehen. Damit sich diese Fehler nicht in den somatischen Körperzellen oder den Keimbahnzellen in Form von Mutationen manifestieren, existieren verschiedene zelluläre Reparaturmechanismen. Im Rahmen dieser DNA-Reparaturvorgänge wird der betroffene Sequenzabschnitt erkannt (z. B. Nukleotid-Dimere), der

fehlerhafte DNA-Einzelstrang vom unveränderten DNAStrang separiert, ausgeschnitten und fehlerfrei neu synthetisiert. An diesen Prozessen sind zahlreiche Proteine beteiligt, von denen einige auch in die DNA-Replikation involviert sind (z. B. Polymerasen und Ligasen). Grundsätzlich wird zwischen verschiedenen Mechanismen unterschieden: der „Nukleotidexzisionsreparatur“ (NER) und der „Basenexzisionsreparatur“ (BER). Die zentrale Bedeutung der DNA-Reparaturmechanismen wird deutlich, wenn eben diese Prozesse in einer eukaryoten Zelle nicht mehr ausreichend funktionieren. Im Falle des Cockayne-Syndroms führt eine Mutation im den Genen CSA oder CSB dazu, dass ein eng an die Transkription gekoppelter Reparaturprozess der NER genomische Fehler in besonders aktiv transkribierten Genen nicht erkennt. Andererseits führen verschiedene Mutationen im XPD-Gen (eine Helikase im sog. globalen NER-Reparaturweg) zur Entwicklung der Hautkrankheiten Xeroderma pigmentosum oder Trichothiodystrophie. Es ist interessant, dass beide Erkrankungen auf der Fehlfunktion desselben Proteins beruhen, sich jedoch hinsichtlich ihres pathologischen Phänotyps gravierend voneinander unterscheiden (> Tabelle 1.1.1).

. Abb. 1.1.1. Schematische Darstellung der in Synthese und Abbau eingebundenen subzellulären Prozesse. Nur die komplexen und hochgradig regulierten Prozesse der Synthese (DNA-Replikation, RNA-Transkription, Protein-Translation) und des Abbaus (durch Enzyme [Proteasen, Nukleasen], das Proteasom und Zellorganellen [Lysosomen]) von

Biomolekülen ermöglicht es der eukaryoten Zelle als kleinster lebender Funktionseinheit, auf unterschiedlichste Anforderungen und Stimuli zu reagieren. Letztendlich antworten Zellen somit durch eine adaptive Synthese (bzw. den adaptiven Abbau) von zellulären und sezernierten Biomolekülen auf Umweltreize (ausführliche Erläuterungen 7 Text)

6

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

. Tabelle 1.1.1. Molekularbiologie und Pathologie ausgewählter Erkrankungen Erkrankung

Betroffener subzellulärer Prozess

Zielstruktur

Pathologie

Cockayne-Syndrom

DNA-Reparatur

CSA, CSB

Zwergwuchs, abnormale Entwicklung des Nervensystems, erhöhte Sensitivität gegenüber Licht

Xeroderma pigmentosum

DNA-Reparatur

XPD (Untereinheit von THIIH)

erhöhtes Hautkrebs-Risiko

Trichothiodystrophie

DNA-Reparatur

XPD (Untereinheit von THIIH)

erhöhte Sensitivität gegenüber Licht, schuppige Haut, spröde Haare

Alzheimer-Erkrankung

Proteinfaltung

Mutationen in APP (amyloid precursor protein), PS-1 und PS-2 (Presenilin) führt zur Anreicherung von Amyloid-βPeptid (Aβ)

Demenz

Creutzfeld-Jacob-Erkrankung

Proteinfaltung

PrPc (zelluläres Prion-Protein)

Demenz

Tay-Sachs-Krankheit

Abbau von Biomolekülen

Verlust von β-Hexosaminidase

Erblindung, Demenz, körperlicher Abbau

Glucozerebrosidose (Gaucher-Syndrom)

Abbau von Biomolekülen

Verlust von Ceramid-βGlukosidase

Vergrößerung der Leber und Milz, Demenz, Skelettveränderungen

MERRF- (Myoklonusepilepsie mit Ragged-redFasern-)Syndrom

mtDNA/Proteinbiosynthese

tRNA-Lysin

Muskeldegeneration, epileptische Anfälle, Koordinations- und Hörstörung

Kearns-Sayre-Syndrom

mtDNA/Proteinbiosynthese/ Energiegewinnung

diverse

Lähmungen, Muskelschwäche, Demenz

Mukoviszidose

Transport

CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)

Schleimsekretionsstörung, Lungeninfektionen und Lungenentzündungen

Liddle-Syndrom

Transport

Natriumkanal

Bluthochdruck

Retinitis pigmentosa

Kommunikation

Proteine der Phototransduktion (z. B. Rhodopsin)

Blindheit

Lungenkrebs, Lymphome

Transkriptionskontrolle

NF-κB

Maligne Transformation

Burkitt-Lymphom

Transkriptionskontrolle

MYC (Translokation des Gens)

Maligne Transformation

Verschiedene Tumorerkrankungen

Kommunikation

E-Cadherin

Metastasierung

mRNA und Transkription Die in Form von DNA gespeicherte Information muss in Botenmoleküle (Ribonukleinsäure, RNS, engl. RNA, oder Messenger-RNA, mRNA) umgeschrieben werden, damit sie für weitere Prozesse zugänglich ist (> Abb. 1.1.1). Auch in diesem Makromolekül kodiert die Abfolge von Nukleotiden die relevante Information; allerdings findet man nicht Thymin, sondern Uracil in den Sequenzen wieder. Darüber hinaus wird mRNA nicht in Form einer Doppelhelix, sondern als einzelsträngiges Polymer aus dem Zellkern in das Zytoplasma transportiert. Typischer-

weise ist der Aufbau einer mRNA in seinen Grundzügen immer gleich. Am „Anfang“ des Moleküls, dem sog. 5‘-Ende, gibt es die „Cap“-Struktur (Triphosphat mit 7-Methylguanosin) und am „Ende“ der mRNA, dem 3‘-Ende, den Poly-A-Anhang (50–250 Adenin-Nukleotide). Die „Cap“-Struktur schützt die mRNA vor dem Abbau durch zelleigene Nukleasen, unterstützt den Export aus dem Zellkern und ist an der Initiation der Proteinbiosynthese (s. Translation) beteiligt. Auch der PolyA-Anhang schützt, zusammen mit gebundenen Proteinen, vor dem frühzeitigen und unkontrollierten

7 1.1 · Molekulare klinische Zellbiologie

Abbau der mRNA. Neben diesen terminalen Strukturen existieren noch weitere nichtkodierende Abschnitte im 5‘- und 3‘-Bereich einer mRNA. Diese Regionen rahmen die für ein Protein kodierende Nukleotid-Sequenz ein und umfassen vorwiegend regulatorische Elemente (z. B. die Konsensus-Sequenz AAUAAA zur Polyadenylisierung). Der Vorgang der mRNA-Synthese wird Transkription genannt. Diese ist hoch komplex, strikt reguliert und beinhaltet eine sequentielle Abfolge von proteinabhängigen Schritten. Zuerst bildet sich in definierten DNA-Promotorbereichen eines Gens (TATA-Box) ein sog. Präinitiations-Komplex, bestehend aus zahlreichen „generellen“ Transkriptionsfaktoren und einer RNA-Polymerase II. Das Entwinden der DNA durch eine Helikase ermöglicht der RNA-Polymerase dann entsprechend der Sequenz des „anti-sense“-DNA-Einzelstrangs, die komplementäre mRNA-„sense“-Sequenz zu synthetisieren. Die mRNA entsteht dabei vom 5‘-Ende in Richtung des 3‘-Endes. Spezifische Terminations-Sequenzen (u. a. auch die Polyadenylisierungs-Sequenz) können den Syntheseprozess durch die Polymerase beenden. Das durch die Transkription entstandene Primärtranskript erfährt abschließend zahlreiche enzymatische Modifikationen, bevor es in das Zytoplasma exportiert wird. So werden einige nichtkodierende Bestandteile, die Introns, entfernt (Spleißen) oder aber einzelne Basen modifiziert (RNA-Editing). Insbesondere in Eukaryonten erhöht der Prozess des sog. alternativen Spleißens bei gegebener Anzahl von Exons die Zahl möglicher Proteine. Eine große Zahl solcher sog. Protein-Isoformen entsteht durch häufig zelltypspezifische Exklusion oder Inklusion bestimmter Exone in die kodierende mRNA. Interessanterweise ist alternatives Spleißen auch eine von Viren viel genutzte Methode, bei beschränktem Platz für kodierende DNA oder RNA die Zahl möglicher Proteine zu erhöhen. Die Herstellung eines spezifischen Gen-Transkripts kann auf unterschiedliche Art und Weise reguliert werden. Neben der Kontrolle durch posttranskriptionelle Mechanismen (z. B. alternatives Spleißen) wird die hergestellte Menge einer mRNA, entsprechend der jeweiligen zellulären Situation, moduliert. Hierbei sind es vor allem „sequenzspezifische“ Transkriptionsfaktoren (TF), die durch Bindung an definierte TF-Bindungstellen in Gen-Promotorregionen für eine differenzielle Transkription verantwortlich sind. Diese können als transkriptionelle Aktivatoren oder auch als Repressoren wirken. Da die meisten Gen-Promotoren unterschiedliche Bindungsstellen für mehrere TFs aufweisen, und darüber hinaus ein TF unterschiedliche Gene in ihrer Expression beeinflussen kann, entsteht ein komplexes regulatorisches Netzwerk. Jeder Zelltyp besitzt eine charakteristische Auswahl und Quantität an TFs, welche

1.1

dem Expressionsprofil dieser Zelle (dem Transkriptom) zugrunde liegt. Welche Transkriptionsfaktoren in einem bestimmten Zelltyp exprimiert werden, wird durch eine Vielzahl regulatorischer Interaktionen bestimmt, die sich während der Entwicklung und Differenzierung der speziellen Zelltypen manifestieren. Muss die Zelle auf Reize ihrer Umwelt reagieren, wird die Anzahl und Aktivität der TFs moduliert (z. B. durch Reduktion der Menge oder Phosphorylierung, d. h. das Anhängen von Phosphatresten) oder aber die subzelluläre Lokalisation von existierenden Faktoren verändert (z. B. Translokation aus dem Zytoplasma in den Zellkern). Transkriptionsfaktoren können die Chromatinstruktur verändern, was häufig als indirekter Effekt bezeichnet wird, oder sie können direkt auf die RNA-Polymerase II und die generellen Transkriptionsfaktoren einwirken. Ebenso scheint hierbei der Interaktion reprimierender TFs mit HistonDeacetylase-Komplexen eine zentrale Bedeutung zuzukommen. Diese führt zu einer Deacetylierung der Histone, was mit einer Hemmung der Transkriptionsinitiation assoziiert ist. Insbesondere die veränderte Aktivität vieler TFs (z. B. durch Überexpression) wird für die Entstehung zahlreicher Tumorerkrankungen diskutiert. Ein gutes Beispiel für solch einen TF stellt der „nuclear factor κB“ (NF-κB) dar, ein Heterodimer, welches aus 5 verschiedenen Protein-Untereinheiten zusammengesetzt sein kann (RelA, NF-κB1, NF-κB2, c-Rel und RelB). Die erhöhte Aktivität dieser Faktoren wird unter anderem gehäuft in Lungentumoren und Plattenepithelkarzinomen beobachtet. Ein anderer onkogen wirkender TF ist MYC, welches an die Promotoren von 15% aller im Genom kodierten Gene bindet. Aufgrund dieser zentralen Stellung von MYC wird diskutiert, ob schon geringste Veränderungen der MYC-Expression unter Umständen dazu führen, dass ehemals „normale“ Zellen entarten. Hierbei können unterschiedliche molekulare Mechanismen für die Dysregulation verantwortlich sein. Sowohl genomische Translokationen des MYC-Gens (z. B. beim Burkitt-Lymphom) oder Amplifikationen des Lokus (z. B. beim Neuroblastom) können der erhöhten Expression des TF zugrunde liegen. Hohe MYC-Mengen führen dann durch Aktivierung von protumorigenen Zielgenen zu dem Prozess der malignen Transformation. Transkriptionelle Dysregulation ist aber nicht nur an der Krebsentstehung beteiligt. So scheint für die Pathogenese der angeborenen Pylorusstenose (Einengung des Magenausgangs) die transkriptionelle Dysregulation der neuronalen Stickoxid-Synthetase verantwortlich zu sein. Die Tatsache, dass genregulatorische Elemente ein hohes Maß an Promiskuität aufweisen, d. h. auch Gene, die sie nicht natürlicherweise regulieren, steuern können, wird in Forschung und Therapie ausgenutzt. So kann

8

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

man gentherapeutisch relevante Gene in den Körper einbringen, die nur am gewünschten Ort aktiv sind, nämlich dort, wo ein Satz an Transkriptionsfaktoren existiert, welcher exakt den verwendeten Promotor und damit das nachgeschaltete therapeutisch wirksame Gen aktiviert. Neben der bisher besprochenen Transkription von mRNA durch RNA-Polymerase II gibt es in Eukaryonten noch die Transkription von rRNA und srRNA durch die RNA-Polymerase I und von tRNA und 5S-rRNA durch RNA-Polymerase III. Diese Polymerasen benötigen unterschiedliche generelle und spezifische TFs. Proteine und Translation Die in Form der mRNA gespeicherte Information wird im Zytoplasma in Proteine „umgeschrieben“ (> Abb. 1.1.1). Proteine bestehen aus einer unterschiedlich langen Sequenz von bis zu 20 verschiedenen Aminosäuren (AS), deren Seitenketten chemische Gruppen mit differierenden chemischen und physikalischen Eigenschaften tragen. So gibt es hydrophobe und hydrophile Seitenketten, die saure, basische, ungeladen polare und nichtpolare Eigenschaften aufweisen. Einzelne AS werden über Peptidbindungen zu langkettigen Polymeren miteinander verbunden. Entsprechend der Reihenfolge der AS entstehen unter physiologischen Bedingungen Proteine einer Konformation mit definierten Eigenschaften. Es gibt unterschiedlichste Proteingruppen und Funktionen; so sorgen Strukturproteine unter anderem für den regelrechten Aufbau einer Zelle (z. B. Aktin), sezernierte Faktoren ermöglichen den Informationsaustausch zwischen Zellen (z. B. Zytokine) und Enzyme dienen als Katalysatoren für die chemische Umsetzung von Biomolekülen (z. B. Proteasen). Die Regel, nach der die mRNA-Nukleotidsequenz in ein Protein umgeschrieben wird, ist der evolutionär hochgradig konservierte genetische Code. Hierbei kodieren je 3 Nukleotide (insgesamt 61 Tripletts, syn. Kodons) der jeweiligen mRNA eine definierte AS. Drei weitere Tripletts entsprechen sog. Stoppkodons und bestimmen das Ende einer zur translatierenden Sequenz. Viele AS können durch mehrere Kodons dargestellt werden; man sagt, der genetische Code ist ‚degeneriert’. Der eigentliche Vorgang der Proteinsynthese wird auch Translation genannt. Hierbei lagert sich zuerst eine Reihe von Initiationsfaktoren an die Cap-Struktur einer mRNA an. Das Ribosom, bestehend aus 2 unterschiedlich großen Untereinheiten, erkennt ein für die AS Methionin kodierendes Startkodon (Sequenz: Adenin/ Uracil/Guanin) und verlängert, durch kontinuierliche Wanderung über die mRNA, das zu synthetisierende Protein (Elongation). Hierbei ist es notwendig, dass ständig einzelne AS für den Einbau in das neu entstehende Polymer zur Verfügung stehen. Dies erfolgt durch tRNA- (Transfer-)Moleküle, welche entsprechend dem

auf der mRNA kodierenden Kodon die geforderte AS transportieren. tRNAs tragen die hierzu komplementären Antikodon-Sequenzen und verknüpfen somit die in den Nukleinsäuren kodierte Information mit den funktionellen Eigenschaften eines Proteins. Erreicht das Ribosom eines der 3 Stoppkodons (für das keine AS-tragende tRNA existiert), so vermitteln „Releasing“-Faktoren die Freisetzung der ribosomalen Untereinheiten und des neu synthetisierten Proteins von der mRNA (Termination). Abschließend erfahren Proteine noch posttranslationale Modifikationen, welche ihre Stabilität beeinflussen und ihre Funktion innerhalb und außerhalb der Zelle weiter spezialisieren. Die korrekte Faltung von Proteinen benötigt die Assistenz molekularer Chaperone (z. B. Hitzeschock 70 Proteine), welche an die am Ribosom entstehenden Polypeptide binden und ihre Fehlfaltung verhindern. Eine weitere Gruppe assistierender Proteine, die Chaperonine binden teil- oder fehlgefaltete Proteine und geben damit Zeit für eine korrekte Faltung. Nach ihrer Synthese werden die meisten Proteine noch durch das Anhängen verschiedener chemischer Gruppen an Aminosäurereste modifiziert. Modifikationen wie Acetylierung, Hydroxylierung, Glykosylierung und Phosphorylierung können dabei sowohl die Struktur als auch die Funktion des einzelnen Proteins maßgeblich verändern. Wie wichtig eine korrekte Sequenz bzw. Faltung für die Funktion eines Proteins ist, zeigt sich an zwei neurodegenerativen Erkrankungen. Bei der Alzheimer-Erkrankung führen wahrscheinlich Mutationen in unterschiedlichen Proteinen dazu, dass es zu einer Anreicherung einer Amyloid-β-Peptid Variante kommt. Diese alternative Variante tendiert zur Oligomerisierung und führt zu den typischen Aggregaten, welche in den Nervenzellen zu beobachten sind. Im Falle der erworbenen Creutzfeld-Jacob-Erkrankung sind es keine genetischen Veränderungen, die das Krankheitsbild hervorrufen. Das PRNP-Gen kodiert für „normales“ PrPc (zelluläres Prion-Protein), das in Nervenzellen exprimiert vorliegt. Die AS-Sequenz des Krankheits-assoziierten PrPsc (Prion-Protein scrapie) ist dazu identisch, das Protein liegt jedoch in einer anderen Konformation vor. Diese modifizierte Version akkumuliert in Nervenzellen und führt zu deren Untergang. Dieser Vorgang ist deshalb so gefährlich, weil wahrscheinlich das pathogene Protein an das normale PrPc bindet und dieses in PrPsc konvertiert. Diese Hypothese würde den infektiösen Charakter von Prionen erklären helfen (> Tabelle 1.1.1). Synthese weiterer Makromoleküle Neben Nukleinsäuren und Proteinen spielen für Zellstruktur und -funktion Fette und insbesondere im extrazellulären Milieu auch Zucker eine zentrale Rolle. Phospholipide, Sphingolipide und Triglyceride, welche die

9 1.1 · Molekulare klinische Zellbiologie

Hauptkomponenten von Biomembranen darstellen, sind aus gesättigten und ungesättigten Fettsäuren unterschiedlicher Kettenlängen aufgebaut. Fettsäuren werden von wasserlöslichen Enzymen synthetisiert und im ER modifiziert. Die letzten Schritte der Lipidsynthese und Modifikation erfolgen auf dem Weg zur Plasmamembran ähnlich wie in Abschnitt 1.1.2.3 für Proteine beschrieben. Unter den polymeren Zuckern sind v. a. die Proteoglykane zu nennen. Sie besitzen einen membranassoziierten oder sezernierten Proteinkern, der kovalent an eine oder mehrere Glykosaminoglykanketten angehängt ist. Dies sind lineare Polymere bzw. sulfatierte Disaccharide, deren Synthese und Kopplung ähnlich, wie für die Proteine beschrieben, im sekretorischen Weg erfolgt. Abbau Für die Bioverfügbarkeit eines Proteins in einer Zelle sind neben der Expression (via Transkription und Translation) dessen Stabilität und der zielgerichtete Abbau von zentraler Bedeutung (> Abb. 1.1.1). Hierbei ist die Proteasom-vermittelte Degradation der wichtigste zielgerichtete Prozess zum Abbau von unnötigen oder sogar schädlichen Genprodukten. Zuerst müssen dafür die abzubauenden Zielproteine für das Proteasom markiert werden. Dies geschieht durch die enzymatische Bindung von kurzen Protein- (Ubiquitin-)Polymeren an LysinSeitenketten eines Zielproteins durch E1-aktivierende Enzyme, E2-konjugierende Enzyme und E3-UbiquitinLigasen. Das aus zahlreichen Untereinheiten bestehende Proteasom erkennt die so markierten Proteine und katalysiert deren Abbau; das dabei frei werdende Ubiquitin kann anschließend erneut für Markierungsprozesse genutzt werden. Ubiquitin- abhängige Proteindegradation erfüllt zwei wesentliche Aufgaben: 1. die engmaschige Kontrolle der Aktivität vitaler zytosolischer Proteine: Zykline beispielsweise sind Zellzyklusproteine, die nur über einen bestimmten Zeitraum während der Zellteilung aktiv sein sollen. Zu einem bestimmten Zeitpunkt werden sie phosphoryliert, was ihre Konformation so verändert, dass sie für die ubiquitinierenden Enzyme erkennbar werden und abgebaut werden können. 2. die Entfernung von Proteinen, die während ihrer Entstehung im ER nicht korrekt gefaltet wurden. Hier werden durch die Fehlkonfiguration hydrophobe Sequenzen exponiert, die sowohl zur Ausschleusung ins Zytoplasma als auch zur Erkennung durch Ubiquitin-Ligasen führen. Während Proteasomen zytosolisch lokalisierte sog. molekulare Maschinen sind, handelt es sich bei Lysosomen um spezialisierte membranbegrenzte Vesikel, welche unterschiedlichste saure Hydrolasen (z. B. Proteasen, Nukleasen, Lipasen) enthalten. Verschmelzen diese Ve-

1.1

sikel mit z. B. endozytotischen Vesikeln, werden die darin enthaltenen Biomoleküle (z. B. Proteine, Nukleinsäuren und Fette) komplett und ungerichtet abgebaut. Aus diesem Grund werden Lysosomen auch als die „Verdauungsorgane“ einer Zelle bezeichnet. Peroxisomen sind ebenfalls membranbegrenzte Vesikel, die jedoch oxidative Enzyme enthalten (z. B. Katalase). Neben dem Abbau von Fettsäuren katalysieren die in ihnen enthaltenen Enzyme auch Entgiftungsreaktionen (z. B. Oxidation von Alkohol zu Acetaldehyd). Dass ein unzureichender Abbau von Biomolekülen mit der Entwicklung von pathologischen Phänotypen assoziiert ist, wird deutlich, wenn man die mehr als 40 erblichen Erkrankungen betrachtet, die allein auf einer Störung des lysosomalen Metabolismus beruhen. Hierbei führt das Fehlen einer spezifischen Hydrolase zur intralysosomalen Anhäufung von Substraten. Beispiele für solche Erkrankungen sind die Tay-SachsKrankheit und die Glucozerebrosidose (> Tabelle 1.1.1).

1.1.2.2 Energie Die meisten Prozesse innerhalb einer Zelle sind energieabhängig. Somit ist die Zelle auf eine fortwährende Versorgung durch Energie angewiesen (> Abb. 1.1.2). Diese Energie steht für die einzelnen Reaktionen in Form einer chemischen Substanz, dem Adenosintriphosphat (ATP) zur Verfügung. Die Synthese dieses Energieäquivalents ist sehr komplex und verteilt sich über verschiedene zelluläre Kompartimente. Typischerweise wird Glucose von einer Zelle aufgenommen und im Zytoplasma zu Pyruvat umgebaut (Prozess: Glykolyse). In den Mitochondrien erfolgt die oxidative Decarboxylierung von Pyruvat unter Bildung von Acetyl-CoA. Unter bestimmten Bedingungen können aber auch Fette (β-Oxidation) und Proteine (Aminosäureabbau) zur Synthese von Acetyl-CoA und somit zur Energiegewinnung beitragen; ATP kann auch direkt hergestellt werden (anaerobe Glykolyse unter Bildung von Milchsäure). Das Acetyl-CoA wird dann im Zitronensäurezyklus vollständig zu CO2 oxidiert und ein sog. energiereiches Reduktionsäquivalent (NADH+H+) hergestellt. Abschließend wird bei der oxidativen Phosphorylierung an der Mitochondrienmembran durch den Übertrag von Elektronen vom Reduktionsäquivalent auf molekularen Sauerstoff Energie frei, die zur Synthese von ATP verwendet wird (Atmungskette). ATP steht nun nach Bedarf den verschiedenen zellulären Prozessen als universeller Energielieferant zur Verfügung. Unter Spaltung des Moleküls in Adenosindiphosphat (ADP) und ein Orthophosphat (-P) kann die frei werdende Energie z. B. für Synthese-, Markierungs- oder Abbauprozesse Verwendung finden.

10

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

. Abb. 1.1.2. Schematische Darstellung weiterer subzellulärer Prozesse. Neben Synthese und Abbau stellen Kommunikation bzw. Signaltransduktion, Transport und Energiegewinnung zelluläre Prozesse dar,

welche eng miteinander verknüpft vorliegen. Beispielhaft werden hier einige mögliche Interaktionen dargestellt (ausführliche Erläuterungen 7 Text)

Die zentrale Schaltstelle der Energiegewinnung, das Mitochondrium, besitzt extrachromosomale DNA (mitochondriale DNA, mtDNA). Ein wichtiger Unterschied zwischen nukleärer DNA und mtDNA ist, dass im Mitochondrium die DNA-Reparaturmechanismen wahrscheinlich weniger effizient sind bzw. in geringerem Ausmaß existieren. Aus diesem Grund ist die Mutationsrate in den Mitochondrien um den Faktor 10 höher als im Zellkern. Es ist deshalb nicht verwunderlich, das eine Reihe von mtDNA-assoziierten Erkrankungen (Mitochondriopathien) beschrieben wurden. So führen z. B. Punktmutationen in der für Lysin kodierenden tRNA zum MERRF-Syndrom und Deletionen zur Ausbildung des Kearns-Sayre-Syndroms (> Tabelle 1.1.1). Eine mögliche Beteiligung von mtDNA-Mutationen an neurodegenerativen Erkrankungen (Parkinson-Syndrom) wird zurzeit diskutiert.

1.1.2.3 Transport Der Transport von Biomolekülen, Nährstoffen, Ionen und Abfallprodukten ist für das Überleben einer Zelle essenziell (> Abb. 1.1.2). Zum einen muss ein wechselseitiger Austausch zwischen intra- und extrazellulärem Milieu erfolgen; zum anderen ist ein gerichteter Transport zwischen subzellulären Kompartimenten erforderlich. Pumpen und Kanäle Der Phospholipid-Bilayer ist die grundlegende Struktureinheit der Biomembranen. Einige wenige Moleküle können diese Membranen durch einfache passive Diffusion durchqueren. Hierzu gehören Gase wie Sauerstoff und Kohlendioxid sowie kleine polare ungeladene Moleküle wie Ethylalkohol und in geringerem Maße auch Harnstoff und Wasser. Diese passive Diffusion verbraucht keine Energie und läuft entsprechend dem Konzentrationsgefälle spontan ab. In Gegensatz dazu sind Phospholipid-Bilayer für große polare ungeladene Moleküle wie Glucose oder Fructose, für polare geladene Moleküle wie Aminosäuren, ATP und Nukleinsäuren

11 1.1 · Molekulare klinische Zellbiologie

und für Ionen wie K+, Na+ oder Ca2+ nicht durchlässig. Solche Substanzen können durch drei Klassen transmembranöser Proteine transportiert werden: ATP-abhängige Pumpen, Ionenkanäle und Transporter. ATP-abhängige Pumpen transportieren Ionen und verschiedene kleine Moleküle aktiv gegen den jeweiligen Konzentrationsgradienten. Es handelt sich um Transmembranproteine mit einer oder mehreren ATP-Bindungsstellen auf der zytosolischen Membranseite. Sie sind u. a. verantwortlich für das allgemeine Ionenmilieu tierischer Zellen und für das saure Milieu in Lysosomen. Die ABC- Unterfamilie hat mit ihrem Mitglied MDR1 (multiple drug resistance 1) besondere medizinische Bedeutung, da dieser Transporter für einen Teil der Resistenzentwicklung maligner Tumoren gegen Chemotherapeutika verantwortlich gemacht wird. ABC-Transporter sind neben speziellen Fettsäuretransportern auch für den Lipidtransport durch Zellmembranen verantwortlich. Zusätzlich zu den ATP-abhängigen Pumpen gibt es noch Ionenkanäle, die es den wichtigsten zellulären Ionen wie K+, Na+ oder Ca2+ und Cl– erlauben, entsprechend ihrem Konzentrationsgradienten die Zellmembran zu durchqueren. Die Fehlfunktion von Transportvorgängen kann zu zahlreichen, schwerwiegenden Erkrankungsbildern führen. So wurden für die autosomal-rezessiv vererbte Mukoviszidose bisher über 150 Mutationen in einem Gen beschrieben, welches für einen Chlorid-Kanal kodiert. Im Falle des Liddle-Syndroms führen Mutationen in einem Natrium-Kanal dazu, dass dieser nicht durch hohe Ionenkonzentrationen geschlossen wird (> Tabelle 1.1.1). Die dritte Hauptklasse von Transportmolekülen sind solche, die ihre Energie aus elektrochemischen Gradienten generieren. Auf diese Weise transportieren sie als Uniporter z. B. Glucose entlang des Konzentrationsgradienten und als Kotransporter Ionen entgegen ihres Konzentrationsgradienten. Wie oben bereits erwähnt besitzen Membranen eine gewisse Permeabilität für Wasser, und dieses folgt dem Konzentrationsgradienten aller löslichen Substanzen (Osmose). Zusätzlich gibt es aber Wasserkanäle, Aquaporine, die die Permeabilität für Wasser selektiv erhöhen können, ein Vorgang, der in der Niere bei der Wasserresorption aus dem Primärharn eine Rolle spielt. Membrantransportproteine haben große Bedeutung in der Medizin. Auch heutzutage stellen spezifische Inhibitoren oder Aktivatoren von Kanälen, Pumpen und Transportern die größte Klasse von Medikamenten, darunter Säurehemmer bei Magengeschwüren, Blutdrucksenker oder Antidepressiva. Ebenso werden diesen Transportproteinen krankheitsverursachende Eigenschaften zugeschrieben. Eine bestimmte Form von Herzrhythmusstörungen konnte kürzlich auf eine Mutation in einem Natriumkanal-Gen zurückgeführt wer-

1.1

den, und eine ebensolche Mutation scheint eine Form der Epilepsie zu bedingen. Transport neu gebildeter Proteine Eine typische Säugetierzelle besitzt bis zu 10.000 verschiedene Proteinsorten. Ein großer Teil der Proteine wird an zytosolischen Ribosomen gebildet und verbleibt im Zytosol. Viele Proteine müssen ihre Aufgaben aber in Organellen, in der Zellmembran oder sogar außerhalb der Zelle erfüllen. Wir wissen inzwischen, dass die Information, die ein Protein zu einem bestimmten Ort bringt, in der Aminosäurenabfolge des Proteins selbst liegt, und zwar gewöhnlich innerhalb eines Abschnittes von etwa 20–50 Aminosäuren, der als Signalsequenz bezeichnet wird. Die einzelnen Organellen tragen einen Satz an Rezeptorproteinen, welche nur an die entsprechenden Signalsequenzen binden. Sobald ein Protein mit seiner Signalsequenz mit seinem korrespondierenden Rezeptor interagiert, wird es über einen translozierenden Kanal in die Organelle eingeschleust. Am längsten und vielleicht am besten bekannt sind die Mechanismen, die Proteine zunächst ins ER einschleusen, bevor sie entweder sezerniert werden oder in den Golgi-Apparat, die Lysosomen oder die Zellmembran als letzten Bestimmungsort gelangen. Hierbei können zwei Mechanismen unterschieden werden: Im Rahmen der kotranslationalen Translokation ins ER wird noch während der Translation die Signalsequenz von einem Signalerkennungspartikel (SRP) detektiert und der Komplex aus Protein und SRP nach Anlagerung an einen SRP-Rezeptor durch einen speziellen Kanal, das Translocon, geschleust. Von geringerer Bedeutung scheint in höheren Tieren die posttranslationale Translokation zu sein, die ohne SRP auskommt. In beiden Fällen wird nach der Translokation die Signalsequenz durch eine Signalpeptidase abgespalten. Durch welche Transportmechanismen gelangen nun die im ER-Lumen befindlichen Proteine zu ihrem finalen Bestimmungsort? Das eine Prinzip des Proteintransports im sekretorischen Weg besteht darin, dass sich aus der Membran eines Kompartiments Membranvesikel abschnüren, die dann mit dem nächsten Kompartiment fusionieren. Die Proteine können so von Organelle zu Organelle wandern, ohne jedes Mal erneut durch eine Membran translozieren zu müssen. Die Exozytose von Proteinen verläuft in Abhängigkeit neuronaler oder hormoneller Signale. Lipide werden gewöhnlich im Komplex mit speziellen Proteinen als Lipoproteinkomplexe exportiert. Nicht sezernierte Membranproteine können im Golgi-Netzwerk je nach Bestimmungsort in unterschiedliche Vesikel aufgenommen werden. Parallel läuft auf diesen Ebenen auch ein retrograder Vesikeltransport, sodass Membranmaterial wieder Richtung ER ersetzt wird. Die Transportvesikel werden nach den

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

wesentlichen beteiligten Proteinen COPI I-, COPI IIund Clathrin-Vesikel benannt. Endozytose Alle eukaryoten Zellen betreiben kontinuierlich Endozytose – ein Prozess, bei dem eine kleine Region der Plasmamembran invaginiert, um bis zu 0,1 µm große Vesikel zu bilden. Neben einer unspezifischen Aufnahme extrazellulären Materials (Pinozytose) gibt es die rezeptorvermittelte Endozytose, bei der ein spezifischer Rezeptor auf der Zelloberfläche einen extrazellulären makromolekularen Liganden erkennt. An der Entstehung der endozytotischen Vesikel sind das bereits angesprochene Clathrin sowie das AP2-Molekül beteiligt. Der überwiegende Teil der endozytotischen Vesikel wird zu Endosomen umgewandelt und fusioniert dann mit Lysosomen. Auf diesem Weg dissoziieren die Rezeptoren von den Liganden; erstere können unter anderem zur Membran zurücktransportiert werden, letztere werden weitgehend abgebaut und dem Metabolismus zugeführt. Eine häufige Störung endozytotischer Internalisierung findet sich bei der familiären Hypercholesterinämie: Aufgrund einer Mutation im LDL- („low densitiy lipoprotein“-)Rezeptor kann das cholesterinhaltige LDL zwar gebunden, nicht aber internalisiert und abgebaut werden, sodass es zu erhöhten Blutcholesterinwerten kommt. Transzellulärer Transport Die Spezialfunktion vieler differenzierter Zellen, z. B. der Darmepithelien, besteht in der Aufnahme von extrazellulärem Material und der unmodifizierten Weitergabe in den Blutkreislauf. Dieser als Transzytose bezeichnete Prozess bedient sich ähnlicher Mechanismen wie Endozytose und Exozytose. Damit der Prozess gerichtet (z. B. vom Darmlumen ins Blut) ablaufen kann, wird die unterschiedliche Affinität membranöser Rezeptoren zu ihren Liganden z. B. in Abhängigkeit von unterschiedlichen pH-Werten auf den beiden Seiten der Zelle ausgenutzt. So findet z. B. der Transport von Immunglobulinen aus dem Darmlumen ins Blut gerichtet statt, da der pH Wert im Darmlumen bei 6, im Blut aber über 7 liegt. Vesikuläre Transportproteine Vesikel werden entlang den Mikrotubuli, einer Komponente des Zytoskeletts, transportiert. Mikrotubuli bestehen aus Tubulinen, die zu Hohlzylindern von 25 µm Durchmesser polymerisieren. Sie gehen üblicherweise von Mikrotubuli organisierenden Zentren (MTOC) aus und können über eine MTOC-nahes (–) Ende und ein MTOC-fernes (+) Ende orientiert werden. Mikrotubuli sind ein prinzipiell dynamisches System, was z. B. beim Aufbau der mitotischen Spindeln von zentraler Bedeutung ist. Colchicin, ein wichtiges Medikament zur Behandlung der Gicht, und Taxol, ein Krebsmedikament,

greifen beide an der Mikrotubilidynamik an. Im Rahmen des vesikulären Transports werden Mikrotubuli eher als stationär angesehen und scheinen als eine Art Leitschiene zu dienen, an der die Vesikel entlanggeführt werden. Die für diese Bewegung verantwortlichen Moleküle (Motorproteine) sind Kinesine, die für den anterograden Transport in (+)-Richtung verantwortlich sind, und Dyneine, die den retrograden Transport in (–)-Richtung bewerkstelligen. In Mikrotubuli-armen zellulären Regionen können Vesikel auch entlang von Mikrofilamenten transportiert werden. Mikrofilamente bestehen aus monomeren Aktinuntereinheiten, sind vor allem submembranös lokalisiert und haben ihre Hauptaufgabe in der Gestaltbildung und Migration der Gesamtzelle. Im Rahmen des intrazellulären Vesikeltransports dienen sie als Leitschiene für Myosin-Motorproteine. Die dritte Gruppe von Zytoskelettproteinen, die Intermediärfilamente (Zytokeratine, Spectrine, Vimentin, Lamine) dient vor allem der Zelladhäsion. Diese Proteine haben große diagnostische Relevanz, da sie dem Histopathologen eine Differenzierung epithelialer Tumoren (Karzinome), welche Zytokeratine, nicht aber Vimentin exprimieren, von mesenchymalen Tumoren (Sarkomen), die Vimentinpositiv und Zytokeratin-negativ sind, erlauben. Nukleärer Transport Die Kernhülle besitzt eine große Zahl von Kernporen – große komplexe Strukturen, die überwiegend aus Nukleoporinen bestehen. Proteine, die zum nukleären Import oder Export anstehen, besitzen nukleäre Lokalisationssignale (NLS) oder nukleäre Exportsignale (NES), die mit entsprechenden Rezeptoren, Importinen oder Exportinen interagieren. Zur Ausschleusung von mRNA aus dem Nukleus in das Zytoplasma verwendet die Zelle bisher noch unvollständig charakterisierte mRNA-Exporter.

1.1.2.4 Kommunikation Liganden Rezeptoren und Signalkaskaden Auf zellulärer bzw. subzellulärer Ebene gibt es einen Austausch von Information, der mit Strukturänderungen der beteiligten Informationsträger einhergeht (> Abb. 1.1.2). Dies bezeichnen wir als intrazelluläre oder extrazelluläre Kommunikation. Ihr wesentlicher Sinn besteht darin, Zellen in ihren Gewebsverband oder organismischen Zusammenhang sinnvoll einzubinden. Man kann formal das initiale Ereignis der Signalaufnahme durch die Zielzelle und die Signalweitergabe unterscheiden. Mittlerweile sind etwa 10 wesentliche Mechanismen der Signalaufnahme beschrieben, denen eine größere Zahl intrazellulärer Signalwege gegenüber-

13 1.1 · Molekulare klinische Zellbiologie

steht, die sich aber nach einigen wenigen Prinzipien ordnen lassen. Zwar werden bestimmte initiale LigandRezeptor-Interaktionen bevorzugt durch bestimmte Signalwege intrazellulär weitergeleitet, aber es gibt reichlich Überschneidungen. Der Besprechung einiger spezieller Rezeptor-LigandInteraktionen und der entsprechenden intrazellulären Signalwege wollen wir einige generelle Bemerkungen voranstellen: Unter den Liganden finden sich membranverankerte und sezernierte Proteine und Peptide, kleine lipophile Moleküle (z. B. Steroidhormone und Schilddrüsenhormone), kleine hydrophile Moleküle (z. B. Adrenalin), Gase (z. B. Stickstoffmonoxid) oder auch physikalische Stimuli (z. B. Licht). Die Rezeptor-Liganden-Interaktion ist von hoher Spezifität und Affinität. Die Zahl der Rezeptoren pro Zelle ist mit 2000 bis 20.000 relativ gering. Dies wird aber durch eine massive Signalamplifikation der mehrstufigen Signaltransduktionskaskade kompensiert, in der ein hierarchisch übergeordnetes Molekül zahlreiche stromabwärts gelegene Moleküle aktivieren kann. Signaltransduktionswege werden gewöhnlich nach einem prominenten Vertreter entweder eines beteiligten Liganden (z. B TGF-β), eines Rezeptors bzw. rezeptorassoziierten Proteins (z. B. G-Protein) oder eines intrazellulären Signaltransduktors (NF-κB) benannt. Am Ende der Signaltransduktionskaskade stehen zwei wesentliche zelluläre Antworten: 1. eine Änderung in der Aktivität oder Funktion spezifischer präexistenter Moleküle oder 2. eine Änderung in der Menge spezifischer zellulär produzierter Proteine, üblicherweise als Resultat einer Modifikation von Transkriptionsfaktoren, die zu einer Aktivierung oder Modifikation der Transkriptionsrate führen. Im Allgemeinen ist die erstbeschriebene Reaktion die schnellere, da auf bereits synthetisierte Proteine Einfluss genommen wird. Die größte Gruppe von Oberflächenrezeptoren sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR). Viele Hormone, wie Adrenalin, Glukagon oder Serotonin, sind GPCR-Liganden. GPCRs haben sieben transmembranöse Domänen und interagieren mit einigen ihrer zytosolischen Domänen mit trimeren G-Proteinen, die unter Umwandlung von GDP in GTP einen ebenfalls transmembranös gelegenen Effektor aktivieren. Der klassische Effektor ist die Adenylat-Cyclase, die dann zyklisches AMP (cAMP), einen sog. Second Messenger aktiviert. GPCRs können auch Ionenkanäle aktivieren. Sehr wichtig ist auch die Inaktivierung des GPCR-Signalweges durch Hydrolyse des GTP zu GDP. Das Choleratoxin z. B. verändert das G-Protein dergestalt, dass gebundenes GTP nicht mehr zu GDP inaktiviert werden kann, so dass die entsprechende Signalkaskade dauerhaft aktiviert ist. Dies führt im Falle der Cholera zu einer andauernden Sekretion von Wasser und Elektrolyten in das Darmlumen und verursacht massive Durchfälle.

1.1

Über einen ähnlichen Mechanismus führt das Toxin des Keuchhustenerregers Bordetella pertussis zu erhöhten cAMP Spiegeln in den Epithelien des Respirationstrakts mit der Folge von Flüssigkeits- und Elektrolytverlust. GPCRs können über G-Proteine und GTP auch die Durchlässigkeit von Ionenkanälen beeinflussen, was bei so unterschiedlichen Mechanismen wie der Herzmuskelkontraktion oder der Lichterkennung in der Netzhaut von Bedeutung ist. Letzterer Mechanismus kann interessanterweise durch spezielle Inhibitormoleküle, die in die Signaltransduktion eingreifen (Arrestine), modifiziert werden, was uns die Adaptation an unterschiedlich helle Lichtbedingungen ermöglicht. Ein weiteres wichtiges Effektorprotein der GPCRs ist die Phospholipase C mit ihrem Second Messenger Inositoltriphosphat (IP3). Dieses System beeinflusst maßgeblich die Blutdruckregulation: Der Ligand Acetylcholin aktiviert GPCRs auf Gefäßendothelien, die über Phospholipase C, IP3 und verschiedene weitere Schritte Stickstoffmonoxid (NO) synthetisieren. NO diffundiert in die benachbarten glatten Muskelzellen und setzt seinerseits als intrazellulärer Ligand eine Signalkaskade in Gang, die zur Erschlaffung der Gefäßmuskulatur und somit sekundär zur Blutdrucksenkung führt. Wie oben erwähnt kann eine Rezeptor-LigandenInteraktion auch zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren führen, was längerfristige Effekte auf das Transkriptom hat. So wird z. B. die GPCR-vermittelte Aktivierung der sog. MAP-Kinase-Kaskade mit konsekutiver Aktivierung von proliferationsinduzierenden Transkriptionsfaktoren für die Herzhypertrophie nach dauerhafter Adrenalinbehandlung verantwortlich gemacht. Eine weitere große Gruppe von Rezeptoren sind die Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTK). RTKs sind vor allem in Proliferation und Wachstum aktiv und werden durch Liganden wie den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), den Nervenwachstumsfaktor (NGF), den Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) und auch Insulin aktiviert. RTKs haben große Bedeutung bei der Krebsentstehung. Anders als bei den GPCRs geht deren Aktivierung mit einer aktivierenden Phosphorylierung der zytosolisch gelegenen Aminosäuren des Rezeptors nach Ligandenbindung und Dimerisierung von RTK-Monomeren einher. Die Phosphorylierung erfolgt durch die intrinsische Tyrosinkinaseaktivität des Rezeptors selbst (Autophosphorylierung). Es folgt dann eine Bindung an Adaptorproteine und membranständige Proteine mit GTPaseAktivität. Ein solches ist Ras, ein membranverankertes Protein, welches wie die G-Proteine mit gebundenem GTP im aktiven Zustand ist. Ras kann auch durch den RTKs eng verwandte Rezeptoren, die Zytokinrezeptoren, aktiviert werden. Alle RTKs, die meisten Zytokinrezeptoren und einige GPCRs aktivieren eine Kinase-Kaskade, die in höheren Eukaryonten in mehreren eng verwand-

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

ten Formen zu finden ist und nach dem zentralen Enzym als MAP-Kinase-Signalweg bezeichnet wird: Vereinfacht dargestellt führt die Aktivierung von Ras zunächst im Zytosol zu einer sequenziellen Phosphorylierung von Raf, MEK und MAP-Kinase. Diese aktivierte MAP Kinase dimerisiert und transloziert in den Zellkern. Dort werden dann zwei Transkriptionsfaktoren, TCF und SRF, phosphoryliert und aktiviert, was zu ihrer Assoziation in einem trimeren Komplex führt und zur Transkription verschiedener Gene führt. Die beispielhafte Aufzählung einiger Rezeptortypen und deren mögliche Interaktionen verdeutlichen die Komplexität des zellulären Signaltransduktionssystems. Diese Komplexität wird noch dadurch erhöht, dass auch zwischen verschiedenen Zelltypen in einem Organismus gravierende Unterschiede hinsichtlich Einflussnahme und Redundanz der Signalwegskomponenten existieren. Dies bedeutet, dass die Aktivierung eines spezifischen Rezeptors in Zelltyp A nicht dieselben biologischen Effekte induzieren muss wie in Zelltyp B. Kommunikation und Adhäsion Eine besondere Form interzellulärer Kommunikation ist die Zell-Zell-Adhäsion. Je nach Art der beteiligten Moleküle ist die Komponente der Strukturgebung oder die des Informationsaustauschs stärker ausgeprägt (> Abb. 1.1.2). Zelladhäsionsmoleküle können homotypisch (zwischen gleichen Molekülen) oder heterotypisch (zwischen verschiedenen Molekülen) interagieren. Mehrere Adhäsionsmolekülfamilien sind bekannt: Die Cadherine konstituieren die Adherens junctions, welche bandförmig auf der Zellmembran verlaufen und insbesondere epitheliale Zellen verbinden sowie mit Bestandteilen von Desmosomen, die äußerst stabile Kontakt- und Klebepunkte zwischen Zellen herstellen. An der zytoplasmatischen Seite der transmembranös gelegenen Cadherine bindet eine Vielzahl von intrazellulären Molekülen, die teils zum Zytoskelett gehören und die adhäsive strukturgebende Funktion intrazellulär fortsetzen, teils aber auch bedeutende kommunikative Aufgaben wahrnehmen. So wird z. B. über die Interaktion bestimmter Cadherine mit dem intrazellulären β-Catenin-Protein, welches in die Zellproliferation eingreift, eine Beziehung zwischen Adhäsion und Zellteilung hergestellt. Eine weitere große Gruppe unter den Adhäsionsmolekülen sind die Integrine, die neben einigen Zell-Zell-Interaktionen viele Zell-Matrix-Interaktionen ausbilden. Es handelt sich um aus zwei verschiedenen Untereinheiten aufgebaute (heterodimere) Proteinkomplexe, die vor allem mit Molekülen der extrazellulären Matrix wie Fibronektin oder Laminin interagieren. Die kommunikative Funktion der Integrine betrifft Signalwege, die in Prozesse wie Zelladhäsion, Zelltod und Zellproliferation eingreifen. Ein angeborener Defekt z. B. im β2-Integrin führt zu einer unzureichenden

Adhäsion von Leukozyten an Gefäßwänden, ungenügendem Einwandern aus den Gefäßen in das Gewebe und damit zu erhöhter Infektanfälligkeit. Eine dritte Gruppe von Zelladhäsionsmolekülen ist die Immunglobulinfamilie (Ig-CAMs). Zu den IgCAMs gehören die Junktions-Adhäsionsmoleküle (JAMs), die zusammen mit den Occludinen und Claudinen die Tight junctions bilden, welche Zellzwischenräume abdichten und so unkontrollierten parazellulären Stofftransport verhindern. Weitere IgCAMs sind neurale Adäsionsmoleküle (NCAMs) und interzelluläre Adhäsionsmoleküle (ICAMs). Letztere sind zusammen mit Molekülen der vierten großen Gruppe, den Selektinen, für die Migration von Leukozyten in die Gewebe verantwortlich. Eine ganz besondere Form interzellulärer Kommunikation wird durch Gap junctions vermittelt. Diese sind aus vielen Connexin-Molekülen aufgebaute transmembranöse Kanäle, die das Zytoplasma benachbarter Zellen direkt verbinden und kleine Moleküle und Ionen passieren lassen. Unterschiedliche Connexintypen führen zu selektiver Permeabilität der Kanäle, sodass zelltypabhängig eine ganz unterschiedliche metabolische oder elektrische Kopplung von Zellen aufgebaut werden kann. Störungen der Zellkommunikation sind sehr häufig an der Entstehung von Erkrankungen beteiligt. So ist die Dysregulation von Rezeptoren und Liganden, und somit eine veränderte Signaltransduktion/Genexpression bei fast allen menschlichen Erkrankungen nachweisbar, wobei diese Veränderung nicht immer die Ursache der Erkrankung ist. Ein Beispiel für direkte Zusammenhänge zwischen defekter Kommunikation und Krankheit ist der Metastasierungsprozess bei Tumorerkrankungen. Zahlreiche Studien konnten zeigen, dass die Metastasierung einiger Tumorzellarten mit der Expression von E-Cadherin korreliert. Je weniger E-Cadherin vorhanden ist, desto eher kann sich die entartete Zelle aus dem Zellverband lösen und an andere Stellen des Körpers gelangen. Eine Schwächung der E-Cadherin-vermittelten Zell-Zell-Interaktion scheint somit den Vorgang der Metastasierung zu unterstützen (> Tabelle 1.1.1).

1.1.3 Zelluläre Prozesse Diese Prozesse setzen sich aus einem oder mehreren der einzelnen subzellulären Prozesse (7 Abschnitt 1.1.2) der Zelle zusammen (> Abb. 1.1.3). So ist für jeden der zellulären Prozesse die Energiegewinnung von zentraler Bedeutung. Im Gegensatz dazu ist für die Migration der Vorgang der Replikation primär von untergeordneter Relevanz. Die zellulären Prozesse greifen also in unterschiedlichem Maße auf die subzellulären Prozesse der Zelle zurück.

15 1.1 · Molekulare klinische Zellbiologie

1.1

. Abb. 1.1.3. Schematische Darstellung zentraler zellulärer Prozesse. Eine eukaryote Zelle kann innerhalb gewisser Grenzen auf exogene Stimuli reagieren und somit ein konstantes „Existenzmilieu“ schaffen (Homöostase). Entsprechende Reize können jedoch dazu

führen, dass die Zelle sich teilt (Proliferation), bewegt (Migration), stirbt (Apoptose) oder Sonderfunktionen im Zellverband bzw. Organismus ausübt (Differenzierung; ausführliche Erläuterungen 7 Text)

1.1.3.1 Zelluläre Homöostase

fische Funktionen ausgeübt (G0/G1-Phase), die Replikation durchgeführt (Synthese-Phase, S-Phase) und der eigentliche Zellteilungsprozess vorbereitet (G2-Phase). Dieser Teilungsprozess (Mitose) unterteilt sich in Prophase [Kondensation der Chromosomen, Ausbildung der bipolaren Mitosespindel], Prometaphase [Auflösung der Kernhülle; ausgehend von den Polkörperchen (Centriolen) werden die Chromosomen an definierten Stellen (Kinetochor) durch Mikrotubulifasern kontaktiert], Metaphase [Anordnung der Chromosomen in einer Ebene (Metaphaseplatte)], Anaphase [durch Kürzung der Mikrotubulifasern werden die Chromosomen zu beiden Polen gezogen (Chromosomen-Segregation)], Telophase [Kinetochorfasern lösen sich auf, und eine neue Kernhülle entsteht] und Zytokinese [die Membran in der Mitte der Zelle schnürt sich ein (Teilungsfurche), bis zwei Tochterzellen mit je einem Zellkern entstanden sind]. Die Geschwindigkeit, mit welcher der Zellzyklus durchlaufen werden kann, variiert von 30 Minuten (im Froschembryo) bis hin zu mehreren Monaten in Geweben mit geringer Proliferationsrate (z. B. adulte Leber). Das Durchschreiten der Interphase und der Eintritt in die Mitose werden unter anderem durch Zykline und „zyklinabhängige Kinasen“ (cdks) reguliert. Zu bestimmten Zeitpunkten innerhalb des Zellzyklus interagieren definierte Zykline und Cdks, um ihrerseits weitere Proteine zu aktivieren. Eine der bekanntesten Zielstrukturen für dieses System ist das Retinoblastom- (Rb-)Protein, welches den Übergang aus der G1-Phase in die S-Phase kontrolliert. Die Phosphorylierung von Rb-Protein führt

Eine eukaryote Zelle ist kein statisches System. Unablässig werden Substanzen synthetisiert und abgebaut. Diese dynamischen Vorgänge auf subzellulärer Ebene sind aber in einem Gleichgewicht, d. h., sie führen nicht notwendigerweise zu mikroskopisch fassbaren Zustandsänderungen auf zellulärer Ebene. Die Zelle erscheint also statisch, ohne es tatsächlich zu sein. So kann sie ökonomisch auf wechselnde Reize und Umweltstimuli reagieren.

1.1.3.2 Proliferation (Zellteilung/Zellzyklus) Die Zellen eines Organismus entstehen durch fortwährende Zellteilung. Diese findet auch dann noch statt, wenn das Größenwachstum des Individuums beendet ist. Ständige Regeneration (z. B. während der Haut-, Wundheilung) und Zellersatz sind Charakteristika höherer Organismen. Von entscheidender Bedeutung für die Erhaltung eines multizellulären Systems ist jedoch, dass die Vermehrung von Gewebe (Proliferation) strikt kontrolliert wird. Zellteilung muss zu einem definierten Zeitpunkt beginnen (z. B. nach Stimulierung durch Zytokine) und wieder enden (z. B. Wegfall des Stimulus). Dabei müssen die sich im Rahmen der Replikation verdoppelten Chromosomen gleichmäßig auf neu entstehende Tochterzellen verteilen. Eine sich teilende Zelle durchläuft verschiedene, gut charakterisierte Stadien. Den größten Teil der Zeit verbringt sie in der Interphase; hier werden zelltypspezi-

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

zur Freisetzung von TFs (E2F-Familienmitglieder), welche wiederum die Expression von Genen induzieren, die ein Fortschreiten des Zellzyklus ermöglichen (z. B. weitere Zykline und DNA-Polymerasen). Es ist erwähnenswert, dass einige Zellen die Fähigkeit besitzen, sich unendlich oft zu teilen (Stammzellen), während deren Abkömmlinge nur eine definierte Anzahl an Teilungen durchlaufen können.

1.1.3.3 Zelltod (Apoptose/Nekrose) Ein Organismus kann nur existieren, wenn zu bestimmten Zeitpunkten in der Entwicklung definierte Zellgruppen absterben. Ebenso ist es notwendig, dass geschädigte und maligne transformierte Zellen aus dem Körper entfernt werden. Dieser Prozess des programmierten Zelltods ist die Apoptose. Zytologisch ist Apoptose durch eine Volumenabnahme der Zelle und des Zellkerns, den Verlust der Zell-Zell-Interaktion, eine Blasenbildung an der Zellmembran und die Fragmentierung des genetischen Materials charakterisiert. Die Induktion der Apoptose kann sowohl durch exogene Faktoren (z. B. die Familie der Todesrezeptoren, „extrinsic pathway“) oder aber durch endogene Faktoren erfolgen (z. B. durch Aktivierung des Proteins p53 nach DNA-Schädigungen, „intrinsic pathway“). Der Prozess der Apoptose ist hoch komplex, stark vernetzt und, aufgrund seiner essenziellen Bedeutung für die einzelne Zelle, strikt reguliert. Sehr vereinfacht dargestellt treten im Falle der rezeptorvermittelten Apoptose durch Bindung von Zytokinen (z. B. „tumor necrosis factor“, TNF) an die entsprechenden Rezeptoren (z. B. TNF-Rezeptor) Konformationsänderungen in den zytoplasmatischen Domänen der Rezeptoren auf. An diese „death domains“ binden dann weitere Adapter-Proteine (TRADD und FADD), aber auch die Procaspase-8, welche durch proteolytische Spaltung in die aktive Caspase-8 überführt wird. Caspase-8 wird auch als Initiator-Caspase bezeichnet, da sie weitere Procaspasen (z. B. Procaspase-3) durch Spaltung aktiviert. Diese Effektor-Caspasen besitzen vorwiegend Substrate, deren Abbau direkt oder indirekt die strukturelle Integrität einer Zelle destabilisieren (z. B. DNA-Reparaturenzyme). Endogene Stimuli (z. B. oxidativer Stress) verändern das Verhältnis von Bcl-2-Familienmitgliedern in der mitochondrialen Membran. In dieser Familie gibt es proapoptotische (z. B. Bax, Bad) und antiapoptotische (z. B. Bcl-xL, Bcl-w) Mitglieder. Entsprechend ihrer Mengenverhältnisse in der Membran regulieren diese Faktoren die Freisetzung von z. B. Cytochrom C (Cyt-C) aus dem Intermembranraum der Mitochondrien. Cyt-C, Apaf-1 und ATP bilden zusammen das Apoptosom,

welches Procaspasen (Effektor-Caspasen) aktiviert. Letztendlich führen sowohl endogene als auch exogene Faktoren dazu, dass die Zielzelle zerstört wird. Von der physiologisch „beabsichtigten“ Apoptose zu trennen ist der Vorgang der Nekrose, welcher den Tod einer Zelle durch eine nicht kompensierbare Schädigung der Homöostase bezeichnet. Hierbei sind es vor allem Gifte, Hypoxie (Sauerstoffarmut), Hypothermie und Krankheitserreger, die zu einer Zerstörung der Zelle führen. Die Folge ist anders als bei der Apoptose eine Entzündungsreaktion in der betroffenen Gewebsregion.

1.1.3.4 Positionierung (Adhäsion/Migration) Die Funktion einer Zelle ist maßgeblich von ihrer Positionierung innerhalb des Mikromilieus abhängig. Wenn sich einzelne Zellen zu großen Funktionseinheiten organisieren, bilden sich Gewebe und Organe. Hier sind es sowohl die Zell-Zell-Kontakte als auch die Zell-Matrix-Kontakte, welche unter anderem die Struktur und Funktion des entsprechenden Gewebes definieren. So sind es z. B. die Tight junctions, die im Wesentlichen für die Aufrechterhaltung der Barrierefunktion von Epithelien verantwortlich sind. Ein Transport durch diese Barriere kann nur aktiv, d. h. unter Energieverbrauch, stattfinden. Positionsänderungen der Zellen sind in diesem Fall nicht erwünscht bzw. kontraproduktiv, da nur die kontrollierte Aufnahme von Nährstoffen durch das Darmepithel eine Kontamination des Körpers mit toxischen Substanzen verhindert. Im Gegensatz dazu sind andere Zellpopulationen (z. B. immunkompetente Zellen wie neutrophile Granulozyten) sehr an hoher Mobilität interessiert, da sie im Organismus ständig nach Pathogenen (hervorgerufen durch z. B. Bakterieninfektionen) suchen. Normalerweise bewegen sich die Neutrophilen im Blutstrom ohne distinkten Zellkontakt; erst auf stimulierten Endothelzellen (z. B. nach Infektion) werden Selektine exprimiert, die eine transiente Adhäsion des Leukozyten ermöglichen. Diese „rollen“ dann unter Verwendung von Integrin-Kontakten über die Gefäßwand, um an der richtigen Stelle in das geschädigte Gewebe einzudringen. Erst hier beginnen die Neutrophilen mit der Bekämpfung von Pathogenen. Ein interessantes Beispiel für wechselnde Anforderungen hinsichtlich der Positionierung einer Zelle stellt die kutane Wundheilung dar. Normalerweise bilden Hautzellen der Epidermis (Keratinozyten) eine Barrierefunktionen gegen exogene Noxen. Wird diese Barriere im Falle einer Verwundung jedoch durchbrochen, muss in kurzer Zeit ein neuer Schutzwall gegen Pathogene

17 1.1 · Molekulare klinische Zellbiologie

geschaffen werden. Hierfür ist es notwendig, dass sich die relativ fest verankerten Keratinozyten lösen (z. B. aus desmosomalen Verbindungen) und durch die Neoexpression von Oberflächenmolekülen (z. B. Integrine, die mit Fibronektin interagieren) ihre Mobilität wiedergewinnen. Gleichzeitig formen sich im Zytoplasma der Keratinozyten kontraktile Elemente (Aktin), welche eine gerichtete Bewegung der Zelle in das Wundmilieu hinein erlauben (Migration). Ist die Wunde geschlossen, verlieren die Keratinozyten ihre Fähigkeit zur Migration und tragen somit zur Ausbildung einer neuen Epidermis bei.

1.1.3.5 Spezialfunktionen und Funktionsdifferenzierung Während der Embryogenese entstehen aus totipotenten Zellen alle für den Organismus relevanten Zellarten (über 200 Typen). Diese unterscheiden sich jedoch hinsichtlich ihres Aufbaus und ihrer Funktion maßgeblich voneinander. Dies bedeutet, dass im Rahmen der Entwicklung einzelner Gewebe und Organe Differenzierungsprozesse vollzogen werden müssen. Ebenso werden ständig neue Zellen aus den pluripotenten Stammzellen eines Organismus heraus generiert, um den Verlust von Zellen innerhalb eines Gewebes zu kompensieren. Diese Spezialisierungsprozesse spiegeln sich im Expressionsprofil (mRNA und Protein) und in der Morphologie der differenzierten Zellen wider. Auf molekularer Ebene sind es vor allem die unterschiedlichsten Kombinationen regulatorischer Elemente (z. B. TFs), welche im Verlauf von Zellteilungsprozessen hin zur differenzierten Zelle die dauerhafte Existenz verschiedener Zelltypen hervorrufen. Ein gutes Beispiel für Differenzierungsprozesse stellen abermals die Keratinozyten der Epidermis dar. Aus Stammzellen entstehen die sog. transient amplifizierenden Keratinozyten des Stratum basale (der untersten Schicht in der Epidermis) mit eingeschränktem Teilungspotential. Nach einer definierten Anzahl an Zellteilungen verlassen die Keratinozyten die Basalschicht und „wandern“ durch die „suprabasalen“ Schichten (Stratum spinosum, Stratum granulosum und Stratum corneum). Im Rahmen dieses Differenzierungsprozesses ändert sich die Expression zahlreicher zellulärer Filamente (z. B. Zytokeratin-1 und Zytokeratin-10 werden ab dem Stratum spinosum exprimiert) und die Morphologie (Stachelzelle, Körnerzelle, Hornzelle). Die Turnover-Zeit vom Stratum basale bis hin zum Stratum corneum beträgt 4–5 Wochen. Letztendlich schilfern abgestorbene Zellen von der Hautoberfläche ab, und müssen durch sich differenzierende Zellen der tiefer gelegenen Epidermisschichten ersetzt werden.

1.1

1.1.4 Ausblick Die molekulare Zellbiologie hat sich zu einer sehr wichtigen medizinischen Basiswissenschaft entwickelt. Als eine der entscheidenden Disziplinen zum Verständnis und zur Weiterentwicklung der medikamentösen Therapie spielt sie in Diagnostik und Prävention eine zentrale Rolle. Naturwissenschaftliche Erkenntnis bedarf adäquater Methodik, und methodische Neuerungen waren es, die der molekularen Zellbiologie in den letzten 30 Jahren die bedeutenden Durchbrüche ermöglicht haben. Im Wesentlichen sind es gentechnische und biochemische Methoden gewesen, die uns bis etwa zur Jahrtausendwende halfen, die grundlegenden subzellulären Mechanismen zu entschlüsseln. Auch wenn die Anzahl der großen zellulären Neuentdeckungen langsam zurückgeht: Überraschungen und revolutionäre Neuentdeckungen sind in der Molekularbiologie immer noch möglich, wie zuletzt an der Entdeckung der Rolle natürlicherweise vorkommender microRNAs (miRNA) in Säugetierzellen und ihrer bahnbrechenden methodischen Nutzung in Form von small interfering RNAs (siRNAs) gezeigt wurde (Methode: RNA-Interferenz). Unter den noch bestehenden großen aktuellen Themen ist der Einfluss der Chromatinstruktur auf die Transkriptionskontrolle (Methode: Chromatinimmunpräzipitation) zu nennen, die dreidimensionale Auflösung größerer Multiproteinkomplexe (Methode: Massenspektrometrie) und die Messung von Proteininteraktionen in lebenden Zellen (Methode: Fluoreszenz-Energietransfer). Ein weiteres zukunftsträchtiges Forschungsgebiet ist die Stammzellbiologie. Die wichtigsten diesbezüglichen molekularen Fragen sind die nach den essenziellen Proteinen für die Stammzellfunktion und die Zellliniendeterminierung sowie die nach den Mechanismen des Stammzelltodes. Auch im Bereich der zellbiologischen Grundlagenforschung sind es vor allem die komplexen und weiterreichenden Beziehungen (Netzwerke), die noch am wenigsten erforscht sind. Hierzu gehört insbesondere die Thematik der Einordnung der Zelle in ihrem dreidimensionalen bzw. multizellulären Kontext. Eine Pionierrolle nimmt hierbei die Neurobiologie ein, da hier die Zell-Zell-Kommunikation natürlicherweise zentraler Forschungsgegenstand sein muss. Aber auch in der Krebsforschung ist nach der weitgehenden Entschlüsselung der zellulären Mechanismen von Zellteilung und Zelltod zunehmend die interzelluläre Kommunikation Gegenstand der Forschung, um herauszufinden, wie Krebszellen von ihrer Umgebung bekämpft werden oder aber diese für ihre Zwecke rekrutieren. Trotz des großen Wissenszuwachses der zurückliegenden Jahre sind die Herausforderungen aber nicht geringer geworden. Die Tatsache allein, dass wir von den

18

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

grundlegenden subzellulären Mechanismen ein grobes Bild haben, bringt uns letztlich noch nicht zu einer molekularen Medizin. Dies wird daran deutlich, dass erst in den letzten Jahren Medikamente auf den Markt gekommen sind, die rational nach molekularen Erkenntnissen entwickelt wurden. Um zu einer flächendeckenden molekularen Medizin zu kommen, brauchen wir erstens eine wesentlich höhere Detailkenntnis, als wir sie derzeit haben, und wir müssen zweitens dem hohen Vernetzungsgrad subzellulärer Prozesse Rechnung tragen. Um die notwendige Detailkenntnis zu erweitern, sind letztlich Arbeiten auf der Ebene von Einzelmechanismen und der fein verästelten molekularen Prozesse notwendig. Dabei gilt es, kaum bekannte Gene in ihrer Funktion zu bestimmen (grob geschätzt noch etwa die Hälfte aller Gene). Wir werden aber auch nicht um die Knochenarbeit herumkommen, auch Gene, die schon „ancharakterisiert“ wurden oder deren wichtigste Vertreter bereits funktionell bekannt sind, in immer wieder neuen Zusammenhängen zu beschreiben. Erst ein wirklich umfassendes Verständnis auf molekularer Ebene kann nebenwirkungsarme und auf die spezifische Erkrankung und vielleicht sogar das spezifische Individuum ausgerichtete Medikamente hervorbringen. Neben der Fortsetzung der Arbeiten mit etablierter Methodik werden es auch erneut methodische Weiterentwicklungen sein, die uns näher zu einer medizinischen Umsetzung molekularer Erkenntnisse führen. Zu den wohl bedeutendsten methodischen Neuerungen gehören die Array-Technologien, die Datenmengen in bis dato nicht gekannter Größenordnung produzieren. Am etabliertesten sind DNA/RNA-Arrays, welche das Expressionsprofil in großem Maßstab darstellen können. Das Pendant auf Proteinebene sind Proteinarrays. Eine andere Form der Array-Technologie wird auch angewandt, um Hunderte von Gewebsproben gleichzeitig zu analysieren (sog. Tissue Arrays). Um diese Datenmengen adäquat nutzen zu können, sind bioinformatische Werkzeuge notwendig. Wenn es gelingt, die generierten Datenmengen zellbiologisch auszuwerten und nicht nur wie bisher einen verschwindend geringen Teil davon, könnte man dem Ziel einer umfassenden und detaillierten Darstellung der subzellulären Mechanismen schnell näher kommen. Bioinformatische Methoden sind v. a. auch nötig, um der zweiten großen Herausforderung zu begegnen, der Darstellung subzellulärer Prozesse in ihrem hoch komplexen regulatorischen Netzwerk. Ziel muss die Erstellung eines umfassenden Beziehungsnetzwerkes molekularer Prozesse sein, wie es z. B. für den Stoffwechsel in den illustrativen „Biochemical Pathways“ (Boehringer) der 1980er Jahre angedeutet wurde. Das Problem scheint nicht bei den Kapazitäten aufseiten der EDV zu liegen, aber es fehlt noch an intelligenten Strategien, wie die Datenmengen in die zu generierenden Netzwerke ein-

zubinden sind. Somit braucht es Köpfe mit einem informatischen wie auch biologischen Grundverständnis, oder aber entsprechende enge Kooperationen der Disziplinen. Es gibt durchaus bereits vielversprechende Ansätze in dieser Richtung, aber noch sind es die Wissenschaftler selbst, die in großer Zahl Literatur auswerten, manuell vernetzen und in Programme einspeisen. Die immensen Datenmengen, die z. B. von Array-Technologien generiert werden, können aber nicht mehr manuell ausgewertet werden. Damit der Großteil dieser Daten nicht verloren geht, sind groß angelegte intelligente bioinformatische Lösungen gefragt. Noch komplexer wird die Situation, wenn wir uns vor Augen halten, dass in der herkömmlichen molekularbiologischen Forschung quantitative Überlegungen kaum eine Rolle spielen. Die zehnfache Induktion eines Gens wird gewöhnlich als bedeutsamer erachtet als die zweifache Regulation, aber welche der beiden nun im jeweiligen zellbiologischen Kontext wirklich relevant ist, kann meist nur empirisch geprüft werden. Hier greift eine Disziplin an, die im Allgemeinen Systembiologie genannt wird. Hier versuchen Mathematiker zusammen mit Biologen, biologische Prozesse mathematisch zu modellieren und zu quantifizieren. Die Modelle werden experimentell überprüft, überarbeitet und erneut geprüft. Aus diesem Wechselspiel, so die Hoffnung, ergeben sich dann Modelle, die prädiktiven Charakter haben und im Idealfall der experimentellen Überprüfung letztlich nicht mehr bedürfen. Die molekulare Zellbiologie hat als zentrale medizinische Grundlagenwissenschaft zum Verständnis humanbiologischer Zusammenhänge extrem viel geleistet. Die Umsetzung ihrer Erkenntnisse in die medizinische Therapie wird die Medizin aber nach allgemeiner Einschätzung revolutionieren.

1.1.5 Literatur Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P (eds) (2002) Molecular Biology of the Cell, 4th edn. Garland Science Publishing, New York Böcker W, Denk H, Heitz Ph. U (eds) (2004). Pathologie, 3. Aufl. Urban & Fischer, München Karp G (2005) Cell and Molecular Biology, 4th edn. John Wiley & Sons, New York KumarV, Abbas AK, Fausto N (eds) (2005) Robbins and Cotran: Pathologic basis of disease, 7th edn. Elsevier Saunders, Philadelphia Lodish et al. (eds) (2004) Molecular Cell Biology, 5th edn. Freeman and company, New York

19 1.1 · Molekulare klinische Zellbiologie

1.1.6 Zeittafel Die angegebenen Zitate beziehen sich nur auf die Zeittafel. 1833

R. Brown

Beschreibung des Zellkerns in Epidermiszellen von Pflanzen

1839

T. Schwann, M. J. Schleiden

Entwicklung der Zelltheorie als kleinste lebende Einheit eines Organismus

1855

R. Virchow

Das Zellteilungsprinzip wird beschrieben; Theorie der Cellular-Pathologie

1857

A. v. Kölliker

Beschreibung von Mitochondrien in Muskelzellen

1882

W. Flemming

Bezeichnung des Kernmaterials in der Interphase als Chromatin; Flemming prägt auch den Begriff„Mitose“.

1898

C. Golgi

Beschreibung des Golgi-Apparats in Nervenzellen

1923

T. S. Painter

Der diploide Satz von Chromosomen wird beschrieben.

1933

T. H. Morgan

Nobelpreis für Entdeckungen zur Bedeutung von Chromosomen als Träger von Erbinformation

1934

T. O. Caspersson, E. Hammersten

Beschreibung der DNA als polymeres Makromolekül

1944

O. T. Avery, C. M. MacLeod, M. McCarty

Identifizierung der DNA als Träger der Erbinformationen

1951

E. Chargaff

Die Chargaff-Regel beschreibt, dass die Basen A:T und C:G in gleichen Verhältnissen existieren.

1953

J. D. Watson, F. H. C. Crick

Modell für die Doppelhelixstruktur der DNA

1961

M. W. Nirenberg

Entschlüsselung des genetischen Codes

1962

F. H. C. Crick, J. D. Watson, M. H. F. Wilkins

Nobelpreis für die Beschreibung der Molekularstruktur der DNA

1963

C. de Duve

Lysosomen werden beschrieben.

1964

R. B. Setlow, W. L. Carrier

Beschreibung der Excisionsreparatur von DNA

1968

R. W. Holley, H. G. Khorana, M. W. Nirenberg

Nobelpreis für die Interpretation des genetischen Codes und dessen Funktion in der Proteinbiosynthese

1972

S. J. Singer, G. L. Nicholson

Entwicklung des Flüssig-Mosaik Modell einer Biomembran

1972

J. F. Kerr, A. H. Wyllie, A. R. Currie

Definition des Begriffs„Apoptose“

1974

A. Claude, G. E. Palade, C. de Duve

Nobelpreis für Untersuchungen zur strukturellen und funktionellen Organisation der Zelle

1988

D. C. Wallace et al.

Beschreibung einer Krankheit, die durch Mutationen in mtDNA verursacht wird

1990

E. R. Fearon, B. Vogelstein

Mehrschrittmodell der Karzinogenese (am Beispiel des Kolonkarzinoms)

1992

E. H. Fischer, E. G. Krebs

Nobelpreis für die Entdeckung der Steuerungsmechanismen des Stoffwechsels

1994

A. Goodman Gilmann, M. Rodbell

Nobelpreis für die Entdeckung der Zellkommunikation (speziell G-Proteine)

1995

E. B. Lewis, C. Nüsslein-Volhard, E. F. Wieschaus

Nobelpreis für Erkenntnisse über die genetische Kontrolle der frühen Embryoentwicklung

1997

S. B. Prusiner

Nobelpreis für die Beschreibung der Prionen

1999

G. Blobel

Nobelpreis für die Entdeckung der Signale, welche Transport und Lokalisation in der Zelle steuern

2000

A. Carlsson, P. Greengard, E. R. Kandel

Nobelpreis für die Entdeckung zur Signalübertragung im Nervensystem

2001

L. H. Hartwell, R. T. Hunt, P. M. Nurse

Nobelpreis für die Analyse von Schlüsselregulatoren im Zellzyklus

2001

J. C. Venter, M. D. Adams, E. W. Myers et al.

Entschlüsselung des gesamten menschlichen Genoms

1.1

20

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

Literatur zur Zeittafel Avery OT, MacLeod CM, McCarty M (9944) Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. J Exp Med 79: 137–158 Brockhaus Nobelpreise Brown R (1833) Trans. Linn. Soc., London, I6: 685–745 Chargaff E (1951) Structure and function of nucleic acids as cell constituents. Fed Proc 10:654–659 de Duve C (1963) The lysosome. Am Sci 208: 64–72 Fearon ER, Vogelstein B (1990) A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell 61: 759-767 Flemming W (1882) Zellsubstanz, Kern und Zelltheilung. Leipzig, Verlag von F. C. W. Vogel; 424 Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. (1972) Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 26: 239–257 Nirenberg MW, Matthaei JH (1961) The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A 47: 1588–602 Painter TS (1923) Studies in mammalian spermatogenesis, II. The spermatogenesis of man. J. Exp. Zool. 37: 291–321

Schleiden MJ (1838) Beiträge zur Phytogenesis. Arch Anat Physiol Wiss Med 5: 137–176 Schwann T (1839) Mikroskopische Untersuchungen über die Übereinstimmung in der Struktur und dem Wachstum der Tiere und Pflanzen. Sander, Berlin Setlow RB, Carrier WL (1964) The disappearance of thymine dimers from DNA: an error-correcting mechanism. Proc Natl Acad Sci USA 51: 226–231 Singer SJ, Nicholson GL (1972) The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science 175: 720–731 Venter JC, Adams MD, Myers EW et al., (2001) The sequence of the human genome. Science 291: 1304–51 Wallace DC, Singh G, Lott MT, Hodge JA, Schurr TG, Lezza AMS, Elsas LJ II, et al (1988) Mitochondrial DNA mutation associated with Leber‘s hereditary optic neuropathy. Science 242: 1427– 1430 Watson JD, Crick FHC (1953) Molecular structure of nucleic acids: a structure of deoxyribose nucleic acids. Nature 171: 737–738

1.2 1.2 Molekulare Mechanismen von Zell-Zell-Wechselwirkungen Thomas Brümmendorf

1.2.1

Bedeutung zellulärer Wechselwirkungen – 22

1.2.2

Zelladhäsionsmoleküle

1.2.2.1 1.2.2.2 1.2.2.3 1.2.2.4

Cadherine – 23 Integrine – 25 Proteine der Immunglobulin-Superfamilie (IgSF) – 28 Selektine und die Rekrutierung von Leukozyten – 33

1.2.3

Connexine und die Gap junctions – 34

1.2.4

Claudine, Occludin und Tight junctions – 35

1.2.5

Ausblick

– 36

1.2.6

Literatur

– 36

1.2.7

Zeittafel

– 39

Literatur zur Zeittafel

– 22

– 40

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

22

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

1.2.1 Bedeutung zellulärer Wechselwirkungen Molekulare Mechanismen für spezifische Wechselwirkungen zwischen Zellen entstanden schon früh in der Evolution, beim Übergang von einzelligen zu vielzelligen Eukaryonten. Während der Embryonalentwicklung der Wirbeltiere spielen Zell-Zell-Wechselwirkungen in der Histogenese und Organogenese eine Rolle, im adulten Organismus stabilisieren sie das ausdifferenzierte Gewebe. Viele zelluläre Interaktionen in der Ontogenese sind überwiegend dynamisch, dagegen sind die meisten ZellZell-Wechselwirkungen im adulten Gewebe weitgehend statisch. Viele Zellen des Immunsystems gehen besonders dynamische, teilweise kurzlebige, zelluläre Interaktionen ein (Alberts et al. 1994; Karp 1999; Lodish et al. 2000; Wolpert et al. 1999). In der Embryonalentwicklung sind Zelladhäsionsprozesse schon bei der Kompaktion des Embryos und später bei allen morphogenetischen Prozessen beteiligt. Zellen interagieren hierbei einerseits mit anderen Zellen, andererseits mit Komponenten der Extrazellulärmatrix (ECM). Ersteres spielt beispielsweise bei der Faltung von Zellverbänden oder bei der Reaggregation wandernder Zellen zu Zielstrukturen eine Rolle, letzteres bei der Zellwanderung oder beim axonalen Wachstum in der Entwicklung des Nervensystems. Im adulten Organismus sind die meisten Zellen in stabile Gewebeverbände integriert, aus denen wiederum die Organe aufgebaut sind. Verschiedene Gewebe unterscheiden sich dabei im Hinblick auf die relative Bedeutung direkter Zell-Zell-Interaktionen im Vergleich zu Zell-Matrix-Wechselwirkungen. Im Bindegewebe mit seinem hohen Anteil an ECM überwiegen Zell-MatrixInteraktionen, und die mechanische Gewebeintegrität basiert hier überwiegend auf der Matrix, zum Beispiel auf den Kollagenfasern. Im Gegensatz dazu überwiegen im Epithelgewebe die direkten Zell-Zell-Wechselwirkungen, und die ECM ist auf die Basallamina beschränkt. Die mechanische Stabilität beruht hier unter anderem auf Zytoskelettnetzwerken, die über sog. Verankerungsverbindungen („anchoring junctions“) mit gleichartigen Netzwerken in Nachbarzellen verbunden sind (> Abb. 1.2.1). Im Epithelgewebe kennt man zwei Arten solcher intrazellulären Verankerungsverbindungen: die mit Aktinfilamenten assoziierten Adherens junctions und die mit Intermediärfilamenten assoziierten Desmosomen. Neben diesen Verankerungsverbindungen finden sich in Epithelzellen zwei weitere Arten von ZellZell-Kontaktstrukturen, die Tight junctions und die Gap junctions (> Abb. 1.2.1). Die meisten Zellen des Immunsystems sind beweglich und interagieren dynamisch mit anderen Zellen. Solche Wechselwirkungen sind für ihre Funktion von

. Abb. 1.2.1. Zellkontaktstrukturen einer Epithelzelle des Dünndarms. Zu Details 7 Text. Aus: Molecular Cell Biology, H. Lodish et al., Copyright 2000, W.H.Freeman and Company, New York. Mit Erlaubnis des Verlags

zentraler Bedeutung, beispielsweise für die Erkennung virusinfizierter Zellen durch zytotoxische T-Zellen, für die Aktivierung von Helfer-T-Zellen durch antigenpräsentierende Zellen, für die Aktivierung von B-Zellen durch Helfer-T-Zellen oder für die Transmigration von Leukozyten durch das Kapillarendothel. Viele der genannten Prozesse werden von Molekülen auf Zelloberflächen vermittelt, die als Zelladhäsionsproteine bezeichnet werden. In diesem Kapitel werden gut charakterisierte Familien solcher Proteine, sowie Proteine der Tight junctions und Gap junctions beschrieben.

1.2.2 Zelladhäsionsmoleküle Die meisten Zelladhäsionsmoleküle sind membranständige Glykoproteine, die aufgrund ihrer Primärstruktur (Aminosäuresequenz) in Proteinfamilien eingeteilt werden. Einen Schwerpunkt dieses Kapitels bilden: x Die Cadherin-Superfamilie (> Abb. 1.2.2b) x Die Integrine-Superfamilie (> Abb. 1.2.2d) x Die Immunglobulin-Superfamilie (> Abb. 1.2.2a) x Die Familie der Selektine (> Abb. 1.2.2c) Daneben gibt es weitere Adhäsionsmoleküle auf Zelloberflächen, die aufgrund ihrer Kohlenhydratanteile klassifiziert werden können. Hierzu zählen beispielsweise die membranständigen Proteoglykane (> Abb. 1.2.2e) und die Sialomuzine (> Abb. 1.2.2f), auf die hier nicht näher eingegangen werden kann. Die meisten Zelladhäsionsproteine haben eine einzige Transmembrandomäne und eine Typ I-Topologie, d. h., sie haben einen zytoplasmatischen Carboxy-

23 1.2 · Molekulare Mechanismen von Zell-Zell-Wechselwirkungen

terminus und einen extrazellulären Aminoterminus (> Abb. 1.2.2g). Membranproteine vom Typ II, die einen intrazellulären Aminoterminus haben, sind wesentlich seltener (> Abb. 1.2.2h). Sogenannte polytopische Adhäsionsproteine haben mehrere Transmembrandomänen (> Abb. 1.2.2k,l). Viele Zelloberflächenproteine sind über einen posttranslational angebrachten Glykosylphosphatidylinositol-Rest (GPI-Rest) in der Zellmembran verankert (> Abb. 1.2.2j). Proteine der Cadherin- und Immunglobulin-Superfamilie sowie die Selektine haben einen erkennbar modularen Aufbau, d. h., sie sind im extrazellulären Abschnitt aus Ketten einzelner Proteindomänen aufgebaut (> Abb. 1.2.2a–c). Cadherine enthalten in der Regel mehrere Domänen des gleichen Typs, sog. Cadherin-typische Domänen. Bei der Immunglobulin-Superfamilie variiert die Zahl der Domänen von Protein zu Protein stark, und es kommen häufig Kombinationen mit ganz anderen Domänentypen vor. Die Integrine sind Heterodimere aus zwei Untereinheiten, die ebenfalls modular aufgebaut sind und repetitive Strukturen enthalten. Wenn zwei gleichartige Moleküle aneinander binden, spricht man von homophiler Interaktion (> Abb. 1.2.2m,p). Bei einer heterophilen Wechselwirkung interagieren unterschiedliche Proteine miteinander (> Abb. 1.2.2n,o). Eine Wechselwirkung von Proteinen auf gegenüberliegenden Zellmembranen wird als trans-Interaktion bezeichnet (> Abb. 1.2.2m,n), bei einer cis-Wechselwirkung dagegen interagieren sie in der gleichen Membran (> Abb. 1.2.2o,p). Ein typisches Beispiel transinteragierender homophiler Adhäsionsproteine sind die Cadherine, die unter anderem an der Aggregation gleichartiger Zellen in der Histogenese beteiligt sind. Heterophile trans-Interaktionen finden sich häufig im Immunsystem, beispielsweise bei der Interaktion des B7-Proteins auf B-Zellen mit dem CD28-Protein auf T-Zellen. Homophile cis-Interaktionen gibt es beispielsweise beim P0-Protein, einem Hauptbestandteil des Myelins im peripheren Nervensystem. Die genannten Interaktionen sind relativ dynamisch, d. h., die beteiligten Proteine sind auch als Monomere stabil, und es liegt ein Gleichgewicht zwischen Monomer und Di- bzw. Oligomer vor. Hiervon zu unterscheiden sind konstitutive Rezeptorkomplexe, deren Untereinheiten als Monomere weitgehend instabil sind. Hierzu zählen die Integrine, die als Heterodimere aus zwei Untereinheiten bestehen. Andere Zell-Zell-Wechselwirkungen (> Abb. 1.2.2q) werden über zwischengeschaltete Linkerproteine vermittelt (Alberts et al. 1994; Karp 1999; Lodish et al. 2000). In den folgenden Abschnitten wird im Einzelnen auf die oben angesprochenen Familien von Zelladhäsionsproteinen eingegangen. Dabei wurden aus jeder Familie solche Proteine für eine eingehende Beschreibung aus-

1.2

. Abb. 1.2.2. MerkmalevonZelladhäsionsmolekülen.Zelladhäsionsmoleküle werden aufgrund struktureller Merkmale (A–F) klassifiziert, können unterschiedlich in der Zellmembran (Doppellinie) verankert sein (G–L) und auf verschiedene Weise miteinander interagieren (M–Q). Für Details 7Text

gewählt, die entweder in einen auf molekularer Ebene im Ansatz verstandenen Krankheitsprozess involviert sind, deren Tertiärstruktur aufgeklärt wurde oder die geeignet sind, allgemeingültige Prinzipien der Zelladhäsion zu erläutern.

1.2.2.1 Cadherine Die Proteine dieser Superfamilie bilden eine große Gruppe von mehr als 80 Zelladhäsionsmolekülen. Sie befinden sich auf den meisten Zelltypen, wobei einzelne dieser Proteine oft spezifische Expressionsmuster im Gewebe zeigen. Die Expression der Cadherine wird im Verlauf der Entwicklung des Organismus dynamisch reguliert. Sie interagieren überwiegend homophil, d. h., ein Cadherin eines bestimmten Typs bindet präferenziell an ein Cadherin des gleichen Typs. Diese Eigenschaften sind die Grundlage dafür, dass Cadherine während der Entwicklung des Organismus an morphogenetischen Prozessen beteiligt sind. Dazu zählen Aggregations- und Umordnungsprozesse von Zellen oder das axonale Wachstum in der Entwicklung des Nervensystems.

24

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

Im Verlauf der Histogenese, mit zunehmender Stabilisierung von Zell-Zell-Wechselwirkungen, tragen Cadherine dann auch zur stabilen Verankerung von Zellen untereinander bei (> Abb. 1.2.1), beispielsweise an den Adherens junctions und in den Desmosomen der Epithelgewebe. Im Zentralnervensystem finden sich Cadherine auch im Bereich von Synapsen, die als eine spezialisierte Variante von Adherens junctions interpretiert werden können. Die meisten Proteine der Cadherin-Superfamilie sind Zellmembranproteine vom Typ I (> Abb. 1.2.2g) und lassen sich aufgrund struktureller Merkmale in mehrere Subgruppen einteilen, die „klassischen“ Cadherine (>25 Vertreter), die desmosomalen Cadherine (6 Vertreter), die Protocadherine (>60 Vertreter) und die atypischen Cadherine. Der zytoplasmatische Abschnitt divergiert von Subgruppe zu Subgruppe, was zu unterschiedlichen intrazellulären Wechselwirkungen führt (Gumbiner 2005; Takeichi u. Abe 2005; Wolpert et al. 1999). „Klassische“ Cadherine Zu dieser Subgruppe zählen unter anderem E-Cadherin (uvomorulin, „epitheliales Cadherin“), sowie N-, M-, P- und R-Cadherin. Da die Eigenschaften des E-Cadherins am besten untersucht sind, beziehen sich die meisten der folgenden Aussagen auf dieses Protein. Die aminoterminale Domäne der „klassischen“ Cadherine trägt maßgeblich zu deren Bindungsspezifität bei. Daher wurde die Tertiärstruktur dieser Domäne aufge-

b

klärt, und zwar für N-Cadherin und E-Cadherin. Cadherintypische Domänen bestehen aus 7 E-Strängen, die zwei in der Art eines Sandwichs angeordnete E-Faltblätter bilden (> Abb. 1.2.3a). Diese Domänen sind daher ähnlich aufgebaut wie Immunglobulindomänen. Ein Charakteristikum der Cadherine sind ihre calciumabhängigen homophilen trans-Interaktionen (> Abb. 1.2.2m). Daneben können sie auch homophile cis-Interaktionen eingehen, wobei zwei Moleküle parallel und lateral miteinander interagieren (> Abb. 1.2.3b) und dabei eine durch Calciumionen stabilisierte X-förmige Anordnung (> Abb. 1.2.3c) ihrer beiden aminoproximalen Domänen ausbilden (> Abb. 1.2.3d,e). Vieles spricht dafür, dass die Ausbildung dieses cis-Homodimers eine Voraussetzung für die trans-Interaktion zwischen benachbarten Zellen ist. Klassische Cadherine wie E-Cadherin bilden in der Zellmembran vieler Zelltypen spezialisierte Multiproteinkomplexe aus, die als Adherens junctions bezeichnet werden (> Abb. 1.2.1). Man geht davon aus, dass Kontraktionen dieser Aktinfilamente im Zusammenwirken mit transzellulären Wechselwirkungen der beteiligten Cadherine an Faltungsprozessen von Epithelien in der Embryonalentwicklung beteiligt sind. Ein Sequenzabschnitt am Carboyxterminus von E-Cadherin enthält eine Bindungsstelle für E-Catenin, ein Vertreter der Armadillo-Proteinfamilie. Dieses wiederum interagiert mit dem strukturell nicht verwandten D-Catenin, welches die Verbindung zum Aktinzytoskelett herstellt. Experimentell konnte gezeigt werden, dass

d

a

c e

. Abb. 1.2.3a–e. Struktur und Interaktionen der Cadherine. a Aminoterminale Domäne des N-Cadherin. Der Aminoterminus der Domäne ist mit „N“ markiert, E-Stränge sind als grüne Pfeile wiedergegeben, und ein kurzes helikales Element ist in rot dargestellt (Shapiro et al. 1995). b Calciumionen (rot) stabilisieren die Cadherin-Struktur und begünstigen die Bildung von cis-Dimeren. c Calciumionen (rot)

in einem Komplex der beiden aminoproximalen Domänen zweier E-Cadherin-Moleküle (Pertz et al. 1999). Parallele Interaktion der beiden aminoproximalen Domänen zweier E-Cadherin-Moleküle in einem cis-Dimer, dargestellt mit Blick auf die Aminotermini d und von der Seite e. Die Domänen des einen Moleküls sind in rot und magenta, die des anderen in blau und grün dargestellt

25 1.2 · Molekulare Mechanismen von Zell-Zell-Wechselwirkungen

diese durch Catenin vermittelte Verbindung zum Zytoskelett für die Zelladhäsion wichtig ist. Dagegen ist die Bedeutung einer Vielzahl weiterer in Adherens junctions nachgewiesener oder mit dem Cadherin-Catenin-Komplex assoziierter Proteine noch wenig verstanden. Neben seiner Rolle in Adherens junctions bindet das E-Catenin an Transkriptionsfaktoren und ist am Wnt-Signaltransduktionsweg beteiligt. E-Cadherin kann als Tumorsuppressorprotein interpretiert werden. Am Ende des vielstufigen Prozesses der Onkogenese steht häufig der Verlust von Zelladhäsion, einhergehend mit invasivem Wachstum des Tumors und Metastasierung. E-Cadherin ist hierbei häufig betroffen, sowohl durch somatische Mutationen als auch durch Mutationen auf Keimbahnebene. Somatische Mutationen im E-Cadherin Gen wurden beispielsweise in Subtypen von Magen- und Mammakarzinomen gefunden, und Keimbahnmutationen können für familiäre Formen des Magenkarzinoms prädisponieren. Ein Verlust der E-Cadherin-abhängigen Zelladhäsion spielt sehr wahrscheinlich auch bei der Metastasierung von Ösophagus-, Kolon-, Prostata-, Leber-, Nieren- und Lungenkarzinomen eine Rolle. Darüber hinaus wurden in verschiedenen Karzinomen, darunter Kolon-, Magen- und Prostatakarzinomen, auch Mutationen in intrazellulären Interaktionspartnern des E-Cadherin, wie E-Catenin, gefunden (Brembeck et al. 2006; Hajra u. Fearon 2002; Nelson u. Nusse 2004; Pertz et al. 1999; Shapiro et al. 1995; Troyanovsky 2005). Desmosomale Cadherine Sechs Vertreter der Cadherine finden sich überwiegend in Desmosomen, genannt Desmoglein-1, -2 und -3 sowie Desmocollin-1, -2 und -3. Die Desmosomen (Maculae adhaerentes) sind scheibenförmige Zellkontaktstrukturen (Durchmesser bis 100 nm), die in verschiedenen Zelltypen vorkommen. Desmosomen einer Zelle interagieren mit gegenüberliegenden Desmosomen der Nachbarzellen, vermittelt über trans-Interaktionen der Desmocolline und Desmogleine, die ihrerseits in desmosomalen Plaques intrazellulär verankert sind (> Abb. 1.2.1). Dort befinden sich unter anderem die Proteine Plakoglobin, ein Vertreter der Armadillo-Genfamilie, und Desmoplakin, ein Vertreter der Plakin-Genfamilie. Mit dem desmosomalen Plaque sind Intermediärfilamente verbunden, wodurch eine mechanische Kopplung des Zytoskeletts benachbarter Zellen erreicht und der Gewebeverband stabilisiert wird. Autoantikörper gegen Desmoglein-1 führen zum Pemphigus foliaceus, Autoantikörper gegen Desmoglein-3 zum Pemphigus vulgaris – beides Krankheitsbilder, bei denen die epidermale Zell-Zell-Adhäsion beeinträchtigt ist. Mutationen im Desmoglein und im Desmoplakin wurden mit einer Form von Palmoplantarkerato-

1.2

se in Zusammenhang gebracht, der Keratosis palmoplantaris striata (Cheng et al. 2005; Johnson u. Takeichi 1999; Karp 1999; Küster 2000; Lodish et al. 2000). Protocadherine und „atypische“ Cadherine Die mehr als 60, ursprünglich im Zentralnervensystem identifizierten Protocadherine haben eine für Zelladhäsionsmoleküle ungewöhnliche Genorganisation, ähnlich der von Antikörpergenen und T-Zell-Rezeptor-Genen. Dies führt dazu, dass variable extrazelluläre Bereiche mit konstanten zytoplasmatischen Bereichen kombiniert werden können. Eine Subgruppe der Protocadherine, die auch als „cadherin-related neuronal receptors“ (CNRs) bezeichnet wurde, wird in verschiedenen Subpopulationen von Neuronen exprimiert und wurde mit der Funktion von Synapsen in Zusammenhang gebracht (Takeichi u. Abe 2005; Yagi 2003).

1.2.2.2 Integrine Die Integrine bilden eine Familie heterodimerer Transmembranproteine, die als zelluläre Rezeptoren für Komponenten der extrazellulären Matrix fungieren, aber auch an direkten Zell-Zell-Kontakten beteiligt sein können. Integrinabhängige Wechselwirkungen von Zellen kontrollieren eine Vielzahl zellulärer Prozesse, wie Zellproliferation, Zelldifferenzierung, Zellwanderung und Apoptose. Integrinabhängige zelluläre Wechselwirkungen sind während der Embryonalentwicklung an dynamischen Prozessen wie zum Beispiel der Wanderung von Mesodermzellen oder der Wanderung von Neuralleistenzellen beteiligt. Im adulten Organismus tragen sie zur Stabilisierung des ausdifferenzierten Gewebeverbands bei, z. B. bei der Anhaftung von Epithelzellen an die darunterliegende Basalmembran (> Abb. 1.2.1). Auch bei sehr dynamischen Zell-Zell-Interaktionen wie der Adhäsion von Thrombozyten an die Gefäßwand und ihrer Aggregation im Zusammenhang mit der Blutgerinnung ist ein Integrin beteiligt (Alberts et al. 1994; Hemler 1999; Karp 1999; Lodish et al. 2000; Wolpert et al. 1999). Integrine bestehen aus zwei Untereinheiten, genannt D-Kette und E-Kette (> Abb. 1.2.2d). Bisher wurden 18 D-Ketten und 8 E-Ketten beschrieben, die 24 unterschiedliche Heterodimere ausbilden können (> Abb. 1.2.4). Die aminoproximale Hälfte der D-Ketten enthält sieben sog. E-Propellermotive, die bei einem Teil der DKetten von einem zusätzlichen Abschnitt, genannt I-Domäne (> Abb. 1.2.5a,b) unterbrochen sind. In der aminoproximalen Hälfte aller E-Ketten befindet sich eine konservierte Region mit Ähnlichkeit zur I-Domäne. Die Propellerdomäne der D-Ketten bildet gemeinsam mit der I-ähnlichen Domäne der E-Ketten die Ligandenbin-

26

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

dungsstelle (Xiong et al. 2001). Integrine können komplexe Konformationsänderungen vollziehen, die eine Aktivierung oder Inaktivierung dieser Rezeptoren erlauben, da sie einen starken Einfluss auf Ligandeninteraktionen haben (ffrench-Constant u. Colognato 2004; Hynes 2002; Shimaoka u. Springer 2003). Fokale Adhäsionen („focal adhesions“/„focal contacts“) sind Multiproteinkomplexe, die eine Verbindung zwischen Aktinfilamenten und der ECM herstellen und an Signaltransduktionsprozessen beteiligt sind. Sie enthalten neben Integrinen verschiedene Linkerproteine, darunter Vinculin, Filamin, D-Actinin und Talin. Letzteres bildet antiparallel orientierte Homodimere aus, die an die zytoplasmatische Domäne der E-Ketten bestimmter Integrine binden und eine Verbindung zu Aktinfilamenten herstellen. Außerdem interagiert es mit der „focal adhesion kinase“ (FAK), eine hochkonservierte Nichtrezeptor-Proteintyrosinkinase, die mit der Regulation der Zellmigration, der Zellproliferation, des Turnovers von fokalen Adhäsionen und mit dem Transfer zelladhäsionsabhängiger antiapoptotischer Signale in Zusammenhang gebracht wurde. Analysen FAK-defizienter Mäuse, die im Lauf der Embryonalentwicklung sterben, bestätigen eine zentrale Bedeutung dieser Kinase. Ein weiteres wichtiges Protein im Zusammenhang mit fokalen Adhäsionen ist das Protein Rho, ein Vertreter einer Gruppe kleiner Guanosintriphosphatasen, die unter anderem die Struktur verschiedener Spezialisierungen des Aktinzytoskeletts regulieren. Während Rho an der Regulation fokaler Adhäsionen beteiligt ist, beeinflusst das Rho-verwandte Cdc42 die Entstehung von Filopodien und das Protein Rac die Entstehung von Lamellipodien (Brakebusch u. Fässler 2003; Grashoff et al. 2004; Hannigan et al. 2005; Miranti u. Brugge 2002; van der Flier u. Sonnenberg 2001). Im Folgenden wird auf solche Integrine beispielhaft eingegangen, die entweder einen Phänotyp in MausKnockout-Modellen zeigen und/oder für die eine Krank-

. Abb. 1.2.4. Integrine: funktionelle Vielfalt durch Kombinatorik. Schematische und vereinfachte Darstellung der strukturellen Vielfalt der Integrine (Hemler 1999). I-Domäne: rot, E-Propellermotife: grün, I-Domänen-ähnlicher Bereich: orange, Cystein-reiche Regionen: blau,

heitsassoziation nachgewiesen wurde. Dabei wurde weitgehend die von Hemler vorgeschlagene Subgruppeneinteilung übernommen (Hemler 1999). Die Kollagenrezeptoren α1β1, α2β1, α10β1 und α11β1 Die Integrine dieser Subgruppe (> Abb. 1.2.4a) sind in erster Linie Rezeptoren für verschiedene Kollagene. Das Integrin DE (CD49a/CD29) spielt eine Rolle bei der Entstehung des Knorpels und wurde – im Mausmodell – mit Osteoarthritis in Zusammenhang gebracht. Das Integrin DE (CD49b/CD29) findet sich vorwiegend auf Thrombozyten und ist am Prozess der Hämostase beteiligt, indem es an Kollagen bindet, das bei Verletzungen der Gefäßwand exponiert wird (White et al. 2004; Zemmyo et al. 2003). Die Lamininrezeptoren α3β1, α6β1 und α7β1 Die in vielen Geweben verbreiteten Integrine DE (CD49c/CD29), DE (CD49e/CD29) und DE sind in erster Linie Rezeptoren für Laminin (> Abb. 1.2.4b). Analysen entsprechender Knockout-Mäuse sprechen dafür, dass DE für die Entwicklung der Epidermis und DE für die Gehirnhistogenese wichtig ist. Die Bindung des Muskelfaser-Integrins DE an das Laminin der Basallamina spielt bei der Muskelfunktion eine Rolle. Daher werden Mutationen im Gen der D-Kette dieses Integrins mit einer vererblichen Form von Muskelschwäche in Zusammenhang gebracht. Auch Mutationen in einem Liganden, nämlich der Laminin-D-Kette, führen zu einer Form vererblicher Muskelschwäche (ffrench-Constant u. Colognato 2004; Hemler 1999; Hynes 2002; van der Flier u. Sonnenberg 2001; Wehrle-Haller u. Imhof 2003). Integrin α6β4 und die Hemidesmosomen Auch das Integrin DE (CD49e/CD104) ist ein Lamininrezeptor, und es ist ein zentraler Bestandteil des

FNIII-Domänen: gelb. Bindungsstellen für Ca2+/Mg2+ sind als Punkte, Cysteinbrücken als Klammern und die Zellmembran als Doppellinie dargestellt

27 1.2 · Molekulare Mechanismen von Zell-Zell-Wechselwirkungen

Hemidesmosoms. Diese subzellulären Strukturen verankern Epithelzellen auf der darunterliegenden Basalmembran, indem sie eine Verbindung zu Keratinfilamenten des Zytoskeletts herstellen (> Abb. 1.2.1). Der ungewöhnlich lange intrazelluläre Bereich des Integrins (> Abb. 1.2.4c) interagiert dabei mit Komponenten des hemidesmosomalen Plaques und der extrazelluläre Abschnitt des Integrins mit Laminin-5 in der Basalmembran. Dementsprechend fehlen die Hemidesmosomen bei E4-defizienten Mäusen, was zu einer Ablösung der Epithelzellen von der Basalmembran führt. Mäuse mit genetisch inaktivierter D6-Untereinheit zeigen ähnliche Symptome, wie z. B. ausgeprägte Blasenbildung der Haut, und sterben etwa zum Zeitpunkt der Geburt. Beim Menschen wurde eine Korrelation der DE-Expression mit der Prognose bestimmter Karzinome nachgewiesen. Neben dem Integrin DE enthalten die Hemidesmosomen ein weiteres prominentes Transmembranprotein, genannt BP180 (bullöses Pemphigoid-Antigen-2). Die Basalmembran ist im Bereich des Hemidesmosoms über Fibrillen aus Kollagen VII mit der darunterliegenden Dermis verbunden. Der zytoplasmatische Plaque des Hemidesmosoms, in dem Keratinfilamente verankert sind, enthält u. a. Proteine der Plakin-Genfamilie, beispielsweise das BP230 (bullöses PemphigoidAntigen-1) und das Plektin. Eine Reihe von Autoimmunkrankheiten sind auf Autoantikörper gegen BP180, BP230, Laminin-5 oder Kollagen VII zurückzuführen. Mutationen in den Genen für Plektin oder Laminin-5Untereinheiten führen zu Formen der Epidermolysis bullosa (ffrench-Constant u. Colognato 2004; Guo u. Giancotti 2004; Hynes 2002; Janes u. Watt 2006; Küster 2000; van der Flier u. Sonnenberg 2001; Watt 2002; Wehrle-Haller u. Imhof 2003). Die Leukozytenintegrine αLβ2, αMβ2, αXβ2 und αDβ2 Die E-Integrine (> Abb. 1.2.4d) kommen nur auf Leukozyten vor. Integrin DLE wird auch als LFA-1 (CD11a/ CD18) bezeichnet, DME2 als Mac-1 (CD11b/CD18), DXE als CD11c/CD18 und DDE als CD11d/CD18. Während DLE von fast allen Leukozyten exprimiert wird, sind die anderen auf Subpopulationen beschränkt. Die E-Integrine vermitteln die Wechselwirkung von Leukozyten mit Endotheloberflächen und sind an deren transendothelialer Wanderung in das umgebende Gewebe beteiligt. Dabei binden sie an endotheliale Vertreter der IgSF, und zwar über die in den α-Ketten enthaltene I-Domäne (> Abb. 1.2.5a,b). Das weitverbreitete DLE spielt eine wichtige Rolle bei der T-Zell-abhängigen Zytotoxizität und bei der T-Zell/B-Zell-Interaktion im Kontext der Antikörperproduktion. Mäuse mit inaktiviertem E-Gen, denen also alle E-Integrine auf Leukozyten fehlen, zeigen De-

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1.2

b

c

. Abb. 1.2.5a–c. Die I-Domäne der Integrine. Die I-Domäne der D-Kette des Leukozytenintegrins DME2 (Lee et al. 1995). Dargestellt ist die mit dem Liganden interagierende Seite a sowie eine seitliche Ansicht b. Das für die Ligandenbindung wichtige Magnesiumion ist blau dargestellt, die D-Helices rot und die E-Stränge grün. c Bindung der I-Domäne des DLE2-Integrins (rechts) an die aminoterminale Domäne des ICAM-1 (links). Das vom Integrin gebundene zweiwertige Kation (grauer Punkt) stabilisiert die Struktur (Bella et al. 1998). Mit Erlaubnis der National Academy of Sciences, USA

fekte im Adhäsionsverhalten von Leukozyten und eine beeinträchtigte Infektabwehr. Beim Menschen führen Mutationen im Gen der E-Kette zum Typ I der „leukocyte adhesion deficiency“ (LAD-I), einer seltenen autosomal-rezessiven Erbkrankheit, bei der eine verminderte Einwanderung von Leukozyten in entzündetes Gewebe vorliegt, einhergehend mit beeinträchtigter Infektabwehr. Die Mutationen können die Stabilität der E-Kette, die Assoziation der D- und E-Ketten oder die Ligandeninteraktionen des Integrins beeinträchtigen (ffrench-Constant u. Colognato 2004; Hemler 1999; Hogg et al. 2002; Hynes 2002; van der Flier u. Sonnenberg 2001; Weber 2003; Wehrle-Haller u. Imhof 2003). Die α4-Integrine und das αEβ7 Die Integrine DEE (CD49d/CD29), DE und DE (> Abb. 1.2.4e–g) finden sich überwiegend auf Leukozyten und teilweise auch auf nichthämatopoetischen Zellen. Die D-Integrine sind, ebenso wie die E-Integrine, an der Leukozyteninteraktion mit Kapillarendothel beteiligt, beispielsweise bei der Rekrutierung in Entzündungsgebiet. Das Integrin DE bindet dabei an das VCAM-1, ein endotheliales Mitglied der IgSF. Die Analyse von D-defizienten Mäusen legt jedoch nahe, dass DE auch für Funktionen nichthämatopoetischer Zel-

28

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

len wichtig ist, da eine Deletion von D zu Herzentwicklungsstörungen führt und letal ist. Das zweite D-Integrin, nämlich DE, trägt zur Lokalisierung von Lymphozyten in Peyersche Plaques bei, durch Bindung an das dort exprimierte MAdCAM-1. Im Einklang damit haben D-defiziente Mäuse eine verminderte T-ZellLokalisierung in Peyersche Plaques, und E-defiziente Mäuse zeigen eine Verkleinerung der Peyerschen Plaques. Integrin DEE findet sich auf der Mehrzahl der intraepithelialen Lymphozyten und vermittelt deren Wechselwirkung mit Epithelzellen. Daher haben Knockout-Mäuse, denen die DE-Kette oder die E-Kette fehlt, eine reduzierte Zahl intraepithelialer Lymphozyten (ffrench-Constant u. Colognato 2004; Hemler 1999; Hynes 2002; Rice et al. 2005; Rose et al. 2002; van der Flier u. Sonnenberg 2001; Weber 2003). Die Integrine α5β1, α8β1 und αVβ1 Die Integrine DE (CD49e/CD29), DE und DVE (CD51/CD29) bilden eine Fibronektin bindende Subgruppe mit nahe verwandten D-Ketten (> Abb. 1.2.4k). Neben Fibronektin werden teilweise auch andere modular aufgebaute Komponenten der extrazellulären Matrix erkannt, wie Tenascin und Vitronektin. Knockout-Mäuse, denen die D- oder die DV-Kette fehlen, sterben in utero und haben unter anderem Gefäßdefekte. Analysen D-defizienter Mäuse sprechen dafür, das dieses Integrin u. a. an induktiven Wechselwirkungen zwischen Epithelund Mesenchymgewebe während der Histogenese der Nieren beteiligt ist und zur Entwicklung mechanosensorischer Haarzellen im Innenohr beiträgt (ffrench-Constant u. Colognato 2004; Hemler 1999; Hynes 2002; Littlewood u. Müller 2000; Müller et al. 1997; van der Flier u. Sonnenberg 2001). Integrin αIIbβ3 und die αV-Integrine Die DV-Integrine DVE (CD51/CD61), DVE, DVE und DVE sowie das Integrin DIIbE3 (GP IIb/IIIa oder CD41/CD61) bilden eine Subgruppe von Rezeptoren (> Abb. 1.2.4h,j), die überwiegend modular aufgebaute Proteine der extrazellulären Matrix erkennen, u. a. Fibronektin und Vitronektin. Während DIIbE3 weitgehend auf Thrombozyten beschränkt ist, findet sich DVE auf verschiedenen Zelltypen, darunter Makrophagen, Endothelzellen und Osteoklasten. Knockout-Mäuse, denen die E-Kette fehlt, exprimieren weder DIIbE3 noch DVE. Sie haben Defekte in der Hämostase und können daher als Modell für die Erbkrankheit GlanzmannThrombasthenie (s. u.) dienen. Bei Knockout-Mäusen, denen die DV-Kette fehlt und die daher über keines der fünf DV-Integrine verfügen, treten Plazentamissbildungen auf, und sie sterben größtenteils in utero. Beim Menschen wird eine Beteiligung von DVE bei der Proliferation des Glioblastoms diskutiert (ffrench-Constant

u. Colognato 2004; Guo u. Giancotti 2004; Hemler 1999; Hynes 2002; van der Flier u. Sonnenberg 2001). Das Integrin DIIbE3 (> Abb. 1.2.4h) ist der Thrombozytenrezeptor für Fibrinogen sowie den v.-Willebrand-Faktor und spielt eine zentrale Rolle bei der Hämostase. Thrombozyten haben einen weiteren Rezeptor für den v.-Willebrand-Faktor, nämlich den Glykoproteinkomplex GPIb-IX-V, der strukturell nicht mit Integrinen verwandt ist. Nach einer Gewebsverletzung binden Thrombozyten zunächst über den GPIb-IX-V-Komplex an den v.-Willebrand-Faktor, der an die Gefäßwand gebunden ist. Dann wird das Integrin DIIbE3 durch eine komplexe Folge von Prozessen aktiviert, bei denen u. a. Kollagen aus der Gefäßwand beteiligt ist. Das aktivierte DIIbE3 bindet nun ebenfalls an den v.-Willebrand-Faktor und verstärkt dadurch die Bindung der Thrombozyten an die Gefäßwand. Außerdem bindet das aktivierte Integrin nun lösliches Fibrinogen und trägt dadurch indirekt zur Rekrutierung weiterer Thrombozyten bei. Die Glanzmann-Thrombasthenie ist ein relativ seltener vererblicher Blutgerinnungsdefekt, der auf Mutationen in der DIIb-Kette oder der E-Kette zurückgeführt wird. Bei Patienten mit Defekten in der E-Kette ist nicht nur die Funktion von DIIbE, sondern auch die von DvE beeinträchtigt (Clemetson 1999; Hynes 2002; Parise 1999; van der Flier u. Sonnenberg 2001).

1.2.2.3 Proteine der Immunglobulin-Superfamilie (IgSF) Proteine mit mindestens einer Immunglobulin-(Ig-) Domäne werden der Immunglobulin-Superfamilie (IgSF) zugeordnet. Diese Domäne, die ursprünglich in Antikörpermolekülen entdeckt wurde, zählt zu den im Lauf der Evolution erfolgreichsten Proteindomänen (Amzel u. Poljak 1979; Williams u. Barclay 1988). Sie findet sich in mehreren hundert verschiedenen Zelloberflächenrezeptoren, in denen sie mit anderen Domänentypen kombiniert vorkommen kann > Abb. 1.2.6a). Ig-Domänen haben eine Ausdehnung von etwa 4u2,5u2,5 nm und können relativ flexibel oder weitgehend starr miteinander verknüpft sein (> Abb. 1.2.6b,c). Sie bestehen aus einer Serie von 7 oder 9 β-Strängen die in zwei E-Faltblättern angeordnet sind. Die Ig-Domänen haben also eine ähnliche Struktur wie die oben beschriebenen cadherintypischen Domänen (> Abb. 1.2.3a). Im Gegensatz zu den Cadherin-Domänen werden die meisten Ig-Domänen durch eine interne Disulfidbrücke stabilisiert. Ig-Domänen gehen intermolekulare (> Abb. 1.2.6D), aber auch intramolekulare (> Abb. 1.2.6c) Wechselwirkungen ein. Aus mehreren hundert Mitgliedern der IgSF werden hier Vertreter aus dem Nervensystem und dem Immun-

29 1.2 · Molekulare Mechanismen von Zell-Zell-Wechselwirkungen

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1.2

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. Abb. 1.2.6a–d. Strukturelle Vielfalt der Immunglobulin-Superfamilie (IgSF). a Proteine der IgSF können unterschiedlich viele Ig-Domänen haben (dunkle Ellipsen), kombiniert mit anderen Domänen (helle Ellipsen, lange Ellipse). Die meisten haben Transmembrandomänen, manche sind GPI-verankert (Dreiecke). b Der CD4-Corezeptor, der von T-Zell-Subpopulationen exprimiert wird und deren Interaktion mit antigenpräsentierenden Zellen unterstützt, enthält vier Ig-Domänen im extrazellulären Abschnitt, der eine längliche Form

hat (Wu et al. 1997). c Dagegen bilden die vier aminoproximalen Domänen des Axonin-1, einem an der Entwicklung des Nervensystem beteiligten Protein, eine funktionell wichtige U-förmige Domänenanordnung aus (Freigang et al. 2000). d Endotheliale Proteine der IgSF, die Leukozytenintegrine binden und dadurch Wechselwirkungen von Leukozyten mit Endothelzellen vermitteln. Eine Muzinähnliche Domäne ist als Wellenlinie dargestellt

system exemplarisch vorgestellt. Dabei wurden Beispiele ausgewählt, für die ein Zusammenhang mit Erbkrankheiten belegt und/oder anhand deren Strukturaspekte sowie die Bedeutung posttranslationaler Modifikationen erläutert werden können.

durch trägt ICAM-1 zur Adhäsion von Leukozyten an das Endothel bei und spielt so eine wichtige Rolle bei der Rekrutierung von Leukozyten, beispielsweise neutrophiler Granulozyten, in Entzündungsherde. Hierbei bindet es an E-Integrine (> Abb. 1.2.4d), vor allem an DLE2 (> Abb. 1.2.5c) und an DME2 auf der Oberfläche der Leukozyten. Analysen ICAM-1-defizienter Mäuse bestätigen eine Rolle des Proteins bei der Leukozytenwanderung. Pathophysiologisch wichtig ist, dass ICAM-1 verschiedenen Rhinoviren (>80% aller Serotypen) und Coxsackieviren als Zelloberflächenrezeptor dient. Außerdem interagiert es mit Proteinen nichtviraler Pathogene. Es bindet Erythrozyten, die mit dem Erreger der Malaria tropica (Plasmodium falciparum) infiziert sind. Dies spielt sehr wahrscheinlich eine Rolle bei deren Bindung an Gefäßendothel. Das VCAM-1 („vascular cell adhesion molecule-1“), auch CD106 genannt, erfüllt ähnliche Funktionen wie ICAM-1 indem es zur Rekrutierung von Leukozyten aus der Blutbahn in Entzündungsgebiete beiträgt. Im Gegensatz zu ICAM-1 bindet VCAM-1 aber nicht an Esondern an D-Integrine, primär an DE (> Abb. 1.2.4g), aber auch schwach an DE (> Abb. 1.2.4f). Da DE von fast allen Leukozyten, außer von neutrophilen Granulozyten, exprimiert wird, bleibt bei Patienten mit Leukozyten-Adhäsions-Defizienz Typ I, denen funktionelle E-Integrine fehlen, die Leukozytenrekrutierung teilweise erhalten. Analysen VCAM-1-defizienter Mäuse legen eine weitere Funktion der Wechselwirkung von D-Integrinen mit VCAM-1 nahe, und zwar in der Embryonalentwicklung. Beeinträchtigungen spezifischer Zell-Zell-Wechselwirkungen, an denen diese Proteine beteiligt sind, führen zu Störungen in der Histogenese der Plazenta und des Herzens. Ein kleiner Anteil dieser

Endothelzell-Rezeptoren für Leukozyten: ICAMs, VCAM-1 und MAdCAM-1 Eine Reihe von integrinbindenden Mitgliedern der IgSF (> Abb. 1.2.6d) werden auf Endothelzellen exprimiert und vermitteln die Rekrutierung von Leukozyten aus der Blutbahn ins Gewebe. Hierzu zählen x die „interzellulären Adhäsionsmoleküle“ (ICAMs), x das VCAM-1 („vascular cell adhesion molecule-1“) und x das MAdCAM-1 („mucosal adressin cell adhesion molecule-1“). Diese Rezeptoren unterscheiden sich in ihrer Ligandenbindungsspezifität: Die ICAMs binden an E-Integrine (> Abb. 1.2.4d), während VCAM-1 und MAdCAM-1 mit D-Integrinen (> Abb. 1.2.4f,g) interagieren (AfsharKharghan u. Thiagarajan 2006; Bella et al. 1998; Kakkar u. Lefer 2004; Kannagi et al. 2004; Smith et al. 2000; Wang u. Springer 1998; Weber 2003). Das ICAM-1 („intercellular adhesion molecule-1“, CD54) ist der Prototyp einer Subgruppe endothelialer integrinbindender IgSF-Rezeptoren, zu denen auch ICAM-2 (CD102), ICAM-3 (CD50) und ICAM-4 zählen. ICAM-1 wird primär von Endothelzellen, aber auch von anderen Zelltypen exprimiert. Die Expression ist auf Transkriptionsebene regulierbar und wird bei Entzündungsprozessen durch verschiedene Mediatoren, darunter TNFD, Interleukin-1 und Interferon-J induziert. Da-

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

Tiere überlebt jedoch und zeigt, im Einklang mit der oben erwähnten Funktion bei der Leukozytenrekrutierung, eine erhöhte Zahl zirkulierender Leukozyten. Das MAdCAM-1 („mucosal addressin cell adhesion molecule-1“) wird konstitutiv von spezialisiertem Kapillarendothel exprimiert, beispielsweise in den Peyerschen Plaques. Durch Interaktion mit dem Leukozytenintegrin DE (> Abb. 1.2.4f) trägt es zur Rekrutierung von Lymphozytensubpopulationen bei. Das CD2-Protein, ein Korezeptor für T-Zell-Interaktionen Für die Funktion des Immunsystems sind spezifische und kontrollierte Zell-Zell-Kontakte essenziell, beispielsweise die Wechselwirkung des T-Zell-Rezeptors auf T-Lymphozyten mit Molekülen des MHC auf anderen Zellen. Zellen, die mit Viren infiziert sind, präsentieren an MHC-Klasse-I-Proteine gebundene virale Polypeptidfragmente auf ihrer Zelloberfläche. Sie können dann von zytotoxischen T-Lymphozyten identifiziert werden, vermittelt durch deren T-Zell-Rezeptor. Dies leitet eine komplexe Kaskade biochemischer Prozesse ein, die letztendlich zur Zytolyse der virusinfizierten Zellen führen. In vergleichbarer Weise exponieren antigenpräsentierende Zellen Antigenfragmente, in diesem Fall gebunden an MHC-Klasse-II-Moleküle, auf ihrer Oberfläche. Die antigenpräsentierenden Zellen interagieren mit Helfer-T-Zellen, die dadurch aktiviert werden und letztendlich B-Zellen zur Antikörperproduktion veranlassen oder Makrophagen stimulieren können. Solche für die Funktion des Immunsystems kritischen zellulären Wechselwirkungen der T-Lymphozyten werden von verschiedenen Zelladhäsionsmolekülen vermittelt, wie zum Beispiel dem Adhäsionsrezeptorpaar CD2 und LFA-3 (Clark u. Ledbetter 1994; Davis u. van der Merwe PA 1996; Karp 1999; Lodish et al. 2000). Das CD2 bindet an das strukturell ähnliche LFA-3 (CD58), das u. a. von antigenpräsentierenden Zellen exprimiert wird. Beide Proteine haben zwei Ig-Domänen und gehören zu einer Subgruppe strukturell verwandter Proteine der IgSF (> Abb. 1.2.7a), die mit ihren aminoterminalen Domänen interagieren. Die Kontaktoberflächen von CD2 und LFA-3 sind relativ klein, ungewöhnlich hydrophil, enthalten relativ viele geladene Aminosäureseitenketten und wenig komplementäre Oberflächenkonturen (> Abb. 1.2.7b). CD2 und LFA-3 bilden wahrscheinlich im Kontaktbereich der interagierenden Zellen dynamische Cluster aus kurzlebigen Rezeptor-Liganden-Paaren (Wang et al. 1999). Dadurch wird ein Abstand zwischen den Zellmembranen hergestellt, der optimal für die Interaktion des T-Zell-Rezeptors mit dem MHC-Molekül ist (> Abb. 1.2.7a). Schätzungen gehen davon aus, dass dadurch die Effizienz der T-Zell-Interaktionen um mindestens eine Größenord-

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. Abb. 1.2.7a,b. Die Interaktion von CD2 mit LFA-3. a Eine T-Zelle (unten) wird durch Interaktion mit einer antigenpräsentierenden Zelle (oben) stimuliert. Der schwarze Punkt stellt ein Antigenfragment dar und das Dreieck einen GPI-Anker. Der T-Zell-Rezeptor ist stark vereinfacht dargestellt, ohne assoziierte Proteine. b Die aminoterminale Domäne des CD2 (grün) interagiert lateral mit der aminoterminalen Domäne des LFA-3 (gelb). Dabei interagieren negativ geladene Aminosäureseitenketten (rot) der einen Domäne mit positiv geladenen (blau) der anderen Domäne (Wang et al. 1999). Teil b mit Erlaubnis von Elsevier Science, Oxford

nung gesteigert wird. Die zytoplasmatische Domäne des CD2-Proteins wurde im Lauf der Evolution wenig verändert und ist wahrscheinlich an Signaltransduktionsprozessen in T-Lymphozyten beteiligt. Das „neurale Zelladhäsionsmolekül“ (NCAM) und die Polysialinsäure Das NCAM (CD56) ist der erste identifizierte Vertreter von Proteinen der IgSF im Nervensystem. Während der

31 1.2 · Molekulare Mechanismen von Zell-Zell-Wechselwirkungen

Embryonalentwicklung ist es an dynamischen Zell-ZellWechselwirkungen beteiligt, wie der Wanderung von Zellen oder der Faszikulation und Wegfindung wachsender Axone. Im adulten Nervensystem wird es mit der Regulation synaptischer Plastizität in Zusammenhang gebracht. NCAM vermittelt Zell-Zell-Wechselwirkungen über homophile trans-Interaktionen (> Abb. 1.2.8c). Diese Funktion des NCAM wird durch eine besondere posttranslationale Modifikation reguliert, die Polysialinsäure (PSA). Dieses negativ geladene Kohlenhydrat (> Abb. 1.2.8b) wird von zwei ähnlichen D2,8-Polysialyltransfera sen synthetisiert, und zwar spezifisch an der fünften Ig-Domäne des NCAM (> Abb. 1.2.8a). Bemerkenswert ist, dass diese Polysialylierung des NCAM im Lauf der Embryonalentwicklung stark reguliert wird, unter anderem durch die Menge an vorhandener Transferase. Da PSA stark negativ geladen ist, interagiert das „embryonale“ NCAM-PSA wesentlich schwächer homophil als das „adulte“. Dies führt dazu, dass die Wechselwirkungen

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. Abb. 1.2.8a–d. NCAM und die Polysialinsäure. a Biosynthese der Polysialinsäure (PSA) an der fünften Ig-Domäne des NCAM durch die D-Polysialyltransferase (PST). Dunkle Ellipsen repräsentieren IgDomänen, helle Ellipsen FNIII-Domänen und schwarze Punkte potenzielle N-Glykosylierungsstellen. b PSA ist über N-glykosidisch verknüpfte Kohlenhydrate an das NCAM-Protein gebunden. GlcNAc: NAcetylglucosamin. c In Abwesenheit von PSA bindet NCAM (dunkle Symbole) homophil in trans-Orientierung, und die Zelloberflächen liegen nahe beieinander. Andere Zelloberflächenrezeptoren (helle Symbole) interagieren ebenfalls. d Die Synthese von PSA (graue Ellipsen) vermindert nicht nur die homophile NCAM-Interaktion, sondern interferiert indirekt auch mit den Wechselwirkungen anderer Rezeptoren (Bruses und Rutishauser 2001)

1.2

benachbarter NCAM-tragender Zelloberflächen im embryonalen Gehirn (> Abb. 1.2.8d) schwächer sind als im adulten (> Abb. 1.2.8c) was teilweise die im Vergleich zum adulten Gehirn größere strukturelle Plastizität während der Entwicklung erklären kann. Im Einklang damit findet sich NCAM-PSA im adulten Gehirn vorwiegend in Bereichen, in denen Zellwanderungen (olfaktorisches System) oder synaptische Plastizität (Hippocampus) beobachtet werden. Mäuse, deren NCAM-Gen mit genetischen Verfahren inaktiviert wurde, zeigen Defekte im Wanderungsverhalten bestimmter Zelltypen und in der Faszikulation bestimmter Axone. Außerdem haben sie eine beeinträchtigte Langzeitpotenzierung und zeigen Lerndefizite bei Orientierungstests (Bruses u. Rutishauser 2001; Doherty et al. 2000; Durbec u. Cremer 2001; Sandi 2004; Walmod et al. 2004; Zhou et al. 2003). Das Zelladhäsionsmolekül L1 und vererbliche Entwicklungsstörungen des Gehirns Das Zelladhäsionsmolekül L1 ist ein vorwiegend, aber nicht ausschließlich, im zentralen und peripheren Nervensystem exprimiertes Protein der IgSF. Es findet sich vorwiegend auf Axonen des sich entwickelnden und adulten Nervensystems, wird aber auch von Gliazellen, wie Schwann-Zellen exprimiert. Zellkulturexperimente und Analysen L1-defizienter Mäuse sprechen dafür, dass L1 an einer Vielzahl von Prozessen, die von Zell-ZellWechselwirkungen abhängen, beteiligt ist. Hierzu gehören die Wanderung von Zellen, das Auswachsen und die Faszikulation von Axonen sowie deren Interaktion mit Schwann-Zellen. Im Einklang mit der Komplexität der histogenetischen Prozesse, an denen L1 beteiligt ist, bindet es an eine Vielzahl verschiedener Interaktionspartner wie Mitglieder der IgSF, Integrine und Komponenten der extrazellulären Matrix. Mäuse, bei denen das L1-Gen inaktiviert wurde, zeigen teilweise vergrößerte Ventrikel, Hydrozephalus, Defekte des Kortikospinaltrakts und des Corpus callosum. Sie haben Schwierigkeiten, die Hinterbeine zu koordinieren, eine verminderte Schmerzsensibilität und ein beeinträchtigtes Explorationsverhalten. Die anatomischen Veränderungen der L1-defizienten Mäusen sind in Teilaspekten denen ähnlich, die bei L1-assoziierten Erbkrankheiten beim Menschen auftreten. Beim Menschen führen Mutationen im L1-Gen (Region X28 des X-Chromosoms) zu rezessiv vererblichen Gehirnmissbildungen, genannt „L1 disease“ (> Abb. 1.2.9). Diese Erbkrankheit, die mit einer Häufigkeit von 1:30.000 bei männlichen Neugeborenen auftritt, zeigt ein breites phänotypisches Spektrum, darunter Hydrozephalus (> Abb. 1.2.9d) und Missbildungen des Kortikospinaltrakts (> Abb. 1.2.9b). Die krankheitsverursachenden Mutationen können die Oberflächeneigenschaften des L1 verändern, das Protein destabilisieren

32

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

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. Abb. 1.2.9a–d. L1-assoziierte Erbkrankheit. Mutationen im L1 können zu Missbildungen des kortikospinalen Axontraktes führen (Kamiguchi et al. 1998, Wong et al. 1995). Der Kortikospinaltrakt (CST) ist in einem Querschnitt auf der Höhe der Medulla gut zu erkennen a. Bei einem Patienten mit einer Mutation im L1-Gen ist der Kortikospinaltrakt missgebildet b. Mit Erlaubnis von Elsevier Science, Oxford. Aufgrund der großen Variabilität der Symptome gibt es sowohl Patienten ohne Hydrozephalus c als auch Patienten mit stark ausgeprägtem Hydrozephalus d. Mit Erlaubnis von Academic Press, Orlando

oder zur Expression von Fragmenten führen. Die Symptome variieren unter Patienten mit verschiedenen Mutationen, aber auch unter verwandten Patienten mit derselben Mutation beträchtlich. Trotz dieser Variabilität besteht teilweise ein Zusammenhang zwischen der Art der Veränderungen im L1-Protein und der Art und Schwere der auftretenden Symptome. Patienten, bei denen das L1-Protein im extrazellulären Bereich vorzeitig terminiert wird, haben das höchste Risiko für Hydrozephalus (> Abb. 1.2.9d) und für schwere geistige Behinderungen sowie eine hohe Mortalität. Gegenwärtig sind die molekularen und zellbiologischen Einzelheiten der zugrunde liegenden histopathogenetischen Prozesse noch wenig erforscht. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass krankheitsassoziierte Mutationen im L1-Protein die Wechselwirkungen mit Interaktionspartnern verändern und den Transport des Proteins an die Zelloberfläche beeinträchtigen können (Brümmendorf u. Lemmon 2001; Doherty et al. 2000; Haspel u. Grumet 2003; Itoh et al. 2004; Kamiguchi et al. 1998; Runker et al. 2003; Sandi 2004; Weller u. Gartner 2001; Wong et al. 1995). Protein P0 und das Myelin Viele Axone im zentralen und peripheren Nervensystem sind von einem mehrlagigen Membransystem umgeben, dem Myelin. Es dient der elektrischen Isolierung der Axone und erhöht ihre Reizleitungsgeschwindigkeit

(saltatorische Erregungsleitung). Das Myelin der peripheren Axone wird von spezialisierten Gliazellen gebildet, den Schwann-Zellen. In der Entwicklung des Nervensystems interagieren diese Zellen mit Axonen und bilden dabei Zytoplasmafortsätze aus, die das Axon sukzessive spiralförmig umschließen. In einem komplexen Prozess („Kompaktion“) zieht sich das Zytoplasma aus den Fortsätzen zurück, sodass letztendlich ein System aufeinanderfolgender Lamellen aus jeweils zwei Schwann-Zellmembranen entsteht. Das häufigste Protein im peripheren Myelin ist das von den Schwann-Zellen synthetisierte P0-Protein. Dieses Transmembranprotein enthält eine extrazellulär gelegene Ig-Domäne und einen basischen zytoplasmatischen Abschnitt. Die extrazellulären Ig-Domänen interagieren homophil in trans-Orientierung, und der positiv geladene intrazelluläre Abschnitt bindet an die negativ geladene zytoplasmatische Oberfläche der gegenüberliegenden Schwann-Zellmembran. Verschiedene Analysen sprechen dafür, dass vier P0-Moleküle ein Homotetramer mit einem Durchmesser von etwa 7 nm und einer großen zentralen Öffnung ausbilden (> Abb. 1.2.10a). Die P0-Tetramere einer Schwann-Zellmembran interagieren wiederum mit P0-Tetrameren (> Abb. 1.2.10b) der gegenüberliegenden Membran (> Abb. 1.2.10c). Analysen P0-defizienter Mäuse zeigen, dass diese weniger kompaktes Myelin und elektrophysiologisch nachweisbare Reizleitungsdefizite aufweisen. Beim Menschen a

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. Abb. 1.2.10a–c. Interaktionen des P0-Proteins im Myelin. Modell für die Anordnung der extrazellulären Domänen des P0 im Myelin (Shapiro et al. 1996). Vier zu einer Schwann-Zellmembran gehörende P0-Moleküle bilden ein cis-Tetramer a. Tetramere einer Schwann-Zellmembran (blau) binden in trans-Orientierung an Tetramere (orange) der gegenüberliegenden Membran b,c. Mit Genehmigung von Cell Press, Cambridge (USA)

33 1.2 · Molekulare Mechanismen von Zell-Zell-Wechselwirkungen

führen Mutationen im P0-Gen zu einer Reihe vererblicher Myelinisierungsdefekte peripherer Nerven. Darunter fällt die Chromosom-1-gekoppelte Form der Charcot-Marie-Tooth-Krankheit (CMT Typ Ib), bei der eine Demyelinisierung peripherer Nerven auftritt, verbunden mit beeinträchtigter Reizleitungsgeschwindigkeit. Bei bestimmten Formen des Dejerine-Sottas-Syndroms, bei dem unter anderem auch Mutationen in P0 gefunden wurden, treten qualitativ ähnliche, aber stärker ausgeprägte Symptome auf. Ähnlich wie bei L1-assoziierten Erbkrankheiten gehen hier mehrere Krankheiten mit teilweise überlappender Symptomatik auf Mutationen in einem einzigen Gen zurück. Einige der krankheitsassoziierten Mutationen im P0-Protein stören sehr wahrscheinlich die Tetramerisierung des P0 (> Abb. 1.2.10a), andere die Interaktion der Tetramere untereinander (> Abb. 1.2.10b). Im Zentralnervensystem gehen Myelinisierungsstörungen auf andere Ursachen zurück, da das P0-Protein hier nicht vorkommt (Kandel et al. 2000; Martini et al. 1995; Shapiro et al. 1996; Shy et al. 2004; Warner et al. 1996).

1.2.2.4 Selektine und die Rekrutierung von Leukozyten Die transendotheliale Wanderung von Leukozyten ist ein für die Funktionen des Immunsystems wichtiger Prozess. T-Lymphozyten können die Blutgefäße verlassen, ins umgebende Gewebe einwandern und über das Lymphsystem wieder in das Blut zurückgeführt werden. Sie zirkulieren dabei präferenziell durch gerade den Gewebetyp, in dem sie zum ersten Mal mit Antigen konfrontiert wurden („lymphocyte homing“). Auch Monozyten und Granulozyten können Blutgefäße verlassen, und zwar spezifisch in Endothelbereichen, die durch Entzündungsprozesse aktiviert wurden. Die bemerkenswerte Spezifität, die dem „homing“ der Lymphozyten und der Einwanderung anderer Leukozyten in Entzündungsgebiete zugrunde liegt, geht auf ähnliche molekulare Mechanismen zurück. Diese Spezifität kommt durch einen obligat sequenziellen Prozess zustande, bei dem drei verschiedene Rezeptor-Liganden-Paare beteiligt sind: die Selektine und ihre Liganden, die Chemokine und ihre Rezeptoren sowie endotheliale Proteine der IgSF, die an Leukozytenintegrine binden (Afshar-Kharghan u. Thiagarajan 2006; Bunting et al. 2002; Cambien u. Wagner 2004; Kakkar u. Lefer 2004; Kannagi et al. 2004; Ley 2003; Ley u. Kansas 2004; Melchers et al. 1999; Rice et al. 2005; Rose et al. 2002; Rosen 2004; Weber 2003; Wehrle-Haller u. Imhof 2003). In einem ersten Aktivierungsschritt werden Selektine (> Abb. 1.2.11f) auf der Oberfläche der Kapillarendothels exprimiert (> Abb. 1.2.11b), und zwar über

1.2

verschiedene Mechanismen (s. unten). Diese Selektine interagieren mit proteingebundenen Kohlenhydratstrukturen auf den Leukozyten. Da diese Wechselwirkung relativ schwach ist, erlaubt sie ein „Rollen“ der Leukozyten über die Endotheloberfläche. Unter diesen Bedingungen können Chemokine, die vom aktivierten Endothel gebildet werden, an entsprechende ChemokinRezeptoren der Leukozyten binden (> Abb. 1.2.11c). Dies wiederum bewirkt unter anderem eine Aktivierung von E-Integrinen der Leukozyten (> Abb. 1.2.11d), die dann mit Endothelzell-Rezeptoren, beispielsweise ICAM-1, interagieren (> Abb. 1.2.6d). Hierdurch wird letztendlich die Wanderung der Leukozyten durch das Endothel eingeleitet. Dies ist ein noch wenig verstandener Prozess, bei dem neben einer Interaktion des Leukozytenintegrins DLE mit dem Endothelrezeptor JAM-1 (> Abb. 1.2.6a) auch die Endothelproteine PECAM-1 und CD99 eine Rolle spielen. Der erste Schritt in diesem Prozess, nämlich die Bindung eines sich im strömenden Blut verhältnismäßig schnell bewegenden Leukozyten an die Oberfläche des Endothels, stellt spezielle Anforderungen an die dabei beteiligten Selektine. Bemerkenswert ist, dass sie nicht wie die meisten anderen Zelladhäsionsmoleküle mit Proteinliganden interagieren, sondern mit einer Tetrasaccharidstruktur, genannt Sialyl-LewisX (sLex), die auf einer Reihe von Zelloberflächenproteinen vorkommt (> Abb. 1.2.11g). Diese Struktur wird von einer konservierten Domäne am Aminoterminus der Selektine gebunden (> Abb. 1.2.11f), die Ähnlichkeit zu calciumabhängigen (C-Typ) Lektinen hat. Das E-Selektin (ELAM-1) findet sich auf aktiviertem Kapillarendothel, wo seine Expression dynamisch reguliert wird: Zytokine wie IL-1 bewirken eine schnelle (ca. 1 h) Heraufregulierung auf Transkriptionsebene. Das E-Selektin bindet an mindestens drei Liganden auf Leukozyten, nämlich an PSGL-1, an ESL-1 und an ein anderes Selektin, das L-Selektin. Da metastasierende Tumorzellen häufig Sialyl-LewisX-ähnliche Strukturen exprimieren, wird E-Selektin mit dem Prozess der Metastasierung in Zusammenhang gebracht. Auch P-Selektin (GMP-140, PADGEM) wird vom Kapillarendothel exprimiert, findet sich aber auch auf Thrombozyten. P-Selektin liegt in intrazellulären Vesikeln gespeichert vor, aus denen es sehr schnell mobilisiert werden kann, beispielsweise als Reaktion auf Histamin oder Thrombin. Ein wichtiger Interaktionspartner auf Leukozyten ist das PSGL-1, ein homodimeres Transmembranprotein mit einem hohen Anteil O-glykosidisch gebundenen, sialinsäurereichen Kohlenhydrats. Auch in Thrombozyten liegt P-Selektin in intrazellulären Vesikeln gespeichert vor, aus denen es schnell mobilisierbar ist. Man geht davon aus, dass es zur Rekrutierung von Leukozyten in Thromben beiträgt. Ein Ver-

34 a

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen b

. Abb. 1.2.11a–g. Selektine und die Leukozyten-Endothel-Interaktion. a–e Vereinfachtes Schema der Leukozyten-Endothel-Interaktion (zu Details 7 Text). f Die Selektine haben eine aminoterminale Lektin-ähnliche Domäne (U-förmig), ein EGF-ähnliches Motiv (Kreis) und unterschiedlich viele CR-Domänen (Quadrate). g Die Sialyl-LewisX-Struktur (sLex) ist ein verzweigtes Tetrasaccharid

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gleich von Knockout-Mäusen, denen E-Selektin oder P-Selektin fehlt, spricht für eine begrenzte funktionelle Redundanz dieser beiden endothelialen Selektine. Das L-Selektin (LAM-1, LECAM-1) wird von Leukozyten exprimiert und ist das einzige konstitutiv exprimierte Selektin. N-glykosidisch gebundene Kohlenhydrate machen mehr als 40% der Molekülmasse aus, wobei Unterschiede zwischen verschiedenen Leukozytensubpopulationen bestehen. Das L-Selektin auf neutrophilen Granulozyten trägt die sLeX-Struktur, sodass es hier als Ligand der endothelialen P- und E-Selektine fungieren kann. Ursprünglich wurde L-Selektin in erster Linie als „lymph node homing receptor“ interpretiert, der für die Rekrutierung von Lymphozyten in die Lymphknoten wichtig ist. Analysen L-Selektin-defizienter Mäuse sowie die weite Verbreitung auf verschiedenen Subklassen von Leukozyten sprechen dafür, dass es zusätzlich auch bei der Rekrutierung von Leukozyten in Entzündungsherde eine Rolle spielt.

Bei Patienten mit „leukocyte adhesion deficiency type II“ (LAD-II), einer sehr seltenen Erbkrankheit, liegt ein Defekt in der Biosynthese von GDP-Fukose vor. Da die sLex-Struktur Fukose enthält (> Abb. 1.2.11g), fehlen diese Selektinliganden bei den betroffenen Patienten. Sie haben unter anderem eine Leukozytose und eine erhöhte Anfälligkeit für Infektionen.

1.2.3 Connexine und die Gap junctions Die Connexine bilden eine Multigenfamilie aus mindestens 20 integralen Membranproteinen (> Abb. 1.2.12a). Jeweils sechs dieser Moleküle bilden ein ringförmiges Hexamer, genannt Connexon, mit einer zentralen Öffnung, die für Moleküle Abb. 1.2.12b). Ansammlungen von mehreren hundert Gap-junctionKanälen werden Gap junctions genannt (Herve 2004, Herve 2005, Sohl et al. 2005). Gap junctions finden sich in den meisten Geweben. Allerdings können in verschiedenen Geweben unterschiedliche Connexine exprimiert werden, die dann Gap junction-Kanäle mit unterschiedlichen physiologischen Eigenschaften (Permeabilität, Regulierbarkeit) bilden. In Zellen, die gleichzeitig mehrere Connexine exprimieren, entstehen gemischt zusammengesetzte Connexone. Außerdem können Gap-Junktion-Kanäle aus unterschiedlich zusammengesetzten Connexonen gebildet werden (> Abb. 1.2.12b). Da die Gap junctions die Zytoplasmata verschiedener Zellen miteinander verbinden, ermöglichen sie die elektrische und metabolische Kopplung großer Zellpopulationen. Beispielsweise kann der hormoninduzierte Anstieg der cAMP-Konzentration in einer Zelle so zu einer Reaktion in benachbarten Zellen führen. Die calciumabhängige Kontraktion glatter Muskelzellen wird durch Gap junctions synchronisiert. Außerdem

1.2

finden sich Gap junctions in elektrischen Synapsen des Nervensystems. Die Permeabilität von Gap-junctionKanälen wird über Konformationsänderungen der Connexine reguliert, und zwar u. a. durch Calciumionen. Wird die Zellmembran beispielsweise einer Epithelzelle verletzt, so strömt Calcium in die Zelle ein. Dies induziert den Verschluss der Gap junctions der geschädigten Zelle und schützt so ihre Nachbarn. Mindestens 8 Connexine wurden mit Erbkrankheiten in Zusammenhang gebracht. Mutationen im Connexin-32-Gen verursachen eine X-Chromosom-gekoppelte Form der Charcot-Marie-Tooth-Krankheit, die mit Myelindefekten und Axondegeneration im peripheren Nervensystem einhergeht. Man kennt bereits mehr als 90 verschiedene Mutationen im Connexin-32, darunter solche, die die Stabilität des Moleküls betreffen, und andere, die die Kanaleigenschaften verändern. Mutationen im Gen des Connexin-26 führen u. a. zu Formen erblicher Taubheit und Mutationen im Connexin-46 oder im Connexin-50 zu bestimmten Ausprägungen vererblicher Linsenkatarakte (Gerido u. White 2004; Rabionet et al. 2002; Wei et al. 2004).

1.2.4 Claudine, Occludin und Tight junctions Die Claudine und das Occludin sind polytopische Membranproteine, die in den Tight junctions vorkommen. Die Claudine bilden eine Molekülfamilie mit mindestens 23 Mitgliedern, die zum Teil ubiquitär, zum Teil aber auch gewebespezifisch exprimiert werden. Tight junctions unterschiedlicher Gewebe enthalten daher wahrscheinlich verschiedene Repertoires an Claudinen. Occludin war das erste in Tight junctions identifizierte Protein. Es hat zwar keine Sequenzähnlichkeit mit den Claudinen, zeigt aber eine ähnliche Domänenorganisation (> Abb. 1.2.13a, b). Der lange carboxyproximale Bereich bindet an ZO-1, eines von mehreren Adapterproteinen, die indirekt die Verbindung zu Aktinfilamenten herstellen. Daneben enthalten Tight junctions eine Vielzahl anderer Moleküle, darunter das IgSF-Protein JAM-1 (> Abb. 1.2.6a) welches bei der Transmigration von Leukozyten durch das Kapillarendothel beteiligt ist (> Abb. 1.2.11e). Die Tight junctions (Zonulae occludentes) befinden sich im apikalen Bereich von Epithel- und Endothelzellen und umschließen diese als ringförmiges Band, das einen festen Kontakt zur Nachbarzelle herstellt (> Abb. 1.2.1). Im Elektronenmikroskop ist dieses Band als netzförmige Struktur, aufgebaut aus aneinandergereihten 3–4 nm großen Partikeln, darstellbar (> Abb. 1.2.13c). Tight junctions haben zwei wichtige Funktionen. Einerseits schränken sie die Lateralmobilität von

36 a

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen b

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. Abb. 1.2.13a–c. Proteine und Funktionen der Tight junctions. Die Claudine a und das Occludin b haben vier Transmembrandomänen und intrazelluläre Amino- und Carboxytermini. EM-Aufnahme (Gefrierbruchmethode) von Dünndarmepithelzellen eines Frosches c. Im oberen Teil (*) fehlt die Membran der obenliegenden Zelle, und netzförmig angeordnete Proteinaggregate werden sichtbar. Im mittleren Bereich (#) blieb ein Teil der obenliegenden Zellmembran erhalten (Staehelin und Hull 1978). Mit Genehmigung von Scientific American, New York

1.2.5 Ausblick Wechselwirkungen von Zellen untereinander und mit Komponenten der Extrazellulärmatrix spielen eine zentrale Rolle beim Aufbau aller mehrzelligen Organismen. Zelluläre Interaktionen werden überwiegend von speziellen Zelloberflächenproteinen vermittelt, die als Zelladhäsionsmoleküle bezeichnet werden. Die gegenwärtig am besten untersuchten Klassen solcher Proteine sind die Cadherine, die Integrine, die Selektine und die Moleküle der Immunglobulin-Superfamilie. Viele Erbkrankheiten, die auf fehlende oder veränderte Zelladhäsionsmoleküle zurückgehen, werden wahrscheinlich auf absehbare Zeit kaum für therapeutische Interventionen zugänglich sein. Dagegen ist zu erwarten, dass die dynamischen zellulären Interaktionen, die im Immunsystem vorkommen, für Therapieansätze besser zugänglich sind. Zelladhäsionsmoleküle können hier als therapeutische Zielstrukturen infrage kommen, zum Beispiel, um die Bindung pathogener Viren oder Mikroorganismen an ihre Rezeptoren zu supprimieren oder um die Rekrutierung von Leukozyten aus der Blutbahn in das umgebende Gewebe gezielt zu beeinflussen. Danksagung Ich bedanke mich besonders bei Frau Gabriele Kronmüller für die Anfertigung der Abbildungen. Meinen ehemaligen und gegenwärtigen Kollegen, die zu diesem Kapitel beigetragen haben, danke ich für Diskussionen und Unterstützung. Dieses Kapitel gibt ausschließlich die Meinung des Autors wieder und nicht notwendigerweise auch die Auffassung der Novartis Pharma AG.

Membranproteinen ein und teilen dadurch die Plasmamembran in zwei getrennte Domänen auf, den apikalen und den basolateralen Bereich. Andererseits regulieren sie die parazelluläre Diffusion löslicher Substanzen zwischen den Epithelzellen hindurch. Tight junctions isolieren daher Körperhöhlen vom umgebenden Gewebe, beispielsweise in exokrinen Drüsen, sowie im Magen-, Darm- oder Nierenepithel. Diese Funktion ist bei einer Reihe von Krankheiten beeinträchtigt. Beispielsweise führen Mutationen im Gen des Claudin-16 (Paracellin-1) zu einem rezessiven Nierendefekt, der mit verminderter parazellulärer Rückresorption von Magnesium einhergeht und daher zu Magnesiumverlust in den Urin führt (Brümmendorf u. Lemmon 2001; Feldman et al. 2005; Gonzalez-Mariscal et al. 2003; Lee et al. 2006; Matter u. Balda 2003; Weber 2003).

1.2.6 Literatur Afshar-Kharghan V, Thiagarajan P (2006) Leukocyte adhesion and thrombosis. Curr.Opin.Hematol. 13: 34–39 Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson JD (1994) Molecular Biology of the Cell. Garland Publishing, Inc., New York Amzel LM, Poljak RJ (1979) Three-dimensional structure of immunoglobulins. Annu.Rev.Biochem. 48: 961–997 Bella J, Kolatkar PR, Marlor CW, Greve JM, Rossmann MG (1998) The structure of the two amino-terminal domains of human ICAM-1 suggests how it functions as a rhinovirus receptor and as an LFA-1 integrin ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 4140–4145 Brakebusch C, Fässler R (2003) The integrin-actin connection, an eternal love affair. EMBO J. 22: 2324–2333 Brembeck FH, Rosario M, Birchmeier W (2006) Balancing cell adhesion and Wnt signaling, the key role of beta-catenin. Curr. Opin. Genet.Dev. 16: 51–59 Brümmendorf T, Lemmon V (2001) Immunoglobulin superfamily receptors: cis-interactions, intracellular adapters and alternative splicing regulate adhesion. Curr.Opin.Cell Biol. 13: 611 618

37 1.2 · Molekulare Mechanismen von Zell-Zell-Wechselwirkungen Bruses JL, Rutishauser U (2001) Roles, regulation, and mechanism of polysialic acid function during neural development. Biochimie. 83: 635–643 Bunting M, Harris ES, McIntyre TM, Prescott SM, Zimmerman GA (2002) Leukocyte adhesion deficiency syndromes: adhesion and tethering defects involving E2 integrins and selectin ligands. Curr.Opin.Hematol. 9: 30–35 Cambien B, Wagner DD (2004) A new role in hemostasis for the adhesion receptor P-selectin. Trends Mol.Med. 10: 179–186 Cheng X, Den Z, Koch PJ (2005) Desmosomal cell adhesion in mammalian development. Eur.J.Cell Biol. 84: 215–223 Clark EA, Ledbetter JA (1994) How B and T cells talk to each other. Nature. 367: 425–428 Clemetson KJ (1999) Primary haemostasis: sticky fingers cement the relationship. Curr.Biol. 9: R110–R112 Davis SJ, van der Merwe PA (1996) The structure and ligand interactions of CD2: implications for T-cell function. Immunol. Today 17: 177–187 Doherty P, Williams G, Williams EJ (2000) CAMs and axonal growth: a critical evaluation of the role of calcium and the MAPK cascade. Mol.Cell Neurosci. 16: 283–295 Durbec P, Cremer H (2001) Revisiting the function of PSA-NCAM in the nervous system. Mol.Neurobiol. 24: 53–64 Feldman GJ, Mullin JM, Ryan MP (2005) Occludin: structure, function and regulation. Adv.Drug Deliv.Rev. 57: 883–917 ffrench-Constant C, Colognato H (2004) Integrins: versatile integrators of extracellular signals. Trends Cell Biol. 14: 678–686 Freigang J, Proba K, Leder L, Diederichs K, Sonderegger P, Welte W (2000) The crystal structure of the ligand binding module of axonin-1/TAG-1 suggests a zipper mechanism for neural cell adhesion. Cell. 101: 425–433 Gerido DA, White TW (2004) Connexin disorders of the ear, skin, and lens. Biochim.Biophys.Acta. 1662: 159–170 Gonzalez-Mariscal L, Betanzos A, Nava P, Jaramillo BE (2003) Tight junction proteins. Prog.Biophys.Mol.Biol. 81: 1–44 Grashoff C, Thievessen I, Lorenz K, Ussar S, Fässler R (2004) Integrinlinked kinase: integrin's mysterious partner. Curr.Opin.Cell Biol. 16: 565–571 Gumbiner BM (2005) Regulation of cadherin-mediated adhesion in morphogenesis. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 6: 622–634 Guo W, Giancotti FG (2004) Integrin signalling during tumour progression. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 5: 816–826 Hajra KM, Fearon ER (2002) Cadherin and catenin alterations in human cancer. Genes Chromosomes.Cancer. 34: 255–268 Hannigan G, Troussard AA, Dedhar S (2005) Integrin-linked kinase: a cancer therapeutic target unique among its ILK. Nat.Rev.Cancer. 5: 51–63 Haspel J, Grumet M (2003) The L1CAM extracellular region: a multidomain protein with modular and cooperative binding modes. Front Biosci. 8: s1210–25.: s1210–s1225 Hemler ME (1999) Integrins. In: Kreis T, Vale R (Hrsg.) Guidebook to the Extracellular Matrix, Anchor, and Adhesion Proteins. Oxford University Press, Oxford, S. 196–212 Herve JC (2004) The connexins. Biochim. Biophys. Acta. 1662: 1–2 Herve JC (2005) The connexins, Part III. Biochim.Biophys.Acta. 1719: 1–2 Hogg N, Henderson R, Leitinger B, McDowall A, Porter J, Stanley P (2002) Mechanisms contributing to the activity of integrins on leukocytes. Immunol.Rev. 186: 164–71.: 164–171 Hynes RO (2002) Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. %20;110: 673–687 Itoh K, Cheng L, Kamei Y, Fushiki S, Kamiguchi H, Gutwein P, Stoeck A, Arnold B, Altevogt P, Lemmon V (2004) Brain development in

1.2

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38

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

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39 1.2 · Molekulare Mechanismen von Zell-Zell-Wechselwirkungen

1.2.7 Zeittafel 1838/1839

M. J. Schleiden und T. Schwann entdecken, dass Organismen sind aus Zellen aufgebaut sind.

(Schleiden 1838, Schwann 1839)

1907

Schwämme können aus vereinzelten Zellen reaggregieren.

(Wilson 1907)

1955

Townes und Holtfreter beschreiben die Reaggregation unterschiedlicher Zelltypen zu geschichteten Gewebeaggregaten („sorting out“).

(Townes und Holtfreter 1955)

1958–1962

Entdeckung humaner Leukozyten-Antigene durch verschiedene Arbeitsgruppen

(Klein 1982)

1959

Beschreibung der Lymphozyten-Zirkulation durch J. L. Gowans

(Klein 1982)

1971

M. S. Bretcher charakterisiert ein integrales Membranprotein (Glykophorin).

(Barclay et al. 1993)

1972

D. Allan entwickelt die Lektin-Affinitätschromatographie zur Isolierung von Glykoproteinen. Singer und Nicolson beschreiben das„fluid mosaic model“ der Zellmembran.

(Barclay et al. 1993, Singer und Nicolson 1972)

1975

A. Helenius und K. Simons solubilisieren Membranproteine mit Detergenzien. M. M. Letarte isoliert Leukozyten-Antigene über Immunaffinitätschromatographie.

(Barclay et al. 1993)

1979

Identifikation des N-Glykosylierungsmotivs durch Bause und Hettkamp. C. A. Sunderland und P. Parham verwenden monoklonale Antikörper zur Analyse von Zelloberflächenproteinen.

(Barclay et al. 1993, Bause und Hettkamp 1979)

1982

Williams und Gagnon stellen das Konzept der Immunglobulin-Superfamilie vor.

(Williams und Gagnon 1982)

1986–1987

Klonierung der ersten Integrin-Untereinheiten durch verschiedene Arbeitsgruppen

(Hynes 1992)

1987

Expressionsklonierung von Leukozyten-Antigenen in COS-Zellen durch Seed und Aruffo; Klonierung des „neuralen Zelladhäsionsmoleküls“ NCAM

(Cunningham et al. 1987, Seed und Aruffo 1987)

1987–1988

Klonierung der ersten Cadherine durch verschiedene Arbeitsgruppen

(Geiger und Ayalon 1992)

1989

Klonierung der drei Selektine durch verschiedene Arbeitsgruppen

(Bevilacqua und Nelson 1993)

1990

Strukturaufklärung der ersten beiden Domänen des CD4

(Ryu et al. 1990, Wang et al. 1990)

1995

Strukturaufklärung der aminoterminalen Domäne des E-Cadherin und der I-Domäne der Integrine

(Lee et al. 1995, Overduin et al. 1995, Qu und Leahy 1995)



Entdeckung verschiedener Arbeitsgruppen, dass E-Catenin an Transkriptionsfaktoren bindet

(Nelson und Nusse 2004)

1999

Genomorganisation der Protocadherine

(Wu und Maniatis 1999)

1.2

40

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

Literatur zur Zeittafel Barclay AN, Birkeland ML, Brown MH, Beyers AD, Davis SJ, Somoza C, Williams AF (1993) The Leucocyte Antigen FactsBook. Academic Press, London Bause E, Hettkamp H (1979) Primary structural requirements for N-glycosylation of peptides in rat liver. FEBS Lett. 108: 341–344 Bevilacqua MP, Nelson RM (1993) Selectins. J.Clin.Invest. 91: 379–387 Cunningham BA, Hemperly JJ, Murray BA, Prediger EA, Brackenbury R, Edelman GM (1987) Neural cell adhesion molecule: structure, immunoglobulin-like domains, cell surface modulation, and alternative RNA splicing. Science. 236: 799–806 Geiger B, Ayalon O (1992) Cadherins. Annu.Rev.Cell Biol. 8: 307–332 Hynes RO (1992) Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell. 69: 11–25 Klein J (1982) Immunology, the Science of Self-Nonself-Discrimination. John Wiley & Sons, New York Lee JO, Rieu P, Arnaout MA, Liddington R (1995) Crystal structure of the A domain from the alpha subunit of integrin CR3 (CD11b/ CD18). Cell. 80: 631–638 Nelson WJ, Nusse R (2004) Convergence of Wnt, beta-catenin, and cadherin pathways. Science. 303: 1483–1487 Overduin M, Harvey TS, Bagby S, Tong KI, Yau P, Takeichi M, Ikura M (1995) Solution structure of the epithelial cadherin domain responsible for selective cell adhesion. Science. 267: 386–389 Qu A, Leahy DJ (1995) Crystal structure of the I-domain from the CD11a/CD18 (LFA-1, alpha L beta 2) integrin. Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A. 92: 10277–10281

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1.3 1.3 Die zytogenetischen Grundlagen der Molekularen Medizin Heidemarie Neitzel und Karl Sperling

1.3.1

Einleitung

– 42

1.3.2

Chromosomentheorie der Vererbung – 43

1.3.3

Grundlagen der Chromosomenphysiologie

1.3.3.1 1.3.3.2

Strukturen der Chromosomen und des Chromatins – 46 Funktionelle Gliederung der Chromosomen und Genkartierung

1.3.4

Zellzyklus und Checkpoint-Kontrolle – 49

1.3.5

Chromosomopathien

1.3.5.1 1.3.5.2 1.3.5.3

Aneuploidien – 51 Imprinting – 52 Strukturelle Chromosomenmutationen

1.3.6

Somatische Chromosomenmutationen – 54

1.3.6.1 1.3.6.2 1.3.6.3

Somatische Rekombination – 54 Chromosomeninstabilität – 55 Chromosomenmutationen in der Tumorgenese

1.3.7

Ausblick

– 57

1.3.8

Literatur

– 58

1.3.9

Zeittafel

– 62

– 46 – 47

– 51

– 53

– 56

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

42

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

1.3.1 Einleitung Die Molekulare Medizin ist eine analytische Wissenschaft mit dem Ziel, einen medizinischen Sachverhalt bis hin zu seinen molekularen Ursachen aufzuklären. Die Zytogenetik hingegen stellt die Verbindung zytologischer, speziell chromosomaler Beobachtungen mit genetischen Sachverhalten dar und wird daher als eine deskriptive Disziplin angesehen. Diese Sichtweise ist aus mehrfachen Gründen zu einfach: Zum einen ist die Zytogenetik nicht rein deskriptiv, da sie auf einem höheren Niveau biologischer Organisation als der DNA entscheidende biologisch-medizinische Sachverhalte in einem logischen Zusammenhang darzustellen vermag. Sie relativiert damit zugleich eine weit verbreitete Ansicht, dass ein zellbiologisches Phänomen dann aufgeklärt und verstanden ist, wenn man die beteiligten Moleküle identifiziert und benannt hat. Zum anderen hat sie durch ihren neuen Zweig, die molekulare Zytogenetik, unmittelbar Anschluss an die molekulare Genetik und damit auch die Molekulare Medizin gefunden. So basieren einige der größten Erfolge der Molekularen Medizin auf zytogenetischen Beobachtungen, wie die folgenden drei Beispiele aus der Entwicklungsgenetik, der medizinischen Genetik und der Tumorgenetik belegen sollen. 1. Der erste Fall betrifft einen Befund aus dem Jahr 1959, wonach Individuen mit der Chromosomenkonstitution 47,XXY männlich und solche mit der Konstitution 45,X weiblich sind. Dies sprach dafür, dass beim Vorliegen eines Y-Chromosoms die ontogenetische Entwicklung in männliche Richtung verläuft. Später konnte gezeigt werden, dass nur ein kleiner Bereich im kurzen Arm des Y-Chromosoms hierfür verantwortlich ist. Dies führte zur Identifizierung des SRY-Gens („sex determining region on Y“), dem Schalter-Gen, das beim Menschen und beim Säuger die Entwicklung des undifferenzierten Embryos in männliche Richtung bestimmt. Die Mutation nur eines einzigen Basenpaares in diesem Gen, die dessen Funktionsverlust bedingt, führt zur Entstehung weiblicher Individuen mit einem männlichen Chromosomensatz, die aufgrund fehlender Gonaden steril sind. Die molekulare Analyse hat dabei nicht nur diese besondere Form von Sterilität aufklären können, sondern zugleich dasjenige Gen beim Säuger identifiziert, das für die Geschlechtsbestimmung verantwortlich ist (Übersicht bei Wolf 1995). 2. Eine zytogenetische Auffälligkeit war es auch, die mit einer der häufigsten genetisch bedingten Ursachen geistiger Behinderung einhergeht, dem sog. Fragilen-X-Syndrom. Zytogenetisch auffällig war eine brüchige (fragile) Stelle im terminalen Bereich des

langen Armes des X-Chromosoms. Gestützt auf die Lokalisation konnte das Gen identifiziert und zugleich ein vollkommen neuer Mutationsmechanismus beschrieben werden. Es handelt sich um eine Vermehrung von Basentripletts der Folge (CCG)n im nichtkodierenden Bereich des FMR1-Gens („fragile X mental retardation-1“). Es kommt aber nur dann zu klinischen Konsequenzen, wenn bereits eine sog. Prämutation, also eine geringfügigere Vermehrung des Basentripletts, vorliegt. Durchlaufen diese so veränderten Sequenzen die Oogenese, nicht die Spermatogenese, so kann es zur erneuten Vermehrung des Basentripletts und damit zur Ausprägung klinischer Symptome kommen. Mit der Aufdeckung dieses Mechanismus wurde zugleich die Erklärung für ein bislang vollkommen rätselhaftes Phänomen geliefert, die Antizipation. Gemeint ist damit, dass bei bestimmten genetisch bedingten Erkrankungen das Erkrankungsrisiko und die Schwere der Erkrankung von Generation zu Generation zunehmen. Das gleiche Phänomen konnte inzwischen für mehr als ein Dutzend weiterer neurologischer Erkrankungen belegt werden (Übersicht bei Kaufmann u. Reiss 1999; O’Donovan et al 2003), bei denen die Schwere der Erkrankung und das Manifestationsalter mit der zunehmenden Länge der Basentripletts korreliert. 3. Ein letztes Beispiel soll den Stellenwert zytogenetischer Beobachtungen für das Verständnis der Tumorgenese illustrieren. Kennzeichnend für das Burkitt-Lymphom, eine in Deutschland seltene Krebserkrankung, sind charakteristische Translokationen der Krebszellen zwischen einem Chromosom 8 und einem Chromosom 2, 14 oder 22, die jeweils die gleichen Bruchstellen betreffen. Es bedeutete einen wissenschaftlichen Durchbruch auf dem Gebiet der Tumorgenetik, als im Oktober 1982 zwei Arbeitsgruppen unabhängig voneinander zeigen konnten, dass als Folge dieser Translokationen das C-MYC-Gen auf Chromosom 8 in Nachbarschaft zu den Genen der schweren (Chromosom 14) oder der leichten Ketten der Immunglobulingene (Chromosom 2 und 22) gelangt, die gerade in diesen Zellen besonders aktiv sind. Als Folge der Translokation kommt es zu einer gesteigerten Expression des C-MYC-Gens als entscheidendem frühen Schritt in der Genese dieser Tumoren. Zum ersten Mal konnte damit für die Kanzerogenese ein Zusammenhang zwischen einer strukturellen Chromosomenveränderung und der Expression der davon betroffenen Gene hergestellt werden. Im Gegensatz zu den beiden vorausgegangenen Beispielen handelt es sich hier nicht um Veränderungen in der Keimbahn, sondern um Mutationen in somatischen Zellen (Übersicht bei Look 1998).

43 1.3 · Die zytogenetischen Grundlagen der Molekularen Medizin

Diese drei speziellen Beispiele illustrieren einen allgemeinen Sachverhalt: die Zytogenetik ist schon deshalb eine wesentliche Grundlage der Molekularen Medizin, weil die Gene auf den Chromosomen angeordnet sind. Die Genkarte stellt das entscheidende Ordnungsprinzip in der Genetik dar, durchaus vergleichbar mit der Orientierungshilfe mittels Landkarten im täglichen Leben. So können strukturelle Veränderungen der Chromosomen, die die Keimbahn betreffen und mit klinischen Auffälligkeiten einhergehen oder die maligne Zellen auszeichnen, den Weg zu den jeweils betroffenen Genen weisen. Der Lageort des Gens lässt zudem Hinweise auf die Genexpression zu, da die Chromosomen selbst funktionell untergliedert sind. Hier soll der Versuch unternommen werden, gestützt auf die allgemeinen Grundlagen der Chromosomentheorie der Vererbung und der Chromosomenphysiologie, die molekularen Grundlagen zytogenetischer Phänomene darzustellen und ihre Bedeutung für das Verständnis medizinischer Sachverhalte aufzuzeigen, ganz im Sinne der einleitend gebrachten Beispiele.

1.3.2 Chromosomentheorie der Vererbung Die etwa 25 000 Gene des Menschen verteilen sich auf 23 Chromosomenpaare. Jeweils ein einfacher, haploider Chromosomensatz, wird von der Mutter und vom Vater an die Nachkommen vererbt. Die befruchtete Eizelle, die Zygote, weist danach in der Regel einen normalen diploiden Satz aus 46 Chromosomen auf. Sämtliche Körperzellen gehen durch Zellteilung, Mitose, aus der befruchteten Eizelle hervor. Sie enthalten daher ebenfalls 46 Chromosomen und im Prinzip auch sämtliche Erbanlagen. Dass sich die verschiedenen Gewebe in morphologischer und physiologischer Hinsicht unterscheiden, beruht darauf, dass in den verschiedenen Geweben jeweils nur bestimmte Gene aktiv sind. Diese entwicklungs- und gewebsspezifische Regulation der Genaktivität ist Grundlage jeden Entwicklungs- und Differenzierungsgeschehens. Die Bedeutung der Chromosomen als Träger der Erbanlagen liegt einmal darin, die korrekte Verteilung der Gene auf die Tochterzellen zu gewährleisten und zum anderen die korrekte Weitergabe der Gene bei der Keimzellbildung, der Meiose, zu sichern. Zugleich sind die Chromosomen der Interphase (das Chromatin) aber auch das Substrat der Genregulation. Diese Erkenntnisse haben Anfang des letzten Jahrhunderts ihren Niederschlag in der „Chromosomentheorie der Vererbung“ gefunden, die zugleich die Geburtsstunde der Zytogenetik markiert. Dabei ergab sich eine vollständige Korrelation zwischen den im Kreuzungs-

1.3

experiment ermittelten Befunden und den zytogenetischen Beobachtungen (> Abb. 1.3.1). Das paarweise Vorhandensein der Erbanlagen in den Körperzellen entsprach dem paarweisen Vorliegen der Chromosomen, das einfache Vorhandensein in den Keimzellen der Reduktion der diploiden auf die haploide Chromosomenzahl während der Meiose. Die lichtmikroskopisch sichtbaren Chiasmata der Prophase der Meiose stellen das Korrelat für den im Kreuzungsexperiment ermittelten Austausch von Genen zwischen homologen Chromosomen (Crossing-over) dar. Diese genetischen Austauschereignisse waren es, die T. H. Morgan und seine Schüler in den 1920er Jahren des letzten Jahrhunderts die Erstellung der ersten Genkarten bei der Taufliege Drosophila ermöglichten. Die so ermittelte Entfernung der Gene wird in cM (centiMorgan) angegeben. Hierbei entspricht die genetische Distanz von 1 cM einer Rekombinationsrate zwischen zwei Genen von 1%. Es war ein fast einmaliger Zufall in der Wissenschaft, als Heitz und Bauer 1933 in Berlin (und unabhängig von ihnen Painter in den USA) zeigen konnten, dass das damals genetisch am besten analysierte Objekt, die Drosophila, sich zugleich auch zytogenetisch in besonderer Weise auszeichnet. In den Speicheldrüsen der Larven finden sich sog. Riesenchromosomen. Es handelt sich dabei um Interphasechromosomen, die aus mehr als 1.000 gepaarten Chromatiden bestehen, was ihre große Länge und Dicke erklärt. Sie weisen eine spezifische Bandenstruktur auf, wobei ein bestimmtes Gen einer distinkten Bande zugeordnet und damit die lineare Anordnung der Gene auf den Chromosomen sichtbar gemacht werden konnte. Damals schien es ausgeschlossen, jemals die Reihenfolge der Gene auch auf den menschlichen Mitosechromosomen oder die Expression der Gene lichtmikroskopisch nachweisen zu können. Heute ist dies dank des Fortschrittes auf dem Gebiet der molekularen Zytogenetik möglich. Mittels der Technik der Fluoreszenz-insitu-Hybridisierung (FISH) können die Gene beim Menschen rasch kartiert und ihr Verlust bei bestimmten Erkrankungen lichtmikroskopisch nachgewiesen werden (> Abb. 1.3.2). Einzelheiten zu diesen Verfahren finden sich im Kapitel „Chromosomopathien“ im Band „Monogen bedingte Erbkrankheiten 2“ (Ganten u. Ruckpaul 2000). Die FISH-Analyse kann mit Einzelsonden geschehen, aber auch mit einem Gemisch von Proben, die repräsentativ für ein einzelnes Chromosom („chromosome painting“) oder einzelne Chromosomenabschnitte sind. Verwendet man hierfür unterschiedliche Fluorochrome, ergibt sich ein chromosomales Bandenmuster, das der Kodierung durch ein Strichmuster entspricht und als „chromosomal bar code“ bezeichnet wird. Dieser Nachweis kann auch in Zellkernen vorgenommen

44

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

. Abb. 1.3.1. Gegenüberstellung von zytogenetischen Beobachtungen mit den entsprechenden genetischen Befunden, die durch das

Kreuzungsexperiment erschlossen wurden, die zusammen dann die „Chromosomentheorie der Vererbung“ begründet haben

werden, sodass man dank der FISH-Technik nicht mehr auf Metaphasechromosomen und damit auf proliferierende Zellen für eine zytogenetische Untersuchung angewiesen ist (Interphase-Zytogenetik). Mittels der komparativen genomischen Hybridisierung („comparative genomic hybridization“, CGH) kann man sogar sämtliche chromosomale Aneuploidien an DNA bis zu einer

Größe von ca. 3Mbp nachweisen (> Abb. 1.3.2). Durch die Chip-basierte Array-CGH kann die Auflösung noch einmal wesentlich gesteigert werden (Übersicht bei Pinkel u. Albertson 2005; Lockwood et al. 2006; Ylstra et al. 2006). Ebenso kann heute für jedes Gen die entwicklungsund gewebsspezifische Expression auf RNA-Ebene

45 1.3 · Die zytogenetischen Grundlagen der Molekularen Medizin

a

b

c

1.3

. Abb. 1.3.2a–d. a Schematische Darstellung der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH). Hierzu wird eine DNA-Probe, die mit einem Fluorochrom markiert ist, auf menschliche Metaphasechromosomen hybridisiert. Deren DNA wurde zuvor in den einzelsträngigen Zustand überführt. b Ausschnitt aus einer Metaphase nach FISH mit zwei Sonden von Chromosom 7, der für Williams-Beuren-Syndrom (WBS) kritischen Region in 7q11.2 (rot) und der Kontrollregion in der Zentromerregion von Chromosom 7 (grün): Beide Fluoreszenz-Signale sind auf beiden Chromosomen 7 nachweisbar. c Metaphase einer WBS-Patientin, die eine Deletion für die beim Williams-BeurenSyndrom kritische Region in 7q11.2 aufweist: Das rote FISH-Signal ist nur auf einem der beiden Chromosomen 3 nachweisbar; das zweite, deletierte Chromosom 3 ist durch den Pfeil markiert. d Prinzip der komparativen genomischen Hybridisierung (CGH) und der Array-CGH: Die DNA wird mit unterschiedlichen Fluorochromen markiert: Testperson (grün), Normalperson (rot). Anschließend werden beide DNAs auf normale Metaphasechromosomen hybridisiert und die Ratioprofile von grüner zu roter Fluoreszenz bestimmt. Bei einer Verminderung (dim = diminished) in der TestDNA kommt es zu einer Abweichung des Ratioprofils nach rot, bei Vorliegen von zusätzlichem Material (enh = enhanced) in der Test-DNA zu einer Abweichung nach grün. Das Prinzip der Array-CGH ist praktisch identisch, die beiden DNAs (Test-DNA: grün, Kontroll-DNA: rot) werden aber hier auf ein Panel von gespotteten DNA-Proben hybridisiert, deren genomische Lokalisation bekannt ist und die das Genom in gleichmäßigen Abständen abdecken. Damit ist die Sensitivität der Array-CGH deutlich höher als die der konventionellen CGH

d

durch In-situ-Hybridisierung ermittelt werden. Hierzu wird z. B. an Gewebsschnitten der Maus die betreffende mRNA durch Hybridisierung mit der betreffenden Gensonde erfasst. Mittels DNA-RNA-Hybridisierung können sogar die Transkripte an den (Meiose-)

Chromosomen nachgewiesen und damit auch beim Säuger aktive Gene lichtmikroskopisch dargestellt werden. Damit hat auch die Säugerzytogenetik unmittelbaren Anschluss an die molekulare Genetik gefunden.

46

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

1.3.3 Grundlagen der Chromosomenphysiologie 1.3.3.1 Strukturen der Chromosomen und des Chromatins Das Erbgut einer normalen Körperzelle des Menschen besteht aus ca. 6 u109 Basenpaaren (Bp), die aneinandergereiht einen DNA-Faden von etwa 2 m Länge und 2 nm Durchmesser ergeben würden. Tatsächlich ist dieser nicht durchgehend, sondern in die 46 Chromosomen des diploiden Satzes aufgeteilt. Das lichtmikroskopisch sichtbare Chromosom besteht aus zwei identischen Spalthälften, den Chromatiden, die jeweils eine durchgehende DNA-Doppelhelix aufweisen. Im Metaphasechromosom ist die DNA um das mehr als 10.000-Fache kondensiert (> Abb. 1.3.3). Diese Verkürzung geschieht in mehreren Stufen. Die erste Organisationseinheit der Chromatinstruktur sind die Nukleosomen, die aus zweifach um ein Oktamer aus den Histonen H2A, H2B, H3 und H4 gewickelter DNA bestehen. Der Nukleosomenfaden von 10 nm ist fast immer zu der 30-nm-Faser verpackt, die sich wahrscheinlich nicht durch ein helikales Supercoiling sondern durch eine Zickzack-Anordnung unter Einbeziehung des Linker-Histons H1 bildet (Bednar et al. 1998), wobei eine weitere Verdichtung des Genoms um das 6- bis 7-Fache erreicht wird. Zur Bildung der Metaphasechromosomen muss diese 30-nm-Faser noch weiter verdichtet werden (Swedlow u. Hirano 2003). Dieser letzte Schritt der Packung eines Chromatinfadens ist noch nicht endgültig geklärt. Es spricht jedoch vieles

dafür, dass die Chromatinfibrille im Interphasekern Schleifen von 50 bis mehr als 100 Kilobasenpaare (Kb) DNA ausbildet, deren Basis aus einem mehrere 100 Bp AT-reichen Abschnitt besteht, der mit einem schwer löslichen Proteinkomplex verbunden ist, der Kernmatrix oder SAR („scaffold-associated region“). Deren Hauptkomponente sind Topoisomerase IIα und das SMC2-Protein („structural maintenance of chromosomes 2“, SMC2, Untereinheit des Condensin-I-Komplexes) (Übersicht bei Earnshaw 1988; Koshland u. Strunnikov 1996; Hart u. Laemmli 1998; Losada und Hirano 2005). Beim Übergang in die Mitose kommt es zum Zusammentreten einzelner dieser Proteinkomplexe unter Ausbildung einer durchgehenden Achse, dem eigentlichen „scaffold“. Durch anschließende helikale Faltung kommt es dann zur Ausbildung der Chromatiden mit etwa 700 nm Durchmesser. In dem kompakten Zustand der Metaphasechromosomen, der Transportform, ist das genetische Material inaktiv. In der Interphase liegt das Chromatin in dekondensierter Form vor, die einzelnen Chromosomen sind nicht mehr sichtbar. Sie können jedoch nach In-situ-Hybridisierung als distinkte Bereiche im Interphasekern nachgewiesen werden. Der Begriff „Chromosomenterritorium“ wurde hierfür bereits 1909 von Boveri geprägt (Übersicht bei Cremer et al. 1982; Marshall et al. 1997; Bridger u. Bickmore 1998; Belmont et al. 1999). Die Chromosomen können ihre Position im Interphasekern verändern; wenn die Zelle jedoch ausdifferenziert ist, scheint ihre Anordnung stabil zu sein (Übersicht bei Zink u. Cremer 1998). . Abb. 1.3.3. Schematische Darstellung der Chromosomenorganisation, ausgehend von der DNA bis hin zum lichtmikroskopisch sichtbaren Chromosom. Nähere Einzelheiten 7 Text (nach Hart u. Laemmli 1998)

47 1.3 · Die zytogenetischen Grundlagen der Molekularen Medizin

In Zellen mit stark reduzierter genetischer Aktivität liegt auch das Chromatin in kompakter Form vor, wie z. B. in den Spermien oder in den Zellkernen der Lymphozyten des peripheren Bluts. Die Regel aber ist, dass das Chromatin der Zellkerne aus stärker und schwächer anfärbbaren Anteilen, d. h. unterschiedlich kondensierten Bereichen, besteht. Hierfür hat Gutherz (1907) den Begriff Heteropyknosis vorgeschlagen. Durchgesetzt hat sich hingegen die von Heitz (1928, 1929) eingeführte Bezeichnung Heterochromatin für die gegenüber dem Euchromatin stärker angefärbten Bereiche.

1.3.3.2 Funktionelle Gliederung der Chromosomen und Genkartierung Weitere Einsichten in die funktionelle Gliederung des Genoms haben verschiedene Verfahren der differenziellen Anfärbung der Chromosomen in Verbindung mit der Genkartierung erbracht. Das verbreiteteste Verfahren hierfür ist die sog. G-Bandentechnik, die auf einer speziellen Vorbehandlung der Chromosomen und anschließender Giemsa-Färbung beruht. An Chromosomen der Prophase können so mehr als 850 dunkle und helle Banden unterschieden werden (> Abb. 1.3.4). Die hellen G-Banden werden auch als R-Banden („reverse bands“) bezeichnet. Eine Untergruppe davon bilden die T-Banden, die sich bevorzugt an den Chromosomenenden finden. Mittels der C-Bandentechnik werden die zentromernahen Bereiche spezifisch angefärbt, wobei die besonders großen C-Banden der Chromosomen 1, 9, 16

a

b

. Abb. 1.3.4a–d. Darstellung des Bandenmusters des Chromosoms 11 mit unterschiedlicher Auflösung. a Ca. 200 Banden pro haploidem Genom. Im mittleren Abschnitt des langen Armes von Chromosom 11 ist eine dunkle Bande erkennbar. Diese ist auf dem 400-Bandenstadium b eindeutig in zwei Banden aufgeteilt. Eine gute

1.3

und Y auffallen. Diese können zwischen verschiedenen Individuen erheblich variieren (chromosomale Heteromorphismen). Mittels In-situ-Hybridisierung kann heute sogar das Bandenmuster der Chromosomen im Interphasekern nachgewiesen und gezeigt werden, dass deren Größe etwa einem 600 Bandenstadium entspricht. Das heißt, die Gesamtlänge von Interphase- und Mitosechromosomen ist kaum verschieden, die Unterschiede betreffen die Ausbildung und Anordnung der Chromatinfibrille (Lemke et al. 2002). Nach Zugabe des Basenanalogons Bromdesoxyuridin (BrdU) während der DNA-Replikation können die neu synthetisierten Bereiche aufgrund ihrer geringen Anfärbung nachgewiesen werden. Hierbei zeigt sich, dass die R-Banden in der ersten Hälfte der S-Phase repliziert werden, die G-Banden in der zweiten Hälfte und ganz zum Schluss die C-Banden sowie das genetisch inaktive X-Chromosom im weiblichen Geschlecht. Bemerkenswert ist, dass die Zahl der Replikationsbanden praktisch der maximalen Anzahl von Banden entspricht, die nach differenzieller Färbung darstellbar sind. Geht man von 1.000 Banden pro haploidem Genom, d. h. pro 3u109 Bp, aus, entspricht eine Bande bzw. eine Replikationseinheit im Durchschnitt etwa 3u106 Bp oder 3 Mbp. Da die Initiationsstellen für die Replikation („replication origins“) ca. 50 bis mehr als 100 Kbp auseinanderliegen, sollten in einer Replikationseinheit etwa 10 bis 50 derartiger Replikons zusammengefasst sein (Übersicht bei Holmquist 1992; Craig u. Bickmore 1993; Machida et al. 2005). Direkte Hinweise auf die genetische Ausstattung der einzelnen chromosomalen Banden lieferte die Kartie-

c

d

Bänderungsqualität mit ca. 550 Banden ist in c gezeigt, wobei der kurze Arm drei distinkte dunkle Banden aufweist. Auf dem 850-Bandenstadium d kann die Bande 11p14.1 deutlich von 11p14.3 unterschieden werden. Die Schemazeichnungen b–d stammen aus ISCN, 1995 (Sperling et al. 1997)

48

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

rung von Genen und repetitiven DNAs mittels In situHybridisierung. Die Befunde werden ausführlich im Kapitel „Chromosomopathien“ im Band „Monogen bedingte Erbkranheiten 2“ (Ganten u. Ruckpaul 2000) abgehandelt und lassen sich folgendermaßen zusammenfassen: 1. Die Chromosomen 13, 18 und 21 sind die Autosomen mit der niedrigsten Anzahl von Genen. Es sind auch die einzigen Autosomen, für die eine Trisomie mit dem Leben vereinbar ist, alle anderen Trisomien enden als Spontanaborte bzw. bereits vor der Implantation. 2. Die T-Banden sind die genreichsten Regionen, gefolgt von den R-Banden. Speziell finden sich hier die sog. „house-keeping genes“, die für den Grundmetabolismus der Zellen verantwortlich und in nahezu sämtlichen Zellen aktiv sind. Die G-Banden sind hingegen wesentlich genärmer und enthalten vor allem die entwicklungs- und gewebsspezifisch exprimierten Gene. Die C-Banden sind praktisch genleer (Übersicht bei Holmquist 1992; Craig u. Bickmore 1993). 3. Die chromosomalen Banden unterscheiden sich auch hinsichtlich der vorherrschenden repetitiven Elemente. So weisen die T- und R-Banden überwiegend kurze repetitive Elemente von etwa 300 Bp Länge auf („short interspersed nucleotide elements“, SINES), deren wichtigste Vertreter die Alu-Elemente sind (genannt nach einer charakteristischen Schnittstelle für das Restriktionsenzym AluI). In den G-Banden finden sich überwiegend längere repetitive Elemente („long interspersed nucleotide elements“, LINES), die weit über 1.000 Bp lang sein können (Übersicht bei Smit 1996; Kazazian 2005). 4. Das C-Banden-Material im Bereich der Zentromere besteht überwiegend aus sehr kurzen, millionenfach vorhandenen repetitiven Elementen (sog. SatellitenDNAs). Die großen C-Banden der Chromosomen 1, 9, 16 und Y sind jedoch deutlich komplexer aufgebaut. In Analogie zu Befunden an Drosophila und Erdmaus dürften sie dem β-Heterochromatin entsprechen, das C-Banden-positive Material in den Zentromerregionen der übrigen Chromosomen dem α-Heterochromatin (Neitzel et al. 1998). Werden diese Befunde zur genetischen Zusammensetzung der verschiedenen chromosomalen Strukturen in Bezug gesetzt zu den Vorstellungen ihrer molekularen Organisation, so ergibt sich folgendes Chromosomenmodell: Die Schleifen des Interphasechromatins, die durch SARs voneinander getrennt werden, stimmen hinsichtlich ihrer Länge gut mit einzelnen Replikons überein. Vermutlich handelt es sich dabei um die

gleichen funktionellen Grundeinheiten (funktionelle Domänen). Ein Cluster aus 10 bis 50 dieser Elemente dürfte einer chromosomalen Bande von 3 Mbp entsprechen. Diese Bereiche weisen zudem eine gut übereinstimmende Basenzusammensetzung auf. Es handelt sich um sog. Isochore, die sich im Dichtegradienten abtrennen lassen. Das Isochor mit dem höchsten GC-Gehalt ist bevorzugt in den T-Banden anzutreffen. Bei diesen Isochoren handelt es sich um ein Kennzeichen der Warmblüter und vermutlich eine evolutionäre Anpassung an die hohe Körpertemperatur, die eine entsprechende Stabilität der DNA erfordert (Bernardi 1989). Die R- und T-Banden sind besonders genreich, sie replizieren in der frühen S-Phase und haben eine offene Konformation und dürften größere Schleifen ausbilden als die G-Banden. Diese weisen deutlich weniger Gene auf, die in der Regel gewebsspezifisch exprimiert sind. Ihre Schleifen sind kleiner, der Kondensationsgrad in der Mitose größer. Aus klinischer Sicht ist bedeutsam, dass sich Veränderungen von R-Banden-Material gravierender auf die Entwicklung auswirken als von G-Banden [7 Kap. „Chromosomopathien“ im Band „Monogen bedingte Erbkrankheiten 2“ (Ganten u. Ruckpaul 2000)]. Die C-Banden bestehen nahezu ausschließlich aus repetitiven DNAs. Dies erklärt, weshalb Unterschiede in ihrer Menge ohne offenkundige klinische Auswirkungen sind. Neben diesen globalen Vergleichen erlaubt die vergleichende Genkartierung aber auch Einsichten, die die Regulation der Genaktivität betreffen. Aus der menschlichen Genkarte wird ersichtlich, dass Gene, die aufeinanderfolgende Schritte bestimmter Stoffwechselprozesse steuern, generell auf unterschiedlichen Chromosomen bzw. chromosomalen Abschnitten gelegen sind, anders als bei Bakterien, bei denen sie in ein Operon eingeschlossen sind. Dies trifft auch für solche Gene zu, die verschiedene Untereinheiten eines Proteins kodieren und daher in stöchiometrischen Verhältnissen vorliegen müssen. Ihre Regulation muss daher individuell erfolgen (Sperling 1999). Die Genkarte stellt das entscheidende Ordnungsprinzip in der Genetik dar. Die Angabe, wo welche Gene, klonierte DNA-Fragmente oder bereits sequenzierte Abschnitte gelegen sind, war die Voraussetzung für die Erstellung der vollständigen Basensequenz des menschlichen Genoms. Der Genkartierung kommt daher im Rahmen des Humangenomprojekts eine zentrale Rolle zu. Ebenso wichtig ist der rasche Zugriff auf diese Daten. Hier soll nur auf die Datenbank des NCBI (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/) hingewiesen werden, die viele Banken zusammenfasst und Verbindungen von der Chromosomenkarte bis hinunter zu der Sequenz des Gens und seiner Beschreibung herstellt.

49 1.3 · Die zytogenetischen Grundlagen der Molekularen Medizin

1.3.4 Zellzyklus und CheckpointKontrolle Charakteristische Kennzeichen proliferierender Zellen sind das Zellwachstum und die Zellteilung. Der gesamte Zellzyklus setzt sich danach aus der Interphase sowie der Kern- und der Zellteilung (Zytokinese) zusammen, bei der die Chromosomen sichtbar werden. Der gesamte Ablauf der Mitose dauert etwa eine Stunde. Die Interphase hingegen ist sehr viel länger und variiert in dieser Hinsicht auch erheblich zwischen verschiedenen Geweben. Sie wird in drei Phasen unterteilt: die S-Phase (Synthese), in der die Verdoppelung des genetischen Materials stattfindet, die G1-Phase (engl. „gap“, Lücke), dem Zeitabschnitt vom Ende der Mitose bis zu Beginn der S-Phase, sowie der G2-Phase, dem Abschnitt zwischen Ende der S-Phase und Beginn der Mitose. Zur Kennzeichnung solcher Zellen, die sich nicht mehr teilen (z. B. die Muskelzellen des Erwachsenen) oder nur nach einem bestimmten Stimulus (z. B. die Lymphozyten des peripheren Blutes) wurde der Begriff G0-Phase eingeführt (> Abb. 1.3.5). Fusioniert man Mitosezellen mit solchen der G1-, Soder G2-Phase, kommt es in letzteren sofort zum Eintritt eines mitoseähnlichen Prozesses unter Ausbildung vorzeitig kondensierter Chromosomen („premature chro-

1.3

mosome condensation“, PCC). Erwartungsgemäß bestehen die Chromosomen der G1-Phase nur aus einer Chromatide, die der G2-Phase aus zwei noch eng gepaarten Chromatiden. Die Chromosomen der S-Phase hingegen zeigen ein „pulverisiertes“ Aussehen. Hierbei ist die Chromosomenkontinuität jedoch nicht aufgehoben, die ungefärbten Bereiche zwischen den einzelnen Fragmenten stellen vielmehr die Orte der DNA-Verdoppelung dar. So findet man in der frühen S-Phase nur einzelsträngige, in der späten S-Phase hingegen doppelsträngige Fragmente. Dies zeigt, dass bestimmte Bereiche der Chromosomen zu diskreten Zeiten der S-Phase repliziert werden. Diese Versuche zeigen, dass sich im Zytoplasma der Mitosezellen ein Faktor befindet, MPF (maturation promoting factor), dessen Vorhandensein bestimmt, wann eine Zelle in die Mitose eintritt und durch den alle nachfolgenden Prozesse wie die Chromosomenkondensation, die Auflösung der Kernmembran und die Ausbildung des Spindelapparats gesteuert werden (Übersicht bei Sperling u. Rao 1974; Sperling 1982; Lewin 1990). In vergleichbarer Weise wird die Chromosomenkondensation auch in der Meiose reguliert. So kommt es bei der In-vitro-Fertilisation nicht selten zur Ausbildung vorzeitig kondensierter Spermienchromosomen, wenn die Oozyten nach dem Eindringen des Spermiums . Abb. 1.3.5. Schematische Darstellung von Zellzyklus und Chromosomenzylus. Der Ablauf des Zellzyklus wird entscheidend durch spezifische zyklinabhängige Proteinkinasen (innerer Bildteil, nach Shackelford et al. 1999), die hier als S-CDK und M-CDK zusammengefasst wurden, und den APC („anaphase promoting complex“) gesteuert. Zugleich erfahren die Chromosomen charakteristische Veränderungen. In der G1-Phase bestehen sie aus einer Chromatide, an die sich der Prä-RC („pre replication complex“) anlagert. Die R-Banden replizieren in der frühen S-Phase, was sich an vorzeitig kondensierten S-Phase-Chromosomen (S-PCC) als Färbelücke darstellt, in der späten S-Phase sind diese Bereiche doppelsträngig und die replizierenden G-Banden ungefärbt. Beim Übergang in die Mitose kommt es durch helikale Faltung zu einer weiteren Verkürzung der Chromosomen. Weitere Einzelheiten 7 Text. (1): Checkpoints nach Schädigung der DNA; (2): Topoisomerase-IIabhängiger Checkpoint; (3): Spindel- (Kinetochor-)Checkpoint; (R): Restriktionspunkt

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

in der Metaphase II arretiert bleiben (Schmiady et al. 1986). Heute sind die Faktoren identifiziert, die den Eintritt in die Mitose und S-Phase steuern. Es handelt sich um spezifische zyklinabhängige Proteinkinasen, CDKs („cyclin-dependent protein kinase“). Die katalytischen Untereinheiten dieser Kinasen sind nur dann aktiv, wenn sie mit einer regulatorischen Untereinheit, bestimmten Zyklinen, zusammentreten. Die Mitose wird durch die M-CDK (syn. MPF) gesteuert, die sich aus der Proteinkinase CDC2 („cell division control“, cdc, CDK1) und Zyklin A oder B zusammensetzt, die S-Phase durch die S-CDKs (> Abb. 1.3.5). Die Aktivität der Proteinkinasen variiert mit dem Zellzyklus, was entscheidend von der Verfügbarkeit der jeweiligen Zykline abhängt, die, wie der Name bereits verrät, zyklisch synthetisiert und nach Ubiquitinilierung durch das Proteasom abgebaut werden (Übersicht bei Solomon et al. 1990; Ohi u. Gould 1999; Tyers u. Jorgensen 2000; Pines u. Rieder 2001). In der frühen Prophase beginnt der Prozess der Chromosomenkondensation, in den zwei SMC-Komplexe („structural maintenance of chromosomes“, SMC) einbezogen sind, Condensin I und Condensin II (Übersicht bei Hirano 2005). Inzwischen wurde erstmalig eine autosomal-rezessive Erkrankung beim Menschen beschrieben, bei der es in den Zellen der Patienten zu einem vorzeitigen Eintritt in die Chromosomenkondensation kommt und zwar unmittelbar nach Beendigung der S-Phase (Neitzel et al. 2002). Ursächlich sind Mutationen im MCPH1-Gen, das offenbar ein Regulator des sogenannten Condensin-II-Komplexes ist (Trimborn et al. 2004; Trimborn et al. 2006). Nach Eintritt in die Mitose ordnen sich die Chromosomen in der Äquatorialplatte der Metaphase an. Erst nachdem alle Chromosomen so ausgerichtet sind, setzt die Trennung der Zentromerregion ein. Hierfür ist der Anaphase-Promoting-Complex (APC oder Cyclosom) verantwortlich, der zum einen diejenigen Proteine abbaut, die die Schwesterzentromere verbinden, und so den Eintritt in die Anaphase ermöglicht (> Abb. 1.3.5). Zum anderen trägt der APC-Komplex zum Abbau von Zyklin B und Komponenten des Spindelapparats bei. Zugleich wird dadurch der Block beseitigt, der die Anlagerung des Präreplikationskomplexes an die Chromatiden als Voraussetzung für die nachfolgende DNA-Synthese verhindert (Übersicht bei Peters 2002; Castro et al. 2005). Für den geregelten Ablauf des Zellzyklus ist entscheidend, dass die Mitose nicht beginnt, bevor die DNA vollständig repliziert ist und dass die Anaphase nicht eintritt, bevor sämtliche Chromosomen korrekt in der Äquatorialplatte angeordnet sind. Hierfür sind Kontrollmechanismen verantwortlich, die eng mit den Regulatoren des

Zellzyklus kooperieren. Von besonderer Bedeutung ist das „DNA damage response network“ (> Abb. 1.3.5), da die DNA das einzige Molekül der Zelle ist, das im Falle einer Schädigung nicht ersetzt, sondern repariert wird. Nach einer Schädigung der DNA kommt es zu einer Verlangsamung oder Arretierung des Zellzyklus in der G1-, S- oder G2-Phase, bis der Schaden behoben ist. Allerdings gibt es in der späten G2-Phase einen bestimmten Zeitpunkt („point of no return“), von dem an auch hohe Strahlendosen oder andere exogene Noxen den Eintritt in die Mitose nicht mehr aufhalten können. Bei einer Reihe höherer Tiere liegt dieser Punkt erst in der mittleren Prophase (Pines u. Rider 2001). Es ist eine Vielzahl von Genen an dem „DNA damage response network“ beteiligt. Solche, die der Schadenserkennung (Sensoren) dienen, und jene, die die Weiterleitung des jeweiligen Signals („signal transducer“) bis hin zu den Strukturen („target“) veranlassen, die die Arretierung des Zellzyklus bewirken (Übersicht bei Weinert 1998a, 1998b; Lisby u. Rothstein 2004). Hierbei besteht eine enge Kopplung mit den Prozessen, die für die Regulation des Zellzyklus und die DNA-Reparatur verantwortlich sind. Im Falle von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) zählen dazu das ATM- und das NBS-Gen (Übersicht bei O’Driscoll u. Jeggo 2006). Eine Mutation in diesen Genen führt zu den autosomal-rezessiven Krankheiten Ataxia teleangiectatica bzw. dem Nijmegen-breakageSyndrom. Ihre Zellen weisen eine erhöhte Chromosomeninstabilität auf und eine extreme Empfindlichkeit gegenüber ionisierenden Strahlen, durch die bevorzugt DSBs ausgelöst werden. Auch diese Erkrankungen sind ein Beispiel dafür, wie eine zytogenetische Auffälligkeit, die erhöhte spontane und strahleninduzierte Chromosomenbrüchigkeit, den Weg zur Identifikation des zugrunde liegenden Gens eröffnet hat (Sperling et al. 1998; Digweed et al. 1999; Digweed u. Sperling 2004). Klinisch weisen diese Patienten ein hohes Tumorrisiko auf. Die Checkpoint-Kontrolle betrifft aber nicht nur DNA-Veränderungen, sondern auch die vollständige Anordnung der Chromosomen in der Äquatorialplatte der Metaphase als Voraussetzung für ihre korrekte Aufteilung. Ein einzelnes, fehlorientiertes Chromosom führt zur Blockierung in der Metaphase (Übersicht bei Rieder u. Salmon 1998; Dobie et al. 1999; Zachariae 1999). Für den Zusammenhalt der Schwesterchromatiden bis in die Prophase ist primär der Proteinkomplex Cohesin verantwortlich (Übersicht bei Losada u. Hirano 2005). Beim Roberts-Syndrom (Übersicht bei Van Den Berg u. Francke 1993) liegt eine Störung in der Kohäsion vor, zytogenetisch ist eine vorzeitige Trennung der Zentromere zu beobachten, die auf einem fehlenden Zusam-

51 1.3 · Die zytogenetischen Grundlagen der Molekularen Medizin

menhalt des zentromerischen Heterochromatins beruht. Die Kinder weisen u. a. schwere Skelettfehlbildungen auf. Als ursächlich wurden Mutationen im ESCO2-Gen identifiziert, einem hoch konservierten Protein, das für die Ausbildung der Schwesterchromatidkohäsion in der S-Phase verantwortlich ist. Auch bei der autosomal-rezessiven „Mosaic Variegated Aneuploidy“ liegt ein Gendefekt vor, der das BUB1B-Gen betrifft, das eine wichtige Rolle bei der Schwesterchromatidkohäsion und beim Spindelcheckpoint spielt (Kitajima et al. 2005). Die Betroffenen weisen in somatischen Zellen eine hohe Aneuploidierate und ein hohes Krebsrisiko auf. 1999 gelang es, das Gen zu identifizieren, das dem autosomal-rezessiven ICF-Syndrom („immunodeficiency“, „centromeric instability“, „facial anomalies“) zugrunde liegt (Okano et al. 1999; Xu et al. 1999). Zytogenetisch sind die Patienten durch eine „Instabilität“ des Heterochromatins der Chromosomen 1, 9 und 16 gekennzeichnet. Diese beruht auf einer Hypomethylierung dieser Chromatinfraktion infolge eines Defekts der DNA-Methyltransferase, DNMT3B. Damit geht auch eine Hypomethylierung des inaktiven X-Chromosoms im weiblichen Geschlecht einher, das zugleich früher repliziert und vermutlich nicht mehr der vollständigen Inaktivierung unterliegt (Hansen et al. 2000). Auch hier hat der zytogenetische Befund entscheidend zur Aufklärung dieses komplexen Krankheitsbildes beigetragen.

1.3.5 Chromosomopathien Die Chromosomopathien werden in einem eigenen Kapitel im Band „Monogen bedingte Erbkranheiten 2“ (Ganten u. Ruckpaul 2000) abgehandelt. Hier werden nur die Ergebnisse kurz zusammengefasst, die unmittelbar die molekulare Medizin berühren. Bei den verschiedenen Chromosomopathien können strukturelle von numerischen Mutationen unterschieden werden. Hinzu kommen Mosaike und Chimären, worunter das Vorliegen mehrerer chromosomal unterschiedlicher Zellinien in einem Individuum verstanden wird. Der unterschiedlichen Klassifikation liegt auch ein verschiedener Entstehungsmechanismus zugrunde (Sperling u. Neitzel 2000). Hinsichtlich der Häufigkeit von Chromosomenanomalien zum Zeitpunkt der Befruchtung nimmt der Mensch eine Sonderstellung ein, da vermutlich mehr als 30% aller Zygoten einen aberranten Chromosomensatz aufweisen, insbesondere eine Aneuploidie. Als eine Erklärung hierfür wird der fehlende Checkpoint gegenüber Chromosomenfehlverteilungen in der Oogenese angenommen. Die Zellteilungen nach der Befruchtung laufen rasch nacheinander ab und scheinen ebenfalls besonders feh-

1.3

leranfällig zu sein, da ein Großteil von 6–10 Zell-Embryonen nach FISH-Analyse eine Mosaikkonstitution aufweisen und etwa 10% vollkommen aberrante („chaotic“) Karyotypen (Delhanty et al. 1997). Diese Befunde sprechen dafür, dass die Checkpoint-Kontrolle bei den ersten Zellteilungen noch nicht wirkungsvoll funktioniert (Übersicht bei Handyside u. Delhanty 1997). Sie erklären zugleich, dass diskrepante chromosomale Befunde zwischen dem extraembryonalen Gewebe und dem eigentlichen Fetus nicht selten sind (Sperling et al. 1997). Ein erheblicher Anteil chromosomal aberranter Embryonen geht bereits vor der Implantation zugrunde, darunter praktisch sämtliche autosomale Monosomien, ein weiterer Teil führt zu einem Spontanabort. Der Anteil Neugeborener mit einem auffälligen Karyotyp liegt bei 0,6%.

1.3.5.1 Aneuploidien Die ungleiche Überlebensrate der verschiedenen Chromosomenanomalien ist Ausdruck der jeweiligen genetischen Imbalanc. Beispielhaft hat Gropp (1982) dies für die Maus gezeigt, da hier Spezialstämme zur Verfügung stehen, mit denen für jedes Autosom gezielt trisome bzw. monosome Feten erzeugt werden können. Entsprechend wie beim Menschen sind bald nach der Implantation nur noch trisome Feten zu finden, deren charakteristische Überlebensrate von dem jeweils betroffenen Chromosom abhängt. Dabei können – ebenso wie beim Menschen – verschiedene Trisomien gleiche Fehlbildungen aufweisen, während andere Fehlbildungsmuster charakteristisch für bestimmte Trisomien sind. Diese Semispezifität kann damit erklärt werden, dass komplexe morphogenetische Prozesse durch zahlreiche Gene gesteuert werden, die auf unterschiedlichen Chromosomen gelegen sind. Die Veränderungen in der Dosis jedes einzelnen Gens münden dabei in einen recht übereinstimmenden pathogenetischen Prozess ein. Wird hierdurch z. B. die Proliferation bestimmter Zellen während der Embryogenese verlangsamt, führt dies zu einer Hypoplasie. Wenn dadurch in einer kritischen Phase der Differenzierung eines Blastems weniger Zellen als normal zur Verfügung stehen, kann nach dem Alles-oder-nichts-Gesetz die Morphogenese gerade noch normal ablaufen oder so gestört sein, dass es zu einer Fehlbildung kommt. Dabei dürften auch stochastische Effekte eine Rolle spielen, ob ein kritischer Schwellenwert über- oder unterschritten wird. Zum Verständnis der Ätiologie derartiger Chromosomopathien spielt also nicht nur die genetische Ausstattung des jeweiligen Chromosoms eine Rolle, sondern auch der Zufall.

52

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

1.3.5.2 Imprinting Der hohe Prozentsatz trisomer Zygoten und die Fehlerrate der ersten Zellteilungen kann auch dazu führen, dass es durch Anaphaseverlust oder Non-Disjunction des überzähligen Chromosoms zur Entstehung einer diploiden Zelllinie kommt. In einem Drittel der Fälle stammen dann beide Chromosomen nur von einem Elternteil, es liegt eine uniparentale Disomie (UPD) vor. Als Folge davon können Chromosomenabschnitte auftreten, die vollkommen identisch sind, d. h. die gleichen Allele aufweisen (uniparentale Isodisomie). Dies kann zu Homozygotie für seltene rezessive Erkrankungen führen, obwohl nur ein Elternteil heterozygoter Genträger ist (Engel 1998). Darüber hinaus kann es als Folge einer UPD zu Entwicklungsstörungen kommen, die auf einen Imprintingeffekt zurückgehen. Gemeint ist damit, dass die Expression bestimmter Gene von der elterlichen Herkunft abhängig ist. So ist in bestimmten Arealen des Gehirns (Hippocampus, Zerebellum) nur das mütterliche UBE3A-Gen auf dem Chromosom 15 aktiv. Im Falle einer paternalen UPD 15 wird daher das betreffende Protein dort nicht gebildet, und es kommt zum Angelman-Syndrom (AS). Der gleiche Effekt stellt sich ein, wenn das mütterliche Gen infolge einer Deletion verloren ging. Betrifft die Deletion das väterliche bzw. die UPD das mütterliche Chromosom 15, führt dies zum Prader-Willi-Syndrom. Hier ist das klinische Bild durch den Ausfall bestimmter väterlicher Gene bestimmt. Die Aktivität dieser Gene wird durch ein „Imprinting Center“ über eine größere Entfernung hinweg gesteuert und führt zu charakteristischen gametenspezifischen Methylierungsmustern. Es handelt sich hierbei also auch um ein chromosomales Phänomen (Brannan u. Bartolomei 1999; Ben-Porath u. Cedar 2000; Sleutels et al. 2000). Ein gesicherter Imprintingeffekt fand sich neben dem Chromosom 15 für paternale UPD 6 (transienter neonataler Diabetes mellitus), maternale UPD 7 (SilverRussell-Syndrome), paternale UPD 11 (Beckwith-Wiedemann-Syndrom), maternale UPD 14 (Minderwuchs und vorzeitige Pubertät) und paternale UPD 14 (starker Minderwuchs mit Skelettdysplasie). Derartige epigenetische Prozesse, bei denen die elterlichen Erbanlagen unterschiedlich programmiert sind, spielen in der frühen Entwicklung eine wesentliche Rolle. Erste Belege hierfür lieferte der zytogenetische Hinweis auf parthenogenetische Entwicklung beim Menschen (Surani 1995). Zum einen betrifft es gutartige Geschwülste, die sog. ovariellen Teratome. Diese können differenzierte Strukturen aller drei Keimblätter ausbilden und weisen stets einen weiblichen Chromosomensatz auf. Sie gehen auf eine unbefruchtete Eizelle zurück,

die die 1. Reifeteilung durchlaufen hat und infolge Verdopplung des haploiden Satzes wieder diploid wurde. Im anderen Fall handelt es sich um eine – abortive – Entwicklung mit ausschließlich väterlichem Erbgut. Durch Befruchtung einer kernlosen Eizelle mit einem X-haltigen Spermium und anschließender Verdopplung des haploiden Satzes kommt es zu vollständigen Blasenmolen, die keinen Embryo, sondern ausschließlich extraembryonales Gewebe aufweisen. Das heißt, die väterlichen Gene steuern bevorzugt die Entwicklung des extraembryonalen Gewebes, die mütterlichen die des eigentlichen Embryos. Ein weiteres epigenetisches Phänomen betrifft die X-Inaktivierung im weiblichen Geschlecht. Der sog. Dosiskompensationsmechanismus führt dazu, dass im weiblichen Geschlecht eines der beiden X-Chromosomen inaktiviert wird und dadurch die Zahl aktiver Xchromosomaler Gene in beiden Geschlechtern annähernd gleich ist. Die X-Inaktivierung findet in der frühen Embryogenese zufällig zwischen dem väterlichen und mütterlichen X statt, bleibt dann aber über die Zellteilungen hinweg erhalten. Das heißt, dass jede Zelle monosom für die X-gebundenen Gene ist und weibliche Individuen Mosaike aus Zellen darstellen, in denen entweder das väterliche oder das mütterliche X aktiv ist (Übersicht bei Migeon 1994). Dieser Mosaikstatus manifestiert sich besonders eindrucksvoll im Falle X-chromosomaler Hautkrankheiten (Übersicht bei Happle 1998). Die Inaktivierung des X-Chromosoms ist ein reversibler Prozess, da in den Oozyten beide X aktiv sind, in der Spermatogenese hingegen X-und Y-Chromosom inaktiviert werden. Sichtbarer Ausdruck davon ist das kompakte „Sexvesikel“ im Pachytän. Auch in weiblichen somatischen Zellen hat der inaktive Zustand des einen X sein morphologisches Korrelat in Form des Geschlechtschromatins (syn. Barr-Körperchen). Damit lassen sich weibliche von männlichen Zellen einfach unterscheiden. Ganz entsprechend sind 47,XXY-Individuen Geschlechtschromatinpositiv, 45,X-Individuen Geschlechtschromatin-negativ. 47,XXX-Individuen weisen in einem hohen Prozentsatz ihrer Zellen zwei Geschlechtschromatinkörperchen auf. Im Prinzip erklärt die Inaktivierung überzähliger X-Chromosomen bzw. die fehlende Inaktivierung im Falle der 45,X-Konstitution die geringen klinischen Auswirkungen gonosomaler gegenüber autosomalen Aneuploidien. Ein weiteres Kennzeichen der X-Inaktivierung ist die DNA-Replikation in der späten S-Phase und der hohe Grad an Methylierung der DNA sowie die Acetylierung der Histone (Übersicht bei Migeon 1994).

53 1.3 · Die zytogenetischen Grundlagen der Molekularen Medizin

1.3.5.3 Strukturelle Chromosomenmutationen Es waren strukturelle Mutationen des X-Chromosoms, die die Voraussetzung zur Aufklärung des Mechanismus der Inaktivierung legten. Generell gilt hierbei, dass beim Vorhandensein eines normalen und eines aberranten XChromosoms letzteres praktisch stets inaktiv ist, was die geringen klinischen Auswirkungen vom Grundsatz her verständlich macht. Überraschend war jedoch, dass Isochromosomen für den langen Arm nicht selten sind, solche für den kurzen Arm aber unter Neugeborenen bislang nicht gefunden wurden. Diese Isochromosomen sind genetisch aktiv, die genetische Imbalance ist daher so groß, dass die Embryonen frühzeitig zugrunde gehen. Das heißt aber auch, dass das für die Inaktivierung verantwortliche Segment auf dem langen Arm gelegen sein muss. Durch weitere strukturelle Chromosomenmutationen konnte das Inaktivierungszentrums auf Xq13.2 lokalisiert und das entscheidende Gen Xist (X inactive specific transcript) identifiziert werden (Übersicht bei Lee u. Jaenisch 1997; Brockdorff 1998; Kelley u. Kuroda 2000). Diese Inaktivierung kann im Falle von X-Autosomentranslokationen auch auf das angrenzende autosomale Material übergreifen und die betreffenden Gene – teilweise – inaktivieren (Übersicht bei Lyon 1998). Im Falle balancierter X-Autosomen-Translokationen ist das Translokationschromosom bei den Trägerinnen regelmäßig aktiv und das normale X inaktiv. Es kommt daher zu keiner genetischen Imbalance, sodass in der Regel damit keine klinischen Konsequenzen verbunden sind. Betrifft die Bruchstelle jedoch ein Gen, z. B. das für die Muskeldystrophie vom Typ Duchenne, sind die heterozygoten Genträgerinnen erkrankt, da das normale Gen ja auf dem inaktiven X-Chromosom gelegen ist, nicht exprimiert wird und das andere Allel infolge der Chromosomenmutation defekt ist. Strukturelle Chromosomenanomalien der Autosomen können direkt den Weg zu Genen mit Krankheitswert weisen. Offensichtlich ist dies im Falle „balancierter“ Translokationen, bei denen eine Bruchstelle innerhalb des Gens gelegen ist und dabei eine dominante Mutation bedingt. Etwa 6% derartiger Träger sind klinisch auffällig. Nicht immer ist der Karyotyp-PhänotypBezug jedoch so einfach. Die Bruchstellen können auch mehrere Hundert Kb vom eigentlichen Gen entfernt sein und dessen Expression beeinflussen. Es handelt sich dabei um einen „Positionseffekt“, der nicht auf DNA, sondern auf Chromosomen- (Chromatin-)Ebene erklärt werden muss. Im Gegensatz zum Menschen ist dieses Phänomen bei Hefe, Drosophila und mit Einschränkungen auch bei der Maus bereits gut analysiert (Übersicht bei Wallrath 1998; Cockell u. Gasser 1999; Dobie et al. 1997).

1.3

Ebenso wie Translokationen können auch Mikrodeletionen wegweisend für die Identifizierung betroffener Einzelgene oder ganzer Genkomplexe sein. Größere Deletionen und/oder Duplikationen bestimmter Chromosomenabschnitte, wie sie insbesondere unter den Nachkommen von Personen mit balancierten Translokationen gefunden werden, stellen die Zwischenglieder zu kompletten Trisomien oder Monosomien dar. Dennoch ist es angesichts der großen klinischen Variabilität nur sehr eingeschränkt möglich, einzelne Komponenten des klinischen Bildes der reinen Trisomien bestimmten Chromosomenabschnitten zuzuordnen. Allgemein zeigte sich jedoch, dass Veränderungen von T- und RBanden größere klinische Auswirkungen zeigen als die von G-Banden. Dies entspricht ihrem Gehalt von Genen und ist von praktischer Bedeutung für die Beurteilung des genetischen Risikos der Nachkommen von Trägern balancierter Chromosomentranslokationen. Exakte Vorhersagen sind jedoch nicht möglich, sodass man in der genetischen Beratung auf empirische Daten angewiesen ist (Stengel-Rutkowski et al. 1988). Ein besonderer Aspekt aus molekularer Sicht betrifft die Entstehung struktureller Chromosomenmutationen. So ist die Mutationsrate für Robertson-Translokationen, bei denen es zur „Fusion“ zweier akrozentrischer Chromosomen kommt, mit 4 u10-4 höher als für jede Genmutation, betrifft aber ganz bevorzugt die Fusion zwischen den Chromosomen 13 und 14 sowie 14 und 21. Ebenso ist die Mutationsrate für Mikrodeletionen bzw. -duplikationen auf Chromosom 17p12, die das Myelin-Gen, PMP22, betreffen und mit zwei neurologischen Erkrankungen einhergeht („hereditary neuropathy with liability to pressure palsies“, HNPP, und „Charot-Marie-Tooth Disease type 1B“, CMT1) mit 1 u10-4 ungewöhnlich hoch. In beiden Fällen ergab die Analyse, dass an der Entstehung der Umbauten bestimmte repetitive Elemente beteiligt sind. So weisen die Chromosomen 13, 14 und 21 Repeats auf, die eine starke Homologie miteinander haben. Nimmt man zusätzlich an, dass diese Sequenzen auf Chromosom 14 invertiert sind, würde ein Crossingover in diesem Bereich während der Oogenese die bevorzugte Entstehung derartiger Translokationschromosomen erklären (Sullivan et al. 1996). Im Falle des Chromosoms 17 geht die hohe Mutationsrate auf ungleiches Crossing-over zwischen zwei Repeats von 24 Kb zurück, die das PMP22-Gen flankieren. Diese Repeats enthalten zudem Signalstrukturen, die bei der Rekombination eine wichtige Rolle spielen („meiosis processing sequences“, MEPS), was eine Erklärung für die besonders hohe Crossing-over-Rate in diesem Bereich sein dürfte. Vermutlich wird dieser Entstehungsmechanismus noch bei einer Reihe weiterer Mikrodeletions-Syndrome vorliegen, da Repeats der erforderlichen Länge und Se-

54

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

quenzübereinstimmung für ein (ungleiches ) Crossingover auch am Genlokus für das Williams-Beuren-, das Angelman- und Prader-Willi-, aber auch das DiGeorgeSyndrom gefunden wurden (Übersicht bei Lupski 1998). Einen Spezialfall stellen Repeats mit gegenläufiger Orientierung auf dem gleichen Chromosom dar („inverted repeats“). Im Falle des Gens für den Blutgerinnungsfaktor VIII, das auf Xq gelegen ist, befindet sich ein Repeat innerhalb des Gens, zwei andere etwa 500 Kb entfernt. Kommt es zur Rekombination zwischen diesen Repeats, entsteht eine Inversion, durch die das Gen inaktiviert wird. Diese Situation liegt bei nahezu der Hälfte aller Patienten mit schwerer Hämophilie vor. Die Neumutationen treten nahezu ausschließlich im männlichen Geschlecht auf. Eine Erklärung hierfür liegt auf der Hand: In der Spermatogenese liegt der lange Arm des X ungepaart vor, sodass es infolge intrachromosomaler Paarung zu derartigen Rekombinationsereignissen kommt, im weiblichen Geschlecht hingegen paaren sich die homologen X-Chromosomen normal (Pratt et al. 1994). Diese Beispiele zeigen aber auch, dass eine zytogenetische Analyse erforderlich ist, um die Ätiologie dieser monogen bedingten Krankheiten zu verstehen.

1.3.6 Somatische Chromosomenmutationen Die Zahl der Zellen des menschlichen Körpers mit etwa 1014 liegt weit über der Rate somatischer (Gen-) und Chromosomenmutationen, d. h., jede beliebige Mutation dürfte in den Zellen jedes Individuums wiederholt aufgetreten sein. Hier geht es 1. um regelmäßig auftretende Chromosomenveränderungen, die eine konstitutive Eigenschaft des Genoms sind (mitotisches Crossingover und Schwesterchromatidaustausche), 2. um eine stark erhöhte somatische Mutationsrate als Folge von Genmutationen der Keimbahn (Chromosomeninstabilitätssyndrome) und 3. um solche somatischen Chromosomenmutationen, die den Zellen einen Vorteil verschafft haben und sich daher ausbreiten konnten (Tumorgenese).

1.3.6.1 Somatische Rekombination Das Auftreten von somatischem (syn. mitotischem) Crossing-over ist aus der Drosophila-Genetik schon seit mehr als 60 Jahren bekannt. Eine der Voraussetzungen hierfür ist die regelmäßige Assoziation der homologen Chromosomen auch in den Somazellen. Dies liegt in den menschlichen und den Säugetierzellen offensichtlich nicht vor. Dennoch gibt es alte zytogenetische Beobach-

tungen, die einen Hinweis auf mitotisches Crossing-over liefern. Wie bereits erwähnt wurde, bleiben die Schwesterchromatiden bis in die Metaphase hinein gepaart. Hat sich in der vorausgegangenen Interphase ein somatisches Crossing-over ereignet, sollte dies zu Translokationsfiguren zwischen zwei homologen Chromosomen führen, die identische Bruchstellen betreffen. Bei der Auswertung normaler Lymphozytenmetaphasen zeigt sich, dass die spontane Häufigkeit dieser Austauschereignisse (ca. 1 auf 1.000 Metaphasen) praktisch ebenso hoch ist wie die zwischen allen heterologen Chromosomen zusammen (Therman u. Kuhn 1976) und bevorzugt genreiche Chromosomenabschnitte betrifft (Therman u. Kuhn 1981). Dieses Phänomen ist im Falle einer autosomal-rezessiven Krankheit, dem BloomSyndrom, extrem erhöht. Hier konnte auch der direkte molekulargenetische Beweis erbracht werden, dass es an homologen Stellen zur Rekombination kommt (German u. Ellis 1998). Bei Patienten mit dem Bloom-Syndrom, die heterozygot für zwei unterschiedliche Mutationen sind (Compound-Heterozygote), kommt es als Folge eines somatischen Crossing-overs innerhalb des Gens zur Bildung von Schwesterchromatiden mit der normalen Sequenz bzw. den beiden Mutationen. Nach der Mitose führt dies zu Zellen, die unverändert den Defekt aufweisen und solchen, die „geheilt „ sind (> Abb. 1.3.6). Das gleiche Phänomen wurde inzwischen auch bei Patienten mit Fanconi-Anämie gefunden und durch Sequenzanalyse bestätigt (Lo Ten Foe et al. 1997). Es ist zu erwarten, dass eine derartige „somatische Gentherapie“ auch das Krankheitsgeschehen beeinflusst. Dieses Phänomen sollte sich stets dann zeigen, wenn Individuen heterozygot für ein rezessives Gen sind, da als Folge somatischen Crossing-overs Zellen gebildet werden, die homozygot für den Defekt sind (> Abb. 1.3.6). Die pigmentlosen Flecken, die häufig bei Patienten mit dem Bloom-Syndrom zu finden sind, werden in diesem Sinne gedeutet. Da vermutlich jeder Mensch heterozygot für mehrere rezessive Gene ist, dürfte dieses Phänomen gar nicht so selten sein, allerdings ist die Beweisführung nicht einfach (Übersicht bei Happle 1998). Regelmäßige Rekombinationsereignisse finden auch zwischen Schwesterchromatiden statt. Dies lässt sich zytogenetisch nachweisen, indem man Zellen in Gegenwart des Basenanalogons BrdU kultiviert, wonach sich die Schwesterchromatiden differenziell anfärben lassen. Etwa 5–8 Schwesterchromatidaustausche, SCEs (sister chromatid exchanges), können so pro Metaphase nachgewiesen werden. Es wurde lange diskutiert, ob es sich hierbei um ein natürliches oder infolge der DNA Markierung induziertes Phänomen handelt. Die Antwort darauf haben zwei zytogenetische Beobachtungen geliefert: Im Falle von Ringchromosomen führt ein einfacher

55 1.3 · Die zytogenetischen Grundlagen der Molekularen Medizin

a

b

1.3

herangezogen, da meiotische Rekombination dafür nicht infrage kommt. Die SCE-Rate wird durch bestimmte mutagene Noxen stark erhöht, sodass angenommen werden kann, dass es sich um einen Prozess handelt, der bei der DNA-Reparatur eine Rolle spielt (Übersicht bei Tucker et al. 1993). Auch dies ist ein Beispiel dafür, dass ein grundlegendes zellbiologisches Phänomen erst durch die Zytogenetik entdeckt wurde und jetzt im Hinblick auf seine pathogenetische Relevanz gewertet werden muss.

1.3.6.2 Chromosomeninstabilität

c

d

. Abb. 1.3.6. Genetische Konsequenzen von somatischem Crossingover. a Paarung der homologen Chromosomen mit somatischem Crossing-over in der Interphase, Anordnung der Chromosomen in der Metaphase (die Pfeile weisen auf die Zellpole hin) und Ergebnis nach Auftrennung in der Anaphase. Die homologen Chromosomen sind durch unterschiedliche Grautöne gekennzeichnet. Die Schemata darunter geben die genetischen Konsequenzen von somatischem Crossing-over wieder; b Entstehung von Homozygotie bei Heterozygotie für ein rezessives Gen; c Entstehung normaler Zellen bei „Compound-Heterozygoten“; d Entstehung von „Zwillingsflecken“ bei doppelt Heterozygoten. Nähere Erläuterungen 7 Text

Schwesterchromatidaustausch zu großen dizentrischen Ringen, ein doppelter zu ineinander verhakten Ringen, was ohne Markierung der DNA nachweisbar ist und damit die spontane Natur der SCEs belegt. Zudem hat sich gezeigt, dass bei Patienten mit dem Bloom-Syndrom die SCE-Rate drastisch erhöht ist, d. h. das defekte Protein ist in diesen Prozess involviert. Die biologische Bedeutung dieser Rekombinationsvorgänge ist nicht offensichtlich, da sie keine genetischen Konsequenzen haben sollten. Im Falle ungleicher SCEs allerdings kann es zur Vermehrung bzw. Verminderung bestimmter Sequenzen kommen. Dies wird als eine Erklärung für die variable Größe des Y-Heterochromatins

Einzelne Chromosomenbrüche treten in wenigen Prozent der Metaphasen auf. Nach Exposition gegenüber ionisierenden Strahlen steigen sie dosisabhängig an und können auch noch Jahre nach einer Exposition zur biologischen Dosisabschätzung herangezogen werden, weil die T-Lymphozyten des peripheren Blutes besonders langlebig sind, d. h. zum Teil viele Jahre im peripheren Blut persistieren. Aus dem Aberrationsmuster der Chromosomen in der ersten Mitose nach Bestrahlung wird ersichtlich, ob das Chromosom uninem oder bereits verdoppelt war. So führt eine Exposition in der G1-Phase zu Aberrationen vom Chromosomentyp, in der späteren S- und G2-Phase vom Chromatidtyp (> Abb. 1.3.7). Das weitere Schicksal der Zellen hängt davon ab, wie groß die genetische Imbalance nach der Zellteilung ist. Besonders langlebig sind balancierte reziproke Translokationen, die mittels „chromosome painting“ sehr empfindlich nachgewiesen werden können (Übersicht bei Obe u. Müller 1999). Einzelne Chromosomenbrüche stellen gesundheitlich kein besonderes Risiko dar. Findet sich hingegen

. Abb. 1.3.7. Zusammenhang zwischen dem Stadium des Zellzyklus, zu dem eine Exposition mit ionisierenden Strahlen erfolgt und dem chromosomalen Aberrationsmuster in der darauf folgenden Mitose (aus Sperling und Obe 1977)

56

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

eine erhöhte Chromosomeninstabilität bei Patienten mit einer genetisch bedingten Erkrankung, kommt ihr plötzlich ein großes Gewicht zu: Es weist darauf hin, dass das betreffende Gen direkt oder indirekt in die Aufrechterhaltung der DNA-Integrität involviert ist, d. h. in ein zentrales zellbiologisches Geschehen. Die betroffenen Patienten zeichnen sich durch ihr hohes Krebsrisiko aus und oftmals ihre spezifische Empfindlichkeit gegenüber bestimmten Mutagenen. So weisen die Zellen von Patienten mit der Ataxia teleangiectatica oder dem Nijmegen-breakage-Syndrom eine Überempfindlichkeit gegenüber ionisierenden Strahlen auf, die von Patienten mit der Fanconi-Anämie gegenüber Agenzien, die die einzelnen DNA-Stränge vernetzen. Diese zytogenetische Auffälligkeit dient als differenzialdiagnostisches Kriterium.

1.3.6.3 Chromosomenmutationen in der Tumorgenese Nahezu sämtliche Tumore weisen einen aberranten Chromosomensatz auf, zahlreiche davon zusätzlich eine Chromosomeninstabilität als Folge somatischer Mutationen, die Gene des „DNA damage response network“ betreffen. Hierdurch werden Zellen mit unterschiedlichen genetischen Imbalancen generiert, die im Hinblick auf raschere und kontinuierliche Proliferation ausgewählt werden. Zufällige Mutationen und Selektion sind daher die Grundlagen für die Entwicklung (Evolution) von Krebszellen. Entscheidende Einblicke in die Tumorgenese haben spezifische Chromosomenumbauten ermöglicht, durch die bestimmte Protoonkogene aktiviert (z. B. Burkitt-Lymphom, > Abb. 1.3.8) oder neue Fusionsgene generiert werden (z. B. 9/22 Translokation bei der chronisch myeloischen Leukämie). Mikrodeletionen der Bande 15q14 finden sich bei etwa 5% aller Patienten mit dem Retinoblastom und trugen entscheidend dazu bei, das Rb-Gen zu identifizieren und seine Natur als Tumorsuppressorgen aufzuklären. Im diesem Fall handelt es sich um eine Keimbahnmutation. Als Folge somatischer Mikrodeletionen können derartige Genverluste ebenfalls eintreten und durch FISHAnalyse nachgewiesen werden („loss of heterozygosity“, LOH). Dabei zeigte sich, dass in vielen Tumoren ein bestimmtes elterliches Chromosom bevorzugt betroffen ist, in der Mehrzahl das maternale Chromosom (Übersicht bei Feinberg 1998). Am Beispiel embryonaler Tumore (z. B. Wilms-Tumor) bei Kindern mit dem Wiedemann-Beckwith-Syndrom ließ sich nachweisen, dass hier genomisches Imprinting eine Rolle spielt, da das andere Allel in diesen Zellen nicht aktiv ist. Überraschenderweise zeigte sich für das IGF2-Gen im Wilms-Tumor, dass beide Allele

. Abb. 1.3.8. Chromosomale Umbauten beim Burkitt-Lymphom. Als Folge einer Translokation kommt das C-MYC-Gen auf Chromosom 8q24 in die Nachbarschaft der Gene für die leichten (κ, λ) Ketten oder das Gen für die schwere (H) Kette der Immunglobuline

aktiv sind, obwohl normalerweise nur das väterliche exprimiert wird. Hier und in vielen anderen Tumoren kommt es daher zu einem „loss of imprinting“ (LOI), einer der häufigsten Veränderungen in Tumoren überhaupt (Übersicht bei Feinberg 1998). Hier soll noch auf zwei Auffälligkeiten eingegangen werden, die speziell beim Neuroblastom eine pathogenetisch wichtige Rolle spielen (Übersicht bei Gutmann u. Collins 1998). Es handelt sich um die Bildung kleiner Chromatinfragmente („double minute chromatin bodies“, dmin) und längere einheitlich gefärbte Chromosomenabschnitte („homogeneously staining regions“, HSR). Diese sind Ausdruck der Amplifikation des MYCN-Onkogens auf Chromosom 2. Hierdurch werden extrachromosomale Elemente gebildet, die vermutlich ringförmig sind, kein Zentromer (Kinetochor) besitzen und daher bei der Mitose zufällig verteilt werden. Sie verleihen den Zellen offensichtlich einen Proliferationsvorteil. Sehr selten kommt es zur Integration in das Genom und zur Ausbildung der HSRs (> Abb. 1.3.9). Diese wenigen Beispiele sollen die zentrale Rolle der molekularen Zytogenetik in der Tumorforschung unterstreichen. In dem Katalog von Mitelman et al. (1994) sind mehr als 84.000 derartiger Fälle zusammengestellt.

57 1.3 · Die zytogenetischen Grundlagen der Molekularen Medizin

1.3

. Abb. 1.3.9. Zytogenetische Auffälligkeiten beim Neuroblastom. Als Folge einer Amplifikation des MYCN-Gens auf Chromosom 2 kommt es zur Entstehung kleiner, extrachromosomaler Partikel. Gelegentlich kommt es zur Integration in ein Chromosom und weiterer

Amplifikation, was zu einer homogen angefärbten Region führt („homogeneously staining region“, HSR) (nach Gutmann u. Collins 1998)

1.3.7 Ausblick

bei etwa 10% aller geistig schwer behinderten Kinder, wobei die Werte zwischen einzelnen Untersuchern zwischen 7% und 23% variieren (Knight u. Flint 2000). Als wichtigsten Entstehungsmechanismus derartiger Imbalancen werden inter- und intrachromosomale Rekombinationsereignisse angenommen, die auf repetitive Elemente im Genom zurückzuführen sind. Solche Elemente, die im Bereich der Telomerregionen liegen und sich nur geringfügig zwischen unterschiedlichen Chromosomen unterscheiden, begünstigen die Entstehung chromosomaler Translokationen, die nach der Meiose zu genetisch unbalancierten Nachkommen führen können ( Flint et al. 1995; Ballif et al. 2000; Varley et al. 2000). Jene Repeats, die bestimmte chromosomale Bereiche flankieren, erhöhen das Risiko für ungleiches Crossingover (Lopez et al. 2000; Trost et al. 2000). Als Folge davon kommt es zu Mikrodeletionen und -duplikationen. Bei einer systematischen, genomweiten Suche nach derartigen Imbalancen wird sicherlich bei wesentlich mehr Patienten mit angeborenen Fehlbildungen und geistiger Behinderung als bisher die eigentliche Ursache gefunden werden. Den entscheidenden diagnostischen Durchbruch zum genomweiten Nachweis von Mikrodeletionen dürften DNA-Chips geordneter DNA-Fragmente oder Oligonukleotide darstellen. Derzeit sind Chips verfügbar,

In diesem Beitrag wurde die Zytogenetik als medizinische Grundlagenwissenschaft dargestellt, die zu neuen Einsichten in die molekulare Ursache von Krankheiten geführt hat. Tatsächlich hat die Zytogenetik zugleich auch eine wesentliche angewandte Seite. Jährlich werden in Deutschland mehr als 100.000 zytogenetische Analysen durchgeführt, etwa 70.000 davon im Rahmen der vorgeburtlichen Diagnostik. Der diagnostische Umfang liegt daher deutlich über dem derzeitigen molekulargenetischen Nachweis schwerer monogen bedingter Erkrankungen. Vermutlich wird er in den kommenden Jahren noch deutlich zunehmen. Es spricht vieles dafür, dass bestimmte genomische Imbalancen, die sich bislang einem allgemeinen Nachweis weitgehend entzogen, als ursächlich für einen beträchtlichen Teil ungeklärter Krankheitsfälle infrage kommen. Es handelt sich um submikroskopische Deletionen und Duplikationen als Folge von Neumutationen oder familiärer, kryptischer Translokationen. So liegt eine Mikrodeletion am Locus 22q11.2 etwa 6% aller angeborenen Herzfehler und mehr als 10% aller pränatal diagnostizierten Herzfehlbildungen zugrunde, bei denen die anderen bekannten Ursachen ausgeschlossen wurden. Submikroskopische Imbalancen im Bereich der Telomerregionen finden sich

58

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

die mehr als 30.000 Fragmente menschlicher DNA von 150 bis 200 Kbp („bacterial artificial chromosomes“, BACs) aufweisen oder solche mit bis zu 500.000 Oligonukleotiden, die das Genom gleichmäßig abdecken (Übersicht bei Pinkel u. Albertson 2005; Lockwood et al. 2006; Ylstra et al. 2006). Die jeweilige Anzahl der Genkopien wird dabei durch „comparative genomic hybridization“ bestimmt (Array-CGH). Der Zeitaufwand ist vergleichsweise gering, da die DNA des Testgewebes ohne vorherige Kultivierung eingesetzt werden kann und der Ablauf zudem automatisierbar ist. Da hiermit selbstverständlich auch vollständige Aneuploidien nachgewiesen werden und die Auflösung deutlich größer ist als bei der klassischen Zytogenetik, dürfte die Array-CGH in den nächsten Jahren die bisherige personal- und zeitaufwendige zytogenetische Diagnostik in der medizinischen Genetik zunehmend ersetzen. Den betroffenen Familien kann bei bekannter Ursache eine umfassende, individuelle Beratung angeboten werden. Bei Vorliegen einer Neumutation wird das Wiederholungsrisiko generell vernachlässigbar sein, bei familiären kryptischen Translokationen hingegen kann es präzisiert und auf die Möglichkeit einer pränatalen Diagnostik hingewiesen werden. Aus wissenschaftlicher Sicht eröffnen derartige Mikrodeletionen und -duplikationen zudem einen besonders einfachen, direkten Weg, die zugrunde liegenden Gene zu identifizieren. Von der verantwortungsbewussten Einführung dieser Methode in die medizinische Praxis wird es abhängen, ob die neuen diagnostischen Möglichkeiten im Sinne der Patienten und Ratsuchenden eingesetzt werden und gleichzeitig die bemerkenswerten wissenschaftlichen Optionen genutzt werden können. Der Qualitätssicherung kommt hierbei nicht nur im Hinblick auf die Zuverlässigkeit der Befundung, sondern auch bezüglich des Kontextes insgesamt, in dem diese Untersuchung angeboten und in Anspruch genommen werden, eine zentrale Bedeutung zu (Sperling et al. 1997). Drei Bereiche sind hierbei zu unterscheiden: 1. Die Strukturqualität Hierzu zählen die Qualifikation des Untersuchers, sowie die Rahmenbedingungen für die Inanspruchnahme der jeweiligen Leistung insgesamt, z. B. die Sicherstellung eines angemessenen Beratungsangebots. 2. Die Prozessqualität Diese betrifft die praktische Durchführung der Untersuchung mit interner und externer Qualitätskontrolle. So haben z. B. erste Untersuchungen gezeigt, dass Mikrodeletionen auch bei den unauffälligen Eltern der Probanden vorliegen können und daher nicht in jedem Fall klinisch relevant sein müssen (Ballif et al. 2000).

3. Die Ergebnisqualität Dazu rechnen die medizinischen und gesellschaftlichen Konsequenzen, die sich aus diesen neuen diagnostischen Möglichkeiten ergeben. Die zukünftige Entwicklung wird zeigen, ob diese methodische Revolution molekularzytogenetischer Diagnostik zugleich einen Fortschritt der molekularen Medizin bedeutet.

1.3.8 Literatur Arnold J (1879) Virchow’s Arch Path Anat 77: 181 Ballif BC, Kashork CD, Shaffer LG (2000) FISHing for mechanisms of cytogenetically defined terminal deletions using chromosome-specific subtelomeric probes. Eur J Hum Genet 8: 764– 770 Ballif BC, Kashork CD, Shaffer LG (2000) The promise and pitfalls of telomere region-specific probes. Am J Hum Genet 67: 1356– 1359 Barr ML, Bertram LF (1949) A morphological distinction between neurones of the male and the female and the behavior of the nucleolar satellite during accelerated nucleoprotein synthesis. Nature 163: 676–677 Barr ML, Bertram LF (1953) Surg Gynec Obstet 96: 641 Bednar J, Horowitz RA, Grigoryev SA, Carruthers LM, Hansen JC, Koster AJ, Woodcock CL (1998) Nucleosomes, linker DNA, and linker histone form a unique structural motif that directs the higher-order folding and compaction of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 14173–14178 Belmont AS, Dietzel S, Nye AC, Strukov YG, Tumbar T (1999) Largescale chromatin structure and function. Curr Opin Cell Biol 11: 307–311 Beneden van E (1883) Recherches sur la Maturation de L’Oeuf, la Fécondation et la Division Cellulaire. Arch. Biol. 4: 265 Ben-Porath I, Cedar H (2000) Imprinting: focusing on the center. Curr Opin Genet Dev 10: 550–554 Bernardi G (1989) The isochore organization of the human genome. Ann Rev Genet 23: 637–661 Boveri T(1887) Über die Befruchtung der Eier von Ascaris megalocephala. Sitzungsberichte der Gesellschaft für Morphologie und Physiologie in München 3: 71–80 Boveri T (1903) Über die Konstitution der chromatischen Kernsubstanz. In: Verhandlungen der Deutschen Zoologischen Gesellschaft, 13. Jahresversammlung zuWürzburg (Korschelt E, Hrsg.) S. 10–33. Leipzig: Wilhelm Engelmann Boveri, T. 1902. Über mehrpolige Mitosen als Mittel zur Analyse des Zellkerns.Verh Phys -med Ges Würzberg NF 35: 67–90 Boveri T (1914) Zur Frage der Entstehung Maligner Tumoren, Fischer, Jena, Germany Brannan CI, Bartolomei MS (1999) Mechanisms of genomic imprinting. Curr Opin Genet Dev 9: 164–170 Bridger JA, Bickmore WA (1998) Putting the genome on the map. Trends Genet 14: 403–409 Bridges CB (1913) Nondisjunction of the sex chromosomes of Drosophila. J Exp Zool 15: 587–606 Brockdorff N (1998) The role of Xist in X-inactivation. Curr Opin Genet Dev 8: 328–333 Brown R (1833) On the Organs and Mode of Fecundation in Orchideae and Asclepiadeae. The Transactions of the Linnean Society of London 16/3: 709–737

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1.3

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60

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

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1.3

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62

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

1.3.9 Zeittafel Die angegebenen Zitate sind in den Literaturteil integriert. 1833

Beschreibung des Zellkerns in Epidermiszellen von Orchideen als »areola« durch R. Brown

1842

Beschreibung von Chromosomen (»Cytoblasten«) in Pollen durch K. Naegeli

1876

Beschreibung der Befruchtung beim Seeigel und Bedeutung des Zellkerns für die Vererbung durch O. Hertwig

1879

Beschreibung der Längsspaltung der Chromosomen bei der Zellteilung und Einführung des Begriffs »Mitose« durch W. Flemming. 1882 wird durch ihn der Begriff »Chromatin« geprägt. Im gleichen Jahr hat J. Arnold erstmals menschliche Chromosomen gezeichnet.

1882

Annahme von der Konstanz der Chromosomenzahl durch Untersuchungen an Pflanzen von E. Strasburger (Arch. mikr. Anat. 21: 476, 1882). Im Jahr 1888 wurde die Zahlenkonstanz durch Boveri auch für Tiere bestätigt.

1883

Nachweis durch E. van Beneden, dass die Zygote von beiden Eltern die gleiche Anzahl von Chromosomen erhält und die Meiose zur Halbierung der Chromosomenzahl führt

1885

Keimbahn-Theorie von A. Weismann. Die Keimbahnzellen stammen nur von Keimbahnzellen ab und sind daher potenziell unsterblich, während die somatischen Zellen zugrunde gehen. Daher kann es auch keine Vererbung erworbener somatischer Eigenschaften geben (Fischer Vlg. Jena 1885).

1887

Individualität der Chromosomen durch T. Boveri belegt. Danach bleiben die Chromosomen im Anschluss an die Anaphase auch im Interphasekern als distinkte Strukturen bestehen.

1888

Einführung des Begriffs »Chromosom« durch W. Waldeyer

1891

Erste Beschreibung eines X-Chromosoms bei der Feuerwanze durch H. Henking

1903

Begründung der Chromosomentheorie der Vererbung durch W. S. Sutton und T. Boveri, der zeigte, dass die Chromosomen sich nicht nur in ihrer Form sondern auch ihrer Funktion unterscheiden

1905

Entdeckung des XY-Mechanismus der Geschlechtsbestimmung bei Insekten durch E. B. Wilson

1909

Beschreibung und richtige Interpretation der Chiasmata in der Meiose durch F. A. Janssens

1911

Erklärung des Faktorenaustauschs (crossing-over) durch Chiasmabildung und Nachweis der linearen Anordnung der Gene auf den Chromosomen durch T. H. Morgan

1913

Nachweis von Nondisjunction bei Drosophila durch C. B. Bridges

1912

Bestimmung der diploiden Chromosomenzahl des Menschen mit 47 durch H. de Winiwarter und 1923 mit 48 durch T. S. Painter

1914

Chromosomentheorie der Krebsentstehung von T. Boveri

1929

Einführung der Bezeichnung »Heterochromatin« für stärker gefärbte Chromosomenregionen der Interphase durch E. Heitz

1949

Nachweis des Geschlechtschromatins bei Katzen durch M. L. Barr und E. A. Bertram und beim Menschen

1956

Nachweis der diploiden Chromosomenzahl des Menschen mit 2n=46 durch J. H. Tjio und A. Levan sowie C. E. Ford und J. L. Hamerton

1959

47,XXY-Karyotyp beim Klinefelter-Syndrom durch P. A. Jacobs entdeckt, 45,XO-Karyotyp beim Turner-Syndrom durch C. E. Ford sowie Trisomie 21 beim Down-Syndrom durch J. Lejeune

1960

Lymphozytenkultur zur einfachen Darstellung der menschlichen Chromosomen von P. C. Nowell und P. S. Moorhead et al. beschrieben

1960

Erstmals charakteristische somatische Chromosomenanomalie (sog. Philadelphia-Chromosom) bei Malignom (chronisch myeloischer Leukämie) durch P. C. Nowell und D. A. Hungerford beschrieben. J. D. Rowley wies 1973 nach, dass es sich um eine reziproke Translokation handelt.

1961

M. Lyon findet funktionelles Mosaik der X-Chromosomenaktivität bei der Maus und formuliert das Konzept vom Dosis-Kompensationsmechanismus beim weiblichen Säuger für X-chromosomale Gene (Lyon Hypothese).

1963

Beschreibung der ersten strukturellen Chromosomenanomalie beim Menschen durch J. Lejeune: 5p– (Katzenschrei-Syndrom)

1964

Erste Erkrankung mit Chromosomeninstabilität (Fanconi-Anämie) durch T. M. Schröder beschrieben und 1965 von J. German ebenfalls beim Bloom-Syndrom gefunden

1966

Steele und Breg zeigen, dass Zellen der Amnionflüssigkeit nach Kultivierung zur Chromosomenanalyse des Feten geeignet sind.

1968

Differenzielle Darstellung der menschlichen Chromosomen nach Anfärben mit Quinacrin durch T. Caspersson und L. Zech beschrieben

1969

In-situ-Hybridisierung von DNA-DNA und RNA-DNA durch J. R. Gall und M. L. Pardue beschrieben. Damit wurde die methodische Grundlage für die molekulare Zytogenetik gelegt.

1.4 1.4 Analyse von Biochips: Von der Sequenz zum System Ralf Herwig, Johannes Schuchhardt, Lukas Chavez und Hans Lehrach

1.4.1

Analyse von Krankheitsprozessen in der modernen Genomforschung – 65

1.4.2

Biochips I: Messung des Transkriptoms

1.4.2.1 1.4.2.2

Technologien zur Messung der Genexpression Plattformvergleich – 68

1.4.3

Biochips II: Messung transkriptioneller Abhängigkeiten – 69

1.4.3.1 1.4.3.2 1.4.3.3

RNS Interferenz (RNAi) – 69 Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP-on-Chip) – 70 Sequenzbasierte Motivsuche – 72

1.4.4

Bildauswertung und Qualitätskontrolle von Biochips

1.4.4.1 1.4.4.2

Datenakquirierung – 73 Bildverarbeitung und Qualitätskontrolle

1.4.5

Detektion differenziell exprimierter Gene

1.4.5.1 1.4.5.2 1.4.5.3 1.4.5.4

Analyse von Expressionsunterschieden – 74 Statistische Testentscheidungen – 76 Korrekturverfahren für statistische Testentscheidungen – 77 Vergleich von statistischen Testentscheidungen und Verifizierung von Markergenen – 77

1.4.6

Analyse von Genexpressionsprofilen – 78

1.4.6.1 1.4.6.2 1.4.6.3

Ähnlichkeiten in multidimensionalen Beobachtungen – 79 Auffinden koregulierter Gene durch Clusteranalyse – 80 Validierung von Clusterergebnissen – 81

1.4.7

Klassifizierung

1.4.7.1 1.4.7.2 1.4.7.3

Binäre Klassifikationsprobleme – 83 Multiparametrische Verfahren – 84 Kreuzvalidierung – 86

– 66 – 66

– 73

– 73

– 74

– 83

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

1.4.8

Genetische Netzwerke

1.4.8.1 1.4.8.2 1.4.8.3

Vorwärtsmodellierung und Simulation genetischer Netzwerke Reverse engineering – 87 Netzwerkmotive – 90

1.4.9

Datenbanken und Datenintegration

1.4.9.1 1.4.9.2 1.4.9.3

Primärdatenbanken – 91 Datenbanken für funktionelle Annotation – 92 Standardisierung und Datenbankintegration – 93

1.4.10

Ausblick – Systembiologie in der molekularen Medizin

1.4.11

Literatur

– 94

1.4.12

Zeittafel

– 99

Literatur zur Zeittafel

– 86

– 100

– 87

– 91

– 93

65 1.4 · Analyse von Biochips: Von der Sequenz zum System

1.4.1 Analyse von Krankheitsprozessen in der modernen Genomforschung Die traditionelle biologische Forschung war in der Vergangenheit auf die Analyse einzelner biologischer Vorgänge fokussiert. Für spezielle Fragestellungen sind die entsprechenden Datensätze für den Beweis einzelner Hypothesen generiert und analysiert worden. Da sich aber in der Evolutionsgeschichte in einem Zeitraum von mehreren Milliarden Jahren biologische Prozesse zu fein regulierten und dabei sehr komplexen Netzwerken entwickelt haben, die die Komplexität der modernen Genomforschung ausmachen, haben die von einzelnen Hypothesen getriebenen Ansätze die Grenzen ihrer Effektivität erreicht. Dieser Paradigmenwechsel lässt sich z. B. in der Krebsforschung ablesen. Auch durch jahrzehntelange Forschung konnten – mit Ausnahme von Krebserkrankungen bei Kindern – keine wesentlichen Verbesserungen der Heilungsraten bei den verbreiteten Krebserkrankungen erreicht werden (Leaf 2004). Auch sehr erfolgreiche Wirkstoffe wie z. B. Herceptin oder Glivec sind nur auf einen Teil der Patienten mit individuellen Merkmalen anwendbar. Die wesentlichen Gründe für die Krebsentstehung sind Infektion, Umwelteinflüsse und genetische Prädisposition. Auf molekularer Ebene ist die Krebsentstehung jedoch nicht eindeutig klassifizierbar, stattdessen besteht hier ein komplexes Zusammenspiel verschiedener Faktoren, die Entstehung, Wachstum und Progression von Tumoren fördern (Hanahan u. Weinberg 2000). Diese komplizierten Mechanismen interagierender Moleküle, organisiert in zellulären Netzwerken der Signaltransduktion, Genregulation und des Metabolismus, können nur durch die Hochdurchsatzmethoden der modernen Genomforschung experimentell aufgelöst werden. In den letzten zwanzig Jahren, verbunden mit der Erfindung von PCRReaktionen und der DNS-Sequenzierung, ist der eher hypothesengerichtete Ansatz daher durch die Anwendung systematischer Ansätze komplementiert worden. Diese breiteren, datengerichteten Ansätze sind durch neue hochparallele und automatisierte Methoden in der molekularbiologischen Praxis möglich geworden. Obwohl anfänglich für Kartierungs- und Sequenzierungsprojekte entwickelt, sind Methoden wie Hochdurchsatzsequenzierung und Biochiptechnologie ein fester Bestandteil der klinisch orientierten Genomforschung geworden. Biochips erlauben es, die Expression von Tausenden von Genen in einem einzigen Experiment zu messen. Arbeitsgruppen weltweit nutzen diese und andere Technologien der funktionellen Genomforschung, um Gene als diagnostische Marker und Interventionspunkte für Therapien zu identifizieren und durch die

1.4

Analyse der zugrunde liegenden zellulären Netzwerke eine möglichst individuelle Medikation zu ermöglichen (Herwig u. Lehrach 2006). Dabei ist die anfängliche Euphorie der 1990er Jahre in der Betonung der Bedeutung dieser Methoden für die medizinische Forschung einer eher kritischen (und realistischeren) Sichtweise gewichen. Speziell bei der Entwicklung von neuen Medikamenten ist die Entwicklung nicht so schnell fortgeschritten, wie das am Anfang erhofft wurde, so gibt es z. B. ein zunehmendes Missverhältnis zwischen den Kosten bei der Medikamentenentwicklung und der Anzahl marktfähiger Produkte (Booth u. Zemmel 2004). Immer mehr kommt man zu der Erkenntnis, dass die komplexen Störungen, die den meisten polygenen Erkrankungen zugrunde liegen, eine umfangreichere Kenntnis der relevanten biologischen Prozesse erfordern (Hood u. Perlmutter 2004). Diese Lücke versuchen die Genomforschung auf experimenteller Seite sowie die bioinformatische Forschung auf analytischer Seite nun zu schließen. Biochips nehmen in diesem Zusammenhang immer noch eine zentrale Rolle ein. Die fortschreitende Vollsequenzierung von Genomen (Mensch, Maus, Ratte, Zebrafisch, Wurm, Drosophila, Hefe) ist die Basis für die Erstellung von Biochips, die eine genomweite Analyse von DNS-DNS-, DNS-RNS- oder DNS-Protein-Interaktionen erlauben. Biochips sind eine Schlüsseltechnologie in der modernen molekularen Medizin und gestatten einen komplexen Einblick in fundamentale Prozesse wie Zellentwicklung, -wachstum und -differenzierung. Der dieser Technik eigene hohe Parallelisierungsgrad erlaubt Visualisierung und simultane Analyse von komplexen genetischen Veränderungen. Neue Anwendungen von Biochips – wie z. B. RNS-Interferenz (RNAi) oder ChIP(Chromatin Immunopräzipitation-)on-Chip erlauben ferner eine kausale (nicht nur deskriptive) Interpretation der Expressionsmuster und somit die zielgerichtete Messung von genregulatorischen Netzwerken. In den letzten Jahren hat sich die Bioinformatik zu einem unverzichtbaren Bestandteil der Genomforschung entwickelt. Bioinformatische Werkzeuge wurden etabliert, die es erlauben, große Datensätze systematisch zu speichern, zu durchsuchen und auszuwerten. Dabei sind vor allem robuste mathematisch-statistische Verfahren von Bedeutung, die den immer noch hohen Fehlerraten bei Chip-Experimenten angepasst sind. Ein wesentliches Element der bioinformatischen Analyse ist das Filtern der Daten und damit die Trennung von Daten mit hohem Informationsgehalt von Daten mit niedrigem Informationsgehalt (> Abb. 1.4.1). Zur umfassenden Beschreibung eines biologischen Prozesses müssen üblicherweise unterschiedliche experimentelle Techniken eingesetzt werden. Ein wesentlicher Bestandteil der Bioinformatik ist daher die Korrelationsanalyse dieser Da-

66

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

. Abb. 1.4.1. Biochipexperimente und Krankheitsprozesse. Bioinformatische Komponenten dienen zur Identifizierung von Markern (Ebene 1), zur Konstruktion qualitativer, zellulärer Netzwerke bestehend aus Reaktionen, die mit diesen Markern assoziiert sind (Ebene 2) und zur dynamischen, quantitativen Modellierung dieser Netzwerke (Ebene 3)

ten, z. B. die Korrelation von Expressionsprofilen koregulierter Gene mit gemeinsamen Bindungsstellen in den entsprechenden Promotorregionen (Tavazoie et al. 2000) oder von RNAi- und ChIP-on-Chip-Zielgenen (Boyer et al. 2006; Babaie et al. 2007). Dadurch können kausale Beziehungen zwischen Genen, etwa einem Transkriptionsfaktor und seinen Zielgenen, hergestellt werden, die als Ausgangspunkt für eine mathematische Modellierung des Krankheitsprozesses dienen. Bioinformatische Methoden werden eingesetzt zur Detektion differenziell exprimierter Gene (7 1.4.5) und damit zur Identifizierung von Markergenen (z. B. für bestimmte Krankheitsstadien), zur Detektion von Genregulationsmustern (7 1.4.6), zur Klassifizierung von Patientengruppen (7 1.4.7) und nicht zuletzt zur Analyse und Visualisierung von krankheitsrelevanten Netzwerken (7 1.4.8). Bioinformatische Entwicklungen schließen aber auch die Entwicklung von Datenbanken, deren Integration und die Erstellung von Ontologien zur Beschreibung und automatischen Erfassung biologischer Information ein (71.4.9). Dadurch entsteht ein umfassendes Bild des dem entsprechenden Phänotyp zugrunde liegenden Genexpressionszustands.

1.4.2 Biochips I: Messung des Transkriptoms Biochips sind die am häufigsten genutzte Technologie zur Messung der Genexpression, da alternative Verfahren, wie z. B. Messungen durch RT-PCR oder In-situHybridisierungen (ISH) nicht den hohen Parallelisierungsgrad haben. Diese Techniken werden jedoch zumeist komplementär eingesetzt, z. B. bei der Verifizierung der unbekannten Markergene, die durch einen Biochip detektiert wurden (vgl. 7 1.4.5.4).

Ein Biochip besteht aus einem festen Trägermaterial (z. B. beschichteter Kunststoff oder beschichtetes Glas), auf der DNS-Sequenzen (Proben) immobilisiert sind, die spezifisch für die Gene des entsprechenden Organismus sind. Aus dem Zielmaterial wird mRNS extrahiert und markiert, und in einem Hybridisierungsexperiment wird die Stärke der gebundenen, markierten cRNS an der Probe detektiert, was als Indikator für die entsprechende Genexpression im Zielmaterial gilt (> Abb. 1.4.2). Die unterschiedlichen Plattformen für Chip-Experimente unterscheiden sich im Oberflächenmaterial, der Auswahl und dem Verfahren zur Immobilisierung der Proben sowie der Art der Markierung.

1.4.2.1 Technologien zur Messung der Genexpression Eine weit verbreitete Technologie ist das Affymetrix GeneChip System (Lockhart et al. 1996; Wodicka et al. 1997; Cho et al. 1998; Lipshutz et al. 1999), bei der Gene durch eine Menge von kurzen Oligonukleotidproben repräsentiert werden (typischerweise elf 25-mere, die über die Gensequenz verteilt sind). Man nutzt photolithographische Verfahren, um an exakten Positionen auf dem Chip einzelsträngige DNS-Sequenzen durch lichtgesteuerte Kupplungsreaktionen aufzubauen. Am Ende enthält jede Position rund zehn Millionen Moleküle des jeweiligen Oligonukleotids (> Abb. 1.4.2). Affymetrix-Chips haben sich zum Standard in der pharmazeutischen Industrie entwickelt, weil sie einen hohen Grad an Reproduzierbarkeit im Herstellungsprozess erreichen. Whole-Genome-Chips, die einen großen Teil des Transkriptoms abdecken, sind für etliche Organismen erhältlich, z. B. für Mensch, Maus, Ratte, Rind und Schwein. Ein Affymetrix-Chip-Experiment ist üblicherweise ein Einfarbenexperiment, d. h. die Markierung erfolgt mit einem Fluoreszenzfarbstoff, und genau ein experimenteller Zustand kann in einem Experiment gemessen werden. Die Proben der Whole-Genome-Chips tasten üblicherweise die nähere Umgebung des 3‘-Endes des entsprechenden Gens ab. Als neues Format bietet Affymetrix auch sogenannte Exon-Chips an (Mensch und Maus), auf denen die Oligonukleotidproben in den bekannten Exonbereichen verteilt sind. Dieses Chipformat bietet die Möglichkeit, spezifisch nach Splice-Varianten in unterschiedlichen Ausgangsmaterialien zu suchen. Eine alternative Technologie bietet Agilent (Hughes et al. 2000, 2001). Die immobilisierten Proben sind hier länger (60-mere), dafür gibt es genau eine Probe pro Gensequenz. Zur Immobilisierung wird eine ähnliche Technik wie beim Tintenstrahldrucker eingesetzt, um winzige Tröpfchen der zur Oligonukleotidsynthese be-

67 1.4 · Analyse von Biochips: Von der Sequenz zum System

1.4

. Abb. 1.4.2. Prinzip von Hybridisierungsexperimenten mit der cDNS Plattform (links) und dem Affymetrix GeneChip System (rechts). Im oberen Bereich ist jeweils die Konstruktion der Proben dargestellt, im unteren Bereich die Präparation des Zielmaterials. Der mittlere

Bereich beschreibt schematisch die Strategie zur Detektion differenziell exprimierter Gene mit dem Zweifarbenexperiment (cDNS-Plattform) und zweier Einfarbenexperimente (Oligonukleotidplattform). (Bilder aus Adjaye et al. 2004 und http://www.affymetrix.com)

nötigten Reaktionslösungen auf kleinste Flächen zu dosieren. Die 60-mer-Proben sind sehr spezifisch für das jeweilige Gen und zeigen typischerweise bessere Hybridisierungseigenschaften als kurze Proben. Experimente mit der Agilent-Plattform können als Ein- oder Zweifarbenexperiment durchgeführt werden, sodass also ein oder zwei Zustände pro Experiment verglichen werden können. Als erweiterte Möglichkeit bietet Agilent seit kurzem das „Arrays-on-Array“-Format, das es erlaubt, bis zu acht verschiedene Experimente auf demselben Chip durchzuführen. Agilent-Chips sind für verschiedene Organismen (z. B. Mensch, Maus, Ratte, Zebrafisch) verfügbar, es besteht ferner die Möglichkeit, durch das Design eigener Sequenzen nutzerspezifische Chips herzustellen. Ein neues Chipformat bietet das Illumina BeadChip System (Gunderson et al. 2004; Kuhn et al. 2004), das ein beadbasiertes Verfahren zur Immobilisierung der Proben nutzt. Hunderttausende dieser Beads sind auf der Oberfläche des Chips verteilt und in bestimmte Beadklassen unterteilt. Jede Beadklasse trägt dabei eine

spezifische Sonde. Die Probensequenzen (50-mere) sind verbunden mit einer Erkennungssequenz für die entsprechende Beadklasse. Nach der Assemblierung der Beads erfolgt eine Identifizierung und exakte Bestimmung der einzelnen Beadklassen und Probensequenzen. Auch Illumina bietet die Möglichkeit, verschiedene Experimente (entweder sechs oder acht) auf demselben Chip durchzuführen. Illumina Chips sind verfügbar für Mensch, Maus und Ratte. Andere kommerzielle Systeme sind Amersham Biosciences, NimbleGen, Febit und Applied Biosystems. Historisch waren cDNS-Chips die erste Technologie zur Messung hochparalleler Genexpression (Lennon u. Lehrach 1991). Zunächst für Nylonmembranen und radioaktive Markierung des Zellmaterials entwickelt (Poustka et al. 1989; Lehrach et al. 1990; Meier-Ewert et al. 1993; Maier et al. 1994, 1997), sind die meisten heute verfügbaren cDNS-Chips auf Glas erhältlich (Schena 1995, 1996; DeRisi 1996, 1997; Adjaye et al. 2004). cDNSChips sind weit verbreitet in der akademischen Forschung, da sie es erlauben, auch Proben zu analysieren,

68

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

die nicht über kommerzielle Anbieter erhältlich sind. Die verwendeten einzelsträngigen cDNS-Sequenzen haben eine hohe Variabilität in der Probenlänge (100– 3000 bp) und werden durch PCR-Reaktionen amplifiziert. Die PCR-Produkte werden dann durch SpottingRoboter auf die Glasoberfläche transferiert. cDNS-ChipExperimente sind Zweifarbenexperimente. Die während der reversen Transkription unterschiedlich markierten mRNS-Mengen werden gemischt und binden im Hybridisierungsexperiment an ihre komplementären Einzelstränge auf dem Chip. Nach erfolgter Inkubation und den entsprechenden Waschschritten zum Entfernen falsch-positiver Signale wird der Chip durch einen oder zwei Laser angeregt, und in zwei verschiedenen Kanälen werden zwei digitale Bilder erzeugt, die für jede Probe auf dem Chip den Grad der gebundenen Fluoreszenz wiedergeben (> Abb. 1.4.2).

1.4.2.2 Plattformvergleich Jede Plattform hat Vorteile bzw. Nachteile bezüglich Spezifität der Hybridisierung, benötigter Materialmenge, Abdeckung des Genoms und anderer Faktoren (Hardiman 2004). Die implizite Annahme bei allen Chip-Eperimenten ist, dass das gemessene Signal (d. h. die Menge des an der Probe gebundenen markierten Materials) proportional zur Konzentration des entsprechenden Gens im untersuchten Material ist. Änderungen in der gemessenen Signalintensität können dann als Konzentrationsänderungen interpretiert werden. Die Signalintensität ist allerdings nur eine grobe Näherung für die tatsächliche Konzentration des Gens, und diese Interpretation ist nur dann korrekt, wenn die Beziehung zwischen Signalintensität und Konzentration annähernd linear ist. ChipExperimente zeigen allerdings oft Abweichungen von dieser Annahme, z. B. Sättigungseffekte, wenn das Signal über dem Detektionsniveau liegt oder andere nichtlineare Effekte, wenn das Signal unterhalb des Detektionsniveaus liegt. Whole-Genome-Chips enthalten Proben für einen Großteil des Genoms. Diese Chips werden typischerweise zu Beginn einer Studie verwendet, wenn Marker noch nicht bekannt sind, und neue Information gewonnen werden soll. Wenn allerdings a priori Information vorhanden ist, geht man oft aus Kostengründen, aber auch aus Gründen des Designs, zu themenspezifischen Chips über, die eine begrenzte Anzahl von Genen repräsentieren, z. B. mit Bezug auf eine bestimmte Krankheit (Krebs, Diabetes), auf eine bestimmte zelluläre Funktion (Kinasen) oder auf vorher bestimmte Markergene. Verschiedene Studien haben Chip-Plattformen miteinander verglichen (Parrish et al. 2004; Kuo et al. 2002;

Tan et al. 2003; Barnes et al. 2005). Die meisten Studien stellten dabei eine schwache Korrelation der globalen Genexpression fest. Die Gründe für diese schlechte Vergleichbarkeit liegen in Unterschieden bei der Bindungssensitivität aufgrund der unterschiedlichen Probenlängen, aufgrund der verschiedenen chemischen Behandlungen und aufgrund unterschiedlicher Datenprozessierung. DNS-Chips benutzen primär kurze Oligonukleotide (15–25 nt), längere Oligonukleotide (50–120 nt) und PCR-amplifizierte cDNS-Sequenzen (100–3.000 bp) als Proben. Kurze Oligonukleotide haben oft Spezifizitätsprobleme (Kreuz-Hybridisierungen) beim Herauslesen der Genexpression aus komplexem Zielmaterial im Vergleich zu cDNS-Sequenzen, die starke Signale produzieren und sehr spezifisch an ihr Gegenstück binden. Üblicherweise zeigen auch längere Oligonukleotidsequenzen eine bessere Spezifität, die mit der von cDNS vergleichbar ist (Stears et al. 2003). Eine weitere Variation besteht in der Annotation der Proben. Typischerweise variieren die Annotation und das Design der Proben, da die Chiphersteller verschiedene Datenbanken zugrunde gelegt haben, wie z. B. Unigene, Refseq, LocusLink, ENSEMBL etc. Diese Probenannotation muss regelmäßig aktualisiert werden, was zu gravierenden Änderungen in der Interpretation der Daten führen kann (Dai et al. 2005). Der wohl umfangreichste Plattformvergleich wurde in der MAQC-Studie durchgeführt (MAQC Consortium 2005). Hier wurden die meisten gängigen Plattformen in den Vergleich mit einbezogen, und anhand unterschiedlichen Materials (humanes Gehirn gegen humanen Gewebemix) die Korrelation der Expressionsunterschiede zwischen den verschiedenen Plattformen getestet. Die Studie kommt zu dem Ergebnis, dass die Oligonukleotid-Plattformen (Affymetrix, Agilent, Illumina) eine sehr gute Korrelation zeigen. Die Korrelation zwischen Oligonukleotid- und cDNS-Plattformen waren allerdings deutlich schlechter. Der Vergleich beruht auf einer Teilmenge von ca. 12.000 Genen, für die Proben auf allen Plattformen vorhanden waren, d. h., dem Datenvergleich war eine umfassende Reannotation der Proben vorangegangen. Alternativ zu Biochips gibt es noch weitere Hochdurchsatzverfahren zur Bestimmung der Genexpression, z. B. SAGE, ArrayCGH und EST-Sequenzierung. Eine völlig neue Technologie zur Messung der Genexpression wurde kürzlich mit der „2nd-generation-sequencing“Technologie eingeführt (454, Solexa). Diese hochparallele Technologie basiert auf dem „Sequencing-by-Synthesis“-Prinzip, bei dem DNS-Moleküle auf Beads immobilisiert werden (454-System) oder auf einer planaren Oberfläche (Solexa) (Margulies et al. 2005). Danach wird die DNS amplifiziert und dient als Maske für einzelne fluoreszenzmarkierte Nukleotide. In einer Abfolge

69 1.4 · Analyse von Biochips: Von der Sequenz zum System

aus Zugabe von Nukleotiden und anschließender Bilderkennung der entsprechenden Markierung entsteht so in jedem Zyklus an jeder Position ein neues Nukleotid, und so kann am Ende der Prozedur die jeweilige Sequenz des im Zielmaterial vorkommenden Moleküls bestimmt werden. Die Methoden sind hochparallel und erlauben das Auslesen von Millionen von Sequenzresultaten in einem Experiment. Dieses Verfahren kann für viele Anwendungen verwendet werden, z. B. Genexpressionsanalysen, aber auch Analysen von Sequenzunterschieden wie Mutationen und Splice-Varianten (Thomas et al. 2006).

1.4.3 Biochips II: Messung transkriptioneller Abhängigkeiten Der Weg vom Gen zu seinem Protein beginnt bei der DNS-abhängigen Synthese der RNS (Transkription). Sämtliche Faktoren, die regulatorisch auf den Prozess der Transkription wirken, gelten als Transkriptionsfaktoren (TF). Man unterscheidet dabei zwischen direkt und indirekt wirkenden Regulationen. Eine direkte transkriptionelle Regulation liegt vor, wenn der TF durch die Bindung an spezifischen DNS-Regionen, den Transkriptionsfaktorbindungsstellen (TFBSs), Einfluss auf die Expression eines Gens ausübt. Indirekte transkriptionelle Regulation liegt vor, wenn ein TF über nachgelagerte Prozesse regulatorisch auf die Genexpression wirkt. Insgesamt wirken TF entweder verstärkend (Aktivatoren) oder aber unterdrückend (Repressoren) auf die Transkription ihrer Zielgene. In den letzten Jahren wurden Verfahren entwickelt, mit denen man diese transkriptionellen Abhängigkeiten im Experiment messen kann. Die Verbindung dieser Techniken mit Biochips erlaubt dabei die hochparallele, genomweite Messung des Transkriptionseffekts. Durch ein RNS-Interferenz- (RNAi-)Experiment ist es möglich, kausale Zusammenhänge in Bezug auf die transkriptionellen Abhängigkeiten von TF und ihren Zielgenen zu detektieren (7 1.4.3.1). Ohne weitere Zusatzinformationen ist es jedoch nicht möglich, zwischen direkter und indirekter transkriptioneller Regulation zu unterscheiden. Ein experimenteller Ansatz, um direkte transkriptionelle Zusammenhänge zwischen TF und Zielgenen zu messen, ist Chromatin-Immunopräzipitation mit anschließender Hybridisierung auf einem Biochip (ChIP-on-Chip, 7 1.4.3.2).

1.4.3.1 RNS Interferenz (RNAi) Mittels eines RNS-vermittelten Interferenzexperiments (RNAi) ist es möglich, die Proteinbiosynthese eines Gens

1.4

posttranskriptionell zu verringern („silencing“, „knockdown“) (Carrington u. Ambros 2003; Paddison et al. 2002). Während des zweiten Abschnitts der Proteinbiosynthese, der Translation, dient die mRNS als Matrize für den sukzessiven Aufbau eines Polypeptids. Die Quantität der Proteinbiosynthese ist u. a. limitiert durch die Konzentration der entsprechenden mRNS. Der Wirkungsmechanismus eines RNAi-Experiments liegt in der Verringerung der Konzentration der mRNS eines Gens. Durch ein RNAi-Experiment kann gezielt die Degradierung ausgesuchter mRNS induziert werden, was folglich zu einer Verminderung der Proteinsynthese und somit zur Verminderung der Aktivität des entsprechenden Proteins führt. Die Degradierung von mRNS wird durch kurze doppelsträngige RNS- (dsRNS-)Moleküle initiiert. dsRNS-Fragmente, die regulatorisch auf die Genexpression wirken, wurden zunächst in den Modellorganismen Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster und Arabidopsis thaliana untersucht (Fire et al. 1998; Lee et al. 1993; Lim et al. 2003; Llave et al. 2002; Reinhart et al. 2002), kommen aber nicht nur in wirbellosen Tieren und Pflanzen vor, sondern ebenso in Vertebraten (Lagos-Quintana et al. 2003; Lim et al. 2003). Es gibt unterschiedliche Klassen regulatorischer dsRNS. MikroRNS (miRNAs) haben eine Länge von 20–25 bp und entstehen aus Vorläufer-RNS, welche von nicht proteinkodierenden DNS-Regionen des Genoms transkribiert werden. Diese einzelsträngigen VorläuferRNS vollziehen eine selbstkomplementäre Faltung und werden daraufhin durch die Ribonuklease-Dicer geschnitten. Small-interfering-RNS-Fragmente (siRNAs) entstehen ebenfalls durch das Schneiden längerer Vorläufer dsRNS durch Dicer (Agrawal et al. 2003). Die Vorläufer-RNS sind im Falle von siRNAs jedoch exogener Herkunft (z. B. durch die Infektion mit einem Virus oder durch In-vitro-Manipulationen). Trotz ihrer unterschiedlichen Abstammung sind miRNAs und siRNAs funktionell gleich (Carrington u. Ambros 2003). Der Vorgang des Gene Silencing beginnt mit der Inkorporation der dsRNS-Fragmente in einen RNS-induzierten Silencing-Komplex (RISC). Nach dem Abbau eines der beiden Stränge der dsRNS kann es zur Hybridisierung zwischen der weiterhin im RISC inkorporierten einzelsträngigen RNS und komplementärer proteinkodierender mRNS kommen. Die katalytische Komponente des RISC, die Argonaut-Proteine, sind Endonukleasen und werden durch die Bindung der mRNS dazu veranlasst, diese zu degradieren (> Abb. 1.4.3) (Carrington u. Ambros 2003; Ronemus et al. 2006). Durch die Transfizierung einer Zellkultur mit TFspezifischen siRNAs ist es somit möglich, die Aktivität dieses TF stark zu reduzieren. Dieses Vorgehen erlaubt es, den transkriptionellen Einfluss des ausgeschalteten

70

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

. Abb. 1.4.3. Mechanismus der RNS-Interferenz (RNAi). Doppelsträngige RNS endogener (miRNA) oder exogener (siRNA) Herkunft wird durch die Endoribonuklease DICER in kleine Fragmente der Länge 10–25 bp geschnitten. Die kurzen dsRNS-Fragmente werden in

den RNS-induzierten Silencing-Komplex (RISC) inkorporiert, und ein Strang der dsRNS wird abgebaut. Komplementäre mRNS bindet an die RISC-gebundene RNS. Die anschließende Degradierung der mRNS führt zu dem Effekt des Gene silencing

TF auf andere Gene zu untersuchen. 24 bis 72 Stunden nach der Transfizierung kann mithilfe eines Biochips das Transkriptionsprofil der Zellkultur gemessen werden. Zur Kontrolle wird zum gleichen Zeitpunkt das Transkriptionsprofil eines biologischen Replikats der verwendeten Zellkultur ermittelt, welches anstatt mit den TF-spezifischen siRNAs mit unspezifischen siRNAs transfiziert wurde. Der Vergleich der Transkriptionsprofile zwischen spezifischer und unspezifischer RNAi spiegelt den Einfluss des ausgeschalteten TF auf die Transkription wider und erlaubt somit eine Identifizierung seiner Zielgene.

bezeichnet, und von dieser wird ein Teil für eine spätere Verwendung zurückbehalten. Durch die Zugabe von TF-spezifischen Antikörpern wird eine Anreicherung solcher DNS-Fragmente initiiert, die in der Probe von dem zu untersuchenden TF gebunden sind. Aufgrund der selektiven Bindung der Antikörper an den zu untersuchenden TF ist es möglich, eine Fällung der TF spezifischen DNS-Fragmente zu erreichen (Sandmann et al. 2006). Im Vergleich zu der Input-Probe liegt jetzt eine Probe vor, in der es eine Anreicherung von solchen DNS-Fragmenten gibt, an die der TF im natürlichen Zustand der Zellkultur gebunden ist. Eine weitere Erhöhung der Konzentration der DNS-Fragmente ist durch PCR möglich. Diese Probe wird als IP- („immunoprecipitated“-)Probe bezeichnet (> Abb. 1.4.4). Um den DNS-Fragmenten, an denen der TF gebunden ist, Positionen auf dem Genom zuordnen zu können, wird eine Variante der Biochips verwendet, die als Promotor- oder Tiling-Chip bezeichnet wird. TFBS sind gehäuft in der proximalen Promotorregion zu finden (bis zu 250bp vor der Anfangsposition der Transkription [TSS] eines Gens in Richtung der 5’-Region). Nichtsdestotrotz können TFBS auch in weiter entfernten Promotorregionen oder sogar erst hinter der TSS lokalisiert sein. Somit wird die Suche nach regulatorisch wirkenden DNS-Protein-Bindungsregionen in der Praxis häufig auf einen Bereich von –8 kb und bis zu +2 kb um die TSS eines Gens ausgedehnt (Boyer et al. 2005). Hierzu werden Oligonukleotide generiert, die in regelmäßigen Abständen komplementär zu diesem Bereich sind. Das

1.4.3.2 Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP-on-Chip) Der Ausdruck ChIP-on-Chip setzt sich aus der Kombination zweier unterschiedlicher Techniken zusammen. Insgesamt dient der Ansatz der Suche nach ProteinDNS-Interaktionen. Zunächst werden die Protein-DNSVerbindungen, wie sie im natürlichen Zustand innerhalb der zu untersuchenden Zellkultur vorkommen, durch die Zugabe von Formaldehyd vernetzt und somit stabilisiert (Orlando 2000). Daraufhin wird die DNS durch den Einsatz von Ultraschall in kleine Fragmente der Länge 0.2–1 kb zerlegt. Dies führt dazu, dass innerhalb der Probe sowohl proteingebundene, als auch ungebundene DNS-Fragmente vorliegen. In diesem Zustand wird die Probe häufig als genomische bzw. Input-Probe

71 1.4 · Analyse von Biochips: Von der Sequenz zum System

1.4

b

a

c

d

. Abb. 1.4.4a–d. Prinzip der Chromatin-Immunopräzipitation. a Die Protein-DNS-Verbindungen werden durch die Zugabe von Formaldehyd fixiert. Durch Ultraschall wird die DNS in Fragmente der Länge 0,2–1 kb zerlegt (Input-Probe). In einem Teil der Probe wird die Fällung bestimmter DNS-Protein-Komplexe durch die Zugabe von TF-spezifischen Antikörpern erreicht (IP-Probe). Anschließend erfolgt ein Zweifarbenexperiment mit einer Reihe von Tiling-Chips.

b Der Bereich um die Transkriptions-Startposition (TSS) eines Gens wird in regelmäßigen Abständen durch komplementäre Oligonukleotide abgetastet. c Gegenüberstellung der absoluten Intensitätswerte der IP- und Input-Probe (log2). d Beispiel einer chromosomalen Region, die von einem spezifischen TF gebunden wurde. Die Intensitätswerte benachbarter Oligonukleotide sind in der IP-Probe signifikant größer als in der Input-Probe

Verhältnis zwischen der Länge der Oligonukleotide und ihrem Abstand zueinander bestimmt die Dichte eines Tiling-Chips und somit ebenfalls die Genauigkeit der späteren Zuordnung einer TFBS zu ihrer genomischen Position. Bei einer Länge von ca. 60 bp pro Oligonukleotid und einem Abstand relativ zur genomischen Sequenz von durchschnittlich 240 bp zueinander, werden ca. 35 Oligonukleotide benötigt, um den oben genannten Bereich abzudecken. Mithilfe eines solchen Tiling-Chips wird die Konzentration der TF-spezifischen DNS-Fragmente der IP-Probe im Verhältnis zu der Konzentration der TF-unspezifischen DNS-Fragmente der Input-Probe bestimmt. Hierbei werden die IP- und die Input-Proben mit zwei unterschiedlichen Farbstoffen markiert, auf den Tiling-

Chip aufgetragen (Zweifarbenexperiment) und für jedes Oligonukleotid sowohl die beiden absoluten Intensitätwerte gespeichert, als auch das Verhältnis zwischen IP- und Input-Probe berechnet. Die Bestimmung von signifikant unterschiedlichen Intensitätswerten erfolgt dann mit einigen Variationen analog zu den Zweifarben experimenten bei Whole-Genome-Chips (vgl. 7 1.4.2 und 1.4.5). Erste Tiling-Chip-spezifische Methoden wurden kürzlich veröffentlicht (Boyer et al. 2005; Li et al. 2005; Ji und Wong 2005).

72

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

1.4.3.3 Sequenzbasierte Motivsuche Mithilfe der Röntgenkristallographie ist es möglich, Protein-DNS-Bindungen zu visualisieren (Reményi et al. 2003). Dadurch wird deutlich, dass die Bindungsdomänen der TF auf unterschiedliche Weise Wechselwirkungen mit der DNS eingehen können. Darüber hinaus können TF in Konglomeraten mit anderen TF oder mit weiteren transkriptionellen Kofaktoren DNS binden. Die Sequenzspezifizität eines TF lässt somit Variabilität zu. Die TFBS eines TF ist folglich nicht zwingend eine feste lineare Sequenz, sondern ein variables Motiv. Die Länge einer TFBS ist mit etwa 8–14 bp relativ kurz (Matys et al. 2006). Ist das Sequenzmotiv bekannt, für dass ein TF eine Bindungsaffinität besitzt, so kann dieses genutzt werden, um in der genomischen DNS nach potenziellen Bindungsstellen zu suchen. Ebenso können Protein-DNS-Bindungen, die durch ein ChIP-on-Chip-Experiment aufgedeckt wurden, durch die Suche nach bekannten TFBS validiert werden. Die Motivsuche ist somit ein weiteres Werkzeug, um transkriptionelle Abhängigkeiten zu untersuchen.

Die Identifizierung eines Musters in der DNS, welches als Bindungsstelle für einen TF gilt, ist aufgrund der Sequenzvariabilität bei Protein-DNS-Bindungen nicht trivial, und es gibt eine Vielzahl algorithmischer Ansätze zur Lösung dieses Problems. Ein Großteil dieser Algorithmen erwartet als Eingabe einen Sequenzdatensatz, der bereits potenzielle Zielgene eines TF enthält. Eine mögliche Quelle hierfür sind z. B. Sequenzabschnitte, die in einem ChIP-on-Chip-Experiment von einem TF gebunden wurden, aber auch Promotorsequenzen von Genen, die über experimentelle Zustände koreguliert sind (vgl. 7 1.4.6). In solchen TF-spezifischen Sequenzdatensätzen wird dann nach Motiven gesucht, die statistisch überrepräsentiert sind (MacIsaac u. Fraenkel 2006). Die Vorgehensweisen der verschiedenen Algorithmen lassen sich grob in deterministische (Pavesi et al. 2004) und probabilistische (Hughes et al. 2000; Bailey u. Elkan 1994) Methoden unterteilen. Darüber hinaus bieten multifunktionale Softwarepakete neben der Möglichkeit, verschiedene Algorithmen sequenziell auf einen Datensatz anwenden zu können, noch weiterführende

a

b

. Abb. 1.4.5a,b. Überblick über Sequenzanalyseprogramme. a Zusammenstellung von Anwendungen, Softwarepaketen und Datenbanken zu Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen. b Darstellung eines

Bindungsmotivs. Die Höhe eines Buchstabens entspricht der Häufigkeit seines Auftretens in den Referenzsequenzen

73 1.4 · Analyse von Biochips: Von der Sequenz zum System

Analysemethoden (> Abb. 1.4.5). Hierzu gehört u. a. der Vergleich von Motiven untereinander, das Clustern von Motiven, eine Signifikanzanalyse gefundener Motive sowie das Suchen gegebener Motive in weiteren Sequenzen (Gordon et al. 2005). TF-spezifische Motive werden in speziellen Datenbanken gespeichert und können von dort abgerufen werden (Matys et al. 2006; Sandelin et al. 2004).

1.4.4 Bildauswertung und Qualitätskontrolle von Biochips 1.4.4.1 Datenakquirierung Üblicherweise erfolgt die digitale Quantifizierung der Biochips über einen Laserscanner. Jeder Chiphersteller vertreibt dabei ein eigenes Scannergerät, das an die entsprechenden Datenträger angepasst ist und den entsprechenden experimentellen Bedingungen (z. B. Oberflächenchemie) genügt. Der Scanner liefert für jeden Ort auf dem Chip einen Wert, der den Grad der aufgenommenen Fluoreszenz beschreibt. Die gescannte Region wird dabei in kleine Flächen aufgeteilt (Pixel). Der von der Auflösung bestimmte Wert für einen Pixel schwankt zwischen 0 und 65.536 (16-bit-Bild). Bei Zweifarbenexperimentenwerden zwei Bilder in getrennten Scan-Prozeduren erzeugt. Dabei nutzt man die Tatsache, dass die verwendeten Farbstoffe (Cy3 und Cy5) Licht mit verschiedenen Wellenlängen absorbieren und emittieren, das dann in den entsprechenden Bereichen detektiert werden kann. Bei den Cyanin-Farbstoffen sind die Bereiche 510–550 nm für Cy3-Farbstoff und 630–660 nm für Cy5-Farbstoff. Die entsprechenden Prozeduren werden nacheinander durchgeführt.

1.4.4.2 Bildverarbeitung und Qualitätskontrolle Das Problem der Bildverarbeitung besteht darin, der jeweiligen Probe (Bildpunkt) eine Gruppe von Pixeln in dem digital abgespeicherten Bild zuzuordnen und diese zu quantifizieren (Lim 1990; Wolberg 1990). Die meisten Bildverarbeitungsprogramme sind zweistufige Verfahren: Im ersten Schritt wird versucht, das Zentrum eines jeden Bildpunkts zu finden, also die exakte Position der einzelnen Zielprobe auf dem Biochip (Gitterdetektion), und im zweiten Schritt wird für jeden Bildpunkt in einer definierten Pixel-Umgebung über eine mathematische Funktion die Signalintensität berechnet (Quantifizierung). Die Genauigkeit der Quantifizierung ist dabei von der Auflösung abhängig, mit der der Biochip aufgenommen wurde. Für eine hinreichende

1.4

Genauigkeit sollten diese Bildpunktbereiche nach der Bildaufnahme aus mindestens 5u5=25 Pixeln bestehen. Die entstehende Pixelmatrix kann für die Integration des Bildbereichs mit verschiedenen Faktoren korreliert werden, die beispielsweise das Zentrum des Bildpunktbereichs anders gewichten als seine Randbereiche. Einige Quantifizierungsmethoden gehen dabei von einer festen Pixelfunktion aus, z. B. einer Normalverteilung, sodass die Gewichte entsprechend der Dichtefunktion der Verteilung eingestellt werden können (Steinfath et al. 2001). Andere Methoden arbeiten verteilungsunabhängig und benutzen Klassifikationsmethoden, um den Pixelbereich in Signal- und Rauschbereich aufzuteilen (Segmentation) und diese getrennt zu quantifizieren (Jain et al. 2002). Ein wesentliches Element bei der Quantifizierung der Bildpunkte ist neben der Errechnung der Bildpunktintensität die Berechnung eines lokalen Hintergrundes, um chipspezifische Einflussfaktoren zu eliminieren. Daher geht meist nicht nur der Bildpunkt in die Quantifizierung ein, sondern auch dessen Nachbarschaft. Weitaus die meisten Bildverarbeitungsprogramme sind semiautomatische Verfahren und erfordern die nutzergesteuerte Einstellung des Bildpunktgitters. Diese semiautomatischen Verfahren haben zwei entscheidende Nachteile: 1. Die Nutzerinteraktion ist bei durchaus realistischen Größenordnungen von 20.000–100.000 Bildpunkten sehr zeitaufwendig und 2. Die Nutzerinteraktion ist oft fehlerhaft und führt zu schlecht reproduzierbaren Resultaten. Vermehrt wird daher an vollautomatischen Verfahren gearbeitet, die das Bildpunktgitter automatisch finden. Dabei müssen Rotation des Gitters und lokale Verzerrungen der einzelnen Bildpunkte berücksichtigt werden. In der Praxis genutzte kommerzielle Bildverarbeitungsprogramme sind z. B.: 1. ImaGene (www.biodiscovery.com) 2. GeneSpotter (www.microdiscovery.com) 3. GenePix (www.moleculardevices.com/) 4. AIDA (www.raytest.com) 5. ArrayVision (www.imagingresearch.com) Bei der korrekten Bestimmung eines Intensitätswertes für den jeweiligen Bildpunkt gibt es eine Reihe von Punkten, die berücksichtigt werden müssen. Ein Problem besteht z. B. in der wechselseitigen Beeinflussung von Bildpunkten, die nicht klar voneinander getrennt sind, in schlecht gefundenen Gitterkoordinaten und lokalen Artefakten. Nach der Bildverarbeitung ist jeder Probe ein Intensitätswert zugeordnet, der proportional zur Konzentration des entsprechenden Gens im experimentellen Material ist. Zur Qualitätskontrolle verwenden die meisten

74

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

. Abb. 1.4.6. Qualitätskontrolle von Biochips mit der CheckReport-Software von MicroDiscovery GmbH

Chips Proben mit unterschiedlichen Kontrolleigenschaften, z. B. Verdünnungsreihen, um den dynamischen Bereich der Signalintensitäten abzudecken, Housekeeping-Gene, Positivkontrollen, um den oberen Signalbereich, und Negativkontrollen, um den unteren Signalbereich abzutasten. Numerische Kriterien wie z. B. Korrelationstabellen von technischen und biologischen Replika oder M/A-Graphiken, die die Abhängigkeit des Expressionsunterschieds von der Stärke des Signals wiedergeben, werden üblicherweise benutzt, um die Güte der Daten zu berechnen, zu visualisieren und damit fehlerhafte Experimente auszusortieren (> Abb. 1.4.6).

rung ihres Expressionsniveaus zeigen. Das mRNS-Material kann dabei z. B. aus gesundem und krankem Gewebe stammen, was Rückschlüsse auf die an der Krankheit beteiligten Gene und deren Proteine zulässt oder aus unterschiedlichen Stadien der Entwicklung eines Organismus, was die Charakterisierung entwicklungsspezifischer Gene erlaubt. Biochips ermöglichen die parallele Detektion differenziell exprimierter Gene und somit die umfassende Identifizierung von Markergenen und deren funktioneller Eigenschaften, z. B. erlauben sie detaillierte Rückschlüsse auf die mit den Markern verbundenen Signalübertragungswege. Insbesondere diese Charakteristik macht den Einsatz von Biochips für die pharmazeutische Forschung sehr attraktiv.

1.4.5 Detektion differenziell exprimierter Gene Eine wichtige Anwendung von Biochips besteht in der Identifizierung differenziell exprimierter Gene, d. h. solcher Gene, die bei Hybridisierung von mRNS-Material unterschiedlichen Ursprungs eine signifikante Ände-

1.4.5.1 Analyse von Expressionsunterschieden Um die differenzielle Expression eines Gens zu beurteilen, wurde ursprünglich lediglich der Expressionsquo-

75 1.4 · Analyse von Biochips: Von der Sequenz zum System

1.4

tient, also der Quotient aus gemessener Intensität bei Hybridisierung mit der Kontrollprobe und der behandelten Probe, als Kriterium verwendet (DeRisi et al. 1996, 1997; Schena et al. 1995, 1996; Iyer et al. 1999). Gene, deren Expression um mehr als einen bestimmten Schwellwert variierten, wurden als differenziell exprimiert bezeichnet. Als „zuverlässige“ Schwelle galt lange Zeit ein Faktor von mindestens 2, d. h. Genexpressionsunterschiede von weniger als 2 wurden als nicht signifikant eingestuft. Dieses Vorgehen ist allerdings zu ungenau und hängt ganz wesentlich von der Güte der Experimente ab. Gerade geringe Expressionsunterschiede, wie sie signifikant erst in einer ausreichenden Anzahl von (wenigstens 4) Experimenten nachgewiesen werden können, sind interessant – z. B., um eine Krankheit in einem frühen Stadium zu erkennen. Zahlreiche statistische Auswerteverfahren wurden – oft in Abhängigkeit von der Technologie – entwickelt, um den Expressionsquotienten zu bewerten (Greller u. Tobin 1999; Chen et al. 1997; Hilsenbeck et al. 1999; Lee et al. 2000; Roberts et al. 2000; Manduchi et al. 2000; Newton et al. 2001). Meist basieren diese Ver-

fahren auf bestimmten Verteilungsannahmen an die Struktur der Daten, z. B. auf der Modellierung mit geeigneten Dichtefunktionen. Eine wichtige Frage bei der Detektion differenziell exprimierter Gene betrifft die Anzahl der biologischen Wiederholungen, so dass eine verlässliche Berechnung der Signifikanz des Intensitätsquotienten gewährleistet ist. Eine einfache Simulation zeigt, wie die Höhe der detektierbaren differenziellen Expression von der Anzahl der Wiederholungen abhängt (> Abb. 1.4.7). Während augenfällige Expressionsunterschiede von 1:10 oder 1:5 bereits mit einem geringem Stichprobenumfang mit hoher Wahrscheinlichkeit detektierbar sind, kommt es gerade bei den kleinen Expressionsunterschieden sehr stark auf die Anzahl der Versuche an. Die Simulation zeigt, dass bei realistischer Annahme eines Experimentenfehlers von 15% und 4 experimentellen Wiederholungen bereits 90% der Expressionsunterschiede 1:2 detektiert werden können, aber nur 55% der Expressionsunterschiede 1:1,5. Um hier auf das gleiche Niveau zu gelangen, müssten mindestens sieben biologische Replika gemacht werden.

. Abb. 1.4.7. Simulation zur Detektion differenziell exprimierter Gene. Der Expressionsquotient, der durch statistische Tests detektiert werden kann, ist abhängig vom Stichprobenumfang, d. h., wieviele biologische Replika gemacht wurden. Hierzu wurden aus simulierten Verteilungen entsprechend dem eingestellten Grad der differenziellen Expression (z. B. 1:2, rote Kurve) und entsprechend dem Stichprobenumfang Daten zufällig gezogen (X-Achse). Die t-Test-Statitistik wurde berechnet und notiert, ob die differenzielle Expression signifi-

kant zum Niveau 0,05 detektiert wurde. Der Vorgang wurde 1000-mal wiederholt, und der Anteil korrekt detektierter Expressionsunterschiede wurde aufgetragen (Y-Achse). Zum Beispiel zeigt die Simulation, dass bei 4 Wiederholungen über 90% aller Expressionsquotienten von 1:2 detektiert werden können. Kleinere Expressionsunterschiede können nur mit genügendenWiederholungen reproduzierbar detektiert werden (1:1,5 schwarz, 1:2 rot, 1:3 grün, 1:5 blau, 1:10 gelb, 1:20 lila)

76

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

1.4.5.2 Statistische Testentscheidungen

und weiterhin

Die Verwendung von statistischen Tests zur Detektion differenziell exprimierter Gene hat sich als sehr zuverlässig und sensitiv erwiesen (Claverie 1999; Ideker et al. 2000; Callow et al. 2000; Baldi u. Long 2001; Thomas et al. 2001; Herwig et al. 2001). Hierbei muss allerdings vorausgesetzt werden, dass genügend Wiederholungen der Chip-Experimente vorliegen. Mathematisch handelt es sich bei den meisten verwendeten Testverfahren um das sog. Zwei-StichprobenLokationsproblem (Lehmann 1975; Best u. Rayner 1987). Für jede Probe erhält man bei Wiederholung des Experiments zwei Folgen von Intensitätswerten, X1,...,XN und Y1,...,YM (behandelte Gruppe und Kontrollgruppe). Bei der statistischen Modellierung geht man davon aus, dass die Messreihen einer bestimmten Wahrscheinlichkeitsverteilung genügen, z. B. einer Normalverteilung. Es werden dann zwei Hypothesen gebildet: x H0: Die Messreihen haben denselben Mittelwert (Nullhypothese). x H1: Die Messreihen haben verschiedene Mittelwerte (Alternative).

sprechenden Mittelwerte. Diese Teststatistik hat eine vorgegebene Verteilung. Unter der Bedingung, dass Kontroll- und Behandlungsgruppe beide normalverteilt sind, ist dies eine t-Verteilung mit M+N–2 Freiheitsgraden. Zu jedem experimentellen Ergebnis kann daher ein P-Wert berechnet werden, der die Wahrscheinlichkeit unter der Nullhypothese angibt, mit der diese t-Verteilung einen noch extremeren Wert annimmt als den beobachteten. Somit ist der P-Wert ein Maß für die Signifikanz der Abweichung der Daten von der Nullhypothese, und daher indiziert ein kleiner P-Wert, dass das entsprechende Gen differenziell exprimiert ist. T-Tests sind parametrische Verfahren, die voraussetzen, dass die Daten einer parametrisierbaren Wahrscheinlichkeitsverteilung folgen, in diesem Fall einer Normalverteilung, während der Wilcoxon-Rangsummentest und der Permutationstest nichtparametrische Verfahren sind, die eine wesentlich schwächere Verteilungsannahme benötigen und daher für größere Problemklassen anwendbar sind. Ist also in der Praxis nicht klar, dass die gemessenen Intensitätswerte normalverteilt sind, so kann auf die nichtparametrischen Verfahren zurückgegriffen werden. Bei einem statistischen Test treten zwei Arten von Fehlern auf (> Tab. 1.4.1). Entscheidet man aufgrund der Teststatistik positiv, d. h., der Test suggeriert differenzielle Expression, aber das Gen ist nicht differenziell exprimiert (falsch-positiv), so spricht man vom Fehler 1. Art (V). Entscheided man aufgrund der Teststatistik negativ, d. h., der Test suggeriert keine differenzielle Expression, aber das Gen ist differenziell exprimiert (falschnegativ), so spricht man vom Fehler 2. Art (T). Allen statistischen Testentscheidungen ist gemein, dass sie nur jeweils einen dieser Fehler kontrollieren können. Kontrolliert man den Fehler 1. Art, so gibt man dazu ein Signifikanzniveau D vor (im Allgemeinen  D = 0.01 bzw. D = 0.05) und klassifiziert alle Gene als signifikant differenziell exprimiert, die einen P-Wert unterhalb dieser Schwelle haben. Bei zutreffenden Verteilungsannahmen bedeutet dies, dass der Fehler 1. Art

Statistische Tests erlauben die Bewertung, ob diese Reihen aus der gleichen Population stammen (keine differenzielle Expression) oder nicht (differenzielle Expression). In der Praxis genutzte Testverfahren sind hierbei: x t-Test mit gleichen Varianzen x t-Test mit ungleichen Varianzen x Wilcoxons Rangsummentest (auch Mann-WhitneyU-Test) x Permutationstests Allen Tests ist gemeinsam, dass sie über eine Teststatistik, d. h. eine mathematische Funktion auf den Daten, einen P-Wert errechnen, der es erlaubt, die Signifikanz der differenziellen Expression zu bewerten. Beim t-Test hat die Teststatistik z. B. die Form

und

die ent-

. Tab. 1.4.1. Fehler von statistischen Testentscheidungen.

wobei SX2 und SY2 die empirischen Varianzen der Kontrollgruppe und der behandelten Gruppe sind, d. h.

bzw.

Teststatistik für Probe nicht signifikant

Teststatistik für Probe signifikant

Gen nicht differenziell exprimiert

Kein Fehler U

Fehler 1. Art V

Gen differenziell exprimiert

Fehler 2. Art T

Kein Fehler S

77 1.4 · Analyse von Biochips: Von der Sequenz zum System

kleiner als das vorgegebene Signifikanzniveau D gehalten wird.

1.4.5.3 Korrekturverfahren für statistische Testentscheidungen Der hohe Parallelisierungsgrad von Chipexperimenten induziert das Problem des multiplen Testens. Selbst wenn das vorgegebene Signifikanzniveau für eine einzelne Probe eingehalten werden kann, bedeutet z. B. ein Niveau von D = 0.05, dass 5% aller Gene falsch-positiv klassifiziert werden. Bei einem Durchsatz von 10.000 Genen bedeutet dies immerhin eine Menge von theoretisch möglichen 500 falsch-positiven Kandidaten. Um mögliche Folgekosten etwa bei Northern Blots oder RT-PCR-Experimenten zu vermeiden, können also strengere Kriterien angesetzt werden. Dies leisten statistische Korrekturverfahren. Die Wahrscheinlichkeit, eine korrekte Ablehnung der Nullhypothese zu bekommen, ist bei einer Einzelmessung ps = (1 – Ds) und daher (bei Annahme unabhängiger Einzelmessungen) bei der globalen Messung pg = (1 – Ds)n. Die Wahrscheinlichkeit, in einem der Einzeltests einen Fehler 1. Art zu machen, ist daher Dg = P (V > 0) = 1 – (1 – Ds)n (vgl. > Tab. 1.4.1). Dieser Fehler kann sehr schnell sehr groß werden. Zum Beispiel ist die Wahrscheinlichkeit, bei 100 Einzeltests mit einem jeweiligen Signifikanzniveau von 0,05 einen Fehler 1. Art zu machen, bereits 0,994. Diesen Fehler nennt man FWER („family-wise error rate“) des Experiments. Zweck der Korrekturverfahren ist es, statt des Signifikanzniveaus Ds der Einzelmessung dieses globale Signifikanzniveau Dg zu kontrollieren. Bei der Bonferroni-Korrektur wird dabei der angestrebte P-Wert durch die Anzahl der durchgeführten Tests, also die Anzahl der getesteten Gene, dividiert und nur solche Gene als signifikant angesehen, deren P-Wert unterhalb dieser korrigierten Schwelle liegt. Dies bedeutet bei 10.000 Genen und einem P-Wert von 0,05 eine korrigierte Schwelle von 5*10-6. Die Bonferroni-Korrektur (und auch alternative Verfahren wie die Korrektur nach Holm) ist allerdings zu streng und lässt in der Praxis zu wenig interessante Kandidaten zu. Mit anderen Worten, durch strengere Kontrolle des Fehlers 1. Art steigt der Fehler 2. Art. Daher wurden Verfahren entwickelt, die das multiple Testen durch sog. ResamplingMethoden bewerten (Shaffer 1995; Westfall u. Young 1993). Diesen Methoden liegt folgende Überlegung zugrunde: Man berechnet für ein Gen den Wert anhand der Teststatistik. Dies geschieht durch die bekannte Gruppeneinteilung von N Werten der Kontrolle und M Werten der Behandlung. Permutiert man diese Werte, d. h., teilt man die N+M-Werte willkürlich in zwei Grup-

1.4

pen der Größen N und M und errechnet für diese Permutation den Wert der Teststatisitik, so erhält man einen Wert, der unabhängig von der biologischen Gruppierung ist. Dieses Vorgehen wiederholt man für alle möglichen Permutationen und zählt diejenigen Fälle, bei denen man einen noch extremeren Wert für die Teststatistik erhält als den errechneten. Als adjustierten P-Wert erhält man den Quotienten aus denjenigen Fällen, die man gezählt hat, und der Anzahl aller möglichen Permutationen. Die Anzahl der Permutationen wächst sehr rasch, sodass man ab einer bestimmten Gruppengröße nicht mehr alle Permutationen durchzählen kann. Zum Beispiel für N = M = 3 gibt es 20 mögliche Permutationen, für N = M = 6 bereits 924 und für N = M = 12 gibt es 2.704.156 Permutationen. Bei der Auswertung von Chipdaten benötigt man eine Abschätzung des Fehlers 1. Art, die einen geeigneten Kompromiss zwischen zu vielen falsch-positiven Ergebnissen auf der einen Seite (keine Korrektur) und zu wenig signifikanten Ergebnissen auf der anderen Seite findet (FWER-Korrektur). Alternativ zur Kontrolle der FWER ist dafür die Berechnung der „false discovery rate“ (FDR) eingeführt worden. Die FDR ist die erwartete Anzahl von Fehlern 1. Art unter den abgelehnten Hypothesen E (Q), Q = V/(V + S) (Benjamini u. Hochberg 1995). Im Allgemeinen führt die FDR zu mehr signifikanten Ergebnissen als die Korrekturmethoden zur FWER, weshalb diese Verfahren im Moment sehr populär sind. Verschiedene Methoden zur Berechnung der FDR werden in Tsai et al. (2003) diskutiert.

1.4.5.4 Vergleich von statistischen Testentscheidungen und Verifizierung von Markergenen Die Güte eines Testverfahrens wird oft durch ROC- („receiver operating characteristic“-)Kurven dargestellt (> Abb. 1.4.8), indem man die Falsch-positiv-Rate (X-Achse) der Wahr-positiv-Rate (Y-Achse) gegenüberstellt. Idealerweise hat eine ROC-Kurve ein Integral von 1 und ist eine gerade Linie (keine falsch-positiven Testentscheidungen, maximale Sensitivität), sodass verschiedene statistische Testentscheidungen anhand des Integrals ihrer ROC-Kurve verglichen werden können. ROC-Kurven-Analysen setzen allerdings die Kenntnis über entsprechende Kontrollen voraus, z. B. die Verwendung von Genen, die in beiden Zuständen in der gleichen bzw. verschiedenen Konzentrationen vorkommen. Ist diese Voraussetzung nicht gegeben, so müssen die statistischen Testentscheidungen mit alternativen Technologien überprüft werden.

78

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

. Abb. 1.4.8. ROC-Kurven zum Vergleich von Normalisierungsverfahren und statistischen Testentscheidungen. Sechs unabhängige Experimente wurden gemacht, um Wildtyp-Zebrafische gegen chemisch behandelte Zebrafische (Lithium) zu vergleichen. 105 cDNS wurden als differenziell exprimiert durch unabhängige Methoden (ISH) erkannt und dienen als Wahr-positiv-Gruppe. Die Falsch-positivGruppe bilden 2.304 Kopien einer Arabidopsis-thaliana-cDNS, die in gleichen Konzentrationen dem entsprechenden Zielmaterial beigegeben wurden. Linkes Bild: Güte eines nichtparametrischen Tests

(Van-der-Waerden-Test) bei der Detektion differenziell exprimierter Gene mit verschiedenen Normalisierungsmethoden zur Datenprozessierung, Mediannormalisierung (schwarz), Varianzstabilisierung (rot) und lineare Regression (grün). Rechtes Bild: Student-t-test mit denselben Methoden zur Datenprozessierung. Anhand der ROC-Analyse erkennt man, dass der nichtparametrische Test eine bessere Güte als der t-Test hat und dass es auch innerhalb der Methoden zur Datenprozessierung Unterschiede gibt

Die Verifizierung von Markergenen durch unabhängige Methoden beschränkt sich allerdings aus Kostengründen auf eine Teilmenge von Genen. Die jeweilige Methode, die zur Verifizierung benutzt wird, richtet sich nach der experimentellen Fragestellung. Ist etwa die Lokalisierung der Genexpression von Interesse (z. B. beim Vergleich verschiedener Gewebe und der Detektion gewebespezifischer Marker), so nutzt man zur Visualisierung der Expressionsunterschiede WISHs („wholemount in situ hybridisations“) (Dickmeis et al. 2001; Poustka et al. 2007) (> Abb. 1.4.9a,b). Das Standardverfahren zur Validierung von Chipdaten ist RT-PCR (Kahlem et al. 2004; Adjaye et al. 2005) (> Abb. 1.4.9c). RT-PCR ist eine sehr sensitive Technologie, die auf der Amplifizierung der Markerprobe im Zielgewebe durch Polymerasekettenreaktion beruht. Durch einen Vergleich mit einer Kontrollprobe werden durch spezielle Verfahren auch kleine Expressionsänderungen detek-

tiert (Pfaffl 2001). Experimentelle Ergebnisse zeigen, dass ca. 85–95% der Expressionsunterschiede bei ChipExperimenten durch RT-PCR verifiziert werden können (Canales et al. 2006).

1.4.6 Analyse von Genexpressionsprofilen Eine wichtige Fragestellung beim Einsatz von Biochips besteht darin, die Expression der Gene über eine Reihe von Zuständen zu messen – z. B., um zeitaufgelöste Änderungen der Genexpression bei Zugabe von Medikamenten zu untersuchen, um die Transkriptionsstärke in verschiedenen Stadien der Entwicklung eines Organismus zu analysieren oder um die Transkriptionsstärke in verschiedenen Geweben zu untersuchen. Dazu wird entsprechend der biologischen Fragestellung für jeden Zu-

79 1.4 · Analyse von Biochips: Von der Sequenz zum System a

1.4

b

c

. Abb. 1.4.9a–c. Validierung von Chip-Experimenten. a Visuelle Verifizierung von Expressionsunterschieden zweier Gene (in Duplikaten) aus einer Studie zur Entwicklung im Zebrafisch (Dickmeis et al. 2001). Beide cDNS zeigen eine Überexpression beim Vergleich mit Tar*-injiziertem Zielmaterial mit dem Tar-Wildtyp. b In-situ-Hybridisierung

(ISH) validiert diese lokalisierte Genexpressionsunterschiede. c Korrelation zwischen Expressionsunterschieden von Biochip-Daten (blaue Balken) und qPCR (graue Balken) im Mausgehirn (Kortex) beim Vergleich von Kontrollmäusen mit genetisch veränderten Modellmäusen (TS65DN-Maus als Modell für Trisomie 21) (Kahlem et al. 2004)

stand ein Chip-Experiment durchgeführt und für jede Probe auf dem Biochip ein sog. Genexpressionsprofil erstellt, also ein Vektor von Intensitätswerten, der die Stärke der Transkription in den entsprechenden Experimenten beschreibt. Ziel der Bioinformatik ist es dann, durch Gruppierung der Genexpressionsprofile Gengruppen zu identifizieren, die ein ähnliches Profil zeigen und somit koreguliert sind.

1.4.6.1 Ähnlichkeiten in multidimensionalen Beobachtungen Das Auffinden von Genen mit ähnlichen Genexpressionsprofilen führt zu der Annahme, dass diese Gene denselben regulatorischen Prozessen unterliegen müssen. Ferner bietet dieses Vorgehen die Möglichkeit, bisher uncharakterisierte Gene durch funktionell bekannte Gene mit ähnlichem Genexpressionsprofil zu charakterisieren.

80

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

Ziel der mathematischen Clusteranalyse ist es, die verschiedenen Gengruppen zu berechnen, so dass Gene mit ähnlichen Expressionsprofilen in dieselbe Gruppe eingeordnet werden und Gene mit verschiedenen Expressionsprofilen in verschiedene Gruppen (Duda u. Hart 1973; Jain u. Dubes 1988; Mirkin 1996). Misst man an N Genen P verschiedene Zustände, z. B. P verschiedene Zeitpunkte nach Behandlung mit einem Medikament oder Hybridisierung mit mRNS aus P verschiedenen Geweben, so führt das zu einer NxP-Datenmatrix in der jede Zeile dem Genexpressionszustand eines Gens auf dem Biochip entspricht und in der jede Spalte den Genexpressionszustand eines Zustands über alle Gene widerspiegelt. Die mathematische Ähnlichkeit zweier Datenpunkte (Gene) wird üblicherweise durch ein Distanzmaß bzw. Ähnlichkeitsmaß gemessen, das die Genexpressionszustände numerisch bewertet. Ist also X = (x1 ,...,xP) der Vektor, der die Expression von Gen X über die P Versuche beschreibt, und ist Y = (y1 ,... ,yP) der Vektor, der die Expression von Gen Y über die P Versuche beschreibt, so ist z. B. ein häufig benutztes Distanzmaß die Euklidische Distanz

Sind die Genexpressionsprofile der Gene über die P Versuche ähnlich, so wird dieses Maß einen kleinen Wert liefern, also eine hohe Ähnlichkeit indizieren, weichen die Genexpressionsprofile voneinander ab, so liefert dieses Maß einen großen Wert. In der Literatur benutzte Distanz- bzw. Ähnlichkeitsmaße sind: x Euklidische Distanz x Hamming-Distanz x Pearson-Korrelationskoeffizient x Rangkorrelationskoeffizient x Transinformation Ein Clusteralgorithmus entscheidet anhand eines solchen Ähnlichkeitsmaßes, ob zwei Gene in dieselbe Gruppe gehören oder nicht. Sind mehrere Genexpressionsvektoren im gleichen Cluster, so wird ein gemeinsamer den Cluster repräsentierender Genexpressionsvektor berechnet, z. B. als Mittelwert der dem Cluster zugeordneten Genexpressionsvektoren. Dadurch kann wiederum die Ähnlichkeit zwischen zwei Clustern berechnet werden.

1.4.6.2 Auffinden koregulierter Gene durch Clusteranalyse Häufig verwendete Clusterverfahren sind: x Hierarchische Verfahren x K-means x Graphentheoretische Ansätze x Selbstorganisierende Karten (SOM) Hierarchische Verfahren starten mit N Clustern, d. h., jeder Datenpunkt wird einem Cluster zugeordnet. In jedem Schritt des Algorithmus werden diejenigen Cluster zusammengeführt, die die geringste Distanz (die größte Ähnlichkeit) voneinander haben. Bestehen die Cluster aus nur einem Datenpunkt, so werden die Genexpressionsprofile direkt verwendet, die Distanz zweier Cluster mit zwei oder mehr Elementen wird entweder über die Distanz der Mittelwertsvektoren der den Clustern zugeordneten Datenpunkte berechnet („average linkage“), über die minimale Distanz von Elementen aus beiden Clustern („single linkage“) oder über die maximale Distanz von Elementen aus beiden Clustern („complete linkage“) berechnet. Der Algorithmus ist dann beendet, wenn alle Genexpressionsvektoren demselben Cluster zugeordnet sind. Hierarchische Verfahren liefern also keine direkte Information über die Anzahl der im Datensatz enthaltenen Gruppen. Die Ergebnisse eines hierarchischen Clusterverfahrens lassen sich allerdings sehr übersichtlich in Form eines Dendrogramms darstellen (> Abb. 1.4.10), weshalb sie häufig benutzt werden (Eisen et al. 1998; Alon et al. 1998; Wen et al. 1998). Beim K-means Verfahren muss man die Anzahl der zu berechnenden Cluster vorgeben. Dies geschieht zumeist dadurch, dass K zufällig ausgewählte Datenpunkte als Clustermittelpunkte initialisiert werden. Dann wird in einem iterativen Verfahren, jeder Datenpunkt dem ähnlichsten der K-initialisierten Datenpunkte zugeordnet, anschließend werden die Mittelpunkte der K-Cluster als Mittelwertsvektoren der jeweils den Clustern zugeordneten Datenpunkte neu berechnet usw. Die Iteration wird so lange wiederholt, bis eine vorher festgelegte Anzahl von Iterationen überschritten ist oder bis sich die Partition stabilisiert hat (Tavazoie et al. 1999). K-meansAlgorithmen sind abhängig von der zufälligen Initialisierung der Cluster (> Abb. 1.4.11). Daher wurde an Modifikationen gearbeitet, die die Anzahl der Cluster, K, aus den Daten selbst berechnet (Herwig et al. 1999, 2000). Graphentheoretische Ansätze arbeiten oft mit sog. Schwellwertgraphen. Ein Graph ist eine Menge von Ecken, die durch Kanten miteinander verbunden sind. Bei einem Schwellwertgraph entsprechen die Ecken den Datenpunkten, und die Kanten zwischen zwei Ecken werden gewichtet mit der paarweisen Ähnlichkeit der zugehörigen Genexpressionsvektoren. Zu einer vorgege-

81 1.4 · Analyse von Biochips: Von der Sequenz zum System

1.4

. Abb. 1.4.11. Initialisierungsproblem beim K-means-Algorithmus. 3 Cluster von Datenpunkten (Kreise) werden fehlerhaft partitioniert durch zufällige Initialisierung dreier Clustermittelpunkte (Vierecke). Die rot gefärbten Punkte beschreiben die initialisierten Clustermittelpunkte. Cluster 1 wird korrekt gefunden. Cluster 2 wird geteilt, da zwei Datenpunkte im Initialisierungsschritt des Algorithmus als Mittelpunkte verschiedener Cluster gesetzt wurden. Cluster 3 wird einem falschen Clustermittelpunkt zugeordnet

benen Ähnlichkeitsschwelle werden diejenigen Kanten aus dem Graph gestrichen, die unterhalb der Ähnlichkeitsschwelle sind. Cluster entstehen dabei als mehr oder weniger vollständige Teilgraphen, die mit speziellen Algorithmen berechnet werden können. Graphentheoretische Ansätze sind ebenfalls zur Clusteranalyse von Genexpressionsdaten verwendet worden (Ben-Dor et al. 1999; Sharan u. Shamir 2000). Weitere Clusteralgorithmen für Genexpressionsdaten sind selbstorganisierende Karten, SOM (Tamayo et al. 1999; Törönen et al. 1999), die an der Theorie neuronaler Netze angelehnt sind.

1.4.6.3 Validierung von Clusterergebnissen Während die Entwicklung neuer Clusteralgorithmen im Laufe der letzten Jahre stetig vorangetrieben wurde, fehlen vergleichende Studien über die Güte der einzel9 . Abb. 1.4.10. Dendrogramm als Ergebnis eines hierarchischen Clusterverfahrens. 78 Marker für die frühe humane Embryonalentwicklung zeigen eine Separierung von innerer Zellmasse (ICM) und Trophektoderm (TE). Für jede cDNS wurde der logarithmierte Genexpressionsquotient aus Signal und mittlerem Signal über alle 5 experimentellen Zustände berechnet. Benutzt wurde die Pearson-Korrelation zur Berechnung der paarweisen Ähnlichkeiten und„average-linkage“ als Aktualisierungsregel. Das Clusterergebnis zeigt eine klare Aufteilung in ICM-überexprimierte Gene und TE-überexprimierte Gene (Adjaye et al. 2005). Das Dendrogramm wurde mit der J-Express-Pro-2.7-Software erzeugt (www.molmine.com)

82

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

nen Verfahren sowie Kriterien zur Bewertung des erhaltenen Clusterergebnisses. Die Validierung von Clustern ist jedoch in der Praxis sehr wichtig, da man oft vor dem Problem steht, welches der erhaltenen Clusterergebnisse die Daten am besten gruppiert, sei es, dass man denselben Datensatz mit verschiedenen Algorithmen bearbeitet, oder sei es, dass man für denselben Algorithmus verschiedene Parametereinstellungen (Anzahl der Cluster, Schwellwerte bei graphentheoretischen Ansätzen etc.) gewählt hat. In Jain und Dubes (1988) und Mirkin (1996) findet man einige Funktionen, mit denen man Clusterergebnisse bewerten kann. Zwei Klassen von Kriterien zur Validierung von Clusterergebnissen lassen sich unterscheiden: x externe Kriterien x interne Kriterien Bei externen Kriterien vergleicht man die berechnete Partition des Datensatzes mit A-priori-Wissen. Bei Simulationen etwa, bei denen man die korrekte Partition kennt, wird die errechnete Partition mit der wahren Par-

titon durch numerische Funktionen bewertet. Numerische Funktionen dieser Art sind z. B. der Jaccard-Koeffizient, der Rand-Index, Fowlkes und Mallows Statistik oder Huberts *-Statistik. So intuitiv diese Verfahren sind, sie lassen sich nur anwenden, wenn genügend A-priori-Wissen vorhanden ist. Ihr Einsatz ist daher weitgehend für Simulationsexperimente interessant. Interne Kriterien bewerten die errechnete Partition aus dem Datensatz selbst. Sinnvolle Konzepte zur Bewertung eines errechneten Genexpressionsclusters sind etwa „Kompaktheit“ und „Isolation“ (> Abb. 1.4.12). Kompaktheit bewertet die clusterinterne Abweichung der zugehörigen Datenpunkte – also, wie ähnlich die dem Cluster zugeordneten Datenpunkte sind. Isolation bewertet die Abweichung eines Clusters von den anderen errechneten Clustern – also, ob der Cluster genügend isoliert von anderen Clustern ist. Die mathematische Bewertung erfolgt wiederum durch Funktionen, die die paarweise Distanz von Datenpunkten und Clustern beschreiben. Es ist klar, dass diejenigen Cluster gut bewertet werden, die kompakt und isoliert sind, während bei nichtkompakten, nichtisolierten Clustern da-

. Abb. 1.4.12. Bewertung von Clusterergebnissen. Links: Cluster aus verschiedenen cDNS, die eine gehirnspezifische Genexpression haben. Verglichen wurden hier 9 verschiedene Gewebe in der Maus mit einem Whole-Genome-Ansatz, darunter 3 verschiedene Gehirnregionen (Kortex, Zerebellum, Midbrain). Rechts: Kompaktheit (X-Achse) und Isolation (Y-Achse) werden benutzt, um die Clustermitglieder zu

bewerten. Kreuze entsprechen den gehirnspezifischen cDNS, Kreise entsprechen einem anderen gewebespezifischen Cluster (Leber). GrüneRauten entsprechen zufällig erzielten Werten. Die Validierung erlaubt eine nachträgliche Reinigung von Genexpressionsclustern von Elementen, die fälschlich dem Cluster zugeordnet wurden, um die Güte z. B. bei nachfolgenden Promotoranalysen zu erhöhen

83 1.4 · Analyse von Biochips: Von der Sequenz zum System

von auszugehen ist, dass sie keine biologische Bedeutung haben. Eine oft verwendete Strategie zur Bewertung von Clustern besteht in der funktionellen Validierung der Cluster. Diese Strategie geht von der Annahme aus, dass Genexpressionscluster diejenigen Gene miteinander in Verbindung setzen, die funktionell ähnlich sind. In der Literatur werden oft Gene-Ontology- (GO-)Annotationen benutzt (vgl. 7 1.4.9). Für viele Gene ist diese funktionelle Kategorisierung bekannt, und so können berechnete Cluster daraufhin validiert werden, ob sie angereicherte funktionelle Information besitzen. Geht man von einem Cluster der Größe m aus, bei dem k Mitglieder eine bestimmte funktionelle Annotation besitzen (m–k besitzen eine andere Annotation) und sind n die Anzahl der untersuchten Gene und K die Anzahl aller Gene mit der speziellen Annotation, so wird die Wahrscheinlichkeit, das beobachtete Ergebnis bezüglich dieser Annotation zufällig zu bekommen, durch die hypergeometrische Verteilung berechnet, d. h.

Der P-Wert, also die Wahrscheinlichkeit einer noch signifikanteren Beobachtung, ist dann . Mit diesem Vorgehen lassen sich Genexpressionscluster auf funktionelle Information hin validieren. Signifikante Cluster sind dann solche, die einen niedrigen P-Wert bezüglich einer bestimmten Annotation haben.

1.4.7 Klassifizierung Klassifikationssysteme sind von großer Bedeutung in der biomedizinischen Forschung und Praxis: Die automatisierte Datengewinnung eröffnet völlig neue Möglichkeiten, Marker für die Diagnose von Krankheiten und für die Prognose von Krankheitsverläufen zu identifizieren. So werden z. B. zunehmend Biochips für den Einsatz in der Krebsdiagnostik eingesetzt. Aber auch Peptid- und Proteinarrays sowie massenspektrometrische Verfahren werden in der Forschung im Hinblick auf ihre diagnostische Einsetzbarkeit getestet. Bereits recht früh wurden an klinischen Proben Expressionsstudien an Brustkrebs und Darmkrebs (Perou et al. 1999; Alon et al. 1999) publiziert. Gene von potenzieller Funktion wurden identifiziert und bestimmten Krankheitsbildern zugeordnet. Eine umfassende Untersuchung von mehr als 60 menschlichen Krebszelllinien liefern Ross et al. (2000) und Scherf et al. (2000). Klassifikation von

1.4

Genexpressionsprofilen hat in der Literatur zur Klassifizierung von Krankheiten und deren Subtypen geführt. Golub et al. (1999) konnten zwei Typen von Leukämie, akute myeloische Leukämie (AML) und akute lymphatische Leukämie (ALL), auf der Basis von 50 Genen klassifizieren, die aus einer Gesamtanzahl von 6.817 Genen ausgesucht wurden. In dieser Studie gelang es, 36 von 38 Patienten korrekt zu klassifizieren. Die 50 relevanten Gene enthielten dabei solche, deren differenzielle Expression in den Subformen bekannt waren, sowie auch bisher unbekannte. Alizadeh et al. (2000) klassifizierten B-Zell-Lymphome (DLBL) in zwei getrennte Subformen und benutzten dazu einen Biochip mit 17.856 Genen.

1.4.7.1 Binäre Klassifikationsprobleme Es gibt viele verschiedene Ansätze, Klassifikationssysteme zu konstruieren. Vier besonders verbreitete Methoden werden im Folgenden kurz vorgestellt: x die logistische Regression, x das naive Bayessche Klassifikationssystem, x die Support-Vektor-Maschine und x das Entscheidungsbaumverfahren. Einen Vergleich der Leistung der verschiedenen Verfahren findet sich in Statnikov et al. (2005). In der Praxis ist das binäre Klassifikationsproblem, d. h. die Entscheidung bezüglich zweier Klassen, besonders häufig und wichtig. Daher beschränken wir uns im Folgenden auf diesen Fall. Die besprochenen Verfahren können aber auch auf allgemeinere Klassifikationsprobleme angewendet werden. Typischerweise wird ein Klassifikationssystem mit einem oder mehreren am Patienten gemessenen Parametern gefüttert und liefert einen Klassifikationswert zurück, der den Patienten einer Gruppe zuordnet. Der Klassifikationsprozess erfolgt in mehreren Stufen: die Messwerte werden zu einem Eigenschaftsvektor zusammengefasst, der dann durch ein Entscheidungsverfahren einer Klasse zugewiesen wird. Die einfachsten Klassifikationssysteme sind eindimensionale Schwellwertverfahren: dem Messwert x wird eine Klasse c(x) zugeordnet, die durch einen Schwellwert bestimmt ist. Zur Veranschaulichung sei angenommen, dass die Messwerte x aus normalverteilten Grundgesamtheiten gezogen sind. Dann erhält man zwei Verteilungen, die erste repräsentiert die Kontrollgruppe und damit die Nullhypothese, dass der Proband gesund ist, die zweite repräsentiert die Patientengruppe. Die Streuung der Messwerte ist im Wesentlichen auf zwei Ursachen zurückzuführen: Schwankungen im Messprozess und biologische Schwankungen. Schwankungen im Messprozess entstehen zum Beispiel bei der Probenent-

84

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

1.4.7.2 Multiparametrische Verfahren

. Abb. 1.4.13. Klassifikation von normalverteilten Messwerten. Die blaue Kurve repräsentiert Messungen an einer Kontrollgruppe, die rote Kurve an einer Patientengruppe. Wird zur Klassifikation ein Schwellwert festgelegt (gestrichelte Linie), so führt das zu einer gewissen Anzahl von falsch-positiv (blau schraffiert) und falsch-negativ (rot schraffiert) klassifizierten Fällen. Der Prozentsatz korrekter Klassifikationen kann als Maß für die Güte des Klassifikationssystems verwendet werden. Je besser die Verteilungen getrennt sind, desto größer ist der Prozentsatz korrekter Klassifikationen, im Beispiel mehr als 95%

nahme und Aufbereitung oder bei der eigentlichen physikalischen Messung. Biologische Schwankungen sind zum Beispiel verursacht durch die Abhängigkeit des Parameters vom zirkadianen Rhythmus des Probanden sowie durch natürliche Schwankungen in der Bevölkerung aufgrund genetischer, metabolischer oder sonstiger Ursachen. Macht man die vereinfachende Annahme, dass die Breite der Schwankung in beiden Gruppen gleich groß ist, so kommt man zu der in > Abb. 1.4.13 dargestellten Situation. Aufgrund der oben besprochenen Schwankungen ist stets mit einer gewissen Anzahl von Fehlklassifikationen zu rechnen. Ein oft verwendetes Kriterium zur Bewertung der Güte eines Klassifikationssystems ist der Prozentsatz der korrekt klassifizierten Fälle in einem vorgegebenen Kollektiv. Dieses Maß ist vor allem dann sinnvoll, wenn die Patientengruppe und die Kontrollgruppe von vergleichbarer Größe sind und es keine weiteren Anforderungen an die falsch-positiv oder falsch-negativ Raten gibt. Die Bestimmung eines optimalen Schwellenwertes kann jetzt durch systematische Anpassung erfolgen. Dieser Prozess wird oft in einem iterativen Verfahren umgesetzt und wird als „Training“ des Klassifikationssystems bezeichnet.

Bisher wurde nur ein einzelner Parameter zur Klassifikation eingesetzt. Bei der Untersuchung komplizierterer Datensätze (z. B. bei komplexen Erkrankungen) ist es aber in der Regel erforderlich, mehrere Parameter zu berücksichtigen. Im Allgemeinen sind Klassifikationssysteme so gebaut, dass die eingehenden Messparameter in einen Merkmals- oder Eigenschaftsvektor zusammengefasst werden. Dieser Vektor enthält in jeder Komponente die kontinuierliche Ausprägung eines bestimmten Merkmals, wie zum Beispiel Alter, Blutzucker usw. In diesem Merkmalsraum versucht das Klassifikationssystem, Regionen zu definieren, die den vordefinierten Klassen zugeordnet werden. Einfache Klassifikationssysteme definieren entlang der Merkmalsachsen Schwellwerte und definieren durch logische Verknüpfung rechteckige Regionen im Eigenschaftsraum. Allgemeinere Klassifikationssysteme berücksichtigen auch Korrelationen in den Messparametern. Die Funktionsweise verschiedener Klassifikationssysteme wird im Folgenden am Beispiel eines Datensatzes zur Diagnostik neurodegenerativer Prozesse diskutiert. Anhand des Alters und einer Peptidmarkerkombination im Blut („peptide ratio“) soll die von Spezialisten vorgegebene Zuweisung in die zwei Klassen „nicht gefährdet“ und „gefährdet“ maschinell reproduziert werden. In > Abb. 1.4.14 ist die Operation von vier verschiedenen Klassifikationsmethoden für diesen Datensatz dargestellt. Logistische Regression (Hosmer u. Lemeshow 2000): Bei der logistischen Regression handelt es sich um ein Trennsystem, das eine Trennlinie oder Trennebene in den Merkmalsraum legen kann. Die Trennlinie wird algorithmisch so lange verschoben, bis eine maximierte Anzahl von korrekten Klassifikationen erreicht wird. Diese Art von Systemen funktioniert gut, wenn die Merkmale in einfacher linearer Abhängigkeit voneinander sind. Naives Bayessches Klassifikationssystem (Domingos u.

Pazzani 1997): Das Verfahren basiert auf der Annahme unabhängiger normalverteilter Messgrößen, die in zwei oder mehr Dimensionen ausgedehnt sind. Das Bayessche Klassifikationssystem definiert für normalverteilte Messgrößen ein optimales Klassifikationssystem. Die Klassifikationsregionen können dabei deutlich komplizierter sein als bei der logistischen Regression, so sieht man in > Abb. 1.4.14 beim Bayesschen Klassifikationssystem zwei kegelförmige Gebiete. Der Grund dafür ist die rigorose Annahme normalverteilter Messdaten. Es hängt von der Natur der Fragestellung ab, ob eine solche Annahme wirklich sinnvoll ist.

85 1.4 · Analyse von Biochips: Von der Sequenz zum System

1.4

. Abb. 1.4.14. Operation verschiedener Klassifikationssysteme bei der Klassifikation neurodegenerativer Erkrankungen (anonymisierte Daten, verwendet mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. Jens Wiltfang, Universitätsklinik Erlangen). Ziel ist es, anhand von im Blutplasma bestimmten molekularen und weiteren physiologischen Parametern eine Zuordnung des Patienten vorzunehmen. Aus Gründen der Darstellbarkeit erfolgt hier eine Beschränkung auf 2 Parameter: einen proteomischen Parameter, der aus Peptidmarkern im

Blut abgeleitet ist, und einen physiologischen Parameter, das Alter. Blaue und gelbe Punkte repräsentieren Messwerte, die am Patientenkollektiv gewonnen wurden. Die Farbe des Hintergrundes zeigt, wie das Klassifikationssystem den entsprechenden Punkt im Merkmalsraum einstuft. Punkte, die eine andere Farbe als der Hintergrund haben, sind als Fehlklassifikation einzustufen. Oben links: logistische Regression, oben rechts: Bayessches Klassifikationssystem, unten links: Support-Vektor-Maschine, unten rechts: Entscheidungsbaum

Support-Vektor-Maschinen (Vapnik 1999; Brown et al.

tion verhält sich das System wie eine logistische Regression, im allgemeinen Fall kann durch die Superposition verschiedener Kernfunktionen auch eine sehr komplizierte Klassifikation abgebildet werden. Im Trainingsprozess werden die Parameter der Kernfunktionen angepasst, bis ein Optimum erreicht ist.

1999; Cristianini u. Shawe-Taylor 2000): In der Praxis sind die Daten oft nur näherungsweise (oder gar nicht) normalverteilt. Ein flexibles Verfahren zur Klassifikation bilden die Support-Vektor-Maschinen (SVM). Dieses Verfahren versucht, unter Einsatz einer geeigneten Transferfunktion (Kernfunktion) ein Klassifikationssystem zu definieren. Häufig eingesetzt werden radiale Basisfunktionen oder normale Kernfunktionen. Im einfachen Grenzfall von einer einzelnen linearen Kernfunk-

Entscheidungsbäume (Pittman 2004): Entscheidungs-

bäume definieren eine hierarchische Zerlegung des Datensatzes in Untergruppen, die durch einen Baum ver-

86

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

anschaulicht werden kann. Ausgehend vom Stamm des Baumes wird der Datensatz auf der Basis von binären Entscheidungen in Klassen und Unterklassen zerlegt, bis eine ausreichende Genauigkeit erreicht ist. Für die formale Definition der Entscheidungen können verschiedene Verfahren eingesetzt werden. Im Beispiel wurde in jeder Stufe eines der Kriterien, Alter und Peptide-Ratio, mit einem optimierten Schwellwert eingesetzt. Die resultierende Zerlegung des Merkmalsraumes ist orthogonal, das linke untere Feld repräsentiert die Zuordnung zur Klasse „nicht gefährdet“.

1.4.7.3 Kreuzvalidierung Ein wichtiger Schritt besteht nach der Parameteroptimierung in der Validierung des Klassifikationssystems. Dazu gibt es verschiedene Vorgehensweisen. x Datensatzteilung: In der Regel spaltet man den Datensatz in einen Trainings- und einen Testdatensatz auf, etwa im Verhältnis 80% zu 20%. Mit dem einen Teil des Datensatzes (80%) wird das Training mit den oben genannten Verfahren vorgenommen, danach wird das Klassifikationssystem zur Vorhersage auf den Testdatensatz (20%) angewendet. Dadurch vermeidet man die Überschätzung der Vorhersagegüte durch ungenügende Statistik („Over-FittingEffekt“). x K-fache Kreuzvalidierung: Gründlicher als die einfache Testvorhersage ist die Kreuzvalidierung. Dazu wird der Datensatz in K disjunkte Teile zerlegt (in der Praxis etwa fünf), jeder dieser Teildatensätze dient einmal zum Test, der Rest der Daten zum Training. Der mittlere Fehler über alle K Klassifikationsprozesse dient dann als Fehlermaß. Diese Methode hat den Vorteil, dass die Aufteilung des Datensatzes gegenüber der ersten Methode eine weniger große Rolle spielt. Jeder Datenpunkt wird genau einmal als Testpunkt verwendet und K1-mal als Trainingspunkt. Eine Variante dieser Methode besteht darin, die Aufteilung der Daten in Trainings- und Testdaten K-mal zufällig vorzunehmen. Der Vorteil hierbei ist, dass die Größe der Teildatensätze individuell eingestellt werden kann. x Leave-one-out-Kreuzvalidierung: Diese Methode ist die K-fache Kreuzvalidierung mit K=N, wobei N die Anzahl aller Datenpunkte ist. Das heißt, N mal wird der Klassifikator an allen bis auf einen Datenpunkten trainiert und eine Vorhersage wird für den verbleibenden Datenpunkt gemacht. Wie zuvor wird der Gesamtfehler aus dem Durchschnitt aller Klassifikationen berechnet.

1.4.8 Genetische Netzwerke Ein zentrales Anliegen der molekularen Biologie ist das Verständnis der zellulären Netzwerke, insbesondere von genregulatorischen und metabolischen Netzwerken sowie Signaltransduktionswegen, da diese Netzwerke die fundamentalen Mechanismen der Zelle steuern und ihre Störung (z. B. durch Mutation von Proteinen) zu Krankheitsprozessen führen. Diesen Netzwerken liegen mannigfaltige zelluläre Vorgänge, darunter Transkriptionskontrolle, RNS-Splicing, Transport von mRNS, Translationskontrolle, posttranslationale Modifikationen und Degradierung von mRNS- und Proteinprodukten zugrunde. Die Modellierung der Gesamtheit dieser zellulären Vorgänge ist äußerst komplex und mit den bisher zur Verfügung stehenden Daten nur schwer bzw. gar nicht möglich. Da man bei der Datengenerierung (7 1.4.2 und 1.4.3) im Wesentlichen auf Genexpressionsmessungen angewiesen ist, bleibt die Modellierung zellulärer Vorgänge vor allem auf die Modellierung der Transkription beschränkt. Die Zelle wird dabei als Netzwerk von Genprodukten (mRNS, Proteine) interpretiert, die Interaktionen resultieren aus der Transkription eines Gens und dem Effekt seines Proteins auf die Aktivierung anderer Gene (> Abb. 1.4.15). Der Zustand der Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt wird dabei über das Genexpressionsniveau aller zu diesem Zeitpunkt gemessenen Gene definiert und bestimmt das Verhalten der Zelle zum nächsten Zeitpunkt. Man betrachtet also im Wesent-

. Abb. 1.4.15. Visualisierung von wechselseitigen physikalischen Interaktionen bei Hefegenen. Bekannte physikalische Wechselwirkungen von Hefegenen (Saccharomyces cerevisiae, http://mips.gsf. de/genre/proj/yeast/) wurden graphisch dargestellt und der resultierende Graph nach Zusammenhangskomponenten untersucht. Ein Interaktionsnetzwerk aus 25 Genen wurde durch einen dreidimensionalen Graphen visualisiert (BioMiner, MicroDiscovery, Berlin)

87 1.4 · Analyse von Biochips: Von der Sequenz zum System

lichen Änderungen des Genexpressionszustands über die Zeit. Vom analytischen Standpunkt aus können genetische Netzwerke entweder als deterministische oder als stochastische Systeme angesehen werden. In einem deterministischen System (z. B. einem Booleschen Modell) bestimmt ein Zustand in einem bestimmten Zeitpunkt eindeutig den Zustand des darauffolgenden Zeitpunktes, es gibt also nur einen Nachfolgezustand. Bei stochastischen Systemen kann ein Zustand zu einem bestimmten Zeitpunkt mehr als einen Nachfolgezustand haben, die Nachfolgezustände werden gemäß einer Wahrscheinlichkeitsverteilung angenommen. Netzwerkanalysen beschäftigen sich zum einen mit der Analyse von Eigenschaften, die als Effekte auftreten, wenn die Netzwerkparameter bekannt sind (Vorwärtsmodellierung), und zum anderen mit dem Schätzen eines erklärenden Netzwerks bei vorliegenden experimentellen Daten („reverse engineering“).

1.4.8.1 Vorwärtsmodellierung und Simulation genetischer Netzwerke Bei der Vorwärtsmodellierung startet man von deterministischen, regulatorischen Beziehungen, bei denen die Interaktionen der verschiedenen Elemente des zu modellierenden Systems vorgegeben sind. Die Elemente können Gene, Proteine oder auch komplexere Elemente sein. Es gibt im Moment einige Plattformen in dieser Richtung, z. B. das E-Cell-Projekt (http://www.e-cell.org, Tomita et al. 2000) und PyBioS (http://pybios.molgen. mpg.de, Wierling 2006). Das E-Cell-System soll die Definition der Funktionen von Proteinen, Protein-ProteinInteraktionen, Protein-DNS-Interaktionen und anderer zellulärer Prozesse gestatten und deren Modellierung ermöglichen. PyBioS ist eine Modellierungsplattform zur Analyse biochemischer Reaktionsnetzwerke mit einer umfangreichen Schnittstelle zu Datenbanken und experimentellen Daten (> Abb. 1.4.16). Die Parameter für die Interaktionen, z. B. Konzentrationen, Reaktionsraten etc., werden dabei durch Literaturrecherche, aber auch zunehmend durch geeignete Experimente gewonnen. Weitere Parameter betreffen die Startparameter der beteiligten Simulationsobjekte. Sind diese gefunden, so liefert die Vorwärtsmodellierung die Änderung dieser Parameter in der Zeit. Interessante Fragen bei der Vorwärtsmodellierung sind dann z. B. das Verhalten des Systems, wenn ein bestimmtes Gen ausgeschaltet wird (Knockout-Experiment), oder das Verhalten des Systems bei Zugabe eines bestimmten Medikaments. Das ultimative Ziel der Vorwärtsmodellierung ist es, ein möglichst genaues Modell der bioche-

1.4

mischen Vorgänge in der Zelle zu bekommen, um dann In-silico-Behandlungen durchzuführen, was eine erhebliche Bedeutung für die klinische und pharmazeutische Forschung hat. Im Bereich der kombinatorischen Therapie könnten dann z. B. Wechselwirkungen verschiedener Medikamente simuliert und geeignete Behandlungen gefunden werden, um einen bestimmten – den gewünschten – Genexpressionszustand der Zelle herzustellen. Diese Entwicklung wird allerdings noch Jahre auf sich warten lassen, da die zum Training der Modelle nötigen Daten weder in der Quantität noch in der Qualität dafür vorliegen. Nichtsdestotrotz liefern Hochdurchsatzverfahren die einzige Möglichkeit, die entsprechenden Daten für die Interaktionsparameter dieser sehr komplexen Systeme zu gewinnnen. Beim Auffinden der nötigen Parameter kann nur umfangreiches Expertenwissen helfen, die relevante Literatur muss durchforstet werden, und die regulativen Interaktionen zwischen den Elementen des Netzwerks müssen identifiziert werden. Beim Aufbau der Modellierungsumgebung muss die Klasse von Gleichungen definiert werden, die die Interaktionen beschreiben. Meistens dienen hierzu gewöhnliche Differenzialgleichungen, es gibt aber auch Varianten, die stochastische Differenzialgleichungen und sog. dynamische Bayessche Netze verwenden.

1.4.8.2 Reverse engineering Der Zweck des sog. Reverse engineering ist die Schätzung eines genetischen Netzwerkes, also der wechselseitigen Regulation der beteiligten Gene, aus den experimentellen Daten. Hat man etwa eine Zeitreihe gemessen, z. B. Hybridisierungsexperimente zu verschiedenen Zeitpunkten in der Entwicklung eines Organismus oder während der Antwort auf Medikamentenzugabe bzw. Umwelteinfluss, so stellt jedes Experiment die Messung des Zustands der Genexpression zu einem festen Zeitpunkt dar, und das Experiment am nächsten Zeitpunkt sollte durch die Regeln und Parameter des berechneten Netzwerkes möglichst gut wiedergegeben werden können. Die Ansätze unterscheiden sich dabei nach der Art der Dateninterpretation. Nimmt man die Expressionsdaten selbst, so spricht man von stetigen Modellen. Bildet man die Expressionsdaten durch eine Vorverarbeitung, z. B. einen geeigneten Schwellwert binär ab, so spricht man von Booleschen Modellen (Kauffman 1993; Somogyi et al. 2001). Bei Booleschen Modellen interessiert also nur, ob ein Gen im momentanen Expressionszustand aktiviert ist oder nicht, nicht aber die Stärke der Aktivierung. Boolesche Modelle können durch Tabellen beschrieben werden, in denen für jedes beteiligten Gen

88

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

a

b

c

. Abb. 1.4.16a–c. Modellierung von Signaltransduktionswegen mit dem PyBioS-System (http://pybios.molgen.mpg.de). a Perzeption extrazellulärer Apoptosesignale. b Ausschnitt aus dem Diagramm des

PyBioS-Modells der extrinsischen, rezeptorvermittelten Apoptose. c In-silico-Experiment zur zellulären Antwort auf eine Variation eines extrazellulären Apoptose-Signals (FasL)

89 1.4 · Analyse von Biochips: Von der Sequenz zum System

. Tab. 1.4.2. Zustandsbeschreibung eines Booleschen Netzwerks mit drei Genen (> Abb. 1.4.17). Aktueller Zustand

Nächster Zustand

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000

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111

011

. Abb. 1.4.17. Darstellung eines Booleschen Netzwerks von 3 Genen (vgl. > Tab. 1.4.2). Jeder Zustand des Netzwerks hat genau einen Folgezustand, der durch die Vernetzungsregeln definiert ist. Dies führt bei gegebenen Anfangswerten zu einer Abfolge von

1.4

notiert wird, ob es aktiv ist oder nicht und in denen für jeden möglichen Zustand sein Nachfolgezustand definiert ist. Ein Boolesches Modell mit n Genen hat 2 n verschiedene Zustände. > Tabelle 1.4.2 veranschaulicht die möglichen Zustände eines Systems mit drei Genen (23 = 8 Zustände) mit den jeweiligen Nachfolgezuständen, die durch bestimmte Interaktionsregeln der Gene definiert sind (> Abb. 1.4.17). Dabei kann die Konnektivität des Modells, also die Anzahl der für die Regulation eines Genes relevanten Gene variieren. Die Konnektivität ist ein wichtiger Parameter, da er die Komplexität des Netzwerkes und damit seine numerische Berechnung erheblich beeeinflusst. Jeder Zustand hat dann aufgrund der Regeln einen klar definierten Folgezustand. In den letzten Jahren sind Algorithmen entwickelt worden, die eine Berechnung der wechselseitigen Regu-

Zuständen. Zustände, die immer wieder angestrebt werden, sind sog. Attraktoren, im ersten Fall ein Punktattraktor und im zweiten Fall ein dynamischer Attraktor, bestehend aus zwei Zuständen (Somogyi et al. 2001)

90

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

lationen erlauben (Liang et al. 1998; Akutsu et al. 1999, 2000). Diese Algorithmen sind für eine kleine Anzahl von Genen (n < 50) und geringe Konnektivität (k = 3) brauchbar, erreichen aber schnell ihre obere Leistungsgrenze. Bei den stetigen Modellen verzichtet man auf die Binarisierung der Expressionsdaten (Mjolsness et al. 1991; McAdams u. Shapiro 1995; Arkin et al. 1997, 1998; McAdams u. Arkin 1997; Chen et al. 1999; Weaver et al. 1999; Hache et al. 2007). Hierbei kann man zwischen Modellen unterscheiden, die auf paarweisen Vergleichen der Genexpressionsvektoren beruhen, und Methoden, die die Gesamtheit der Geninteraktionen modellieren. Bei den letzteren Modellen geht man davon aus, dass jedes Gen einen regulativen Einfluss auf alle anderen Gene hat und dass dieser regulative Einfluss durch Gewichte geschätzt werden kann. Diese Gewichte können auch gleich Null oder negativ sein, sodass auch berücksichtigt wird, ob ein Gen von anderen Genen nicht beeinflusst oder gehemmt wird. Viele in der Literatur beschriebenen Modelle dieser Art lassen sich in folgender mathematischen Differentialgleichung unterbringen:

Eine wichtige Teilmenge dieser Modelle sind lineare Modelle. Hierbei ist die Aktivierungsfunktion linear, d. h. f(z) = z, die Reaktionsraten werden als konstant angenommen, so dass man das vereinfachte Modell

bekommt (D’Haeseleer 1998, 1999). Die interessierenden Parameter, die Gewichte wij , werden dann mit bekannten statistischen Modellen (lineare Regression, „simulated annealing“) aus den Daten geschätzt. Neben diesen Ansätzen gibt es auch probabilistische Modelle, die der Stochastizität wechselseitiger Genregulierung größere Rechnung tragen. Durch sog. Bayessche Netzwerke (Jensen 1996) werden Gene und die an ihrer Regulation beteiligten Gene durch eine Wahrscheinlichkeitsverteilung beschrieben. Diese Bayesschen Netzwerke haben den Vorteil, dass sie eine lokale Modellierung zulassen (Friedman et al. 2000; Pe’er et al. 2001; Tanay und Shamir 2001).

1.4.8.3 Netzwerkmotive Hierbei sind: f(): Funktion, die die Aktivierung der Expression beschreibt xi(t): Genexpression von Gen i zum Zeitpunkt t ri: Reaktionsrate von Gen i wij: Gewicht, das den Einfluss von Gen j auf Gen i beschreibt uk(t): externer Input (z. B. Medikament) zum Zeitpunkt t vik: Einfluss des k-ten externen Inputs auf Gen i bi: Basisexpressionslevel von Gen i Oi: Degradierungskonstante des i-ten Genprodukts Die Aktivierungsfunktion, f, wird dabei als monoton angenommen. Dies folgt der experimentellen Beobachtung: Mit Zunahme der Konzentrationen der regulierenden Signale nimmt die individuelle Genaktivierung ebenfalls zu. Meistens haben diese Funktionen sigmoide Form, sodass Sättigungseffekte und die unterschiedlich schnelle Zunahme der Genaktivierung berücksichtigt werden können, z. B.

Ein zweiter Satz von Parametern berücksichtigt externen Input, z. B. Chemikalien, Temperaturänderungen, Abbau von Nährstoffen etc.). Die Degradierungskonstante berücksichtigt den individuellen Abbau des Genprodukts.

Die Dimensionalität genregulatorischer Netzwerke ist das größte Problem bei den in 7 1.4.8.2 aufgeführten mathematischen Verfahren. Man geht daher dazu über, Teile dieser Netzwerke zu identifizieren. Das Gesamtnetzwerk wird als Zusammenschluss verschiedener Module, sog. Netzwerkmotive, interpretiert. Davidson et al. (2002) haben die frühe Entwicklung beim Seeigel mit unterschiedlichen experimentellen Techniken, wie QPCR, Chip-Experimente, WISHs sowie bioinformatische Methoden zur Analyse von TFBS, untersucht. Dieses entwicklungsspezifische Netzwerk ist mit ca. 50 verschiedenen Proteinen eher groß, es beinhaltet jedoch noch kleinere, elementare Bauteile, die sich topologisch charakterisieren lassen. Shen-Orr et al. (2002) haben das transkriptionelle Netzwerk von Escherichia coli untersucht. Als Ausgangsbasis wurde eine Datenbank (RegulonDB, Salgado et al. 2001) und zusätzliche Literatur verwendet. Mit zeitlich aufgelösten Daten gelang die Identifizierung von drei verschiedenen, kleinen Netzwerkmotiven, die charakteristische funktionelle Eigenschaften haben und aus denen das Gesamtnetzwerk konstruiert werden konnte. In ähnlicher Weise haben Lee et al. (2002) Saccharomyces cerevisiae untersucht. Die Autoren benutzten 106 verschiedene Heferegulatoren und identifizierten potenzielle Zielgene durch ChIP-on-Chip Experimente (vgl. 7 1.4.3.2). Sie fanden ca. 4.000 signifikante regulatorische Bindungen (im Durchschnitt 38 Zielgene pro Regulator). Ihre Analyse enthüllte sechs verschiedene

91 1.4 · Analyse von Biochips: Von der Sequenz zum System

elementare Motive, die die drei aus der vorangegangenen Studie einschließen: x Autoregulation motif – ein Regulator bindet an die Promoterregion seines eigenen Gens. x Multi-component loop – es handelt sich um eine Schleife, die zwei oder mehr Regulatoren beinhaltet. x Feedforward loop – ein Regulator kontrolliert einen anderen Regulator, und beide binden an ein Zielgen. x Single-input motif – ein Regulator bindet an verschiedene Promotoren. x Multi-input motifs (dense overlapping regulons) – eine Menge von Regulatoren bindet gemeinsam an eine Menge von Promotoren. x Regulatory chain – eine Kette von Regulatoren, wobei der nte Regulator an den Promoter des n+1ten Regulators bindet. Motiven kann eine charakteristische biologische Funktion zugeordnet werden – z. B. bei „feedforward loops“. Hier besteht die Möglichkeit einer zeitlichen Kontrolle des Signalprozesses, da die Expression des Zielgens abhängig von der Akkumulierung von Aktivierungssignalen der Regulatoren sein kann (Shen-Orr et al. 2002). Die Klassifizierung von Netzwerkmotiven und die Konstruktion und Integration der Motive in große Netzwerke (Bottom-up-Verfahren) ist gegenwärtig eine Hauptaufgabe der bioinformatischen Netzwerkanalyse. Forscher arbeiten an einer Art Baukonstruktion für biologische Funktion, die die fundamentalen Bestandteile zusammenträgt und deren Kombinationen funktionell charakterisiert, ähnlich einem Bauplan für elektrische Schaltkreise.

1.4.9 Datenbanken und Datenintegration Es ist klar, dass die Flut von Daten nicht nur aus BiochipExperimenten gespeichert, sortiert und vergleichbar gemacht werden muss (Zehetner u. Lehrach 1994). Insbesondere die Analyse von Krankheitsprozessen und die Entwicklung von mathematischen Modellen für zelluläre Systeme erfordert Informationen über DNS-, RNS-, Proteinsequenz, Genexpression, Proteinexpression und -interaktionen sowie kinetische Daten. Solche Informationen werden in biologischen Datenbanken gespeichert und zugänglich gemacht. Es existiert eine große Zahl verfügbarer öffentlicher Datenbanken, deren Inhalt von primären Daten (also Rohdaten aus Experimenten) bis zu hochgradig interpretierten Daten (z. B. die Informationen über biochemische Reaktionsnetzwerke) reicht. Diese Datenbanken sind ein wichtiger Bestandteil der medizinischen Forschung, weil sie einen systematischen Überblick über

1.4

das vorhandene Wissen bieten und somit häufig die Ausgangshypothesen liefern, an denen neue experimentelle Ergebnisse bewertet werden.

1.4.9.1 Primärdatenbanken Der Annotation von Genen und Proteinen kommt nicht nur beim Design von Biochips (vgl. 7 1.4.2) sondern auch bei der nachfolgenden Interpretation der Daten, eine große Bedeutung zu. Es existiert eine Vielzahl öffentlicher Datenbanken, die mehr oder weniger detaillierte Informationen hierzu liefern (z. B. GenBank, EMBL, IMAGE, SwissProt, PDB), aber oft sehr unterschiedlich in der Annotierung vorgehen. Der Vereinheitlichung von Datenformaten und der Definition von einheitlichen Strukturen und Grammatiken für biologische Daten hat sich das Gene Ontology Consortium verschrieben (http://geneontology.org/). Das Konsortium setzt sich aus mehreren Datenbanken von Modellorganismen zusammen: SGD (Saccharomyces-cerevisiae-Genom Datenbank; Ball et al. 2000), FlyBase (Datenbank zum Genom von Drosophila melanogaster; FlyBase Consortium 1999) und MGD/GXD (Mausgenom-Datenbank; Blake et al. 2000; Ringwald et al. 2000). Weitere Datenbanken von Modellorganismen sind bereits integriert worden, wie z. B. von Arabidopsis thaliana (TAIR; Huala et al. 2000). Neben der Vereinheitlichung der Annotation gibt es Bestrebungen, die Qualität von Biochips und den Folgeanalysen zu erhöhen (Microarray Gene Expression Database Group MGED, http://www.mged.org), um deren Nutzung in der klinischen Praxis zu ermöglichen. MGED ist ein Diskussionsforum zur Definition von Standards in Biochip-Experimenten, wie Annotierung, Datenrepräsentation, standardisierte Protokolle, Normalisierungsmethoden und dem Austausch von Information aus verschiedenen Datenbanken sowie die Definition von gemeinsamen Schnittstellen zur Veröffentlichung der Daten. Das National Center for Biotechnology (NCBI) und das European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI) stellen die meist genutzten öffentlichen Datenbanken zur Verfügung. Diese Zentren bieten Information über Nukleotidsequenzen, Molekülstrukturen, Genexpressionsdaten und andere primäre Daten, z. B. GenBank, RefSeq und UniGene (NCBI) bzw. TrEMBL, UniProt und Ensembl (EMBL-EBI). Des Weiteren existieren Datenbanken über Proteinfamilien, Domänen und funktionelle Gruppen sowie Datenbanken zu RNS und MikroRNS. Genexpressionsdaten sind verfügbar im Gene Expression Omnibus (GEO) und ArrayExpress. Diese Datenbanken gewähren freien Zugang zu großen Sammlungen experimenteller Daten. Diese Daten

92

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

beinhalten alle diskutierten Biochip Plattformen (vgl. 7 1.4.2.1) sowie alternative Technologien, z. B. SAGE und ArrayCGH. Einen Überblick über die aktuellen molekularbiologischen Datenbanken gibt die jährlich erscheinende Datenbankausgabe von Nucleic Acids Research (Galperin 2007).

1.4.9.2 Datenbanken für funktionelle Annotation Für die Analyse von Krankheitsprozessen ist funktionelle Information, z. B. in Form von biochemischen Pathways, von besonderem Interesse. Diese Information wird von einer großen Anzahl von Datenbanken zur Verfügung gestellt. Die Datenbanken bieten eine integrierte Visualisierung und Repräsentation funktioneller Information über die verschiedenen Komponenten eines biochemischen Reaktionsnetzwerks und bilden eine Basis für die mathematische Modellierung dieser Systeme. Die meisten Datenbanken sind auf spezielle Klassen biochemischer Reaktionsnetzwerke beschränkt. KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Kanehisa et al. 2006), Reactome (Joshi-Tope et al. 2005) und BioCyc (Karp et al. 2005) enthalten metabolische Reaktionen und verschiedene Signaltransduktionswege. KEGG bietet Information über 317 verschieden Pathways, die über Sequenzhomologie der beteiligten Moleküle für 38 eukaryotische Organismen und eine Vielzahl von Mikroorganismen verfügbar sind. KEGG kann über verschiedene Schnittstellen angesprochen werden, z. B. über die Internetschnittstelle, ftp oder sogenannte Web-Services. Reactome ist entstanden als Kooperation des European Bioinformatics Institute (EBI), des Cold Spring Harbor Laboratory und des Gene Ontology Consortium. Zugrunde liegt ein sehr detailliertes Datenmodell für die Komponenten und Interaktionen biochemischer Reaktionen (Ontologie), das z. B. Informationen über Stöchio-

metrie und zelluläre Lokalisation enthält wie auch Referenzen zu externen Datenbanken. Dies beinhaltet z. B. Informationen über Bildung von Proteinkomplexen, Phosphorylierungen und Translokation von Molekülen. Eine weitere Pathway-Datenbank ist BioCyc, die Pathways unterschiedlicher Organismen wie z. B. Escherichia coli (EcoCyc), Mikroorganismen (MetaCyc) und Mensch (HumanCyc) bündelt. Daneben existieren viele PathwayDatenbanken, die einen Fokus auf Signalübertragungswege haben, wie z. B. BioCarta, Spike, Transpath, STKE, NetPath und die Pathway Interaction Database (PID), die über die Nature Publishing Group zugänglich ist. Weitere Fokusse von Reaktionsdatenbanken sind Protein-Protein-Interaktionen (Hermjakob et al. 2004; Xenarios et al. 2000) und genregulatorische Prozesse. Informationen über Genregulation sind allerdings im Moment nur limitiert verfügbar, wichtige Informationsquellen hierbei sind RegulonDB, TRED und Transfac. Im Moment existiert noch kein einheitliches Datenmodell, das die Informationen dieser und anderer (im Ganzen ca. 230!) Datenbanken funktioneller Informationen integriert und einen einheitlichen Zugang zur Verfügung stellt. Stattdessen ist zu beobachten, dass die Diversifizierung weiter voranschreitet und die gespeicherte Information noch spezialisierter werden wird. So gibt es z. B. Datenbanken über Mutationen in Signalproteinen, Datenbanken für Interaktionen spezieller Organismen und bezüglich einzelner Krankheiten. Einen Überblick über den Inhalt der oben diskutierten Datenbanken für den Menschen bietet > Tab. 1.4.3. Neben topologischer Information, also der Information über die Vernetzung der verschiedenen Moleküle, ist zur Analyse der Netzwerke (vgl. 7 1.4.8) kinetische Information nötig, d. h. Information über die kinetischen Gesetze der am Netzwerk beteiligten Reaktionen, kinetische Konstanten etc., die in Datenbanken wie BRENDA (Schomburg et al. 2004) und SABIO-RK (Wittig et al. 2006) gespeichert sind. Solche Informa-

. Tab. 1.4.3. Anzahl der Reaktionen bzw. Interaktionen in selektierten Datenbanken und deren Schnittmengen (Quelle: http://pybios.molgen.mpg.de/CPDB/)

Reactome

KEGG

HumanCyc

PID

Biocarta

Intact

Reactome

12042

KEGG

209

1498

HumanCyc

93

199

1077

PID

8

0

0

1064

Biocarta

62

0

1

114

2160

Intact

78

0

1

0

42

5690

Dip

15

0

2

0

25

114

Dip

1152

93 1.4 · Analyse von Biochips: Von der Sequenz zum System

tionen sind ebenfalls nur sehr limitiert verfügbar, und kinetische Information ist im Gegensatz zu topologischer Information in viel stärkerem Maß vom jeweiligen Experiment abhängig. In letzter Zeit ist man dazu übergangen, auch mathematische Modelle biochemischer Reaktionsnetzwerke zu speichern und verfügbar zu machen. Voraussetzung dafür war die Entwicklung eines einheitlichen Schemas (SBML), in dem Informationen wie kinetische Parameter, Modelltopologie, mathematische Beschreibung der Kinetik, Konzentrationen etc. abgebildet werden können. Eine Datenbank zur Speicherung mathematischer Modelle ist z. B. BioModels (Le Novère et al. 2006), die zurzeit ca. 120 verschiedene Modelle beinhaltet.

1.4.9.3 Standardisierung und Datenbankintegration Die Diversität der Datenbanken macht es in der Praxis schwer, einen umfassenden Einblick in einen Krankheitsprozess zu gewinnen, da der Nutzer häufig zwischen mehreren Datenbanken wechseln muss, um zu den entsprechenden Informationen zu gelangen. Daher gibt es internationale Initiativen, die für viele Datentypen standardisierte Schemata entwickeln, mit denen die entsprechenden Daten integriert, ausgetauscht und visualisiert werden können. Die meisten dieser Schemata benutzen dabei formatierten Text, wie es in XML- (eXtensibleMarkup-Language-)Formaten vorgegeben ist. XML besteht aus hierarchisch angeordneten Schlüsselwörtern, die mit der jeweiligen Information belegt sind. Die Menge der Schlüsselwörter kann dabei sehr flexibel definiert werden, was zur Entwicklung von zahlreichen XML-Formaten für unterschiedliche Datentypen geführt hat (> Tab. 1.4.4) (Achard et al. 2001).

1.4

Die Integration verschiedener Datenbanken in eine gemeinsame Nutzerschnittstelle leistet z. B. das EnsMart (http://www.ensembl.org/EnsMart) System. EnsMart ist ein öffentlich zugängliches Data-Warehouse-System (Kasprzyk et al. 2004), das mit einer umfangreichen Suchschnittstelle verknüpft ist. Das System basiert auf der Ensembl-Datenbank, die über viele Verknüpfungen zu anderen Datenbanken und zahlreiche Organismen verfügt (u. a. Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus, Danio rerio, Fugu rubripes, Anopheles gambiae, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis briggsae and Caenorhabditis elegans) (Birney et al. 2004). EnsMart ist an zentralen Objekten organisiert, sog. Fokusse, die mit den Daten assoziiert sind. Zentrale Objekte sind z. B. Gen und SNP („single nucleotide polymorphisms“). Das System besteht aus einer Nutzerschnittstelle zur Interaktion, aus einer lokalen Datenbank und einer optimierten Suchschnittstelle zur Datenwiedergabe. Ein anderes System zur Integration von Datenbanken ist SRS („Sequence Retrieval System“). Zunächst für Sequenzdaten entwickelt (Etzold u. Argos 1993; Etzold et al. 1996), wurde SRS auf viele andere Datentypen erweitert. SRS wurde zunächst von LION Bioscience Ltd. als kommerzielles Produkt vertrieben, seit 2006 von BioWisdom Ltd. SRS hat ein objektorientiertes Design. Es benutzt Metadaten zur Definition von Datenklassen und Regeln für die strukturierte Eingabe von Information. SRS besitzt eine eigene Sprache (Icarus) zur Programmierung der Datenbankschnittstellen (Zdobnov et al. 2002).

1.4.10 Ausblick – Systembiologie in der molekularen Medizin Eine große Herausforderung der Datenanalyse in der Genom- und Proteomforschung ist es, die in der Litera-

. Tab. 1.4.4. Wichtige XML-Standards in der funktionellen Genomik XML-Format

Beschreibung

Information

BSML

Bioinformatic Sequence Markup Language

Genomische Sequenzen

MATHML

Mathematical Markup Language

Mathematische Formeln

BioML

Biopolymer Markup Language

Annotation von Protein- und DNS-Sequenzen

MAGEML

Microarray and gene expression Markup Language

Biochip-Experimente

PSI-MI

Proteomics Standards Initiative Molecular Interaction

Protein-Protein-Interaktionen

SBML

Systems Biology Markup Language

Mathematische Modelle für Reaktionsnetzwerke

BioPAX

Biological Pathways Exchange

Beschreibung biologischer Pathways

CML

Chemical Markup Language

Chemische Information

CellML

Cell Markup Language

Mathematische Modelle für Reaktionsnetzwerke

94

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

tur erzeugten Daten in die Analyse von neuen Experimenten zu integrieren. Die dazu notwendigen Datenbanken sind vorhanden und müssen in der Zukunft sinnverknüpfend in Verbindung miteinander gebracht werden. Systeme wie TAVERNA bieten die Möglichkeit, über Web-Service-Schnittstellen mit einer einheitlichen Nutzerschnittstelle eine Vielzahl von Datenbanken anzusprechen (http://taverna.sourceforge.net/). Die meisten kommerziell erhältlichen Genomanalyse-Programmpakete erreichen bisher mit einer einfachen Ausgabe der Resultate und Visualisierungsmethoden ihre Grenzen. Dabei wird gegenwärtig dem Nutzer die Entscheidung überlassen, ob diese Ergebnisse in Übereinstimmung mit dem schon existierenden Wissen stehen oder nicht. Will man daher die bioinformatische Arbeit in den kommenden Jahren charakterisieren, so wird sie in verstärktem Maße integrativ und komplex sein, neben den bisherigen Aufgaben von Datenerfassung, Datenanalyse und Datenspeicherung wird zunehmend die Datenintegration und die funktionelle Interpretation der Daten treten. Genomforschung und Bioinformatik sind eng miteinander verbunden. Eine Tendenz der letzten Jahre geht zu immer komplexeren Fragestellungen und damit komplexeren Projekten, die oft nicht mehr von einem Labor allein durchgeführt werden, sondern von weltweit vernetzten Forschungskonsortien, vergleichbar den Sequenzierungsprojekten der 1990er Jahre. Letztlich liegt dieser komplexen Forschungsstruktur die Erkenntnis zugrunde, dass Krankheitsprozesse nur über systematische Ansätze aufzuklären sind. Diese Entwicklung wird getrieben durch neue experimentelle Verfahren, die immer größere Datenmengen liefern, z. B. Tiling Arrays, Exon Arrays, 2nd Generation Sequencing Technologie. Dieser Entwicklung trägt die neue Disziplin der Systembiologie Rechnung, zu der sich ein Teil der Bioinformatik weiterentwickelt hat. Systembiologie zielt auf die Erklärung von Physiologie und Erkrankung auf der Ebene von Interaktionen z. B. von molekularen Signalwegen, Regulationsnetzwerken, Zellen und letztlich dem gesamten Organismus (Klipp et al. 2005). Mithilfe von Computermodellen werden in silico Voraussagen über den Krankheitsfortschritt oder den Effekt individueller Therapien erzeugt. Diese neuen Verfahren werden unser Wissen über Krankheitsprozesse und die Interpretation von Daten aus Hochdurchsatztechnologien vorantreiben. Eine weitere Zukunftskomponente betrifft die Datenintegration. Statt der Entwicklung neuer Verfahren ist immer mehr eine parallele Verarbeitung und Korrelation verschiedener Verfahren zu beobachten. Entscheidend für den Schritt von der qualitativen, explorativen Datenanalyse zur quantitativen, prädiktiven Analyse ist die Kombination von experimentellen Daten mit der umfangreichen Kenntnis über das zugrunde liegende

biochemische Reaktionssystem. Immer mehr werden daher integrierte bioinformatische Werkzeuge zur Modellierung und Simulation solcher Systeme unter Einarbeitung experimenteller Daten entwickelt werden. Objekte dieser Systeme sind mathematische Modelle der Reaktionsnetzwerke als Teil des Krankheitsprozesses. Zuverlässige mathematische Modelle für Krankheitsprozesse gibt es im Moment allerdings nur in sehr limitierter Form, insbesondere im Bereich der Krebsforschung. Beispiele betreffen hier generelle Charakteristika von Signalwegen (Bhalla u. Iyengar 1999) wie verzögerte Signaldauer, Schwellwertverhalten etc., und Modelle für einzelne Pathways wie EGFR (Schoeberl et al. 2002) und NFκB (Cho et al. 2003). In der Zukunft werden solche Modelle in noch viel stärkerem Maße als bisher in der medizinischen Genomforschung entwickelt werden.

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1.4

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

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1.4

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98

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

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99 1.4 · Analyse von Biochips: Von der Sequenz zum System

1.4.12 Zeittafel Die angegebenen Zitate beziehen sich nur auf die Zeittafel. 1869

Entdeckung der DNS durch Miescher

1902

Boveri und Sutton postulieren DNS als Träger des Erbguts.

Avery et al. (1944)

Einem US-Forscherteam gelingt der Nachweis, dass die DNS Träger der genetischen Information ist.

Chargaff (1951)

Vier Bausteine der DNS, die »Basen«, liegen in bestimmten Verhältnissen zueinander vor (Chargaff-Regel). Dabei bilden Adenin (A) und Thymin (T) sowie Guanin (G) und Cytosin (C) jeweils ein Paar.

Watson und Crick (1953)

Entdeckung der räumlichen Struktur der DNS (Doppelhelix)

Sanger (1951)

Entschlüsselung der Aminosäuresequenz von Insulin; damit ist bewiesen, dass Eiweiße aus einer definierten Abfolge von Aminosäuren bestehen.

Jacob und Monod (1961)

Erste allgemeine Studie zum Regulationsmechanismus von Genen

Nierenberg u. Matthaei (1961), Nierenberg et al. (1966), Khorana et al. (1966), Speyer et al. (1963)

Entzifferung des genetischen Kodes: Je drei DNS-Bausteine definieren jede der 20 Aminosäuren.

Linn u. Arber (1968)

Entdeckung der Restriktionsenzyme, die DNS-Moleküle an definierten Stellen schneiden können

Temin u. Mizutani (1970), Baltimore (1970)

Entdeckung des Enzyms reverse Transkriptase, mit dessen Hilfe einige Retroviren ihre Erbinformationen umschreiben können, um sie in die Wirts-DNS einzubauen

Dayhoff (1969), Needleman u. Wunsch (1970)

Entwicklung erster Verfahren zur Sequenzanalyse

Jackson et al. (1972)

Mithilfe von Restriktionsenzymen gelingt es, DNS zu zerschneiden und mit einem weiteren Enzym (Ligase) wieder zu verbinden. So entsteht das erste vollständige rekombinante DNS-Molekül.

Sanger u. Coulson (1975), Maxam u. Gilbert (1977)

Entwicklung leistungsfähiger Methoden zur DNS-Sequenzierung

1982

Das erste gentechnisch hergestellte Medikament (Insulin) wird in den USA vertrieben.

1982

Erste Sequenzdatenbanken entstehen (GenBank und EMBL).

Mulis u. Faloona (1986)

Polymerasekettenreaktion (PCR) zur enzymatischen Amplifizierung von Nukleotidsequenzen

1987

Entwicklung der automatischen DNS-Sequenzierung

1988

Die Initiative »Human Genome Project« wird in den USA und in Japan beschlossen. Sie soll die systematische Entschlüsselung des menschlichen Erbguts leisten.

Capecchi (1989)

Entwicklung einer zuverlässigen Technik, mit der bestimmte Gene in Mäusen gezielt ausgeschaltet werden können (»Knockout-Methode«)

Pearson u. Lipman (1988), Altschul et al. (1990)

Entwicklung von Standardprogrammen zur Sequenzanalyse (FASTA, BLAST)

Lehrach et al. (1990); Lennon u. Lehrach (1991); Schena et al. (1995); Lockhart et al. (1996)

Entwicklung von Genchips zur parallelen Messung des Transkriptionszustands ganzer Genome durch Hybridisierungsexperimente

1995

Beitritt Deutschlands zum »Human Genome Project«

Weber u. Myers (1997)

Entwicklung der Shotgun-Methode zur Hochdurchsatzsequenzierug ganzer Genome

Fire et al. (1998)

Fire und Mellow entdecken die RNS-Interferenz-Stummschaltung von Genen durch doppelsträngige RNS.

Dunham et al. (1999)

Sequenzierung des ersten menschlichen Chromosoms (Chromosom 22)

Hattori et al. (2000)

Sequenzierung des menschlichen Chromosoms 21; Sequenzierung des ersten Insekts (Drosophila melanogaster)

International Human Genome Sequencing Consortium (2001), Venter et al. (2001)

Sequenzierung des kompletten menschlichen Genoms

1.4

100

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

Literatur zur Zeittafel Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (1990) Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215:403–410 Avery OT, MacLeod CM, MacCarty M (1944) Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. J Exp Med 79:137–158 Baltimore D (1970) Viral RNA-dependent DNA polymerase. Nature 226:1209-1211 Capecchi M (1989) The new mouse genetics: Altering the genome by gene targeting. Trends Genet 5:70–76 Chargaff E (1951) Structure and function of nucleic acids as cell constituents. Fed Proc 10:654–659 Dayhoff M (1969) Atlas of protein sequence and structure. National Biomedical Research Foundation, Silver Spring, Maryland Dunham I, Hunt AR, Collins JE et al. (1999) The DNA sequence of human chromosome 22. Nature 402:489–495 Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. In: Nature Bd 391:S 806–811 Hattori M, Fujiyama A, Taylor TD et al. (2000) The DNA sequence of human chromosome 21. Nature 405:311–319 International Human Genome Sequencing Consortium (2001) Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409:860–921 Jackson D, Symons R, Berg P (1972) Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of simian virus 40: circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of E. coli. Proc Natl Acad Sci USA 69:2904– 2909 Jacob F, Monod J (1961) Genetic regulatory mechanisms in the sythesis of proteins. J Mol Biol 3:318–356 Khorana HG, Büchi H, Ghosh H, Gupta N, Jacob TM, Kössel H, Morgan R, Narang SA, Ohtsuka E, Wells RD (1966) Polynucleotide synthesis and the genetic code. Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 31:39–49 Lehrach H, Drmanac R, Hoheisel J et al. (1990) Hybridization Fingerprinting in Genome Mapping and Sequencing. In: Davies KE, Tilghman S (eds) Genome Analysis Volume 1: Genetic and Physical Mapping, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, p 39–81 Lennon G, Lehrach H (1991) Hybridization analyses of arrayed cDNA libraries. Trends Genet 7:314–317

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1.5 1.5 Mitochondriale DNA des Menschen Bernd Wissinger

1.5.1

Struktur und Funktion der Mitochondrien – 102

1.5.2

Das mitochondriale Genom des Menschen – 103

1.5.3

Transkription und RNA-Prozessierung

1.5.4

Translation

– 107

1.5.5

Replikation

– 108

1.5.6

Mitochondriale Vererbung

1.5.7

Mitochondriale Erkrankungen

1.5.8

mtDNA als molekularer Marker

1.5.9

Literatur

– 116

1.5.10

Zeittafel

– 118

– 104

– 111 – 113 – 115

Literatur zur Zeittafel – 118

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

102

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

1.5.1 Struktur und Funktion der Mitochondrien Ein Primärmerkmal von Eukaryonten ist der Besitz von Mitochondrien als Bestandteile des Zytoplasmas. Mitochondrien sind zumeist stäbchenförmig und messen zwischen 0,2–1 µm im Durchmesser und 2–8 µm in Längsrichtung. Ihre Zahl schwankt je nach Zelltyp zwischen wenigen Dutzenden in den Spermien und primordialen Keimzellen bis zu Zehntausenden in Leberzellen oder reifen Oozyten. Die bisherige Vorstellung von Mitochondrien als solitären Zellorganellen ist jedoch nicht länger haltbar; Mitochondrien durchziehen die Zelle als verzweigte Netzwerke, welche dynamischen Fusions- und Spaltungsprozessen unterliegen. Die Mitochondrien einer Zelle bilden somit eine strukturelle und physiologische Einheit, die man als mitochondriales Retikulum bezeichnet (Okamoto u. Shaw 2005). Mitochondrien besitzen zwei Membranen, die äußere und die innere Mitochondrienmembran. Dadurch werden zwei in sich abgeschlossene Kompartimente geschaffen, der Intermembranraum und der innere Matrixraum. Die innere Mitochondrienmembran ist stark aufgefaltet und bildet dadurch Invaginationen, die sog. Cristae, die in den Matrixraum hineinreichen. Durch die Cristae wird die Fläche der inneren Mitochondrienmembran stark vergrößert. Neuere Untersuchungen mittels Elektronenmikroskop-Tomographie zeigen, dass die Cristae je nach Zelltyp tubulär, lamellenförmig oder unregelmäßig mit sackartigen Ausstülpungen gestaltet sind und lediglich durch dünne Tubuli mit dem anliegenden Rest der Innenmembran in Verbindung stehen (Manella 2006). Die äußere und innere Mitochondrienmembran unterscheiden sich erheblich in ihrem Aufbau und ihren biophysikalischen Eigenschaften. Die äußere Membran ähnelt in ihrer Lipidzusammensetzung derjenigen typischer intrazellulärer Membransysteme (z. B. der des endoplasmatischen Retikulums). Sie enthält einen relativ geringen Anteil an Protein und besitzt Poren (Porine), die eine hohe Permeabilität für Ionen und Metabolite gewährleisten. Im Gegensatz dazu ist die Lipidzusammensetzung der inneren Mitochondrienmembran ungewöhnlich: Es findet sich kein Cholesterin, dafür ein hoher Anteil von Kardiolipin – Merkmale, wie sie für die Membran von Bakterien typisch sind. Die innere Mitochondrienmembran enthält einen extrem hohen Anteil an Proteinen (etwa 80%) und ist weitgehend inpermeabel für Metabolite, sodass der Stoffaustausch von spezifischen Translokatorproteinen abhängig ist (Palmieri 1994). Die Mitochondrien sind der Ort der aeroben Energiegewinnung (oxidative Phosphorylierung) und wichtiger Knotenpunkt im Stoffwechsel der Zelle. Von besonderer Bedeutung ist dabei der Citratzyklus (Krebs-

zyklus), der im Matrixraum der Mitochondrien angesiedelt ist. Hier wird das aus der Decarboxylierung von Pyruvat und dem Abbau von Fettsäuren gewonnene Acetyl-CoA in einem zyklischen Reaktionsprozess zu CO2 oxidiert. Dabei entstehen Reduktionsäquivalente in Form von NADH+H+ bzw. FADH2, die in die Atmungskette eingespeist werden. Die Atmungskette setzt sich aus vier Proteinkomplexen, eingebettet in die innere Mitochondrienmembran, zusammen: x NADH-Ubichinon-Oxidoreduktase (NADH-Dehydrogenase, Komplex I) x Succinat-Ubichinion-Oxidoreduktase (Komplex II) x Ubichinon-Cytochrome c-Oxidoreduktase (Komplex III) x Cytochrome c-Oxidase (Cytochrom-Oxidase, Komplex IV) Die von den Reduktionsäquilaventen in den Komplex I bzw. Komplex II (für FADH2) eingespeisten Elektronen durchlaufen ein Redoxkette und werden schließlich auf O2-Moleküle übertragen, die nachfolgend zu H2O reduziert werden. Gekoppelt an diesen exergonen Elektronentransport ist ein gerichteter Transport von Protonen in den Intermembranraum. Es entsteht dadurch ein elektrochemisches Potential für Protonen (Protonengradient) zwischen dem Intermembran- und dem Matrixraum. Der Rückfluss der Protonen entlang dieses Gradienten wird durch den membranständigen ATPaseKomplex kanalisiert und treibt dabei die Synthese von ATP aus ADP und freiem Phosphat an (Chemiosmotische Theorie nach Mitchell). Neben der Bereitstellung von Reduktionsäquivalenten für die Atmungskette nehmen der Citratzyklus und die vorgeschaltete Pyruvatdecarboxylase eine Zentralstellung im katabolen und anabolen Stoffwechsel der Zelle ein. Dazu gehört beispielsweise die Bereitstellung von Ausgangssubstraten für die Biosynthese bestimmter Aminosäuren, für die Fettsäuresynthese, die Glukoneogenese und die Porphyrinbiosynthese. Eine weitere besondere Bedeutung der Mitochondrien besteht in ihrer Funktion als intrazellulärer Ca2+-Speicher und als Vermittler des apoptotischen Zelltods (7 Kap. 1.8). Bereits Ende des 19. Jahrhunderts wurde von Richard Altmann die Vermutung aufgestellt, dass Mitochondrien und Chloroplasten von ursprünglich selbstständigen Organismen abstammen, die im Laufe einer zellulären Symbiose zu Organellen „domestiziert“ worden sind. An dieser Endosymbiontenhypothese zur Erklärung des Ursprungs der Organellen gibt es kaum mehr ernsthafte Zweifel (zur Übersicht s. Margulis 1981). Vergleichende Sequenzanalysen deuten auf eine Verwandtschaft der Vorläufer der Mitochondrien mit Vertretern aus der Gruppe der D-Proteobakterien hin. Obwohl man in der Größe und Struktur des mitochondrialen Genoms, so-

103 1.5 · Mitochondriale DNA des Menschen

wie in der Zahl und Anordnung der darin kodierten Gene eine sehr große Variabilität zwischen verschiedenen Eukaryontengruppen findet, verstärken sich Hinweise auf einen monophyletischen Ursprung der Mitochondrien (zur Übersicht s. Gray et al. 1999). So sind beispielsweise die Aminosäuresequenzen mitochondrial kodierter Proteine zwischen den verschiedenen Eukaryontengruppen weit besser konserviert, als zu den homologen Proteinen der am nächsten verwandten Bakterien. Auch mit der Identifizierung „primitiver“ mitochondrialer Genome, wie kürzlich jenes des heterotrophen Flagellaten Reclinomonas americana mit insgesamt 97 Genen, gelingt es zunehmend, Bindeglieder für den monophyletischen Evolutionsweg der Mitochondrien zu rekonstruieren (Lang et al. 1997).

1.5.2 Das mitochondriale Genom des Menschen Die Beobachtung von nichtmendelnden Erbgängen und das daraus entwickelte Konzept von extrachromosomalen, plasmatischen Erbfaktoren geht zurück auf Arbeiten von Bauer und Correns zu Beginn des 20. Jahrhunderts. Den entscheidenden Impuls für eine eigenständige Mitochondriengenetik lieferten jedoch die Arbeiten von Ephrussi über die Erzeugung und das Kreuzungsverhal-

a . Abb. 1.5.1a,b. Das mitochondriale Genom des Menschen. a Schematische Darstellung der Struktur und des Aufbaus des humanen mitochondrialen Genoms. Der äußere Kreis stellt den H-Strang und der innere Kreis den L-Strang der mtDNA dar. Die Gene für die beiden rRNA-Gene (12S, 16S) sind in rot, die proteinkodierenden Gene (ND16, CO1-3, ATP6, ATP8 und CYB) in blau und die tRNA-Gene (benannt

1.5

ten von atmungsdefizienten petite-Mutanten (kleine Kolonien) bei der Bäckerhefe. Mit dem Nachweis von DNA in Mitochondrien (mtDNA) im Jahr 1963 und der nachfolgenden Entwicklung von Methoden zur Isolierung von mtDNA mittels Dichtezentrifugation wurde schließlich die Ära der Molekulargenetik der Mitochondrien eingeleitet, die mit der Komplettsequenzierung des humanen mitochondrialen Genoms im Jahre 1981 einen ersten Höhepunkt feiern konnte (Anderson et al. 1981). Die damals ermittelte Sequenz (Cambridge Sequence) mit einer Gesamtlänge von 16569 bp bildet noch heute das Grundgerüst der humanen mtDNA-Referenzsequenz (http://www. mitomap.org/mitoseq.html). Andererseits zeichnet sich die humane mtDNA durch ihre Sequenzvariabilität aus, sodass man typischerweise 10 bis 20 Sequenzabweichungen beim Vergleich zweier Individuen findet. Das humane mitochondriale Genom ist ein singuläres, doppelsträngiges Ringmolekül (> Abb. 1.5.1). Im nativen Zustand ist dieses Ringmolekül in eine negativ gewundene „supercoil“-Konformation aufgedrillt. Bei der mtDNA wird historisch zwischen H- („heavy“) und L- Strang („light“) des Ringmoleküls unterschieden; eine Differenzierung, die auf die unterschiedliche Dichte der beiden Einzelstränge in der denaturierenden CsCl-Dichtezentrifugation abhebt. Der GC-Gehalt der humanen mtDNA ist mit 44% nur unwesentlich höher als der des Kerngenoms.

b im Ein-Buchstaben-Code für die jeweils spezifizierte Aminosäure) in grün dargestellt. OH, OL – Replikationsursprung des H- bzw. L-Stranges. IHR, IHT, IL – Initiationsorte für die Transkription der vom H- bzw. L-Strang kodierten Gene. b Elektronenmikroskopische Aufnahme eines partiell entfalteten mtDNA-Moleküls aus menschlichen HeLaZellen (75.000-fache Vergrößerung)

104

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

. Tabelle 1.5.1. Gene im humanen mitochondrialen Genom Klasse /Komplex

Zahl

rRNAs

2

tRNAs

22

Proteinkodierende Gene (Untereinheiten der ~)

13

Bezeichnung/ Gensymbol 12S, 16S tRNATrp, etc.

NADH-Ubiquinon-Oxidoreduktase

7

ND1, ND2, ND3, ND4 ND4L, ND5, ND6

Ubiquinon-Cytochrome c-Oxidoreduktase

1

CYB

Cytochrome c-Oxidase

3

CO1, CO2, CO3

ATP-Synthetase

2

ATP6, ATP8

Das mitochondriale Genom des Menschen enthält insgesamt 37 Gene, darunter Gene für zwei ribosomale RNAs (12S- und 16S-rRNA), für 22 Transfer-RNAs (tRNAs) und 13 proteinkodierende Gene (> Tabelle 1.5.1). Die Letztgenannten kodieren für Untereinheiten der mitochondrialen Atmungskettenkomplexe I (7 Gene, ND1-6), III (1 Gen, CYB) und IV (3 Gene, CO13) bzw. der ATP-Synthetase (2 Gene, ATP6 und ATP8). Da die Mehrzahl der Untereinheiten dieser Multiproteinkomplexe kernkodiert ist, haben wir hier interessanterweise Mosaikstrukturen, zusammengesetzt aus kernund mitochondrial kodierten Bestandteilen, vor uns. Anders als sonst üblich hat es sich für das mitochondriale Genom in der Literatur eingebürgert, den Matrizenstrang als den kodierenden Strang zu benennen. Dieser Konvention entsprechend wird die überwiegende Mehrzahl der mitochondrialen Gene (28/37) vom H-Strang kodiert, lediglich 8 tRNA-Gene und das ND6Gen sind auf dem L-Strang lokalisiert. Das mitochondriale Genom des Menschen – und dies gilt für alle höheren Tiere – zeichnet sich durch seine Kompaktheit und äußerst ökonomische Anordnung und Struktur der Gene aus. Diese enthalten keine Introns und grenzen mit ihren kodierenden Sequenzen zumeist un-

. Abb. 1.5.2. Partiell überlappende Kodierung zwischen dem ATP8und ATP6-Gen. Die beiden Gene überlappen in einem 46 bp langen Abschnitt. Dargestellt ist die Transkriptsequenz (in schwarz) und die von den beiden Genen genutzten Leseraster samt der zugehörigen Aminosäuresequenz (ATP8 in blau, ATP6 in grün). Gezeigt ist weiter-

mittelbar aneinander. An drei Positionen im humanen mitochondrialen Genom findet sich sogar eine überlappende Kodierung von Genen (> Abb. 1.5.2). Auch fehlen den proteinkodierenden Genen die sonst üblichen nichttranslatierten Sequenzabschnitte vor und nach dem Leseraster einschließlich der Ribosomenbindungstelle. Und schließlich werden in der Mehrzahl der Fälle die letzten Basen der Terminationskodons erst durch die Polyadenylierung der prozessierten Transkripte ergänzt (> Abb. 1.5.2, 7 Abschn. 1.5.3 „Transkription und RNA-Prozessierung“). Die Kompaktheit des humanen mitochondrialen Genoms mit seiner engen Aneinanderreihung der Gene spiegelt sich in der extrem hohen mittleren Gendichte von 447,8 bp/Gen wieder. Der ca. 1100 bp lange Abschnitt zwischen den Genen für die tRNAPro und die tRNAPhe, der die Promotoren und den Replikationsursprung für den H-Strang enthält, ist der einzige größere Sequenzanteil der mtDNA, der keine kodierende Funktion hat (> Abb. 1.5.1). Aufgrund des geringen kodierenden Potentials des mitochondrialen Genoms ist der genetische Apparat der Mitochondrien größtenteils von kernkodierten Genfunktionen abhängig. So werden im Extremfall (beim Menschen und generell allen höheren Tieren) alle für die Replikation und der Transkription notwendigen Faktoren und alle Proteinkomponenten des Translationsapparats vom Kern kodiert und müssen in die Mitochondrien importiert werden.

1.5.3 Transkription und RNA-Prozessierung Die Transkription der Gesamtheit aller Gene des humanen mitochondrialen Genoms wird von lediglich zwei Promotoren, je einem für den H- und den L-Strang, gesteuert. Die beiden Promotoren („heavy/light strand promotor“, HSP/LSP) liegen eng benachbart in der nichtkodierenden Region des mt-Genoms (> Abb. 1.5.3). Sie setzen sich aus je zwei Sequenzelementen, einer ca. 10–15 Basenpaare langen Sequenz um die Initiationsstelle der Transkription und die sich davor anschließende Binde-

hin die Vervollständigung des UAA-Stoppkodons für das ATP6-Gen durch die Polyadenylierung des Transkripts und die vom „universellen“ genetischen Code abweichende Verwendung des UGA-Tripletts für die Kodierung der Aminosäure Tryptophan (*)

105 1.5 · Mitochondriale DNA des Menschen

1.5

. Abb. 1.5.3. Funktionelle Organisation der mtDNA-Kontrollregion. Schematische Darstellung und Positionierung der für die Initiation der Transkription und der H-Strang Replikation bedeutsamsten Sequenzelemente. Die Promotoren für die Transkription des H- (HSP-) und L-Stranges (LSP) setzen sich aus der „Core“-Sequenz (in schwarz) um den Initiationsort der RNA-Synthese (IHR bzw. IL) und den benachbarten Bindungsstellen für den Transkriptionsfaktor mtTFA (in gelb, Orientierung in Pfeilrichtung) zusammen. Weitere sekundäre mtTFABindungsstellen im Bereich des LSP sind hellgelb dargestellt. Die

Transkription der Gene auf dem H-Strang erfolgt von zwei Initiationsorten aus. Am IHR initiiert die Transkription der rRNA-Gene, am IHT die Transkription des kompletten H-Stranges mit der Mehrzahl der tRNAGene und proteinkodierenden Gene. Am IL initiiert die Synthese des RNA-Primers (7S-RNA) als Ausgangspunkt für die Replikation des HStranges. Für die Stabilisierung und Prozessierung des RNA-Primers ist die Präsenz evolutiv konservierter Sequenzelemente (CSB1-3, in grau) essenziell. Ansetzend an dem prozessierten RNA-Primer beginnt am OH die Replikationssynthese des H-Stranges

stelle für den Transkriptionsfaktor mtTFA im Bereich zwischen den Positionen –12 bis –39 vor der Initiationsstelle, zusammen. Die kritischen Sequenzelemente von HSP und LSP sind nur partiell konserviert; die daraus abzuleitende Konsensussequenz für die Initiationsstelle lautet 5c-ACC(G)0-1CC(A)3-4GA-3c, wobei die Transkription an der Position der zentralen Adenosinnukleotide initiiert. Die mtTFA-Bindestellen von HSP und LSP zeigen bezüglich der Transkriptionsrichtung eine gegensätzliche Orientierung, d. h., die Aktivierung der Transkription durch mtTFA erfolgt unabhängig von der Orientierung der entsprechenden Bindungsstelle. Die Bindungsaffinität von mtTFA für den LSP ist weitaus höher als für den HSP. Zusätzlich befinden sich weitere, schwächere mtTFA-Bindungsstellen stromab des LSP. Der Transkriptionsfaktor mtTFA ist für die Transkriptionsinitiation essenziell. Er krümmt und entwindet das DNA-Molekül als Voraussetzung für die Bildung des Initiationskomplexes, bestehend aus der mitochondrialen RNA-Polymerase POLRMT und dem Transkriptionsfaktor TFB1M bzw. TFB2M (Fisher et al. 1992; Falkenberg et al. 2002). Ausgehend von den Initiationstellen können beide Stränge des mt-Genoms in nahezu ihrer gesamten Länge transkribiert werden, und es entstehen dabei polycistronische Vorläufer-Transkripte (> Abb. 1.5.4). Pulsmarkierungsexperimente zeigen, dass der L-Strang etwa 2- bis 3-fach stärker transkribiert wird als der H-Strang. Mit Ausnahme der 7S RNA, die als RNA-Vorläufer für die Initiation der DNA-Replikation benötigt wird (s. u.), haben die L-Strang - Transkripte jedoch eine sehr geringe Lebensdauer und sind nur in geringer Menge im Transkriptpool nachweisbar. Diese hohe Turnover-Rate der L-Strang-Primärtranskripte verhindert möglicherweise eine Antisense-Interferenz mit den komplementären Transkripten des H-Stranges.

Im Transkriptpool der Mitochondrien überwiegen jedoch kürzere RNA-Spezies definierter Länge, die aus der Prozessierung der Primärtranskripte des L- und HStranges noch während der Transkription hervorgehen (Ojala et al. 1981) (> Abb. 1.5.4). Für die Spaltung des Primärtranskripts ist die in der Organisation des mt-Genoms auffällige Positionierung der tRNAs zwischen den proteinkodierenden Genen von Bedeutung. Die Primärtranskripte werden nämlich durch spezifische endonukleolytische Spaltungsreaktionen am 5c- und 3c-Ende der tRNAs unter Beteiligung einer RNAse P und einer 3c-tRNA-Prozessierungsendonuklease in die reifen rRNAs, tRNAs und proteinkodierenden mRNAs zerlegt (Ojala et al. 1981; Rossmanith et al. 1995). Lediglich in zwei Fällen (ATP8/ATP6/CO3 und ND4L/ND4) bleibt eine di- bzw. tricistronische Transkripteinheit erhalten. Die Transkriptspaltung durch die mitochondriale RNAse P (mtRNAse P) erfolgt analog zum Mechanismus der tRNA-Prozessierung bei Bakterien und im Kern der Eukaryonten (Altman et al. 1986). Die mtRNAse P ist ein Ribonukleoproteinkomplex mit einem 340 Nukleotide langen RNA-Anteil, welcher identisch ist mit der H1-RNA der nukleären RNAse P (Puranam u. Attardi 2001). Wichtig ist hieraus die Erkenntnis, dass Mitochondrien einen geregelten RNA-Importmechanismus für die kernkodierte H1-RNA und auch den RNA-Anteil der an der Replikation beteiligten RNAse MRP (s. u.) haben müssen. Da mitochondriale Erkrankungen (Mitochondriopathien, 7 Abschn. 1.5.7) sehr häufig durch Mutationen in den tRNA-Genen verursacht sind, versucht man, sich diesen RNA-Import aus dem Zytoplasma für Therapieansätze nutzbar zu machen (Kolesnikova et al. 2004). Neben der endonukleolytischen Spaltung der Vorläufertranskripte sind weitere posttranskriptionelle Mo-

106

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

. Abb. 1.5.4. Transkription und Prozessierung der mtDNA-Transkripte. Linearisierte Darstellung der mtDNA (Farbcodierung der Gene entsprechend Abb. 1.5.2) mit der Übersicht über die vom H- und L-Strang abgelesenen Primärtranskripte und deren nachfolgende Prozessierung. Zwei verschiedene Primärtranskripte werden vom H-Strang abgelesen, die durch die alternative Transkriptionsinitiation am IHR bzw. IHT spezifiziert sind. Das kürzere rRNA-Vorläufertranskript

terminiert am Ende des 16s rRNA-Gens und liefert die Hauptmasse der rRNAs. Die Zerlegung der Primärtranskripte erfolgt durch endonukleolytisches „Ausschneiden“ der tRNAs bereits während der Transkription. Die proteinkodierenden mRNAs werden nachfolgend durch Polyadenylierung vervollständigt und stabilisiert. Im Gegensatz dazu werden die nichtkodierenden Abschnitte des L-StrangTranskripts rasch abgebaut

difikationen der mitochondrialen Transkripte erforderlich. In frühen Untersuchungen konnte bereits gezeigt werden, dass die reifen mRNA-Transkripte einen 50–60 Nukleotide langen Poly(A)-Schwanz tragen. Auch die rRNA-Transkripte werden am 3c-Ende adenyliert, jedoch finden sich hier nur Abschnitte mit 5–10 Adenosinnukleotiden. Im Gegensatz dazu sind die reifen tRNAs nicht 3c-adenyliert, stattdessen muss wie bei den zytosolischen tRNAs das typische 3c-terminale CCA-Trinukleotid durch eine Nukleotidyltransferase angehängt werden (Reichert u. Mörl 2000). Sieben der 13 Leseraster für proteinkodierende Gene (ND1-ND4, ATP6, CO3, CYB) enden ohne vollständiges Terminationskodon. Erst durch die Polyadenylierung der prozessierten Transkripte wird das Ende des Leserasters zu einem funktionellen Stoppkodon ergänzt (Anderson et al. 1981) (> Abb. 1.5.2). Aus dem bisher vorgestellten Modell der mitochondrialen Transkription und Prozessierung wäre ein stöchiometrisches Verhältnis zwischen den mRNA-, tRNAund rRNA-Transkriptspezies zu folgern. Im Transkriptpool der Mitochondrien sind jedoch lediglich die verschiedenen mRNAs in annähernd gleichem Mengenverhältnis vorhanden, während die rRNAs in einem 15bis 60-fachen Überschuss vorliegen (Attardi 1985). Nur ein Teil dieses Überschusses resultiert aus der höheren Lebensdauer der rRNA. Der entscheidende Unterschied

ist durch eine deutlich erhöhte Neusyntheserate der rRNAs begründet (Gelfand u. Attardi 1981). Wie wird in den Mitochondrien dieser Unterschied in der Syntheserate bewerkstelligt? Attardi et al. konnten durch eine Reihe von Untersuchungen zeigen, dass bei der Transkription des H-Strangs zwei alternative Wege existieren. Sie sind durch die Verwendung unterschiedlicher Transkriptionsinitiationsstellen gekennzeichnet. Die Transkription des kompletten H-Strang-Vorläufertranskripts, aus welchem die reifen mRNAs hervorgehen, initiiert am 5c-Ende des 12S-rRNA-Gens (IHT). Im Gegensatz dazu erfolgt die Transkriptionsinitiation für die Hauptmenge der rRNAs direkt am circa 90 bp weiter stromauf gelegenen HSP (IHR) und schließt das Gen für die tRNAPhe mit ein (Montoya et al. 1983) (> Abb. 1.5.3). Diese am IHR initiierte Transkription terminiert frühzeitig bereits am 3c-Ende des 16S-rRNA-Gens (> Abb. 1.5.4). Entscheidend dafür ist der kernkodierter Terminationsfaktor (mTERF), ein 34-kD-Protein mit zwei basischen Abschnitten für die Bindung an die DNA und drei Leucinzipperdomänen, welches spezifisch an ein Sequenzmotiv am 5c-Ende des tRNALeu(UUR)-Gens bindet. Im phosphorylierten Zustand bildet mTERF an dieser Stelle eine physikalische Barriere, an welcher die mtRNA-Polymerase stoppt und vom DNA-Molekül abfällt (Kruse et al. 1989; Prieto-Martin et al. 2004). mTERF bindet aber zusätzlich auch an die IHR, wodurch eine auch elektro-

107 1.5 · Mitochondriale DNA des Menschen

nenmikroskopisch beobachtbare Loop-Struktur entsteht, in der sich wie in einer Mikrodomäne die Transkription der Hauptmasse der rRNA vollzieht (Martin et al. 2005).

1.5.4 Translation Mitochondrien unterhalten einen eigenen Proteinbiosyntheseapparat, der beim Menschen für die Synthese von lediglich 13 Polypeptidketten aufrechterhalten wird. Wesentliche funktionelle Bestandteile des Proteinbiosyntheseapparats wie z. B. die ribosomalen Proteine, die Aminoacyl-tRNA-Synthetasen und die Initiations-, Elongations- und Terminationfaktoren der Translation werden alle vom Kern kodiert und müssen importiert werden. Lediglich die RNA-Bestandteile des Proteinbiosyntheseapparats – rRNAs und t-RNAs – sind mitochondrial kodiert. Die mitochondrialen Ribosomen (Mitoribosomen) unterscheiden sich in ihrer Zusammensetzung deutlich von der zytoplasmatischer und auch prokaryoter Ribosomen. Die Sedimentationskoeffizienten der intakten Monosomen bzw. der großen und der kleinen Untereinheit betragen in Säugermitochondrien 55S, 39S und 28S (Patel et al. 2001). Die Gesamtmolekularmasse eines solchen Mitoribosoms beträgt ca. 3,5u106 Da und ist damit deutlich größer als die bei E. coli. Sehr ungewöhnlich ist das relative Massenverhältnis von RNA zu Protein, welches bei den Mitoribosomen lediglich 1:3 beträgt. Ausschlaggebend dafür ist einerseits der hohe Anteil und die große Anzahl ribosomaler Proteine (ca. 85–90 beim Rind), die deutlich über derjenigen in Prokaryonten und auch der zytoplasmatischer Ribosomen liegt, und anderseits die geringe Größe der mitochondrialen rRNA-Moleküle. Die tierischen Mitoribosomen enthalten lediglich zwei rRNA-Spezies, 16S- und 12S-rRNA, mit einer Länge von ca. 1560 bzw. 950 Nukleotiden. Eine kleine rRNA, wie sie bei anderen Systemen (5S-rRNA bei Eubakterien bzw. 5,8S-rRNA bei Eukaryonten) aber auch bei Pflanzenmitochondrien vorkommt, fehlt bei tierischen Mitoribosomen. Trotz ihrer geringeren Größe zeigen Faltungsmodelle für die beiden mitochondrialen rRNAs deutliche strukturelle Ähnlichkeit mit der 23S- und 16S-rRNA von E. coli. Der Größenunterschied spiegelt sich dabei insbesondere im Fehlen einiger Sekundärstrukturelemente wieder (Wolstenholme 1992). Am auffälligsten ist das Fehlen einer Anti-Shine-Dalgarno-Sequenz am 3c-Ende der 12S-rRNA. Bei E. coli ist die Interaktion dieses Abschnittes am 3’-Ende der 16S-rRNA mit einer purinreichen Sequenz am 5c-Ende der bakteriellen mRNAs (Shine-DalgarnoSequenz) für eine effiziente Translation notwendig. Andererseits wurde bereits angeführt, dass die Mehrzahl der reifen mitochondrialen Transkripten unmittelbar

1.5

mit dem Initiationskodon der Translation beginnt. Auch fehlt den mitochondrialen Transkripte ein 5c-terminales (7-methyl-guanosin-)m7G(5c)ppp-cap, welches für die Translation eukaryoter mRNAs wichtig ist. Die sich daraus ergebende Frage nach dem Mechanismus der Transkripterkennung und Translationsinitiation durch die Mitoribosomen ist bis heute ungeklärt. Die Mitoribosomen enthalten im Vergleich mit den zytoplasmatischen Ribosomen einen geringeren Anteil basischer Proteine. Antikörper gegen die ribosomalen Proteine der Mitoribosomen zeigen keine Kreuzreaktion mit denen der zytoplasmatischen Ribosomen, und es ist offensichtlich, dass der größte Teil, wenn nicht sogar alle ribosomalen Proteine der Mitoribosomen von distinkten nukleären Genen kodiert werden (Pietromonaco et al. 1991). Die Einzelprozesse der mitochondrialen Translation – Initiation, Elongation und Termination – sind nur ansatzweise erforscht. Einzelne Komponenten wie die Elongationsfaktoren EF-Tu, EF-Ts und EF-G und der Terminationsfaktor RF1 konnten isoliert und die zugehörigen Gene kloniert werden. In ihrer Aminosäuresequenz ähneln sie den homologen Faktoren von E. coli. Auch die bislang spärlichen biochemischen Untersuchungen zum Elongationszyklus zeigen eine nahe Verwandtschaft zur Translation im prokaryoten System (Cai et al. 2000). Die Proteinbiosyntheseleistung der Mitochondrien ist vergleichsweise gering und beträgt nur ein Bruchteil der Gesamtmasse der in der Zelle synthetisierten Polypeptide. Entsprechend niedrig ist die Konzentration der Proteinbiosynthese-Komponenten in den Mitochondrien. Bei vergleichbarem Volumeninhalt beträgt die Zahl der Mitoribosomen bzw. die Konzentration der tRNAs und der Translationsfaktoren nur circa 0,1–1% derjenigen einer stoffwechselaktiven Prokaryontenzelle (Cai et al. 2000). Der größte Teil der Mitoribosomen ist mit der inneren Mitochondrienmembran assoziiert. Offensichtlich erfolgt hier ein unmittelbarer Einbau der neusynthetisierten Proteine in die Membran (Liu u. Spremulli 2000). Eine der Schlüsselerkenntnisse bei der Analyse des mitochondrialen Genoms war die Entdeckung, dass Mitochondrien einen vom „universellen“ Kode abweichenden genetischen Kode verwenden (Barrell et al. 1979). In den humanen Mitochondrien wird das Kodon AUA mit Methionin statt Isoleucin „übersetzt“, UGA kodiert für Tryptophan anstatt der Terminationsfunktion im universellen Kode, und die üblicherweise für Arginin kodierenden Tripletts AGA und AGG dienen als Stoppkodons (> Tabelle 1.5.2). Schließlich werden zusätzlich zum AUG auch die Tripletts AUA und AUU (im mtGenom anderer Säuger darüber hinaus auch AUC; Wolstenholme 1992) als Initiationskodons verwendet. An internen Kodons wird AUU und AUC jedoch regel-

108

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

. Tabelle 1.5.2. Genetischer Kode in Mitochondrien Kodon

„Standard Kode“

Säuger-Mitochondrien

UGA

Stop

Trp

AUA

Ile

(f-)Met

AGA, AGG

Arg

Stop

AUU, AUC

Ile

f-Met/Ile*

* Neben AUG dienen auch AUA, AUU und AUC als Initiationskodons der Translation. Interne AUU und AUC werden als Ile übersetzt.

. Abb. 1.5.5. tRNA-Struktur und Kodon/Antikodon-Erkennung in Mitochondrien. Sekundärstruktur der mitochondrialen tRNAVal mit der Antikodonsequenz UAC. Die Uridinbase an der ersten Antikodonposition interagiert mit allen vier Basen an der dritten Kodonposition und erlaubt damit eine Erkennung aller vier Kodons (GUN) für Valin („super-wobble“). Zusätzlich hervorgehoben ist das CCA-Trinukleotid am 3‘-Ende der tRNA. Die Anbindung dieses Trinukleotids erfolgt posttranskriptionell durch eine Nukleotidyltransferase

recht als Isoleucin translatiert. Die genannten Abweichungen vom universellen genetischen Kode gelten soweit als bekannt für die Mitochondrien aller Vertebraten. Im mitochondrialen Genom niederer Tiere, Einzeller, Pilze und Pflanzen finden sich jedoch auch andere Kodeabweichungen und zwischenzeitlich gibt es auch zahlreiche Beispiele für abweichende genetische Kodes im Kerngenom (Knight et al. 2001). Die Abänderung des genetischen Kodes ist eng mit der Evolution einer unkonventionellen Kodonerkennung durch die tRNAs verknüpft. Die vom humanen mitochondrialen Genom kodierten 22 tRNAs sind ausreichend für die komplette Dekodierung aller 60 translatierten Tripletts. Grundlage dafür ist, dass alle Kodons der einheitlich „übersetzten“ Kodonquartette (CUN-Leucin, GUN-Valin, UCN-Serin, CCN-Prolin, ACN-Threonin, GCN-Alanin, CGNArginin und GGN-Glycin) von einer einzigen tRNASpezies erkannt werden. Bei diesem als „super wobble“ bezeichneten Mechanismus paart eine unmodifizierte Uridinbase an erster Position in der Antikodonsequenz mit allen vier Basen an der dritten Stelle im Kodon (Barrell et al. 1980) (> Abb. 1.5.5). Bei Kodonquartetten, die für zwei unterschiedliche Aminosäuren kodieren (z. B. CAU/CAC-Histidin und CAA/CAG-Glutamin) erfolgt

offensichtlich eine Spezifizierung der „super wobble“Erkennung. Kodons mit Purinbasen an der dritten Kodonpositon werden von tRNAs mit einer Modifikation des Uridins an der ersten Antikodonpositon spezifiziert, während die mit Pyrimidinbasen endenden Kodons von tRNAs mit Guanin an der ersten Antikodonposition erkannt werden. Die mitochondrialen tRNAs zeigen einen ungewöhnlich hohen Anteil von Adenosin- und Uridinnukleotiden und sind in ihrer Struktur und Sequenz weit weniger stark konserviert als die tRNAs bei Prokaryonten und die nukleär kodierten tRNAs von Eukaryonten. Insbesondere die Größe und Sequenz der üblicherweise konservierten Loops des DHU- und des TYC-Arms ist sehr variabel. Ein extremes Beispiel ist die tRNASer(AGY), bei der der DHU-Arm durch eine kurze ungepaarte Ausfaltung ersetzt ist.

1.5.5 Replikation Die Replikation der beiden mtDNA-Stränge verläuft asynchron. Zunächst erfolgt eine Replikation des H-Stranges bis nach circa 2/3 des Molekülumfangs die Signalsequenz für die Initiation der L-Strang-Replikation freigelegt wird (Clayton 1982). Die Initiation der Replikation am OH, dem Replikationsursprung für den H-Strang im nichtkodierenden Abschnitt der mtDNA, ist eng mit dem Prozess der Transkriptionsinitiation am L-Strang-Promotor (HSP) verknüpft. Ähnlich wie bei einigen prokaryoten Replikons (z. B. ColE1, Phage T7) bilden RNA-Primer die Ausgangssubstrate für die DNASynthese bei der Replikation des H-Stranges (Chang u. Clayton 1985). Daher muss zu Beginn der Replikation zunächst ausgehend vom HSP eine RNA-Synthese initiiert werden. Die Synthese des RNA-Primers erfolgt analog der herkömmlichen Transkription unter Beteiligung des Initiationsfaktors mtTFA und der mtRNA-Polymerase (> Abb. 1.5.3). Es ist ungeklärt, inwieweit sich die Synthese von RNA-Primern (als 7S-RNA in der älteren

109 1.5 · Mitochondriale DNA des Menschen

Literatur bezeichnet) als Ausgangspunkt für die Replikation vom ordinären Transkriptionsprozess unterscheidet; ob also auch die üblichen L-Strang-Transkripte ein Substrat für die Replikationsinitiation darstellen. Kennzeichnend für den Beginn des Replikationsprozesses ist die Ausbildung eines stabilen RNA-DNA-Hybrids (R-Loop) zwischen dem neusynthetisierten RNA-Primer und dem L-Strang (> Abb. 1.5.6). Die Ausbildung des R-Loops wird durch evolutiv konservierte Sequenzabschnitte, die sog. „conserved sequence blocks“ (CSBIIII), stabilisiert (Xu u. Clayton 1996). Beim R-Loop am mitochondrialen OH (H-Strang „origin of replication“) handelt es sich jedoch nicht um eine simples RNA-DNAHybrid, sondern um eine komplexe Struktur, die den verdrängten DNA-Strang mit einbezieht und durch die erhöhte Torsionspannung des partiell entwundenen DNA-Moleküls konfiguriert wird. Der RNA-Anteil des R-Loops nimmt dabei eine Faltungsstruktur ein, die für die nachfolgende Prozessierung durch die mitochondriale RNAse MRP, einer sequenzspezifischen Endoribonuklease erforderlich ist (Lee u. Clayton 1997) (> Abb. 1.5.6) Wie bei der RNAse P handelt es sich auch bei der RNAse MRP um einen Ribonukleoprotein(RNP-)Komplex mit einem RNA- und einem Proteinanteil (Chang u. Clayton 1987). Die Funktion der RNAse MRP in den Mitochondrien besteht in der endonukleolytischen Spaltung des RNAPrimers im Bereich des R-Loops, wodurch ein Angriffspunkt für die mitochondriale DNA-Polymerase generiert wird. Noch während der Replikationssynthese wird der RNA-Primer am 5c-Ende des neusynthetisierten H-Strangs abgebaut. Die mitochondriale DNA-Synthese erfordert eine spezifische, kernkodierte Polymerase, die DNA-Polymerase J. Dieses Enzym setzt sich aus zwei Polypeptidketten zusammen, einer größeren, katalytisch aktiven Untereinheit von etwa 125–140 kDa mit DNA-Polymerase- und 3'-5'-Exonuklease-Aktivität und einer kleineren, akzessorischen E-Untereinheit (Lecrenier u. Foury 2000). Die mit der großen Untereinheit assoziierte Exonukleaseaktivität hat offensichtlich „proof reading“-Funktion, da Mäuse mit einer Mutation in dem entsprechenden Abschnitt der DNA-Polymerase eine 3- bis 5-fach erhöhte Mutationsrate der mtDNA aufweisen (Trifunovic et al. 2004) Die Initiation der DNA-Synthese am RNA-Primer gewährleistet jedoch nicht obligatorisch die vollständige Replikation des mitochondrialen Genoms. Typisch für die mtDNA bei Wirbeltieren ist das Auftreten von Molekülen mit einem partiell duplizierten H-Strang. Im Bereich benachbart zum OH bildet sich ein sog. D-Loop, eine Triplexstruktur aus den beiden Elternsträngen und einem etwa 570–650 Nukleotide langen Tochter-HStrang (7S-DNA) (> Abb. 1.5.6) Diese Struktur entsteht

1.5

durch einen frühen Replikationsstopp des H-Strangs, wobei Tochter- und Template-Strang weiter assoziiert bleiben (Clayton 1982). Die Beobachtung, dass die 7S-DNA-Moleküle einheitliche 3c-Enden aufweisen, impliziert die Beteiligung eines spezifischen Abbruchmechanismus, wobei evolutiv konservierte Sequenzmotive („termination associated sequences“, TAS) eine wichtige Rolle spielen. Die Frequenz von mtDNA-Molekülen mit D-Loops variiert zwischen Zellen und Gewebe und ist abhängig von den jeweiligen physiologischen Bedingungen. Zum Teil sind Präparationen mit einem über 75%igen Anteil an mtDNA-Molekülen mit D-Loops beschrieben (Robberson u. Clayton 1972). Ob die Ausbildung von DLoops lediglich Ausdruck eines replikationskompetenten Zustands ist, oder ob er eine regulatorische Funktion hat, ist bislang nicht geklärt. Es fehlen bislang auch schlüssige Erkenntnisse darüber, ob die im D-Loop terminierten Tochter-H-Stränge in vivo tatsächlich auch weiter verlängert werden können, oder ob für einen erfolgreichen Replikationszyklus vollständig neu synthetisierte Stränge, die der Termination an den TAS entgehen, notwendig sind. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass u. a. Sequenzabschnitte des D-Loops Verankerungspunkte mit der inneren Mitochondrienmembran darstellen (Jackson et al. 1996). Wie bei anderen Replikationssystemen sind bei der mitochondrialen DNA Replikation neben der DNAPolymerase J weitere akzessorische Proteine beteiligt. Dazu gehören eine DNA-Helikase zum Entwindung der DNA vor der Replikationsgabel und ein Einzelstrangbindeprotein (SSB) zur Stabilisierung der Einzelstränge (> Abb. 1.5.6) Die Replikationsgabel des H-Strangs erreicht erst nach ca. 2/3 des Molekülumfangs den Initiationsort für die Replikation des L-Strangs (ori L oder OL). Der OL umfasst einen etwa 30 Nukleotide langen Abschnitt zwischen den Genen für tRNAAsn und tRNACys. In diesem Bereich kann sich der freigelegte elterliche H-Strang in eine thermodynamisch stabile Haarnadelstruktur auffalten. Auch die Initiation der L-Strang-Replikation erfordert zunächst die Synthese eines RNA-Primers mittels einer spezifischen mtDNA-Primase. Die RNA-Synthese initiiert an einem thymidinreichen Sequenzmotiv im Loop der OL-Haarnadelstruktur und setzt sich bis zu einem konservierten Sequenzabschnitt an der Basis der Haarnadelstruktur fort (Hixson et al. 1986). An dieser Stelle erfolgt die Transition von der RNA- zur DNA-Synthese, wobei das 3c-Ende des RNA-Primers der DNA-Polymerase J als Angriffspunkt dient (Wong and Clayton 1985). Von hier aus erfolgt die weitere Elongation und Replikation des L-Stranges entsprechend der am H-Strang, nur in gegenläufiger Richtung (> Abb. 1.5.6)

110

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen a

b

. Abb. 1.5.6a,b. Replikation des humanen mitochondrialen Genoms. a Initiationsprozesse der H-Strang Replikation. Zunächst erfolgt ausgehend vom LSP und initiiert durch den Transkriptionsfaktor mtTFA die Synthese eines RNA-Primers (7S RNA) durch die mtRNAPolymerase. Anteile des Transkripts verbleiben am template-Strang und bilden dabei eine komplexe RNA-DNA Hybridstruktur (R-Loop) aus, die durch evolutiv konservierte Sequenzelemente (CSB1-3) stabilisiert wird. Die Ausbildung des R-Loops und die tRNA-ähnliche Rückfaltungsstruktur des freien Transkriptendes sind Voraussetzung für die endonukleolytische Spaltung des Transkripts durch die RNAse MRP. Das prozessierte 3‘-Ende des Transkripts dient dann als Ansatz-

punkt für die mtDNA-Polymerase γ und ist damit Ausgangspunkt (OH) für die DNA-Synthese bei der H-Strang-Replikation. Es kommt dabei zur Ausbildung der typischen dreisträngigen D-Loop-Struktur. Vor der Replikationsgabel müssen die elterlichen DNA-Stränge durch eine DNA-Helikase entwunden und der freigelegte elterliche HStrang durch Einzelstrangbindeproteine (SSB) fixiert werden. b Übersicht über den Replikationszyklus der humanen mtDNA. Die Replikation des DNA-Moleküls verläuft asynchron. Zunächst erfolgt die Replikation des H-Strangs, bis nach ca. 2/3 des Molekülumfangs der Replikationsursprung des L-Strangs freigelegt wird und die L-StrangReplikation initiiert (nach Clayton 1982)

111 1.5 · Mitochondriale DNA des Menschen

Noch vor Beendigung der L-Strang-Replikation werden die beiden Tochter-mtDNA-Moleküle voneinander getrennt, und die verbleibende Lücke im neusynthetisierten L-Strang wird rasch aufgefüllt. Die RNA-Primer an den 5'-Enden der neusynthetisierten Tochterstränge werden abgebaut und die Enden durch eine DNA-Ligase geschlossen. Schließlich werden die vollständig replizierten Tochter-mtDNA-Moleküle durch eine Topoisomerase in ihre übliche „Supercoil“-Struktur aufgedrillt, wobei jedes Molekül ca. 100 negativ superhelikale Windungen erhält (Clayton 1982). Zusätzlich und koexistent zum oben beschriebenen Mechanismus der asymmetrischen Replikation wird die Existenz eines konventionellen, für beide Stränge synchronen Replikationsmechanismus, ausgehend vom OH, diskutiert (Holt et al. 2000). Anders als im Kern gibt es keinen spezifischen Mechanismus, der dafür sorgt, dass die mtDNA-Moleküle bei einer Teilung bzw. Aufspaltung des mitochondrialen Retikulums regelrecht auf die Tochtermitochondrien verteilt werden. Die mtDNA ist jedoch innerhalb der Mitochondrien nicht frei verteilt. Mikroskopische Beobachtungen zeigen vielmehr, dass die mtDNA mit Proteinen assoziiert und in Form von distinkten Nukleoidkomplexen vorliegt. Einzelne Nukleoide bestehen aus 2–8 mtDNA-Molekülen und beinhalten u. a. einen hohen Anteil an mtTFA und der Helikase, sodass man annimmt, dass diese Proteine neben ihrer Aufgabe bei der Transkription und der Replikation auch eine Strukturfunktion im Sinne einer Dekorierung und der Verpackung der mtDNA haben. Die Nukleoide zeigen eine gewisse Mobilität, sodass es bei der Fusion von Zellen mit distinkten Mitochondrien zu einer langsamen, gegenseitigen Durchmischung innerhalb des mitochondrialen Retikulums kommt (Legros et al. 2004). Die bisherige Vorstellung von einer Teilung eines Mitochondriums in zwei Tochterorganellen muss dahingehend korrigiert werden, dass das mitochondriale Retikulum einem ständigen dynamischen Prozess von Fusion und Aufspaltung unterliegt (Chen u. Chan 2005). Eine intensive Vermehrung von Mitochondrien und die korrelierte hohe Replikationsrate der mtDNA beobachtet man insbesondere in Perioden aktiver Zellteilung, bei Ausdauertraining, elektrischer Muskelstimulierung und bestimmter Hormonstimulation. Dabei sind die Prozesse der Replikation und Transkription des mitochondrialen Genoms und die Expression kernkodierter Mitochondrienproteine eng miteinander verkoppelt. So aktivieren die nukleären Transkriptionsaktiviatoren NRF-1 und NRF-2 sowohl die Gene für kernkodierte Bestandteile der Atmungskettenkomplexe, als auch die Gene für mtTFA und den RNA-Anteil der RNase MRP (Virbasius u. Scarpulla 1994). Die Bedeutung dieser nukleären Faktoren für die Replikation und damit letztlich

1.5

den Erhalt der mtDNA wird durch „Knockout“-Experimente an Mäusen unterstrichen. Sowohl die gezielte Ausschaltung des NRF1-Gens, als auch die des mtTFAGens führt im homozygoten Zustand zu einem drastischen Verlust an mtDNA und zum frühen Absterben der Embryonen (Huo et al. 2001; Larsson et al. 1998).

1.5.6 Mitochondriale Vererbung Die mitochondriale DNA und die damit verbundenen Merkmale werden bei Säugern grundsätzlich rein mütterlich (maternal) vererbt (Giles et al. 1980; Birky 1995) (> Abb. 1.5.7). Während manche Populationsgenetiker aus der Beobachtung mutmaßlich rekombinanter mtDNA seit längerem zumindest einen seltenen väterlichen (paternalen) Beitrag zur mitochondrialen Erblinie fordern, gibt es bislang beim Menschen nur einen einzigen belegbaren Fall einer paternalen mtDNA-Transmission (Schwartz u. Vissing 2002). Ausschlaggebend für die maternale Vererbung ist das große Plasmavolumen und die darin enthaltenen Mitochondrien der Eizelle (ca. 100.000) gegenüber der Spermazelle (etwa 100) und effektive physikalische und biochemische Barrieren, die das Eindringen und den Verbleib väterlicher Mitochondrien weitestgehend ausschließen. Bei der Befruchtung dringen das Mittelteil und der Schanz des Spermiums mit den darin enthaltenen Mitochondrien zwar häufig in die Eizelle ein, jedoch ist die mtDNA dieser Mitochondrien geschädigt und wird zudem aktiv abgebaut (Nishimura et al. 2006). Mutationen in der mitochondrialen DNA führen zu einem gemischterbigen Genotyp, der als Heteroplasmie bezeichnet wird und der Homoplasmie (Reinerbigkeit) gegenübergestellt wird. Da sowohl die Verteilung der mtDNA-Moleküle bei der Teilung der Mitochondrien, als auch die Aufteilung der Mitochondrien bei der Zellteilung weitgehend ungeregelt erfolgt, tritt Heteroplasmie in jedwedem graduiertem Verhältnis auf. Ausgeprägte Schwankungen im Heteroplasmiegrad lassen sich bereits zwischen verschiedenen Geweben eines Individuums feststellen (mitotische Segregation) (Howell et al. 1994; Matthews et al. 1994). Neuere Untersuchungen bei heteroplasmatischen Mäusen zeigen für einige Gewebe eine rein zufällige Segregation, für andere jedoch eine altersabhängige Selektion bestimmter mtDNA-Genotypen (Jenuth et al. 1997). Betrachtet man in diesem Zusammenhang jedoch die vergleichsweise geringe Zahl an Zellteilungen in der mütterlichen Keimbahn, so überrascht, dass auch zwischen Geschwistern große Unterschiede im Heteroplasmiegrad beobachtet werden und in der Generationsfolge heteroplasmatische Genotypen rasch in Reinerbigkeit

112

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

. Abb. 1.5.7. Maternale Vererbung und Anwendung der mtDNAAnalyse für forensische Fragestellungen. Dargestellt sind Teile des Stammbaums der Zarenfamilie mit farblicher Kennzeichnung der beiden maternalen Erblinien. Durch forensische Vergleichsanalysen der mtDNA zwischen Knochenfunden aus einem Massengrab in der Nähe von Jekatarinenburg und Proben von Familienmitgliedern der

beiden maternalen Erblinien (mit Pfeilen gekennzeichnet) konnte die Identität der sterblichen Überreste der Zarenfamilie bewiesen werden. Eine beim Zar Nikolaus vorhandene Heteroplasmie an einer Nukleotidposition der mtDNA (*) zeigte sich auch bei der Untersuchung der mtDNA seines Bruders Georgij, nicht jedoch bei den weiter entfernt verwandten Familienmitgliedern

übergehen. In Anlehnung an populationsgenetische Modelle ist daher die sog. „Bottleneck“-Hypothese zur Erklärung dieses Phänomens aufgestellt worden (Ashley et al. 1989). Danach beruht die rasche Entmischung heteroplasmatischer Genotypen auf einem Prozess, der dafür sorgt, dass nur eine geringe Zahl an mtDNA-Molekülen effektiv zur mtDNA-Population in der Nachkommenschaft beiträgt. Eine solche Einengung („bottleneck“) der effektiven mtDNA-Population erklärt den beobachtbaren genetischen Drift im relativen Verhältnis zweier mtDNA-Populationen. In einem eleganten Ansatz konnten Shoubridge et al. durch Untersuchungen an heteroplasmatischen Mäusen den „bottleneck“ dem Stadium der primordialen weiblichen Keimzellen mit einer effektiven mtDNA-Population von lediglich etwa 200 Molekülen zuordnen (Jenuth et al. 1996). Der „bottleneck“ bei der Weitergabe der mtDNA von einer Generation zur nächsten ist daneben aber auch von immenser Bedeutung für die Evolution der mtDNA. Im Vergleich zum nukleären Genen zeigt die mitochondriale DNA eine etwa 10-fach erhöhte Divergenzrate, d. h., die mtDNA evolviert rascher als das Kerngenom. Ein Grund dafür ist die wesentlich höhere Mutationsrate (Khrapko et al. 1997), die durch die Exposition der mtDNA mit mutagenen Sauerstoffderivaten und ineffizienten DNA-Reparaturmechanismen begründet wird (Shadel u. Clayton 1997). Tritt aber eine Mutation auf, so kann sie sich bei einer großen effektiven Ausgangspopu-

lation an mtDNA-Molekülen nur schwer etablieren und nur über sehr lange Zeiträume in der Population „durchsetzen“. Ist die effektive Ausgangspopulation aber klein – wie beim „bottleneck“ –, so kann eine Mutation durch den genetischen Drift sehr schnell akkumulieren. Der „bottleneck“ begünstigt daher die Fixierung neuer mtDNA-Mutationen in der Keimbahn und trägt wesentlich zur hohen Diversität und raschen Evolution der mtDNA bei (Howell et al. 1996). Die meisten Experten betrachten die mitochondriale Vererbung als rein asexuellen Prozess mit einer ausschließlich klonalen Weitergabe der mtDNA in strikt getrennten Erblinien. Über längere Zeiträume kommt es in solchen rein klonalen Erblinien jedoch zur Anreicherung nachteiliger Mutationen. Dieser fortschreitende genetische Degenerationsprozess wird nach der erstmalig von Hermann Muller theoretisch begründeten Formulierung als „Muller’s ratchet“ bezeichnet (Muller 1964). Es scheint jedoch so, als ob die Mitochondrien Strategien entwickelt hätten, „Muller’s ratchet“ zu blockieren oder zumindest zu verlangsamen. Allein schon die geringe Größe des mitochondrialen Genoms verringert bereits die Zahl potenzieller Mutationen. Von großer Bedeutung ist aber wohl auch der „bottleneck“ bei der Weitergabe der mtDNA von einer zur nächsten Generation. Durch den damit verbundenen genetischen Drift werden Neumutationen rasch exponiert und können im Fall nachteiliger Eigenschaften durch Selektion

113 1.5 · Mitochondriale DNA des Menschen

besser eliminiert werden (Hoekstra 2000). Eine andere, attraktive Lösung des Problems böte sich durch Rekombination, entweder zwischen mtDNA-Molekülen einer Erblinie (z. B. bei Heteroplasmie) oder durch den Eintrag paternaler mtDNA-Moleküle in die Eizelle bei der Befruchtung. In-vitro-Experimente mit mitochondrialen Lysaten hatten gezeigt, dass die für eine Rekombination notwendigen Enzymaktivitäten in den Mitochondrien durchaus vorhanden sind (Thyagarajan et al. 1996), dennoch war diese Frage lange Zeit heftig umstritten. Zwischenzeitlich gibt es jedoch einige sehr sorgfältige Studien, sowohl im experimentellen System als auch in vivo, die eindeutig eine wenn auch seltene Rekombination der mtDNA belegen (Sato et al. 2005; Zsurka et al. 2005).

1.5.7 Mitochondriale Erkrankungen Eine Übersicht über das menschliche mitochondriale Genom und den genetischen Apparat der Mitochondrien wäre unvollständig, ohne zumindest kurz auf dessen medizinische Bedeutung einzugehen. Für eine ausführliche Abhandlung dieser Thematik sei auf eine Reihe ausführlicher Übersichtsarbeiten verwiesen: Howell (1999) und Schon (2000).

1.5

Mutationen im mitochondrialen Genom sind für eine Reihe z. T. sehr schwerwiegender Erkrankungen (Mitochondriopathien) verantwortlich (> Tabelle 1.5.3; für eine komplette Übersicht, 7 MITOMAP-Datenbank: http://www.mitomap.org/). Schätzungen für Großbritannien gehen von einer Gesamtprävalenz pathogener mtDNA-Mutationen in der Größenordnung von 1:8.000 aus (Chinnery et al. 2000). Deletionen und/oder partielle Duplikationen der mtDNA sind die Ursache für spezifische Krankheitsbilder, wie das Kearns-Sayre-Syndrom (KSS, Multisystemerkrankung), die mildere progressive externe Ophthalmoplegie (PEO, Myopathie der äußeren Augenmuskulatur) und das Pearson-Syndrom (Erkrankung des Knochenmarks und der Bauchspeicheldrüse). Die Erkrankungen treten immer sporadisch auf, was für einen somatischen Ursprung der Deletionen spricht. Es sind Dutzende verschiedener Deletionen beschrieben. Sie variieren in ihrer Ausdehnung zwischen 1 und 10 kb und erfolgen zumeist zwischen kurzen Sequenzwiederholungen der mtDNA. Die häufigste Deletion (common deletion) betrifft einen 4977-bp-Abschnitt zwischen dem ATP8-und dem ND5-Gen. MtDNA-Deletionen liegen immer heteroplasmatisch vor und sind häufig mit partiellen mtDNA-Duplikationen assoziiert. Dutzende mutmaßlich pathogene Punktmutationen der mtDNA sind in den letzten Jahren beschrieben wor-

. Tabelle 1.5.3. Die wichtigsten pathogenen mtDNA-Mutationen Mutation (Nukleotidaustausch)

Gen (Proteinveränderung)

Homo./ Heteroplasmie

Erkrankung*

Deletionen (1–10kb)

diverse

het.

Kearns-Sayre-Syndrom, Pearson-Syndrom, PEO

1555A:G

12S-rRNA

hom.

Taubheit

3243A:G

tRNALeu(UUR)

het.

MELAS / DMDF

3260A:G

tRNA

Leu(UUR)

het.

MMC

3271T:C

tRNA

Leu(UUR)

het.

MELAS

3302A:G

tRNALeu(UUR)

het.

Myopathie

8344A:G

tRNALys

het.

MERRF / MELAS

Lys

het.

MERRF

8356T:C

tRNA

8993T:G

ATP6 (Leu156Arg)

het.

M. Leigh / NARP

8993T:G

ATP6 (Leu156Pro)

het.

M. Leigh / NARP

3460G:A

ND1 (Ala52Thr)

hom./het.

LHON

11778G:A

ND4 (Arg340His)

hom./het.

LHON

14484T:C

ND6 (Met64Val)

hom./het.

LHON

* PEO – Progressive External Ophthalmoplegia; MELAS – Mitochondrial Encephalopathy, Lactic Acidosis and Stroke-like Episodes; DMDF – Diabetes mellitus and Deafness; MMC – Maternal Myopathy and Cardiomyopathy; MERRF – Myoclonic Epilepsy and Ragged-Red Fibers; NARP – Sensory Neuropathy, Ataxia and Retinitis pigmentosa; LHON – Lebers hereditary Optic Neuropathy.

114

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

den. Dabei ist aufgrund der interindividuellen Sequenzvariablität der mtDNA die Bewertung einer Mutation als pathogen oftmals schwierig, gerade wenn es sich um Einzelbeobachtungen handelt. Anders als bei den sporadisch auftretenden Deletionen kann man bei den Punktmutationen häufig den mütterlichen Erbgang erkennen. Der Grad der Erblichkeit hängt jedoch davon abhängt, ob Heteroplasmie oder Homoplasmie für die Mutation vorliegt. Die meisten der bekannten Punktmutationen betreffen die Gene für die mitochondrialen tRNAs, wobei in diesen Fällen immer Heteroplasmie vorliegt. Klassische Beispiele für solche tRNA-Mutationen sind das MERRF-Syndrom („myoclonic epilepsy and ragged-red fibers“), verursacht durch Mutationen im tRNALys-Gen, und das MELAS-Syndrom („mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes“) mit Mutationen insbesondere im Gen für die tRNALeu(UUR). Andere häufige mit tRNA-Mutationen assoziierte Krankheitsbilder und Symptome sind Myopathien (Skelettmuskelmyopathien, Kardiomyopathien, PEO), Enzephalopathien, Diabetes mellitus und Taubheit. Dabei sind das klinische Bild und die Ausprägung der Einzelsymptome in starkem Maß vom Heteroplasmiegrad in den verschiedenen Geweben abhängig. So findet man beispielsweise ein und dieselbe Mutation (3243A:G) im Gen für die tRNALeu(UUR) sowohl bei MELAS-Patienten, als auch bei Fällen von PEO oder Diabetes mellitus plus Taubheit. Sehr spezifisch dagegen ist die klinische Ausprägung der 1555A:G Mutationen im Gen für die 12S-rRNA in Form einer Schwerhörigkeit. Das Spektrum der Punktmutationen in den proteinkodierenden Genen des mt-Genoms ist vergleichsweise gering. Neben sporadischen Einzelfällen mit Mutationen im CYB- bzw. den CO-Genen gibt es drei klassische Krankheitsbilder, die durch „missense“-Mutationen in proteinkodierenden Genen verursacht werden. Die maternal vererbte Form des Morbus Leigh ist eine meist tödlich verlaufende, neurodegenerative Erkrankung der Basalganglien und des Stammhirns, die durch die Mutationen 8993T:G (Leu156Arg) oder 8993T:C (Leu156Pro) im ATP6-Gen verursacht wird. Die Mutationen liegen dabei heteroplasmatisch vor und Leigh-Patienten zeigen einen sehr hohen Anteil (>90%) mutierter mtDNA. Interessanterweise führen die gleichen Mutationen bei geringerem Anteil mutierter mtDNA-Moleküle (70–90%) zu einem gänzlich anderem Krankheitsbild, dem NARPSyndrom (Neuropathy, Ataxia and Retinitis pigmentosa), welches durch axonale Neuropathie, Gleichgewichtstörungen und Netzhautdegeneration gekennzeichnet ist. Weitaus häufiger als der Morbus Leigh oder das NARP-Syndrom tritt die Lebersche hereditäre Optikusneuropathie (LHON) auf. LHON ist eine spezifische Erkrankung des Sehnervs, die mit einem hochgradigen Verlust des Sehvermögens einhergeht. Typisch für

LHON ist das Auftreten einer Punktmutation im ND1(3460G:A; Ala52Thr), ND4- (11778G:A; Arg340His) oder ND6-Gen (14484T:C; Met64Val). Im Gegensatz zu anderen mtDNA-Mutationen findet man bei LHON-Patienten überwiegend eine Homoplasmie für die jeweilige Mutation, die sich auch über viele Generationen hinweg zeigen lässt. Die Bedeutung von mtDNA-Mutation bei neurodegenerativen Erkrankungen des Alters wie der ParkinsonErkrankung und der Alzheimer-Erkrankung ist eine seit längerer Zeit diskutierte Frage (Howell 1999). Manche Autoren mutmaßen, dass möglicherweise das Zusammenwirken verschiedener Sequenzvarianten in der mtDNA bzw. spezifische mtDNA-Haplotypen ein erhöhtes erbliches Risiko für diese Erkrankungen mit sich bringen (Shoffner et al. 1993). Neuere Untersuchungen zeigen andererseits eine sehr ausgeprägte und spezifische Akkumulation somatischer mtDNA-Mutationen in der Substantia nigra von Parkinson-Patienten, die begleitet ist von einer deutlich erhöhten Zahl cytochromoxidasenegativer, d. h. atmungskettendefizienter Neuronen (Bender et al. 2005). Manche Forscher leiten aus diesen Ergebnissen bereits ein grundlegendes Prinzip für den Alterungsprozess im Allgemeinen ab. Unbestritten ist dabei, dass die mtDNA aufgrund des hohen Sauerstoffumsatzes bei der oxidativen Phosphorylierung in den Mitochondrien ständig hohen Konzentrationen an reaktiven Sauerstoffderivaten (Peroxid, Sauerstoff- und Superoxidradikalen) mit hohem mutagenem Potential ausgesetzt ist. In der Tat ist der Anteil oxidierter Basen in der mtDNA etwa 16-mal höher als in der nukleären DNA (Richter 1994). Leider ist der Nachweis einer unterschwelligen, ungerichteten Akkumulation von somatischen Punktmutationen technisch schwierig und Teil der Kontroverse über Ergebnisse, die eine altersabhängige Anreicherung von mtDNA-Deletionen oder Mutationen in der Promotorregion der mtDNA zeigen (Corral-Debrinski et al. 1992; Michikawa et al. 1999; Chinnery et al. 2001). Neuen Schub für eine Beteiligung der mtDNA an Alterungsprozessen liefern zwei unabhängige Untersuchungen an Mausmutanten mit einer Mutation in der Exonukleasedomäne der mitochondrialen DNA-Polymerase J. Der damit verursachte Verlust der „proofreading“-Aktivität des Enzyms führt zu einer deutlich erhöhten Mutationsrate in der mtDNA. Solche Mäuse zeigen eindeutige Merkmale vorzeitigen Alterns (Progeria) und sterben weitaus früher als Kontrolltiere (Trifunovic et al. 2004; Kujoth et al. 2005). Von der als „mtDNA-mutator“-Maus bezeichneten Mutante erhofft man sich auch Fortschritte für die weitere Erforschung mitochondrialer Erkrankungen, der es bisher an der Verfügbarkeit geeigneter Tiermodelle mangelte. Bis dato stand hier lediglich ein Mausmodell mit einer in der Keimbahn vererbten, hete-

115 1.5 · Mitochondriale DNA des Menschen

roplasmatischen mtDNA-Deletion auf der Habenseite (Inoue et al. 2000).

1.5.8 mtDNA als molekularer Marker Die mtDNA wird sehr häufig als Marker bei forensischen Untersuchungen und für phylogenetische Fragestellungen angewendet. Die wesentlichen Gründe dafür sind die im Vergleich zur nukleären DNA hohe Kopienzahl der mtDNA in biologischen Proben, die hohe interindividuelle Sequenzvariabilität und die klonale Weitergabe der mtDNA. Letzteres ist beispielsweise dann wichtig, wenn die Identität bzw. die Verwandtschaft einer Person geklärt werden soll, für die nur Vergleichsproben von entfernten Familienmitgliedern zur Verfügung stehen. Ein Paradebeispiel dafür und generell für den Wert der mtDNA-Analyse in der Forensik ist die Identifizierung der sterblichen Überreste der letzten Zarenfamilie. Soweit aus Aufzeichnungen und Zeugenaussagen bekannt, wurde die Zarenfamilie in der Nacht vom 16. auf den 17. Juli 1918 im Keller des Ipatijev-Hauses in Jekatarinenburg von bolschewikischen Revolutionären erschossen. Danach wurden die Leichen fortgeschafft und in einer Grube am Straßenrand verscharrt. Im Jahr 1991 wurde von zwei russischen Amateurhistorikern 30 Kilometer von Jekatarinenburg entfernt ein Massengrab mit 9 Skeletten, darunter vermeintlich auch die der Zarenfamilie, entdeckt. Für die forensische Untersuchung wurde mtDNA aus den Knochenresten extrahiert und ein Sequenzvergleich mit der mtDNA von lebenden Verwandten der mütterlichen Erblinien durchgeführt (> Abb. 1.5.7). Dabei konnte mit großer Sicherheit die Identität der Funde als die sterblichen Überreste von Zar Nicholas II, der Zarin Katharina und drei ihrer Töchter bestimmt werden (Gill et al. 1994). Die zunächst aufgekommene Unsicherheit über die Identität des Zaren aufgrund einer Heteroplasmie im untersuchten mtDNAAbschnitt konnte durch deren Bestätigung an Proben des exhumierten Bruders des Zaren, Georgij, ausgeräumt werden (Ivanov et al. 1996). Durch die klonale Weitergabe der mtDNA in der mütterlichen Linie lassen sich insbesondere auch Rückschlüsse auf die Populationsgeschichte und die Herkunft des modernen Menschen ziehen. Grundlage dafür ist die Sequenzvariabilität der mtDNA innerhalb und zwischen Populationen, Volksstämmen oder Sprachgruppen. Die gefundenen mtDNA-Haplotypen können in einen „Stammbaum“ integriert werden („maximum parsimony analysis“), mit dem versucht wird, die Entstehung und Entwicklung der rezenten Haplotypen aus einer gemeinsamen Wurzel zu strukturieren. Aufsehen erregt hat hier insbesondere eine Studie von Cann, Vigilant et al. über den Ursprung und die Herkunft der

1.5

mütterlichen Erblinie. Sie kamen aufgrund einer vergleichenden Untersuchungen der mtDNA von 134 verschiedenen Individuen verschiedener Rassen und geographischer Herkunft zu dem Schluss, dass alle rezenten mtDNA-Haplotypen auf einen gemeinsame Wurzel (Stammmutter, „Eva“) in Afrika zurückgeführt werden können (Cann et al. 1987, Vigilant et al. 1991). Auch wenn diese „Out-of-Africa“-Hypothese aufgrund der fossilen Belege weitgehend unstrittig ist, so hat doch die Datierung dieser Stammmutter auf etwa 200.000 Jahre vor unserer Zeit für sehr viele kontroverse Diskussionen gesorgt. Der Streit entzündet sich darüber, ob und inwieweit Homo erectus, der bereits vor ca. 1 Mio. Jahren aus Afrika kommend weite Gebiete Europas und Asiens besiedelt hat, zur Evolution des modernen Menschen außerhalb Afrikas beigetragen hat. Oder ist er durch eine zweite Einwanderungswelle vor ca. 50.000–100.000 Jahren vollständig vom Homo sapiens verdrängt worden ist. Letztere Hypothese wird durch die Untersuchung der mtDNA aus Knochenfunden des Neandertalers gestützt, bei der Abweichungen im Vergleich mit der mtDNASequenz des modernen Menschen gefunden wurden (Krings et al. 1997). Dies deutet darauf hin, dass der von der frühen Homo erectus-Besiedlung abstammende Neandertaler zwar eine Zeit lang neben dem neu eingewanderten Homo sapiens in Europa gelebt hat, es aber offensichtlich zu keiner merklichen Vermischung zwischen beiden Spezies gekommen ist, zumindest nicht in der mütterlichen Erblinie. Nach Ansicht von Brian Sykes, Professor für Humangenetik an der Universität Oxford, lassen sich 95% der Europäer aufgrund der mtDNA-Sequenz sogar auf eine von sieben europäischen Stammmüttern zurückverfolgen. Geschäftstüchtig und öffentlichkeitswirksam wie er ist, hat Brian Sykes darüber nicht nur ein populärwissenschaftliches Buch geschrieben (Die sieben Töchter Evas, Luebbe Verlag, 2001), sondern auch eine Firma gegründet, bei der man seine Abstammung von Ursula, Xenia, Helena, Velda, Tara, Katrine oder Jasmine (so nennt er die sieben Stammmütter) feststellen lassen kann. Neuerdings kann man auch prüfen lassen, ob man von Dschingis Khan abstammt. Aber das ist eine andere Geschichte … Wie auch immer man solchen „Anwendungen“ gegenübersteht, so ist doch bemerkenswert, dass unser heutiges Bild vom Ursprung des modernen Menschen, von seiner Besiedlung der Kontinente und der Herkunft von Volks- und Sprachgruppen insbesondere durch die Ergebnisse der mtDNA-Analysen geprägt ist.

116

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

1.5.9 Literatur Altman S, Baer M, Guerrier-Takada C, Vioque A (1986) Enzymatic cleavage of RNA by RNA. Trends Biochem Sci 11: 515–518 Anderson S, Bankier AT, Barrell BG, de Bruijn MHL, Coulson AR, Drouin J, Eperon IC, Nierlich DP, Roe BA, Sanger F, Schreier PH, Smith AJH, Staden R, Young IG (1981) Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature 290: 457–465 Ashley MV, Laipis PJ, Hauswirth WW (1989) Rapid segregation of heteroplasmic bovine mitochondria. Nucleic Acids Res 17: 7325–7331 Attardi G (1985) Animal mitochondrial DNA: an extreme example of genetic economy. Int Rev Cytol 93: 93–145 Barrell BG, Bankier AT, Drouin J (1979) A different genetic code in human mitochondria. Nature 282: 189–194 Barrell BG, Anderson S, Bankier AT, de Bruijn MH, Chen E, Coulson AR, Drouin J, Eperon IC, Nierlich DP, Roe BA, Sanger F, Schreier PH, Smith AJ, Staden R, Young IG (1980) Different pattern of codon recognition by mammalian mitochondrial tRNAs. Proc Natl Acad Sci USA 77 : 3164–3166 Bender A, Krishnan KJ, Morris CM, Taylor GA, Reeve AK, Perry RH, Jaros E, Hersheson JS, Betts J, Klopstock T, Taylor RW, Turnbull DM (2005) High levels of mitochondrial DNA deletions in substantia nigra neurons in aging and Parkinson disease. Nat Genet 38: 515–517 Birky CW (1995) Uniparental inheritance of mitochondiral and chloroplast genes: mechanisms and evolution. Proc Natl Acad Sci USA 92: 11331–11338 Cai YC, Bullard JM, Thompson NL, Spremulli LL (2000) Interaction of mitochondrial elongation factor Tu with aminoacyl-tRNA and elongation factor Ts. J Biol Chem 275: 20308–20314 Cann RL, Stoneking M, Wilson AC (1987) Mitochondrial DNA and human evolution. Nature 325: 31–36 Chang DD, Clayton DA (1985) Priming of human mitochondrial DNA replication occurs at the light-strand promotor. Proc Natl Acad Sci USA 82: 351–355 Chang DD, Clayton DA (1987b) A mammalian mitochondrial RNA processing activity contains nuclear-encoded RNA. Science 235: 1178–1184 Chen H, Chan DC (2005) Emerging functions of mammalian mitochondrial fusion and fission. Hum Mol Genet 14: R283–289 Chinnery PF, Johnson MA, Wardell TM, Singh-Kler R, Hayes C, Brown DT, Taylor RW, Bindoff LA, Turnbull DM (2000) Epidemiology of pathogenic mitochondrial DNA mutations. Ann Neurol 48: 188–193 Chinnery PF, Taylor GA, Howell N, Brown DT, Parsons TJ, Turnbull DM (2001) Point mutations of the mtDNA control region in normal and neurodegenerative human brains. Am J Hum Genet 68: 529–532 Clayton DA (1982) Replication of animal mitochondrial DNA. Cell 28: 693–705 Corral-Debrinski M, Horton T, Lott MT, Shoffner JM, Beal MF, Wallace DC (1992) Mitochondrial DNA deletions in human brain: regional variability and increase with advanced age. Nat Genet 2: 324–329 Falkenberg M, Gaspari M, Rantanen A., Trifunovic A, Larsson NG, Gustafsson CM (2002) Mitochndrial transcription factors B1 and B2 activate transcription of human mtDNA. Nat Genet 31: 289–294 Fisher RP, Lisowsky T, Parisi MA, Clayton DA (1992) DNA wrapping and bending by a mitochondrial migh mobility group-like transcriptional activator protein. J Biol Chem 267: 3358–3367 Gelfand R and Attardi G (1981) Synthesis and turnover of mitochondrial ribonucleic acids in HeLa cells: the mature ribosomal and

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117 1.5 · Mitochondriale DNA des Menschen Kruse B, Narasimhan N, Attardi G (1989) Termination of transcription in human mitochondria: identification and purification of a DNA binding protein factor that promotes termination. Cell 58: 391–397 Kujoth GC, Hiona A, Pugh TD, Someya S, Panzer K, Wohlgemuth SE, Hofer T, Seo AY, Sullivan R, Jobling WA, Morrow JD, Van Remmen H, Sedivy JM, Yamasoba T, Tanokura M, Weindruch R, Leeuwenburgh C, Prolla TA (2005) Mitochondrial DNA mutations, oxidative stress, and apoptosis in mammalian aging. Science 309: 481–484 Lang BF, Burger G, O‘Kelly CJ, Cedergren R, Golding GB, Lemieux C, Sankoff D, Turmel M, Gray MW (1997) An ancestral mitochondrial DNA resembling an eubacterial genome in miniature. Nature 387: 493–497 Larsson NG, Wang J, Wilhelmsson H, Oldfors A, Rustin P, Lewandoski M, Barsh GS, Clayton DA (1998) Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice. Nat Genet 18: 231–236 Lecrenier N, Foury F (2000) New features of mitochondrial DNA replication system in yeast and man. Gene 246: 37–48 Lee DY, Clayton DA (1997) RNAse mitochondrial RNA processing correctly cleaves a novel R loop at the mitochondrial DNA leading-strand origin of replication. Genes Develop 11: 582–592 Legros F, Malka F, Frachon P, Lombes A, Rojo M (2004) Organization and dynamics of human mitochondrial DNA. J Cell Sci 117: 2653–2662 Liu M and Spremulli L (2000) Interaction of mammalian mitochondrial ribosomes with the inner membrane. J Biol Chem 275: 29400–29406 Manella CA (2006) The relevance of mitochondrial membrane topology to mitochondrial function. Biochim Biophys Acta 1762: 140–147 Margulis, L (1981) Symbiosis in cell evolution. Freeman, San Francisco Martin M, Cho J, Cesare AJ, Griffith JD, Attardi G (2005) Termination factor mediated DNA loop between termination and initiation sites drives mitochondrial rRNA synthesis. Cell 123: 1227–1240 Matthews PM, Hopkin J, Brown R, Stephenson J, Hilton-Jones D, Brown GK (1994) Comparison of the relative levels of the 3243 AoG mtDNA mutation in heteroplasmic adult and fetal tissues. J Med Genet 31: 41–44 Michikawa Y, Mazzucchelli F, Bresolin N, Scarlato G, Attardi G (1999) Aging-dependent accumulation of point mutations in the human mtDNA control region for replication. Science 286: 774–779 Montoya J, Gaines GL, Attardi G (1983) The pattern of transcription of the human mitochondrial rRNA genes reveals two overlapping transcription units. Cell 34: 151–159 Muller HJ (1964) The relation of recombination to mutational advance. Mutat Res 1: 2–9 Nishimura Y, Yoshinari T, Naruse K, Yamada T, Sumi K, Mitani H, Higashiyama T, Kuroiwa T (2006) Active digestion of sperm mitochondrial DNA in single living sperm revealed by optical tweezers. Proc Natl Acad Sci USA 103: 1382–1387 Ojala D, Montoya J, Attardi G (1981) tRNA punctuation model of RNA processing in human mitochondria. Science 290: 470–474 Okamoto K, Shaw JM (2005) Mitochondrial morphology and dynamics in yeast and multicellular eukaryotes. Annu Rev Genet 39: 503–36 Palmieri F (1994) Mitochondrial carrier proteins. FEBS Lett 246: 48–54 Patel VB, Cunningham CC, Hantgan RR (2001) Physiochemical properties of rat liver mitochondrial ribosomes. J Biol Chem 276: 6739–6746

1.5

Pietromonaco SF, Denslow ND, O’Brien TW (1991) Proteins of mammalian mitochondrial ribosomes. Biochimie 73: 827–836 Prieto-Martin A, Montaya J, Martinez-Azorin F (2004) Phosphorylation of rat mitochondrial transcription termination factor (mTERF) is required for transcription termination but not for binding to DNA. Nucleic Acids Res 32: 2059–2068 Puranam RS, Attardi G (2001) The RNase P associated with HeLa cell mitochondria contains an essential RNA component identical in sequence to that of the nuclear RNase P. Mol Cell Biol 21: 548–561 Reichert A, Mörl M (2000) Repair of tRNAs in metazoan mitochondria. Nucleic Acids Res 28: 2043–2048 Richter C (1994) Role of mitochondrial DNA modifications in degenerative diseases and aging. Curr Topics Bioenerg 17: 1–16 Robberson DL, Clayton DA (1972) Replication of mitochondrial DNA in mouse L cells and their thymidine kinase- derivatives: displacement replication on a covalently-closed circular template. Proc Natl Acad Sci USA 69: 3810–3814 Rossmanith W, Tullo A, Potuschak T. Karwan R, Sbisa E (1995) Human mitochondrial tRNA processing. J Biol Chem 270: 12885–12891 Sato A, Nakada K, Akimoto M, Ishikawa K, Ono T, Shitara H, Yonekawa H, Hayashi JI (2005) Rare creation of recombinant mtDNA haplotypes in mammalian tissues. Proc Natl Acad Sci USA 102: 6057–6062 Schon EA (2000) Mitochondrial genetics and disease. Trends Biochem Sci 25: 555–560 Schwartz M, Vissing J (2002) Paternal inheritance of mitochondrial DNA. New Engl J Med 347: 576–580 Shadel GS, Clayton DA (1997) Mitochondrial DNA maintenance in vertebrates. Annu Rev Biochem 66: 409–435 Shoffner JM, Brown MD, Torroni A, Lott MT, Cabell MF, Mirra SS, Beal MF, Yang CC, Gearing M, Salvo R, Watts RL, Juncos JL, Hansen LA, Crain BJ, Fayad M, Rechord CL, Wallace DC (1993) Mitochondrial DNA variants observed in Alzheimer and Parkinson disease patients. Genomics 17: 171–184 Thyagarajan B, Padua RA, Campbell C (1996) Mammalian mitochondria possess homologous recombination activity. J Biol Chem 271: 27536–27543 Trifunovic A, Wredenberg A, Falkenbaerg M, Spelbrink JN, Rovio AT, Bruder CE, Bohlooly-Y M, Gidlöf S, Oldfors A, Wibom R, Törnell J Jacobs HT, Larsson NG (2004) Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase. Nature 429: 417–423 Vigilant L, Stoneking M, Harpending H, Hawkes K, Wilson AC (1991) African populations and the evolution of human mitochondrial DNA. Science 253: 1503–1507 Virbasius CA and Scarpulla RC (1994) Activation of the human transcription factor A gene by nuclear respiratory factors: a potential link between nuclear and mitochondrial gene expression in organelle biogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 91: 1309– 1313 Wolstenholme DR (1992) Animal mitochondrial DNA: structure and evolution. Int Rev Cytol 141: 173–216 Wong TW, Clayton DA (1985) Isolation and characterization of a DNA primase from human mitochondria. J Biol Chem 260: 11530–11535 Xu B, Clayton DA (1996) RNA-DNA hybrid formation at the human mitochondrial heavy-strand origin ceases at replication start sites: an implication for RNA-DNA hybrids serving as primers. EMBO J 15: 3135–3143 Zsurka G, Kraytsberg Y, Kudina T, Kornblum C, Elger CE, Khrapko K, Kunz WS (2005) Recombination of mitochondrial DNA in skeletal muscle of individuals with multiple mitochondrial DNA heteroplasmy. Nat Genet 37: 873–877

118

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

1.5.10 Zeittafel 1856

Erste mikroskopische Beobachtungen von Mitochondrien (Granulae) in Muskelzellen durch Albert von Kölliker (von Kölliker 1856)

ab 1883

Erste Formulierungen der Endosymbiontenhyothese durch Schimper, Altmann und Mereschkowsky (Schimper 1883; Altman 1890; Mereschkowsky 1905)

1898

Namensgebung Mitochondrien durch Benda (Benda 1898)

1909

Nichtmendelnde, plasmatische Vererbung (Correns 1909)

1952

Beschreibung der Ultrastruktur der Mitochondrien durch Palade (Palade 1952)

1953

petite-Mutanten bei der Hefe, Beginn der Mitochondriengenetik (Ephrussi 1953)

1961

Chemiosmose-Theorie der oxidativen Phosphorylierung durch Mitchell (Mitchell 1961)

1963

Nachweis von DNA in Mitochondrien (Nass u. Nass 1963)

ab 1970

Studien zur physikalischen Organisation, der Transkription und Replikation des mitochondrialen Genoms, vor allem von Clayton und Attardi (Aloni u. Attardi 1971; Robberson u. Clayton 1972)

1979

Abweichender genetischer Kode in Mitochondrien (Barrell et al. 1979)

1981

Komplette Sequenz des humanen mitochondrialen Genoms (Anderson et al. 1981)

1982

„Bottleneck“-Hypothese zur Vererbung der mtDNA in der Keimbahn (Hauswirth u. Laipis 1982)

1987

Phylogenie des humanen mitochondrialen Genoms, „Out-of-Africa“-Hypothese (Cann et al.1987)

1988

Erste Beschreibung einer durch eine mtDNA-Mutation verursachten Erkrankung (Wallace et al. 1988)

1989

Generierung von mtDNA depletierter rho--Zellen (King u. Attardi 1989)

1997

Die Analyse von mtDNA aus Knochenfunden des Neandertalers zeigt nur entfernte Verwandtschaft mit dem modernen Menschen (Krings et al. 1997)

1998

„Knockout“-Mausmodell für den mitochondrialen Transkriptionsfaktor mtTFA führt zum Verlust von mtDNA (Larsson et al 1998)

2000

Erzeugung eines ersten Mausmodells mit einer mtDNA-Deletion (Inoue et al. 2000)

2002

Beschreibung eines Falls mit paternal vererbter mtDNA beim Menschen (Schwartz u. Vissing 2002)

2004

„mtDNA-mutator“-Maus mit Mutation in der mitochondrialen DNA-Polymerase als Modell für mitochondrial bedingte Alterungsprozesse (Trifunovic et al. 2004)

2005

Nachweis von Rekombination im humanen mitochondrialen Genom (Zsurka et al. 2005)

Literatur zur Zeittafel Aloni Y, Attardi G (1971) Symmetrical in vivo transcription of mitochondrial DNA in HeLa cells. Proc Natl Acad Sci U S A 68: 1757– 1761 Altman R (1890) Die Elementarorganismen und Ihre Beziehungen zu den Zellen. Verlag von Veit, Leipzig Anderson S, Bankier AT, Barrell BG, de Bruijn MHL, Coulson AR, Drouin J, Eperon IC, Nierlich DP, Roe BA, Sanger F, Schreier PH, Smith AJH, Staden R, Young IG (1981) Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature 290: 457– 465 Barrell BG, Bankier AT, Drouin J (1979) A different genetic code in human mitochondria. Nature 282:189–194 Benda C (1898) Weitere Mitteilungen über die Mitochondria. Verh Physiol Ges Berlin 376–383

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119 1.5 · Mitochondriale DNA des Menschen Krings M, Stone A, Schmitz RW, Krainitzki H, Stoneking M, Pääbo S (1997) Neandertal DNA sequences and the origin of modern humans. Cell 90: 19–30 Larsson NG, Wang J, Wilhelmsson H, Oldfors A, Rustin P, Lewandoski M, Barsh GS, Clayton DA (1998) Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice. Nat Genet 18: 231–236 Mereschkowsky C (1905) Über Natur und Ursprung der Chromatophoren im Pflanzenreiche. Biol Centralbl 25:593–604 Mitchell P (1961) Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature 191: 144–148 Nass S, Nass MMK (1963b) Intramitochondrial fibers with DNA characteristics: Enzymatic and other hydrolytic treatments. J Cell Biol 19: 613–629 Palade GE (1952) The fine structure of mitochondria. Anat Rec 114: 427–451 Robberson DL, Clayton DA (1972) Replication of mitochondrial DNA in mouse L cells and their thymidine kinase – derivatives: displacement replication on a covalently-closed circular template. Proc Natl Acad Sci U S A 69: 3810–3814

1.5

Schimper AFW (1883) Über die Entwicklung der Chlorophyllkörner und Farbkörner. Botanische Zeitung 41:105–114 Schwartz M, Vissing J (2002) Paternal inheritance of mitochondrial DNA. New Engl J Med 347:576–580 Trifunovic A, Wredenberg A, Falkenbaerg M, Spelbrink JN, Rovio AT, Bruder CE, Bohlooly-Y M, Gidlöf S, Oldfors A, Wibom R, Törnell J Jacobs HT, Larsson NG (2004) Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase. Nature 429:417–423 Von Kölliker A (1856) Zeitschrift für wissenschaftl Zoologie VIII, 311–318 Wallace DC, Singh G, Lott MT, Hodge JA, Schurr TG, Lezza AM, Elsas LJ, Nikoskelainen EK (1988) Mitochondrial DNA mutation associated with Leber‘s hereditary optic neuropathy. Science 242: 1427–1430 Zsurka G, Kraytsberg Y, Kudina T, Kornblum C, Elger CE, Khrapko K, Kunz WS (2005) Recombination of mitochondrial DNA in skeletal muscle of individuals with multiple mitochondrial DNA heteroplasmy. Nat Genet 37:873–877

1.6 Regulationsmechanismen der Transkription in Eukaryonten Rainer Renkawitz und Joerg Leers

1.6.1

Transkription durch die RNA-Polymerase

– 121

1.6.1.1 1.6.1.2 1.6.1.3 1.6.1.4 1.6.1.5

Aufbau eines Gens – 121 Aufbau eines Promotors – 121 Basale Transkriptionsfaktoren – 121 RNA-Polymerase II – 122 Regulationssequenzen – 124

1.6.2

Das Chromatin

1.6.3

„Regulationsmaschinen“

1.6.3.1 1.6.3.2 1.6.3.3

Mediatorkomplexe – 129 Chromatin-Modifikationskomplexe – 129 Chromatin-Remodeling-Komplexe – 130

1.6.4

Regulation durch nichtkodierende RNA – 131

1.6.5

Regulationsmodelle mit klinischer Relevanz

1.6.5.1 1.6.5.2 1.6.5.3 1.6.5.4 1.6.5.5

NFκB – 132 Fos/Jun – 132 Kernrezeptoren – 133 HOX-Gene – 134 Imprinting – 134

1.6.6

Ausblick

– 135

1.6.7

Literatur

– 135

1.6.8

Zeittafel

– 137

– 125

Literatur zur Zeittafel

– 129

– 132

– 138

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

121 1.6 · Regulationsmechanismen der Transkription in Eukaryonten

1.6.1 Transkription durch die RNA-Polymerase 1.6.1.1 Aufbau eines Gens Die von Generation zu Generation weitergegebene, also vererbte, Information bezeichnet man als das Genom. Diese Information beinhaltet in kodierter Form die Anleitung zur Produktion von Proteinen, und diese Proteine wiederum bestimmen die Entwicklung von einzelnen Zellen, komplexeren Organen bis hin zum vollständigen Organismus. Das Genom besteht aus Desoxyribonukleinsäure (DNA) und ist untergliedert in Untereinheiten, den sog. Genen. Jedes Gen enthält die Information für ein Protein. Der Mensch z. B. besitzt ca. 25.000 Gene. Jedes Gen enthält einen transkribierten Bereich (Matrize), der mittels einer RNA-Polymerase in Ribonukleinsäure (RNA) umgeschrieben wird. Nur ein Teil dieses transkribierten Abschnitts trägt die Information für ein Protein, andere Bereiche wiederum tragen keine Informationen für die Proteinsynthese und werden nach der Transkription wieder aus dem RNA-Transkript entfernt. Neben den transkribierten Bereichen gibt es regulatorische Abschnitte, die nicht in RNA umgeschrieben werden. Diese regulatorischen Abschnitte bestimmen, wie oft ein Gen transkribiert wird, d. h., wie viel RNA-Kopien von einem Gen angefertigt werden. In der Regel folgt aus einer hohen Transkriptionsrate eine entsprechend hohe Proteinmenge. Die Transkriptionsrate jedes Gens wird zu jedem Zeitpunkt von der Entstehung bis zum Tod einer Zelle exakt reguliert. Eine Deregulation auch nur eines einzigen Gens, wie sie zum Beispiel durch Mutationen erfolgen kann, kann dramatische Auswirkungen auf die Zelle haben. Im vorliegenden Kapitel wird die Transkription von Genen behandelt.

1.6.1.2 Aufbau eines Promotors Der Transkriptionsstartpunkt, bei dem die RNA-Polymerase II mit der RNA-Synthese beginnt, wird durch die sog. TATA-Box bestimmt. Diesen Abschnitt bezeichnet man auch als den „core“-Promotor. Die TATA-Box, die in der Regel die Sequenz TATAAA besitzt, befindet sich 25 Basenpaare (Bp) stromauf („upstream“) von dem Transkriptionsstartpunkt und ist die Erkennungs- und Bindestelle des „TATA-binding protein“ (TBP). Mutationen auch nur einer einzigen Base innerhalb des TATAAA-Motivs führen zu einer drastischen Reduktion der Transkriptionsrate. Die meisten Gene besitzen eine solche TATA-Box. Interessanterweise gibt es eine Gruppe von Genen, die keine TATA-Box aufweist. Diese Gene kodieren für Proteine, die in jeder Zelle benötigt werden und aus diesem Grund Haushaltsgene genannt werden.

1.6

Statt der TATA-Box besitzen sie GC-Boxen, GC-reiche Regionen, an die der ubiquitär exprimierte Transkriptionsfaktor SP1 bindet und die Transkription aktiviert. Des Weiteren besitzen die Promotoren derjenigen Gene keine TATA-Box, die von den RNA-Polymerasen I und III transkribiert werden. Die RNA-Polymerase I transkribiert die Gene der ribosomalen RNAs 28S, 18S und 5,8S, während die RNA-Polymerase III die 5S-rRNA und tRNAs synthetisiert. Das heißt, die Gene, die von der RNA-Polymerase I oder III transkribiert werden, kodieren für Transkripte, die nicht in Protein translatiert werden.

1.6.1.3 Basale Transkriptionsfaktoren Die „core“-Promotorregion eines Gens ist der Bereich, der den Startpunkt der Transkription festlegt. Für diesen Prozess sind mehrere Proteine notwendig, die sich zum sog. Präinitiationskomplex (PIC) zusammenlagern. Das TATA-binding protein TBP ist schon bei seiner Bindung an die TATA-Box mit mindestens 12 weiteren Proteinen assoziiert, den sog. TBP-assoziierten Faktoren (TAFs), die die Bindung von TBP an die DNA regulieren. TBP und TAFs formen zusammen den TFIID-Komplex (> Abb. 1.6.1). TBP bindet in der kleinen Furche der DNA und erzeugt dadurch eine starke Biegung der Doppelhelix. Diese Biegung ermöglicht die Bindung der Proteine TFIIA und TFIIB benachbart zu TFIID an die DNA. Beide Faktoren sorgen für eine stabilere Assoziation des TFIID-Komplexes an die DNA. Der Komplex aus TFIID, TFIIA und TFIIB bildet die Oberfläche für die Bindung der RNA-Polymerase II (Roeder 2005). Diese Rekrutierung der RNA-Polymerase II wird durch den Faktor TFIIF stabilisiert. Der Komplex wird dann durch die Faktoren TFIIE und TFIIH komplettiert. TFIIE reguliert die unterschiedlichen enzymatischen Aktivitäten von TFIIH. Diese bestehen in einer Helikasefunktion, die zu einer Entwindung der DNA-Helix und dem nachfolgenden Aufbrechen des DNA-Doppelstrangs und somit zu einem offenen Promotorkomplex führt. Des Weiteren ist TFIIH mitverantwortlich für die Phosphorylierung der C-terminalen Domäne der RNA-Polymerase II (7 1.6.1.4). Diese Phosphorylierung erlaubt der RNA-Polymerase II den Promotorbereich zu verlassen („promotor clearance“) und mit der RNAPolymerasereaktion, der Transkription, zu beginnen. Während einige Transkriptionsfaktoren nach dem Start der Polymerisation den Promotor verlassen, bleiben andere Faktoren wie TFIID, TFIIA, TFIIE und TFIIH auch weiterhin im Promotorbereich. Dies hat zur Folge, dass eine Re-Initiation durch den Aufbau eines neuen vollständigen Komplexes schneller erfolgen kann.

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

1.6.1.4 RNA-Polymerase II

. Abb. 1.6.1. Die Transkriptionsfaktoren TFIIA, -B, -D und -E sind für die Initiation der Transkription durch die RNA-Polymerase II essenziell. Der Zusammenbau dieses generellen Proteinkomplexes beginnt mit der Bindung von TFIID an die TATA-Box. Die an TFIIF gebundene Polymerase kann an den Komplex binden, nachdem TFIIA, -B und -D auf dem Promotorbereich der DNA positioniert sind. Dabei ermöglichen TFIIE und TFIIF der Polymerase den Zugang zur DNA. (TS) Stelle des Transkriptionsstarts

Die RNA-Polymerase II ist ein Enzym, das aus 2 großen und 12 kleinen Untereinheiten besteht. Sequenzvergleiche dieser Untereinheiten zwischen weit entfernt verwandten Organismen ergaben einen hohen Konservierungsgrad. So zeigen die großen Untereinheiten der RNA-Polymerase II von Wirbeltieren immer noch Sequenzhomologien mit RNA-Polymerase-Untereinheiten von E. coli. Diese Vergleiche erlauben den Schluss, dass die RNA-Polymerase II sehr früh in der Evolution entstanden ist und sich seither vergleichsweise wenig verändert hat. Die C-terminale Domäne (CTD) der größten Untereinheit besitzt 52 Wiederholungen der 7 Aminosäuren: Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. Die Aminosäuren Serin und Threonin innerhalb dieser Sequenz können phosphoryliert werden. Im unphosphorylierten Zustand rekrutiert die CTD den Multiproteinkomplex-Mediator (7 1.6.3.1). Er ist damit Teil des PIC. Nach der Phosphorylierung der CTD durch TFIIH, sowie durch Komponenten des Mediators, verliert der Mediator die Bindungsaffinität zur CTD und damit zur RNA-Polymerase II. Dieses Ablösen vom Mediator ist der entscheidende Schritt, der es der RNA-Polymerase erlaubt, mit der Transkription zu beginnen (Meinhart et al. 2005). Den Prozess der eigentlichen Polymerasereaktion, die in 5c-3c-Richtung erfolgt, bezeichnet man als Elongation. Hierbei werden Triphosphat-Nukleotide über eine Veresterung des D-Phosphats mit dem 3'-OH-Ende des bestehenden RNA-Strangs verknüpft. Die Energie, die diese Reaktion benötigt, entsteht durch die Abspaltung der E- und J-Phosphate des jeweils neu hinzugefügten Nukleotids. Während der Polymerisation bewegt sich die RNA-Polymerase entlang des DNA-MatrizenStrangs. Dabei wird die DNA-Doppelhelix kontinuierlich geöffnet und nach der Passage wieder geschlossen. Aufgrund der helikalen Struktur bedarf dieser Vorgang einer ständigen Entwindung der DNA (> Abb. 1.6.2).

. Abb. 1.6.2. Modell der Transkriptionselongation. In Bewegungsrichtung (horizontaler Pfeil) der RNA-Polymerase wird die DNA-Doppelhelix einzelsträngig entwunden und nach Passage der RNA-Polymerase wieder geschlossen. Die neu entstehende RNA wächst in 5c-3c-Richtung

123 1.6 · Regulationsmechanismen der Transkription in Eukaryonten

Erfahrungsgemäß kann die RNA-Polymerase II den RNA-Strang während der Elongationsphase um etwa 2000 Nukleotide pro Minute verlängern. Noch bevor der neu synthetisierte RNA-Strang 30 Nukleotide lang ist, erfolgt das sog. Capping. Bei diesem Vorgang wird an das 5c-Phosphat-Ende der mRNA ein 7-Methylguanosin-Cap über eine 5c-5c-Triphosphat-Verbindung angehängt. Beim Beginn der Translation ist das Cap wichtig für die Bindung der Ribosomen an die mRNA (vgl. Kap. 1.7). Nach der Transkription eines Gens durch die RNAPolymerase II erfolgen zwei offensichtlich zusammenhängende Prozesse (> Abb. 1.6.3). Das primäre RNATranskript wird etwa 10–30 Bp unterhalb einer Basenabfolge AAUAAA geschnitten. An das freie 3c-Ende werden anschließend mehr als 250 Adenosinmoleküle angehängt. Diesen Schritt bezeichnet man als Polyadenylierung, die dem Schutz vor Nukleasen dient, den Export der mRNA erleichtert und damit die Translationseffizienz erhöht. Gleichzeitig mit der Polyadenylierung läuft weiter unterhalb die Termination der Transkription ab (Buratowski 2005). Die für die Polyadenylierung sowie für die Termination verantwortlichen Proteinkomplexe sind mit der CTD der RNA-Polymerase II assoziiert und begleiten die Polymerase während der Elongationsphase. Nach der Termination wird die CTD dephosphoryliert, die Polyadenylierungsproteine fallen ab, und die RNA-Polymerase II steht für eine erneute Initiation der Transkription zur Verfügung. Bei den Eukaryonten ist in der Regel der kodierende Bereich von nichtkodierenden Genabschnitten unter-

1.6

brochen. Die kodierenden Bereiche bezeichnet man als Exons („expressed sequences“), während die nichtkodierenden Bereiche Introns („intervening sequences“) genannt werden. In der Regel bestehen eukaryote Gene aus mindestens 2 bis hin zu 400 Exons. Interessanterweise ist die Länge der Introns oftmals viel größer als die der Exons und kann bis zu mehrere Megabasen umfassen. Das primäre Produkt der Transkription umfasst also zunächst einmal ein viel längeres RNA-Molekül als es für die Translation benötigt wird. Der Vorgang, der für die Entfernung der überflüssigen Abschnitte verantwortlich ist, bezeichnet man als Spleißen (> Abb. 1.6.4). Dieser Prozess läuft zeitlich parallel zur Elongation der Transkription ab. Wie auch die Proteine, die das Capping, die Polyadenylierung und die Termination regulieren, so sind auch die Spleißfaktoren an die phosphorylierte CTD der RNA-Polymerase II gebunden. Diese Spleißfaktoren sind RNA-Protein-Komplexe, die als snRNP U1, U2 bis U6 bezeichnet werden. Im sog. Spleißosom erfüllen sie unterschiedliche Aufgaben (> Abb. 1.6.4). Der Mechanismus des Herausspleißens von Introns besteht zunächst in der Erkennung der Grenzen des Introns durch das Spleißosom. Die 5c-Intron-Enden beginnen nahezu immer mit der Abfolge GU und weisen am 3c-Ende immer die Basen AG auf. Nach Fixierung dieser Enden durch das Spleißosom bildet der dazwischen liegende Abschnitt, das Intron also, eine Art Lasso- oder auch Lariatstruktur. Die Enden der Exons wiederum gelangen auf diese Weise in sehr dichte räumliche Nähe, sie werden gespalten und die Exons verbunden (Kornblihtt et al. 2004).

. Abb. 1.6.3. Spaltung und Polyadenylierung des Primärtranskripts. Eine spezifische Endonuklease erkennt das Spaltungssignal (AAUAAA) und spaltet das Primärtranskript. Anschließend wird ein Schwanz aus etwa 250 Adenosinmolekülen durch das Enzym PolyAPolymerase an das 3c-Ende angefügt. Die Reifung der Prä-mRNA findet im Zellkern statt, wobei die reife mRNA entsteht, die nachfolgend ins Zytoplasma transportiert und dort zum Protein translatiert wird. Das Primärtranskript enthält eine 5c-Cap-Struktur, die auch nach der Prozessierung erhalten bleibt

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

a

nen sukzessive verändert werden, während andere Bereiche konstant bleiben. Verdopplungen und anschließende Translokationen von Exons in die Introns anderer Gene können erfolgen, was zu modularen Ergänzungen eines bestehenden Proteins führt. Ein weiterer Grund für die Organisation in Exons und Introns ist die Möglichkeit, aus einem einzigen Gen und seinem primären Transkript unterschiedliche Spleißprodukte zu generieren. Diesen Prozess bezeichnet man als alternatives Spleißen. Dabei werden nicht unbedingt nur benachbarte Exons miteinander verknüpft, sondern ein oder mehrere Exons können mitsamt den dazwischen liegenden Introns entfernt werden. Dadurch können unterschiedliche Proteine gebildet werden. Durch den Mechanismus des alternativen Spleißens ergibt sich also gegenüber der Zahl von 25.000 menschlichen Genen eine weit höhere Anzahl an resultierenden Genprodukten.

1.6.1.5 Regulationssequenzen b . Abb. 1.6.4.a,b. a Spleißen von Introns aus Prä-mRNA. Introns bilden eine Lariatstruktur und werden anschließend aus dem Primärtranskript entfernt. Die reife mRNA besteht anschließend lediglich aus Exonsequenzen. b Zusammenbau eines Spleißosoms. Beginn und Ende von Introns sind durch spezifische Sequenzen festgelegt. Das Spleißdonorsignal am 5c-Ende des Introns ist durch die Sequenz GU, das Akzeptorsignal am 3c-Ende des Introns durch die Basenfolge AG gekennzeichnet. Zu Beginn des Spleißvorgangs binden U1- und U2snRNP an die Start- und Verzweigungssequenz. Danach bindet der Komplex aus U4–U6 und komplettiert das Spleißosom

Worin liegt nun der Sinn eines solch komplizierten Mechanismus? Die Unterteilung des primären Transkripts in kodierende und nichtkodierende Abschnitte hat wahrscheinlich enorme Vorteile für die Evolution von Proteinen. Einzelne Bausteine eines Proteins kön-

Man unterscheidet verschiedene regulatorische Bereiche innerhalb eines Gens. Der Abschnitt, der oberhalb des „core“-Promotors lokalisiert ist, ist der so genannte „upstream“-Promotor. Weiter entfernt von der transkribierten Region liegende andere regulatorische Abschnitte nennt man je nach ihrer Funktion Enhancer, Silencer und Isolatoren. Regulierende Transkriptionsfaktoren binden an Erkennungsstellen, die einen kurzen Bereich von 6 bis 12 Basenpaaren umfassen. Nach der Bindung an die Regulationssequenzen beeinflussen die Transkriptionsfaktoren die Transkriptionsrate entweder positiv (Transaktivatoren) oder negativ (Transrepressoren). Die regulatorischen Bereiche können zum Teil mehrere 10.000 Basenpaare entfernt vom Promotor lokalisiert sein. Sie liegen sowohl vor den Genen („upstream“) als auch dahinter („downstream“) oder in den Genen selbst, dann in der Regel in Introns. Wenn sie aktivieren, spricht

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man von Enhancer-Elementen oder, wenn sie reprimieren, von Silencer-Elementen. Die Kombination und Anzahl der auf die Transkriptionsrate aktivierend oder reprimierend wirkenden Bindestellen führt zu einer spezifischen Genaktivität. Proteine, die an diese Enhancer- oder Silencer-Elemente binden, sind in der Regel gewebsspezifische Faktoren oder Proteine, die nur während einer bestimmten Phase des Zellzyklus in der Zelle aktiviert werden. Sie werden oftmals durch Modifikationen wie Phosphorylierungen reguliert oder durch Hormone in ihrer Funktion als Aktivator oder Repressor festgelegt (7 1.6.5). Diese Proteine sind in der Lage ihr aktivierendes bzw. reprimierendes Signal von den weit entfernt liegenden Enhancer- bzw. Silencer-Elementen auf den PIC zu übertragen. Dabei interagieren diese Proteine mit Proteinen am Transkriptionsstartpunkt. Die sich zwischen den entfernt liegenden Regulationssequenzen und dem Transkriptionsstart befindende DNA, die mehrere 10000 Basenpaare umfassen kann, bildet dabei eine Schleife (> Abb. 1.6.5) (West u. Fraser 2005). Der genaue Wirkungsmechanismus von aktivierenden oder reprimierenden Proteinen auf die Transkription ist noch nicht endgültig geklärt. Oftmals besitzen aktivierende,

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an Enhancer bindende Proteine die Eigenschaft, Enzyme zu rekrutieren, die Histone acetylieren. Im Gegensatz dazu können reprimierende, an Silencer bindende Proteine Enzyme binden, die Histone deacetylieren (7 1.6.2.2). Diese antagonistischen enzymatischen Wirkungen auf die Modifikationen von Histonen resultieren in einem offenen Chromatin im Falle der aktivierenden Proteine und in einem kompakten Chromatin im Falle der reprimierenden Transkriptionsfaktoren.Diese Unterschiede in der Struktur des Chromatins bestimmen dann graduell die Zugänglichkeit anderer DNA-bindender Proteine am Promotor. Daneben interagieren viele dieser aktivierenden oder reprimierenden Transkriptionsfaktoren mit Proteinen des PIC, wie TAFs oder Mediatorkomponenten, sowie mit Chromatin-Remodeling-Komplexen (7 1.6.3). Die große Distanz, die enhancerbindende Transkriptionsfaktoren überwinden können, um ihr Signal auf den PIC zu übertragen, beinhaltet ein prinzipielles Problem. Wie kann verhindert werden, dass ein Enhancer nur das Gen reguliert, das reguliert werden soll? Ein benachbartes Gen könnte ebenfalls unter Kontrolle des „fremden“ Enhancers geraten. Um die Autarkie der Regulation jedes einzelnen Gens zu gewährleisten, gibt es sog. Isolatoren, die die äußere Begrenzung einer Genregulationseinheit darstellen. Enhancerbindende Transkriptionsfaktoren sind nicht in der Lage, ihr Signal über einen solchen Isolator hinweg zu vermitteln. In höheren Eukaryonten bindet der Faktor CTCF an diese Isolatoren und bewirkt eine Enhancerblockade. Auf welchem molekularen Weg die Enhancerwirkung verhindert wird, ist im Moment noch unklar. Es wird diskutiert, dass die Annäherung der enhancergebundenen Transkriptionsfaktoren zum PIC durch den CTCF-gebundenen Isolator verhindert wird (Ohlsson et al. 2001; West u. Fraser 2005).

1.6.2 Das Chromatin . Abb. 1.6.5. Transkriptionsfaktoren und Multiproteinkomplexe regulieren die Genaktivität. DNA (schwarze Linie) ist um Histon-Oktamere (graue Ovale) gewickelt und bildet die Nukleosomen. Transkriptionsfaktoren (rote Ovale) können an„upstream“-Promotor-Elemente oder an Enhancer-Sequenzen gebunden sein. DNA-gebundene Transkriptionsfaktoren rekrutieren Multiproteinkomplexe unterschiedlicher Funktion. Chromatin-Remodeling-Komplexe bewirken die ATPabhängige Verschiebung und Veränderung der Nukleosomen. Chromatinmodifizierende Komplexe verändern die Acetylierung, die Methylierung und die Phosphorylierung der Histone. Diese Veränderungen markieren das Chromatin für die Genaktivierung bzw. für die Genrepression. Der Mediatorkomplex verbindet die DNA-gebundenen Transkriptionsfaktoren mit dem Präinitiationskomplex (PIC), der die Transkription durch die RNA-Polymerase II (Pol II) ermöglicht. Große Abstände zwischen Enhancer und Promotor werden durch die Ausfaltung des Chromatins und die Interaktion (graue Pfeile) zwischen Enhancer- und Promotor-Komplexen überbrückt

Die DNA der Eukaryonten ist auf den Chromosomen des Zellkerns untergebracht. Der Mensch hat 46 Chromosomen, die insgesamt einen DNA-Gehalt besitzen, der eine Gesamtlänge von zwei Metern einnehmen würde, wenn man die DNA der einzelnen Chromosomen aneinanderreihte. Diese enorme DNA-Länge muss im jeweiligen Zellkern unterzubringen sein, der in der Regel einen Durchmesser von 5–10 μm besitzt. Die Lösung dieses Mengenproblems wird durch die Verpackung in das Chromatin ermöglicht. Chromatin erlaubt es, dass während der Arbeits- oder Interphase des Zellzyklus die DNA für die Genaktivität und auch zur Verdopplung durch DNA-Polymerasen erreichbar ist. Dieses während der Interphase des Zellzyklus relativ wenig verpackte

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

Chromatin muss für die Durchführung der Mitose deutlich kompakter vorliegen. Bei der Mitose bilden sich die Mitosechromosomen durch eine zunehmende Verpackungsdichte des Chromatins. Das ist notwendig, da die Mitose vollständige Chromatiden eines jeden Chromosoms auf die Tochterzellen verteilt. Dieses wäre mit räumlich sehr ausgedehntem Chromatin nicht möglich. Der maximale Verkürzungs- und Verpackungsgrad im Mitosechromosom lässt sich mit ca. 10.000 angeben. Wie sieht die Verpackung aus? Die kleinste Untereinheit des Chromatins liegt in Form sog. Nukleosomen vor (> Abb. 1.6.6) (Strahl u. Allis 2000). Diese Nukleosomen bestehen aus einem DNA-Abschnitt von ca. 200 Bp Länge, der um einen Proteinanteil, die Histone, herumgewickelt ist. Histone sind basische Proteine, die in der Lage sind, an das saure DNA-Molekül zu binden. Insgesamt bildet ein Oktamer von Histonen die Grundstruktur, die jeweils aus zwei Histonen vom Typ H2a, H2b, H3 und H4 besteht. Die genaue Anordnung der Histone innerhalb eines Oktamers lässt sich am besten in Form zweier Tetramere beschreiben: H2a (2x) plus H2b (2x) bildet ein Tetramer und H3 (2x) plus H4 (2x) füllen das Oktamer auf. Um dieses Oktamer herum liegt die DNA in ca. zwei Windungen, die schon zu einer deutlichen Verkürzung des DNA-Moleküls führen. Die ca. 200 Basenpaare an DNA, die mit einem Nukleosom verbunden sind, befinden sich über einem Abschnitt von 147 Bp in engem Kontakt zum Nukleosom. Der verbleibende Anteil an DNA wird als sog. Linker bezeichnet, der eine Verbindung zum nächsten Nukleosom darstellt. LinkerAbschnitte können in ihrer Länge variieren und werden durch das Histon H1, einem fünften Histon, gebunden. H1 ermöglicht eine stärkere Kompaktierung des Chromatins, indem es durch eine Verbindung zweier Nukleosomen zu einer Faltung höherer Ordnung der Chromatinfaser führt. Durch diese Faltung wird das dünnere Chromatinfilament mit einem Durchmesser von ca. 10 nm zu einem kürzeren aber dickeren Chromatinfaden mit einem Durchmesser von ca. 30 nm überführt. Diese Chromatinfaltung stellt den größten Anteil des Chromatins während der Interphase dar. Für den Wechsel von der Interphase zur Mitose muss ein weiterer Verpackungsgrad erzielt werden. Auch diese zusätzliche Verkürzung erfolgt durch unterschiedliche Hierarchien. Der nächsthöhere Verpackungszustand ist durch eine Struktur beschrieben, die einen Durchmesser von ca. 300 nm einnimmt und die dadurch zustande kommt, dass der 30-nm-Faden über eine Schleifenstruktur an chromosomale Gerüstproteine gebunden wird. Die dreidimensionale Struktur des Chromosomengerüsts selbst liegt in einer gewundenen Anordnung vor, sodass der 300-nm-Faden nun im Mitosechromosom einen Durchmesser von 700 nm einnimmt, unter gleichzeitiger Verkürzung auf die Länge der mikroskopisch

. Abb. 1.6.6. Die Chromatinstruktur. Die DNA (schwarze Linie) ist um Histon-Oktamere (jeweils zwei Moleküle H2A, H2B, H3 und H4) gewunden und bildet so das Nukleosom. Viele dieser Nukleosomen hintereinander bilden eine Chromatinfaser mit einem Durchmesser von 10 nm. Durch das nicht dargestellte Histon H1 wird diese Faser weiter zu einer 30-nm-Faser verpackt. Die Histone des Nukleosoms ragen mit ihren N-terminalen Enden aus dem Nukleosom heraus (rote Linien). Wie am Beispiel für das Histon H3 gezeigt, kann dieser N-Terminus unmodifiziert vorliegen oder aber an verschiedenen Aminosäuren Modifikationen aufweisen (nach Strahl u. Allis 2000)

sichtbaren Mitosechromosomen (Watson et al. 2004). Die Morphologie und die Funktion mitotischer Chromosomen sind in Kapitel 1.3 (zytogenetische Grundlagen) näher erläutert. Neben der oben beschriebenen Funktion der Chromatinverpackung, eine Verkürzung der enormen DNAMengen des Zellkerns zu ermöglichen, gibt es wichtige regulatorische Funktionen des Chromatins während der Interphase. Innerhalb der regulatorischen Funktionen muss man zwei grundsätzliche Funktionsebenen unterscheiden. Einerseits können chromatinverpackte Gene und regulatorische Sequenzen direkt durch Chromatinmodifikationen (s. u.) in ihrer Aktivität beeinflusst werden. Darüber hinaus sind aber auch mehr globale Funktionen des Chromatins erkennbar, die zu einer Untergliederung größerer Genomabschnitte in sog. chromosomale Territorien führt (Cremer u. Cremer 2001). Die genauere Untersuchung der Verteilung von Sequenzabschnitten innerhalb des Interphase-Zellkerns hat gezeigt, dass Chromatin nicht beliebig im Zellkern verteilt vorliegt und auch keine willkürliche Vermischung der Chromatinabschnitte verschiedener Chromosomen zu beobachten ist. Vielmehr gibt es eine Zellkernarchitektur, die in Form von Chromosomenterritorien sichtbar wird. Eine durch verschiedene Experimente unterstütze Erklärung zur Funktion der Territorien führt an, dass an den Außengrenzen der Territorien die aktiven Gene liegen, die über die Zwischenräume der Territorien mit den notwendigen Regulationsfaktoren und Enzymen ver-

127 1.6 · Regulationsmechanismen der Transkription in Eukaryonten

1.6

. Abb. 1.6.7. Vielfältige Modifikationen der N-terminalen Aminosäuren der Histone beeinflussen die Genaktivität. Für jedes der Histone des Nukleosoms sind die N-terminalen Aminosäuren dargestellt. Bekannte Modifikationen sind die Phosphorylierung (gelbes P), die Acetylierung (rotes A), sowie die Methylierung (grünes M) (nach Peterson u. Laniel 2004)

sorgt werden. Mit der gleichen Argumentation kann man davon ausgehen, dass die Gene im Inneren der Territorien häufig inaktiv sind, da sie nicht von den notwendigen Regulationsfaktoren erreicht werden können. Allerdings ist völlig unklar, über welche Mechanismen ein inaktives Gen von der inneren Region eines Territoriums nach außen wandert, um zu einem aktiven Gen zu werden. Neben der Rolle des Chromatins als globale Organisationsform spielt Chromatin aber auch eine wichtige Rolle bei der lokalen Regulation. Strukturanalysen der Nukleosome haben gezeigt, dass die Hauptanteile der Histonmoleküle von der DNA umschlossen werden, die ca. zwei Mal um das Nukleosom herum gewunden vorliegt. Darüber hinaus wurde aber deutlich, dass die N-terminalen Enden der Histone aus diesen Nukleosomenstrukturen herausragen (> Abb. 1.6.6). Diese sog. Histonschwänze sind potenzielle Substrate für Enzyme, die das Chromatin modifizieren. Eine wichtige Modifikation der Histone stellt die Acetylierung dar. HistonAcetyltransferasen (HAT) sind in der Lage, die Histonschwänze zu acetylieren (> Abb. 1.6.7). Dieses geschieht an den Seitenketten der Lysine und führt zu einer Änderung der Ladung der Histone. Prinzipiell sind Histone basische Proteine mit einer positiven Ladung, die relativ stabil an die negativ geladene DNA binden. Durch die Acetylierung erfolgt eine Reduzierung der positiven Ladung, sodass die Histone nun nicht mehr fest an die DNA gebunden vorliegen. Solche Acetylierungen beobachtet man an den Lysinresten der Schwänze an den Histonen H2a, H2b, H3 und H4 (Peterson u. Laniel 2004; Strahl u. Allis 2000). Es hat sich gezeigt, dass acetyliertes Chromatin in Verbindung mit Genaktivierung gefunden wird. Entsprechend können aktive Gene durch die Wirkung von Histon-Deacetylasen (HDAC) deacetyliert und damit inaktiviert werden. Die Mechanismen der spezifischen Zielstellenerkennung und Acetylierung, bzw. Deacetylierung werden im Abschnitt 1.6.3 beschrieben. Neben der Acetylierung wurde auch die Phosphorylierung bestimmter Histonschwänze beobachtet. Besonders die Phosphorylierung von Serinen

scheint eine Rolle im Zusammenhang mit Genaktivierung zu spielen. Die beteiligten Enzyme sind Phosphokinasen bzw. Phosphatasen. Eine weitere, sehr wichtige Modifikation der Histonschwänze ist die Methylierung von Lysinen bzw. von Argininen. Hier kann man keine pauschale Beschreibung der Funktion eines methylierten Lysin- bzw. Argininrests angeben. Vielmehr scheint die exakte Aminosäure, bzw. die exakte Position im Histonschwanz, von wichtiger Bedeutung dafür zu sein, ob sich eine Methylierung als Aktivierung der Genaktivität auswirkt oder vielmehr als Repression. Diese und weitere Modifikationen können auch in Kombination auftreten, sodass der Begriff des „Histon-Kodes“ geprägt wurde. Das heißt, in Abhängigkeit vom Modifikationsmuster wird an den unterschiedlichen Histonschwänzen eine Repression bzw. eine Aktivierung der Genaktivität erreicht. Die Auflockerung des Chromatins bzw. die Bindung spezifischer Transkriptionsaktivatoren an modifizierte Histone entsprechend dem Histon-Kode alleine reicht noch nicht aus, um der RNA-Polymerase (7 1.6.1) die Synthese entlang der DNA durch die Nukleosomen hindurch zu ermöglichen. Darüber hinaus sind manche Bindestellen für sequenzspezifische Transkriptionsaktivatoren durch Nukleosomen besetzt. So hat man gesehen, dass in Abhängigkeit von der jeweiligen DNA-Sequenz Nukleosomen nicht gleichmäßig und zufällig über die DNA verteilt sind, sondern vielmehr, dass Nukleosomen häufig eine Positionierung aufweisen. Die Konsequenz einer solchen Positionierung besteht darin, dass u. U. wichtige Regulationssequenzen in engem Kontakt zum Nukleosom vorliegen und somit nicht zugänglich sind, bzw. dass andere Sequenzen im LinkerBereich zwischen den Nukleosomen zu finden sind. Daher ist ein weiterer Aspekt der DNA-Verpackung im Chromatin durch die Positionierung der Nukleosomen gegeben. Diese scheinbar statische Anordnung von Nukleosomen kann durch sog. Remodeling-Komplexe verändert werden (7 1.6.3). Man kann davon ausgehen, dass ein Nukleosom-Remodeling (energieabhängiges Verschieben oder Öffnen von Nukleosomen) nicht nur

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

für die Freigabe von Regulationssequenzen notwendig ist, sondern auch für die Passage der RNA-Polymerase durch die Nukleosomen hindurch (Watson et al. 2004). Neben der Modifikation der Histone kann aber auch die DNA selbst modifiziert sein. Hier spielt die Methylierung von Cytosinen eine wichtige Rolle, die benachbart zu einem Guanosin vorliegen. Man spricht hier von sog. CpG-Dinukleotiden, die an der 5-Position des Cytosins methyliert sein können. Eine solche Methylierung hat meistens zur Folge, dass ein benachbartes Gen über einen längeren Zeitraum abgeschaltet bleibt. Diese Abschaltung wird durch Proteine erzielt, die spezifisch 5-Methyl-Cytosin erkennen und weitere Modifikationen wie z. B. die Deacetylierung von Histonen vermitteln. Das heißt, auch die methylierte DNA wirkt indirekt über die Veränderung der Histonmodifikationen auf die Genaktivität. Die Tatsache, dass DNA-Methylierung an CpG-Dinukleotiden zu finden ist, erklärt einen Mechanismus zum Erhalt eines bestimmten DNA-Methylierungsmusters auch nach der DNA-Replikation. Dadurch, dass eine CpG-Sequenz ein Palindrom darstellt, findet sich auf dem komplementären Strang ebenso eine CpG-Sequenz (> Abb. 1.6.8). In der Regel sind methylierte Cytosine in einer CpG-Sequenz auch auf dem komplementären Strang am Cytosin methyliert. Andere, unmethylierte CpG-Sequenzen, sind auf beiden DNASträngen unmethyliert. Nach erfolgter DNA-Replikation ist der jeweils neue DNA-Einzelstrang zunächst einmal nicht methyliert. Bestimmte Enzyme, die Erhaltungsmethylasen, erkennen nun solche CpG-Sequenzen, die nur auf einem Strang die Methylierung aufweisen, und vermitteln die Methylierung auf dem zweiten Strang. Hingegen bleiben CpG-Sequenzen, die unmethyliert waren, auch nach der Replikation unmethyliert, da die Erhaltungsmethylasen hier nicht wirken können. So wird leicht erklärbar, dass von einer Replikation zur nächsten ein bestimmtes Methylierungsmuster von einer Zellteilung zur nächsten weitervererbt wird (Robertson 2005). Dieses Muster ist so stabil, dass es auch von Eltern auf die Nachkommen vererbt werden kann, was den Vorgang der genetischen Prägung ermöglicht. Dieses Phänomen (engl. „imprinting“) führt dazu, dass für bestimmte Gene nur eines der beiden elterlichen Allele aktiv ist, während das andere inaktiv bleibt. So gibt es manche Gene, die nur am väterlichen Allel Aktivität aufweisen, während andere Gene nur am mütterlichen Allel Aktivität zeigen. Dieses Aktivitätsmuster wird durch ein bestimmtes DNA-Methylierungsmuster vermittelt, das in den Keimzellen gebildet wird und auch nach der Befruchtung im erwachsenen Organismus erhalten bleibt. Die durch eine genetische Prägung regulierten Gene sind in der Regel für das embryonale Wachstum entscheidend (7 1.6.5).

. Abb. 1.6.8. Das Muster methylierter und unmethylierter CpGDinukleotide bleibt auch nach der Replikation erhalten. (Oben) Eine DNA-Doppelstrang-Sequenz ist mit zwei CpG-Dinukleotiden dargestellt. Eines der beiden CpG-Dinukleotide (rot) ist am Cytosin methyliert (rotes Dreieck). Diese Methylierung befindet sich auch auf dem komplementären Strang am entsprechenden C-Nukleotid. Ein weiteres unmethyliertes CpG (grün) ist auch auf dem komplementären Strang nicht methyliert. (Mitte) Nach erfolgter Replikation ist der jeweils neu synthetisierte Strang (kursiv) in allen Positionen unmethyliert (grün). (Unten) Die nur in einem Strang methylierten CpGDinukleotide werden durch Erhaltungsmethylasen auch auf dem komplementären Strang methyliert, sodass am Ende dieser Reaktion das CpG-Dinukleotid wieder auf beiden Strängen eine Methylierung aufweist. Das ursprünglich unmethylierte CpG-Dinukleotid bleibt auch im Anschluss an die Replikation weiterhin unmethyliert

Die hier besprochenen Regulationsmechanismen, die zur Abschaltung einzelner Gene führen, dienen auch der Inaktivierung größerer Genomabschnitte. Solche Bereiche, die dauerhaft inaktiv bleiben, bezeichnet man als Heterochromatin. Heterochromatin fällt dadurch auf, dass es nicht die zellzyklusabhängige Dekondensierung während der Interphase und stärkere Verpackung während der Mitose mitmacht, sondern permanent kompakt vorliegt. Das konstitutive Heterochromatin enthält repetitive Sequenzen, wie man sie an den Chromosomenenden, bzw. im Bereich des Zentromers findet (7 Kap. 1.3). Darüber hinaus liegt das zweite X-Chromosom bei weiblichen Säugern heterochromatisch als kompakter Barr-Körper auch während der Interphase vor. Dieses Heterochromatin bezeichnet man als das fakultative Heterochromatin (Watson et al. 2004).

129 1.6 · Regulationsmechanismen der Transkription in Eukaryonten

1.6.3 „Regulationsmaschinen“ Die Transkription wird durch eine Vielzahl von Faktoren reguliert. Nur diese große Anzahl an antagonistischen oder mit sich synergierenden oder miteinander kompetitierenden Faktoren gewährleistet eine Feinabstimmung in der Genregulation, wie sie zu beobachten ist. Bestimmte Teilaufgaben bei der Transkriptionskontrolle, und zwar solche, die in jeder Zelle zu jedem Zeitpunkt ablaufen, werden von großen Proteinkomplexen oder auch „Regulationsmaschinen“ bewerkstelligt. Diese Komplexe integrieren die Funktionen vieler einzeln wirkender, spezifischer Faktoren. Im Folgenden sollen drei dieser „Maschinen“ besprochen werden.

1.6.3.1 Mediatorkomplexe Der Mediator ist ein Komplex, der mit der RNA-Polymerase II am PIC vorliegt. Er bindet dort an die unphosphorylierte CTD (vgl. Abschn. 1.6.1.4). Der Mediator umfasst einen 1–2-MDa-Proteinkomplex von bis zu 37 Proteinen. 22 dieser Untereinheiten sind in allen Eukaryonten von Saccharomyces cerevisiae bis hin zum Menschen konserviert. Während der Mediatorkomplex in der Hefe schon zu Beginn der 1990er Jahre aufgereinigt wurde, entsprang die Isolierung des Mediators der Säuger mehr einem Zufallsprodukt. Verschiedene Gruppen versuchten unabhängig voneinander, mit unterschiedlichen Methoden Proteine zu identifizieren, die mit jeweils einem anderen Transkriptionsfaktor interagieren. Interessanterweise isolierten diese Gruppen trotz unterschiedlicher Methoden und unterschiedlicher Ausgangsproteine nahezu den gleichen Proteinkomplex, dessen Bestandteile sich als Komponenten des Mediators erwiesen. Mit diesen Ergebnissen, die überraschenderweise verdeutlichten, dass verschiedene Transkriptionsfaktoren an ein und denselben Komplex binden und dadurch mit dem PIC physisch in Kontakt treten können, war offensichtlich geworden, dass der Mediator als Integrationsstelle für eine Reihe von Transkriptionsfaktoren wirken kann. Das wird dadurch ermöglicht, dass die unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren mit immer wieder anderen Untereinheiten des Mediatorkomplexes interagieren können (> Abb. 1.6.5). So besitzen auch funktionell antagonistisch wirkende Transkriptionsfaktoren im Mediatorkomplex eine Interaktionsstelle mit dem PIC. Auch virale Proteine, die Einfluss auf die Transkription nehmen, interagieren mit dem Mediator. So sind das tumorpromovierende Protein E1A des Adenovirus oder der stärkste bekannte Transaktivator im eukaryoten System, das VP16-Protein des Herpes-simplex-Virus, mediatorinteragierende Transkriptionsfaktoren. Auch sie benutzen den Mediator als An-

1.6

dockstelle, um die transaktivierende Wirkung zu vermitteln (Lewis u. Reinberg 2003). Der molekulare Mechanismus, der der Wirkung des Mediatorkomplexes auf die Transkriptionsrate zugrunde liegt, ist bislang nicht vollständig geklärt. Wie kontrolliert die Bindung des Mediators an die CTD die Aktivität der RNA-Polymerase II? Es scheint so zu sein, als ob hier dem Faktor TFIIH eine Schlüsselrolle zukommt. Der Mediator kann TFIIH phosphorylieren und somit die Kinaseaktivität von TFIIH, die normalerweise die CTD phosphoryliert, hemmen. Offensichtlich ist der Mediator in der Lage, den Übergang von der Initiation zur Elongationssphase der Transkription zu verzögern und damit die Transkriptionsrate zunächst einmal zu erniedrigen. Aktivatoren, die mit dem Mediator interagieren, könnten die Phosphorylierung von TFIIH inhibieren – ein Schritt, der zu einer erhöhten Transkriptionsrate führen würde. Analog dazu könnten Repressoren diese Phoshorylierung steigern – mit dem Effekt einer verringerten Transkription. Nachdem die RNA-Polymerase mit der Polymerisation begonnen und den Transkriptionsstartpunkt verlassen hat, verbleiben der Mediator neben TFIID, TFIIA, TFIIE und TFIIH am Transkriptionsstartpunkt. Als Integrationskomplex für viele Transkriptionsfaktoren bildet der Mediator damit eine ideale Oberfläche für die Reassemblierung des PIC und damit für die Organisation der Re-Initiation (Roeder 2005).

1.6.3.2 Chromatin-Modifikationskomplexe Ein Mechanismus der Transaktivatoren und auch der Transrepressoren wirkt auf den am Transkriptionsstart lokalisierten Mediatorkomplex. Eine andere Möglichkeit der Transkriptionskontrolle ist die Veränderung der Chromatinstruktur in der Nähe eines Promotors. Durch die Auflockerung des Chromatins, wie es durch die Acetylierung der Histonschwänze geschieht, ist die DNA für DNA-bindende Proteine zugänglich. Eine besser zugängliche Promotorregion bedeutet automatisch eine erhöhte Bindung der für den Aufbau des PIC nötigen Proteine und damit eine erhöhte Transkriptionsrate. Umgekehrt verursacht eine Deacetylierung und in den meisten Fällen eine Methylierung der Histonschwänze ein kompaktes Chromatin und damit eine Reduktion der Transkriptionsrate (Peterson u. Laniel 2004). Die aktivierend oder reprimierend wirkenden Transkriptionsfaktoren besitzen allerdings selbst nicht das Vermögen, das Chromatin zu modifizieren. Dazu bedarf es enzymatischer Funktionen wie der Acetyltransferase, Deacetylase oder Methyltransferase. Diese Enzymaktivitäten sind in größeren, sog. Chromatin-Modifikationskomplexen integriert, die, je nach Funktion, Koaktivator-

130

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

oder Korepressorkomplex genannt werden und die an die DNA-gebundenen Transkriptionsfaktoren binden (> Abb. 1.6.5). Der erste Koaktivatorkomplex, der Mitte der 1990er Jahre entdeckt wurde, besteht u. a. aus einem Adapterprotein, das mit einem DNA-gebundenen Aktivator interagieren kann. Es gibt drei sehr verwandte Adapterproteine, die nach ihrem Molekulargewicht p160 genannt werden. Diese rekrutieren ein Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 300 KDa, entweder CBP oder das nah verwandte p300, und dieses wiederum bindet das Protein P/CAF. CBP, p300 als auch P/CAF besitzen die enzymatische Funktion der Histonacetyltransferase, d. h., sie sorgen durch die Acetylierung der Histonschwänze für eine Auflockerung des Chromatins und damit eine gesteigerte Transkriptionsrate. Neben den beiden Histonacetyltransferasen wird durch das p160Protein auch das Enzym CARM 1 gebunden. CARM 1 ist eine Argininmethyltransferase, die spezifische Arginine des N-terminalen Endes von Histon H3 methyliert. Diese Methylierungen führen zu einer gesteigerten Transkription (7 1.6.2). Neben den DNA-bindenden aktivierenden Regulationsfaktoren gibt es auch Repressoren. Ähnlich dem oben genannten Koaktivatorkomplex bindet ein Adapterprotein an den DNA-bindenden Faktor. Dieser Adapter interagiert wiederum mit Proteinen, die mit Histonen interagieren sowie mit dem Enzym HDAC (Histondeacetylase). Dieses Enzym ist für die Deacetylierung von Histonenden verantwortlich, die zu einem kompakteren Chromatin und damit zu einer Verringerung der Transkriptionsrate führt (Silverstein u. Ekwall 2005). Ein wichtiger Korepressor ist der Mi-2/NuRD-Komplex („nucleosome Remodeling and histone deacetylase“), der aus etwa 7 Untereinheiten besteht. Eine dieser Untereinheiten, das Protein MBD2, bindet an methylierte CpGs (7 1.6.2). Solche methylierten Nukleotide findet man im Genom im Bereich von Heterochromatin und auch in anderen Abschnitten mit geringer Transkription. Der Mi-2/NuRD-Komplex lagert sich an diese methylierten CpGs an und deacetyliert durch die KomplexUntereinheiten HDAC1 und HDAC2. Dies führt ebenso zu einem kompakten Chromatin im Bereich von methylierter DNA (Bowen et al. 2004).

1.6.3.3 Chromatin-Remodeling-Komplexe Viele Transkriptionsfaktoren sind nicht in der Lage, DNA zu binden, wenn die DNA-Sequenz im Nukleosom um ein Histon-Oktamer gewunden ist. Dies bedeutet, dass ein stark mit Nukleosomen besetzter Promotor für Transkriptionsfaktoren schlecht zugänglich ist und die

Transkriptionsrate dementsprechend niedrig ist. Die Chromatin-Modifikationskomplexe sind in der Lage, Chromatin strukturell zu verändern. Dies führt einerseits zu Oberflächen, die von Proteinen mit Chromooder Bromodomänen gebunden werden können (s. u.), andererseits werden die positiven Ladungen der Histonschwänze durch die Modifikationen verringert, was zu einer geringeren Affinität der Histone zu der negativ geladenen DNA führt. Solche Nukleosomen, die verstärkt acetyliert sind, können daher leichter in ihrer Position verändert werden. Die Chromatin-Modifikationskomplexe sind dazu allerdings nicht in der Lage. Für diesen Prozess, den man Chromatin-Remodeling nennt, gibt es spezielle „Maschinen“, die Nukleosomen entlang der DNA bewegen können. Die Energie, die für diesen Prozess notwendig ist, wird aus der Hydrolyse von ATP gewonnen. Je nach ATPase, die zu einem Chromatin-Remodeling-Komplex gehört, unterscheidet man unterschiedliche Komplexe. Der bereits angesprochene NuRD-Komplex besitzt mit Mi-2 eine ATPase vom sog. Chd1-Typ. Komplexe mit dieser Art von ATPase besitzen Komponenten, die mittels Chromodomänen in der Lage sind, methylierte Histone zu binden. Außerdem besitzen sie zusätzlich HDAC-Untereinheiten, die Chromatin deacetylieren. Chromatin-Remodeling-Komplexe mit der ATPase-Komponente vom Typ ISWI zeichnen sich dadurch aus, dass sie Nukleosomen zusammensetzen können oder die gegebene Struktur des Chromatins stabilisieren können (Lusser u. Kadonaga 2003). Der am besten studierte ChromatinRemodeling-Komplex ist der Swi/Snf-Komplex, der zunächst in Hefe entdeckt und charakterisiert wurde. Dieser Komplex besitzt eine ATPase vom Typ SNF2. Die Komplexe dieses Typus besitzen Untereinheiten mit Bromodomänen, die acetylierte Proteine binden können. Wie auch beim Mediator wurde der Swi/Snf-Komplex redundant bei zwei unabhängigen Screens entdeckt. In einer Untersuchung wurden Mutanten isoliert, die einen Defekt im „Mating-type Switching“ besaßen (SWI), im anderen Ansatz wurden Gendefekte im Sucrosestoffwechsel untersucht („sucrose non-fermenting“, SNF). Der Komplex besteht aus ungefähr 12 Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von ca. 2 MDa. Der Komplex gliedert sich in einen nichtvariablen Kernkomplex sowie variable Komponenten. Die variablen Komponenten sind dafür verantwortlich, dass der Swi/SnfKomplex sowohl zu transkriptioneller Aktivierung als auch zu Repression führen kann. Eine ATPase-Aktivität vom SNF2 Typ besitzen in Wirbeltieren die nah verwandten Komponenten BRM und BRG1, jedoch befindet sich immer nur eines der beiden Proteine in einem Swi/Snf-Komplex (Roberts u. Orkin 2004). Die Anwesenheit eines dieser ATP-hydrolysierenden Proteine ist essenziell für den funktionellen Komplex, da durch die-

131 1.6 · Regulationsmechanismen der Transkription in Eukaryonten

sen Prozess die Energie für das Verschieben der Nukleosomen gewonnen wird. Interessanterweise sind die Komponenten, die ATP hydrolysieren, auch unabhängig von anderen Untereinheiten in der Lage, Nukleosomen zu verschieben. Was ist dann aber die Funktion der Nicht-ATPase-Untereinheiten im Swi/Snf-Komplex? Grundsätzlich gibt es zwei bekannte Funktionen. Die Nicht-ATPase-Untereinheiten sind in der Lage, die Chromatin-Remodeling-Funktion der ATPase-Komponenten zu regulieren. So ist bekannt, dass andere Swi/ Snf-Untereinheiten beide Swi/Snf-ATPasen BRM und BRG1 in ihrer Chromatin-Remodeling-Funktion verstärken. Die zweite Aufgabe besteht in der Interaktion mit Transkriptionsfaktoren, die an die DNA gebunden haben. Durch solche Protein-Protein-Interaktionen wird der Swi/Snf-Komplex an Promotorbereiche indirekt assoziiert und kann dort lokal Einfluss auf das Chromatin nehmen (> Abb. 1.6.5). Wie geschieht eigentlich Chromatin-Remodeling? Am deutlichsten werden die Mechanismen, wenn man die Wirkung der SNF2-ATPasen, die zur Auflockerung des Chromatins führen, mit denen der ISWI-ATPasen vergleicht, die in der Regel eine bestehende Chromatinorganisation stabilisieren. An Mononukleosomen wurde gezeigt, dass SNF2-Komplexe die Interaktion zwischen Histonen und DNA unterbrechen können; ISWI-Komplexe waren dazu in parallelen Ansätzen nicht in der Lage. Im Gegensatz zu ISWI-Komplexen können SNF2Komplexe Histone von einem DNA-Template auf ein zweites übertragen, hingegen können beide Komplexe die Bewegung von Nukleosomen entlang der DNA katalysieren. Während SNF2-Komplexe das Auseinanderbauen von Nukleosomen fördert, katalysiert der ISWIKomplex den Zusammenbau von Nukleosomen. Diese Wirkungen machen deutlich, wie diese „Maschinen“ auf die Chromatinstruktur Einfluss nehmen können, und wie verschiedene Chromatin-Remodeling-Komplexe antagonistische Funktionen übernehmen (Lusser u. Kadonaga 2003).

1.6.4 Regulation durch nichtkodierende RNA Neben der Regulationskontrolle der Transkription wurde in den letzten Jahren ein wichtiger Mechanismus der posttranskriptionellen Regulation („post-transcriptional gene silencing“, PTGS, oder RNA-Interferenz, RNAi) entdeckt (Mendes Soares u. Valcarcel 2006). Die Basis dieses Regulationsmechanismus besteht in doppelsträngiger RNA, die durch eine RNAse mit dem Namen Dicer in kurze, 21 Nukleotide lange RNA-Abschnitte zerlegt wird. Diese kurze RNA, die auch als „short interfering RNA“ (siRNA) bezeichnet wird, wird von einem Enzym-

1.6

komplex RISC (RNA „induced silencing complex“) aufgenommen. Mit Hilfe der siRNA kann der RISC-Komplex an mRNA-Sequenzen binden, die komplementäre Sequenzen zur siRNA enthält. RISC schneidet die mRNA an der Bindestelle und führt somit zu einem sequenzspezifischen mRNA-Abbau. Man nimmt an, dass sich dieser Mechanismus als eine Schutzfunktion gegen doppelsträngige RNA-Viren entwickelt hat. Darüber hinaus scheint der molekulare Mechanismus des posttranskriptionellen Silencing auch auf der Transkriptionsebene zu einer Repression zu führen. Hier handelt es sich um die Abschaltung von Heterochromatin. Das konstitutive Heterochromatin, das aus wiederholten DNA-Sequenzen besteht, wird durch bidirektionale Transkription in RNA-Abschnitte übersetzt, die eine doppelsträngige Konformation einnehmen können. Doppelsträngige RNA dient dann wieder als Substrat für den Dicer, was wiederum zur RNA-Spaltung und zum Einbau in RISC-Komplexe führt. Da die gebildete RNA von repetitiver DNA stammt, wird sie auch als „repeat associated siRNA“ bezeichnet (rasiRNA). Die RISC-ähnlichen Komplexe, die rasiRNA aufnehmen, werden als RITS-Komplexe (RNA „induced transkriptional silencing“) bezeichnet, da sie zu einer Transkriptionsrepression führen. Über noch unbekannte Mechanismen ist RITS in der Lage, das transkribierte Heterochromatin sowohl über DNA-Methylierung als auch über Histonmethylierung abzuschalten. Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Mechanismen, die durch siRNA und rasiRNA vermittelt werden und durch perfekt gepaarte doppelsträngige RNA charakterisiert sind, wird eine andere Klasse regulatorischer RNA, die sog. MicroRNA (miRNA), von einzelsträngigen RNA-Vorläufermolekülen gebildet. Durch Zurückfaltung auf interne komplementäre Bereiche wird auch eine doppelsträngige RNA erzeugt, dennoch handelt es sich hier um nicht perfekt gepaarte Moleküle. Auch diese werden durch Dicer und RISC prozessiert, bzw. an MessengerRNA-Sequenzen gebunden. Diese Bindung führt nicht zu einer RNA-Spaltung, sondern es wird die Translation dieser mRNA-Moleküle blockiert. Die Zielsequenzen für die paarende miRNA liegen im 3c-Bereich und unterhalb des translatierten Bereiches der mRNAs. Der Mechanismus der Translationsblockade ist noch unbekannt. Wo kommen die miRNA-Vorläufermoleküle her? Im Gegensatz zu siRNA und rasiRNA, deren Herkunft entweder exogen (doppelsträngige RNA-Viren) oder von transkribierten Heterochromatinbereichen stammen, gibt es für die miRNAs ganz spezifische Gene. Man geht davon aus, dass einzelne miRNA-Moleküle mehrere verschiedene mRNAs in der Translation blockieren können, da die Bindung der miRNA an die mRNA unterschiedliche Fehlpaarungen erlaubt. Es gibt eine zunehmende Anzahl von Experimenten, die zei-

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

gen, dass miRNAs in der Entwicklung und Differenzierung eine wichtige Rolle spielen und dass sie bei einer Fehlregulation auch zur Entstehung menschlicher Tumore beitragen. Nur ca. 2% der Sequenzen des menschlichen Genoms findet man in Form von mRNA-Molekülen vertreten. Dennoch führen aktuelle Untersuchungen mit immer sensitiveren Methoden und genomweiten Suchen zu dem Befund, dass der größte Teil des Genoms transkribiert wird. Eine große Klasse synthetisierter RNAs, die nicht zur Gruppe der mRNAs gerechnet werden können, sind nichtkodierende RNAs. Hiermit beschreibt man RNA-Sequenzen, die von spezifischen Genen abgelesen werden, ohne jedoch für ein Protein zu kodieren. Diesen ncRNAs konnte man bisher in den meisten Fällen noch keine Funktion zuordnen. Nur in wenigen Ausnahmen konnte ein Funktionsbereich gefunden werden. Zu diesen Fällen gehört die XistRNA, die für die Abschaltung des zweiten X-Chromosoms bei weiblichen Säugern zuständig ist. Auch im Bereich der Gengruppen, die ein Imprinting aufweisen (7 1.6.5), befinden sich Gene, die zwar eine RNA produzieren, nicht aber für ein Protein kodieren können.

leküle, virale Infektion, oxidativer Stress und verschiedene Zytokine. Diese Zytokine, wie z. B. Interleukin-1, binden an Rezeptortyrosinkinasen an der Oberfläche von Zellen, die eine Kaskade von Signalen im Zytoplasma initiieren (Johnson u. Lapadat 2002). Ein Zielort der Signalkaskade ist ein Inhibitormolekül (INB), welches die Translokation von NFNB in den Kern verhindert. Erst durch die Aktivierung der Signalkaskade wird INB phosphoryliert und ermöglicht NFNB, in den Zellkern einzuwandern (> Abb. 1.6.9). Dort findet dieser Regulationsfaktor seine spezifischen Bindestellen auf der DNA im Bereich von Promotoren oder von Enhancer-Sequenzen. Dadurch werden benachbarte Gene aktiviert, und es kommt zur Transkription. Daher ist es nicht verwunderlich, dass eine abnormale Aktivierung von NFNB eine zentrale Rolle in vielen Entzündungsprozessen, wie z. B. Asthma und rheumatoider Arthritis spielt. Darüber hinaus kann die konstitutive Aktivität von NFNB zur Zellproliferation und zur Hemmung von Apoptose führen. Somit spielt NFNB auch eine wichtige Rolle in der Entwicklung verschiedener Tumore, wie z. B. Leukämien, Karzinomen und Adenokarzinomen.

1.6.5 Regulationsmodelle mit klinischer Relevanz

1.6.5.2 Fos/Jun

Die exakte Genregulation ist eine Voraussetzung für geregelte Zelldifferenzierung und Zellproliferation, für die Entwicklung mehrzelliger Organismen sowie für den Stoffwechsel. Daher stellt die zeitliche und räumliche Kontrolle der Genregulation eine der wichtigsten fundamentalen Prozesse in der Biologie und Medizin dar. Inzwischen kennt man viele Beispiele für eine Fehlregulation der Genaktivität im Zusammenhang mit pathologischen Situationen. Daher ist das Verständnis der Transkriptionsmechanismen und der Regulationsmechanismen von hoher klinischer Bedeutung. Der jeweils aktuelle Stand der Informationen zu einzelnen Genen ist auf der Datenbank des Weizmann-Instituts gespeichert (http://www.genecards.org/). Einige wenige Beispiele für Regulationsmechanismen mit klinischer Relevanz sind hier zusammengefasst.

1.6.5.1 NFκB NFNB ist ein DNA-bindender Transkriptionsfaktor, der aus zwei Proteinen der Rel-Familie gebildet wird. NFNB stellt einen wichtigen Regulator in der Abwehr von Infektionskrankheiten und zellulärem Stress dar (Luo et al. 2005). Die Aktivierung von NFNB erfolgt durch eine Vielzahl verschiedener Signale, wie z. B. bakterielle Mo-

Die Fos- und Jun-Proteine sind Mitglieder der Transkriptionsfaktoren der Klasse bZIP („basic zipper“) (Hess et al. 2004). Diese „basic zipper“-Transkriptionsfaktoren können über die basische Domäne an die DNA binden und über die Zipper-Domäne eine Homo- oder Heterodimerisierung durchführen. Fos und Jun wurden ursprünglich als die beiden Untereinheiten des Transkriptionsfaktors AP-1 identifiziert. Sie regulieren die Expression einer Vielzahl von Genen, die in Differenzierung, Apoptose und Zellproliferation eingreifen. Die Regulation von Fos und Jun erfolgt über ein großes Spektrum physiologischer und pathologischer Stimuli, wie Zytokine, Wachstumsfaktoren, Stresssignale und Infektionen. Regulationsmechanismen beruhen sowohl auf der Bereitstellung unterschiedlicher Mengen der verschiedenen Fos- und Jun-Mitglieder, als auch auf der Ebene der Proteinmodifikation durch Phosphorylierung (> Abb. 1.6.9). Diese Phosphorylierungen können über verschiedene Kinasen erfolgen, u. a. innerhalb von Signaltransduktionskaskaden, die über zellmembrangebundene Rezeptortyrosinkinasen gestartet werden (Johnson u. Lapadat 2002; Karin u. Hunter 1995). Die Tatsache, dass Fos und Jun als zelluläre homologe Gene der retroviralen Onkoproteine (v-Fos und v-Jun) entdeckt wurden, zeigt schon deutlich, dass die Fehlfunktion beider Proteine eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung spielt.

133 1.6 · Regulationsmechanismen der Transkription in Eukaryonten

1.6

. Abb. 1.6.9. Exemplarische Darstellung von drei Regulationskaskaden mit klinischer Relevanz. Steroidhormone binden zytoplasmatische Rezeptoren, die nach Dimerisierung in den Zellkern einwandern und an spezifische DNA-Sequenzen binden. Dieser Typ von Rezeptor wandert also direkt in den Kern ein und reguliert dort benachbarte Gene. Daher werden diese Rezeptoren auch als Kernrezeptoren bezeichnet. Zytokine, wie z. B. Interleukin-I (Il-I) binden an Interleukinrezeptoren (Il-IR) und können eine Signalkaskade auslösen. Ein Zielmolekül dieser Signalkaskaden ist der Inhibitor IκB, der

phosphoryliert wird (gelber Kreis) und sich von den NFκB-Untereinheiten ablöst. NFκB kann nun in den Zellkern einwandern und an spezifische Regulatorsequenzen binden. Andere Wachstumsfaktoren oder Zytokine binden an ihre spezifischen Rezeptoren, die eigene Signalkaskaden in den Zellkern hineinleiten. Zielmoleküle können u. a. die Transkriptionsfaktoren Fos und Jun sein, die durch die Phosphorylierung zur Dimerisierung und DNA-Bindung geführt werden. Fos und Jun, auch bekannt als Transkriptionsfaktor Ap1, sind in der Lage, benachbarte Gene zu aktivieren

1.6.5.3 Kernrezeptoren

rung der Transkriptionsrate. Die Rezeptoren des anderen Typs sind bereits in der Abwesenheit ihres Hormons an ihre Erkennungssequenzen gebunden. Die meisten Rezeptoren dieser großen Proteinfamilie binden als Heterodimer mit einem gemeinsamen Heterodimerisierungspartner an die DNA. Dieser Partner ist der Rezeptor für 9-cis Retinsäure (RXR). In Abwesenheit des spezifischen Hormons assoziieren diese Rezeptoren mit Korepressorkomplexen und vermitteln dadurch die Repression der Transkription (Privalsky 2004). Nach der Bindung des Hormons verlieren die Rezeptoren durch eine Konformationsänderung die Affinität zu den Korepressorkomplexen und binden stattdessen Koaktivatorkomplexe, die für eine Steigerung der Transkriptionsrate sorgen (Perissi u. Rosenfeld 2005). Die Kern-Hormonrezeptoren übersetzen ein Hormonsignal also ohne die Vermittlung einer Signalkaskade direkt in eine geänderte Transkription. Die direkten physiologischen Wirkungen jedes einzelnen Rezeptors sind unglaublich vielfältig und aus diesem Grund noch nicht vollständig erforscht. Exemplarisch seien hier einige Funktionen einiger Rezeptoren erwähnt: Der Östrogenrezeptor führt zur Ausbildung der weiblichen Geschlechtsorgane, der Entwicklung des Gehirns, kardiovaskulärer Funktion, Regulation des Knochenstoffwechsels sowie zur Induktion des Epiphysenschlusses. Der Cortisonrezeptor führt zur Aktivierung der Glukoneogenese, der anabolen Funktion in der

Kern-Hormonrezeptoren sind Transkriptionsfaktoren, die durch Hormone gesteuert werden, deren lipophile Struktur es erlaubt, dass Zell- und Kernmembranen passiert werden. Die Kernrezeptoren sind daher im Gegensatz zu Rezeptoren von Wachstumsfaktoren, für die die Zellmembran undurchdringlich ist, nicht als Transmembranrezeptoren in der Zellmembran lokalisiert, sondern im Zytoplasma oder im Kern. Man unterscheidet zwei Gruppen von nukleären Hormonrezeptoren (Gronemeyer et al. 2004). Die relativ kleine Gruppe der Steroidrezeptoren, die Rezeptoren für Östrogen, Progesteron, Testosteron, Cortison und Aldosteron sind, und eine Familie von etwa 50 Rezeptoren, die neben dem Thyroidhormon hauptsächlich Nahrungsmittelkomponenten bzw. Metabolite von Nahrungsmitteln bindet. Diese Stoffe wie Retinsäure, Vitamin D3, Gallensäure oder oxidierte Cholesterole wirken im Körper als Hormone. In der Abwesenheit von Hormonen sind die Steroidrezeptoren überwiegend im Zytoplasma lokalisiert. Dort sind sie mit Heat-shock-Proteinen assoziiert. Nach Bindung des Hormons löst sich der Rezeptor aus diesem Komplex, dimerisiert mit einem Rezeptor gleichen Typs, wandert in den Kern und bindet an spezifische Erkennungssequenzen auf der DNA (> Abb. 1.6.9). Dort binden Koaktivatorkomplexe an das Rezeptor-Homodimer und vermitteln die Steige-

134

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

Leber, der katabolen Funktion in Muskel- und Fettgewebe und hat vielfältige Einflüsse auf Entzündungsprozesse, u. a. durch Reduktion von T-Zellen. Der Thyroidhormonrezeptor ermöglicht die Steuerung des Grundumsatzes, der Gehirnentwicklung (Kretinismus), des Liver-X-Rezeptor-(LXR-)HDL-Transports aus den Zellen, die Steigerung des Cholesterinabbaus in der Leber sowie die Differenzierung von Fettgewebe (Glass 2006). Fehlfunktionen der Kern-Hormonrezeptoren können zu den unterschiedlichsten Krankheiten im Bereich der Stoffwechselkontrolle, der Reproduktion und des Zellwachstums führen. Hierzu zählen Tumorereignisse, Fertilitätsstörungen sowie Diabetes und Obesitas. Daher stellen auch die Kernrezeptoren eine sehr große Zielgruppe für die Entwicklung neuer Pharmazeutika dar (Gronemeyer et al. 2004). Die ligandenabhängige An- oder Abschaltung bestimmter Gene konnte genutzt werden, um die detaillierten Vorgänge im Promotorbereich zu untersuchen. Ein erstaunliches Ergebnis war, dass die Bindung von Regulationsfaktoren und weiterer Regulatorkomplexe (Remodeling-Komplexe, Modifikationskomplexe, Mediatorenkomplexe, 7 1.6.3) nicht einmalig und statisch an den Promotor erfolgt, sondern vielmehr, dass sequenzielle Bindungen und Modifikationen zu beobachten sind. So werden in den ersten Stunden der Genanschaltung verschiedene, alternierende Aktivierungsund Repressionszyklen durchlaufen (Metivier et al. 2006).

1.6.5.4 HOX-Gene Homeobox- (Hox-)Gene wurden bei Drosophila aufgrund auffälliger Phänotypen im Falle einer Mutation entdeckt. Die Phänotypen zeigten eindeutig, dass die Gene nicht für Strukturproteine kodieren, sondern vielmehr Regulationsfaktoren bilden, die die Identität einzelner Segmente festlegen. Bei einer Mutation führt das dazu, dass einzelne Segmente eine falsche Identität aufweisen. Diesen Regulationsfaktoren ist gemeinsam, dass sie mittels einer bestimmten DNA-Bindedomäne (der Homeobox) an DNA-Sequenzen binden können. Die Homeobox-Gene sind in ihrer Struktur und in ihrer Funktion bei allen tierischen Lebewesen hoch konserviert. Die HOX-Gene des Menschen umfassen 39 Mitglieder, die in vier Gruppen im Genom vorliegen. Fehlregulationen der HOX-Gene beim Menschen können zu Entwicklungsstörungen führen, besonders bei der Ausbildung der Extremitäten. Darüber hinaus wurden veränderte HOX-Gene im Zusammenhang mit akuter myeloischer Leukämie gefunden (Lappin et al. 2006).

1.6.5.5 Imprinting Der englische Begriff „Imprinting“ beschreibt eine genomische Prägung, die darin besteht, dass väterliche und mütterliche Allele unterschiedlich exprimiert werden. Dieser Unterschied ist unabhängig von der Nukleotidsequenz, da selbst bei völlig gleichen Sequenzen die elterlichen Allele verschieden exprimiert werden. Solch ein Phänomen wird auch allgemein als Epigenetik beschrieben. Die große Bedeutung des Imprinting wird im Falle von Fehlverteilungen von Chromosomen deutlich. Die sog. uniparentale Disomie (UPD) beschreibt eine Situation, in der eines der Chromosomen in einem homologen Chromosomenpaar verloren gegangen ist und durch eine Verdopplung des verbliebenen Chromosoms ersetzt wurde. Hier liegen also zwei völlig identische Chromosomen vor, die beide entweder ursprünglich von der Mutter oder vom Vater stammten. Liegt z. B. eine mütterliche UPD des Chromosoms 15 vor, so ist das die Ursache für das Auftreten des sog. Prader-Willi-Syndroms (Robertson 2005). Dieses Syndrom ist durch mentale Retardierung und Obesitas gekennzeichnet. Tritt jedoch eine UPD des ursprünglich väterlichen Chromosoms 15 auf, so entwickelt sich das Angelman-Syndrom. Dieses verursacht erhebliche mentale Retardierung und viele andere pathologische Merkmale. In beiden Fällen liegt die vollständige Anzahl aller diploiden Gene vor. Dennoch zeigen diese uniparentalen Disomien, dass offensichtlich einige der Gene der Mutter, bzw. einige der Gene des Vaters auf dem Chromosom 15 nicht exprimiert sind. Der molekulare Mechanismus des Abschaltens eines der beiden elterlichen Allele erfolgt in der Regel über DNA-Methylierung (7 1.6.2). So führt nicht nur eine UPD zu pathologischen Situationen, sondern auch ein „loss-of-imprinting“ (LOI) kann zu ähnlichen Phänotypen führen. Die Ursache für LOI ist in der Regel der Verlust der DNA-Methylierung an bestimmten Genen. Viele der Gene, die eine genomische Prägung aufweisen, spielen eine Rolle im Wachstum und der Zellproliferation. Daher ist es nicht verwunderlich, dass LOI-Situationen auch in Verbindung mit Tumorereignissen gefunden wurden. Man kennt ca. 80 Gene, die ein elterliches Imprint aufweisen. Diese Gene sind häufig in Gruppen organisiert, wobei jeweils mütterlich und väterlich geprägte Gene in diesen Gruppen gemischt vorliegen. Exemplarisch wird das am chromosomalen Locus 11p15.5 verdeutlicht, der im Falle einer paternalen UPD oder eines LOI zum Beckwith-Wiedemann-Syndrom mit überhöhtem Geburtsgewicht, erhöhter embryonaler Tumorrate und vielen anderen Merkmalen führt (Robertson 2005) (> Abb. 1.6.10). Ein weiteres auffälliges, aber für solche Regionen typisches Merkmal ist darin zu sehen, dass eine große Anzahl der Gene mit einem Imprint nicht für ein Protein kodieren, sondern

135 1.6 · Regulationsmechanismen der Transkription in Eukaryonten

1.6

. Abb. 1.6.10. Chromosomale Region 11p15.5 mit pathologischen Imprinting-Defekten. Eine Gruppe von 15 Genen ist in Form von Pfeilen dargestellt, die die Transkriptionsrichtung anzeigen. Aktive Gene (grün) und inaktive Gene (rot) sind sowohl auf dem väterlichen Chromosom (oben), als auch auf dem mütterlichen Chromosom (unten) angegeben. Wichtige Regionen mit methylierten CpG-Sequenzen (rote Kreise) bzw. unmethylierten CpG-Sequenzen (weiße Kreise) zeigen die differenzielle Methylierung beider elterlicher Chromosomen. Der Faktor CTCF kann nur an die unmethylierten DNA-Sequenzen

binden und führt zu einer Abschaltung von Genen durch die Blockade benachbarter Enhancer-Sequenzen. Interessanterweise enthält das Gen KCNQ1 ein Antisense-Transkript (KNCQ1OT1). Dieses Antisense-Transkript scheint nicht für ein Protein zu kodieren. Auch das Gen H19 bildet eine nichtkodierende RNA. Sowohl Tumorereignisse als auch das Beckwith-Wiedemann-Syndrom werden durch Mutationen und Translokationen in dieser Region, durch uniparentale Disomie, sowie durch Loss-of-Imprinting verursacht

eine nichtkodierende RNA produzieren (7 auch 1.6.4). Die molekulare Wirkungsweise dieser nichtkodierenden RNA ist noch unbekannt. Die allelspezifische DNA-Methylierung ist Ursache für die jeweilige An- oder Abschaltung von Genen. Am Locus 11p15.5 war gezeigt worden, dass ein DNA-bindender Faktor, CTCF, an spezifische Sequenzen bindet und für die Abschaltung einiger Gene sorgt (Ohlsson et al. 2001). Der Mechanismus beruht auf der Blockade der Enhancer-Wirkung auf diese Gene (7 1.6.1.5). Im Falle der DNA-Methylierung kann CTCF nicht binden und ermöglicht so die Anschaltung der Gene.

eine bestimmte Gengruppe falsch reguliert erscheint, wird man Regulationsmechanismen nur dann aufklären können, wenn gezeigt wurde, an welcher Stelle der Regulationskontrolle ein Defekt vorliegt. So wird die Zukunft der Analyse von Regulationsvorgängen sicherlich in einer Kombination der funktionellen Untersuchung einzelner Gene, der funktionellen Genomik aller Gene und der Bioinformatik bestehen.

1.6.6 Ausblick Die Sequenzierung des menschlichen Genoms hat zur Identifizierung aller proteinkodierenden Gene geführt. Der Nachweis möglicher zusätzlicher, nichtkodierender Gene, die RNA-Produkte mit regulatorischen Funktionen produzieren, ist sicherlich eine wichtige Herausforderung der Bioinformatik. Jedoch wird die Bioinformatik nie alleine in der Lage sein, weder die Funktion der proteinkodierenden noch der nichtkodierenden RNA-Gene vorherzusagen. Vielmehr zeigt sich immer wieder, dass für eine immer noch sehr große Anzahl von Genen experimentelle Untersuchungen notwendig sind, um etwas über ihre Funktion zu lernen. In diesem Bereich der Zuordnung von Funktionen zu einzelnen Genen wird ein großer Anteil zukünftiger Forschungsaktivitäten liegen. Die funktionelle Genomik (7 Kap. 1.4) wird neben der potenziellen Möglichkeit zur Prognose und Therapie von Erkrankungen einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Genfunktion liefern. Allerdings wird diese Technik immer nur den Aktivitätszustand einzelner, vieler oder aller Gene beschreiben können. Wenn es jedoch darum geht herauszufinden, warum

1.6.7 Literatur Bowen NJ, Fujita N, Kajita M, Wade PA (2004) Mi-2/NuRD: multiple complexes for many purposes. Biochim Biophys Acta 1677: 52–57 Buratowski S (2005) Connections between mRNA 3c end processing and transcription termination. Curr Opin Cell Biol 17: 257–261 Cremer T, Cremer C (2001) Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nat Rev Genet 2: 292–301 Glass CK (2006) Going nuclear in metabolic and cardiovascular disease. J Clin Invest 116: 556–560 Gronemeyer H, Gustafsson JA, Laudet V (2004) Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nat Rev Drug Discov 3: 950–964 Hess J, Angel P, Schorpp-Kistner M (2004) AP-1 subunits: quarrel and harmony among siblings. J Cell Sci 117: 5965–5973 Johnson GL, Lapadat R (2002) Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases. Science 298: 1911–1912 Karin M, Hunter T (1995) Transcriptional control by protein phosphorylation: signal transmission from the cell surface to the nucleus. Curr Biol 5: 747–757 Kornblihtt AR, de la Mata M, Fededa JP, Munoz MJ, Nogues G (2004) Multiple links between transcription and splicing. RNA 10: 1489–1498 Lappin TR, Grier DG, Thompson A, Halliday HL (2006) HOX genes: seductive science, mysterious mechanisms. Ulster Med J 75: 23–31 Lewis BA, Reinberg D (2003) The mediator coactivator complex: functional and physical roles in transcriptional regulation. J Cell Sci 116: 3667–3675

136

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

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137 1.6 · Regulationsmechanismen der Transkription in Eukaryonten

1.6.8 Zeittafel 1953

Watson, Crick, Franklin und Wilkins: Aufklärung der Struktur der DNA-Doppelhelix (Watson u. Crick 1953).

1959

Weiss und Gladstone weisen die enzymatische Aktivität der RNA-Polymerase nach (Weiss u. Gladstone 1959).

1960

Jacob und Monod postulieren das Operon-Modell, das die Regulation des lac-Operon in Bakterien beschreibt (Jacob et al. 1960).

1961

Lyon findet die Erklärung für die Dosiskompensation der beiden X-Chromosomen in weiblichen Säugern im Vergleich zum einzelnen X-Chromosom in männlichen Säugern. Die Dosiskompensation beruht auf der Inaktivierung eines der beiden X-Chromosomen (Lyon 1961).

1966

Scaife und Beckwith gelingt der Nachweis einer Promotor-Region als Startstelle der Transkription (Scaife u. Beckwith 1966).

1973

Cohen, Chang, Boyer und Helling zeigen, dass DNA-Moleküle neu kombiniert und kloniert werden können (Cohen et al. 1973).

1974

Kornberg entwickelt das Konzept von Nukleosomen, die aus Histonen bestehen, um die eukaryote DNA herumgewickelt ist (Kornberg 1974).

1975

Riggs, Holliday and Pugh postulieren eine wichtige Rolle für die DNA-Methylierung in Eukaryonten, die zur Repression der Genaktivität führt (Holliday u. Pugh 1975; Riggs 1975).

1977

Gilbert und Sanger entwickeln Methoden zur Sequenzierung von DNA (Maxam u. Gilbert 1977; Sanger et al. 1977).

1978

Tjian gelingt der Nachweis von Transkriptionsfaktoren, die sequenzspezifisch an DNA binden (Tjian 1978).

1981

Schaffner identifiziert Enhancer-Elemente, die Gene regulieren können, selbst wenn sie mehrere Tausend Basenpaare oberhalb oder sogar unterhalb des Gens liegen (Banerji et al. 1981).

1984

Surani, McGrath und Solter weisen nach, dass sowohl das mütterliche, als auch das väterliche Genom für die Embryonalentwicklung notwendig sind. Sie konnten zeigen, dass die Genome beider Eltern nicht gleich sind, sondern eine genetische Prägung (Imprint) enthalten (McGrath u. Solter 1984; Surani et al. 1984).

1994

Peterson, Kingston und Green isolieren Chromatin-Remodeling-Komplexe (Cote et al. 1994; Kwon et al. 1994).

1994

Kornberg et al. beschreiben einen Mediatorkomplex (Kim et al. 1994).

1995

Brown et al. produzieren einen ersten Microarray, mit dem gleichzeitig die Aktivität vieler Gene bestimmt werden konnte (Schena et al. 1995).

1996

Allis und Schreiber zeigen, dass die Acetylierung und Deacetylierung von Histonen Gene reguliert (Mizzen et al. 1996; Taunton et al. 1996).

1998

Fire, Mello et al. zeigen, dass die durch doppelsträngige RNA verursachte RNA-Interferenz bei beliebigen Genen sequenzabhängig funktioniert (Fire et al. 1998).

1999

Die Struktur der RNA-Polymerase wird von Darst und Kornberg aufgeklärt (Fu et al. 1999; Zhang et al. 1999).

2001

Die Sequenzierung des humanen Genoms durch zwei unterschiedliche Konsortien, die von Venter und von Collins geleitet wurden, führt zur vollständigen Genomsequenz (Lander et al. 2001; Venter et al. 2001).

2006

Andrew Z. Fire (Stanford University, School of Medicine, Stanford, CA, USA) und Craig C. Mello (University of Massachusetts, Medical School, Worcester, MA, USA) erhielten für ihre bahnbrechenden Arbeiten zum spezifischen Abbau der mRNA im Jahre 2006 den Nobelpreis für Physiologie und Medizin. Mit diesem Nobelpreis wird nicht nur ihre Leistung im Rahmen der Grundlagenforschung gewürdigt, sondern auch das Potenzial der von ihnen charakterisierten Mechanismen zur möglichen zukünftigen Therapie von Patienten (Fire et al. 1998). Roger D. Kornberg (Stanford University, School of Medicine, Stanford, CA, USA) erhielt im Jahre 2006 den Nobelpreis für Chemie für seine grundlegenden Arbeiten über die Mechanismen der Transkription. Besonders die kristallographischen Aufklärungen der Struktur der DNA-abhängigen RNA-Polymerase waren ein wichtiger Durchbruch im Verständnis des Transkriptionsvorgangs (Fu et al. 1999; Zhang et al. 1999).

1.6

138

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

Literatur zur Zeittafel Banerji J, Rusconi S, Schaffner W (1981) Expression of a beta-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell 27: 299–308 Cohen SN, Chang AC, Boyer HW, Helling RB (1973) Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 70: 3240–3244 Cote J, Quinn J, Workman JL, Peterson CL (1994) Stimulation of GAL4 derivative binding to nucleosomal DNA by the yeast SWI/ SNF complex. Science 265: 53–60 Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806–811 Fu J, Gnatt AL, Bushnell DA, Jensen GJ, Thompson NE, et al (1999) Yeast RNA polymerase II at 5 A resolution. Cell 98: 799–810 Holliday R, Pugh JE (1975) DNA modification mechanisms and gene activity during development. Science 187: 226–232 Jacob F, Perrin D, Sanchez C, Monod J (1960) [Operon: a group of genes with the expression coordinated by an operator.]. C R Hebd Seances Acad Sci 250: 1727–1729 Kim YJ, Bjorklund S, Li Y, Sayre MH, Kornberg RD (1994) A multiprotein mediator of transcriptional activation and its interaction with the C-terminal repeat domain of RNA polymerase II. Cell 77: 599–608 Kornberg RD (1974) Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science 184: 868–871 Kwon H, Imbalzano AN, Khavari PA, Kingston RE, Green MR (1994) Nucleosome disruption and enhancement of activator binding by a human SW1/SNF complex. Nature 370: 477–481 Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC, et al (2001) Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409: 860–921 Lyon MF (1961) Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L.). Nature 190: 372–373

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1.7 1.7 Mechanismen der Translationskontrolle in Eukaryonten Martina U. Muckenthaler und Thomas Preiss

1.7.1

Der Ablauf der Translation

1.7.1.1 1.7.1.2 1.7.1.3 1.7.1.4

Die Translationsmaschinerie – 140 Translationsinitiation – 140 Translationselongation – 141 Translationstermination – 141

1.7.2

Globale Kontrolle der Translationsinitiation

1.7.2.1 1.7.2.2 1.7.2.3 1.7.2.4

Regulation der Initiation durch Phosphorylierung – 142 Regulation durch molekulares Mimikry – 145 Proteolyse von eIF4G – 146 Zelluläre Stresszustände regulieren die Translation – 146

1.7.3

mRNA-spezifische Translationskontrolle

1.7.3.1 1.7.3.2

5‘-UTR-vermittelte Translationskontrolle – 147 3‘-UTR-vermittelte Kontrolle der Translation – 151

1.7.4

Ausblick

– 154

1.7.5

Literatur

– 155

1.7.6

Zeittafel

– 140

– 142

– 147

– 156

Literatur zur Zeittafel

– 157

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

140

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

Das Ribosom ist eine komplexe, biologische Maschine, die den genetischen Kode der mRNA in Proteine übersetzt. Dieser mehrstufige Prozess wird Translation genannt und ist ein essenzieller Schritt in der Genexpression. Die Translation kann durch diverse, physiologische und pathophysiologische Faktoren reguliert werden. Dieses Kapitel bietet eingangs einen Überblick über den Vorgang der Translation und die daran beteiligten Komponenten. Der Schwerpunkt des Kapitels liegt jedoch auf den verschiedenen Mechanismen zur Regulation der Translation und insbesondere der Translationsinitiation.

1.7.1 Der Ablauf der Translation 1.7.1.1 Die Translationsmaschinerie In der Translation muss der Kode der aus 4 Nukleotiden (A, U, C und G) bestehenden mRNA in eine Abfolge von 20 Aminosäuren übersetzt werden. 3 Nukleotide (ein Triplett) stehen dabei für eine Aminosäure. Manche Aminosäuren wie Serin, Leucin oder Arginin werden von sechs verschiedenen Tripletts kodiert; für Tryptophan oder Methionin gibt es nur ein Triplett. Die Translation beginnt in der Regel an einem für Methionin kodierenden AUGTriplett, dem sog. Startkodon. Die Tripletts UAG, UAA und UGA sind, von bestimmten Ausnahmen abgesehen, die Stoppsignale der Translation. Für die Übersetzung eines Nukleotidtripletts in eine Aminosäure bedarf es eines Adaptermoleküls, der Transfer-RNA (tRNA). Dabei handelt es sich um 75–80 Nukleotide lange RNA-Moleküle, die eine kleeblattähnliche Sekundärstruktur ausbilden. Mit dem sogenannten Antikodon-Arm erkennt die tRNA über Basenpaarung den genetischen Kode der mRNA. Am Aminoacyl-Arm der tRNA ist die entsprechende Aminosäure kovalent gekoppelt. Für jede tRNA gibt es ein spezifisches Enzym, welches diese mit einer Aminosäure belädt. Für den mechanischen Rahmen der Translation, das Ablesen der mRNA und die Bildung von Peptidbindungen sind die Ribosomen zuständig. Eukaryote zytoplasmatische Ribosomen bestehen aus über 80 ribosomalen Proteinen und vier verschiedenen ribosomalen RNA-Molekülen (rRNA). Unterscheiden lassen sich zwei Untereinheiten, die 40S- und die 60S-Untereinheit (die Einheit „S“ steht für Svedberg und ist ein Maß für das Sedimentationsverhalten bei Gradientenzentrifugationen). Meist werden mRNAs von mehreren Ribosomen gleichzeitig translatiert, man spricht dann von Polysomen. Die Translation wird generell in 3 Phasen eingeteilt: 1. die Initiation, 2. die Elongation und 3. die Termination (Sonenberg et al. 2000).

Jede Phase benötigt sowohl eine Reihe an spezifischen Proteinen, als auch ATP bzw. GTP als Energieträger.

1.7.1.2 Translationsinitiation Unter der Translationsinitiation versteht man Vorgänge, die dazu führen, dass die 40S- und 60S-ribosomalen Untereinheiten nahe dem 5c-Ende der mRNA zusammengeführt werden, sodass die Proteinsynthese am Startkodon, in den meisten Fällen dem ersten AUG-Triplett, beginnen kann. Während in Bakterien die kleine ribosomale Untereinheit über Basenpaarung der 16S-rRNA mit der komplementären Shine-Dalgarno-Sequenz in der Nähe des AUG direkt an die mRNA binden kann, wird in eukaryoten Zellen die kleine ribosomale Untereinheit mithilfe mehrerer Translationsinitiationsfaktoren an die mRNA rekrutiert. Vereinfachend kann man die Initiation an einer typischen mRNA in drei Abschnitte unterteilen (> Abb. 1.7.1): 1. die Bindung der 40S-ribosomalen Untereinheit und damit assoziierter Faktoren nahe des 5c-Endes der mRNA; 2. ein „Scanning“ dieses Präinitiationskomplexes entlang der mRNA; 3. Erkennen des Startkodons und Anlagerung der 60S-Untereinheit zur Bildung des 80S-Ribosoms. Die Bindung der 40S-Untereinheit wird entscheidend durch die beiden, im Nukleus angefügten, posttranskriptionellen Modifikationen an den Enden der mRNA – die Cap-Struktur (m7GpppN) und den Poly(A)-Schwanz – beeinflusst (Preiss u. Hentze 2003; Sachs u. Varani 2000; Sonenberg et al. 2000). Der eukaryote Initiationsfaktor (eIF) 4F bindet an die Cap-Struktur der mRNA. eIF4F besteht aus dem Cap-bindenden Protein eIF4E, welches die interagierenden Proteine eIF4G und eIF4A an das 5c-Ende der mRNA bringt. eIF4A ist eine ATP-abhängige Helikase und kann, stimuliert durch den Translationsfaktor eIF4B, Sekundärstrukturen in der Cap-nahen Region der mRNA auflösen. eIF4G ist ein multifunktioneller Adapter, der verschiedene Komponenten des Translationsinitiationsapparats zusammenführt. eIF4G bindet weiterhin an das Poly(A)-bindende Protein (PABP). Die daraus folgende Zirkularisierung ist bedeutsam für die effiziente mRNA-Translation. eIF4G kann auch an eIF3 binden und so die 40S-Untereinheit an die mRNA rekrutieren. Die 40S-Untereinheit bindet in Form des sog. 43S-Präinitiationskomplexes an die mRNA, der weiterhin auch eIF3 und den ternären Komplex enthält. Der ternäre Komplex besteht aus der beladenen Initiator-Methionyl-tRNA (Met-tRNAiMet), eIF2 und GTP. Ein gängiges Modell der Translationsinitiation besagt, dass sich dann der 43S-Komplex in 3c-Richtung an

141 1.7 · Mechanismen der Translationskontrolle in Eukaryonten

1.7

einheit an. Das 80S-Ribosom ist jetzt bereit für die erste Peptidbindung. Die Proteinsynthese beginnt meist (zu etwa 95%) am ersten Initiationskodon nach der CapStruktur.

1.7.1.3 Translationselongation

. Abb. 1.7.1. Die Initiationsphase der Translation. Gezeigt ist eine eukaryote mRNA mit den zwei typischen, posttranskriptionellen Modifikationen, der Cap-Struktur (m7Gppp) und dem Poly(A)Schwanz (AAA). Das proteinkodierende offene Leseraster ist durch ein Start- und ein Stoppkodon markiert. In einem ersten Schritt bindet ein Proteinkomplex (eIF4F), der aus eIF4E, eIF4G und eIF4A besteht, an die Cap-Struktur. Die Bindung des Poly(A)-bindenden Proteins (PABP) an eIF4G führt zur Zirkularisierung der mRNA. Im Folgenden wird die kleine ribosomale Untereinheit (40S) mit den Initiationsfaktoren eIF3 und dem ternären Komplex, bestehend aus eIF2, der Met-tRNAiMet und GTP, an die mRNA rekrutiert. Dieser sog. 43S-Präinitiationskomplex bewegt sich dann in einem Scanningvorgang in 3c-Richtung entlang der mRNA. Die Kodon-Antikodon-Interaktion der Initiator-tRNAMet identifiziert das Startkodon AUG. Daraufhin erfolgen die Freisetzung der eIFs und die Bindung der großen ribosomalen Untereinheit (60S). Dieses 80S-Ribosom kann die Proteinbiosynthese nach Maßgabe der kodierenden Region der mRNA beginnen

der mRNA entlang bewegt (Kozak 1999). Dieses „Scanning“ der mRNA benötigt ATP-Hydrolyse und endet mit dem Erreichen des Startkodons. Dort bindet die Met-tRNAiMet über ihr Antikodon an das AUG. Das im ternären Komplex gebundene GTP wird durch eIF2 hydrolysiert. Daraufhin wird eIF2-GDP und eIF3 von der 40S-ribosomalen Untereinheit freigesetzt. eIF2-GDP ist inaktiv und muss zu eIF2-GTP regeneriert werden, um wieder an einem neuen Translationsinitiationszyklus teilnehmen zu können. Dieser Schritt wird durch den Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor eIF2B katalysiert und ist ein wichtiger Kontrollpunkt der Translationsinitiation (7 1.7.2.1). Unter dem Einfluss von eIF5B und der Spaltung eines weiteren GTPs lagert sich die 60S-Unter-

Die Translationselongation besteht aus drei, immer wiederkehrenden Schritten (Sonenberg et al. 2000). Sobald sich das 80S-Ribosom am Initiationskodon ausgebildet hat, kann die Proteinbiosynthese beginnen. Die Met-tRNAiMet ist an der Peptid- (P-)Stelle des Ribosoms gebunden. Die Aminoacyl-tRNA, die zum zweiten Kodon gehört, bindet mit ihrem Antikodon an die mRNA, und zwar so, dass sie an der Eingangsstelle (A-Stelle) des Ribosoms sitzt. Daran beteiligt ist der Elongationsfaktor 1 (eEF1). Katalysiert durch die 60Sribosomale Untereinheit kommt es zur Peptidbindung zwischen dem Initiator-Methionin und der darauf folgenden Aminosäure. Das entstandene Dipeptid befindet sich vorerst noch an der A-Stelle des Ribosoms und wird dann in dem 3. Schritt zusammen mit der mRNA an die P-Stelle transloziert. Dieser Schritt benötigt eEF2. Durch diese Bewegung wird die A-Stelle für die Bindung der nächsten (dritten) Aminoacyl-tRNA freigemacht. Der Zyklus beginnt wieder mit Schritt 1 – und zwar so lange, bis die mRNA Triplett für Triplett dekodiert wurde und das Ribosom auf ein Stoppkodon trifft (UAG, UAA oder UGA). Jedes einzelne Triplett muss exakt in die richtige Aminosäure übersetzt werden – nur so ist gewährleistet, dass ein funktionstüchtiges Protein entsteht. Die Elongationsfaktoren führen dazu Qualitätskontrollen durch, die Energie benötigen, und zwar zwei Moleküle GTP pro Ausbildung einer Peptidbindung. Mutationen in der DNA, die durch Einfügung oder Deletion von Nukleotiden entstehen, können das Leseraster verschieben („Frameshift“). Dies führt zum Einbau von falschen Aminosäuren und meist zum baldigen Abbruch der Translation, da das Ribosom auf ein verfrühtes Stoppkodon trifft. In seltenen Fällen können von Ribosomen ausgeführte Frameshifts aber auch gezielt für die Regulation der Genexpression eingesetzt werden (7 1.7.3.1 und > Abb. 1.7.5).

1.7.1.4 Translationstermination Sobald sich ein Stoppkodon an der A-Stelle befindet, bindet dort ein Komplex aus den Releasefaktoren (RF) 1 und 3. RF1 ist in seiner Struktur einer tRNA ähnlich. Er besetzt die A-Stelle und katalysiert die Freisetzung des fertigen Polypeptids von der letzten tRNA. Das Ribosom

142

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

zerfällt dann wieder in 40S- und 60S- Untereinheiten (Sonenberg et al. 2000). In bestimmten Fällen kann aber ein Stoppkodon einfach überlesen werden, was dann zu einem verlängerten Protein führt (7 1.7.3.1 und > Abb. 1.7.5). Auch in Proteinen, die die seltene Aminosäure Selenocystein enthalten, wird die Funktion des Stoppkodons verändert (Sonenberg et al. 2000). Die mRNA für die selenabhängige Glutathion-Peroxidase 1 (Se-GPX1) oder die im Schilddrüsenstoffwechsel wichtige Deiodase enthält ein UGAKodon, welches für Selenocystein kodiert. Dies wird gesteuert durch eine sekundärstrukturreiche Sequenz in der 3c-nichttranslatierten Region („untranslated region“, UTR) der Se-GPX1-mRNA, der „selenocystein insertion sequence“ (SECIS). Bei geringen Selenmengen in der Zelle wird dieses UGA als frühzeitiges Stoppkodon gelesen. Die mRNA wird dann über den „nonsense-mediated decay“- (NMD-)Weg abgebaut (7 1.7.1.4). „Nonsense-mediated decay“ (NMD) NMD ist ein Überwachungsmechanismus in der Zelle, der aktiviert wird, wenn Ribosomen auf ein frühzeitiges Stoppkodon („nonsense codon“) stoßen. Solche Stoppkodons können z. B. durch Leserasterverschiebungen oder Punktmutationen entstehen und führen potenziell zu einem carboxyterminal-verkürzten Polypeptid. Die Identifizierung eines Nonsense-Kodons führt zum Abbau der mRNA, dem „nonsense-mediated decay“. Damit wird verhindert, dass funktionsuntüchtiges Protein hergestellt wird. Für die Unterscheidung zwischen einem regulären und einem frühzeitigen Stoppkodon ist sowohl der Spleißvorgang als auch die Translation von Bedeutung. Ein kritischer Punkt für die Auslösung von NMD ist, ob weiter als 50 Nukleotide vom 3c-Ende des Stoppkodons entfernt ein Exon-ExonÜbergang in der mRNA vorliegt. Exon-Exon-Übergänge werden im Nukleus während des Spleißvorgangs sequenzunabhängig durch einen Multiproteinkomplex, den sog. „Exon-junction-complex“ markiert und dann im Zytoplasma während der Translation erkannt (Holbrook et al. 2004). Nonsense-Mutationen sind ursächlich an über 240 verschiedenen Erbkrankheiten beteiligt (z. B. Zystische Fibrose, Hämophilie, Duchenne-Muskeldystrophie und Marfan-Syndrom). Zusätzlich werden viele Formen von Kolon-, Brust- und Blasenkrebs durch Leserasterverschiebungen in regulatorischen Genen verursacht (z. B. p53, BRCA1, BRCA2) (McKusick u. Amberger 1994). Anhand von Nonsense-Mutationen im β-globin-Gen lässt sich die Bedeutung des NMD veranschaulichen. Unterliegt die mutierte mRNA dem NMD, dann folgt die resultierende E-Thalassämie einem rezessiven Vererbungsmuster. Andere Nonsense-Mutationen im βGlobin-Gen, deren mRNAs dem NMD entgehen, führen

schon bei Patienten mit heterozygotem Genotyp zu klinisch signifikanten Ausprägungen der Erkrankung.

1.7.2 Globale Kontrolle der Translationsinitiation Die Synthese von Proteinen verbraucht etwa 5% der menschlichen Kalorienaufnahme und ca. 30–50% der Energie eines wachsenden Bakteriums (Meisenberg u. Simmons 1998). Viele Ressourcen werden in das Translationssystem investiert – in die Ribosomen, tRNAs und beteiligte Faktoren. Der Translationsprozess ist daher streng reguliert, und zwar überwiegend im ersten Schritt – der Translationsinitiation (Gebauer u. Hentze 2004). Die Anbindung der 40S-ribosomalen Untereinheit an die mRNA kann auf vielfältige Weise kontrolliert werden: durch die Phosphorylierung von Initiationsfaktoren (7 1.7.2.1), deren Interaktion mit Repressorpeptiden (7 1.7.2.2) oder deren Proteolyse (7 1.7.2.3). Als Konsequenz dieser Vorgänge ändert sich in erster Linie die generelle Translationsaktivität in der Zelle. Dies schließt jedoch nicht spezifische Effekte auf einzelne mRNASpezies aus, die drastisch von diesem generellen Trend abweichen können (Dever 2002).

1.7.2.1 Regulation der Initiation durch Phosphorylierung Eine wichtige Strategie, die Translation zu regulieren, besteht in der Phosphorylierung von beteiligten Proteinen, beispielsweise während des Zellzyklus, Virusinfektionen oder Zellstress. Viele der eIFs (eIF4E, -4G, -4B, -2, und -3) können phoshoryliert werden (Dever 2002; Gingras et al. 1999; Proud 2005). Die Phosphorylierung der 4E-Bindeproteine (4E-BP) (7 1.7.2.2), von eIF3, -4B, -4E, -G und dem ribosomalen Protein S6 korreliert mit der Aktivierung der Proteinsynthese, während eine Phosphorylierung der D-Untereinheit von eIF2 (eIF2D zur Hemmung der Translation führt (7 1.7.2.1). Die Phosphorylierung der eIFs wird hauptsächlich über zwei Signaltransduktionswege reguliert (> Abb. 1.7.2). Beide führen, stimuliert durch Mitogene, Wachstumsfaktoren, Hormone oder Zytokine, zur Aktivierung der Proteinbiosynthese. Diese Signaltransduktionswege sind 1. der Ras-/MAPK-Signalweg, der zur Aktivierung von Mnk-1, einer an eIF4G-gebundenen eIF4E-Kinase führt und 2. der PI3-K-(Phosphatidylinositol-3-Kinase-)/Akt-/ mTOR-(mammalian Target Of Rapamycin-)Signalweg, der zur Phosphorylierung des ribosomalen Proteins S6, eIF4B, eIF4G und den 4E-BPs führt (7 1.7.2.2).

143 1.7 · Mechanismen der Translationskontrolle in Eukaryonten

1.7

. Abb. 1.7.2. Intrazelluläre Signalwege zur Regulation der Translation. In diesem Modell sind der RAS-Signalweg durch türkisfarbene Ovale und der TOR-Signalweg durch graue Ovale dargestellt. Rezeptoren erkennen extrazelluläre Signale wie Wachstumsfaktoren, Hormone oder Zytokine. Weiterhin ist ein Kanal für den Transport von Aminosäuren (AS) und ein Signalweg über Phosphatidyl-inositol-4,5-bisphosphat [PtdIns(4,5)P2] und Phosphatidyl-inositol3,4,5-trisphosphat [PtdIns(3,4,5)P3] gezeigt. Die Translationsinitiationsfaktoren sind als orangefarbene Rauten und das ribosomale Protein S6 als orangefarbenes Quadrat dargestellt

Ein Seitenarm des zweiten Signaltransduktionswegs führt auch zur Phosphorylierung der H-Untereinheit von eIF2B, einem Faktor, der für das Recycling von eIF2 zwischen seiner GTP- und GDP-Form verantwortlich ist (7 1.7.1.2). Andere Signalwege führen zur Veränderung von IP3 (Inositoltriphosphat) und der Calciumionenkonzentration und beeinflussen somit die Proteinkinase C (PKC) und die doppelsträngige RNA-abhängige eIF2D-Kinase (PKR) (7 1.7.2.1). Translationskontrolle und Krebs Der PI3-K-/Akt-/mTOR-Signalweg ist bei mehreren Krebsarten fehlreguliert. Krebsauslösende Mutationen wurden an Schlüsselstellen dieses Signalweges gefunden und beinhalten sowohl Protoonkogene als auch Tumorsuppressorgene (Bader et al. 2005). Die große Bedeutung dieses Signalwegs für die Krebsentstehung wird weiterhin dadurch deutlich, dass der mTOR-Inhibitor Rapamycin das Tumorwachstum bei verschiedenen Krebsarten hemmt. Zielgene des PI3-K-/Akt-/mTOR-Signalwegs sind bei Krebs überexprimiert und schließen sowohl den Pol1-Transkriptionsfaktor TIF-1A ein, der eine erhöhte rRNA-Synthese induziert, als auch ribosomale Proteine (z. B. des S6-ribosomalen Proteins; 7 1.7.3.1) und eIFs. So führt die Fehlregulierung der Phosphorylierung von eIF4E und der 4E-BP (7 1.7.2.2) zu erhöhtem Zellwachstum und vermehrter Zellproliferation. Weitere Zielproteine, die mTOR-abhängig phosphoryliert werden, sind eIFs, die zur Bindung der klei-

nen ribosomalen Untereinheit an die mRNA führen (7 1.7.1.2). Darüber hinaus regulieren Onkogene wie C-MYC, ras oder virale Onkogene Teile des Translationsapparats. Eine Schlüsselfrage ist, ob die erhöhte Proteinsyntheserate selbst Krebs verursachen kann, oder ob die erhöhte Translationsrate in der malignen Zelle eine nötige Konsequenz der erhöhten Zellproliferation ist. Mehrere Befunde weisen darauf hin, dass eIF4E als Onkogen wirkt und damit ursächlich an der Krebsentstehung beteiligt sein kann (Bader et al. 2005). Am deutlichsten wurde diese Rolle von eIF4E in eIF4E-überexprimierenden, transgenen Mäusen gezeigt. Diese Mäuse entwickeln Tumore diversen histologischen Ursprungs wie B-Zell-Lymphome, Angiosarkome oder hepatozelluläre Adenome. In diesem Tiermodell ist die onkogene Aktivität von eIF4E deutlich damit verknüpft, den programmierten Zelltod zu hemmen. So führt die eIF4E-Überexpression dazu, dass eine durch C-MYC induzierte Apoptose bei der Entstehung von Lymphomen aufgehoben werden kann, was zur Beschleunigung der Tumorentstehung führt. Interessanterweise sind eIF4E- und C-MYC-überexprimierende Tumore gegen Rapamycin resistent. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass eIF4E ein „downstream target“ von mTOR ist und ein antiapoptotisches Signal von Akt ausführt (Ruggero u. Sonenberg 2005). Überdurchschnittlich erhöhte eIF4E-Mengen liegen beispielsweise in Brustkarzinomen vor. Auch hier führt die konstitutive Aktivierung des eIF4F-Komplexes zur erhöhten Resistenz gegenüber

144

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

der Apoptose. Auch andere eIFs findet man in Tumoren in erhöhter Konzentration. Erhöhte eIF4A-Werte wurden z. B. in menschlichen Melanomen nachgewiesen, erhöhte eIF4G-Werte in 30% der Fälle von Lungenkarzinomen und verschiedene Untereinheiten von eIF3 sind in mehreren Krebsarten überexprimiert (Rosenwald 2004). Wie kann eine veränderte Proteinsyntheserate zur Regulation der Zellproliferation führen? Eine weitgehend akzeptierte Hypothese ist die folgende: Ist das Potenzial zur Translationsinitiation hoch, d. h., alle Komponenten des Translationsapparates sind in ausreichender Menge vorhanden, dann wird die Translationsrate von schlecht translatierbaren mRNAs stärker stimuliert im Vergleich zu gut translatierbaren mRNAs. Ist dagegen das Translationspotential durch einen Mangel an Translationsinitiationsfaktoren begrenzt, trifft dies insbesondere schlecht translatierbare mRNAs. Diese können unter Wettbewerbsbedingungen nur unzureichend den Translationsapparat an sich rekrutieren. Ineffizient translatierbare mRNAs haben oft lange, stark strukturierte 5c-UTRs, die möglicherweise die Bindung oder das Scanning der 40S-ribosomalen Untereinheit hemmen. In diese Kategorie fallen viele Wachstumsfaktoren, Rezeptoren und Tyrosinkinasen. Eine Aktivierung der Translationsinitiation führt daher zur verstärkten Translation speziell dieser mRNAs. Diese Hypothese wird z. B. durch folgende Befunde unterstützt: Die Ornithindecarboxylase-(ODC-)mRNA hat ausgeprägte Sekundärstrukturen in ihrem 5c-UTR. ODC ist das limitierende Enzym für die Polyaminsynthese, und Polyamine sind wichtig für den Eintritt in die S-Phase des Zellzyklus. In mit eIF4E transformierten Zellen wird die ODC-mRNA mit höherer Effizienz translatiert, und zwar am Übergang von G1 zur S-Phase des Zellzyklus. Eine Überexpression der eIF4E-BPs dagegen hemmt die ODC-Synthese (Pyronnet et al. 2000). Ein alternativer Translationsmechanismus (IRES-abhängig; 7 1.7.3.1) führt dagegen zur verstärkten Expression der ODC-mRNA am G2-/M-Übergang des Zellzyklus, ein Zeitpunkt, an dem die generelle Proteinbiosynthese herunterreguliert ist. Weitere, in eIF4Etransformierten Zellen überexprimierte mRNAs sind Zyklin D1 (involviert in der Regulation einer Kinase, die den Übergang von der G1- zur S-Phase im Zellzyklus steuert); C-MYC (Transkriptionsfaktor) und der Fibroblasten-Wachstumsfaktor FGF2 (Zimmer et al. 2000). Weiterhin zeigen neuere Daten, dass nach Aktivierung von Ras und Akt etwa 200 mRNAs übermäßig translatiert werden (Bader et al. 2005). Die funktionelle Charakterisierung dieser Gene wird Aufschluss über weitere Zielgene geben, die durch eine Überexpression von Translationsinitiationsfaktoren verstärkt exprimiert werden.

Regulation der Initiation durch Phosphorylierung von eIF2α Ein weitere, wichtige Kontrollstelle in der Regulation der globalen Proteinsynthese ist die Phosphorylierung von eIF2D das an der Ausbildung des ternären Komplexes beteiligt ist (7 1.7.1.2). Vier eIF2D-phosphorylierende Kinasen sind bekannt. Sie hemmen die zelluläre Proteinsynthese als Antwort auf Virusinfektionen, bei Eisenmangel in den erythroiden Vorläuferzellen, bei Aminosäuremangel und bei zellulären Stresszuständen (Dever 2002; Gebauer u. Hentze 2004; Holcik u. Sonenberg 2005; Sonenberg et al. 2000): 1. Die doppelsträngige RNA-(dsRNA-)abhängige eIF2DKinase (PKR), die durch doppelsträngige RNA, wie z. B. die genomische RNA von Viren, aktiviert wird. Die Bindung von dsRNA an PKR induziert eine Dimerisierung und Autophosphorylierung der Kinase, was diese in die katalytisch aktive Form bringt. PKR ist in der Zelle assoziiert mit Ribosomen. Auch führt eine virale Infektion zur Ausschüttung von IFN-β, welches die Transkription von PKR stimuliert. 2. Die durch Häm regulierte eIF2D-Kinase oder Hämregulierter Inhibitor (HRI); HRI spielt eine wichtige Rolle in der eisenabhängigen Regulation der Translation in erythroiden Vorläuferzellen. Eisen, ein zentraler Bestandteil des Häms, wird im letzten Schritt der Hämbiosynthese durch die Ferrochelatase in das Protoporphyrin eingebaut. Bei normaler Eisenverfügbarkeit bindet Hämin (die oxidierte Form von Häm mit Fe3+) an HRI und hemmt sowohl die Autophosphorylierung, als auch die Phosphorylierung von eIF2D. Eisenmangel aktiviert HRI und führt zur Hemmung der Translation und der Bildung von hypochromischen, mikrozytären Erythrozyten. 3. Die GCN2-Proteinkinase wird durch Aminosäuremangel aktiviert. 4. Die im endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisierte PKR-ähnliche ER-Kinase (PERK); PERK wurde vor kurzem in der Maus identifiziert. Diese Kinase vermittelt das Abschalten der Proteinbiosynthese, wenn im ER viele Proteine vorliegen, die nicht korrekt gefaltet werden können. Ein menschliches Homolog von PERK ist die im Pankreas vorkommende eIF2D-Kinase (PEK). Mutationen in PEK konnten in zwei Familien mit Wolcott-Rallison-Syndrom nachgewiesen werden (Delepine et al. 2000). Diese seltene, autosomal rezessiv vererbte Erkrankung zeichnet sich durch einen permanenten, neonatal bzw. früh in der Kindheit einsetzenden insulinabhängigen Diabetes aus. Die oben genannten Kinasen zeigen große Homologie in ihren katalytischen Domänen. Die regulatorischen Do-

145 1.7 · Mechanismen der Translationskontrolle in Eukaryonten

1.7

. Abb. 1.7.3a,b. Der Initiationsfaktor eIF4G und homologe Proteine. a eIF4G kommt in menschlichen Zellen in zwei Isoformen vor (eIF4GI und II), die beide die gleiche Domänenstruktur aufweisen und in analoger Weise an weitere Initiationsfaktoren binden. Die beiden mit den mRNA-Enden interagierenden Proteine eIF4E und PABP binden an das N-terminale Drittel von eIF4G, während das zentrale Drittel mit eIF3 und eIF4A interagiert. Das C-terminale Drittel enthält eine weitere Bindestelle für eIF4A sowie für die Kinase Mnk-1 (nicht dargestellt). Viele Picornaviren spalten eIF4G mithilfe eigener Proteasen zwischen dem ersten und zweiten Drittel (dargestellt ist hier die Spaltstelle der Poliovirus-Protease 2A, 7 4.1). Drei eng verwandte eIF4E-Bindeproteine, 4E-BP1, 2 und 3, sind molekulare Ebenbilder

der eIF4E-bindenden Region von eIF4G. Das Protein 4E-T besitzt am N-Terminus ein ähnliches Modul und weist an anderen Stellen in seiner Polypeptidsequenz nukleäre Import- (NLS) bzw. Exportsignale (NES) auf, die für seine Funktion bedeutsam sind (7 Text). Zwei unterschiedliche Proteine mit Homologie zum zentralen Drittel von eIF4G sind ebenfalls bekannt: p97/NAT1/DAP-5 sowie Paip-1. Paip-1 besitzt außerdem eine PABP-bindende Domäne, die jedoch auf der Ebene der Aminosäuresequenz keine Ähnlichkeit mit der entsprechenden Domäne von eIF4G hat. b Extrazelluläre Stimuli können durch Regulierung des Phosphorylierungsstatus der 4E-BPs die Menge an verfügbarem eIF4F-Komplex beeinflussen und so die Translation steuern

mänen und die Regulationskreise, die zu ihrer Aktivierung führen, sind aber unterschiedlich. Allen gemeinsam ist die Fähigkeit durch eIF2D-Phosphorylierung am Ser-51 eine Inaktivierung von eIF2B herbeizuführen – dem Faktor, der für den Austausch von GDP zu GTP an eIF2 verantwortlich ist (7 1.7.2.1). Dies führt zu einer Reduzierung der Konzentration an ternärem Komplex (Met-tRNAiMet-eIF2-GTP) und damit einer Hemmung der Translation. Ein weiterer Beleg für die Wichtigkeit dieses Kontrollmechanismus ist, dass eine experimentelle Blockade der eIF2D-Phosphorylierung zur malignen Transformation von Zellen führt (Clemens 2004).

1.7.2.2 Regulation durch molekulares Mimikry

2003) die Interaktionen mit diesen Faktor zu einem bevorzugten Objekt für regulative Eingriffe. Dies spielt etwa für die Insulinwirkung in Zielzellen eine Rolle und ist beim apoptotischen Zelltod sowie in der Krebsentstehung bedeutsam. eIF4G kann in drei etwa gleich große Regionen unterteilt werden (> Abb. 1.7.3a): 1. An das aminoterminale Drittel bindet das Poly(A)Schwanz-bindende Protein PABP und eIF4E. 2. An das mittlere Drittel binden eIF4A und eIF3. 3. An das carboxyterminale Drittel binden ein zweites eIF4A-Molekül und die Proteinkinase Mnk-1. Zur Steuerung der eIF4G-Funktionen besitzt die Zelle eine Reihe von Proteinen, die zu Teilbereichen von eIF4G homolog sind und daher in Konkurrenz zu eIF4G an Initiationsfaktoren binden können (> Abb. 1.7.3a) (Sonenberg et al. 2000).

In der frühen Initiationsphase der Translation macht die zentrale Adapterfunktion von eIF4G (Preiss u. Hentze

Die bereits erwähnten 4E-BPs regulieren die Bindung zwischen eIF4G und eIF4E (> Abb. 1.7.3b). Die drei

146

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

4E-BPs in Säugerzellen besitzen eine Molekularmasse von etwa 10–12 kDa und sind untereinander zu etwa 40–56% identisch (> Abb. 1.7.3a). Alle drei Isoformen enthalten ein hochkonserviertes eIF4E-Bindungsmotiv, wie es auch in eIF4G vorkommt. Die 4E-BPs imitieren so die eIF4E-bindende Region von eIF4G auf molekularer Ebene und inhibieren die Aktivität von eIF4E, indem sie dessen Bindung an eIF4G blockieren (Gingras et al. 1999). Insulin sowie eine Vielzahl anderer extrazellulärer Stimuli kann über den PI3-K-Weg eine Phosphorylierung der 4E-BPs bewirken (7 1.7.2.1). Die hypophosphorylierten 4E-BPs binden gut an eIF4E, während hyperphosphorylierte Proteine keine eIF4E-Bindung zeigen (> Abb. 1.7.3b). Somit kann Insulin die Translationsrate in insulinsensitiven Zellen stimulieren. Ein weiteres eIF4E-bindendes Protein ist 4E-T (für eIF4E-Transporter, > Abb. 1.7.3). 4E-T ist ein Protein von etwa 108 kDa und alterniert zwischen Nukleus und Zytoplasma. Es sorgt für den Import eines Anteils der eIF4E-Moleküle in den Zellkern, aber auch in die zytoplasmatischen „processing bodies“ (7 1.7.3.2). Die Rolle der nukleären Subpopulation von eIF4E ist ungeklärt; sie könnte zur Integration von nukleären und zytoplasmatischen Schritten der Genexpression beitragen. Ein Protein mit weitreichender Homologie zu eIF4G wurde in ganz unterschiedlichen Studien beschrieben (Holcik et al. 2000). So wurde es unter dem Namen p97 durch seine Homologie zu eIF4G identifiziert, als NAT1 fiel es als bevorzugtes Ziel für mRNA-Editierung in Leberkarzinomzellen auf, und ein Fragment des Proteins wurde als DAP-5 in einem Screen für Apoptoseblocker gefunden. p97/NAT1/DAP-5 ist zu 28% identisch mit den C-terminalen zwei Dritteln von eIF4G und bindet eIF3 und eIF4A (> Abb. 1.7.3a). Erwartungsgemäß bindet es jedoch nicht an eIF4E und inhibiert damit die zelluläre Translation. Die zelluläre Rolle von p97/NAT1/ DAP-5 könnte die eines proapoptotischen Faktors sein (7 1.7.2.3); die Editierung (und damit Inaktivierung) der p97-mRNA in Leberkrebszellen könnte eine Verbindung zu malignem Wachstum bedeuten (7 auch 1.7.2.1). PAIP-1 („Poly(A)-Binding-Protein-Interacting Protein“) ist ein Protein mit Homologie zum mittleren Drittel von eIF4G und interagiert mit eIF4A (> Abb. 1.7.3a) (Sachs u. Varani 2000). Entdeckt wurde es jedoch durch die Fähigkeit, über seinen C-Terminus an das menschliche Poly(A)-Bindeprotein zu binden. PAIP-1 hat kein Bindungsmotiv für eIF4E, kann aber dennoch als Koaktivator für die Cap-abhängige Translation fungieren.

1.7.2.3 Proteolyse von eIF4G Eine Reihe von Picornaviren nutzt die proteolytische Spaltung von eIF4G als Teil ihrer Infektionsstrategie.

Dies fördert die virale Translation und inhibiert zugleich die zelluläre Translation (7 1.7.3.1). Mittlerweile gibt es Hinweise darauf, dass dies in mancher Hinsicht zellulären Prozessen nachempfunden ist. So wird während der Apoptose eIF4G durch Caspase-3 gespalten (Morley et al. 2005). Die resultierenden Fragmente unterscheiden sich jedoch von denen, die durch eine virale Infektion hervorgerufen werden. Ein 76 kDa großes Fragment mit der Fähigkeit an eIF4E, -4A und -3 zu binden, kann in apoptotischen Zellen akkumulieren. Es ist unklar, ob dieses Fragment eine translationale Aktivität besitzt. In vielen Fällen korreliert die Spaltung von eIF4G während der Apoptose zeitlich mit der Verminderung der zellulären Proteinsynthese. In späteren Stadien der Apoptose werden noch weitere Initiationsfaktoren proteolytisch gespalten. Es ist daher nicht sicher, ob die Spaltung von eIF4G eine aktive Rolle in der Apoptose spielt oder eher eine Begleiterscheinung darstellt. Auch p97/NAT1/ DAP-5 wird während der Apoptose an einem Caspasemotiv gespalten. Das C-terminal verkürzte Rumpfprotein von 86 kDa kann weiterhin eIF3 und -4A binden und ist möglicherweise verantwortlich für die fortgesetzte IRES-abhängige Translation (7 1.7.3.1) einiger mRNAs während der Apoptose (Holcik u. Sonenberg 2005; Holcik et al. 2000).

1.7.2.4 Zelluläre Stresszustände regulieren die Translation Verschiedene physiologische oder umweltbedingte Stresszustände wie UV-Strahlung, Temperaturschwankungen, Schwermetalle, Glucosemangel, Hypoxie, oxidativer Stress oder Behandlung mit Medikamenten oder Toxinen führen zur einer adaptiven Antwort der Zellen, die eine Reduktion der generellen Translationsrate mit einschließt (Holcik u. Sonenberg 2005). Das vermeidet den Verbrauch zellulärer Ressourcen zur Synthese von Proteinen, die entweder unnötig sind oder sogar schädlich für die zelluläre Stressantwort. Ein Großteil der stressbedingten Änderungen der Translation lassen sich auf eine Hemmung der eIF2-Aktivität durch die eIF2D-Kinasen zurückführen (Dever 2002; Proud 2005) sowie auf die Hemmung der eIF4F-Funktion durch verminderte Aktivität der Ras-/MAPK- und PI3-K/Akt-/ mTOR-Signalwege (7 1.7.2.1). Die Hemmung der Translation führt zur Bildung sog. „stress-granules“ (SG), die aus mRNAs mit blockierten Initiationskomplexen (40S-ribosomale Untereinheit, eIF2, -3, -4E, -4G und PABP) sowie weiteren Komponenten (etwa die Helikase p54/Rck und die RNA-bindenden Proteine TIA-1 und TIAR) bestehen (Kedersha et al. 2005). Man nimmt an, dass die SG die meisten zellulären mRNAs enthalten außer jenen, die die für die Stressantwort benötigten

147 1.7 · Mechanismen der Translationskontrolle in Eukaryonten

Proteine kodieren. Die SG fungieren daher als eine Art stressaktivierte Sortierstation, in der mRNAs vorübergehend gelagert werden, bis sie entweder wieder zur aktiven Translation zurückgeführt oder schließlich abgebaut werden. Die verschiedenen Stressarten haben gemeinsam, dass sie zur vermehrten Expression von „Heat shock“Proteinen führen (Schneider 2000). Heat-shock-Proteine (Hsp) können die Zelle vor dem Zelltod bewahren. Die meisten Mitglieder der Hsp-Familie sind molekulare Chaperone, die eine Rolle in der Proteinfaltung, im Proteintransport und dem Zusammenbau von Multiproteinkomplexen spielen. Während eines Zellstresses schützen sie die Proteine, spielen eine Rolle in der Reparatur von geschädigten Proteinen und beim Abbau von zerstörten Proteinen durch den Ubiquitin-Proteasom-Weg. Wie die Hsp-Proteine selbst während eines zellulären Stresszustandes weiterhin translatiert werden, ist nicht genau geklärt. Die 150–200 Nukleotide langen 5c-UTRs der Hsp-mRNAs weisen kaum Sekundärstruktur auf. Mechanismen, wie „Ribosome shunting“ und IRES-vermittelte Translation (7 1.7.3.1) wurden in einigen Fällen als alternativer Translationsinitiationsmechanismus vorgeschlagen. Zelluläre Stresszustände sind von medizinischer Relevanz, da sie bei verschiedenen Erkrankungen, wie Diabetes, Alzheimer, viralen Infekten, Schlaganfall, Herzerkrankungen und Krebs eine Rolle spielen (Holcik u. Sonenberg 2005). Zusätzlich hat man auch eine Konditionierung von Zellen mit einem subletalen Stress beobachtet, die einen Schutz gegen spätere, sonst letale Attacken bietet (McDunn u. Cobb 2005). Ein Ziel der pharmakologischen Forschung ist es daher, diese Konditionierungseffekte zur besseren Verträglichkeit von chirurgischen Eingriffen, wie etwa Organtransplantationen, zu nutzen.

1.7.3 mRNA-spezifische Translationskontrolle Während bei der globalen Translationskontrolle die meisten mRNAs in einer Zelle reguliert werden, kommt es bei der mRNA-spezifischen Translationskontrolle zur Regulation einzelner Klassen an mRNAs. Gut verstandene Beispiele für diesen Typ von Translationskontrolle findet man in der Regulation des Eisenmetabolismus, im Zellwachstum und der Zelldifferenzierung, und auch in der Embryogenese. Regulatorische Steuerelemente befinden sich oft in den 5c- und 3c-nichttranslatierten Regionen. Diese Steuerelemente binden häufig Proteine, welche dann die Translation regulieren.

1.7

1.7.3.1 5‘-UTR-vermittelte Translationskontrolle Im 5c-UTR der mRNA beginnt die Translation. Dort kommt es zur Bindung der 40S-ribosomalen Untereinheit, dem Scanningprozess und dem Anfügen der 60S-ribosomalen Untereinheit. Diese Vorgänge können gestört werden durch stabile RNA-Sekundärstrukturen in der 5c-UTR, wie man sie häufig in den mRNAs von Wachstumsgenen findet (7 1.7.2.1). Alternativ kann die Bindung von Repressorproteinen an Steuerelemente in der mRNA die Translation blockieren. Mehrere Beispiele einer 5c-UTR-vermittelten Translationskontrolle sind im Folgenden aufgeführt. Die IRE-/IRP-vermittelte Translationskontrolle Ein gut verstandenes Beispiel einer 5c-UTR-vermittelten Translationskontrolle ist die Biosynthese des intrazellulären Eisenspeicherproteins Ferritin. Überschüssiges Eisen wird durch Ferritin gebunden und so entgiftet. Ein erhöhter zellulärer Eisengehalt führt zu vermehrter Ferritinproduktion. Bei geringem Eisengehalt wird die Ferritinproduktion vermindert. Maßgebend für diese Regulation ist eine Sekundärstruktur in der 5c-UTR, das Iron-Responsive Element (IRE) (Hentze et al. 2004). Bei niedriger intrazellulärer Eisenmenge bindet daran das Iron Regulatory Protein 1 oder 2 (IRP-1 oder IRP-2) und blockiert die Translation des Ferritins. Eine Voraussetzung dafür ist, dass das IRE nicht weit von der Cap-Struktur entfernt lokalisiert ist. IREs, die mehr als 100 Nukleotide vom Cap entfernt sind, hemmen die Translation nur eingeschränkt. Dieser Befund stimmt damit überein, dass ein früher Schritt in der Translationsinitiation gehemmt wird, nämlich die Anbindung des 43S-Präinitiationskomplexes an den Cap-Bindekomplex eIF4F (> Abb. 1.7.4a). Steigt der Eisengehalt in der Zelle, so fällt das IRP von der mRNA ab, und das jetzt benötigte Eisenspeicherprotein kann wieder translatiert werden (> Abb. 1.7.4b). Mutationen im IRE des L-Ferritins, welche die IRP-Bindung verhindern, führen beim Menschen zum erblichen Hyperferritinämie-Katarakt-Syndrom. Diese Erkrankung ist durch erhöhte Werte an Serum-Ferritin und eine frühe Katarakterkrankung gekennzeichnet (Beaumont et al. 1995; Girelli et al. 1995). Neben der Eisenspeicherung werden auch der Eisenverbrauch und die zelluläre Eisenaufnahme über das IRE-/IRP-System reguliert. Ähnlich wie das Ferritin wird auch die Translation des Enzyms eALAS, das den ersten Schritt der erythroiden Hämbiosynthese katalysiert, eisenabhängig reguliert. Dagegen trägt der Transferrinrezeptor (TfR) fünf IREs im 3c-UTR. In eisendefizienten Zellen führt dort die IRP-Bindung zur Stabilisierung der TfR-mRNA durch die Blockade einer

148

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen a

b

. Abb. 1.7.4a,b. Translationale Regulation des Eisenspeicherproteins Ferritin. In der 5c-UTR der Ferritin-mRNA befindet sich ein regulatorisches RNA-Steuerelement, das IRE („iron-responsive element“). a Bei niedrigem zellulären Eisenspiegel bindet daran IRP-1 („iron regu-

latory protein“). Der IRE-/IRP-1-Komplex hemmt die Translation in der Initiationsphase, weil der eIF4F-Komplex den Präinitiationskomplex nicht mehr an die mRNA rekrutieren kann. b Bei hohem Eisenspiegel kann die Ferritin-mRNA ungehemmt translatiert werden

Schnittstelle für eine Endonuklease. Durch die verstärkte Transferrinrezeptorsynthese wird dem Eisenmangel entgegengesteuert.

selektiven Phosphorylierung des ribosomalen Proteins S6 bei der Translationskontrolle von TOP enthaltenden mRNAs (Ruvinsky et al. 2005).

Translationskontrolle der 5‘-TOP-mRNAs Für das Wachstum einer Zelle ist es wichtig, dass die Bestandteile des Translationsapparats in ausreichender Menge vorhanden sind. Die Expression der ribosomalen Proteine, Elongationsfaktor 1A und 2 (nur in hämatopoetischen Zellen), oder des Poly(A)-bindenden Proteins werden wachstumsabhängig auf Translationsebene reguliert. In wachsenden Zellen befinden sich diese mRNAs in Polysomen und in ruhenden Zellen in der subpolysomalen Population. Sie haben gemeinsam, dass sie im 5c-UTR einen terminalen Oligopyrimidintrakt (5c-TOP) haben. Auf den ersten Blick scheint es, dass eine ruhende Zelle viele Vorräte und Energie verschwendet, indem sie sich ein Reservoir an ineffizient translatierten mRNAs leistet. Dies hat aber den Vorteil, dass die Zelle schnell auf eine beginnende Zellteilung reagieren kann. An dieser Stelle wird plötzlich eine große Translationskapazität benötigt (Meyuhas u. Hornstein 2000). Bemerkenswerterweise folgt in allen mRNAs dieser Familie ein Cytosin direkt auf die Cap-Struktur. Das ist vergleichsweise selten – nur etwa 17% der eukaryoten mRNAs haben an dieser Position ein Cytosin – der weitaus größere Teil der mRNAs beginnt mit einem Adenosin. Dann folgt eine Reihe von 4–14 Pyrimidinen – das 5c-TOP-Motiv (Meyuhas u. Hornstein 2000). Die Position des 5c-TOP, gleich anschließend an das Cap, ist von großer Bedeutung. Unbekannt sind sowohl Faktoren, die an ein 5c-TOP binden, als auch Signaltransduktionskaskaden, die Wachstumssignale an die Translationsmaschinerie übermitteln (Meyuhas u. Hornstein 2000). Neuere Befunde widerlegen auch die seit langem postulierte Rolle einer

Upstream-ORFs In einigen mRNAs findet man im 5c-UTR vor dem Startkodon für den eigentlichen kodierenden Bereich noch weitere AUGs – sog. „upstream“ AUGs (uAUG) (Meijer und Thomas 2002). Befindet sich das uAUG in einem anderen Leseraster mit eigenem Stoppkodon, so spricht man von einem „upstream open reading frame“ (uORF). Je nach Lage des Stoppkodons kann der uORF auch teilweise mit dem eigentlichen kodierenden Bereich überlappen. Befindet sich das uAUG im gleichen Leseraster wie das übliche Startkodon, dann können zwei Proteine entstehen, wobei das eine um eine zusätzliche aminoterminale Domäne verlängert ist. Die Benutzung der verschiedenen AUGs ist in solchen Fällen streng reguliert. Meist schwächen vorgeschaltete uORFs die Translation am eigentlichen kodierenden Bereich ab. Das liegt daran, dass eukaryote Ribosomen nach der Termination kaum dazu in der Lage sind, mit einer neuen Translationsrunde am folgenden Startkodon zu beginnen. Dies ist ein Unterschied zu Bakterien, in deren mRNAs oft mehrere Leseraster hintereineinandergeschaltet sind. Beispiele für regulatorische uORFs sind die mRNAs für CLN3, bcl-2 und c-mos. Eine Mutation, die den uORF in der mRNA von G1-Zyklin aufhebt, führt zu einem beschleunigten Zellzyklus. Oft ist die Kodierungskapazität des uORFs unwichtig, aber die Länge und Position des uORFs oder die Zusammensetzung der Sequenz, die sich zwischen dem uORF und dem eigentlichen kodierenden Bereich befindet, sind bedeutsam. All diese Parameter beeinflussen die Re-Initiationsrate am eigentlichen Startkodon. In einigen Fällen ist die Funktion des uORFs von dessen Kodierungskapazität mitbestimmt. Man vermutet,

149 1.7 · Mechanismen der Translationskontrolle in Eukaryonten

dass das Peptid, welches durch die Translation des uORFs entsteht, die Translationstermination am Ende des uORF beeinflusst. Beispiele für peptidspezifische uORFs sind die S-adenosyl-methionine decarboxylase (AdoMetDC) oder der zweite uORF im gp48-Transkript des menschlichen Zytomegalievirus. Wie in Abschnitt „Nonsensemediated decay“ bereits besprochen, können sich uORFs auch auf die mRNA Stabilität auswirken. Unkonventionelle Translationsinitiationsmechanismen Viren verfolgen eine Vielzahl von unkonventionellen Strategien, mit denen sie sich den zellulären Translationsapparat zunutze machen (> Abb. 1.7.5) (Hellen u. Sarnow 2001; Sonenberg et al. 2000). Die meisten bisher untersuchten zellulären mRNAs hingegen folgen dem in Abschnitt 1.7.1.2 beschriebenen Scanningmodell für Cap-stimulierte Translationsinitiation. Die Ursachen für diesen Unterschied liegen wohl in den Beschränkungen, denen die virale Genexpression unterliegt. So ist es etwa besonders ökonomisch, durch den Gebrauch von „Frameshifting“ oder „Readthrough“ die Kodierungskapazität eines größenlimitierten Genoms zu erweitern. Charakteristisch für den Verlauf vieler viraler Infektionen ist auch eine selektive Inhibierung der

1.7

Translation von zellulären mRNAs zugunsten der viralen mRNAs. Virale mRNAs weisen zum Teil keine Cap-Struktur am 5c-Ende auf oder besitzen keinen Poly(A)-Schwanz. Die untranslatierten Regionen der viralen mRNA können darüber hinaus Strukturelemente enthalten, die für die Replikation oder Verpackung benötigt werden, jedoch mit konventioneller Translationsinitiation unvereinbar sind. Diese Nachteile muss das Virus in geeigneter Form kompensieren und im Verlauf der Infektion in einen Vorteil für die virale Genexpression wandeln. Dazu greift das Virus häufig in den zellulären Translationsablauf ein, indem es Vorgänge wie die Rekrutierung der 40S-Untereinheit, das Scanning oder die Startkodonauswahl in „seinem Sinne“ modifiziert. Die Untersuchung dieser Translationsinitiationsvarianten trägt daher sowohl zum Verständnis der viralen als auch der konventionellen zellulären Mechanismen bei. Im Folgenden soll dies durch einige prägnante Beispiele von viralen Translationsstrategien illustriert werden. Interne Ribosomenplatzierung

„Internal ribosome entry sites“ (IRES) sind RNA-Strukturen, die Translationsinitiationskomplexe ohne Beteiligung des mRNA-5c-Endes direkt an interne Positionen . Abb. 1.7.5. Virale Translationsstrategien. Viren verwenden eine Vielfalt von translationalen Strategien zur Expression ihres Genoms. Im oberen Teil der Abbildung ist eine hypothetische virale mRNA dargestellt. Sie enthält insbesondere mehrere, überlappende kodierende Bereiche. Darunter befindet sich eine ausführliche Sammlung von Translationsmechanismen, die zur Expression der unterschiedlichen genetischen Informationen führen können. Dazu gehören unorthodoxe Translationsinitiationsmechanismen, aber auch Vorgänge während der Elongationsphase, die von dem normalen Dechiffrieren der proteinkodierenden Regionen abweichen. Ein Virus bedient sich typischerweise einer Kombination einiger (jedoch nicht aller) dieser Mechanismen. Weitere Informationen im Text

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen a

b

. Abb. 1.7.6a,b. Translation durch interne Platzierung von Ribosomen. a Der experimentelle Test eines RNA-Elements auf IRES-Aktivität („Internal Ribosome Entry Site“) erfolgt üblicherweise durch Einfügen in den intercistronischen Bereich einer bicistronischen ReportermRNA. In dieser Anordnung wird das zweite Cistron durch eukaryote Ribosomen normalerweise nicht translatiert. Eine authentische IRES

aktiviert jedoch selektiv dieses zweite Cistron. b Schematische Darstellung der Genomstruktur eines Picornavirus. In der 5c-untranslatierten Region der viralen mRNA befindet sich ein komplex strukturiertes RNA-Element mit IRES-Funktion. Dieses Element steuert die Translation eines viralen Polyproteins, das durch Proteaseaktivität in die einzelnen funktionellen Einheiten gespalten wird

auf der mRNA rekrutieren können. Der übliche Labortest auf eine Funktion als IRES besteht daher darin, die zu untersuchende Sequenz zwischen zwei kodierende Bereiche einer bicistronischen Reporter-mRNA zu bringen (> Abb. 1.7.6a). Normalerweise wird in dieser Anordnung das zweite Cistron nicht translatiert. Eine authentische IRES besitzt jedoch gerade diese Eigenschaft, selektiv die Translation des stromabwärts gelegenen zweiten Cistrons zu stimulieren. IRES-Elemente können die sonst notwendige Cap-Struktur funktionell ersetzen, und viele virale IRES-Elemente benötigen zur Funktion nur eine Auswahl der sonst erforderlichen Initiationsfaktoren. Die IRES-Elemente des Hepatitis-C-Virus (HCV) und der verwandten Pestiviren zeigen eine besonders weitgehende Umsetzung dieses Prinzips. Das HCVIRES-Element ist eine komplexe RNA-Struktur, die aus ca. 350 Nukleotiden der untranslatierten Region sowie etwa 30–50 Nukleotiden des kodierenden Bereichs besteht. Die HCV-IRES kann Ribosomen ohne jede Beteiligung der eIF4-Gruppe von Initiationsfaktoren rekrutieren. Zu den Picornaviren gehören einige bedeutende Krankheitserreger von Mensch und Tier. Picornavirale RNA besitzt am 3c-Ende einen Poly(A)-Schwanz, während das 5c-Ende zunächst kovalent an das virale Protein VPg gebunden ist (> Abb. 1.7.6b). Dieses Protein wird jedoch offenbar kurz nach der Ankunft in der Zelle abgetrennt, sodass die virale RNA effektiv als mRNA ohne Cap-Struktur translatiert wird. Alle picornaviralen RNAs besitzen ein ca. 450 Nukleotide langes IRESElement mit extensiver Sekundärstruktur. Anhand der Struktur ihrer IRES-Elemente können die Picornaviren in 3 Gruppen eingeteilt werden: 1. das Hepatitis-A-Virus, 2. die Kardio- und Aphthoviren und 3. die Enteroviren, etwa das Poliovirus, oder die Rhinoviren.

Das Enzephalomyokarditis-Virus (EMCV) ist ein typisches Beispiel aus der 2. Gruppe. Das EMCV-IRESElement kann die 40S-ribosomale Untereinheit nicht direkt binden, sondern benötigt dafür nahezu alle eIFs außer dem Cap-Bindeprotein eIF4E. Neben einer unterschiedlichen Auswahl an zellulären eIFs benötigen die verschiedenen IRES-Typen zudem verschiedene weitere zelluläre RNA-Bindeproteine, denen eine Rolle bei der Stabilisierung der probaten Tertiärstruktur des IRES zukommt. Die meisten Picornaviren blockieren die Translation von zellulären mRNAs, indem sie Modifikationen an Initiationsfaktoren induzieren. So steuern Kardioviren die Dephosphorylierung der 4E-BPs und begünstigen so die Inaktivierung von eIF4E (7 1.7.2.2). Entero-, Rhinound Aphthovirusinfektionen führen zu einer proteolytischen Spaltung von eIF4G in ein N-terminales Drittel mit den Bindestellen für eIF4E und PABP sowie ein größeres C-terminales Fragment mit Bindungsstellen für eIF3 und -4A. Diese Modifikationen sind verantwortlich für die drastische Reduktion der Translation von zellulärer mRNA, während picornavirale, IRESs enthaltende RNAs (mit Ausnahme von HAV) dadurch in ihrer Funktion nicht beeinträchtigt werden. Ursprünglich dachte man, dass IRES-Elemente eine Eigenheit von Viren wären. Doch eine wachsende Zahl von Publikationen beschreibt IRES-Elemente auch in regulären zellulären mRNAs. Diese Befunde werden noch kontrovers diskutiert, und es ist bisher recht wenig über die Mechanismen bekannt, die der Funktion von zellulären IRES-Elementen zugrunde liegen (Holcik et al. 2000; Komar u. Hatzoglou 2005; Kozak 2003; Merrick 2004). In einigen Fällen ist dokumentiert, dass die Translation dieser mRNAs selektiv an die zellulären Bedingungen angepasst werden kann. Zwei Beispiele dafür sind die mRNAs für Ornithindecarboxylase sowie p58PITSLRE, deren IRES jeweils nur beim Übergang von der G2- zur M-Phase im Zellzyklus aktiviert werden (7 1.7.2.1).

151 1.7 · Mechanismen der Translationskontrolle in Eukaryonten

Ribosomen-Shunt

„Shunting“ ist eine Form des diskontinuierlichen Scannings, bei dem 40S-ribosomale Untereinheiten das Scanning vom 5c-Ende aus beginnen, aber dann an einer Shuntdonorstelle zum Überspringen des restlichen 5c-UTRs ansetzen und dann an einer Shuntakzeptorstelle in der Nähe des Startkodons „landen“ (Ryabova et al. 2002) (> Abb. 1.7.5). Die 35S-RNA der Pflanzenpararetroviren weist eine ca. 600 Nukleotide lange 5c-UTR auf. Mit Ausnahme der ersten 80 Nukleotide und des Bereichs um das Startkodon faltet sich diese Region in eine komplexe Haarnadelstruktur, die an das virale Coat-Protein bindet. Translation eines dicht stromaufwärts der Haarnadelbasis gelegenen uORF A, gefolgt von einer partiellen Aufschmelzung der Haarnadelbasis durch das terminierende Ribosom, lösen den Sprung in die Nähe des authentischen Startkodons aus. Ein ähnlicher Shuntmechanismus findet auch an dem „tripartite leader“ der Adenovirus-mRNA statt. Initiierende 40S-Untereinheiten können hier das authentische Startkodon sowohl durch konventionelles Scanning als auch durch einen sORF-unabhängigen Shunt erreichen. Letzteres bedarf dreier Regionen mit Komplementarität zum 3c-Ende der 18S-rRNA, obwohl eine direkte Basenpaarung nicht gezeigt worden ist. Shunting ist der vorherrschende Mechanismus im späten Infektionsstadium, wenn die Aktivität von eIF4F stark reduziert ist. Ähnliche 5c-UTR-Regionen mit 18S-rRNAKomplementarität wurden auch in menschlichen hsp70und c-fos-mRNAs gefunden. Tatsächlich werden diese mRNAs unter zellulären Hitzeschockbedingungen (und einhergehender eIF4F-Inaktivierung, 7 1.7.2.4) vorwiegend über einen Shuntmechanismus translatiert.

1.7.3.2 3‘-UTR-vermittelte Kontrolle der Translation In den ersten Stunden des Lebens ist eine präzise, zeitliche und räumliche Kontrolle der Genexpression besonders wichtig. Dieser Zeitraum ist jedoch gleichzeitig durch weitgehende Abwesenheit von mRNA-Transkription gekennzeichnet. Entscheidende Vorgänge in dieser Phase beruhen daher auf Substanzen, mit denen die Eizelle bereits zuvor ausgestattet wurde. Maternale mRNAMoleküle und die Steuerung ihrer Expression spielen eine herausragende Rolle während der Eizellreifung und frühen Embryogenese (Sonenberg et al. 2000). Fehler in der posttranskriptionalen Steuerung der maternalen mRNA-Expression führen meist zu drastischen Fehlentwicklungen des Embryos. Es hat sich herausgestellt, dass die 3c-UTRs vieler mRNAs in der Embryonalentwicklung eine zentrale Bedeutung haben, da sie cis-agierende Elemente beherbergen, die Lokalisierung, Stabilität oder

1.7

Translation der mRNA regulieren. Translationskontrolle durch 3c-UTR-Elemente ist aber auch in späteren zellulären Differenzierungsvorgängen zu beobachten und findet auch in somatischen Zellen mit aktivem Nukleus statt. Kontrollierte Translation ermöglicht besonders schnelle und große Anpassungen in der Synthese von Proteinen, wie sie beispielsweise für die neuronale Plastizität erforderlich sind. Bei erster Betrachtung erscheint die translationale Kontrolle, ausgehend von der 3c-UTR, als wenig elegante Lösung. Ein Vorteil der 3c-UTR ist jedoch, dass regulative Elemente in diesem Bereich keine anderen Funktionen der mRNA beeinträchtigen. Die 5c-UTR ist durch die Erfordernisse des Scanningprozesses und der translatierte Bereich durch seinen Informationsgehalt für die Polypeptidsynthese eingeschränkt. Regulation über 3c-UTR-Elemente kann außerdem über eine Beeinflussung der Poly(A)-Schwanz-Funktion auf die Kommunikation zwischen den mRNA-5c- und -3c-Enden während der Translationsinitiation wirken (7 1.7.1.2). Im Folgenden sollen die oben eingeführten Konzepte anhand einiger Beispiele weiterentwickelt und erläutert werden. mRNA-Maskierung und Polyadenylierung Die Vorgänge bei der regulierten Translation maternaler mRNAs sind großenteils im Frosch Xenopus laevis untersucht worden. Nach ihrer Entstehung während der Embryogenese werden Eizellen in der Prophase ihrer ersten meiotischen Teilung arretiert, und die Gentranskription wird weitgehend eingestellt. Die spätere Eizellreifung ist dann gekennzeichnet durch eine Fortführung der Meiose und wird in Xenopus durch Progesteron stimuliert. Reife Eizellen stoppen dann ein weiteres Mal in der Metaphase ihrer zweiten meiotischen Teilung. Nach der Befruchtung beginnen die ersten mitotischen Zellteilungen, und nach 12 Teilungen im Froschembryo wird dann die zygotische Transkription aktiviert. Ein komplexes hierarchisch organisiertes Netzwerk der kontrollierten Translation maternaler mRNAs steuert die notwendigen Vorgänge während dieser Phase der transkriptionalen Inaktivität. Regulierte Polyadenylierung ist der am besten bekannte Mechanismus zur Steuerung der maternalen mRNA-Translation. Die mRNA für die c-mos-Kinase ist hierfür ein gutes Beispiel. Die c-mos-mRNA 3c-UTR weist ein „cytoplasmic polyadenylation element“ (CPE) auf, eine U-reiche Sequenz, die als Bindestelle für das Protein CPEB dient (> Abb. 1.7.7). CPEB ist sowohl an der Repression von CPE-enthaltenden mRNAs vor der Eizellreifung, als auch an der späteren Aktivierung ihrer Translation beteiligt. Translational inaktive mRNA liegt zunächst in weitgehend deadenylierter Form in sog. „germ cell granules“ vor, die Ähnlichkeiten mit den zuvor erwähnten SG (7 1.7.2.4), aber auch mit den im

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

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b

was wiederum zur Rekrutierung von eIF4G und Auflösung der repressiven Maskin-/eIF4E-Interaktion führt (> Abb. 1.7.7b). Das CPE-Element und CPEB spielen eine wichtige Rolle in der Regulierung vieler maternaler mRNAs. Mittlerweile sind allerdings neben CPEB noch weitere RNA-bindende Proteine (Pumillio, DAZL) bekannt, die teils gemeinsam und in verschiedenen mRNA-spezifischen Kombinationen die maternale mRNA-Expression regulieren. Untersuchungen etwa in Mäusen weisen darauf hin, dass die im Xenopus-Modellsystem gewonnenen Erkenntnisse im Wesentlichen auch für Säugetiere gültig sind. Translationale Alternativen zum Poly(A)-Schwanz

. Abb. 1.7.7a,b. Translationale Kontrollfunktion der 3c-untranslatierten Region während der Oogenese und frühen embryonalen Entwicklung. „Cytoplasmic polyadenylation elements“ (CPEs) befinden sich in der 3c-UTR vieler maternaler mRNAs und steuern deren translationale Aktivität, indem sie die Initiation der Translation am 5c-Ende direkt oder durch Einflussnahme auf den Polyadenylierungsstatus kontrollieren (7 Text). a CPEs sind Bindestellen für das CPEB-Protein, welches weiterhin Maskin rekrutiert. Das Maskin-Protein weist Homologien zu eIF4G auf und hemmt so die produktive Interaktion zwischen eIF4E und eIF4G, was zur Hemmung der Translationsinitiation führt. b Während der Eizellreifung wird CPEB phosphoryliert und wird somit zum Aktivator der mRNA-Polyadenylierung und Translation. Dafür rekrutiert phosphoryliertes CPEB, das an das Polyadenylierungssignal bindende CPSF und die Poly(A)-Polymerase GLD2, die den Poly(A)-Schwanz verlängert (Sternensymbol). Dies führt zur verstärkten Bindung des Poly(A)-bindenden Proteins ePABP und zur Verstärkung der Translation (Sternensymbol)

Folgenden beschriebenen „processing bodies“ haben (7 1.7.3.2). Für die Repression der Translation rekrutiert CPEB das Maskin-Protein, welches ein eIF4E-interagierendes Motiv ähnlich dem in eIF4G aufweist. Maskin kann über dieses Motiv an Cap-gebundenes eIF4E binden und dessen produktive Interaktion mit eIF4G blockieren (> Abb. 1.7.7a). Als Teil der hierarchischen Aktivierungskaskade während der Eizellreifung wird CPEB dann durch die Kinase Aurora-A/Eg2 phosphoryliert und wird zu einem Aktivator der mRNA-Polyadenylierung und -Translation. Dazu rekrutiert CPEB einen Komplex, bestehend aus dem „cleavage and polyadenylation specificity factor“ (CPSF) und der Poly(A)-Polymerase „germline development deficient 2“ (GLD2), der den Poly(A)-Trakt verlängert. Der längere Poly(A)Schwanz bindet dann verstärkt embryonales (e)PABP,

Rotaviren sind eine Hauptursache für Diarrhö bei Kindern und tragen in erheblichem Maße zur weltweiten Kindersterblichkeitsrate bei. Rotavirale mRNAs besitzen eine Cap-Struktur, aber keinen Poly(A)-Schwanz. Stattdessen enden ihre 3c-UTRs in einer kurzen, konservierten Sequenz, die an das reovirale „nonstructural protein“- (NSP-)3 bindet (Sachs 2000). Mithilfe von NSP3 verfolgen die Rotaviren eine translationale Strategie, die besonders auf die Funktion der 3c-Enden der mRNA abzielt. NSP3 bindet nämlich auch an den zellulären Faktor eIF4G und unterbricht dadurch dessen Interaktion mit dem Poly(A)-Bindeprotein PABP. Das Virus erzielt damit eine zweifache Wirkung: Einerseits wird so die PABP-abhängige zelluläre Translation selektiv inhibiert (7 1.7.1.2); andererseits kann die Bindung von NSP3 an eIF4G eine Brücke zwischen den Enden der Rotavirus-mRNAs aufbauen und so die Translation von Rotavirus-mRNAs spezifisch stimulieren. Ein zelluläres Gegenstück zu dieser Strategie könnten die S-Phase-spezifischen Histon mRNAs in Metazoen sein. Sie enden mit einer konservierten Haarnadelschleife, die viele Funktion eines Poly(A)-Schwanzes übernimmt (Jaeger et al. 2005). So ist sie essenziell für die Histon-mRNA-Translation und bindet in somatischen Säugerzellen den Faktor SLBP („stem loop binding protein“). Erythropoese: 15-Lipoxygenase-mRNA Während der Reifung von Säugetier-Retikulozyten zu Erythrozyten werden die Mitochondrien abgebaut (> Abb. 1.7.8a). Das Enzym 15-Lipoxygenase (LOX) ist an der Zerstörung von internen Membranen und Mitochondrien beteiligt. LOX-mRNA wird in frühen Reifestadien – vor Ausstoß des Zellkerns – transkribiert und zunächst in inaktiver Form im Zytoplasma gespeichert. Die 3c-UTR von Kaninchen LOX-mRNA enthält 10 annähernd identische Kopien einer Sequenz von 19 Nukleotiden (Gebauer u. Hentze 2004). Dieses „differentiation control element“ (DICE) vermittelt die translationale

153 1.7 · Mechanismen der Translationskontrolle in Eukaryonten

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. Abb. 1.7.8a,b. Translationale Regulation der 15-Lipoxygenase. Die Bildung des Enzyms 15-Lipoxygenase (LOX) wird während der Erythropoese auf der Ebene der Translation reguliert. a Schematische Darstellung der Erythropoese. Während der Reifung der roten Blutzellen stoßen die späten Normoblasten ihren Zellkern aus. Alle für die weiteren Schritte nötigen mRNA-Moleküle müssen zu diesem Zeitpunkt schon gebildet worden sein. Die mRNA für 15-Lipoxygenase

darf jedoch erst in reifen Retikulozyten translatiert werden, wenn das Enzym für den Abbau der Mitochondrien benötigt wird. b Die Translation der LOX-mRNA wird durch das DICE-Element im 3c-UTR reguliert. Die Proteine hnRNP K und –E1 binden an dieses Element und verhindern die Bildung ribosomaler 80S-Komplexe am 5c-Ende der mRNA. Dazu blockieren sie die Anlagerung der 60S-Untereinheit nach erfolgter Bindung der 40S-Untereinheit

Repression in frühen erythroiden Zellen durch Bindung an die heteronukleären Ribonukleoproteine (hnRNP) K und E1. Das DICE kann in die 3c-UTR anderer mRNAs „transplantiert“ werden und benötigt für seine Funktion in vitro weder eine 5c-Cap-Struktur noch einen Poly(A)Schwanz. hnRNP K und E1 inhibieren die Initiation der LOX-mRNA Translation auf der Ebene der Anlagerung der 60S-ribosomalen Untereinheit (> Abb. 1.7.8b). Eine offene Frage ist, ob Störungen in der Kontrolle der 15-LOX-Synthese als Ursache für klinische Befunde infrage kommen. Die Untersuchung von Anämieformen, die mit einer gestörten Reifung der erythroiden Vorläuferzellen einhergehen, könnte darüber Aufschluss geben.

complex“) binden miRNAs durch Basenpaarung an spezifische Ziel-mRNAs. Ist die Komplementarität zwischen miRNA und mRNA nahezu vollständig, dann kommt es zur endonukleolytischen Spaltung der Ziel-mRNA. Bei geringerer Komplementarität dagegen wird vorwiegend die Translation der Ziel-mRNA gehemmt. Obwohl man für die meisten miRNAs noch keine Ziel-mRNA mit Sicherheit kennt, geht man davon aus, dass meist mehrere (gleiche oder verschiedene) miRNAs an die 3c-UTR der Ziel-mRNA binden, sodass komplexe kombinatorische Effekte den Wirkmechanismus der miRNAs bestimmen (Bartel u. Chen 2004). Studien zum Mechanismus der Translationskontrolle durch miRNAs liefern bisher kontroverse Ergebnisse (Valencia-Sanchez et al. 2006). Eine Hemmung der Translationsinitiation ähnlich der Situation mit maternalen mRNAs (7 1.7.3.2) wurde vor kurzem beschrieben (> Abb. 1.7.9). Dieses Modell ist auch kompatibel mit der Beobachtung, dass miRNAs zur Anreicherung ihrer Ziel-mRNAs in „processing bodies“ (PB) führen. PB bestehen zum Teil aus den gleichen Komponenten wie die oben beschriebenen „germ cell granules“, und mRNA-Assoziierung mit PB erfordert einen Block der Translationsinitiation. Im Gegensatz zu diesem Modell wurde in einer weiteren Studie eine miRNA-stimulierte Dissoziation der Ribosomen während der Translationselongation an der Ziel-mRNA beobachtet. Bedingt durch die weitreichende Rolle von miRNAs in diversen zellulären Prozessen ist zu vermuten, dass eine Fehlsteuerung der miRNA-Expression auch kausal an einer Vielzahl von Erkrankungen beteiligt ist. So ist fast die Hälfte der bekannten miRNAs in krebsassoziier-

Kontrolle der mRNA-Expression durch mikroRNAs Mikro- (mi-)RNAs sind nichtkodierende RNAs von etwa 21 Nukleotiden Länge, die regulatorisch in Entwicklungsprozesse, Zelldifferenzierung und Metabolismus eingreifen. miRNA Klonierungsstrategien und bioinformatische Analysen führten zu der Hypothese, dass die Expression von bis zu 30% der menschlichen Gene durch miRNAs reguliert wird. miRNAs werden zunächst als längere RNAs (pri-miRNAs) transkribiert und noch im Nukleus durch den Ribonukleasekomplex Drosha auf etwa 70–100 Nukleotide große, sekundärstrukturreiche RNAs (pre-miRNAs) verkürzt. Nach dem Transport in das Zytoplasma werden die pre-miRNAs durch Dicer, einen weiteren Multiproteinkomplex, erkannt, der sie in die etwa 22 Nukleotide lange, reife Form überführt. Eingebettet in RISC („RNA-induced silencing

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen . Abb. 1.7.9. Translationsregulation durch miRNAs. miRNA-Bindung an partiell komplementäre 3c-UTRSequenzen führt zur Inhibition der Translation. Aktuelle Untersuchungen beschreiben dies entweder als die Folge einer Hemmung der Translationsinitiation oder einer Dissoziation der Ribosomen während der Elongation

ten chromosomalen Regionen lokalisiert, z. B. an sog. „fragile sites“, also an bekannten chromosomalen Bruchstellen, die bei bestimmten malignen Erkrankungen entweder deletiert („minimal regions of loss of heterozygosity“) oder amplifiziert („minimal amplicons“) sind. So ist beispielsweise das miR15a-16-Cluster in der chromosomalen Region 13q14 lokalisiert, das bei der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) häufig deletiert ist. Für die beiden darin enthaltenen miRNAs konnte gezeigt werden, dass sie die zelluläre Apoptose verstärken, indem sie die Expression des antiapoptotischen Gens BCL-2 verringern. miRNAs können auch selbst Onkogene sein: Das mir-17-92-Cluster führt zur verstärkten Ausprägung des B-Zell-Lymphoms im Tiermodell (Esquela-Kerscher u. Slack 2006; Hammond 2006). Weiterhin spielen miRNAs eine Rolle bei der Insulinsekretion, im Fettsäurestoffwechsel und bei Neurodegenerativen Erkrankungen. Darüber hinaus sind zelluläre miRNAs wichtig für die Replikation von pathogenen Viren, und miRNAs sind auch in den Genomen von Viren kodiert. So braucht beispielsweise das den Menschen infizierende Hepatitis-C-Virus die zelluläre miRNA (miR-122a), um die eigene Replikation zu erleichtern. Die bisher beschriebenen Funktionen einzelner miRNAs scheint allerdings nur die berühmte „Spitze des Eisbergs“ zu sein – es ist zu erwarten, dass miRNAs nicht nur auf fundamentale Weise die Expression des zellulären Transkriptoms kontrollieren, sondern auch als Folge von Fehlregulationen bei vielen verschiedenen Erkrankungen eine Rolle spielen.

1.7.4 Ausblick Der Aufbau eines komplexen Organismus und dessen Fähigkeit, mit der sich ständig verändernden Umwelt zu interagieren, erfordert präzise Kontrollmechanismen

zur Steuerung der Genexpression. In zunehmendem Maße zeigt sich, dass die Kontrolle der mRNA-Translation dazu einen wichtigen Beitrag liefert. Die molekularen Mechanismen der Translationsinitiation und ihre Steuerung sind Gegenstand intensiver Untersuchungen in der Grundlagenforschung, aber auch in der Molekularen Medizin. Es zeigt sich an vielen Stellen, dass durch zunehmende Detailkenntnisse in einem Teilbereich Querverbindungen zu anderen Aspekten dieses Forschungszweigs entstehen. Die Erforschung der Wechselwirkungen zwischen Translationsinitiationsfaktoren und der Regulation ihrer Funktion hat mittlerweile ein hohes Niveau erreicht. Dadurch werden Vorgänge wie die Aktivierung von Zielzellen durch Insulin oder die Zusammenhänge zwischen Translation und natürlichem sowie malignem Zellwachstum auf molekularer Ebene transparent. Aktuelle Beschreibungen des Translationsinitiationsmechanismus am 5c-Ende einer typischen mRNA beziehen mittlerweile eine wichtige Rolle des am 3c-Ende gelegenen Poly(A)-Schwanzes mit ein. Gemeinsam mit den in der 3c-untranslatierten Region gelegenen Steuerelementen regelt der Poly(A)-Schwanz zentrale Vorgänge der Genexpression während der Embryogenese auf translationaler Ebene. Immer mehr Steuerelemente zur posttranskriptionalen Kontrolle der Genexpression werden in 5c- und 3c-untranslatierten mRNA-Regionen identifiziert. Dies hat mittlerweile auch zur der Erkenntnis geführt, dass Krankheiten auf Mutationen in solchen Steuerelementen beruhen können. Das Studium der vielfältigen viralen Strategien zur Nutzung der zellulären Translationsmaschinerie ist ein wichtiger Aspekt der Erforschung der viralen Pathogenese und kann zur Entwicklung von neuen Therapieansätzen führen. Erkenntnisse in diesem Bereich erlauben aber auch ein besseres Verständnis der Translationsmechanismen an zellulären mRNA-Molekülen.

155 1.7 · Mechanismen der Translationskontrolle in Eukaryonten

Danksagung Die Arbeit von T. P. wird durch die Sylvia & Charles Viertel Charitable Foundation, den Australian Research Council und den National Health & Medical Research Council gefördert. Die Arbeit von M. U. M. wird durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft, das Bundesministerium für Forschung und Technik und die Landesstiftung Baden-Württemberg gefördert.

1.7.5

Literatur

Bader AG, Kang S, Zhao L und Vogt PK (2005) Oncogenic PI3K deregulates transcription and translation. Nat Rev Cancer 5: 921–9 Bartel DP und Chen CZ (2004) Micromanagers of gene expression: the potentially widespread influence of metazoan microRNAs. Nat Rev Genet 5: 396–400 Beaumont C, Leneuve P, Devaux I, et al. (1995) Mutation in the iron responsive element of the L ferritin mRNA in a family with dominant hyperferritinaemia and cataract. Nat. Genet. 11: 444–446 Clemens MJ (2004) Targets and mechanisms for the regulation of translation in malignant transformation. Oncogene 23: 3180–8 Delepine M, Nicolino M, Barrett T, Golamaully M, Lathrop GM und Julier C (2000) EIF2AK3, encoding translation initiation factor 2-alpha kinase 3, is mutated in patients with Wolcott-Rallison syndrome. Nat Genet 25: 406–9 Dever TE (2002) Gene-specific regulation by general translation factors. Cell 108: 545–56 Esquela-Kerscher A und Slack FJ (2006) Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nat Rev Cancer 6: 259–69 Gebauer F und Hentze MW (2004) Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol 5: 827–35 Gingras A-C, Raught B und Sonenberg N (1999) eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu. Rev. Biochem. 68: 913–963 Gingras AC, Raught B und Sonenberg N (1999) eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem 68: 913–63 Girelli D, Corrocher R, Bisceglia L, et al. (1995) Molecular basis for the recently described hereditary hyperferritinemia-cataract syndrome: a mutation in the iron-responsive element of ferritin L-subunit gene. Blood 86: 4050–4053 Hammond SM (2006) MicroRNAs as oncogenes. Curr Opin Genet Dev 16: 4–9 Hellen CU und Sarnow P (2001) Internal ribosome entry sites in eukaryotic mRNA molecules. Genes Dev 15: 1593–612 Hentze MW, Muckenthaler MU und Andrews NC (2004) Balancing acts: molecular control of mammalian iron metabolism. Cell 117: 285–97 Holbrook JA, Neu-Yilik G, Hentze MW und Kulozik AE (2004) Nonsense-mediated decay approaches the clinic. Nat Genet 36: 801–8 Holcik M und Sonenberg N (2005) Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol 6: 318–27 Holcik M, Sonenberg N und Korneluk RG (2000) Internal ribosome initiation of translation and the control of cell death. Trends Genet 16: 469–73 Jaeger S, Barends S, Giege R, Eriani G und Martin F (2005) Expression of metazoan replication-dependent histone genes. Biochimie 87: 827–34 Kedersha N, Stoecklin G, Ayodele M, et al. (2005) Stress granules and processing bodies are dynamically linked sites of mRNP remodeling. J Cell Biol 169: 871–84

1.7

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156

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

1.7.6 Zeittafel Der Umfang dieses Kapitels gestattete es nicht, auf die historische Entwicklung der Translationsforschung einzugehen. Für den interessierten Leser bieten sich als Einstieg zwei Übersichtsartikel von Autoren an, die dieses Feld maßgeblich mit beeinflusst haben. Die frühen biochemischen Experimente, die die Grundlagen für das

heutige Verständnis der Proteinsynthese etabliert haben, hat Paul Zamecnik zusammengefasst (Zamecnik 1979). Ein Buchbeitrag von Mathews, Sonenberg und Hershey beschreibt die Anfänge der Forschung zur Kontrolle der Translation (Mathews et al. 2000). Die folgende Tabelle listet darüber hinaus einige Wissenschaftler auf, deren Arbeiten maßgeblich zu den neueren Entwicklungen der Translationsforschung beigetragen haben.

Richard J. Jackson

Beschreibung effizienter zellfreier Translationssysteme aus Kaninchen-Retikulozyten, die breite Anwendung zum Studium der Translationsmechanismen fanden (Craig et al. 1992; Pelham u. Jackson 1976). Experimentelle und konzeptionelle Beiträge zu Mechanismen der Translationsinitiation (Jackson 2000).

Nahum Sonenberg

Beschreibung der Rolle der Cap-Struktur und assoziierter Proteine bei der Translationsinitiation (Sonenberg u. Shatkin 1977). Entdeckung der IRES-abhängigen Translationsinitiation (Pelletier u. Sonenberg 1988). Entdeckung einer Rolle von Translationsinitiationsfaktoren in der Zelltransformation (Lazaris-Karatzas et al. 1990). Beschreibung des Wirkmechanismus von Insulin auf die Proteinsynthese (Pause et al. 1994). Wichtige Beiträge zum Mechanismus der Cap-stimulierten, Poly(A)-stimulierten und IRES-abhängigen Translationsinitiation. Untersuchungen zur Signaltransduktion und Proteinsynthese (Sonenberg et al. 2000).

Hans Trachsel

Studien zur Regulation der Translation durch Phosphorylierung von Initiationsfaktoren (Farrell et al. 1977). Erkenntnisse zur Rolle der Cap-Struktur und interagierender Proteine bei der Translationsinitiation (Sonenberg et al. 1981).

Marylin Kozak

Aufstellung des Scanningmodells der Cap-abhängigen Translationsinitiation (Kozak 1978). Beschreibung der Kontexteffekte für die Erkennung des Startkodons (Kozak 1986).

Lynn E. Maquat

Abbau der β-Globin-mRNA in β-Thalassämie durch ein frühzeitiges Stoppkodon (Maquat et al. 1981).

Marvin Wickens

Beschreibung des Polyadenylierungssignals und des daran bindenden zytoplasmatischen CPSF. Wichtige Beiträge zur Translationskontrolle und Poly(A)-Schwanzlängenveränderung während der Oozytenreifung (Fox et al. 1989; Sheets et al. 1995; Wickens u. Stephenson 1984).

Matthias W. Hentze

Endeckung des »iron-responsive element« in der 5‘-UTR der Ferritin-mRNA (Hentze et al. 1987). Aufklärung von molekularen Mechanismen der Translationskontrolle durch RNA-Protein-Wechselwirkungen in der 5‘- und 3‘-UTR (Muckenthaler et al. 1998; Ostareck et al. 2001).

Joel D. Richter

Entdeckung eines zytoplasmatischen Polyadenylierungs-Kontrollelements (CPE) und daran bindender Faktoren (CPEB) (Hake u. Richter 1994; McGrew et al. 1989; Stebbins-Boaz et al. 1999).

Peter Sarnow

Entdeckung des ersten IRES-Elements in einer zellulären mRNA (Sarnow 1989; Macejak u. Sarnow 1991). Beschreibung des ersten zellfreien Systems zum Studium der translationalen Synergie zwischen CapStruktur und Poly(A)-Schwanz (Iizuka et al. 1994).

Anne Ephrussi

Lokalisierung und Translationskontrolle von oskar am posterioren Pol von Drosophila-Eizellen (Ephrussi et al. 1991; Ephrussi u. Lehmann 1992; Gunkel et al. 1998).

Marla J. Berry

Beschreibung eines 3‘-UTR-Elements, das die Dekodierung des Stoppkodons als Selenocystein-Kodon steuert (Berry et al. 1991 a,b).

Victor Ambros

Beschreibung der ersten miRNAs und ihres Regulationsmechanismus durch genetische Analyse der Entwicklung des Wurmes C. elegans (Lee u. Ambros 2001; Lee et al. 1993).

Elizabeth R. Gavis

Kontrolle der nanos-mRNA-Translation in Drosophila melanogaster (Crucs et al. 2000; Gavis et al. 1996).

Alan B. Sachs

Beschreibung eines molekularen Mechanismus für die Funktion des Poly(A)-Schwanzes in der Translationsinitiation (Tarun u. Sachs 1996; Wells et al. 1998).

Carlo Croce

Erste Befunde, dass miRNAs eng mit der Krebsentstehung verknüpft sein können (Calin et al. 2002; Calin et al. 2004).

Tom Tuschel David Bartel

Klonierungsstrategien und bioinformatische Analysen zeigen die weite Verbreitung von miRNAs in Tieren, Pflanzen und Viren (Jones-Rhoades u. Bartel 2004; Lagos-Quintana et al. 2002; Pfeffer et al. 2004).

157 1.7 · Mechanismen der Translationskontrolle in Eukaryonten

Literatur zur Zeittafel Berry MJ, Banu L, Chen YY, et al. (1991 a) Recognition of UGA as a selenocysteine codon in type I deiodinase requires sequences in the 3c untranslated region. Nature 353: 273–6 Berry MJ, Banu L und Larsen PR (1991 b) Type I iodothyronine deiodinase is a selenocysteine-containing enzyme. Nature 349: 438–40 Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M, et al. (2002) Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 15524–9 Calin GA, Sevignani C, Dumitru CD, et al. (2004) Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 2999– 3004 Craig D, Howell MT, Gibbs CL, Hunt T und Jackson RJ (1992) Plasmid cDNA-directed protein synthesis in a coupled eukaryotic in vitro transcription-translation system. Nucleic Acids Res 20: 4987–95 Crucs S, Chatterjee S und Gavis ER (2000) Overlapping but distinct RNA elements control repression and activation of nanos translation. Mol Cell 5: 457–67 Ephrussi A, Dickinson LK und Lehmann R (1991) Oskar organizes the germ plasm and directs localization of the posterior determinant nanos. Cell 66: 37–50 Ephrussi A und Lehmann R (1992) Induction of germ cell formation by oskar. Nature 358: 387–92 Farrell PJ, Balkow K, Hunt T, Jackson RJ und Trachsel H (1977) Phosphorylation of initiation factor elF-2 and the control of reticulocyte protein synthesis. Cell 11: 187–200 Fox CA, Sheets MD und Wickens MP (1989) Poly(A) addition during maturation of frog oocytes: distinct nuclear and cytoplasmic activities and regulation by the sequence UUUUUAU. Genes Dev 3: 2151–62 Gavis ER, Curtis D und Lehmann R (1996) Identification of cis-acting sequences that control nanos RNA localization. Dev Biol 176: 36–50 Gunkel N, Yano T, Markussen FH, Olsen LC und Ephrussi A (1998) Localization-dependent translation requires a functional interaction between the 5c and 3c ends of oskar mRNA. Genes Dev 12: 1652–64 Hake LE und Richter JD (1994) CPEB is a specificity factor that mediates cytoplasmic polyadenylation during Xenopus oocyte maturation. Cell 79: 617–27 Hentze MW, Caughman SW, Rouault TA, et al. (1987) Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science 238: 1570–1573 Iizuka N, Najita L, Franzusoff A und Sarnow P (1994) Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 14: 7322–7330 Jackson RJ (2000). Comparative view of initiation site selection mechanisms. In: Sonenberg N, Hershey JBW und Mathews MB (Hrsg). Translational Control of Gene Expression. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York: 185– 244 Jones-Rhoades MW und Bartel DP (2004) Computational identification of plant microRNAs and their targets, including a stressinduced miRNA. Mol Cell 14: 787–99 Kozak M (1978) How do eucaryotic ribosomes select initiation regions in messenger RNA? Cell 15: 1109–1123

1.7

Kozak M (1986) Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell 44: 283–292 Lagos-Quintana M, Rauhut R, Yalcin A, Meyer J, Lendeckel W und Tuschl T (2002) Identification of tissue-specific microRNAs from mouse. Curr Biol 12: 735–9 Lazaris-Karatzas A, Montine KS und Sonenberg N (1990) Malignent transformation bya eukaryotic initiation factor subunit nthat binds to mRNA 5’cap. Nature 345: 544–547 Lee RC und Ambros V (2001) An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science 294: 862–4 Lee RC, Feinbaum RL und Ambros V (1993) The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 75: 843–54 Macejak DG und Sarnow P (1991) Internal initiation of translation mediated by the 5’ leader of a cellular mRNA. Nature 353: 90–94 Maquat LE, Kinniburgh AJ, Rachmilewitz EA und Ross J (1981) Unstable beta-globin mRNA in mRNA-deficient beta o thalassemia. Cell 27: 543–53 Mathews MB, Sonenberg N und Hershey JBW (2000). Origins and principles of translational control. In: Sonenberg N, Hershey JBW und Mathews MB (Hrsg). Translational Control of Gene Expression. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York: 1–31 McGrew LL, Dworkin-Rastl E, Dworkin MB und Richter JD (1989) Poly(A) elongation during Xenopus oocyte maturation is required for translational recruitment and is mediated by a short sequence element. Genes Dev 3: 803–15 Muckenthaler M, Gray NK und Hentze MW (1998) IRP-1 binding to ferritin mRNA prevents the recruitment of the small ribosomal subunit by the cap-binding complex eIF4F. Molecular Cell 1: 383–388 Ostareck DH, Ostareck-Lederer A, Shatsky IN und Hentze MW (2001) Lipoxygenase mRNA silencing in erythroid differentiation: The 3’UTR regulatory complex controls 60S ribosomal subunit joining. Cell 104: 281–90 Pause A, Belsham GJ, Gingras AC, et al. (1994) Insulin-dependent stimulation of protein synthesis by phosphorylation of a regulator of 5’-cap function [see comments]. Nature 371: 762–7 Pelham HR und Jackson RJ (1976) An efficient mRNA-dependent translation system from reticulocyte lysates. Eur J Biochem 67: 247–56 Pelletier J und Sonenberg N (1988) Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature 334: 320–325 Pfeffer S, Zavolan M, Grasser FA, et al. (2004) Identification of virusencoded microRNAs. Science 304: 734–6 Sheets MD, Wu M und Wickens M (1995) Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation. Nature 374: 511–6 Sonenberg N, Guertin D, Cleveland D und Trachsel H (1981) Probing the function of the eucaryotic 5c cap structure by using a monoclonal antibody directed against cap-binding proteins. Cell 27: 563–72 Sonenberg N, Hershey JWB und Mathews MB, Eds. (2000). Translational Control of Gene Expression. Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press Sonenberg N und Shatkin AJ (1977) Reovirus mRNA can be covalently crosslinked via the 5’ cap to proteins in initiation complexes. Proc Natl Acad Sci U S A 74: 4288–92

158

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

Stebbins-Boaz B, Cao Q, de Moor CH, Mendez R und Richter JD (1999) Maskin is a CPEB-associated factor that transiently interacts with elF- 4E [published erratum appears in Mol Cell 2000 Apr;5(4):following 766]. Mol Cell 4: 1017–27 Tarun SZ, Jr und Sachs AB (1996) Association of the yeast poly(A) tail binding protein with translation initiation factor eIF-4G. EMBO J. 15: 7168–7177

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1.8 1.8 Molekulare Grundlagen der Apoptose Peter Daniel

1.8.1

Eine biologische Rationale des programmierten Zelltods – 160

1.8.2

Kompartimentierung von Zelltodsignalen – 162

1.8.3

Zelltodsignalwege – 162

1.8.3.1 1.8.3.2 1.8.3.3 1.8.3.4 1.8.3.5

Extrinsischer Signalweg – 164 Intrinsischer Signalweg – 166 Caspasen - Effektormoleküle der Apoptose – 171 Endphase der Apoptose und Elimination apoptotischer Zellen – 174 Caspaseunabhängiger und nichtapoptotischer Zelltod – 175

1.8.4

Stressinduzierte Signalwege – 176

1.8.4.1 1.8.4.2 1.8.4.3 1.8.4.4

Die integrierte Stressantwort des endoplasmatischen Retikulums – 176 DNA-Schädigung, p53-Signalweg und nukleäre Stressantwort – 178 PI3-/Akt-Kinase-/mTOR-Signalweg – 180 Telomerverkürzung, DNA-Schädigung und Seneszenz – 181

1.8.5

Störungen der Zelltodregulation in der Pathogenese von Erkrankungen – 182

1.8.5.1 1.8.5.2 1.8.5.3 1.8.5.4 1.8.5.5

Immunsystem – 182 Infektionskrankheiten – 185 Herz-Kreislauf-Erkrankungen – 187 Degenerative Erkrankungen – 187 Tumorerkrankungen – 189

1.8.6

Ausblick

– 194

1.8.7

Literatur

– 194

1.8.8

Zeittafel

– 200

Literatur zur Zeittafel

– 202

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

160

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

1.8.1 Eine biologische Rationale des programmierten Zelltods Mit der Evolution multizellulärer Organismen wurde es nötig, genetische Programme zu entwickeln, die soziale Interaktionen im Gewebsverband regulieren. Die Entwicklung spezialisierter Gewebe erfordert nicht nur Zellwachstum an der richtigen Stelle und Differenzierung in die entsprechenden spezialisierten Zelltypen, sondern auch die gezielte Elimination überflüssiger oder gar unerwünschter Zellen. Um diesen „altruistischen“ Zelltod zu regulieren, haben tierische Zellen genetisch determinierte Regulationsmechanismen entwickelt, die im entwicklungsbiologischen Kontext als „programmierter Zelltod“ bezeichnet werden, da der Zelltod durch genetisch determinierte Programme zu genau definierten Zeitpunkten in den zu eliminierenden Gewebsarealen induziert wird. Dieser Begriff umfasst verschiedene Zelltodtypen, von denen die Apoptose der am besten untersuchte Mechanismus ist (Golstein et al. 2003). Zelltod spielt jedoch nicht nur in der Embryonalentwicklung und Organogenese eine wesentliche Rolle (> Abb. 1.8.1a–c), sondern auch in der Aufrechterhaltung der Homöostase adulter, ausgereifter Gewebe. Einerseits werden hierdurch gealterte Zellen, z. B. in Haut und Schleimhäuten, aus dem Gewebsverband entfernt. Andererseits werden Zelltodsignalwege auch in gestressten Zellen aktiviert, z. B. nach oxidativem Stress oder auch Hypoxie, Wachstumsfaktorentzug, Überproduktion aberranter oder fehlgefalteter Proteine oder Aktivierung von Onkogenen oder Tumorsuppressorgenen im Rahmen einer gestörten Zellproliferation. Hierdurch werden geschädigte oder gar gefährliche Zellen aus dem Gewebsverband entfernt, und zwar gezielt und unter Vermeidung von Entzündungsreaktionen, d. h. ohne Gewebsschädigung. Erst durch solche exakt regulierten und gezielt aktivierbaren Zelltodmechanismen war die Entstehung multizellulärer Organismen mit komplexen Gewebs- und Organstrukturen möglich. Morphologisch und biochemisch können im Wesentlichen vier Zelltodformen unterschieden werden: Apoptose, Autophagie, mitotische Katastrophe und Nekrose (Clarke u. Clarke 1996). Apoptose (griech. „apo“ für „weg“ und „ptosis“ für „Fall“) wurde 1972 von den Pathologen Kerr, Wyllie und Currie als eigenständiges und bedeutendes zellbiologisches Phänomen definiert. Jedoch wurden bereits im 19. Jahrhundert Zelltodphänomene beschrieben, vorwiegend im Kontext von entwicklungsbiologischen Veränderungen von Geweben. Ein exzellenter Überblick zur Geschichte der Zelltodforschung, vor allem im 19. Jahrhundert, wurde von Clarke zusammengestellt (Clarke u. Clarke 1996). Durch die klassische Morphologie mit Kernschrumpfung, Kondensation des Chromatins im Zellkern, Frag-

a

d

b

c

. Abb. 1.8.1a–d. Entwicklungsbiologie und Morphologie des apoptotischen Zelltods. Für eine regelrechte Organentwicklung im Rahmen der Embryogenese müssen, neben der gezielten Zellvermehrung, ausgewählte Zellen und Gewebsareale aktiv entfernt werden. Gezeigt ist die Elimination von Zellen aus den Zehenzwischenräumen zwischen Tag 51 (a) und Tag 60 (b) der Embryogenese. In c sind apoptotische Zellen (tiefblau) in einem Querschnitt durch die Zehenknospen dargestellt. Wäre die Apoptose dieser Zellen behindert, dann würden schwimmhautartige Gewebsareale zwischen den Zehen verbleiben. d zeigt elektronenmikroskopische Aufnahmen einer normalen, vitalen Zelle (oben) im Vergleich zu einer apoptotischen Zelle (Mitte) mit kondensiertem, scholligem Chromatin (1), beginnender Fragmentierung des Zellkerns (2), Abschnürung von Zytosol enthaltenden Plasmamembranvesikeln (Blebbing, Zeiose; 3) und geschwollenen Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum (4). Bei Autophagie hingegen zeigt die sterbende Zelle (unten) eine Zunahme von Vesikeln im Zytosol, die Lysosomen entsprechen, die Zellbestandteile endophagozytiert haben und im Fall der Aufnahme von Organellen typische Doppelmembranen aufweisen (5). Sowohl bei Autophagie als auch bei Apoptose bleibt die Zellmembran, im Gegensatz zur Nekrose, über lange Zeiträume intakt

161 1.8 · Molekulare Grundlagen der Apoptose

mentierung des Zellkerns und Ausstülpung von Zellmembranblasen infolge der Zerstörung des Zytoskeletts bei gleichzeitig erhaltener Integrität der Plasmamembran, kann die Apoptose, die auch nach der Klassifikation von Schweichel und Merker als Typ I- (heterophagischer) Zelltod bezeichnet wird (Clarke 1990; Schweichel u. Merker 1973), einfach von der Autophagie (Typ II) und einem regulierten, nekroseähnlichen Zelltod (Typ III-, nichtlysosomaler Zelltod) mit Anschwellen der Organellen, der Zelle und Zerstörung der Plasmamembran abgegrenzt werden (> Abb. 1.8.1d). Durch Abschnürung von ausgestülpten Membrananteilen kommt es zur Bildung apoptotischer Körperchen, die auch Kernfragmente enthalten können. Apoptotische Zellen und apoptotische Körperchen werden durch Phagozytose von professionellen Phagozyten und auch benachbarten Gewebszellen rasch und ohne Entzündungsreaktion und Gewebsschädigung entfernt. Hingegen ist die Nekrose, wie bereits von Rudolf Virchow beschrieben, die schwerste Form der Zell- und Gewebszerstörung (griech. „nekros“ für „Tod“) und geht mit allenfalls defekter Gewebsregeneration und Narbenbildung einher. In nekrotischen Zellen kommt es sehr früh zur Permeabilisierung der Zellmembran, Zellkern und Organellen schwellen an, ohne dass es zur Chromatinkondensation kommt. Wesentlich für die Apoptosemorphologie ist die Aktivierung von Effektorproteasen, den Caspasen (7 1.8.3.3), welche die Zelle von innen heraus abbauen, sowie die Hemmbarkeit des apoptotischen Zelltods durch das antiapoptotische Protein Bcl-2 (7 1.8.3.2). Beides trifft für die Nekrose nicht zu. Während die Apoptose ein aktiv regulierter und energieabhängiger Vorgang ist, ist Nekrose für die betroffene Zelle ein passives Ereignis, das z. B. durch thermische, mechanische oder chemische Schädigung der Zelle ausgelöst werden kann. Autophagozytose, kurz Autophagie, die auch als Typ-II-Zelltod bezeichnet wird, ist eine Stress- und Anpassungsreaktion der Zelle auf Wachstumsfaktor-, Substrat- oder Energiemangel. Typischerweise kommt es zur Aufnahme von Zellbestandteilen, insbesondere auch Organellen, in Lysosomen, die dann als Autophagosomen in der Zelle nachweisbar sind und, im Fall der Autophagozytose von Organellen, elektronenmikroskopisch typische Doppelmembranstrukturen zeigen (> Abb. 1.8.1d). Durch den lysosomalen Abbau gelingt es der Zelle, den Energiestoffwechsel aufrechtzuerhalten, bis schließlich die ersten Zellfunktionen versagen. Autophagie geht nicht mit Caspaseaktivierung einher, und in gestressten Zellen wird Autophagie durch das apoptosehemmende Bcl-2 sogar begünstigt, da der Stressor in diesem Fall keine Apoptose auslösen kann und das Überleben der gestressten Zelle verlängert wird. Dies ist sinnvoll, da die Zufuhr von Wachstumsfaktoren, Sub-

1.8

straten und Energie den Autophagieprozess umkehren kann, um nach der Überwindung des Mangels klonogenes Überleben zu ermöglichen (Lum et al. 2005). Die mitotische Katastrophe ist ein archaischer Zelltodmechanismus, der in proliferierenden Zellen infolge von Fehlern in der mitotischen Zellteilung, z. B. Defekten im mitotischen Spindelapparat und aberranter Verteilung von Chromosomen in die Tochterzellen, ausgelöst werden kann. Sie wurde 1989 erstmals in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe als von der mitotischen p34cdc2- (CDK1-)Kinase-abhängiger Mechanismus beschrieben. Sie ist weder Bcl-2- noch caspasereguliert (Okada u. Mak 2004). Morphologisch geht sie mit einer Vergrößerung des Zellkerns und, aufgrund des Ausbleibens der Anaphase, mit Vermehrung des Chromosomensatzes, also Verlust von Euploidie (Diploidie) und Entwicklung einer Polyploidie, einher. Durch asymmetrische, abortive Mitosen kann es zur Bildung von Mikronuklei kommen. Erschwert wird die Betrachtung dieser Zelltodformen dadurch, dass es Mischformen geben kann, z. B. geht Apoptose nach längerer Zeit und Zusammenbruch des Energiemetabolismus, d. h. ATP-Depletion, in vitro in eine Nekrose über (Searle et al. 1975). In vivo wird dies nicht beobachtet, da apoptotische Zellen auf ihrer Oberfläche ein „Iss-mich“-Signal präsentieren und rasch, ohne Entzündungsreaktion, phagozytiert werden (Krysko et al. 2006). Ist die Mitochondrienfunktion und ATPSynthese gestört, dann kann regulierter Zelltod aber auch von vornherein in einem nekrotischen Phänotyp resultieren (Martinou u. Green 2001; Scholz et al. 2005; Zong et al. 2004). Im Organismus wäre dies fatal, da die Nekrose infolge der Freisetzung von Zellinhalten ein „Gefahr“-Signal darstellt und zur Aktivierung von Entzündungsreaktionen und resultierender Gewebeschädigung führen kann. Interessanterweise unterscheiden sich diese Signalwege und zellulären Reaktionsformen in tierischen Zellen fundamental von denen in Pflanzenzellen (Lam 2004). Entwicklungsgeschichtlich haben sich diese Programme also erst spät, nach Auftrennung in Tier- und Pflanzenwelt, entwickelt. Auch in Pilzen, z. B. Hefen, finden sich nicht sämtliche Komponenten von Zelltodsignalwegen wieder. Obwohl einzelne Arbeiten von regulierten Zelltodwegen schon in Bakterien wie Escherichia coli berichten, findet sich das evolutionär älteste Zelltodprogramm erst im fakultativen Vielzeller Dictyostelium. Um Zeiten knapper Ressourcen zu überstehen, bilden diese amöboiden Einzelzellen unter Nahrungsentzug einen multizellulären Organismus, der in der Bildung von Sporen resultiert. Hierfür sterben die Zellen im Stiel der Sporenkapsel über einen apoptoseähnlichen Mechanismus mit typischer Kernmorphologie und Chromatinkondensation (Golstein et al. 2003). Wesentlich fortschrittlichere

162

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

. Abb. 1.8.2. Evolutionär konservierte Apoptoseregulation. Apoptosesignalwege sind evolutionär konserviert. Die wesentlichen Komponenten des Bcl-2-regulierten intrinsischen Apoptosewegs finden sich sowohl beim Wurm C. elegans als auch beim Menschen und anderen Säugern: Egl-1 und BH3-only-Proteine, ced-4 und APAF-1, CED-3 und die Initiatorcaspase-9 bzw. Effektorcaspase-3. Allen Apop-

tosewegen ist zudem gemeinsam, dass es über Liganden zur Ausbildung signaltransduzierender Proteinkomplexe kommt. Diese Komplexe rekrutieren Adapterproteine, die wiederum Initiatorcaspasen binden und hierdurch deren Aktivierung auslösen. Dieses Prinzip findet sich auch beim extrinsischen, über Todesrezeptoren regulierten Signalweg

und denen des Menschen in weiten Zügen ähnliche Zelltodprogramme finden sich bei der Fruchtfliege Drosophila melanogaster und dem Wurm Caenorhabditis elegans. Für die Erforschung der Organentwicklung und des programmierten Zelltods in C. elegans erhielten Sidney Brenner, Robert Horvitz und John Sulston im Jahre 2002 den Nobelpreis für Medizin und Physiologie. Neben dem entwicklungsbiologisch programmierten Zelltod spielt der regulierte Zelltod eine zentrale Rolle bei der Reaktion der Zelle auf verschiedenste StressStimuli. Diese reichen von exogenen Noxen, wie z. B. Hypoxie, aber auch oxidativer Stress oder ionisierende Bestrahlung und die damit verbundene DNA-Schädigung, bakteriellen Infektionen oder die Attacke durch Killerzellen des Immunsystems bis hin zu endogen aktivierten Stressreaktionen, z. B. infolge von Störungen in der Zellzyklusregulation, Missfaltung von Proteinen im endoplasmatischen Retikulum oder der Elimination gealterter Zellen im Rahmen der Gewebserneuerung und Gewebshomöostase.

(Kischkel et al. 1995) bzw. des Apoptosoms (Li et al. 1997), an die sich eine kaskadenartig verstärkende Aktivierung einander nachgeschalteter apoptosefördernder Faktoren anschließt, welche die Aktivierung apoptoseausführender Enzyme, der Caspasen, vermitteln. Diese Nutzung von Proteinkomplexen zur Aktivierung von Effektormolekülen der Apoptose ist ein evolutionär konserviertes Prinzip, das zu solch archaischen Organismen wie C. elegans zurückverfolgt werden kann (> Abb. 1.8.2). Hierdurch wird nicht nur eine versehentliche Aktivierung potenziell letaler Signale minimiert, sondern auch eine Fokussierung von Signalkomplexen innerhalb der für den Signalweg wichtigen Kompartimente wie der Plasmamembran oder Zellorganellen erleichtert. Wird z. B. die Initiatorcaspase-8 zufällig außerhalb eines solchen Signalkomplexes proteolytisch in die theoretisch aktiven Untereinheiten gespalten, so zeigt sich dennoch keine wesentliche Enzymaktivität. Nur die innerhalb von Signalkomplexen wie dem DISC gebundene und durch das Prinzip der induzierten Nähe (7 1.8.3.1) aktivierte Initiatorcaspase kann ihre Funktion effizient entfalten (Shi 2004).

1.8.2 Kompartimentierung von Zelltodsignalen 1.8.3 Zelltodsignalwege Programmierter Zelltod, Apoptose, wird durch distinkte Signale und Signalwege reguliert. Ein diesen Signalwegen gemeinsames Prinzip ist die Ausbildung eines zytosolischen, todesinduzierenden Signaltransduktionskomplexes des DISC („death-inducing signaling complex“)

Konzeptionell können zwei wesentliche Apoptosesignalwege unterschieden werden (> Abb. 1.8.3). Der extrinsische Apoptoseweg dient der Erkennung regulierter Apoptosesignale aus der Zellumgebung. Über diesen

163 1.8 · Molekulare Grundlagen der Apoptose

1.8

. Abb. 1.8.3. Apoptosesignalwege. Zwei wesentliche Apoptosesignalwege werden voneinander unterschieden: Der extrinsische, durch Zelltodliganden und Todesrezeptoren aktivierte (linker Teil der Abbildung) und der intrinsische Signalweg, der durch Mitochondrien und das endoplasmatische Retikulum (ER) reguliert und durch intrazelluläre Stress-Signale, z. B. nach DNA-Schädigung im Zellkern oder ER-Stress, aktiviert wird. Gemeinsam ist beiden Apoptosewegen die Aktivierung von Effektorcaspasen über signalwegspezifische Initiatorcaspasen. Die Aktivierung der Initiatorcaspase erfolgt in einem Signalkomplex, wodurch eine Kompartimentierung von Zelltodsignalen an ausgewählten Orten in der Zelle erreicht wird. Im extrinsischen Signalweg erfolgt dies im DISC („death inducing signaling complex“), der aus Todesligand, -rezeptor, dem Adapter FADD und der Initiatorcaspase-8 (oder -10) gebildet wird und durch FLIP-Proteine gehemmt werden kann. Im intrinsischen Signalweg wird die Initiatorcaspase-9 im Apoptosom gebunden und aktiviert, das energieabhängig über einen dATP-abhängigen Mechanismus aus dem Adapter APAF-1 und Cytochrom c gebildet wird. Reguliert wird der intrinsische Weg über die Bcl-2-Genfamilie: BH3-only-Proteine inaktivieren antiapoptotische Bcl-2-Familienproteine oder binden direkt an Bax und/oder Bak. Hierdurch werden Bax und Bak aktiviert und permeabilisieren die äußere Mitochondrienmembran. Hierdurch werden der APAF-1-Aktivator Cytochrom c und Smac freigesetzt. Smac hemmt die IAP-Proteine, wodurch eine wirksame Aktivierung von Effektorcaspasen ermöglicht wird

Mechanismus können gezielt unerwünschte Zellen aus einem Gewebsverband eliminiert werden. Er wird durch Todesliganden aktiviert, die von benachbarten Zellen parakrin oder von der betroffenen Zelle selbst autokrin gebildet und freigesetzt werden. Die Todesliganden binden an Todesrezeptoren, die daraufhin oligomerisieren. Der durch Bindung des Todesliganden stabilisierte Komplex aus Ligand und Rezeptor bindet daraufhin Adaptermoleküle und kann hierdurch Effektormoleküle der Apoptose, Caspasen, im Komplex binden, die dann konsekutiv innerhalb des Komplexes aktiviert werden und die Endphase des Zelltods einleiten. Der intrinsische Zelltodsignalweg wird hingegen über intrazellulär erzeugte Signale eingeleitet, z. B. nach Schädigung der zellulären DNA (nukleärer Stress), massiver Akkumulation fehlgefalteter Proteine [endoplasmatisches-Retikulum- (ER-)Stress] oder unter nutritivem Stress bei Entzug von Wachstumsfaktoren (> Abb. 1.8.3).

Er wird durch die zelltodfördernden und zelltodhemmenden Mitglieder der Bcl-2-Genfamilie (7 1.8.3.2) kontrolliert (Daniel et al. 2003). Das wesentliche Charakteristikum des intrinsischen Wegs ist aber, dass er über spezifische, organellenvermittelte Signalwege ausgeführt wird. Dies erlaubt eine Kompartimentierung und subzellulär fokussierte Aktivierung und Regulation von Signalen. Wesentliche Organellensysteme hierfür sind die Mitochondrien, das endoplasmatische Retikulum, die Lysosomen und der Zellkern. Wie im Falle der Todesrezeptoren wird eine Kompartimentierung von Zelltodsignalen zudem durch die Bildung von Proteinsignalkomplexen erzielt. Im Fall des intrinsischen Signalwegs, der Mitochondrien zur Freisetzung proapoptotischer Faktoren in das Zytosol stimuliert, ist dies das Apoptosom, das analog zum DISC im Zytosol gebildet wird (Li et al. 1997).

164

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

. Abb. 1.8.4. Genfamilie der TNF-ähnlichen Rezeptoren. Gemeinsam ist diesen Rezeptoren die Organisation in cysteinreiche extrazelluläre Domänen, die eine Trimerisierung der Rezeptoren ermöglichen. Stabilisiert werden diese Rezeptortrimere nach Bindung der spezifischen Liganden aus der TNF-Supergenfamilie (oberer Teil). Rot umrandet ist die Unterfamilie der Todesrezeptoren, die durch das

Vorhandensein einer Todesdomäne charakterisiert sind. Über die Todesdomäne werden über homotypische Interaktionen die Adapterproteine FADD und TRADD rekrutiert, die ebenfalls eine Todesdomäne tragen. Die anderen Rezeptorfamilienmitglieder aktivieren bevorzugt den NF-NB-Signalweg, wirken also eher zellaktivierend und antiapoptotisch

1.8.3.1 Extrinsischer Signalweg

ohne Transmembran- und zytosolische Signaltransduktionsdomänen oder um membrangebundene Rezeptoren ohne funktionelle zytosolische Todesdomänen handelt. Decoy-Rezeptoren werden z. B. durch alternatives Spleißen gebildet. Die biologische Funktion der Decoy-Rezeptoren für die Apoptoseregulation, vor allem in vivo und für experimentelle Tumortherapien mit Todesliganden, wie z. B. TRAIL, ist jedoch noch völlig ungeklärt. Dies gilt insbesondere für die Frage, ob durch diese Köderrezeptoren in malignen Tumoren Resistenzen gegenüber apoptoseinduzierenden Liganden ausgelöst werden können.

Todesrezeptoren Diese in der Plasmamembran lokalisierten Transmembranrezeptoren sind durch ihre Primärstruktur repetitiver cysteinreicher extrazellulärer Domänen charakterisiert, welche die Bindung der Liganden als Trimer ermöglichen und die Trimerisierung dieser Rezeptoren vermitteln (Daniel et al. 2001). Zusätzlich enthalten sie im intrazellulären Teil eine als Todesdomäne („deathdomain“, DD) bezeichnete Aminosäuresequenz, welche die Bindung von signaltransduzierenden Adapterproteinen und die Bildung des DISC ermöglicht (Medema et al. 1997). Gegenwärtig sind 6 Death-Rezeptoren bekannt: Der 55-kDa-TNF-Rezeptor (TNF-R1), CD95 (APO-1, Fas), die TRAIL-Rezeptoren DR4 (TRAIL-R1; „death receptor“, DR) und DR5 (TRAIL-R2), sowie DR3 und DR6 (> Abb. 1.8.4). Neben den Todesrezeptoren enthält diese Supergenfamilie aber eine Vielzahl von Rezeptoren ohne Todesdomäne, die in den jeweiligen Signalwegen und Geweben häufig wichtige Überlebenssignale vermitteln. Sog. Köderrezeptoren (Decoy-Rezeptoren) wiederum können Liganden der Death-Rezeptoren binden und sequestrieren, da es sich entweder um lösliche Moleküle

DISC-Bildung und das Prinzip der induzierten Nähe Die Bindung der entsprechenden Liganden (CD95-/ Fas-Ligand), TNF (Tumor Nekrose Faktor) oder TRAIL („TNF-related apoptosis inducing ligand“) induziert und stabilisiert die Trimerisierung der Todesrezeptoren und erhöht hierdurch die lokale Konzentration der Rezeptoren am Ort der Ligandenbindung. Durch das Prinzip der induzierten Nähe wird hierdurch auch die Bindung der Adapterproteine an die Todesdomäne (DD) des Rezeptor-Oligomers vermittelt (> Abb. 1.8.5). Als Adapterproteine wirken FADD („Fas associated death domain“)

165 1.8 · Molekulare Grundlagen der Apoptose

. Abb. 1.8.5. Biologisches Prinzip der induzierten Nähe. Durch Bildung von Proteinkomplexen wird in todesinduzierenden Signalkomplexen eine lokale Anreicherung und durch Adapterproteine vermittelte induzierte Nähe von Procaspase-Zymogenen erreicht, die sich hierdurch autokatalytisch selbst aktivieren und als aktive Caspasen dann nachgeschaltete Effektorcaspasen aktivieren. Gezeigt ist der TNF-induzierte DISC („death inducing signaling complex“, linker Teil der oberen Abbildung) und das mitochondriale APAF-1 Apoptosom, die eine Aktivierung der Procaspase-8 bzw. -9 vermitteln. Dieses Prinzip der induzierten Nähe (blaue Pfeile) ist sehr effektiv, um Signale lokal zu kompartimentieren, evolutionär konserviert und findet sich z. B. auch bei der Aktivierung des NF-NB-regulierenden IKK-Kinasekomplexes. Dort wird die IKK-Kinase am TNF-Rezeptor-/Adapterproteinkomplex oder NOD-Protein-Komplexen (z. B. Inflammasom) rekrutiert und vermittelt dort die Phosphorylierung und Hemmung des inhibitorischen INB-Proteins. Hierdurch wird die Aktivierung des dimeren Transkriptionsfaktors NF-NB ermöglicht

1.8

im TNF-R1, TRAIL und CD95-/Fas-Signalweg bzw. RIP1 („receptor interacting protein 1“) und RAIDD („RIP-associated ICH-1/Ced-3-homologous protein with a death domain“) im TNF-R1-Signalweg (Daniel et al. 2001). Im Fall der TRAIL-Rezeptoren und des CD95-Todesrezeptors bindet FADD direkt an die DD des Rezeptors, im Fall von TNF ist hierzu noch die Bindung des Adapterproteins TRADD (TNF-receptor associated DD) erforderlich. Dort vermittelt TRADD auch die Bindung der RIP-Kinase, welche die Aktivierung des NF-NB-Signalwegs über die INB-Kinase (IKK) vermittelt. Die zusammengelagerten Rezeptoren binden und aktivieren über diese Adapterproteine die als Inducerbzw. Initiatorcaspasen bezeichneten Effektorenzyme der Apoptose, die hierdurch zu den aktiven heterotetrameren Caspasen gespalten und prozessiert werden. Caspase-8 ist die dominante, durch den Todesrezeptor aktivierte Caspase und wird, über FADD, z. B. von den TRAILRezeptoren (DR3, 4 und 5), CD95/Fas und TNF-R1 gebunden und aktiviert. Die der Caspase-8 nahe verwandte Caspase-10 wirkt vorwiegend im TRAIL-Rezeptorweg, kann aber Caspase-8 auch im CD95-DISC funktionell komplementieren. Der TNF-R1 kann die Procaspase-2 über die TRADD-, RIP- und RAIDDAdapterproteine in den DISC binden. Kürzlich wurde auch eine Bindung der Procaspase-2 in den CD95-/ Fas-DISC beschrieben. Allerdings trägt die Procaspase-2 eine CARD- und keine DED-Domäne (7 1.8.3.3), und der Mechanismus der Bindung in den Komplex, insbesondere die Natur des beteiligten Adapterproteins, ist daher noch unklar (Riedl u. Shi 2004). Die Aktivierung dieser Initiatorcaspasen erfolgt durch das Prinzip der induzierten Nähe. Die Frage, ob hierzu die proteolytische Spaltung in die p10- und p20-Untereinheiten und Bildung von p20-/p10-Heterotetrameren erfolgen muss, wie sie im Fall der Effektorcaspasen zwingend erforderlich ist, wird kontrovers diskutiert (Shi 2004). Weiterhin konnte ein membranunabhängiger, zytosolischer Caspase-8/FADD-Komplex nach TNF-R1-Aktivierung nachgewiesen werden. Dieser als Komplex II bezeichnete DISC enthält auch den Adapter TRADD und die RIP1-Kinase und vermittelt, ebenfalls über das Prinzip der induzierten Nähe, die Aktivierung von Caspase-8 und NF-NB (Micheau u. Tschopp 2003). Gehemmt werden kann die Bindung in den DISC und Aktivierung von Caspase-8/-10 durch FLIP-Proteine (CD95/„Fas linked inhibitor protein“, > Abb. 1.8.3). FLIP kommt in Form von drei Spleißvarianten vor: die kurze („short“) Variante FLIPS, die lange Spleißvariante FLIPL und das kürzlich beschriebene FLIPR (Budd et al. 2006). FLIPL ähnelt in seiner Peptidsequenz stark der Procaspase-8 und enthält eine DED, sowie der p10 und p20 Untereinheit der Procaspase-8 homologe Abschnitte,

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

jedoch kein aktives katalytisches Zentrum. FLIPL kann daher über seine DED in den DISC binden und die Procaspase-8 kompetitiv verdrängen. Des Weiteren interagiert FLIPL, wie auch FLIPS, wahrscheinlich im Sinne einer homotypischen Interaktion, mit der Procaspase-8 und wird als Substrat mit langsamer Kinetik gespalten, wirkt also als klassischer Substratinhibitor der Caspase-8-Enzymaktivität. Allerdings wurde kürzlich auch gezeigt, dass FLIPL-/Caspase-8-Heterodimere als DISC agieren können und durch Interaktion der DEDs in beiden Proteinen und sterische Interaktion mit den caspasehomologen Anteilen von FLIPL eine Aktivierung der Caspase-8 vermitteln können (Micheau et al. 2002). Ob die Caspase-8-Aktivierung durch FLIP-Proteine gehemmt wird, hängt somit sowohl vom Expressionsmuster der FLIP-Spleißvarianten ab als auch von deren Expressionsniveau, vor allem von FLIPL. In diesem Zusammenhang ist es von Interesse, dass z. B. beim Apoptoseschutz aktivierter T-Lymphozyten durch Kostimulation über CD28-Ligation bevorzugt FLIPS (und nicht FLIPL) induziert wird. Eine Hochregulation von FLIPL und FLIPR wurde bei malignen Tumoren beobachtet (Budd et al. 2006).

1.8.3.2 Intrinsischer Signalweg Die Bcl-2-Genfamilie Bcl-2 wurde aufgrund der krankheitscharakteristischen t(14;18)-Translokation in follikulären Lymphomen entdeckt (Tsujimoto et al. 1984). Diese Mutation bringt das Bcl-2-Gen unter die Kontrolle des IgH-Enhancers und führt zur Hochregulation der Bcl-2-Gen-Expression in den malignen B-Zellen (Tsujimoto u. Croce 1986). Bcl-2 war das erste Gen, für das eine zelltodregulierende Wirkung beschrieben wurde (Vaux et al. 1988). Es hemmt Apoptose und trägt hierdurch entscheidend zur Therapieresistenz und der schlechten klinischen Prognose follikulärer Lymphome und auch anderer Tumorerkrankungen mit deregulierter, hoher Bcl-2-Expression bei. Mittlerweile wurden eine Vielzahl Bcl-2-homologer Proteine entdeckt, die eine wesentliche Rolle bei der Regulation des intrinsischen Zelltodsignalwegs spielen (Daniel et al. 2003). Bcl-2-Familienmitglieder liegen, abhängig vom Vorhandensein einer Transmembrandomäne und dem Aktivierungszustand des Proteins, als zytosolische oder membranassoziierte Proteine vor. Bcl-2 ist (bis auf die Bcl-2D-Spleißvariante, die keine Transmembrandomäne trägt) an der äußeren Mitochondrienmembran, dem endoplasmatischen Retikulum (ER) und der Kernmembran lokalisiert. Das homologe und ebenfalls antiapoptotisch wirksame Bcl-xL liegt sowohl zytosolisch als auch membrangebunden vor und transloziert in apoptotischen Zellen zur äußeren Mitochondrien-

membran und dem ER. Nichtaktiviertes Bax ist zytosolisch, Bak hingegen konstitutiv in der äußeren Membran von Mitochondrien und der ER-Membran nachweisbar. Spezifische Organellenlokalisation wird durch C-terminale Signalsequenzen erzielt, über die z. B. Nbk in die ER-Membran, nicht jedoch in Mitochondrien lokalisiert wird. Die Aktivierung des mitochondrialen Apoptosesignalwegs (> Abb. 1.8.3) wird von Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, Bfl-1 und weiteren apoptosehemmenden Mitgliedern der Bcl-2-Genfamilie kontrolliert. Neben diesen Apoptosehemmern existieren jedoch auch proapoptotische Bcl-2-Familienproteine. Reguliert wird das Zusammenspiel dieser komplexen Genfamilie durch spezifische Proteininteraktionen zwischen den zelltodfördernden und den zelltodhemmenden Spielern (Chen et al. 2005). Diese Interaktionen werden wesentlich (jedoch nicht ausschließlich) durch evolutionär konservierte Domänen, die Bcl-2-Homologie- (BH-)Domänen, vermittelt (> Abb. 1.8.6). Alle antiapoptotischen Bcl-2-Homologen verfügen über die 4 α-helikalen BH-Domänen BH1 bis BH4 und eine Transmembrandomäne. Die zelltodfördernden Bcl-2-Proteine werden aufgrund ihrer Interaktion in zwei weitere Subfamilien unterteilt: die Bax-homologen Proteine Bax, Bak und Bok, sowie die wachsende Familie der BH3-only-Proteine (Fletcher u. Huang 2006). Während die Bax-Homologen eine BH1-, BH2- und BH3-Domäne sowie eine Transmembrandomäne tragen, findet sich in den BH3-only-Proteinen nur eine BH3-Domäne, die für die zelltodfördernde Wirkung dieser Proteine essenziell ist und daher namensgebend war. Überexpression von Bcl-2 oder dessen antiapoptotischen Homologen hemmt Zelltod durch Apoptose und blockiert die nachgeschaltete Aktivierung von Effektormechanismen der Apoptose, wie z. B. der Caspasen. Mitochondrien Mitochondrien enthalten und erzeugen eine Vielzahl toxischer Proteine und Substanzen aufgrund ihrer wichtigen Funktion als Energielieferanten der Zelle. Werden Mitochondrien im Rahmen der Apoptose permeabilisiert, dann gelangt der Inhalt des Intermembranraums zwischen innerer und äußerer Mitochondrienmembran in das Zytosol (Martinou u. Green 2001). Hierzu gehören das Cytochrom c, das, neben seiner Funktion beim Elektronentransport in der Atmungskette, eine wesentliche Funktion bei der Bildung und Aktivierung eines zytosolischen Signalkomplexes, des Apoptosoms, spielt und hierdurch die Aktivierung der Caspasekaskade auslöst. Neben Cytochrom c werden weitere caspaseaktivierende Proteine, Smac/Diablo („second mitochondrial activator of caspases/direct iAP binding protein with low pI“) und die Serinprotease Omi/HtrA2 freige-

167 1.8 · Molekulare Grundlagen der Apoptose

1.8

. Abb. 1.8.6. Bcl-2-Genfamilie. Durch DNA- bzw. Proteinsequenzvergleiche wurden vier D-helikale Homologiedomänen in Mitgliedern der Bcl-2-Genfamilie identifiziert, die als Bcl-2-Homologiedomänen (BH)1 bis 4 bezeichnet werden. In den antiapoptotischen Familienmitgliedern finden sich alle 4 BH-Domänen, außer in den Bak-In-

hibitoren Mcl-1 und Bfl-1 sowie den viralen Homologen. Die drei proapoptotischen Multidomänenproteine tragen die BH-Domänen 1 bis 3, während die proapoptotischen BH3-only-Proteine namensgebend nur die BH3-Domäne und teils eine Transmembrandomäne tragen

setzt (Daniel et al. 2003). Weitere proapoptotische Faktoren sind die Endonuklease G, die eine Rolle bei der Degradierung der zellulären DNA zu haben scheint und das Flavoprotein AIF („apoptosis inducing factor“), dessen Rolle in der Apoptoseregulation sehr umstritten ist. Weiterhin erzeugen Mitochondrien eine große Menge reaktiver Oxidantien, die potenziell DNA-schädigend wirken und hierdurch den p53-Signalweg aktivieren können (7 1.8.4.2). In C. elegans konnte durch genetische Analysen in Defektmutanten und gezielte Kreuzung von Mutanten mit mehreren derartigen genetischen Defekten in der Apoptosesignalkaskade eine Hierarchie der Apoptosesignaltransduktion erarbeitet werden (Lettre u. Hengartner 2006). Das Bcl-2-homologe C.-elegans-Todesgen 9 („C. elegans death gene 9, ced-9“) hemmt Apoptose und verhindert die Aktivierung der nachgeschalteten Caspase ced-3 (> Abb. 1.8.2). Interessanterweise kann humanes Bcl-2 in C. elegans Zelltod hemmen und umgekehrt. Diese Mechanismen sind somit evolutionär hoch-

gradig konserviert. Allerdings scheint in C. elegans ced-9 direkt mit ced-4 zu interagieren und dessen Aktivität zu hemmen. Eine solche direkte Hemmung des ced4-Homologs APAF-1 durch Bcl-2 findet jedoch in Säugern nicht statt. Dort entfaltet Bcl-2 seine zelltodhemmende Wirkung oberhalb der Aktivierung des Apoptosoms durch direkte Hemmung Bax-/Bak-abhängiger Signale, bevor es zur Freisetzung von Cytochrom c aus den Mitochondrien kommt. Modelle für die Aktivierung von Bax und Bak durch BH3-only-Proteine Bereits früh wurde eine wechselseitige Bindung von Bcl-2-Familienmitgliedern gezeigt, und mehrere dieser Proteine wurden aufgrund derartiger Interaktionen z. B. mittels des Yeast-2-Hybrid-Systems kloniert. Unter Nutzung von Bax- und Bak-defizienten Zellen wurde entdeckt, dass BH3-only-Proteine ihre zelltodfördernde Wirkung indirekt über einen Bax-/Bak-abhängigen Mechanismus entfalten und eine Konformationsänderung

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

in diesen Proteinen auslösen, die mit deren Aktivierung und Oligomerisierung in der äußeren Mitochondrienmembran einhergeht. In der Folge konnte auch für das C.-elegans-System gezeigt werden, dass egl-1, eines der beiden bisher in C. elegans identifizierten BH3-onlyProteine, in seiner Aktivität durch ced-9 gehemmt wird. Allerdings besitzt C. elegans kein proapoptotisches Baxoder Bak-homologes Multidomänen-Bcl-2-Homolog. Daten aus humanen Systemen zeigten allerdings, dass Bcl-2 und Bcl-xL im Rahmen der Apoptose durch Caspasen zu Bax-ähnlichen proapoptotischen Proteinen konvertiert werden können. Eine solche Umkehrung der Funktion von ced-9 zu einem proapoptotischen Protein wurde auch in C. elegans gezeigt. Mittlerweile ist klar, dass BH3-only-Proteine als funktionelle Bindeglieder zwischen sehr diversen, übergeordneten Zelltodsignalen und der Aktivierung des mitochondrialen Apoptosewegs durch Bax und/oder Bak wirken (> Abb. 1.8.7a; Fletcher u. Huang 2006). Während das BH3-only-Protein Bid durch Spaltung zum trunkierten Bid (tBid) aktiviert wird und den Todesrezeptorweg mit dem mitochondrialen Weg verknüpft, agieren Puma, Noxa, Hrk und Nbk als Effektoren des p53-Signalwegs, der z. B. nach DNA-Schädigung oder durch Onkogene aktiviert wird. Dort führt p53 zur transkriptionellen Aktivierung der genannten BH3-only-Gene. Bad hingegen wirkt als Sensor für antiapoptotische Signale über die PI3- und die Akt-Kinase, die Bad in der BH3-Domäne phosphorylieren und hierdurch inaktivieren. Wachstumsfaktorentzug induziert in hämatopoetischen Zellen Apoptose durch Inaktivierung des PI3-Kinasewegs und resultierender Dephosphorylierung zum apoptosefördernden Bad. Bim und Bmf hingegen dienen als Sensoren für zytoskelettalen Stress, der Bim aus der Bindung an den Motor-DyneinKomplex bzw. Bmf aus der Bindung an das AktinZytoskelett freisetzt und hierdurch die Aktivierung des intrinsischen Apoptosewegs vermittelt (Daniel et al. 2003). Trotz der Etablierung der hierarchischen Aktivierung von Bax und Bak ist dennoch der exakte Mechanismus ungeklärt. Strukturanalysen zeigen, dass Peptide aus BH3-Domänen in eine Tasche, gebildet aus BH1, -2 und -3 Domäne, z. B. von Bcl-xL, Bcl-2 oder Bcl-w binden können (> Abb. 1.8.7b). Für die BH3-only-Proteine Bid, Bim und Puma konnte eine Bindung an Bax oder Bak nachgewiesen werden. Hieraus wurde das Modell einer direkten Aktivierung von Bax und Bak durch Bindung dieser BH3-only-Proteine postuliert (Aktivatormodell; Kuwana et al. 2005). Dieses Modell kann aber insofern nicht korrekt sein, als ein 3-facher Ausfall von Bid, Bim und Puma den apoptosedefizienten Phänotyp der Bax-/Bak-Defizienz vollständig imitieren müsste. Dies ist aber weder entwicklungsbiologisch im Maus-

modell nachweisbar noch in Zellkulturmodellen der Fall. Interessanterweise interagieren alle BH3-only-Proteine mit deutlich höherer Affinität mit antiapoptotischen Bcl-2-Familienmitgliedern und werden hierdurch in ihrer proapoptotischen Aktivität gehemmt. Hieraus leitet sich das Sensitizer-Modell ab, in dem BH3-only-Proteine durch Bindung an antiapoptotische Bcl-2-Familienmitglieder diese funktionell sequestrieren und hierdurch deren hemmende Wirkung auf Bax bzw. Bak aufheben (Chen et al. 2005; Fletcher u. Huang 2006). Dieses Modell lässt aber die Frage des Mechanismus der Bax-/Bak-Aktivierung offen und postuliert eine ständige spontane Aktivität von Bax und Bak. Interessanterweise binden antiapoptotische Bcl-2-Homologe wie Bcl-2, Bcl-xL oder Mcl-1 an aktiviertes Bax oder Bak und hemmen hierdurch die Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran und die Freisetzung von Cytochrom c. Eine solche doppelte Hemmebene, sowohl auf dem Niveau der BH3-only-Proteine als auch auf Ebene des aktivierten Bax und Bak ergibt angesichts einer solchen spontanen, für die Zelle gefährlichen Aktivierbarkeit von Bax und Bak, durchaus Sinn. Dennoch favorisieren die meisten Arbeitsgruppen derzeit noch ein „Mischmodell“ (Letai et al. 2002), in dem BH3-only-Proteine sowohl Bax/Bak aktivieren können (Bid, Puma, Bim) als auch Bcl-2 und dessen antiapoptotische Homologen sequestrieren können (alle BH3-only-Proteine). Eine Vielzahl funktioneller Daten besagt, dass Bax und Bak funktionell redundant sind. Neuere Daten zur Apoptoseinduktion durch BH3-only-Proteine belegen aber, dass die Regulation komplexer ist. Proteolytische Spaltprodukte von Bid, die durch Caspase-8 und -3 (15 kDa tBid) bzw. Granzym B (13 kDa tBid) aus dem 22-kDa-Bid-Protein gebildet werden, aktivieren differenziell Bax (13 kDa tBid) bzw. Bak (15 kDa tBid). Ebenso aktiviert Nbk einen Bax-abhängigen/Bak-unabhängigen Zelltodsignalweg (Gillissen et al. 2003). Die funktionelle Rationale dieser differenziellen Aktivierbarkeit von Bax und Bak ermöglicht eine feinere Regulierbarkeit des Systems durch BH3-only-Proteine, die durch unterschiedliche Zelltodstimuli differenziell induziert und aktiviert werden können und teils auch gewebespezifisch exprimiert werden. Ebenso inhibieren antiapoptotische Bcl-2-Familienmitglieder nicht alle BH3-only-Proteine und interagieren präferenziell mit Bax oder Bak. So vermitteln Mcl-1, Bfl-1 und Bcl-xL einen doppelten Schutz vor Aktivierung von Bak, während Bax nur durch Bcl-xL und dagegen kaum durch Mcl-1 oder Bfl-1 gehemmt wird (Willis et al. 2005).

169 1.8 · Molekulare Grundlagen der Apoptose

1.8

a

c

b

. Abb. 1.8.7a–c. Regulation des intrinsischen, mitochondrialen Apoptosewegs. a Funktionelle Analysen haben gezeigt, dass BH3-onlyProteine über einen indirekten Mechanismus den intrinsischen Apoptoseweg am Mitochondrium oder dem ER aktivieren, in dem sie Bax und/oder Bak aktivieren. Bax transloziert nach Aktivierung und hieraus resultierender Konformationsänderung aus dem Zytosol in die äußere Mitochondrienmembran. Bak ist hingegen konstitutiv dort lokalisiert und wird dort, neben der Hemmung durch Bcl-2/Bcl-xL zusätzlich über Mcl-1 und Bfl-1 gehemmt und abgesichert. BH-onlyProteine können diese Hemmung von Bax und Bak durch Bindung und Inaktivierung von antiapoptotischen Bcl-2-Familienmitgliedern entfalten. Des Weiteren wurde eine direkte Bindung von proteoly-

tisch gespaltenem, trunkiertem Bid (tBid), Bim und Puma an Bax bzw. Bak gezeigt. Da verschiedene BH3-only-Proteine durch sehr unterschiedliche Signalkaskaden aktiviert werden und differenziell Bax bzw. Bak aktivieren, wird hierdurch ein hohes Maß an Regulierbarkeit des intrinsischen Signalwegs erreicht. b 3D-Modell für die Bindung einer D-helikalen BH3-Domäne in die Bindetasche des antiapoptotischen Bcl-xL, die aus dessen BH1, BH2 und BH3-Domäne gebildet wird. c Strukturformel (oberer Teil) eines hochspezifischen Bcl-2-Inhibitors, ABT-737, der in die Bindetasche von Bcl-xL (und Bcl-2 und Bcl-w) bindet (unterer Teil) und es hierdurch inaktiviert und somit z. B. Tumorzellen für die Apoptose sensibilisiert

Mechanismen der Mitochondrienaktivierung durch Bax Der apoptoseregulierende Mechanismus der Bcl-2-Familienmitglieder ist, obwohl Bcl-2 als eines der ersten Gene in dieser Signalkaskade identifiziert wurde, immer noch nicht vollständig klar. Als gesichert gilt, dass Bax und dessen Homologe Bak und Bok direkt Mitochondrien aktivieren können, die daraufhin Cytochrom c und ATP aus dem Raum zwischen innerer und äußerer Mitochondrienmembran freisetzen (Daniel et al. 2003). Dieser Vorgang kann durch Bcl-2 gehemmt werden. Die

Aktivierung der Mitochondrien kann hierbei in distinkte Aktivierungsschritte unterteilt werden: 1. Die Konformationsänderung im N-Terminus von Bax löst die Translokation vom Zytoplasma in die äußere Mitochondrienmembran aus und geht mit der Insertion in die Membran und Bildung von alkaliresistenten Bax-Oligomeren einher. Der Bax N-Terminus scheint dabei eine hemmende Funktion zu haben, da Mutanten von Bax ohne N-Terminus oder die in malignen Gliomen nachgewiesene Bax-<Spleißvariante konstitutiv in die äußere Mitochond-

170

2.

3. 4.

5.

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

rienmembran translozieren. Die Aktivierung von Bak ist, wie im Falle von Bax, mit einer N-terminalen Konformationsänderung verbunden, gefolgt von der Bildung von Bak-Oligomeren. Jedoch befindet sich Bak konstitutiv in der Mitochondrienmembran, wo es durch Bindung an hemmende Interaktionspartner wie VDAC2 kontrolliert wird (Chandra et al. 2005). Oligomerisierung von Bax und/oder Bak führt zur Öffnung von Kanälen und Freisetzung von Cytochrom c. Die Atmungskette als Energielieferant bleibt aber noch aktiv. Erst später kommt es durch den Einstrom zytosolischer Ionen und Wasser zum Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials ('<m), gefolgt von der mitochondrialen Permeabilitäts-Transition mit Anschwellen der Mitochondrien und Platzen der äußeren und später auch der inneren Membran. Letztlich kommt es zum Zusammenbruch der Atmungskette.

Es ist aber nach wie vor nicht völlig geklärt, wie diese permeabilisierenden Kanäle gebildet werden. Sowohl für Bcl-2 als auch Bax konnte gezeigt werden, dass diese Proteine nicht nur über die BH-Domänen dimerisieren, sondern auch oligomerisieren können, um selbst Kanäle zu bilden. Neben dieser Kanalbildung regulieren Bcl-2 und Bax aber auch spannungsabhängige mitochondriale Kanäle, die in der äußeren Membran durch Proteine der VDAC („voltage dependent anion channel“) Familie und in der inneren Membran durch das ANT-Protein (Adenin-Nukleotid-Transporter) gebildet werden. Die Aktivität dieser Kanäle kann durch den peripheren Benzodiazepinrezeptor, der auch in der äußeren mitochondrialen Membran lokalisiert ist, moduliert werden. Reaktive Sauerstoffmetabolite sind in wesentlichem Ausmaß an der Oxidation von Membranlipiden im Rahmen der Apoptose beteiligt. Dies wiederum könnte, wie neuere Daten vermuten lassen, ein wichtiger Faktor in der Regulation des mitochondrialen Apoptosewegs sein, da eine derartige Oxidation von Lipiden die Membraneigenschaften verändert und die Einsenkung und Oligomerisierung proapoptotischer Bcl-2-Familienmitglieder, z. B. von Bax, erleichtert (Priault et al. 2002). Auch mitochondriale Fusion und Spaltung wurden als zentrale Ereignisse in der Regulation der Mitochondrienpermeabilisierung postuliert (Youle u. Karbowski 2005). Aus evolutionärer Sicht könnten Mitochondrien „versklavte“ Mikroorganismen sein, die ursprünglich als pathogene, bakterienähnliche Parasiten die Wirtszelle infizierten, nun aber wichtige zelluläre Funktionen erfüllen (Endosymbiontentheorie). So könnten Eukaryonten durch die Kooperation mit solchen intrazellulären Parasiten die Zellatmung und die effiziente ATP-Synthese

über den Zitratzyklus erworben haben. Andererseits könnte das mitochondriale Apoptoseprogramm ursprünglich ein Pathomechanismus zur Abtötung der Wirtszelle gewesen sein, der, einmal unter Kontrolle gebracht, nun eine wichtige zelluläre Funktion darstellt. Unterstützt wird diese Hypothese durch das Vorhandensein eines eigenen mitochondrialen Genoms und einer eigenen Proteinbiosynthesemaschinerie, die jedoch auf Proteine aus dem Genom der „Wirtszelle“ angewiesen ist. Hingegen regulieren Mitochondrien ihre Vermehrung unabhängig vom Zellteilungszyklus der Wirtszelle. Dies erfolgt über mitochondriale Spaltung (Fission). Ebenso können Mitochondrien über aktive Fusion zu langen, verzweigten Röhrensystemen verschmelzen. Die Arbeitsgruppe von Youle zeigte als erste, dass Mitochondrien im Rahmen der Apoptose ihre elongierte Form verlieren, fragmentiert werden und sich in Zellkernnähe umverteilen. Herunterregulation der für Mitochondrienspaltung wichtigen Proteine Drp1 und hFis1 kann zwar die Fragmentierung der Mitochondrien nach Apoptoseinduktion verhindern und die Cytochrom-cFreisetzung verzögern, nicht jedoch die Apoptoseausführung über Bax-/Bak-abhängige Stimuli und Freisetzung von Smac/Diablo. Dies zeigt, dass mitochondriale Fission kein zentrales Ereignis in der Freisetzung von Cytochrom c und der Regulation des mitochondrialen Apoptosesignalwegs ist. Wesentlich für die frühe Freisetzung von Cytochrom c, die der Freisetzung anderer proapoptotischer Faktoren wie z. B. Smac aus dem Intermembranspalt zwischen innerer und äußerer Mitochondrienmembran vorangehen kann, ist ein Verschlussmechanismus der mitochondrialen Cristae, der erst kürzlich aufgeklärt werden konnte (Youle u. Karbowski 2005). Die innere Mitochondrienmembran hat eine deutlich größere Fläche als die äußere Membran. Dies bedingt die Faltung der inneren Membran in Form von nach innen, in die Matrix eingesenkter Zisternen, der Cristae. Dies führt zu einer erheblichen Vergrößerung der für die zelluläre Atmung wichtigen Austauschfläche zwischen Matrix und Mikromilieu des Intermembranspalts, dem Ort der ATP-Synthese durch die Proteinkomplexe der Atmungskette. Diese Cristae werden durch das OPA1-Protein verschlossen, wodurch eine Kompartimentierung des Intermembranraums ermöglicht wird. OPA1 liegt hierbei in einer membranverankerten und einer löslichen, durch proteolytische Spaltung gebildeten Form im Intermembranspalt vor, wobei letztere durch die PARL-Protease („presenilin-associated rhomboid-like“) gebildet wird. Rhomboide sind evolutionär konservierte, membranständige Proteasen. Die PARL-Protease ist im Intermembranspalt an der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert und ist an der Regulation der Fusion von Mitochondrien beteiligt. Zwar ist in PARL-defizienten Zel-

171 1.8 · Molekulare Grundlagen der Apoptose

len die Mitochondrienfunktion in der Zellatmung nicht gestört, jedoch sind die Zellen nicht mehr gegen Apoptoseinduktion durch das dem Dynamin verwandte OPA1-Protein geschützt. PARL-defiziente Mitochondrien zeigen stark erniedrigte Spiegel der löslichen, im Intermembranspalt lokalisierten Form von OPA1. Überexpression einer OPA1-Mutante, die per se im Intermembranspalt lokalisiert ist, komplementiert den PARLKnockout-Genotyp und normalisiert die Mitochondrienfunktion, d. h., sie stabilisiert die mitochondrialen Cristae und verlangsamt die Cytochrom-c-Freisetzung (Cipolat et al. 2006). Werden Mitochondrien nun z. B. durch das BH3only-Protein Bid zur Apoptose aktiviert, dann werden die OPA1-Oligomere gespalten und die Cristae werden geöffnet. Dies könnte erklären, warum die Freisetzung geringer Mengen von Cytochrom c in einigen Zellsystemen bereits kurz vor dem massiven Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials nachweisbar ist, gefolgt von einer späteren Welle der massiven Freisetzung von Cytochrom c und anderen Faktoren. Dies erklärt auch, warum in der Mehrzahl der biologischen Systeme die Cytochrom-c-Freisetzung erst dann gut nachweisbar ist, wenn die Apoptose intrazellulär bereits weit fortgeschritten ist und das mitochondriale Membranpotential bereits zusammengebrochen ist. In derart permeabilisierten Mitochondrien könnten aus dem Zytosol hineindiffundierte Caspasen dann integrale Proteine wie OPA1 und Komponenten der Atmungskette spalten, was dann zur Öffnung der Cristae und dem Zusammenbruch der physiologischen Mitochondrienfunktion führt. Die PARL-Protease ist auch für die physiologische Mitochondrienfunktion, die koordinierte Biosynthese von ATP, wichtig. PARL-Knockout-Mäuse zeigen bis zur 4. Embryonalwoche eine normale Entwicklung, sterben dann jedoch aufgrund einer generalisierten Multisystematrophie, die mit gesteigerter Apoptose einhergeht und vor allem auch Neurone betrifft.

1.8

a

b

1.8.3.3 Caspasen – Effektormoleküle der Apoptose

. Abb. 1.8.8a,b. CaspaseaktivierungdurchProteolyse.Cysteinylaspartasen, kurz: Caspasen, sind Proteasen, die aus enzymatisch inaktiven Zymogenen gebildet werden a. Namensgebend war das Vorhandensein eines Cysteins im aktiven Zentrum des Enzyms und die Spaltung an Aspartat im Substratprotein. Autokatalytische Spaltung von Procaspasen führt zur Abspaltung der kleinen Untereinheit p10, gefolgt von der Prodomäne, die ein Heterotetramer bildet, bestehend aus zwei p10- und zwei p20-Untereinheiten b. Große und kleine Untereinheit interagieren über Kontaktregionen, die aus E-Faltblattstrukturen gebildet werden. CARD: Caspase-Rekrutierungsdomäne, DED: Todeseffektordomäne (death effector domain)

Caspasen werden als Zymogene, d. h. als inaktive Vorstufen des aktiven Enzyms, synthetisiert und zeigen eine Lokalisation im Zytosol und im Zellkern, jedoch nicht in den Mitochondrien oder Lysosomen. Ihr aktives Zentrum trägt ein Cystein, und sie spalten vor einem Aspartat im Substratprotein, woraus sich der Name Cysteinylaspartase, kurz Caspase ableitet (Shi 2004). Die inaktiven Zymogene werden auch als Procaspasen bezeichnet. Sie bestehen aus einer N-terminalen Prodomäne, der in der Peptidsequenz eine große (p20) und eine kleine Un-

tereinheit (p10) folgen, die über kurze Linker-Peptide miteinander verbunden sind (> Abb. 1.8.8a). Das katalytische Zentrum ist in der kleinen Untereinheit lokalisiert. Die Caspasen-2, -8/-10 und -9 sind Caspasen mit langer Prodomäne und agieren als sog. Initiatorcaspasen, da sie die Endstrecke der Apoptose einleiten. In den Prodomänen sind regulatorische Domänen lokalisiert, Caspase-Rekrutierungsdomänen (CARD) im Falle von Caspase-2 und -9 sowie eine Todeseffektordomäne im Falle

172

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

der Caspase-8 und -10. Hierüber können die Initiatorcaspasen mit Adaptermolekülen wie FADD oder APAF-1 interagieren, die für ihre Aktivierung benötigt werden. Effektorcaspasen tragen hingegen eine kurze Prodomäne, da ihre Aktivierung nicht in Signalkomplexen erfolgt, sondern durch proteolytische Spaltung durch funktionell übergeordnete Initiatorcaspasen. Die wichtigsten Effektorcaspasen sind die Caspasen-3, -6 und -7. Die reifen und enzymatisch aktiven Caspasen stellen Heterotetramere aus jeweils zwei p10- und zwei p20-Untereinheiten dar, die sich durch Interaktion von Kontaktflächen aus E-Faltblatt-Tertiärstrukturen aneinanderlagern (> Abb. 1.8.8b). Dies gilt vor allem für die Effektorcaspasen. Funktionell den Caspasen verwandt ist Granzym B, das von zytotoxischen T-Lymphozyten oder NK-Zellen über Perforinkanäle in die zu lysierende Zielzelle eingeschleust wird. Granzym B zeigt zwar keine strukturelle Homologie zu Caspasen, ist funktionell aber ebenfalls eine Cysteinylaspartase und prozessiert und aktiviert Caspase-3, die wiederum das BH3-only-Protein Bid spaltet. Hierdurch aktiviert Granzym B sowohl direkt die Caspasekaskade als auch den mitochondrialen Apoptoseweg und induziert den apoptotischen Zelltod in der Zielzelle. Dies unterstützt den lytischen, durch Perforin vermittelten Zelltod der Zielzelle im Rahmen der Killerzellattacke (Voskoboinik et al. 2006). Caspase-Aktivierungsmaschinen Initiatorcaspasen werden im jeweiligen Signalweg in heteromultimeren Proteinkomplexen aktiviert, wie z. B. dem DISC (Medema et al. 1997), dem Apoptosom (Li et al. 1997) und weiteren Komplexen. Nach Todesrezeptorligation wird der DISC aus Todesrezeptor (z. B. CD95, oder TNF-R1, DR4, -5, oder -6), Adaptermolekülen (TRADD, FADD), und Procaspase-8 bzw. -10 gebildet (> Abb. 1.8.3 u. 1.8.5). Im Gegensatz zu Effektorcaspasen, die als freie Tetramere aktiv sind, muss die Aktivierung von Procaspasen immer im Komplex erfolgen (Shi 2004). Zufällig, z. B. durch Caspase-3 vermittelte Spaltung von Caspase-8 (oder-9) führt zu keiner nennenswerten Enzymaktivität. Weiterhin zeigen Procaspasen bereits ohne proteolytische Spaltung, eine wenn auch geringe enzymatische Aktivität im Komplex, die in Form einer autokatalytischen Spaltung zur Prozessierung (proteolytischen Spaltung) und weiteren Aktivierung des Zymogens führt. Diese Autokatalyse wird durch die im Signalkomplex erreichte induzierte Nähe dramatisch verstärkt (> Abb. 1.8.5). Im intrinsischen Signalweg wird nach Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran Cytochrom c freigesetzt (Yang et al. 1997). Dieses zytosolische Cytochrom c bindet an das ebenfalls zytosolische APAF-1 Adapterprotein und löst hierdurch, gemeinsam mit dem

a

b

c . Abb. 1.8.9a–c. Aktivierung des APAF-1-Apoptosoms. a Domänenorganisation von APAF-1 in N-terminale Caspase-Rekrutierungsdomäne (CARD), gefolgt von der CED-4-Domäne, die hohe Homologie zum C.-elegans-Protein CED-4 zeigt, und zwei Clustern von 7 bzw. 6 WD-40-Domänen am C-Terminus. b Regulation der APAF-1-Aktivierung. Nach Freisetzung von Cytochrom c aus apoptotischen Mitochondrien bindet Cytochrom c an die WD40-Domänen von APAF-1. Durch diese Konformationsänderung wird die Bindung von dATP ermöglicht, die energieabhängig eine weitere Konformationsänderung und Stabilisierung des APAF-1-/Cytochrom-c-Komplexes vermittelt. Derart aktiviertes APAF-1 bildet einen heptameren, radartigen Komplex (c), dessen CARD-Domänen die Radnabe bilden. Dorthin wird über die CARD-Domäne die Procaspase-9 rekrutiert, die durch das Prinzip der induzierten Nähe autokatalytisch aktiviert wird. Der Komplex aus APAF-1, Cytochrom c, dATP und Procaspase-9 wird als Apoptosom bezeichnet. Rechter Teil von c: Oberflächenmodell, abgeleitet aus röntgenkristallographischer Analyse von Apoptosomkomplexen

ubiquitären dATP (oder, wenn auch wesentlich weniger effektiv, ATP) und der Procaspase-9 die Bildung eines DISC aus, der hier als Apoptosom bezeichnet wird (> Abb. 1.8.9). Bindung von Cytochrom c an APAF-1 erfolgt hierbei in einer durch zwei Cluster von WD40-Peptidsequenzen im C-Terminus von APAF-1 gebildeten Tasche. Durch die hieraus resultierende Konformationsänderung wird von APAF-1 eine heptamere Radstruktur gebildet, deren Nabe die CARD-Domänen des APAF-1 Heptamers bilden (> Abb. 1.8.9). Gemeinsam mit der Bindung und Hydrolyse von dATP an die ced-4-Homo-

173 1.8 · Molekulare Grundlagen der Apoptose

logiedomäne von APAF-1 wird eine Konformationsänderung und Stabilisierung des APAF-1-Rads ausgelöst, wodurch die CARD-Domänen exponiert werden (Kim et al. 2005). Dies ermöglicht wiederum die Bindung der Procaspase-9 an die APAF-1-CARD-Domänen. Hierdurch werden mindestens zwei Procaspase-9Zymogene in engen räumlichen Kontakt gebracht und autokatalytisch aktiviert (Riedl u. Shi 2004). Kürzlich wurde ein weiterer Signalkomplex, das PIDDosom, beschrieben, der im p53-Signalweg zu agieren scheint und zur Aktivierung von Procaspase-2 führt (Tinel et al. 2007). Das durch p53 induzierbare Todesdomänenprotein PIDD („p53 induced death domain“) interagiert mit dem Adapterprotein RAIDD und bindet hierüber die RIP1-Kinase. Hierdurch vermittelt dieser Komplex ein Überlebenssignal durch Aktivierung des NF-NB-Signalwegs und wirkt der proapoptotischen Funktion von p53 entgegen. Des Weiteren kann aber, über die CARD-Domäne von RAIDD, die Procaspase-2 in den Signalkomplex gebunden werden. Diese Daten zur Funktion von Caspase-2 als Initiatorcaspase sind allerdings noch kontrovers, da andere Gruppen berichten, dass Caspase-2 über einen exklusiv von Caspase-3 bzw. -7-abhängigen Weg, d. h. infolge einer durch Effektorcaspasen vermittelten proteolytischen Spaltung, aktiviert wird und somit nicht als Initiatorcaspase agiert. Dennoch konnte für Procaspase-2 in einer Reihe von Arbeiten eine dem Mitochondrium vorgeschaltete Funktion gezeigt werden (Zhivotovsky u. Orrenius 2005). Weiterhin scheint Procaspase-2 durch Ereignisse im Zellzyklus aktivierbar zu sein und kann auch im Zellkern nachgewiesen werden, wo sie mit Zyklin D2 interagiert. Effektorcaspasen Die in den Signalkomplexen aktivierten Initiatorcaspasen können durch limitierte Proteolyse die Effektorcaspasen-3, -6 und -7 aktivieren und hierdurch die Endphase der Apoptose einleiten (Riedl u. Shi 2004). Diese Effektorcaspasen attackieren und spalten eine Vielzahl regulatorischer und struktureller Proteine und leiten hierdurch die endgültige Exekution des apoptotischen Zelltods ein und machen den Vorgang unumkehrbar (Fischer et al. 2006). Strukturen, die von Caspasen proteolytisch gespalten werden, erfüllen im Wesentlichen folgende Kriterien: Ihre Spaltung führt (1) zum Anhalten des Zellteilungszyklus, (2) inaktiviert Reparaturmechanismen, z. B. der DNAReparatur, (3) zerlegt strukturell wichtige molekulare Strukturen, wie das Zytoskelett und die Kernmembran, (4) stört den Kontakt zur Extrazellulärmatrix und benachbarten Zellen, d. h., die Zelle löst sich ab und (5) markiert die Zelle für die Phagozytose.

1.8

Hierdurch vermitteln Caspasen die wichtigen biochemischen und morphologischen Charakteristika der Apoptose, die zu deren Entdeckung geführt haben. Caspaseregulation durch IAP-Proteine Zusätzlich zur Aktivierung in Signalkomplexen bzw. durch enzymatische Prozessierung werden Caspasen durch die Inhibitor-der-Apoptose-Proteine (IAP) reguliert. IAPs können in 3 Klassen eingeteilt werden, und zwar in IAP mit oder ohne RING-Finger-Domäne sowie das IAP Survivin, das nur eine halbe BIR-Domäne („Baculovirus internal repeat“; Signaturdomäne der IAPs) besitzt und nicht als zentraler Apoptose-, sondern als Mitoseregulator fungiert. Dies erklärt die in teilungsaktiven Zellen, wie z. B. Tumorzellen, generell hohe Expression von Survivin. Daten zur Apoptoseregulation durch Survivin sind kontrovers. Humane IAPs binden an aktivierte Caspasen und hemmen deren Aktivität. IAPs von Insekten oder insektenpathogenen Viren, in denen die IAPs entdeckt wurden (s. Namensgeber Baculovirus für die BIR-Domänen), blockieren hingegen auch die Aktivierung zuvor inaktiver Caspasen. RING-Finger-tragende IAPs, wie z. B. das NF-NB-induzierbare cIAP2, wirken als E3-Ubiquitinligasen und vermitteln Ubiquitinierung aktivierter Caspasen, gefolgt von deren proteasomalem Abbau. Hierdurch werden zufällig aktivierte Caspasen rasch aus dem System entfernt und die Zelle geschützt. Nicht-RINGFinger-tragende IAPs wie z. B. XIAP wirken, indem sie von der aktiven Caspase als bevorzugtes Substrat gebunden und dann mit sehr langsamer Kinetik gespalten werden, agieren also als Substratinhibitoren. Dieser Mechanismus der Caspasehemmung ist sehr effizient und muss daher während der Apoptoseexekution antagonisiert werden. Dies erfolgt im mitochondrialen Apoptoseweg durch Freisetzung von drei Proteinen, Smac (Diablo im Maussystem), der Serinprotease Omi/ HtrA2 (> Abb. 1.8.10) und dem ARTS Protein. Alle drei Proteine binden über eine kurze N-terminale Peptidsequenz an IAPs und hemmen hierdurch deren Bindung an Caspasen. Hierdurch wird eine massive Verstärkung der Caspaseaktivierung erreicht. Dieser Mechanismus der IAP-Hemmung durch IAP-Antagonisten ist evolutionär konserviert und wurde mit 3 Orthologen („reaper, grim, hid“) auch bei Drosophila melanogaster nachgewiesen, bisher jedoch noch nicht bei C. elegans. Dort findet sich allerdings das evolutionär „älteste“ Beispiel für eine Caspase, ced-3, die sowohl als Initiator- als auch als Effektorcaspase agiert und durch das APAF-1-Homolog ced-4 reguliert wird. Nichtapoptotische Caspasefunktionen Neben den beschriebenen Caspasen existieren weitere Caspasen beim Menschen, die nichtapoptotische Funk-

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

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b . Abb. 1.8.10. Regulation der Caspaseaktivität durch IAP-Proteine und deren Gegenspieler Smac. IAPs („inhibitor of apoptosis proteins“) hemmen aktivierte Caspasen, die Effektorenzyme der Apoptose. Als E3-Ubiquitinligasen vermitteln RING-Finger-tragende IAPs die Ubiquitinierung gefolgt vom proteasomalen Abbau aktiver Caspasen. Des Weiteren hemmen IAPs die Caspaseaktivität, indem sie, analog zu FLIPL, als klassische Substratinhibitoren an aktive Caspasen binden und mit langsamer Kinetik proteolytisch gespalten werden. Durch diese beiden Mechanismen wird die Zelle vor einer zufälligen und unkontrollierten Aktivierung dieser Killerenzyme geschützt. Wird hingegen die Caspasekaskade über den intrinsischen Apoptoseweg aktiviert, dann erfolgt die Caspaseaktivierung über Cytochrom-cAusstrom in das Zytosol, gefolgt von der Bildung des Apoptosoms und Aktivierung der Procaspase-9 und der nachgeschalteten Effektorcaspasen. Gleichzeitig erfolgt die Freisetzung von Smac (Diablo in der Maus). Smac hemmt die Bindung von IAPs an Caspasen, indem es über ein N-terminales Peptidmotiv an IAPs bindet (AVP). Durch diesen Wegfall der IAP-vermittelten Caspasehemmung wird die Aktivierung der Effektorcaspasen drastisch verbessert

tionen haben (Schwerk u. Schulze-Osthoff 2003). Caspase-1, -4, -5 und -11 (ein Caspase-4-Homolog) sind weniger proapoptotisch relevant, sondern vielmehr wichtig für Entzündungsreaktionen. So prozessiert Caspase-1, die erste identifizierte humane Caspase (Yuan et al. 1993), die unreife Form von Interleukin-1 zur inflammatorisch wirksamen und sezernierten reifen Form des Proteins und wird daher auch als Interleukin-1Ekonvertierendes Enzym („interleukin-1E converting enzyme“, ICE) bezeichnet. Caspase-12 wurde initial als wichtige Initiatorcaspase beim ER-Stress-induzierten Apoptoseweg publiziert. Diese Daten konnten allerdings nicht bestätigt werden (Hotchkiss u. Nicholson 2006). Zudem tragen die meisten Menschen, ausgenommen etwa 25% der Schwarzafrikaner, eine zur Verkürzung der Peptidkette führende Punktmutation. Biochemische Daten zeigen zudem, dass die vollständige Caspase-12 nicht proteolytisch aktiv ist. Vielmehr spielt Caspase-12 eine Rolle bei der Regulation von Entzündungsvorgängen, da sie, der Caspase-8/FLIPL-Interaktion vergleichbar, als Substratinhibitor die Aktivität von Caspase-1 bei der IL-1E-Reifung hemmt und hierdurch die Freisetzung von aktivem IL-1 verhindert. Da IL-1 ein zentraler Aktivator des unspezifischen Immunsystems ist und eine wichtige schützende Funktion in der Frühphase septischer Infektionen spielt, ist der Besitz von unmutierter Caspase-12 in den entsprechenden Populationen mit erhöhter Sepsismortalität und Frühgeburtskomplikationen bei Schwangeren verbunden (Scott u. Saleh 2007). Caspase-8 hingegen übt eine bisher biochemisch noch nicht definierte Funktion in der Embryonalentwicklung und der Reifung hämatopoetischer Zellen aus. Deletion des Caspase-8-Gens ist embryonal letal infolge einer gestörten Entwicklung der Dottersack-Endothelzellen. Des Weiteren führt der Verlust der Caspase-8 in der Hämatopoese zu einer gestörten Entwicklung lymphatischer und myeloischer Zellen (Kang et al. 2004). Caspase-14 wird nur im verhornenden Plattenepithel der Haut exprimiert und scheint an der Differenzierung und Hornbildung beteiligt zu sein.

1.8.3.4 Endphase der Apoptose und Elimination apoptotischer Zellen Die Aktivierung von Caspasen führt zur Aktivierung von nachgeschalteten Enzymkaskaden, welche die Zelle von innen heraus zerstören und die nachfolgende Phagozytose und den Abbau erleichtern (Fischer et al. 2006; Riedl u. Shi 2004). Durch Caspase-3 wird ein Hemmer der durch Caspase aktivierten DNAse (CAD), ICAD („inhibitor of CAD“), gespalten und inaktiviert. Hier-

175 1.8 · Molekulare Grundlagen der Apoptose

durch wird die CAD-Nuklease aktiviert (Enari et al. 1998). Eine weitere DNAse wird im intrinsischen Apoptoseweg aus den Mitochondrien freigesetzt, Endonuklease G. Durch Spaltung des Proteins Lamin wird die Zellkernmembran in ihrer Integrität gestört und zytosolische DNAsen können in den Zellkern gelangen, wo sie die genomische DNA an exponierten Stellen des Chromatins, entsprechend den 180 Basenpaaren der Wicklungen um Histonproteine, spalten. Bei Analyse der genomischen DNA im Agarosegel kann dann die sog. DNA-Leiter nachgewiesen werden (Wyllie 1980). Gleichzeitig verändert sich die Chromatinstruktur, und es kommt zu einer Kondensation des Chromatins, die sich in elektronenmikroskopischen Aufnahmen als schollige, schwarze, d. h. elektronendichte Strukturen im Zellkern abbildet (> Abb. 1.8.1d). Durch Fragmentierung des Zellkerns kommt es zur Bildung von Mikronuklei, wie sie z. B. auch in mit ionisierender Strahlung exponierten Zellen nachgewiesen werden können. Die Zerstörung des Zytoskeletts durch Caspasespaltung z. B. von Aktinen (Fischer et al. 2006), führt zur Bildung apoptotischer Körperchen durch Abschnürung von Zellanteilen, die auch Mikronuklei enthalten können (> Abb. 1.8.1d). Dieser Vorgang wird auch als Zeiose oder Blebbing bezeichnet. Apoptose ist ein aktiver, energieabhängiger Mechanismus. Neben der Aufrechterhaltung der Membranintegrität ist z. B. auch die Bildung des Apoptosoms energieabhängig und geht mit der Hydrolyse von (d)ATP einher (Kim et al. 2005). In der Spätphase der Apoptose kommt es zur Depletion des ATP-Pools und hierdurch zur Inaktivierung von ATP-abhängigen Pumpen. Dies führt zur Vakuolisierung von Organellen, Mitochondrien und ER schwellen an. Letztlich käme es, wenn die Zelle nicht bereits zuvor durch Phagozytose aus dem Gewebsverband entfernt worden wäre, zur sekundären Nekrose, die in vitro in Zellkulturmodellen nach längerer Inkubation apoptotischer Zellen nachgewiesen werden kann (Searle et al. 1975). ATP-Depletion wird durch Caspase-3-vermittelte Spaltung des ATP-verbrauchenden DNA-Reparaturenzyms PARP (Poly- (ADP-ribose-)Polymerase) gehemmt. Wird PARP, z. B. bei unzureichender Caspaseaktivierung, nicht gespalten und inaktiviert, dann wird durch Poly-ADP-Ribosylierung von Histonproteinen der ATP-Pool depletiert, und es entwickelt sich rasch ein nekrotischer Phänotyp (Los et al. 2002). Im Gegensatz zur Nekrose bleibt bei der Apoptose initial die Plasmamembran erhalten. Allerdings wird die Lipidzusammensetzung verändert. Sphingomyeline werden gespalten und zelltodfördernde Ceramide gebildet, welche die Apoptose weiter verstärken, indem sie den mitochondrialen Apoptoseweg über einen Bax-abhängigen Mechanismus aktivieren bzw. verstärken. Phosphatidylseringruppen, die normalerweise durch

1.8

eine ATP-abhängige Flipase zur Innenseite der Membran sortiert werden, sind vermehrt auf der Außenseite der Zelle lokalisiert und machen sie hierdurch als apoptotische Zelle kenntlich (Koopman et al. 1994). Die von innen heraus degradierte Zelle kann nun von umliegenden Phagozyten wie z. B. Gewebsmakrophagen eliminiert werden (Krysko et al. 2006). Dieser Vorgang erfolgt in vivo sehr rasch, sodass Apoptose im intakten Gewebsverband extrem schwierig nachzuweisen ist. Dies erklärt auch, warum Apoptose als zellbiologischer Mechanismus erst sehr spät erkannt und definiert wurde (Kerr et al. 1972). Physiologisch werden apoptotische Zellen rasch und ohne Auslösung von Entzündungssignalen aus dem Gewebe eliminiert. Dies erfolgt über die Erkennung von „Iss-mich“-Signalen durch Makrophagen oder nichtprofessionelle Phagozyten, z. B. von normalerweise auf der zytosolischen Seite der Plasmamembran befindlichen Phosphatidylserinen auf der Zelloberfläche. Auch dendritische Zellen des Immunsystems phagozytieren apoptotische Zellen rasch und effizient. Interessanterweise erfolgt hierdurch nicht die Aktivierung einer spezifischen T-Zell-Antwort, sondern es werden, da kein „Gefahr“- („Danger“-)Signal gegeben wurde, Toleranzmechanismen aktiviert. Würde hingegen der Zelltod über Nekrose exekutiert, dann würde Zellinhalt in den Extrazellulärraum gelangen und eine Entzündungsreaktion stimulieren. Das hieraus resultierende Gefahrsignal würde eine effiziente Antwort des spezifischen Immunsystems auslösen. Dies wurde z. B. für den nekrotischen Zelltod von Tumorzellen und die Auslösung einer tumorspezifischen Immunantwort gezeigt (Krysko et al. 2006).

1.8.3.5 Caspaseunabhängiger und nichtapoptotischer Zelltod Eine Vielzahl experimenteller Daten zeigt, dass Zelltod auch caspaseunabhängig aktiv exekutiert werden kann. So kann Apoptose, je nach Zell- und Gewebstyp, sehr unterschiedlich ausgeführt werden, und auch die Morphologie ist somit nicht einheitlich. Selbst Charakteristika wie Chromatinkondensation und oligonukleosomale DNA-Fragmentierung sind nicht obligat. Zudem ist mittlerweile klar, dass es fließende Übergänge zwischen Apoptose und Nekrose geben kann, z. B. beim Zelltod, der durch TNFD oder nach DNA-Schädigung durch Zytostatika ausgelöst wird (Los et al. 2002). Ist der Zelltod durch Manipulation übergeordneter Zelltodregulatoren, z. B. durch Überexpression von Bcl-2 oder Inaktivierung von Bax/Bak, hemmbar, also apoptotisch, dann handelt es sich um caspaseunabhängige Apoptose.

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

Wird der ATP-Gehalt einer Zelle depletiert, z. B. durch Entkoppler der Atmungskette (Martinou u. Green 2001), oxidativen Stress, z. B. durch Vergiftung mit Arsentrioxid (Scholz et al. 2005) oder Polyadenosylribosylierung durch das DNA-Reparaturenzym PARP (Los et al. 2002), dann wird zwar der intrinsische Apoptoseweg aktiviert, aber aufgrund der Energiedepletion kommt es nicht zur Caspaseaktivierung, und es entwickelt sich ein nekroseähnlicher Zelltod mit raschem Verlust der Integrität der Plasmamembran und Anschwellen der Zelle und ihren Organellen. Ebenso kann die Apoptose caspaseunabhängig über die Aktivierung eines funktionell nur ansatzweise definierten Zelltodwegs eingeleitet werden, der über lysosomale Calpaine und Cathepsine, also Nicht-Caspase-Proteasen, vermittelt wird. Neuere Daten zur Regulation der Autophagie lassen aber eher vermuten, dass es sich hierbei um Formen der lysosomal ausgeführten Autophagozytose handelt. Von der Apoptose abgegrenzt werden kann der für die Gewebshomöostase und Entwicklungsbiologie sehr wichtige autophagozytotische oder Typ-II-Zelltod (Typ I ist die Apoptose). Autophagie kann in experimentellen Modellen durch Nährstoffentzug ausgelöst werden und wird somit über den metabolismuskontrollierenden mTOR-Signalweg reguliert (Easton u. Houghton 2006). Ebenso kann ein Wachstumsfaktorentzug, z. B. Zellkultur von Interleukin-3- (IL-3)-abhängigen Zellen in IL-3 freiem Zellkulturmedium, die Autophagozytose induzieren (Lum et al. 2005). Über die Endophagozytose von Zellbestandteilen kann die betroffene Zelle den Substratmangel über längere Zeit kompensieren, bis letztlich der Zelltod über einen nichtapoptotischen Weg exekutiert wird, der dann eine nekroseähnliche Morphologie aufweist. Werden Energielieferanten, bzw. Wachstumsfaktoren, hier IL-3, im Kulturmedium komplementiert, dann erholt sich die Mehrzahl der Zellen und kann erneut klonogen wachsen (Lum et al. 2005). Interessanterweise wird dieser Zelltodweg durch Überexpression von Bcl-2 oder Bcl-xL begünstigt (Shimizu et al. 2004). Im Fall des IL-3-Entzugs würden IL-3-abhängige Zellen nach wenigen Stunden bis Tagen bevorzugt über Apoptose sterben. Bcl-xL schützt die betroffene Zelle vor der raschen Elimination durch Apoptose und begünstigt die volle Ausbildung des autophagozytotischen Phänotyps. Ebenso wie die Autophagie wird der Zelltod aus bestimmten Stresskonditionen des Zellzyklus durch nichtapoptotischen, aber regulierten Zelltod vermittelt (Zong et al. 2004). Diese aktiv regulierten Zelltodwege sorgen dafür, dass durch Störungen z. B. der DNA-Replikation, der DNA-Reparatur oder der Chromosomenverteilung auf Tochterzellen genetisch geschädigte Zellen eliminiert werden. Hierdurch wird genetische Stabilität gewährleistet. Während der unregulierte Eintritt in die S-Phase, z. B. infolge einer Aktivierung von S-Phase-

Transition auslösenden Onkogenen wie C-MYC, E2F-1 oder K-ras, oder DNA-Schädigung bevorzugt apoptotischen Zelltod auslösen, wird Zelltod durch Störungen in der Mitose auch über nichtapoptotischen Zelltod ausgeführt (Molz et al. 1989). Zelltod durch „mitotische Katastrophe“ ist nicht durch Bcl-2 hemmbar und ist caspaseunabhängig (Okada u. Mak 2004). Charakteristisch für die mitotische Katastrophe ist die Entwicklung einer Aneuploidie, meist einer massiven Polyploidie, verursacht durch repetitive abortive Zellteilungszyklen ohne abschließende, koordinierte mitotische Zellteilung, teils mit erheblichen chromosomalen Aberrationen. Betroffene Zellen werden deutlich größer und zeigen einen angeschwollenen Zellkern, teils auch durch aberrante, asymmetrische Mitosen gebildete Mikronuklei mit variablem Chromosomengehalt. Die sehr unterschiedliche Biochemie dieser Form des Zelltods deutet auf einen evolutionär archaischen Zelltodmechanismus hin, der sich möglicherweise bereits vor der Entwicklung des Apoptoseprogramms ausgebildet hat, um Fehler in der Mitose zu erkennen und geschädigte Zellen zur Aufrechterhaltung genomischer Stabilität zu eliminieren.

1.8.4 Stressinduzierte Signalwege 1.8.4.1 Die integrierte Stressantwort des endoplasmatischen Retikulums Ein erst vor kurzem entdeckter Mechanismus der Apoptose wird über das endoplasmatische Retikulum (ER) aktiviert, z. B. durch eine ER-Stress-Antwort wie der UPR („unfolded protein response“), die infolge der Akkumulation aberranter Proteine im ER ausgelöst werden kann. ER-Stress-Antworten werden jedoch nicht nur durch missgefaltete Proteine ausgelöst (z. B. nach Hitzeschock oder Akkumulation aberranter Proteine), sondern z. B. auch durch Glucosemangel und Hypoxie (Marciniak u. Ron 2006). Ein weiterer ER-Stress-Aktivator ist die Entleerung der ER-Calciumspeicher, z. B. durch Thapsigargin, einen Hemmer der Sarko-/Endplasmatischen-Retikulum-Calcium-ATPase (SERCA). Weiterhin kann ER-Stress durch Störungen der Protein-N-Glykosylierung (z. B. durch Tunicamycin) und des Weitertransports in den Golgi-Apparat (z. B. durch Brefeldin A) ausgelöst werden. Aufgrund der Vielzahl möglicher Stressfaktoren wird statt UPR besser der Begriff der „integrierten Stressreaktion“ („integrated stress response“, ISR) gebraucht. Reguliert wird die ER-Stress-Antwort durch Chaperone, d. h. Sensoren der Stressantwort, die die Missfaltung von Proteinen erkennen und an missgefaltete Proteine binden (Szegezdi et al. 2006). Durch Bindung missgefalteter Proteine an Chaperone werden die Protein-

177 1.8 · Molekulare Grundlagen der Apoptose

kinasen IRE1 („inositol-requiring enzyme 1“) und PERK („pancreatic ER kinase- (PKR-) like ER kinase“) und der Transkriptionsfaktor ATF6 („activating transcription factor 6“) aus der Bindung an Chaperone freigesetzt und hierdurch aktiviert. Alle drei Faktoren sind unter Ruhebedingungen über ihren N-Terminus im ER-Lumen an das Chaperon BiP/Grp78 („Immunoglobulin heavy chainbinding protein/78 kDa glucose-regulated protein precursor“) gebunden (Szegezdi et al. 2006). Unter ER-Stress bindet BiP hingegen an missgefaltete Proteine, und die nun freigesetzten Kinasen bilden Homooligomere, die eine aktivierende Autophosphorylierung vermitteln. Aktiviertes IRE1 ist eine Endonuklease, welche die mRNA des Transkriptionsfaktors XBP1 (X-Box bindendes Protein 1) spaltet und hierdurch posttranskriptionell modifiziert. Durch Translation der prozessierten XBP1-mRNA wird ein aktives XBP1 gebildet, das die Transkription von ER-Chaperon-Genen stimuliert, sowie des Transkriptionsfaktors CHOP [„CCAAT/enhancer-binding protein-(C/EBP-)homologous protein/ GADD153“ („growth arrest and DNA-damage inducible protein 153“)]. PERK hingegen phosphoryliert und inaktiviert den Translationsinitiationsfaktor eIF2D, wodurch die Proteintranslation gebremst und so die weitere Akkumulation fehlerhafter Proteine gehemmt wird. Diese Hemmung der Translation kann jedoch von Genen umgangen werden, die im 5´-untranslatierten Bereich regulatorische Sequenzen, wie z. B. eine IRES-Sequenz, tragen („internal ribosomal entry site“). Hierdurch kann der eIF2D-vermittelte Translationsblock umgangen werden. Eines dieser Gene ist ATF4, das für einen C/EBP-Transkriptionsfaktor („cAMP response element-binding transcription“) kodiert. ATF4 vermittelt die Expression von Genen des Aminosäuremetabolismus und der Glutathionbiosynthese, hält hierdurch den Stoffwechsel aufrecht und schützt die gestresste Zelle vor weiterem oxidativen Stress (Harding et al. 2003). Zusätzlich induziert ATF4 aber auch die Expression des proapoptotischen Faktors CHOP, der bei anhaltendem ER-Stress Zelltod auslöst. Über Hemmung der Proteinexpression von Zyklin D1 über PERK/eIF2D wird ein Wachstumsstopp der betroffenen Zelle im Zellteilungszyklus erreicht (Brewer u. Diehl 2000; Zhang et al. 2006a), und über Hemmung der Genexpression von Bcl-2 und NF-NB über CHOP eine vermehrte Sensibilität für Apoptose vermittelt (Kim et al. 2006). Für CHOP und PERK wurde weiterhin eine Aktivierung des p53-Signalwegs gezeigt, die im Fall von PERK über eine Stabilisierung des p53-Proteins durch Hemmung von Hdm-2 über ribosomale Proteine erreicht wird (Zhang et al. 2006a). Weiterhin induziert PERK die Expression von Redoxenzymen, die oxidativen Stress im Rahmen der IRS abschwächen.

1.8

Der neben PERK/CHOP und IRE1/XBP1 dritte Signalweg wird durch Spaltung des Transkriptionsfaktors ATF6 vermittelt. Diese erfolgt jedoch nicht am ER, sondern nach Freisetzung aus der Bindung an BiP/Grp78 und Demaskierung eines Golgi-Lokalisationssignals. Gefolgt vom Transport zum Golgi-Apparat reift ATF6 infolge Spaltung durch die S1P- und S2P-Proteasen („Golgi site 1/2 protease“) zum aktiven Transkriptionsfaktor und vermittelt die Genexpression von Chaperonen, CHOP und XBP1, wirkt also ebenfalls im IRE1-Signalweg (Shen u. Prywes 2004). Infolge der erhöhten Expression von ER-ChaperonProteinen wird die korrekte Faltung von Proteinen begünstigt und dem ER-Stress entgegengesteuert. Gelingt dies nicht und hält der ER-Stress an, dann werden in der Zelle Apoptosesignale aktiviert, die über CHOP und PERK zum Teil über den p53-Signalweg erzeugt werden. Weiterhin wurde eine direkte Aktivierung des mitochondrialen Wegs durch aus dem ER freigesetztes Calcium beschrieben, dass direkt mitochondriale Permeabilisierungskanäle stimulieren soll. Analog zur Aktivierung der Procaspase-9 im mitochondrialen Apoptosom wurde zudem die Caspaseaktivierung am ER als wichtiger Mechanismus der Apoptoseaktivierung gezeigt. Allerdings sind die Mechanismen dieser Caspaseaktivierung bisher kaum untersucht. Daten zur Aktivierung der Procaspase-12 nach ER-Stress, insbesondere infolge der Akkumulation von Plaqueproteinen beim M. Alzheimer, wurden mittlerweile verworfen. Andere Arbeiten zeigten eine Aktivierung der Procaspase-4 sowie der Procaspase-8. Eine Spleißvariante der Caspase-8, Caspase-8L, bindet zudem an das ER-Chaperon-Protein BAP31 („31 kDa B cell receptor associated protein“) und könnte hierdurch mit BAP31 einen lokalen ER-DISC bilden. BAP31 wird durch Caspase-8 zu einem p20-Fragment gespalten, für das eine Aktivierung des mitochondrialen Apoptosewegs gezeigt wurde (Breckenridge et al. 2002). Interessanterweise ist die ER-induzierte Apoptose durch Bcl-2 hemmbar. Dieses Protein lokalisiert nicht nur in die Mitochondrienmembran, sondern auch in die ER-Membran. Auch für Bax und Bak wurde eine ERLokalisation gezeigt. Inaktivierung von Bax/Bak oder Überexpression von Bcl-2 am ER schützt vor ER-Stressinduzierter Apoptose. Ebenso konnte für BH3-onlyProteine mittlerweile eine proapoptotische Funktion am ER gezeigt werden. Die beiden BH3-only-Proteine Nbk/ Bik und Spike sind selektiv am ER lokalisiert und scheinen dort eine wichtige regulatorische Funktion zu haben (Daniel et al. 2003). Durch Aktivierung des p53-Wegs über PERK und CHOP sowie Hochregulation der p53-Zielgene Nbk/Bik, Puma und Noxa wird zudem die nachgeschaltete Aktivierung des mitochondrialen Apoptosewegs erreicht.

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

1.8.4.2 DNA-Schädigung, p53-Signalweg und nukleäre Stressantwort DNA-Schädigung, z. B. infolge von oxidativem Stress, chemischen Mutagenen oder ionisierender Bestrahlung, aktiviert Signalmechanismen, die nach Detektion der Art des DNA-Schadens (z. B. Punktmutation, Einzeloder Doppelstrangbruch) spezifische DNA-Reparaturmechanismen aktivieren (Kastan u. Bartek 2004). Die hierdurch gebildeten Proteinkomplexe vermitteln, neben ihrer Reparaturfunktion die Aktivierung von Stresskinasen, die sowohl Zellzyklusarrest an Checkpunkten des Zellteilungszyklus als auch Zelltodsignalwege regulieren. Über die Aktivierung der ATM-Kinase („Ataxia teleangiectasia mutated“) und der verwandten ATR-Kinase („AT related“) wird der p53-Signalweg aktiviert (Brown u. Attardi 2005; Lavin et al. 2006). Das p53-Gen wurde aufgrund der häufigen Überexpression des p53-Proteins in malignen Tumoren und seiner Stabilisierung durch virale Onkogene entdeckt (May u. May 1999). Mutationsuntersuchungen in humanen Tumoren zeigten, dass es eines der am häufigsten mutierten Gene ist (Daniel et al. 2004). Durch genetische und funktionelle Analysen im Tiermodell wurde seine Funktion als wichtiges Tumorsuppressorgen erkannt. Neben p53 konnten mittlerweile zwei homologe Proteine mit teils redundanter Funktion identifiziert werden, p63 und p73. Zumindest p63 scheint seine physiologische Rolle aber weniger in der DNA-Schadenskontrolle als vielmehr in der Organentwicklung und Differenzierung, vor allem der Haut, zu haben (MurrayZmijewski et al. 2006). P53 entfaltet seine Funktion als Wächter des Genoms durch seine Wirkung als Transkriptionsfaktor, der wichtige zellteilungshemmende und zelltodfördernde Zielgene transkriptionell aktiviert (Vousden u. Lu 2002). Weiterhin wirkt p53 als transkriptioneller Repressor zellteilungsfördernder und zelltodhemmender Gene. Hierdurch wird einerseits die geschädigte Zelle im Zellteilungszyklus arretiert und ihre Reparatur des Schadens ermöglicht (Sengupta u. Harris 2005). Andererseits vermitteln diese p53-abhängigen Signale bei anhaltender Aktivierung des Signalwegs und Scheitern der Reparatur die Aktivierung eines terminalen Zellzyklusarrests mit Einleitung einer vorzeitigen, prämaturen Seneszenz (Bhonde et al. 2006). Seneszente Zellen können noch kurze Zeit ihre Funktion im Gewebsverband erfüllen, sterben dann aber langsam über Autophagozytose. Zellteilungsarrest in der frühen G1-Phase wird über transkriptionelle Aktivierung des p21CIP/WAF-1-Gens vermittelt, das als Hemmer der Komplexe aus Zyklinen und zyklinabhängigen Kinasen wirkt. In Zellen, die sich bereits in der S-Phase befinden oder in Zellen mit gestörtem G1-Arrest, z. B. infolge

eines Funktionsverlusts des Rb-Proteins, wird Arrest am Ende der G2-Phase, vor Eintritt in die Mitose, aktiviert. Dies erfolgt über Hemmung der Zyklin-Abzw. -B-Komplexe mit der Cdk1-Kinase (Daniel 2003). Aktivierung von Zellteilungsarrest und Seneszenz ist die überwiegende Stressreaktion schwer geschädigter normaler Körperzellen. In Zellen mit gestörten Checkpunktprogrammen des Zellzyklus, wie es in vielen Tumorzellen der Fall ist, aktiviert p53 hingegen bevorzugt Zelltodsignalwege. Unterstützt wird diese zweigeteilte Funktionalität von p53 durch das p21-Protein, das nicht nur wichtig für die Aktivierung von Arrestprogrammen ist, sondern auch die Apoptose hemmt und Seneszenz vermittelt und hierdurch letztendlich Autophagie begünstigt (Kastan u. Bartek 2004; Wendt et al. 2006). Aktiviert wird p53 im Wesentlichen durch posttranslationale Modifikationen des p53-Proteins, die zur Verminderung des Abbaus und der Stabilisierung des p53-Proteins führen. Die Aktivierung des p53-Signalwegs geht aber meist auch mit transkriptioneller Aktivierung des p53-Gens einher. Gezeigt wurde auch, dass die ATM- und ATR-Kinase p53 durch Phosphorylierung am N-Terminus modifizieren, hierdurch dessen Aktivität erhöhen und zudem seine Halbwertszeit stabilisieren (> Abb. 1.8.11). Unterstützt wird dies durch die Chk1und Chk2-Kinasen, die durch ATR bzw. ATM phosphoryliert und aktiviert werden und ebenfalls p53 phosphorylieren (Kastan u. Bartek 2004). Weiterhin muss p53 acetyliert werden, um transkriptionell aktiv zu werden. Acetylierung und Stabilität des p53-Proteins wird über das Hdm-2-Protein reguliert, das an p53 im Zellkern bindet und p53 hierdurch funktionell inaktiviert. Hdm-2 ist eine RING-Finger-Domäne-tragende E3-Ubiquitinligase, die p53 dem proteasomalem Abbau zuführt. Die basale p53-Protein-Expression ist in normalen Zellen daher sehr niedrig. P53 ist jedoch ein transkriptioneller Aktivator des Hdm-2-Gens [Mdm-2 („murine double minute 2“) in der Maus]. Über diesen Mechanismus vermittelt p53 einen negativen Rückkopplungsmechanismus, der erst bei zellulären Stressreaktionen und p53-Aktivierung durchbrochen werden kann (Toledo u. Wahl 2006; > Abb. 1.8.11). Ein weiterer wichtiger Weg der p53-Aktivierung wird über Onkogene ausgelöst, die das p14ARF-Tumorsuppressorgen aktivieren (p19ARF in der Maus). ARF wird, wie auch der CDK-Inhibitor p16INK4a vom INK4-Genlokus kodiert, allerdings unter Nutzung des Exons 1E statt –D und mit einem anderen Leseraster („alternative reading frame“, ARF) im Exon 2. ARF entfaltet seine p53-aktivierende Wirkung, indem es an Hdm-2 bindet und sequestriert. Hierdurch wird p53 stabilisiert und durch posttranslationale Modifikation aktiviert.

179 1.8 · Molekulare Grundlagen der Apoptose

. Abb. 1.8.11. p53-Signalweg. Der p53-Signalweg wird durch diverse intrazelluläre Stressreaktionen aktiviert. Hierzu zählen insbesondere DNA-Schädigung, Telomerverkürzung im Rahmen der replikativen Zellalterung und Seneszenz, jedoch auch ER-Stress und Hypoxie. P53 wird vor allem posttranskriptionell reguliert und durch Phosphorylierung und Acetylierung aktiviert und stabilisiert. P53Phosphorylierung, z. B. nach DNA-Schädigung und Erkennung verkürzter Telomerenden erfolgt durch Chk1 bzw. -2 sowie ATM- und ATR-Kinasen, die wiederum durch DNA-Reparaturmechanismen aktiviert werden. Aktiviertes p53 bindet als Tetramer an die DNA und wirkt dort als transkriptioneller Aktivator (oder Repressor) regulatorischer Gene, die Zellzyklusarrest und Seneszenz vermitteln, sowie bei anhaltendem zellulären Stress oder irreparabler Zellschädigung Zelltod auslösen. P53 induziert auch die Expression p53-regulierender Gene, vor allem des Hdm-2-Proteins, das an p53 bindet, als E3-Ubiquitinligase p53-Ubiquitinierung vermittelt und p53 hierdurch dem proteasomalen Abbau zuführt. P53 wird auch durch deregulierte Aktivierung von Onkogenen (C-MYC, E2F-1, K-ras etc.) aktiviert. Dies erfolgt wesentlich (aber nicht ausschließlich) über das p14ARFTumorsuppressorgen, das an Hdm-2 bindet und es hierdurch funktionell inaktiviert und im Nukleolus des Zellkerns sequestriert. P14ARF kann allerdings auch p53-unabhängig Zellzyklusarrest auslösen, z. B. durch Hemmung der zyklinabhängigen Kinase Cdk1, und Bax/Bak-abhängige Apoptose auslösen

Entgegen früherer Daten wurde mittlerweile gezeigt, dass ARF zusätzlich zur Wirkung auf Hdm-2 über den DNA-Schädigungssignalweg wirkt (> Abb. 1.8.11). Durch Aktivierung der ATM-, ATR- und Chk-Kinasen vermittelt p14ARF Zellzyklusarrest, Seneszenz und Apoptose und schützt den Organismus hierdurch vor onkogeninduzierter Zelltransformation (Sherr 1998). Zum Teil werden diese Effektormechanismen über p53-unabhängige Mechanismen vermittelt (Sherr 2006). Dies gilt vor allem für Apoptoseexekution über Bax-/Bak-abhängige und unabhängige Signale (Hemmati et al. 2006) und den Zellzyklusarrest in der G2-Phase durch Inaktivierung

1.8

der p34cdc2-Kinase (Normand et al. 2005), wohingegen G1-Arrest und Seneszenz über vorwiegend p53-abhängige Signale vermittelt werden. Um an DNA binden zu können, muss p53 tetramerisieren. Dies ermöglicht eine weitere Ebene der Regulation durch p53-Spleißvarianten oder dessen Homologe p63 bzw. p73 (Murray-Zmijewski et al. 2006; Vousden u. Lu 2002). Spleißvarianten, die nur die Tetramerisierungsdomäne, nicht jedoch die N-terminale Transaktivierungsdomäne enthalten und somit nicht mehr an DNA binden können, wirken als dominant-negative p53-Analoga. Sie inaktivieren die Funktion von Wildtyp-p53 (oder dessen p63 und p73-Homologen), indem sie durch Bindung in den tetrameren Komplex dessen DNA-Bindung blockieren. Interessanterweise kann p73D, d. h. die p73-Spleißvariante, der die C-terminale DNA-Bindungs- bzw. Transaktivierungsdomäne fehlt, in p53- bzw. p63-Komplexe binden und so deren Aktivität blockieren. Die zelltodfördernde Funktion von p53 wird über die transkriptionelle Aktivierung von zelltodfördernden Genen vermittelt und erfolgt über die Bindung von p53-Komplexen an die Promotorregion dieser Gene (Vousden u. Lu 2002). Zielgene sind CD95/Fas und der TRAIL-Rezeptor II (DR5), jedoch nicht die Todesliganden. Weiterhin werden kritische Komponenten des intrinsischen Apoptosewegs induziert, und zwar Bax und Bak, sowie diverse BH3-only-Proteine, insbesondere Puma, Noxa, Hrk und Nbk (> Abb. 1.8.7a), sowie das Apoptosom-Adapterprotein APAF-1. Beschrieben wurde aber auch eine transkriptionsunabhängige zelltodfördernde Funktion von p53. So wurde, analog der BH3-only-Proteine, eine Bindung von p53 an Bcl-xL beobachtet, die eine mitochondriale Lokalisation von p53 vermitteln kann. Allerdings ist diese Interaktion niedrigaffin und wird auch unter Bedingungen beobachtet, die nicht in Apoptose resultieren. Die direkte mitochondriale Lokalisation und Aktivierung des intrinsischen Zelltodsignalwegs über Hemmung antiapoptotischer Bcl-2-Familienmitglieder wird aufgrund dieser Befunde sehr kontrovers diskutiert. Strukturbiologische Daten zeigen zudem, dass die Kontaktfläche von p53 und Bcl-xL nicht in der durch BH1-, -2- und -3-Domäne gebildeten Bindetasche für D-helikale BH3-Domänen, sondern an deren abgewandter Seite des Proteins modelliert wurde. Somit agiert p53 als Aktivator des intrinsischen Apoptosewegs über Hochregulation von BH3-only-Proteinen, die wiederum die Multidomänenproteine Bax und Bak aktivieren und den Zelltod über die Freisetzung mitochondrialer Faktoren, Bildung des Apoptosoms und Aktivierung der Caspasekaskade auslösen. Über Hochregulation von Todesrezeptoren kann zudem, falls über p53-unabhängige Mechanismen Todesliganden

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

exprimiert werden, für Apoptosesignale des intrinsischen Signalwegs sensibilisiert werden. Dies ist von therapeutischem Interesse, da die Gabe rekombinanter Todesliganden, vor allem TRAIL, oder agonistischer Antikörper gegen TRAIL-Todesrezeptoren Tumorzellen über einen synergistischen Mechanismus massiv für den Zelltod sensibilisiert (Marini et al. 2006; v. Haefen et al. 2004; Wendt et al. 2005).

1.8.4.3 PI3-/Akt-Kinase-/mTOR-Signalweg Die physiologische Funktion der PI3-Kinase besteht darin, aktivierende Signale von Zelloberflächenrezeptoren, wie z. B. Rezeptortyrosinkinasen, Wachstums- und Überlebenssignale in das Zellinnere zu transduzieren und mit nachgeschalteten Signalkaskaden zu vernetzen (> Abb. 1.8.12). Die aktivierte PI3-Kinase bildet aus

Membranphospholipiden an der Position 3 phosphorylierte Phosphatidylinositole (PIP3) und vermittelt hierüber eine fokal erhöhte Bindung der PDK1-Kinase und der Akt-Kinase (Proteinkinase-B, PKB) an die Zellmembran. Hierdurch und über die Phosphorylierung durch die PDK1-Kinase wird die Akt-Kinase aktiviert und induziert vor allem den NF-NB-Signalweg, der wiederum Zellvermehrung und Zelltodhemmung vermittelt. Akt phosphoryliert zudem das BH3-only-Protein Bad in der BH3-Domäne und inaktiviert es hierdurch. Gehemmt wird der Signalweg durch die PTEN-Phosphatase, die in einer Vielzahl von Tumoren inaktiviert ist (Sansal u. Sellers 2004). Sowohl die PI3-Kinase als auch die Akt-Kinase können aber auch über rezeptorunabhängige Signale, z. B. über den Ras-Signalweg, das Bcr-Abl-Fusionsgen und den mTOR-Signalweg aktiviert werden. Dies resultiert in einer Überaktivierung des PI3-/Akt-Signalwegs, der bei vielen malignen Tumoren

. Abb. 1.8.12. PI3-/Akt-Kinase-/mTOR-Signalweg. Wachstumsfaktoren aktivieren Rezeptortyrosinkinasen in Tumorzellen, und dies führt zur Aktivierung des PI3-Kinase-Wegs und der Akt-Kinase, die wichtige Überlebenssignale vermittelt und hierdurch Zelltodmechanismen hemmt. Des Weiteren vermittelt dieser Signalweg die Aktivierung des mTOR-Signalwegs, der eine zentrale regulatorische Rolle im Zellmetabolismus spielt. Der mTOR-Weg reguliert unter anderem Zellgröße, -vermehrung und –motilität und in Tumorzellen Therapieresistenz und Metastasierung. Nahrungs-, Energie-, Sauerstoff- oder Wachstumsfaktorentzug hemmen den mTOR-Weg und aktivieren hierdurch Stressreaktionen, wodurch die Proteintranslation gehemmt wird. Dies erfolgt über Aktivierung der S6-Kinase und Hemmung des 4E-BP1-Proteins, wodurch der Translationsinitiationsfaktor eIF4E aktiviert wird. S6: ribosomales S6-Protein, S6K: S6-Kinase, eIF4E: eukaryoter Initiationsfaktor 4E, 4E-BP1: eIF-4E-bindendes Protein 1

181 1.8 · Molekulare Grundlagen der Apoptose

beobachtet wird und mit Therapieresistenz, Hormonunabhängigkeit, vermehrter Proliferation und Metastasierung assoziiert ist (Choo u. Blenis 2006). Der mTOR-Weg wirkt als Sensor für zellulären Stress wie z. B. Wachstumsfaktormangel, Nährstoffdefizit oder auch Hypoxie. Fallen Überlebenssignale über die PI3Kinase weg, dann werden über die inhibitorischen Proteine TSC1 und -2, analog zu einem „Totmann“-Schalter, mTOR und die nachgeschalteten Signalwege inaktiviert. Dies führt zu einer Hemmung der ribosomalen Proteinbiosynthese, zu einer Verminderung der Zellgröße und, im Extremfall, zur Aktivierung von Zelltod über Autophagie oder Apoptose. Für den mTOR-Signalweg wurde kürzlich eine wichtige Rolle in malignen Tumoren beschrieben, insbesondere hinsichtlich der Regulation der Proteintranslation durch den mTOR-Komplex 1 (mTORC1), der die Aktivierung der ribosomalen Proteintranslationsmaschinerie auslöst (> Abb. 1.8.12). Über den zweiten mTOR-Komplex (mTORC2) reguliert mTOR das Zytoskelett, Zellmotilität und den Akt-Signalweg. Die Akt-Kinase wiederum aktiviert, über Hemmung des TSC1-/TSC2Proteinkomplexes (Tuberöse-Sklerose-Protein 1 und 2), den mTOR Komplex 1 und induziert hierüber Proteintranslation, vermehrte Stoffwechselaktivität und Zunahme von Zellgröße und Zellvermehrung. mTOR-Aktivität scheint also gerade in Tumoren mit dereguliertem PI3-/ Akt-Kinase-Signalweg von Bedeutung zu sein. Hemmung von mTOR bietet dort eine Möglichkeit, auch bei Vorliegen von Defekten der PTEN-Phosphatase eine Hemmung des PI3-/Akt-Kinase-Signalwegs zu erreichen. Interessanterweise ist dieser Signalweg über den pharmakologischen Inhibitor Sirolimus (Rapamycin) und dessen Analoga, wie z. B. Everolimus (RAD-001), Temsirolimus (CCI-779) und AP23573, gut hemmbar (Easton u. Houghton 2006). Rapamycin bildet mit dem Bindungsprotein FKBP12 (FK506-bindendes Protein mit Molekulargewicht 12 kDa) und mTOR einen Komplex und hemmt hierdurch die Bindung von mTOR an das Raptor-Protein im Komplex 1. Hingegen scheint das Rictor-Protein („rapamycin-insensitive companion of mTOR“) im Komplex 2 nicht durch Rapamycin beeinflusst zu werden. Aktuelle Daten zeigen aber, dass Rapamycin dennoch über den Rictor-Komplex den Akt-Signalweg hemmen kann. Hemmung von mTOR über Rapamycin oder dessen Analoga induziert, in Abhängigkeit vom zellulären Kontext, eine Stresssituation analog zu akutem Nährstoffentzug. Dies löst Wachstumsarrest und/oder Zelltod über Apoptose und Autophagie aus. Gleichartige Effekte können durch Hemmung der PI3- bzw. der Akt-Kinase erzielt werden. Interessanterweise wirken Kombinationen von Rapamycin und PI3-Kinase-Inhibitoren stark synergistisch.

1.8

Aufgrund der zentralen Bedeutung der durch mTOR und PI3-/Akt-Kinase regulierten Signalwege und der Wirksamkeit der Inhibitoren wird deren klinischer Einsatz derzeit intensiv geprüft (Easton u. Houghton 2006). Phase-I-/II-Studien zeigen Aktivität von Rapamycin bei akuten myeloischen Leukämien. Die Analoga Emsirolimus, Everolimus und AP23573 werden derzeit in klinischen Studien bei verschiedenen hämatologischen Neoplasien und soliden Tumoren getestet und zeigen Aktivität als Monosubstanzen bei hämatologischen Neoplasien und dem Nierenzellkarzinom und in der Kombination mit z. B. Aromatasehemmern beim Mammakarzinom.

1.8.4.4 Telomerverkürzung, DNA-Schädigung und Seneszenz Adulte Körperzellen sind in ihrer Fähigkeit zur Selbsterneuerung eingeschränkt. Werden beispielsweise humane Fibroblasten in vitro kultiviert, so sind sie in der Lage, etwa 50 Zellteilungszyklen zu durchlaufen. Danach arretieren sie permanent im Zellzyklus, zumeist in der G1-Phase, und verlieren die Fähigkeit zur Vermehrung. Gleichzeitig entwickeln sie eine charakteristische Morphologie mit langen Zellausläufern, vakuolisierten Organellen und Vermehrung der Lysosomen. Dieses Phänomen wird auch bei der physiologischen Zellalterung beobachtet und wird als replikative Seneszenz bezeichnet. Ursächlich verantwortlich hierfür ist die Verkürzung der Chromosomenenden, der Telomere. Die dort befindlichen, repetitiven, nichtkodierenden DNA-Sequenzen werden bei jeder Zellteilung aufgrund der Biochemie der DNA-Replikation verkürzt. Telomere tragen multimere Proteinkomplexe, welche die Chromosomenenden vor der Verdauung durch Nukleasen und vor der Erkennung durch DNA-Reparaturkomplexe schützen und die Regeneration der Telomere nach der Zellteilung kontrollieren (de Lange 2002; Hockemeyer et al. 2005). Konventionelle, an der DNA-Reparatur beteiligte Proteinkomplexe sind nicht in der Lage, verkürzte Telomerenden wiederherzustellen. Regeneriert wird die Telomer-DNA daher durch das Enzym Telomerase, eine zelluläre reverse Transkriptase, das aus einem Protein und einem RNA-Anteil besteht. Die RNA-Einheit agiert hierbei als das Template für die Synthese der repetitiven DNA-Sequenzen des Telomers. Die Telomerase verlängert hierdurch das freie 3´-Ende der DNA. Der komplementäre Strang wird durch konventionelle DNA-Polymerasen aufgefüllt. Während der Embryogenese ist die Telomerase ubiquitär exprimiert, wird jedoch in ausgereiften Geweben herunterreguliert. Da die Homöostase der Telomerlängen wichtig für das Langzeitüberleben und die Fähigkeit zum klonogenen Wachstum ist, erhal-

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

ten Gewebsstammzellen die Expression der Telomerase aufrecht, wohingegen postmitotische Gewebe sie verlieren. Tumorzellen hingegen zeigen eine deregulierte Expression der Telomerase und erlangen hierdurch die Fähigkeit zur unbegrenzten Zellteilung, zeigen also in dieser Hinsicht große Ähnlichkeit zu Stammzellen. Die Verkürzung von Telomeren aktiviert eine zelluläre Stressantwort, die auf der Aktivierung von DNAReparatur-Signalwegen beruht (d‘Adda di Fagagna et al. 2003). Freiliegende Telomerenden werden von Proteinkomplexen erkannt, die auch an der Erkennung von DNA-Doppelstrangbrüchen beteiligt sind. Hierdurch werden die bereits aus der DNA-Schädigungsantwort bekannten Stresskinasen, d. h. ATM, ATR und Chk1, Chk2 aktiviert (Verdun u. Karlseder 2006). Durch die resultierende Aktivierung des p53- und des p14ARF-Signalwegs werden Checkpunktprogramme des Zellteilungszyklus aktiviert und seneszenzvermittelnde Gene induziert (Dimri 2005). In Folge wird die Zelle im Zellteilungszyklus arretiert und erlangt die charakteristische Morphologie der seneszenten, irreversibel im Wachstum gestoppten Zelle. Diese Beobachtungen legen eine Funktion der Telomerase in der Zellalterung nahe. Telomerasedefiziente Mäuse zeigen in der Tat, neben der beschleunigten Verkürzung der Telomere, eine Verkürzung der Lebensspanne und Defekte in der Wundheilung und Zellregeneration, z. B. des Knochenmarks nach Bestrahlung oder Chemotherapie (Rudolph et al. 1999). Allerdings entwickeln sie bei Weitem nicht das volle Spektrum einer Progerie, d. h. einer vorzeitigen Alterung, wie sie z. B. bei Defekten der RecQ-DNA-Helikase WRN beim WernerSyndrom beobachtet wird (Orren 2006).

1.8.5 Störungen der Zelltodregulation in der Pathogenese von Erkrankungen 1.8.5.1 Immunsystem Zelltodmechanismen spielen eine zentrale Rolle in der Regulation des spezifischen Immunsystems (Krammer 2000). Durch gezielte Induktion von Apoptose werden Zellen des spezifischen Immunsystems eliminiert, sobald sie gegen körpereigene Strukturen reagieren und hierdurch im falschen Signalkontext aktiviert werden. Ebenso ist Apoptose für die Funktion von Effektorzellen des zellulären Immunsystems von Bedeutung, vor allem für zytotoxische T- und NK-Zellen. Sie exprimieren apoptoseinduzierende Liganden wie den CD95-/Fas-Liganden und aktivieren zudem Apoptosesignalwege in ihren Zielzellen, indem sie über die Ausschüttung von porenbildenden Perforinen, die sich in die Plasmamemb-

ran der Zielzelle einsenken, apoptoseinduzierende Enzyme, vor allem Granzym B, in die Zielzelle einschleusen (Voskoboinik et al. 2006). Granzym B wirkt vergleichbar den Caspasen, spaltet eine Vielzahl zellulärer Substrate und aktiviert zudem die Caspasekaskade. Hierdurch wird in der Zielzelle Apoptose ausgelöst. Ein klassisches Beispiel hierfür sind die bei der Virushepatitis, vor allem der Hepatitis B, beobachteten azidophilen CouncilmanKörperchen, die Hepatozyten entsprechen, in denen nach Kontakt mit zytotoxischen T-Zellen Apoptose ausgelöst wurde (Chisari 1996). Autoimmunität Um autoimmune Reaktionen des Immunsystems gegen körpereigene Strukturen zu verhindern, müssen autoreaktive Zellen bei der Reifung des Immunsystems und auch in ausdifferenzierten T- und B-Lymphozyten des spezifischen Immunsystems streng kontrolliert werden. Dies erfolgt über die Mechanismen der immunologischen Toleranz. Dies kann einerseits durch Entzug von T-Zell-Hilfe oder die Aktivität regulatorischer T-Zellen erfolgen. Andererseits kann die autoreaktive T- oder B-Zelle aktiv zum Schweigen gebracht werden, z. B. durch Auslösung von Signalen die Anergie induzieren und die Zelle refraktär gegen Aktivierungssignale über den Antigenrezeptor werden lassen. Diesen Fail-safeMechanismen übergeordnet ist aber die Deletion unerwünschter und gefährlicher T- und B-Zellen über Apoptosesignale. Sind Apoptosemechanismen gestört, ist auch die Deletion autoreaktiver Zellen behindert, und es können sich autoimmune Erkrankungen entwickeln (Strasser 2005). Während der Reifung im Thymus bzw. im Knochenmark aus lymphozytären Stammzellen durchlaufen unreife T- und B-Zellen zwei wesentliche Checkpunkte. Der erste kontrolliert, ob es der Zelle gelingt, einen Antigenrezeptor zu exprimieren, d. h., ob es ihr gelungen ist, ein Rearrangement des Antigenrezeptors aus den verschiedenen Genelementen durch somatische homologe Rekombination herzustellen, die schwere Kette von IgM im Fall der heranreifenden B-Zelle, die T-Zell-Rezeptor-E-Kette im Fall der unreifen T-Zelle, in beiden Situationen komplementiert durch eine zweite „Surrogatkette“. Zellen, denen dies gelang, werden positiv selektiert und erhalten Wachstums- und Differenzierungssignale. Diese Zellen exprimieren in der Folge den reifen Antigenrezeptor und durchlaufen nun die zweite Runde der Selektion. Den T-Zellen werden Autoantigene in der Medulla des Thymus präsentiert. Die noch im Knochenmark befindlichen B-Zellen können lösliche Antigene erkennen. Wird während dieser Reifungsstufe Antigen erkannt, dann erfolgt die negative Selektion, und die aktivierte Zelle wird deletiert (Palmer 2003). Anstelle zur T- und B-Zell-Aktivierung, gefolgt von der Bildung von

183 1.8 · Molekulare Grundlagen der Apoptose

Effektorzellen, führt dieses aktivierende Signal zum Zelltod. Dieser Zelltod wird daher auch als aktivierungsinduzierter Zelltod, AICD („activation induced cell death“) bezeichnet. Gleichermaßen sind reife T- und B-Zellen einer solchen negativen Selektion durch AICD ausgesetzt. Dies kann sowohl im Rahmen der T- und B-Zell-Zirkulation durch die Körpergewebe und Lymphe erfolgen als auch in den primären und sekundären lymphatischen Geweben. Ein Ort, der für eine solche Negativselektion spezialisiert ist, ist das Keimzentrum der Lymphfollikel (Defrance 2005). Hier durchlaufen aktivierte B-Lymphozyten als Zentroblasten und Zentrozyten erneute Selektionsrunden zur Elimination potenziell autoreaktiver Zellen infolge der somatischen Hypermutation der variablen Regionen der rearrangierten Immunglobuline. Ebenso werden B-Zellen, denen die Immunglobulin-Klassenumschaltung von IgM zu IgG, -A oder –E nicht gelingt, über Apoptose deletiert. Außer beim AICD spielt die Apoptose auch eine wichtige Rolle bei der Abschaltung einer erfolgreich abgelaufenen Immunantwort. Die im Rahmen der Immunabwehr expandierten T- und B-Zell-Klone müssen, um Raum für andere Klone zu lassen, wieder zurückgefahren werden. Hier wird der Zelltod nicht über AICD und Antigenrezeptorsignale vermittelt, sondern über fehlende Stimulation und Kostimulation über professionelle antigenpräsentierende Zellen. Dieser Zelltod infolge des Entzugs von Wachstumsfaktoren wird als Tod durch Vernachlässigung („neglect“) bezeichnet (Fas et al. 2006). AICD wird über todesrezeptorvermittelte Signale ausgeführt. Die Aktivierung von T-Zellen infolge der Ligation des T-Zell-Rezeptors führt zur Hochregulation des CD95-/Fas-Liganden, der auch als APO-1L bezeichnet wird. CD95L wird als membranständiges Molekül exprimiert, das auch über Aktivierung von Metalloproteasen der Extrazellulärmatrix abgespalten werden und als lösliches Molekül vorliegen kann (Krammer 2000). In Zellkulturexperimenten wurde gezeigt, dass die autokrine Produktion des CD95L T-Zell-Apoptose induziert und auch in benachbarten T-Zellen Apoptose auslösen kann (Dhein et al. 1995). Im Gegensatz zum autokrinen Suizid der aktivierten T-Zelle wird dies als Fratrizid, Brudermord, bezeichnet. Für den zweiten Todesliganden, TRAIL (APO-2L), wurde eine Kontrollfunktion in der Thymozytenreifung gezeigt (Palmer 2003). Ebenso scheint ein Teil des AICD auch über TRAIL vermittelt zu werden. Interessanterweise sind ruhende T-Zellen weitgehend refraktär gegenüber CD95L-induzierter Apoptose und zeigen erst nach Aktivierung eine über Tage hinweg zunehmende Empfindlichkeit gegenüber CD95L (Krammer 2000). Dies ist mit einer Herunterregulation von FLIP-Proteinen verbunden, die über einen IL-2-abhängigen Mechanismus vermittelt wird (Budd et al. 2006). Dies erklärt die apoptosesensibilisierende

1.8

Wirkung des T-Zell-Wachstumsfaktors IL-2. In ruhenden T-Zellen wirkt CD95L hingegen als kostimulatorisches Molekül, das die Aktivierung durch Ligation des T-Zell-Rezeptors verbessert. Dies deutet auf eine duale Funktion von todesligandenvermittelten Signalen bei ruhenden und aktivierten T-Zellen hin. In der Tat führt die Inaktivierung von Caspase-8 durch Überexpression des viralen Caspase-8-Inhibitors crmA oder die Überexpression von FLIPL bzw. einer dominantnegativen FADD-Mutante oder Verlust von FADD im Mausmodell zu einer Störung der T-Zell-Reifung und T-Zell-Aktivierung (Kang et al. 2004; Schwerk u. SchulzeOsthoff 2003). Dies deutet auf eine antiapoptotische Signalkomponente von Todesrezeptoren hin, die in malignen Tumoren kürzlich als NF-NB-vermittelt aufgeklärt werden konnte. Inaktivierung von Todesrezeptorsignalwegen führt sowohl im Mausmodell als auch beim Menschen zu Autoimmunität (Bidere et al. 2006). Mäuse mit defekter Expression des CD95-Todesrezeptors durch einen Spleißdefekt im CD95-Gen („lpr (lymphoproliferation)“Mutante) oder einer inaktivierenden Punktmutation („lprcg; lpr complementing gld“) oder eines Defekts des murinen CD95L [„gld- (generalized lymphoproliferative disorder“-)Mutante] entwickeln rasch nach Geburt eine massive Akkumulation aberranter ruhender, anerger, nichtklonaler T-Zellen mit niedriger CD8-Expression und Herunterregulation des T-Zell-Rezeptors (Krammer 2000). In Abhängigkeit vom genetischen Hintergrund des Mausmodells entwickeln sie zudem eine Hypergammaglobulinämie und ein Lupus-erythematodesähnliches Krankheitsbild. Beim Menschen konnte ein ähnliches Krankheitsbild mit somatischer Mutation im CD95-System identifiziert werden, das als ALPS (Autoimmunes Lymphoproliferationssyndrom) oder Canale-Smith-Syndrom bezeichnet wird. ALPS kann in 4 Klassen eingeteilt werden: Typ Ia Typ Ib

mit Mutation des CD95 Rezeptors, mit Mutation des CD95L, die beide in einer gestörten Bindung des FADD Adaptermoleküls und fehlender DISC Bildung resultieren. Typ II zeigt eine gestörte Aktivierung nachgeschalteter Effektormoleküle wie der Caspase-10. Typ III, auch als ALD („autoimmune lymphoproliferative disorder“) bezeichnet, zeigt keine dieser Mutationen, könnte aber durch im Signalweg nachgeschaltete Veränderungen bedingt sein. Bei ALPS nachgewiesene Mutationen sind Veränderungen in der Keimbahn, werden also familiär weitergegeben. Die sorgfältige Analyse von ALPS-belasteten Familien zeigte interessanterweise ein gehäuftes Auftreten von malignen Lymphomen. Dies deutet auf eine Tumor-

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

kontrollfunktion von Todesrezeptoren in der Lymphompathogenese hin. Unterstützt wird dies durch den Nachweis von CD95-Mutationen vor allem bei hochmalignen B-Zell-Lymphomen des Burkitt-Typs (nicht jedoch bei anderen Lymphom-Entitäten). Mutationen des CD95Systems sind, da die ALPS-Lymphome insgesamt sehr selten sind, allenfalls Kofaktoren, ähnlich der deregulierten Bcl-2-Expression bei follikulären Lymphomen. Hochregulation von FLIP-Proteinen wurde hingegen in den T-Zellen von Patienten mit multipler Sklerose nachgewiesen. Diese Hochregulation von FLIP steht wahrscheinlich mit der Stärke und Kostimulation der T-Zell-Aktivierung in Verbindung, könnte die Inaktivierung autoreaktiver T-Lymphozyten verhindern und hierdurch die Autoimmunreaktion gegen Myelinproteine durch Verbesserung des T-Zell-Überlebens fördern (Budd et al. 2006). Störungen in der Regulation des intrinsischen Apoptosewegs lymphatischer Zellen sind ebenfalls mit Autoimmunität assoziiert (Bidere et al. 2006; Strasser 2005). Diese Befunde stammen jedoch sämtlich aus dem Mausmodell, und Daten aus dem Menschen, die derartige Pathomechanismen im klinischen Kontext belegen würden, liegen noch nicht vor. Überexpression von Bcl-2 unter Kontrolle des als Promotor wirkenden Immunglobulin-Schwerketten-Gen-Enhancers führt im B-ZellKompartiment von Mäusen lediglich zu einer Hyperplasie der B-Zell-Areale. Hingegen resultiert die Inaktivierung des BH3-only-Proteins Bim durch genetischen Knockout in einer massiven Störung der T-Zell-Deletion im Thymus und in reifen T-Zellen in der Peripherie, die in einer Akkumulation autoreaktiver Lymphozyten resultiert. Weiterhin zeigen Bim-defiziente Mäuse eine Expansion der B-Zell-Kompartimente und entwickeln, abhängig vom genetischen Hintergrund des untersuchten Inzucht-Mausstamms, eine Lupus-erythematodes-ähnliche Erkrankung. Gestörte Bim-Expression und gestörte T-Zell-Deletion im Thymus wurde auch in einem Modell für Diabetes mellitus im NOD-Mausmodell („non-obese diabetes“) beobachtet. Störungen der Apoptoseregulation finden sich auch in den an Autoimmunerkrankungen beteiligten nichtlymphatischen Geweben. So finden sich in den proliferierenden Synovialzellen von Patienten mit rheumatoider Arthritis Mutationen des p53-Gens (Yamanishi et al. 2002). Bei der Basedow-Krankheit hingegen zeigen die hyperplastischen Thyreozyten eine erhöhte Expression von FLIP-Proteinen, die möglicherweise durch die Sekretion der Interleukine-4 und -10 durch infiltrierende T-Lymphozyten vermittelt wird (Budd et al. 2006). Immundefizienz Erbliche Immundefektsyndrome werden zumeist durch Defekte im Rearrangement der T- bzw. B-Zell-Rezep-

toren bei der Reifung der lymphatischen Zellen im Knochenmark (B-Zellen) bzw. Thymus (T-Zellen) verursacht. Diese entstehen durch diverse Defekte in DNA-Reparaturmechanismen, die zu Defekten in der somatischen homologen Rekombination führen, sowie durch Defekte der Gene, die die VDJ-Rekombination vermitteln. Schlägt das Rearrangement des Antigenrezeptors fehl, dann bleiben Überlebenssignale aus, und die betroffene Zelle kann nicht durch positive Selektion zur weiteren Proliferation und Differenzierung stimuliert werden (Anderson 2006; v. Boehmer u. Fehling 1997). Die Bildung reifer lymphatischer Zellen bleibt aus, und die nicht positiv selektierten unreifen Zellen sterben über Aktivierung des intrinsischen Apoptosewegs oder über Autophagie. Erworbene Immundefektsyndrome, insbesondere das durch Infektion mit humanen Immundefektviren (HIV) ausgelöste AIDS („acquired immunodeficiency syndrome“), zeigen ebenfalls eine Beteiligung von Zelltodmechanismen bei der Depletion der T-Zellen. Einerseits aktiviert die virale Replikation Apoptosemechanismen der Zelle, die vonseiten der Zelle und des Organismus die virale Replikation und weitere Verbreitung infektiöser Partikel verhindern sollen. Aktivierung von DNAsen und RNAsen in der durch Proteolyse dekompartimentierten apoptotischen Zelle haben vermutlich die Funktion, virale Erbsubstanz vor der Phagozytose abzubauen. Dendritische Zellen phagozytieren bevorzugt apoptotische Zellen, also auch HIV-infizierte apoptotische T-Zellen und werden hierdurch selbst infiziert. In der Tat stellt die HIV-Infektion dendritischer Zellen einen wesentlichen Mechanismus zur weiteren Infektion von CD4-positiven T-Zellen dar, da diese professionellen antigenpräsentierenden Zellen Kontakt mit ständig neuen T-Zellen haben, um diese zu regulieren (Ludewig et al. 1996). Dennoch können, obwohl frühere Untersuchungen das Ausmaß der Infektion von T-Zellen mit HIV unterschätzten, direkte viral vermittelte zytopathische Effekte die massive Depletion CD4-positiver T-Zellen nicht erklären. Die Beteiligung indirekter Mechanismen ist daher wahrscheinlich. Frühe Untersuchungen zeigten eine vermehrte Empfindlichkeit nichtinfizierter T- und B-Zellen gegenüber AICD sowohl in CD4-T- als auch in B-Zellen von HIVinfizierten, asymptomatischen Patienten (Ameisen 1998; Groux et al. 1992). Eine Apoptosesensibilisierung konnte experimentell durch verschiedene virale Proteine, gp120 (env), tat, und nef, gezeigt werden. Apoptosesensibilisierung wurde erstmals für das gp120-env-Protein gezeigt, das an den CD4-Rezeptor auf der T-Zelle binden kann. In der Tat kann durch Ligation von CD4 in ruhenden, nicht-HIV-infizierten T-Zellen Apoptose ausgelöst bzw. AICD verstärkt werden (Newell et al. 1990). Das HIV-tat-Protein hingegen ist zellpermeabel

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und aktiviert einen CD95-abhängigen Apoptoseweg durch Stimulation der Expression des CD95/FasL (Westendorp et al. 1995). Env-Glykoproteine der Virushülle transduzieren, neben der Bindung an CD4, auch ein Apoptosesignal nach Bindung an Korezeptoren, die Chemokinrezeptoren CCR5 und CXCR4. Hierfür wurde sowohl eine Aktivierung des Todesrezeptorsignalwegs als auch des intrinsischen, mitochondrialen Apoptosewegs gezeigt (Ahr et al. 2004). Eine Schlüsselrolle bei der Aktivierung von Apoptosewegen nimmt hierbei der Todesrezeptor CD95 ein, und auch Beteiligung von TRAIL und TNF-Rezeptoren wurde gezeigt (Westendorp et al. 1995). Im Gegensatz hierzu ist der Zelltod infizierter T-Zellen CD95-unabhängig und wird durch direkte intrazelluläre Effekte des vpr-Proteins sowie durch HIV-kodierte Proteasen vermittelt. Wahrscheinlich spielen bei den sehr unterschiedlichen klinischen Verläufen der HIV-Erkrankung auch die unterschiedliche klinische und biologische Potenz von HIV-Stämmen in der Auslösung der T-Zell-Apoptose eine Rolle. Ein weiterer Faktor dürfte die individuell unterschiedliche intrinsische Apoptoseresistenz nichtinfizierter T-Zellen sein, die nicht nur vom individuellen genetischen Hintergrund sondern möglicherweise auch von den klinisch eingesetzten Medikamenten und deren Fähigkeit zur Apoptosehemmung (oder -förderung) abhängt.

1.8.5.2 Infektionskrankheiten Infektiöse Mikroorganismen nutzen subversiv Signalwege ihres Wirtsorganismus, um sich zu vermehren. Die Hemmung oder Aktivierung von Zelltodprogrammen nimmt hierbei einen zentralen Stellenwert ein. Die Auslösung von Zelltod in Zellen des unspezifischen und spezifischen Immunsystems schwächt die körpereigene Abwehr und begünstigt die Ausbreitung der Infektion. Bakterien und Pilze nutzen Zelltodprogramme des infizierten Wirtsorganismus, um infizierte Zellen abzutöten. Über zelltodinduzierende Toxine werden umliegende Zellen des Gewebes geschädigt und das Eindringen in das Gewebe erleichtert. Apoptoseinduktion in infizierten Phagozyten hat zum Ziel, das Immunsystem zu schwächen (vgl. HIV). Viren wirken hingegen wesentlich subtiler. Neben der Infektion lymphatischer Zellen mit dem Ziel einer Immunsuppression des spezifischen Abwehrsystems hemmen sie zentrale Zelltodsignalwege, um hierdurch zelluläre Abwehrreaktionen zu umgehen, die virusinfizierte Zellen ansonsten rasch über Apoptose eliminieren würden, um den lytischen Zyklus früh zu stoppen.

1.8

Bakterien und Pilze Phagozytose durch Makrophagen und neutrophile Granulozyten soll die intrazelluläre Zerstörung von Bakterien über die Endozytose in Phagosomen ermöglichen. Die Reifung des Phagosoms, insbesondere die Fusion von Phagosomen mit Lysosomen, führt zur Freisetzung von Enzymen in das Phagosom, die zur Zerstörung und dem Abbau der phagozytierten Bakterien führen. Allerdings haben diverse Bakterienstämme Strategien entwickelt, die es ihnen ermöglichen, dieser biochemischen, bakteriziden Attacke zu entkommen. Yersinien können durch Antiphagozytose der Phagozytose entkommen. Listerien entweichen dem Phagosom in das Zytosol und Salmonellen, Mykobakterien und Legionellen hemmen die Reifung des Phagosoms. Des Weiteren aktivieren die meisten dieser phagozytoseresistenten Bakterien Signalmechanismen, die in den Phagozyten Zelltod auslösen. Hierdurch werden die Bakterien entweder in den Extrazellulärraum freigesetzt oder gelangen in weitere Phagozyten, sobald versucht wird, die sterbende Wirtszelle durch Phagozytose aus dem Gewebsverband zu entfernen. Hierdurch wird die Immunabwehr gehemmt, und die Infektion kann sich ausbreiten. Ziel des Immunsystems ist daher, derart infizierte Zellen zu eliminieren. Einerseits gelingt dies, indem die infizierten Zellen durch besonders aktivierte Phagozyten aufgenommen und abgetötet werden. Auf der anderen Seite aktivieren bakterielle Bestandteile als Gefahrsignal TOLL-ähnliche Rezeptoren, die eine zelluläre Stressantwort der infizierten Zelle aktivieren. Zum Teil werden diese Signale über NOD-Proteine vermittelt. In diesem Rahmen wird auch das NALP3-Inflammasom aktiviert, ein Proteinkomplex der die Aktivierung der Procaspase-1 vermittelt und hierdurch die Prozessierung und Freisetzung proinflammatorischer Zytokine wie IL-1E und IL-18 stimuliert (Ogura et al. 2006). Die Bildung des Inflammasoms führt zur Bindung und Aktivierung der Procaspase-1, die insbesondere die proteolytische Reifung des Pro-Interleukin-1E zum aktiven, sezernierten IL-1E vermittelt. Die Inaktivierung des Inflammasomkomplexes in NALP3-defizienten Mäusen begünstigt daher die Infektion mit z. B. Salmonellen (Lara-Tejero et al. 2006). Durch Überstimulation oder andauernde Aktivierung einer solchen Stressreaktion kann es aber auch zur Aktivierung von Effektorcaspasen mit daraus resultierendem apoptotischen Zelltod kommen. Einige Bakterien bilden zudem Toxine, die in die physiologische Regulation von Apoptosesignalwegen eingreifen. Neisserien bilden PorB, ein VDAC-ähnliches Protein, über das sie den mitochondrialen Apoptoseweg aktivieren, in dem sie Calciumefflux aus Mitochondrien in das Zytosol, gefolgt von Caspaseaktivierung, auslösen (Muller et al. 2000). Ebenso induzieren Salmonellen den

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

apoptotischen Zelltod infizierter Makrophagen über einen Caspase-3-abhängigen Signalweg. Obwohl dies ein wesentlicher pathogener Mechanismus für Salmonelleninfektionen zu sein scheint, ist der Mechanismus der Zelltodaktivierung noch unklar. Staphylococcus aureus bildet mehrere apoptoseinduzierende Toxine. Das porenbildende Panton-Valentine Leukocidin induziert direkt, über einen Bax-unabhängigen Mechanismus, die Freisetzung von Cytochrom c und Smac aus Mitochondrien und ist mit schweren nekrotisierenden Infektionen assoziiert (Genestier et al. 2005). Das Alphatoxin von S. aureus induziert über einen todesrezeptorunabhängigen Weg die mitochondrienvermittelte Caspaseaktivierung und zusätzlich einen caspaseunabhängigen, nekroseähnlichen Zelltodmechanismus (Essmann et al. 2003). Aspergillus-fumigatus-Gliotoxin hingegen aktiviert den mitochondrialen Apoptoseweg, indem es über einen noch unklaren Mechanismus Bak aktiviert (Pardo et al. 2006). Des Weiteren ist das im Rahmen der Immunantwort gebildete TNF-α an der Schädigung bakteriell infizierter Gewebe beteiligt. Dies erfolgt einerseits durch die Anlockung von Neutrophilen und Makrophagen, andererseits aber auch direkt über die zelltodfördernde Wirkung z. B. auf Endothelzellen. Viren Viren nutzen Zelltodsignalwege des Wirtsorganismus wesentlich subtiler als Bakterien und Pilze. Neben der Inaktivierung von spezifischen Immunreaktionen des T- und B-Zell-Systems ist ihr wesentliches Ziel eine möglichst effiziente Virusreplikation durch Umprogrammierung der zellulären Biosynthese. So hemmen sowohl das adenovirale E1a- als auch das humane Papilloma-Virus- (HPV-)E7-Protein das humane Rb-Protein und ermöglichen hierdurch die Aktivierung der viralen DNA-Synthese unter Umgehung der S-Phase-Kontrolle durch den Rb-Signalweg. Die Elimination der infizierten Zelle durch Apoptose ist, neben der Hemmung der Virusreplikation durch Interferone, ein wesentlicher Mechanismus der Virusabwehr. Hierdurch werden Endonukleasen aktiviert, die neben der zellulären vor allem auch die virale DNA bzw. RNA degradieren sowie die Proteinsynthese der Zelle abschalten. Apoptotische Zellen werden durch Phagozytose rasch aus dem Gewebsverband entfernt und lysosomal abgebaut. Zusammen mit der Interferonantwort wird hierdurch virale Replikation bereits vor der Aktivierung des spezifischen Immunsystems gehemmt. Viren haben daher das Ziel, Apoptose zu hemmen und hierdurch eine Verlängerung des lytischen Zyklus mit höheren Virustitern zu erreichen (White 2006). Immunsuppression wird durch Infektion lymphatischer Zellen erreicht. Neben der bereits beschriebenen

Infektion mit HIV mit Depletion des T-Zell-Kompartiments wird eine abwehrhemmende Infektion lymphatischer Zellen z. B. bei Hepatitis C, Epstein-Barr-, Adeno-, HPV- (Serotyp 16 und 18), Herpes-, SV40- und Masernviren beobachtet. Durch Expression viraler Proteine werden hierbei die zentralen Apoptosesignalachsen inaktiviert, und zwar der Todesrezeptor-, der mitochondriale Apoptoseweg und der p53-Signalweg. Adenoviren inaktivieren mittels des E1b-55-kDaProteins das p53-Tumorsuppressorgen. Einen vergleichbaren Effekt haben das Large-T-Antigen von SV40 und das E6-Protein von HPV. Der Todesrezeptorweg wird durch virale Analoga des humanen FLIP-Proteins inaktiviert. Solche FLIP-Analoga wurden auch in Herpesviren (vFLIP) nachgewiesen. Beim Kaposi-Sarkom (KS), das durch KS-assoziierte Herpesviren ausgelöst wird, trägt die Expression von vFLIP in infizierten Endothelzellen entscheidend zur Tumorgenese bei. Das adenovirale E1b-19-kDa-Protein wiederum bindet FADD und inaktiviert hierdurch ebenfalls den extrinsischen Signalweg. Von besonderer Bedeutung ist des Weiteren die Hemmung des mitochondrialen Apoptosewegs durch virale Bcl-2-Homologe. Das erste virale Bcl-2-Homolog, BHRF1, wurde bei Epstein-Barr-Viren entdeckt. BHRF1, das adenovirale E1b-19-kDa-Protein und weitere v-Bcl-2-Proteine in anderen Virussystemen hemmen Apoptose über einen Bax-/Bak-abhängigen Signalweg, analog zum zellulären Bcl-2 (White 2006). Interessanterweise können virale Gene multifunktional wirken, wie z. B. das adenovirale E1b-Gen, dessen 55-kDaProtein p53 und als 19-kDa-Protein sowohl den intrinsischen als auch den extrinsischen Apoptoseweg hemmt. Ein unangenehmer Nebeneffekt von solch hochwirksamen Mechanismen zur Zelltodhemmung ist die onkogene Wirkung dieser apoptosehemmenden Proteine. Onkogene Transformation einer Zelle erfordert, neben einer Stimulation der Zellproliferation, zwingend die Inaktivierung von Zelltodsignalwegen. Eine solche onkogene Wirkung wurde für die Inaktivierung von p53, Überexpression von Bcl-2, Verlust von Bax und Bak sowie die Überexpression von FLIP-Proteinen, auch durch virale Mechanismen, beschrieben. Viren erzeugen zudem häufig Proliferationssignale, um die DNA- und Proteinsynthesemaschinerie der Zelle durch einen aberranten Eintritt in die S-Phase des Zellteilungszyklus zu aktivieren, um hierdurch eine höhere Virusproduktion zu erreichen. Dies wird z. B. durch Inaktivierung des Rb-Proteins durch adenovirales E1a- und HPV-E7 Protein erreicht. In Kombination mit den genannten apoptosehemmenden Genprodukten erklärt dies die tumorinduzierende Wirkung onkogener Viren (White 2006).

187 1.8 · Molekulare Grundlagen der Apoptose

1.8.5.3 Herz-Kreislauf-Erkrankungen Zelltodmechanismen spielen in der Kardiologie vor allem bei ischämischen Erkrankungen eine Rolle. Beim Myokardinfarkt (und auch bei Hirninfarkten) spielt, neben dem nekrotischen Zelltod infolge des Sauerstoffmangels und der Erstickung, Apoptose eine wesentliche Rolle im Randgebiet des Infarkts, der sog. Penumbra. Auch bei der Reperfusion ischämischer Gewebsareale, z. B. nach Beseitigung eines Thrombus, kann im reperfundierten Areal Zelluntergang durch Apoptose beobachtet werden. Wird der Zelltod, z. B. durch Hemmung von Caspasen, pharmakologisch gehemmt, dann kann das Infarktgebiet deutlich verkleinert werden und reperfusionsinduzierte Apoptose gehemmt werden (Chandrashekhar et al. 2004). Allerdings waren bisherige Versuche, diese Erkenntnis klinisch umzusetzen, nicht erfolgreich. Der Grund hierfür könnte darin liegen, dass auch caspaseunabhängige Zelltodmechanismen aktiviert werden. Auch bei Kardiomyopathien scheinen Apoptosephänomene eine Rolle beim Zellverlust zu spielen. Ektope Überexpression von Caspase-8 im Herzmuskel von Mäusen führt zu einem 10-fach gesteigerten Zellverlust durch Apoptose, die mit der raschen Entwicklung einer schweren dilatativen Kardiomypathie einhergeht. Umgekehrt kann Caspasehemmung die Entwicklung eines Herzversagens in verschiedenen Kardiomyopathiemodellen abschwächen (Hilfiker-Kleiner et al. 2006). Eine therapeutische Manipulation von Zelltodsignalwegen wird jedoch erfolgreich in der interventionellen Kardiologie genutzt. Dort werden Stents mit Taxanen oder Rapamycin-Analoga beschichtet. Taxane induzieren Zelltod über Apoptose und mitotische Katastrophe durch Aktivierung mitotischer Checkpunktprogramme über einen p53-unabhängigen Weg. Rapamycin hemmt den mTOR-Signalweg und vermittelt hierüber Abschaltung der Proteintranslation, Zellschrumpfung und Zelltod über Apoptose oder Autophagie. Hierdurch wird die Intimaproliferation der wieder durchgängigen Gefäße an der Kontaktfläche und der unmittelbaren Nähe des Stents lokal gehemmt. Präklinische Daten weisen darauf hin, dass auch durch Hemmung stressinduzierter Kinasen der Zellverlust von Kardiomyozyten gehemmt werden kann. So kann durch Hemmung der c-Jun-N-terminalen Kinasen (JNK), Mitgliedern der Familie der mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAP-Kinasen), unter Myokardischämie und Reperfusion ebenfalls die Infarktgröße verkleinert und Zellverlust vermindert werden (Duplain 2006). Hierbei scheint die Aktivierung der Akt-Kinase und des mTOR-Signalwegs nach Hypoxie und Reoxygenierung unter Reperfusion einen wichtigen Überlebenssignalweg darzustellen (Shao et al. 2006). Ähnliche Stressreaktionen scheinen auch bei der Regu-

1.8

lation von Hypoxie und reperfusionsinduziertem Zelltod anderer Organsysteme, wie z. B. dem ZNS, beteiligt zu sein.

1.8.5.4 Degenerative Erkrankungen Ein Überwiegen von Zelluntergang im Verhältnis zur Zellregeneration führt zu Zellverlust, Gewebsdegeneration, vorzeitiger Alterung und Atrophie des betroffenen Organs. Besonders betroffen sind postmitotische Organe, vor allem die Neurone des Nervengewebes (Bredesen et al. 2006). Degenerative Erkrankungen infolge einer ungenügenden Regeneration betreffen aber auch Gewebe mit sehr guter Regenerationsfähigkeit wie Leber und Niere. Dort können Stoffwechselstörungen, Speicherkrankheiten, Vergiftungen oder auch chronische Virusinfektionen zu Zellverlust des Gewebes und Funktionsverlust des Organs führen. Beispiele hierfür sind im Fall der Leber die hereditären Speichererkrankungen, insbesondere die Galaktosämie, chronische Virushepatitiden, insbesondere Hepatitis C, die durch Kupferspeicherung ausgelöste Leberzelldegeneration bei M. Wilson, Schwermetallvergiftung der Niere, z. B. durch Cadmium, und nicht zuletzt die alkoholinduzierte Leberzelldegeneration. Neurodegeneration Vergiftungen, Hypoxie und Hypoglykämie sind wesentliche Auslöser einer akuten Degeneration von Neuronen. Ähnlich dem Myokardinfarkt führt die Hypoxie, neben der Auslösung von nekrotischem Zelltod im Infarktzentrum, vor allem in der Peripherie des Infarkts, der Penumbra, zu apoptotischem Zelltod, der z. B. durch Caspasehemmung vermindert werden kann. Ebenso erfolgt der Zellverlust bei chronischen neurodegenerativen Erkrankungen über die Apoptose, die über den intrinsischen Apoptoseweg reguliert wird. Stressreaktionen des endoplasmatischen Retikulums (ER) spielen eine wesentliche Rolle bei einer ganzen Reihe neurodegenerativer Erkrankungen, insbesondere der infektiösen spongiösen Creutzfeldt-Jakob-Enzephalopathie, der Alzheimer-Erkrankung, der ParkinsonKrankheit und der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) (Bredesen et al. 2006). Unterstützt wird die pathogenetische Bedeutung eines apoptotischen Zelltodmechanismus durch den Nachweis aktivierter Caspasen in Geweben von Patienten mit ALS, Chorea Huntington, der Alzheimer-Krankheit und anderen neurodegenerativen Erkrankungen (Friedlander 2003). Neben der Aktivierung von ER-Stress-Programmen scheint der Mehrzahl der neurodegenerativen Erkrankungen gemeinsam zu sein, dass es in der betroffenen Nervenzelle auch vermehrt zu oxidativem Stress, resul-

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

tierender DNA-Schädigung und Störungen der Mitochondrienfunktion kommt. Teils scheint dieser oxidative Stress, wie im Fall der ALS, ein auslösender pathogenetischer Faktor zu sein, der sekundär die Mitochondrienfunktion stört und den mitochondrialen Apoptosesignalweg aktiviert. Mitochondrien sind überlebenswichtig aufgrund ihrer effizienten ATP-Synthese über den Citratzyklus und die Atmungskette und ihrer Fähigkeit, Calcium zu sequestrieren. Gefährlich sind sie aufgrund der Synthese reaktiver Sauerstoffspezies, über die sie Neurone für neurotoxische Insulte sensibilisieren können. Infolge der stressinduzierten Apoptose kommt es vor allem in postmitotischen Geweben wie dem Nervengewebe zum Zellverlust. Besonders empfindlich sind hierfür die Neurone des Kleinhirns. Ataxia teleangiectatica Patienten mit Ataxia teleangiectatica (AT) zeigen eine stark erhöhte Empfindlichkeit für DNA-Schäden, die z. B. durch ionisierende Strahlung oder oxidativen Stress ausgelöst werden können. Aufgrund der resultierenden genetischen Instabilität zeigen sie zudem eine genetische Prädisposition für Tumorerkrankungen, die sich bereits im Kindesalter manifestiert. Namensgebend war die schwere zerebelläre Ataxie infolge der starken Apoptoseinduktion in Purkinje-Zellen des Kleinhirns und deren resultierender Depletion. Neben AT existieren eine Reihe weiterer seltener Erbkrankheiten mit ähnlichem Symptomenkomplex, jedoch unterschiedlich starker Ausprägung und Schwere. Patienten mit AT tragen inaktivierende Mutationen in der ATM-Kinase, wohingegen AT-ähnliche Erkrankungen infolge von Defekten in Komponenten des MRN-Komplexes (Mre11, Rad50 und Nbs1) oder der ATR- (AT related-)Kinase auftreten. Die ATM- bzw. ATR-Kinase und MRN wirken als zelluläre Sensoren für DNA-Doppelstrangbrüche, die zur Phosphorylierung und Aktivierung einer Vielzahl von Substratproteinen mit Funktionen in der DNA-Reparatur führen. Diese ATM-Substrate signalisieren für Zellzyklusarrest und Apoptose durch Aktivierung des p53-Signalwegs (7 1.8.4.2). Sind die ATM-/ATR-Kinase oder der MRN-Komplex hingegen defekt, dann bleiben die DNAStrangbrüche bestehen oder werden aberrant und fehlerhaft zusammengefügt. Da die ATM-abhängige Reparatur nur langsam erfolgt, ist die Aktivierung von Zellzyklusarrest wichtig für eine koordinierte Reparatur. Reparaturdefekte, gemeinsam mit der Unfähigkeit, ZellzyklusCheckpunkte zu aktivieren, resultieren in der Aktivierung des intrinsischen Apoptosewegs, der dann zur Apoptose und Degeneration der betroffenen Neurone führt. ER-Stress-induzierte Neurodegeneration ER-Stress-Reaktionen werden durch Störungen in der Struktur und Funktion des ER und der Anhäufung aber-

ranter, missgefalteter Proteine und gestörter Calciumhomöostase hervorgerufen. Bei anhaltendem ER-Stress werden über die ER-Stress-Antwort Zelltodsignale erzeugt, die den intrinsischen Apoptoseweg aktivieren (Bredesen et al. 2006; Szegezdi et al. 2006). Übertragbare, spongiöse Enzephalopathien sind durch die Akkumulation abnormer zellulärer Prionenproteine (PrP) gekennzeichnet, die als PrP(SC) bezeichnet werden. Als Ursache werden Störungen der Proteasomfunktion, Veränderungen in der Reifungskontrolle zellulärer Proteine und die integrale Stressantwort des endoplasmatischen Retikulums auf missgefaltete Proteine diskutiert. ER-Stress scheint hierbei nicht nur für die gestörte Neuronenfunktion bei der Prionenerkrankung verantwortlich zu sein, sondern auch für die Aktivierung des intrinsischen Zelltodapparats, der zur Apoptose der betroffenen Zelle führt. Ähnlich der Prionenerkrankung kommt es bei der Alzheimer-Krankheit zur Akkumulation aberranter Proteinkomplexe in sogenannten Plaques. Betroffen hiervon sind das Amyloid-E und das Tau-Protein, deren physiologische Funktion unbekannt ist. Familiäre Formen der Alzheimer-Krankheit zeigen zum Teil Mutationen im Amyloid-Vorläuferprotein APP („amyloid precursor protein“), häufiger jedoch Mutationen in Presenilin-1 und -2 oder dem Tau-Protein. Durch die APP-Mutation oder die Presenilin-Mutationen wird die Proteolyse des APP-Proteins durch die E- und J-Sekretase beeinträchtigt, und es entsteht das pathogene, als Amyloid akkumulierende 42-kDa-Amyloid-E anstelle der 40-kDa-Variante (Goedert u. Spillantini 2006). Dies führt über die Aktivierung von ER-Stress zu synaptischer Degeneration und apoptotischem Zelltod von Neuronen des limbischen Systems und des Kortex als Grundlage für die kognitiven Störungen bei der Alzheimer-Krankheit. Neben oxidativem Stress und hieraus eventuell resultierender DNA-Schädigung mit Aktivierung des p53-Signalwegs kommt es bei der Alzheimer-Krankheit – analog zur Akkumulation von Prionenproteinen bei der Creutzfeldt-Jakob-Erkrankung – zur Auslösung von ER-Stress-Programmen aufgrund der Akkumulation aberranter Proteine in den für diese Erkrankung typischen Plaques. Beide Mechanismen aktivieren das intrinsische Zelltodprogramm, das sowohl über den ER- als auch den mitochondrialen Signalweg ausgeführt und über Bcl-2-Familienproteine reguliert wird. Ebenfalls durch Akkumulation aberranter Proteine entsteht die Pathologie der Parkinson-Krankheit. In etwa 90% der Patienten mit M. Parkinson wird die Akkumulation von D-Synuclein (PARK1) beobachtet, die für die typischen Lewis-Einschlusskörperchen verantwortlich ist und mit dem Verlust dopaminerger Neurone in der Substantia nigra einhergeht. Neben Mutationen im PARK1-Gen sind hierfür, allerdings seltener, Muta-

189 1.8 · Molekulare Grundlagen der Apoptose

tionen in der E3-Ubiquitinligase PARK2 (Parkin) und den Proteinkinasen PARK6 und -8 verantwortlich (Hardy et al. 2006). Diese Anhäufung von D-Synuclein führt zu einer Störung des Membranproteintransports vom ER zum Golgi-Apparat und löst hierdurch ERStress und Zelltod von Neuronen aus. Dieser neuronale Zelltod kann interessanterweise durch Überexpression der Rab1-GTPase revertiert werden, die den ER-/GolgiTransport von Proteinen stimuliert (Cooper et al. 2006). Bei der Regulation von Apoptose in Neuronen scheint das Protein Huntingtin eine wesentliche Rolle zu spielen. Mutationen in Huntingtin sind das auslösende pathogenetische Prinzip bei der Chorea Huntington, die zum Zellverlust dopaminerger Neurone im Striatum des ZNS führt. Interessanterweise wurde auch ein Verlust von Huntingtinexpression bei anderen neurodegenerativen Erkrankungen beobachtet (Zhang et al. 2003a). Huntingtin hemmt die Apoptose von Neuronen und die Inaktivierung von Huntingtin durch genetischen Knockout löst Neurodegeneration aus. Störungen der Huntingtinfunktion führen als frühes Ereignis zur gesteigerten Aktivität eines caspasevermittelten Zelltodwegs (Zhang et al. 2003b). Huntingtin wirkt hierbei allerdings als direkter Inhibitor der Caspase-3 (Zhang et al. 2006b). Bei der familiären amyotrophen Lateralsklerose (FALS) nimmt die Auslösung von oxidativem und ER-Stress ebenfalls eine zentrale pathogenetische Rolle ein. Interessanterweise konnten hier bei 10% der betroffenen Patienten Mutationen in der Cu-/Zn-Superoxiddismutase SOD1 als wahrscheinliches pathogenetisches Prinzip identifiziert werden (Friedlander 2003). Mutierte SOD1 aktiviert über die Erzeugung von reaktiven Oxidantien den intrinsischen Apoptoseweg über Mitochondrien sowie das ER. Mutierte SOD1 interagiert mit Chaperonproteinen des ER-Stress-Signalwegs und wird hierdurch zum ER geleitet.

1.8.5.5 Tumorerkrankungen Apoptose als Abwehrmechanismus gegen Onkogene Die Regulation von Zellproliferation und Zelltod erfolgt durch eng miteinander verknüpfte Signalwege. In normalen adulten Geweben besteht ein dynamisches Gleichgewicht zwischen Zellproliferation durch mitotische Teilung und Zelluntergang durch regulierten Zelltod. Dies spiegelt sich auch in der Bedeutung dieser beiden zellbiologischen Phänomene bei der Entstehung von benignen und malignen Tumoren wider. Die ungehemmte Aktivierung von zellzyklusaktivierenden Signalwegen z. B. durch die zellulären Onkogene C-MYC (Cory et al. 1999), E2F-1 (Cam u. Dynlacht 2003) oder Ras und des-

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sen Aktivatoren wie z. B. EGF- oder Her2-/neu-Rezeptor (Hingorani u. Tuveson 2003) fördert die Tumorentstehung. Neben dem Proliferationssignal und der Induktion von S-Phase-Genen werden aber auch Zelltodsignalwege aktiviert, insbesondere der intrinsische Apoptoseweg. Diese Aktivierung von Apoptosesignalen durch Onkogene wirkt einem Verlust der Wachstumskontrolle bei alleiniger, zufälliger Aktivierung eines Onkogens entgegen und stellt einen wichtigen, tumorprotektiven Kontrollmechanismus dar. So induziert die Überexpression des C-MYC-Gens in B-Lymphozyten Apoptose und nicht Tumorwachstum. Erst durch die zusätzliche Störung zelltodfördernder Signalwege wird eine Tumorentstehung begünstigt (Vaux et al. 1988). Dies kann durch Inaktivierung des Tumorsuppressorgens p53 erfolgen (Eischen et al. 1999), oder durch Überexpression von Bcl-2 (Fanidi et al. 1992; Strasser et al. 1990) oder Verlust von Bax (Eischen et al. 2001). Auch die Inaktivierung von BH3-only-Proteinen scheint an der malignen Transformation von Tumorzellen beteiligt zu sein (Egle et al. 2004; Sturm et al. 2006). Ebenso kann die Deregulation von Transkriptionsfaktoren, vor allem von NF-NB, onkogeninduzierte Apoptosesignale hemmen (Dutta et al. 2006). Im Fall von NF-NB erfolgt dies durch Induktion der NF-NB-Zielgene Bcl-2, Bcl-xL und Bfl-1, sowie des IAP-Proteins cIAP2. Hochregulation der Genexpression antiapoptotischer Gene kann auch durch chromosomale Translokationen erfolgen. Dies ist ein Mechanismus, der vor allem in malignen Lymphomen beobachtet wird. Die vor allem in follikulären Lymphomen gefundene t(14;18)-Translokation bringt das Bcl-2-Gen unter Kontrolle des Immunglobulin-Schwerketten-Gen-Enhancers (Tsujimoto u. Croce 1986; Tsujimoto et al. 1984) und führt zu dereguliert hoher Bcl-2-Expression, die mit ausgeprägter Apoptose- und Therapieresistenz dieses Lymphomtyps einhergeht. Bei MALT-Lymphomen bedingt die typische t(11;18)-Translokation die Fusion des für cIAP2 kodierenden API2-Gens mit dem MALT1-Genlokus und führt hierdurch zur Überexpression von cIAP2 (Dierlamm et al. 1999). Interessanterweise scheinen auch Micro-RNAs (miRNAs), dies sind endogene „small-interfering“ RNAs (siRNAs), an der Deregulation apoptoseregulierender Gene beteiligt zu sein. Bei der chronischen lymphatischen Leukämie des B-Zell-Typs (B-CLL) kommt es durch Gendeletion zum Verlust der miRNAs miR-15 und miR-16, die in normalen Zellen bcl-2-mRNA herunterregulieren würden (Calin et al. 2002; Cimmino et al. 2005). Durch Verlust von miR-15 und miR-16 werden höhere bcl-2-mRNA-Spiegel exprimiert, und dies erklärt zumindest teilweise die bei B-CLL häufig erhöhte Expression des Bcl-2-Proteins. In der Mehrzahl der malignen Tumore spielen jedoch epigenetische Veränderungen die wesentliche Rolle bei der

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

Inaktivierung zelltodfördernder Gene, z. B. durch DNAMethylierung von CpG-Inseln oder die Aktivierung von Histondeacetylasen (Baylin u. Ohm 2006). So wird eine Methylierung des Bax-Gens mit resultierender Hemmung der Genexpression wesentlich häufiger beobachtet als eine inaktivierende Mutation des Bax-Gens. Eine Hemmung epigenetischer Mechanismen der Genaktivierung durch Hemmung von Histondeacetylasen und DNA-Methyltransferasen ist möglich und wird bei malignen Tumoren klinisch erprobt (Yoo u. Jones 2006). Umgekehrt führt die Inaktivierung von Zelltodsignalwegen per se nicht zur Entstehung eines malignen Tumors, sondern erhöht lediglich die Zellularität des betroffenen Zellkompartiments, einer Hyperplasie. Überexpression von Bcl-2 (McDonnell et al. 1989) oder BaxVerlust (Knudson et al. 1995) führt in normalen B-Zellen zur Hyperplasie der B-Zell-Regionen, insbesondere der Lymphfollikel. Erst durch die Aktivierung eines die Zellteilung fördernden Onkogens kommt es zur malignen Transformation. Aktivierung von C-MYC in Bcl-2-transgenen Mäusen führt dann zur beschleunigten Entwicklung von hochmalignen B-Zell-Lymphomen im Vergleich zur alleinigen Überexpression von C-MYC in B-Zellen. Auch im Rahmen der malignen Progression, d. h. der Entwicklung eines höhermalignen Klons des ursprünglichen Tumors, wird häufig eine weitere Inaktivierung von Zelltodsignalwegen beobachtet. Apoptosedefekte in den Tumoren korrelieren daher häufig mit einem schlechteren Verlauf der Erkrankung, sind also prognostische Faktoren, die für eine Risikoabschätzung genutzt werden können (Rau et al. 2003; Sturm et al. 2001). Solche Apoptosedefekte können durch Inaktivierung zelltodfördernder oder Überexpression zelltodhemmender Gene entstehen. Die Apoptosedefekte in Tumorzellen begünstigen zudem die Metastasierung der Tumorzellen in andere Regionen des Körpers. Aus dem Tumor, z. B. über Blut oder Lymphe, ausgeschwemmte Zellen sterben zum weitaus größten Teil, da sie den Kontakt zu ihrem physiologischen Mikromilieu verlieren. Diese Art des Zelltods spielt eine wesentliche Rolle, um die Organisation von Geweben mit spezialisierten Zelltypen aufrechtzuerhalten. Zellen, die in eine fremde Umgebung gelangen, sterben über Apoptose, die in diesem Fall als Anoikis, Heimatlosigkeit, bezeichnet wird (Frisch u. Francis 1994). Anoikis wird im korrekten Gewebsumfeld durch zelltodhemmende Signale über Kontakte zu benachbarten Zellen, der lokalen Extrazellulärmatrix und Wachstumsfaktoren verhindert (Gilmore 2005). Anoikis verhindert z. B. auch, dass sich gealterte und potenziell genotoxisch geschädigte, abgeschilferte Zellen des Gastrointestinaltraktepithels andernorts wieder ansiedeln. In malignen Tumoren des Gastrointestinaltrakts kann Anoikis gestört sein, und Abtropfmetas-

tasen werden z. B. bei Kopf-Hals-Tumoren und Karzinomen der Speiseröhre beobachtet. Auf ähnlichem Weg bilden sich auch Metastasen anderer Tumore, z. B. innerhalb des Atemwegsepithels bei Bronchialkarzinomen. In diesem Kontext ist ein weiteres regulatorisches Konzept von Interesse für das Verständnis der Zelltodresistenz von Tumorzellen. Zellbiologische Daten weisen darauf hin, dass das Überleben von Tumorzellen, möglicherweise aber auch das von normalen Zellen, durch Abhängigkeits- („Dependence“-)Rezeptoren reguliert wird (Mehlen 2005). Diese Rezeptoren gehören keiner homogenen Genfamilie an, sondern sind über ihre funktionelle Relevanz für das Überleben der Zelle im jeweiligen Kontext definiert. Ligandenbindung vermittelt Überlebenssignale, abhängig vom jeweiligen Rezeptor und Zelltyp. Sobald sie nicht mehr von ihren natürlichen Liganden besetzt sind, signalisieren diese Rezeptoren jedoch für Zelltod. Hierbei kommt es zur ligandenunabhängigen Bildung von Rezeptor-CaspaseKomplexen, die die Caspaseaktivierung und Apoptose vermitteln. Erstes Beispiel hierfür war das Tumorsuppressorgen DCC („deleted in colorectal cancer“), das den Liganden Netrin-1 bindet (Forcet et al. 2001; Mehlen et al. 1998). Durch Inaktivierung von DCC wird dieser Kontrollmechanismus inaktiviert und die Tumorzelle verliert die Fähigkeit, in Situationen, in denen kein Netrin-1 vorhanden ist, über Apoptose zu sterben, z. B. nach Verlassen des lokalen Mikromilieus bei invasivem oder metastatischem Wachstum. Als weitere Netrinrezeptoren wirken die UNC5H-Rezeptoren, der Adenosinrezeptor A2b und Neogenin, das wie auch DCC zur NCAM-Familie gehört. Netrin-1 vermittelt in normalen Zellen über DCC und UNC5H Wachstum und Überleben, z. B. von Neuronen während der ZNS-Entwicklung. Chemotherapie und ionisierende Strahlung Neben der Bedeutung bei der Tumorentstehung und Tumorprogression spielen Zelltodmechanismen eine zentrale Rolle beim Ansprechen auf Tumortherapien. Die große Mehrzahl der aktuellen Tumortherapien basiert auf der Auslösung genetischer Schäden, die für proliferierende oder metabolisch aktive Zellen fatal sind (Bentzen 2006; Brown u. Attardi 2005; Brown u. Wilson 2003; Chabner u. Roberts 2005). Hieraus wird auch verständlich, warum diese Therapien mit derart schweren Nebenwirkungen für Gewebe mit hoher Zellteilungsrate sind, wie z. B. das Knochenmark, Epithelien des Gastrointestinaltrakts und der Lunge, Haarfollikel sowie für die Spermatogenese. Dennoch, und dies ist im Hinblick auf die zentrale Rolle der Inaktivierung von Apoptosesignalwegen bei der Tumorgenese erstaunlich, zeigen maligne Tumoren eine im Vergleich zum Normalgewebe erhöhte Apoptoserate, wahrscheinlich infolge der apoptosefördernden Wirkung des transformierenden Onkogens. Da

191 1.8 · Molekulare Grundlagen der Apoptose

Apoptosedefekte mit der Resistenz gegen klinische Tumortherapien einhergehen, können solche Genotypen auch als prädiktive Faktoren für die Abschätzung eines Therapieerfolgs vor Beginn der Tumortherapie genutzt werden (Daniel et al. 2004). Sowohl Chemotherapie- als auch strahleninduzierte DNA-Schäden aktivieren DNA-Reparaturmechanismen, die nach Erkennung der DNA-Läsion, gefolgt von der Bindung von Reparaturkomplexen an die Läsion, zur Aktivierung der Stresskinasen ATM, ATR, Chk1 und -2 führen, die den p53-Signalweg aktivieren (Kastan u. Bartek 2004). Gleichzeitig versucht die Zelle, die Läsion zu reparieren. Hierfür ist es erforderlich, dass über die Hochregulation von Hemmern der zyklinabhängigen Kinasen (CDK-Inhibitoren) die weitere S-Phase-Aktivität und DNA-Synthese verhindert wird (Pei u. Xiong 2005). Dies erfolgt über p53-abhängige Mechanismen, z. B. über die Hochregulation des CDK-Inhibitors p21CIP/WAF-1, und über p53-unabhängige Signale, wie z. B. über den CDK-Inhibitor p16INK4a, der G1-Arrest auslöst. DNAgeschädigte Zellen werden hierdurch vorwiegend in der G1-Phase arretiert, ein kleiner Prozentsatz auch in der späten G2-Phase, um aberrante Mitosen zu verhindern. Bei Vorliegen von Defekten in der G1-Checkpunktregulation, vor allem in p53-defizienten Zellen, erfolgt der Arrest bevorzugt in der G2-Phase (Bhonde et al. 2006). Gelingt die Reparatur des Schadens nicht, dann vermittelt die persistierende Aktivierung des p53-Signalwegs entweder prämature Seneszenz oder löst Apoptose aus. Welcher Mechanismus dominiert, hängt von der genetischen Ausstattung der Tumorzelle ab. Checkpunktund p53-profiziente Zellen antworten auf die irreparable DNA-Schädigung bevorzugt mit Seneszenz. Kommt es jedoch zum Wiedereintritt einer seneszenten Zelle in den Zyklus, dann werden Kontrollsignalwege aktiviert, die in der aberrant proliferierenden Zelle Apoptose auslösen. Checkpunktdefizienten Zellen hingegen gelingt ein Anhalten im Zellzyklus nur teilweise, es kommt zu aberranten Zellteilungen und Aktivierung nachgeschalteter Zellzyklus-Checkpunkte und nicht zur Auslösung von prämaturer Seneszenz. Letztlich führt dieses aberrante Proliferationsverhalten der checkpunktdefizienten, zumeist p53-mutierten Zelle dann zur Aktivierung von in diesem Fall p53-unabhängigen Zelltodsignalwegen, die vorwiegend über den intrinsischen Apoptoseweg ausgeführt werden. Apoptose scheint also als Schutzmechanismus zu wirken, der die Elimination seneszenter Zellen vermittelt, die aufgrund einer fehlerhaften Checkpunktregulation wieder in den Zellteilungszyklus eintreten (Bhonde et al. 2006). Im klinischen Kontext führt dies, über das p53-Zielgen p21CIP/WAF-1 vermittelt, zur Therapieresistenz und zu frühen Rezidiven, z. B. nach Radiochemotherapie (Rau et al. 2003; Wendt et al. 2006).

1.8

Analog hierzu liegen aktuelle Daten vor, die zeigen, dass DNA-schädigende Tumortherapien in apoptosedefekten Zellen Autophagie auslösen (Shimizu et al. 2004). Autophagie scheint also als ein weiterer Schutzmechanismus zu wirken und stellt zudem einen neuen Wirkmechanismus für Tumortherapien dar. Allerdings zeigen zellbiologische Untersuchungen, dass sowohl Seneszenz als auch Autophagie unter adäquaten Stimulationsbedingungen überwunden werden können, d. h. dass seneszente oder autophagische Tumorzellen unter besonderen Umständen wieder klonogen wachsen können. Möglicherweise erklärt dies, warum konventionelle, DNA-schädigende Therapien meist keine Heilung der Tumorerkrankung ermöglichen und, früher oder später, überlebende, „schlafende“ Tumorzellen ein Rezidiv der Erkrankung auslösen. Onkogensucht und zielgerichtete Tumortherapie Neben den konventionellen, DNA-schädigenden Tumortherapien etablieren sich in der Tumorbehandlung zunehmend neuartige, molekular definierte und rationale, zielgerichtete Therapieansätze. Zumeist basieren sie auf monoklonalen Antikörpern, die an Zelloberflächenrezeptoren binden bzw. regulatorisch wichtige Proteine hemmen, sowie niedermolekularen Kinase-Inhibitoren, die in wichtige, häufig als treibendes Onkogen wirkende Signale eingreifen. Aufgrund der hohen Spezifität sind sie mit deutlich weniger Nebenwirkungen verbunden als konventionelle Chemotherapeutika oder ionisierende Bestrahlung. Das prominente Beispiel für eine wirksame zielgerichtete Tumortherapie ist der Kinasehemmer Imatinib (STI-571, Glivec) bei der Behandlung der chronischen myeloischen Leukämie (CML). Bis zur Einführung von Imatinib bestand die Standardtherapie der CML in einer zytoreduktiven Behandlung mit Interferon-D und dem Nukleosidanalogon Arabinosid C oder dem Antimetaboliten Hydroxyharnstoff als Hemmer von Replikationsgabeln der DNA-Synthese, sowie einer kurativen, allerdings mit erheblichen Nebenwirkungen und Mortalität assoziierten Knochenmarkstammzell-Transplantation. Aktuell hat Imatinib die Interferon- und Hydroxyharnstoff-Behandlung abgelöst. Durch die Hemmung der Abl-Kinase und der hieraus resultierenden Hemmung des Onkogensignals, des Bcr-Abl-Fusionsgen-Produkts, werden Wachstumshemmung und apoptotischer Zelltod ausgelöst. Dies ist von besonderem Interesse, da tierexperimentelle Daten Hinweise auf das Phänomen der „Onkogensucht“ („oncogene addiction“) der Tumorzelle erbracht haben, d. h., dass die Hemmung des transformierenden Onkogens zum Absturz der malignen Zelle und Wachstumsarrest, Differenzierung oder apoptotischem Zelltod führt (Jonkers u. Berns 2004). Ein derartiger Effekt wird auch durch Imatinib ausgelöst und

192

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

. Abb. 1.8.13. Onkogensucht und gezielte Tumortherapie. Die maligne Transformation von Tumoren durch ein Onkogen (Onkogen 1) erfordert zusätzliche genetische Ereignisse, insbesondere die Inaktivierung von Zelltodsignalwegen z. B. durch Hochregulation des zelltodhemmenden Bcl-2 (Onkogen 2). Findet dies nicht statt, dann wird die transformierte Zelle über apoptotischen Zelltod eliminiert. Für die Aufrechterhaltung des malignen Phänotyps benötigen Tumorzellen die andauernde Aktivität des auslösenden Onkogens.

Wird das Onkogen durch zielgerichtete Therapie inaktiviert, dann werden Stressreaktionen ausgelöst, die zu andauerndem Wachstumsarrest (prämature zelluläre Seneszenz) oder Zelltod führen, der über Apoptose oder Autophagie vermittelt sein kann. Sekundäre genetische Veränderungen (Onkogen 3) infolge genetischer Instabilität der Tumorzelle und Selektionsdruck, z. B. durch das Mikromilieu oder die Tumortherapie, können ein Fortschreiten der Erkrankung und Therapieresistenz auslösen

erklärt den therapeutischen Effekt (> Abb. 1.8.13). In der Tat kann durch Gabe eines Bcr-Abl-Hemmers die Eradikation von bcr-abl-tragenden Zellen im Patienten gelingen (le Coutre et al. 1999), und zwar unter die Nachweisgrenze der Polymerasekettenreaktion (ca. 1 in 100.000 Zellen). Mittlerweile sind weitere derart zielgerichtete Therapien in der Entwicklung oder bereits im klinischen Einsatz. Bei Karzinomen wird die EGF-Rezeptor-Tyrosinkinase mittels die Rezeptoraktivierung blockierenden Antikörpern (Cetuximab) oder niedermolekularen Kinase-Inhibitoren gehemmt und die Tumorzelle für Radio- und Chemotherapie sensibilisiert. Ebenso sind Komponenten des nachgeschalteten PI3-/ Akt-Kinase-/mTOR-Signalwegs therapeutisches Ziel (> Abb. 1.8.12). Vor allem beim Nierenzellkarzinom, das hochresistent gegen konventionelle Tumortherapien ist, zeigen die neuen, von Rapamycin abgeleiteten mTORInhibitoren gute klinische Wirksamkeit (Easton u. Houghton 2006). In Abhängigkeit vom transformierenden Ereignis und der Akkumulation sekundärer genetischer Veränderungen kann aber eine solche Onkogensucht von der Tumorzelle überwunden werden. Dies resultiert in unzureichendem Therapieansprechen, Persistenz ruhender oder seneszenter Tumorzellen oder gar einer Progression unter der Therapie (> Abb. 1.8.13).

Zielgerichtete Therapie durch Apoptoseinduktion Neben diesen klinisch bereits etablierten Signalwegstherapien befinden sich eine Reihe weiterer Therapiemodalitäten zur gezielten Apoptoseinduktion in der präklinischen und beginnenden klinischen Entwicklung. Besonderes Potenzial darf von agonistischen AntiTRAIL-Rezeptor-Antikörpern (Marini et al. 2006) bzw. dem Todesliganden TRAIL [„TNF-related apoptosis inducing ligand“, „APO-2 ligand“ (APO-2L)] selbst erwartet werden (Wendt et al. 2005). TRAIL-Rezeptoren sind breit in verschiedenen Tumorentitäten exprimiert und werden nach DNA-Schädigung über einen p53-abhängigen Signalweg hochreguliert. Toxizität von TRAIL für Normalgewebe wurde zwar gezeigt, scheint aber, im Gegensatz zu den Todesliganden TNFD oder APO-1-/ Fas-Ligand, kein größeres Problem für eine systemische Therapie darzustellen (Daniel et al. 2001). Während die Zelltodsignalwege, die Apoptose durch Bestrahlung oder Chemotherapie vermitteln, in malignen Tumoren häufig inaktiviert sind, wird durch TRAIL-Rezeptor-Aktivierung in den meisten Tumoren eine Apoptose induziert, die den DNA-Schädigungs-induzierten Zelltod synergistisch verstärken kann. TRAIL entfaltet seine Wirkung, indem es an die TRAIL-Rezeptoren DR (Death

193 1.8 · Molekulare Grundlagen der Apoptose

1.8

. Abb. 1.8.14. Zielgerichtete Therapie über Zelltodsignalwege. Der extrinsische Apoptoseweg wird durch Todesrezeptoren (z. B. TRAIL-Rezeptoren DR4 und DR5) und deren Liganden (z. B. TRAIL) aktiviert. Der intrinsische Signalweg kann z. B. nach DNASchädigung und Aktivierung von nukleären Stressreaktionen über Stabilisierung des p53-Proteins ausgelöst werden und führt über proapoptotische, Bcl-2-homologe BH3-only-Proteine, sowie die Multidomänen-Bcl-2-homologen Proteine Bax und Bak zur Aktivierung des Mitochondriums mit resultierender Cytochrom-c-Freisetzung, Bildung des APAF-1-Apoptosom-Komplexes und Exekution der Apoptose durch Aktivierung der Caspasekaskade. Antiapoptotische Bcl-2-Homologe (Bcl-2, Bcl-xL etc.) hemmen diese Ereignisse. Freisetzung des SmacProteins aus Mitochondrien hemmt die Aktivität von IAP-Proteinen. Inaktivierung dieser CaspaseInhibitoren löst in Tumorzellen, unabhängig von übergeordneten Apoptosedefekten und Resistenzmechanismen, Zelltod aus. Möglichkeiten zur therapeutischen Apoptoseaktivierung sind rot hervorgehoben

Rezeptor)4 und DR5 bindet und hierdurch die Bildung des DISC aus dem Rezeptor und dem zytosolischen Adapterprotein FADD sowie der Initiatorcaspase-8 bildet, die in der Folge nachgeschaltete Caspasen als Effektoren des apoptotischen Zelltods aktiviert (> Abb. 1.8.14). Ein wesentlicher Teil des synergistischen, sensibilisierenden Effekts von TRAIL auf Chemo- bzw. Radiotherapie wird allerdings durch die zusätzliche Aktivierung des intrinsischen, mitochondrialen Apoptosewegs vermittelt. Dieser Effekt wird vollständig über das BH3-only-Protein Bid vermittelt, das durch Caspase-8 und -3 zum trunkierten Bid (tBid) gespalten und hierdurch aktiviert wird. In Tumorzellen aktiviert tBid den intrinsischen Apoptoseweg über einen vollständig Bax-abhängigen Mechanismus. Verlust von Bax bzw. der TRAIL-Rezeptor-Expression resultiert in TRAIL-Resistenz, sodass vor klinischer Applikation von TRAIL oder agonistischer Anti-DR4- oder -DR5-Antikörper die Expression dieser kritischen Regulatoren überprüft werden sollte (v. Haefen et al. 2004; Wendt et al. 2005). Dies ist relevant, da mittlerweile gezeigt wurde, dass TRAIL, neben der zelltodfördernden Wirkung, auch vollständig gegensätzliche Effekte haben kann. So kann TRAIL in apoptoseresistenten Tumoren die Tumorproliferation

stimulieren und eine Metastasierung fördern (Barnhart et al. 2004; Trauzold et al. 2006). Diese Effekte werden über die Aktivierung des NF-NB-Signalwegs durch TRAIL vermittelt. Weitere interessante, jedoch noch weit von einer klinischen Anwendung entfernte Ansätze betreffen die Manipulation von Komponenten des intrinsischen Apoptosewegs, und zwar insbesondere die Aktivierung des Tumorsuppressorgens p53, z. B. durch Antagonisierung des p53-Inhibitors Hdm-2, der als E3-Ubiquitinligase für p53 wirkt und über die Ubiquitinierung von p53 dieses für den Abbau über das Proteasom markiert (> Abb. 1.8.11 u. 1.8.14). Die Hemmung von Hdm-2 gelingt durch eine neue Klasse von Substanzen, den Nutlinen, die an Hdm-2 binden und hierdurch die Interaktion von Hdm-2 mit p53 behindern (Vassilev et al. 2004). Dies stellt in Hdm-2-überexprimierenden Tumorzellen die p53-Funktion wieder her und resultiert in Zellzyklusarrest oder Apoptose (Stühmer et al. 2005). Tumoren, die das antiapoptotische Bcl-2 überexprimieren, sollen hingegen durch Herunterregulation von Bcl-2 für Apoptose sensibilisiert werden (Adams et al. 2005). Versuche, auf mRNA-Ebene durch systemische Gabe des Antisense-Oligonukleotids Genasense (G3139,

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Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

Oblimersen) die Expression des Bcl-2-Proteins zu hemmen und in Kombination mit Chemotherapeutika das Therapieansprechen von malignen Melanomen, B-CLL oder Multiplem Myelom zu verbessern, zeigten in Phase-III-Studien allerdings nur geringe Effekte. Der Grund für diese geringe Wirksamkeit dürfte im Vorhandensein Bcl-2-homologer Apoptosehemmer liegen, die durch Genasense nicht gehemmt werden können: Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1 und Bfl-1/A1. Ein in höherem Maße vielversprechender Ansatz, diesen Signalweg therapeutisch zu nutzen, ist aber der Einsatz von niedermolekularen Bcl-2-Antagonisten. Ein wichtiger Vorteil dieses Ansatzes ist, dass neben Bcl-2 auch weitere antiapoptotische Mitglieder der Bcl-2-Genfamilie gehemmt werden können, wie z. B. Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1 und Bfl-1/A1, für die ebenfalls in einer Reihe von Tumoren deregulierte Expression und Bedeutung für Therapieresistenz gezeigt wurde. Bcl-2-Antagonisten entfalten ihre Wirkung, in dem sie die aus den Bcl-2Homologie- (BH-)1, BH2- und BH3-Domänen gebildete Bindetasche von Bcl-2 besetzen und hierdurch proapoptotische BH3-only-Proteine bzw. die Multidomänen-Proteine Bax und Bak aus der Bindung an Bcl-2 (oder dessen Homologen) freisetzen (Daniel et al. 2003) (> Abb. 1.8.7b,c). Hierdurch wird die Aktivierung, Oligomerisierung und Einsenkung von Bax oder Bak in die Mitochondrienmembran erleichtert. Die hierdurch entstehenden Kanäle setzen proapoptotische Killerfaktoren wie Cytochrom c und Smac aus den Mitochondrien in das Zytosol frei (> Abb. 1.8.14). Durch solche niedermolekularen BH3-Mimetika wird die Aktivierung des intrinsischen Apoptosesignalwegs erleichtert (Baell u. Huang 2002). Das BH3-Mimetikum ABT-737 (> Abb. 1.8.7c) zeigt in der Monotherapie eindrucksvolle präklinische Aktivität in Bronchialkarzinomen (Oltersdorf et al. 2005), Leukämien und Lymphomen, hemmt jedoch nur Bcl-2, Bcl-xL und Bcl-w (van Delft et al. 2006). Hemmstoffe mit Aktivität gegen Mcl-1 und das NF-NB regulierte Bfl-1/A1 sind in Entwicklung (Fesik 2005). Schließlich haben andere Therapieansätze die Aktivierung der Caspasesignalkaskade zum Ziel. Durch Einsatz des Smac-Proteins oder Peptiden aus dem N-terminalen Anteil von Smac gelingt die Hemmung von IAPs, die als endogene Hemmer aktivierter Caspasen häufig in Tumorzellen überexprimiert sind und die Exekution der Apoptose hemmen (> Abb. 1.8.14). Durch Gabe von Smac-Peptiden gelingt, im Zusammenspiel mit TRAIL, z. B. die Elimination von therapierefraktären Glioblastom-Xenotransplantaten im Mausmodell (Fulda et al. 2002). Die Tatsache, dass mittlerweile auch niedermolekulare IAP-Inhibitoren identifiziert werden konnten, erleichtert die präklinische Weiterentwicklung dieses Ansatzes, direkt Zelltodeffektorprogramme in Tumor-

zellen zu attackieren (Wang et al. 2004). Normale Körperzellen sind hingegen gegenüber IAP-Inhibitoren weitestgehend resistent. Ein besonderer Aspekt, Tumorzellen über Smac oder niedermolekulare IAP-Antagonisten für die Apoptose zu sensibilisieren, ist, dass hierdurch die häufig in Tumorzellen beobachteten Defekte in zentralen apoptoseregulierenden Genen wie (1) Funktionsverlust von proapoptotischen Regulatoren wie p53 und Bax oder (2) Überexpression von antiapoptotischen Regulatoren wie Bcl-2 oder Bcl-xL umgangen werden können, da die Therapie direkt die Effektorphase des programmierten Zelltods als Ziel hat, die sowohl vom intrinsischen als auch vom extrinsischen Signalweg genutzt wird (Hasenjager et al. 2004).

1.8.6 Ausblick Fortschritte in der Erforschung von Zelltodsignalwegen haben das Verständnis der Krankheitspathogenese wesentlich verbessert. Diese Erkenntnisse zur molekularen Pathogenese degenerativer, immunologischer und maligner Erkrankungen haben eine Reihe vielversprechender therapeutischer Ansätze eröffnet. Nun endlich, 35 Jahre nach Definition eines neuen zellbiologischen Prinzips, bieten diese neuen genetischen und molekularen Erkenntnisse die Perspektive eines paradigmatischen Fortschritts in der Medizin, vorwiegend in der Onkologie und der Behandlung degenerativer Erkrankungen. Während bei degenerativen Erkrankungen vorwiegend zelltodhemmende Ansätze verfolgt werden, zielt die moderne Tumormedizin auf eine Überwindung von Überlebensstrategien maligner Tumoren. Aufgrund der enormen genetischen Diversität maligner Tumoren, bedingt durch die hohe Komplexität der regulierenden Signalwege, steht gerade hier eine Individualisierung therapeutischer Ansätze im Vordergrund, zugeschnitten auf das genetische Profil und die hierdurch gestörten Signalkaskaden.

1.8.7 Literatur Adams JM, Huang DC, Strasser A, Willis S, Chen L, Wei A, van Delft M, Fletcher JI, Puthalakath H, Kuroda J, Michalak EM, Kelly PN, Bouillet P, Villunger A, O‘Reilly L, Bath ML, Smith DP, Egle A, Harris AW, Hinds M, Colman P and Cory S (2005). Subversion of the Bcl-2 life/death switch in cancer development and therapy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 70: 469–77 Ahr B, Robert-HebmannV, Devaux C and Biard-Piechaczyk M (2004). Apoptosis of uninfected cells induced by HIV envelope glycoproteins. Retrovirology 1: 12 Ameisen JC (1998). HIV. Setting death in motion. Nature 395: 117, 119 Anderson MK (2006). At the crossroads: diverse roles of early thymocyte transcriptional regulators. Immunol Rev 209: 191–211

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1.8

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198

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

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199 1.8 · Molekulare Grundlagen der Apoptose Westendorp MO, Frank R, Ochsenbauer C, Stricker K, Dhein J, Walczak H, Debatin KM and Krammer PH (1995). Sensitization of T cells to CD95-mediated apoptosis by HIV-1 Tat and gp120. Nature 375: 497–500 White E (2006). Mechanisms of apoptosis regulation by viral oncogenes in infection and tumorigenesis. Cell Death Differ 13: 1371–7 Willis SN, Chen L, Dewson G, Wei A, Naik E, Fletcher JI, Adams JM and Huang DC (2005). Proapoptotic Bak is sequestered by Mcl-1 and Bcl-xL, but not Bcl-2, until displaced by BH3-only proteins. Genes Dev 19: 1294–305 Wyllie AH (1980). Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation. Nature 284: 555–6 Yamanishi Y, Boyle DL, Rosengren S, Green DR, Zvaifler NJ and Firestein GS (2002). Regional analysis of p53 mutations in rheumatoid arthritis synovium. Proc Natl Acad Sci USA 99: 10025–30 Yang J, Liu X, Bhalla K, Kim CN, Ibrado AM, Cai J, Peng TI, Jones DP and Wang X (1997). Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked. Science 275: 1129–32 Yoo CB and Jones PA (2006). Epigenetic therapy of cancer: past, present and future. Nat Rev Drug Discov 5: 37–50 Youle RJ and Karbowski M (2005). Mitochondrial fission in apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol 6: 657–63

1.8

Yuan J, Shaham S, Ledoux S, Ellis HM and Horvitz HR (1993). The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Cell 75: 641–52 Zhang F, Hamanaka RB, Bobrovnikova-Marjon E, Gordan JD, Dai MS, Lu H, Simon MC and Diehl JA (2006a). Ribosomal stress couples the unfolded protein response to p53-dependent cell cycle arrest. J Biol Chem 281: 30036–45 Zhang Y, Leavitt BR, van Raamsdonk JM, Dragatsis I, Goldowitz D, Macdonald ME, Hayden MR and Friedlander RM (2006b). Huntingtin inhibits caspase-3 activation. Embo J 25: 5896–906 Zhang Y, Li M, Drozda M, Chen M, Ren S, Mejia Sanchez RO, Leavitt BR, Cattaneo E, Ferrante RJ, Hayden MR and Friedlander RM (2003a). Depletion of wild-type huntingtin in mouse models of neurologic diseases. J Neurochem 87: 101–6 Zhang Y, Ona VO, Li M, Drozda M, Dubois-Dauphin M, Przedborski S, Ferrante RJ and Friedlander RM (2003b). Sequential activation of individual caspases, and of alterations in Bcl-2 proapoptotic signals in a mouse model of Huntington‘s disease. J Neurochem 87: 1184–92 Zhivotovsky B and Orrenius S (2005). Caspase-2 function in response to DNA damage. Biochem Biophys Res Commun 331: 859–67 Zong WX, Ditsworth D, Bauer DE, Wang ZQ and Thompson CB (2004). Alkylating DNA damage stimulates a regulated form of necrotic cell death. Genes Dev 18: 1272–82

200

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

1.8.8 Zeittafel 1842

Vogt entdeckte 1842 den programmierten Zelltod bei entwicklungsbiologischen Untersuchungen über die Metamorphose der Kaulquappen der Gemeinen Geburtshelferkröte (Vogt 1842). Exzellente Übersicht über Zelltodforschung im 19. Jahrhundert bei Clarke u. Clarke (1996).

1858

Virchow, der Begründer der Zellularpathologie, beschreibt den Vorgang der Nekrose als schwerste Form der Gewebszerstörung und die Nekrobiose als Sterben des Gewebes im lebenden Körper (Virchow 1871).

1863

Beschreibung des Begriffs der Histolyse bei der Metamorphose der Insekten durch Weissmann (1863)

1872

Beschreibung des Zelltods von Knorpelzellen bei der Knochenbildung (Stieda 1872)

1883

Erster Bericht zur Phagozytose im Rahmen des Gewebsumbaus durch Metchnikoff (1883)

1885

Flemming beschreibt als erster die Kernveränderungen (Chromatolyse) beim Zelltod von Follikelzellen des Ovars (Flemming 1885).

1886

Mayer beschreibt den Zelltod von Muskelzellen (Sarkolyten) bei der Metamorphose der Kaulquappe (Mayer 1886).

1892

Erstbeschreibung der Autophagozytose. Metchnikoff beschreibt das Phänomen der Bildung von Phagozyten aus untergehendem Muskelgewebe (Metchnikoff 1892).

1898

De Bruyne prägt den Begriff der Autophagozytose (De Bruyne 1898)

1889

Felix beschreibt in menschlichen Embryonen das Konzept des histogenetischen Zelltods und einer„Wachstumsenergie“, die das Überleben von Zellen vermittelt. Dies wäre somit die Erstbeschreibung des Konzepts eines zelltodhemmenden Wachstumsfaktors (Felix 1889).

1906

Definition des Begriffs des histogenetischen Zelltods aufgrund der Beobachtungen bei Motoneuronen von Hühnerembryonen (Collin 1906)

1914

Konzept eines Gleichgewichts von Zelltod und Nachbildung in adulten Geweben (Gräper 1914)

1951

Glücksmann grenzt den Begriff des histogenetischen, gewebsformenden Zelltods ab zum morphogenetischen (entwicklungsbiologischen, metamorphotischen) Zelltod und dem phylogenetischen Zelltod (z. B. Verlust von Kiemen und Schwanz beim Menschen) (Glücksmann 1951).

1972

Definition des Phänomens der Apoptose als entwicklungsbiologisch determinierte physiologische Zelltodform in Abgrenzung zur Nekrose durch Wyllie, Kerr und Currie (Kerr et al. 1972).

1973

Definition der morphologischen Zelltodtypen I (Apoptose), Typ II (Autophagozytose) und Typ III (nichtlysosomal, nekroseähnlich) (Schweichel u. Merker 1973)

1975

Chemotherapie induziert Apoptose und Autophagie in Tumorzellen (Searle et al. 1975).

1980

Apoptose führt zur oligonukleosomalen Fragmentierung der genomischen DNA und einer„DNA-Leiter“ bei Analyse der genomischen DNA apoptotischer Zellen im Agarosegel (Wyllie 1980).

1984

Klonierung des bcl-2-Genlokus durch die Gruppe von Croce bei einem Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie und t(14;18)-Translokation (Tsujimoto et al. 1984).

1986

Klonierung der Caenorhabditis-elegans-Todesgene ced-3 und ced-4 (Ellis u. Horvitz 1986)

1988

Vaux zeigt, dass Bcl-2 mit C-MYC bei der Immortalisierung von prä-B-Zellen kooperiert (Vaux et al. 1988).

1989

Bcl-2-Überexpression in B-Zellen verlängert B-Zell-Überleben und induziert hyperplastische Lymphfollikel (McDonnell et al. 1989); Telomerverkürzung führt zu Seneszenz gefolgt von Zelltod in Hefezellen (Lundblad u. Szostak 1989); Erstbeschreibung der mitotischen Katastrophe in S. pombe (Molz et al. 1989)

1990

Entdeckung des ersten Todesrezeptors, CD95 (APO-1), durch Krammer (Trauth et al. 1989) und Yonehara (Fas) (Yonehara et al. 1989); C-MYC kooperiert mit Bcl-2 bei der Lymphomentstehung (Strasser et al. 1990).

1991

p53 induziert Apoptose (Yonish-Rouach et al. 1991); Bcl-2-Überexpression in B-Zellen transgener Mäuse induziert Autoimmunität (Strasser et al. 1991)

1992

Das S-Phase-Eintritt induzierende Onkogen C-MYC induziert Apoptose, die durch Bcl-2 gehemmt wird (Fanidi et al. 1992).

201 1.8 · Molekulare Grundlagen der Apoptose

1993

Klonierung von Bax als erstem proapoptotischen Bcl-2-Homolog (Oltvai et al. 1993); Die Gruppe von Raff zeigt, dass Bcl-2 den mitochondrialen Apoptoseweg hemmt (Jacobson et al. 1993); Entdeckung der ersten humanen Caspase, Interleukin-1E-converting enzyme (ICE, Caspase-1) (Yuan et al. 1993); Klonierung des ersten baculoviralen IAP (Crook et al. 1993)

1994

Klonierung von CD95-Liganden (CD95L, FasL, APO-1L) (Suda u. Nagata 1994); selektive, antigenspezifische Immunsuppression durch Ligation des CD95-/Fas-Todesrezeptors (Daniel u. Krammer 1994); Bcl-2 hemmt einen über das endoplasmatische Retikulum vermittelten Apoptoseweg (Lam et al. 1994).

1995

Klonierung von Bad (erstes BH3-only-Protein) und Definition der proapoptotischen Wirkung von Bad infolge der Verdrängung von Bax aus der Bindung von Bad an Bcl-2 und Bcl-xL (Yang et al. 1995); Klonierung des Todessliganden TRAIL (Wiley et al. 1995); autokriner und parakriner aktivierungsinduzierter Zelltod (AICD) wird durch CD95L vermittelt (Dhein et al. 1995); Erstbeschreibung des todesrezeptorassoziierten Signaltransduktionskomplexes DISC (Kischkel et al. 1995); Klonierung des Adapterproteins FADD/MORT1 (Boldin et al. 1995; Chinnaiyan et al. 1995)

1996

Klonierung von Caspase-8 (FLICE) (Muzio et al. 1996); Cytochrom-c-Freisetzung aus Mitochondrien und dATP sind wichtig für die Apoptoseexekution (Liu et al. 1996); Klonierung der ersten Säuger-IAP-Proteine durch die Gruppe von Vaux (Uren et al. 1996)

1997

Die Gruppe von Wang zeigt, dass APAF-1 Cytochrom-c-induzierte Caspaseaktivierung vermittelt (Zou et al. 1997) und als Adapterprotein das APAF-1/Caspase-9-Apoptosom bildet (Li et al. 1997); die Gruppe von Fesik publiziert die erste Röntgenstrukturanalyse eines Komplexes aus Bcl-xL mit einem BH3-Peptidkomplex (Sattler et al. 1997); Klonierung des ersten TRAIL-Decoy-Rezeptors DcR1/TRID; TRAIL killt bevorzugt Tumorzellen (Pan et al. 1997; Sheridan et al. 1997).

1998

Klonierung des BH3-only-Proteins Bim (O’Connor et al. 1998)

1999

Das BH3-only-Protein Bid induziert Apoptose über einen Bax-abhängigen Mechanismus (Desagher et al. 1999); Inaktivierung von Bim induziert Autoimmunität im Mausmodell (Bouillet et al. 1999); Herunterregulation von C-MYC löst Regression C-MYC-induzierter Hautpapillome aus (Pelengaris et al. 1999); Beclin-1 vermittelt Autophagie (Liang et al. 1999); Elimination von CML-Leukämiezellen in Patienten durch Hemmung der Bcr-Abl-Kinase (le Coutre et al. 1999)

2000

Die Gruppen von Wang und Vaux klonieren den Caspaseaktivator Smac (human) (Du et al. 2000) bzw. Diablo (Maus) (Verhagen et al. 2000); Mehlen und Bredesen publizieren das Konzept der„Dependence“-Rezeptoren als Überlebenssignale in malignen Tumoren (Mehlen u. Bredesen 2000); Bid induziert Aktivierung von Bax, Oligomerisierung und Einsenkung in die äußere Mitochondrienmembran (Eskes et al. 2000).

2001

Das BH3-only-Protein Puma ist ein wichtiger Apoptoseeffektor des p53-Signalwegs (Nakano u. Vousden 2001; Yu et al. 2001).

2002

Nobelpreis für Medizin und Physiologie für die Arbeiten von Sidney Brenner, Robert Horvitz und John Sulston über die Entwicklungsbiologie und Apoptoseregulation des Nematoden Caenorhabditis elegans (Marx 2002); Weinstein postuliert das Konzept der Onkogensucht von Tumorzellen (Weinstein 2002).

2003

BH3-only-Proteine induzieren Apoptose selektiv über Bax oder Bak (Gillissen et al. 2003; Yu et al. 2003).

2004

Apoptosedefiziente Zellen sterben über Autophagie (Shimizu et al. 2004); Bim hemmt die Entstehung MYC-induzierter Tumore und wirkt somit als Tumorsuppressorgen.

2005

Erster spezifischer Bcl-2-Inhibitor (ABT-737) von der Fesik-Gruppe publiziert (Oltersdorf et al. 2005); Bak wird durch einen doppelten Schutzmechanismus über Bcl-xL und Mcl-1 gehemmt (Willis et al. 2005); BH3-only-Proteine zeigen selektive Affinität zu antiapoptotischen Bcl-2-Familien-Proteinen (Chen et al. 2005).

2006

Apoptose und Autophagie sind funktionell miteinander verknüpft: Calpain spaltet das Autophagie-Gen ATG5, das dann Bcl-xL hemmt und die Apoptose induziert (Yousefi et al. 2006); Selektiver Verlust von BH3-only-Proteinen in humanen Tumoren (Sturm et al. 2006)

1.8

202

Sektion 1 · Allgemeine Grundlagen

Literatur zur Zeittafel Boldin MP, Varfolomeev EE, Pancer Z, Mett IL, Camonis JH and Wallach D (1995). A novel protein that interacts with the death domain of Fas/APO1 contains a sequence motif related to the death domain. J Biol Chem 270: 7795–8 Bouillet P, Metcalf D, Huang DC, Tarlinton DM, Kay TW, Kontgen F, Adams JM and Strasser A (1999). Proapoptotic Bcl-2 relative Bim required for certain apoptotic responses, leukocyte homeostasis, and to preclude autoimmunity. Science 286: 1735–8 Chen L, Willis SN, Wei A, Smith BJ, Fletcher JI, Hinds MG, Colman PM, Day CL, Adams JM and Huang DC (2005). Differential targeting of prosurvival Bcl-2 proteins by their BH3-only ligands allows complementary apoptotic function. Mol Cell 17: 393–403 Chinnaiyan AM, O‘Rourke K, Tewari M and Dixit VM (1995). FADD, a novel death domain-containing protein, interacts with the death domain of Fas and initiates apoptosis. Cell 81: 505–12 Clarke PG and Clarke S (1996). Nineteenth century research on naturally occurring cell death and related phenomena. Anat Embryol (Berl) 193: 81–99 Collin R (1906). Recherches cytologiques sur le développement de la cellule nerveuse. Névraxe 8: 181–309 Crook NE, Clem RJ and Miller LK (1993). An apoptosis-inhibiting baculovirus gene with a zinc finger-like motif. J Virol 67: 2168– 74 Daniel PT and Krammer PH (1994). Activation induces sensitivity toward APO-1 (CD95)-mediated apoptosis in human B cells. J Immunol 152: 5624–32 De Bruyne C (1898). Recherches au sujet de l‘intervention de la phagocytose dans le développement des invertébrés. Arch Biol 15: 181–300 Desagher S, Osen-Sand A, Nichols A, Eskes R, Montessuit S, Lauper S, Maundrell K, Antonsson B and Martinou JC (1999). Bid-induced conformational change of Bax is responsible for mitochondrial cytochrome c release during apoptosis. J Cell Biol 144: 891–901 Dhein J, Walczak H, Bäumler C, Debatin KM and Krammer PH (1995). Autocrine T-cell suicide mediated by APO-1/(Fas/CD95). Nature 373: 438–41 Du C, Fang M, Li Y, Li L and Wang X (2000). Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition. Cell 102: 33–42 Ellis HM and Horvitz HR (1986). Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell 44: 817–29 Eskes R, Desagher S, Antonsson B and Martinou JC (2000). Bid induces the oligomerization and insertion of Bax into the outer mitochondrial membrane. Mol Cell Biol 20: 929–35 Fanidi A, Harrington EA and Evan GI (1992). Cooperative interaction between c-myc and bcl-2 proto-oncogenes. Nature 359: 554–6 Felix W (1889). Ueber Wachsthum der quergestreiften Muskulatur nach Beobachtungen am Menschen. Z Wiss Zool 48: 224–259 Flemming W (1885). Ueber die Bildung von Richtungsfiguren in Säugethiereiern beim Untergang Graaf‘scher Follikel. Anat Physiol Jahrgang 1885: 221–244 Gillissen B, Essmann F, Graupner V, Starck L, Radetzki S, Dörken B, Schulze-Osthoff K and Daniel PT (2003). Induction of cell death by the BH3-only Bcl-2 homolog Nbk/Bik is mediated by an entirely Bax-dependent mitochondrial pathway. Embo J 22: 3580–90 Glücksmann A (1951). Cell deaths in normal vertebrate ontogeny. Biol Rev Camb Philes Soc 26: 59–86 Gräper L (1914). Eine neue Anschauung über physiologische Zellausschaltung. Arch Zellforsch 12: 373–394

Jacobson MD, Burne JF, King MP, Miyashita T, Reed JC and Raff MC (1993). Bcl-2 blocks apoptosis in cells lacking mitochondrial DNA. Nature 361: 365–9 Kerr JF, Wyllie AH and Currie AR (1972). Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 26: 239–57 Kischkel FC, Hellbardt S, Behrmann I, Germer M, Pawlita M, Krammer PH and Peter ME (1995). Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. Embo J 14: 5579–88 Lam M, Dubyak G, Chen L, Nunez G, Miesfeld RL and Distelhorst CW (1994). Evidence that BCL-2 represses apoptosis by regulating endoplasmic reticulum-associated Ca2+ fluxes. Proc Natl Acad Sci USA 91: 6569–73 le Coutre P, Mologni L, Cleris L, Marchesi E, Buchdunger E, Giardini R, Formelli F and Gambacorti-Passerini C (1999). In vivo eradication of human BCR/ABL-positive leukemia cells with an ABL kinase inhibitor. J Natl Cancer Inst 91: 163–8 Li P, Nijhawan D, Budihardjo I, Srinivasula SM, Ahmad M, Alnemri ES and Wang X (1997). Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell 91: 479–89 Liang XH, Jackson S, Seaman M, Brown K, Kempkes B, Hibshoosh H and Levine B (1999). Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin 1. Nature 402: 672–6 Liu X, Kim CN, Yang J, Jemmerson R and Wang X (1996). Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome c. Cell 86: 147–57 Lundblad V and Szostak JW (1989). A mutant with a defect in telomere elongation leads to senescence in yeast. Cell 57: 633– 43 Marx J (2002). Nobel Prize in Physiology or Medicine. Tiny worm takes a star turn. Science 298: 526 Mayer S (1886). Die sogenannten Sarkoplasten. Anat Anz 1: 231– 235 McDonnell TJ, Deane N, Platt FM, Nunez G, Jaeger U, McKearn JP and Korsmeyer SJ (1989). bcl-2-immunoglobulin transgenic mice demonstrate extended B cell survival and follicular lymphoproliferation. Cell 57: 79–88 Mehlen P and Bredesen DE (2000). Dependence receptors: links between apoptosis, nervous system development and control of tumorigenesis. Bull Cancer 87: 537–41 Metchnikoff E (1892). La phagocytose musculaire. I. Atrophie des muscles pendant la transformation des batraciens. Ann Inst Pasteur 6: 1–12 Metschnikof E (1883). Untersuchungen über die mesodermalen Phagocyten einiger Wirbeltiere. Biol Zentralbl 3: 560–565 Molz L, Booher R, Young P and Beach D (1989). cdc2 and the regulation of mitosis: six interacting mcs genes. Genetics 122: 773– 82 Muzio M, Chinnaiyan AM, Kischkel FC, O‘Rourke K, Shevchenko A, Ni J, Scaffidi C, Bretz JD, Zhang M, Gentz R, Mann M, Krammer PH, Peter ME and Dixit VM (1996). FLICE, a novel FADD-homologous ICE/CED-3-like protease, is recruited to the CD95 (Fas/ APO-1) death--inducing signaling complex. Cell 85: 817–27 Nakano K and Vousden KH (2001). PUMA, a novel proapoptotic gene, is induced by p53. Mol Cell 7: 683–94 O‘Connor L, Strasser A, O‘Reilly LA, Hausmann G, Adams JM, Cory S and Huang DC (1998). Bim: a novel member of the Bcl-2 family that promotes apoptosis. Embo J 17: 384–95 Oltersdorf T, Elmore SW, Shoemaker AR, Armstrong RC, Augeri DJ, Belli BA, Bruncko M, Deckwerth TL, Dinges J, Hajduk PJ, Joseph MK, Kitada S, Korsmeyer SJ, Kunzer AR, Letai A, Li C, Mitten MJ, Nettesheim DG, Ng S, Nimmer PM, O‘Connor JM, Oleksijew A,

203 1.8 · Molekulare Grundlagen der Apoptose Petros AM, Reed JC, Shen W, Tahir SK, Thompson CB, Tomaselli KJ, Wang B, Wendt MD, Zhang H, Fesik SW and Rosenberg SH (2005). An inhibitor of Bcl-2 family proteins induces regression of solid tumours. Nature 435: 677–81 Oltvai ZN, Milliman CL and Korsmeyer SJ (1993). Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell 74: 609–19 Pan G, Ni J, Wei YF, Yu G, Gentz R and Dixit VM (1997). An antagonist decoy receptor and a death domain-containing receptor for TRAIL. Science 277: 815–8 Pelengaris S, Littlewood T, Khan M, Elia G and Evan G (1999). Reversible activation of c-Myc in skin: induction of a complex neoplastic phenotype by a single oncogenic lesion. Mol Cell 3: 565–77 Sattler M, Liang H, Nettesheim D, Meadows RP, Harlan JE, Eberstadt M, Yoon HS, Shuker SB, Chang BS, Minn AJ, Thompson CB and Fesik SW (1997). Structure of Bcl-xL-Bak peptide complex: recognition between regulators of apoptosis. Science 275: 983–6 Schweichel JU and Merker HJ (1973). The morphology of various types of cell death in prenatal tissues. Teratology 7: 253–66 Searle J, Lawson TA, Abbott PJ, Harmon B and Kerr JF (1975). An electron-microscope study of the mode of cell death induced by cancer-chemotherapeutic agents in populations of proliferating normal and neoplastic cells. J Pathol 116: 129–38 Sheridan JP, Marsters SA, Pitti RM, Gurney A, Skubatch M, Baldwin D, Ramakrishnan L, Gray CL, Baker K, Wood WI, Goddard AD, Godowski P and Ashkenazi A (1997). Control of TRAIL-induced apoptosis by a family of signaling and decoy receptors. Science 277: 818–21 Shimizu S, Kanaseki T, Mizushima N, Mizuta T, Arakawa-Kobayashi S, Thompson CB and Tsujimoto Y (2004). Role of Bcl-2 family proteins in a non-apoptotic programmed cell death dependent on autophagy genes. Nat Cell Biol 6: 1221–8 Stieda L (1872). Die Bildung des Knochengewebes. Festschrift des Naturforschervereins zu Riga zur Feier des fünfzigjährigen Bestehens der Gesellschaft practischer Ärtze zu Riga. Engelmann, Leipzig Strasser A, Harris AW, Bath ML and Cory S (1990). Novel primitive lymphoid tumours induced in transgenic mice by cooperation between myc and bcl-2. Nature 348: 331–3 Strasser A, Whittingham S, Vaux DL, Bath ML, Adams JM, Cory S and Harris AW (1991). Enforced BCL2 expression in B-lymphoid cells prolongs antibody responses and elicits autoimmune disease. Proc Natl Acad Sci USA 88: 8661–5 Sturm I, Stephan C, Gillissen B, Siebert R, Janz M, Radetzki S, Jung K, Loening S, Dörken B and Daniel PT (2006). Loss of the tissuespecific proapoptotic BH3-only protein Nbk/Bik is a unifying feature of renal cell carcinoma. Cell Death Differ 13: 619–27 Suda T and Nagata S (1994). Purification and characterization of the Fas-ligand that induces apoptosis. J Exp Med 179: 873–9 Trauth BC, Klas C, Peters AM, Matzku S, Moller P, Falk W, Debatin KM and Krammer PH (1989). Monoclonal antibody-mediated tumor regression by induction of apoptosis. Science 245: 301–5 Tsujimoto Y, Finger LR, Yunis J, Nowell PC and Croce CM (1984). Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cells with the t(14;18) chromosome translocation. Science 226: 1097–9 Uren AG, Pakusch M, Hawkins CJ, Puls KL and Vaux DL (1996). Cloning and expression of apoptosis inhibitory protein homologs that function to inhibit apoptosis and/or bind tumor necrosis

1.8

factor receptor-associated factors. Proc Natl Acad Sci USA 93: 4974–8 Vaux DL, Cory S and Adams JM (1988). Bcl-2 gene promotes haemopoietic cell survival and cooperates with c-myc to immortalize pre-B cells. Nature 335: 440–2 Verhagen AM, Ekert PG, Pakusch M, Silke J, Connolly LM, Reid GE, Moritz RL, Simpson RJ and Vaux DL (2000). Identification of DIABLO, a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins. Cell 102: 43–53 Virchow R (1871). Vorlesungen über Pathologie: Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische und pathologische Gewebelehre. 4. Auflage, Verlag von August Hirschwald, Berlin Vogt C (1842). Untersuchungen über die Entwicklungsgeschichte der Geburtshelferkröte (Alytes obstetricans). Jent und Gassmann, Solothurn Weinstein IB (2002). Cancer. Addiction to oncogenes-the Achilles heal of cancer. Science 297: 63–4 Weissmann A (1863). Die Entwickelung der Dipteren im Ei nach Beobachtungen an Chironomus spec., Musca vomitoria und Pulex canis. Z Wiss Zool 13: 107–220 Wiley SR, Schooley K, Smolak PJ, Din WS, Huang CP, Nicholl JK, Sutherland GR, Smith TD, Rauch C, Smith CA and et al. (1995). Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis. Immunity 3: 673–82 Willis SN, Chen L, Dewson G, Wei A, Naik E, Fletcher JI, Adams JM and Huang DC (2005). Proapoptotic Bak is sequestered by Mcl-1 and Bcl-xL, but not Bcl-2, until displaced by BH3-only proteins. Genes Dev 19: 1294–305 Wyllie AH (1980). Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation. Nature 284: 555–6 Yang E, Zha J, Jockel J, Boise LH, Thompson CB and Korsmeyer SJ (1995). Bad, a heterodimeric partner for Bcl-XL and Bcl-2, displaces Bax and promotes cell death. Cell 80: 285–91 Yonehara S, Ishii A and Yonehara M (1989). A cell-killing monoclonal antibody (anti-Fas) to a cell surface antigen co-downregulated with the receptor of tumor necrosis factor. J Exp Med 169: 1747–56 Yonish-Rouach E, Resnitzky D, Lotem J, Sachs L, Kimchi A and Oren M (1991). Wild-type p53 induces apoptosis of myeloid leukaemic cells that is inhibited by interleukin-6. Nature 352: 345–7 Yousefi S, Perozzo R, Schmid I, Ziemiecki A, Schaffner T, Scapozza L, Brunner T and Simon HU (2006). Calpain-mediated cleavage of Atg5 switches autophagy to apoptosis. Nat Cell Biol 8: 1124– 32 Yu J, Wang Z, Kinzler KW, Vogelstein B and Zhang L (2003). PUMA mediates the apoptotic response to p53 in colorectal cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA 100: 1931–6 Yu J, Zhang L, Hwang PM, Kinzler KW and Vogelstein B (2001). PUMA induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cells. Mol Cell 7: 673–82 Yuan J, Shaham S, Ledoux S, Ellis HM and Horvitz HR (1993). The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Cell 75: 641–52 Zou H, Henzel WJ, Liu X, Lutschg A and Wang X (1997). Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3. Cell 90: 405–13

2

2 Modelle 2.1 Tiermodelle in der biomedizinischen Forschung Michael Strehle und Stefan Britsch

2.2 Zellkulturtechniken, Zellmodelle und Tissue Engineering Anna M. Wobus und Heike Mertsching

2.3 Molekülmodelle und Modellmoleküle: Strukturanalyse großer biologischer Moleküle für die Medizin Yves A. Muller und Udo Heinemann

2.1 2.1 Tiermodelle in der biomedizinischen Forschung Michael Strehle und Stefan Britsch

2.1.1

Einführung – Warum Tierversuche? – 208

2.1.2

Strategien zur genetischen Veränderung von Versuchstieren – 208

2.1.2.1 2.1.2.2 2.1.2.3 2.1.2.4

Entwicklungs- und fortpflanzungs-biologische Grundlagen Transgene Techniken – 210 Klonierung durch Kerntransfer – 217 Internationale Konsortien – 218

2.1.3

Beispiele genetisch veränderter Tiermodelle in der biomedizinischen Forschung – 218

2.1.3.1 2.1.3.2 2.1.3.3

Entwicklung und Krebs – 218 Stoffwechsel – 226 ZNS – 228

2.1.4

Ausblick

– 230

2.1.5

Literatur

– 230

2.1.6

Zeittafel

– 240

Literatur zur Zeittafel

– 208

– 241

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

208

Sektion 2 · Modelle

2.1.1 Einführung – Warum Tierversuche? Die Entwicklung und Funktion komplexer biologischer Systeme, wie sie das Herz-Kreislauf-System oder das menschliche Gehirn darstellen, unterliegen komplizierten Steuerungsmechanismen, die sich in vitro, d. h. in Zell- oder Organkultur, nur unvollständig analysieren lassen. Tierversuche und der Einsatz von Tiermodellen sind daher unersetzlich für die Erforschung komplexer Lebensvorgänge, aber auch für die Aufklärung von Krankheitsprozessen und die Entwicklung neuer Behandlungskonzepte. Der reduktionistische Rückgriff auf einfache Modellsysteme wie z. B. die Fliege Drosophila melanogaster oder den Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist zwar für die Untersuchung konservierter biologischer Prozesse wissenschaftlich extrem fruchtbar (Lawrence 1992). Dieser Forschungsansatz stößt jedoch an Grenzen angesichts der unterschiedlichen Größe und Komplexität der Genome, sowie grundlegender Unterschiede im Körperbauplan und der Physiologie von Wirbellosen und Wirbeltieren. Demgegenüber sind dem Einsatz von Versuchstierspezies, die dem Menschen besonders nahe verwandt sind, z. B. Primaten, sowohl ethisch als auch praktisch-experimentell enge Grenzen gesetzt. Vor diesem Hintergrund haben die Kleinsäuger Ratte und Maus traditionell eine bedeutsame Rolle als Versuchs- und Labortiere gespielt. Sie zeichnen sich zum einen durch leichte Haltungsbedingungen, kurze Generationszeiten und eine große Zahl von Nachkommen aus, zum anderen sind Physiologie und Anatomie kleiner Nager dem Menschen sehr ähnlich. So zeigen Mäuse mit angeborenen oder erworbenen Stoffwechselstörungen wie beispielsweise Diabetes mellitus ähnliche Krankheitssymptome, wie sie beim Menschen auftreten. Solche Mäuse besitzen also Modellcharakter für die Erforschung dieser Erkrankungen. Einzelne Organsysteme, wie das Gehirn von Nagern, wurden in den vergangenen Jahrzehnten morphologisch und physiologisch außerordentlich gut charakterisiert und stellen heute Referenzmodelle für ihre Erforschung dar. Die Entwicklung der modernen Molekulargenetik in der zweiten Hälfte des vergangenen Jahrhunderts bedeutete nicht nur für die biomedizinische Grundlagenforschung eine Revolution. Sie hat auch die Bedeutung von Mäusen und Ratten als Versuchstiere und Tiermodelle nachhaltig beeinflusst. Die Entwicklung transgener Techniken ermöglichte es erstmals, die Expression einzelner Gene in der Maus und der Ratte gezielt zu verändern und dadurch ihre spezifischen Funktionen in einem intakten Säugerorganismus selektiv zu analysieren (Britsch 2006). Viele transgene Schlüsseltechniken wurden ursprünglich in der Ratte oder der Maus ent-

wickelt. Noch heute ist Gene-Targeting durch homologe Rekombination in ES-Zellen ausschließlich auf die Maus beschränkt (Britsch 2006). Dies hat entscheidend dazu beigetragen, dass die Zahl von Mäusen, die als Versuchstiere in der biomedizinischen Forschung eingesetzt werden, gegenüber anderen Spezies dramatisch zugenommen hat (> Abb. 2.1.1). Die systematische und vergleichende Charakterisierung verschiedener Säugergenome in jüngster Zeit sowie die damit verbundene Verfügbarkeit hochauflösender genetischer und physikalischer Kartierungen haben die Identifizierung mutanter Gene im Genom von Säugern stark vereinfacht und beschleunigt. Dies hat zu einer Renaissance der Erforschung natürlicher Mutationen in diesen Spezies geführt. Sie bildet darüber hinaus eine entscheidende Voraussetzung für zahlreiche überregionale, systematische MutageneseScreens in der Maus, z. B. dem „NIH Neurogenomics Project“, die in den letzten Jahren initiiert wurden (Vitaterna et al. 2006). Diese Entwicklungen unterstreichen die wachsende Dominanz von genetisch veränderten Mäusen in der biomedizinischen Forschung. Wir werden uns daher in der folgenden Darstellung auf diese konzentrieren.

2.1.2 Strategien zur genetischen Veränderung von Versuchstieren Transgene Techniken ermöglichen es, dem Genom eines Organismus genetische Information hinzuzufügen oder sie gezielt zu entfernen. Durch die Entwicklung von Klonierungstechniken mittels Kerntransfer ist es zudem möglich geworden, das gesamte Genom eines Organismus beliebig oft auf einen neuen Organismus zu übertragen und damit zu kopieren. Im Folgenden sollen fortpflanzungsbiologische Grundlagen sowie die verschiedenen transgenen Techniken exemplarisch am Modellorganismus Maus dargestellt werden.

2.1.2.1 Entwicklungs- und fortpflanzungsbiologische Grundlagen Wenige Tage nach der Geburt der weiblichen Maus sind bereits alle Oozyten vorhanden, die im gesamten Leben des Tieres gebildet werden. Sie sind in einem Übergangsstadium zwischen der Pro- und Metaphase der ersten Reifeteilung arretiert und verharren in diesem Reifestadium bis zur Ovulation. Diese wird bei Erreichen der Geschlechtsreife durch zwei Hormone (Follikel stimulierendes Hormon, FSH, und luteinisierendes Hormon, LH), eingeleitet. Die Oozyte vollendet nun die erste Reifeteilung und vollzieht die zweite Reifeteilung bis zur

209 2.1 · Tiermodelle in der biomedizinischen Forschung

2.1

a

b . Abb. 2.1.1a,b. 2004 in Deutschland eingesetzte Versuchstiere. a Prozentuale Verteilung der in der biologischen Grundlagenforschung eingesetzten Versuchstiere. b Für die Erforschung spezifischer

Krankheitsgruppen eingesetzte Versuchstiere. Quelle: Bundesministerium für Verbraucherschutz, Ernährung und Landwirtschaft, 2006

210

Sektion 2 · Modelle . Abb. 2.1.2. Schematische Darstellung verschiedener Stadien der frühen Mausentwicklung. Obere Reihe: Die Eizelle nach der Ovulation, in der Metaphase der zweiten Reifeteilung arretiert (links). Ein Spermium ist in die Eizelle eingedrungen, diese hat die zweite Reifeteilung vollendet und das zweite Polkörperchen ausgestoßen (Mitte). Nach 10–14 Std. sind in der Zygote der männliche und weibliche Pronukleus vorhanden (rechts). Mittlere Reihe: Die Vorkerne verschmelzen nach 14–20 Std., um einen gemeinsamen Kern zu bilden (links). Nach 20–38 Std. ist das 2-Zell-Stadium erreicht (Mitte). Nach 62–74 Std. wird die kompaktierte Morula gebildet (rechts). Unten: Nach 3,5 Tagen ist das Blastozystenstadium erreicht. Nachdem die Blastozyste die azelluläre Hülle (Zona pellucida) verlassen hat, kann die Implantation in die Uteruswand stattfinden

Metaphase, in der sie dann bis zur Befruchtung durch ein Spermium arretiert bleibt. Die Embryonalentwicklung beginnt mit der Befruchtung der Eizelle durch das Spermium (> Abb. 2.1.1). Der Eintritt des Spermiums in die Eizelle löst die zweite Reifeteilung aus. Nukleäre Membranen formen sich um den mütterlichen und väterlichen Chromosomensatz und bilden so etwa 10 h nach der Befruchtung den weiblichen und männlichen Pronukleus. Die Pronuklei verschmelzen, danach werden die ersten Teilungen des Embryos eingeleitet (> Abb. 2.1.2). Das 2-Zell-Stadium wird nach ca. 20 h erreicht, und nach 3,5 Tagen sind etwa 64 Zellen vorhanden, die eine Blastozyste bilden (> Abb. 2.1.2). Die Implantation des Embryos in den Uterus findet nach etwa 4,5 Tagen statt. Der erste klar definierte Differenzierungsschritt im Säuger läuft während der Bildung der Blastozyste ab, wenn innere Zellmasse und Trophektoderm entstehen (> Abb. 2.1.2). Das Trophektoderm entwickelt sich nach der Implantation zu den extraembryonalen Membranen,

die den Embryo umgeben und zur Bildung der Plazenta beitragen. Die innere Zellmasse entwickelt sich zum eigentlichen Embryo. Von Zellen der inneren Zellmasse können Zelllinien etabliert werden. Solche Zellen können auch nach einer Kultivierung in vitro zu allen Strukturen des Embryos beitragen und sich in alle Zelltypen differenzieren. Sie werden deshalb pluripotente embryonale Stammzellen (ES-Zellen) genannt.

2.1.2.2 Transgene Techniken Bei der Identifizierung und Charakterisierung von Genen mittels transgener Techniken lassen sich zwei grundsätzliche Strategien unterscheiden: Beim genetischen Screen wird versucht, die einem bestimmten Phänotyp zugrunde liegenden mutierten Allele bzw. Gene zu identifizieren. Dieses am Phänotyp orientierte Vorgehen ist als „forward genetics“ bekannt.

211 2.1 · Tiermodelle in der biomedizinischen Forschung

Im Gegensatz dazu hat der am Genotyp orientierte Ansatz das Ziel, die Funktion eines identifizierten Gens durch Deletion, Mutation oder Überexpression in vivo aufzuklären. Diese Strategie wird auch als „reverse genetics“ bezeichnet. Genotyporientierte Techniken Transgene

Transgene Mäuse werden durch Mikroinjektion von DNA in den männlichen Pronukleus von Zygoten hergestellt (> Abb. 2.1.3) (Costantini u. Lacy 1981; Palmiter et al. 1982; Steward et al. 1982). Für diese Injektionen werden lineare DNA-Fragmente eingesetzt, die typischerweise aus dem jeweils zu exprimierenden Gen und einem geeigneten kurzen Promotorfragment bestehen. Von den injizierten Fragmenten werden dabei einige stabil an einem zufälligen Ort in das Genom eingebaut; der Rest wird degradiert. Abhängig vom jeweiligen Integrationsort kann die Stärke der Transgenexpression durch benachbarte Enhancer- oder Repressorelemente beeinflusst werden, sodass der Integrationsort das gewebespezifische Expressionsmuster des Transgens beeinflussen kann. Das bedeutet praktisch, dass immer mehrere Mauslinien hergestellt werden müssen, die das Transgen an unterschiedlichen Orten integriert haben, um eindeutige Aussagen über Funktion und Expression des Transgens zu erhalten (Nagy et al. 2002). Das zu exprimierende Gen kann allerdings durch große Chromosomenabschnitte aus YACS („yeast artificial chromosomes“) umgeben werden. Diese enthalten das gewünschte Promotorfragment in einem definierten Kontext aus spezifischen Enhancer- und Repressorelementen. Dadurch wird eine Expression des Transgens ermöglicht, die unabhängig ist vom jeweiligen Integrationsort in das Wirtsgenom (Schedl et al. 1992). YACKonstrukte sind aufgrund ihrer Größe von mehreren hundert Kilobasen allerdings schwierig herzustellen und zu handhaben. Man greift daher zur Herstellung von

a

b

. Abb. 2.1.3a–c. Herstellung von transgenen Mäusen durch Injektion von DNA in den männlichen Pronukleus der Zygote. Befruchtete Eizellen werden aus dem Eileiter isoliert. a Mittels einer Injektionsnadel wird eine DNA-haltige Lösung in den männlichen Pronukleus der

2.1

Transgenen vermehrt auf BAC- („bacterial artificial chromosomes“-)Konstrukte zurück, die etwa 80–300 Kilobasen groß sind (Giraldo u. Montoliu 2001). Gene-Targeting

Die Technik des Gene-Targeting verbindet die gezielte Veränderung von Genen mittels homologer Rekombination in embryonalen Stammzellen mit der Erzeugung von transgenen Mäusen durch Blastozysteninjektion und Transfer der Blastozysten in Ammenmütter. Embryonale Stammzelltechnologie

Embryonale Stammzelllinien wurden erstmals in den 1980er Jahren etabliert (Evans u. Kaufman 1981; Martin 1981; Magnuson et al. 1982). In Kultur werden diese Zellen im Allgemeinen auf primären embryonalen Fibroblasten, sog. Feederzellen, gehalten. Diese Fibroblasten produzieren verschiedene Faktoren, die das Wachstum erleichtern und die Differenzierung hemmen; zusätzlich wird dem Kulturmedium LIF („leukaemia inhibitory factor“) zugefügt (Smith et al. 1988). Rekombinante DNA wird meist durch Elektroporation in die ES-Zellen eingebracht, wobei durch einen kurzen Stromimpuls vorübergehend die Zellmembranpermeabilität erhöht wird (> Abb. 2.1.5). Die Zellen bauen die aufgenommene DNA mit einer geringen Frequenz in ihr Genom ein. Von etwa 1.000 Zellen, die fremde DNA aufnehmen, baut eine Zelle die DNA stabil in ihr Genom ein. Gene-Targeting durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen

Durch die Technik des Gene-Targeting ist es möglich geworden, Genabschnitte gezielt zu deletieren („knockout“) oder an spezifischen Orten des Genoms neu hinzuzufügen („knock-in“). Grundlage dieser Technik ist die Beobachtung, dass DNA, die über große Bereiche zu entsprechenden Abschnitten des Empfängergenoms homolog ist, nicht nur zufällig, sondern auch mittels homo-

c Zygote injiziert. b Die injizierten Zygoten werden in die Eileiter einer Ammenmutter transferiert. c Aus den injizierten Zygoten entwickeln sich transgene Mäuse (grün dargestellt)

212

Sektion 2 · Modelle

a

b

loger Rekombination in ES-Zellen integriert wird (> Abb. 2.1.4a) (Doetschman et al. 1987; Thomas u. Capecchi 1987). Abhängig von der genauen Struktur und vom Genabschnitt, der eingebracht wird, findet in etwa 1–10% aller Fälle Integration durch homologe Rekombination statt. Zur Einführung rekombinanter DNA in ein Wirtsgenom mittels homologer Rekombination wird ein sog. Targeting-Vektor eingesetzt (> Abb. 2.1.4a). In diesem Targeting-Vektor wird rekombinante DNA, über die eine gezielte Mutation in das Genom eingeführt soll, von längeren Abschnitten genomischer DNA flankiert, die homolog zu dem gewünschten Integrationsort sind. Außerdem enthält ein Targeting-Vektor Selektionsmarker, um das seltene Ereignis der homologen Rekombination identifizieren zu können. Als positive Selektions-

. Abb. 2.1.4a,b. Mutation von Genen durch homologe Rekombination. a GeneTargeting aI Der Targeting-Vektor enthält das Neomycin-Resistenzgen (neo, rosa) als positiven und das Thymidinkinase-Gen (tk, violett) als negativen Selektionsmarker. aII Durch homologe Rekombination mit dem endogenen Genlocus in den Exons I und III (hellblau) wird neo in den Locus integriert. Exon II (dunkelblau) wird dabei eliminiert, das Gen somit inaktiviert. b Konditionelles Gene-Targeting bI Im Targeting-Vektor sind Exon II und neo von loxP-Sequenzen (schwarze Dreiecke) flankiert und werden durch homologe Rekombination in den genomischen Locus integriert. bII Expression der Cre-Rekombinase in den ES-Zellen eliminiert neo. bIII Expression von Cre in der Maus deletiert Exon II und inaktiviert so das Gen

marker werden Gene wie Neomycin-Phosphotransferase (neo) verwendet, die Resistenz gegen bestimmte Antibiotika vermitteln. Nur Zellen, die den Targeting-Vektor und damit das Resistenzgen stabil in ihr Genom integriert haben, können in Gegenwart des Antibiotikums wachsen. Die Anwesenheit eines negativen Selektionsmarkers wie Thymidinkinase (Tk) oder Diphtherietoxin A (DTA) ist dagegen, direkt oder über Stoffwechselprodukte, toxisch für eine Zelle. Der Targeting-Vektor ist so konstruiert, dass der negative Selektionsmarker nur bei homologer Rekombination des Vektors in das Genom verloren geht; Zellen, die den Vektor nicht homolog in das Genom integriert haben, sterben (Mansour et al. 1988) (> Abb. 2.1.4a; > Abb. 2.1.5). Resistente ES Zellen werden dann mit molekularen Techniken

213 2.1 · Tiermodelle in der biomedizinischen Forschung

2.1

. Abb. 2.1.5. Herstellung von transgenen Mäusen durch Einsatz der embryonalen Stammzelltechnologie. Blastozysten werden aus dem Uterus einer Maus isoliert, und die innere Zellmasse der Blastozyste wird in Kultur genommen (oben links). Solche in vitro kultivierten embryonalen Stammzellen behalten in Kultur ihr vollständiges Entwicklungspotenzial und können durch Einbringen von DNA genetisch verändert werden. Blastozysten werden aus einem unterschiedlichen Mausstamm isoliert (oben rechts), und die veränderten embryonalen Stammzellen werden in diese Blastozysten mikroinjiziert (unten Mitte). Die injizierten Blastozysten werden in Ammenmütter transferiert. Aus solchen injizierten Blastozysten entwickeln sich chimäre Tiere (unten Mitte). Embryonale Stammzellen und Empfänger-Blastozysten stammen von unterschiedlichen Mausstämmen, die sich u. a. durch ihre Fellfarbe voneinander unterscheiden (schematisch durch die gelbe oder weiße Fell- bzw. Zellfarbe dargestellt). Chimäre Tiere, die sich aus injizierten Blastozysten entwickeln, besitzen deshalb ein geflecktes Fell

(Southern-Blot oder PCR) untersucht, um diejenigen zu identifizieren, die den Targeting-Vektor mittels homologer Rekombination in das Genom integriert haben. Embryonale Stammzellen mit einem durch die oben beschriebenen Techniken veränderten Genom werden in Blastozysten injiziert (> Abb. 2.1.5). Die injizierten Blastozysten werden in Ammenmütter transferiert und entwickeln sich zu chimären Mäusen, die aus zwei Zellpopulationen bestehen: x Nachkommen der Blastozystenzellen und x Nachkommen der veränderten ES-Zellen. Um die beiden Populationen unterscheiden zu können, benutzt man ES-Zellen, die von einem Maustamm mit

beiger Fellfarbe (Agouti) abstammen, und Blastozysten eines Stammes mit schwarzer Fellfarbe (C57/Black6). Die Chimären können dann an ihrer gefleckten Fellfarbe erkannt werden (> Abb. 2.1.5) (Bradley et al. 1984). Tragen veränderte ES-Zellen auch zur Bildung der Keimbahn bei, d. h. entwickeln sich auch Keimzellen aus diesen ES-Zellen, kann das veränderte Gen an die Nachkommen weitergegeben werden (Bradley et al. 1984). Durch Verpaarung von Chimären können deshalb Stämme etabliert werden, die eine Kopie der veränderten DNA in allen Zellen des Körpers tragen. Durch Verpaarung von solchen heterozygoten Tieren können schließlich Tiere mit zwei Kopien der veränderten DNA erzeugt werden. Die Mutation liegt dann im homozygoten Zustand vor.

214

Sektion 2 · Modelle

a

b

. Abb. 2.1.6a–c. Recombineering in E. coli. a Eine Genkassette mit Neomycin-Resistenzgen (neo, rosa) und homologen Bereichen (hellblau, türkis) wird mittels PCR amplifiziert. b Die Genkassette wird in rekombinationskompetente E.-coli-Bakterien eingebracht, die bereits einen BAC mit genomischer DNA aus dem Ziellocus (dunkelblau) enthalten. Die Kassette wird durch homologe Rekombination (rot) in den BAC integriert. c Der modifizierte BAC wird linearisiert und als Targeting-Vektor in ES-Zellen elektroporiert. Hier findet homologe Rekombination zwischen dem BAC und dem endogenen Genlocus statt. Die Genkassette wird in das Genom integriert und zerstört das Leseraster des Zielgens

c

Recombineering von Targeting-Vektoren

Da ein Targeting-Vektor möglichst lange Bereiche homologer DNA enthalten soll, um die Frequenz der homologen Rekombination in den gewünschten Integrationsort zu verbessern, ist seine Klonierung meist kompliziert und zeitaufwendig. Es wurden daher Methoden entwickelt, BAC- („bacterial artificial chromosomes“-)basierte Targeting-Vektoren ohne langwierige Klonierungsschritte direkt in Bakterien zu konstruieren (Murphy 1998; Zhang et al. 1998b). Da diese Systeme auf der homologen Rekombination in Bakterien beruhen, werden sie auch als „recombinational engineering“ oder kurz „recombineering“ bezeichnet (Copeland et al. 2001). Basis der Technik sind Rekombinationssysteme aus bakteriellen Phagen wie RecET (Zhang et al. 1998b) und ORed (Murphy 1998), die in E.-coli-Bakterien exprimiert werden. In diese Bakterien werden BACs eingebracht, die genomische DNA des Mauslocus enthalten, der mutiert werden soll. Mittels PCR wird eine Genkassette mit Resistenzmarkern und anderen funktionellen Elementen wie loxP-Sequenzen amplifiziert, die von kurzen, etwa 50 Basenpaaren langen, Sequenzen flankiert wird, die

homolog zum Mauslocus sind (> Abb. 2.1.6a). Die amplifizierte Kassette wird nun in die Bakterien eingebracht, die bereits den BAC und das Phagen-Rekombinationssystem enthalten. In den Bakterien kommt es dann zu homologer Rekombination zwischen dem BAC und den kurzen homologen Armen der Kassette, so dass die Kassette in den BAC integriert wird (> Abb. 2.1.6b). Bakterien, in denen die Kassette homolog rekombiniert hat, werden identifiziert und vermehrt. Der modifizierte BAC wird isoliert, aufgereinigt und linearisiert und kann dann als Targeting-Vektor für die Elektroporation in murine ES-Zellen verwendet werden. Dort findet homologe Rekombination zwischen dem BAC und dem endogenen Locus statt (> Abb. 2.1.6c). Die Identifizierung positiver ES-Zell-Klone erfolgt wie bei einem herkömmlichen Targting-Vektor. Das Recombineering ermöglicht so, den zeitlichen Aufwand für die Konstruktion eines Targeting-Vektors von mehreren Monaten auf zwei bis drei Wochen zu reduzieren, und verbessert zudem durch längere homologe Sequenzen im Targeting-Vektor die Frequenz der homologen Rekombination in ES Zellen (Testa et al. 2003; Yang u. Seed 2003).

215 2.1 · Tiermodelle in der biomedizinischen Forschung

2.1

Konditionelles Gene-Targeting

Fortgeschrittene transgene Techniken

Durch homologe Rekombination und ES-Zell-Technologie können Genabschnitte deletiert („knock-out“) oder neue Genabschnitte eingebracht werden („knockin“) (Hanks et al. 1995). Es war bisher allerdings nicht möglich, die Mutation im Organismus auf ein bestimmtes Organ oder ein Entwicklungsstadium zu begrenzen. Dies führte im Fall eines embryonal letalen Phänotyps oder schwerer multipler Entwicklungsdefekte dazu, dass adulte oder möglicherweise überlagerte subtile Entwicklungsstörungen nicht analysiert werden konnten. Durch die Entwicklung der konditionellen, durch eine Rekombinase vermittelten Mutagenese konnte diese Einschränkung überwunden werden (> Abb. 2.1.4b) (Gu et al. 1993; Kuhn et al. 1995; Dymecki 1996; Rodriguez et al. 2000). Diese Technologie basiert auf dem Einsatz der DNA-Rekombinasen Cre und Flp. Cre ist ein Enzym aus dem Bakteriophagen P1, Flp entstammt der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Beiden ist gemeinsam, dass sie spezifische Signalsequenzen erkennen und die gesamte DNA zwischen zwei solchen Sequenzen, die in gleicher Orientierung vorliegen müssen, entfernen. Die Erkennungssequenzen für Cre werden als loxP-Sequenzen bezeichnet, die für Flp als FRT-Sequenzen. Werden durch homologe Rekombination loxP- oder FRT-Sequenzen in ein Gen eingebaut, so kann später durch Expression der Rekombinase die DNA zwischen den Erkennungssequenzen aus dem Genom deletiert werden (> Abb. 2.1.4b). Gewebe- oder zelltypspezifische Expression von Cre im Tier vermag somit eine gewebe- oder zelltypspezifische Mutation zu induzieren. Dies erlaubt die Deletion einzelner Gene ebenso wie ganzer Chromosomenabschnitte bzw. interchromosomale Rekombination. Die Kombination von gewebespezifischen Promotoren mit induzierbaren Varianten von Cre oder Flp ermöglicht eine exakte zeitliche und räumliche Kontrolle über die Rekombination (Logie u. Stewart 1995; Kellendonk et al. 1996; Brocard et al. 1997). Die vielfältigen Möglichkeiten der Konditionellen Mutagenese haben eine entsprechende Zahl von murinen Cre-Stämmen hervorgebracht. Darunter sind für die Erforschung von Krankheiten interessante Cre-Transgene wie Myosin Heavy Chain oder Tie2, die im Herzen bzw. in Endothelien exprimiert werden, ZNS-spezifische wie Nex oder CamKII oder das leberspezifische Albumin-Cre-Transgen (Tsien et al. 1996; Kellendonk et al. 2000; Schwab et al. 2000; Theis et al. 2001). Zur Zeit der Niederschrift dieses Kapitels waren über 100 verschiedene Cre-Mausstämme publiziert; einen Überblick bietet die Cre-Transgene Datenbank (http://nagy.mshri. on.ca/cre/).

Die Cre-/loxP-Technik wurde seit ihrer Konzeption beständig weiterentwickelt und modifiziert. So ist es z. B. möglich, beliebige von loxP-Elementen flankierte DNASequenzen gezielt in einen genomischen Locus einzufügen, wenn dort eine einzelne loxP-Sequenz vorhanden ist (Kolb et al. 1999). Modifizierte Erkennungssequenzen, die jeweils nur untereinander rekombinieren, erlauben den Austausch von Genkassetten in einem Locus (Schlake u. Bode 1994; Bouhassira et al. 1997). Die CreRekombinase kann auch dazu benutzt werden, in vivo molekulare „Schalter” zu verwirklichen. Sind die loxPErkennungssequenzen nicht in die gleiche Richtung orientiert, so wird die dazwischen befindliche DNA bei der Rekombination nicht deletiert, sondern invertiert. Auf diese Weise kann z. B. eine zuvor transkriptionell inaktive cDNA unter die Kontrolle eines Promotors gebracht werden (Kano et al. 1998). Eine entwicklungsbiologisch interessante Variante molekularer Schalter sind durch Cre oder Flp aktivierbare Markergene wie lacZ oder Green Fluorescent Protein (GFP). Hier ist eine von loxP- oder FRT-Erkennungssequenzen flankierte Stoppkassette so in das Markergen integriert, dass dieses nicht transkribiert bzw. translatiert wird. Durch Expression der Rekombinase wird die Stoppkassette irreversibel entfernt und das Markergen aktiviert (Akagi et al. 1997; Novak et al. 2000). Zellen, in denen die Rekombinase zu einem beliebigen Zeitpunkt der Entwicklung unter Kontrolle eines spezifischen Promotors exprimiert wurde, bleiben so dauerhaft markiert, ihr weiteres Schicksal kann durch nachfolgende Entwicklungsstadien hindurch verfolgt werden (Dymecki u. Tomasiewicz 1998; Zinyk et al. 1998). Zelltypspezifische lacZ- oder GFP-Reporterlinien sind etablierte Werkzeuge der biomedizinischen Forschung, die besonders in komplexen Geweben wie dem ZNS unverzichtbar sind. Eine besondere Herausforderung hier ist z. B. die Markierung von axonalen Projektionen. Dieses Problem wurde durch Fusionsproteine von β-Galaktosidase bzw. GFP mit dem Tau-Protein elegant gelöst. Tau bindet an axonale Mikrotubuli und gewährleistet damit, dass das Markerprotein entlang des gesamten Axons lokalisiert ist; gewebespezifische Promotoren erlauben die Expression des Fusionsproteins in verschiedenen Neuronentypen (Callahan u. Thomas 1994; Mombaerts et al. 1996; Rodriguez et al. 1999). Eine vollständige Markierung der Neurone wird auch in transgenen Mäusen erzielt, die GFP und verschiedene seiner spektralen Varianten unter Kontrolle von Regulationselementen des Thy-1-Gens exprimieren. Die 25 etablierten Linien zeigen deutliche und spezifische Expression des Markergens in distinkten neuronalen Subtypen (Feng et al. 2000). Übersichtsartikel zum Thema „Zellmarker in vivo” finden sich in

216

Sektion 2 · Modelle

(Hadjantonakis et al. 2003; Misgeld u. Kerschensteiner 2006). Manchmal ist es für die funktionelle Analyse bestimmter Zellpopulationen wünschenswert, die Zellen nicht nur zu markieren, sondern auch zu inaktivieren bzw. zu zerstören. Eine Möglichkeit ist die Expression von Diphtherietoxin A unter der Kontrolle von zelltypspezifischen Promotoren: Das Toxin wird in diesen Zellen exprimiert und tötet sie ab, andere Gewebe werden nicht geschädigt (Breitman et al. 1987; Palmiter et al. 1987). Ein neueres System kombiniert eine konditionell inaktive Form des Diphtherietoxins mit zelltypspezifischer Expression der Cre-Rekombinase: Cre deletiert eine loxP-flankierte Stoppkassette hinter dem Startkodon des Toxins und aktiviert dieses damit (Brockschnieder et al. 2004). Interessant sind auch Systeme, die eine reversible Inaktivierung bestimmter Zelltypen in vivo ermöglichen. Neurone können durch Aktivierung bestimmter G-Protein-gekoppelter Kaliumkanäle reversibel hyperpolarisiert und damit elektrisch inaktiviert werden [Übersicht in (Dascal 1997)]. Der Allatostatin-Rezeptor aus Drosophila kann als G-Protein-gekoppelter Rezeptor diese Kaliumkanäle in Wirbeltieren aktivieren, ohne dabei säugerspezifische Botenstoffe wie Somatostatin zu binden (Birgul et al. 1999). Durch zelltypspezifische Expression des Allatostatin-Rezeptors in Mäusen und Gabe von Allatostatin können so gezielt und reversibel Neurone inaktiviert werden, ohne die Zellen dabei zu zerstören (Gosgnach et al. 2006; Tan et al. 2006). Phänotyporientierte Techniken In einem klassischen genetischen Screen wird versucht, die einem bestimmten Phänotyp zugrunde liegenden mutierten Allele zu identifizieren. Chemische Mutagene wie ENU (Ethyl-Nitroso-Harnstoff) erzeugen zufällige Punktmutationen im Genom und können mit hoher Frequenz mutante Phänotypen hervorbringen (Justice et al. 1999; Hrabe de Angelis et al. 2000; Nolan et al. 2000). Die Identifikation der kausalen Mutation ist jedoch aufwendig, da durch chemische Mutagenese kein molekularer Marker in den Ort der Mutation eingebracht wird. Genau dies lässt sich jedoch mit Techniken der insertionellen Mutagenese erreichen. Gene-Trapping

Gene-Traps sind Vektoren, die für auf dem Phänotyp basierte Screens in ES-Zellen eingesetzt werden. Sie integrieren an zufälligen Stellen in ein Genom und können dadurch Mutationen erzeugen. Es existieren verschiedene Varianten von Trapping-Vektoren: Enhancer-Trap, Promoter-Trap, PolyA-Trap und Gene-Trap (Stanford et al. 2001). Gene-Trap-Vektoren werden am häufigsten genutzt; sie enthalten generell einen Spleißakzeptor, ein

Reportergen wie E-Galaktosidase, ein Antibiotikaresistenzgen und ein Polyadenylierungssignal (> Abb. 2.1.7a). Der Vektor wird durch Elektroporation oder Retroviren in ES-Zellen eingebracht. Inseriert ein Gene-Trap-Vektor in das Intron eines aktiv transkribierten Gens, so kann das Reportergen über den Spleißakzeptor an das endogene Transkript gespleißt werden. Dies bewirkt zum einen die Trunkation des endogenen Transkripts und damit Genprodukts, zum anderen wird das Reportergen nun unter Kontrolle des endogenen Promotors exprimiert und kann in den ES-Zellen nachgewiesen werden (> Abb. 2.1.7a). Da die Sequenz des Gene-TrapVektors bekannt ist, kann durch RACE („rapid amplification of cDNA ends“) die Identität des Gens, in das der Vektor integriert hat, leicht festgestellt werden. Mit dieser Technik können allerdings effizient nur Gene mutiert werden, die in undifferenzierten ES-Zellen tatsächlich exprimiert werden. Eine weitere Einschränkung ist, dass Gene mit vielen Introns häufiger mutiert werden als Gene mit wenigen oder keinen Introns, und dass manche Loci im Genom bevorzugt Trapping-Vektoren integrieren. Retrovirale Vektoren integrieren bevorzugt in die 5‘-Region transkriptionell aktiver Gene (Bushman 2002). Um das gesamte Genom mit Mutationen möglichst vollständig abzudecken, müssen daher verschiedene Varianten von Trapping-Vektoren eingesetzt werden. Zurzeit verfolgen die Firma Lexicon Genetics und das Internationale Gene Trap Consortium (IGTC) das Ziel, Banken von murinen ES-Zellen zu generieren, die in jedem bekannten Gen des Mausgenoms einen GeneTrap-Vektor integriert haben (Zambrowicz et al. 1998; Skarnes et al. 2004). Transposons

DNA-Transposons sind mobile genetische Elemente, die aus ihrem Integrationsort im Genom ausgeschnitten und an einer anderen Stelle wieder in das Genom integriert werden können. Durch Insertion eines Transposons in das Leseraster eines Gens kann somit die Funktion dieses Gens zerstört werden. Damit bieten sich Transposons als Werkzeug für auf dem Phänotyp basierte genetische Screens an. Mit Erfolg wurden diese Systeme z. B. bereits in C. elegans und Drosophila eingesetzt (Zwaal et al. 1993; Spradling et al. 1995). Transposon-basierte Mutagenese in der Maus stellt eine relativ neue Entwicklung dar. Da die Maus keine aktiven endogenen Transposons besitzt, wurden Systeme aus anderen Organismen wie Drosophila und C. elegans getestet (Schouten et al. 1998; Zhang et al. 1998a; Zagoraiou et al. 2001; Drabek et al. 2003). Das am weitesten entwickelte System ist „Sleeping Beauty“ aus Zebrafisch. Sleeping Beauty wurde durch Mutagenese aus inaktiven Genen der Tc1-/Marriner-Transposase gene-

217 2.1 · Tiermodelle in der biomedizinischen Forschung a

b

2.1

Das Transposon kann nun an jeder Stelle des Genoms wieder integriert werden, die das Dinukleotid TA aufweist (> Abb. 2.1.7b). Häufig erfolgt die Reintegration in der Nachbarschaft der ursprünglichen Integrationsstelle, ein Phänomen, das als „local hopping“ bezeichnet wird (Horie et al. 2003). Erfolgen viele Exzisions- und Reintegrationsvorgänge hintereinander, dann werden sich im betroffenen genomischen Locus aufgrund der beschriebenen Einfügung von Nukleotiden Mutationen anhäufen. Man kann dies ausnutzen, um einen gegebenen Genlocus ohne großen experimentellen Aufwand mit Mutationen zu sättigen. Das Sleeping-Beauty-System kann in ES-Zellen, befruchteten Eizellen und somatischen Zellen der Maus eingesetzt werden (Luo et al. 1998; Dupuy et al. 2002; Yant et al. 2000). Werden Markergene und funktionelle Elemente in das Transposon integriert, dann kann das System wie Gene-Trap-Vektoren für groß angelegte phänotypbasierte genetische Screens verwendet werden (Izsvak u. Ivics 2005; Keng et al. 2005).

2.1.2.3 Klonierung durch Kerntransfer

. Abb. 2.1.7a,b. Gene-Traps und Transposons. aI Ein Gene-TrapVektor mit Reportergen und Selektionsmarker (lacZneo, blau), SpleißAkzeptor (SA, grün), und Polyadenylierungssignal (pA, violett). Bei Transkription des Gens wird Exon I an Exon II gespleißt. aII Der Vektor hat zwischen den Exons inseriert. Exon I wird nun an den Gene-TrapVektor gespleißt und die mRNA damit trunkiert. bI Die Transposase „Sleeping Beauty“ (SB) schneidet ein von gegenorientierten Repeats (schwarze Dreiecke) flankiertes Transposon (blau) aus einem genomischen Locus; dabei werden einige zusätzliche Basenpaare eingefügt (rot). bII Die Transposase integriert das Transposon in einen neuen genomischen Locus

riert (Ivics et al. 1997). Das System besteht aus zwei Komponenten: der Transposase Sleeping Beauty und einem Transposon, einem kurzen Stück DNA, das von zwei entgegengesetzt orientierten Erkennungssequenzen flankiert wird (> Abb. 2.1.7b). Die Transposase schneidet das Transposon aus dem initialen Integrationsort aus und fügt an der Stelle drei zusätzliche Basenpaare ein.

Bei der Klonierung durch Kerntransfer wird der Kern einer Zelle in eine unbefruchtete Eizelle, deren eigener Kern zuvor entfernt wurde, überführt. Dies geschieht entweder durch direkte Injektion des Spenderkerns in die entkernte Empfängereizelle oder durch Fusion der entkernten Empfängereizelle mit der Spenderzelle (Campbell et al. 1996; Wakayama u. Yanagimachi 1999). Nach Stimulation der Eizelle, welche die Befruchtung durch ein Spermium simuliert, setzt mit den ersten Zellteilungen die frühe Embryonalentwicklung ein. Wenn der frühe Embryo in eine Ammenmutter überführt wird, kann er sich in die Plazenta einnisten und sich zu einem vollständigen Organismus entwickeln. Die Erbinformation dieses Organismus ist identisch mit der des Kernspenders. Der Vorgang kann beliebig oft und über mehrere Generationen klonierter Organismen wiederholt werden. Alle auf diesem Wege entstandenen Nachkommen sind damit klonalen Ursprungs (Wakayama u. Yanagimachi 1999). Klonierungen von Säugetieren (Schafe, Rinder, Kaninchen, Mäuse) wurden erstmals Mitte der 1980er Jahre erfolgreich durchgeführt (Willadsen 1986; Prather et al. 1987; Tsunoda et al. 1987; Collas u. Robl 1990). Bei diesen Experimenten wurden Zellen als Kernspender verwendet, die aus sehr jungen Embryonen vor der Implantation stammten. Erst 1997 wurde das erste Schaf (Dolly) aus einer adulten, differenzierten Euterzelle kloniert (Wilmut et al. 1997). Bei allen Fortschritten bei der Klonierung durch Kerntransfer muss jedoch kritisch angemerkt werden,

218

Sektion 2 · Modelle

dass die Effizienz von Klonierungsexperimenten immer noch sehr niedrig ist und die klonierten Tiere vor allem bei Experimenten mit Kerntransfer aus adulten, differenzierten Geweben häufig an teilweise gravierenden gesundheitlichen Störungen leiden (Rhind et al. 2003).

2.1.2.4 Internationale Konsortien Die Maus ist ein wichtiger Modellorganismus für die Erforschung menschlicher Physiologie und Pathologie. In den letzten Jahren wurden Anstrengungen unternommen, die Erzeugung von Mutanten und Mausmodellen zu fördern und international zu koordinieren. Ziel ist es, eine Nullmutation für jedes Gen der Maus zu generieren, zu charakterisieren und der wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung zu stellen. Die wichtigsten Konsortien sind hier kurz aufgeführt: IMMC: International Mouse Mutant Consortium Bemüht sich, öffentliche und private Ressourcen zusammenzuführen, um Mutanten für jedes Mausgen herzustellen, und Gene von hohem biomedizinischem Interesse zu charakterisieren. Setzt sich zudem für standardisierte Verfahren zur Identifizierung und Analyse von Phänotypen ein (Nadeau et al. 2001). EMMC: European Mouse Mutagenesis Consortium Strebt die Herstellung einer ES-Zellbank von konditionellen und Nullmutanten für alle Mausgene an (Auwerx et al. 2004). KOMP: Knock-out Mouse Project Herstellung einer genomweiten ES-Zellbank von Nullmutanten durch gezielte und randomisierte insertionelle Mutagenese (Austin et al. 2004). Webseite: www.nih.gov/science/models/mouse/knockout/index.html IGTC: International Gene Trap Consortium Koordiniert Bemühungen, eine ES Zellbank mit Mutanten für jedes Mausgen mittels Gene-Trapping zu erzeugen und zur Verfügung zu stellen (Skarnes et al. 2004). Webseite: www.genetrap.org CTC : Complex Traits Consortium Bietet eine Plattform für Forschungsvorhaben, die sich der Analyse komplexer polygener Phänotypen und Erkrankungen widmen. Webseite: www.complextrait.org Neuromice: Eine Initiative zweier amerikanischer Mutageneseprojekte und des Jackson Laboratory, um Mauslinien mit

neuronalen und Verhaltensphänotypen zu generieren, zu charakterisieren und der wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung zu stellen. Webseite: www.neuromice.org

2.1.3 Beispiele genetisch veränderter Tiermodelle in der biomedizinischen Forschung Genetisch veränderte Tiermodelle, d. h. transgene und Knockout-Mäuse, aber auch Mäuse mit spontanen Mutationen sind in allen Bereichen der biomedizinischen Forschung zu einem unverzichtbaren Bestandteil geworden. Eine ausführliche Darstellung würde angesichts der rasanten Entwicklung den Rahmen dieses Beitrags sprengen. Dieses Kapitel beschränkt sich auf ausgewählte Beispiele aus den Bereichen Entwicklung, Krebs, Stoffwechsel und ZNS.

2.1.3.1 Entwicklung und Krebs Der Wnt-Signalweg Wnt und Krebs. Kolorektale Karzinome stellen die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache in westlichen Industrieländern dar. Sie gehören außerdem zu den am besten molekulargenetisch untersuchten Krebsarten. Bevor aus einer normalen Darmepithelzelle eine maligne Kolonkarzinomzelle entsteht, kommt es zur schrittweisen Akkumulation somatischer Mutationen in mehreren Onkogenen und Tumorsuppressorgenen (Vogelstein u. Kinzler 1993). Viele der kausal beteiligten Gene sind heute identifiziert. Die am frühesten auftretenden Mutationen betreffen Schlüsselkomponenten des WntSignalwegs: APC, E-Catenin, und Axin2. Daneben spielen weitere Gene, wie z. B. p53, smad4, oder K-ras eine wichtige Rolle bei der Tumorprogression (Vogelstein u. Kinzler 2004). In etwa 85% aller sporadischen Kolonkarzinome des Menschen werden Mutationen des APCGens gefunden. Unter den restlichen Fällen treten E-Catenin- (10%), oder Axin2-Mutationen (< 5%) auf. Zur Entdeckung von APC hat das Auftreten von Keimbahnmutationen dieses Gens wesentlich beigetragen: Bei der autosomal-dominanten Familiären Adenomatosis polyposis coli (FAP) liegt eine erbliche Mutation im APC-Gen vor. In betroffenen Familien wird eine Kopie des mutierten APC-Gens vererbt (Groden et al. 1991; Kinzler et al. 1991). Durch Spontanmutation der zweiten, intakten Kopie („loss of heterozygosity“) kommt es bei den betroffenen Patienten zum Auftreten tausender, zunächst gutartiger Polypen (sog. Adenomen) im Dickdarm. Werden diese nicht rechtzeitig erkannt und entfernt, entwickeln sie sich zu bösartigen Adenokarzino-

219 2.1 · Tiermodelle in der biomedizinischen Forschung

men. Loss of heterozygosity ist ein typisches Merkmal für Mutationen in Tumorsuppressorgenen (Weinberg 1991). Dieser sog. Second-hit-Mechanismus wurde bereits 1971 von Knudson für familiäre Tumorerkrankungen postuliert (Knudson 1971). Loss of heterozygosity im APC-Locus wird jedoch auch bei sporadischen kolorektalen Tumoren beobachtet (Rowan et al. 2000). Mausmodelle haben wesentlich zur Aufklärung der Funktionen von APC beigetragen. So wurde eine Spontanmutation in der Maus beobachtet, die mit sehr hoher Frequenz Darmtumore induziert („multiple intestinal neoplasia“, Min) (Moser et al. 1990). Der Phänotyp wird autosomal-dominant vererbt, zeigt also den gleichen Erbgang wie FAP beim Menschen. Allerdings ist die Verteilung der Tumore bei der Maus und beim Menschen unterschiedlich. Während bei der FAP Tumore bevorzugt im Dickdarm auftreten (in ca. 50% treten allerdings auch Adenome in Magen und Duodenum auf), sind diese bei der Min-Maus vor allem im Dünndarm lokalisiert. In beiden Spezies liegt eine Mutation des APCGens vor (Su et al. 1992). Untersuchungen an der MinMaus haben u. a. geholfen, genetische Faktoren, wie z. B. das mom-1-Gen („modifier of min 1“), zu identifizieren, die Entstehung und Verlauf kolorektaler Karzinome modifizieren (Dietrich et al. 1993; MacPhee et al. 1995). Mäuse mit gezielter Mutation des APC-Gens durch homologe Rekombination in ES-Zellen zeigen den gleichen Phänotyp wie Min-Mäuse und konnten die zentrale Bedeutung dieses Gens bei der Karzinogenese belegen (Fodde et al. 1994; Ito et al. 1995). Interessanterweise wurden auch in kolorektalen Karzinomen der Ratte, die nach Behandlung mit verschiedenen Karzinogenen auftraten, gehäuft Mutationen des APC-Gens beobachtet (Kakiuchi et al. 1995). Grundlegend für das Verständnis der molekularen Funktionen von APC bei der Tumorentstehung war die Beobachtung, dass APC, E-Catenin und Axin/Axin2 zentrale Komponenten des Wnt-Signalwegs darstellen. Mutationen in diesen Genen führen zur konstitutiven Aktivierung des Wnt-Signalwegs (Polakis 2000; Logan u. Nusse 2004; Gregorieff u. Clevers 2005). Wnt-Proteine (sprich: Wint, der Name ist abgeleitet von int-1, dem ersten in der Maus entdeckten Wnt-Gen und seinem Drosophilahomolog wingless) bilden eine Familie von Signalmolekülen, die sowohl während der Embryonalentwicklung als auch im adulten Organismus exprimiert werden (einen ausgezeichneten Überblick zum Thema Wnt gibt die Wnt-Homepage: http://www. stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html). Gegenwärtig sind 19 Mitglieder der Wnt-Familie bekannt. Zu ihren Funktionen gehören grundlegende entwicklungsbiologische Vorgänge wie die Kontrolle von Zellproliferation und -determination und die Steuerung von Muster- und Achsenbildung (Logan u. Nusse 2004). Einzelne Wnts

2.1

besitzen außerdem protoonkogene Eigenschaften: Wnt-1 wurde in der Maus primär in aktivierter Form nach Integration von MMTV in Tumoren der Brustdrüse entdeckt (Nusse u. Varmus 1982). Historisch betrachtet basiert ein Großteil unserer Kenntnisse des Wnt-Signalwegs auf genetischen Untersuchungen an verschiedenen Tiermodellen, v. a. Drosophila und Maus (Wodarz u. Nusse 1998; Logan u. Nusse 2004). Dies war zum Teil durch die unerwarteten biochemischen Eigenschaften von Wnt-Proteinen – ihre ausgeprägte Hydrophobizität – bedingt, die ihre Isolierung und biochemische Charakterisierung lange Zeit erschwerten (Nusse 2005). Wnts übertragen ihr Signal durch Interaktion mit transmembranären Frizzled-Rezeptoren und einem Mitglied der LDL-Rezeptor-Familie, LRP, auf Zielzellen (Bhanot et al. 1996). Dies führt durch die Hemmung seines Abbaus zur Stabilisierung von zytoplasmatischem E-Catenin und zu seiner Translokation in den Zellkern. Dort bindet E-Catenin an Transkriptionsfaktoren der LEF-1-/TCF-Familie. E-Catenin-/TCF-Komplexe aktivieren die Transkription spezifischer Zielgene wie z. B. Zyklin D1 und c-myc (Tetsu u. McCormick 1999). Dieser Signalweg wird als E-Catenin-abhängiger oder kanonischer Wnt-Signalweg bezeichnet. Wnts können außerdem unabhängig von E-Catenin/TCF zelluläre Antworten auslösen. Dieser alternative Signalmodus wird als E-Catenin-unabhängiger oder nichtkanonischer WntSignalweg bezeichnet. In jüngeren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass über den nichtkanonischen Signalweg Wnts u. a. Veränderungen des Zytoskeletts induzieren, Ca2+-abhängige Signalwege und Zellpolarität steuern (Veeman et al. 2003). Kernelement des kanonischen Wnt-Signalwegs ist E-Catenin. In Abwesenheit von Wnt ist E-Catenin an APC und Axin/Axin2 gebunden. Dies ist die Voraussetzung für seine Phosphorylierung durch Caseinkinase I und die Serin-/Threonin-Kinase GSK3E (Glykogensynthase-Kinase 3E). Phoshoryliertes E-Catenin wird von der Ubiquitinylierungsmaschinerie der Zelle erkannt und in Proteosomen degradiert (Logan u. Nusse 2004). Eine effektive Phoshorylierung und damit die Degradierung von E-Catenin in der Zelle findet nur statt, wenn E-Catenin in einem Multiproteinkomplex mit APC und Axin/Axin2 vorliegt (Polakis 1999; Polakis 2000). Durch welche molekularen Mechanismen Wnt-Signale diesen Prozess unterbrechen, ist gegenwärtig nicht vollständig klar. Jüngere Untersuchungen zeigen, dass Wnts die zytoplasmatische Phosphorylierung von LRP induzieren, wodurch Axin an LRP binden kann. Dadurch wird möglicherweise Axin aus dem Degradationskomplex entzogen und E-Catenin stabilisiert (Tamai et al. 2004). Die Bedeutung von APC für die Degradation von E-Catenin konnte in Tumorgeweben nachgewiesen wer-

220

Sektion 2 · Modelle

den. So korreliert in Kolontumoren das Auftreten von APC-Mutationen mit erhöhten zytoplasmatischen E-Catenin-Spiegeln und verstärkter Transkription E-Catenin-abhängiger Gene. Durch Transfektion mit Wildtyp-APC können die erhöhten E-Catenin-Spiegel gesenkt werden. In Kolonkarzinomen ohne APC-Mutation finden sich Mutationen im E-Catenin-Gen. Interessanterweise handelt es sich dabei um Veränderungen von Serin- und Threoninresten, die von GSK3E phosphoryliert werden und essenziell sind für den Abbau von E-Catenin – eine Beobachtung, die im Mausmodell eindrucksvoll bestätigt werden konnte: Durch die Cre-/ loxP-vermittelte konditionelle Deletion jener Molekülbereiche von E-Catenin, die für dessen Abbau kritisch sind, kann die Expression von stabilisiertem E-Catenin spezifisch im Darmepithel induziert werden. Solche Mutanten entwickeln eine intestinale Polypose (Harada et al. 1999). Darüber hinaus entwickeln Mäuse, in denen konstitutiv aktives E-Catenin als Transgen spezifisch in der Haut exprimiert wurde, Tumoren der Haarfollikel (Gat et al. 1998). Beide Beobachtungen zeigen, dass APC über die Kontrolle von E-Catenin als Tumorsuppressor agieren kann (Polakis 1999; Polakis 2000). Nahezu alle Mutationen des APC-Gens, die in Tumoren beobachtet werden, führen zum Verlust der Axinbindungsaktivität, wobei die Bindung an E-Catenin häufig erhalten bleibt (Polakis 2000). Werden Zellen, die eine derartige APC-Mutation tragen, mit einem trunkierten APC-Gen transfiziert, das lediglich für die Bindungsstellen von E-Catenin und Axin kodiert, so kann hierdurch die E-Catenin Konzentration gesenkt werden. Auch in einem transgenen Mausmodell konnte gezeigt werden, dass das Vorhandensein einer einzigen Axinbindungsstelle sowie der E-Catenin-Bindungsstellen ausreicht, um in den mutanten Tieren das Auftreten von Tumoren zu verhindern (Smits et al. 1999). Wird jedoch die Axinbindungsstelle deletiert, so ist in den betreffenden Zellen die Regulation des E-Catenin-Spiegels gestört. Die Bindung an Axin ist daher offensichtlich essenziell für die Funktion von APC als Tumorsuppressor. Wird in Kolonkarzinomzellen, die durch eine APC-Mutation die Fähigkeit zur Kontrolle des E-Catenin-Abbaus verloren haben, Axin überexprimiert, so kann dadurch der E-Catenin-Spiegel supprimiert werden (Polakis 1999, 2000). Wnt und Stammzellen. Die gesunde Darmschleimhaut besteht bei Menschen wie bei Mäusen aus fingerförmigen Einsenkungen (Krypten) und Ausstülpungen (Villi), wobei letztere nur im Dünndarm vorkommen. Während ihres Lebenszyklus werden Schleimhautepithelien kontinuierlich in einem stark proliferierenden Progenitorzellkompartiment, das an der Kryptenbasis lokalisiert ist, gebildet. Differenzierende Epithelzellen

wandern nach ihrer Bildung an der Kryptenbasis zur Kryptenoberfläche oder zur Villusspitze, wo sie am Ende ihres Lebenszyklus in das Darmlumen abgestoßen werden. Genetische Untersuchungen in der Maus haben gezeigt, dass Wnt-Signale eine zentrale Steuerungsfunktion auch bei diesem physiologischen Prozess ausüben. E-Catenin-/TCF4-Komplexe sind die vorherrschenden nukleären Effektoren kanonischer Wnt-Signale im Darm. Mäuse mit einer Nullmutation des TCF4-Gens entwickeln einen vollständigen Verlust des in den Schleimhautkrypten lokalisierten Progenitorzellkompartiments. Wird außerdem der Wnt-Rezeptor-Komplex durch transgene Expression eines extrazellulären Inhibitors, Dickkopf-1, blockiert, kommt es zum vollständigen Verlust von Krypten in den betroffenen Mäusen (Korinek et al. 1998; Pinto et al. 2003; Kuhnert et al. 2004). Beide Beobachtungen zeigen, dass kanonische Wnt-Signale essenziell für Aufrechterhaltung der Homöostase des intestinalen Epithels sind. In einem sehr eleganten genetischen Experiment konnte die Arbeitsgruppe von Hans Clevers nachweisen, dass sowohl in kolorektalen Karzinomzellen als auch in Progenitorund Stammzellen des gesunden Darmepithels durch E-Catenin/TCF4 identische genetische Programme gesteuert werden (van de Wetering et al. 2002). In kolorektalen Adenomen mit APC-Mutation und konstitutiver Aktivierung des Wnt-Signalwegs liegt also eine pathologische Fortsetzung des physiologischen Progenitorzellstatus gesunder Darmepithelzellen mit gestörter Proliferations- und Differenzierungssphase vor. Dies könnte die Akkumulation weiterer Mutationen und damit die Tumorprogression dieser Zellen begünstigen (Reya u. Clevers 2005). Eine wachsende Zahl genetischer Untersuchungen, vor allem in der Maus, deutet auf eine duale Funktion von Wnt-Signalen in der normalen Biologie von Stammzellen verschiedener Gewebe und deren maligner Entartung hin. Diese Beobachtungen haben zu einem erweiterten Bild der Tumorentstehung als einer Stammzellerkrankung beigetragen (Reya et al. 2001; Reya u. Clevers 2005). Das Neuregulin-/erbB-Signalsystem Neureguline (NRG) sind Signalproteine, die sowohl während der Embryogenese als auch im adulten Organismus Zell-Zell-Interaktionen im Nervensystem, im Herzen und in anderen Organen vermitteln (> Tab 2.1.1). NRG binden an transmembranäre Tyrosinkinaserezeptoren der erbB-Familie. Über die Aktivierung intrazellulärer Signalwege werden zelluläre Antworten wie z. B. Proliferation, Survival, Migration oder Differenzierung durch NRG-Signale ausgelöst (Adlkofer u. Lai 2000; Garratt et al. 2000a; Buonanno u. Fischbach 2001; Yarden u. Sliwkowski 2001; Citri et al. 2003; Falls 2003).

2.1

221 2.1 · Tiermodelle in der biomedizinischen Forschung

. Tab. 2.1.1. Beispiele biologischer Funktionen des Neuregulin-1-/erbB-Signalsystems Funktion

in vivo

in vitro

Schwann-Zellen

Migration, Überleben, Proliferation, von Schwann-Zell-Vorläufern Differenzierung, Myelinisierung von Schwann-Zellen

9 9

9 9

Sympathische Neurone

Migration sympathogener Neuralleistenzellen

9

Nebennierenmark

Migration von Vorläuferzellen zur Nebennierenanlage

9

Muskelspindeln

Induktion, Differenzierung von Muskelspindeln

9

ENS

Postnatales Überleben enterischer Neurone und Gliaa

9

Sensorische/Motoneurone

Überleben von Neuronen, Faszikulation peripherer Nervena

9

Kraniale Ganglien

Besiedlung von Ganglienanlagen durch Neuralleistenzellen

9

NME

Synthese und Clustering von Acetylcholinrezeptoren

(‡)b

9

Oligodendrozyten

Proliferation, Überleben, Differenzierung, Myelinisierung

‡

9

Zerebelläre Körnerzellen

Migration entlang radialer Glia

Kortikale Interneurone

Migration

9

Neuronale Vorläuferzellen

Neuroblastenmigration

9

Hippocampale Neurone

Inhibition von LTP

9

Versch. Neuronentypen

Steuerung von Synthese und Funktion von GABA-, NMDA-Rezeptoren

9

Herz

Trabekulation des embryonalen Myokards Herzklappenentwicklung Entwicklung des Reizleitungssystems Aufrechterhaltung der adulten Herzfunktion Kardiotoxizität von Zytostatika

9 9 9 9

9

Epitheliale Proliferation, tubuloalveoläre Differenzierung während Schwangerschaft und Laktation

9

9

Organ PNS

ZNS

9

9

Brustdrüse

Abkürzungen: PNS, Peripheres Nervensystem; ZNS, Zentrales Nervensystem; ENS, Enterisches Nervensystem; LTP,„longterm potentiation“; NME, Neuromuskuläre Endplatte; in vivo, in vitro, experimentelle Beobachtung basiert auf In-vivo-, bzw. In-vitro-Untersuchungen. ‡, Funktion in diesem Typ von Untersuchung nicht beobachtet. Referenzen zu den gen. Funktionen sind im Text aufgeführt. a indirekte Funktion des NRG1-/erbB-Systems; b Entwicklungsdefekte im Bereich neuromuskulärer Synapsen, wie sie in NRG1-/ erbB2-/erbB3-Mutanten beobachtet wurden, sind wahrscheinlich indirekt und beruhen auf dem Fehlen terminaler Schwann-Zellen.

NRG wurden ursprünglich unabhängig voneinander als Faktoren beschrieben und später kloniert, die 1. erbB2 aktivieren (Holmes et al. 1992; Wen et al. 1992; Peles et al. 1993), 2. Gliazell-Proliferation (Raff et al. 1978; Brockes et al. 1980; Lemke u. Brockes 1984; Goodearl et al. 1993; Marchionni et al. 1993), oder 3. die Bildung von Acetylcholinrezeptoren in Muskelzellen induzieren (Jessell et al. 1979; Falls et al. 1993).

Bei allen isolierten Proteinen handelte es sich um unterschiedliche Isoformen, die vom NRG–1 Gen synthetisiert werden (Falls 2003). NRG sind durch eine EGF-ähnliche extrazelluläre Domäne gekennzeichnet. Sie genügt für die Rezeptorbindung und -entfaltung der biologischen Aktivität von NRG. Durch alternatives Spleißen können unterschiedliche Varianten (D und E) der EGF-Domäne, die sich in ihrer Rezeptoraffinität unterscheiden, gebildet werden. Durch den Gebrauch unterschiedlicher Promotoren ent-

222

Sektion 2 · Modelle

stehen außerdem unterschiedliche Isoformen des NRG-1-Gens, Typ I („neu differentiation factor“, NDF; heregulin, HRG; „acetylcholine receptor inducing activity“, ARIA), Typ II („glial growth factor“, GGF) und Typ III („sensory and motor neuron-derived factor“, SMDF; „cysteine-rich domain neuregulin-1“, CRDNRG-1). Typ I–III-Isoformen unterscheiden sich durch ihre extrazelluläre Struktur, N-terminal von der EGFDomäne. So besitzen Typ I und II eine immunglobulinähnliche extrazelluläre Domäne, Typ I zusätzlich eine stark glykosylierte Domäne. Ausschließlich Typ III NRG-1 besitzt eine cysteinreiche Domäne (CRD) mit interner hydrophober Sequenz, die transmembranär lokalisiert ist und eine haarnadelförmige Anordnung der Typ-III-Isoform in der Zellmembran bedingt. NRG-1Isoformen werden als primär sezernierte oder transmembranäre Liganden gebildet. Membranassoziierte Formen können außerdem sekundär proteolytisch gespalten und Teile des Liganden extra- bzw. intrazellulär freigesetzt werden. In einer aktuellen Studie wurde jüngst in vitro beobachtet, dass die Interaktion der extrazellulären Domäne von Type-III-NRG-1 mit erbB-Rezeptoren nicht nur ein anterogrades Signal („forwardsignaling“) auf die Zielzelle vermittelt, sondern außerdem ein retrogrades Signal („back-signaling“) induziert, indem es als Folge der Rezeptorbindung zur proteolytischen Abspaltung der intrazytoplasmatischen Domäne des Liganden kommt. Diese transloziert in den Zellkern und reprimiert dort apoptoseinduzierende Gene (Bao et al. 2003). Die einzelnen Isoformen des NRG-1-Gens unterscheiden sich ebenfalls durch ihr räumlich-zeitliches Expressionsmuster im jeweiligen Organismus: Type-INRG-1 wird vor allem während der frühen Embryogenese exprimiert, Type II findet sich vor allem im ZNS während der späten Embryogenese sowie postnatal, Type III ist neben dem ZNS vor allem in Axonen sensorischer und motorischer Neurone exprimiert (Meyer u. Birchmeier 1994; Meyer et al. 1997). In letzter Zeit wurden weitere NRG identifiziert, NRG-2, -3, -4, die von unterschiedlichen Genen kodiert werden und sich in ihrer Expression von NRG-1 unterscheiden (Busfield et al. 1997; Carraway et al. 1997; Higashiyama et al. 1997; Zhang et al. 1997). So ist beispielsweise NRG-4 im adulten Pankreas und Skelettmuskel, jedoch nicht im Nervensystem, exprimiert (Harari et al. 1999). NRG–4 Signale scheinen hier die Differenzierung von Somatostatin produzierenden Zellen im endokrinen Pankreas zu steuern (Huotari et al. 2002). NRG übertragen ihre Signale mithilfe von erbB-Rezeptoren auf Zielzellen. Die Familie der erbB-Tyrosinkinaserezeptoren umfasst vier Mitglieder, den EGF-Rezeptor (erbB1, HER1), erbB2 (HER2, Neu), erbB3 (HER3) und erbB4 (HER4). Alle erbB-Rezeptoren besit-

zen einen einheitlichen Aufbau, der aus einer extrazellulären Ligandenbindungsdomäne, einer einfachen, transmembranären Domäne und einer zytoplasmatischen Tyrosinkinasedomäne besteht. Die Bindung eines spezifischen Liganden führt zur Homo- (z. B. erbB1/erbB1) oder Heterodimerisierung (z. B. erbB2/erbB3) von erbBRezeptoren. In der Folge kommt es zur Tyrosinkinaseaktivierung und zur Phosphorylierung von Tyrosinresten der zytoplasmatischen Domäne, die als Bindungsstellen für intrazelluläre Signalübertragungsmoleküle wie z. B. grb2, grb7, PLCJ, shc oder p85 dienen (Schlessinger 2000; Buonanno u. Fischbach 2001; Yarden u. Sliwkowski 2001; Citri et al. 2003; Falls 2003). Eine Sonderstellung unter den erbB-Rezeptoren nimmt erbB2 ein: Trotz intensiver Suche wurde bisher kein Faktor identifiziert, der direkt an diesen Rezeptor bindet und die tyrosinspezifische Phosphorylierung von erbB2 induziert. Verschiedene Liganden können jedoch indirekt die Phoshorylierung von erbB2, d. h. die erbB2vermittelte Signalübertragung, auslösen. So bindet z. B. Neuregulin-1 mit hoher Affinität direkt an erbB3 und erbB4 (Plowman et al. 1993; Carraway et al. 1994; Tzahar et al. 1994). Dies induziert die schnelle tyrosinspezifische Phosphorylierung von erbB2 in Zellen, die erbB3 oder erbB4 koexprimieren (Peles et al. 1993; Carraway et al. 1994; Sliwkowski et al. 1994; Wallasch et al. 1995). Ähnliches wird bei Liganden des EGF-Rezeptors beobachtet, die zwar direkt an den EGF-Rezeptor, jedoch nicht an den erbB2-Rezeptor binden, aber Phosphorylierung von erbB2 induzieren, wenn beide Rezeptoren in der gleichen Zelle koexprimiert werden (King et al. 1988). Diese In-vitro-Beobachtungen deuteten schon früh auf eine zentrale Rolle von erbB2 als Korezeptor in der Übertragung von Signalen hin, die durch die direkte Bindung eines spezifischen Liganden an EGF-, erbB3- oder erbB4-Rezeptoren ausgelöst werden. Entwicklungsbiologische Funktionen. Wesentlich für das Verständnis der entwicklungsbiologischen Funktionen des NRG1-/erbB-Signalsystems war die Analyse von Mäusen mit gezielten Mutationen (Knockout-Mäuse) in den einzelnen Rezeptor- und Liganden-Genen (Adlkofer u. Lai 2000; Garratt et al. 2000a; Olayioye et al. 2000; Buonanno u. Fischbach 2001; Yarden u. Sliwkowski 2001; Garratt et al. 2003). Diese Arbeiten haben gezeigt, dass NRG-1-/erbB-Signale essenzielle Funktionen bei der Steuerung der Entwicklung des peripheren Nervensystems (PNS), des Herzens und der Brustdrüse übernehmen (> Tab. 2.1.2). Die genetische Analyse in der Maus konnte belegen, dass funktionelle NRG-1 Rezeptoren in vivo Heterodimere sind, wobei während der Embryogenese NRG-1-Signale im PNS durch erbB2/ erbB3, im Herz durch erbB2-/erbB4-Heterodimere übertragen werden (> Tab. 2.1.2).

223 2.1 · Tiermodelle in der biomedizinischen Forschung

2.1

. Tab. 2.1.2. Knockout-Mausmutanten des Neuregulin-1-/erbB-Signalsystems Mausmutante

Art der Mutation

Entwicklungsdefekte

Literatur

Herz

PNS

Brustdrüse

Letalitätszeitpunkt/ -ursache

n. a.

E10.5 (Herz)

(Meyer u. Birchmeier 1995; Erickson et al. 1997)

n. a.

Geburt (PNS)

(Wolpowitz et al. 2000)

Liganden NRG1−/−

Typ I–III-Isoformen

+

+

CRD-NRG1−/−

Typ-III-Isoform

normal

+

Ig-NRG1−/−

a

Typ-I- und -II-Isoform

+

normal

n. a.

E10.5 (Herz)

(Kramer et al. 1996)

CT-NRG1−/−

zytoplasmatischer Teil, Typ I (II, III?)

+

n. u.

n. a.

E10.5 (Herz)

(Liu et al. 1998)

NRG1α−/−

α-Isoform der EFG-Domäne

normal

normal

+

normale Lebenserwartung

(Li et al. 2002)

NRG1flox/flox

konditionell, NRG1

abhängig von Cre-Aktivitätc

erbB2−/−

erbB2

+

+

n. a.

E10.5 (Herz)

(Lee et al. 1995; Erickson et al. 1997; Britsch et al. 1998)

erbB3−/−

erbB3

normalb

+

n. a.

Geburt (PNS)

(Erickson et al. 1997; Riethmacher et al. 1997)

erbB4−/−

erbB4

+

normal

n. a.

E10.5 (Herz)

(Gassmann et al. 1995)

erbB2−/−R

erbB2 in allen Geweben, außer Herz

normal

+

n. a.

Geburt (PNS)

(Morris et al. 1999; Woldeyesus et al. 1999)

erbB4−/−R

erbB4 in allen Geweben, außer Herz

normal

normal

+

normale Lebenserwartung

(Tidcombe et al. 2003)

erbB2flox/flox

konditionell, erbB2

abhängig von Cre-Aktivität c

erbB4flox/flox

konditionell, erbB4

abhängig von Cre-Aktivität c

Rezeptoren

Abkürzungen: n. a., nicht analysierbar aufgrund der vorzeitigen Letalität mutanter Mäuse; n. u., nicht untersucht; +, Entwicklungsdefekt in der jeweiligen Mausmutante beobachtet. a ausgenommen die Entwicklung von Muskelspindeln. b Die Trabekulierung des Herzmuskels verläuft normal in erbB3−/−-Mäusen, Defekte der Herzklappenentwicklung wurden in einer einzelnen Studie berichtet (Erickson et al. 1997), in weiteren Studien jedoch nicht bestätigt. c Eine ausführliche Darstellung konditioneller Mutageneseansätze findet sich im Text.

Mäuse mit gezielten Mutationen des erbB2-, erbB4oder des Neuregulin-1-Gens sterben innerhalb eines sehr ähnlichen Zeitfensters während ihrer frühen Embryonalentwicklung an den Folgen identischer Defekte der Herzentwicklung. Diese sind dadurch gekennzeichnet, dass der sich entwickelnde Herzmuskel keine normale Trabekulierung ausbildet. Während dieses Entwicklungsvorgangs werden erbB2 und erbB4 von embryonalen Herzmuskelzellen exprimiert. Der Ligand Neuregulin-1 wird von benachbarten Endokardzellen exprimiert (Meyer u. Birchmeier 1994; Gassmann et al. 1995; Lee et al. 1995; Meyer u. Birchmeier 1995). erbB3 wird während der Embryonalentwicklung nicht im Herzmuskel, jedoch in Neuralleistenzellen exprimiert. Aus diesen Zellen entwickeln sich alle wesentlichen

Bestandteile des peripheren Nervensystems wie z. B. Schwann-Zellen oder Neurone des sympathischen Nervensystems. Mäuse mit Mutationen des erbB3-Rezeptor-Gens zeigen eine normale Herzentwicklung und überleben daher – in allerdings reduzierter Anzahl – bis zur Geburt. In diesen Mäusen beobachtet man komplexe Störungen bei der Entwicklung des peripheren Nervensystems, die u. a. durch den Verlust von Schwann-Zellen, die sekundäre Degeneration von motorischen und sensorischen Nerven und eine schwere Hypoplasie des sympathischen Nervensystems gekennzeichnet sind. Diese Defekte sind mit dem Leben nicht vereinbar. Die betroffenen Mutanten sterben daher unmittelbar nach der Geburt (Erickson et al. 1997; Riethmacher et al. 1997; Britsch et al. 1998).

224

Sektion 2 · Modelle

Mithilfe von eleganten genetischen Strategien ist es gelungen, Funktionen von erbB2 während der späten Embryonalentwicklung zu untersuchen (Morris et al. 1999; Woldeyesus et al. 1999). Durch „knock-in“ sowie durch transgene Expression von erbB2 (Vergl. Kap. 2) wurde eine normale Kopie des erbB2-Gens unter der Kontrolle eines Promotors exprimiert, der spezifisch in embryonalen Herzmuskelzellen exprimiert wird. Hierdurch wurde die essenzielle Funktion von erbB2 während der embryonalen Herzentwicklung ausschließlich im Herzen erhalten, wohingegen in allen übrigen Körperzellen erbB2 in mutierter Form vorlag. Erwartungsgemäß ist die Herzentwicklung in diesen als „heart rescues“ bezeichneten erbB2-Mutanten normal, und die Tiere überleben bis zur Geburt. Interessanterweise treten in diesen Mutanten die gleichen Entwicklungsdefekte des peripheren Nervensystems auf, wie sie in erbB3-Mutanten beobachtet werden (Morris et al. 1999; Woldeyesus et al. 1999). Mithilfe von Gene-Targeting in der Maus konnten also in eleganter Weise sequenzielle Funktionen von erbB-Rezeptoren, wie sie aus In-vitroUntersuchungen abgeleitet wurden, genetisch in vivo bestätigt werden. Das Neuregulin-1-Gen wird in mehreren unterschiedlichen Spleißvarianten während der Embryonalentwicklung exprimiert. So wird die Entwicklung des Herzmuskels, d. h. seine Trabekulierung, durch die Typ-I-Isoform gesteuert, während die Entwicklung des peripheren Nervensystems in den späteren Phasen vor allem durch die Typ-III-Isoform gesteuert wird (Meyer u. Birchmeier 1994; Meyer et al. 1997). Mäuse mit einer gezielten Mutation der Typ-III-Isoform haben daher eine unauffällige Herzentwicklung, zeigen jedoch wiederum ähnliche Entwicklungsdefekte des peripheren Nervensystems, wie sie in erbB3-Mutanten und erbB2Mutanten mit „heart rescue“ auftreten (Wolpowitz et al. 2000). Keine der bisher erwähnten Mausmutanten des Neuregulin-/erbB-Signalsystems ist postnatal lebensfähig. Postnatale, oder späte entwicklungsbiologische Funktionen dieses Signalsystems waren daher konventionellen Gene-Targeting-Strategien nicht zugänglich. Mithilfe des Cre-/loxP-Systems (vergl. Kap. 2) konnten solche Funktionen erstmals in vivo analysiert werden: NRG1-Signale sind während einer frühen Entwicklungsphase essenziell für das Überleben von SchwannZellen und ihren Vorläuferzellen. Es kommt daher in Mutanten des NRG-Signalsystems zu einem weitgehenden Verlust dieser Zellen. Während ihrer weiteren Entwicklung verlieren Schwann-Zellen die Abhängigkeit von Neuregulin-Signalen für ihr Überleben. Allerdings werden erbB2-/erbB3-Rezeptoren und NRG-Liganden weiterhin von Schwann-Zellen bzw. begleitenden Axonen exprimiert. In Mäusen mit konditioneller Mutation

des erbB2-Gens in Schwann-Zellen wurden Defekte in der Myelinscheidenbildung im Bereich peripherer Nerven beobachtet. Es wurde damit erstmals nachgewiesen, dass dieser Signalweg sequenziell unterschiedliche Phasen der Schwann-Zell-Entwicklung steuert (Garratt et al. 2000b). Interessanterweise kommt es in Mäusen mit reduzierter axonaler Expression von Typ-III-NRG1 zu einer Hypomyelinisierung, während in Mäusen mit transgener Überexpression dieses Liganden eine dramatische Hypermyelinisierung auftritt. Durch den systematischen Vergleich dieser Mäuse konnte genetisch in vivo belegt werden, dass axonal exprimiertes NRG1 direkt die Ausbildung umgebender Myelinscheiden steuert (Michailov et al. 2004). Durch konditionelle Mutagenese von erbB2 wurde es außerdem möglich, Funktionen dieses Signalsystems im adulten Herzen zu untersuchen. So sind Mäuse mit spezifischer Mutation des erbB2-Gens im postnatalen Myokard bis zum Erreichen des Erwachsenenalters lebensfähig, sie entwickeln jedoch das klinische und pathophysiologische Bild einer progredienten, dilatativen Kardiomyopathie mit Erweiterung der Herzhöhlen, sekundärer Herzmuskelhypertrophie und einer Störung der myokardialen Kontraktionsfähigkeit (Ozcelik et al. 2002). Bisher ist unklar, über welche zellulären Mechanismen erbB2-Signale die Physiologie des adulten Myokards steuern. erbB2 und erbB4 sind im T-Tubulus-System des Herzmuskels exprimiert, sie beeinflussen daher möglicherweise die elektromechanische Koppelung (Ozcelik et al. 2002). In Mäusen mit einer Mutation von erbB2 im adulten Herzen ist außerdem die Sensitivität des Herzmuskels gegenüber kardiotoxischen Medikamenten gesteigert. Diese Beobachtung war von großer klinisch-medizinischer Bedeutung, da sie einen direkten Zusammenhang herstellt zwischen physiologischen Funktionen von erbB2-Signalen im Herzmuskel und bekannten Funktionen von erbB2 bei der Entstehung und Therapie von Tumorerkrankungen. Wir werden hierauf im Folgenden näher eingehen. erbB2 und Tumorentstehung. Der erbB2-Rezeptor wur-

de ursprünglich aufgrund seines onkogenen Potentials entdeckt (King et al. 1985; Bargmann et al. 1986; Yamamoto et al. 1986). Nach einmaliger Gabe der mutagenen Substanz N-Ethyl-N-Nitrosoharnstoff (EtNU) am postnatalen Tag 1 entwickeln Ratten mit hoher Frequenz Schwannome des Trigeminus-Ganglions. In all diesen Tumoren findet sich die gleiche Punktmutation an Position 2012 der Nukleotidsequenz von erbB2 (Nikitin et al. 1991). Diese Punktmutation verändert eine Aminosäure in der transmembranären Domäne des Rezeptors. Das mutierte erbB2-Gen kann auf NIH3T3-Fibroblasten übertragen werden und induziert in solchen

225 2.1 · Tiermodelle in der biomedizinischen Forschung

Zellen maligne Transformation (Bargmann et al. 1986). Die mutierte Variante des Gens wird deshalb als Onkogen bezeichnet. Außergewöhnlich an erbB2 ist, dass Überexpression des nichtmutierten Protoonkogens in Fibroblasten genügt, um maligne Transformation zu induzieren (Di Fiore et al. 1987). Überexpression wird häufig in menschlichen Tumoren beobachtet. Diese Überexpression kann durch Amplifikation des Gens, aber auch durch andere molekulare Mechanismen erreicht werden (Hynes u. Stern 1994). In Karzinomen der Brustdrüse und der Ovarien korreliert solch eine Überexpression mit der Erkrankungsprognose der betroffenen Patientinnen (Slamon et al. 1987). Obwohl gezeigt worden war, dass erbB2 in Zellkultur, d. h. in NIH3T3-Zellen maligne Transformation induziert und dass somatische Mutationen oder Überexpression von erbB2 in Tumoren auftreten, stand lange ein direkter Beweis für eine Rolle in der Tumorentstehung in vivo aus. Dieser Beweis wurde in transgenen Tieren erbracht. Er war aus historischer Sicht für die generelle Akzeptanz der Erforschung von Onkogenen wichtig, die sich während der 1980er Jahre rasant entwickelt hatte. Transgene Expression der mutierten Variante von erbB2, unter der Kontrolle des MMTV-(„mouse mammary tumor virus“-)Promotors, induziert Brusttumore (Muller et al. 1988; Bouchard et al. 1989). Abhängig von der transgenen Linie entwickeln sich die Tumore scheinbar synchron oder asynchron. Wenn das Transgen schon früh während der Entwicklung im Brustepithel exprimiert wird, bilden sich Tumore, die das gesamte Epithel umfassen. Wenn das Transgen spät während der Entwicklung der Brustdrüse exprimiert wird, werden asynchrone Tumore, die zufällig im Epithel verteilt sind, beobachtet. Diese Tumore, aber auch das umliegende normal erscheinende Epithel exprimieren das Transgen. Demnach müssen auch in diesem Gewebetyp zusätzliche genetische Veränderungen akkumulieren, bevor eine maligne Transformation eintritt. Dieses Modell reflektiert die Tumorentstehung beim Menschen nur teilweise, weil in Brusttumoren des Menschen erbB2-Amplifikation und -Überexpression, aber keine Mutationen beschrieben wurden. Deshalb wurden auch transgene Mausstämme hergestellt, die den normalen erbB2-Rezeptor im Brustepithel überexprimieren (Guy et al. 1992). Transgene Überexpression des nichtmutierten erbB2-Rezeptors führt ebenfalls mit hoher Frequenz zur Entwicklung von zufällig verteilten Brusttumoren. Diese Tumore treten, abhängig vom transgenen Stamm, nach 6–9 Monaten auf. Die durchschnittliche Anzahl der Tumore variiert in einzelnen transgenen Linien (2 bis 50 unabhängige Tumore/Tier). Auch der Anteil der malignen Tumore variiert in den verschiedenen Linien, wobei in allen Linien, die Tumore entwickeln, auch maligne Karzinome beobachtet werden.

2.1

Neben den beschriebenen Mechanismen der Überexpression und Amplifikation von erbB2 spielt auch die Kooperation verschiedener erbB-Rezeptoren eine bedeutsame Rolle bei der erbB2-vermittelten Tumorentstehung. So steigert die gleichzeitige Expression von erbB3 die erbB2-vermittelte Transformation und das Tumorzellwachstum von NIH3T3-Zellen (Alimandi et al. 1995; Wallasch et al. 1995). Außerdem erhöht die Koexpression von erbB2 in vitro die Affinität des EGF-Rezeptors für EGF (Sliwkowski et al. 1994; Karunagaran et al. 1995). In Mammakarzinomen von Mäusen, die erbB2 als Transgen überexprimieren wurde die gleichzeitige Überexpression von erbB1 beobachtet (DiGiovanna et al. 1998). Der Verlust von erbB2 in Tumorzellen mit autokriner, erbB1-vermittelter Wachstumsstimulation führt zur Hemmung des Tumorzellwachstums (Jannot et al. 1996). Koexpression von erbB2 und erbB4 wird in mehr als 50% kindlicher Medulloblastome beobachtet. Ein großer Anteil dieser Tumoren exprimiert außerdem Neuregulin-1. Die gleichzeitige Expression aller drei Signalkomponenten ist ein prognostisch wichtiger Faktor für den Verlauf dieser Tumorerkrankungen (Gilbertson et al. 1997). Angesichts seiner Bedeutung für die Entstehung und Progression maligner Tumoren, fand der erbB2-Rezeptor große klinische Beachtung, sowohl als diagnostischer Parameter, aber auch als Drug-Target für die Entwicklung neuer therapeutischer Konzepte. So wird beispielsweise die Amplifikation von erbB2 mithilfe von FISH („fluorescent in situ hybridization“) heute klinisch als prognostischer Parameter bei Patientinnen mit invasivem Mammakarzinom eingesetzt (Yarden u. Sliwkowski 2001). Die gegenwärtig den größten Erfolg versprechenden und am weitesten fortgeschrittenen Strategien zur therapeutischen Beeinflussung von erbB2 basieren auf dem Einsatz kleiner, niedermolekularer Inhibitoren, die mit der Tyrosinkinaseaktivität von erbB2 interferieren, sowie auf dem Einsatz monoklonaler Antikörper, die an erbB2 binden und dessen Aktivität hemmen können (Holbro u. Hynes 2004). Der monoklonale Antikörper 4D5 war der erste derartige Antikörper für den gezeigt werden konnte, dass er durch Bindung an die extrazelluläre Domäne von erbB2 die Proliferation von erbB2überexprimierenden Tumorzellen in vitro hemmen kann (Hudziak et al. 1989; Lewis et al. 1993). Eine humanen Antikörpern in ihren Eigenschaften angeglichene Variante dieses Antikörpers (Trastuzumab, HerceptinTM, Genentech/Roche) ist heute ein klinisch validiertes Standardmedikament für die Therapie metastasierender, erbB2-überexprimierender Mammakarzinome geworden (Baselga et al. 1996; Pegram et al. 1998; Cobleigh et al. 1999). Herceptin wird sowohl als Einzelsubstanz als auch in Kombination mit weiteren Zytostatika gegeben.

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Sektion 2 · Modelle

Herceptin hemmt die Aktivierung von erbB2 und nachgeschalteten, intrazellulären Signalwegen und beschleunigt seine Internalisierung (Sliwkowski et al. 1999). Gegenwärtig befindet sich ein weiterer monoklonaler anti-erbB2-Antikörper, 2C4 (Pertuzumab, OmnitargTM, Genentech/Roche), in der klinischen Phase-IIErprobung zur Behandlung von Ovarialkarzinomen. Im Gegensatz zu Herceptin bindet Omnitarg an eine extrazelluläre Domäne von erbB2, die für die Rezeptor-Heterodimerisierung kritisch ist, und kann daher diesen Prozess spezifisch hemmen (Agus et al. 2002; Burgess et al. 2003; Cho et al. 2003; Franklin et al. 2004). Bemerkenswerterweise bedingen die unterschiedlichen Wirkungsmechanismen beider Antikörper, dass Omnitarg auch in Tumoren mit niedriger erbB2-Expression therapeutisch wirksam ist (Agus et al. 2002). Omnitarg hemmt wahrscheinlich auto- bzw. parakrine proliferative Signale, die von erbB2-Heterodimeren auf Tumorzellen aufgenommen werden. Omnitarg wird daher möglicherweise ein wichtiges neues Tumormedikament werden, welches hilft, das therapeutische Spektrum bisheriger Medikamente, so wie Herceptin, zu erweitern (Badache u. Hynes 2004). Herceptin verbessert in Kombination mit konventionellen Zytostatika signifikant das Überleben von Patientinnen mit Mammakarzinom. In Kombination mit Anthrazyklinen oder nach vorausgegangener Anthrazyklinbehandlung ist eine Herceptin-Behandlung mit einem gesteigerten Risiko kardialer Nebenwirkungen in Form dilatativer Kardiomyopathien verbunden (Slamon et al. 2001; Seidman et al. 2002). Diese primär klinische Beobachtung zieht eine wichtige Verbindung zu den zuvor dargestellten Befunden der Mausgenetik: 1. Die gezielte Mutation von NRG1, erbB2, oder erbB4 führt zu embryonal letalen Entwicklungsdefekten, die durch die gestörte Trabekelbildung des Herzmuskels, eine Erweiterung der Herzhöhlen und eine gestörte Pumpfunktion des Herzens gekennzeichnet sind. 2. Mäuse mit konditioneller Mutation von erbB2 im adulten Herzen entwickeln das klinische Bild einer dilatativen Kardiomyopathie. 3. Darüber hinaus ist die zytotoxische Wirkung von Anthrazyklinen auf erbB2-mutante Kardiomyozyten in vitro gesteigert. Mäuse mit herzspezifischer Mutation des erbB2-Rezeptors werden damit einerseits zu wichtigen Tiermodellen für die Prüfung neuer Tumormedikamente, die mit erbB2-Signalen interferieren, zum anderen werden sie helfen die molekularen Mechanismen aufzuklären, die zur Entwicklung dilatativer Kardiomyopathien führen (Crone et al. 2002; Ozcelik et al. 2002).

2.1.3.2 Stoffwechsel Diabetes mellitus Das Modellsystem Maus eignet sich nicht nur zur genetischen Analyse von entwicklungsbiologisch relevanten Genen oder monogenen Defekten, es bietet sich auch zur Erforschung von komplexen polygenen Erkrankungen wie Diabetes mellitus an. Diabetes mellitus ist primär eine Störung des Kohlenhydratstoffwechsels. Die wichtigsten klinischen Symptome sind erhöhter Blutzucker, Zuckerausscheidung im Harn und vermehrte Harnmenge. In Spätstadien der Krankheit leiden die Patienten zudem an Gefäßschäden, Neuro-, Retino- und Nephropathien sowie einem erhöhten Risiko für Schlaganfall und koronare Herzerkrankungen (Kahn u. Weir 1994). Die Ursachen der Krankheit liegen in einer Sekretionsstörung des Hormons Insulin bzw. in einer Insulinresistenz der Zielorgane. Insulin wird von den E-Zellen der Langerhans-Inseln des Pankreas gebildet und sezerniert. Es bindet im Zielorgan an den Insulinrezeptor und aktiviert diesen. Der Insulinrezeptor phosphoryliert zelluläre Proteine wie die Insulinrezeptorsubstrate (IRS) und beeinflusst über eine Signalübertragungskette die Expression zellulärer Gene (Übersicht in Taniguchi et al. 2006). Wird vom Organismus Nahrung aufgenommen, so führt der Anstieg des Blutzuckergehalts zur Ausschüttung von Insulin aus den E-Zellen. Dieses Signal veranlasst die Resorption und Speicherung der Nährstoffe in insulinsensitiven Organen. Leber und Skelettmuskulatur nehmen über Transportproteine Glucose auf und deponieren sie in Form von Glykogen. Auch das Fettgewebe kann Glucose aufnehmen und für die De-novo-Fettsynthese nutzen. Sinkt der Insulinspiegel, so geben diese Organe Nährstoffe wieder an das Blut ab. Insulin ist somit entscheidend an der Regulation des Energiestoffwechsels und der Glucosehomöostase beteiligt, und eine Störung der Insulinwirkung führt längerfristig zu einer schweren Stoffwechselentgleisung (Kahn u. Weir 1994). Man unterscheidet bei Diabetes mellitus zwei Hauptformen, den insulinabhängigen Typ 1 und den nichtinsulinabhängigen Typ 2. Diabetes mellitus Typ I. Beim sog. juvenilen oder insulinabhängigen Diabetes Typ 1 sind die insulinsezernierenden E-Zellen des Pankreas durch eine Autoimmunreaktion zerstört worden. Die Erkrankung manifestiert sich häufig in den ersten zwei Lebensjahrzehnten. Die Patienten leiden primär an Hyperglykämie und sind zur Regulierung des Blutzuckers auf die Injektion von Fremdinsulin angewiesen. Bei der Entstehung dieses Leidens spielen sowohl genetische Prädisposition als auch Umweltfaktoren eine Rolle, der Vererbungsweg ist allerdings bisher noch nicht vollständig geklärt (Tisch u. McDevitt

227 2.1 · Tiermodelle in der biomedizinischen Forschung

1996). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass der Genotyp des Major Histocompatibility Complex II (MHC) die wichtigste Determinante ist (Todd et al. 1987). Darüber hinaus könnten bis zu 19 weitere Genloci an der Entstehung der Krankheit beteiligt sein (Davies et al. 1994). Es stehen einige Tiermodelle für Diabetes Typ 1 zur Verfügung, deren wichtigstes die NOD-Maus sein dürfte. NOD steht für „non obese diabetic“. Die Maus wurde aus einer spontanen Mutante ausgezüchtet und zeigt in Vererbung und Immunpathologie Ähnlichkeit mit Diabetes Typ 1 im Menschen (Makino et al. 1980). Neben den durch Insulinmangel ausgelösten Stoffwechselstörungen ist dies vor allem die Zerstörung der E-Zellen durch eine Autoimmunreaktion. Die Erkrankung hat auch in der Maus eine polygene Basis, neben MHC II sind zwei weitere Loci beteiligt (Hattori et al. 1986; Prochazka et al. 1987). Diabetes Mellitus Typ II. Der sog. nichtinsulinabhängige

Diabetes Typ 2, auch Altersdiabetes, macht über 90% aller Diabeteserkrankungen aus. Diese Form des Diabetes ist durch eine Resistenz der Zielorgane gegen die physiologischen Wirkungen von Insulin und eine Störung der Insulinsekretion gekennzeichnet. Er tritt meist erst in fortgeschrittenem Lebensalter auf. Beim Diabetes Typ 2 ist die Regulierung des Blutglucosespiegels häufig durch diätetische und medikamentöse Maßnahmen möglich, ansonsten ist aber ebenfalls die Injektion von Fremdinsulin notwendig (Kahn u. Weir 1994). In einer Subform des Diabetes Typ 2, MODY (für „maturity onset of diabetes in the young“), entwickeln sich aufgrund einer Störung der Insulinsekretion die diabetischen Symptome bereits in jungen Jahren. Die genetischen Ursachen von MODY sind gut charakterisiert. Es sind sechs Gendefekte bekannt, die autosomaldominant vererbt werden und zu einer Störung der Insulinsekretion führen: in den Transkriptionsfaktoren HNF4A (MODY1), HNF1A/TCF1 (MODY 3), IPF1/ PDX1 (MODY4), HNF1B/TCF2 (MODY5), NeuroD1 (MODY6) sowie im Glucokinase-Gen (MODY2); MODY2 und MODY3 treten dabei am häufigsten auf (Froguel u. Velho 1999; Übersicht in Fajans et al. 2001). Monogenetische Erkrankungen wie MODY können gut im Tiermodell nachgebildet werden. Es existieren mehrere systemische und gewebespezifische Nullmutanten des Glucokinase-Gens, die alle leichte bis schwere Hypo- oder Hyperglykämie zeigen (Bali et al. 1995; Grupe et al. 1995; Terauchi et al. 1995; Postic et al. 1999). Diese Phänotypen stützen die Hypothese, dass Glucokinase als zellulärer Glucosesensor fungiert und für die Insulinsekretion der E-Zellen essenziell ist (Review in Magnuson u. Kim 2004). Neue Mausmodelle für MODY2 mit Mutationen im Glucokinase-Gen konnten zudem in

2.1

einem groß angelegten ENU-Mutations-Screen für Diabetes identifiziert werden (Inoue et al. 2004). Nullmutanten wurden auch für die MODY-Gene HNF1A (Pontoglio et al. 1996; Lee et al. 1998; Pontoglio et al. 1998; Lee et al. 2003), HNF4A (Gupta et al. 2005; Miura et al. 2006), HNF1B (Wang et al. 2004), Neurod1 (Naya et al. 1997) und IPF/PDX1 (Jonsson et al. 1994; Ahlgren et al. 1998) erzeugt. Neben teilweise gravierenden Entwicklungsdefekten zeigen alle Mutanten Störungen in der Regulation des Blutzuckers und können somit zu einem erweiterten Verständnis der molekularen Ursachen des Diabetes Typ 2 MODY beitragen. Abgesehen von MODY ist die Genetik von Diabetes Typ 2 komplex, an der Ausprägung der Krankheit sind verschiedene Gene sowie Umweltfaktoren beteiligt. Ein wichtiges Merkmal ist die Insulinresistenz von Skelettmuskulatur, Leber und Fettgewebe, die dem Vollbild eines Diabetes Typ 2 vorausgeht (Martin et al. 1992). Auch wenn die genetischen Ursachen von Diabetes Typ 2 beim Menschen noch nicht vollständig aufgeklärt sind, so können Tiermodelle doch dazu beitragen, die Rolle einzelner Gene gezielt zu studieren. Das erste Tiermodell für Diabetes Typ 2 war die Goto-Kakizaki- (GK-)Ratte, eine spontan aufgetretene Mutante. Der Diabetes der GK-Ratte ist, wie der des Menschen, polygen; es werden gestörte Insulinsekretion sowie reduzierte E-Zellmasse beobachtet (Portha 2005). Die fa/fa- („fatty“-)Ratte (Zucker u. Zucker 1961) und die ob/ob-Mäuse („obese“) (Ingalls et al. 1950) bzw. db/ db-Mäuse („diabetic“) (Hummel et al. 1966) sind ebenfalls natürliche Mutanten. Sie sind übergewichtig und entwickeln ein Syndrom aus Hyperglykämie, Hyperinsulinämie und Glucoseintoleranz, das dem Diabetes Typ 2 des Menschen ähnlich ist (Coleman 1973, 1978). Die Gene für fa, ob und db konnten kloniert werden: ob kodiert für das Hormon Leptin, fa und db für den Leptinrezeptor (Zhang et al. 1994) (Tartaglia et al. 1995; Iida et al. 1996; Phillips et al. 1996). Leptin wird von Adipozyten sezerniert, es erhöht u. a. den Grundstoffwechsel und senkt Seruminsulin und Blutzucker (Halaas et al. 1995; Pelleymounter et al. 1995). Eine Störung der Leptin-Signaltransduktion führt zur Deregulation des Körpergewichts und in der Folge zur Manifestation eines nichtinsulinabhängigen Diabetes (Chen et al. 1996; Chua et al. 1996; Lee et al. 1996). Konventionelle und konditionelle Nullmutationen von Genen des erweiterten Insulinsignalsystems in der Maus konnten ebenfalls entscheidend zu einem besseren Verständnis der molekularen Ursachen von Diabetes Typ 2 beitragen (Übersicht in Plum et al. 2005). Eine erschöpfende Darstellung aller relevanten Mausmutanten ist an dieser Stelle sicherlich nicht möglich, die gewählten Beispiele sollen den Stand der Forschung illustrieren.

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Sektion 2 · Modelle

Nullmutanten des Insulinrezeptors sterben kurz nach der Geburt an schweren diabetischen Stoffwechselstörungen (Accili et al. 1996; Joshi et al. 1996). Mithilfe des Cre-/loxP-Systems erzeugte gewebespezifische Nullmutanten des Rezeptors zeigen massive Insulinresistenz und Glucoseintoleranz für das leberspezifische Null-Allel (Michael et al. 2000), während in der skelettmuskelspezifischen Mutante der Glucosemetabolismus nicht beeinträchtigt ist (Bruning et al. 1998). Im muskelspezifischen Null-Allel des Glucosetransporters und -sensors Glut4 sind ebenfalls Insulinresistenz und Glucoseintoleranz zu beobachten (Zisman et al. 2000). Ein voll entwickelter Diabetes-Typ-2-Phänotyp manifestiert sich, wenn sowohl der Insulinrezeptor als auch der „insulin-like growth factor receptor“ (IGF-1R) im Muskel inaktiviert werden (Fernandez et al. 2001). Wird der Insulinrezeptor im weißen Fettgewebe inaktiviert, dann wird eine reduzierte Körperfettmasse beobachtet, die Tiere werden nicht übergewichtig und sind vor adipöser Glucoseintoleranz geschützt (Bluher et al. 2002). Dagegen führt die fettgewebespezifische Deletion von Glut4 zu Insulinresistenz in Leber und Skelettmuskulatur (Abel et al. 2001). Die Deletion des Insulinrezeptors (Kulkarni et al. 1999) oder von IGF1-R (Kulkarni et al. 2002) in den E-Zellen des Pankreas unterbindet bzw. beeinträchtigt die Sekretion von Insulin ebenso wie eine Inaktivierung der b-zellspezifischen Glucokinase (Aizawa et al. 1996). Doppelmutanten für Insulinrezeptor und IGF1-R in den E-Zellen entwickeln Diabetes Typ 2 (Ueki et al. 2006). Inaktivierung des Insulinrezeptors im Gehirn führt zu milder Insulinresistenz und Übergewicht (Bruning et al. 2000). Es konnte gezeigt werden, dass Insulin im Gehirn den Glucosemetabolismus in der Leber indirekt über den Interleukin-6-/STAT3-Signalweg steuern kann (Inoue et al. 2006). Nullmutanten der Signalmoleküle IRS-1 und IRS-2 („insulin receptor substrate“) zeigen Glucoseintoleranz und Insulinresistenz (Araki et al. 1994; Tamemoto et al. 1994; Kubota et al. 2000; Previs et al. 2000). Werden Null-Allele vom Insulinrezeptor und IRS-1 im heterozygoten Zustand kombiniert, dann entwickeln etwa 40% der Tiere Diabetes Typ 2 (Bruning et al. 1997) Aus den oben angeführten Beispielen wird deutlich, dass vor allem die gewebespezifische Deletion von diabetesrelevanten Genen im Modellsystem Maus für die Erforschung des Diabetes mellitus unverzichtbar ist – einer Erkrankung, die multiple Organsysteme des Körpers betrifft und an deren Entstehung unterschiedliche Signalsysteme und Umweltfaktoren beteiligt sind.

2.1.3.3 ZNS Neurodegeneration – Alzheimer-Erkrankung Neurodegenerative Erkrankungen bezeichnen eine heterogene Gruppe chronisch-progredienter Störungen des Nervensystems, zu denen neben anderen die Alzheimer-Erkrankung, Parkinson-Erkrankung, Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Prionenerkrankungen und Trinukleotid-Repeat-Erkrankungen, wie z. B. Chorea Huntington, zählen. Neurodegenerative Erkrankungen führen in der Regel zu schwersten körperlichen oder mentalen Behinderungen der Betroffenen. Ihre zugrunde liegenden Pathomechanismen sind bislang meist nur unvollständig verstanden, kausal angreifende Therapieformen daher in der Regel nicht verfügbar. Vor diesem Hintergrund stellen neurodegenerative Erkrankungen sowohl für die biomedizinische Grundlagenforschung als auch für die klinische Medizin eine anhaltend große Herausforderung dar. Neurodegenerative Erkrankungen treten meist (mit Ausnahme der Chorea Huntington) sowohl sporadisch als auch erblich auf. Typische Merkmale sind ein häufig autosomal-dominanter Erbgang, die Dysfunktion und schließlich der Untergang spezifischer Neuronenpopulationen des ZNS sowie in vielen Fällen das Auftreten intra- oder extrazellulär lokalisierter, pathologischer Proteinablagerungen. In den vergangenen Jahren konnten Mutationen in unterschiedlichen, krankheitsassoziierten Genen nachgewiesen werden. Häufig führen diese nicht primär zum Funktionsverlust des Genprodukts, sondern zum Erwerb neuer, toxischer Eigenschaften, die direkt oder indirekt mit der Funktion von Nervenzellen interferieren. Transgene Mausmodelle, die beim Menschen identifizierte Mutationen rekapitulieren, sind für die Erforschung Neurodegenerativer Erkrankungen außerordentlich bedeutsam gewesen. Mit ihrer Hilfe konnten vielfach Krankheitsmodelle etabliert werden, welche die Entwicklung und Erprobung neuer Behandlungskonzepte wesentlich unterstützen. Dies soll im Folgenden an einem ausgewählten Beispiel, der Alzheimer-Krankheit, illustriert werden (Hardy u. Gwinn-Hardy 1998; Price et al. 1998a; Wong et al. 2002). Die Alzheimer-Erkrankung ist die häufigste Ursache einer Demenz im Erwachsenenalter. Hauptsymptome sind der allmählich fortschreitende Verfall kognitiver und mnestischer Alltagsfunktionen und der Persönlichkeit der betroffenen Individuen. In den meisten Fällen treten diese Krankheitssymptome um das 7. Lebensjahrzehnt auf, können sich – insbesondere bei familiären Alzheimer-Formen – aber auch früher manifestieren (Albert u. Drachman 2000; Selkoe u. Podlisny 2002). Morphologische Korrelate dieser klinischen Symptome sind der Funktionsverlust, der Verlust synaptischer Kontakte und

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schließlich der Untergang von Nervenzellen vor allem in der Großhirnrinde, den Amygdala, dem Hippocampus und dem basalen cholinergen Vorderhirn. Im Gehirn Erkrankter können charakteristischerweise pathologische Proteinablagerungen in Form intrazellulärer, sog. „neurofibrillary tangles“ (NFT) und extrazellulärer, E-Amyloid (AE) enthaltender Plaques nachgewiesen werden. NFT stellen schwerlösliche filamentäre Proteinaggregate dar, finden sich in Soma, distalem Axon, proximalen Dendritenabschnitten sowie in synaptischen Endigungen befallener Nervenzellen und bestehen vor allem aus einer hyperphosphorylierten Form des mikrotubulusassoziierten Proteins Tau. AE entsteht durch proteolytische Spaltung von Amyloid-Precursor-Protein (APP) und kann zu hochmolekularen fibrillären Proteinkomplexen aggregieren, in die Bestandteile untergegangener oder dystropher Neurone und Gliazellen eingeschlossen sein können (Price et al. 1998a; Selkoe u. Podlisny 2002). APP wird als transmembranäres Protein von Neuronen des ZNS exprimiert. Durch die proteolytische Aktivität von BACE1 (E-site APP cleaving enzyme 1) und J-Secretase wird APP an spezifischen Stellen gespalten und das pathogene Peptidfragment AE freigesetzt (Price et al. 1998a; Sinha et al. 1999; Vassar et al. 1999; Yan et al. 1999; Selkoe u. Podlisny 2002). Interessanterweise wurden bei familiären Alzheimer-Formen verschiedene Mutationen im APP-Gen identifiziert, die in der Nähe der Spaltungsregionen von BACE1 und J-Secretase liegen und die Spaltung von APP erleichtern oder zur Bildung von AE-Peptiden mit besonders hoher Aggregationsneigung führen. Charakteristisches Merkmal aller APP-Mutationen, die bei familiären Alzheimer-Formen gefunden werden, ist also, dass sie zu gesteigerter bzw. erleichterter AE-Bildung führen (Wong et al. 2002). Während Mutationen im APP-Gen in weniger als 10% der familiären Alzheimer-Erkrankungen gefunden werden, lassen sich in ungefähr 50% aller Fälle Präsenilin-Mutationen nachweisen (Sorbi et al. 2001). Bisher wurden mehr als 80 verschiedene Mutationen im Präsenilin-1-Gen bei familiären Alzheimer-Erkrankungen nachgewiesen. In weit selteneren Fällen wurden außerdem Mutationen im Präsenilin-2-Gen beobachtet (Wong et al. 2002). Präseniline stellen transmembranäre Proteine dar, die im endoplasmatischen Retikulum neuronaler und nichtneuronaler Zellen exprimiert sind. Sie besitzen außerordentlich vielfältige Funktionen in der Regulation spezifischer Signalwege, wie z. B. des NotchSignalwegs. Wichtig für das Verständnis ihrer Funktion bei der Entstehung der Alzheimer-Krankheit war die Beobachtung, dass sie die katalytische Untereinheit im J-Secretase-Komplex bilden. Die Mehrzahl der bisher identifizierten, mit Alzheimer assoziierten PräsenilinMutationen beeinflussen daher die J-Secretase-Aktivität und führen zur gesteigerten Bildung von AE

2.1

(Brunkan u. Goate 2005; Wines-Samuelson u. Shen 2005). Durch die transgene Expression einer bei familiärer Alzheimer-Krankheit nachgewiesenen APP-Mutation (APP717) unter der Kontrolle des PDGF-E-Promotors war es erstmals gelungen, ein Mausmodell für AE-Amyloidose zu etablieren. In diesen Tieren wurden erhöhte AE-Konzentrationen, diffuse AE-Ablagerungen und alzheimerähnliche Plaquebildungen im Hippocampus und Neokortex beobachtet (Games et al. 1995; Masliah et al. 1996). In der Folge wurden unterschiedliche mit Alzheimer assoziierte Mutationen von APP und Präsenilin1 mithilfe unterschiedlicher Promotoren in transgenen Mäusen exprimiert. Die Schwere der AE-Ablagerungen korreliert in diesen Tieren mit der Stärke der Transgenexpression (Wong et al. 2002). Neben alzheimertypischen morphologischen Veränderungen konnten in verschiedenen transgenen Linien auch Lern- und Gedächtnisdefizite beobachtet werden (Chen et al. 2000). Bei gleichzeitiger transgener Expression von APP und Präsenilin1-Mutationen kommt es außerdem zur Akzeleration von AE-Ablagerungen im Gehirn transgener Mäuse (Borchelt et al. 1997). Die genannten Beobachtungen im transgenen Tiermodell konnten also die wesentlichen pathophysiologischen Konzepte zur Entstehung der Alzheimer-Erkrankung und eine zentrale Rolle von APP und Präsenilin-Mutationen bestätigen (Price et al. 1998b; Wong et al. 2002). Aufgrund ihrer Schlüsselfunktion bei der Bildung von AE werden BACE1 und Präseniline als mögliche Angriffspunkte (Drug-Targets) kausaler Therapiestrategien bei der Alzheimer-Krankheit diskutiert. Homozygot mutante BACE1-Mäuse sind gesund, fertil und zeigen keine auffälligen phänotypischen Veränderungen. Im Gehirn BACE1-mutanter Mäuse wird darüber hinaus kein AE gebildet (Cai et al. 2001; Luo et al. 2001; Roberds et al. 2001). BACE1 könnte daher ein vielversprechendes Drug-Target für die Behandlung der Alzheimer-Erkrankung darstellen. Allerdings wurden in jüngeren Untersuchungen erstmals Verhaltensänderungen und Veränderungen von Neurotransmittern im Gehirn von BACE1-Knockout-Mäusen beschrieben (Harrison et al. 2003). Mäuse mit homozygoter Mutation von Präsenilin1 sterben unmittelbar nach der Geburt an respiratorischer Insuffizienz aufgrund von Deformationen des Brustkorbs. Präsenilin1-Mutanten zeigen darüber hinaus weitere Entwicklungsdefekte, die auf eine Störung der Segmentation und Somitenbildung während der Embryogenese zurückzuführen sind (Shen et al. 1997). Ähnliche Phänotypen wurden in Mäusen mit homozygoter Mutation des Notch1-Gens beobachtet und reflektieren kritische Funktionen von Präsenilin1 bei der Regulation des Notch-Signalwegs (Swiatek et al. 1994; Conlon et al.

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Sektion 2 · Modelle

1995; Brunkan u. Goate 2005). Während der Embryogenese steuert Präsenilin1 außerdem die Migration und Differenzierung von neuronalen Vorläuferzellen im Gehirn (Shen et al. 1997; Handler et al. 2000). Mithilfe des Cre-/loxP-Systems konnten die physiologischen Funktionen von Präsenilin1 im adulten Gehirn untersucht werden. Mäuse mit spezifischer Mutation von Präsenilin1 in exzitatorischen Neuronen des adulten Vorderhirns sind weitgehend unauffällig und zeigen lediglich geringgradige Gedächtnisdefizite, die durch intensives Training kompensiert werden können (Saura et al. 2004). Während Mäuse mit einer Mutation von Präsenilin2 sowohl in ihrer Embryonalentwicklung als auch postnatal unauffällig sind (Herreman et al. 1999), führt die gleichzeitige konditionelle Mutation von Präsenilin1 und 2 im adulten Vorderhirn zu einer Verstärkung von Gedächtnisdefiziten (Saura et al. 2004). Präsenilin1 und -2 besitzen also offensichtlich redundante Funktionen. Interessanterweise wurden in diesen Doppelmutanten auch Veränderungen der synaptischen Plastizität und eine mit steigendem Alter der Tiere zunehmende Neurodegeneration beobachtet (Beglopoulos et al. 2004; Feng et al. 2004; Saura et al. 2004). Die auffällige Ähnlichkeit von Befunden in Präsenilin-Knockout-Mäusen mit pathologischen Veränderungen, wie sie bei der AlzheimerKrankheit auftreten, deuten damit möglicherweise auf bisher nicht charakterisierte Funktionen von Präsenilinen in der Pathogenese dieser Erkrankung hin (WinesSamuelson u. Shen 2005).

2.1.4 Ausblick Transgene Technologien zur gezielten genetischen Veränderung von Nagern haben in den vergangenen zwei Jahrzehnten die biomedizinische Grundlagenforschung und in wachsendem Maße die klinische Forschung revolutioniert. Die Kerntechnologien – Gene-Targeting durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen – sind dabei nach wie vor auf ihre Anwendung in der Maus beschränkt. Versuche, diese Techniken durch Kombination mit der Klonierung von Säugerzellen auf andere Versuchstierspezies zu übertragen, sind weit hinter ihren Erwartungen zurückgeblieben. Aufgrund dessen sind genetisch veränderte Mäuse seit Jahren der dominierende Organismus bei Säugetierversuchen. Primäres Ziel transgener Techniken war es, Gene gezielt überzuexprimieren (Gain-of-function-Analysen) oder sie selektiv zu deletieren (Loss-of-function-Analysen) und so ihre Funktionen in einem intakten Säugerorganismus untersuchen zu können. Die kontinuierliche Weiterentwicklung transgener Techniken hat dazu geführt, dass mit ihrer Hilfe heute Genexpression konditionell, d. h. räumlich und zeitlich gesteuert werden kann.

Neueste transgene Techniken ermöglichen darüber hinaus, die Funktion definierter Zellen, wie z. B. Nervenzellen, reversibel und selektiv zu beeinflussen. Mithilfe transgener Techniken wurde in den letzten Jahren eine wachsende Zahl von Mauslinien etabliert, die als genetische Werkzeuge universell einsetzbar sind und z. B. die selektive Visualisierung von Substrukturen von Nervenzellen (z. B. aussprossende Axone), spezifischer intrazellulärer Stoffwechselprozesse (z. B. Proteinabbau durch das Ubiquitin-/Proteasomen-System) oder übergeordneter funktioneller Systeme des ZNS (z. B. Pyramidenbahn-System) ermöglichen. Die Verbindung von molekularem Imaging und transgenen Techniken stellt daher augenblicklich eines der dynamischsten und faszinierendsten Forschungsfelder dar. Weitere, wichtige Impulse für den Einsatz genetisch veränderter Tiermodelle können in der vergleichenden Charakterisierung verschiedener Säugergenome und der Etablierung systematischer, überregionaler Mutagenese-Screens in der Maus gesehen werden. Es kann deshalb erwartet werden, dass es durch die kontinuierliche technische Fortentwicklung sowie durch die Konvergenz von wissenschaftlichen Erkenntnissen aus ganz unterschiedlichen Ansätzen zu einer weiter wachsenden Bedeutung transgener Tiermodelle in der biomedizinischen Grundlagenforschung kommen wird.

2.1.5 Literatur Abel, E.D., O. Peroni, J.K. Kim, Y.B. Kim, O. Boss, E. Hadro, T. Minnemann, G.I. Shulman, and B.B. Kahn. 2001. Adipose-selective targeting of the GLUT4 gene impairs insulin action in muscle and liver. Nature 409: 729–33 Accili, D., J. Drago, E.J. Lee, M.D. Johnson, M.H. Cool, P. Salvatore, L.D. Asico, P.A. Jose, S.I. Taylor, and H. Westphal. 1996. Early neonatal death in mice homozygous for a null allele of the insulin receptor gene. Nat Genet 12: 106–9 Adlkofer, K. and C. Lai. 2000. Role of neuregulins in glial cell development. Glia 29: 104–11 Agus, D.B., R.W. Akita, W.D. Fox, G.D. Lewis, B. Higgins, P.I. Pisacane, J.A. Lofgren, C. Tindell, D.P. Evans, K. Maiese, H.I. Scher, and M.X. Sliwkowski. 2002. Targeting ligand-activated ErbB2 signaling inhibits breast and prostate tumor growth. Cancer Cell 2: 127– 37 Ahlgren, U., J. Jonsson, L. Jonsson, K. Simu, and H. Edlund. 1998. beta-cell-specific inactivation of the mouse Ipf1/Pdx1 gene results in loss of the beta-cell phenotype and maturity onset diabetes. Genes Dev 12: 1763–8 Aizawa, T., N. Asanuma, Y. Terauchi, N. Suzuki, M. Komatsu, N. Itoh, T. Nakabayashi, H. Hidaka, H. Ohnota, K. Yamauchi, K. Yasuda, Y. Yazaki, T. Kadowaki, and K. Hashizume. 1996. Analysis of the pancreatic beta cell in the mouse with targeted disruption of the pancreatic beta cell-specific glucokinase gene. Biochem Biophys Res Commun 229: 460–5 Akagi, K., V. Sandig, M. Vooijs, M. Van der Valk, M. Giovannini, M. Strauss, and A. Berns. 1997. Cre-mediated somatic site-specific recombination in mice. Nucleic Acids Res 25: 1766–73

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2.1

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238

Sektion 2 · Modelle

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239 2.1 · Tiermodelle in der biomedizinischen Forschung Zambrowicz, B.P., G.A. Friedrich, E.C. Buxton, S.L. Lilleberg, C. Person, and A.T. Sands. 1998. Disruption and sequence identification of 2,000 genes in mouse embryonic stem cells. Nature 392: 608–11 Zhang, D., M.X. Sliwkowski, M. Mark, G. Frantz, R. Akita, Y. Sun, K. Hillan, C. Crowley, J. Brush, and P.J. Godowski. 1997. Neuregulin-3 (NRG3): a novel neural tissue-enriched protein that binds and activates ErbB4. Proc Natl Acad Sci USA 94: 9562–7 Zhang, L., U. Sankar, D.J. Lampe, H.M. Robertson, and F.L. Graham. 1998a. The Himar1 mariner transposase cloned in a recombinant adenovirus vector is functional in mammalian cells. Nucleic Acids Res 26: 3687–93 Zhang, Y., F. Buchholz, J.P. Muyrers, and A.F. Stewart. 1998b. A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nat Genet 20: 123–8 Zhang, Y., R. Proenca, M. Maffei, M. Barone, L. Leopold, and J.M. Friedman. 1994. Positional cloning of the mouse obese gene

2.1

and its human homologue [published erratum appears in Nature 1995 Mar 30;374(6521):479]. Nature 372: 425–32 Zinyk, D.L., E.H. Mercer, E. Harris, D.J. Anderson, and A.L. Joyner. 1998. Fate mapping of the mouse midbrain-hindbrain constriction using a site-specific recombination system. Curr Biol 8: 665–8 Zisman, A., O.D. Peroni, E.D. Abel, M.D. Michael, F. Mauvais-Jarvis, B.B. Lowell, J.F. Wojtaszewski, M.F. Hirshman, A. Virkamaki, L.J. Goodyear, C.R. Kahn, and B.B. Kahn. 2000. Targeted disruption of the glucose transporter 4 selectively in muscle causes insulin resistance and glucose intolerance. Nat Med 6: 924–8 Zucker, L.M. and T.F. Zucker. 1961. Fatty, a new mutation in the rat. J. Heredity: 275–278 Zwaal, R.R., A. Broeks, J. van Meurs, J.T. Groenen, and R.H. Plasterk. 1993. Target-selected gene inactivation in Caenorhabditis elegans by using a frozen transposon insertion mutant bank. Proc Natl Acad Sci USA 90: 7431–5

240

2.1.6 Zeittafel Gene targeting durch homologe Rekombination in ES-Zellen der Maus

Klonierung durch Kerntransfer

Transgene durch Injektion rekombinanter DNA die Zygote

1970er

Molekulares Modell der allgemeinen homologen Rekombination (Holliday 1964; Meselson and Radding 1975)

1980er

Klonierung verschiedener Säugerspezies (Schaf, Rind, Kanninchen, Maus) durch Kerntransfer unter Verwendung von Präimplantationsembryonen als Kernspender (Willadsen 1986; Prather et al. 1987; Tsunoda et al. 1987; Collas and Robl 1990)

1980er

Integration mikroinjizierter, rekombinanter DNA in das Wirtsgenom und ihre Vererbung über die Keimbahn (Costantini and Lacy 1981; Gordon and Ruddle 1981; Steward et al. 1982)

1981

Isolierung pluripotenter ES-Zellen der Maus aus Präimplantations-Blastozysten (Evans and Kaufman 1981; Martin 1981)

1996/98

Klonierung der ersten Schafe und Rinder durch Kerntransfer aus fetalen somatischen Zellen (Campbell et al. 1996; Cibelli et al. 1998)

1982

Erzeugung von transgenen (Riesen-) Mäusen durch Mikroinjektion eines rekombinanten Wachstumsfaktorgens (Palmiter et al. 1982)

1984

Demonstration der Keimbahnkompetenz von ES-Zellen der Maus nach Langzeit-Kultivierung in vitro (Bradley et al. 1984)

1997

Klonierung des ersten Tieres (Schaf Dolly) durch Kerntransfer aus adulten somatischen Zellen (Wilmut et al. 1997)

1984/85

Gewebespezifische, gezielte Expression von Transgenen (Swift et al. 1984; Hanahan 1985)

1985

Homologe Rekombination in Säugerzellen zwischen künstlichem targeting vector und Eglobin Genlocus (Smithies et al. 1985)

1997

Klonierung von transgenen Schafen, die humanen Gerinnungsfaktor IX mit der Milch produzieren durch Kerntransfer von zuvor genetisch veränderten Fibroblasten (Schnieke et al. 1997)

1987

Selektive Eliminierung von embryonalen Zelllinien mit Hilfe von mikroinjizierten Transgenen (Palmiter et al. 1987)

1987

Homologe Rekombination in Maus ES-Zellen am Beispiel des selektionierbaren HPRT Genlocus (Doetschman et al. 1987; Thomas and Capecchi 1987)

1998

Klonierung der ersten Maus durch Kerntransfer aus adulten Kumuluszellen (Wakayama et al. 1998)

1992

Erzeugung von transgenen Mäusen durch Microinjection von YACS (Schedl et al. 1992)

1988

Homologe Rekombination in Maus ES-Zellen am Beispiel des nicht-selektionierbaren int-2 Genlocus (Mansour et al. 1988)

2000

Klonierung von Rindern durch Kerntransfer aus Fibroblasten nach deren Langzeitkultivierung in vitro (Kubota et al. 2000)

1994

Konditionelle Transgenexpression in der Maus (Furth et al. 1994)

1994

Zelltyp-spezifisches Gene targeting in der Maus mit Hilfe des Cre/loxP Systems (Gu et al. 1993)

2000

Kombination von Gene targeting in fetalen Fibroblasten und Klonierung durch Kerntransfer im Schaf (McCreath et al. 2000)

1998

Kombination von Cre/loxP System und Oozyteninjektion zur Erzeugung von single copy transgenes in der Maus (de Wit et al. 1998)

2000

Kombination von Gene targeting in ES-Zellen der Maus und Klonierung von Mäusen durch Kerntransfer aus ES-Zellen (Rideout et al. 2000)

2000

Erste interspezifische Klonierung durch Kerntransfer (Lanza et al. 2000)

2000

Kombination von Cre-vermitteltem Kassettenaustausch und Mikroinjektion in Oozyten (Lauth et al. 2000)

2006

Konditionelle Expression molekularer Schalter (z.B. Allatostatin-Rezeptor) zur epigenetischen, reversiblen Inaktivierung von Nervenzellen (Gosgnach et al. 2006)

2000

Etablierung eines Repertoires von Neuronalen Reporter-Mauslinien durch transgene Expression spektraler Varianten von Thy-1 XFP (Feng et al. 2000)

Sektion 2 · Modelle

Historische Entwicklung von transgenen Techniken zur genetischen Manipulation von Säugetieren

241 2.1 · Tiermodelle in der biomedizinischen Forschung

Literatur zur Zeittafel Bradley, A., M. Evans, M.H. Kaufman, and E. Robertson. 1984. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature 309: 255–6 Campbell, K.H., J. McWhir, W.A. Ritchie, and I. Wilmut. 1996. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line [see comments]. Nature 380: 64–6 Cibelli, J.B., S.L. Stice, P.J. Golueke, J.J. Kane, J. Jerry, C. Blackwell, F.A. Ponce de Leon, and J.M. Robl. 1998. Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts. Science 280: 1256–8 Collas, P. and J.M. Robl. 1990. Factors affecting the efficiency of nuclear transplantation in the rabbit embryo. Biol Reprod 43: 877–84 Costantini, F. and E. Lacy. 1981. Introduction of a rabbit beta-globin gene into the mouse germ line. Nature 294: 92–4 de Wit, T., D. Drabek, and F. Grosveld. 1998. Microinjection of cre recombinase RNA induces site-specific recombination of a transgene in mouse oocytes. Nucleic Acids Res 26: 676–8 Doetschman, T., R.G. Gregg, N. Maeda, M.L. Hooper, D.W. Melton, S. Thompson, and O. Smithies. 1987. Targetted correction of a mutant HPRT gene in mouse embryonic stem cells. Nature 330: 576–8 Evans, M.J. and M.H. Kaufman. 1981. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292: 154–6 Feng, G., R.H. Mellor, M. Bernstein, C. Keller-Peck, Q.T. Nguyen, M. Wallace, J.M. Nerbonne, J.W. Lichtman, and J.R. Sanes. 2000. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron 28: 41–51 Furth, P.A., L. St Onge, H. Boger, P. Gruss, M. Gossen, A. Kistner, H. Bujard, and L. Hennighausen. 1994. Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proc Natl Acad Sci USA 91: 9302–6 Gordon, J.W. and F.H. Ruddle. 1981. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science 214: 1244–6 Gosgnach, S., G.M. Lanuza, S.J. Butt, H. Saueressig, Y. Zhang, T. Velasquez, D. Riethmacher, E.M. Callaway, O. Kiehn, and M. Goulding. 2006. V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs. Nature 440: 215–9 Gu, H., Y.R. Zou, and K. Rajewsky. 1993. Independent control of immunoglobulin switch recombination at individual switch regions evidenced through Cre-loxP-mediated gene targeting. Cell 73: 1155–64 Hanahan, D. 1985. Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/ simian virus 40 oncogenes. Nature 315: 115–22 Holliday, R.A. 1964. Mechanism for gene conversion in fungi. Genet Res 5: 282–304 Kubota, C., H. Yamakuchi, J. Todoroki, K. Mizoshita, N. Tabara, M. Barber, and X. Yang. 2000. Six cloned calves produced from adult fibroblast cells after long-term culture. Proc Natl Acad Sci USA 97: 990–5 Lanza, R.P., J.B. Cibelli, F. Diaz, C.T. Moraes, P.W. Farin, C. Farin, C.J. Hammer, M.D. West, and P. Damiani. 2000. Cloning of endangered species (Bos gaurus) using interspecies nuclear transfer. Cloning 2: 79–90 Lauth, M., K. Moerl, J.J. Barski, and M. Meyer. 2000. Characterization of cre-mediated cassette exchange after plasmid microinjection in fertilized mouse oocytes. Genesis 27: 153–8

2.1

Mansour, S.L., K.R. Thomas, and M.R. Capecchi. 1988. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature 336: 348–52 Martin, G.R. 1981. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 78: 7634–8 McCreath, K.J., J. Howcroft, K.H. Campbell, A. Colman, A.E. Schnieke, and A.J. Kind. 2000. Production of gene-targeted sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells. Nature 405: 1066–9 Meselson, M.S. and C. Radding. 1975. A general model of genetic recombination. Proc Natl Acad Sci USA 72: 358–361 Palmiter, R.D., R.R. Behringer, C.J. Quaife, F. Maxwell, I.H. Maxwell, and R.L. Brinster. 1987. Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene. Cell 50: 435–43 Palmiter, R.D., R.L. Brinster, R.E. Hammer, M.E. Trumbauer, M.G. Rosenfeld, N.C. Birnberg, and R.M. Evans. 1982. Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes. Nature 300: 611–5 Prather, R.S., F.L. Barnes, M.M. Sims, J.M. Robl, W.H. Eyestone, and N.L. First. 1987. Nuclear transplantation in the bovine embryo: assessment of donor nuclei and recipient oocyte. Biol Reprod 37: 859–66 Rideout, W.M., 3rd, T. Wakayama, A. Wutz, K. Eggan, L. Jackson-Grusby, J. Dausman, R. Yanagimachi, and R. Jaenisch. 2000. Generation of mice from wild-type and targeted ES cells by nuclear cloning. Nat Genet 24: 109–10 Schedl, A., F. Beermann, E. Thies, L. Montoliu, G. Kelsey, and G. Schutz. 1992. Transgenic mice generated by pronuclear injection of a yeast artificial chromosome. Nucleic Acids Res 20: 3073–7 Schnieke, A.E., A.J. Kind, W.A. Ritchie, K. Mycock, A.R. Scott, M. Ritchie, I. Wilmut, A. Colman, and K.H. Campbell. 1997. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science 278: 2130–3 Smithies, O., R.G. Gregg, S.S. Boggs, M.A. Koralewski, and R.S. Kucherlapati. 1985. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination. Nature 317: 230–4 Steward, T.A., E.F. Wagner, and B. Mintz. 1982. Human beta-globin gene sequences injected into mouse eggs, retained in adults, and transmitted to progeny. Science 217: 1046–8 Swift, G.H., R.E. Hammer, R.J. MacDonald, and R.L. Brinster. 1984. Tissue-specific expression of the rat pancreatic elastase I gene in transgenic mice. Cell 38: 639–46 Thomas, K.R. and M.R. Capecchi. 1987. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell 51: 503–12 Tsunoda, Y., T. Yasui, Y. Shioda, K. Nakamura, T. Uchida, and T. Sugie. 1987. Full-term development of mouse blastomere nuclei transplanted into enucleated two-cell embryos. J Exp Zool 242: 147–51 Wakayama, T., A.C. Perry, M. Zuccotti, K.R. Johnson, and R. Yanagimachi. 1998. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 394: 369–74 Willadsen, S.M. 1986. Nuclear transplantation in sheep embryos. Nature 320: 63–5 Wilmut, I., A.E. Schnieke, J. McWhir, A.J. Kind, and K.H. Campbell. 1997. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385: 810–3.

2.2 Zellkulturtechniken, Zellmodelle und Tissue Engineering Anna M. Wobus und Heike Mertsching

2.2.1

Einleitung

– 243

2.2.2

Zellkulturtechniken

2.2.2.1 2.2.2.2 2.2.2.3 2.2.2.4 2.2.2.5

Etablierung einer Zellkultur – 243 Wachstumsverhalten von Zellen in Kultur – 244 Charakterisierung zellulärer Leistungen – 249 Nachweis von Kontaminationen – 251 Kryokonservierung – 252

2.2.3.

Zellkulturmodelle

2.2.3.1 2.2.3.2 2.2.3.3 2.2.3.4 2.2.3.5

Monolayer-Kulturen – 252 Kokulturen und organotypische Kulturen Dreidimensionale Kulturen – 257 Suspensionskulturen – 258 Differenzierungsmodelle – 259

2.2.4

Tissue Engineering – 263

2.2.4.1 2.2.4.2 2.2.4.3 2.2.4.4

Grundlagen des Tissue Engineering – 263 Trägermaterialien – 265 Konstruktion von Geweben in vitro – 266 Regulatorische Aspekte – 269

2.2.5

Ausblick

– 270

2.2.6

Literatur

– 271

2.2.7

Zeittafel

– 273

– 243

– 252

Literatur zur Zeittafel

– 255

– 274

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

243 2.2 · Zellkulturtechniken, Zellmodelle und Tissue Engineering

2.2.1 Einleitung Die moderne Zell- und Molekularbiologie ist ohne den Einsatz von Zell- und Gewebekulturen nicht denkbar. Die „In-vitro-Zellbiologie“ bildet heute die Grundlage für die Aufklärung grundlegender Wachstums- und Differenzierungsprozesse tierischer Zellen. Säugerzellkulturen finden Einsatz in der biomedizinischen Grundlagenforschung, der Virologie, Immunologie, Strahlenbiologie und Krebsforschung. Darüber hinaus spielen Zellkulturen eine große Rolle in der medizinischen Diagnostik (u. a. pränatale Diagnose, Tumordiagnostik), zur Herstellung von biologischen Wirkstoffen für Diagnostik, Prophylaxe und Therapie, zur Produktion von Impfstoffen und Arzneimitteln und für toxikologische Untersuchungen. Durch neueste Entwicklungen auf den Gebieten der Stammzellforschung und des Tissue Engineering werden Zellkulturen mehr und mehr Eingang in die regenerative Medizin finden. Seit den ersten Versuchen der Kultivierung neuronaler Gewebeexplantate von Froschembryonen durch Harrison (1907) und der Entwicklung von Zellkulturtechniken durch Carrell (1912), die den Beginn der Zellund Gewebezüchtung als eigenständige Disziplin begründeten, sind unzählige methodische Weiterentwicklungen erfolgt. Sie ermöglichen es heute, Zellen unter Bedingungen zu kultivieren, die diese zu komplexen Differenzierungs- und Stoffwechselleistungen befähigen und damit In-vivo-Bedingungen in vielen Aspekten nahe kommen. Im folgenden Beitrag werden einige grundlegende Zellkulturtechniken behandelt und häufig verwendete Zellmodelle, komplexe Zellsysteme und Differenzierungsmodelle sowie ausgewählte Verfahren des Tissue Engineering vorgestellt.1

2.2.2 Zellkulturtechniken 2.2.2.1 Etablierung einer Zellkultur Eine Zellkultur beginnt mit der sterilen Präparation und Dissoziation von Zellen aus Geweben eines Organismus. Zellkulturen können von Embryonen, fetalen Geweben, Gewebebiopsien oder Operationsmaterial erwachsener (adulter) Organismen angelegt werden, 1

Ausgenommen sind u. a. die Hybridomtechnologie, transgene Zellkulturen und Stammzelltransplantation, da diese in den Kapiteln 4.5, 4.6 und 4.4 behandelt werden. Im Hinblick auf methodische Grundlagen der Zellkultur, wie z. B. Laborausrüstung, Sterilisationstechniken, Medienherstellung und Kulturgefäße, wird auf die einschlägige Literatur verwiesen (Freshney 1994; Pollard u. Walker 1997; Doyle et al. 1998; Lindl 2002; Doyle u. Griffith 2000; Masters 2000).

2.2

wobei fetale Zellen in der Regel besser wachsen als adulte Zellen. Die Wahl geeigneter Kulturmedien und Seren, der Zusatz von Supplementen oder die Verwendung serumfreier Kulturen (Maurer 1992) wird von vielen Faktoren bestimmt, u. a. vom Organismus, dem Zelltyp sowie der Aufgabenstellung und den spezifischen Anforderungen (Freshney 1994). Heute werden Zellkulturmedien unter standardisierten Bedingungen nach den Regeln einer „guten Herstellungspraxis“ („good manufacturing practice“) hergestellt, nach Richtlinien für sachgemäße Lagerung („good storage practice“) gelagert und mit quantitativen und qualitativen Angaben der Bestandteile angeboten. So sind spezifische Medien zur Kultur von Insektenzelllinien (z. B. Schneider, SF, Grace), Mauszellen (z. B. Dulbeccos modifiziertes Eagle-MEM), Hybridomzellen (z. B. RPMI, Iscoves modifiziertes DMEM) oder menschlichen Zellen (z. B. Hams F10) verfügbar. Auch die Kultivierungstemperatur richtet sich nach Organismus und Zelltyp. Die für die meisten Säugerzellen verwendete Temperatur von 37 °C muss für Zellen von Kaltblütern verringert werden, so z. B. für Fischzellkulturen auf 20 °C. Das verwendete Gasgemisch hängt von der Pufferung des Mediums ab. Natriumhydrogenkarbonat- und HEPES-gepufferte Medien werden am häufigsten eingesetzt. Meist wird ein Gasgemisch gewählt, das 5% CO2 in Luft enthält. Zum Anlegen einer Zellkultur werden die Gewebestücke von Blut- und Plasmabestandteilen, von unerwünschten Geweben, sowie von nekrotischen Anteilen befreit. An die mechanische Präparation schließt sich in der Regel eine enzymatische Dissoziation der Gewebefragmente an. Häufig verwendete Enzymlösungen zur Gewebedissoziation sind Trypsin (0,1–0,25%), TrypsinEDTA, Kollagenase, Pronase, Hyaluronidase und Dispase. Ein synthetischer Puffer zur schonenden Zell- und Gewebedissoziation ist AccutaseTM. Enzymfreie Dissoziationspuffer ergeben jedoch nicht bei allen Geweben zufriedenstellende Resultate. Bei Explantatkulturen werden Gewebeexplantate in wenig Medium direkt auf die Kulturunterlage übertragen, wo nach einigen Tagen Zellen aus dem Explantat auswachsen. Diese Methode findet vielfach bei der Kultur menschlicher Fibroblasten Anwendung. Problematisch kann die Explantatkultur sein, wenn aufgrund des Wachstums „unerwünschter“ Zellen die eigentlich zu etablierenden Zellen überwachsen werden. So kann z. B. die unerwünschte Vermehrung von Fibroblasten durch Pferdeserum verhindert werden. Zur Fraktionierung und Separation von Zellen können Dichtegradientenzentrifugation, flowzytometrische Sortierung (FACS) oder magnetische Separationsverfahren (MACS) eingesetzt werden (Freshney 1994).

244

Sektion 2 · Modelle

Zur Erhöhung der Adhäsions- und Migrationseigenschaften von Zellen werden Kulturgefäße mit extrazellulären Matrixproteinen wie Fibronektin, Collagen, Laminin oder Gelatine oder mit synthetischen Proteinen wie Poly-D-Lysin oder Poly-Ornithin beschichtet. Präparationsprotokolle zum Anlegen von Zellkulturen sind u. a. bei Lindl (2002), Freshney (1994) und Doyle et al. (1998) beschrieben. Im lebenden Organismus werden Zellen und Gewebe durch Blutgefäße mit Nährstoffen versorgt und von Stoffwechselprodukten entsorgt. Diese Aufgabe muss in der Zellkultur durch das Medium erfolgen. Während Nährstoffe wie Aminosäuren, Vitamine und Spurenelemente in der Regel in ausreichender Menge verfügbar sind, ist die Versorgung der Zellen mit Sauerstoff ein limitierender Faktor. Eine Zellpopulation kann in Kultur eine Zelldichte von maximal 2u107 erreichen. Dabei werden die Nährstoffe des Mediums metabolisiert und toxische Stoffwechselprodukte akkumuliert, was zu einer Verschiebung des pH-Werts ins saure Milieu führt. Insbesondere Tumorzellen und undifferenzierte Stammzellen verfügen über sehr hohe Proliferationsraten (Zellverdopplungsraten von 8–10 h), während permanente Linien differenzierter Zellen mit geringerer Stoffwechselaktivität wesentlich längere Generationszeiten (24 h und mehr) besitzen. Bei der routinemäßigen Zellkultur wird in der Regel zwischen der Subkultur (Passagierung) ein Mediumwechsel durchgeführt. Die Passagierung dient dazu, einer Zellpopulation, die aufgrund ihrer Zelldichte in ihrem weiteren Wachstum gehemmt wäre, eine Vermehrung zu ermöglichen. Dazu werden die Zellen im Verhältnis 1:2 bis 1:10 auf neue Kulturgefäße übertragen.

2.2.2.2 Wachstumsverhalten von Zellen in Kultur Nicht alle Zellen lassen sich leicht in eine Zellkultur überführen. Beim Übergang vom Wachstum im Gewebeverband zum isolierten Zellwachstum in Kultur unterliegen die Zellen vielfältigen Veränderungen und Adaptationsprozessen. In morphologischer Hinsicht zeigen kultivierte Zellen z. B. eine „epithelioide“ oder „fibroblastoide“ Morphologie (> Abb. 2.2.1), sie können genetische Veränderungen (Genmutationen, numerische und/oder strukturelle Chromosomenaberrationen) erfahren oder biochemische Eigenschaften verlieren. In genetischer Hinsicht unterscheidet man grundsätzlich zwischen x diploiden „normalen“ Zelllinien und x permanenten, transformierten Zelllinien, die „spontan“ (durch unbekannte Umweltfaktoren) während der Adaptation an die Zellkulturbedingungen oder

c

a b

. Abb. 2.2.1a-c. Morphologie von Zellen etablierter Linien mit fibroblastoiden (a) und epithelioiden (b) Wachstumseigenschaften, bzw. von Stammzellen oder Tumorzellen (c)

gezielt durch Viren bzw. mutagene Substanzen maligne transformiert wurden. Der Begriff der „malignen“ Transformation ist von dem der „genetischen“ Transformation zu unterscheiden: Mit der Einführung von DNA in Eukaryontenzellen ist nicht notwendigerweise eine maligne Transformation der Zellen verbunden; die Aufnahme von fremder DNA kann jedoch zu maligner Transformation führen. Während die Lebensfähigkeit diploider Zellen begrenzt ist, sind permanente („etablierte“) Zelllinien zeitlich unbegrenzt kultivierbar. Wachstumsphasen Die Lebensdauer von Zelllinien ist von der Spezies, dem Alter des Spenders, vom Zelltyp und den Kulturbedingungen abhängig. Dabei scheint ein Zusammenhang zwischen der maximalen Lebensdauer von Individuen einer bestimmten Art und deren Zellwachstum in Kultur zu bestehen. Hayflick und Moorhead beschrieben bereits 1961, dass menschliche Fibroblasten in Kultur nicht unbegrenzt vermehrungsfähig sind, sondern dass Mensch- und Mauszellen unterschiedliche Wachstumsphasen durchlaufen (> Abb. 2.2.2): In Phase I adaptieren sich explantierte Zellen an die Kulturbedingungen, vermehren sich und bilden eine Primärkultur. Phase II ist durch konstante Zellvermehrung gekennzeichnet. Die Phase II kann bei menschlichen Zellen etwa 50 Passagen betragen, während sie bei Mauszellen nur etwa 5–10 Passagen andauert. Demzufolge tritt Phase III, charakterisiert durch Absinken der Proliferationsfähigkeit und Auftreten irreversibler degenerativer Zellveränderungen, bei Zellen des Menschen oder der Maus zu unterschiedlichen Zeiten ein. Sind Zellen in Phase III nicht spontan transformiert, sind sie nicht mehr vermehrungsfähig. Werden Zellen in dieser Phase jedoch spontan „maligne“ transformiert, dann kann dies zur Etablierung einer permanenten Zelllinie führen, die unbegrenztes Wachstum zeigt. Während sich Zellen von Nagetieren relativ leicht etablieren lassen, sind Zellen anderer Spezies, z. B. von Mensch, Huhn oder Rind, re-

245 2.2 · Zellkulturtechniken, Zellmodelle und Tissue Engineering

. Abb. 2.2.2. Wachstumsphasen und Lebensdauer von Zellen des Menschen und der Maus in Kultur. Phase I: Adaptationsphase, Phase II: Wachstumsphase, bei der Maus 5–10, beim Menschen ca. 50 Passagen, Phase III: Degenerative Phase. Werden Zellen in diesem Stadium spontan transformiert, können unbegrenzt „permanent“ wachsende Linien etabliert werden. Nach neuesten Befunden kann durch effiziente Kulturmedien die Phase II bei Mauszellen signifikant verlängert werden

lativ stabil gegenüber einer Transformation zum unbegrenzten Wachstum. Differenzierte Zellen permanenter Linien zeichnen sich durch sog. „Kontakthemmung“ aus, d. h., bei Erreichen eines konfluenten Zellrasens wird die Zellvermehrung blockiert (> Tab. 2.2.1). Dagegen bilden viele etablierte Zelllinien bei Erreichen der Konfluenz Zellaggregate („Foci“) aus, die über eine reduzierte Kontakt- und Zellteilungshemmung, verbunden mit verringerter Adhäsionsfähigkeit, verfügen. Während diploide Zellen über einen normalen („euploiden“) Karyotyp verfügen, sind etablierte Zelllinien im Hinblick auf Morphologie und Karyotyp meist heterogen. Ein Maß für die genetische Stabilität/Heterogenität ist die „stem-line“ („Stammlinie“), die den prozentualen Anteil von Zellen mit der häufigsten Chromosomenzahl repräsentiert (> Abb. 2.2.3). Proliferation Bei der Vermehrung von Zellen etablierter Linien können grundsätzlich 5 Wachstums- oder Proliferations-

2.2

phasen (> Abb. 2.2.4) unterschieden werden, deren Verlauf und Dauer vom Zelltyp, von der Einsaat-Zelldichte sowie den Kulturbedingungen, wie z. B. Nährstoffen und pH-Wert des Mediums, abhängen. Während der Latenzzeit (lag-Phase) adaptieren sich die Zellen an die Wachstumsbedingungen der Zellkultur, ehe in der Phase des exponentiellen (logarithmischen) Zellwachstums gleichmäßige Zellteilungen stattfinden. In dieser Phase kann die durchschnittliche Wachstumsrate sowie die Generationszeit einer Zellpopulation ermittelt werden. Die durchschnittliche Wachstumsrate (Wr) lässt sich nach folgender Formel berechnen (Halle 1976): Wr = (log2 Nt  log2 N0) : t = 3,3219 (lg Nt  lg N0) : t mit N0 Zellzahl zum Zeitpunkt 0, Nt Zellzahl zur Kultivierungszeit t (in Tagen); log2 Logarithmus zur Basis 2, lg Logarithmus zur Basis 10. Aus dieser Formel leitet sich die Verdopplungszeit (tv) der untersuchten Zellpopulation ab, wobei tv der durchschnittlichen Generationszeit der Population in der Phase exponentiellen Wachstums entspricht: tv = 1 : Wr Während der Verzögerungsphase verringert sich die Wachstumsrate, und die Zellpopulation geht bei einer Zelldichte von 5u104 bis 5u105 Zellen/cm2 in die stationäre Phase über. In dieser Plateauphase besteht ein Gleichgewicht zwischen Vermehrung und Absterben von Zellen. Diploide Zellen sind zu einem konfluenten Monolayer ausgewachsen, und aufgrund der Kontakthemmung der Zellen findet keine weitere Zellvermehrung statt. Dieser Gleichgewichtszustand kann über mehrere Wochen andauern. Der größte Teil der Zellpopulation befindet sich in der G1-Phase des Zellzyklus. Zellen in der stationären Phase werden z. B. eingesetzt, um Medien zu „konditionieren“, d. h., im Kulturüberstand von Zellen werden Proteine (Enzyme, Wachstumsfaktoren) angereichert, die das Wachstum anderer . Abb. 2.2.3. Stammlinien- („stem-line“-) Chromosomenzahl von chinesischen Hamsterzellen (n=22 Chromosomen) der Linie V79, mit heteroploidem, tetraploidem und diploidem Chromosomensatz

246

Sektion 2 · Modelle

. Tab. 2.2.1. Allgemeine Eigenschaften normaler und transformierter Zellen. Parameter

Normale Zellen (Primärkultur)

Transformierte Zellen (Permanente Zelllinie)

Kultivierbarkeit/Subkultur

begrenzt kaum Wachstum in Suspension

unbegrenzt Wachstum in Suspension; Koloniebildung in Soft-Agar

Karyotyp

diploid: Euploidie

heteroploid: Aneuploidie, Polyploidie

Zellpopulation

heterogen

homogen

Zellmorphologie

heterogen Zellen groß

homogen Zellen kleiner, rund

Kern-Zytoplasma-Verhältnis

gering

hoch

Wachstumsrate

niedrig

hoch

Generationszeit

~ 36–48 h

~ 12–24 h

Klonierungseffizienz

gering

hoch

Serumabhängigkeit/ Wachstumsfaktorabhängigkeit

hoch (10–20% Serum)

gering (5–10 % Serum)

Tumorigenität

gering

hoch

Differenzierungsleistung

meist vorhanden

begrenzt

Adhäsionseigenschaften

hoch „Kontakthemmung“ des Wachstums

geringer geringe„Kontakthemmung“, Bildung von„Foci“

Zellmembran/Agglutinierbarkeit

keine Agglutinierbarkeit durch Lektine

veränderte Membraneigenschaften, hohe Agglutinierbarkeit durch Lektine

Zellen unterstützen. Bei längerer Kultur in der stationären Phase treten aufgrund von Nährstoffmangel, durch Akkumulation toxischer Substanzen im Medium (pH-Wert-Abfall) unphysiologische Bedingungen auf, sodass die Zellpopulation in die Regressions- oder Absterbephase übergeht (> Abb. 2.2.4).

Es sind zahlreiche Methoden zum Nachweis der Proliferationsfähigkeit von Zellen entwickelt worden, wie u. a.: x Zellzählung mit dem Hämozytometer, x Messung der Zellvermehrung über Einbau radioaktiv markierten 3H-Thymidins,

. Abb. 2.2.4. Proliferationsphasen von Zellen etablierter Linien in Kultur. Aus der durchschnittlichen Wachstumsrate kann in der Phase der exponentiellen Zellvermehrung aus der Zellzahl (N0) zum Zeitpunkt „0“ und der Zellzahl (Nt) zum Zeitpunkt „t“ die Generationszeit ermittelt werden

247 2.2 · Zellkulturtechniken, Zellmodelle und Tissue Engineering

x Bromdesoxyuridin- (BrdU-)Markierung, x elektronische Zellzählung, sowie x fluorimetrische und spektrophotometrische Methoden. Zytophotometrie und Time-lapse-Kinematographie geben Aufschluss über die Dynamik einer individuellen Zellpopulation. Klonierung Ein weiterer Parameter zur Charakterisierung einer Zellkultur ist ihre Plattierungs- oder Klonierungseffizienz (PE). Nach Einsaat einer definierten Anzahl von Einzelzellen werden nach etwa 1-wöchiger Inkubation die (aus jeweils einer einzelnen Zelle) gebildeten Klone mit einem Proteinfarbstoff (z. B. Kristallviolett) angefärbt und der prozentuale Anteil gebildeter Kolonien (bestehend aus ca. 50–100 Zellen/Klon) ermittelt. Während die Bestimmung der Koloniebildungsrate von adhärent wachsenden etablierten Zelllinien auf gängigen Gewebekulturschalen erfolgt, muss für Tumorzellen, hämatopoetische Stammzellen und verschiedene transformierte Linien eine Klonierung in semisoliden Medien, wie z. B. in Softagar oder Methylzellulose, erfolgen. Es gibt Hinweise dafür, dass die in vitro ermittelte „colony forming efficiency“ (CFE) die Stammzellpopulation eines Tumors definiert. Die PE kann variieren zwischen: x 0,001 und 5% (primäre menschliche Tumoren, hämatopoetische Zellen), x 1 und 5% (menschliche Keratinozyten), x 20 und 60% (menschliche Fibroblasten) und x 50 und 100% (etablierte Zelllinien). Lebensfähigkeit (Viabilität) Zum Nachweis der Lebensfähigkeit einer Zellpopulation kann eine Vitalfärbung z. B. mit Trypanblau (Lindl 2002) durchgeführt werden. Der Test beruht darauf, dass tote Zellen aufgrund von Membranschädigungen den Farbstoff aufnehmen und angefärbt werden, während lebende Zellen mit intakter Zellmembran farblos bleiben. Über die reproduktive Fähigkeit einer Zellpopulation gibt jedoch nur der Koloniebildungstest Auskunft. Für Zytotoxizitätsanalysen werden Testverfahren eingesetzt, die nach Einwirkung toxischer Substanzen z. B. die Stoffwechselaktivität der Zellen erfassen und anschließend mit unterschiedlichen Färbereaktionen quantitativ nachgewiesen werden. So werden der Neutralrot- oder Tetrazolium(MTT)-Test sowie der Kenazidblau-Test in Verbindung mit kolorimetrischen Messverfahren routinemäßig in Toxizitätsanalysen eingesetzt. Vergleichende Zytotoxizitätsstudien haben ergeben, dass eine Korrelation zwischen der akuten Toxizität in vivo (LD50) und der an kultivierten Zellen ermittelten Zytotoxizität (IC50) besteht (Halle u. Spielmann 1994). Diese

2.2

Untersuchungen sind vor dem Hintergrund der Bemühungen um die Schaffung von Ersatz- und Ergänzungssystemen zum Tierversuch von großer Bedeutung [3R-Konzept: „refine, reduce, replace“, nach Russel u. Burch (1959)]. Zellzyklus Die Generationszeit einer Zelle ist durch den Lebenszyklus (Zellzyklus) der Zellen definiert und lässt sich in 4 Phasen einteilen. Der Zellzyklus beginnt mit einer postmitotischen G1-Phase, danach folgt die DNA-Synthese- oder S-Phase, gefolgt von einer prämitotischen G2-Phase, die in die Mitose- oder M-Phase übergeht. Die Mitosephase ist die kürzeste Phase des Zellzyklus. Liegen Zellen im Ruhestadium vor, spricht man von G0-Phase. Zellen in der G0-Phase (z. B. Lymphozyten des peripheren Blutes) können durch Zytokine zur Zellteilung induziert werden und wieder in den Zellzyklus eintreten. Zyklinabhängige Kinasen, CDKs, regulieren die Aktivität von Targetmolekülen, wie das RB-Protein (Retinoblastomprotein), über Phosphorylierungsreaktionen. Die CDKs selbst werden durch Aktivatoren (Zykline) oder Inhibitoren (p15, p16, p21, p27) reguliert. Darüber hinaus sind Tumorsuppressorgene, wie p53, und Wachstumsfaktoren, wie TGFE an Regulationsprozessen des Zellzyklus beteiligt. Durch die Interaktion der CDKs, Zykline und CDK-Inhibitoren werden Kontrollpunkte im Zellzyklus, sog. Checkpoints, an den Übergängen zwischen G1- und S-Phase und zwischen G2- und M-Phase reguliert. Mithilfe der Flowzytometrie (FACS) kann die Dauer der einzelnen Zellzyklusphasen ermittelt werden (Watson u. Erba 1992). Für flowzytometrische Analysen werden Suspensionen von Einzelzellen oder Zellkernen benötigt. Als Färbelösungen werden DNA-interkalierende Substanzen wie Ethidium- oder Propidiumjodid verwendet. Charakteristische DNA-Histogramme sind in > Abb. 2.2.5 dargestellt. Synchronisation Viele biochemische und molekularbiologische Experimente erfordern eine Anreicherung von Zellen in einer bestimmten Phase des Zellzyklus, die durch Zellsynchronisation erreicht wird. Eine Synchronisation kann durch chemische und physikalische Methoden oder durch FACS-Sortierung erzielt werden. Eine einfache Zellsynchronisation wird durch das Abschütteln mitotischer Zellen erreicht, da mitotische Zellen vorwiegend als runde Zellen auf dem Zellrasen liegen. Ein Nachteil dieser Methode ist die geringe Ausbeute (nur 5–8% der Gesamtzellzahl) und die Beschränkung auf adhärente Zellen. Dichtegradienten-Auftrennung in Ficoll-Gradienten ermöglicht die Anreicherung von Zellen aus statischen Suspensionskulturen. Um Zellen vorwiegend

248

Sektion 2 · Modelle . Abb. 2.2.5a,b. DNA-Histogramme von undifferenzierten embryonalen P19-Zellen (a) und differenzierten epithelialen EPI-7-Zellen (b). Die G0-/G1-Phase der differenzierten Zellen ist signifikant länger als die der undifferenzierten Stammzellen

in der G1-Phase anzureichern, kann eine Synchronisation durch Serumentzug oder Isoleucinmangel angewendet werden (Lindl 2002). Mithilfe der FACS-Sortierung können Zellen zu etwa 85% in der S-Phase angereichert werden (Doyle et al. 1998). Chemische Synchronisationstechniken beruhen auf der Blockierung des Zellzyklus und der anschließenden Selektion von Zellen. So kann die DNA-Synthese durch Antimetabolite wie 5-Fluordesoxyuridin blockiert werden. Den flowzytometrischen Techniken zur Zellsynchronisation ist in jedem Fall der Vorzug zu geben. Zellalterung Vor über 40 Jahren entdeckten Hayflick und Moorhead, dass kultivierte menschliche Zellen nur begrenzt kultivierbar sind, d. h., sich nur etwa 50 Passagen in Kultur vermehrten und danach abstarben, ein Phänomen, das auch als „Hayflick limit“ beschrieben wurde (Hayflick u. Moorhead 1961; Hayflick 1965). Ursachen für den Prozess der Zellalterung (Seneszenz) liegen in den Chromosomenenden. Mit der Anzahl der DNA-Replikation bzw. Zellteilungen werden die Chromosomenenden (Telomere) kürzer, und es wurde eine Korrelation zwischen der Verkürzung der Telomere und Zellalterung festgestellt. Die DNA der Telomere von Säugerzellen enthält Wiederholungen von Hexamersequenzen der Nukleotide TTAGGG. Das Enzym Telomerase synthetisiert und elongiert die Telomere während der DNA-Replikation und verhindert dadurch eine Verkürzung der Chromosomen. Während Stammzellen und Tumorzellen eine hohe Telomeraseaktivität besitzen, zeichnen sich Körperzellen in erwachsenen Organismen durch eine geringe Telomeraseaktivität aus. Während der Zellkultivierung nimmt mit zunehmender Anzahl der Passagen die Telomeraseaktivität ab. Dies ist mit einer Verkürzung der Telomere verbunden und kann letztlich zum Verlust der Chromosomenenden oder zu ihrer Fusion führen, sodass sich die Zellen nicht mehr teilen können („replikative Seneszenz“). Durch Übertragung des die Telomerase kodierenden Gens in telomerasenegative Zellen kann die Lebensspanne der Zellen verlängert werden.

Die Beziehung zwischen Telomeraseaktivität und Krebsentstehung sowie Telomeraseaktivität und Zellalterung hat praktische Bedeutung in der Biotechnologie und Konsequenzen für die Tumortherapie und Geweberegeneration. Durch die Einführung von Telomerase in normalerweise begrenzt kultivierbare menschliche Zellen kann die Produktion von kommerziell wichtigen Proteinen gesteigert bzw. erst möglich werden. Da Tumorzellen eine erhöhte Telomeraseaktivität aufweisen, kann in der Tumordiagnostik mit Telomerase-Assays („telomeric repeat amplification protocol“, TRAP-Assay) maligne Entartung nachgewiesen werden. Im Gegensatz zum Menschen gibt es nach neuesten Befunden offenbar bei somatischen Zellen von Nagern, wie Maus und Ratte, keinen derartigen Kontrollmechanismus der replikativen Zellalterung. Kürzlich wurde gezeigt, dass sich z. B. Oligodendrozyten und SchwannZellen länger als bisher bekannt in Kultur vermehren lassen und dass für Alterungsprozesse in Nagerzellkulturen offensichtlich die Kulturbedingungen ausschlaggebend sind. Demzufolge wäre die frühere Lehrmeinung, wonach Zellen der Maus nur für eine begrenzte Zeit – ohne maligne Transformation – in Kultur gehalten werden können, nicht mehr aufrechtzuerhalten. Das heißt, unter geeigneten Kulturbedingungen sind Nagerzellen im Gegensatz zu menschlichen Zellen in vitro offenbar zu kontinuierlichem Wachstum in der Lage. Als Erklärung könnte dienen, dass die meisten Nagerzellen 5- bis 10-mal längere Telomere als menschliche Zellen und eine hohe Telomeraseaktivität haben. Hieraus ergibt sich die Frage, ob aus dem Verhalten der Telomere in kultivierten Zellen auf die Alterung des Organismus bzw. auf Tumorentwicklung geschlossen werden kann. Obwohl Alterungsprozesse nicht allein auf der Basis der Telomerlänge definiert werden können, besteht offenbar eine Korrelation zwischen Telomeraseaktivität und Alterung sowie Tumorentstehung. Diese Frage hat neue Bedeutung im Zusammenhang mit der Reprogrammierung adulter somatischer Zellkerne erlangt, ein Verfahren, das zur Klonierung des Schafs „Dolly“ führte (Wilmut et al. 1997). Die Fusion eines somatischen Zellkerns (mit kürzeren Telomerenden

249 2.2 · Zellkulturtechniken, Zellmodelle und Tissue Engineering

und geringerer Telomeraseaktivität) in eine enukleierte Eizelle erlaubte die Überprüfung der Telomerhypothese der Zellalterung im Verfahren des somatischen Kerntransfers (SCNT, „therapeutisches Klonen“). Die Untersuchungen ergaben ein überraschendes Resultat: In den rekonstruierten Embryonen wurde eine höhere Telomeraseaktivität als in den Donorzellen nachgewiesen, was darauf hinweist, dass durch den somatischen Kerntransfer (SCNT) die proliferative Kapazität der alternden Donorzellen wiederhergestellt wurde. Der Befund, dass durch Kerntransfer in enukleierte Eizellen somatische (gealterte) Zellen wieder in ein jugendliches Stadium überführt werden können (Lanza et al. 2000a), wird zukünftige Bedeutung für die Stammzellforschung und regenerative Zelltherapie haben. Ebenso werden die neuen Daten zur induzierten Pluripotenz somatischer Zellen durch 4 Pluripotenzgene die Stammzellforschung revolutionieren (7 2.2.7).

2.2.2.3 Charakterisierung zellulärer Leistungen Etablierte Zelllinien werden neben ihren Wachstumseigenschaften durch morphologische, genetische, biochemische und serologische Parameter charakterisiert. Für die Zellkultur wurden Richtlinien für „gute Zellkulturpraxis“ („good cell culture practice“, GCCP) zur Standardisierung und Qualitätssicherung – ähnlich den Grundsätzen der „good laboratory practice“ (GLP) – erarbeitet, die für alle Arbeiten mit Zellkulturen, insbesondere in der industriellen Forschung und für die Zulassung von Zellkulturprodukten bindend sein sollten. Sie enthalten Mindestanforderungen, die Qualität, Aussagekraft, Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit in der Zellkultur gewährleisten (Hartung et al. 2001). Morphologische Eigenschaften

Während differenzierte Zellen von Primärkulturen (z. B. Skelettmuskelzellen, Endothelzellen, Keratinozyten) häufig eine dem terminalen Entwicklungsstadium entsprechende Morphologie auch in Kultur ausprägen, erlangen viele etablierte Zelllinien im Verlauf der Kultivierung eine „epithelioide“ (> Abb. 2.2.1a) oder „fibroblastoide“ (> Abb. 2.2.1b) Morphologie. Diese wird u. a. von Wachstumsphase, Differenzierungsstadium, Substrat und Kulturmedium beeinflusst (Freshney 1994). Auch die Form der Kolonien ist ein wertvoller morphologischer Parameter zur Charakterisierung einer Zelllinie. Ein Hinweis auf den Differenzierungszustand von Zellen gibt auch das Kern-Zytoplasma-Verhältnis: Stammzellen und Tumorzellen zeichnen sich durch ein hohes Kern-Zytoplasma-Verhältnis aus (> Abb. 2.2.1c). So sind Tumorzellen bereits wegen ihres hohen Kern-Zytoplas-

2.2

ma-Verhältnisses durch starke Kernfärbung im Gewebeverband zu erkennen. Genetische Parameter

Eine Zelle ist durch ihr Genom, die Gesamtheit der genetischen Information, definiert, welche nahezu ausschließlich in den Chromosomen lokalisiert ist. Ein Charakteristikum jeder Zelllinie ist deshalb auch der Chromosomensatz oder Karyotyp. Die mikroskopische Analyse des Chromosomensatzes von Zellen ist meist die erste direkte Untersuchungsmethode, um die Spezies und eventuelle Abnormalitäten in Anzahl und Struktur von Chromosomen festzustellen. Bei der pränatalen Diagnose werden die Anzahl der Chromosomen, sowie eventuelle strukturelle Chromosomenabnormalitäten (Chromosomenaberrationen) erfasst. Oft verändern Zellen während der Anpassung an die Zellkultur (durch „spontane“ Transformation) ihren Chromosomensatz, d. h. werden aneuploid oder polyploid. Eine Aussage über die genetische Homogenität bzw. Heterogenität erlaubt die „stem-line“ (> Abb. 2.2.3). Je höher der prozentuale Anteil von Zellen mit dem normalen speziesspezifischen Chromosomensatz ist, desto homogener ist eine Zelllinie. Die Stem-line einer permanenten Zelllinie sollte nicht unter 50% liegen, optimal ist eine Stem-line zwischen 85% und 95%. Die Darstellung des Karyotyps einer Zelllinie allein erlaubt meist noch keine Aussage über mögliche Strukturveränderungen einzelner Chromosomen. Insbesondere die Chromosomen der Maus sind wegen ihrer akrozentrischen Morphologie schwer voneinander zu unterscheiden, und auch menschliche Chromosomen können nach konventioneller Chromosomenfärbung auf der Basis unterschiedlicher Zentromerlokalisierung nur in verschiedene Gruppen (A–E, XY) eingeteilt werden. Zur Identifizierung einzelner Chromosomen wurden verschiedenste Markierungstechniken entwickelt, die eine Identifizierung von Chromosomen nach ihren spezifischen Bandenmustern erlauben (7 Kap. 1.3 „Zytogenetische Grundlagen“). Die verschiedenen Bandentechniken erfordern gute Chromosomenpräparationen im Hinblick auf Mitose-Index und Spreitung der Metaphasechromosomen. Die häufigsten angewendeten Chromosomen-Bandingtechniken sind: 1. G-Banden: Trypsin-Giemsa-Banden, 2. Q-Banden: Quinacrin-Fluoreszenz-Banden, 3. C-Banden: konstitutive Heterochromatin-Banden und 4. R-Banden: reverse Giemsa-Banden. Eine exakte Typisierung von Zellen wird durch DNAFingerprinting erreicht. Die Methode ergibt individualspezifische Muster des Restriktions-Fragment-LängenPolymorphismus (RFLP) von Zellen. Jedes Individuum

250

Sektion 2 · Modelle

verfügt über eine individuell definierte DNA-Zusammensetzung, die nach Verdauung der DNA mit Restriktionsendonukleasen, Auftrennung in Agarose-Gelen, Southern-Blotting, und Hybridisierung mit autoradiographisch markierten einzelsträngigen DNA-Proben nachgewiesen werden kann. Aufgrund der individuellen Spezifität ist die DNA-Fingerprint-Technik eine Methode in der forensischen Medizin geworden und wird zur Charakterisierung von Zelllinien und zum Nachweis von Kreuzkontaminationen eingesetzt. Eine weitere Möglichkeit zur genetischen Charakterisierung und Identifizierung von Zelllinien bietet die PCR- („polymerase-chain-reaction“-)Technik mithilfe von gewebespezifischen Gensequenzen. Darüber hinaus können mit der FISH- („fluorescent in situ hybridization“-)Technik individuelle Genorte auf Chromosomen lokalisiert werden: Nach Hybridisierung biotin- oder digoxigeninmarkierter spezifischer Nukleinsäureproben mit Chromosomen werden die gebildeten Komplexe durch Fluoreszenzsignale sichtbar. Biochemische und serologische Marker

Die Synthese- und Sekretionsleistungen von Zelllinien, die durch das spezifische Genexpressionsmuster der kultivierten Zellen definiert sind, haben für die In-vitroZellbiologie besondere Bedeutung. Die biochemischen Eigenschaften kultivierter Zellen sind durch die Spezies, den Zelltyp und das Entwicklungsstadium definiert. Zur Charakterisierung einer Zelllinie kann ein Isoenzymprofil bestimmt werden. Die Isoenzymanalyse beruht auf der Eigenschaft von Isoenzymen, gleiche Substratspezifitäten, aber verschiedene Molekularstrukturen aufzuweisen, und damit unterschiedliche elektrophoretische Mobilität nach Gelelektrophorese zu zeigen. Zusätzlich können Enzyme posttranslational während der Differenzierung modifiziert werden. Als besonders geeignete Parameter für Isoenzymanalysen gelten Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PD), Laktatdehydrogenase (LDH) und Nukleosidphosphorylase. Die spezies- und zelllinienspezifischen Zymogramme können auch Hinweise auf Kreuzkontaminationen geben. Für biochemische Arbeiten ist es oft erforderlich, rein synthetische Kulturmedien (Maurer 1992) zu verwenden, um Zellprodukte nachzuweisen, oder Synthese oder Abbau zu studieren. Untersuchungen zum Kohlenhydratstoffwechsel oder Aminosäuremetabolismus kultivierter Zellen können mithilfe von HPLC- und NMR-Studien (Doyle et al. 1998) durchgeführt werden. Auch unter Bedingungen der Kultur in synthetischen Medien ist es heute möglich, zelluläre Differenzierungsleistungen in vitro zu erhalten. Eine spezifische Syntheseleistung nach Differenzierungsinduktion ist z. B. der Anstieg der Aktivität der Kreatinkinase in myogenen Zelllinien, oder die Bildung des P450-Enzyms in Hepato-

zyten. Zur Charakterisierung funktioneller Eigenschaften differenzierter und spezialisierter Zellen, z. B. von Nerven- und Muskelzellen dienen spannungsabhängige und rezeptoroperierte Ionenkanäle. Zum Nachweis gewebespezifischer Differenzierung von kultivierten Zellen eignen sich weiterhin Zelloberflächenantigene (insbesondere für hämatopoetische und embryonale Stammzellen) und Histokompatibilitätsantigene (Hay 1992), sowie auch intrazelluläre Strukturproteine. Hier sind es insbesondere Intermediärfilamentproteine des Zytoskeletts, die mit immunhistochemischen Techniken eine Unterscheidung differenzierter Zellen erlauben. So sind endodermale und epitheliale Zellen durch das Vorkommen von Zytokeratinen, kardiogene und myogene Zellen durch Desmin, neuronale Zellen durch Neurofilamentproteine und Astrozyten durch gliafibrilläres saures Protein (GFAP) charakterisiert. Vimentin ist charakteristisch für mesenchymale Zellen. Es hat sich aber gezeigt, dass Vimentin als Zytoskelettbestandteil fast aller in vitro kultivierter Zellen vorkommt und deshalb als gewebespezifischer Zellmarker weniger geeignet ist. Absterben von Zellen in Kultur: Seneszenz, Apoptose und Nekrose

Nichttransformierte Zellen haben in Kultur eine begrenzte Lebenszeit. Das Ende der Proliferationskapazität, die zu „zellulärer Seneszenz“ oder Zelltod führt, kann jedoch sehr verschiedene Ursachen haben und unterschiedliche biochemische Prozesse beinhalten. Danach ist zwischen Seneszenz, Apoptose und Nekrose zu unterscheiden. Seneszenz. Seneszenz, d. h. Zellalterung einer Population, tritt ein, wenn Zellen sich – auch in Anwesenheit von Mitosestimuli – nicht mehr teilen können. Zellalterung wurde u. a. in diploiden menschlichen Fibroblasten untersucht, die nach 30 bis 60 Zellverdopplungen ihr Wachstum einstellen. Zelluläre Seneszenz ist zu unterscheiden vom sogenannten Ruhestadium einer Population („quiescence“). Dieses wird durch Entzug von Wachstumsfaktoren, Serummangel oder Kontaktinhibition ausgelöst. Zur Erklärung des Phänomens der zellulären Seneszenz werden mehrere Hypothesen diskutiert: 1. Der Verlust der proliferativen Kapazität basiert auf einer Akkumulation von Schäden auf DNA-, RNAoder Proteinebene. 2. Zellalterung ist analog zu Differenzierungsprozessen genetisch programmiert. 3. Zelluläre Seneszenz entsteht als Folge genetischer Veränderungen. 4. Zellalterung erfolgt nach Überschreitung einer bestimmten Anzahl von Zellteilungen und Kulturpassagen aufgrund der Verkürzung der Telomere („replikative Seneszenz“).

251 2.2 · Zellkulturtechniken, Zellmodelle und Tissue Engineering

Apoptose und Nekrose. Nicht nur im lebenden Organismus, sondern auch in Kultur unterliegen Zellen einem kontrollierten und genetisch determinierten Prozess, der zum Absterben der Zellen führt. Dieses zelluläre Suizidprogramm, auch „programmierter Zelltod“ oder Apoptose genannt, ist mit morphologischen, biochemischen und physiologischen Veränderungen verbunden und ist vom physiologischen Zelltod (Nekrose) zu unterscheiden, der durch unphysiologische Bedingungen, u. a. pH-Wert-Veränderungen und Nährstoffmangel, hervorgerufen wird. Programmierter Zelltod ist von zentraler Bedeutung für die Entwicklung und Homöostase höherer Organismen. Apoptose spielt eine Rolle bei gestörten Zell-Zellund Zell-Matrix-Interaktionen („Anoikis“) und ist an zellulären Abwehrmechanismen, z. B. gegenüber Virusinfektionen oder ionisierender Strahlung, beteiligt. Weiterhin führt das Fehlen von Wachstumsfaktoren zu programmiertem Zelltod, während Apoptose-Regulatorgene (z. B. bcl-2) Apoptoseprozesse verhindern oder vermindern können. Während bei Nekrose eine Population membrangeschädigter Zellen lysiert, führt Apoptose zum Absterben einzelner Zellen. Ein Merkmal der Apoptose ist die Bildung von charakteristischen DNAbzw. Chromatinfragmenten. Ursache dieser Fragmentierung ist die Aktivierung einer endogenen, zellulären Endonuklease, die die DNA an spezifischen Orten schneidet (Wyllie 1980). Es entstehen Multimere von ca. 200 bp großen DNA-Fragmenten, die mit Histonproteinen assoziiert sind. Dieser spezifische DNA-Abbau ermöglicht den Nachweis von Apoptose in kultivierten Zellen. Zum quantitativen Nachweis von Apoptose kann eine Auftrennung in Agarose-Gelen mit anschließender Ethidiumbromidfärbung, ein SandwichELISA, oder Flowzytometrie durchgeführt werden. Zum qualitativen Nachweis von Apoptose in situ wurde ein zytochemischer Test auf der Grundlage der Bildung spezifischer Nukleosomen-DNA-Fragmente etabliert, der sog. TUNEL-Assay (TdT-mediated dUTP nick end-labelling) (Kill u. Faragher 2000): An 3‘-OH-Enden solcher doppel- oder einzelsträngiger DNA-Fragmente apoptotischer Zellen werden digoxigeninmarkierte Nukleotide gekoppelt, die über Bindung mit Fluoresceinkonjugaten immunhistochemisch nachgewiesen werden können. Da normale nichtapoptotische Zellen nur sehr wenige freie 3‘-OH-Enden enthalten, erlaubt diese Insitu-Technik eine Lokalisierung des programmierten Zelltods auf zellulärer Ebene. Aufgrund der Bedeutung von Apoptoseprozessen insbesondere für die Tumortherapie sind in den letzten Jahren neue Nachweistechniken eingeführt worden, die u. a. auf Veränderungen in der Zusammensetzung der Zellmembran-Phosphatidylserine (Annexin-V-Assay), der Aktivierung spezifischer Apoptoseenzyme (Cas-

2.2

pase-3-Assay) oder veränderten Mitochondrien-Membranpotentialen beruhen. Für biotechnologische Verfahren ist es von großer Bedeutung, Apoptose infolge von Nährstoffmangel zu verhindern, um Zellen lange in großtechnischen Anlagen kultivieren zu können. Darüber hinaus kann der Apoptoseprozess biochemisch oder genetisch beeinflusst werden. So können antiapoptotische Gene (bcl-2) in Zellen transfiziert werden, was zu einer erhöhten Überlebensrate führen kann und zur Produktsteigerung eingesetzt wird.

2.2.2.4 Nachweis von Kontaminationen Zellkulturen können durch Bakterien, Viren, Mykoplasmen („pleuropneumonia-like organisms“, PPLO), Pilze oder Protozoen verunreinigt oder mit Zellen anderer Linien oder Spezies kontaminiert sein („Kreuzkontamination“). Kontaminationen durch Viren, Bakterien und Mykoplasmen

Mit Pilzen, Protozoen oder Bakterien verunreinigte Zelllinien sollten verworfen werden. Auch der Einsatz von Antibiotika (Bakterien: Gentamycin, Amphothericin B; Mykoplasmen: Fungizon, BM-Cyclin) bringt nicht den gewünschten Erfolg, da meist eine Restkontamination bestehen bleibt. Viren- oder Mykoplasmenkontaminationen können durch Serum und Trypsin bzw. durch unsterile Handhabung hervorgerufen werden. Bei Veränderungen der Zellmorphologie, Proliferationskinetik, biochemischen oder genetischen Eigenschaften einer Zelllinie sollte an die Möglichkeit einer Kontamination gedacht werden. Zum Nachweis von Mykoplasmen sind verschiedene Techniken entwickelt worden: 1. Kultur und Identifizierung der Mykoplasmen auf speziellen Nährböden, 2. Elektronenmikroskopie, 3. PCR-Analyse mit mykoplasmenspezifischen Sequenzen, 4. DNA-Färbung mit Bisbenzimid-Hoechst 33258 (Chen 1977). Es ist zu empfehlen, in regelmäßigen Abständen Zelllinien auf eventuelle Mykoplasmenkontamination zu überprüfen. Virale Kontaminationen in Zellkulturen können durch Elektronenmikroskopie oder mit Hämadsorptionstests nachgewiesen werden. Für den Nachweis einer Kontamination von Zelllinien mit viralen Sequenzen ist die PCR-Technik die Methode der Wahl. Sie erlaubt den Nachweis latenter, nur in wenigen Zellen und in geringer Menge erfolgter Infektionen. Neben proviraler DNA

252

Sektion 2 · Modelle

kann auch im Zytoplasma befindliche virale RNA mit der RT-PCR-Analyse erfasst werden. Mithilfe der PCR ist eine Unterscheidung der exogenen von den in Nagern zahlreich vorkommenden verwandten endogenen retroviralen Sequenzen auch auf proviraler Ebene möglich (so haben z. B. viele endogene Retroviren aus BALB/cMäusen eine 170–190 bp umfassende Insertion in der LTR-Region). Die Problematik viraler Kontaminationen ist insbesondere für die Vakzineproduktion oder die Herstellung monoklonaler Antikörper in Zellkulturen für humane Diagnostik und Therapie von großer Bedeutung. Kreuzkontaminationen

Ein besonderes Problem stellen Kreuzkontaminationen mit anderen Zelllinien bzw. Zellen anderer Spender oder anderer Gewebe dar (Nelson-Rees et al. 1981). So wurde festgestellt, dass von 466 Zelllinien 62 durch Kreuzkontamination mit anderen Zelllinien kontaminiert waren. Eine Charakterisierung und Identifizierung der verwendeten Zelllinien kann auf Grund von Chromosomenanalysen, Isoenzymmustern, durch serologische Methoden (Doyle et al. 1998), aber vor allem durch PCR- und DNA-Fingerprint-Techniken erfolgen.

2.2.2.5 Kryokonservierung Die Tiefkühlkonservierung von Zellkulturen ermöglicht eine Langzeitlagerung von Zellen unter Erhalt ihrer spezifischen Merkmale und Eigenschaften. Wesentliches Ziel der Kryokonservierung besteht darin, ungewollte Veränderungen (z. B. Differenzierung, Dedifferenzierung, Verlust von Syntheseleistungen) während fortlaufender Zellkultur zu verhindern. Als kritische Faktoren der Tiefkühlkonservierung gelten folgende Parameter: 1. Art und Qualität der kryoprotektiven Substanzen, 2. zeitliches Schema der Temperatursenkung während der Phase des Einfriervorgangs, 3. Verhinderung von Kristallwasserbildung beim Einfrieren, 4. Lagerungstemperatur und 5. Auftauvorgang. Kryoprotektive Substanzen (Vitrifikationsflüssigkeiten) verhindern beim Einfrieren eine Kristallwasserbildung in der Zelle. Substanzen zur Verhinderung der Kristallwasserbildung sind Dimethylsulfoxid (DMSO), Glyzerol sowie hohe Glucose- und Serumkonzentrationen, die dem auf 4 °C gekühlten Einfriermedium zugegeben werden. In der Regel wird 5–10% DMSO einem 10–20% serumhaltigen Medium mit hohem Glucosegehalt zugesetzt. Da DMSO selbst ein Induktor der Differenzierung ist, muss für Stammzelllinien ein optimaler Gehalt an

DMSO ermittelt werden. Sobald sich Zellen in DMSOhaltigem Medium befinden, sollte die Temperatur der Zellsuspension 4 °C nicht überschreiten. Eine Methode zur Kryokonservierung ist dann geeignet, wenn nach dem Auftauen der Zellen eine gute Überlebensfähigkeit und keine Veränderung der Differenzierungseigenschaften erreicht werden. Ein kritischer Faktor beim Einfriervorgang von lebenden Zellen ist die Kristallisationstemperatur. Es ist notwendig, dass Wärme, die während des Einfrierens entsteht, möglichst schnell abgeführt wird, um eine Kristallwasserbildung und damit verbundene Zellschädigung zu vermeiden. Langjährige empirische Erfahrungen haben gezeigt, dass während der Phase des Einfrierens die Temperaturabsenkung um etwa 1 °C/min erfolgen sollte. Als einfache Methode für die Konservierung von kultivierten Säugerzellen hat sich das Einstellen der gefüllten Kryoampullen in Styroporblöcke und 24 h Lagerung bei 80 °C und anschließende Überführung in flüssigen Stickstoff bei 196 °C erwiesen. Für erhöhte Anforderungen sind programmierbare Kryokonservierungsapparate entwickelt worden, die ein elektronisch kontrolliertes Absenken der Temperatur gewährleisten. Eine optimale Lagerung des Zellmaterials ist in flüssigem Stickstoff bei –196 °C gewährleistet. Es wurden inzwischen auch Techniken entwickelt, die ein Einfrieren von adhärenten Zellen ohne vorheriges Ablösen direkt auf der Kulturschale („in situ freezing“) ermöglichen. Entscheidend für die Überlebensfähigkeit der Zellen ist auch das rasche Auftauen der Zellsuspension. Zur Ermittlung der Lebensfähigkeit der Zellen nach der Kryokonservierung können der Trypanblau-Test und ein Klonierungstest durchgeführt werden.

2.2.3 Zellkulturmodelle Die anfänglich verwendeten Kultursysteme sind in den vergangenen 25 Jahren in einem Maße verfeinert worden, die es heute erlauben, Zellen unter Bedingungen zu kultivieren, die der In-vivo-Situation relativ nahe kommen. Dabei erlangen komplexe Differenzierungsmodelle eine immer größere Bedeutung.

2.2.3.1 Monolayer-Kulturen Die zweidimensionale einschichtige Kultur von Zellen wird als Monolayer-Kultur bezeichnet. Sie beruht auf der Eigenschaft von kultivierten Zellen, an Substrate zu adhärieren. Man unterscheidet zwischen x Primärkulturen, die nur über eine begrenzte Zeit in vitro kultiviert werden können, und

253 2.2 · Zellkulturtechniken, Zellmodelle und Tissue Engineering

x Kulturen von diploiden Zellstämmen und etablierten Zelllinien mit unbegrenzter Vermehrungsfähigkeit.

2.2

tion“-)Technik spezifisch markiert (Lichter u. Cremer 1992). Primärkultur von Tumorzellen

Primär- und Kurzzeitkulturen Von einer Primärkultur spricht man, wenn Zellen und Gewebe bis zur ersten Subkultur in vitro gehalten werden. Kultiviert man Zellen nur für wenige Tage, wie Lymphozyten des peripheren Blutes für 72 h, spricht man von Kurzzeitkulturen. Primärkulturen werden entweder nach enzymatischer Dissoziation von Gewebefragmenten oder aus Explantatkulturen angelegt. Primärkulturen sind zunächst heterogen, verfügen aber in der Regel noch über gewebespezifische Leistungen. Während der Phase der Adaptation an die Kulturbedingungen verlieren Primärkulturen viele ihrer morphologischen und biochemischen Eigenschaften. Primärkulturen sind nach wie vor für viele Untersuchungen geeigneter als etablierte Zelllinien, da sie dem ursprünglichen Zelltyp noch ähnlicher sind. Ein Nachteil liegt in ihrer begrenzten Vermehrbarkeit. Im Folgenden werden einige Beispiele für Kurzzeit- und Primärkulturmodelle vorgestellt, die besondere Bedeutung in der Zellforschung erlangt haben. Kurzzeitkultur menschlicher Lymphozyten

Bei der Einführung der Technik der Lymphozytenkultur des peripheren Blutes (Moorhead et al. 1960) waren noch relativ große Blutmengen erforderlich. Dagegen können heute Mikrokulturen angesetzt werden, die nur noch 0,2 bis 0,8 ml Ganzblut erfordern. Beim Umgang mit menschlichem Blut sind aufgrund der Virusinfektionsgefahr Sicherheitsmaßnahmen, wie das Tragen von Handschuhen und Arbeiten an einer sterilen Werkbank, zwingend vorgeschrieben. Nach der Blutentnahme unter Heparinzusatz zur Verhinderung von Blutgerinnung werden die Lymphozyten (bei Erwachsenenblut nach Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation) in Medium überführt. Durch Zusatz von Interleukinen werden die in der G0-Phase befindlichen Lymphozyten des peripheren Bluts mitotisch stimuliert und beginnen mit der Zellteilung. 48 h nach Kulturbeginn werden die Zellen mit Kolchizin versetzt, hypotonisch behandelt und fixiert. Nach Herstellung von Präparaten können Chromosomenfärbungs- und Banding-Techniken zur Karyotypisierung eingesetzt werden. Die Lymphozytenkultur ist eine der wichtigsten diagnostischen Techniken in der Humangenetik zur Aufklärung von numerischen und strukturellen Chromosomenaberrationen. Neben den Banding-Techniken werden in zunehmendem Maße einzelne Chromosomensegmente und Genorte auf den Chromosomen mit In-situ-Hybridisierungsmethoden, wie der FISH- und der CISS- („chromosomal in situ suppression hybridiza-

Für die Tumordiagnostik ist es häufig erforderlich, Zellkulturen aus humanen Tumoren zu etablieren. Ausgangsmaterial können solide Tumoren, neoplastische Exsudate oder Blutzellen sein. Die Kultur von Tumorzellen ergibt oft nur Erfolgsraten von 40 bis 60%, da Tumorzellen z. T. andere Nährstoffanforderungen als normale Zellen haben. Ein weiteres Problem stellt die Kontamination mit Fibroblasten und die Gefahr des „Überwachsens“ der Tumorzellpopulation dar. Deshalb erfordert die Kultur von Tumorzellen spezifische selektive Medien, Substrate, Feederlayer- und Klonierungstechniken (Freshney 1994). Primärkultur von Hepatozyten

Hepatozyten sind im Organismus für die Entgiftung und Metabolisierung von Xenobiotika verantwortlich – eine Aufgabe, die von Enzymen des Cytochrom-P450-Systems geleistet wird. Hepatozytenkulturen werden u. a. für Mutagenitäts- und Kanzerogenitätstests und für Stoffwechseluntersuchungen von Xenobiotika eingesetzt. Obwohl für die Hepatozytenkultur spezielle Medien entwickelt wurden, verlieren Hepatozyten während konventioneller Kultur ihre Lebensfähigkeit und ihre Stoffwechseleigenschaften. Durch die Verwendung spezifisch optimierter Medien, von extrazellulären Matrixproteinen, insbesondere Kollagen und anderen Matrixproteinen, Kokultur mit anderen Zelltypen, Supplementation des Mediums mit Hormonen und Aktivierung der Cytochrom-P450Enzyme können Hepatozyten auch unter Langzeitbedingungen kultiviert werden. Durch diese optimierten Kulturbedingungen sind heute geeignete Verfahren zur Hepatozytenkultur verfügbar, die auch während längerer In-vitro-Kultur die Aktivität des Cytochrom-P450-Enzymkomplexes aufrechterhalten und eine Metabolisierung von Xenobiotika ermöglichen (Lindl 2002). Kultur von Herzmuskelzellen

Herzzellen von Säugern sind bereits zum Zeitpunkt der Geburt nahezu vollständig differenziert. Herzzellen lassen sich jedoch als Primärkultur über eine begrenzte Zeitdauer kultivieren und für biochemische, molekularbiologische und pharmakologisch-physiologische Untersuchungen einsetzen (s. Lindl 2002) Die Herzzellen verfügen zunächst über spontane rhythmische Aktivität, exprimieren kardiale Gene und Proteine, bilden Sarkomerstrukturen und zeigen charakteristische Aktionspotentiale. Primäre Kulturen embryonaler oder neonataler Herzzellen dedifferenzieren jedoch im Verlauf weiterer Subkulturen und die Zellen verlieren ihre physiologische Aktivität. Durch verbesserte Kulturverfah-

254

Sektion 2 · Modelle

ren und den Einsatz von extrazellulären Matrixproteinen können Kardiomyozyten jedoch auch in komplexen Gewebeverbänden ihre Funktion erhalten (Eschenhagen et al. 1997). Darüber hinaus ist die Entwicklung von Herzzellen aus embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) gezeigt worden (Wobus u. Boheler 2005). Primärkultur von Skelettmuskelzellen

Skelettmuskelzellen können aus embryonalem oder neonatalem Muskelgewebe kultiviert werden (Freshney 1994). Die Kultur von Skelettmuskelzellen erwachsener Spender ist mithilfe der Kultur von Satellitenzellen möglich, die teilweise das Differenzierungsprogramm der Skelettmuskeldifferenzierung rekapitulieren. Satellitenzellen proliferieren, migrieren und fusionieren in vielkernige Myotuben. Extrazelluläre Matrixproteine verbessern den Kulturerfolg erheblich. Jedoch ist nach terminaler Differenzierung eine weitere Vermehrung der differenzierten Myotuben nicht mehr möglich. Primärkulturen von Nervenzellen

Nervenzellen aus embryonalem Gewebe können zwar als Primärkultur 3–4 Wochen in Kultur gehalten werden, sie verfügen jedoch nicht mehr über eine nennenswerte Proliferationskapazität (postmitotische Neuronen). An Primärkulturen sind neben der Analyse von Differenzierungsprozessen Untersuchungen zum Metabolismus von Transmittern, der Funktion neuronaler Rezeptoren sowie die Untersuchung von neurotoxischen Wirkungen möglich. Die Etablierung einer Nervenzellkultur, z. B. aus dem Kleinhirn von Mäusen, umfasst die mechanische Präparation, enzymatische Dissoziation und die Einsaat in Poly-D-Lysin-Laminin-beschichtete Kulturgefäße (Lindl 2002). Es wurden weiterhin Zelllinien von neuronalen und neuroendokrinen Tumoren (PC12) sowie von Teratokarzinomen etabliert, die u. a. in der Neurotoxizitätstestung eingesetzt werden. Neuronale Zelllinien wurden auch durch Immortalisierung gewonnen, aus transgenen Mäusen etabliert, bzw. können aus embryonalen Stammzellen generiert werden (Wobus u. Boheler 2005).

frei von endogenen Viren, was es ermöglicht, die Linie für die Produktion von Impfstoffen gegen humane Viren einzusetzen (Hayflick 1965). 1970 wurde eine zweite diploide Linie, MRC-5, gewonnen, die gleichermaßen für die Virusproduktion einsetzbar ist. Beide diploide Zellstämme zeigen nach etwa 50 Zellgenerationen erste Anzeichen natürlicher Alterungsphänomene und sterben in Kultur ab (> Abb. 2.2.4).2 Veränderungen der Wachstumseigenschaften sind mit Veränderungen der Genexpression von Onkogenen oder Tumorsuppressorgenen verbunden. So wurden vier Komplementationsgruppen für das Merkmal „unbegrenzte Teilungsfähigkeit“ identifiziert. Die Immortalisierung menschlicher embryonaler Fibroblasten erforderte die Expression von mindestens zwei kooperierenden Onkogenen, wie z. B. ras und myc, oder ras und SV40-large-T. Das Durchlaufen natürlicher Seneszenzerscheinungen in diploiden Zellen ermöglicht es, biologische Veränderungen zu untersuchen, die Zellen während der Alterung durchlaufen (Zytogerontologie). Zellpopulationen, die von normalen adulten Geweben abstammen, haben längere Populationsverdopplungszeiten als solche, die von embryonalen Zellen angelegt werden. Von allen Subkulturen können Zellen kryokonserviert werden, sodass relativ große Zellmengen kultiviert werden können. Eine Übersicht über Merkmale von nichtetablierten Primärzellkulturen und etablierten transformierten Zelllinien gibt > Tab. 2.2.2. Permanente (etablierte) Zelllinien

Permanente Zelllinien, die noch über gewebespezifische Eigenschaften verfügen, wurden aus verschiedensten Geweben etabliert und haben für zell-, molekularbiologische sowie biochemische Untersuchungen große Bedeutung erlangt (> Tab. 2.2.3). Zahlreiche Zelllinien werden in Zellbanken aufbewahrt3, die Angaben zu Spe2

Diploide Zellstämme und permanente Zelllinien Diploide Zellstämme

Für viele molekularbiologische und biochemische Untersuchungen sind homogene Zellpopulationen mit hohen Proliferationsraten erforderlich. Nach einer Anzahl von Subkulturen sterben Primärkulturen jedoch entweder ab oder transformieren in eine permanente Zelllinie mit unbegrenzter Lebensdauer. Deshalb war die Entwicklung des menschlichen diploiden Zellstamms („cell strain“) WI-38 durch Hayflick und Moorhead (1961) ein Meilenstein in der Geschichte der Zellkultur. Zellen der Linie WI-38 haben einen diploiden Karyotyp und sind

3

Obwohl diploide Zelllinien für die Vakzineproduktion verwendet wurden, sind in der Vergangenheit Zwischenfälle der Kontamination von Virusimpfstoffen aus primären diploiden Zellen bekannt geworden: Während des 2. Weltkriegs kam es zu Kontaminationen in Gelbfiebervakzine mit Hepatitis-B-Virus; in den 1950er Jahren war Poliovakzine aus primären Rhesusaffennierenzellen mit SV40 kontaminiert. Eine ausführliche Diskussion der Sicherheitsstandards von Zelllinien für die Vakzineherstellung findet sich bei Petricciani (1991) und Minor (1994). Einige wichtige Zellbanken sind: 1. American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA (USA) (http://www.atcc.org/contact.cfm) 2. European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Dawn, Salisbury, Wiltshire SP4 OBR, UK (www.ecacc.org.uk) 3. Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) – Bereich Menschliche und Tierische Zellkulturen – Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig (http:// www.dsmz.de)

255 2.2 · Zellkulturtechniken, Zellmodelle und Tissue Engineering

2.2

. Tab. 2.2.2. Häufig verwendete diploide Zellstämme und permanente Zelllinien (nach Freshney, 1994). Name

Morphologie

Herkunft

Karyotyp

Charakteristika

Diploide Zellstämme W1-38

fibroblastoid

Mensch, Lunge

diploid

Infektion durch menschliche Viren

MRC-5

fibroblastoid

Mensch, Lunge

diploid

Infektion durch menschliche Viren

Permanente Zelllinien BHK21

fibroblastoid

Syrischer Hamster, Niere

aneuploid

Transformierbar durch Polyoma-Virus

Caco-2

epithelioid

Mensch, Kolon

aneuploid

Transport von Ionen und Aminosäuren

HeLa

epithelioid

Mensch, Zervix

aneuploid

Expression von G6PD Typ A

L5178Y

Lymphozyt

Maus

aneuploid

Suspensionskultur, Mutationstestung

L929

fibroblastoid

Maus

aneuploid

L-Zell-Klon

P388

Lymphozyt

Maus

aneuploid

Suspensionskultur

STO

fibroblastoid

Maus

aneuploid

Feederlayer für embryonale Stammzellen

. Tab. 2.2.3. Beispiele permanenter Zelllinien, die Eigenschaften differenzierter Zellen ausprägen können (nach Freshney, 1994). Zellinie

Herkunft

Spezies

Marker

Friend Erythroleukämie

Milz

Maus

Hämoglobinsynthese

HL60

myeloische Leukämie

Mensch

Phagozytose

C6

Glioma

Ratte

GFAP-, GPDH-Synthese

L6

Skelettmuskel

Ratte

Myotubenbildung

MDCK

Niere

Hund

„Domes“, Ionen-Transport

HaCaT

Keratinozyten

Mensch

Keratinisierung

MCF-7

Brustdrüsengewebe

Mensch

„Domes“, α-Laktalbumin-Synthese

3T3

Embryo

Maus

Differenzierung in Adipozyten

zies und Zelltyp, Kulturmedium, Kultivierungsbedingungen, Morphologie, Virus- oder Mykoplasmenkontaminationen, Karyotyp und DNA-Fingerprints sowie Angaben zur Herkunft enthalten. Da die Proliferation von Primärkulturen differenzierter Zellen in Kultur limitiert ist, wurden viele permanente Linien etabliert, die zwar nicht mehr über die gesamte Differenzierungsleistung verfügen, jedoch als kontinuierliche Zelllinie kultivierbar sind. So können bestimmte Fragen zur neuronalen bzw. myogenen Differenzierung, zur Zytotoxizität oder Differenzierungsfähigkeit auch an Neuroblastomzellen bzw. an myogenen C2C12- oder L6-Zellen untersucht werden (> Tab. 2.2.3).

2.2.3.2 Kokulturen und organotypische Kulturen Im folgenden Kapitel stehen Kultursysteme im Mittelpunkt, die Zellen zu komplexen zellulären Leistungen befähigen. Feederlayer-Kultur

Viele Zellen lassen sich nur kultivieren, wenn sie auf einem „Ammennährrasen“, sog. Feederlayern, kultiviert werden. Die Feederzellen werden durch Bestrahlung oder Mutagenbehandlung in ihrer Proliferation irreversibel blockiert, behalten aber ihre Adhäsionseigenschaften und verfügen über Stoffwechselaktivität, sodass

256

Sektion 2 · Modelle

das Medium mit Proteinen angereichert wird, die den darauf wachsenden Zellen zur Verfügung stehen. Dabei können neben dem wachstumsstimulierenden Effekt durch diffusible Wachstumsfaktoren auch direkte ZellZell-Kontakte für den Feederlayer-Effekt verantwortlich sein. Als Feederlayer werden z. B. embryonale Mausfibroblasten, peritoneale Makrophagen oder fetale Zellen des Dünndarms (Freshney 1994) verwendet. Die Lebensfähigkeit von Neuronen kann z. B. durch Kultivierung auf einem Monolayer aus Gliazellen erheblich gesteigert werden. Kollagen-Gel-Kulturen

Wechselwirkungen von Zellen mit extrazellulären Matrixproteinen spielen eine wesentliche Rolle bei Entwicklungs- und Differenzierungsprozessen. So sind z. B. Kollagene, Fibronektin, Laminine und Proteoglykane für die Differenzierung von Herz-, Skelettmuskel und glatten Muskelzellen essenziell. Laminine oder synthetische Makromoleküle, wie Poly-D-Lysin, ermöglichen bzw. induzieren das Auswachsen von Neuronen. Komplexe extrazelluläre Matrixpräparate („Matrigel“) steigern die Differenzierungsfähigkeit vieler Zelltypen. Darüber hinaus spielen ECM-Proteine, insbesondere Proteoglykane, eine wichtige Rolle bei der Modulation der Wachstumsfaktoraktivität. Ebenso wird die Polarität verschiedener Zelltypen (Hepatozyten, Epithelzellen) von Matrixproteinen bestimmt. Besondere Bedeutung für die organotypische Kultur von Hepatozyten und Epithelzellen hat Kollagen I erlangt. Hepatozyten können aus Laborsäugern sowie der menschlichen Leber gewonnen und unter Verwendung

. Abb. 2.2.6. Organotypische Kokultur von Epithel- und Mesenchymzellen unter Vermittlung einer Kollagen-Matrix. Unter Kontrollbedingungen werden Keratinozyten nur auf Kollagen Typ I kultiviert (links). Kokulturen werden angelegt, indem mesenchymale Zellen

von Kollagen oder „Matrigel“ kultiviert werden. Eine weitere Optimierung im Hinblick auf die Zellfunktion wird durch Kokultur mit heterologen Zellen, bzw. in Bioreaktoren erreicht (Gerlach u. Neuhaus 1994). In organotypischen Kultursystemen von Hautepithel werden Epithelzellen mit mesenchymalen Zellen unter Vermittlung einer Kollagenmatrix kultiviert (> Abb. 2.2.6). Unter diesen Bedingungen erfolgt eine Reorganisation des mehrschichtigen Plattenepithels, das sowohl hinsichtlich Gewebearchitektur, Zellproliferation und Zellfunktion eine weitgehende Vergleichbarkeit mit den Wachstums- und Differenzierungsfunktionen der Haut erlaubt. So differenzieren Epithelzellen in Keratinozyten und bilden Komponenten der Basalmembran. Kokulturen mit Hepatozyten

Die Kokultur von metabolisch aktiven Hepatozyten mit anderen Zellsystemen, die über spezifische Reportersysteme verfügen, erlaubt die Aktivierung von Pharmaka und Toxinen für den Nachweis von Zytotoxizität, Genotoxizität bzw. Kanzerogenität, da viele mutagene bzw. kanzerogene Substanzen erst durch metabolische Aktivierung durch Leberenzyme (Cytochrom-P450-Enzymkomplex) wirksam werden. Kokulturmodelle mit Leberzellen dienten zur Entwicklung eines In-vitro-Modells für den septischen Schock (Hartung u. Wendel 1993) oder von extrakorporalen Leber-Funktions-Systemen (Gerlach 1996). Die komplexen Kultursysteme tragen damit ganz wesentlich zur Entwicklung von alternativen Zellmodellen zum Ersatz und zur Ergänzung von Tierversuchen sowie zu neuen Therapieverfahren im Tissue Engineering bei.

unter (oben), bzw. in das Kollagen-Gel (unten) inkorporiert werden. Beide Kokulturen ermöglichen Proliferation und Differenzierung in normale Keratinozyten, die ein normal strukturiertes Epithel bilden können (nach Fusenig u. Boukamp 1994)

257 2.2 · Zellkulturtechniken, Zellmodelle und Tissue Engineering

2.2

Perfusionskulturen

Sphäroide und Konfrontationskulturen

Durch die bisher behandelten Kulturverfahren kann zwar die Differenzierungsleistung verbessert werden, die Ansammlung von zellschädigenden Stoffwechselmetaboliten wird jedoch nicht verhindert. Außerdem ist für viele Zelltypen, z. B. Nierenzellen oder Chondrozyten, das Wachstum als Monolayer untypisch. Um die Nachteile von Monolayer-Kulturen zu umgehen, wurden verschiedene Methoden der Perfusionskultur entwickelt, z. B. die permanente Durchströmung von Kulturen in Hohlfasersystemen, in Kapillarmembran-Bioreaktoren (Gerlach u. Neuhaus 1994) oder in speziellen Perfusionskammern, wobei die Zellen auf BiopolymerMembranen kultiviert werden (Minuth et al. 1992). Während die Kapillarmembran-Bioreaktoren kostenintensiv sind, ermöglicht die Membranperfusionskultur auf relativ einfache Weise eine Zellkultur auf einer individuellen Unterlage bei kontinuierlicher Nährstoffversorgung und erlaubt z. B. die Kultur von Knorpelzellen oder die Differenzierung von Nierentubuluszellen. Insbesondere im Tissue engineering haben matrixbeschichtete perfundierbare Bioreaktoren eine große Bedeutung (7 2.2.4„Tissue Engineering“).

Eine besondere Form der dreidimensionalen Kultur sind die sog. Sphäroide. Multizelluläre Sphäroide können von Primärkulturen, immortalisierten, transformierten oder nichttransformierten Zellen erhalten werden. Als Beispiel für „histotypische“ Sphäroide sollen die Retinosphäroide aus dissoziierten embryonalen Zellen der Hühnchen-Retina erwähnt werden, bei denen sich nach Langzeitrotationskultur neben neuroepithelialen Zellen auch Pigment- und Gliazellen entwickeln und die Neuronen synaptische Funktionen ausprägen (Layer et al. 1992). Tumorigene Zellen bilden in der Regel nach kürzerer Kulturdauer (10–30 Tage) größere Sphäroide (Durchmesser 1–3 mm) als normale Zellen, die meist nur Aggregate von 100 bis 200 µm erreichen. Sphäroide bilden höher differenzierte Strukturen aus als die in MonolayerKultur gewachsenen Zellen. Besondere Bedeutung haben die Sphäroide für die Tumorforschung, da Tumorzellen in Sphäroiden über eine spezifische Wachstums-, Zell- und Stoffwechselkinetik verfügen und komplexe Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen entwickeln, die auch in Tumorgeweben ausgebildet sind (Mueller-Klieser 1987) (> Abb. 2.2.7). Aus diesem Grund stellen Sphäroide in der experimentellen Krebsforschung geeignete Zellsysteme zur Untersuchung der Wirkung von Strahlen und zytotoxischen Agenzien auf Tumoren dar. Im Sphäroid entwickeln sich Gradienten im Hinblick auf Proliferations- und Stoffwechselaktivität, Nekrose und Differenzierung, d. h., es bilden sich konzentrische Schichten unterschiedlich organisierter Zellen (> Abb. 2.2.7). Dies ermöglicht Stoffwechseluntersuchungen an Zellmodellen in vitro und Untersuchungen zur Viabilität von Sphäroiden nach Zytostatikabehandlung (Doyle et al. 1998). Eine Weiterentwicklung der Tumorzell-Sphäroide stellt die „Alginatkulturtechnik“ (Boxberger u. Meyer 1994) dar. Sphäroide sind weiterhin die Grundlage für die Entwicklung von sog. Konfrontationskulturen zur Untersuchung der Invasivität von Zellpopulationen (Mareel et al. 1995). Eine Methode zur Etablierung von Konfrontationskulturen beruht darauf, dass Gewebefragmente normaler Zellen, z. B. aus dem Hühnerherzen, mit Tumorzell-Sphäroiden auf semisoliden Medien kultiviert werden und anschließend die Invasivität der Tumorzellen in die Aggregate aus „normalen“ Zellen untersucht wird. Konfrontationskulturen erlauben eine Unterscheidung zwischen invasiven und nichtinvasiven Zellen, sowie die In-vitro-Analyse von Therapiemöglichkeiten.

2.2.3.3 Dreidimensionale Kulturen Dreidimensionale Kulturen, z. B. Aggregatkulturen oder Sphäroide, wurden entwickelt, um die Nachteile von Monolayer-Kulturen (gewebeuntypische Art der Sauerstoffversorgung, Nährstoffzufuhr und Entsorgung toxischer Stoffwechselprodukte) zu vermeiden. Darüber hinaus sind Zellen unter Bedingungen dreidimensionaler Kultur zu „histotypischen“ oder „organotypischen“ Differenzierungsleistungen in der Lage. Eine Sonderform der 3D-Kulturen sind die „embryoid bodies“ aus embryonalen Stammzellen (7 2.2.3.5 „Differenzierungssysteme“). Aggregatkulturen

Bereits seit den 1950er Jahren ist bekannt, dass Zellen unter bestimmten Kulturbedingungen („Rundschüttler“) spontan dreidimensionale Aggregate bilden (Moscona 1961) und in der Folge zu homo- oder heterotypischen Aggregaten reaggregieren können. Die Aggregate sind lange in Kultur haltbar, die Zellen werden zu erhöhten Differenzierungsleistungen angeregt und können organoide Strukturen bilden. Aggregatkulturen finden Einsatz in der Neurotoxikologie, wobei z. B. an fetalen Rattenhirn-Zellen neuronale Zellfunktionen nach Einwirkung neurotoxischer Substanzen analysiert werden.

258

Sektion 2 · Modelle

. Abb. 2.2.7. Morphologie und Parameter von Tumorsphäroiden im Vergleich zu soliden Tumoren. Im Gegensatz zu Sphäroiden enthalten Tumore Blutgefäße, die für das Wachstum der Tumorzellen ausschlaggebend sind. Sowohl in soliden Tumoren als auch in Tumor-

sphäroiden bilden sich Konzentrationsgradienten hinsichtlich Sauerstoffkonzentration, Nährstoffen, Proliferation und Stoffwechselendprodukten aus, jedoch teilweise in entgegengesetzter Ausrichtung (nach Kunz-Schughart u. Mueller-Klieser 2000)

2.2.3.4 Suspensionskulturen

Schaumbildung sowie von Scherkräften, die durch mechanische Bewegung entstehen (Doyle et al. 1994).

Statische Suspensionskulturen

Viele Tumorzellen zeigen nach ihrer Etablierung als permanente Zelllinie eine verringerte Adhäsion an die Kulturunterlage. Die Zellen wachsen als sog. „statische Suspensionskulturen“ in Einzelzellen oder Zellaggregaten, ohne an die Unterlage zu attachieren. Ein solches Wachstumsverhalten zeigen z. B. lymphoblastoide Zellen und Myelomzellen. Weiterhin können transformierte Zellen, die normalerweise als adhärente Kultur wachsen (z. B. HeLa, BHK-21, L929), in Suspensionskulturen überführt werden, wenn die Kulturgefäße geschüttelt oder die Kulturflüssigkeit mit den Zellen mechanisch bewegt wird. Eine Adaptation an die Bedingungen der Suspensionskultur gelingt mit hoch transformierten oder tumorigenen Zelllinien besser als mit solchen, die stark adhärent wachsen. Vorteile der Suspensionskultur gegenüber adhärent wachsenden Zellen sind: x Einfache Subkultur-Regimes, x keine proteolytischen Enzyme erforderlich, x keine längeren lag-Phasen nach Passagierung, x homogene Einzelzellsuspensionen, x Ansätze in großen Volumina und hohen Zelldichten möglich, x eine große Zelloberfläche ermöglicht effiziente Virusinfektion (Vakzineherstellung), x Kontrolle und Überwachung des Kulturmediums ist gewährleistet. Es sind viele praktikable Systeme zur Suspensionskultur entwickelt worden, so bewegen z. B. Magnetstäbe oder Quirle die Kulturflüssigkeit („CellSpin“, „Super-Spinner“, Heidemann et al. 1994). Entscheidend für den Erfolg der Suspensionskultur ist eine optimale pH-, CO2-, O2- und Nährstoff-Kontrolle, die Verhinderung von

Massenkultur in Bioreaktoren

Eine Massenkultur von Zellen ist z. B. erforderlich zur x Extraktion von Zellbestandteilen, wie DNA oder Mikrosomen, x Virusproduktion bei der Vakzineherstellung, x Bioproduktion von pharmakologischen Wirkstoffen, und zur x Produktion von Enzymen und Antikörpern. Für die Isolierung von 7 mg DNA werden z. B. 109 Zellen benötigt. Ein Ansatz zur Virusisolierung für die Vakzineproduktion umfasst etwa 5u1010 Zellen. Die Kulturmenge kann zwischen 1.000 und 10.000 l betragen. Standardkulturen (sog. „batch cultures“) beginnen mit der Inokulation von Zellen in ein bestimmtes Flüssigkeitsvolumen. Die anschließende Zellvermehrung ist charakterisiert durch Nährstoffverbrauch, pH-WertVerschiebung und Akkumulation von Stoffwechselprodukten. Je nach der Art, in der Medium zugefügt, bzw. ausgetauscht wird, unterscheidet man verschiedene Kulturverfahren: 1. Graduelle Addition frischen Mediums („fed batch“), 2. Unterbrechung der Kultur durch Hinzufügen frischen und Entfernen verbrauchten Mediums („semicontinuous batch“), 3. Kontinuierliches Hinzufügen frischen Mediums bei gleichzeitiger Entfernung verbrauchten Mediums in einem rezirkulierenden System („Perfusionskultur“), und 4. Homöostatische Kultur ohne Fluktuation von Nährstoffen, Metaboliten und Zellen, erreicht durch kontinuierliches Hinzufügen und Abführen von Medium und Zellen („continuous-flow culture“).

259 2.2 · Zellkulturtechniken, Zellmodelle und Tissue Engineering

Vergleicht man die Effizienz der 4 Systeme, dann ergibt die kontinuierliche Perfusionskultur die höchsten Produktraten pro l Kulturflüssigkeit. Die Effizienz von Kultursystemen kann weiter vergrößert werden, indem durch zusätzlich eingebrachte Oberflächen in Form von Röhren, Filterplatten oder Partikeln die Oberfläche um ein Vielfaches vergrößert wird. Oft werden Suspensionskulturen mit Trägermaterialien („Carrier“) komplettiert. Die Zellen wachsen adhärent auf der Oberfläche der Carrier und werden in Suspensionskultur bewegt. Als Mikrocarrier werden Partikel z. B. aus Glas, Polystyren, Polyacrylamid, Dextran, Zellulose oder Kollagen eingesetzt. Eine besonders große Kulturoberfläche wird bei porösen Trägerpartikeln erreicht, die eine um 20- bis 50-fache Erhöhung der Zelldichte ermöglichen. Die Scherkräfte sind verringert, und die Zellen können mithilfe von Enzymen aus den Carriern isoliert werden.

2.2.3.5 Differenzierungsmodelle Zelluläre Differenzierungsmodelle erlauben die Analyse einzelner Zellen und ihrer Entwicklungslinien („lineages“), ihrer Interaktionen, sowie die Modulation von Differenzierungsprozessen in vitro. Allerdings können auch die „besten“ Differenzierungssysteme nicht die gesamte Komplexität differenzierter Zellen im Organismus und ihre Wechselwirkungen im Gewebeverband widerspiegeln.

2.2

Nach ihrem Entwicklungspotential unterscheidet man totipotente (Zygote, Blastomeren), pluripotente (embryonale Stammzellen, ES-Zellen), multipotente (z. B. hämatopoetische) Stammzellen sowie zahlreiche verschiedene differenzierte Zelltypen. Neben multipotenten Stammzellen sind Vorläuferzellen in ihrer Differenzierungsfähigkeit auf die spezifische Entwicklungslinie des Gewebes beschränkt (> Abb. 2.2.8). Mit abnehmender Entwicklungsfähigkeit ist ein Verlust der Proliferationsfähigkeit verbunden. Zur Untersuchung von Differenzierungsprozessen stehen zahlreiche komplexe In-vitro-Zellsysteme zur Verfügung. Die Differenzierung kann mit Differenzierungsfaktoren, aber auch durch Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktion induziert werden. Physiologische Differenzierungsinduktoren sind z. B.: 1. Wachstumsfaktoren, z. B. x Nervenwachstumsfaktor (NGF), x transformierender Wachstumsfaktor (TGFE), oder x epithelialer Wachstumsfaktor (EGF), 2. Hormone, z. B. x Hydrokortison, x Glukagon oder x Thyroxin, 3. Vitamine, z. B. x Vitamin D und dessen Abbauprodukte (all-trans Retinsäure), oder 4. anorganische Ionen, z. B. x Calcium oder x Selen. . Abb. 2.2.8. Schematische Darstellung der Proliferations- und Differenzierungsfähigkeit totipotenter und pluripotenter Stammzellen, multipotenter Stammzellen und partiell spezialisierter Vorläuferzellen bis zu terminal differenzierten und spezialisierten Zellen

260

Sektion 2 · Modelle

Nichtphysiologische Differenzierungsfaktoren sind z. B. Dimethylsulfoxid (DMSO), Hexamethylenbisazetamid (HMBA), Natriumbutyrat, Hydroxyharnstoff oder Zytosinarabinosid. Terminale Differenzierung spezialisierter Zellen

Die terminale Differenzierung von determinierten Vorläuferzellen soll am Beispiel eines Zellmodells der mesodermalen Entwicklung, der Maus-Zelllinie 10T ½, erläutert werden: Werden 10T ½-Zellen mit geringen Konzentrationen von 5-Azazytidin behandelt, werden Adipoblasten, Chondroblasten und Myoblasten gebildet, die weiter in Fett- und Knorpelzellen und vielkernige Myotuben differenzieren können. Es muss davon ausgegangen werden, dass die 10T ½-Linie multipotente mesenchymale Stammzellen enthält. Mithilfe der myogenen Differenzierung von 10T ½-Zellen wurden wesentliche Schritte der Regulation der Myogenese und der Expression der myogenen Regulatorgene aufgeklärt. Differenzierung von multipotenten hämatopoetischen Stammzelllinien

Alle Versuche, hämatopoetische Stammzellen aus Blut und Knochenmark direkt in vitro zu vermehren, sind trotz großer Anstrengungen bisher nicht sehr erfolgreich. Das heisst, hämatopoetische Stammzellen besitzen nur im Organismus im Kontext mit umgebenden Zellen (der Stammzell-„Nische“) die Fähigkeit zur Vermehrung und Entwicklung in die verschiedenen Blutzelltypen. Es gelang jedoch die Etablierung von hämatopoetischen Zelllinien, die sich in vitro vermehren lassen und eine gewisse Differenzierungsfähigkeit besitzen. Dafür waren folgende methodische Grundlagen die Voraussetzung: 1. Entwicklung von Techniken zur Klonierung hämatopoetischer Zellen in Anwesenheit von koloniestimulierenden Faktoren (Metcalf 1989; Cross u. Dexter 1991), 2. Entwicklung der Knochenmark-Feederzellkultur (Dexter et al. 1984) und 3. Etablierung lymphoblastoider und erythroider Vorläuferzelllinien. Neben menschlichen lymphoblastoiden Zelllinien von B- und T-Zellen und leukämischen Zelllinien (HL-60Zellen) hat die Maus-Friend-Erythroleukämie- (FEL-) Zelllinie (Rossi u. Friend 1967) besondere Bedeutung als Differenzierungsmodell erlangt. Während HL-60Zellen in Abhängigkeit vom induzierenden Agens in vier myeloide Zelltypen differenzieren können, und zwar x in Granulozyten (mit DMSO oder RA), x in Monozyten (mit Vitamin D3),

x in Makrophagen (mit Phorbolestern) und x in Eosinophile (mit G/M-CSF), durchlaufen FEL-Zellen (nach DMSO-Induktion) nur erythroide Differenzierung. Weiterhin wurde aus Langzeitknochenmarkkulturen nach Infektion mit src-Moloney-Maus-Leukämievirus eine IL-3 abhängige Zelllinie „FDCP-mix“ etabliert, die nicht tumorigen ist, viele Charakteristika normaler hämatopoetischer Stammzellen besitzt und sich in mehrere Zelltypen entwickeln kann (Freshney 1994). In den vergangenen Jahren wurde postuliert, dass sich Knochenmarkstammzellen nicht nur in Zellen des Blutsystems entwickeln können, sondern auch zur Bildung von Skelettmuskel- und Leberzellen beitragen und Zellen in Gehirn, Herz und Gefäßsystem erneuern können. Jedoch stellte sich durch verfeinerte Nachweistechniken heraus, dass die überwiegende Mehrzahl dieser „Transdifferenzierungen“ auf Fusionen der Donorstammzellen mit den Zellen des Empfängerorganismus zurückzuführen sind (s. Wagers u. Weissman 2004; Wobus u. Boheler 2006). Weiterhin sind im Knochenmark weitere Stammzellen vorhanden, wie endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) und mesenchymale Stammzellen (MSCs). Aufgrund der Bedeutung mesenchymaler Stammzellen für das Tissue engineering werden MSCs im Folgenden eingehender behandelt. Kultur und Differenzierung mesenchymaler Stammzellen

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind seit der 1960er Jahren bekannt und wurden nach Kultur von Knochenmarkzellen als adhärent wachsende Zellen oder „colony forming unit-fibroblasts“ (CFU-F) definiert (Friedenstein et al. 1976). MSCs zeichnen sich durch das höchste Proliferationspotential adulter Stammzellen aus und können bis zur 2.000- fachen Menge der Ausgangszellzahl vermehrt werden. MSCs wurden u. a. aus Knochenmark, peripherem und Nabelschnur-Blut, Fettgewebe, Niere, Lunge und Leber isoliert. In der Folgezeit wurde die Differenzierungsfähigkeit von MSCs in die mesenchymalen Zelltypen, Knorpel-, Knochen-, Skelettmuskel-, Sehnen- und Fettzellen beschrieben (Caplan u. Bruder 2001). MSCs sind charakterisiert durch ihre Morphologie (fibroblastoide Zellen), Zelloberflächenmarker (CD44, CD29, CD90, SH2, SH3, SH4, MHC-1, Sca-1) und ihre Vermehrungs- und Entwicklungsfähigkeit (> Abb. 2.2.9). Ein besonders interessanter mesenchymaler Zelltyp wurde nach Kultivierung von Knochenmarkzellen isoliert, sog. „multipotential adult progenitor cells“ (MAPC) (Reyes et al. 2001). Die Zellen zeigen eine hohe Vermehrungsrate ohne Alterungsphänomene und eine beacht-

261 2.2 · Zellkulturtechniken, Zellmodelle und Tissue Engineering

2.2

Differenzierung pluripotenter embryonaler Stammzellen

Aus embryonalen Stammzellen können drei pluripotente Zelltypen als permanente undifferenzierte Stammzelllinien etabliert werden (> Abb. 2.2.10): 1. embryonale Stammzellen (ES-Zellen), 2. embryonale Karzinomzellen (EC-Zellen) und 3. embryonale Keimzellen (EG-Zellen).

. Abb. 2.2.9. Entwicklungspotenzial mesenchymaler Stammzellen aus dem Knochenmark. Mesenchymale Stammzellen können isoliert und in vitro vermehrt werden. Mesenchymale Stammzellen besitzen das Potenzial, über die jeweiligen Vorläuferzellen in Knochen-, Knorpel-, Muskel-, Stroma-, Sehnen- und Fettgewebe reifen zu können

liche Differenzierungsfähigkeit vorwiegend in Zellen der mesodermalen Linie. MAPC exprimieren auch Pluripotenzgene (Oct-4, Nanog). Die Entwicklung in Zelltypen aller drei Keimblätter konnte nicht bestätigt werden. Inzwischen wurde ein ähnlicher mesenchymaler Vorläuferzelltyp („unrestricted somatic stem cells“, USSCs) auch aus dem Nabelschnurblut isoliert. Die Kultivierbarkeit, Vermehrungsrate und Differenzierungsfähigkeit machen mesenchymale Stammzellen deshalb zu einer attraktiven Quelle für regenerative Zelltherapien, insbesondere im Tissue Engineering. Es ist mittlerweile akzeptiert, dass die extrazelluläre Umgebung, die sog. extrazelluläre „Nische“, die Entwicklungsfähigkeit der Stammzellen determiniert (Watt u. Hogan 2000). Die Untersuchung der Entwicklungsfähigkeit von hämatopoetischen Stammzellen aus Blut und Knochenmark sowie anderer gewebespezifischer Stammzellen und die Aufklärung der Mechanismen der Proliferation und Differenzierung stehen derzeit im Mittelpunkt der Stammzellforschung, die darauf gerichtet ist, Stammzellen im Tissue Engineering (7 2.2.4 „Tissue engineering“) und für regenerative Zelltherapien einzusetzen (7 Kap. 4.4. „Medizinische Perspektiven der kardialen Stammzellforschung“).

Während EC-Zelllinien von Mensch und Maus bereits seit den 1970er Jahren existieren, wurden ES-Zelllinien der Maus 1981 (Evans u. Kaufman 1981; Martin 1981), EG-Zelllinien der Maus 1992 (Matsui et al. 1992), und ES- und EG-Zelllinien des Menschen 1998 (Thomson et al. 1998; Shamblot et al. 1998) erstmals beschrieben. Diese pluripotenten embryonalen Stammzellen sind neben ihrer nahezu unbegrenzten Proliferationsfähigkeit („self-renewal“) und der Entwicklung in Zelltypen aller drei primären Keimblätter durch spezifische Eigenschaften und Marker charakterisiert: 1. undifferenzierter Phänotyp, gekennzeichnet durch hohes Kern-Zytoplasma-Verhältnis, 2. hohe Aktivität an alkalischer Phosphatase, 3. Expression von spezifischen Transkriptionsfaktoren (z. B. Oct-4, nanog) 4. Expression stadienspezifischer embryonaler Antigene (z. B. SSEA-1, SSEA-3/4) 5. Hypomethylierung der DNA, 6. hohe Telomeraseaktivität sowie 7. eine kurze G1-Phase des Zellzyklus (s. Wobus u. Boheler 2005). EC-Zellen repräsentieren die Stammzellen von Teratokarzinomen (> Abb. 2.2.10), die nach Transfer früher Embryonalstadien an extrauterine Orte gebildet werden. EC-Zellen weisen in der Regel Karyotypveränderungen auf und verhalten sich deshalb nicht mehr wie normale embryonale Zellen. Sie können in vivo (nach Transplantation in extrauterine Orte als Teratom oder Teratokarzinom) und in vitro (nach Differenzierungsinduktion) in Zellen aller drei Keimblätter differenzieren. Dagegen repräsentieren ES-Zellen pluripotente Stammzellen, die direkt aus der inneren Zellmasse von Mäusen (Evans u. Kaufman 1981; Robertson 1987) oder aus einzelnen Blastomeren isoliert und als permanente Linien etabliert wurden. ES-Zellen der Maus können sowohl in vivo nach Transfer in die Blastozyste (Bradley et al. 1984) als auch in vitro nach Differenzierung in dreidimensionalen Aggregaten, sog. „embryoid bodies“, in Zellderivate des Endoderms, Ektoderms und Mesoderms differenzieren und sich in zahlreiche spezialisierte Körperzellen entwickeln. Während der In-vitro-Differenzierung werden gewebespezifische Gene und Proteine exprimiert und Prozesse der embryonalen Ent-

262

Sektion 2 · Modelle . Abb. 2.2.10. Herkunft und Kultivierung pluripotenter embryonaler Stammzellen (ESC), embryonaler Karzinomzellen (ECC) und embryonaler Keimzellen (EGC) der Maus. Die pluripotenten ECC sind die Stammzellen von Teratokarzinomen. ESCLinien werden direkt aus den undifferenzierten Zellen früher Embryonalstadien, und EGC-Linien aus primordialen Keimzellen des Embryos/Fetus etabliert. ESC und EGC sind pluripotent, d. h., sie können in vivo und in vitro Gewebe aller drei Keimblätter bilden, jedoch allein keinen vollständigen Organismus bilden (nach Wobus u. Boheler 2005)

wicklung rekapituliert. Die differenzierten Zellen zeigen die funktionellen Eigenschaften der spezialisierten Zellen (Wobus u. Boheler 2005, 2006). Ein weiterer pluripotenter Zelltyp sind embryonale Keim- (EG-)Zellen, die aus primordialen Keimzellen der Maus und des Menschen etabliert wurden. EG-Zellen der Maus zeigen eine hohe Proliferations- und Entwicklungsfähigkeit, während die Vermehrung und Entwicklungsfähigkeit von humanen EG-Zellen geringer ist. Die einzigartigen Eigenschaften von ES-Zellen bilden die Grundlage der ES-Zell-Technologie, bei der nach homologer Rekombination spezifische Gene in ES-Zellen inaktiviert werden, diese anschließend in Blastozysten transferiert und dadurch Mäuse mit bestimmten genetischen Defekten geschaffen wurden (Thomas u. Capecchi 1987). Diese auch als „gene targeting“ bezeichnete Technologie hat zu einer großen Zahl mutanter Mäusestämme geführt, die infolge des Gendefekts Entwicklungsstörungen und/oder einen veränderten Phänotyp aufweisen, bzw. infolge gravierender Fehlbildungen in frühen Stadien der Embryonalentwicklung absterben. In solchen Fällen ist die Differenzie-

rungsanalyse von („knock-out“) ES-Zellen in vitro eine exzellente Alternative, um die Folgen von Gendefekten („loss of function“) auf die embryonale Entwicklung zu untersuchen. Ebenso können auch gezielt Genfunktionen in ES-Zellen überexprimiert („gain of function“) und deren Folgen auf die zelluläre Entwicklung untersucht werden. Die Entwicklungsfähigkeit insbesondere von humanen ES-Zellen in funktionell aktive spezialisierte Körperzellen ermöglicht ihren Einsatz auf vielen Gebieten der Biowissenschaften und der Medizin, z. B. für: 1. die Analyse früher embryonaler Entwicklungsprozesse in vitro, 2. den Einsatz in der Pharmaforschung als Zellmodell für Wirkstoffscreening, 3. die Analyse der embryotoxischen, zytotoxischen und mutagenen Wirkung von Umweltfaktoren, und 4. die Nutzung für Zell- und Gewebetherapie (s. Wobus u. Boheler 2005). Hinsichtlich des Einsatzes von Stammzellen in der Transplantationsmedizin wird auf Kap. 4.4. „Medizi-

263 2.2 · Zellkulturtechniken, Zellmodelle und Tissue Engineering

nische Perspektiven der kardialen Stammzellforschung“ verwiesen.

2.2.4 Tissue Engineering Der Begriff „Tissue Engineering“ wurde 1988 von der National Science Foundation (USA) definiert als interdisziplinäres Arbeitsgebiet der Ingenieur- und Lebenswissenschaften zur Aufklärung der grundsätzlichen Mechanismen und Funktionen in gesunden und pathologischen Geweben. Ziel ist die Entwicklung biologischer Ersatzgewebe zur Unterstützung oder zum Ersatz von geschädigten oder ausgefallenen Gewebeoder Organfunktionen sowie die Erweiterung des endogenen Regenerationspotenzials (Lanza et al. 2000b) (> Abb. 2.2.11).

2.2.4.1 Grundlagen des Tissue Engineering Der Bedarf an lebenswichtigen Geweben und Organen für Transplantationen nach genetisch bedingten Missbildungen oder Fehlfunktionen, nach krankheitsbedingtem Funktionsausfall, Unfall oder aufgrund altersbedingter Degeneration steigt kontinuierlich. Zwar stößt die Herstellung bioartifizieller Organe wie Leber, Niere oder Herz wahrscheinlich an biologische Grenzen, doch es ist heute bereits möglich, einfach organisierte Gewebe außerhalb des Körpers (ex vivo oder in vitro) in komplexen bioartifiziellen Gewebestrukturen herzustellen. Diese werden in Patienten zur Unterstützung erkrankter Gewebe implantiert (Lanza et al. 2000b) bzw. wird die Organfunktion mit externen bioartifiziellen Organsystemen unterstützt, bis ein zur Transplantation geeignetes Organ zur Verfügung steht.

. Abb. 2.2.11. Tissue Engineering zur Herstellung von Ersatzgeweben erfordert die Interaktion von Zellen mit Wachstumsfaktoren und Signalmolekülen im Zusammenhang mit Trägermaterialien, die aus abiotischen Gerüstsubstanzen und/oder biotischen Matrixmolekülen bestehen können

2.2

Ein Gewebe ist ein Verbund aus spezifischen Zellen und Bestandteilen der extrazellulären Matrix (ECM). Die Struktur und Funktion der Organe basiert auf komplexen Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen, die wesentlich die gewebetypspezifischen Funktionen im Organismus bestimmen (Krieg u. LeRoy 1998). Störungen dieser Wechselwirkungen sind Grundlage für Fehlfunktionen oder Erkrankungen. Die Klärung dieser molekularen Mechanismen steht im Fokus der Forschung für das Tissue Engineering. Die gewebespezifische Funktion und Integration des bioartifiziellen Gewebes ist eine Grundvoraussetzung für den Langzeitersatz des geschädigten Organs (Stock u. Vacanti 2001). Hierbei spielen die Mechanismen der zellulären Interaktion (Griffith 2002), der Zell-MatrixWechselwirkung (Hubbel 1995), die Ausrichtung der Zellen in der Matrix (Skalak u. Price 1996), die Leitstrukturen nicht besiedelter Matrixkomponenten (Nerem u. Seliktar 2001) und die Vaskularisation der bioartifiziellen Gewebe vor bzw. nach Implantation (Skalak 2005) eine entscheidende Rolle. Die Optimierung und Modifizierung der Matrices (Hutmacher 2001) im Hinblick auf die Langzeitfunktion der bioartifiziellen Gewebe ist nach wie vor einer der Forschungsschwerpunkte des Tissue Engineering. Durch diese zellbiologischen Grundvoraussetzungen von funktionellen Gewebeverbänden ergeben sich die drei wesentlichen Grundbausteine für die Ex-vivo-Herstellung bioartifizieller Gewebe und Organe beim Tissue Engineering (Lanza et al. 2000b; > Abb. 2.2.11): 1. Funktionelle gewebespezifische Zellen, 2. Trägerstrukturen (Matrices, Scaffold), die eine dreidimensionale (3D-)Form vorgeben, die zellulären Komponenten umschließen und in ihrer Funktion unterstützen, und 3. Kulturgefäße (Bioreaktoren), in denen die Zellen auf die Matrix aufgebracht und das bioartifizielle Gewebe ex vivo reifen kann. Funktionelle gewebespezifische Zellen Nach meist enzymatischer Isolation der Zellen aus Biopsiematerial müssen diese ex vivo vermehrt werden. Hierzu werden die Zellen in der Regel zweidimensional auf Kunststoffoberflächen ohne Kontakt zu Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) vermehrt, da diese u. U. Signaltransduktionsmechanismen aktivieren, die zu Veränderungen in der Expression von Genen (die z. B. Oberflächenproteine oder Zytoskelettproteine kodieren) führen und dadurch Dedifferenzierungsprozesse auslösen, die zu einem Funktionsverlust führen. Nach Besiedlung der Matrixstrukturen oder nach Implantation der bioartifiziellen Gewebe in den Organismus können diese intrazellulären Signalketten wieder ihre physiologische Funktion erhalten (Redifferenzierung). Aller-

264

Sektion 2 · Modelle

dings findet häufig eine Redifferenzierung nicht statt, und das Implantat bleibt funktionslos. Diese Erkenntnisse erfordern die Optimierung der Kulturbedingungen von primären Zellkulturen. So müssen Chondrozyten unmittelbar nach Isolation dreidimensional kultiviert werden, damit sie während dieser Ex-vivo-Proliferationsphase nicht dedifferenzieren. Vorteil dieser 3D-Kultur ist, dass die Chondrozyten in unmittelbarem Kontakt mit Komponenten der ECM (z. B. Kollagen) wachsen (Walles et al. 2004) und dadurch sowohl eine Proliferation als auch eine gewebespezifische ECM-Synthese möglich ist. Die Optimierung der Zellkulturtechniken ermöglicht es heute, für unterschiedliche Zellen Bedingungen für Proliferation ohne Dedifferenzierung zu etablieren. Ein nach wie vor ungelöstes Problem für das Tissue Engineering stellen terminal differenzierte Zellen, wie z. B. postmitotische Neurone oder Herzzellen, dar. Diese Zellen können zwar als Primärkulturen kultiviert, aber nicht weiter vermehrt werden, sodass keine ausreichende Zellmenge zur Besiedlung der Trägerstrukturen generiert werden kann. Ein Ausweg wird in der Verwendung von adulten Stamm- und Vorläuferzellen sowie Zellderivaten aus embryonalen Stammzellen gesehen (7 2.2.3.5 „Differenzierungssysteme“, und Kap. 4.4.„Medizinische Perspektiven der kardialen Stammzellforschung“).

Extrazelluläre Matrix Ein Gewebe ist ein Verbund aus spezifischen Zellen und Bestandteilen der extrazellulären Matrix. Die Struktur und Funktion der Organe basiert auf komplexen ZellZell- und Zell-Matrix-Interaktionen. Die extrazelluläre Matrix muss auf molekularer Ebene als im Fließgleichgewicht begriffen werden. Die Komponenten der ECM werden von Zellen synthetisiert und sezerniert, aber auch extrazellulär oder nach Endozytose intrazellulär abgebaut. Darüber hinaus wird durch die Bindung von Zellrezeptoren an definierte ECM-Komponenten die Genexpression in den Zellen reguliert. Die ECM besteht zu großen Teilen aus verschiedenen Proteinen und Glykoproteinen bzw. Polysacchariden. Die vorherrschende Proteinfamilie ist die der Kollagene, die verschiedene Arten von Fasern bilden und in fast jedem Gewebe vorhanden sind. Elastische Fasern werden aus den Proteinen Fibrillin und Elastin gebildet. Eine weitere Gruppe bilden Glykosaminoglykane, langkettige Polysaccharide, welche mit Proteinen assoziieren und noch größere Makromoleküle, Proteoglykane, bilden. Aus der Vielfalt und den Interaktionen von Proteinen, Glykosaminoglykanen und Proteoglykanen ergeben sich die gewebetypspezifischen Eigenschaften der ECM. Basierend auf diesen funktionellen Zell-Matrix-Wechselwirkungen werden die Charakteristika von Matrices für das Tissue Engineering definiert.

Gewebespezifische Bioreaktortechnologie Während der In-vitro-Kultur der Zellen müssen die Zufuhr von Nahrung und Sauerstoff sowie der Abtransport von Stoffwechselprodukten und Kohlendioxid sichergestellt sein. Bei Verwendung von Zellkulturflaschen und Petrischalen kann das Zellkulturmedium nicht kontinuierlich ausgetauscht werden. Bessere Kulturbedingungen liegen in Gefäßen mit Rührvorrichtungen vor, da hierbei größere Mengen an Kulturmedium eingesetzt werden können. Gewebekonstrukte werden so einer permanenten Strömung ausgesetzt. Eine verfahrenstechnische Weiterentwicklung sind „rotierende Bioreaktoren“, bei denen eine stetige Bewegung der Nährflüssigkeit durch Drehung der Kulturgefäße erzeugt wird und zusätzlich das Nährmedium kontinuierlich durch frisches ersetzt werden kann (7 2.2.3.4 „Suspensionskulturen“). Weiterentwicklungen dieser Systeme führen zu geschlossenen Systemen, die gewebespezifische Stimuli integrieren, wie z. B. mechanische Stimuli für die Kultur von Knorpel oder Dehnung („stretch“) für Herzzellen. Nanotechnologie für das Tissue Engineering Nanopartikel bieten in der Medizin eine neue Technologie für diagnostische und therapeutische Ansätze. Sie können sich zum Beispiel als selektives Kontrastmittel für bildgebende Diagnoseverfahren in Tumoren akkumulieren, vor Ort Tumorgewebe durch Erhitzen zerstören, als Vektoren für die Gentherapie dienen oder spezifische therapeutische Substanzen transportieren („drug delivery“). All diese Verfahren befinden sich derzeit jedoch noch im Entwicklungsstadium. Vaskularisation Alle vitalen Gewebe – außer Knorpel und obere Hautschichten – sind durch Blutgefäße mit dem Blutkreislaufsystem verbunden. Die mangelnde Sauerstoff- und Nährstoffversorgung von Zellverbänden während der Herstellung von Geweben im Tissue Engineering führt zum Funktionsverlust und Absterben der Gewebe. Bioartifizielle Gewebe, die 0,8 mm im Querschnitt überschreiten, benötigen schon vor der Implantation ein funktionelles Blutgefäßsystem, das unmittelbar nach Implantation in das Kreislaufsystem des Empfängers integriert werden kann. Nach Implantation sind die Angiogeneseprozesse des Organismus meist nicht effektiv genug, um ein Absterben des implantierten Gewebes zu verhindern (Walles et al. 2003). Die fehlende Vaskularisation der Trägermaterialien für das Tissue Engineering komplexer 3D-Strukturen gilt zurzeit noch als weitgehend ungelöstes Problem. Deshalb wurden zahlreiche experimentelle Konzepte zur Vaskularisation solcher 3D-Konstrukte entwickelt. Die meisten Konzepte konzentrieren sich auf die Neo-

265 2.2 · Zellkulturtechniken, Zellmodelle und Tissue Engineering

vaskularisierung (Neoangiogenese) (Skalak 2005). Bisher konnte jedoch noch keine ausreichende Sauerstoffund Nährstoffzufuhr sichergestellt werden. Selbst nach Induktion einer Kapillarsprossung in vitro führte die fehlende Integration in das Blutsystem des Empfängers zur Nekrose, speziell im Zentrum von 3D-Konstrukten. Einen möglichen Lösungsansatz stellt die Generierung vaskularisierter Trägermaterialien durch Azellularisierungsprozesse von stark vaskularisierten tierischen Geweben unter Erhalt der Röhrenstrukturen der Blutgefäße dar (Mertsching et al. 2005). Eine funktionelle Rebesiedlung der Gefäßstrukturen und der Kapillaren mit Endothelzellen konnte experimentell belegt werden. Kokulturen von Endothelzellen mit Urothelzellen, Hepatozyten oder Chondrozyten, zeigen, dass es sich um eine universell einsetzbare vaskularisierte Kollagenmatrix für das Tissue Engineering handeln könnte. Durch Modifikation einer bestehenden Technologie, dem Spritz-Druck-Verfahren (SFF), wird ebenfall versucht, die Probleme bezüglich der Struktur und Durchblutung der Ersatzgewebe zu lösen. Dazu werden modifizierte „dreidimensionale Tintenstrahldrucker“ eingesetzt (Hutmacher et al. 2004). Der Druckkopf wird mit einem Zell-Matrix-Gemisch befüllt, und anschließend werden dann Schicht für Schicht Zellen und Matrix in beliebige Formen gedrückt. Dieses Verfahren wird momentan bei der Regeneration von Knochen getestet. Nach tomographischer Vermessung des Defekts wandelt ein Computerprogramm die zweidimensionalen Röntgenbilder in ein dreidimensionales Modell um. Auf der Grundlage dieser Daten wird das Zell-Matrix-basierte Implantat in seine endgültige Form gebracht. Der Vorteil dieser Verfahren ist, dass das Zell-Matrix-Gemisch mit unterschiedlichen funktionellen Signalmolekülen, wie Adhäsions- und Wachstumsfaktoren oder „Drug-delivery“-Systemen ausgestattet werden kann (Prokop 2001).

2.2.4.2 Trägermaterialien Trägermaterialien für das Tissue Engineering müssen eine gewebetypspezifische Organisation der Zellen sowie der spezifischen Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen ermöglichen. Zellen benötigen gerichtete ZellMatrix-Kontakte und mechanische Unterstützung, um diese auszubilden bzw. zu erhalten. Die Form- und mechanische Stabilität ist eine wichtige Komponente für die erfolgreiche Implantation des bioartifiziellen Gewebes. Das Trägermaterial beeinflusst wesentlich die Funktion der Zellen und damit letztendlich auch die Langzeitfunktion des Implantats. Aus diesen Gründen kann es kein optimales Trägermaterial für alle bioartifiziellen

2.2

Gewebe geben, sondern diese müssen gewebespezifisch optimiert werden. Nach Implantation darf durch die Komponenten des Trägermaterials keine allergene, zytotoxische oder immunologische Abstoßungsreaktion hervorgerufen werden (Biokompatibilität). Im Idealfall ist das Material nicht nur biokompatibel, sondern bioresorbierbar, d. h. es wird nach Implantation durch Remodelingprozesse von den Zellen abgebaut und durch die Synthese von gewebetypspezifischer ECM ersetzt. Die Trägermaterialien müssen steril, sollten bioverträglich, und je nach Anwendung entweder langzeitstabil oder bioabbaubar, porös oder unterschiedlich flexibel sein. Als Ausgangsmaterial kommen anorganische Substrate wie Metalle, Keramik, oder Kunststoffe, zum Beispiel bioabbaubare Polyhydroxyester, und aus biologischem Material gewonnene ECM (meist Kollagene) infrage. Es existiert eine Vielfalt an Formen, wie zementharte oder flexible, faserhaltige Röhren, schwammartige Schichten, wässrige und gummiartige Gele. Die im Tissue Engineering eingesetzten Matrixmaterialen lassen sich in drei Gruppen unterteilen. Abiotische Trägermaterialien

Als abiotische Materialien werden Metall, Kunststoff und Keramik verwendet. Der Einsatz der abiotischen Materialien ist sehr eingeschränkt; sie werden z. B. im Bereich des Tissue engineering von Knochen und Gelenken verwendet. Für die meisten anderen Anwendungsfelder eignen sich die Materialien aufgrund ihrer biochemischen, thrombogenen und mechanischen Eigenschaften nicht. Synthetisch biologische Trägermaterialien

Die Auswahl biologisch inerter synthetischer Materialien basiert auf den Materialeigenschaften resorbierbarer Polymere, die die Bedürfnisse am späteren Implantationsort positiv unterstützen. Als wichtige Auswahlkriterien seien genannt: Für die Polyuretane ihre elastische Komponente, für die Poly(Methyl-metacrylate) deren physikalische Festigkeit und Transparenz, für die Poly(VinylAlkohole) deren hydrophile Eigenschaften, für Polyethylen die Zähigkeit und die Wasserabsorptionsfähigkeit, für die Poly(Vinyl-pyrrolidone) deren Suspensionseigenschaften oder für Derivate der Polyglykolsäure deren hydrophobe Eigenschaften. Diese Materialien und ihre Derivate werden häufig als Trägermaterial für die Herstellung von Blutgefäßen, Herzklappen, Haut oder als Brustimplantate und für Kontaktlinsen verwendet. Für die Herstellung von Drug-delivery-Systemen werden Poly-(2-hydroxy ethyl methacrylate), -(N-vinyl pyrrolidone), -(methyl methacrylate), -(Vinyl-Alkohol), -(acrylic acid), -(ethylene-co-vinyl acetate), -(ethylene glycol), -(methacrylic acid) eingesetzt. Zur Herstellung von bio-

266

Sektion 2 · Modelle

degradierbaren Trägerstrukturen werden in Abhängigkeit von der gewünschten Resorptionszeit Polylactide (PLA), Polyglycolide (PGA), Poly(lactide-co-glycolide) (PLGA), Polyanhydride oder Polyorthoester benutzt.

da die Klappenexplantate eine schwache inflammatorische Reaktion, Verkalkungen und eine fehlende Rebesiedlung der Matrixoberfläche zeigten. Funktionalisierte Trägermaterialien

Biologische Trägermaterialien

Im Fokus der Forschung stehen vermehrt biologische Materialien aus natürlichen Polymeren, wie modifizierte Glykosaminoglykane oder Kollagen-ChondroitinsulfatAggregate, die z. B. bei Hauttransplantaten eingesetzt werden. Auch modifizierte Komponenten der ECM, wie Kollagene, Fibrinogen, Thrombin („fibrin glue“), Elastin und Fibrin (Neuroblast) und Matrigel werden in allen Bereichen des Tissue engineering benutzt und befinden sich zum Teil bereits in der klinischen Anwendung (z. B. Kollagen I als Trägersubstanz für Knorpeltransplantate). Eine Alternative zu synthetischen biologischen Materialien sind die zellfreien menschlichen (allogenen) oder tierischen (xenogenen) Matrices. Diese Matrices werden vorwiegend im Bereich des kardiovaskulären Tissue engineering eingesetzt und basieren auf zellfreien Herzklappen oder Blutgefäßen von Spendertieren oder Menschen (Leyh et al. 2003). Aufgrund des Mangels an menschlichen Spenderblutgefäßen oder -herzklappen werden Herzklappenmatrices von Schwein und Schaf verwendet. Durch chemische oder enzymatische Verfahren werden die vorhandenen Zellen abgebaut. Ein kritischer Punkt bei der Verwendung dieser Matrices ist die Gefahr einer Abstoßungsreaktion bedingt durch xenogene ECM-Komponenten oder nicht entfernte Zelldebris. Biologische Matrices besitzen sehr gute Eigenschaften für die Adhäsion, Proliferation und Migration der Zellen. Sie gewährleisten die In-vivo-Funktion von implantierten bioartifiziellen Geweben. Allerdings besteht ein potenzielles Risiko der Übertragung pathogener Viren, wie z. B. porciner endogener Retroviren. Nach der Implantation immunologisch fremder Gewebe entstehen Abstoßungsreaktionen, sodass eine lebenslange Immunsuppression nach Implantation notwendig wird. Im Tissue Engineering wird durch unterschiedliche Strategien versucht, diese Reaktion des Immunsystems zu vermeiden, z. B. mit dem Prinzip der „guided tissue regeneration“. Hierbei werden zellfreie Trägerstrukturen, die lediglich die Form des zu ersetzenden Gewebes vorgeben, implantiert. Diese Scaffolds werden nach Implantation durch exogene (Matrix) und endogene Mechanismen des Körpers (Zellmigration) gewebetypspezifisch mit Zellen bewachsen (Nerem u. Seliktar 2001; Stock u. Vacanti 2001). Ein Beispiel sind Versuche zur Besiedelung von azellulären Herzklappen. Erste Implantationen von porcinen azellulären kryokonservierten Herzklappenmatrices (SYNERGRAFT, Cryolife Inc., USA) verliefen allerdings noch nicht erfolgreich,

Die Weiterentwicklung des Tissue Engineering hat dazu geführt, die Oberflächen der Trägermaterialien zu modifizieren, um spezifische Funktionen, wie z. B. Zelladhäsion, selektiv zu unterstützen. Hierbei werden z. B. durch Plasmabehandlung mit reaktiven Gasen funktionelle Gruppen eingeführt oder ultradünne Schichten (wenige Nanometer) aufgetragen. Häufig werden zusätzlich auch Makromoleküle, wie z. B. RGD-Peptide (Arg-Gly-Asp, eine Rezeptorkomponente der ECM) oder Integrine zur Steigerung der Zelladhäsion oder Metalle zur antimikrobiellen Ausstattung der Oberflächen eingesetzt. Ein weiterer gewünschter Effekt ist die Nanound Mikrostrukturierung der Oberflächen und die Vergrößerung der reaktiven Oberfläche durch die „layerby-layer“-Technologie.

2.2.4.3 Konstruktion von Geweben in vitro Bioartifizielle Gewebe im klinischen Einsatz Künstliche Haut

Die Haut ist das größte menschliche Organ, das sich aus Oberhaut (Epidermis) und Unterhaut (Dermis) zusammensetzt. Die Epidermis besteht aus lebenden und abgestorbenen Keratinozyten, die die verhornte, obere Schutzschicht der Haut (Lederhaut) bilden. Die Dermis besteht aus Fibroblasten und einem hohen Anteil an Kollagen, Elastin und Glykosaminoglykanen. Die Kommunikation der unterschiedlichen Zellen beider Schichten ist die Grundlage für die Funktionen der Haut, wie z. B. der Schutz vor penetrierenden Substanzen oder die Wundheilung. Großflächige Hautverletzungen, entstanden durch Verbrennungen, Verätzungen oder schwere Formen des Diabetes mellitus, sind ein Anwendungsgebiet für das Tissue Engineering von autologen Hauttransplantaten. Zur Generierung des bioartifiziellen Hautgewebes werden Zellen aus einer (etwa briefmarkengroßen) Hautbiopsie oder auswachsende Zellen von Follikeln aus („gezupften“) Haarwurzeln des Patienten in vitro vermehrt. Wichtig für den Vermehrungsprozess sind die epidermalen Vorläuferzellen der Keratinozyten. Unter organotypischen Kulturbedingungen (Air-Lift-Kultur) oder auf Feederlayer-Zellen differenzieren die Vorläuferzellen in Keratinozyten und bilden ein mehrschichtiges Epithel. Dieses Gewebe entspricht der menschlichen Epidermis, besitzt aber keine Dermis, Haare, Schweißdrüsen oder Pigmentzellen. Die bioartifizielle Haut hat meistens eine andere Textur und ähnelt Nar-

267 2.2 · Zellkulturtechniken, Zellmodelle und Tissue Engineering

bengewebe, sodass trotz erster klinischer Erfolge die derzeitige Situation noch nicht befriedigt. Bei der Hautregeneration tiefer Wunden liegt der Schwerpunkt auf der Schaffung eines „semisynthetischen Hautersatzes“, d. h., die Wunde wird mit biologischen und/oder synthetischen, bioabbaubaren porösen Materialien aufgefüllt, die eine Migration von Zellen (wie Fibroblasten, Makrophagen oder Lymphozyten) aus gesunden Hautarealen in die Wunde auslösen sollen. Die Wunde wird danach durch eine luft- und wasserdurchlässige Silikonfolie verschlossen. Nachdem sich die Dermis regeneriert hat, entfernt man die Silikonschicht und transplantiert darauf eine in vitro generierte mehrschichtige Epidermis. Eine weitere Form ist die „Haut aus der Tube“ (Recell). Hierbei werden Gemische aus unterschiedlichen Hautzelltypen mit physiologischer Kochsalzlösung (Recell), Proteinen der ECM oder Fibrin (BioSeed-S) auf die Wunde gesprüht, wo sie weiter wachsen und die Wunde verschließen. Regeneration von Knorpel

Neben der Haut sind bioartifizielle autologe Knorpeltransplantate im klinischen Einsatz. Dies ist dadurch begründet, dass Knorpelgewebe nur wenige Nährstoffe benötigt und im menschlichen Körper nicht vaskularisiert ist. Die Abnutzung und Degeneration von Gelenkknorpelgewebe ist aufgrund zunehmenden Alters der Bevölkerung, Übergewicht sowie von Sportverletzungen in den westlichen Industrieländern weit verbreitet. Allein in Deutschland sind 1,5 Mio. Menschen wegen degenerativer Gelenkerkrankungen in Behandlung. Zur Behandlung derartiger Erkrankungen ist die autologe Chondrozytentransplantation (ACT) seit etwa zehn Jahren in die klinische Praxis eingeführt (> Abb. 2.2.12). Hierzu werden aus einer Biopsie des gesunden Kniegelenks Knorpelzellen isoliert und in vitro kultiviert. Durch die Kulturbedingungen dedifferenzieren die Chondrozyten zu fibroblastenähnlichen Zellen, die

2.2

sich schnell vermehren. Bei der Transplantation wird zunächst das schadhafte Knorpelgewebe entfernt, dann der Defekt mit den autologen in vitro vermehrten Zellen aufgefüllt und das Operationsfeld mit autologer Knochenhaut geschlossen. Es wird angenommen, dass die Zellen im Gewebe wieder zu Chondrozyten redifferenzieren und Kollagen II produzieren. Die klinischen Daten belegen allerdings, dass nicht der benötigte elastische hyaline Knorpel produziert wird, sondern zum Großteil der weniger strapazierfähige Faserknorpel (Lindahl et al. 2003). Trotzdem können die Patienten die Gelenke nach vier bis sechs Wochen wieder normal belasten. In Deutschland wurden seit 2002 ca. 600 solcher Transplantationen pro Jahr durchgeführt. Ein neues Verfahren ist die autologe BandscheibenZelltransplantation ADCT („autologous disc chondrocyte transplantation“). Bei dieser Therapie von Bandscheibenvorfällen wird dem Patienten eine (geringe Menge) Bandscheibenbiopsie entnommen, die Zellen isoliert und für ca. 3 Monate expandiert. Unter örtlicher Betäubung injiziert der Chirurg die Zellen danach in den Bereich der defekten Bandscheibe. Dort vermehren sich die Zellen, produzieren Knorpel und gleichen den Gewebeverlust aus, der durch den Bandscheibenvorfall und die Operation entstanden sind. Die erste klinische Wiederherstellung eines ganzen Körperteils durch Tissue Engineering liegt ebenfalls im Bereich der Knorpelregeneration. Zur Rekonstruktion eines verstümmelten Ohres wurden einem Patienten Chondrozyten aus einer Rippe entnommen, in vitro expandiert und mit Fibrin in eine dem Ohr entsprechende Form gegossen. Diese Form wurde aus biokompatiblen Fasermaterialien als Träger kombiniert mit Gelmatrices aus Agarose, Alginat und Hyaluronsäure. Das Transplantat reifte nicht im Brutschrank, sondern auf dem Rücken einer Maus. Es entstand ein formstabiles Transplantat aus hyalinem Knorpel, das anschließend dem Patienten transplantiert und mit einem Hautlappen überzogen wurde. Dieses Verfahren zeigt die prinzipielle

. Abb. 2.2.12. Autologe Chondrozytentransplantation [Erklärung im Text (nach McPherson u. Tubo 2000)]

268

Sektion 2 · Modelle

Eignung und Anwendung der rekonstruktiven Medizin mithilfe des Tissue Engineering, es ist aber noch weit entfernt von einem klinischen Routineverfahren, beispielsweise für Unfallopfer. Regeneration von Knochen

Knochen, Knorpel und Sehnen sind Abkömmlinge des Mesenchyms. Mesenchymale Stammzellen (MSC) können u. a. aus dem Knochenmark von Erwachsenen isoliert und in vitro vermehrt werden. Knochengewebe wird von Osteoblasten gebildet, die wiederum aus Knochenmarkstammzellen entstehen. Es sind zahlreiche Signalmoleküle bekannt, die die osteogene Differenzierung mesenchymaler Stammzellen regulieren. Dazu zählen z. B. die sogenannten BMPs („bone morphogenetic proteins“). Die Knochenwachstumsfaktoren sorgen dafür, dass Zellen „angelockt” werden und auch in künstliches Trägermaterial hineinwachsen. Die US-amerikanische Zulassungsbehörde FDA (Food and Drug Administration) hat ein rekombinantes BMP-2 für orthopädische Anwendungen zugelassen und somit erste Voraussetzungen für den Ersatz von Knochen durch Tissue Engineering geschaffen. Als Trägermaterial werden anorganische Knochensubstanzen aus Calciumphosphat/Hydroxyapatit eingesetzt. Ein wesentliches Kriterium ist die Porosität des Materials. Solche künstlichen Knochenstrukturen mit oder ohne Zellen wurden schon in zahlreichen Tierexperimenten implantiert und belegen die biomechanische Eignung des Materials. Für den Langzeitersatz fehlte allerdings die Vaskularisation des Implantats. Dieses Problem wurde auf eine neue Art bei einem 56 Jahre alten Patienten gelöst, bei dem man den durch einen Tumor zerstörten Unterkiefer rekonstruierte. Durch Computersimulation wurde die Form des Unterkiefertransplantats modelliert und analog ein Geflecht aus Titandraht hergestellt. Diese Form wurde mit Calciumphosphat und Hydroxyapatit, BMB-2 und Knochenmarkzellen des Patienten aufgefüllt und unterhalb des Schulterblatts eingepflanzt. Das Transplantat reifte für 7 Wochen im Körper des Patienten. Es entstand ein zunehmend festeres, vaskularisiertes Knochengewebe. Nach dieser Zeit wurde das Unterkiefer-Transplantat mit Blutgefäßen und einigen Muskelsträngen aus dem Rückenmuskel entnommen und in den Unterkiefer transplantiert. Das Titandrahtgerüst soll später wieder entfernt werden. In ähnlicher Weise konnte die komplette Vorderstirnplatte einer Patientin ersetzt werden. Zellbasierte Therapien In den letzten Jahren wurde aufbauend auf den Ergebnissen der Stammzellforschung eine weitere Strategie der regenerativen Medizin, die Zelltherapie, intensiv untersucht und bereits in ersten klinischen Studien erprobt. Hierbei werden körpereigene (autologe) Zellen des Pa-

tienten, meist adulte Stamm- oder Progenitorzellen aus dem peripheren Blut oder dem Knochenmark, isoliert und entweder unmittelbar oder nach einer In-vitro-Vermehrungsphase in das zu therapierende Gewebe injiziert. Anwendungsbereiche sind die Transplantation von Knochenmark bzw. Knochenmarkstammzellen nach der Chemotherapie von Krebserkrankungen. Bereits Mitte der 1980er Jahre gelang es, gentechnisch hergestellte hämatopoetische Wachstumsfaktoren zur Mobilisierung und Vermehrung der Stammzellen einzusetzen und so die Stammzelltherapie im hämatopoetischen System in der Klinik einzuführen. Im Jahr 2000 wurden in Deutschland 2.105 autologe und 1.438 allogene Stammzelltransplantationen durchgeführt. Derzeit werden Multizentren-Studien durchgeführt, um die Effektivität adulter Stammzelltransplantationen zur Regeneration von Herzgewebe bei Patienten nach Herzinfarkt zu untersuchen (7 4.4.„Medizinische Perspektiven der kardialen Stammzellforschung“). Bioartifizielle Gewebe in präklinischen Testverfahren Blutgefäße

Der Bedarf an transplantierbaren Blutgefäßen nach Verletzungen, Bypass-Operationen und schweren Thrombosen ist groß. Derzeit werden hierfür Gefäßprothesen aus Kunststoff eingesetzt, wobei 40% solcher synthetischen Bypasses nach einem Jahr, bedingt durch Thromben, nicht mehr durchgängig sind. Im Bereich des Tissue Engineering werden diese Kunststoffprothesen oder neue Materialien (wie z. B. ein Gemisch aus 92% Polyglycolsäure und 8% Milchsäure) mit Fibroblasten, glatten Muskelzellen und Endothelzellen in einem Durchfluss-Bioreaktorsystem unter pulsierenden Flussbedingungen besiedelt. Diese konditionierten dreischichtigen Gefäßprothesen können einem Druck von 2.000 mmHg standhalten. Erste autologe endothelialisierte Prothesen befinden sich in klinischen Testverfahren. Herzklappen und Herzmuskelgewebe

Herzklappen können von Geburt an, nach Infektion oder Alterung defekt sein. Seit Jahrzehnten werden diese routinemäßig durch biologische, mechanische Kunststoff- oder Metall-Herzklappenprothesen ersetzt. Patienten mit synthetischen Herzklappen müssen lebenslang Gerinnungshemmer einnehmen. Die Haltbarkeit biologischer Prothesen ist zeitlich begrenzt und bedingt so Mehrfachoperationen, was besonders bei Kindern problematisch ist. Erfolgversprechende Strategien berücksichtigen den biochemischen Aufbau einer Herzklappe. Die Oberseite der drei Segel ist mit Kollagen verstärkt, die Unterseite besteht hauptsächlich aus Elastin. Eine dieser Strategien

269 2.2 · Zellkulturtechniken, Zellmodelle und Tissue Engineering

nutzt die Kollagenmatrix von Schweine-Aortenklappen als Gerüst für das neue Herzklappensegel. Im ersten Schritt werden enzymatisch oder chemisch die tierischen Zellen entfernt. Diese azelluläre Matrix wird entweder direkt oder nach Modifikation zur Langzeitstabilisierung ohne In-vitro-Besiedelung implantiert. Alternativ kann die Klappe mit Endothelzellen und/oder Muskelzellen, Fibroblasten oder endothelialen Vorläuferzellen aus dem peripheren Blut besiedelt werden. Eine andere Strategie liegt in der Verwendung von bioabbaubaren Polymeren, die sich bis zum Zeitpunkt der Implantation mehr oder weniger aufgelöst haben. Die Strukturen werden mit Myofibroblasten, Blut- oder Nabelschnurstammzellen besiedelt und in einem Perfusionsbioreaktor kultiviert. Jährlich erleiden 300.000 Menschen in Deutschland einen Herzinfarkt. Deshalb gibt es seit Jahrzehnten Bestrebungen, auch den Herzmuskel durch bioartifizielle Implantate zu regenerieren. Ein Problem hierbei ist jedoch, dass Herzmuskelzellen des Menschen terminal differenziert sind und somit in vitro nicht vermehrt werden können. Aus diesen Gründen liegt die Hoffnung auf stammzellvermittelten Zelltherapiestrategien. Neuronale Gewebe

Mit steigender Lebenserwartung gewinnen neurodegenerative Erkrankungen wie Altersdemenz (AlzheimerKrankheit) und Parkinson-Krankheit an Bedeutung. In Deutschland leiden ca. 250.000 Menschen an der Parkinson-Erkrankung. Hier stehen stammzellbasierte Therapieformen im Fokus der Forschung. In den letzten Jahren wurden auch beim Menschen in Regionen des Mittelhirns multipotente neuronale Vorläuferzellen, die in Astrozyten, Neurone und Oligodendrozyten differenzieren können, identifiziert. Die Kultivierung und gezielte Differenzierung dieser Zellen stellt – ebenso wie die Gewinnung neuronaler Zellen aus ES-Zellen – die Grundlage für neue therapeutische Strategien dar. Luftröhre

Patienten mit Atemwegstumoren oder nach langer künstlicher Beatmung haben häufig großflächige Verletzungen der Luftröhre. Synthetische Materialien eignen sich aufgrund der Anfälligkeit für bakterielle Infektionen und der fehlenden Vaskularisation nicht für den Ersatz der Luftröhre. Deshalb gibt es Bestrebungen, einen autologen bioartifiziellen Trachea-Ersatz, basierend auf einer vaskularisierten porcinen Matrix, aufzubauen. In ersten Implantationsstudien konnte gezeigt werden, dass diese Kollagenmatrix mit autologen Zellen des Patienten rebesiedelt werden kann. DNA-Fingerprint-Analysen belegten, dass während des Azellularisierungsprozesses der Matrix alle porcinen Zellen entfernt wurden und das Implantat nur aus autologen Zellen des Patienten be-

2.2

stand. Das Implantat integrierte sich innerhalb von 3 Monaten in das native Gewebe, wurde vaskularisiert und von einem funktionellen Flimmerepithel in vivo besiedelt. Der Remodeling-Prozess der xenogenen Matrix findet demzufolge im Organismus statt. Immunologisch waren keine Anzeichen einer Abstoßungsreaktion der xenogenen Matrix nachweisbar (Walles et al. 2004, 2005). Niere, Pankreas und Leber

In den letzten Jahren wurden vermehrt Arbeiten publiziert, die eine Differenzierung verschiedener Nierengewebezellen (z. B. Endothelvorläuferzellen, intraglomeruläre Mesangialvorläuferzellen und Tubulivorläuferzellen) aus unterschiedlichen Gewebequellen beschreiben. Derzeit sind jedoch noch keine Verfahren zur effizienten In-vitro-Differenzierung von bioartifiziellem Nierengewebe bekannt. In Deutschland leiden 4 Millionen Menschen an Diabetes mellitus. Obwohl die Bildung insulinproduzierender Zellen aus diversen Stammzellpopulationen gezeigt wurde, ist die In-vitro-Kultivierung funktionaler E-Zellen derzeit noch nicht möglich. Jedoch wird an verschiedenen Strategien zur Generierung von E-Zellen aus pluripotenten Stammzellen und pankreatischen Vorläuferzellen gearbeitet (s. Wobus u. Boheler 2005, 2006). Die menschliche Leber verfügt über ein hohes Selbstregenerationspotential. Bei Schädigung durch Fibrosen und Zirrhosen, nach Hepatitis B und C oder durch Alkoholmissbrauch, ist die Leberfunktion oft stark eingeschränkt, sodass eine Transplantation erforderlich ist. Zur Überbrückung des Zeitraums, bis eine geeignete Spenderleber zur Verfügung steht, wird bereits ein bioartifizielles Lebersystem klinisch eingesetzt. Hierbei werden Hepatozyten in Hohlfaserbioreaktoren gezüchtet und für wenige Stunden an den Kreislauf des Patienten zur Entgiftung des Blutes angeschlossen. Zwei Parameter sind allerdings noch zu optimieren: 1. die effektive Kultur der Hepatozyten ohne Funktionsverlust und 2. das optimale Design des funktionellen Bioreaktors. Die Stammzellforschung ist darauf ausgerichtet, ideale Wachstumsbedingungen und molekulare Signale zur Differenzierung von Leberstammzellen in funktionelle Hepatozyten zu finden.

2.2.4.4 Regulatorische Aspekte In Deutschland wird die Gewinnung und/oder Anwendung von humanen Zellen, Geweben und von Stoffen menschlicher Herkunft und den zu ihrem Einsatz erforderlichen Materialien, Geräten und Vorrichtungen

270

Sektion 2 · Modelle

durch verschiedene Gesetze und Rechtsverordnungen geregelt. Die wichtigsten sind das Gewebegesetz (ab 1.8.2007), das Arzneimittelgesetz (AMG), die Pharmabetriebsverordnung (PharmBetrV), das Transplantationsgesetz (TPG), das Transfusionsgesetz (TFG), das Medizinproduktegesetz (MPG), das Embryonenschutzgesetz (EschG) und das Stammzellgesetz (StZG). Zur Herstellung von autologen oder allogenen Zellund Gewebeprodukten ist grundsätzlich eine arzneimittelrechtliche Herstellungserlaubnis der zuständigen Landesbehörde (Regierungspräsidium) erforderlich. Die Bundesbehörde, das Paul-Ehrlich-Institut, übt bei der Festlegung der Bedingungen während des Herstellungsprozesses eine beratende Funktion aus. Die Empfehlungen sind die Grundlage für die Produktionsvorschriften zur Herstellungserlaubnis. Alle Arbeitsschritte zur Herstellung von Zell- und Gewebeprodukten müssen zudem der pharmazeutischen Betriebsverordnung § 1 Abs. 3 entsprechen, und es gelten die Anforderungen der EG-Richtlinie guter medizinischer Herstellungspraxis (GMP), gemäß § 1a PharmBetrV. In den USA ist die „Food and Drug Administration“ (FDA) für Zell- und Gewebeprodukte verantwortlich. 2001 wurde ein Regelwerk für „Human Cells, Tissues, and Cellular and Tissue Based Products: Establishment, Registration and Listing“ verabschiedet. Die USA verfolgen hierbei einen pragmatischen Ansatz, der sich an den potenziellen Risiken orientiert, die mit einem Produkt verbunden sind. Als Produkte gelten Pharmaka, Medizinprodukte, Biologicals oder Kombinationsprodukte. Für Produkte, die implantiert werden sollen oder unmittelbar lebenserhaltende Qualität haben, verlangt die FDA präklinische und klinische Studien, mit denen Sicherheit und Effektivität demonstriert werden soll. Die Herstellungsverfahren müssen GMP-Standards erfüllen. Im Gegensatz zu den USA gibt es in Europa noch kein einheitliches Regelwerk. Eine besondere EG-Richtlinie, die das Tissue Engineering von Zellen und Geweben und damit die Herstellung von Zell- und Gewebeprodukten zur medizinischen Anwendung regelt, wird seit 2002 diskutiert. Die EG-Richtlinie „Menschliche Gewebe und Zellen“ enthält nur Mindestanforderungen. Die Mitgliedsstaaten können eigene strengere Bestimmungen erlassen. Dieses zersplitterte System nationaler Regelungen mit sehr unterschiedlichen Markteintrittsbarrieren und Rahmenbedingungen hemmt in Europa die Entwicklung neuer Therapiekonzepte beträchtlich. Bis 2009 soll jedoch eine Kommission eingerichtet werden (Committee for Advanced Therapies, CAT), die dann für die europaweite Zulassung von TE-Produkten nach einheitlichen Richtlinien verantwortlich ist.

2.2.5 Ausblick Zelluläre Kommunikation im Gewebeverband spielt eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung und Funktion gesunder Gewebe und Organe sowie bei der Entstehung von Krankheiten. Diese Mechanismen der zellulären Interaktion und der Zell-Matrix-Wechselwirkung sind von gravierender Bedeutung für die gewebespezifische Funktion im Organismus. Die Prozesse können – wie im vorliegenden Beitrag gezeigt – an vielen Zelltypen mithilfe kultivierter Zellen auch außerhalb des Organismus untersucht werden. Die Methodik der Zellkultur ist heute dem empirischen Stadium weitgehend entwachsen. Die Anwendung modernster molekular- und zellbiologischer Techniken in Zusammenhang mit der Entwicklung hoch komplexer Zellmodelle erlaubt es, von Zellkulturen der „2. und 3. Generation“ zu sprechen. Darunter werden in erster Linie dreidimensionale Zellmodelle zusammengefasst, bei denen im Vergleich zu den vielfach noch gebräuchlichen zweidimensionalen Kulturen eine den In-vivo-Verhältnissen entsprechende Anordnung und Interaktion der Zellen erreicht wird. Unter diesen Bedingungen entwickeln Zellen auch in Kultur gewebespezifische Leistungen, die denen im lebenden Organismus bereits recht nahe kommen. Die Kultivierung von Zellen in dreidimensionalen Aggregaten und die Verwendung von Wachstums- und extrazellulären Matrixfaktoren erlaubt Untersuchungen von Zell-Zell- und Zell-MatrixInteraktionen unter organotypischen Bedingungen, ohne dass für derartige Untersuchungen lebende Tiere zur Organentnahme und zu unmittelbaren Versuchszwecken verwendet werden müssen. Mithilfe von Zellkulturen sind eine Vielzahl von diagnostischen Verfahren entwickelt worden, angefangen von der pränatalen Diagnose bis hin zur Untersuchung komplexer pathologischer Zustandsformen wie Metastasierung und Invasivität. Der vorangegangene Beitrag hat Beispiele für derartige zell- und molekularbiologische, genetische, entwicklungsbiologische und biochemische Untersuchungsverfahren mit Zellmodellen aufgezeigt, die in der medizinischen Grundlagenforschung und in der klinischen Praxis Anwendung finden. Darüber hinaus ist die moderne Biotechnologie ohne Zellkulturen nicht mehr denkbar, und viele biotechnologische Verfahren und Produkte auf der Grundlage tierischer und humaner Zellen kommen der medizinischen Diagnostik und Therapie zugute. Weiterhin wurde im vorliegenden Kapitel an einigen Beispielen demonstriert, dass in Kultur generierte Zellen und Gewebe durch Verfahren des Tissue Engineering bereits heute für einen Gewebeersatz eingesetzt werden können. Die intensiven weltweiten Arbeiten auf dem

271 2.2 · Zellkulturtechniken, Zellmodelle und Tissue Engineering

Gebiet der Stammzellforschung und regenerativen Medizin lassen zukünftig auf weitere Therapien hoffen.

2.2.6 Literatur Boxberger, H.-G. and T.F. Meyer (1994) A new method for the 3-D in vitro growth of human RT112 bladder carcinoma cells using the alginate culture technique. Biol. Cell. 82: 109–119 Bradley, A., M. Evans, M.H. Kaufman and E. Robertson (1984) Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature 309: 255–256 Caplan, A.I. and S.P. Bruder (2001) Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol. Med. 6: 259–264 Carrel, A. (1912) On the permanent life of tissues outside of the organism. J. Exp. Med. 15: 516–528 Chen, T. R. (1977) In situ demonstration of mycoplasma contamination in cell cultures by fluorescent Hoechst 33258 stain. Exp. Cell Res. 104: 255–262 Cross, M. and T.M. Dexter (1991) Growth factors in development, transformation and tumorigenesis. Cell 64: 271–280 Dexter, T.M., E. Spooncer, P. Simmons and T.D. Allen (1984) Longterm marrow culture: An overview of technique and experience. In: Wright, D.G. and J.S. Greenberger (eds.) Long-Term Bone Marrow Culture, Kroc Foundation Series 18, Alan R. Liss, New York, pp.57–96 Doyle, A. and J.B. Griffiths (Eds.) (2000) Cell and Tissue Culture for Medical Research. John Wiley & Sons, Ltd. Chichester New York Weinheim Brisbane Singapore Toronto Doyle, A., J.B. Griffiths and D.G. Newell (Eds.) (1998) Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures. John Wiley & Sons, Chichester New York Brisbane Toronto Singapore Eschenhagen, T., C. Fink, U. Remmers, H. Scholz, J. Wattchow, J. Weil, W. Zimmermann, H.H. Dohmen, H. Schafer, N. Bishopric, T. Wakatsuki and E.L. Elson (1997) Three- dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: new heart muscle model system. FASEB J. 8: 683–694 Evans, M.J. and M.H. Kaufman (1981) Establishment in culture of pluripotential stem cells from mouse embryos. Nature 291: 154–156 Freshney, R.I. (1994) Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 3rd edition., John Wiley & Sons, Inc., New York Friedenstein, A.J., U.F. Gorskaja and N.N. Julagina (1976) Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Exp. Hematol. 4: 267–274 Fusenig, N. and P. Boukamp (1994) Carcinogenesis studies of human cells: Reliable in vitro models. In: Cell Culture in Pharmaceutical Research. Fusenig, N.E. and H. Graf (eds.) Springer-Verlag Berlin-Heidelberg, pp. 80–102 Gerlach, J.C. (1996) Development of a hybrid liver support system: a review. Int. J. Artif. Organs 19: 645–654 Gerlach, J.C. and P. Neuhaus (1994) Culture model for primary hepatocytes. In Vitro Cell. Dev. Biol. 30A: 640–642 Griffith LG (2002). Emerging design principles in biomaterials and scaffolds for Tissue engineering. Ann. N. Y. Acad. Sci. 961: 83–95 Halle, W. (1976) Zell- und Gewebezüchtung bei Tieren, VEB Gustav Fischer Verlag, Jena Halle, W. und H. Spielmann (1994) Zur Qualität der Vorhersage der akuten Toxizität (LD50) aus der Zytotoxizität (IC50x) für eine Gruppe von 26 Neurotropika aufgrund der Daten des „Erweiterten Registers der Zytotoxizität“. ALTEX (Alternat. Tierexp.) 11: 148–153

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272

Sektion 2 · Modelle

Martin, G. (1981) Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma cells. Proc. Natl. AScad. Sci. USA 78: 7634–7638 Masters, J.R.W. (2000) Animal Cell Culture. Third Edition. A Practical Approach. Oxford University Press Matsui, Y., K. Zsebo and B.L.M. Hogan (1992) Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell 70: 841–847 Maurer, H.R. (1992) Towards serum-free, chemically defined media for mammalian cell culture, In: Freshney, R.I. (edt.) Animal Cell Culture – A Practical Approach. IRL Press Oxford, pp. 15–46 McPherson, J.M. and R. Tubo (2000) Articular cartilage injury. In: Lanza, R.P., R. Langer and J. Vacanti (Eds.) Principles of Tissue engineering. Academic Press San Diego San Francisco New York London Sydney Tokyo, pp. 697–709 Mertsching, H., T. Walles, M. Hofmann, J. Schanz and W.H. Knapp (2005) Engineering of a vascularized scaffold for artificial tissue and organ generation. Biomaterials 26: 6610–6617 Metcalf, D. (1989) The molecular control of cell division, differentiation, commitment and maturation of haematopoietic cells. Nature 339: 27–30 Minor, P.D. (1994) Ensuring safety and consistency in cell culture production processes: viral screening and inactivation. Trends Biotechnol. 12: 257–261 Minuth, W.W., G. Stöckl, S. Kloth and R. Dermietzel (1992) Construction of an apparatus for perfusion cell cultures which enables in vitro experiments under organotypic conditions. Europ. J. Cell Biol. 57: 132–137 Moorhead, P.S., P.C. Nowell, W.J. Mellman, D.M. Battips and D.A. Hungerford (1960) Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood. Exp. Cell Res. 20: 613– 616 Moscona, A.A. (1961) Rotation-mediated histogenetic aggregation of dissociated cells. Exp. Cell Res. 22: 455–475 Mueller-Klieser, W. (1987) Multicellular spheroids – a review on cellular aggregates in cancer research. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 113: 101–122 Nelson-Rees, W.A., D.W. Daniels and R.R. Flandermeyer (1981) Crosscontamination of cells in culture. Science 212: 446–447 Nerem, R.M. and D. Seliktar (2001) Vascular Tissue engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3: 225–243 Petricciani, R.L. (1991) Regulatory philosophy and acceptability of cells for the production of biologicals. Dev. Biol. Stand. 75: 9–15 Pollard, J.W. and J.M. Walker (Eds.) (1997) Basic Cell Culture Protocols. Second Edition. In: Walker, J.M. (ed.) Methods in Molecular Biology. vol. 75, Humana Press, Totowa, New Jersey Prokop, A. (2001) Bioartificial organs in the twenty-first century: nanobiological devices. Ann. N. Y. Acad. Sci. 944: 472–490 Reyes, M., T. Lund, T. Lenvik, D. Aguiar, L. Koodie and C.M. Verfaillie (2001) Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. Blood 98: 2615–2625 Robertson, E. (1987) Embryo-derived stem cell lines. In: Robertson, E.J. (ed.) Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A Practical Approach. IRL Press, Oxford, pp.71–112

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273 2.2 · Zellkulturtechniken, Zellmodelle und Tissue Engineering

2.2.7 Zeittafel 1907

Kultivierung neuronaler Gewebeexplantate von Froschembryonen durch Harrison (Harrison 1907)

1912

Carrel etabliert erste Zellkulturen von Bindegewebe (Carrel 1912).

1948

Einzelzellklonierung von L-Zellen (Sanford et al. 1948)

1952

Moscona legt Aggregatkulturen von embryonalen Zellen des Hühnchens an (Moscona 1952).

1955

Entwicklung halbsynthetischer Zellkulturmedien durch Eagle (Eagle 1955) Entwicklung der Feederlayer-Technik (Puck u. Marcus 1955)

1960

Einsatz von Phytohämagglutinin als Mitoseinduktor in Leukozytenkulturen

1961

Kultivierung menschlicher diploider Fibroblasten, begrenzte Lebenszeit humaner diploider Fibroblasten (Hayflick U. Moorhead 1961)

1963

Etablierung der embryonalen Mausfibroblastenlinie 3T3 (Todaro u. Green 1963)

1964

Entwicklung eines zellulären Transformationsassays (Todaro u. Green 1964) Zellzyklusstudien an kultivierten Säugerzellen

1967

Etablierung von Mensch-Maus-Hybrid-Zelllinien (Weiss u. Green 1967) Etablierung der Maus-Friend-Erythroleukämiezelllinie (FEL) (Rossi u. Friend 1967)

1968

Yaffe etabliert myogene Zelllinien mit Erhalt der Differenzierungsfähigkeit in vitro (Yaffe 1968 a, b). Induktion und Isolierung von Nährstoffmutanten in CHO-Zellen (Kao u. Puck 1968)

1970

Klonierung humaner Lymphozyten in vitro (Choi u. Bloom 1970) Entwicklung multizellulärer Sphäroide als Modellsystem für solide Tumoren (Sutherland et al. 1970)

1971

Morphologische Transformation von CHO-Zellen (Hsie u. Puck 1971)

1975

Kultur von Hautepithelzellen als Grundlage für Hauttransplantationen (Rheinwald u. Green 1975) Demonstrationen des Entwicklungspotenzials von in vitro kultivierten Mausteratokarzinomzellen (Mintz et al. 1975)

1977

Entwicklung der Feederzell-Kultur für Knochenmarkzellen (Dexter et al. 1977)

1980

Klonierung hämatopoetischer Zellen in Agarkulturen unter Anwesenheit von koloniestimulierenden Faktoren (Burgess u. Metcalf 1980)

1981

Etablierung pluripotenter Maus-ES-Zelllinien (Evans u. Kaufman 1981; Martin 1981)

1987

Homologe Rekombination in ES-Zellen zur Schaffung von Knockout-Tieren (Thomas u. Capecchi 1987)

1994

Autologe Chondrozytentransplantation (Brittberg et al. 1994) Hämatopoetische Zelllinie ,,FDCP-mix« (Freshney 1994)

1998

Kultivierung pluripotenter humaner ES- und EG-Zellen (Shamblott et al. 1998 ; Thomson et al. 1998)

1999

Rekonstitution einer funktionierenden Blase mithilfe des autologen Tissue engineering beim Hund (Oberpenning et al. 1999)

2001

Knochenmarkzellen der Maus regenerieren Herzfunktion nach Infarkt im Tiermodell (Orlic et al. 2001)

2005

Entwicklung von Oozyten aus embryonalen Stammzellen der Maus (Huebner et al. 2003)

2006

Identifizierung von 4 Pluripotenzfaktoren Oct3/4, Sox2, c-myc und Klf4, die Fibroblasten der Maus in embryonale Stammzellen reprogrammieren können (Takahasi u. Yamanaka 2006)

2007

Nachweis der korrekten Reprogrammierung somatischer Zellen der Maus in induzierte pluripotente Stamm (iPS)-Zellen, die embryonalen Stammzellen entsprechen (Wernig et al. 2007, Maherali et al. 2007, Okita et al. 2007)

2.2

274

Sektion 2 · Modelle

Literatur zur Zeittafel Brittberg M, Lindahl A, Nilsson A, Ohlsson C, Isaksson O, Person L (1994) Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med 331: 889–895 Burgess AW, Metcalf D (1980) The nature and action of granulocytemacrophage colony-stimulation factors. Blood 56: 947–958 Carrel A (1912) On the permanent life of tissues outside of the organism. J Exp Med 15: 516–528 Choi KW, Bloom AD (1970) Cloning human lymphocytes in vitro. Nature 227: 171–173 Dexter TM, Allen TD, Lajtha LG (1977) Conditions controlling the proliferation of haemopoietic stem cells in vitro. J Cell Physiol 91: 335–345 Eagle H (1955) Nutrition needs of mammalian cells in tissue culture. Science 122: 501–504 Einsatz von Phytohämagglutinin als Mitoseinduktor in Leukozytenkulturen Evans MJ, Kaufman MH (1981) Establishment in culture of pluripotential stem cells from mouse embryos. Nature 291: 154–156 Freshney RI (1994) Culture of animal cells. A manual of basic techniques, 3rd edn. Wiley, Chichester New York Harrison RG (1907) Observations on the living developing nerve fibre. Anat Rev 1: 116–118 Hayflick L, Moorhead PS (1961) The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res 25: 585–621 Hsie AW, Puck TT (1971) Morphological transformation of Chinese hamster cells by dibutyryl adenosine cyclic 3’:5’-monophosphate and testosterone. Proc Natl Acad Sci USA 68: 358–361 Huebner K, Fuhrmann G, Christenson LK, Kehler J, Reinbold R, DeLaFuente R, Wood J, Strauss III JF, Boiani M, Schoeler HR (2003) Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science 300: 1251–1256 Kao F-T, Puck TT (1968) Genetics of somatic mammalian cells. VII. Induction and isolation of nutritional mutants in Chinese hamster cells. Proc Natl Acad Sci USA 60: 1275–1281 Maherali N, Sridharan R, Xie W, Utikai J, Eminli S, Arnold K, Stadtfeld M, Yachenko R, Tchieu J, Jaenisch R, Plath K, Hochedlinger K (2007) Global epigenetic remodelling in directly reprogrammed fibroblasts. Cell Stem Cell 1: 55–70 Martin G (1981) Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma cells. Proc Natl Acad Sci USA 78: 7634–7638 Mintz B, Illmensee K, Gearhart JD (1975) Developmental and experimental potentialities of mouse teratocarcinoma cells from embryoid body cores. In: Sherma MI, Solter D (eds) Teratomas and differentiation. Academic Press, New York, pp 59–82 Moscana AA (1952) Cell suspensions from organ rudiments of chick embryos. Exp Cell Res 3: 535–539

Oberpenning F, Meng J, Yoo JJ, Atala A (1999) De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering. Nat Biotechnol 17: 149–155 Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S (2007) Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 448: 313–317 Orlic D, Kajstura J, Chimenti S et al. (2001) Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature 410: 701–705 Puck TT, Marcus PI (1955) A rapid method for viable cell titration and clone production with HeLa cells in tissue culture: the use of X-irradiated cells to supply conditioning factors. Proc Natl Acad Sci USA 41: 432–437 Rheinwald JG, Green H (1975) Serial cultivation of strains of human epidermal kerationcytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell 3: 331–343 Rossi GB, Friend C (1967) Erythrocytic maturation of (Friend) virusinduced leukemic cells in spleen clones. Proc Natl Acad Sci USA 58: 1373–1380 Sanford KK. Earle WR, Likely GD (1948) The growth in vitro of single isolated tissue cells. J Natl Cancer Inst 9: 229–246 Shamblott MJ, Axelman J, Wand S et al. (1998) Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells. Proc Natl Acad Sci USA 95: 13726–13731 Sutherland RM, Inch WR, McCredie JA, Kruuv J (1970) A multicomponent radiation survival curve using an in vitro tumour model. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med 18: 491–495 Takahashi K, Yamanaka S (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126: 663–676 Thomas KR, Capecchi MR (1987) Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell 51: 503–512 Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS et al. (1998) Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282: 1145–1147 Todaro GJ, Green H (1963) Quantitative studies of the growth of mouse embryo cells in culture and their development into established lines. J Cell Biol 17: 299–313 Todaro GJ, Green H (1964) An assay for cellular transformation by SV40. Virology 23: 117–119 Weiss MC, Green H (1967) Human-mouse hybrid cell lines containing partial complements of human chromosomes and functioning human genes. Proc Natl Acad Sci USA 58: 1104–1111 Wernig M, Meissner A, Foreman R, Brambrink T, Ku M, Hochedlinger K, Bernstein BE, Jaenisch R (2007) In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature 448: 318–324 Yaffe D (1968a) Developmental changes preceding cell fusion during muscle cell differentiation in vitro. Exp Cell Res 66: 33–48 Yaffe D (1968b) Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA 61: 477–483

2.3 2.3 Molekülmodelle und Modellmoleküle: Strukturanalyse großer biologischer Moleküle für die Medizin* Yves A. Muller und Udo Heinemann

2.3.1

Einleitung

– 276

2.3.1.1 2.3.1.2 2.3.1.3 2.3.1.4

Biophysikalische Prinzipien der Molekülstrukturen – 276 Physikalische Prinzipien intermolekularer Wechselwirkungen – 276 Faltungsprinzipien von Proteinen – 277 Supersekundärstruktur, Strukturmotiv, Domänenstruktur – 279

2.3.2

Strukturbiologische Methoden – 280

2.3.2.1 2.3.2.2 2.3.2.3 2.3.2.4 2.3.2.5

Kernmagnetische Resonanzspektroskopie – 280 Kristallstrukturanalyse – 281 Elektronenmikroskopie und -diffraktion – 282 Andere biophysikalische Methoden – 282 Modellierung von Molekülen und intermolekularen Wechselwirkungen – 283

2.3.3

Molekülstrukturen in Biologie und Medizin

2.3.3.1 2.3.3.2 2.3.3.3 2.3.3.4 2.3.3.5

Cytochrom-P450-System – 283 Wachstumsfaktoren – 284 Cystinknotenwachstumsfaktoren – 286 Hämatopoetische Wachstumsfaktoren – 287 G-Proteine als molekulare Schalter – 287

2.3.4

Moleküle beflügeln die Arzneimittelentwicklung – 289

2.3.5

Ausblick

– 290

2.3.6

Literatur

– 290

2.3.7

Zeittafel

– 294

– 283

* Dieser Beitrag wurde unverändert aus der 2. Auflage übernommen.

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

276

Sektion 2 · Modelle

2.3.1 Einleitung Die Molekulare Medizin handelt von Molekülen und ihren vielfältigen Funktionen im gesunden und kranken Organismus. Diese Funktionen sind eng an die genaue dreidimensionale Molekülstruktur geknüpft: Die große Mehrzahl der Proteine und Nukleinsäuren einer Zelle besitzen eine definierte räumliche Struktur, die auf der Ebene einzelner Atome exakt beschrieben werden kann. Ein wichtiger Teil dieser Struktur sind charakteristisch geformte Oberflächen mit diskreten biophysikalischen Eigenschaften wie elektrostatisches Potenzial, Hydrophobizität oder die Fähigkeit zur Ausbildung gerichteter, nichtkovalenter Wechselwirkungen (z. B. durch Wasserstoffbrücken) mit anderen Molekülen. Die Komplementarität dieser Oberflächen ist für die Interaktion zwischen Molekülen und damit die Ausprägung ihrer Funktionalität entscheidend. Mit der Kristallstrukturanalyse und der kernmagnetischen Resonanzspektroskopie stehen gut etablierte Methoden zur Generierung exakter dreidimensionaler Molekülmodelle von Proteinen oder Nukleinsäuren zur Verfügung. Sie werden durch biophysikalische Techniken mit geringerer Orts-, aber häufig höherer Zeitauflösung ergänzt, mit denen Strukturumwandlungen von Molekülen oder Komplexbildung zwischen Molekülen untersucht werden können. Durch Kombination dieser Methoden ist es gelungen, viele biologische Makromoleküle strukturell und funktionell eingehend zu charakterisieren. Insbesondere haben sie zu einem weitgehenden Verständnis der biophysikalischen Prinzipien der Molekülstrukturen und intermolekularer Wechselwirkungen geführt. Diese Prinzipien sollen im Folgenden ebenso kurz zusammengefasst werden wie die wichtigsten strukturanalytischen Methoden, wobei wir uns auf Proteine beschränken wollen. Am Beispiel einiger Modellmoleküle wollen wir dann beschreiben, wie Proteinstrukturen zu einem vertieften Verständnis biologischer Vorgänge beitragen. Schließlich soll gezeigt werden, dass dreidimensionale Proteinstrukturen darüber hinaus in sehr direkter Weise für die gezielte Entwicklung von Arzneimitteln eingesetzt werden können.

2.3.1.1 Biophysikalische Prinzipien der Molekülstrukturen Biologische Makromoleküle sind bei chemischer Betrachtung kovalent verknüpfte, lineare Polymere von definierter Länge. Die einzelnen Moleküle bestehen aus einer limitierten Anzahl sich in unterschiedlicher Reihenfolge wiederholender Bausteine, nämlich den 4 Nukleotiden bei DNA und RNA und den 20 Aminosäuren der Proteine. Durch Verknüpfung unterschiedlicher

Makromoleküle, wie z. B. bei der posttranslationalen Glykosylierung von Proteinen, können Verzweigungen auftreten. Während sich die sequenzielle Zusammensetzung eines Proteins unmittelbar aus dem genetischen Kode ergibt, ist seine biologische Funktionsfähigkeit davon abhängig, ob das Protein eine definierte dreidimensionale Struktur ausbildet, in welcher die Seitenketten bestimmte räumliche Anordnungen zueinander einnehmen. Für Enzyme bildet diese räumliche Positionierung der Seitenketten die Voraussetzung für die effektive Katalyse chemischer Reaktionen. Im Falle von RezeptorLiganden-Wechselwirkungen bildet die spezifische Verteilung unterschiedlicher Seitenketten an der Proteinoberfläche die Grundvoraussetzung für hochspezifische und hochaffine molekulare Erkennungsprozesse. Anhand von Rückfaltungsexperimenten an Ribonuklease S hat Anfinsen (1973) gezeigt, dass die dreidimensionale Struktur eines Proteins allein durch dessen Aminosäuresequenz bestimmt ist. Obwohl mittlerweile einige Fälle bekannt sind, bei denen die räumliche Teilstruktur eines Proteins vom Faltungsweg (Dobson 1999) oder vom Vorhandensein oder der Abwesenheit eines spezifischen Bindungspartners abhängt (Schumacher et al. 2001), und obwohl bekannt ist, dass die Proteinfaltung in vivo oft von Helferproteinen abhängig ist (Ellis u. Hemmingsen 1989; Fischer u. Schmid 1990; Freedman 1989), ist die Allgemeingültigkeit der AnfinsenSchlussfolgerungen kaum eingeschränkt. Eine detaillierte Vorhersage der dreidimensionalen Struktur, ausgehend von der Sequenz, ist jedoch bis heute nicht möglich. Deshalb müssen die Strukturen biologischer Makromoleküle immer noch aufwändig experimentell bestimmt werden.

2.3.1.2 Physikalische Prinzipien intermolekularer Wechselwirkungen Die unterschiedlichen Kräfte, welche die Struktur biologischer Makromoleküle stabilisieren, können unterteilt werden in x polare Wechselwirkungen und x apolare Wechselwirkungen. Polare Wechselwirkungen. Zu den polaren Wechselwirkungen gehören ionische Wechselwirkungen zwischen entgegengesetzten Ladungen. An der Oberfläche von Proteinen sind oft Salzbrücken zu finden, welche zwischen den Seitenketten von basischen und sauren Aminosäuren gebildet werden können. Interessanterweise treten solche Salzbrücken gehäuft bei thermostabilen und halophilen Proteinen auf, und sie scheinen eines der wenigen Merkmale zu sein, welche diese Pro-

277 2.3 · Molekülmodelle und Modellmoleküle: Strukturanalyse großer biologischer Moleküle für die Medizin

teine von den nicht thermostabilen und halophilen Proteinen unterscheiden (Karshikoff u. Ladenstein 1998; Pace 2000; Perl et al. 2000). Wasserstoffbrückenbindung Eine der wichtigsten polaren Wechselwirkungen ist die Wasserstoffbrückenbindung, welche zwischen einem Donoratom, wie z. B. dem Sauerstoff einer Hydroxylgruppe, und dem Wasserstoffbrückenakzeptor, wie z. B. einem freien Elektronenpaar an einem Stickstoff- oder Sauerstoffatom, gebildet werden kann. Von allen möglichen Wasserstoffbrücken in Proteinen besitzen die Wasserstoffbrücken, welche zwischen Atomgruppen der Hauptkette gebildet werden, nämlich zwischen dem Wasserstoff der (N-H)-Gruppe und dem Sauerstoff der Karbonylgruppe, eine herausragende Bedeutung für das Verständnis von Proteinstrukturen. Schon in den frühen 1950er Jahren schlugen Pauling et al. (1951) anhand der Betrachtung möglicher Wasserstoffbrückenbindungsmuster der Hauptkette mehrere verschiedene lokale Faltungsmotive für Proteine vor. Da diese Motive nur Hauptkettenatome involvieren, sollten sie unabhängig von der Sequenz eines Proteins sein und somit in sehr unterschiedlichen Proteinen vorkommen können. Erst in den 1960er Jahren, als die Kristallstrukturen von Myoglobin und Hämoglobin von John Kendrew und Max Perutz experimentell aufgeklärt wurden (Kendrew et al. 1960; Perutz et al. 1968), konnte die herausragende Rolle dieser Wasserstoffbrücken bestätigt werden. Heute ist bekannt, dass die von Pauling vorgeschlagenen Motive wie D-Helices und E-Faltblätter fester Bestandteil fast aller Proteine und prägend für deren Struktur sind (Schulz u. Schirmer 1979). Dipol-Dipol-Wechselwirkungen Eine weitere Klasse polarer Wechselwirkungen bilden die Dipol-Dipol-Wechselwirkungen. So besitzen z. B. D-Helices wegen der Ausrichtung der Hauptkettenatome einen makroskopischen Dipol (Hol et al. 1978; Wada 1975). Dieser Dipol ist der Grund, weshalb negativ geladene Liganden, wie z. B. die Phosphatgruppen des Nukleotids ATP, oft am N-terminalen Ende von D-Helices gebunden werden. Apolare Wechselwirkungen. Apolare hydrophobe Wechselwirkungen zwischen aliphatischen und aromatischen Seitenketten führen dazu, dass Wassermoleküle aus hydrophoben Umgebungen herausgedrängt werden. Dies ist nicht unähnlich der Tröpfchenbildung von Lipiden in Wasser. In Proteinen führt dies zu einer spezifischen Verteilung der unterschiedlichen Aminosäuren. Während polare Aminosäuren sich hauptsächlich auf die Oberfläche von Proteinen verteilen, bilden Aminosäuren mit hydrophoben Seitenketten mehr oder weniger aus-

2.3

gedehnte zusammenhängende hydrophobe Bereiche im Inneren des Proteins aus. Die Bildung eines solchen hydrophoben Kerns wird als eine der treibenden Kräfte während der Faltung angesehen (Kauzmann 1959). Den apolaren Wechselwirkungen gemeinsam ist, dass sie nur über sehr kurze Distanzen wirken, d. h., dass sich hauptsächlich benachbarte Atomgruppen gegenseitig beeinflussen und sich aneinander ausrichten. Bemerkenswert ist weiter, dass die polaren und apolaren Wechselwirkungen in ihrer Summe einen sehr großen Stabilisierungsbeitrag zur Struktur liefern. Dieser große Beitrag wird jedoch fast vollständig durch den Verlust an Entropie, welcher aus den extremen Einschränkungen der Konformationsfreiheitsgrade resultiert, aufgebraucht (Pace et al. 1991). Übrig bleibt eine nur sehr geringe Gesamtstabilität. Die freie Faltungsenergie eines Proteins beträgt typischerweise 20–65 kJ/mol (5–15 kcal/mol). Dies entspricht in etwa dem Beitrag, welchen 4–5 Wasserstoffbrücken zur Stabilität eines Proteins liefern. Dies bedeutet auch, dass eine singuläre Punktmutation dazu führen kann, dass ein mutiertes Protein destabilisiert wird und seine native Faltung nicht mehr einnehmen kann. Solche destabilisierenden Punktmutationen sind der Grund für viele „molekulare“ Erkrankungen.

2.3.1.3 Faltungsprinzipien von Proteinen Eine sehr einfache Beschreibung des Aufbaus von Proteinstrukturen unterscheidet zwischen x Primärstruktur, x Sekundärstruktur, x Tertiärstruktur und x Quartärstruktur. Während die Sequenz eines Proteins als Primärstruktur bezeichnet wird, werden unter der Sekundärstruktur typische lokale Strukturelemente verstanden, welche durch Wasserstoffbrücken zwischen Atomgruppen der Hauptkette stabilisiert werden (Branden u. Tooze 1999; Schulz u. Schirmer 1979). Die wichtigsten Sekundärstrukturelemente sind die D-Helix, das E-Faltblatt und die E-Schleifen (> Abb. 2.3.1). In D-Helices bildet die Hauptkette eine rechtsgängige helikale Struktur mit Wasserstoffbrücken zwischen der CO-Gruppe des Restes i und der NH-Gruppe des Restes i+4. In E-Faltblättern liegt die Hauptkette in einer langgestreckten Konformation vor, und Wasserstoffbrücken werden zwischen benachbarten Segmenten ausgebildet, ähnlich den Sprossen zwischen den Steigen einer Leiter. E-Faltblätter bestehen aus einem regelmäßigen Geflecht solcher Wasserstoffbrücken zwischen mehreren benachbarten Segmenten. Verlaufen die benachbarten Segmente in derselben Richtung, d. h. parallel zueinander, wird von einem paral-

278

Sektion 2 · Modelle a

b

c

d

. Abb. 2.3.1a–d. Hauptkettengeometrie in Proteinen. (a) Wasserstoffbrückenbindung (rot gestrichelte Linien) zwischen den Resten i und i+4 in D-Helices sowie schematische Bänderdarstellung einer D-Helix. (b) 4-strängiges paralleles E-Faltblatt in einer Strichdarstellung und einer schematischen Bänderdarstellung in grün. In E-Faltblättern werden Wasserstoffbrücken (grün gestrichelte Linien) zwischen benachbarten Segmenten ausgebildet. (c) Rotationsfreiheitsgrade entlang der Hauptkette, dargestellt an einem Tripeptid. Wegen

der Planarität der Peptidbindung (graue Parallelogramme) sind nur die Winkel M und \ in Grenzen frei rotierbar. (d) Ramachandran-Diagramm: Die Auftragung aller M- und \-Winkel eines 610 Reste langen Proteins zeigt, dass sich die Winkel in bestimmten, sterisch erlaubten Bereichen häufen. Die Darstellungen wurden mit den Programmen Molscript, Raster3d und Procheck erzeugt (Kraulis 1991; Laskowski et al. 1993; Merritt u. Murphy 1994)

lelen E-Faltblatt gesprochen. Verlaufen die Segmente in entgegengesetzter Richtung, liegt ein antiparalleles E-Faltblatt vor. Als E-Schleifen werden Strukturmotive aus 4 Aminosäuren, in denen eine Hauptkettenwasserstoffbrücke zwischen den Resten i und i+3 gebildet wird, bezeichnet (Venkatachalam 1968). Dies hat zur Folge, dass sich die Richtung der Kette umkehrt. D-Helices und E-Faltblätter unterscheiden sich nicht nur im Muster der Wasserstoffbrücken, sondern auch in der Konformation der Hauptkette. Die Konformation der Hauptkette wird über die Dihedralwinkel M und \ beschrieben. Die Bindungen N-CD und CD-C sind wegen der partiellen Tautomerie der Peptidbindung die beiden einzigen Bindungen entlang der Hauptkette, um die frei

gedreht werden kann. Die dazu gehörigen Winkel M und \ können aus sterischen Gründen jedoch nicht beliebige Werte einnehmen. Diese Tatsache wurde erstmals von Ramachandran u. Sasisekharan (1968) systematisch untersucht. Die Auftragung der M- und \-Werte mehrerer Proteinstrukturen in einem Ramachandran-Diagramm zeigt, dass Reste in D-Helices Dihedralwinkel im Bereich um M=–60° und \=–40° und Reste in E-Faltblätter im Bereich um M=–120° und \=+140° besitzen. Mit Tertiärstruktur wird die dreidimensionale Gesamtstruktur des Proteins bezeichnet. Besteht das Protein aus mehreren verschiedenen Aminosäureketten, d. h. aus mehreren Untereinheiten, wird die räumliche Orientierung der einzelnen Untereinheiten zueinander

279 2.3 · Molekülmodelle und Modellmoleküle: Strukturanalyse großer biologischer Moleküle für die Medizin

als Quartärstruktur bezeichnet. Anhand des Sekundärstrukturanteils können die Tertiärstrukturen in verschiedene Klassen eingeteilt werden, z. B. werden Proteine, die nur aus D-helikalen bzw. E-Faltblattstruktur-Elementen bestehen, als D-Strukturen und E-Strukturen bezeichnet. D/E-Strukturen bezeichnen Proteinstrukturen, die aus einem zentralen E-Faltblatt bestehen, welches von D-Helices flankiert ist, während D+E-Strukturen Tertiärstrukturen beschreiben, welche aus räumlich separaten D-helikalen und E-Faltblatt-Bereichen bestehen (Branden u. Tooze 1999).

2.3.1.4 Supersekundärstruktur, Strukturmotiv, Domänenstruktur Zuzüglich zur systematischen Beschreibung von Strukturen anhand unterschiedlicher Strukturebenen finden bei der Diskussion von Proteinstrukturen eine Reihe anderer Begriffe Anwendung. Als Supersekundärstruktur werden lokale Überstrukturen von Sekundärstrukturelementen bezeichnet. Ein Beispiel hierfür bildet der D-helikale Coiled-coil, welcher aus 2 umeinander gewundenen D-Helices besteht und eine linksgängige Superhelix ausbildet. Die Helices können sowohl parallel als auch antiparallel zueinander angeordnet sein. Ein prominentes Beispiel für einen Coiled-coil enthält der Transkriptionsfaktor GCN4 (Ellenberger et al. 1992); hier werden die einzelnen Helices von 2 unterschiedlichen Untereinheiten zur Verfügung gestellt, und der Coiled-coil stellt das eigentliche Dimerisierungsmotiv dar. Eine weit verbreitete Supersekundärstruktur ist die [EDE]-Einheit, in der 1 D-Helix 2 benachbarte parallele E-Faltblatt-Stränge verknüpft. Die Rossmann-Faltung besteht aus einer 2-fachen Wiederholung dieses Motivs, nämlich einem 3-strängigen parallelen E-Faltblatt mit 2 verbrückenden D-Helices. Die Rossmann-Faltung ist ein weit verbreitetes Strukturmotiv und kommt sehr häufig in den Bindungstaschen von Nukleotiden, wie z. B. ATP oder FAD, vor. In vielen dieser Nukleotide bindenden Strukturen binden die Nukleotide entlang dem E-Faltblatt auf der C-terminalen Seite dieses Faltungsmotivs, und die N-terminale Seite einer der beiden D-Helices ist durch das ihr eigene Dipolmoment an der Stabilisierung der negativen Ladungen der Phosphatgruppen beteiligt. Ein weiteres weit verbreitetes Strukturmotiv stellt das [D-Helix-Schleife-D-Helix]-Motiv dar, welches häufig in Transkriptionsfaktoren, wie z. B. 434 Cro, vorkommt und hier unmittelbar an der Bindung der DNA beteiligt ist (Anderson et al. 1987). In diesem Strukturmotiv lagert sich die 2. Helix in die tiefe Furche der DNA ein, und Reste an der Oberfläche der Helix sind für die sequenzspezifische Erkennung der DNA verantwortlich. Die Vielzahl der mittlerweile bestimmten Proteinstruk-

2.3

turen hat gezeigt, dass ähnliche Strukturmotive ähnliche Funktionen in sehr unterschiedlichen Proteinen erfüllen und dass das Vorhandensein eines bestimmten Strukturmotivs auch unmittelbare Rückschlüsse auf die Funktion eines Proteins erlaubt. Jedoch können ähnliche Aufgaben in Proteinen auch durch unterschiedliche Strukturmotive erfüllt werden. Eine weitere nützliche Beschreibung von Strukturen liefert die Betrachtung der Domänenstruktur eines Proteins. Als Domänen werden kompakte, strukturell unabhängige Faltungseinheiten bezeichnet, welche typischerweise aus 80–200 Aminosäuren bestehen (Branden u. Tooze 1999). Viele Proteine können als Abfolge von Domänen beschrieben werden. Hier sind die verschiedenen Domänen wie Perlen auf einer Kette aufgereiht. Zum Beispiel besteht der Gerinnungsfaktor FVIIa aus einer J-karboxyreichen Domäne, gefolgt von 2 EGF-Domänen (Epidermal-growth-Faktor-ähnliche Domänen) und einer Serinproteasedomäne. Eine sehr bekannte Domäne ist die Immunglobulindomäne. Eine typische Immunglobulindomäne besteht aus ungefähr 100 Resten, welche sich zu 2 flach aufeinander liegenden E-Faltblättern anordnen. Oft sind die beiden Faltblätter über eine Disulfidbrücke miteinander verknüpft. IgG-Antikörper bestehen aus 12 solcher Immunglobulindomänen, welche sich auf 4 Ketten verteilen. Jedoch kommen Immunglobulindomänen nicht nur in Antikörpern vor, sondern u. a. auch in den extrazellulären Domänen von Rezeptoren. Da die verschiedenen Domänen nicht nur über ihre dreidimensionale Struktur charakterisiert sind, sondern auch durch eine ähnliche Sequenz, lässt sich die Domänenstruktur eines neuen Proteins relativ leicht durch Sequenzvergleich vorhersagen. Probleme gibt es jedoch bei der genauen Abgrenzung der Domänen. In der molekularbiologischen Literatur wird der Begriff „Domäne“ häufig fälschlicherweise zur Bezeichnung eines Sequenzmotivs verwendet. Während charakteristische Sequenzmotive allein solche Bereiche hervorheben, welche eine hohe Sequenzübereinstimmung aufweisen, kann die eigentliche Domäne deutlich größer sein und flankierende Segmente einschließen, welche für die korrekte Faltung und thermodynamische Stabilität der Domäne benötigt werden. Eine Proteindomäne im eigentlichen Sinn zeichnet sich durch Kompaktheit aus; ihre Oberfläche verhält sich zur Oberfläche einer Kugel gleichen Volumens wie (1,64±0,08):1. In vielen Fällen lässt das Vorhandensein einer bestimmten Domäne Rückschlüsse auf eine mögliche Funktion zu, andere Domänen wie z. B. Immunglobulindomänen können fast ubiquitär in funktionell sehr unterschiedlichen Proteinen vorkommen. Interessanterweise scheint es jedoch eine Unterteilung zu geben zwischen Domänen, die intrazellulär vorkommen, und solchen, die bevorzugt in extrazellulären Proteinen auftreten.

280

Sektion 2 · Modelle

2.3.2 Strukturbiologische Methoden Unsere intime Kenntnis der räumlichen Strukturen biologischer Makromoleküle und ihrer vielseitigen Wechselwirkungen verdanken wir einer Kollektion strukturbiologischer Methoden, die im Lauf einiger Jahrzehnte entwickelt und perfektioniert wurden. Hier ist nicht der Ort, diese Methoden im Detail darzustellen. Dennoch ist für ein Verständnis von Proteinstrukturen und ProteinLigand-Wechselwirkungen eine gewisse Vertrautheit mit modernen biophysikalischen Techniken von großem Vorteil. Im Folgenden sollen daher die wichtigsten strukturbiologischen Methoden in ihren Grundzügen kurz skizziert und in den Grenzen ihrer gegenwärtigen Anwendbarkeit dargestellt werden.

2.3.2.1 Kernmagnetische Resonanzspektroskopie Als Methode zur strukturellen Analyse organischer Moleküle wird die kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMR-Spektroskopie) seit etwa 50 Jahren eingesetzt. Sie beruht darauf, dass die magnetischen Kernmomente (Kernspins) der Atome eines Moleküls mit einem äußeren Magnetfeld wechselwirken. Durch Anregung der Kerne mit einer Radiofrequenz kommt es zu Energieübergängen einzelner Kernspins, es entsteht ein Spektrum. Dieses Spektrum kann außerordentlich detailreich sein, da jeder Kern eines geordneten Moleküls ein unter-

schiedliches Magnetfeld erfährt. Das äußere Feld wird nämlich durch die Spins der umgebenden Kerne in seiner Stärke moduliert, sodass im Prinzip jeder Kern an einer charakteristischen Stelle im Spektrum erscheint, welche durch seine räumliche Umgebung, mithin durch die Molekülstruktur, bestimmt wird. Die Anwendbarkeit der NMR-Spektroskopie auf die Strukturanalyse biologischer Makromoleküle wurde mit der Entwicklung spezieller Techniken zur Aufnahme mehrdimensionaler Spektren möglich (Ernst et al. 1987). Mit diesen Techniken wird durch den Einbau zusätzlicher NMR-aktiver Kerne (13C, 15N) in das Protein und den Transfer der Magnetisierung zwischen diesen und 1H eine Dekonvolution der sehr komplexen Spektren erreicht, entsprechend einer Aufweitung in 2 oder 3 Dimensionen (Wüthrich 1995). Mit diesen neu entwickelten Techniken konnten in den 1980er Jahren die ersten NMR-Strukturen von Proteinen bestimmt werden (Braun et al. 1986; Kline et al. 1986; Williamson et al. 1985). Die NMR-Spektroskopie ist auch geeignet, räumliche Strukturen von Nukleinsäuren zu bestimmen, obwohl für diese Moleküle einige zusätzliche Schwierigkeiten auszuräumen sind (Wemmer 1991). Mittlerweile hat sich die NMR-Spektroskopie fest als Methode zur Analyse der dreidimensionalen Struktur von Proteinen und Nukleinsäuren in Lösung etabliert. Sie kann nach grundsätzlich bekannten Protokollen (Wüthrich 1995) für die Proteinstrukturanalyse eingesetzt werden (> Abb. 2.3.2). Die NMR-Spektroskopie ist der Kristallstrukturanalyse (s. unten) in vielen Aspekten komplementär. Sie . Abb. 2.3.2. Generisches Protokoll einer NMR-Strukturanalyse, adaptiert nach Wüthrich (1995)

281 2.3 · Molekülmodelle und Modellmoleküle: Strukturanalyse großer biologischer Moleküle für die Medizin

2.3

wird in der Regel für die Strukturanalyse von Molekülen in wässriger Lösung eingesetzt. NMR-spektroskopisch bestimmte Proteinstrukturen stimmen in der Regel mit Kristallstrukturen der gleichen Moleküle weitgehend überein (Decanniere et al. 2000; Kline et al. 1986; Pflugrath et al. 1986; Starich et al. 1996; Wüthrich 1995), wenngleich Strukturunterschiede im Detail nicht ausgeschlossen werden können. Grundsätzliche Beschränkungen der NMR-Spektroskopie liegen in der erreichbaren Auflösung und der Größe untersuchbarer Moleküle. Die Auflösung ist im Vergleich mit vielen Kristallstrukturen gering, da die NMR-Strukturen in der Regel experimentell unterbestimmt sind: Sie müssen mit weniger experimentellen Daten auskommen, als zur Festlegung der Ortskoordinaten aller Atome des Moleküls erforderlich wären. Eine derzeit noch bestehende Größenbeschränkung auf Moleküle mit einer relativen Molekülmasse von etwa ≤30 kDa wird durch neu entwickelte Verfahren u. U. bald aufgehoben sein (Riek et al. 2000).

ist in der Regel an der Ausbildung von Gitterkontakten beteiligt. Solche Proteinkristalle (> Abb. 2.3.3) erlauben die exakte Analyse der dreidimensionalen Struktur von Proteinen, Protein-Ligand-Komplexen und makromolekularen Assoziaten durch Röntgenbeugungsmethoden. Dabei werden Kristalle mit monochromatischem Röntgenlicht bestrahlt, und die Reflexintensitäten des Beugungsmusters (in der Regel einige 10.000) werden ermittelt. Die Reflexe werden mit Miller-Indizes h, k, l bezeichnet. Ihre Intensitäten sind den Quadraten der sog. Strukturfaktoramplituden proportional

2.3.2.2 Kristallstrukturanalyse

Aus 7 Gl. 2.3.2 wird ein grundsätzliches Problem der Kristallstrukturanalyse deutlich: Während das Volumen V der Elementarzelle und die Strukturfaktoramplituden experimentell bestimmt werden können, ist dies für die zugehörigen Phasen Dhkl der Reflexe nicht möglich. Weitgehend allgemein anwendbare Methoden zur Lösung des Phasenproblems bei der Proteinstrukturanalyse

Viele wasserlösliche Proteine und auch einige integrale Membranproteine können durch kontrollierten Entzug von Lösungsmittel kristallisiert werden. In diesen Proteinkristallen bleiben die Moleküle von wässrigem Medium umgeben; nur ein geringer Anteil der Oberfläche a

(Gl. 2.3.1) aus denen wiederum durch eine Fourier-Summation die Elektronendichte an jedem Ort x, y, z des Kristalls (der Elementarzelle) berechnet werden kann: (Gl. 2.3.2)

b

c

. Abb. 2.3.3a–c. Röntgenstrukturanalyse von biologischen Makromolekülen. Die Strukturanalyse führt über die Kristalle der Makromoleküle (a) und deren Diffraktionsmuster (b) zur Elektronendichte (c). Die Elektronendichte (blau) hüllt das Atommodell (Strichdarstellung) ein. Je höher die Auflösung, desto detailreicher ist die resultierende Elektronendichte, und umso genauer wird das Atommodell sein. Die

hier gezeigte Elektronendichte hat eine Auflösung von 1,3 Å. Für die Abbildung wurden Kristalle des „sex hormone binding globulin“ (Grishkovskaya et al. 2000), Diffraktionsmuster und Elektronendichte eines VEGF (vascular endothelial growth factors) (Heiring et al., pers. Mitteilung) verwendet

282

Sektion 2 · Modelle

stehen mittlerweile allerdings zur Verfügung (s. unten). Wurde die Elektronendichte im Sinn eines atomaren Proteinmodells interpretiert (> Abb. 2.3.3), ist es nun leicht möglich, Strukturfaktoramplituden Fhkl,calc durch eine reziproke Fourier-Summation aus diesem Modell zu berechnen. Deren Übereinstimmung mit den experimentell bestimmten Amplituden, Fhkl,obs, kann als

(Gl. 2.3.3)

dargestellt werden und dient als Qualitätsmerkmal einer Kristallstruktur: Je kleiner R und je größer die Zahl experimenteller Daten (die Auflösung der Struktur), umso höher ist die Qualität der Analyse. Seit ihren ersten Anfängen (Kendrew et al. 1960; Perutz et al. 1968) hat sich die Proteinkristallographie als Methode zur Strukturanalyse stetig und teilweise revolutionär weiterentwickelt. Zu den bedeutendsten Fortschritten des letzten Jahrzehnts zählen x die Einführung von Kryotechniken (Hope 1990) und x die fast allgemeine Verfügbarkeit von Synchrotronstrahlungsquellen für Diffraktionsexperimente (Helliwell 1997), x die Methode der anomalen Dispersion bei verschiedenen Wellenlängen (MAD) nach Einführung von Selenomethionin in Proteine zur Lösung des Phasenproblems (Hendrickson et al. 1990) und x die Entwicklung von Computeralgorithmen auf dem Weg zur automatischen Generierung, Interpretation und Verfeinerung der Elektronendichte und abgeleiteter Proteinmodelle (De la Fortelle u. Bricogne 1997; Perrakis et al. 1999; Sheldrick 1997; Terwilliger u. Berendzen 1999; Weeks u. Miller 1999). Diese und andere Entwicklungen haben dazu geführt, dass in den letzten Jahren eine große Zahl von Strukturen komplexer makromolekularer Gebilde hoher biologischer Signifikanz mit Röntgenbeugungsmethoden bestimmt werden konnten. An dieser Stelle soll beispielhaft lediglich auf die Strukturen des Nukleosomenkernpartikels (Luger et al. 1997), des Hefeproteasoms (Groll et al. 1997), des Bluetongue-Virus (Grimes et al. 1998), der RNA-Polymerase II (Cramer et al. 2000) und der ribosomalen Untereinheiten (Ban et al. 2000; Schluenzen et al. 2000; Wimberly et al. 2000) verwiesen werden.

2.3.2.3 Elektronenmikroskopie und -diffraktion Noch größere Partikel sowie Strukturen, die sich der Kristallisation entziehen, können mithilfe der Kryo-

elektronenmikroskopie untersucht werden. Mit dieser Methode ist es möglich, die Gestalt ungefärbter Einzelpartikel aus einer vitrifizierten wässrigen Lösung mit einer Auflösung von 4 Å zu untersuchen (Kühlbrandt u. Williams 1999). Zentraler Bestandteil der Kryoelektronenmikroskopie sind computergestützte Bilderkennungsverfahren, bei denen in jüngster Zeit bedeutende Fortschritte erzielt wurden. Zu den mittels Kryoelektronenmikroskopie bei einer Auflösung von ≤12 Å bestimmten Strukturen großer Molekülkomplexe gehören das didekamere Hämozyanin des Mollusken Haliotis tuberculata (Meissner et al. 2000), die große ribosomale Untereinheit (Matadeen et al. 1999) und das Hämagglutinin des Influenzavirus (Böttcher et al. 1999). Neben tiefgefrorenen Einzelmolekülen können auch Membranen und zweidimensionale Kristalle mittels Elektronenmikroskopie untersucht werden. Hoch geordnete Proben können in der Elektronendiffraktion fast atomare Ortsauflösung erlauben, wie beispielsweise bei der 3,4-Å-Struktur eines pflanzlichen Lichtsammlerkomplexes gezeigt werden konnte (Kühlbrandt et al. 1994). Allerdings wird die hohe Auflösung in der Regel nur in der Präparatebene erreicht und nicht senkrecht dazu.

2.3.2.4 Andere biophysikalische Methoden Als strukturanalytische Methoden mittlerer bis hoher Ortsauflösung tendieren die Elektronenmikroskopie, die NMR-Spektroskopie und die Röntgenstrukturanalyse dazu, statische Molekülstrukturen zu suggerieren. Selbstverständlich entspricht dieses vereinfachte Bild nicht der Wirklichkeit: Alle makromolekularen Strukturen und Komplexe besitzen eine Dynamik, die durch Fluktuationen der Struktur oder globale Strukturänderungen auf unterschiedlichsten Zeitskalen charakterisiert ist. Die Elektronenmikroskopie, die NMR-Spektroskopie und auch die Röntgenstrukturanalyse können einige Aspekte dieser Dynamik sehr wohl beschreiben. Andere bleiben ihnen verschlossen und erfordern zusätzliche, biophysikalische Methoden, die häufig eine hohe Zeitauflösung, aber begrenzte Ortsauflösung liefern. Dynamische Prozesse wie Strukturumlagerungen, Assoziation und Dissoziation und (enzymkatalysierte) chemische Umsetzungen können mithilfe der optischen Spektroskopie (UV/Vis, CD, IR, Raman), von hydrodynamischen Untersuchungen, mit Licht- und Röntgenstreuung sowie kalorimetrisch beschrieben werden. Aus Platzgründen muss auf eine detaillierte Diskussion der verschiedenen experimentellen Ansätze hier verzichtet und auf die einschlägige Literatur verwiesen werden (z. B. Holtzhauer 1996).

283 2.3 · Molekülmodelle und Modellmoleküle: Strukturanalyse großer biologischer Moleküle für die Medizin

2.3.2.5 Modellierung von Molekülen und intermolekularen Wechselwirkungen Manche Zustände von oder Prozesse zwischen biologischen Makromolekülen bleiben der experimentellen Untersuchung grundsätzlich oder wegen im Einzelfall ungünstiger Randbedingungen verschlossen. Der Prozess der Faltung einer Polypeptidkette zur nativen Proteinstruktur gehört zu diesen Vorgängen. Obwohl es für eine Reihe von Proteinen gute Modellvorstellungen zum Faltungsprozess gibt (Baker 2000; Bryngelson et al. 1995; Dobson u. Karplus 1999) und in einigen Fällen auch Faltungsintermediate nachgewiesen und strukturell charakterisiert wurden (Baldwin u. Rose 1999), bleibt der vollständige Faltungsweg eines Proteins der experimentellen Charakterisierung unzugänglich. Durch Kombination experimenteller Daten mit computergestützter Modellierung kann das Verständnis des Vorgangs gefördert werden (Dinner et al. 2000; Duan u. Kollman 1998; Zhou u. Karplus 1999). Dabei können scheinbar sehr einfache Computermodelle zu überraschenden Einsichten in den Prozess der Proteinfaltung führen (Shakhnovich 1998). Die Grundlage vieler Modellierungstechniken für Makromoleküle und ihre Wechselwirkungen bilden atomare Kraftfelder der Form

2.3

der Proteinkette und von intermolekularen Assoziations- und Dissoziationsprozessen. Kraftfelder können auch mit experimentellen Daten kombiniert und erfolgreich bei der Bestimmung und Verfeinerung von Röntgen- und NMR-Strukturen eingesetzt werden (Brünger et al. 1987).

2.3.3 Molekülstrukturen in Biologie und Medizin Indem sie Aspekte der biologischen Funktion von Proteinen und anderen Makromolekülen auf atomarer Ebene erklären und damit grundlegende Erklärungsmodelle für biologische Prozesse liefern, sind Kristallund NMR-Strukturen häufig von direkter medizinischer oder pharmakologischer Relevanz. Dies gilt insbesondere für Strukturen von menschlichen Proteinen, von Proteinen aus eukaryotischen Modellorganismen und aus humanpathogenen Mikroorganismen. Unter den menschlichen Proteinen sind wiederum diejenigen von besonderem Interesse, die medizinisch relevante chemische Umsetzungen als Enzyme katalysieren oder an Signaltransduktionsprozessen beteiligt sind. Aus der großen Fülle von Proteinen, die in diese Kategorie fallen, sollen nachfolgend 4 biochemische Systeme bzw. Proteinfamilien exemplarisch vorgestellt werden.

(Gl. 2.3.4)

2.3.3.1 Cytochrom-P450-System

welche die Energie E(R) eines Ensembles von Atomen mit kartesischen Koordinaten R wiedergeben (Karplus u. Petsko 1990). Die Energie hängt von der Struktur des von diesen Atomen gebildeten Moleküls ab. Referenzwerte für die Länge der kovalenten Bindungen (b0), die Bindungswinkel (Θ0) und Torsionswinkel sind bekannt, und die relativen Beiträge dieser Werte zur Gesamtenergie werden durch Kraftkonstanten Ki skaliert. Die Gesamtenergie hängt weiterhin von paarweisen nichtkovalenten interatomaren Wechselwirkungen ab, die in 7 Gl. 2.3.4 über Lennard-Jones-6/12-Terme und ein Coulomb-Potenzial beschrieben werden. Kraftfelder in unterschiedlichen Parametrisierungen finden vielfältige Anwendung für die Simulation von Strukturfluktuationen bis hin zur vollständigen Ent- und Rückfaltung

Die große Familie der Cytochrome P450 umfasst Proteine mit vielfältigen enzymatischen Aktivitäten. Die membranständigen P450-Enzyme von Säugern sind an der Umsetzung vieler Xenobiotika, dem Metabolismus von Arzneimittelmolekülen und Kanzerogenen sowie der Biosynthese von Steroidhormonen und Prostaglandinen beteiligt (Ortiz de Montellano 1995; Peterson u. Graham 1998). Die Kristallstrukturen einiger löslicher, bakterieller Cytochrome P450 sind seit einiger Zeit bekannt (Cupp-Vickery u. Poulos 1995; Hasemann et al. 1994; Park et al. 1997; Poulos et al. 1985; Ravichandran et al. 1993; Yano et al. 2000). Kürzlich wurde erstmalig über die dreidimensionale Struktur eines Cytochroms P450 aus einem Säugetier (Kaninchen) berichtet (Williams et al. 2000). In der mitochondrialen Matrix von Nebennieren katalysiert Cytochrom P450scc (CYP11A1) die Konversion von Cholesterin zu Pregnenolon, dem ersten Schritt in der Biosynthese der Steroidhormone (Bernhardt 1995). Die für die Generierung aktiver Sauerstoffspezies aus molekularem Sauerstoff zur Hydroxylierung und schließlich Spaltung der Seitenkette am Cholesterin nötigen Elektronen erhält das Enzym von NADPH über ein

284

Sektion 2 · Modelle

Elektronentransfersystem, zu dem zunächst die membranassoziierte Adrenodoxinreduktase und dann das lösliche Adrenodoxin gehören. Die Adrenodoxinreduktase ist ein Flavoprotein, in dem Elektronen von NADPH auf FAD übertragen werden. Diese Elektronen wandern einzeln weiter zu dem [2Fe-2S]-Zentrum des Adrenodoxins und werden schließlich von diesem auf die Hämgruppe des Zytochroms übertragen. Die Strukturen und Wechselwirkung dieser beiden Proteine wurden kürzlich eingehend charakterisiert (> Abb. 2.3.4). Die Kristallstruktur eines verkürzten Adrenodoxins, Adx(4–108), zeigte zunächst, dass das Protein aus 2 b

a

c

. Abb. 2.3.4a–c. Elektronenübertragung im Cytochrom-P450-System. Das Enzym Adrenodoxinreduktase (b) bindet NADPH und transferiert ein Elektron über FAD auf das lösliche Ferredoxin Adrenodoxin (a). Im Komplex zwischen beiden Proteinen (c) hat der Isoalloxazinring des FAD von Adrenodoxinreduktase einen Abstand von etwa 10 Å vom [2Fe-2S]-Zentrum des Adrenodoxins. Das Elektron überbrückt diesen Abstand vermutlich durch Wanderung entlang kovalenter Bindungen und Wasserstoffbrücken (Müller et al. 2001). Ausgehend von der Orientierung der Proteine im Elektronentransferkomplex wurde in der Abbildung die freie Adrenodoxinreduktase (Ziegler et al. 1999) um 60° nach rechts und das freie Adrenodoxin (Müller et al. 1998) um 60° nach links gedreht. In den Bänderdarstellungen beider Proteine wurden die prosthetischen Gruppen und die für die Komplexbildung wichtigsten Aminosäureseitengruppen explizit eingetragen. Mit freundlicher Genehmigung von Dr. J. J. Müller, MaxDelbrück-Zentrum

strukturell getrennten Subdomänen besteht (Müller et al. 1998). [2Fe-2S]-Ferredoxine aus Pflanzen sind ähnlich aufgebaut, unterscheiden sich jedoch in der Region der Proteine, die für die Wechselwirkung mit Redoxpartnern in erster Linie verantwortlich ist (Müller et al. 1999). Saure Seitenketten, die für die Wechselwirkung des Proteins sowohl mit der Adrenodoxinreduktase als auch mit Cytochrom P450scc verantwortlich sind, liegen eng benachbart an der Oberfläche des Adrenodoxins. Diese Anordnung macht eine gleichzeitige Bindung beider Proteine an das Adrenodoxin unwahrscheinlich und spricht damit für einen Elektronentransfer über frei bewegliches Adrenodoxin. Die Adrenodoxinreduktase ist der Glutathionreduktase strukturell verwandt und ist ebenfalls ein in 2 globuläre Domänen getrenntes Protein (Ziegler et al. 1999). Eine Domäne (> Abb. 2.3.4c) bindet das FAD durch nichtkovalente Wechselwirkungen. Das NADPH assoziiert so mit der anderen Domäne des Proteins, dass sein Adeninring in optimalem Stapelabstand über dem Isoalloxazinring des FAD positioniert wird (Ziegler u. Schulz 2000). Diese Anordnung erlaubt die Übertragung eines Hydridions auf das Flavin, welches nach 2-fachem Transfer jeweils eines einzelnen Elektrons auf Adrenodoxin und Abgabe eines Protons an seine Umgebung in seinen Grundzustand zurückkehrt. In der Kristallstruktur eines chemisch quer vernetzten Komplexes aus Adrenodoxin und Adrenodoxinreduktase (Müller et al. 2001) weist das [2Fe-2S]-Zentrum des Adrenodoxins einen Abstand von etwa 10 Å vom Isoalloxazinring des reduktasegebundenen FAD auf. Die Struktur erlaubt, wahrscheinliche Pfade für den Elektronentransfer vom FAD zum [2Fe-2S]-Zentrum des Adrenodoxins vorherzusagen. Im Vergleich zur Kristallstruktur des freien Proteins lassen sich darüber hinaus durch Bindung des Adrenodoxins ausgelöste Strukturänderungen der Reduktase erkennen: Durch geringfügige Rotation der beiden globulären Domänen gegeneinander wird die Kontaktfläche zum Adrenodoxin optimiert.

2.3.3.2 Wachstumsfaktoren Extrazelluläre Proteine, welche eine hormonelle Funktion besitzen und über die Aktivierung von Zelloberflächenrezeptoren die Genexpression regulieren, werden oft unter dem Begriff Wachstumsfaktor zusammengefasst. Obwohl sich die dreidimensionalen Strukturen dieser Wachstumsfaktoren sehr stark unterscheiden, lassen sie sich in verschiedene Strukturklassen einteilen (> Abb. 2.3.5). Die Cystinknotenwachstumsfaktoren sind vorwiegend homodimere Proteine, d. h., sie bestehen aus 2 identischen Untereinheiten. Das Monomer enthält

285 2.3 · Molekülmodelle und Modellmoleküle: Strukturanalyse großer biologischer Moleküle für die Medizin

a

b

c

d

ein zentrales, unregelmäßiges, 4-strängiges E-Faltblatt, welches auf der einen Seite durch mehrere Schlaufen abschließt und auf der anderen das Cystinknotenmotiv enthält. Dieses Motiv besteht aus 3 Disulfidbrücken; 2 Disulfidbrücken bilden eine ringartige Struktur und verbrücken 2 benachbarte E-Faltblatt-Stränge. Eine 3. Disulfidbrücke durchdringt diese Ringstruktur und verknüpft die 2 restlichen E-Faltblatt-Stränge. Zu dieser Klasse von Wachstumsfaktoren gehören TGF-E, die BMP, GDNF, E-NGF, NT3, NT4/5, PDGF und VEGF (McDonald u. Hendrickson 1993; Sun u. Davies 1995). Eine weitere Klasse von Wachstumsfaktoren besitzt eine 4-Helixbündel-Struktur. In dieser Struktur sind 4 D-Helices parallel zueinander gepackt. Die 1. D-Helix ist parallel zur 2. ausgerichtet, die 3. parallel zur 4. Jedoch sind die beiden Letzteren antiparallel zu den ersten beiden angeordnet, was zu einer sog. Up-up-down-downTopologie führt (Wells u. De Vos 1996). Die Helices können unterschiedlich lang sein. Zur kurzen Variante der 4-Helixbündel-Wachstumsfaktoren gehören Interleukin2 (IL-2), IL-3, IL-4, GM-CSF. Prominente Vertreter der langen Varianten sind der eigentliche Wachstumsfaktor (z. B. human growth factor), Erythropoetin (EPO), Leukemia-inhibitory-Faktor (LIF) sowie IL-6. Einige dieser Wachstumsfaktoren sind nur als Dimer aktiv, wie z. B. der Steel factor (SCF) oder M-CSF. Die Helixbündelwachstumsfaktoren einer weiteren Klasse bestehen nicht aus 4, sondern aus 6 Helices und können sowohl als Mo-

2.3

. Abb. 2.3.5a–d. Vertreter unterschiedlicher Strukturklassen von Wachstumsfaktoren. (a) VEGF (vascular endothelial growth factor), ein Vertreter der Cystinknotenwachstumsfaktoren, (b) humaner Wachstumsfaktor, ein Vertreter der langen Varianten der 4-Helixbündel-Wachstumsfaktoren,(c)E-Kleeblatt-Wachstumsfaktor-Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF-2), (d) Interleukin 8, ein Vertreter der Klasse der C-X-C-Chemokine

nomer (Interferon-D, Interferon-E) sowie als Dimer vorkommen (Interferon-γ und Interleukin-10). Die Gruppe der Fibroblastenwachstumsfaktoren (fibroblast growth factor, FGF-1–FGF-18) sowie IL-1D und IL-1E gehören zur Gruppe der E-Kleeblatt-Wachstumsfaktoren. Sie sind monomere Proteine, bestehend aus einem sich 3-mal wiederholenden Motiv aus E-Faltblättern, welches ihnen das Aussehen eines Kleeblatts verleiht (Zhu et al. 1991). Chemokine sind homodimere Wachstumsfaktoren, welche aus einem E-Faltblatt bestehen und einer quer hierzu liegenden D-Helix. Abhängig von einem bestimmten Sequenzmotiv wird zwischen x der Gruppe der C-C-Chemokine und x der Gruppe der C-X-C-Chemokine unterschieden (Clore u. Gronenborn 1995). Zur 1. Gruppe gehören Rantes, MIP-1D und MIP-1E; zur 2. Gruppe gehören IL-8 und MGSA. Beide Gruppen unterscheiden sich des Weiteren in der Art, wie die beiden Monomere dimerisieren. Alle bekannten Chemokine binden an Oberflächenrezeptoren, welche zur Klasse der 7-Transmembran-Helix-Rezeptoren gehören und deren Signaltransduktion über G-Proteine verläuft. Deshalb werden sie auch als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bezeichnet. Weitere spezifische Strukturtypen von Wachstumsfaktoren bilden die Klassen der EGF-Familie, die TNFD-Familie und die Insulinfamilie.

286

Sektion 2 · Modelle

Obwohl die meisten Wachstumsfaktoren sich einer dieser Strukturklassen zuordnen lassen, bedeutet dies nicht, dass die Wachstumsfaktoren einer Klasse an eine bestimmte Gruppe ähnlicher Rezeptoren binden und innerhalb der Zelle dieselben Signalübertragungsprozesse auslösen. Einige klassenspezifische Merkmale gibt es jedoch: Wie oben erwähnt aktivieren beispielsweise die Chemokine die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, und die meisten der 4-Helixbündel-Proteine aktivieren die JAK-Kinasen, welche ihrerseits die STAT-Transkriptionsfaktoren aktivieren. Auffällig ist auch, dass die meisten der Cystinknotenwachstumsfaktoren sowie alle bekannten E-Kleeblatt-Wachstumsfaktoren an Rezeptoren der Klasse der Rezeptortyrosinkinasen binden (Krauss 1997). Jedoch gibt es viele Ausnahmen von diesen simplen Strukturfunktionsschemen. Zum Beispiel wirken die dimeren 4-Helixbündel-Wachstumsfaktoren über Rezeptortyrosinkinasen, und die TGF-E-ähnlichen Cystinknotenwachstumsfaktoren wirken nicht über Rezeptortyrosinkinasen, sondern über Rezeptoren mit Serin-Threonin-Kinase-Aktivität, ähnlich wie die Wachstumsfaktoren der TNF-D-Familie.

2.3.3.3 Cystinknotenwachstumsfaktoren Wie weiter oben erwähnt, sind die Cystinknotenwachstumsfaktoren durch das Cystinknotenmotiv charakterisiert. Die einzelnen Wachstumsfaktoren lassen sich jedoch noch einmal in verschiedene Untergruppen unterteilen, abhängig von der Verteilung der verschiedenen Cysteinreste auf die Sequenz sowie der Anzahl der Aminosäureninsertionen zwischen den Cysteinresten. In den verschiedenen dreidimensionalen Strukturen führt dies z. B. zu unterschiedlich großen Ringstrukturen, welche durch 2 Disulfidbrücken ausgebildet werden und durch den die 3. Disulfidbrücke hindurchgefädelt ist. Ein weitaus größerer Unterschied entsteht jedoch durch die unterschiedliche Quartärstruktur der verschiedenen Mitglieder. Während die Faltung der Monomere aller Mitglieder sehr ähnlich ist, ergeben sich durch die unterschiedliche Dimerisierung 3 verschiedene Klassen. Diese Klassen lassen sich am besten anhand eines orthogonalen Achsensystems beschreiben. In allen Dimeren können die Monomere über eine Rotation um 180° ineinander überführt werden. Ausgehend von einem Monomer und je nach Ausrichtung dieser 2-zähligen Rotationsachse entlang den 3 Raumrichtungen werden 3 unterschiedliche Dimere erzeugt. Im Fall von NGF, NT3 und NT4/5 verläuft die 2fache Rotationsachse parallel zur Strangrichtung der E-Stränge im zentralen 4-strängigen E-Faltblatt. Als Folge hiervon bilden beide 4-strängige E-Faltblätter eine Art E-Sandwich. Im Fall von TGF-E und GDNF verläuft die

2-fache Rotationsachse senkrecht zur Einzelstrangrichtung, jedoch immer noch parallel zur E-Faltblatt-Ebene. Auch hier entsteht ein E-Sandwich, jedoch mit den beiden N-Termini der beiden Monomeren an entgegengesetzten Polen. Im Fall von VEGF und PDGF ist die 2fache Rotationsachse entlang der noch übrig bleibenden Raumrichtung ausgerichtet. Die Rotationsachse ist senkrecht zu den E-Faltblatt-Strängen und zur Ebene des E-Faltblatts orientiert. Als Folge hiervon besteht das Dimer aus 2 E-Faltblättern, welche flach nebeneinander angeordnet sind. Eine 4. Klasse bildet die Struktur des humanen Choriongonadotropin; dieses besteht aus 2 unterschiedlichen Untereinheiten, und die Dimerisierung lässt sich keiner der 3 obigen Klassen zuordnen (Sun u. Davies 1995). Die Cystinknotenwachstumsfaktoren sind ein gutes Beispiel dafür, wie bei gleichbleibender Tertiärstruktur durch unterschiedliche Quartärstruktur molekulare Vielfalt erzeugt wird. Diese molekulare Vielfalt erweitert unmittelbar die Möglichkeiten, mit denen diese Wachstumsfaktoren Rezeptoren aktivieren können. Ihnen allen ist gemeinsam, dass sie ihre biologische Funktion durch die Dimerisierung der extrazellulären Domäne der Rezeptoren erfüllen. Da diese Wachstumsfaktoren selbst Homodimere sind und somit jede potenzielle Bindungsstelle an der Oberfläche des Wachstumsfaktors 2-fach vorkommt, ist intuitiv ersichtlich, wie diese an 2 identische Rezeptoren binden können und somit diese dimerisieren. In den letzten Jahren sind die Kristallstrukturen von Vertretern dieser verschiedenen Cystinknotenwachstumsfaktoren im Komplex mit Domänen ihrer spezifischen Rezeptoren aufgeklärt worden, nämlich von VEGF im Komplex mit Domäne 2 des Flt-Rezeptors (Wiesmann et al. 1997), NGF im Komplex mit Domäne 5 des TrkA-Rezeptors (Wiesmann et al. 1999) und BMP-2 im Komplex mit BMPR-IA (Kirsch et al. 2000). Diese Strukturen zeigen, dass als Folge der unterschiedlichen Dimerisierung sehr unterschiedliche Rezeptorbindungsstellen an der Oberfläche der verschiedenen Wachstumsfaktoren benutzt werden, dass in allen Komplexen die einzelnen Rezeptordomänen jeweils Kontakte mit beiden Monomeren gleichzeitig ausbilden und dass die Dimere im Komplex so orientiert sind, dass im zellulären Kontext die 2fache Rotationsachse, welche die Dimere charakterisiert, senkrecht zur Zelloberfläche ausgerichtet sein würde (Wiesmann u. De Vos 2000). Dieses Beispiel zeigt sehr schön, wie die Quartärstruktur bei vergleichbarer Tertiärstruktur der Einzelkomponenten das Repertoire von Erkennungsprozessen substanziell erweitert.

287 2.3 · Molekülmodelle und Modellmoleküle: Strukturanalyse großer biologischer Moleküle für die Medizin

2.3.3.4 Hämatopoetische Wachstumsfaktoren Eine wichtige Klasse von 4-Helixbündel-Wachstumsfaktoren bilden die hämatopoetischen Wachstumsfaktoren. Sie regulieren die Differenzierung von Rückenmarkstammzellen in rote und weiße Blutzellen und Blutplättchen. Die dazu gehörigen Rezeptoren bestehen aus einer ausgedehnten, extrazellulären N-terminalen Domäne, die aus mindestens 2 Fibronektin-Typ-III-Domänen gebildet wird, einem kurzen Transmembransegment von ungefähr 20 Aminosäuren und einer intrazellulären C-terminalen Domäne. Strukturbiologische Fragen zur Funktion dieser Rezeptoren betreffen die Ligandenspezifität und den Mechanismus der Signaltransduktion. Sehr lange wurde angenommen, dass es nach der Bindung des Liganden zu einer allosterischen Konformationsänderung kommt. Nach dieser Hypothese induziert der Ligand im extrazellulären Teil eine Konformationsänderung, welche über das Transmembransegment an den intrazellulären Teil des Rezeptors weitergegeben wird. Diese Strukturänderung ermöglicht dann die Wechselwirkung mit intrazellulären Liganden. Solche allosterischen Konformationsänderungen treten in vielen biochemischen Prozessen auf und sind durch Hilfe der dreidimensionalen Strukturaufklärung auf atomarer Ebene verstanden. Zum Beispiel wird die Sauerstoffkonzentration im Blut durch positive und negative Effektoren des Hämoglobins reguliert. Die Bindung dieser Effektoren verändert hierbei die Affinität des Hämoglobins zum Sauerstoff (Baldwin u. Chothia 1979; Perutz et al. 1987). Dieser Mechanismus scheint jedoch nicht für die hämatopoetischen sowie voraussichtlich alle Rezeptoren mit nur einem einzigen Transmembransegment zu gelten. Die Kristallstruktur der extrazellulären Domäne des Rezeptors im Komplex mit dem Hormon zeigt, dass die Bindung des Hormons die Dimerisierung des Rezeptors herbeiführt (De Vos et al. 1992). Auffallend ist, dass die C-terminalen Reste der extrazellulären Domäne, nämlich das Segment, welches zur Membran führt, keine definierte Konformation besitzen und im Kristall ungeordnet sind. Durch die fehlende Ordnung dieses Segments muss geschlossen werden, dass evtl. auftretende Konformationsänderungen bei Bindung des Hormons nicht an die intrazelluläre Domäne weitergeleitet werden können, sondern dass die Dimerisierung der extrazellulären Domäne zur Dimerisierung der intrazellulären Domäne führt und dies das eigentliche Signal ist. Dieses Modell erklärt auch den glockenförmigen Verlauf der Hormonaktivierung in Abhängigkeit von der Hormonkonzentration in vivo. Werden Zellen in Kultur durch Zugabe des Wachstumshormons zur Teilung bewegt, wird zunächst ein Anstieg der Proliferationsrate mit Zu-

2.3

nahme der Hormonkonzentration beobachtet, ab einer bestimmten Konzentration nimmt die Proliferationsrate jedoch wieder stetig ab. Im Modell wird dies elegant durch die Verdrängung des 2. Rezeptors aus dem Komplex unter Bildung inaktiver 1:1-Komplexe bei zunehmender Hormonkonzentration erklärt. Ein sehr elegantes Experiment zeigte, dass die Dimerisierung hinreichend für die Aktivierung des Rezeptors ist. Versuche, durch Phagen-Display ein Peptid zu erzeugen, welches die Bindung des Hormons Erythropoetin an seinen Rezeptor verhindert, führten zu einem Peptid, welches nicht nur das natürliche Hormon verdrängt, sondern seinerseits den Rezeptor aktivieren kann (Wrighton et al. 1996) und die Proliferation von Stammzellen induziert. Die Kristallstruktur des Komplexes zeigt, dass das Peptid als Dimer an den Rezeptor bindet und so 2 Rezeptormoleküle dimerisiert. Hormon-RezeptorWechselwirkungen sind nicht nur von fundamentaler biochemischer Bedeutung, sondern spielen auch bei pathologischen Prozessen eine herausragende Rolle. Strukturbiologische Untersuchungen liefern hier entscheidende Beiträge zum Verständnis dieser Prozesse.

2.3.3.5 G-Proteine als molekulare Schalter Die obigen Beispiele beschränkten sich auf die strukturbiologische Beschreibung solcher Prozesse, welche an der Zelloberfläche während der Signaltransduktion stattfinden. Im Folgenden wird noch ein Beispiel eines zentralen intrazellulären Prozesses diskutiert. In vielen Signaltransduktionsprozessen konvergieren die unterschiedlichen Rezeptoraktivierungsmechanismen bei den G-Proteinen. Von diesen ausgehend werden über eine Kaskade von Kinasen sehr unterschiedliche Transkriptionsprozesse ausgelöst. Obwohl die G-Proteine nur die relativ simple Reaktion der Hydrolyse von GTP zu GDP durchführen, also eine GTPase-Aktivität besitzen, werden sie doch als zentrale Schalter von Signaltransduktionsprozessen betrachtet. G-Proteine spielen, zuzüglich zur Signaltransduktion, auch eine Rolle beim nukleären Import (Ran), dem Aufbau des Zytoskeletts (Rho, Rac), dem zellulären Proteintransport (Rab, ARF) und bei den ribosomalen Elongationsprozessen (EF-Tu) (Krauss 1997). G-Proteine kommen in 2 verschiedenen Zuständen vor, einem ruhenden inaktiven Zustand, in dem GDP an das Protein gebunden ist, und einem aktiven Zustand, in dem GTP gebunden ist. Im letzteren Zustand kann das Protein das Signal weiterleiten und nachgeschaltete Kinasen aktivieren. Die eigentliche Hydrolyse von GTP zu GDP verläuft spontan, jedoch relativ langsam ab, und die Kinetik dieser Reaktion bestimmt in Abwesenheit von regulatorischen Proteinen das Zeitfenster für die Signal-

288

Sektion 2 · Modelle a

b

d

c . Abb. 2.3.6a–d. G-Proteine als molekulare Schalter. (a) Inaktives G-Protein im Komplex mit GDP (Tong et al. 1991), (b) Komplex zwischen G-Protein und einem Nukleotidaustauschfaktor (GEF) (Boriack-

Sjodin et al. 1998), (c) Komplex zwischen G-Protein und Effektor (Nassar et al. 1995), (d) Komplex zwischen G-Protein und GTPase aktivierendem Protein (GAP) (Scheffzek et al. 1997)

transduktion. Durch Wechselwirkung mit unterschiedlichen Proteinen können G-Proteine in verschiedenen Zuständen reguliert werden (> Abb. 2.3.6). GEF-Proteine (Guanin-Nukleotid-Exchange-Faktoren) bewirken den Austausch von GDP durch GTP. Da G-Proteine hierdurch aktiviert werden, stellen die GEF-Proteine das eigentliche hereinkommende Signal dar. Dieses Signal wird an sog. Effektormoleküle, welche G-Proteine im GTP-gebundenen Zustand binden, weitergeleitet. GAP-Proteine („GTPase activating proteins“) beschleunigen die Hydrolyse von GTP zu GDP und stellen das Signal ab, indem sie G-Proteine in den inaktiven Zustand überführen. Des Weiteren wechselwirken G-Proteine mit GDI-Proteinen, den „guanine nucleotide dissociation inhibitors“. Diese scheinen sowohl die Hydrolyse als auch den Austausch von GDP durch GTP zu inhibieren. Am wichtigsten könnte jedoch die Eigenschaft der GDI sein, G-Proteine durch Binden des Isoprenankers von der Membranoberfläche abzulösen (Hoffman et al. 2000). Wegen der herausragenden Rolle von G-Proteinen in biochemischen und pathogenen Prozessen, wie z. B. Krebs, werden diese Proteine intensiv strukturbiologisch untersucht (Geyer u. Wittinghofer 1997; Sprang 1997).

Es wird geschätzt, dass in 25–30% aller humanen Tumoren Mutationen im G-Protein RAS vorkommen. Ein Teil der strukturbiologischen Untersuchungen fokussiert auf der eigentlichen Hydrolysereaktion. Mit Hilfe von Substratanaloga wie z. B. nicht hydrolysierbarem GTP (GDPNHP, GDP-CH2P oder GDP-[AlF4]–) konnten die verschiedenen Zustände entlang der Reaktionskoordinate detailliert charakterisiert werden. Die Unterschiede in den Nukleotiden GDP und GTP bewirken unterschiedliche Konformationen in den sog. Switch-Regionen, und diese Strukturänderungen ermöglichen unterschiedliche Interaktionen mit den regulierenden Proteinen (Branden u. Tooze 1999). Die strukturbiologische Aufklärung des Komplexes zwischen RAS und SOS (Boriack-Sjodin et al. 1998) ermöglichte erste Einblicke in den Mechanismus, wie die Bindung von GEF-Proteinen den Austausch von GDP durch GTP unterstützt. In der Struktur ist klar zu sehen, dass es zu einer Aufweichung der Wechselwirkung zwischen dem Nukleotid und dem Protein kommt. Während die Bindungstasche der Phosphate verändert wird, bleibt die Nukleosidbindungstasche unverändert. Dies legt nahe, dass in diesem Komplex die Affinität für GDP und GTP gleich hoch sein sollte und dass allein die

289 2.3 · Molekülmodelle und Modellmoleküle: Strukturanalyse großer biologischer Moleküle für die Medizin

im Vergleich zu GDP ungefähr 10-fach höhere zelluläre GTP-Konzentration den Austausch bewirkt. Durch die Strukturaufklärung des Komplexes RasRasGAP (Scheffzek et al. 1997) und weiterer Komplexe ist inzwischen sehr gut vorstellbar, wie GAP-Proteine zur Beschleunigung der Hydrolyse von GTP zu GDP beitragen. Es stellte sich heraus, dass GAP-Proteine entweder indirekt die Geometrie des aktiven Zentrums stabilisieren, welche die Hydrolyse unterstützt, oder sogar direkt die Seitenkette einer Aminosäure zum aktiven Zentrum beisteuern, welche sich unmittelbar an der Katalyse beteiligt. Mittlerweile ist auch die Struktur eines Komplexes zwischen einem G-Protein und einer Domäne eines Effektorproteins bekannt (Nassar et al. 1995) sowie die Struktur eines G-Protein-GDI-Komplexes (Hoffman et al. 2000). Strukturbiologische Untersuchungen an G-Proteinen werden von der Hoffnung getragen, dass die Aufklärung der verschiedenen Mechanismen zur Entwicklung von Wirkstoffen führen könnte, welche Fehlfunktionen dieser wichtigen Schalter korrigieren könnten.

2.3.4 Moleküle beflügeln die Arzneimittelentwicklung Mit den Fortschritten bei der Strukturanalyse geht die Hoffnung einher, dass die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur eines Proteins es ermöglichen kann, am Computer Wirkstoffe zu entwickeln, welche die Funktion dieses Proteins inhibieren und somit als potenzielle Arzneimittel einsetzbar wären. Obwohl auch hier die Methoden kontinuierlich verbessert wurden, kann die Methode des computergestützten De-novo-Designs das klassische Durchmustern von Substanzbibliotheken nach Leitstrukturen und deren anschließende Optimierung durch gezielte organische Synthese nicht vollständig ersetzen. Die Anwendung des De-novo-Designs ist dadurch eingeschränkt, dass die exakten geometrischen Abmessungen der Bindungstaschen, welche durch die Strukturanalyse erhalten werden, es noch nicht ermöglichen, exakte Bindungsbeiträge von möglichen Wechselwirkungen zwischen Liganden und Protein genau abzuschätzen. Hierfür gibt es mehrere mögliche Gründe. Es ist bekannt, dass Proteine beweglicher und adaptiver sind, als dies eine einzelne Kristallstruktur suggeriert. Abhilfe kann hier durch die Strukturbestimmung einer Vielzahl unterschiedlicher Protein-Liganden-Komplexe geschaffen werden, welche in ihrer Summe Einblicke in die Plastizität des aktiven Zentrums liefern. Des Weiteren scheint es, dass die theoretischen Modelle, welche zur Berechnung von Bindungsaffinitäten benutzt werden, im Moment noch zu simpel sind. Einen Überblick über aktuelle Methoden zum Design von Wirkstoffen gaben Böhm et al. (1996).

2.3

Am Beispiel der HIV-Protease soll gezeigt werden, welche konkreten Beiträge die Strukturanalyse zur Entwicklung von Inhibitoren und damit Pharmaka leisten kann (Wlodawer u. Vondrasek 1998). Die HIV-Protease ist eines von 3 Enzymen, welches von der RNA des humanen Immundefizienzvirus (HIV) kodiert wird. Inhibitoren der reversen Transkriptase, wie z. B. das Nukleosidanalogon AZT [3'-Azidothymidin (Sandstrom u. Oberg 1993)], werden schon seit den frühen Stadien der Ausbreitung der erworbenen Immunschwäche AIDS bei der Bekämpfung der Infektion eingesetzt. 1989 wurde die erste Kristallstruktur der HIV-Protease bestimmt (Navia et al. 1989; Wlodawer et al. 1989). Das Protein ist ein Homodimer, besteht überwiegend aus E-Faltblättern und ist durch 2 große Lappen ausgezeichnet, welche sich über das aktive Zentrum falten. Die Struktur zeigt, dass die HIV-Protease zur Familie der sauren Proteasen gehört. Im aktiven Zentrum dieser Enzyme spielen 2 Aspartatreste eine zentrale Rolle; diese unterstützen die nukleophile Addition eines Wassermoleküls an die Karbonylgruppe der Amidbindung. Die Suche nach möglichen Inhibitoren zeigte, dass Pepstatin, ein Inhibitor der Proteasen Renin und Cathepsin D, auch die HIV-Protease inhibiert. Pepstatin enthält die nicht natürliche Aminosäure Statin, eine J-Amino-E-Hydroxykarbonsäure, welche an die Aspartatreste bindet und nicht hydrolysiert werden kann. Bei der Entwicklung der Inhibitoren wurde diese zentrale funktionelle Gruppe beibehalten, und die flankierenden Reste wurden im Sinn der beobachteten Substratspezifität der HIV-Protease variiert (West u. Fairlie 1995). Röntgenstrukturanalysen der verschiedenen InhibitorProtease-Komplexe dienten zur Überprüfung der Bindungsmodi der Inhibitoren und lieferten ihrerseits wieder Vorschläge zur Optimierung des Inhibitors. Die dabei aufgestellten Hypothesen mussten dann erneut durch Synthese der Verbindungen überprüft werden. Diese zyklische Vorgehensweise von Design, Synthese und Strukturaufklärung stellt das zentrale Dogma des strukturunterstützten rationalen Wirkstoffdesigns dar. In den Kristallstrukturen der Komplexe der HIVProtease mit Pepstatinderivaten wurde beobachtet, dass in allen Fällen ein zwischen dem Inhibitor und den Amidgruppen von Ile50 und Ile50' der dimeren Protease eingelagertes Wassermolekül konserviert ist. Dies gab Anlass zu der Hoffnung, durch Substitution des Wassers durch eine funktionelle Gruppe des Inhibitors einen entscheidenden Entropiegewinn zu erzielen und damit zu einer höher affinen Bindung zu kommen. Ausgehend von dieser Überlegung wurden zyklische Harnstoffderivate synthetisiert. Obwohl die Moleküle sehr gute Bindungseigenschaften hatten, zeichneten sie sich jedoch durch schlechte pharmakologische Eigenschaften aus und finden heute keine Anwendung mehr. Die Entwick-

290

Sektion 2 · Modelle

lung der jetzt erhältlichen Inhibitoren, wie z. B. der Verbindung Saquinavir (Roche), machte ausführlich Gebrauch von der Strukturanalyse. Allein bis 1996 wurden ungefähr 400 verschiedene Kristallstrukturen der HIVProtease mit unterschiedlichen Inhibitoren bestimmt (Vondrasek u. Wlodawer 1996). Zusammenfassend ist zu sagen, dass die Strukturbiologie mittlerweile routinemäßig bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe eingesetzt wird, der hierfür benötigte Aufwand ist jedoch beträchtlich.

2.3.5 Ausblick Es wurde dargestellt, wie dreidimensionale Proteinstrukturen grundsätzlich beschaffen sind und welche Methoden zu ihrer Analyse eingesetzt werden. An ausgewählten Beispielen wurde gezeigt, wie Proteinstrukturen zur Erklärung biologischer Prozesse und medizinischer Fragen beitragen. Dabei haben wir uns im Wesentlichen von unserem Interesse leiten lassen und solche Proteinfamilien diskutiert, die uns besonders wichtig und relevant erschienen. Wir sind damit dem klassischen, „hypothesengetriebenen“ Vorgehen gefolgt, das in den Biowissenschaften bis vor kurzem die Norm war. Diesem Vorgehen wird jetzt auch in der Strukturbiologie mehr und mehr ein systematischer, „proteomweiter“ Ansatz gegenüber gestellt, so wie in der Biologie „genomweite“ Analysen in der Folge der Genomsequenzierungsprojekte Bedeutung erlangt haben. Entsprechend dem neuen Paradigma der strukturellen Genomforschung („structural genomics“) wird nämlich in einer internationalen Initiative versucht, Proteinstrukturen systematisch und mit hohem Durchsatz so zu bestimmen, dass in absehbarer Zeit für jede Proteinsequenzfamilie mindestens eine Kristall- oder NMR-Struktur in Datenbanken verfügbar ist (Blundell u. Mizuguchi 2000; Burley 2000; Montelione u. Anderson 1999; Terwilliger et al. 1998). An diesem internationalen Großprojekt sind auch europäische Gruppen beteiligt (Heinemann 2000; Heinemann et al. 2000). Ist es erfolgreich, wird es in wenigen Jahren möglich sein, auf dem Wege der Homologiemodellierung zu jeder beliebigen Proteinsequenz zumindest ein grobes dreidimensionales Modell im Computer zu erzeugen (Brenner 2000; Gaasterland 1998; Koonin et al. 1998; Linial u. Yona 2000; Šali 1998; Shapiro u. Lima 1998). Über erste Erfolge der systematischen Proteinstrukturanalyse mit hohem Durchsatz wurde bereits berichtet (Christendat et al. 2000). Es ist aber nicht zu erwarten, dass die strukturelle Genomforschung die klassische, an der Analyse ausgewählter Systeme und hochkomplexer supramolekularer Gebilde orientierte, Strukturbiologie ablösen wird. Vielmehr darf erwartet werden, dass sie diese ergänzt und es dem

Molekularbiologen erlauben wird, mit geringem Aufwand Hypothesen aus computergenerierten dreidimensionalen Proteinmodellen zu erzeugen. Zur gleichen Zeit gibt die strukturelle Genomforschung Anlass, die Methodik der Proteinstrukturanalyse weiterzuentwickeln und auf hohen Durchsatz zu optimieren (Abola et al. 2000; Lamzin u. Perrakis 2000; Montelione et al. 2000).

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Sektion 2 · Modelle

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2.3

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294

Sektion 2 · Modelle

2.3.7 Zeittafel Die angegebenen Zitate sind in den Literaturteil integriert. 1830

Beschreibung von Kristallen des Hämoglobins durch Baumgärtner

1895

Entdeckung der Röntgenstrahlen durch Röntgen

1912

Demonstration der Röntgenbeugung an Kristallen (Friedrich et al. 1912)

1913

Bragg und Bragg beschreiben die Kristallstruktur des Diamanten

1927

Davisson und Germer weisen die Elektronendiffraktion an Kristallen nach

1928

Lonsdale beschreibt die Kristallstruktur eines organischen Moleküls

1934

Bernal und Crowfoot führen Röntgenbeugungsexperimente an Pepsinkristallen durch

1935

Stanley beschreibt Kristalle des Tabakmosaikvirus

1946

Entdeckung der kernmagnetischen Resonanz (Purcell et al. 1946, Bloch et al 1946)

1953

Watson und Crick beschreiben die Struktur des DNA-Doppelstrangs

1960

Beschreibung der Kristallstruktur des Myoglobins (Kendrew et al. 1960)

1966, 1971

Entdeckung der Fourier-Transformation und mehrdimensionalen MRT-Spektroskopie (Ernst u. Anderson 1966, Jeener 1971)

1968

Beschreibung der Kristallstruktur des Hämoglobins (Perutz et al. 1968)

1974

Beschreibung der Kristallstruktur der tRNAPhe (Kim et al. 1974, Robertus et al. 1974)

1978

Beschreibung der Kristallstruktur des Tomato-bushy-stunt-Virus (TBSV) (Harrison et al. 1978)

1980

Beschreibung der Kristallstruktur einer Windung von B-DNA (Wing et al. 1980)

1985

Beschreibung der MRT-Struktur des Proteaseinhibitors IIa aus Rindersperma (Williamson et al. 1985) Beschreibung der Kristallstruktur eines integralen Membranproteins (Deisenhofer et al. 1985)

1987

Beschreibung der Kristallstrukturen des Repressor-Operator-Komplexes des Phagen 434 (Anderson et al. 1987)

1992, 1993

Beschreibung der Kristallstrukturen von Rezeptor-Ligand-Komplexen (De Vos et al. 1992, Banner et al. 1993)

2000

Beschreibung der Kristallstrukturen der ribosomalen Untereinheiten (Ban et al. 2000, Schluenzen et al. 2000, Wimberley et al. 2000)

3

3 Diagnostik 3.1 Klinische Proteomik Birgit Kersten und Erich E. Wanker

3.2 Pharmakogenetik und Pharmakogenomik Ivar Roots, Gabriele Laschinski und Urs A. Meyer

3.3 Bioinformatik Jens G. Reich

3.4 Gendiagnostik Andrea Bauer, Sabina Solinas-Toldo und Jörg D. Hoheisel, Peter Schirmacher und Roland Penzel und Stefan Aretz

3.1 3.1 Klinische Proteomik Birgit Kersten und Erich E. Wanker 3.1.1

Einführung

– 298

3.1.2

Teilgebiete der Proteomik

3.1.2.1 3.1.2.2 3.1.2.3 3.1.2.4 3.1.2.5 3.1.2.6

Identifizierung von Proteinen – 299 Differenzielles Display und Quantifizierung von Proteinen – 300 Proteinmodifikationen – 302 Strukturelle Proteomik – 302 Proteinlokalisation – 303 Protein-Protein-Wechselwirkungen – 303

3.1.3

Klinische Proteomik

3.1.3.1 3.1.3.2 3.1.3.3

Protein-Expressionsprofile bei verschiedenen Erkrankungen – 306 Aufdeckung von Biomarkern bei verschiedenen Erkrankungen – 307 Proteomik und Medikamentenentwicklung – 307

3.1.4

Ausblick

– 308

3.1.5

Literatur

– 308

3.1.6

Zeittafel

– 312

Literatur zur Zeittafel

– 299

– 305

– 312

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

298

Sektion 3 · Diagnostik

3.1.1 Einführung Das Wort Proteom wurde im September 1994 von Mark Wilkins eingeführt (Wilkins et al. 1996) und bezeichnet das gesamte Proteinkomplement, das von einem Genom exprimiert und nach der Expression modifiziert werden kann. Unter Proteomik („proteomics“) versteht man die systematische Untersuchung der Proteine eines Organismus, eines Gewebes oder eines spezifischen Zelltyps mithilfe molekularbiologischer, biochemischer und zellbiologischer Methoden (Anderson et al. 2001). Das Wort Proteomik wurde ursprünglich benutzt, um die Auftrennung von Proteinen aus komplexen Gewebs- oder Zellextrakten mittels 2-dimensionaler (2D)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zu beschreiben (Anderson u. Anderson 1996). In diesem Sinne wurden die ersten Proteomikstudien in den 1970er Jahren durchgeführt, als Forscher damit begannen, die Muster der Proteinspots, die sie nach der elektrophoretischen Trennung erhielten, zu katalogisieren und erste Datenbanken von exprimierten Proteinen aufzubauen (O’Farrell 1975). Obwohl die Proteintrennung in den 2D-Gelen zunehmend reproduzierbar wurde, war die Identifizierung der Proteine in den Spots schwierig, da es noch an effektiven Methoden zur Proteinanalyse fehlte. In den 1990er Jahren wurde dieses Problem durch die hochsensitive Massenspektrometrie (MS) überwunden (Henzel et al. 1993), eine Entwicklung, die als wichtigster Meilenstein in der Proteomikforschung innerhalb der letzten 25 Jahre betrachtet wird. Die Kombination von 2D-Gelelektrophorese (2DE) zur Trennung und MS zur Identifizierung der Proteine war der Beginn einer neuen Ära. Ein weiterer außerordentlicher Schritt war die Entschlüsselung des Humangenoms, die eine systematische Analyse der Genprodukte ermöglichte und das Forschungsinteresse in Richtung Proteinfunktion lenkte (Lander et al. 2001; Venter et al. 2001). Im Zuge dieser Entwicklungen musste der Begriff Proteomik erweitert werden: Heute umfasst er neben der Proteinidentifizierung (7 3.1.2.1) und -quantifizierung (7 3.1.2.2) die systematische Untersuchung von Proteinmodifikationen (7 3.1.2.3), die Hochdurchsatzanalyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen (7 3.1.2.6), systematische Lokalisationsstudien (7 3.1.2.5) sowie Proteinstrukturbestimmung mit Röntgenstrahlkristallographie (Pandey u. Mann 2000) (7 3.1.2.4). Alle Strategien und Methoden, die sich ausschließlichen mit der Untersuchung von Genen oder BotenRNA („messenger“-RNA, mRNA) befassen, wie zum Beispiel umfassende Transkriptionsprofilanalysen, Mutageneseanalysen (Schindewolf et al. 2000) oder systematische Antisense-Experimente (Gonczy et al. 2000) werden für gewöhnlich nicht unter Proteomik eingeordnet.

Warum brauchen wir die Proteomforschung? Proteine verändern sich in Antwort auf externe oder interne Signale und Prozesse ständig in ihrer Aktivität, Stabilität und subzellulären Lokalisation und gehen fortwährend neue Wechselwirkungen ein. In der postgenomischen Ära ist es deshalb unser Ziel, die komplexen biologischen Prozesse, an denen die Proteine beteiligt sind, mit molekularbiologischen, biochemischen und zellbiologischen Hochdurchsatzmethoden umfassend zu untersuchen. So führt allein die Identifizierung eines offenen Leserahmens in genomischen Datensätzen mit bioinformatischen Methoden nicht zwingend zur Vorhersage eines funktionellen Gens (Pandey u. Lewitter 1999). Oft ist die Identifizierung des dazugehörigen Genprodukts mittels Proteomikmethoden (7 3.1.2.1) entscheidend für die Verifizierung des Gens. In einem speziellen Zelltyp ist außerdem zu einer bestimmten Zeit immer nur ein Teil der Gene aktiviert, was sich mittels Transkriptionsanalysen (Analyse der exprimierten mRNAs) untersuchen lässt. Da die mRNA-Mengen aber oft nicht mit der Expressionshöhe der jeweiligen Proteine korrelieren (Gygi et al. 1999b), ist die zusätzliche Identifizierung und Quantifizierung der exprimierten Proteine für die systematische Analyse genregulatorischer Netzwerke nötig (7 3.1.2.1 und 3.1.2.2). Generell ist keine direkte lineare Beziehung zwischen dem Genom und seinem Proteinkomplement zu verzeichnen. Im eklatanten Gegensatz zur veranschlagten Zahl von 22.221 menschlichen Genen (Orchard et al. 2005) wird das Proteom auf 100.000 bis mehrere Millionen Proteinmoleküle geschätzt (Laurell u. Marko-Varga 2002). Zu dieser Vielfalt tragen verschiedene Prozesse auf transkriptionaler, posttrankriptionaler, translationaler und posttranslationaler Ebene der Regulation bei (> Abb. 3.1.1). Nach der Transkription der DNA in eine RNA können durch alternatives Spleißen unterschiedliche mRNAs entstehen, die nach der Translation zu unterschiedlichen Proteinen führen. Nach der Translation können die Proteine weiter stabil oder transient modifiziert werden. Über 200 posttranslationale Proteinmodifikationen wie Methylierungen und Phosphorylierungen wurden beschrieben, die Einfluss auf die Aktivität, Stabilität, Struktur, Lokalisation und Wechselwirkungen der Proteine haben (Meri u. Baumann 2001). Diese Modifikationen sind nicht von der DNA-Sequenz ablesbar und lassen sich nur durch eine Untersuchung der Proteine erfassen (7 3.1.2.3). Auch Fragen nach der subzellulären Lokalisation sowie nach Wechselwirkungspartnern der Proteine zur Erhellung zellulärer Strukturen können nicht aus der Kenntnis der DNA-Sequenz beantwortet werden und erfordern systematische Analysen auf der Proteinebene (7 3.1.2.5 und 3.1.2.6).

299 3.1 · Klinische Proteomik

3.1

. Abb. 3.1.1. Verschiedene Ebenen der Regulation auf dem Weg von der DNA zum funktionellen Protein

Nicht so sehr das genetische „Layout“ also, sondern vielmehr die komplexen Prozesse auf der Proteinebene bestimmen den Phänotyp einer Zelle. Deshalb ist die systematische Proteomanalyse unerlässlich für unser Verständnis der zellulären Funktion. Über die Grundlagenforschung hinaus wird sie die Identifizierung von neuen Biomarkern für die Diagnostik und von neuen Targets für die Therapie komplexer Erkrankungen ermöglichen.

3.1.2 Teilgebiete der Proteomik 3.1.2.1 Identifizierung von Proteinen Gewinnung, Handhabung und Lagerung von Proteinproben sind kritische Schritte bei der Identifizierung von Proteinen in großem Maßstab. Proben aus Geweben oder Zelllinien enthalten mehr als 10.000 verschiedene Proteine, die zum Teil mittels ein- bzw. zweidimensionaler Elektrophorese (2DE) aufgetrennt werden können. Nach der Trennung lassen sich die Proteine in den Gelen

mit Silber oder Coomassie anfärben. Die Spots werden ausgeschnitten, das enthaltene Protein wird enzymatisch (oft mit der Protease Trypsin) zu Peptiden verdaut, die durch MS bestimmbar sind. Für die massenspektrometrische Proteinidentifizierung stehen zwei Verfahren bereit: Bei der Erfassung der Peptidmassen nach Henzel („peptide mass mapping“) (Henzel et al. 1993) wird das Massenspektrum der Peptide mittels MALDI-TOF („matrix-assisted laser desorption/ionisation – time of flight“) bestimmt. Durch die Automatisierung der MALDI-Identifizierung können mittlerweile Hunderte von Proteinspots parallel ausgeschnitten, enzymatisch verdaut und analysiert werden (Berndt et al. 1999). Das experimentell ermittelte Massenspektrum der analysierten Peptide wird mit theoretischen Peptidmassen aus Protein- oder Nukleotidsequenzdatenbanken verglichen. So lässt sich in vielen Fällen das Protein bereits identifizieren („MALDI fingerprinting“). Das Prinzip der Peptidfragmentierung („peptidefragmentation“) beruht auf der Sequenzanalyse einzelner Peptide (Fenn et al. 1989) und wird über die ESI-MS/

300

Sektion 3 · Diagnostik

MS-Methode umgesetzt. Die Peptide werden mittels Elektrospray („electrospray ionisation“, ESI) direkt von der flüssigen Phase ionisiert und in ein Tandem-Massenspektrometer gesprüht, wo sie in N- oder C-terminale Fragmente aufgetrennt werden. ESI-MS/MS ist technisch komplizierter als MALDI-TOF, hat aber den großen Vorteil, dass zur Identifizierung der Proteine Sequenzinformationen der Peptide anstelle einfacher Peptidmassen verwendet werden, wodurch ein eindeutiger Nachweis der Proteine möglich wird. Die massenspektrometrischen Methoden zur Proteinidentifizierung entwickeln sich rasch weiter. Inzwischen gibt es Geräte, in denen eine MALDI-Ionenquelle mit Tandem-Massenspektrometern für die Fragmentierung von Peptiden kombiniert wird (Shevchenko et al. 2000). Die Verbindung der Hochdurchsatzkapazität der MALDI-Methode mit der Spezifität der Peptidsequenzierung ermöglicht eine automatisierte Ein-Schritt-Analyse. Neueste Bemühungen zielen auf Beschleunigung der Präparation und Auftrennung der Proben in integrierten Geräten ab. Die 2DE/MS-Methoden haben große Beiträge zur Identifizierung komplexer Proteome geleistet, unterliegen jedoch bestimmten Limitationen. Obwohl die besten 2D-Gele bis zu 10.000 verschiedene Proteinspots auflösen können (Klose u. Kobalz 1995), lassen sich nur die Proteine visualisieren, die im Proteinextrakt in den größten Mengen vorkommen. Die Konzentration vieler Proteine liegt unter der Nachweisgrenze der verwendeten Proteinfarbstoffe. Zur Überwindung dieses Problems können verschiedene Techniken zur subzellulären Fraktionierung bzw. zur Affinitätsreinigung angewandt werden, die zu einer Verringerung der Probenkomplexizität vor der Elektrophorese führen. Ein elegantes Beispiel für die Analyse eines Sub-Proteoms ist die 2DE-Untersuchung des Phagosoms, welche zur Identifizierung von mehr als 250 Proteinen dieser Organelle führte (Gagnon et al. 2002). In einem alternativen Ansatz werden komplexe Proteinmischungen ohne vorherige Gelelektrophorese mittels MS analysiert. Damit lassen sich gering konzentrierte Proteine identifizieren oder auch andere mittels gel-basierter Methoden nicht erfassbare, etwa hydrophobe, Proteine. Die „Multidimensionale Protein-Identifikationstechnologie“ („multidimensional protein identification technology“, MudPIT) (Link et al. 1999) beruht auf der Peptidtrennung mittels Flüssigchromatographie und anschließender MS. Komplexe Proteingemische werden zunächst verdaut und anschließend in zwei unabhängigen, nacheinander gereihten Flüssigchromatographiesystemen getrennt. Von der zweiten Säule werden die Peptide direkt in ein Ionenfallen-Massenspektrometer („ion trap mass spectrometer“) eluiert, wo sie vollautomatisch identifiziert werden.

3.1.2.2 Differenzielles Display und Quantifizierung von Proteinen 2DE-Methoden Zum Verständnis der molekularen Grundlagen von Erkrankungen und zur Aufdeckung von molekularen Markern (7 auch 3.1.3) ist die Analyse von Proteinprofilen und die Quantifizierung bestimmter Proteine in verschiedenen Zuständen (gesund/krank, behandelt/unbehandelt) zu verschiedenen Zeitpunkten (Verlaufsstudien) von großem Interesse. In den meisten Proteomiklaboratorien werden 2D-Gele verwendet, um Proteinprofile zu analysieren und damit Proteine zu identifizieren, deren Expression unter bestimmten Bedingungen hoch- oder herunterreguliert ist. Die Proteine aus den zu vergleichenden Proben werden mittels 2DE getrennt. Proteine, die nur in einem Zustand sichtbar oder deutlich stärker exprimiert sind, werden durch Analyse der Gelbilder selektiert und mit MS analysiert. 2DE-Experimente sind jedoch oft schwer reproduzierbar und erfordern viel praktische Erfahrung. Eine bedeutende Verbesserung wurde hier durch die Differenz-Gelelektrophorese („difference gel electrophoresis“, DIGE) erzielt, bei der zwei Pools von Proteinen aus zwei verschiedenen Zuständen mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden und anschließend in ein und demselben 2D-Gel aufgetrennt werden (Unlu et al. 1997). Dadurch reduziert sich sowohl die Abhängigkeit von der Qualität der Präparation bzw. der Auftrennung als auch die Anzahl der zu analysierenden Gele. Ein weiterer Vorteil ist die hohe Sensitivität und der große dynamische Bereich der Fluoreszenzfarbstoffe. Damit ist es möglich, auch niedrig konzentrierte Proteine zu detektieren und vergleichend zu analysieren. Massenspektrometrische Methoden Eine aktuelle Übersicht zu MS-Methoden, die in der quantitativen Proteomik verwendet werden, wurde unlängst von Ong und Mann (2005) publiziert. Eine Kombination von radioaktiver Markierung und MS kann verwendet werden, um Proteine in Zellextrakten zu quantifizieren (Oda et al. 1999). Zu diesem Zwecke lässt man z. B. Bakterien in zwei verschiedenen Medien wachsen, eines davon weist natürliche Stickstoffisotope auf, das andere ist mit N15 angereichert. Die Bakterienproteine werden gemischt, aufgetrennt und mittels MS analysiert. Die beiden Versionen jedes Peptides werden als Doppel-Peak registriert und können über die Anzahl der Stickstoffatome detektiert werden. Das Verhältnis der Peak-Höhen erlaubt die relative Quantifizierung des dazugehörigen Proteins in den beiden Zuständen.

301 3.1 · Klinische Proteomik a

b

3.1

c

. Abb. 3.1.2a-c. Detektion von Proteinen in humanen Proben unter Verwendung verschiedener Typen von Protein-Mikroarrays. a Protein-Mikroarray, b Antikörper-Mikroarray, c reverser Protein-Mikro-

array. Ausführliche Erklärungen zu den dargestellten Methoden finden sich im Text (7 3.1.2.2)

Bei der sog. ICAT- („isotope-coded affinity tags“-) Methode werden von zwei Zuständen cysteinhaltige Peptide in vitro markiert und dann der MS zugeführt (Gygi et al. 1999a). Da die Markierung in vitro erfolgt, ist diese Methode auch zur Analyse humaner Proben anwendbar.

den die Mikroarrays mit entsprechenden Serumverdünnungen inkubiert. Die gebundenen Antikörper werden dann mithilfe von fluoreszenzmarkierten Zweitantikörpern detektiert (Robinson et al. 2002). Protein-Mikroarrays, auf denen Antikörper immobilisiert wurden (sog. Antikörper-Mikroarrays, AMAs), finden Anwendung bei der Quantifizierung von interessanten Proteinen in klinischen Proben oder können zum Vergleich von klinischen Proben eingesetzt werden (> Abb. 3.1.2b). Die zu vergleichenden Proben werden mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und dann gleichzeitig auf einem AMA inkubiert (ähnlich der Bestimmung von mRNA-Profilen mittels DNA-Mikroarrays). Skreekumar et al. (2001) konnten mit dieser Methode die Auf- und Abregulation einiger Proteine in LoVo-Kolonkarzinom-Zellen unter Bestrahlung untersuchen, indem sie Proteinextrakte von bestrahlten und unbestrahlten Zellen mit Antikörper-Arrays testeten. In anderen Studien mit Antikörper-Arrays wurden kinetische Analysen zur Expression von Rezeptorkinasen (Nielsen et al. 2003) oder Zytokinen (Schweitzer et al. 2002) durchgeführt. Analytische Untersuchungen zur Proteinexpression in Zelllysaten oder Gewebeextrakten können auch

Analytische Anwendungen von ProteinMikroarrays Zur Herstellung von Protein-Mikroarrays können gereinigte Proteine, Antikörper oder Proteinlysate verwendet werden (> Abb. 3.1.2). Sie werden mithilfe von Robotern (Mikroarrayer: Kontakt-Arrayer oder Piezo-Arrayer) systematisch und in hoher Dichte auf beschichtete Glasobjektträger immobilisiert (Hultschig et al. 2006; Kersten et al. 2005; Labaer u. Ramachandran 2005; Zhu u. Snyder 2003). Hunderte bis Tausende adressierte Proteinproben lassen sich auf einem Mikroarray unterbringen und können dann parallel, in einem Experiment, analysiert werden. So können Protein-Mikroarrays (PMAs), die verschiedene Proteinantigene enthalten (> Abb. 3.1.2a), eingesetzt werden, um die Menge von bestimmten Autoantikörpern in Patientenseren semiquantitativ oder quantitativ zu bestimmen. Dabei wer-

302

Sektion 3 · Diagnostik

unter Verwendung sog. reverser Protein-Mikroarrays (RPMAs) durchgeführt werden. Bei dieser Art von Array werden nicht die Antikörper immobilisiert, sondern die Zelllysate (> Abb. 3.1.2c). Danach werden Antikörper, mit denen ein bestimmtes Protein in den Lysaten nachgewiesen werden soll, in Form einer Antikörperlösung auf die RPMAs gegeben. Der Nachweis gebundener Antikörpermoleküle erfolgt durch Inkubation der RPMAs mit einem fluoreszenzmarkierten Zweitantikörper. In einer weiteren eleganten Methode zur Analyse von Proteinprofilen wird die Chromatographie auf Chipoberflächen mit MALDI-TOF kombiniert. Diese als SELDI („surface-enhanced laser desorption/ionization – time of flight“) bezeichnete Methode hat bereits zur Aufdeckung zahlreicher diagnostischer Marker geführt (Tang et al. 2004). Ausgehend von biologischen Proben wie Serum oder Zelllysaten werden zunächst, je nach verwendeter chromatographischer Oberfläche, verschiedene Sub-Sets von Proteinen aus der Probe extrahiert und an der Chipoberfläche festgehalten. Nach Entfernung der ungebundenen Proteine von der Chipoberfläche werden die immobilisierten Proteine mittels MALDI-TOF identifiziert. Der Vergleich der Spektren, die aus Patientenproben gewonnen wurden, mit denen Gesunder kann zur Aufdeckung von Proteinen führen, die durch die Erkrankung hoch- oder herunterreguliert werden.

3.1.2.3 Proteinmodifikationen Posttranslationale Modifikation, wie Phosphorylierungen und Glykosylierungen sind nicht direkt an der DNA-Sequenz ablesbar. Sie modulieren jedoch die Aktivität vieler Proteine. Bis jetzt wurden etwa hundert unterschiedliche Typen von posttranslationalen Modifikationen beschrieben, und die Aufdeckung vieler weiterer wird erwartet (7 RESID-Datenbank: http://www.ebi.ac.uk/ RESID/). Die Proteintrennung mittels 2DE-Techniken liefert oft eine ausreichende Auflösung, um Modifikationsstadien eines Proteins direkt zu identifizieren. Einige dieser Modifikationen können auf dem 2D-Gel als Spot-Serien, die von einem Spot ausgehen („trains of spots“), identifiziert werden. Dabei handelt es sich um Gruppen von Spots, die einen regelmäßigen Abstand bezüglich ihres Molekulargewichtes oder ihres isoelektrischen Punktes aufweisen. Phosphorylierungen z. B. verändern die Proteinladung und sind als horizontale Spot-Serien erkennbar. Auch MS-Technologien kommen zum Einsatz (Reinders u. Sickmann 2005), wobei die Phosphoproteine einer Probe zuerst chromatographisch angereichert wer-

den. Markierung mit stabilen Isotopen kann in Kombination mit MS angewandt werden, um die Dynamik der Modifikationen zu studieren (Mann u. Jensen 2003). Phosphorylierte Proteine in Lysaten können auch durch Protein-Mikroarrays, AMAs und RPMAs (Sheehan et al. 2005) (7 auch 3.1.2.2) nachgewiesen werden. Einige Studien berichten vom erfolgreichen Einsatz von „sandwich“-Anordnungen auf AMAs (Nielsen et al. 2003). Zu diesem Zwecke wurden sog. Fängerantikörper („capture antibodies“) auf dem Array immobilisiert, die außerhalb der Phosphorylierungsstelle an die gesuchten Proteine binden und diese während der Inkubation mit dem Lysat an der Oberfläche „festhalten“. Anschließend wird der Array mit fluoreszenzmarkierten phosphospezifischen Antikörpern inkubiert, um den Phosphorylierungsstatus der gebundenen Proteine zu ermitteln. Inkubiert man die Arrays gleichzeitig mit einem dritten Antikörper, der ebenfalls außerhalb der Phosphorylierungsstelle bindet, so lässt sich auch die Menge des gebundenen Proteins ermitteln. Mit dieser Multiplexmethode wurden aus Zelllysaten erfolgreich Phosphorylierungsstatus und Menge von Signaltransduktionsproteinen bestimmt (Nielsen et al. 2003). Eine aktuelle Übersicht verschiedener Multiplexing-Verfahren mit Protein-Mikroarrays wurde kürzlich publiziert (Kersten et al. 2005). Ausgehend von Zell- oder Gewebslysaten zielen alle oben beschriebenen Methoden darauf ab, Phosphorylierungen zu erfassen. Phosphorylierungsstudien können aber auch in vitro durchgeführt werden, vor allem, wenn es darum geht, potenzielle Substrate von Kinasen zu finden. Dazu werden zunehmend Arrays mit rekombinanten Proteinen eingesetzt (Kramer et al. 2004; Zhu et al. 2000). Dieser Ansatz wurde unlängst angewandt, um im hohen Durchsatz nach neuen Substraten für Arabidopsis-MAP-Kinasen zu suchen (Feilner et al. 2005). Kurz danach wurde eine ähnliche Methode publiziert, mit der es gelang, im großen Maßstab Hefekinasen zu analysieren (Ptacek et al. 2005). Es ist zu erwarten, dass in naher Zukunft umfangreiche Studien zur Identifizierung von Substraten menschlicher Kinasen folgen werden.

3.1.2.4 Strukturelle Proteomik Ein wichtiger Schlüssel zum Verständnis der Funktion eines nicht charakterisierten Proteins ist die Analyse seiner Struktur, entweder experimentell oder ausgehend von Modellen. Die grundlegenden Methoden zur Strukturbestimmung, zu denen u. a. die Kristallstrukturanalyse und die kernmagnetische Resonanzspektroskopie gehören, werden im vorliegenden Buch ausführlich von Udo Heinemann beschrieben (7 Kap. 2.3).

303 3.1 · Klinische Proteomik

In den letzten Jahren wurden verschiedene Initiativen gestartet, um in hohem Durchsatz Proteinstrukturen zu untersuchen (Bussow et al. 2005; Sali et al. 2003). Von den zahlreichen Strukturen, die in verschiedenen Datenbanken abgelegt wurden, gehören nur wenige zu menschlichen Proteinen. Das ist vor allem auf die Probleme bei der In-vitro-Gewinnung zurückzuführen (Bussow et al. 2005). Systematische Expressionsstudien haben gezeigt, dass nur etwa 20% aller humanen Proteine in löslicher Form in E. coli produziert werden können (Bussow et al. 2004). Strukturbestimmungen erfordern aber das Vorhandensein löslicher, korrekt gefalteter Proteine. Die effektive Produktion von biologisch aktiven humanen Proteinen bleibt eine große Herausforderung für alle Initiativen zur strukturellen Proteomik.

3.1.2.5 Proteinlokalisation Eine Proteomikstrategie, die zunehmend an Bedeutung gewinnt, ist die systematische Analyse der Lokalisation der Proteine in den Zellen. In der Hefe S. cerevisiae wurde eine proteomweite Studie durchgeführt, in der die Lokalisation epitopmarkierter Proteine unter Verwendung von epitopspezifischen Antikörpern untersucht wurde (Kumar et al. 2002). Die subzelluläre Lokalisation von 2.744 Proteinen konnte bestimmt werden, für 955 dieser Proteine war zuvor keine Funktion bekannt. Die Integration der Ergebnisse mit schon publizierten Daten ließ eine deutliche Korrelation zwischen den Proteinfunktionen und der Lokalisation der Proteine in Hefe erkennen. Weitere groß angelegte Lokalisierungsstudien wurden in der Hefe S. pombe (Ding et al. 2000), in D. melanogaster (Morin et al. 2001) und in Säugerzellen (Simpson et al. 2000) unter Verwendung von GFP-markierten Proteinen durchgeführt. Für die Zukunft ist mit der Automatisierung von Proteinlokalisationsstudien zu rechnen. Sie werden bedeutende Einsichten in die subzelluläre Organisation und das Wechselspiel der Proteine auf dem molekularen Niveau in Raum und Zeit liefern.

3.1.2.6 Protein-Protein-Wechselwirkungen Auch die Identifizierung seiner Wechselwirkungspartner kann wertvolle Hinweise auf die Funktion eines Proteins liefern. Die systematische Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen ist deshalb eines der Schlüsselprojekte in der Proteomforschung. Von der Etablierung von Protein-Interaktionsnetzwerken werden umfangreiche Erkenntnisse zu zellbiologischen Funktionszusammenhängen und zur Identifizierung von neuen Zielmolekülen für Medikamente erwartet.

3.1

Isolierung und Charakterisierung von Proteinkomplexen Ein attraktiver Weg zum Studium von Protein-ProteinWechselwirkungen ist die Reinigung ganzer Proteinkomplexe aus Zellextrakten mittels Affinitätschromatographie (Rigaut et al. 1999). Das kann direkt über verschiedene Affinitäts-Tags des zu untersuchenden Proteins erfolgen, wie z. B. Glutathion-S-Transferase (GST) oder indirekt über Antikörper, DNA, RNA oder kleine Moleküle, die spezifisch an das zu untersuchende zelluläre Targetprotein binden. So wurde das humane Spleißosom unter Verwendung von biotinylierter RNA als Fängermolekül gereinigt (Barabino et al. 1989). Seine Komponenten wurden mit 2DE analysiert, wobei 19 neue Faktoren identifiziert werden konnten. In Kolokalisationsstudien mit Immunfluoreszenz- (IF-)Mikroskopie wurde dann bestätigt, dass viele der identifizierten Proteine in Zellen tatsächlich mit dem Spleißosom assoziiert sind. Verwendet man Affinitäts-Tags, so lässt sich über den Tag (z. B. GST) das zu analysierende Protein an Kügelchen („beads“) binden, und die Proteine, die ihrerseits mit diesem Protein assoziieren, können aus dem Extrakt herausgezogen werden. Nach dem Waschen der Kügelchen zur Entfernung unspezifisch gebundener Proteine wird der Komplex eluiert und mittels Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Proteine werden dann mit MS identifiziert. So ist es in einem einzelnen Experiment möglich, viele verschiedene Komponenten von Proteinkomplexen zu bestimmen. Mit dieser Strategie wurden Komplexe des humanen HIP1-Proteins untersucht (Waelter et al. 2001). Unter Verwendung von GST-HIP1 ließen sich Huntingtin, Clathrin und D-Adaptin in dem isolierten Komplex detektieren. Diese HIP1-Wechselwirkungspartner wurden dann mit zellbiologischen Methoden funktionell charakterisiert. Des Weiteren können Epitop-getaggte Proteine in einer Zelle überexprimiert werden. Unter Verwendung eines Antikörpers, der das jeweilige Epitop erkennt, wird dann der Komplex, bestehend aus dem getaggten Protein und seinen Wechselwirkungspartnern, immunopräzipitiert (Wen et al. 2003). Das erfordert zwar einen Expressionsklon, der das getaggte Protein überexprimiert, aber es ist nicht mehr erforderlich, spezifische Antikörper gegen jedes Fängerprotein zu gewinnen. Da bereits Full-length-cDNAs für viele menschliche Proteine zur Verfügung stehen, sollte es mit dieser Strategie schon in naher Zukunft möglich sein, viele unbekannte menschliche Proteinkomplexe systematisch aufzuschlüsseln. Die Analyse von Proteinkomplexen ermöglicht neue Arten von funktionellen Untersuchungen. Zum Beispiel konnten in einer Studie zu Profilin I und II viele unbekannte Signalmoleküle durch Affinitätschromatogra-

304

Sektion 3 · Diagnostik

phie/MS identifiziert werden, die die Aktinpolymerisation regulieren und in die Endozytose involviert sind (Witke et al. 1998). Eine Kombination aus Affinitätschromatographie und MS wurde auch zur systematischen Analyse des gesamten Hefe-Proteoms verwendet (Gavin et al. 2002). Mittels Tandem-Affinitätsreinigung („tandem affinity purification“, TAP) wurden 589 Proteinkomplexe gereinigt und hinsichtlich ihrer Zusammensetzung untersucht. Der Vergleich von Hefe- und humanen Proteinkomplexen zeigt Konservierungen zwischen den Arten und erlaubte die Generierung eines detaillierten Wechselwirkungsnetzwerks. In ähnlicher Weise wurde auch eine Interaktionskarte von 221 molekularen Wechselwirkungen der TNF-D/NF-NBSignalübertragungskette etabliert (Bouwmeester et al. 2004). Hefe-2-Hybrid System Die Entwicklung des Hefe-2-Hybrid-Systems („yeast two hybrid“, Y2H) ist eine der wichtigsten Entwicklungen zur effektiven Bestimmung von Protein-ProteinWechselwirkungen in Hefe (Fields u. Song 1989). In einem typischen Y2H-Ansatz wird das zu analysierende Protein als sog. Köderprotein („bait“) an die DNA-bindende Domäne (DBD) eines Transkriptionsfaktors fusioniert und in Hefe exprimiert. Mit diesem Köderprotein wird eine Bibliothek von sog. Beuteproteinen („preys“) durchmustert, welche mit der Aktivierungsdomäne (AD) eines Transkriptionsfaktors fusioniert sind (> Abb. 3.1.3). Kommt es zur Wechselwirkung des Köderproteins mit einem Beuteprotein, werden die DBD und die AD des Transkriptionsfaktors in enge räumliche Nähe gebracht. Damit wird der künstliche Transkriptionsfaktor rekonstruiert, was zur Aktivierung der Transkription eines Reportergens in der Hefe führt (> Abb. 3.1.3). Wechselwirkungen werden dann sowohl über das Wachstum der Hefen auf selektiven Platten als auch über die Blaufärbung der Hefen, bedingt durch die Aktivierung eines LacZ-Reporters und daraus resultierende E-Galaktosidaseaktivität der Hefen, detektiert (> Abb. 3.1.3). Derzeit wird das Y2H-System in einem array-basierten und einem bibliothekenbasierten Format angewandt. In der Arraymethode wird ein definiertes Set von Proteinen (Matrize) in Hefeklonen als AD-Fusionsproteine exprimiert und auf selektive Platten gespottet. Die gesamte Matrix wird dann mit dem zu testenden Köderprotein mittels Wechselwirkungs-„mating“ durchmustert (Goehler et al. 2004). Wenn einmal eine Matrix aus Hefeklonen, die AD-Fusionsproteine exprimieren, etabliert ist, können mit diesem Vorgehen hoch reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden. Bei der Bibliothekenmethode wird eine Beuteproteinbibliothek hergestellt. Kleine Pools der Beute-

a

b . Abb. 3.1.3a,b. Das Hefe-2-Hybrid-System. a Schematische Darstellung des Prinzips der Methode. DBD, DNA-bindende Domäne eines Transkriptionsfaktors. AD, Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsfaktors. b Beispiel für ein positives Testergebnis. Die erfolgte Wechselwirkung zwischen Protein A und Protein B wird sowohl über das Wachstum der Hefen auf selektiven Platten (Wachstum) als auch über die Blaufärbung der Hefen, bedingt durch die Aktivierung eines LacZ-Reporters und die daraus resultierende E-Galaktosidaseaktivität, detektiert (LacZ)

proteine (AD-Fusionen) werden dann gegen Köderproteine (DBD-Fusionen) getestet. Diese Methode ist relativ zeitaufwendig und erfordert das wiederholte Sequenzieren der Beuteklone nach jedem BibliothekenScreen. Die mittels Y2H-Methode gefundenen Wechselwirkungen sind potenzieller Natur und müssen mit anderen Techniken oder funktionellen Methoden verifiziert werden. Der große Vorteil der Methode liegt in ihrer Eignung zum hohen Durchsatz und zur Automatisierung. In den letzten Jahren war es möglich, genomweite Y2H-Wechselwirkungsstudien für S. cerevisiae (Uetz et al. 2000), C. elegans (Li et al. 2004) und D. melanogaster (Giot et al. 2003) durchzuführen. Unlängst wurden auch die ersten großen humanen Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke veröffentlicht, die mit Y2H erstellt wurden (Rual et al. 2005; Stelzl et al. 2005). Stelzl et al. (2005) analysierten systematisch Proteinmatrizen von 4.456 Köder- und 5.632 Beuteproteinen mit einem automatisierten Y2H-Interaktions-MatingScreen. Dabei wurden zwischen 1.705 verschiedenen Proteinen 3.186, meist bis dahin noch unbekannte, Wechselwirkungen identifiziert, die in ein großes Netzwerk mit vielen Verknüpfungen überführt wurden. Die Qualität der ermittelten Wechselwirkungen wurde mit unabhängigen In-vitro-Methoden, wie z. B. Immunopräzipitation, verifiziert. Protein-Arrays und Phage-Display Protein-Mikroarrays, PMAs, sind nicht nur zur Quantifizierung eines spezifischen Proteins in Zellextrakten

305 3.1 · Klinische Proteomik

oder Körperflüssigkeiten gut geeignet (7 3.1.2.2), sie lassen sich auch hervorragend für die globale Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen nutzen (Ramachandran et al. 2004; Zhu et al. 2001). So verwendeten Zhu et al. (2001) PMAs mit etwa 5.600 gereinigten rekombinanten Hefeproteinen zur Identifizierung von Wechselwirkungspartnern von Calmodulin. Mit der Array-Methode lassen sich umfassende Sätze von Proteinen unter diversen Bedingungen direkt in vitro auf verschiedene funktionelle Aktivitäten untersuchen, auch auf Wechselwirkungen mit DNA, RNA und Lipiden (Feilner et al. 2004; Hultschig et al. 2006; Kersten et al. 2004; Merkel et al. 2005). In herkömmlichen Array-Studien wurden gereinigte Proteine verwendet, deren Herstellung mit einem gewissen Aufwand verbunden ist. In einer aktuellen Untersuchung gelang es, Arrays mit ungereinigten Proteinen einzusetzen, um neue Wechselwirkungen humaner Proteine aufzudecken (Grelle et al. 2006) (> Abb. 3.1.4). E.-coli-Klone aus einer menschlichen cDNA-Expressionsbibliothek (Bussow et al. 2000) wurden im 384-well-Format exprimiert. Zelllysate wurden dann auf Membranen immobilisiert. Nach der Inkubation der Membran mit dem zu untersuchenden GSTgetaggten Protein wurde gebundenes GST-Protein mit einem Zweitantikörper detektiert. So konnte Caytaxin als Wechselwirkungspartner des Proteins CHIP identifiziert werden. Für Caytaxin war bekannt, dass es in Patienten mit der sog. Cayman-Ataxie mutiert vorliegt (Bomar et al. 2003). Die weitere funktionelle Analyse dieser Wechselwirkung zeigte, dass Caytaxin vom CHIP in vitro ubiquitiniert wird (Grelle et al. 2006). Weitere funktionelle Zusammenhänge in Hinblick auf die Ataxie bleiben zu klären. Die sog. Phage-Display-Methode ist eine weitere interessante Methode, um Wechselwirkungspartner von Proteinen zu identifizieren (Winter et al. 1994). Hierbei werden Banken von Bakteriophagen generiert, die Peptide oder Proteine exprimieren, welche an ein Kapsidoder Hüllprotein fusioniert sind. Durch diese Fusion werden die Peptide bzw. Proteine auf der Oberfläche der Phagen präsentiert. Diese Phagenbibliotheken werden dann mit einem gewünschten Fängerprotein inkubiert und bindende Phagen, also solche die ein wechselwirkendes Protein auf ihrer Oberfläche tragen, in mehreren Selektionsrunden angereichert. Diese Methode ist sehr effizient, um sowohl nach Peptid-Protein- als auch Protein-Protein-Wechselwirkungen zu suchen. Wie das Y2H-System ist diese Methode einfach und hochdurchsatzfähig. Mit Phage-Displays konnten neue Moleküle in der Signalübertragungskette des epidermalen Wachstumsfaktors (Zozulya et al. 1999) und Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen identifiziert werden (Hufton et al. 1999).

3.1

. Abb. 3.1.4. Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer membranbasierten Proteomikmethode (Grelle et al. 2006). Die Abbildung zeigt ein Flussschema mit den wichtigsten Teilschritten der Methode. Die Klone einer humanen cDNA-Expressionsbibliothek werden in E. coli exprimiert. Nach der Lyse der Klone im 384-wellFormat werden die Lysate auf eine Nitrozellulosemembran gespottet (Doppelspots für jede Probe). Anschließend wird der Proteinfilter mit dem zu untersuchenden GST-getaggten Protein inkubiert. Nach dem Waschen der Membran werden gebundene GST-Proteinmoleküle mit einem anti-GST-Antikörper detektiert. PPIs werden durch Doppelspots angezeigt, die ein Signal über dem Hintergrundsignal liefern (siehe Image)

3.1.3 Klinische Proteomik Obwohl in den letzten Jahren große Fortschritte bei der Aufklärung der molekularen Grundlagen verschiedener Erkrankungen erzielt wurden, ist unser Wissen zur Pathogenese noch immer sehr lückenhaft. Proteomische Ansätze können helfen, diese Lücken zu schließen. Von besonderem Interesse für die Medizin sind dabei die Beiträge der Proteomforschung zur Untersuchung veränderter Proteinexpression in Körperflüssigkeiten und Geweben (7 3.1.3.1), bei der Entwicklung von Biomar-

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Sektion 3 · Diagnostik

kern für die frühe Diagnostik (7 3.1.3.2) sowie die Identifizierung neuer Angriffspunkte für die therapeutische Intervention (7 3.1.3.3) (Vitzthum et al. 2005).

In vielen Studien der vergangenen Jahre wurde 2DE verwendet, um differenzielle Proteinexpression zu analysieren (7 3.1.2.2). Inzwischen existieren zahlreiche Datenbanken mit 2DE-Daten aus verschiedenen Geweben von Kranken und Gesunden. Einen übersichtlichen Zugang zu vielen dieser Banken findet man über den ProteomikServer von ExPASy („Expert Protein Analysis System“) des Schweizer Instituts für Bioinformatik unter folgender Internetadresse: http://www.expasy.org/ch2d/2d-index. html. > Abbildung 3.1.5 zeigt 2D-Bilder von Gewebsproben einer Brustkarzinompatientin und einer Gesunden. Eines der im kranken Gewebe überexprimierten Proteine, GRP4, wurde in der Abbildung markiert (Bini et al. 1997). In einer weiteren Studie konnten 170 differenziell exprimierte Proteine bei Brustkrebspatientinnen identifiziert werden (Page et al. 1999). Mit der vergleichenden 2DE-Methode konnte eine Klassifizierung von Leukämie in verschiedene Subtypen vorgenommen werden (Hanash et al. 2002). Auch wurden mit 2DE und MS Proteine gefunden, die kritisch für den akuten Beginn einer Herzerkrankung sind (Arnott et al. 1998).

Eine bedeutende Verbesserung der 2D-Methodik vor allem für vergleichende Analysen wurde durch die Einführung der DIGE erzielt (7 3.1.2.2). Zhou et al. (2002) untersuchten mit DIGE Unterschiede in der Proteinexpression zwischen Speiseröhrenkarzinomzellen und gesundem Gewebe. In den Krebszellen waren zahlreiche Proteine hoch- oder herunterreguliert. Ein Problem mit 2DE in klinischen Anwendungen ist oft, dass relativ große Proteinmengen benötigt werden, Gewebsprobenmaterial meist aber nur in kleinen Mengen zugänglich ist. Für bestimmte Methoden zur Isolierung von Zellen aus bestimmten Zelltypen wie die Laser-Mikrodissektion („laser-capture micro-dissection“), liefern klinische Proben nicht ausreichend Proteinmaterial, um mittels 2DE analysiert zu werden. Proteinexpressionsprofile können alternativ mit analytischen Protein-Mikroarrays (7 3.1.2.2) erstellt werden. Für das Objektträgerformat wird deutlich weniger Gewebematerial benötigt. Die vergleichende Proteinprofilierung mit ProteinMikroarrays hat in den letzten Jahren deutlich zugenommen. Knezevic et al. untersuchten mit Antikörper-Mikroarrays spezielle Krebszellpopulationen, die mittels Laser-Mikrodissektion gewonnen wurden, und identifizierten Proteine, deren Expression mit der Tumorprogression korreliert. Viele dieser Proteine sind in Signalwege involviert (Knezevic et al. 2001). In anderen Studien wurden reverse Protein-Mikroarrays, RPMAs (7 3.1.2.2), zur semiquantitativen oder quantitativen

. Abb. 3.1.5. Gelbilder nach 2DE-Analyse und nachfolgender Silberfärbung von einer Patientenprobe aus Brustkarzinomgewebe (krank) und einer entsprechenden Gewebsprobe einer gesunden Frau (gesund). Das Gelbild aus der 2D-PAGE-Datenbank an der Uni-

versität in Sienna ist öffentlich zugänglich (http://www.expasy.org/ ch2d/2d-index.html). Der Pfeil zeigt als Beispiel einen Spot, in dem das Protein GRP4 (94 KDa Glucose-regulated protein) mittels MS nachgewiesen wurde. GRP4 ist im Karzinomgewebe überexprimiert

3.1.3.1 Protein-Expressionsprofile bei verschiedenen Erkrankungen

307 3.1 · Klinische Proteomik

Proteinanalyse verwendet (Nishizuka et al. 2003; Paweletz et al. 2001). Paweletz et al. z. B. spotteten Proteinextrakte aus Geweben direkt auf Mikroarrays, um verschiedene Phosphoproteine mittels phosphorspezifischer Antikörper im Extrakt nachzuweisen und zu quantifizieren. Es wurde gezeigt, dass das Voranschreiten der Krebserkrankung mit zunehmender Phosphorylierung der Serin/Threonin-Kinase Akt und abnehmender Phosphorylierung der extrazellulären signalregulierten Kinase ERK einhergeht. Für das Auffinden von Proteinen, die eine Immunantwort bei verschiedenen Autoimmunerkrankungen induzieren, werden PMAs mit Proteinantigenen verwendet (7 3.1.2.2) und mit entsprechenden Patientenseren inkubiert. Der Nachweis von Antikörpern einer bestimmten Klasse (z. B. IgG), die aus dem Serum an bestimmte Antigen-Spots auf dem Mikroarray gebunden haben, erfolgt mittels fluoreszenzmarkierter Zweitantikörper, die spezifisch für die jeweilige Antikörperklasse sind. Mit dieser Methode wurden Autoantigene identifiziert, die bei Patienten mit rheumatoider Arthritis eine verstärkte Immunantwort auslösen (Robinson et al. 2002). Neben der Anwendung im Rahmen von Autoimmunerkrankungen lassen sich diese Mikroarrays auch einsetzen, um die Immunantwort bei anderen Erkrankungen wie Krebs (Imafuku et al. 2004) oder Allergien (Harwanegg u. Hiller 2005) zu untersuchen. Auch im Zusammenhang mit infektiösen Erkrankungen werden zunehmend PMAs eingesetzt (Kreutzberger 2006). Hierbei verwendet man Arrays mit bakteriellen oder viralen Proteinen, um im Rahmen der Serumdiagnostik Antikörper gegen die Erreger nachzuweisen. Diese Methoden werden dazu beitragen, diagnostische Marker für verschiedene Infektionen zu finden und geeignete Vakzinen gegen die Infektionen zu entwickeln.

3.1.3.2 Aufdeckung von Biomarkern bei verschiedenen Erkrankungen Es besteht substanzielles Interesse an der Anwendung von Proteomikmethoden für die Identifizierung von Krankheitsmarkern. Das kann, wie soeben beschrieben, mit vergleichender Expressionsprofilierung geschehen, des Weiteren sind Ansätze zur Analyse von sezernierten Proteinen und zur direkten Proteinprofilierung von Seren („serum profiling“) von Interesse (Ludwig u. Weinstein 2005). Ostergaard et al. (1999) fanden mittels 2DE im Urin von Patienten mit Blasenzellkarzinom den Marker Psoriasin, der sich sehr gut zum Verfolgen des Krankheitsverlaufs eignet. Auch die bereits erwähnte SELDI-Technik (7 3.1.2.2) erfreut sich zunehmender Anwendung, um Biomarker

3.1

zu identifizieren. Dabei werden Sub-Sets von Proteinen aus biologischen Proben durch Chromatographie an Chipoberflächen immobilisiert und dann der MS-Analyse zugeführt. Auf diese Weise konnten unterschiedliche Peptidmuster von Krebspatienten und Gesunden gewonnen werden (Petricoin u. Liotta 2004). Ein weiterer sehr effektiver Ansatz zum Auffinden von Krebsmarkern ist die Identifizierung von Autoantikörpern gegen Tumorproteine in Patientenseren (Imafuku et al. 2004). So konnte eine Reihe von Markerantigenen dadurch aufgedeckt werden, daß Expressionsbibliotheken (Hanash 2003) oder Peptidbibliotheken (Mintz et al. 2003) mit Patientenseren durchmustert wurden. Verschiedene Proteomikmethoden werden zur Aufdeckung von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet (7 3.1.2.6). Mithilfe eines Y2H-Systems konnte z. B. ein Netzwerk von mehr als 180 Wechselwirkungen für Chorea Huntington erstellt werden (Goehler et al. 2004). Basierend auf den gewonnen Daten konnte ein potenzieller Modulator für die Pathogenese der Erkrankung gefunden werden. Ein unlängst beschriebenes Netzwerk von humanen Proteinwechselwirkungen (7 3.1.2.6) bezog bekannte Krankheitsproteine ein und wurde im Kontext beschriebener Signalwege analysiert (Stelzl et al. 2005). So konnten neue Wechselwirkungen von Krankheitsproteinen, die sich bestimmten Signalwegen zuordnen lassen, mit bisher uncharakterisierten Proteinen identifiziert werden. Damit ließen sich nunmehr auch diese theoretisch dem Signalweg zuordnen. Praktisch wurde die Zuordnung für zwei neue Wechselwirkungspartner von Axin-1, einem Protein des WntSignalwegs, bestätigt. Diese beiden neuen Wechselwirkungspartner, ANP32A und CRMP1, modulierten die Aktivität von Wnt in In-vitro-Experimenten und spielen damit sehr wahrscheinlich auch in vivo eine Rolle in diesem Signalweg. Dieser Ansatz, Y2H-Daten bioinformatisch mit bekannten Signalwegen zu verknüpfen, ist sehr vielversprechend und eröffnet neue Möglichkeiten für die Markersuche.

3.1.3.3 Proteomik und Medikamentenentwicklung Zurzeit ist die pharmazeutische Industrie sehr daran interessiert, moderne Proteomiktechnologien in ihre Programme zu integrieren, um damit die Erforschung von Zielmolekülen und Kandidatensubstanzen für Medikamente zu beschleunigen (Calvo et al. 2005; Ilag 2005). Zahlreiche Studien zeigen die Anwendung funktioneller Proteomik zur Identifizierung von potenziellen Medikamenten-Targets in spezifischen Signalwegen. Lewis et al. entdeckten Proteine, die durch die Signalkaskade der mitogenaktivierten Proteinkinase-Kinase (MKK)/

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Sektion 3 · Diagnostik

ERK reguliert werden (Lewis et al. 2000). 45 Targets wurden identifiziert, von denen zuvor nur 5 als MKK/ERKEffektoren bekannt waren. In einem anderen Projekt wurden verschiedene Proteasen identifiziert, die möglicherweise als Zielmoleküle geeignet sind. Dabei wurden Biopsien von Patienten mit Kolonkarzinom in Mikrotiterplatten hinsichtlich verschiedener Proteaseaktivitäten untersucht, wobei in den Tumorbiopsien erhöhte Werte bestimmter Metallproteasen gefunden wurden (McKerrow et al. 2000). Viele Studien, die im Rahmen von Medikamentenentwicklungen durchgeführt werden, konzentrieren sich auf zelluläre, nukleäre oder membranassoziierte Rezeptoren, weil diese die häufigsten Targets für Medikamente darstellen. Diese Rezeptoren können in Signalwege, Zellwachstum, Genexpression und metabolische Veränderungen involviert sein. Neben Transkriptionsfaktoren und nukleären Rezeptoren sind die sogenannten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) von besonderem Interesse, weil sie die größte Familie von Rezeptoren und die größte Klasse von Zielmolekülen im menschlichen Genom darstellen (Neumann et al. 2002). Sie vermitteln den Hauptteil der zellulären Antworten auf Hormone, Neurotransmitter, Nahrungsmittel und andere bioaktive Substanzen. Aus diesen Gründen konzentrieren sich viele Proteomikstudien auf GPCRs (Thomsen et al. 2005). So publizierten Neumann et al. eine einfache Methode, um funktionelle GPCRs, die zuvor mit Detergenzien solubilisiert wurden, auf Mikroarrays zu immobilisieren (Neumann et al. 2002). In einer anderen PMAStudie wurde das Bindungsverhalten von GPCRs analysiert, indem die Bindung von Neurotensin an verschiedene GPCRs untersucht wurde (Fang et al. 2003). Weitere Möglichkeiten zum Auffinden von pharmakologisch wirksamen Substanzen können sich aus Strukturanalysen ergeben („structure-based drug design“). Zum Auffinden von Substanzen können Substanzbibliotheken gescreent werden. In einem iterativen Prozess kann die Struktur bindender Substanzen dahingehend optimiert werden, dass die Substanz exakt in die Bindungsstelle des Proteins passt, was entscheidend für die Inhibition der Funktion des Proteins ist.

3.1.4 Ausblick Die Proteomik stellt uns ein breites Spektrum nützlicher Methoden zur Verfügung, um Proteinfunktionen in hohem Durchsatz zu untersuchen. Eine zukunftsweisende Technologie sind Proteom-Chips, die alle Proteine eines Organismus im Mikroarray-Format für verschiedenste funktionelle Analysen zur Verfügung stellen (Kung u. Snyder 2006). Des Weiteren wird die MS-Analyse von aufgetrennten Proteinen zu einem besseren Verständnis

funktioneller Komplexe und ihrer Veränderungen im physiologischen Kontext führen. Wir postulieren, dass sich die Proteomforschung in der Zukunft neben der Expressionsanalyse durch 2DE mehr und mehr auf sensitivere Techniken, wie z. B. verschiedene Protein-Array-Technologien konzentrieren wird. Diese Techniken erlauben eine schnelle und zuverlässige Quantifizierung kleiner Mengen von Proteinen in Geweben Gesunder und Kranker. Wir nehmen an, dass sowohl systematische als auch hypothesengesteuerte Studien zu ProteinProtein-Wechselwirkungen, Koimmunopräzipitationen und Kolokalisationen eine zentrale Rolle in der Proteomikforschung der nächsten 10 Jahre spielen werden. Die Entwicklung von Hypothesen für diese Untersuchungen und die umfangreichen Daten, die in solchen Studien generiert werden, stellen eine große Herausforderung für die Bioinformatik dar. Aus diesen Studien werden umfassende neue Informationen zu Signalübertragungswegen und zu funktionellen Proteinkomplexen gewonnen werden, die einen großen Gewinn für die biomedizinische Forschung mit sich bringen werden. Da es in absehbarer Zeit Volle-Länge-cDNAs für alle humanen Proteine geben wird, werden sich die proteomischen Studien der nächsten Jahre auf das humane Proteom konzentrieren. Das Verständnis komplexer physiologischer Prozesse in einer Zelle wird wichtige Informationen und Impulse für die Systembiologie liefern, die neue Hypothesen sowohl mit traditionellen genomischen und proteomischen Methoden als auch mit bioinformatischen Ansätzen testen kann.

3.1.5 Literatur Anderson NG, Anderson NL (1996) Twenty years of two-dimensional electrophoresis: past, present and future. Electrophoresis 17: 443–53 Anderson NG, Matheson A, Anderson NL (2001) Back to the future: the human protein index (HPI) and the agenda for post-proteomic biology. Proteomics 1: 3–12 Arnott D, O‘Connell KL, King KL, Stults JT (1998) An integrated approach to proteome analysis: identification of proteins associated with cardiac hypertrophy. Anal Biochem 258: 1–18 Barabino SM, Sproat BS, Ryder U, Blencowe BJ, Lamond AI (1989) Mapping U2 snRNP-pre-mRNA interactions using biotinylated oligonucleotides made of 2‘-OMe RNA. Embo J 8: 4171–8 Berndt P, Hobohm U, Langen H (1999) Reliable automatic protein identification from matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric peptide fingerprints. Electrophoresis 20: 3521–6 Bini L, Magi B, Marzocchi B, Arcuri F, Tripodi S, Cintorino M, Sanchez JC, Frutiger S, Hughes G, Pallini V, Hochstrasser DF, Tosi P (1997) Protein expression profiles in human breast ductal carcinoma and histologically normal tissue. Electrophoresis 18: 2832–41 Bomar JM, Benke PJ, Slattery EL, Puttagunta R, Taylor LP, Seong E, Nystuen A, Chen W, Albin RL, Patel PD, Kittles RA, Sheffield VC, Burmeister M (2003) Mutations in a novel gene encoding a CRAL-TRIO domain cause human Cayman ataxia and ataxia/ dystonia in the jittery mouse. Nature Genetics 35: 264–9

309 3.1 · Klinische Proteomik Bouwmeester T, Bauch A, Ruffner H, Angrand PO, Bergamini G, Croughton K, Cruciat C, Eberhard D, Gagneur J, Ghidelli S, Hopf C, Huhse B, Mangano R, Michon AM, Schirle M, Schlegl J, Schwab M, Stein MA, Bauer A, Casari G, Drewes G, Gavin AC, Jackson DB, Joberty G, Neubauer G, Rick J, Kuster B, SupertiFurga G (2004) A physical and functional map of the human TNF-alpha/NF-kappa B signal transduction pathway. Nature Cell Biology 6: 97–105 Bussow K, Nordhoff E, Lubbert C, Lehrach H, Walter G (2000) A human cDNA library for high-throughput protein expression screening. Genomics 65: 1–8 Bussow K, Quedenau C, Sievert V, Tischer J, Scheich C, Seitz H, Hieke B, Niesen FH, Gotz F, Harttig U, Lehrach H (2004) A catalog of human cDNA expression clones and its application to structural genomics. Genome Biol 5: R71 Bussow K, Scheich C, Sievert V, Harttig U, Schultz J, Simon B, Bork P, Lehrach H, Heinemann U (2005) Structural genomics of human proteins--target selection and generation of a public catalogue of expression clones. Microb Cell Fact 4: 21 Calvo KR, Liotta LA, Petricoin EF (2005) Clinical proteomics: from biomarker discovery and cell signaling profiles to individualized personal therapy. Biosci Rep 25: 107–25 Ding DQ, Tomita Y, Yamamoto A, Chikashige Y, Haraguchi T, Hiraoka Y (2000) Large-scale screening of intracellular protein localization in living fission yeast cells by the use of a GFP-fusion genomic DNA library. Genes Cells 5: 169–90 Fang Y, Lahiri J, Picard L (2003) G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery. Drug Discov Today 8: 755–61 Feilner T, Hultschig C, Lee J, Meyer S, Immink RG, Koenig A, Possling A, Seitz H, Beveridge A, Scheel D, Cahill DJ, Lehrach H, Kreutzberger J, Kersten B (2005) High throughput identification of potential Arabidopsis mitogen-activated protein kinases substrates. Molecular and Cellular Proteomics 4: 1558–68 Feilner T, Kreutzberger J, Niemann B, Kramer A, Possling A, Seitz H, Kersten B (2004) Proteomic studies using microarrays. Current Proteomics 1: 283–295 Fenn JB, Mann M, Meng CK, Wong SF, Whitehouse CM (1989) Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science 246: 64–71 Fields S, Song O (1989) A novel genetic system to detect proteinprotein interactions. Nature 340: 245–6 Gagnon E, Duclos S, Rondeau C, Chevet E, Cameron PH, SteeleMortimer O, Paiement J, Bergeron JJ, Desjardins M (2002) Endoplasmic reticulum-mediated phagocytosis is a mechanism of entry into macrophages. Cell 110: 119–31 Gavin AC, Bosche M, Krause R, Grandi P, Marzioch M, Bauer A, Schultz J, Rick JM, Michon AM, Cruciat CM, Remor M, Hofert C, Schelder M, Brajenovic M, Ruffner H, Merino A, Klein K, Hudak M, Dickson D, Rudi T, Gnau V, Bauch A, Bastuck S, Huhse B, Leutwein C, Heurtier MA, Copley RR, Edelmann A, Querfurth E, Rybin V, Drewes G, Raida M, Bouwmeester T, Bork P, Seraphin B, Kuster B, Neubauer G, Superti-Furga G (2002) Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature 415: 141–7 Giot L, Bader JS, Brouwer C, Chaudhuri A, Kuang B, Li Y, Hao YL, Ooi CE, Godwin B, Vitols E, Vijayadamodar G, Pochart P, Machineni H, Welsh M, Kong Y, Zerhusen B, Malcolm R, Varrone Z, Collis A, Minto M, Burgess S, McDaniel L, Stimpson E, Spriggs F, Williams J, Neurath K, Ioime N, Agee M, Voss E, Furtak K, Renzulli R, Aanensen N, Carrolla S, Bickelhaupt E, Lazovatsky Y, DaSilva A, Zhong J, Stanyon CA, Finley RL, Jr., White KP, Braverman M, Jarvie T, Gold S, Leach M, Knight J, Shimkets RA, McKenna MP, Chant J, Rothberg JM (2003) A protein interaction map of Drosophila melanogaster. Science 302: 1727–36

3.1

Goehler H, Lalowski M, Stelzl U, Waelter S, Stroedicke M, Worm U, Droege A, Lindenberg KS, Knoblich M, Haenig C, Herbst M, Suopanki J, Scherzinger E, Abraham C, Bauer B, Hasenbank R, Fritzsche A, Ludewig AH, Buessow K, Coleman SH, Gutekunst CA, Landwehrmeyer BG, Lehrach H, Wanker EE (2004) A Protein Interaction Network Links GIT1, an Enhancer of Huntingtin Aggregation, to Huntington‘s Disease. Mol Cell 15: 853–65 Gonczy P, Echeverri C, Oegema K, Coulson A, Jones SJ, Copley RR, Duperon J, Oegema J, Brehm M, Cassin E, Hannak E, Kirkham M, Pichler S, Flohrs K, Goessen A, Leidel S, Alleaume AM, Martin C, Ozlu N, Bork P, Hyman AA (2000) Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature 408: 331–6 Grelle G, Kostka S, Otto A, Kersten B, Genser KF, Muller EC, Walter S, Boddrich A, Stelzl U, Hanig C, Volkmer-Engert R, Landgraf C, Alberti S, Hohfeld J, Strodicke M, Wanker EE (2006) Identification of VCP/p97, Carboxyl Terminus of Hsp70-interacting Protein (CHIP), and Amphiphysin II Interaction Partners Using Membrane-based Human Proteome Arrays. Molecular and Cellular Proteomics 5: 234–44 Gygi SP, Rist B, Gerber SA, Turecek F, Gelb MH, Aebersold R (1999a) Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotechnol 17: 994–9 Gygi SP, Rochon Y, Franza BR, Aebersold R (1999b) Correlation between protein and mRNA abundance in yeast. Mol Cell Biol 19: 1720–30 Hanash S (2003) Disease proteomics. Nature 422: 226–32 Hanash SM, Madoz-Gurpide J, Misek DE (2002) Identification of novel targets for cancer therapy using expression proteomics. Leukemia 16: 478–85 Harwanegg C, Hiller R (2005) Protein microarrays for the diagnosis of allergic diseases: state-of-the-art and future development. Clin Chem Lab Med 43: 1321–6 Henzel WJ, Billeci TM, Stults JT, Wong SC, Grimley C, Watanabe C (1993) Identifying proteins from two-dimensional gels by molecular mass searching of peptide fragments in protein sequence databases. Proc Natl Acad Sci U S A 90: 5011–5 Hufton SE, Moerkerk PT, Meulemans EV, de Bruine A, Arends JW, Hoogenboom HR (1999) Phage display of cDNA repertoires: the pVI display system and its applications for the selection of immunogenic ligands. J Immunol Methods 231: 39–51 Hultschig C, Kreutzberger J, Seitz H, Konthur Z, Bussow K, Lehrach H (2006) Recent advances of protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology 10: 4–10 Ilag LL (2005) Functional proteomic screens in therapeutic protein drug discovery. Curr Opin Mol Ther 7: 538–42 Imafuku Y, Omenn GS, Hanash S (2004) Proteomics approaches to identify tumor antigen directed autoantibodies as cancer biomarkers. Dis Markers 20: 149–53 Kersten B, Possling A, Blaesing F, Mirgorodskaya E, Gobom J, Seitz H (2004) Protein microarray technology and ultraviolet crosslinking combined with mass spectrometry for the analysis of protein-DNA interactions. Analytical Biochemistry 331: 303– 313 Kersten B, Wanker EE, Hoheisel J, Angenendt P (2005) Multiplex approaches in protein microarray technology. Expert Review of Proteomics 2: 499–510 Klose J, Kobalz U (1995) Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis 16: 1034–59 Knezevic V, Leethanakul C, Bichsel VE, Worth JM, Prabhu VV, Gutkind JS, Liotta LA, Munson PJ, Petricoin EF, 3rd, Krizman DB (2001) Proteomic profiling of the cancer microenvironment by antibody arrays. Proteomics 1: 1271–8

310

Sektion 3 · Diagnostik

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311 3.1 · Klinische Proteomik Robinson WH, DiGennaro C, Hueber W, Haab BB, Kamachi M, Dean EJ, Fournel S, Fong D, Genovese MC, de Vegvar HE, Skriner K, Hirschberg DL, Morris RI, Muller S, Pruijn GJ, van Venrooij WJ, Smolen JS, Brown PO, Steinman L, Utz PJ (2002) Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses. Nature Medicine 8: 295–301 Rual JF, Venkatesan K, Hao T, Hirozane-Kishikawa T, Dricot A, Li N, Berriz GF, Gibbons FD, Dreze M, Ayivi-Guedehoussou N, Klitgord N, Simon C, Boxem M, Milstein S, Rosenberg J, Goldberg DS, Zhang LV, Wong SL, Franklin G, Li S, Albala JS, Lim J, Fraughton C, Llamosas E, Cevik S, Bex C, Lamesch P, Sikorski RS, Vandenhaute J, Zoghbi HY, Smolyar A, Bosak S, Sequerra R, Doucette-Stamm L, Cusick ME, Hill DE, Roth FP, Vidal M (2005) Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature 437: 1173–1178 Sali A, Glaeser R, Earnest T, Baumeister W (2003) From words to literature in structural proteomics. Nature 422: 216–25 Schindewolf C, Lobenwein K, Trinczek K, Gomolka M, Soewarto D, Fella C, Pargent W, Singh N, Jung T, Hrabe de Angelis M (2000) Comet assay as a tool to screen for mouse models with inherited radiation sensitivity. Mamm Genome 11: 552–4 Schweitzer B, Roberts S, Grimwade B, Shao W, Wang M, Fu Q, Shu Q, Laroche I, Zhou Z, Tchernev VT, Christiansen J, Velleca M, Kingsmore SF (2002) Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification. Nature Biotechnology 20: 359–65 Sheehan KM, Calvert VS, Kay EW, Lu Y, Fishman D, Espina V, Aquino J, Speer R, Araujo R, Mills GB, Liotta LA, Petricoin EF, 3rd, Wulfkuhle JD (2005) Use of reverse phase protein microarrays and reference standard development for molecular network analysis of metastatic ovarian carcinoma. Molecular and Cellular Proteomics 4: 346–55 Shevchenko A, Loboda A, Ens W, Standing KG (2000) MALDI quadrupole time-of-flight mass spectrometry: a powerful tool for proteomic research. Anal Chem 72: 2132–41 Simpson JC, Wellenreuther R, Poustka A, Pepperkok R, Wiemann S (2000) Systematic subcellular localization of novel proteins identified by large-scale cDNA sequencing. EMBO Rep 1: 287– 92 Sreekumar A, Nyati MK, Varambally S, Barrette TR, Ghosh D, Lawrence TS, Chinnaiyan AM (2001) Profiling of cancer cells using protein microarrays: discovery of novel radiation-regulated proteins. Cancer Res 61: 7585–93 Stelzl U, Worm U, Lalowski M, Haenig C, Brembeck FH, Goehler H, Stroedicke M, Zenkner M, Schoenherr A, Koeppen S, Timm J, Mintzlaff S, Abraham C, Bock N, Kietzmann S, Goedde A, Toksöz E, Droege A, Krobitsch S, Korn B, Birchmeier W, Lehrach H, Wanker EE (2005) A human protein-protein interaction network: A resource for annotating the proteome. Cell 122: 957– 968 Tang N, Tornatore P, Weinberger SR (2004) Current developments in SELDI affinity technology. Mass Spectrom Rev 23: 34–44 Thomsen W, Frazer J, Unett D (2005) Functional assays for screening GPCR targets. Curr Opin Biotechnol 16: 655–65 Uetz P, Giot L, Cagney G, Mansfield TA, Judson RS, Knight JR, Lockshon D, Narayan V, Srinivasan M, Pochart P, Qureshi-Emili A, Li Y, Godwin B, Conover D, Kalbfleisch T, Vijayadamodar G, Yang M, Johnston M, Fields S, Rothberg JM (2000) A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae.[comment]. Nature 403: 623–7 Unlu M, Morgan ME, Minden JS (1997) Difference gel electrophoresis: a single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis 18: 2071–7

3.1

Venter JC, Adams MD, Myers EW, Li PW, Mural RJ, Sutton GG, Smith HO, Yandell M, Evans CA, Holt RA, Gocayne JD, Amanatides P, Ballew RM, Huson DH, Wortman JR, Zhang Q, Kodira CD, Zheng XH, Chen L, Skupski M, Subramanian G, Thomas PD, Zhang J, Gabor Miklos GL, Nelson C, Broder S, Clark AG, Nadeau J, McKusick VA, Zinder N, Levine AJ, Roberts RJ, Simon M, Slayman C, Hunkapiller M, Bolanos R, Delcher A, Dew I, Fasulo D, Flanigan M, Florea L, Halpern A, Hannenhalli S, Kravitz S, Levy S, Mobarry C, Reinert K, Remington K, Abu-Threideh J, Beasley E, Biddick K, Bonazzi V, Brandon R, Cargill M, Chandramouliswaran I, Charlab R, Chaturvedi K, Deng Z, Di Francesco V, Dunn P, Eilbeck K, Evangelista C, Gabrielian AE, Gan W, Ge W, Gong F, Gu Z, Guan P, Heiman TJ, Higgins ME, Ji RR, Ke Z, Ketchum KA, Lai Z, Lei Y, Li Z, Li J, Liang Y, Lin X, Lu F, Merkulov GV, Milshina N, Moore HM, Naik AK, Narayan VA, Neelam B, Nusskern D, Rusch DB, Salzberg S, Shao W, Shue B, Sun J, Wang Z, Wang A, Wang X, Wang J, Wei M, Wides R, Xiao C, Yan C, et al. (2001) The sequence of the human genome. Science 291: 1304–51 Vitzthum F, Behrens F, Anderson NL, Shaw JH (2005) Proteomics: from basic research to diagnostic application. A review of requirements & needs. Journal of Proteome Research 4: 1086–97 Waelter S, Scherzinger E, Hasenbank R, Nordhoff E, Lurz R, Goehler H, Gauss C, Sathasivam K, Bates GP, Lehrach H, Wanker EE (2001) The huntingtin interacting protein HIP1 is a clathrin and alphaadaptin-binding protein involved in receptor-mediated endocytosis. Hum Mol Genet 10: 1807–17 Wen YD, Cress WD, Roy AL, Seto E (2003) Histone deacetylase 3 binds to and regulates the multifunctional transcription factor TFII-I. J Biol Chem 278: 1841–7 Wilkins MR, Sanchez JC, Gooley AA, Appel RD, Humphery-Smith I, Hochstrasser DF, Williams KL (1996) Progress with proteome projects: why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it. Biotechnol Genet Eng Rev 13: 19– 50 Winter G, Griffiths AD, Hawkins RE, Hoogenboom HR (1994) Making antibodies by phage display technology. Annu Rev Immunol 12: 433–55 Witke W, Podtelejnikov AV, Di Nardo A, Sutherland JD, Gurniak CB, Dotti C, Mann M (1998) In mouse brain profilin I and profilin II associate with regulators of the endocytic pathway and actin assembly. Embo J 17: 967–76 Zhou G, Li H, DeCamp D, Chen S, Shu H, Gong Y, Flaig M, Gillespie JW, Hu N, Taylor PR, Emmert-Buck MR, Liotta LA, Petricoin EF, 3rd, Zhao Y (2002) 2D differential in-gel electrophoresis for the identification of esophageal scans cell cancer-specific protein markers. Mol Cell Proteomics 1: 117–24 Zhu H, Bilgin M, Bangham R, Hall D, Casamayor A, Bertone P, Lan N, Jansen R, Bidlingmaier S, Houfek T, Mitchell T, Miller P, Dean RA, Gerstein M, Snyder M (2001) Global analysis of protein activities using proteome chips. Science 293: 2101–5 Zhu H, Klemic JF, Chang S, Bertone P, Casamayor A, Klemic KG, Smith D, Gerstein M, Reed MA, Snyder M (2000) Analysis of yeast protein kinases using protein chips. Nature Genetics 26: 283–289 Zhu H, Snyder M (2003) Protein chip technology. Current Opinion in Chemical Biology 7: 55–63 Zozulya S, Lioubin M, Hill RJ, Abram C, Gishizky ML (1999) Mapping signal transduction pathways by phage display. Nat Biotechnol 17: 1193–8

312

Sektion 3 · Diagnostik

3.1.6 Zeittafel 1975

Entwicklung der 2DE-Technologie, Beginn der Katalogisierung von Mustern exprimierter Proteine (Klose 1975; O’Farrell 1975)

1989

Entwicklung des Hefe-2-Hybrid-Systems zur systematischen Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen (Fields u. Song 1989)

1993

Entwicklung der hochsensitiven Massenspektroskopie und des Peptidmassen-Fingerabdrucks, MALDI-TOF („matrix-assisted laser desorption/ionisation – time over flight“) (Henzel et al. 1993)

1993

Entwicklung der MS-basierten Peptidsequenzierung mittels Peptidfragmentierung (Fenn 1993); Peptide werden mittels ESI (Elektrospray,„electrospray ionisation“) direkt von der flüssigen Phase ionisiert.

1996

Einführung des Proteom-Begriffs durch Mark Wilkins (Wilkins et al. 1996)

1996

Einführung des Proteomik-Begriffs (Anderson u. Anderson 1996); dieser Begriff wurde ursprünglich benutzt, um die Auftrennung von Proteinen aus komplexen Gewebs- oder Zellextrakten mittels 2DE zu beschreiben.

1997

Entwicklung der differenziellen Gelelektrophorese („difference gel electrophoresis“, DIGE) zur vergleichenden Untersuchung von Proteinextrakten zweier Zustände in einem 2D-Gel (Unlu et al. 1997)

1999

Einführung der multidimensionalen Protein-Identifikationstechnologie („multidimensional protein identification technology“) (Link et al. 1999)

2001

Sequenzierung des humanen Genoms (Lander et al. 2001; Venter et al. 2001)

2001

Design des ersten Hefe-Proteom-Mikroarrays für die Analyse von Protein-Protein- und Protein-Lipid-Wechselwirkungen (Zhu et al. 2001)

2004

Entwicklung einer Methode zur Herstellung von Protein-Mikroarrays durch In-vitro-Expression der Proteine auf dem Mikroarray (Ramachandran et al. 2004)

2004

Entwicklung und Anwendung reverser Protein-Mikroarrays zur quantitativen Erfassung von Proteinmodifikationen im Rahmen von Signalübertragungsketten (Chan et al. 2004)

2005

Erste Hochdurchsatzanalysen von In-vitro-Proteinphosphorylierungen mit Protein-Mikroarrays zum Auffinden neuer Kinasesubstrate (Feilner et al. 2005; Ptacek et al. 2005)

2005

Erstellung der ersten humanen Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke (Rual et al. 2005; Stelzl et al. 2005)

Literatur zur Zeittafel Anderson NG, Anderson NL (1996) Twenty years of two-dimensional electrophoresis: past, present and future. Electrophoresis 17: 443–53 Chan SM, Ermann J, Su L, Fathman CG, Utz PJ (2004) Protein microarrays for multiplex analysis of signal transduction pathways. Nat. Med. 10: 1390–6 Feilner T, Hultschig C, Lee J, Meyer S, Immink RG, Koenig A, Possling A, Seitz H, Beveridge A, Scheel D, Cahill DJ, Lehrach H, Kreutzberger J, Kersten B (2005) High throughput identification of potential Arabidopsis mitogen-activated protein kinases substrates. Molecular and Cellular Proteomics 4: 1558–68 Fenn JB (1993) Ion formation from charged droplets: Roles of geometry, energy, and time. Am Soc Mass Spectrom 4: 524– 35 Fields S, Song O (1989) A novel genetic system to detect proteinprotein interactions. Nature 340: 245–6 Henzel WJ, Billeci TM, Stults JT, Wong SC, Grimley C, Watanabe C (1993) Identifying proteins from two-dimensional gels by molecular mass searching of peptide fragments in protein sequence databases. Proc Natl Acad Sci U S A 90: 5011–5

Klose J (1975) Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik 26: 231–43 Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC, Baldwin J, Devon K, Dewar K, Doyle M, FitzHugh W, Funke R, Gage D, Harris K, Heaford A, Howland J, Kann L, Lehoczky J, LeVine R, McEwan P, McKernan K, Meldrim J, Mesirov JP, Miranda C, Morris W, Naylor J, Raymond C, Rosetti M, Santos R, Sheridan A, Sougnez C, Stange-Thomann N, Stojanovic N, Subramanian A, Wyman D, Rogers J, Sulston J, Ainscough R, Beck S, Bentley D, Burton J, Clee C, Carter N, Coulson A, Deadman R, Deloukas P, Dunham A, Dunham I, Durbin R, French L, Grafham D, Gregory S, Hubbard T, Humphray S, Hunt A, Jones M, Lloyd C, McMurray A, Matthews L, Mercer S, Milne S, Mullikin JC, Mungall A, Plumb R, Ross M, Shownkeen R, Sims S, Waterston RH, Wilson RK, Hillier LW, McPherson JD, Marra MA, Mardis ER, Fulton LA, Chinwalla AT, Pepin KH, Gish WR, Chissoe SL, Wendl MC, Delehaunty KD, Miner TL, Delehaunty A, Kramer JB, Cook LL, Fulton RS, Johnson DL, Minx PJ, Clifton SW, HawkinsT, Branscomb E, Predki P, Richardson P, Wenning S, Slezak T, Doggett N, Cheng JF, Olsen A, Lucas S, Elkin C, Uberbacher E, Frazier M, et al. (2001) Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409: 860–921.

313 3.1 · Klinische Proteomik Link AJ, Eng J, Schieltz DM, Carmack E, Mize GJ, Morris DR, Garvik BM, Yates JR, 3rd (1999) Direct analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat Biotechnol 17: 676–82 O‘Farrell PH (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem 250: 4007–21 Ptacek J, Devgan G, Michaud G, Zhu H, Zhu X, Fasolo J, Guo H, Jona G, Breitkreutz A, Sopko R, McCartney RR, Schmidt MC, Rachidi N, Lee SJ, Mah AS, Meng L, Stark MJ, Stern DF, De Virgilio C, Tyers M, Andrews B, Gerstein M, Schweitzer B, Predki PF, Snyder M (2005) Global analysis of protein phosphorylation in yeast. Nature 438: 679–84 Ramachandran N, Hainsworth E, Bhullar B, Eisenstein S, Rosen B, Lau AY, Walter JC, LaBaer J (2004) Self-assembling protein microarrays. Science 305: 86–90 Rual JF, Venkatesan K, Hao T, Hirozane-Kishikawa T, Dricot A, Li N, Berriz GF, Gibbons FD, Dreze M, Ayivi-Guedehoussou N, Klitgord N, Simon C, Boxem M, Milstein S, Rosenberg J, Goldberg DS, Zhang LV, Wong SL, Franklin G, Li S, Albala JS, Lim J, Fraughton C, Llamosas E, Cevik S, Bex C, Lamesch P, Sikorski RS, Vandenhaute J, Zoghbi HY, Smolyar A, Bosak S, Sequerra R, Doucette-Stamm L, Cusick ME, Hill DE, Roth FP, Vidal M (2005) Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature 437: 1173–1178 Stelzl U, Worm U, Lalowski M, Haenig C, Brembeck FH, Goehler H, Stroedicke M, Zenkner M, Schoenherr A, Koeppen S, Timm J, Mintzlaff S, Abraham C, Bock N, Kietzmann S, Goedde A, Toksöz E, Droege A, Krobitsch S, Korn B, Birchmeier W, Lehrach H, Wanker EE (2005) A human protein-protein interaction network: A resource for annotating the proteome. Cell 122: 957– 968

3.1

Unlu M, Morgan ME, Minden JS (1997) Difference gel electrophoresis: a single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis 18: 2071–7 Venter JC, Adams MD, Myers EW, Li PW, Mural RJ, Sutton GG, Smith HO, Yandell M, Evans CA, Holt RA, Gocayne JD, Amanatides P, Ballew RM, Huson DH, Wortman JR, Zhang Q, Kodira CD, Zheng XH, Chen L, Skupski M, Subramanian G, Thomas PD, Zhang J, Gabor Miklos GL, Nelson C, Broder S, Clark AG, Nadeau J, McKusick VA, Zinder N, Levine AJ, Roberts RJ, Simon M, Slayman C, Hunkapiller M, Bolanos R, Delcher A, Dew I, Fasulo D, Flanigan M, Florea L, Halpern A, Hannenhalli S, Kravitz S, Levy S, Mobarry C, Reinert K, Remington K, Abu-Threideh J, Beasley E, Biddick K, Bonazzi V, Brandon R, Cargill M, Chandramouliswaran I, Charlab R, Chaturvedi K, Deng Z, Di Francesco V, Dunn P, Eilbeck K, Evangelista C, Gabrielian AE, Gan W, Ge W, Gong F, Gu Z, Guan P, Heiman TJ, Higgins ME, Ji RR, Ke Z, Ketchum KA, Lai Z, Lei Y, Li Z, Li J, Liang Y, Lin X, Lu F, Merkulov GV, Milshina N, Moore HM, Naik AK, Narayan VA, Neelam B, Nusskern D, Rusch DB, Salzberg S, Shao W, Shue B, Sun J, Wang Z, Wang A, Wang X, Wang J, Wei M, Wides R, Xiao C, Yan C, et al. (2001) The sequence of the human genome. Science 291: 1304–51 Wilkins MR, Sanchez JC, Gooley AA, Appel RD, Humphery-Smith I, Hochstrasser DF, Williams KL (1996) Progress with proteome projects: why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it. Biotechnol Genet Eng Rev 13: 19– 50 Zhu H, Bilgin M, Bangham R, Hall D, Casamayor A, Bertone P, Lan N, Jansen R, Bidlingmaier S, Houfek T, Mitchell T, Miller P, Dean RA, Gerstein M, Snyder M (2001) Global analysis of protein activities using proteome chips. Science 293: 2101–5

3.2 Pharmakogenetik und Pharmakogenomik Ivar Roots, Gabriele Laschinski und Urs A. Meyer

3.2.1

Individualisierte Arzneitherapie – 315

3.2.2

Pharmakogenomik

3.2.2.1 3.2.2.2

Das Genom und seine Diversität – 316 Multifaktorielle und multigene Aspekte der Arzneimittelwirkung

3.2.3

Genvarianten arzneimittelmetabolisierender Enzyme, die zu Änderungen der Pharmakokinetik führen – 317

3.2.3.1 3.2.3.2 3.2.3.3 3.2.3.4 3.2.3.5 3.2.3.6

CYP2C19-abhängige Response auf Protonenpumpenhemmer – 319 Substrate von CYP2C9 – 319 Codein und Morphin – 320 Cyclophosphamid und Tamoxifen – 321 Östrogenmetabolismus über CYP1A1-Varianten – 322 Genotyp-basiertes Versagen einer antiemetischen Therapie mit 5-Hydroxytryptamin-Typ-3-Rezeptor-Antagonisten – 323

3.2.4

Genetische Varianten von Arzneimitteltransportern – 324

3.2.5

Genotyp-basierte Dosisempfehlungen – 325

3.2.6

Ausblick auf künftige Implementierung der Pharmakogenetik bei der Krankenversorgung – 327

3.2.7

Literatur

– 328

3.2.8

Zeittafel

– 330

– 315 – 317

Literatur zur Zeittafel – 331

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

315 3.2 · Pharmakogenetik und Pharmakogenomik

3.2.1 Individualisierte Arzneitherapie Pharmakogenetik ist ein Teilgebiet der klinischen Pharmakologie. Es befasst sich mit genetischen Faktoren, die Einfluss auf erwünschte und unerwünschte Wirkungen von Arzneimitteln haben. Durch Berücksichtigung der pharmakogenetischen Eigenschaften eines Patienten bei der Auswahl und Dosierung von Arzneimitteln soll die Arzneitherapie wirksamer und zugleich sicherer werden. Dem Arzt wird damit kein neues Behandlungskonzept an die Hand gegeben, vielmehr hilft ihm die Pharmakogenetik, dem Ideal einer Arzneitherapie nach Maß näherzukommen. Dem Ziel einer individualisierten Therapie dient darüber hinaus auch die Berücksichtigung zahlreicher weiterer beim Patienten vorliegender Faktoren (> Abb. 3.2.1). Die Pharmakogenetik hat von den Fortschritten der molekularen Biologie in den späten 1990er Jahren profitiert, vor allem vom Humanen Genomprojekt. Pharmakogenetische Phänomene waren jedoch seit langem bekannt (Meyer 2004), so z. B. die hämolytische Anämie, unter der Menschen mit angeborenem Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenasemangel nach Einnahme bestimmter Lebensmittel und Medikamente leiden. Schon vor 50 Jahren wurde die Polyneuropathie bei Langsamacetylierern im Rahmen einer Behandlung mit Isoniazid entdeckt (Bönicke u. Lisboa 1957). In diese Reihe gehört auch die verlängerte Apnoe nach Gabe von Succinylcholin bei Trägern einer besonderen Cholinesterasevariante (Kalow 1956).

3.2

Heute kennt man eine Vielzahl von genetischen Varianten, die die Funktion von Rezeptoren und anderen Zielstrukturen für Arzneimittel in klinisch relevantem Ausmaß verändern. Es waren jedoch die arzneimittelabbauenden Enzyme, die zuerst als mögliche Ursache für die interindividuelle Variationsbreite bei der Reaktion auf einzelne Wirkstoffe erkannt wurden und die demzufolge bisher auch am besten untersucht sind. Nahezu alle wichtigen Enzyme im Arzneimittelstoffwechsel weisen genetische Variationen auf. Die Folgen, die sich daraus für die Enzymaktivität ergeben, können von einer kaum messbaren Erniedrigung bis zur völligen Defizienz reichen; in wenigen Fällen, wie bei den sog. ultraschnellen Metabolisierern bezüglich Cytochrom P450-2D6 (CYP2D6), kann es aber auch zu einer stark erhöhten Enzymaktivität kommen. Diese Unterschiede in der Aktivität sind bei heterozygoten Merkmalsträgern im Sinne einer Gen-Dosis-Beziehung weniger ausgeprägt als bei homozygoten. Genetische Polymorphismen bei arzneimittelmetabolisierenden Enzymen und Arzneimitteltransportern wirken sich in erster Linie auf die Pharmakokinetik eines Wirkstoffs aus.

3.2.2 Pharmakogenomik Im Kontext der Sequenzierung des menschlichen Genoms ist der Begriff Pharmakogenomik entstanden. Pharmakogenomik bezieht sich auf die Auswirkungen der Gesamtheit der Gene – eben des Genoms – auf die

. Abb. 3.2.1. Ursachen für die individuelle Variabilität der Arzneimittelwirkung

316

Sektion 3 · Diagnostik

Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln und Organismus, d. h. auf die Entwicklung, Wirksamkeit und Toxizität von Arzneimitteln. Der Begriff Pharmakogenetik wurde bis jetzt viel enger als die Auswirkung der Variabilität einzelner Gene auf die Arzneimittelwirkung angewendet. Die Unterscheidung der Begriffe Pharmakogenetik und Pharmakogenomik ist aber letztlich arbiträr, und sie werden oft nebeneinander für die gleichen Inhalte verwendet.

3.2.2.1 Das Genom und seine Diversität Das Jahr 2001 wird in die Geschichte der Biologie und Medizin eingehen als das Jahr, in dem das menschliche Genom, über 90% der DNS-Sequenz von 3,2 Milliarden Basen, aufgeklärt und der Öffentlichkeit zugängig gemacht wurde (Venter et al. 2001, Int. Human Genome Sequencing Consortium 2001). Diese erste Sequenz hatte noch viele Lücken und Fehler und basierte auf der DNS nur weniger Individuen. In kurzer Zeit wurden die noch bestehenden Lücken aber geschlossen und seit Oktober 2004 liegt eine praktisch vollständige Genomsequenz vor (Int. Human Genome Sequencing Consortium 2004). Diese rasante Entwicklung wurde durch technische Fortschritte in der Sequenzierung und der Bioinformatik möglich. Die Aufklärung der Sequenz der insgesamt ca. 20.000 bis 25.000 menschlichen Gene, d. h. der funktionellen Abschnitte des Genoms, die Informationen für RNS und Proteine enthalten, ist allerdings nur der erste Schritt zum Verständnis, was uns Menschen von anderen Spezies und untereinander unterscheidet. Bereits jetzt spricht man von der „post-genome era“, der Nach-Genom-Zeit, in der wir verstehen lernen, in welcher Art einzelne Gene reguliert sind und Funktionen beeinflussen. Die Komplexität der Genexpression ist allerdings groß. Etwa 60% der aus der DNS-Sequenz des Genoms abgeleiteten Proteine können heute schon einer bestimmten funktionellen Gruppe, z. B. einer Rezeptorenfamilie, zugeteilt werden. Viele Gene können aber auf verschiedene Weise in Proteine umgesetzt werden, pro Gen entstehen durchschnittlich 3–4 verschiedene Boten-Ribonukleinsäuren und Proteine, dies führt zu zusätzlicher Diversität der Funktion von Proteinen. Dies und die große kombinatorische Vielfalt der Architektur vieler Proteine und Proteinkomplexe und deren funktionelle Veränderung durch weitere Prozesse (z. B. Phosphorylierung, Glykosylierung) lässt vermuten, dass die 20.000 bis 25.000 Gene ein menschliches Proteom von möglicherweise bis zu einer Million verschiedener Proteine erzeugen. Da es diese Proteine sind, die schlussendlich für Funktionen verantwortlich sind, ist die Proteomik von essenzieller Bedeutung, um die komplexen zellulären

Regulationen oder eben das Funktionieren von Zellen, Organen und Organismen zu verstehen. Ein weiter Weg liegt vor uns bis zu diesem Ziel. So hat man in den letzten Jahren neue Funktionen kleiner einsträngiger und doppelsträngiger RNS-Abschnitte in der Genregulation entdeckt, die die Translation von mRNS, die Stabilität von mRNS oder auf anderen Wegen die Genexpression verändern. Ein wichtiges Ziel des humanen Genomprojekts ist die Erfassung von DNS-Sequenzunterschieden zwischen Individuen und Populationen. Was macht uns Menschen verschieden voneinander, nicht nur in Bezug auf äußere Eigenschaften (Haare, Augenfarbe, Körpergröße, Intelligenz etc.), sondern auch auf das vererbte Risiko, eine bestimmte Krankheit zu entwickeln (z. B Krebs) oder eben auf Arzneimittel mit einer gefährlichen Nebenwirkung zu reagieren? Auch die Wirkungslosigkeit eines Arzneimittels kann vererbt sein: Die analgetische Wirkung von Codein fehlt bei langsamen Metabolisierern mit Mutationen des Cytochrom-P450-Enzyms CYP2D6 (siehe unten). Zwei nichtverwandte Menschen unterscheiden sich in ihrer Genomsequenz insgesamt nur durch ca. 3–10 Millionen Basen, d. h. nur durch etwa 0,1% der Sequenz; 99,9% der Sequenz sind damit bei allen Menschen identisch. Die häufigsten Sequenzunterschiede sind sog. „SNPs“ oder „single nucleotide polymorphisms“, d. h. Unterschiede in einzelnen Basenpaaren. Sie treten je nach Art der Sequenz alle 300 bis 3.000 Basen auf. Von einem Polymorphismus spricht man, wenn der Unterschied an dieser Stelle bei mindestens 1% der untersuchten Bevölkerung vorkommt. SNPs, die in noch größerer Häufigkeit vorkommen, z. B. bei 10–20% der Bevölkerung, können als genetische Marker ähnlich einem Fingerabdruck dienen, um die Beteiligung multipler Genvarianten an einem Krankheitsrisiko oder einer Prädisposition zu einer unerwünschten Arzneimittelwirkung zu erfassen (Evans u. Relling 1999; Roses 2000). Zurzeit werden von einem internationalen Konsortium SNPs in möglichst hoher Dichte bei größeren Populationen untersucht (http://snp.cshl.org), um möglichst alle SNPs zu erfassen. Obschon in der Praxis noch nicht eindeutig nachgewiesen, ist das Konzept glaubwürdig, dass SNPs als Marker für multigene Krankheiten und Arzneimittelantworten dienen können, d. h. ein komplexes Muster genetischer Marker weist auf die genetische Prädisposition zu einer Krankheit oder zu einer fehlenden oder zu starken Arzneimittelwirkung hin. In den letzten 2 Jahren wurden zusätzlich beträchtliche strukturelle Unterschiede beim Vergleich individueller Genomsequenzen entdeckt. Diese betreffen Unterschiede in der Zahl von Genkopien sowie größere Insertionen und Deletionen ganzer Sequenzsegmente. Deshalb ist die gesamte Sequenzvariation zwischen 2 Individuen wohl eher in der

317 3.2 · Pharmakogenetik und Pharmakogenomik

Größenordnung von 20–30.000.000 Basenpaaren oder ungefähr 1% des Genoms zu sehen (Khaja et al. 2006; Wong et al. 2007). Eine Gruppe von benachbarten SNPs auf dem gleichen Chromosom wird oft zusammen als sog. „Haplotypen-Block“ vererbt und vereinfacht die Genotypisierung, da in diesem Fall nur einige wenige SNPs repräsentativ sind für den Haplotyp (www.hapmap.org). Genetisch bedingte Ursachen für die Unterschiede zwischen weißen und afroamerikanischen Patienten in Bezug auf die Wirkung von Arzneimitteln zur Behandlung von Herzinsuffizienz (Wood 2001) könnten so erfasst werden. Falls ein SNP-Muster oder Haplotyp mit veränderter Arzneimittelwirkung einhergeht und sich diese SNPs in der kodierenden oder flankierenden Sequenz bekannter Gene befinden, können die Ursachen der Unterschiede als sog. Kandidatengene angegangen werden.

3.2.2.2 Multifaktorielle und multigene Aspekte der Arzneimittelwirkung Die genannten Beispiele genetischer Einflüsse auf die Arzneimittelwirkung sind vorwiegend Situationen, bei denen einzelne (z. B CYP2D6) oder mehrere Gene [z. B CYP2C9 und VKORC1 (Gen der Vitamin-K-Epoxid-Reduktase)] einen wichtigen Einfluss auf die Kinetik oder Dynamik eines bestimmten Arzneimittels ausüben. Interindividuelle Unterschiede in der Wirkung einer Arzneimitteltherapie entstehen aber viel häufiger durch komplexe Interaktionen zwischen Patienten-(host-) Faktoren, Umwelteinflüssen und genetischer Variabilität (> Abb. 3.2.1). So kann ca. 60–70% der Variation in der Dosis von Warfarin oder Acenocoumarol vorausgesagt werden, die eine definierte Wirkung auf die Gerinnung hat, wenn Patientenfakten wie Alter, Körpergewicht zusammen mit Ernährungsfakten (Vitamin K), anderen Arzneimitteln und den genetischen Polymorphismen von CYP2C9 und VKORC1 berücksichtigt werden (Takahashi et al. 2006; Rieder et al. 2005). Die große Herausforderung für die Zukunft ist die Erfassung dieser kombinierten Einflüsse und von multiplen Genvarianten, um die Arzneimittelwirkung bei einem individuellen Patienten vorauszusagen und die Wahl und Dosierung eines Arzneimittels entsprechend individuell anzupassen. Maßgeschneiderte Arzneimittel, individualisierte oder persönliche Medizin sind einige der Schlagworte, die in diese Zukunft weisen.

3.2

3.2.3 Genvarianten arzneimittelmetabolisierender Enzyme, die zu Änderungen der Pharmakokinetik führen Arzneimittel werden, wie andere Fremdstoffe (Xenobiotika) auch, über sog. Phase-I- und Phase-II-Reaktionen metabolisiert. Hierbei verlieren sie meist ihre pharmakodynamische Wirkung und werden hydrophiler, was ihre Elimination aus dem Körper erheblich erleichtert. Bei Phase-I-Reaktionen erfolgen häufig nur kleine Molekülmodifikationen, in erster Linie Oxidation oder Reduktion des Substrates. Für die Oxidation sind die Cytochrom-P450-Enzyme maßgebend. > Tabelle 3.2.1 zeigt, dass eine Vielzahl von Cytochrom-P450-Enzymen existiert, die sich durch Substratspezifität, Molekulargewicht, Induzierbarkeit und spezifische Hemmbarkeit unterscheiden. Die betreffenden Gene liegen meist auf unterschiedlichen Chromosomen. In der Bevölkerung findet man bei allen Cytochrom-P450-Enzymen genetisch bedingte Varianten, die zum Teil große Aktivitätsänderungen nach sich ziehen. Die Häufigkeit dieser Varianten variiert oft interethnisch ganz erheblich (> Tab. 3.2.1). Bei der sog. Phase II des Fremdstoffmetabolismus laufen synthetische Reaktionen ab. So kann ein Substrat z. B glukuronidiert, acetyliert oder mit einer Methylgruppe versehen werden. Wie > Tabelle 3.2.2 zeigt, sind auch diese Reaktionen genetisch variabel, mit teils erheblichen Auswirkungen auf die Pharmakokinetik und die daraus resultierende Wirksamkeit des betreffenden Medikamentes. Die bimodale Verteilung der ArylaminN-Acetyltransferase-Aktivität (NAT2) veranschaulicht deutlich, dass sich in einer Population phänotypisch zwei klar voneinander abgrenzbare Untergruppen befinden (> Abb. 3.2.2). Die Genotypisierung erlaubt eine weitere Aufgliederung in homozygote und heterozygote Merkmalsträger (Blum et al. 1991). Innerhalb der Langsamacetylierer lassen sich verschiedene Haplotypen differenzieren, die mit unterschiedlichen phänotypischen Aktivitäten assoziiert sind. Während in der weißen Bevölkerung der Langsamacetylierer knapp überwiegt, findet man bei den fernöstlichen Völkern ganz überwiegend den schnellen Acetylierertyp. Diese interethnischen Unterschiede haben auch Folgen für den durchschnittlichen Dosisbedarf solcher Medikamente, die maßgeblich über NAT2 verstoffwechselt werden. Unabhängig von der ethnischen Zugehörigkeit kann durch eine Bestimmung des Acetylierertyps ein Patient seine individuelle Dosis erhalten, die im therapeutischen Bereich liegt.

318

Sektion 3 · Diagnostik

. Tab. 3.2.1. Genetische Polymorphismen von Cytochrom-P450-Enzymen als wichtige Enzyme im oxidativen Arzneimittel- und Fremdstoff-Stoffwechsel und deren klinische Auswirkungen (Roots et al. 2004) Phase-I-Enzyme

Häufigkeit genetischer Varianten *

Betroffene Wirkstoffe (Beispiele)

CYP1A2

Europäer: 46% stark induzierbar

Coffein, Clozapin, Imipramin, Lidocain, Paracetamol, Theophyllin

CYP2A6

Europäer: 1% reduzierte Aktivität

Fadrazol, Losigamon, Halothan, Nikotin, Tegafur

CYP2B6

Europäer: ca. 2% reduzierte Aktivität

Bupropion, Propofol

CYP2C8

Europäer: ca. 1,7% reduzierte Aktivität

Carbamazepin, Cerivastatin, Paclitaxel, Pioglitazon, Rosiglitazon, Verapamil, Warfarin

CYP2C9

Europäer: 1–3% reduzierte Aktivität

Celecoxib, Clopidogrel, Diclofenac, Fluvastatin, Glibenclamid, Ibuprofen, Losartan, Nateglinid, Phenprocoumon, Phenytoin, Piroxicam, Sildenafil, Tolbutamid, Torasemid, Warfarin

CYP2C19

Europäer: 3% keine Aktivität Asiaten: 14–20% keine Aktivität

Cyclophosphamid, Diazepam, Lansoprazol, Omeprazol, Pantoprazol, Proguanil, Propranolol, Rabeprazol

CYP2D6

Europäer: 7% keine Aktivität Asiaten, Fernost: 1% keine Aktivität Europäer: 2–3% sehr hohe Aktivität Araber und Äthiopier: 5–25% sehr hohe Aktivität

Ajmalin, Amitriptylin, Carvedilol, Codein, Flecainid, Fluoxetin, Galanthamin, Haloperidol, Metoprolol, Mexiletin, Ondansetron, Propafenon, Propranolol, Tamoxifen, Timolol, Tropisetron

CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7

Mehrere Mutationen sind bekannt, einige davon sind selten und führen zu einer reduzierten Enzymaktivität; CYP3A7 wird bei einigen Erwachsenen exprimiert.

Cyclosporin A, Cortisol, Dapson, Diltiazem, Erythromycin, Lidocain, Midazolam, Nifedipin, Paclitaxel, Sildenafil, Simvastatin, Tacrolimus, Triazolam, Verapamil, Zolpidem

* Häufigkeit homozygoter Genotypen.

Langsamacetylierer Schnellacetylierer

. Abb. 3.2.2. Histogramm der Arylamin-N-Acetyltransferase-2-Aktivität, gemessen anhand des Verhältnisses der Coffeinmetaboliten 5-Acetylamino-6-formylamino-3-methyluracil (AFMU) und 1-Methylxanthin (1X). 795 gesunde Freiwillige und Patienten (alle deutscher Abstammung) erhielten entweder eine Tasse Kaffee oder 100 mg Coffein als Tablette. Der Urin wurde über 5 h gesammelt. Die genann-

ten beiden Metaboliten wurden mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) quantifiziert. Es ergibt sich eine bimodale Verteilung mit 45,3% phänotypischen Schnellacetylierern und 54,7% Langsamacetylierern. Diese Aufteilung wurde bei der Genotypisierung bestätigt. Es finden sich 5,7% diskrepanter Fälle (Cascorbi et al. 1999)

319 3.2 · Pharmakogenetik und Pharmakogenomik

3.2

. Tab. 3.2.2. Genetische Polymorphismen wichtiger Enzyme im Arzneimittel- und Fremdstoff-Stoffwechsel (Phase I und Phase II) und deren klinische Auswirkungen (Roots et al. 2004) Phase-I-Enzyme (außer CYP)

Häufigkeit genetischer Varianten *

Betroffene Wirkstoffe (Beispiele)

Flavinabhängige Monoxygenase 3

Europäer: 9% reduzierte Aktivität

Albendazol, Benzydamin, Perazin, Sulindac

Butyrylcholinesterase

Europäer: 0,03% keine Aktivität

Succinylcholin

Dihydropyrimidin-Dehydrogenase

Heterozygote: 1% reduzierte Aktivität

5-Fluoruracil

Arylamin-N-Acetyltransferase 2 (NAT2)

Europäer: 55% Langsamacetylierer Asiaten, Fernost: 17% Langsamacetylierer

Dapson, Isoniazid, Hydralazin, Procainamid, Sulfonamide

UDP-Glucuronosyltransferase 1A1

Europäer: 10,9% reduzierte Aktivität Asiaten: 1–4% reduzierte Aktivität

Irinotecan

Glutathion-S-Transferase GST M1

Europäer: 55% keine Aktivität

Erhöhtes Risiko für Blasenkrebs

Catechol-O-Methyltransferase

Europäer: 25% reduzierte Aktivität

Amphetamin, Östrogen, L-Dopa, α-Methyldopa

Thiopurin-S-Methyltransferase

Europäer: 0,3% keine Aktivität

Azathioprin, 6-Mercaptopurin

Phase-II-Enzyme

* Häufigkeit homozygoter Genotypen.

3.2.3.1 CYP2C19-abhängige Response auf Protonenpumpenhemmer Im Folgenden soll anhand einiger klinischer Beispiele die Bedeutung von Polymorphismen arzneimittelmetabolisierender Enzyme für die Therapie dargelegt werden. Ein gutes Beispiel für eine nach pharmakogenetischen Gesichtspunkten optimierte Therapie ist der Protonenpumpenhemmer Omeprazol. Der Wirkstoff wird zu etwa 80% über CYP2C19 metabolisiert (Rost u. Roots 1996). Menschen mit einer CYP2C19-Defizienz („poor metabolizer“, PM) verstoffwechseln Omeprazol über CYP3A4, jedoch wesentlich langsamer als Individuen mit normal hoher Enzymaktivität (extensiver Metabolisierer, EM). Bei ihnen wurden im Plasma Flächen unter der Konzentrations-Zeit-Kurve (AUC) gemessen, die zehnmal höher als bei EMs sind (> Abb. 3.2.3). Der Erfolg einer Eradikationstherapie scheint vom CYP2C19-Genotyp abzuhängen, was verständlich ist in Anbetracht der sehr unterschiedlichen Exposition gegenüber dem Wirkstoff Omeprazol bei Individuen mit unterschiedlichem CYP2C19-Genotyp. Mehrere klinische Studien konnten zeigen, dass die Eliminationsquote von Helicobacterpylori bei Patienten mit CYP2C19Defizienz höher ist als bei Menschen, die zwei normal aktive Gene aufweisen (Übersicht bei Roots et al. 2004),

die Erfolgsrate von heterozygoten Merkmalsträgern liegt zwischen diesen beiden Gruppen. Die überwiegende Mehrzahl dieser Untersuchungen wurde in Japan und Korea durchgeführt. Dort betrifft CYP2C19-Defizienz ca. 15–20% der Bevölkerung, sie ist damit fünfmal so häufig wie bei weißen Europäern. Omeprazol hat offenbar eine große therapeutische Breite, auch relativ hohe Plasmaspiegel sind nicht toxisch. Wenn der Arzt den CYP2C19-Genotyp seines Patienten kennt, könnte er diesen bei der Therapie berücksichtigen, also z. B. einem Schnellhydroxilierer die doppelte Dosis geben. Es sollte jedoch nicht vergessen werden, dass auch andere Faktoren den Erfolg einer Eradikationstherapie maßgeblich mitbestimmen, z. B. Resistenzen von Helicobacter pylori oder Polymorphismen in Interleukin-1β (Take et al. 2003). Auch die anderen Protonenpumpenhemmer – Pantoprazol, Lansoprazol und Rabeprazol – unterliegen dem CYP2C19-Polymorphismus.

3.2.3.2 Substrate von CYP2C9 Das CYP2C-Cluster auf Chromosom 10q24 enthält nicht nur das Gen für CYP2C19, sondern auch die Gene für CYP2C9 und CYP2C8. Auch bei den letzteren beiden handelt es sich um hochpolymorphe Enzyme,

320

Sektion 3 · Diagnostik

a

b . Abb. 3.2.3a,b. a Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve bei gesunden Probanden mit unterschiedlichem CYP2C19-Genotyp nach oraler Gabe von 40 mg Omeprazol p.o. Die folgenden Genotypen wurden getestet (fünf Probanden pro Gruppe): * homozygot mutiert (CYP2C19*2/*2), Phänotyp: Metabolismus defizient, da keine CYP2C19-Aktivität („poor metabolizer“, PM); – heterozygot Wildtyp/Mutation (CYP2C19*1/*2), Phänotyp: intermediärer Metabolisierer, da Metabolisierungskapazität reduziert; – homozygot Wildtyp (CYP2C19*1/*1), Phänotyp: Schneller Metabolisierer, EM (Brockmöller et al. 2000). b Eradikationsrate von Helicobacter pylori bei 62 Patienten mit peptischem Ulkus nach sog. Eradikationstherapie (Omeprazol und Antibiotika). Die Patienten sind entsprechend ihrem CYP2C19-Genotyp gruppiert (Furuta et al. 2001)

die eine Reihe von klinisch wichtigen Wirkstoffen als Substrate haben, darunter auch orale Antidiabetika (> Tab. 3.2.1). Träger des Allels CYP2C9*3 haben eine erheblich herabgesetzte Enzymaktivität, die zu einer verlangsamten Clearance bestimmter Antidiabetika führt. Der größte Effekt zeigt sich bei Glibenclamid (Glyburide) (Kirchheiner et al. 2005). Etwa 0,4% der weißen Bevölkerung weisen den homozygoten Genotyp CYP2C9*3/*3 auf. Bei Individuen mit dem Genotyp CYP2C9*2/*2 (ca. 0,9% bei Weißen) ist die Enzymaktivität mäßiggradig verringert. Bei Schwarzafrikanern und den Völkern des fernen Ostens sind diese varianten Allele sehr selten. Die reduzierte Aktivität von CYP2C9 kommt klinisch hauptsächlich bei der Therapie mit Warfarin zum Tragen (Takahashi et al. 2006). Inwieweit sie bei der Behandlung mit oralen Antidiabetika oder nichtsteroidalen Antirheumatika berücksichtigt werden muss, steht noch nicht fest. Bei der Therapie von Epileptikern mit Phenytoin ist schon seit Jahrzehnten bekannt,

. Abb. 3.2.4. Codein wird im Körper über CYP2D6 durch O-Demethylierung zum pharmakodynamisch wirksamen Morphin metabolisiert. Bei homozygoten Trägern der Defizienz von CYP2D6 ist die Wirksamkeit von Codein nur sehr gering, wohingegen Träger der Genduplikation eine besonders starke Wirkung aufweisen

dass ca. 1% dieser Patienten mit einer vergleichsweise niedrigen Dosis von 50–100 mg/Tag auskommt, statt wie die meisten mit 300–400 mg/Tag. Die Ursache liegt in der langsamen Verstoffwechselung von Phenytoin bei homozygoten Trägern der CYP2C9*3-Variante.

3.2.3.3 Codein und Morphin Nicht immer führt die Metabolisierung zur Inaktivierung der Medikamente. Im Falle der sog. Pro-Drugs wird eine pharmakologisch inaktive Substanz erst im Körper zum eigentlichen Wirkstoff umgesetzt. So wird Codein über CYP2D6 O-demethyliert, es entsteht Morphin, welches selbst, aber vor allem als Morphin6β-Glucuronid, hustenstillend und analgetisch wirksam ist (> Abb. 3.2.4). Bei Menschen mit homozygoter CYP2D6-Defizienz ist Codein weitgehend unwirksam. Das Codein-6-glucuronid ist jedoch ein von CYP2D6 unabhängig gebildeter Metabolit, der eine schwache Wirksamkeit besitzt (Lötsch et al. 2006). Patienten mit einer CYP2D6-Genduplikation („ultraschnelle Metabolisierer“) weisen eine weit überdurchschnittliche Bildung von Morphin auf und reagieren nicht selten mit Nebenwirkungen (Kirchheiner et al. 2006). Ein anderes Beispiel für ein Pro-Drug ist das Antimalariamittel Proguanil. Es wird über CYP2C19 zum aktiven Wirkstoff Cycloguanil metabolisiert. Individuen mit CYP2C19-Defizienz verstoffwechseln Proguanil über CYP3A4, allerdings nur zu einem geringeren Teil, daher ist die Wirksamkeit von Proguanil bei diesen Patienten reduziert. Morphin wirkt natürlich nicht nur als Metabolit von Codein, sondern bildet als eigenständiges Medikament die tragende Säule der Opioidtherapie. Die bekannte Varianz von Person zu Person im Dosisbedarf von Morphin hat viele Gründe, hauptsächlich liegt ihr die Tole-

321 3.2 · Pharmakogenetik und Pharmakogenomik

3.2

. Abb. 3.2.5. Individueller Morphinbedarf bei Patienten unter Berücksichtigung spezifischer genetischer Varianten, die Einfluss auf die Wirksamkeit von Morphin haben. Bei diesem Vergleich wurden

Patienten, die keine der drei aufgeführten Mutationen besaßen, in ihrem relativen Morphinbedarf gleich 1 gesetzt. Modifiziert nach Lösch u. Geisslinger (2006a)

ranzentwicklung zugrunde. Auch pharmakogenetische Ursachen sind von Bedeutung (Lötsch u. Geisslinger 2006, 2006a). So ist die Wirksamkeit von Morphin bei Patienten mit einer bestimmten Mutation am Opioidrezeptor μ (OPRM1 118G) auf die Hälfte herabgesetzt, was durch Verdopplung der Dosis kompensiert werden muss. Die Mutationen COMT 472A an der Catechol-O-Methyltransferase und MC1R 29insA am Melanocortin-1-Rezeptor steigern die Wirksamkeit von Morphin um ca. ein Drittel. > Abbildung 3.2.5 zeigt den individuellen Morphin-Dosisbedarf bei Vorliegen bestimmter Kombinationen der drei genannten Mutationen beim Patienten.

Wir haben die Plasmaeliminationskonstante (ke) bei 49 Krebspatienten berechnet, die ≤1000 mg Cyclophosphamid pro m2 Körperoberfläche erhielten, meist zusammen mit anderen Zytostatika (Timm et al. 2005). > Abbildung 3.2.6 zeigt, dass bei der Eliminationskonstanten ein deutlicher Gen-Dosis-Effekt besteht, wenn die Ergebnisse den CYP2C19-Genotypen zugeordnet werden. „Poor metabolizer“ zeigen erwartungsgemäß die langsamste Elimination [Genotyp CYP2C19*2/*2; ke=0,076 (SD=0,014) h-1]. Bei homozygoten Trägern des Wildtypallels erfolgte die Elimination um ca. 50% schneller [CYP2C19*1/*1; ke=0,113 (SD=0,028) h–1]. Künftige Studien sollten zeigen, inwieweit ein Zusammenhang mit dem Therapieerfolg besteht. Dabei müsste auch der Genotyp der anderen am Stoffwechsel von Cyclophosphamid beteiligten Enzyme berücksichtigt werden. Eines der Standardmedikamente zur adjuvanten Behandlung von Mammakarzinomen ist Tamoxifen, ein Östrogenrezeptorantagonist. Auch Tamoxifen ist als Pro-Drug anzusehen. Zwei aktive Metaboliten, Endoxifen und 4-Hydroxy-Tamoxifen, besitzen in vitro eine ca. 100fach höhere Aktivität als die Muttersubstanz. Endoxifen ist der weitaus bedeutendere Metabolit der beiden (> Abb. 3.2.7). Er wird über zwei sequenzielle CYP-Reaktionen gebildet. Der erste Schritt erfolgt mit großer Kapazität über CYP3A4. Diese Reaktion kann z.B. durch Enzyminduktoren stimuliert oder durch eine inhibitorische Komedikation gehemmt werden, wodurch die

3.2.3.4 Cyclophosphamid und Tamoxifen Cyclophosphamid ist ein breit eingesetztes Zytostatikum, das von einer Vielzahl polymorpher Enzyme, vor allem aus der Familie der CYP-Enzyme, metabolisiert wird. Klinikern ist bekannt, dass die Wirksamkeit und Verträglichkeit von Cyclophosphamid große interindividuelle Unterschiede aufweist. Cyclophosphamid ist ein Pro-Drug. Es wird durch CYP2C9, CYP2B6, CYP2C19 und CYP3A in 4-Hydroxy-Cyclophosphamid umgewandelt und damit metabolisch aktiviert. Dieser Metabolit ist der Vorläufer einer Reihe alkylierender Produkte, wie z. B des Phosphoramidmustard.

322

Sektion 3 · Diagnostik

der aktive Metabolit Endoxifen deutlich vermindert entsteht. Die klinisch entscheidende Varianz zur Bildung von Endoxifen liegt aber im genetischen Polymorphismus von CYP2D6. Es konnte gezeigt werden, dass homozygote Träger der CYP2D6-Defizienz („poor metabolizer“) eine deutlich schwächere Wirksamkeit von Tamoxifen aufwiesen (Goetz et al. 2005; Jin et al. 2005). Umgekehrt dürfte die Wirksamkeit von Tamoxifen bei Trägern der Genduplikation besonders gut sein.

3.2.3.5 Östrogenmetabolismus über CYP1A1-Varianten

Wirksamkeit schwanken kann. Große genetische Einflüsse auf CYP3A4 sind nicht bekannt. Das über CYP3A4 entstehende N-Desmethyl-Tamoxifen ist nunmehr Substrat für CYP2D6. Dieses Enzym kann durch andere gleichzeitig gegebene Substrate, wie z. B. Paroxetin oder trizyklische Antidepressiva, gehemmt werden, sodass

Auch endogene Substrate wie 17β-Estradiol und Östron können über polymorphe Enzyme des Fremdstoff-Stoffwechsels metabolisiert werden (Kisselev et al. 2005). > Abbildung 3.2.8 zeigt die Genotyp-Phänotyp-Korrelation verschiedener CYP1A1-Varianten, die – zusammen mit Cytochrom-P450-Reduktase – in Spodoptera-frugiperda- (Sf9-)Insektenzellen exprimiert wurden. Im Vergleich zum Wildtypprotein (CYP1A1.1) ist die Metabolitenbildung bei der Enzymvariante CYP1A1.2 deutlich höher, vor allem, was die Bildung von 2-OH-Produkten betrifft. Da die verschiedenen Östrogenmetaboliten unterschiedliche pharmakodynamische Profile haben, kann diese Änderung im Metabolitenmuster auch die Suszeptibilität gegenüber Krankheiten beeinflussen, die von Östrogenen beeinflusst werden. Dazu gehören Osteoporose, Brustkrebs, Ovarialkrebs und Arteriosklerose.

. Abb. 3.2.7. Bildung des aktiven Metaboliten Endoxifen aus Tamoxifen über zwei sequenzielle CYP-Reaktionen. Man erkennt, dass hierbei die CYP2D6-Reaktion bei homozygoten Trägern der Defizienz ein

Nadelöhr darstellt. Die In-vitro-Wirksamkeit der beiden aktiven Metaboliten ist als Vielfaches derjenigen der Muttersubstanz Tamoxifen angegeben (Jin et al. 2005)

. Abb. 3.2.6. Plasmaeliminationskonstante (ke) von Cyclophosphamid in Abhängigkeit vom CYP2C19-Genotyp. 49 onkologische Patienten wurden mit Cyclophosphamiddosen unter 1.000 mg/m2 Körperoberfläche behandelt. Die Ergebnisse sind als Box-Plots dargestellt. Patienten mit CYP2C19-Defizienz (CYP2C19*2/*2) weisen die langsamste Elimination auf (Timm et al. 2005)

323 3.2 · Pharmakogenetik und Pharmakogenomik

. Abb. 3.2.8. Genetische Varianz im Metabolitenmuster von 17βEstradiol und Estron. Die CYP1A1-Varianten wurden – zusammen mit Cytochrom-P450-Reduktase – in Sf9-Insektenzellen exprimiert (Kisselev et al. 2005). Das Diagramm zeigt die katalytische Effi-

3.2

zienz (Vmax/Km). CYP1A1.1 entspricht dem Wildtypprotein; CYP1A1.2 (Ile462Val) wird durch CYP1A1*2 kodiert; CYP1A1.4 (Thr461Asn) wird durch CYP1A1*4 kodiert

3.2.3.6 Genotyp-basiertes Versagen einer antiemetischen Therapie mit 5-Hydroxytryptamin-Typ-3-RezeptorAntagonisten 5-HT3-Antagonisten wie Ondansetron und Tropisetron haben die Therapie von Erbrechen unter Zytostatika einen bedeutenden Schritt vorwärts gebracht. Dennoch leiden 20–30% der Patienten immer noch unter Übelkeit und Erbrechen. 5-HT3-Antagonisten sind Substrate von CYP2D6. Es hat sich herausgestellt, dass bei Trägern der CYP2D6-Genduplikation Tropisetron und Ondansetron nur wenig wirksam sind (> Abb. 3.2.9) (Kaiser et al. 2002). Offenbar erreichen bei ultraschnellen Metabolisierern die Plasmaspiegel nicht den therapeutischen Bereich. Die betreffenden Patienten sollten deshalb eine erheblich höhere Dosis von Tropisetron oder Ondansetron erhalten. Unter europäischen Kaukasiern gibt es nur 2–3% ultraschnelle Metabolisierer, bei Arabern und in der Bevölkerung Nordostafrikas beläuft sich deren Anteil jedoch auf 5–25% (vgl. > Tab. 3.2.1). Die Wirksamkeit einer antiemetischen Therapie mit 5-HT3-Antagonisten hängt – außer von der Aktivität von CYP2D6 – auch von einer Rezeptorvariante ab. Tremblay et al. (2003) haben beobachtet, dass eine AAGDeletion in der Promotor-Region des 5-HT3-Rezeptors (-100_-102 nucleotide position) bei Patienten mit unbefriedigender Kontrolle von Übelkeit und Erbrechen signifikant häufiger war. Homozygote Träger der Dele-

. Abb. 3.2.9. Anzahl der Episoden von Erbrechen innerhalb der ersten 5 h nach Verabfolgung einer emetogenen zytostatischen Therapie bei Patienten mit unterschiedlichem CYP2D6-Genotyp. Die Abbildung zeigt, dass Träger der CYP2D6-Genduplikaton (überwiegend CYP2D6*1/*2x2, d. h. Träger von 3 aktiven Genen) im Durchschnitt 2,3 Episoden hatten und damit beträchtlich über den entsprechenden Werten von Wildtypallelträgern bzw. Trägern der CYP2D6-Defizienz (Träger von 0, 1 oder 2 aktiven CYP2D6-Genen) lagen (Kaiser et al. 2002)

324

Sektion 3 · Diagnostik

tion erwiesen sich als Nonresponder. Da dieser Genotyp aber nur bei 1,5% der Patienten auftritt, ist sein Beitrag zur Gesamtzahl der Therapieversager doch eher gering.

3.2.4 Genetische Varianten von Arzneimitteltransportern Gemäß der klassischen Lehrmeinung verteilen sich Pharmaka im Gewebe mittels passiver Diffusion. Nach der Entdeckung und Beschreibung einer Reihe von Transmembrantransportern ist jedoch klar, dass viele Arzneimittel auch aktiv durch biologische Membranen geschleust werden. Transmembrantransporter sind integrale Proteine der Zellmembran. Sie kommen in Organen vor, die an der Absorption und Exkretion beteiligt sind, wie z. B. Darm, Leber und Niere. Außerdem sind sie ein wichtiger Teil der Barriere zwischen Blut und Gewebe (Blut-Hirn-Schranke, Blut-Plazenta-Schranke etc.), die empfindliche Gewebe gegen toxische Fremdstoffe schützt. Ähnlich wie fremdstoffmetabolisierende Enzyme können auch die Transporter durch Transkriptionsfaktoren in ihrer Aktivität reguliert werden (Podvinec u. Meyer 2006). Nach der Transportrichtung unterscheidet man Aufnahme- und Effluxtransporter. Zu den Aufnahmetransportern gehören die Familien organische anionentransportierende Polypeptide (OATP, Gen: SLC21A, solute carrier family 21A), organische Kationentransporter (OCT, Gen: SLC22A) und Peptidtransporter (PEPT, Gen: SLC15A). Effluxtransporter der ABC-Familie („adenosin-triphosphat-binding cassette“), zu denen auch P-Glykoprotein zählt, spielen eine wichtige Rolle bei der Ausscheidung von Arzneimitteln. OATP-Proteine bilden eine große Transporterfamilie, die in zahlreichen Geweben des menschlichen Körpers (z. B Leber, Niere, Gehirn, Darm) exprimiert wird. In der Leber beteiligen sich diese Polypeptide an der Extraktion von Fremdstoffen und Arzneimitteln aus dem Blut der Pfortader. Zu den klinisch wichtigen Substraten gehören u. a. der Hydroxymethylglutaryl(HMG)-CoAReduktasehemmer Pravastatin (Hsiang et al. 1999), das Antihistaminikum Fexofenadin und die ACE-Hemmer Enalapril und Temocaprilat. OATP-C (SLC21A6, SLCO1B1, ABC1B1) kommt ausschließlich in den basolateralen Membranen der Hepatozyten vor. In den Exons des OATP-C-Gens wurde eine Reihe von SNPs gefunden (Tirona et al. 2001; Nozawa et al. 2002; Michalski et al. 2002), wobei die meisten selten vorkommen. Zu den häufigsten SNPs gehören A388G, C463A und T521C, die als OATP-C*1b, *4 bzw. *5 bezeichnet werden. Allerdings war die Allelfrequenz bei US-Amerikanern europäischer Abstammung, US-Amerikanern afrikanischer Abstam-

mung und bei Japanern deutlich unterschiedlich (Tirona et al. 2001; Nozawa et al. 2002). Die meisten Varianten führten bei In-vitro-Experimenten zu einer Änderungen der OATP-C-Transportfunktion. Unterschiedliche OATP-C-Haplotypen haben Einfluss auf die Pharmakokinetik von Pravastatin (Mwinyi et al. 2004). Statistisch signifikante Effekte der OATP-CAllele *1a, *1b, und *5 zeigten sich in einer klinischen Studie mit gesunden männlichen Probanden deutscher Abstammung, in der die Kinetik von Pravastatin nach einer oralen Einzeldosis von 40 mg untersucht wurde (> Abb. 3.2.10) (Mwinyi et al. 2004). OATP-C*5 scheint zu einer verzögerten Aufnahme von Pravastatin in die Leberzelle zu führen, die Plasmakonzentrationen bleiben daher hoch. Das Vorhandensein des OATP-C*1bAllels beschleunigt anscheinend die Aufnahme des Wirkstoffs, sodass die Konzentration im Plasma niedrig ist. Aus diesen Ergebnissen schon den Schluss zu ziehen, dass die Pravastatindosen entsprechend dem OATP-CGenotyp zu variieren seien, erscheint voreilig, bevor nicht der Einfluss auf die Zielgröße Cholesterolkonzentration belegt ist. Erste Untersuchungen zeigen, dass auch Cholesterolvorstufen, wie z. B das Lathosterol, von dem OATP-C-Polymorphismus betroffen sind (Gerloff et al. 2006). Die meisten Effluxtransporter, die am Transport von Arzneimitteln beteiligt sind, gehören der ABC-Familie an. P-Glykoprotein, das Genprodukt von MDR1 („multidrug resistance gen 1“, ABCB1), ist der derzeit am besten untersuchte Effluxtransporter, es folgen Mitglieder der MRP- („multidrug resistance associated protein“, ABCC-)Unterfamilie. P-Glykoprotein wurde zuerst als der Faktor identifiziert, der in der Krebszelle zur Arznei-

. Abb. 3.2.10. Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve nach oraler Gabe von 40 mg Pravastatin bei verschiedenen OATP-C-Haplotypen. Der Kruskal-Wallis-Test ergab einen Wert von P=0,006 für die Unterschiede der AUC-Werte zwischen den drei Gruppen. Im Mann-Whitney-Test ergab der Vergleich zwischen den Gruppen *1a/*1a und *1a/*5 einen P-Wert von 0,049 (Mwinyi et al. 2004)

325 3.2 · Pharmakogenetik und Pharmakogenomik

mittelresistenz führt. Durch seine Lokalisation in Geweben mit exkretorischer oder absorptiver Funktion, wie z. B. den kanalikulären (apikalen) Membranen der Hepatozyten, den Bürstensäumen in proximalen Tubuluszellen der Niere und den apikalen Polen der Enterozyten (Tanigawara 2000), wurde aber sehr schnell klar, dass P-Glykoprotein auch für die Pharmakokinetik von Arzneimitteln entscheidend sein kann. Allgemein kann man sagen, dass P-Glykoprotein als Effluxtransporter die Arzneimittelresorption vermindert und die Arzneimittelexkretion begünstigt. Während funktionell wichtige Mutationen bei arzneimittelmetabolisierenden Enzymen schon sehr lange bekannt waren und auch frühzeitig Methoden zu ihrer Genotypisierung entwickelt wurden (Blum et al. 1991; Heim u. Meyer 1991), erfolgten vergleichbare Schritte bei den Transportern erst vor wenigen Jahren. Den Anfang bildete die systematische Sequenzierung des Gens von P-Glykoprotein durch Hoffmeyer et al. (2000), bei der sich eine Vielzahl von Mutationen ergab. Die polymorphe Expression von P-Glykoprotein könnte ein wichtiger Faktor bei der individuellen Response auf Arzneimittel sein. Zahlreiche Studien haben pharmakogenetische Effekte von SNPs im MDR1-Gen gezeigt (u. a. Hoffmeyer et al. 2000; Hauser et al. 2005; Fellay et al. 2002). Ein nicht kodierender Nukleotidaustausch in Exon 26 3435C>T ist mit einer signifikant niedrigeren Expression von P-Glykoprotein im intestinalen Gewebe assoziiert. Homozygote Träger des T-Allels haben daher höhere Steady-State-Digoxinspiegel als Heterozygote und als Träger zweier Wildtypallele (Hoffmeyer et al. 2000). Was jedoch den Einfluss einzelner SNPs auf die P-Glykoprotein-Funktion betrifft, so haben bisherige Studien auch zu widersprüchlichen Ergebnissen geführt (Siegmund et al. 2002; Gerloff et al. 2002). Eine Erklärung hierfür könnten unterschiedliche experimentelle Bedingungen, die Beteiligung anderer Transporter und die genetische Umgebung des MDR1Gens sein. Interessanterweise konnte eine Haplotypanalyse der MDR1-SNPs 2677G>T/A in Exon 21 und 3435C>T in Exon 26, die miteinander gelinkt sind, ein Teil der widersprüchlichen Ergebnisse früherer Studien erklären (Johne et al. 2002). Deshalb sollten künftige Studien stärker den Aspekt der Haplotypen berücksichtigen. Noch nicht abschließend geklärt ist die Frage, wie die stille, nichtkodierende Mutation 3435C>T in Exon 26 zu Aktivitätsänderungen von P-Glykoprotein führen kann. Das Linkage mit der Tripelmutation G2677T/A wurde schon erwähnt. 2677T und 2677A führen jeweils zu einem Aminosäureaustausch. Kürzlich zeigten Schaefer et al. (2006), dass die einzelnen Proteinvarianten eine signifikant unterschiedliche Transportkapazität für Vincristin aufweisen (> Abb. 3.2.11).

3.2

3.2.5 Genotyp-basierte Dosisempfehlungen Wenn bei einem arzneimittelmetabolisierenden Enzym eine eindeutige Korrelation zwischen Phänotyp und Genotyp besteht und der Genotyp des Patienten bekannt ist, kann der behandelnde Arzt die Dosierung von Arzneimitteln, die durch dieses spezielle Enzym verstoffwechselt werden, dem Genotyp entsprechend anpassen. Etwa 7% der weißen Bevölkerung sind homozygot defizient für CYP2D6, d. h., bei ihnen ist keine Enzymaktivität nachweisbar (Sachse et al. 1997) (> Tab. 3.2.1). Diese Menschen metabolisieren Substrate von CYP2D6 bedeutend langsamer und haben entsprechend höhere Plasmaspiegel. Eine Standarddosis zeigt eine unerwartet große Wirkung und eine erhöhte Nebenwirkungsrate, die auf eine relative Überdosierung zurückzuführen ist. Ungefähr 3% der weißen Bevölkerung tragen eine CYP2D6-Genduplikation. Hierbei handelt es sich um etwas Außergewöhnliches, denn diese Menschen haben drei aktive Allele und damit eine Enzymaktivität, die erheblich über der normaler Wildtypallelträger liegt. Klinische Studien legen nahe, dass durch eine genotypadaptierte Dosierung in den beiden genannten Fällen mangelnde Wirksamkeit und verstärkte Nebenwirkungen vermieden werden können. Polymorphismen arzneimittelabbauender Enzyme haben nicht bei allen Arzneimitteln klinisch messbare Auswirkungen, die Pharmakokinetik vieler Substanzen wird kaum dadurch beeinträchtigt. Die meisten Wirkstoffe werden über CYP3A4 verstoffwechselt. Dessen

. Abb. 3.2.11. Sättigungskinetik des ATP-abhängigen Vincristin[H3]-Transports in Membranvesikeln, isoliert aus HighFive-Insektenzellen, die P-Glykoprotein (ABCB1)-Varianten exprimieren. ABCB1893Ala entspricht dem Wildtyp an Exon 21 2677G. Die Mutation 2677T führt zu einem Aminosäureaustausch 893Ser. Am gleichen Genort kommt eine alternative Mutation 2677A vor, die zu 893Thr führt. Km= Michaelis-Menten-Konstante, Vmax= maximale Transportgeschwindigkeit [Vmax wurde auf die relative Proteinexpression bei Wildtyp (=1,0) normalisiert] (Schaefer et al. 2006)

326

Sektion 3 · Diagnostik

AUC

Clearance

. Abb. 3.2.12. Einfluss des CYP2D6-Polymorphismus auf die Elimination von Doxepin. Links: Plasmaspiegelverläufe bei gesunden Probanden mit den Genotypen homozygot Wildtyp (EM), heterozygot (intermediärer Metabolisierer, IM), homozygot defizient (PM) oder

Genduplikation (ultraschneller Metabolisierer, UM) nach Einnahme einer Einzeldosis von 75 mg razemischem E-, Z-Doxepin. Rechts: Orale Clearance des E-Enantiomers von Doxepin. (Kirchheiner et al. 2002, ergänzt mit Daten für UM)

Aktivität zeigt große interindividuelle Unterschiede; inwieweit dies genetische Hintergründe hat, ist allerdings noch nicht abschließend geklärt. Außerdem ist der Einfluss polymorpher Enzyme wie CYP2D6, CYP2C19 und CYP2C9 immer dann vernachlässigbar, wenn der Wirkstoff über alternative Stoffwechselwege abgebaut werden kann. Eine Dosierung entsprechend dem Genotyp ist nur sinnvoll, wenn das polymorphe Enzym für den Metabolismus einer Substanz mit kleiner therapeutischer Breite ausschlaggebend ist. Diese Bedingungen werden nur von wenigen der gebräuchlichen Wirkstoffe erfüllt.

Für eine Reihe von Wirkstoffen, die über polymorphe Enzyme verstoffwechselt werden, sind Dosierungsempfehlungen bereits entwickelt worden (Brockmöller et al. 2000; Kirchheiner et al. 2001, 2004). In > Abb. 3.2.12 kann man deutlich erkennen, wie sich der CYP2D6-Genotyp auf die systemische Clearance und die AUC des Antidepressivums Doxepin auswirkt (Kirchheiner et al. 2002). Ist der CYP2D6-Genotyp des Patienten bekannt, können die Plasmakonzentrationen durch entsprechende Dosierung im gewünschten Bereich gehalten werden (> Abb. 3.2.13).

. Abb. 3.2.13. Arzneimitteldosierung entsprechend Genotyp. Die Abbildung zeigt vier Patienten mit unterschiedlichem CYP2D6-Phänotyp (PM, homozygot defizient; IM, intermediärer Metabolisierer, EM, homozygot Wildtyp, UM, ultraschneller Metabolisierer) und die entsprechenden Genotypen. Die Standarddosis eines Arzneimittels führt bei den vier Patienten zu unterschiedlichen PlasmakonzentrationsZeit-Kurven (gepunktete Linie) und zu unterschiedlicher Wirksamkeit (z. B. Therapieversagen bei UM, Nebenwirkungen bei PM). Wenn die Arzneimitteldosis dem CYP2D6-Genotyp angepasst wird (die Säulen markieren die Dosisanpassung in Prozent), sind die Plasmakonzentrations-ZeitVerläufe bei allen Patienten gleich (durchgezogene Linie)

327 3.2 · Pharmakogenetik und Pharmakogenomik

3.2 ultrarapid metabolizer extensive metabolizer intermediate metabolizer poor metabolizer

. Abb. 3.2.14. Dosierungsempfehlungen für Antidepressiva entsprechend dem CYP2D6-Genotyp. Die Berechnungen haben die empfohlene Standarddosis des jeweiligen Wirkstoffes zur Grundlage. Anhand publizierter genotypspezifischer pharmakokinetischer Daten wurden Dosierungen berechnet, die bei allen Genotypen zu gleichen Plasmaspiegeln führen. PM, „poor metabolizer“ (CYP2D6

defizient); IM, „intermediate metabolizer“ (heterozygot Wildtyp mit einem defizienten Allel oder zwei Allelen, die zu einer reduzierten Aktivität führen); EM, „extensive metabolizer“ (homozygot Wildtyp); UM, „ultrafast metabolizer“ (ein Wildtypallel plus ein weiteres Wildtypallel, das eine Duplikation trägt) (Kirchheiner et al. 2001, 2004)

> Abbildung 3.2.14 zeigt Dosierungsempfehlungen für Antidepressiva, die an den CYP2D6-Genotyp angepasst sind. Bei der Berechnung wurde außerdem das pharmakodynamische Potenzial der Metaboliten berücksichtigt. Genetisch bedingte Differenzen der Enzymaktivität bleiben nämlich ohne klinische Auswirkungen, wenn der Metabolit genauso wirksam wie die Muttersubstanz ist. Doch das ist selten der Fall, die meisten Metaboliten haben keine therapeutischen Wirkungen.

eine bürokratische Forderung zu erfüllen. So kann die notwendige Reduktion der Phenytoindosis bei Epileptikern mit dem seltenen Genotyp CYP2C9*3/*3 direkt aus vorhandenem Wissen abgeleitet werden (Brockmöller et al. 2000). Die Wirksamkeit dieser individualisierten Dosierung lässt sich dann leicht anhand klinischer Kriterien kontrollieren. Schwieriger ist es, wenn anhand des CYP2D6-Genotyps entschieden werden soll, ob ein Schizophrener mit Haloperidol behandelt wird oder nicht. Haloperidol wird zwar zum größten Teil über CYP2D6 verstoffwechselt, es gibt aber auch einen alternativen Weg über die Reduktion einer Carbonylgruppe, bei der ein pharmakologisch aktiver Metabolit entsteht. Eine klinische Studie konnte allerdings zeigen, dass die Wirksamkeit von Haloperidol tatsächlich vom CYP2D6Genotyp abhängt – sie war bei langsamen Metabolisierern am größten, während die Therapie bei ultraschnellen Metabolisierern versagte (Brockmöller et al. 2002). Die Pharmakogenetik ist Teil der künftigen Molekularen Medizin. Eine Diagnose auf molekularer Basis wird Hand in Hand gehen mit einer spezifischen, molekularen Arzneitherapie. Man kann erwarten, dass die Therapie dadurch effektiver und sicherer wird. Durch die Reduktion von Nebenwirkungen und die Vermeidung einer unwirksamen Therapie sollten auch die Kosten sinken. Die Einführung der Pharmakogenetik in die klinische Praxis wird beschleunigt werden, sobald pharmakogenetisches Wissen Eingang in die Computersoftware des Arztes am „point of drug prescription“ gefunden hat.

3.2.6 Ausblick auf künftige Implementierung der Pharmakogenetik bei der Krankenversorgung Die geschilderten Beispiele verdeutlichen, dass es unter bestimmten Bedingungen schon heute möglich ist, die Arzneitherapie an die genetische Ausstattung des Patienten anzupassen. Nach den Regeln der evidenzbasierten Medizin ist allerdings zu fordern, dass eine auf pharmakogenetischer Basis berechnete Dosierung sich in klinischen Studien als überlegen gegenüber Standardmethoden erweist. Einige Studien, u. a. mit Antidepressiva, Neuroleptika und Azathioprin, liegen bereits vor. Nur sollte sich die Forderung nach aufwendigen klinischen Prüfungen in vernünftigen Grenzen halten. Schlussfolgerungen, die sich direkt aus klinischer Beobachtung und wissenschaftlichen Erkenntnissen ableiten lassen, müssen nicht formal bestätigt werden, nur um

328

Sektion 3 · Diagnostik

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3.2

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330

Sektion 3 · Diagnostik

3.2.8 Zeittafel „So musst du sein, dir kannst du nicht entfliehen, So sagten schon Sibyllen, so Propheten; Und keine Zeit und keine Macht zerstückelt Geprägte Form, die lebend sich entwickelt.“

Diese Zeilen aus Dämon, Urworte orphisch, sind eines von mehreren Beispielen, in denen Johann Wolfgang von Goethe sein Verstehen des Vererbungsmodus ausdrückte – lange, bevor Gregor Mendel 1866 seine Vererbungsregeln aufstellte. In der Mitte des 20. Jahrhunderts wird sich zeigen, dass diese Regeln sehr wohl auch auf die Reaktion eines Individuums auf Medikamente und andere Fremdstoffe zutreffen, also auf die Pharmakogenetik. Einige für die Entwicklung der Pharmakogenetik bedeutsame Entdeckungen und Ereignisse (Meyer 2004) seien im Folgenden genannt.

1932

Schmecken und Nichtschmecken von Phenylthiocarbamid wird auf eine monogenetisch übertragene Eigenschaft zurückgeführt (Snyder 1932).

1953

Die langsame und schnelle Acetylierung von Isoniazid wird von Bönicke und Reif (1953) sowie Hughes et al. (1953) beschrieben.

1956

Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel in Erythrozyten wird von Alving et al. (1956) als Ursache der primaquininduzierten Hämolyse erkannt.

1957

Kalow und Staron (1957) finden die Defizienz der Pseudocholinesterase im Serum als Ursache der verlängerten Apnoe nach Gabe von Succinylcholin.

1959

Friedrich Vogel (1959) prägt den Begriff Pharmakogenetik.

1967

Sjöqvist et al. zeigen, dass der Stoffwechsel trizyklischer Antidepressiva unter genetischer Kontrolle ist (Alexanderson et al. 1969).

1975/77

Eichelbaum (Bonn) sowie Smith (London) und ihre Mitarbeiter entdecken unabhängig voneinander den Spartein/ Debrisoquin-Hydroxylierungs-Polymorphismus (Cytochrom P450 2D6) (Eichelbaum 1975; Eichelbaum et al. 1979; Mahgoub et al. 1977).

1980

Entdeckung des genetischen Polymorphismus der Thiopurin-S-Methyltransferase (TPMT) durch Weinshilboum und Sladek (Weinshilboum 2003).

1984

Beschreibung des Hydroxylierungspolymorphismus von Mephenytoin (CYP2C19) durch Küpfer und Preisig (1984).

1988

Gonzalez und Meyer (1988) klonieren das CYP2D6-Gen und charakterisieren den genetischen Defekt des SparteinDebrisoquin-Polymorphismus.

1990

Heim und Meyer (1990) publizieren den ersten allelspezifischen pharmakogenetischen Gentest für CYP2D6.

1991

Das Gen der Arylamin-N-Acetyltransferase-2 wird kloniert, einschließlich der mutierten Allele, die den langsamen Acetylierer-Phänotyp bedingen (Blum et al. 1991).

1999

Das SNP-Consortium, ein Zusammenschluss öffentlicher und industrieller Forschungseinrichtungen, liefert freiverfügbare Information über die Genomvielfalt (Masood 1999).

2000

Die erste umfangreiche pharmakogenetische Wissenssammlung (PharmGKB Internetseite) wird auf der Basis des National Institutes of Health Pharmacogenetics Research Network errichtet.

2000

Erstmalige systematische Suche nach funktionell wirksamen Mutationen in einem Arzneimittel-Transporter-Gen (P-Glykoprotein) (Hoffmeyer et al. 2000).

2001

Erste Analyse („draft“) des menschlichen Genoms (Venter et al. 2001, International Human Genome Sequencing Consortium 2001).

2003

Beginn des HapMap-Projektes zur Beschreibung der Haplotyp-Blöcke des Menschen.

2003

Die Food and Drug Administration (FDA) veröffentlicht einen Entwurf einer Guideline zur Bewertung pharmakogenetischer Daten im Rahmen der Arzneimittelentwicklung

2004

Publikation der weitgehend fehlerfreien Sequenz von 99% des euchromatischen menschlichen Genoms mit 20.000 bis 25.000 eiweißkodierenden Genen (International Human Genome Sequencing Consortium, 2004)

331 3.2 · Pharmakogenetik und Pharmakogenomik

Literatur zur Zeittafel Alexanderson B, Evans DA, Sjöqvist F (1969) Steady-state plasma levels of nortriptyline in twins: influence of genetic factors and drug therapy. Br Med J 4: 764–768 Alving AS, Carson PE, Flanagan CL, Ickes CE (1956) Enzymatic deficiency in primaquine-sensitive erythrocytes. Science 124: 484–485 Blum M, Demierre A, Grant DM, Heim M, Meyer UA (1991) Molecular mechanism of slow acetylation of drugs and carcinogens in humans. Proc Natl Acad Sci USA 88: 5237–5241 Bönicke R, Reif W (1953) Enzymatische Inaktivierung von Isonicotinsäure hydrizide im menschlichen und tierischen Organismus. Naunyn Schmiedebergs Arch Exp Pathol Pharmakol 220: 321–323 Eichelbaum M (1975) Ein neuentdeckter Defekt im Arzneimittelstoffwechsel des Menschen: Die fehlende N-Oxidation des Spartein. Habilitationsschrift, Medizinische Fakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Eichelbaum M, Spannbrucker N, Steincke B, Dengler HJ (1979) Defective N-oxidation of sparteine in man: a new pharmacogenetic defect. Eur J Clin Pharmacol 16: 183–187 Gonzalez FJ, Skoda RC, Kimura S, Umeno M, Zanger UM, Nebert DW, Gelboin HV, Hardwick JP, Meyer UA (1988) Characterization of the common genetic defect in humans deficient in debrisoquine metabolism. Nature 331: 442–446 Heim M, Meyer UA (1991) Predicting debrisoquine phenotype. Lancet 337: 363 Hoffmeyer S, Burk O, von Richter O, Arnold HP, Brockmöller J, Johne A, Cascorbi I, Gerloff T, Roots I, Eichelbaum M, Brinkmann U (2000) Functional polymorphisms of the human multidrug-re-

3.2

sistance gene: multiple sequence variations and correlation of one allele with P-glycoprotein expression and activity in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 97: 3473–3478 Hughes HB (1953) On the metabolic fate of isoniazid. J Pharmacol Exp Ther 109: 444–452 International Human Genome Sequencing Consortium (2001). Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409: 860–921 International Human Genome Sequencing Consortium (2004) Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature 431: 931–945 Kalow W, Staron N (1957) On distribution and inheritance of atypical forms of human serum cholinesterase, as indicated by dibucaine numbers. Can J Biochem Physiol 35: 1305–1320 Küpfer A, Preisig R (1984) Pharmacogenetics of mephenytoin: a new drug hydroxylation polymorphism in man. Eur J Clin Pharmacol 26: 753–759 Mahgoub A, Idle JR, Dring LG, Lancaster R, Smith RL (1977) Polymorphic hydroxylation of debrisoquine in man. Lancet 2: 584–586 Masood E (1999) As consortium plans free SNP map of human genome. Nature 398: 545–546 Meyer UA (2004) Pharmacogenetics – five decades of therapeutic lessons from genetic diversity. Nat Rev Genet 5: 669–676 Snyder LH (1932) Studies in human inheritance IX. The inheritance of taste deficiency in man. Ohio J Sci 32: 436–468 Venter JC, Adams MD, Myers EW, Li PW, Mural RJ, et al. (2001) The sequence of the human genome. Science 291: 1304–1351 Vogel F (1959) Moderne Probleme der Humangenetik. Ergebn Inn Med Kinderheilk 12: 52–125 Weinshilboum R (2003) Inheritance and drug response. N Engl J Med 348: 529–537

3.3 Bioinformatik Jens G. Reich

3.3.1

Einleitung

– 333

3.3.2

Das menschliche Genom als Textspeicher – 334

3.3.3

Sequenzanalyse als Basis der Bioinformatik – 336

3.3.3.1

Praktische Verfahren der Sequenzanalyse

3.3.4

Genomkartierung

3.3.5

Vergleichende Genomanalyse: Die evolutionäre Verwandtschaft allen Lebens – 340

3.3.6

„Transkriptom“: Expressionsanalyse des Genoms – 341

3.3.7

Proteomik: Das Eiweißprofil einer Zelle – 342

3.3.8

Strukturbiologie: Die Analyse der molekulären Raumstruktur von Proteinen und Nukleinsäuren – 342

3.3.9

Genetische Diversität des menschlichen Genoms – 343

3.3.10

Datenbanken und Analysewerkzeuge im World Wide Web (WWW) – 344

3.3.11

Weiterführende Literatur – 344

3.3.12

Zeittafel

– 338

– 339

– 345

Literatur zur Zeittafel – 345

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

333 3.3 · Bioinformatik

3.3.1 Einleitung Bioinformatik ist ein Wissenschaftszweig, dessen Methodik (molekulare und genetische Datenbanktechnologie) ganz überwiegend im Internet angesiedelt ist. Man findet zu jeder Fachfrage qualifizierte Abhandlungen und Serviceangebote, indem man entweder konkrete Webadressen eingibt oder sich mithilfe einer Suchmaschine (z. B. „google“) über Anfragestichworte in den entsprechenden Sachbereich „einwählt“. Aus diesem Grund kann die hier gegebene Darstellung sich auf die Einführung in die gedanklichen Grundbegriffe der Teildisziplin und auf einige praktische Ratschläge beschränken. Ebenso wird Originalliteratur, sonst in molekularund zellbiologischen Darstellungen unverzichtbar, hier nur an einigen Stellen zitiert. Mit dem Rückgriff der naturwissenschaftlichen Medizin auf die molekulare Architektur der menschlichen Organe und Zellen ist auch eine Wissenschaftsdisziplin in eine strategische Position gekommen, die sie so in den Jahrzehnten zuvor nicht besaß. Sie behandelt biomedizinische Sachverhalte mit den Methoden der Informatik und mathematischen Modellierung. Man kann sie als biomedizinische Informatik kennzeichnen, in handlicher, aber inhaltlich verkürzter Form auch als Bioinformatik. Andere Aspekte haben auch zu anderen Namensgebungen geführt, die jeweils besondere Facetten des Gebiets betonen: Biomathematische Modellierung, Molekulare Datenbanktechnologie, Bio-Computing u. a. Die strategische Rolle dieser Disziplin kann man so charakterisieren, dass sie nicht mehr im Nebenschluss, sondern nunmehr im Hauptschluss des Stromes medizinischen Erkenntnisgewinns liegt. Sie ist zwar immer noch eine Hilfswissenschaft des Biomediziners, in dem Sinne, dass die fundamentalen Erkenntnisse durch molekularbiologische und genetische Experimente sowie durch pathophysiologische Beobachtung von Labortieren gewonnen und durch Beobachtungen an Menschen bestätigt werden. Aber ihre Ergebnisse sind nicht mehr nur Erläuterungen, Modelle, Denkfiguren der biomedizinischen Forschung, also begleitende Erkenntnisse, sondern ohne den breiten Einsatz von Bioinformatik lässt sich neues Wissen oft überhaupt nicht mehr gewinnen. Man sieht das augenfällig daran, dass hochwertige Personalcomputer und Workstations in jedem einschlägigen Forschungslaboratorium benutzt werden, und zwar nicht nur wie einst für Textverarbeitung oder statistische Tabellenkalkulation, sondern als Modellierungsinstrument und über das Internet als Vernetzungswerkzeug mit den weltweiten Datenbanken, Bibliotheken und biomathematischen Software-Angeboten. Noch vor wenigen Jahren bestand die Hauptanwendung von Mathematik und Informatik vor allem in der medizinischen Biometrie. Deren Verfahren wurden im

3.3

Wesentlichen als heuristisches Instrument benutzt. Vor allem für die Frage, ob ein durch biomedizinische Experimente oder Beobachtungen gewonnener Sachverhalt als „signifikant“, also plausibel und überzeugend, beurteilt werden soll, leistete die mathematische Statistik wichtige Hilfsdienste. Aber es galt wohl stets, dass ein wesentlicher neuer Sachverhalt nur dann wirklich überzeugend war, wenn man ihn zumindest im Umriss „mit bloßem Auge“ erkennen konnte und nicht erst durch komplizierte mathematische Auswertung. Diese Hilfsrolle hat sich verändert. Bioinformatische Methoden sind heute unverzichtbare Werkzeuge, sowohl bei der physikochemischen Untersuchung von Biomakromolekülen und in den Fächern, die man mit Genomik, Proteomik, Metabolomik, Transkriptomik, „Interaktomik“ und einer ganzen Plejade weiterer „Omiks“ zu bezeichnen begonnen hat (es gibt sogar ein spezielles Journal „OMICS – A Journal of Integrative Biology“), als auch beim Studium der komplexen Vernetzungszusammenhänge in der Regulation von metabolischen und Differenzierungsprozessen. Und beides ist von einschneidender Bedeutung für die Medizin. Das all diesen „Omiken“ Gemeinsame, das dann auch diese Begriffswahl plausibel macht, ist die enorme numerische Vielfalt an Elementen (Gene, Genexpressionselemente, Boten-RNS-Spezies, Proteine in mannigfaltigen epigenetischen Modifikationen usw.) sowie das unglaublich verzweigte, bei der Beschreibung zu „kombinatorischer Explosion“ neigende System von gegenseitigen Interkonversionen und physikochemischen Interaktionen, die das molekularbiologisch modellierte organismische System auszeichnen. Konzeptionell neuartig ist die Betrachtungsweise dieser Phänomene vom Funktionsaspekt der biologischen Information her. Beide Phänomenklassen bedingen, dass Hochleistungscomputer und Internet unverzichtbare methodische Voraussetzungen für die erstrebte ganzheitliche Betrachtung sind. Die Bioinformatik hat ihre eigene Methoden- und Denkwelt, die sich sowohl vom Begriffs- und Faktenarsenal der Informatik einerseits als auch dem der Medizin, Biochemie und Biophysik andererseits stark unterscheidet, auf denen sie gleichwohl aufbaut und in die sie hineinwirkt. Das Gebiet, dessen Bezeichnung vom Gegenstandsbereich her eher zu weit ist („genomische und zellbiologische Informatik“ wäre präziser), ist gleichwohl heute so weit verzweigt, und seine Beherrschung verlangt so spezifische Methoden und Begriffe, dass man ein eigenes Ausbildungsfach dafür zu schaffen begonnen hat. Es wäre deshalb auch nicht zweckmäßig und aus Gründen der inneren Logik auch nicht sinnvoll, im Rahmen dieses einführenden Kapitels eine systematische Darstellung zu geben. Dafür gibt es geeignete Monographien, von denen wir einige bei den Literaturangaben aufführen. Es wird vielmehr um eine Übersicht gehen,

334

Sektion 3 · Diagnostik

die die Grundideen und begrifflichen Zusammenhänge des Fachs mit Zellbiologie, Pathophysiologie und Humangenetik klarstellt. Die zugrunde liegenden experimentell-methodischen Ansätze werden in den anderen Kapiteln dieses Buches genauer dargestellt.

3.3.2 Das menschliche Genom als Textspeicher Aus bioinformatischer Sicht enthält das menschliche Genom die Gesamtheit aller Baupläne, aller Strukturund Regulationsinformationen, die von jeder Zelle benötigt wird, um ihre Lebenstätigkeit aufrecht zu erhalten. Beim vielzelligen Organismus enthält es zudem die Informationen, die die notwendige Kommunikation und Steuerung zwischen den Zellen ermöglichen. Eine vollständige Kopie des Genoms wird bei jeder Zellteilung auf jede Tochterzelle übergeben. Auch bei der Entwicklung von Individuen einer neuen Generation, beginnend mit der Befruchtung der weiblichen Eizelle durch eine Spermazelle, wird ein voller Informationssatz aus den elterlichen Informationen gebildet und auf den zukünftigen Nachkommen übertragen. Das menschliche Genom lässt sich zum einen als materielle Struktur und zum anderen auch als Informationsbestand beschreiben. Sein wichtigster Bestandteil sind die 46 Chromosomen, die in jedem Kern einer Zelle mit diploidem Chromosomensatz in kondensierter Form vorhanden sind und mit speziellen Verfahren sichtbar gemacht werden können oder spontan bei der Zellteilung (Mitose) sichtbar werden. Jedes Chromosom besteht aus zwei fadenförmigen DNS-Molekülen, die als Doppelhelix verknäuelt und von zahlreichen Strukturproteinen umgeben als Nukleosomen vorliegen. Ein DNS-Faden wäre im aufgewickelten Zustand (was nur durch technische Tricks zu erreichen ist und in der Natur nicht vorkommt) einige Meter lang und besteht als Biopolymer aus einer Sequenz von einigen hundert Mio. Nukleotiden. Es gibt vier Arten von Nukleotiden, die mit chemischen und biochemischen Methoden an ihren Purin- bzw. Pyrimidinbasen erkennbar sind und mit den Buchstabenabkürzungen A und G sowie C und T bezeichnet werden. Dieser Übergang zur Abkürzung durch Buchstaben markiert den Übergang von der Biochemie zur Informatik und Textverarbeitung. Die Primärstruktur der DNS kann damit als Textfolge von entsprechend vielen Buchstaben verstanden werden. Die chemische Struktur sichert eine eindeutige Leserichtung des DNS-Textes: Man liest vom 5‘-Ende zum 3‘-Ende des Moleküls. Eine Sequenz, die in umgekehrter Reihenfolge gelesen würde, ergäbe ein anderes Molekül (so wie jeder unserer buchstabenkodierten Texte in der Schriftsprache nur in einer

definierten Leserichtung Sinn ergibt – von links nach rechts in lateinischer und von rechts nach links in arabischer und anderen Schriftsprachen). In der DNS-Doppelhelix sind zwei Fäden miteinander verwunden, die durch Wasserstoffbrücken zueinander komplementärer Nukleotide zusammengehalten werden. Zu jedem DNS-Text (z. B. 5‘}ATTTCG}3') gehört auf dem anderen Strang ein komplementärer Text (also in gegenläufiger Richtung gelesen: 5'} CGAAAT}3'), sodass die DNS üblicherweise komplementär gepaart auftritt: 5‘…A T T T C G…3‘ | | | | | | 3‘…T A A A G C…5‘

usw.

Das gesamte menschliche Genom befindet sich als Text kodiert in den 46 Chromosomen und umfasst ca. 3 Mrd. zueinander komplementärer Basenpaare (Nukleotidbausteine), als nahezu identische „Sicherungskopie“ jeweils doppelt vorhanden. Die Chromosomen sind nach ihrer Größe, der enthaltenen Textlänge und zahlreichen anderen Eigenschaften karyotypisch deutlich unterscheidbar. Es werden 44 Autosomen und zwei Geschlechtschromosomen unterschieden. Die Autosomen bilden 22 „homologe“ Paare von jeweils mikroskopisch sehr ähnlichen (gleich langen) und in ihrem molekularen Text nahezu gleichen Exemplaren (Unterschiede in der Textfolge zwischen homologen Autosomen treten nur alle 100 bis 1.000 Buchstaben auf). Die Autosomen werden nach ihrer Größe geordnet mit Nummern von 1 bis 22 versehen. Beim weiblichen Geschlecht finden sich weiterhin zwei wiederum zueinander sehr ähnliche X-Chromosomen, beim männlichen Geschlecht je ein X- und ein Y-Chromosom, die deutlich verschieden sind (das Y ist klein, während das X eines der größeren Chromosomen ist). Mit histologischen Methoden kann man auf den Chromosomen und damit auch auf dem zugehörigen DNS-Doppelfaden feiner unterteilte Abschnitte (Banden) unterscheiden, für die eine genau vereinbarte Nomenklatur vorliegt. So kann man DNS-Veränderungen (Deletionen, Translokationen) oft bereits mikroskopisch charakterisieren, ohne dass man alle Einzelheiten des zugehörigen Textes aufklären muss (analog wie bei einem Buch: wenn in einem Exemplar eine Seite oder ein ganzes Kapitel fehlt). Eine solche mikroskopisch nachweisbare Veränderung umfasst allerdings Hunderttausende, wenn nicht Millionen Buchstabenpaare des molekularen DNS-Textes. Geringfügigere Veränderungen lassen sich nur mit molekulargenetischen Methoden erfassen, indem man den Genomabschnitt kloniert und sequenziert. Neuerdings kann die Feinstruktur auch durch die PCR-Reaktion direkt und durch Hybridisie-

335 3.3 · Bioinformatik

rungs-Chips indirekt, aber fehlerfrei, nachgewiesen werden. Der Genomtext liegt im ruhenden Kern als DNSDoppelfaden in Eiweiß (Histon) verpackt vor und ist damit strukturell ganz analog wie ein informatisch kodierter Text z. B. im Plattenspeicher eines PCs. Und ebenso, wie ein Schaden im Plattenspeicher ärgerlich für den Nutzer ist, weil der Textabschnitt unlesbar wird, so kann ein Schaden im DNS-Text (durch chemische Mutagene, Röntgen- oder UV-Strahlung und andere Einwirkungen) die kodierte Information unlesbar machen und damit die zelluläre Funktion zerstören. Diese Analogie setzt sich auch dahingehend fort, dass man den Textinhalt eines Genomabschnitts in den Speicher eines Computers einschreiben kann. Verwendet man zur Speicherung eines Nukleotidpaars ein Byte (man kann natürlich einen 4-Buchstabentext auch dichter packen), dann passt das menschliche Genom in eine Datei von ca. 3 Gigabyte, also in den Speicher eines modernen PC’s. Einen Überblick über die moderne informatische Darstellung des menschlichen Genoms kann man sich auf der Website des European Bioinformatics Institute (EBI) verschaffen. Eine mögliche Einwahl ist über die Adresse www.ensembl.org/, und dort kann man dann das Icon von Homo sapiens anwählen und alle zusammengefassten Informationen aufsuchen. Eine alternative Darstellung, die durch ständigen Abgleich praktisch den gleichen Informationsgehalt hat, findet man bei einer Visite der Homepage des NCBI (National Center of Biotechnology Information) in den USA (www.ncbi.nih. gov/), von der aus man sich beispielsweise zu den Sequenzdaten für Homo sapiens durchwählen kann (http:// www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html). Allerdings ist die dargestellte Genomsequenz nicht diejenige eines bestimmten Individuums, sondern ein sog. Referenz- oder Standardgenom eines virtuellen Individuums. Will man alle individuellen Varianten erfassen, so braucht man bedeutend größere Speicherkapazitäten – für die nächsten Jahrzehnte ein sehr wahrscheinlicher Bedarf: Mit entsprechend gestalteten DNA-Chips wird man nämlich schon in naher Zukunft alle Unterschiede eines individuellen Genoms vom Standard feststellen können. Was man bisher über die Buchstabenunterschiede an einzelnen Positionen des Genomtextes gefunden hat, ist in der Datensammlung dbSNP („data base of SNPs“, „single nucleotide polymorphisms“) des NCBI einsehbar. Die Verschlüsselung der Genominformation als buchstabenkodierter Text ist selbstverständlich eine Umschreibung. Im Computer wird Text als Schaltzustand von Transistoren dargestellt; auf dem Bildschirm oder auf dem Papier sind es die geometrischen Formen von Schwärzungen auf einer ebenen Fläche. In der Zelle bestimmt die spezifische Nukleotidfolge der DNS über

3.3

physikochemische Wechselwirkungen die molekulare Feinstruktur des Moleküls. Der DNS-Doppelfaden bildet nämlich nur bei oberflächlicher Betrachtung eine homogene Wendeltreppe, während die spezifische Abfolge sich in Unterschieden der Feinstruktur widerspiegelt. Die Erkennung von Nukleotidfolgen in der geöffneten DNS erfolgt über diese Struktur: Ein Eiweißmolekül beispielsweise, das die Transkription eines DNS-Abschnitts reguliert, „erkennt“ die zugehörige Regulatorstelle der DNS, weil an sie seine regulierende Domäne mit deutlich höherer Affinität als für alle anderen DNS„Textstellen“ gebunden wird. Im Ergebnis erkennen alle Eiweißmoleküle, die in irgendeiner Form mit DNS interagieren (erkennen, spalten, ligieren, kopieren), den Text nach räumlichen physikochemischen Eigenschaften, aber im Prinzip analog wie die CPU eines Prozessors, freilich nicht immer mit gleicher Präzision. Die Mechanismen der DNS-Reparatur machen sich zumeist die Anwesenheit des komplementären Strangs zunutze, ähnlich wie man eine Computerdatei durch Mehrfachspeicherung oder selbstkorrigierende Verschlüsselung sichern kann. Die strukturelle Analogie zwischen DNS-Text und Computerdatei reicht noch weiter. So wie ein Text aus dem peripheren Speicher in die Zentraleinheit gelesen werden kann, so wird die Nukleotidsequenz eines Moleküls in RNS umgeschrieben. Sie liegt dann in gleicher Leserichtung als spezifische Nukleotidabfolge vor, mit dem Unterschied, dass das Thymidinnukleotid (T) durch ein Uracilnukleotid (U) ersetzt ist. Die RNS bildet auch keine Doppelhelix aus, sondern ist als Fadenmolekül direkt durch Enzyme zu bearbeiten (spleißen, spalten, verlängern usw.). Und so, wie ein Text aus dem Zentralspeicher auf den Bildschirm umgesetzt werden kann, so kann die Boten-RNS als Vorlage für die Synthese eines Eiweißmoleküls dienen, wobei nunmehr 3 Buchstaben (ein Kodon) für einen spezifischen Aminosäurebaustein kodieren. Ein ziemlich kleiner Anteil des menschlichen Genoms wird auf diese Weise als Bauvorschrift für Eiweiße der Zelle benutzt. Man kann diesen Anteil schätzen. Das menschliche Genom kodiert für (geschätzt) ca. 100.000 durch ihre Aminosäuresequenz unterschiedene Eiweiße. Manche Variation entsteht dabei durch Umorganisation von vorhandenen Genabschnitten, denn es gibt nur ca. 25.000 Gene (im Sinn von kodierenden DNS-Abschnitten). Ein Eiweißmolekül besteht im Mittel aus etwa 500 Aminosäuren, d. h., es ist durch 1.500 Nukleotide kodiert. Also kodieren mindestens 1.500 u25.000 = 37,5 Mio. DNS-Buchstaben für alle nachweisbaren Eiweiße, das sind 1,25% von 3 Mrd. DNS-Text-Buchstaben insgesamt. Es ist heute noch nicht klar, welche Funktion die 98,75% „Rest“-DNS erfüllen, wenn man von einem geringen Anteil an regulatorischen Orten in der Nähe von eiweißkodierenden

336

Sektion 3 · Diagnostik

Sequenzen absieht, mit denen Öffnung und Transkriptionsgeschwindigkeit solcher Sequenzen gesteuert wird. Es hat den Anschein, als ob große Teile des menschlichen Genomtextes sinnlos sind: vielleicht Platzhalter für evolutionär neue Information, ähnlich wie im Plattenspeicher eines Computers beliebiger „Müll“ stehen kann, bis eine bestimmte Instruktion ihn mit definiertem Inhalt versieht. Für die informatische Behandlung des menschlichen Genoms ist es eine entscheidende Komplikation, dass die kodierenden Textdateien keineswegs kompakt vorliegen, sondern weit verstreut über den Gesamtgenomtext und zudem noch in „zerhackter“ Form, also mit nichtkodierenden Textabschnitten (Introns) zwischen den kodierenden Teilstücken (Exons). So kann ein längeres Eiweißmolekül von z. B. 1.000 Aminosäuren gelegentlich durch z. B. 50 solcher Exonabschnitte unterschiedlichster Länge (im Mittel also 60 Nukleotide pro Exon) kodiert sein. Dazwischen sind dann z. B. 30.000 Buchstaben als Introns (also ein 10-facher Textumfang!) eingebaut. Auch für diese verteilte Speicherung gibt es eine Analogie bei der Speicherung von Dateien z. B. auf einer Diskette; allerdings gibt es für das Genom kein Dateiverzeichnis, nach dem man den sinntragenden Text ermitteln kann. Der zelluläre „Spleißmechanismus“ ist vielmehr aufgrund örtlicher Besonderheiten der Raumstruktur der DNS in der Lage, Exons und Introns zu unterscheiden und die Bruchstücke richtig zusammenzufügen. Der Molekularbiologe, dem ein Genomabschnitt als DNS-Text vorliegt, hat also die Aufgabe, diese Kodierungsstruktur zu entschlüsseln, wenn er erkennen will, was für ein Eiweiß oder was für eine Ribonukleinsäure in diesem Abschnitt kodiert und wie ihre Ablesung reguliert ist. Für diese Aufgabe steht ein ganzes Arsenal von Computerprogrammen zur Verfügung, die mit mathematischen Methoden in den vorliegenden Genabschnitten Exons, Introns, Promoter-Strukturen und andere Transkriptionsfaktorenbindungsorte, Spleißorte usw. vorherzusagen gestatten und damit die genaue experimentelle Aufklärung der genetischen Architektur durch geeignete Arbeitshypothesen erleichtern. Diese Methoden sind in den einschlägigen Darstellungen der Bioinformatik unter dem Allgemeinbegriff „gene prediction“ auffindbar (siehe z. B. Mount 2001).

3.3.3 Sequenzanalyse als Basis der Bioinformatik Historisch gesehen hat sich die Bioinformatik in den späten 1980er Jahren aus dem Spezialgebiet der Sequenzanalyse von Biomakromolekülen entwickelt. Seit den 1960er Jahren konnte man Aminosäuresequenzen von Eiweißen und seit den frühen 1980er Jahren Nukleotid-

sequenzen von Nukleinsäuren ermitteln, und das Wissen nahm sowohl dem quantitativen Ausmaß nach als auch hinsichtlich des qualitativen Verständnisses so stark zu, dass die klassischen Methoden der Papier- und Bleistiftanalyse von Sequenzen durch den Einsatz von Computerprogrammen ersetzt werden mussten. Alle bioinformatischen Verfahren, die das Genom als Text auffassen, arbeiten mit gemeinsamen Werkzeugen, die man als Ähnlichkeitsanalyse auffassen kann. Beispielsweise kann man DNS-Abschnitte verschiedener Arten als funktionsgleich nachweisen, wenn der Text übereinstimmt. Man gibt dem Computerprogramm für beide Genome einen Suchauftrag und findet identische oder fast identische Textstellen. Für die Auffindung von teilweise identischen Segmenten kann man entsprechende logische Ausdrücke bilden, ähnlich wie man in einem Text mit dem Suchmuster „Sonne“ Einträge wie „Sonnensegel“ und „Sonnenflecken“ gemeinsam heraussuchen kann. Auf diese Weise kann man in genomischen Datenbanken z. B. alle β-Globin-Sequenzen der verschiedensten Tierarten heraussuchen und danach einen Stammbaum aufstellen. Ähnlichkeit erscheint hier als Identität oder Nahezu-Identität von Buchstabenfolgen. Mit gewissen Einschränkungen kann man Textähnlichkeit als evolutionäre Verwandtschaft interpretieren: Man spricht von Homologie. Dazu allerdings reicht das Kriterium von anteiliger Identität der Buchstabenfolge nicht mehr aus. So sind im Deutschen die Worte „Drommete“ und „Trompete“ durchaus verschieden, sodass man sie in einem Lexikon nicht als Verwandte auffinden wird. Ihre hohe Ähnlichkeit wird man nur erkennen, wenn man sie untereinander anordnet (ein „alignment“ bildet), Drommete | | | | | ||| Tr om p et e, und dann berücksichtigt, dass die Paare D/T und M/P ähnliche Laute sind, die längerfristig über Aussprachevarianten ineinander übergehen können. Man erkennt dann die evolutionäre Verwandtschaft, die Homologie, beider Textstellen. Das ist auch ein Hinweis auf gleiche Bedeutung, allerdings kein zwingender: Auch verwandte und fast gleich klingende Wörter können verschiedene Bedeutung tragen („Post“ vs. „Posten“). Die Analyse von genomischen Sequenzen mithilfe von mathematischen Algorithmen ist zu einem wichtigen Werkzeug der molekularen Genetik geworden. Es gibt seit einigen Jahren Standardverfahren dieser Methode in zahlreichen Varianten (z. B. BLAST, FASTA). Sie sind über Internet für jeden Nutzer zugänglich, der einen Such- oder Analyseauftrag formuliert und eine Aufstellung der hinsichtlich Textähnlichkeit am meisten

337 3.3 · Bioinformatik

verwandten Sequenzen aus den Genomdatenbanken erhält. Im Zusammenhang mit dem Begriff der Homologie ist die statistische Signifikanz von Sequenzähnlichkeit von entscheidender Bedeutung. Das Grundprinzip hierfür lautet: Die Ähnlichkeit zweier Sequenzstücke ist signifikant, wenn ihr Auftreten durch Zufall zwar nicht unmöglich, aber doch außerordentlich überraschend wäre. Zur Illustration, wie dieses Prinzip eingesetzt wird, sei kurz die mathematische Behandlung eines einfachen Falles skizziert. Wir nehmen an, dass wir einen vorhandenen Textabschnitt Buchstabe für Buchstabe erwürfeln wollten. Die Wahrscheinlichkeit dafür, dass wir den jeweils richtigen Buchstaben treffen, sei mit p bezeichnet (für das 4-Buchstaben-Alphabet der DNS ist p ungefähr bei 0.25, wenn jeder Buchstabe etwa gleich häufig auftritt). Die Wahrscheinlichkeit, ein Wort der Länge L (z. B. aus L=10 Buchstaben) richtig zu erwürfeln, ist gleich dem Produkt aus den einzelnen Wahrscheinlichkeiten, also p up up u}up = pL. In einer Datenbank, die N+L Buchstaben enthält (z. B. N = 1 Mio.), suchen wir das Wort und nehmen an, dass wir mit einem Fenster mit der Buchstabenlänge L über die Buchstabenfolge gleiten und jedes Mal auf volle Übereinstimung testen. Es gibt N verschiedene Fensterpositionen mit Textausschnitten von jeweils L Buchstaben. Das bedeutet, dass wir den Versuch, das Wort zu erwürfeln, N mal unabhängig (nicht vollständig, wegen der Überlappung von Fenstern, aber praktisch unabhängig) wiederholen. Wie überraschend ist es nun, wenn ich das Wort in der Datenbank von 1 Mio. Textbuchstaben finde? Die Antwort erhält man durch eine indirekte Überlegung. Die Wahrscheinlichkeit Q, dass ich bei einmaligem Versuch das Wort verfehle (also wenigstens eine Abweichung zwischen Suchwort und Textausschnitt in einem Fenster von L Buchstaben registriere) ist gleich 1pL. Die Wahrscheinlichkeit, dass ich bei N Versuchen niemals das Wort treffe, ist das entsprechende Produkt von Einzelwahrscheinlichkeiten, also QN, wofür man als sehr gute Näherung die Exponentialfunktion QN # exp ( N upL) einführen kann. Die Wahrscheinlichkeit, wenigstens einmal das Wort zu treffen, ist wiederum das Komplement dazu: Wahrscheinlichkeit (Wort tritt t1-mal auf) = 1exp (NupL).

3.3

Für p = ¼, L = 10 und N = 106 ermittelt man auf dem Taschenrechner den Wert 0.61. Das bedeutet: Man hat eine gute Chance, das Wort der Länge L = 10 durch Zufall zu treffen; das Auftreten ist nicht überraschend. Beträgt L dagegen 16, dann ist die Wahrscheinlichkeit gleich 2 u104, also sehr klein, sodass der Treffer überraschend ist. Im ersteren Fall würden wir das Auftreten des 10-Buchstaben-Worts in der 1-Millionen-Datenbank als zufällig denkbar, nicht signifikant, im zweiten den 16-Buchstaben-Treffer als hochsignifikant, d. h. unter Zufallseinwirkung als sehr überraschend ausweisen. Diese Berechnungen werden komplizierter, wenn bei der Homologiesuche auch Abschnitte zugelassen sind, die nicht vollständig übereinstimmen, oder wenn Lücken und Einschübe erlaubt sind (s. Karlin u. Altschul 1990; Arratia u. Waterman 1994; Vingron u. Waterman 1994). Das Grundprinzip bleibt jedoch immer das gleiche: Die Wahrscheinlichkeit für das zufällige Auftreten eines Befundes geht mit der Größe der Datenbank (der Anzahl an wiederholten Suchvorgängen) exponentiell gegen Null. Damit einhergehend steigt die „Überraschung“. Man nützt dieses Prinzip für den Entwurf passender sog. Primer für die PCR-Reaktion aus: Ein Oligonukleotid der Länge 10 ist zum Aufsuchen eines bestimmten Genortes ungeeignet, weil es im 3-Milliarden-Genom des Menschen einige Tausend Mal vorkommen müsste. Ein Oligo der Länge 16 ist eher geeignet, da man es mit Wahrscheinlichkeit 0,5 mindestens einmal, aber nicht sehr oft im Genom finden wird. Ein Oligo der Länge 20 hingegen tritt durch Zufall nur mit geringer Wahrscheinlichkeit (0,0027) ein- oder mehrmals auf: Kennt man eine solche Sequenz am interessierenden Ort, dann kann man recht sicher sein, dass sie nicht noch an anderer Stelle durch reinen Zufall zu erwarten ist. In allen Fällen muss man sich aber bewusst bleiben, dass Überraschungseffekt und Signifikanz durch Vergleich mit einem idealisierten Zufallsmodell ermittelt werden. Dessen Grenzen mögen bei einem Umfang des menschlichen Genoms erreicht sein. Das Analogon des Münzwurfs zeigt, dass das Modell nicht mehr plausibel bleibt, wenn die Anzahl der Versuche alle Grenzen überschreiten würde. Die Theorie sagt z. B. für das wiederholte Münzenwerfen, dass man eine ununterbrochene Serie der Länge von 30-mal „Zahl oben“ wenigstens einmal erwarten kann, wenn man 1-Milliarde-mal würfelt – und trotzdem wird niemand mehr an unbeeinflussten Zufall glauben wollen, wenn man eine solche Serie erzielt hat. (Milliardenfacher Münzwurf ist allerdings auch nicht realisierbar; analoge „Zufalls“-Versuche könnte man jedoch z. B. bei radioaktivem Zerfall durchführen).

338

Sektion 3 · Diagnostik

3.3.3.1 Praktische Verfahren der Sequenzanalyse Ein historischer Meilenstein der Entstehung der Bioinformatik als Fach war die Publikation des NeedlemanWunsch-Algorithmus (Needleman u. Wunsch 1970), also einer programmierbaren Rechenvorschrift, mit der ein Computer die verwandtschaftlichen Ähnlichkeiten von Aminosäure- oder Nukleotidbuchstabensequenzen herausfiltern und numerisch bewerten konnte. Der Algorithmus wurde später verfeinert und schneller gestaltet (sog. Smith-Waterman-Verfahren), aber er bleibt weiterhin eines der wichtigsten Werkzeuge der Bioinformatik. In seiner Grundform ermöglicht er das Alignment (buchstabengerechte Anordnung) von ähnlichen Sequenzen und damit die Suche nach bestimmten Sequenzmotiven oder Sequenzen in umfangreichen Datenbanken. Die Suche nach Sequenzübereinstimmungen erfolgt mit den mathematischen Verfahren der dynamischen Programmierung. Die Grundidee ist sehr leicht zu verstehen. Sie wird in den Lehrbüchern der Bioinformatik dargestellt. Im Prinzip stellt man die zu vergleichenden Sequenzen als Buchstabenfolge in der ersten Reihe und der ersten Spalte einer rechteckigen Matrix dar, notiert in den Matrizenzellen den Grad der Übereinstimmung von zwei Buchstaben in den zugehörigen Positionen und sucht dann einen Weg durch die Matrix, bei dem die Übereinstimmung (z. B. die Summe der beieinander liegenden Sequenzabschnitte) möglichst groß wird. Das Aufsuchen ähnlicher Sequenzen oder Sequenzabschnitte aus umfangreichen Datenbanken wird heutzutage durch entsprechende Programme unterstützt. Nahezu alle Programme arbeiten entweder nach dem FASTA oder dem BLAST-Algorithmus, deren Unterschiede im Suchalgorithmus in den einschlägigen Lehrbüchern erklärt werden. BLAST („basic local alignment search tool“) steht dabei für eine Sammlung der am meisten genutzten Sequenzanalyseprogramme und wird vom bereits erwähnten National Center for Biotechnology Information betrieben. Prinzipiell geht es darum, experimentell ermittelte Sequenzen mit bereits in den BLAST-Datenbanken vorhandenen abzugleichen. Eine Suche in der Datenbank erfolgt entweder über ein Webinterface oder mithilfe von lokal installierten Programmen. Seit Mitte der 1980er Jahre werden DNS-Sequenzen in steigendem Maße aufgeklärt und „annotiert“ (d. h. mit ausführlicher Zusatzinformation versehen). Anfangs wurden sie noch in Originalarbeiten in Tabellenform mitgeteilt; aber davon ist man abgekommen, weil der Umfang an Genomtext nicht mehr mit traditionellem Tabellendruck zu bewältigen war. Heute werden neu entdeckte Nukleotidsequenzen in Sequenzdatenbanken gesammelt und über das Internet für die Nutzung zur

Verfügung gestellt. Sie sind untereinander vernetzt, sodass sie sich im Großen und Ganzen auf dem gleichen Informationstand befinden. Die gegenwärtig populärste Sammlung von Nukleotidsequenzen wird als „GenBank“ vom National Center for Biotechnology Information (NCBI) in Bethesda, Maryland (USA) unterhalten (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html). Sie ist mit einem Kommunikationssystem ENTREZ verbunden (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gquery/gquery. fcgi), das die Vernetzung der zahlreichen Datenbanken durch den Nutzer ermöglicht. Über diese Internetdokumentation kann man auch relevante Literatur aussuchen lassen und hat Zugang anderen Datenbanken, in denen mehr als nur Sequenzen gespeichert und annotiert sind. Genbank wurde vor einigen Jahren mit der „EMBL Data Base“ des European Molecular Biology Laboratory in Heidelberg vereinigt, die jetzt in Hinxton (England) unter dem gemeinsamen Markenzeichen „ensembl“ lokalisiert ist: http://www.ebi.ac.uk/ensembl/). Die Nukleotidsequenzdatenbank enthält Sequenzabschnitte, z. T. vollständige Gene (also die regulatorischen Randabschnitte sowie alle Exons und Introns) und neuerdings in zunehmendem Maße ganze Genome (zunächst kleinere Genome von Mikroorganismen) in Buchstabenform. Neben den langen Nukleotidtexten enthält ein Eintrag (von dem es viele Zehntausende gibt – die Datenbanken wachsen mit hoher Geschwindigkeit) zahlreiche zusätzliche Klartextinformationen, sog. Annotationen, die in einem bestimmten Textformat abgelegt sind: x Zugangskodes für einen Eintrag x Querverweise auf andere Datenbanken, die das gleiche Objekt, oft unter anderen Aspekten, enthalten x Genaue Bezeichnung des Gens oder Genabschnitts x Angaben zur Funktion des zugehörigen Genprodukts (wenn der DNS-Text für ein solches kodiert) x taxonomische Quelle (von welcher Art die Sequenz ermittelt wurde – es wird ein Standardgenom dieser Art angenommen) x Angaben zur Genstruktur des beigefügten Genomtextes (z. B. Exon, Intron, repetitive Abschnitte) x Autorennamen und Referenzen auf Artikel, in denen die Entdeckung mitgeteilt wurde x Statistische Angaben (Länge, Buchstabenhäufigkeit u. a. ) Über diese globale Nukleotidsammlung hinaus gibt es auch Spezialdatenbanken für die genomischen Sequenzen bestimmter, häufig erforschter Arten, die dann auch speziellere Angaben zu diesen Objekten als nur Gensequenzen enthalten, z. B.: x Flybase, eine Datenbank für molekulargenetische Angaben über die Taufliege Drosophila (flybase.bio. indiana.edu)

339 3.3 · Bioinformatik

x ACEDB, die Datenbank für Angaben über den Rundwurm Caenorhabditis elegans, einschließlich seiner Genomsequenz (www.acedb.org, angesiedelt am EBI in Hinxton) x TIGR (The Institute for Genome Research) – enthält partielle und vollständige Genomsequenzen zahlreicher prokaryotischer, protozoischer und Pilzorganismen (www.tigr.org) x SGD (Saccharomyces Genome Database, www. yeastgenome.org/) enthält neben vielen spezifischen Angaben auch die vollständige Sequenz der Bäckerhefe. Neuere Entwicklungen dieser Datenbanken gehen in zwei Richtungen: x Sie werden mehr und mehr zu umfangreichen und komplexen Informationsdateien, bei denen die Gensequenz nur eine Teilinformation darstellt x Der Eintrag enthält nur noch einen geringen Teil der mitgeteilten Information. Er ist vielmehr mit zahlreichen Querverweisen (Links) ausgestattet, über die man Details anwählen kann.

3.3.4 Genomkartierung Bei der genomischen Textanalyse kommt es auf die Beschaffenheit der Sequenz an; bei der Kartierung hingegen geht es darum, wo im Genom sich eine gegebene Sequenz befindet. Ein Gen zu kartieren, d. h. festzustellen, auf welchem Abschnitt welchen Chromosoms sich die zugehörige Information als DNS-Sequenz befindet – das ist eine wesentliche Vorbedingung dafür, dass man ein Gen, das für ein bestimmtes Merkmal (z. B. hoher Cholesteringehalt im Blut) verantwortlich ist, klonieren (d. h. in Bakterien vermehren) und sequenzieren kann. Die Karte eines Genomabschnittes kann man vergleichen mit der Markierung eines Autobahnabschnitts im Autoatlas. In regelmäßigen Abständen entlang der Strecke sind Markierungen aufgestellt, die es z. B. gestatten, sehr genau die Position eines Fahrzeugs mitzuteilen, das liegen geblieben ist. Auf dem Genom spricht man von Markern, und die Abstände zwischen ihnen werden entweder genetisch oder physikalisch definiert. Der physikalische Abstand zwischen zwei Genorten ist definiert durch die Anzahl von Basenpaaren zwischen ihnen. Der genetische Abstand hingegen wird definiert durch die Häufigkeit, mit der es bei der meiotischen Keimzellreifung zum Austausch von genetischem Material zwischen den homologen Orten am Chromosom kommt (Rekombination). Der genetische Abstand wächst monoton, aber nicht streng proportional mit dem physikalischen Abstand. Im menschlichen Genom beträgt der genetische Abstand im Durchschnitt 1 cM (centimorgan),

3.3

wenn der physikalische eine Million Basenpaare (1 Mbp) beträgt. Das Centimorgan ist die Einheit der genetischen Distanz und ist definiert als Rekombinationswahrscheinlichkeit von 1% pro Meiose (man bezeichnet diese Wahrscheinlichkeit auch mit dem Buchstaben θ und definiert 1 cM durch θ = 0,01). Die Rekombinationswahrscheinlichkeit schwankt an verschiedenen Orten des Genoms erheblich um den genannten Durchschnittswert. Man spricht von „hot spots“ (heißen Flecken) und „cold spots“ (kalten Flecken). Zwischen zwei Hot spots kann es längere Abstände ganz geringer Rekombinationshäufigkeit geben. An solchen Abschnitten kommt es also selten zu Rekombination, und deshalb werden große Sequenzabschnitte als unveränderte Kopie weitervererbt. Wenn sich z. B. die DNSInformation für zwei Gene auf dem Chromosom in einem solchen „kalten“ Abschnitt befindet, dann werden die betreffenden Allele mit großer Wahrscheinlichkeit gemeinsam auf ein neues Chromosom übertragen und nicht durch Rekombination auf das homologe Chromosom neu zusammengesetzt. Man sagt, sie seien „gekoppelt“ („linked“). Von Kopplungsgleichgewicht („linkage equilibrium“) spricht man, wenn zwischen den beiden Genorten frei rekombiniert wird, während die mehr oder weniger starke Kopplung (also θ-Werte, die gegen null tendieren) als Kopplungsungleichgewicht („linkage disequilibrium“) bezeichnet wird. Bei der Rekombination werden also stets aus den zwei Ursprungstexten (auf den homologen Chromosomen an der gleichen Stelle befindlich) durch Vermischung zwei neue Texte erstellt, die aber gleich lang sind und im Prinzip den gleichen Inhalt aufweisen. Auf diese Weise kann es z. B. geschehen, dass zwei Buchstabenvarianten, die zuvor auf den verschiedenen Chromosomen auftraten, nach dem Überkreuz-Austausch nunmehr auf demselben vorhanden sind, während das zweite „neue“ gar keine Variante mehr trägt. Ein genetischer Marker war noch in gar nicht fernen Zeiten nicht etwa ein Genomabschnitt, sondern in der Regel eine phänotypisch feststellbare Eigenschaft, die von einem bestimmten Genort vererbbar bestimmt wird. Die zahlreichen Blutgruppen oder HLA-Antigene sind solche Marker, nämlich als Eiweiße sind sie Genprodukte von einem genau feststehenden Genort. Durch geschickte Untersuchungen gelang es, solche Marker zytogenetisch definierten Chromosomenorten zuzuordnen. Mit der technischen Realisierung der Gentextablesung wurden anstatt charakteristischer Genprodukte zunehmend gewisse DNS-Oligonukleotide der Primärstruktur als Marker benutzt, wenn sie nur einmal auf dem Genom vorkommen (im vorigen Abschnitt wurde das Abschätzungsprinzip dargestellt, mit dem man berechnet, wie lang sie sein müssen, damit sie mit hoher Sicherheit nur einmal vorkommen, also Unikate sind). Für jeden von ihnen ist die Position auf dem Chromo-

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Sektion 3 · Diagnostik

som festzustellen, und dann dienen sie zur Kartierung weiterer Genomabschnitte. Oligos mit bekannter Lokalisierung auf Chromosomen und Abschnitten nennt man STS („sequence tagged site“). Zur Aufstellung einer Karte benutzt man 3 Methoden: x Isolierung eines bestimmten Chromosoms und Feststellung eines Satzes unikaler Markersequenzen auf ihm x Kartierung durch das Radiation-Hybrid-(RH-) Verfahren x Kartierung aus einem Satz von Familienstammbäumen Bei der Verwendung von Oligos als Marker hat man neben der Bedingung der Unikalität auch noch technische Gesichtspunkte zu berücksichtigen, beispielsweise, wie gut sie für die PCR-Reaktion (Enzym, das DNS-Segmente erkennt und kopiert) geeignet sein müssen. Die Kartierung durch Hybridisierung bestrahlter Genomabschnitte („radiation hybrid mapping“) ist eine physikalische und geschieht nach folgendem Prinzip: Der Genomabschnitt wird durch Klonierung vervielfältigt, und jeder Klon wird mit einer kräftigen Röntgendosis bestrahlt. Dadurch entstehen zahlreiche DNS-Bruchstücke unterschiedlicher Länge, die mit gewissen anderen teilweise überlappen. Jedes dieser Bruchstücke wird in die Zellen einer Zellkultur integriert und dadurch vermehrt. In jedem Klon kann man nun das Vorhandensein der Marker testen. Zwei Marker werden im intakten Genomabschnitt umso näher beieinander liegen, je seltener sie durch den zufälligen Schnitt getrennt wurden. Mithilfe dieses paarweisen Vorkommens und der Überlappungen auf verschiedenen Klonen kann ein entsprechend komplexer Computeralgorithmus die lineare Folge der Marker mit hoher Sicherheit feststellen: eine Art Puzzlespiel. Eine andere Variante der Entwicklung eines Panels geht von genetischen Abständen aus. Hier wird ausgenutzt, dass während der Reifungsteilung der Vorläufer der Geschlechtszellen die Chromosomen durch „crossing-over“ weitgehend nach dem Zufallsprinzip Genomabschnitte austauschen (rekombinieren). Hat man nun DNS-Proben von stark verzweigten und über viele Generationen erfassten Familien (wie in dem CEPH-Panel des französischen Centre des Ètudes de Polymorphisme Humain), dann liegen genug Platzwechsel auf andere Chromosomen vor, dass man wiederum nach dem gleichen Prinzip zwei Marker als umso näher beieinander definiert, je seltener die Allele durch Rekombination voneinander getrennt werden. Auch hier gibt es wahrscheinlichkeitstheoretische Algorithmen, die das notwendige Puzzlespiel aufzulösen helfen.

Die gegenwärtig am besten ausgearbeiteten RH-Karten werden von folgenden Institutionen im Internet angeboten: x Whitehead Institute /MIT Center for Genome Research x Stanford Human Genome Center. Das NCBI zeigt eine integrierte RH-Karte. Die populärste genetische Karte des Humangenoms wird vom französischen Généthon Centre entwickelt. Andere Karten sind die deCode Map und die Marshfield Map. Eine internationale Datenbank für die Annotation des humanen Genoms wird bei www.dbg.org betreut. Das bereits erwähnte, vom NCBI in Bethesda bei Washington unterhaltene Informationssystem bietet auch genetische und physikalische Karten an, die ebenso wie Nukleotid- und Proteindatensammlungen über die Suchmaschine ENTREZ angesprochen werden können. Zum System gehört ein grafisches Interface, das es gestattet, speziell Karten des humanen Genoms aufeinander abzubilden und, wo es möglich ist, auch Sequenzdatenbanken einzubeziehen. Schließlich ermöglicht das System auch Querverweise auf die Datenbank OMIM von humanen Krankheitsbildern, die nach den Mendelschen Gesetzen vererbt werden. Für all diese Vergleiche und Recherchen bietet das System ein verzweigtes Panel zur interaktiven Informationsrecherche an.

3.3.5 Vergleichende Genomanalyse: Die evolutionäre Verwandtschaft allen Lebens Nachdem Ende der 1980er Jahre zunächst die Idee vorherrschte, vor allem das menschliche Genom zu kartieren und zu sequenzieren, hat sich inzwischen die Erkenntnis durchgesetzt, dass viele molekulargenetische und medizinisch relevante Sachverhalte sich weit besser an sog. „Modellgenomen“ studieren lassen – das sind Genome von Spezies, die aufgrund ihrer Struktur leichter aufzuklären und außerdem direkter experimenteller oder züchterischer Bearbeitung zugänglich sind. Gegenwärtig stehen die Genome von Labormaus, Laborratte, Zebrafisch, Fugu-Fisch, Rundwurm Caenorhabditis elegans (C. elegans), Taufliege Drosophila melanogaster und Bäckerhefe S. cerevisiae im Vordergrund des komparativ ausgerichteten Forschungsinteresses. Das ganze Projekt ist deshalb fruchtbar, weil, wie sich inzwischen herausstellte, die Organisations- und Steuerungsprinzipien der Genome und sogar die Strukturen einzelner Gene im Tierreich nach einem einheitlichen Prinzip aufgebaut sind, was dem komparativen Ansatz für jeweils passende Fragestellungen hohe Aussagekraft verleiht. Das Maus-

341 3.3 · Bioinformatik

genom weist hohe Ähnlichkeit mit dem menschlichen Genom auf, und die Unterarten Mus musculus und Mus spretus sind (wegen der Möglichkeit der experimentellen Inzucht) genetisch weit besser charakterisiert als Homo sapiens. Der Zebrafisch Danio rero hat einen embryonalen Zyklus, der bei weitgehend durchsichtigem Körper im Aquarium (nicht im Ei oder in utero) stattfindet. Der japanische Fugu-Fisch hat ein sehr kompaktes Genom, das aber kartographische Ähnlichkeit mit dem menschlichen aufweist und als Studienmodell für den Nachweis von Genstrukturen (Exon-Intron) von Nutzen ist. Drosophila melanogaster schließlich ist seit hundert Jahren genetisch charakterisiert und kartiert worden, und es ist eine Fülle von Genen und Mutationen der Organdifferenzierung bekannt, wobei überraschend viele Analogien zu Homo sapiens nachgewiesen sind. Drosophila ist darüber hinaus hervorragend geeignet, um embryonale Entwicklungsprozesse zu studieren, z. B. die Ausprägung von Augen- oder Flügelanlagen als polygenes Phänomen. Die Hefe Saccharomyces ist das wichtigste Studienobjekt für die Erforschung des Wachstumszyklus der Zelle. Bei Caenorhabditis elegans tritt Eutelie auf, d. h., der reife Fadenwurm hat stets die gleiche Anzahl von 959 Körperzellen, von denen jede ganz individuell differenziert ist, wodurch man Prozesse der Genexpression gut studieren kann (abgesehen davon, dass das Tier leicht auf Agarkolonien von Bakterien zu züchten ist). An C. elegans hat man darüber hinaus den neuralen Entwicklungsprozess sowie die zelluläre Architektur der Apoptose genetisch aufgeklärt. Die Bedeutung für die medizinische Grundlagenforschung ist mit diesen kurzen Skizzen nur im Umriss erfasst. Wesentlich ist jedoch, dass für diese Modellorganismen die volle genomische und Genomexpressionsinformation ermittelt wird. Gerade der Vergleich der Genome zwischen so genau charakterisierten, aber in völlig verschiedenen Lebensbedingungen existierenden Arten (zu denen dann noch zahlreiche Bakterien- und Parasiten- sowie pflanzliche Genome kommen) hat einen sprunghaften Fortschritt in der Aufklärung auch des menschlichen Genoms hervorgebracht. Für Analysen dieser Art bietet das NCBI die Oberfläche ENTREZ an, in der neben vielen anderen Informationen auch die physikalischen und genetischen Karten verschiedener Organismen aufeinander abgebildet werden und verglichen werden können.

3.3.6 „Transkriptom“: Expressionsanalyse des Genoms Unter Genexpression versteht man die Transkription von DNS-Abschnitten in Struktur-RNS und Boten-RNS sowie die Umsetzung der Boten-RNS-Sequenzen in Pro-

3.3

tein. Das Genom enthält Bauplaninformation für Genprodukte (Eiweiße und manche RNS) und auch Steuerungsinformation für den Abgriff (Promoter-, Enhancer-Sequenzen usw.) und für die Spleißung (Donor- und Akzeptorstellen für das Spleißen). Da jede Körperzelle den gleichen Informationsbestand aufweist, unterliegt sowohl die Tatsache der Ablesung (jede Zelle liest überhaupt nur einen Teil der Information) als auch die dabei hergestellte Molekülzahl sorgfältiger Steuerung. Bei funktionellen oder entwicklungsdynamischen Änderungen des Zellstoffwechsels ändern sich diese Verhältnisse. Zum Beispiel hat eine Tumorzelle ein anderes mRNS-Profil als die zugehörige gesunde Zelle; ebenso ist das Genproduktspektrum vom Funktions- und Krankheitszustand einer Zelle abhängig. Wenn man berücksichtigt, dass jede Körperzelle einige Tausend bis mehrere Zehntausend verschiedener Genprodukte abgreift, dann wird die Komplexität dieser Vorgänge klar: Nach der elektrophoretischen Auftrennung markierter Transkriptsegmente oder Peptidspaltprodukte entstehen Muster mit Tausenden von Banden oder Flecken, deren unterschiedliche Farbintensität auf quantitative Unterschiede hinweist. Neuerdings ist es gelungen, das Prinzip der Hybridisierung, d. h., dass sich zueinander komplementäre Nukleinsäureabschnitte durch Wasserstoffbrückenbindung sehr spezifisch verbinden können, auch für die Analyse der Genexpression (d. h. Ablesung der Gene) in großem Maßstab verwendbar zu machen. Man stellt beispielsweise Mikrochips her, auf denen Oligonukleotide in mikroskopisch kleinen, aber sehr genau auffindbaren Abständen aufgebracht sind, sodass eine zu einem individuellen Oligonukleotid komplementäre mRNS-Sequenz (oder -teilsequenz) fest gebunden und mit Farbverfahren sichtbar gemacht wird. Auf diese Weise kann man ein quantitativ bewertbares Muster der in einer Zelle auftretenden individuellen mRNS-Moleküle gewinnen. Diese Transkriptomanalyse ist ein Zwischenschritt zur Proteomanalyse, da die mRNS nur ein Zwischenschritt zur Proteinsynthese ist und die Anzahl an mRNS-Molekülen aufgrund von weiteren Bearbeitungsprozessen noch nichts quantitativ Genaues über die letztlich in den Ribosomen gebildete Anzahl von Proteinmolekülen aussagt, deren Analyse das eigentliche Ziel der funktionellen Genomik ist. Gegenwärtig werden in großem Umfang Datenbanken von EST-Sequenzen angelegt. EST („expressed sequence tags“) werden gewonnen, indem man BotenRNS in DNS umschreibt (mit dem Enzym Transkriptase) und dann PCR-sequenziert. Im Ergebnis liegen „Genschnipsel“ der Länge von einigen Hundert Nukleotiden vor, von denen gewiss ist, dass sie transkribiert wurden. Oft lässt sich aus ihnen auch die Exonstruktur ableiten, wenn der zugehörige genomische Abschnitt

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Sektion 3 · Diagnostik

ebenfalls vorliegt. Vor allem aber sind ESTs, wenn sie hinreichend deutlich auf das zugehörige Gen verweisen, ein Hinweis darauf, dass das Gen im gegebenen Funktionszustand der gegebenen Zelle exprimiert wird. EST-Datenbanken sind ein wertvolles Hilfsmittel in der bioinformatischen Analyse des menschlichen und anderer Genome.

3.3.7 Proteomik: Das Eiweißprofil einer Zelle Während bis in die 1980er Jahre das Studium des Genoms und des Zellstoffwechsels weitgehend voneinander getrennt verliefen und nur geringfügig integriert abliefen, hat sich neuerdings eine enge Verzahnung herausgebildet. Die mächtige methodische Kopplung besteht darin, dass heutzutage anstelle der direkten Sequenzierung der Primärstruktur eines Eiweißes die Sequenzierung der zugehörigen genomischen DNS und Übersetzung in die Proteomsprache weitaus einfacher ist. Die DNS-Sequenz-Datenbanken enthalten Angaben über die kodierenden Abschnitte, die sich einfach in Aminosäuresequenz umsetzen lassen. Die Mehrzahl der neu entdeckten Proteine, besonders solche, die nur in Spuren in der Zelle vorkommen, sind über den zugehörigen Sequenzbauplan im Genom gefunden worden. Man kennt auf diese Weise die Sequenz von Zehntausenden von „vermutlichen“ Proteinen, für die noch keine Funktion bekannt ist. In manchen Fällen lässt sich die Funktion durch „Knockout“-Versuche ermitteln: Man schaltet das zugehörige Gen ab oder inaktiviert es durch gezielte Mutagenese (Maus, Zebrafisch und Taufliege sind geeignete Modellorganismen) und ermittelt die Auswirkungen im Phänotyp. Leider sind diese oft nicht deutlich oder dadurch verdeckt, dass andere Genabschnitte für die Funktion kompensatorisch einspringen. Über das Studium von individuellen Protein-Protein-Wechselwirkungen im Hefemodell lassen sich mitunter erstaunlich präzise Vorhersagen über die funktionelle Rolle von Proteinen gewinnen. Als Informationsbestand darüber, welches Protein überhaupt zu welchem Protein „passt“, d. h. in Wechselwirkung treten könnte, weil sie sich aneinander binden können, ist die Analyse des Proteombestands von Zellen und Organen von eminenter Bedeutung. Das Gebiet der „Proteomik“, das sich mit dem Eiweißprofil von Zellen und Geweben in verschiedenen Entwicklungszuständen des Organismus (klassifizierbar nach Alter, Geschlecht und ggf. Krankheitszustand) oder physiologischen oder pathologischen Funktionszuständen von Zellen befasst, hat einen stürmischen Aufschwung durch den Ausbau neuer Nachweisverfahren

wie 2D-Gelektrophorese und durch den molekülgenauen Nachweis von Peptidfragementen mittels Massenspektroskopie genommen. Die Komplexität dieser zellbiologischen Zustandsbeschreibungen hat einen neuen Teilzweig der Bioinformatik mit wieder neuen Computerprogrammen und Auswertungsverfahren stimuliert. In dieser Situation kann die „In-silico“-Analyse (d. h. Computeranalyse) von Proteinsequenzen von großem heuristischen Wert sein. Speziell annotierte Datenbanken (z. B. die am EBI betreute Datenbank „SwissProt“ einer Genfer Forschergruppe) erlauben ein systematisches Studium von Proteinen anhand ihrer Sequenz. Es hat sich herausgestellt, dass es in den Hunderttausenden bekannter Proteinsequenzen nur einige Tausend unterschiedliche Sequenzdomänen gibt, die in der Evolution recht gut konserviert und daher an ihrer Homologie erkennbar sind. Das Universum von Proteinprimärstrukturen lässt sich so in einige Tausend Proteinfamilien und -superfamilien (bestehen aus Proteinen, die nur gewisse Domänen gemeinsam haben) klassifizieren. Es ist bereits heute ein häufiges Ereignis, dass eine neu abgelesene DNS-Sequenz durch Homologievergleich der zugehörigen Proteinsequenz funktionell eindeutig charakterisiert werden kann (z. B. als Hexokinase oder Tyrosinkinase). Die vergleichende Sequenzanalyse von Proteinen macht sich nicht nur die Familienähnlichkeit von Eiweißen bezüglich ihrer evolutionären Herkunft zunutze, sondern auch die Tatsache, dass auch die Raumstruktur von Proteinen gewissen Gesetzmäßigkeiten folgt, die auf der Sequenzebene erkennbar sind (allerdings nicht eindeutig, 7 3.3.8).

3.3.8 Strukurbiologie: Die Analyse der molekulären Raumstruktur von Proteinen und Nukleinsäuren Die Sequenz eines Proteins ist im Genom als DNS-Nukleotidfolge abgespeichert. Aber die biologische Bedeutung dieser Information realisiert sich in der Zelle nicht als Text, sondern als Raumstruktur, die die Proteinkette einnimmt. Dabei gibt es spontan entstehende Strukturen und solche, in die die Kette hineingeprägt wird. Spontan entstehen Raumstrukturen, wenn die Seitenketten der Aminosäuren untereinander oder mit dem wässrigen Milieu in Wechselwirkungen treten, die einen stabileren Zustand herstellen (Wasserstoffbrücken, hydrophobe Wechselwirkungen u. a. ). Den im Ribosom entstehenden Proteinfäden werden darüber hinaus gewisse Strukturen durch die zellulären Membranen aufgeprägt, in die sie hineingefaltet werden oder durch die sie geschleust werden, um an ihren Wirkort zu gelangen (z. B. Signalpeptide kanalisieren den Durchgang durch Membranen).

343 3.3 · Bioinformatik

Die Struktur von Proteinen im zellulären Milieu lässt sich aus ihren Kristallen durch Röntgenbeugung und bei kleineren Proteinen in Lösung durch magnetische Kernresonanzspektroskopie ermitteln. Mit weiteren physikalischen Methoden lässt sich die Dynamik dieser Raumstruktur bei der Ausübung der Funktion (z. B. der Katalyse oder der Bindung von Liganden) vermessen. Solche Raumstrukturen liegen bei vielen Hunderten von Proteinen vor, und die Zahl wächst stetig. Sie liegen als umfangreiche Sätze von relativen Raumkoordinaten jedes Atombestandteils, aus dem das Molekül besteht, vor. Die Datenbank PDB (http://www.rcsb.org/pdb/) des Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) stellt die weltweit ermittelten Raumstrukturen in kompakter Form vor. Neben den notwendigen Quellund Referenzannotationen und Hinweisen auf die zelluläre Funktion werden auch gewisse Charakterisierungen der Struktur vorgenommen. Beispielsweise wird aus dem Rückgrat der Raumstruktur (der fortlaufenden Kette von Peptidbindungen) auf die Sekundärstruktur (Helix, Faltblatt, Knäuel) des entsprechenden Abschnitts geschlossen. Wie bereit erwähnt, lassen sich auch schon aus der Primärstruktur mit gewisser Sicherheit die Sekundärstrukturen vorhersagen (z. B. falten sich Abfolgen hydrophober Aminosäuren gern zum Faltblatt). So gibt es Vorhersagealgorithmen für die wahrscheinliche Sekundärstruktur eines Sequenzabschnitts. Noch erfolgreicher ist es, für einen gegebenen Sequenzabschnitt (ein „Wort“) einen ähnlichen Abschnitt in der PDB aufzusuchen und aus dessen Struktur auf die der Testsequenz zu schließen. Der DALI-Server (http://www.ebi.ac.uk/dali/), von einer Forschergruppe in Helsinki entwickelt und betreut, ermöglicht eine solche Analyse (s. Holm u. Sander 1996). Dabei handelt es sich um einen Netzwerkdienst, der dreidimensionale Vergleiche von Proteinstrukturen ermöglicht. Man kann strukturell ähnliche Proteine zu einer gegebenen Sequenz mithilfe von Datenbankwerkzeugen identifizieren. Hierbei wird sowohl ein Arsenal von Faltungsmustern gängiger Proteinklassen als auch ein umfangreiches Programmsystem zur Identifizierung von Sekundärstrukturen bereitgehalten. Die theoretische Vorhersage der Sekundärstruktur eines Sequenzabschnitts ist gegenwärtig nicht mit überzeugender Sicherheit möglich. Gleichwohl ist sie ein wichtiges Element für die Vorhersage der 3D-Struktur eines Eiweißes. Die Raumstruktur eines Eiweißes kann mithilfe von Röntgenbeugungsdiagrammen und NMR-Spektren abgeleitet werden. Hierzu sind Computerprogramme für die Bewältigung der Auswertungen und der physikalischen Modellierung unabdingbar. Die Vorhersage von Proteinstrukturen, für die keine Raumstruktur eines verwandten Exemplars bekannt sind, ist gegenwärtig noch sehr unsicher, da eine umfassende physikalische

3.3

Theorie der Faltung fehlt. Die Vorhersage der 3D-Struktur aus der Primärstruktur ist eine der großen Herausforderungen für die Molekularbiologie des 21. Jahrhunderts.

3.3.9 Genetische Diversität des menschlichen Genoms Alle Menschen haben das gleiche Genom, aber jeder mit anderen, quantitativ relativ geringfügigen Varianten. Lediglich eineiige Zwillinge haben zumindest die Textinformation der DNS im Zellkern nahezu vollständig identisch. Kein konkretes menschliches Genom stimmt mit dem Standardgenom, das in den Datenbanken vertreten ist, genau überein. Die Unterschiede sind überwiegend Punktmutationen (in einzelnen Nukleotiden), und sie treten an manchen Genomorten zahlreich, an anderen selten auf. Das liegt daran, ob die Information überlebenswichtig ist oder nicht. Der rote Blutfarbstoff Hämoglobin verträgt nur an wenigen Stellen eine Variation, weil seine lebenswichtige Funktion keinesfalls behindert werden darf. An vielen Positionen wird die Funktionalität durch eine Mutation so eingeschränkt, dass die betreffende Person Nachteile bei der Weitergabe ihrer DNS an die Nachkommen hat: Die Mutation stirbt aus. An anderen, offenbar zahlreicheren Orten des Genoms ist der selektive Druck geringer: Zufällig als Kopierfehler entstehende Varianten bringen dort keinen Nachteil, sodass zwischen den Individuen einer Population im Laufe vieler Generationen Unterschiede entstehen. Die Anzahl variabler Positionen (d. h. die genetische Diversität) in unserem Genom ist noch nicht zuverlässig bestimmt worden – einfach weil noch nicht hinreichend viele Genomabschnitte für eine größere Anzahl von Personen exakt sequenziert wurden. Die bisherigen Ergebnisse besagen, dass die genetische Diversität beim Menschen je nach Genomort zwischen 1 auf 100 und 1 auf 5.000 Nukleotidbuchstaben beträgt. Ob das viel oder wenig ist, hängt vom Vergleichsmaßstab ab. Immerhin bedeutet es, dass zwischen zwei nicht verwandten Personen einige Millionen Unterschiede im Textbestand auftreten. Zweifellos trägt dieser Umstand zur genetischen Verschiedenheit innerhalb der menschlichen Art und ebenso zur konstitutionellen Disposition für bestimmte phänotypische Merkmale (u. a. Neigung zu Erkrankungen) erheblich bei. Auch hier werden DNA-Chips die genaue Vermessung der Diversität in größeren Probandenkollektiven möglich machen. Ihre Diagnostik wird in wenigen Jahren durch die Verbesserung der Methodik relativ billig sein. Diese genetische Aussage ist nahezu fehlerfrei, sodass individuelle genetische Profile für die Feststellung der Ätiologie und Pathogenese von definierten Erkrankungen, ja vielleicht

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Sektion 3 · Diagnostik

sogar für die Nosologie (Krankheitslehre) allgemein von großer Bedeutung sein werden. In früheren Jahrzehnten konnte man lediglich den Phänotyp mit einiger Schwankung bestimmen, während die genetische Information sehr limitiert war – heute verhält es sich umgekehrt so, dass man das Genom einer Zelle im Prinzip genau entschlüsseln kann, während die Folgen im Metabolismus auch weiterhin nur schwer genau zu ermitteln sind. Erste Ansätze zu einer genetischen Charakterisierung von Krankheiten werden bereits bei der vererbten Disposition zu bestimmten Tumorerkrankungen und Stoffwechselerkrankungen (z. B. Cholesterinumsatz) diagnostisch benutzt, vom Einsatz der genetischen Diagnostik von zahlreichen Gendefekten abgesehen, die heutzutage klinische Standardverfahren sind. Es ist offensichtlich, dass auch auf diesem Gebiet die Bioinformatik zur Auswertung und Deutung der massenhaft anfallenden Daten von strategischer Bedeutung sein wird. Es sei nicht verschwiegen, dass diese Aussichten auf eine sehr genaue Aufschlüsselung des individuellen menschlichen Genoms (Stichwort „gläserner Mensch“) nicht nur Zustimmung, sondern auch Besorgnisse auslöst. Risiken und Chancen bei der Anwendung lassen sich jedoch auf einem Gebiet, auf dem mit so hoher Präzision Faktenanalyse möglich geworden ist, zuverlässig trennen und durch staatliche Regulation gestalten.

3.3.10 Datenbanken und Analysewerkzeuge im World Wide Web (WWW) Sinnvolle Startadresse für den Einstieg in die weltweit angebotenen Genomdatenbanken sind die Webseiten des European Bioinformatics Institute (EBI) und des National Center of Biotechnology Information, wobei der Vorzug individuell in der unterschiedlichen Gestaltung dieser Informationsangebote liegt: http://www.ensembl.org http://www.ncbi.nlm.nih.gov Beide Webseiten, die einander regelmäßig in den Leistungsangeboten (nicht in der Gestaltung) spiegeln, ermöglichen zu einer Reihe von Datenbanken und Werkzeugen: x Nukleotidsequenzen x SwissProt (Protein Sequenzen) x OMIM (Online Mendelain Inheritance in Man, eine Informationssammlung genetischer Defekte und ihrer molekularen Grundlage mit umfangreicher Hintergrundinformation) x MMDB (Molecular Modelling Database: kristallographisch bestimmte Strukturen von Proteinen und RNS) x dbEST [Sammlung von automatisch generierten ESTs (meist aus humaner Quelle)]

x dbSTS [Sammlung von kartierten Markerorten („sequence tagged sites“)] x dbSNP (Datenbank von Einzelnukleotidsequenzvarianten der Genome mehrerer Spezies) x UniGene [Sammlung von transkribierten Genabschnitten, die sich (durch Überlappung) zu längeren Einheiten (manchmal ganzen Genprodukten) vereinigen ließen] x HAPMAP [Datenbank genetischer Varianten beim Menschen] Ein für die tiefere Sequenzanalyse auch von Spezialdatenbanken nützliches Programm ist SRS (Sequence Retrieval System) des EMBL. Man wählt www.embl.de und fragt sich mit dem Stichwort SRS durch, um an den Server zu kommen, der entsprechende Dienste anbietet. Es wird ein Verzeichnis aller erreichbaren Datenbanken gezeigt. Das SRS erlaubt es, Sequenzsammlungen unterschiedlicher Formatierung miteinander vergleichbar zu machen. Im Internet werden auch zahlreiche weitere Analysewerkzeuge angeboten, für deren Beschreibung auf die Lehrbücher der Bioinformatik verwiesen werden muss.

3.3.11 Weiterführende Literatur Zunächst werden einige neuere Monographien zitiert, die einen Überblick über die Methoden und Ressourcen der Genom-Informatik anbieten: Rauhut R (2001) Bioinformatik: Struktur-Sequenz-Information. Wiley-VCH Weinheim etc Baxevanis AD und Ouellette BFF eds. (2005) Bioinformatics. A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins. 3nd edition. Wiley-Interscience New York etc Mount DW (2001) Bioinformatics. Sequence and genome Analysis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW und Lipman DJ (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215: 403–410 Arratia R und Waterman MS (1994) A phase transition for the score in matching random sequences allowing deletions. Ann. Appl. Prob. 4: 200–225 Dayhoff MO (1972) Atlas of protein sequence and structure. National Biomedical Research Foundation, Georgetown University, Washington D.C. Fleischmann RD et al. (1995) Whole genome random sequencing and assembly of Hemophilus influenzae. Science 269: 496–512 Holm L und Sander C (1996) Mapping the protein universe. Science 273: 595–603 Karlin, S und Altschul SF (1990) Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes. Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 2264–2268 Needleman SB und Wunsch C (1970) A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J. Mol. Biol. 48: 443–453 Staden R (1984) Computer methods to locate signals in nucleic acid sequences. Nucleic Acids Res. 12: 505–519 Vingron M und Waterman MS (1994) Sequence alignment and penalty choice. Review of concepts, case studies and implications. J Mol Biol. 235: 1–12

345 3.3 · Bioinformatik

3.3

3.3.12 Zeittafel 1962

Zuckerkandl und Pauling publizieren erste evolutionäre Stammbaumanalysen auf der Grundlage von Eiweißsequenzen.

1970

Needleman und Wunsch publizieren ein Dynamic-programming-Verfahren für die Analyse von Sequenzpaaren.

1972

Margret Dayhoff publiziert erste Datensammlung (Protein Information Resource, PIR) von Eiweißsequenzen.

1979

Walter Goad gründet den Protoyp der DNS-Datensammlng GenBank.

1986

Beginn der Human Genome Projects zur Aufklärung des menschlichen Genoms

1986

Roger Staden (Cambridge, England) veröffentlicht eine Sammlung bioinformatischer Verfahren zur Sequenzanalyse.

1990

Stephen Altschul publiziert sein BLAST-Verfahren zur Ermittlung von Homologien in umfangreichen Sequenzdatenbanken.

1995

Publikation der ersten Genomsequenz eines Bakteriums (Hemophilus influenzae) (Fleischmann et al. 1995)

2000

Vollständiger Entwurf der DNS-Sequenz des menschlichen Genoms von zwei Konsortien gleichzeitig publiziert (Francis Collins und Craig Venter)

Literatur zur Zeittafel Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW und Lipman DJ (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215: 403–410 Dayhoff MO (1972) Atlas of protein sequence and structure. National Biomedical Research Foundation. Georgetown University, Washington D.C. Fleischmann RD et al.(1995) Whole genome random sequencing and assembly of Hemophilus influenzae. Science 269: 496– 512

Needleman SB und Wunsch C (1970) A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J. Mol. Biol. 48, 443–453 Staden R (1984) Computer methods to locate signals in nucleic acid sequences. Nucleic Acids Res. 12: 505–519 Zuckerkandl E aund Pauling L (1962) Molecular Disease, Evolution, and Genic Heterogeneity. Horizons in Biochemistry, Eds. Michael Kasha and Bernard Pullman, pp. 189–225

3.4 Gendiagnostik Andrea Bauer, Sabina Solinas-Toldo und Jörg D. Hoheisel, Peter Schirmacher und Roland Penzel und Stefan Aretz

3.4.1

Methodische Grundlagen – 347 Andrea Bauer, Sabina Solinas-Toldo und Jörg D. Hoheisel

3.4.1.1 3.4.1.2 3.4.1.3 3.4.1.4 3.4.1.5 3.4.1.6 3.4.1.7 3.4.1.8

Einführung – 347 Nukleinsäurehybridisierung – 348 Amplifikation durch PCR – 350 Sequenzanalyse – 353 DNS-Chip-Technologie – 355 Ausblick – 359 Literatur – 360 Zeittafel – 362

3.4.2

Grundlagen der klinischen Anwendung – 363 Peter Schirmacher und Roland Penzel

3.4.2.1 3.4.2.2 3.4.2.3 3.4.2.4 3.4.2.5

Klinische Fragestellungen und Anwendungsbereiche Material und Aufarbeitung – 364 Diagnostische Verfahren – 365 Perspektiven – 369 Literatur – 369

3.4.3

Grundlagen der molekulargenetischen Diagnostik erblicher Krankheiten – 370 Stefan Aretz

3.4.3.1 3.4.3.2 3.4.3.3 3.4.3.4 3.4.3.5 3.4.3.6

Einführung – 370 Humangenetische Beratung – 372 Aussagekraft und Methodik – 372 Material und Untersuchungsauftrag – 372 Indikationen in der klinischen Diagnostik – 372 Literatur – 376

– 363

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

347 3.4 · Gendiagnostik

3.4

3.4.1 Methodische Grundlagen Andrea Bauer, Sabina Solinas-Toldo und Jörg D. Hoheisel 3.4.1.1 Einführung Auf dem Gebiet der Medizin ist eine Revolution im Gange. Neue Erkenntnisse in der molekularen Genetik und Biotechnologie und speziell die Entwicklungen in der Genomforschung führen zu bisher nicht da gewesenen Erkenntnissen, Fertigkeiten und Perspektiven. Dabei finden diese rasanten Veränderungen parallel auf drei Ebenen statt. Zum einen vergrößert der enorme Erkenntnisgewinn aus den Untersuchungen der Genomanalyse das grundlegende, molekulare Verständnis biologischer Vorgänge und führt damit zu direkten Verbesserungen in medizinischen Anwendungen. Zweitens stehen als Ergebnis der methodischen Entwicklungen neue Verfahren zur Verfügung, die umwälzende Diagnose- und Behandlungsformen ermöglichen. Und drittens wandelt sich zumindest ein Teil der biomedizinischen Diagnostik von der Untersuchung von Einzelaspekten zu einer Analyse gesamtheitlicher zellulärer Zusammenhänge – eine Entwicklung, die auch ein Umdenken der Wissenschaftler und Ärzte erfordert. Zeitlich befinden sich die weltweiten Anstrengungen der Genomanalyse bereits in einer dritten Phase (> Tab. 3.4.1). Zu Beginn bestand der Hauptteil der Ar-

. Abb. 3.4.1. Aspekte funktioneller Studien im Bereich der grundlegenden Nukleinsäure- und Proteinanalytik

beit darin, grundlegende Konzepte zu entwickeln und in praktischer Anwendung zu bestätigen, die solche Studien überhaupt möglich machen, gefolgt von einer Periode, die stark durch die reine (Sequenz-)Datenproduktion geprägt war. Mittlerweile steht die Bestimmung der aus dieser Information abzuleitenden zellulären Funktionen im Mittelpunkt. Dies erfordert eine starke Ausweitung der Analysen auf die vielen molekularen Aspekte, die Einfluss auf die Regulation zellulärer Mechanismen nehmen, und eine Vernetzung mit den Ergebnissen aus anderen Molekülklassen (> Abb. 3.4.1). Die molekulare Diagnostik steht damit an der Schwelle zu einem Zeitalter, in dem für jeden Patienten eine individuelle Aussage getroffen werden kann.

. Tab. 3.4.1. Liste wegweisender Genomprojekte Sequenz

Länge

Contigs

Publikation

Menschliches Genom

ca. 3.286.000.000

viele

The International Genome Sequencing Consortium 2000

135.600.000

viele

Adams et al. 2000

Drosophila melanogaster Menschliches Chromosom 21q

33.827.000

5

Hattori et al. 2000

Menschliches Chromosom 22q

33.573.000

12

Dunham et al 1999

115.409.000

12

The Arabidopsis Genome Initiative 2000

wenige

The C. elegans Sequencing Consortium 1998

4.639.000

1

Blattner et al. 1997

12.068.000

4

Goffeau et al. 1996

Haemophilus influenzae Rd

1.830.138

1

Fleischmann et al. 1995

S. cerevisiae chromosome 3

315.339

1

Oliver et al. 1992

Human Cytomegalovirus

229.354

1

Chee et al. 1989

Epstein-Barr-Virus

172.281

1

Baer et al. 1984

Bacteriophage Lambda

48.502

1

Sanger et al. 1982

Menschliches Mitochondrium

16.569

1

Anderson et al. 1981

5.375

1

Sanger et al. 1977

Arabidopsis thaliana Caenorhabditis elegans Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae

Bacteriophage phi X174

97.100.000

348

Sektion 3 · Diagnostik

Dieser Artikel behandelt grundlegende Techniken der molekularen Gendiagnostik und zeigt einige wichtige Anwendungen. Viele andere, zum Teil schon länger etablierte Methoden sind im Einsatz, und neue kommen ständig hinzu. Gleichzeitig gibt es eine Vielzahl an weiteren Anwendungen in Genomanalytik und Diagnostik. Aufgrund der rasanten Entwicklungen in diesem Feld, haben wir uns jedoch auf zentrale Themen konzentriert.

3.4.1.2 Nukleinsäurehybridisierung Hybridisierung ist die Ausnutzung des grundlegenden Merkmals von Nukleinsäuren, sich zu Doppelstrangstrukturen zusammenzulagern, wenn die beiden Einzelmoleküle eine komplementäre Sequenz aufweisen. Diese Eigenschaft ist essenziell für das Kopieren und Vererben genetischer Information. In der Molekularbiologie macht sie es möglich, eine bestimmte Sequenzfolge in einem Gemisch aus Nukleinsäuren nachzuweisen, indem ein komplementäres Fragment als markierte Sonde zugesetzt wird. Wichtig für die Stabilität eines DNS-Doppelstrangs sind aber nicht nur die Basenpaarungen, sondern auch die Stapelung der Basen, wie auch Effekte der Hydrathülle auf das Phosphat-Rückgrat. Daher wird die Spezifität einer Hybridisierung nicht nur durch den Grad der Komplementarität zwischen den Sequenzen, sondern auch durch Faktoren wie etwa chemische Modifikation der Nukleotide, Pufferzusammensetzung und Temperatur stark beeinflusst. Gleichzeitig kann über die Inkubationsdauer regulierend eingegriffen werden. Sequenzen, die in vielen Kopien vorliegen oder sich durch eine einfache und sich häufig wiederholende Basenabfolge wie etwa d(GT):d(CA) auszeichnen, finden schneller einen Partner als Sequenzen, die in nur geringer Kopienzahl vorhanden sind. Grundsätzlich basieren viele der nachfolgend beschriebenen Methoden auf dem Effekt der Doppelstrangbildung, sprich der Hybridisierung. Beispielsweise lagern sich zur Initiation der DNSAmplifikation (7 3.4.1.3) oder DNS-Sequenzierung (7 3.4.1.4) vor Beginn der Polymerasereaktion zuerst einzelsträngige Primer-Moleküle an einen vorliegenden Einzelstrang an. Bei vielen Hybridisierungstechniken ist eine der Nukleinsäuren auf einem Träger fixiert, während die andere als Probe frei in der Lösung vorliegt und eine Markierung – etwa in Form eines Fluoreszenzfarbstoffs – trägt. Ein klassisches Beispiel dafür ist die DNS-ChipTechnologie (7 3.4.1.5). Nach Inkubation unter Bedingungen, die eine mehr oder minder spezifische Hybridisierung erlauben, wird nicht oder unspezifisch gebundenes Probenmaterial weggewaschen. Die Position der

Markierung der auf dem Träger verbliebenen Probenmoleküle identifiziert die Nukleinsäuren, an die Probenmaterial binden konnte, und gibt durch die Signalintensität Auskunft über die Stärke der Bindung. Ein Vorteil der Hybridisierungstechnik ist die Tatsache, dass eine Vielzahl verschiedener Moleküle gleichzeitig untersucht werden kann. Falls sinnvoll, können bei geeigneten Bedingungen selbst ähnliche (homologe) Sequenzen identifiziert werden (etwa Genfamilien oder sich entsprechende Sequenzen zwischen verschiedenen Organismen). Da jede Nukleinsäure sowohl als Sonde als auch als Ziel einer Hybridisierung verwandt werden kann, können die Untersuchungen je nach Fragestellung so gestaltet werden, dass möglichst viel Information mit möglichst geringem Aufwand gewonnen wird. Southern- und Northern-Analysen Diese Technik repräsentiert einen Meilenstein in der Analyse von Nukleinsäuren und wurde 1975 von Edwin Southern eingeführt, dessen Name auch zum Synonym für die Methode wurde (Southern 1975). Soll beispielsweise die Kolinearität zwischen einer klonierten DNS und genomischer DNS überprüft werden, wird genomische DNS mit einem Restriktionsenzym geschnitten und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Durch die Vielzahl der entstehenden Fragmente und ihre unterschiedliche Größe sind im Gel keine distinkten Banden zu erkennen, sondern ein DNS-„Schmier“. In diesem „Schmier“ verstecken sich allerdings alle Fragmente, die durch die Restriktionsnuklease produziert werden. Die DNS wird dann aus dem Gel auf einen Filter übertragen (Southern-Blot) und fixiert. Jetzt kann ein definiertes und markiertes DNA-Fragment auf diesen Filter hybridisiert werden. Da auf dem Filter die genomische DNS so fixiert ist, wie sie im Gel aufgetrennt wurde, kann die Größe der positiven genomischen Fragmente ermittelt werden. Über einen Vergleich der Fragmentgrößen mit denen der klonierten DNS lässt sich feststellen, ob diese mit dem genomischen Bereich identisch ist oder ob durch die Klonierung Veränderungen stattgefunden haben. In Anlehnung an die Bezeichnung Southern-Blot wurde der Transfer eines RNS-Gels als Northern-Blot bezeichnet. Das Prinzip entspricht vollständig dem eines Southern-Blot. Eine Anwendung sind Studien der Genexpression. RNS wird aus unterschiedlichen Geweben gewonnen und soll darauf untersucht werden, wie stark ein bestimmtes Gen jeweils transkribiert wurde. Dazu wird eine passende Sonde (z. B. die cDNS) auf die Gesamt-RNS eines Northern-Blots hybridisiert, um die individuelle RNS nachzuweisen. Durch den Vergleich der Signalstärken lassen sich Unterschiede in der RNSMenge feststellen.

349 3.4 · Gendiagnostik

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) Die In-situ-Hybridisierung ist eine seit längerem gut etablierte zytogenetische Technik, mit der die Lokalisierung von DNS-Sequenzen in ganzen Zellkernen der Interphase oder Chromosomen der Metaphase möglich ist. Eine DNS-Sonde wird auf die denaturierte Ziel-DNS der Zellpräparate hybridisiert und über eine Fluoreszenzmarkierung sichtbar gemacht (> Abb. 3.4.2). Diese Technik ist als Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, oder FISH, bekannt (Lichter et al. 1990) und findet breite Anwendung in der molekularen Diagnostik. Die Verfügbarkeit verschiedener Fluorochrome erlaubt die gleichzeitige Verwendung multipler Sonden, die sich so differenziell darstellen lassen. Anwendungen sind beispielsweise der Nachweis numerischer und struktureller chromosomaler Aberrationen (> Abb. 3.4.3), die Detektion chromosomaler Imbalancen und Genamplifikationen, die Lokalisation viraler Integrationsorte und die Analyse der Nukleusorganisation. Untersuchungen erfolgen entweder an intakten und kondensierten Chromosomenstrukturen, die im Metaphasenstadium präpariert werden, oder am Kern von Zellen in der Interphase. Die Interphasezytogenetik bietet eine wichtige Alternative, wenn numerische oder strukturelle Aberrationen in Tumoren diagnostiziert werden sollen. Die Präparation der Metaphasespreitungen aus Tumormaterial ist beispielsweise häufig erfolglos oder bleibt von ungenügender Qualität für FISH-Experimente. Außerdem sind teilungsfähige Zellen, die in der Metaphase präpariert werden, oft nicht repräsentativ für die klonale Zusammensetzung der Zellpopulation in vivo.

. Abb. 3.4.2. Hybridisierung einer DNS Sonde auf menschliche Metaphasechromosomen. Das spezifische Hybridisierungssignal ist am Telomer beider homologen Chromosomen und auf den Interphasekernen zu erkennen

3.4

Ein weiteres wichtiges Verfahren ist die vergleichende genomische Hybridisierung („comparative genomic hybridisation“, CGH) (Kallioniemi et al. 1992). Sie ermöglicht eine umfassende Analyse des Zugewinns und Verlusts von chromosomalem Material etwa in einem Tumor. Die Analyse basiert auf dem Vergleich von Hybridisierungssignalen von Tumor-DNS und normaler Referenz-DNS. Die beiden DNS-Präparationen werden unterschiedlich markiert. Gleiche Mengen werden dann gemischt auf normale Metaphasechromosomen hybridisiert („chromosomale CGH”). Die Referenz-DNS zeigt die homogene Fluoreszenzfärbung auf allen Chromosomen. Teile des Genoms, die im Tumor in höherer (etwa Trisomien) oder niedrigerer Kopienanzahl (Deletionen) vorkommen, werden in der entsprechenden chromosomalen Region im Vergleich zur Referenz-DNS

. Abb. 3.4.3a–g. Beispiele numerisch und strukturell chromosomaler Aberrationen, die mittels Interphasezytogenetik nachgewiesen werden können. Links sind die Chromosomen und rechts die entsprechenden Hybridisierungssignale auf einem skizzierten Interphasekern nach FISH mit spezifischen DNS-Sonden gezeigt. a normale Zelle, b–d Veränderungen der Kopienzahl einer Sequenz. Bei Verwendung einer bruchpunktüberspannenden Sonde ändert sich durch das chromosomale Bruchereignis die Anzahl der Hybridisierungssignale auf den Interphasekernen, e, f bei Verwendung zweier den Bruchpunkt flankierenden Sonden, die mit 2 verschiedenen Fluorochromen nachgewiesen werden, ändert sich ihre gegenseitige Position auf dem Interphasekern

350

Sektion 3 · Diagnostik

dass die Hybridisierung von Oligonukleotiden für viele Anwendungen die im Allgemeinen beste Methodik darstellt.

. Abb. 3.4.4. Vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) mit der DNS eines Pankreaskarzinoms. Grüne chromosomale Regionen zeigen überrepräsentierte, und rote Regionen zeigen unterrepräsentierte Regionen im Genom des Tumors. Eine gleichmäßige Rot-grünFärbung entspricht einem balancierten Karyotyp in der entsprechenden Region des Tumors

eine stärkere bzw. schwächere Fluoreszenzintensität aufweisen (> Abb. 3.4.4) und sind über das Verhältnis beider Fluorochrome erkennbar. Balancierte Veränderungen (z. B. balancierte Translokationen und Inversionen) können jedoch nicht erfasst werden. Die Auflösung der chromosomalen CGH ist allerdings begrenzt, kann jedoch bedeutend verbessert werden, indem man die Chromosomen durch definierte DNSFragmente ersetzt (7 3.4.1.5 „DNA-Chip-Technologie“). Oligomerhybridisierung Die Verwendung kurzer Oligomere ist in vieler Hinsicht ein spezielles Teilgebiet der Nukleinsäurehybridisierung. Meist sind Oligonukleotide synthetisch hergestellt, sodass ihre Sequenz vollständig bekannt und definiert ist. Der Einfluss der Hybridisationsbedingungen und damit die Selektivität eines Experiments sind wesentlich stärker als bei längeren Sonden. Liegt eine Basenfehlpaarung zur Ziel-DNS in der Mitte eines kurzen Oligonukleotids, ist die Duplexstabilität meist so stark reduziert, dass zwischen Oligomeren mit dieser Fehlpaarung oder einer vollständig komplementären Sequenz einfach diskriminiert werden kann. Liegt eine Fehlpaarung am Ende eines Moleküls, ist der Effekt schwächer; die Länge kontinuierlicher Sequenz bestimmt den Grad der Selektivität. Oligonukleotide erlauben außerdem, bestimmte, häufig vorkommende DNS-Motive zu vermeiden oder sie ganz gezielt zu suchen. Insgesamt lässt sich sagen,

Ligationsverstärkter Nachweis Bei diesem Nachweisverfahren werden zwei Oligonukleotide genutzt, die direkt nebeneinander an die ZielDNS binden. Die Oligonukleotide sind dabei so gewählt, dass der Ort der Mutation dem 3‘-Ende des ersten Oligonukleotids entspricht. Das 5‘-Ende des zweiten Oligomers kann nur dann an dieses 3‘-Ende ligiert werden, wenn die Ziel- und die Oligomersequenz an dieser Stelle zueinander komplementär sind. Bei einem Basenaustausch können die beiden Enden der Oligonukleotide nicht miteinander verbunden werden. Durch die Verwendung zweier Moleküle und der zusätzlichen Selektivität der Ligase erhöht sich die Spezifität des Nachweises wesentlich (Landegren et al. 1988). In Abwandlung dieses Ansatzes kann auch nur ein einzelnes, dafür längeres Oligonukleotid verwandt werden, von dem die beiden Enden zur Ziel-DNS komplementär sind und quasi den zwei getrennten Oligonukleotiden von oben entsprechen. Nur bei vollständig passender Sequenz werden beide Enden durch die Ligase verbunden, sodass ein zirkuläres Molekül entsteht. Über Rolling-circle-Amplifikation (Zhong et al. 2001) können dann von diesem Molekül viele Kopien hergestellt werden. Dabei wird der ehemalige Mittelteil des Oligonukleotids ebenfalls amplifiziert und kann als Zielsequenz für einen Nachweis verwandt werden. Dadurch ist es möglich, selbst die Bindung an Einzelmoleküle nachzuweisen (Larsson et al. 2004).

3.4.1.3 Amplifikation durch PCR Die Amplifikation von DNA durch eine Polymerasekettenreaktion („polymerase chain reaction“, PCR) (Saiki et al. 1985) hat sich in kürzester Zeit zu einem Grundbaustein molekularer Genetik entwickelt. Die PCR ist eine enzymatische Methode zur In-vitro-Amplifikation spezifischer DNS-Abschnitte (> Abb. 3.4.5). Synthetische Oligonukleotid-Primer, deren Sequenzen komplementär zu dem rechten und linken Ende eines DNS-Stückes sind, werden nach ihrer Bindung durch eine DNS-Polymerase verlängert. Anschließend werden die DNS-Moleküle durch eine Temperaturerhöhung in ihre Einzelstränge denaturiert, wodurch die Zielsequenzen wieder für neue Primer zugänglich werden und somit die Reaktion von vorne beginnen kann. Da jeder neu synthetisierte Strang in dem folgenden Zyklus als Vorlage zur Polymerasereaktion dient, kommt es jeweils zu einer Verdopplung der zwischen den Primern liegenden Sequenz. Durch mehrfaches Wiederholen erfolgt somit

3.4

351 3.4 · Gendiagnostik

. Abb. 3.4.5. Exponentielle DNS-Amplifikation durch PCR. Ein DNSDoppelstrang wird in Gegenwart eines Überschusses passender Primer-Moleküle (orange) thermisch denaturiert. Beim Abkühlen binden die Primer-Oligonukleotide an ihre Bindungsstellen und werden

anschließend durch eine hitzestabile DNS-Polymerase verlängert. Bei jedem Zyklus verdoppelt sich die Kopienzahl der DNS-Region, die zwischen den beiden Primer-Molekülen liegt (blau)

eine exponentielle Vervielfältigung. Dies macht die PCR so empfindlich, dass beispielsweise DNS-Sequenzen aus einem einzigen Haar amplifiziert und nachgewiesen werden können. Durch die Entdeckung und Einführung hitzestabiler DNS-Polymerasen – wie etwa die des thermophilen Bakteriums Thermus aquaticus (Taq-Polymerase) (Saiki et al. 1988) – ist die Anwendung stark vereinfacht, da zwischen den Zyklen keine frische Polymerase zugesetzt werden muss. In einer Standard-PCR wird in einem anfänglichen Denaturierungsschritt die DNS in ihre beiden Einzelstränge aufgeschmolzen, um die Bindungsstellen für die Primer zugänglich zu machen. Die Temperatur beträgt üblicherweise 93–97°C; je höher der GC-Gehalt der Zielsequenz ist, um so höher muss die Temperatur sein, um sie sicher zu denaturieren. Mit zunehmender Temperatur sinkt jedoch die Halbwertszeit der Polymeraseaktivität. Während sie für Taq-Polymerase bei 92,5°C noch mehr als 2 h beträgt, verringert sie sich bei einer Temperatur von 95°C auf 40 min und bei 97,5°C auf 5 min. Anschließend wird die Reaktion auf eine Temperatur abgekühlt, bei der beide Primer-Moleküle an die DNS binden können („annealing“). Sie ist sowohl von der Länge der Sequenz als auch von der Basenzusammensetzung der Primer abhängig. Danach wird die Temperatur üblicherweise auf etwa 72°C erhöht, um optimale Temperaturbedingungen für die Polymerisation zu schaffen. Trotz der relativ kurzen Zeit, in der die Reaktion auf diese Elongationstemperatur gebracht wird, kommt es

dabei nicht zu einem Wiederablösen der Primer, da sie während des Aufheizens bereits von der Polymerase verlängert werden. Die Dauer der Elongation richtet sich unter anderem nach der Größe der zu amplifizierenden DNS. Bei 72°C werden zwischen 35 und 100 Nukleotide pro Sekunde eingebaut. Somit sollte eine Minute Elongation für ein Fragment von 2 kb ausreichend sein. Man wählt jedoch üblicherweise eine Zeit von 1 min/kb, da in späteren Zyklen die Konzentration des Produkts im Verhältnis zur Konzentration des Enzyms ansteigt und sich dadurch auch die zur Verlängerung aller gebundener Primer benötigte Zeit erhöht. Im Anschluss an die Elongationsphase wird die Reaktion wieder auf die Schmelztemperatur erhitzt, und ein neuer Zyklus beginnt. Die Anzahl der Zyklen richtet sich hauptsächlich nach der Ausgangskonzentration der DNS: Anzahl der Zielmoleküle

105

104

103

50

Anzahl der Zyklen

25–30

30–35

35–40

40–45

Nachdem die gewünschte Zahl an Zyklen durchlaufen wurde, erfolgt meist eine abschließende Inkubation bei 72°C, um unvollständige Produktmoleküle noch fertigzustellen. Häufig wird auch die Zwei-Temperatur-PCR angewandt, bei der die Anlagerungstemperatur der Primer der Elongationstemperatur entspricht. Da pro Zyklus nur zwei statt drei Temperaturen erforderlich sind,

352

Sektion 3 · Diagnostik

wird die Gesamtdauer einer PCR durch dieses Verfahren wesentlich verkürzt.

Akzeptor ausreichend weit voneinander entfernt sind, um den Energietransfer zu unterbinden.

RT-PCR Prinzipiell ist die RT-PCR (Reverse Transkriptase-PCR) (Veres et al. 1987) eine Amplifikation von RNS-Sequenzen. Da jedoch RNS nicht als Matrize für die üblichen PCR-Polymerasen dient, wird der PCR eine Reverse Transkription vorangestellt. Die produzierte ErststrangcDNS kann in einer anschließenden PCR selektiv amplifiziert werden. Der Vorteil dieser Methode gegenüber anderen Techniken zur Untersuchung von RNS-Molekülen liegt in der für die PCR typischen Sensitivität. Durch RT-PCR können Transkripte nachgewiesen werden, die in einer nur sehr geringen Kopienzahl pro Zelle vorliegen.

In situ PCR Die In-situ-PCR kombiniert die extreme Empfindlichkeit der PCR mit der In-situ-Hybridisierung. Zunächst werden spezifische Sequenzen in einer einzelnen Zelle mittels PCR amplifiziert und anschließend direkt oder mittels Hybridisierung nachgewiesen (Haase et al. 1990). Die Schwierigkeit der Technik liegt darin, die Zellen bzw. das Gewebe so zu permeabilisieren, dass die PCR-Komponenten relativ frei, die DNS der Zelle und die PCRProdukte dagegen wenig diffundieren können. Man unterscheidet die In-situ-PCR in suspendierten intakten Zellen von der PCR auf Objektträgern. Ersteres wird wie ein normaler PCR-Ansatz in kleinen Reaktionsgefäßen durchgeführt, die zweite Methode dagegen direkt auf dem Objektträger. Dazu werden die Objekte mit dem PCR-Mix überschichtet und mit einem Deckglas abgedeckt. Im Vergleich zu einer normalen PCR ist der Amplifikationsgrad der Zielsequenzen bei einer In-situ-PCR sehr gering. Eine ausführliche Abhandlung über die In-situ-PCR ist bei Komminoth et al. (1995) zu finden.

Real-Time-PCR Bei der quantitativen Real-Time-PCR wird zu einer Amplifikationsreaktion ein Fluoreszenzfarbstoff zugegeben, dessen Signalintensität der Menge an PCR-Produkt äquivalent ist. So kann während der Amplifikation der Anstieg der Produktmenge verfolgt werden. Die einfachste Variante besteht darin, einen interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff wie Ethidiumbromid oder SYBR Green zuzusetzen. Je mehr doppelsträngige DNS vorliegt, desto mehr Farbstoff kann interkalieren und dadurch seine Fluoreszenz steigern. Ein Nachteil ist, dass nur ein PCR-Produkt gleichzeitig verfolgt werden kann. In kommerziellen Systemen werden deshalb häufig speziell markierte Oligonukleotide genutzt. Pro PCR-Produkt kann dann ein spezifisches Oligonukleotid mit spezifischer Farbe verwandt werden, sodass vergleichende Messungen möglich sind. Der Nachweis nutzt meist den Energietransfer (Förster Resonanz Energietransfer, FRET) zwischen einem Donor-Fluorophor und einem Akzeptor-Fluorophor. Im LightCycler-System binden an die frisch synthetisierte DNS zwei Sonden, von denen eine mit dem Donor- und die andere mit dem Akzeptorfarbstoff markiert ist. Nur dadurch kommen die beiden Fluorophore in ausreichend physikalische Nähe, sodass der Akzeptor nach Anregung des Donors ein Lichtsignal aussendet. Bei TaqMan-Proben und Molecular Beacons dagegen sind beide Farbstoffe an die Enden eines Oligonukleotids gebunden. In dieser Konfiguration unterdrückt der Akzeptor durch den Energietransfer das Leuchten des Donors, der hier das Reportermolekül bildet. Bei TaqMan-Sonden wird nach der Bindung des Oligonukleotids an neu synthetisierte DNS der Akzeptor durch die Polymerase abgespalten, wodurch der zweite Fluoreszenzfarbstoff zu leuchten beginnt. Bei Molecular Beacons ändert sich beim Hybridisieren die Struktur des Moleküls. Die intramolekulare Faltung wird aufgehoben, wodurch im linearen Molekül Donor und

PCR und DNS-Sequenzierung Da die PCR nicht nur die Synthese von größeren DNSMengen ermöglicht, sondern auch bestimmte Sequenzen aus einem Gemisch heraus amplifiziert, ist sie eine Alternative zur konventionellen Klonierungsstrategie für die DNS, die sequenziert werden soll. Bei neueren Sequenziermethoden (7 3.4.1.4) wird ein Klonierungsschritt völlig umgangen und durch Molekülvereinzelung und anschließende PCR ersetzt. Obwohl prinzipiell ähnlich, besteht ein gravierender Unterschied zwischen der Sequenzierung klonierter DNS und nur PCR-amplifizierter DNS. Beim Sequenzieren klonierter DNS sind die analysierten Moleküle alle gleich; sie gehen aus einem einzigen Molekül hervor. Für PCR-Produkte trifft das nicht zu. Sie können durchaus verschiedene genomische Moleküle als Ursprung haben. Wird beispielsweise ein Bereich aus dem diploiden menschlichen Genom amplifiziert, der in zwei Allelen vorkommt, die sich in einer Base unterscheiden, so setzt sich das PCR-Produkt aus zwei unterschiedlichen DNS-Fragmenten zusammen, eine fehlerfreie Amplifikation vorausgesetzt. In der anschließenden Sequenzreaktion ist dann an der entsprechenden Stelle keine eindeutige Basenzuweisung möglich. Die Fehlerrate der Polymerase hat dagegen kaum einen Effekt auf das Sequenzergebnis. Liegt am Beginn der PCR nur ein einziges Molekül vor, und wird direkt im ersten Zyklus durch die Polymerase ein Nukleotid fehlerhaft eingebaut, so tragen am Ende der PCR ein Viertel aller Moleküle den Fehler. Meist wird jedoch von einer erheblich größeren Molekülzahl ausgegangen. Soll

353 3.4 · Gendiagnostik

beispielsweise ein einzelnes Gen aus einem Nanogramm menschlicher DNS heraus amplifiziert werden, so liegen zu Beginn der PCR etwa 500 Moleküle vor. Selbst, wenn ein Fehler im ersten Zyklus auftritt, so tragen am Ende der PCR weniger als 1% der Moleküle den Fehler. Genetic Fingerprinting; PCR in der forensischen Medizin In den letzten Jahren liest man in den Medien immer häufiger den Begriff des genetischen Fingerabdrucks („genetic fingerprinting“). Darunter versteht man die Analyse bestimmter genetischer Eigenschaften, deren Kombination für jedes Individuum einzigartig ist. Somit können, analog zum klassischen Fingerabdruck, unbekannte DNS-Proben (z. B. aus Blut, Knochen, Haut, Haaren oder Sperma) mit dem genetischen Material bekannter Personen verglichen werden. Die meisten Analysesysteme basieren auf der Tatsache, dass sich im menschlichen Genom viele nichtkodierende Bereiche befinden. Während Veränderungen in den Genen zu Defekten führen können, unterliegen diese Bereiche keinem starken Selektionsdruck. Veränderungen werden weitervererbt, ohne dass sich für den Träger daraus ein positiver oder negativer Effekt ergibt. Aus diesem Grund liegen nichtkodierende Bereiche in einer Population sehr heterogen vor. Ein Teil besteht aus wiederholten Sequenzen („repeats“). Ein spezieller Typ sind TandemRepeats, sich direkt mehrfach wiederholende Sequenzen. Sie liegen bei allen Individuen einer Population vor, unterscheiden sich jedoch individuell in der Anzahl der Repeat-Einheiten, die aufeinander folgen. Für die Analyse werden Primer verwendet, die spezifisch sind für bekannte Sequenzen direkt rechts und links solcher hypervariablen Loci. Die Größe der PCRProdukte ist abhängig von der Anzahl der TandemRepeats zwischen den beiden Primern und ermöglicht somit die Anfertigung eines individuumspezifischen Fragmentprofils. Als Ausgangsmaterial genügen wenige DNS-Moleküle. Dies ermöglicht eine Nutzung in der forensischen Medizin zur Identifizierung eines Individuums oder zur Klärung von Verwandtschaftsverhältnissen, da die Länge der Repeat-Sequenzen nach den Mendelschen Regeln vererbt wird. Selbst Untersuchungen an alten Skelettteilen waren erfolgreich. In alten Knochen findet sich, abhängig von ihrem Alter und den Expositionsbedingungen, mehr oder weniger degradierte DNS. Trotzdem kann häufig ihre Herkunft bestimmt werden. Ein spektakulärer Beweis dafür war die Identifikation der Leichname der 1918 erschossenen Zarenfamilie (Gill et al. 1994).

3.4

3.4.1.4 Sequenzanalyse Zur Sequenzierung der DNS muss die Abfolge der Nukleotide in einem DNS-Molekül in eine nachweisbare Größe umgewandelt werden. Durch die grundlegenden Arbeiten von Maxam und Gilbert (1977) sowie Sanger et al. (1977a) wurde es erstmals möglich, von einer DNS eine Population kürzerer Fragmente herzustellen, die jede mögliche Fragmentlänge enthält, und die Fragmentgröße gleichzeitig mit der Art der terminal gelegenen Base korreliert. Das Auslesen erfolgt über eine Elektrophorese in Acrylamid-Gelen oder Kapillaren, die es erlauben, Moleküllängen von einer Base Unterschied nachzuweisen. Von den beiden Methoden etablierte sich das enzymatische Sequenzieren (Sanger et al. 1977a) als Standardverfahren, mit dem alle bisher abgeschlossenen Genomprojekte durchgeführt wurden (> Tab. 3.4.1). Während der letzten Jahrzehnte gab es eine Vielzahl von alternativen Methoden zur Sequenzierung. Allerdings konnte keine vom Durchsatz, der Robustheit und der Genauigkeit mit der lang etablierten, optimierten und stark automatisierten Technik der Sanger-Sequenzierung konkurrieren. Mittlerweile wurden aber zwei Verfahren entwickelt, die speziell für die diagnostische Sequenzierung von hohem Interesse sind und zumindest für solche Anwendungen die Sanger-Sequenzierung ersetzen könnten. Sanger-Sequenzierung Die Technik basiert auf dem Einbau von Nukleotidderivaten, die zum Abbruch einer Polymerasereaktion führen (> Abb. 3.4.6). An einen schon bekannten Teil der Ziel-DNS wird ein Primer-Molekül gebunden und durch eine Polymerasereaktion verlängert. In vier getrennten Reaktionen wird neben den vier Desoxynukleotiden jeweils eine Base zusätzlich als Didesoxynukleotid zugegeben. An der Position eines Adenosins (dA) in der Vorlagen-DNS wird dadurch beispielsweise entweder das Desoxythymidin (dT) oder das Didesoxythymidin (ddT) eingebaut. Während Moleküle mit einem dT durch die Polymerase weiter verlängert werden, bricht nach Einbau eines ddT die Reaktion ab. Dadurch ist eine Korrelation zwischen der Länge der Moleküle und der Art der endständigen Base gegeben, da alle Moleküle, die kein ddT an dieser Stelle tragen, um mindestens ein Nukleotid länger oder durch den Einbau eines anderen Didesoxynukleotids an einer früheren Position entsprechend kürzer sind. Durch eine Automation und Optimierung der Prozesse über einen Zeitraum von 30 Jahren werden mit diesem Verfahren Leselängen im Kilobasenbereich und eine Fehlerrate von weniger als einem Fehler in 10.000 gelesenen Basen erreicht.

354

Sektion 3 · Diagnostik

. Abb. 3.4.7. Auslesen einer Pyrosequencing-Reaktion. Nach Zugabe eines einzelnen Nukleotid-Triphosphats in einer Polymerasereaktion wird über eine Reaktionskette (7 Text) ein Lichtsignal produziert, das der Zahl der eingebauten Nukleotide äquivalent ist. Durch sequenzielle Zyklen mit den 4 Basen kann so die Sequenz der untersuchten DNS bestimmt werden

. Abb. 3.4.6. Enzymatisches Sequenzieren; die Zusammensetzung der Nukleotidgemische für die 4 Sequenzierreaktionen ist oben angegeben. Für die T-Reaktion ist das Prinzip gezeigt: Nach Bindung eines Primer-Moleküls an die Vorlage wird über eine Polymerasereaktion der Komplementärstrang synthetisiert. Zufällig wird an jeder Position eines T für einen Teil der Moleküle das Didesoxynukleotid (ddT) eingebaut, worauf die Reaktion abbricht. Dadurch entstehen Molekülen, die alle ein T am 3‘-Ende tragen und eine distinkte Länge besitzen. Aus der Abfolge der Fragmentgrößen aus allen 4 Reaktionen in einer gelelektrophoretischen Auftrennung lässt sich die Sequenz ablesen

Pyrosequencing Dieses Verfahren wurde 1998 publiziert (Ronaghi et al. 1998). Ähnlich wie bei der Sanger-Sequenzierung wird in Lösung ein Primer-Molekül an bekannte Teile einer DNS hybridisiert und in Gegenwart von Nukleotiden durch eine Polymerase verlängert. Zur Auslesung ist aber keine Elektrophorese zur Molekültrennung notwendig. Beim „Pyrosequencing“ wird pro Reaktionszyklus nur ein Nukleotid-Triphosphat zugegeben. Ist das Nukleotid komplementär zur Base in der DNS, wird es als Monophosphat eingebaut; gleichzeitig wird Pyrophosphat freigesetzt. In Gegenwart des Enzyms ATP-Sulfurylase wird mithilfe des Pyrophosphats Adenin-5‘-Phosphosulfat in ATP umgesetzt. Ein wei-

teres Enzym – Luciferase – wandelt zugegebenes Luciferin mittels des ATP dann in Oxiluciferin um, das ein Lichtsignal aussendet. Über diese Reaktionskette wird in einem Gefäß ein Lichtsignal produziert, das der Menge an eingebautem Nukleotid-Triphosphat äquivalent ist (> Abb. 3.4.7). Am Ende jeder Reaktion wird überschüssiges Triphosphat über ein viertes Enzym abgebaut, damit ein weiterer Zyklus mit einer anderen Base folgen kann. Die Leselänge ist beim Pyrosequencing auf etwa 100 Basen begrenzt. Deshalb wurde es meist für den Nachweis von Polymorphismen in bekannten Sequenzen genutzt. Im Jahr 2005 wurde aber ein Gerät auf den Markt gebracht, das es erlaubt, durch eine hohe Parallelität solcher Reaktionen große Datenmengen zu gewinnen (Margulies et al. 2005). Von einem DNS-Fragment werden kurze Bruchstücke über Adapter an kleine Kugeln („beads“) gebunden. Dabei wird die DNA so verdünnt, dass im Mittel nur ein Fragment pro Bead gebunden ist. Nach einer Amplifikation trägt jeder Bead etwa 10 Mio. Kopien des jeweiligen Bruchstücks. Die Beads werden dann einzeln auf 1,6 Mio. kleine Picoliter-Gefäße verteilt, in denen eine Pyrosequencing-Reaktion durchgeführt wird. Der Primer bindet dabei an den Adapterbereich der DNS-Bruchstücke, sodass ein einziges PrimerMolekül für alle Reaktionen verwendet werden kann. Da im Mittel 400.000 der Reaktionen verwertbar sind, lassen sich pro Lauf im Mittel etwa 20 Mio. Basenpaare lesen.

355 3.4 · Gendiagnostik

Chip-basierte Sequenzierung durch Synthese Bei einem alternativen, aber grundsätzlich ähnlichen, Ansatz wird DNS in Bruchstücken wiederum über Adapter an einen festen Träger gebunden und dort amplifiziert (www.solexa.com/technology/demo). Bei diesem System handelt es sich um eine planare Oberfläche, auf der nebeneinander viele verschiedene Moleküle gemeinsam binden. Nach Zugabe eines adapterspezifischen Primers und einer Polymerase werden vier Nukleotid-Triphosphat-Derivate zugegeben, die je nach Base an ihrem 3‘-Ende mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. Durch die Positionierung der Farbstoffe an der 3‘-Position kann nach Einbau der passenden Base die Synthese nicht fortschreiten. Nach dem Wegwaschen der freien Nukleotide wird für jedes Molekül der Farbstoff des eingebauten Nukleotids ausgelesen und dadurch die Base charakterisiert. Danach wird der Farbstoff abgespalten. An das nun wieder zugängliche 3‘-Ende kann im nächsten Zyklus ein neues NukleotidTriphosphat eingebaut werden, um die nächste Base zu lesen. Das Prinzip ist seit längerem bekannt (Canard u. Sarfati 1994). Die Entwicklung eines funktionsreifen Systems hat jedoch mehr als ein Jahrzehnt benötigt. Dafür kann nun mit einem Lauf etwa eine Gigabase an Sequenz gelesen werden. Alternative Verfahren Sequenzierung durch exonukleolytischen Verdau an einem Einzelmolekül und Detektion des abgespaltenen Nukleotids ist eine weitere, potenziell extrem schnelle Sequenziermethode. Dazu muss ein einzelnes DNSMolekül, dessen Nukleotide alle eine basenspezifische (Farb-)Markierung tragen, mit einem Ende an eine feste Oberfläche gekoppelt werden. Mithilfe einer Exonuklease wird dann ein Nukleotid nach dem anderen abgespalten und über seine Markierung charakterisiert. Wegen der vielen komplexen Einzelschritte ist diese Technik jedoch noch weit von einer routinemäßigen Nutzung entfernt. Weitere Möglichkeiten sind u. a. das rastermikroskopische Abtasten einzelner DNS-Stränge oder die Messung des Stromflusses beim Transport kurzer DNSFragmente durch Nanoporen (Shendure et al. 2004). Ob sich eine dieser oder noch andere Methoden durchsetzen, bleibt abzuwarten. Ziel einer diagnostischen Sequenzierung ist jedoch, das gesamte Genom eines Menschen für den Preis von etwa 1.000 US-Dollar vollständig sequenzieren zu können. Serielle Sequenzierung Mit den neuen Sequenziermethoden wird die DNS-Sequenzierung auch wieder für Analysen attraktiv, bei denen sie bis vor kurzem anderen Technologien und speziell chip-basierten Verfahren (7 3.4.1.5) unterlegen war. Die serielle Analyse der Genexpression (SAGE) ist ein

3.4

Beispiel dafür. Sie erlaubt gegenüber den bisher nur relativen Messungen auf DNA-Microarrays eine echt quantitative Bestimmung von Transkriptmengen (Velculescu et al. 1995). Dazu werden aus einer mRNA erstellte Gemische von cDNS-Molekülen über ihr OligodT-Ende an eine Oberfläche gebunden und anschließend mit einem Restriktionsenzym geschnitten. An die am Trägermaterial verbliebenen Restfragmente wird eine Kassette ligiert, die eine Schnittstelle für eine Restriktionsnuklease besitzt, welche von den cDNS-Restmolekülen ein je nach Enzym 9–12 bp langes Fragment abschneidet. Diese kurzen Fragmente werden über eine Ligation in zufälliger Reihenfolge zu einem langen Molekül zusammengelagert, das dann durch Sequenzierverfahren gelesen werden kann. Jedes Fragment kommt mit hoher Wahrscheinlichkeit nur in einem bestimmten Gen vor und dient somit als dessen Repräsentant. Durch die Häufigkeit, mit der es in der Sequenz auftaucht, lässt sich die Transkriptmenge des entsprechenden Gens in der Ausgangs-mRNA bestimmen. Mutationsanalyse Durch eine kürzlich erschienene Arbeit (Sjöblom et al. 2006) wurde ebenfalls dokumentiert, dass Sequenzierung für das Identifizieren wie auch die darauf aufbauende Analyse von gesundheitlich relevanten Mutationen genutzt werden kann, auch wenn diese Untersuchung noch mit der Sanger-Sequenzierung durchgeführt wurden. Die DNS von 13.000 Genen in 11 Brustkrebs- und 11 Kolontumoren wurde sequenziert. Durch den Vergleich der Daten mit der „normalen“ menschlichen Sequenz konnten eine ganze Reihe bisher unbekannter Mutationen gefunden werden, die mit großer Wahrscheinlichkeit mit der Ausbildung des Tumors zu tun haben. Der Durchsatz von sowohl DNS-Sequenzierung wie auch der DNS-Chip-Analysen (s. u.) ersetzt mittlerweile die bisherigen Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von Mutationen (> Abb. 3.4.8).

3.4.1.5 DNS-Chip-Technologie Seit dem Ende der 1980er Jahre wird unter dem Schlagwort DNS-Chip- oder Microarray-Technologie an der Entwicklung von Verfahren gearbeitet, die durch hohe Parallelität einen großen Datendurchsatz bei der Analyse von Nukleinsäuren erlauben. Als Sonden werden DNS-Moleküle bekannter Sequenz in einem geordneten Raster auf einem Träger fixiert (> Abb. 3.4.9). Zu dieser Matrize wird als Probe die zu untersuchende Nukleinsäure gegeben, die meist mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert wird. Eine Hybridisierung an trägergebundene DNS-Sensormoleküle passender Sequenz wird dann durch ein Farbsignal an der entsprechenden Rasterposi-

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Sektion 3 · Diagnostik

. Abb. 3.4.8. Zusammenfassende Darstellung verschiedener älterer Methoden zur Identifikation von Mutationen oder Polymorphismen (nach Cotton 1993). CDI, Carbodiimid-Modifikation; CCM, Chemisches Schneiden („chemical cleavage of mismatch“); DGGE, denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese; SSCP, Einzelstrangkonformationsänderung („single-strand conformation polymorphism“); HET, Heteroduplex-Analyse; ASO, allelspezifische Oligonukleotidbindung; ASA, allelspezifische Amplifikation; BPS, Einzelbasensequenzierung; LIG, Ligationsverfahren

tion angezeigt. Zusätzlich kann über die Signalintensität eine Aussage über die Anzahl gebundener Sondenmoleküle getroffen werden. Damit ist auch die Bestimmung dynamischer Veränderungen auf der Ebene der Nukleinsäuren möglich, etwa das Auftreten genomischer Amplifikationen bzw. Deletionen (Stichwort CGH; 7 3.4.1.2) oder Änderungen in Transkriptmengen. Basierend auf dem grundlegenden Prinzip ist eine Vielzahl von Anwendungen möglich, wodurch DNS-Chips bereits jetzt beim Entschlüsseln funktioneller Zusammenhänge und in naher Zukunft für diagnostische Untersuchungen eine zentrale Rolle spielen werden. Herstellung und experimentelle Durchführung DNS-Chips können auf sehr unterschiedliche Art und Weise hergestellt werden. Am bekanntesten ist die lichtkontrollierte In-situ-Synthese von Oligonukleotiden direkt auf der Chip-Oberfläche (Pease et al. 1994). Für die In-situ-Oligomersynthese stehen aber auch alternative Verfahren zur Verfügung. Je nach System erreichen die Ausbeuten der Synthese auf dem Chip mittlerweile auch

nahezu quantitative Werte, wie sie von der normalen Oligonukleotidsynthese bekannt sind. Neben diesem Ansatz wird aber auch das einfachere Prinzip der Bestückungsrobotik für die Herstellung von DNS-Chips genutzt. Kleine Flüssigkeitstropfen mit Oligonukleotiden oder PCR-Produkten werden aus Vorratsgefäßen entnommen und durch einen in drei Dimensionen beweglichen Roboterarm direkt auf die Oberflächen aufgebracht und dort fixiert (Lehrach et al. 1990; Schena et al. 1995). Zur Analyse wird das Probenmaterial markiert und auf den Chip gegeben. Zurzeit erfolgt das Auslesen der DNS-Chips meist über den Nachweis von Fluoreszenzsignalen. Durch ständig verbesserte Farbstoffe und andere, technische Entwicklungen wird die Nachweisgrenze immer weiter verbessert. Anstatt die Wellenlängen der Farbstoffe auszuwerten, können stattdessen oder auch zusätzlich deren Abklingzeiten gemessen werden. Völlig anders geartete Nachweismethoden sind ebenfalls in der Entwicklung, wobei die direkte elektronische Auslesung (z. B. Hintsche et al. 1997) sicherlich die potenziell eleganteste Option aus einer Reihe von Möglichkeiten darstellt. Für Chip-Experimente sind eine Vielzahl von Parametern wichtig, um aus den Untersuchungen relevante Daten gewinnen zu können. Oft wird der Einfluss selbst einfacher Faktoren unterschätzt. Da große Datenmengen bearbeitet werden, ist es beispielsweise zu erwarten, dass eine experimentell verursachte Streuung auftritt, deren Breite von der Zahl der Datenpunkte abhängt. Deshalb können solche Datensätze nur über eine statistische Auswertung sinnvoll bewertet werden. Ein zielgerichtetes experimentelles Design und adäquate Probenpräparation sind weitere wichtige Punkte. Die Einsatzmöglichkeiten der DNS-Chip-Technologie sind sehr weit gefächert. Damit trägt die Methodik wesentlich dazu bei, dass bald weite Bereiche der Diagnostik und Prognostik vermehrt auf molekularer Basis erfolgen werden, was dazu führt, dass die individuellen Unterschiede zwischen Patienten, aber gleichzeitig auch die Verschiedenheit des krankheitsverursachenden Agens – etwa zwischen Pathogenen gleichen Typs –, verstärkt erkannt werden und damit in die Therapieentscheidung mit einfließen können. Transkriptanalysen Die zurzeit am meisten genutzte Anwendung von DNSChips ist der Bereich des Transcriptional profiling, der Bestimmung der Transkriptmengen vieler oder aller Gene eines Organismus. Obwohl schon länger diskutiert und auch auf Nylonfiltern angewandt (z. B. Gress et al. 1992), erregte speziell eine wegweisende Publikation von 1995 über Analysen an 27 Pflanzengenen auf Glasoberflächen (Schena et al. 1995) breite Aufmerksamkeit

357 3.4 · Gendiagnostik

3.4

. Abb. 3.4.9. Beispiele für DNS-Chips oder Microarrays. Oben links ist ein Größenvergleich für eine Form eines Chips mit einem Pfennig gezeigt. Häufig werden jedoch auch Objektträger von 2u7 cm Fläche als Basis genutzt. Oben rechts ist ein Chipformat zu sehen, auf dem durch lichtgesteuerte chemische Synthese Oligonukleotide produziert werden. In der Mitte ist dagegen das Aufbringen vorgefertigter

Moleküle mittels Robotern gezeigt. In der unteren Reihe sind Beispiele für Hybridisierungen auf Chips aus PCR-Produkten (links) und Oligonukleotiden (Mitte) zu sehen. Rechts unten ist – in Erweiterung der Entwicklung – das Ergebnis einer Inkubation mit fluoreszenzmarkierten Proteinen auf einem Antikörper-Chip gezeigt (Kusnezow et al. 2006). Die Skalierung aller Abbildungen ist unterschiedlich

und machte DNS-Chips allgemein zum Thema. Das Grundprinzip des Analyseverfahrens ist einfach (> Abb. 3.4.10). Aus zwei Zellpopulationen (etwa Krebs- und Normalgewebe) wird die RNS isoliert und üblicherweise in eine cDNS umgeschrieben. Gegebenenfalls wird noch ein Amplifikationsschritt durchgeführt. Gleichzeitig wird jede der zwei Präparationen mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff markiert. Werden die beiden Präparationen gemischt auf einen DNS-Chip hybridisiert, lassen sich unmittelbar Unterschiede in den Transkriptmengen nachweisen. Liegt ein bestimmtes Transkript in beiden Geweben in gleichen Mengen vor, bildet sich auf den Belegpunkten des Chips, die das entsprechende Gen repräsentieren, eine Mischfarbe der beiden Fluoreszenzfarbstoffe, beispielsweise gelb wenn ein roter und ein grüner Farbstoff genutzt wurden. Ist ein Transkript dagegen in einem der beiden Gewebe häufiger vorhanden, verschiebt sich das Signal in Abhängigkeit der Differenz in Richtung rot oder grün. Vor einer solch ersten Auswertung sind bereits eine große Zahl an Analyseschritten notwendig, wie etwa eine Subtraktion des Hintergrundsignals, eine Korrektur der Intensitätsfaktoren zwischen den Farbstoffen und eine Normalisierung der Daten. Sollen mehr als nur zwei Zustände – etwa ein zeitlicher Verlauf – untersucht werden, wird einer der beiden Farbstoffe meist für eine Standardbedingung genutzt, auf die alle anderen Präparationen bezogen werden.

Neben Variationen der Transkriptmenge sind aber auch vermehrt Änderungen in der Reifung der RNS von Interesse, da dies ebenfalls ein wichtiges regulatives Element darstellt. Zwar ist es dabei nicht, wie oft kolportiert, so wichtig, dass sich die Gesamtzahl der menschlichen Gene von den ursprünglich geschätzten 80.000 bis 100.000 auf tatsächlich etwa 30.000 reduziert hat – was ist schon ein Faktor von drei im Vergleich zur hoch komplexen Funktionalität eines menschlichen Körpers –, nichtsdestotrotz macht diese Tatsache deutlich, dass eine von vielen Ebenen der Regulation auch in der Reifung der RNS liegt. Liegen auf einem DNS-Chip Repräsentanten der einzelnen Blöcke (Exons) eines Gens vor, lässt sich wiederum äquivalent zum Verfahren des Transkriptmengennachweises eine Änderung in der Zusammenstellung des endgültigen RNS-Genprodukts aus den einzelnen Exons nachweisen. Genotypisierung Ein weiterer augenblicklicher Schwerpunkt der Nutzung von DNS-Chips liegt im Nachweis einzelner Basenaustausche, Mutationen und Polymorphismen der DNS-Sequenz. Dafür lassen sich auf dem Chip grundsätzlich drei Verfahren durchführen. Eine ist die direkte Hybridisierung auf chip-gebundene Oligomere unterschiedlicher Sequenz. Genauere Ergebnisse liefert eine kontinuierliche Beobachtung des Hybridisierungsprozesses. Die Assoziations- und Dissoziationskurven der Hybridi-

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Sektion 3 · Diagnostik

schiedlichen Bereichen wie etwa dem Gesundheitswesen, der Nahrungsmittelkontrolle oder der Abwasserwirtschaft von ständig wachsender Bedeutung. Auf wissenschaftlicher Ebene findet sie breite Anwendung in der Kartierung von Krankheitsgenen. Zum Erstellen einer genetischen Karte werden genetische Marker in Kopplungsstudien daraufhin untersucht, wie häufig sie während der Meiose durch Rekombinationsereignisse getrennt werden. Je weiter zwei Marker voneinander entfernt sind, umso häufiger sollte dies im Mittel der Fall sein. Gerade für das Aufspüren polygenischer Erbkrankheiten schafft eine genetische Karte hoher Dichte die Grundvoraussetzung für die statistischen Untersuchungen, die zur Lokalisierung notwendig sind.

b a

c

d

. Abb. 3.4.10. Das Prinzip des Nachweises von Transkriptmengenänderungen. Aus Zellen, die unterschiedlich behandelt wurden oder aus verschiedenen Geweben stammen, wird RNS isoliert und – meist durch eine reverse Transkriptionsreaktion – mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Nach gemeinsamer Hybridisierung auf einen DNS-Chip binden die einzelnen Transkriptmoleküle an die passenden Belegpunkte des Chips. Unterschiede in Transkriptmengen können dann unmittelbar über die Färbung jedes Belegpunkts bestimmt werden. Unten ist ein Teil des Ergebnisses einer solchen Reaktion gezeigt, die auf einem DNS-Chip produziert wurde, der 12.000 Genfragmente trägt, die mit der Ausbildung von Krebs assoziiert sind

sierung erlauben eine optimale Unterscheidung zwischen der Bindung solcher Fragmente mit vollständiger Sequenzhomologie und Molekülen, die sich um nur eine Base in der Sequenz unterscheiden (Jobs et al. 2003). Alternativ kann eine enzymatische Reaktion durchgeführt werden (Solokov 1989; Pastinen et al. 2000). So reagieren einige Polymerasen und die meisten Ligasen sehr spezifisch darauf, ob die endständige Base eines Moleküls eine Basenpaarung mit dem komplementären Strang eingeht. Solche Analysen können entweder als Gemisch verschiedener Moleküle in Lösung durchgeführt werden, die in einem zweiten Schritt über bekannte Sequenzanteile mittels des DNS-Chips nur voneinander getrennt werden (Hauser et al. 2006), oder sie finden unmittelbar an den einzelnen DNS-Molekülen auf dem Chip statt. Genotypisierung wird unter anderem zum Nachweis von Mikroorganismen genutzt. Dies ist in so unter-

Andere Anwendungen Analysen mit DNS-Chips erschöpfen sich aber nicht nur in den oben genannten Untersuchungen. Selbst recht einfache Variationen können zu anderen Untersuchungsfeldern führen. Ein Beispiel dafür ist die Untersuchung des Methylierungszustands genomischer DNS. Cytidin in der Dimersequenz d(CG) liegt im menschlichen Genom in zwei Varianten vor, methyliert oder unmethyliert. Der Methylierungszustand wird intrazellulär durch Enzyme geändert, wodurch beispielsweise die Zugänglichkeit und damit Aktivität eines Gen-Promotors – und damit des Gens selbst – variiert wird. Deshalb ist eine Kenntnis der Änderungen des Methylierungszustands wichtig für das Verständnis zellulärer Regulation. Für eine solche Analyse wird genomische DNS isoliert und mit Bisulfit behandelt. Unmethyliertes Cytidin wird dabei durch eine chemische Reaktion in Uridin und nach Amplifikation in Thymidin umgewandelt – sprich, es findet in der Sequenz ein Basenaustausch statt, der über eine Genotypisierung nachgewiesen werden kann. Eine Analyse ganz anderer Art ist die Untersuchung, ob der Verlust einzelner Gene einen Einfluss auf das Wachstum von Zellen ausübt (Shoemaker et al. 1996). Dazu werden gezielt einzelne Gene in Zellen so modifiziert, dass sie ihre Funktion verlieren. Dies kann beispielsweise durch den Einbau einer DNS-Kassette geschehen, die das Gen unterbricht (> Abb. 3.4.11). Gleichzeitig wird mit dieser Kassette ein kurzes Stück DNS in die individuelle Zellmutante eingeführt, das für diese Mutante spezifisch ist. Alle Kassetten besitzen identische Primer-Bindungsstellen, sodass aus allen Zellen mit einem einzigen Primer-Paar die jeweiligen Markersequenzen gemeinsam isoliert werden können. Dadurch können Mutanten zusammen inkubiert werden. Nach Wachstum unter bestimmten Bedingungen – etwa mit Wirkstoffen, deren Nebenwirkungen untersucht werden – kann der Titer jeder einzelnen Mutante in dem Gemisch über die Menge an vorhandener Markersequenz

359 3.4 · Gendiagnostik

3.4

Grundprinzip – zu einer großen Anwendungsbreite der Chip-Technologie führen (Hoheisel 2006).

3.4.1.6 Ausblick

. Abb. 3.4.11. Parallele Untersuchung von Deletionsmutanten. Für jedes Gen wird eine Deletionsmutante hergestellt, wobei anstelle des jeweiligen Gens eine kurze 20-mer-Sequenz eingeführt wird (in Realität meist 2), die für die spezielle Mutante charakteristisch ist. Rechts und links jeder Markierungssequenz liegen Sequenzen, die allen Mutanten gemeinsam sind. Dadurch können nach Mischen der Deletionsmutanten die Markersequenzen aller Zellen gemeinsam über PCR isoliert werden. Durch Hybridisierung auf einen DNS-Chip zeigen sie den Titer jeder einzelnen Mutante im Gemisch an. Dadurch können Unterschiede im Wachstum unter verschiedenen Inkubationsbedingungen nachgewiesen werden, was beispielsweise Rückschlüsse auf die molekulare Funktion des deletierten Gens und/oder der zugesetzten Wirkstoffe zulässt

im gemeinsamen PCR-Produkt bestimmt werden. Dadurch sind Unterschiede im Zellwachstum einfach zu analysieren, die wiederum Rückschlüsse auf mögliche Funktionen der deletierten Gene geben. Insgesamt sind die Möglichkeiten der Chip-Technologie bei weitem noch nicht ausgereizt. Sie reichen heute schon von der Typisierung von pathogenen Organismen oder Tumoren, über den Nachweis viraler oder mikrobieller Infektionen, einer Prognosestellung und behandlungsbegleitender Untersuchungen bis zur Bestimmung von Proteinbindungsstellen in genomischer DNS und selbst zur Synthese von Biomolekülen. Eine Vielzahl anderer Prozesse befindet sich in der Entwicklung und wird – ähnlich wie bei der PCR ausgehend von einem

Was mit der Sequenzierung des menschlichen Genoms begonnen hat (The International Genome Sequencing Consortium 2000, Venter et al. 2000), hat sich inzwischen zu einer essenziellen, neuen Diagnoserichtung entwickelt. Auch wenn viele Testverfahren noch nicht ihre klinische Zulassung erhalten haben, ist es nur eine Frage relativ kurzer Zeit, bis sie in der Routinediagnostik ankommen werden. Mittlerweile gibt es im Online-Mendelian-Inheritance-in-Man- (OMIM-)Katalog (www.ncbi. nlm.nih.gov) mehr als 17.000 Einträge über menschliche Gene und Gendefekte, und die Zahl wird weiter ansteigen. Damit lässt sich über die vielen Möglichkeiten der molekularen Diagnostik ein weites Feld neuer Analyseverfahren etablieren oder auch erst entwickeln. Aber auch methodisch bestehen noch viele Perspektiven. Prozesse zur Analyse einzelner Zellen und zum Nachweis von Einzelmolekülereignissen werden die Nukleinsäurediagnostik, was Sensitivität und Genauigkeit angeht, in neue Dimensionen vordringen lassen. Die DNS-Sequenz gibt nur den statischen Zustand des Informationsträgers „Genom“ wieder. Bereits aufgrund dieser Information ist ein gewisser Grad an Interpretation der kodierten Funktion möglich. Die sehr dynamischen Prozesse und Regelwerke jedoch, die zu einer Umsetzung dieser grundlegenden Information zu einem komplex funktionierenden Organismus führen, können daraus häufig noch nicht abgeleitet werden. Gleichzeitig liegt selbst die genomische Sequenz in einer Zelle nur scheinbar statisch vor. Über Modifikationen – wie etwa Veränderungen des Methylierungszustands –, topologische Veränderungen oder Interaktionen mit anderen Molekülen finden bereits auf dieser Ebene Regulationsprozesse statt, die für dynamische, zelluläre Veränderungen verantwortlich sind. Deshalb sind funktionelle Analysen der nächste Schritt zum Verständnis zellulärer Aktivität. Solche Untersuchungen sind nur noch bedingt allein auf der Ebene der Nukleinsäuren möglich, da Interaktionen zwischen Molekülklassen, wie die Bindung von Proteinen – etwa Transkriptionsfaktoren – an DNS dazu notwendig sind. Doch selbst die rein nukleinsäurebasierende Analytik, wie etwa die Bestimmung globaler transkriptioneller Veränderungen, ist aufgrund ihres dynamischen Charakters so umfangreich, dass eine umfassende Interpretation solcher Vorgänge zurzeit noch nicht wirklich möglich ist. Nur bestimmte Ausschnitte können beobachtet und interpretiert werden. Aber auch die vollständige Sequenzierung des menschlichen Genoms schien vor zwei Dekaden noch sehr weit in der Zukunft

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Sektion 3 · Diagnostik

zu liegen. In Anbetracht der ungeheuer schnell verlaufenden Entwicklung ist das Erreichen einer vollständigen Sicht und damit Nutzung der funktionellen Aspekte in ähnlichen Zeiträumen durchaus im Bereich des Möglichen.

3.4.1.7 Literatur Adams, M. D., Kelley, J. M., Gocayne, J. D., Dubnick, M., Polymeropoulos, M. H., Xiao, H., Merril, C. R., Wu, A., Olde, B., Moreno, R. F., Kervalage, A. R., McCombie, W. R., Venter, J. C. (1991). Complementary DNA sequencing: expressed sequence tags and human genome project. Science 252, 1651–1656 Anderson, S, A. T. Bankier, B. G. Barrell, M. H. de Bruijn, A. R. Coulson, J. Drouin, I. C. Eperon, D. P. Nierlich, B. A. Roe, F. Sanger, P. H. Schreier, A. J. Smith, R. Staden, I. G. Young (1981). Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature 290, 457–465 Baer, R., A. T., Bankier, M. D. Biggin, P. L. Deininger, P. J. Farrell, T. J. Gibson, G. Hatfull, G. S. Hudson, S. C. Satchwell, C. Seguin et al. (1984). DNA sequence and expression of the B95-8 EpsteinBarr virus genome. Nature 310, 207–211 Botstein, D., White, R. L., Skolnick, M., Davis, R. W. (1980). Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet. 32, 314–331 Burke, D. T., G. F. Carle, M. V. Olson (1987). Cloning of large segments of exogenous DNA into yeast by means of artificial chromosome vectors. Science 236, 806–812 Canard, B., R. S. Sarfati (1994). DNS polymerase fluorescent substrates with reversible 3‘-tags. Gene 148, 1–6 Cantor, C.R., Mirzabekov, A. (1992). Southern, E. Report on the sequencing by hybridisation workshop. Genomics 13, 1378– 1383 Chee, M. S., A. T. Bankier, S. Beck, R. Bohni, C. M. Brown, R. Cerny, T. Horsnell, C. A. Hutchison, T. Kouzarides, J. A. Martignetti et al. (1990). Analysis of the protein-coding content of the sequence of human cytomegalovirus strain AD169. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 154, 125–169 Chumakov, I. M., Rigault, P., Le Gall, I., Bellanne-Chantelot, C., Billault, A., Guillou, S., Soularue, P., Guasconi, G., Poullier, E., Gros, I., et al. (1995). A YAC contig map of the human genome. Nature 377 (Suppl.), 175–297 Chumakov, I., P. Rigault, S. Guillou, P. Ougen, A. Billaut, G. Guasconi, P. Gervy, et al. (1992). Continuum of overlapping clones spanning the entire human chromosome 21q. Nature 359, 380– 387 Cotton, R. G. H. (1993). Current methods of mutation detection. Mut. Res. 285, 125–144 Dunham, I., N. Shimizu, B. A. Roe, S. Chissoe, A. R. Hunt, J. E. Collins, R. Bruskiewich, D. M. Beare, M. Clamp et al. (1999). The DNA sequence of human chromosome 22. Nature 402, 489–495 Fleischmann, R. D., M. D. Adams, O. White, R. A. Clayton, E. F. Kirkness, A. R. Kerlavage, C. J. Bult, J. F. Tomb, B. A. Dougherty, J. M. Merrick et al. (1995). Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd. Science 269, 496–512 Gill, P., P. L. Ivanov, C. Kimpton, R. Piercy, N. Benson, G. Tully, I. Evett, E. Hagelberg, K. Sullivan (1994). Identification of the remains of the Romanov family by DNS analysis. Nature Genet. 6, 130– 135 Goffeau, A., B. G. Barrell, H. Bussey, R. W. Davis, B. Dujon, H. Feldmann, F. Galibert, J. D. Hoheisel, C. Jacq, M. Johnston, E. J. Louis,

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3.4

Sjöblom, T., Jones, S., Wood, L. D., Parsons, D. W., Lin, J., Barber, T. D., Mandelker, D., Leary, R. J., Ptak, J., Silliman, N., Szabo, S., Buckhaults, P., Farrell, C., Meeh, P., Markowitz, S. D., Willis, J., Dawson, D., Willson, J. K. V., Gazdar, A. F., Hartigan, J., Wu, L., Liu, C., Parmigiani, G., Park, B. H., Bachman, K. E., Papadopoulos, N., Vogelstein, B., Kinzler, K. W., Velculescu, V. E. (2006). The consensus coding sequences of human breast and colorectal cancers. Science 314, 268–274 Smith, L. M., Sanders, J. Z., Kaiser, R. J., Hughes, P., Dodd, C., Connell, C. R., Heiner, C., Kent, S. B. H., Hood, L. E (1986). Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature 321, 674–679 Solokov, B. P. (1989). Primer extension technique for the detection of single nucleotide in genomic DNS. Nucleic Acids Res. 18, 3671 Southern, E. (1975). Detection of spezific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98, 503–517 The Arabidopsis Genome Intiative (2000). Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature 408, 796–815 The C. elegans Sequencing Consortium (1998). Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science 282, 2012–2018 The International Genome Sequencing Consortium (2000). Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409, 860–921 The International HapMap Consortium. (2005). A haplotype map of the human genome. Nature 437, 1299–1320 The International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature 431, 931–945 Velculescu, V. E., L. Zhang, B. Vogelstein, K. Kinzler (1995). Serial analysis of gene expression. Science 270, 484–487 Venter, J. C., M. D. Adams, E. W. Myers, P. W. Li, R. J. Mural, G. G. Sutton, H. O. Smith et al. (2000). The sequence of the human genome. Science 291, 1304–1351 Veres, G., R. A. Gibbs, S. E. Scherer, C. T. Caskey (1987). The molecular basis of the sparse fur mouse mutation. Science 237, 415–417 Watson, J. D., F. H. C., Crick (1953). Molecular structure of nucleic acids: a structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 171, 737–738 Weissenbach, J., G. Gyapay, C. Dib, A. Vignal, J. Morissette, P. Millasseau, G. Vaysseix, M. Lathrop (1992). A second-generation linkage map of the human genome. Nature 359, 794–801 Zhong, X. B., Lizardi, P. M., Huang, X. H., Bray-Ward, P. L., Ward, D. C. (2001). Visualisation of oligonucleotide probes and point mutations in interphase nuclei and DNA fibers using rolling circle DNA amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3940–3945

362

Sektion 3 · Diagnostik

3.4.1.8 Zeittafel Die angegebenen Zitate sind in den Literaturteil integriert. Zeittafel einiger wichtiger wissenschaftlicher Leistungen der Genomforschung und wegweisender Sequenzierprojekte 1953

Beschreibung der DNS-Struktur (Watson u. Crick 1953)

1972

Erstellung des ersten rekombinanten DNS-Moleküls durch Paul Berg und Mitarbeiter (Jackson et al. 1972)

1975

Entwicklung des Southern-Blots (Southern 1975)

1977

Etablierung von Sequenziermethoden durch Frederick Sanger sowie Allan Maxam und Walter Gilbert (Maxam u. Gilbert 1977; Sanger et al. 1977a)

1977

Sequenzierung des Bakteriophagen phi X174 (Sanger et al. 1977b); 5.375 bp

1980

David Botstein et al. führen eine Methode zur Kartierung von Genen ein (Botstein et al. 1980).

1981

Sequenzierung der DNS im menschlichen Mitochondrium (Anderson et al. 1981); 16.569 bp

1982

Sequenzierung der DNS des Bakteriophagen Lambda (Sanger et al. 1982); 48.502 bp

1982

Vorschlag durch Akiyoshi Wada zur vollständigen Sequenzierung des menschlichen Genoms

1984

Bestimmung der Sequenz des Epstein-Barr-Virus (Baer et al. 1984); 172.281 bp

1984

Etablierung der Pulsfeld-Elektrophorese zur Auftrennung großer DNS-Fragmente (Schwartz u. Cantor 1984)

1985

Entwicklung von PCR durch Kary Mullis und Kollegen (Saiki et al. 1985)

1986

Entwicklung des ersten automatischen Sequenziergeräts durch Leroy Hood und Lloyd Smith (Smith et al. 1986)

1986

Isolierung des ersten Krankheitsgens (Duchenne-Muskeldystrophie) (Monaco et al. 1986)

1987

David Burke, Maynard Olson und George Carle entwickeln künstliche Hefe-Chromosomen (Yeast Artificial Chromosomes, YACs) (Burke et al. 1987).

1991

J. Craig Venter führt die Strategie des Sequenzierens von „expressed sequence tags“ (ESTs) zur Bestimmung aller Gene ein (Adams et al. 1991).

1991

Erster Kongress über DNS-Chips in Moskau, organisiert durch Edwin Southern, Andrei Mirzabekov und Charles Cantor (Cantor et al. 1992).

1992

Erstmalige Sequenzierung eines vollständigen Chromosoms (Saccharomyces-cerevisiae-Chromosom 3) unter Leitung von Steven Oliver und Andre Goffeau (Oliver et al. 1992); 315.339 bp

1992

Die Gruppe von Daniel Cohen publiziert die erste Karte eines menschlichen Chromosoms (Chr. 21) (Chumakov et al. 1992).

1992

Die erste genetische Karte des Genoms wird fertig (Weissenbach et al. 1992).

1995

Fertigstellung der ersten vollständigen YAC-Karte des menschlichen Genoms durch die Gruppe von Daniel Cohen (Chumakov et al. 1995)

1995

Sequenzierung des ersten vollständigen Genoms eines frei lebenden Organismus (Haemophilus influenzae) (Fleischmann et al. 1995); 1.830.138 bp

1995

Erste Publikation über cDNS-Microarrays durch Patrick Brown und Kollegen (Schena et al. 1995)

1996

Fertigstellung der Sequenzierung des ersten Genoms eines Eukaryonten (Saccharomyces cerevisiae), initiiert und koordiniert durch Andre Goffeau (Goffeau et al. 1996); 12.068.000 bp

1998

Die Gruppen von John Sulston und Robert Waterston stellen die Sequenz des Caenorhabditis-elegans-Genoms fertig (The C. elegans Sequencing Consortium, 1998); 97.100.000 bp

1999

Publikation des ersten menschlichen Chromosoms (Chr. 22) durch britische, US-amerikanische und japanische Gruppen (Dunham et al. 1999); 33.573.000 bp

2000

Sequenzierung des ersten Pflanzengenoms (Arabidopsis thaliana) (The Arabidopsis Genome Intiative 2000); 115.409.000 bp

2000

Publikation der ersten Fassung des menschlichen Genoms (The Genome International Sequencing Consortium 2000) (Venter et al. 2000); ca. 3.286.000.000 bp

2004

Publikation der Endfassung des menschlichen Genoms (The Genome International Sequencing Consortium 2004)

2005

Fertigstellung einer SNP-Karte zur Identifizierung von Krankheitsgenen (The International HapMap Consortium 2005)

363 3.4 · Gendiagnostik

3.4.2 Grundlagen der klinischen Anwendung Peter Schirmacher und Roland Penzel 3.4.2.1 Klinische Fragestellungen und Anwendungsbereiche Die molekularpathologische Gewebsanalyse hat sich in den letzten Jahren zu einem wichtigen integrierten Bestandteil der klinischen Pathologie mit rasch zunehmenden Untersuchungszahlen und Anwendungsbereichen entwickelt. Sie erweitert das Methodenspektrum des Pathologen um die Nukleinsäureanalytik. Die hierdurch gewonnenen Zusatzinformationen dienen dem Pathologen zur Präzisierung oder Erweiterung der Diagnose und ermöglichen eine prognostische Beurteilung. Methodisch wurden dafür im Wesentlichen die Polymerasekettenreaktion (PCR) mit ihren verschiedenen Varianten und DNA/RNA-Hybridisierungstechniken für den diagnostischen Einsatz an formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeproben (FFPE) optimiert (> Abb. 3.4.12). Grundsätzlich stellt auch der spezifische Proteinnachweis am Gewebsschnitt mittels Antikörpern (Immunhistologie) ein molekularpathologisches Nachweisverfahren dar, auf das jedoch an dieser Stelle nicht weiter eingegangen wird. Die Darstellung beschränkt sich auf die Nukleinsäureanalytik. Die Anwendungsbereiche der Molekularpathologie sind v. a. die Infektions- und Tumordiagnostik. Derzeit überwiegt quantitativ die Erregerdiagnostik, die Nachweise in der Tumordiagnostik nehmen jedoch rasch zu. In der Infektionsdiagnostik werden überwiegend mittels PCR-basierter Nachweisverfahren erregerspezifische, genomische (meist DNA-, selten RNA-)Sequenzen von Viren, Bakterien, Parasiten und Mykoplasmen bestimmt und gegebenenfalls zur Typisierung oder Resistenztestung weiter analysiert. Diese Nachweisverfahren stehen nicht in Konkurrenz zu den klassischen bakteriologischen,

3.4

virologischen oder parasitologischen Verfahren, da diese an FFPE-Proben nicht anwendbar sind. Eine molekularpathologische Erregerdiagnostik wird dann durchgeführt, wenn sich nach der Begutachtung der histologischen Präparate der Verdacht auf das Vorliegen einer bislang nicht gesicherten Infektionserkrankung ergibt (z. B. bei granulomatöser Entzündung) oder seltener, wenn aus klinischer Sicht nach der Gewebeentnahme der Verdacht aufkommt. Grundsätzlich können alle Erreger nachgewiesen werden. Die gängigen Nachweisverfahren beschränken sich auf klinisch relevante Erreger, die differenzialdiagnostische Probleme bereiten und deren Abklärung nicht selten Gewebsentnahmen erfordert, wie z. B. mykobakterielle Infektionen in der differenzialdiagnostischen Abklärung einer granulomatösen Entzündung. Weiterhin kann der molekularpathologische Nachweis zusätzliche differenzialdiagnostische Informationen liefern, wie z. B. die HPV-Subtypisierung zur Bestimmung des Malignitätspotenzials („low risk/high risk“) bei Plattenepitheldysplasien. Der zweite große Anwendungsbereich der Nukleinsäureanalytik am FFPE-Gewebe ist die Tumordiagnostik. Eine Anforderung ist die exakte Differenzialdiagnose durch molekulare Subtypisierung (z. B. bei Sarkomen und Lymphomen), welche die Voraussetzung für gezielte Therapien schafft. Auch histologisch schwierige Fragen, wie minimale Resttumorformationen, sind ein Grund für molekularpathologische Gewebsanalysen. Hierzu können bei mesenchymalen und hämatologischen Tumoren entitätsspezifische Genveränderungen genutzt werden. Neben den klassischen histopathologischen und immunhistochemischen Merkmalen werden v. a. bei Weichgewebssarkomen und malignen Lymphomen typspezifische chromosomale Translokationen untersucht. Diese können mittels der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) unter Verwendung geeigneter Sonden auf chromosomaler Ebene dargestellt werden. Ein alternatives Nachweisverfahren ist die Reverse-Trans-

In-situ-Hybridisierung

Klonalitätsanalyse Fusionstranskripte EBV Mykobakterien HCV HPV

. Abb. 3.4.12. Methoden und Anwendungsbereiche der molekularpathologischen Gewebsanalyse

364

Sektion 3 · Diagnostik

kriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), mit deren Hilfe translokationsbedingte tumorspezifische Fusionstranskripte nachgewiesen werden können. In Einzelfällen ist die Abgrenzung reaktiver und maligner Lymphknotenerkrankungen allein aufgrund der Histomorphologie und des immunhistologischen Markerprofils nicht sicher möglich. In diesen Fällen ist die PCRgestützte Klonalitätsanalyse des IgH-(B-Zell-Lymphome) bzw. TCR-Rearrangements (T-Zell-Lymphome) eine wesentliche Hilfe. Bei der Bestimmung prognostischer Marker oder therapeutischer Zielstrukturen (prädiktive Tumorpathologie) stehen v. a. Gene, die für Rezeptortyrosinkinasen (RTK) kodieren, im Vordergrund. Diese RTKs spielen nicht nur eine wichtige Rolle in der Pathogenese verschiedener Tumorerkrankungen, sondern sind auch vielversprechende oder bereits etablierte Ziele für eine gerichtete Therapie sowohl mit humanisierten Antikörpern gegen die Ligandenbindungsdomäne als auch mit Tyrosinkinase-Inhibitoren. Etwa 15–20% aller invasiven Mammakarzinome weisen Überexpressionen des Her2/ neu-Protoonkogens auf. Der zugrunde liegende Mechanismus ist hierbei die Amplifikation des Genlocus auf Chromosom 17q12. Die erhöhte Genkopienzahl kann mit der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung an Gewebsschnitten nachgewiesen werden. Da Her2-überexprimierende bzw. amplifizierte Tumoren einer zielgerichteten Antikörpertherapie zugeführt werden können, ist die sichere Bestimmung der Genamplifikation insbesondere in immunhistochemisch nicht eindeutigen Fällen therapeutisch entscheidend. Gastrointestinale Stromatumoren (GIST) zeigen mit hoher Frequenz (50–90%, je nach Studie) aktivierende Mutationen im c-kit-Gen (Typ III RTK) (Penzel et al. 2005). Dabei ist das Ansprechen der Tumoren auf die Behandlung mit dem Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib von der Lokalisation der Mutation im c-kit-Gen abhängig (> Abb. 3.4.15a).

3.4.2.2 Material und Aufarbeitung Klinisch-diagnostischer Ablauf Die Gewebeproben und Operationspräparate werden direkt nach der Entnahme in Formaldehyd eingelegt und mit den klinischen Angaben und Fragestellungen in die Pathologie übersandt. Hier werden sie zunächst zugeschnitten und nach der entsprechenden Fixierungsdauer in Paraffin eingebettet. Die von den Paraffinblöcken erstellten histologischen Schnittpräparate bilden die Grundlage der pathologischen Diagnostik. Nach der mikroskopischen Begutachtung entscheidet der Pathologe, ob und welche molekularpathologischen Zusatzuntersuchungen an den ausgewählten Gewebeproben durchgeführt werden. Die abschließende Interpretation der Er-

Paraffin

. Abb. 3.4.13. Klinisch-diagnostischer Ablauf

gebnisse der molekularpathologischen Zusatzuntersuchungen erfolgt durch den befundenden Pathologen unter Berücksichtigung des klinischen und histologischen Gesamtaspekts (> Abb. 3.4.13). Fixierung und Einbettung Die Gewebefixierung in der diagnostischen Pathologie ist auf eine rasche, strukturerhaltende, dauerhafte, praktikable und kostengünstige Konservierung der Gewebestrukturen ausgerichtet, die nach der Einbettung in Paraffin für die lichtmikroskopische Begutachtung aufgearbeitet werden. Die Fixierung der Gewebeproben in neutralgepuffertem Formaldehyd (üblicherweise 2,5– 4%ig) ist die häufigste Form der Gewebekonservierung in der Routinepathologie. Sie ermöglicht die standardisierte Prozessierung von Gewebeproben bei gleichbleibend guter Erhaltung der Gewebe- und Zellmorphologie und bildet damit die Grundlage für die pathohistologische Diagnostik. Die denaturierende Wirkung der Formaldehydfixierung führt nicht nur zur gewünschten Gewebestabilisierung durch die Bildung von Hydroxymethylenbrücken zwischen Proteinen, sondern degradiert auch hochmolekulare Nukleinsäuren durch Hydrolyse zu relativ kurzen Fragmenten [etwa 500–1.000 Basenpaaren (bp)]. Zudem können kovalente Bindungen

365 3.4 · Gendiagnostik

im Rahmen der Fixierung die für die PCR-Amplifikationen notwendigen Zielsequenzen maskieren (Srinivasan et al. 2002). Bei hoher Kopienzahl ist jedoch die Wahrscheinlichkeit, dass alle Zielsequenzen unzugänglich sind, gering, und somit spielen fixierungsbedingte Sequenzalterationen gegenüber der generellen Fragmentierung der Nukleinsäuren eine eher untergeordnete Rolle. Die schnelle und effektive Penetration des Gewebes durch das Fixans gewährleistet eine rasche Inaktivierung der Nukleaseaktvitäten und verhindert die Nukleinsäurendegradierung durch Autolyse. Generell vollzieht sich die Fixierung bei kleinen Gewebepräparaten wie Biopsien rascher, sodass die Nukleinsäureintegrität bei diesen Proben erfahrungsgemäß besser ist als bei größeren Gewebeproben. Die nachfolgende Paraffineinbettung hat keinen Einfluss auf die Nukleinsäureintegrität und erlaubt auch nach jahrzehntelanger Lagerung bei Raumtemperatur reproduzierbare DNA- und RNANachweise. Assay-Design Die durch Fixierung oder Autolyse beeinträchtigte Nukleinsäureintegrität muss bei der Konzeption und Etablierung von diagnostischen, PCR-gestützten Gewebsanalysen berücksichtigt werden. Um auch bei suboptimaler Integrität (z. B. verspätete Fixierung, zu kurze Fixierungsdauer oder unzureichende Gewebepenetration) reproduzierbare und eindeutige Ergebnisse zu erzielen, müssen die zu amplifizierenden Zielsequenzen sowohl sehr kurz als auch spezifisch sein. Generell sollten DNA-Amplifikate für typspezifische Erregernachweise nicht länger als 200 bp sein. Für die Erregernachweise und die Bestimmung von Fusionstranskripten auf der RNA-Ebene sollten RT-PCR-Produkte eine Länge von 150 bp nicht überschreiten. Wenn möglich, sollten die Erregernachweise bei ausreichender Keimzahl unter stringenten Bedingungen mit typspezifischen „single copy“-Genen durchgeführt werden, da dies den zeitlichen Aufwand begrenzt und die Auswertung vereinfacht. Bei Infektionen mit niedriger Keimzahl (z. B. Mykobakterien) kann die Nachweisgrenze durch Auswahl repetitiver Sequenzen deutlich gesenkt werden. In der Literatur finden sich viele, an Paraffinmaterial erprobte Primer-Sets, die jedoch unter diagnostischen Routinebedingungen mit gesichertem Positivmaterial getestet werden müssen. Im Verlauf der Etablierung und Anwendung sind zusätzliche PCR-Assays mit externen Referenzproben (z. B. Ringversuche) empfehlenswert. Kontrollen und Kontaminationsprophylaxe Ihre hohe Sensitivität macht diagnostische PCR-Nachweise anfällig für Kontaminationen; Verunreinigungen mit einem oder wenigen Target-DNA-Molekülen können bereits zu einem falsch- positiven Ergebnis führen.

3.4

Neben den üblichen Maßnahmen wie dem Gebrauch von aerosolsicheren Filterspitzen müssen die Schritte Gewebeaufbereitung, Reagenzienvorbereitung und PCR-Produktanalytik räumlich getrennt werden. Zur Reduktion der Pipettierschritte empfehlen sich PCR-Komplettgemische, die alle Komponenten außer den analysespezifischen Primern und der DNA-Probe enthalten. Für RNA-Nachweise existieren Transkriptions-Amplifikations-Gemische. Für jede diagnostische Analyse ist eine Kontroll-PCR oder RT-PCR für ein „housekeeping“-Gen zur Kontrolle der diagnostischen Nukleinsäureaufreinigung erforderlich. Bei Erregernachweisen und der Detektion von Fusionstranskripten müssen zusätzlich analysespezifische Positiv- und Negativkontrollen der PCR-Amplifikationen durchgeführt werden. Grundlagen der Gewebsaufarbeitung Zur Nukleinsäureextraktion aus FFPE-Gewebe werden typischerweise 1–3 7,5 µm dicke Mikrotomschnitte aus den Paraffinblöcken gewonnen. Die Verwendung jeweils frischer Messer und die gründliche Reinigung des Mikrotoms mit Hypochloridlösung sind erforderlich. Zur Prozesskontrolle werden Leerblockschnitte durch alle Analyseschritte mitgeführt. Die Gewebeproben werden hitzedenaturiert und proteolytisch aufgeschlossen, meist mit Proteinase K unter Zugabe von Detergenzien und Chelatbildnern. Präparative PCR-Reaktionen für nachfolgende Sequenzierungen oder Restriktionsanalysen können meist bereits an ungereinigter DNA-Lösung erfolgen. Vor Erreger- und RT-PCR-Nachweisen sollten die Nukleinsäuren jedoch aufgereinigt werden. Um den durch die Aufreinigung bedingten Verlust an Nukleinsäuren v. a. bei sehr kleinen Gewebeproben gering zu halten, empfehlen sich säulenfreie Nukleinsäurepräparationsverfahren.

3.4.2.3 Diagnostische Verfahren PCR Die PCR mit ihren verschiedenen Varianten und die DNA/RNA-Hybridisierungstechniken sind die beiden wichtigsten methodischen Bausteine der molekularen Gewebsdiagnostik. Die PCR-basierte, exponentielle Amplifikation von DNA und RNA kann je nach Fragestellung für den direkten typspezifischen Nachweis von Erregern und anderer Zielsequenzen genutzt werden oder als Grundlage für weitere Analyseverfahren wie die DNA-Sequenzierung und Restriktionspolymorphismusanalyse dienen. Im Gegensatz zur PCR als nichtmorphologischem Nachweisverfahren können durch spezifische DNA/RNA-Hybridisierungen die diagnostisch relevanten Zielsequenzen auch in situ, d. h. direkt auf dem Gewebeschnitt, bestimmt werden.

366

Sektion 3 · Diagnostik

Die Voraussetzung diagnostischer PCR-Nachweise ist die Kenntnis der Basensequenz der zu amplifizierenden DNA bzw. RNA. Für die Auswahl geeigneter Oligonukleotid-Primer anhand der Sequenzinformationen (z. B. frei zugängliche Sequenzdatenbanken) können Primer-Auswahlprogramme mit einer Vielzahl individuell einstellbarer Parameter genutzt werden. Die PCR-Nachweisverfahren erfordern möglichst stringente Reaktionsbedingungen, um die Synthese von Nebenprodukten und Artefakten, wie Primer-Dimere, aufgrund von „mismatch“-Bindungen zu minimieren. Ein kritischer Punkt ist die einzusetzende DNA-Menge; ein guter Ansatz ist eine Konzentration von 200 ng/25 µl Reaktionsvolumen. Standard-PCR-Reaktionen werden in der molekularpathologischen Diagnostik zur Synthese von PCR-Produkten genutzt, die anschließend weiteren Analyseverfahren zugeführt werden. Bei Verdacht auf Infektionen, die eine hohe Keimzahl vermuten lassen, können Standard-PCRs auch für den typspezifischen Erregernachweis eingesetzt werden. Für die Sequenzanalyse zur Identifizierung von Mutationen und Erregersubtypen nach gruppenspezifischen Amplifikationen (Pan-Erregernachweise) sollte die primäre PCR mit DNA-Polymerasen durchgeführt werden, die eine 3‘-5‘-Exonuklease-Aktivität („proofreading“) besitzen und eventuell auftretende Synthesefehler korrigieren. Die Detektion der amplifizierten PCR-Produkte mittels ethidiumbromidhaltiger Agarose-Gelelektrophorese ist derzeit die praktikabelste und kostengünstigste Lösung. Für Klonalitätsuntersuchungen und die in seltenen Fällen notwendige DNA-Typisierung zur Probenidentifizierung werden in der Regel fluorochrommarkierte Konsensus-Primer verwendet und die Amplifikate anschließend in DNA-Sequenziersystemen analysiert. Für den typspezifischen Erregernachweis ist die Nachweisgrenze der Standard-PCR nicht immer ausreichend. Dies gilt besonders für Infektionen mit geringer Keimzahl, v.a. für mykobakterielle Infektionen. Finden sich im Erregergenom keine spezifischen repetitiven Sequenzbereiche, die einen Nachweis mit Standard-PCRVerfahren ermöglichen, so kann die Sensitivität bei typspezifischen Erregernachweisen mit einer Nested-PCR erhöht werden. Hierbei werden zwei aufeinanderfolgende PCR-Reaktionen derart verschachtelt, dass das Produkt der primären PCR als Template für die zweite Amplifikation mit unterschiedlichen Primern dient. Prinzipiell kann für die zweite PCR auch nur ein unterschiedlicher Primer („seminested“) in Kombination mit einem „primären“ Primer eingesetzt werden. Die nestedPCR-Varianten sind im Vergleich zur Standard-PCR nicht nur sensitiver, sondern ihre Spezifität wird durch die Verwendung von zwei spezifischen Primerpaaren deutlich erhöht.

Eine weitere Variante der PCR-Methodik ist die Multiplex-PCR. Hierbei werden mit mehreren (multiplen) Primer-Paaren in einer PCR-Reaktion verschiedene Zielsequenzen simultan amplifiziert und anschließend gelelektrophoretisch aufgetrennt. Obwohl die Methode unter optimalen Bedingungen eine Vielzahl von denkbaren Anwendungen erlaubt, kann sie in der molekularpathologischen Gewebsanalyse nur begrenzt eingesetzt werden. Der zeitnahe und kostengünstige Nachweis der verschiedenen PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese fordert, dass sich die Größe der Fragmente um mindestens 50 bp voneinander unterscheidet. Bei maximal amplifizierbarer Länge von 500 bp können ca. 5 verschiedene Zielsequenzen aus FFPE-Gewebe simultan in einem PCR-Ansatz amplifiziert werden. Ein elegantes Beispiel für die Kombination von Nested- und Multiplex-PCR sind PCR-Strategien zur HPV-Subtypisierung. (> Abb. 3.4.14). Aus FFPE-Gewebe isolierte RNA ist besonders von der fixierungsbedingten Fragmentierung betroffen. Folglich werden alle RT-PCR-Nachweise so konzipiert, dass die Länge der Amplifikate 150 bp nicht überschreitet. Für die reverse Transkription der RNA können sog. „random“-Hexamere, oder besser zielsequenzspezifische Primer, verwendet werden. Hilfreich sind „one-step“RT-PCR Systeme, die reverse Transkription und nachfolgende PCR-Amplifikation in einem Reaktionsgefäß erlauben, wodurch nicht nur eine Reduzierung der Pipettierschritte, sondern auch eine bessere Kontaminationsprophylaxe erreicht wird. Zu den typischen Anwendungsbereichen der RT-PCR in der molekularen Gewebsanalyse zählen die tumorspezifischen Fusionstranskriptnachweise. Hybridisierungstechniken Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) dient in der Molekulardiagnostik dem Nachweis chromosomaler Amplifikationen oder Translokationen. Typische Beispiele sind der Amplifikationsnachweis des c-erbB2/ Her2-Gens beim Brustkrebs (> Abb. 3.4.15b) und die differenzialdiagnostisch wichtigen Translokationsnachweise in der hämato-onkologischen und Sarkomdiagnostik. Die Amplifikation einer chromosomalen Region wird mittels einer markierten genspezifischen Sonde am Schnitt dargestellt. Für die Translokationsnachweise können zwei verschiedene Varianten der FISH eingesetzt werden. In der „dual-color-break-apart“-FISH werden zwei mit unterschiedlichen Fluorochromen markierte, zentromer- bzw. telomerwärts des chromosomalen Bruchpunkts gelegene Sonden eingesetzt, sodass im Falle einer Translokation die in normalen Interphasezellkernen nah beieinander erscheinenden Signale getrennt liegen. Die „break-apart“-FISH eignet sich besonders für den Nachweis von Translokationen, bei de-

367 3.4 · Gendiagnostik

3.4

a

HPV

b

. Abb. 3.4.14a,b. PCR-basierte HPV-Subtypisierung am Gewebe (nach Sotlar et al. 2004). a Struktur des HPV-Genoms und NestedMultiplex-PCR-Strategie zur Identifizierung der kanzerogenen (HR) und nicht kanzerogenen (LR) HPV-Subtypen. In der primären PCR wird das HPV-gruppenspezifische E6/E7-Fragment (630 bp) amplifi-

ziert. Dieses wird in den nachfolgenden Multiplex-PCR-Ansätzen (PCR-Primer Pools 1–4) als Template zur Subtypisierung eingesetzt. b Gelelektrophoretische Auftrennung der 4 Multiplex-PCRs mit einem HPV-16-Nachweis (Pool 1, 457 bp); L, Leerblock (Kontaminationskontrolle); K, Extraktionskontrolle

nen ein spezifisches Chromosom in der gleichen Region bricht, aber mit verschiedenen Chromosomen fusioniert (z. B. beim Ewing-Sarkom). Im Gegensatz hierzu werden bei der „dual-color-fusion“-FISH zweifarbig markierte Sonden verwendet, die die Bruchpunkte auf den beteiligten Chromosomen markieren. Das Rearrangement zweier verschiedener betroffener chromosomaler

Loci als Folge einer Translokation wird dann durch die Verschmelzung normalerweise getrennter Signale angezeigt. Die RNA-in-situ-Hybridisierung (RISH) spielt im Gegensatz zu wissenschaftlichen Fragestellungen in der praktischen Gewebsdiagnostik eine eher untergeordnete Rolle.

368

Sektion 3 · Diagnostik

a

b

. Abb. 3.4.15a,b. a Exonstruktur und funktionelle Domänen der Rezeptortyrosinkinase c-kit mit dem Nachweis einer 6-BasenpaarDeletion im Exon 11 durch direkte DNA-Sequenzierung der amplifizierten Exons. Gastrointestinale Stromatumoren (GIST) zeigen mit

einer Häufigkeit von ca. 90% Mutationen im c-kit-Gen, die wiederum zu ca. 75% im Exon 11 lokalisiert sind. b FISH-Nachweis einer Her2Genamplifikation

369 3.4 · Gendiagnostik

3.4.2.4 Perspektiven Der Einsatz der Array-Technologie (DNA-Chips, „mikrofluid-cards“) in der molekularpathologischen Gewebsanalyse verspricht für die Zukunft wesentliche Fortschritte bei der exakten Diagnose und individualisierten Behandlung von Tumorerkrankungen. Dabei können Arrays mit einer begrenzten Anzahl an Zielgenen („low-density arrays“) wertvolle Informationen über Herkunft, prognostisch wichtige Eigenschaften und Therapierbarkeit eines Tumors beisteuern. Auch der Einsatz im Bereich der Infektionsdiagnostik zur schnellen und präzisen Erregeridentifizierung und Resistenztestung stellt eine mögliche Anwendung dar. Die Heterogenität einiger Tumorentitäten oder spärliche Tumoranteile in einer Gewebeprobe werden zudem den Einsatz der lasergestützter Mikrodissektion („laser capture microdissection“, LCM) erfordern, um eine aussagekräftige Tumorzellpopulation gewinnen zu können. Die fortschreitende Miniaturisierung der

3.4

Array-Systeme ermöglicht nicht nur die Analyse sehr kleiner Probenvolumina bei erhöhter Sensitivität, sondern führt auch zur Kostenreduktion durch geringeren Materialverbrauch und wird daher zur weiteren Verbreitung der Methodik beitragen. Durch Automatisierung und Parallelisierung der Analysen z. B. in Liquid-handling-Systemen wird eine deutliche Reduktion von Aufwand, Kosten und Kontaminationsrisiko erfolgen.

3.4.2.5 Literatur Penzel R, Aulmann S, Moock M, Schwarzbach M, Rieker RJ, Mechtersheimer G (2005) The location of KIT and PDGFRA gene mutations in gastrointestinal stromal tumours is site and phenotype associated. J Clin Pathol. 58: 634–9 Sotlar K, Stubner A, Diemer D, Menton S, Menton M, Dietz K, Wallwiener D, Kandolf R, Bultmann B. (2004) Detection of high-risk human papillomavirus E6 and E7 oncogene transcripts in cervical scrapes by nested RT-polymerase chain reaction.J Med Virol.74:107–16

370

Sektion 3 · Diagnostik

3.4.3 Grundlagen der molekulargenetischen Diagnostik erblicher Krankheiten Stefan Aretz 3.4.3.1 Einführung Unter molekulargenetischer Diagnostik („Keimbahnanalytik“) bei erblichen Krankheiten versteht man Untersuchungen zum Nachweis pathogener Mutationen der DNA, die über die Generationen weitergegeben werden können (Keimbahnmutationen). Davon abzugrenzen sind einerseits Mutationen auf chromosomaler Ebene, die mit (molekular-)zytogenetischen Techniken (Chromosomenanalyse, FISH) nachgewiesen werden, und andererseits somatische Mutationen (z. B. bei Tumoren), die nicht über die Keimbahn weitergegeben werden, also nicht erblich sind. Nach dem Zeitpunkt unterscheidet man postnatale von pränatalen und präimplantativen Untersuchungen. Die klinisch relevante molekulargenetische Diagnostik (MD) wird fast ausschließlich bei den überwiegend seltenen, monogen erblichen Krankheiten eingesetzt (> Tab. 3.4.2). Diese folgen den klassischen

Erbgängen und beruhen auf Mutationen in jeweils einem einzelnen Gen (Murken 1996; Passarge 2004; Strachan 2005). Die Interpretation molekulargenetischer Befunde ist oft schwierig und erfordert humangenetisches Fachwissen, der klinisch tätige Arzt muss jedoch die Aussagekraft und die Grenzen dieser Diagnostik kennen, um eine rationale Indikation zur Untersuchung stellen zu können. Zu den Indikationen (Anwendungsbereichen) gehören die Überprüfung einer klinischen Verdachtsdiagnose (Differenzialdiagnose), die Untersuchung auf Heterozygotie bei autosomal-rezessiven oder X-chromosomalrezessiven Erkrankungen (Heterozygotentest), die molekulargenetische Pränataldiagnostik und die prädiktive (vorhersagende) genetische Testung (> Abb. 3.4.16). Die Zahl bekannter, monogen vererbter („mendelnder“) Krankheiten wird derzeit auf ca. 4.000 geschätzt (OMIM, Orphanet). Nur, wenn bei einer bestimmten Krankheit das verantwortliche Gen bekannt ist, kommt bei einem Patienten auch eine MD in Betracht. Im Internet sind Übersichten zu Klinik, diagnostischen Kriterien, Molekulargenetik und Therapie monogener Krankheiten (GeneReviews/GeneTests) sowie Informationen zum

. Abb. 3.4.16. Schematische Darstellung des optimalen Ablaufs einer molekulargenetischen Diagnostik bei verschiedenen Indikationen/ Fragestellungen

371 3.4 · Gendiagnostik

. Tab. 3.4.2. Erkrankungsrisiko (Penetranz), klinisches Manifestationsalter und adäquater Zeitpunkt einer prädiktiven Diagnostik bei verschiedenen, genetisch (mit-)bedingten Krankheiten. Erkrankung/Disposition

Gen (Genotyp)

Erkrankungsrisiko/ Penetranz bei Anlageträgern *

Beginn klinische Manifestation (Lebensjahre)

Alter bei prädiktiver Testung (Lebensjahre)

Hämochromatose

HFE (C282Y/C282Y)

1-2 % (?)

30-60

≥18

Thromboserisiko bei Faktor-VLeiden-Mutation (heterozygot)

FV (G1691A)

5- bis 8-fach erhöht

jedes Alter

jedes Alter****

Thromboserisiko bei Faktor-VLeiden-Mutation (homozygot)

FV (G1691A)

50- bis 80-fach erhöht

jedes Alter

jedes Alter****

autosomal-dominante polyzystische Nierenerkrankung

PKD1, PKD2

>50%

>20

≥18

Achondroplasie

FGFR3

~100%

Geburt

meist Neumutation

Mukoviszidose

CFTR

variabel***

1

pränatal

Phenylketonurie

PAH

variabel***

1

Neugeborene

spinale Muskelatrophie (SMA)

SMN1

>95%

Geburt bis >30

pränatal

Muskeldystrophie Duchenne (DMD)

DMD

~100%

frühe Kindheit

pränatal

Fragiles-X-Syndrom (männliche Anlageträger)

FMR1

~100%**

1

pränatal

klassisches Adrenogenitales Syndrom (AGS)

CYP21

>95%

Geburt bis >20

pränatal

frühmanifeste Krankheiten

erbliche Tumordispositionssyndrome multiple endokrine Neoplasie (MEN) Typ 2 B

RET

~ 100

frühe Kindheit

25

≥18

erblicher Brustkrebs

BRCA1, BRCA2

40 - 80%

>25

≥18

erblicher Darmkrebs (HNPCC)

MLH1, MSH2, MSH6

70 - 80%

>25

≥18

Neurofibromatose Typ 1

NF1

~100%

1

jedes Alter

spätmanifeste neurodegenerative Erkrankungen Alzheimer-Krankheit

APOE (e4/e4)

~ 30%

50-70

-

Huntington-Erkrankung (HD)

HD

~100%

40-50

≥18

Spinozerebelläre Ataxie Typ 1 (SCA1)

ATXN1

~100% **

5-65

≥18

hereditäre motorisch-sensible Neuropathie (HMSN) Typ 1

PMP22

~100%

5-25

≥18

*

Lebenszeitrisiken bei unbehandelten Anlageträgern; bei spätmanifesten Krankheiten sind die altersspezifischen Erkrankungsrisiken in jüngeren Jahren entsprechend niedriger. ** abhängig von Repeat-Expansion *** stark abhängig von Genotyp und familiärer Manifestation **** abhängig von familiärer Manifestation

3.4

372

Sektion 3 · Diagnostik

diagnostischen Leistungsspektrum für den deutschsprachigen und europäischen Raum verfügbar (HGQN, EDDNAL). Durch das geplante Gendiagnostikgesetz (GenDG) sollen genetische Untersuchungen beim Menschen zukünftig in Deutschland auf eine gesetzliche Grundlage gestellt werden.

3.4.3.2 Humangenetische Beratung Die Bedeutung einer angemessenen Patientenaufklärung im Zusammenhang mit genetischen Untersuchungen ist unstrittig und Gegenstand von Richtlinien, Empfehlungen und Positionspapieren von Fachgesellschaften und Bundesärztekammer (BÄK 1998a; BÄK 1998b, BÄK 2003; GfH 2006a). Die möglichen Konsequenzen einer MD müssen mit dem Patienten (bzw. bei Minderjährigen mit ihren Eltern) vor der Untersuchung besprochen werden. Insbesondere jede prädiktive Untersuchung, Heterozygotendiagnostik oder Pränataldiagnostik muss mit dem Angebot einer humangenetischen Beratung verbunden sein, denn die informierte Entscheidung für oder gegen eine genetische Untersuchung kann nur auf der Basis kompetenter, nichtdirektiver Aufklärung über deren Aussagekraft und Konsequenzen erfolgen (Zerres 2003). Die humangenetische Beratung ist eine reguläre kassenärztliche Leistung, sie wird auf ärztliche Überweisung durchgeführt. Die Adressen aller Beratungsstellen sind im Internet verfügbar (GfH 2006b).

3.4.3.3 Aussagekraft und Methodik Bestimmte Mutationstypen (Stoppmutationen, Leserasterverschiebungen) in kodierenden Genbereichen können als sicher krankheitsverursachend eingestuft werden, andere lassen sich hingegen nicht immer eindeutig von Polymorphismen oder niedrigpenetranten Varianten abgrenzen. Solche unklaren Befunde können nur durch ergänzende funktionelle Untersuchungen oder durch intrafamiliäre Kosegregation weiter abgeklärt werden. In einem Teil der Fälle lässt sich die Frage der pathogenen Relevanz einer Variante aber trotz aller Bemühungen nicht eindeutig beantworten. Grundsätzlich lassen sich nur einzelne Gene gezielt molekulargenetisch untersuchen. Ein Screening aller bekannten Erbanlagen („Gen-Check“) ist derzeit weder technisch, finanziell und zeitlich realisierbar, noch ließen sich hierdurch sinnvolle Informationen für den Untersuchten gewinnen. Zum Nachweis einer Mutation wird der relevante Genabschnitt häufig mittels PCR amplifiziert und dann entweder sequenziert oder mit einem anderen mutationsspezifischen Verfahren analysiert. Bei der

Mutationssuche werden Gene vielfach erst mit Suchmethoden durchgemustert („screening“). Auffällige Abschnitte können dann zum Mutationsnachweis sequenziert werden. Gelingt die Identifikation einer Mutation nicht, kann in geeigneten Familien eine indirekte Genotypdiagnostik (Kopplungsanalyse) durchgeführt werden. Wenn eine Person in einer Familie als einzige von einer autosomal-dominanten Erkrankung betroffen ist (sporadischer Erkrankungsfall), dann liegt höchstwahrscheinlich eine Neumutation vor. Das Wiederholungsrisiko bei zukünftigen Geschwistern ist dann gering, im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung aber dennoch leicht erhöht, weil bei einem Elternteil ein nie auszuschließendes Keimzellmosaik für die betreffende Mutation vorliegen kann. Liegt eine Neumutation als somatisches Mosaik vor, dann ist sie unter Umständen nicht in allen Geweben (z. B. Blut) nachweisbar.

3.4.3.4 Material und Untersuchungsauftrag Aus pragmatischen Gründen wird zur postnatalen Diagnostik in der Regel DNA aus Leukozyten des peripheren Blutes (5–10 ml EDTA-Blut) zur Untersuchung verwendet. Der Versand der Proben sollte in bruchsicheren, ausreichend beschrifteten und mit einem lesbaren Absender versehenen Verpackungen entsprechend der Verpackungsanweisung P650 ADR bei Raumtemperatur erfolgen. Unbeschriftete Blutproben dürfen wegen der Verwechslungsgefahr und der Tragweite einer genetischen Untersuchung nicht bearbeitet werden. Der Anforderung sollten neben einer klaren Indikationsstellung ausreichende klinische Informationen über den Patienten und dessen Familienanamnese beiliegen. Im Zweifel empfiehlt sich eine vorherige telefonische Klärung von Indikation und spezifischen Anforderungen mit dem beauftragten Labor oder die Vorstellung des Patienten in einer humangenetischen Beratungsstelle zur rationalen Planung der Diagnostik. Bei prädiktiven Fragestellungen sollte ein schriftliches Einverständnis der zu untersuchenden Person vorliegen.

3.4.3.5 Indikationen in der klinischen Diagnostik Differenzialdiagnostik In vielen Fällen kann der Nachweis einer Mutation eine klinische Verdachtsdiagnose bestätigen bzw. bei der differenzialdiagnostischen Abgrenzung eines Phänotyps helfen. Bei bestimmten Krankheiten kann dem Patienten hierdurch eine invasive Diagnostik erspart bleiben (z. B. die Muskelbiopsie bei Verdacht auf Muskeldystrophie Typ Duchenne). Die meisten klinischen Leitsymptome

373 3.4 · Gendiagnostik

sind nicht spezifisch für eine bestimmte (monogene) Krankheit, ihnen können Mutationen in einem von insgesamt mehreren infrage kommenden Genen zugrunde liegen (Heterogenie). Voraussetzung einer rationalen MD ist deshalb immer eine klare Fragestellung auf der Basis einer fundierten klinischen Verdachtsdiagnose. Nicht für alle Erkrankungen mit identifizierbaren Mutationen ist derzeit auch eine molekulargenetische Routinediagnostik verfügbar: Eine ausgesprochene LocusHeterogenie (z. B. bei Retinitis pigmentosa oder nichtsyndromaler Schwerhörigkeit) kann die Untersuchung erschweren oder aufgrund des unverhältnismäßig großen Aufwands bzw. der geringen Rate positiver Befunde (derzeit) unmöglich machen. Bei einer klinisch diagnostizierten monogenen Erkrankung gelingt der Mutationsnachweis nicht immer, die Detektionsraten schwanken zwischen Abb. 3.4.17). Lässt sich bei einer Risikoperson die in der Fami-

3.4

lie bekannte Mutation ausschließen, dann hat die untersuchte Person im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung kein erhöhtes Erkrankungsrisiko. Anlageträger werden die Krankheit hingegen mit einer von der Mutation abhängigen Wahrscheinlichkeit (Penetranz) entwickeln (> Tab. 3.4.2). Der prädiktive Wert (Vorhersagewert) einer Mutation kann dabei extrem variieren. Aussagen über das Manifestationsalter oder den Krankheitsverlauf sind bestenfalls statistischer Natur. Die prädiktive MD unterscheidet sich qualitativ von einer genetischen Untersuchung zur differenzialdiagnostischen Einordnung einer bereits manifesten Erkrankung. Das Wissen um ein erhöhtes Erkrankungsrisiko berührt Kernbereiche der Privatsphäre und Lebensplanung (Übersicht in Propping et al. 2006). Prädiktive Diagnostik kann von Sorgen befreien, für den Einzelnen und dessen Familie aber auch mit psychosozialen Belastungen verbunden sein und betrifft ebenso versicherungs- wie datenschutzrechtliche Problemfelder (GDV 2001). Jede Person hat nach dem Grundsatz der informationellen Selbstbestimmung das Recht, die eigene genetische Konstitution zu kennen, aber auch ein Recht auf Nichtwissen (Art. 1 GG in Verbindung mit Art. 2 GG). Prädiktive Diagnostik ist deshalb in der Regel volljährigen Personen mit deren schriftlichem Einverständnis vorbehalten. Sie sollte nur auf freiwilliger Basis nach nichtdirektiver humangenetischer Beratung erfolgen. Als paradigmatisch können die hohen Anforderungen bei der Huntington-Erkrankung gelten (IHA 1994); viele weitere, spätmanifeste und nicht therapierbare neurodegenerative Erkrankungen sollten gleichsinnig behandelt werden. Trotz der vielfach formulierten Standards wird derzeit nur ein Bruchteil prädiktiver Untersuchungen von einer humangenetischen Beratung begleitet. Insbesondere ein Screening auf Varianten niedriger Penetranz bzw. Polymorphismen mit umstrittenen präventiven Konsequenzen kann mehr zur Verunsicherung der Patienten als zum medizinischen Nutzen beitragen. Prädiktive Diagnostik sollte nur auf der Grundlage validierter Daten und fachkompetenter Aufklärung erfolgen. Auch die unkritische Durchführung prädiktiver Diagnostik bei Minderjährigen stellt ein Problem dar. Sie ist nur geboten, wenn sich aus dem Ergebnis unmittelbare präventive oder therapeutische Konsequenzen ergeben. Präventive Aspekte Die prädiktive MD hilft zunehmend bei der Charakterisierung von Risikogruppen, die dann gezielt risikoadaptierten Vorsorgemaßnahmen zugeführt werden können (Aretz 2004). In diesem Zusammenhang kommt den erblichen Tumordispositionssyndromen eine besondere Bedeutung zu (> Tab. 3.4.2). Aufgrund der hohen Er-

374

Sektion 3 · Diagnostik

. Abb. 3.4.17. Prädiktive Diagnostik am Beispiel des erblichen Brust- und Eierstockkrebses. Aufgrund der familiären Häufung von Krebserkrankungen eines bestimmten Tumorspektrums (Brustkrebs, Eierstockkrebs) und des jungen Erkrankungsalters bestand in der Familie klinisch V. a. erblichen Brust- und Eierstockkrebs. Alle erstgradig verwandten Frauen einer Erkrankten sind Risikopersonen und sollten in ein intensiviertes Früherkennungsprogramm aufgenommen werden. Bei der einzig noch lebenden erkrankten Person (III:8)

konnte im BRCA1-Gen eine pathogene Mutation identifiziert werden, die Verdachtsdiagnose erblicher Brust- und Eierstockkrebs ist damit molekulargenetisch bestätigt. Daraufhin haben sich einige Risikopersonen prädiktiv testen lassen: Bei einer Frau wurde die Mutation dadurch ausgeschlossen (IV:4); sie kann aus dem Früherkennungsprogramm entlassen werden. Bei IV:5 und IV:6 wurde eine Anlageträgerschaft nachgewiesen

krankungswahrscheinlichkeit (Penetranz) bei Anlageträgern einerseits und den guten Heilungschancen vieler Tumoren bei frühzeitiger Erkennung andererseits sind Maßnahmen zur Krebsprävention hier oft sehr effektiv. Mittels prädiktiver Diagnostik können Früherkennungsmaßnahmen auf die tatsächlichen Anlageträger begrenzt werden (> Abb. 3.4.17). Die MD ist allerdings nur aussichtsreich, wenn die klinischen Kriterien eines erblichen Tumorsyndroms erfüllt sind. Entscheidend für den Erfolg präventiver Konzepte ist die gezielte Erfassung möglicher Risikofamilien durch die an der Basisversorgung beteiligten Ärzte (Familienanamnese!). Die MD und Koordination der Früherkennung sollte dann durch spezialisierte interdisziplinäre Zentren erfolgen (Deutsche Krebshilfe 2007). Ein Hämochromatose-Populationsscreening wird zum Teil als präventivmedizinisch sinnvoll und ethisch vertretbar angesehen, aber kontrovers diskutiert. Ohne adäquate Aufklärung (z. B. über die geringe Penetranz

pathogener Mutationen im HFE-Gen) können solche Programme durch Fehlinterpretation von Befunden zu einer erheblichen Verunsicherung der Untersuchten beitragen. Heterozygotendiagnostik Autosomal-rezessive Erkrankungen manifestieren sich in der Regel nur bei Homozygotie bzw. Compound-Heterozygotie und treten in Verwandtenehen gehäuft auf. Beide Eltern eines Erkrankten sind in der Regel heterozygote Anlageträger und das Wiederholungsrisiko für zukünftige Kinder beträgt 25%. Ein „zur Sicherheit“ gewünschter Heterozygotentest ist hier bei den Eltern überflüssig. Die Untersuchung auf Heterozygotie kommt hauptsächlich bei frühmanifesten, schweren und nicht oder nur unzureichend therapierbaren Krankheiten (z. B. Mukoviszidose oder spinale Muskelatrophie) in Betracht. In diesem Fall ist eine humangenetische Beratung

375 3.4 · Gendiagnostik

indiziert, um das Wiederholungsrisiko bei den Nachkommen einzuschätzen. Die Heterozygotendiagnostik erfolgt meist schrittweise, bei entfernter verwandten Familienangehörigen fällt das Risiko einer Anlageträgerschaft rasch ab. Sind die Mutationen des betroffenen Indexpatienten nicht bekannt, verbleibt auch nach einem unauffälligen Heterozygotentest bei verwandten Familienangehörigen der Eltern ein – meist geringes – Erkrankungsrisiko für deren zukünftige Kinder. Die Berechnung und verständliche Mitteilung von „Restrisiken“ und ihrer Konsequenzen ist wichtiger Bestandteil der humangenetischen Beratung. Die Heterozygotendiagnostik bei X-chromosomalrezessiven Erkrankungen (z. B. Muskeldystrophie Duchenne, Hämophilie) dient der Identifikation von möglichen weiblichen Anlageträgern (Konduktorinnen) unter den Verwandten eines Patienten, denn Söhne von Konduktorinnen haben ein 50%iges Erkrankungsrisiko. Die Ausprägung klinischer Symptome bei Konduktorinnen hängt vom Grad der Inaktivierung des betroffenen X-Chromosoms ab; sie ist nicht vorhersagbar, meistens besteht aber keine oder nur eine milde Manifestation. Ein Heterozygotentest wird in der Regel nur durchgeführt, wenn sich aus der Familienanamnese konkrete Hinweise auf eine molekulargenetisch diagnostizierbare rezessive Erkrankung ergeben. Ein Bevölkerungsscreening (z. B. auf Heterozygotie für Mukoviszidose) wurde in Deutschland angesichts vielfältiger Probleme von der Bundesärztekammer und Fachgesellschaften wiederholt abgelehnt. Pränatale Diagnostik Alle molekulargenetisch diagnostizierbaren monogenen Krankheiten lassen sich prinzipiell auch pränatal feststellen. Voraussetzung ist meistens der vorherige Nachweis der pathogenen Mutation bei einem Elternteil oder einem anderen Verwandten (autosomal-dominanter, X-chromosomaler Erbgang) oder bei beiden Elternteilen bzw. bei einem betroffenen Kind (autosomal-rezessiver Erbgang). Die diagnostischen Voraussetzungen sollten deshalb bei einer geplanten Pränataldiagnostik rechtzeitig vor Eintritt einer Schwangerschaft geklärt sein. Die Verfügbarkeit pränataler Untersuchungsmöglichkeiten hat eine veränderte Wahrnehmung der Schwangerschaft und des heranwachsenden Kindes zur Folge und verlangt von den Eltern heute in zunehmendem Maß Entscheidungen über den diagnostischen Umfang und die Konsequenzen auffälliger Befunde. Aussagekraft, Methoden und Konsequenzen einer invasiven Pränataldiagnostik sowie alternative Entscheidungsmöglichkeiten sollten daher vor Untersuchungsbeginn im Rahmen einer humangenetischen Beratung

3.4

ausführlich erörtert werden. Die Indikationsstellung zu einer molekulargenetischen Pränataldiagnostik ist in der Regel nur dann gerechtfertigt, wenn aus dem Ergebnis der Untersuchung ggf. auch Konsequenzen gezogen werden sollen. In einigen Fällen – z. B. bei erhöhtem Risiko für ein adrenogenitales Syndrom oder eine RhesusInkompatibilität – kann der Befund einer vorgeburtlichen Genotypisierung Bedeutung für die pränatale Therapie bzw. das perinatale Management haben. Die gebräuchlichen Methoden der Materialgewinnung (Amniozentese, Chrionzottenbiopsie) differieren hinsichtlich eingriffsbedingtem Risiko, diagnostischer Aussage und Untersuchungsdauer. Eine molekulargenetische Pränataldiagnostik stellt hohe Anforderungen an die Untersuchungslogistik, sie sollte daher immer rechtzeitig geplant und zentral koordiniert werden. Präimplantationsdiagnostik/ Polkörperdiagnostik Die Präimplantationsdiagnostik (PID) ist ethisch umstritten und wird in Deutschland derzeit aufgrund des Embryonenschutzgesetzes (EschG) nicht angewendet, aber seit über 10 Jahren in zahlreichen anderen Ländern praktiziert. Eine der Hauptindikationen ist das Screening auf altersbedingte Chromosomenstörungen. Daneben kommt dem molekulargenetischen Ausschluss schwerer, monogen erblicher Erkrankungen die größte Bedeutung zu. Das internationale Leistungsspektrum wird kontinuierlich erweitert und kann im Internet abgerufen werden (ESHRE 2006). Die Zellentnahme scheint keine nachteiligen Folgen auf die Entwicklung des Embryos zu haben. Da nur maximal zwei Zellen untersucht werden, sind allerdings Fehldiagnosen möglich. Die Erfolgsaussichten („Baby-take-home“-Rate) und Risiken der Methode unterscheiden sich nicht grundsätzlich von denen der reproduktionsmedizinischen Behandlung ohne PID (Nationaler Ethikrat). In Deutschland wurde als rechtlich tolerierte Alternative zur PID in einigen Universitätskliniken und zunehmend auch in privaten Laboratorien die Polkörperdiagnostik (PKD) etabliert. Da sich mit dieser Methode nur Informationen über das mütterliche Erbgut gewinnen lassen, ist die Aussagekraft eingeschränkt. Das Verfahren ist mit technischen Schwierigkeiten behaftet, zeigte bisher aber keine nachteiligen Folgen bei den hierdurch geborenen Kindern (Nationaler Ethikrat). Genetisch komplexe (multifaktorielle) Krankheiten In den industrialisierten Ländern sind die meisten häufigen Krankheiten („Volks-“ oder „Zivilisationskrankheiten“ wie z. B. Bluthochdruck, Osteoporose, Adipositas, Diabetes mellitus) multifaktoriell bedingt. Die Merkmalsausprägung erfolgt somit erst im Zusammen-

376

Sektion 3 · Diagnostik

wirken mehrerer disponierender Genotypen mit im Einzelnen meist nicht exakt benennbaren exogenen Noxen („Umweltfaktoren“). Bei den disponierenden genetischen Varianten kommt den SNPs die größte Bedeutung zu. Jeder Mensch dürfte mehrere solcher angeborenen Krankheitsdispositionen (Suszeptibilitätsallele, „Risikogene“) tragen. Es besteht allerdings nur ein statistischer Zusammenhang zwischen Variante und Phänotyp; bei den Trägern eines krankheitsrelevanten Genotyps erhöht sich das Erkrankungsrisiko hierdurch meist nur gering (Cichon 2002). Die Identifizierung von SNPs eilt deren funktioneller Charakterisierung und klinischer Validierung derzeit weit voraus. Es ist möglich, dass zukünftig genetische Risikoprofile für multifaktorielle Krankheitsdispositionen erstellt und zur gezielten Prävention eingesetzt werden können. Beim gegenwärtig begrenzten Wissen über die disponierenden Gene ist eine genetische Routinediagnostik bei multifaktoriellen Erkrankungen allerdings nicht gerechtfertigt (GfH 2004). Ungeachtet des fraglichen Nutzens ist derzeit im kommerziellen Bereich eine Ausweitung des molekulargenetischen Leistungsangebotes bei multifaktoriellen Erkrankungen zu beobachten. Über das Internet werden SNP-basierte Tests zur vermeintlich sicheren Abschätzung individueller Krankheitsrisiken angeboten. Die suggerierte Aussagekraft entbehrt meist einer wissenschaftlichen Grundlage und diskreditiert die seriöse medizinische Diagnostik (Propping 2004).

3.4.3.6 Literatur Aretz S, Propping P (2004) Prävention durch die Humangenetik. In: Hurrelmann K, Klotz Th, Haisch J (Hrsg) Lehrbuch Prävention und Gesundheitsförderung. Verlag Hans Huber, Bern, S 265–278 Bundesärztekammer (1998a) Richtlinien zur Diagnostik der genetischen Disposition für Krebserkrankungen. Deutsches Ärzteblatt 95: A1396–A1403 Bundesärztekammer (1998b) Richtlinien zur pränatalen Diagnostik von Krankheiten und Krankheitsdispositionen. Deutsches Ärzteblatt 95: A3236, 3238–3242 und 99: A875 und 100: A583 Bundesärztekammer (2003) Richtlinien zur prädiktiven genetischen Diagnostik. Deutsches Ärzteblatt 100: A1297–A1305

Cichon S, Freudenberg J, Propping P et al. (2002) Variabilität im menschlichen Genom. Bedeutung für die Krankheitsforschung. Deutsches Ärzteblatt 99: A3091–A3101 Deutsche Krebshilfe (2007). URL: www.krebshilfe.de/familiaererkrebs.html [06. September 2007] EDDNAL (European Directory of DNA Diagnostic Laboratories) (2007) URL: www.eddnal.com [06. September 2007] ESHRE (European Society of Human Reproduction and Embryology) (2007) URL: www.eshre.com [06. September 2007] GeneReviews/GeneTests (2007) URL: www.geneclinics.org [06. September 2007] Gesamtverband der Deutschen Versicherungswirtschaft e.V. (2001) Freiwillige Selbstverpflichtungserklärung der Mitgliedsunternehmen des Gesamtverbandes der Deutschen Versicherungswirtschaft e.V. (GDV) vom 7. Oktober 2004. URL www.gdv.de GfH (Deutsche Gesellschaft für Humangenetik e.V.) (2004) Stellungnahme zur genetischen Diagnostik auf Dispositionsfaktoren für multifaktoriell bedingte Erkrankungen und Entwicklungsstörungen sowie Medikamentenreaktionen. medgen 16: 115–117 GfH (Deutsche Gesellschaft für Humangenetik e.V.) (2007a) Leitlinien und Stellungnahmen. URL www.gfhev.de/de/leitlinien/ index.htm [06. September 2007] GfH (Deutsche Gesellschaft für Humangenetik e.V.) (2007b) URL: www.gfhev.de/de/beratungsstellen/beratungsstellen.php HGQN (Humangenetisches Qualitäts-Netzwerk. URL: www.hgqn. org [06. September 2007] IHA (International Huntington Association) WFoNW (1994) Richtlinien für die Anwendung des präsymptomatischen molekulargenetischen Tests zur Huntington-Krankheit. URL: www.dhhev.de/Richtlinien.doc [06. September 2007] Murken J, Grimm T, Holinski-Feder E (2006) Taschenlehrbuch Humangenetik. Thieme Verlag, Stuttgart Nationaler Ethikrat URL: www.ethikrat.org/stellungnahmen/ [06. September 2007] OMIM (Online Mendelian Inheritance in Men) (2007). URL: www. ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM [06. September 2007] Orphanet (Europäische Datenbank seltener Krankheiten) (2007) URL: www.orpha.net [06. September 2007] Passarge E (2004) Taschenatlas der Genetik. Georg Thieme Verlag, Stuttgart Propping P, Aretz S (2004) Die genetische Revolution – Bedeutung für Therapie und Prävention. Der Internist (Berl) 45 Suppl 1: S6–S14 Propping P, Aretz S, Schumacher J, Taupitz J, Guttmann J, Heinrichs B (2006) Ethik in den Biowissenschaften – Sachstandsberichte des DRZE, Band 2: Prädiktive genetische Testverfahren. Naturwissenschaftliche, rechtliche und ethische Aspekte. Verlag Karl Alber, München, 2006 Strachan T, Read A (2005) Molekulare Humangenetik. Spektrum Akademischer Verlag, München Zerres K (2003) Humangenetische Beratung. Deutsches Ärzteblatt 100: A2720–A2727

4

4 Therapie 4.1 Gentherapie Ulrich R. Hengge

4.2 DNA-Reparatur und Mutagenese Wolfgang Goedecke und Petra Pfeiffer

4.3 Antisense-, Ribozym- und RNA-Interferenz-Strategien: Methoden des posttranskriptionellen Gene Silencing in der Molekularen Medizin Jens Kurreck, Steffen Schubert und Volker A. Erdmann

4.4 Medizinische Perspektiven der kardialen Stammzellforschung Marcel Halbach, Michael Reppel, Frank Pillekamp, Jochen Müller-Ehmsen und Jürgen Hescheler

4.5 Monoklonale Antikörper: Grundlagen und ihre Bedeutung in Diagnostik und Therapie Olaf Behrsing und Burkhard Micheel

4.6 Gentechnische Grundlagen für biotechnologische Anwendungen Jörg Knäblein

4.7 Ethische Probleme der Molekularen Medizin: Grundlagen und Anwendungen unter Berücksichtigung der rechtlichen Rahmenbedingungen Carl Friedrich Gethmann und Felix Thiele

4.1 4.1 Gentherapie Ulrich R. Hengge

4.1.1

Einleitung

– 380

4.1.2

Gentransfer – 380

4.1.2.1 4.1.2.2

Strategie – 380 Vektoren – 381

4.1.3

Experimentelle Anwendungen der DNA-Vakzinierung

4.1.3.1 4.1.3.2 4.1.3.3

Infektionskrankheiten – 383 Tumoren – 385 Stoffwechselkrankheiten – 387

4.1.4

Update zu weiteren klinischen Studien und Herausforderungen der Zukunft – 388

4.1.4.1

Sicherheit der Gentherapie

4.1.5

Ausblick

– 389

4.1.6

Literatur

– 390

4.1.7

Zeittafel

– 394

– 383

– 388

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

380

Sektion 4 · Therapie

4.1.1 Einleitung

. Tab. 4.1.1. Somatische Gentherapie

Die Gentherapie ist eine junge Wissenschaft, die Nukleinsäuren zur Therapie einsetzt (Hengge u. Bardenheuer 2004). Die somatische Gentherapie befasst sich mit der Behandlung von somatischen (Körper-)Zellen (> Tab. 4.1.1), wobei das therapeutische Gen ein im Organismus benötigtes Protein kodiert. Die erste klinische Gentherapie wurde 1989 von Rosenberg et al. (1990) durchgeführt, bei der ein Retrovirus zur Transduktion tumorinfiltrierender Lymphozyten verwendet wurde, der für ein Neomycin-Markergen kodierte. Hierdurch konnte das T-Zell-Infiltrat in Melanomen über die Zeit verfolgt werden. Die erste therapeutische Studie wurde an Kindern mit Adenosindeaminase-Immundefektsyndrom (ADA-SCID) Anfang der 1990er Jahre erfolgreich durchgeführt (Blaese et al. 1995; Muul et al. 2003). Mittlerweile wurden weltweit mehr als 1.000 klinische Gentherapiestudien mit über 10.000 Patienten durchgeführt. Eine aktuelle internationale Internetdatenbank findet sich unter http://www.wiley.co.uk/ wileychi/genmed/clinical.

x Therapie von Erkrankungen durch DNA und RNA in Körperzellen

4.1.2 Gentransfer 4.1.2.1 Strategie Grundsätzlich sind verschiedene Aspekte zur Strategie bzw. zur Wahl des Gentaxis (Vektors) zu bedenken (> Tab. 4.1.2). Bezüglich der Strategie lassen sich In-vivo- von Ex-vivo-Methoden unterscheiden (> Abb. 4.1.1). Bei der In-vivo-Strategie wird genetisches Material direkt in Körperzellen transferiert. Die therapeutische DNA oder RNA kann entweder direkt z. B. durch Injektion oder

x Therapeutisches Gen kodiert für ein im Organismus benötigtes Protein x Synthese- und Einsatzort des Proteins können auch verschieden sein (z. B. Gerinnungsfaktoren bzw. Hormone)

. Tab. 4.1.2. Grundsätzliche Aspekte x Strategie – in vivo oder ex vivo? x Organsystem – z. B. Haut (Keratinozyten oder Fibroblasten) x Gentransfermethode (chemisch, biologisch, physikalisch)? x Expressionsdauer – lang oder kurz? x Regulation der Expression- z. B. Insulin, Immunisierung

Elektroporation oder indirekt mittels liposomaler bzw. viraler Vektoren in die Zielzellen eingebracht werden. Die hier in Zielzellen bzw. Gewebe eingebrachten nichtviralen Vektoren werden durch die Anwesenheit von Nukleasen innerhalb weniger Tage degradiert (Hengge et al. 2001). Bei der Ex-vivo-Methode werden Körperzellen entnommen, und der Gentransfer erfolgt in Kultur. Nach entsprechender Proliferation des gewünschten genkorrigierten Gewebes lässt sich das Transplantat dem Wirt zurückgeben (z. B. modifizierte Fibroblasten oder Endothelzellen) (> Abb. 4.1.1). Generell kann die erforderliche Erbsubstanz (Gen) mittels chemischer, physikalischer oder biologischer Methoden (> Tab. 4.1.3) in die verschiedenen Zelltypen bzw. Organe eingebracht werden.

. Abb. 4.1.1. In-vitro- vs. In-vivo-Strategie.

381 4.1 · Gentherapie

4.1

. Tab. 4.1.3. Techniken des Gentransfers Chemisch

Liposomen rezeptormediierte Transfektion

Biologisch

Retro-/Lentiviren Adenoviren Adeno-assoziiertes Virus Herpes-simplex-Virus

Physikalisch

Mikroprojektile („gene gun“) Direkte Injektion Ultraschall Elektroporation

Je nach der beabsichtigten Anwendung ist eine kurzzeitige Herstellung des Genprodukts (z. B. bei der DNAVakzinierung oder zur Abheilung chronischer Wunden) bzw. eine Langzeit- oder Dauersynthese (z. B. bei angeborenen Stoffwechselkrankheiten) wünschenswert.

4.1.2.2 Vektoren Nichtvirale Vektoren Nichtvirale Vektoren führen zur transienten Expression des kodierten Genprodukts. Neben liposomal, d. h. durch kationische Lipide komplexierter Plasmid-DNA kann diese auch durch Elektroporation (mittels elektrischer Pulse) bzw. durch Ultraschallbehandlung (transiente Ruptur der Zellmembranen) sowie auch durch direkte Injektion sog. nackter Plasmid-DNA appliziert werden. Während nahezu alle Gewebe mittlerweile mit-

. Abb. 4.1.2. Direkte Injektion nackter DNA

tels nichtviraler Vektoren transfiziert wurden, bietet die Haut die Möglichkeit der leichten Zugänglichkeit und stellt ein potentes Immunorgan dar. Von unserer Arbeitsgruppe wurde daher die Methode der direkten In-vivo-Injektion nackter DNA, d. h. ohne virale Vektoren, mit einer Insulinnadel und Tuberkulinspritze entwickelt (> Abb. 4.1.2) (Hengge et al. 1995, 1996). Hierbei wird Plasmid-DNA in die obere Dermis unter Aufbau eines hydrostatischen Drucks injiziert und nach Aufnahme transient für einige Tage exprimiert (> Abb. 4.1.3a–d) (Hengge et al. 1995, 1996). Schon nach wenigen Stunden kann das hergestellte Protein (z. B. E-Galaktosidase) vorwiegend in den Keratinozyten der Epidermis nachgewiesen werden (> Abb. 4.1.3a–d). Das entsprechende Protein wird für 3 bis maximal 7 Tage nach Injektion der korrespondierenden DNA synthetisiert. Eine Integration der zugeführten DNA in das chromosomale Erbgut findet nicht statt, was die Sicherheit der Methode

a

b

c

d

. Abb. 4.1.3a–d. Expression von Plasmid-DNA und AAV in der Haut. a 24 h nach Injektion nackter Plasmid-DNA, die für das E-Galaktosidase-Gen kodiert, lässt sich das Genprodukt makroskopisch darstellen. b Histologisch findet sich E-Galaktosidase-Protein in allen Schichten der Epidermis. c 7 Tage nach Injektion eines AAV-E-Gal-

Vektors ist E-Galaktosidase-Protein in der Epidermis und in den Haarfollikeln nachweisbar (6 mm Stanzbiopsie in der Mitte halbiert). Man beachte den Haarfollikel (Pfeil). d Histologisch findet sich das Genprodukt in der Epidermis und im Haarfollikel (Pfeil)

382

Sektion 4 · Therapie

unterstreicht (Hengge et al. 2001). Seit kurzem können wir die topische Applikation nackter DNA in Form von Sprayliposomen erfolgreich anwenden (Meykadeh et al. 2005). Der intrakutane Transport- und Aufnahmemechanismus von DNA in Keratinozyten scheint an eine aktive Proteinsynthese sowie an die Existenz von DNAbindenden Proteinen (z. B. Ezrin und Moesin) gekoppelt zu sein (Basner-Tschakarjan et al. 2004). Im Gegensatz zu den häufig in der Gentherapie eingesetzten viralen Vektoren lässt sich die „nackte“ DNA beliebig oft erneut in der Haut exprimieren; es kommt hier nicht zum Auftreten unerwünschter Immunreaktionen, die bei wiederholter Applikation die Genexpression verhindern könnten. Sog. Lipoplexe oder molekulare Konjugate führen zur Komprimierung der DNA und machen sie somit leichter aufnahmefähig (Chen u. Huang 2005). Diese Polyplexe genannten Kombinationen z. B. aus Polyethylenimin und DNA können auch systemisch verabreicht werden (Erbacher et al. 2004). Gegebenenfalls werden die kleinen Partikel mit spezifischen Liganden, z. B. Transferrin, ausgestattet, was ein selektiveres Targeting an Zielzellen ermöglicht (Kloeckner et al. 2004). Targeting und zellspezifische Expression

Um die DNA-Aufnahme in den gewünschten Zielzellen zu steigern, lassen sich Polyplexe mit Transferrin oder epidermalem Wachstumsfaktor koppeln, was zur rezeptormediierten Endozytose in die entsprechenden rezeptortragenden Zellen führt (Ogris et al. 2003). Diese auch als Nanokomplexe bezeichneten molekularen Konjugate besitzen eine geringe Toxizität und eine gegenüber der klassischen Lipofektion vergleichbare Transfektionseffizienz, die sich sowohl in vitro als auch in vivo nutzen lässt. Die Selektivität der Genexpression lässt sich durch den Einsatz von Promotoren erhöhen, die vorzugsweise im Zielgewebe aktiv sind. Für das maligne Melanom zum Beispiel sind dies melanozytenspezifische Promotoren (z. B. Tyrosinase). Der melanozytenspezifische Promotor (melanozyteninhibitorische Aktivität, MIA) in adeno-assoziierten Virus- (AAV-)Vektoren zusammen mit dem HSV-Thymidinkinase- (TK-)Gen zeigte eine spezifische Expression in Melanomzellen (Schoensiegel et al. 2004). In Tierexperimenten induzierte das in diesem Konstrukt vorhandene HSV-TK-Gen bei nachfolgender Therapie mit Ganciclovir einen Rückgang der Melanome (Schoensiegel et al. 2004). Konditional replizierende Adenovirusvektoren wurden ebenfalls in der Therapie des Melanoms eingesetzt (Liu et al. 2004b). Ein mit einem Targeting-Peptid (RGD) gekoppelter Adenovirusvektor, der das adenovirale E1A-Protein selektiv in tyrosinasepositiven Melanomzelllinien exprimierte, führte zu einer höheren Transduktion von Melanomzel-

len. Nach intratumoraler Injektion zeigte sich in einem Melanom-Xenotransplantationsmodell darüber hinaus eine Tumorregression (Liu et al. 2004b). Auch in eigenen Untersuchungen des menschlichen BLM-Melanoms führten trunkierte adenovirale E1A-Proteine unter der Kontrolle des humanen Telomerase-Promotors zur tumorgerichteten Expression und Regression von Melanommetastasen im Tiermodell (Kirch et al. 2002). In ähnlicher Weise lassen sich leberspezifische, muskelspezifische oder neuronenspezifische Promotoren einsetzen, um eine präferenzielle Expression im erwünschten Zielgewebe zu erreichen. Neue Verfahren des Vektor-Targetings sowie interessante Techniken wie Elektroporation und hydrodynamische Injektion konnten die Transgenexpression in vivo verbessern, indem eine verbesserte Verteilung der Plasmid-DNA im Zielorgan erreicht wurde (Wolff u. Budker 2005). Darüber hinaus wurden verschiedene attenuierte Stämme von Salmonellen, Shigellen, Listerien, Yersinien und apathogenen E. coli-Stämmen als Vektoren zum Transport von DNA in Säugetierzellen erfolgreich eingesetzt (Vassaux et al. 2006). Virale Vektoren Viren haben während der Evolution die Fähigkeit entwickelt, DNA oder RNA in Zellen eines Organismus einzuschleusen und der Transkriptionsmaschinerie zuzuführen. Sie eignen sich daher als hervorragende Vehikel für den Gentransfer (> Tab. 4.1.1). Hierbei lassen sich nichtintegrierende [Adenoviren (Ad) und adeno-assoziierte Viren (AAV)] von integrierenden Viren (z. B. Retroviren) unterscheiden. Zur Einführung in den Aufbau und die Klonierung wird auf hervorragende Übersichtsarbeiten verwiesen (Adenoviren: Volpers u. Kochanek 2004; Alba et al. 2005; AAV: Büning et al. 2004; Ding et al. 2005; Flotte 2005; Muzyczka et al. 2005; Vasileva u. Jessberger 2005; Retroviren: Naldini u. Verma 2000; Mangeat u. Trono 2005; Herpes-Virus-Vektoren: Glorioso u. Fink 2004; Epstein et al. 2005). Onkolytische Viren replizieren in Krebszellen mit höherer Selektivität als in normalen Zellen. Indem sie in den Zielzellen replizieren, lysieren sie diese. Gerade für Tumorzellen, bei denen der antivirale Interferonsignalweg inaktiviert ist bzw. Tumorsuppressorgene mutiert sind, ist in diesen Zellen eine ungehinderte virale Replikation möglich. Vor allem onkolytische Adenoviren oder Herpes simplex-Viren werden zu diesem Zweck auch klinisch eingesetzt (Galanis et al. 2005). Bis heute wurden mehr als 250 Patienten mit ONYX-015, einem replizierenden Adenovirus, in verschiedenen Phase-Iund -II-Studien behandelt. Bis zu 20% der weit fortgeschrittenen unterschiedlichen Tumoren zeigten ein partielles Ansprechen auf die Therapie. Weitere Viren (z. B. Newcastle-disease-Virus, Reovirus, Poliovirus, Vaccinia-

383 4.1 · Gentherapie

virus und Masernvirus) wurden aufgrund ihrer präferenziellen Replikation in Tumorzellen als onkolytische Viren getestet (Lin u. Nemunaitis 2004; Lorence et al. 2003). Eine ungeklärte Frage onkolytischer Viren mit hoher Mutationsfrequenz besteht darin, ob das nach Replikation freigesetzte Virus mit dem ursprünglich injizierten jeweils identisch ist oder sich weiterentwickelt hat. Darüber hinaus sind onkolytische Viren hoch immunogen. Sie sind deshalb auf eine lokale Applikation und auf wenige Verabreichungen beschränkt. Eine Weiterentwicklung der onkolytischen Viren ist die Ausstattung mit Zytokinen, antiangiogenetischen Faktoren bzw. immunologisch aktiven Molekülen, auch „arming“ genannt. Ein Problem dieser Vektoren besteht in der Möglichkeit des Hervorrufens von Autoimmunerkrankungen, z. B. der Vitiligo (Depigmentierung), die nach Vakzinierung von Melanompatienten mit einem Vacciniavirus-Konstrukt aufgetreten ist (Kaufman et al. 2005). Darüber hinaus muss die Fähigkeit onkolytischer Viren zur Rekombination zweifelsfrei untersucht und geklärt werden. Auch die verschiedenen Strategien der Immunevasion, z. B. durch Expression immunsuppressiver Zytokine im Zusammenspiel mit dem effektiven Transgen, bedarf einer sorgfältigen präklinischen Testung. Ebenfalls ist das Überschreiten der Speziesrestriktion eine wesentliche, zu klärende Frage, was durch das aviäre Influenzavirus (Vogelgrippe; H5N1) deutlich wird (Chernajovsky et al. 2006). Lentiviren besitzen die wichtige Eigenschaft, sowohl proliferierende Zellen als auch ruhende Zellen effizient zu infizieren und transduzieren. Diese Eigenschaft zeichnet sie gegenüber klassischen Retroviren aus. Beiden Viren ist die Insertion in das Genom gemeinsam, was eine Weitergabe des genetischen Materials an die Tochterzellen in sich birgt. Um die retrovirale Transduktion sicherer zu machen, wurde untersucht, ob ekotrope murine Moloney Leukämieviren (emMLV) zur Transduktion menschlicher hämatopoetischer Progenitorzellen eingesetzt werden könnten (Yang et al. 2006). Die emMLV waren mit Polylysin gekoppelt, um die normalerweise in humanen Zellen nicht permissiven Viren aufzunehmen. Die Transduktionsrate der emMLV-PL war gleich derjenigen amphotroper eMMLV (mit oder ohne Polylysinkopplung). Auch lentivirale Vektoren werden zur Gentherapie eingesetzt. So konnte z. B. mit einem Lentivirusvektor (nach Pseudotypisierung mit einem Sindbis-VirusOberflächenprotein) in einem Melanom-Mausmodell nach intravenöser Injektion eine hohe Transduktionsrate im Tumor erzielt werden (Morizono et al. 2005). Ein wesentlicher Fortschritt in der lentiviralen Vektortechnologie war die Herstellung integrationsdefizienter lentiviraler Vektoren, die eine stabile Langzeittransduktion ermöglichen (Vargas et al. 2004). Ein solcher Vektor

4.1

führte in postmitotischen Geweben wie Augen und Gehirn von Nagetieren zur Langzeitexpression über mehrere Monate (Yanez-Munoz et al. 2006). Alphaviren besitzen einen breiten Tropismus und führen zu hohen Konzentrationen an Transgen (Lundstrom 2005). Aufgrund einer Präferenz für neuronale Zellen haben Alphavirusvektoren eine große Beliebtheit in den Neurowissenschaften erfahren. Darüber hinaus wurden Semliki-Forest-Virusvektoren zur Aktivierung gegen Viren und Tumoren eingesetzt. Aufgrund der hohen Dichte an Lamininrezeptoren auf Krebszellen wurden konventionelle Sindbis-Vektoren zum tumorspezifischen Targeting in Tiermodellen eingesetzt (Lundstrom 2005). Durch die Anwendung von Nanotechnologie wurden virusartige Funktionen auf Nanopartikel transferiert, was zur Herstellung artifizieller Viren führen wird (Mastrobattista et al. 2006). Hierbei werden wenige Nanometer große Komplexe aus Nukleinsäuren in kompakter Form verwendet, die durch entsprechende virale Liganden mit der Fähigkeit zur Bindung an zelluläre Rezeptoren versehen werden.

4.1.3 Experimentelle Anwendungen der DNA-Vakzinierung 4.1.3.1 Infektionskrankheiten Bei der DNA-Vakzinierung soll ein immunogenes Antigen (eines Pathogens oder eines Tumors) im Zielgewebe exprimiert werden und zu einer Verbesserung der Immunantwort führen. Als die gewünschten Transgene exprimierende Zellen wurden anfangs Myozyten oder Keratinozyten gewählt. In den letzten Jahren hat sich jedoch die Transfektion von dendritischen Zellen und epidermalen Langerhans-Zellen (ggf. mit Aktivierung der Toll-like-Rezeptoren, TLR) etabliert, um eine potente Antigenpräsentation zu erreichen. Neben verschiedenen Tumoren sind auch Infektionskrankheiten einer therapeutischen Vakzinierung zugänglich. In einer Proof-of-concept-Studie konnten wir eine DNA-Vakzinierung gegen Leishmania major im Modell der suszeptiblen Balb/c-Mäuse durchführen (Walker et al. 1998). Durch wiederholte Applikation des gp63-enthaltenden Expressionsvektors konnten spezifische CD8-positive Lymphozyten induziert werden, die zur Protektion in 40% der vakzinierten Tiere führten (> Abb. 4.1.4) (Walker et al. 1998). Vorwiegend die problematischen Infektionen wie HIV, Ebola- (Nabel 2003), Dengue-Virus (Costa et al. 2006) oder SARS (Kong et al. 2005; Wang et al. 2005; See et al. 2006) stellen eine große Herausforderung dar. Die meisten Experten sehen eine Beherrschung der HIV-Infektion nur dann, wenn es gelingt, eine prophy-

384

Sektion 4 · Therapie

. Abb. 4.1.4. Protektion gegen Leishmania major nach DNA-Vakzinierung. Nach DNA-prime- und DNA-boost-Schema über 6 Wochen wurden Mäuse experimentell an den Pfoten infiziert. Die ausblei-

bende Schwellung im Vergleich zum Kontrollwert zeigt die Protektion von 40% der vakzinierten Tiere

laktische Vakzinierung zu entwickeln. Eine solche funktionsfähige prophylaktische HIV-Vakzinierung ist gegenwärtig nicht in Sicht. Neben der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) wurden Fortschritte auf dem Gebiet der therapeutischen HIV-Vakzinierung gemacht. Diese verfolgt das Ziel, durch Induktion HIV-1spezifischer T-Zellen die HIV-Replikation einzudämmen. Hierzu sind verschiedene Prime-Boost-Ansätze im Sinne einer DNA-Vakzinierung und einer Vacciniavirus-Ankara-Boosterung verfolgt worden (Cebere et al. 2006; Goonetilleke et al. 2006). Neben der therapeutischen Vakzinierung wurden verschiedene gentherapeutische Strategien erprobt, um dem Fortschreiten der HIV-Infektion Einhalt zu gebieten. Hierzu zählen verschiedene Strategien RNA-basierter Technologien, dominant-negative virale Proteine oder intrazelluläre Antikörper.

RNA-basierte gentherapeutische Strategien gegen HIV-1, z. B. Ribozyme, RNA-Decoys und siRNA, wurden erfolgreich gegen HIV eingesetzt (Michienzi et al. 2003). Katalytische RNA, auch Ribozyme genannt, greifen in die Regulation der Transkription ein und führen zur Hemmung der HIV-Vermehrung (PuertaFernandez et al. 2002). Mittels multimerer Ribozyme gegen env-RNA konnten humane, CD4-positive T-ZellLinien durch Ribozymexpression für mindestens 60 Tage gegenüber einer HIV-Infektion resistent gemacht werden (Ramezani et al. 2002). Wie die siRNA-Technologie (7 Kap. 4.3), so sind auch Ribozyme immer dann nicht mehr wirksam, wenn das Zielgen im HIV-Genom mutiert. Eine induzierbare Anti-HIV-Hairpin-RNA gegen rev (unter der Kontrolle des Polymerase-II-Promotors) war nach Induktion durch HIV-Tat imstande, nach intrazellulärer Prozessierung zu si-RNA die HIVVermehrung in infizierten Zellen selektiv zu vermindern (Unwalla et al. 2004). Weitere In-vitro-siRNAStudien gegen Rev und Tat führten ebenfalls zum „gene silcencing“ und werden experimentell klinisch gegen HIV eingesetzt (Coburn u. Cullen 2002; Jacque et al. 2002). Lentiviren vom Typ HIV wurden gegen die HIV-Infektion eingesetzt, um siRNA in humanen Zellen dauerhaft zu exprimieren (Trono 2000; Mautino u. Morgan 2002). Hierbei waren HIV-1-Vektoren besonders gut in der Lage, hämatopoietische Stammzellen effizient zu transduzieren. Auf diese Weise exprimieren die nachfolgenden Zellpopulationen das therapeutische Genprodukt und lassen sich so ggf. vor einer HIV-Infektion schützen (An et al. 2003; Morris u. Rossi 2006). Effizienterweise sollten möglichst mehrere siRNA-Gene ver-

. Tab. 4.1.4. Tumorabwehr durch Gentherapie x x

Stärkung der Immunantwort gegen Tumorzellen durch immunstimulatorische Zytokine Expression von Tumorantigenen*

x

Blockade von essenziellen Signalwegen, z. B. durch Expression inhibitorischer Regulatorproteine

x

Expression von Tumorsuppressorproteinen (z. B. Wildtyp p53)

x

Suizidstrategien und Bystander-Effekt

* Nicht die Überexpression von Tumorantigenen, sondern die Expression von Neoantigenen (modifizierte Selbstantigene) scheint hierbei die wesentlichere Rolle zu spielen.

385 4.1 · Gentherapie

wendet werden, um eine gewisse Anzahl von Genen simultan zu reprimieren. Auch können Lentiviren eingesetzt werden, um andere Lentiviren zu verpacken (sog. „Cross-packaging“) (Browning et al. 2001). Eine solche Strategie, bei der HIV-1-Vektoren durch felines Immundefizienz-Virus (FIV) verpackt wurden, war imstande, CD4-Zellen vor einer HIV-Infektion zu schützen (Morris et al. 2004). Das Cross-packaging lentiviraler Vektoren, wie z. B. HIV-1 mit einem FIV-packaging-System, stellt eine sichere Methode dar, um lentivirale Vektoren an Zielzellen HIV-infizierter Individuen zu targetieren. Zusammen mit einer entsprechenden Pseudotypisierung lassen sich auf diese Weise Zelltypen spezifisch und effektiv mittels lentiviraler Vektoren transduzieren (Kobinger et al. 2001). Auch das Konzept der transkriptionellen Repression durch Blockade von Transkriptionsfaktoren, welche an den HIV-Promotor binden, stellt ein interessantes Konzept dar. Solche Transkriptionsrepressoren betreffen die Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne innerhalb des HIV-1 „long-terminal repeat“ (LTR). Diese Strategie war bereits in vitro erfolgreich (Reynolds et al. 2003). Auf diese Weise ließ sich eine bis zu 100-fache Reduktion der HIV-Vermehrung durch Inhibition des HIV-1-Promotors erzielen (Segal et al. 2004). Auch die intrazelluläre Expression rekombinanter Antikörper, sog. „Intrabodies“, führt zur intrazellulären Immunisierung gegen HIV, z. B. gegen das Vif-Protein, das für die Virusproduktion und die reverse Transkription notwendig ist (Goncalves et al. 2002). Lymphozyten, die einen Intrabody gegen Vif exprimierten, zeigten eine vermehrte Resistenz gegenüber der HIV-Infektion, und zwar sowohl gegenüber adaptierten als auch primären HIV-Stämmen. Eine deutliche Wirkung ist vor allem dann zu erwarten, wenn sich diese Intrabodies an Proteine binden, die wirtsseitige Interaktionspartner für HIVProteine darstellen, da das Virus keine Strategie besitzt, nichtviral kodierte Proteine zu synthetisieren. Ein Beispiel eines kritischen, wirtsseitig synthetisierten Proteins stellt der Chemokin-Co-Rezeptor CXCR-4 dar, dessen Blockade zu reduzierter Infizierbarkeit führt (BouHamdan et al. 2001).

4.1.3.2 Tumoren Die meisten Gentherapiestudien werden gegen Krebs durchgeführt (mehr als 66% der Indikationen) (Prud’homme 2005; Edelstein et al. 2004). Eine Übersicht über die in Deutschland laufenden Gentherapiestudien findet sich auf der Webseite des Deutschen Gentransferregisters (http://www.dereg.de), die gemeinsam von der Deutschen Gesellschaft für Gentherapie und

4.1

dem Zentrum für Klinische Studien der Universität Freiburg etabliert wurde. Mit Blick auf das maligne Melanom wurden verschiedene gentherapeutische Strategien zur Therapie des malignen Melanoms entwickelt (> Tab. 4.1.2). Das Konzept der Immuntherapie gegen Krebs basiert auf der Annahme, dass Tumoren zur Generierung schwacher humoraler und/oder zellulärer Immunreaktionen führen (Sahin et al. 1995). Durch Immunisierungsstrategien soll die immunologische Toleranz durchbrochen und eine breite immunologische Antwort auf die Tumorzellen generiert werden, die die individuellen Tumorzellen abtötet (Hengge u. Schadendorf 2000). Entsprechend lassen sich immunstimulatorische Zytokine als Adjuvanzien (z. B. IL-2, IL-12, IL-15, GM-CSF und Interferon-J) einsetzen, um eine systemische Antitumorantwort zu forcieren. Die Transfektion von Tumorzellen mit ZytokinGenen soll zu einer Aktivierung von natürlichen Killerzellen, Makrophagen und dendritischen Zellen (DC) führen, die direkt oder indirekt an der Bekämpfung der Tumorzellen beteiligt sind. Hierdurch lassen sich CD8-positive Effektor-T-Zellen und CD4-positive Helfer-T-Zellen induzieren. Kürzlich wurde über eine DNA-Vakzinierung mit dem IL-12-Gen an Patienten mit malignem Melanom der Stadien III und IV berichtet. Diese Studie basiert auf dem B16-F10 Mausmelanommodell, wo 12 von 15 Mäusen mit subkutanen Melanomen für bis zu 100 Tage metastasenfrei blieben. Bei den ersten 3 behandelten Patienten fand sich ein klinischer Rückgang der Lymphknotenmetastasen nach Vakzinierung mit 200 µg IL-12Expressionsplasmid (Heller et al. 2006). In einer ähnlichen Studie wurde ein IL-12-Expressionsvektor in einer Dosiseskalationsstudie 3-mal pro Zyklus für maximal 7 Zyklen intratumoral appliziert (Heinzerling et al. 2005). Hierbei zeigte sich bei 2 von 9 Patienten je eine stabile Erkrankung bzw. komplette Remission. Bei allen Patienten fand sich eine antigenspezifische Immunantwort gegen MAGE-1 und MART-1. Bei einer weiteren Zytokin-Gentherapie wurde Melanompatienten intratumoral ein Canarypox-Virus-Vektor injiziert, der das IL-12-Gen exprimierte, und zur T-Zell-Akkumulation in injizierten Melanomen führte (Triozzi et al. 2005). Bei 3 von 9 Patienten fand sich im Serum ein Anstieg von IL-12 und Interferon-J. Bei einem Patienten fand sich eine komplette klinische Remission. Unerwünschte Wirkungen waren grippale Symptome, Myalgie und Müdigkeit. Das „melanoma-differentiation-associated“-(mda-) 7/IL-24-Gen, das zu irreversibler Wachstumshemmung und terminaler Differenzierung führt, wurde mittels eines vermehrungsinkompetenten Adenovirus in Melanomzellen exprimiert (Fisher et al. 2003). Bei Patienten, die unter adenoviraler mda-7/IL-24-Gentherapie eine

386

Sektion 4 · Therapie

klinische Teilremission und deutliche Apoptose zeigten, fanden sich signifikant höhere IL-6- und TNF-α-Serumkonzentrationen (Tong et al. 2005). In der klinischen Anwendung dieses Vektors zeigte sich eine komplette und eine partielle Remission (Cunningham et al. 2005). Eine andere interessante Anwendung ist die adaptive Immuntherapie nach T-Zell-Rezeptor-Transfer. Hierbei wurde der Rezeptor von αβ-T-Lymphozyten, die CD8-positiv waren und zytotoxische Eigenschaften besaßen, eingesetzt (Willemsen et al. 2005). Um eine anhaltende Immunität zu erzielen, wurden MHC-Klasse-II-restringierte CD4-T-Lymphozyten mit einem HLA-A1/MAGE.A1-spezifischen αβ-T-Zell-Rezeptor transduziert, was nach spezifischer Stimulation zu einer starken Interferon-J-, TNF-α- sowie IL-2-Produktion führte (Willemsen et al. 2005). Vakzinierung mit dendritischen Zellen Bei der DC-Vakzinierung werden antigenpräsentierende Zellen mit definierten immunogenen Peptiden (z. B. eines Tumors) beladen, die T-Zellen mit dem entsprechenden Rezeptor aktivieren und zur Expansion bringen sollen. So wurden melanom-antigen-gepulste DC seit einigen Jahren in der Therapie des metastasierten Melanoms eingesetzt (Nestle et al. 1998; Thurner et al. 1999). Eine neuere Studie mit DC und autologen Lysaten (n=19) bzw. den melanomassoziierten Antigenen MAGE-3.A2, Tyrosinase, gp100 und MART-1 – zusammen mit dem Adjuvans KLH –, die wöchentlich in die inguinalen Lymphknoten von 32 Patienten injiziert wurden, bestätigt das immunologische Wirkprinzip (Hersey et al. 2004). Wie in früheren Studien fanden sich auch hier drei partielle Remissionen (3/19) in der Gruppe von Patienten, die mit lysat-gepulsten DC vakziniert wurden. In dieser Studie zeigte sich, dass die „delayedtype hypersensitivity“- (DTH-)Reaktion auf autologe Tumorlysate eine Voraussetzung für das klinische Ansprechen war (Hersey et al. 2004). Jedoch fand sich keine Interferon-J-Produktion in der ELISPOT-Technik. Es ist jedoch schwierig, einen Zusammenhang zwischen Tumorregression und der Existenz einer durch die Vakzinierung induzierten zytotoxischen T-Zell-Antwort unzweifelhaft festzustellen, da nicht alle Patienten mit zellulären Immunantworten auf den Tumor eine Regression desselben zeigen. Zytotoxische Effektor-T-Zellen (CTL) sind zur Tumorzelllyse befähigte T-Zellen, die nach Andocken an die Zielzelle diese durch Sekretion von Granzym und Perforin permeabilisieren und damit lysieren. Nach der Vakzinierung mit einem rekombinanten Canarypox-Vektor, der MAGE-3.A1-Peptide exprimierte, zeigte sich, dass Patienten mit Zeichen einer klinischen Tumorregression in 3/4 der Fälle eine CTL-Antwort aufwiesen, während dies nur bei 1/11 Patienten ohne Zeichen der Tumorregression der Fall

war (Karanikas et al. 2003). Kürzlich wurden verschiedene Klonotypen der CTL-Antworten gegenüber dem MAGE-3.A1 identifiziert (Lonchay et al. 2004). Hierdurch wurde es möglich, nicht nur die CTL-Vorläuferfrequenz im Blut als Marker für die zytotoxische Immunantwort zu untersuchen, sondern auch vorherrschende Klonotypen der Anti-MAGE-3 A1-Immunantworten zu identifizieren. In jüngster Zeit wird verbreitet auch RNA in DC transfiziert und zur Induktion tumorspezifischer T-ZellAntworten eingesetzt (Gilboa u. Vieweg 2004; Grunebach et al. 2005). Ein Vorteil gegenüber der (konventionellen) Peptidbeladung von DC besteht darin, dass eine Vakzinierung gegen multiple, durch die RNA kodierte Epitope möglich ist. Entsprechende klinische Studien wurden sowohl gegen das Prostatakarzinom (Rini 2004) als auch gegen das Melanom (Kyte et al. 2006) durchgeführt. Verschiedene Fragestellungen wie die intradermale oder intranodale Administration der Vakzine sowie die optimale Generierung und Reifung von DC werden gegenwärtig untersucht und können noch nicht abschließend beurteilt werden. Eine wichtige Rolle für die resultierenden Immunantworten scheint auch der Tumorphänotyp und weniger die Vakzinierungsplattform zu spielen (Leitch et al. 2004). Die Transduktionsraten von DC und die Expressionsdauer wurden in Abhängigkeit vom verwendeten Vektor untersucht. Je nach Ziel des Gentransfers ist diese bei Langzeitexpression im Gegensatz zur genetischen Vakzinierung unerwünscht. Nach intravenöser Injektion von Hochkapazitäts-Adenovirus-Vektoren sowie lentiviraler Vektoren fand sich eine Transduktion antigenpräsentierender Zellen und B-Zellen trotz Verwendung leberspezifischer Promotoren in bis zu bis zu 30%, während T-Zellen refraktär waren. Im Gegensatz hierzu zeigte die In-vivo-Applikation von AAV8 und 9 nur eine Expression in DC von unter 0,1% (Riviere et al. 2006). Transfektion von Tumorsuppressorgenen bzw. Inaktivierung von Onkogenen Bei den meisten Tumoren findet sich ein Verlust der Funktion von Tumorsuppressorgenen. Tumorsuppressorgene können zum Wachstumsstopp von Tumorzellen führen und diese der Apoptose (programmierter Zelltod) zuführen. Ein Paradebeispiel hierfür ist das p53-Protein, das erst nach einem aufgetretenen DNA-Schaden den Zellzyklus blockiert und die Zellen der Apoptose unterwirft (Roth 2006). Die effektive Expression von Wildtyp p53 konnte Tumorregressionen bereits etablierter, menschlicher Tumoren induzieren und das Wachstum humaner Melanomzellen in Kultur oder Nacktmäusen blockieren (Sauter et al. 2002). Die Kombination von Chemotherapie und adenoviral vermit-

387 4.1 · Gentherapie

teltem Wildtyp p53 war imstande, die amifostin-induzierte Apoptoserate menschlicher Bronchialkarzinomzellen zu erhöhen (Pataer et al. 2006). Ein interessanter Ansatz ist auch die Wachstumsund Invasionshemmung von Melanomen durch Inaktivierung des BRAF-Onkogens mittels lentiviral vermittelter RNA-Interferenz (Sumimoto et al. 2004). Nach lentiviralem Transfer von siRNA gegen die häufigste Mutation des BRAF-Antigens (V599E) zeigte sich, dass die meisten Melanomzelllinien nach Transduktion ein gehemmtes Wachstum sowie eine reduzierte Invasivität aufwiesen. Die reduzierte Invasivität zeigte sich auch in einer Verminderung der Matrixmetalloproteinase-Aktivität und der β1-Integrin-Expression (Sumimoto et al. 2004). Suizidgentherapie Daneben findet sich die Gentherapie, bei der Vorstufen zytotoxischer Medikamente durch Gentransfer metabolisierender Enzyme möglichst selektiv in Tumorzellen in toxische Produkte umgewandelt werden (van Dillen et al. 2002; Fillat et al. 2003). Nach Umwandlung der Prodroge in einen toxischen Metaboliten stirbt die transduzierte Zelle und meist auch einige der Nachbarzellen (sog. „Bystander-Effekt“) (Niculescu-Duvaz u. Springer 2005). So wurde zum Beispiel die Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase (HSV-TK) transferiert, um das nichttoxische Ganciclovir selektiv in Tumorzellen zum toxischen Ganciclovir-Triphosphat umzusetzen.

4.1.3.3 Stoffwechselkrankheiten Als Paradebeispiel der gentherapeutischen Behandlung von Stoffwechselkrankheiten dient die Chronik der Gentherapie der Hämophilie (humaner Gerinnungsfaktor VIII bzw. IX) (Lillicrap et al. 2006). Während bei den zurückliegenden Versuchen an hämophilen Mäusen und Hunden (durch Expression im Muskel) mittels AAV-Gentransfer eine anhaltende Faktor-IX-Aktivität von 4–23% erzielt wurde (Arruda et al. 2004; Liu et al. 2004a), war bei den initialen Versuchen an Patienten der Muskel zwar zur Langzeitexpression befähigt, jedoch ließen sich nur subtherapeutische Serumkonzentrationen erzielen. Daraufhin wurde der Gentransfer in die Leber als dem natürlichen Bildungsort der Gerinnungsfaktoren gewählt, wo zwar therapeutische Spiegel erzielt wurden, jedoch die Expression auf wenige Wochen beschränkt war (Manno et al. 2006). Insgesamt wurden bei den klinischen Hämophiliestudien Patienten mit Missense-Mutationen eingeschlossen, obwohl die Immunreaktion bzw. die Inhibitorformation bei Vorliegen eines prämaturen Stoppkodons oder Frameshift-Mutationen im Faktor-IX-Gen stärker ausgeprägt waren. Auffällig

4.1

war bei den bislang 7 behandelten Patienten, dass die Faktor-IX-Aktivität innerhalb von 4 Wochen auf unter 1% abfiel. Zu diesem Zeitpunkt traten bei den Patienten Hepatitiden mit erhöhten Leberwerten (ALT 600 U/l, AST 200 U/l) auf, weshalb zunächst keine weiteren Patienten eingeschlossen wurden. Diese unerwünschte Wirkung wurde bei den vorangegangenen Tierstudien nicht beobachtet. Die systematische Analyse der Immunreaktionen mittels AAV-Kapsid- und Faktor-IXPeptid-Bibliotheken führte zur Identifizierung hoher CTL-Precursor-Frequenzen für 2 hochkonservierte Peptide (Peptid 74 und Peptid 82) der Serotypen AAV1-8. Interessant war, dass bei Patienten, die vor Therapie hohe Antikörpertiter gegen AAV aufwiesen, die Hepatitis und die entsprechende zelluläre Immunantwort ausblieb und sie nur bei Patienten mit geringen oder fehlenden AAV-Titern auftrat (Manno et al. 2006). Dementsprechend werden Patienten ab sofort vor Einschluss in klinische Studien hinsichtlich bestehender humoraler und zellulärer Immunantworten gegen AAVKapside genau untersucht. Eine Immunantwort gegen das Faktor-IX-Protein war bei keinem der behandelten Patienten feststellbar. Als neue Strategie wird bei diesen Patienten die transiente Immunsuppression für einen Zeitraum von etwa 4 Monaten erprobt, bis das AAVKapsid von den transfizierten Zellen eliminiert ist. Die Expression des Transgens im Muskelgewebe wurde nach AAV-Gentransfer bis zu 2 Jahre beobachtet (Riviere et al. 2006). In der Haut findet sich ein Tropismus von AAV für den Haarfollikel (> Abb. 4.1.3c,d) (Hengge u. Mirmohammadsadegh 2002). Bei einer anderen seltenen Stoffwechselkrankheit stellt die Gentherapie eine echte Alternative zur Knochenmarktransplantation dar, wenn entsprechende allogene HLA-gematchte Spender nicht zur Verfügung stehen. So zeigte eine kürzlich erschienene deutsche Studie die Korrektur der X-gebundenen chronischen Granulomatose (CGD) durch retroviralen Transfer des gp91phox, einem wichtigen Protein in der oxidativen antimikrobiellen Abwehr (Ott et al. 2006). Diese Arbeit ist in zweierlei Hinsicht bemerkenswert: Zum einen wurde hier die erste myeloide Immundefizienz behandelt, indem die neutrophilen Granulozyten von zwei betroffenen Individuen phänotypisch und funktionell korrigiert wurden, die sich beide klinisch signifikant verbesserten. Zum anderen zeigte diese Studie nach nichtmyeloablativer Knochenmarkkonditionierung die insertionelle Aktivierung von 3 wenig erforschten Genen MDS1-EVI1, PRDM16 bzw. SETBP1, die bezeichnenderweise die Langzeithämatopoiese stimulierten und somit zur Expansion der transduzierten Zellpopulation beitrugen. Nach dem Gentransfer zeigten beide Patienten zwischen 15% und 60% funktionell rekonstituierte neutrophile Granulozyten mit guter lytischer Aktivität gegenüber

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Sektion 4 · Therapie

opsonisierten E. coli-Bakterien. Im Gegensatz zu den Gentherapiestudien der schweren kombinierten Immundefizienz (SCID-X1 und ADA-SCID) stellt die Rekonstitution des Gendefekts des gp91phox keinen Wachstumsvorteil für die myeloiden Vorläuferzellen dar. Außerdem bedürfen Phagozyten als kurzlebige Zellen einer konstanten Erneuerung. Diese Ausgangsbedingungen lassen eine kurative Gentherapie unter diesen Gesichtspunkten schwierig erscheinen. Offensichtlich war jedoch die hohe Rate der Vektorintegration in die o. g. drei Loci von determinierten myeloiden Progenitorzellen so effizient, dass dadurch das myeloide Kompartiment unabhängig von Wachstumsfaktoren eine Rekonstitution erfuhr.

4.1.4 Update zu weiteren klinischen Studien und Herausforderungen der Zukunft Derzeit werden verschiedene Strategien erprobt, die klinische Wirksamkeit der Tumorvakzinierung durch Kostimulation und Amplifikation entsprechender Immunzellen zu verstärken. Generell haben die Studien Pilotcharakter, weshalb nur wenige Zentren diese Therapien anbieten können bzw. nur wenige Patienten eingeschlossen werden konnten. Außerdem handelt es sich durchweg um seltene Entitäten bzw. in einigen Fällen um individualisierte Therapeutika, was die geringen Patientenzahlen erklären hilft. Dennoch lässt sich aus kleinen, aber sehr gut analysierten Patientenkollektiven eine hohes Maß an Information gewinnen. Beim Neuroblastom war nach einer IL-2- und lymphotactin-enthaltenden Vakzinierung in 4 von 21 Fällen eine komplette Remission für mehr als 48 Monate zu verzeichnen (Brenner et al. 2000). Weiterhin fand sich bei 5 der 21 Patienten eine Stabilisierung der Erkrankung für mehr als 400 Tage. Bei der Untersuchung des zellulären Immunsystems zeigte sich, dass nicht alle Patienten auf die Vakzine in der gewünschten Weise antworten und dass nicht alle Patienten mit nachweisbaren zellulären Immunantworten wirklich imstande sind, den Tumor zu kontrollieren. Die Vakzinierung gegen Tumoren mit sog. potenten Antigenen stellt kein großes immunologisches Problem dar. Jedoch stellt die Vakzinierung gegen die häufigeren schwächeren Tumorantigene (z. B. „latency membraneprotein“-1 und -2 von Epstein-Barr-Virus bei nasopharyngealem Karzinom und Hodgkin-Erkrankung) ein großes Problem dar. Hier ist es wichtig, entsprechende Kombinationen (z. B. ablative Chemotherapie oder spezifische Antikörpertherapien) begleitend einzusetzen, um regulatorische T-Zellen zu eliminieren, die inhibierende Immunwirkungen bei der Vakzinierung entfalten können. Dies kann z. B. in Form der zeitlich begrenzten

Applikation eines CD45-Antikörpers oder mit ablativer Chemotherapie im Sinne einer Lymphozytendepletion durchgeführt werden. So sind Vakzinierungsanstrengungen in der Zukunft ggf. mit temporärer Lymphodepletion zu kombinieren, um synergistische Effekte zu erhalten.

4.1.4.1 Sicherheit der Gentherapie Im Jahr 1999 ereignete sich der erste tödliche Zwischenfall in der Gentherapie bei einem Jungen mit vererbtem Ornithin-Transcarbamylase-Defekt nach adenoviralem Gentransfer (Raper et al. 2003). Bei hoher Virusdosis und vorgeschädigter Leber kam es nach intrahepatischer Injektion des Virus zum akuten Leberzerfall durch massive Immunaktivierung und einen Zytokin-Boost. Drei Jahre später fanden sich bei der sonst sehr erfolgreichen Therapie der X-chromosomalen kombinierten schweren Immundefizienz (SCID) drei Formen von Leukämie (Hacein-Bey-Abina et al. 2003a,b). Bei diesen Patienten ist es zur insertionellen Mutagenese mit nachfolgender Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen gekommen. Im Jahr 2004 sind zwar keine neuen Fälle insertionell bedingter Tumoren oder Leukämien in klinischen Studien der retroviralen Gentherapie aufgetreten; allerdings sind zwei der drei betroffenen Kinder der SCID-X1-Studie an den Folgen der insertionell bedingten malignen Lymphoproliferation gestorben. Zugleich zeigen jüngste Daten aus mittlerweile mindestens 5 laufenden Studien zur retroviralen Korrektur von Immundefizienzerkrankungen (Mailand: ADA-Defizienz; Paris: SCID-X1; London: SCID-X1 und ADA-Defizienz; NIH: SCID-X1; Muul et al. 2003; Frankfurt: CGD) positiven therapeutischen Nutzen ohne das Auftreten von Sicherheitsproblemen. Da das therapeutische Potenzial des retroviralen Gentransfers kaum mehr infrage steht, ist es nun das höchstrangige Ziel, die früher beobachteten Komplikationen durch ein besseres mechanistisches Verständnis zu vermeiden. Insertionelle Mutagenese Während nichtvirale Vektoren keine Integration in das Genom zeigen und deshalb nur transient exprimieren, ist dies bei retroviralen und lentiviralen Vektoren die Regel. Wie aus den Zwischenfällen der retroviralen Gentherapie bekannt wurde, hat jede Integration in das Genom ein gewisses Risiko der insertionellen Mutagenese. Diese wurde sowohl in Mausmodellen als auch in der klinischen SCID-X1-Gentherapie beobachtet (Li et al. 2002; Baum et al. 2003; Hacein-Bey-Abina et al. 2003a,b). Im Rahmen der Aufklärung der drei lymphoproliferativen Erkrankungen im Rahmen der SCID-X1-Gen-

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therapie wurde in einem X-SCID-Mausmodell gefunden, dass das korrektive therapeutische Gen die IL-2Rezeptor-Gammakette selbst in 1/3 der Tiere zur Lymphomgenese beitragen kann (Woods et al. 2006). Bei der Entwicklung der lymphoproliferativen Erkrankungen nach SCID-Korrektur der IL-2-Rezeptor-Gammakette ist es zur ungebremsten Expression dieses LMO2-Onkogens gekommen (Hacein-Bey-Abina et al. 2003a,b). Im Rahmen der Experimente im X-SCID-Modell der Maus zeigten sich in 33% der Fälle T-Zell-Lymphome, die jedoch frühestens erst 6 Monate nach Transplantation auftraten. Hierbei stellt sich die Frage nach dem Beitrag des Transgens neben der Insertionsstelle im LMO2-Onkogen. In Vorstudien zur klinischen Gentherapie wurden weltweit 88 Mäuse mit demselben Transgen in retroviralen Vektoren behandelt, ohne dass innerhalb einer Experimentalphase von 6 Monaten Lymphome aufgetreten waren. Auch die langfristige Beobachtung von Hunden, Rhesusaffen oder Schafen, die das humane Gen für bis zu 1 Jahr nach der Transplantation exprimierten, zeigten keine Lymphome. Auch in der klinischen Gentherapie traten die beobachteten, leukämieähnlichen Krankheitsfälle 2–3 Jahre nach Transplantation auf. Die lange Latenz bis zum Auftreten von Lymphomen kann möglicherweise durch die Akquisition weiterer komplementärer Mutationen bedingt sein. Um das Risiko der insertionellen Mutagenese zu reduzieren, wurden integrationsdefiziente lentivirale Vektoren konstruiert, die eine stabile Transduktion ermöglichen (Saenz et al. 2004; Vargas et al. 2004). Diese Untersuchungen wurden in vivo in Nagermodellen durchgeführt, bei denen in Augen und Gehirn injiziert wurde (Yanez-Munoz et al. 2006). Die hohe Effizienz des Gentransfers und der Expression eines therapeutischen Proteins führte zur dauerhaften klinischen Besserung im Modell der Retinadegeneration (Yanez-Munoz et al. 2006). An diesem Beispiel konnte gezeigt werden, dass für postmitotische Gewebe eine Vektorintegration keine unabdingbare Voraussetzung für eine Langzeitexpression darstellt. Immunreaktionen Nachdem es in den vergangenen Jahren gelungen ist, eine adäquat hohe Expression des erwünschten Transgens zu gewährleisten, stellen sich zunehmend Probleme der Immunogenität der häufig verwendete Virusvektoren. So wurden beispielsweise die Immunreaktionen auf die AAV-Serotypen 2, 5 und 8 systematisch untersucht, um zelluläre Immunantworten gegen das Viruskapsid bzw. gegen das therapeutische Transgen zu definieren. Insgesamt ging es um die Frage, wie sich eine CD8-positive MHC-Klasse-I-Immunantwort gegen Kapsidproteine entwickelt, wo bei diesem Reaktionsweg

4.1

doch die Aufnahme der Viruspartikel erfolgt und somit normalerweise eine MHC-Klasse-II-Präsentation stattfinden müsste. Am Modell der C57bl/6-Mäuse konnte mittels ELISPOT und intrazytoplasmatischer Zytokinfärbung in Abhängigkeit von den zur Immunisierung bzw. zur Boosterung eingesetzten AAV-Serotypen die Induktion Interferon-J-positiver, CD8-positiver Lymphozyten in der Abstufung AAV2/8 > AAV2/5 > AAV2/2 (Serotypen des AAV bei der Prime- bzw. bei der BoostReaktion) nachgewiesen werden (Grimm et al. 2003). Bei dem Versuch, die B-Zell-Antworten in analoger Weise zu untersuchen (Modellgen: Hunde-Gerinnungsfaktor IX), zeigte sich ein komplexes Bild. Interessant war, dass neutralisierende In-vitro-Aktivitäten nicht automatisch mit einer In-vivo-Neutralisationswirkung verbunden waren.

4.1.5 Ausblick Die Konsolidierungsphase der Gentherapie scheint überwunden und berechtigter Optimismus dahingehend angebracht, dass man in Zukunft molekulare Therapien für eine wachsende Zahl klinischer Erkrankungen entwickeln wird. Trotz aller Fortschritte dieses – noch nicht einmal 15 Jahre alten – Forschungsgebiets gilt es, Lösungen für die gegenwärtigen Probleme der Gentherapie zu finden (> Tab. 4.1.5). Die regulatorischen Auflagen im Umgang mit genetisch markierten Organismen (GMO) und den Voraussetzungen zur Durchführung klinischer Studien sind in den verschiedenen Ländern unterschiedlich. Auch die ethischen Gesichtspunkte international durchgeführter klinischer Studien sind von unterschiedlichen Auflagen geprägt. Es wäre für die Vereinheitlichung und Vergleichbarkeit der verschiedenen Studienaktivitäten notwendig, eine internationale Standardisierung zu erreichen. Dies ist gerade deshalb so wichtig, weil z. B. in

. Tab. 4.1.5. Herausforderungen an die Gentherapie x Gewebe- und zellzyklusspezifisches Targeting x Langzeitexpression/-korrektur (Transduktion von Stammzellen) x Therapie eines ganzen Organs x In-vivo-Regulation der Genexpression x Kontrolle der Immunantwort gegen den Vektor bzw. siRNA x Exzisionsreparatur dominant-negativer Mutationen x Verbesserte topische Applikation („Gencreme“) x Sicherheit und Biokompatibilität

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Sektion 4 · Therapie

China eine adenovirale Gentherapie zur Expression des Wildtyps p53 zugelassen ist. Die dortigen Sicherheitsbestimmungen sowie die regulatorischen Auflagen entsprechen jedoch nicht den europäischen bzw. amerikanischen Standards. Dennoch wird eine solche hochbrisante Therapie aus China in das europäische Ausland und nach Amerika exportiert. Die Positronenemissionstomographie- (PET-)Technologie hat im molekularen Real-time-Imaging in den letzten 5 Jahren große Beliebtheit erfahren (Serganova u. Blasberg 2005). Neben dem klassischen ReportergenDesign wird „gene imaging“ in absehbarer Zeit zum Überwachen der viral und zellbasierten Gentherapie von Tumoren eingesetzt werden (Serganova u. Blasberg 2005). Hierdurch lassen sich mittels nichtinvasiver Invivo-Darstellung quantitative Aussagen zu Vektorkonzentrationen und zur Transduktionseffizienz in klinischen Studien treffen, indem die Lokalisation, das Ausmaß und die Dauer der Transgenexpression verfolgt werden. Weitere Anwendungen stellen das zelluläre Trafficking, das Targeting und die Replikation von Vektoren dar. Eine kürzlich veröffentliche Studie zeigte bei systemischer Anwendung von siRNA nach hepatischer Applikation der korrespondierenden Hairpin-RNA in einem AAV-Vektor schwere toxische Reaktionen mit Todesfolge in Mäusen (Grimm et al. 2006). Die HairpinRNA-Therapie führte zur Übersaturierung des MikroRNA-Stoffwechselwegs in der Leber mit Kompetition um das nukleäre Karyopherin Exportin-5. Diese Ergebnisse sollten die Gentherapeuten zur Umsicht und weiterem Studium zum Verständnis der siRNA mahnen, bevor in klinischen Studien möglicherweise schwere unerwünschte Ereignisse auftreten.

4.1.6 Literatur Alba R, Bosch A, Chillon M. Gutless adenovirus: last-generation adenovirus for gene therapy. Gene Ther 2005; 12: S18–27 An DS, Xie Y, Mao SH, Morizono K, Kung SK, Chen IS. Efficient lentiviral vectors for short hairpin RNA delivery into human cells. Hum Gene Ther 2003; 14: 1207–12 Arruda VR, Schuettrumpf J, Herzog RW, Nichols TC, Robinson N, Lotfi Y, Mingozzi F, Xiao W, Couto LB, High KA. Safety and efficacy of factor IX gene transfer to skeletal muscle in murine and canine hemophilia B models by adeno-associated viral vector serotype 1. Blood 2004; 103: 85–92 Basner-Tschakarjan E, Mirmohammdsadegh A, Hengge UR. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: Evidence for DNAbinding proteins. Gene Ther 2004; 11: 765–74 Baum C, Dullmann J, Li Z, Fehse B, Meyer J, Williams DA, von Kalle C. Side effects of retroviral gene transfer into hematopoietic stem cells. Blood 2003; 101: 2099–114 Blaese RM, Culver KW, Miller AD, Carter CS, Fleisher T, Clerici M, Shearer G, Chang L, Chiang Y, Tolstoshev P, Greenblatt JJ, Rosenberg SA, Klein H, Berger M, Mullen CA, Ramsey WJ, Muul

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Sektion 4 · Therapie

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394

Sektion 4 · Therapie

4.1.7 Zeittafel Die angegebenen Zitate sind in den Literaturteil integriert. Jahr

Ereignis

Referenz

1989

Erste klinische Markergen-Therapie (tumorinfiltrierende Lymphozyten)

Rosenberg et al. 1990

1990

Erste therapeutische Gentherapie Adenosindeaminase-Immundefekt-Syndrom (ADA-SCID)

Blaese et al. 1995; Muul et al. 2003

1995

Erste klinische DNA-Vakzinierung gegen Malaria

Wang et al. 1998

1999

Hepatische Genersatztherapie mit AD-Vektor fordert erstes Todesopfer

Raper et al. 2003

2002

Insertionelle Mutagenese nach retroviralem Gentransfer bei X1-SCID verursacht leukämieähnliche Lymphoproliferation

Hacein-Bey-Abina et al. 2003a, b

2004

Mehr als 10.000 Patienten in über 1.000 Gentherapiestudien behandelt

http://www.wiley.co.uk/wileychi/genmed/clinical

2006

Erfolgreiche Behandlung der chronischen Granulomatose

Ott et al. 2006

4.2 4.2 DNA-Reparatur und Mutagenese Wolfgang Goedecke und Petra Pfeiffer

4.2.1

Mutagenese und DNA-Reparatur – 396

4.2.2

Bedeutung der DNA-Reparatur für den Menschen – 396

4.2.3

Reparatur von Basenschäden – 397

4.2.3.1 4.2.3.2 4.2.3.3 4.2.3.4

Postreplikative Basenfehlpaarungsreparatur (MMR) – 397 Basenexzisionsreparatur (BER) – 399 Nukleotidexzisionsreparatur (NER) – 402 Alkyltransferasen – 403

4.2.4

Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen – 404

4.2.4.1 4.2.4.2

Mechanismus des nichthomologen End-joining (NHEJ) – 404 Mechanismen der homologen Rekombinationsreparatur (HRR)

4.2.5

Reparatur und Transläsionssynthese von „DNA-Crosslinks“ – 406

4.2.6

DNA-Reparatur im Zellzyklus – 407

4.2.7

Literatur

– 407

4.2.8

Zeittafel

– 409

– 405

Literatur zur Zeittafel – 409

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

396

Sektion 4 · Therapie

4.2.1 Mutagenese und DNA-Reparatur Die Weitergabe genetischer Information ist ein äußerst akkurater, aber nie ganz fehlerfrei ablaufender Vorgang. Er erlaubt die Ausstattung der Tochterzellen mit dem bewährten, fast identischen Genom der Mutterzelle. Die Mutationsrate, d. h. die Veränderung der genetischen Information im Zeitraum einer Zellteilungsphase, ist abhängig vom Organismus, Zelltyp und dem betrachteten Allel. Daher ist die Fähigkeit, Mutationsraten kontrollieren zu können, eine herausragende Leistung jeder einzelnen Zelle. Erreicht wird dies durch einen hinreichend genauen Mechanismus der Replikation und das Vorhandensein von Reparatursystemen, die auftretende DNASchäden rechtzeitig eliminieren. Primäre DNA-Schäden bleiben oft ohne Folgen für einen Organismus, besonders dann, wenn sie sich in einem von der betreffenden Zelle nicht transkribierten Gen befinden. In der Folge von Replikation und Segregation können DNA-Schäden zu vererbbaren DNA-Veränderungen führen. Erst dann spricht man von Mutationen. Ziel der DNA-Reparatur ist es daher, auftretende Primärschäden möglichst vor dem nächsten Zyklus von Replikation und Segregation zu beseitigen und damit Mutationen infolge einer primären DNA-Schädigung zu vermeiden. Fehlerhaft arbeitende DNA-Reparatursysteme führen zu einer empfindlichen Steigerung der Mutationsrate. Die Bedeutung der doppelhelikalen Struktur der DNA für den Mechanismus der Replikation und Mutagnese wurde bereits unmittelbar nach ihrer Entdeckung im Jahre 1953 erkannt. Dabei wurde jedoch anfänglich übersehen, dass diese Struktur auch die Grundlage für die Mechanismen der DNA-Reparatur liefert. Ein Grund für diese späte Erkenntnis kann in der zu dieser Zeit vorherrschenden Betrachtung der erstaunlichen Stabilität der DNA-Doppelhelix liegen, die den Blick auf die Dynamik von Beschädigung und Reparatur verstellte. Die ersten molekularen Hinweise auf die Notwendigkeit von DNA-Reparaturprozessen waren die Untersuchungen zur enzymatischen Photoreaktivierung in E. coli, einem Reparatursystem, das in menschlichen Zellen allerdings nicht vorkommt (Crick 1974; Li et al. 1993). Es hat sich seitdem jedoch herausgestellt, dass die Stabilität der DNA in ihrer chemischen Zusammensetzung und auch in ihrer Struktur stark beschädigt werden kann. Die Ursachen sind sowohl in endogenen Prozessen wie Stoffwechselvorgängen und DNA-Metabolismus zu suchen, als auch in exogenen Einflüssen wie der Exposition der Zellen gegenüber Umweltchemikalien oder Strahlung. Während bei Umwelteinflüssen Vermeidungsstrategien das Risiko für DNA-Schäden minimieren können, so machen endogen bedingte DNA-Schädigungen deutlich, dass die DNA-Reparatur eine notwendige Voraussetzung der Überlebensfähigkeit einer jeden Zelle darstellt.

Viele Reparaturmechanismen sind evolutionär sehr alt und haben sich von den Prokaryonten bis zu den Säugetieren erhalten. Die Mechanismen der DNA-Reparatur laufen in Organismen unterschiedlicher Evolutionsstufen ähnlich ab, und Sequenzhomologien der beteiligten Proteine weisen auf einen gemeinsamen Ursprung in der Entwicklungsgeschichte hin. Die wichtigen Reparatursysteme in Säugetieren sind: x die Nukleotidexzisionsreparatur (NER), x die Basenexzisionsreparatur (BER), x die postreplikative Korrektur von Basenfehlpaarungen („mismatch-repair“, MMR), x die nichthomologe Enden-Verknüpfung („non-homologous-end-joining“, NHEJ) und x die homologe Rekombinationsreparatur (HRR). Diese Reparatursysteme arbeiten unabhängig voneinander und sind spezialisiert auf die Beseitigung spezifischer DNA-Schäden. Sind alle Reparaturmechanismen funktionstüchtig, kommt es zu einem Gleichgewicht zwischen mutagenen Einflüssen und Reparatur, das Genom ist dann stabil (Hoeijmakers 2001).

4.2.2 Bedeutung der DNA-Reparatur für den Menschen Im menschlichen Genom sind etwa 125 Gene direkt an der DNA-Reparatur beteiligt (Ronen u. Glickman 2001; Wood et al. 2001). Viele dieser Gene werden mit der Entstehung von Tumoren in Verbindung gebracht. Ihr Ausfall führt zur Prädisposition von Tumoren, weil die empfindliche Balance zwischen DNA-Schädigung und Reparatur gestört ist und die Zelle eine niedrige Mutationsrate nicht mehr aufrechterhalten kann. Diese Gene, die die Integrität des Genoms kontrollieren, und zu ihnen gehören DNA-Reparaturgene, werden „Caretaker“ genannt. Defekte Caretaker erhöhen das allgemeine Tumorrisiko, weil sie die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass die bekannten Tumorsuppressorgene oder Protoonkogene mutieren. Diese werden als „Gatekeeper“ bezeichnet, weil sie kontrollierend auf das Zellwachstum einwirken. Mutationen in Gatekeeper-Genen verschaffen den betroffenen Zellen einen Wachstumsvorteil, der Voraussetzung für die Tumorentwicklung ist (Kinzler u. Vogelstein 1997; Ponder 2001). Als Folge der erhöhten Mutationsrate können noch weitere Gene mutieren, die eine endgültige Manifestation des Tumors bewirken (Cahill et al. 1999) (> Abb. 4.2.1). In den letzten Jahren ist man dazu übergegangen, transgene Mausmodelle mit definierten DNA-Reparaturdefekten zu etablieren und diese mit Krankheiten des Menschen zu vergleichen. Mausmodelle werden noch viele nützliche Informationen zum Verständnis derPhänotypen

397 4.2 · DNA-Reparatur und Mutagenese

4.2

. Abb. 4.2.1a–c. a Modell zur Rolle von DNAReparaturgenen in der Tumorgenese. Durch ein Primärereignis in einer Zelle (rot) wird ein Mutatorphänotyp in den Zellen erzeugt. Ist die Zelle schon heterozygot für das betreffende DNAReparaturgen, genügt die Inaktivierung des intakten Gens. Ansonsten können zwei Mutationen, die beide Allele betreffen, den Mutatorphänotyp auslösen. b Die Zelle weist dann eine erhöhte Mutationsrate auf und reichert Mutationen in Tochterzellen (orange) an. c Ist eine das Tumorwachstum begünstigende Kombination von Genen mutiert, beginnt das Tumorwachstum (blau)

bei defekten DNA-Reparaturmechanismen liefern, auch wenn eine einfache Übertragbarkeit des beobachteten Phänotyps von der Maus auf den Menschen oft nicht möglich ist (Meira et al. 2001; de Boer u. Hoeijmakers 1999).

Die Replikation ist eine der Hauptursachen für Mutationen. Die Fehlerrate des Replisoms ist zwar durch Beteiligung des Replikationsfaktors A (RPA) an der Polymerase D/Primase und den 3c/5c-Exonuklease-Ak-

tivitäten („proof-reading“) der replikativen Polymerasen G und H gegenüber den Einzelpolymerasen herabgesetzt, es kommt jedoch immer noch mit einer Häufigkeit von etwa 109 bis 1010 zum Einbau eines falschen Nukleotids (Kunkel u. Bebenek 2000; Hubscher et al. 2002). Dieser Fehler führt zu einer Basenfehlpaarung („mismatch“) in der replizierten DNA. Ein weiterer häufiger Mutationstyp der Replikation besteht in der Erzeugung kurzer Deletionen oder Insertionen im Bereich repetitiver DNA oder monotoner DNA-Abschnitte (z. B. GACGACGAC). Diese entstehen durch Verschiebungen des neu synthetisierten Strangs am Matrizenstrang. In der replizierten DNA entsteht eine Insertions- oder Deletionsschlaufe, je nachdem, ob der Primer-Strang oder der Matrizenstrang verschoben wurde (> Abb. 4.2.2).

. Abb. 4.2.2a,b. a Entstehung einer Basenfehlpaarung. Durch Einbau eines Guanins im Primer-Strang an einem Thymin im Matrizenstrang entsteht eine G:T-Basenfehlpaarung. b In repetitiven Sequenzen, hier eine Wiederholung eines GAC-Motivs (rot) kann es zur

Schlaufenbildung kommen. Je nachdem, ob diese Schlaufen (rot) im Primer-Strang oder im Matrizenstrang entstehen, kommt es zu Insertionen oder Deletionen. Sowohl Basenfehlpaarungen als auch Schlaufen sind Substrate für das MMR-System

4.2.3 Reparatur von Basenschäden 4.2.3.1 Postreplikative Basenfehlpaarungsreparatur (MMR)

398

Sektion 4 · Therapie

Einen entscheidenden Beitrag zur Reparatur solcher Basenfehlpaarungen und Schlaufen liefert die postreplikative MMR. Das MMR-System ist evolutionär sehr alt und als MutHLS-System schon in E. coli vorhanden. In MMR-defizienten Mutanten zeigen die Zellen einen Mutatorphänotyp mit einer um das 100- bis 1.000-Fache über das Normale erhöhten Mutationsrate. Beim Menschen führen genetische Defekte des MMR-Systems zu HNPCC („hereditary nonpolyposis colon cancer“), einer Darmkrebserkrankung, die als familiäre und spontane Form auftreten kann. Etwa 1–5% aller Darmkrebserkrankungen können der familiären Form von HNPCC zugerechnet werden, was diese Krankheit zur häufigsten genetisch bedingten Tumorerkrankung macht (Peltomaki 2001). Die MMR-Gene sind klassische Caretaker. Es ist daher nicht verwunderlich, dass außer dem Darm noch weitere Gewebe betroffen sind (de la Chapelle 2004). Die Funktionsweise des bakteriellen MutHLS-Systems ist recht einfach und soll daher kurz erläutert werden. Die Erkennung des Replikationsfehlers übernimmt das MutS-Protein, welches die Basenfehlpaarung oder die Insertions- und Deletionsschlaufe erkennt und an diese bindet. Unter Beteiligung des MutL-Proteins kommt es zu einer Translokation vom DNA-Schaden weg, und die dritte Komponente, das MutH-Protein, wird aktiviert. Dessen Aufgabe besteht darin, den neu synthetisierten DNA-Strang zu schneiden und damit die Reparatur des Schadens einzuleiten. Dabei wird die Tatsache ausgenutzt, dass die frisch replizierte E.-coli-DNA hemimethyliert ist. Dies bedeutet, dass der parentale Strang methyliert ist, der neusynthetisierte Tochterstrang hingegen noch nicht. MutH schneidet die von der dam-Methylase am Adenin methylierte Sequenz – GATC – spezifisch nur im nicht methylierten, daher neu synthetisierten DNA-Strang. Der MutH-induzierte Einzelstrangbruch wird von einer Exonuklease (ExoI, ExoVII oder RecJ) entweder in 5c-Richtung oder in 3c-Richtung erweitert. Abschließend wird die fehlerhafte Stelle von Komponenten des PolIII-Holoenzyms aufgefüllt. Mit Ausnahme von C:C-Basenfehlpaarungen können alle anderen möglichen Kombination fehlgepaarter Basen (G:G; A:A; T:T; G:T; A:C) durch das MMR-System effizient erkannt und repariert werden (Hsieh 2001). So übersichtlich der Mechanismus bei E. coli ist, so wird die MMR bei Eukaryonten allein dadurch kompliziert, dass für einige der beteiligten Proteine des E.-coliSystems meist mehrere homologe Proteine vorhanden sind, deren genaue Funktionen noch nicht vollständig bekannt sind. Das MMR-System des Menschen weist fünf zu MutS homologe Proteine (MSH2–MSH6) und vier zu MutL homologe Proteine (MLH1, MLH3, PMS1 und PMS2) auf. Es konnte aber kein homologes Protein zum bakteriellen MutH gefunden werden (Peltomaki 2001).

Für die MMR in mitotischen Zellen sind nur die MSH2-, MSH3- und MSH6-Proteine relevant, die verbleibenden Proteine, MSH4 und MSH5, sind auf die Meiose beschränkt. In Eukaryonten sorgt ein Heterodimer aus MSH2/MSH3 (MutSD für die Erkennung von Basenfehlpaarungen und Schlaufen aus nur einem Nukleotid. Größere Schlaufen werden von einem Komplex aus MSH2/MSH6 (MutSE erkannt. Das menschliche MMR-System läuft nach einem ähnlichen Schema ab wie in E. coli und repariert C:C-Basenfehlpaarungen ebenfalls am schlechtesten (Fang u. Modrich 1993). Die Aktivierung der weiteren Prozesse der MMR erfordert Heterodimere aus MLH1/PMS2 und wahrscheinlich auch andere Kombinationen MutL-homologer Proteine (Peltomaki 2001). Außerdem sind Komponenten des Replisoms beteiligt, eine Exonuklease, vermutlich Exo1, sowie RPA und PCNA („proliferating cell nuclear antigen“). Die enge Kopplung des MMR-Systems an den Replikationsvorgang scheint bei Prokaryonten über das E-clamp Protein und bei Eukaryonten über die analoge Struktur PCNA zustande zu kommen (Harfe u. Jinks-Robertson 2000; Hsieh 2001). Das in E. coli für den Inzisionsschritt verantwortliche MutH-Protein fehlt in Eukaryonten, und es stellt sich die Frage, welches Enzym die Inzision des neu synthetisierten Strangs übernimmt. Ein Kandidat ist die MethylCpG-bindende Endonuklease (Harfe u. Jinks-Robertson 2000). Andererseits zeigt die biochemische Analyse des E.-coli-MutHLS-Systems, dass auch existierende Einzelstrangbrüche verwendet werden können. Es ist daher auch möglich, dass Einzelstrangbrüche die normalerweise während jedes Replikationsvorgangs im neu synthetisierten DNA-Strang entstehen, dazu genutzt werden, den Reparaturvorgang einzuleiten. Anders als bei E. coli wird der neu synthetisierte Strang in Säugerzellen nicht anhand seines Methylierungszustands erkannt, sondern anhand der vorhandenen Einzelstrangbrüche (> Abb. 4.2.3). Auf einen besonderen Aspekt der MMR von G:TBasenfehlpaarungen soll noch hingewiesen werden. Diese können nicht nur durch falschen Einbau von G gegenüber T während der Replikation entstehen, sondern auch durch die Desaminierung von 5-Methylcytosin zu Thymin (vgl. 7 4.2.3.2). Die G:T-Fehlpaarung kann auch durch das BER-System entfernt werden. Da die BER nicht über einen Diskriminierungsmechanismus zwischen neu synthetisiertem und parentalem Strang verfügt, sondern immer das Thymin eliminiert, würde durch die Reparatur mit einer Wahrscheinlichkeit von 50% eine Mutation entstehen. An diesem Beispiel wird deutlich, dass auch von Reparaturprozessen ein Risiko für die Entstehung von Mutationen ausgehen kann. Die Tatsache, dass HNPCC-Erkrankungen ihre Ursache in einer defekten MMR haben, lässt sich diagnos-

399 4.2 · DNA-Reparatur und Mutagenese

4.2

. Abb. 4.2.3a–d. Modell der MismatchReparatur. Dargestellt ist eine Replikationsgabel. a Als Folge der Replikation ist es zu einem Replikationsschaden (Basenfehlpaarung oder Insertions- bzw. Deletionsschlaufe) gekommen. b Der Schaden wird durch MutS erkannt, indem das Protein an diesen bindet. c Mithilfe von MutL wird der neu synthetisierte Einzelstrang unter Mitwirkung hier nicht dargestellter Nukleasen entfernt. d An dem freien 3c-Ende kann die DNA Synthese neu einsetzen

tisch nutzen. Als Folge der defekten Reparatur treten Instabilitäten an Minisatelliten auf, die sich als diagnostisches Kriterium für HNPCC verwerten lassen. Derartig instabile Minisatelliten wurden sowohl in spontanen als auch in familiären Tumoren nachgewiesen (Peltomaki 2001). Die Proteine des MMR-Systems sind auch an der Entstehung dynamischer Mutationen beteiligt. Diese Mutationen entstehen durch spontane Expansion von kurzen repetitiven Abschnitten. Die kleinste infrage kommende, sich wiederholende Einheit („repeat“) sind Trinukleotide, aber auch längere Einheiten bis hin zu Satellitensequenzen wurden nachgewiesen. Die Expansion eines derartigen Allels kann zur Inaktivierung benachbarter Gene führen. Als Mechanismus für die Inaktivierung kommen sowohl epigenetische Faktoren infrage, wenn der Repeat außerhalb des Gens liegt, aber auch die direkte Inaktivierung, wenn der Repeat die kodierende Sequenz oder den Promotor beeinträchtigt. Dynamische Mutationen sind mit neurodegenerativen Krankheiten verbunden, von denen etwa 40 bekannt

sind. Allerdings macht es die Tatsache, dass sich die Neuronen nicht mehr aktiv teilen, unwahrscheinlich für die Expansion der Sequenzen, einen replikationsabhängigen Mechanismus anzunehmen. Dies deutet darauf hin, dass die Komponenten des MMR-Systems möglicherweise auch in sich nicht mehr teilenden Zellen eine bedeutende Rolle bei der Reparatur gerade der repetitiven Sequenzen spielen könnten (Pearson et al. 2005).

4.2.3.2 Basenexzisionsreparatur (BER) Viele DNA-Schäden entstehen in den Zellen spontan im Rahmen des allgemeinen Stoffwechselgeschehens. Derartige Schäden werden in erster Linie durch die Basenexzisionsreparatur entfernt (Lindahl 2000). Es ist daher nicht verwunderlich, dass sowohl Prokaryonten- als auch Eukaryonten ähnliche Enzyme für die BER entwickelten und die Mechanismen nach dem gleichen Grundmuster ablaufen. Die BER besteht in einer Abfolge von fünf Schritten:

400

Sektion 4 · Therapie

1. Erkennung des Schadens, 2. Erzeugung einer apurinischen oder apyrimidinischen Stelle (AP-Stelle), 3. Öffnen und Bearbeiten des Zucker-Phosphat-Rückgrats des geschädigten Strangs an genau der APStelle, 4. Auffüllung der entstandenen Lücke mittels einer DNA-Polymerase und 5. Ligation des verbleibenden Einzelstrangbruchs mit einer Ligase. Je nachdem, ob in der Auffüllreaktion nur das beschädigte Nukleotid ersetzt wird oder ein längerer Sequenzabschnitt neu synthetisiert wird, unterscheidet man

einen „Short-patch“- und „Long-patch“-Modus der BER (> Abb. 4.2.4). Die Erkennung der geschädigten Base und deren hydrolytische Abspaltung erfolgt durch eine DNA-Glykosylase. Da diese Enzyme nur eine begrenzte Substratspezifität für bestimmte DNA-Schäden besitzen, ist das Spektrum der von einer einzelnen DNA-Glykosylase erkennbaren Schäden begrenzt (Cadet et al. 2000; Mitra et al. 2001) Somit sind eine ganze Reihe von unterschiedlichen DNA-Glykosylasen erforderlich, um die große Vielfalt unterschiedlicher Basenschäden zu erfassen. Die Basenexzisionsreparatur ist der vorherrschende Mechanismus, wenn es um die Beseitigung chemischer Modifikationen von Purin- oder Pyrimidinbasen geht.

. Abb. 4.2.4. Modell der Basenexzisionsreparatur. Durch chemische Modifikation wie Desaminierung, Alkylierung und Oxidation werden natürlicherweise in DNA vorkommende Basen (obere Reihe) in potenziell mutagene Basenderivate (untere Reihe) umgewandelt. Jeder dieser DNA-Schäden wird durch bestimmte DNA-Glykosylasen entfernt und in eine AP-Stelle umgewandelt. Unten: Die AP-Stelle wird weiter prozessiert, indem das Zucker-Phosphat-Rückgrat hydrolysiert wird. Dies kann entweder durch eine DNA-Glykosylase-assoziierte

Phosphorylaseaktivität (rechts) oder ein Extraenzym APE1 (Mitte) geschehen. Das Bereitstellen der für die Ligation notwendigen 3c-OH und 5c-Phosphatenden übernimmt je nach Reaktionsweg die Polymerase E oder APE1, und genau ein Nukleotid wird von der Polymerase E aufgefüllt (Short-patch-repair). In einer alternativen Reaktion (links) werden mehrere Nukleotide durch Polymerase G/H aufgefüllt und der verdrängte Strang durch Fen-1 geschnitten (Long-patchrepair)

401 4.2 · DNA-Reparatur und Mutagenese

Bislang sind keine menschlichen Krankheiten mit Defekten in der BER gefunden worden. Vielleicht wird dadurch die Bedeutung dieses Reparaturwegs unterstrichen, da ein Ausfall dieses Reparaturmechanismus wahrscheinlich letal für die betreffende Zelle ist. Dennoch hat die BER eine klinische Relevanz, da sie doch bei der unerwünschten Resistenzentwicklung von Tumorzellen gegenüber bestimmten Chemotherapeutika eine große Rolle spielt (Rajewsky et al. 2000). DNA-Glykosylasen Jede DNA-Glykosylase ist spezialisiert für einen ganz bestimmten Schadenstyp und erkennt und entfernt chemisch modifizierte Basen. Während viele DNA-Glykosylasen das Zucker-Phosphat-Rückgrat intakt lassen und eine AP-Stelle erzeugen, sind andere mit einer Phosphorylaseaktivität assoziiert, die das Zucker-PhosphatRückgrat spaltet und somit keine freie AP-Stelle hinterlässt. Einige wichtige Substrate und die für deren Entfernung verantwortlichen DNA-Glykosylasen beim Menschen werden im Folgenden beschrieben. Eine wichtige spontane Basenmodifikationsreaktion ist die oxidative Desaminierung (ca. 100/Zelle/Tag). So führt beispielsweise die Desaminierung von Cytosin zur Bildung von Uracil in der DNA. Es ist dann die Aufgabe der Uracil-DNA-Glykosylase (UDG), die entstandene G: U-Fehlpaarung zu entfernen, indem Uracil hydrolysiert wird und eine AP-Stelle entsteht (Pearl 2000). Auf diese Weise wird verhindert, dass in der nächsten Replikation eine G:C-A:T-Transition entsteht. In eukaryoter DNA liegen viele Cytosinbasen in methylierter Form als 5-Methylcytosin vor, dessen Desaminierung die Base Thymin ergibt. Die Konsequenzen dieser Desaminierung sind ähnlich wie für das Uracil, da die Replikation zu einer G:C-A:T-Transition führen würde. Diese durch Desaminierung von 5-Methylcytosin induzierten Transitionen kommen sehr häufig vor, und haben dazu geführt, dass 5-Methylcytosin als „endogenes Mutagen“ bezeichnet wird (Lindahl 2000). Im Unterschied zu Uracil ist Thymin eine natürlich in der DNA vorkommende Base. Die Zelle löst dieses Problem durch eine gesonderte DNA-Glykosylase, die auch zur Familie der Uracil-DNA-Glykosylasen gehört, aber spezifisch für G:T-Basenfehlpaarungen ist. (Pearl 2000) Beim Menschen wird das Enzym Thymin-DNA-Glykosylase (TDG) genannt. Dieses Enzym übernimmt den Hauptanteil der Reparatur von G:T-Basenfehlpaarungen. Die Aktivität der TDG ist allerdings gering, es ist ein langsames Enzym. Dies kann damit zusammenhängen, dass G:T-Basenfehlpaarungen, die durch Falscheinbau von Guanin während der Replikation entstehen, präferenziell durch MMR und damit spezifisch für den neu synthetisierten Strang eliminiert werden können (Waters u. Swann 2000).

4.2

Nicht nur Pyrimidinbasen, sondern auch Purinbasen können desaminiert werden. Als spontanes Desaminierungsprodukt des Adenins entsteht Hypoxanthin. Es kann durch Paarung mit Cytosin in der Replikation A:T-G:C-Transitionen erzeugen und ist daher mutagen. Diese Schäden werden durch ein Enzym entfernt, das ein breites Substratspektrum hat und auch alkylierte Basen wie das 3-Methyladenin eliminiert. Daher hat dieses Enzym seinen Namen und wird als 3MeA-DNAGlykosylase bezeichnet und beim Menschen AAG genannt (Lindahl 2000). Eine andere Gruppe von Basenmodifikationen (ca. 20.000/Zelle/Tag) entstehen bei der Oxidation durch Sauerstoff- oder Hydroxylradikale, die ein unvermeidliches Stoffwechselprodukt aerober Lebewesen sind. Auch bei der radiolytischen Spaltung von Wasser, wie sie in der Strahlentherapie passiert, treten Sauerstoffradikale auf, die so eine indirekte mutagene Wirkung erzeugen (Marnett 2000). Sowohl Purine als auch Pyrimidine unterliegen solchen Oxidationsvorgängen. Die mutagene Wirkung des 8-Hydroxyguanins (auch als 8-oxo-G bezeichnet) beruht auf der Tatsache, dass diese Base auch mit Adenin paaren kann, was zu G:C-T: A-Transversionen während der Replikation führt. Der Mensch hat zwei DNA-Glykosylasen, um 8-Hydroxyguanin aus der DNA zu entfernen (Lindahl 2000). Liegt es gepaart mit Cytosin vor, so übernimmt das Enzym Ogg1 die Eliminierung des 8-Hydroxyguanin. Dies ist unmittelbar nach der Oxidation der Fall. Kommt es jedoch erst zu einer Replikation mit einem fehlerhaften Einbau eines mit dem 8-Hydroxyguanin gepaarten Adenins, so gibt es eine spezielle DNA-Glykosylase MutY, die die 8-oxo-G:A-Fehlpaarung erkennt und das Adenin entfernen kann. Nach dieser Reparatur kann das 8-Hydroxyguanin gepaart mit Cytosin vorliegen und ist dann ein Substrat für Ogg1. Auf diese Weise führen auch nach der Replikation noch mehrere Reparaturzyklen zur mutationsfreien Entfernung der geschädigten Base. Die Oxidationssprodukte Thyminglykol und Cytosinglykol, die sich aus den entsprechenden Pyrimidinbasen ableiten, werden durch das Enzym Nth1 entfernt. Das an der NER beteiligte Protein XPD, das bei Xeroderma-pigmentosum-Patienten defekt sein kann (vgl. 7 4.2.3.3), hat eine unterstützende Wirkung bei der Reparatur von Thyminglykol und Cytosinglykol durch hNth1. Außer durch die Aktivität der DNA-Glykosylasen entstehen AP-Stellen auch durch NER-Reparatur und spontane Depurinierung. Bestimmte Alkylierungen (z. B. 7-Methylguanin) führen zu AP-Stellen, indem sie nichtenzymatische Depurinierung fördern (Nilsen u. Krokan 2001).

402

Sektion 4 · Therapie

Entfernung von AP-Stellen Die von den DNA-Glykosylasen erzeugten AP-Stellen werden im weiteren Verlauf der BER in die ursprüngliche Sequenz umgewandelt. Dazu stehen zwei Reaktionswege zur Verfügung, die sich durch die beteiligten Proteine, aber auch durch die Länge der neu synthetisierten DNA-Abschnitte unterscheiden. Der bei Säugetieren vorherrschende Mechanismus besteht in der Inzision des zu reparierenden DNAStrangs an der AP-Stelle mit einer AP-Endonuklease. Beim Menschen sind bislang zwei AP-Endonukleasen bekannt – APE1 (HAP1, APEX, REF1) und ein weiteres Enzym APEXL2. APE1 ist das bedeutsamere und sorgt für die Entfernung von etwa 95% der auftretenden AP-Stellen (Dianov et al. 2003). Die AP-Endonuklease erzeugt ein freies 3c-OH Ende, welches als „Primer“ in der folgenden DNA-Polymerase-katalysierten Auffüllreaktion verwendet wird. APE1 wird durch PARP-1 ersetzt, dessen Interaktion mit Polymerasen diese zu den AP-Stellen dirigiert. Je nach der rekrutierten Polymerase unterscheidet man einen Modus der „Short-patch“-Reparatur oder „Long-patch“Reparatur. Im ersten Reaktionsweg addiert die Polymerase E genau ein Nukleotid an das von APE1 erzeugte 3-OH Ende. Dabei übernimmt die Polymerase E auch die Entfernung des am 5c-Ende verbliebenen Desoxyribosephosphats (dRP). Abgeschlossen wird die Reaktion durch Ligation der Einzelstranglücke durch Ligase III und XRCC4. In der Long-patch-Reparatur werden mehrere Basen von den Polymerasen G/H eingebaut und dabei ein Teil des beschädigten Strangs verdrängt, der in der weiteren Reaktion durch FEN1 entfernt wird. Die Ligation dieses Reaktionswegs wird von Ligase I übernommen (> Abb. 4.2.4) (Dianov et al. 2003).

4.2.3.3 Nukleotidexzisionsreparatur (NER) Die Nukleotidexzisionsreparatur ist hinsichtlich des Schadensspektrums das wohl vielseitigste Reparatursystem (Hoeijmakers 2001). Sie eliminiert chemische Modifikationen der DNA, die strukturelle Veränderungen der Doppelhelix hervorrufen. Man bezeichnet diese Läsionen als „bulky adducts“. Typische Schäden dieses Typs sind Strahlenschäden, wie sie durch ultraviolettes Licht (UV) entstehen. Diese führen zu Quervernetzungen „cross-links“, die die Transkription oder Replikation der DNA verhindern, und müssen deshalb zu Beginn der S-Phase repariert sein, um ein Anhalten des Replikationsapparats zu verhindern. Häufig auftretende UV-Licht-induzierte Strahlenschäden sind das cis-synPyrimidin-Dimer, das unter Bildung eines Cyclobutanrings zwischen benachbarten Pyrimidinen (T-T; C-T; C-C) entsteht, oder die Bildung des (6-4)-Pyrimidin-Py-

rimidon-Photoprodukts. Die Erkennung von DNASchäden durch das NER-Reparatursystem nutzt die strukturelle und chemische Veränderung der DNA. Eine derartige zweigeteilte Erkennung bezeichnet man als „bipartite substrate recognition“ (Hess et al. 1997; Wood 1999). Die Zelle unterscheidet auf diese Weise „bulky adducts“ von anderen Strukturveränderungen der DNAHelix, wie z. B. Einzelstrangschlaufen (> Abb. 4.2.2). Letztere sind deshalb schlechte Substrate für die NERReparatur. Es soll aber darauf hingewiesen werden, dass das NER-System durchaus dazu in der Lage ist, auch andere Läsionen als die „bulky adducts“ zu erkennen und zu reparieren. Dazu gehören DNA-Modifikationen, die durch Alkylierung oder Oxidation entstehen und in erster Linie durch BER entfernt werden. Für diese Schäden kann die NER als eine Art Sicherheitssystem betrachtet werden (Satoh et al. 1993). Die Reparatur von „bulky-adducts“ in aktiv transkribierten Genen unterscheidet sich von der in nichttranskribierten Bereichen des Chromatins. Man unterscheidet zwei NER-Reparaturmechanismen: x die GGR („global genome repair“) und x die TCR („transcription-coupled repair“). Beide Reaktionswege folgen dem allgemeinen Reaktionsschema für die NER, unterscheiden sich aber hinsichtlich der an der Schadenserkennung beteiligten Proteine. Nach der Erkennung des Schadens folgt in beiden Mechanismen eine doppelte Inzision, jeweils auf der 5cund der 3c-Seite der Läsion. Dadurch wird ein kurzes DNA-Fragment (ca. 30 nt) einschließlich des Schadens aus dem Doppelstrang entfernt. Diese Einzelstranglücke wird von einer DNA-Polymerase aufgefüllt und durch eine Ligase geschlossen (> Abb. 4.2.5). Beide Mechanismen unterscheiden sich maßgeblich in der Schadenserkennung. Die Erkennung des DNASchadens der GGR erfolgt durch Bindung eines Heterodimers aus XPC/hHR23B. Auch das XPE-Protein hat eine Affinität zu mit UV-Licht bestrahlter DNA und spielt womöglich bei der Erkennung des Schadens eine Rolle (de Boer u. Hoeijmakers 2000). Durch Bindung weiterer Proteine leitet der XPC/hHR23B-Komplex die nachfolgenden Reparaturschritte ein. Im Unterschied zur GGR erfolgt die Erkennung des Schadens im TCRMechanismus durch Blockierung der Transkription an einem „bulky-adduct“. Das Innehalten der RNA-Polymerase II während der Transkription ist also das Signal für die Schadenserkennung. Defekte der NER beim Menschen führen zu schwerwiegenden Krankheiten mit heterogenen Phänotypen, die sich in den klinischen Krankheitsbildern Xeroderma pigmentosum (XP), Cockayne-Syndrom (CS) und Thrichothiodystrophie (TTD) widerspiegeln. Übereinstimmend mit der Hauptaufgabe der NER beim Menschen,

403 4.2 · DNA-Reparatur und Mutagenese

4.2

. Abb. 4.2.5a-c. Modell der Nukleotidexzisionsreparatur. a Substrate für diesen Reparaturtyp bilden Schäden, die zu einer Zerstörung der helikalen Struktur der DNA führen („bulky-adduct“). b Die Fehlererkennung übernimmt in nichttranskribierten Bereichen der DNA ein Komplex aus XPC/hHR23 und in aktiv transkribierten bereichen die Polymerase II. In beiden Fällen wird der schadhafte Einzelstrang durch zwei Nukleasen (grün) herausgeschnitten. c Die Auffüllreaktion übernimmt die Polymerase G/H, und die Ligase I schließt den reparierten Strang kovalent

der Elimination von Strahlenschäden durch UV-Licht, haben Patienten mit diesen Krankheiten eine stark erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Sonnenlicht. Je nach Krankheit kommt es zu weiteren Symptomen wie Neurodegeneration (CS und TTD), Ichthyosis oder brüchigen Haaren (TTD). Es kommen auch Mischformen der Krankheitsbilder vor (de Boer u. Hoeijmakers 2000). Insgesamt hat man beim Menschen zehn Komplementationsgruppen für NER-assoziierte Krankheiten gefunden, sieben für XP (XP-A bis XP-G), zwei für CS (CS-A und CS-B) und drei für TTD (XP-B, XP-D und TTD-A). Bis auf XPC, das ausschließlich den GGR-Mechanismus betrifft, haben alle anderen Gene Auswirkungen auf beide Reparaturmechanismen. Insgesamt ist der Zusammenhang zwischen vorhandener Mutation und klinischer Erscheinungsform aber bislang sehr schlecht verstanden. So können unterschiedliche Mutationen selbst innerhalb eines Gens unterschiedliche Krankheitsbilder erzeugen. Ein extremes Beispiel ist das XPDGen. In diesem Gen können unterschiedliche Mutationen sowohl XP, TTD und auch eine Mischform aus XP und CS hervorrufen. Da das XPD-Genprodukt eine Helikase und essenzieller Bestandteil des Transkriptionsfaktors TFIIH ist, liegt allerdings die Vermutung nahe, dass Mutationen, die die NER-Funktion von XPD betreffen, den XP-Phänotyp hervorrufen, wohingegen Mutationen, die die Funktion des TFIIH beeinträchtigen,

leichte Transkriptionsdefekte und damit die in TTD beobachteten Entwicklungsstörungen sowie eingeschränkte Keratinsynthese (Ichthyosis, brüchige Haare) verursachen. Ein weiterer unverstandener Aspekt ist die Tatsache, dass XP, nicht aber CS und TTD eine Prädisposition für Tumoren erzeugt (de Boer u. Hoeijmakers 2000).

4.2.3.4 Alkyltransferasen Neben dem für Alkylierungsschäden hauptsächlich zuständigen BER-System besitzen Säugerzellen noch eine alternative Reparaturmöglichkeit, die auf der direkten Reversion des Schadens beruht. Die O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) ist in der Lage, Alkylgruppen von den modifizierten Basen O6-Methylguanin, O6-Ethylguanin, O6-Buthylguanin oder O4-Methythymin zu entfernen (Sancar 1995). Diese werden dabei auf einen Cysteinrest des Proteins übertragen. Dieser Schritt ist irreversibel, und das so alkylierte Protein muss dem ubiquitinabhängigen proteolytischen System zugeführt werden (Mitra et al. 2001). An der Tatsache, dass die Zelle ein ganzes Proteinmolekül für die Eliminierung eines Basenschadens opfert, kann man ermessen, wie wichtig es ist, eine potenziell mutagene DNA-Läsion zu beseitigen. Im

404

Sektion 4 · Therapie

Falle der Replikation würde das O6-Methyl-G mit Thymin paaren und G:C-A:T-Transitionen hervorrufen. Der betriebene Aufwand erlaubt eine schnellere Reparatur dieser Schäden, als wenn die BER allein verantwortlich wäre. Mit Defekten in der MGMT assoziierte Syndrome sind beim Menschen bislang nicht bekannt. Allerdings gibt es klinisch relevante Aspekte im Hinblick auf Tumorerkrankungen. Etwa 20% aller menschlichen Tumorzelllinien besitzen eine reduzierte MGMT-Aktivität, die allerdings nicht immer auf Mutationen im MGMT-Gen zurückzuführen sind. Zur Erklärung dieser Diskrepanz werden auch epigenetische Mechanismen vermutet. Ein weiterer wichtiger Aspekt bezieht sich auf die erworbene Resistenz von Tumorzellen während einer Chemotherapie mit alkylierenden Chemikalien, zu der MGMT beitragen kann (Rajewsky et al. 2000).

Rekombinationsreparatur (HRR) zu rekonstruieren. In somatischen (mitotischen) Zellen steht dazu das in der S-Phase gebildete Schwesterchromatid zur Verfügung, weswegen die HRR weitestgehend auf die S- und G2Phase beschränkt ist. Übereinstimmend mit dieser Zellzyklusabhängigkeit findet Doppelstrangbruchreparatur nach dem NHEJ-Mechanismus hauptsächlich in der G1-Phase statt, wenn kein homologes Schwesterchromatid vorhanden ist. Homologe Rekombination mit dem zweiten homologen Chromosom ist zwar in somatischen Zellen denkbar, aber selten. Diese Form der Reparatur wird aber intensiv genutzt, wenn es um die Beseitigung von Doppelstrangbrüchen in der ersten meiotischen Reifeteilung geht.

4.2.4 Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen

Der NHEJ-Mechanismus ist in der Lage, beliebige DNAEnden, wie sie beispielsweise durch Restriktionsenzyme oder Einwirkung ionisierender Strahlung entstehen, zu verknüpfen (Pfeiffer et al. 2005). Ausführliche Untersuchungen in zellfreien Systemen haben gezeigt, dass diese Wiederverknüpfung ganz bestimmten Regeln folgt und in drei Teilschritten abläuft (Thode et al. 1990): 1. Sie beginnt mit der Fixierung beider Enden und der Ausrichtung („alignment“) beider Enden zueinander. Dabei können zufällige Basenpaarungen zwischen den beiden nichtkomplementären Strängen ausgenutzt werden, man spricht dann von mikrohomologiegerichtetem End-joining. 2. Im 2. Schritt werden nicht zusammen passende Enden so modifiziert, dass sie ligierbar werden (d. h. fehlende Nukleotide werden hinzugefügt oder überzählige Nukleotide deletiert und Lücken aufgefüllt). 3. Den Abschluss der NHEJ-Reaktion bildet eine Ligation, die die beiden gebrochenen DNA-Doppelstränge kovalent miteinander verknüpft (> Abb. 4.2.6).

Doppelstrangbrüche (DSB) in chromosomaler DNA sind besonders gefährliche Läsionen. Schon ein einziger nicht reparierbarer Doppelstrangbruch kann zum Verlust essenzieller genetischer Information (z. B. auf dem distalen azentrischen Chromosomenfragment) und somit zum Zelltod führen (Khanna u. Jackson 2001). Außerdem sind die durch DSB entstandenen DNA-Enden Initiationsstellen für Rekombinationsereignisse und können Chromosomenaberrationen verursachen (Pfeiffer et al. 2004). Solche Chromosomenaberrationen können zur Deregulation von Genaktivitäten oder Bildung unerwünschter Fusionsproteinen führen, die ursächlich für die Ausbildung von Tumoren sein können (Mitelman 2000). Im Gegensatz zur oben beschriebenen Reparatur von Basenschäden (vgl. 7 4.2.3) entsteht bei der DSBReparatur eine besondere Schwierigkeit, da beide DNAStränge geschädigt sind und somit die Matrize für die Wiederherstellung der ursprünglichen Sequenzinformation fehlt. Die Zelle verfolgt nun zwei unterschiedliche Strategien bei der Reparatur solcher Brüche. Erstens versucht sie beliebige durch DSB entstandene DNAEnden wieder miteinander zu verknüpfen, unabhängig davon, welche Struktur und Sequenz diese Enden haben. Das kann zu Deletionen und Insertionen von wenigen Nukleotiden führen. Dieser als nichthomologes Endjoining bezeichnete Mechanismus (NHEJ) ist daher potenziell mutagen (Pfeiffer et al. 2000). Er ist von einfachen Eukaryonten (Hefen) bis hin zu Säugern nachzuweisen (Critchlow u. Jackson 1998). Bei der zweiten, erheblich genaueren Strategie versucht die Zelle, die ursprüngliche Sequenz an der Bruchstelle mit Hilfe der homologen

4.2.4.1 Mechanismus des nichthomologen End-joining (NHEJ)

Hinsichtlich der am NHEJ-Mechanismus beteiligten Enzyme deuten sich Subtypen an, bei denen je nach Konfiguration der Enden unterschiedliche Proteine an der Reaktion beteiligt sind. Die Kernkomponenten sind ein Heterodimer aus den Proteinen Ku70/Ku80, eine katalytisch wirksame Kinase (DNA-PKcs) und die Ligase IV mit dem Kofaktor XRCC4 (O’Driscoll u. Jeggo 2006). Dieser Subtyp ist kinetisch begünstigt und daher für einen Großteil der Reparatur von DSB verantwortlich (Lobrich u. Jeggo 2005). Er zeichnet sich durch Erhalt möglichst vieler Nukleotide der Verknüpfungsstelle aus. Weiterhin gibt es kinetisch benachteiligte Subtypen, die durch Verlust von Nukleotiden an den DNA-Enden

405 4.2 · DNA-Reparatur und Mutagenese

4.2

. Abb. 4.2.6a–g. Möglichkeiten der Reparatur nach dem NHEJ-Mechanismus. Schwarze Bereiche kennzeichnen Basenpaarungen komplementärer Basen beider DNA-Enden, blaue Pfeile symbolisieren Auffüllreaktionen durch eine Polymerase und rote Pfeile symbolisieren nukleolytischen Abbau. a DNA-Endstrukturen, wie sie vom NHEJ-System prozessiert werden können. b Bei kompatiblen DNA-Enden werden diese ohne weitere Modifikation zusammengefügt. c,d Nichtkompatible Enden können ohne Basenpaarung oder unter Nutzung einer solchen Basenpaarung zwischen den Einzelsträngen verbunden werden. e,f Sich dabei ausbildende terminale Basenfehlpaarungen werden entfernt, interne Basenfehlpaarungen bleiben jedoch erhalten. g Bei Basenpaarungen in doppelsträngigen Bereichen kommt es zu einer Verdrängung, um Basenpaarungen möglich zu machen

und die Nutzung charakteristischer Überlappungen gekennzeichnet sind. An diesem Mechanismus sind außer den Kern-Komponenten die Kinasen ATM oder ATR beteiligt, Komponenten des MRN-Komplexes, Artemis und weitere. Ihre Aufgabe besteht vermutlich im Trimmen der Enden und der Stabilisierung der Überlappungsfunktion. Die Proteine ATM und ATR sowie eine für DNA-DSB charakteristische Histonvariante, JH2AX, spielen darüber hinaus bei der Detektion der DSB eine Rolle (O’Driscoll u. Jeggo 2006).

4.2.4.2 Mechanismen der homologen Rekombinationsreparatur (HRR) Die HRR benutzt als Matrize Sequenzinformationen, die sie aus Genombereichen mit homologen Sequenzen erhält. Über einen ausgeklügelten Mechanismus ist sie in der Lage, diese Information an die Stelle zu kopieren, wo sich der Doppelstrangbruch befindet. Es gibt kein universelles Modell für die HRR, das alle genetischen Daten erklärt. Für die Säugerzelle relevante Modelle sind x das DSBR- („double-strand-break-repair“-)Modell und x das SDSA- („synthesis-dependent-strand-annealing“-)Modell (Paques u. Haber 1999). Beide Mechanismen beginnen mit der Generierung langer Einzelstrangenden, die im konkurrierenden NHEJ-

Mechanismus nicht auftreten. Sie werden durch Degradation des DSB-Endes durch eine 5c-3c-Exonuklease gebildet. Die Einzelstrangüberhänge werden durch Bindung des RAD51-Proteins stabilisiert. Unter der Einwirkung von RAD51 ist der 3c-überhängende Einzelstrang dazu in der Lage, einen Strang aus der DNA-Duplex auf dem Schwesterchromatid zu verdrängen und mit der komplementären Sequenz zu hybridisieren. Da es sich um eine Verdrängungsreaktion handelt, wird die sich ausbildende Schlaufe auch als D-loop („displacement loop“) bezeichnet. Die sich dabei ausbildende Struktur aus zwei überkreuzten Strängen wird als Doppel-Holliday-Struktur bezeichnet und in Hefe als Intermediat der meiotischen Rekombination nachgewiesen. Das DSBRModell und das SDSA-Modell unterscheiden sich nun in der Auflösung der Doppel-Holliday-Struktur. Nach dem DSBR-Modell wird die Struktur durch Nukleasen aufgelöst, indem entweder die sich überkreuzenden Stränge oder die nicht überkreuzenden Stränge geschnitten werden. Im ersten Fall führt die Auflösung zu einem Crossover, im zweiten Fall ergibt sich kein Cross-over. Im SDSA-Modell wird der D-loop aufgelöst, indem die neu synthetisierten Einzelstränge miteinander hybridisieren. In diesem Fall gibt es wiederum kein Cross-over (> Abb. 4.2.7).

406

Sektion 4 · Therapie

. Abb. 4.2.7a-d. Modelle zur homologen Rekombinationsreparatur. a Die Initiation der hier dargestellten Modelle, das DSBR-Model und das SDSA-Modell, sind gleich. An den durch den Doppelstrangbruch entstandenen DNA-Enden werden lange 3c-Überhänge erzeugt, indem die komplementären Stränge in 5c-3c-Richtung abgedaut werden. Diese einzelsträngigen 3c-Überhänge werden dazu benutzt, eine Verdrängungsschlaufe („displacement-loop“, D-Loop) zu bilden. b An den freien 3c-OH Enden kann die DNA-Synthese beginnen. c Im DSBR-Modell wird die intermediäre Struktur nukleolytisch aufgelöst, und es entsteht ein Cross-over-Produkt (schwarze Pfeile) oder kein Cross-over (weiße Pfeile). Im SDSA-Modell hybridisieren die neu synthetisierten DNA-Stränge miteinander, und es entstehen nur Produkte ohne Cross-over. d Produkte, die sich aus der Auflösung der in c gezeigten Zwischenstufen ergeben

4.2.5 Reparatur und Transläsionssynthese von „DNA-Crosslinks“ Eine Sonderstellung in der DNA-Reparatur nimmt die Entfernung von Quervernetzungen innerhalb eines DNA-Strangs („intra-strand“) oder zwischen den komplementären Strängen („inter-strand“) ein. Derartige Schäden werden von Mitomycin-C oder Cisplatin hervorgerufen (Nath et al. 1996). Menschen die an einer seltenen Erbkrankheit, der Fanconi-Anämie (FA), leiden, können derartige Schäden nicht eliminieren. Das Krankheitsbild der FA verteilt sich auf 12 Komplementationsgruppen (A, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M). Etwa 85% aller Patienten sind in den Gruppen A, C oder G betroffen. Sie haben ein erhöhtes Risiko, schon in der

Kindheit an Leukämie zu erkranken, bei Erwachsenen kommen auch solide Tumoren vor. Die Proteine, die von den Genen dieser Komplementationsgruppen kodiert werden, lagern sich zu zwei großen Proteinkomplexen zusammen, einer im Zellkern lokalisierten Ubiquitin-E3-Ligase (bestehend aus A, B, C, E, F, G) und einem DNA-Reparaturkomplex (bestehend aus D2 und weiteren, wie z. B. BRCA1, BRCA2, RAD51, MRN-Komplex und PCNA). Ihre Aufgabe ist es, blockierte Replikationsgabeln zu reaktivieren. Da „inter-strand-crosslinks“ und „intra-strand-crosslinks“ zur Blockade von Replikationsgabeln („stalled replication fork“) führen, beruht die Empfindlichkeit von FA-Zellen gegenüber Quervernetzungen der DNA von einer mangelhaften Reaktivierung der Replikations-

407 4.2 · DNA-Reparatur und Mutagenese

gabeln (Kennedy u. D’Andrea 2005). Die genauen Mechanismen der FA-Proteine sind noch nicht im Detail bekannt. Es wird aber angenommen, dass die beiden FA-Komplexe koordinierende Funktionen wahrnehmen und die Steuerung des Zellzyklus und Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen übernehmen. Viele der rekrutierten DNA-Reparaturproteine spielen auch bei der HRR eine Rolle. Man kann daher vermuten, dass die FA-abhängige DNA-Reparatur nach einem der HRR ähnlichen Mechanismus abläuft. Eine weitere Funktion könnten die FA-Komplexe bei der sog. Transläsionssynthese (TLS) spielen. Die Transläsionssynthese ist kein DNA-Reparaturmechanismus, da der DNA- Schaden nicht entfernt wird. Dennoch hilft er der Zelle, indem er verhindert, dass eine einzelne blockierte Replikationsgabel zum Abbruch der S-Phase und damit zum Tod der sich teilenden Zelle führt. Quervernetzungen von benachbarten Pyrimidinen (vgl. 7 4.2.3.3) unter Bildung von Cyclobutanringen führen zu einem Innehalten der Replikationsgabel, weil die an der Replikation beteiligten Polymerasen G/H nicht über sie hinweg synthetisieren. Die Zelle besitzt aber eine ganze Reihe weiterer DNA-Polymerasen, die über genau diese Fähigkeit verfügen und über DNA-Schäden hinweg replizieren können (Sutton u. Walker 2001). Diese Eigenschaft der DNA-Polymerasen wird allerdings durch eine außerordentlich hohe Fehlerrate von 102 bis 103 erkauft („error-prone DNA synthesis“). In Säugerzellen kennt man mittlerweile 14 dieser DNA-Polymerasen, die die sog. UmuC/DinB/Rev1/ Rad30-Protein-Superfamilie bilden. Die biologische Funktion dieser DNA-Polymerasen ist derzeit nur schlecht verstanden. Am besten versteht man beim Menschen wohl die Funktion der Polymerase KIst sie defekt, führt sie zu einer Variante der Krankheit Xeroderma pigmentosum, die daher als XP-V bezeichnet wird. Diese Form des Xeroderma pigmentosum ist nicht auf einen Fehler in der NER zurückzuführen, sondern auf die Unfähigkeit, durch UV-Schäden blockierte Replikationsgabeln mithilfe der DNA-Polymerase K zu reaktivieren. Dabei baut die Polymerase K komplementär zu einem Thymindimer meist korrekterweise zwei Adenine ein, macht also an der Stelle des DNA-Schadens selbst keinen Replikationsfehler im neu synthetisierten Strang. Allerdings wird der Schaden selbst nicht repariert. Die erhöhte Mutationsrate in XP-V Zellen kommt wahrscheinlich dadurch zustande, dass beim Ausfall der DNA-Polymerase Kandere unpräzise arbeitende DNAPolymerasen die Funktion von DNA-Polymerase K ersetzen, dabei aber an der Schadensstelle selbst Replikationsfehler erzeugen.

4.2

4.2.6 DNA-Reparatur im Zellzyklus Neben dem eigentlichen Reparaturgeschehen gibt es noch weitere zelluläre Reaktionen auf DNA-Schäden, die den Zellzyklus betreffen. Werden eukaryote Zellen DNA-schädigenden Chemikalien oder Strahlung ausgesetzt, so reagieren sie mit einem vorübergehenden Innehalten des Zellzyklus an mindestens zwei Kontrollpunkten („checkpoints“). Der erste ist der Übergang von der G1-Phase zur S-Phase, der zweite der Übergang von der G2-Phase zur M-Phase (Abraham 2001). Die Funktion dieser Kontrollpunkte erlaubt den Zellen, DNA-Schäden zu reparieren, bevor sie in kritische Phasen des Zellzyklus eintreten. Ist der Schaden repariert, kann der Zellzyklus fortgesetzt werden oder, wenn die Zelle zu stark geschädigt ist, die Apoptose eingeleitet werden. Wie bei den DNA-Reparaturprozessen erfolgt die Kontrolle des Zellzyklus in einer hierarchischen Abfolge von Ereignissen und beginnt mit der Schadenserkennung. Proteine, die in diesen Schritt involviert sind, werden Sensoren („sensors“) genannt. Sie bilden RF-C (Replikationsfaktor C) oder PCNA („proliferating cell nuclear antigen“) ähnliche Quartärstukturen. Der nächste Schritt ist die Rekrutierung von Mediatorproteinen, die durch ein BRCT-Motiv (BRCA1 C-Terminus-Repeat) gekennzeichnet sind. Sie sorgen für die rasche Aktivierung von Transducer-Proteinen, zu denen die Kinasen ATM/ATR und Checkpoint-Kinasen gehören. Sie phosphorylieren die letzte Stufe der Signaltransduktionskette, die Effektoren. Zu ihnen gehören das p53-Protein und die Familie der cdc25-Phosphatasen (Niida u. Nakanishi 2006). Über diese Checkpoint-Funktion hinaus gibt es aber noch weitere Verflechtungen zwischen Komponenten des Zellzyklus und DNA-Reparatursystemen. Diese Notwendigkeit ergibt sich daraus, dass die Zelle für den Fall der DNA-Schädigung ein geeignetes DNA-Reparatursystem bereithalten muss. Komponenten des Zellzyklus müssen daher Signale, die von der Erkennung eines DNA-Schadens ausgehen, mit der Einleitung geeigneter Reparaturmaßnahmen koordinieren.

4.2.7 Literatur Abraham RT (2001) Cell cycle checkpoint signaling through the ATM and ATR kinases. Genes Dev 15: 2177–2196 Cadet J, Bourdat AG, D‘Ham C, Duarte V, Gasparutto D, Romieu A, und Ravanat JL (2000) Oxidative base damage to DNA: specificity of base excision repair enzymes. Mutat Res 462: 121–128 Cahill DP, Kinzler KW, Vogelstein B, und Lengauer C (1999) Genetic instability and darwinian selection in tumours. Trends Cell Biol 9: M57–M60 Crick F (1974) The double helix: a personal view. Nature 248: 766– 769

408

Sektion 4 · Therapie

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409 4.2 · DNA-Reparatur und Mutagenese

4.2

4.2.8 Zeittafel 1956

Erste Untersuchungen zu DNA-Reparaturmechanismen über Photoreaktivierung von E. coli. (Sancar 2000)

1964

Basenexzisionsreparatur wird an E. coli gefunden und stellt sich als universeller Reparaturmechanismus aller Lebewesen heraus (Krokan et al. 2000).

1968

An Zellen von Patienten mit der Krankheit Xeroderma pigmentosum wurde von Cleaver gezeigt, dass diese extrem UV-sensitiv sind, aber unempfindlich gegenüber Röntgenstrahlen, und dass ein Defekt in der Nukleotidexzisionsreparatur vorliegt (Cleaver 2005).

1975

Taylor konnte zeigen, dass Zellen von Patienten mit der Krankheit Ataxia teleangiectatica empfindlich auf Röntgenstrahlen reagieren, aber unempfindlich gegenüber UV-Licht sind (Taylor et al. 1975).

1989

Doppelstrangbrüche werden physikalisch in der Meiose der Bäckerhefe nachgewiesen und stützen das DSBR-Modell (Sun et al. 1989).

1990

Der NHEJ-Mechanismus wird als komplexe Reparaturmöglichkeit von DNA-Doppelsträngen erkannt (Thode et al. 1990).

1992

Die Bedeutung von p53 als„Wächter des Genoms“ wird erkannt (Lane 1992).

1994

Transkriptionsgekoppelte Nukleotidexzisionsreparatur wird an Zellen von Patienten gefunden, die den Xeroderma-pigmentosum-Phänotyp haben, aber keinen Defekt in der Nukleotidexzisionsreparatur besitzen (Saxowsky u. Doetsch 2006).

1993

Defekte der Mismatch-Reparatur führen beim Menschen zu HNPCC, einer häufigen Tumorerkrankung (Kinzler u. Vogelstein 1996).

Literatur zur Zeittafel Cleaver JE (2005) Cancer in xeroderma pigmentosum and related disorders of DNA repair. Nat Rev Cancer 5: 564–573 Kinzler KW und Vogelstein B (1996) Lessons from hereditary colorectal cancer. Cell 87: 159–170 Krokan HE, Nilsen H, Skorpen F, Otterlei M, und Slupphaug G (2000) Base excision repair of DNA in mammalian cells. FEBS Lett 476: 73–77 Lane DP (1992) Cancer. p53, guardian of the genome. Nature 358: 15–16 Sancar GB (2000) Enzymatic photoreactivation: 50 years and counting. Mutat Res 451: 25–37

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4.3 Antisense-, Ribozym- und RNA-Interferenz-Strategien: Methodendesposttranskriptionellen Gene Silencing in der Molekularen Medizin Jens Kurreck, Steffen Schubert und Volker A. Erdmann

4.3.1

Einleitung

– 411

4.3.2

Antisense-Oligonukleotide – 412

4.3.2.1 4.3.2.2 4.3.2.3 4.3.2.4

Wirkmechanismen von Antisense-Oligonukleotiden Chemische Modifikationen – 412 Delivery von Antisense-Oligonukleotiden – 413 Target-Validierung und klinische Studien – 414

4.3.3

Ribozyme

4.3.3.1 4.3.3.2 4.3.3.3

Klassifikationen und Mechanismen von Ribozymen Entwicklung von Ribozymen – 416 Klinische Anwendungen – 417

4.3.4

RNA-Interferenz – 417

4.3.4.1 4.3.4.2 4.3.4.3 4.3.4.4 4.3.4.5 4.3.4.6 4.3.4.7

Mechanismus der RNA-Interferenz – 418 Design effizienter Small-interfering-RNAs – 419 Vektorbasierte RNA-Interferenz – 419 Spezifität von Small-interfering-RNAs – 420 RNA-Interferenz zur Target-Identifikation und zur Target-Validierung – 421 In-vivo-Applikationen auf dem Weg zur therapeutischen Anwendung – 421 Klinische Studien mit RNA-Interferenz – 422

4.3.5

Ausblick

– 423

4.3.6

Literatur

– 423

4.3.7

Zeittafel

– 424

– 412

– 415 – 415

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

411 4.3 · Antisense-, Ribozym- und RNA-Interferenz-Strategien

4.3.1 Einleitung Die spezifische Inhibition der Expression eines Zielgens ist sowohl für funktionelle Untersuchungen als auch für therapeutische Anwendungen von großer Bedeutung. Ende der 1970er Jahre wurde erstmalig gezeigt, dass Antisense-Oligonukleotide (AS-ONs) aus DNA-Monomeren durch Hybridisierung an eine komplementäre RNA deren Funktion blockieren können (Zamecnik u. Stephenson 1978). Kurze Zeit später wurden RNA-Moleküle entdeckt, die die Umesterung oder Spaltung von Ziel-RNAs katalysieren (Cech et al. 1981; Kruger et al. 1982; Guerrier-Takada et al. 1983). Diese Ribonukleinsäuren mit enzymatischer Aktivität werden als Ribozyme bezeichnet. Antisense-Oligonukleotide und Ribozyme hat man in zahlreichen Studien erfolgreich eingesetzt, um die Synthese eines Genprodukts spezifisch auf RNA-Ebene in Zellkulturversuchen oder in Tiermodellen zu inhibieren. Aus den entstehenden „loss-of-function“-Phänotypen konnten Rückschlüsse auf die Bedeutung des Zielgens gezogen werden. Aufgrund dieser Erfolge wurden klinische Studien initiiert, in denen die Expression schädlicher Gene bei Tumorerkrankungen, viralen Infektionen oder entzündlichen Erkrankungen verhindert werden sollte. Bei diesen Behandlungen erwiesen sich die Oligonukleotide in der Regel als gut verträglich, doch blieb die therapeutische Wirkung hinter den Erwartungen zurück. Einen neuen Aufschwung nahm das Gebiet durch die Entdeckung des natürlichen Mechanismus der RNAInterferenz (RNAi). Erstmalig wurde 1998 für den Fadenwurm Caenorhabditis elegans beschrieben, dass man doppelsträngige RNA-Moleküle nutzen kann, um die Expression eines Gens sequenzspezifisch zu „silencen“

4.3

(Fire et al. 1998). Für diese Entdeckung wurden Andrew Fire und Craig Mello 2006 mit dem Nobelpreis für Medizin oder Physiologie ausgezeichnet. Die Methode der RNA-Interferenz konnte jedoch zunächst nur in niederen Eukaryonten eingesetzt werden, da lange doppelsträngige RNA-Moleküle in Säugerzellen eine unspezifische Interferonantwort auslösen. In ihren bahnbrechenden Arbeiten gelang es Thomas Tuschl und seinen Mitarbeitern dann jedoch zu zeigen, dass mithilfe von kurzen, 21 Nukleotide langen RNA-Molekülen, die als „small“oder „short-interfering“-RNAs (siRNAs) bezeichnet werden, die Expression von Zielgenen spezifisch inhibiert werden kann, ohne dabei eine Immunantwort zu induzieren (Elbashir et al. 2001). Innerhalb nur weniger Jahre hat sich die RNAi zu einer Standardmethode in molekularbiologischen Laboratorien entwickelt, die zur Untersuchung von Genfunktionen, zur genomweiten Identifizierung neuer Targets und zur Validierung potenzieller Targets für neue Wirkstoffe eingesetzt wird. Gemessen an der Zahl der Publikationen ist RNAi das dynamischste Feld in der Biotechnologie. Nur wenige Jahre nach der Entdeckung der inhibitorischen Wirkung von siRNAs haben bereits die ersten klinischen Studien zur Erprobung des therapeutischen Potenzials der RNAi begonnen. Ziel des vorliegenden Aufsatzes ist es, zunächst in die Grundlagen der verschiedenen Methoden zum posttranskriptionellen Gene Silencing einzuführen. In > Abb. 4.3.1 sind die Wirkweisen von AS-ONs, Ribozymen und siRNAs vergleichend dargestellt. Daran anschließend werden die Anwendungsmöglichkeiten in der medizinischen Forschung vorgestellt. Schließlich sollen der Stand der klinischen Erprobung diskutiert und ein Ausblick auf mögliche Entwicklungen in der näheren Zukunft gegeben werden.

. Abb. 4.3.1. Vergleich der Wirkweisen von AntisenseOligonukleotiden, Ribozymen und Small-interfering-RNAs. Für Details 7 Text

412

Sektion 4 · Therapie

4.3.2 Antisense-Oligonukleotide Antisense-Oligonukleotide (AS-ONs) sind (modifizierte) DNA- oder RNA-Oligomere, die durch WatsonCrick-Basenpaarung an eine komplementäre Ziel-RNA binden und deren Funktion inhibieren. Als Folge wird das kodierte Protein nicht mehr gebildet. Gewöhnlich sind AS-ONs 15–20 Nukleotide lang, wodurch gewährleistet werden soll, dass die jeweilige Sequenz einmalig im humanen Genom ist. AS-ONs wirken über verschiedene Mechanismen, die im Folgenden genauer erläutert werden: x Induktion der Ribonuklease H (RNase H) x Inhibition der Translation x Modulation des Spleißens

4.3.2.1 Wirkmechanismen von AntisenseOligonukleotiden RNase H ist eine zelluläre Endonuklease, die an der Entfernung der RNA-Primer bei der DNA-Replikation in Eukaryonten beteiligt ist und daher vorwiegend im Kern vorkommt. Sie erkennt Hybride aus einer DNA und einer RNA und spaltet die RNA-Komponente einer solchen Heteroduplex. Diese enzymatische Eigenschaft macht man sich bei Antisense-Ansätzen zunutze: Das AS-ON besteht aus DNA und induziert daher nach Bindung an die mRNA deren Degradation (> Abb. 4.3.1). Das AS-ON wird dabei freigesetzt und kann die Spaltung weiterer Zielmoleküle bewirken, d. h., es kann substöchiometrisch eingesetzt werden. Bei der Verwendung von Antisense-Agenzien muss allerdings bedacht werden, dass lange RNA-Moleküle komplexe dreidimensionale Strukturen ausbilden. Außerdem binden zahlreiche Proteine an mRNAs. Es ist daher nicht verwunderlich, dass nicht alle AS-ONs eine zufriedenstellende inhibitorische Wirkung zeigen. Ein wichtiger Schritt bei der Entwicklung eines Antisense-Ansatzes ist es daher, gute Bindungsstellen für die AS-ONs an die Ziel-RNA zu identifizieren (Sohail u. Southern 2000). Hierzu werden gewöhnlich bioinformatische Analysen der RNA-Struktur sowie Screenings mit AS-ONs gegen verschiedene Regionen der mRNA vorgenommen. Der Einsatz von AS-ONs führt jedoch nicht notwendigerweise zu einem Abbau der Ziel-RNA. Die meisten der modifizierten Nukleotide, die im Antisense-Feld eingesetzt werden (s. u.), sind keine guten Substrate für die RNase H und induzieren daher nicht die Spaltung der mRNA. Es hat sich jedoch gezeigt, dass AS-ONs die Translation einer mRNA auch durch sterische Blockade des Ribosoms verhindern können. Da Ribosomen, die an einer mRNA entlang wandern, gebundene ONs unter

Umständen verdrängen können, werden als Bindungsstellen für die AS-ONs häufig Bereiche der 5c-untranslatierten Region verwendet, sodass bereits der Zusammenbau des Ribosoms verhindert wird. Bei dieser Form der Inhibition einer mRNA-Funktion muss das AS-ON allerdings dauerhaft gebunden bleiben, sodass höhere Konzentrationen benötigt werden als für die Induktion der RNase H. Für eine weitere Anwendung von AS-ONs, der Modulation des Spleißens, ist es sogar essenziell, dass die RNA nicht gespalten wird (Sazani u. Kole 2003). Rund 60% der humanen Gene werden alternativ gespleißt, und fast 50% der genetischen Erkrankungen hängen mit Mutationen zusammen, die zu fehlerhaftem Spleißen von prä-mRNAs führen. Diese Zahlen verdeutlichen das Potential einer Methode, die derartige Fehler korrigieren kann. Anders als bei den zuvor beschriebenen Anwendungen von AS-ONs soll in diesem Fall also nicht die Expression des Zielgens verhindert werden; vielmehr soll die mRNA-Matrize für die Translation korrigiert werden. Ein Beispiel für eine Krankheit, bei der durch eine Mutation eine zusätzliche Spleißstelle entsteht, ist die E-Thalassämie. Durch den Fehler verbleibt ein Teil eines Introns in der prozessierten mRNA, und es tritt ein vorzeitiges Stoppkodon auf. Mit einem AS-ON kann die anomale Spleiß-Site blockiert werden, sodass die korrekte mRNA wieder gebildet wird. In anderen Fällen wird mit Hilfe von AS-ONs versucht, durch Modulation des Spleißens fehlerhafte Exons zu übergehen („exon skipping“).

4.3.2.2 Chemische Modifikationen Unmodifizierte DNA-ONs werden in biologischen Flüssigkeiten innerhalb kurzer Zeit von Nukleasen abgebaut. Um ihre Wirkung am Zielort entfalten zu können, müssen sie daher durch Modifikationen geschützt werden. Hierzu wird häufig entweder die Phosphodiesterbindung oder die Ribose einzelner Nukleotide verändert. Zu den ersten und noch heute am häufigsten verwendeten modifizierten Nukleotiden gehören die Phosphorothioate (Eckstein 2000). Durch die Substitution eines Nicht-Brücken-Sauerstoffatoms durch ein Schwefelatom (> Abb. 4.3.2) sind Phosphorothioat-ONs gegenüber nukleolytischer Degradation resistent. Sie behalten die Fähigkeit bei, RNase H nach Bindung an die komplementäre RNA zu induzieren, haben allerdings im Vergleich zu unmodifizierten DNA-ONs eine geringere Affinität zum Zielmolekül. Außerdem binden sie an verschiedene Proteine. Dadurch werden zwar die pharmakokinetischen Eigenschaften verbessert, da die Phosphorothioat-ONs länger im Blutstrom verbleiben, es

413 4.3 · Antisense-, Ribozym- und RNA-Interferenz-Strategien

. Abb. 4.3.2. Strukturen modifizierter Nukleotide, die Bestandteil von AS-ONs in klinischen Studien sind

kommt aber auch zu unerwünschten Nebenwirkungen (Levin 1999). Insbesondere im Zentralen Nervensystem sind toxische Effekte nach Applikation von Phosphorothioaten beobachtet worden. Aufgrund der Nachteile von Phosphorothioaten ist eine zweite Generation modifizierter Nukleotide für Antisense-Anwendungen entwickelt worden, bei denen die 2c-OH-Gruppe der Ribose Substituenten trägt. Insbesondere werden 2c-O-methyl und 2c-O-methoxy-ethylRNA-Bausteine (> Abb. 4.3.2) verwendet. Diese Modifikationen sind weniger toxisch als Phosphorothioate und besitzen eine höhere Target-Affinität; sie haben aber einen gravierenden Nachteil: Durch die funktionelle Gruppe an der Ribose werden sie von der RNase H nicht mehr als Substrat erkannt, es erfolgt also kein Abbau der komplementären Ziel-RNA. Um dieses Manko zu kompensieren, werden häufig sog. Gapmere verwendet, die zum Schutz gegen Exonukleasen modifizierte Nukleotide an den Enden tragen und im Zentrum aus DNAoder Phosphorothioat-Bausteinen bestehen, die die Induktion der RNase H gewährleisten. In den vergangenen Jahren wurden große Fortschritte bei der Anwendung von AS-ONs durch die Entwicklung neuer Nukleotidanaloga der 3. Generation erzielt (Kurreck 2003). Die Modifikationen umfassen Substitutionen mit Fluoro- oder Aminogruppen, die

4.3

Verwendung bi- und trizyklischer Verbindungen oder gar den Ersatz des Zucker-Phosphat-Rückgrats durch Peptidverknüpfungen. Die meisten der neueren Varianten haben gute Bindungseigenschaften zur komplementären RNA und sind resistent gegenüber zellulären Nukleasen. Allerdings haben sie in der Regel die Fähigkeit zur Aktivierung der RNase H verloren, sodass sie häufig in Form von Gapmeren eingesetzt werden müssen. Von den zahlreichen Varianten sollen im Folgenden zwei Beispiele etwas genauer vorgestellt werden, die mittlerweile in klinischen Studien erprobt werden: Locked nucleic acids und Phosphorodiamidat-Morpholino-Oligomere (> Abb. 4.3.2). In Locked nucleic acids (LNAs) ist das 2c-Sauerstoffatom mit dem 4c-Kohlenstoff der Ribose durch eine Methylenbrücke verknüpft (zur Übersicht s. Kauppinen et al. 2006). LNAs zeichnen sich durch eine sehr große Affinität zur komplementären RNA und hohe Nukleaseresistenz aus. Als Gapmere sind sie sehr effizient für die Suppression einer Genexpression, und sogar bei der Anwendung im Gehirn wurden keine toxischen Nebenwirkungen beobachtet. Phosphorodiamidat-Morpholino-Oligomere (PMO) besitzen ein ungeladenes Rückgrat (Heasman 2002; Amantana u. Iversen 2005). Dadurch wird die Gefahr unspezifischer Interaktionen mit zellulären Komponenten verringert. Die Morpholino-Oligonukleotide aktivieren RNase H nicht und werden daher gewöhnlich zur sterischen Blockade der Translation eingesetzt.

4.3.2.3 Delivery von Antisense-Oligonukleotiden Eine zentrale Herausforderung bei der Anwendung intrazellulär wirkender Oligonukleotide (AS-ONs, Ribozyme, siRNAs) ist deren effizientes Delivery an den Wirkort. Wegen der negativen Ladungen der Phosphatgruppen von Nukleotiden passieren die ONs die hydrophobe Zellmembran nur in geringem Maße. Für Zellkulturversuche verwendet man daher gewöhnlich Transfektionsagenzien, um eine effiziente Aufnahme der ONs in die Zellen zu erreichen (Seksek u. Bolard 2004). Häufig werden kationische Lipide eingesetzt, welche die negativen Ladungen der Phosphatgruppen neutralisieren und so die Endozytose der Lipid-Nukleinsäure-Komplexe ermöglichen. Erstaunlicherweise werden Oligonukleotide in vivo zu einem gewissen Maß über einen noch nicht bekannten Mechanismus spontan, d. h. auch in Abwesenheit von Transfektionsagenzien, aufgenommen. Dies erklärt, warum in Tiermodellen vielfach mit AS-ONs ein Knockdown ohne weitere Zusätze erreicht wurde. Allerdings wird auch für diese Anwendungen versucht,

414

Sektion 4 · Therapie

die Effizienz durch Carrier zu erhöhen, die nicht toxisch sind.

4.3.2.4 Target-Validierung und klinische Studien Ein wichtiges Anwendungsfeld für Antisense-Strategien ist die Validierung neuer Targets (Bennett u. Cowsert 1999). In der Krebsforschung können einzelne Komponenten von Signalkaskaden oder potenzielle Onkogene mittels AS-ONs ausgeschaltet werden, um zu überprüfen, ob ein Inhibitor dieser Zielmoleküle das Zellwachstum verlangsamen oder stoppen könnte. Auch bei der Entwicklung neuer Medikamente für andere Indikationen lassen sich Antisense-Ansätze zur Target-Validierung einsetzen: Beispielsweise kann die Expression von Schmerzrezeptoren durch AS-ONs inhibiert werden, sodass neue Targets für analgetische Medikamente untersucht werden können (Kurreck 2004). Bei diesem Vorgehen schließt sich in der Regel ein High-throughput-Screening mit großen Bibliotheken niedermolekularer Wirkstoffe an eine erfolgreiche Target-Validierung an. Das Ziel wäre in diesem Fall die Entwicklung eines neuen Medikaments mit einem Wirkstoff, der ein potenter Inhibitor des Zielproteins ist.

Grundsätzlich ist es jedoch auch möglich, die AS-ONs direkt als Medikamente einzusetzen. Rund 20 verschiedene AS-ONs wurden mittlerweile in klinischen Studien erprobt (Crooke 2004). Die Auflistung einiger getesteter AS-ONs in > Tab. 4.3.1 zeigt die Vielfalt der Erkrankungen, von denen man sich neue Therapieoptionen durch die Verwendung von AS-ONs verspricht: Krebs, virale Infektionen, entzündliche Erkrankungen und Herz-Kreislauf-Krankheiten. Allerdings wurde bislang nur ein AS-ON als neuer pharmakologischer Wirkstoff zugelassen: Vitravene ist ein Phosphorothioat, das gegen das Zytomegalievirus gerichtet ist und AIDS-Patienten vor einer Erblindung schützt. Das Medikament, das direkt (intravitreal) in die Augen der Patienten injiziert wird, wurde allerdings mittlerweile in Europa wegen der kommerziellen Bedeutungslosigkeit wieder vom Markt genommen. Neben viralen Infektionen gehören Krebserkrankungen zu den wichtigsten Indikationen, für die AS-ONs entwickelt werden. Mit Hilfe der AS-ONs sollen hierbei Apoptose-Inhibitoren wie Bcl-2 oder Onkogene wie myc inaktiviert werden. Bei entzündlichen Erkrankungen wird versucht, Zytokine oder andere Signalmoleküle bzw. deren Rezeptoren auszuschalten. Ein weiteres AS-ON, das gegen ApoB-100 gerichtet ist, soll den Cholesteringehalt im Blut verringern und so vor Herz-Kreis-

. Tab. 4.3.1. Antisense-Oligonukleotide in klinischen Studien. Firma

Name

Krankheit

Modifikation

Status

ISIS Pharmaceuticals

Vitravene

CMV Retinitis

PS

Zugelassen

ISIS Pharmaceuticals

Alicaforsen

Ulzerative Kolitis

PS

Phase II

ISIS Pharmaceuticals

ISIS 113715

Diabetes

MOE

Phase II

ISIS Pharmaceuticals

ISIS 301012

Hohe Cholesterinspiegel

MOE

Phase II

ISIS Pharmaceuticals

ATL-1102

Multiple Sklerose

MOE

Phase II

ISIS Pharmaceuticals

OGX-011

Krebs

MOE

Phase II

ISIS Pharmaceuticals

ALT-1101

Psoriasis

MOE

Phase I

ISIS Pharmaceuticals

Ly2181308

Krebs

MOE

Phase I

ISIS Pharmaceuticals

Ly2275796

Krebs

MOE

Phase I

Genta

Genasense

Krebs

PS

Phase III

Methylgene

MG98

Krebs

PS

Phase II

Avi BioPharma

Avi4557

Eingriff in den Metabolismus

PMO

Phase I

EpiGenesis Pharmaceuticals

Epi-2010

Asthma

PS

Phase I

Antisense Pharma

AP 12009

Krebs

PS

Phase II

Santaris Pharma

SPC2996

Leukämie

LNA

Phase I/II

PS, Phosphorothioat; LNA, locked nucleic acids; PMO, Phosphorodiamidat-Morpholino-Oligomer.

415 4.3 · Antisense-, Ribozym- und RNA-Interferenz-Strategien

lauf-Erkrankungen schützen. Ein ganz neuer Weg wird mit dem AS-ON Avi4557 beschritten, das gegen Cytochrom P450 3A4 gerichtet ist und damit die Umsetzung pharmakologischer Wirkstoffe verlangsamen soll. Wie aus > Tab. 4.3.1 ersichtlich ist, handelt es sich bei den meisten AS-ONs in fortgeschrittenen Phasen der klinischen Erprobung um Phosphorothioate. In den vergangenen Jahren wurden jedoch auch vermehrt AS-ONs eingesetzt, die Modifikationen der zweiten und dritten Generation enthalten. Die Firma ISIS Pharmaceuticals (Kalifornien, USA) verwendet 2c-O-methoxyethyl-modifizierte ONs. AVI Biopharma (Oregon, USA) and Santaris (Hørsholm, Dänemark) haben ONs der 3. Generation in die Klinik gebracht. ONs können intravenös oder subkutan verabreicht werden, doch wurden auch andere Anwendungsformen für spezielle Erkrankungen entwickelt. Für Behandlungen von Hauterkrankungen wie Psoriasis lassen sich die AS-ONs topisch applizieren. Ein weiteres AS-ON zur Behandlung von Asthma wird über Aerosole direkt in die Lunge eingebracht. Bei den neueren Modifikationen wurde auch nach oraler Gabe eine erhöhte Bioverfügbarkeit beobachtet. Wie bereits in der Einleitung erwähnt, waren die klinisch getesteten AS-ONs in den meisten Fällen gut verträglich. Das Problem waren weniger die Nebenwirkungen, sondern die beschränkten therapeutischen Erfolge. Durch den Einsatz der neueren Modifikationen, durch die die Effizienz der AS-ONs gesteigert wird, sind jedoch weitere Forschritte zu erwarten.

4.3.3 Ribozyme Ribozyme sind Oligonukleotide mit enzymatischer Aktivität. Das erste derartige Molekül, das gefunden wurde, war ein Intron aus dem Ciliaten Tetrahymena thermophila, das sich selbst aus dem Primärtranskript herausspleißen und die beiden Exons zusammenfügen kann (Cech et al. 1981; Kruger et al. 1982). Zahlreiche weitere Ribozyme sind inzwischen in vielen Organismen identifiziert worden. Sie sind auch an zentralen zellulären Vorgängen wie der Ausbildung der Peptidbindung bei der Proteinsynthese im Ribosom beteiligt (Übersicht bei Doudna u. Cech 2002). Die meisten der natürlich vorkommenden Ribozyme katalysieren aber die Hydrolyse oder Umesterung von Phosphodiesterbindungen zwischen Nukleotiden. Sie binden ebenso wie AS-ONs über Basenpaarung an eine komplementäre RNA-Sequenz und besitzen dadurch eine hohe Spezifität. Im Unterschied zu AS-ONs sind Ribozyme aber zusätzlich in der Lage, die gebundene RNA an einer definierten Stelle zu schneiden. Aufgrund dieser intrinsischen Spaltungsaktivität sind Ribozyme

4.3

nicht auf zelluläre Enzyme angewiesen. Sie können nacheinander mehrere Zielmoleküle spalten („multiple turnover“). Ein weiterer Vorteil der Ribozyme besteht darin, dass sie im Gegensatz zu AS-ONs nicht nur von außen zugegeben, sondern auch endogen in Zellen exprimiert werden können. Die in der Natur gefundenen RNA-spaltenden Ribozyme sind zumeist autokatalytisch, d. h. sie schneiden dasjenige RNA-Molekül, dessen Bestandteil sie selbst sind. Im Labor sind im Hinblick auf mögliche therapeutische Anwendungen verkürzte und modifizierte Varianten einiger Ribozyme entwickelt worden, die zur Spaltung auch beliebiger anderer RNA-Moleküle („in trans“) eingesetzt werden können. Insbesondere sind so modifizierte Hammerhead- und Hairpin-Ribozyme gegen therapeutisch relevante Gene gerichtet und in klinischen Studien untersucht worden. Trotz ermutigender Anfangserfolge wurde aber bisher kein Ribozym als Arzneimittel zugelassen.

4.3.3.1 Klassifikationen und Mechanismen von Ribozymen Die natürlich vorkommenden RNA-spaltenden Ribozyme werden grob nach ihrer Größe klassifiziert, wobei große Ribozyme aus mehreren hundert Nukleotiden bestehen, wogegen kleine Ribozyme 30–150 Nukleotide lang sind. Zu den großen Ribozymen zählen: x die RNA-spleißenden Introns, die nach ihrem Mechanismus in die Gruppen I und II unterteilt werden, sowie die x RNase P, die sowohl eine RNA- als auch eine Proteinkomponente enthält und das 5c-Ende von tRNAVorläufern prozessiert. In Zellkulturversuchen ist die Splicing-Aktivität von Gruppe-I-Introns ausgenutzt worden, um pathologisch mutierte Abschnitte der E-Globin mRNA in Zellen von Patienten mit Sichelzellanämie durch das γ-Globin3c-Exon zu ersetzen. Das daraus translatierte Globin verursachte im Gegensatz zur pathogenen Form keine krankhafte Hämoglobinpolymerisation. Mit Varianten der RNase P konnte insbesondere die Vermehrung verschiedener Viren in Zellkultur inhibiert werden. Hinsichtlich einer klinischen Anwendbarkeit sind aber Vertreter der kleinen Ribozyme von größerer Bedeutung. In > Abb. 4.3.3 sind die Sekundärstrukturen des Hammerhead- und des Hairpin-Ribozyms dargestellt, die bisher am besten untersucht wurden. Zu den kleinen Ribozymen werden außerdem das HepatitisDelta-Virus (HDV) und das Varkud-Satellite- (VS-) Ribozym gezählt, die allerdings bisher kaum für therapeutisch relevante Zwecke eingesetzt wurden. Das Ham-

416

Sektion 4 · Therapie

. Abb. 4.3.3. Sekundärstrukturen des Hammerhead-Ribozyms, Hairpin-Ribozyms sowie des DNAzyms 10-23. Die Spaltstelle in der Ziel-RNA ist durch einen Pfeil gekennzeichnet

merhead- und das Hairpin-Motiv, die in Pflanzenpathogenen vorkommen, wurden dagegen in vitro minimiert und für die sequenzspezifische Spaltung beliebiger RNAs optimiert. Sie bestehen aus einer Substraterkennungsregion, die an eine komplementäre Sequenz auf der ZielRNA bindet, und einem stark konservierten katalytischen Zentrum. Die Spaltung erfolgt über einen nukleophilen Angriff der 2'-OH-Gruppe an der Spaltstelle auf sein benachbartes Phosphoratom und benötigt Metallionen. Als Produkte entstehen ein 2'-3'-Cyclophosphat und eine freie 5'-OH Gruppe. Die gespaltene RNA wird freigesetzt und anschließend von zellulären Enzymen abgebaut. Kristallstrukturen von minimierten Hammerhead- und Hairpin-Ribozymen im Komplex mit nicht spaltbaren Substratanaloga sind in den vergangenen Jahren aufgeklärt worden. Trotz der bekannten strukturellen Daten sind die Details des Spaltungsmechanismus bisher aber nicht vollständig ermittelt (eine Übersicht über die Mechanismen von Ribozymen findet sich bei Doudna u. Lorsch 2005). Während Ribozyme aus RNA-Bausteinen natürlich vorkommen, sind bislang noch keine katalytisch aktiven DNA-Oligonukleotide in der Natur entdeckt worden. Es ist aber gelungen, künstliche Desoxyribozyme (DNAzyme) durch In-vitro-Selektion aus randomisierten Bibliotheken zu isolieren (Übersicht Peracchi 2005). Eine der aktivsten Varianten ist das RNA-spaltende „10-23“DNAzym, dessen Sekundärstruktur in > Abb. 4.3.3 dargestellt ist. Der Name leitet sich davon ab, dass es als 23. Klon in der 10. Selektionsrunde identifiziert wurde. In mehreren In-vivo-Studien ist gezeigt worden, dass sich DNAzyme auch für therapeutische Anwendungen eignen sollten. Dabei sind insbesondere Tiermodelle für kardiovaskuläre Krankheiten und Krebs zum Einsatz

gelangt (Zusammenstellung in Schubert u. Kurreck 2004).

4.3.3.2 Entwicklung von Ribozymen Ribozyme können grundsätzlich gegen jede beliebige Ziel-RNA gerichtet werden. Die Auswahl der Spaltstelle auf der Ziel-RNA ist dabei jedoch für ihre Wirksamkeit mitentscheidend. Sie ist deutlichen Beschränkungen unterworfen: Hammerhead-Ribozyme spalten z. B. präferenziell hinter der Sequenzfolge NUH, wobei N ein beliebiges Nukleotid, U ein Uridin und H ein beliebiges Nukleotid außer G ist. Hairpin-Ribozyme bevorzugen eine NGUC-Basenfolge an der Spaltstelle. Ribozyme sind außerdem besonders sensibel gegenüber sterischen Hindernissen durch die Struktur der Ziel-RNA, da sie Raum brauchen, um sich in die katalytisch aktive dreidimensionale Struktur zu falten. Zur Identifikation effizienter Spaltstellen sind zahlreiche experimentelle Verfahren entwickelt worden. Andere Ansätze zielen darauf ab, die Bindungseigenschaften der Ribozyme so zu verbessern, dass sie auch an schwer zugänglichen Stellen der RNA katalytisch aktiv werden können. Die aus Ribonukleotiden aufgebauten Ribozyme werden noch schneller von Nukleasen abgebaut als AS-ONs, die aus DNA bestehen. Nukleotidmodifikationen wie die in 7 4.3.2.2 vorgestellten, aber auch weitere Modifikationen speziell am 2c-Sauerstoff der Ribose, sind daher auch verwendet worden, um Ribozyme zu stabilisieren. Da Ribozyme hinsichtlich ihrer korrekten Faltung sehr anspruchsvoll sind, bergen solche Modifikationen immer die Gefahr, dass die Ausbildung der enzymatisch aktiven Struktur behindert wird. Für das

417 4.3 · Antisense-, Ribozym- und RNA-Interferenz-Strategien

Hammerhead-Ribozym und das DNAzym sind optimierte Modifikationsschemata entwickelt worden, die eine erhebliche Stabilisierung bewirken, ohne die Aktivität stark zu beeinträchtigen. Derartig stabilisierte Ribozyme sind in den unten beschriebenen klinischen Studien eingesetzt worden. Schließlich stellt sich das Problem der Applikation: Wie AS-ONs können auch Ribozyme exogen zur Zelle gegeben werden (7 4.3.2.3). Ribozyme können aber auch intrazellulär von Plasmiden aus exprimiert werden (Übersicht bei Michienzi u. Rossi 2001). So wird eine länger anhaltende Inhibition des Zielgens ermöglicht, da die Dauer der Wirkung nicht in erster Linie durch den Abbau des Ribozyms begrenzt ist. Verwendet man geeignete Promotoren, kann die Expression zelltypspezifisch oder induzierbar gesteuert werden. Um eine effiziente Aufnahme eines Ribozym kodierenden Plasmids zu ermöglichen, werden häufig virale Vektoren als Genfähren eingesetzt. Die verschiedenen Möglichkeiten des Gentransfers mithilfe von Retroviren, Adenoviren und adeno-assoziierten Viren werden im Kap. 4.1 „Gentherapie“ dieses Bandes sowie unten im Zusammenhang mit der RNA-Interferenz genauer beschrieben (7 4.3.4.3).

4.3.3.3 Klinische Anwendungen Ribozyme sind mit Erfolg für die gezielte Inhibition von Genen in vivo verwendet worden. In Tiermodellen für kardiovaskuläre Erkrankungen, Krebs, virale Infektionen und Arthritis konnten therapeutisch relevante Gene mit exogen gegebenen, stabilisierten Ribozymen oder mit intrazellulär exprimierten Ribozymen spezifisch gehemmt werden. Beispiele für diese Studien finden sich bei Wright u. Kearney (2001), Perrachi (2004) sowie Schubert u. Kurreck (2004). Auf der Basis der positiven Ergebnisse aus den Tierversuchen wurde die Wirksamkeit mehrerer Ribozyme auch in klinischen Tests untersucht (Übersicht bei Sullenger u. Gilboa 2002). Gentherapeutische Ansätze wurden mit Ribozymen gegen HIV-1 verfolgt. In Phase-I-Studien wurden z. B. CD34+-hämatopoetische Vorläuferzellen von AIDS-Patienten entnommen. Diese Zellen wurden dann durch retroviralen Gentransfer ex vivo mit Hairpin- oder Hammerhead-Ribozymen transduziert, die gegen wichtige virale Gene gerichtet waren und somit eine Resistenz gegen HIV-1 auf die Stammzellen und ihre Abkömmlinge übertragen können. Die Zellen, die daraufhin das Ribozym exprimierten, wurden wieder in den Blutkreislauf des Patienten infundiert. Dieses Vorgehen erwies sich als ungefährlich für die Patienten, aber die genetisch modifizierten Zellen blieben nur etwa ein Jahr im Körper nachweisbar

4.3

(Michienzi et al. 2003). Eine zentrale Aufgabe, die sich aus diesem und aus ähnlichen Befunden ergibt, ist die effiziente Transduktion pluripotenter hämatopoetischer Stammzellen, die allerdings noch nicht in zufriedenstellendem Maße möglich ist. Chemisch stabilisierte Ribozyme wurden von der Firma Ribozyme Pharmaceuticals (RPI) seit den späten 1990er Jahren in klinischen Tests evaluiert. Das Hammerhead-Ribozym mit dem Markennamen ANGIOZYME ist gegen die Rezeptortyrosinkinase VEGF-R1 gerichtet, die eine wichtige Rolle bei der Angiogenese spielt und daher ein interessantes Zielmolekül für die Krebstherapie darstellt. ANGIOZYME erwies sich bei der klinischen Erprobung als gut verträglich. In Phase-II-Studien wurde daraufhin die therapeutische Wirksamkeit bei Brustkrebspatientinnen sowie Patienten mit Kolorektalkarzinomen in Verbindung mit einer Chemotherapie untersucht. Dabei ergab sich zunächst kein klarer Vorteil der Ribozymtherapie. Zwei weitere chemisch stabilisierte Ribozyme sind in klinische Studien gelangt: HEPTAZYME ist ein Ribozym, das gegen das Hepatitis-C-Virus gerichtet ist. In den Studien ergab sich wiederum eine gute Verträglichkeit, aber in Phase-II-Untersuchungen konnte die Menge an HCV-RNA im Serum von infizierten Patienten durch das Ribozym nur um rund 10% verringert werden (Peracchi 2004). HERZYME ist ein in vitro entwickeltes Ribozym, das gegen den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor 2 (HER-2) gerichtet ist, der in aggressiven Brustkrebsarten überexprimiert wird. In Phase-I-Untersuchungen ergaben sich keine starken Nebenwirkungen bei der Behandlung mit dem Ribozym. Diese klinischen Studien lassen vermuten, dass die Anwendung von therapeutisch relevanten Ribozymen am Patienten möglich und weitgehend ungefährlich ist. Eine therapeutische Wirksamkeit ist allerdings noch nicht überzeugend nachgewiesen worden. Mit der Entdeckung der RNA-Interferenz steht nun eine neue Methode zur Verfügung, deren Effizienz erheblich größer ist als diejenige von Ribozymen. Symptomatisch für diese Einschätzung ist die im Jahre 2003 erfolgte Entscheidung von Ribozyme Pharmaceuticals, der führenden Firma im Ribozymgebiet, die Arbeiten zu Ribozymen einzustellen und sich unter dem Namen „Sirna Therapeutics“ ganz auf RNAi-Strategien zu konzentrieren.

4.3.4 RNA-Interferenz Der Begriff RNA-Interferenz oder RNAi bezeichnet einen zellulären Vorgang, bei dem der Abbau einer mRNA durch homologe, doppelsträngige RNA (dsRNA)

418

Sektion 4 · Therapie

induziert wird. Dieser sehr effiziente Prozess, in den eine Reihe von zellulären Proteinen involviert sind, ist in allen bisher untersuchten höheren Eukaryonten konserviert. Fire, Mello et al. haben 1998 zum ersten Mal eine spezifische Geninhibition durch dsRNA im Fadenwurm Caenorhabditis elegans beschrieben (Fire et al. 1998). Seitdem hat sich herausgestellt, dass Bestandteile der RNAi-Maschinerie in erheblichem Umfang auch an der Steuerung der Genexpression bei zahlreichen Entwicklungs- und Differenzierungsprozessen beteiligt sind (Übersicht bei Wienholds u. Plasterk 2005). Die Untersuchung des komplexen RNA-Regulationsnetzwerkes ist ein faszinierendes und sehr dynamisches Forschungsgebiet, das unser Verständnis der molekularen Lebensvorgänge enorm bereichert hat. Daneben ist RNAi aber auch zu einem sehr wirkungsvollen Laborwerkzeug zum spezifischen Genknockdown entwickelt worden. Durch die erheblichen Fortschritte bei der Aufklärung des molekularen Mechanismus der RNAi konnte die Methode stetig weiter verbessert und immer erfolgreicher angewendet werden. Mit Spannung werden jetzt die Ergebnisse der ersten klinischen Studien erwartet, in denen RNAi für therapeutische Zwecke erprobt wird.

4.3.4.1 Mechanismus der RNA-Interferenz Der molekulare Mechanismus der RNA-Interferenz, der zunächst in der Fruchtfliege Drosophila aufgeklärt wurde, wird im Folgenden und in > Abb. 4.3.4 kurz dargestellt. Ausführlichere Beschreibungen finden sich in zahlreichen neueren Reviews, unter anderem bei Eckstein (2005), Hammond (2005) sowie Tomari u. Zamore (2005). RNAi wird ausgelöst, wenn lange doppelsträngige RNA im Zytoplasma einer Zelle auftaucht. Da lange dsRNA oft im Verlaufe viraler Infektionen entsteht, wird vermutet, dass RNA-Interferenz ein evolutionär alter Mechanismus zur Abwehr von Viren ist. Die dsRNAMoleküle werden von Dicer, einer Endonuklease des RNase-III-Typs, so zerschnitten, dass 19-mere RNA-Duplexe zurückbleiben. Auf jeder Seite einer Duplex befinden sich 3c-Überhänge von zwei Nukleotiden. Die so getrimmten kurzen RNA-Duplexe werden als „small“oder „short-interfering“-RNAs (siRNAs) bezeichnet. Im nächsten Schritt bildet sich der RNAi-Effektorkomplex, der „RNA induced silencing complex“ (RISC), der aus mehreren Proteinen und einem der beiden siRNA-Stränge besteht. Der andere Strang wird aus dem Komplex entfernt, verworfen und abgebaut. Welcher der beiden . Abb. 4.3.4. Schematische Darstellung des Mechanismus der RNA-Interferenz

419 4.3 · Antisense-, Ribozym- und RNA-Interferenz-Strategien

Stränge in RISC geladen wird und dann als „guide strand“ die Zerstörung komplementärer mRNAs einleitet, hängt von thermodynamischen Charakteristika der siRNA-Duplex ab. Der aufgenommene siRNA-Strang, der auch als Antisense-Strang bezeichnet wird, bindet anschließend über Basenpaarung an eine komplementäre Sequenz auf der Ziel-mRNA. Diese Bindung induziert die Spaltung der mRNA in der Mitte der Zielsequenz. Verschiedene Formen von RISC sind in der Literatur beschrieben worden. Ein wesentlicher Bestandteil ist in jedem Fall ein Protein der Argonaut-Familie oder ihrer Homologe. Die Nukleaseaktivität des Komplexes ist in einer konservierten Region in Ago2 lokalisiert worden. Nach dem Spaltungsschritt wird der mit einem siRNA-Strang beladene RISC wieder freigesetzt und steht für weitere Katalyserunden zur Verfügung. RISC wirkt also wie eine programmierbare sequenzspezifische Endonuklease. In Säugetierzellen gibt es gegenüber dem eben beschriebenen Mechanismus einen bedeutsamen Unterschied. Auch hier wird dsRNA von mehr als etwa 30 bp Länge im Zytoplasma als Hinweis auf das Eindringen fremden genetischen Materials interpretiert. Die Säugerzelle löst aber daraufhin die Interferonantwort aus: die Proteinsynthese kommt zum Erliegen, vorhandene RNAs werden abgebaut, und die Zelle stirbt. Diese unspezifische Antwort hat zunächst die Verwendung von RNAi in Säugerzellen zur gezielten Geninhibition verhindert, obwohl die RNAi-Maschinerie auch in diesen Zellen voll funktionsfähig ist. Die Interferonantwort kann umgangen werden, wenn man statt langer dsRNA die 21-meren siRNAs einsetzt, die nach dem Vorbild der Dicer-Produkte aufgebaut sind (Elbashir et al. 2001). Dadurch wird keine Interferonantwort ausgelöst, sondern ein Strang der siRNA wird in RISC eingebaut und vermittelt spezifisches Silencing eines gewünschten Gens. Seit dieser Entdeckung hat sich die Zahl der Studien, in denen RNAi zur Geninhibition eingesetzt wird, explosionsartig vermehrt.

4.3.4.2 Design effizienter Small-interferingRNAs Verschiedene siRNAs, die gegen dieselbe mRNA gerichtet sind, zeigen eine Inhibition ihres Zielgens zwischen 0% und annähernd 100%. Welche Charakteristika einer siRNA entscheiden über ihre Effizienz? Zunächst muss dafür gesorgt werden, dass der Antisense-Strang, der komplementär zum Zielmolekül ist, in RISC aufgenommen wird. Dieser asymmetrische Einbau ist abhängig von der Struktur der siRNA, insbesondere davon, welches Ende der siRNA-Duplex das thermodynamisch stabilere ist. Mehrere Algorithmen zur Vorher-

4.3

sage wirksamer siRNAs sind entwickelt worden, die aufgrund von thermodynamischen Kriterien solche siRNA-Stränge berechnen, die besonders gut in RISC aufgenommen werden (beschrieben in Leung u. Whittaker 2005). Darüber hinaus wurde aber auch gefunden, dass die Struktur der Ziel-RNA von Bedeutung für die Stärke der Geninhibition ist: selbst thermodynamisch hervorragende siRNAs können sich als unwirksam erweisen, wenn sich das Zielmolekül durch ungünstige Faltungen der Anlagerung des beladenen RISC entziehen kann. siRNAs sind in biologischen Flüssigkeiten erstaunlich stabil. Um die Resistenz gegenüber nukleolytischem Abbau weiter zu steigern, können aber auch modifizierte Nukleotide an einigen Stellen der siRNA Duplex eingebaut werden. Desoxyribonukleotide an den 3c-Überhängen sind eine häufig verwendete stabilisierende Modifikation, aber auch Phosphorothioate, LNA Bausteine und Modifikationen am 2c-Sauerstoff der Ribose sind an verschiedenen Positionen der siRNA mit Erfolg eingesetzt worden.

4.3.4.3 Vektorbasierte RNA-Interferenz Der Effekt einer exogen zugegebenen siRNA hält einige Tage an. Danach ist die intrazelluläre Konzentration der siRNA durch Zellteilungen und nukleolytischen Abbau soweit reduziert, dass keine weitere Geninhibition beobachtet wird. siRNAs können aber auch intrazellulär exprimiert werden und dadurch länger wirksam bleiben. Dabei werden gewöhnlich Promotoren des PolymeraseIII Typs verwendet, die auf die Transkription von kurzen RNAs ohne Cap und Poly(A)-Schwanz spezialisiert sind. Die beiden siRNA-Stränge können entweder von distinkten Promotoren aus hergestellt werden, oder es wird zunächst ein durchgängiges Molekül transkribiert, in dem die beiden komplementären siRNA-Stränge durch eine Haarnadelschleife zusammengehalten werden. Solche Moleküle werden als „short-hairpin“-RNA (shRNA) bezeichnet. Die shRNA ist ein Substrat für Dicer, der die Struktur zu einer reifen siRNA prozessiert (> Abb. 4.3.5). Wirksame shRNAs müssen effizient vom Plasmid transkribiert und anschließend in das Zytoplasma exportiert werden. Deshalb ist eine erwiesenermaßen gute siRNA nicht ohne Weiteres auch in eine funktionsfähige shRNA überführbar. Die intrazelluläre Prozessierung läuft wesentlich schneller ab, wenn die shRNA nach dem Vorbild endogener MikroRNA-Vorläufer aufgebaut ist, die mit den siRNAs mechanistisch verwandt sind. Solche Pre-microRNAs werden von Polymerase-II-Promotoren aus transkribiert und anschließend polyadenyliert. An definierten Positionen befinden sich Basenfehl-

420

Sektion 4 · Therapie

. Abb. 4.3.5. Expression von „short-hairpin“-RNAs (links) und pre-micro-RNAs (rechts) zur Geninhibition über RNAi. Die schraffierten Flächen entsprechen zusätzlichen MikroRNA-Elementen

paarungen zwischen den beiden MikroRNA-Strängen (> Abb. 4.3.5). Die zelluläre Maschinerie, die für die Prozessierung endogener MikroRNAs zuständig ist, schneidet diese Vorläufer, sorgt für den Transport ins Zytoplasma und führt zu zügigem Einbau des Guide-Strangs in RISC. Plasmidvektoren lassen sich verwenden, um Zellen stabil mit shRNAs zu transfizieren. In stabil transfizierten Zellen wird die Expression des Zielgens über einen fast beliebig langen Zeitraum inhibiert. Inzwischen sind außerdem für shRNAs Plasmidsysteme entwickelt worden, mit denen eine induzierbare oder gewebsspezifische Expression möglich ist. Die Transfektion von Zellen mit Expressionsplasmiden unter Verwendung der üblichen Protokolle ist häufig nicht zufriedenstellend, insbesondere, wenn Primärzellen oder Stammzellen das Ziel sind. Ein effizienterer Gentransfer wird mit viralen Vektoren erreicht. Dazu wird das Genom geeigneter Viren so weit reduziert, dass sie nur einmal die Zielzellen transduzieren und sich danach nicht mehr replizieren können, d. h., alle Teile des Virusgenoms, die mit der Pathogenese und der Ausbreitung des Virus im Wirtsorganismus zu tun haben, werden entfernt. Retroviren integrieren ihr Genom an zufälligen Stellen im Genom der Wirtszelle. Ein Fremdgen kann mithilfe solcher Viren also in das Zellgenom übernommen werden. Die Expression des Gens bleibt durch die Aufnahme in die DNA des Wirtes auch in den Tochterzellen erhalten. Adenovirale Vektoren integrieren das Fremdgen nicht ins Zellgenom, sondern liegen in episomaler Form im Zellkern vor. Dadurch ist die Gefahr einer Mutagenese durch Insertion weitgehend ausge-

schlossen. Andererseits wird das Episom nicht repliziert, wenn die Zelle sich teilt, sodass die Methode für sich teilende Zellen ungeeignet ist. Zudem sind Adenoviren stark immunogen. Eine interessante Alternative sind Vektoren, die auf den adeno-assoziierten Viren (AAV) beruhen. Sie sind nicht pathogen oder immunogen und transduzieren Zellen mit hoher Effizienz. Im Gegensatz zu den Wildtypen insertieren rekombinante AAV-Vektoren ihr Genom nicht im Wirtsgenom, da die hierzu notwendigen Gene entfernt wurden. Eine umfassende Übersicht über den Einsatz viraler Vektoren in der Gentherapie findet sich im Kap. 4.1 „Gentherapie“ des vorliegenden Bandes.

4.3.4.4 Spezifität von Small-interferingRNAs siRNAs gelten als sehr spezifische Werkzeuge zur Regulation von Genen. Dennoch sind unspezifische, sog. „off-target“-Effekte von siRNAs und shRNAs in erheblichem Maße nachgewiesen worden. Auslöser dieser ungewollten Regulation kann eine zufällige Komplementarität zwischen der siRNA und Nicht-Ziel-RNAs sein. Die meisten siRNAs können zumindest teilweise an andere mRNAs als das Zielmolekül hybridisieren. Eine solche Teilkomplementarität kann unter Umständen ausreichen, um die gebundene mRNA zu zerstören oder ihre Translation zu inhibieren. Neben den Effekten, die durch zufällige Komplementarität ausgelöst werden, ist aber auch unspezifische Genregulation gefunden worden, die nicht durch ein-

421 4.3 · Antisense-, Ribozym- und RNA-Interferenz-Strategien

fache Misspaarung zu erklären ist. Obwohl ursprünglich davon ausgegangen wurde, dass siRNAs und shRNAs keine Interferonantwort auslösen, ist in einigen Genexpressionsanalysen eine erhebliche Induktion von interferonstimulierten Genen gefunden worden. Auch eine Hochregulation von Stress- und Apoptosegenen wurde bei höheren siRNA-Konzentrationen beschrieben. Der unspezifische Einfluss einer siRNA auf das Expressionsmuster einer Zelle folgt keinem einfachen Muster. Jede siRNA scheint ihre eigene „Signatur“ zu haben. Die meisten Off-target-Effekte einer siRNA sind konzentrationsabhängig. Da siRNAs häufig bereits im niedrigen nanomolaren Bereich und darunter starken spezifischen Gen-knockdown zeigen – sie sind damit übrigens um ein bis zwei Größenordnungen effizienter als AS-ONs –, bietet sich im Labor die Möglichkeit, mit sehr niedrigen siRNA-Konzentrationen zu arbeiten, um die Gefahr unspezifischer Effekte möglichst gering zu halten.

4.3.4.5 RNA-Interferenz zur Target-Identifikation und zur Target-Validierung RNA Interferenz ist heute eine Standardmethode, um die Funktion neu entdeckter Gene zu untersuchen, wie sie z. B. bei der Sequenzierung des menschlichen Genoms gefunden wurden. Eine enorme Anzahl an Studien ist in den vergangenen Jahren veröffentlicht worden, in denen einzelne Gene in Zellkulturexperimenten inhibiert wurden, um Aufschluss über ihre Funktion zu bekommen oder um Stoffwechselwege aufzuklären. Mit der Entwicklung von Expressionsbibliotheken für shRNAs sowie von Bibliotheken chemisch synthetisierter siRNAs, die gegen sämtliche Gene des menschlichen Genoms gerichtet sind, bieten sich jetzt auch neue Möglichkeiten für die Identifikation therapeutisch interessanter Zielmoleküle. Die neue Methode wird als „reverse genetics“ bezeichnet. Im Gegensatz zur klassischen Genetik, in der ein aberranter Phänotyp als Ausgangspunkt genommen wird, um die zugrunde liegenden genetischen Veränderungen aufzufinden, wird bei dieser Methode eine große Anzahl von Genen systematisch in Zellkultur durch RNAi inhibiert. Die Zellpopulation wird daraufhin auf neu auftauchende Phänotypen durchsucht. Die Veränderungen können so auf das jeweilige inhibierte Gen zurückgeführt werden (Silva et al. 2004). Bereits vor der Synthese genomweiter Bibliotheken lieferte ein Screening mit einer kleineren Bibliothek, die nur shRNAs gegen die Familie der de-ubiquitinylierenden Enzyme enthielt, entscheidende Hinweise auf die Funktion des Tumorsuppressorgens CYLD, dessen Fehlen eine erhebliche Bedeutung für die Entstehung von familiärer Zylindromatose hat (Brummelkamp et al. 2003).

4.3

Dieser Befund eröffnete neue therapeutische Wege, Zylindromatose mit bereits existierenden niedermolekularen Medikamenten zu behandeln. RNAi ermöglicht darüber hinaus die Entwicklung neuer Tiermodelle für menschliche Krankheiten. Die zeitaufwendige und experimentell anspruchsvolle Herstellung transgener Tiere wird durch diese Technik immens vereinfacht. Ein Gen-knockdown kann durch lokale oder systemische Gabe einer siRNA in das erwachsene Tier bewirkt werden. Selbst solche Gene, deren Inhibition zu embryonal letalen Phänotypen führt, können so mithilfe der RNAi in vivo inhibiert werden. Eine Übersicht über die Verwendung von siRNAs in Tiermodellen findet sich bei Leung u. Whittaker 2005.

4.3.4.6 In-vivo-Applikationen auf dem Weg zur therapeutischen Anwendung Wie bei den anderen beschriebenen oligonukleotidbasierten Ansätzen ist auch bei der Anwendung von RNAi in vivo die zelluläre Aufnahme der siRNA eine der größten Hürden. Insbesondere im Tierversuch bietet sich häufig die lokale Injektion einer siRNA oder eines viralen Vektors an, der für eine shRNA kodiert. Eine systemische Gabe wird im Tierversuch häufig durch hydrodynamische Injektion in die Schwanzvene erreicht. Dabei wird die siRNA oder der Vektor in einem großen Flüssigkeitsvolumen mit erhöhtem Druck injiziert. Diese Methode führt zu einer Anreicherung des Oligonukleotids insbesondere in der Leber. Für eine Anwendung für therapeutische Zwecke am Menschen ist diese Methode nicht geeignet. Deswegen werden zurzeit alternative, verträgliche Applikationswege entwickelt. So konnte die Halblebenszeit einer chemisch modifizierten siRNA im Plasma nach intravenöser Injektion in Mäuse erheblich gesteigert werden, wenn die siRNA in spezialisierte Liposomen verpackt wurde. Die verbesserte Bioverfügbarkeit schlug sich in stark verbesserter Wirksamkeit gegen das Hepatitis-B-Virus nieder (Morrisey et al. 2005). Ebenfalls stark verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften wurden erreicht, wenn eine chemisch modifizierte siRNA an Cholesterin gekoppelt wurde. Diese siRNA reduzierte nach intravenöser Gabe die Konzentration von endogenem Apolipoprotein B im Plasma von Mäusen (Soutchek et al. 2004). Weiterhin sind Wege gezeigt worden, siRNAs spezifisch in solche Zellen zu leiten, die mit dem HI-Virus infiziert sind. Dazu wurden siRNAs über das positiv geladene Protein Protamin an einen Antikörper gegen ein HIV-Oberflächenprotein gekoppelt. Die siRNAs wurden in vitro und in vivo nur von den Zellen aufgenommen, die das HIVProtein auf ihrer Außenseite präsentieren (Song et al. 2005). Auch die intranasale Gabe von siRNAs gegen

422

Sektion 4 · Therapie

respiratorische Viren hat sich im Tiermodell als ein gangbarer Weg erwiesen (u. a. Bitko et al. 2005). Schließlich ist auch ein Gentransfer ex vivo mit siRNAs durchgeführt worden. siRNAs gegen HIV-1 wurden mit einem lentiviralen Vektor in primäre hämatopoetische Vorläuferzellen eingebracht. Anschließend wurden die transduzierten Zellen in Mäusen expandiert. Nach 60 Tagen wurden Thymozyten aus den Tieren isoliert. Bis zu 53% der untersuchten Zellen trugen das Transgen und waren signifikant gegen eine Infektion mit HIV-1 geschützt (Banerjea et al. 2003). Es wird erwartet, dass in Kürze klinische Studien zur RNAi gegen HIV begonnen werden.

4.3.4.7 Klinische Studien mit RNA-Interferenz Die Erfahrungen, die mit dem klinischen Einsatz von AS-ONs und Ribozymen gewonnen wurden, kommen jetzt der Entwicklung von Therapeutika zugute, die nach dem RNAi-Prinzip arbeiten. Deswegen sind bereits wenige Jahre, nachdem entdeckt wurde, dass siRNAs in Säugetierzellen anwendbar sind, die ersten klinischen Studien begonnen worden. > Tab. 4.3.2 gibt eine Übersicht über klinische Studien mit RNAi-Therapeutika, die nach Angabe der jeweiligen Firmen bereits laufen oder kurz vor dem Beginn stehen. Acuity Pharmaceuticals und Sirna Therapeutics testen die Sicherheit und Effizienz von siRNAs, die gegen altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und diabetische Retinopathie wirken sollen. Die siRNAs sind gegen den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor VEGF bzw. seinen Rezeptor VEGF-R1 gerichtet und sollen die übermäßige Neubildung von Gefäßen im Auge verhindern, die ein Kennzeichen der beiden Krankheiten ist. Acuity hat Ende 2005 die Phase I bereits erfolgreich

abgeschlossen. Die verwendete siRNA wird direkt ins Auge injiziert, kann also direkt in das Zielorgan abgegeben werden und gelangt nicht in die Blutzirkulation. Das Medikament wurde von AMD-Patienten gut toleriert. Anfang 2006 hat Acuity mit Phase-II-Studien begonnen. Auch Intradigm entwickelt eine siRNA, die Gefäßneubildung durch Unterbrechung des VEGFWegs inhibieren und in der Tumortherapie eingesetzt werden soll. Dabei soll eine ligandengesteuerte Aufnahme selektiv in Tumorzellen eingesetzt werden. Im Tierversuch wurden siRNAs in Nanopartikel verpackt, die an ihrer Außenseite Peptide trugen, die von den Integrinen auf Tumorzellen erkannt und aufgenommen werden. Auf diese Art soll bei systemischer Gabe eine besonders hohe Spezifität für das erkrankte Gewebe erreicht werden. Ein für Therapeutika gut zugängliches Organ ist die Lunge. Alnylam Pharmaceuticals und Sirna untersuchen die Wirksamkeit von siRNAs, die intranasal gegeben werden. Alnylam will auf diesem Wege siRNAs zur Bekämpfung von Atemwegsinfektionen mit Viren wie dem respiratorischen Synzytialvirus (RSV) und Influenzaviren in den Körper einbringen. Sirna Therapeutics entwickelt intranasal applizierbare siRNAs, die Zytokine inhibieren sollen, die bei der Entstehung von Asthma von Bedeutung sind. Ebenfalls gegen Viren gerichtet sind zwei RNAi-Ansätze von Benitec. Besonders interessant ist dabei die gentherapeutische Strategie gegen das HI-Virus. Um die Anpassung des Virus an ein Medikament, den sog. „viral escape“, und dadurch die Wirkungslosigkeit der Therapie zu verhindern, sollen hier mehrere oligonukleotidbasierte Wirkstoffe gleichzeitig angewandt werden. Die Strategie sieht vor, hämatopoetische Vorläuferzellen ex vivo mit einem lentiviralen Vektor zu transduzieren, der für drei verschiedene therapeutische Oligonukleotide kodiert:

. Tab. 4.3.2. Laufende und geplante klinische Studien mit RNA-Interferenz. Die Zusammenstellung basiert auf Internetangaben der Firmen (Stand März 2006). Acuity Pharmaceuticals

Altersbedingte Makuladegeneration (AMD); diabetische Retinopathie

Phase II

Alnylam Pharmaceuticals

Respiratorisches Synzytialvirus (RSV)

Phase I

Influenza

Phase I geplant

Hepatitis-C-Virus

Phase I geplant

HIV

Phase I geplant

Intradigm

Kolonkarzinom

Phase I geplant

Sirna Therapeutics

AMD

Phase I

Asthma

Phase I geplant

Benitec

423 4.3 · Antisense-, Ribozym- und RNA-Interferenz-Strategien

1. eine shRNA gegen virale Proteine, 2. ein Ribozym gegen den Virusrezeptor CCR5, der ein valides Zielmolekül für Anti-HIV-Ansätze ist, sowie 3. ein sog. Decoy-Oligonukleotid, das über seine stabile Tertiärstruktur fest und spezifisch an das virale tat-Protein binden kann, welches für die Transkription von HIV-1 essenziell ist. Durch die Kombination der verschiedenen Wirkstoffe, die gegen unterschiedliche Zielmoleküle gerichtet sind und über unterschiedliche Mechanismen wirken, soll eine lang anhaltende und robuste Inhibition des Virus sichergestellt werden.

4.3.5 Ausblick Der Antisense-Strategie liegt eine ebenso einfache wie brillante Idee zugrunde: Theoretisch sollte sich zu jeder mRNA ein komplementäres Oligonukleotid designen lassen, das an das Zielmolekül bindet und so dessen Funktion inhibiert. Für derartige Techniken besteht gerade nach dem Abschluss der Sequenzierung des humanen Genoms (sowie der Genome zahlreicher Modellorganismen) ein großer Bedarf. Noch immer ist die Funktion Tausender von Proteinen unbekannt. In revers-genetischen Ansätzen können Antisense-Strategien genutzt werden, um die Expression von Genen gezielt zu inhibieren und aus den resultierenden „loss-of-function“-Phänotypen Rückschlüsse auf die Funktion der Proteine ziehen zu können. Seit rund drei Jahrzehnten werden Antisense-Oligonukleotide zu diesem Zweck erfolgreich eingesetzt. Anders als bei niedermolekularen Wirkstoffen, die Proteinfunktionen beeinflussen (sollen), gibt es für Antisense-Agenzien keine Unterscheidung in sog. „druggable“ und „non-druggable“ Targets. AS-ONs wurden aber nicht nur zu Forschungszwecken, sondern auch als potenzielle neue Therapeutika getestet. Gemessen an den Erwartungen, die in diese Technologien gesetzt wurden, müssen die bisherigen Ergebnisse allerdings als enttäuschend angesehen werden: Ein AS-ON hat zwar die Marktzulassung erhalten, es ist aber nur von geringer Bedeutung. Die weiteren AS-ONs konnten in klinischen Studien aufgrund unbefriedigender Effizienz bislang nicht überzeugen. Ribozyme sind eine weitere Klasse von Oligonukleotiden, in die große Erwartungen gesetzt wurden. Sie sollten im Vergleich zu den AS-ONs überlegen sein, da sie eigene katalytische Aktivität besitzen und nicht auf die Unterstützung durch zelluläre Enzyme angewiesen sind. Die Entwicklung aktiver Ribozyme ist allerdings sehr anspruchsvoll, da sie durch den Einbau modifizierter Nukleotide gegen nukleolytischen Abbau stabilisiert werden müssen, ohne dass dabei die katalytische

4.3

Effizienz beeinträchtigt wird. Auch mit Ribozymen wurden klinische Studien durchgeführt, die aber aufgrund des geringen therapeutischen Erfolgs größtenteils wieder beendet wurden. Die Entdeckung der RNA-Interferenz gibt nun Anlass zu der Hoffnung, dass mit ihrer Hilfe die lange gehegten Erwartungen erfüllt werden können. Offensichtlich ist diese Methode deutlich effizienter als die beiden schon länger bekannten Ansätze. Daher ist RNAi innerhalb nur weniger Jahre zu einer Standardtechnologie in molekularbiologischen Laboratorien geworden. Schon jetzt hat sie zu einem enormen Erkenntnisfortschritt über die Funktion von Genen und deren Produkten beigetragen. Mit umfassenden Bibliotheken ist es mittlerweile möglich, sämtliche Gene des humanen Genoms selektiv zu silencen. Mit großem Interesse werden nun die Ergebnisse der ersten RNAi-basierten klinischen Studien erwartet. Sollten die Hauptprobleme des Delivery und der Spezifität zufriedenstellend gelöst werden, so könnten siRNAs nicht nur ein wertvolles Forschungswerkzeug, sondern auch ein wichtiges therapeutisches Prinzip der Zukunft werden.

4.3.6 Literatur Amantana A, Iversen PL (2006) Pharmacokinetics and biodistribution of phosphorodiamidate morpholino antisense oligomers. Curr Opin Pharmacol 5: 550–555 Banerjea A, Li M-J, Bauer G, Remling L, Lee N-S, Rossi J, Akkina R (2003). Inhibition of HIV-1 by lentiviral vector-transduced siRNAs in T lymphocytes differentiated in SCID-hu mice and CD34+ progenitor cell-derived macrophages. Mol Ther 8: 62–71 Bennett CF, Cowsert LM (1999) Antisense oligonucleotides as a tool for gene functionalization and target validation. Biochim Biophys Acta 1489: 19–30 Bitko V, Musiyenko A, Shulyayeva O, Barik S (2005) Inhibition of respiratory viruses by nasally administered siRNA. Nat Med 11: 50–55 Brummelkamp TR, Nijman SM, Dirac AM, Bernards R (2003) Loss of the cylindromatosis tumour suppressor inhibits apoptosis by activating NF-kappaB. Nature 424: 797–801 Cech TR, Zaug AJ, Grabowski PJ (1981) In vitro splicing of the ribosomal RNA precursor of Tetrahymena: involvement of a Guanosine nucleotide in the excision of the intervening sequence. Cell 27: 487–296 Crooke ST (2004) Progress in antisense technology. Annu Rev Med 55: 61–95 Doudna J, Cech TR (2002) The chemical repertoire of natural ribozymes. Nature 418: 222–228 Doudna J, Lorsch JR (2005) Ribozyme catalysis: not different, just worse. Nat Struct Mol Biol 12: 395–402 Eckstein F (2000) Phosphorothioate oligonucleotides: What is their origin and what is unique about them? Antisense Nucleic Acids Drug Dev 10: 117–121 Eckstein F (2005) Small non-coding RNA as magic bullets. Trend Biochem Sci 30: 445–452 Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411: 494–498

424

Sektion 4 · Therapie

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4.3.7 Zeittafel Die angegebenen Zitate sind in den Literaturteil integriert. Erstes Experiment mit Antisense-Oligonukleotiden

Zamecnik u. Stephenson 1978

Entdeckung der ersten katalytisch aktiven Nukleinsäure

Cech et al. 1981; Kruger et al. 1982

Entdeckung eines in trans aktiven Ribozyms

Guerrier-Takadaet al. 1983

Entdeckung der RNA Interferenz in C. elegans

Fire et al. 1998

Verwendung von siRNAs in Säugerzellen

Elbashir et al. 2001

4.4 4.4 Medizinische Perspektiven der kardialen Stammzellforschung Marcel Halbach, Michael Reppel, Frank Pillekamp, Jochen Müller-Ehmsen und Jürgen Hescheler

4.4.1

Paradigmenwechsel in der Therapie: Von der medikamentösen Behandlung zur Zelltherapie – 426

4.4.2

Eigenschaften von Stammzellen – 427

4.4.2.1 4.4.2.2 4.4.2.3 4.4.2.4

Bedingungen für die Eignung eines Zelltyps zur Zelltherapie Embryonale Stammzellen – 427 Adulte Stammzellen – 431 Myoblasten – 434

4.4.3

Therapeutischer Nutzen der Stammzelltherapie des Myokardinfarkts – Ergebnisse bisheriger Studien – 434

4.4.3.1 4.4.3.2

Studien mit Kardiomyozyten aus embryonalen Stammzellen Studien mit adulten Stammzellen – 435

4.4.4

Elektrophysiologische und molekularbiologische Untersuchungen an humanen ESKM – 437

4.4.5

Humane ESKM auf dem Weg zum klinischen Einsatz – welche nächsten Schritte sind zu tun? – 439

4.4.6

Reprogrammierungsstrategien – 440

4.4.6.1 4.4.6.2

Kerntransfer in Eizellen (Klonen) Zellfusion – 440

4.4.7

Aktueller Stand der neurologischen Stammzellforschung – Zelltherapie der Parkinson-Krankheit – 441

4.4.8

Ausblick

4.4.9

Literaturverzeichnis

4.4.10

Zeittafel

– 427

– 434

– 440

– 441 – 442

– 447

Literatur zur Zeittafel – 448

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

426

Sektion 4 · Therapie

4.4.1 Paradigmenwechsel in der Therapie: Von der medikamentösen Behandlung zur Zelltherapie Dank der Fortschritte der modernen Pharmakotherapie ist es gelungen, regulierend in eine Vielzahl pathophysiologischer Prozesse einzugreifen und auf diese Weise schwerwiegende Erkrankungen zu heilen bzw. zu lindern. Viele Volkskrankheiten unterschiedlicher Ätiologie (ischämisch, degenerativ, autoimmun, infektiös und viele mehr) sind jedoch durch einen Untergang von Zellen charakterisiert, der durch Pharmaka und die Regenerationsfähigkeit des menschlichen Körpers weder nachhaltig aufgehalten noch umgekehrt werden kann. Der exogene Ersatz untergegangenen Gewebes durch eine Applikation von Stammzellen im Rahmen der Zelltherapie stellt daher für diese Krankheitsbilder eine vielversprechende zukünftige Therapieoption dar. Der exogene Ersatz untergegangenen Gewebes ist kein gänzlich neues Konzept, sondern bereits vielfach bewährt. Neben der Transplantation ganzer Organe und der Transfusion von Blutbestandteilen wird, im Bereich der Hämatoonkologie, die allogene Transplantation adulter Stammzellen (aus Knochenmark oder peripherem Blut) seit Jahrzehnten erfolgreich angewandt, um Malignome (Leukämie, Lymphome, myelodysplastische Syndrome) und Anämien (aplastische Anämie, Thalassaemia major) zu behandeln. Die Liste der durch Zelluntergang gekennzeichneten Erkrankungen, deren Therapie zukünftig durch eine Applikation embryonaler oder adulter Stammzellen erfolgen könnte, umfasst Krankheitsbilder jeglicher Ätiologie. Zu ihnen gehören u. a. neurologische Erkrankungen (Luque u. Ribotta 2004) (Parkinson-Krankheit, multiple Sklerose, Schlaganfall, Querschnittslähmung), hepatische Erkrankungen (Fujikawa et al. 2005) (Morbus Wilson, D1-Antitrypsin Mangel, toxisch und viral bedingte Lebererkrankungen), orthopädische Erkrankungen (Hui et al. 2005) (Arthrose, traumatische Gelenkschäden, Knochendefekte), Diabetes mellitus Typ 1 (Fujikawa et al. 2005) und kardiovaskuläre Erkrankungen [Myokardinfarkt (Assmus et al. 2002; Britten et al. 2003; Kehat et al. 2004; Menard et al. 2005), Bradykardie (Kehat et al. 2004; Xue et al. 2005), Kardiomyopathien (Nagaya et al. 2005)]. Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen die mit Abstand häufigste Todesursache in den westlichen Industrieländern dar. Nach Angaben des Statistischen Bundesamts waren im Jahre 2002 47% aller Todesfälle in der Bundesrepublik Deutschland durch Erkrankungen des kardiovaskulären Systems bedingt, wobei die chronische ischämische Herzkrankheit sowie der akute Myokardinfarkt die höchste Mortalität aufwiesen. Obwohl Fort-

schritte in der Prävention sowie der medikamentösen, interventionellen und kardiochirurgischen Therapie zu einer signifikanten Reduktion der Inzidenz und Letalität der koronaren Herzkrankheit während der vergangenen Jahrzehnte geführt haben (Keil 2005), verdeutlicht die immer noch hohe Mortalität die Notwendigkeit neuer Behandlungsansätze. Aufgrund der epidemiologischen Bedeutung des Myokardinfarkts werden die medizinischen Perspektiven der kardialen Stammzellforschung in diesem Kapitel exemplarisch für die medizinischen Perspektiven der Stammzellforschung im Allgemeinen dargestellt. Im Jahre 1992 wurde erstmalig über eine intramyokardiale Implantation myogener Zellen berichtet (Marelli et al. 1992). Eine Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen wurde seitdem im Rahmen tierexperimenteller Studien zur Zelltherapie verwendet, darunter embryonale Kardiomyozyten (Roell et al. 2002), neonatale Kardiomyozyten (Müller-Ehmsen et al. 2002), Myoblasten (Menasche et al. 2003), aus embryonalen Stammzellen differenzierte Kardiomyozyten (ESKM) (Hodgson et al. 2004; Menard et al. 2005; Min et al. 2003) und adulte Stammzellen (Schächinger et al. 2004; Wollert et al. 2004). Da die allogene Transplantation embryonaler und neonataler Kardiomyozyten beim Menschen keine Option darstellt, liegen die Schwerpunkte der Zelltherapieforschung derzeit bei den drei letztgenannten Zelltypen. Die Zelltherapie im Rahmen klinischer Pilotstudien erfolgte zunächst unter Verwendung von adulten Knochenmarkstammzellen (Hamano et al. 2001). Neben einer Reihe von Studien zur Zelltherapie mittels adulter Knochenmarkstammzellen (Assmus et al. 2002; Cleland et al. 2006; Janssens et al. 2006; Wollert et al. 2004; detaillierte Übersicht in Wollert u. Drexler 2005) wurden seitdem mehrere Studien zur Zelltherapie mit Myoblasten aus der Skelettmuskulatur durchgeführt (Dib et al. 2005; Herreros et al. 2003; Menasche et al. 2003; Siminiak et al. 2004; Smits et al. 2003; detaillierte Übersicht in Smits 2004). ESKM wurden bislang nicht in klinischen Studien eingesetzt. Neben Untersuchungen an Kleintiermodellen (Hodgson et al. 2004; Min et al. 2003; detaillierte Übersicht in Xiao 2003) wurde 2005 die erste Studie zur Zelltherapie mit ESKM im Großtiermodell veröffentlicht (Menard et al. 2005), bei der ESKM in infarzierte Schafherzen injiziert wurden. Unabhängig vom applizierten Zelltyp fanden sich in den o. g. Studien Hinweise darauf, dass die Herzfunktion nach einem Myokardinfarkt durch zelltherapeutische Ansätze verbessert werden kann. Aufgrund einer Vielzahl offener Fragen und ungelöster Probleme, die in den folgenden Abschnitten dieses Kapitels genannt werden, kann der Nutzen der Zelltherapie beim Myokardinfarkt derzeit jedoch nicht abschließend beurteilt werden.

427 4.4 · Medizinische Perspektiven der kardialen Stammzellforschung

Neben offenen Fragen und Problemen bezüglich der Zellbiologie existieren, insbesondere im Zusammenhang mit der Forschung an embryonalen Stammzellen, auch ethische Bedenken, die auf wissenschaftlicher, religiöser und gesellschaftlicher Ebene kontrovers diskutiert werden. Stammzellen, insbesondere embryonale Stammzellen bzw. ESKM, besitzen nicht nur ein großes Potenzial im Rahmen der Zelltherapie, sondern auch für eine Reihe weiterer biologisch-medizinischer Untersuchungen. Humane ESKM eröffnen neue Möglichkeiten des Pharmascreenings, da sie bezüglich ihrer physiologischen Eigenschaften (z. B. Elektrophysiologie, Signaltransduktion) nativen humanen Kardiomyozyten eher entsprechen als derzeit eingesetzte Tiermodelle. Des Weiteren kann die Entwicklung kardialer Differenzierung und Funktionen [z. B. funktionelle Genomik (Beqqali et al. 2006), Elektrophysiologie] mit Hilfe embryonaler Stammzellen untersucht werden, wodurch nicht nur das Verständnis der physiologischen Herzfunktion, sondern auch das Verständnis pathophysiologischer Mechanismen sowie die Entwicklung gezielter therapeutischer Ansätze verbessert werden können.

4.4.2 Eigenschaften von Stammzellen 4.4.2.1 Bedingungen für die Eignung eines Zelltyps zur Zelltherapie Für einen erfolgreichen Einsatz von Zellen im Rahmen der Zelltherapie, d. h. eine Verbesserung der Herzfunktion, eine Verminderung der Letalität und eine Vermeidung schwerwiegender Nebenwirkungen, müssen mehrere Bedingungen erfüllt sein (Lee u. Makkar 2004; Strauer u. Kornowski 2003): 1. Die Zellen dürfen vom Immunsystem des Empfängers nicht abgestoßen werden, 2. aus den Zellen dürfen sich keine Tumoren entwickeln, 3. die Zellen müssen in großer Zahl gewonnen werden können, und 4. die Zellen dürfen nicht arrhythmogen wirken. Weitere Eigenschaften, die für einen Einsatz von Zellen in der Zelltherapie von Vorteil wären, sind 1. eine Differenzierung der Zellen zu Kardiomyozyten im Sinne eines exogenen Ersatzes untergegangenen Myokards, 2. eine funktionelle Integration der Zellen in das Myokard des Empfängers und 3. keine ethischen Bedenken gegen die Verwendung der Zellen.

4.4

Ein Zelltyp, der all diese Eigenschaften in sich vereint, steht derzeit nicht zur Verfügung. Die aktuell in der Zelltherapieforschung eingesetzten Zelltypen weisen jeweils Vor- und Nachteile auf, die in den folgenden Abschnitten und in > Tab. 4.4.1 beschrieben werden.

4.4.2.2 Embryonale Stammzellen Die frühe embryonale Entwicklung im Anschluss an die Befruchtung der Eizelle ist durch eine Proliferation totipotenter Stammzellen gekennzeichnet. Dadurch entsteht zunächst ein kompaktes Zellaggregat, die Morula. Innerhalb des Zellaggregats bildet sich anschließend eine blasenförmige Struktur. In diesem Blastozystenstadium erfolgt die Implantation des Embryos in den Uterus. Die Blastozyste besteht aus dem Trophektoderm und der inneren Zellmasse; aus letzterer entwickeln sich sämtliche embryonalen Strukturen aller drei Keimblätter, während sich aus dem Trophektoderm Teile der Plazenta und die Eihäute entwickeln. Da die Zellen der inneren Zellmasse die Fähigkeit besitzen, jedes Gewebe des wachsenden Organismus hervorzubringen, sind sie per definitionem pluripotent. Embryonale Stammzelllinien werden aus diesen Zellen der inneren Zellmasse generiert (Thomson et al. 1998) (> Abb. 4.4.1). Sie sind durch folgende Eigenschaften charakterisiert, die gleichzeitig die Definition einer embryonalen Stammzelle darstellen (Thomson et al. 1998): 1. Entstehung aus einem Embryo im Prä- oder Periimplantationsstadium, 2. langfristige undifferenzierte Proliferation und 3. Potenzial zur Entwicklung zu Zelltypen aller drei Keimblätter, auch nach langfristiger Kultivierung der undifferenzierten Zellen. Zu den Zelltypen, die bereits in vitro aus embryonalen Stammzellen gewonnen werden konnten, gehören hämatopoetische Zellen (Wang 2006), Skelettmuskelzellen (Bhagavati u. Xu 2005), glatte Muskelzellen (Huang et al. 2005), Adipozyten (Xiong et al. 2005), Hepatozyten (Schwartz et al. 2005), Chondrozyten (Kawaguchi et al. 2005), Osteozyten (Kawaguchi et al. 2005), endotheliale Zellen (Huang et al. 2005), Melanozyten (Fang et al. 2006), Neuronen (Zeng et al. 2004), Gliazellen (Benveniste et al. 2005), Inselzellen des Pankreas (Ku et al. 2004) und Kardiomyozyten (Doss et al. 2004; Odorico et al. 2001) (> Abb. 4.4.2). Ob die in 7 4.4.2.1 genannten Bedingungen für einen erfolgreichen Einsatz in der Zelltherapie durch embryonale Stammzellen erfüllt werden können, ist noch nicht gewiss.

428

Sektion 4 · Therapie . Abb. 4.4.1. Gewinnung embryonaler Stammzellen und Darstellung der Pluripotenz. Embryonale Stammzellen werden aus der inneren Zellmasse (IZM) einer Blastozyste gewonnen. Die auf diese Weise gewonnenen Stammzellen können in vitro kultiviert werden. Unter definierten Kulturbedingungen entwickeln sich Aggregate differenzierter Zellen („embryoid bodies“). Aufgrund der Pluripotenz embryonaler Stammzellen umfasst die Differenzierung Zelltypen aller 3 Keimblätter [aus Doss et al. (2004), mit freundlicher Genehmigung des Journal of Cellular and Molecular Medicine]

. Abb. 4.4.2. Immunhistochemische Darstellung des sarkomerischen Proteins α-Aktinin in humanen ESKM. Als Zeichen einer kardialen Differenzierung exprimieren spontan schlagende, aus humanen embryonalen Stammzellen differenzierte Zellen D-Aktinin (gelb). Eine geordnete Querstreifung der ESKM ist aufgrund des unreifen Entwicklungsstadiums nicht zu erkennen. Zellkerne sind mittels Hoechst-Farbstoff blau gefärbt

Immunogenität Viele Autoren vertreten die Hypothese, dass die allogene Transplantation humaner embryonaler Stammzellen bzw. ESKM zu einer Abstoßung der Zellen durch das Immunsystem führen (Kehat u. Gepstein 2003; Lee u.

Makkar 2004; Strauer u. Kornowski 2003) und eine immunsuppressive Therapie erforderlich machen wird. Nach Transplantation muriner embryonaler Stammzellen in infarzierte Mäuseherzen fand sich eine deutliche zelluläre und humorale Immunantwort (Kofidis et al. 2005; Swijnenburg et al. 2005), die diese Hypothese untermauert. In einer 2005 veröffentlichten Arbeit (Drukker et al. 2006) über die Immunogenität humaner embryonaler Stammzellen konnte hingegen gezeigt werden, dass diese (undifferenziert und differenziert) nur wenig immunogen sind. Eine Injektion der Zellen in Mäuse mit humanen Leukozyten („human PBMC-reconstituted Trimera mouse model“) (Drukker et al. 2006) rief eine schwache Immunantwort hervor. Ebenso zeigten sich nach Transplantation muriner ESKM in infarzierte Rattenherzen keine Anzeichen einer Immunantwort (Hodgson et al. 2004). Ein Vergleich zwischen einer Transplantation muriner ESKM in infarzierte Schafherzen mit und ohne Immunsuppression ergab sogar eine Überlegenheit der Gruppe ohne Immunsuppression hinsichtlich der Steigerung der linksventrikulären Ejektionsfraktion (LVEF) (Menard et al. 2005). Zeichen einer Immunrejektion wurden nicht gefunden. Obwohl die Immunogenität embryonaler Stammzellen bzw. daraus differenzierter Kardiomyozyten derzeit nicht abschließend beurteilt werden kann, ist davon auszugehen, dass bei einer Transplantation embryonaler Stammzel-

429 4.4 · Medizinische Perspektiven der kardialen Stammzellforschung

len im Gegensatz zur Organtransplantation eine stark immunsuppressive Therapie nicht notwendig sein wird. Darüber hinaus werden bereits Strategien entwickelt, die eine Vermeidung der Abstoßung zum Ziel haben (7 4.4.6). Teratogenität In den genannten Transplantationsstudien mit murinen ESKM (Hodgson et al. 2004; Menard et al. 2005) fanden sich keinerlei Hinweise auf eine Entstehung von Teratomen oder Teratokarzinomen. Auch bei einer Transplantation humaner ESKM in Schweineherzen mit komplettem AV-Block (Kehat et al. 2004; Xue et al. 2005) oder infarzierte Mäuseherzen (Kofidis et al. 2006) zeigten sich keine Zeichen einer Tumorentstehung. Die Injektion undifferenzierter oder aus Teratomen stammender differenzierter humaner embryonaler Stammzellen in Mäuse mit humanen Leukozyten führte hingegen zur Entwicklung von Teratomen (Drukker et al. 2006), ebenso die Transplantation undifferenzierter muriner embryonaler Stammzellen in infarzierte Mäuseherzen (Swijnenburg et al. 2005). In diesem Zusammenhang könnte für die kardiale Zelltherapie eine Untersuchung von Erdo et al. (2004) zur Zelltherapie des Schlaganfalls von Bedeutung sein: Die Transplantation muriner embryonaler Stammzellen führte zu einer Bildung von Teratokarzinomen bei homologer Transplantation in Mäuse, nicht jedoch bei Xenotransplantation in Ratten. Da die Applikation humaner ESKM in Tiermodellen stets xenogen ist, ist daher unklar, ob solche Modelle überhaupt zum Ausschluss der Teratogenität geeignet sind. Zurzeit kann also nicht ausgeschlossen werden, dass die Transplantation embryonaler Stammzellen oder ESKM ein teratogenes Risiko birgt. Es ist jedoch davon auszugehen, dass dieses Risiko mit zunehmender Differenzierung der Zellen abnimmt, was für eine Selektion möglichst reifer ESKM („lineage selection“) zum Zwecke der Transplantation spricht (Doss et al. 2004). Kultivierung, Differenzierung und Selektionierung großer Zellmengen Für die Zelltherapie des Myokardinfarkts werden große Zellmengen benötigt. Bei der bislang einzigen Studie zur Transplantation von ESKM im Großtiermodell wurden beispielsweise 30u106 Zellen pro Tier injiziert (Menard et al. 2005), bei den klinischen Studien zur Transplantation adulter Stammzellen zwischen 2,8u107 (Strauer et al. 2002) und 2,5u109 (Wollert et al. 2004) Zellen. Theoretisch können embryonale Stammzellen und ESKM in unbegrenzter Menge produziert werden. Unter Verwendung aktuell gebräuchlicher Kultur- und Differenzierungsprotokolle setzt die Herstellung einer für Transplantationen ausreichenden Menge von ESKM jedoch immer noch äußerst aufwendige Zellkulturarbeiten vor-

4.4

aus. Um eine Gewinnung ausreichender Zellmengen für die Zelltherapie zu realisieren, wurden bereits eine Reihe von Modifikationen der Kultur- bzw. Differenzierungsprotokolle vorgenommen. Die Zugabe verschiedener Faktoren (z. B. Retinolsäure) (Wobus et al. 1997), TGFE-2 (Kumar u. Sun 2005), BMP-2 (Kawai et al. 2004) führte zu einer Erhöhung der Rate kardialer Differenzierung bei murinen embryonalen Stammzellen, die vermutlich über eine gesteigerte Expression von Transkriptionsfaktoren der GATA-Familie sowie Nkx-2.5 vermittelt wurde (Sachinidis et al. 2003a). Bei humanen embryonalen Stammzellen zeigte sich durch Zugabe von 5-Azacytidin eine geringe Erhöhung der Differenzierungsrate, jedoch nur bei Applikation in einem definierten Zeitraum des Kultivierungsprozesses (Xu et al. 2002). Bei einer zu frühen Gabe des 5-Azacytidin wurde ein gegenteiliger Effekt erzielt. Durch eine Kokultivierung humaner embryonaler Stammzellen mit END-2Zellen („murine visceral endoderm-like cells“) (Mummery et al. 2003) sowie eine serumfreie Kultivierung (Passier et al. 2005) konnte die Anzahl kardial differenzierter Zellen deutlich gesteigert werden. Die Förderung kardialer Differenzierung durch serumfreie Kultivierung war zuvor auch für murine embryonale Stammzellen beschrieben worden (Sachinidis et al. 2003b). Neben einer Optimierung der Kultivierung und Differenzierung embryonaler Stammzellen, mit dem Ziel, große Mengen von ESKM herzustellen, ist es für einen Einsatz dieser Zellen in der Zelltherapie wichtig, kardial differenzierte Zellen hochgradig aufzureinigen, um die Bildung von Teratomen oder Teratokarzinomen durch eine unkontrollierte Proliferation undifferenzierter Stammzellen zu vermeiden. Die Selektionierung kardialer Zellen („lineage selection“) kann bei murinen Stammzellen über verschiedene Mechanismen erfolgen. Da ESKM schlagende Areale innerhalb der „embryoid bodies“ (multizelluläre Aggregate, die während der Kultivierung embryonaler Stammzellen spontan entstehen) ausbilden, kann eine grobe Aufreinigung kardial differenzierter Zellen durch ein Herausschneiden der schlagenden Areale aus den Embryoid bodies erfolgen. Diese Technik zur Selektionierung von ESKM wird auch bei humanen embryonalen Stammzellen verwendet (Kehat et al. 2004; Reppel et al. 2004). Für eine höhergradige Selektionierung werden genetische Modifikationen genutzt. Dabei erfolgt die Expression eines grün fluoreszierenden Proteins (GFP) oder einer Antibiotikaresistenz unter der Kontrolle eines spezifischen kardialen Promotors (z. B. „myosin light chain-2v“, „D-cardiac myosin heavy chain“). Anhand der GFP-Fluoreszenz kardial differenzierter Zellen kann dann mittels eines FACS-Geräts („fluorescence activated cell sorting“) eine Selektionierung der Zellen erfolgen (Müller et al. 2000) (> Abb. 4.4.3), oder eine Zugabe von Antibiotika führt zur gezielten Eli-

430

Sektion 4 · Therapie

a

b

. Abb. 4.4.3a,b. Aufreinigung ventrikulär differenzierter muriner ESKM. Ausschließlich ventrikulär differenzierte Zellen exprimieren GFP (grün fluoreszierendes Protein) unter dem ventrikelspezifischen Promotor MLC-2v. a Immunhistochemische Färbungen GFP-positiver Zellen. Die Zellen sind positiv für die Sarkomerproteine MHC (1), D-Aktinin (2), f-Aktin (3) und Troponin I (4). b FACS-Sortierung. Im

Anschluss an die fluoreszenzaktivierte Sortierung der Zellen weisen die ventrikulär differenzierten ESKM eine Reinheit von 97% auf. Die Intensität der grünen Fluoreszenz ist gegen den „forward scatter“, ein indirektes Maß für die Zellgröße, aufgetragen [aus Müller et al. (2000), mit freundlicher Genehmigung des FASEB Journals]

minierung nichtkardial differenzierter und undifferenzierter Zellen, da nur kardial differenzierte Zellen die Antibiotikaresistenz aufweisen (Zandstra et al. 2003). Entsprechende Verfahren zur Aufreinigung humaner ESKM wurden bislang nicht beschrieben. Trotz der hohen Effizienz der genannten Verfahren, die eine mehr als 90%ige Aufreinigung ermöglichen, darf nicht außer Acht gelassen werden, dass die große Menge von Zellen, die bei einer Transplantation injiziert werden, immer noch eine nicht zu vernachlässigende Anzahl nichtkardial differenzierter Zellen beinhaltet, aus denen sich Tumoren entwickeln könnten. Eine theoretische Effizienz der Selektionierung von 99% hätte beispielsweise bei einer Transplantation von 108 Zellen zur Folge, dass immer noch 106 nichtkardial differenzierte Zellen bzw. undifferenzierte Stammzellen transplantiert würden. Für eine sichere Zelltherapie mit ESKM ist daher eine Aufreinigung der Zellen auf 100% ESKM-Anteil anzustreben. Sowohl die Techniken zur Aufreinigung humaner ESKM als auch die zur Kultivierung und Differenzierung humaner embryonaler Stammzellen sind aktuell auf einem Entwicklungsstand, der eine Transplantation in klinischen Studien nicht ermöglicht. Aufgrund ihrer Fähigkeit zur unbegrenzten Proliferation und kardialen Differenzierung sind embryonale Stammzellen jedoch der aussichtsreichste Kandidat für einen zukünftigen Einsatz in der Zelltherapie.

bislang nicht beschrieben worden (Hodgson et al. 2004). Befürchtungen hinsichtlich des arrhythmogenen Potenzials basieren lediglich auf einer In-vitro-Untersuchung an murinen ESKM (Zhang et al. 2002), bei denen eine Heterogenität der Aktionspotenzialdauer und -aufstrichgeschwindigkeit nachgewiesen wurde. Außerdem konnten bei diesen Zellen leicht frühe und späte Nachpotenziale induziert werden. Über die Verwendung humaner ESKM zur Therapie des Myokardinfarkts liegt bislang lediglich eine tierexperimentelle Studie vor (Kofidis et al. 2006), in der die funktionelle Integration der applizierten Zellen sowie das Auftreten von Arrhythmien nicht untersucht wurden. Zur Zellersatztherapie bradykarder Arrhythmien mittels humaner ESKM liegen zwei tierexperimentelle Studien vor (Kehat et al. 2004; Xue et al. 2005). Durch eine In-vivo-Implantation humaner ESKM in die Ventrikelwand adulter Herzen des Schweins bzw. Meerschweinchens mit komplettem AV-Block konnte in beiden Studien ein vom Implantationsort ausgehender Ersatzrhythmus erzeugt werden. Ob humane ESKM unter den von diesem experimentellen Ansatz stark abweichenden Bedingungen einer Applikation in infarziertes Gewebe, bei der die atrioventrikuläre Überleitung intakt wäre und die ESKM einer Fremderregung durch das umliegende Ventrikelmyokard unterlägen, ebenfalls ektope Erregungen hervorrufen könnten, kann anhand dieser Studien nicht beurteilt werden. Außerdem konnte nicht geklärt werden, ob die transplantierten humanen ESKM eine elektrische Kopplung mit den adulten Kardiomyozyten des Ventrikelmyokards eingingen und selbst einen neuen Schrittmacher bildeten, oder ob die

Arrhythmogenität und funktionelle Integration Die Entwicklung von Arrhythmien nach einer Transplantation muriner ESKM in infarziertes Myokard ist

431 4.4 · Medizinische Perspektiven der kardialen Stammzellforschung

4.4

. Tab. 4.4.1. Vor- und Nachteile von ESKM und adulten Stammzellen bezüglich eines Einsatzes in der Zelltherapie. Zelltyp

Aus embryonalen Stammzellen differenzierte Kardiomyozyten (ESKM)

Adulte Stammzellen

Vorteile

– unlimitierte Proliferation der undifferenzierten Stammzellen – Pluripotenz – kardiale Differenzierung

– autologe Gewinnung – Gewinnung großer Zellzahlen möglich (abhängig vom Subtyp) – Einsatz in klinischen Studien bereits erfolgt

Nachteile

– – – –

– kardiale Differenzierung fraglich – aufwendige Aufreinigung/ Massenkultur (abhängig vom Subtyp) – Kalzifizierungsrisiko

Risiko einer Immunabstoßung Tumorrisiko Arrhythmierisiko Einsatz in klinischen Studien vermutlich erst in > 10 Jahren – aufwendige Aufreinigung/ Massenkultur

angrenzenden adulten Kardiomyozyten, z. B. durch parakrine Effekte, zur Ausübung der Schrittmacherfunktion angeregt wurden. Hierdurch wird evident, dass die Erforschung der Arrhythmogenität, einschließlich genauer Pathomechanismen und möglicher Gegenmaßnahmen, eine Untersuchung der funktionellen Integration der ESKM in adultes kardiales Gewebe voraussetzt. Eine solche Untersuchung liegt derzeit nicht vor. In den o. g. Arbeiten zur Transplantation humaner ESKM in Herzen mit komplettem AV-Block (Kehat et al. 2004; Xue et al. 2005) wurde die Frage nach der funktionellen Integration, die in vivo aufgrund technischer Limitationen nicht beantwortet werden konnte, in einem weiteren experimentellen Ansatz in vitro untersucht. Beide Arbeitsgruppen etablierten dazu eine Kokultur humaner ESKM mit neonatalen Kardiomyozyten der Ratte auf „microelectrode arrays“ (Kulturschalen mit 60 in den Boden integrierten Ableitelektroden zur zweidimensionalen Messung der Erregungsausbreitung; > Abb. 4.4.7). Mittels der Microelectrode arrays konnte nachgewiesen werden, dass elektrische Kopplungen zwischen Arealen mit ESKM und Arealen mit neonatalen Kardiomyozyten ausgebildet wurden und eine Erregungsweiterleitung zwischen den Arealen in beide Richtungen möglich war, d. h., dass eine funktionelle Integration stattfand. Der Nachweis einer strukturellen Integration erfolgte durch eine immunhistologische Darstellung von gap junctions im Grenzgebiet zweier Areale mit unterschiedlichen Zelltypen. Obwohl diese Untersuchungen zweifelsfrei gezeigt haben, dass in vitro eine strukturelle und funktionelle Kopplung zwischen humanen ESKM und neonatalen Kardiomyozyten der Ratte stattfinden kann, kann anhand dieser Untersuchungen weder die Qualität bzw. Arrhythmogenität der Integration in vivo beurteilt werden, noch können Rückschlüsse auf eine Integration in adultes Myokard gezogen werden. Aussagen über das Arrhythmierisiko einer Transplantation von ESKM im

Rahmen der Zelltherapie können also anhand dieser Untersuchungen nicht getroffen werden. Zur abschließenden Beurteilung des Arrhythmierisikos einer Transplantation von ESKM sowie deren funktioneller Integration sind daher weitere Studien notwendig. Die Gefahr schwerwiegender Arrhythmien muss derzeit als gering eingeschätzt werden, da die Transplantation muriner ESKM in infarziertes Myokard bislang keine Hinweise auf eine Entstehung von Arrhythmien ergeben hat.

4.4.2.3 Adulte Stammzellen Der Begriff adulte Stammzellen beschreibt nichtausdifferenzierte Zellen des menschlichen Körpers, die dazu fähig sind, 1. sich in unbegrenztem Maße unter Bewahrung des nichtausdifferenzierten Zustands zu teilen und 2. sich zu spezialisierten Zellen zu differenzieren. Adulte Stammzellen konnten bereits in einer Vielzahl von Organen nachgewiesen werden, z. B. im Knochenmark, Gehirn, Leber, Fett und in der Haut (Mummery 2004). Subtypen Die Entnahme adulter Stammzellen für die Zelltherapie am Herzen erfolgt aus dem Knochenmark oder aus zirkulierendem Blut (Britten et al. 2003). Beide Quellen enthalten keine homogene Stammzellpopulation, sondern setzen sich aus einer Vielzahl unterschiedlicher Subtypen adulter Stammzellen zusammen. Darüber hinaus enthalten beide Quellen sogenannte Vorläuferzellen („progenitor cells“), die ein Zwischenstadium der Entwicklung adulter Stammzellen zu spezialisierten Zellen darstellen und ebenfalls im Rahmen der Zelltherapie verwendet werden. Subtypen bzw. Vorläuferzellen sind

432

Sektion 4 · Therapie

beispielsweise hämatopoetische Stammzellen, „sidepopulation“- (SP-)Zellen, mesenchymale Stammzellen (auch „marrow stromal cells“ genannt), „multipotent adult progenitor cells“ (MAPCs), CD133+-Zellen und endotheliale Vorläuferzellen. Auch diese Subtypen stellen keine streng homogene Population dar, sondern können anhand einer heterogenen Verteilung von Oberflächenmarkern in weitere Untergruppen aufgeteilt werden. In den meisten Studien zur Zelltherapie werden mononukleäre Knochenmarkstammzellen verwendet, d. h., dass Knochenmark aspiriert wird und über einen Dichtegradienten (z. B. Ficoll-Gradient) von Thrombozyten und Erythrozyten getrennt wird (Strauer et al. 2002). Dabei findet keine Selektionierung von Subtypen statt, hämatopoetische Stammzellen dominieren die inhomogene Stammzellpopulation. Dieses einfache Verfahren erlaubt die Gewinnung ausreichender Mengen autologer Stammzellen für eine Transplantation. Eine Transplantation aufgereinigter Subtypen kann ebenfalls durchgeführt werden. Die Gewinnung mesenchymaler Stammzellen, eines Subtyps der mononukleären Knochenmarkstammzellen, der sich durch Adhäsion in Kultur auszeichnet, erfolgt beispielsweise durch Kultivierung des Knochenmarkaspirats (Chen et al. 2004). CD133+ Zellen können z. B. durch eine Markierung mit Ferrit unter Verwendung eines MACS-Geräts („magnetic cell separation“) selektioniert werden (Stamm et al. 2003). Die Zahl der Subtypen, die anhand der Expression von Oberflächenmarkern unterschieden werden können und zur Zelltherapie verwendet werden könnten, ist kaum zu überschauen. Eine detaillierte Darstellung der Subtypen ginge über den Rahmen dieses Kapitels hinaus, weshalb im Folgenden generelle Aspekte adulter Stammzellen (und Vorläuferzellen) geschildert werden. Zu beachten ist außerdem, dass auch die gegenwärtig verwendeten Subtypen immer noch eine heterogene Zellpopulation darstellen, weshalb der Beitrag verschiedener Subtypen-Untergruppen zu beobachteten Effekten in Zelltherapiestudien derzeit nicht genau beurteilt werden kann. Transdifferenzierung Während embryonale Stammzellen pluripotent sind, d. h. zu Zelltypen aller drei Keimblätter differenzieren können, ist die Potenz adulter Stammzellen (einschließlich der verschiedenen Subtypen und Vorläuferzellen) zurzeit umstritten. Während man zunächst davon ausging, dass adulte Stammzellen nur innerhalb begrenzter Zelllinien zu spezialisierten Zellen heranreifen (z. B. hämatopoetische Stammzellen nur zu spezialisierten Zellen des Bluts), wurde 2001 von Orlic et al. behauptet, dass aus Knochenmark gewonnene adulte Stammzellen zu einer kardialen Differenzierung (auch als Transdifferen-

zierung oder Plastizität bezeichnet) fähig sind (Orlic et al. 2001). Aus in vivo in infarzierte Mäuseherzen injizierten Knochenmarkstammzellen wurde angeblich neues Myokard einschließlich neuer Gefäße gebildet. Diese viel beachteten Ergebnisse konnten bislang trotz einer Vielzahl von Versuchen von renommierten Arbeitsgruppen nicht reproduziert werden (Murry et al. 2004). Stattdessen fanden sich Belege für das Auftreten von Fusionen zwischen nativen Kardiomyozyten und Knochenmarkstammzellen (Alvarez-Dolado et al. 2003; Nygren et al. 2004) (> Abb. 4.4.4), die die von Orlic et al. gemachten Beobachtungen erklären könnten. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass zur Evaluation der Transdifferenzierung verwendete, auf Fluoreszenzmarkern basierende Methoden (FACS, Fluoreszenzmikroskopie) nicht geeignet sind, eine Transdifferenzierung von einer Autofluoreszenz oder einem Übereinanderliegen von nicht transdiffenzierten Stammzellen und nativen Kardiomyozyten sicher zu unterscheiden (Gruh et al. 2006). Eine Transdifferenzierung (Expression herzspezifischer Marker) ohne Zellfusion konnte, mit geeigneten Methoden, bei einem experimentellen Ansatz nachgewiesen werden, bei dem Knochenmarkstammzellen mit embryonalem Myokard kokultiviert wurden bzw. in lebende Hühnerembryonen injiziert wurden (Eisenberg et al. 2006). Ein vergleichbarer Ansatz einer Kokultur adulter Stammzellen mit neonatalen Kardiomyozyten ergab jedoch, dass zwar eine Expression kardialer Marker und Ionenkanäle in den adulten Stammzellen induziert wurde, in elektrophysiologischen Patch-clampMessungen jedoch keine funktionelle Relevanz der molekularbiologischen Ergebnisse nachgewiesen werden konnte (Lagostena et al. 2005). Ob eine kardiale Differenzierung von Knochenmarkstammzellen nach Transplantation in infarzierte Herzen tatsächlich auftritt oder zumindest durch bestimmte Bedingungen induziert und therapeutisch genutzt werden kann, kann daher aktuell nicht abschließend beurteilt werden. Damit bleibt offen, ob ein exogener Ersatz untergegangenen Myokards im Sinne einer Zellersatztherapie mithilfe adulter Knochenmarkstammzellen jemals realisiert werden kann. Parakrine Effekte und Neovaskularisation Unabhängig von einem exogenen Ersatz untergegangenen Myokards wurden alternative Wirkungsmechanismen der Therapie mit adulten Stammzellen beschrieben, die einen Einsatz auch ohne Transdifferenzierung begründen könnten. Diesen alternativen Mechanismen ist gemeinsam, dass sie das Überleben bzw. die Funktionsfähigkeit von Kardiomyozyten des Empfängers fördern, anstatt untergegangene Kardiomyozyten zu ersetzen. Neben der durch das Infarktgeschehen akut hervor-

433 4.4 · Medizinische Perspektiven der kardialen Stammzellforschung

a

b

4.4

c

. Abb. 4.4.4a–c. Zellfusion statt Transdifferenzierung. Bei transgenen Mäusen (GFP-positives Knochenmark, lacZ-positive native Kardiomyozyten) (Details s. Nygren et al. 2004) wurde ein Infarkt durch Ligatur der linken Koronararterie induziert. GFP-markierte adulte Knochenmarkstammzellen wurden durch Zytokine mobilisiert und wanderten in das infarzierte Herz ein. Nach 28 Tagen durchgeführte histologische Untersuchungen bestätigten das Auftreten von Fusionen zwischen Knochenmarkstammzellen und nativen Kardiomyozyten. Eine Transdifferenzierung der Knochenmarkstammzellen

trat hingegen nicht auf. a Für GFP (grün) und D-Aktinin (rot) positiver Kardiomyozyt. b X-gal-Färbung (blau; Färbung tritt nur bei Expression des lacZ-Gens auf ) des in a dargestellten Kardiomyozyten. Die blaue Färbung der GFP-positiven Zelle belegt die Zellfusion, da GFP nur in Knochenmarkstammzellen und lacZ nur in nativen Kardiomyozyten exprimiert wird. c Kernfärbung durch Hoechst-Farbstoff (blau). Die dargestellte GFP-positive Zelle besitzt zwei Zellkerne, ein weiterer Beleg für eine Zellfusion [aus Nygren et al. (2004), mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group]

gerufenen Nekrose der Kardiomyozyten im Gebiet absoluter Ischämie wird der Untergang funktionellen Myokards durch Remodeling-Prozesse bestimmt, bei denen Apoptose und Fibrosierung pathophysiologisch von Bedeutung sind. Diese Prozesse können durch eine Transplantation adulter Stammzellen beeinflusst werden. Dies geschieht u. a. über eine Stimulation der Bildung neuer Gefäße (Vaskulogenese) bzw. des Wachstums vorhandener Gefäße (Angiogenese), wodurch die Versorgung im Randgebiet des Infarktes verbessert wird und die Apoptose von Kardiomyozyten sowie die Kollagenbildung vermindert werden (Kocher et al. 2001). Gefäßbildung bzw. -wachstum können sowohl durch eine Differenzierung der transplantierten Stammzellen zu Gefäßzellen (Asahara u. Kawamoto 2004) gefördert werden als auch durch die parakrine Sekretion angiogenetischer Faktoren (Rehman et al. 2003; Vandervelde et al. 2005). Das Wirkungsspektrum von adulten Stammzellen sezernierter Faktoren umfasst neben der Angiogenese auch antiapoptotische Wirkungen und eine Hemmung der Kollagenbildung (Vandervelde et al. 2005). Diese in vitro und tierexperimentell gewonnen Erkenntnisse über potenzielle Wirkmechanismen der Transplantation adulter Stammzellen stellen sicherlich erst den Anfang einer grundlagenwissenschaftlichen Erforschung des therapeutischen Potenzials dieser Zellen dar. Derzeit bestätigen sie aber zumindest, dass adulte Stammzellen unabhängig vom Transdifferenzierungspotenzial auch zukünftig ein Kandidat für die Zelltherapie kardialer Erkrankungen sein könnten.

Arrhythmogenität und funktionelle Integration Da eine Transdifferenzierung adulter Stammzellen zu voll funktionsfähigen Kardiomyozyten umstritten ist, ist davon auszugehen, dass im Rahmen aktueller klinischer Studien keine relevante funktionelle Integration transplantierter adulter Stammzellen im Sinne eines aktiven Beitrags zur Kontraktion des Empfängerherzens stattfindet. Trotzdem muss bedacht werden, dass eine gewisse elektrische Kopplung zwischen Empfängerkardiomyozyten und transplantierten adulten Stammzellen auch ohne kardiale Transdifferenzierung vorhanden ist. Humane mesenchymale Stammzellen exprimieren Connexine und bilden intakte Gap junctions mit Kardiomyozyten des Hundes aus (Valiunas et al. 2004). In einem In-vitro-Modell für Erregungsblockierungen, bei dem zwei Areale neonataler Rattenkardiomyozyten durch einen bis zu 450 µm breiten Spalt separiert wurden, konnte eine Erregungsausbreitung zwischen beiden Arealen durch eine Plattierung humaner mesenchymaler Stammzellen in den Spalt erzeugt werden (Beeres et al. 2005). Die Geschwindigkeit der Erregungsausbreitung war jedoch um den Faktor 11 reduziert. Darüber hinaus ergaben intrazelluläre Aktionspotenzialableitungen, dass die Potenziale der Stammzellen ein deutlich reduziertes Ruhemembranpotenzial (23r13 mV) sowie eine stark verminderte Amplitude (15r8 mV) aufwiesen; es lag also kein typisches kardiales Aktionspotenzial vor. Als Folge dieser Inhomogenität der Erregungsausbreitung und der Aktionspotenzialparameter ist eine Induktion von Arrhythmien (Erregungsblockierungen, Reentry-Tachykardien) durch eine Transplantation adulter Stammzellen theoretisch nicht auszuschlie-

434

Sektion 4 · Therapie

ßen. In der klinischen Praxis der Transplantation adulter Stammzellen, die aktuell die Therapie mehrerer hundert Patienten umfasst, hat sich bislang jedoch kein Arrhythmierisiko gezeigt. Immunogenität, Teratogenität und Kalzifizierung Da adulte Stammzellen in großen Mengen autolog gewonnen werden können, d. h. Spender und Empfänger identisch sind, besteht keine Gefahr immunologischer Reaktionen aufgrund einer Transplantation. Des Weiteren ist nicht zu erwarten, dass sich aus transplantierten adulten Stammzellen Neoplasien entwickeln. Es besteht jedoch das Risiko, dass unselektierte, aus Knochenmark gewonnene Zellpopulationen osteogene Zellen enthalten, die eine Kalzifizierung des Herzens hervorrufen und dadurch die Herzfunktion beeinträchtigen könnten. Bei Injektion unselektierter Knochenmarkstammzellen (Knochenmarkaspirat ohne Aufreinigung durch Ficoll-Gradienten-Zentrifugation) in infarzierte Herzen der Ratte traten unerwartet starke Kalzifizierungen auf (Yoon et al. 2004), während bei einer Kontrollgruppe, der durch ein Kultivierungsprotokoll aufgereinigte Stammzellen injiziert wurden, keine Kalzifizierungen beobachtet wurden. In den bislang abgeschlossenen klinischen Studien zur Zelltherapie mit mononukleären Knochenmarkstammzellen wurde eine Kalzifizierung nicht beschrieben. Dies deutet darauf hin, dass durch die in den klinischen Studien durchgeführte Ficoll-Gradienten-Zentrifugation osteogene Zellen aussortiert werden und das Kalzifizierungsrisiko deutlich reduziert wird.

4.4.2.4 Myoblasten Satellitenzellen der Skelettmuskulatur bzw. aus diesen entwickelte Myoblasten sind ortsständige Zellen der Skelettmuskulatur, die durch Schädigung reifer Muskelfasern zur Proliferation und Differenzierung angeregt werden und untergegangenes Skelettmuskelgewebe regenerieren können. Da sie lediglich zu Skelettmuskelzellen differenzieren können, sind sie keine Stammzellen, sondern Vorläuferzellen. Sie können autolog gewonnen und durch Kultivierung in großen Mengen hergestellt werden (Menasche et al. 2003). Von Vorteil ist, dass sie keinerlei Abstoßungsreaktionen hervorrufen. Das Risiko einer Bildung von Tumoren besteht ebenfalls nicht. Arrhythmogenität und funktionelle Integration Diese Eigenschaften der Myoblasten führten zu einer der ersten klinischen Studien zur Zelltherapie am Herzen (Menasche et al. 2003), die im Jahre 2000 begann. Vier von zehn im Rahmen dieser Studie behandelten Patienten entwickelten ventrikuläre Tachykardien, die

eine Versorgung der betroffenen Patienten mit AICDs („automatic implantable cardioverter defibrillators“) erforderlich machte. Mehrere darauf folgende kleine Studien zur Transplantation von Myoblasten bestätigten das gehäufte Auftreten von Arrhythmien (Wollert u. Drexler 2005). Laufende multizentrische, randomisierte, kontrollierte und doppelblinde Studien zur Zelltherapie mit Myoblasten haben daher als Einschlusskriterium eine Versorgung (vorbestehend oder Implantation im Rahmen der Studie) des Patienten mit einem AICD (Menasche 2005; Smits 2004). Diese fortlaufende klinische Verwendung von Myoblasten trotz des bekannten Risikos ist ethisch umstritten. Befürworter der Zelltherapie mit Myoblasten verweisen darauf, dass alle bislang durchgeführten kleinen Studien aufgrund des Studiendesigns nicht klar belegen konnten, dass die aufgetretenen Arrhythmien durch die Transplantation der Myoblasten verursacht wurden und nicht durch die vorhandene Grunderkrankung der Patienten (Menasche 2005). In den vor Beginn klinischer Studien durchgeführten tierexperimentellen Studien waren keine lebensgefährlichen Arrhythmien beobachtet worden (Smits 2004). Eine funktionelle Integration von Myoblasten in das Empfängermyokard findet nicht statt. In-vitro-Kokulturen von Myoblasten und neonatalen Kardiomyozyten der Ratte zeigten, dass keine suffiziente Erregungsausbreitung durch Myoblastenareale möglich ist (Beeres et al. 2005). Intrazelluläre Ableitungen in infarzierten Rattenventrikeln nach In-vivo-Transplantation von Myoblasten bestätigten die fehlende Kopplung zwischen Myoblasten und Empfängermyokard (Leobon et al. 2003). Da Skelettmuskelzellen, also die physiologischen „Nachkommen“ der Myoblasten, keine Gap junctions besitzen und eine Erregungsausbreitung zwischen Skelettmuskelfasern nicht stattfindet, sondern jede Muskelfaser separat neuronal erregt wird, überraschen diese Ergebnisse nicht.

4.4.3 Therapeutischer Nutzen der Stammzelltherapie des Myokardinfarkts – Ergebnisse bisheriger Studien 4.4.3.1 Studien mit Kardiomyozyten aus embryonalen Stammzellen Die Transplantation von ESKM wurde bislang ausschließlich in Tierexperimenten angewandt. Zunächst durchgeführte Transplantationen muriner ESKM in infarzierte Herzen der Maus oder Ratte ergaben, dass die intramyokardial injizierten Zellen auch Wochen nach der Transplantation noch histologisch im Empfängerherzen nachweisbar waren und zu einer Verbesserung

435 4.4 · Medizinische Perspektiven der kardialen Stammzellforschung

4.4

darin eine signifikante Steigerung der LVEF im Vergleich zu Kontrolltieren. Bei zwei Studien zur Transplantation humaner ESKM in nichtinfarzierte Herzen erfolgte die Injektion in den Ventrikel von Schweinen (Kehat et al. 2004) bzw. Meerschweinchen (Xue et al. 2005) mit einem kompletten AV-Block. In beiden Untersuchungen konnte ein vom Transplantationsgebiet ausgehender Ersatzrhythmus nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis ist in doppelter Hinsicht bedeutsam, da es zum einen Hinweis auf die Gefahr ektoper Arrhythmien nach Zelltransplantation gibt (7 4.4.2.2) und zum anderen ein weiteres therapeutisches Einsatzgebiet von ESKM aufzeigt, nämlich die Therapie bradykarder Arrhythmien durch einen „biologischen“ Schrittmacher. Die bislang durchgeführten tierexperimentellen Studien legen nahe, dass eine Verbesserung der Herzfunktion im Anschluss an einen Myokardinfarkt durch eine Transplantation von ESKM potenziell erreichbar ist. Eine intensive Fortführung der Forschung an embryonalen Stammzellen ist sinnvoll und in Anbetracht der vielversprechenden tierexperimentellen Ergebnisse unerlässlich. . Abb. 4.4.5a,b. Langanhaltende Verbesserung der LVEF nach Applikation muriner ESKM in infarzierte Herzen der Ratte. a M-Mode Echokardiographie-Aufnahmen 12 Wochen nach Applikation muriner ESKM (Therapiegruppe, rechts) bzw. Medium-Injektion (Kontrollgruppe, links) belegen eine Dilatation sowie eine verminderte LVEF in der Kontrollgruppe im Vergleich zur Therapiegruppe. b Echokardiographische Untersuchungen 3, 6, 9 und 12 Wo-chen nach Injektion zeigen, dass die Verbesserung der LVEF bereits nach 3 Wochen nachweisbar ist und während des gesamten Nachuntersuchungszeitraums stabil anhält [aus Hodgson et al. (2004), mit freundlicher Genehmigung der American Physiological Society]

der Herzfunktion, der Vaskularisierung und des Überlebens (im Vergleich zu Kontrolltieren mit Myokardinfarkt und Injektion von zellfreiem Medium) führten (Hodgson et al. 2004; Min et al. 2003; Xiao 2003) (> Abb. 4.4.5). 2005 wurde die erste und bislang einzige Studie am Großtiermodell veröffentlicht, bei der murine ESKM in infarzierte Herzen des Schafs injiziert wurden (Menard et al. 2005). Vier Wochen nach der Transplantation (die Transplantation erfolgte 2 Wochen nach Infarkt) war die linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF) um durchschnittlich 6,6% gestiegen, während sie bei Kontrolltieren (Infarkt und Injektion von zellfreiem Medium) im Mittel um 9,9% gefallen war (verglichen mit 2 Wochen nach dem Infarkt bzw. unmittelbar vor der Transplantation). Zur Transplantation humaner ESKM in infarzierte Herzen existiert momentan lediglich eine Studie (Kofidis et al. 2006). Eine intramyokardiale Injektion der humanen ESKM in infarzierte Herzen der Maus bewirkte

4.4.3.2 Studien mit adulten Stammzellen Veränderungen der LVEF Adulte Stammzellen werden seit mehreren Jahren im Rahmen klinischer Studien zur Behandlung des Myokardinfarktes verwendet. Wichtige Ergebnisse bislang durchgeführter klinischer Studien sind in > Tab. 4.4.2 zusammengefasst. Die ersten Studien, die eine kleine Patientenzahl aufwiesen und nicht alle Gütekriterien klinischer Studien erfüllten (nicht randomisiert, doppelblind und kontrolliert), zeigten, dass die Transplantation autologer adulter Stammzellen, unabhängig vom verwendeten Subtyp (mononukleäre Knochenmarkstammzellen, mesenchymale Stammzellen, endotheliale Vorläuferzellen), keine Nebenwirkungen hervorrief und zu einer Steigerung der LVEF führte (Assmus et al. 2002; Strauer et al. 2002; Wollert et al. 2004). Die randomisierte und kontrollierte BOOST-Studie (Wollert et al. 2004) zur intrakoronaren Applikation mononukleärer Knochenmarkstammzellen ergab beispielsweise, dass die LVEF in der Therapiegruppe 6 Monate nach Zellgabe um durchschnittlich 6,7% zugenommen hatte, in der Kontrollgruppe hingegen nur um 0,7%. 18 Monate nach Zellgabe waren jedoch keine signifikanten Unterschiede in der LVEF beider Gruppen mehr nachweisbar (Cleland et al. 2006). Die erste randomisierte, doppelblinde und kontrollierte klinische Studie zur intrakoronaren Injektion mononukleärer Knochenmarkstammzellen zeigte ebenfalls keine signifikante Steigerung der LVEF

436

Sektion 4 · Therapie

. Tab. 4.4.2. Klinische Studien zur Zelltherapie des Myokardinfarkts mit adulten Stammzellen. Abkürzungen: i.c., intrakoronar; i.m., intramyokardial; Ktrl., Kontrollpatienten; MNC, mononukleäre Knochenmarkstammzellen; CPC, zirkulierende Progenitorzellen; MSC, mesenchymale Stammzellen; LVEF, linksventrikuläre Ejektionsfraktion (mit Angabe der Veränderung der mittleren LVEF); LVEDV, linksventrikuläres enddiastolisches Volumen. Studie

Fallzahl

Gabe

Zelltyp

Ergebnisse Verbesserungen

Komplikationen

(Strauer et al. 2002)

10 (10 Ktrl.)

i.c.

MNC

myokardiale Perfusion, kontraktile Funktion

Keine

(Assmus et al. 2002) (TOPCARE-AMI)

59 (11 Ktrl.)

i.c.

MNC, CPC

LVEF (+8,5%; bei Ktrl. +1,5%) , regionale Wandbewegung, Infarktgröße, Koronarfluss

Keine

(Wollert et al. 2004) (BOOST)

30 (30 Ktrl.)

i.c.

MNC

LVEF (+6,7%, bei Ktrl. +0,7%), regionale Wandbewegung

Keine

(Stamm et al. 2003)

6 (0 Ktrl.)

i.m.

CD133+

myokardiale Perfusion

supraventrikuläre Tachykardien bei 2 Patienten

(Chen et al. 2004)

34 (35 Ktrl.)

i.c.

MSC

LVEF (+18%, bei Ktrl. +5%), regionale Wandbewegung, Infarktgröße, LVEDV

Keine

(FernandezAviles et al. 2004)

20 (13 Ktrl.)

i.c.

MNC

LVEF (+5,8%, bei Ktrl. keine signifikante Veränderung), regionale Wandbewegung

Keine

(Janssens et al. 2006)

33 (34 Ktrl.)

i.c.

MNC

regionale Wandbewegung, Infarktgröße, NICHT LVEF

Keine

(Schächinger et al. 2006) (REPAIR-AMI)

101 (103 Ktrl.)

i.c.

MNC

LVEF (+6%, bei Ktrl. +3%)

Keine

(Lunde et al. 2005) (ASTAMI)

52 (49 Ktrl.)

i.c.

MNC

NICHT LVEF, NICHT Infarktgröße, NICHT LVEDV

Keine

(im Vergleich zur Kontrollgruppe), sondern lediglich eine signifikante Reduktion der Infarktgröße und der regionalen Wandfunktion (Janssens et al. 2006). Die ASTAMI-Studie, die auch randomisiert, doppelblind und kontrolliert durchgeführt wurde, bestätigte die fehlende Verbesserung der LVEF in der Therapiegruppe (Cleland et al. 2006; Lunde et al. 2005). Verglichen mit der Kontrollgruppe zeigte sich sogar eine leichte Verschlechterung der LVEF (1,2% vs. 4,3% nach 6 Monaten). In der REPAIR-AMI-Studie (ebenfalls randomisiert, doppelblind und kontrolliert) (Cleland et al. 2006; Schächinger et al. 2006)war die Steigerung der LVEF in der Therapiegruppe hingegen signifikant größer als in der Kontrollgruppe (6% vs. 3%). Applikationsmodus Die Applikation von Zellen in infarzierte Herzen kann auf verschiedene Arten erfolgen (Wollert u. Drexler 2005): 1. intrakoronar (i.c.) im Rahmen einer Koronarangiographie,

2. transepikardial-intramyokardial (i.m.) bei einer Bypass-Operation oder 3. transendokardial-intramyokardial im Rahmen einer elektrophysiologischen Katheteruntersuchung. Der Einfluss des Applikationsmodus auf den Verbleib applizierter Zellen im Herzen des Schweins wurde kürzlich erstmals szintigraphisch untersucht (Hou et al. 2005). Dabei zeigte sich, dass der Verbleib munonukleärer Zellen aus dem peripheren Blut nach i.m.-Injektion im Vergleich zu einer i.c.-Gabe deutlich erhöht war (11r3% vs. 2,6r0,3% 1 h nach Applikation). Dieses Ergebnis ist insofern wichtig, als dass bei einem Großteil der bislang durchgeführten klinischen Studien die Zellgabe intrakoronar erfolgte. Da die Mechanismen der Zelltherapie unklar sind und in der genannten Studie im Gegensatz zu den klinischen Studien Zellen aus dem peripheren Blut verwendet wurden, müssen die Ergebnisse aber mit Vorsicht interpretiert werden. Insbesondere kann nicht beurteilt werden, ob neben dem Verbleib der Zellen auch die Herzfunktion durch i.m.-Applikation

437 4.4 · Medizinische Perspektiven der kardialen Stammzellforschung

gesteigert werden kann. Diese relevante Fragestellung kann nur durch weiterführende Studien zum Applikationsmodus beantwortet werden. Applikationszeitpunkt und Zellzahl Zurzeit gibt es keine Informationen darüber, zu welchem Zeitpunkt nach einem Myokardinfarkt eine Applikation den größten Nutzen aufweist oder welche Zellzahl idealerweise appliziert werden sollte. Sowohl die Applikationszeitpunkte als auch die Zellzahlen schwanken zwischen den bislang durchgeführten klinischen Studien erheblich [Zeitpunkt nach Infarkt: ca. 2.–6. Tag; Zellzahl: 2,8u107 (Strauer et al. 2002) bis 2,5u109 (Wollert et al. 2004)], wurden aber nicht innerhalb einer Studie systematisch variiert. Bezüglich des idealen Zeitpunkts muss in Erwägung gezogen werden, dass die durch einen Myokardinfarkt hervorgerufene Entzündungsreaktion eine Integration von Stammzellen behindern könnte, was für eine spätere Gabe spricht. Andererseits könnte eine frühere Gabe den Myokarduntergang im Periinfarktgebiet sowie frühe Remodeling-Prozesse positiv beeinflussen. Die bislang durchgeführten, meist kleineren Studien haben die Sicherheit und Machbarkeit der Zelltherapie mit adulten Stammzellen überzeugend belegt. Der therapeutische Nutzen einer Zelltherapie mit adulten Stammzellen kann derzeit jedoch nicht sicher beurteilt werden. Die Rahmenbedingungen der genannten Untersuchungen unterscheiden sich bezüglich der applizierten Subtypen, der Einschlusskriterien, des Applikationsmodus, der Zahl der applizierten Zellen und des Applikationszeitpunkts erheblich. Daher ist es durchaus möglich, dass eine Optimierung der Rahmenbedingungen zu einem signifikanten und reproduzierbaren Nutzen dieser Form der Zelltherapie führen wird. Um die Wirksamkeit zu evaluieren und optimale Rahmen-

. Abb. 4.4.6. Differenzierung muriner embryonaler Stammzellen zu atrialen, ventrikulären und schrittmacherartigen ESKM. In Patchclamp-Messungen an ESKM konnten typische Aktionspotenziale und

4.4

bedingungen zu definieren, sollte die weitere Erforschung der Zelltherapie mit adulten Stammzellen ausschließlich im Rahmen großer, multizentrischer Studien erfolgen.

4.4.4 Elektrophysiologische und molekularbiologische Untersuchungen an humanen ESKM Für einen Einsatz humaner ESKM in der Zelltherapie im Sinne eines exogenen Ersatzes untergegangener Kardiomyozyten sollte gewährleistet sein, dass humane ESKM grundlegende physiologische Eigenschaften humaner Kardiomyozyten aufweisen. Elektrophysiologische und molekularbiologische Untersuchungen ergaben Aufschluss über die physiologischen Eigenschaften von ESKM. Mittels RT-PCR und Immunhistologie konnte die Expression verschiedener mit der kardialen Entwicklung oder Differenzierung in Verbindung stehender Gene nachgewiesen werden, darunter Nkx2.5, Gata-4, kardiales D-Aktin, D-MHC, ANF, Troponin I und T sowie MLC-2V (Segev et al. 2005; Xu et al. 2002). Sowohl humane als auch murine ESKM weisen unterschiedliche kardiomyozytäre Differenzierungstypen auf, die, wie bei adulten Kardiomyozyten, in die 3 Gruppen Schrittmacherzellen, atriale und ventrikuläre Kardiomyozyten unterteilt werden können (He et al. 2003; Maltsev et al. 1994; Mummery et al. 2003) (> Abb. 4.4.6). Während über entwicklungsabhängige Veränderungen der Aktionspotenzialeigenschaften humaner ESKM bislang keine Untersuchungen vorliegen, zeigten Malsev et al. (1994) für murine ESKM, dass zu Beginn der spontanen elektrischen Aktivität (Tag 7+2 bis 7+4) lediglich Ca2+- und „transient outward“-K+-Ströme vorhanden sind, während im weiteren Verlauf der Entwick-

Ionenströme der 3 kardialen Differenzierungstypen nachgewiesen werden [in Anlehnung an Maltsev et al. (1994)]

438

a

Sektion 4 · Therapie

b

d

c

e

. Abb. 4.4.7a–e. β-adrenerge und muskarinerge Modulation humaner ESKM. a „Microelectrode array“ zur multifokalen synchronen Messung kardialer Feldpotenziale. In den Boden eines „microelectrode arrays“ sind 60 Elektroden integriert (in Form eines Quadrats angeordnet), auf denen Kardiomyozyten direkt kultiviert werden können. Die Zellen werden durch den Messvorgang nichtbeeinträchtigt. b Typische kardiale Feldpotenziale. Anhand der Feldpotenzialmessungen kann die Schlagfrequenz des Zellverbands ermittelt werden. Form und Parameter der Feldpotenziale lassen darüber hinaus Rückschlüsse auf Parameter lokaler Aktionspoten-

ziale zu (Halbach et al. 2003). c Humane ESKM auf einem „microelectrode array“. d Physiologische Reaktion bei Gabe des E-AdrenozeptorAgonisten Isoprenalin (Iso). Das mithilfe eines „microelectrode arrays“ gemessene „inter-spike interval“ (ISI) zwischen aufeinander folgenden Feldpotenzialen nimmt ab, d. h., die Schlagfrequenz nimmt zu. e Physiologische Reaktion bei Gabe des m-Cholinozeptor-Agonisten Carbachol (Cch). Das ISI nimmt (temporär) zu, d. h., die Schlagfrequenz wird vermindert [aus Reppel et al. (2004), mit freundlicher Genehmigung der S. Karger AG]

lung (bis Tag 7+18) zusätzlich Na+-, If-, IK1-, IK-, IK,Achund IK,ATP-Ströme auftreten. Die Morphologie der Aktionspotenziale bislang untersuchter muriner und auch humaner ESKM deutet jedoch darauf hin, dass trotz einer zunehmenden Differenzierung der Zellen stets ein embryonales Entwicklungsstadium vorliegt. Anhand pharmakologischer Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass ESKM auf eine Reihe kardioaktiver Substanzen physiologisch reagieren. Isoprenalin, ein Agonist des E-Adrenozeptors, führte bei humanen ESKM zu einer Erhöhung der spontanen Schlagfrequenz und des L-Typ-Ca2+-Stroms (Reppel et al. 2004). Carbachol, ein Agonist muskarinerger Cholinozeptoren, bewirkte eine Senkung der spontanen Schlagfrequenz (Reppel et al. 2004) (> Abb. 4.4.7). Die Aufstrichgeschwindigkeit des Aktionspotenzials humaner ESKM konnte durch den Na+-Kanalblocker Tetrodotoxin (TTX) verringert werden (Satin et al. 2004), die Dauer des Aktionspotenzials durch den Ca2+-Kanalblocker Nifedipin (Satin et al. 2004). Eine Applikation des

HERG-K+-Kanalblockers E4031 rief eine deutliche Verlängerung der Aktionspotenzialdauer hervor (He et al. 2003). Zusammenfassend können diese Ergebnisse als eine Bestätigung grundlegender physiologischer Eigenschaften humaner ESKM gewertet werden. Sowohl die Ausprägung der drei kardialen Differenzierungstypen als auch die Reaktion auf kardioaktive Pharmaka bilden eine vielversprechende Basis für den Einsatz humaner ESKM in der Zelltherapie. Entsprechende Ergebnisse liegen für adulte Stammzellen nicht vor. Neben einem Einsatz in der Zelltherapie stellen humane embryonale Stammzellen auch ein ideales Modell für die entwicklungsbiologische und pharmakologische Forschung dar. Viele Fragestellungen zur Entwicklung des menschlichen Herzens konnten bislang nicht untersucht werden, da In-vivo-Untersuchungen ethisch nicht vertretbar und obsolet sind. Humane embryonale Stammzellen rekapitulieren in vielerlei Hinsicht die menschliche Herzentwicklung und bilden daher ein ge-

439 4.4 · Medizinische Perspektiven der kardialen Stammzellforschung

eignetes Modell für entwicklungsbiologische Fragestellungen. Die präklinische pharmakologische Forschung ist zurzeit auf umfangreiche Tierversuche zu Wirkungen und Nebenwirkungen neu entwickelter Substanzen angewiesen, die erhebliche Kosten verursachen und deren Ergebnisse nur bedingt auf den Menschen übertragbar sind. Humane embryonale Stammzellen haben das Potenzial, als ein neues Modell mit physiologischen Eigenschaften menschlicher Zellen die Zahl der für pharmakologische Tests notwendigen Tierversuche zu reduzieren und zusätzlich eine verbesserte Übertragbarkeit auf den Patienten zu gewährleisten.

4.4.5 Humane ESKM auf dem Weg zum klinischen Einsatz – welche nächsten Schritte sind zu tun? Die Schritte, die auf dem Weg zu einem sicheren und effizienten klinischen Einsatz von humanen ESKM getan werden müssen, sind in > Abb. 4.4.8 dargestellt. 1. Zunächst ist es unerlässlich, die Eigenschaften humaner ESKM in vitro genauestens zu charakterisieren. Insbesondere wird es wichtig sein, entwick-

4.4

lungsbedingte Unterschiede der strukturellen und funktionellen Eigenschaften der Zellen zu erforschen und ein Entwicklungsstadium zu definieren, das optimale Bedingungen für einen Einsatz in der Zelltherapie aufweist. 2. Des Weiteren muss eine gezielte und hochgradige Aufreinigung der am besten geeigneten Zellen erfolgen, um eine optimale Effizienz der Zelltherapie zu erzielen und schwerwiegende Nebenwirkungen, z. B. eine Entstehung von Teratomen durch eine Verunreinigung mit proliferativen pluripotenten Stammzellen, zu vermeiden. Die Selektionierung könnte durch Antibiotikagabe bei selektiver Resistenz der ESKM (Expression eines Resistenzgens unter einem herzspezifischen Promotor) (Klug et al. 1996; Zandstra et al. 2003) oder durch „cell sorting“ nach selektiver Markierung der ESKM (z. B. durch spezifische Antikörper) (Stamm et al. 2003) oder GFP-Expression unter einem herzspezifischen Promotor (Müller et al. 2000) erreicht werden. Neben der hochgradigen Aufreinigung müssen Methoden entwickelt werden, die die Gewinnung ausreichend hoher absoluter Zellzahlen für eine effektive Transplantation ermöglichen.

. Abb. 4.4.8. Humane ESKM auf dem Weg zum klinischen Einsatz – welche nächsten Schritte sind zu tun? (in Anlehnung an Odorico et al. 2001)

440

Sektion 4 · Therapie

3. Im nächsten Schritt müssen Experimente in Tiermodellen durchgeführt werden, um die Effizienz (3a) und die Sicherheit (3b) der Zelltherapie zu belegen. Neben einer Evaluation der Herzfunktion wird eine genaue Erforschung der Mechanismen der Zelltherapie (parakrine Effekte, funktionelle Integration der Zellen einschließlich eines aktiven Beitrags zur Kontraktion des Empfängermyokards) notwendig sein, um eine Optimierung des therapeutischen Nutzens durch gezielte Modifikationen der Mechanismen zu ermöglichen. Der Ausschluss bzw. die Vermeidung einer Immunabstoßung der transplantierten Zellen ist darüber hinaus entscheidend für eine effiziente Zelltherapie. Mögliche Strategien zur Vermeidung einer Immunabstoßung sind neben einer medikamentösen Immunsuppression eine Modifizierung der MHC-Gene (Odorico et al. 2001) oder eine vollständige Reprogrammierung (Cowan et al. 2005) der Erbinformationen (7 4.4.6). Das Risiko einer Tumorbildung muss ebenfalls ausgeschlossen bzw. durch eine Verbesserung der Methodik (z. B. Selektionierung hoch differenzierter Zellen) behoben werden. Zu einem sicheren histologischen Ausschluss sind Langzeitstudien (Beobachtungszeiträume >1 Jahr) notwendig, da sich manche Tumoren sehr langsam entwickeln. Außerdem wird die o. g. Erforschung der funktionellen Integration genutzt werden müssen, um Aufschluss über das arrhythmogene Potenzial humaner ESKM zu erhalten. Erst im Anschluss an die genannten Untersuchungen wird es, einen signifikanten therapeutischen Nutzen und einen Ausschluss schwerwiegender Risiken vorausgesetzt, vertretbar sein, klinische Pilotstudien zu initiieren. Aus heutiger Sicht werden die notwendigen Vorarbeiten wahrscheinlich mehr als eine Dekade in Anspruch nehmen (Strauer u. Kornowski 2003).

diskutiert. Neben einer Modifizierung der MHC-Gene (Odorico et al. 2001) könnte das sog. „nuclear reprogramming“ eine Immunabstoßung verhindern. Ziel dieser Methode ist es, Zellen zu erzeugen, die pluripotent sind (aber kardial differenziert werden können) und die vollständige Erbinformation des Empfängers beinhalten. Dies kann theoretisch durch verschiedene Ansätze erreicht werden: 1. Enukleation einer Eizelle und Injektion eines Zellkerns einer somatischen Zelle des Empfängers (Klonen) 2. Fusion einer embryonalen Stammzelle mit einer somatischen Zelle des Empfängers (Do u. Scholer 2004)

4.4.6.1 Kerntransfer in Eizellen (Klonen) Die durch Klonen reprogrammierte Eizelle kann in vitro bis zum Blastozystenstadium kultiviert werden; der Blastozyste kann dann die innere Zellmasse entnommen werden (7 4.4.2.2), aus der eine embryonale Stammzelllinie etabliert werden kann (therapeutisches Klonen). Aus diesen embryonalen Stammzellen differenzierte geklonte Kardiomyozyten könnten ohne die Gefahr einer immunologischen Abstoßung transplantiert werden. Das therapeutische Klonen menschlicher Zellen ist in Deutschland (im Gegensatz zu England, Schweden, den Niederlanden und vielen anderen Ländern) aufgrund des Embryonenschutzgesetzes aus dem Jahre 1991 verboten. Außerdem gelang es bislang weltweit nicht, menschliche Zellen (nachweisbar) zu klonen. Bei verschiedenen Tierspezies konnte das therapeutische Klonen hingegen bereits realisiert werden (Wakayama et al. 2001).

4.4.6.2 Zellfusion

4.4.6 Reprogrammierungsstrategien Ein großer Vorteil adulter Stammzellen im Vergleich zu embryonalen Stammzellen ist die Möglichkeit einer autologen Gewinnung der Zellen (der Empfänger ist der Spender – Zellen werden z. B. aus dem Knochenmark entnommen und ins Herz transplantiert), weshalb keine Abstoßungsreaktionen zu befürchten sind. Obwohl die Immunogenität humaner embryonaler Stammzellen derzeit nicht hinreichend beurteilt werden kann (7 4.4.2.2) und es durchaus möglich ist, dass eine moderate immunsuppressive Therapie eine Abstoßung humaner ESKM verhindern kann, werden bereits alternative Ansätze zur Vermeidung einer Immunreaktion

Nuclear reprogramming durch eine Fusion adulter somatischer Zellen mit embryonalen Stammzellen stellt eine neue Alternative zum Klonen dar, bei der keine Eizellen benötigt werden, sondern stattdessen eine bereits etablierte embryonale Stammzelllinie verwendet wird. Das Ziel der Reprogrammierung, die adulte somatische Zelle in einen Zustand der Pluripotenz zurückzuversetzen, kann durch diese Methodik erreicht werden. Das Genexpressionsmuster mit embryonalen Stammzellen fusionierter somatischer Zellen zeigt eine Reaktivierung typisch embryonaler Gene (z. B. Oct4, Rex-1, nanog, TDGF1) sowie eine Deaktivierung differenzierungsspezifischer Gene (Cowan et al. 2005; Do u. Scholer 2004); die entstandenen Hybride können langfristig ohne Ver-

441 4.4 · Medizinische Perspektiven der kardialen Stammzellforschung

lust der Expression embryonaler Gene kultiviert werden. Die Hybride sind jedoch tetraploid, d. h., sie besitzen einen doppelten Chromosomensatz. Versuche, den Zellkern der embryonalen Stammzelle vor der Fusion zu entfernen (entsprechend der Enukleation der Eizelle beim Klonen), führten nicht zu einer Reprogrammierung der somatischen Erbinformation, d. h., die Hybride waren nicht pluripotent (Do u. Scholer 2004). Bei Fusion somatischer Zellen mit isolierten Karyoplasten (Zellkern einschließlich eines schmalen Zytoplasmasaums) embryonaler Stammzellen entstanden hingegen pluripotente (tetraploide) Hybride (Do u. Scholer 2004). Die genannten Ergebnisse gewähren höchst interessante Einblicke in die Mechanismen der Reprogrammierung der Erbsubstanz adulter somatischer Zellen, über die bislang nur wenige Erkenntnisse vorliegen. Die Tetraploidie limitiert derzeit jedoch den Einsatz der Methode zur Vermeidung einer Immunreaktion im Rahmen der Zelltherapie mit humanen ESKM.

4.4.7 Aktueller Stand der neurologischen Stammzellforschung – Zelltherapie der ParkinsonKrankheit Die in diesem Kapitel dargestellten medizinischen Perspektiven der kardialen Stammzellforschung weisen viele Parallelitäten zur Stammzellforschung in anderen Fachbereichen, z. B. in der Neurologie, auf. Die Therapie einer Vielzahl neurologischer Erkrankungen, darunter der Parkinson-Krankheit (Taylor u. Minger 2005), Multiple Sklerose (Keirstead 2005), Schlaganfall und Querschnittslähmung (Luque u. Ribotta 2004), könnte durch den Ersatz untergegangener Zellen entscheidend verbessert werden, ein alltäglicher klinischer Einsatz der Zelltherapie liegt aber in weiter Ferne. Am weitesten fortgeschritten ist die Zelltherapie der Parkinson-Krankheit. Seit mehr als 15 Jahren wird die Transplantation dopaminerger Zellen aus dem Mesencephalon menschlicher Embryonen klinisch eingesetzt. Der Nutzen dieser Therapie ist jedoch umstritten: Nach anfänglichen Fallberichten über Therapieerfolge (Mendez et al. 2005; Piccini et al. 1999) ergaben die ersten doppelblinden, kontrollierten Studien keinen signifikanten Therapieeffekt (Freed et al. 2001; Olanow et al. 2003). Neben dem fraglichen Nutzen der Transplantation embryonalen Gewebes ist dieser zelltherapeutische Ansatz mit ethischen Bedenken verbunden und nur in äußerst begrenztem Umfang anwendbar, da für die Therapie eines Parkinson-Patienten Gewebe aus mehr als 8 Embryonen benötigt wird (Taylor u. Minger 2005). Dadurch ergibt sich die Notwendigkeit der Erschließung alternativer Zellquellen.

4.4

Neben embryonalen Neuronen werden in der neurologischen Stammzellforschung neurale Vorläufer- und Stammzellen sowie adulte Knochenmarkstammzellen und embryonale Stammzellen eingesetzt. Neurale Stammzellen können zwar in großer Zahl in vitro vermehrt werden, eine stabile dopaminerge Differenzierung ist bislang jedoch nicht gelungen (Taylor u. Minger 2005). Im August 2000 berichteten zwei Arbeitsgruppen über eine Transdifferenzierung mesenchymaler Stammzellen aus dem Knochenmark zu neuronalen Zellen in vitro (Sanchez-Ramos et al. 2000; Woodbury et al. 2000). Weitere Arbeiten zeigten die Möglichkeit einer neuronalen Transdifferenzierung in vivo (Brazelton et al. 2000; Mezey et al. 2000); eine Transplantation neuronal transdifferenzierter adulter Knochenmarkstammzellen führte zu funktionellen Verbesserungen in einem Rattenmodell der Parkinson-Erkrankung (Dezawa et al. 2004). Analog zu den Entwicklungen in der kardialen Stammzellforschung wurde jedoch gezeigt, dass auch die vermeintliche neuronale Transdifferenzierung adulter Stammzellen ein Artefakt sein könnte, hervorgerufen durch Zellfusionen (Alvarez-Dolado et al. 2003; Terada et al. 2002) oder zytotoxische Kulturbedingungen (Lu et al. 2004; Neuhuber et al. 2004). Eine neuronale Differenzierung embryonaler Stammzellen konnte hingegen zweifelsfrei nachgewiesen werden (Okabe et al. 1996; Strubing et al. 1995); unter anderem wurden dopaminerge Neurone aus embryonalen Stammzellen der Maus (Lee et al. 2000), des Affen (Takagi et al. 2005) und des Menschen (Yan et al. 2005) gewonnen. Eine Transplantation von aus embryonalen Stammzellen gewonnenen dopaminergen Neuronen führte zu einer Abschwächung der Parkinson-Symptomatik in einem Mausmodell (Barberi et al. 2003) und einem Primatenmodell (Takagi et al. 2005) der Parkinson-Krankheit. Vor einem Einsatz dieses Zelltyps in klinischen Studien müssen jedoch die gleichen potenziellen Risiken ausgeschlossen werden, die für die Verwendung von ESKM beschrieben wurden (7 4.4.2.2), d. h., es müssen Strategien zur Vermeidung einer Immunantwort etabliert werden und eine hochgradige Selektion differenzierter Zellen zur Vermeidung einer Tumorbildung stattfinden.

4.4.8 Ausblick Embryonale und adulte Stammzellen besitzen ohne Zweifel ein beachtliches Potenzial, die Therapie des Myokardinfarkts und der daraus resultierenden chronischen Herzinsuffizienz zu revolutionieren. Auf dem Weg zu einem Einsatz von Stammzellen in der klinischen Routine sind bereits große Fortschritte erzielt worden. ESKM

442

Sektion 4 · Therapie

wurden in Tiermodellen in infarzierte Herzen injiziert und trugen zu einer signifikanten Verbesserung der Herzfunktion bei. Adulte Stammzellen wurden in einer Reihe klinischer Studien eingesetzt und verbesserten die regionale Wandbewegung und die Infarktgröße. Trotzdem ist der Einsatz adulter Stammzellen im klinischen Alltag noch nicht vertretbar. Während die Sicherheit der Applikation adulter Stammzellen als weitestgehend bewiesen gilt, ist ihre Effizienz angesichts der Ergebnisse neuester Studien unklar. Darüber hinaus existieren viele offene Fragen bezüglich der optimalen Methodik, insbesondere des am besten geeigneten Stammzellsubtyps, der Zellzahl, des Applikationszeitpunkts und des Applikationsmodus (i.c. bzw. i.m.). Außerdem ist wenig über die Mechanismen der Zelltherapie mit adulten Stammzellen bekannt. Die optimalen Rahmenbedingungen zu finden, die Mechanismen der Zelltherapie zu verstehen und diese Kenntnisse zur Optimierung der Effizienz zu nutzen muss das Ziel der Forschung an adulten Stammzellen in den kommenden Jahren sein und neben weiteren klinischen Studien auch grundlagenwissenschaftliche Untersuchungen einschließen. Da Sicherheit und Machbarkeit der Zelltherapie mit adulten Stammzellen durch die vorliegenden kleineren Studien hinreichend belegt sind, sollten nun weitere klinische Studien – ausschließlich multizentrisch und mit einer hohen Patientenzahl – durchgeführt werden, um die Effizienz der Therapie und die optimalen Rahmenbedingungen gezielt und umfassend zu untersuchen. Ein Beispiel stellt die kürzlich begonnene multizentrische BOOST-2 Studie dar, die ca. 200 Patienten einschließt und u. a. gezielt die Gabe unterschiedlich hoher Zellzahlen untersucht. Ein Einsatz der Zelltherapie mit adulten Stammzellen in der klinischen Routine ist bis zum Vorliegen eindeutiger Ergebnisse großer Studien nicht vertretbar und wird daher erst in einigen Jahren realisierbar sein. Trotz der positiven Ergebnisse bisheriger tierexperimenteller Studien liegt der Einsatz von ESKM in der Routinetherapie des Myokardinfarkts immer noch in weiter Ferne. Zuvor muss gezeigt werden, dass die Applikation von ESKM keine schwerwiegenden Risiken für den Patienten birgt (Arrhythmien, Tumorbildung), dass keine immunologische Abstoßung transplantierter Zellen erfolgt und dass sich die in ersten Tierversuchen nachgewiesene Effizienz in weiteren Versuchen bestätigt. Die Beantwortung aller in diesem Kapitel genannten offenen Fragen erfordert umfangreiche Untersuchungen, die vermutlich weit mehr als 10 Jahre in Anspruch nehmen werden. Ob diese Untersuchungen letztendlich zu einem erfolgreichen Einsatz von ESKM in der Therapie des Myokardinfarkts führen werden, kann derzeit nicht sicher beurteilt werden. Ein baldiger klinischer Einsatz von ESKM ist nicht zu erwarten. Das

Potenzial dieses Zelltyps und die damit verbundenen Hoffnungen auf einen zukünftigen therapeutischen Nutzen sind jedoch sehr hoch und werden durch den aktuellen Stand der Forschung bestätigt. Eine intensive Fortsetzung der begonnenen Erforschung von ESKM ist daher vielversprechend und unerlässlich. Neben ESKM und adulten Knochenmarkstammzellen könnten in Zukunft auch weitere Arten von Stammzellen Bedeutung in der Zelltherapie erlangen, zu denen aktuell noch keine Zelltherapiestudien vorliegen. Kürzlich gelang beispielsweise die Gewinnung pluripotenter Stammzellen aus dem Hoden der adulten Maus (Guan et al. 2006). Aus diesem neuen Stammzelltyp ließen sich Kardiomyozyten differenzieren, die charakteristische molekularbiologische und elektrophysiologische Eigenschaften differenzierter Kardiomyozyten aufwiesen (Guan et al. 2006). Die Zelltherapie besitzt, nach dem aktuellen Stand der Forschung, zweifelsohne ein großes Potenzial, die Therapie des Myokardinfarkts und anderer schwerwiegender Erkrankungen nachhaltig zu verbessern. Wann ein Einsatz in der klinischen Routine realisiert werden kann, kann derzeit nicht sicher beantwortet werden. Des Weiteren bleibt abzuwarten, welcher Zelltyp – bzw. welche Mischung unterschiedlicher Zelltypen – letztendlich den größten Nutzen und das geringste Risiko für den Patienten aufweisen wird.

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445 4.4 · Medizinische Perspektiven der kardialen Stammzellforschung rapid morphological changes and mimics neuronal phenotype. J Neurosci Res 77: 192–204 Nygren JM, Jovinge S, Breitbach M, Sawen P, Roll W, Hescheler J, Taneera J, Fleischmann BK, Jacobsen SE (2004) Bone marrowderived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat Med 10: 494–501 Odorico JS, Kaufman DS, Thomson JA (2001) Multilineage differentiation from human embryonic stem cell lines. Stem Cells 19: 193–204 Okabe S, Forsberg-Nilsson K, Spiro AC, Segal M, McKay RD (1996) Development of neuronal precursor cells and functional postmitotic neurons from embryonic stem cells in vitro. Mech Dev 59: 89–102 Olanow CW, Goetz CG, Kordower JH, Stoessl AJ, Sossi V, Brin MF, Shannon KM, Nauert GM, Perl DP, Godbold J, Freeman TB (2003) A double-blind controlled trial of bilateral fetal nigral transplantation in Parkinson‘s disease. Ann Neurol 54: 403–414 Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, Jakoniuk I, Anderson SM, Li B, Pickel J, McKay R, Nadal-Ginard B, Bodine DM, Leri A, Anversa P (2001) Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature 410: 701–705 Passier R, Oostwaard DW, Snapper J, Kloots J, Hassink RJ, Kuijk E, Roelen B, de la Riviere AB, Mummery C (2005) Increased cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells in serum-free cultures. Stem Cells 23: 772–780 Piccini P, Brooks DJ, Bjorklund A, Gunn RN, Grasby PM, Rimoldi O, Brundin P, Hagell P, Rehncrona S, Widner H, Lindvall O (1999) Dopamine release from nigral transplants visualized in vivo in a Parkinson‘s patient. Nat Neurosci 2: 1137–1140 Rehman J, Li J, Orschell CM, March KL (2003) Peripheral blood „endothelial progenitor cells“ are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors. Circulation 107: 1164–1169 Reppel M, Boettinger C, Hescheler J (2004) Beta-adrenergic and muscarinic modulation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Physiol Biochem 14: 187–196 Roell W, Lu ZJ, Bloch W, Siedner S, Tiemann K, Xia Y, Stoecker E, Fleischmann M, Bohlen H, Stehle R, Kolossov E, Brem G, Addicks K, Pfitzer G, Welz A, Hescheler J, Fleischmann BK (2002) Cellular cardiomyoplasty improves survival after myocardial injury. Circulation 105: 2435–2441 Sachinidis A, Fleischmann BK, Kolossov E, Wartenberg M, Sauer H, Hescheler J (2003a) Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovasc Res 58: 278–291 Sachinidis A, Gissel C, Nierhoff D, Hippler-Altenburg R, Sauer H, Wartenberg M, Hescheler J (2003b) Identification of plateledderived growth factor-BB as cardiogenesis-inducing factor in mouse embryonic stem cells under serum-free conditions. Cell Physiol Biochem 13: 423–429 Sanchez-Ramos J, Song S, Cardozo-Pelaez F, Hazzi C, Stedeford T, Willing A, Freeman TB, Saporta S, Janssen W, Patel N, Cooper DR, Sanberg PR (2000) Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Exp Neurol 164: 247–256 Satin J, Kehat I, Caspi O, Huber I, Arbel G, Itzhaki I, Magyar J, Schroder EA, Perlman I, Gepstein L (2004) Mechanism of spontaneous excitability in human embryonic stem cell derived cardiomyocytes. J Physiol 559: 479–496 Schächinger V, Assmus B, Britten MB, Honold J, Lehmann R, Teupe C, Abolmaali ND, Vogl TJ, Hofmann WK, Martin H, Dimmeler S, Zeiher AM (2004) Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infarction: final one-year results of the TOPCARE-AMI Trial. J Am Coll Cardiol 44: 1690–1699

4.4

Schächinger V, Tonn T, Dimmeler S, Zeiher AM (2006) Bone-marrowderived progenitor cell therapy in need of proof of concept: design of the REPAIR-AMI trial. Nat Clin Pract Cardiovasc Med 3 Suppl 1: S23–S28 Schwartz RE, Linehan JL, Painschab MS, Hu WS, Verfaillie CM, Kaufman DS (2005) Defined conditions for development of functional hepatic cells from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev 14: 643–655 Segev H, Kenyagin-Karsenti D, Fishman B, Gerecht-Nir S, Ziskind A, Amit M, Coleman R, Itskovitz-Eldor J (2005) Molecular analysis of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Dev Growth Differ 47: 295–306 Siminiak T, Kalawski R, Fiszer D, Jerzykowska O, Rzezniczak J, Rozwadowska N, Kurpisz M (2004) Autologous skeletal myoblast transplantation for the treatment of postinfarction myocardial injury: phase I clinical study with 12 months of follow-up. Am Heart J 148: 531–537 Smits PC (2004) Myocardial repair with autologous skeletal myoblasts: a review of the clinical studies and problems. Minerva Cardioangiol 52: 525–535 Smits PC, van Geuns RJ, Poldermans D, Bountioukos M, Onderwater EE, Lee CH, Maat AP, Serruys PW (2003) Catheter-based intramyocardial injection of autologous skeletal myoblasts as a primary treatment of ischemic heart failure: clinical experience with six-month follow-up. J Am Coll Cardiol 42: 2063–2069 Stamm C, Westphal B, Kleine HD, Petzsch M, Kittner C, Klinge H, Schumichen C, Nienaber CA, Freund M, Steinhoff G (2003) Autologous bone-marrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration. Lancet 361: 45–46 Strauer BE, Brehm M, Zeus T, Kostering M, Hernandez A, Sorg RV, Kogler G, Wernet P (2002) Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circulation 106: 1913–1918 Strauer BE, Kornowski R (2003) Stem cell therapy in perspective. Circulation 107: 929–934 Strubing C, Ahnert-Hilger G, Shan J, Wiedenmann B, Hescheler J, Wobus AM (1995) Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech Dev 53: 275–287 Swijnenburg RJ, Tanaka M, Vogel H, Baker J, Kofidis T, Gunawan F, Lebl DR, Caffarelli AD, de Bruin JL, Fedoseyeva EV, Robbins RC (2005) Embryonic stem cell immunogenicity increases upon differentiation after transplantation into ischemic myocardium. Circulation 112: I166–I172 Takagi Y, Takahashi J, Saiki H, Morizane A, Hayashi T, Kishi Y, Fukuda H, Okamoto Y, Koyanagi M, Ideguchi M, Hayashi H, Imazato T, Kawasaki H, Suemori H, Omachi S, Iida H, Itoh N, Nakatsuji N, Sasai Y, Hashimoto N (2005) Dopaminergic neurons generated from monkey embryonic stem cells function in a Parkinson primate model. J Clin Invest 115: 102–109 Taylor H, Minger SL (2005) Regenerative medicine in Parkinson‘s disease: generation of mesencephalic dopaminergic cells from embryonic stem cells. Curr Opin Biotechnol 16: 487–492 Terada N, Hamazaki T, Oka M, Hoki M, Mastalerz DM, Nakano Y, Meyer EM, Morel L, Petersen BE, Scott EW (2002) Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion. Nature 416: 542–545 Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM (1998) Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282: 1145–1147 Valiunas V, Doronin S, Valiuniene L, Potapova I, Zuckerman J, Walcott B, Robinson RB, Rosen MR, Brink PR, Cohen IS (2004) Human mesenchymal stem cells make cardiac connexins and form functional gap junctions. J Physiol 555: 617–626

446

Sektion 4 · Therapie

Vandervelde S, van Luyn MJ, Tio RA, Harmsen MC (2005) Signaling factors in stem cell-mediated repair of infarcted myocardium. J Mol Cell Cardiol 39: 363–376 Wakayama T, Tabar V, Rodriguez I, Perry AC, Studer L, Mombaerts P (2001) Differentiation of embryonic stem cell lines generated from adult somatic cells by nuclear transfer. Science 292: 740– 743 Wang L (2006) Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells. Trends Cardiovasc Med 16: 89–94 Wobus AM, Kaomei G, Shan J, Wellner MC, Rohwedel J, Ji G, Fleischmann B, Katus HA, Hescheler J, Franz WM (1997) Retinoic acid accelerates embryonic stem cell-derived cardiac differentiation and enhances development of ventricular cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol 29: 1525–1539 Wollert KC, Drexler H (2005) Clinical applications of stem cells for the heart. Circ Res 96: 151–163 Wollert KC, Meyer GP, Lotz J, Ringes-Lichtenberg S, Lippolt P, Breidenbach C, Fichtner S, Korte T, Hornig B, Messinger D, Arseniev L, Hertenstein B, Ganser A, Drexler H (2004) Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet 364: 141–148 Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, Black IB (2000) Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res 61: 364–370 Xiao YF (2003) Cardiac application of embryonic stem cells. Sheng Li Xue Bao 55: 493–504 Xiong C, Xie CQ, Zhang L, Zhang J, Xu K, Fu M, Thompson WE, Yang LJ, Chen YE (2005) Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev 14: 671–675

Xu C, Police S, Rao N, Carpenter MK (2002) Characterization and enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Circ Res 91: 501–508 Xue T, Cho HC, Akar FG, Tsang SY, Jones SP, Marban E, Tomaselli GF, Li RA (2005) Functional integration of electrically active cardiac derivatives from genetically engineered human embryonic stem cells with quiescent recipient ventricular cardiomyocytes: insights into the development of cell-based pacemakers. Circulation 111: 11–20 Yan Y, Yang D, Zarnowska ED, Du Z, Werbel B, Valliere C, Pearce RA, Thomson JA, Zhang SC (2005) Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells 23: 781–790 Yoon YS, Park JS, Tkebuchava T, Luedeman C, Losordo DW (2004) Unexpected severe calcification after transplantation of bone marrow cells in acute myocardial infarction. Circulation 109: 3154–3157 Zandstra PW, Bauwens C, Yin T, Liu Q, Schiller H, Zweigerdt R, Pasumarthi KB, Field LJ (2003) Scalable production of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Tissue Eng 9: 767–778 Zeng X, Cai J, Chen J, Luo Y, You ZB, Fotter E, Wang Y, Harvey B, Miura T, Backman C, Chen GJ, Rao MS, Freed WJ (2004) Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells 22: 925–940 Zhang YM, Hartzell C, Narlow M, Dudley SC, Jr. (2002) Stem cellderived cardiomyocytes demonstrate arrhythmic potential. Circulation 106: 1294–1299

447 4.4 · Medizinische Perspektiven der kardialen Stammzellforschung

4.4.10 Zeittafel 1981

Kultivierung pluripotenter embryonaler Stammzellen der Maus

(Evans und Kaufman 1981; Martin 1981)

1991

Differenzierung von Kardiomyozyten aus embryonalen Stammzellen der Maus

(Wobus et al. 1991)

1992

Intramyokardiale Implantation myogener Zellen (Myoblasten) im Tiermodell

(Marelli et al. 1992)

1993

Elektrophysiologischer Nachweis der drei Differenzierungstypen kardialer Zellen (schrittmacherartig, atrial, ventrikulär) in murinen Embryoid bodies

(Maltsev et al. 1993)

1996

Intramyokardiale Implantation von Kardiomyozyten aus murinen embryonalen Stammzellen im Kleintiermodell

(Klug et al. 1996)

1998

Etablierung einer humanen embryonalen Stammzelllinie

(Thomson et al. 1998)

1998

Markierung von Kardiomyozyten aus embryonalen Stammzellen durch „green fluorescent protein“-Expression unter der Kontrolle eines herzspezifischen Promotors

(Kolossov et al. 1998)

1999

Intramyokardiale Implantation adulter Knochenmarkstammzellen im Tiermodell

(Tomita et al. 1999)

1999 (veröffentlicht 2001)

Zelltherapie mit adulten Knochenmarkstammzellen bei 5 Patienten mit ischämischer Kardiomyopathie

(Hamano et al. 2001)

2000 (veröffentlicht 2001)

Zelltherapie mit Myoblasten nach Myokardinfarkt beim Menschen (case report)

(Menasche et al. 2001)

2001

Angebliche Regenerierung infarzierten Myokards durch kardiale Transdifferenzierung adulter Knochenmarkstammzellen (bislang nicht reproduzierbar)

(Orlic et al. 2001)

2002

Klinische Studien zur Zelltherapie des Myokardinfarkts mit adulten Stammzellen

(Assmus et al. 2002; Strauer et al. 2002)

2003

Klinische Studie zur Zelltherapie des Myokardinfarkts mit Myoblasten

(Menasche et al. 2003)

2004

Nachweis von Zellfusionen zwischen adulten Knochenmarkstammzellen und nativen Kardiomyozyten; keine Anzeichen für eine Transdifferenzierung

(Nygren et al. 2004)

2005

Intramyokardiale Implantation von Kardiomyozyten aus murinen embryonalen Stammzellen im Großtiermodell

(Menard et al. 2005)

2005 / 2006

Randomisierte, doppelt geblindete, kontrollierte klinische Studien zur Zelltherapie des Myokardinfarkts mit adulten Knochenmarkstammzellen

(Janssens et al. 2006; Lunde et al. 2005; Schachinger et al. 2006)

2006

Implantation von Kardiomyozyten aus humanen embryonalen Stammzellen in infarzierte Herzen der Maus

(Kofidis et al. 2006)

2006

Eine hochgradige Aufreinigung von Kardiomyozyten aus embryonalen Stammzellen (über ein Antibiotika-Resistenz-Gen unter Kontrolle eines herzspezifischen Promoters) verhindert das Auftreten von Teratomen nach Transplantation

(Kolossov et al. 2006)

4.4

448

Sektion 4 · Therapie

Literatur zur Zeittafel Assmus B, Schachinger V, Teupe C, Britten M, Lehmann R, Dobert N, Grunwald F, Aicher A, Urbich C, Martin H, Hoelzer D, Dimmeler S, Zeiher AM (2002) Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction (TOPCARE-AMI). Circulation 106: 3009–3017 Evans MJ, Kaufman MH (1981) Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292: 154–156 Hamano K, Nishida M, Hirata K, Mikamo A, Li TS, Harada M, Miura T, Matsuzaki M, Esato K (2001) Local implantation of autologous bone marrow cells for therapeutic angiogenesis in patients with ischemic heart disease: clinical trial and preliminary results. Jpn Circ J 65: 845–847 Janssens S, Dubois C, Bogaert J, Theunissen K, Deroose C, Desmet W, Kalantzi M, Herbots L, Sinnaeve P, Dens J, Maertens J, Rademakers F, Dymarkowski S, Gheysens O, Van Cleemput J, Bormans G, Nuyts J, Belmans A, Mortelmans L, Boogaerts M, Van de WF (2006) Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet 367: 113–121 Klug MG, Soonpaa MH, Koh GY, Field LJ (1996) Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts. J Clin Invest 98: 216–224 Kofidis T, Lebl DR, Swijnenburg RJ, Greeve JM, Klima U, Gold J, Xu C, Robbins RC (2006) Allopurinol/uricase and ibuprofen enhance engraftment of cardiomyocyte-enriched human embryonic stem cells and improve cardiac function following myocardial injury. Eur J Cardiothorac Surg 29: 50–55 Kolossov E, Fleischmann BK, Liu Q, Bloch W, Viatchenko-Karpinski S, Manzke O, Ji GJ, Bohlen H, Addicks K, Hescheler J (1998) Functional characteristics of ES cell-derived cardiac precursor cells identified by tissue-specific expression of the green fluorescent protein. J Cell Biol 143: 2045–2056 Kolossov E, Bostani T, Roell W, Breitbach M, Pillekamp F, Nygren JM, Sasse P, Rubenchik O, Fries JW, Wenzel D, Geisen C, Xia Y, Lu Z, Duan Y, Kettenhofen R, Jovinge S, Bloch W, Bohlen H, Welz A, Hescheler J, Jacobsen SE, Fleischmann BK (2006) Engraftment of engineered ES cell-derived cardiomyocytes but not BM cells restores contractile function to the infarcted myocardium. J Exp Med 203: 2315–2327, Epub 2006 Sep 5 Lunde K, Solheim S, Aakhus S, Arnesen H, Abdelnoor M, Forfang K (2005) Autologous stem cell transplantation in acute myocardial infarction: The ASTAMI randomized controlled trial. Intracoronary transplantation of autologous mononuclear bone marrow cells, study design and safety aspects. Scand Cardiovasc J 39: 150–158 Maltsev VA, Rohwedel J, Hescheler J, Wobus AM (1993) Embryonic stem cells differentiate in vitro into cardiomyocytes representing sinusnodal, atrial and ventricular cell types. Mech Dev 44: 41–50

Marelli D, Desrosiers C, el Alfy M, Kao RL, Chiu RC (1992) Cell transplantation for myocardial repair: an experimental approach. Cell Transplant 1: 383–390 Martin GR (1981) Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 78: 7634– 7638 Menard C, Hagege AA, Agbulut O, Barro M, Morichetti MC, Brasselet C, Bel A, Messas E, Bissery A, Bruneval P, Desnos M, Puceat M, Menasche P (2005) Transplantation of cardiac-committed mouse embryonic stem cells to infarcted sheep myocardium: a preclinical study. Lancet 366: 1005–1012 Menasche P, Hagege AA, Scorsin M, Pouzet B, Desnos M, Duboc D, Schwartz K, Vilquin JT, Marolleau JP (2001) Myoblast transplantation for heart failure. Lancet 357: 279–280 Menasche P, Hagege AA, Vilquin JT, Desnos M, Abergel E, Pouzet B, Bel A, Sarateanu S, Scorsin M, Schwartz K, Bruneval P, Benbunan M, Marolleau JP, Duboc D (2003) Autologous skeletal myoblast transplantation for severe postinfarction left ventricular dysfunction. J Am Coll Cardiol 41: 1078–1083 Nygren JM, Jovinge S, Breitbach M, Sawen P, Roll W, Hescheler J, Taneera J, Fleischmann BK, Jacobsen SE (2004) Bone marrowderived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat Med 10: 494–501 Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, Jakoniuk I, Anderson SM, Li B, Pickel J, McKay R, Nadal-Ginard B, Bodine DM, Leri A, Anversa P (2001) Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature 410: 701–705 Schachinger V, Tonn T, Dimmeler S, Zeiher AM (2006) Bone-marrowderived progenitor cell therapy in need of proof of concept: design of the REPAIR-AMI trial. Nat Clin Pract Cardiovasc Med 3 Suppl 1: S23–S28 Strauer BE, Brehm M, Zeus T, Kostering M, Hernandez A, Sorg RV, Kogler G, Wernet P (2002) Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circulation 106: 1913–1918 Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM (1998) Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282: 1145–1147 Tomita S, Li RK, Weisel RD, Mickle DA, Kim EJ, Sakai T, Jia ZQ (1999) Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation 100: II247–II256 Wobus AM, Wallukat G, Hescheler J (1991) Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation 48: 173–182

4.5 4.5 Monoklonale Antikörper: Grundlagen und ihre Bedeutung in Diagnostik und Therapie Olaf Behrsing und Burkhard Micheel

4.5.1

Einleitung

– 451

4.5.2

Eigenschaften von Antikörpern – 451

4.5.3

Immunisierungen

4.5.4

Gewinnung polyklonaler Antikörper – 453

4.5.5

Gewinnung monoklonaler Antikörper – 454

4.5.5.1 4.5.5.2 4.5.5.3 4.5.5.4 4.5.5.5

Zellfusionen – 454 Antikörperscreening – 455 Klonierungen – 455 Antikörperproduktion und -reinigung – 455 Speziesherkunft monoklonaler Antikörper – 456

4.5.6

Chemische und biochemische Modifizierung von Antikörpern – 456

4.5.6.1 4.5.6.2

Gewinnung von Antikörperfragmenten – 456 Markierung von Antikörpern – 456

4.5.7

Rekombinante Antikörpertechniken – 457

4.5.7.1 4.5.7.2 4.5.7.3 4.5.7.4 4.5.7.5 4.5.7.6 4.5.7.7

Klonierung von Antikörpergenen – 457 Gentechnische Herstellung von Antikörperfragmenten – 457 Rekombinante Antikörper – 459 Antikörper-Display-Techniken – 459 Antikörpergewinnung aus humanisierten und transgenen Mäusen Bispezifische Antikörper – 462 Katalytische Antikörper – 462

– 452

4.5.8

Nutzung von monoklonalen Antikörpern

4.5.8.1 4.5.8.2

Antikörper als Nachweisreagenzien – 462 Antikörper zur Isolierung von Molekülen und Zellen

– 461

– 462 – 464

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

450

Sektion 4 · Therapie

4.5.9

Antikörper in der Medizin – 464

4.5.9.1 4.5.9.2 4.5.9.3 4.5.9.4

Antikörper in der Diagnostik – 465 Antikörper als Therapeutika – 466 Antikörper in der Gentherapie – 470 Antikörper als Vakzine – 470

4.5.10

Ausblick

– 470

4.5.11

Literatur

– 471

4.5.12

Zeittafel

– 475

Literatur zur Zeittafel – 475

451 4.5 · Monoklonale Antikörper: Grundlagen und ihre Bedeutung in Diagnostik und Therapie

4.5.1 Einleitung In den letzten 30 Jahren wurden auf den verschiedenen Gebieten der Biowissenschaften rasante Fortschritte erzielt, ermöglicht durch eine Reihe wichtiger methodischer Entwicklungen, von denen an prominenter Stelle sicher die Gentechnik zu nennen ist. Einen wichtigen Platz nimmt zweifelsohne auch die Hybridomtechnik (Köhler u. Milstein 1975) ein, die es erlaubt, Antikörper, d. h. exklusive Bindemoleküle, einer definierten Spezifität zu entwickeln.

4.5.2 Eigenschaften von Antikörpern Antikörper werden vom Immunsystem aller Wirbeltiere zur Bekämpfung von „Fremdsubstanzen“ (in der Immunologie als Antigene bezeichnet) gebildet, bei denen es sich unter natürlichen Bedingungen in erster Linie um Bestandteile von Infektionserregern handelt (Janeway et al. 2005; Jerne 1973; Male et al. 2006). Nicht nur Biomoleküle (Proteine, Kohlenhydrate, Lipide, Nukleinsäuren), sondern auch unterschiedliche synthetische Verbindungen können als Antigen fungieren. Antikörper werden von ausdifferenzierten B-Lymphozyten (Plasmazellen) synthetisiert und sezerniert. Sie zirkulieren dann in den Blut- und Lymphbahnen und gelangen so an die Orte im Organismus, wo sie für die Abwehr benötigt werden. Im Laufe einer solchen Immunantwort binden sie genau die Substanzen, die ihre Synthese ausgelöst haben. Antikörper zeichnen sich durch eine große Spezifität und eine enorme Vielfalt aus. Man nimmt an, dass in

. Abb. 4.5.1. Grundschema eines Antikörpers der IgG-Klasse. VH und VL: variable (V) Bereiche der schweren (H) und der leichten (L) Kette im N-Terminus; CL: konstante Domäne der leichten Kette; CH1, CH2 und CH3: die 3 konstanten Domänen der schweren Kette. Die

4.5

einem menschlichen Organismus bis zu 1011 verschiedene Antikörper ständig vorliegen (Janeway et al. 2005). Theoretisch ist so gewährleistet, dass gegen jeden potenziellen Infektionserreger eine Antikörperbildung erfolgen kann. Ein B-Lymphozyt synthetisiert Antikörper einer einzigen Spezifität (Burnet 1959; Nossal 1993). Die Fähigkeit zur Synthese eines spezifischen Antikörpers wird vor dem ersten Antigenkontakt angelegt, sodass eine Vielzahl von B-Lymphozyten schon in der „Erwartung des Unvorhersehbaren“ zur Verfügung steht. Bei Bedarf, d. h. bei Kontakt mit einem neuen Krankheitserreger, können dann sofort Antikörper gegen diesen Erreger gebildet werden (Ada u. Nossal 1987; Burnet 1959; Weissman u. Cooper 1993). Verglichen mit anderen Eiweißen sind Antikörper sehr stabile Moleküle. Alle Antikörper haben eine ähnliche kompakte globuläre Struktur. Sie werden in verschiedene Klassen und Subklassen eingeteilt und wegen ihrer Assoziation mit Immunprozessen auch als Immunglobuline (Ig) bezeichnet. Zwei identische Heterodimere (bestehend aus je einer leichten und einer schweren Kette), die zu einem symmetrischen Molekül mit einer Y-Form assoziieren (> Abb. 4.5.1), bilden die Grundstruktur (Edelman 1970; Porter 1967). Das Molekül ist in Domänen organisiert, die dreidimensionale Struktur wird durch Disulfidbrücken zwischen den Ketten und innerhalb der Ketten stabilisiert. Bei Immunglobulinen der Klassen IgA und IgM können diese Grundstrukturen Oligomere bilden. Antikörper enthalten einen Kohlenhydratanteil, der für die Bindung an verschiedene Rezeptoren wichtig ist, der bei der Antigenbindung jedoch keine Rolle spielt. Wie zu erwarten besitzen Anti-

Antigenbindungsregion wird von den variablen Bereichen beider Ketten gebildet. Die Ketten sind untereinander durch Disulfidbrücken verknüpft

452

Sektion 4 · Therapie

körper unterschiedlicher Spezifität auch eine unterschiedliche Primärstruktur. Die variablen Bereiche, die Antikörper unterschiedlicher Bindungsspezifität voneinander unterscheiden, sind in der Nähe des N-Terminus der leichten und der schweren Kette lokalisiert. Hier befindet sich die Antigenbindungsregion, die von je drei hypervariablen Loops (auch „complementarity determining regions“, CDRs, genannt) der leichten und der schweren Kette gebildet wird. Antikörper sind bivalent, denn sie besitzen immer mindestens zwei identische Antigenbindungsregionen. Die Bereiche des Antikörpermoleküls, die nicht direkt an der Antigenbindung beteiligt sind, sind in ihrer Aminosäuresequenz von einem Antikörper zum anderen (innerhalb einer Antikörperklasse und -subklasse) identisch (konstante Bereiche). Hier können Antikörper von verschiedenen körpereigenen Effektormolekülen oder Effektorzellen gebunden werden, wodurch die von den Antikörpern erkannten Fremdsubstanzen eliminiert und damit für den Organismus unschädlich gemacht werden. Ein Antikörper ist damit ein bifunktioneller Adapter, der die Bindung eines Antigens an aktive körpereigene Moleküle bzw. Zellen vermittelt (> Abb. 4.5.1). Antikörper können aus ihrem ursprünglichen Milieu herausgenommen werden und entfalten auch in vitro ihre Bindungsfunktionen. Die Mechanismen der Immunabwehr sind im Laufe der Evolution der Wirbeltiere zum Schutz gegen Infektionserreger und gegen entartete bzw. nicht mehr funktionstüchtige Zellen selektiert worden. Das Immunsystem kann aber wahrscheinlich a priori nicht zwischen gefährlichen und ungefährlichen Antigenen unterscheiden, es differenziert offensichtlich nur zwischen „fremd“ und „selbst“ (Cohen 1988), weshalb gegen alle Fremdsubstanzen eine Immunabwehr induziert werden kann, auch wenn sie harmlos sind. Diese Tatsache können wir uns zunutze machen, indem wir eine Immunantwort gegen Substanzen induzieren, gegen die spezifische Bindungsreagenzien erforderlich sind. Das theoretisch unerschöpfliche Potenzial des Immunsystems erlaubt es, gegen fast jede Substanz auch einen spezifischen Antikörper zu erzeugen, wenn diese für die immunisierte Spezies „fremd“ ist. Selbst eine Immunisierung gegen „kleinere“ Moleküle (in der Immunologie als Haptene bezeichnet) ist nach einer kovalenten Kopplung an „fremde“ Trägerproteine möglich. Schon zu Beginn des 20. Jahrhunderts wurden Antikörper praktisch eingesetzt, zuerst durch Emil von Behring zur Behandlung von akuten Infektionserkrankungen bei Patienten in Form einer passiven Immunisierung und dann für die Bestimmung der ABO-Blutgruppen durch Landsteiner (Mazumdar 2003). Bald darauf wurden Antikörper auch für Untersuchungen in der Gerichtsmedizin und der Lebensmittelindustrie und natürlich in der biomedizinischen Forschung verwen-

det. In vielen Bereichen der Biowissenschaften und der Medizin, insbesondere in der medizinischen Diagnostik, sind Antikörper heute zu unverzichtbaren Werkzeugen geworden.

4.5.3 Immunisierungen Für die Bildung und Gewinnung von Antikörpern ist eine Immunisierung mit dem entsprechenden Antigen erforderlich (Harlow u. Lane 1988). Diese Immunisierung kann die Folge einer Infektion mit einem Krankheitserreger oder eines natürlichen Kontakts mit einem Antigen sein. In den meisten Fällen werden die Spender der Antikörper jedoch gezielt immunisiert, überwiegend in Form einer Injektion. Um einen hohen Antikörpertiter zu erzeugen und die Bereitstellung von vielen antikörperbildenden Zellen zu bewirken, wird das Antigen zur sog. Hyperimmunisierung mehrere Male injiziert. Beim Menschen erfolgt die Immunisierung mit einer Vakzine zum Schutz gegen Infektionserkrankungen. Bei einem Versuchstier kann jedes beliebige Antigen injiziert werden, gegen das Antikörper erforderlich sind. Dabei gibt es vielfältige Immunisierungsstrategien, die von Antigen zu Antigen verschieden und teilweise nur empirisch zu ermitteln sind. Generell rufen lösliche Antigene eine schlechtere Immunantwort hervor als partikuläre. Die gleichzeitige Verabreichung mit Adjuvanzien (Petrovsky u. Aguilar 2004) verbessert den Immunisierungseffekt. Dabei handelt es sich um Substanzen, die selbst nicht immunogen sind, aber eine allgemeine Verstärkung der Immunantwort durch Aktivierung der an den Immunreaktionen beteiligten Zellen auslösen. Für die Immunisierungen können entsprechend der jeweiligen Fragestellung ganze Zellen, Zellfraktionen oder Moleküle injiziert werden. Sollen Antikörper gegen kleine Moleküle gewonnen werden (Haptene oder Peptide, bis 1500 Da), so müssen diese für die Immunisierung an Trägermoleküle gekoppelt werden. Zur Vakzinierung gegen unterschiedliche Krankheitserreger wird heute neben der Nutzung von rekombinanten Impfstoffen (Mäkelä 2000) (bei der z. B. nur immunogene, aber vollkommen ungefährliche Bestandteile eines Infektionserregers injiziert werden) der genetischen Immunisierung (Srivastava u. Liu 2003) eine große Bedeutung beigemessen. Bei dieser Methode wird anstelle des eigentlichen Antigens das Gen intramuskulär bzw. subkutan verabreicht, sodass es, mit einem entsprechenden Promotor versehen, in einigen Zelltypen transient exprimiert wird. Gegen dieses Genprodukt erfolgt dann eine Immunantwort, einschließlich der Bildung von Antikörpern. Diese Methode wird inzwischen erfolgreich bei der Antikörpergewinnung aus Versuchstieren eingesetzt (Kilpatrick et al. 2000; Lang u. Thomp-

453 4.5 · Monoklonale Antikörper: Grundlagen und ihre Bedeutung in Diagnostik und Therapie

son 2002). Da Immunisierungen im Allgemeinen am lebenden Versuchstier vorgenommen werden, wäre es in vielerlei Hinsicht günstiger, Vorläufer-B-Lymphozyten in vitro zu aktivieren. Diese Zellen könnten dann in der Zellkultur zu antikörperbildenden Plasmazellen ausdifferenzieren. Besonders interessant wäre ein solches Verfahren für die Gewinnung humaner Antikörper, da Menschen aus nahe liegenden Gründen nicht wie ein Versuchstier gegen die verschiedensten Antigene hyperimmunisiert werden können. Einige Protokolle für eine erfolgreiche In-vitro-Immunisierung wurden beschrieben (Duenas et al. 1996), ein handliches Routineverfahren existiert bisher leider noch nicht. Da das Immunsystem „fremd“ von „selbst“ unterscheidet, muss der Antikörperspender sorgfältig gewählt werden. Will man Antikörper gegen Proteine einer bestimmten Tierspezies herstellen, kann es beim Einsatz einer nahe verwandten Spezies bei der Immunisierung zu Misserfolgen kommen, wenn eine große Sequenzhomologie besteht. Andererseits erfolgt jedoch in einigen Fällen auch eine heftige Immunantwort gegen stark konservierte Proteine.

4.5.4 Gewinnung polyklonaler Antikörper Das übliche Verfahren vor der Ära der monoklonalen Antikörper war die Gewinnung der erforderlichen Antikörper aus dem Serum von größtenteils artifiziell (hyper-)immunisierten Spendern (> Abb. 4.5.2). Die spezifischen Antikörper, ihr Anteil beträgt gewöhnlich weni-

4.5

ge Prozent des Gesamtimmunglobulins, können aus solchen Immunseren durch Isolierung der Immunglobulinfraktionen oder durch Affinitätschromatographie mithilfe des immobilisierten Antigens angereichert werden (Harlow u. Lane 1988, 1999). Ein Antikörper bindet eine limitierte Region auf der Oberfläche des Antigens (einige hundert Å2). Diese gebundene Region wird als Antigendeterminante oder Epitop bezeichnet und umfasst für Proteine etwa 7 bis 10 Aminosäurereste. Da jedes Antigen mehrere Epitope auf seiner Oberfläche trägt, wird bei jeder Immunreaktion die Bildung zahlreicher Antikörper induziert, weil verschiedene B-Lymphozyten, die jeweils Immunglobulinrezeptoren für gerade diese Epitope tragen, aktiviert werden. Diese B-Lymphozyten differenzieren zu antikörperproduzierenden Klonen. Unter natürlichen Bedingungen ist eine Antikörperantwort deshalb immer polyklonal, selbst wenn mit gereinigtem Antigen immunisiert wird. Ein Immunserum enthält demzufolge ein Gemisch von verschiedenen Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen und darüber hinaus eine Vielzahl anderer Antikörper, die den Schutz gegen überall vorkommende Antigene, einschließlich der potenziellen Pathogene, gewährleisten. Selbst, wenn dann zur Reinigung immobilisiertes Antigen eingesetzt wird, erhält man also ein polyklonales Antikörpergemisch. Für einige Fragestellungen kann es jedoch sehr vorteilhaft sein, ein solches komplexes Antikörpergemisch gegen ein bestimmtes Antigen zur Verfügung zu haben. In der Natur wird die Strategie der polyklonalen Reaktion verfolgt, um Infektionserreger effektiv zu eliminieren. Werden viele verschiedene Antikörper gebildet, ist

. Abb. 4.5.2. Möglichkeiten der Antikörpergewinnung. Polyklonale Antikörper werden aus dem Serum immunisierter Säugetiere bzw. aus dem Eidotter immunisierter Hühner gewonnen. Monoklonale Antikörper erhält man durch Kultivierung von Hybridomzellen, die durch Fusion von B-Lymphozyten und Myelomzellen hergestellt wurden. Voraussetzung für die Gewinnung rekombinanter Antikörper ist die Klonierung der Antikörpergene. Aus Genbibliotheken, die die Information für eine Vielzahl von Antikörpern enthalten, lassen sich über Display-Techniken spezifische Antikörper gewinnen. Die Variabilität der Bibliotheken kann durch den Einbau synthetischer Nukleotidsequenzen erhöht werden

454

Sektion 4 · Therapie . Abb. 4.5.3. Herstellung monoklonaler Antikörper. B-Lymphozyten von immunisierten Versuchstieren werden mit unbegrenzt wachsenden Myelomzellen (Krebszellen der B-Zell-Reihe) fusioniert, wodurch man unbegrenzt wachsende antikörperproduzierende Hybridomzellen erhält. Nach der Zellfusion erfolgt mithilfe von speziellen Zellkulturmedien die Selektion der fusionierten Zellen. Anschließend werden mit immunologischen Tests diejenigen Hybridomzellen identifiziert, die die gewünschten Antikörper produzieren. Hybridomzellen eines Klons gehen auf eine einzige B-Zelle zurück und synthetisieren somit monoklonale, vollkommen identische Antikörper

die Chance größer, dass einige von ihnen den Erreger inaktivieren, d. h. gegen essenzielle Epitope gerichtet sind. Polyklonale Antikörper können also äußerst nützliche Reagenzien sein, die zudem im Vergleich zu monoklonalen Antikörpern viel leichter und billiger herstellbar sind. Als Quelle polyklonaler Antikörper wird neben dem Serum von Säugetieren seit einiger Zeit auch der Eidotter aus Hühnereiern genutzt (Janson et al. 1995; Schade et al. 2005). Bei Vögeln werden Antikörper über das Ei an die Kücken als natürliche passive Immunisierung weitergegeben. Diese Antikörper stellen einen ersten Immunschutz nach dem Schlüpfen dar (ein Mechanismus, der der Plazentapassage von Immunglobulinen bei Säugern vergleichbar ist).

4.5.5 Gewinnung monoklonaler Antikörper Polyklonale Immunseren lassen sich zwar relativ schnell und kostengünstig herstellen, sie sind jedoch schwer zu standardisieren, da die Immunantwort ein dynamischer Prozess ist. Die Zusammensetzung eines Immunserums unterscheidet sich daher von Individuum zu Individuum und sogar von Blutabnahme zu Blutabnahme. Zur Gewinnung von Antikörpern gegen einzelne Epitope ist es deshalb erforderlich, diejenigen Zellen zu isolieren und zu vermehren, die die gewünschten Antikörper produzieren (> Abb. 4.5.2). Da B-Lymphozyten

nur eine begrenzte Lebensdauer haben, müssen sie in unbegrenzt teilungsfähige Klone umgewandelt werden. Dies ist mithilfe der Hybridomtechnik möglich, die es erlaubt, monoklonale Antikörper zu gewinnen (> Abb. 4.5.3) (Köhler u. Milstein 1975; Milstein 1980, 2000).

4.5.5.1 Zellfusionen Bei dieser Technik werden B-Lymphozyten immunisierter Spender mit Myelomzellen (maligne Zellen der B-Zell-Reihe; es werden Zelllinien verwendet, die selbst keine Immunglobuline mehr produzieren) fusioniert, sodass Hybridzellen entstehen, die die Eigenschaften beider Zellen – Antikörperproduktion und unbegrenzte Teilungsfähigkeit – in sich vereinen (Köhler u. Milstein 1975; Galfré u. Milstein 1981). Alle von einer Hybridzelle abstammenden Tochterzellen (ein Klon) produzieren in ihrer Aminosäuresequenz und damit auch in ihren Bindungseigenschaften identische Antikörper, die als monoklonale Antikörper bezeichnet werden. Der größte Teil der heute verfügbaren monoklonalen Antikörper stammt von der Maus. Praktisch läuft das Verfahren so ab, dass Mäusen nach einer möglichst intensiven Immunisierung Milzzellen entnommen werden, die dann in vitro mit den Myelomzellen fusioniert werden. Um eine Zellfusion zu erzielen, werden die Zellen mit Polyethylenglykol (PEG) behandelt, dabei erhält man eine Hybridzelle auf etwa 1.000 bis 10.000 Elternzellen. Durch den Einsatz einer

455 4.5 · Monoklonale Antikörper: Grundlagen und ihre Bedeutung in Diagnostik und Therapie

Elektrofusionseinrichtung lässt sich diese geringe Ausbeute um den Faktor 10 bis 100 steigern (Karsten et al. 1988). Zur Isolierung der hybridisierten Zellen wird ein einfaches Selektionsverfahren verwendet. In dem eingesetzten Selektionsmedium (HAT-Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin bzw. Azaserin und Thymidin enthält) können die verwendeten Myelommutanten aufgrund eines Enzymdefekts nicht wachsen. Da die nicht fusionierten B-Lymphozyten nur eine begrenzte Lebensdauer haben, überleben in diesem Medium nur Hybridzellen.

4.5.5.2 Antikörperscreening Gewöhnlich produziert nur ein geringer Teil der verwendeten Lymphozyten (einige Prozent) und damit auch der Hybridzellen Antikörper gegen das eingesetzte Antigen. Darum werden die Zellen nach der Fusion in der Regel so in Mikrotiterplatten eingesät, dass in jeder Vertiefung nur wenige Zellkolonien wachsen. Diese Kolonien müssen nun auf ihre Antikörperproduktion getestet werden, um die gewünschten Hybridome identifizieren und weiterführen zu können. Für dieses Screening sind schnelle und einfache Festphasen-Immuntests in Mikrotiterplatten am besten geeignet (Harlow u. Lane 1999). Gerade bei diesem Schritt der Hybridomtechnik ist ein sehr großer Aufwand an „Handarbeit“ erforderlich. Die Einführung einfacher Selektions- und automatisierter Massenscreeningverfahren würde das Auffinden seltener Antikörper deutlich erleichtern und es erlauben, die für die Proteomanalyse benötigten Nachweismoleküle schneller zu erzeugen (Love et al. 2006). Als Indikator werden in den Immuntests heute in erster Linie Enzyme eingesetzt, die ein farbloses Substrat in ein farbiges (in seltenen Fällen in ein fluoreszierendes) Produkt umwandeln. Die Auswertung erfolgt photometrisch oder fluorimetrisch direkt in den Mikrotiterplatten. Im Gegensatz zu diesen Enzymimmuntests („enzym-linked immunsorbent assay“, ELISA) wurden in früheren Jahren sehr häufig Radioimmuntests („radioimmunoassay“, RIA) eingesetzt. Für die weitere Charakterisierung der Antikörper wird dann entsprechend der jeweiligen Fragestellung das gesamte Repertoire an immunologischen Nachweisverfahren genutzt. Wenn beim ersten Screening der Einsatz eines einfachen Festphasentests nicht möglich ist (wie z. B. beim Nachweis von intrazellulären Antigenen, die nicht in isolierter Form verfügbar sind), kann die Suche nach spezifischen Antikörpern sehr aufwendig werden.

4.5

4.5.5.3 Klonierungen Sind die Hybridome identifiziert, die den gewünschten Antikörper produzieren, müssen sie vermehrt werden (Galfré u. Milstein 1981). In den ersten Tagen nach der Fusion sind Zellhybride sehr instabil, sie können Chromosomen und infolgedessen auch die Fähigkeit zur Antikörperproduktion verlieren, ohne dabei ihre Vitalität einzubüßen. Zur Etablierung stabiler Antikörperproduzenten werden die Zellen zum frühestmöglichen Zeitpunkt kloniert, d. h., man lässt einzelne Klone heranwachsen, die man dann wiederum auf ihre Antikörperproduktion testet. Nach mehreren Wiederholungen dieser Klonierung gelangt man zu stabilen antikörperproduzierenden Klonen. Aber selbst diese Klone müssen von Zeit zu Zeit wieder rekloniert werden, da sich die während der Zellteilungen auftretenden Nichtproduzenten in der Regel schneller vermehren und die Produzenten aus der Kultur verdrängen.

4.5.5.4 Antikörperproduktion und -reinigung Für Laborzwecke reicht im Allgemeinen die Vermehrung der Zellen in Kulturflaschen, dabei werden Antikörperkonzentrationen von ca. 20 µg/ml erreicht (Galfré u. Milstein 1981). In den ersten Jahren der Hybridomtechnik wurden die Hybridomzellen für die Antikörperproduktion in syngene Mäuse (d. h. Inzuchtmäuse des Stammes, aus dem sowohl Myelomzellen als auch B-Lymphozyten stammen) intraperitoneal injiziert. Die sich im Bauchraum vermehrenden malignen Hybridomzellen produzieren sehr große Mengen an Antikörpern, die dann in der Aszitesflüssigkeit enthalten sind. Dieses Verfahren wird aus ethischen Gründen heute abgelehnt. Für die Großproduktion werden Hybridomzellen in Rollerflaschen oder Fermentern (bis 20 m3) kultiviert (Birch u. Racher 2006; Hale et al. 2004). Auch Hohlfasersysteme (Gramer u. Britton 2000) und spezielle Kulturgefäße, in denen das Reservoir mit dem Nährmedium von den Zellen durch eine semipermeable Membran getrennt ist, kommen zum Einsatz. Für therapeutische Zwecke müssen monoklonale Antikörper im kg-Maßstab produziert werden. Hybridomzellen können in flüssigem Stickstoff über Jahrzehnte aufbewahrt werden und sind nach dem Auftauen wieder für eine Antikörperproduktion einsetzbar. Damit stehen die Produzenten identischer Antikörper theoretisch ewig zur Verfügung. Um Antikörper in der Praxis einsetzen zu können, müssen sie aus dem Kulturüberstand isoliert werden, da dieser einen großen Überschuss an anderen Substanzen enthält. Für die Reinigung haben sich verschiedene Va-

456

Sektion 4 · Therapie

rianten der Affinitätschromatographie durchgesetzt (Huse et al. 2002). Diese Verfahren beruhen auf spezifischen, nichtkovalenten, reversiblen Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen (s. auch 5.4.8.2). Für die Antikörperreinigung werden in erster Linie die bakteriellen Fc-Rezeptoren Protein A und Protein G eingesetzt (Zola u. Neoh 1989; Huse et al. 2002; Roque et al. 2004). Beide Proteine binden Immunglobuline der Klasse IgG aus verschiedenen Spezies. Schwierigkeiten ergeben sich bei der Isolierung von Antikörpern anderer Klassen (wie z. B. IgA oder IgM). Ist das Antigen nicht verfügbar, müssen hier oft verschiedene chromatographische Verfahren kombiniert werden.

4.5.5.5 Speziesherkunft monoklonaler Antikörper Die überwiegende Mehrheit der heute zur Verfügung stehenden monoklonalen Antikörper stammt aus der Maus. Inzuchtmäuse lassen sich leicht immunisieren und kostengünstig halten. Außerdem stehen exzellente Myelomlinien für Fusionen zur Verfügung. Auch aus einigen anderen Spezies (z. B. Ratte, Hamster, Kaninchen, Huhn) wurden inzwischen monoklonale Antikörper gewonnen, wobei neben Myelomlinien aus der Maus auch einige Myelome aus den betreffenden Spezies zum Einsatz kamen (Kuo et al. 1985; Mallender u. Voss 1995; Moldenhauer et al. 1982; Nishinaka et al. 1991). In geringem Umfang wurden auch humane monoklonale Antikörper hergestellt. Die besten Fusionserfolge wurden dabei mit Heteromyelomlinien erzielt, die das Ergebnis einer Fusion von Mausmyelomzellen mit humanen B-Zellen waren (Jahn et al. 1986). Erst mit diesen Zellen wurden stabile humane Hybridome erzeugt. Das größte Problem bei der Herstellung humaner Hybridome war und ist jedoch die geringe Zahl an antikörperproduzierenden B-Lymphozyten, die für eine Fusion zu Verfügung stehen. Unter den für diese Fragestellung einsetzbaren peripheren Blutlymphozyten befinden sich (bedingt durch eine fehlende Hyperimmunisierung) nur wenige B-Lymphozyten, die den gewünschten Antikörper produzieren. Um die Anzahl fusionierbarer Zellen zu erhöhen, wurden B-Lymphozyten in vitro durch eine Infektion mit dem Epstein-Barr-Virus in proliferierende Linien überführt, wodurch sich jedoch die Zahl der spezifisch reagierenden B-Zellen nicht erhöhte (Jahn et al. 1990). Hier würde eine effektive In-vitro-Immunisierung eine Lösung darstellen.

4.5.6 Chemische und biochemische Modifizierung von Antikörpern Für die Charakterisierung und die praktische Anwendung müssen Antikörpermoleküle oft mit anderen Molekülen gekoppelt oder mithilfe von Proteasen fragmentiert werden.

4.5.6.1 Gewinnung von Antikörperfragmenten Für Anwendungen, in denen z. B. die Bindung von Effektorzellen oder -molekülen unerwünscht ist, werden antigenbindende Fragmente der Antikörper hergestellt, denen die C-terminale Hälfte der schweren Ketten und damit der größte Teil der konstanten Region fehlt (Harlow u. Lane 1988). Univalente Antikörperfragmente („fragment antigen binding“, Fab) lassen sich durch Verdau mit Papain gewinnen, dabei entstehen auch Fc-Fragmente (von „fragment crystallizable“). Durch Spaltung mit Pepsin erhält man bivalente F(ab´)2Fragmente, der Fc-Teil wird in diesem Fall in kleine Bruchstücke zerlegt. Die Gewinnung von Antikörperfragmenten hat wesentlich zur Aufklärung der Antikörperstruktur beigetragen. Auch heute kristallisiert man hauptsächlich Fab-Fragmente, um durch Röntgenstrukturanalyse die Bindungsregion von Antikörpern zu erforschen.

4.5.6.2 Markierung von Antikörpern Antikörper sind Bindungsmoleküle, die ihre eigentliche Abwehrfunktion im Organismus überwiegend in Kooperation mit anderen Molekülen und Zellen ausüben. In Ausnahmefällen genügen Antikörper allein zur Abwehr von infektiösen Prozessen (z. B. bei der Neutralisierung von bakteriellen Toxinen oder Viren, wenn sie genau gegen die Epitope gerichtet sind, die Toxine oder Viren zum Anheften an Zelloberflächenrezeptoren benötigen). Meistens ist die Bindung des Fc-Teils des Antikörpermoleküls an Effektorzellen (wie z. B. Makrophagen) oder Effektormoleküle (wie Komplementproteine) erforderlich, um Fremdzellen und/oder -moleküle zu inaktivieren. Auch in der Forschung sind Antikörper ohne Modifikation nur begrenzt einsetzbar. Direkte Methoden, die vor etwa 30 Jahren in großem Umfang zum Nachweis von Antigen-Antikörper-Reaktionen verwendet wurden (z. B. Präzipitations- oder Agglutinationstests), sind mit monoklonalen Antikörpern nur in Ausnahmefällen zu realisieren; sie sind darüber hinaus relativ insensitiv und haben einen hohen Antikörperverbrauch.

457 4.5 · Monoklonale Antikörper: Grundlagen und ihre Bedeutung in Diagnostik und Therapie

Für die meisten Tests werden die Antikörper mit einer leicht nachweisbaren Substanz verknüpft (Aslan u. Dent 1998). Die ersten Kopplungen, die praktische Bedeutung erlangten, wurden mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszeinisothiozyanat (FITC) durchgeführt, der im alkalischen Milieu sehr leicht an freie NH2-Gruppen von Proteinen bindet. Fluoreszein wird mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops bzw. eines Fluorometers nachgewiesen und ist auch heute noch der am häufigsten verwendete Fluoreszenzmarker. Weitere in größerem Maßstab eingesetzte Marker sind Radioisotope, die aufgrund ihrer Strahlung nachweisbar sind, und Enzyme. Die Kopplung von Enzymen kann durchaus problematisch sein, da hier zwei biologisch aktive Moleküle kovalent verknüpft werden müssen, ohne dass ihre Aktivität verloren geht. Die am häufigsten eingesetzten Markerenzyme sind Peroxidase (aus Meerrettich), alkalische Phosphatase (aus dem Kälberdarm) und β-Galaktosidase (aus Bakterien). Es werden noch zahlreiche weitere Marker für unterschiedliche Zwecke eingesetzt (wie z. B. kolloidales Gold in der Elektronenmikroskopie oder in Teststreifen). Für die Kopplung an andere Moleküle oder feste Träger werden in erster Linie die NH2- oder die COOHGruppen der Antikörper genutzt. Wenn die Kopplungsgruppe in unmittelbarer Nähe der Antigenbindungsregion lokalisiert ist, kann nach der Kopplung die Antigenbindung verloren gehen. Alternativ muss dann über Kohlenhydrate oder SH-Gruppen gekoppelt werden. An dieser Stelle soll auch das Avidin-Biotin-System hervorgehoben werden (Wilchek et al. 2006), das eine Standardisierung bei den Immuntests und außerdem eine Signalverstärkung erlaubt. Beim Avidin handelt es sich um ein Protein aus Hühnereiern (das ähnlich reagierende Streptavidin wird aus Bakterien isoliert), das mit einer sehr hohen Affinität (etwa 1015 M1) das Vitamin Biotin bindet. Es sind verschiedene Biotinderivate erhältlich, die eine leichte Kopplung an Proteine erlauben. Avidin und Streptavidin können relativ einfach mit Enzymen und anderen Markern gekoppelt werden. So lässt sicht das Avidin-Biotin-System als universelles Nachweisverfahren in verschiedenen immunologischen Tests einsetzen, wodurch man z. B. die Markierung jedes einzelnen Antikörpers mit einem Markerenzym umgehen kann. Alternative universelle Nachweissysteme wurden ebenfalls entwickelt, haben jedoch bisher nicht die weite Verbreitung des AvidinBiotin-Systems gefunden (Martin et al. 1990; Micheel et al. 1988).

4.5

4.5.7 Rekombinante Antikörpertechniken Auch bei der Antikörpergewinnung und -modifikation haben DNA-Techniken neue Möglichkeiten eröffnet (> Abb. 4.5.2).

4.5.7.1 Klonierung von Antikörpergenen Voraussetzung für die gentechnische Manipulation eines Proteins ist die Klonierung und Sequenzierung der entsprechenden Gene und die Expression in einem Organismus, der eine effektive Produktion erlaubt. Antikörper sind in dieser Hinsicht verhältnismäßig komplizierte Moleküle. Die Gene, die für die leichten und schweren Ketten kodieren, sind auf zwei verschiedenen Chromosomen lokalisiert, und der Teil der Antikörper, der für die Bindung verantwortlich ist, unterscheidet sich von einem Antikörper zum anderen, teilweise auch am N-Terminus. Die Antikörpergenvariabilität entsteht auf somatischer Ebene bei der Reifung der B-Lymphozyten, wobei aus über die Keimbahn weitergegebenen Antikörpergensegmenten durch somatische Rekombination die eigentlichen Antikörpergene zusammengefügt werden, und zwar in jedem B-Lymphozyten zu einer neuen, einzigartigen Kombination (> Abb. 4.5.4) (Tonegawa 1983). Die Sequenzvielfalt in diesem Bereich verursacht große Probleme bei der Klonierung der Antikörpergene. Für die Amplifikation des Gens für einen bestimmten Antikörper mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) müssen, im Gegensatz zu „normalen“ Genen, Primer-Gemische (sog. entartete Primer) eingesetzt werden. Die Erfolgsrate der Amplifikation ist hierbei nicht sicher vorhersagbar. Bei allen vorrangig untersuchten Säugerspezies (Mensch, Maus, Ratte) traten diese Probleme auf. Dagegen genügt bei der Klonierung von Antikörpergenen aus Hühnern ein Primer-Paar. Im Huhn entsteht die Antikörpervielfalt durch Genkonversion, wodurch die Termini der Antikörpergene auch im variablen Teil identisch sind (Sayegh et al. 1999). Eine Genklonierung von Hühnerantikörpern ist damit ungleich leichter (Andris-Widhopf et al. 2000).

4.5.7.2 Gentechnische Herstellung von Antikörperfragmenten Um bindende Antikörperfragmente zu erhalten, genügt die Klonierung und Expression der variablen Bereiche (Skerra u. Plückthun 1988). Für zahlreiche praktische Anwendungen ist dies ausreichend. Auch für In-vivoAnwendungen erscheinen Antikörperfragmente attraktiv, da sie in Gewebe eindringen können, die möglicher-

458

Sektion 4 · Therapie

. Abb. 4.5.4. Genetische Grundlagen der Antikörpervariablilität. Die Antikörpervielfalt ist in erster Linie auf somatische Rekombinationen zurückzuführen. Rekombiniert werden V-, D- und J-Gensegmente („variable“, „diversity“ und „joining“), die in ihrer Gesamtheit über die Keimbahn an die Nachkommen weitergegeben werden. Vorläuferzellen der B-Lymphozyten und alle somatischen Zellen (außer den B-Lymphozyten) enthalten diese Gensegmente. Die V(D)JRekombination erfolgt in den B-Lymphozyten nach dem Zufallsprinzip (Janeway et al. 2005; Roitt et al. 1998). Der Genabschnitt, der den variablen Bereich einer schweren Kette eines Antikörpermoleküls kodiert, besteht aus einem V-Segment, einem D-Segment und einem J-Segment; der Genabschnitt, der den variablen Bereich einer leichten Kette kodiert, besteht aus einem V-Segment und einem J-Segment. Die Gene, die die schweren und leichten Antikörperketten kodieren, sind auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert [beim Menschen ist das für die schwere Kette Chromosom 14, für die leichte O-Kette Chromosom 22 und für die leichte N-Kette Chromosom 2 (Roitt et al. 1998); für die leichten Kette existieren bei allen Säugern zwei Varianten]. Die Kombination von V-, D- und J-Segmenten zum funktionsfähigen Genabschnitt erfolgt auf somatischer Ebene. Hierbei werden während der Differenzierung der B-Lymphozyten beim Menschen aus einem Satz von 65 V-Gensegmenten für die schweren Ketten, 40 V-Gensegmenten für die N-Ketten und 30 V-Gensegmenten

für die OKetten, sowie 27 D-Gensegmenten für die schweren Ketten und 6 J-Gensegmenten für die schweren Ketten, 5 J-Gensegmenten für die NKetten und 4 J-Gensegmenten für die OKetten (Janeway et al. 2005) (bei der Maus ist die Anzahl beträchtlich größer) jeweils ein V-, D- und J-Gensegment für die schwere Kette und je ein V- und J-Gensegment für die leichte Kette in einem B-Lymphozyten rekombiniert, die dann jeweils den funktionellen Genbereich zur Kodierung der variablen Region eines bestimmten Antikörpermoleküls bilden. Ein B-Lymphozyt erhält damit eine einmalige Kombination der Gensegmente und exprimiert demzufolge einen einmaligen Antikörper. Die enorme Antikörpervielfalt wird zusätzlich zu dieser V(D)J-Rekombination durch Ungenauigkeiten in der Verknüpfungsstelle, die Zufallskombination von schweren und leichten Ketten und im Laufe der Immunantwort durch Mutationen in der Antigenbindungsstelle (somatische Hypermutation) erhöht. Bis auf die somatische Hypermutation führen die gleichen Mechanismen zur Vielfalt der T-ZellRezeptoren. Dargestellt sind nur die Gensegmente für die Kodierung der schweren Kette: im oberen Teil die nichtrekombinierten V-, D- und J-Gensegmente für den variablen Bereich und ein C-Gensegment für den konstanten Bereich in somatischen bzw. in Vorläuferzellen der B-Lymphozyten und im unteren Teil rekombinierte VDJ-Genbereiche verbunden mit einem C-Segment in reifen B-Lymphozyten

459 4.5 · Monoklonale Antikörper: Grundlagen und ihre Bedeutung in Diagnostik und Therapie

weise intakten Antikörpern unzugänglich sind. Am häufigsten werden sog. Einzelketten-Fv-Fragmente („single chain Fv“, scFv) hergestellt. Das geschieht durch Verknüpfung der beiden Genabschnitte, die für die variablen Domänen der leichten und der schweren Kette kodieren. Dabei wird ein Genabschnitt eingefügt, der für eine kurze Peptidsequenz (in der Regel aus ca. 15 Glycinund Serinresten bestehend) kodiert. So erhält man ein Gen, das sich mithilfe entsprechender Vektoren in unterschiedlichen Organismen exprimieren lässt. Besonders verbreitet ist die Expression in Bakterien (z. B. Escherichia coli), da sich diese im Vergleich zu Säugerzellen viel schneller vermehren, ihre Ansprüche an die Nährmedien viel bescheidener sind und sie für eine Kultivierung viel robuster sind (Breitling u. Dübel 1997; Worn u. Plückthun 2001). So lassen sich große Antikörpermengen in relativ kurzer Zeit gewinnen, was für kommerzielle Fragestellungen besonders wichtig ist. Es konnten jedoch nicht alle Antikörper als funktionelle scFv-Fragmente in E. coli exprimiert werden. Die Ursache hierfür liegt vor allem in der unzureichenden Faltung vieler Antikörperfragmente, die eine gestörte Antigenbindung zur Folge hat. Versuche, den gesamten Fab-Teil der Antikörper als scFab in Bakterien zu exprimieren, führten zu keiner generellen Lösung des Problems. Aus diesem Grunde müssen Antikörperfragmente und -konstrukte häufig in anderen Expressionssystemen produziert werden, z. B. in Hefen, Insektenzellen, Säugerzellen, zellfreien Systemen etc. (Verma et al. 1998). Die Antigenbindung erfolgt zwar in der Regel durch die hypervariablen Regionen beider Ketten des Antikörpermoleküls, gelegentlich überwiegt jedoch der Anteil der schweren Kette. In solchen seltenen Fällen können sog. Einzeldomänenantikörper („single domain“, sdAb) gewonnen werden, die nur aus der jeweiligen bindenden Domäne bestehen. Bei Cameliden (Kamelen und Lamas) gibt es zwei Immunglobulinsubklassen, die nur schwere, aber keine leichten Ketten besitzen. Die Antigenbindung erfolgt somit an einer Bindungsregion, die nur von der schweren Kette gebildet wird (HamersCasterman et al. 1993). Derartige Antikörper lassen sich leichter klonieren, und die Aussicht, ein solches „camelizing“ auch mit Antikörpern anderer Spezies über rekombinante Techniken zu erreichen, erscheint sehr attraktiv (Holt et al. 2003).

4.5.7.3 Rekombinante Antikörper Der Vorteil rekombinanter Techniken besteht nicht nur in der Möglichkeit, Genprodukte außerhalb des Ursprungsorganismus in großen Mengen zu exprimieren. Diese Genprodukte können weiterhin auf Genebene mit anderen Proteinen fusioniert werden, sodass Produkte

4.5

mit vollkommen neuen Eigenschaften entstehen. Theoretisch können enzymmarkierte Antikörper deshalb auch gentechnisch hergestellt werden. Ein Problem ist in diesen Fällen die Expression der Markerenzyme. Die rekombinante Expression von Peroxidase ist bisher nicht gelungen, da sie für ihre Aktivität ein Koenzym benötigt. Erfolgreich wurde dagegen ein Fusionsprotein exprimiert, das aus alkalischer Phosphatase aus E. coli und einem Antikörper besteht (Kerschbaumer et al. 1997). Beschrieben wurden auch Fusionsproteine aus Antikörpern und GFP („green fluorescent protein“), die für immunologische Nachweisverfahren einsetzbar sind (Casey et al. 2000). Da sich jedoch Antikörper für Nachweisverfahren relativ leicht mit chemischen Methoden koppeln lassen, werden rekombinante Techniken in erster Linie dann eingesetzt, wenn das Fusionsprotein für den In-vivoEinsatz vorgesehen ist. Für therapeutische Anwendungen (z. B. in der Immuntherapie von Tumoren) werden u. a. Antikörper-Toxin- und Antikörper-EnzymFusionsproteine entwickelt (Schrama et al. 2006). Daneben wurden zahlreiche monoklonale Mausantikörper mit gentechnischen Methoden so modifiziert, dass sie nach Applikation beim Menschen eine möglichst geringe Immunogenität aufweisen. Durch die Rekombination von variablen Regionen eines Mausantikörpers mit konstanten Regionen eines humanen Immunglobulins wurden sog. chimäre Antikörper hergestellt, die in Patienten weniger immunogen sind als komplette Mausantikörper (Glennie u. Johnson 2000; Morrison et al. 1984; Presta 2006). Bei der sog. „Humanisierung“ werden nur die hypervariablen Regionen eines Mausantikörpers mit bekannter Spezifität in das Gerüst eines humanen Antikörpers eingebaut. Dabei wird eine noch geringere Immunogenität erreicht, Bindungsstärke und Spezifität des Antikörpers können sich jedoch ändern, weil auch die Gerüstregionen Einfluss auf die Struktur der Antigenbindungsstelle haben (Glennie u. Johnson 2000; Jones et al. 1986). Chimäre und „humanisierte“ Antikörper werden wegen ihrer Komplexität in eukaryoten Systemen exprimiert.

4.5.7.4 Antikörper-Display-Techniken Die Klonierung von Antikörpergenen und die Herstellung von scFv ermöglichte nicht nur die gentechnische Manipulation von Antikörpern und ihre Expression in anderen Zellsystemen, sie erlaubte auch die Herstellung von Antikörperbibliotheken, aus denen, vergleichbar mit der Hybridomtechnik, Antikörper einer gewünschten Spezifität selektiert werden können. Das erste erfolgreich eingesetzte System war das Phagen-Display (> Abb. 4.5.5).

460

Sektion 4 · Therapie

. Abb. 4.5.5. Gewinnung rekombinanter Antikörper mithilfe des Phagen-Display. Die Gene der variablen Bereiche von Antikörpern (VH und VL) werden mit den Genen fusioniert, die für Oberflächenproteine von E.-coli-infizierenden filamentösen Phagen kodieren. Dadurch werden die Antikörperfragmente an der Phagenoberfläche exprimiert. Damit können mit Hilfe der Phagen große Antikörper-

bibliotheken neuer, unbekannter Spezifitäten angelegt werden, aus denen sich, ähnlich wie aus einem immunisierten Tier, spezifische Antikörper isolieren lassen. Der isolierte, spezifisch bindende Phage enthält auch die genetische Information für die Synthese des Antikörperfragments. Er kann unbegrenzt vermehrt und für die Herstellung von Einzelkettenantikörpern eingesetzt werden

Zunächst werden aus B-Lymphozyten immunisierter oder nichtimmunisierter Spender die Gene für die verschiedenen variablen Regionen der leichten und der schweren Ketten der Antikörper isoliert. Diese werden dann als scFv-Gene in diejenige Region des Genoms von filamentösen fd/M13-Phagen übertragen, die für das pIII-Protein an der Phagenoberfläche kodiert, über das die Anheftung des Phagen an E.-coli-Zellen erfolgt. Die auf solchen Phagen basierenden Plasmide (Phagemide) bewirken nach Transfer in Bakterien und Superinfektion mit Helferphagen die Freisetzung eines Phagengemischs, das verschiedene rekombinante pIII-scFv-Fusionsproteine an der Oberfläche exprimiert. Aus diesem Gemisch können durch Bindung an das entsprechende Antigen diejenigen Phagen isoliert werden, die auf ihrer Oberfläche die entsprechenden Antikörperfragmente und im Phagengenom die Gene enthalten, die für dieses Fragment kodieren. Diese Phagen können dann wiederum unbegrenzt vermehrt werden (McCafferty et al. 1990; Barbas et al. 1991; Little et al. 1994). Da man mit solchen „Phagenantikörpern“ selbst kaum arbeiten kann, werden die Antikörperfragmente durch separate Expression in speziellen E.-coli-Stämmen gewonnen. Mithilfe einer Phagenbibliothek können spezifische Antikörperfragmente innerhalb weniger Wochen erzeugt werden, da-

rum ist diese Methode zu einer echten Alternative zur konventionellen Hybridomtechnik geworden (obwohl natürlich auch hier zahlreiche technische Probleme zu überwinden sind, bevor man einen spezifischen Antikörper in den Händen hat). Die Variabilität der Antikörperbibliotheken aus B-Lymphozyten wurde durch Einführung synthetischer Nukleotidsequenzen erweitert, sodass in einigen Bibliotheken bis zu 1012 verschiedene Antikörperspezifitäten vertreten sein können. Da die Phagenbanken in erster Linie aus B-Lymphozyten vom Menschen hergestellt wurden, können mit dieser Methode humane rekombinante Antikörper gewonnen werden. Damit lässt sich die Schwäche der Hybridomtechnik in Bezug auf humane Antikörper umgehen. Durch die enorme Vielfalt der zur Verfügung stehenden Spezifitäten und die verhältnismäßig kurze Zeit, die für die Selektion benötigt wird, ist das Phagen-Display zum wichtigen Werkzeug in der Herstellung humaner Antikörper geworden. Neben dem Phagen-Display sind noch einige weitere Verfahren (Bakterien-, Hefe- und Ribosomen-Display) entwickelt worden, die bisher jedoch nur begrenzte Verbreitung gefunden haben, obwohl das Ribosomen-Display offensichtlich zahlreiche Nachteile des Phagensystems überwinden kann (Hanes et al. 2000). Im Gegensatz

461 4.5 · Monoklonale Antikörper: Grundlagen und ihre Bedeutung in Diagnostik und Therapie

4.5

. Abb. 4.5.6. Herstellung transgener Mäuse zur Produktion humaner Antikörper (verändert nach Jakobovits 1994). Durch Inaktivierung der endogenen murinen Immunglobulin- (Ig-)Gene in embryonalen Stammzellen (ES) und anschließender Übertragung dieser Zellen in scheinträchtige Mütter wurden Mäuse gewonnen, die keine Antikörper (Ak) produzierten (sog. Knockout-Mäuse). In andere embryonale

Stammzellen wurden zusätzliche humane Immunglobulin-Gene eingeschleust und die Zellen danach in scheinträchtige Mütter überführt. Mit diesem Ansatz konnten Mäuse gewonnen werden, die sowohl murine als auch humane Antikörper produzierten. Durch Kreuzungen der beiden Mausstämme konnten Mäuse selektiert werden, die nur humane Antikörper produzierten (sog. XenoMäuse)

zur Hybridomtechnik, die vollkommen frei zugänglich ist, sind jedoch die Display-Verfahren patentrechtlich weitgehend geschützt. Vor der Selektion von Antikörpern hatte man das Phagensystem für das Screening von Peptidbibliotheken eingesetzt (Scott u. Smith 1990). Dabei werden Nukleotidsequenzen, die für Peptide mit einer zufälligen Aminosäuresequenz kodieren, in die pIII-Region der Phagen übertragen, sodass große Peptidbibliotheken zur Verfügung stehen. Mithilfe dieser Bibliotheken lässt sich das Epitop ermitteln, an das ein bestimmter monoklonaler Antikörper bindet. Dieses Epitop-Mapping ist nur für Sequenzepitope (die von einer kontinuierlichen Aminosäuresequenz abhängig sind) erfolgreich, nicht jedoch für Konformationsepitope (die im nativen Antigenmolekül aufgrund der Tertiärstruktur entstehen) (van Regenmörtel u. Pellequer 1994). In einigen Fällen können sog. Mimotope identifiziert werden, die chemisch nicht mit dem Epitop des ursprünglichen Antigens identisch sind, aber aufgrund einer zufälligen Konformationsähnlichkeit in die Antigenbindungsregion „passen“ (Böttger et al. 1999). Die Identifizierung der von Antikörpern erkannten Sequenzepitope ist ebenfalls über Bibliotheken chemisch synthetisierter Peptide möglich (Reineke et al. 2002).

Antikörper auch in vivo zu erhalten. Versuche zur Übertragung humaner hämatopoetischer Stammzellen in SCID-Mäuse („severe combined immunodeficiency disease“; Mäuse, die weder spezifische Antikörper noch T-Zell-Rezeptoren bilden können) brachten keine befriedigenden Resultate (Nguyen et al. 1997). Eine andere Mausmutante scheint sich besser für die Besiedelung mit humanen Lymphozyten zu eignen (Traggiai et al. 2004). Es ist allerdings nicht klar, ob man diese Mäuse für die Herstellung humaner monoklonaler Antikörper einsetzen kann. Inzwischen ist es jedoch gelungen, transgene Mäuse zu züchten, die mit den humanen Keimbahngenen für die Antikörperbildung ausgestattet sind und ausschließlich humane Antikörper produzieren (> Abb. 4.5.6) (Davis et al. 1999; Jakobovits 1994; Lonberg 2005). Dazu wurden zunächst Knockout-Mäuse erzeugt, die keine funktionellen Mausantikörper-Gensegmente mehr enthielten. Außerdem wurden transgene Mäuse durch die Einführung von humanen Antikörper-Gensegmenten in die Keimbahn hergestellt. Durch Kreuzung entstanden dann Mäuse, die mit der Bildung von humanen Antikörpern auf jedes Antigen reagierten, das für den Mausorganismus „fremd“ ist, also auch auf Antigene menschlichen Ursprungs. Diese Mäuse sind damit die idealen Spender für B-Lymphozyten, aus denen mithilfe der Hybridomtechnik hochaffine humane Antikörper gewonnen werden können. Derartige Antikörper sollten bei einer In-vivo-Therapie im Menschen keine Immunreaktion auslösen. Die ersten mit dieser Technik hergestellten Antikörper haben schon ihren Weg in die Klinik gefunden.

4.5.7.5 Antikörpergewinnung aus „humanisierten“ und transgenen Mäusen Neben den Versuchen zur In-vitro-Immunisierung und den Display-Techniken gab es mehrere Ansätze, humane

462

Sektion 4 · Therapie

Es wird sich zeigen, inwieweit diese transgenen, humane Antikörper produzierenden Mäuse die bisherigen Probleme in der Therapie beseitigen können. Da Antikörper Unikate sind, ist kaum zu erwarten, dass in jedem Fall versucht wird, für etablierte, sehr gute murine Antikörper neue Äquivalente zu finden. Für diese wird man eher der Weg der „Humanisierung“ der Antikörper mit gentechnischen Methoden begehen.

4.5.7.6 Bispezifische Antikörper Natürlich vorkommende Antikörper sind mindestens bivalent und, da sie identische Antigenbindungsregionen haben, monospezifisch. Mit biochemischen, zelltechnischen und gentechnischen Methoden können Antikörper mit zwei unterschiedlichen Bindungsregionen gewonnen werden (Cao u. Lam 2003; Carter 2001; Holliger u. Winter 1993). Bei der biochemischen Methode werden F(ab’)2Fragmente der ausgewählten Antikörper erst reduktiv in monovalente Fragmente gespalten, danach gemischt und oxidativ reassoziiert. Alternativ lassen sich durch Fusion von zwei verschiedenen Hybridomen HybridHybridome erzeugen, die die Gene zur Expression von zwei verschiedenen Antikörpern besitzen (Karawajew et al. 1987). Mit gentechnischen Methoden wurden durch unterschiedliche Klonierungsstrategien ebenfalls bispezifische Antikörperfragmente erzeugt. Auch die Herstellung von rekombinanten Antikörpermolekülen mit mehr als zwei verschiedenen Antigenbindungsregionen ist gelungen (Hudson u. Kortt 1999). Generell finden bispezifische Antikörper dort Anwendung, wo es wichtig ist, Moleküle und Zellen zu verbinden und andere Methoden nicht den gewünschten Erfolg haben. Bispezifische Antikörper, die gleichzeitig ein nachzuweisendes Antigen und ein Markerenzym binden, wurden u. a. in Immuntests und in der Immunhistologie eingesetzt. Der größte Nutzen wird jedoch vom Einsatz bispezifischer Antikörper für immuntherapeutische Zwecke in der Tumorbehandlung erwartet. Hierfür sind z. B. Antikörper vorgesehen, die mit einer Bindungsregion mit einem Antigen auf der Oberfläche der Tumorzellen reagieren und mit der anderen Bindungsregion mit einem Epitop von Effektormolekülen oder -zellen (Booy et al. 2006).

4.5.7.7 Katalytische Antikörper Eine besondere Entwicklung auf dem Gebiet der Antikörpertechniken hängt mit der gewaltigen Vielfalt der Antikörper zusammen. Da wahrscheinlich bis zu 1011 verschiedene Antikörper in einem menschlichen Indivi-

duum synthetisiert werden können, sollten einige von ihnen ihr Antigen nicht nur binden, sondern auch umwandeln können, weil die Bindungsstelle katalytische Eigenschaften besitzt. Es wird geschätzt, dass „nur“ ca. 5.000 unterschiedliche Enzyme existieren. Von besonderem Interesse wären darum solche katalytisch wirkenden Antikörper, die Reaktionen beschleunigen (Substratspaltungen oder Synthesen), für die bisher keine Enzyme bekannt sind (Jencks 1986). Katalytische Antikörper lassen sich sowohl mithilfe der Hybridomtechnik als auch des Phagen-Display erzeugen. Die katalytische Wirkung der Antikörper beruht meist auf einer Stabilisierung des Übergangszustands der betreffenden chemischen Reaktion. Wegen der Kurzlebigkeit der Übergangszustände werden für Immunisierung bzw. Phagenselektion stabile Übergangszustandsanaloga eingesetzt. Die meisten etablierten katalytischen Antikörper wirken esterolytisch (Xu et al. 2004). Allerdings sind die Umsatzraten geringer als die typischer Enzyme. Der spektakulärste katalytische Antikörper, der bisher hergestellt wurde und auch kommerzielle Anwendung gefunden hat, besitzt Aldolaseaktivität (Wagner et al. 1995).

4.5.8 Nutzung von monoklonalen Antikörpern Die Anwendungsgebiete der Antikörper sind heute so umfassend, dass wir hier nur einen kleinen Überblick geben können. Der Bedarf an spezifischen Antikörpern ist in den letzten Jahren enorm angestiegen, und auf zahlreichen Gebieten, wie z. B. der Genomforschung, ist der Mangel an geeigneten Antikörpern zur Identifizierung und Charakterisierung der Genprodukte zum limitierenden Faktor geworden. Techniken zur Massenproduktion von Antikörpern sind deshalb unbedingt erforderlich. Die eingesetzten Methoden zum Antikörpernachweis sind vielfältig, lassen sich aber auf wenige Grundprinzipien reduzieren. Hier sind in der Zukunft durch vermehrten Einsatz von Multiplex- und Microarray-Methoden gewaltige Umbrüche zu erwarten (Angenendt 2005).

4.5.8.1 Antikörper als Nachweisreagenzien Für den Nachweis von löslichen Antigenen mithilfe von Antikörpern stehen sehr viele immunologische Tests zur Verfügung, die teilweise eine außerordentlich hohe Sensitivität besitzen (Harlow u. Lane 1999). Die meisten Antigennachweise werden heute mit Enzymimmuntests durchgeführt (obwohl in klinischen Bereichen auch noch zahlreiche Radioimmuntests eingesetzt werden).

Zwei-Seiten-Bindungstest Kompetitionstest

463

4.5 · Monoklonale Antikörper: Grundlagen und ihre Bedeutung in Diagnostik und Therapie

. Abb. 4.5.7. Zwei Grundprinzipien von Festphasen-Enzymimmuntests. In beiden Fällen wird ein Antikörper (monoklonaler Antikörper MoAk 1 bzw. MoAk) an eine feste Phase (in vielen Fällen Mikrotiterplatten) adsorbiert. Im Zwei-Seiten-Bindungstest erfolgt anschließend die Inkubation mit dem nachzuweisenden Antigen und danach eine Inkubation mit einem enzymgekoppelten Antikörper (MoAk 2), der gegen ein anderes Epitop des Antigens gerichtet ist. Anschließend wird durch das gebundene Enzym ein farbloses Substrat in ein farbiges Produkt umgewandelt. Das Signal ist der Antigenkonzentration proportional. Im Kompetitionstest konkurriert das nachzuweisende Antigen mit dem enzymmarkierten Antigen um den an der festen Phase adsorbierten Antiköper. Ein hohes Signal zeigt in diesem Fall eine niedrige Antigenkonzentration an

Wegen der leichten Handhabbarkeit werden Festphasentests bevorzugt. Dabei wird ein Bindungspartner an eine feste Phase irreversibel adsorbiert, und obwohl die verschiedensten Varianten angewendet werden, laufen die meisten Tests nach zwei Grundprinzipien ab (> Abb. 4.5.7). Zwei-Seiten-Bindungs-Tests oder Sandwich-Tests können zum Nachweis „größerer“ Moleküle eingesetzt werden (Schuurs u. van Weemen 1977), die wenigstens zwei Epitope besitzen und von zwei Antikörpern gleichzeitig gebunden werden können. Dieses Testprinzip ist für alle Proteine einsetzbar. Hierbei wird der erste Antikörper an einen festen Träger (vorrangig Mikrotiterplatten aus Polystyrol) adsorbiert, dann erfolgt die Inkubation mit der Probe, die das Antigen enthalten kann und anschließend die Inkubation mit einem zweiten, enzymmarkierten Antikörper gegen ein anderes Epitop des Antigens. Zuletzt wird über den Enzymnachweis das Vorhandensein und evtl. die Konzentration des Anti-

4.5

gens bestimmt. Zum Nachweis von Haptenen (kleine Moleküle, die selbst nur ein Epitop darstellen), werden zunächst ebenfalls spezifische Antikörper an die feste Phase adsorbiert. Anschließend wird mit einer Mischung aus enzymmarkiertem Hapten und der Probe, die das Hapten enthalten kann, inkubiert. Markiertes und unmarkiertes Hapten konkurrieren um die Bindung an die Antikörper, wodurch auf die Konzentration des Haptens in der untersuchten Probe geschlossen werden kann. Wesentliches Merkmal der oben beschriebenen Tests ist, dass nach jedem Inkubationsschritt das Auswaschen nichtgebundener Reagenzien erfolgt. Durch den Einsatz von Mikrotiterplatten und Plattenphotometern kann die Methode automatisiert und so ein großer Probendurchsatz gewährleistet werden. Die Inkubationszeiten und die Waschprozeduren bedeuten jedoch einen beträchtlichen Zeitverlust. Um die Durchsatzraten zu erhöhen, wird intensiv an neuen Verfahren wie Microarrays gearbeitet, die besonders bei der Bewältigung sehr großer Testreihen einen Vorteil bieten können. Neben den oben beschriebenen „heterogenen“ Immuntests hat man sog. „homogene“ oder separationsfreie Tests entwickelt, bei denen die Proben nur mit den Nachweisreagenzien in Kontakt gebracht werden müssen. Nach kurzer Inkubationszeit kann dann die Auswertung erfolgen. Die etablierten Testprinzipien sind vielfältig, ein universelles für beliebige Antigene existiert bisher nicht (Self u. Cook 1996). Ein Teil dieser Tests erfordert teure Messapparaturen (wie z. B. das BiaCore) (Alfthan 1998), die meisten sind bisher nur für spezielle Antigene (Rabbany et al. 1994; Sellrie et al. 2006) bzw. nur für eine visuelle Auswertung [wie z. B. Schwangerschaftsschnelltests (Asch et al. 1988)] einsetzbar. Auch zum Nachweis nicht gelöster Antigene steht eine Vielzahl immunologischer Verfahren zur Verfügung. Hier sollen einige erwähnt werden, die zum Routinerepertoire vieler biomedizinischer Laboratorien gehören. Beim Immunblotting wird die elektrophoretische Auftrennung von Proteingemischen mit einem immunologischen Nachweis kombiniert. Zuerst wird die Probe (z. B. ein Zellextrakt) mittels der Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Proteine werden anschließend auf einen Flächenträger (z. B. Nitrozellulose) übertragen. Mithilfe eines markierten spezifischen Antikörpers kann dann das Antigen (semiquantitativ) nachgewiesen werden. Dabei lässt sich auch sein Molekulargewicht leicht ermitteln. Da Proteine bei der elektrophoretischen Auftrennung denaturiert werden, sind für das Immunblotting Antikörper gegen Sequenzepitope erforderlich. Der Nachweis zellulär lokalisierter Antigene erfolgt in erster Linie durch die Immunfluoreszenz, die in den verschiedensten Varianten besonders in der Immun-

464

Sektion 4 · Therapie

diagnostik von Infektions- und Tumorerkrankungen Anwendung gefunden hat. Am häufigsten werden indirekte Immunfluoreszenztests eingesetzt, bei denen fixierte oder unfixierte Gewebeproben – es kann sich um Zellsuspensionen oder Gewebeschnitte handeln – zuerst mit einem monoklonalen Antikörper gegen ein zellulär lokalisiertes Antigen und danach mit einem fluoreszenzfarbstoffmarkierten Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper (aus einer anderen Spezies wie Ziege oder Kaninchen) inkubiert werden. Zwischen den Inkubationen müssen die Proben gewaschen werden. Die Auswertung erfolgt in einem Fluoreszenzmikroskop oder (bei der Analyse von Zellsuspensionen) mithilfe eines Durchflusszytometers. Auch Markierungen mit Enzymen (Bildung unlöslicher Produkte, die im Lichtmikroskop sichtbar sind) und Kolloiden (für die Elektronenmikroskopie) sind gebräuchlich. Durch geschickte Kombination der verwendeten Antikörper und Marker lassen sich mehrere Antigene gleichzeitig nachweisen. Antikörper können auch verwendet werden, wenn (u. U. rekombinant hergestellte) Genprodukte charakterisiert werden sollen, von denen nur die Peptidsequenz bekannt ist. Es wird dann eine kurze, potenziell immunogene Sequenz ausgewählt, das betreffende Peptid wird synthetisiert und an ein Trägermolekül gekoppelt, sodass Antikörper erzeugt werden können. Diese Antikörper ermöglichen dann nicht nur die Lokalisation des Genprodukts in Zellen und Geweben, sondern auch die Isolierung des rekombinanten bzw. natürlichen Genprodukts. Eine weitere interessante Neuentwicklung auf dem Gebiet immunologischer Nachweisverfahren betrifft Versuche, Antikörper in organischen Lösungsmitteln einzusetzen (Stöcklein et al. 2000). Unter natürlichen Bedingungen erfolgen Antigen-Antikörper-Reaktionen im wässrigen isotonischen Milieu. Bei vielen Umweltanalysen sind jedoch Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln erforderlich, und erste Untersuchungen haben gezeigt, dass einige Antikörper auch unter diesen Bedingungen funktionieren. Damit eröffnen sich für Antikörper neue Anwendungsmöglichkeiten als Nachweisreagenzien in der Chemie und evtl. als Katalysatoren.

4.5.8.2 Antikörper zur Isolierung von Molekülen und Zellen Da die Antigen-Antikörper-Bindung reversibel ist, sind Antikörper auch für die Reinigung von Antigenen einsetzbar. Mithilfe der Immunaffinitätschromatographie können prinzipiell alle löslichen Antigene, für die ein spezifischer Antikörper zur Verfügung steht, einfach und schnell isoliert werden. Dazu wird der Antikörper

kovalent an Trägerpartikel gebunden und dann mit dem Gemisch inkubiert, das das Antigen enthält. Nachdem die nichtgebundenen Substanzen durch Waschen des Trägers bei neutralem pH-Wert entfernt wurden, kann das gebundene Antigen durch Änderung des Milieus (z. B. mit saurem oder basischem Puffer) in reiner Form gewonnen werden. Die Bindungsaffinität sollte dabei nicht zu groß sein, damit bei der Elution Antikörper und Antigen nicht zerstört werden. Für die Isolierung kleinster Antigenmengen wird häufig eine Immunpräzipitation durchgeführt. Dabei wird das Antigen zunächst mit dem monoklonalen Antikörper inkubiert. Da gewöhnlich keine Präzipitation erfolgt, wird anschließend ein polyklonaler Anti-Maus-Ig-Antikörper zugesetzt. Das gebildete Präzipitat kann dann abzentrifugiert werden. Antikörper können auch zur Isolierung von lebenden Zellen genutzt werden. Die Bindung von fluoreszenzfarbstoffmarkierten Antikörpern an Oberflächenantigene von Zellen in Suspension erlaubt ihre Charakterisierung im fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS) und auch ihre Isolierung (Herzenberg et al. 1976; Herzenberg u. De Rosa 2000). Dabei kann die markierte Zellpopulation in einer Reinheit von mehr als 99% angereichert werden. Da sich verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe gleichzeitig nachweisen lassen, können Zellen isoliert werden, die ganz bestimmte Kombinationen von Oberflächenantigenen tragen. Eine einfachere Methode, die allerdings keine Mehrfachmarkierung erlaubt und weniger reine Zellpopulationen liefert, ist die magnetische Zellseparierung (z. B. mit einem „magnetic cell sorter“, MACS) (Miltenyi et al. 1990). Hier werden Antikörper verwendet, die an magnetische Mikropartikel gekoppelt sind. Nach der Bindung der markierten Antikörper an die gewünschten Zellen, können diese mit einem Magneten aus einer Zellsuspension separiert werden. Nach dem gleichen Prinzip lassen sich auch gelöste Antigenmoleküle reinigen.

4.5.9 Antikörper in der Medizin Der gewaltige Aufschwung, den die Technik zur Herstellung monoklonaler Antikörper erfahren hat, ist nicht zuletzt der Tatsache zuzuschreiben, dass ihr Einsatz auf dem medizinischen Sektor für die Grundlagenforschung, für die Diagnostik und zunehmend auch für die Therapie zu einem enormen Erkenntniszuwachs geführt hat. Die ersten Publikationen zur Erzeugung monoklonaler Antikörper gegen Histokompatibilitäts- und Differenzierungsantigene (Galfré et al. 1977; Williams et al. 1977) waren dann auch die eigentlichen Auslöser des großen Interesses der wissenschaftlichen Gemeinschaft an der Hybridomtechnik. In der Medizin werden monoklonale

465 4.5 · Monoklonale Antikörper: Grundlagen und ihre Bedeutung in Diagnostik und Therapie

Antikörper inzwischen als Reagenzien zum Nachweis der unterschiedlichsten zellulären und löslichen Antigene eingesetzt, und ständig kommen neue Anwendungsbereiche hinzu (Milstein u. Waldman 1999). Im Zusammenhang mit der Entzifferung des humanen Genoms ist vom Einsatz spezifischer Antikörper ein heute noch nicht überschaubarer Aufschwung zu erwarten. In dem Maße, wie zu den neu identifizierten Genen (besonders denjenigen, die im Zusammenhang mit bestimmten Krankheiten stehen) die Genprodukte identifiziert werden sollen, werden Antikörper erforderlich sein. Neben ihrer Rolle als Nachweis- und Isolierungsreagenzien werden sie auch ihren Platz bei der Identifizierung der Regionen der Proteinmoleküle finden, die für bestimmte Funktionen verantwortlich sind.

4.5.9.1 Antikörper in der Diagnostik Seit ihrer Entdeckung sind Antikörper eng mit der Medizin verbunden. Heute spielen die monoklonalen Antikörper sowohl für die Diagnostik als auch für die Therapie eine wichtige Rolle (Dordick 1988; Borrebaeck 2000). Die Diagnostik von pathologischen Zuständen mithilfe von Immuntests ist in klinischen Laboratorien Routine. Nachgewiesen werden bestimmte lösliche Antigene von Infektionserregern (Viren, Bakterien, Pilzen, Parasiten) und von Tumoren oder auch normale Antigene in unnatürlich hohen Konzentrationen in Körperflüssigkeiten (Blut, Urin etc.). Enzymimmuntests werden am häufigsten eingesetzt. Beispiele hierfür sind Tests zum Nachweis von Tumormarkern (α-Fetoprotein, AFP; karzinoembryonales Antigen, CEA) (Duffy 2001; Weber et al. 1988) und Schwangerschaftstests auf der Basis des Nachweises von HCG (humanes Choriongonadotropin) (Asch et al. 1988). Das Problem bei solchen Tests ist die Auswahl von relevanten Merkmalen. So ist die Identifizierung von neuen und zuverlässigen Tumormarkern (> Tab. 4.5.1) eine wichtige Voraussetzung für eine verbesserte Tumordiagnostik und -therapie. Da es keine einheitlichen Tumorantigene gibt und bei vielen Tumorformen bisher gar keine spezifischen Tumorantigene gefunden wurden, wird in zahlreichen Laboratorien nach derartigen Markern gesucht (Yang u. Yang 2005). Im Serum nachgewiesene Tumormarker können ein Anzeichen dafür sein, ob (aber nicht, wo genau) im Organismus ein Tumor wächst, und, wenn der Tumormarker spezifisch für eine bestimmte Tumorform ist, um welchen Tumor es sich handelt. Besonders nach operativer Entfernung eines Tumors können diese Marker als Indikatoren für Rezidive oder Metastasen im sog. Tumormonitoring herangezogen werden (Zusman u. Ben-Hur 2001).

4.5

Auch bei den verschiedenen Infektionserregern muss geklärt werden, welches der unterschiedlichen Antigene des Erregers als diagnostischer Marker geeignet ist, um dann die entsprechenden Antikörper produzieren zu können. Welche Schwierigkeiten mit der Identifizierung von Infektionserregern verbunden sein können, zeigt sich bei der Diskussion um zuverlässige, diagnostisch relevante Immuntests zum Nachweis der übertragbaren spongiformen Enzephalopathien („transmissable spongiform encephalopathy“, TSE), wie z. B. BSE („bovine spongiform encephalopathy“) (Deslys et al. 2001). Die als Prionen („proteinacious infectious particles“) bezeichneten Erreger, die keine Nukleinsäuren enthalten, werden mit Antikörpern nachgewiesen. Wegen der Ähnlichkeit zu den normalen nichtinfektiösen PrionProteinen müssen besonders hohe Forderungen an die Spezifität und wegen der relativ späten Diagnostizierbarkeit der Erkrankung besonders hohe Ansprüche an die Sensitivität des Tests gestellt werden. Ein einfacher, dringend benötigter Schnelltest am lebenden Organismus steht bisher als Routinemethode nicht zur Verfügung. Inwieweit ein kürzlich beschriebener nichtimmunologischer Amplifikationstest (Saa et al. 2006) diese Anforderungen in der Praxis erfüllt, muss sich erst zeigen. Antigene in oder auf Zellen bzw. in Geweben haben diagnostische Relevanz für zahlreiche Erkrankungen. Am besten geeignet für Tests an Geweben mit Verdacht auf maligne Entartungen sind Antiköper, die ihre Antigene auch noch nach einer denaturierenden Vorbehandlung durch Fixierung und Einbettung der Gewebe in Paraffin erkennen können. Tests zum Nachweis von Oberflächenantigenen von Zellen in Suspension werden am häufigsten mithilfe der Durchflusszytofluorometrie (der analytischen Variante eines FACS) durchgeführt. Diese Untersuchungen haben einen gewaltigen Erkenntniszuwachs bei der Charakterisierung von Blutzellen gebracht und sind in der immunologischen und häma-

. Tab. 4.5.1. Mit Antikörpern nachweisbare Tumorantigene (aus Micheel 1998). Virusinduzierte Tumorantigene Tumorantigene, die auf genetische Veränderungen zurückzuführen sind Normale Zellbestandteile als Tumorantigene – Onkofetale Antigene – Kohlenhydratantigene – Muzine – Differenzierungsantigene – Individuelle Antigene in malignen Zellklonen – Rezeptoren „Tumorantigene“, die nicht auf den Tumorzellen lokalisiert sind

466

Sektion 4 · Therapie

tologischen Diagnostik zur allgemeinen Praxis geworden (Herzenberg u. De Rosa 2000). Bei diagnostischen Tests mit Zellen und Geweben werden auch zahlreiche normale Antigene untersucht, weil sich aus ihrer Verteilung Rückschlüsse auf pathologische Zustände bzw. Konsequenzen für eine Therapie ergeben können. Für eine erfolgreiche Bluttransfusion ist die Ermittlung der Blutgruppen mit Antikörpern erforderlich, auch hier spielen monoklonale Antikörper heute die wichtigste Rolle. Für eine erfolgreiche Transplantation müssen in jedem Falle die MHC- („major histocompatibility complex“-)Antigene (beim Menschen als HLA – „human leukocyte antigens“ – bezeichnet) von Spender und Empfänger bestimmt werden, um eine möglichst große Ähnlichkeit in den MHCs zu erzielen und damit die Abstoßungswahrscheinlichkeit übertragener Organe zu verringern. Auch hierfür werden monoklonale Antikörper genutzt (Williams 1979). Von großer Bedeutung für die Grundlagenforschung und die Diagnostik sind monoklonale Antikörper gegen die CD- („cluster of differentiation“-)Marker, durch die sich besonders die Zellen des hämatopoetischen Systems, einschließlich der Lymphozyten, voneinander unterscheiden lassen. Diese Oberflächenantigene sind ideale diagnostische Indikatoren, denn in Abhängigkeit vom Immunstatus ändert sich nicht nur der Anteil immunologisch aktiver Zellen sondern auch die Expression bestimmter CD-Marker durch diese Zellen. Wie die meisten derartigen Untersuchungen an Leukozyten werden diese Analysen mit einem Durchflusszytofluorometer durchgeführt. Ein bekanntes Anwendungsbeispiel für die Nutzung der CD-Marker ist die Ermittlung des Anteils der zytotoxischen T-Lymphyozyten (Tc-Zellen) und der T-Helfer-Lymphozyten (Th-Zellen) an den peripheren Blutlymphozyten von AIDS-Patienten, der sich aus der Bestimmung von CD8-positiven (Indikator für Tc-Zellen) und CD4-positiven Zellen (Indikator für Th-Zellen) ergibt (Wood et al. 1986). Weiterhin lässt sich durch die Bestimmung von Adhäsionsmolekülen (die für die Anlagerung von Zellen an andere Zellen verantwortlich sind) der Aktivierungszustand von Immunzellen ermitteln. Auch für die Tumordiagnostik sind einige normale Differenzierungsantigene bedeutsam, die für bestimmte Zelltypen spezifisch sind. So kann der immunhistologische Nachweis von Cytokeratinen in Zellen des Lymphknotengewebes darauf hindeuten, dass sich metastasierte Tumorzellen epithelialen Ursprungs in den Lymphknoten befinden. Die meisten diagnostischen Verfahren werden in vitro durchgeführt. Es gibt aber, besonders in der Onkologie, auch gute Ansätze für die Nutzung von Antikörpern in der In-vivo-Diagnostik mithilfe der Immunszintigraphie (Kenanova u. Wu 2006). Hierbei werden dem

Patienten mit einem Radioisotop markierte Antikörper injiziert, die mit einem Tumorantigen auf der Oberfläche der Tumorzellen reagieren. Durch eine Szintigraphie kann dann der Tumor lokalisiert werden. Eine breite Routineanwendung dieser Technik ist bisher allerdings nicht möglich. Die ungelösten Probleme bestehen vor allem darin, dass nur ein geringer Teil der markierten Antikörper den Zielort erreicht, dass Antikörper möglicherweise in anderen Organen akkumulieren und dass sie eine Immunantwort auslösen. Es sind die gleichen Probleme, die auch bei der therapeutischen Anwendung von monoklonalen Antikörpern auftreten.

4.5.9.2 Antikörper als Therapeutika Da die natürliche Funktion von Antikörpern in der Abwehr von Infektionserregern besteht, war es nahe liegend, Antikörperpräparate für eine passive Immunisierung zu verwenden, d. h., einen Spender zu immunisieren und die gewonnenen Antikörper einem Empfänger zu injizieren. Diese Antikörpertherapie hat zu Beginn des 20. Jahrhunderts bei akuten Infektionen auch sehr spektakuläre Ergebnisse gebracht (Mazumdar 2003). Sie entspricht damit exakt dem von Paul Ehrlich formulierten Konzept der „Zauberkugeln“, die nur an ihrem Zielort ihre Wirkung entfalten, ohne den Organismus zu schädigen (zitiert nach Sauerteig 2000). Diese passive Immunisierung wird bei einigen Indikationen (bestimmten akuten Infektionen, Schlangenbissen) auch heute noch mit polyklonalen Antikörpern durchgeführt. Die Herstellung brauchbarer, spezifischer polyklonaler Antikörper gegen Tumorantigene erscheint dagegen fast unmöglich, denn diese Antigene sind von normalen Gewebeantigenen nur schwer zu unterscheiden und häufig nur schwach immunogen. Darum basieren die meisten antikörpervermittelten Therapieansätze bei Tumorerkrankungen auf monoklonalen Antikörpern (> Tab. 4.5.2). Bei anderen Erkrankungen werden ebenfalls monoklonale Antikörper eingesetzt. So wird z. B. bei der Therapie von Entzündungsreaktionen (bei Morbus Crohn oder rheumatoider Arthritis) die Wirkung des Tumornekrosefaktors (TNFD) mit monoklonalen Antikörpern aufgehoben (Bell u. Kamm 2000). Zwar erfolgt die Behandlung von Schlangenbissen immer noch mit polyklonalen Antikörpern, es gibt jedoch vielversprechende Ansätze zur Herstellung humaner monoklonaler Antikörper gegen Schlangentoxine über eine DNA-Vakzinierung transgener Mäuse (Harrison et al. 2000; Green 1999). Zur Aktivierung der Fibrinolyse bei der Beseitigung von Blutgerinnseln wird mit bispezifischen Antikörpern experimentiert, die gleichzeitig mit Fibrin und mit dem Gewebe-Plasminogenaktivator reagieren (Tada et al. 1994).

467 4.5 · Monoklonale Antikörper: Grundlagen und ihre Bedeutung in Diagnostik und Therapie

4.5

. Tab. 4.5.2. Auswahl therapeutisch eingesetzter monoklonaler Antikörper (verändert und gekürzt nach Glennie u. John 2000 und Reichert et al. 2005). Indikation

Zielantigen

Bezeichnung des Antikörpers

Typ

Transplantatabstoßung

CD3

Orthoclone/OKT3

muriner Aka

CD25

Zenapax

humanisierter Ak

Angina pectoris

Gpb-IIbIIIa- Rezeptor

ReoPro (Abciximab)

chimärer Ak

Morbus Crohn

TNFD

Infliximab

chimärer Ak

Chron. lymphat. Leukämie

CD52

Campath-1H

humanisierter Ak

Non-Hodgkin- Lymphom

CD20

Rituxan

chimärer Ak

Mammakarzinom

Her2/neu

Herceptin

humanisierter Ak

Respiratorisches Synzytialvirus

Virusprotein

Synagis

humanisierter Ak

Allergie

IgE

Xolair

humanisierter Ak

Kolonkarzinom

vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor

Avastin

humanisierter Ak

a b

Ak, Antikörper. Gp, Glykoprotein.

Mit therapeutischem Ziel applizierte Antikörper können zwar über die Blutbahn in nahezu jeden Bereich des Organismus gelangen, bei bestimmten soliden Tumoren ist der Zugang jedoch erschwert. Hier kann durch eine Injektion in den Tumor eine bessere Wirkung erzielt werden. Allerdings ist gerade das Erreichen des gewünschten Wirkorts durch die injizierten Antikörper nicht selbstverständlich. Die Ablagerung in anderen Organen (wie z. B. der Niere) kann darüber hinaus zu schädigenden Wirkungen führen – besonders, wenn die Antikörper mit Radioisotopen oder Toxinen gekoppelt sind. Diese Probleme müssen für jeden therapeutischen Antikörper individuell gelöst werden, generelle Richtlinien existieren bisher nicht. Da Antikörper in vivo eine begrenzte Lebensdauer haben, ist die Kenntnis ihrer Pharmakokinetik von großer Bedeutung für den Erfolg einer passiven Immunisierung. Die Halbwertzeiten von Antikörpern sind abhängig von ihrer Klasse und Subklasse, sie können damit auch bei monoklonalen Antikörpern sehr unterschiedlich sein. Antikörperfragmente, z. B. scFv, werden in der Regel schneller abgebaut als intakte Antikörper (Chapman et al. 1999), wobei nicht sicher ist, ob dieser Nachteil durch den Vorteil der besseren Gewebepenetration aufgewogen wird. Antikörper aus der Maus werden im Menschen generell schneller abgebaut als humane Antikörper, weshalb letztere sich u. a. für eine Therapie in jedem Falle besser eignen. Gravierender ist jedoch die Immunogenität von Antikörpern fremder Spezies. Die Abwehrreaktion des Empfängerorganismus führt schon

nach kurzer Zeit zur Unwirksamkeit des therapeutischen Antikörpers und in einigen Fällen zu schweren Nebenwirkungen, der sog. „Serumkrankheit“, die zuerst als Folge des Einsatzes von Immunseren bei der Behandlung von akuten Infektionen beschrieben wurde. Bei der Verwendung von monoklonalen murinen Antikörpern wurden wiederholt Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper (sog. „human anti-mouse antibodies“, HAMAs) (Hasholzner et al. 1997; Presta 2006) nachgewiesen, allerdings waren die dadurch bedingten Nebenwirkungen bei hohen Konzentrationen verhältnismäßig gering (vielleicht aufgrund einer Toleranzinduktion, wie sie nach der Injektion von großen Proteinmengen bei Versuchstieren beobachtet werden kann). Wenn auch zu Beginn einer Studie oft monoklonale Antikörper von der Maus eingesetzt werden, wird doch generell angestrebt, mit humanen Antikörpern zu arbeiten. Wie oben beschrieben ist dies über die Chimärisierung oder „Humanisierung“ von murinen Antikörpern möglich. Gangbare Wege sind außerdem die Immunisierung „humanisierter“ Mäuse und die Verknüpfung von humanen scFv-Fragmenten mit konstanten Domänen eines humanen Antikörpers. Der Einsatz humaner Antikörper ist noch aus einem anderen Grunde wichtig. Wie am Anfang betont wurde, sind an der Vernichtung von Infektionserregern durch Antikörper auch immer Effektormechanismen des Organismus beteiligt. Auf welche Weise bei der passiven Immuntherapie der eigentliche Schutz durch Antikörper funktioniert, ist weitgehend unbekannt, wenn auch da-

468

Sektion 4 · Therapie

. Abb. 4.5.8. Möglichkeiten der therapeutischen Wirksamkeit von Antikörpern in vivo. Die Antikörper können dem Schutz von Zellen dienen (1a bis e) bzw. zur Wachstumsinhibition oder Zerstörung von Zellen (in erster Linie von Tumorzellen) beitragen (1d und e; 2 bis 7). 1. Hemmung von externen Faktoren, die auf Zellen einwirken können a. Hemmung eines Toxins b. Bindung an ein Bakterium, dadurch Inaktivierung der pathogenen Wirkung c. Bindung an ein Virus, dadurch Verhinderung des Eindringens in Zellen d. Bindung an Rezeptoren anderer Zellen, dadurch Inhibition von Signalwirkungen (Wachstumsförderung, Zerstörung) auf die Zielzelle e) Neutralisierung von löslichen Zytokinen oder Wachstumsfaktoren 2. Hemmung der Zellteilung durch Blockierung von Rezeptoren für Wachstumsfaktoren bzw. Bindung an Rezeptoren, die eine Induktion von intrazellulären Mechanismen bewirken, die die Zellteilung beeinflussen (z. B. Induktion von Apoptose) 3. Zelllyse nach Anlagerung von Komplement und Aktivierung der Komplementkaskade 4. Zelllyse nach Bindung von zytotoxischen körpereigenen Effektorzellen an die Fc-Region eines Antikörpers über die Fc-Rezeptoren dieser Zellen (sog. „antibody-dependent cellular cytotoxicity“, ADCC) 5. Zelllyse durch an die Antikörper gebundene toxische Komponenten (radioaktive Isotope; pflanzliche oder bakterielle Toxine; Chemotherapeutika; Enzyme, die nichttoxische Substanzen am Tumor in toxische Moleküle umwandeln – Pro-Drug-Konzept) 6. Zelllyse durch zytotoxische körpereigene Zellen, die über bispezifische Antikörper an den Tumor gebunden und aktiviert werden 7. Zelllyse durch körpereigene T-Zellen, die nach gentechnischer Manipulation tumorantigenbindende Antikörperfragmente (sog. „T-bodies“) exprimieren

von ausgegangen wird, dass hierbei die gleichen Mechanismen wirken müssen, die in vitro als effektiv identifiziert wurden (> Abb. 4.5.8) (Glennie u. Johnson 2000). Wenn Antikörper lösliche Antigenmoleküle binden, werden sie über ihre Fc-Region von Fc-Rezeptoren phagozytisch aktiver Zellen (wie z. B. Makrophagen) gebunden, die den Komplex dann aufnehmen und zerstören. Dieser Mechanismus ist wahrscheinlich auch für die Eliminierung von Toxinen nach einer passiven Immunisierung verantwortlich. Wenn Antikörper an Zellen binden, kann durch die Aktivierung der Komplementkaskade eine Lyse der Zellen (der letzte Schritt bei diesem Prozess ist der Einbau von porenbildenden Molekülen in die Membran) erfolgen. Diese komplementabhängige Lyse („complementdependent cytotoxicity“, CDC) erfolgt jedoch vorrangig bei Zellen des Blutsystems. Für die Lyse anderer Zellen ist die antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität („antibody-dependent cellular cytotoxicity“, ADCC) verantwortlich. Hierbei binden NK-Zellen („natural killer cells“) mit ihren Fc-Rezeptoren an den Fc-Teil von Antikörpern, die ihrerseits auf Targetzellen fixiert sind. Dabei werden die NK-Zellen aktiviert und lysieren die Targetzellen. Diesem Mechanismus wird die größte Bedeutung bei der Zerstörung von Tumorzellen bei einer passiven Antikörpertherapie beigemessen. Wahrscheinlich wirken jedoch die verschiedensten Abwehrmechanismen in einer Weise zusammen, die in vitro nur bedingt simuliert werden kann, sodass über einen Therapieerfolg letztendlich nur die In-vivo-Studien entscheiden. Mausantikörper werden von Fc-Rezeptoren humaner Zellen nicht immer gebunden, darum ist auch in dieser Hinsicht die Anwendung humaner Antikörper geboten. Da nicht alle Subklassen humaner Antikörper die CDC bzw. ADCC ausreichend unterstützen, werden große Anstrengungen zur Optimierung der therapeutisch eingesetzten Antikörper unternommen. Unter anderem soll die Verstärkung der Effektorreaktionen durch Veränderung der Glykosylierung und der Sequenz des Fc-Teils erreicht werden. Wie unterschiedlich die Wirkung monoklonaler Antikörper selbst in relativ nahe verwandten Spezies sein kann, zeigte sich bei einem klinischen Phase-I-Test mit dem „humanisierten“ superagonistischen Antikörper TGN 1412. Der Antikörper bindet an CD28, ein humanes T-Zell-Aktivierungsantigen, und sollte bei Erkrankungen des Immunsystems und bei Leukämien zum Einsatz kommen. Die Testpersonen erhielten eine Dosis von 100 µg/kg Körpergewicht und erkrankten akut lebensbedrohlich. Zuvor behandelte Makaken zeigten bei einer um Größenordnungen höheren Dosis nur leichte Lymphknotenschwellungen (Suntharalingam 2006). Dieser Test brachte noch einmal die Tatsache in Erinnerung, dass Antikörper nicht nur nützliche Ab-

469 4.5 · Monoklonale Antikörper: Grundlagen und ihre Bedeutung in Diagnostik und Therapie

wehrmoleküle sind, sondern dass sie auch schwerwiegende Immunopathien auslösen können, wenn sie passiv verabreicht oder vom eigenen Organismus produziert werden. Die Notwendigkeit der sorgfältigen Prüfung eines Antikörpers, bevor er als Medikament zugelassen wird, wurde durch diesen tragischen Unfall noch einmal deutlich unterstrichen. Neben der Nutzung von intakten Antikörpern wird für therapeutische Zwecke auch der Einsatz von artifiziell veränderten Antikörpern aktiv betrieben. In erster Linie sind hier die bispezifischen Antikörper zu nennen, die gegen Tumorantigene und Aktivierungsantigene von Effektorzellen reagieren. Mit diesen Antikörpern können auch körpereigene T-Zellen aktiviert werden, die normalerweise nicht in Kooperation mit Antikörpern wirken, aber aufgrund ihrer natürlichen Abwehrfunktion gegen virusinfizierte Zellen ein starkes zytotoxisches Potenzial besitzen (van Spriel et al. 2000; Cao u. Lam 2003). Zur Aktivierung der zytotoxischen Aktivität von T-Zellen wurde eine weitere Strategie erprobt, die sog. T-Bodies (Eshhar 2001; Hombach et al. 2000). Das sind Fusionsproteine aus einem Einzelkettenantikörper mit Antitumoraktivität und einem Protein der Signalübertragungskette, welches zur Aktivierung der zytotoxischen Wirkung von T-Zellen erforderlich ist. Mithilfe der T-Bodies kann man die Antigenerkennung von T-Zellen umgehen, die normalerweise nur im Zusammenhang mit einer Peptidpräsentation durch MHC-Moleküle erfolgt. Nach Kontakt mit den tumorantigentragenden Tumorzellen wird die zytotoxische Aktivität dieser manipulierten T-Zellen aktiviert. Für therapeutische Ansätze stehen heute zahlreiche monoklonale Antikörper zur Verfügung, die Tumorantigene auf der Oberfläche von Tumorzellen erkennen (Farah et al. 1998; Glennie u. Johnson 2000; Murray 2000; Reichert et al. 2005; White et al. 2001). Die ersten Studien wurden mit unmodifizierten Mausantikörpern durchgeführt. Darüber hinaus wurden Antikörper verwendet, die mit pflanzlichen oder bakteriellen Toxinen (Immuntoxine) (Kreitman 2006) oder mit Radioisotopen (Kenanova u. Wu 2006) gekoppelt waren. Die Heilungserfolge in den ersten Studien waren, mit Ausnahme von Tumoren des Blutsystems, eher gering. Die Immunreaktionen gegen die Fremdantikörper waren erstaunlicherweise nicht sehr heftig. Allerdings wurden diese Untersuchungen an Patienten im fortgeschrittenen Krankheitsstadium durchgeführt, deren Immunsystem teilweise durch die Chemotherapie geschwächt war. Erfolge wurden beim Einsatz von Antikörpern zur Verhinderung von Mikrometastasen nach einer konventionellen Therapie beschrieben (Riethmüller et al. 1994). Diese Effekte lassen sich am besten mit der normalen Funktion von Antikörpern erklären, da das Immunsys-

4.5

tem auch unter natürlichen Bedingungen nur eine begrenzte Anzahl von Infektionserregern vernichten kann. Auch bei bispezifischen Antikörpern sind die Aussichten auf eine therapeutische Anwendung gut – insbesondere, weil sie in sehr geringen Konzentrationen wirksam sind (Löffler et al. 2000; van Spriel et al. 2000). Unter den 2004 in der EU und den USA für eine Therapie zugelassenen 18 monoklonalen Antikörpern waren neun „humanisierte“ und fünf chimäre (Reichert et al. 2005). Je 8 waren für die Therapie von immunologischen Funktionsstörungen und von Tumorerkrankungen vorgesehen (> Tab. 4.5.2). Alle diese Antikörper, die entweder eine zytotoxische oder wachstumsinhibierende Wirkung haben, werden in der Praxis immer in Kombination mit konventionellen Behandlungsmethoden angewendet. Eine vollständige Heilung allein durch die Antikörpertherapie ist derzeit noch nicht möglich. Da sich aber auf dem Gebiet der Antikörperherstellung und -manipulation neue Richtungen herausgebildet haben, ist zu erwarten, dass die Anzahl der zu testenden Substanzen zunehmen wird und dass auch die Wirkungsweise der etablierten Antikörper in vivo besser aufgeklärt wird. Damit dürften sich die Heilungschancen für Krebspatienten erheblich verbessern. Wahrscheinlich ist hier eine Kombination mehrerer Antikörper gegen verschiedene Epitope der Oberflächenantigene der Targetzelle ein erfolgversprechender Ansatz, da unter natürlichen Bedingungen die Polyklonalität der Immunantwort, d. h. die Bildung vieler verschiedener Antikörper, die Effektivität garantiert. Dem steht jedoch der exorbitant hohe Aufwand entgegen, der für jeden einzelnen Antikörper eines solchen Gemischs bis zu seiner Zulassung getrieben werden muss. Neben diesen In-vivo-Therapieansätzen wurde auch eine Ex-vivo-Therapie mit monoklonalen Antikörpern entwickelt, die keine „Humanisierung“ der Antikörper erfordert. Voraussetzung hierfür sind Antikörper, die Tumorzellen unter einer Vielzahl anderer Zellen eindeutig identifizieren und eliminieren. Grundlage der Ex-vivo-Therapie ist eine Kombination aus Strahlentherapie und autologer Knochenmarktransplantation bei der Krebsbehandlung. Vor einer radikalen Radiotherapie, die möglichst alle Tumorzellen im Organismus abtötet, werden den Patienten Knochenmarkzellen entnommen, die nach Abschluss der Bestrahlung zur Regeneration der Blutzellen reinfundiert werden. Zur Eliminierung evtl. metastasierter Tumorzellen aus dem entnommenen Knochenmark (sog. „purging“) werden spezifische monoklonale Antiköper entweder zusammen mit Komplement oder als Immuntoxin eingesetzt, um die Tumorzellen abzutöten. Außerdem kann man mit Antikörpern beladene Magnetkügelchen zur Entfernung der Tumorzellen benutzen (Champlin 1996).

470

Sektion 4 · Therapie

4.5.9.3 Antikörper in der Gentherapie Gentherapeutische Ansätze stehen vor dem generellen Problem der genauen Adressierung des eingesetzten Vektors in vivo. Als „Genfähren“ eingesetzt, könnten sich Antikörper hier als nützliche Werkzeuge erweisen, indem sie dafür sorgen, dass die gentechnischen Konstrukte spezifisch nur an die vorgesehenen Zielzellen binden und effektiv internalisiert werden. Auch der Einsatz solcher Antikörper für eine Ex-vivo-Gentherapie scheint möglich (Yano et al. 2000). Allerdings sind diese Konzepte bisher nur in ersten Ansätzen realisiert worden. Ein weiterer potenzieller Anwendungsbereich von Antikörpern betrifft nicht den Ersatz „defekter“ Gene, sondern die Beeinflussung von Genaktivitäten in der Zelle auf unterschiedlichen molekularen Ebenen. Hierbei wird an Antikörper gedacht, die permanent oder transient ein Abschalten von unerwünschten intrazellulären Aktivitäten ermöglichen, indem sie in der Zelle an entsprechende Ziele binden. Die prinzipielle Realisierbarkeit solcher Ansätze wurde durch Injektion von Antikörpern in Zellen bzw. auch durch Expression von Antikörperfragmenten im Zytoplasma nach Übertragung von Antikörpergenen (sog. Intrabodies) gezeigt (Marasco 1995). Intrabodies in Kartoffeln hemmten sehr erfolgreich ein Enzym der Stärkesynthese (Jobling et al. 2003). Das Konzept der Intrabodies ist jedoch mit zahlreichen Problemen behaftet, da Antikörper im Zytoplasma oft nicht die für eine Antigenbindung erforderliche Konformation erlangen und deshalb speziell für diese Zwecke verändert werden müssen.

4.5.9.4 Antikörper als Vakzine Antiidiotypische Antikörper, die mit der Antigenbindungsregion eines anderen Antikörpers (Antikörper 1) reagieren, können in seltenen Fällen in ihren eigenen Antigenbindungsregionen Strukturen enthalten, die eine molekulare Mimikry des Antigens (bzw. genauer der Antigendeterminante) darstellen, gegen die der Antikörper 1 reagiert (Jerne et al. 1982). Im Falle einer solchen Mimikry kann ein antiidiotypischer Antikörper als Surrogat des Antigens für eine aktive Immunisierung genutzt werden. Besonders in den Fällen, in denen das betreffende Antigen schwer in reiner Form darstellbar ist, erscheint eine solche Immunisierung sehr attraktiv (McCarthy et al. 2003). Sie wurde bereits in verschiedenen experimentellen Tumorsystemen erfolgreich eingesetzt. Einige Vakzinierungsstudien mit antiidiotypischen Antikörpern werden auch bei Tumorpatienten durchgeführt. Erste Erfolge wurden beschrieben, jedoch ist eine Verallgemeinerung kaum möglich, da der größte Teil der antiidiotypischen Antikörper keine Mimikry-

strukturen des Antigens enthält, und der Erhalt von Mimikryantikörpern eher die Ausnahme als die Regel ist.

4.5.10 Ausblick Der Wert monoklonaler Antikörper für die biomedizinische Forschung und Praxis ist offenkundig. Es ist davon auszugehen, dass die Zahl der einsetzbaren monoklonalen Antikörper deutlich zunehmen und auch die Kommerzialisierung weiter voranschreiten wird. Mit den 18 für Therapien zugelassenen Antikörpern wird ein jährlicher Umsatz von mehr als 10 Mrd. $ erzielt, etwa 300 weitere Antikörper befinden sich derzeit in der klinischen Erprobung. Antikörper für die unterschiedlichsten Anwendungsbereiche werden in Zukunft in vielfältigen Modifikationen verfügbar sein, wobei gentechnisch veränderte Antikörper eine besondere Rolle spielen werden. Die Veränderungen werden sich nicht auf die Herstellung von Fragmenten, die Verringerung der Immunogenität (z. B. durch „Humanisierung“) oder die Gewinnung von Antikörperfusionsproteinen beschränken, sondern es werden verstärkt Untersuchungen zur Manipulation der Antigenbindungsregion (Affinitätserhöhung oder Veränderung der Spezifität) und des Fc-Teils (Verstärkung der Effektorfunktionen durch Veränderung der Sequenz und der Glykosylierung) durchgeführt werden. Eine Erhöhung der Affinität wurde bislang jedoch kaum durch gezielte Mutationen am Antikörper erzielt, sondern in erster Linie durch den Einsatz evolutiver Systeme, wie z. B. durch Phagen-, Ribosomen- oder Hefe-Display (Feldhaus u. Siegel 2004; Jermutus et al. 2001; Konthur et al. 2005). Der Bedarf an spezifischen Antikörpern ist in den letzten Jahren enorm gestiegen und wird allein durch Anwendung der arbeitsaufwendigen und schwer zu automatisierenden Hybridomtechnik kaum gedeckt werden können. Auch darum werden sich wahrscheinlich in zunehmendem Maße Antikörperbanken durchsetzen (es sei denn, es gelingt, eine einfache Selektionsmethode für die Hybridomtechnik zu etablieren). Hier dominiert bisher das Phagen-Display. Inwieweit andere Systeme, wie das Ribosomen-Display (Lipovsek u. Plückthun 2004; Rothe et al. 2006), eine größere Bedeutung erlangen werden, müssen zukünftige Untersuchungen zeigen. Die Selektion spezifischer Antikörper ist bei Nutzung dieser Systeme, verglichen mit der Hybridomtechnik, einfacher und schneller. Bisher werden alle für therapeutische Zwecke vorgesehenen Antikörper mithilfe von Säugerzellkulturen produziert. Unter anderem deshalb gehören Antikörper zu den teuersten Medikamenten überhaupt – die Behandlung eines Patienten kann jährlich mehrere 10.000

471 4.5 · Monoklonale Antikörper: Grundlagen und ihre Bedeutung in Diagnostik und Therapie

€ kosten. Darum besteht großes Interesse an der Adaptierung alternativer Expressionssysteme. Gute Chancen werden der Antikörperproduktion in transgenen Pflanzen oder transgenen Tieren eingeräumt (Verma et al. 1998; Ko u. Koprowski 2005; Houdebine 2002). Außerdem ist der Antikörperverbrauch bei den bisher etablierten Therapien zu hoch. Durch Optimierung verschiedener Parameter (Affinität, Halbwertzeit, Komplementaktivierung usw.) oder durch Ausstattung der Antikörper mit zusätzlichen Effektorfunktionen (Toxine, Enzyme, Bispezifität o. ä.) sollte er sich deutlich reduzieren lassen. Die Etablierung von Antikörperproduzenten für therapeutische Zwecke ist sehr aufwendig, viele hierfür entwickelte Techniken werden deshalb zunächst auf diesen Bereich beschränkt bleiben. So scheint die Gewinnung humaner monoklonaler Antikörper mithilfe transgener Mäuse, die das gesamte humane Antikörperrepertoire enthalten, verhältnismäßig einfach zu sein (Brüggemann 1997; Green 1999; Lonberg 2005). Die Verbreitung dieser Mäuse und damit die allgemeine Nutzung wird jedoch aus urheberrechtlichen Gründen limitiert. Deshalb werden Versuche zur Entwicklung einer einfachen In-vitro-Immunisierung unter Nutzung menschlicher Zellen auch in Zukunft einen hohen Stellenwert haben. Es ist somit kaum vorhersehbar, welcher Methode die Zukunft gehört. Es ist aber auch nicht auszuschließen, dass andere Bindungsmoleküle die Antikörper ersetzen werden. Sicher ist, dass eine Reihe von Alternativen zur Komplementierung führen wird. Hierbei kommt evolutiven In-vitro-Methoden eine besondere Bedeutung zu. Neue Proteine mit antikörperähnlichen Bindungseigenschaften wurden bereits beschrieben (Beste et al. 1999; Binz et al. 2005), auch nach Peptiden und anderen kleinen Molekülen, die Antikörper evtl. ersetzen könnten, wird gesucht (Kodadek et al. 2004). Seit Jahren wird an molekularen Imprints gearbeitet, synthetischen Polymeren, die in Anwesenheit der zu bindenden Substanzen gebildet werden (Mosbach 2006). Als weiteres Forschungsgebiet muss in diesem Zusammenhang die Suche nach bindenden bzw. katalytisch aktiven RNA-Molekülen erwähnt werden, die als Aptamere, Aptazyme, Spiegelmere oder Ribozyme bekannt wurden (Bunka u. Stockley 2006; Eulberg u. Klussmann 2003; Khan 2006). Entscheidend für die Nutzung von alternativen Bindungsmolekülen wird in jedem Falle sein, wie leicht sich diese Moleküle gewinnen lassen, wie spezifisch sie sind und wie gut sie sich für eine praktische Anwendung in vitro und in vivo eignen.

4.5

4.5.11 Literatur Ada GL, Nossal G (1987) The clonal-selection theory. Sci Am 257(Aug): 62–69 Alfthan K (1998) Surface plasmon resonance biosensors as a tool in antibody engineering. Biosens Bioelectron 13: 653–663 Andris-Widhopf J, Rader C, Steinberger P, Fuller R, Barbas CF 3rd. (2000) Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display. J Immunol Methods 242: 159–181 Angenendt P (2005) Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today 10: 503–11 Asch RH, Asch B, Asch G, Asch M, Bray R, Rojas FJ (1988) Performance and sensitivity of modern home pregnancy tests. Int J Fertil 33: 154–161 Aslan M, Dent A (1998) Bioconjugation – Protein coupling techniques for the biomedical sciences. Macmillan Reference Ltd., London Barbas CF 3rd, Kang AS, Lerner RA, Benkovic SJ (1991) Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: the gene III site. Proc Natl Acad Sci U S A 88: 7978–7982 Bell S, Kamm MA (2000) Antibodies to tumour necrosis factor alpha as treatment for Crohn‘s disease. Lancet 355: 858–860 Beste G, Schmidt FS, Stibora T, Skerra A (1999) Small antibody-like proteins with prescribed ligand specificities derived from the lipocalin fold. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 1898–1903 Binz HK, Amstutz P, Plückthun A (2005) Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains. Nat Biotechnol 23: 1257–1268 Birch JR, Racher AJ (2006) Antibody production. Adv Drug Deliv Rev 58: 671–685 Booy EP, Johar D, Maddika S, Pirzada H, Sahib MM, Gehrke I, Loewen S, Louis SF, Kadkhoda K, Mowat M, Los M (2006) Monoclonal and bispecific antibodies as novel therapeutics. Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 54: 85–101 Borrebaeck CA (2000) Antibodies in diagnostics – from immunoassays to protein chips. Immunol Today 21: 379–382. Böttger V, Peters L, Micheel B (1999) Identification of peptide mimotopes for the fluorescein hapten binding of monoclonal antibody B13-DE1. J Mol Recognit 12: 191–197 Breitling F, Dübel S (1997) Rekombinante Antikörper. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg Berlin Brüggemann M, Taussig MJ (1997) Production of human antibody repertoires in transgenic mice. Curr Opin Biotechnol 8: 455– 458 Bunka DH, Stockley PG (2006) Aptamers come of age – at last. Nat Rev Microbiol 4: 588–596 Burnet FM (1959) The clonal selection theory of acquired immunity. Cambridge University Press, London Cao Y, Lam L (2003) Bispecific antibody conjugates in therapeutics. Adv Drug Deliv Rev 55: 171–197 Carter P (2001) Bispecific human IgG by design. J Immunol Methods 248: 7–15 Casey JL, Coley AM, Tilley LM, Foley M (2000) Green fluorescent antibodies: novel in vitro tools. Protein Eng 13: 445–452 Champlin R (1996) Purging: elimination of malignant cells from autologous blood or marrow transplants. Curr Opin Oncol 8: 79–83 Chapman AP, Antoniw P, Spitali M, West S, Stephens S, King DJ (1999) Therapeutic antibody fragments with prolonged in vivo half-lives. Nat Biotechnol 17: 780–783 Cohen IR (1988) The self, the world and autoimmunity. Sci Am. 258 (Apr): 52–60

472

Sektion 4 · Therapie

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475 4.5 · Monoklonale Antikörper: Grundlagen und ihre Bedeutung in Diagnostik und Therapie

4.5

4.5.12 Zeittafel 1890

Entdeckung der Antitoxine und Begründung der Serumtherapie durch Behring und Kitasato (Mazumdar 2003)

1900

Landsteiner entdeckt die ABO-Blutgruppenantigene (Mazumdar 2003).

1906

Ehrlich formuliert die Seitenkettentheorie als Vorläufer des Konzepts der Oberflächenrezeptoren auf Lymphozyten (Mazumdar 2003).

1935–1936

Reinigung von Antikörpern durch Heidelberger und Kendall (Grabar 1976; Mazumdar 2003)

1938

Tiselius und Kabat weisen nach, dass Antikörper Gammaglobuline sind (Grabar 1976).

1942

Fluoreszenzmarkierung von Antikörpern durch Coons (Grabar 1976)

1948

Fagraeus weist nach, dass Antikörper von Plasmazellen gebildet werden (Grabar 1976).

1955–1957

Jerne und Burnet stellen die Selektionstheorien der Antikörperbildung auf (Burnet 1959; Grabar 1976; Mazumdar 2003).

1959

Aufklärung der Struktur des Antikörpermoleküls durch Porter, Edelmann und Nisonoff (Grabar 1976; Porter 1967; Edelman 1970)

1975

Herstellung der ersten monoklonalen Antikörper (Köhler u. Milstein 1975)

1976

Tonegawa weist nach, dass die Antikörpervielfalt durch somatische Rekombination entsteht (Tonegawa 1983).

1984

Herstellung von chimären Antikörpern (Morrison et al. 1984)

1986

Herstellung von humanisierten Antikörpern (Jones et al. 1986)

1986

Zulassung des ersten monoklonalen Antikörpers als Therapeutikum (Presta 2006)

1988

Erste rekombinante Expression von bindenden Antikörperfragmenten in Bakterien (Skerra u. Plückthun 1988)

1990

Selektion von rekombinanten Antikörpern aus Antikörperbibliotheken mithilfe des Phagen-Display (Barbas et al. 1991; McCafferty et al. 1990)

1993

Nachweis, dass Kamele Antikörper ohne leichte Ketten besitzen (Hamers-Casterman et al. 1993)

1994

Generierung von transgenen Mäusen, die humane Antikörper produzieren (Jakobovits 1994)

1998 bis jetzt

Zulassung zahlreicher chimärer und humanisierter Antikörper als Therapeutika (Reichert 2005)

2002

Zulassung des ersten humanen Antikörpers (aus Antikörperbibliotheken) als Therapeutikum (Reichert 2005)

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4.6 Gentechnische Grundlagen für biotechnologische Anwendungen Jörg Knäblein

4.6.1

Biotechnologie – die Wissenschaft, die Leben schafft – 478

4.6.2

Die Anfänge der Biotechnologie – 478

4.6.3

Von traditionellen zu modernen Biotechnologien – 479

4.6.3.1 4.6.3.2 4.6.3.3 4.6.3.4 4.6.3.5 4.6.3.6

Molekulare Genetik und enzymatische Kinetik – 479 Penicillin und andere lebensrettende Antibiotika – 480 Steroide: Wirkstoffe mit lebenskontrollierender Funktion – 481 Großtechnische Herstellung essenzieller Aminosäuren – 481 Vitamin B12 und andere lebenswichtige Kofaktoren – 482 Fermentation von Zitronensäure – 483

4.6.4

Ein kleines Molekül des Bakteriums – eine große Bedeutung für die Menschheit – 484

4.6.4.1 4.6.4.2 4.6.4.3 4.6.4.4

Plasmide und der genetische Kode – 485 Genscheren revolutionieren die Biotechnologie – 486 Biotechnologen verleihen Säugerzellen Unsterblichkeit – 487 Von der „Evolution in der Petrischale“ zu „maßgeschneiderten Designerbugs“ – 487 Humanes Insulin ist der erste Biotech-Blockbuster – 487 Vom Hype zur Depression – 489

4.6.4.5 4.6.4.6

4.6.5

„Enabling-Technologien“ ermöglichen eine rasante Entwicklung der Gentechnologie – 490

4.6.5.1 4.6.5.2

Mit Gentechnologie zu „Designer-Drogen“ Der Siegeszug von Vitamin C – 491

4.6.6

Moderne Biopharmazeutika sind quasi ubiquitär in der Molekularen Medizin – 492

4.6.6.1 4.6.6.2 4.6.6.3 4.6.6.4 4.6.6.5

Antikörper als Biopharmazeutika – 494 siRNA für Diagnostik und Therapie – 494 Individualisierte Medizin und Herceptin – 495 Transplantation und Organogenese – 496 Humane Stammzellen und klonierte Embryonen

– 490

– 497

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

4.6.7

Verschiedene Wirkmechanismen moderner Biopharmazeutika – 497

4.6.7.1 4.6.7.2

Koagulation versus Lyse bei der Blutgerinnungskaskade AIDS – 499

4.6.8

Beschleunigte Entwicklung mit Hochdurchsatz – 500

4.6.8.1 4.6.8.2

Revolution durch Evolution – 501 Hochdurchsatzklonierung ohne Restriktionsenzyme

4.6.9

Die moderne Biotechnologie – 503

4.6.10

Ausblick

– 504

4.6.11

Literatur

– 506

4.6.12

Zeittafel

– 508

– 497

– 502

478

Sektion 4 · Therapie

4.6.1 Biotechnologie – die Wissenschaft, die Leben schafft „Biotechnologie“ ist eine Verknüpfung der griechischen Wörter „bios“, „techne“ und „logos“, also Leben, Kunstfertigkeit/Technik und Wissen. Biotechnologie ist demnach die technische Nutzbarmachung des Wissens über Mikroorganismen zum Wohle der Menschheit oder nach einer weniger pathetischen Definition der Universität Hohenheim: „… technische Verfahren, in denen Organismen, Zellen oder Zellbestandteile zum Einsatz kommen. Ziel dieser Verfahren sind die nachhaltige Herstellung von Produkten der Pharma-, Lebensmittelund Kosmetikindustrie sowie ein nachhaltiger Schadstoffab- und umbau im Bereich der Umweltbiotechnologie“. Noch ausführlicher ist die Definition der Europäischen Föderation Biotechnologie (EFB) aus dem Jahre 1989: „… die integrierte Anwendung von Naturwissenschaften und Ingenieurswissenschaften mit dem Ziel, Organismen, Zellen, Teile daraus und molekulare Analoge technisch zu nutzen. Die Biotechnologie befasst sich folglich mit dem Einsatz biologischer Prozesse im Rahmen von technischen Verfahren und industriellen Produktionen. Sie ist damit eine stark anwendungsorientierte Wissenschaft der Mikrobiologie und Biochemie in enger Verbindung mit der Technischen Chemie und der Verfahrenstechnik“. Auch wenn diese Definitionen sehr unterschiedlich sind, eines haben sie alle gemeinsam: Biotechnologie verbessert unser Leben (gentechnisch hergestellte Medikamente, gentechnisch verbesserte Lebensmittel) – und teilweise macht sie es sogar erst möglich.

4.6.2 Die Anfänge der Biotechnologie Menschen haben sich „Biotechnologie“ im weitesten Sinne bereits seit Tausenden von Jahren zu Nutze gemacht, indem sie die Natur auf ihre Bedürfnisse zugeschnitten haben: Anfangs biologisch, dann technologisch, und schließlich biotechnologisch. Etwa 5.000 Jahre vor Christi Geburt beherrschten die Sumerer in Mesopotamien (dem Zweistromland zwischen Euphrat und Tigris, in dem der Bibel nach „Milch und Honig fließen“ – der heutige Irak) bereits die technische Kunst des Bierbrauens. Auf einer sumerischen Tontafel (dem „Monument Bleu“ im Pariser Louvre aus dem 3. Jahrtausend vor unserer Zeit) ist das Enthülsen von Emmerweizen (einer alten Kulturform des Weizens) zur Bierbereitung im Detail dargestellt. In manchen Jahren wurde in Mesopotamien fast die Hälfte der Getreideernte benutzt, um daraus das typische Bier (Kasch oder Bufa) zu brauen. Weitere tausend Jahre später waren es die Ägypter, die bereits die biologische Kunst der Weinherstellung

(Irep) bis zur Perfektion beherrschten. Schließlich, etwa dreitausend Jahre vor Christi Geburt kannten die Babylonier bereits 20 verschiedene Biersorten, und im Ägypten des Alten Reiches (ca. 2600 v. Chr.) galt Bier (Henket) als Volksnahrungsmittel – die Bierbrauerei war bereits ein königliches Monopol, und Reisbier war nachweislich auch schon am chinesischen Kaiserhof der HsiaDynastie im Jahre 2200 v. Chr. bekannt. Allerdings sollte erwähnt werden, dass diese frühen Biotechnologien natürlich sehr empirisch waren, die Prozesse nicht immer funktionierten und vor allem nicht reproduzierbar waren. Eine weitere Biotechnologie wurde bereits 1700 vor Christi Geburt in den Gesetzen des sumerischen Königs Hammurabi erwähnt: die Technik der Handbestäubung von Dattelpalmen. Hammurabi (1728 v. Chr. – 1686 v. Chr.) war einer der bedeutendsten altorientalischen Herrscher und der 5. König der ersten Dynastie von Babylon und König von Sumer und Akkad. Altüberlieferte Fermentationsverfahren setzten sich dann dort durch, wo die entsprechenden Rohstoffe zur Verfügung standen: Gerstenbier in Mitteleuropa (Malz, Hopfen, Saccharomyces cerevisiae), Reiswein (Reis, Aspergillus oryceae) und Reisschnaps Sake in Ostasien (Reis, Koji, S. cerevisiae), Kwaß in Russland (Gerstenmalz, Roggenmalz, Roggenmehl, Lactobacillus spec.), Pombe in Südamerika und Zentralafrika (Maische aus Hirse und Hefe, Schizosaccharomyces pombe), Pulque seit der Aztekenzeit in Mittelamerika (Früchte, Zymomonas mobilis). In Gebieten mit Milchviehzucht entstanden – meist durch spontane Gärung aus den etwa 500.000 Mikroben, die in nur 1 ml Milch enthalten sind – Dickmilch (Streptococcus lactis), Kefir (Lactobacillus kefir) und Käseerzeugnisse (z. B. Streptococcus salivarius): Die Sumerer hatten bereits Technologien entwickelt, um sogar selektiv bestimmte Käsesorten herzustellen, und später gab es einen Schimmelkäse nach Art des Roquefort (Penicillium roquefortii), der schon um 250 n. Chr. als eine gallische Spezialität galt, die auf dem Schiffswege nach Rom eingeführt wurde. Das Bierbrauen zum Beispiel entwickelte sich jedoch erst zur richtigen „Braukunst“, als sich im 6. Jahrhundert Mönche der Sache annahmen: Der Devise „Liquida non fragunt ieiunum“ („Flüssiges bricht nicht das Fastengebot“) verdanken wir die besonders kräftigen und alkoholhaltigen Starkbiere. Bier wird in Deutschland heute ausschließlich nach dem in Bayern schon seit 1516 geltenden Reinheitsgebot aus Gerstenmalz, Hopfen und Wasser unter Zusatz von Hefe bereitet. Auch heute noch steht Bier an der Spitze aller biotechnologisch erzeugten Produkte: Fast 1,5 Mrd. hl Bier mit einem Marktwert von ca. 50 Mrd. Euro werden alljährlich getrunken. Und davon werden allein 100 Mio. hl in Deutschland gebraut.

479 4.6 · Gentechnische Grundlagen für biotechnologische Anwendungen

4.6.3 Von traditionellen zu modernen Biotechnologien Bereits am Anfang des letzten Millenniums wurden „traditionelle“ Biotechnologien entwickelt, um nun hochwertige Lebens- und Genussmittel herzustellen: 1276 wird die erste Whiskeybrennerei in Irland errichtet, und 200 Jahre später werden Mikroorganismen gezielt eingesetzt, um Sauerkraut (Leuconostoc mesenteroides) und Joghurt (z. B. Lactobacillus bulgaricus) mithilfe von fermentativen Prozessen zu produzieren. Die Bakterien und Hefen selbst sind jedoch so klein, dass man sie mit bloßem Auge nicht erkennen kann; so blieb ihre Entdeckung dem Erfinder des Mikroskops vorbehalten. Dies ist der Delfter Linsenschleifer Antonie van Leeuwenhoek (1632–1723), der 1676 bei 200-facher Vergrößerung zum ersten Male Mikroorganismen tatsächlich zu sehen bekommt. Die ersten Zeichnungen von Bakterien veröffentlicht er im Jahre 1684 (van Leeuwenhoek 1684) und wird – obwohl er nie eine Universität besucht hatte – in die damals bedeutendste Vereinigung von Wissenschaftlern aufgenommen: die Londoner Royal Society. Rasant folgen nun fantastische Entdeckungen – Meilensteine auf dem Wege zur modernen Biotechnologie. Die Grundlagen der klassischen Genetik werden von dem englischen Wissenschaftler Charles Darwin (1809– 1882) in seiner Evolutionstheorie „Survival of the fittest“ postuliert. Am 1. Juli 1859 wurde Darwins Schrift „Über den Ursprung der Arten durch Mittel der natürlichen Selektion oder die Erhaltung bevorzugter Rassen im Kampf um das Leben“ vor der Königlichen Linné-Gesellschaft verlesen (Darwin 1859). 1860 ist es der französische Wissenschaftler und Begründer der Mikrobiologie und Biotechnologie Louis Pasteur (1822–1895), der durch den gezielten Einsatz von „Reinkulturen“ (also phänotypisch einheitlich Bakterien) der Gattung Acetobacter Alkohol zu Essig veredelt. Wenige Jahre später kann der Augustinerpater Johann Gregor Mendel (1822– 1884) in der im Jahre 1866 erschienenen Abhandlung „Versuche über Pflanzen-Hybriden“ die Vererbung bestimmter Phänotypen in seinen bekannten Experimenten mit Erbsen zeigen (Mendel 1866).

4.6.3.1 Molekulare Genetik und enzymatische Kinetik Der Baseler Pathologe Johann Friedrich Miescher (1811–1887) ist es, der 1869 als erster einen Zellkern anfärbt, und aus diesem anfärbbaren Nukleus an der Universität Tübingen das Molekül Nukleinsäure isoliert. Dies ist der eigentliche Beginn der molekularen Genetik, jedoch erst vierzig Jahre später, nämlich 1909, postuliert der dänische Genetiker Wilhelm Johannsen (1857–1927)

4.6

den Begriff des „Genotypen“, dessen vererbbare Charakteristika er als „Gene“ bezeichnet. Ein weiterer wichtiger Meilenstein in der Entwicklung zur modernen Biotechnologie ist die Beschreibung der Kinetik von Fermentationsprozessen, also die Geschwindigkeit, mit der ein bestimmtes Substrat S durch ein bestimmtes Enzym E zu dem Zielprodukt P umgesetzt wird. Enzyme beschleunigen eine große Bandbreite chemischer Reaktionen um einen Faktor von 100 Mio. bis zu einer Billion (108–1012). Nehmen wir an, eine enzymkatalysierte Reaktion würde in einer Sekunde vollständig ablaufen, so würde die gleiche Reaktion ohne Enzym (bei einem angenommen Faktor von 1012) theoretisch 300.000 Jahre benötigen! Die Mehrzahl der Stoffwechselreaktionen im Organismus wäre ohne Enzyme so langsam, dass sie keinerlei Nutzen hätten. Enzyme machen also das Leben überhaupt erst möglich. Die katalytische Aktivität von Enzymen beruht großenteils darauf, dass sie die Substrate in günstiger räumlicher Ausrichtung zu Enzym-Substrat-(ES-)Komplexen zusammenführen. Enzyme beschleunigen die Reaktionen durch Herabsetzung der Aktivierungsenergie, also der Aktivierungsbarriere, die zum Stattfinden der Reaktion vom Substrat zum Produkt erforderlich ist. Bei konstanter Enzymkonzentration steigt die Reaktionsgeschwindigkeit mit wachsender Substratkonzentration an, bis eine maximale Geschwindigkeit erreicht ist – bei ausreichend hoher Substratkonzentration sind dann nämlich alle katalytischen Zentren besetzt, sodass die Reaktionsgeschwindigkeit ein Maximum erreicht. Diesen Sättigungseffekt gibt es bei nichtkatalysierten Reaktionen nicht. Es sind der Berliner Biochemiker Leonor Michaelis (1875–1945) und seine Kollegin Maud Menten (1879–1960), die bereits 1913 diese Maximalgeschwindigkeit mit der Bildung eines definierten ESKomplexes interpretieren. Dies ist damit der älteste und allgemeinste (wenn auch indirekte) Beleg für die tatsächliche Existenz von ES-Komplexen. Seitdem man diese Zusammenhänge verstand, konnte man die Substratzuführung bei Fermentationsprozessen so steuern, dass die Raum-Zeit-Ausbeute im Reaktionskessel optimiert werden konnte. An folgenden Beispielen wird gezeigt, wo diese Erkenntnisse, gepaart mit gentechnischen Methoden, zu einer zwingend notwendigen erheblichen Verbesserung der Produktausbeute führten, um lebenswichtige und teilweise lebensrettende Substanzen überhaupt erst großtechnisch herstellen zu können.

480

Sektion 4 · Therapie

4.6.3.2 Penicillin und andere lebensrettende Antibiotika Die immense Bedeutung der Biotechnologie für die Menschheit wird an einem weiteren Beispiel klar: Alexander Fleming (1881–1955) arbeitete als Bakteriologe am St. Mary’s Hospital in London, als er 1928 auf einer mit Staphylococcus bewachsenen Agarplatte um einen darauf gefallenen Pilz eine klare Zone feststellte, auf der keine Bakterien gewachsen waren. Dieser Pilz, den Fleming als Penicillium notatum identifizierte, hatte eine wachstumshemmende Substanz ausgeschieden, die für diesen Hof verantwortlich war. Er nannte diese geheimnisvolle Substanz entsprechend Penicillin und veröffentlichte seine Arbeiten im British Journal of Experimental Pathology (Fleming 1929). Fleming selbst erkannte dessen enorme medizinische Wirksamkeit gegen Bakterien jedoch nicht: Streptokokken, Staphylokokken, die Erreger von Milzbrand (Anthrax), Diphtherie, Pfeiffer-Drüsenfieber und Wundstarrkrampf (Tetanus) konnten damit gleichermaßen gehemmt werden. Es ist 1938 der ukrainische Biochemiker Ernst Boris Chain (1906–1979) an der Englischen Universität in Oxford, der auf Flemings Arbeiten aufmerksam wird. Als 1939 der 2. Weltkrieg ausbricht, besteht plötzlich ein riesiger Bedarf an Heilmitteln, um die Bakterieninfektionen der Verwundeten zu bekämpfen. So greift Chain zusammen mit dem australischen Pathologen Howard Florey (1898–1998) die Arbeiten von Fleming wieder auf, weil sie deren enorme Bedeutung für die Bekämpfung von bakteriellen Infektionen sehen. Sie erproben das mühselig aus den gesammelten Nährlösungen gewonnene gelbe Pulver an Mäusen, die vorher mit krankheitserregenden Bakterien infiziert wurden. Und tatsächlich: Die Mäuse werden nach kurzer Zeit wieder gesund. Wegen der militärischen Bedeutung unterstützen die englische und die amerikanische Regierung die Bemühungen, Penicillin in ausreichenden Mengen zu gewinnen. 1941 wurde Penicillin erstmalig an einem 43-jährigen Patienten erprobt, der an einer gefährlichen Staphylokokken- und Streptokokkeninfektion erkrankt war. Nach einer kurzzeitigen Besserung verstarb der Patient jedoch einen Monat später: die verfügbare Menge an Penicillin war zu gering, obwohl es sogar aus dem Urin des Patienten zurück gewonnen wurde. Es mussten neue biotechnologische Verfahren her, um größere Mengen dieser lebensrettenden Substanz zu erhalten. Ein Problem war jedoch, dass Flemings PenicilliumStamm nur auf Oberflächen wuchs und lediglich 2 µg Penicillin pro ml Nährlösung ergab. Unter Einbeziehung der National Academy of Science und dem legendären Northern Regional Research Laboratory (NRRL) wurde nun – die Forschung fand jetzt in den USA statt – nach einem Stamm gesucht, der sich auch submers kultivieren

ließ. 1943 wurde schließlich Penicillium chrysogenum isoliert, der immerhin schon 40 µg Penicillin pro ml Kulturbrühe ergab. Anstelle der Oberflächenkultur wurde jetzt das sog. „deep-tank“-Verfahren eingesetzt und so konnten mit einer entwickelten Mutante von P. chrysogenum bereits 150 µg/ml Penicillin gewonnen werden. Experten für die Ernährung von Schimmelpilzen konnten durch den Einsatz von Maisquellwasser als Substrat die Ausbeuten weiter um ein Mehrfaches erhöhen. Um den Prozess weiter zu beschleunigen, beauftragte das War Production Board der USA nun Universitäten und andere Labors mit der Suche nach UV-induzierten Mutanten („Evolution in der Petrischale“) – schließlich beteiligten sich auch die Stanford University, das Cold Spring Harbor Laboratory und fast zwanzig US-Firmen an der weiteren Optimierung. Durch verbesserte Prozessführung und Zufütterung (Michaelis-Menten) konnte eine Produktion von 1500 µg Penicillin pro ml erreicht werden – von anfangs 2 µg/ml ist das ein Faktor von 750. Am 1. März 1944 wurde die erste Großanlage zur submersen Fermentation von Penicillin in Betrieb genommen, sodass die Produktion von 210 Mio. Einheiten (1 Einheit = 0,6 µg) 1943 auf 1.663.000 Mio. Einheiten im Jahr 1944 gesteigert werden konnte. Im Folgejahr wurde die Produktion sogar auf 6,8 Trillionen Einheiten erhöht. Die Ausbeuten waren von 1-Liter-Flaschen mit 1% auf 30.000-Liter-Tanks mit 90% Ausbeute gesteigert worden. Nur so konnten durch den engagierten Einsatz vieler Wissenschaftler, die an der Entwicklung des Penicillins mitgewirkt hatten, 1943 bereits 1.500 Militärangehörige behandelt werden. Und nur ein Jahr später wurden unzählige Verwundete am D-Day (6. Juni 1944) durch den Einsatz von Penicillin gerettet. Für ihre erfolgreichen und lebensrettenden Arbeiten erhielten Florey, Chain und Fleming 1945 den Physiologie-Medizin-Nobelpreis „für die Entdeckung des Penizillins und seiner Heilwirkung bei verschiedenen Infektionskrankheiten“. Seitdem sind die Antibiotika aus der Therapie von Infektionskrankheiten nicht mehr wegzudenken, und ausgehend vom Penicillin führte die Entwicklung über Streptomycin, Tetracyclin (beide aus Streptomyces spec.), Cephalosporin (Cephalosporium acremonium), Rifamycin (Nocardia mediterranei) und viele weitere von Mikroorganismen ausgeschiedene Substanzen zu den halbsynthetischen Antibiotika: Natürliche Bausteine der Antibiotika werden von Chemikern gewonnen und dann modifiziert, um die antibiotische Wirksamkeit zu erhöhen und die Resistenzausbildung bei den Krankheitserregern zu verhindern. Gemeinsam ist allen als Medikament eingesetzten Antibiotika, dass sie selektiv solche Stoffwechselprozesse stören, die speziell in Bakterien vorkommen und für diese lebenswichtig sind, je-

481 4.6 · Gentechnische Grundlagen für biotechnologische Anwendungen

doch in den menschlichen Organismus nicht eingreifen. Wie wir später noch sehen werden, sind Antibiotika außerdem als Selektionsmarker von extrem wichtiger Bedeutung für die Gentechnologie, weil sie die fundamentalen Stoffwechselprozesse in Bakterien hemmen. Abschließend sei noch gesagt, dass es heutzutage optimierte Verfahren in Kombination mit gentechnisch erzeugten Hochleistungsstämmen gibt, die 20.000-mal mehr Penicillin in einem Liter Nährlösung produzieren als Flemings Pilz.

4.6.3.3 Steroide: Wirkstoffe mit lebenskontrollierender Funktion Während in der Biotechnologie manchmal die Gewinnung der Bakterienbiomasse selbst das Ziel ist (z. B. „single cell protein“ als Tierfutter, was praktisch die Biomasse von Methylophilus methylotrophus darstellt, der auf billigem Methylalkohol wächst), so geht es bei der industriellen Produktion jedoch meistens darum, mithilfe der Mikroorganismen ein bestimmtes Produkt herzustellen. Wie wir gerade bei der Synthese von Antibiotika gesehen haben, bewerkstelligen die Bakterien hierbei über mehrere Stufen die komplette Biosynthese; bei der sog. „Biotransformation“ sind es lediglich einzelne Schritte. Eine wichtige Substanzklasse, für die viele Biotransformationen entwickelt wurden, sind die Steroide, aus denen verschiedenste Wirkstoffe hergestellt werden (Rosenkranz 1951). Es gibt heutzutage eine Reihe therapeutisch wichtiger Steroide – eines jedoch, welches zu besonderem Ruhm gelangte, ist ein Derivat des Alkaloids Diosgenin. Der in Wien geborene Chemiker Carl Djerassi (1923 bis heute) arbeitete in den 1950er Jahren in Mexiko in einer kleinen Firma, die Diosgenin aus dem wild wachsenden Yamswurz (Dioscorea) isolierte, um es in das weibliche Sexualhormon Progesteron und auch in Testosteron umzuwandeln. Dann wurde herausgefunden, dass der Schimmelpilz Rhizopus arrhizus sogar in der Lage ist, in diesem komplizierten viergliedrigen, alicylischen Ringsystem selektiv an Position 11 des C-Rings von Steroiden eine Hydroxylierung durchzuführen. Diese Aufgabe, nämlich nur an einem bestimmten Kohlenstoff ein Wasserstoffatom gegen eine OH-Gruppe auszutauschen und zwar nur in einer von zwei möglichen Richtungen (das Thema „enantioselektive Synthese und Chiralität“ werden wir später noch einmal ausführlicher betrachten), kann chemisch nur in mehreren Reaktionsstufen, mit vielen Nebenprodukten und einer geringen Ausbeute bewerkstelligt werden. Die Entdeckung weiterer mikrobieller Biotransformationen folgte. Als Leiter eines Teams von Chemikern bei der Firma Syntex in Mexico City gelang Djerassi am 15. Oktober 1951 die erste Synthese eines

4.6

steroidalen oralen Kontrazeptivums (Rosenkranz et al. 1951), der „Pille“, deren 50. Geburtstag im Oktober 2001 gefeiert wurde. Wir alle kennen die vielfältigen Auswirkungen dieser Entdeckung, die man eigentlich schon als erstes „Lifestyle-Präparat“ bezeichnen könnte. Zuvor war es bereits gelungen, ein anderes sehr wichtiges Steroidhormon zu isolieren, nämlich das von der Nebennierenrinde abgesonderte Cortison (Lardon u. Reichstein 1952). Als man kurze Zeit später feststellte, dass Cortison bei Patienten mit rheumatischer Arthritis schmerzlindernd wirkt, entstand plötzlich eine riesige Nachfrage nach diesem Medikament. Die Firma Merck benötigte anfangs 37 Schritte, um Cortison aus der Gallensäure von Rindern herzustellen, sodass 1 Gramm umgerechnet ca. 200 Euro kostete. Durch den kombinierten Einsatz von Rhizopus arrhizus und Gentechnik konnte die Anzahl der Schritte auf 11 reduziert werden und der Preis für 1 Gramm auf etwa einen Euro – ein frühes Beispiel der sog. „weißen Biotechnologie“, um eine Industrieproduktion sowohl ökologisch als auch ökonomisch zu ermöglichen.

4.6.3.4 Großtechnische Herstellung essenzieller Aminosäuren Aminosäuren wie Lysin und Methionin können von Nichtwiederkäuern, z. B. Menschen, Hühnern und Schweinen, nicht oder nur mit ungenügender Geschwindigkeit synthetisiert werden und müssen mit der Nahrung zugeführt werden. Sie werden deshalb als essenziell bezeichnet. Mit Ausnahme von Methionin ist ausschließlich die L-Form physiologisch aktiv, und nur sie wird für die Medizin, für Sportler und für Futtermittel benötigt. Gemeinsam mit Methionin und Threonin ist Lysin besonders wichtig, weil diese Aminosäuren in Getreide kaum vorkommen. Bei Menschen, die sich hauptsächlich von Getreide (Weizen, Mais, Reis) ernähren, und bei Tierfutter spielt dieser Gesichtspunkt deshalb eine entscheidende Rolle. Tatsächlich nimmt der Bedarf an essenziellen Aminosäuren als Futtermittelzusatz und für medizinische Zwecke (z. B. Infusionslösungen) rasch zu. Gegenwärtig werden fermentative und chemische Methoden zur industriellen Herstellung von L-Aminosäuren anstelle der konventionellen Isolierung aus Eiweißhydrolysaten eingesetzt. Chemisch synthetisierte Aminosäuren sind aber optisch inaktive Gemische (Racemate) von D- und L-Isomeren – dies bedeutet, sie verhalten sich wie Bild und Spiegelbild. Sie haben zwar, genauso wie unsere rechte und linke Hand, denselben Aufbau, drehen jedoch polarisiertes Licht in entgegengesetzte Richtungen. Proteine werden ausschließlich aus L-Aminosäuren aufgebaut, daher ist die Synthesemaschine der Zellen eben

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Sektion 4 · Therapie

nur auf die Produktion von L-Aminosäuren eingestellt, und dies bedeutet, dass der Organismus ausschließlich die L-Formen der Aminosäuren verwerten kann. Über die sog. Streckersynthese kann man nun zwar z. B. großtechnisch mithilfe von Kobaltcarbonylkatalysatoren aus Acrylnitril Lysin herstellen, allerdings muss dieses Racemat sehr aufwendig getrennt werden, um ausschließlich das gewünschte L-Lysin zu erhalten. Auch bei anderen Substanzen aus der Pharma- und Agroindustrie ist eine enantiomerenreine Produktion durch ganze Bakterien oder isolierte Enzyme von äußerster Wichtigkeit: Wirkstoffe mit Chiralitätszentren können häufig nur mit biotechnologischen Methoden ökonomisch lohnend hergestellt werden. Dies ist umso wichtiger, als über 50% der Top 100 Arzneimittel auf enantiomerenreinen Wirkstoffen basieren und diese bereits jetzt einen Umsatz von mehr als 100 Milliarden US-Dollar haben – Tendenz steigend. Im Gegensatz zur chemischen Synthese produzieren also Bakterien zu 100% die biologisch aktive L-Form der Aminosäuren und sind deshalb bei solchen stereochemisch komplizierten Synthesen immer weit überlegen. Ein guter Lysinproduzent war zunächst Corynebacterium glutamicum, wenngleich er jedoch zwei Nachteile hatte: Er stellt nicht ausschließlich Lysin her (sondern auch Threonin und Methionin) und wird zudem noch durch hohe Lysinkonzentration gehemmt (sog. Feedback-Hemmung). In Wildstämmen entsteht Lysin aus Pyruvat, Aspartat und dem Oxalacetat des Zitronensäurezyklus – katalysiert durch das allosterische Schrittmacherenzym Aspartatkinase. Wenn nun mehr Lysin entsteht, als die Zelle benötigt, hemmt dieses die Aspartatkinase; herrscht Mangel, so erhöht das die Synthese. In der Natur ist dieser Mechanismus zwar durchaus sinnvoll – wir hingegen wollen aber Lysin im Überschuss herstellen, und dies funktioniert nur, wenn man den natürlichen Kontrollmechanismus ausschalten kann. So wurde durch den Einsatz biotechnologischer Verfahren (Screening, Mutagenese und anschließende Selektion) eine bestimmte Mutante entwickelt, in der die Struktur der Aspartatkinase leicht verändert ist, sodass das Enzym zwar noch Lysin herstellen kann, aber nicht mehr durch dieses gehemmt wird. Mit dieser Mutante von Corynebacterium glutamicum ohne Feedback-Hemmung lässt sich heutzutage Lysin in riesigem Überschuss herstellen. Auch die Lysinproduktion ist damit ein gutes Beispiel für einen Industrieprozess, der durch den Einsatz von Biotechnologie und die Kenntnis der Enzymreaktion (sowie der ihr zugrunde liegenden MichaelisMenten-Kinetik) ökonomisch gestaltet werden konnte. So kann bei heutigen industriellen Fermentationen mehr als ein Drittel der im Medium angebotenen Zucker zu Lysin umgesetzt werden und dabei durchaus Konzentrationen von 120 g Lysin je Liter Medium im Zeitraum von

60 h in einem 500-m3-Bioreaktor erreicht werden. Für medizinische Zwecke und als Futtermittelzusatz werden inzwischen jährlich etwa 600.000 t Lysin mit einem Marktwert von annährend 1 Mrd. Euro produziert. In jüngster Zeit wurden sogar transgene Raps- und Sojasorten entwickelt, die einen höheren Gehalt an Lysin haben – und damit einen höheren Nährwert.

4.6.3.5 Vitamin B12 und andere lebenswichtige Kofaktoren Bei den biotechnologisch erzeugten Stoffen (Kleinmolekülen) kann man grundsätzlich zwischen Feinchemikalien und den großen Industrieprodukten („bulk“) unterscheiden. Danach ist L-Lysin ganz klar ein großes Industrieprodukt. Feinchemikalien hingegen sind solche, die durch chemische Synthese nur schwer oder gar nicht hergestellt werden können, die zumeist nur in geringen Mengen benötigt werden, aber oft sehr hochwertig sind. So besitzen z. B. viele Enzyme in ihrem aktiven Zentrum kovalent gebundene organische Substanzen, sog. prosthetische Gruppen, oder sie binden reversibel sog. Kofaktoren (auch Koenzyme genannt). Vitamin B12 ist einer der wichtigsten Vertreter dieser Gruppe und als Methylcobalamin z. B. an der Methylgruppenübertragung bei der Methioninbiosynthese aus Homocystein beteiligt. Der jährliche weltweite Bedarf an Vitamin B12 ist mit nur etwa 20 t zwar sehr klein (es wird zur Blutbildung und als Leberschutzpräparat verwendet und etwa die Hälfte als Futtermittel für Wachstum und Knochenaufbau), dafür hat ein Kilogramm jedoch einen Marktwert von fast 10.000 Euro. Damit gehört es entsprechend der obigen Definition zu der Gruppe von Feinchemikalien. Beim Vitamin B12 (Cyanocobalamin) handelt es sich um eine rot gefärbte, kristalline Substanz, die zur Behandlung verschiedener Anämien (Blutkrankheiten) und von Mangelzuständen dient und bemerkenswerterweise ausschließlich von Mikroorganismen hergestellt werden kann. So wird dieser Komplex z. B. im Verdauungstrakt pflanzenfressender Tiere (Darmflora) oder im Erdboden (von Bodenbakterien) synthetisiert. Das Vitamin findet sich daher lediglich in den Wurzeln von (Nahrungs-)Pflanzen, nicht aber in deren oberirdischen Teilen wie Blattgemüsen oder Getreidekörnern. Bisher gibt es nur eine Ausnahme: Inzwischen hat man nämlich herausgefunden, dass durch die Symbiose des Sanddorns (Hippophae rhamnoides) mit dem Mikroorganismus Actinomyces spec. in den Samenschalen des Sanddorns eine Vitamin-B12-Konzentration entsteht, wie sie vorher nur von der Leber bekannt war. Der Mensch versorgt sich mit diesem Vitamin fast ausschließlich durch „tierische“ Lebensmittel wie Fleisch, Innereien, Milch und Eidotter, weshalb bei rein vegetarischer Ernährung die Gefahr von

483 4.6 · Gentechnische Grundlagen für biotechnologische Anwendungen

Mangelerscheinungen besteht. Der tägliche Bedarf für einen Erwachsenen liegt bei ca. 3 mg, wobei bereits ein geringer Mangel an B12 zu Befindlichkeitsstörungen führen kann, deren wirkliche Ursache – eben der VitaminB12-Mangel – häufig nicht erkannt wird, weil die Symptome unspezifisch sind. Es sind Zustände wie allgemeine Schwäche und Müdigkeit, depressive Verstimmung, Gedächtnisstörungen, Veränderungen der Persönlichkeit, Muskelschlaffheit und Bewegungsstörungen. Der Normalgehalt in menschlichem Blut beträgt nur 0,0002 µg (Millionstel Gramm) Vitamin B12 pro ml. Im Körper werden lediglich kleine Mengen des Cyanocobalamins gespeichert (zwischen 2–5 mg), davon 50–90% in der Leber. Unterschreitet der Gehalt allerdings über eine längere Zeit einen gewissen „Mindestbestand“, so ist eine ordnungsgemäße Blutbildung nicht mehr gewährleistet, und es kann zur früher tödlichen perniziösen Anämie kommen. 1926 wurde diese Krankheit erstmals erfolgreich mit ein bis zwei Pfund roher Rinderleber pro Woche behandelt. Für die Tragweite dieser lebensrettenden Erkenntnis erhielten deshalb George Hoyt Whipple (1878–1976), George Richards Minot (1885–1950) und William Parry Murphy (1892– 1987) 1934 den Medizin-Nobelpreis. Heute wird bei perniziöser Anämie das fehlende Vitamin B12 einfach direkt in die Blutbahn injiziert. Es gibt verschiedene Produktionsstämme (Bacillus megatherium, Pseudomonas denitrificans und Propionibacterium shermanii) für Cobalamin, der Vorstufe zum Cyanocobalamin – teilweise sogar mit 50.000-facher Überproduktion im Vergleich zum Wildtyp, die wie schon bei der biotechnologischen Penicillin- und Lysinproduktion durch „Evolution in der Petrischale“ erhalten wurden. In einem einstufigen anaeroben Prozess kann z. B. der Produktionsstamm von Pseudomonas denitrificans bei viertägigem Wachstum in Zuckerrübenmelasse bis zu 60 mg Cobalamin pro Liter erzeugen, welches in das Medium abgegeben wird. Am Ende wird die Kultur in Gegenwart von Cyanid erhitzt, und man erhält so Cyanocobalamin, welches aufgereinigt und dann dem Patienten als Vitamin B12 zur Verfügung gestellt werden kann.

4.6.3.6 Fermentation von Zitronensäure Die kommerzielle Produktion von Zitronensäure begann 1826 durch die Englische Montserrat Co. Ltd. die durch J. & E. Sturge in Shelby gegründet wurde. 1990 verkaufte die Firma ihre Zitronensäuresparte (inzwischen mit einer biotechnologischen Produktionskapazität von 23.000 t pro Jahr) für ca. 100 Mio. US-Dollar an Bayer, um dessen weltweite Produktionskapazität auf 150.000 t zu erhöhen.

4.6

Doch gehen wir zurück in das Jahr 1826: Als Ausgangssubstanz für die Produktion von Zitronensäure diente damals Zitronensaft von importierten Zitrusfrüchten aus Italien. Aus ihnen wurde Calciumcitrat gewonnen, welches leicht in Zitronensäure überführt werden kann, deren Struktur 1838 von dem deutschen Chemiker Justus von Liebig (1803–1873) (Eisenbrand 1995) aufgeklärt wurde. Italien eroberte schnell das Monopol auf die Produktion, und die Preise stiegen. Als Italien jedoch während des 1. Weltkriegs seine Zitrusplantagen vernachlässigte, stiegen die Preise so stark an, dass andere Länder nach günstigeren Alternativen zur Herstellung suchten. Am Anfang der mikrobiologischen Zitronensäureproduktion stand die bereits 1893 gemachte Beobachtung, dass Schimmelpilze beim Wachstum auf Zucker Zitronensäure ins Medium ausscheiden. Anfangs wurden nur geringe Anteile des mit der Glucose angebotenen Kohlenstoffs in der Zitronensäure wiedergefunden. Versuche mit einer großen Zahl an Schimmelpilzen und anderen Mikroorganismen, die auf Zucker wachsen können, zeigten, dass die höchste Zitronensäurekonzentration durch einen ganz bestimmten Pilz erreicht werden kann. Später wurde die spezielle Stoffwechselaktivität des Pilzes Aspergillus niger beschrieben, der viel mehr Zitronensäure produziert als alle anderen – auch, unter welchen speziellen Bedingungen er dies tut. Zum Beispiel kann man die Ausbeute erhöhen, indem man den pH-Wert erniedrigt: Die beiden Enzyme im Citratzyklus, die den Abbau von Zitronensäure katalysieren, werden bei fallendem pH-Wert inaktiviert. Ein anderes Enzym (Aconitase), welches die Umlagerung von Zitronensäure bewirkt, benötigt Eisen als Kofaktor und wird durch den Mangel an Eisenionen gehemmt. Deshalb muss neben einem sauren pH-Wert von 2 bis 3 auf die Abwesenheit von Eisen geachtet werden. Das erreicht man z. B. durch die Zugabe von sog. „gelbem Blutlaugensalz“ (Kaliumhexacyanoferrat), welches mit den Eisenionen eine schwerlösliche Verbindung bildet, das „Berliner Blau“. Diese biotechnologischen Prozessverbesserungen sind übrigens weitere Beispiele für die enorme Wichtigkeit vom Ausbau der Erkenntnisse über Enzymkinetiken. 1923 war es schließlich die Firma Pfizer in New York, die die erste Großproduktion von Zitronensäure aufnahm, und weitere Anlagen in Deutschland, Belgien, Großbritannien und der Tschechoslowakei folgten. Seit 1960 wird Aspergillus auch im Submersverfahren fermentiert, obwohl es anfänglich schwierig war, überhaupt die Produktausbeuten wie beim Oberflächenverfahren zu erreichen. Die Kultivierung des Pilzes in der Nährlösung und der Einfluss der Scherkräfte des Rührwerkes (das mit hoher Drehzahl arbeiten muss, um eine ausreichende Belüftung dieses ausgesprochenen Aero-

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Sektion 4 · Therapie

biers zu gewährleisten), bedingen eine geänderte Morphologie von Aspergillus niger mit ungewünschten Konsequenzen. Durch intensive biotechnologische Prozessentwicklung hat man diese Schwierigkeiten in den Griff bekommen, und heute werden in den technischen Anlagen in Rühr- oder Turmbioreaktoren (sogar bis 500 m3) durchaus 85% der eingesetzten Rohstoffe in Zitronensäure umgewandelt. Diese mikrobiologisch erzeugte Zitronensäure ist chemisch völlig identisch mit dem Naturprodukt aus Zitrusfrüchten. Da sie Schwermetalle bindet, wird die Zitronensäure z. B. in der Notfallmedizin bei Vergiftungen eingesetzt oder in klinischen Labors, um die Gerinnung von Blutproben zu hemmen. Wegen ihres Geschmacks wird sie außerdem für Bonbons, Limonaden, Konfitüren und Lebensmittel eingesetzt, sowie in Wasch- und Spülmitteln, weil sie Komplexe mit Calcium und Magnesium bildet und dadurch das Wasser enthärtet. Alles in allem liegt der jährliche Bedarf inzwischen bei ca. 700.000 t – eine Menge, die man nicht aus Zitrusfrüchten hätte gewinnen können – es sei denn, man hätte ganz Italien komplett mit Zitronenbäumchen zugepflanzt. Im Gegensatz zu der vorher beschriebenen Feinchemikalie Vitamin B12 zählt Zitronensäure also ganz klar zu den großen Industrieprodukten. Der Marktwert liegt bei etwa 700 Mio. Euro, und dies ist der Grund, warum Produktionsstämme von Aspergillus zu den bestgehüteten Schätzen der Biotechnologie gehören.

4.6.4 Ein kleines Molekül des Bakteriums – eine große Bedeutung für die Menschheit 1928 führt der englische Mediziner und Bakteriologe Frederick Griffith (1877–1941) das Experimentum crucis durch, also das Schlüsselexperiment zur Erarbeitung „gentechnischer Grundlagen für biotechnologische Anwendungen“. Griffith arbeitet dabei mit zwei verschiedenen Stämmen von Streptococcus pneumoniae, dem Erreger der Lungenentzündung. Ein Stamm hatte keine Kapsel und trug deshalb die Bezeichnung R („rough“, rau), und der andere bildete Kapseln, war glatt und wurde deshalb als S-Stamm bezeichnet („smooth“, glatt). Im Experiment an Mäusen war der glatte S-Stamm tödlich, der raue R-Stamm harmlos. Tötete man die Bakterien des gefährlichen S-Stamms durch Hitze ab und injizierte sie einer Maus, nahm das Tier keinen Schaden. Injizierte man der Maus hingegen eine Mischung aus lebenden (harmlosen) R-Bakterien und abgetöteten S-Bakterien, so starb diese. Die ursprünglich harmlosen R-Pneumokokken hatten den tödlichen Faktor des S-Stamms übernommen. Griffith konnte hitzeinaktivierte Bakterien in pathogene umwandeln, d. h., er zeigte die „genetische

Transformation“, also die Umwandlung vom Genotyp eines Mikroorganismus durch den Transfer von Genen – aus einem anderen Mikroorganismus – in eben dessen Genotyp bzw. Phänotyp. Dies ist das erste Mal, dass Mikroorganismen bewusst genetisch manipuliert wurden, dass also Erbmaterial von einem Organismus auf einen anderen übertragen wurde. Der kanadische Mediziner Oswald Theodore Avery (1877–1955) am Rockefeller Institute in New York ging noch einen Schritt weiter: Er nahm nicht einfach hitzeinaktivierte S-Pneumokokken, sondern stellte Zellextrakte her, die er immer weiter aufreinigte. Alle Fraktionen (Zellwandbestandteile, diverse Proteinfraktionen und nukleinsäurehaltige Fraktionen) wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, aus R-Formen S-Formen zu schaffen. Wenn Ethanol zugesetzt wurde, gab es einen Niederschlag im Reagenzglas, und das „Prinzip“ funktionierte nicht mehr. Kohlenhydrate, wie die Bakterienkapseln, präzipitierten nicht mit Alkohol, Nukleinsäuren dagegen gut – und Proteasen zeigten keinen Effekt. Das Experiment gelang also nur mit aktiven nukleinsäurehaltigen Fraktionen – und wenn das RNA spaltende Enzym Ribonuklease addiert wurde, war das „Prinzip“ immer noch wirksam. Schließlich führte Avery einen chemischen Test zum Nachweis des DNA-Zuckers Desoxyribose durch, bei dem sich dieser blau färbte: Das „transformierende Prinzip“ waren also weder Proteine noch Kohlehydrate oder RNA; es war DNA! So konnte er schließlich 1944 die „DNA“ als Träger aller genetischen Informationen identifizieren, indem er zeigte, dass gewisse Bakterien durch Aufnahme chemisch reiner DNA neue vererbbare Merkmale annehmen können. Diese eleganten Experimente von Griffith und Avery, mit dem sie die DNA als das „transformierende Prinzip“ identifizierten, waren somit die ersten Gentechnikexperimente der Geschichte. 1953 sind es der Biochemiker James D. Watson (1928 bis heute) und der Physiker Francis H. Crick (1916– 2004) mit ihren bahnbrechenden Arbeiten, die die dreidimensionale doppelhelikale Struktur des „Moleküls des Lebens“ aufklären (Watson u. Crick 1953) und außerdem den Mechanismus der Weitergabe von genetischer Information beschreiben. Diese 3D-Struktur der DNA und ihr Replikationsmechanismus können demnach als die erste „dreidimensionale Kopiermaschine“ (Kenneth Boulding, 1910–1993) bezeichnet werden. Schon drei Jahre später isoliert der amerikanische Biochemiker Arthur Kornberg (1918 bis heute) das Enzym, welches das „Molekül des Lebens“ synthetisiert: DNA-Polymerase (Kornberg et al. 1956). Für diese Entdeckung erhält er 1959 den Nobelpreis für Physiologie/Medizin. Parallel zu diesen beeindruckenden Experimenten und bahnbrechenden Erkenntnissen arbeiten Wissenschaftler zur gleichen Zeit auch an der Erforschung der

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dreidimensionalen Struktur von komplexen Proteinen: John C. Kendrew und Kollegen veröffentlichen 1958 in Nature die Struktur von Myoglobin (Kendrew et al. 1958) und kurze Zeit später Max F. Perutz und Kollegen die dreidimensionale Struktur von Hämoglobin (Perutz et al. 1963). Beide erhalten den Chemie-Nobelpreis für ihre „studies on the structures of globular proteins“, und durch ihre Arbeiten ebnen sie praktisch den Weg zur heutigen Strukturbiologie, auf deren Wichtigkeit wir an anderer Stelle noch zu sprechen kommen werden.

4.6.4.1 Plasmide und der genetische Kode Es folgt die Entdeckung des Plasmids, eines Stücks zirkulärer extrachromosomaler DNA, welches von Mikroorganismen genutzt wird, um schnell bestimmte genetische Eigenschafen sowohl horizontal (sogar artfremd) als auch vertikal weiterzugeben: Häufig werden auf diesem Plasmid z. B. Resistenzgene für Antibiotika, Gene für den Abbau von xenobiotischen Verbindungen oder für die Produktion von Restriktionsendonukleasen, Toxinen oder Virulenzfaktoren vererbt. Dem Wirtsbakterium können sie dadurch entscheidende Selektionsvorteile verleihen, indem diese Plasmide es den Mikroorganismen ermöglichen, sich schnell an eine neue Umgebung anzupassen (dies ist heute eine Geißel, weil dies z. B. in Krankenhäusern auch schnell zu multiresistenten Keimen führen kann, die durch kein Antibiotikum mehr beherrscht werden können). Als nächstes wird der Prozess der Transkription entdeckt, bei dem ein Strang der DNA-Doppelhelix mithilfe einer RNA-Polymerase abgelesen und in ein mRNAMolekül (Messenger-RNA) mit komplementärer Nukleotidsequenz umgeschrieben wird. Und es sind die französischen Biologen François Jacob (1920 bis heute) und Jacques Monod (1910–1976), die 1960 zeigten, dass mRNA als Träger der gesamten genetischen Information dient, die zur Synthese eines Proteins benötigt wird – quasi als genetische Blaupause. Außerdem zeigen sie, dass sich neben den sog. Strukturgenen noch weitere Sequenzen mit Signalfunktion auf der DNA-Matrize befinden. Sie postulieren das Operatormodell: eine DNA-Sequenz am Beginn einer Gruppe von benachbarten und funktionsmäßig zusammengehörigen Strukturgenen (sie zusammen werden als Operon bezeichnet), an welche regulatorisch wirkende Proteine (Aktivatoren oder Repressoren) gebunden werden können (Jacob et al. 1960). Dann gibt es noch die Promotorregion, die durch Anlagerung der RNA-Polymerase den Beginn der Transkription bestimmt. Ein Beispiel hierfür ist das LactoseOperon mit dem entsprechenden lac-Repressor, dessen Wechselwirkung mit dem Operator durch Anlagerung von einem Induktor (z. B. IPTG) verhindert werden

4.6

kann. Als Folge davon wird die Transkription nicht mehr durch den Repressor unterdrückt, und die auf den Operator folgenden Strukturgene können zuerst in mRNA umgeschrieben und anschließend exprimiert werden. Für diese bahnbrechenden Entdeckungen erhalten Jacob und Monod 1965 den Nobelpreis für Physiologie/Medizin. Der nächste entscheidende Durchbruch kam mit der Entschlüsselung des genetischen Kodes, der die Sprache der Nukleinsäuren mit der Sprache der Proteine verknüpft. Da diese Übersetzung von einer Sprache in die andere an den sog. Ribosomen (das ist die Proteinbiosynthesemaschinerie) erfolgt, heißt dieser ribosomale Syntheseprozess auch Translation. Durch die sequenzspezifische Verknüpfung von Nukleotiden auf chemischem Wege und die ribosomale Proteinsynthese mit isolierten Zellbestandteilen in vitro war der nächste Schritt vorgezeichnet: Man brauchte „lediglich“ das Proteinsynthesesystem im Reagenzglas nachzuvollziehen. Mit dem synthetischen Polynukleotidmaterial wird das ribosomale In-vitro-Proteinsynthesesystem programmiert und erforscht, welche Polypeptidprodukte entstehen. Auf diese Weise sind die Voraussetzungen geschaffen, den genetischen Kode zu dechiffrieren, und es ist der amerikanische Biochemiker Marshall W. Nirenberg (1927 bis heute), der am National Institute of Health in Bethesda bereits ein Jahr später zeigte, dass das Kodontriplett UUU in der mRNA die Aminosäure Phenylalanin im Protein kodiert (Nirenberg et al. 1962). Für diese Entdeckung erhält er 1968 den Nobelpreis für Physiologie/Medizin. Zum Abruf der genetischen Information wird also die DNA zunächst in mRNA überschrieben (Transkription), und anschließend liefert diese an den Ribosomen die Anleitung für den Zusammenbau der Aminosäuren in der richtigen Reihenfolge (Translation). Diese erfolgt durch lineare Ablesung der mRNA, wobei jeweils drei Nukleotide (Kodon) den Einbau einer bestimmten Aminosäure in die wachsende Polypeptidkette bestimmen. Eine mit der entsprechenden Aminosäure beladene tRNA (Transfer-RNA), die sozusagen als Adaptermolekül fungiert, lagert sich mithilfe ihrer Matrizenerkennungsregion (Antikodon) sequenzabhängig an den mRNA-Ribosomenkomplex an. Ein Starttriplett sorgt dabei für den Beginn und ein Stoppkodon für das Ende der Proteinsynthese. Nachdem nun das „Rätsel der Transkription und Translation“ geklärt ist, erhalten 1962 Watson & Crick, zusammen mit ihrem Kollegen Maurice Wilkins, den Nobelpreis für Physiologie/Medizin.

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Sektion 4 · Therapie

4.6.4.2 Genscheren revolutionieren die Biotechnologie Ein weiterer Meilenstein ist 1968 die Entdeckung von Restriktionsenzymen durch den Schweizer Biophysiker Werner Arber in Genf (1929 bis heute), für die er 1978 den Nobelpreis für Physiologie/Medizin erhält (Linn u. Arber 1968). Diese sog. „Genscheren“ sind in der Lage, charakteristische, kurze Sequenzen von wenigen Basen in DNA-Molekülen spezifisch zu erkennen und die Doppelhelix an diesen bestimmten Erkennungssequenzen zu zerschneiden. Einige dieser Restriktionsenzyme trennen die Doppelhelix glatt durch (sog. „blunt end“, z. B. SmaI), andere zerschneiden die beiden Stränge um einige Basen versetzt und erzeugen dadurch überstehende Einzelstrangenden. Die Basen in diesen Enden sind komplementär und können sich dadurch leicht wieder aneinanderlagern. Sie werden deshalb als „klebrige“ Enden bezeichnet (sog. „sticky ends“, z. B. EcoRI oder BamHI). Nun werden die so erhaltenen Restriktionsfragmente der DNA und der Plasmide im Reagenzglas gemischt und kombinieren aufgrund ihrer klebrigen Enden spontan nach einer statistischen Verteilung neu, also rekombinieren. Die noch verbliebenen Bruchstellen im Rückgrat dieser rekombinanten DNA werden schließlich mit dem Enzym Ligase wieder verklebt. Diese Methode ermöglicht es zum ersten Mal, genetische Information nach Belieben neu zu kombinieren und auf diese Weise synthetische Gene zu erzeugen. Nun besteht allerdings das Problem, aus den vielen rekombinierten DNAMolekülen diejenigen herauszufinden, die sich exakt so zusammengelagert haben, wie es erforderlich ist. Man verwendet daher für solche Versuche künstlich hergestellte Plasmide, Transportvehikel, die auch als Vektoren bezeichnet werden, weil sie zusätzliches genetisches Material aufnehmen und transportieren können. Einer der ersten für Klonierungen eingesetzten Vektoren war pBR322, ein Derivat eines aus Escherichia coli stammenden Plasmids. Der Name bedeutet, dass es sich dabei um das 322. Plasmid der Wissenschaftler Bolivar und Rodriguez aus Herbert Boyers Arbeitsgruppe an der Universität von San Francisco handelt. Ihre Veröffentlichung wurde bis 1990 zu einer der meistzitieren Publikationen überhaupt (Bolivar et al. 1977). E. coli ist ein Bakterium, das in großen Mengen die Verdauungstrakte von Menschen und Tieren bevölkert und beim Abbau der Nahrung hilft – benannt wurde es nach Ihrem Entdecker Theodor Escherich (1857–1911), einem deutschen Kinderarzt, der 1887 seine Arbeit zum Thema „Die Darmbakterien des Säuglings und ihre Beziehungen zur Physiologie der Verdauung“ veröffentlichte (Escherich 1887). Wie wir noch sehen werden, avancierte dieser Mikroorganismus E. coli schnell zum Parade- und Arbeitspferd der modernen Biotechnologie.

Das Plasmid pBR322 besitzt z. B. für das Restriktionsenzym EcoRI lediglich eine einzige Schnittstelle und trägt zusätzlich zwei sog. genetische Marker, die das Auffinden des Plasmids erheblich erleichtern. Ihre Relevanz für die Biotechnologe hatten wir im Zusammenhang mit der Herstellung von Antibiotika schon kurz diskutiert. Bei den Markern handelt es sich nämlich tatsächlich um Gene für die Resistenz sowohl gegen das Antibiotikum Ampicillin (AmpR) als auch gegen Tetracyclin (TetR). Die Schnittstelle für das Restriktionsenzym BamHI liegt bei diesem Vektor genau in der TetR-Sequenz, sodass dieses Resistenzgen durch Behandlung mit BamHI zerschnitten wird und die Resistenz damit verloren geht (sog. Insertionsinaktivierung). Führt man diesen Vektor in eine Bakterienzelle ein (man spricht dann von einem transformierten Mikroorganismus), so kann sich das Plasmid in ihr vermehren. Diese Bakterien können leicht selektiert werden, indem man sie auf Agarplatten überimpft, die entweder eines oder beide Antibiotika enthalten. Auf diese Weise kann man zwischen drei verschiedenen Ereignissen unterscheiden: 1. Bakterien, die keinen Vektor aufgenommen haben, können nicht wachsen. 2. Bakterien, die den unveränderten Vektor enthalten, sind resistent gegen beide Antibiotika (TetR, AmpR). 3. Bakterien, die das gewünschte genetische Material enthalten, nämlich Vektor plus zusätzlichen FremdDNA-Abschnitt (sog. „insert“), sind zwar resistent gegen Ampicillin (AmpR), aber empfindlich gegenüber Tetracyclin (TetS), weil das Resistenzgen (TetR) durch die Aufnahme der Fremd-DNA in die interne BamHI-Schnittstelle zerstört wurde. Man kann jetzt über die sog. Stempeltechnik Klone identifizieren, die empfindlich gegenüber Tetracyclin (TetS) und resistent gegenüber Ampicillin (AmpR) sind. Wenn man einen solchen Klon – in Gegenwart von Ampicillin als Flüssigkultur in einem Schüttelkolben – wachsen lässt, kann man daraus in großen Mengen die PlasmidDNA extrahieren und die darin enthaltene genetische Fremd-DNA isolieren. Auf diese Weise kann man also jeden gewünschten DNA-Abschnitt klonieren und beliebig vervielfältigen. Nur zwei Jahre nach Entdeckung dieser so wichtigen Restriktionsenzyme sind es die amerikanischen Biologen Howard Temin (1934–1994) und David Baltimore (1938 bis heute), die das „zentrale Dogma der Genetik“, nämlich den unidirektionalen Fluss genetischer Information, widerlegen (Temin et al. 1970). Bisher war man davon ausgegangen, dass der genetische Informationsfluss lediglich von der DNA in mRNA (Transkription) und von dort in Protein (Translation) erfolgt. Temin und Baltimore zeigten jedoch, dass es ein virales Enzym gibt, welches mRNA zunächst in einzelsträngige cDNA (kom-

487 4.6 · Gentechnische Grundlagen für biotechnologische Anwendungen

plementäre DNA) zurückübersetzt: reverse Transkriptase. Dieser Durchbruch ermöglichte es jetzt, sogar eukaryote DNA zu klonieren, weil in der mRNA bereits die Introns eliminiert („gespliced“) wurden, d. h., unnötige genetische Informationen, die für die Synthese des Proteins nicht erforderlich sind, wurden bei der Transkription schon entfernt. Für ihre Entdeckungen erhalten beide im Jahre 1975 den Nobelpreis für Physiologie/ Medizin. Am Brookhaven National Laboratory, New York, wird 1971 die Protein-Daten-Bank (PDB) etabliert, die sich schnell zu einem zentralen Repositorium für Proteinkoordinaten entwickelt, welche zwischen Wissenschaftlern weltweit ausgetauscht werden. Wie wir bereits gesehen haben, werden strukturbiologische Informationen immer wichtiger, und so avanciert die PDB zu einem sehr wichtigen Werkzeug der modernen Biotechnologie und schafft die Basis für rationales, strukturbasiertes Design von Medikamenten. Dann, 1973, ist ein weiterer wichtiger Meilenstein der Gentechnologie erreicht: Unabhängig voneinander entwickeln Allan Maxam und Walter Gilbert in Harvard (Gilbert u. Maxam 1973) und Frederick Sanger (Sanger et al. 1973) in Cambridge eine Methode, um DNA zu sequenzieren, d. h. die Abfolge der Nukleinsäuren zu entschlüsseln und damit die genetische Information zu lesen und zu verstehen. Dies hat einen entscheidenden Einfluss auf die Zukunft der gesamten Biotechnologie, und so erhalten Walter Gilbert und Frederick Sanger 1980 den Chemie-Nobelpreis – Sanger bereits zum zweiten Mal, nachdem er diesen schon 1958 für die Strukturaufklärung des Insulins erhalten hatte.

4.6.4.3 Biotechnologen verleihen Säugerzellen Unsterblichkeit Zur selben Zeit arbeiten Georges J. F. Köhler und César Milstein am Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology in Cambridge an einem Verfahren, um monoklonale Antikörper herzustellen. Bisher mussten Wissenschaftler, um einen Antikörper herzustellen, in Tiere das entsprechende Antigen injizieren und warten, dass deren Immunsystem dagegen gerichtet einen Antiköper produziert. Zu einem späteren Zeitpunkt wurde dann Blut aus dem Tier entnommen, um den Antikörper zu isolieren – dies war allerdings eine Mischung verschiedener Antiköper, sog. polyklonale Antiköper, mit sehr unterschiedlichem Bindungsverhalten (Affinität) zu dem entsprechenden Antigen. Der einzige Weg, um monoklonale Antikörper zu erhalten, war, die Lymphozyten zu klonieren, von denen jeder einzelne lediglich eine Form des Antikörpers produziert, d. h. einen monoklonalen Antikörper.

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Lymphozyten sind jedoch kurzlebige Zellen und können nicht einfach kultiviert werden. Köhler und Milstein waren jedoch in der Lage, genau diese Lymphozyten mit krebsartigen Myelomazellen zu fusionieren. Dies hatte zur Folge, dass die resultierende Hybridomazelle zwei wertvolle Eigenschaften in sich vereint: Sie produziert ausschließlich eine einzige Form des Antikörpers (monoklonal) und teilt sich endlos (eine sonst sehr negative Eigenart von Krebszellen) – auf diese Weise liefert sie eine nie versiegende Quelle für diesen monoklonalen Antikörper (Köhler u. Milstein 1975). Heutzutage basieren viele biotechnologisch hergestellte Medikamente (z. B. therapeutische und diagnostische Proteine) auf Antikörpern, weshalb diese Technologie die Medizin revolutioniert hat. Außerdem konnten so zielgerichtete (targetspezifische) Medikamente entwickelt werden, die systemisch verabreicht werden, jedoch automatisch ihr Zielgewebe finden, wo sie ausschließlich, d. h. selektiv, z. B. einen Tumor bekämpfen können – ohne andere Teile des Körpers in Mitleidenschaft zu ziehen. Ein solches Beispiel ist Herceptin, welches wir später noch im Detail besprechen werden.

4.6.4.4 Von der „Evolution in der Petrischale“ zu „maßgeschneiderten Designerbugs“ Jetzt bricht eine neue Ära der Biotechnologie an: Durch intelligente Kombination all dieser Erkenntnisse und Methoden ist man nun in der Lage, in vitro DNA-Abschnitte beliebig neu zu kombinieren und somit auch Plasmide gezielt zu manipulieren (z. B., um ein künstliches Gen zu erzeugen), in E. coli beliebig zu vervielfältigen und anschließend in großen Mengen zu isolieren. Über die DNA-Sequenzierung kann jetzt auch überprüft werden, ob tatsächlich das korrekte genetische Material kloniert wurde. Ist dies der Fall, so kann man, wie vorher beschrieben, mithilfe der so gewonnenen Plasmidvektoren Fremd-DNA auch in andere Mikroorganismen übertragen. Würde das Plasmid z. B. die Information für die Bildung des menschlichen Wachstumshormons enthalten, so müsste diese wie eine zelleigene Information verarbeitet werden, und die Bakterien sollten authentisches humanes Wachstumshormon produzieren.

4.6.4.5 Humanes Insulin ist der erste Biotech-Blockbuster Tatsächlich gelingt es 1973 Stanley Cohen (1935 bis heute) von der Stanford University und Herbert Boyer (1938 bis heute) von der Universität in San Francisco,

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diese Theorie zu bestätigen, indem sie diese neuen Biotechnologien erfolgreich einsetzen (Cohen et al. 1973). Zum ersten Mal kann auf diese Weise ein synthetisches Gen in E. coli exprimiert werden: humanes Insulin. Das erste rekombinant hergestellte Biopharmazeutikum war also humanes Insulin, welches tatsächlich von immenser Wichtigkeit ist: Die WHO schätzt, dass etwa 170 Mio. Menschen an Diabetes leiden – eine Zahl, die sich bis zum Jahr 2030 wahrscheinlich verdoppeln wird. Bereits 1921 gelang den beiden Kanadiern Frederick G. Banting (1891–1941) und Charles H. Best (1899– 1978) in Toronto die Isolierung des Insulins aus tierischen Bauchspeicheldrüsen. Sie entdeckten die pharmakologische Wirksamkeit des Insulins, welches das einzige Hormon ist, mit dem der normale Blutzuckergehalt auf 70–120 mg/100 ml eingestellt werden kann. Bereits zwei Jahre später wurde Insulin für die Therapie eingesetzt – diese Arbeit wurde als so epochal angesehen, dass sie noch im selben Jahr mit dem Nobelpreis für Physiologie/Medizin honoriert wird.

Allein in Deutschland werden zur Behandlung von Diabetes mellitus jährlich mehr als 500 kg reines Insulin benötigt; weltweit sind es mehr als sechs Tonnen. Wenn man diese Zahlen vor Augen hat und weiß, dass mehr als 50 Bauchspeicheldrüsen von Schlachttieren benötigt werden, um den Insulinbedarf eines Diabetikers zu befriedigen, so wird klar, dass die konventionelle Gewinnung von Insulin nicht ausreicht. Oftmals kommt es beim Patienten außerdem zu allergischen Reaktionen, wenn man ihm z. B. das Insulin vom Schwein verabreicht – oder das Immunsystem des Patienten bildet bei längerer Gabe Antikörper gegen das körperfremde Insulin, einer der Gründe, warum in Deutschland seit dem 15. März 2005 keine tierischen Insulinzubereitungen mehr zugelassen sind. Wie kann man nun aber authentisches humanes Insulin (das vom Immunsystem des Patienten nicht als körperfremd erkannt wird) in E. coli herstellen? Dabei geht man von der insulinspezifischen mRNA aus, die man in den Zellen der menschlichen Bauchspeicheldrüse in relativ großen Mengen findet. Wie schon erwähnt,

. Abb. 4.6.1. Produktion eines humanen Proteins in E. coli. Ein menschliches Gen (z. B. Insulin) wird in E. coli eingeschleust und das gewünschte humane Protein durch die bakterielle Synthesemaschinerie produziert. Hierzu wird aus menschlichen Zellen die gesamte mRNA isoliert, enzymatisch durch reverse Transkriptase in doppel-

strängige DNA umgewandelt, durch Restriktionsenzyme geschnitten und mithilfe von Ligasen in den Expressionsvektor kloniert. Rekombinante Plasmide, die das Insulin-Gen enthalten, werden in die Bakterienzelle eingeschleust und bringen diese dazu, humanes Insulin herzustellen

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4.6

. Abb. 4.6.2. Gentechnische Produktion von rekombinantem Insulin. Ein Plasmid, welches das Gen für die Herstellung von humanem Insulin enthält, wird in ein Wirtsbakterium eingeschleust, welches dann bei seiner Kultivierung die Insulinvorstufe (Proinsulin) produziert. Die Vorstufe dieses Biopharmazeutikums kann dann aufgearbeitet, maturiert und formuliert werden, um es den Diabetikern zur Verfügung zu stellen. Diese sog. rekombinante Herstellung von humanem Insulin in E. coli führte regelrecht zu einem „Hype“, als

Cohen und Boyer auf diese Weise erfolgreich das erste kommerzielle Biopharmazeutikum herstellten. Zum ersten Mal in der Medizingeschichte wurden so im Juli 1980 am Londoner Guy’s Hospital 17 Freiwillige mit einem Säugetierhormon behandelt, welches nicht aus Säugetierorganen stammt, sondern aus Bakterien. Auf dieser Grundlage entstand die erste Biotech-Firma: Am 15. Oktober 1980 ging „Genentech“ an der New York Wall Street an die Börse

ist diese mRNA aus Eukaryonten bereits gespliced, d. h., die Introns (im Prinzip DNA, die nicht für Proteine kodiert) wurden bereits entfernt. Diese mRNA kodiert für eine Vorstufe des Insulins (Präproinsulin), wie sie zunächst auch im menschlichen Körper gebildet wird. Mit dem Enzym Reverse Transkriptase kann jetzt aus der mRNA eine komplementäre DNA (sog. cDNA) und daraus anschließend eine doppelsträngige DNA erzeugt werden, die durch Ligation in den Vektor kloniert wird. Dieses Plasmid wird in ein Wirtsbakterium eingeschleust, welches bei seiner Kultivierung die Insulinvorstufe (Proinsulin) in das Medium abgibt. Diese kann dann aufgearbeitet, maturiert und formuliert werden, um es den Diabetikern zur Verfügung zu stellen. Die soeben beschriebene rekombinante Herstellung von humanem Insulin in E. coli führte regelrecht zu einem „Hype“, als Cohen und Boyer auf diese Weise erfolgreich das erste kommerzielle Biopharmazeutikum herstellten. Zum ersten Mal in der Medizingeschichte wurden so im Juli 1980 am Londoner Guy’s Hospital 17 Freiwillige mit einem Säugetierhormon behandelt, welches nicht aus Säugetierorganen stammt, sondern aus Bakterien. Auf dieser Grundlage entstand die erste Biotech-Firma: Am 15. Oktober 1980 ging „Genentech“ an der New

Yorker Wall Street an die Börse. Die Faszination („Biomania“) über dieses erste Medikament, welches mithilfe der modernen Biotechnologie hergestellt wurde, und das riesige Potenzial dieser neuen Technologie führten dazu, dass der anfängliche Börsenwert je Genentech-Aktie innerhalb der ersten 20 Minuten von 35 auf 89 US $ nach oben kletterte (Dickson 1980). Am Abend dieses historischen Tages hatte diese erste Biotech-Firma bereits eine Marktkapitalisierung von 66 Mio. US $!

4.6.4.6 Vom Hype zur Depression International avancierte diese Methode zur Herstellung von rekombinanten Biopharmazeutika schnell zum allgemeinen Prinzip, nach dem Gentechnologie für die biotechnologische Produktion nutzbar gemacht werden kann. Auch in Deutschland beantragte die Firma Hoechst vier Jahre nach dieser Erfolgsstory eine Produktionsanlage für gentechnisches Humaninsulin und erhielt eine Vorabgenehmigung. Die Anlage wurde gebaut, allerdings erst 1998 nach 14 (!) Jahren Bürokratie („Sicherheitsbedenken“) und öffentlichen Diskussionen zur Produktion von Insulin aus E. coli zugelassen. Da allerdings ein dringender Bedarf vorhanden war, importierte man schon all die Jahre über Insulin aus dem Ausland. Dieses

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Insulin wurde im Ausland für deutsche Patienten übrigens nach genau demselben Verfahren hergestellt – soviel zur Bewertung der Sicherheitsbedenken …

4.6.5 „Enabling-Technologien“ ermöglichen eine rasante Entwicklung der Gentechnologie Ein Quantensprung für die Gentechnologie/Biotechnologie ist eine relativ simple Technologie, die aber die molekulare Biologie grundlegend revolutioniert: 1983 entwickelt Kary Mullis einen Prozess, den er Polymerasekettenreaktion („polymerase chain reaction“, PCR) nennt (Mullis et al. 1986). Durch dieses Verfahren löst er das Kernproblem der molekularen Genetik: die Vervielfältigung von Genen. Mit anderen Worten: „Wie kann man viele Kopien eines bestimmten DNA-Abschnitts erzeugen, der von Interesse ist?“ Die PCR kann dieses Problem sehr elegant lösen, indem sie dieselben Moleküle verwendet, die auch die Natur einsetzt: Zwei sog. „Primer“, die den DNA-Abschnitt flankieren, der vervielfältigt werden soll, dienen zum Start für die DNAPolymerase, den dazwischen liegenden Teil zu kopieren. Mithilfe von einzelnen Nukleotiden und weiteren Zusätzen wird dieser Vorgang viele Male wiederholt. Da die Erzeugung dieser neuen und in vitro erzeugten DNAAbschnitte exponentiell erfolgt, werden in kürzester Zeit einige Millionen Kopien der gewünschten DNA erzeugt. Außerdem kann man mithilfe dieser Methode gezielt Mutationen in ein Gen einführen und dadurch die Aminosäuresequenz des kodierten Proteins verändern. Dies kann technisch ganz einfach dadurch erfolgen, dass man in den Primer die gewünschte Mutation einbaut. Wie wir im nächsten Abschnitt sehen werden, kann dies sehr positive Auswirkungen auf das Protein haben (z. B. Insulinvarianten mit besserer Bioverfügbarkeit). Für die Entwicklung der PCR erhielt Kary Mullis 1993 den Nobelpreis für Chemie. 1984 ist ein weiteres wichtiges Jahr für die medizinische Biotechnologie: Die Struktur des ersten transmembranen Proteins, das photosynthetische Reaktionszentrum aus Rhodopseudomonas viridis, wird gelöst (Deisenhofer et al. 1984). Die Herausforderung bei diesem 150 kDa großen Protein lag darin, dass es aus 11 transmembranen, hydrophoben D-Helices besteht. Diese dreidimensionale Struktur war ein großer Schritt vorwärts bei der zielgerichteten Entwicklung (Design) neuer Medikamente, weil viele der aussichtsreichsten Medikamentenkandidaten auf membrangebundene Proteine gerichtet sind. Für diese bahnbrechenden Arbeiten bei der Strukturaufklärung erhielten mein Doktorvater Robert Huber vom Max-Planck-Institut für Biochemie, zusammen mit seinen Kollegen Johann

Deisenhofer und Hartmut Michel, 1988 den Nobelpreis für Chemie.

4.6.5.1 Mit Gentechnologie zu „DesignerDrogen“ In den folgenden Jahren werden nun über sog. „protein engineering“ Insulinvarianten (Muteine) biotechnologisch produziert, die entweder besser verträglich sind, einen schnelleren Wirkungseintritt haben, oder aber eine bessere bzw. längere Wirksamkeit besitzen. Es handelt sich dabei um Varianten, die es in der Natur gar nicht gibt, d. h. die ausschließlich gentechnisch zugänglich sind. Wenn Insulin unter die Haut (subkutan) gespritzt wird, kommt es dort zu kurzzeitig hohen Konzentrationen, und die Insulinmoleküle lagern sich zu Hexameren zusammen, also immer sechs Moleküle aneinander. Diese müssen nach der Injektion unter die Haut zunächst wieder in Di- und Monomere dissoziieren, bevor sie in die Blutbahn resorbiert und zu ihren Zielzellen gelangen können, um somit physiologisch aktiv zu werden. Dies dauert relativ lange und stellt für viele Diabetiker ein Problem dar. Das 1996 zugelassene Insulin lispro (Humalog) z. B. wirkt deutlich schneller und gleichzeitig nicht so lange wie natives Insulin. Das Vertauschen der Aminosäuren Prolin 28 und Lysin 29 reduziert die Hexamerenbildung um den Faktor 300, wodurch der Wirkungseintritt deutlich schneller (60 min statt sonst 90 min) und die Wirkungsdauer viel kürzer wird (2 h gegenüber 6 h). Ein anderes Beispiel ist Insulin aspart, bei dem ebenfalls die Assoziation herabgesetzt wird. Durch den Austausch von Prolin an Position 28 der B-Kette durch eine Asparaginsäure wird eine zusätzliche negative Ladung eingefügt, welche eine Hexamerenbildung verhindert. Aber auch eine verlangsamte Freisetzung – eine Art „controlled release“ – kann auf biotechnologischem Wege durch Depotbildung beim Insulin glargine (Lantus) erreicht werden. Anfügen von zwei zusätzlichen Argininen an die B-Kette und Austausch des Asparagins in Position 21 der A-Kette verschiebt deutlich den pH zum Basischen (wir erinnern uns: Am isolelektrischen Punkt sind die Ladungen elektrisch neutral, und das Protein hat die geringste Löslichkeit), sodass das Insulin bei physiologischen Bedingungen (pH 7,4) ausfällt. An der Einstichstelle bildet sich folglich ein Depot, aus dem Insulin langsam freigesetzt wird – so erfolgt eine konstante Freisetzung des Insulins über 24 Stunden.

491 4.6 · Gentechnische Grundlagen für biotechnologische Anwendungen

4.6.5.2 Der Siegeszug von Vitamin C Ein weiterer Meilenstein beim Einsatz der Gentechnik in der Biotechnologie ist die großtechnische Herstellung von Vitamin C (L-Ascorbinsäure). Menschen und andere Primaten besitzen keine Gulonolacton-Oxidase, sodass wir Vitamin C nicht synthetisieren können und somit durch die Nahrung aufnehmen müssen, um Mangelerscheinungen zu verhindern (etwa 100 mg täglich). Skorbut ist die am längsten bekannte Avitaminose, die durch Mangel an Ascorbinsäure hervorgerufen wird und bei der es infolge einer gestörten Bindegewebesynthese zu den bekannten klinischen Symptomen kommt: Brüchigkeit der Blutgefäße mit allgemeinen Blutungen, Zahnausfall und Gingivitis, verzögerte Wundheilung. Dieses Phänomen war seither vor allem bei Seefahrern bekannt, und es gab schließlich um 1900 einen Erlass des Deutschen Kaisers für seine Matrosen, dass diese jeden Tag löffelweise Zitronensäure schlucken mussten. Dies führte jedoch nicht zur gewünschten Prävention vor Skorbut, sondern lediglich zu Durchfall. Es ist zwar korrekt, dass Zitrusfrüchte vor Skorbut schützen, doch wie wir heute wissen, ist es tatsächlich das darin enthaltene Vitamin C, welches vor der Krankheit schützt, und nicht, wie fälschlich angenommen, die Zitronensäure. Und so schwor der Doppel-Nobelpreisträger Linus Pauling (1901–1994) auf Vitamin C als Fänger von freien Radikalen und schluckte täglich mehrere Gramm dieses Antioxidans zur Gesundheitsprophylaxe: Er war nie erkältet und wurde immerhin 93 Jahre alt (allerdings ist er wegen der Übersäuerung des Urins an einem Harnblasenkarzinom gestorben). 1933 gelang dem gebürtigen Polen Tadeusz Reichstein (1897–1996) an der ETH Zürich erstmals die Synthese von Vitamin C, indem er Glucose in mehr als zehn Zwischenstufen chemisch zu L-Xylose abbaute und dann mit Blausäure (HCN) zu L-Ascorbinsäure umwandelte. Allerdings war diese Methode für eine großtechnische Produktion viel zu kompliziert und lieferte schlechte Ausbeuten (deshalb erhielt Reichstein zwar 1950 den Medizin-Nobelpreis – wie wir aber noch sehen werden, für seine Arbeiten zum Cortison und nicht für die Vitamin-C-Synthese). Reichstein und sein junger Kollege Grüssner arbeiteten deshalb an der Verbesserung der Synthese und wollten zunächst Sorbose als Zwischenstufe herstellen: Mithilfe eines Nickelkatalysators und Wasserstoff konnten sie Glucose unter einem Druck von 150 bar mit 100%iger Ausbeute zu Sorbit reduzieren. Allerdings ist der nun folgende Schritt, nämlich die chemische Oxidation von Sorbit in die Vitamin-C-Vorstufe Sorbose sehr kompliziert. Die beiden asymmetrischen Kohlenstoffatome der L-Ascorbinsäure liegen bereits im Glucosemolekül vor, und die Regiospezifität der Oxidation ist somit der Schlüsselschritt der Vitamin-C-Syn-

4.6

these. Wieder waren es Mikroorganismen, die solche chemisch schwierigen Reaktionen mit Leichtigkeit durchführen können. Bereits 1896 hatte der französische Chemiker Gabriel Bertrand (1867–1962) beschrieben, wie man mit dem Bakterium Acetobacter suboxydans (nach heutiger Nomenklatur: Gluconobacter oxydans), und zwar mit dessen Sorbitol-Dehydrogenase, Sorbit in Sorbose umwandeln kann. Reichstein und Grüssner nutzten nun die Kombination von chemischer Synthese mit dem biotechnologischen Schritt der Umwandlung von D-Sorbit in L-Sorbose. Diese wird dann chemisch zu 2-Keto-L-Gulonsäure (2-KLG) oxidiert und durch Säurebehandlung und Wasserabspaltung zu L-Ascorbinsäure umgewandelt. Die beiden „Biotechnologen“ boten das „Reichstein-und-Grüssner-Verfahren“ der Firma Roche in Basel an, die bereits 1934 das Vitamin-CPräparat Redoxon auf den Markt brachte. Roche hatte bereits zuvor Interesse an einer anderen Methode gezeigt: Der Ungar Albert von Szent-Györgyi Nagyrapolt (1893–1986) hatte Vitamin C aus Paprika isoliert und erhielt 1937 den Nobelpreis für Medizin/Physiologie. Jahrzehntelang wurde Vitamin C hauptsächlich nach dem Verfahren von Reichstein und Grüssner hergestellt, bis man jüngst mit der Gentechnik einen rein biotechnologischen Prozess entwickeln konnte. Bakterien der Gattung Erwinia setzen mithilfe von drei Enzymen D-Glucose bis zur 2,5-Diketo-D-Gluconsäure (2,5-DKG) um. Diese könnte nun als Substrat für das Bakterium Corynebacterium spec. dienen, welches daraus mit seiner im Zytoplasma befindlichen 2,5-Diketo-D-GluconsäureReduktase 2-Keto-L-Gulonsäure (2-KLG) herstellen könnte, welches seinerseits – wie wir bereits beim „Reichstein-und-Grüssner-Verfahren“ gesehen haben – einfach oxidiert und durch Säurebehandlung und Wasserabspaltung zu L-Ascorbinsäure umgewandelt werden kann. Man müsste jetzt einfach beide Bakterien in einer Kofermentation zusammenbringen, um großtechnisch Vitamin C herzustellen. Es ergeben sich hierbei allerdings einige Probleme: Die gramnegativen Bakterien der Gattung Erwinia und die grampositiven der Gattung Corynebacterium haben sehr unterschiedliche Ansprüche an die Zusammensetzung der Nährmedien, an pH- und Temperaturoptimum und besitzen sehr unterschiedliche Wachstumsraten, sodass ein Organismus den anderen verdrängen würde. Dies sind nur einige der vielen Schwierigkeiten, die eine Kofermentation unmöglich machen. Aber auch hier bietet eine neue Disziplin, die erst durch die Gentechnologie möglich wurde, die Lösung: „metabolic engineering“. Durch die gentechnische Manipulation wurde die genetische Information, die zur Expression der 2,5-Diketo-D-Gluconsäure-Reduktase erforderlich ist, aus Corynebacterium in das Erbgut von Erwinia eingeschleust. Mithilfe der Gentechnik ist

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Sektion 4 · Therapie

. Abb. 4.6.3. Vitamin-C-Synthese durch Erwinia-Zellen. Durch die Konstruktion eines Hybrids aus dem gramnegativen Bakterium Erwinia und dem grampositiven Corynebacterium konnte ein Hochleistungsstamm zur Produktion von Vitamin C hergestellt werden. Beim sog. „metabolic engineering“ wurde die genetische Information zur Expression der 2,5-Diketo-D-Gluconsäure-Reduktase aus Corynebacterium in das Erbgut von Erwinia eingeschleust. So ist es gelun-

gen, die metabolische Kapazität zweier sehr unterschiedlicher Bakterien (z. B. sehr unterschiedliche Wachstumsraten und Ansprüche an die Zusammensetzung der Nährmedien, sowie an pH- und Temperaturoptimum) elegant zu vereinen. Die rekombinanten Erwinia-Zellen produzieren in 120 h etwa 120 g 2-KGL pro Liter Fermentationsbrühe, wobei ca. 60% der Glucose umgesetzt werden!

es also eindrucksvoll gelungen, die metabolische Kapazität zweier sehr unterschiedlicher Bakterien elegant zu vereinen: Die rekombinanten Erwinia-Zellen produzieren in 120 h etwa 120 g 2-KGL pro Liter Fermentationsbrühe, wobei ca. 60% der Glucose umgesetzt werden! An diesem faszinierenden Beispiel kann demonstriert werden, wie man von einer komplizierten rein chemischen Synthese durch den Einsatz der Biotechnologie (und hierbei besonders die gentechnologische Herstellung künstlicher Hybridstämme) zu einem fermentativen für die Großproduktion geeigneten (fast) „Eintopfverfahren“ kommen kann. Durch Metabolic engineering konnte u. a. bei BASF die Vitamin-B2-Synthese von einem chemischen 8-Stufen-Prozess auf einen einstufigen Fermentationsprozess umgestellt werden, und bei DSM konnte die 10-stufige Synthese des Antibiotikums Cephalexin durch einen biotechnologischen Prozess substituiert werden. Auf diese Weise können die Produktionskosten teilweise auf die Hälfte reduziert und der Energieeinsatz und Materialverbrauch sogar um 65% gesenkt werden. Gleiches gilt für die Umweltbelastung, denn die chemische Synthese erfolgt in organischen Lösungsmitteln und der biotechnologische Prozess im wässrigen Medium.

Im Falle von Vitamin C konnte durch Metabolic engineering der Herstellungspreis um den Faktor 50 reduziert werden, und inzwischen werden jährlich mehr als 30.000 t mit einem Marktwert von etwa 400 Mio. Euro produziert.

4.6.6 Moderne Biopharmazeutika sind quasi ubiquitär in der Molekularen Medizin Wir haben jetzt gesehen, wie man lebenswichtige Produkte mithilfe von Mikroorganismen herstellen kann, wie man diese aus ihnen direkt isolieren kann, oder wie man auf gentechnologischem Wege Bakterien in die Lage versetzt, für sie völlig nutzlose – aber für den Menschen sehr wertvolle – Kleinmoleküle herzustellen. Als nächstes wollen wir uns nun mit dem aus Sicht der Molekularen Medizin wichtigsten Aspekt der Biotechnologie befassen: der Entwicklung von Biopharmazeutika. Biopharmazeutika – auch wenn diese mit ihren knapp 20 Jahren noch sehr jung sind – generieren bereits jetzt einen Umsatz von mehr als 30 Mrd. US-Dollar pro Jahr. Mit einem dramatischen Wachstum von mehr als 20% stellen sie somit auch einen höchst lukrativen Markt

493 4.6 · Gentechnische Grundlagen für biotechnologische Anwendungen

dar, der nach Schätzungen bereits im Jahr 2010 auf mehr als 90 Milliarden US-Dollar angewachsen sein wird. „Men love to wonder, and that is the seed of science“ (Ralph Waldo Emerson, 1803–1882), und dies ist der Grund, warum die moderne Biotechnologie in kurzer Zeit zu so vielen Facetten der Life Sciences geführt hat. Im Folgenden werde ich versuchen, einen breiten – wenn auch nicht kompletten – Überblick zum aktuellen Stand der medizinischen Biotechnologie mit Schwerpunkt Biopharmazeutika zu geben. Eine wertvolle Ergänzung stellt das „biotechnology hub“ „global pharma specialists“ (www.get-gps.net) dar. Hier werden kontinuierlich neue Errungenschaften der pharmazeutischen Biotechnologie vorgestellt und von einem kompetenten Netzwerk pharmazeutischer Spezialisten und Mediziner analysiert und diskutiert – nach dem Motto: „knowledge is power – shared knowledge is success“. Außerdem hat der Autor in seinem Buch Modern Biopharmaceuticals – Design, Development and Optimization in 4 Bänden einen umfassenden Überblick zum aktuellen Stand der medizinischen Biotechnologie zusammengestellt (Knäblein 2005). Was genau verbirgt sich nun hinter dem Begriff „moderne Biopharmazeutika“? Dieser Begriff wurde bereits in den 1980ern für eine Klasse von Pharmazeutika geprägt, die mit modernen Biotechnologien produziert wurden – hauptsächlich Substanzen auf Proteinbasis, die durch Genetic engineering in E. coli erzeugt wurden, dem Arbeitspferd der modernen Biotechnologie. Später allerdings wurden vermehrt auch CHO-Zellen (chinese hamster ovary) eingesetzt, wie wir noch am Beispiel von Faktor VIII sehen werden. In zunehmendem Maße werden auch so zukunftsweisende „Proteinfabriken“ wie pflanzliche Expressionssysteme entwickelt, die durchaus zur Herstellung von humanen Proteinen eingesetzt werden können (Knäblein 2003; Knäblein u. McCaman 2003; Knäblein 2004). Pflanzliche Expressionssysteme weisen gegenüber herkömmlichen Produktionsverfahren etliche Vorteile auf (hohe Sicherheit, kurze Entwicklungszeiten, geringe Kosten etc.) und lassen sich außerdem beliebig und sehr einfach „hochskalieren“ – sie stellen deshalb inzwischen eine wesentliche Lösung der weltweit zu geringen Proteinproduktionskapazitäten dar (Klimyuk et al. 2005; Knäblein 2005a, 2005b, 2006). Nun aber wieder zurück zu E. coli: Bemerkenswert an diesem Einzeller ist u. a., dass er nur etwa 2 µm (2 Tausendstel Millimeter) lang ist, das fadenförmige DNA-Molekül jedoch eine Länge von 1,4 mm hat, also 1.500-mal länger als das Bakterium selbst. So ist die DNA extrem gefaltet und auf eine „Dicke“ von 2 nm (2 Millionstel Millimeter) komprimiert, um überhaupt in die Zelle zu passen. Das E.-coli-Chromosom enthält mehr als 8 Mio. Nukleotide (4 Mio. auf jedem Strang). Das ergibt ein Molekulargewicht von etwa 2,2 Mrd. Da und der Informations-

4.6

gehalt entspricht einem Lehrbuch von etwa 1.000 Seiten (das Genom des Menschen besteht aus etwa 3 Mrd. Nukleotiden und entspricht somit einer Bibliothek von etwa 1.000 Bänden). Es gibt neben E. coli keinen anderen Organismus, für den es auch nur annähernd so viel Erfahrung in der Expression der unterschiedlichsten Proteine gibt. Abhängig von der Wahl des Expressionsvektors und der verwendeten Signalsequenz besteht die Möglichkeit, rekombinante Proteine löslich aus dem Zytoplasma, aus Einschlusskörpern oder aus dem periplasmatischen Raum zu gewinnen – manchmal sogar einfach aus dem Kulturüberstand. Etwa jedes vierte neue Medikament, welches für den Markt zugelassen wird, ist heute ein Biopharmazeutikum und wird meistens mithilfe eines der oben genannten Systeme hergestellt. Bisher wurden ca. 250 Mio. Menschen weltweit mit ihnen behandelt. Wie wir sehen werden, führt eine rasante Entwicklung im Bereich der modernen Biopharmazeutika dazu, dass diese Klasse von Medikamenten stetig wächst. Zunächst wollen wir uns jedoch mit einigen Typen und Wirkmechanismen von Biopharmazeutika beschäftigen und der Frage auf den Grund gehen, wie die Entschlüsselung des humanen Genoms und die Entwicklung von Medikamenten zusammenhängen, die in der Molekularen Medizin zum Einsatz kommen. Nachdem die Sequenz des Humangenoms inzwischen bekannt ist, werden jetzt neue Technologien benötigt, um aus einer Vielzahl an genetischen Informationen die Sequenzen herauszufinden, die für eine Wirkstoffentwicklung interessant sind. Eine solche Klasse von „druggable targets“ stellen z. B. die GPCRs (G-protein coupled receptors) dar, die in der Signaltransduktion involviert sind. Mithilfe von „homology/orthology mining“ wird das menschliche Genom (im Vergleich mit den Genomen anderer Spezies) nach neuen Sequenzen durchsucht, die wahrscheinlich (aufgrund der Sequenzhomologie) zu einer Proteinfamilie gehören, die bereits zuvor als „druggable targets“ (z. B. GPCRs) identifiziert wurde. Auf dieser Grundlage können dann neue Medikamente entwickelt werden. Bei fast allen Medikamenten gibt es jedoch Patienten, die nicht auf deren Verabreichung reagieren, oder zumindest nicht in der erwarteten (und gewünschten) Art und Weise. Diese Patienten werden auch als „Nonresponder“ bezeichnet, weil sie sich in ihrem genetischen Profil so unterscheiden, dass das Medikament nicht die gewünschte Wirkung entfalten kann. Die dafür verantwortlichen genetischen Unterschiede können manchmal aus nur einer unterschiedlichen Base im Genom des Nonresponders bestehen und werden folglich als SNPs bezeichnet (single nucleotide polymorphism). Dieser Umstand führt dazu, dass man teilweise für bestimmte

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Sektion 4 · Therapie

Patientenpopulationen ein eigenes Medikament entwickelt, welches auf das genetische Profil dieser Individuen zugeschnitten ist. Hierfür wird in der Pharmakokinetik und Pharmakodynamik auch der Begriff „maßgeschneiderte Medizin“ (oder „individualized medicine“) verwendet (7 auch Kap. 3.2).

gionen richtig geknüpft werden, und auch die bakteriellen Chaperone dieses Kompartiments sind ihrer Aufgabe besser gewachsen als die des Zytoplasmas. Auch andere Arten komplexer Proteine konnten jetzt mithilfe dieser neuen Biotechnologien hergestellt werden.

4.6.6.2 siRNA für Diagnostik und Therapie 4.6.6.1 Antikörper als Biopharmazeutika Neben Robert Koch (1843–1919) und Emil von Behring (1854–1917) war es sicherlich Paul Ehrlich (1854–1915), der um die Jahrhundertwende die größte Bedeutung für das damalige Gesundheitswesen hatte. Speziell bei der Entwicklung von Schutzimpfungen hatte er die Vision von der „magic bullet“, z. B. einem Antikörper, der sehr spezifisch, und damit selektiv, bestimmte Krankheiten bekämpft. Auch wenn es diesen Wissenschaftlern bereits 1893 gelang, das Antiserum zur Bekämpfung der Diphtherie („Würgeengel der Kinder“) zu schaffen und damit vielen Kindern das Leben zu retten, so dauerte es weitere hundert Jahre, bis es zum ersten Mal gelang, auch komplexe Moleküle, wie z. B. funktionsfähige Antikörperfragmente in rekombinanten E.-coli-Zellen herzustellen. Dies liegt zum einen daran, dass es sich bei Antikörpern um recht komplexe Moleküle handelt, die aus zwei Ketten (der „schweren“ und der „leichten“ Kette) aufgebaut sind und deren korrekte Faltung in eukaryoten Zellen durch Hilfsproteine (Chaperone) unterstützt wird (Kirkpatrick et. al. 1995; Bornemann et al. 1995). Bei den Chaperonen handelt es sich um intrazelluläre Proteine, die zu den Hitzschockproteinen zählen und meist ATP-abhängig die Ausbildung einer definierten Raumstruktur (durch Faltung) neu synthetisierter Polypeptidketten beschleunigen. Die für die Ausbildung einer korrekten dreidimensionalen Faltung bei manchen Proteinen essenziellen Chaperone gibt es zwar auch in Prokaryonten (das bekannteste ist z. B. groEL in E. coli), bei den Antikörpern kommt jedoch noch eine Schwierigkeit hinzu: Die beiden Ketten sind durch interne Disulfidbrücken stabilisiert, für deren Ausbildung ein oxidierendes biochemisches Milieu erforderlich ist. Der eigentliche Durchbruch bei diesem Problem gelang durch eine Fusion des Antikörpergens an eine bakterielle Signalsequenz, die eine Sekretion des Antikörperfragments in den periplasmatischen Raum bewirkt (Skerra u. Plückthun 1988; Better et al. 1988). Dieser periplasmatische Raum, der sich zwischen den beiden Zellmembranen des Bakteriums befindet, die zusammen mit der von ihnen umschlossenen Peptidoglykanschicht die Außenhülle des Bakteriums bilden, enthält im Gegensatz zum Zytoplasma ein biochemisches Milieu, in dem Antikörper korrekt gefaltet werden können. Nur hier können die Disulfidbrücken innerhalb der Antikörperre-

Im Laufe der Zeit kamen weitere Molekülklassen zur Gruppe der Biopharmazeutika hinzu: DNA-basierte Medikamente (z. B. „antisense“, gentherapeutische Therapien und kürzlich auch siRNAs, „small interfering“ RNAs), sowie Stammzellen und artifizielle Organe. Das Phänomen RNA-Interferenz (RNAi) wird ausführlich im Kap. 4.3 beschrieben und soll deshalb an dieser Stelle nur kurz angeschnitten werden. Erst in den späten 1990er Jahren wurde das Phänomen des Abschaltens von Genen in Pflanzen, Pilzen und Invertebraten zwar wahrgenommen, war zu dem Zeitpunkt jedoch sehr wenig charakterisiert. Inzwischen ist RNAi auch in Säugetieren sehr gut erforscht, wo es über das Spalten von Ziel-mRNA-Molekülen mithilfe von siRNAs eine Gensuppression hervorruft. Auf diese Weise werden in der Natur verschiedenste Prozesse reguliert: x Entwicklungsbiologische Ereignisse, x Schutz vor schädlichen mobilen genetischen Elementen wie Viren und Transposons, x Eliminierung von ungewollten und defekten mRNATranskripten. Ein großer Vorteil dieser meistens aus 21 Nukleotiden bestehenden siRNA-Moleküle ist, dass sie in beliebigen Mengen chemisch zugänglich sind und künstlich in vitro und in vivo in den Organismus eingeschleust werden können, um dort zielsequenzspezifisch mRNA zu spalten und diese somit auszuschalten. Homologieabhängiges „gene silencing“, also die Suppression der Expression bestimmter Gene wurde zwar 1994 in dem Pilz Neurospora crassa beobachtet (Cogoni et al. 1994), jedoch war der Mechanismus noch völlig unklar. Erst als Andy Fire (1960 bis heute) et al. 1998 in Nature das Phänomen der Gensuppression durch die künstliche Einführung von Doppelstrang-RNA (dsRNA) in C. elegans beschreiben, wird der zugrunde liegende Mechanismus klarer (Fire et al. 1998). Und es ist die Vision, diesen Mechanismus für therapeutische Zwecke einzusetzen, die einen großen Optimismus und eine regelrechte RNAi-Euphorie hervorruft. Im Jahre 2006 erhalten Andy Z. Fire und sein Kollege Craig C. Mello deshalb den Nobelpreis für Physiologie/Medizin. So werden in kürzester Zeit unzählige Experimente auf diesem Gebiet durchgeführt, u. a. mit Zelllysaten von Drosophila (Tuschl et al. 1999; Elbashir et al. 2001) und in kultivierten

495 4.6 · Gentechnische Grundlagen für biotechnologische Anwendungen

4.6

Humane Genome sind meistens zu mehr als 99% identisch, und nur weniger als 1% Variation ergeben die genetischen Unterschiede zwischen den Individuen – mehr als 80% werden durch die angesprochenen SNPs verur-

sacht. Heutzutage werden Hochdurchsatzverfahren angewendet, um schnell, präzise und ökonomisch mithilfe von DNA-Chips die SNPs in den Patientengenomen zu identifizieren, und es gibt zuverlässige Testsysteme, um Nonresponder vor der Therapie auszusortieren. Ein instruktives Beispiel für die erfolgreiche Anwendung der individualisierten Medizin stellt das von Genentech und Roche entwickelte und vermarktete Krebsmittel Herceptin dar. Krebs ist meistens das Resultat aus mehreren genetischen Veränderungen (es gibt auch monogenetische Formen), und gerade auf diese zielt eine targetspezifische Behandlung ab: Weil diese Abnormalitäten nicht in gesunden Zellen vorkommen, können gezielt und ausschließlich Krebszellen bekämpft werden. Um die Patienten zu identifizieren, die diese genetischen Veränderungen tragen (und bei denen das Medikament demzufolge wirken kann), ist eine zuverlässige Diagnose zwingend erforderlich. Herceptin (Trastuzumab) ist eines der wenigen Therapeutika, welches spezifisch gegen den humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-2 (HER-2) von Brustkrebszellen gerichtet ist. HER-2 wurde ursprünglich 1984 von Robert A. Weinberg entdeckt (Weinberg1984); später wurde durch Axel Ullrich und Denis J. Slamon herausgefunden, dass

. Abb. 4.6.4. Herceptin, Struktur und Mechanismus. Herceptin (Trastuzumab) ist eines der wenigen Therapeutika, welches spezifisch gegen den humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-2 (HER-2) von Brustkrebszellen gerichtet ist; das HER2/neu-Gen wird ausschließlich in Brustkrebs hochreguliert. Herceptin stellt einen humanisierten monoklonalen Antikörper dar, der gegen das in 20–

30% der humanen Brustkrebserkrankungen überexprimierte HER-2 gerichtet ist. HER-2 kann deshalb gleichzeitig als spezifischer Biomarker eingesetzt werden, um die Patientinnen zu diagnostizieren, die empfänglich für eine Therapie mit Herceptin sind – die also „Responder“ sind. Auf diese Weise kann ein extrem hoher Therapieerfolg erreicht werden

Drosophila, aber auch in humanen Zellen (Elbashir et al. 2001). Von besonderem Interesse für die pharmazeutische Industrie war besonders die Arbeit von Thomas Tuschl (1967 bis heute) et al., in der sie über die Möglichkeit der Suppression von endogenen und heterologen Genen in verschiedenen humanen Zelllinien berichteten. Unter anderem konnten zielsequenzspezifisch bestimmte Gene in den für die Medizin äußerst wichtigen humanen embryonalen Nieren- und HeLa-Zellen mithilfe von 21 dsRNAs mit 3‘-Überhängen aus nur zwei Nukleotiden erzielt werden. Damit erschließt sich eine neue Klasse von hochpotenten und äußerst selektiven Biopharmazeutika, von denen sich auch tatsächlich schon einige in klinischen Studien befinden. Ähnliches gilt auch für die sog. MikroRNAs (miRNAs), über die an anderer Stelle in diesem Buch berichtet wird.

4.6.6.3 Individualisierte Medizin und Herceptin

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Sektion 4 · Therapie

das HER2/neu-Gen ausschließlich in Brustkrebs hochreguliert wird (Slamon et al. 1987). Herceptin stellt nun einen humanisierten monoklonalen Antikörper dar, der gegen das in 20–30% der humanen Brustkrebserkrankungen überexprimierte HER-2 gerichtet ist. HER-2 kann deshalb gleichzeitig als spezifischer Biomarker eingesetzt werden, um die Patientinnen zu diagnostizieren, die empfänglich für eine Therapie mit Herceptin sind – die also „Responder“ darstellen. Auf diese Weise kann ein extrem hoher Therapieerfolg erreicht werden. Zwei zur Indikationserweiterung durchgeführte aktuelle Phase-III-Studien, in denen Herceptin gegen eine besonders aggressive Form von Brustkrebs getestet wird, konnten sogar vorzeitig erfolgreich beendet werden, weil die klinischen Endpunkte erreicht waren. Sobald eine bestimmte Krankheit diagnostiziert und ihr Wirkmechanismus bekannt ist, können auch gentherapeutische Ansätze zu sehr wirksamen „individualized medicines“ entwickelt werden. Gleiches gilt natürlich für genetische Vakzinierung, den Einsatz von sog. DecoyOligodeoxynukleotiden (ODNs, die auf der Ebene von Transkriptionsfaktoren wirken), Antisense-RNA und die vorher diskutierten siRNAs und miRNAs.

4.6.6.4 Transplantation und Organogenese Weitere Gebiete, auf denen es momentan bemerkenswerte Fortschritte in der Entwicklung von potenten Biopharmazeutika gibt, sind Zelltherapie und Transplantationsmedizin. Obwohl Organtransplantationen eine der herausragenden Errungenschaften der letzten 30 Jahre sind, so ist leider gleichzeitig klar geworden, dass die zur Verfügung stehenden Organe bei weitem nicht ausreichen – auch wenn man versucht, durch das Klonen von Schweinen aus gezielt genetisch veränderten Zellen, mit der sog. Xenotransplantation (also Schweine als Organspender für den Menschen) das Problem in den Griff zu bekommen. Damit soll es beispielsweise möglich werden, auf genetischer Basis störende Zuckerreste von der Oberfläche von Schweinezellen zu entfernen, die für die hyperakute Abstoßung in Primaten verantwortlich sind. Wie wir wissen, gibt es ähnliche Probleme jedoch auch, wenn Organe von einem Menschen auf einen anderen Menschen übertragen werden. Neben diesen „technischen“ Problemen wie Abstoßungsreaktionen (weil Spender und Empfänger genetisch unterschiedlich sind und das Immunsystem des Empfängers deshalb versucht, den „Fremdkörper“ zu bekämpfen), gibt es ein ganz anderes Dilemma: lediglich 8% der (potenziellen) Spender haben unterschrieben, dass sie mit der Entnahme und Weiterverwendung ihrer Organe einverstanden sind. Es gibt ca. 60.000 Dialysepatienten in Deutschland. Etwa 12.000 dieser Patienten stehen auf der Warteliste

für eine Nierentransplantation. Aber pro Jahr werden in Deutschland nur 2.200 Nieren transplantiert. Dies bedeutet alleine für die Universitätsklinik Charité in Berlin, dass etwa 1.000 Patienten auf eine Spenderniere warten müssen. Ein weiteres Problem ist, dass bei der Organtransplantation auch Viren insbesondere solche der Herpesgruppe (CMV) und andere Pathogene übertragen werden können. So erkrankten z. B. Anfang 2005 in Deutschland 6 Organempfänger an Tollwut, weil die Spenderin mit dem tödlichen RNA-Virus infiziert war. Das Leben der Empfänger war zwar zunächst gerettet, weil sie ein Organ erhalten hatten. Sie verstarben dann jedoch an dieser unerwünschten „Nebenwirkung“. Obwohl die Prävalenz dieses zur Familie der Rhabdoviridae gehörenden „Tiervirus“ in unseren Breitengraden fast gleich Null ist, so sterben jedoch z. B. in Indien jedes Jahr ca. 50.000 Menschen an Tollwut. Dieser Vorfall wirft deshalb mehrere Fragen gleichzeitig auf: x Wie umfangreich müssen die Organe vor der Transplantation getestet werden? x Welche Analysen sind sinnvoll? x Gibt es überhaupt eine Methode, um ein Infektionsrisiko komplett auszuschließen? Diese Fragen sind gerade vor dem Hintergrund wichtig, dass bisher ca. 70.000 Transplantationen in Deutschland erfolgreich und – bis dato – ohne übertragene Krankheiten durchgeführt worden waren. Hierbei ist jedoch ein weiterer Punkt zu beachten: Manche Krankheiten haben eine lange Latenzperiode – bei Tollwut z. B. kann diese bis zu sieben Jahre betragen und bei sog. slow viruses sogar länger. Die beschriebenen Aspekte machen also eines offensichtlich: Wir benötigen unbedingt andere Quellen für die Beschaffung von Transplantationsorganen! Organogenese ist hier das Stichwort. Mit dieser Biotechnologie ist es möglich, aus einzelnen Zellen komplette Organe zu synthetisieren. So wird es möglich, die für Transplantationen erforderlichen Organe zu generieren und gleichzeitig Infektionsrisiken, die vom Spender ausgehen, auszuschließen – vorausgesetzt, dass man eine Quelle für die zur Organogenese geeigneten Zellen hat. Eine solche Quelle ist z. B. humanes embryonales Gewebe, welches jedoch nur sehr schwierig zu beschaffen ist und in Deutschland durch das Embryonenschutzgesetz geregelt wird. Embryonales Gewebe besteht aus funktional sehr diversen Stamm- bzw. Vorläuferzellen, deren zeitliches und räumliches Wachstum zwar vorprogrammiert ist, sich jedoch auch ex vivo steuern lässt. Die Organogenese von komplexen Geweben, wie z. B. der Niere, erfordert hierbei einen sehr koordinierten, sequenziellen Transformationsprozess mit einzelnen Stadien der zeitabhängigen Abfolge von Zell-Zell-, Zell-Matrix-, und Zell-Signal-Interaktionen in die Richtung aller drei

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Raumachsen. Und tatsächlich konnten Methoden entwickelt werden, um in vitro sowohl funktionsfähiges Nierengewebe als auch kontrahierende Herzzellverbände zu erhalten (Knäblein 2005). Auch wenn diese Organogenese, also die Entwicklung bzw. Herstellung von ganzen Organen aus Zellen noch im Anfangsstadium steckt, so können defekte Zellen heute schon einfach ersetzt werden.

4.6.6.5 Humane Stammzellen und klonierte Embryonen Wie eingangs erwähnt war es jedoch nicht einfach, die erforderlichen Zellen oder das notwendige embryonale Gewebe zu beschaffen, und deshalb ist die Stammzellforschung zu einem sehr wichtigen und zentralen Bestandteil der biomedizinischen Forschung geworden. Infolge von großen internationalen Anstrengungen gibt es inzwischen sogar eine Methode, um beliebig viele humane embryonale Stammzellen zu produzieren. Erinnern wir uns an das Jahr 1996, als Ian Wilmut vom Roslin Institute in Schottland das Schaf „Dolly“ klonierte (Campbell et al. 1996). Wilmut isolierte dafür den Zellkern aus der (somatischen) Euterzelle eines ausgewachsenen Schafs und führte diesen in eine entkernte Eizelle, welche er in einer Schafleihmutter zum kompletten Schaf „Dolly“ heranwachsen ließ. Damit war „Dolly“ das erste klonierte Säugetier, welches durch somatischen Zellkerntransfer („somatic cell nuclear transfer“, SCNT) erzeugt wurde. Dies war zwar ein Riesenerfolg für die Reproduktionsmedizin an sich – wir interessieren uns jedoch mehr für den Einsatz von humanen Zellen. James Thomson von der University of Wisconsin und John Gearhart von der Johns Hopkins University waren die ersten, die es schafften, humane Stammzellen zu isolieren, zu propagieren und somit überhaupt für die Forschung zugänglich zu machen. Die Anwendung humaner embryonaler Stammzellen (hES) wird ausführlich im Kap. 4.4 behandelt.

4.6.7 Verschiedene Wirkmechanismen moderner Biopharmazeutika Nachdem wir nun die verschiedenen Klassen von Biopharmazeutika kennen gelernt haben, möchte ich im folgenden Abschnitt auf die zugrunde liegenden Wirkmechanismen eingehen. Ein Beispiel für den Mechanismus eines wirkungsvollen modernen Biopharmazeutikums wurde bereits erwähnt: das Krebsmittel Herceptin. Die häufigsten Krebsarten sind Brust-, Eierstock-, Prostata-, Darm-, und Lungenkrebs. Etwa 3,2 Mio. Menschen erkranken jedes Jahr an einer dieser Krebsarten

4.6

– 1,7 Mio. sterben. Deshalb werden große Anstrengungen unternommen, wirkungsvolle Krebsmittel zu entwickeln. Häufig ist es aber leider gerade bei Zytostatika der Fall, dass diese den ganzen Körper extrem in Mitleidenschaft ziehen. Herceptin ist deshalb ein so beeindruckendes Krebsmittel, weil es gleich mehrere Wunschprofile in sich vereint. Der erste Aspekt ist eine hervorragende Kombination aus hoher Spezifität und hoher Selektivität, d. h., Herceptin bindet ausschließlich an den im Falle von Brustkrebs hochregulierten humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-2 (HER-2). Deshalb kann das Medikament systemisch (d. h. intravenös) verabreicht werden, reichert sich lokal aber ausschließlich am Tumor an, weil nur dort der Rezeptor zum Andocken vorhanden ist. Außerdem handelt es sich bei Herceptin um einen humanisierten Antikörper. Dies bedeutet, dass der Antikörper bei der Herstellung so modifiziert wurde, dass er – obwohl er nicht menschlichen Ursprungs ist – vom Immunsystem des Patienten nicht als „Fremdkörper“ erkannt und folglich nicht bekämpft wird. Dies war bei früheren Generationen von Antikörpern, die z. B. murinen Ursprungs waren, anders: Aufgrund der Unterschiede im Aufbau humaner und muriner Antikörper wurden diese als körperfremd erkannt. Dies bedeutet, dass das Immunsystem des Patienten das Medikament bekämpft, indem es bereits nach der ersten Gabe sog. neutralisierende Antiköper bildet. Wird das Medikament erneut verabreicht, kann es sein, dass es sofort durch das Immunsystem erkannt und „abgefangen“ und somit schließlich unwirksam gemacht wird. Wie bereits erwähnt ist ein weiterer Vorteil von Herceptin, dass es sich dabei um eine „individualisierte Medizin“ handelt – es ist genau zugeschnitten auf eine bestimmte Patientenpopulation: Ausschließlich Frauen, bei denen im Vorfeld durch einen diagnostischen Test HER-2 gefunden wurde, werden auch mit Herceptin behandelt. Auf diese Weise ist praktisch gewährleistet, dass das Medikament bei den Patientinnen tatsächlich auch wirkt. Neben Krebs stehen zwei weitere Geißeln der Menschheit ganz oben auf der Liste der tödlichen Krankheiten: Blutungsstörungen und AIDS.

4.6.7.1 Koagulation versus Lyse bei der Blutgerinnungskaskade Fangen wir mit der „Zymogenaktivierung“ an, die einen zentralen Regulationsmechanismus z. B. bei der Blutgerinnung und Fibrinolyse darstellt. Die meisten der „trypsin-like“ Serinproteasen werden als inaktive Vorläuferproteine (Proenzyme oder Zymogene) synthetisiert und müssen anschließend an einen bestimmten Kofaktor binden oder partiell proteolytisch prozessiert werden. Dies induziert eine Konformationsänderung und damit

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eine katalytische Aktivität, welche einen Teil der N-terminalen Domäne abspaltet. Das wiederum hat eine konformelle Änderung des Enzyms zur Folge und damit eine Erhöhung der katalytischen Aktivität um mehrere Größenordnungen. Während die biologisch inaktiven Vorläufer (sog. precursor) von Trypsin und Chymotrypsin fast komplett inaktiv sind, erhöht sich ihre katalytische Aktivität um einen Faktor von fast 104–106 durch diese proteolytische Aktivierung. Bei einer Aktivierungskaskade, wie wir sie in der Blutgerinnung vorfinden, aktiviert eine Proteinase ein anderes Proenzym, und dieses wiederum ein weiteres Proenzym, sodass – wie bei einem Schneeballsystem – die Aktivierung mehrfach potenziert wird. Deshalb ist es verständlich, dass vom menschlichen Körper eine Vielzahl von Regulierungsmechanismen gleichzeitig benutzt wird, um dieser komplexen und lebenswichtigen Aktivierungskaskade unter physiologischen Bedingungen ein möglichst hohes Maß an Sicherheit zu verleihen. Im Falle der Hämophilie A fehlt der für die Blutgerinnung essenzielle Faktor VIII, bzw. wird nicht in ausreichendem Maße zur Verfügung gestellt oder besitzt eine deutlich verminderte Aktivität. Dieser Faktor stimuliert die Aktivierung von Faktor X durch den Faktor IXa, eine weitere Serinprotease der Kaskade. Mehr als 350.000 Menschen weltweit leiden an Hämophilie – ungefähr 80% davon an Hämophilie A. Der genetische Defekt wird als geschlechtsgebundenes, rezessives Merkmal vererbt – eine berühmte Trägerin dieser Krankheit war Königin Victoria von England, die den Defekt auf die königlichen Familien von Preußen, Spanien und Russland übertrug. Und so warnte der französische Arzt Grandidier bereits im Jahre 1873, dass man allen Mitgliedern von Bluterfamilien die Heirat verbieten sollte. Trotzdem kam im Jahre 1904 der Zarewitsch Alexis zur Welt, der erste männliche Erbe, der seit dem 17. Jahrhundert einem regierenden russischen Zaren geboren wurde. Nach vier gesunden Töchtern freuten sich Zar Nikolaus II. und seine Frau Alexandra (eine Enkelin von Königin Victoria) über einen augenscheinlich gesunden Sohn – doch bereits nach sechs Wochen bemerkten die Eltern die ersten Blutergüsse, die sich bei den kleinsten Berührungen bildeten. Inzwischen lernte man immer mehr über die Krankheit und ihre Heilung, und so wurde später Faktor VIII aus Spenderblut aufgearbeitet und dann den Patienten zur Verfügung gestellt. Dies birgt aber die schon bekannten Risiken, dass auch Pathogene wie HIV, Hepatitis B und C mit übertragen werden. In der Vergangenheit ist dies auch häufiger passiert, weil die Blutspenden nicht umfassend auf Kontaminationen getestet wurden – obwohl inzwischen zuverlässige Tests zur Verfügung stehen. Das damit verbundene Risiko einer Infektion wurde in eini-

gen Fällen billigend in Kauf genommen. Das Infektionsrisiko kann man natürlich dadurch verringern, dass man den Faktor VIII biotechnologisch herstellt, wozu man allerdings zuerst das entsprechende Gen isolieren muss. Bei Faktor VIII ist dies aus mehreren Gründen nicht trivial: Wie wir bereits gesehen haben, hat er eine zentrale Schlüsselrolle in der Gerinnungskaskade und ist deshalb nur in geringsten Mengen im Blut vorhanden. Es war demzufolge eine äußerst schwierige Aufgabe, bei einer Plasmakonzentration von nur 0,05 µg/ml einige mg Protein aus 25.000 Litern Rinderblut aufzuarbeiten. Man hat dann die Aminosäuresequenzen mehrerer Peptide des aus 2.332 Aminosäuren bestehenden 330-kDa-Protein bestimmt und konnte so eine Reihe von DNA-Sonden synthetisieren, mit denen man nun zuverlässig – und sogar bereits im Fetus – Hämophilie diagnostizieren kann. Aber noch viel wichtiger: Es gelang schließlich, das 186-kb-Gen für Faktor VIII aus einer Genbibliothek des Menschen zu klonieren und damit den rekombinanten Faktor VIII in CHO-Zellen zu produzieren. Nichtsdestoweniger werden in einigen Schritten bei der Fermentation Plasma bzw. Proteine (z. B. Albumin) verwendet, die tierischen Ursprungs sind. Diese bergen das Risiko einer Infektion mit BSE (bovine spongiforme Enzephalopathie) oder TSE (transmissible spongiforme Enzephalopathie) bzw. Varianten der Creutzfeld-Jakob-Krankheit. Um ein Infektionsrisiko komplett auszuschließen, müsste man demnach ein Medikament wie Faktor VIII ganz und gar ohne Proteine herstellen, also in einem synthetischen Medium. Dies ist insofern nicht einfach, als die Adaption von Säugetierzellen (z. B. CHO), die für die Produktion eingesetzt werden, sehr aufwendig und schwierig ist. Dass dies allerdings nicht unmöglich ist, hat gerade Baxter mit ADVATE gezeigt, einem neuen rekombinanten Volllängen-Faktor VIII, der komplett ohne Plasma oder Albumin hergestellt und im Jahre 2004 in Europa zugelassen wurde. Die besondere Herausforderung bei der Entwicklung und Produktion dieses besonderen Faktor-VIII-Präparats ohne den Einsatz von Plasma oder Albumin liegt darin, dass es sich um einen komplexen Prozess und ein ungewöhnlich großes wie labiles Molekül handelt, welches obendrein noch auf komplexe posttranslationale Modifikationen angewiesen ist. Es handelt sich dabei um einen Volllängen-Faktor VIII mit der kompletten Funktionalität der B-Domäne, um die Interaktionen mit den Schlüssel-Chaperonen (ERGIC-53, Calnexin und Calreticulin) zu gewährleisten, die eine wichtige Rolle beim intrazellulären Transport und der korrekten Faltung während der Biosynthese spielen. Eine weitere Schwierigkeit stellt die gleichzeitig notwendige Koexpression des v.-Willebrand-Faktors (vWF) in den CHO-Zellen dar. Obwohl FVIII und vWF

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4.6

. Abb. 4.6.5. Struktur und Funktion von Faktor VIII. Der lebenswichtige Faktor VIII besitzt eine zentrale Schlüsselrolle in der Gerinnungskaskade und besteht aus 2.332 Aminosäuren (330 kDa), die von einem 186-kb-Gen kodiert werden. Die rekombinante Produktion in CHO-Zellen ist sehr aufwendig und schwierig, weil einen Volllängen-Faktor VIII mit der kompletten Funktionalität der B-Domäne notwendig ist, um die Interaktionen mit den Schlüssel-Chaperonen (ERGIC-53, Calnexin und Calreticulin) zu gewährleisten, die eine wichtige Rolle beim intrazellulären Transport und der korrekten Faltung

während der Biosynthese spielen. Eine weitere Schwierigkeit stellt die gleichzeitig notwendige Koexpression des v.-Willebrand-Faktors (vWF) in den CHO-Zellen dar. Bei ADVATE handelt es sich um die erste Darreichungsform von Faktor VIII, die gänzlich ohne den Einsatz von Plasma bzw. Protein hergestellt wurde. Damit stellt ADVATE eine neue Generation moderner Biopharmazeutika dar – einen neuen Standard, weil es frei von jeglichem Infektionsrisiko für den Patienten ist!

genetisch identisch mit denen sind, aus denen zuvor Baxters anderes Faktor-VIII-Marktpräparat, Recombinate, hergestellt wurde, muss über extensive biochemische Charakterisierung gezeigt werden, dass die Adaption der CHO-Zellen an serumfreies Medium das Produkt in keiner Weise verändert. In der vorklinischen Entwicklungsphase konnte dann auch gezeigt werden, dass physikochemische und funktionale Charakteristika (Glykosylierung, Thrombinaktivierung etc.) denen von Recombinate entsprechen. Hämostatische Effizienz und Toxikologiestudien mit ADVATE und Recombinate in Tiermodellen zeigten ebenfalls Bioäquivalenz. Es handelt sich somit bei ADVATE um die erste Darreichungsform von Faktor VIII, die gänzlich ohne den Einsatz von Plasma bzw. Protein hergestellt wurde. Damit stellt ADVATE eine neue Generation moderner Biopharmazeutika dar – einen neuen Standard, weil es frei von jeglichem Infektionsrisiko für den Patienten ist.

4.6.7.2 AIDS Nachdem wir uns mit den Ursachen von Krebs und Hämophilie beschäftigt und exemplarisch zwei sehr effektive moderne Biopharmazeutika und deren Wirkmechanismen diskutiert haben, soll als Nächstes eine der schlimmsten Krankheiten unserer modernen Gesellschaft betrachtet werden: AIDS. HIV-1 („human immunodeficiency virus type 1“) ist die Ursache von AIDS („acquired immune deficiency syndrome“) – einer Krankheit, die zum ersten Mal 1981 von dem amerikanischen Virologen Robert C. Gallo (1937 bis heute) beschrieben wurde (Gallo et al. 1981). Er war es auch, der zwei Jahre später das Virus entdeckte und damals von einer Hybris sprach im Zusammenhang mit der ersten großen Pandemie in der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts. In den vorangegangenen zwei Jahrzehnten rühmte sich die medizinische Wissenschaft nämlich besonders, Infektionskrankheiten besiegt zu

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haben, zumindest in den reichen Ländern der industrialisierten Welt. Das Auftreten von Retroviren mit der Fähigkeit, außergewöhnlich komplexe und verheerende Krankheiten zu verursachen, hat diesen Anspruch dann jedoch tatsächlich als Hybris entlarvt: Das Virus ist heute auf der ganzen Welt verteilt und hat Millionen von Menschen infiziert. Besonders kritisch ist die Situation in den Ländern der Sub-Sahara-Region, wo ungefähr 70% aller weltweit betroffenen Menschen leben: Das sind mehr als 30 Millionen. Insgesamt hat die weltweite AIDS-Pandemie bereits mehr als 28 Millionen Menschenleben gekostet, und es sind mehr als 42 Mio. Menschen infiziert – bis zum Jahr 2010 werden schätzungsweise weitere 45 Mio. dazukommen. Trotz massiver Informations-, Aufklärungs- und Schutzmaßnahmen ist AIDS unaufhaltsam auf dem Vormarsch: ca. 15.000 neue Fälle pro Tag. An diesen Zahlen wird auch ersichtlich, welchen Einfluss diese Krankheit auf unsere Sozial- und Gesundheitssysteme hat, wenn man bedenkt, dass die Summe der Behandlungskosten für einen Patienten vom „US Center for Disease Control and Prevention“ auf 155.000 $ geschätzt werden – das sind insgesamt mehr als 6 Mrd. $ im Jahr. Bedingt durch die Komplexität der HIV-1-Infektion und die natürlichen Strategien einer effizienten evolutiven Anpassung, war es bisher schwierig, eine sichere Therapie zu finden, da gerade Viren sich am schnellsten an einen neuen Lebensraum anpassen können. Diese extreme Anpassungsfähigkeit mussten sie wahrscheinlich entwickeln, damit sie nicht von den sich ebenfalls schnell ändernden Verteidigungsmechanismen ihrer Wirtsorganismen eliminiert wurden. Auf molekularer Ebene bedeutet dies, dass sich das Virengenom mit hoher Mutationsrate repliziert, wobei sich hauptsächlich die Hüllproteine des Virus ändern. Dies hat zur Folge, dass das Immunsystem des Wirts das Virus (nach erfolgter Mutation der Hülle) nicht wiedererkennt und deshalb nicht effektiv bekämpfen kann. Beim Menschen bedeutet dies, dass ein Medikament, welches speziell gegen einen bestimmten HIV-Typ (bzw. gegen dessen Hüllproteine) gerichtet ist, nach erfolgter Replikation und Mutation dieses Virus nicht mehr unschädlich machen kann. Deshalb muss eine andere Vorgehensweise gewählt werden, die nicht mehr auf der Proteinebene ansetzt, sondern gentherapeutisch z. B. die Replikation des Virus verhindert. Bisher kann die Virusreplikation teilweise durch konventionelle Ansätze wie HAART („highly active antiretroviral therapy“) unterdrückt werden, jedoch gibt es zunehmend Limitierungen bei dieser Methode: Auftreten von resistenten Virusmutanten, Unverträglichkeit beim Patienten und die hohen Kosten bei einer Kombinationstherapie mit mehreren Medikamenten.

Außerdem kann das Virus nicht komplett vernichtet werden, weil es Zellen gibt, die latent mit HIV infiziert sind, jedoch nicht als solche erkannt werden. Und tatsächlich können diese latent infizierten Zellen nicht durch HAART bekämpft werden, was eines der größten Probleme in der AIDS-Therapie darstellt. Neueste gentherapeutische Ansätze richten sich deshalb nicht gegen die Inhibierung der Virusreplikation, sondern zerstören die viralen Reservoirs. Die genetischen Konstrukte bestehen aus einem extern induzierbaren System, welches sowohl den latenten Provirus als auch das potente virale transaktivierende TAT-Protein kontrolliert – ohne, dass der Zellzyklus beeinflusst wird. Ein zweites System auf demselben genetischen Konstrukt bewirkt die Expression eines Suizidgens (als Antwort auf das essenzielle virale REV-Protein), welches einen schnellen Zelltod durch Apoptose hervorruft. Das Ganze wird durch die Überexpression von P53 herbeigeführt, die wiederum durch das Provirus selbst ausgelöst wird. Dieses gesamte Vektorkonstrukt wird in virale „leere“ HIV-1-Partikel verpackt und auf diese Weise in jede Zelle eingeschleust, die für Infektion mit dem Virus empfänglich ist. Dieses elegante Biopharmazeutikum ist zusätzlich so konzipiert, dass die Funktion einer normalen (also nichtinfizierten) Zelle nicht beeinflusst wird. Das heißt, eine transduzierte Zelle (also eine, die das Vektorkonstrukt aufgenommen hat) bleibt völlig normal und wird nicht durch den Vektor bekämpft. Alle Zellen jedoch, die mit dem HIV-1 infiziert sind (egal, ob latent oder nicht), werden spezifisch und sehr effizient zerstört. Dass dieses Konzept funktioniert, wurde bereits gezeigt – jetzt muss daraus ein Medikament entwickelt werden (vgl. hierzu Kap. 4.1). Nachdem wir gesehen haben, wie unterschiedlich die Ursachen verschiedener Krankheiten (z. B. Krebs, Hämophilie und AIDS) auf molekularer Ebene sein können – und wie unterschiedlich dementsprechend auch die Wirkmechanismen für ein Biopharmazeutikum sein müssen –, wollen wir uns mit verschiedenen Optimierungsmethoden beschäftigen. Dabei geht es hauptsächlich darum, wie man per se Medikamente unabhängig von der gewünschten Indikation schneller und möglichst frei von Nebenwirkungen entwickeln kann.

4.6.8 Beschleunigte Entwicklung mit Hochdurchsatz Die Verkürzung der Entwicklungszeit für ein Medikament ist aus mehreren Gründen von extremer Wichtigkeit. Der Pharmakonzern muss mit diesem einen Medikament, welches es tatsächlich erfolgreich auf den Markt schafft, diejenigen mitfinanzieren, die sich während der

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extrem langen Entwicklungszeit als ungeeignet erweisen. Dies kann bereits in der vorklinischen bzw. toxikologischen Entwicklungsphase passieren oder aber zu einem späteren Zeitpunkt während einer der drei klinischen Entwicklungsphasen. Oftmals werden dabei mehr als einhunderttausend Substanzen für eine bestimmte Indikation getestet, von denen später tatsächlich nur eine einzige als Medikament auf den Markt kommt. Die Patentlaufzeit jedoch zählt ab dem Zeitpunkt, wo zum ersten Mal für eine bestimmte Substanz biologische Aktivität gezeigt wurde. Lediglich für die nach der Markteinführung noch verbleibende Restlaufzeit des Patents können Gewinne erzielt werden, denn sobald das Patent abläuft, überschwemmen GenerikaHersteller mit ihren preiswerteren Nachahmerprodukten den Markt. Es ist also wichtig, viele Substanzen parallel auf ihre mögliche Entwicklung zu einem Medikament zu testen und frühzeitig eine Selektion derjenigen Verbindungen zu treffen, die die besten Voraussetzungen für eine Entwicklung bis zur Marktreife haben. Parallelisierung, Miniaturisierung und Hochdurchsatzverfahren sind die Methoden, um schnell und substanzsparend möglichst viele Kandidaten zu testen. Im Folgenden werden wir Methoden und Technologien diskutieren, mit denen dieses Ziel erreicht werden kann, und beginnen mit dem von Manfred Eigen (Chemienobelpreisträger 1967) entwickelten Ansatz der „directed evolution“ (Eigen 1971).

4.6.8.1 Revolution durch Evolution Bei diesem evolutiven Optimierungsprozess ist es wichtig, die richtigen Substanzbibliotheken auszuwählen, aus denen das Medikament entwickelt werden soll. Die Wichtigkeit dieser Bibliotheksstrategie, d. h. die Auswahl und Zusammensetzung der für diesen Ansatz eingesetzten Proteinvarianten und zu generierenden Mutanten, wird an einem Zahlenbeispiel sehr deutlich. Die Anzahl aller theoretisch möglichen Mutanten wird als Komplexität bezeichnet, und diese Zahl übersteigt die Anzahl aller tatsächlich synthetisierbaren (und natürlich evaluierbaren) Substanzen um mehrere Größenordnungen. Nach Manfred Eigen spricht man in diesem Zusammenhang auch von dem Komplexitätsproblem bei proteinevolutionären Ansätzen. Ein Rechenbeispiel zeigt das immanente und intrinsische Problem: Von einem Protein, bestehend aus 200 Aminosäuren, gibt es ungefähr 10260 Varianten, die theoretisch alle untersucht werden müssten, um den erforderlichen Sequenzraum vollständig zu analysieren. Diese unvorstellbar große Zahl kann man besser an einem Gleichnis verdeutlichen: würde das gesamte Universum ausschließlich aus diesem einen Protein bestehen, wären dies höchstens 1075

4.6

Proteinvarianten. Die Diskrepanz zwischen dem erforderlichen Sequenzraum und dem maximal möglichen Sequenzraum beträgt also Hunderte von Potenzen – oder: eine Zehn mit 185 Nullen! Demnach könnte man selbst mit einer Brute-ForceMethode (bei der der gesamte Sequenzraum nach einer Trial-and-error-Methode durchsucht wird) niemals erfolgreich sein, weil einfach nicht genügend Materie zur Verfügung steht. Deshalb arbeitet die Natur nach einem anderen Prinzip: der natürlichen Evolution. Dabei werden Varianten eines Proteins bzw. diejenigen Mutanten mit verbesserten Eigenschaften selektioniert. Der Selektionsdruck führt dann zu einem Subset von Varianten bzw. Mutanten (Quasispezies), die sich gegenüber allen anderen Mutanten durchsetzen. Dies führt dann von einer vorteilhaften Quasispezies zu einem verbesserten Phänotyp. Dass Mutationen tatsächlich zu einem verbesserten Phänotypen führen, hatte ja bereits 1866 der Augustinerpater Johann Gregor Mendel durch seine Erbsenexperimente gezeigt. In-vitro-Mutagenese, und damit die Optimierung von Proteinen über die Veränderung ihrer Gene, wurde allerdings erst viel später mit der Einführung von modernen molekularbiologischen Methoden möglich. Um jedoch ein Protein zu optimieren, welches den Ansprüchen genügt, nämlich den Sequenzraum möglichst gleichmäßig zu durchforsten, müssen mehrere Methoden miteinander kombiniert werden – wie z. B. Kassettenmutagenese und DNA-Shuffling. Hierbei entsteht allerdings eine komplexe Mischung aus einer unvorstellbar großen Anzahl von Mutanten, die gar nicht mehr handhabbar sind. Selbst die Beschränkung auf Einfach-, Zweifach- oder Dreifachmutanten würde schon außerhalb klassischer Screeningmethoden liegen. Heute zum Einsatz kommende Methoden zur „directed evolution“ von Biopharmazeutika berücksichtigen deshalb beide Seiten des Problems: (a) Erhöhung des Durchsatzes (z. B. durch „highthroughput-screening“, HTS) in der therapeutischen Evaluierung bei gleichzeitiger Beibehaltung der pharmakologisch relevanten Eigenschaften und (b) Reduktion der Komplexität von Proteinbibliotheken bei gleichzeitiger Erhöhung der Chancen, eine verbesserte Variante des gesuchten Biopharmazeutikums zu enthalten. Somit macht der Ansatz der „directed evolution“ den profunden Unterschied zwischen herkömmlichen und modernen Biopharmazeutika: Es ermöglicht zum ersten Male eine intendierte Wirkstoffentwicklung – und nicht mehr wie bisher eine Wirkstofffindung. Auf diese Weise konnten z. B. bereits Proteasen entwickelt werden, deren Substratspezifität so verändert wurde, dass sie jetzt gezielt und ausschließlich eine pharmakologisch relevante Zielsequenz hydrolysieren können. Z. B. wurde ein

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Gewebe-Plasminogenaktivator (t-PA) aus einer mikrobiellen Protease entwickelt, welcher humanes Plasminogen effizienter spaltet als humanes t-PA oder jedes andere Enzym (Koltermann et al. 2003). Außerdem konnten mit dieser Methode auch Antikörper, Peptidhormone und Zytokine so verändert werden, dass sie eine optimierte Affinität aufweisen, eine erhöhte katalytische Aktivität, verbesserte Thermo- oder pH-Stabilität oder einfach besser exprimiert werden (Knäblein 2005). „Directed evolution“ kann also sowohl für die Optimierung der pharmakologischen Eigenschaften von Entwicklungskandidaten erfolgreich eingesetzt werden als auch für die Verbesserung von Marktprodukten (Convenience, Compliance, Lifecycle-Management, Patentschutz etc.).

4.6.8.2 Hochdurchsatzklonierung ohne Restriktionsenzyme Nachdem wir erläutert haben, wie man ein gewünschtes Biopharmazeutikum entwickeln kann, wollen wir uns jetzt ansehen, wie man eine solche Vielzahl von Genen aus einem HTS-Ansatz überhaupt klonieren und exprimieren kann. Es leuchtet ein, dass hierbei ebenfalls Hochdurchsatzmethoden zum Einsatz kommen müssen – aber wie funktioniert das? Bei der Klonierung eines Gens durch Standardrestriktionsenzyme und Ligase kommt es darauf an, dass die passenden Restriktionsenzyme eingesetzt werden, d. h., diese dürfen das zu klonierende Gen nur außerhalb der kodierenden Sequenz schneiden (und nicht intern) und den Vektor ausschließlich in dessen „multiple cloning site“ (und nicht im „backbone“). Die Fragmente („open reading frames“, ORFs) müssen isoliert und aufgereinigt werden, um sie dann im richtigen Verhältnis zu mischen und in die kompatiblen Überhänge des Vektors zu klonieren – und dies unter Beibehaltung des korrekten Leserahmens und der Orientierung. Jede Klonierung muss deshalb einzeln betrachtet und sorgfältig geplant werden. Die Methode ist folglich nicht für einen Hochdurchsatz geeignet. Um diese Probleme in den Griff zu bekommen, wird häufig das entsprechende Gen mithilfe der PCR amplifiziert, wobei die für die Klonierung notwendigen Restriktionsschnittstellen in den Primern integriert sind. Auf diese Weise kann man eine überschaubare Anzahl von Fragmenten in die entsprechenden Expressionsvektoren klonieren und so mit verträglichem Aufwand eine Bibliothek erstellen. Bei dem vorher beschriebenen HTS-Ansatz handelt es sich jedoch häufig um Millionen von Genen, die von einer Vektorplattform in eine andere kloniert werden müssen; die PCR-Methode ist also ebenfalls unzureichend. Das ideale System für eine Highthroughput-Klonierung müsste maximale Kompatibili-

tät und Flexibilität besitzen bei einem minimalen Aufwand für die Planung und Durchführung des Experiments und müsste gewährleisten, dass sowohl Leseraster als auch Orientierung der ORFs auch bei der Subklonierung in ein anderes System erhalten bleiben. Zusätzlich müsste das System zeitsparend und einfach in der Handhabung sein, keine Restriktionsenzyme verwenden und ohne Gelelektrophorese, Aufreinigung und lange andauernde Ligation auskommen. Was zunächst unmöglich erscheint, gibt es inzwischen tatsächlich: das Gateway-System von Invitrogen. Dieses Klonierungssystem stellt ein neues Verfahren in der Molekularbiologie dar, indem es sich die Rekombinationsmechanismen des Bakteriophagen Lambda zunutze macht und somit herkömmliche Systeme bzgl. Geschwindigkeit und Effizienz um Potenzen übertrifft. Einfache Automatisierung dieses Systems machen sogar eine Ultrahochdurchsatzklonierung möglich. Gateway ermöglicht den effizienten Gentransfer durch eine modifizierte Rekombinase des Lambda-Phagen, der gewöhnlich die zelluläre Maschinerie des Wirts nutzt, um sich selbst zu propagieren; dazu infiziert er seine Wirtszelle und integriert die gesamte DNA in das Wirtschromosom. Bei dieser konservativen und sequenzspezifischen Reaktion wird eine 25-Basenpaar-Region im Wirtsgenom („bacterial attachment“, „attB site“) erkannt und bindet an eine 243-Basenpaar-Sequenz im Phagengenom („phage attachment“, attP). Mithilfe des bakteriellen dimeren „Integration host-factors“ (IHF) und der vom Phagen kodierten Integrase (Int) werden die DNA-Stränge exakt zur Deckung gebracht und das Phagengenom an der attB-Stelle in das bakterielle Genom integriert. Bei diesem Austausch entstehen zwei neue Sequenzen, die nun die Phagen-DNA flankieren: attL (links) und attR (rechts). Nachdem die PhagenDNA in das Wirtsgenom integriert ist, wird sie zusammen mit der Wirts-DNA repliziert und kann über lange Zeit als latenter Phage erhalten bleiben. Zu einem bestimmten Zeitpunkt jedoch – meistens in einer Stresssituation – löst sich die Phagen-DNA an den spezifischen Sequenzen attL und attR aus dem Wirtsgenom und wird zu funktionsfähigen Viren verpackt, die sich freisetzen, indem sie die Wirtszelle lysieren und nun den nächsten gesunden Wirt infizieren. Das Gateway-System nutzt genau diese Sequenzen für eine schnelle und selektive Rekombination ohne den Einsatz von Restriktionsenzymen und Ligase. Dazu befinden sich die attP- und attB-Sequenzen auf dem sog. Donorplasmid, während sich die entsprechenden Pendants für die Rekombination (attL und attR) auf allen anderen Zielplasmiden (z. B. verschiedene Expressionsvektoren mit diversen tags für die Aufreinigung oder diversen Signalsequenzen für verschiedene Kompartimente oder für die Expression in verschiedenen Wirts-

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zellen) befinden. Auf diese Weise können die att-Sequenzen als Paare genutzt werden, um ganze Batterien von DNA-Kassetten einfach zwischen verschiedenen mit Gateway kompatiblen Vektoren hin und her zu klonieren. Sobald ein bestimmtes Gen, ein ORF oder irgendein anderes DNA-Fragment einmal in das Donorplasmid kloniert wurde, kann es mit wenig Aufwand in jeden kompatiblen Zielvektor transferiert werden, z. B. in eine Batterie von Expressionsvektoren, um das beste Expressionssystem für ein paralleles Expressionsscreening zu ermitteln. Der Vorteil besteht darin, dass beim Transfer sowohl die Orientierung als auch der Leserahmen unabhängig von der Sequenz erhalten bleiben. Da es bei diesem System keinerlei Anforderungen an die DNA-Sequenz gibt (lediglich die att-Sequenz muss im Donorplasmid vorhanden sein), können ganze Pools von völlig heterogenen DNA-Fragmenten mit derselben hohen Effizienz in einer einzigen Reaktion transferiert werden. Dazu werden einfach die Donorplasmide mit den Zielvektoren gemischt und sowohl Integrase als auch IHF hinzugefügt, um die Rekombination zwischen den attL- und attR-Sequenzen zu katalysieren. Die hohe Spezifität der DNA-Rekombination und die Stringenz bei der Klonselektion führen zu einer gesamten Effizienz für das Gateway-System von über 95%. Ein einziges Donorplasmid kann also dazu eingesetzt werden, z. B. dasselbe Protein in hundert verschiedenen Wirten zu exprimieren (E. coli, CHO, Pflanzen etc.), um die höchste Ausbeute zu erzielen oder um verschiedene Konstrukte eines Proteins zu vergleichen, um die besten Domänengrenzen oder den besten Linker zu ermitteln. Zusammenfassend kann man sagen, dass das Gateway-System eine äußerst effiziente Methode darstellt, um Hochdurchsatzklonierung durchzuführen – und zwar unabhängig von der Sequenz des ORFs. Da keine Restriktionsenzyme und Amplifikation durch PCR notwendig sind, kann es auch zu keiner ungewollten Mutation bei der Subklonierung kommen. Somit stellt Gateway einen Quantensprung dar, der sogar eine Hochdurchsatzklonierung nach einem Standardmechanismus ermöglicht und kompatibel mit dem riesigen Aufkommen aus den HTS-Ansätzen beim vorher beschrieben Design von Biopharmazeutika ist. Als Nächstes müssen die so erhaltenen Substanzen natürlich ausgiebig in entsprechenden In-vitro- und In-vivo-Testsystemen validiert werden, bevor sie in der Klinik am Menschen getestet werden können. Das wichtige und für die Entwicklung eines Medikaments abschließende Thema der Validierung und das Procedere der Zulassung (sozusagen „von der Transkription zur Preskription“) werden umfassend im Kap. 2.1 beschrieben.

4.6

4.6.9 Die moderne Biotechnologie Ein Ruck, ein Raunen und ein Staunen ging um die Welt, als der koreanische „Stammzellpionier“ Woo Suk Hwang behauptete, dass er 11 hES-Zelllininien von Patienten im Alter von 2 bis 56 Jahren kloniert hätte (Hwang et al. 2005). Während in seinen ersten Experimenten noch 248 humane Eizellen notwendig waren, um eine SCNT-hES Zelllinie zu erzeugen (Hwang et al. 2004), so wurden jetzt angeblich nur noch weniger als 20 gebraucht. Tatsächlich hat sich jedoch leider herausgestellt, dass diese Ergebnisse gefälscht waren. Denn diese Methode wäre in der Tat für das therapeutische Klonen (Ersetzen defekter Zellen, Herstellung von Organen und anderen Transplantaten etc.) hervorragend geeignet gewesen, weil der Patient (Empfänger) gleichzeitig der Spender ist. Dies würde bedeuten, dass das genetische Profil von Spender und Empfänger identisch ist und es folglich zu keiner Abstoßungsreaktion kommen könnte, weil die Zellen und daraus generierte Organe vom Immunsystem des Empfängers nicht als fremd erkannt würden. Solche Zellen könnten zum ersten Male z. B. Diabetes mellitus wirklich heilen, und so hätte endlich eine moderne Biotechnologie zur Verfügung gestanden, um für jeden Patienten unbegrenzt hES-Zellen und autologes Gewebe für die Transplantationsmedizin zur Verfügung zu stellen. Leider waren all diese Ergebnisse gefälscht, sodass Hwang und alle weiteren Koautoren Science im Dezember 2005 offiziell baten, diese Publikation zurückzuziehen. Hwang, mit dem ich bei seinem Besuch in Berlin im September die (aus damaliger Sicht) faszinierenden Experimente diskutieren konnte, wurde inzwischen nach sehr kurzer Euphorie wieder vom Wissenschaftsthron gestoßen. An der großen Bedeutung von embryonaler Stammzellforschung ändert diese unglückliche Episode zwar nichts, aber dennoch: Der Fall Hwang ist ein extremes und bedauerliches Beispiel für wissenschaftliches Fehlverhalten und gießt außerdem Öl in das Feuer der Stammzelldebatte. Unabhängig von dieser Debatte muss man sich die Frage stellen, warum hochkarätige Forscher überhaupt in die Situation kommen, dass sie Ergebnisse fälschen. Egal, ob es zur Erhöhung der Reputation, Erweiterung des Bekanntheitsgrads oder Akquisition von Forschungsgeldern geschah – wie auch immer die Antwort lauten mag: Ruhm und Ehre dürfen niemals über die Ethik in der Wissenschaft gestellt werden. Friedrich Nietzsche (1844–1900) stellte einmal die Frage „Do you believe that sciences would ever have arisen and become great, if there had not beforehand been magicians, alchemists, astrologers, and wizards who thirsted and hungered after secrets and forbidden powers?“. Und gerade beim Thema Stammzellforschung

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Sektion 4 · Therapie

gibt es viele ethische Aspekte zu beachten. Wir leben in einer pluralen, freiheitlichen Gesellschaft, und natürlich gibt es bei diesen wegweisenden Biotechnologien – auch wenn sie darauf abzielen, unser Leben ständig zu verbessern – wichtige und fundamentale Überlegungen: Das Vordringen in Grenzbereiche führt Beteiligte und Betroffene in die Diskussion der zentralen Frage „Dürfen wir alles, was wir können?“. So wichtig es ist zu definieren, was geboten, erlaubt, problematisch oder gar unzulässig ist, genauso wichtig ist allerdings auch, dass wir uns nicht hinter der Ethik verstecken und sie somit zum Hemmschuh für die Wissenschaft wird. Eine genaue Abwägung aller Risiken und Chancen ist hier notwendig und eine detaillierte, fachliche und ehrliche Diskussion aller Argumente, die allerdings den Rahmen dieses Kapitels bei weitem sprengen würde. Es sei vielleicht lediglich erwähnt, dass die Freiheitsgrade bei der Stammzellforschung weltweit extrem unterschiedlich sind. So ist es in Deutschland schon schwierig, eine Stammzelle einzuführen (geschweige denn selbst herzustellen), und das nur unter der Vorausetzung, wenn diese für einen ganz bestimmten Zweck eingesetzt werden soll und vor einem bestimmten Stichtag hergestellt wurde – in anderen Ländern gibt es teilweise gar keine Vorschriften. Auch in der Wissenschaft gibt es sehr unterschiedliche Auffassungen – oder diese ändern sich über die Zeit. Ian Wilmut z. B. warnte 2001 in seinem Science-Artikel „Don’t Clone Humans“ davor, Menschen zu klonen (Jaenisch u. Wilmut 2001). Inzwischen ließ er sich allerdings von Woo Suk Hwang vor Ort genau erklären, wie dies funktioniert. Und ironischerweise erhält Professor Ian Wilmut 2005 den Paul-Ehrlich-Preis – den begehrtesten deutschen Wissenschaftspreis – für die grundlegenden Arbeiten, die zur Klonierung des ersten Säugetiers geführt haben, in dem Land, wo man sich teilweise dafür rühmt, dass man so restriktiv beim Klonen ist. James D. Watson hat auch seine eigene Ansicht zum Thema „human cloning“: So sagte er bei einem FacultyMeeting an der Charité, dass es immer von dem jeweiligen Experiment und dem verfolgten Ziel abhängt, was zulässig ist. Demnach muss alles von Fall zu Fall neu entschieden werden. Doch hier stellt sich dann die alles entscheidende Frage „quis custodiet ipsos custodes“, also: Wer kontrolliert die Wächter bzw. Entscheidungsträger? Zu diesem Zweck hat die UNESCO das International Bioethics Committee (IBC), etabliert, welches im April 2001 den Report „The use of embryonic stem cells in therapeutic research“ herausgegeben hat (UNESCO, IBC-Report 2001), der die ethischen Aspekte der hES-Zellforschung beleuchtet. Da dies lediglich Empfehlungen sind, kann nach wie vor jedes Land nach seinen eigenen Gesetzen entscheiden, was es zulassen möchte und was nicht. Und wie bereits erwähnt ist es

aufgrund einer Entscheidung des Deutschen Bundestages in Deutschland völlig unmöglich, hES herzustellen. Selbst der Import ist lediglich unter sehr strengen Auflagen möglich und nur, wenn die Stammzelle vor dem 1. Januar 2002 hergestellt wurde. Ähnlich schwierig nachzuvollziehen war eine andere Entscheidung des Deutschen Bundestages zur modernen Biotechnologie im November 2004: Entgegen den Empfehlungen und Warnungen der Max-Planck-Gesellschaft und der Deutschen Forschungsgemeinschaft, dass „} Forschung in Deutschland so unmöglich wird }“ hat der Deutsche Bundestag dieses sehr restriktive Gentechnikgesetz trotzdem verabschiedet. Und genau an diesem Tag, als man sich in Deutschland über die Kompetenz der zwei wichtigsten wissenschaftlichen Organisationen hinweggesetzt hat, entschieden sich die Schweizer mit großer Mehrheit durch einen Volksentscheid für Stammzellforschung. Ob dies der Innovationsoffensive der deutschen Bundesregierung sehr zuträglich sein wird, bleibt also abzuwarten (vgl. hierzu Knäblein 2005). Zur ethischen Diskussion und Reflexion dieser Fragen sei auf das Buch Modern Biopharmaceuticals – Design, Development and Optimization verwiesen, welches der Autor herausgegeben hat.

4.6.10 Ausblick Lassen wir nun die 20.000 Jahre Biotechnologie einmal Revue passieren, so stellen wir fest, dass sie anfänglich zur Bereitstellung von Lebensmitteln (im weitesten Sinne) genutzt wurde und später auch zur gezielten Herstellung von lebenswichtigen Substanzen und Pharmazeutika (Feinchemikalien und große Industrieprodukte) wie z. B. Penicillin, L-Lysin, Cyanocobalamin (Vitamin B12), und Zitronensäure. Bis zur Einführung der Molekularbiologie erfolgt die Stammoptimierung, die für eine industrielle Produktion dieser Substanzen zwingend notwendig war, durch Screening, Mutagenese und anschließende Selektion bestimmter Hochleistungsmutanten („Evolution in der Petrischale“) eher zufällig. Durch bahnbrechende Entdeckungen und intelligente Experimente von ambitionierten Wissenschaftlern werden molekulargenetische Methoden immer weiter entwickelt und ermöglichen so die beschriebene Entwicklung der Biotechnologie. Und erst jetzt, nach Einzug der Gentechnologie, können Produktionssysteme (Bakterien und Säugetierzellen) gezielt entwickelt werden, sodass sie die gewünschten Umsetzungen durchführen (z. B. Biotransformation) oder durch Kombination verschiedener Gene aus verschiedenen Organismen bestimmte Substanzen erst herstellen (z. B. Hybrid zur großtechnischen Produktion von L-Ascorbinsäure, Vitamin C). Lediglich auf diese Weise können die Substan-

505 4.6 · Gentechnische Grundlagen für biotechnologische Anwendungen

zen überhaupt großtechnisch hergestellt und damit flächendeckend für die Menschheit zur Verfügung gestellt werden. Wir haben außerdem gesehen, dass verschiedene Proteine mit wichtigen biologischen Funktionen im Körper nur in Spuren gebildet werden. Soweit diese für therapeutische und diagnostische Zwecke von Bedeutung sind, besteht inzwischen die Möglichkeit, sie mit gentechnischen Methoden herzustellen. Dazu muss die entsprechende genetische Information aus dem menschlichen Gewebe isoliert und in einen einzelligen Organismus (z. B. E. coli) oder eine Tierzelle (z. B. CHO) übertragen werden. Solche rekombinanten Zellen können in großem Maßstab kultiviert werden und liefern dabei das gewünschte Produkt. Durch das Einschleusen humaner Gene in Bakterienzellen wurde es so auch erstmals möglich, wertvolle Biopharmazeutika wie rekombinantes Insulin herzustellen. Die Gentechnologie ermöglicht aber außerdem das Design von künstlichen Biopharmazeutika mit verbesserter Bioverfügbarkeit, die es in der Natur gar nicht gibt – besprochen haben wir hier z. B. verschiedene Insulinvarianten. Auch der komplexe Faktor VIII z. B. ist ein wichtiges Protein aus der menschlichen Blutgerinnungskaskade und lebenswichtig für die Therapie der Hämophilie. Seine aufwendige Klonierung und eindrucksvolle Produktion in Säugetierzellen (denn nur sie sind in der Lage, die notwendigen Kohlehydratketten anzuhängen) wurde beschrieben. Interferone gegen Multiple Sklerose, Gewebe-Plasminogenaktivator (t-PA) gegen Herzinfarkt und Erythropoetin gegen Anämien sind weitere lebenswichtige Proteine, die erst durch den Einsatz gentechnischer Methoden in der Biotechnologie produziert werden konnten. Außerdem haben wir die Wichtigkeit von monoklonalen Antikörpern (z. B. Herceptin) besprochen, die von Hybridomazellen gebildet werden, welche durch Fusionierung von B-Lymphozyten mit Myelomzellen entstehen. Antiköperbasierte Biopharmazeutika haben vor allem in der Tumortherapie und als Immundiagnostika Verwendung gefunden. Gentechnik kann jedoch nicht nur dazu benutzt werden, Bakterien oder Zellkulturen zur Überproduktion von eigenen oder von Fremdproteinen zu bewegen; der Mensch kann noch direkter mit der Gentechnik in Berührung kommen. Wie wir bereits beim Faktor VIII gesehen haben, kann sie auch für die pränatale Diagnostik genutzt werden. Schon seit geraumer Zeit werden bestimmte Chromosomenanomalien pränatal diagnostiziert. Man entnimmt dazu Zellen aus dem Dottersack des Fetus, und eine Analyse der Chromosomen lässt erkennen, ob z. B. eine Trisomie vorliegt. Dann ist ein zusätzliches Exemplar der Chromosomen 13, 18, oder 21 vorhanden, was zu Mongolismus führt. Viele Erbkrankheiten können heute pränatal diagnostiziert werden, was

4.6

ein Vorteil sein kann – allerdings gibt es auch hier eine gesellschaftlich-ethische Diskussion, ob man z. B. Gentherapie zur Heilung einsetzen soll oder nicht und ob z. B. Versicherungen dann diese potenziellen Patienten später gar nicht oder nur unter modifizierten Modalitäten aufnehmen etc. Skeptiker der pränatalen Diagnostik befürchten, dass nicht nur schwer beschädigte Embryonen abgetötet werden, also nicht nur negative Selektion, sondern auch positive Selektion betrieben wird. Es könnte also z. B. nach Geschlecht und wünschenswerten Eigenschaften ausgewählt werden. Die Genomdiagnostik erlaubt außerdem den Nachweis viraler und bakterieller Infektionen im Körper und dient zur Erkennung von genetisch bedingten Stoffwechselstörungen. DNA-Sonden werden zur Erstellung von sog. DNA-Fingerprints verwendet, die insbesondere für forensische Zwecke (Vaterschaftsnachweis, Täteridentifizierung) von großem Nutzen sind. Wir haben gesehen, dass es im Zusammenhang mit Gesundheit und Ernährung der Menschheit eine konservative Biotechnologie gibt, der wir inzwischen eine große Anzahl von Produkten verdanken; die eigentlichen Produzenten sind hier Mikroorganismen, die entweder natürlich gezüchtet, in ihrer Leistungsfähigkeit durch Mutation und Auslese gesteigert oder aber durch Gentechnologie verändert bzw. erst erzeugt wurden. Darüber hinaus gibt es eine brisante Biotechnologie – besonders brisant und in der Öffentlichkeit diskutiert, wenn es um pränatale Diagnostik oder gar um Klonierung und Stammzellforschung geht. Logischerweise schließt sich nun die Frage nach möglichen Gefahren an. Welche potenziellen Gefahren gehen von künstlichen Bakterien oder Säugerzellen aus, die in biotechnologischen Prozessen eingesetzt werden? Mikroorganismen, die plötzlich humanes Insulin herstellen, die Bakterienhybride, die in großen Mengen Glucose in Vitamin C umsetzen, oder die Säugetierzellen, die für uns den lebenswichtigen Faktor VIII produzieren – wir züchten und vermehren diese künstlichen Organismen in hermetisch abgeschlossenen Reaktionsgefäßen, den Bioreaktoren. Dies ist jedoch nicht neu: Wie hätte man sonst Impfstoffe gegen Kinderlähmung, Wundstarrkrampf oder Röteln entwickeln können? Hier gibt es Erfahrungen und Technologien, um große Mengen pathogener Bakterien und Viren herzustellen. Da die Handhabung von gentechnisch veränderten Organismen keine zusätzlichen Sicherheitsvorkehrungen benötigt, geht von ihnen auch keine besondere Gefahrenquelle aus. Gänzlich anders ist die Situation, wenn wir etwas „Künstliches“ in die freie Natur entlassen, z. B. transgene Organismen in Freilandstudien untersuchen wollen. Solche Versuche bedürfen der Freigabe durch die entsprechenden Zulassungsbehörden, die diese lediglich erlauben, wenn man mit an Sicherheit grenzender Wahr-

506

Sektion 4 · Therapie

scheinlichkeit eine Gefahr für Mensch und Umwelt ausschließen kann. Es gibt außerdem heutzutage die Möglichkeit, die Organismen gentechnisch zusätzlich so zu verändern, dass sie sich im Gegensatz zum Wildtyp in der Natur nicht ausbreiten können. Handelt es sich jedoch um machtbesessene, aggressive und skrupellose Staaten, die vorsätzlich biologische Kampfstoffe mithilfe von gentechnisch manipulierten Mikroorganismen ausbringen wollen, so wäre dies zwar eine Tat von Wahnsinnigen – ausgeschlossen ist sie deshalb jedoch nicht. Menschen, Gentechnologie und Klonen – das ist der Stoff, aus dem Aldous Huxley bereits vor zwei Generationen eine Schreckensvision in seinem Roman Schöne neue Welt kreierte: 96 identische Klone bedienen 96 identische Maschinen. Heute sind wir soweit – zumindest technisch! Was momentan noch Utopie, aber schon bald Realität sein könnte, da es teilweise bereits praktiziert wird, ist die pränatale Diagnostik als Entscheidungsgrundlage über Leben und Tod. Wie wir bereits gesehen haben, können wir etliche Eigenschaften und Krankheiten bereits vor der Geburt diagnostizieren – die Frage ist lediglich, welche Konsequenzen wir daraus ziehen. Wo liegt bei vermeidbaren Krankheiten die Grenze des Tolerierbaren? Welche Ausprägungen von Abnormalitäten werden noch akzeptiert? Wer definiert diese? Was gehört noch zur Schwankungsbreite und was ist schon Indikator für einen Schwangerschaftsabbruch? Was sind die gewünschten Eigenschaften? Es könnte zur Aufstellung einer genetischen Wertskala kommen (bei Versicherungen passiert dies teilweise schon!), und der Mensch würde anhand seines Genpasses bewertet werden. Oder man versucht beim „Menschen nach Wunsch“ bestimmte Veranlagungen und Merkmale zu vermeiden, bzw. Eltern möchten ein Kind mit bestimmten Eigenschaften haben, ein sog. „Designerbaby“, und es stellt sich die Frage: Gott oder Darwin? Ähnlich wie bei Genie und Wahnsinn liegen Nutzen und Heilung auch hier sehr eng neben Missbrauch und Frevel. Wie zuvor bei der Atomphysik zeigt sich auch bei der Biotechnologie ganz offensichtlich die Ambivalenz zwischen dem Nutzen für die Menschheit durch wissenschaftlich-technischen Fortschritt und den damit einhergehenden potenziellen Gefahren. Dieses Dilemma erinnert mich an eine Schlüsselszene in dem Film „Jurassic Park“ und den folgenden Ausspruch: „Biotechnology is the most powerful force which was ever on the planet. But you play with it like a child, who just found his father’s gun.“ Ob die uns heute zur Verfügung stehenden Biotechnologien entsprechend der Überschrift meines ersten Abschnitts („Biotechnologie – die Wissenschaft, die Leben schafft“) genutzt werden, also ausschließlich zum Wohle der Menschheit, hängt letzten Endes von unser aller Verantwortungsbewusstsein ab. Dazu ist ein entsprechendes gesellschaftliches Umfeld erforderlich: Ver-

nunft bei den Wissenschaftlern, Aufgeklärtheit in der Bevölkerung, Ethik in der Industrie, Wissen in der Politik sowie Unabhängigkeit für die Legislative. Nur wenn wir dies weltweit umsetzen können, haben wir auch die Möglichkeit, diese mächtigen Biotechnologien ausschließlich zum Wohle der Menschheit einzusetzen und unseren Planeten langfristig im Sinne unserer Spezies zu nutzen, nicht jedoch kurzfristig auszunutzen. Danksagung Elemente für die Erstellung der > Abb. 4.6.1 und 4.6.3 wurden freundlicherweise von Reinhard Renneberg und dem Elsevier Verlag zur Verfügung gestellt (aus Reinhard Renneberg. Biotechnologie für Einsteiger, Elsevier GmbH München, Spektrum Akademischer Verlag, 2006, ISBN 3-8274-1538-1). Die restlichen Abbildung basieren auf Material aus dem Buch „Modern Biopharmaceuticals“ (Jörg Knäblein. Modern Biopharmaceuticals – Design, Development and Optimization, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, 2005, ISBN 3-527-31184-X.), hier speziell > Abb. 4.6.4 von Roche, und 4.6.5 von Baxter.

4.6.11 Literatur MONOGRAPHIEN Breitling F, Dübel S. (1997) Rekombinante Antikörper, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, ISBN 3-8274-0029-5 Dellweg H (1994) Biotechnologie verständlich. Ernst Klett Schulbuchverlag, Stuttgart, Düsseldorf, Berlin, Leibzig, ISBN 3-12984350-7 Eisenbrand G, Schreier P (1995) Römpp Lexikon Lebensmittelchemie, Thieme Verlag, Stuttgart, New York, ISBN 3-437-00682-7 Gottschalk G (1986) Biotechnologie, Köln: vgs, ISBN 3-8025-1238-3 Knäblein J (2005) Modern Biopharmaceuticals – Design, Development and Optimization, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, ISBN 3-527-31184-X Oduncu FS, Schroth U, Vossenkuhl W (2002) Stammzellenforschung und therapeutisches Klonen. Vandenhoeck & Ruprecht, Göttingen, ISBN 3-525-45707-3 Renneberg R (2006) Biotechnologie für Einsteiger, Elsevier GmbH München, Spektrum Akademischer Verlag, ISBN 3-8274-1538-1 Stryer L. (1991) Biochemie, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, ISBN 3-86025-005-1 Voet D, Voet JG (1992) Biochemie, VCH Verlagsgesellschaft mbH, D-6940 Weinheim, ISBN 3-527-28242-4

ZEITSCHRIFTEN / BEITRAGSWERKE Better M et al. (1988) E. coli secretion of an active chimeric antibody fragment. Science 240: 1041–1043 Bolivar F, Rodriguez RL, Green PJ, Betlach MC, Heynecker HL, Boyer HW, Crosa JH, Falkow S (1977) Construction and characterization of new cloning vehicles. A multi purpose cloning system. Gene 2: 95–113 Bornemann KD et al. (1995) Roles of heavy and light chains in IgM polymerization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4912–4916 Campbell KH, McWhir J, Ritchie WA, Wilmut I (1996) Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 380: 64–66

507 4.6 · Gentechnische Grundlagen für biotechnologische Anwendungen Cogoni C, Romano N, Macino G (1994) Suppression of gene expression by homologous transgenes. Antonie Van Leeuwenhoek. 65: 205–209 Cohen SN, Chang AC, Boyer HW, Helling RB (1973) Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc Natl Acad Sci 70: 3240–3244 Darwin C (1859) On the origin of species by means of natural selection or the preservation of favoured races in the struggle for life. narrated at the Royal Linné-Society Deisenhofer J, Epp O, Miki K, Huber R, Michel H (1984) X-ray structure analysis of a membrane protein complex. Electron density map at 3 A resolution and a model of the chromophores of the photosynthetic reaction center from Rhodopseudomonas viridis. J Mol Biol 180: 385 – 398 Dickson D (1980) Genentech makes splash on Wall Street, Nature 287: 669 – 670 Eigen M (1971) Selforganization of matter and the evolution of biological macromolecules. Naturwissenschaften. 58: 465–523 Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411: 494–498 Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T (2001) RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes & Development. 15: 188–200 Escherich T (1887) Ueber Darmbakterien im allgemeinen und diejenige der Säuglinge im Besonderen, sowie der Beziehungen der letzteren zur Aetiologie der Darmerkrankungen. Centralblatt für Bakteriologie. 1: 705–713 Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806–811 Fleming A (1929) On the antibacterial action of cultures of a penicillium with special reference to their use in the isolation of B. influenzae. British Journal of Experimental Pathology 10: 226– 236 Gallo RC, Poiesz BJ, Ruscetti FW (1981) Regulation of human T-cell proliferation: T-cell growth factor and isolation of a new class of type-C retroviruses from human T-cells. Haematol Blood Transfus. 26: 502–514 Gilbert W, Maxam A (1973) The nucleotide sequence of the lac operator. Proc Natl Acad Sci 70: 3581–3584 Hwang WS et al. (2004) Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst. Science 303: 1669–1674 Hwang WS et al. (2005) Patient-specific embryonic stem cells derived from human SCNT blastocysts. Science 308: 1777– 1783 Jacob F, Perrin D, Sanchez C, Monod J (1960) Operon: a group of genes with the expression coordinated by an operator. CR Hebd Seances Acad Sci. 250: 1727–1729 Jaenisch R, Wilmut I (2001) Developmental biology. Don‘t clone humans! Science 291: 2552 Kendrew JC et al. (1958) A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by X-ray analysis. Nature 181: 662– 666 Kirkpatrick RB et.al. (1995) Heavy chain dimers as well as complete antibodies are efficiently formed and secreted from Drosophila via a BiP mediated pathway. J. Biol. Chem. 270: 19800– 19805 Klimyuk V, Marillonnet S, Knäblein J, McCaman M, Gleba Y (2005) Production of recombinant proteins in plants. In: Modern Biopharmaceuticals – Design, Development and Optimization. pp. 893-917; Editor: J. Knäblein. Publisher: Wiley-VCH. ISBN 3-52731184-X

4.6

Knäblein J (2003) Biotech: A New Era In The New Millennium – Fermentation and Expression of Biopharmaceuticals in Plants. SCREENING – Trends in Drug Discovery 4: 14–16 Knäblein J, McCaman M (2003) Modern Biopharmaceuticals – Recombinant Protein Expression in Transgenic Plants. SCREENING-Trends in Drug Discovery 6: 33–35 Knäblein J (2004) Biopharmaceuticals expressed in plants – a new era in the new Millennium. In: Müller R, Kayser O (Eds) Applications in Pharmaceutical Biotechnology., pp. 35-56. Publisher: Wiley-VCH. ISBN 3-527-30554-8 Knäblein J (2005) Plant-based Expression of Biopharmaceuticals. In: Meyers RA (Ed.) Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, 2nd ed., Vol. 10, pp. 489–410. Publisher: Wiley & Sons. ISBN 3-527-30552-1 Knäblein J (2006) Pflanzliche Expressionssysteme – eine “reife“ Technologieplattform. In: Renneberg R (Ed) Biotechnologie für Einsteiger. pp. 196–197. Publisher: Elsevier GmbH, München. ISBN 3-8274-1538-1 Köhler G, Milstein C (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495–497 Koltermann A, Kettling U, Haupts U, Tebbe J, Scholz P, Pilling J, Werner S, Rarbach M, PCT Patent Application 2003, WO 03/095670 Kornberg A et al. (1956) Metaphosphate synthesis by an enzyme from Escherichia coli. Biochim Biophys Acta 20: 215–227 van Leeuwenhoek A (1684) Phil. Trans. Roy. Soc. London 14: 568 Linn S, Arber W (1968) Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. In vitro restriction of phage fd replicative form. Proc Natl Acad Sci, 59: 1300–1306 Mendel G (1866) Versuche über Pflanzen-Hybriden. Verhandlungen des naturforschenden Vereines, Abhandlungen, Brünn 4: 3-47 Mullis K et al. (1986) Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction, Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 51 Pt 1: 263–273 Nirenberg MW et al. (1962) An intermediate in the biosynthesis of polyphenylalanine directed by synthetic template RNA. Proc Natl Acad Sci 48: 104–109 Perutz MF et al (1963) A three-dimensional Fourier synthesis of reduced human haemoglobin at 5.5 Å resolution Nature 199: 633–638 Lardon A, Reichstein T (1952) Partial synthesis of cortisone and related compounds from sarmentogenin; adrenal cortical compounds and related drugs. Pharm Acta Helv.27: 287–302 Rosenkranz G, Djerassi C, Yashin R, Pataki J (1951) Cortical hormones from allsteroids; synthesis of cortisone from Reichsteen‘s compound D. Nature 168: 28 Sanger F. et al. (1973) Use of DNA polymerase I primed by a synthetic oligonucleotide to determine a nucleotide sequence in phage fl DNA. Proc Natl Acad Sci 70: 1209–1213 Skerra A, Plückthun A (1988) Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in E. coli. Science 240: 1038–1041 Slamon DJ et al. (1987) Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 235: 177–182 Tuschl T, Zamore PD, Lehmann R, Bartel DP, Sharp PA (1999) Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes & Development 13: 3191–3197 Temin HM, Mizutani S (1970) RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus. Nature 226: 1211–1213 Watson JD, Crick FH (1953) Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 171: 737–738 Weinberg, RA (1984) Oncogenes and the molecular basis of cancer, Harvey Lect. 80: 129–136

508

Sektion 4 · Therapie

4.6.12 Zeittafel Die angegebenen Zitate sind in den Literaturteil integriert. 1676

Der Delfter Linsenschleifer Antonie van Leeuwenhoek entwickelt ein Mikroskop, mit dem er bei 200-facher Vergrößerung zum ersten Mal Mikroorganismen tatsächlich zu sehen bekommt (van Leeuwenhoek 1684).

1859

Die Grundlagen der klassischen Genetik werden von dem englischen Wissenschaftler Charles Darwin in seiner Evolutionstheorie „Survival of the fittest“ postuliert (Darwin 1859).

1866

Der Augustinerpater Johann Gregor Mendel beschreibt in seiner Abhandlung „Versuche über Pflanzen-Hybriden“ die Vererbung bestimmter Phänotypen (Mendel 1866).

1887

Der Deutsche Kinderarzt Theodor Escherich veröffentlicht seine Arbeit zum Thema „Die Darmbakterien des Säuglings und ihre Beziehungen zur Physiologie der Verdauung“, in der er das später nach ihm benannte Bakterium E. coli beschreibt (Escherich 1887).

1928

Alexander Fleming stellt auf einer mit Staphylococcus bewachsenen Agarplatte um einen darauf gefallenen Pilz eine klare Zone fest. Dieser Pilz, Penicillium notatum, hatte eine wachstumshemmende Substanz ausgeschieden: Penicillin (Fleming 1929).

1951

„Biotransformation“: Wichtige therapeutische Substanzen werden durch selektive Hydroxylierungen an Steroiden/ Alkaloiden mit dem Schimmelpilz Rhizopus arrhizus entwickelt (Rosenkranz 1951).

1952

Das sehr wichtige, von der Nebennierenrinde abgesonderte Steroidhormon Cortison kann isoliert werden (Lardon u. Reichstein 1952).

1953

„Moleküls des Lebens“: Der Biochemiker James D. Watson und der Physiker Francis H. Crick klären durch ihre bahnbrechenden Arbeiten die dreidimensionale doppelhelikale Struktur der DNA auf (Watson u. Crick 1953).

1956

Der amerikanische Biochemiker Arthur Kornberg isoliert das Enzym, welches das „Molekül des Lebens“ synthetisiert: DNA-Polymerase (Kornberg et al. 1956).

1958

Strukturbiologie: Die dreidimensionale Struktur des komplexen Proteins Myoglobin wird aufgeklärt (Kendrew et al. 1958).

1960

Das Operator-Modell wird beschrieben, und der Prozess der Transkription wird entdeckt, bei dem ein Strang der DNADoppelhelix mithilfe einer RNA-Polymerase abgelesen und in ein mRNA-Molekül (Messenger-RNA) mit komplementärer Nukleotidsequenz umgeschrieben wird (Jacob et al. 1960).

1962

Am National Institute of Health in Bethesda zeigt Nirenberg, dass das Kodontriplett UUU in der mRNA die Aminosäure Phenylalanin im Protein codiert. Auf diese Weise sind die Voraussetzungen geschaffen, um den genetischen Kode zu dechiffrieren (Nirenberg et al. 1962).

1963

Max F. Perutz und Kollegen lösen die dreidimensionale Struktur von Hämoglobin (Perutz et al. 1963).

1968

Der Schweizer Biophysiker Werner Arber entdeckt Restriktionsenzyme, die sequenzspezifisch DNA „zerschneiden“ (Linn u. Arber 1968).

1970

Die amerikanischen Biologen Howard Temin und David Baltimore widerlegen das „zentrale Dogma der Genetik“, nämlich den unidirektionalen Fluss genetischer Information, als sie das Enzym reverse Transkriptase entdecken (Temin et al. 1970).

1973

Unabhängig voneinander entwickeln Allan Maxam und Walter Gilbert in Harvard (Gilbert u. Maxam 1973) und Frederick Sanger (Sanger et al. 1973) in Cambridge eine Methode, um DNA zu sequenzieren, d. h., die Abfolge der Nukleinsäuren zu entschlüsseln und damit die genetische Information zu lesen.

1973

Stanley Cohen von der Stanford University und Herbert Boyer von der Universität in San Francisco exprimieren ein synthetisches Gen in E. coli und produzieren rekombinantes humanes Insulin (Cohen et al. 1973).

1975

Köhler und Milstein fusionieren Lymphozyten mit krebsartigen Myelomazellen und erzeugen die erste Hybridomazelle zur Herstellung monoklonaler Antikörper (Köhler u. Milstein 1975).

1977

Das erste für Klonierungen eingesetzte „multipurpose cloning system“ pBR322, ein Derivat eines aus E. coli stammenden Plasmids, wird beschrieben. Diese Veröffentlichung wurde bis 1990 zu einer der meist zitieren Publikationen überhaupt (Bolivar et al. 1977).

1980

Die erste Biotech-Firma „Genentech“ geht am 15. Oktober 1980 an der New Yorker Wall Street an die Börse (Dickson 1980).

509 4.6 · Gentechnische Grundlagen für biotechnologische Anwendungen

1981

Der amerikanische Virologe Robert C. Gallo zeigt, dass HIV-1 („human immunodeficiency virus type 1“) die Ursache von AIDS („acquired immune deficiency syndrome“) ist (Gallo et al. 1981).

1983

Kary Mullis entwickelt einen Prozess, den er Polymerasekettenreaktion („polymerase chain reaction“, PCR) nennt, und löst damit das Kernproblem der molekularen Genetik: die Vervielfältigung von Genen (Mullis et al. 1986).

1984

Die Struktur des ersten transmembranen Proteins, das photosynthetische Reaktionszentrum aus Rhodopseudomonas viridis, wird gelöst (Deisenhofer et al. 1984).

1887

Axel Ullrich und Denis J. Slamon finden heraus, dass das HER2/neu-Gen ausschließlich in Brustkrebs hochreguliert wird (Slamon et al. 1987). Dies führt später zur Entwicklung eines humanisierten monoklonalen Antikörpers gegen Brustkrebs: Herceptin.

1988

Expression und Ausschleusen von korrekt gefalteten Antikörperfragmenten in den periplasmatischen Raum von E coli (Skerra u. Plückthun 1988; Better et al. 1988).

1994

Homologieabhängiges „gene silencing“, also die Suppression der Expression bestimmter Gene, wurde in dem Pilz Neurospora crassa beobachtet (Cogoni et al. 1994).

1996

Ian Wilmut vom Roslin Institute in Schottland kloniert das Schaf „Dolly“ durch somatischen Zellkerntransfer („somatic cell nuclear transfer“, SCNT) aus der (somatischen) Euterzelle eines ausgewachsenen Schafs (Campbell et al. 1996).

1998

Andy Fire und Kollegen beschreiben das Phänomen der Gensuppression durch die künstliche Einführung von Doppelstrang-RNA (dsRNA) in C. elegans (Fire et al. 1998). Das erste Medikament, welches patientenspezifisch entwickelt wurde (die Brustkrebspatientinnen werden vor der Therapie getestet, ob sie auf das Krebsmittel überhaupt ansprechen werden), kommt auf den Markt: Herceptin.

1999

Arbeiten von Tuschl mit Zelllysaten von Drosophila führen zu der Vision, den RNAi-Mechanismus für therapeutische Zwecke einzusetzen (Tuschl et al. 1999).

2003

Das erste Medikament, welches vollkommen frei von tierischen Bestandteilen hergestellt wurde, also ohne BSE- und TSE-Risiko, kommt auf den Markt: Faktor VIII „ADVATE“.

2005

Das vierbändige „Guinessbuch der Biotechnologie“ wird publiziert mit Beiträgen der weltweit hochkarätigsten Wissenschaftler aus Akademie und Industrie – inklusive mehrerer Nobelpreisträger: Modern Biopharmaceuticals – Design, Development, and Optimization.

4.6

4.7 Ethische Probleme der Molekularen Medizin Grundlagen und Anwendungen unter Berücksichtigung der rechtlichen Rahmenbedingungen Carl Friedrich Gethmann und Felix Thiele

4.7.1

Einleitung

– 511

4.7.2

Wissenschaftstheoretische Vorbemerkungen

4.7.2.1 4.7.2.2 4.7.2.3

Herstellungsapriori der empirischen Wissenschaften am Beispiel der Gentechnik – 512 Praktisches und poietisches Handeln – 513 Grundlagenforschung – 514

4.7.3

Ethische Grundlagen – 514

4.7.3.1 4.7.3.2 4.7.3.3

Moral und Ethik – 514 Mensch und Natur – 516 Grenzen des Abwägens – 517

4.7.4

Ausgewählte Probleme der bioethischen Diskussion – 518

4.7.4.1 4.7.4.2 4.7.4.3 4.7.4.4 4.7.4.5

Fragestellungen – 519 Moralischer Status des menschlichen Embryos Genetische Testverfahren – 523 Gentherapie am Menschen – 525 Patente auf Biomaterialien – 527

4.7.5

Ausblick

– 529

4.7.6

Literatur

– 530

4.7.6.1 4.7.6.2 4.7.6.3 4.7.6.4

Literatur zur Einführung in die Ethik und angewandte Ethik Literatur zur Einführung in die Bioethik – 530 Lexika – 530 Zitierte Literatur – 530

– 512

– 519

– 530

Ganten/Ruckpaul (Hrsg.) Grundlagen der Molekularen Medizin, 3. Auflage © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008

511 4.7 · Ethische Probleme der Molekularen Medizin

4.7.1 Einleitung Kaum eine moderne, wissenschaftlich-technische Entwicklung hat so tief greifende Kontroversen hervorgerufen wie die Gentechnik, die eine wichtige methodische Grundlage der Molekularen Medizin bildet. Allerdings werden diese Kontroversen von den Teilnehmern sehr unterschiedlich interpretiert: Einige beurteilen die neuen Entwicklungen skeptisch und halten den Einspruch potenziell oder aktuell Betroffener oder in deren Namen auftretender Bürgergruppen für dringend geboten, wobei sie sich etwa auf „die Moral“, „die Ethik“ oder auch auf allgemeine Menschenrechte berufen – den Befürwortern und Betreibern biowissenschaftlicher Forschung unterstellen sie dabei gelegentlich Bedenkenlosigkeit, Gewinnsucht oder gar eine nicht gezügelte „Bastelsucht“, wie sie explizit von E. Chargaff (1982) unterstellt wurde. Andere, darunter häufig auch Forscher auf dem Gebiet der Biowissenschaften, betrachten diese Skepsis als ein bloßes Forschungshemmnis, als Verhinderung eines notwendigen Fortschritts – und unterstellen den Skeptikern etwa einen Mangel an biologischer Bildung oder hysterische Furcht vor dem wissenschaftlichen Fortschritt. Vertreter der Wirtschaft sehen die skeptischen Einsprüche am ehesten als Investitionsbremse und Versagen vor den Aufgaben der Zukunft. Bei allen Beteiligten besteht allerdings weitgehend – wenn auch sicher nicht durchgängig – ein Einverständnis darüber, dass diese Diskussionen nicht nach der Art eines Konfessionskriegs um Glauben oder Unglauben geführt werden sollten: Den Parteien in der Kontroverse sollen nur solche Lösungen als akzeptabel gelten, die durch Vorweisen guter Gründe für die eigene Position und argumentatives Zurückweisen der anderen Position gewonnen sind. Die Kontroversen können nur dauerhaft aufgelöst werden, wenn die Antworten nicht durch Macht oder Gewalt herbeigeführt werden, nicht auf Täuschung oder List beruhen, sondern durch Überzeugung der jeweils anderen Partei gewonnen sind. Ein entsprechender Überzeugungsversuch kann nur dann erfolgreich sein, wenn er den Standards des Begründens und Rechtfertigens genügt, die die jeweils andere Partei ebenfalls unterstellt. Stehen sich nicht nur zwei „Interessengruppen“ mit holzschnittartigen Profilen gegenüber, wie sie oben exemplarisch umrissen wurden, werden vielmehr bei einem Thema von gesamtgesellschaftlichem Interesse zahlreiche Positionen mit noch zahlreicheren Gründen vertreten, wird es gemäß Gesichtspunkten rationaler Arbeitsteilung empfehlenswert sein, die kritische Rekonstruktion und Explikation solcher Standards in professionelle Hände zu geben. Es ist seit jeher eine der Hauptaufgaben der Philosophie und – insofern Handlungen und Handlungsaufforderungen betroffen sind – insbesondere der Ethik, sol-

4.7

che Standards rekonstruktiv zu entwickeln und auf ihre Eignung zur Bewältigung unterschiedlich gearteter Konfliktlagen zu prüfen; etwa, typische Argumentationsweisen auf ihre Triftigkeit hin zu prüfen, vorgebrachte Gründe auf deren Verträglichkeit oder Unverträglichkeit mit anderen zu prüfen, verborgene Prämissen aufzuspüren und Ähnliches mehr. Aus dieser Beschreibung wird bereits deutlich, dass von der Ethik nicht zu erwarten ist, sie solle solche Konflikte entscheiden. Der Ethiker verfügt auch nicht über wie auch immer geartete „höhere“ Einsichten, hat keinen privilegierten Zugang zu absolut gültigen moralischen Werten oder ewigen Prinzipien, der es ihm erlauben könnte, sich solche Kompetenz anzumaßen. Die spezifischen Leistungen des Ethikers sind vielmehr eher beratender Art, er kann den Parteien die Einigung auf bestimmte Standards und ggf. auch auf komplette Konfliktlösungsstrategien empfehlen. Die Kompetenz, über die er hierzu verfügen sollte, ist prinzipiell lehr- und lernbar und beruht – wie jede andere disziplinäre Kompetenz – v. a. auf methodisch geschulter Routine. Entsprechend diesem Verständnis vermag die unter Ethikern geführte Fachdebatte die gesellschaftlichen Verfahren der Entscheidungsfindung auch nicht zu ersetzen. Gleichwohl wird sich die Gesellschaft von dem Fundus der in diesen Debatten entwickelten und oft in einer langen philosophischen Tradition aufbewahrten Vorschläge und Empfehlungen einigen Gewinn versprechen dürfen. Daher hat schon die antike Philosophie aufgrund der Komplexität der gesellschaftlichen Konflikte und der schwindenden Wirkung des Mythos als Mittel der Streitschlichtung die Institutionalisierung und Professionalisierung des Fachs „Ethik“ betrieben Die Neuzeit hat die gesellschaftlichen Konfliktlagen noch verschärft, weil sie sich auf keine naturwüchsig gültigen, fraglosen Konventionen mehr verlassen konnte. Angesichts der rasanten Entwicklungen in den Wissenschaften und der abnehmenden Überschaubarkeit der Folgen dieser Entwicklungen wird die gegenwärtige Aufgabe der Ethik v. a. darin gesehen, das in der Ethik seither erarbeitete Reflexionspotenzial auf die neuen Fragestellungen zu beziehen und ggf. zu erweitern. Dies wird umso aussichtsreicher sein, je mehr eine interdisziplinäre Kooperation aller für eine Konfliktlage relevanten Fachwissenschaften erreicht wird. Gemäß dem skizzierten und unten noch weiter auszuführenden Verständnis der praktischen Aufgabe der Ethik finden sich in diesem Kapitel auch keine endgültigen Antworten auf moralische Fragen bezüglich der Gentechnik aus dem Mund des Ethikers. Ziel dieses Kapitels ist es vielmehr, einige mögliche Beiträge der Ethik bei der Bewältigung moralischer Probleme moderner Wissenschaft und Technik zu explizieren und an derzeit viel diskutierten Beispielen zu illustrieren. In diesem

512

Sektion 4 · Therapie

Beitrag ist im Wesentlichen Fachliteratur angegeben. Zu Beginn der Bibliographie findet sich eine Aufstellung von Literatur, die zur Einführung in die (Bio-)Ethik geeignet ist. Unabhängig von den ethischen Überlegungen ist dem Forschungsgebiet der Molekularen Medizin ein rechtlicher Rahmen vorgegeben, der von den auf diesem Gebiet Tätigen beachtet werden muss. (Die meisten hier relevanten Gesetzestexte und Verordnungen finden sich im Internet – beispielsweise auf den Internetseiten des Bundesamtes für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit.) Die rechtlichen Vorgaben sind zum einen im Europarecht, zum anderen im deutschen Verfassungsrecht und weiteren Gesetzen formuliert. Auf europäischer Ebene ist zunächst das Menschenrechtsübereinkommen zur Biomedizin („Bioethikkonvention“) zu nennen, das 1997 vom Europarat erstellt wurde und das neben Bestimmungen zu den Patientenrechten und zur medizinischen Forschung auch Regelungen für die Gentechnik enthält. Die Bundesrepublik hat dieses Dokument bislang aber nicht gezeichnet und ratifiziert, sodass es für Deutschland keine Rechtskraft hat. Dennoch wird die Bioethikkonvention in bioethischen Diskussionen häufig als Referenzpunkt verwendet. Auch auf nationaler Ebene bindend sind dagegen die beiden Richtlinien der EU-Kommission (90/219/EEC und 90/220/EEC sowie deren Fortentwicklungen) zur Forschung mit und Freisetzung von gentechnisch veränderten Organismen (GVO). Diese Richtlinien sind u. a. umgesetzt und ausdifferenziert im deutschen Gentechnikgesetz (GenTG) von 1990 (letzte Änderung 2002) und verschiedenen Verordnungen, durch die gentechnische Anlagen und Arbeiten, das Freisetzen von GVO sowie das Inverkehrbringen geregelt sind. Für die Molekulare Medizin ebenfalls relevant ist die EU-Richtlinie (98/44/EG), die den rechtlichen Schutz biotechnologischer Erfindungen durch Patente regelt (7 4.7.4.5) Auf nationaler Ebene sind als rechtliche Vorgaben für die Molekulare Medizin vor allem die GrundgesetzArtikel 1 (Menschenwürde) und 2 (Recht auf Leben und körperliche Unversehrtheit) sowie der Artikel 5 (Wissenschaftsfreiheit) relevant. Eine ausführliche Interpretation der verfassungsrechtlichen Grundlagen kann hier nicht erfolgen. Allerdings soll darauf hingewiesen werden, dass auch unter Verfassungsrechtlern eine lebhafte Debatte darüber besteht, wie die verfassungsrechtlichen Vorgaben mit Blick auf die medizinische Forschung zu interpretieren sind: Dass die Würde des Menschen unantastbar ist, wie es im Artikel 1 des Grundgesetzes heißt, ist unbestritten. Wenig Einigkeit herrscht dagegen, wenn es um die Frage geht, was dies beispielsweise für die verbrauchende Embryonenforschung heißt [7 4.7.4.2 sowie Merkel (2002)]. Zudem müssen die im

Grundgesetz verankerten Grundrechte wie das Recht auf Leben und das Recht auf informationelle Selbstbestimmung im Konfliktfall gegen andere Grundrechte wie die Forschungsfreiheit abgewogen werden. Unabhängig von diesem verfassungsrechtlichen Interpretationsspielraum sind die für die Molekulare Medizin relevanten Forschungs- und Anwendungsfelder durch spezielle Gesetze reguliert. Genannt wurde bereits das Gentechnikgesetz, einschlägig sind zudem das Embryonenschutzgesetz (ESchG), das Stammzellgesetz (StZG) sowie das Arzneimittelgesetz (AMG) (7 4.7.4.2. und 4.7.4.4).

4.7.2 Wissenschaftstheoretische Vorbemerkungen Die Wissenschaftstheorie befasst sich u. a. mit der Frage nach den Kriterien, die herangezogen werden sollen, wenn eine Erkenntnis als eine spezifisch wissenschaftliche Erkenntnis qualifiziert werden soll [zur Einführung s. Janich (1997), Carrier (2006)]. Diese generelle Fragestellung ist in eine Reihe von Teilfragen zu zerlegen; so etwa wird untersucht, welche Arten wissenschaftlicher Erkenntnis sich unterscheiden lassen (empirische, analytische, synthetisch-apriorische, deskriptive, präskriptive u. a.) oder wie die jeweiligen wissenschaftlichen Erkenntnisse zustande kommen – eine Frage, die der Methodologie des wissenschaftlichen Erkennens zuzurechnen ist. Den methodologischen Fragestellungen wiederum ist auch das Bemühen um angemessene Rekonstruktionen des für einzelne Erkenntnisbereiche spezifischen Verhältnisses zwischen bestimmten Fertigkeiten und bestimmten Wissensformen zuzurechnen – des Verhältnisses von Können und Wissen (Gethmann 1996a). Die angemessene Bestimmung eines solchen Verhältnisses spielt v. a. auch für die Behandlung der ethischen Grundlagen der medizinbezogenen Biowissenschaften eine bestimmende Rolle, wie im Folgenden am Beispiel der Gentechnik illustriert werden soll.

4.7.2.1 Herstellungsapriori der empirischen Wissenschaften am Beispiel der Gentechnik Genetisches Wissen ist zunächst ein „knowing how“, kein „knowing that“, es verdankt sich sowohl historisch als auch systematisch einem bestimmten Können: der gezielten Intervention in den Genbestand. Vor der Entstehung der molekularen Biologie vollzog sich dieses „knowing how“ unter den Bedingungen erfahrungsgestützten Züchtens, ohne dass eine Theorie über die rele-

513 4.7 · Ethische Probleme der Molekularen Medizin

vanten biologischen Grundlagen zur Verfügung stand. Immerhin waren die Mendel-Gesetze als Versuch einer gesetzesmäßigen Verallgemeinerung der Züchtungserfahrung bereits ein gutes Beispiel für die Fundierung eines „knowing that“. Heute denkt man bei einem für das genetische Wissen einschlägigen Können eher z. B. an die Fähigkeit, DNA in das Genom eines Bakteriums zu integrieren. Dass das genetische Wissen auf einem Können „beruht“, bedeutet: Je mehr man wissen will, umso mehr muss man können. Geht man davon aus, dass genetisches Wissen in relevantem Umfang erwünscht ist, da man auf diesem Weg bestimmte Zwecke (z. B. die Therapie von Krankheiten) besser als bisher zu erreichen hofft, gilt wissenschaftsethisch ein Erweiterungsgebot: Damit mehr Wissen erworben werden kann, muss das zugrunde liegende Können verfügbar gemacht werden. Diese Haltung, Fähigkeiten und Fertigkeiten zu vergrößern, um bestimmte Zwecke realisieren zu können, kennzeichnet die Einstellung der meisten Fachwissenschaftler. Insofern ist der Vorwurf, im Rahmen der gentechnischen Forschung würde Forschung allein um der Forschung willen betrieben, vielleicht in Bezug auf die Motivation einzelner Forscher zutreffend, für die wissenschaftstheoretische Struktur dieser Wissenschaftsform jedoch generell uneinschlägig. Dass Wissen auf Können aufbaut, ist in den Wissenschaften keineswegs die Ausnahme. So wie die Gentechnik darauf beruht, in den Genbestand von Organismen eingreifen zu können, ist die Mechanik in der lebensweltlichen Fähigkeit zum Gerätebau fundiert; sie setzt ein Können voraus, etwa die Beherrschung einer Messpraxis, in der es auf festgelegte Weise mit Messinstrumenten wie Metermaß, Uhr und Waage zu hantieren gilt, deren Verfügbarkeit wiederum die Beherrschung des Messgerätebaus voraussetzt (Janich 1997). Ähnliches gilt – mutatis mutandis – für die empirischen Wissenschaften generell: Das (Herstellen-)Können ist Bedingung der Möglichkeit des Erkennens. In terminologischer Anlehnung an Kant lässt sich auch sagen, Erkenntnisproduktion in den empirischen Wissenschaften sei durch ein Herstellungsapriori gekennzeichnet [vgl. hierzu Mittelstraß (1974), insbesondere S. 75f].

4.7.2.2 Praktisches und poietisches Handeln Die empirischen Wissenschaften (z. B. Biologie und Physik) unterscheiden sich von den praktischen Wissenschaften (z. B. Medizin und Recht) insofern, als sie es vorwiegend mit einem herstellenden – poietischen – Handeln zu tun haben. Im Kontext des Arzt-PatientenVerhältnisses jedoch oder im Zusammenhang von Familie, Recht und Staat steht v. a. die Organisation des

4.7

zwischenmenschlichen – praktischen – Handelns zur Debatte. Praktisches Handeln unterscheidet sich vom Herstellen nicht durch Merkmale der Handlungsbeschreibung (eine Herstellungshandlung kann durchaus in einem praktischen Kontext stehen), sondern durch die Art des Misslingens. Während das Misslingen einer poietischen Handlung in im weitesten Sinn instrumentellen Störungen manifest wird, gilt eine praktische Handlung dann als gescheitert, wenn sie einen Konflikt zwischen den an der Handlung beteiligten Personen auslöst. So wird z. B. die genetische Modifikation von Pflanzen, die ja zunächst nur in die Sphäre des poietischen, des herstellenden Handelns gehört, dann auch mit den Kategorien des zwischenmenschlichen, praktischen Handelns beschreibbar, wenn sie (potenziell) Konflikte hervorruft – etwa zwischen demjenigen, der die Modifikation durchführen will oder sich von dem Produkt Linderung seiner gesundheitlichen Beeinträchtigung verspricht, einerseits und demjenigen, der solche Modifikationen als Eingriff in komplexe Naturzusammenhänge für zu riskant hält, oder demjenigen, der ein rechtsgültiges Patent auf das anzuwendende Modifikationsverfahren besitzt, andererseits. In diesem Zusammenhang werden in der Diskussion häufig zwei Funktionen des poietischen Handelns im Verhältnis zum Wissen miteinander vermengt: x die Applikationsebene und x die Konstitutionsebene. Während auf der Applikationsebene die Umsetzung des schon verfügbaren Wissens in poietisches Handeln erfolgt und damit das (Grundlagen-)Wissen durch die „Anwendung“ primär nicht erweitert wird, handelt es sich auf der Konstitutionsebene um eine Erweiterung des Wissens durch eine Erweiterung des Könnens; das Können dient der Wissenserzeugung. Diese Unterscheidung ist für die moralische Beurteilung gerade der Handlungen von Forschern von Bedeutung. Zunächst führt sie für die Grundlagenforscher zu einer Entlastung von Verantwortung, da diese nicht für alle Folgen (und Folgen von Folgen) einstehen müssen, die sich durch die Anwendung des von ihnen erzeugten Wissens durch andere ergeben. Die moralischen Probleme der Wissenserzeugung sind jedoch dem Grundlagenforscher aufzubürden, weil jeder für die unmittelbaren Folgen seines Handelns aufzukommen hat. Es wird häufig übersehen, dass – unbeschadet der Freiheit der Forschung – der Forscher schon bei der Wissenserzeugung (etwa bezüglich der Laborsicherheit) und nicht erst bei der Wissensanwendung Verpflichtungen zu übernehmen hat – Wissenserzeugung spielt sich ebenso wenig wie Wissensanwendung in moralisch indifferenten Räumen ab, aber die Träger der Verpflichtungen sind jeweils andere Akteure.

514

Sektion 4 · Therapie

4.7.2.3 Grundlagenforschung Somit ist auch die „Grundlagenforschung“ nicht moralisch indifferent; die Sphäre der Verpflichtung beginnt nicht erst mit der Anwendung von Erkenntnis. Es sind lediglich andere ethische Maßgaben, die bei der Wissenserzeugung und der Wissensanwendung zu beachten sind. In den Biowissenschaften, v. a. in der Gentechnik, verliert die Unterscheidung von Grundlagenforschung und angewandter Forschung daher auch zunehmend ihre Bedeutung. Wissenserzeugung und Wissensanwendung gehen zunehmend ineinander über und lassen sich immer weniger verschiedenen Professionen zuordnen (etwa nach dem Muster der Unterscheidung zwischen Naturforschern auf der einen und Ingenieuren oder Ärzten auf der anderen Seite).

4.7.3 Ethische Grundlagen 4.7.3.1 Moral und Ethik In den Kontroversen um die Molekulare Medizin stehen Fragen normativer Art zur Diskussion, d. h. Fragen danach, wie etwas sein soll, und nicht danach, wie etwas ist. Derartige Fragen im Zusammenhang mit der Gentechnik sind z. B.: x „Ist es verboten, Menschen zu klonen?“ x „Ist es erlaubt, transgene Tiere zu generieren?“ x „Ist es geboten, die Welternährung mittels der grünen Gentechnik sicherzustellen?“ Der Ethiker unternimmt es, Empfehlungen zu entwickeln und zu rechtfertigen, die geeignet sind, zur Lösung der kontroversen Fragen beizutragen. Zur Einführung in die Ethik finden sich weiterführende Literaturangaben zu Beginn der Bibliographie. Disziplin „Ethik“ Die Ethik ist eine akademische Subdisziplin der Philosophie und verfügt über alle dazugehörigen sozialen und kognitiven Attribute wie Lehrbücher, Axiomatiken und Methoden, Institute und Bibliotheken sowie Kongresse und Kontroversen. In der öffentlichen Debatte wird oftmals übersehen, dass sich die professionelle Ethik unter dem Titel „Bioethik“ (Gethmann u. Thiele 2005) schon seit Jahren mit den Problemen der Gentechnik – besonders der auf den Menschen bezogenen „roten“, aber auch der „grünen“ Gentechnik – befasst. Dabei ist die Bioethik keine „neue“ Ethik – vielmehr wird das methodische Instrumentarium der Ethik auf einen neuen Gegenstandsbereich angewandt. Da allerdings mit den durch die Gentechnik neu entwickelten Handlungsmöglichkeiten auch neues und z. T. eben auch für diesen Ge-

genstandsbereich spezifisches Konfliktpotenzial entsteht, sodass eine angemessene Beratung auch eine tiefere Kenntnis der wissenschaftlich-technischen Zusammenhänge erfordert, vermag es nicht zu verwundern, dass hier eine Spezialisierung innerhalb der Ethik stattgefunden hat. Andere Formen der Spezialisierung sind etwa die Technikethik oder die Wirtschaftsethik. Ethik und Moralen Gegenstand der Ethik sind in erster Linie Handlungsweisen von Akteuren (zur Bestimmung der „praktischen Subjekte“ 7 4.7.4.2 „Moralischer Status des menschlichen Embryos“): Es geht ihr nicht, jedenfalls nicht in der Hauptsache, um die Beurteilung einzelner empirisch beschreibbarer Handlungsvorkommnisse. Vielmehr werden Handlungen als Befolgung unterstellter Regeln rekonstruiert, die die Handlungs-„Üblichkeiten“, die Handlungsweisen eines Einzelnen oder einer Gemeinschaft bestimmen. Ein Ensemble solcher Regeln formuliert das „Ethos“ eines Einzelnen oder einer Gemeinschaft, am besten zu übersetzen als „das Übliche“ oder „das, was üblich ist“ (Marquard 1995). Gleichbedeutend mit dem griechischen Wort „Ethos“ ist der auf das Lateinische „mos“ zurückgehende Ausdruck „Moral“. Der entsprechende althergebrachte deutsche Ausdruck ist „Sitte“; gemeint ist ein Ensemble von Handlungsregeln, denen ein Mitglied einer Gemeinschaft meist implizit folgt, die ein Einzelner oder eine Gruppe als handlungsleitende Orientierung geltend machen, die sie als Rechtfertigungsgrund für ihr Handeln anerkennen oder denen sie unter gewöhnlichen Umständen fraglos folgen. Das Wort „Ethik“ sollte man, wie bei Namen von Disziplinen üblich, nur im Singular verwenden, auch wenn es mehrere Ansätze und Kontroversen gibt, sich verschiedene Ethiktypen oder ethische Theorien unterscheiden lassen. Moral(en) hingegen können auch im Plural auftreten: Moralen kann es so viele geben, wie es menschliche Gruppenbeziehungen gibt. So kann man Familienmoralen, Nachbarschaftsmoralen, Stammesmoralen, Standesmoralen, Klassenmoralen, religiöse Moralen, Staatsmoralen, Rassenmoralen, Wirtschaftsmoralen, Menschheitsmoralen u. a. m. unterscheiden. Eine Regel einer Familienmoral könnte z. B. lauten: „Bei uns soll es eine gemeinsame Mahlzeit pro Tag geben“. Eine Handlungsanleitung einer Wirtschaftsmoral könnte lauten: „Man soll schlechtem Geld kein gutes hinterherwerfen“. Schließlich sind auch Sätze einer Gruppenmoral wie „Du sollst nicht begehren deines Nächsten Weib!“ bekannt. Für die ethische Beurteilung solcher – praktizierter oder postulierter – Moralen sind Kriterien notwendig, die aber nicht ihrerseits letztlich wieder von Moralen abhängig sein dürfen – eine Empfehlung einer Handlungsanleitung zum Zweck der Beilegung von Konflikten

515 4.7 · Ethische Probleme der Molekularen Medizin

kann nämlich nur dann erfolgreich sein, wenn sie nicht eine Moral unterstellt, die derjenigen der anderen Konfliktparteien entgegensteht. Solche Kriterien sind Sollsätze, die nicht der Handlungsanleitung, sondern der Beurteilung von Handlungen dienen. Klassische Beispiele hierfür sind etwa die Goldene Regel „Was du nicht willst, dass man dir tu’ das füg’ auch keinem andern zu!“ (zit. nach Tobias 4.16, in abgewandelter Form bereits bei Isokrates zu finden) oder das sog. Utilitätsprinzip „Handle so, dass du durch deine Handlung das größte Glück der größten Zahl verwirklichst!“ (Bentham 1970). Ebenfalls als Kriterium der Handlungsbeurteilung anzusehen ist der kategorische Imperativ Kants: „Handle so, dass die Maxime deines Handelns jederzeit eine allgemeine Norm sein könnte!“ [in einer Kant (1994) nachempfundenen Kurzfassung]. Kant selbst gab verschiedene Fassungen an, unter denen die bekannteste Fassung wohl die erste Fassung ist: „Handle nur nach derjenigen Maxime, durch die du zugleich wollen kannst, dass sie allgemeines Gesetz werde“. Diese Regeln geben keine materialen Handlungsanleitungen an die Hand; vielmehr stellen sie formale Kriterien dar, die eine Handlungsanleitung wenigstens erfüllen muss, wenn sie für alle Parteien akzeptabel sein und einen Konflikt mit einiger Tragfähigkeit beilegen soll. Ethik als Konfliktbewältigung Solche Kriterien greifen natürlich nur dort, wo normative Fragen zur Beantwortung anstehen, die konfliktrelevant sind, die also – potenziell oder faktisch – durch zwei Parteien wesentlich verschiedene Antworten erfahren. Unter einem Konflikt ist dabei eine Situation zu verstehen, in welcher zwei Handelnde unvereinbare Zwecke anstreben. Zwei Zwecke sind unvereinbar, wenn ihre Realisierung nicht zugleich möglich ist. Es gibt vielerlei Weisen, einen Konflikt aus der Welt zu schaffen – darunter etwa diejenige, den Opponenten durch Anwendung von Gewalt oder List von seinen Zwecken abzubringen oder ihn gar zugleich mit seinen Zwecken zu liquidieren. Wird die Bewältigung von Konflikten mit den Mitteln argumentierender Rede versucht, sollte von diskursiver Konfliktbewältigung gesprochen werden. Die Ethik kann danach nun vereinfachend charakterisiert werden als die Kunst (und die Lehre ihrer Beherrschung), derartige konfliktbezogene Diskurse (Rechtfertigungsdiskurse) zu führen (Gethmann 1982; Gethmann u. Sander 1999). Ethischer Universalismus Der Erfolg solcher Diskurse ist von der Erfüllung einiger Voraussetzungen abhängig. Von besonderem Interesse ist die Entscheidung, wer als Teilnehmer an ethischen Diskursen zugelassen wird. Drei mögliche Typen von Entscheidungen sind denkbar:

4.7

1. Jemand könnte unterstellen, nur er selbst sei autorisiert, an moralischen Diskursen teilzunehmen und Verpflichtungen festzulegen (ethischer Solipsismus). Im Rahmen dieser Position können nur Konflikte gelöst werden, die der zugelassene Teilnehmer mit sich selbst hat. Obwohl es so scheinen mag, dass der ethische Solipsismus eine verbreitete Position ist, stellt er keine ernst zu nehmende Position der ethischen Reflexion dar. 2. Von größerer Bedeutung ist die Unterstellung, dass nur diejenigen, die einer bestimmten Gruppe angehören, am ethischen Diskurs teilnehmen dürfen (ethischer Partikularismus). Viele faktisch gültige Moralen sind von diesem partikularistischen Typ, weil sie die Teilnahme am Diskurs auf Personen mit bestimmten Merkmalen einschränken (Mitgliedschaft in einem bestimmten Stamm, einer sozialen Klasse, Religion, Rasse, Geschlecht usw.). Partikularistische Moralen können durchaus zufriedenstellend Konflikte innerhalb der jeweiligen Gruppe, für die sie gültig sind, lösen (z. B. als Standesmoral); sie finden allerdings dort ihre Grenze, wo Konflikte über Gruppengrenzen hinweg auftreten können. 3. Wird von einer Moral ein möglichst hohes Konfliktlösungspotenzial erwartet, sollte jedermann das Recht haben, an einem ethischen Diskurs teilzunehmen (ethischer Universalismus). Dementsprechend sind die drei großen Modelle der Ethik, – die Tugendethik (Aristoteles), – die Verpflichtungsethik (Kant) und – die Nutzenethik (Bentham) am Universalismus orientiert. Auch mit Blick auf die Ausweitung der Interaktions- und damit der Konfliktmöglichkeiten im Zug der Globalisierung ist der ethische Universalismus daher die angemessenste Position (Gethmann 2000). Ethik und Politik Im Falle komplexer politischer Entscheidungen, die eine sorgfältige Abwägung erfordern, suchen Politiker in aller Regel den Rat einschlägiger Experten: Steuerreformen und Klimapolitik beruhen zumindest teilweise auf wissenschaftlicher Expertise. Zwar werden in der politischen Entscheidungsfindung oft nicht nur wissenschaftliche Informationen berücksichtigt, doch zeigt sich in diesem Umstand eher ein organisatorisches Defizit, insofern es wünschenswert ist, dass Entscheidungsfindung im Rahmen der Wissenschaftspolitik rational relativ zu bestimmten Standards ist. Politische Entscheidungsfindung durch wissenschaftliche Beratungsgremien zu unterstützen, hat eine lange Tradition und insofern Ethik eine Wissenschaft ist, spricht daher vieles für die Unterstützung politischer Entscheidungsfindung in

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Sektion 4 · Therapie

Fragen der Lebenswissenschaften durch Ethik-Komitees. Allerdings wird vereinzelt auch die Auffassung vertreten, dass die Ethik als genuines Mittel politischen Handelns gebraucht werden könnte. In diesem Falle stünde dann auch der Vorwurf des Missbrauchs der Ethik für politische Zwecke im Raum (Kuhlmann 2001).

4.7.3.2 Mensch und Natur Der Mensch hat zur Sicherung seiner Existenz und zur Besserung seiner Lebensumstände in einer nicht stets nur menschenfreundlichen Natur schon vor langer Zeit durch Züchten in den genetischen Bestand verschiedener Tier- und Pflanzenspezies eingegriffen, um sie seinen Zwecken gemäß zu verändern (Janich u. Weingarten 1999). Kaum je ist dies in der Vergangenheit für grundsätzlich moralisch verwerflich erklärt worden, und es sind auch aus heutiger Sicht keine diesbezüglichen triftigen Argumente gegen züchterisches Handeln zu erkennen. Durch die Gentechnik werden zunächst lediglich die Instrumente der Intervention in den Genbestand verfeinert, ohne dass sich an der zweckgemäßen Planung des Züchtens und seiner moralischen Qualifikation etwas ändert. Dies wäre nur dann der Fall, wenn der direkte Eingriff in die genetische Konstitution eines Organismus moralisch anders zu bewerten wäre als der traditionelle Eingriff mittels Züchtung durch Reproduktion ganzer Individuen. Zwar werden gelegentlich solche Behauptungen vorgebracht, die allerdings notorisch unbegründet bleiben. Wenn sich bestimmte Zwecke, die Menschen in Bezug auf die Natur haben – etwa Nahrungsmittelgewinnung oder die Behandlung von Krankheiten – gegenüber jedermann rechtfertigen lassen, ist eine Intervention in den Genbestand aus ethischer Sicht nicht nur eine erlaubte, sondern u. U. sogar eine gebotene Handlungsoption. Natürliche Bedingungen und menschliche Zwecksetzungen Zwecke, deren Realisierung Menschen planen, sind keine Naturphänomene, sondern kulturelle Setzungen. Sie können je nach Lebens- und Handlungsumständen sehr unterschiedlich sein und sich auch mit diesen ändern. Sie sind darum jedoch keineswegs der Beliebigkeit anheimgestellt. Die Realisierung solcher Zwecke hängt oft davon ab, was technisch möglich ist, was „die Natur zulässt“. Jedoch zieht „die Natur“ allenfalls Grenzen des Machbaren, nicht jedoch bereits von sich aus Grenzen des Erlaubten – sei es, dass Wasser aus einem Fluss auf einen Acker umgeleitet, sei es, dass Saatgut gentechnisch verändert werden soll: Für die Frage, ob eine Intervention in „die Natur“ ethisch rechtfertigbar ist oder nicht, ist

nicht der Hinweis auf die natürlichen Gegebenheiten, sondern der Hinweis auf die normativen Erfordernisse ausschlaggebend (Birnbacher 2006). Bei der Ermittlung dieser Erfordernisse spielt natürlich auch das durch die Naturwissenschaften bereitgestellte Kausalwissen eine bedeutende Rolle, da Konflikte ja gerade auch dann entstehen, wenn ein anderer von den (Fern-)Folgen einer Handlung in unwillkommener Weise betroffen ist (in Fortführung der Beispiele: Das Feld des Nachbarn liegt trocken, das Risiko evtl. entstehender Monokulturen schränkt die Handlungsmöglichkeiten zukünftiger Generationen ein). Argumente gegen gentechnische Interventionen lassen sich daher auch nicht allein auf die gegenüber der züchterischen Praxis so neuartigen Instrumente gewinnen – die ethische Beurteilung eines Einsatzes dieser Instrumente gründet allein auf der Verträglichkeit der mit deren Einsatz verbundenen sicheren und riskierten Folgen mit den Zwecksetzungen von jedermann. Anthropozentrismus und Pragmazentrismus In Beiträgen zur ökologischen Ethik wird häufig gefordert, dass der sog. Anthropozentrismus, also diejenige Position, die menschliches Handeln als den Ausgangspunkt moralischer Überlegungen wählt, zugunsten eines Biozentrismus, der die Natur in den Mittelpunkt stellt, (und anderer Zentrismen) aufgegeben werden sollte [zur Einführung in die ökologische Ethik s. Krebs (1997), Nida-Rümelin u. von der Pfordten (1995)]. Demgegenüber kann keine dieser Positionen darum herumkommen, dass sich ihre wie auch immer gerechtfertigten Aufforderungen an Menschen richten. Dies dokumentiert, dass der Mensch als Akteur für sich selbst und in seiner seine Handlungen fundierenden Wirklichkeitserfassung unhintergehbar ist. Natürliche Handlungsumstände sind nur als Bedingungen und Begrenzungen des menschlichen Machens und Handelns gegeben. Dies schließt allerdings nicht aus, dass der Mensch seine Handlungsumstände in vielen Fällen als „anders“, als nichtmenschlich erlebt. Ein solchermaßen verstandener struktureller Pragmazentrismus schließt aber keineswegs aus, dass der Mensch mit seinen Handlungszwecken in Konflikte mit Zwecken geraten kann, die in nichtmenschlichen, natürlichen Objekten gewissermaßen involviert sind (Gethmann 2002). Daher lässt sich in diesem Sinn auch problemlos von „Rechten der Natur“ sprechen. Die nichtmenschlichen Naturwesen haben „Anspruch“ darauf, vom Menschen verantwortlich behandelt zu werden [zu diesem sog. tutorischen Modell der Verantwortung des Menschen gegenüber der Natur siehe exemplarisch für den Tierschutz Gethmann (2001)]. Die Respektierung der Natur durch den Menschen hat aber dort ihre Grenzen, wo es um das Zweck-Mittel-Verhältnis zwischen

517 4.7 · Ethische Probleme der Molekularen Medizin

moralischen Subjekten (7 4.7.4.2 „Moralischer Status des menschlichen Embryos“) und anderen Wesen geht. Im Konfliktfall darf das moralische Subjekt niemals instrumentalisiert werden, d. h. vollständiges Mittel für nichtmenschliche Wesen sein. Naturgemäßes Handeln Dem hier skizzierten Ansatz zufolge heißt naturgemäß zu handeln nicht, moralische Regeln an bestimmten natürlichen (biologischen oder physikalischen) Eigenschaften von Gegenständen und Lebewesen abzulesen, wie es gemäß bestimmter Lesarten von „Naturethik“ und „Naturrecht“ gesehen wird (Altner 1991; MeyerAbich 1997). Naturgemäß handeln heißt demnach vielmehr, die Handlungsorientierungen mit Rücksicht auf die Tatsache zu setzen, dass vieles (einschließlich unserer selbst) ohne unser Zutun entstanden ist, dass wir uns und andere Gegenstände nicht nur als bloße Produkte unserer selbst behandeln können (Fey u. Gethmann 2001). Dies lässt sich an dem schon von Aristoteles herangezogenen Beispiel des Verhältnisses des Bildhauers zu seinem Werk illustrieren: Der Bildhauer muss, um erfolgreich sein Werk zu schaffen, die Natur des Stoffes respektieren. Dieser Respekt vor der Natur schließt jedoch nicht aus, dass die Skulptur vollständig sein Werk ist. Der Bildhauer und niemand sonst, auch keine „Natur“, hat etwas am Werk getan – der Bildhauer und die Natur treten nicht als Autorenkollektiv auf. Naturgemäß handeln heißt, anzuerkennen, dass das Spektrum der Handlungsmöglichkeiten beschränkt ist – es heißt nicht, dass das Spektrum auf genau eine Handlungsmöglichkeit eingeschränkt ist. Selbst wenn wir nicht machen können, was wir wollen, sagt uns die Natur nicht, was wir sollen. Bei den Fragen nach der Zulässigkeit gentechnischer Interventionen werden stereotyp zweierlei Arten von Befürchtungen geäußert, die in der faktischen Diskussion oft vermischt auftreten: 1. Zum einen geht es um eine Beurteilung der Gefahren, die dem Menschen und seiner natürlichen Umgebung durch die Gentechnik drohen – hier handelt es sich um eine Risiko-Chancen-Abwägung, die ein Abwägungsproblem aufwirft, bzw. um die Fragen, ob es prinzipielle Grenzen für die Abwägung von Chancen und Risiken gibt (vgl. dazu den folgenden Abschnitt). 2. Zum anderen stößt die Gentechnik aber nicht nur wegen ihres Gefahrenpotenzials auf Ablehnung, sondern wegen eines Verlusts an Vertrautheit mit der natürlichen Umgebung, der durch sie vermeintlich oder tatsächlich herbeigeführt wird. Die „Schiege“ – halb Schaf, halb Ziege – wird vermutlich nicht wegen ihres Risikopotenzials als bedrohlich empfunden. Vielmehr wird die Hervorbringung solcher We-

4.7

sen wohl deshalb zumeist abgelehnt, weil sie als Angriff auf die Vertrautheit mit der Natur erfahren wird. Damit stellt sich die Frage, ob es so etwas wie das Recht auf Vertrautheit mit der natürlichen Umgebung, man könnte auch sagen: ein „Naturheimatrecht“, gibt, das zwar keine Konstanz der natürlichen Umgebung, wohl aber so etwas wie ein Recht auf eine moderate Veränderungsgeschwindigkeit beinhaltet. Man wird also, gerade im Blick auf die Gentechnik, nicht nur zu überlegen haben, ob die Naturveränderung in bestimmten Dimensionen gefährlich ist, sondern ob z. B. in bestimmten Bereichen die Verlangsamung von Veränderungsgeschwindigkeiten (etwa durch Moratorien) zu fordern ist. Hare (1981, deutsch 1992, S. 160–165) hat darauf hingewiesen, dass die Präferenzen eines Individuums in aller Regel eine Zeitorientierung besitzen. Er unterschied zwischen „Jetzt-für-Jetzt“-, „Jetzt-für-Dann“- und „Dann-für-Dann“-Präferenzen. Aus moralpsychologischer Sich ist es daher verständlich, wenn jemand die „Jetzt-für-Jetzt“- und vielleicht auch die „Jetzt-fürDann“-Präferenz hat, dass eine bestimmte Technik, z. B. die Keimbahntherapie, nicht zur Anwendung kommt. Es ist in vielen Fällen aber fraglich, ob, sollte die Keimbahntherapie einmal eine im technischen Sinn sichere Methode sein, die „Dann-für-Dann“-Präferenz immer noch gegen die Anwendung der Keimbahntherapie sprechen würde.

4.7.3.3 Grenzen des Abwägens In Bezug auf die Wissenschaftsentwicklung erscheint es – zumindest prima facie – ratsam, sich so zu verhalten, wie man sich auf Neuerungen aller Art lebensweltlich verhält: Man sollte versuchen, die Chancen einer Entwicklung zu ergreifen und die mit ihr gegeben Risiken zu vermeiden. Insofern ist die Rationalität des Handelns hier wie in allen anderen lebensweltlichen Kontexten zunächst durch das Abwägen von Chancen gegen Risiken ausgezeichnet. Durch elementare Beispiele kann man sich jedoch leicht vor Augen führen, dass Menschen keineswegs immer bereit sind, ihre Urteilsbildung über Handlungsoptionen allein an dem Ergebnis eines solchen Abwägens auszurichten. Das Halten gegebener Versprechen, das Verwerfen des Lügens, das Gebot der Hilfeleistung sind elementare normative Überzeugungen, die viele für empfehlenswert halten und an denen sie auch dann festhalten, wenn die Nachteile des Festhaltens an diesen Überzeugungen im Einzelfall nahe legen, zu lügen, ein Versprechen nicht zu halten oder eine Hilfeleistung zu verweigern.

518

Sektion 4 · Therapie

Kategorische und pragmatische Grenzen der Abwägbarkeit Es bedarf keiner langen Debatte, in der Entwicklung der Gentechnik Chancen zu erkennen, die man nach Abwägung gegen die Risiken ergreifen möchte. Aber es ist zu fragen, ob es Grenzen des Abwägens zwischen Chancen und Risiken geben sollte und ob durch diese Grenzen ein Korridor der Handlungsoptionen auszuzeichnen ist, dessen Begrenzungen aus ethischen Gründen nicht überschritten werden dürfen, sodass für derartige Fälle ein unbedingtes, d. h. kategorisches Verbot gerechtfertigt wäre. Ein Beispiel für eine solche Grenze ist das Verbot, einen Menschen vollständig zu instrumentalisieren – d. h. lediglich als Mittel zu verwenden. (Dieses – auf eine der Fassungen von Kants kategorischem Imperativ zurückgehende – Verbot findet sich in der sog. Objektformel auch in der richterlichen Auslegung des Menschenwürdeparagrafen des Grundgesetzes durch das Bundesverfassungsgericht.) So muss z. B. geprüft werden, ob bei der Forschung an menschlichen Embryonen bzw. beim (vorstellbaren) reproduktiven Klonen der Embryo bzw. der Klon in moralisch unzulässiger Weise instrumentalisiert wird [7 4.7.4.2„Moralischer Status des menschlichen Embryos“, zur moralischen Beurteilung des reproduktiven Klonens s. Gethmann u. Thiele (2001)]. Innerhalb eines solchen Korridors ist eine Lösung des beschriebenen Konflikts zwischen möglichem Schaden (Risiko) und möglichem Nutzen (Chance) durch eine Abwägung möglich, für die sich Rationalitätsstandards formulieren lassen (Shrader-Frechette 1991). Zu diesen könnte ein Optimierungsprinzip gehören, das besagt: „Wähle diejenige Handlungsoption, bei deren Realisierung die mögliche Chance das mögliche Risiko (maximal) übersteigt.“ Ferner wird vorgeschlagen, in Bezug auf das zwischenmenschliche Handeln ein Konsistenzprinzip annehmen: „Lasse dir das Risiko zumuten, das du dir und andern auch sonst ceteris paribus zumutest“ (Gethmann 1993a). So einfach diese Normen der Optimierung und Konsistenz zu verstehen sind, so schwierig gestalten sich die Operationalisierungs- und Subsumtionsprobleme. Für die ordinale oder gar kardinale Vergleichbarkeit von Risiken und Chancen ist vorausgesetzt, dass die Wahrscheinlichkeit von Ereignissen sicher eingeschätzt werden kann, was bei seltenen Ereignissen aus methodischen Gründen nur sehr grob möglich ist. Ferner ist für eine Abwägung, die dem erforderlichen Präzisionsniveau genügt, eine einigermaßen sichere Einschätzung der er-

wartbaren Nutzen und Schäden erforderlich. Schließlich wirft die Aggregation von Risiko-Chancen-Abwägungen bei kollektiven Akteuren (Familien, Gruppen, Gesellschaften) große methodische Probleme auf. In Bezug auf das letztgenannte Problem ist es allerdings häufig hilfreich, die infrage stehende Handlungsweise (z. B. die Präimplantationsdiagnostik) mit bestehenden und moralisch bereits bewerteten Handlungsweisen (z. B. die Abtreibung nach pränataler Diagnostik) zu vergleichen. Zu den moralischen Problemen, die keiner grundsätzlichen Abwägung zugänglich sind, gehören die Rechte Angehöriger künftiger Generationen (Langzeitverantwortung). Würde man nämlich die Verpflichtung für künftige Generationen nach dem Muster von Chancen-Risiko-Abwägungen debattieren, würde die Verpflichtung aufgrund der Diskontierungseffekte schnell erlöschen (Birnbacher 1988; Gethmann u. Kamp 2000). Die Langzeitverpflichtung spielt in der Diskussion um die Gentechnik eine wichtige Rolle, z. B. im Zusammenhang mit der Forderung, aus Verpflichtung gegenüber dem „Erbe der gesamten Menschheit“ sei eine Verantwortung für den Genpool zu übernehmen (UNESCO 1997). Das Grundproblem der Langzeitverpflichtung ist ihre Rechtfertigbarkeit. Einen möglichen Ansatz bildet die Überlegung, dass die Annahme einer befristeten Geltung von Menschenrechten in einen pragmatischen Widerspruch führen würde. Der Widerspruch zeigt sich, wenn man sich klarmacht, dass jede Befristung auf die n-te Generation gegenüber der n+1-ten Generation Willkür wäre (Hofmann 1981). Allerdings ist Vorsicht geboten, aus der unbeschränkt gültigen Zukunftsverpflichtung unmittelbar materielle Schlüsse zu ziehen. Der unbeschränkt gültigen Verpflichtung steht eine Abschattung der Verbindlichkeit gegenüber. Diese Abschattung könnte z. B. so operationalisiert werden, dass sich ab der Generation der Kinder der Enkel die Verbindlichkeit halbiert. Diese Verminderung lässt sich damit begründen, dass der Verantwortliche spätestens hier nicht mehr zur handelnden Generation gehört. Die Fernfolgenverantwortung beinhaltet dennoch, dass für keine Generation nach uns der Grad der Verantwortung = 0 beträgt (Gethmann 2001).

4.7.4 Ausgewählte Probleme der bioethischen Diskussion Das breite Spektrum der in der Bioethik diskutierten Probleme sowie deren ethische Komplexität lässt sich anhand ausgewählter, in der aktuellen Diskussion besonders diskutierter Probleme exemplarisch dokumentieren; für weiterführende Literatur siehe z. B. die Text-

519 4.7 · Ethische Probleme der Molekularen Medizin

sammlungen von Düwell u. Steigleder (2003), Kuhse u. Singer (2006), Sass (1989) sowie die Lexika von Chadwick (1998), Post (2003) und Korff et al. (1998).

4.7.4.1 Fragestellungen Grundsätzlich ist zwischen medizinethischen Fragestellungen im engeren Sinn – also von solchen Fragen, die primär im Rahmen der medizinischen Praxis entstehen – und im weiteren Sinn – also von Fragen, die die ethische Beurteilung biowissenschaftlicher Forschung betreffen – zu unterscheiden [zur Einführung in die medizinische Ethik: Beauchamp u. Childress (2001), Beckmann (1996), Thiele (2005b), Wiesing (2000)]. Zu den medizinethischen Fragen im engeren Sinn gehören Fragen, die den Krankheitsbegriff (Lanzerath 2000; Wieland 1975) oder das Arzt-Patienten-Verhältnis (Wieland 1985) betreffen, aber auch Fragen, die sich am Beginn (z. B. Präimplantationsdiagnostik, Abtreibung und Therapiemaßnahmen bei schwerstgeschädigten Neugeborenen) und am Ende des menschlichen Lebens (z. B. Sterbehilfe) stellen, sowie Fragen der Allokation von Ressourcen im Gesundheitswesen. [In Kuhse u. Singer (2006) findet sich eine Auswahl von Texten, die verschiedene Positionen abdecken. Zur moralischen Problematik am Lebensbeginn s. auch Birnbacher (2000), Hoerster (1995a,b) und Merkel (2001), zur Sterbehilfediskussion Battin et al. (1998), Gose et al. (1997), Hegselmann u. Merkel (1992), Hoerster (1998), Kutzer (1997, 2001), Singer (1994), Spaemann (1997), Thiele (2005a) sowie Steinbock u. Norcross (1994), zur Rationierung in der Medizin Breyer et al. (2001), Ethik in der Medizin (2001), Kirch u. Kliemt (1997), Nagel u. Fuchs (1998).] Zwar mögen sich manche dieser Fragen aufgrund von Entwicklungen der molekularen Medizin verschärft stellen, doch sind sie nicht primär durch die molekulare Medizin hervorgerufen. Demgegenüber sind durch die Entwicklung der molekularen Medizin Handlungsoptionen eröffnet worden, die die Arzt-Patienten-Sphäre grundsätzlich oder derzeit jedenfalls faktisch überschreiten. Durch die Ergebnisse der Humangenomforschung sind nie da gewesene Hoffnungen für die Prävention, Diagnose und Therapie von Erkrankungen geweckt worden. Diese Forschung birgt erhebliche Risiken. In diesem Kontext ist es sinnvoll, zwischen medikotechnischen Problemen der Humangenomforschung (z. B. den Sicherheitsstandards von Gentherapieprotokollen) und moralischen Problemen (z. B. der moralischen Akzeptabilität von Interventionen in das menschliche Genom) zu unterscheiden. Die folgende Darstellung beschränkt sich auf diese zuletzt genannten moralischen Probleme. Vor allem folgende Kontexte finden in der Öffentlichkeit derzeit besondere Beachtung:

4.7

x die Forschung an menschlichen Embryonen (7 4.7.4.2 „Moralischer Status des menschlichen Embryos“), x die Anwendung gentechnischer Methoden in der (medizinischen) Praxis (7 4.7.4.3 „Genetische Testverfahren“, 7 4.7.4.4 „Gentherapie am Menschen“) sowie x die mit der wirtschaftlichen Verwertung gentechnischer Forschungsergebnisse verbundenen Probleme (7 4.7.4.5 „Patente auf Biomaterialien“).

4.7.4.2 Moralischer Status des menschlichen Embryos Die moralische Zulässigkeit der Forschung an menschlichen Embryonen bzw. der Präimplantationsdiagnostik wird derzeit kontrovers diskutiert [zur Einführung s. Solter (2003); vgl. auch Birnbacher (1996), Deutsche Forschungsgemeinschaft (2001), Gerhardt (2001), Lauritzen (2001), Singer et al. (1990)]. Inhaltlich eng damit verbunden sind moralische Fragen der Abtreibung und das Schicksal schwerstgeschädigter Neugeborener. Letztere werden in diesem Kapitel, das den moralischen Problemen der Molekularen Medizin gewidmet ist, nicht behandelt. Allerdings sind die Problembereiche inhaltlich eng verbunden, sodass der Interessierte aus der reichlich vorhandenen Literatur viel für das vorliegende Thema profitieren kann. Bei der Diskussion hinsichtlich der moralischen Zulässigkeit der Forschung an menschlichen Embryonen bzw. der Präimplantationsdiagnostik stehen zwei Fragen im Vordergrund: 1. Welche Eigenschaft muss ein menschlicher oder Primatenembryo, ein Fetus usw. haben, damit von einem praktischen Subjekt, ausgestattet mit bestimmten Rechten, wie z. B. dem Recht auf Leben, gesprochen werden kann? 2. Unabhängig davon ist zu klären, ob diejenigen Rechte, die wir praktischen Subjekten zuschreiben, diesen immer und immer in vollem Umfang zukommen oder Abwägungen zugänglich sind. Welche Eigenschaft muss etwas haben, damit es ein praktisches Subjekt ist? Bezüglich dieser ersten Frage können drei Positionen unterschieden werden (Gethmann 1998a): 1. Speziezismus

Anhänger der ersten Position behaupten, dass alle und nur Mitglieder der Spezies Homo sapiens auch praktische Subjekte seien [Baumgartner et al. (1998), EKD/DBK (1989)]. Diese Position ist weit verbreitet und brächte es mit sich, dass zumindest ab dem Zeitpunkt der Ver-

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Sektion 4 · Therapie

schmelzung von Ei und Samenzelle ein moralisches Subjekt vorliegt. (Es wird zumeist angenommen, dass Ei- und Samenzelle vor der Verschmelzung noch keine moralischen Subjekte sind. Warum das so sein soll, wird nicht begründet.) Diese Position wird als Speziezismus kritisiert, da sie auf starken, oft implizit religiösen, nicht begründeten Prämissen beruht. Deutlich wird der religiöse Bezug in EKD/DBK (1989); zur Kritik am Speziezismus sei auf Gethmann (1998a) und Merkel (2002a) verwiesen. Zudem ist es in bestimmten Fällen gegenintuitiv anzunehmen, dass nur Mitglieder unserer Spezies moralische Subjekte sein können. Besonders aufschlussreich ist hierfür die Beschreibung von Singer (1994, Kap. 8) des Lebens „einiger Leute“ mit herabgesetzten intellektuellen Fähigkeiten – gemeint sind Menschenaffen –, die gleichwohl Anzeichen moralischen und politischen Handelns zeigen. Zur Unterstützung des Speziezismus werden oftmals sog. Potenzialitätsargumente herangezogen: Danach sind Embryonen moralische Subjekte, weil sie sich, wenn ihre Entwicklung nicht unterbunden wird, aller Wahrscheinlichkeit nach zu voll ausgebildeten Menschen, die ja zweifelsfrei moralische Subjekte sind, entwickeln werden [Baumgartner et al. (1998), S. 228ff, Schöne-Seifert (2002), Wieland (2002)]. Die Problematik dieses Arguments lässt sich an einem Beispiel zeigen: Wären Potenzialitätsargumente grundsätzlich korrekt, dann müsste auch folgendes Argument gelten: x Jeder erwachsene Bürger ist bei Bundestagswahlen wahlberechtigt. x Kinder sind potenzielle, erwachsene Bürger. x Daher müssen Kinder bei Bundestagswahlen ihre Stimme abgeben dürfen. Nun haben Kinder in Deutschland kein Wahlrecht bei Bundestagswahlen. Zwar lässt sich darüber diskutieren, ob es zweckmäßig ist, das Wahlalter auf 18 Jahre festzulegen oder ob ein Mindestalter von 21 oder 12¾ Jahren angemessener sei. Nur wird eine solche Diskussion nicht mit Argumenten der Art geführt werden, dass Kinder bzw. Jugendliche das Potenzial hätten, erwachsen zu werden, sondern mit Argumenten, die sich auf bestimmte Fähigkeiten richten, die diese Kinder bereits an den Tag legen. Ebenso erscheint es fragwürdig, Embryonen schon deshalb als moralische Subjekte anzusehen, weil sie das Potenzial haben, voll ausgebildete Menschen zu werden. Eine gründliche Rekonstruktion der Potenzialitätsargumente würde zeigen, dass es sich um ein Ensemble sehr unterschiedlicher Argumentationstypen (mit Familienähnlichkeit) handelt (Merkel 2001, S. 476].

2. Pathozentrismus

Die zweite Position ist durch die Auffassung gekennzeichnet, dass moralische Subjekte die Eigenschaft haben, „bewusstseinsfähig“ oder „leidensfähig“ zu sein (Birnbacher 1996; Hoerster1995b; Singer 1993, besonders Kap. 2). Folgt man diesem Ansatz, bedeutet dies zum einen, dass einige Mitglieder der Spezies Homo sapiens (evtl. Embryonen) möglicherweise keine praktischen Subjekte sind, und zum anderen, dass es moralische Subjekte geben kann, die nicht Mitglied der Spezies Homo sapiens sind – Kandidaten hierfür sind z. B. Primaten. Dies hätte dann Implikationen insbesondere auch für den Tierschutz (Nida-Rümelin 2005; Nida-Rümelin u. von der Pfordten 2005). Problematisch ist diese Position, wenn sie auf der Grundlage eines ethischen Naturalismus formuliert wird. [Zur Einführung in die Debatte zum Naturalismus siehe z. B. Frankena (1939)] Naturalistische Ansätze definieren normative Begriffe, wie z. B. „das Gute“ oder auch „praktisches Subjekt“ mithilfe deskriptiver Begriffe wie z. B. „Leidensfähigkeit“. Es stellt sich aber für jede dieser Definitionen zunächst die Frage, ob sie adäquat ist. Vor allem aber besteht ein normatives Defizit: Eine Forderung ist nicht bereits dadurch gerechtfertigt, dass etwas der Fall ist. 3. Pragmazentrismus

Die dritte hier zu erwähnende Position ist die des oben schon angeführten Pragmazentrismus, der argumentiert, dass es sich bei praktischen Subjekten um diejenigen handelt, die Urheber ihrer eigenen Handlungen (Akteure) sind (Gethmann 1998a). Handlungen können, wie zu Beginn dieses Kapitels beschrieben, Konflikte erzeugen. Ethik zielt darauf, Strategien zur Konfliktbewältigung zu entwickeln und den konfligierenden Akteuren durch Gründe gerechtfertigt zu empfehlen. Die Definition praktischer Subjekte als Akteure fügt sich daher leicht in die Rekonstruktion der Ethik als Instrument der Konfliktbewältigung ein. In Bezug auf die Forschung an menschlichen Embryonen lässt diese Positionen erhebliche Zweifel daran zu, ob Embryonen in einem vernünftigen Sinn als Akteure angesehen werden können. Anwendung der Kriterien

Für welche der 3 Positionen man sich auch entscheidet, es ist von besonderer Bedeutung, auf welche Weise in der Praxis festgestellt werden kann, ob etwas, von dem wir vermuten, dass es ein praktisches Subjekt ist, die dafür notwendigen Kriterien auch tatsächlich erfüllt. Mit Blick auf die menschliche Entwicklungsphase vor der Geburt, aber auch mit Blick auf extrem behinderte Menschen, bestehen erhebliche Probleme, dies festzustellen.

521 4.7 · Ethische Probleme der Molekularen Medizin

Am einfachsten würde dies – Einigkeit über den zugrunde gelegten Speziesbegriff unterstellt – noch beim Kriterium „Mitglied der Spezies Homo sapiens“ gelingen – z. B. durch einen Gentest oder eine andere Methode der Artbestimmung. Allerdings wurden oben einige Argumente skizziert, die gegen diesen Ansatz sprechen. Plausibler scheinen dagegen zunächst Kriterien wie Bewusstseinsfähigkeit oder Leidensfähigkeit. Allerdings bedarf es für diese Kriterien weiterer verhaltensbeschreibender Ausdifferenzierungen, um zu entscheiden, ob sie erfüllt sind oder nicht (wie unterscheidet man ein bewusstloses Wesen von einem Lebewesen mit Bewußtseinsfähigkeit usw.). Zudem bliebe auch hier das Naturalismusproblem ungelöst. Aber auch dann, wenn Urheber von Handlungen (Akteure) moralische Subjekte sind, bleibt das Problem bestehen, ein praxistaugliches Verfahren zu etablieren, das die Differenzierung von Akteuren und Nichtakteuren erlaubt. Dabei wird man mit einer gewissen Fehleranfälligkeit rechnen müssen, die aber nicht, wie oft behauptet, gegen andere als das (wenig fehleranfällige) Spezieskriterium spricht. Bei allen Praxisregeln tritt dieses Problem auf und lässt sich in der Regel mit einer „Sicherheitsmarge“ in akzeptabler Weise beheben. Allerdings ist die Festlegung von Praxisregeln keine rein philosophische Aufgabe; moralische Überlegungen dazu, welche Kriterien geeignet sind, sollten mit dem besten verfügbaren naturwissenschaftlichen Wissen für eine praxistaugliche Regelung kombiniert werden. Rechte praktischer Subjekte und ihre Schranken Wenn geklärt worden ist, was wir als praktisches Subjekt anerkennen sollten, muss immer noch die zweite, davon unabhängige Frage untersucht werden, welche Rechte moralischen Subjekten zukommen und wann und in welchem Umfang dies der Fall ist. In der moralischen Debatte um die Zulässigkeit der Forschung an menschlichen Embryonen wird diese Differenzierung oft vernachlässigt: Auch wenn vorausgesetzt wird, dass Embryonen moralische Subjekte sind, was nach dem zuvor Gesagten keineswegs unumstritten ist, ist damit noch kein hinreichendes Kriterium dafür abgegeben, welche Rechte Embryonen dadurch zukommen. Es ist daher problematisch, wenn es in einem gemeinsamen Dokument der deutschen Kirchen heißt, dass „von der Sache her } die Verknüpfung des Gedankens der Gottebenbildlichkeit bzw. der Würde des Menschen mit dem unbedingten Lebensrecht des Menschen zwingend“ sei (EKD/DBK 1989, IV.2). Recht auf Leben

Das in diesem Zusammenhang zentrale Recht ist das Recht auf Leben. Zwar ist es nicht kontrovers (wenn auch nicht trivial), dass jedem moralischen Subjekt ein Recht

4.7

auf Leben zukommt. Die für die Forschung an Embryonen entscheidende Frage ist aber nicht, ob Embryonen ein Recht auf Leben haben, sondern, ob dieses Recht auf Leben uneingeschränkt gilt. Sollte dies der Fall sein, wie oftmals behauptet wird, dann wäre die Forschung an Embryonen, aber auch die Abtreibung eines Fetus unter allen Umständen moralisch verwerflich. Allerdings ist die Annahme eines uneingeschränkten Rechts auf Leben für Embryonen nicht plausibel: Wenn ausgewachsene Menschen kein unbedingtes Lebensrecht haben, wie dies bei Notwehr und im („gerechten“) Krieg der Fall ist, aus welchen Gründen sollte dann ein uneingeschränktes Lebensrecht für Embryonen gerechtfertigt sein? Hier wird nicht behauptet, dass gegenüber dem Embryo eine Notwehrsituation bestünde; hier wird lediglich argumentiert, dass unter bestimmten Umständen das Lebensrecht in moralisch gerechtfertigter Weise eingeschränkt sein kann. Aus Gründen der Konsistenz erscheint es daher nicht plausibel anzunehmen, dass Embryonen ein uneingeschränktes Lebensrecht zukommen soll, wenn dies bei Erwachsenen und Feten nicht der Fall ist. Abwägungen zwischen Handlungsoptionen

Wenn eine Abwägung zwischen den Schutzgründen zugunsten des Embryos und den Gründen, die für eine Einschränkung seines Lebensrechts gelten, getroffen werden muss, bedeutet dies nicht zwangsläufig, dass die Abwägung grundsätzlich oder auch nur meistens gegen das Lebensrecht des Embryos ausgeht. Der Ausdruck „Güterabwägung“ ist aus der ethischen Theorie in den lebensweltlichen moralischen Sprachgebrauch „abgesunken“. Dadurch entsteht leicht der Eindruck, es ließen sich nur Güter, d. h. materielle Gegenstände, die für die Zweckrealisierung gewählt werden, abwägen. Daneben lassen sich jedoch auch Zwecke, Ziele und Mittel abwägen. Der Ausdruck „abwägen“ erzeugt ferner bei vielen Diskussionsteilnehmern die Assoziation von Beliebigkeit und Willkür. Demgegenüber ist nach allen drei klassischen ethischen Paradigmen das moralische Abwägen wesentlicher Teil der moralischen Urteilskraft („Gewissen“), und die Rekonstruktion verallgemeinerbarer Regeln des Abwägens folglich ein Teil der Aufgabe der Ethik. Im Rahmen der Tugendethik sind v. a. die Tugenden der Klugheit und des Maßhaltens auf das Abwägen bezogen, aber auch Tapferkeit und Gerechtigkeit sind Themen des Abwägens. Im Rahmen der Verpflichtungsethik werden Abwägungen keineswegs abgelehnt – es gilt lediglich die These, dass nicht alles abwägbar ist. Das nutzenethische Paradigma („Utilitarismus“) lässt demgegenüber alle Zwecke zur Abwägung zu. Lediglich die Wertethik lässt aufgrund der Vorstellung einer „Werthierarchie“ keine Abwägung zu; schon wegen dieses

522

Sektion 4 · Therapie

„Rigorismus“ muss daher die Wertethik als moralisch kontraintuitiv gelten. Abwägung des Lebensrechts

Grundsätzlich geht es beim moralischen Abwägen um Verfahren, die nach verallgemeinerbaren Regeln erfolgen. In der aktuellen bioethischen Diskussion wird gegenüber dieser Abwägungsthese eingewandt, dass man sich eine Gradierung des Lebensschutzes gar nicht vorstellen könne. Demgegenüber ist es durchaus möglich, den Schutzanspruch eines Embryos einer Gradierung zuzuordnen. So kann man bereits in die Gebärmutter implantierte Embryonen als mit einem sehr hohen Lebensschutz ausgestattet ansehen, während zur Implantation vorgesehene Embryonen, „überzählige“, aber adoptionsfähige Embryonen und schließlich nicht adoptionsfähige Embryonen schrittweise als mit weniger Lebensschutzrecht ausgestattet angesehen werden können. Die Abwägungsstufen wären also: x implantierte Embryonen x zur Implantation vorgesehene Embryonen x „überzählige“, aber zur Adoption anstehende Embryonen x nicht adoptionsfähige Embryonen Auch bezüglich des Zwecks der Vernichtung des Embryos lässt sich durchaus eine Gradierung angeben, wobei die Heilung eines konkreten, nahe stehenden Individuums im Rahmen einer mit guten Heilungsaussichten ausgestatteten Standardtherapie als sehr hoher Zweck, über verschiedene Zwischenstufen ein unbestimmter Nutzen für die Menschheit als Ganzes als relativ niedrig anzusetzender Zweck unterstellt werden können. Die Rangfolge wäre etwa: x Heilung eines nahe stehenden Individuums: Standardtherapie (gute Heilungsaussichten) x Heilung irgendeines Individuums: Standardtherapie (gute Heilungsaussichten) x Heilung irgendeines Individuums: Heilversuch (schlecht bestätigte Therapie) x Nutznießer ist eine Klasse von Individuen (z. B. der Parkinson-Patienten) x Nutznießer ist die Spezies „Mensch“ (Krankheiten überhaupt) Hinsichtlich des Abwägungsproblems ist auch durchaus mit zu bedenken, dass die Frage des moralischen Status des Embryos in pragmatischer Konsistenz mit Antworten einer Gesellschaft zur Abtreibungsfrage stehen muss. Wer unter Rekurs auf den Personenstatus den Menschen mit einem kategorischen Lebensschutzanspruch ausgestattet sieht, muss logisch zwingend Abtreibungen jeder Abwägung entziehen. Wer per Kontraposition Abtreibungen unter gewissen Bedingungen (und sei es auch

allein die medizinische Indikation) für zulässig hält, hat grundsätzlich zugestanden, dass der Lebensschutz des Menschen Abwägungen zugänglich ist (Bioethikkommission des Landes Rheinland-Pfalz 1999, besonders These II,9). Missbrauchsrisiken

Abschließend soll auf ein Argument hingewiesen werden, das von denjenigen vorgebracht wird, die zwar den Nutzen der Embryonenforschung anerkennen, aber annehmen, dass die Missbrauchsgefahr dieser Forschung so groß ist, dass sie unterlassen werden sollte. Solche Argumente, die gewöhnlich als Schiefe-Ebene- oder Dammbruchargumente bezeichnet werden, beruhen zum einen auf empirischen Vermutungen darüber, wie eine Gesellschaft zukünftig mit einer neuen Technik umgehen wird. Darüber hinaus ist diesen Argumenten – meist implizit – die Annahme eingebaut, dass negative Folgen des Einsatzes dieser Technik auf jeden Fall eintreten würden und auch durch Gesetze nicht verhindert werden könnten. Bei näherer Betrachtung sind in aller Regel sowohl die den Schiefe-Ebene-Argumenten zugrunde liegenden empirischen Annahmen als auch die angenommenen gesellschaftlichen Gesetzmäßigkeiten nicht plausibel (Kamp 1998). Für die Kritik eines Schiefe-Ebene-Arguments im Zusammenhang mit der Keimbahntherapie wird auf 7 4.7.4.4 „Gentherapie am Menschen“ verwiesen. Die Forschung an menschlichen Embryonen: Die Rechtslage

Den maßgeblichen Rechtsrahmen für die Forschung an menschlichen Embryonen stellt das Embryonenschutzgesetz (ESchG) dar. Es verbietet sowohl die verbrauchende Forschung als auch die Erzeugung eines Embryos zum Zweck des Verbrauchs – selbst der Versuch ist strafbar. Nach dem ESchG ist der Import von embryonalen Zellen aus Drittländern aber zumindest dann erlaubt, wenn die entsprechenden Zelllinien schon vor dem Import existierten. Werden die Zelllinien allerdings anlässlich der Anfrage hergestellt, kann der Import im Sinne einer Anstiftung zu einer Straftat geahndet werden. Anlässlich dieser unklaren Rechtslage und der Bedeutung der Stammzellforschung für die Medizin hat der Deutsche Bundestag 2002 das „Stammzellgesetz“ (StZG) erlassen. Das StZG erlaubt den Import von embryonalen Stammzellen dann, wenn die entsprechenden Zelllinien vor dem 1. Januar 2002 aus »überzähligen« Embryonen hergestellt wurden, d. h. aus Embryonen, die ursprünglich zu Fortpflanzungszwecken hergestellt, dafür aber nicht mehr verwendet wurden. ESchG und StZG sind umstritten. Zum einen erscheint es vielen Lebenswissenschaftlern problematisch, bei international fortschreitender Entwicklung der Stammzellforschung in Deutsch-

523 4.7 · Ethische Probleme der Molekularen Medizin

land nur an Stammzellen aus der Anfangsphase dieses Forschungsbereiches experimentieren zu dürfen. Zudem ist unter Rechtswissenschaftlern umstritten, inwiefern der restriktive Schutz des zu Forschungszwecken bestimmten Embryos durch das ESchG und das StZG in Einklang zu bringen ist mit dem erheblich zurückgefahrenen Schutz des Embryos im Kontext der rechtlichen Regelung zur Abtreibung (Bioethik-Kommission des Landes Rheinland-Pfalz 2002, Merkel 2002b).

4.7.4.3 Genetische Testverfahren Unter dem Begriff „genetischer Test“ wird in der bioethischen Debatte häufig die direkte Analyse einer DNASequenz verstanden. Diese Verwendungsweise ist aus wissenschaftstheoretischer Sicht fragwürdig, da eine direkte DNA-Analyse in der Medizin lediglich eine Variante einer genetischen Untersuchung ist – andere Varianten sind etwa biochemische Analysen von Genprodukten, die Rückschlüsse auf zugrunde liegende Gene erlauben, die phänotypische Analyse eines Individuums oder einer Familie. Die Durchführung von Tests, seien es DNA-Analysen, Familienanamnesen oder auch körperliche Untersuchungen, ergeben prädiktive und probabilistische Daten, sodass sie aus wissenschaftstheoretischer Sicht gleich zu bewerten sind. Einige Autoren befürchten, dass die prognostischen Daten von genetischen Tests im Rahmen der Risikofeststellung falsch interpretiert werden könnten, sodass einige Individuen schlechter eingestuft werden würden, als es ihrem biologischen Risiko entspricht. Zwar ist diese Befürchtung nicht von der Hand zu weisen, doch existiert die Gefahr der Fehlinterpretation für alle anderen Untersuchungsverfahren auch. Dass eine Fehlinterpretation in Bezug auf Ergebnisse von genetischen Tests besonders häufig vorkommt, ist empirisch bislang nicht überzeugend belegt (Low et al. 1998). Anwendungsbereiche genetischer Tests Die Erhebung einer Familienanamnese ist seit langem fester Bestandteil der medizinischen Praxis, ohne dass dies im Allgemeinen als moralisches Problem aufgefasst wurde und wird. Es ist daher zunächst verwunderlich, wenn im Gegensatz dazu direkte DNA-Analysen als moralisch problematisch angesehen werden. Der Grund dafür scheint zu sein, dass den „Genen“ ein wesentlich größerer Einfluss auf unsere Persönlichkeit eingeräumt wird als ihnen tatsächlich zukommt. Zur Kritik am sog. genetischen Determinismus sei auf Bartram et al. (2000), Kap. 2, verwiesen. Die Anwendung genetischer Tests im Gesundheitswesen, wie sie schon seit langer Zeit praktiziert wird, wirft durchaus moralische Fragen auf [zur Einführung s. Bartram et al. (2000), Kap. 3]. Allerdings

4.7

hat dies weniger mit dem Umstand zu tun, dass dort genetische Tests genutzt werden, sondern vielmehr mit dem Beratungsbedarf, der den Patienten aus der Kenntnis bestimmter Untersuchungsergebnisse erwächst. Dass die Debatte um die moralischen Probleme genetischer Testsverfahren in letzter Zeit sehr intensiv geführt wird, hat insbesondere mit dem Missbrauchspotenzial zu tun, das entstehen könnte, wenn solche Verfahren ohne großen zeitlichen und finanziellen Aufwand und möglicherweise ohne das Wissen und die Kontrolle des Getesteten durchgeführt und die Ergebnisse verbreitet werden können. Genetische Testverfahren gehören zu den früh zur Anwendungsreife gebrachten Resultaten der Gentechnik. Die Ursache dafür liegt u. a. darin, dass die Kommerzialisierung dieser Tests ökonomisch viel versprechend erscheint. Im Folgenden werden zwei mögliche Anwendungsbereiche für genetische Tests diskutiert, die vielfach für moralisch problematisch gehalten werden und die daher einen aktuellen Testfall für die Integration der Ergebnisse der Genforschung in die medizinische Praxis darstellen. Dabei handelt es sich 1. um die Anwendung von genetischen Tests im Versicherungswesen und 2. um den Einsatz von genetischen Tests auf dem Arbeitsmarkt. Genetische Tests im Versicherungswesen

Im Zusammenhang mit der möglichen Anwendung von genetischen Tests im Rahmen medizinischer Untersuchungen vor Abschluss von Versicherungsverträgen wird befürchtet, dass Individuen mit einem erhöhten genetischen Risiko höhere Versicherungsprämien bezahlen müssten oder im Extremfall überhaupt keinen Versicherungsvertrag abschließen können (Bartram et al. 2000, Kap. 4; Sorrell 1998; Thiele 2001a,b). Zunächst stellt sich die Frage, inwieweit sich DNA-Analysen überhaupt von anderen medizinischen Tests, die schon lange Verwendung im Versicherungswesen finden, unterscheiden. Die Familienanamnese, bei der ja auch genetisches Wissen erhoben wird, gehört zu den seit langer Zeit verwendeten Datengrundlagen im Versicherungswesen. Aus Gründen der moralischen Konsistenz gilt aber: „Sind die Erhebung einer Familienanamnese und die Durchführung einer körperlichen Untersuchung im Rahmen des Versicherungswesens moralisch akzeptabel, gilt dies auch für direkte Analysen der DNASequenz.“ Im Umkehrschluss gilt damit zugleich auch: „Sollte es sich herausstellen, dass die Anwendung von DNA-Tests im Versicherungswesen moralisch verwerflich ist, gilt dies auch für eine Familienanamnese.“

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Sektion 4 · Therapie

Der Hinweis auf die gängige Versicherungspraxis allein reicht daher nicht als Rechtfertigung der Forderung nach Zulassung genetischer Tests im Versicherungswesen aus. Es bleibt daher zu fragen, ob es ein Recht auf Versicherungsschutz unabhängig vom genetischen Risiko gibt. Wird diese Frage bejaht, sollte die Anwendung genetischer Tests (auch der Familienanamnese) zu Versicherungszwecken verboten werden. Da der Zweck der Risikoprüfung vor Versicherungsabschluss nicht die Erhebung „genetischen“ Wissens, sondern allgemein „prädiktiven“ Wissens ist, gilt die Argumentation dieses Absatzes auch für andere medizinische Untersuchungen, wie z. B. HIV-Tests und sogar körperliche Untersuchungen, bei denen auch prognostische Daten gewonnen werden. Um zu einer Lösung zu gelangen, ist es hilfreich, zwischen zwei Versicherungstypen zu unterscheiden: zwischen solchen Versicherungsarten, bei denen nach Art etwa der Sozialversicherung die Beitragszahlungen auf dem gemittelten Risiko des Versichertenkollektivs – in der Regel einem Großteil der Bevölkerung – beruhen, und solchen Versicherungen, bei denen das individuelle Risiko die Höhe der Beitragszahlungen bestimmt, etwa den Privatversicherungen. Beim ersten Typ, der z. B. in der Gesetzlichen Krankenversicherung verwirklicht ist, spielt der Einsatz von genetischen (und anderen) Tests zumindest für die Berechnung der Beitragssätze keine Rolle, sodass gesetzliche Krankenversicherungen in den weiteren Überlegungen vernachlässigt werden dürfen. Wenn in einer Privatversicherung im Rahmen der Risikoprüfung das individuelle Risiko des Versicherungsinteressenten geprüft werden soll, kommen für eine derartige Untersuchung auch genetische Tests in Frage. Im Fall eines erhöhten (genetischen) Risikos kann dann der Fall eintreten, dass die zu zahlenden Prämien so hoch sind, dass der Interessent sich eine Police nicht leisten kann. Wäre dieser Fall moralisch akzeptabel? Anders gefragt: Gibt es ein Recht auf (Lebens- bzw. Kranken-)Versicherungsschutz? Keine dieser Fragen kann hier ausführlich behandelt werden. Es dürfte aber unbestritten sein, dass ein gewisses Maß an basalen Leistungen einer Krankenversorgung, die in der Regel über eine Krankenversicherung bereitgestellt werden, also eine Grundversorgung für jedermann, verfügbar sein sollten, sodass es moralisch geboten ist, ein Recht auf (Mindest-) Krankenversicherungsschutz einzuräumen. Ob dies allerdings auch für Lebensversicherungen gilt, die im Allgemeinen nicht die Grundversorgung, sondern die Zusatzversorgung abdecken, ist fraglich.

(1994), Kap. 7]. Genetische Tests könnten in Zukunft zu einer Verbesserung des Arbeitschutzes führen und z. B. den gezielten Schutz von Allergikern vor einer Exposition mit Allergenen ermöglichen. Darüber hinaus sind Fälle denkbar, in denen der Arbeitnehmer besonders verantwortungsvolle Positionen einnimmt – paradigmatisch ist hier der Aufgabenbereich des Piloten –, bei denen sich der Arbeitgeber mit weitgehenden Sorgfaltspflichten und möglichen Schadensersatzansprüchen konfrontiert sieht. Hier könnte zukünftig eine Untersuchung auf bestimmte Risiken möglich werden. Darüber hinaus gehört auch der Schutz vor Täuschungen durch den Arbeitnehmer zu den legitimen Interessen des Arbeitgebers. Die Anwendung von genetischen Tests in Arbeitsverhältnissen birgt daher Chancen, die sowohl im Interesse des Arbeitnehmers als auch im Interesse des Arbeitgebers begründet liegen können. Allerdings gibt es auch berechtigte Bedenken, dass genetische Tests zu einer moralisch nicht akzeptablen (und rechtlich auch nicht akzeptierten) Diskriminierung und Stigmatisierung von (potenziellen) Arbeitnehmern führen: Evtl. kann noch nachvollziehbar sein, dass ein Arbeitgeber das Interesse hat, möglichst „leistungsfähige“ Arbeitnehmer einzustellen – zumal krankheitsbedingte Kündigungen nur schwer durchzusetzen sind. Nur lässt die gängige Praxis eine solche Auswahl in der Regel nicht zu, um möglichst jedermann eine Chance auf Arbeit zu gewährleisten. Darüber hinaus ist aber auch vorstellbar, dass aufgrund wissenschaftlich nicht aussagekräftiger Interpretationen von Testergebnissen (z. B. angebliche genetische Marker für Kriminalität) Arbeitsverhältnisse verweigert werden. Schließlich ist auch denkbar, dass die Ergebnisse genetischer Testverfahren unberechtigterweise an Dritte weitergegeben werden. Die Anwendung genetischer Tests in Beschäftigungsverhältnissen erfordert daher eine sorgfältige Abwägung sowohl der Interessen des Arbeitnehmers als auch des Arbeitgebers. Sie sollte behutsam erfolgen, möglichst unter Anlehnung an die bestehende Arbeitsrechtspraxis. Interessant ist in diesem Zusammenhang der Vergleich mit dem HIV-Test: Die Frage, ob ein solcher Test durchgeführt wurde, ist dem Arbeitgeber in der Regel nicht erlaubt, wohl aber die Frage, ob eine manifeste Aids-Erkrankung vorliegt. Hierbei handelt es sich jedoch primär nicht um ein moralisches Problem, sondern um ein juristisches: Es muss geklärt werden, wie sich Vorschriften zum wirksamen Schutz der Rechte von Arbeitnehmer und Arbeitgeber in der Praxis verwirklichen lassen (für Regulierungsvorschläge 7 Nationaler Ethikrat 2005).

Genetische Tests in Beschäftigungsverhältnissen

Auch die Anwendung genetischer Testverfahren in Beschäftigungsverhältnissen birgt moralische Probleme [zu den juristischen Fragen der Thematik s. Wiese

Biobanken

Biobanken sind Sammlungen menschlicher Körpersubstanzen wie Gewebe und Blut, wobei vor allem die

525 4.7 · Ethische Probleme der Molekularen Medizin

Sammlung von genetischen Informationen der Spender im Vordergrund steht. Für die medizinische Forschung erhofft man sich von Biobanken die Aufklärung der Ursachen und Mechanismen von Erkrankungen. Aus moralischer Sicht relevant ist der adäquate Schutz der Spender: Geregelt werden muss u. a. die Weitergabe von Daten als auch deren Auswertung, da sie die Persönlichkeit des Spenders und seiner (genetisch) Verwandten in Mitleidenschaft ziehen können (Nationaler Ethikrat 2004; Tutton u. Corrigan 2004).

4.7.4.4 Gentherapie am Menschen Von der Inkorporation menschlicher und nichtmenschlicher Gene in Körperzellen (somatische Gentherapie) und Keimbahnzellen (Keimbahntherapie) des Menschen wird ein erheblicher Fortschritt in der Therapie von Erkrankungen mit einer genetischen Komponente erwartet. Somatische Gentherapie Die somatische Gentherapie ist aus moralischer (nicht aus technischer) Sicht relativ unproblematisch, da die transferierten Gene nicht an die Nachkommen vererbt werden [zu den moralischen Problemen s. Birnbacher (1994), Rehmann-Sutter u. Müller (1995)]. Momentan gibt es auch bezüglich der somatischen Gentherapie noch schwerwiegende technische Probleme; darüber hinaus existieren auch bezüglich der experimentellen Durchführung der somatischen Gentherapie moralisch relevante Probleme – bekannt ist der sog. Gelsinger-Fall. Hierbei handelt es sich um wichtige, aber nicht für die somatische Gentherapie spezifische Probleme, sondern um Fragen der moralisch akzeptablen medizinischen Forschung am Menschen. Zur Einführung in diese Thematik sei auf Helmchen u. Winau (1986), Kuhse u. Singer (2006), Teil VII, Wiesing (2000) verwiesen. Die somatische Gentherapie ist auch aus rechtlicher Sicht zulässig, solange im Rahmen der Therapie nicht vorsätzlich Keimzellen verändert werden. Zusätzlich greifen die allgemeinen Regelungen des Arzneimittelgesetzes (AMG), weil die übertragene Erbinformation sowie die dazu benutzen Vektoren Arzneimittel im Sinne des AMG sind. Keimbahntherapie Im Gegensatz zur somatischen Gentherapie ist die Keimbahntherapie durch das Embryonenschutzgesetz eindeutig unter Strafe gestellt. Die moralische Akzeptabilität der Keimbahntherapie dagegen wird kontrovers diskutiert: Einen spekulativen und vorsichtig optimistischen Blick in die Zukunft erlaubt die Arbeit von Silver (1998). Von Gegnern der Keimbahntherapie wird u. a. behauptet, dass die Keimbahntherapie zu einer „neuen“ Eugenik

4.7

– im Gegensatz zu einer „alten“ Eugenik führen werde, mit der die rassenhygienische Bewegung des 19. und 20. Jahrhunderts gemeint ist [für eine Einführung in die Geschichte der „alten Eugenik“ s. Kühl (1997), s. auch Buchanan et al. (2000)]. Andere Debatten, die im Zusammenhang mit der Keimbahntherapie stehen, behandeln z. B. die Frage, ob es überhaupt moralisch akzeptabel ist, die „naturgegebene“ oder auch „gottgegebene“ genetische Konstitution zu verändern. Solche oft unter dem Titel „Heiligkeit des Lebens“ diskutierten Ansätze sind besonders in religiösen Moralen zu finden, werden aber in diesem Kapitel nicht diskutiert (s. aber Kuhse 1987). Die Begriffe „Eugenik“ und „genetic enhancement“ spielen für die folgende Argumentation eine wichtige Rolle und werden wie folgt verwendet [s. dazu auch Thiele (2002 a)]: x „Eugenik“ ist die Intervention in genetische Prozesse menschlicher Individuen mit dem Ziel einer Verbesserung der genetischen Anlagen einer Population. x „Genetic enhancement“ ist die Intervention in die genetischen Prozesse eines menschlichen Individuums mit dem Ziel einer Verbesserung der genetischen Anlagen dieses Individuums. Argument der schiefen Ebene

Ein Argument, das für ein Verbot der Keimbahntherapie angeführt und im Folgenden untersucht werden soll, lautet: „Die Anwendung der Keimbahntherapie wird in moralisch verwerflicher Weise eugenische Konsequenzen haben. Daher sollte die Keimbahntherapie verboten werden.“ Dieser Typ Argument wird üblicherweise Argument der schiefen Ebene oder auch Dammbruchargument genannt: Dabei wird angenommen, dass eine Anfangshandlung, die moralisch akzeptabel ist (in diesem Fall die Behandlung schwerer Erkrankungen mithilfe der Keimbahntherapie) unausweichlich andere Handlungen zur Folge hat, die moralisch verwerflich sind – hier eugenische Konsequenzen, wie z. B. die Züchtung von „Arbeitssklaven“ (Kamp 1998). Schiefe-Ebene-Argumente, wie die angeführte Behauptung, enthalten eine empirisch-prognostische und eine moralische Komponente, von deren Korrektheit die Gültigkeit des Gesamtarguments abhängt: Um als Prognose überzeugend zu sein, müsste gezeigt werden, dass die Anwendung der Keimbahntherapie tatsächlich die vorhergesagten eugenischen Folgen verursachen würde. Darüber hinaus müsste auch gezeigt werden, dass die Folgen einer Anwendung der Keimbahntherapie moralisch verwerflich und damit verbietenswert

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Sektion 4 · Therapie

sind. Beide Behauptungen sollen im Folgenden untersucht werden. Eugenik als Folge der Gentherapie

Würde die Anwendung der Keimbahntherapie eugenische Folgen haben? Natürlich kann dies der Fall sein: In den Händen eines totalitären Regimes könnte die Keimbahntherapie zum Zwecke eugenischen „Populationsdesigns“ eingesetzt werden. Aber nur, wenn Eugenik in jedem Fall aus der Anwendung der Keimbahntherapie folgen würde, entfaltet das Argument gegen die Keimbahntherapie – d. h. das Argument, dass die Keimbahntherapie verboten werden sollte, weil es eugenische Folgen hat – seine volle Kraft. Problematisch ist an diesem Argument, dass es voraussetzt, dass die Anwendung der Keimbahntherapie in quasi gesetzmäßiger Weise bestimmte Folgen nach sich zieht – nur, dass hier nicht von natürlichen Prozessen die Rede ist, die durch Naturgesetze beschrieben werden können, sondern von menschlichen Handlungen, von denen wir (zumindest in aller Regel) annehmen, dass sie freiwillig, d. h. eben nicht in gesetzmäßiger Weise, zustande kommen. Aber auch die schwächere Behauptung, dass die Anwendung der Keimbahntherapie nicht auf jeden Fall, aber doch sehr wahrscheinlich zur Eugenik führen würde, bleibt problematisch, da hier eine moralische (d. h. präskriptive) Behauptung auf sehr weitgehenden empirischen (d. h. deskriptiven), kaum durch Prognosen abzusichernden Annahmen basiert. Die Überzeugungskraft von Schiefe-Ebene-Argumenten leidet unter einer systematischen Schwäche der zugrunde liegenden Prognosen. Wichtiger ist aber noch, dass in unverständlicher Weise die Möglichkeit außer Acht gelassen wird, mittels Normdesign die möglichen Folgen menschlichen Handelns in gezielter Weise zu beeinflussen. Das in vielen Ländern eingeführte Verbot der Keimbahntherapie ist selbst ein Beispiel für die Möglichkeit des Normdesigns – ob es als Beispiel für ein gerechtfertigtes Design taugt, ist eine andere Frage. Der Hinweis darauf, dass es möglich ist, die Folgen der Keimbahntherapie bestimmten Zwecken gemäß zu regulieren, beweist nicht, dass die Anwendung der Keimbahntherapie keine eugenischen Folgen hat oder haben kann. Aber er zeigt, dass es Möglichkeiten gibt, die Anwendung neuer Techniken wie z. B. der Keimbahntherapie moralischen Vorgaben gemäß zu regulieren. Aber auch, wenn sich eugenische Maßnahmen als Folge einer Anwendung der Keimbahntherapie verhindern lassen dürften, gilt dies für das „genetic enhancement“ nicht in gleichem Maß: Die Anwendung der Keimbahntherapie würde zu Beginn vermutlich v. a. auf die Behandlung allgemein als besonders schwerwiegend anerkannter Krankheiten beschränkt bleiben; im Erfolgsfall würde

aber sicherlich die Tendenz bestehen, die Therapie auch auf Fälle weniger schwerwiegender Erkrankungen und schließlich auch auf leichte Erkrankungen und solche Zustände, die heute nicht einmal als Erkrankungen eingestuft werden, auszudehnen. Spätestens dann würde die Keimbahntherapie zu einer Keimbahnmanipulation werden. Natürlich gilt auch hier, wie oben ausgeführt, dass sich im Prinzip der Gebrauch der Keimbahntherapie in einer Weise regulieren lässt, dass nur die Behandlung von Krankheiten zugelassen wird, aber nicht das „genetic enhancement“. Allerdings kann eine Unterscheidung zwischen „Behandlung“ und „Enhancement“ nur auf der Basis einer Definition des Begriffs „Krankheit“ gelingen. Ohne hier eine lange und nicht abgeschlossene Debatte über den Krankheitsbegriff darzulegen, lässt sich doch festhalten, dass jede brauchbare Definition des Krankheitsbegriffs eine subjektive Komponente beinhalten wird, d. h.: Das, was wir als Krankheit bezeichnen, wird nie allein durch empirische Parameter bestimmbar sein, sondern immer auch davon abhängen, wie der Krankheitswert eines bestimmten Zustands eingeschätzt wird. Dass die Bestimmung von Krankheit auch eine subjektive Komponente enthält, heißt aber nicht, dass diese Bestimmung rein subjektiv erfolgt – und auch nicht, dass der Krankheitswert eines Zustands von der subjektiven Einschätzung eines einzelnen Individuums abhängt [zum Krankheitsbegriff s. Lanzerath (2000)]. Im Folgenden soll allerdings ein anderes Problem im Vordergrund der Untersuchung stehen. Moralische Beurteilung der Folgen genetischer Therapie

Sind die Folgen einer Anwendung der Keimbahntherapie moralisch verwerflich und damit verbietenswert? Es besteht ein weitgehender Konsens darüber, dass die Durchführung eugenischer Maßnahmen aus moralischer Perspektive äußerst problematisch ist; im Folgenden wird daher davon ausgegangen, dass eugenische Maßnahmen verboten werden sollten; allerdings stellt sich die Frage, ob dies auch für das „genetic enhancement“ gelten sollte. Dazu soll im Folgenden ein Argument untersucht werden, das häufig gegen die Anwendung der Keimbahntherapie vorgebracht wird. Oft wird argumentiert, dass der Embryo oder der Fetus nicht in eine Keimbahntherapie einwilligen könnten und der Eingriff daher zu unterbleiben habe. Zwar trifft es zu, dass der Embryo oder Fetus nicht hat zustimmen können, doch gilt dies auch für andere Kontexte, z. B. die pränatale Diagnostik durch Amniozentese, das (sogar gesetzlich vorgeschriebene) Neugeborenenscreening, aber auch für Operationen im Säuglingsalter. In diesen und ähnlich gelagerten Fällen erwarten

527 4.7 · Ethische Probleme der Molekularen Medizin

wir von den Eltern oder dem Vormund, dass sie oder er im mutmaßlichen Interesse des Individuums handeln. Zumindest in der westlichen Welt werden die elterlichen bzw. vormundschaftlichen Rechte, über die Zukunft ihres Kindes mitzubestimmen, in starkem Maß geschützt; in dieser Traditionslinie, die uns im Großen und Ganzen akzeptabel scheint, liegt es daher an den Gegnern der Anwendung der Keimbahntherapie, zu zeigen, dass eine moderate Manipulation der genetischen Konstitution eines Individuums negative Auswirkungen auf dieses Individuum haben wird – Auswirkungen, die aus moralischer Sicht negativer einzuschätzen sind als andere Manipulationen, die wir bislang für moralisch akzeptabel halten: z. B. eine streng konfessionelle oder streng atheistische Ausbildung (Agar 1998). Akzeptiert man diese Argumentation, ist nur gezeigt, dass die fehlende Einwilligung des Betroffenen allein für ein Verbot der Keimbahntherapie aus moralischen Gründen nicht ausreicht. Es ist damit – auch wenn es den Autoren wenig wahrscheinlich erscheint – aber nicht ausgeschlossen, dass andere Argumente, z. B. die Irreversibilität der Intervention in den Genbestand, oder eine Kombination verschiedener Argumente ein Verbot vielleicht rechtfertigen können. Dennoch könnte es sein, dass nach Abwägung der mit der Keimbahntherapie verbundenen Chancen und Risiken schwerwiegende moralische Bedenken bleiben, die ein Verbot der Keimbahntherapie ratsam erscheinen lassen. Ein generelles Verbot der Keimbahntherapie aus moralischen Gründen erscheint aber kaum gerechtfertigt. Ein Verbot aus sicherheitstechnischen Gründen ist dagegen zum gegenwärtigen Zeitpunkt (und vermutlich auch noch für lange Zeit) durchaus gerechtfertigt.

4.7.4.5 Patente auf Biomaterialien Die Genforschung und ihre kommerzielle Verwertung haben eine Debatte über die moralische Akzeptabilität der Patentierung von menschlichen und nichtmenschlichen Genen und anderen Biomaterialien angestoßen. Obwohl es mittlerweile eine größere Zahl nationaler und internationaler Gesetze und Konventionen zur Patentierbarkeit von Biomaterialien gibt, bleibt eine erhebliche Unsicherheit darüber bestehen, was genau patentiert werden kann und welche Rechte aus diesen Patenten entstehen. Die moralische Debatte zu diesem Thema hat drei Schwerpunkte: 1. Sind „Patente auf Leben“ unmoralisch und sollten daher Patente auf Pflanzen und Tiere, insbesondere aber auf menschliche Gene aus moralischer Sicht verboten werden? 2. Behindert die Patentierung von Biomaterialien die biomedizinische Forschung?

4.7

3. Führt die Biopatentierung zu einer unfairen Verteilung von Ressourcen zwischen den reichen, industrialisierten Ländern und den sich entwickelnden Ländern? Keine dieser Fragen kann zum gegenwärtigen Zeitpunkt als geklärt gelten, und starke politische und ökonomische Interessen machen diese Fragen zu einem weit über akademische Interessen hinaus wichtigen Thema [s. auch Baumgartner u. Mieth (2003), Thiele (2002c)]. Patente und Patentrecht Patente sind ein wirtschaftspolitisches Instrument und sollen der Innovationsförderung dienen. Dazu gehören die Absicherung materieller Investitionen und der Schutz geistigen Eigentums (wie z. B. Erfindungen). Letzteres soll es dem Erfinder ermöglichen, eine angemessene Belohnung für seine der Allgemeinheit nützlichen Dienste zu erhalten (Strauss 1998). Die moralische Rechtfertigung von Patenten gründet letztlich darauf, dass durch die Vergabe von Patenten eine Steigerung des allgemeinen Wohlstands erreicht werden kann, indem der kreative Prozess nicht nur durch puren Erfindungsdrang gefördert wird, sondern auch durch den Anreiz materieller Vorteile durch eine Erfindung. Entdeckungen gelten (zumindest im europäischen Patentrecht) als nicht patentierbar. So ist z. B. die Beschreibung einer „Gensequenz“ – d. h. die Beschreibung der Basenabfolge im DNA-Strang – eine Entdeckung und keine Erfindung. Die Kenntnis eines „Gens“ erfordert dagegen neben dem Wissen um die Sequenz auch die Kenntnis der Funktion dieser Sequenz. Wesentlich für die Vergabe von Patenten ist das Vorliegen einer Erfindung. Nun ist die bloße Beschreibung einer „Gensequenz“, die im menschlichen Genom vorhanden ist, nur eine Entdeckung und damit nach den oben genannten Gründen für eine Patentvergabe nicht patentierbar. Wird allerdings mit der Sequenz des Gens auch seine Funktion beschrieben, d. h. das „Gen“ beschrieben, so ist damit mehr als eine bloße Entdeckung verbunden. Die Beschreibung der Funktion eines Gens erfordert eine geistige Leistung – z. B. die Ausarbeitung eines geeigneten experimentellen Ansatzes. Es erscheint daher durchaus gerechtfertigt, im Fall der Beschreibung von Sequenz und Funktion von schützenswertem, geistigem Eigentum zu sprechen. Wird mit der Beschreibung von Sequenz und Funktion zudem noch der Plan einer gewerblichen Nutzung verbunden, ist die prinzipielle Patentierbarkeit gegeben. Das Patentrecht ist nationalen und europäischen Rechtsvorschriften, durch die die Forschung und die Vermarktung von Forschungsergebnissen reguliert werden, nachgeordnet. So berechtigt ein Patent allein den Patentinhaber noch nicht, die geschützte Erfindung auch

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Sektion 4 · Therapie

tatsächlich zu benutzen. Die Erlaubnis zur Nutzung ist von weiteren geltenden Regelungen wie z. B. dem Gentechnikgesetz oder dem Tierschutzgesetz abhängig. Ein Patent ist daher zunächst nur ein ausschließendes Nutzungsrecht; d. h. der Patentinhaber darf Dritte von der Nutzung des Patentinhalts ausschließen und für die Nutzung Lizenzen erteilen (und Gebühren verlangen). Durch die EU-Biopatentrichtlinie sind solche Patente ausgeschlossen, die wider die öffentliche Ordnung oder die guten Sitten verstoßen. Damit ist dafür Sorge getragen, dass neben explizit gemachten Patentverboten – wie dem Verbot der Patentierung von Verfahren zur Manipulation der menschlichen Keimbahn und zur kommerziellen Verwendung menschlicher Embryonen – auch weitergehende moralische und rechtliche Erwägungen zu einer Verweigerung eines Patents führen können. Zwar haben sich Patente seit langer Zeit bewährt, doch kann es im Einzelnen durchaus gerechtfertigt sein, moralische Bedenken gegen einzelne Patente bzw. die Vergabe von Patenten in bestimmten Bereichen zu erheben. Für die moralische Beurteilung der Patentierung von Biomaterialien sollte unterschieden werden zwischen Argumenten, die eine Patentierung unter allen Umständen ausschließen (kategorische Verbote), und solchen, die dies nur unter bestimmten Voraussetzungen tun (hypothetische Verbote). Ethische Beurteilung der „Patente auf Leben“ Bei dem Argument, dass „Patente auf Leben“ unmoralisch seien und die Patentierung von Pflanzen und Tieren, insbesondere aber von menschlichen Genen moralisch nicht akzeptabel sei, handelt es sich um den Versuch, ein kategorisches Verbot aufzustellen [z. B. Rifkin (1998), Kap. 2]. Es dürfte schwierig sein, eine alle wesentlichen Facetten aufnehmende Definition von „Leben“ aufzustellen; aber auch nach der alltagssprachlichen Verwendung des Wortes ist ein Gen kein „Leben“, sondern nur ein Bestandteil desselben. Weiterhin ist ein Mensch auch nicht allein die Summe seiner Gene, sodass die Patentierung aller Gene des Menschen immer noch nicht die Patentierung von Leben bedeuten würde. Darüber hinaus räumt das Patentrecht dem Inhaber desselben keine Verfügungsgewalt über das patentierte Lebewesen ein. Hält jemand z. B. das Patent für die Herstellung von transgenen Tieren, bedeutet dies nicht, dass er diese transgenen Tiere auch herstellen und nutzen darf. Letzteres ist ihm nur mit einer von der Patentvergabe unabhängigen Erlaubnis möglich. Das Patent erlaubt dem Inhaber lediglich, Dritte von der Nutzung auszuschließen. Im Zusammenhang mit der Patentierung von Lebewesen von einer neuen Form der „Sklaverei“ zu sprechen, ist daher nicht begründet. Schließlich wird mit dem Patent auf ein Lebewesen oder ein Gen auch nicht

das einzelne Exemplar dieses Lebewesens oder Gens patentiert, sondern die damit verbundene Erfindung. So kann daher ein bestimmtes menschliches Gen Gegenstand einer patentierten Erfindung sein. Kommt dieses Gen darüber hinaus im Genom des Menschen vor, werden aber nicht – wie zuweilen behauptet – Lizenzgebühren fällig, weil das betreffende Gen im Kontext des individuellen Genoms keine Erfindung des Patentinhabers darstellt. Patente als Forschungsbehinderung Lässt sich kein kategorisches Verbot der Patentierung menschlicher Gene begründen, könnte es dennoch sein, dass sich aus der Abwägung der mit der Patentierung von Genen verbundenen Chancen und Risiken schwerwiegende moralische Bedenken ergeben, die ein Ende dieser Praxis als moralisch geboten erscheinen lassen. Die Förderung der biomedizinischen Forschung mit dem mittelbaren Ziel der Gesundheitsförderung ist eine Aufgabe, die allgemein als moralisch akzeptabel, vielleicht sogar als moralisch geboten angesehen wird (Patzig 1989). Sollte die Patentierung von menschlichen Genen, wie vielfach behauptet wird, zu einer massiven Behinderung der biomedizinischen Forschung führen, weil binnen kurzer Zeit das gesamte menschliche Genom patentiert sein und die Patente in den Händen weniger marktbeherrschender Life-science-Unternehmen liegen werde, spräche dies gegen die Vergabe von Patenten auf menschliche Gene. In den letzten Jahren haben hohe, zu einem großen Teil privatwirtschaftliche Investitionen in die Biotechnologie zu einer rasanten Zunahme der Forschungsaktivitäten in diesem Bereich geführt. Da diese Investitionen in Erwartung zukünftiger, d. h. noch nicht existierender Gewinne gemacht werden, besteht ein hohes Interesse der Kapitalgeber daran, die Investitionen abzusichern. Ein Instrument dazu ist die Beantragung von Patenten, um so eine zukünftige Verwertung der Forschungsergebnisse sicherzustellen. Es ist daher davon auszugehen, dass ein erheblicher Teil der heutigen Biotechnologieforschung überhaupt erst möglich geworden ist, weil die getätigten Investitionen u. a. durch Patente abgesichert werden konnten. Ob ein Verbot von Patenten auf menschliche Gene zu einem Rückgang der Investitionen in die Biotechnologie führen würde, bleibt empirisch zu prüfen. Die Befürchtung, dass die Konzentration von Schlüsselpatenten (z. B. auf weite Teile des menschlichen Genoms) in den Händen einiger, ausschließlich am kommerziellen Gewinn orientierter Patentinhaber die zukünftige Entwicklung der biomedizinischen Forschung behindern könnte, erscheint als begründet, was man u. a. daran festmachen kann, dass sich in der letzten Zeit vermehrt Rechtsstreitigkeiten wegen Schlüsselpatenten

529 4.7 · Ethische Probleme der Molekularen Medizin

geführt werden. Bei den Ergebnissen des Humangenomprojekts handelt es sich aber zunächst nur um bloße Sequenzen des menschlichen Genoms, sodass aus den oben genannten Gründen keine Patentierbarkeit besteht. Allerdings bietet die EU-Biopatentrichtlinie Möglichkeiten, durch Aufhebung von existierenden Patenten bzw. durch die Vergabe von Zwangslizenzen im öffentlichen Interesse derartigen Entwicklungen entgegenzuwirken. Patente und Verteilungsgerechtigkeit Schließlich wird argumentiert, dass die Patentierung von menschlichen und anderen Genen zu einer ungerechten Verteilung von Ressourcen v. a. zwischen den reichen Industrieländern und den Entwicklungsländern führen würde. In diesem Zusammenhang wird auch von „Biokolonialismus“ gesprochen (Rifkin 1998, S. 88]. Es ist korrekt, dass es durch eine Patentvergabe zu einer moralisch nicht akzeptablen Ungleichverteilung von Ressourcen kommen könnte, die verhindert, zumindest aber kompensiert werden sollte (Parry 2005; Straus 2005). Es könnte beispielsweise dazu kommen, dass Entwicklungsländer für die Behebung von gesundheitlichen Missständen auf die Nutzung von Patenten angewiesen sind, wobei die Patentinhaber und damit auch die Nutznießer der Lizenzgebühren in den Industrieländern beheimatet sind. Dies ist allerdings auch schon heute der Fall. Viele wirksame Arzneimittel, die durch Patente geschützt sind, werden von den Patentinhabern zu einem Preis abgegeben, der für die Industrieländer akzeptabel, für die Entwicklungsländer allerdings zu teuer ist. Daraus ergibt sich eine moralische Verpflichtung, dieser Ungleichverteilung abzuhelfen, und es erscheint durchaus fraglich, ob die heute existierenden Kompensationsmechanismen etwa durch Entwicklungshilfe ausreichend sind (Developing World Bioethics 2001). Dennoch werden wenige fordern, die Patentvergabe auf Arzneimittel zu beenden. Letzteres müsste aus Gründen einer konsistenten Argumentation aber fordern, wer die Vergabe von Patenten auf Gene verhindern will, weil sie zu einer Ungleichverteilung von Ressourcen führe. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass ein kategorisches Verbot der Patentierung menschlicher Gene aus moralischer Sicht nicht gerechtfertigt werden kann.

4.7.5 Ausblick Der Rekurs auf „die Ethik“ dient in der öffentlichen Diskussion oft als Appell an eine Instanz, von der man Hilfsmittel gegen die durch die Forschungsentwicklung in den biomedizinischen Disziplinen eröffneten Handlungsmöglichkeiten erhofft (Geyer 2001). Die professionelle Wissenschaftsethik ist demgegenüber von Haus

4.7

aus weder forschungsfreundlich noch forschungsfeindlich (Gethmann 1996b). Vielmehr versucht sie – stets am Zweck der Konfliktbewältigung orientiert – durch kritische Rekonstruktion moralischer Überzeugungen und deren Beurteilung am Leitfaden ethischer Kriterien eine kritische Sortierung der mutmaßlich eröffneten Handlungsoptionen. Dabei wird grundsätzlich vom Prinzip der Forschungsfreiheit ausgegangen, wie es auch dem deutschen Grundgesetz entspricht. Das heißt, dass die Einschränkung von Forschung einer Rechtfertigung durch Gründe bedarf, die mit elementaren Lebensinteressen der Menschen zu tun haben. Dabei ist zu berücksichtigen, dass ein Forschungsverbot meistens einen unüberblickbaren Raum von unterlassenen Handlungsfolgen impliziert, die durchaus erwünscht sein können. Ein Forschungsverbot kann daher niemals mit „Argumenten der leichten Hand“ wie religiös motivierten Antipathien, diffusen Befürchtungen oder Ressentiments gerechtfertigt werden. Vielmehr muss es sich um wahrscheinliche und für die Lebensbedingungen moralisch kompetenter Akteure bedrohliche Folgen handeln. Die professionelle Ethik ist Teil des Rationalitätsparadigmas „Wissenschaft“. Sie steht der Wissenschaft nicht in der Grundhaltung der Opposition gegenüber, sondern ist der Ort, an dem die Wissenschaften ihre normativen Präsuppositionen und Prämissen mit den Mitteln wissenschaftlicher Rationalität selbstkritisch überprüfen. Dies schließt die Bereitschaft ständiger Selbstkontrollen und auch ggf. der Revision des ethischen Urteils ein. Dieses Selbstverständnis der Ethik ist zu beachten, wenn ihre Rolle im Feld der wissenschaftlichen Politikberatung bestimmt wird. Wissenschaft hat stets reversibel zu sein, politisches Handeln kann sich diese falsifikationistische Grundeinstellung nur in Grenzen erlauben. Gleichwohl hat die Gesellschaft einen Anspruch darauf, dass ihr nicht nur Forschungsergebnisse präsentiert werden, die möglichst verständlich und verlässlich sein sollen, sondern dass die Wissenschaft auch die Frage der ethischen Erlaubtheit der mit ihren Ergebnissen eröffneten Handlungsoptionen prüft und das Ergebnis öffentlich darstellt. Hinsichtlich des Verhältnisses von professioneller Ethik und den moralischen Überzeugungen der Bürger muss gelten, was auch sonst für den Verkehr der Bürger in liberalen Gesellschaften gilt: Jeder Bürger darf erwarten, dass seine Überzeugungen so weit wie möglich respektiert werden. Er kann jedoch nicht beanspruchen, dass seine Überzeugungen ohne Weiteres Geltung für jedermann erhalten. Verbindlichkeiten für jedermann kann nur beanspruchen, was parteieninvariant nach argumentativen Regeln ausgewiesen wird und darauf beruhend oft – keineswegs jedoch immer – nach den dafür festgelegten Prozeduren Gesetzeskraft (Thiele 2004) erlangt.

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4.7.6 Literatur

4.7.6.4 Zitierte Literatur

4.7.6.1 Literatur zur Einführung in die Ethik und angewandte Ethik

Altner G (1991) Naturvergessenheit. Grundlagen einer umfassenden Bioethik. Wissenschaftliche Buchgesellschaft, Darmstadt Agar N (1998) Liberal eugenics. Public Affairs Q 12: 137–155. Arrington RL (1997) Ethics I (1945 to the present). In: Canfield JV (ed) Routledge history of philosophy, Band X. Routledge, London Bartram C, Beckmann JP, Breyer F et al. (2000) Humangenetische Diagnostik. Wissenschaftliche Grundlagen und gesellschaftliche Folgen. Springer, Berlin Heidelberg New York Battin M, Rhodes R, Silvers A (eds) (1998) Physician assisted suicide. Expanding the debate. Routledge, New York Baumgartner HM, Honnefelder L, Wickler W, Wildfeuer AG (1998) Menschenwürde und Lebensschutz: Philosophische Aspekte. In: Rager G (Hrsg) Beginn, Personalität und Würde des Menschen. Alber, Freiburg, 161–242 Beauchamp TL, Childress JF (2001) Principles of biomedical ethics. Oxford University Press, New York Beckmann JP (Hrsg) (1996) Fragen und Probleme einer medizinischen Ethik. deGruyter, Berlin Bentham J (1970) An introduction to the principles of morals and legislation. In: Burns JH, Hart HLA (eds) Principles of morals and legislation. Clarendon Press, Oxford Bioethik Kommission des Landes Rheinland-Pfalz (1999) Bericht zur Präimplantationsdiagnostik. Thesen zu den medizinischen, rechtlichen und ethischen Problemstellungen. 20.6.1999, Mainz Bioethik Kommission des Landes Rheinland-Pfalz (2002) Embryonale Stammzellen. 23.8.2002 Birnbacher D (1988) Verantwortung für zukünftige Generationen. Reclam, Stuttgart Birnbacher D (1994) Genomanalyse und Gentherapie. In: Sass HM (Hrsg) Medizin und Ethik. Reclam, Stuttgart, 212–231 Birnbacher D (1996) Ethische Probleme der Embryonenforschung. In: Beckmann JP (Hrsg) Fragen und Probleme einer medizinischen Ethik. deGruyter, Berlin, 228–253 Birnbacher D (2000) Selektion von Nachkommen. Ethische Aspekte. In: Mittelstraß J (Hrsg) Die Zukunft des Wissens. Vorträge und Kolloquien des XVIII. Deutschen Kongresses für Philosophie, Konstanz 1999. Akademieverlag, Berlin, S 457–471 Birnbacher D (2006) »Natur« als Maßstab menschlichen Handelns. In: ders. Bioethik zwischen Natur und Interesse. Suhrkamp, Frankfurt, 145-165 Breyer F, Kliemt H, Thiele F (eds) (2001) Rationing in medicine. Ethical, legal, and practical aspects. Springer, Berlin Heidelberg New York Buchanan A, Brock DW, Daniels N, Witzler D (2000) From Chance to Choice. Genetics and Justice. Cambridge University Press, Cambridge Carrier M (2006) Wissenschaftstheorie zur Einführung. Junius, Hamburg Chadwick R (ed) (1998) Encyclopedia of applied ethics, vol 4. Academic Press, San Diego Chargaff E (1982) Wenig Lärm um Viel. Bemerkungen zur genetische Bastelsucht. In: Chargaff E (Hrsg) Unbegreifliches Geheimnis. Lett-Cotta, Stuttgart, S 144–168 Developing World Bioethics (2001) Vol 1: 1 Deutsche Forschungsgemeinschaft (2001) Empfehlungen der Deutschen Forschungsgemeinschaft zur Forschung mit menschlichen Stammzellen, 3.5.2001. DFG, Bonn EKD/DBK (1989) Gott ist ein Freund des Lebens. Herausforderungen und Aufgaben beim Schutz des Lebens. Gemeinsame Erklärung des Rates der Evangelischen Kirchen in Deutschland und der Deutschen Bischofskonferenz. Paulinus, Trier

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4.7.6.2 Literatur zur Einführung in die Bioethik Buchanan A, Brock DW, Daniels N, Wikler D (2000) From chance to choice. Genetics and justice. Cambridge University Press, Cambridge Charlesworth M (1997) Leben und sterben lassen. Bioethik in einer liberalen Gesellschaft. Rotbuch, Hamburg Düwell M, Steigleder K (Hrsg) (2003) Bioethik. Eine Einführung. Suhrkamp, Frankfurt Kitcher P (1997) The lives to come. Touchstone, New York. Deutsch: Kitcher P (1998) Genetik und Ethik. Die Revolution der Humangenetik und ihre Folgen. Luchterhand, München Kuhlmann A (2001) Politik des Lebens – Politik des Sterbens. Biomedizin in der liberalen Demokratie. Fest, Berlin Kuhse H, Singer P (eds) (22006) Bioethics. An anthology. Blackwell, Oxford London

4.7.6.3 Lexika Chadwick R (ed) (1998) Encyclopedia of applied ethics, vol 4. Academic Press, San Diego Chadwick R (ed) (2001) The concise encyclopedia of the ethics of new technologies. Academic Press, San Diego Düwell M, Hübenthal C, Werner MH (Hrsg) (2002) Handbuch Ethik. Metzler, Stuttgart Korff W, Beck L, Mikat P (Hrsg) (1998) Lexikon der Bioethik. 3 Bände. Gütersloher Verlagshaus, Gütersloh Mittelstraß J (Hrsg) (1984–22005) Enzyklopädie Philosophie und Wissenschaftstheorie, 4 Bände Metzler, Stuttgart Post SG (Hrsg.) (2003) Encyclopedia of Bioethics. Macmillan, New York Sandkühler HJ (Hrsg) (22005) Enzyklopädie Philosophie, 2 Bände. Meiner, Hamburg

531 4.7 · Ethische Probleme der Molekularen Medizin Ethik in der Medizin (2001) Themenheft: Gerechtigkeit im Gesundheitswesen bei knapper werdenden Ressourcen, Bd 13, Heft 1–2. Springer, Heidelberg Faden RR, Beauchamp TL (1986) A history and theory of informed consent. Oxford University Press, Oxford Fey GH u. Gethmann CF (2001) Wir dürfen unsere Evolution nicht dem Zufall überlassen. Frankfurter Allgemeine Zeitung, 31.1.2001. Auch in: Nida-Rümelin J (Hrsg) Ethische Essays. Suhrkamp, Frankfurt, 442–448 Frankena WK (1939) The naturalistic fallacy. Mind, XL VIII. Deutsch: Frankena WK (1974) Der naturalistische Fehlschluß. In: Grewendeorf G, Meggle G (Hrsg) Seminar: Sprache und Ethik. Zur Entwicklung der Metaethik. Surhkamp, Frankfurt, S 83–99 Gerhardt V (2001) Der Mensch wird geboren. Kleine Apologie der Humanität. C.H. Beck, München Gethmann CF (1982) Proto-Ethik. Zur formalen Pragmatik von Rechtfertigungsdiskursen. In: Stachowiak H, Ellwein T (Hrsg) Bedürfnisse, Werte und Normen im Wandel, Bd I. Fink, München, S 113–143 Gethmann CF (1993 a) Zur Ethik des Handelns unter Risiko im Umweltstaat. In: Gethmann CF, Kloepfer M (Hrsg) Handeln unter Risiko im Umweltstaat. Springer, Berlin Heidelberg New York, S 1–54 Gethmann CF (1996 a) Heilen: Können und Wissen. Zu den philosophischen Grundlagen der wissenschaftlichen Medizin. In: Beckmann JP (Hrsg) Fragen und Probleme einer medizinischen Ethik. deGruyter, Berlin, S 68–93 Gethmann CF (1996b) Wissenschaftsethik. In: Mittelstraß J (Hrsg) (1984–1996) Enzyklopädie Philosophie und Wissenschaftstheorie, Bd 4. BI/Metzler, Mannheim Stuttgart Gethmann CF (1998 a) Praktische Subjektivität und Spezies. In: Hogrebe W (Hrsg) Subjektivität. Fink, München, S 125–145 Gethmann CF (1999) Zumutbarkeit und Inkaufnahme von Risiken. In: Honnefelder L, Streffer C (Hrsg) Jahrbuch für Wissenschaft und Ethik, Bd 4. deGruyter, Berlin, S 283–291 Gethmann CF (2000) Das abendländische Vernunftprojekt und die Pluralität der Kulturen. In: Pinkau K, Stahlberg C (Hrsg) Zukunft der Aufklärung. Hirzel, München, S 23–44 Gethmann CF (2001) Tierschutz als Staatsziel – Ethische Probleme. In: Thiele F (Hrsg) Tierschutz als Staatsziel? Naturwissenschaftliche, rechtliche und ethische Aspekte. Europäische Akademie, Bad Neuenahr-Ahrweiler, Graue Reihe 25: 50–72 Gethmann CF (2002) Pragmazentrimus In: Ingensiep HW, Eusterschulte A (Hrsg) Philosophie der natürlichen Mitwelt. Grundlagen – Probleme – Perspektiven. Königshausen& Neumann, Würzburg Gethmann CF, Kamp G (2000) Gradierung und Diskontierung von Verbindlichkeiten bei der Langzeitverpflichtung. In: Mittelstraß J (Hrsg) Die Zukunft des Wissens. Akademieverlag, Berlin, S 281–295 Gethmann CF, Sander T (1999) Rechtfertigungsdiskurse. In: Grunwald A, Saupe S (Hrsg) Ethik in der Technikgestaltung. Praktische Relevanz und Legitimation. Springer, Berlin Heidelberg New York, S 117–151 Gethmann CF, Thiele F (2001) Moral arguments against the cloning of humans. In: Gethmann CF, Thiele F (eds) Poiesis and praxis, vol 1. Springer, Berlin Heidelberg New York Gethmann CF u. Thiele F (2005) Bioethik. In: Mittelstraß J (Hrsg) Enzyklopädie Philosophie und Wissenschaftstheorie. Band 1, Metzler, Stuttgart, 470-474 Geyer C (2001) Biopolitik. Suhrkamp, Frankfurt Hare RM (1992) Moralisches Denken: seine Ebenen, seine Methode, sein Witz. Suhrkamp, Frankfurt Hare RM (1997) Sorting out ethics. Clarendon Press, Oxford

4.7

Harris J (1997) „Goodbye Dolly?“ The ethics of human cloning. J Med Ethics 23: 353–360 Hegselmann R, Merkel R (Hrsg) (1992) Zur Debatte über Euthanasie. Beiträge und Stellungnahmen. Suhrkamp, Frankfurt Hoerster N (1995 a) Abtreibung im säkularen Staat. Argumente gegen den §218. Surhkamp, Frankfurt Hoerster N (1995 b) Neugeborene und das Recht auf Leben. Suhrkamp, Frankfurt Hoerster N (1998) Sterbehilfe im säkularen Staat. Suhrkamp, Frankfurt Hofmann H (1981) Rechtsfragen der atomaren Entsorgung. KlettCotta, Stuttgart Janich P (1997) Kleine Philosophie der Naturwissenschaften. Beck, München Janich P, Weingarten M (1999) Wissenschaftstheorie der Biologie. Fink, Paderborn Kamp G (1998) Artikel: Dammbruchargument. In: Korff W, Beck L, Mikat P (Hrsg) (1998) Lexikon der Bioethik, Bd 1. Gütersloher Verlagshaus, Gütersloh, S 453–455 Kant I (1994) Grundlegung zur Metaphysik der Sitten. Meiner, Hamburg Kliemt H (1986) Grundzüge der Wissenschaftstheorie. Eine Einführung für Mediziner und Pharmazeuten. Fischer, Stuttgart New York Kirch W, Kliemt H (1997) Rationierung im Gesundheitswesen. Roderer, Regensburg Krebs A (1997) Naturethik. Grundtexte der gegenwärtigen tier- und ökoethischen Dikussion. Suhrkamp, Frankfurt Kühl S (1997) Die Internationale der Rassisten. Aufstieg und Niedergang der internationalen Bewegung für Eugenik und Rassenhygiene im 20. Jahrhundert. Campus, Frankfurt Kuhlmann A (2001) Politik des Lebens – Politik des Sterbens. Biomedizin in der liberalen Demokratie. Fest, Berlin Kuhse H (1987) The sanctity-of-life-doctrine in medicine. Clarendon Press, Oxford. Deutsch: Kuhse H (1994) Die „Heiligkeit des Lebens“ in der Medizin. Eine philosophische Kritik. Fischer, Erlangen Kuhse H, Singer P (1985) Should the baby live? The problem of handicapped infants. Oxford University Press, Oxford. Deutsch: Kuhse H, Singer P (1993) Muss dieses Kind am Leben bleiben? Das Problem schwerstgeschädigter Neugeborener. Fischer, Erlangen Kuhse H, Singer P (Hrsg.) (22006) Bioethics. An anthology. Blackwell Publishers, Oxford Kutschera F von (1999) Grundlagen der Ethik. deGruyter, Berlin Lanzerath D (2000) Krankheit und ärztliches Handeln. Zur Funktion des Krankheitsbegriffes in der medizinischen Ethik. Alber, Freiburg Lauritzen P (ed) (2001) Cloning and the future of human embryo research. Oxford University Press, New York Low L, King S, Wilkie T (1998) Genetic discrimination in life insurance: empirical evidence from a cross sectional survey of genetic support groups in the United Kingdom. BMJ 317: 1632– 1635 Marquard O (1995) Abschied vom Prinzipiellen: philosophische Studien. Reclam, Stuttgart Merkel R (2001) Früheuthanasie. Rechtsethische und strafrechtliche Grundlagen ärztlicher Entscheidungen über Leben und Tod in der Neonatalmedizin. Nomos, Baden-Baden Merkel R (2002a) Contra Speziesargument. Zum normativen Status des Embryos und zum Schutz der Ethik gegen ihre biologistische Degradierung. In: Damschen G u. Schönecker D (Hrsg) Der moralische Status menschlicher Embryonen. De Gruyter, Berlin, 35–58

532

Sektion 4 · Therapie

Merkel R (2002b) Forschungsobjekt Embryo. Verfassungsrechtliche und ethische Grundlagen der Forschung an menschlichen embryonalen Stammzellen. Deutscher Taschenbuch Verlag, München Meyer-Abich KM (1997) Praktische Naturphilosophie. Erinnerung an einen vergessenen Traum. Beck, München Mittelstraß J (1974) Die Möglichkeit von Wissenschaft. Suhrkamp, Frankfurt Nagel E, Fuchs C (1998) Rationierung und Rationalisierung im deutschen Gesundheitswesen. Thieme, Stuttgart New York Nationaler Ethikrat (2004) Biobanken für die Forschung. Berlin Nationaler Ethikrat (2005) Prädiktive Gesundheitsinformationen bei Einstellungsuntersuchungen. Berlin Nida-Rümelin J, von der Pfordten D (1995) Ökologische Ethik und Rechtstheorie. Nomos, Baden-Baden Nida-Rümelin J (22005) Tierethik I: Zu den philosophischen und ethischen Grundlagen des Tierschutzes. In: Nida-Rümelin J (Hrsg) Angewandte Ethik. Die Bereichsethiken und ihre theoretische Fundierung. Ein Handbuch. Kröner, Stuttgart, S 458– 483 Nida-Rümelin J, von der Pfordten D (22005) Tierethik II: Zu den ethischen Grundlagen des Deutschen Tierschutzgesetzes. In: Nida-Rümelin J (Hrsg) Angewandte Ethik. Die Bereichsethiken und ihre theoretische Fundierung. Ein Handbuch. Kröner, Stuttgart, S 484–509 Parry B (2005) From the corporeal to the informational: exploring the scope of benefit sharing agreements and applicability to sequence databases. In Thiele F, Ashcroft R (Hrsg) Bioethics in a small world. Springer, Heidelberg, 73–91 Patzig G (1989) Gibt es eine Gesundheitspflicht? Ethik in der Medizin. Springer, Berlin Heidelberg New York, Heft 1, S 3–12 Rehmann-Sutter C, Müller H (1995) Ethik und Gentherapie. Zum praktischen Diskurs um die molekulare Medizin. Attempto, Tübingen Rifkin J (1998) The biotech century. Tarcher&Putnam, New York. Deutsch: Rifkin J (1998) Das biotechnische Zeitalter. Goldmann, München Sass HM (Hrsg) (1989) Medizin und Ethik. Reclam, Stuttgart Schöne-Seifert B (1996) Medizinethik. In: Nida-Rümelin J (Hrsg) Angewandte Ethik. Die Bereichsethiken und ihre theoretische Fundierung. Ein Handbuch. Kröner, Stuttgart, S 552–648 Schöne-Seifert B (2002) Contra Potentialitätsargument. Probleme einer traditionellen Begründung für embryonalen Lebensschutz. In: Damschen G u. Schönecker D (Hrsg) Der moralische Status menschlicher Embryonen. De Gruyter, Berlin, S 169–185 Shrader-Frechette K (1991) Risk and Rationality. University of California Press, Berkeley Silver LM (1998) Remaking eden. How genetic engineering and cloning will transform the american family. Avon Books, New York Singer P (ed) (1991) A companion to ethics. Blackwell, Oxford Singer P (1993) Practical ethics. Cambridge University Press, Cambridge. Deutsch: Singer P (1994) Praktische Ethik. Reclam, Stuttgart Singer P (1994) Rethinking life&death. The Text Publishing Company, Melbourne. Deutsch: Singer P (1998) Leben und Tod. Der Zusammenbruch der traditionellen Ethik. Fischer, Erlangen Singer P, Kuhse H, Buckle S (eds) (1990) Embryo experimentation. Ethical, legal and social issues. Cambridge University Press, Cambridge

Solter D et al. (2003) Embryo Experimentation in Europe. Springer, Heidelberg Sorell T (ed) (1998) Health care, ethics and insurance. Routledge, London Spaemann R (1997) Es gibt kein gutes Töten. In: Spaemann R, Fuchs T (Hrsg) Töten oder Sterben Lassen. Worum es in der Euthanasiedebatte wirklich geht. Herder, Freiburg, S 12–30 Steinbock B, Norcross A (eds) (1994) Killing and letting die. Fordham University Press, New York Stingl M (1997) Ethics I (1900–45). In: Canfield JV (ed) Routledge history of philosophy, vol X. Routledge, London Straus J (1998) Patentierung. In: Korff W, Beck L, Mikat P (Hrsg) (1998) Lexikon der Bioethik, Bd 2. Gütersloher Verlagshaus, Gütersloh, S 830–834 Straus J (2003) Patents on Biomaterials – A new colonialism or a means for technology transfer and benefit sharing. In Thiele F, Ashcroft R (Hrsg) Bioethics in a small world. Springer, Heidelberg, 45–72 Thiele F (Hrsg) (2001 a) Genetische Diagnostik und Versicherungsschutz. Europäische Akdemie, Bad Neuenahr-Ahweiler, Graue Reihe 20 Thiele F (Hrsg) (2001 b) Tierschutz als Staatsziel? Naturwissenschaftliche, rechtliche und ethische Aspekte. Europäische Akademie, Bad Neuenahr-Ahweiler, Graue Reihe 25 Thiele F (2002 a) A moral argument against human germline therapy? Poiesis Prax 1: 160–164 Thiele F (2002 b) Genetic Tests in the Insurance System. Criteria for a Moral Evaluation. Poiesis Prax 3 Thiele F (2002 c) Zur moralischen Bewertung der Patentierung von Genen. In: Steigleder K, Düwell M (Hrsg) Bioethik – Eine Einführung. Suhrkamp, Frankfurt Thiele F (2004) Bioethics. Its foundation and its application in political decision-making. In: MacHamer P, Wolters G (Hrsg) Science, Values and Objectivity. Pittsburgh University Press, Pittsburgh, 256–274 Thiele F (Hrsg) (2005a) Aktive und Passive Sterbehilfe. Fink, Paderborn Thiele F (2005b) Ethik, medizinische. In: Mittelstraß J (Hrsg) Enzyklopädie Philosophie und Wissenschaftstheorie. Band 2, Metzler, Stuttgart, 417–421 Tutton R, Corrigan O (Hrsg) (2004) Genetic Databases: Socio-Ethical Issues in the Collection and Use of DNA. Routledge, London UNESCO (1997) Universal declaration on the human genome and human rights. UNESCO, Paris Wiese G (1994) Genetische Analysen und Rechtsordnung. Luchterhand, Neuwied Wiesing U (Hrsg) (2000) Ethik in der Medizin. Ein Reader Reclam, Stuttgart Wieland W (1975) Diagnose. Überlegungen zur Medizintheorie. deGruyter, Berlin Wieland W (1985) Strukturwandel der Medizin und ärztliche Ethik. Philosophische Überlegungen zu den Grundfragen einer praktischen Wissenschaft. Winter, Heidelberg Wieland W (2002) Pro Potentialitätsargument. Moralfähigkeit als Grundlage von Würde und Lebensschutz. In: Damschen G u. Schönecker D (Hrsg) Der moralische Status menschlicher Embryonen. De Gruyter, Berlin, 149–168

533

Sachverzeichnis 17E-Estradiol 322 2,5-Diketo-D-Gluconsäure 491 2,5-DKG 491 2-Keto-L-Gulonsäure 491 2-KLG 491 25-Basenpaar-Region 502 2D-Gelelektrophorese (2DE) 298 2DE (2D-Gelelektrophorese) 298–300, 302, 303, 306, 308 3’-UTR 151 3D-Struktur der DNA 484 40S-ribosomale Untereinheit 140 434 Cro 279 45,X 52 47,XXX 52 47,XXY 52 4E-Bindeproteine (4E-BP) 142, 145, 146, 150 5-Methyl-Cytosin 128 5-HT3-Antagonisten 323 5-Hydroxytryptamin-Typ-3-RezeptorAntagonisten 323 5’-UTR der mRNA 147 60S-Untereinheit 140 7-Methylguanosin-Cap 123 80S-Ribosom 140 9-cis Retinsäure (RXR) 133 D-Catenin 24 D-Helix 277 D-Synuclein (PARK1) 188 E-Amyloid (AE) 229 E-Catenin 14, 24, 218, 219, 220 E-Faltblatt 2428, 277 E-Galaktosidase 215, 216 E-Globin-Gen 142 E-Kleeblatt-Wachstumsfaktor 285 E-Oxidation 9 E-Sandwich 286 E-Schleifen 277 E2-Integrinen 33

A ABCB1 324 aberrante Mitosen 191 aberrante Proteine 176 aberrante Verteilung von Chromosomen 161 Abiotisches Trägermaterial 265 Abstoßungsreaktion 496, 503 Acetyl-CoA 9

Acetylierertyp 317 acterial attachment 502 ADA-SCID 380, 388, 394 Adaptermoleküle 163 Adapterproteine 164 Adaption 498 Adenosintriphosphat (ATP) 9 Adenovirale E1A-Proteine 382 Adenoviren 186 Adhäsion 14, 16 Adherens junction 14, 22, 24 Adrenodoxin 284 Adrenodoxinreduktase 284 adulte Stammzellen 431 ADVATE 498 Aerobiers 483 Affinität 487 Affinitätschromatographie 303, 304 Affinitätsreinigung 300, 304 Aggregatkultur 257 Ähnlichkeitsmaß 80 AICD 183, 184 AIDS 184, 497 Akt-Kinase 180, 181, 187 Aktivatoren 485 Aktivierung von Onkogenen 160 Albumin 498 Alphatoxin 186 ALPS 183 ALS 228 alternatives Spleißen 7, 124, 164 Alterungsprozess 114 Alzheimer 147, 228 Alzheimer-Erkrankung 6, 8 Alzheimer-Krankheit 188 AMAs (Antikörper-Mikroarrays) 301, 302 Aminosäure 8, 140 Aminosäureabbau 9 Ampicillin 486 Amplifikationen 366 Amyloid-E 188 anaerobe Glykolyse 9 Anämien 482, 505 Anaphase 15, 161 Anaphase-Promoting-Complex 50 Aneuploidie 51, 176 Angelman-Syndrom 52, 134 Anoikis 190 anomale Dispersion 282

ANT-Protein 170 Antibiotika 480 Antigen 487 Antigenbindungsregion 452 Antigendeterminante 453 Antigene 451 Antigenrezeptor 182 Antikodon 485 Antikörper 451, 487 Antikörperbibliothek 460 Antisense 494 Antisense-Oligonukleotide 411 Antisense-RNA 496 Antizipation 42 AP-1 132 APAF-1 172, 179 APAF-1-Homolog ced-4 173 APC 218, 219, 220 Aphthoviren 150 APO-1L 183 Apoptose 16, 160, 251, 500 Apoptosedefekte 190 apoptosehemmende Mitglieder 166 Apoptoseinduktion 185 Apoptoseregulation 184 Apoptosesensibilisierung 184 Apoptosesignalkaskade 167 Apoptosesignaltransduktion 167 Apoptosesignalwege 162, 190 Apoptosom 163, 166, 172, 175, 177 APP 229 ARF 178, 179 Argininmethyltransferase 130 Array-CGH 58 Array-Technologie (DNA-Chips, „mikrofluid-cards“) 18, 369 Array-Express 91 artifizielle Organe 494 Arylamin-N-Acetyltransferase 317 arzneimittelabbauende Enzyme 315 Arzneimittelgesetz 512 Arzneimitteltransporter 324 Arzneimittelwirkung 314 ASTAMI-Studie 436 Ataxia teleangiectatica 50, 188 ATF4 177 ATF6 177 ATM 191 ATM-Kinase 178, 188 Atmungskette 9, 102

A

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Sachverzeichnis

atomare Kraftfelder 283 ATP-abhängige Pumpen 11 ATR 188, 191 ATR-Kinase 178 attB site 502 Ausstülpung von Zellmembranblasen 161 Autoantigene 182 Autoantikörper 301, 307 Autoimmunerkrankungen 307 Autoimmunität 182, 184 Autoimmunreaktion 184 autokriner Suizid 183 autologe BandscheibenZelltransplantation ADCT 267 autologe Chondrozytentransplantation (ACT) 267 autologe oder allogene Zell- und Gewebeprodukte 270 autologes Gewebe 503 Autolyse 365 Autophagie 160, 161, 176, 181, 184, 187, 191 Autophagosomen 161 Autophagozytose 161, 176 Autosomen 334 average linkage 80 Avitaminose 491 Axone 31, 32 Azellularisierung 265

B B-Lymphozyten 451, 505 B-Zell-Lymphome 154, 190, 364 BAC 211, 214 Backbone 502 Bak 166, 177, 179, 186, 194 Bakterien 363 Bakterienhybride 505 Bakteriophage Lambda 502 BamHI 486 Banding-Technik 253 Basenexzisionsreparatur (BER) 396, 399 Bax 166, 177, 179, 193, 194 Bax-Gen 190 Bax-/Bak-abhängig 179 Bax-/Bak-abhängiger Signalweg 186 Bax-