Biología molecular de la célula - 3a edición

El codigo genetico 2.' posicion

1." poslcl6n 18Xtremo 5'1

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AmlnOlicidos y SUS sfmbolos

Codones

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Acido aspArtico

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Acido glulamico

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Tript6fano

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-

BIOLOGIA MOLECULAR DE

LA

-

ELULA TERCERA EDICION

Bruce Alberts. Dennis Bray Julian Lewis • Martin Raff Keith Roberts. James D. Watson Traduddo poT

Meree Durforl i Call Catednltica de Biologfa Celular Animal y Vegetal de la Facultad de Biologfa de 1a Universidad de Barcelona

Miquel Llobera i Sande Catedriitico de Bioquimica y Bialag!a Molecular de Iii Facultad de Biologfa

de 1a Universidad de Barcelona

EDICIONES OMEGA, S.A. Plal6. 26 • 08006 Barcelona

BruceAlberlses DoclOr (Ph.D.) par la Universidad de Harvard y actualmente es Presidente de la National Academy of SCiences y Profesor de Bioqufmica y Bioffsica en la Universidad de California, San Francisco. Denllis Brayes Doctor (Ph.D.) por el Massachusetts Institute ofTechnology y actualmente esta becado por el Medical Research Council en el Departamento de Zoologia de la Universidad de Cambridge. Julian Lewis es Doctor (D.Phil.) por la Universidad de Oxford y actualmente es Senior Scientist en la Imperial Cancer Research Fund Developmental Biology Unit, de la Universidad de Oxford. Marti" Raffes Doctor (M.D.) por la Universidad de McGill y actualmente es Profesor del MRC Laboratory for Molecular Cell Biology y del Biology Department University College de Londres. Keith Roberlses Doctor (Ph.D.) por la Universidad de Cambridge y actualmente es Director del Depanmem ofCel! Biology del John Innes Institute de Norwich. James D. Watson es DoclOr (Ph.D.) por la Universidad de Indiana y actualmente es Director del Cold Spring Harbor Laboratory. Es autorde Molecular Biologyo[tlleGe/ley, con Francis Crick y Maurice Wilkins, recibi6 el Premio Nobel de Medicina y Fisiologfa en 1962.

En la traducci6n han colaborado: Ora. M. Gracia Bozzo, Ora. Roser Pagan, Ora. Montserrat Poquet. Dr. Manuel Reina, Dr. Josep Valero y Dr. Sen~n Vilar6.

Quedan rigurosamente prohibidas. sin la autorizaci6n escrita de los titulares del "Copyright", bajo las sanciones establecidas en las leyes, la reproducci6n total 0 parcial de esta obra por cualquier medio 0 procedimiento, cornprendidos la reprograffa y el tralamiemo informatlco, y la distribuci6n de ejemplares de ella mediante alquiJer o prestamo publicos, asf como la exportaci6n e importaci6n de esos cjcmplares para su distribuci6n en vema, fuera del ambito de la Comunidad Econ6mica Europea. Aul.horized translation from English language edition published by Garland Publishing. Inc. MOLECULAR BIOLOGY OF THB CEll

CI993. 1989. 1994 by BruceAlbens, Dennis Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts and James D. Watson y para la edici6n espanola CI996 EdicionesOmega. SA, Barcelona ISBN 84-282-101 I-X DepOsito legal B. 23.553-96 Printed in Spain Lnd. GrM. Ferr~ Olsina, SA - VlIadomat, 158-160 int. -08015 Barcelona

Cublcrta antcrlor: III fOlograffa muestra una libra nerviosa de rala en cultlvo. Estl!. marcada con un nuorocromo asociado a un anticuerpo que reconoce el soma celular y las prolongaciones dendrftkas de la cl!lulll (amarillo). Los tenninales nerviosos (verde) de Olras neuronas (no visibles) que han eslablecido sinapsis con la celula eslan marcados con un anlicuerpo direrente. (Por conesra de Olar Mundigl y Piclro de Camilli.) Cubicna poslerior-Ios aUIOTeS, en orden alrabetico. alravesando Abbey Road en Londres, yendo a comer. La mayor parte de esla lercera edid6n Sf ha escrito en una casa situada en el lingulo de la imagen. (FotografJa de Richard Olivier.) Dedkalorla: Gavin Borden, Ultimo presidente de Garland Publishing. cunido durante Ia ascensi6n cerca del Mount McKinley. a mediadosde 1980, oon Bruce Alberts, autorde ~8iologra Molecu1ardc La celula~ y el ramoso gufa de montatla Mugs Stwnp (1940-1992).

fndice general Caracterlsticas especiales fndice de materias Agradecimientos Nota allector Nota de Los traductores

i ,

xv xvii xxxix xliii

xlv

PARTE

Introducci6n a la celuia 1. La evoluci6n de la celula

2. Pequefias moleculas, energia y biosintesis 3. Macromoleculas: estructura, forma e informaci6n 4. C6mo se estudian las celulas

3 43 93 147

PARTE

Genetica molecular 5. Funci6n de las proteinas 6. Mecanismos geneticos basicos 7. Tecnologia del DNA recombinante 8. El nueleo celular 9. EI control de la expresi6n genica

207 237 313 359 429

509

,

Glosario fndice alfabetico

III

541 589 641 697 771 843 925 977

PARTE

Las celulas en su contexto social 19. Adhesi6n celular, uniones celulares y matriz extracelular 20. Celulas germinaJes y fecundaci6n 21. Mecanismos celulares del desarrollo 22. Celulas diferenciadas y conservaci6n de los tejidos 23. EI sistema inmunitario 24. Cancer

II

PARTE

Organizaci6n interna de la celuia 10. Estructura de la membrana 11. T'ransporte de mohkuJas pequeflas a traves de la membrana y base i6nica de la excitabilidad de la membrana 12. Compartimientos intracelulares y clasificaci6n de proteinas 13. Tea-fico vesicular mediante las rutas secretora yendocftica 14. Conversi6n energetica: mitocondrias y cloroplastos 15. Transmisi6n de seflales entre celulas 16. EI citoesqueleto 17. El cicio de divisi6n celular 18. Los mecanismos de la divisi6n celular

I

1017 1083

IV

Illl

1219 1279 1345 G-l 1- J

xiii

Caracteristicas especiales Panel I-I

C£luJas eucariotas: esquema de sus principales organulos

18-19

Panel 1-2

Modelos celu.lares y tejidos con los que estan construidas las plantas 5uperiores

30-31

Panel 1-3

Algunos de los diferentes lipos de celuJas existeOles en el cuerpo de un vertebrado

36-39

Tabla 2-1

Composici6n quImica aproximada de una ceJula bacleriana

Panel 2-1

45

Propiedades qufmicas del agua y su influencia sabre el componamienlo de las moleculas biol6gicas

50-51

Panel 2-2

Enlaces y grupos qufmicos frecuentes en las moleculas biol6gicas

52-53

Panel 2-3

Algunos de los tipos de azucares encontrados habituaJrnente en las celulas

54-55

Panel 2-4

Algunos de los tipos de acidos grasos encontrados hahirualmente en las celulas y las eslructuras que (annan

56-57

Panel 2-5

Los 20 aminoa.cidos que inlervienen en la sfnlesis de las prole[nas

58-59

Pane12-6

Resumen de los principales tipos de nucle6tidos y sus derivados existentes en las celuJas

6l>-61

Tabla 3-1

Composici6n quimica aproximada de una bacteria tfpica y de una oolula de mamffero tipica

94

Tabla 3-2

Enlaces qufmicos covalemes y no covalentes

95

Panel 3-1

Principales tipos de fuerzas no covalentes d~biles que unen las moleculas entre sf

Tabla 3-3

La relacion entre las diferencias de energfa libre y las conSlantes de equiHbrio

Panel 3-2

Estructuras del DNA y del RNA

Tabla 1J-I

Comparacion de las conccmraciones i6nicas en cl interior y el exterior de una c~lula de mamffero

542

Equilibrio del agua intracelular: el problema y su soluci6n

552

,

Panel 11-1

96-97 101

104-105

Panel 11-2 Deduction de la ecuaci6n de Nernst

562

Panel 11-3 Algunos experimentos c1asicos realizados en el axon gigante del caJamar

568

Tabla 12-1

Volumenes relativos ocupados por los principales compartimientos intracelulares en una celula hepatica tipica (hepatocito)

Tabla 12-2 Cantidades relativas de tipos de membrana en dos cclulas eucariotas

591 591

Panel 12-1

Estudio de las secuencias sefial y de la translocaci6n de protefnas a traves de membranas

Panel 13-1

Estrategias utiJizadas para estudiar los mecanismos moleculares implicados en el transporte vesicular

682-683

Panel 14-1

Energfa libre y reacciones biol6gicas

714-715

Panel 16-1

Polimerizacion de la actina y la tubuJina

682-883

Panel 18-1

los seis estadios de la division celular

982-983

Pane121-1

Revisi6n de genetica chisica

Panel 21-2 Caracterfsticas generales del desarrollo temprano de las plantas con nares CapftuJo 22 A~ndice CatAlogo de las c~luJas del cuerpo humano aduho

598

1148-1149 1189

1271-1274

xv

.

Indice de materias

II

Parte

Introducci6n a la celula

Capitulo

La evolucl6n de la celula Desde lIu moiecuJas huea la prlmet'a (;t!Jula Eo condiciones prebi6ticas se pueden formar mol~ulas biol6gicas Pueden desllrrolJarse sistemas qufmicos complejo! en un enlomo lllejado de su equilibria qufmico

Los polinucle6tidos son capaces de dirigir su propia sllllesis Las molkulas aUlorrepLicantes esllin somelidas II III selecci6n natural A1gunas mollkulas espedalizadas de RNA pueden catalizar reacciones bioqufmicas La informad6n Ollyc desde los polinucle6lidos a los polipeplidos las membranas definieron la primera relula Todas las relulas aetuales utillzan el ON.... como material hereditario Resumen De los procarlolas a los ellcorlola! Las cl!lulas procariotas son estructuralmenlc simples pero bioqulmicamente diversas Las reacciones metab6licas evolucionan Comparando secuencias de DNA se pueden dcducir relaciones evolutivas Las cianobaeterias pueden fijar CO, y N, Las baeterias pueden realizar la oxidaci6n aerdbica de las moleculas nutritivas Las c~lulas eucariOias poseen varios orgJinulos caracterfsticos Las c~lulas eucariOlas dependen de las rnitocondrias para su rnetaboJismo oxldatlvo Los cloroplaslos son descendlenles de una celula procariola incorporada

,

, , 6 7 8

8 10

1 Las dlulas eucariOlas conrienen una rica dOlaci6n de membranas internas Las celulas eucariotas tienen un citoesqueleto Entre los prolOzoos se encuentran las cclulas mas compleJas conocldliS En las celulas eucariotas el material genctico esta empaquetado de fonna compleja Resllmen De las tt1ulas simples a los organlsmos plurk:elulares Las celulas se pueden asociar formando colonias

'"

25 25 26 27

27 28

21

Las dlulas de un organismo superior se especializan ycooperan La organizaci6n pluricelular depende de la cohesi6n enlre las dlulas L.1S capas de dlulas epiteliales envuelven un medio lnterno prolegldo La comunicaci6n cClula·celula controla es esquema espacial de los organismos pluricelulares La memoria celular permile el desarrollo de palrones complejos Los programas b4sicos de desarrollo tienden a ser conservados en Ia evolucidn Las cclulas somaticas del cuerpo de los venebrados mueslran m4s de 200 lipos diferentcs de cspecJalizaci6n Los genes pueden ser activados y desaclivados Comparaciones entre secuencias revelan celllenares de familias de genes 110111610gos Resumen

22

81bllograffa

43 43 45 46 47 48 49 62

las ~lulas oblienen energfa mediante la oxidaci6n de mol&:u1as biol6gicas La dcgradaci6n de una molecula organica se reali:w a trav~s de una secuencia de reacciones catallUldas enzimll.ticamenle Parle de la energfa liberada en las reacciones de oxidaci6n se acopla a la reacd6n de formaci6n de ATP La hidr6lisis del ATP genera orden en las clHulas Resumen

62

FJ allmenlo y la obtenckSn de la energfa celular 69 Las moleculas alimentidas son degradadas en Ires etapas para producir ATP 69 La g1ucolisis puede producir ATP incluso en ausencia de oxfgeno 70 EI NADH es elintermediario central ell el catabolismo oxldativo 73

11 12 12 12

l' 15

16 17

2<J

29

32 32 33

34 34 36 37 37

'1 '1

Pequeiias moleculas, energia y sfntesis Los componenlCS qulinkos de una dlula

La qufmica celular se basa en los compueslos de carbono Las cclulas ulllizan cuatro ripos Msiros de molcculas pequel'ias Los aztlcarcs son las moiccuilis alimenticilis de III celula Los acidos grasos son componellles de las membranas celulares Los amlno4cldos son las subunldades de las prOlefnas Los nucle6lidos son las subunidades del DNA y del RNA Resumen

Orden biokSgk:oyenergta El orden bioldgico resuha posible gTllcias a la Iibcrad6n de energfa calorffica por parte de las celu1as Los organismos fOiosintetizadores ulilizan la luz solar para slnletizar compuestos organicos La energ(a qufmica pasa de las plantas a los anlmales

63 63 64

65

66 66 67 69

xvii

74

Los~Irmeros biol6gicos se sinletlzan mediante la repeticiOn

aJ oldgeno impulsa la formaciOn de ATP Los aminoacidos y los nucle6tidos forman pane del cicio del N

75 16

Resumen

Resumen

n n

EI metabolismo esta dominado por el cicio del acido cltrico

e reacelones elemenlales de deshidratadOn

En la fosfonlaciOn oxidatlva, la lransferencia de eleclrones

U b50s£ntesls YI. cread6n de orden El cambio de eneTgfa Iibre de una reaa:kSn determlna sl bla puede producirse 0 no A menudo las reacdones de bios{nlesis eslan acopladas dlrectamente a la hldr6tisis del ATP Las coenzimas inlervienen en la lransferencia de delenninados grupos quImicos La estruetura de las coenzimas sugiere que se formaron en un mundo de RNA La biosfntesls neceslta poder reductor

n 78

80

CoordlnackSn entre calaboUsmo y bk>5fnlesls El melabolismo esla organizado y regulado Las vias metab6licas eslan reguladas a lraves de cambios de la actlvidad enzimatica Las reacdones catab6licas pueden revertirse mediante un apone de energl'a Las enzimas pueden activarse e inhibirse mediante modificaciones covalenles Las reacciones eslan companimenladas, lanto dentro de las c~lulas como dentro de los organismos

87 89 89 91

82

Blbllografia

91

93

Resumen

102

Addoanudclcos Los genes estlin fonnados por DNA Las mol~culas de DNA consisten en dos largas cadenas unidas por pares de bases complementarlas La estructura del DNA proporclona una explicacl6n del proceso de la herenda Los errores en el proceso de replicaci6n del DNA generan mUlaclones La secuencia de nucle6tidos de un gen delermina [a secuencia de aminoaddos de una Ilrolelna Portiones de la secuencla de DNA se copian en mollkulas de RNA para gular la sfnlesis de protelnas Las moll!culas de RNA de eucariolas son conadas y recombinadas, eliminandose secuencias intron Las secuencias de nucle6tidos del mRNA son Mleldas~ en grupos de Ires y traducidas a aminoaddos Las moll!culas de !RNA emparejan los aminoicidos con los grupos de nucle6tidos El mensaje de RNA se lee de un enremo al otro por un ribosoma A1gunas molecu.las de RNA acruan como C81aJizadores

102 102

Resumen

116

Esuuctun de lu prolefnas La fonna de una molecula proteica estll. detennlnada por

I 16

la secuencia de sus aminOlicidos Diferentes cadenas proteicas presentan esquemas de plegamiento 19uales Las prolefnas son mol~ulas asombrosamente vers4tiles Las protefnas presentan diferentes nlveles de organlzaclOn eSlructuraJ

116

(ndlce de materias

B6

Resllmen

Las interacclones especfficas de una macromolecula dependen de enlaces d~biles no covalentes 94 Una h~lice es un motivo estruetwal comun en las estrueturas biol6gicas generadas a partir de subunidades repelidas 99 La dlfusiOn es el primer paso hacia el reconoclmiento molecular 99 Los movimientos t~nnicos unen a las moiKulas y luego las separan 99 La constante de equilibria constiluye una medida de la !uen.a de interacdOn entre dos moll!culas 100 Los 'lomos y las molKulas se mueven mpidamente 101 Los proccsos de reconocimienlo molecular nunea pueden ser perfectos 101

xviii

B6 B6

81

MacromolecuIas: estructura, forma e informaci6n ProcesoI de reconoclmlento molecular

84 84

103

106 108 108 109 110 111

III

ll2 113

119 120 122

Capffulo

S

Los dominios est4n formadas par cadenas pollpeptldicas que se pUegan adelante y atrlis. generando delgadas clrcunvoludones en la superflcle de la protefna De entre la gran cantidad de cadenas polipeptldicas posibles. unicamente un nUmero relalivamenle pequeno de elias lIegaria a ser util Normalmenle las nuevas prolelnas se desarrollan por aJ{eraciones menores de prolelnas antiguas Las nuevas prOlefnas pueden desarrollarse por recomblnaci6n de dominios polipeptfdicos preexistentes Las homologlas estruetwales pueden contnbuir en la asignaciOn de !undones a las prOlefnas descubienas recientemente Las subunidades proteicas pueden ensamblarse fonnando grandeseslrucluras Un solo [ipo de subunldad proleiea puede interacdonar consigo misma fonnando agregados geom~lricos regulares A menudo las prOlefnas superenrolladas colaboran en la conslrucdOn de grandes estruCIUras en las c~lulas Las proternas pueden ensamblarse rommndo laminas, tubos 0 esferas Muchas estructuras celulares son capaces de aUloensamblarse No todas las estructuras biol6g1cas se forman por autoensamblaje

124

125

125 127

129

130 130 131 132 132

RC$ll/llcll

134 135

Las proteCnas como cataJlzadores

135

La confomlaciOn de una proterna determlna sus propiedades qurmicas El primer paso de la call1.lisis enzimll.tica es la uniOn del substrato Las enzimas aceleran las reacciones estabtlizando delenninados eslados de transickSn Las enzimas pueden facililar Ia fonnaci6n y Ia rorura de enlaces covalenles a uav& de una calaIisis adda y b4siea simultanea Ademlis, las enzimas pueden incrementar las velocidades de reacciOn fonnando enlaces covalentes Intennedios con sus subslralos las enzimas aceleran las reacciones qufmicas pero no pueden hacerlas energ~tieamelllem's favorables l.as en7Jmas pueden delenninar el senlido de una vfa acoplando detenninadas reacciones a la hidrOlisis del ATP Los complejos multienzimliticos ayudon a Incrementar la velocldad del metabolismo celular

135 137

138

139

140 140 141

Resumen

14 J 142

Blhllografia

143

C6mo se estudian las «Hulas Obscrvacl6n de la estructura de las celulas con el mlcroscoplo EI microscopio 6ptico puedc resolver detalles si/uados 1I O,21.lffi de distancia Para la observati6n microsc6pica, normalmcnte los tejldas son fijados y seccionados

147 149

150

Los diferentes componentes de la cc!lula pueden sec lenidos

selectivamente

151

Mediante la microsc:;opia de tluorescencia se pueden localizar

mo1E!culas cIllas celulas de forma especlfica Las celuJas vivas se pueden observar con nitldez en

152 Wl

microscopio de contraste de fases 0 de contcaste de fases interferencial Mediamc lecnicas elcctronieas [as imaraci6n del DNA, el fundamento del proceso de replicaci6n es el apareamiento de bases La horquilla de replicaci6n del DNA es asim~trica El elevado grado de fidelidad del mecanlsmo de replicaci6n del DNA requlere la eristenda de una meeanismo de ~correcci6n de galeradas5610 la replicacl6n del DNA en direcci6n 5' a 3' pennite la existencia de un eficieme procesos de correcd6n deerrores Una enzima especial que polimeriza nucle6tidos sinletiza conas moleculas cebadoras de RNA sobre la cadena relTasada Vnas protelnas especiales ayudan a abrlr la doble Mllee del DNA por delante de la horquilla de replicaci6n Una moh!cula de DNA polimerasa m6v11 se mallliene unida al DNA mediante un alllllo deslizante En la horquilla de replicati6n. una serie de proternas cooperan entre sl fonnando una -mdquina de replicaci6nUn sistema de correcci6n de galeradas que e1imina los errorell de replicaci6n producidos por la m4quina de repUcaci6n

268

238 241

242 243 244 245 246

249 252

253

254 254 255 257

Meeanlsmos de reparacl6n del DNA 258 Las secuencias de DNA 51.' mantienen con un elevado grado de fidelidad 258 Las frecuencias de mutaci6n observadas en «Iulas proliferativas son conslstenles con los vaIores evolutivos estimados 259

[ndice de malerias

227

Resumen

Mecanismos geneticos basicos

xx

226

259 260

260 261 263 263

266

268 269

270

271

272 273 273 275 276

las horqullJas de replicaclon se inician en el origen las DNA to~olsomerasas cvitan que el DNA se enrede durante a replicacion La replicacion del DNA en los eucariolas es blisicamente similar a la de los procariotas

Resllmen

277

278 280 280

RecomblnacHSn geneUca La re.;;ombinacion general esla guiada por interacciones de apareamielllO de bases entre cadenas oomplementarias de dos moltkulas homologas de DNA 282 La recomblnacion general puede iniciarse en una muesca de una cadena de la doble helice de DNA 283 Las reacciones de hibridacion del. DNA proporcionan un modelo seneillo para la fase de apareamiento de bases en la recomblnacion general 294 La prOlefna RccA pennite a una molOCula de una sola cadena de DNA aparearse oon una region homologa de una doble helke en E. coli 285 La recombinacidn genelica general habimalmenle mpone lffi intercamblo cruzado de cadenas 0 entrecruzamienlo 287 La oonvenion I¢nk:a SoC produce combinando procesos de recombinadon general y de s(ntesis limitada de DNA 287 Los mecanlsmos de correa:ion de efTOres pueden evilar la recombinadon genetk:a promlscua entre dos secuencias de DNA mal apareadas 288 Enzimas de recombinaclon espedfica de lugar ponen y quitan del genoma secuencias especiales de DNA 289 La recombinacion lransposicional puede insenar un elememo gem!lico movil en cualquier sccuencia de DNA 291

""

Resumen

292

VIrus, phlsmldos yelemcnlos genetlcos transponlbles Los virus son elementos gem!ticos moviles La cubierta eKterior de un virus puede scr una capsidc proteica 0 una envoltura membranosa Los genomas vfrlcos se presentan en una gran variedad de formas vfricas y pueden ser tanto de DNA como de RNA Los cromosomas vfricos codifican enzimas implicadas en la replicaeion de su licido nudeioo Tanto los virus RNA como los virus DNA se replican mediante la formacion de cadenas oomplemcntarias Los virus ulilizan la maquinaria de I..Uioo intracelular de sus ctlulas hul!sped Diferentes virus recubienos geman a panir de diferentes membranas ululares Los cromosomas vfricos pueden integnuse en los eromosomas del huesped La sfntesis continuada de algunas prolefnas vfricas puede transfonnar a las celulas en cancerosas Los \;rus lumorales RNA son relrovirus El virus del SIDA es un retrovirus Algunos elemenlos lransponib1es estan estrc.::hamente relacionados con los retrovirus Otros elementos lransponibles se transfieren directamente a sf mlsmos desde un lugar a otro del gellOma Probablemenle la mayorfa de los virus evolucionaron a pamr de plasmidos

306

Resumen

307

Bibllograaa

308

Reswllf:1l

I

IHbridacion de dcldos nuclelcos La hibridacion de ~cidos nucleicos proporclona un metodo sensible para la delea:lon de secuencias de!erminadas de nucle6tidos Las lransrerencias Northern y Southern facilitan la hibridaclon oon moltkulas de ~cidos nudeicos separadas elcctrofore!icamenle El an~lisis de los polimorlismos de longitud de los fragmcmos de reslrlccion (RFLP) facUita el aml.l.isis genelioo de los grandes genomas Las moleculas sinteticas de DNA facili!an el diagn6stico prenatal de enfermedades genl!licas La hibridaclon poco rigurosa pennile idenlificar genes relaclonados de fonna indirecta Las lecnicas de hibridaeion in situ penni{en localizar secueneias espedficas de acidos nucleicos en los cromosomas yen las ctlulas

Resumen

(ndiee de materias

294

29' 296 297 298 300

301 301 302

30< 305

305

CapftulO

Tecnologfa del DNA recombinante Fragmenl8c16n, scparacl6n y secuenclacl6n de molkulas deDNA Las endonucleasas de reslrlcclon oorlan las moJeculas de DNA en secuencias nucleolldicas espedficas Los mapas de restriccion muestran la distribucion de pequei'ias secuenclas nucleotfdicas a 10 largo del eromosoma Las moltkulas de DNA de diferentes tamai'ios pueden separarse mediante la electroforesis en gel Las moleculas purificadas de DNA pueden ser marcadas ill vitro con radlois6topos 0 con marcadores qufmicos los fragmenlos ;llslados de DNA pueden ser rapldamente secuenclados Las huellas del DNA revelan loslugares donde las protefnas se unen a la molecuta de DNA

293 293

7 314

315 315 317 316 31' 320 322 322

323

Cionaje de DNA Se pucde conslruir una llbrerla de DNA utilizando veetores vCricos 0 veclores plasmfdicos Dos lipos de Iibrerfas de DNA cubren diferemes propOsitos Los clones cDNA comienen secuendas codificantes oolllinuas Pueden pre parse librerlas cDNA a partir de poblaciones selecclonadas de mol~ulas de mRNA Para idcntificar los clones de interes en una librerla de DNA pucde utllizarse tanto una sonda DNA como un ensayo para In prote[na expresada La traduccion ill vilro faci!lta la identificaci6n del cIon de DNA correcto La sel(.'Cc!on de clones DNA solapados permite "caminar" sabre el cromosoma hasta un gen vc.::mo de interes Se estdn construyendo librerfas genomicas de clones ordenados para organlsrnos selecclonados El clonaje posiclonal de DNA revela la presencia de genes de funciones imprevistas Mediante una reaccion de polimerizacion en cadena se pueden donar segmemos de DNA en un tubo de ensayo

331 332 333

'"

335 335 337 337 339 340

32
667 88B

BB9

890 892 893

Resumen

894

Prote(nas de uniOn a la actina Un dtoesqueleto unido de manera sendlla a la membrana proporciona soporte mecdnico a la membrana plasmlhica de los eritrocitos

894

894

Protefnas de entrecruzamiento con diferentes propiedades organizan ensamblajes particulares de actina Las prOlefnas de uni6n a la actina con propiedades diferentes esnin construldas a panir de m6dulos semejantes La gelsolina, cuando se activa por Ca 2•• fragmenta los filamentos de actina En las celulas eucariotas se han encontrado multiples tipos de miosina En celulas no musculares pueden formarse transitoriamente ensamblajes semejantes a los musculares Los contactos focales permiten que los filamentos de actina se extiendan hacia el substrato Los microvilli ilustran de que forma los haces de filamentos entrecnlzados de actina pueden estabilizar zonas locales de la membrana plasmatica EI comportamiento de la corteza celular depende de un equilibrio de interacciones cooperativas y competitivas entre una gran colecci6n de protefnas de Uni611 a la actina La migraci6n de las celulas animales compona tres subprocesos distintos dependientes de actina EI mecanismo de la locomod6n celular puede ser disecciomtdo geneticamente Resumen

E1 cicio celular de los embrlones tempranos y la Juncl6n delMPF EI crecimlento del oocito de Xellopus estll equilibrado por la divisi6n del huevo Un regulador citoplasmatico. el MPF. contrala la entrada en la mitosis Las oscilaciones de la actividad MPF controlan el cicio de divisi6n celular

xxx

(ndice de materias

B97 898

900 902

902

904 906 907 90B

Blbllograffa

920-

Capfmlo

17 926

La replicad6n del DNA nuclear ocurre durante una fase

especffica de la Interfase: la fase 5 Paralelamente al crecimiento continuo de la ciilula, durante el cicio celular se producen una serie de procesos discretos Un sistema de control central desencadena los procesos esenciales del cicio celular El control del cicio celular es un mecanismo basado en una protefna quinasa Resumen

897

El musculo 908 Las miofibirillas estan formadas por ensambJajes repetitiyos de fllamentos gruesos y de)gados '9)t) La contracd6n se produce por el deslizamiento de los 910 filamentos de miosina y de actina entre sf Las cabezas de miosina "camlnan" hacia el extremo menos de los filamentos de actina 913 La contracd6n muscular se inlcia por un aumento repentino de la concentraci6n de Ca 2• citos6lico 915 La troponina y la troporniosina median la regulaci611 de la contracci6n delmusculo esqueletico por el Ca" 916 Otras prOlefnas accesorias mantienen la arquitectura de la 916 miofibrilla y Ie propordonan su elasticidad La misma maquinaria contractU, en una forma modil1cada. se encuentra en el muscuJo cardfaco y en el musculo liso 917 En muchas celulas, la activad6n de la miosina depende de la fosforUaci6n de la cadena Iigera de la miosina 918 Resumen 920

EI cicio de la divisi6n celuJar La estrategla general del cicio celular

895

927

929

929 931 933

933 934

La acumulaci611 y la destrucci6n de ciclina controla la activaci6n y la inactivaci6n de MPF La degradaci6n de la ciclina desencadena la salida de la mitosis EI MPF puede actuar como autQcataHtico. estimulando su propia activaci6n EI MPF activo induce los procesos subordinados de la mitosis EI sistema de control del cicio celular permite tiempo suficiente para que se produzca una ronda de replicaci6n del DNA en cada imerfase Un bloqueo de la re-replicaci6n asegura que ningUn segmento de DNA se replique mas de una vez en cada cicio celular EI paso por la mitosis hace desaparecer el bloqueo a las re-replicaciones Resumen

937 939 939

939 940 94 I

941 943

Las levaduras y la gen~tlca molecular del slslema de

935

control del cicio celular

943

El crecimiento celular requiere una Interfase prolongada 936

con puntos de control del cicio celular

944

Las levaduras de fisi6n y de gemacl6n cambian de forma a medida que van progresando a 10 largo del cicio celular Las mutacioncs del cicio de division celular detienen el cicio en puntas especfficos; las mutaciones wee permiten al cicio saltarse un punta de control de tamal'io Las subunidades del MPF en las levaduras son hom6logas a las del MPF en animales La actividad del MPF esta regulada pOT fosforilaci6n y desfosforilaci6n El mecallismo de activacion del MPF controla eJ tamana de las levaduras de fisi6n Para la mayorfa de las cclulas el punta de control principal del cicio celuJar se encuclltra en ellnicio de G1 La prOle(na Cdc2 se asocia con la cidina G j para conduclr ala celula mas alia del Inieio Las clclinas G1 median rnuchos de los controles que actuan

en el lnido

955

972

956

Blbllograffa

973

945 947 948 948 949

949 951

La quinasa de lnido pone en marcha la fabricacion de los componentes necesarios para la replicacion del DNA Los controles par retroallmentadon aseguran que las cEllulas completen un proceso de cicio celular antes de comenzar el siguiente El DNA dai'iado genera una sei'ial que retrasa la mitosis Generalmente los controlesporretroalimentacion en el cicio celular dependen de sei'iales inhibidoras Resumen

La regulacion del creclmiento y de la proliferacion de las cEllulas de mamifero se estudia nonnalmente en lineas celulares cuhivadas Los faetores de credmiento estimulan In proliferacion de cEllulas de mamlfero EI crecimiemo cclular y la division celular pueden ser regulados independientemente Las celulas pueden retrasar su division entrando en un estado especializado de no-crecimiento La ausencia de suero evita el paso por el punto de control G] EI sistema de control del cicio celular puede desensamblarse nlpidamente pero solo puede ensamblarse de nuevo, lentamente Las celulas veeinas compiten par los faetores de crecimiento Las celulas animales normales en eultivo necesitan anclarse para superar el Inido Estudios en celulns cnncerosns revelanla existencin de genes implicados en el control de la proliferaci6n celular Los factores de crecirniemo desencadenan cascadas de sei'lales intracelulares Las ciclinas y la Cdk son inducidas par factores de crecimiento tras un largo retras.o La protelna retinoblastoma acttia manteniendo la proliferaci6n bajo control La probabilidad de entrar en GG aumenta can el mlrnero de divislones celulares: la senescencla celular EI euerpo se genera y se mantiene mediante complieados patrones rcguladores de la division celular Resume/l

945

l

Controles de la division celular en los anlmales pluricelulares El sistema de control del cicio celular es m~s elaborado que el de las levaduras

952

952

953 95. 955

957 959 960 961

962 963 964 966 967 968 968

969 971

Cap{culo

Los mecanlsmos de la dlvisl6n celular

18

Vision de conjunto de la fase M Trcs caracterfsticas son exclusivas de la fase M: la condensaci6n cromosomica, el huso mitotico yelanillocontnlctil La division celular depende de la duplicaci6n del centrosoma Tradicionalmente la fase M se divide en seis estadios Los org~nulos ciloplasmMicos grandes se fragmentan durallle la fase M asegurando que se heredan correctamente Resumen

977

Mitosis Laformaci6n del huso mitotico en unacelula en fase M se acompafta de cnmbios sorprendentes en las propiedades dimlmicas de los mlcrotubulos Las interacdones entre microlubulos orientados en direcciones opuestas conducen el ensamblaje del huso Los cromosomas replicados se unen a los microtubulos por sus cinetocoros En los cromosomas de la levadura los complcjos proteicos cinetoc6ricos se ensamblan siguiendo secuencias especfficas de DNA centroml!rico Los cinelOcoros capmran los microtubulos nucJeados en los palos del huso Los extrcmos ~m~s" de los microlubulos cinetoc6ricos pueden ai'iadlr y perder subunidades de tubulina mientras estan adheridos al cinetocoro Los palos del hus.o repelen los crornosomas Las cromlltidas hijas se unen a polos opuestos del huso medianle sus cinetocoros Fuerz.as bipolares equilibradas mantiellen a los cromosomas en la placa metafllsica Los microll1bulos son dinllmicos en el huso metafasico

985

fndJce de materias

957

977 978 980 984 985

986 986 988

989 990

99 I 991 992 992 993

Las cromatidas hermanas se separan repentillamente ell la anafase La anafase se retrasa hasta que lodos los cromosomas se posicionan en la placa rnetafasica Dos procesos diferentes separan las crornatidas en la anafase EI desensarnblaje de los microtubulos cinetoc6ricos se produce dural1le la anafase A Dos fucrzas distintas podrfan contribuir a la anafase B En la telofase se recompone la envoltura nuclear a1rededor de los grupos de cromosomas Resumen

995 996 996 996 998 999 1000

Cltoclnesls EI huso rnitotico detennlna ellugar de la scgmentaci6n del citoplasma durante la citocinesis EI huso se reposiciona especfficamente creando divisiones celulares asimetricas La actina y la miosina generan las fuerF.as necesarias para la segmentaci6n En casos especiales, delerminados componentes celulares se puedell segregar a ulla sola cl!lula hija En las celulas de las plantas superiores, la citocinesis ocune mediante un mecanismo especial Una red de citoesqueleto determina el plano de division de las cEllulas vegetales La elaborada fase M de los organismos superiores evoJucion6 gradualmente a partir de organismos procariotas de fisi6n Reslmlen

IOlll

BlbUografia

1011

1001 1002 1003 1005 1006

1007 1009 1011

xxxi

Parte

Las celulas en su contexto social

IV

Adhesi6n celular, uDiones celulares y matriz extracelular UnIOIlef; celulares

Las uniones estancas forman una barrera de pcrmeabilidad selectiva a travE!s de los cpi/elios Las uniones de anclaje coneclan el citoesqueleto entre celulas 0 entre Ja cl'iluJa y la matriz extracelular Las uniones adherentes conectan haces de fibras de actina entre cclulas 0 entre la ccluJa 'J 13 matriz extraceJular Los desmosomas conectan filamentos intemledios entre c~lu[as; [os hemidesmosomas los unen a [a lamina basal Las uniones de lipo gap ~rmite}l el paso directo de pequeflas moll!culas e 1~1\llas Los conexones de las unlones de tipo gap estan compuestos por seis subunidades La mayor parte de [as cellilas embrionarias est~n acopladas entre sf durame las primeras etapas del desarrollo mediante uniones de tipo gap La pemleabilidad de las uniones de tipo gap esta regulada En los vegetales, [os plasmodesmos realizan muchas de las funciones de [as uniones de tipo gap Resumen

1018

1019 1021

1022

1024 1026 1027

1028 1029 1030 1031

Adhesion Intercelular 1032 Existen dos vias fundamentales mediante las cua[es las celulas animales se unen para formar tejldos 1032 Las celu[as de vertebrados disociadas pueden reagregarse en tejidos organizados mediante rnecanismos de adhesion selectiva celula-celula 1033 Las cadherinas median la union celula-cl!lula rlepcndicnte de Ca~' en los vertebrados 1035 Las cadherinas median la adhesion cclula-c~lu[aa traves de un mecanismo homofilico 1036 La adhesion interceJular independicmc de Ca~' esta mediada principalmente por unas protefnas pcrtcnecienles a la superfamilla de las inmunoglobulinas 1037 Muchos tipos de moJeculas de superficie celular actuan paralelamcnte mediando la adhesion selectiva celula-cl!lula y celula-matriz 1038 Los contactos no adhesivos pueden ser los inlciadores de fen6menos de adhesion intercelulat espec(ficos de tejido que poslcriormente son orientados yestabilizados por contactos de union 1040 Resumen

lO41

La malrlze,;tracelular de los anlmales La matriz extracelular estd producida y orientada por las cl!lulas que engloba Las cadenas de Fclucosaminoglucano (GAG) ocupan grandes vohlmenes, ormando geles hidratados Parece que el adda hialuronico facilita la migracion cel\tlar durante la morfogellcsis y la reparaci6n de los tejidos Los proteoglucanos estan compuestos por cadenas de GAG unidas covalentemente a una proteina central Las cadenas de protcoglucanos pueden regular las actividades de moleculas secrcladas de sel'ializaci6n Las cadenas de GAG pueden estar altamente otganizadas en la matriz extracelular

1041

xxxii

fndice de materias

CapflUlo

19

Los proteoglucanos de superficie celular acman como correceplorcs Las colligcnas son las pr01c1nas mas abundames de la malriz extracelular Las moleculas de colagella son sccretadas con unas extensiones no helicoidales en cada una de las regiones terminales Despues de su secrecion. las moleculas fibrilares de procol~gena son degradadas hasta moMculas de col~gena, [as cuales se organizan en fibrillas Las cohlgenas asociadas a fibrillas organizan estas fibrillas Las cl!lulas participan de [a organizacion de las fibras de co[agena que secretan ejerciendo lensiones mec~nicas sobre la malriz La elastina confiere a los tejidos su elasticidad La fibronectina es 1m protefna extracelular adhesiva que contribuye a la adhesion de [a ce[ula a la matriz Las diversas formas de fibronectina son producto de una maduracion a1temativa del RNA Las g[ucoproteinas de [a matriz ayudall a delerminar las vias de migracion ce[lliar !...1S moleculas de colagena de tipo IV se ensamb[an formando una red laminar que facilita la formacion de [a lamina basal La lamina basal esta compuesta fundamentalmente por co[agena de tipo IV, proteoglucanos del tipo heparan su]fato, laminilla y entactina Las laminas basales realizan divcrsas y complejas funciones La degradaclon de los componentes de la matriz extracelular esta estrechamente controlada Resumen Receplores de la malriz exlracelular en celulas anlmales: las Integrlnas Las integrinas son hcterodfmeros transrnembrana Las integrinas pueden inleraccionar con el citoesqueleto para unir las celulas a la matriz extracelular Las integrin3S permiten aI citoesqueleto y a la matriz extracelular comunicarse a traves de la membrana plasmatica Las cl!lulas pueden regular la actividad de sus integrinas Las intcgrinas pucdcn activar cascadas de seflalizaci6n intracelular Resumen La pared celular de los vegetales

1048 1048

1051

1052 1053

1054 1055 1057 1058 1059

1059

1060 11162 11165 1066 11167 1068 11169 11169 1070 1071 1072 1073

1046

La composici6n de la pared celular depcnde del tipo celulat Las fuerzas de lension de las paredes celulares permiten a las celulas vegetales desarrollar una presion de turgenda La pared celular esta constituida por mlcrofibrillas de ceJulosa ermclejidas con una red de poHsaCliridos yprotcfnas Los micron1hulos orieman la deposicion de la pared celular Resumen

1076 1078

1047

Bibliograf(a

1079

1042 1043

1044 1045

1073

1074

1074

Cl!lulas germlnaJes y fecundacl6n Las venlajll5 del sexo

En los animales pluricelulares. 18 rase diplolde es oompleja y larga mlcnlras que la haploide es senema y cona La reproducclon sexual confiere una venlaja oompelitiva a los organismos que se encuentran en un ambienle que cambia de forma imprevisible Resumen Meiosis La meiosis implica dos divisiones nucleares en lugar de una sola La redisuibucl6n gl!:nica aumenla dcbido al entrecruzamiento entre las CTomatidas hom6logas no hermanas EI apareamlenlo meiotico crom0s6mico culmina con la formaci6n del complejo slnapton~mico Se cree que los n6dulos de recombinaci6n median los intercambios de crom4ddas los qulasmas desempei\an un Irnportante pape! en la segregaci6n cromos

I •• ~

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20

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10

H

C

0

c. ,

M,

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N.

P

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""M

lieve un lipa c3ractcrfstico de qufmica (Figura 2-1). Leual es esta qufmica especial y cdlllo surgi6? La substancia mas abundante de la celuJa viva es el agua. Conslituye aproxi· madamente el 70 % del peso de las celulas. La mayoria de reacciones intracelulares ocurren en un media acuoso. La vida en eSle planela empez6 en el mar, y las condiciones que reinaban en aquel ambiente primitivo imprimicron un sella pcr· manenle en la qufmica de la materia viva. Todos los organismos han sido disei\ados en base a las propiedades caraclerfsticas del agua, tales COIllO Sll cankleT polar, su habilidad para formaT enlaces de hidr6geno y su alta tensi6n superficial. Por ejemplo. el agua rodea complclamenlc a las moleculas palaTes mientras que tiende a reunir las mol~culas no polares, farmando grandes agregados. En el Pane12-1 (pAgs. 50-51) se resumen algunas prapiedades impartantes del agua. Apane del agua, la gran rnayorfa de las otras mol~culas de una c~lula son compuestos de carbona, centro de atenci6n de la quimlca org:1nlca. EI carbona destaca entre todos los elementos de la Tierra por su capacidad de formar grandes moleculas; en este aspecto Ie sigue el silicia, muy par debajo de el. Debido a su reducido tamana y a los cuatro electranes de la capa externa el atomo de carbona puede formar cuatro enlaces covalentes fuertes can otras atomos. Y, 10 que es mas import3ntc, se puede unir a atros atamos de carballo formando cadenas y anillos, gencrando nsf mol~culas grandes y complcjas cuyo tamafio no ticne un !fmite superior obvio. Los otros -

C'C~

I NH'

N

'

H2

c0 N

C<X>-

CH

N H

NH

Ciertas combinaciones simples de thomos -tales como los grupos metilo (-CH:J, hidroxilo (-DH). carboxilo (-CoOl·n y amino (-NH 2)- se presenlan repetidamente en las moleculas biol6gicas. Cada uno de estos grupos liene propiedades qufmicas y ffsicas distintas que influyen sobre el comportamiento de cualquicr molecula en que se presente el grupo. EI Panel 2-2 (pags. 52-53) resume los tipos principales de grupos quimicos y algunas de sus propiedades sobresalienles. Los pesos at6micos de H, C, N Y a son I, 12, 14 Y 16 respectivamente. Las molecuJas orglinlcas pequeiias de la celula tienen pesos moleculares que osciIan entre 100 y 1000 ycontienen hasta unos 30 ~tomos de carbono. NormalmenIC se hallan librcs en soluci6n, donde algunas de elias forman un acervo de intermediarios a partir de los cualcs se construyen largos polfmeros. denominados macromoleculas. Tambien existen intermedjarios esenciales en las reacciones quimicas que transfonnan la energfa derivada de los aJimentos en fonnas utiles de energia (10 cual se discute mas adelante). Las moleculas pequeiias representan una decima parte deltotaJ de materia organica de una celula y (a grandcs rasgosJ s610 existen del orden de un millar de lipos diferentes de elias (Tabla 2-). Todas las moleculas biol6gicas se sintetizan a partir de los mismos compuestos simples y se dcgradan a estos mismos compuestos, ocurriendo la sfnlesis y la degradaci6n a traves de secuencias de cambios qu(micos de aJcance limitado y siguiendo reglas precisas. Por consiguiente, los compuestos de una clHula pueden ser c1asificados en un reducido mlmero de familias dist'intas. Dado que las macromoleculas de una c~lula) que constituyen el lema del Capitulo 3 de este libro. estan formadas a panir de estas mismas moleculas pequeiias, pertenecen a sus mismas familias. A grandes rasgos, podemos dccir que las celulas poseen cuatro grandes familias de moleculas organicas pequenas: los azUcares simples. los acldos grasus, los amlnolicldos y los nucle6tidos. Cada una de estas familias conliene mllchos miembros diferentes, que prescnlan rasgos qulmicos cOlllunes. Aunque algunos compuestos celulares no pueden clasificnrse en estas categorfas, las cuatro familias, junto con las macromoleculas fonnadas a partir de eUas, constiluyen un porcentaje sorprendentemente elevado de la masa celular total ITabla 2-1).

H

c 1- c.1. . /

COO-

C' /

CH

I NH' '

H

Figura 2-2 Losorganlsmosvlvos I1nlcamente slnletlzan WI reducido nl1mero de las moleculas orginlcas. que en principia podrian produclr. De los seis aminoacidos que se muestrnn en ia figura. unicamente el de ia pane superior (ellript6fano) es sintctizado por las celulas.

Tabla 2-1 Composlci6n qufmica aproxlmada de unacelula bacteriana Porcentaje del peso celular total Agua lanes inorganicos Azlicares y precursores Amino grupo carbololo

H

I HN-C-COOH z I CH,

+ -

pH7

H

I

_

H)N-C-COO

I

CH, f~.

ionizadll

son familiares en nuesua experiencia diaria. Cuando es necesario oblener ener· gia, las cadenas de acido graso pueden ser liberadas de los lriacilgliceridos y ser degradadas haSla unidades de dos carbonos. A continuaci6n, estas unjdades de dos carbonos, que constilUyen el grupo acetilo de una rnoleCllla hidrosoluble denominada acetil GoA, son degradadas a lraves de varias reacciones que liberan energfa y que describiremos mas adelante. Pero la funci6n mas importante de los acidos grasos reside en la construcci6n de las membranas de la celula. Estas finas capas semipermeables que limitan a lodas las celulas y envuelvcn sus organulos internos cstan compllestas fUIldamentalmente de fosfoUpldos, pequefias moleculas que se parecen a los triaciglireridos en que estan conSlruidas en su mayor parte a partir de a.cidos grasos y gJicerol. En los fosfolipidos. sin embargo. el g1icerol esta unido ados cadenas de acido graso y no a Ires. Ellugar reslante del glicerol esla acoplado a un grupo (osfato, que a su vez esta unido a otro pequeno compueslO hidromico como la etallolamino, la COlilla 0 la serino. Cada molecula de fosfolfpido Hene una cola hidrof6bica --compuesta por las dos cadenas de acido graso- y una cabeza polar hidroFilica en la que se encuentra el fosfalo. Si se coloca una pequena cantidad de fosfolfpido en agua. se extendem sobre la superficie fonnando una monDeapa de moleculas de fosfolipido: en eSla lamina las colas de las molecuJas quedan densamente empaquetadas unas con OUas y dirigidas hacia el aire y las cabezas se hallan en contacto con el agua (Panel 2·4. pags. 56·57). Dos de estas laminas se pueden combinar. cola contra cola. formando un "sandwich~' de fosfolfpidos. 0 blcapa IIpldlca, una estructura extraordinariamente importante que es la base eslructural de todas las membranas celuJares (como se discllte en el Capflulo 10).

Figura 2·6 EI am..inoacldo alanlna. En la c~lula, ell la que el pH es cercano a 7, cl aminoacido se halla en fonna ionizada. Sin embargo, aI ser incorporado a una cadena polipeptfdica las cargas de los gropos amino y carboxilo del aminoacido Iibre desaparec:::en_ A la derocha de las f6nnulas eslructurales se mueslran modelos de bolas y varillas y de espacio lIeno. En el caso de la alanina, la cadcna lateral es un gropo -eHJ •

aXlremo amino delllc;~a

TN-H Ph.

H-¢-CHrO

o-~

,

N-H

Ser

H-C-OI1-OH

Glu

N-H 0 tt-t-CH,-CH,-ef.

o-~ I

()o~

Los aminoacidos son las subunidades de las prote(nasS

-

,

N-H

Los aminoacidos comunes son quimicamenle variados. pero lodos ellos contienen un grupo de acido carboxfiico y un grupo amino, ambos unidos al mismo alomo de carbono (Figura 2-6). Se ulilizan como subunidades en la sintesis de las prolelnas, que son largos polfmeros lineales de aminoacidos unidos cabezacola mediante un enlace peptfdico entre el grupo carboXl1ico de un aminoacido y el grupo amino del aminoacido siguiente (Figura 2-7). Aunque exislen muchos aminoacidos posibles. en las proteinas 5610 hay 20 aminoo.cidos comunes, cada uno de eUos con una cadelJa lateral diferente unida alll.lomo de carbona a (Panel 2·5, pags. 58-59). EsIOS mismos 20 aminoacidos se presentan una y otra vez en tOOas las proteinas, incJuidas las producidas por las bacterias. las plantas y los animales. Aunque la selecci6n de estos 20 aminoll.cidos probablemente sea un ejemplo de un accidenle evolutivo. la versatilidad quimica que proporcionan es de una importancia vital. Por ejemplo. 5 de los 20 aminoacidos presentan cadenas lalerales que pueden lransportar una carga (Figura 2-8) mientras que los Olros no estll.n cargados pero son reactivos de formas diferel1les (Panel 2-5, pags. 58·59). COOlO veremos, las propiedades de las cadenas laterales de los aminmkidos detenninan las propiedades de las proteinas y constiluyen la base de las dislintas y sofisticadas funciones desempefiadas por elias. 48

Capilulo Z: Pequefias mol&:ulllS, energfa y biosfntesis

lV'

,

0

-

,H

H-C-CH1-CH2~CH2-CH1-N-W

()ooa.

CH,-C

CH,-\

~

generando un ion hidroxilo. Cuenda actue como base acepta un prolon formando un jon hidronio. En saludan &Cuola Ie mayona de protones estjn como iones

+

hidronio.

0-

OH

O-H

",,'"

/

prolon

boH

Ji

un ion H+ (proton). Por ejemplo,

H'

be,e

/

prOlon

0

0

+

H

'tido

jon hidrOl 4 l, esto puede ocurrir denlro de Ie miama molecula, formlindose un soilla

de 506 miembros.

SISTEMA DE NUMERACION los 'Iomos de carbone de un 8ZUcaf a-o-glucoSI

S8 numeran a partir del elctremo mas cercano al aldehldo 0 Ie cetona.

ESTEREOISOMEROS

ISOMEROS

FORMASoYl

Los monosecaridos tienen muchos is6meros Clue (Jnicamente se diferencien en la orientaci6n de sus grupos hidroxilo -par ejemplo, III glucosa, III galactose y III mllnosa son isOmeros entre st

HO

~

HQ

Dos isameros Clue sean imagenes sspecularss uno del otro tienen las mismas propiedades C1ufmicas y por ello reciben eI mismo nombre, distinguiendolos mediante el prefi}o DOL

HPHO

o-glUU,lacelllto pirUVlllo

~rboxilllSll

rimas actuaJes, como el ATP, el aeetil CoA y el NADH. De acuerdo con este punta de vista, estas moleculas debieron evolucionar con un nucledtido unido cava-

lentemente debido a 1a utilidad que suponia este nucle6tido para la uni6n de la 7-DEHiDROCOlESTEROl

coenzima en un mundo de RNA.

La biosfntesis necesita poder reductor Hemos visto como en las c~lulas se producen continuamente reacciones de oxidaci6n y de reducci6n. La energfa qu{mica de las mohkll..Ias alimenticias se Libera mediante reacciones de oxidaci6n, mientras que para producir moleculas biol6gicas la cetula necesita -entre otras casas- lIevar a cabo una serie de reae· cioncs de reducci6n que requieren un aporte de energfa qufmica. Aplicando el principio de las reacdones acopladas que hemos descrito en p:1ginas anteriores, las c~lulas canalizan directamente la energfa qufmica derivada del catabolismo hada la sfntesis del NADH (por ejemplo, vease Figura 2-22), EI enlace de alta energfa que se forma entre cl hidr6gcno y el anillo de nicotinamida, dando lugar al NADH proportiona energfa para reacdones enzimalicas dcsfavorables, trans· firiendo el hjdr6geno (como ion hidruro) a otra mol~ula. Por ello se dice que el NADH, y tambien el NADPH (estrechamente relacionado con el y en el que se puede convenir can faciLidad) son transponadores de "poder reductor". Ambos se utilizan como coenzimas en numerosos tipos de reacciones de reducci6n. Para saber c6mo ocune la transferencia de hidr6geno en la practica. consi· deremos un solo paso de biosfntesis: la Ultima reacci6n de la via de sfntesis de la mol~ula lipfdica co/esterol. En esta reacei6n. dos atomos de hidr6geno se anaden al anillo csteroide polidclico. reduciendo un doble enJace carbono-carbono. Como en la mayona de reacciones de biosfmesis. los constituyentes de los dos ~1tomos de bidr6geno que son nccesarios en esta reacci6n son suministrados en forma de ion hidruro del NADPH mas un prot6n (HO) de la soluci6n (H- + Ho = 2H) (Figura 2·33). Como en el NADH, el ion hidruro del NADPH que debe ser transferido forma parte de un anillo de nicotinamida y se separa facilmeme debido a que el anillo puede adoptar un estado aromMico mlts estable si pierde el ion hidruro (vease Figura 2-24). Por consiguiente, tanto el NADH como el NADPH mantienen este ion hidruro a traves de un enlace de alta energfa y, a

82

Capflulo 2 : Pequefias mollkulas. energfa y biosfntesis

m::mD. H'

COlESTEROl

Figura 2-33 Fase final de una de la5 rulllS de biosintesis que conducen a la formaci6n del colesterol. La reduccion del enlace C=C se consigue medianle la transferencia de un Ion hidruro procedente de la mol~ula lransportadora NADPH, mas un prolon (U') de la soluci6n,

Figura 2·34 La eSI.n1ctura del NADPH. Se diferencia de la del NADH (vl'!asc Figura 2-24) I1nicamcnte por la presencia de un grupo fosfato adicionaJ. eI cual permite que el NADPH sea reconocido selcctivamente por enzimas implicadas en la biosfnlesis.

.nillode nlcotln.mld.

partir de el, puedeo transferirlo a olra molecuJa siempre que exista la enzima adecuada para catalizar la transferencia. La diferencia eOlle el NADH y el NADPH es trivial desde el punto de vista quimico: el NADPH tiene un grupo fosfato mas. en una zona de la molecula ale· jada de la regi6n activa (Figura 2-34). Este grupo fosfato extra carece de importancia para la reacci6n de transferencia del ion hidnuo. pero sirve de asa para unir el NADPH como coenzima. Por regia general, el NADH se une a enzimas que catalizan reacciones catab6licas. mienuas que el NADPH acnla con enzimas que catalizan reacciones de biosfntesis. AI tener las dos coenzimas que actuan en procesos diferentes. la celula puede mantener la relaci6n NADPH:NADJ» alta para aponar el poder reductor necesario para los procesos de biosfntesis mientras que. simuJtl1neamente. puede mantener la relaci6n ADH:NAO' baja para tener NAD' disponible para aceptar electrones durante el catabolismo.

o

cb

AClOOS NUCLEICOS

glUCOM

. . o

glue6geno

0-·-----·

o

tl tl o

Inergfa de I. hidroli,i, del nliCleoeido IrifOllfalO

I

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H

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H

gluc6geno

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11

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H,o J

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energl. de I. hidroli,;, del nliClaO,ldo trllo.f.to

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0

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PRorelNAS protein.

I

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o OH I D=P-oI o I

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OH

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tl tl o

OH

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OH

OH

RNA

energf. de I. hidrOll,i, del nliCleo.ido trlfO$f.lo

OH

OH

Figura 2-35 Sfntesls de macromolkuJu. Esbozo de las reacciones de polimerizaci6n mediante las cuales se sinlctizan Ires dases de polimeros biol6gicos, mostrando que en I I I I 1 , 0 cada caso 1a sfntesis Implica la perdida de agua (deshidrataci6nl. En la figura no se --·--C-C-N-C-C-N-C-C I I HI I RI 'OH mueslra el consumo de nude6sidos trifosfato ahamente energeticos, necesaria para R H H activar cada mon6mero antes de su adici6n. Por el conuario, la reaccion inversa -Ia proIeln. degradacl6n de los tres tipos de polfmeros- se produce mediante la simple adici6n de agua (hidr6Iisis). H

0

R

0

H

La blos{ntesls y la creacl6n de orden

83

POllMERIZACION POR LA CABEZA (p.

e;" PflOTEfNAS. AC1DOS GRASOS)

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cede mon6melo Ilenspone un enlece rico en energ;e que ser6 utilizedo pere I, edici6n de, mooomelo siguiente

+

POLIMERIZAC'ON POR LA COLA

0~+0').-J1

Las principales macromollkulas sintetizadas por las relulas son los polinucle6lidos (DNA y RNA), los polisadridos y las proteinas. Son extraordinariarnente diversos en cuanto a eslructura, e induyen las mollkulas mas complejas conocidas. A pesar de eUo. se simetizan a partir de un numero relativamente reducido de pequenas mol&:ulas (denominadas momjmeros a sublmid"desl. a travt!s de una reslringida gama de reacciones qufmicas, En la Figura 2-35 se muesua un esbozo sobresimplificado del mecanismo de adici6n de mon6meros a las protefnas, a los polinude6tidos y a los polisae que hay un. soI.lI ~ en u"" ~Iul. lrpb de mlImlfero Ide un yolumen .proxim.oo de 2000 pm~ IS .prOlCquenas moleculas que se unen a la superficie de una enzima permitiendole catalizar reacciones especfficas. La reactividad del TPP depende de suo Atomo de carbona "acfdico·, que imcrcambia rnpidamente su Atomo de hidr6geno por un Aloma d;carbona de una molecuJa de substrata. Probablemente Otra5 regiones de la molecula de TPP acnian como ~asas· mediante las cuales la enzima manliene ala coenzima en posici6n correcta. Probablemente las coenzimas evoludonaron primero en un "mundo de RNA ~ • donde se unfan a moleculas de RNA para colaborar con elias en los procesos de catAlisis (se discute en eI Capflulo t).

137

Figura 3-59 Modelo! de espaclo Ueno, genendos por ordenadorI de dOl enzimas. En (A) se presenta el c1u)(:romo c unido a su coenzima hemo. En (8) se presenta la lisozima de la clara de huevo, con un substrato oUgosactrido unldo. En ambos casas el Uganda unldo se presenta en mjo. (Por cortesfa de Richard J. Feldmann.)

IAI

101

el m1mero de recambio. A menudo el m1mero de recamhio es de aproximada· mente 1000 mollkulas de substrato procesadas cada segundo por cada mol&:ula de enzima pero puede Jlegar a alcanzar valores mayores en casos extremos. EI otro parAmerro cin~tico utiJizado con frecuencia para cat8cterizar a una enzima es su ~, que es la concentraci6n de substato que permile aJcanzar la mitad de la velocidad mwma de la reacci6n (Figura 3-60). Una KM baja significa que 1a enz.ima alcanza su mAxima velocidad catalitica a una baja concenrraddn del substrata, y por 10 general indica que la enzima se une a su substrata fiUy fuertemente.

Las enzimas aceleran las reacciones estabilizando determinados

estados de transici6n36 Las enzimas consiguen que las reacciones qufmicas se produzcan a velocidades extremadamente allas -mucha mc1s que a traves de cualquier cauUisis sintetica. Esta eficiencia puede ser atrlbuida a varios factores. En primer lugar, la enzima actua aumentando la concentracl6n local de las mol~culas de substraro en ellugar catalltico y manteniendo los alomos adecuados en una orientaci6n correcta para 1a reacci6n que se producira a continuaci6n. Sin embargo, 10 mas imporlame es que una parte de la energfa de fijaci6n contribuye directamente a la catalisis. Antes de formar los productos finales de 1a reacci6n, las mol~culas del substrata pasan a traves de una serie de formas intermedias de geometrfa y distribuci6n electr6nica a1teradas y son las energfas libres de estas rormas intermedias y en especial las de los estad05 de translci6n mas inestables, los principales determinantes de la velocidad de la reacci6n. Las enzimas presentan mayor aft· nidad por estos estados inestables de transici6n de los substratos que por sus

~

138

conc.ntraclon d. lubllrllto-

Capftulo 3: Macromoloculas: estructura, forma e Informacl6n

Figura 3-60 Cln~ca enzlmlhlca. La velocidad de una reacci6n enziImhica (V) aumeRla cuando aurnenta la concentracl6n del substrato, hasta alcanzar un valor mUimo (V..J. En este puntO, todos los lugaTes de unl6n al substrata de las molecuJ.as enzim!ticas I!Stlln ocupados;"y la velocidad de la reaccl6n est! Iimitada por la velocidad del proceso de calonentes, dibujados sabre una escala logarftmica, indicando el intervalo de resolucl6n del ojo humano y de los microscopios 6plico y electr6nico. En microscopia se utilizan normaimenle las siguienles unidadcs de longilud: 11m (micr6melro) = I~m nm (nan6melro) = I~m A(unidad AngstrOm) = IOID m

2 ONDAS EN FASE

2 ONOAS OESFASAOAS

Figura 4-2 Interferenda entre oodas lumLnosas. Cuando dos ondas de luz se comhinan enfa.se, la amplilud de 1a onda resultante es mayor y la luminosidad queda incrementada. Dos ondas de luz desfasadas se anulan parclaJmente una a Otnl., produciendo una onda de menor amplilud, y por consiguiente, de menor intensidad luminosa.

OS(;urid.d

,,, EI microscopio 6ptico puede resolver detalles situados a 0,2 J.lrn de distancia 2 En general, un haz de una radiaci6n de una longitud de onda determinada no puede uLilizarse para examinar detalles estructurales mucho mas pequefios que su propia longitud de onda: e5to supone una limitaci6n fundamental de los microscopios. As! pues, el lfmite de resoluci6n de un microscopio 6ptico esta delenninado por la longitud de onda de la luz visible, que abarca desde 0,4 J.1ffi (para el violeta) basta 0,7 J.Lm (para el mjo lejano). En la prnetica, las bacterias y las mitocondrias. que tienen aproximadamente 500 run {O,S ~l de diametro, son las estrueturas mas pcqueiias que se pueden observar nftidamente aI mi· croscopio 6ptico; los detalJes mas pequeiios que estas dimensiones quedan os· curecidos por los efectos de la nalura1eza ondulatoria de la Iuz. Para comprender el porque de este efecto, hemos de estudiar 10 que Ie sucede a un haz de ondas luminosas cuando atraviesa las lentes de un microscopio. Dada su naturaleza ondulatoria. la luz no sigue exactamente la linea recta idealizada de sus rayos pred.icha por la 6ptica geometrica. Por el contrario. cuando las ondas luminosas viajan a traves de un sislema 6ptico 10 haeen por una diversidad de rutas tigeramente direrentes, de manera que se interfieren eOlre elias generando efectos opticas de difraai6n. Si dos trenes de ondas que alcanzan el mismo punto por diferentes caminos estan exaclamente en fase, con coincidencia de las crestas y de los scnos, se refuerzan cl uno al otro aumentando la luminosidad. Por el contrario, si los trenes de ondas estan desfasados, intcrfieren uno con otro y se an ulan total 0 parcialmente (Figura 4-2). La incidencia de la luz sobre un objeto altera las relaciones de fase de las ondas lum..inosas, produciendo complejos efectos de interferencia. A gran aumento la sombra de un borde recto, por ejemplo, iluminado con una luz de longitud de onda unifor· me, aparece como un conjunto de Iineas paralelas. mientras que la de una mancha circular apareee como un conjunto de aomos concentricos (Figura 4-3). Por la misma raWn, observado a lrave. del microscopio un punto aparece como un disco borroso, mientras que dos objetos puntuales prdximos entre sf ofreeen imagenes superpuest'as y pueden Ilegar a confundirse en una sola imagen. La perfecci6n de las lenles, por alia que sea, no puede supcrar esta Iimitaci6n im· puesta por la naturaleza ondulatoria de la Iuz. La separaci6n liJnite a la que dos objetos pueden verse scparados -conocida como lfrn.Ite de resolud6o- depende tanto de la longitud de onda de la luz como de la apertura nwnerica de las lentes del sistema utilizado (Figura 44). En las mejores condiciones posibles: con luz violeta Oongitud de onda, ), = 0,4 ~) Yuna apertura nwnerica de 1,4, ellfmitc de resoluci6n trorico que se puede obtener con el microscopio 6ptico es tan 5610 de 0.2 J.Lrn. Esta resoluci6n ya fue a1canzada por los fabricantes de microscopios a finales del siglo XIX y con los microscopios con· tempor6neos producidos en seric, muy raramente se alcanza. Aunque es posible Obscrvaci6n de la estruclum de las ct!lulas con el microscoplo

•

Figura 4-3 Efectos de borde. F.feclos de inlerferencia observados a gran aumcnto cuando 1a luz pasa por el borde de un ohjelo s6lido colocado entre la ruente de luz y cl ohservador.

149

LEoms

RESOlUCtON: el poder de rlsoluelon de un microscopio depende de Ie emplitud del cono de iluminllciOn Y. por 10 tanto, de I•• lente.

objelivo V oonden.ador. 5e calcule con II f6rmule

IMAGEN

'!!J

muesl'.

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--LUZ

I. lentl objetivo eolecle un cone de lUI gt:l'Ieflndo unelmegen

resolucion. 0,61 ~ en donde:

Figura 4·4 Apertura numerica. Paso de los rayos luminosos cuando atraviesan una muestra transparente en un microscopio, ilustrando el concepto de apertura numerica y su relaci6n con ellfmite de resoluci6n.

" ..n8

e_ m'tad de" .lnchu,. angul" del cono de r.yos oolectedol por I, lente objellvo dude un punla lfpico de I.

muestrelcomo ,. maxima enehur." de 180". I' "Ilor de senD IIliene un

I' Ienle coodenAdor enloea un eooo de ,eyol luminosos en ~ uno de los

valor mjJ-l80tes eondensadot"'"

b,~~:=-

filamento '!'\CtIndescente (luente de electrone.l

/1',," leOies

11/ defleclOt del

musllt'

h.l

Ienles objetivo _

Ienla

IMAGEN SOBRE UNA PANTAlLA

Figura 4- J 7 CaraclerfstJcas prtnclpales de un mlcroscoplo 6ptlco, de un mlcroscoplo eJectr6nlco de Iransmlsl6n y de un mlcroscoplo elec:tr6nlco de barrldo. EI dibujo pone de relieve las similitudes generales del disei'io de estos tipos de microscopios. Mienlrns que las lentes del microscopio 6ptico son de vidrio. las del microscopio eleclr6nico son bobinas magneticas. Los dos tipos de microscopios electronicos requieren que la muestra se coloque en el vado.

"c,0

H IMAGEN

IMAGEN SOBRE UNA PANTAlLA FUJOflESCfNTE

08SERVAOA

OlRECTAMENTE

MICROSCOPlO

MfOlOSCOPlO ELECTRONICO DE TRANSMISIQN

0f'TIC0

I I CH, I CH, I CH,

MICAOSCOPlO ELECTRONICO

DE BAARlDO

,C"

o Para podec sec estudiadas at microscopio electr6nico, las muestras biol6gicas requieren una preparaci6n especial9 En los primeros tiempos de su aplicaci6n a materiales biol6gicos, el microscopio eleclr6nico revel6 la existencia en las cEHulas de una gran camidad de estructu· ras inimaginables. Sin embargo. antes de que se pudieran hacer estes descubrimjentos. los espeeialistas en microscopia electr6nica tuvieron que dcsarrollar nuevos procedimientos de inclusi6n, de corte y de linci6n de los lejidos. Puesto que las muestras para microseopia eleetr6nica han de ser expucstas a un vado muy inlenso, no es posible la observaei6n de las mueSlras vivas y hu· medas. Normalmente los lejidos son protegidos por fijaci6n -primero con gill' tarafdehfdo. que une eovalentemenle las mohkulas proteicas a SliS vecinas, y despues con tetr6xido de osmio, que une y estabiliza las bicapas lipfdicas y tam· bien las protefnas (Figura 4-18). Puesto que los eleetrones tienen un poder pe· netrante mlly limitado, normal mente los tejidos fijados son eortados en seecio· nes eXlremadamente as (de 50 a 100 nm de espesor-aproximadamente 1/200 del espesor de una celula) antes de pader observarlos. Esto se logra deshidratando la muestra e infiltn1ndola con una resina monomeriea que polimeriza formando un bloque s6lido de phistico; el bloque se puede cortar mediante L1na euchilJa de vidrio 0 de diamante, en un micr6tomo especial (ultramicr610mo). Estas seccio1les ultrafinas, libres de agua y de otros solventes vol";d'

"'

OIf1lt proleln.. pasan ;llII;llVU de Ie met"I

ICl CROMATOGRAFfA DE AFINIDAD

Figura 4-39 Tres lJpos de matriz utlllzad05 en cromatogTB.na. En la cromatografia de intercambio i6nico (A) la rnatriz insoluble presenta cargas i6nicas que retardan las molkulas de carga opuesta. Las matrices utilizadas habitualmenle para separar protefnas son la dietilaminoetilcelulosa (DEAE-c:elulosa). de carga positiva. y la carboximetilcelulosa (eMcelulosa) y la fosfocelulosa, de carga negativa. La fuerza de uni6n entre las mol~ulas disueltas y la matm de imen::ambio ionico depende de la fuerza i6nia y del pH de la soluci6n eluyente que alraviesa la columna, panimelros que pueden variarse de una manera sislemtitica (como en la Figura 4-401 para conseguir una separaci6n mas dectiva_ En la cromalografia de mlraci6n en gel (8)la malriz es inene pero porosa. las molkulas suficienlemenle pequeilas para peneuar en el interior de la matriz se reuasan y viajan mtis lemameme a lrav~ de la columna. En el comercio exislen bolitas de polisactiridos con puentes cruzados (dextrano 0 agarosa) en una amplia gama de tamafios de para adecuadas para el rraccionamiento de molk:ulas de diversos pesos moleculares, desde menos de 500 hasta mas de 5 x 10' dalions. La cromalOgraffa de afinidad (0 utiliza una malriz insoluble que estti unida covaJenlemente a un ligando especifico, como por ejemplo una molkula de anlicuerpo 0 un subslrato enzimtitico. que se unirti a una prolefna determinada de la mueslra. Las mol~ulas de enzima que se han unido a substralOS inmovilizados en columnas de eSle tipo se puerlen eluir con una soluci6n concenlrada del substralo en forma Iibre. mientras que molkulas que se han unido a amicuerpos inmovilizados pueden eluirse disociando el complejo anlfgeno-amicuerpo con soludones concentradas de sales 0 con soluciones de pH alto 0 bajo. Amenudo se consiguen purificadones elevadas con un solo paso a traves de estas columnas. lumna que contiene una matriz s6lida porosa. Las diferentes protefnas de In mezcia se van retrasando mAs 0 menos a causa de su interacci6n con la matriz de la columna y pueden recogerse por separado en su estado fundonal nativo a medida que fluyen por el extremo inferior de la columna (Figura 4-38). En fund6n del tipo de matriz que se utiJice, las protefnas se pueden separar seg(m su carga (cromatograffa de intereambio i6nico), su hidrofobiddad (cromatograffa hidrof6biea), su tamaf'io (cromatograffa de filtraci6nj, 0 su capaddad para unirse a determinados grupos qufmieos (cromatograffa de afinidad). Actualmente se comercializan un gran mlmero de tipos diferentes de matriz para cromamgraffa (Figura 4-39). Las columnas de imercambio i61lico estan lIenas de pequenas bolitas que comienen cargas positivas 0 negativas, de modo que las protefnas se separan en fund6n de la disposid6n de cargas de su superfide. Las columnas 1Iidrof6bicas estan llenas de unas bolitas con cadenas laterales hidrof6bicas que sobresalen de elias, de modo que las protefnas que tengan regiolles hidrof6bicas al descubierto quedan retardadas en su tn1nsito por la columna. Las COlllmTlas defiltraci6Tl eTl gel, que separan protefnas en fund6n de su tamano, comienen diminUlas bolhas porosas: a medida que van descendiendo por la columna, las mol~culas sufidemememe pequefias para penetrar en los poros pasan sucesivamente por el interior de esras esferas, mientras que las moIlkulas mlis grandes permanecen en la solud6n Ouyendo entre las esferas, y por 10 tanto, eluyen Ollis rlipidameme a traves de la columna y salen primero. Ademas de permitir la separad6n de las moltXuJas, la cromatograffa de filtraci6n en gel constituye un buen sistema para determinar el tamaf'io de las moltXulas. Este tipo de cromatograffa en columna no produce fracdones altamenle purificadas sl se parte de una mezcla compleja de protefnas: un unico paso a trav~ de una columna suele incrementar la propord6n en la mezcla de una protefna determinada en no ma..s de veinte veces. Pueslo que la mayorfa de las protefnas Fracclonamiento de las ee:lulas y amUisis de sus mol~uJas

177

ilIt

(Al CROMATQGRAF(A DE INTERCAMBIO IONICO

1

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num••o de fr.eciones _

L...J

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y .. eplic:en e Ie coIumne ~g...lente (81 CROMATOGRAFfA DE FllTRACI6N EN GEL

1

numero de fr.eclones _ L-...J HW frKeIones .. 'eeogen, .. metelen y .. eplieen ele column.- algulente leI CROMATOGRAftA DE AFINIOAD

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Figura 4-40 PuriOcad6n de prote'nas por cromatografCa. Resultados Ifpicos que se obtienen cuando se utilizan sllcesivamenle tres pasos cromalograficos diferentes para purificar una protefna.. En esle ejemplo se fraceion6 un extraCIO complelo hacl~ndolo pasar primero a Iraves de una resina de inlercambio i6nico empaquelada en una columna (A). La columna se lav6 y las protefnas se eluyeron haciendo pasar desde la parte superior de la columna una soluci6n de sal a una concentraci6n progresivamenle mayor. Las protelnas con menor afinidad por la resina de intercambio i6nico pasaron direclamente a Ira\'~ de la columna y fueron recogidas en las primeras fracciones eluidas que salieron por la parte inferior de la columna. Las restantes prolefnas fueron eluidas de manera secuencial de acuerdo con su afinidad por la resina -las unidas mAs intensamente necesilaron una concentraci6n de sal mas elevada para ser eluidas. La prolefna de inler~ sali6 en fonna de un pequeno pico y se deleclo por su aClividad enzim:ttica. Las fracciones con actividad fueron recogidas y aplicadas a una segunda columna de fl1traci6n en gel {B). La posicion de eluci6n de la prole(na lodavfa impura fue delerminada de nuevo por su actividad enzimalica, y las fracciones aclivas fueron recogidas y purificadas hasta homogeneidad medianle una columna de afinidad (e) que conlenfa inmovilizado un substrato de la enzima.

numero de fr.celona, _ "----J se rKogan Vmete len estes frKelones, que eho.e eontlenen Ie protelne eltemente pl.lrlfieeda

representan individualmente menos del 1/1000 de Ja protefna celuJar total, para conseguir purificarlas suele ser necesario utilizar sucesivamente varios tipos di· ferentes de columnas para conseguir la pweza suficiente (Figura 4-40). Un procedimiento ml1s eficiente, conocido como cromatograffa de aflnIdad, utiliza interacciones de enlace, importantes desde el punto de vista biol6gico, que se producen en la superficie de las protefnas. Por ejemplo, si un substrato enziml1tico se acopla covalentemente a una matm inerte, como pueden ser pequefias esferas de un polisacoirido, la enzima espedfica de este substrato fijado a la columna serl1 retenida en la matrix y podrl1 ser eluida navada) en forma casi pura. De fonna similar, puede inmovilizarse un DNA cono de secuencia disenada es· pecfficamente y utilizarse para purificar protemas que se unan al DNA y que reo conozcan esta secuencia de nucle6tidos en los cromosomas (Figura 9-23). Alternativamente, se pued.en acoplar anticuerpos espedficos a una mal.riZ para purificar mol~u1as proteicas reconocidas par los anticuerpos. Debido a la elevada especificidad de estas coJumnas de afinidad, algunas veces se pueden conseguir, en un solo paso, purificaciones del orden de 1000 a 10 000 veces. 178

Capftulo 4 : C6mo se estudlan las cl!lulas

11 ooiiIU

La resoluci6n de las columnas convencionales de cromatograffa estl1 limitada por la falta de homogeneidad de las matrices (como la celulosa), la cual genera un flujo desigual de los disolventes a traves de la columna. Se han desarrolJado nuevas resinas cromatognUicas (la mayorfa basadas en compuestos de s!lice) en forma de diminutas esferas (de 3 a 10 J.lm de diameuo) que pueden ser empaquetadas mediante un aparato especial formando un lecho uniforme en la colunma. Con estas colwnnas de cromatografia liquida de alta resolud6n (HPLC. de Higll Performance Liquid Chromatography) se a1canza un alto grado de separaci6n. Como las colwnnas de HPLC contienen partfcu1as empaqueradas de forma muy compacta, la velocidad de Oujo a traves de eUas es practicamente nuJa a menos que se apliquen a1tas presiones. Por esta raz6n, normalmente estas matrices se empaquetan en cilindros de acero y requieren un sistema sofisticado de bombas y vaJvulas para forzar a Ouir el disolvente a lraveS de la columna a la presi6n suficiente para producir un flujo deseado de aproximadamente un volumen de columna por minuto. En la cromatograffa en columna convencional, la velocidad de flujo debe ser lenta (a menudo de aproximadamente un volumen de columna por hora) para dar tiempo a los solutos a que se fraccionen en equilibrio con el interior de las grandes partlcuJas de la matriz. En la HPLC los solutos se equUibran rapidamente con el interior de las diminutas esferas, de manera que solutos con diferentes afinidades por la matriz son separados entre sf de forma muy eficiente, siempre a rapida velocidad de flujo. Esto pennite que muchos fraccionamientos puedan realizarse en cuesti6n de minutos, mientras que para obtener una separaci6n pobre en la cromatograffa convencional se requieren horas. Por consiguieme, la HPLC se ha convertido en el metodo escogido para muchas separaciones de protemas y de pequeflas molecuJas.

Mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, pueden determinarse el tamafio y la composici6n de subunidades de una protema2.4

OH

I

CH,

I

CH,

I

SH 50s

Flgura4-41 EldetergentedodecU .uUato a6dIco (SOS) YeI &gente reduclor tJ-mercaptoelan01. EsIOS dos reactivos qufmicos se ulillzan para solubilizar prolemas para elecrroforesis en gel de poliacrilamida con SOS. EI 50S se presenta aquf en su fonna lonizada.

Las prQ(efnas suelen tener una carga neta positiva 0 negativa, que refleja la de los aminoacidos cargados que contienen. Si se aplica un campo electrico a una soluci6n que contenga una molecula proteica, la prorefna migrara a una veloci· dad que dependera de su carga neta, de su tamaflo y de su forma. Esta tecnica, conocida como electroCoresl.s, se utiliz6 inicialmente para separar mezclas de prote!nas tanto libres en soluciones acuosas como incluidas en una matriz s61ida porosa tal como el almid6n. A mediados de los aflos 1960 se desarroU6 una versi6n modificada de este mtitodo -- fosfalo desde el ATP hasta la g1ucosa, fonnando g1ucosa 6-fosfato. Emonces la g1ucosa 6-fosfalo es procesada mediante series de Olras enzimas que calalizan la cadena de reacciones conocidas como g1ucolisis. La g1ucolisis lransfonna la g1ucosa en piruvato y produce una ganancia neta de moleculas de ATP para la celula (vease Figura 2-21).

mea 5-2 E1 camblo de conformaci6n de la hexoqulnasa causado par la unl6n de g1ucosa. las Uneas trazan el Clnso del esqueleto hidrocarbonado de la hexoquinasa. Estas eslruCluras fueron delenninadas por analisis de difracci6n de rayos X de criSlales de la prOlelna, sin y con g1ucosa. La uni6n de g1ucosa cambia Ia proleina desde una confonnaci6n abierta a una confonnaci6n t:errada.

Como diSCUlimos a continuacion, las proteinas cuyos cambios de conformaci6n acoplan dos lugares de uni6n separados de su molecula, han sido seleccionadas durante la evoluci6n ya que penniten a la celula relacionar la presencia de una molecula a la presencia 0 ausencia de cualquicr otra molecula. Este tipo de acoplamiento conformacional se denomina a/osteria. Una protefna cuya actividad esla regulada de esla fonna se denomina proceina a/osu!rica y la uansici6n que surre se denomina transici6n alosterlca .

Dos Iigandos cuyos lugares de uni6n estan acoplados pueden afectar recfprocamente la uni6n del otro2: Cuando dos Iigandos prefieren unirse a la misma conformaci6n de una prote(na aloslcrica, consideraciones lennodimimicas basicas aseguran que cada Iigando incrementa la afinidad de la protema por el Olro Iigando. ESle concepto se denomina conex16n (linkage). Esta bien i1ustrado por el ejemplo considcrado en la Figura 5-5, en el que la uni6n de la glucosa a la hexoquinasa incrementa la afinidad de la enzima por la molt~cula X, y viceversa. La relad6n de conexi6n es cuantitalivamcnte rcciproca de forma, por ejemplo, que si la glucosa dene un gran efeclo sabre la union de X, X tambien tendra un gran efeclo sobre la uni6n de glucosa. Si dos Iigandos se unen a conformaciones diferelltes de una protelna alosterica, 1im,os mas adelante. "'''''~",ndo las diferencias en la secuencia de aminoacidos entre los una familia proteica puede construirse un "arbol evolutivo~, que al a el patr6n de dupJicaci6n genica y de divergencia que ha dado lu(vease Figura 8-76). En la Figura 5-13 se presenta un arbol evolutema quinasas. No resulta sorprendente que a menudo las quinafunciones relacionadas se localicen en ramas vecinas del arbol: todas las proteina quinasas que participan en procesos de Sei'laliza.'*'~ I05forilando cadenas laterales de tirosina se hallan agrupadas en la :,:~:::::r izquierda del fuho\. las otras Quinasas mostradas fosfori.\an cade serina 0 de trconina. y muchas de elias estan agrupadas. al pa-

:

5-12 Estroclura tridimensional de un dominlo proteina quJnasa. dUUellira del dominio quinasa de la quinasa dependien,e de AMP cfdico. "'Upt'rpuestas al dibujo de la es'ructura, las cabezas de flec1la rojas indican .nares en que se han encontrado insertos de entre 5 y 100 aminoacidos en miembros de la familia de protefna quinasas. Estos insertos estan ocalizados en asas sobre la superficie de la enzima, donde otros ligandos lDleractuan con la protelna. Asi. los insertos difcrencian las distintas quinasas -:onfuiendoles la capacidad de interaccionar can otras protefnlls, EI ATP dador de un grupo fosfato en la reacciOn) y el peptido que sera fosforilado unen en el Jugar activo de la enzima, que llbarca desde el asa que une el g;rupo fosfato (amarillo) hasta el asa catalitica (naranja). (Adaptado de DR Knighton et aL Science235:407-414. 1991.0 1991theAAAS.)

!I!!!!'__ como maquinas

215

Cdc 7

, MA>

. •

Arbol e\loluti\lo de algunas prote{na qulnasas. A pesar de que las cclulas eucariotas superiores contiencn cenlenares de tales enzimas, en fa figura s6lo se mueSlran algunas de las que se discuten en este libra.

I,

KSSl ERKl

.ecepto. POGF subf :Ie liroslll' ~ llaseS

receptor

Cdk2

EGF

Cd02

s~

quinalUl dependiente de AMP eielico

LcIc

quinlllUl depend'ente de GMP eklico P'Olelllll quinllSlI C

RlIf Mos

uin8SlI de la ' clIden, lige.a de la miosina

quinllf.l dependienlll de CII '/Calmodulinll

~iClieCdO,C,-­ de ,e de ton{onn.o.ci.6n de \u.s VTolebuu vueden eslo.r d\riwoos de unn mattern Iwidirecc:iOllaJ por In utilizacion tk energfa qllfmica. Por ejemplo, aooplando cambias alostericos a la hit/rolisis de ATP las protefnas puedell tksarrollar rrabajo util, como generar IIna fuerza meainica 0 oombear jOlles a tmiffls de ulla membrum1. Las estructllras tridimensionales de varias protelnas, determilllidas por cristalografla lie raros X. han revelado de quefomul un pequeno cambia local generado por In i.idr6Usis de lin mu:k6sidD trifas/alo u amplifica dnndo I"gar cambiol mayores en alTOs '''gares de In protefna; de esta forma estas proteltulS SOl! capaces de actuar como tmnsductores de in!onJllu;i6n, matares, relojes 0 factores de ellSllmblaje. Se lamlan "mdquinas protelc:as" altamente eficiemes mediante in incorpomci61l de lIIuduu $ubunidades proteiau dl{erentes a ,m gran agregado, en el clud los mouimielltos alostericos de cadn col1l,xmente individual est4n coominados para realiLar In mayorla. si no todns, las reacciones biol6giros.

Nacimiento, ensamblaje y muerte de las protefnas Hemos descrito algunos de los extraordinarios inslrumcntos celulares formados por protefnas. Ahora consideraremos de que manera se forman y se deslruyen eslOS instrumentos. EI mccanismo de la sintesis proteica se discute en olra par· Ie. Ahora empezaremos considerando c6mo se pliega y c6mo se ensambla una proteina a medida que va abandonando el ribosoma en forma de cadena polipeptidica.

Se cree que las protefnas se pliegan a traves de un intermediario globular fundido 17 Muchas prolefnas purificadas se pliegan ill vitro de forma adecuada despues de haber sido desplegadas. por 10 que durante muchos aFlos se pens6 que las prolef-

PROCESOD£ PlEGAOO AcnVADO

PROCESOS DESACTIVAOOS

globulo fundido

/

catalisis por chllperon~

~~

proteina P.......

correctamente

226

~~"'.IUI chaP8r~

Capitulo 5 : Funci6n de las protemas

ACCIDENTES IRRECUPERABLES

Figura 5-27 VIsl6n actual del plegamiento proteico. Una proteina acabada de sintetizar nipidamel11e adquiere un estado de "globulo fundido" (vease Figura 5-28). Despues, mas lelltamellte. se producen plegamielllOs a traves de multiples etapas, algunas de las cual~ produdrlan la muerte de la proterna sin la ayuda de chaperollas moleculares. AJgunas moleculas pueden no conseguir plegarse correctamente y seran reconoddas y degradadas por enzimas proteolfticas (vcase Figura 5-39).

Figura 5-28 Estructura de un gl6bulo fundido. (Al La forma de gl6bulo fundido del dtocromo b562 es mas abierta y menos ordenada que la protefna nativa, moslrada en {Bl. N6tese que el gl6bulo fundido comiene la mayor pane de la estruetura secundaria de la forma nativa. aunque los fmales de las helices a estrin deshilachados y una de estas helices s610 estri formada pardalmente. (Por cortesfa de Joshua Wand).

IAI

IBI

-.:="""adoptar todas las conformadones posibles mientras se van pleganque consiguen adoptar la conformaci6n de menor energfa posible, la

ne que es el estado correcta de la prote(na. Ahara sabemos que esro pesar de las ahas veloddades que adquieren los movimiemos mole_=,.'~ una protefna (vease pag. 101), para cualquier prmeina grande existen _=',ov", mas conformaciones posibles de las que se pueden explorar duran_ segundos que tarda la proteina en plegarse. Ademas, la existencia rnutantes que tiellen defectos especfficos de plegamiento indica _ la evoluci6n se ha ida seleccionando una secuencia de aminoaci,",,,,"",,,nada, no s6lo en funci6n de las propiedades de la estructura final n por la capacidad de plegarse rapidamclltc adoptando su confordad de algunas proteinas purificadas y desnaturalizadas de recu:>-ucurras nativas par si mismas ha hecha pasible disecar experimenesos del plegamiento de las proteinas. Las protefnas se pliegan .xmando estructuras en las que se ha fonnado la mayor parte de la estructura secundaria final (helices 0: y laminas 13) y en las ""~,,,,,,,,,,,tos se disponen de una forma cxtraordinariamente semejame a :1Ja 5·27). Esta conformad6n extraordinariamente abierta y flexi......--:-:='-.... gl6blllo fLmdido (mohen globule) (Figura 5-28) es el punta de ft'lCe'SO relativamente lento en el que se producen muchos ajustes ~."'-'="-=' ~erales intentando formar correctamente la estructura terdaria. ::::~ ~-eriores hada la conformad6n final se han de produdr diferen~ de ellos pueden condudr a plegamientos incorrectos a no la colaborad6n de una chaperona molecll/ar. protefnas especuya fond6n consiste en ayudar a otras protefnas a plegarse emucturas estables y activas (Figura 5-27).

:

....,,,=,,,,.., :

:::::,mOleCUlares fadlitan l8 de las proteinas

rculares se identificaron por primera vex en las bacterias. mutantes de E. coli que eran incapaces de utilizar bactef£."plicarse. Estos mutantes producen versiones ligeramenp:mentes de la maquinaria de chaparones, reladonada estI"fs par calor 60 y 70 (hsp60 Yhsp70, de Heat-Shock Pro""...""=defectuosas en determinadas etapas del ensamblaje

'::.~; :::::

•

".lo1Il!!i5!!!iiiEV muene de las protefnas

227

deSCIlI111da por proteoljS4

mllquinarill

r!f ribosomll

maquinarill semejlll'\le a hsp60

maquinaria semejllnte a hsp60

protelna plegada correctamente

proteina plegada correcta

Las celulas eucariotas tienen familias de protefnas hsp60 y hsp70, de forma que diferentes miemhros de las familias actuan en compartimientos cclulares distintos. Asi, como discutimos en el Capitulo 12, las mitocondrias contienen sus propias moleculas hsp60 y hsp70, diferentes de las que actuan en el dtoso], yen el reticulo endoplasmatico existe una hsp especial OIamada Blp) que colabora en el plegamiento de las proteinas. Tanto las proteinas hsp60 como las hsp70 actuan con un reduddo numero de protefnas asociadas, cuando colaboran en el plegamiento de otras proteinas. Presentan afinidad por las zonas hidrof6hicas asequibles que muestran las protefnas plegadas de forma incompleta e hidrolizan ATP, posiblemente uniendose y liberandose de su proteina en cada cicio de hidr61isis del ATP. Originalmeme se pens6 que las chaperonas moleculares s610 actuaban impidiendo la agregaci6n promiscua de las protefnas todavia no plegadas (de ahf su nombre; chaperon signifiea "dama de compania de senoritas"). Sin embargo ahora se cree que tambien interactuan mas fntimamente con sus "c1ientes" produciendo efectos que podrian asemejarse a un "masaje proteico". Las chaperonas se unen a las regiones hidrof6bicas expuestas, y dan un masaje a las regiones de la protefna que estan medio plegadas a partir del intermediario globular fundido, eamhiando su estructura de tal manera que proporciona a la proteina otra posibilidad de plegarse (vease Figura 5-27). En otros aspectos los dos tipos de proteinas hsp actuan de forum diferenle. Se cree que la maquinaria hsp70 actua precozmentc en la vida de lUla proteina, uniendose a eadenas de unos siete aminoacidos hidrof6bicos antes de que la protefna se libere del ribosoma (Figura 5-29). Por el contrario, las protefnas semejantes a hsp60 forman una estructura parecida a un gran barril (Figura 5-30) que actua mas tarde en la vida de la proteina; se cree que esta chaperona fonna una "camara de aislamiento" dentro de la cual se colocan las proteinas a media plegar, y se les facilita un entomo favorable dande puedan intentar volverse a plegar (vease Figura 5-29). Estas chaperonas moleculares se denominan proteflJas de estres par calor debido a que su s{ntesis se incrementa natablemenle tras una breve exposici6n

10Qnm

228

Capitulo 5 : Funci6n de las protefnas

10 nm

Figura 5-29 Dos famillas de chaperonas molec::ulares. Las protefnas hsp70 acluan de forma lemprana, reconociendo pequcii.as zonas de la superficie de las protefllA Las protefnas semejames a hsp60 aCluan mas larde y forman una especie de contenedor denlro del se transfieren las protefnas que todao no se han plegado completameme. ambos casos, ciclos repetidos de hidr611sis de ATP contribuyen a que proteinas hsp sigan cietos de uni6n l Jiberaei6n de la prOleina e1iente, facilitando su plegamienlO.

Figum 5-30 Estructura de una chaperona semejante a hsp60, determlnada por mlcroscopia electronlca. En (A) se muestra un gran numero de paniculas contrastadas negativameme y en (B) un modele tridimensional de una de cslas partfculas. obtenido par melOdos de procesamicmo de imagenes basados en ordenador. Tanto en procariotas como en cllcariotas se encuentran estructuras simiJares, parccidas a un gran barril. A este lipo de proleina se It' denomina hsp60 en las mitocondrias. groEl en bacterias y Tep·I en el citosol de las celulas de vertebrados. (A, de B.M. Phipps el aI., EMBO). 10:1711-1722,1991; B, de B.M. Phipps et aL Nature361:475·477, 1993. © Macmillan Magazines Ltd.)

a elevadas temperaturas (por ejemplo, 42°C). Ello parece retlejar de retroalimentaci6n que responde a un incremento de la cantimedio desplegadas (como las producidas por las elevadas lemConna que se incrementa la sintesis de chaperonas que ayudan a i"Olverse a plegar. :~

:

temas contienen series de moh~culas plegadas mdependiente l9

'lIegamiento de una protefna acabada de sinlelizar empieza conla nLimero de dominios estructurales estables, que se ~ con unidades funcionales, y que parecen tener orfgenes evolulivos En otros aparmdos dellibro discutimos los proccsos por los que se e"o'Olucionado las protcfnas, poniendo de relieve de que manera se - proteinas mediante el barajado de exones que codificaban domide proteinas utiles (veanse pags. 413-424). La evoluci6n ha de estos dominios en forma de unidades plegadas que retie..,,"""".. induso c.uano.() son separados de la proteina -bien sea par . ...,'" -'a, bien, de manera mas eficiente, por tecnicas de ingenierfa minios proteicos de este tipo, que muy a menudo panicipan en :~~::ti,·o de exones, se denominan m6dulos; ahora que conocemos de DNA de centenares de genes, se ha puesto de manifiesto la im~:;;.,_.JIldeterminado

"""""_:"lIDOS

:

•

:

:~~~~.,.:"': m6dulos.

proteicos tienen tipicamente entre 40 y 100 aminoacidos de tamano y Sll capacidad de plegarse indepcndientemente :~';;:,,;:: detcrminar la estructura tridimensional de muchos de ellos en Ie tecnicas de NMR de elevada resoluci6n, la cual es una alter-~=_'flte a la cristalografia de rayos X. En la Figura 5-31 se i1ustran al~eii.o

•

• .J cit! complemenlo 3e conllol

modulo de -"rloglobulina

mOdulo de fibrone SINTESIS DEL RNA CEBADOR

III i

1

'I II 111I1I11i11

LA NUEVA CADENA DE DNA INICIA LA S[NTESIS DE LA CADENA CONDUCTORA

",' Ii II'

LAS CADENAS CEBADORAS DE RNA INICIAN LA SfNTESIS DE CADENAS ADICIONALES DE DNA

1

I

~.Jlililiiliiliiiillliiiiiilj"".'ililillilill"~ liii"" ~ «,"';:

l!\\il\jt!"!!i"~I'I'I}llilllliilllilllll\ll\\i~\ ~'

• horquilla 1

horquilla 2 •

5e generan cl05 horquillas de replicaclon cornplctas, una de las cuales sn dcSpt : Mecanismos I!eneticos basicos

Figura 6-62 Sinapsis de DNA catalizada por la protema RecA. Experimentos in vitra indican que entre estructuras de una sola cadena de DNA recubierta de protefnas RecA (rajo) y una doble helice (verde), se forman diferentes tipos de complejos. En primer lugar, se forma un complejo sin que se produzca apareamiento de bases que se transforma en un complejo con apareamiento de bases en cuanto se encuentra una regi6n de secuencia hom610ga. Probablemente este complejo es inestable ya que esta formado por una forma de DNA poco usual, y genera un DNA heteroduplex (una hebra verde y la otra raja) mas una hebra sencilla desplazada de la helice original (verde); asf, la estructura mostrada en este diagrama migra hacia la izquierda enrollando el DNA de "entrada" y produciendo el DNA "de salida". El resultado neto es un intercambio de hebras identico al descrito anteriormente en la Figura 6-59. (Adaptado de S.C. West, Annu. Rev. Biochem. 61:603-640, 1992. © Annual Reviews Inc.)

Figura 6-63 Dos tipos de migraci6n de las cadenas, observados en experimentos in vitro. (A) La migraci6n espontanea es un tipo de proceso en el que las cadenas se mueven arriba y abajo, de forma aleatoria, con 10 que progresa muy poco sobre distancias largas. Por el contrario, la migraci6n dirigida por la protefna RecA (B) se produce a una \Telocidad uniforme y en una sola direcci6n; puede estar dirigida par el ensamblaje polarizado del filamento de protefnas RecA sobre la cadena sencilla de DNA, la cual ocurre en la direcci6n indicada. Ademas, en la recombinaci6n participan helicasas que catalizan la migraci6n de cadenas dirigida por protefnas, incluso con mas eficiencia.

La recombinaci6n genetica general habitualmente supone un intercambio cruzado de cadenas 0 entrecruzamiento 43 Parece que el paso mas dificil y mas lento del proceso de recombinaci6n genica general es el intercambio de una cadena sencilla entre las dos dobles helices (vease Figura 6-59). Tras este intercambio inicial, parece que la ampliaci6n de la regi6n de apareamiento y el establecimiento de otros intercambios entre cadenas de las dos dobles helices que se hallan en estrecho contacto son procesos rapidos. Durante estos procesos, a menudo se produce la eliminaci6n de una pequefia cantidad de nude6tidos y la resintesis local de DNA, de forma parecida a como ocurre en los procesos de reparaci6n del DNA. Debido al elevado mlmero de posibilidades que pueden darse, es facH que diferentes organismos puedan seguir diferentes pasos en este punto. En la mayoria de los casos, sin embargo, se forma una importante estructura intermediaria, un intercambio cruzado de cadenas 0 entrecruzamiento (cross-strand exchange), en la que participan las dos helices de DNA. En la Figura 6-64 se muestra una de las vias mas sencillas a traves de la cual se puede formar esta estructura: En el intercambio cruzado de cadenas (tambien denominado "union de Holliday") las dos helices homologas de DNA que inicialmente se aparearon se mantienen unidas mediante el intercambio mutuo de dos de las cuatro cadenas presentes, una de cada helice. Para mantener esta estructura no es necesario que se rompan pares de bases; la estructura presenta dos propiedades importantes: (1) el punto de intercambio entre las dos dobles helices hom610gas de DNA (en la Figura 6-64, ellugar donde las dos cadenas se cruzan) puede migrar rapidamente en una u otra direcci6n siguiendo las helices, mediante una migracion de doble cadena; (2) el intercambio cruzado de cadenas consta de dos pares de cadenas: uno de cadenas cruzadas y el otro de cadenas no cruzadas. Sin embargo, la estructura puede isomerizar al sufrir la serie de movimientos de rotacion que se muestran en la Figura 6-65, de forma que las dos cadenas que originalmente no se entrecruzaban ahora si que se entrecruzan, y viceversa. Con el fin de regenerar dos helices de DNA separadas y de conduir asi el proceso de apareamiento, las dos cadenas entrecruzadas se han de cortaro Si las dos cadenas entrecruzadas se cortan antes de la isomerizaci6n del entrecruzamiento, las dos helices originales de DNA se separan en forma casi inalterada, habiendose intercambiado un fragmento muy corto de DNA de una sola cadena. Sin embargo, si las dos cadenas entrecruzadas se cortan despues del proceso de isomerizaci6n, un trozo de cada una de las dos helices originales quedara unido, mediante una uni6n heteroduplex, a una zona de la otra helice de DNA: en otras palabras, las dos helices de DNA se habran entrecruzado (vease Figura 6-65). La isomerizacion de las cadenas cruzadas puede ocurrir espontaneamente a una cierta velocidad, pero tambien puede estar dirigida enzimaticamente 0 regulada por las celulas de alguna otra forma. Probablemente, durante la meiosis se produce algtin tipo de control, cuando las dos dobles helices de DNA que se emparejan se constrifien en una elaborada estructura denominada complejo sinaptonemico (como se discute en el Capitulo 20).

des helices hem61egadas de DNA

FORMACl6N DE UNA MUESCA E INTERCAMBIO DE CADENAS

FORMACl6N DE UNA

I MUESCA E INTERCAMBIO + DE CADENAS

I UNI6N DE LAS + CADENAS ROTAS

des meh3culas de DNA unidas per un entrecruzamiente de cadenas

Figura 6-64 Formaci6n de un entrecruzamiento de cadenas. Existen muchas vias diferentes que pueden conducir desde un entrecruzamiento entre cadenas (vease Figura 6-59) a un intercambio de cadenas, aunque en la figura se muestre una sola de ellas.

La conversi6n genica se produce combinando procesos de recombinaci6n general y de sfntesis limitada de DNA44 Una ley fundamental de la genetica dice que la contribuci6n genetica de cada uno de los padres al hijo es identica: se hereda un juego completo de genes del padre y otro de la madre. Asi, cuando una celula diploide entra en meiosis produciendo cuatro celulas haploides (vease Capitulo 20), exactamente la mitad de los genes de estas celulas han de proceder de la madre (los genes que la celula diploide hered6 de la madre) y la otra mitad, del padre (los genes que la celula diploide hered6 del padre). En un animal pluricelular, como es el caso del hombre, no es posible comprobar directamente si se cumple esta predicci6n, pero en Recombinaci6n genetica

287

Figura ()-()5 Isomerizaci6n de un entrecruzamiento de cadenas. Si no se ha producido la isomerizaci6n, el corte de las dos cadenas cruzadas finaliza el intercambio sin que se haya producido entrecruzamiento. Si se produce isomerizaci6n (etapas B y el, el proceso de corte de las dos cadenas produce dos moleculas de DNA que se han entrecruzado (abajol. Por consiguiente, se cree que la isomerizaci6n es necesaria para que el proceso de rotura y nueva uni6n de dos dobles helices hom610gas de DNA de lugar a una recombinaci6n general. La etapa Aya se ha ilustrado antes (vease Figura 6-64).

dos cromosomas hom61ogos

A

otros organismos, como en los hongos, en los que es posible recuperar y analizar cada una de las cuatro celulashijas producidas por meiosis a partir de una unica celula, se pueden encontrar muchos casos en los que aparentemente se han violado las reglas geneticas estandar. Por ejemplo, ocasionalmente la meiosis produce tres copias de la version materna (alelos) de un gen y una sola copia del alelo paterno, 10 cual pone de manifiesto que una de las dos copias del alelo paterno ha sido cambiada a una copia del alelo materno. Este fenomeno se conoce como conversion genica. A menudo ocurre en asociacion con los procesos de recombinaci6n genetica general, y se cree que es importante en la evolucion de ciertos genes (vease Figura 8-74). Parece ser que la conversion genica tiene unas consecuencias directas sobre los mecanismos de recombinacion general y de reparacion del DNA. Durante la meiosis, se forman uniones heteroduplex en los lugares de entrecruzamiento de cromosomas homologos maternos y paternos. Si las secuencias maternas y paternas son ligeramente diferentes, la union heteroduplex puede incluir algunos errores de apareamiento de bases. Estos errores en la doble helice pueden ser corregidos por la maquinaria de reparacion del DNA, la cual puede eliminar los nucleotidos de la cadena paterna y reemplazarlos por nucleotidos complementarios a los de la cadena materna, 0 viceversa. La consecuencia de ese sistema de reparaci6n sera una conversion genica. Tambien se puede dar una conversion genica mediante otros mecanismos, pero todos ellos requieren la existencia de algun tipo de proceso de recombinacion que una entre sf dos copias de dos secuencias de DNA fuertemente relacionadas. Debido a que se genera una copia extra de una de las dos secuencias de DNA, en el proceso tambien ha de participar una pequefia parte de biosfntesis de DNA. Estudios geneticos muestran que normalmente la conversion genica afecta a pequefias zonas de DNA, y que en muchos casos unicamente se cambia una parte de un gen. La conversion genica tambien puede ocurrir en celulas en mitosis, aunque esto solo se produce raramente. Tal como ocurre en celulas en meiosis, probablemente los procesos de conversion genica que se producen en las celulas en mitosis aparecen como consecuencia de procesos de reparacion de aparejamiento de bases en el DNA heteroduplex. En la Figura 6-66 se ilustra otro mecanismo que probablemente se produce en celulas en mitosis y en celulas en meiosis.

FORMACI6N DE UNA ESTRUCTURA DE INTERCAMBIO DE CADENAS CRUZADAS

j

CORTE DE LAS DOS CADENAS DE DNA CRUZADAS

Los mecanismos de correcci6n de errores pueden evitar la recombinaci6n genetica promiscua entre dos secuencias de DNA mal apareadas 45 Como hemos discutido antes, la recombinaci6n general se dispara cuando dos cadenas de DNA de secuencia complementaria se emparejan formando un heteroduplex entre dos dobles helices (vease Figura 6-64). Experimentos lIevados a cabo in vitro con protefna RecA purificada muestran que puede ocurrir el emparejamiento de forma eficiente incluso cuando las secuencias del DNA no se apareen bien -por ejemplo, cuando solo un promedio de cuatro de cada cinco nucleotidos formen parejas de bases. Siendo asf, ide que forma pueden las celulas de vertebrados evitar la recombinaci6n general promiscua entre los varios cen288

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

cromosomas que se han entrecruzado

muesca

S

/

~

••••••••••••••••••••••••••••••••).1•••••••••••• 3'

5' 3'

helice de DNA

5' helice de DNA

la DNA polimerasa desplaza una cadena de la helice roja; entonces, esta hebra se aparea con la helice verde

1

etapa 1

.........................................

.........E- .

la DNA polimerasa se para, el exceso de DNA de cadena sencilla es degradado por nucleasas y todos los cortes reparados

1

etapa 2

, ............................................... la replicaci6n normal del DNA produce tres alelos rojos y un alelo verde del gen X

1

etapa 3

Figura 6-66 Proceso de recombinaci6n general que puede causar conversi6n genica. EI proceso empieza cuando se produce una muesca en una de las cadenas de la helice de DNA raja. En la etapa Iia DNA polimerasa inicia la sintesis de una copia extra de una de las cadenas de la Mlice raja, desplazando la copia original como una hebra sencilla. Esta hebra sencilla se aparea con la region homologa de la Mike verde, como se muestra en la Figura 6-59. En la etapa 2, la corta region no apareada de la cadena verde producida en la etapa I es degradada, completandose la transferencia de secuencias de nucleotidos. EI resultado normalmente se observa en el siguiente cicio celular, despues de que la replicacion del DNA haya separado las dos cadenas no apareadas (etapa 3). Como se describe en el texto, la reparacion de errores de apareamiento de pares de bases en una union heteroduplex tambien produce conversion genica.

RESULTADO NETO: UN ALELO VERDE DEL GEN X SE HA CONVERTIDO EN UN ALELO ROJO

tenares de copias de DNA de secuencias estrechamente relacionadas que se haHan repetidas en sus genomas- (vease pag. 423) ? A pesar de que no conocemos la respuesta a esta pregunta, diversos estudios en bacterias y levaduras han demostrado que los mismos sistemas de correcci6n de errores de apareamiento que eliminan los errores de replicaci6n (vease Figura 6-50) tambien interrumpen los procesos de recombinaci6n genetica general entre secuencias de DNA que se emparejan de forma imperfecta. Se conoce, por ejemplo, que los genes hom610gos de las dos bacterias estrechamente relacionadas Escherichia coli y Salmonella typhimurium generalmente no se recombinan, a pesar de que, como sabemos, sus secuencias de nucle6tidos son identicas en un 80%; sin embargo, cuando el sistema de correcci6n de errores de apareamiento se halla inactivado por mutaci6n, la frecuencia de estos procesos de recombinaci6n interespecies se incrementa unas 1000 veces. As!, sabemos que el sistema de correcci6n de errores de apareamiento reconoce normalmente las bases mal apareadas de un intercambio de cadenas inicial e impide los pasos posteriores necesarios para que se produzca la rotura y nueva uni6n de las dos helices emparejadas. Este mecanismo protege el genoma bacteriano de cambios de secuencia que, de otra forma, se producirian mediante recombinaci6n con moleculas de DNA que ocasionalmente entran en la celula. Se cree que en las celulas de vertebrados, que contienen muchas secuencias de DNA estrechamente relacionadas, este mismo tipo de sistema de correcci6n ayuda a impedir que se produzcan procesos de recombinaci6n promiscua que, de otra forma, mezclarian el genoma (Figura 6-67).

Enzimas de recombinaci6n especffica de lugar ponen y quitan del genoma secuencias especiales de DNA46 Adiferencia de la recombinaci6n general, la recombinaci6n genetica especitlca de Ingar esta guiada por una enzima de recombinaci6n que reconoce secuenRecombinaci6n genetica

289

/

secuencias repetidas, similares pero no identicas " "

1 1 LA DETECCI6N DE UN ERROR ABORTA EL APAREAMIENTO E IMPIDE LA RECOMBINACI6N

!,rmRCAMBIO DE CADENAS

j

r= - -

=?::v=e:~::~--=c=~~_

1

OCURRE RECOMBINACI6N 51 LA CORRECCI6N DE ERRORE5 FALLA

+

cias especfficas de nucle6tidos presentes en una 0 en ambas mohkulas de DNA que se recombinan. No es necesario que se produzca un apareamiento de bases entre las moleculas de DNA que se recombinan, e incluso cuando este se produce, la uni6n heteroduplex que se forma es tan s610 de unos cuantos pares de bases de longitud. Separando y volviendo a unir moltkulas de DNA de doble hebra en lugares determinados, este tipo de recombinaci6n permite que varios tipos de secuencias de DNA se desplacen dentro y entre cromosomas. La recombinaci6n especffica de lugar fue descubierta como el sistema mediante el cual un virus bacteriano, el bacteri6fago lambda, traslada su genoma dentro y fuera del cromosoma de E. coli. En su estado integrado el virus esta escondido en el cromosoma bacteriano y se replica como parte del DNA del huesped. Cuando el virus entra en una celula, se sintetiza una enzima codificada por el genoma del virus, la llamada integrasa lambda. Esta enzima cataliza un proceso de recombinaci6n que se inicia cuando mUltiples copias de la proteina integrasa se unen fuertemente a una secuencia especial del DNA del cromosoma circular del bacteri6fago. Ahora, el complejo resultante DNA-proteina puede unirse a otra secuencia especial de DNA del cromosoma bacteriano, uniendo estrechamente entre sf el cromosoma de la bacteria y del bacteri6fago. Entonces, la integrasa cataliza las reacciones necesarias de corte yempalme, utilizando una corta regi6n de homologia de secuencia para formar en el punto de uni6n una diminuta uni6n heteroduplex (Figura 6-68). La integrasa se parece a una DNA topoisomerasa en que forma una uni6n covalente reversible con el DNA en ellugar en el que rompe la cadena de DNA. El mismo tipo de mecanismo de recombinaci6n especffica de lugar puede realizarse a la inversa por el bacteri6fago lambda, permitiendole salir de su lugar de integraci6n en el cromosoma de E. coli para multiplicarse rapidamente en la celula bacteriana. Esta reacci6n de eliminaci6n esta catalizada por un complejo de la enzima integrasa y otra protefna del bacteri6fago, la cual se sintetiza por el virus unicamente cuando la celula huesped esta estresada. Si los lugares reconocidos por una enzima de recombinaci6n como esta se sueltan, entonces el DNA comprendido entre ellos en lugar de ser eliminado sera invertido (vease Figura 9-57). Muchas otras enzimas que catalizan procesos de recombinaci6n especifica de lugar se parecen a la integrasa lambda en que requieren una corta regi6n de secuencias identicas de DNA sobre las dos regiones de la helice de DNA que se 290

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos blisicos

Figura 6-67 La correcci6n de errores impide que se produzca recombinaci6n general a partir de genomas desestabilizados que contienen secuencias repetidas. Estudios en bacterias y levaduras sugieren que el sistema de correcci6n de errores descrito previamente en la Figura 6-50 tiene la funci6n adicional descrita aqui.

cromosoma circular del bacteriofago lambda

( secuencias de lugar de union

cromosoma bacteriano

-=======::::::====== LA INTEGRASA SE UNE

CATAuSIS DE ROTURA Y NUEVA UNION DE LA DOBLE

1

complejo proteico de la integrasa lambda

!

1

=H=EBRA=§;;~S·ii2~;P=_

t-=======:::-::::=======:::::=====LAINTEGRASA SE DISOCIA

I

Figura 6-68 La inserci6n de DNA del bacteri6fago lambda en el cromosoma bacteriano. En este ejemplo de reeombinaci6n especifiea de lugar la enzima integrasa lambda se une a una secuencia de DNA "de union" de eada cromosoma, mientras haee cortes que generan eortas seeuencias hom6logas de DNA; entonees la integrasa cambia las hebras y las une, formando una uni6n heterodl1plex de 7 pares de bases de longitud. Cada una de las reacciones de rotma de cadenas y de uni6n de eadenas requiere nuevas uniones, que estan producidas por la DNA topoisomerasa, mientras que la energia de rotma de un enlace fosfodiester se almacena en una union covalente transitoria entre el DNA y la enzima (vease Figura 6-64).

I

DNA del bacteriofago integrado en el cromosoma bacteria no

van a unir. Debido a este requerimiento, cada una de las enzimas de esta clase es relativamente exigente respecto a las secuencias de DNA que recombina, de forma que puede esperarse que catalice un proceso determinado de uni6n que sea litil para el virus, el plasmido, el elemento transponible 0 la celula que la presenteo Estas enzimas pueden utilizarse como herramientas en animales transgenicos para estudiar la influenciade determinados genes sobre el comportamiento celular, como se ilustra en la Figura 6-69. Las enzimas de recombinaci6n especifica de lugar que cortan y vuelven a unir dos dobles helices de DNA, a menudo 10 hacen de una manera reversible: como el caso del bacteri6fago lambda, el mismo sistema enzimatico que une dos moleculas de DNA tambien puede separarlas de nuevo, recuperando de forma precisa la secuencia de ambas moleculas originales de DNA. Por ella, este tipo de recombinaci6n se denomina recombinaci6n conservativa espec(fica de lugar para distinguirla de la recombinaci6n transposicional espec(fica de lugar, mecanisticamente diferente, que exponemos a continuaci6n.

La recombinaci6n transposicional puede insertar un elemento genetico m6vil en cualquier secuencia de DNA47 Muchas secuencias m6viles de DNA, incluyendo muchos virus y elementos transponibles, codifican integrasas que insertan su DNA en un cromosoma a traves de un mecanisme diferente del que utiliza el bacteri6fago lambda. Como la integrasa lambda, cada una de estas enzimas reconoce una secuencia especifica de DNA del elemento genetico m6vil cuya recombinaci6n cataliza. A diferencia de la enzima de lambda, sin embargo, estas enzimas no requieren una secuencia de DNA "diana" especifica y no forman ninguna uni6n heterodliplex. En lugar de ello, introducen cortes en ambos extremos de la secuencia lineal de DNA del elemento genetico m6vil y catalizan un ataque directo de estos extremos de DNA sobre la molecula de DNA diana, rompiendo dos enlaces fosfodiester cercanos de la molecula diana. Debido a como estan construidos estos cortes, en la molecula de DNA recombinante quedan dos pequeuos huecos de una sola heliRecombinaci6n genetica

291

unidad de transcripci6n

gen de interes sin el promotor

lugares reconocidos por la enzima de recombinaci6n

I

gen marcador

--- l,

--_I

h~r..(/~"

adici6n de una sonda de DNA cion ada y radiactiva, e incubaci6n para ~;;:;;;~ permitir que se produzca la hibridaci6n

-r.__-. _'
TRATAMIENTO CON NUCLEASA S1 PARA ROMPER EL BUCLE

5' 3

3'

tf'ttf'tt TTTTTTT 5'

eopia de eDNA de doble cadena realizada a partir de un mRNA original

Figura 7-23 Sfntesis de eDNA. Se obtiene una eopia en DNA (eDNA) de una moIeeula de mRNA mediante la enzima transeriptasa inversa (vease pag. 303), formandose asf una heliee hfbrida DNA/RNA. El tratamiento del hfbrido DNA/RNA con aIeali degrada seleetivamente el RNA hasta nucle6tidos. La cadena sencilla de cDNA que permanece es copiada por la DNA polimerasa formando una doble heliee de cDNA. Tal como se indica, tanto la transcriptasa inversa como la DNA polimerasa requieren un eebador para poder iniciar la sfntesis. En el easo de la transeripci6n inversa se utiliza un pequeno oligonude6tido, en este ejemplo se ha hibridado un oligo(dT) con la larga cola poli-A earacterfstiea del extrema 3' de la mayoria de mRNA. Es de destacar que la mayor parte de las moleculas de eDNA producidas carecen de extremos eohesivos; las moIeculas que poseen extremos romos se pueden donar mediante diferentes proeedimientos que son similares (pero menos eficientes) a los descritos en la Figura 7-21.

transfectadas con exito; si la bacteria se hace crecer en presencia del antibi6tico, solamente sobreviviran las celulas que contengan los plasmidos. Cada una de las bacterias que fue transfectada contendra, en general, un fragmento de DNA insertado diferente; este inserto sera heredado por toda las celulas de la progenie de la bacteria que formaran una pequefia colonia en una placa de cultivo. La colecci6n de muchas pequefias bacterias supervivientes contiene la Iibrena de DNA, formada por un gran mlmero de insertos de DNA diferentes. El problema es que s610 unas cuantas de ellas tendran insertos de DNA con el gen de interes. Es necesario identificar dichas bacterias a fin de recuperar el DNA de interes en forma pura y en cantidades titHes. Antes de describir c6mo puede hacerse esto, es necesario describir una segunda estrategia en la construcci6n de Iibrerias de DNA muy utilizada en el clonaje de genes.

Dos tipos de librerias de DNA cumplen diferentes prop6sitos1 7 El procedimiento de cortar el genoma completo de una celula mediante una nucleasa de restricci6n, tal como se acaba de describir, en ocasiones recibe el nombre de aproximaci6n de la "perdigonada" al clonaje de genes. Produce una gran cantidad de fragmentos de DNA -para una celula de mamffero, del orden de un mill6n- que generaran por tanto millones de colonias diferentes de celulas transfectadas. Cada una de estas colonias estara compuesta por un clon derivado de una sola celula antecesora, y por 10 tanto, contendni un pIa.smido recombinante con un inserto de la misma secuencia de DNA gen6mico. Se dice que un plasmido como este contiene un clon de DNA gen6mico, y la colecci6n completa de plasmidos se denomina una libreria de DNA gen6mico. Sin embargo, debido a que el DNA gen6mico se ha cortado al azar en pequefios fragmentos, t1nicamente algunos de estos fragmentos contendran genes enteros; muchos de ellos tan s610 contendran una parte de un gen y la mayona de los clones de DNA gen6mico obtenidos del DNA de una celula eucariota superior contendran DNA no codificante, el cual, como se vera en el Capitulo 8, constituye la mayor parte del DNA de estos genomas. Clonaje de DNA

333

,--- gen A --,

If

gen B

iii i i' I Iii 1 ill 111111111~I 1111II! 111111111Iii icrom~~~mico 11111 ex6n

intr6n

1

11

TRANSCRIPCI6N

1

mRNA

CLONAJE DE DNA

-

I

11111

1

--- -----

MADURACI6N DEL RNA

_

I

-

transcritos deRNA -

fragmentos de DNA

1

gen B

"1111111111

1

DNA n.o transcnto

DIGESTI6N POR UNA NUCLEASA DE RESTRICCI6N

== == lImUl1

,--- gen A --,

1

I

TRANSCRIPCI6N INVERSA Y CLONAJE

--

clones de DNA gen6mico

•

•

clones de cDNA

Una estrategia altemativa consiste en iniciar el proceso de clonaje seleccionando las secuencias de DNA que se transcriben a RNA, y que, por 10 tanto, probablemente corresponden a genes. Ello se realiza mediante la extracci6n del mRNA (0 de una subfraccion purificada del mRNA) de las celulas, ya continuacion, haciendo una copia de DNA eomplementario (eDNA) de cada una de las moleculas de mRNA presentes; esta reacci6n esta catalizada por la enzima transcriptasa inversa de retrovirus, la cual sintetiza una cadena de DNA sobre un molde de RNA. Las moleculas de DNA de una sola cadena sintetizadas por la transcriptasa inversa se transforman en moleculas de DNA de doble cadena mediante la DNA polimerasa, y estas moleculas se insertan en vectores viricos 0 plasmidicos y se clonan (Figura 7-23). Cada uno de los clones obtenidos de esta forma se denomina clon de eDNA, y la colecci6n completa de clones derivados de una preparacion de mRNA constituye una librena de eDNA. Existen importantes diferencias entre los clones de DNA genomico y los clones de cDNA Los clones gen6micos representan una muestra al azar de todas las secuencias de DNA de un organismo, y salvo muy raras excepciones, sera el mismo independientemente del tipo celular que se haya utilizado para prepararlo. Par el contrario, los clones de cDNA solo contienen las regiones del genoma que se han transcrito a mRNA; las celulas de diferentes tejidos contienen diferentes juegos de moleculas de mRNA, por 10 que se obtendra una libreria de cDNA diferente en funcion del tipo celular empleado para su construcci6n.

Los clones de eDNA eontienen seeuencias eodifieantes eontinuas 18 La utilizacion de una libreria de cDNA para el clonaje de genes tiene varias ventajas. Asi, algunas celulas especializadas producen grandes cantidades de determinadas proteinas y en estos casos la cantidad de mRNA que codifica esta proteina se produce en un exceso tal que la libreria de cDNA preparada a partir de estas celulas estara muy enriquecida en las moleculas cDNA que codifican esta proteina, 10 cual facilita la identificacion del clan deseado en la libreria (Figura 7-24). Por ejemplo, la hemoglobina se fabrica en grandes cantidades en los eritrocitos en desarrollo; por ella los genes de globinas fueron de los primeros en ser clonados.

334

Capitulo 7 : Tecnologia del DNA recombinante

Figura 7 -24 Difertmcias entre clones de eDNA y clones gen6mieos. En este ejemplo, el gen Ase transcribe muy poco mientras que el gen B10 hace frecuentemente, y ambos genes contienen intrones (verde). En los clones de DNA gen6micos se incluyen tanto los intrones como el DNA no transcrito, de forma que muchos clones contendran s610 una parte de la secuencia codificante de un gen. En los clones de cDNA no hay secuencias de intrones ya que se han eliminado en el proceso de maduraci6n del RNA para formar el mRNA, y por ella contienen una secuencia codificante continua.

La caracterfstica mas importante de los clones de cDNA es que contienen la secuencia ininterrumpida de un gen. Frecuentemente los genes eucariotas consisten en pequefias secuencias cortas de DNA codificante (exones) separadas por regiones largas de DNA no codificante (intrones); la producci6n del mRNA supone la eliminaci6n de las secuencias no codificantes del transcrito de RNA inicial y la union entre sf de todas las secuencias codificantes. Ni las celulas bacterianas ni las levaduras realizan estas modificaciones sobre el RNA producido a partir de un gen de una celula eucariota. Asf pues, si la intencion del proceso de clonaje estriba tanto en deducir la secuencia de aminoacidos de una protefna a partir de la del DNA, como en producir grandes cantidades de la protefna expresando el gen clonado en una bacteria 0 en una levadura, es mucho mejor partir del cDNA. Las librerfas gen6micas (genotecas) y las librerfas de cDNA constituyen recursos inagotables ampliamente utilizados en investigaci6n. Hoy en dfa, muchas de estas librerfas son tambien asequibles comercialmente.

linfoeitos T

<jr...r

TRANSCRIPCI6N RNA normal

la ausencia del gen la droga X confiere a la celulas resistencia a la droga

r

Figura 7-47 Inactivaci6n genica selectiva por recombinaci6n hom61oga en el rat6n. DNA c1onado de raton se modifica por ingenieria genetica de modo que se Ie inserta un gen bacteriano, denominado neo, que, tras integraci6n en un cromosoma de rat6n, confiere a las celulas la resistencia a una droga (droga X) que en caso contrario resultaria leta!. En un extremo del DNA c1onado de rat6n se afiade un gen virieo, el gen tk. La integraci6n de tk en un cromosoma de rat6n hace sensibles a las celulas a otra droga (droga Y). La mayor parte de las inserciones que tienen lugar en el cromosoma son a! azar, y casi siempre incluyen ambos extremos del DNA modificado (A). Si se seleccionan las celulas, poco frecuentes, capaces de crecer en presencia de ambas drogas, se obtendnin colonias de celulas en las que se ha incorporado, por recombinaci6n hom610ga, el centro del DNA modificado sin los extremos; muchas de estas celulas mostranin un reemplazamiento genico similar al mostrado en (B).

LA CELULA SOBREVIVE

se regulan los genes de mamifero y como ciertos genes (denominados oncogenes) producen cancer. Tambien es posible producir moscas del vinagre transgenicas, en las que copias tinicas de un gen se han insertado al azar en el genoma de Drosophila. En este caso la estrategia consiste en insertar primero el fragmento de DNA entre las dos secuencias terminales de un elemento transponible particular de Drosophila, denominado elemento P. Las secuencias terminales del elemento P Ie permiten integrarse en los cromosomas de Drosophila si la enzima transposasa del elemento P tambien se halla presente (vease pag. 305). Por 10 tanto, para hacer moscas del vinagre transgenicas, el DNA adecuadamente modificado se inyecta en un embrion muy joven de la mosca del vinagre con un plasmido que contenga el gen que codifica la transposasa. Normalmente, cuando se hace esto y como resultado del proceso de transposicion, el gen inyectado entra en la linea germinal en forma de una copia tinica (Figuras 7-45 Y7-46).

cerebro medio

cerebelo

El direccionamiento genico hace posible obtener ratones transgenicos que carecen de determinados genes38 Si se introduce una molecula de DNA que contiene un gen de raton mutado en una celula de raton, frecuentemente se inserta al azar en el cromosoma, pero una vez de cada mil, reemplazara una de las dos copias del gen normal por recombinacion homologa. Aprovechando estos fenomenos infrecuentes "de direccionamiento genico" (gene targeting) es posible inactivar cualquier gen en una celula de raton por reemplazamiento genico. Este metodo se completa con el proceso en dos etapas que se describe a continuacion, permitiendo la obtencion de un raton con un gen defectuoso. En primer lugar, el fragmento de DNA que contiene el gen mutante deseado (0 parte del gen) se transfecta en una linea especial de celulas germinales pluriIngenierfa de DNA

Figura 7-48 Rat6n transgenico en que se han ellminado, por recombinaci6n hom61oga, ambas copias de un gen del factor de crecimiento Wnt-l. CA) Secci6n de cerebro de un embrion normal. (B) Secci6n de cerebro de un embri6n mutante, que carece de cerebelo y de la mayor parte del cerebro medio, y morini in utero. (Fotografias cortesia de Mario CapecchL) 353

discos tomados de hoja de tabaco

-1lT-

discos de hoja incubados con Agrobacteria modificada por ingenieria genetica durante 24 h.

callos ~I medio selectivo s610 _ - - - - _ / ~ermite proliferar a las celulas vegetales que han adquirido el DNA de la bacteria

tallos

crecimiento de la plantula enraizada (A)

planta adulta que porta el transgen que estaba originalmente en la bacteria

citoplasma transgen de interes

gen marcador seleccionable

plasmido recombinante en Agrobacterium

~~~L~~!~~~~-! repeticiones de 25 pares de nucle6tidos del T-DNA

(8)

EL DNA SE EXTRAE DEL pLASMIDO EN FORMA LINEAL Y SE TRANSFIERE DIRECTAMENTE A LA CELULA VEGETAL. DONDE SE INTEGRARA EN EL CROMOSOMA VEGETAL

potentes derivadas del embrion (denominadas celulas madre embrionarias 0 celulas ES -de Embrionic Stem Cells), que crecen en cultivo celular. Tras un perfodo de proliferacion celular, las escasas colonias de celulas en las que se ha podido producir un reemplazamiento genico, se afslan mediante doble seleccion con drogas (Figura 7-47). De entre elIas se identifican las colonias correctas mediante PCR 0 transferencia Southern: contendnin secuencias de DNA recombinante en las que el fragmento insertado ha reemplazado todo 0 parte de una copia del gen normal. En la segunda etapa, celulas individuales de la colonia identificada se recogen con una micropipeta y se inyectan en un embrion temprano de rat6n. Las celulas madre embrionarias transfectadas colaboran con las celulas del embrion huesped para formar el rat6n de apariencia normal (vease Figura 2132); una gran parte de estos animales quimericos, induyendo en casos favorables celulas de la linea germinal, proceden de las celulas madre modificadas arti354

Capitulo 7 : Tecnologia del DNA recombinante

Figura 7-49 Procedimiento utilizado para obtener una planta transgenica. (A) Esquema del proceso. Se corta un disco de una hoja y se cultiva en presencia de Agrobacteria portadora de un phismido que contiene tanto un marcador seleccionable como el transgen deseado. Las celulas de la periferia del disco, heridas, secretan substancias que atraen Agrobacteria,la cualles inyecta el DNA. S610 sobreviven aquellas celulas que expresan el marcador selectivo, es decir aquellas que han recibido el DNA adecuado, y formanin un callo. Manipulando los factores de crecimiento que recibe el callo se puede inducir la formaci6n de tallos que enraizaran y se desarrollaran dando lugar a una planta adulta portadora del transgen. (B) Preparaci6n del plasmido recombinante y su transferencia ala celula de la planta. Un plasmido de Agrobacterium, portador de la secuencia de T-DNA se modifica para incluir un marcador seleccionable (por ejemplo, el gen de resistencia a kanamicina) y el transgen deseado, entre los 25 pares de bases repetidos del T-DNA CuandoAgrobacterium reconoce una celula vegetal, inyecta una cadena de DNA en el citoplasma de la celula utilizando el mecanismo que normalmente transfiere la secuencia de T-DNA.

ficialmente. Estos animales se cruzan para obtener machos y hembras, cada uno de los cuales son heterocigotos para el reemplazamiento genico (es decir, tienen una copia normal y una copia mutante del gen). Cuando se cruzan estos dos ratones, una cuarta parte de su descendencia debe ser homocigota respecto al gen modificado. El estudio de estos homocigotos permite examinar la funci6n del gen modificado en ausencia del gen normal. La capacidad de preparar ratones transgenicos que carecen de un gen normal conocido ha sido un gran avance, y actualmente esta tecnica se utiliza ampliamente para analizar las funciones de diversos genes de mamffero (Figura 7-48).

Las plantas transgenicas son importantes tanto para la biologia celular como para la agricultura39 Cuando una planta sufre un dafio en muchos casos puede reparar el dafio mediante un proceso por el cual celulas diferenciadas se "desdiferencian", proliferan y rediferencian en otros tipos celulares. En algunos casos las celulas desdiferenciadas pueden llegar a formar un meristemo apical, que puede generar una planta completamente nueva, incluyendo los gametos. Esta notable plasticidad de las celulas vegetales puede ser utilizada para generar plantas transgenicas a partir de celulas cultivadas. Cuando se cultiva un trozo de tejido de una planta en un medio esteril que contiene nutrientes y factores de crecimiento adecuados, muchas de las celulas son estimuladas a crecer indefinidamente de una forma desorganizada, produciendo una masa de celulas relativamente indiferenciadas denominada callo. Si se manipulan adecuadamente los nutrientes y los reguladores del crecimiento, es posible inducir la formaci6n de meristemos apicales y radiculares en el callo, pudiendo, en muchas especies, regenerar la planta completa. Los cultivos de callos se pueden disociar tambien mecanicamente en celulas aisladas, que creceran y se dividiran como un cultivo en suspensi6n. En un gran mimero de plantas -entre las que se incluyen el tabaco, la petunia, la zanahoria, la patata y Arabidopsis- a partir de celulas aisladas se pueden obtener pequefios grupos de celulas (un clon), a partir de los cuales se puede regenerar una planta completa. Del mismo modo que se puede obtener un rat6n transgenico por manipulaci6n genetica de celulas embrionarias en cultivo, pueden obtenerse plantas transgenicas a partir de celulas vegetales aisladas cultivadas, transfectadas con DNA (Figura 7-49). La capacidad de producir plantas transgenicas ha acelerado el progreso en muchas areas de la biologfa celular vegetal. Ha jugado un papel importante, por ejemplo, en el aislamiento de receptores para los reguladores del crecimiento y en el analisis de los mecanismos de morfogenesis y de expresi6n genica en plantas. Ha abierto nuevas posibilidades en agricultura que pueden beneficiar tanto al agricultor como al consumidor. Ha hecho posible, por ejemplo, modificar el contenido de lfpidos, almid6n y protefnas de reserva almacenadas en las semilias, aumentar la resistencia de las plantas a plagas y virus, y crear plantas modificadas que toleran habitats extremos como margenes de concentraci6n de sal 0 suelos encharcados. La mayor parte de los avances en la comprensi6n del desarrollo animal procede de estudios sobre la mosca del vinagre Drosophila y del nematodo Caenorhabditis elegans, que son abordables para el analisis genetico extensivo asf como para la manipulaci6n experimental. Los progresos en la biologia del desarrollo de las plantas han sido mucho mas lentos comparativamente. La mayor parte de los organismos que se han encontrado mas adecuados para el analisis genetico tienen ciclos vitales largos y genomas enormes, 10 cual ha hecho de su estudio genetico clasico y molecular una labor que requiere mucho tiempo y esfuerzo. Por ella se ha dedicado especial atenci6n a una planta pequefia de crecimiento rapido, Arabidopsis thaliana, que tiene grandes ventajas para ser escogida como "planta modelo" (vease Figura 21-93). Ingenierfa de DNA

355

Resumen La tecnologfa del DNA recombinante ha revolucionado el estudio de la celula. Las tecnicas de ingenieria del DNA pueden utilizarse para crear cualquier gen mutante e insertarlo en el cromosoma de las celulas, de forma que pase a ser una parte permanente del genoma. Si la celula utilizada para esta transferencia de genes es un huevo fecundado (para un animal) 0 una celula vegetal totipotente en cultivo, se obtendrdn organismos transgenicos que expresardn el gen mutante y 10 pasardn a su progenie. Es especialmente importante para el bi6logo celular la posibilidad que proporciona esta tecnologfa de alterar celulas de manera espectjica -permitiendo discernir el efecto que tiene sobre una celula el cambio de una sola protefna que ha sido mutada intencionadamente por tecnicas de "genetica inversa". Las consecuencias prdcticas de la tecnologfa del DNA recombinante tambien abarcan otras posibilidades. Se pueden utilizar las bacterias, las levaduras 0 incluso celulas de mamifero para, mediante ingenierfa genetica, producir una protefna en grandes cantidades, 10 cual hace posible analizar en detalle la estructura y la funci6n de esta protefna, 0 utilizar la protefna como una vacuna 0 como un fdrmaco con jinalidad medica.

Bibliograffa Citas 1. Sambrook, J.; Fritsh, E.F.; Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Watson, J.D.; Tooze, J. The DNA Story: A Documentary History of Gene Cloning. New York: W.H. Freeman, 1981. Watson, J.D.; Tooze, J.; Kurtz, D.T. Recombinant DNA: A Short Course. New York: W.H. Freeman, 1983. 2. Kessler, c.; Manta, V. Specificity of restriction endonucleases and DNA modification methyltransferases-a review (Edition 3). Gene 92:1-248,1990. 3. Danna, K.J. Determination of fragment order through partial digests and multiple enzyme digests. Methods Enzymol. 65:449-467, 1980. Nathans, D.; Smith, H.O. Restriction endonucleases in the analysis and restructuring of DNA molecules. Annu. Rev. Biochern. 44:273-293, 1975. 4. Andrews, AT. Electrophoresis, 2nd ed. Oxford, UK: Clarendon Press, 1986. Evans, G.A. Physical mapping of the human genome by pulsed field gel analysis. Curro Opin. Genet. Dev. 1:7581, 1991. Southern, E.M. Gel electrophoresis of restriction fragments. Methods Enzymol. 68:152-176,1979. 5. Lehman, LR DNA polymerase I of Escherichia coli. In The Enzymes, Vol. 14A (P.D. Boyer, ed.), pp. 16-38. New York: Academic Press, 1981. Richardson, C.c. Polynucleotide kinase from Escherichia coli infected with bacteriophage T4. Nucleic Acids Res. 2:815, 1971. Rigby, P.W.; Dieckmann, M.; Rhodes, c.; Berg, P. Labeling deoxyribonucleic acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase L ]. Mol. Bioi. 113:237-251,1977. 6. Griffin, H.G.; Griffin, AM. DNA sequencing. Recent innovations and future trends. Appl. Biochern. Biotech. 38:147-159,1993.

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Capitulo 7 : Tecnologia del DNA recombinante

Maxam, AM.; Gilbert, W. A new method for sequencing DNA Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560-564,1977. Maxam, AM.; Gilbert, W. Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages. Methods Enzyrnol. 65:499-560, 1980. Prober, J.M.; Trainor, G.; Dam, R; et al. A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain terminating dideoxynucleotides. Science 238:336-341, 1987. Sanger, F.; Nicklen, S.; Coulson, AR DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467, 1977. 7. Cartwright, LL.; Kelly, S.E. Probing the nature of chromosomal DNA-protein contacts by in vivo footprinting. Biotechniques 11:188-203,1991. Galas, D.J.; Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 5:3157-3170, 1978. Tullius, T.D. Physical studies of protein-DNA complexes by footprinting. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chern. 18:213-237, 1989. 8. Schildkraut, c.L.; Marmur, J.; Doty, P. The formation of hybrid DNA molecules and their use in studies of DNA homologies.]. Mol. Biol. 3:595-617, 1961. Wetmur, J.G. Hybridization and renaturation kinetics of nucleic acids. Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 5:337-361, 1976. Wetmur, J.G. DNA probes: applications ofthe principles of nucleic acid hybridization. Critical Review in Biochern. Mol. BioI. 26:227-259, 1991. 9. Berk, AJ.; Sharp, P.A. Sizing and mapping of early adenovirus mRNAs by gel electrophoresis of SI endonuclease digested hybrids. Cell 12:721-732, 1977. Gerhard, D.S.; Kawasaki, E.S.; Bancroft, F.C.; Szabo, P. Localization of a unique gene by direct hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3755-3759, 1981. Pardue, M.L.; Gall, J.G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 64:600-604, 1969. Wallace, RB.; Shaffer, J.; Murphy, RF.; et al. Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to X174 DNA: the effect of a single base pair mismatch. NucleicAcids Res. 6:3543-3557, 1979.

10. Alwine, J.C.; Kemp, D.J.; Stark, G.R Method for delection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diabenzylozymethyl-paper and hybridization with DNA probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5350-5354,1977. Southern, E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. BioI. 98:503-517,1975. Thomas, P.S. Hybridization of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitrocellulose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201-5205, 1980. 11. Chang, C.; Meyerowitz, E.M. Plant genome studies: restriction fragment length polymorphism and chromosome mapping information. Curro Opin. Genet. Dev. 1:112-118, 1991. Kidd, K.K. Progress towards completing the human linkage map. Curro Opin. Genet. Dev. 1:99-104,1991. Pourzand, C.; Cerutti, P. Genotypic mutation analysis byRFLP/PCR Mutat. Res. 288:113-121,1993. 12. Gilbert, F.; Marinduque, B. DNA prenatal diagnosis. Curro Opin. Obstet. Gynecol. 2:226-235,1990. Lathe, R Synthetic oligonucleotide probes deduced from amino acid sequence data. Theoretical and practical considerations.]. Mol. BioI. 183:1-12, 1985. 13. McGinnis, W.; Garber, RL.; Wirz, J.; et al. A homologous protein-coding sequence in Drosophila homeotic genes and its conservation in other metazoans. Cell 37:403-408, 1984. 14. Stephenson, E.C.; Pokrywka, N.J. Localizatino of bicoid message during Drosophila oogenesis. Curro Top. Dev. BioI. 26:23-34,1992. Trask, B.J. Gene mapping by in situ hybridization. Curro Opin. Genet. Dev. 1:82-87, 1991. 15. Ausubel, F.M.; Brent, R; Kingston, RE.; et al., eds. Curret Protocols in Molecular Biology. New York: Wiley, 1993. Drlica, K. Understanding DNA and Gene Cloning. New York: Wiley, 1984. 16. Cohen, S.N. The manipulation of genes. Sci. Am. 233(1):24-33, 1975. Foster, T.J. Plasmid-determined resistance to antimicrobial drugs and toxic metal ions in bacteria. MicrobioI. Rev. 47:361-409,1983. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.J. Mol. BioI. 166:557-580, 1983. Novick, RP. Plasmids. Sci. Am. 243(6):102-127,1980. 17. Lennon, G.G.; Lehrach, H. Hybridization analyses of arrayed cDNA libraries. Trends Genet. 7:314-317, 1991. Maniatis, T., et al. The isolation of structural genes from libraries of eucaryotic DNA. Cell 15:687-701, 1978. 18. Okayama, H.; Berg, P. High-efficiency cloning of fulllength cDNA. Mol. Cell BioI. 2:161-170, 1982. Southern, E.M. Genome mapping: cDNA approaches. Curro Opin. Genet. Dev. 2:412-416, 1992. 19. Calvet, J.P. Molecular approaches for analyzing differential gene expression: differential cDNA library construction and screening. Pediat. Nephrol. 5:751757,1991. Hedrick, S.M.; Cohen, D.l.; Nielsen, E.A.; Davis, M.M. Isolation of cDNA clones encoding T cell-specific membrane-associated proteins. Nature 308:149-153, 1984. 20. Yang, J.; Ye, J.; Wallace, D.C. Computer selection of oligonucleotide probes from amino acid sequences for use in gene library screening. Nucleic Acids Res. 12:837843,1984. Young, R.A.; Davis, RW. Efficient isolation of genes using antibody probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1194-1198,1983. Bibliografia

21. Hope, l.A.; Struhl, K. GCN4 protein, synthesized in vitro, binds HIS3 regulatory sequences: implications for general control of amino acid biosynthetic genes in yeast. Cell 43:177-188, 1985. Ricciardi, RP.; Miller, J.S.; Roberts, B.E. Purification and mapping of specific mRNAs by hybridization-selection and cell-free translation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4927-4931,1979. 22. Stubbs, L. Long-range walking techniques in positional cloning strategies. Mammalian Genome 3:127-142, 1992. 23. Burke, D.T. The role of yeast artificial chromosomes in generating genome maps. Curro Opin. Genet. Dev. 1:69-74,1991. Carrano, A.V.; de Jong, P.J.; Branscomb, E.; et al. Constructing chromosome- and region-specific cosmid maps of the human genome. Genome 31:1059-1065, 1989. Coulson, A.; Kozono, Y.; Lutterbach, B.; et al. YACs and the C. elegans genome. Bioessays 13:413-417, 1991. Hauge, B.M.; Hanley, S.; Giraudat, J.; et al. Mapping the Arabidopsis genome. Symp. Soc. Exper. BioI. 45:45-56, 1991. 24. Harris, A.; Argent, B.E. The cystic fibrosis gene and its product CFTR Semin. Cell BioI. 4:37-44, 1993. Hyser, C.L. Unraveling the mysteries of Duchenne and Becker muscular dystrophy. Mol. Chern. Neuropathol. 10:15-20,1989. Wicking, C.; Williamson, B. From linked marker to gene. Trends Genet. 7:288-293, 1991. 25. Allen, R.W.; Wallhermfechtel, M.; Miller, W.V. The application of restriction fragment length polymorphism mapping to parentage testing. Transfusion 30:552564,1990. Bottema, C.D.; Sommer, S.S. PCR amplification of specific alleles: rapid delection of known mutations and polymorphisms. Mutat. Res. 288:93-102,1993. Nelson, D.L. Appliations of polymerase chain reaction methods in genome mapping. Curro Opin. Genet. Dev. 1:62-68, 1991. Pourzand, C.; Cerutti, P. Genotypic mutation analysis by RFLP/PCR. Mutat. Res. 288:113-121,1993. Saiki; RK.; Gelfand, D.H.; Stoffel, S.; et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239:487-491,1988. 26. Olson, M.V. The human genome project. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4338-4344, 1993. Szostak, J.W. In vitro genetics. Trends Biochem. Sci. 17:89-93,1992. 27. Itakura, K.; Rossi, J.J.; Wallace, RB. Synthesis and use of synthetic oligonucleotides. Annu. Rev. Biochem. 53:323-356, 1984. 28. Melton, D.A.; Krie~, P.A.; Rebagliati, M.R; et al. Efficient in vitro syntheSIS of biologically active RNA and RNA hybridization probes from plasmids containing a bacteriophage SP6 promoter. Nucleic Acids Res. 12:7035-7056, 1984. 29. Abelson, J.; Butz, E., eds. Recombinant DNA. Science 209:1317-1438,1980. Balbas, P.; Bolivar, F. Desi~n and construction of expression plasmid vectors III E. coli. Methods Enzymol. 1985: 14-37, 1990. Gilbert, W.; Villa-Komaroff, L. Useful proteins from recombinant bacteria. Sci. Am. 242(4):74-94,1980. Mille, LX Baculoviruses: high-level expression in insect cells. Curro Opin. Genet. Dev. 3:97-101,1993. Rose, A.B.; Broach, J.R Propagation and expression of cloned genes in yeast: 2-micron circle-based vectors. Methods Enzymol. 185:234-279, 1990. 357

30. Alam, J.; Cook, J.L. Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription. Anal. Biochem. 188:245-254, 1990. Bellen, H,J.; Wilson, C.; Gehring, W,J. Dissecting the complexity of the nervous system by enhancer detection. Bioessays 12:199-204, 1990. 31. Jockusch, B.M.; Zurek, B.; Zahn, R; Westmeyer, A; Fuchtbauer, A Antibodies against vertebrate microfilament proteins in the analysis of cellular motility and adhesion.]. Cell Sci. S14:41-47, 1991. Lederberg, J.; Lederberg, E.M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. ]. Bacteriol. 63:399-406,1952. Nusslein-Volhard, c.; Weischaus, E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature 287:795-801, 1980. 32. Kaiser, K From gene to phenotype in Drosophila and other organisms. Bioessays 12:297-301,1990. Landel, C.P.; Chen, S.; Evans, G.A. Reverse genetics using transgenic mice. Annu. Rev. Physiol. 52:841-851, 1990. Provost, G.S.; Kretz, P.L.; Hamner, RT.; et al. Transgenic systems for in vitro mutation analysis. Mutat. Res. 288:133-149, 1993. 33. Baase, W.A.; Eriksson, AE.; Zhang, X,J.; et al. Dissection of protein structure and folding by directed mutagenesis. Faraday Discuss. 93: 173-181, 1992. Sharon, J.; Kao, C.Y.; Sompuram, S.R Oligonucleotidedirected mutagenesis of antibody combining sites. Int. Rev. Immunol. 10:113-127, 1993. 34. Garoff, H. Using recombinant DNA techniques to study protein targeting in the eucaryotic cell. Annu. Rev. Cell Biol. 1:403-445, 1985. Kelly, J.H.; Darlington, G,J. Hybrid genes: molecular approaches to tissue-specific gene regulation. Annu. Rev. Genet. 19:273-296, 1985.

358

Capitulo 7 : Tecno1ogia del DNA recombinante

35. Leclerc, D.; Brakier-Gingras, L. Study of the functic)ll of Escherichia coli ribosomal RNA through site-directed mutagenesis. Biochem. Cell BioI. 68:169-179, 1990. Scherer, S.; Davis, RW. Replacement of chromosome segments with altered DNA segments constructed in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4951-4955,1979. Struhl, K. The new yeast genetics. Nature 305:391-397, 1983. 36. Herskowitz, l. Functional inactivation of genes by dominant negative mutations. Nature 329:219-222, 1987. Weintraub, H.; lzant, J.G.; Harland, RM. Anti-sense RNA as a molecular tool for genetic analysis. Trends Genet. 1:22-25, 1985. 37. Boyd, A.L.; Samid, D. Review: molecular biology of transgenic animals.]. Anim. Sci. 71(S3):1-9, 1993. Palmiter, RD.; Brinster, RL. Germ line transformation of mice. Annu. Rev. Genet. 20:465-499, 1986. Rubin, G.M.; Sprading AC. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science 218:348-353, 1982. Smith, P.A.; Corces, V.G. Drosophila transposable elements: mecanisms of mutagenesis and interactions with the host genome. Adv. Genet. 29:229-300, 1991. 38. Babinet, c.; Morello, D.; Renard, J.P. Transgenic mice. Genome 31:938-949,1989. Gossen, J.; Vijg, Transgenic mice as model systems for studying gene mutations in vivo. Trends Genet. 9:2731,1993. Gridley, T. Insertional versus targeted mutagenesis in mice. New BioI. 3:1025-1034, 1991. 39. Davey, M.R; Rech, E.L.; Mulligan, B,J. Direct DNA transfer to plant cells. Plant Mol. BioI. 133:273-285, 1989. Walden, R; Schell, J. Technique in plant molecular biology-progress and problems. Eur. ]. Biochem. 192:563-576, 1990.

EI nueleo celular

8 ·ElDNA~ko,1U

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£1 DNA de una celula eucariota se halla confinado en el nlieleo, que ocupa alrededor del 10% del volumen celular. EI nudeo esta delimilado por una envo!tura flllclear (armada por dos membranas concentricas. Estas membranas estern perforadas a intervalos por poms nucleaTes. a traves de los cuaJes se produce el lransporte activo de determinadas molecuJas entre el nucleo y el choplasma. La envollura nuclear estc1. conectada directamente con la membrana del reticula endopl
La cromatina activa es bioqufmicamente diferente l5 tOUe diferencia la eromatina aetiva de la inactiva? La respuesta a esta pregunta requerira la purificaci6n y caracterizaci6n de las protefnas cromos6micas que son propias de cada una de elias, Se han realizado algunos avances hacia esa meta can el desarrollo de melOdos bioqufmicos disei'lados para aislar cromatina activa basandose en Sll estado relativamente descondensado. EI anaIisis de las proteinas eromos6micas de la fracci6n de cromatina activa sugiere 10 siguiente: (1) la histona Hl parece unirse COil menos fuerza a al menos algun tipo de eromatina activa; algunos subtipos particulares de esta histona podrfan estar representados preferentemenle. (2) Aunque en la cromatina activa las cuatro histonas nucleos6micos estan presenles en cantidades normales, parecen estar altarnente aeetiladas cuando se comparan con las mismas histonas de la cromatina inactiva. (3) La histona nucleos6mica H2B parece eSlar menos fosforilada en la cromatina inactiva, (4) La cromatina activa esta muy enriquecida en una forma v~iante menor de la hislona H2A que se encuentra en muchas especies, incluida Drosophila y el hombre. (5) Los nudeosomas de la cromalina activa se unen seleetivamente ados pequei'las proteinas cromos6micas similares, denominadas HMG 14 YHMG 17, De'acuerdo con su presencia exdllsivamente en la cromatina activa estas proteinas del "grupo de elevada movilidad" (HMG, de High-Mobility-Group) se encuentran en cantidad suficiente para unirse a I de cada 10 nucleosomas de la cromatina total; ademas, su secuencia de aminoacidos ha side muy conservada durante la evoluci6n, 10 que implica que cumplen funciones imponantes,

Figura 8-26 La heterocromatlna es lnactlva transcripclonalmente.

envottura nuclear

helerocromat,na perifllrica

La estructura global de los cromosomas

Autorradiograffa de una seccion ultrafina de un nucleo celular de una ceJula que ha sido marcada can un pulso de uridina- 3 H para marcar los lugares donde se produce la sfntesis del RNA (granos de plata), Las areas bu:mcas son regiones de heterocromalina, que tiende a empaquelarse en la region interior de la envoltura nuclear. NormaJmente la heterocromalina suele lefiirse de oscuro en las eleclronmicrograf(as (por ejemplo, vease Figura 8-71), pero debido aJ metoda especial de preparacion de eSla muestra han quedado de color claro. Como se puede observar, Ja mayor pan.e de la sfntesis de RNA tiene lugar en la eucromatina que rodea las areas de heterocromalina. (Por cortesfa de Stan Fakan.) 377

Todos 0 alguno de estos cam bios podrian jugar un papel importante en el desempaquetamiento de la eromatina de los genes activos, contribuyendo a haeer el DNA aeeesible como molde para la sfntesis de RNA; sin embargo son neeesarios mas resultados experimentales para poder eomprobar esta idea. En el Capitulo 9 se exponen los mecanismos que pueden controlar la transici6n entre eromatina aetiva e inacriva.

CTomosoms i

j

ceotr6mefo

La heterocromatina esta muy condensada yes transcripcionalmente inactiva l6 Los estudios realizados en los alios 30 con microcopia 6plica diferenciaron entre dos tipos de cromatina en el mlcleo inlerfasieo: una forma altamente eondensada denominada hererocromatina y todo el reSlO, que esta menos eondensada, denominada eucromatlna. La heteroeromatina fue identificada originalmente porque perrnaneee extraordinariamente compaetada durante la interfase; posteriormente se encontr6 que era transcripcionalmente inacriva (Figura 8-26). En una celula tipica en interfase, aproximadamente el 10% del genoma se encuentra empaquetado en heterocromatina. Aetualmente parece claro, por 10 que se ha descrito anteriormente, que la eucromatina existe al menos bajo dos formas: alrededor del 10% esta en la forma de cromatina activa, que es la menos condensada, mientras el resto es eucromatina inactiva, que esta mas condensada que la eucromatina activa pero menos que la heterocromatina. Asf pues se cree que la heterocromatina podrfa ser una clase especial de cromatina inactiva en transcripci6n que podrfa tener otras funciones. Par ejemplo, en mamfferos y en muchos otros eucariotas superiores el DNA que rodea a cada centr6mero esta formado por secuencias de nucle6tidos simples y repetidas. Este DNA satelite constituye la mayor parte de la heteroeromatina en dichos organismos.

'--'

CTom,l.,tids

Figura 8·27 DlbuJo de un cromosoma metafli.slco tiplco. Cada crOlmitida hija conliene una de las dos molcculas hijas idCllIicas de DNA que se han generado previamente en el ciclo cclular por la replicaci6n del DNA.

Los cromosomas mit6ticos estan formados por cromatina en su forma mas condensada 17 Con excepci6n de unos cuantos casos muy especializados, como son los cromosomas plumulados y politenicos descritos anteriormente, la mayor parte de los cromosomas en interfase estan demasiado extendidos, son tan delgados, yestan tan entremezclados que no son deteetables. Por el comrario, los cromosomas de casi todas las eelulas son perfectamente visibles durante la mitosis, cuando se empaquetan formando unas estructuras mucho mas condensadas. Este empaquetamiento, que reduce una longitud de DNA de 0,5 cm a alrededor de 5 11m, haec posible que el huso mit6tico segregue los cromosomas en las celulas hijas sin romperlos. Esta condensaci6n esta acompafiada de la fosforilaci6n de todas las histonas HI de la celula en cinco de sus residuos de serina. Debido a que la histona HI colabora en el empaquetamiento de los nucleosomas (vease Figura 8·15), parece probable que su fosforilaci6n desempeile un papel causal en la eondensaci6n de los cromosomas. La Figura 8-27 muestra un cromosoma mJt6tico tfpico durante la memfase mit6tiea. Las dos moleculas de DNA hijas producidas par replieaci6n del DNA durante la fase S del cicio de divisi6n celular, estan plegadas por separado, formando dos cromosomas hermanos (den om in ados cromdtidas hermallas) mantenidos juntos POt sus centr6meros. Normalmente, estos cromosomas mit6ticos estan cubiettos por diversas moleculas, entre las que se cuentan grandes camidades de tibonucleoprotefnas. Una vez eliminada est a envoltura, en las electronmicrograffas se puede observar que cada cromatida esta organizada en bucles de ctomatina que proceden de un eje central (Figuras 8-28 y 8-29). Algunos experimentos demuestran que el orden en que aparecen detetminadas ca· racterfs(ieas visibles de un eromosoma mit6tico representa, aproximadamente, el arden de los genes a 10 largo de la molecula de DNA. Para ilustrar el modo .tan organizado como se pliega y empaqueta la larga helice de DNA, en la Figura 8-30 se ha reptesenrado cada cromAlida como una serie de dominios en bucle 378

Capftulo 8: EI m1c1co celular

'--'

0.1

~m

Figura 8-28 Electronmlcrograf!a de barrldo de una regl6n cereana a un extremo de un cromosoma m1t6tico t(plco. Se cree que cada protuberancia representa la parte superior de un dominio en forma de bude. Es de destacar que es posible diferenciar c1arameilte las dos cronuhidas hermanas tal como se han representado en la Figura 8-27. (De M.P. Marsden y U.K. Laemmli. Cell 17: 849-858.1979, © Cell Press.)

Figura 8-29 Electronmicrograffa de una sola cromatida de un cromosoma mltotlco. EI cromosoma (de un insecto) fue tralado para revelar los bucles de fibras cromat!nicas que proceden de un eje central de la cromatida. Estas micrograffas apoyan la idea de que en todos los cromosomas la cromatina esta doblada en series de dominios en forma de bucle (vease Figura 8-18). (Por cortesfa de Victoria Foe.)

Tnm

fregmento cono de une doble h6lice de DNA

'1.

T 1

11 nm

crometine en te forma de 'cadene de cuentes' 0 'cuentn ensartadas·

Figura 8-30 Modelo del empaquetamlento de la cromatlna. I1uslracion esquematica de algunos de los muchos grados de empaquelamiento de la cromalina que se han poslulado para explicar el allo grado de empaquelamiento del cromosoma metafasico.

T

nucleosomes compeetedos en lorma de fibre de crometine de 30 nm

30 nm

secc,6n del cromosome en una forme eKtllnd,de

T

""om

1

§_

_~o~od~••>=== burbuje de replicacl6n

burbuja de replicaci6n

marcaje, se deduce que la horquilla de replicaci6n se desplaza a unos 50 nuc1e6tidos por segundo. ESla velocidad es una decima parte de la velocidad estimada de dcsplazamicnto de la horquilla de replicaci6n en bacterias, 10 cual probablemente refleja 1a dificultad que supone replicar el DNA estrechamente empaquelado en 1a cromatina. . Tal como se ha comentado anteriormente, se cree que un cromosoma humana de tamaf\.o media esta farmado por una molecula de DNA de unos 150 millones de pares de nucle6tidos. La replicaci6n de una mohkula de este tamano a partir de una horquilla de repHcaci6n que se desplazara a una velocidad de 50 nucle6tidos por segundo, requerirfa 0,02 x 150 x l()& =3 x 106 segundos (alrededor de 800 horas). Como se esperaba, los experimentos antes descrilos revelaron que en cada eromosoma eucariota en replieaci6n aetuan numerosas horquillas de replicaci6n que se desplazan simultaneamente. Mas aun, exislen regiones del cromosoma que presentan numerosas horquillas de replieaci6n muy juntas, mienlras que otras regiones del mismo eromosoma no presenta ninguna. Qtros experimentos posteriores han demOSlrado 10 siguiente: (1) los orfgenes de replicaci6n tienden a ser activados en grupos de enlre 20 y 80 unidades (denominados unidades de replicaci6n). (2) A 10 largo de la fase S se van activando nuevas unidades de replieaci6n hasla que todo el DNA esta replieado; (3) Dentro de una unidad de replieaci6n, los orfgenes de replicaci6n estan espaciados a intelValos de entre 30 000 Y 300 000 pares de nucle6tidos; posiblemente exista un unieo origen de replieaci6n par bucle de la cromatina. (4) Como oeurre en las baeterias, las horquillas de replicaci6n se forman por parejas y se desplazan en sentidos opuestos desde un punto de origen comun dando lugar a una burbuja de replicaci6n; dichas horquillas se detienen s610 euando se eneuentran con otra burbuja de replieaci6n en erecimiento 0 cuando alcanzan un extremo del eromosoma. De esta manera muehas horquillas de replieaci6n pueden actuar de fonna independiente sobre cada eromosoma y formar de este modo dos helices hermanas completas de DNA (vease Figura 8-36).

Figura 8-36 Los expcrlmentos que demostraron el patr6n de desplazamlento de las horqulllas de repllcacl6n durante la rase s. El DNA de nueva sfntesis en las celulas humanas en cultivo se marc6 brevemente COil un pulso de timidina tritiada (timidina-lH) de elevada actividad especffica. En eJ experimento que se iJustra en (Al Jas celulas se lisaron y el DNA se extendi6 sobre un portaobjelos de vidria que fue recubierto por una emuJsi6n ratognl.fica. Tras algunos meses de exposici6n se reve16la emulsi6n, y apareci6 una \fnea de granos de plata sobre el DNA radiactivo. E1 experimento en (B) es igual que el de A pero despues del nlarcaje las celulas se incubaron en un media libre de radiactividad, con 10 cual el DNA sintetizado qued6 mareado menos intensamente. Se observ6 que las parejas de trazas oseuras en (B) presentaban regiones de mellor marcaje en direcciones opuestas, demostrando eJ desplazamiellto bidireccional de Ja horquilta de replicaci6n a partir de un origen de replicaci6n comun (vease Figura 6-51). En esta figura se presenta el DNA coloreado en raja unicamenle como una ayuda para la interpretaci6n del autorrad.iograma; el DNA no marcado no es visible en estos experimentos. Se cree que una horquill!l de repJicaci6n s610 se detiene cuando encuentra oITa horquil1a desplazandose en direcci6n opuesta 0 cuando alcanza el extrema de un cromosoma; de esta forma se replica la totalidad del DNA.

Regiones distintas del mismo cromosoma se replican en diferente momento2.2 La replicaci6n del DNA en la regi6n situada entre dos orfgenes de replicaci6n,

requiere tan s610 a1rededor de 1 hora para completarse, segun las estimas realizadas de las mayores distancias conoeidas entre orfgenes de replicaci6n y la velocidad de desplazamiento de la horquilla de replicaci6n. Sin embargo, en las cclulas de mamffero la rase S dura alrededor de 8 horas. Esto implica que no todos los orfgenes de replicaci6n son activados simuhaneamente Y.que cada unidad de replicaci6n (que contiene un grupo de entre 20 y 80 orfgenes de replicaci6n) este replicando s610 dmante una pequena parte de la fase S.

Repllcacl6n del cromosoma

385

iExiste una activaci6n al azar de las diferentcs unidades de replicaci6n, 0 bien existe un orden definido de replicaci6n de las diferentes regiones del genorna? Un experimento que puede responder a esta pregunta consiste en el marcaje de poblaciones celulares sincronizadas, con el analogo de la timidina bromodesoxiuridina (BrdU), durallle diferentes perfodos de tiempo a 10 largo de la fase S. Posteriormente, en la fase M, se pueden reconocer las regiones del cromosorna rnit6tico que han incorporado BrdU en su DNA gracias a su distintas propiedades de tinci6n, 0 mediante el uso de anticuerpos anti-BrdU. Los resultados muestran que diferentes regiones de cada cromosoma se replican en un orden reproducible dtuante la fase S (Figura 8-37). Ademas, como era de esperar a partir de la observaci6n de grupos de horquillas de replicaci6n visualizados por autorradiograffa, el momento en que se realiza la replicaci6n est a coordinado en grandes regiones de cromosoma.

La cromatina muy condensada se replica tardfamente en la fase 5, mientras que la cromatina activa se replica tempran0 23 Parece que el orden en que se activan los orfgenes de replicaci6n depende, aI menos en parte, de la estructura de la cromatina en la que se encuentren. Se describi6, por ejemplo, que durante la interfase la heterocromatina permanece en una conformaci6n fiUy condensada (similar a la cromatina mit6tica), mientras que la cromatina activa adquiere una conformaci6n descondensada que probablemente es necesaria para permitir la sfntesis de RNA. La heterocromatina se replica muy tardfamente en la fase S, sugiriendo que el orden de replicaci6n esta relacionado con el empaquetamiento del DNA en la cromatina. Esta sugerencia esta de acuerdo con el orden en que se replican los dos cromosomas X en una celula de hernbra de mamffero. A pesar de que ambos cromosomas contienen esencialmente las rnismas secuencias de DNA, unicamente uno de ellos es activo transcripcionalmente mientras que el otro no 10 es (se discute en el Capftulo 9). Casi todo el crornosorna X inactivo se encuentra condensado en heterocromatina y su DNA se replica tardfamente al final de la fase S, mientras que su horn610go activo esta menos condensado y se replica a 10 largo de toda la fase S. Estos hechos apoyan la hip6tesis de que las regiones del genorna cuya cromatina esta menos condensada durante la interfase, y por ello son mas accesibles a la maquinaria de replicaci6n, se replican primero. Experimentos de autorradiograffa muestran que las horquillas de replicaci6n se desplazan a velocidades similares a 10 largo de toda la fase S, de forma que el grado de condensaci6n de la cromatina afectarfa a1 tiempo de iniciaci6n de las horquillas de replicaci6n pero no a su velocidad una vez formadas. La relaci6n que se ha sugerido entre la estructura de la cromatina y el momento en el que se produce la replicaci6n del DNA se apoya asimismo en estudios en los que se ha medido el momento en el que se replican determinados genes. Los resultados muestran que en todas las celulas estudiadas, los genes constitutivos, que estan siempre activos, se replican muy temprano ell la fase S en todas las celulas estudiadas. Por el contra rio, los genes que s610 son activos en unos cuantos tipos celulares generalmente se replican temprano en la fase S en las celulas en que son activos y mas tarde en las que son inactivos.

Las unidades de replicaci6n tardfas coinciden con las bandas ricas en A-Ten los cromosomas metafasicos24 Parece que muchas de las unidades de replicaci6n corresponden a distintas bandas cromos6micas que se hacen visibles mediante varios procesos de fijaci6n y tinci6n usados para obtener los cariotipos. Como se ha dcscrito previamente, en el complemento haploide de cromosomas de una celula de mamffero, durante las primeras fases de la mitosis se pueden distinguir unas 2000 bandas oscuras, las bandas dcas en A- T (bandas G), separadas por un tlumero igual de bandas claras ricas en G-C (bandas R). Es curiosa que las bandas ricas en A-T Y 386

Capftulo 8: EI nucJeo celular

Figura 8-37 D1ferentes reglones de un cromosoma se replican en dlferentes momentos de la fase S. Estas micrografias, obtenidas con el microscopiu optico, muestTan cromosomas mitoticos tenidos en los que se ha marcado de forma diferendaJ eJ DNA en replicad6n durante intervalos definidos de la fase S. En estos experimenlOs, las celulas se hicieron crecer en presencia de BrrlU (un amilogo de limidina) yen allsencia de timidina para marcar el DNA unifonnemente. Desplles las celulas fueron expueslas a pulsos breves de timidina en ausenda de BrdU durante la fase S temprana, media 0 tardia. Dado que el DNA sintetizado durante el pulso con timid ina es DNA de doble helice con timidina en una cadena y BrdU en la otTa, se tine mas intensamente que el otro DNA (que contiene BrdU en las dos cadenas) yse visualiza como bandas brillantes fjlechas) en estos negativos. Las lfneas discontinuas conectan posidones similares de las tres copias del cromosoma mostrado. (Por cones(a de Elton Stubblefield.)

las bandas ricas en G-C se repliquen en diferentes momenlOs de la fase S. ExperimenlOS como el descrito en la Figura 8-37 sugieren que la mayor parte de las bandas ricas en G-C se rcplican durante la primera mitad de la fase S mientras que la mayor parte de las bandas ficas en A-T 10 hacen en la segunda mit ad de la rase S. Se ha sugerido que los genes de expresi6n conSlitutiva se encuentran localizados fundamentalmente en las bandas ricas en G-C. mientras que los genes de expresi6n especffica de lipo celular -Ia gran mayorfa de los cualcs ser~11 inaclivos en muchas c~luJas- estan situados en las bandas ficas en A-T. Como se coment6 previamente. actualmente consriruye un complelo misterio por qu~ el genoma de los mamfferos ha de estar segregado en eslOS grandes bloques aJ· lemos de cromalina -muchos de eUos de un tamano similar a un genoma baCleriano. Tambi~n se desconoce cuantos de los orfgenes de replicaci6n presentes en una unidad de repJicaei6n se aclivan aJ mismo tiempo. Un posibilidad es que la eromatina de las unidades de replicaei6n tardfas permanezca condensada aun despu~ del final de la rase M, y 5610 se descondense en la segunda milad de la fase S. permitiendo 5610 enronees el aceeso simuJtaneo a todos sus orfgenes de replicaci6n. En este caso, la replicaci6n "todo 0 nada- del DNA de una unidad de replicaci6n podrfa ser el reflejo de la descondensaci6n en bloque de grandes dominios de cromatina.

EI patr6n ordenado de activaci6n de los orfgenes de replicaci6n puede contribuir a la memoria de la c~luJa25 En huevos en divisi6n de muchas especies. ell los cuaJes se encucnlran almaeenadas grandes cantidades de los componentes dc la eromalina (como las hisro· nas) que se precisan para fabricar un nuevo nudeo, la fase S es ex(remadamente breve. Como se i1uslra en la Figura 8-38, una corta fase S implica el usa de un numero excepcionalmente grande de orfgenes de replicaci6n espaciados a intervaJos de s610 unos euantos miles de pares de nucle6tidos (a diferencia de las decenas 0 centenares de miles de pares de nucle6tidos que separan los orfgenes de replicaci6n durante el desarrollo mas tardfo). EI hecho de que cuaJquier DNA ex(fano introducido en el interior de un huevo de rana feeundado se replique, parece indiear que posiblemente en ese modelo eelular no se requiera una sceuencia especffiea de DNA para formac un origen de replicaei6n. Asf pues, la replicaci6n del DNA puede considerarse como un proceso potencialmente muy n1pido que en algunas c~luJas esta sujelo a un complejo sistema de regulaci6n que reslringe la iniciaci6n de las horquillas de replicaci6n, de modo que diferentes regiones del genoma se replican en diferentes mOtnenlos. Se ha sugerido, por ejemplo, que la eromatina que se replica temprano se ensambla en parte can una serie de protefnas eromos6micas especiales que se han producido durante la fase GI' de modo que euando una regi6n cromos6mica se ha deseondensado formando cromatina act iva, su ceplicaci6n temprana haec que reclute prolefnas que Ie ayudaran a mantener su estado descondensado de una generaci6n a la siguieote. Desde este punta de vista, el momento en que se produce la replicaci6n del DNA eontribuiria al proeeso de la memoria celular que faci.lita la transcripci6n continua de los genes expresados.

,

Figura 8·38 En nucleos embrionarios en divisl6n nliplda actoan un gran nomero de orlgenes de repUcackSn. En estas elccLronmicrograHas de cromalina descondensada de un embri6n lemprano de Drosophila, se observa que las burbujas de replicaci6n (flechas) eslm muy pr6ximas. En eSle embri6n los perfodos entre algunas divisiones nucleares sucesivas son de unos 10 minulos. Debido a que los orfgenes de replicackSn ulilizados son muy proldmos (distan 5610 unos cuantos miles de nucle6tidos), 5610 se requiere alrededor de un minuto para replicar el DNA exhllell1e entre ellos. (Por conesfa de Victoria Foe.) RepUcacl6n del cromosoma

387

Factores unidos a la cromatina aseguran que cada regi6n del DNA s610 se replique una vez 26 En una fase S normal, cl genoma se ha de replicar completo y una sola vcz. Tal como se ha descrito previamente, en muchas celulas eucariolas el proceso de replicaci6n del DNA es asincr6nico y puede durar baslante tiempo. Debido a que los origenes de replicaci6n se activan en diferentes momentos en diferenles regiones del cromosoma, hacia la pane media y final de la fase S, algunos ya han sido replicados completamente mienU"as otros aun no han empezado a hacerlo. Asf pues se plantea un imponante problema de "regisrro~ durante las etapas media y final de la fase S. Aquellos orfgenes de replicaci6n ya utilizados se han duplicado, y son, aI menos respecto a sus secuencias de DNA, esencialmente iguales a los que aun no se han activado. Sin embargo, en cada fase S cada origen de replicaci6n debe ser utilizado una sola vez. iC6mo se puede controlar eSle proceso? Algunos experimentos de fusi6n celular han aponado importantes c1aves para la comprensi6n del problema. Cuando se fusionan celulas en fase S con celulas en fase G.. se induce la sfntesis de D A en el ntlcleo de las celulas en fase G,tlo cual sugiere que la transici6n de fase GI as est'ii mediada par un activador de la sfnlesis de DNA, que difunde. Por el comrario, cuando las celulas en fase S se fusionan con cl!lulas en fase G2 (es decir, celulas que acaban de complelar la fase S), en el ntlcleo G2 no se induce la s(ntesis de DNA. Dado que la sfntesis de DNA contintla inalterada en el ntlcleo en fase S, implica que el ntlcleo en G2 es incapaz de iniciar nuevos procesos de replicaci6n porque todo su DNA se encuenlra bloqueado de alguna forma. Por ejemplo, un inhibidor Que no difunde de la replicaci6n puede haberse unido fuertemente aI DNA. Un inhibidor de escas caracterfsticas que se uniera a la cromatina recien formada en In cola de las horquillas de replicaci6n podrfa explicar el hecho de que el DNA replicado una vez no volviera a hacerlo dentro de la misma fase S (vease Figura 8-39A). Otra alternativa igualmente plausible consistirfa en la existencia de unas proteinas iniciadoras 0 "factores permisivos~, unidas debilmente at DNA, que serran necesarias para la replicaci6n y que se destruirfan 0 inactivarfan por el paso de la horquilla de replicaci6n (1;igura 8-39B). Sea cual sea la naturaleza del bloqueo de la re-replicaci6n del DNA, ha de ser eliminado en el momento de la mitosis (0 un poco antes), ya que {ras la divisi6n celular, el DNA del ntlcleo G1 que aparece en las celulas hijas ya no estti protegido de la replicaci6n. Se ha padido observar que los fragmentos de DNA bacteriano que se replican cuando se inyectan en un huevo fertilizado de rana pueden quedar 3fecta-

IAI

Figura 8-39 Dos mecanlsmos que lie han propuesto para expUcar el bloqueo de la re-repllcacI6n. Esle bloqueo, que protege aI DNA repl.icado de una poSierior replicaci6n en el mismo cicio celular, es crucial para marcar las zonas ya replicadas, pero se desconoce su nalUraleza molecular. Normalmente, el bloqueo lermina durante la mitosis, aunque en algunos lipos celulares especializados (las cl'!lulas salivares gigantes de Drosophila. por ejemplo) se elimina el bloqueo sin necesidad de milosis, hacienda posible la formaci6n de cromosomas poIite"icos gigantes. (A) Modelo basado en la adici6n de un inhibidor a tada la cromatina ya replicada; (8) madelo basado en la presencia de una proteina iniciadora, o "factores pennisivos~, que aCluarian una unica vez y que deberfan unirse al DNA s610 durante la milosis.

181 protein.. Iniciodorn unidas dlibilmente

DNA

/ I \ ~ONA

G,

I ~

~

I

h61ic:es de DNA hi.., de Ie etomolino pl"olegido

prolel.no

==1

G,

• 388

Capitulo 8: EI ntlcleo celuJar

i~iei.ooro .......-\

mK!'VO

~ITOSISEUMINA EllNHIBlOOR

eI DNA del nUdeo '"' f _ G1 .. puede voIve< a rep/icer

~

5

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===========1~:-':'::""'""

A

MITOSIS PERMITE QUE SE UNAN Al DNA OTRAS Pfl:OTEINAS INICtADORAS

==f*=t= ==t=t===t==

dos por un bloqueo de la re-replicaci6n. Asl pues, el mecanismo responsable del bloqueo no puede depender de un origen de replicaci6n aJlamente especffico. EI bloqueo no afecta al virus SV40, probablemente debido a que su antfgeno T suo minislra tanto las funciones de iniciador como de DNA helicasa. subsliluyendo a los componentes celulares amllogos y evadiendo de esle modo los comroles a los que estan sujetos.

Amedida que el DNA se replica, se van ensarnblando nuevas histonas en la cromatina27 En cada cicio celular son necesarias una gran camidad de hiSlonas, aproximadamenle la misma C3filidad en masa que el DNA sintelizado, para fonnar la nueva cromalina. Por esta raz6n, muchos organismos poseen varias copias de cada uno de los genes de las hislonas. Por ejemplo, en las c~HuJas de venebrado se encuentran alrededor de 20 copias de un grupo de secuencias, carla uno de los cuales contiene los cinco genes de las histonas. Adiferencia de 10 que sucede con muchas protefnns. que se sintetizan continuamcnte a 10 largo de toda In interfase, las histonas se sinteliznn mayoritnrinmente en la fase S, durante III que el nivel de los mRNA de hiSlonas se incremenla uoas 50 veces como resulmdo del efeclo combinado de un aumento de la velocidad de transcripci6n y una reducci6n de su velocidad de degradaci6n. De· bido a un mecanismo que depende de las propiedades especiales de su extremo 3' (se discule en el Capitulo 9) cuando la sfntesis de DNA lermina al [mal de la rase S (0 cuando se aiiaden inhibidores que detienen la sfnlesis de DNA prematuramcnle), los mRNA de las histonas mayores se degradan en cuesti6n de minUlos. Por el contrario, las moleculas de histona son nOlablemente eslables y pueden sobrevivir toda la vida de In celula. La estrecha relaci6n entre la Slntesis de DNA y la de histonas puede ser debida a un meeanismo de retroalimentaci6n que conlrole los niveles de histonas libres asegurando que ~te sea el adecuado para la canlidad de DNA de nueva s(ntesis. Cuando las hislonas se han ensamblado en nucleosomas, raramente. 0 nun· ca, Iiberan el DNA al que eslan unidas. Sin embargo, a medida que la horquiJIa de replicaci6n avanza, ha de alravesar de alguna forma los nucleosomas pal'ernos, los cuales parecen eslar adaptados a pennitir el paso a su traves lamo para la transcripci6n como para la replicaci6n. Seglin una de las hip6tesis propueslas, cada nucleosoma se dividirfa durante la replicaci6n del DNA en dos Ymedios nucleosomas", permitiendo el acceso de la DNA polimerasa al DNA nucleos6mi· co desenrollado (Figura 8·40). EI DNA de nueva sfntcsis ccrcano a una horquilla de replicaci6n hereda las histonas palernas, pero tambi~n necesha de una cierta canlidad de histonas de nueva sfntesis para complelar su empaquetamiento en cromalina (v~ase Figura 8·40). Exislen algunas evidencias que sugieren que un ensamblador de nudeosomas viajaria con la horquilla de replicaci6n, empaquelando el DNA recien sinlClizado, en cuanlo emerge de la maquinaria de replicaci6n. La cromatina de nueva sfnlesis requiere, sin embargo. al menos una hora para eslar complelamente madura; hasta esle momento, por ejemplo, las histonas nuevas son mas sensibles de 10 normal a enzimas que son capaces de modificarlas. Desconocemas cuales son las diferencias qufmicas entre la cromatina madura y la inmadura, pero se cree que la maduraci6n implica tanto modificaciones covalentes de las histonas como uni6n de otras protefnas a la cromatina.

Los tel6meros son secuencias cortas, repetidas, ricas en G, que se made" at extremo de los cromosomas par acci6n de la telomera.sa28 Como ya se ha descrito, la DNA polimerasa no puede replicar completamente el extrema de una molecula lineal de DNA de un modo ordinario, y clio ha conducido al desarrollo de unas secuencias de DNA especialcs lIamadas tel6meros, situadas en el extremo de los cromosornas eucariotas. Estas secuencias que son simUares Repllcacl6n del cromosoma

389

regiOn centrlll del nucleoSOlnll

=====i~'''d'';'::C::

nuevlII caden.as de DNA 185 dos mitlldet de III Ionll cantral del nuclaosoma", encuentran unidas a una de las moltk:uln hljas de DNA

horquilill dll repllcacion

El

L

NUClE9S0~SE

VUElVE A ENSAMBLAR

R~===================='pronto otro oct,mero de hilton.. "

un;r' a asIa

~ooo====ti2T========= ~7=1n~~~~}a

entre sf en organismos Ian diferentes como los protozoos, los hongos.las plantas y los mamrreros, consisten en muchas copias de secuencias cartas, en tandem, que comienen bloques de G. En humanos esla secuencia es GGGl"A. EI problema de replicar los extremos de los cromosomas esta resueho de manera ingeniosa por acci6n de la enzima telomerasa. Esla enzima reconoce la cadena rica en G de una secuencia telomerica repetida y 1a aJarga en direcci6n 5' a 3'. En ausencia de una cadena de DNA complemenlario, la telomerasa simeliza una copia de la secuencia repclida empleando un molde RNA que es un componente de la propia cnzima. La cnzima contiene, por lanto, la informaci6n necesaria para manlener las caracter{sticas de la secuencia telomerica. Despues de varios cidos de extensi6n por la lelomerasa, se puede completar la replicaci6n dcl extrema del cromosoma empleando dichas extensiones como molde para la s{nlesis de la cadena complememaria por 1a DNA polimerasa (Figura 8-41). Dado que el proceso de rceorte y recuperaci6n de las secuencias del lel6mero esta equilibrado 0010 aproximadamenle, cada extrema de cromosoma conliene un numero variable de repeliciones en tandem, que, en general, son de varios dentos de pares de bases de longilud.

Resumen £Studios In vitro ikl vinu de slmlo SV40 como sistema modelo sugieren que tonto en las cilultu eucarloUl$ como en las procarloliU la repllcacl6n ikE DNA Sf! inicia con Ia un16n al DNA th .,,10 DNA Ilelicasa, mediada par una protelna iniciadora que, d su ve:t, Sf! halla unldn tl1 orlgen de replicad6n. En el orlgen de replicaci6n Sf! fonna una bUrbUJd de repllau:16n parefecto de dos horquillas de replicncwn que Sf! dleJdn una de Ia otra. En los eucarlottu superlores, parece que durante Ia fase S los orlgent!S de replicaci6n vednos Sf! activan en grupos, denominados Ullidades de re· pllcad6n, cuyos orlgenes Sf! hallan Sf!parados unos 100 000 nucle6ruros de media. Dado qlle Ia horquilla de replicaci6n se desplaza a Imos 50 nllcle6tidos par segun· do, s6Io Sf! necesitarln una hord para la s£ntesis de DNA de llna unldtul de replica. cl6n. A traves de una ftlSe S tlplCd de 8 horas se van acrivatuIo las dijere'Jtes ,mldn·

390

Capftulo 8: EI nudeo celuJar

Figura 840 Modelo especulal1vo que muestra cOmo 51! podrfa abrlr un nudeosoma para pennllir la repUcacl6n del DNA. Despuk de que pase la horquilla de replicad6n. el nucleosoma 51! reensamblarfa. De esle modo las histonas del mlcleo pennanecerian en 1000 momento unidas a1 DNA. A pesar de que segUn eJ diagrama los v;ejos nucleosomas se heredan inlaclOS por la helice de DNA sintelizada sabre la cadena conduClora. exislen ev;dendas de que eI nucleosoma se ha heredado inlacto por cualquiera de las dos hebras hermanas de la molecula de DNA. Asimismo, isle es solamente uno de [os muchos modelos diferentes posibles.

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eadeNl paterna

J'

TTGGGGlTGGGGTIGGGGTTG iMAACCCC .... 5" c:ade1lII .eQl!n s,ntel".cl., ,ncomplet.

LA TUOMERASA

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I

TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG aimesi. por I Meece CCCAAC . . aecl6n d. r. S' telomer... LA TELOMERASA MARGA LOS EXTREMOS 3' lelomer.sa con RNA plltr6n unido

(.Inl''';' de ONA sobre un mold. RNA)

I

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RETRASADA PaR LA DNA POUMERASA (,Intes" de DNA sob•• un molds DNA)

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de,fU cromatina, slendo las regiones oolldensada$ de In cromatina las ,UUnlit! tn iniciar ,1" replicaci6n. La correspondencia entre ,midndes de repllcaci6n y las

Figura 8·41 Repllcaclon del tel6mero. La figura resume las reacciones implicadas en la fonnaci6n de las secuencias repetidas ricas en G que fonnan los extremos de los cromosomas (leI6meros) de diversos organismos eucariotas, tal como sugieren los experimenlos realizados en el ciliado Tetrallymena. La cadena incomllieta recien sintetizada es copiada en la cadena retrasada de la horquilla de replicaci6n (vcase Figura 6-41). Como se ha indicado, la telomerasa es un complejo de prolefna y RNA que conliene un patron de RNA para la sfntesis de una secuencia telomerica rica en G. Eslas repeticiones son GGGlTG en Tetrallymella, pem son GGGITA en humanos 'i Gl_l"" en la levadura Saccharomycescercllisiae. Se cree que la cadena relrasada se completa can la acci6n de la DNA polimeras..1 Ct. que pona la actividad primasa en una de sus subunidndes (vt'!ase Figura 8-35).

bandas que contlenen millonts de ,Jares de bases observadas en los cromosomas mJt6tk:os ew:arlotclS sugieren que las ,midades de re/'llcacMn ,wdrlan correspo"der a dominios estnlct"raws diferentes de ia cromatilla l",erfllsien. Despues deqm~ ptue In horquilln de repliau:i6n, in estmctllra de ia croltlati'la Ie recupera mediante In adici6n a las antiguM histonaslleredadas por las lIIolklllas de DNA hijas. de mtevas histonns y de otras prote(IIas cromos6micas.. Se prodlU:e ,m bloqlU!O JoroJ de Ja re-repJk:tu:i6n, de naturaJez.a tksconocida. qlle illlpide que se prothu£a una nueva repliMCi6n de las regiones ya repliaulas, Ilasta que et cromosoma pase por una mitosis; este bJoqueo es necesario para asegurar qlle aula regi6n de DNA se repliqlle IIna soia lJf!Z etl aulafaseS. La repliau:i6n de los extremos de los cromosonuu se resueJve oon IIna estnlctll' m renninaJ espedalizada (el reMmeroJ y lma enzima (In retomerasaJ que extie,ule ala estructura IItltizando un moltk! RNA que es parte de In propia leJomemsn.

Sfntesis y procesamiento del RNA Hasta aqu! hemos considerado de qu~ forma se organi7..an los cromosomas en glandes complejos de DNA y proteinas, y romo se duplican estos complejos antes de que una cl!lula se divida. Sin embargo, la principal funci6n de un cromosoma es actuar como un molde para la sfntesis de moleculas de RNA, ya que s610 asf la cl!luJa puede utilizar la infomlaci6n gen~rica almacenada en los cromosomas. En Ia cl!lula sc produce una gran cantidad de sintesis de RNA: la velocidad a 1a que se incorporan los nucle6tidos al RNA durante la interfase es 20 veces mayor que la velocidad a la que se incorporan al DNA durante la fase S. La sfntesis de RNA, tambi~n denominada transcrlpc::16n del DNA, es un proceso muy selectivo. En la mayona de las cl!luJas de mamffero 5610 se copian a sccuencias de RNA funcionales (RNA mensajero maduro 0 RNA estructural) alredcdar del I % de las secuencias de llucle6tidos del DNA. La selccci6n ticnc lugar a dos niveles, que se abordanin, par ese orden en csta sccci6n: (1) se transcribe 5610 una parte de la secuencia de DNA, produciendo RNA nucleares, y (2) tan s610 una pequena porci6n de las secuencias de nucle6t.idos de los RNA nucleares sobrevive tOOas las ctapas del proceso de maduraci6n del RNA que preceden a la exportaci6n de las moleculas de RNA al citoplasma. Comenzaremos describiendo las RNA polimerasas, las enzimas que catalizan tada la transcripci6n del DNA. Sfntesls y procesamlento del RNA

391

HINI

lubunidad W de E. coli 11407 .minojcidOII • • H.I II

Iev.dur.

HtNl.

•

Drosophif.

HtNI.

•

..

•1

•• ••

Figura 8-42 Orlgen cornun de las

I

•

• •

I

COOH

•

S •••

RNA pollmerasas baclerlanas y COOH

• • • • • • • • COOH

Las RNA polimerasas intercambian subunidades cuando inician cada cadena de RNA29 Como se describi6 someramente en el Capitulo 6, la transcripci6n se InICla cuando la molecula de RNA polimerasa se une a una secuencia promotora del DNA de doble helice. A continuaci6n, en una etapa de iniciaci6n compleja no bien comprendida, las dos cadenas de DNA se separan loca[mente formando un complejo abierto. En esta elapa la cadena molde queda expuesta, y puede iniciarse la sfntesis del RNA complementario. Entonces la polimerasa empieza a dcsplazarse a 10 largo de III cadena molde, extendiendo [a cadena de RNA en crccimiento en la direcci6n 5' a 3' mediante la adici6n secuencial de ribonucle6tidos trifosfato, hasta que alcan7A1 una sel/at de para rterminnci6/1 0 SlOp) momento en el que la cadena de RNA formada y la molecula de RNA polimerasa se separan del DNA. Cada molecula de RNA representa, pues, una copia en cadena senciUa de la secuencia nucleotidica de una cadena de DNA de una regi6n relativamente pequei\a del genoma (vease Figura 6-2). Este segmento transcrito de DNA se denomina unkind de tmnscripci611. Generalmente las RNA pollmerasas estan fonnadas por multiples cadenas polipeptfdicas de pesos moleculares de 500 000 daltons 0 maS. Las enzimas de bacterias y de eucariOlas estflm:f-ir-'.....

I. las moleculas de RNA polimerasa de celulas eucariotas, como ocurre con

7000 nuc1e6tidos, aunque son bastante rrecuenles las moleculas de RNA de longitudes que oscilan entre 10 000 Y20 000 nude6tidos. Eslas longitudes, superiores a los 1200 ll11cledlidos de RNA necesarios para codificar una prot'cfna media de 400 amino, __ protein, de uni6n a poli·A

IAI

404

161

Capftulo 8: El nucleo celular

200 I'm

FIgura 8-59 Transporte de moleculas de mRNA a lraw!s de los poros nucleares. (A) lIustraci6n esqucmatica del cambio que al parecer ocurre en las protcfnas unidas a la molecula de RNA cuando se desplazan hacia el exterior del nucleo. (B) Electronmicrografia de una gran molecula de mRNA producida en una glandula salival de insecto: aparentemente, esta molecuia [j1eclla) ha sido ~cazada" en el momento en que salfa del micleo al citoplasma. (B, de'B.j. Stevens yH. Swift,f. Gel/Bioi 31: 55~ 71-: 1966, ~n.pel1lliso de copyright de The"Rocke¥eller ~ University Press.)

Estudios reaHzados en mutantes de levadura sugieren que para los RNA que contienen intrones este proceso s610 es posible cuando ha finalizado completamenle la maduraci6n del RNA. Cuando una mutaci6n crca un defecto en la maquinaria de maduraci6n, los precursores del mRNA no procesados pcrmanecen en el nucleo, mientras que los mRNA que no necesilan maduraci6n {Io que induye la mayor parle de los mRNA en esta sencilla c~lula eucariotal. son transportados normalmente al citoplasma. Esta observaci6n es consistenle con la idea de que los RNA son retenidos por los componenles de los espliceosomas, que at parecer forman grandes agregados en el interior de los nucleos eucariolas. Estos agregados podrfa.l1 aClUar como "islas de maduraci6n~ (Figura 8-60); aunque se desconoce c6mo est

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edad en semanas

(8)

miento del DNA ocurre aun antes de que se inicie la transcripcion de los genes de globinas, sugiriendo que los genes estan regulados en dos etapas. En la primera etapa, la cromatina que contiene el grupo de genes de globina se descondensa, 10 cual al parecer facilita el acceso de algunas de las proteinas reguladoras al DNA. En la segunda etapa, las proteinas reguladoras restantes se ensamblan en el DNA y dirigen la transcripcion de cada uno de los genes (Figura 9-53). Se cree que los cambios extensos que sufre la estructura de la cromatina propios de la primera etapa requieren una region de DNA denominada region de control del locus 0 LCR (de Locus Control Region), que se encuentran a bastante distancia por delante del grupo de genes (vease Figura 9-52). Ha side posible establecer la importancia de la LCR a partir del estudio de ciertos pacientes con un tipo concreto de talasemia, una forma severa de anemia., Se ha visto que en estos pacientes ellocus de ~ globina se mantiene silencioso en las celulas eritroblasticas, a pesar de tener el gen de ~ globina y las regiones reguladores intactas; el defecto consiste en la delecion de ciertas zonas que eliminan total 0 parcialmente la LCR. Asimismo, el gen de ~ globina en las celulas eritroblasticas se mantiene resistente a DNasaI, 10 que indica que es incapaz de seguir el proceso normal de descondensacion propio del desarrollo de las celulas eritroblasticas. Experimentos posteriores utilizando ratones transgenicos han confirmado el gran efecto que LCR tiene sobre la expresion de los genes de globina. Por ejemplo, cuando el gen de ~ globina humano y sus regiones reguladoras (las mostradas en la Figura 9-45) se insertan en diferentes regiones del genoma del raton, el gen se expresa en un nivel bajo, dependiendo del lugar de insercion. Este comportamiento es tipico de los genes de mamifero, e indica que la posicion del gen afecta su expresion (Tabla 9-2). Cuando se incluye la LCR con el gen, el gen de ~ globina se expresa a un nivel elevado en las celulas eritrobhisticas independientemente dellugar de insercion, indicando que la LCR puede superar los efectos de posicion. Aunque se han identificado algunas proteinas que se unen a LCR, se desconoce cwil es el mecanisme que modifica la estructura del locus completo de la ~ globina. En la siguiente seccion exponemos algunas de las ideas que podrian explicar como se producen estos cambios.

Figura 9-52 EI grupo de los genes del tipo de la II globina de humanos. (A) La regi6n cromos6mica grande comprtmde 100 000 pares de nucle6tidos, y contiene los cinco genes de gIobina y una regi6n de control del locus (descrita en el texto). (B) Variaciones de la expresi6n de los genes del tipo de la p globina durante varias fases del desarrollo de los humanos. Cada una de las cadenas de globina codificadas par estos genes se combina con una cadena de la a. globina formando la hemoglobina de los gl6bulos rojos. (A, segl1n F. Grosveld, G.B. van Assendelft, D.H. Greaves, y G. Kollias, Cell 51:975-985, 1987. © Cell Press.)

~,

ETAPA 1 SE AlTERA LA ESTRUCTURA DE LA CROMATINA

~

~ ETAPA2 SE ACTIVA El GEN

!

RNA polimerasa

\.

protein a reguladora

RNA

No se conocen los mecanismos que forman la cromatina activa El modelo hipotetico para explicar la activacion global de las globinas, que se esquematiza en la Figura 9-53, implica que en los eucariotas existen proteinas de union a secuencias especificas de DNA que actl1an descondensando la cromatina en un area local del cromosoma que podria tener decerias de miles de pares de nucleotidos de longitud. Alternativamente, los cambios en la estructura de la cromatina observados en los genes activos podrian ser una consecuencia automcitica, mas que un requisito previo, del ensamblaje de factores de transcripcion, de la RNA polimerasa, 0 de ambos, en un promotor. Hemos visto que el ensamblaje de los factores generales de transcripcion en los promotores parece acompafiarse de cambios en la distribucion de los nucleosomas en ellugar de ensamblaje; posiblemente esta pequefia perturbacion se pueda transmitir a largas distancias por alglin mecanisme de propagaci6n desconocido. 466

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

Figura 9-53 Las dos etapas por las cuales se actlvan algunos genes, incluidos los del grupo de genes de las globinas. En la etapa 1 se modifica la estructura de una gran regi6n de la cromatina, descondensandose en preparaci6n para la transcripci6n. En la etapa 2, las protefnas reguladoras (representadas en este esquema simplificado por una unica protefna) se unen a lugares especfficos de la cromatina induciendo la sfntesis del RNA (transcripci6n).

Tabla 9-2 La expresi6n de un gen transferido a un rat6n generalmente presenta efectos de posici6n del cromosoma, con diferentes niveles de actividad genica en animales transgenicos derivados de forma independiente Porcentaje del total de mRNA en Saco Copias genicas vitelino Hfgado Est6mago Cerebro por celula Gen end6geno Animal transgenico 1 Animal transgenico 2 Animal transgenico 3 Animal transgenico 4

20

5 1 30 13 0,4

3,4 4,8 4,4 0,4

0,1

0

2

0,1 1,3 4,7 0

0 0 0 0

4 4 4 12

En estos experimentos llevados a cabo con el gen de la aifa-fetoprotefna de raton, el fragmento de DNA inyectado en el huevo del raton fertilizado incluye 14000 pares de nucleotidos de secuencia 5'-flanqueante, donde se localizan tres incrementadores (enhancers) que afectan la expresion de este gen. Se utiliz6 la tecnica de hibridizacion para comparar el nivel de mRNA producido por el gen inyectado con el que normaimente produce el gen endogeno de la aifa-fetoproteina en los tejidos fetaies indicados. (Datos de R.E. Hammer et ai., Science 235:53, 1987.)

Tengan 0 no los eucariotas protefnas capaces de descondensar dominios de la cromatina, es valioso especular acerca de c6mo podrfan hacerlo estas protefnas. Actualmente s6lo podemos imaginar este rilecanismo. En la Figura 9-54 se esquematizan tres posibilidades. Se trata de tres modelos muy distintos, 10 cual es un indicio de 10 lejos que estamos de comprender la transici6n entre la cromatina activa e inactiva.

La tensi6n superhelicoidal del DNA pennite la acci6n a distancia40 Uno de los tres modelos que se recogen en la Figura 9-54 implica la existencia de cambios topo16gicos en un bucle cerrado de DNA de doble cadena que conduce a

wa~

:c ----1------.· locus de control

.

cromatlna norma I en el dominio'en bucle

C

delareg~·

LUGAR DE LA NUCLEACI6N

PUNTa DE ENTRADA DE LA PROTEiNA QUE SE DESPLAZA

1

PUNTa DE GIRO ACTIVO DEL DOMINIO DE CROMATINA CONSTRENIDA

1

[() 0 :J L j

I

ALTERACI6N DE LA CROMATINA, CATALIZADA paR PRaTE fNA

I'-.

\-

I

LA TENSI6N SUPERHELICOIDAL ALTERA LA CROMATINA

PARA EL ENSAMBLAJE a DESENSAMBLAJE DE PROTEiNAS DE CUBIERTA SaBRE LA :1ATINA

~~~

.~

cIt

Figura 9-54 Tres modelos propuestos para explicar la influencia a gran distancia de una regi6n dominio de control sobre la actlvidad genica. Se postula que el bucle de cromatina mostrado representa un dominio cromosomico en bucle completo (descrito en el Capitulo 8), que puede contener mas de 100 000 pares de nucleotidos de DNA. Cada modelo propone una funci6n diferente para el lugar LCR. EI mecanismo actual causante de los efectos a gran distancia es desconocido, y se podrfan proponer otros mecanismos.

GAN~NCIA

LA a PERDIDA DE PROTEiNAS DE CUBIERTA ALTERA LA ESTRUCTURA DE LA CROMATINA

----1----_--.11

cromatina activa

Estructura de la cromatina y control de la expresi6n genica

467

DNA con un extremo libre

DNA con los extremos fijos

I~~~~~~~~'"'O\

1--~~~~~~~~~'"'4

'\\\::\,~,

I

I

desenrollamiento de 10 pares de bases del DNA (una vuelta de laMlice)

desenrollamiento de 10 pares de bases del DNA (una vue Ita de la halice)

~.,\ ~., ,~""'OV...o---...:;~ "-'" .~ ~;0\,,"'-... ""'\;~.

ilL I'lli.

la halice de DNA ha de girar una vuelta

la hal ice de DNA forma un sobreenrollamiento (B)

(A)

la formaci6n de DNA sobreenrollado, una conformaci6n que adopta el DNA en respuesta a una tension superhelicoidal. El DNA sobreenrollado se ha podido estudiar especialmente en pequefias moleculas circulares, como los cromosomas de algunos virus y phismidos. Sin embargo, estas rnismas consideraciones se pueden aplicar a cualquier regi6n de DNA cuyos extremos sean incapaces de rotar libremente -como por ejemplo en un bucle de cromatina anclado firmemente a la base. En la Figura 9-55 se ilustra una manera sencilla de visualizar las limitaciones topo16gicas que provoca el sobreenrollamiento del DNA. En un DNA de doble cadena cuyos extremos esten fijos se forma un sobreenrollamiento para compensar cada 10 pares de nucle6tidos que se han abierto (desenrollado) en la helice; la formaci6n de este sobreenrollamiento es favorable energeticamente pues permite al resto de las regiones en las que las bases aun permanecen apareadas recuperar el giro normal de la helice. En bacterias como E. coli existe un tipo especial de DNA topoisomerasa II, denominada DNA girasa, que, empleando la energfa de hidr6lisis del ATP, sobreenrolla constantemente el DNA, manteniendolo siempre bajo tensi6n. Estos sobreenrollamientos son sobreenrollamientos negativos, y tienen el sentido de giro opuesto a los sobreenrollamientos positivos que se muestran en la Figura 9-55 y que se forman cuando una regi6n de la doble helice se abre. Asf, cuando se abre una regi6n de la doble helice de DNA en una bacteria, mas que crearse un sobreenrollamiento positivo, 10 que ocurre es que se elimina un sobreenrollarniento negativo. Dado que durante este proceso se reduce la tensi6n superhelicoidal del DNA, la apertura de la doble helice de DNA en E. coli es energeticamente favorable comparada con la apertura de la doble helice de un DNA que no este sobreenrollado. Las DNA topoisomerasas de tipo II eucariotas eliminan tensi6n superhelicoidal mas que producirla (se describe en el Capftulo 8). Por ello, la mayor parte del DNA de una celula eucariota no esta bajo tensi6n. Sin embargo el desenrollamiento de la doble helice esta asociado con la etapa de iniciaci6n de la transcripci6n. Ademas, una molecula de RNA polimerasa en movimiento (asf como otras protefnas que desenrollan el DNA) tendera a generar tensi6n superhelicoidal positiva en el DNA por delante y tensi6n superhelicoidal negativa por detras (Figura 9-56). Asf, estos efectos topo16gicos podrfan generar tales fuerzas en un

SOBREENROLLAMIENTO NEGATIVO se facilita la apertura de la helice

468

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

SOBREENROLLAMIENTO POSITIVO se dificulta la apertura de la helice

Figura 9-55 La tensi6n superhelicoidal del DNA origina su sobreenrollamiento. (A) En el caso de una moltkula de DNA con un extrema libre (0 con un corte que actue como un pivote de giro), la doble helice de DNA gira una vuelta cada 10 pares de nucle6tidos que se abren. (B) 5i se impide la rotaci6n, la tensi6n superhelicoidal que se genera en el DNA abre la helice. Una forma de acomodar esta tensi6n es incrementar el giro de la helice de forma que haya 11 pares de nucle6tidos en vez de 10 por vuelta de helice, como en el ejemplo; sin embargo, la doble helice de DNA resiste dicha deformaci6n dobhindose en bucles sobreenrollados. De este modo se forma un sobreenrollamiento en el DNA por cada 10 pares de bases abiertas. El sobreenrollamiento formado aquf es un sobreenrollamiento positivo (vease Figura 9-56).

Figura 9-56 Sobreenrollamiento de un segmento de DNA debido a una protefna que patrulla la doble helice de DNA. Los dos extremos del DNA que se muestran son incapaces de rotar uno respecto al otro libremente, y se asume que la protefna que se desplaza tambien es incapaz de rotar libremente. En estas condiciones el movimiento de la protefna causani la acumulaci6n de un exceso de vueltas de helice por delante y un deficit de vueltas por detnis, como se muestra en la figura. Las evidencias experimentales sugieren que una molecula de RNA polimerasa en movimiento produce sobreenrollamiento de este modo; la tensi6n superhelicoidal que genera por delante hace mas dificil abrir la doble helice, pero esta tensi6n ha de facilitar la liberaci6n del DNA de los nucleosomas ya que la separaci6n del DNA de las histonas del nucleo del nucleosoma ayuda a rela:jar la tensi6n superhelicoidal positiva.

lugar concreto que se propagaran a traves de todo un dominio de la cromatina. Sin embargo aun se desconoce si algun fen6meno de este tipo esta implicado en los cambios a gran escala de la estructura de la cromatina.

Resumen Los genomas de los organismos eucariotas esttin empaquetados en la cromatina. Algunas formas de cromatina estdn tan condensadas que los genes que contienen son silenciosos transcripcionalmente. A pesar de que se desconocen los detalles de este tipo de empaquetamiento, se cree que podrla tratarse de un mecanismo utilizado por las celulas para silenciar grandes regiones de sus genomas. En algunos casos es posible revertir este silenciamiento, activtindose los genes que conten(an, pero la manera en que ocurre es tambien desconocida. En formas de cromatina menos condensada el DNA se encuentra aun empaquetado en forma de nucleosomas. Los nucleosomas posicionados en el punto de inicio de la transcripci6n bloquean el ensamblaje de los factores generales de transcripci6n. Estos nucleosomas parecen desplazarse, por un mecanismo desconocido, cuando la transcripci6n se activa por prote(nas reguladoras.

Mecanismos geneticos que originan tipos celulares especializados 41 Aunque los organismos unicelulares han de ser capaces de activar y desactivar genes, los organismos pluricelulares ademas requieren interruptores geneticos capaces de generar y mantener sus diferentes tipos celulares. En particular, cuando una celula de un organismo pluricelular se diferenciil hacia un tipo celular determinado, generalmente la elecci6n de destino se mantiene a 10 largo de muchas generaciones celulares, 10 que significa que los cambios de expresi6n genica implicados en la elecci6n deben recordarse. Este fen6meno de memoria celular es un requisito previo para la creaci6n de tejidos organizados y para el mantenimiento de tipos celulares diferenciados. Por el contrario, los cambios simples de la expresi6n de los genes tanto en eucariotas como en procariotas son temporales; por ejemplo, el represor de triptOfano reprime la expresi6n de los genes del triptOfano en la bacteria unicamente en presencia de tript6fano; en cuanto desaparece del medio los genes son activados de nuevo, y los descendientes no tendnin memoria de que sus antecesores fueron expuestos al tript6fano. Sin embargo, incluso en los procariotas es posible heredar algunos cambios en la expresi6n genica. En esta secci6n examinaremos de que forma los mecanismos de regulaci6n genica pueden combinarse entre sf para formar interruptores que, una vez activados, sean recordados por las sucesivas generaciones celulares. Empezaremos considerando algunos de los mecanismos geneticos mejor conocidos de diferenciaci6n celular que actuan en bacterias y en levaduras.

Los cambios de fase de las bacterias son provocados por reorganizaciones del DNA42 Hemos visto que en las celulas eucariotas la diferenciaci6n generalmente no implica cambios detectables en las secuencias de DNA. En cambio, en algunos procariotas se pueden alcanzar patrones de regulaci6n genica hereditarios a base de reorganizaciones especificas del DNA que activan 0 desactivan a genes concretos. Dado que todos los cambios que se producen en una secuencia de DNA son copiados con exactitud en las replicaciones posteriores del DNA, cualquier estado de actividad genica alterado se heredara por toda la progenie de la celula en la que se ha dado la reorganizaci6n. En principio, algunas de estas reorganizaciones son reversibles y en tales casos, si consideramos perfodos de tiempo suficientemente largos, se establecen patrones de actividad genica alternante. . Mecanismos geneticos que originan tipos celulares especializados

469

segmento que se invierte I

I

promotor

H2

(A)

ACTIVO RNA

ACTIVO

ACTIVO

+

...

t

ijJ.l/J.-

protefna H2

promotor

c:=

promotor H1

;;C:r

•••

(8)

represor

C:::]ili '.l t ••

+

•••

INACTIV6

*.i

el represor bloquea la sfntesis de H1

_---'/

protefna represora

H2

represor

INACTIVO

INACTIVO

promotor H1

c:::

ACTIVO ACTIVO

+

segmento que se invierte

RNA

+

....

•

f>.fI

protefna H1

En la bacteria Salmonella se presenta un mecanismo de diferenciaci6n celular de este tipo, conocido por cambio de fase, que ha sido muy estudiado. Aunque en eucariotas superiores no existe el modo de diferenciaci6n equivalente, sf tiene un efecto importante sobre ellos, ya que es el mecanismo que utilizan algunas de las bacterias causantes de enfermedades para i.Ll ser detectadas por el sistema inmune. El cambio de la expresi6n genica en Salmonella se produce por la inversi6n esponidica de un segmento especffico de DNA de 1000 pares de nucle6tidos que afecta la expresi6n de la protefna de la superficie celular flagelina, para la que la bacteria tiene dos genes. La inversi6n esta catalizada por una enzirna de· recombinaci6n especffica de lugar, 10 que cambia la orientaci6n de un promotor situado en el interior de los 1000 pares de nucle6tidos que se invierten. Con el promotor en una de las orientaciones la bacteria sintetiza un tipo de flagelina; con el promotor en la otra orientaci6n la bacteria sintetiza el otro tipo de flagelina (Figura 9-57). Dado que las inversiones se dan muy raramente, cuando se producen se generan clones enteros de bacterias con un tipo u otro de flagelina. Probablemente este fen6meno del cambio de fase evolucion6 porque protege a la poblaci6n bacteriana contra la respuesta inmune de sus huespedes vertebrados. Si el huesped fabrica anticuerpos contra un tipo de flagelina, las escasas bacterias cuya flagelina sea distinta debido a una inversi6n genica podran sobrevivir y multiplicarse. Las bacterias que se afslan de los medios naturales suelen presentar cambios de fase para uno 0 varios rasgos fenotfpicos, pero generalmente estas "inestabilidades" se eliminan en las cepas estandar dellaboratorio. S610 se han estudiado unos cuantos mecanismos subyacentes a este proceso y no todos consisten en inversiones de segmentos de DNA. Por ejemplo, una bacteria que provoca una enfermedad humana de transmisi6n sexual comun (Neisseria gonorrhoeae) evita el ataque inmune mediante una variaci6n hereditaria de las propiedades de su superficie, que se genera por conversion genica (descrito en el Capftulo 6) mas que por inversi6n genica. Este mecanismo depende de la protefna de recombinaci6n RecA, y transfiere secuencias de DNA desde "cassettes genicas" silenciosas a un gen que se expresa; este mecanismo tiene la ventaja de que genera mas de 100 variantes de una protefna mayoritaria de la superficie bacteriana.

En levaduras, algunas proteinas reguladoras determinan la identidad del tipo celular 43 Debido fundamentalmente a su gran facilidad de crecimiento y de manipulaci6n genetica, las levaduras se han analizado con gran detalle como organismo 470

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

Figura 9-57 Cambios en la expresi6n genica mediante inversiones de DNA en bacterias. Transcripci6n altemante de dos genes de flagelina en una bacteria Salmonella, causada por un suceso sencillo de recombinaci6n especifica de lugar que invierte un pequeno segmento de DNA que contiene un promotor, de modo que en la orientaci6n (Al activa la transcripci6n del gen HZ de flagelina asi como la proteina represora que bloquea la expresi6n del gen de flagelina HI. Cuando el promotor se invierte (B), deja de activar al gen HZ y al represor, y el gen HI que ahora esta libre de represi6n, se expresa. El mecanismo de recombinaci6n se activa raramente (alrededor de una vez en 105 divisiones celularesl. Asi, la producci6n de uno u otro tipo de flagelina tiende a ser hereditaria en cada clon de celulas.

modelo para el estudio de los mecanismos de control genico en eucariotas. La levadura comun de panadero, Saccharomyces cerevisiae, ha sido especialmente util por su capacidad de diferenciarse en tres tipos celulares, aunque el mecanismo difiere en algunos aspectos basicos del que usan las celulas de plantas y animales. S. cerevisiae es un eucariota unicelular que puede existir tanto en estado haploide como diploide. Las celulas diploides se forman por un proceso denominado apareamiento, en el que dos celulas haploides se fusionan. Para que dos celulas haploides se puedan aparear han de diferir en su tipo de apareamiento (sexo). En Saccharomyces cerevisiae, existen dos tipos de apareamiento, a y a, especializados en el apareamiento mutuo. Cada uno de allos produce un molecula senal especifica (factor de apareamiento) que difunde, y una protefna receptora. Estas moleculas capacitan a la levadura, respectivamente, para comunicarse y para reconocerse y fusionarse con celulas del tipo contrario. Las celulas diploides resultantes, denominadas at a, presentan caracterfsticas propias que las distinguen de los tipos parentales: no son aptas para el apareamiento pero pueden formar esporas (esporular), generando celulas haploides por meiosis en situaciones de carencia de nutrientes. Los mecanismos por los cuales se establecen y mantienen estos tres tipos de celulas ilustran algunas de las estrategias que se han descrito previamente para cambiar el patron de expresion genica. El tipo de apareamiento de la celula haploide viene determinado por un unico locus genetico, ellocus del tipo de apareamiento (MAT, de Mating-Type Locus), que en la celula de tipo a codifica una unica protefna reguladora, aI, y en una celula de tipo a codifica dos protefnas reguladoras, al y a2. La protefna al no tiene ningl1n efecto sobre la propia celula de tipo a, pero 10 tendra sobre la celula diploide resultante del apareamiento: mientras tanto la celula de tipo a fabrica la protefna reguladora por defecto. En cambio, la protefna a2 actua en la celula a como un represor transcripcional que reprime los genes especificos de a, mientras que al actua como un activador transcripcional que activa los genes especificos de a. Cuando se fusionan las ce-

proteinas reguladoras producidas por el locus MA T

conjunto de genes controlados por MA T

tipo celular

MCM1

a

a

aSG ACTIVO

a (haploide)

aSG INACTIVO hSG

a1 (sin efecto)

aII

a

ACTIVO

MCM1

l-a2

a (haploide)

aSG INACTIVO

a 1 . MCM1 aSG

a1

ACTIVO

a2

a

hSG

II a

a

ACTIVO

MCM1

l-a2

a/a (diploide)

aSG INACTIVO aSG INACTIVO

a2

a1

a2-t~a1 I

Mecanismos geneticos que originan tipos celulares especializados

hSG INACTIVO

Figura 9-58 Control del tipo celular en levadura. El tipo celular en levaduras esta controlado pOI tres proteinas reguladoras (aI, a2 y all producidas por ellocus MAT. Se transcriben diferentes grupos de genes en las celulas haploides de tipo a, a y diploides (tipo a/a). Las celulas haploides expresan una serie de genes especificos de celula haploide (hSG) y o bien un grupo de genes especificos de a (aSG) 0 de a (aSG). Las celulas diploides no expresan ninguno de estos genes. Las proteinas aI, 0.2, yal controlan muchos genes diana en cada tipo de celula mediante su uni6n, en diferentes combinaciones, a las secuencias reguladoras situadas por delante de estos genes. Es de destacar que la proteina 0.1 es activadora, mientras que 0.2 es represora, yambas actuan en combinaci6n con una proteina reguiadora ubicua deno~inadaMCMl. En la celula diploide, 0.2 y al forman un heterodimero que desactiva un grupo distinto de genes (entre los que se incluye el gen que codifica la proteina activadora 0.1) de los que inactivaba 0.2 y MCMl. Este ejemplo relativamente simple de control genico es un buen ejemplo de control combinatorio de la expresi6n genica (vease Figura 9-38). Las proteinas al y 0.2 reconocen en ambos casos su secuencia de uni6n mediante un homeodominio (vease Figura 9-13).

471

lulas de los dos tipos de apareamiento la combinacion de las protefnas reguladoras al y a2 genera un patron de expresion genica completamente distinto al de cualquiera de las celulas progenitoras. En la Figura 9-58 se esquematiza el mecanismo por el cuallos genes especfficos del tipo de apareamiento se expresan en cada uno de los tres tipos celulares. Se trata de uno de los primeros ejemplos de control genico combinatorio y min es uno de los mejor conocidos a nivel molecular. Aunque en muchos laboratorios las cepas de S. cerevisiae se mantienen estables durante muchas generaciones, algunas cepas aisladas del medio natural cambian repetidamente entre los tipos celulares a y a por un mecanismo de reorganizacion genica que recuerda el de cambio de fase en N. gonorrhoeae, aunque el mecanismo en detalle parece ser particular de levadura. En cada uno de los extremos del locus MAT del cromosoma de la levadura existe un locus silencioso que codifica las protefnas reguladoras especfficas del tipo de apareamiento: en un lado codifica al y a2, y en el otro al. En cada division celular sucesiva el gen activo en ellocus MAT es eliminado y substituido por una nueva copia del locus silencioso del tipo de apareamiento opuesto. Este mecanismo se ha denominado mecanismo cassette pues el cambio supone eliminar un gen de la posicion "activa" y su substitucion por otro. El cambio es reversible porque aunque el gen original en ellocus MAT se elimina, queda siempre una copia silenciosa en el genoma. Nuevas copias de DNA realizadas a partir de los genes silenciosos actuan como cassettes desechables que seran insertadas alternativamente en el locus MAT que actua como "cabezallector" (Figura 9-59). Resultados de tests geneticos sugieren que las cassettes silenciosas se mantienen inactivas por el mismo mecanismo que silencia los genes localizados en el extremo de los cromosomas de levadura (vease Figura 9-51A): el DNA en un locus silencioso parece estar empaquetado en forma de cromatina inactiva.

Dos proteinas fagicas que se reprimen mutuamente su sintesis determinan el estado del bacteri6fago lambda44 La observacion de que a partir de la informacion genica de un solo nueleo somatico se pueda desarrollar un vertebrado 0 una planta elimina la posibilidad de que los cambios irreversibles en el DNA sean la causa principal de la diferenciacion de las celulas eucariotas superiores (a pesar de que estos constituyen una parte esencial del proceso de diferenciacion de los linfocitos -descrito en el Ca-

gen silencioso tipo"

locus MAT

gen silencioso tipo a

se inserta la cassette a nueva

TIPO DE APAREAMIENTO

ex

se elimina la cassette " antigua

TIPO DE APAREAMIENTO

se inserta una cassette lZ nueva

472

Capitulo 9 : EI control de la expresi6n genica

a

Figura 9-59 Modelo de las cassettes para la alternancia de tipo de apareamiento en la levadura. EI cambia de cassettes se da por un proceso de conversi6n genica que se dispara cuando la nucleasa realiza un corte de doble cadena en una secuencia especffica del DNA en el locus MAT. A continuaci6n se elimina el DNA cerca del corte y se substituye par una copia de la cassette silenciosa del tipo de apareamiento opuesto.

pitulo 23). Aunque, en principio, los cambios reversibles de secuencias de DNA, similares a los descritos en los casos de Salmonella y de las levaduras, pueden ser responsables de algunos de los cambios hereditarios de expresi6n genica que se observan en los organismos eucariotas superiores, actualmente no disponemos de ninguna evidencia que demuestre su existencia. Sin embargo, existen otros mecanismos, como los que ya se han descrito en este capitulo, que son capaces de producir un patr6n de expresi6n genica hereditario que presente una serie de estados discretos estables. En las celulas eucariotas no se comprende completamente ninguno de estos mecanismos, pero los estudios sobre el bacteri6fago lambda han aportado mucha informaci6n a nivel molecular, de un interruptor genetico que puede alternar, "flip-flop", entre dos estados estables, 10 que podrfa ser un modelo de interruptor que tambien actuara en el desarrollo de los eucariotas superiores. Previamente hemos descrito que este virus bacteriano puede permanecer integrado en el DNA de una celula de E. coli en condiciones favorables, de forma que se replica automaticamente cada vez que la bacteria se divide, en lugar de multiplicarse en el citoplasma y matar a su huesped. El cambio entre estos dos estados viene mediado por dos proteinas codificadas por el genoma virico. El genoma consta de unos 50 genes que en los dos estados se transcriben siguiendo patrones muy diferentes. Por ejemplo, en un virus que se ha de integrar se producini la proteina integrasa, necesaria para insertar el DNA del virus en el genorna de la bacteria y al mismo tiempo se han de reprimir la producci6n de las proteinas viricas implicadas en la replicaci6n del virus. Una vez se ha escogido entre uno de los dos patrones de expresi6n, este se mantiene estable. No podemos aqui detenernos en los detalles de este complejo sistema: regulador de la expresi6n genica, pero destacaremos algunas de sus caracteristicas generales. En el coraz6n del sistema se encuentran dos proteinas reguladoras de genes sintetizadas por,el virus: la proteina represora lambda (proteina el), descrita anteriormente, y la proteina ero. Estas proteinas bloquean cada una de ellas la sintesis de la otra, organizaci6n que permite tinicamente dos estados posibles. En el estado 1 (el estado de profago) el represor lambda ocupa el operador, bloqueando la sintesis de represor y tambien activando su propia sintesis. En el estado 2 (el estado Utico) la proteina cro ocupa un lugar diferente en el operador, bloqueando la sintesis del represor y activando su propia sintesis (Figura 9-60). En el estado de profago la mayor parte del DNA del virus integrado de forma estable no se transcribe; en el estado lftico este DNA se transcribe extensamente, se replica, se empaqueta en nuevos bacteri6fagos, y se libera cuando se lisa la celula huesped. Cuando la bacteria huesped va creciendo bien, el virus tiende a adoptar el estado 1, permitiendo que el DNA del virus se vaya multiplicando nipidamente, conjuntamente con el cromosoma huesped. Cuando se dana la celula huesped, un virus integrado se transforma del estado 1 al estado 2, se multiplica en el citoplasma de la celula y se escapa rapidamente de ella. Esta conversi6n esta inducida por proteinas reguladoras bacterianas que inactivan la proteina represora. Sin embargo, en ausencia de tales interferencias el represor de lambda bloquea tanto la producci6n de la proteina cro como activa su propia sintesis, y este bude de retroalimentaci6n positiva es el que ayuda a mantener el estado de profa-

astado astable 1: estado de profago sa sintetiza la proteina represora de lambda

eI • ACTIVO

•

estado estable 2: estado Utieo se sintetiza la proteina ero

ero

eI

INACTIVO

INACTIVO

ero opera or

RNA

•

I '..

represor de lambda

RNA proteina ero

Mecanismos geneticos que originan tipos celulares especializados

• ACTIVO

• •

Figura 9-60 Version simplificada del sistema regulador de tipo interruptor, que determina el estilo de crecimiento del bactericSfago lambda en la celula huesped E. coli. En el estado estable 1 (estado de profago) el bacteriofago sintetiza la protefna represora en grandes cantidades, que activa su propia sfntesis e inactiva la sfntesis de varias protefnas del fago, entre las que se cuenta la protefna cro. En el estado estable 2 (estado lftico) el bacteriOfago sintetiza la protefna cro en grandes cantidades, la cual inactiva la sfntesis del represor, de forma que se sintetizan muchas protefnas vfricas y comienza la replicacion libre del DNA del virus en la celula de E. coli, produciendo finalmente numerosas partfculas vfricas y matando la celula. Este ejemplo muestra como dos protefnas reguladoras pueden combinarse en un circuito produciendo dos estados estables. Como se muestra en la Figura 9-11, tanto el represor lambda como la protefna cro reconocen el operador mediante un motivo helice-giro-helice.

473

T

el efecto de la senal puntual es recordado par tadas las celulas descendientes

Figura 9-61 Diagrama esquematico que muestra c6mo un bucle de retroalimentaci6n positiva puede generar memoria celular. La protefna A es una protefna reguladora que activa su propia transcripci6n. Todos los descendientes de la celula original recordanin que la celiIla progenitora recibi6la senal que inici6 la producci6n de la protefna.

la proteina A no se sintetiza ya que normalmente es necesaria para su propia transcripci6n

go estable. Los bucles de retroalimentacion positiva son un rasgo caracteristico de muchos circuitos de memoria celular (Figura 9-61). Un principio general importante que se deriva del caso del bacteriofago lambda es que s'e puede conseguir un sofisticado patron de comportamiento con un escaso mlmero de proteinas reguladoras de genes que afectan reciprocamente su sintesis y su actividad. Sabemos que las celulas eucariotas utilizan variaciones de esta sencilla estrategia para establecer y mantener patrones de expresion genica hereditarios. Por ejemplo, algunas proteinas reguladoras implicadas en el establecimiento del plan de desarrollo de Drosophila (descrito en el Capitulo 21), estimulan su propia transcripcion, de modo que se crea un bucle de retroalimentacion positiva que estimula su sintesis continuada; al mismo tiempo estas proteinas reprimen la transcripcion de los genes que codifican otras proteinas reguladoras importantes.

La expresi6n de una proteina reguladora critica puede disparar la expresion de una bateria de genes situados por debajo (en direccion 3')45 En general se trata de una combinacion de proteinas reguladoras, mas que de una proteina unica, la que determina donde y cuando se ha de transcribir un gen eucariota. Pero aunque el control sea combinatorio, una unica proteina puede ser decisiva para cambiar una celula de una via de desarrollo 0 estadQ de diferenciacion a otro. Un ejemplo notable procede de los estudios de diferenciacion de una fibra muscular in vitro. Una fibra muscular esqueIetica de mamifero tipica es extremadamente larga y contiene muchos nucleos. Se forma por fusion de muchas celulas precursoras denominadas mioblastos. La fibra muscular madura se diferencia de otras celulas por un gran numero de proteinas caracteristicas, que incluyen tipos especificos de actina, miosina, tropomiosina y troponina (todas elIas forman parte del sistema contractil), creatina fosfoquinasa (propia del metabolismo tipico de las celulas musculares), y receptores de acetilcolina (que hacen a la membrana sensible a la estimulacion nerviosa). En mioblastos proliferantes estas proteinas especificas de musculo y sus mRNA estan ausentes 0 se encuentran presentes en baja concentracion. Cuando los mioblastos empiezan a fusionarse unos con otros, todos estos genes se activan en un proceso coordinado que es parte de la transformacion general que presenta su patron de expresion genica. Todo este programa de diferenciacion del musculo puede desencadenarse en fibroblastos de la piel en cultivo y en algunos otros tipos celulares introdu474

Capitulo 9 : EI control de la expresi6n genica

Figura 9-62 Efecto de la expresi6n de la protefna MyoD en fibroblastos. Como se muestra en la micrografia de inmunofluorescencia, los fibroblastos de la piel se han convertido en celulas musculares por efecto de la expresi6n inducida experimentalmente del gen myoD. Los fibroblastos crecieron en cultivo, yfueron transfectados tres dfas antes de la observaci6n con un L----.J 20 ~m plasmido recombinante que contiene la secuencia codificante de myoD. Aunque s610 un porcentaje pequeno de los fibroblastos incorpora el DNA y produce la protefna MyoD, estas celulas se fusionan formando miotubulos alargados, que se muestran tenidos con anticuerpos que detectan una protefna especffica del musculo. Las celulas tenidas estan mezcladas con una capa confluente de fibroblastos, cuyos nucleos se pueden apreciar en la imagen. Cultivos control transfectados con otro plasmido no contienen celulas musculares.

ciendo cualquier gen que codifica uno de los miembros de una familia de protefnas helice-bucle-helice -las denominadas proteinas miogenicas (por ejemplo MyoD, Myf5 0 miogenina)- que normalmente se expresan unicamente en fibras musculares (Figura 9-62). En el DNA adyacente a muchos genes especfficos de musculo se pueden detectar secuencias de union a estas protefnas. A partir de estudios con ratones transgenicos parece que el modo de accion de MyoD y MyfS implica la activacion de miogenina: si se elimina el gen de miogenina por insercion genomica dirigida, las celulas musculares no pueden diferenciarse. Es probable que tanto los fibroblastos como otros tipos celulares que se convierten en fibras musculares por las protefnas miogenicas hayan acumulado una serie de protefnas reguladoras que pueden cooperar con las protefnas miogenicas activando los genes especfficos del musculo. Desde este punta de vista serfa una combinaci6n de protefnas reguladoras, mas que una simple protefna, la que determiriarfa la diferenciacion celular. Esta idea es consistente con el hecho de que algunos tipos celulares no se convierten en fibras musculares por accion de miogenina 0 protefnas relacionadas; dichas celulas, probablemente no habrfan acumulado las otras protefnas reguladoras necesarias. A continuacion veremos como el control combinatorio tiene implicaciones importantes tanto para la evolucion como para el desarrollo de los organismos pluricelulares.

El control genico combinatorio es la norma en los eucariotas46 Ya hemos discutido como pueden actuar de modo combinado multiples protefnas reguladoras controlando la expresion de un determinado gen. Sin embargo, Figura 9-63 La importancia para el desarrollo del control combinatorio.

celula embrionaria

INDUCCI6N DE LA PROTEfNA REGULADORA

•

IIZQUIERDA I

I DERECHA I

celula A

celula B

INDUCCI6N DE LAS PROTEfNAS REGULADORAS •

celula C

celula D

celula E

INDUCCI6N DE LAS PROTE[NAS REGULADORAS.

celula G

celula H

celula I

celula J

celula K

celula L

celula F

Y

•

celula M

Mecanismos geneticos que originan tipos celulares especializados

Este esquema muestra c6mo las combinaciones de unas cuantas protefnas reguladoras pueden generar muchos tipos celulares diferentes durante el desarrollo. En este esquema simple la decisi6n de sintetizar una de' un par de protefnas reguladoras (representadas por cfrculos numerados) se toma deJ>pues de cada divisi6n celular. Siendo conscientes de su posici6n en el embri6n, la celula hija situada hacia la izquierda del embri6n siempre escoge sintetizar la protefna par, mientras que la situada hacia la derecha en el embri6n sintetizanin la impar. Se asume quela producci6n de cada protefna reguladora es autoperpetuante (contribuyendo asf a la memoria celular). Asf pues, las celulas en un clon en crecimiento contendrfan un mlmero creciente de protefnas reguladoras. Es de destacar que en este ejemplo, puramente hipotetico, se han generado ocho tipos celulares (G a N) con cinco protefnas reguladoras diferentes. Si se continua el esquema, se pueden llegar a especificar 10 000 tipos celulares con s610 25 protefnas reguladoras diferentes.

celula N

475

como demuestra el ejemplo de las protefnas miogenicas, el control combinatorio significa min mas: no solo cada uno de los genes esta regulado por la accion de numerosas protefnas reguladoras, sino que cada protefna reguladora participa en el control de muchos genes. Ademas, aunque algunas protefnas reguladoras como MyoD 0 miogenina son especfficas de un unico tipo celular, es mas frecuente que una protefna reguladora determinada este activa en una variedad de tipos celulares, en diferentes partes del cuerpo y en distintos momentos del desarrollo. En la Figura 9-63 se ilustra esquematicamente como el control genico combinatorio hace posible generar una gran cantidad de complejidad biologica con un numero relativamente reducido de protefnas reguladoras. El control combinatorio permite que una protefna reguladora dada no tenga necesariamente una funcion unica y claramente definida, como por ejemplo la de activacion de un grupo determinado de genes 0 la de determinacion de un cierto tipo celular. En lugar de ello, puede tener diferentes funciones que se solapan con las de las otras protefnas reguladoras. Estas protefnas se podrfan comparar con las palabras de un idioma: se utilizan con diferentes sentidos en una variedad de contextos y raramente se utilizan aisladas; una combinacion adecuada es la que contiene la informacion necesaria para especificar un proceso de regulacion genica. Una consecuencia del control genico combinatorio es que el efecto de afiadir una nueva protefna reguladora a una celula dependera de la historia anterior de la celula, pues esta historia determina que protefnas reguladoras se encuentran ya presentes en la celula. Asf durante el desarrollo una celula puede acumular una serie de protefnas reguladoras que pueden no alterar la expresion genica. Cuando se expresa el ultimo miembro de la combinacion requerida de protefnas reguladoras, se completa el mensaje regulador, provocando grandes cambios en el patron de expresion genica. Este modelo, como ya hemos visto, puede explicar el fenomeno de transformacion dramcitico de un fibroblasto en una fibra muscular por la adicion de una unica protefna reguladora. Asimismo podrfa justificar la diferencia, descrita en el Capftulo 21, entre los procesos de determinacion celular, por los cuales una celula queda determinada a seguir una cierta ruta de diferenciacion y un destino, y el proceso de diferenciacion celular por el cual una celula determinada expresa su caracter especializado. Un rasgo esencial de estas ideas es que, una vez que se empieza a expresar una protefna reguladora, puede actuar manteniendo su propia expresion, contribuyendo de este modo a la memoria celular como se discutira de nuevo mas adelante. El control genico combinatorio tiene otra importante consecuencia para la evolucion. Dado que las protefnas reguladoras no son exclusivas de un circuito de regulacion 0 de un gen diana particular, cambio sutiles en elIas pueden producir cambios substanciales en el comportamiento de las celulas.

Se hereda un cromosoma X inactivo47 Hemos visto anteriormente que las protefnas reguladoras pueden producir patrones de expresion genica heredables tanto en celulas eucariotas como procariotas. En la Figura 9-61 se ilustra un posible mecanismo, basado en un bucle de retroalimentacion positiva en el control de la expresion de un gen. Exclusivamente en eucariotas existe un mecanismo adicional, que permite que se herede el patron de organizacion de la cromatina. Posiblemente el ejemplo mas dramatico al respecto sea la inactivacion de uno de los dos cromosomas X en las celulas de las hembras de mamffero. Los cromosomas X e Y son los cromosomas sexuales de los mamfferos: todas las celulas femeninas contienen dos cromosomas X, mientras que las masculinas contienen un cromosoma X y un cromosoma Y. Probablemente debido a que una dosis doble de los productos del cromosoma X podrfa resultar letal, las celulas femeninas han desarrollado un mecanismo para mantener inactivado permanentemente en cada celula uno de los dos cromosomas X. En el raton esto ocurre entre el tercero y el sexto dfas de desarrollo, cuando, en cada celula uno 476

Capitulo 9 : EI control de la expresi6n genica

celula de un embrion temprano

Figura 9-114 Inactivaci6n del X. Herencia clonal de un cromosoma X condensado e inactivo, que tiene lugar en las hembras de los mamfferos.

Xm

CONDENSACION DE UN CROMOSOMA X SELECCIONADO AL AZAR

HERENCIA DIRECTA DEL PATRON DE CONDENSACION DEL CROMOSOMA

'--

----'1 L-I

en este cion solo es activo el cromosoma X m

-'

en este cion solo es activo el cromosoma X p

de los dos cromosomas X, al azar, se condensa en forma de heterocromatina. Este cromosoma se puede ver al mieroscopio optieo durante la interfase como una estructura diferente conocida como corpusculo de Barr, localizado cerca de la membrana nuclear, y se replica al final de la fase S. La mayor parte de su DNA no se transcribe. Este cromosoma X inactivo se hereda fielmente, por 10 que cada hembra es un mosaieo compuesto de grupos clonales de celulas en los que s610 es activo el cromosoma X heredado del padre CXp) y otro mlmero aproximadarnente igual de grupos de celulas en las que tinieamente es activo el cromosomaXheredado de la madre 0Cm). En general, en el animal adulto tanto las celulas que expresan ~ como las que expresan ~ se distribuyen en pequefios grupos, 10 cual refleja la tendencia de las celulas hijas de permanecer cerca unas de las otras durante las tiltimas etapas del desarrollo embrionario y del crecimiento (Figura 9-64). El proceso de condensacion que forma la cromatina condensada (heterocromatina) en un cromosoma X tiene la tendencia a producirse de forma continua a 10 largo del cromosoma. Ello se ha demostrado mediante estudios utilizando animales mutantes en los que uno de los cromosomas X se ha unido a una porcion de un autosoma (un cromosoma no sexual). En estos cromosomas hfbridos a menudo sucede que algunas regiones del autosoma que son adyacentes al cromosoma X inactivado se encuentran condensadas en heterocromatina de forma que los genes que contienen se encuentran inactivados de una manera hereditaria. Esto sugiere que la inactivacion del cromosoma X se produce mediante un proceso cooperativo, que puede imaginarse como una especie de "cristalizacion" de la cromatina que se extiende desde un lugar de nucleacion situado en el cromosoma X. De hecho, se ha localizado genetieamente un tinieo Mecanismos geneticos que originan tipos celulares especializados

477

12345 t

limite

genes I

+

12345

'i

~

~

1 2 3 4 5

~

4 5

1 2 3 4 5

•

~

•

~

1 2 3 4 5

~

proliferaci6n de la celula

~

~

~

cion de celulas con el gen 1 inactivo

cion de celulas con los genes 1, 2 Y 3 inactivos

cion de celulas sin ningun gen inactivo

12345

it'*

eucromatina

(A)

(8)

centro de inactivaci6n en el cromosoma X: fragmentos rotos de cromosoma X no sufren inactivaci6n a menos' que induyan dicho centro. Una vez se ha establecido la estructura condensada de la cromatina, un proceso desconocido hace que la estructura sea heredada de esta forma durante todas las sucesivas replicaciones del DNA. Sin embargo este cambio no es absolutamente permanente ya que el cromosoma X inactivado se reactiva en el proceso de formaci6n de las celulas germinales en la hembra.

Los genes de Drosophila y de levadura tambien pueden inactivarse por caracterfsticas hereditarias de su estructura cromatinica48 Hemos descrito dos ejemplos de efectos de posici6n sobre la expresi6n genica -uno en Drosophila y otro en levadura- que se parecen en diferentes aspectos a la inactivaci6n del cromosoma X (vease Figura 9-51). En ambos casos, una forma especfficamente condensada de cromatina impide la expresi6n de algunos genes, y en ambos casos el estado de condensacion de la cromatina es hereditario. En las moscas que presentan reordenaciones cromos6micas, fenomenos de separaci6n y reagrupamitmto que situan la mitad de una regi6n de heterocromatina cerea de una region de eucromatina tienden a inactivar los genes eucromatfnicos cercanos. La situacion es amiloga a la fusi6n de un autosoma de mamifero con un cromosoma X inactivado, tal como se acaba de describir; los fen6menos de inactivacion son muy similares a estos: la zona de inactivacion se expande desde el punto de separaci6n del cromosoma hasta cubrir uno 0 mas genes. Ademas, mientras que el grado del efecto de expansion es diferente en diferentes celulas, la zona inactivada establecida en una celula embrionaria se hereda de una manera estable por toda la progenie celular (Figura 9-65). El ejemplo de efecto de posici6n que se describe en la Figura 9-51 tambien comparte algunos rasgos con la inactivaci6n del cromosoma X, como son el efecto de expansion y la heredabilidad del estado de condensacion de la cromatina. Aun no ha sido probado que lainactivacion del cromosoma X y los efectos de posicion ob~ervados en moscas tengan un mecanismo comun, pero el paralelismo entre ellos es notable. La identificaci6n y clonaje recientemente de algunos genes de Drosophila y de levadura necesarios para el efecto de posicion permitira descubrir, probablemente, los mecanismos moleculares implicados en estos fenomenos. En la Figura 9-66 se muestra un esquema hipotetico de c6mo podria explicarse el efecto de expansi6n y la naturaleza hereditaria del estado de condensacion de la cromatina. Independientemente de su base molecular, el empaquetamiento de determinadas regiones del genoma formando cromatina condensada es un tipode mecanismo regulador que no se presenta en las bacterias. El fen6meno crucial de esta forma de regulaci6n genica exc1usiva de los eucariotas es el almacen de 478

1 2 3

pronto en el embri6n en desarrollo, se forma la heterocromatina y se extiende sobre la eucromatina vecina hasta distancias diferentes en diferentes celulas

~SLOCACI6N l b~C~'OMOSOMAS heterocromatina

12345

'E

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

Figura 9-65 Fen6meno de variegaci6n por efecto de posici6n en Drosophila. (A) Normalmente, la heterocromatina (rojo) no ocupa las regiones adyacentes de eucromatina (verde) debido ala existencia de limites especiales de secuencias, de naturaleza desconocida. Sin embargo, en algunas moscas que heredan ciertas translocaciones cromos6micas, este limite no esta presente. (B) Durante las primeras fases del desarrollo de estas' moscas, la heterocromatina se extiende sobre el DNA cromosomico vecino, alcanzando diferentes distancias en celulas diferentes. Pronto, esta expansion se detiene, pero el patron establecido de heterocromatina se hereda, de tal modo que se producen grandes clones de celulas descendientes que presentan los mismos genes vecinos condensados en forma de heterocromatina, y por 10 tanto, inactivos (de aquf la apariencia "variegada" de algunas de estas moscas; vease Figura 9-5IB). Este fenomeno se asemeja en muchos aspectos a la inactivacion del cromosoma X que se produce en los mamfferos.

....... .............. ,'t), gen inactivo

kPLICACION DEL DNA

""I ~~o~~~~.~:~~:Ltel una unIon cooperativa

gen activo

~CCOJ REPLICACION DEL

D~

I-

~.CO.C-~

no se unen proteinas

proteina libre

~

I

~OIC lOS DOS GENES HIJOS SON INACTIVOS

lOS DOS GENES HIJOS SON ACTIVOS

una memoria estable de estados genicos en una estructura cromatfnica hereditaria, en lugar de tratarse de un mecanisme de retroalimentacion estable de genes autorreguladores de protefnas reguladoras que pueden difundir de un lade a otro del nticleo. Se desconoce si los mecanismos de este tipo acttian solo en grandes regiones inactivas de los cromosomas 0 si tambil~n pueden hacerlo a nivel de uno 0 de unos cuantos genes.

Cuando las celulas de vertebrados se dividen, pueden heredar el patr6n de metilaci6n del DNA49 Los nucleotidos del DNA pueden ser modificados de forma covalente, yen vertebrados la metilacion de citosina parece constituir un mecanisme importante para distinguir genes activos de los que no 10 son. La molecula de 5-metilcitosina (5-metil C), tiene la misma relacion con la citosina que la timidina con el uracilo, y de manera similar no afecta al apareamiento de bases (Figura 9-67). La metilacion en el DNA de vertebrados esta restringida a los nucleotidos citosina (C) en 'la secuencia CG, que esta apareada exactamente con la misma secuencia (en direccion opuesta) de la otra hebra de la helice del DNA. Consecuentemente, un sencillo mecanisme permite que un patron preexistente de metilaci6n del DNA se herede directamente por las moleculas de DNA hijas. Una enzima Hamada metilasa de mantenimiento acttia preferentemente sobre las secuencias CG apareadas previamente con una secuencia CG metilada. A consecuencia de eHo, el patron preexistente de metilacion de la cadena parental de DNA acttia como un molde para la metilacion de las cadenas de DNA hijas, haciendo que el patron sea heredado directamente a traves de la replicacion del DNA (Figura 9-68). Las bacterias producen enzimas que han sido muy titiles para el estudio de la metilacion en las celulas de vertebrados. Utilizan la metilacion en A 0 en C en una secuencia especffica a fin de protegerse de la accion de sus propias nucleasas de restriccion. Por ejemplo, la nucleasa de restriccion HpaII, corta la secuencia CCGG siempre y cuando la C central no este metilada. Asf la susceptibilidad de una molecula de DNA a ser cortada por la HpaII puede utilizarse para detectar si determinados puntos del DNA estan metilados 0 no. La heredabilidad de los patrones de metilacion en vertebrados se puede estudiar en celulas en cultiva utilizando en primer lugar enzimas metiladoras bacterianas para introducir grupos metilo en las citosinas, y despues utilizando nucleasas de restriccion para seguir la heredabilidad de dichos grupos. La enzima utilizada normalmente para introducir bases 5-metil C en secuencias determinadas CG es la enzima HpaII metilasa, que normalmente protege a la bacteria contra su propia nuclea-

Figura 9-67 Formaci6n de 5-metilcitosina por metilaci6n de una citosina en la doble helice del DNA. En los vertebrados este fenomeno esta restringido a citosinas (Cl escogidas que forman parte de la secuencia CG. Mecanismos geneticos que originan tipos celulares especializados

Figura 9-66 Esquema general que permite la herencia directa de estados de expresi6n de genes durante la replicaci6n del DNA. En este modelo hipotetico, porciones de un grupo de protefnas reguladoras de la expresion genica, que se unen entre sf de forma cooperativa, se transfieren directamente desde la helice paterna de DNA (arriba a la izquierdal a ambas Mlices hijas. Entonces, el grupo de protefnas heredado de cada una de las helices hijas provoca que se unan a el otras copias de la misma protefna reguladora. Como la union es cooperativa, el DNA sintetizado a partir de una Mlice paterna de DNA identica a la anterior, pero que no presenta las protefnas unidas (arriba a la derechal, permanecera libre de ellas. Si estas protefnas unidas inactivan la transcripcion de un determinado gen, el estado inactivo del gen se heredani directamente, como en el ejemplo. Si la union cooperativa de las protefnas requiere secuencias especfficas de DNA, estos fenomenos estanin limitados a regiones de control genico especfficas; sin embargo, si la union se puede propagar a todo 10 largo del cromosoma, podrfa explicar el efecto de expansion asociado con los estados heredables de la cromatina que se discute en el texto.

citosina H

5-metilcitosina H

H

H

metilacion

479

CH 3

CH3

I

I

citosina no metilada

\

y

CH

I

ACGTATCGT

5'

citosina metilada

3'1,1I.WUII.5' I

ACGTATCGT 5'

3'

3'1I.WUII.5' TGCATAGCA

__ m_et_i1a_c_i6_n....... ::

TGCATAGCA

3.

replicaci6n del DNA

no reconocido por una enzima metilante de mantenimiento

II.WUII.:: ACGTATCGT

3'

TGCATAGCA

I

I

CH3

reconocido por una enzima metilante de mantenimiento CH 3

I

I

CH 3 metilaci6n

.

ACGTATCGT 5'!I"li~~~3'

III1I11II

3' . . . . . . . . . . . 5' TGCATAGCA

I CH3

sa de restriccion. Si se utiliza esta enzima para metilar la C central de la secuencia CCGG de una molecuia clonada de DNA que luego se introduce en una celula de vertebrado, se puede demostrar que el patron de metilacion se mantiene como hemos descrito: cada secuencia individual metilada CG se mantiene a 10 largo de muchas divisiones, mientras que las secuencias CG no metiladas permanecen sin metilar. La existencia de la metilasa de mantenimiento explica la herencia automlitica de nucleotidos 5-metil C, pero dado que normalmente no metila DNA no metilado previamente, no puede explicar como se afiadio el primer grupo metilo a un organismo vertebrado. Si se inyecta DNA completamente carente de metilacion a un huevo de raton fertilizado, se afiadinin grupos metilo a casi cada secuencia CG (con una importante excepcion que se discutira mas adelante). Se cree que este efecto es debido a otra actividad metilasa de establecimiento presente en el huevo. Como se vera, la metilacion de novo tambien ocurre durante los procesos de diferenciacion de celulas especializadas, aunque se desconoce como se realiza.

En las celulas de los vertebrados la metHacion del DNA refuerza las decisiones del desarroll0 50 Aunque en un principio se propuso que la metilacion del DNA podrfa jugar un papel dominante en la generacion de los diferentes tipos celulares de mamfferos, actualmente se Ie reconoce un papel mas suti!. En algunos invertebrados, incluyendo a Drosophila, el DNA no esta metilado y sin embargo el proceso de diversificacion de los diferentes tipos celulares parece ser similar entre Drosophila y los vertebrados. Algunas observaciones apoyan la idea de que la metilacion del DNA en vertebrados esta relacionada con la inactivacion genica, pero que solo es un mecanismo de refuerzo de una decision adoptada previamente por otro mecanismo. Asf pues experimentos con la enzima Hpall demuestran que en general el DNA de los genes inactivos esta mas fuertemente metilado que el de los genes activos. Sin embargo, cuando un gen que estaba inactivo se activa durante el desarrollo pierde parte de su metilacion unicamente despues de haber sido activado. De manera similar, el cromosoma X femenino descrito anteriormente, primero se condensa e inactiva, y solo posteriormente incrementa el nivel de metilacion de sus genes. Entonces, ique hace la metilacion? Y, icual es su utilidad para el organismo? Tenemos al menos dos indicios importantes al respecto. Primero, se puede preparar el DNA correspondiente a un gen de actina especffico de musculo en dos formas, una completamente metilada y otra sin metilar. Cuando estas dos versiones del gen se introducen en celulas musculares en cultivo, ambas se transcriben 480

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

Figura 9-68 De que forma se pueden heredar con precisi6n los patrones de metilaci6n del DNA. En los DNA de vertebrados, una gran cantidad de las bases de citosina de la secuencia CG estan metHadas (vease Figura 9-67). Dada la existencia de una enzima metHante dirigida par grupos metHo (la metHasa de mantenimiento), una vez se ha establecido un determinado patron de metHacion del DNA, cada punto de metHacion se hereda en el DNA descendiente, tal como se muestra en esta figura. Esto implica que los cambios en los patrones de metHacion del DNA se pueden perpetuar en toda la progenie de una celula.

"".'& i,rn"~"pci'" protefnas

factores generales

GEN ACTIVO

• PERDIDA DE LAS PROTEiNAS REGULADORAS

I I

&

GEN INACTIVO PERO MEN GOTEO u

NUEVA MEnlAC'ON DEL DNA

Figura 9-69 De que forma la metilaci6n del DNA puede ayudar a inactlvar genes. La uni6n de las proteinas reguladoras y de los factores generales de transcripci6n cerca de un promotor activo impide la metilaci6n del DNA por un mecanismo desconocido. Si la mayona de estas proteinas de uni6n al DNA especfficas de secuencia se disocian, como ocurre cuando el gen se inactiva, la secuencia de DNA puede metilarse, 10 que impedini que se unan otras proteinas e inactivara completamente el gen.

~HHHHi-----

=_6

UN'ON DEPROrriNAS

.MET"C_

GEN COMPLETAMENTE INACTIVO

a la misma elevada velocidad. Sin embargo, cuando se introducen en fibroblastos, que normalmente no transcriben el gen, el gen no metilado es transcrito a nivel bajo pero mucho mas alto que el del gen ex6geno metilado 0 que el del gen end6geno del fibroblasto (que tambien esta metilado), que no se transcriben en absoluto. Segundo, a partir de experimentos bioquimicos se ha podido identificar en vertebrados una proteina que se une fuertemente al DNA Yque contiene nucle6tidos 5-metil C agrupados. Se cree que la uni6n de esta proteina empaqueta el DNA metilado de tal forma que 10 hace especialmente resistente ala activaci6n por la maquinaria de transcripci6n. Estos experimentos sugieren que la metilaci6n del DNA se utiliza en vertebrados fundamentalmente para asegurar que cuando un gen se inactiva quede completamente inactivado (Figura 9-69). Los experimentos realizados para comprobar si una secuencia de DNA que se transcribe con gran frecuencia en un tipo celular determinado de vertebrado 10 hace 0 no en otro tipo celular han demostrado diferencias de velocidad de transcripci6n entre dos tipos celulares del orden de mas de 106 veces. Genes inactivos de vertebrados se transcriben mucho menos que genes inactivos de bacterias, en los que las mayores diferencias conocidas en cuanto a la velocidad de transcripci6n entre genes expresados y no expresados son de aproximadamente 1000 veces. La metilaci6n del DNA podria ser la responsable de al menos una parte de esta diferencia. Ademas, como se vera mas adelante, la metilaci6n del DNA es necesaria para al menos un tipo de memoria celular.

La actividad gen6mica heredable requiere la metilaci6n del DNA51 La celulas de mamfferos son diploides, conteniendo un grupo de genes heredado , del padre y otro de la madre. Se han encontrado pocos casos en los que la expresi6n de un gen dependa de si se ha heredado del padre 0 de la madre. Este fen6menD se ha denominado actividad gen6mica heredable 0 marcaje del genoma (genomic imprinting). Aunque no fue descubierto de ese modo, se han observado ejemplos notables en experimentos con ratones transgenicos. Por ejemplo, es posible obtener ratones transgenicos en los que una de las dos copias normales del gen que codifica elfactor de crecimiento similar ala insulina-2 (IGF-2, de Insulinlike Growth Factor-2") se ha inactivado por mutaci6n. Este rat6n, heterocigoto, se Mecanismos geneticos que originan tipos celulares especializados

481

desarrolla normalmente si el gen defectivo Igf-2 procede de la madre, pero presentan graves anomalias, creciendo solamente la mitad de 10 que es normal, si el gen defectivo Igf-2 procede del padre. La explicaci6n se obtuvo del anaIisis posterior de estos ratones transgenicos y de ratones normales. Tanto en los ratones normales como en los transgenicos s610 se transcribe la copia del gen Igf-2 paterno, mientras que el gen obtenido de la madre es silencioso: se dice en este caso que el gen obtenido de la madre ha sido marcado (imprinted). Aunque los mecanismos de marcaje del genoma no estan daros, es muy probable que participe la metilaci6n del DNA. Asi, en ratones transgenicos defectivos en la metilasa de mantenimiento, el marcaje del gen Igf-2 materna no se produce 10 que nos indica que el mecanismo que permite diferenciar las copias materna y paterna del gen Igf-2 implica la metilaci6n del DNA. Tambien es muy interesante el hecho de que los ratones que carecen de metilasa de mantenimiento mueran en el estado de embriones tempranos. Esto podria ser la consecuencia de un marcaje del genoma defectuoso, pero tambien se podria argtiir que el fallo primario fuese la imposibilidad de reforzar las decisiones del desarrollo por metilaci6n del DNA, 10 que conduciria a que los miles de genes inactivos que existen en una celula de vertebrados mantuvieran una velocidad de transcripci6n minima.

En los mamiferos, las islas ricas en CG estan asociadas con alrededor de 40 000 genes52 Debido al funcionamiento de la via de reparaci6n de DNA, los residuos C metilados en el genoma tienden a ser eliminados en el curso de la evoluci6n. La desaminaci6n accidental de una C no metilada da lugar a U, base que habitualmente no esta presente en el DNA, por 10 que es reconocida facilmente por la enzima de reparaci6n de DNA, la uracilo DNA glucosilasa, eliminada y luego reemplazada por una C (se describe en el Capitulo 6). Pero la desaminaci6n accidental de una 5-metil C no puede ser reparada de este modo, porque el producto de la . desaminaci6n es una T que, por 10 tanto, no se puede diferenciar de los otros residuos T no mutantes del DNA. Aunque existe un sistema especial de reparaci6n para eliminar estos mutantes T (vease pag. 267), muchas de estas desaminaciones no son detectadas, por 10 que los residuos C del genoma que estan metilados tienden a mutar a T durante la evoluci6n. A 10 largo de la evoluci6n mas de tres de cada cuatro CG se han perdido por este sistema, dejando a los vertebrados con una deficiencia notable en este dinude6tido. Las secuencias CG que todavia existen estan distribuidas de una forma desigual por el genoma; en determinadas regiones, de 1000 a 2000 pares de bases de longitud, las secuencias CG estan presentes a densidades de entre 10 y 20 veces su densidad media en todo el genoma; estas zonas reciben el nombre de Islas CG. Estas islas, con algunas notables excepciones, parecen mantenerse no metiladas en todos los tipos celulares. Se ha observado que rodean los promotores de los llamados genes de mantenimiento (housekeeping genes) -genes isla CG intrones

exones de la dihidrofolato reductasa

5'

RNA

DNA

~ 3'

gen de la hipoxantina fosforribosil transferasa i'iii·"!!"'ii'W;kj"::;'_·

5'

-"!i,i'!E! 10 horas

~

mRNA de factor INESTABLE de crecimiento mRNA de histona

LASfNTESIS DEL DNA MODUlASU ESTABILIDAD

30 minutos 1 hora cuando la celula esta sintetizando DNA. pero 12 minutos cuando la celula no sintetiza DNA

bacterias en las que permite a las proteinas ribos6micas presentes en exceso reprimir la traducci6n de sus propios mRNA -constituyendo un mecanisme de regulaci6n par retroalimentaci6n negativa. En las celulas eucariotas una forma de control negative traduccional particularmente bien estudiada permite que la sintesis de la proteinaferritina, de almacenamiento de hierro, se ajuste nipidamente al nivel de iones de hierro solubles. La regulaci6n par hierro depende de una secuencia de aproximadamente 30 nucle6tidos en la secuencia lider 5' de la molecula de mRNA de la ferritina. Este elemento de respuesta al hierro se pliega formando una estructura en forma de bucle que se une a una proteina represora de la traducci6n denominada aeonitasa, que bloquea la traducci6n de cualquier secuencia de RNA que se encuentre par detnis (vease Figura 9-83). La aconitasa es una proteina que une hierro y la exposici6n de la celula al hierro produce su disociaci6n del mRNA de la ferritina, liberando el bloqueo de la traducci6n e incrementando la producci6n de ferritina hasta 100 veces.

Figura 9-84 Establlidad del RNA. Tres RNA distintos con vidas medias muy diferentes. La degradaci6n continua y nipida de las moltkulas de mRNA que codifican varios factores de crecimiento permite que su concentraci6n vade con rapidez en respuesta a senales extracelulares. La vida media del RNA del factor de crecimiento viene determinada por una senal, que condiciona su nipida degradaci6n, en la regi6n 3' no traducida (UTR 3') (vease Figura 9-85). Las histonas son necesarias especialmente para construir la nueva cromatina formada durante la sfntesis del DNA; un cambio notable en su estabilidad ayuda a confinar la sfntesis de histonas ala fase Sdel cicio celular.

La expresi6n genica puede estar controlada por variaciones de la estabilidad del mRNA64 La mayoria de los RNA de una celula bacteriana son muy inestables: tienen un periodo de vida media de aproximadamente 3 minutos. Debido a que los mRNA bacterianos se sintetizan y degradan con rapidez, las bacterias pueden adaptarse nipidamente a los cambios ambientales. Los mRNA de las celulas eucariotas son mas estables. Algunos, como los que codifican la ~-globina, tienen un periodo de vida media de mas de 10 horas. Sin embargo, otros tienen un periodo de vida media de menos de 30 minutos. A menudo, los mRNA inestables codifican proteinas reguladaras, tales como factores de crecimiento y proteinas de regulaci6n genica, cuyos niveles cambian nipidamente en las celulas (Figura 9-84). Muchos de estos mRNA son inestables debido a que contienen secuencias especificas que estimulan su degradaci6n. Por ejemplo, cuando mediante tecnicas de DNA recombinante se transfiere la secuencia larga rica en nucle6tidos A y U en la regi6n 3' no traducida (UTR) de algunos mRNA inestables, a otros mRNA estables, estos se vuelven inestables. Esta secuencia rica en AU parece acelerar la degradaci6n del mRNA estimulando la eliminaci6n de la cola poli-A que se encuentra en el extremo 3' de muchos mRNA eucariotas. Contrariamente, otros mRNA inestables contienen lugares de reconacimiento para endonucleasas especificas que cartan el mRNA en sus regiones UTR 3' (Figura 9-85). La estabilidad de un mRNA puede cambiar en respuesta a senales extracelulares. Asi par ejemplo, las harmonas esteroideas afectan a una celula no s610 incrementando la transcripci6n de determinados genes sino tambien incrementando la estabilidad de varios de sus mRNA. Por el contrario, la adici6n de iones hierro a las celulas reduce la estabilidad del mRNA que codifica la proteina receptara que se une a la proteina de uni6n al hierro transferrina, con 10 que se reduce la producci6n del receptor. Parece ser que la desestabilizaci6n del mRNA del receptor de transferrina esta mediada par la misma proteina de uni6n al Controles post-transcripcionales

495

DOS MECANISMOS EUCARIOTAS PARA LA DEGRADACI6N DEL mRNA

5'

I

secuencia codificante 3' UTR Ii I mil 1ji!§!li\\l1AAAAA 3'

5'

II'

L...J

l l

secuencia rica en AU P=::IIlI\\'IIlA 3'

5'

5'

degradaci6n

Mill

Figura 9-85 Control de la degradaci6n del RNA. Determinadas secuencias especiales en la regi6n 3' no traducida (UTRl de los mRNA inestables son las responsables de su nipida degradaci6n. Como se ha indicado, las secuencias ricas en AU que se encuentran en las UTR 3' de muchos mRNA de vida carta son las responsables de la eliminaci6n nipida de la cola poli-A, 10 que hace inestable aI mRNA. Otros mRNA contienen secuencias en su UTR 3' que actl1an como lugares de corte para endonudeasas especificas.

AAAAA 3'

AAAAA 3'

degradaci6n

una secuencia de 50 nucle6tidos rica en AU y conservada evolutivamente en la regi6n UTR 3' favorece la eliminaci6n de la cola poli-A, 10 que hace que el mRNA sea inestable

una secuencia repetida en la secuencia UTR 3' permite el corte de la regi6n UTR 3' por una endonucleasa especffica. Los fragmentos son degradados con rapidez

RNA que controla la traducci6n del mRNA de la ferritina. En este caso, la aconitasa se une ala UTR 3' del mRNA del receptor de transferrina provocando un incremento en la producci6n de receptor, probablemente al impedir la acci6n de secuencias que, de otra manera, activarian la degradaci6n del mRNA. Cuando se afiade hierro la aconitasa es liberada del mRNA con 10 que se reduce la estabilidad de este (Figura 9-86).

La degradaci6n selectiva del mRNA esta acoplada a la traducci6n65 El control de la estabilidad del mRNA en celulas eucariotas se comprende mejor para el caso de los mRNA que codifican histonas. Estos mRNA tienen una vida media de aproximadamente 1 hora durante la fase S del cielo celular (cuando se necesitan nuevas histonas) pero se degradan en cuesti6n de minutos cuando se detiene la sfntesis de DNA. Si se inhibe la sfntesis de DNA con una droga durante la fase S, los mRNA de las histonas se vuelven inestables inmediatamente, quizas porque la acumulaci6n de histonas libres en ausencia de DNA que unir aumenta la velocidad de su degradaci6n. La regulaci6n de la estabilidad de las histonas depende de un corto tallo y un buele 3' que reemplaza la cola poli-A del extremo 3' de otros mRNA (vease figura 9-84). Despues de que el mRNA de las histonas se haya sintetizado por la CARENCIA DE HIERRO aconitasa citos61ica

aconitasa citos61ica

5'_...,.....

mRNA de ferritina

~

AAA 3'

mRNA del receptor de transferrina 5' . . iliiiiiiiiiiiiiiiil

~

bloqueo de la traducci6n

_

AAA3'

el mRNA es estable y se traduce

SE SINTETIZA RECEPTOR DE TRANSFERRINA

EXCESO DE HIERRO

mRNA del receptor mRNA de ferritina

5'

5,IIIIIIIIIIIide . .transferrina .iiiiliiiii..._ _

••

~ el mRNA se degrada

--- - AAA 3' ~ el mRNA se traduce SE SINTETIZA FERRITINA (A)

496

:~"'.I_

AAA3'

...

ll_!._l_ _I!I._ccCc'~"'w'c

~!:. .~ i i _ - = = (B)

Capitulo 9 : EI control de la expresi6n genica

i

Figura 9-86 Dos controles posttraduccionales controlados par hIerro. En respuesta a un incremento en la concentraci6n citos6lica de hierro, una celula aumenta su sfntesis de ferritina para unir el hierro extra (Al y reduce la sfntesis de receptores de transferrina para reducir la importaci6n de hierro (B). Ambas respuestas estan mediadas por la misma protefna reguladora de respuesta aI hierro, la aconitasa, que reconoce rasgos comunes en las estructuras en tallo y bude de los mRNA que codifican la ferritina y el receptor de transferrina. Cuando la aconitasa une hierro, se disocia del mRNA. Debido a que el receptor de transferrina y la ferritina estan reguladas por diferentes tipos de mecanismos, sus niveles responden de forma opuesta a las concentraciones de hierro, a pesar de estar regulados par la misma protefna sensible aI hierro. (Adaptado de M.W. Hentze et aI., Science 238: 1570-1573, 1987; J.L. Casey et aI., Science, 240: 924-928, 1988.)

RNA polimerasa II, una reacci6n de segmentaci6n especial, que requiere un apareamiento de bases con un pequeno RNA de una particula ribonucleoproteica crea este extremo 3'. Si por metodos de DNA recombinante se transfiere este extrema 3' a otros mRNA, tambien se vuelven inestables cuando se para la sintesis de DNA. Por 10 tanto, como ocurre en otros tipos de mRNA, la velocidad de degradaci6n esta fuertemente influida por senales pr6ximas al extremo 3', donde se cree que empieza la degradaci6n del RNA. Si en medio de una secuencia codificante de un mRNA de una histona se inserta un cod6n de paro, el mRNA ya no se degrada rapidamente. Por 10 tanto se ha sugerido que la nucleasa responsable de la degradaci6n de los mRNA se une al ribosoma y que la mayor parte del mRNA de la histona ha de ser traducido antes de que la nucleasa pueda empezar a digerir el extrema 3' del mRNA. Esta hip6tesis podria explicar por que la mayona de los mRNA inestables se estabilizan selectivamente cuando las celulas se tratan con el inhibidor de la sintesis proteica cicloheximida. El acoplamiento de la degradaci6n del mRNA a la traducci6n puede ser un mecanisme para asegurar que las moleculas de mRNA recien sintetizadas en una celula eucariota no sean destruidas hasta que se hayan traducido al menos una vez.

EI control citoplasmatico de la longitud de las cadenas de poli-A puede afectar tanto ala traducci6n como ala estabilldad del mRNA66 La poliadenilaci6n inicial de una molecula de RNA (descrita en el Capitulo 8) tiene lugar en el mlcleo aparentemente de forma automatica para casi todos los precur': sores de mRNA eucariotas (siendo una excepci6n los mRNA de las histonas descritos previamente). Una vez en el citoplasma,las colas poli-A de 200 nucle6tidos de longitud de muchos transcritos, son recortadas paulatinamente durante algunos dfas. No se han observado colas poli-A mas cortas de 30 residuos A, 10 que sugiere que esta sena la longitud minima necesaria para la estabilidad del mRNA. Asimismo, la longitud de algunas colas poli A esta controlada especfficamente, bien por adici6n selectiva de poli-A bien por eliminaci6n selectiva de poli A (Figura 9-87A). Docitos y huevos en maduraci6n constituyen un ejemplo notable de control de la expresi6n genica mediante adici6n de poli A a mRNA especfficos. En estas celulas gigantes parecen estar inactivas muchas de las vias de degradaci6n de mRNA, de forma que las celulas puedan fabricar grandes cantidades de mRNA como preparaci6n para la fertilizaci6n. Muchos de los mRNA se almacenan con

l l

mRNA

Figura 9-87 EI control de la longitud de la cola poH-A afecta tanto ala estabUidad como ala traducci6n del mRNA. (A) la mayoria de los mRNA tiene colas poH-A que exceden la longitud minima de 30 residuos A. Las colas de determinados mRNA pueden alargarse 0 cortarse especfficamente en el citosol, 10 cual influye en la traducci6n de estos mRNA. (B) Se ha propuesto un modelo para expHcar la estimulaci6n de la traducci6n que se observa al incrementar la longitud de la cola poH-A. Las subunidades ribos6micas grandes pueden ser recicladas directamente, una vez han acabado la cadena proteica, desde cerca del extremo 3' de una molecula de mRNA al extrema 5' para iniciar de nuevo la sintesis de una molecula de proteina, por proteinas especiales de uni6n a la secuencia poH-A (rojo). subunidad ribos6mica pequena en el cod6n de iniciaci6n

corte y adici6n de la cola pol i-A

alargamiento de la cola poli-A

NUCLEO

--_.....)

(~------­

CITOSOL

, tt ,

conjunto de mRNA traducibles

subunidad ribos6mica grande LAS PROTEfNAS UNIDAS A LA COLA POLl-A CATALIZAN LA ENTRADA DE LA SUBUNIDAD RIBOSCMICA GRANDE

perdida gradual de poli-A de todos los mRNA

J

...

l ...... .,.

degradaci6n rapida de mRNA

(A)

Controles post-transcripcionales

(B)

inicio de la traducci6n por el ribosoma completo

497

colas poli-A de s610 10 a 30 residuos A en sus extremos 3' yen esta forma no se traducen. En ciertos momentos del desarrollo, cuando son necesarios los productos codificados por estos mensajeros, se les anade poli A al extrema 3', 10 que estimula notablemente la iniciaci6n de su traducci6n. En la Figura 9-87B se explica c6mo la adici6n de poli A al extremo 3' puede afec:tar al inicio de la traducci6n pr6ximo al extrema 5' del mRNA.

Algunos mRNA contienen sefiales de reconocimiento que interrumpen el proceso normal de la traduccion67 Los controles traduccionales descritos hasta el momenta afectan la velocidad con la cual se inician las nuevas cadenas de protefna sobre una molecula de RNA. Normalmente, la traducci6n, una vez se ha iniciado, llega automaticamente hasta el final, Sin embargo, existen casos especiales, en los que por un proceso denominado recodificaci6n traduccional se puede modificar la protefna que finalmente se produce. La forma de recodificaci6n observada con mayor frecuencia es la de cambio de pauta de lectura traduccional. Este tipo de recodificaci6n es muy frecuente en retrovirus, permitiendoles sintetizar mas de una protefna a partir de un mismo mRNA. Estos virus suelen producir tanto las protefnas de la capside (proteinas Gag) como la transcriptasa inversa y la integrasa (proteinas Pol) a partir del mismo transcrito de mRNA. Los virus necesitan muchas mas copias de la protefna Gag que de la protefna Pol, y muchos de ellos consiguen ajustar sus producciones relativas teniendo los genes gagy pol en pautas de lectura diferentes, con un cod6n de para al final de las secuencias codificantes de gag que puede ser eliminado por un cambio de pauta de lectura traduccional poco frecuente. El cambio de pauta de lectura ocurre exclusivamente en un cod6n particular y requiere una senal de recodificaci6n, que parece que es un rasgo estructural de la secuencia de RNA siguiente a este lugar (Figura 9-88) Principios similares a este se utilizan en algunas otras formas de recodificaci6n en lugares especfficos del mRNA. Asf pues, se han descrito senales de recodificaci6n que provocan un cambio de pauta de lectura de +1 en lugar del-l que actua en los RNA viricos y que se muestra en la Figura 9-88. En otras ocasiones la secuencia nucleotfdica que rodea al cod6n de paro 10 hace ser debil, de forma que se afiaden aminoacidos adicionales al final de la cadena polipeptfdica. Mas sorprendente aun es el mecanisme descubierto recientemente que inserta el aminoacido modificado selenocisteina en una cadena proteica. La selenocistefna, que es esencial para la funci6n de algunas enzimas, contiene un Momo de selenio en lugar del atomo de azufre de la cistefna y se encuentra unida a una molecula de tRNA especial. El tRNA tiene afinidad hacia una senal de recodificaci6n presente en las moleculas de mRNA que codifican protefnas que utilizan selenocistefna. La selenocistefna se incorpora en codones UGA especiales, que en muchos otros casos podrfan haber servido como codones de paro deteniendo la sfntesis de protefnas.

SIN CAMBIO DE PAUTA DE LECTURA (90% de los ribosomas)

498

CAMBIO DE PAUTA DE LECTURA (10% de los ribosomasl

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

Figura 9-88 El cambio de pauta de lectura traduccional es necesario para producir la transcriptasa inversa y la integrasa de un retrovirus. La transcriptasa inversa virica y la integrasa se producen por el corte de la gran protefna de fusi6n Gag-Pol, mientras que las protefnas de la capside del virus se producen a partir del corte de la protefna Gag, mas abundante. Tanto la protefna Gag como la protefna de fusi6n se inician en el mismo punta, pero la protefna Gag termina en un cod6n de para de la misma pauta de lectura (no mostrado); el cambia de pauta de lectura indicado elimina este cod6n de paro, permitiendo la sfntesis de la protefna de fusi6n mas larga. EI cambia de pauta de lectura ocurre debido a que ciertos rasgos de la estructura local'del RNA (induyendo un bude de RNA que no se muestra) hacen que el tRNALeu unido aI extrema carboxilo del polipeptido en crecimiento se deslice un nude6tido hacia atras sobre el ribosoma, de modo que ya no se aparea can el cod6n UUA que ha especificado su incorporaci6n, sino can el cod6n UUU; el siguiente cod6n en la nueva pauta de lectura (AGG) especifica una arginina en lugar de una glicina. La secuencia que se muestra procede del virus del SIDA, HIV. (Adaptado de T. Jacks et aI., Nature 331: 280-283, 1988.)

cola

3'

EL RNA I REGULADOR SE UNEALRNAII ELRNAIY EL RNA II FORMAN UNA HELICE PERFECTA

3'

RNAI

forma activa del RNA II

Es muy probable que las reacciones catalizadas por RNA tengan un origen muy antiguo 68 Todos los mecanismos de control post-transcripcional descritos en esta secci6n dependen de que una determinada molecula de RNA sea reconocida especfficamente para un tratamiento especial, como la maduraci6n edici6n 0 degradaci6n. En algunos casos este reconocimiento esta realizado por proteinas especializadas de uni6n al RNA. Sin embargo, en otros casos, el reconocimiento de secuencias de RNA especfficas es nevado a cabo por otras moleculas de RNA que utilizan el apareamiento RNA-RNA como parte de su mecanismo de reconocimiento. Por ejemplo, se sabe que los apareamientos RNA-RNA juegan un papel importante en la traducci6n, en la maduraci6n del RNA en otras formas de procesamiento del RNA y en la edici6n del RNA que tiene lugar en tripanosomas. Intentando diseccionar los mecanismos de control post-transcripcional se ha entrado de neno en el mundo del RNA. Las moleculas de RNA tienen otros papeles reguladores en la celulas. La estrategia del RNA antisentido para la manipulaci6n experimental de celulas consiste en impedir que las celulas expresen un gen determinado (vease pag. 350) mimetizando un mecanismo normal del que se sabe que regula la expresi6n de algunos genes seleccionados en bacterias, y puede ser que la celula 10 utilice mas ampliamente de 10 que hasta ahora se habia creido. Un ejemplo bien conocido de este tipo de mecanismo es el que forma el control por retroalimentaci6n de la iniciaci6n de la replicaci6n del DNA de una gran familia de plasmidos de DNA bacterianos. Este controllimita el numero de copias de plasmido que una celula puede contener, evitando que el plasmido mate a la celula por un exceso de replicaci6n (Figura 9-89). Los estudios de las reacciones catalizadas por el RNA son de un gran interes desde el punto de vista evolutivo. Tal como describimos en el Capitulo 1, parece que las primeras celulas carecfan de DNA y podrian haber contenido pocas 0 ninguna proteina. Muchas de las reacciones catalizadas por RNA parecen ser f6siles moleculares -descendientes de la compleja red de reacciones catalizadas por RNA que se cree dominaron el metabolismo hace 3,5 mil millones de afios. La tecnologia del DNA recombinante ha permitido que, utilizando RNA polimerasas, se puedan producir in vitro grandes cantidades de RNA puros de una secuencia determinada cualquiera (vease Figura 7-36), haciendo posible estudiar la quimica detallada de las reacciones catalizadas por RNA. A partir de la comprensi6n de muchas de estas reacciones, los bi610gos tienen la esperanza de ser capaces de trazar la via por la cual evolucion6 la primera celula viva.

forma inactiva del RNA II

Figura 9-89 Estrategia del RNA antisentido para regular el munero de phismidos en una bacteria. La interacci6n reguladora entre dos moleculas de RNA mantiene constante el mimero de copias de pllismido en la familia ColEl de los pllismidos de DNA bacteriano. El RNA I (de aproximadamente 100 nucle6tidos de largo) es un RNA regulador que inhibe la actividad del RNA II (de aproximadamente 500 nucle6tidos de largo) en la iniciaci6n de la replicaci6n del DNA del pllismido. La concentraci6n del RNA I se incrementa en proporci6n al mimero de moltkulas de DNA plasmfdico en la celula, de modo que a medida que el mimero aumenta se inhibe su replicaci6n. El RNA I tiene una secuencia complementaria a la del extrema 5' del RNA II. En el RNA II, la secuencia 2 es complementaria tanto de la secuencia 1 como de la secuencia 3, y se desplaza de una a la otra mediante su uni6n al RNA I; por 10 tanto el RNA I altera la conformaci6n de la secuencia 4 inactivando el RNA II. (Seglin H. Masukata y J. Tomizawa, Cell 44:125136,1986.)

Resumen Muchos de los pasos de la ruta que va desde el RNA hasta la prote{na estdn regulados por las celulas para controlar la expresiOn genica. Se cree que la mayoria de los genes estdn regulados en multiples niveles, aunque habitualmente predomina el Controles post-transcripcionales

499

control de la iniciacion de la transcripcion (control transcripcionalJ. Sin embargo, algunos genes son transcritos a un nivel constante y activados y desactivados exclusivamente por mecanismos reguladores post-transcripcionales. Estos procesos incluyen (1) la atenuacion del transcrito por su prematura ftnalizaciOn, (2) seleccion alternativa del punto de maduracion, (3) control de la jormacion del extremo 3' por ruptura y adiciOn de poli-A, (4) control del transporte desde el nu.eleo al citoplasma, (5) localizacion de mRNA en lugares particulares de la celula, (6) edicion del RNA, (7) control de la iniciacion de la traduccion, (8) degradaciOn regulada del mRNA, y (9) recodiftcacion traduccional. La mayorla de estos procesos de control requieren el reconocimiento de secuencias espectjicas 0 de estructuras que sean reguladas en la molecula de RNA. Este reconocimiento se puede llevar a cabo ya sea por una prote{na reguladora 0 por una molecula reguladora de RNA.

Bibliografia General Branden, e.; Tooze, J. Introduction to Protein Structure. New York: Garland, 1991. Darnell, J,; Lodish, H.; Baltimore, D. Biologfa celular y molecular, 2." ed. Barcelona: Ediciones Omega, S.A., 1993. Lewin, B. Genes, 4th ed. New York: Wiley, 1990. Schleif, R. Genetics and Molecular Biology. Reading, MA: Addison-Wesley, 1986. Stent, G.S.; Calendar, R Molecular Genetics: An Introductory Narrative, 2nd ed. San Francisco: W.H. Freeman, 1978. Watson, J.D.; Hopkins, N.H.; Roberts, J.W.; Steitz, J.A.; Weiner, A.M. Molecular Biology of the Gene, 4th ed. Menlo Park, CA: Benjamin-Cummings, 1987.

CUas 1. Gurdon, J.B. The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles.]. Bmbryol. Exp. Morphol. 10:622-640, 1962. Gurdon, J.B. The generation of diversity and pattern in animal development. Cell 68:185-199, 1992. Nomura, K; Komamine, A. Identification and isolation of single cells that produce somatic embryos at a high frequency in a carrot suspension culture. Plant Physiol. 79:988-991, 1985. Steward, F.C.; Mapes, M.O.; Mears, K Growth and organized development of cultured cells. Am. ]. Bot. 45:705-713, 1958. Wareing, P.F.; Phillips, J.D.J. The Control of Growth and Differentiation in Plants, 3rd ed. Oxford, UK Pergamon Press, 1986. 2. Garrels, J,I. Changes in protein synthesis during myogenesis in a clonal cell line. Dev. BioI. 73:134-152,1979. 3. Lucas, P.e.; Granner, D.K. Hormone response domains in gene transcription. Annu. Rev. Biochem. 61:11311173,1992. Miesfeld, RL. The structure and function of steroid receptor proteins. Crit. Rev. Biochem. Mol. BioI. 24:101117,1989. Pilkis, S.J.; Granner, D.K Molecular physiology of the regulation of hepatic gluconeogenisis and glyucolysis. Annu. Rev. Physiol. 54:885-909, 1992.

500

Capitulo 9 : EI control de la expresi6n genica

4.

5. 6.

7. 8.

9.

Yamamoto, K. Steroid receptor regulated trancription of specific genes and gene networks. Annu. Rev. Genet. 19:209-252, 1985. Darnell, J.E., Jr. Variety in the level of gene control in eucaryotic cells. Nature 297:365-371, 1982. Derman, E., et al. Transcriptionai control in the production ofliver-specific mRNA's. Cell 23:731-739, 1981. Ptashne, M. A Genetic Switch, 2nd ed. Cambridge, MA: Cell Press and Blackwell Press, 1992. Gilbert, W.; Millier-Hill, B. The lac operator is DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58:2415-2421, 1967. Jacob, F.; Monod, J. Genetic regulatory mechansism in the synthesis ofproteins.J, Mol. BioI. 3:318-356,1961. Kaiser, A.D. Mutations in a temperate bacteriophage affecting its ability to lysogenize, E. coli. Virology 3:4261,1957. Ptashne, M. Specific binding of th 'A. phage repressor to 'A. DNA. Nature 214:232-234, 1967. Seeman, N.C.; Rosenberg, J.M.; Rich, A. Sequence specific recognition of double helical nucleic acids by proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:804-808, 1976. Crothers, D.M.; Steitz, T.A. Transcriptional activation by Escherichia coli CAP protein. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, K.R Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. Dickerson, RE. DNA structure from A to Z. Methods Enzymol. 211:67-111, 1992. Hagerman, P.J. Sequence-directed curvature of DNA. Annu. Rev. Biochem. 59:755-781, 1990. Harrison, S.C. Molecular characteristics of the rgulatory switch in phages 434 and 'A.. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, KR. Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. van der Vliet, P.e.; Verrijzer, C.P. Bending of DNA by transcription factors. Bioessays 15:25-32, 1993. Miller, J.H.; Reznikoff, W.S., eds. The Operon. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1978. Mitchell, P,J.; Tijan, R Transcriptional regulation in mammalian cells by sequence-specific DNA binding proteins. Science 245:371-378, 1989. Verdier, J.-M. Regulatory DNA-binding proteins in yeast: an overview. Yeast6:271-297, 1990.

10. Harrison, S.C. A structural taxonomy of DNA-binding domains. Nature 353:715-719, 1991. Pabo, C.O.; Sauer, RT. Transcription factors: structural families and principles of DNA recognition. Annu. Rev. Biochem. 61:1053-1095,1992. Steitz, TAo Structural stuaies of protein-nucleic acid interaction: the sources of sequence-specific binding. Q. Rev. Biophys. 23:205-280, 1990. Wright, P.E. Solution structures of DNA-binding domains of eukaryotic trancription factors. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, K.R Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. 11. Harrison, S.C.; Aggarwal, AX DNA recognition by proteins with the heliz-turn-helix motif. Annu. Rev. Biochem. 59:933-969, 1990. Laughon, A.; Scott, M.P. Sequence of a Drosophila segmentation gene: protein structure homology with DNA-binding proteins. Nature 310:25-31, 1984. Sauer, RT.; Yocum, RR; Doolittle, RF.; Lewis, M.; Pabo, C.O. Homology among DNA-binding proteins suggests use of a conserved super-secondary structure. Nature 298:447-451,1982. 12. Scott, M.P.; Tamkun, J.W.; Hartzell, G.W. The structure and function of the homeodomain. Biochim. Biophys. ACta 989:25-48, 1989. Wuthrich, K; Gehring, W. Transcriptional regulation by homeodomain proteins: structural, functional and genetic aspects. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, KR Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. 13. Coleman, J.E. Zinc proteins: enzymes, storage proteins, transcription factors, and replication proteins. Annu. Rev. Biochem. 61:897-946,1992. Miller, J.; McLachlan, A.D.; Klug, A. Repetitive zinc-binding domains in the protein transcription factor IlIA from xenopus oocytes. EMBO]. 4:1609-1614,1985. Rhodes, D.; Klug, A. Zinc fingers. Sci. Am. 268(2):56-59, 62-65, 1993. 14. Knight, KL.; Sauer, RT. Biochemical adn genetic analysis of operator contacts made by residues within the beta-sheet DNA binding motif of Mnt repressor. EMBOj. 11:215-223, 1992. Schwabe, J.W.R DNA between the sheets. Curro BioI. 2:661-663,1992. 15. Alber, T. Protein-DNA interactions: how GCN4 binds DNA. Curro BioI. 3:182-184,1993. Lamb, P.; McKnight, S.L. Diversity and specificity in transcriptional regulation: the benefits of heterotypic dimerization. Trends Biochem. Sci. 16:417-422, 1991. Landschulz, W.H.; Johnson, P.F.; McKnight, S.L. The leucine zipper: a hypothetical structure common to a new class of DNA-binding proteins. Science 240:17591764,1988. McKnight, S.L. Molecular zippers in gene regulation. Sci. Am. 264(4):54-64, 1991. O'Shea, E.; Rutkowski, R; Kim, P.S. Evidence that the leucine zipper is a coiled coil. Science 243:538-542, 1989. 16. Benezra, R; Davis, RL.; Lockshon, D.; Turner, D.L.; Weintraub, H. The protein Id: a negative regulator of helixloop-helix DNA-binding proteins. Cell 61:49-59, 1990. Garrell, J.; Campuzano, S. The helix-loop-helix domain: a common motif for bristles, muscles and sex. Bioessays 13:493-498, 1991. Bibliograffa

Lassar, A.B.; Davis, RL.; Wright, W.E.; et al. Functional activity of myogenic HLH proteins requires heterooligomerization with E12/E47-like proteins in vivo. Cell 66:305-315, 1991. Murre, C.; McGaw, P.S.; Baltimore, D. A new DNA binding and dimerization motif in immunoglobin enhancer binding, daughterless, MyoD, and myc proteins. Cell 56:777-783, 1989. Tapscott, S,J.; Weintraub, H. MyoD and the regultaion of myogenesis by helix-loop-helix proteins. j. Clin. Invest. 87:1133-1138,1991. 17. Pabo, e.O.; Sauer, RT. Transcription factors: structural families ana principles of DNA recognition. Annu. Rev. Biochem. 61:1053-1095,1992. 18. Fried, M.; Crothers, D.M. Equilibria and kinetic of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9:6505-6525, 1987. Shaffer, C.D.; Wallrath, L.L.; Elgin, S.C.R Regulating genes by packaging domains: bits of heterochromatin in euchromatin? Trends Genet. 9:35-37, 1993. 19. Kadonga, J.T. Purification of sequence-specific binding proteins by DNA affinity chromatography. Methods Enzymol. 208:10-23, 1991. Kadonaga, J.T. Mfinity purification of sequence-specific DNA binding proteins. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:5889-5893, 1986. Rosenfeld, P.J.; Kelly, T.J. Purification of nuclear factor I by DNA recognition site affinity chromatography. ]. BioI. Chem. 261:1986.

Vinso, C.R; LaMarco, KL.; Johnson, P.F.; Landschulz, W.H.; McKnight, S.L. In situ detection of sequencespecific DNA binding activity specificied by a recombinant bacteriophage. Genet. Dev. 2:801-806, 1988. 20. Beckwith, J. The operon: an historical account. In Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology (F.C. Neidhart, J.L. Ingraham, K.B. Low, et al., eds.), Vol. 2, pp. 1439-1443. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1987. Jacob, F.; Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. ]. Mol. BioI. 3:318-356, 1961. Ptashne, M. A Genetic Switch, 2d ed. Cambridge, MA: Cell Press and Blackwell Press, 1992. Yanofsky, C. Transcriptionall regulation: elegance in design and discovery. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, KR Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. 21. Sigler, P.B. The molecular mechanism of trp repression. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, K.R Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. Yanofsky, C.; Crawford, I.P. The tryptopphan operon. In Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology (F.C. Neidhart, J.L. Ingraham, KB. Low, et al., eds.), Vol. 2, pp. 1231-1240. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1987. 22. Bushman, F.D. Activators, deactivators and deactivated activators. Curro BioI. 2:673-657, 1992. Englesberg, E.; Irr, J.; Power, J.; Lee, N. Positive control of enzymes synthesis by gene C in the L-arabinose system.]. Bacteriol. 90:946-957, 1965.

501

23.

24.

25.

26.

Hoopes, B.C. McClure, W.R Strategies in regulation of transcription initiation. In Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology (F.e. Neidhart, J.L. Ingraham, KB. Low, et al., eds.), Vol. 2, pp. 1231-1240. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1987. Johnson, A.D.; Poteete, AR; Lauer, G.; et al. A repressor and Cro-components of an efficient molecular switch. Nature 294:217-223, 1981. Ptashne, M.; Jeffrey, A; Johnson, AD.; et al. How the A repressor and Cro work. Cell 19:1-11, 1980. Beckwith, J. The lactose operon. In Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology (F.e. Neidhart, J.L. Ingraham, KB. Low, et al., eds.), Vol. 2, pp. 1444-1452. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1987. Gralla, J.D. lac repressor. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, KR Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. Beardsley, T. Smart genes. Sci. Am. 265(2):86-95,1991. Buratowski, S.; Sharp, PA Initiation of transcription by RNA polymerase II. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, K.R Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. Johnson, P.F.; McKnight, S.L. Eukaryotic transcriptional regulatory proteins. Annu. Rev. Biochem. 58:799-839, 1989. Zawel, L.; Reinberg, D. Initiation of transcription by RNA polymerase II: a multi-step process. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. BioI. 44:68-108, 1993. Geidsuschek, E.P.; Kassavetis, GA RNA polymerase III transcription complexes. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, KR Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory ' Press, 1992. Gill, G. Complexes with a common core. Curro BioI. 2:565-567, 1992. Hernandez, N. TBP, a universal eukaryotic transcription factor? Genes Dev. 7:1291-1308,1993. Hisatake, K, et al. The p250 subunit of native TAT boxbinding factor TFIID is the cell-cycle regulatory protein CCG1. Nature 362:179-181,1993. Peterson, M.G.; Tijan, R Transcription: the tell-tail trigger. Nature 358:620-621, 1992. Reeder, RH. Regulation of transcription by RNA polymerase I. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, KR Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. Roeder, RG. The complexities of eukaryotic transcription initiation: regulation of preinitiation complex assembly. Trends Biochem. Sci. 16:402-408, 1991. Ruppert, S.; Wang, E.H.; Tijan, R Cloning and expression of human TAF,,250: a TBP-associated factor implicated in cell-cycle regulation. Nature 362:175-179, 1993. White, RJ.; Jackson, S.P. The TATA-binding protein: a central role in transcription by RNA polymerases I, II and III. Trends Genet. 8:284-288, 1992. Drapkin, R; Merino, A; Reinberg, D. Regulation of RNA polymerase II transcription. Curro Opin. Cell BioI. 5:469-476,1993.

502

Capitulo 9 : EI control de la expresi6n genica

27.

28.

29.

30.

Hochschild, A Protein-protein interactions and DNA loop formation. In DNA Topology and Its Biological Effects (N.R Cozzarrelli, J.C. Wang, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990. Kustu, S.; North, AK.; Weiss, D.S. Prokaryotic transcriptional enhancers and enhancer-binding proteins. Trends Biochem. Sci. 16:397-402,1991. Milller, H.-P.; Schaffner, W. Transcriptional enhancers can act in trans. Trends Genet. 6:300-304, 1990. North, A.K.; Klose, K.E.; Stedman, KM.; Kustu, S. Prokaryotic enhancer-binding proteins reflect eukaryote-like modularity: the puzzle of nitrogen regulatory protein e.]. Bacterial. 175:4267-4273, 1991. Schleif, R DNA looping. Annu. Rev. Biochem. 61:199223,1992. Adhya, S. Multipartite genetic control elements: communication by DNA looping. Annu. Rev. Genet. 23:227-250,1989. Johnson, P.F.; McKnight, S.L. Eukaryotic transcriptional regulatory proteins. Annu. Rev. Biochem. 58:799-839, 1989. Mitchell, P.J.; Tjian, R Transcriptional regulation in mammalian cells by sequence-specific DNA-binding proteins. Science 245:371-378, 1989. Serfling, E.; Jasin, M.; Schaffner, W. Enhancers and eukaryotic gene transcription. Trends Genet. 1:224-230, 1985. Brent, R; Ptashne, M. A eukaryotic transcriptional activator bearing the DNA specificity of a prokaryotic repressor. Cell 43:729-736, 1985. Greenblat, J. Protein-protein interactions as critical determinants of regulated initiation and termination of transcription. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, KR Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. Lin, Y-S.; Green, M.R Mechanism of action of an acidic transcriptional activator in vitro. Cell 64:971-981, 1991. Ptashne, M.; Gann, AA.F. Activators and targets. Nature 346:329-331, 1990. Goodbourn, S. Negative regulation of transcriptional initiation in eukaryotes. Biochim. Biophys. Acta 1032:53-77,1990. Herschbach, B.M.; Johnson, A.D. Transcripted repression in eukaryotes. Annu. Rev. Cell BioI. 9:479-511, 1993. Jackson, M.E. Negative regulation of eukaryotic transcription.]. Cell Sci. 100:1-7, 1991. Guarente, L. Mechanism and regulation of transcriptional activation in eukaryotes: conserved features from yeasts to humans. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, KR Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. Herr, W. Oct-l and Oct-2: differential transcriptional regulation by proteins that bind to the same DNA sequence. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, K.R Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. Johnson, A A combinatorial regulatory circuit in budding yeast. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, KR Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. Martin, KJ.; Green, M.R Transcriptional activation by viral immediate-early proteins: variations on a common theme. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, KR Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992.

31.

32.

33.

34.

35. 36.

37.

Thompson, C.C.; McKnight, S.I. Anatomy of an enhancer. Trends Genet. 8:232-236, 1992. Yamamoto, K.R; Pearch, D.; Thomas, J.; Miner, J.N. Combinatorial regulation at a mammalian composite respones element. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, K.R Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. Pankratz, M.J.; Jackle, H. Making stripes in the Drosophila embryo. Trends Genet. 6:287-292, 1990. St. Johnston, D.; Nusslein-Volhard, C. The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell 68:201-219,1992. Scott, M.P.; O'Farrell, P.H. Spatial programming of gene expression in early Drosophila embryogenesis. Annu. Rev. Cell BioI. 2:49-80, 1986. Small, S.; Levine, M. The initiation of pair-rule stripes in the Drosophila blastoderm. Curro Opin. Genet. Dev. 1:255-260, 1991. Jackle, H.; Sauer, F. Transcriptional cascades in Drosophila. Curro Opin. Cell BioI. 5:505-512,1993. Small, S.; Kraut, R; Hoey, T.; Warrior, R; Levine, M. Trancriptional regulation of a pair-rule stripe in Drosophila. Genes Dev. 5:827-839,1991. Crossley, M.; Orkin, S.H. Regulation of the beta-globin locus. Curro Opin. Genet. Dev. 3:232-237, 1993. Evans, T.; Felsenfeld, G.; Reitman, M. Control of globin gene transcription. Annu. Rev. Cell BioI. 6:95-124, 1990. Higgs, D.R; Wood, W.G. Understandig erythroid differentiation. Curro BioI. 3:548-550, 1993. Minie, M.; Clark, D.; Trainor, C., et al. Developmental regulation of globin gene expression. ]. Cell Sci. 16(Suppl.):15-20, 1992. Berk, A.J. Regulation of eukaryotic transcription factors by post-translational modification. Biochim. Biophys. Acta 1009:103-109, 1989. Hunter, T.; Karin, M. The regulation of trancription by phosphorylation. Cell 70:375-387, 1992. Stragier, P.; Losick, R Cascades of sigma factor revisited. Mol. Microbial. 4:1801-1806,1990. Grunstein, M. Histones as regulators of genes. Sci. Am. 267(4):68-74B, 1992. Kornberg, RD.; Lorch, Y. Chromatin structure and transcription. Annu. Rev. Cell BioI. 8:563-587, 1992. Svaren, J.; Harz, W. Histones, nucleosomes and trancription. Annu. Rev. Cell BioI. 8:563-587, 1992. Winston, F.; Carlson, M. Yeast SNF/SWI transcriptional activators and the SPT/SIN chromatin connection. Trends Genet. 8:387-391,1992. Wolffe, A. Chromatin: Structure and Function. San Diego, CA: Academic Press, 1992. Croston, G.E.; Kadonaga, J.T. Role of chromatin structure in the regulation of transcription by RNA polymerase II. Curro Opin. Cell BioI. 5:417-423, 1993. Fedor, M.J. Chromatin structure and gene expression. Curro Opin. Cell BioI. 4:436-443, 1992. Grunstein, M. Nucleosomes: regulators of transcription. Trends Genet. 6:395-400, 1990. Kornberg, R.D.; Lorch, Y. Irresistible force meets immovable object: transcription and the nucleosome. Cell 67:833-836, 1991. Struhl, K. Gene expression: chromatin and transcription factors: who's on first? Curro BioI. 3:220-221,1993.

Bibliograffa

38.

39.

40.

41. 42.

43.

Workman, J.L.; Taylor, I.C.A.; Kingston, RE. Activation domains of stably bound GAL4 derivatives alleviate repression of promoters by nucleosomes. Cell 64:533-544, 1991. Aparicio, a.M.; Billington, B.L.; Gottschling, D.E. Modifiers of position effect are shared between telomeric and silent mating-type loci in S. cerevisiae. Cell 66:1279-1287,1991. Gottschling, D.E.; Aparicio, a.M.; Billington,B.L.; Zakian, VA Position effect at S. cerevisiae telomees: reversible repression of Pol II transcription. Cell 63:751-762,1990. Henikoff, S. Position effect and related phenomena. Curro Opin. Genet. Dev. 2:907-912,1992. Wilson, C.; Bellen, H,J.; Gehring, W.J. Position effects on eukaryotic gene expression. Annu. Rev. Cell BioI. 6:679-714,1990. Dillon, N.; Grosveld, F. Transcriptional regulation of multigene loci: multilevel control. Trends Genet. 9:134-137,1993. Evans, T.; Felsenfeld, G.; Reitman, M. Control of globin gene transcription. Annu. Rev. Cell BioI. 6:95-124, 1990. Grosveld, F.; Antoniou, M.; Berry, M.; et al. The regulation of human globin gene switching. Philos. Trans. R. Soc. Lond. (BioI.) 339:183-191,1993. Minie, M.; Clark, D.; Trainor, C.; et al. Developmental regulation of globin gene expression. ]. Cell Sci. 16 (Suppl.):15-20, 1992. Ausio, J. Structure and dynamics of trancriptionally active chromatin.]. Cell Sci. 102:1-5, 1992. Freeman, LA; Garrard, W.T. DNA supercoiling in chromatin structure and gene expression. Crit. Rev. Eukar. Gene Express. 2:165-209,1992. Hsieh, T.S. DNA tipoisomerases. Curro Opin. Cell BioI. 4:396-400, 1992. Wang, J.C. DNA topoisomerases: why so many?]. BioI. Chem. 266:6659-6662, 1991. Svaren, J.; Chalkley, R The structure and assembly of active chromatin. Trends Genet. 6:52-56, 1990. Gene expression and differentiation. Curro Opin. Genet. Dev. 2:197-303,1992. Berg, D.E.; Howe, M.M., eds. Mobile DNA. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1989. Johnson, RC. Mechanism of site-specific DNA inversion in bacteria. Curro Opin. Genet. Dev. 1:404-411, 1991. Meyer, T.F.; van Putten, J.P. Genetic mechanisms and biological implications of phase variation in pathogenic neisseriae. CUn. Microbial. Rev. 2 (Suppl.):SI39SI45,1989. Pillus, L. An acquired state: epigenetic mechanisms in transcription. Curro Opin. Cell BioI. 4:453-458, 1992. Prescott, D.M. DNA gains, losses, and rearrangements in eukaryotes. Dev. BioI. 6:13-29, 1989. Robertson, B.D.; Meyer, T.F. Genetic variation in pathogenic bacteria. Trends Genet. 8:422-427, 1992. van de Putte, P.; Goosen, N. DNA inversions in phages and bacteria. Trends Genet. 8:457-462,1992. Dolan, J.W.; Fields, S. Cell-type-specific transcription in yeast. Biochim. Biophys. Acta 1088:155-169,1991. Herskowitz, I. A regulatory hierarchy for cell specialization in yeast. Nature 342:749-757,1989.

503

44.

45.

46.

47.

48.

49.

Johnson, A A combinatorial regulatory circuit in budding yeast. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, K.R. Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. Ptashne, M. A Genetic Switch, 2d ed. Cambridge, MA: Cell Press and Blackwell Press, 1992. Ptashne, M.; Jeffrey, A; Johnson, AD.; et al. How the A repressor and Cro work. Cell 19:1-11, 1980. Scott, M.P.; O'Farrell, P.H. Spatial programming of gene expression in early Drosophila embryogenesis. Annu. Rev. Cell BioI. 2:49-80, 1986. Braun, T.; Rudnicki, M.A.; Arnold, H.-H.; Jaenisch, R. Targeted inactivation of the muscle regulatory gene Myf-5 results in abnormal rib development and perinatal death. Cell 71:369-382, 1992. Hasty, P.; Bradley, A; Morris, J.H.; et al. Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene. Nature 364:501-506, 1993. Miller, J.B.; Everitt, E.A.; Smith, T.H.; Block, N.E.; Dominov, J.A. Cellular and molecular diversity in skeletal muscle development: news from in vitro and in vivo. Bioessays 15:191-196,1993. Nabeshima, Y.; Hanaoka, K.; Hayasaka, M.; et al. Myogenin gene disruption results in perinatal lethality because of severe muscle defect. Nature 364:532-535, 1993. Weintraub, H.; Davis, R.; Tapscott, S.; et al. The myoD gene family: nodal point during specification of the muscle cell lineage. Science 251:761-766,1991. Buckingham, M. Making muscle in manunals. Trends Genet. 8:144-149,1992. Garcfa-Bellido, A Homeotic and atavic mutations in insects. Am. Zool. 17:613-629, 1977. Giere, A Molecular models and combinatorial principles in cell differentiation and morphogenesis. Cold SpringHarborSymp. Quant. Bioi. 38:951-961,1974. Johnson, P.F.; McKnight, S.L. Eukaryotic transcriptional regulatory proteins. Annu. Rev. Biochem. 58:799-839, 1989. Sprague, G.F., Jr. Combinatorial associations of regulatory proteins and the control of cell type in yeast. Adv. Genet. 27:33-62, 1990. Ballabio, A; Willard, H.F. Manunalian X-chromosome inactivation and the XlST gene. Curro Opin. Genet. Dev. 2:439-447,1992. Lyon, M.F. X-inactivation: controlling the X chromosome. Curro Bioi. 3:242-244, 1993. Lyon, M.F. Epigenetic inheritance in mammals. Trends Genet. 9:123-128, 1993. Lyon, M.F. Some milestones in the history ofX-chromosome inactivation. Annu. Rev. Genet. 26:17-28, 1992. Riggs, AD.; pfeiffer, G.P. X-chromosome inactivation and cell memory. Trends Genet. 8:169-174, 1992. Eissenberg, J.C. Position effects variegation in Drosophila: towards a genetics of chromatin assembly. Bioessays 11:14-17,1989. Henikoff, S. Position-effect variegation after 60 years. Trends Genet. 6:422-426, 1990. Barras, F.; Marinus, M.G. The great GATC: DNA methylationinE. coli. Trends. Genet. 5:139-143,1989. Holliday, R. Epigenetic inheritance based on DNA methylation. Exs 64:452-468, 1993.

504

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

50. Bird, A The essentials of DNA methylation. Cell 70:5-8, 1992. Cedar, H. DNA methylation and gene activity. Cell 53:34,1988. Graessmann, M.; Graessmann, A DNA methylation, chro. matin structure and the regulation of gene expression. Exs 64:404-424, 1993. Tate, P.H.; Bird, AP. Effects of DNA methylation on DNA-binding proteins and gene expression. Curro Opin. Genet. Dev. 3:226-231, 1993. 51. Bird, AP. Genomic imprinting: imprints on islands. Curro Bioi. 3:275-277, 1993. Haig, D.; Graham, C. Genomic imprinting and the strange case of the insulin-like growth factor II receptor. Cell 64:1045-1046, 1991. Li, E.; Bestor, T.H.; Jaenisch, R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell 69:915-926, 1992. Sasaki, H.; Allen, N.D.; Surani, MA DNA methylation and genomic imprinting in manunals. Exs 64:469-486, 1993. 52. Antequera, F.; Bird, A CpG islands. Exs 64: 169-185, 1993. 53. Jones, K.A. HIV trans-activation and transcriptional control mechanisms. New BioI. 1:127-135, 1989. Landrick, R.; Yanofsky, C. Transcription attenuation. In Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology (F.C. Neidhart, J.L. Ingraham, K.B. Low, et al. eds.), Vol. 2, pp. 1276-1301. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1987. Yanofsky, C. Operon-specific control by transcription attenuation. Trends Genet. 3:356-360, 1987. 54. Black, D.L. Activation of c-src neuron-specific splicing by an unusual RNA element in vivo and in vitro. Cell 69:795-807, 1992. Green, M.R. Biochemical mechanisms of constitutive and regulated pre-mRNA splicing. Annu. Rev. Cell Bioi. 7:559-599, 1991. Rio, D.C. RNA binding proteins, splice site selection, and alternative pre-mRNA splicing. Gene Express. 2:1-5,1992. 55. Baker, B.S. Sex in flies: the splice of life. Nature 340:521524,1989. 56. Peterson, M.L. Balanced efficiencies of splicing and cleavage-polyadenylation are required for mu-s and mummRNAregulation. Gene Express. 2:319-327, 1992. 57. Beadle, G. Genes and the chemistry of the organism. Am. Sci. 34:31-53,1946. 58. Izaurralde, E.; Mattaj, I.W. Transport of RNA between nucleus and cytoplasm. Semin. Cell Bioi. 3:279-288, 1992. Maquat, L.E. Nuclear mRNA export. Curro Opin. Cell Bioi. 3:1004-1012,1991. 59. Davis, I.; Ish-Horowicz, D. Apical localization of pairrule transcripts requires 3' sequences and limits protein diffusion in the Drosophila blastoderm embryo. Cell 67:927-940, 1991. Kislauskis, E.H.; Singer, R.H. Determinants of mRNA localization. Curro Opin. Cell Bioi. 4:975-978, 1992. 60. Agabian, N. Trans splicing of nuclear pre-mRNAs. Cell 61:1157-1160,1990. Chan, L. RNA editing: exploring one mode with apolipoprotein B mRNA Bioessays 15:33-41, 1993.

r

[

Sioof, P.; Benne, R RNA editing in trypanosome mitochondria: guidelines for models. FEBS Lett. 325:146151,1993. Sollner-Webb, B. RNA editing. Curro Opin. Cell BioI. 3:1056-1061,1991. 61. Fouillot, N.; Tlouzeau, S.; Rossignol, J.-M.; Jean-Jean, O. Translation of the hepatitis B virus P gene by ribosomal scanning as an alternative to internal initiation. ]. Virol. 67:4886-4895, 1993. Lindahl, L.; Hinnebusch, A Diversity of mechanisms in the regulation of translation in prokaryotes and lower eukaryotes. CU". Opin. Genet. Dev. 2:720-726, 1992. Oh, S.K.; Sarnow, P. Gene regulation: translational initiation by internal ribosome binding. Curro Opin. Genet. Dev. 3:295-300,1993. 62. Hinnebusch, AG. Involvement of an initiation factor and protein phosphorylation in translational control of GCN4 mRNA Trends Biochem. Sci. 15:148-152, 1990. Rhoads, RE. Regulation of eukaryotic protein synthesis by initiation factors.]. BioI. Chem. 268:3017-3020, 1993. Sarre, T.F. The phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2: a principle of translational control in mammalian cells. Biosystems 22:311-325,1989. 63. Melefors, 0.; Hentze, M.W. Translational regulation by mRNA/protein interactions in eukaryotic cells: ferritin and beyond. Bioessays 15:85-90, 1993.

Bibliograffa

64. Sachs, A.B. Messenger RNA degradation in eukaryotes. Cell 74:413-421, 1993. Theil, E.C. Regulation of ferritin and transferrin receptormRNAs,J. BioI. C}lem. 265:4771-4774,1990. 65. Marzluff, W.F. Histone 3' ends: essential and regulatory functions. Gene Express. 2:93-97, 1992. 66. Wickens, M. In the beginning is the end: regulation of poly(A) addition and removal during early development. Trends Biochem. Sci. 15:320-324, 1990. 67. Bock, A.; Forchhammer, K.; Heider, J.; Baron, C. Selenoprotein synthesis: an expansion of the genetic code. Trends Biochem. Sci. 16:463-467, 1991. Hatfield, D.; Oroszlan, S. The where, what and how ofribosomal frameshifting in retroviral protein synthesis. Trends Biochem. Sci. 15:186-190, 1990. Weiss, RB. Ribosomal frameshifting, jumping and readthrough. Curro Opin. Cell BioI. 3:1051-1055,1991. 68. Eguchi, Y.; Itoh, T.; Tomizawa, J. Antisense RNA. Annu. Rev. Biochem. 60:631-652, 1991. Noller, H.F.; Hoffarth, V.; Zimniak, L. Unusual resistance of peptidyl transferase to protein extraction procedures. Science 256:1416-1419, 1992. Weiner, A.M. mRNA splicing and autocatalytic introns: distant cousins or the products of chemical determinism? Cell 72:161-164, 1993.

505

Organizacion interna de lacelula

EJeclronmicrograffa de vesiculas sencillas y recubiertas de la carn. inlema de la membrana plasm4tica de una celuJa heptitica de rat6n. Tambit!:n

se pueden observar numerosos mamenlos de queratina. (De N. Hirokaway ,. Heuser, Cefl30:395-406, 1982.)

Simulad6n por ordenador de una bicapa de fosfolipidos de 0,8 nm en el agua. Los alOmOS de f6srom se muestran en verde, los de nitr6geno en azuloscuro, los de oxfgeno Iipfdico en rojo, los grupos lenninales de las cadenas en magenta y otms alomos de carbona en gris; los alomos de hidr6geno del carbono se han omitido. las molOCul.as de agua se muestran en amarillo (oxfgeno) y blanco (hidr6genol. (De R.M. Venable, Y. Zhang. B.J. HardyyR.W. Paslor, Science 262:223·228, 1993.)

Estructura de lamembrana

10 ·....··de---.

Las membranas celulares son cruciales para la vida celular. La membrana plasmttlIca roden a la celula, deHniendo su extcnsi6n y mamcniendo las diferencias esendales entre el contenido de 1a celula y su entomo. Dentro de la celula eucariota, las membranas del retfculo endoplttsm..ico, del complejo de Golgi, de las mitocondrias

y de atros org
la o riemaci6n" de una proreina de membrana puede delerminarse de varias O1aneras. Una de elias consiste en utiJizar un reactivo marcador (por ejemplo, uno que comenga una marca radiacliva 0 fluorescenle) que se una covalen· temenle, y que sea soluble en agua, es dedr, que no pueda penelrar en la bicapa. por 10 que 5610 se unira a grupos espedficos del lado asequible de la membrana. A conlinuaci6n, se solubilizan las O1embranas can un detergente. se separan las protefnas por eleclroforesis en gel de poliacrilamida can SDS. las protefnas marcadas se deteclan ya sea por su radiactividad (mediante autorradiograffa sobre gel) 0 por su fluorescencia (exponiendo el gel a luz uluaviolela). Ulilizando este sistema de marc;aje vectorial es posible determinar c601o se halJa orientada una prolefna de membrana en dicha membrana. delectada como una banda sobre el gel: par ejemplo, si se marca lanto desde ellado externo (cuando se marcan cclulas intactas 0 fantasmas con la membrana soldada) como desde el lado inlerno (citoplasmatico, cuando se marcan vesfculas invertidas). debe ualarse de una prolefna transmembrana. Una via alternativa a ~sta consiste en exponer tanto la superficie eXlerna como la superficie imerna a enzimas proteoIflicas que no atraviesen la membrana: si una protefna queda parcialmenre digerida por eSle lralamienlo de ambas superficies, debe trararse de una prolefna rransmembrana. Ademas, para determinar si una zona especffica de una prolefna lransmembrana esra expuesta a un lado u otro de la membrana, se pueden ulilizar anticuerpos marcados que se unen unicamente a una determinada reo gi6n de la protefna. Al estudiar las protefnas de la membrana plasmMica del gl6bulo roje humano mediante electroforesis en gel de poliacrilamida Call SDS, se dctectan aproximadamente 15 bandas proteicas principales, cuyos pesos moleculares oscilan entre 15000 Y250 000. Tres de estas protefnas -Ia espectrina, la gillcoforina y la banda 3- constituyen mas del 60% (en peso) de la protefna lotal de la membrana (Figura 1O-24). Cada una de eslas Ires prolefnas esla dispuesla en la membrana de diferellle manera. Por clio las utilizaremos como ejemplo de las Ires maneras principales conocidas en que las proteinas se asocian can las membra· nas, no ~Io en los gl6bulos rojos, sino lambien en otros tipos celulares.

Figura IO-Z3 Preparacl6n de fantasmas de eritroclto, soldados y no soldados. y de vesiculas Ndel derecho" y"del reves". Tal como se ha indicado, los erilrocitos se rompen en un unico punto, produciendo fantasmas con un solo agujero. Las vesfculas mas pequei'ias se producen rompiendo mecanicamente los ranlasmas; la orientaci6n de 13 membrana en eslas vesfculas puede ser lanto con la earn exterior original hacia el exterior 0 vueha del re~. dependiendo de las condiciones i6nicas ulilizadas durante el procedirnienlo de rotuta.

M

La espectrina es una prote(na del citoesqueleto asociada

no covalentemente a la cara citoplasmatica de la membrana del eritrocito ll Muchas de las moleculas de proleina asociadas con la membrana del eritrocilo humano son prolefnas perifericas de membrana asociadas con eJ lado citoplasmalico de la bicapa Iipfdica. la mas abundante de eslas proteinas es la especlrina, una barra larga. delgada y flexible, de aproximadamente 100 nm de longitud, que consliluye aproximadamenle e125% de la masa total de las protefnas aso· ciadas a la membrana (unas 2,5 x lOS copias por celula). Constituye el principal componente del entramado proteico (el ciroesquefelO) que se extiende por el in524

Capftulo 10 : Eslructura de la membrana

.....

molecular aproximado

/ ' espectrin. (l espectrin. II ..........oquinna

prolelne 100 000 JO 000 82

band. 3 glucoforffUI -proteln.a banda 4, 1

ooo-ii

'" 000

'A'

--lI

-.etin.

'81

Figura 10-24 Patron de electroforesls en gel de poUacrlJamlda con SOS de las proternas de la membrana de gJ6bulos rojos humanos. EJ gel en (AJ esta teilido con azul de Coomassie. Fl dibujo {BJ indica la posici6n en el gel de a1gunas de

las prOleinas mayoritarias; la gJucoforina se muestra en color roja para dislinguirla de la proteina banda 3. En el dibujo se han omitido olms bandas del gel. La gran cantidad de carbohidralOs de las molecu.las de glucoforina retarda so migraci6n, por 10 que lie desplazan casi tan lentamente como las molecutas de la protefna banda 3, que son mocha mayores. (A, porconesla de Ted Steck.l

CAOENAo

eaOH

union flellible entre dom;niOI

domlnlo de 106 llmlnokldOI de longllud

CAOENAII (A)

Flguna 10-25 Mole.:ullU de especuina de eritrocltos humanos. La prOle£na esl parinas fonnadoras de canales. 10 que pennite a detenninados solutos h..idroffficos de hasta 600 daltons difundir a tra~ de la bicapa Lipfdica externa. Las porinas (y las protefnas fonnadoras de canales relacionadas estrueturalmente con elias de la membrana de mitocondrias y cloroplastos) tienen una lamina ~ en tugar de una helice ex como estructura transmembranosa primordial. La estructura at6mica de una porina aislada de la membrana externa de una Meteria rotosint~tica se determin6 mediante cristaJowaffa de rayos X en J 990. Consiste de un trfmero en el que cada mon6mero fonna un barril ~ tubular, que atraviesa la bicapa Iipfdica y canriene un canallieno de agua en su centro. EI barril estil formado a partir de 16 cadenas antiparalelas de l&nina p, que se curvan 10 suficiente como para fonnac una estruetura eiUndrica (Figura 10-32). Cadenas palaces laterales revisten el interior del canal aeuoso, mientras que cadenas no polares se proyectan desde el exterior del barril interactuando con el nucloo hidrof6bico de la bicapa lipfdica. 530

Capftulo 10: Estructura de la membrana

FlgurnlO-32 Estruetura trldlmenalonal de un trimero de porto. de Rhodobtu:ter CApsulahu

detennlnado porcri$Wognffa de rayos X. W Cada mon6mero consiste en un bamlll de 16 cadenas

antiparalelas que (orman un canal transmembrana Ileno de agua. (B) Los mon6meros se asocian apretadamente formando trfmeros, los cuaies poseen tres canales separados para la difusi6n de solutos pequefios a travtls de la membrana bacteriana eXlema. Una larga espiral de la cadena polipeptfdica (se muestra en raja), que conecta dos cadenas Il. se proyeeta hada eJ interior del lumen de carla canal. estrech4ndolo hasta fonnar una secci6n tranlIversai de 0,6)( 1nm. V\daptado de M.S. Weiss et al.• FEBS Leu. 280: 379-382.1991.)

Figura 10·33 Estrnctura tridimensional del centro de reacd6n rotoslnt~tlcode la bacteria Rhodopseudomonas viridis. La estnlctura se determin6 par amilisis de difraccl6n de rayos X de cristales de este complejo proleico lransmembrana. EI complejo esta formado par cuatro subunidades, 1.. M, H Y un cltocromo. Las subunidades L y M forman el nudeo del centro de reacci6n y cada una contiene cinco helices (l que atraviesan la bleapa Iipfdica La localizaci6n de varias coenzimu rranspanadoras de electrones se muestra en negro. (Adaplado de un dibujo de J. Richardson, basado en datos de J. Deisenhofer, O. Epp, K. Mild, R. Huber y H. Michel, Nature318:618-624, 1985.)

Las prote(nas de membrana acwan a menudo

como grandes complejosl5 Hasta la fecha la mas compleja estructura de una protefna transmemhrana que ja· mas ha sido cstudiada mediame crislalograffa de rayos X es el centro de reacci61l !otosinrerico hacleriano, cuyn estruclura at6mica se defini6 en 1985. Los resultados de estc anaIisis fueron de importancia general en la hiologfa de memhranas par· que dcmostraron par primera vez que multiples polipeplidos pueden asociarse en una membrana formando una compleja maquinaria proteica (Figura 10·33). En el Capftulo 14 disculimos c6mo acluan eSlos complejos folosintelicos capturando la energfa lumfnica y us:1ndola para bombear H' a traves de la membrana. A menudo las prole{nas de membrana estan dispuestas forrnando grandes complejos, no wlo para captar varias formas de energia, sino tambien para transducir las senaJes extracelulares en intracelulares (10 Cllal se discute en el Capitulo 15).

Much.. protemas de membrana difunden en el plano de la membrana l6 Como ocurre con los Upidos de membrana, las pWle£nas no saltan (j1ip·f1op) a traves de la bicapa, sino que giran alrededor de un eje aproximadameme perpendicular al plano de la bicapa (difwi6n rotaciona/). Ademas, muchas prolernas de membrana son capaces de desplazarse lateralmente por la membrana (difusidn latera/). La primera evidencia de que algunas prote£nas de la membra· na plasmaLica son m6viles en el plano de la membrana fue obtenida en 1970 mediante un experimento en el que se rusionaron artil'icialmente reluJas de rat6n con cl!lulas humanas, produciendo cl!luJas hibridas (heterocorionres). Para Protefnas de membrana

531

distinguir las protefnas de membrana plasmatica de rat6n de las humanas se utilizaron dos anticuerpos con distinlO marcaje. Aunque al principio las proteinas de rat6n y las humanas estaban confinadas a su propia mitad del heterocarlome reclt!n formado, las dos ciases de protefnas difundieron y se mezciaron ocupando. a la media hora, toda la superficie del heterocarionte (Figura 10-34). Poco despues Sf obtuvieron otras evidencias de la movilidad proteica de la membrana gracias al descubrimiento de los procesos lIamados agrupamiento (patching) y formaciDn de caperuzn (capping). Cuando los Iigandos. como los anticuerpos. que tienen mM de un lugar de uni6n (par ella lIamados Iigandos mulltlJQlemes) Sf unen a protefnas espedficas de la superficie celular. las proteinas tienden a agregarse. mediante enlaces cruzados, formando grandes grupos (patches), )0 cual indica que las proteinas son capaces de desplazarse lateralmente por la bicapa Iipfdica. Una vez ronnados los agregados en la superficie de una c~luJa capaz de moverse, como un leucocito, son trasladados activamente a uno d~ los palos celuJares. formando una caperuza (0 ~cap", Figura 10-35).

C~LULA

Cl:LULA

DE RATON

~

HUMANA

V

- - protafn. )( de membrana

prolel", de IFUSION CElUlAR membren.

proteloe de membr.n.

AGRUPAMENTo HETEROCARIONTE

protelna Y de membrana

~ adlCi6n d•• nticuerpoe .n~X

1 grupode pfoteinal X

enlic:uerpol lAl contra protelnllS de membrana humane, me«:edo. con

.nlicuerpos I AI contre proteIn. de membf".oe e de rat6n, mercedOI con

nuorescencll leI

•

>-e rodamlna leI

FORMACIONI DE UNA CAPERUZA

tiempo. 0 mlnutOI INCUBACION A 37"C

• tiempo • «l minutos

Figura 10-34 Experimento que muestra 18 mezclade protefnu de membrana

plaMniitica que se produce en dlulu hfbrldas rat6n-humanas. Inicialmente las prolefnas de rat6n y las protefnas humanas est"n con6nadas a sus proplas mitades de la membrana plasmatica del heterocarionte reden fonnado, pero se van entremezclando. Los dos anticuerpos que se usan para visualizar las protefnas se pueden distinguir en un microscopio de f1uorescenda dado que la fluorescefna es verde y la rodamina es roja. {Basado en observadones de LO. Fryey M. Edidin,J. Cell SCi. 7:319-335, 1970, con la autorizaci6n de The Company of Biologists.) 532

Capftulo 10: Estructura de la membrana

caperwa de proteIn.. X

Figura 10-35 Agrupamlentoy fonnad6n de una caperuza de una protefna de la superflde a!lular en un leucoclto. Los anticuerpos bivalentes enlrecruzan las molOCulas proteicas a las que se unen. Esto hace que estas moloculas formen grandes grupos, los cuales son arrastrados activamCntC hacla el extremo posterior de la celula y ronnan una "caperuza.· EI. centrosoma, que gobiema la polaridad antero-poslerior de la celula, se mueslra en Ilamllja.

.............. ~ Itt MARCil,

1

~~~

I

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~

~~ 1

I

RECUPERA,CI6N

I.,

• 18)

La velocidad de difusi6n lateral de las proteinas de membrana puede medirse utilizando la tecnica de rccllperaci6n de fluorescellcia despues de [Ofobianqueamiento (FRAP, de Fluorescence Recovery After Photobleaching). Habitualmente este metoda camparta el marcaje de 13 proteina de superficie que se prelcnde estudiar. con un Iigando especffico nuorescentc. como un anticucrpo Ouarescentc. (Es imponante que se utilicen los fragmentos monovalenlcs de los anticuerpos, que 5610 poseen un Jugar de uni6n al antfgeno, para evilar la rormaci6n de enlaces cruzados entre moleculas vecinas.) wego, elligando Ouorescente es blanqueado en una pequci'la oirea mediante un rayo l:iser, y se mide el tiempo que tardan las protefnas de membrana adyacentes que transportan mol~ulas de anticuerpo fluorescente no blanqueadas, hasta difundir en el area blanqueada (Figura 10-36). A partir de estas mediciones se puedcn caJcular los cocficientes de difusi6n de la protc(na de superficle celular que habfa sido marcada. Los valores de los coeficientes de' difusi6n para las diferentes prOlefnas de membrana en celulas diferentes son muy variables, pero estan tfpicamente comprendidos entre una decima 0 una centesima parte de los valores correspondientes para las molecuJas de fosfolfpidos de la misma membrana.

Flgun. to-37 Dlagr-ama de una ct!!luJa epilellal en el que see rnuestn. como una protefna de membn.na plasmaUca see haJla connnada en un dominio particular de la membrana, La protcfna A(enla zona apical de la membrana) y la protefna B(en la zona basal y basolaterall pueden dlfundir laleralmenle en sus dominios respeclivos pem no pueden entrar en el Olm, en parte debido a la uni6n celular especial denominada unldn estrecha 0 estanaJ. 19ualmenle, las molOCulas Iip[dicas de la monocapa exterior (no ciloplasml1lica) de la membrana plasmatica, tampoco pueden difundir entre ambos dominios, pem los Irpidos de la monocapa inlerior (ciloplasmatica) s[ pueden haccllu (IIU ~ muestra),

Prote[nas de membrana

BlANOUEO

•

~

I

=

liempo_

Ie)

FIgura 1D-36 MedlckSn de la veJoddad de difusl6n lateral de una prole£na de membrana plasm'tka, mediante la Iknlca FRAP. Una prolefna espec{fica se mares. sabre la superficie de la celula, con un anticuerpo monovalenle nuorescenle que se une sola mente a esta protefna (para simpUficar. no se muestran Olras protefnas). Lucgo se blanquean los anticuerpos de una pequena area ulilizando un biser, la intensidad de 1a nuorescencia se va recuperando a medida que la molOOtlas blanqueadas difunden hada el resto de Ja supert'icie celular y que las moleculas no blanqueadas difunden a la zona iluminada con ell{iser. (Vista lateral en A y superficial en B.) (e) Grllfico que muestra la velocidad de rccupcraci6n, Cuanlo mayor es el coeficiente de difusi6n de la prolefna de membrana, mayor es la velocidad de recuperaci6n.

protei.". A

membrana plasmjllea apical membrana

prOlelna B

pla5m'lice

lat8f1l1

I

Ijmina Dasel

533

Figura 10-38 Tres domlnlos de la membrana plasmdOca de esperma de cobaya, deflnidos medJante antJcuerpos monoclonales. (A) es Ull t:S({ut:llla ul;ll;lspt:rma de cobaya y cada uno de los Ires pares de micrografIas (8), (e) y (0) muestra una tinci6n inmunoOuorescente de superfieie celuJar utilizando diferentes anticuerpos monoclonales (a la derecha) junto a una micrograffa de oontraste de fase de la misma celula (a la izquierda). £1 anticuerpo utilizado en (8) 5610 marca la eabeza anterior del espennalozoide, el de (C) 5610 marea la pane posterior de lacabeza yel de (D) 5610 marca la cola. (Cortesia de Selena Carroll y IA) Diana Myles.)

]

perte anterior de Ie ClIbele

]

de Ie eebeze

perte POlteriw

Las c~lu]as pueden confinar a IIpidos y a protemas en dominios especfficos de la membrana l7 8 reconocimiento de que las membranas biol6gicas son Ou.idos bidimensiona· les constituy6 un gran avance en la comprensi6n de la estructura y de la funci6n de la membrana. Ha quedado claro, sin embargo, que la representaciOn de la membrana como un mar Iipfdico en el cual tOOas las protefnas flotan libremente, es una sobresimplificaci6n. Muchas c~lulas tienen sistemas que les penniten lirnitar sus protefnas de membrana en dominios especfficos de la bicapa lipidica continua. Por ejemplo, en c~lulas epiteliales como las que revisten el intestino 0 los tt1bulos del rif16n, cienas enzimas de la membrana plasmc1lica y algunas proternas de transpone estc1n Iimitadas a la superficie apical de la c~lulas mientras que ouas protefnas se hallan confinadas a las superficies basal y lateral (Figura 10-37). Esta distribuci6n asimetrica de las protefnas es a rnenudo esencial para la funci6n del epitelio, como se discute en el Capitulo II. La composici6n Iipidiea de estos dos dominios de membrana tambi~n es diferente, 10 cual demuesrra que las celulas epiteliales pueden evitar la difusi6n de las moleculas lipidicas y protelcas entre los domlnlos. Experimentos con !ipidos marcados, no obstante, sugieren que s610 estc1n confinadas de esta manera las moleculas Iipfdicas de la monocapa externa. Se cree que la separaci6n tanto de moleculas de prole(na como de moJElculas Jipfdicas se mantiene, aI menos en parte, por las barreras formadas por un ripo especffico de uniones intercelulares (IIamadas wliolles estrechas 0 estancas, discutidas en el Capftulo 19). Esta claro que las protefnas de membrana que forman estas unlones Intercelulares no pueden dlfundir lateralmente entre las membranas que estdn interactuando Una celula tambien puede crear dominios de membrana sin utilizar uniones inlercelulares. El espermatozoide de mamfferos, por ejemplo, es una celula aislada que presenta varias zonas estructural y funcionalrnente distintas delimitadas por una membrana plasm~tica continua. Cuando se observa un espermalOzoide por microscupia de IrllnunoOuorescencla utUlzando dlferemes antlCuerpos que reaccionen con antfgenos de superficie, se constata que la membrana plasmc1tica presenta aI menos tres dominios diferentes (Figura 10-38). En algunos casos, los antfgenos son capaces de difundir dentro de los Iimites de su propio dominio: se desconoce c6mo se evita que abandonen dichos dominios. En los dos ejemplos que se aeaban de considerar, tanto la difusi6n de las moleculas de Ifpidos COIllU la lit: proldnas t::Han cunIinada a domlnlos especlallzados dentro de una membrana plasmatiea continua. Las celulas tambien tienen sistemas mas drnsticos para inmovilizar cienas protemas de membrana. Uno de eUos es[~ c1aramente representado en la membrana pliIpura de Halo-, bacterium. Alii las moleculas de bacteriorrodopsina se ensamblan formando grandes cristales bidimensionales en los que las moleculas proteicas individuales est6.n relativamente fijas unas respecto a las otras; los gnuu.ll:s agrt:K----15Iim

.1

mas unidas a membranas y la fosforilaci6n oxidativa y 1a fotosfntesis requieren una membrana semipermeable para acoplar el transporte de H+ con la smtesis de ATP. Adem~s. los sistemas de membranas intracelulares no 0010 proporcionan un area extra de membrana. sino que crean companimientos que estlin se· parados del dtosol, dando a la c~lula espacios acuosos funcionalmente especializados. Como la bicapa lipfdica de los organuJos de membrana es impermeable ala mayoria de las moleculas hidrofl1icas, la membrana de cada orgAnulo ha de disponer de protefnas transportadoras que son responsables de 1a importaci6n 0 exportaci6n de metabolitos especfficos. Cada membrana de un orgo1oulo ha de tener tambi~n un mecanismo de imponaci6n y de incorporaci6n al orgAnuJo de las protefnas espec(ficas que hacen que dicho orgAnulo sea unico. En la Figura 12-1 se iJustran los compartimientos mAs imponantes comunes a todas las c~luJas eucariotas. El nacleo contiene el genoma principal y es ellugar m;is imponante de s(ntesis de DNA y de RNA.. EI citoplasma que 10 circunda consiste en el citosol y los orgdnulos citoplasmo1ticos suspendidos en ~1. El citosol constituye un poco mas de la mitad del volumen total de la c~lula y es el lugar donde no s610 tiene lugar la sfntesis de protefnas sino tambi~n donde se desarroHan la mayona de las reacciones del metabolismo intermediario celular -es decir, el elevado mlmero de reacciones mediante las cuales algunas mol~culas pequenas son dcgradadas y otras son sintetizadas proporcionando los elementos para la construcci6n de las macromol~culas (se explica en el Capftulo 2). Aproximadamente la mitad del o1rea total de membrana de una c~lula se uti· liza para englobar los espacios laberfnticos del reticulo endoplasmdtico (ER). El ER presenta muchos ribosomas unidos a su superficie citoplasmo1tica. los cuales sintetizan protefnas integrates de membrana y protemas solubles destinadas a ser segregadas 0 a ser transponadas a otros organulos. Veremos que existe una diferencia imponante entre el sistema a tTaves del cuallas protemas son dirigidas aI ER 0 a otros organulos citoplasmo1ticos: mientras que las pTOtefnas son translocadas a otros orgo1nulos solamente cuando su sfntesis ha concluido, son translo· cadas al ER durante su sfntesis. por 10 que los ribosomas sobre los que se estlin produciendo esto1n unidos a la membrana del ER. EI ER tambi~n produce los Ifpidos del resto de la c~lula y tambi~n acnJa como a1mac~n de iones Ca 2•• EI complejo de Golgi consiste en una serie de compartimientos organizados en forma de sa· cos discoidales Ilamados cistemus del Golgi; recibe lfpidos y protefnas del ER y las disrribuye hacia diferentes destinos intracelulares. generalmente modifico1ndolas covalentemente durante el viaje. las mitocondrias y (en las plantas) los cJoroplastos, generan la mayor parte del ATP que se utiliza para desplazar las reacciones biosint~ticas que requieren un aporte de energfa Iibre. Los lisosomas presentan enzimas digestivas que de· 590

Capftula 12: Compartimientos Intracelulares ydaslflcacl6n de protelnas

Figura 12·1 Los prlnclpales oompartlrnJentos lntracelulares de una d1ula animal. El c1tosol (grisl, el retfcula endoplasm4.tico, eI complejo de Golgi, el nl1cleo, las mitocondrias, los endosomas,los lisosomas y los peroxisomas son diferentes oompartimientos que se hallan aislados del resto de la celula mediante, at menos, una membrana dotada de penneabilidad selectiva.

Tabla 12-1 Volumenes relaUvos ocupados por los prlnclpales compartlmlenlos lntracelulares en una c~lula hepallca tfplca (hepalocllo) Compartlmlento IntrnceluJar

PorcenlaJe del volumen celuJar total

Citosol Mitooondria Vesfculas del ER rugoso Veskulas del ER liso y de Golgi Nucleos Peroxisomas usosomas Endosomas

Numero aproxlmado por celula*

5'

1

22 9

1700 1

6 6

1

.00 300

1 1 1

200

se cree que lodas las cislemas del retkulo endoplasmatico liso y rugosa eslan conectadas, formando un unico gran compartimiento. En cada celu1a el complejo de GoIgi esta organlzado en un nl1mero discmo de grupos de ci$temas aplladas (dictiosomas) ytodavfa no se ha estab1ecido claramente el grado de interconexi6n entre cUos. o

gradan tanto orgAnulos muenos como maccomoltkuJas y partfculas captadas del exterior de la ce:lula por endodtosis. En su camino hada los Jisosomas, las macromollkulas y las partfcuJas endocitadas primero han de pasar por una serie de companimiemos Jlamados endOSQmas. Los peroxisomas (tambi~n conocidos como microcuerpos) son pequenos compartimientos vesiculares que canrienen enzimas que panidpan en diversas reacciones oxidativas. En general, cada orgoinulo rodeado por membrana realiza el mismo dpo de funcioncs boisicas en (0dos los tipos celulares pero varia en abundancia y puede (ener propiedades adicionaJes que difieren de un dpo celuJar a otro de acuerdo con las funciones especiaJizadas de las ce:lulas djferenciadas. En su conjunto, estos orglinuJos ocupan casi la mitad del volumen celular [fabla 12-1), y se requiere una gran canridad de membranas intracelulares para fabricarlos (odos. Asf, en las dos celulas de mamffero que se analizan en la Tabla 12-2.

Tabla 12-2 Canlldades relatlvas de tlpos de membrana en dos celulas eucarlotas PorcentaJe de membrana celular total Tipo de membrana

Hepatoci{o·

Celula exocrina pancrc,hlca o

Membrana plasmlhka 2 5 Membrana del ER rugosa 35 60 Membrana del ER lisa 16 ~

peroxi.omu IIIJo.

El reticulo endoplasmatico 23 Todas las celulas eucariotas tienen un reticula endoplasmllUoo (ER de Endoplasmic Reticulum). Su membrana constituye nonnalmenle mas de la mitad del total de la membrana de 1a celula (vease Tabla 12-2). Est;! organizado en (anna de una red laberlntica de tubulos ramificados y de s en ellumen del ER esta facilitado por las altas concentradones de protefnas de uni6n a Ca2> presentes en el ER. En algunos tipos celuJares, quizas en la mayorfa de ellos, existen regiones especfficas del ER especializadas en el almacenamiento de Ca 2>. Por ejemplo, las celulas muscuJares tienen una abundante regi6n especializada del ER liso, Hamada reticulo sarcoplasmdtico, la cual secuestra Ca 2 > del citosol por medio de una ATPasa de Ca2• que bombea Ca 2;; la liberaci6n de Ca 2• y la posterior recaptaci6n del Ca2.. POt el retfculo sarcoplasmatico median la contracci6n rapida y la relajaci6n de la miofibrillas durante cada cicio de contracci6n muscuJar (explicado en el Capftulo 16). A continuad6n explicaremos las dos funciones mas importantes del ER: la sfntesis y modificad6n de protefnas, y la sfntesis de lfpidos.

Las regiones lisas del ER pueden separarse de las rugosas mediante centrifugaci6n26 Para estudiar las funciones y las caracterfsticas bioqufmicas del reticula endaplasmMico, es necesario aislar su membrana. A primera vista, esto puede parecer una tarea imposible ya que el ER esta extraordinariamente entremezclado con oleos componentes del citoplasma. Afortunadamente, cuando se rompen par homogeneizaci6n los tejidos a cclulas, el ER se fragmenta en numerosas vesfculas pequei'ias y eerradas (-100 nm de diametra), denominadas mIcrosomas, que resultan relativamente faeiles de purifiear. Los microsomas derivados del ER rugoso estan tapizados de ribosomas, y reciben el nombre de microsomas rllgosos. Los ribosomas se encuentran siempre en la superficie exterior de dichos mierosamas, siendo su interior biaqufmieamente equivalente al espado luminal del ER (Figura 12-36). Dado que pueden ser purificados en su forma funcional, los microsomas rugosos son especialmente litiles para el estudio de muchos procesos que realiza el ER rugoso. Para el bioqufmico representan autenticas pequeilas versiones del ER rugoso, todavia capaces de sintetizar protefnas, glueosilar protefnas y sintetizar Ifpidos. 620

Capftulo 12: Compartimiemos intracelulares y c1asillcacl6n de protefnas

'------'

IAI

200nm

18(

En estos homogenados tambh~n se encuentran muchas vesfculas de ramana similar aI de los microsomas rugosos, pem sin rihosomas unidos a elIas. Estos microsomas Usos derivan en parte de porciones lisas del ER y en parte de fragmentos vesiculados de la membrana plasmatica, del complejo de Golgi, de los endosomas y de las milocondrias (la proporci6n depende del tipo de tejido de que se trate): Por consiguiente, mientras que los microsomas mgosos pueden sec equiparados a porciones rugosas del ER, los orfgenes de los microsomas lisos no resultan faciles de determinar. Una excepci6n importame la constituye el hfgada. Debido a las enormes cantidades de ER lisa existentes en el hepalocito, la mayor parte de los microsomas Usos de los homogenados hepaticos derivan del ER liso. Como los ribosomas contienen grandes cantidades de RNA, los microsomas rugosos son mas densos que los mlcrosomas Iisos. Por consiguiente, los microsomas rugosos pueden separarse de los demas mediante una cenlrifugaci6n en equilibrio (Figura 12-37). Cuando se comparan propiedades tales como la actividad enzimatica 0 la composici6n polipeptfdica de los microsomas rugosos con las de los lisos oblenidos de un tejido como el hfgado, se observa que son notablemente similares, aunque no identlcas: aparentemente la mayorfa de los componentes de la membrana del ER pueden difundir libremente entre las regiones rugosa y lisa de la membrana, tal como cabrfa esperar de un sistema de flujo continuo de membrana. No obstante, los mlcrosbmas rugosos presentan mas de 20 protefnas que no estan presentes en los microsomas lisos, demoslJando Que debe de existir algun mecanismo restrictivo para un conjunto de proleinas de la

ER'".:'7R'

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mezcle homoge· nalzede

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0°0-:- QOOO-

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centrlfugscloPl

microsomes lisos y mlcrosomes rugosos

los mlcrosomes lisos tie nan menor densidad. por 10 que dejen de sedimentsr y floten e concentraciOPles menores de sscsross

'------' 200 nm

Figura 12-36 Electronmlcrografias de rlbosomas. Cuando se rompen celulas par homogeneizaci6n, las cisternas del ER rugoso (Aj se fragmentan formando pequenas vesfculas cerradas, denominadas microsomas rugasos {Bj. De forma similar, el ER lisa se fragmenta formando pequeftas vesfculas que carecen de ribosomas, yque se denominan microsamas Usos. (A, cortesfa de Daniel S. Friend; B, cortesfa de George Palade.}

Figura 12-37 Procedimlento de aJslamJento utiilzado para purlficar mlcrosomas rugosos y iisos a partir del ER. Cuando los dos tipos de microsomas se sedimentan hasta el equilibria a Iraves de un gradiente de sacarosa, se separar\ erldosoma temprerlO

La relaci6n entre endosomas tempranos y tardfos es incierta26 No esta claro c6mo se desplazan las moleculas endocitadas de un compartimiento endosomal a otto y acaban en los lisosomas. Una hip6tesis serfa que los . endosomas tempranos van desplazandose lentamente hacia el interior de 10. celula y pasan a ser endosomas tardfos; estos se convierten en lisosomas como resultado de su fusi6n can las vesiculas que transportan hidrolasas desde 10. red del trans Golgi, de su continuo reciclaje de 10. membrana y de su incremento de 10. acidificaci6n. Olra hip6tesis serfa que los endosomas lempranos y tardios son dos compartimientos separados y que el transporte entre elias tlene lugar a traYeS de un compartimiento intermediario de transporte -mediante una red dinamica de tUbulos 0 mediante el desprendimiento de trozos del endosoma temprano que son transportados aI interior celular, donde se fusionan con los endosomas tardios (Figura 13-34). Los endosomas tempra~s y tardios se diferencian, en reaUdad, en su composici6n proteica: concretamente, estan asociados con diferentes protefnas rab, las cuales son importantes para dirigir el transporte vesicular, como veremos mas adelante (vease Tabla 13-1, pag. 689).

Las macromoleculas pueden ser transferidas a traves de las himinas de celulas epiteUales mediante transcitosis 27 Algunos receptores de la superficie de las celulas epiteUales polarizadas transfieren macromoleculas espedficas desde un espacio extracelular a otro, mediante un proceso Uamado transcitosls. Estos receptores siguen la tercera via descrita a partir de los endosomas (vease Figura 13-32). Las ratas recien nacidas, por ejemplo, obtienen anticuerpos de la leche materna (que les ayudan a protegerse de las infecciones) transportandolos a traves de su epiteUo intestinal. EI lumen del intestino es algo acido, y a esee bajo pH los anticuerpos de la leche se unen a receptores especfficos de la superficie apical (absortiva) de la celulas epiteliales del intestino y son internalizados via depresiones y vesiculas revestidas de cJatrina, y transferidos a los endosomas tempranos. Los complejos receptor-anticuerpo permanecen intactos en los endosomas y son recuperados en vesfculas de transporte que se fusionan con el dominio basolateral de la membrana plasmatica. Al ser expuestos al pH neutro del fluido extracelular, los anticuerpos se disocian de sus receptores y entran en el torrente circulatorio de los recien nacidos. En la madre, la secreci6n de estos anticuerpos a la leche tam bien tiene lugar por transcitosis, pero en direcci6n opuesta, desde la sangre hasta la leche. Otras ma666

Capitulo 13 : Tnillco vesicular mediante las rulas sccrClora y cndocftica

~

,/

0 /

~

I

microtubulo

TAANSPORTE MEDIAOO PaR

MICROTUBULOS

erldosome tardio

sino que acaban en los lisosomas, donde son degradados con el EGF. Por consiguiente, la uni6n de EGF conUeva un descenso en la concenlraci6n de los receptores de EGF en la superficie celular -un proceso llarnado regulaci6n por disminuci6n (down regulation). Como resultado de ella, la concentraci6n delligando sefial en el medio cxtracelular regula el numero de maleculas de receptor complementario de la superficie de la celula diana (discutido en Capftulo 15).

0

I

I

~

JVl.-O

L7'-' '- 0--

I

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!isosome

....... 0 -

~

red del tr,rlS

Goigi

.. . • • .'

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unIOn aSlrecha

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I

membrana@)_ plasmAliea apical endosoma temprano basalaleral

-()

membrana plnmAtie. apical

I

Figura 13·35 Dos compartlmlentos endosomales tempranos dlstlntos en una c~JuJa epltellal. Los dominios basolateraJ y apical de la membrana plasmtitica comunican con dislinlos compartimientos endosomales tempranos, a pesar de que las mol~ulas endocltadas en ambos dominios que no tienen senales para su reciclaje 0 lransellosis se encuentnln en un compartimlenlo endosomal tardio comun anles de ser digerldas en los llsosomas.

membfana

pl..mlilie. basalalefal

•

•

mfferos, incluidos los humanos, tambie;n transportan anlicuerpos a la leche de esta manera, pero los anticuerpos permanecen en el intestino del reei~n naeido y no entran, como pasa en las ratas, en el torreme ciTculatorio. EI hecho de que los diferentes receptores puedan seguir diferentes caminos a partir de los endosomas impliea que, ademas de un lugar de uni6n para el Ligando y olro para la depresi6n revestida, muchos receptores tambi~n han de presentar senales de c1asificaei6n que los gufen desde el endosoma hasta la vesfcula de transporte apropiada, y por 10 tanto a la membrana adecuada de la c~lu­ la. Se deseonoce todavia la naturaleza de estas senales.

Las celuJas epiteliales tienen dos compartimientos endosomales tempranos distintos pero un solo compartimiento endosomal tardio comun.28 En e~lulas epiteliales polarizadas, la endocitosis ocurre tanto en el dominio basolateral de la membrana plasm

bloqueado por mutantes A,B,C

bloqueado por mutanles 0,'"

las protelnas de transporte apic.ll 58 puritican mediante IU union I una columna con un 8n1icuerpo especfflCO

683

yema formando la vesicula revestida. Una vez la vesicula se desprende, la cuhierta se pierde rapidamenle. EI mecanismo por el cual se desprende tam poco se conoce, pero se ha demostrado que in vitro una proteina chaperona de la familia hsp70 actDa como una ATPasa de eliminacion de to. cubierta que utiliza la energfa de la hidr6lisis de ATP para eliminar la cuhierta de las vesiculas revestidas de datrina. Sin embargo, en la c~lula ha de actuar alglin mecanismo de control adicional para evitar que la cubierta de clatrina se elimine de la yema revestida de datrina antes de que tenga tiempo de formar una vesfcula, a pesar de que la cubierta persiste mas tiempo en la yema que en la vesfcula. Una posibilidad es que la perdida de la cubierta este controlada por Ca2., el cual puede unirse a las cadenas ligeras de clatrina y desestabilizar la cubierta de clalrina. Las bombas de Ca~' de la membrana plasmatica bomhean Ca2+ hacia el exterior de la celula y por 10 tanto la concentraci6n de Ca~' se mantiene extremadamente baja en 1a cara citos6lica de la membrana, 10 cual permite que las depresiones se manlengan revestidas; pero una vez las vesfculas revestidas se forman y migran alejandose de la membrana, se encuentran con concentraciones de Ca2+ mayores, que podrfan desencadenar la perdida del revestimiento. Normalmente las vesfcuJas pinocfticas revestidas de datrina son de tamano pequeno y uniforme, pero la datrina tambien esta irnplicada en la formaci6n de vesiculas mayores, tanto de vesiculas de secreci6n que contienen grandes agregados de proteina como de fagosomas que contienen grandes partfculas. En estos casos la c1alrina no forma revestimientos completos sino que se concenlra en detenninadas zonas de las vesiculas que se forman. Parece que la formaci6n de los parches de datrina ayudan a que la membrana se doble, pero el gran tamafio de la carga unida a los receptores evita que la membrana se pliegue 10 sufidente como para pennitir que se fonne un revestimiento completo.

Las adaptinas reconocen protemas transmembrana especfficas y las nnen al revestimiento de clatrina41 Se cree que el ensamblaje de la cubierta de las vesfculas revestidas tiene dos fundones como minimo: proporciona la fuerza mecanica para "estirar" hacia el exterior la membrana, fonnando una yema, y ayuda a capturar receptores de membrana especfficos junto con las moleculas a las que estan unido~. Una se-

~If~

~".~ t

ELiMINACION Of VEsiCULAS

--L FORMACION OE VEsicULAS

rlK:eplor de carga

k-----" clatrina

684

Capitulo 13 : TnUlco vesicular mediante las rutas secretora y endocftica

Figura 13-52 Transporteselectlvo

medJado porves(culas revestldas de

c1atrtna. Las adaptinas se unen tanto a los trisquelions de c1atrina como a los receptores de carga.

gunda moltkula principal de recubrimiento presente en estas vesiculas, un complejo formado por muchas subunidades Uamado adaptina, participa en ambas funciones. Las adaptinas son necesarias tanto para unir el revestimiemo de clatrina a la membrana como para atrapar diversos receptores proteicos transmembrana, los cuales capturan mollkulas especfficas en el interior de la vesicula. De este modo un grupo seleccionado de moleculas a transportar, unidas a sus receptores de carga especlficos, se incorporan allumen de cada una de las vesiculas de transporte revestidas de clatrina acabadas de formar (Figura 13-52). Las vesiculas revestidas de clatrina no son todas iguales. Hemos visto, por ejemplo, que algunas de elias, las que participan en el tn\nsito desde el complejo de Golgi hasta los endosomas tardios, son ricas en receptores M6P; otras, que participan en la ruta desde la membrana plasmatica a los endosomas tempranos, son ricas en receptores de compuestos extracelulares como las LOL. Aunque parece que el revestimiento de clatrina en si mismo es el mismo en cada caso, las adaptinas son diferentes y median la captura de diferentes receptores. Las adaptinas reconocen peptidos sefial en la cola citoplasmatica de los receptores. Una secuencia caracterfstica de cuatro residuos de aminoacido, que parece que fonna un giro brusco en la cadena polipeptfdica, es una parte esencial de la sena/ de elldocitosis compartida par los receptores de la superficie celular que participan en la endocitosis mediada por receptor a partir de la membrana plasmMica (Figura 13-53). Por el contrario, en la red del trans Golgi las adaptinas reconocen una secuencia de aminoacidos fosforilados enla zona carboxilo tenninal de los receptores M6P.

Las vesiculas revestidas de coat6mero median el transporte vesicular no selectivo42

motecula de carga

membrana pla,malica

adepllna

Figura 13-53 Pcptldo seoaJ para la endo 1), fas reacciones con un gran incremento de 5 (esto es, las reacciones que tengan una oS > 0) se harran favorecidas, es decir, se producirlm espontl§neamente. Como se discute en af Capitulo 2, la energia caforifiea provoca una conmociOn afeatoria de fas mofecufas. Dado que fa transterencia de cafor desde un sistema cerrado af medio incremanta el numero de disposiciones diferentes que pueden adoptar fas molecufas def medio exterior, incrementa fa entropfa del medio. Se puede damostrar qua la liberadOn de una determinada cantidad de energia caloritica tiene un etecto de desorden mayor a temperaturas bajas que a aftas, y qua, como se definiO anteriormente, ef vafor para la J),5 def medio (J),5ma ,), es iguaf a fa cantidad de cafor transferida desde ef sistema (h) af medio dividida por la temperatura (T):

LA ENERGIA LlBRE DE GIBBS, G AI trabajar con un sistema biolOgico cerrado, nos puede interesar disponer de un sistema sendtto de predecir sl una reacciOn va a tener lugar 0 no en al sistama. Hamos vista que la cuestiOn crucial es si, al producirse la reacciOn, la variaciOn de entropla del universo es positiva 0 negativa. En nuestro sistema ideatizado de la celulacaja, la variaciOn de entropia en el universe tiene dos componentes -Ia variaciOn de entropfa para el sistema cerrado de la caja y la variaciOn da antropfa en al mar circundant&- y ambos componentes deben ser considarados conjuntamante para cualquier tipo de predicciOn que se haga. Por ejemplo, es posible que una reacciOn absorba calor, haga disminuir la entropia del mar (o.5mar < 0) Y cause un gran incremento del desorden en el interior de la caja (J),5caja > 0), de manera qua la variaciOn total t..5unlve"JOt..5mar + t..5caia sea mayor que O. En esta caso la reacciOn sucedera espontaneamente siempre que durante la reaceiOn al mar cada calor a la caja. Un ejemplo de reaceiOn de este tipo es la disoluciOn da cloruro sOdico an un vaso da pracipitados conteniendo agua (la Mcaja M). Esta reacciOn tiena lugar espontanaamente a pasar da que la temparatura del agua sube cuando la sal sa disualva. los qulmicos han encontrado Litil detinir nuevas Hfunciones compuestas Mque describen combinacionesde propiedades fisicas del sistema. Las propiedades que sa pueden combinar son: la temperatura (T), la presiOn (Pl, el volumen IV), la energia (E), y la entropfa (5). La entalpfa (HI es una de estas funciones compuestas. Pero la tunciOn compuesta mlls utit para los biOlogos es. con diferencia, Ie energia fibre de Gibbs, G. Esta funciOn es util como estrategia de contaje que permite dedudr los cambios de entropfa del universo resultantes de reaceiones quimicas en la caja, evitando cualquier consideradOn sobre los cambios de entropia an al mer. Para una caja de volumen Va presiOn P, la definiciOn de G es

donde Hes la entalpfa descrita antes (E + PV), Tes Ie temperatura absoluta y 5 es la entropfa. Cada uno de estos parametros esta refarido unicamente al intarior de la caja. Durante una reacciOn que se produzca en la caja, la variaciOn de la anargla libre (Ia G de los productos menos la G de los substratos inidales) se senala como J),G, y como ahora demostraremos, es una medida directa de la cantidad de desorden generado en el universo cuando tiene lugar la reacdOn.

A temperatura constanta, la variaciOn de energfa libre (t..G) durante la reacciOn as igual a oH- Tto5. Como toH _ -h, el calor absorbido del mar, tenemos

-AG_-!Jt+ TAS ·4G-h+TAS Y -AGIr-IIIT+4$ Pero como hlTes igual a la variaciOn de antropfa dal mar (05ma,), y.1.5 en la reacciOn anterior es to5caja , tenemos

-AGIT-ASw..+

-AS.

Podemos concluir que una reacciOn se producira en la direcciOn an la que suponga que la variaciOn de energfa libre (oG) sea menor que cero, porqua en este caso, cuando tenga lugar la reacciOn se producira una variadOn positiva da la anlfopla del universo. Asf, la variaci6n de la anergia Iibre as una medida directa de la Vlrlaci6n de la entropia del universo, Para una serie eompleja de reaeeiones aeopladas en las qua participen muehas moh!ieulas diferentes, la variad6n total de energra libre sa puede medir simplemente sumando la anergia Iibre de todas las especies moleculares despues de la reacci6n y comparando este valor con la suma de la energfa libre antes de la reaceiOn; los valores de energla libre da los compuestos ml§s comunes sa puedan eneontrar en tablas publieadas. De esta manera se puede predaeir la direcei6n da una raacd6n determinada y, en consacuencia, refutar Meilmente cualquier meeanismo propuesto. Asl, pO'" ejemplo, de los valores observados para la magnitud del gradienta alactroquimico de protones a lfaveS de la membrana mitocondrial interna. se pueda asegurar que la enzima AlP sintetasa raquiere al paso de mes de un prot6n por cada molecula de AlP que sintetiza, EI valor de toG de una reaeei6n es una medida diracta del grado de desplazamiento del equilibrio da dicha reaeei6n. El elevado valor negativo qua presenta la eelula para la hidr61isis de AlP simplementa rafleja el hacho de que las eelutas mantienen la reacei6n da hidr61isis del AlP unas 10 veees alejada del valor de equilibrio. Si una reaeci6n alcanza el equilibrio,"toG _ 0, la reacei6n tiene lugar a la misma velocidad en un sentido qua en al otro. Para la hidr6tisis del AlP, el equilibrio se aleanza euando la gran mayor!a del AlP ha sido hidroli2ado, tal como ocurre en una eelula muerta.

715

pulsar orras reacciones. Debido a que la eficiente conversi6n de ADP en ATP en la mitocondria mantiene una concentraci6n de ATP elevada en relaci6n a la de ADP y de PI' la reacci6n de hidr61isis del ATP se mantiene muy lejos del equilibrio, por 10 que tl.G tiene un valor muy negativo. Si no existiera eSle desequilibrio, la hidr6lisis del ATP no se podrfa utiJizar para impulsar las reacciones de la celula, de forma que mllchas reacciones biosintelicas se producirfan ~hacia atn1s~ en lugar de ~hacia adelante".

La respiraci6n celulac es notablemente eficiente lO Por medio de la fosforilaci6n oxidativa, cada par de electrones del NADH propor· cionan energfa para la fonnaci6n de aproximadamente 2,5 molecllias de ATP. El par de electrones del FADH 2, que liene una energfa algo mas baja, unicamente ge· nera aproximadamente 1,5 moleculas de ATP. En total. a partir de cada moltkllia de acetil CoA que entra en el cicio del acido dtrico se forman aproximadamcntc 10 O1oleculas de ATP, 10 que significa que a partir de una molecula de glucosa se producen unas 20 O1oleculas de ATP y 84 a partir de una molecuJa de palmitato. un acido graso de 16 atomos de carbono. Si tambien se incluyen las rcacciones energeticas que se producen antes de que se forme el acetil GoA. la oxidaci6n oompleta de una molOCu..la de glucosa produce un rendimiento neto aproximado de 30 moleculas de ATP. rnientras que a partir de la oxidaci6n completa de una rnalerola de palmitato se producen aproximadamente 1JO moleculas de ATP netas. Estas cifras son vaJores maximos aproximados. ya que la cantidad de ATP producido en la milocondria depende del porcentaje de energfa del gradiente electroquimico que se utiUce para ouos fines diferentes a la smtesis de ATP. Cuando se comparan las variaciones de energfa Iibre de la combusti6n directa de grasas y de hidratos de carbono hasta CO2 y H20 con la cantidad lotal de energfa almacenada en enlaces fosfato del ATP duranle las correspondientes oxidaciones biol6gicas, se observa que a menudo la eficiencia con que se transforma la energfa de oxidaci6n en energia de enlace de fosfato del ATP es superior al40%. Este valor es considerablemente superior al de la eficiencia de la mayorfa de los aparalos de conversi6n energetica no biol6gica. Si las celulas trabajaran con un rendimiento igual al que tienen un motor electrico 0 un motor de gasolina (entre 10% y 20%), un organismo deberfa comer de una fomla voraz para mant.enerse vivo. Adcmc1.s, pucsto que la energfa no utilizada se libera en forma de calor, los organismos de gran volumen tendrfan que desarroUar l1leCaniSlllos mas eficientes para poder ceder este calor al medio. Los eswdiantes a veces se preguntan por que las interconversiones celulares siguen estas vfas tan complcjas. De hecho, la oxidaei6n de los azucares hasta CO 2 y H2 0 podrfa realizarse mas directamenre, eliminando el cicio del dcido cftrico y muchos de las pasos de la cadena respiratoria. De esta forma, la respiraci6n hubiera resultado mas fdeil de estudiar pero el resuhado habrfa sido desastroso para la celula. La oxidaci6n produce inmensas cantidades de energfa libre que s610 a pequeiias dosis puede ser utilizada de forma eficiente. Las vfas oxidativas complejas implican muchos intermediarios, cada uno de los cuales se dife· rencia de su predecesor en algunos detalles. Como resullado de ello, la energfa Iiberada se fraceiona en pequef'ios paquetes que pueden ser convertidos de for· rna eficiente en enlaces de alta energfa de mo1ect!las utiles, como el ATP y el NADH mediante reacciones acopladas (vease Figura 2-17).

Resumen La mitocondrla real1zn Ia mayorla tU las oxidaciones q/U se prodUCt!n en Ia cilula y genera Ia mayor parte del ATP que Sf? genera en las dlulas animales. La matrlz mitocondrial mntiene una gran ooriedad de enzimas, entre las q/U se 'ulilan las que oxidan el piruOOIO y los tfcidos grasos hasta tu:etil GoA, Y las enzimas del cicio del dcido dtrlm. ql,e oxidllll este acetil GoA hasta CO;r En estas reac:dones se prod,u:en grandes Mntidlula tk NADH (y tk FADHJ. La energla dLsponibk re$ulUmle tk Ia

716

CaphuJo 14 : Conversi6n energ~tlca: m.itocondrias y doroplaslOS

combiruu;wn del oxfgeno con los electrones reaaillQ$ rrtUlsportados por el NADH y el FADH7 se utiUzn medumte llna cadena de trall$porte electronico qlre se halla inc:luidn en In membrana interna de In mitocondria y q.4e recibe el nombre de cadena respiratoria. La cadena respiratoria bombea protona h&1n el exterior de la malriz mitocondrial, generando asf un gnuJlente ekc:troqufmico de protones al que conm· buyen tanto el potencial de membrana como In diferencla de pH. ate gnuJie"te trall$membrana se utilizo, a su tIt!%o para slnteliuu ATP y para impulstlr el trans· porte activo de detem'inados metabolltos a traves de In membrana mitocondrinl Intema. La comblnacl6n de estas reacciones es in respDIl$lIbk de lin eFlCienre intercambio de ATP·ADP entre In mitocondrin y el eltosol qlle m.ant/ene elaceroo celillar de ATP aitamente cargaLIo, de forma qlre el ATP pllede ser Iltllizado para illll,,,lsar muchas de las retICC/ones celulares que requieren e"erg(a.

La cadena respiratoria y la ATP sintasa II

membrana interna

membrana aldarna

MfTOCONDRlA DlSGREGAOA POR UL TRASONIDOS

I

ptJ0c> 0

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0

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vesiculAS CON LA CARA

Despues de estas consideraciones generales sabre la funci6n de las mitocondrias, pasemos a esrudiar con mayor detalle la cadena respiratoria -Ia cadena de transporte de electrones que es tan crucial para todo el metabolismo oxidativo. La mayona de los elementos de la cadena san componentes intrfnsecos de la membrana mitocondrial interna, y suministran algunos de los ejemplos nuts daros de las complejas interaceiones que puedan tener lugar entre protefnas individuales en una membrana biol6gica.

A partir de las rnitocondrias se pueden aislar partfculas invertidas funcionales l2 La cadena respiratoria es relativamente inaccesible a la manipuJaci6n experimental en las milocondrias intactas. Fragmentando las mitocondrias mediante ultrasonidos, es posible aislar partfcufas submitocotldriafes que estan formadas por crestas rotas que se han fusionado de nuevo, constituyendo pequenas vesIculas cerradas de unos 100 nm de dicimetro (Figura 14-23). Cuando estas partlculas submitocondriales se examinan al microscopio electr6nico. se aprecia que su superficie est sangulnell

villi.. ~ulll&

•

di,ln,l

lBI SEftALlZActON SINAPTICA varias neuronlls

varin dluln dillnll

La seiializaci6n autocrina puede coordinar decisiones

de grupos de cf!lulas idf!nticas3 Todas las fonnas de senalizaci6n que hemos descrito penniten a un tipo celula.r inDui.r sobre OlTO tipo celuJa.r. Sin emba.rgo, mediante el mismo mecanismo las celulas pueden enviar senales a otras celulas del ntismo tipo, de 10 que se deduce que pueden enviarse incluso senales a eUas mismas. En una seflalizaci6n de cste tipo, denominada aUlocrina, una celula segrega moleculas senal que pueden 774

CapftuJo 15: Transmisi6n de seftales entrecBulas

.

Figura 15-5 5ei'ializacI6n 8ulocrina. Un grupo de celulas id~nticas produce concentrnciones de moll!cula gei'ial m1s elevadas que una dlula sola.

UNA SOLA CfLULA SENAL RECIBE UNA SENAL AUTOCRINA MAs DEBIL

EN UN GRUPO DE CELULAS SEIiiAL IDENTICAS. CADA CELULA RECIBE UNA SENAL AUTOCRINA MAYOR

unirse a receptorcs de la propia c~lula. Durante el desarrollo, por ejemplo, cuando una c~lula ha sido dirigida a una etapa determinada de diferenciaci6n, puede 00menzar a segregar seilales aulocrinas que refuercen esta decisi6n de desarrollo. La seilalizaci6n autocrina es mAs efectiva cuando se lleva a cabo simultaneamente por varias c~lulas vecinas del mismo tipo. por 10 que puede utilizarse para estimular a grupos de c~lulas id~nticas para que tomen las mismas decisiones de desarrollo (Figura 15-5). Asf, se cree que la seilalizaci6n autocrina constituye un posible mecanismo sobre el que se basa el Mefecto comunitario" observado en las primeras etapas del desarrollo, segun el cual un grupo de c~lulas id~micas puede responder a seflaJes que inducen diferenciaci6n mientras que una c~lula aislada no puede hacerlo. Pero, la senalizaci6n autocrina no se produce s610 durante el desarrollo. Los elcosanoldes son mol~culas senal que a menudo actuan de una forma autocrina en los mamfferos maduros. Estos derivados de acidos grasos est.m sinletizados por celuJas de lodos los tejidos de mam(fero. $e sintetizan continuamente en la membrana plasmatica y se Iiberan al exterior celular, donde son rapidamente degradados por enzimas del medio extracelular. Sintetizados a partir de precursores (principalmente de dcido araqlliddnico) liberados a partir de los fosfolfpidos de la membrana celular mediante la aed6n de fosfolipasas (Figura 15-6). tienen una gran variedad de aetividades biol6gicas; por ejemplo influyen sabre la eOnlracd6n del museulo liso y la agregaci6n de las plaquetas y participan en las respues-

losfollpido d& membr.n&

'j-o-IH,

;vv-v-v-v=vv~-o-tH 'r -{}-A--G--' x ~

I

I

CH2

losfoliplISli

okido .r.,qu,dOnico t20 e8rbonot) en conforln8C06n .xtendid8

kido .rllCfutdOnico en conform.ciOn plegllde

Figura 15-6 Lasfnteslsdeun eicosanolde. Los eicosanoides son continuamente sintelizados en las membranas. a panir de cadenas de tlcidos grasos de 20 carbonos que cOlllCngan. al menos, tres dobles enlaces. como se muestra en (Al p.1ra el caso de la sfnlesis de proslaglandina PGEz, EJ subfndice se refiere a los dos dobles enlaces carbono-carbono siluados filera del anillo de PGEr Enslen cuatm da.ses principales de cicosanoides -las prosrnglandinas. las prostaddinas, los rromboxnllOS y los !eucornetl05- y (odas eRas cstAn sintetizadas a panirdel OXIGENASA

~ucotrlerlOS

prostKielinM.

,.,

tromoourlOS

775

tas inflamatorias y febriles. Cuando las c~lulas se activan por dano tisulnr 0 por a1gun tipo de senales qufmicas, se incrementa la velocidad de sfntesis de ccosanoides; el incremento resultante de los niveles locales de eicosanoides influye tanto sobre las c~lulas que los sintetizan como sobre sus vecinas inmediatas. Figura 15·7 SenaJizacl6n a traves de

Las uniones comunicantes permiten que la informaci6n de

sefializaci6n sea compartida por las celulas vecinas

4

Qtra via para coordinar las actividades de las c~luJas vecinas consisle en las unlo· nes comunlcantes 0 de tJpo gap. Se trata de uniones especializadas reluJa-c~lula que pueden fonnarse entre membranas plasm~ticassiruadas en eslrecho conlac10. y que conectan directamcnle los citoplasmas de las c~lulas que unen, a trav~ de esuechos canales Uenos de agua (v~ase Figura 19-15). Los canales penniten el inlercambio de pequeflas molecuJas sefial intraceluJares (mediadores imrace/flUlres). como el Ca20 y el AMP cfclico. pero no el de macromoleculas como protefnas y ~eidos nucleieos. Asf pues, las relulas eonectadas por uniones de lipo gap pueden comunicarse entre eUas directamente. sin tener la difieultad de la barrera que supone la presencia de las membranas plasm~licas (Figura 15-7). Como se diseule en el Capftulo 19, el patr6n de distribuci6n de las conexiones eomunicantes en un tejido puede ponerse de manifieslO lanto electrieamente, con electrodos intraeelulares, como visualmente. {ras la microinyecci6n de colorantes solubles en agua. Esludios de esle tipo indican que las e~lulas de un embri6n en desarrollo forman y deshacen uniones comunicantes siguiendo patrones espedfieos y muy interesantes. 10 eual sugiere que eslas uniones juegan un importante papel en los procesos de sefializaci6n que tienen lugar entre eslas e~luJas. Puede sospecharse que, como en el caso de la sefializaci6n autoerina deserita con anlerioridad. las uniones eomunicantes eolaboran en la coord inaci6n del eomponamiento de las e~lulas vecinas de tipo simiJar. Sin embargo, no sabemos qu~ pequenas mol~cll.las en particular son importantes transportadores de senales a lraves de las uniones comunieantes; lampoeo se ha definido con precisi6n eu~1 es la funci6n precisa de la comunicaci6n a lTav~ de las uniones de lipo gap en el desarrollo animal.

Cada celula esta programada para responder a combinaciones espedficas de moMculas sefial5 dada de un organismo pluricelular est~ expuesta a lllllehas diferentcs de su entomo. Est'as senales pucden ser solllbles, estar unidas a In mnlriz cxtracclular 0 estar unidas a la superlide de las celulas vecinas. y pueden aCluur ell varios millones de combinaciones posibles. La celula respondera a esln seleetividad de babel, de acuerdo con su car~eter especffico adquirido mediante In progresiva especializaci6n eelular, en el curso del desarrollo. Asf pues. una c~lula puede estar programada para responder a un conjumo de sel'lnles, diferenci~ndose, a otro conjullio de senales. proliferando. y a un tercer grupo de scnales. desarrollando algunas funeiones especializndas. La mayorfa de las relulas de los animales superiores, sin embargo, eSlan programadas para depender de un grupo espedfieo de senales simplemente para sobrevivir: euando son deprivadas de las sefiales adecuadas (por ejemplo. en una plaea de eultivo), las e~lulas inieian un programa suicida y se aUlodestruyen -un proceso denominado nlllerte cell/tar programada. que se discule mas extensamenle en el Capitulo 21 (Figura 15-8). Diferentes lipos de celulas requieren diferenles eonjuntos de sefiales de supervivencia, y par ello su loealizaci6n esta reslringida a diferenles ambiemes en el cuerpo. Debido a que generalmente las moleculas senal aenian en eombinaciones de elias. un animal puede eontrolar el eomportamiento de sus celulas de una manera altamente especffiea, utilizando una diversidad limitada de tales moleeulas: dent os de moleculas senal pueden utilizarse en millones de eombinaeiones dUerentes. Cualquier

c~lula

-quiz~s denlOS- senales

776

CaprtuJo 15: Transmisi6n de senates entre c~luJas

unlones comunlcantes. las celulas

que esuin conectadas por uniones comunicanles comparten las pequenas moleculas, incluidas las pequenas moleculas senal intracelulares, por 10 que pueden responder a senaJes extracelulares de una forma coordinada.

'

~

_ MUERTE CELULAR _

~

PROGRAMADA

A" \!) -

B_

~. ~

SOBREVIVE

C/

A" @ -

B_




o mplaamillico

CITOSOL

lAl

,.,

Seiializaci6n vfa receptores de superficle celular asociadas a protefnas G

J

milocondria

C1TOSOl

795

membrana plnm61ice polarizeda

:

::.j

.... '.

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..

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'ta:. .

.

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"

canal de Ce l • reguledo por voltaje c8rrado

seJilAL

TERMINAl ::.. NERVIOSO .,

membrana plasm61ica dnpolarizada

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\

::.:.:: •••• .:: ••

.

::::.:".

canaldeCa~'

~re en el drosol disminuya: esta disminud6n estimula a la guaniJaro ciclasa, la cual sintetiza GMP delico recuperando los niveles y haciendo que la celula r{jpidamente recobre el estado en el que cstaba anles de que la luz la activara. La activaci6n de la guanilato ciclasa por la disminuci6n de los niveles de Cal. esta mediada por una proteina sensible al Cal. denominada recoverina la cual, contrariamente a la calmodulina. es inactiva cuando se halla llnida a Ca2' yac· tiva cuando esta Iibre de Ca z.; estimula In cielasa cuando los niveles de Caz, son bajos Iras In respuesta a la luz. Este mecanismo dependiente de Cal. es de imponancin crucial, en dos aspectos. En primer lugar. permite al fotorreceptor revenir rapidamente basta su est ado de reposo, (fpieo de In oscuridad, tras un nash de luz, haciendo posible que el fotorreceplor pueda ser sensible a la corta duraci6n del nash. En segundo lugar. contribuye a permitir que el fotorreceplor se adaple, disminuyendo la intensidad de la respuesta cuando se expone a la luz continuamente. Como expJicaremos mas adelantc, la adaptaci6n significa que la celula receptora puede actuar como un detector sensible a cambios de la 806

Capfmlo 15: Transmisi6n de senales entre celulas

segmento e>

-.

0::::. 0::::'

= = = =

radop"na llCtiva

CIOn' Ie. de N,cenada.

celull

hiperpol,riz8dl

alta V'IlIocidad de liber.ciOn de tr.nsmisor

M,ew

Figura 15-40 La respuesta a Ja luz de una dluJa fotolTeceptora en bast6n. Los fotones son absorbidos por las moleculas de rodopsina situadas en los discos del segmento exterior. Ello dctennina que los canales de Na' de la membrana pJasmatica se cierren. 10 cual hiperpolariza la membrana y reduce la velocidad de liberaci6n del neurotransmisor desde la regi6n sinaptica. Debido a que el neurotransmisor aett:ia inhibiendo muchas de las neuronas retinianas postsinapticas, la iluminaci6n Crena la inhibici6n y, de esla Conna, de hecho. las aCliva

bI)I veloci6ad de liberiICiOn de

t.ansmi_

IlUMINACION

inlensidad del eslImulo en un enormemenle ampljo abanico de niveles basaJes de estimulaci6n. En la Tabla 15-3 se recogen datos de las principales protefnas G traladas en eSle caphulo.

Las sena1es extracelulares son notablemente amplificadas mediante la ulHizaci6n de mensajeros intracelulares y de cascadas enzirnaticas 29 A pesar de diferencias en delalles moleculares, todos los sistemas sef'alizadores iniciados por rcceplores dependiclHes de protefnas G comparlCn cicnas caracterfslicas y est:in gobernados por principios generales similares. Todos ellos, por ejemplo, dependcn de complejas cascadas 0 inician cadenas de mensajcros intracelulares. A difcrencia de 10 que ocurre con siSlemas de sei'lalizaci6n m:is directos utilizados por los receptores intracelulares discutidos anles y por recepto· res relacionados can canales i6nicos, tratados en el Capftulo II, las cascadas cataHticas de mediadores intracelulares proporcionan numcrosas oportunida· des de amplificar y de regular las respuestas a sefiales extracelulares. En la cascada de la transducci6n visual que acabarnos de describir, por ejemplo, una sola molecula de rodopsina activada cataliza la activaci6n de dentos de mol6culas de transdudna a una vclocidad de unas 1000 molecuJas de lransducina por segundo. Cada molecula de transducina activada activa una molecula de fosfodieste· rasa de GMP cfclico, cada una de las cuales hidroliza unas 4000 moleculas de GMP dclico por segundo. Esta cascada catalitica se manlienc durante aproximadamente un segundo, produciendo la hidr61isis de mas de 10~ molecuJas de GMP dcLico par cada cuanto de luz absorbida. que derra lransiloriamente centenares de canales de Na' de la membrana plasmatica (Figura 15-41). De forma similar. cuando una molecuJa seflal extracelular se une a un receptor que indirectamcnte acliva la adenil cic1asa via proteina G•• cada protefna receptora puede activar muchas molecuJas de proteina G•• cada una de las cuales puede activar a una molecula de adenil cic1asa. Como cada molecula de G. pennanece aCliva durame algunos segundos antes de hidrolizar su GTP unido. Seiiallzacl6n via receptores de superflcle celular asociados a prolc(nas G

807

Tabla 15-3 Las prlnclpaJes faml1las de proteCnas G trimerlcas* Algunos mJembros Subunldades Famill. delafamllla

•

G, G. G,

II

G. G, (transductna)

III

G.

o,

... ..

. ..

.

Fundones aCliva adenil ciclasa; aCliva canales de Cal< activa adenil ciclasa en neuronas sensoriales aloUalo inhibe adenil ciclasa; activa canales de K' activa canales de K'; inactiva canales de ea:'; activa fosfolipasa C-~ activa fosfodiesterasa de GMP dclico en fotorreceptores en bast6n de venebrado acliva fosfolipasa C-~

Modlfkado por toxlna baeteriana col~rica

activa

col~rica

aCliva

penusica inhibe penusica inhibe colerica acliva y pertuslca inhibe no tiene efecto

• Las familias se determinan por Ia relacidn entre las secuencias de aminoaddos de las subunidades u. Onlcameme se preseman ejemplos seleccionados. En mamfferos se han descrito unas 20 subunidades a y at menos 4 subunidades ~ y 7 subunidades 'Y.

puede manlener activa a la ciclasa a la que se halla un ida durante algunos se· gundos, de forma que la ciclasa puede calalizar la conversi6n de un gran nlimero de moleculas de ATP a AMP cfclico (Figura J5-42). Un tipo de amplificaci6n como este se presenta en la rum de los fosfolfpidos de inosilOl. Como resultado de eUa, una senal extracelular a concentraci6n nanomolar no'" M) induce a menudo concentraciones micromolares (10-6 M) de un segundo mensajero intracelular como el AMP dclico 0 el Ca:', Estas moleculas acnian como efeclores aloslericos aClivando enzimas determinadas, por 10 que una unica mol~cula scf'lal eXlracelular puede provocar la alteraci6n de varios miles de mol~culas en la celula diana. Ademrts, carla una de las prorefnas reguladoras de la cadena de procesos que se han aClivado puedc ser una diana independienle de la regulaci6n. ral como ocurre por ejemplo en la cascada melab6lica que produce la degradaci6n del gluc6geno en las fibras del musculo esqueletico, ESlas cascadas rnelab6licas explosivas han de estar reguladas por rnecanismos muy eficlenlcs y scnsibles, Por consiguienle, no resulla sorprendenlc que las celulas presenlen l11ccanismos eficaces para la degradaci6n rtipida del AMP cfc1ico y para el amortiguamienlo y secuesrTO del Ca2 •• asf como para la inactivaci6n de las enzimas que responden y para las protefnas transponadoras, una vez se han activado. Todo esto es c1aramente esencial para parar la respuesla y para definir el estado eSlacionario a partir del cual la celula ha de responder. Como hemos visla anles (v~ase ptig. 777), en generalla respuesla a la eSlimulaci6n puede ser frenada rrtpidamente unicamente si los mecanismos lam bien son rrtpidos.

Las celulas pueden responder de forma subita a incrementos graduales de la concentraci6n de una serial extracelularo A1gunas respuesras celulares a Iigandos de sefializaci6n aumenlan gradualmen· te de fonna proporcional a la concentraci6n del ligando. La respuesla primaria a las hormonas esteroideas (vease Figura 15· I3) sigue a menudo esle paU'6n, posiblemenle porque cada receptor hormonal une una sola molecula de hormona, y cada secuencia de DNA de reconocimiento especifico de un gen que responde a las honnonas eSleroideas acrua de forma independienle. A medida 808

Capftulo 15 : Transmlsl6n de seiiales entre celulas

una molkula de rodoplina ablorbe un lolon

$I

aetivan 500 molllcul88 de trasdU
que aumenta la concenlraci6n de la hormona, la concentraci6n de los com plejos hormona-receptor aumenta de forma proporcionai, y tambi~n awuenta proporcionalmente el numero de complejos unidos a secuencias especfficas de reconocimiento de los genes que responden: asf pues, la celula responde de una manera lineal. Sin embargo. otras respuestas a Iigandos de seflalizaci6n empiezan de manera mAs subita cuando aumenta la concentraci6n delligando. A1gunas de eUas pueden ocurrir incluso de una forma que casi es del "todo 0 nada~, siendo indeteetable por debajo de una concentraci6n umbral de Iigando y aumentando hasta un mAximo en wanto esta concentraci6n umbral se sobrepasa. Algunos factores de crecimiemo, por ejemplo, aetuan como senales de todo 0 nada indicando a las celulas que deben empezar a replicar su DNA como preludio de una divisi6n celular. leual puede ser la base molecular de una respuesta abrupta como esta, casi a modo de interruptor, ante una senal gradual? Un posible mecanismo para escalonar la respuesta consiste en que para que se produzca la respuesta haga faJta que a una macromolt:cuJa diana se Ie una una molt:cula 0 un complejo intracelular. Por ejemplo, en algunas respuestas inSenalizacl6n vfa receplores de superficie celular asoclados a proleinas G

FIgura 15-43 Respuesla que presentan las celulas del ovlduclo de gallina ante la estlmulaci6n por 18 hormona esteroldea estradiol. Una vez activados. los reccl>lores de estradiol activan la transcripci6n de varios genes direrentes. La grnfica muestra las curvas dosis·respuesta para dos de estos genes. que codifican las proteinas del huevo conalbumina uno y olJQtllbllmina el otro. La cinetica lineal de respuesla para la conalbumina indica que cada rnolfi'icula de receptor activado que se une al gen de la conalbumina incremellla la actividad del gen en la misma cantidad. Por el conlrnrio, el retraso seguido del abruplo incremento en la c1netica de respuesta para la ovoalbumina sugiere que para iniciar la transcripci6n de eSle gen se Ie han de unir simultltneamente mlts de un receptor activado (en eSle caso son 2 receplOres). (A.daptado de E.R. Mulvihill y R.D. Palmiter. I. Bioi. Chern. 252:2060-2068. 19n.) 809

'"

Figura 15-44 Cinetlcas de actlvacl6n en funcl6n de la concentraci6n de la moiecuia senal. Las curvas muestral1 c6mo se incremenla la pendiente de la respuesta a medlda que se incrementa el numero de moleculas de efector que se han de unir simultaneamenle para activar una macromolecula diana. Las curvas de la grMica son las que cabe esperar sl la activaci6n necesitara la uni6n simuhanea de 1. 2, 8016 molCculas de efector. respectivamente.

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$ubunidades proteicas inactives

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ligando se/'lal '5·

2.0

concentraci6n relativa de molecules de ef&Ctor

ducidas par hormonas esteroideas parece que han de unirse simultaneamente mas de un complejo hormana-receplor a una secuencia de DNA espedfica de

reconocimiento para conseguir activar un gen determinado. Como resultado de ello, In activaci6n del gen empieza de forma mas abrupta que si fucra suficicnle la uni6n de un solo complejo para producir eSla aClivaci6n (Figura 15-43). Un mecanisme similar a este aetDa en las activaciones mediadas por la quinasa A y por la calmodulina. como hemos discutido antes. Por ejemplo, se han de unir dos 0 mas iones Ca2• para conseguir que la calmodulina adopte su conformaci6n activa; como resultado de ello, se produce lin incremento de dncuenta veccs en la activaci6n del proceso cuando la concentraci6n de Ca 2' tan s610 se incremen~ ta diez veces. Este tipo de respuestas son lanto mas abruptas cuanto mayor sea el nlimero de moltkulas que cooperan, de forma que si el mlmero es sufidentemente elevado se pueden conseguir respuestas cercanas al "todo 0 nada" (Figuras 15-44 y 15-45). Tambicn se consiguen respuestas subitas cuando un Ugando activa a una enzima y al mismo tiempo inhibe otra enzima que cataliza la reacd6n opuesta a la de la primera enzima. Ya hemos hablado de un ejemplo de este habitual sistema de regulad6n en la estimulaci6n de la degradaci6n del gluc6geno en las celulas del musculo esqueh~tico, en las cuales un incremento en la concentrad6n intracelular de AMP cfclico actjva la fosforilasa quinasa e inhibe la acci6n opuesta de la fosfoprotefna fosfatasa. ESle mecanismo puede producir respueslas muy abruptas, pero en todo caso ligeramente graduales de acuerdo can la variaci6n de la concentraci6n del Uganda senal. Sin embargo, existe otro mecanismo par el cual una celula puede responder de forma "todo 0 nada" de modo que en cuanto la senal sobrepasa un valor umbral se produce una respuesta rapida y maxima. Todas las respuestas "lodo a nada" de este tipo dependen generalmente de la retroalimentaci611 positiva. Por este mecanismo, las celulas nerviosas y musculares generan potellciales de acci611 siguiendo la ley del" todo a nada", en respuesta a neurotransmisores (se discute en el Capitulo II). La activaci6n de los receptores de acetilcolina en una uni6n neuromuscular, par ejemplo, abre los canales cati6nicos de la membrana plasmalica de la cclula muscular. Et resultado de ella es un inl1ujo neto de Na' que despolariza localmente la membrana plasmatica. Esto hace que los canales de Nat controlados por voltaje situados en esta regi6n de la membrana se abran, produciendo un nuevo influjo de Na', el cua! despolariza aun mas la 810

Capltul0 15: Transm.lsl6n de seftales entre c~lulas

compleios proteicos Ilctivos ensnmblados de forma cooperativ8

Figura 15-45 Un tJpo de mecanlsmo de senailzacl6n del que cabe esperar que presente una respuesta sublta. Aquf se requiere la uni6n de ocho moJeculas de un ligando senal sobre un complejo protcico para activarlo: In capacidad de las subunidades para ensamblarse formando el complejo activo depende del cambio alosterico de conformaci6n que sufre cada subunidad cuando se une a su ligando. La un16n de un ligando formando un complejo de este lipo es generalmenle un proceso cooperativo, que genera una respuesta escalonada cuando cambia la concentraci6n delligando, como se explica en el Capftulo 5. A bajas concetltraciones delligando, el numero de complejos activos se incrementara subitamente en proporci6n a la octava pOlencla de la concemraci6n delligando.

membrana por 10 que los canales de Na' todavfa se abren mM, elc. Si la despolarizaci6n inicial excede un cieno umbral, csta retroalimenlaci6n posiliva tiene un efcclo "explosivo", produciendo un potencial de acci6n que se propaga por toda In membrana del mllsculo. Como hemos disculido antes, tiene lugar un mecanismo de retroalimenmci6n positivo como cstc cuando cl Cah cs liberado del EH. o del redculo sarcoplasmarico a traves de canales de Ca2.; el Ca2. liberado puede unirse a los canales de Ca2. incrementando mas la liberaci6n de Cal', produciendo asf una espiga de Ca2. tipo "todo 0 nada".

rLn ,,,'m, ~ '"oct'_'

~--i

-, ",""m, /1 -

EI efecto de algunas sefiales puede ser recordado por la c~lula31

lugal do ----' u"i6" para el producto

Un mecanismo de aceleraci6n par relroalimentaci6n positiva puede cSlablecerse entre prolefnas senal que en lugar de ser canales i6nicos presenten actividad enzimatica. Supongamos por ejemplo que un Iigando senal determinado activa una enzima localizada a mitad de la cadena de acont'ecimienlos que transmiten la scflal, y que dos 0 mas moleculas del producto de esta reacci6n emimatica se unen a la enzima activandola atin mas (Figura 15-46). La consccuencia sera que en ausencia del Ugando se producira una velocidad muy pequena de sfntesis del producto enzimatico, y que eSla velocidad aumentara muy lentamente cuando aumente la concentraci6n delligando hasta que. a un determinado valor umbral de concentraci6n del Iigando, se formam suficiente canudad de producto para activar la emima, estableciendose entonces un sistema de autoaceleraci6n. Entonces, la concentraci6n del producto enzimatico aumentara stibitamenle hasta el nivcl mas alto posible. De eSla forma, la celula puede traducir una variaci6n gradual de la conccntraci6n de un lignndo senal en un cambio de tipo "interruptor" de los niveles de lin producto enzilm1.lico delerminado, gencrando una respuesla de tipo "todo 0 nada" en la celula. £Ste tipo de mecanismo tiene una imponante propiedad que 10 hace inutiIizable para detenninados prop6silos y tinicarnente titi! para otros. Si un sislerna como este ha side activado aumenlando la concentraci6n delligando senal por encima del umbral, generalmente permanecera activo cuando la seilal vuelva a descender por debajo del valor umbral: en lugar de reflejar fielmente los niveles reales de seflal en cada momento, este sistema de respllesta liene memoria. Va hemosdiscutido cl ejemplo de la CaM quinasa II, la cual es acuvada por Ca2'-calmodulina a autofosforilarse y a fosforilar otras protefnas. La autofosforilaci6n mantiene activa la quinasa cuando los niveles de Ca 2 • ya han vuelto a la normalidad y el complejo CaZ··calmoduJina sc ha disociado de la enzima (veasc Figura 15-35). Tambien puedc actuar un mecanisme de autoactivaci6n de memoria mas abajo en lin proceso de seflalizaci6n, a nivel de la transcripci6n gcnica. Por cjemplo, la senal que desencadena la determinaci6n de la fibra muscular activa una serie proteinas reguladoras de genes especfficos de celula muscular que estimulan lanlO la transcripci6n de eslos mismos genes como de otros genes que producen muchas otras protefnas de celula muscular (vease pag. 475).

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UNION DE DOS MO!.1:CUlAS DEL PROOUCTO DE LA

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prodUC1o de

I. em,ma

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,,,zima muyaetN'

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Figura 15·46 Un mecanlsmo de "retroalimentacl6n POSltlv8 acelcrante". La uni6n inicial del Ugando sefta! activa la enzima para generar un producto, el cual se une a la propia enzima, incrementado aun mas su actividad enzimatica.

Resumen Los receptores asociados con prote{nas G aetiwm a inactivan i"din!CIamente f!nzl· mas unidas a 10 membrana plasmtftic:a a c:anales 16nkos. a traves de prole{niI$ reguladoras G trimeriau (prote{nas GJ, que Sf! inaalvan a s{ munuu medUrnte 10 111dr61isis de.1 GTP que llevan unido. Alg.,nos receptores asocliliuu a prote{niI$ G ac:tivan 0 '"ac:tluan In amnii elelma, altermuio as{ In concentrac:i6" Illtracelllltlr del ",ediador Intracelultlr AMP dclico. Otros aetivan IIntl fosfolipllStI C espedf1a, de. fosfoUpidos de inositol (la fosfoliptUll C-llJ, 10 elltllll1drollzn elfos/atidilinosltol bis/osfato (PIPJ generando dos mediadores intracel"lores -el inositol Iris/as/ato (IPJ, qlle libera eaz- destk el ER itu:rementando as{ In concentracwn de eaz· ell el dtosol, y el diaci/gUcerol, q"e permnnece en In membralla plnsmdticn y aetiva In q"innsn C. Un Illcremento de /05 nlvela de AMP del/co 0 de or- afecta la dluln es·

Seiiallzacl6n vfa receptorcs de superncle celular asoclados a protefnas G

811

amullwdo {til/II/nasa A y In fill/mull Ct'M, respectivtltnenle. til qll/mull C, In qll/tuua A y In quilUlStI CaM los/orUn" pro/ell/as diana detem.ilwd/IS sobre res/duos de uri/,a y de treon/nn, alteramlo In m:l;vitl,1d de estm protelnas. Giuln tipo de ce-

lula tie"e oofljuntos caracterlstioos de prote£tlas diana que SOil regrdadas de esta forma. 10 Clud pennUi! a In dlllin presetrtar 511 ",spuesta prop/a y carac:terlstica a c:nmbios de los niveles ;ntroc:elulnres de AMP cfclico 0 de Cal' libre. A traves de las cascadns meditulas por el AMP cfclioo 0 por el Qr2', las rrsplfesUU a 1m senales utrac:elulnres pueden ser enornreme"te ampl iftcadns. Las diferellln resplle$las medilUiLu por estos receptores SOli rtfpidamf?nte fre,lndiu C1umdo elligmufo senal ttrtra€e/ulares elimilUldo. Ello es debldo a qlle las prote{IUlS G Sf! auto/lind/van Ilidrolwmdo eI GTP que ,levan IInido, diP, es rtfpidnmetlte

desfas/orllndo mediante una fosfatasn (olos/orllado por II1Il1 quimlSil), el diacilglicernl es rdpidnmelltedegradado, los mu;le6tidos dclioos SOil rdpidamellte Iridrolizados por Ima fosfodiesterasa. el GIr' es rdpidametlte bombeado lracia fllera del citosol y las profeflms SOtl rdpidameflfe desfosforiladas por protef"a fosfatasas. El oo"amlO y rdpido recambio de eslos mediadores i"'racelulares llace posibk que se prodllZCtlllll rtfpido incremellto de SIIS OOllcellfraciolles cuatulo Ins d''''as respOIIdell a smlales extracelulares. Atlemds, las dlulas pll.edell ,uilWlr la cooperatlvidad y la retrrxdlmelltaci611 positilla IJam IUlcer que 5"S respueslas seall mas $IIbitas.

Sefializaci6n via receptores de superficie celular asociados a enzimas Como los receptores asociados a proteinas G, los receptores asociados a enzimas son protemas transmembrana cuyo dominio de uni6n aI Iigando se halla sobre la superficie exterior de la membrana plasmoitica. En lugar de lener un dominio cilos6lico que se asocia a una protefna G trimerica, sus dominios citos6licos tienen una actividad enzimfitica asociada 0 estan asociados directamente a una enzima. Mientras que los receptores asociados a protefnas G atraviesan sieIe veces la membrana. habilualmenle cada subunidad de los receplores cataHticos la alraviesan una sola vez. Existen cinco c1ases conocidas de receptores asociadas a enzimas: (l) el receptor gllallilaro cielasa, que calalizan la producci6n de GMP cfclico en el citosol; (2) los receptores t;ros;na qllillasa, que fosforilan determinados residuos de tirosina de un pequeno grupo de prolefnas senal intracelulares: (3) los receptores asociados a tirosina qllillasas, que est an asociados a protefnas que tienen actividad lirosina quinasa; (4) los rcccptores tirosina fosfarasa, que eliminan grupos fosfato de residuos de tirosina de dClcrminadas protefnas scnal intracelulares, y (5) los recepcores seri"altreollifla q/linam, que fosforilan delerminados residuos serina 0 neon ina de algunas proleinas intracelulares. Empezaremos nueslra discusi6n con el recepwr guanilato ciclasa.

Los receptores guaniJato ciclasa generan GMP cfclico directamente3 1 Los peptidos lIatriurelicos alriales (ANP, de Atrial Natriuretic Pcplidcs) constituyen una familia de hormonas peptfdicas, muy relacionadas enlre sf, que son segregadas por celulas musculares del atrium del coraz6n cuando se incrementa la presi6n de la sangre. Los ANP eslimuJan el riMn para que segregue Na- y agua e inducen a las celulas musculares Iisas de las paredes de los vasos sanguineos a que se relajen. Ambos efectos tienden a disminuir la presi6n sangufnea. EI receptor de ANP que media estas respuestas se halla presente en las ce:lulas del rin6n y en las celulas de la musculatura lisa de los vasos sangldneos; se trata de una protefna que atraviesa una sola vez la membrana plasmatica, que tiene un lugar cXlracelular de uni6n a ANP y lin dominio intracclular con actividad guanilalO ciclasa. La uni6n de ANP activa la cic1asa para producir GM P cfclico, el cual, a su vez, sc une y acliva una proteina qllinusa depelldieme de GMP cfelico (qu;"asa G), la cual fosforila determinadas protefnas sobre residuos de serina 0 treo812

Capftulo 15 : Transmisi6n de senales entre ce:lulas

dominio semejente e una inmunoglobulina dominio rico en cistelnas _

._"'_""_"""_+_-I"_+__ ss

ss

"

+,~~~~membrana CITOSOL plasm8tica

dominio tirosina quinasa

Figura J 5-47 Scls subfarnUias de receptores lirosina quinasa. Solamenle se indican uno 0 dos miembros de cada subfamilia. N6tese que en algunas subfamilias el dominio tirosina quinasa se halla inrerrumpida por una "regi6n insertada en la quinasa". No se canace el significado funcional de los dominios ricos en cisterna y de los dominios semcjanrcs a una inmunoglobulina.

regi6n insertada en la quinasa

raceplor receptor de raceptor receptor de EGF de NGF insulina, de FGF reCeplOr raceplor receptor de VEGF de IGF·' de PDGF, receplor de M-CSF

nina. Asf, los receptores guanilalo c1c1asa utilizan el GMP cfclico como mediadar intracelular de la misma forma que algunos receplOres asociados con protefnas G utilizan el AMP cfclico, can la diferencia de que la uni6n entre el ligando y la actividad cidasa se produce directamente en Iligar de sHeeder vfa una prolefna G trimerica. A pesar de que conoeemos relativamente poeos reeeptores que pertenezcan a la familia guanilato ciclasa, muchos receptores conocidos perteneeen a la familia tirosina qllillasa, de la que trataremos a eontinuaci6n.

Los receptores para la mayorfa de los factores de crecimiento son protefnas transmembrana que presentan actividad protefna tirosina quinasa especffica 32 La primera protefna receptora que se reconoci6 que presentaba actividad protei~ na t1TOslna qulnasa especifica (en 1982) fue el receptor para el factor de crecimiemo epidermico (EGF, de Epidermal Growth Factor). EI EGF es una pequefia protefna {53 residuos de aminmicidal que estimula la proliferaci6n de las celulas epidermicas y de una gran variedad de otros tipos celulares. Su recep(Qr es una protefna transmembrana, que atraviesa la membrana una sola vez, de unos 1200 residuos de aminoacido y que presenta una larga zona extracelular glucosilada que se line a EGF. Cuando el EGF se une a esta porci6n, se aCliva un dominio intracelular con actividad tirosina quinasa. Una vez activado, el receptor transfiere un grupo fosfato del ATP a determinadas cadcnas laterales de tirosina, tanto de la propia protefna receptora como de otras protefnas celulares determinadas. Muchas alros receptores para facIO res de crecimienta y diferenciaci6n tambien SOil receptares tiroslna quinasa. Entre elias, cabe destacar los receplOres para el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF, de Platelet-Derived Growth Factor). para los factores de crecimiento de los fibroblastos (FGF, de Fibroblast Growth Factors), para cl factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF, de Hepatocyte Growth Factor), para elfactor de crecimiento-I para iflSlIli"a y compuestos andlogos (fGF-I, de Insulin, insuli"like Growth FacIOr-l), para el factor de crecimiento neuronal (NGF, de Nerve Growth FacIOr), para el factor de crecimiefllo vascular endotelial (VEGF, de Vascular Endothelial Growth Factor), y para elfactor estimllladorde laformaci61l de colonias de macr6fagos (M-CSF, de Macrophage Colony Stimulating Factor), todos los cuaJes son protefnas. Como se muestra en la Figura 15-47, la familia de receptores can actividad tirosina quinasa puede subdividirse en un determinado numero de subfamilias estructurales; en cada

Sciializacion via receptares de supcrflcie cclular asociadas a cnzimas

813

I

dlmero de PDGF

'om

1 lAl

IBI

caso los receplores se fosforilan a sf mismos para iniciar la cascada de senalizaci6n imraceJular. iDe que forma la uni6n de una protefna especffica del dominic extracelular de un receptor lirosina quinasa acHva el dominic catalitico que se halla siluado al DUO lado de la membrana plasmMica? Resulta diffcil de imaginar que un cambia de conformaci6n pueda propagarse a traves de la bicapa Iipfdica a traves de una helice (X sencilla que alraviesa la membrana. EI problema qued6 resuelto cuando se demostr6 que la uni6n de un ligando haee que el receptor de EGF forme dfmeros. 10 cual permite a los dos dominios citoplasmaticos fosforilarse uno aJ ouo sobre varios resldUQS lirosina. Esta fosforiJaci6n crnzada se denomina autofosforikJci6n porque se produce demro del receptor dimerico. En el caso de los receptores de PDGF elligando es un dimero que reacciona con dos receplOres a la vel. (Figura 15-48). E! EGF, par el contrario, es un mon6mero que al parecer induce un cambio de confonnaci6n en el dominio extracelular de su receptor, 10 cual induce la dirnerizaci6n del receptor. Se cree que la dimerizaci6n del receptor es un mecanismo general de la activaci6n de los receptores asociados a enzirna que tienen un unico dominio transmembrana. La dimerizaci6n del receptor puede utilizarse experirnentalmente para inactivar espec{ficamente detenninados receptores, en un intento de determinar su importancia en una respuesta celular particular. La estralegia supone In transfecci6n de c~lulas con un DNA que codifica una forma mutalHe de un receptor tirosina quinasa que dillleriza normalmente pero que tiene un dominio quinasa inactivo. Cuando se coexpresan a elevado nivel can receptores normales, los receptores mutantes acn.ian de L1na manera dominante llegatiua (v~ase Figura 744), inhabilitando los receptorcs normales al formar dfmeros inactivos con ellos. Los procesos de senalizaci6n desencadenados por los receptores de EGF, POGF Yde FGF sc han annlizado con gran detalle. En cada caso las tirosinas de autofosforilaci6n se lltilizan como lugarcs de uni6n, de aha afinidad, para protefnas senal intTUcelulares de In c~lula diana. Cada una de estas protefnns se line a diferentes lugares fosforilndos del receptor activado, reconociendo ademas de la fosfotirosina, dCl'Crminadas cnracterfsticas del entomo de la cadena polipeptfdica. Una vel. se han unido al receptor, muchas de estas protefnas resuhan fosforiladas sobre tirosinas, y asf son activadas. De esta forma se cree que la autorosforilaci6n en tirosinas actua como una especie de interruptor que desencadena el ensamblaje transitorio de un complejo senal intracelular. el cual libera la senal al interior de la cellila. Los receptores de insulina y de IGF-I acn1an de una fomla ligeramente dire· rente_ En primer lugar, dado que los receptores son tetrameros (vease Figura 15· 47), se cree que la uni6n delligando no induce una dimerizaci6n sino una interacei6n alost~rica entre las dos mitades del receptor. En segundo lugar, la uni6n de insulina hace que el receptor fosforile su dominio catalftico, el Cllal activa la capacidad de fosforilar otra protefna (denominada substrata- J del receptor de ins"lina 0 IRS·), de insIllin Receptor Substrate-i) sabre mliltiples tirosinas. Las fos· fotirosinas de IRS·) actuan como lugares de uni6n de alta afinidad para el aco· plamienro y aetivaci6n de proteinas senal intracelulares, muchas de las cuales tambi~n se unen directamenle a otros receptores tirosina quinasa acLivados. 814

CapftuJo 15: Transmlsl6n de sciiales entrecelulas

'_plor de PDGF

Figura 15-48 Factordecrecimiento derivado de las plaquetas (PDGF). (Al Estructul1l. dimerica de la protelna. con las regiones de uni6n al receptor sombreadas en amarillo. EJ dimero se mantiene por tres enlaces disulfuro (nose muestran). {B} Debido a que PDGF es un dimero con dos lugares de uni6n, puede unirse a dos receptores adyacentes, iniciando asi el proceso de senalizaci6n intracelular. EI factor de crecimiemo neuronal (NGF), como las demas protefnas de la familia de las mmrotrofinilS (discutida en el Capitulo 21). lambi~n actua como dimeros que entrecruzan sus tirosina quinasas.

membrana plasm!lica

receptor de PDGF

crrosoL

I

740 dominio 751 t,rosina quinua n1 dividido

..---J damioio SH2

dommio SH3

IAI

dominio de unl6n para la 101101lrosine

dominlo de uni6n para !a cadena lateral de un eminoacido

«I

lSI

Los residuos tirosina fosforilados son reconocidos por prote{nas con dominios 5H2" Se ha encontrado una colecci6n complct

~

'" .~".

"',m FILAMENTOS INTEAMEDfOS " " " " " "

Los filemento. 'ntarmed,o. JOn estructurel parecidn • cuarde., de un dl'metro de aproKimadamente 10 ",m; esl'n form&dos por lal protel",el de los mamentOI intermedlol, qua conlliluyen una grim familia heterogl!inea de protelnas. Uno de 10. tiPOI de fila menlO. intermedias forma una red !lamada I"mlna nuclear que se localila debajo de la membrane nuclear interna. Otros filamentol intermediOI se extienden a 10 largo del ciloplasma proporclonl,.,do a las cl!ilula. relilteneia mec"nlca y ,oll""iendo la lanli6n mec"nice de los tejidos epitelialea medianle I, u,.,i6n de 10. citoplumas de lal cl!ilulas vecinas a trav'. de 111I unionas celular".

2Snm

25 11m

el extremo menos de los mierotubulos esta estabilizado mediante la uni6n a una estructura que recibc el nombre de centrosoma, y los extremos can crecimien· to rapido estan entonces libres para afiadir moUiculas de tubulina (Figura 16-3). EI centrosoma suele estar localizado cerca del nucleo, en la zona central de la celula. En un momento determinado, centenares de rnicrotubulos crecen a partir de un cemrosoma, a1argandose muchas mieras, con su ~extremo mas" dirigido hacia la periJeria celular. Cada uno de estos mieronibulos es una estructura di· narnica que tanto puede acortarse como a1argarse: despues de unos minutos de crecimiento durante los cuales se produce la adici6n de subunidades, su extremo mas puede sufrit una repentina transici6n que implica una perdida de tales subunidades, de forma que la longitud del microtubulo disminuye rapidamente y puede lIegar incluso a desaparecer. La red mierOlubular que emerge a partir del centrosoma esta enviando constantemente nuevas microtubulos que reemplazan a los viejos que se han despolimerizado (Figura 16·4). La naturaleza del citoesqueleto

Figura 16-2 LostrestJposde flIamentos protelcos que constlluyen el citoesqueleto. Se muesrra una elcctronmicrografia de cada tipo de filamento y Wl diagrama esquem~tico de como estan fomlados a panirde subunidades. Tambien puede observarse esquemaocamente la distribud6n de cada filamento en un tipo de relula epitelial Los colores utilizados paR cada opo de liIamento se utilizan tambien en el resto del capitulo. (las micrografias de los filamentos de actina. de los microl11bulos Yde los filamentos intennedios porconesia de Roger Craig. Richard Wade y Roy

Quinlan. respectivamente.) 845

Figura J 6-3 Un centrosoma con micronibulos adherldos. Como hemos indicado, el extremo menos, de crecimiento lento, de cada microlubulo se encuentra inmerso en la matriz del centrosoma (verde claro) que rodea a un par de estruclUras que reciben el nombre de centr(%s. Esla matriz colabora en la delerminaci6n del nlimero de microtubulos de una celula mediante la nucleaci6n del crecimiento de los microtubulos de nueva formaci6n.

+ +

La red microtubular puede encontrar el centro de la ccHula3 l.Qu~

es 10 que determina que las hileras de microtubulos lengan una posici6n delerminada en la celula? Experimentos en los cuales se utilizan ctHulas pigmentarias aisladas a pan.ir de las escamas de peces han proporcionado datos muy importanlcs: en la celula exiSlen grandes celulas a1argadas que contienen gr~nu­ los lIenos de pigmento. Los gninuJos, que pueden ser marr6n oscuro, amarilJos, rojos. 0 iridisccntes. dependiendo de la especie. estan unidos a los microtubulos y pueden agregarse en el centro de la retula 0 dispersarse a traves del ciroplasmao El movimienlO de los granuJos de pigmento se produce a 10 largo de los microtubulos y puede ser controlado por el pez; de esla forma pueden cambiar el color de su piel. En una celula pigmentaria mantenida en cultivo, el movimiento puede ser controlado convenientemente mediante la aplicaci6n de hormonas u olros reaclivos. que hacen variar las concentraciones de AMP ticHco del cilosol: un incremento de la concenlraci6n de AMP cfclico provoca la dispersi6n de los granulos. mientras que una disminuci6n implica una agregad6n de los mismos. Los granulos de pigmento pueden ser utilizados como marcadores de la disposi· ci6n de los micrOlubuJos en la celula (Figura 16-5). Si cortamos, con una aguja. una porci6n de una celuJa pigmenlaria. el frag· mento celular restanle puede sobrevivir durante largos perfodos de tiempo inc1uso aunque desaparezca su nueleo. Si realizamos la misma operaci6n cuando los granulos pigmentarios se encuenlran dispersos por el dloplasma. algunos de eSlos grnnulos qucdan auapados en el fragmento celuJar. Si, inmediatamente despues de la operaci6n inducimos una agregaci6n de los granulos de pigmenlo en eSle fragmento celular mediante lfalamienlos hormonales, estos se mueven hada ellugar donde se ha producido el corte. Pero si esta agregad6n se induce 4 horas despu~s de la operad6n, los granuJos en vez de 1110verse hada la zona donde se ha producido la lesi6n, se mueven exactamenle hada el centro del fragmento celular. Investigaciones posteriores mueSlran que cste cambio impll· ca una redistribuci6n importante de los microtubulos dentro del fragmento, de forma que ahara SlJ eXlremo menDs se encuentra en el centro del fragmento, como si eSluvieran en el centro de una celula inlacta. En efecto, el fragmento celular aislado se ha convertido en una minicelula respecto a la organizaci6n de sus microtubulos: los microtubulos se han reorganizado alrededor de un nuevo centro organizador de microtubulos (Figura 16-6).

• •

,

+ +

Figura 16-4 Cn:l mon6mero librll

.ubun~ Mill

poIlmero

LalNESTABIUDAD OINAMICA vel INTEACAMBIQ AOTATOAIO son dos comportamientos observados en los pollmeros del citoesqueleto. Ambos procesos estan asociados a la hidrolisis de nucle6tidos trifosfato. Se cree que la inestabilidad dinamica predomina en los microtubulos mientres que el intercambio rotatorio podria predominar en los filamentos de actina

La hidr6lisis del nucleotido unido reduce la afinidad de union de cada subunidad respeclo a la subunidad vecina, haciendola mas Mellmente disociable de cada uno de los extremos del memento lvease Figura 16-33 para elillble mecanismo). Es habilual que la forma se aflada al mamento V que 18 forma 0 se disgregue del filamento. Consideremos solo los acontecimientos del extremo m
o

0 000 000 000

'- If'o.

.'-=-..

CD

Como antes, el pollmero creO de cnbcza "camina" hacia el exlremo mas del filamenlo de actina con el que contacta.

a 10 largo de los micronlbulos (vease Figura 16-37), no serfa sorprcndente descubrir un tipo adicional de prolefnas rnOioras que se desplazaraJl hacia el extrema menos de los filamentos de actina.

En celulas no muscuJares pueden formarse trans ito riamente ensamblajes semejantes a los musculares48 En las celulas eucariotas superiores se fannan transitoriamenlc haces comractiles organizados de filamentos de actina y de fLiamentos de miosina para realizar una funci6n especffica y luego se deshacen. Mlis destacado aun, la divisi6n eelular en las celulas animales es posible gracias a un baz a modo de cintu.r6n de mamentos de actina y de miosina, conocido como el anilIo ConlrticlU. Esle anillo aparece justa debajo de la membrana plasm;itica durante la fase M del cicio de divisi6n celuJar; las fuerzas generadas por este anillo constrincn la mitad de la cclula conduciendo a la eventual separaci6n de las dos celulas hijas mediante un proceso conocido como citocinesis (Figura 16-72). EI anillo contn1ctil se forma al iniciarsc la divisi6n celular a partir de actina, miosina y otras protefnas. Este proceso puede scguirse mediante la tinci6n con anticuerpos nuorescentes antimiosina de las celulas en divisi6n. Por ejemplo, en los huevos del erizo de mar que est ,

«

plasmlllica

Secuestra mon6meros de actina

Iimosina

•

SltD

La migraci6n de las c~lulas animates comporta tres subprocesos distintos dependientes de aClina51 Los movimlentos de deslizamiento de las celulas animales son de muy diffcil ex·

plicaci6n a nivel molecular. Diferentes partes de la cclula cambian a la vez, y adenu1s no hay un {mica org ••

/\

extremo mal de los lilementos de actina sabre el extrema del disco Z

extremo meno, de lilamentol de actina

miosina·11. Dado que las cabezas deben imeracruar con los filamemos de aClina en la regi6n de solapamiento, los filamentos de actina han de tener polaridades opuestas a cada lado del saroomero. Esto ha side demostrado utilizando cabezas de miosina para "decorar"los ftlamemos de actina unidos a discos Z aislados. Se encontr6 que tOOas las pumas de necha de la miosina apuntaban en direcci6n opuesta a las bandas Z ntientras que los extremos menos apuntaban hacia los fl· lamentos de miosina (Figura 16-89).

disco Z

Flgura 16-89 Acada ladodela linea media de un san:6mero los rnamentos de mloslna y de actina se solapan con la m1sma polaridad relallva.

Las cabezas de miosina "caminan" hacia el extrema lnenos de los ftIamentos de actina S5 La contracci6n muscular est. La contracci6n se activa con la presencia de Caz', par la quinasa de Ja cadena ligera de la miosina, que calaliza la fosforilaci6n de un lugar particular en uno de los dos lipas de cadenas ligeras de la miosina. Las mo1ecuJas de miosina no muscular esuln reguJadas por el mismo mecanismo (vease Figura 16-73).

919

ximadamente 10 veces mas lentamente que Ja miosina del musculo esquel~tico, 10 cual produce un cicio de uni6n lento que supone que estas c~lulas s610 pueden conuaerse lentamente.

Resumen La oo"tracci6" ,muclliar se produce ",edla"te el desliznmlenlo de los jilamelllos de aclina respeclo los de ",Ioslna. La reglones de In cabeza de las molklllas de mloslna, que se proyeclan desde los fllnmelllos de ",iosina. hllcian lin cklo COndllcido porel ATP en qlle se "nell a losfllamenlos de aclina adyacellles, y se prodllce 1111 cambio co"jormaciomd qlle e",pll}a elflla",ellto de ",los/"a CQlltra el/llamell10 de act;'la, y elllom:es se separan. Di,lersas protelllas accesorias especlflcasjacilllall este cicio ell el ",dscllio y ",alltlene" los filamelllos de actina y de mlosilla en dlsllOslclones sllperp,.estas y paralelas COli la orlentac/6" correcla para que Sf! produua el desliznmle,Jto. Orras dos protelnas aa::ewrlas -troponlna y tropomlosina- permiten que la contrncci6n del rrllUc:r.do esquelitioo y del mWeldo cardlaco esti rtgI,lnda por el or', En lasflbrasdel nll!u;1I10 lIso,yen In mayorla dedlulas no mwclllnres, In actina y la miosbUl prodllam In contracd6" ch IIIUl JomUl similar a la del nll!u;lllo nqllelitico y rordlaco, Sin embargo, 'as lI1lidades oolltrtfctlles SOli mds peqllenas y menDs orgatlizadas en eslas ct"dasj tanto Sll ac:fiuidad como Sll estado ch ensambla}e estd" controlndos por ,ma josjorl'ad6" de In cade"a lIgera de In "'losina lkpelldie"te de or'.

Bibliograffa General Amos. LA.: Amos, W.o. Molecules of the Cytoskeleton. New York: Guilford Press. 1991. Bershadsky, A.D.: Vasiliev, I.M. Cytoskeleton. Ne\'V York: Plenum Press. 1988. Bray, D. Ceu Movements. New York: Garland Publishing, 1992. Kreis, T.E.; Vale, R.D., eds. Guidebook to Cytoskelelal and Motor Proteins. Oxford, UK: Oxford University Press. 1993.

Chas I. Cell motility. Trellds Cell Bioi. 3:363-412, 1993. Elson. E.L Cellular mechanics as an indicator of eytoskeletal structure and function. AIlIIll. Rev. Biophys. Biopllys. Cllem. 17:397-430, 1988. Ingher. D.E. Cellular tensegrity: defining new rules of biological design that govern the cytoskeleton. j. Qll Sci. 104:613-627. 1993. 2. Gelfand, V.I.: Bershadsky. A.D. Microtubule dynamics: mechanisms, regulation, and function. Antill. Rei'. Qlf Bioi. 7:93-116, 1991. Karsenti, E.; Maro, 0. Centrosomes and the spatial distribution of microtubules in animal cells. Trellds Biocliem. Sci. 11:460-463, 1986. 3. McNiven. M.A.: Porter, KR Organization of microtubles in centrosome-free cytoplasm. j. Cell Bioi. 106:1593-1605.1988. 4. Corthesy-Theulaz, I.: Pauloin, A.; Pfeffer. S.R. Cytoplasmic dynein participates in the centrosomallocaUzation of the Golgi complex..}. Qll Bioi. 118:1333-1345. 1992. 920

Capftulo 16: EI cltoesqueleto

Kreis. T.E. Role of microtubules in the organization of the Golgi apparatus. Cell Motil. Cytoskelero" 15:6770, 1990. Lee. c.: Chen. LB. Dynamic behavior of endoplasmic reticulum in living cells. CeIl54:37-46. 1988. Terasald, M. Recent progress on structural interactions of the endoplasmic reticulum. Cell Moti!. CytoskeletOil 15:71-75. 1990. Vale, R Intracellular transport using microtubule-based motors. Amm. Rev. Cell BioL 3:347-378, 1987. 5. Euteneuer, U.; Schliwa, M. Persistent. directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of miocrotubules. Natllre 31 0:58-61. 1984. Lee. I.: Ishihara, A.: Threiot, I.A.; Jacobson, K. Principles of locomotion for simple-shaped cells. Nlltllre 362:167·171,1993. 6. Euteneuer, U.; Schliwa. M. Mechanisms of centrosome positinjng during the wound response in SSC-I cells. J. Cell Bioi. 116:1157-1166. 1992. Gyoeva. F.K.: Gelfand, V.1. Coalignment of vimentin intermediate mamets with microtubules depends on kinesin. Nature. 353:445-448, 1991. Kupfer, A.: Singer. S.I. Cell biology of cytotoxic and helper T cell functions: inmmunonuorescence microscopic studies of single cells and cell couples. All/Ul. Rell.I/tImullol. 7:309-337. 1989. 7. Albers, K.; Fuchs, E. The molecular biology of intermediate filament proteins. lilt. Rev. Cytol. 134:243-279, 1992. Cary, R.B.; Klymkowsky. M.W. Finding filament function. Curro Bioi. 2:43-45,1992. Steinert. P.M.: Roap. D.R. Molecular and cellular biology of intermediate filaments. AIIIIII. Rev. Biocllem. 57:593-625,1988.

8. Chou, Y.-H.; Bischoff. J.R: Beach, D.; Goldman, RD. Intermediate filament reorganization during mitosis is mediated by p34loides, y la duraci6n de su cicio celular es aproximadamente de 2 horas. Si se colocan en situaci6n de ayuno, entran en meiosis y forman esporas haploides, las cuales germinan cuando las condiciones rnejoran y forman celulas haploides que pueden proliferar 0 fusionarse sexualmente (conjugarse) en fase G] formando celulas diploides, dependiendo del enlorno y de Q[ros factores. Las levaduras de fisi6n, pOT el contrario, normalmente proliferan como celulas haploides, y en condiciones de ayuno se fusionan formando celulas diploides que atraviesan nipidamente la meiosis y la esporulaci6n y regeneran celulas haploides. Las cepas de levaduras de gemaci6n mas utilizadas en ellaboratorio son celulas mutantes que puedell proliferar, igual (lue las levaduras de fisi6n, como celulas haploides.

,

(AI SIN CONTROL NUTRICIONAL DEL CICLO CELULAR

(B) CON CONTROL NUTRICIONAL DEL CICLO CELULAR

• o

2

,

reducei6n de .. nutriei6n

•

5 6 7 unid&des de tiempo _

o

2

,

redooci6n de .. nutriei6n

alms, dependiendo de d6nde se apliquen el control de tamano a la mayorfa de los controles ambientales. Asf pues en la levadura de gemaci6n el punta de control GI' Hamada Inicio, es el punta de conlrol de lamano molo del huso. En las figuras de la izquierda lajlecha roja seii.ala la direcci6n en que crece el microrubuJo, mientras que lafleclw gris seflala la direcci6n de deslizamiento del cromosoma. En la figura de la derecha se presenla una reconstrucci6n tridimensional por ordenador de un cromosoma de trit6n en prometafase, a partir de varias secciones finas. Este cromosoma (azul) no ha hecho mas que iniciar su desplazamiento hacia eJ [)olo del huso tras la uni6n de su cinetocoro (Ilaranja) a un microtubulo (blanco). (De C.L Rieder yS.P. Alexander. J. Cell 8iol. 110:81-95,1990, con permiso de copyright de The Rockefeller Universiry Press.)

Figura 18·20 Experimento que demuestnl que los mlcrotubulos c1net0c6rlcos metafulcos afiaden subunldades por su extremo "mu" unldo al c1netocoro. En este experimento se inyecl6 lubulina mareada con f1uorescencia a una cl!lula viva. en la que aeab6 incorpornndose a los microtubulos del huso (!Jerde). Entonces se inlrodujo lubulina mareada con rodamina a una cl!lula en metafase, en la que se incorporo a unos microlubulos cineloc6rlcos, concretamenle en el extremo "mas· (naranja) por el que se unen al dnetocoro. Tambil!n se observa una cierta incorporad6n en e1 centrosoma. (umesia de G. Borlsy.)

eada cinetocoro captura cada vez mas microlubulos, a medida que se desliza hacia el polo del huso, donde la densidad de microtubulos es mas alta. Durante este proceso las interacciones iniciales de los microtubulos que se produdan en los costados se convierten en interacciones en los extremos. con el cinetocoro adherido al polo ~mas~ de cada microlubulo. Finalmente, el cinelOcoro contrario, situado en la otra cromatida hermana, sem capturado por el extremo Iibre de un microtubulo procedente del polo contrario del huso, colocando a las cromatidas para su segregaci6n y tensando el sistema de microtubulos cinel0c6ricos. Dichas tensiones se deben a las propiedades especiales de los acoplamientos entre microtuhulos y cinetocoros, que veremos a continuaci6n.

Los extremos "mas" de los microtubuJos cinetoc6ricos pueden anadir y perder subunidades de tubulina mientras estan adheridos al cinetocoro lO Como los microujbulos polares, que despues de eSlablecer los conexiones emzadas en el ecuador del huso continuan anadiendo subunidades a llllO de sus extremos y perdiendo[as en el Olro, los microtubulos cinetoc6ricos tambien mantienen un eslado de Ilujo dinamico. Si se inyecta tubulina marcada qufmicamente en celulas mit6ticas durante la metafase, se observa que se incorpora continuamcnte a dichos micronjhulos cerca de su punto de uni6n al cinctocoro (Figura 18-20). VerCIllOS brevemelllc que durante la anafasc ocurrc la rcacci6n inversa, y que se pierden moleculas de tubulina de estos microtubulos cineloc6ricos a medida quc se desplaza hacia el polo del huso. Este hecho hace necesario que tanto la adici6n como la perdida de Illol&ulas de tubulina se produ7.ca mientras el cineiocoro conserva una uni6n Illecanica firme can los microtubulos. Dicha uni6n continuara siempre bajo presi6n, tanto si las moleculas de tubulina se anaden como si se pierden. Asf pues, parece que el cinelocoro acnia como un collar corredizo, que mantiene una asociaci6n lateral con las sllhllnidades de tubulina polimerizada cerca del extremo del microtubulo mienlras permite la adici6n 0 la perdida de moleculas de tubulina en dicho extrema (vease Figura 18-28, mas adelante). Cuando se afladen molecuJas de tubulina, el collar se mantiene en el extrema del microtubulo desliZ-

I I ,

lranja preprof•• ica

do_m_"'_~_'_b_"_~_'_~, En la telofase el fragmoplasto est. f ~ por dos juegos de mietotubulot palares. Las veskul.. derivada. del GoIgi que transportan precuraorn de pared celular .soo::iada$ eon micro!ubulos H 8CUmulan en Ia fe916n ecuaton.l y so fusiorlan fonnat'ldo Ia plae. celular tempr.na.

restot cIe microtubulo. polarn del huso

_

Los microtubulot c1e1 fr.gmoplasto .. forman de nUllVo en la perileria de la plat.' ee1ular temprana. En asta fe9i6n Ie reclutan nuevas vesiculas deriv.d.. del Golgi, V as lusionan sl borde de la plae. celulsr, extendi6ndola hacia III exterior.

placa celular temprana

microtllbuloa del fragmoplaslo

G, La membrana de la placa celular an crecimiento se fusiona con la membrana plallm.tica de la c'lula madre, completando la nueva pared celular. En cada UM de las dOl c'lulas hii" Ie relltahlece la formacion cortical de microtubulol Interfhlco•.

formaclon cortlt.'1 de micrOlubulos interf••ico.

plasmodesfl'lOt

lAl

Figura 18~39 Caracterisllcas princlpales de la mitosis y de Ja dloclnesls en una d!lula vegetal superior, (A) Diagramas que muestrnn celulas vegetales en Gz' lclofasc, cilocinesis, y G. temprana, resaltando los cambios dimtmicos que se producen en 13 dislribuci6n de los microtubulos a 10 largo del cicio celular. (B) MicrograrIas de inmunonuorescencia de ceJuias de la punta de las rakes de cebolla, moslrando la rranja preprorasica de microllJbulos en Gz y el rragmoplasto en cilocinesis. Los micron1bulos se lifien de IIt!rd~, y los cromosomas de QZlIl. (8, conesfa de Kim Findlay.)

1008

Capftulo 18: Los mecanismos de la divisi6n celular

'"

visi6n: cuando se forme la nueva placa celular, durante la citocincsis, crccen\ par los bordes hasta fusionarse con la pared de la celula progenitora, precisamente en la zona que anleriormenle ocupaba la franja preprofase (veasc Figura 18-39). Aunque tras la desaparici6n de la franja preprofase se dcsplace el contenido celular mediante cenlrifugaci6n, la placa celular en crecimiento tendera a encontrar su camino de vuelta al plano definjdo por la anterior franja preprofase. Ahora sabemos que la franja preprofase contiene numerosos filamentos de actina ademas de microtubulos. La presencia de fLIamentos de actina no se limi[a a la corteza celuJar; en relulas vacuoLizadas tambien forman un cstructura discoidal radial de fLIanlentos, que cruza la relula y se conecta al nudeo central en divisi6n, sujet Iibre citoplasmared de la blasmla. (0) Mientras. en el polo vegetativo, el epitelio conliml.a invaginandose. (E y F) El epitelio continuasu invaginaci6n y se extiende formando untubo illlestinallargo: las cl!lula que se invaginan cambian activamenle su empaquetamiento sin alterar demasiado su forma celular normal. convirtiendo asf su formaci6n inicial de cupula aplanada en un tuba digestivo largo y estrecho. Este tipo de movimiento de tejidos, en el que una capa de cl!lulas se a1arga en una dirccci6n al mismo tiempo que se acorta en la otra, es una de las causas principales del remodelaje durante el desarrollo animal y se denomina exrensi6n conl.lt!rgeme. AI mismo tiempo, a1gunas cl!lulas de la capa epitelial que se invagina proycctan filopodies hacia el interior de la cavidad del blasl(K;ele; diches filopodios entran en COnlacto con las paredes de la cavidad, se adhieren a ella, y se cantmen, contribuyendo asf a dirigir el desplazamiento invaginante. (G) EI extremo del tuba digestivo entra en cantaeto con la pared de la blastula en la localizaci6n donde aparecerli la futura boca. Aquf se fusionarli el epitelio formando un agujero. CA, de R.D. Burke, R.L. Myers, T.L. Sexton, yc. Jackson, Dev.BioL 146:542-557, 1991; B·G segUn L. WolperyT. Gustafson, Endeavollr26:85-90, 1967.)

aconlccimientos, comenzando a partir de una senciUa bh1sluJa hucca. Esquematicamente. las celuJas situadas en el polo vegetativo se invaginan, formando un tubo que finalmente entrara en conlacto con el epiteJio cerca del polo opuesto del embri6n. fonnando la boca. Mientras Ian 10, en determinados pun los salen celulas del epileJio invaginado y se desplazan por el interior de la cavidad del cuerpo formando el lejido conjuntivo embrionario, 0 mest!"qllima. En la estructura triestratificada (ormada por la gastrulaci6n, la lAmina interna, el tubo digestivo primitivo. cs el e"dodermo; la lamina externa, es decir el epitelio que ha permanecido extcrno, es el ecrodermo; y entre ambos esta el mesodermo, la capa mas laxa de lejido formada por celulas mcsenquimalosas. ESlas son las lres hojas gennlnalcs iniciales caracterfslicas de los animales superiores. La organizaci6n del embri6n en estas tres capas se corresponde, a grandes rasgos, con la organizaci6n del adulto -inlestino en el inlerior, epidermis en el exlerior, y lejido conjumivo y. musculo entre ambos. Globalmenle se puede decir que estas tres capas de lejidos adultos derivan respeclivamente del endodenno, del ectodermo y del mesodermo, aunque exislen excepcioncs. EI proccso de la gastrulaci6n es mas complejo en el huevo de Xenopus que en el de erizo de mar. Sin embargo, cs imponante conocer sus principios basicos ya que los ejes fundamentalcs del cuerpo de un venebrado se generan por los desplazamientos de la gaslrulaci6n. Los detalles de est'e proceso se describen en la Figura 21-6. Ellejido situado junto a la media luna gris, a un lado del polo vegetativo. juega un papel fundamental. Aquf la gastrulaci6n comienza con una pequefta invaginaci6n que se eXliende gradualmente formando el blaslopora -una linea de penetraci6n que finalmente se curva rodcando cl polo vegetativo. EI lugar donde comienza la invaginaci6n define el labia dorsal del blasloporo; CSIC tcjido juega un papel importanle en las complejas series de movimientos que se producen a continuaci6n y a partir de el se produciran las estrucluras Movimlentos morfogenicos y la forma del mapa corporal

1115

PQLOANIMAL

linea media dorul

,, ,,,

,, ,, tabla dOfHI del b1..toporo

'11/,

'~~~~v,

tapOn vitelino

POLOVEGETATIVO

im6genes eJlterioles ~

cavidad

ectodermo neural

........

tptaca neuraU

intestinal

b1a5locele oblit...clo

_ _do

-labia del blastopore

vitelo

'mm

""

secdones lransYef'U1es

dorsales del eje principal del cuerpo. Como ocune en el erizo de mar. el resultado final del proceso completo es una estructura triestratificada: un capa de ectodermo extern a, un tubo interno de endodermo formando el rudimento del intestino, y entre ellos un capa de mesodermo. De nuevo. la boca se desarrolla como un orificio formado en un punto anterior en el que el endodenno y el ec· todermo entran en comacto directo sin intervenci6n del mesodermo. La transformaci6n que se ha producido durante la gastrulaci6n se puede resumir dibujando sobre la superficie del embri6n, al inicio de la gastrulaci6n. un mapa de deslillQ que indique las regiones destinadas a formar especfficamente cada una de las panes del cuerpo del adulto; en la Figura 21-68 se muestra uno de eslos mapas.

Los movimientos de gastrulaci6n se organizan alrededor dellabio dorsal del blastoporo< 7 EJ labio dorsal del blastoporo desempena una funci6n central no 5610 en el sentido geometrico. sino tambien como fuente de control. Si se secciona el labio dorsal de un blastoporo de un embri6n nonnal al comienzo de la gastrulaci6n y dicho labio se injerta en otro embri6n en posici6n diferente, el embri6n receptor

1116

'6'

Figura 21-6 La gastruJacl6n en Xenopus.. CA) Las im~genes exteriores (arriba) muestran el embri6n como un objelO semitransparente, la visi6n es lateral; las secciones transversales (abajo) est~n extraidas del plano medio (el plano en el que se cruzan las Ifncas dorsales y ventrales). Las diTecciones del movimiento celular se indican mediante flechns rojm. La gastrulaci6n se inicia cuando aparece una cona invaginaci6n. el primer signo del futuro blastoporo. en el exterior de la bl~stula. La invaginaci6n se extiende gradualmente, CllJ'VlIndose alrededor de la bltislula hasta que cierra el cfrculo envolviendo un grupo de celulas con abundante vilelo (que finalmente quedartin encerradas en el inlestino y ser.in digeridas). Mienlras eslO ocurre, varias capas de celulas se repliegan alrededor dellabio del blasloporo yse desplazan hacla el interior del embri6n. AI mismo liempo el epilelio externo de la rcgi6n del polo animal se extiende ocupando el lugar de la capas celulares que se han replegado. Finalmente, el epilelio del hemisfcrio animal se extiende de esta fonna cuhrlendo la superficle exlerna del emhri6n en su tOlalidad. y a medida que se complela la gastrulaci6n. el circulo del blastoporo se contrae quedando reducido pr~cticamente a un punlO. (8) Mapa del destino de las diferentes zonas del embri6n temprano de Xe,lOpUJ (visto lateralmente) al inidar la gaslrulaci6n. que muestra los orfgenes de las celulas que formaran las tres capas germinales como resultado de los movimientos en la gaslrulad6n. Las distintas partes del mesodermo (placa lateral. somitas y nOlocorda) derivan de celulas situadas mtis profundamente en la franja rayada. de cuyo epitelio se segregarAn posteriormente; las otras celulas, incluidas las 111M superfidales de la franja rayada. dar6n lugar al ectodermo (azul y rajo. en la parte superior) 0 al endoderll1O (mnarillo. pane inferior). En resumen, las primeras celulas que se IJliegan hada el inlerior de huevo, es dedr que inlJOl'lcio/lulI. efectuanll1ovimienlOS en el interior del embri6n formando las estructuras endodermicas y mesodermlcas mas anteriores, mientras que las ultimas celulas en illvolucionar forman las estructuras mas posteriores. (Segllll R.E. Keller,}. Exp. Zool. 216:81- 10 I. 1981.)

CapCtulo 21: Mec:anJsmos celulaTes del desarrollo

~"-'~ E"='~ el labio do....l de un bl.stoporo del d&dor " inje." el'l un luger ,norma''''' 81 receptor

localizacian de invaginaei6n

~.

.~ .

."

.

.

el embfi6 ---- 0,5 mm ~ Plstilo: Organo que condene uno 0 nUcleo mas ovarios, cede uno de los cuales del tubo contiene Ovulos. Cede Ovulo es polinico huesped de dlulas que atraviesen la maiosis, formando un saco embrionario que contiene la dlula huevo femenina lcosfera). En la feeundeciOn. une celula espermatica se fusiona con la relula huevo construvendo el futuro embriOn diploide, mientras que Ie otra 58 fusiona con des nucleos del S8CO embrionario cOflstituvendo al tejido triploide endospermico. Sepalos: eslruetures an forma de hoja que forman un revestimienlo protector durante el desarrollo floral temprano.

p6Ulo-

piltilo

v-m- lernprene

.. n~

La estructura de la flO!" as variada y caracterfstka de cada

espeeie; comprende cualro formaciones de estructuras concentricas que padrlan considerarse hojas modiflCadas.

LASEMILLA Una samilla consta de un embri6n quiesceote. reservas nlllritivas y la envoltura. AI final de su desarrollo eI contenido de agua puede

haber descendido desde un 90 a un 5%. Est' protegida por un truto Cuyos tejides son de origen matemo.

• la oostera fecundada del interior del saco embrionario creee formando un embri6n, sirviendose de los nutrientes transponados desde el endospermo por medio del suspensor, Una serie compleja de divisiones celulares, ilustrada aqul por una hierba pequefla llamada zurr6n de pastor, origina un embri6n con un meristemo apical da la ralz, un maristemo apical del brote, y una lmonocotiledOneas) 0 dos (dicotiledOneasl hojas 0 cotiledones. El desarrollo sa detiane en este estadlo, y al saco embrlonario, que contiena el embri6n, se conviene ahora en una semlUa preparada para su dispersl6n y capal de sobrevivir en circunstancias adversas.

Para qua un embriOn continue su desarrollo es neeesario qua su semilla germine, un proceso que depende de factores internos lestado qulescente) y de factores medioambienlales, como el agua, la temperatura y el oxlgeno. las reservas nUlritivas para la fase temprana de la germinaciOn pueden sar tanlO el endospermo (maid como los cotil8dones 19uisentes y judlas). Habitualmente, primero emerga la raiz primaria de la samille, para assgurar al suministro da egue necesario para Ie pl8ntula desde al comlenzo. EI cotiledon(as) pueda(nl apar8C9r por encima del sualo, como en la judia de jardin mOSlrada aqul, 0 continuar debajo del suelo, como en los gulsantas. En ambos cases los cotiledones acaber'n por extinguirse. . Ahora el meristemo apical puede mostrer su capacidad para el crecimianto continuo, produciando al petrOn tipice de nudes. internudos y vames ('lease Figure 21-841.

germinaci6n de

una judla da Jardin

Panel21·2 Caractedstlcas generales del desarrollo temprano de las plantas con Dores.

1189

se detiene poco despues de este estadio, y el embri6n queda empaquetado en una semiffa, especializada para la dispersi6n y para la supervivencia en condiciones adversas. EI embri6n en la semilla se estabiliza por deshidralaci6n, y puede permanecer latente durante un perfodo de tiempo muy largo -incluso centenares de all0S. Cuando se rehidratan, las semillas germinan y continua el desarrollo embrionario.

Los m6dulos repetitivos de una planta son generados secuencialmente por los meristemos71 Sin entrar en detalles, el embri6n de un insecta 0 de una animal vertebrado es un modelo rudimentario a pequena escala del organismo madura, y los detalles de la eslructura del cuerpo se completan progresivamente a medida que este aumenta de tamano. EI embri6n de la planta crece hasta convertirse en adulto de manera bastante diferente: las partes de la planta adulta se generan secuen· cialmente par medio de grupos de celulas que proliferan estableciendo las estructuras perifericas de la planta. Estos gmpos de celulas, todos importantes. se denominan meristemos aplcaJes (vease Figura 21-84). Cada meristemo esta formado por una poblaci6n de cclulas madre autorrenovables. A medida que estas celulas se van dividiendo, producen una progenie que emergera desde la regi6n meristem.~44:!3-104.lm.

Ilobenoon, ILl l'lurlpolf1lllalll..... c.llimea ........,. ["mlbe mouoepnn line.. TrmdlGmrt. 2:9-13.'_ \\"Llllam•• R.L. ~ aI. M)'&Iold &.uUml.o InhlbltOt)' r.."or maln,aln. the da"lop"",ntal pmenllal of tmbl)'Oflk .,em ClI'I". 336>685-687. 1988. 26, Well'. P,A, Prlnciplel of De>....... pmenl. pp. 289-437. New \'0,1;; !lOll, 1939. 27, SI~lll."n.IL O~dle D"wmln.tlO1\ dc, en!en 0'11"'lIll'Ken drI Ampltlb"'''embryo I-VI. Ar'l'h. /),'w, Mt'(!h. 0". 52:448-555. 191 B. U, Uuc~I"g/l4m, M, Making mu,""Ie III mammal•. T..t'Ilds GrlrOl. 6: 144_ H9. 1992. W~lnlra"b. fl.. dtronlc PM 1iIf-14. ..... tho .....,Iullonary Iollpllnulonl of domlnanl mulalionl In p"tOem-fonnallon lIl""'I. 0..""""'1ml I) 1991 :47·54. 39 Cook!. I. PnlpnlleJ of Ih. prim.ry ofJl/lnl.. llon n.ld In Ihe .mbryo of Xow,,,,, /Mr.s. I.... I'.ltern (ormallon and regulation followlnll e~"f Inhibition or ",ltoolo. J. £mb'}:p, MQrpl'Qi, 3O:4s.!l'1ty .r. Indep.",d..nl of DNA rc:pllc.·

tion In X'''op0<S embryo•. /),,,,.,Ioprmm 112:S59-5119. 1991. SJlt"h, N. Toward•• molocuJar unde"'landig of iliffemUI,lon mechanisms In AscldlaJI embryo" 1JI0QSllY' 7:51·56,1987. 40. I!lll" R.E., Yuan, I.V.; Horvitz, It,ll. ,\lechanJ$ms and funClkml of cell d ••th. ..11"'0. Ret'. c.,U lJIol. 7:G6J· 698,1991.

Va"". D.L.; .....el<m.on. 1.1.; Klm. S.K.

de.'"

~nUon

of pro-

grammed cell In o...,wrhabdlli, elq;ans by human bd.2..'idtn""2511:1955-1957, 1992.

41. Lawrence, I'A Tile Maldng of.

~ly:

111. Genetlco of

Anlnl.1 ~Ign. Oxford. UK: BI.clo:well Sclenllflc,

1\192, Lowrence, P.A, f'aralleglt1~nlJl and comparlmem. In lhe DrostJph{/~ embryo. N~lure 313:639·&42.1985, 4J, Campoll.Qnega, IA: Hanensleln, V, n\e Embryonic l)e· velopmenl of Drow/,hfla me/anogal/fr. flerlln: Sprin. ger.I985, Poe. V.£.: Alt>erU, 8.M. Sludleo of "ud.,a, .nd cytoplas· m!c behavlm during the five mllollc cy.:les ,hat pre' cede ~O$lmlallon ;n Drosophila embryogenesl,. I. Q:IISCI.61:31-70,19BJ. r..epdn, M.; Gru".wald, II. cell llhape chong... duri"8 gUI",I"'!on In D/W{Jphl/a. o.,,,,lo/,mrm 110:73.84.

42,

Man~le.·Arlao. A.:

,"".

Tect",ou. C,),1, A olngle cdl .pp"",cb 10 f'",I,lems of oell lineage and ""mmhmem during .",t>yug.,,,,,'b of Drosophila ""'1tI"''8...lI.... Developmenr 100:1·12, 1987 44. 51. )ohnslon, D.; NUliSlcln.volhRtd, C. The OIigin of pal. tern .nd polarlt~ It\ lh" Drosophf/~ "mbry. CsII Gll:201·219,1992, 45. Ande""", I::. V,; $. 3:Q1.Q5. 1993.

1.1"""'' '

68

l>ubouIe.

"_ia 11"lVRJ'd UnlVl:'f1It)' Pre", 1968.

51ruhl, G, GenCi co"trolUtlK "When! bpllI'lf!cation In DrolOplllla thorn. Prrx. NMI. Atvl
70

11

n.

of

71

l>e\,·l"p"."l

LV., ,.... V.H

In pellphe'al llINlolu erk GmaDn!. 7;7ZJ-T.D.1'93 64. HarlenItftn. V~ Pooakony. LW. A dual funI:doa 01 the ."-It ...... In ~ tftIOllJurn de>"t1opmerM. Dort< 8IoL 142:13-30. 1M tlt'lll:ler. P. S,rnpoon. P The clx>la of ~d fale In m.. t'Pldefmlt "r 0 .....,'11I14. QrU64,10IJ·l092. 1991 Slembe1a. P.W, 1'al1l", aIf m.. knlle nil"- 0",. BIoI. 3.'163·765.1993. 65, McGlnnll, W.; Garber, R.L; 1t1.:., J.; !Cur,*,,"-. "'; Cehrln. WI. A homolOfloul poIeln.codln, Wfjuence In Df'Owphll~ homeOiIc ",neoand III co_tlon In llll>e. m",..-nl. CrlI31:403•• oe, HIM. MUllo" M ),1.; Ca"llKtI, AE.; De R6bl:rdl, KM. A 11... m..ooo.·eonlalntn, 80ne expretllO Iht .upt"k"I"jWI of tht Fet.... mookey neol1tx. I, Comp. Nturoi. 145:61·ll4,1972, 110. Goolln, K.: 1I."kt'. G. I:.ptrlmem.... ~lVIlkmOl On 1M pmom of ""l,rlly by h!p~'ll\p"1 nr1IlyIIs or ""urorl&Ipowtll cones. Cftl7s:217.227, 199J. Sch_b. M.£.; ""pIN"""",. I.P.: Bandtlow, e.1i.. Inhlbl. 10r5 of Murltt OOl'srnwth. Annu. /IftJ, ,'V""fWd 16~-S95, 199J. ~ I,.,tl, N,:

l'oo, M,·" Orlenlallon ", ntll,I,a pDWIh hy UtfKcll"lar t1tclrlc lIt1dJ. I. ,'V""fflICl, 2:483·0196.

"" IIlbllulfarr,

TD.I.,.Lavlp,

M_:

!'lllC,,tk, M. Ta.... 11(rac:tlon: art by chemo,ropllll\! TrmdI ,\'t".--t 15:303·310.1991, \\11...... S.W. Cues /rom d~ ~nal ....i"'noe ""'. ,ants In Dro urty and ~ ftII'lIIUo"' In the ao;U()IlS oIlIiii'\'e puwItl fKtoI. 1'MWNtO/1lWi. 7:91·".19&1 1lloonm,. H. The d>an&l.. _ of .-.rotn:Jp/\lt taoIOn. TmItb tww'Ofd. 14 160S- 179. IMI . . . SaMs. I_R. TOIlOIfItIlIlc ..... and rnokcuIar plm.... QIn o,M. ,'\ItWOWOOI. 3:t7·74. II!I3. Sptrry.It,W tylnchaocdtlty.-t>or ....... we Ilber palWInI arid _tUl«d. riry.Cftl nm...._ 10lSuppll:77-. 1m llodflold. So; Kalb. R.G. Aa~1 ItJ'UmInI dIa.... dwi.. I>t\ltOrIIII dt,elopilCllL QIn 0piJ0. ,'\:no""'" ]:87-92, II!I3. 1lCl. a.rt-. II. 'o1ooMI n:ptritolOl IIOd cankaI dt.,1 'I" mL 23I.lt9-204. It." Oint. H.T.; Do!tUI, EA; e.-tIroo!.hton. M. N· mtthyl'D'upIItaI1l '"'tIllO' .......... dn ",, 6...... lin ",11,10