Protein Saflaştırma: Kromatografik Teknikler

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1 Kromatografik Teknikler (Uygulama Örnekli) Doç. Dr. Münir TUNCER ÖNSÖZ Başta biyoloji bölümler...

Author: Münir Tuncer

186 downloads 1138 Views 7MB Size Report

This content was uploaded by our users and we assume good faith they have the permission to share this book. If you own the copyright to this book and it is wrongfully on our website, we offer a simple DMCA procedure to remove your content from our site. Start by pressing the button below!
Report copyright / DMCA form

DOWNLOAD PDF

PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1 Kromatografik Teknikler (Uygulama Örnekli)

Doç. Dr. Münir TUNCER

ÖNSÖZ Başta biyoloji bölümleri olmak üzere, temel tıp bilimleri, biyokimya bölümleri, çevre ve gıda mühendisliği bölümleri; eczacılık, veterinerlik ve ziraat fakülteleri de dâhil olmak üzere, temel fen bilimlerinin hemen her alanından bilim insanları proteinlerin saflaştırılması ve karakterizasyonu ile ilgili çalışmalarını sürdürmektedirler. Bu çalışmaların sonucu olarak da son zamanlarda, ister doğal ister rekombinant proteinlerle ilgili olsun, Ülkemizde bazı çalışmalar giderek artmaktadır. Fakat bu çalışmaların yapılması esnasında yararlanılabilecek Türkçe bir kaynağın olmadığı da dikkat çekmektedir. Bu nedenle, proteinlerin saflaştırılmasında kullanılan kromatografik teknikleri teorik ve pratik olarak açıklayan bu kitabın hazırlanması gerekli görülmüştür. Bu Kitabın devamı niteliğinde olan Protein Saflaştırma 2: Elektroforetik Teknikler’in yazımı ise devam etmekte olup, en kısa zamanda sizlere ulaştırılması için gayret gösterilmektedir. Özellikle lisansüstü öğrencilerinin yanı sıra, lisans öğrencileri ve araştırmacılara da yararlı olacağını umduğum bu kitap 11 bölümden oluşmaktadır. Kitabın ilk bölümünde proteinlerin saflaştırılması ile ilgili temel bilgilere yer verildikten sonra, takip eden bölümlerde ise hem düşük basınçlı hem de yüksek basınçlı kromatografi tekniklerinin temel prensipleri ele alınmıştır. Daha sonraki bölümlerde ise proteinlerin saflaştırılmasında ve karakterizasyonunda sıklıkla kullanılan her bir kromatografi tekniği, uygulama örnekleri ile birlikte ayrı ayrı ele alınmıştır. Kitabın hazırlanması ve basılması aşamasında gösterilen tüm özene karşın, kitapta bazı hataların da olabileceğini; bu tür hataların hoşgörü ile karşılanmasını ve eleştirilerin tarafıma iletilmesini bekler, kitabın genç meslektaşlarıma, öğrencilere ve hayatı “protein” olan bilim insanlarına yararlı olmasını dilerim. E-posta: [email protected] Mersin, 2008


Bu kitabın hazırlanması süresince, Onlar için ayırmam gereken zamanlardan kısmak durumunda kaldığım çocuklarım; Merve ve A. Oğuzhan’a …


PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1: Kromatografik Teknikler

İÇİNDEKİLER

SAYFA NO:

1. PROTEİN SAFLAŞTIRMADA TEMEL PRENSİPLER 1.1. Giriş ……………………………………………………………………………………………..… 1.2. Biyokimyasal Araştırmalara Genel Yaklaşım ……………………………………………….... 1.2.1. In Vivo Çalışmalar ……………………………………………………………………... 1.2.2. In Vitro Çalışmalar ……………………………………………………………………... 1.3. Enzimler Neden Saflaştırılmalıdır? …………………………………………………...……….. 1.4. Protein Saflaştırmada Temel Faktörler ………………………………………………...……... 1.5. Enzimlerin ve Diğer Proteinlerin Kararlılıklarının Korunması ………………………………. 1.5.1. Denatürasyonun Önlenmesi ………………………………………………………….. 1.5.2. Katalitik Bölge İnaktivasyonunun Önlemesi ………………………………………... 1.5.3. Proteolitik Parçalanmanın Önlenmesi ……………………………………………….. 1.6. Proteinlerin Özütlenmesi (Ekstraksiyonu) ….………………………………………………... 1.6.1. Nükleik Asitler ve Lipitlerin Uzaklaştırılması ………………………………………... 1.7. Ön-fraksiyonlama Prosedürleri ve Yoğunlaştırma …………………………………….......... 1.7.1. Çöktürme (Presipitasyon) ....……………………………………………………….…. 1.7.2. Ultrafiltrasyon ……………………………………………………….……………….…. 1.7.3. İyon Değiş-Tokuş Kromatografisi ………………………..……………………….…. 1.7.4. Kuru Formdaki Sephadex G-25 İlavesi ………………………………………….….. 1.7.5. Diyaliz ve Liyofilizasyon ……………………………………………………………..… 1.8. Rekombinant Proteinlerin Saflaştırılması …………………………………………..…........... 1.8.1. İnklüzyon Cisimleri ……………………………………………………………..……… 1.8.2. Etiketleme ………………………………………………………………………..…….. 1.9. Kromatografik ve Elektroforetik Teknikler …………………………………………..…..……. 1.10. Saflaştırma Prosedürlerinin Takibi ……………………………………………………….…..

1 2 4 4 5 6 6 7 7 8 9 11 12 14 17 19 19 20 20 20 21 23 25

2. KROMATOGRAFİNİN TEMEL PRENSİPLERİ 2.1. Giriş ……………………………………………………………………..………........................ 2.2. Dağılma Katsayısı ……………………………………………………..………........................ 2.3. Kromatografinin Mantığı ……………………………………………...………........................ 2.4. Kolon Kromatografisinin Kullanımı ………………………………...…………....................... 2.5. Kromatografi Terminolojisi ……………………………………………………....................... 2.6. Kromatografi Sistemleri ……………………………………………..…………....................... 2.7. Kolon Kromatografisinin Parametreleri ……………………………..…………..................... 2.8. Kromatografik Sistemlerde Çözünürlük ……………………………..………….................... 2.8.1. Kapasite Faktörü ………………………………………………………...................... 2.8.2. Verimlilik ……………………………………………………..……….......................... 2.8.3. Seçicilik ……………………………………………………...…………....................... 2.9. Kuantifikasyon, İnternal ve Eksternal Standartlar ……………………..……….................... 2.10. Kromatografik Sistemlerin Seçimi …………………………………..………........................

27 27 28 29 31 32 32 34 36 36 38 39 40

3. DÜŞÜK BASINÇ SIVI KROMATOGRAFİSİ (LPLC) 3.1. Giriş …………………………………………………………………………….......................... 3.2. Kullanılan Kolonların Özellikleri …………………………………….…………...................... 3.3. Destek Materyalleri (Matriksler) ……………………………………….………...................... 3.4. Durgun Fazlar …………………………………………………………..………...................... 3.5. Kolonun Paketlenmesi …………………………………………………................................. 3.6. Paketlenmiş Kolonun Kontrolü ………………………………………..………...................... 3.7. Örnek Materyalinin Hazırlanması …………………………………..…………...................... 3.8. Örneklerin Kolona Yüklenmesi ……………………………………..…………....................... 3.9. Örneğin Kolondan Elüsyonu ………………………………………..…………....................... 3.10. Dedektörler ve Fraksiyonların Toplanması ………………………..…………....................

43 44 45 46 47 48 50 51 53 56

4. YÜKSEK PERFORMANS SIVI KROMATOGRAFİSİ (HPLC) 4.1. Giriş ………………………………………………………………..……………........................ 4.2. HPLC’nin Avantaj ve Sınırlamaları ………………………………….…………..................... 4.3. HPLC Sistemleri ………………………………………………………………......................... 4.4. Matriksler ve Durgun Fazlar ………………………………………….………........................

59 59 60 61

i



4.5. HPLC Kolonları ……………………………………………………………….......................... 4.6. HPLC Kolonun Paketlenmesi …………………………………………………....................... 4.7. HPLC Hareketli Fazları …………………………………………….…………........................ 4.8. HPLC Pompaları ………………………………………………..……………......................... 4.9. Örnek Hazırlama ………………………………………………..……………......................... 4.10. Örneklerin Kolona Yüklenmesi ………………………………..……………........................ 4.11. Örneklerin Elüsyonu …………………………………………..……………......................... 4.12. Detektörler ……………………………………………………...……………........................ 4.12.1. Refraktif İndeks Dedektörleri ………………………..……………......................... 4.12.2. UV/Vis Spektrofotometrik Dedektörler …………………….………..................... 4.12.3. Flouresans Dedektörleri ……………………………………………....................... 4.12.4. Konduktivite Dedektörleri …………………………………………......................... 4.12.5. Elektrokimyasal Dedektörler ………………………………………........................ 4.13. HPLC Uygulamaları ………………………………………………………….........................

63 66 67 68 71 72 74 76 80 82 87 88 88 89

5. JEL FİLTRASYON KROMATOGRAFİSİ (GFC) 5.1. Giriş ……………………………………………………………..…….……...…........................ 5.2. GFC’nin Temel Prensipleri .......……………………………….…….…………....................... 5.3. Matriksler …………………………………………………….……….……….......................... 5.4. Deneysel Parametreler …………………………………………..…….………....................... 5.5. Moleküllerin Davranış Özellikleri …………………………….…….…………........................ 5.6. Deneysel Koşulların Dizaynı ………………………………………….………........................ 5.6.1. Performans ………………………………………………….…………....................... 5.6.2. Matriks Seçimi …………………………………………...….…………....................... 5.6.2.1. Deneyin Amacı …………………………………..…………......................... 5.6.2.2. Ayrıştırılacak Olan Moleküllerin Özellikleri …........................................... 5.6.2.3. Örnek Materyalinin Özellikleri …………………………….......................... 5.6.3. Kromatografi Koşullarının Seçimi ……………………………………...................... 5.6.3.1. Kolon Seçimi ………………………………………………........................... 5.6.3.2. Akış Oranı …………………………………………………........................... 5.6.3.3. Örnek Materyalinin Özellikleri …………………………….......................... 5.6.3.4. Hareketli Faz ……………………………………...………............................ 5.6.3.5. Optimizasyon ……………………………………………….......................... 5.7. Jel Filtrasyon Kromatografisinin Gerçekleştirilmesi ……………….…………..................... 5.7.1. Jelin Hazırlanması ……………………………………….……………...................... 5.7.2. Kolonun Paketlenmesi ve Dengelenmesi ………………….………….................... 5.7.3. Örneğin Kolona Yüklenmesi ……………………………….…………...................... 5.7.4. Elüsyon …………………………………………………….…………......................... 5.7.5. Kolonun Temizlenmesi ………………………………….……………....................... 5.7.6. Kolonun ve Jellerin Korunması ………………………….……………..................... 5.8. GFC Uygulama Örnekleri ……………………………………………………………...............

91 91 93 93 95 98 98 100 100 102 103 103 103 105 105 108 108 109 109 111 111 111 111 113 114

6. İYON DEĞİŞ-TOKUŞ KROMATOGRAFİSİ (IEC) 6.1. Giriş ………………………………………………………………….…………......................... 6.2. İyon Değiş-tokuş Kromatografisinin Teorisi ……………………….…………...................... 6.3. İyon-değiştirici Matriksler ………………………………………….…………......................... 6.4. Fonksiyonel Yüklü Gruplar ……………………………………….……………...................... 6.5. Kapasite ……………………………………………………………………….......................... 6.6. Deneysel Koşulların Dizaynı …………………………………………...………..................... 6.6.1. İyon-değiştiricinin Seçimi ……………………………………...………..................... 6.6.1.1. Ayrıştırma İşleminin Özgül Gereksinimleri ……….………....................... 6.6.1.2. Örnek Bileşiklerinin Moleküler Büyüklükleri ………………....................... 6.6.1.3. Örnek Bileşiklerinin Kararlılığı ve İzoelektrik Noktaları ……..................... 6.6.2. Başlangıç Koşullarının Dizaynı ………………………………….............................. 6.6.2.1. Başlangıç pH’sının Seçilmesi …………………………………................... 6.6.2.2. Kuvvetli veya Zayıf İyon-değiştiricinin Seçimi ……………….................... 6.6.2.3. Tampon Seçimi …………………………………….…………...................... 6.7. İyon Değiş-Tokuş Kromatografisinin Gerçekleştirilmesi ……………………….................... 6.7.1. Kolon Seçimi ve Dizaynı ……………………………………………….....................

117 117 119 120 121 122 122 122 124 124 125 125 129 130 133 133

ii



6.7.2. İyon-değiştiricinin Miktarı ve Kapasitesi ……………………………….................... 6.7.2.1. Kullanılabilir ve Dinamik Kapasitenin Belirlenmesi ………….................... 6.7.3. İyon-değiştiricinin Hazırlanması ………………………………………..................... 6.7.4. Kolonun Paketlenmesi ve Kontrolü …………………………………….................... 6.7.5. Örnek Materyalinin Hazırlanması ve Yüklenmesi …………………….................... 6.7.6. Elüsyon …………………………………………………….....………......................... 6.8. Kolonun Rejenerasyonu, Temizlenmesi ve Korunması ……………….………................... 6.9. IEC Uygulama Örnekleri ……………………………………………..………..........................

133 133 136 137 137 137 140 141

7. ODAKLAMA KROMATOGRAFİSİ (KROMATOFOKUSİNG) 7.1. Giriş ……………………………………………………………………………........................ 7.2. Odaklama Kromatografisinin Mekanizması ..................................................................... 7.2.1. pH Gradientinin Oluşturulması ............................................................................ 7.2.2. Proteinlerin Davranışları ...................................................................................... 7.2.3. Odaklama Etkisi .................................................................................................. 7.3. Materyaller ve Ekipmanlar ............................................................................................... 7.4. Çözünürlüğü Etkileyen Faktörler ..................................................................................... 7.5. Deneysel Koşulların Dizaynı ........................................................................................... 7.5.1. Jel ve Tampon Seçimi ........................................................................................ 7.5.2. İyon-Değiştiricinin Miktarı .................................................................................. 7.5.3. Jelin Hazırlanması ............................................................................................. 7.5.4. Kolonun Paketlenmesi ve Kontrolü .................................................................... 7.5.5. Örnek Materyalin Hazırlanması ve Yüklenmesi ................................................. 7.5.6. Elüsyon .............................................................................................................. 7.6. Polybuffer ve Amfolitlerin Proteinden Ayrıştırılması ....................................................... 7.7. Denatüre Edici Ajanların Varlığında Kromatofokusing ................................................... 7.8. Odaklama Kromatografisi Uygulamaları ..........................................................................

145 146 146 147 148 149 150 153 153 153 153 153 154 154 155 156 156

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ (AC) 8.1. Giriş ……………………………………………………………………………........................ 8.2. Affinite Kromatografisinin Temel Prensipleri ………………………………....................... 8.3. Materyaller …………………………………………………………….………....................... 8.3.1. Matriks Materyalleri …………………………………………..……….................... 8.3.2. Ligand Seçimi ve Ayırıcı-Kol ……………………………......………..................... 8.3.3. Ligandın Matrikse Bağlanması …………………………….…………................... 8.3.4. Reaksiyona Girmeyen Reaktif Grupların Bloke Edilesi ..................................... 8.3.5. Bağlama Verimliliğinin Taranması ..................................................................... 8.4. Pratik Prosedürler ……………………………………………………..………...................... 8.5. Affinite Kromatografisinin Uygulamaları …………………………..…………..................... 8.6. İmmünoaffinite Kromatografisi ........................................................................................ 8.6.1. Temel Prensipler ................................................................................................ 8.6.2. Poliklonal Antikorların (Antisera) Üretimi ............................................................ 8.6.2.1. Poliklonal Antikorların Avantaj ve Dezavantajları ................................... 8.6.3. Monoklonal Antikorların Üretimi .......................................................................... 8.6.3.1. Monoklonal Antikorların Avantaj ve Dezavantajları ................................ 8.6.4. İmmünoglobilinlerin Serumdan Fraksiyonlanması .............................................. 8.6.5. Antikorların Tutuklanması ve Proteinlerin Elüsyonu ........................................... 8.7. Grup-Özgüllüğü Göstern Ligandlarla Affinite Kromatografisi ……………………............ 8.7.1. Lektin Affinite Kromatografisi ……………………………….………...................... 8.7.1.1. Konkanavalin A (Con A) ....................................................................... 8.7.1.2. Lentil Lektin .......................................................................................... 8.7.1.3. Wheat Germ Lektin ................................................................................ 8.7.1.4. Helix pomatia Lektin ............................................................................. 8.7.2. Boya-Ligand Affinite Kromatografisi ………………………..……….................... 8.7.2.1. Boya Kolonlarından Proteinlerin Elüsyonu .......................................... 8.7.2.2. Boya Adsorbentlerinin Temizlenmesi ve Korunması ........................... 8.7.3. Heparin Affinite Kromatografisi ……………………………..………..................... 8.7.4. Kalmodulin Affinite Kromatografisi ………………………….………....................

159 160 162 162 162 164 166 167 167 169 169 169 170 173 173 177 178 179 180 180 181 182 182 182 183 184 185 185 186

iii



8.7.5. Nükleotid Affinite Kromatografisi …………………………………….................... 8.7.5.1. Poli–U Affinite Kromatografisi ……………………………....................... 8.7.5.2. Poli–A Affinite Kromatografisi ……………………………....................... 8.7.5.3. 5’ AMP ve 2’5’ ADP Affinite Kromatografisi ……………........................ 8.7.6. Protein-A ve Protein-G ile Affinite Kromatografisi ……………............................ 8.7.6.1. Protein-A Affinite Kromatografisi …………………………....................... 8.7.6.2. Protein-G Affinite Kromatografisi …………………………...................... 8.7.7. Küçük Ligandlar ile Affinite Kromatografisi ………………………….................... 8.7.7.1. Benzamidin Affinite Kromatografisi ………………………...................... 8.7.7.2. Lizin Affinite Kromatografisi ………………………………....................... 8.7.7.3. Arjinin Affinite Kromatografisi ……………………………........................ 8.8. Metal Şelat Affinite Kromatografisi …………………………………..………..................... 8.8.1. Matriks Materyalleri ........................................................................................... 8.8.2. Kolonun Hazırlanması ve Dengelenmesi ........................................................... 8.8.3. Örnek Materyalinin Yüklenmesi ve Elüsyonu .................................................... 8.9. Kovalent Kromatografisi …………………………………………….………........................ 8.10. Affinite Kolonlarının Rejenerasyonu ve Saklanması .....................................................

187 187 188 188 189 189 190 191 191 192 192 193 193 193 194 195 197

9. HİDROFOBİK İNTERAKSİYON KROMATOGRAFİSİ (HIC) 9.1. Giriş ………………………………………………………………….………........................... 199 9.2. HIC’nin Temel Prensipleri ……….…….…….................................................................... 200 9.3. HIC’yi Etkileyen Faktörler …………………………………………………………………….. 201 9.4. HIC ile RPC’nin Karşılaştırılması ……………………………………………………............ 203 9.5. HIC Adsorbentleri …………………………………………………………………………….. 204 9.6. Deneysel Koşulların Dizaynı …………………………………………...………................... 205 9.6.1. Stratejik Noktalar …………………………………………………………………….. 205 9.6.2. HIC Jelinin Seçimi …………………………………………………………………… 206 9.6.3. Tarama Deneyleri ……………………………………………………………………. 207 9.7. Hidrofobik İnteraksiyon Kromatografisinin Gerçekleştirilmesi ………………................... 208 9.7.1. Kolon Seçimi ve Dizaynı ………………………………………………................... 208 9.7.2. Kolonun Paketlenmesi ve Kontrolü ……………………………………................. 208 9.7.3. Örnek Materyalinin Hazırlanması ………………………………………………….. 208 9.7.4. Örnek Materyalinin Yüklenmesi ……………………............................................ 210 9.7.5. Elüsyon …………………………………………………….....………...................... 210 9.8. Kolonun Rejenerasyonu, Temizlenmesi ve Korunması ……………….………................ 213 9.9. HIC Uygulama Örnekleri ..…………………………………………..………........................ 213 9.9.1. HIC’nin Amonyum Sülfat Çökeltmesi ile Birlikte Kullanılması ………........……… 213 9.9.2. HIC’nin IEC ile Birlikte Kullanılması ………………………………………………… 213 9.9.3. HIC’nin GFC ile Birlikte Kullanılması ……………………………………………….. 215 9.9.4. Tek-adımda Saflaştırma Tekniği Olarak HIC ……………………………………… 215 10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ (RPC) 10.1. Giriş ………………………………………………………………….………............................ 217 10.2. RPC’nin Temel Prensipleri ……………………….……...................................................... 217 10.3. RPC Adsorbentleri ……………………………………………………………………………… 220 10.3.1. RPC Matriksleri ………………………………………………………………………… 220 10.3.2. RPC Ligandları ………………………………………………………………………… 222 10.4. RPC’de Çözünürlük ……………………………………………………………………………. 223 10.4.1. Bağlama Kapasitesi …………………………………………………………………… 224 10.5. Deneysel Koşulların Dizaynı ………………………………………………………………….. 224 10.5.1. Kolon Uzunluğu ................................................................................................... 224 10.5.2. Hareketli Fazın Akış Oranı .................................................................................. 225 10.5.3. Kromatografik İşlemin Gerçekleştirildiği Sıcaklık ................................................. 225 10.5.4. Hareketli Fazın Kompozisyonu ............................................................................ 226 10.5.5. Gradient Elüsyonu …………………………………………………………………….. 228 10.5.6. RPC’nin Kullanım Amacı ..................................................................................... 229 10.5.6.1. Tuz Giderimi ............................................................................................ 229 10.5.6.2. Yüksek Çözünürlüklü Saflaştırma ........................................................... 230 10.5.6.3. Büyük-Ölçekli Preparatif Saflaştırma ..................................................... 230

iv



10.5.6.4. Saflaştırma İşleminin Basamakları .......................................................... 230 10.6. RPC’nin Gerçekleştirilmesi ............................................................................................... 233 10.6.1. Kolon Materyalinin Seçimi ................................................................................... 233 10.6.1.1. Uygulamanın Gereksinimleri ................................................................... 233 10.6.1.2. Örnek Bileşenlerinin Moleküler Kütleleri ................................................. 234 10.6.1.3. Örnek Bileşenlerinin Hidrofobisiteleri ...................................................... 234 10.6.1.4. Örnek Bileşenlerinin Sınıfı ....................................................................... 235 10.6.2. Hareketli Faz Seçimi ............................................................................................ 235 10.6.2.1. Organik Çözücü ...................................................................................... 235 10.6.2.2. pH ........................................................................................................... 236 10.6.2.3. İyon-eşleştirme Ajanları .......................................................................... 238 10.6.3. Örnek Materyalinin Hazırlanması ....................................................................... 239 10.6.4. Hareketli Fazın Hazırlanması ............................................................................. 240 10.6.4.1. Hareketli Fazın Depolanması ................................................................. 240 10.6.4.2. Organik Çözücünün İmhası .................................................................... 241 10.6.5. Dedeksiyon ........................................................................................................... 241 10.6.5.1. Hayalet Pikler .......................................................................................... 241 10.6.5.2. Hareketli Fazın Dengelenmesi ................................................................ 242 10.6.6. Kolonun Dengelenmesi ....................................................................................... 242 10.6.7. Elüsyon Koşulları ................................................................................................ 243 10.6.8. Kolonun Rejenerasyonu, Temizlenmesi ve Korunması ..................................... 244 10.7. RPC Uygulama Örnekleri ................................................................................................. 245 10.7.1 Doğal Olarak Sentezlenen Peptidler ve Proteinler .............................................. 246 10.7.1.1. Trombosit-Türevli Büyüme Faktörünün Saflaştırılması ......................... 247 10.7.2. Rekombinant Peptidler ve Proteinler .................................................................. 248 10.7.2.1. İnklüzyon Cisimlerinin Saflaştırılması .................................................... 249 10.7.2.2. Rekombinant İnsan Epidermal Büyüme Faktörünün Saflaştırılması ...... 249 10.7.3. Kimyasal Olarak Sentezlenen Peptidler .............................................................. 249 10.7.3.1. Fosforile PDGF α-reseptör-türevli pY574α Peptidinin Saflaştırılması .... 250 11. İNCE TABAKA ve KÂĞIT KROMATOGRAFİSİ 11.1. Giriş …………………........................................................................................................ 11.2. Temel Prensipler ………………………………………………………………….................... 11.3. İnce-tabakaların Hazırlanması ………………………………………………….................... 11.4. Örneğin Uygulanması …………………………………………………………...................... 11.5. TLC Tankları ve Plakanın Geliştirilmesi …………………………..…………….................. 11.6. Kesiksiz Plaka Geliştirme ………………………………………….……………................... 11.7. Analitlerin Belirlenmesi ……………………………………………..…………...................... 11.8. Kâğıt Kromatografi (PC) …………………………………………..…………….................... 11.8.1. Temel Prensipler ……………………………………………...………….................. 11.8.2. Deneysel Prosedür ……………………………………………………….................

253 253 254 255 257 259 260 261 261 262

Ek-1: Amonyum sülfat ile çökeltme tablosu .............................................................................. 263 KAYNAKLAR ........................................................................................................................... 265

v



vi



SEMBOLLER VE KISALTMALAR

ε

Kromoforun molar ekstinksiyon sabiti (molar absorbtivite)

α

Seçicilik faktörü

β

Volümetrik faz oranı

ΔE

Deneysel dalga boyundaki absorbans değişimi

½h

Pikin yarı yüksekliği

a

Gaus pikinin birinci yarısının %10 yüksekliğindeki genişliği

A

Absorbans

a

Gaus pikinin birinci yarısının alanı

A280

280 nm’deki absorbans

Af

Asimetri faktörü

APMSF

4-Aminofenil-metilsülfonil florid

AS

Adsorbent yüzey alanı

AUFS

Tam ölçek sapma absorbans birimi (Absorbance Units for Full-Scale Deflection)

b

Gaus pikinin ikinci yarısının %10 yüksekliğindeki genişliği

b

Gaus pikinin ikinci yarısının alanı

BSA

Bovin serum albümin

C

Protein derişimi (mg mL-1)

CDI

N,N’-karbonildiimidazol

CM

Analitin hareketli faz içindeki derişimi

Cp

Enzim preparatındaki toplam protein yoğunluğu

CS

Analitin sabit faz içindeki derişimi

d

Küvetin ışık yolu (cm)

D

Örnek molekülünün diffüzyon kat sayısı

dA

Analitin yükleme noktasından (orijin) olan uzaklığı

Da

Dalton

dm

TLC’de solvent (hareketli faz) ucunun, orijin noktasından olan uzaklığıdır

DMSO

Dimetil sülfoksid

E

Standart protein solüsyonunun (1 mg ml-1) 280 nm’deki absorbansı

EDTA

Etilendiamin tetra asetik asit

EGTA

Etilen glikol tetra asetik asit

ELISA

Enzim-linked immünosorbent assay

ES

Enzim-substrat kompleksi

ETE

Eelektroforetik titrasyon eğrisi

FAB

Hızlı atom bombardımanı

FC

Mobil fazın akış oranı (mL dk-1)

FPLC

Hızlı protein sıvı kromatografisi

FSH

Folikül stimüle edici hormon

GFC

Jel filtrasyon kromatografisi

GLC

Gaz-sıvı kromatografisi

vii



GlcNAc

N-asetilglikozamin

h

Pik yüksekliği

H

Kuramsal levha yüksekliği

HETP

Kuramsal levhaya yüksek denge

HIC

Hidrofobik interaksiyon kromatografisi

HMW

Yüksek moleküler kütleli standart proteinleri

HPLC

Yüksek performans sıvı kromatografisi

HPTLC

Yüksek performanslı TLC

I

Dedektör küvetinden geçen ışın şiddeti

IEC

İyon değiş-tokuş kromatografisi

Io

Dedektör küvetine gönderilen ışın şiddeti

IR

İnfrared

k

Kapasite (alıkonma) faktörü

K

Toplam bağlama sabiti

kat

Katal (1 kat = 6 x 107 U ve 1 U = 1,7 x 10-8 kat’dır).

Kav

Ortalama dağılma kat sayısı

Kd

Kromatografide dağılma kat sayısı

kDa

Kilodalton

KTE

Kromatografik titrasyon eğrisi

L

Kolonun yatak uzunluğu

L

Ligand

LH

Luteinizing hormon

LMW

Düşük moleküler kütleli standart proteinleri

LPLC

Düşük basınç sıvı kromatografisi

M

Kolona yüklenen bileşiklerin kütlesi

MPLC

Orta basınç sıvı kromatografisi

Mr

Göreceli moleküler kütle

MS

Mas (kütle) spektrofotometre

MW

Moleküler kütle (ağırlık)

N

Kuramsal levha sayısı

n

Pik kapasitesi

ODS

Oktadesilsilan

OS

Oktasilan

PAGE

Poliakrilamid jel elektroforezi

PC

Kâğıt Kromatografi

PEG

Polietilenglikol

pHI

İzoelektrik pH

pI

İzoelektrik nokta

PMSF

Fenil-metilsülfonil florid

R

Dedektör tepkime değeri

Rf

Gecikme faktörü (retantion factor)

viii



RI

Refraktif indeks

RIA

Radioimmünoassay

RID

Refraktif indeks dedektörü

RPC

Ters-faz kromatografi

RP-HPLC

Ters-faz HPLC

RS

Çözünürlük

s

Grafik kaydedicinin hızı (cm dk-1)

SDS

Sodyum dodesil sülfat

SDS-PAGE

Sodyum dodesil sülfat-Poliakrilamid jel elektroforezi

SFE

Süperkritik sıvı ekstraksiyonu (Supercritical Fluid Extraction)

t

Örnek molekülünün göç zamanı

t’R

Düzeltilmiş elüsyon zamanı

TFCK

Tosilfenilalanilklorometilketon

TLC

İnce tabaka kromatografisi

to

Kolondan transit geçen bir analitin elüsyon zamanı

tR

Bir analitin kolondan elüsyonu (alıkonma) için geçen süre (= analite ait pikin tepe noktası = Ve)

U

Enzim ünitesi

ū

Hareketli fazın kolon boyunca lineer akış oranı

UV

Ultra Viole

V

Hacim (mL)

Vα

İlk pikin elüsyon hacmi

V’R

Düzeltilmiş elüsyon hacmi

VD

Farklı moleküler büyüklüklere ve Kd değerlerine sahip iki madde için elüsyon hacimlerindeki fark

Vi

Kd değeri 1’e eşit olan molekül için kullanılabilir olan matriks içindeki mobil fazın hacmi

Vis

Görünür (visable) dalga boyu

VM

Kolondan transit geçen analitlerin elüsyon hacmi veya kolon içindeki mobil fazın toplam hacmi

Vmax

Reaksiyon hızının maksimum değeri

Vo

Kolon materyalleri dışında kalan hareketli fazın hacmi; GFC için boşluk hacmi (enzimatik reaksiyonlar için reaksiyonun başlangıç hızı)

VR

Bir analitin kolondan elüsyon (alıkonma) hacmi (= analite ait pikin tepe noktası = te)

VS

Durgun faz hacmi

Vsep

Kolon yatağının ayrıştırma hacmi

Vt

Kolon yatak hacmi

Vω

Son pikin elüsyon hacmi

w

Gaus pikinin yükselme noktasındaki (0,607) genişliği (2σ) veya TLC’de leke genişliği

w0,5

Gaus pikinin yarı yüksekliğinin genişliği

wB

Gaus pikinin taban genişliği (4σ) ix



x

1. PROTEİN SAFLAŞTIRMADA TEMEL PRENSİPLER

1.1. Giriş İster akademik amaçlı çalışmalar için, isterse endüstriyel ve klinik uygulamalar için olsun, proteinlerin elde edildiği kaynaklar oldukça farklıdır. Protein kaynaklarının başlıca gruplarını ise mikroorganizmalar, bitkiler, hayvan dokuları ve rekombinant proteinler oluşturmaktadır. Protein kaynaklarının bu kadar farklı ve çeşitli olmasına rağmen, bu kaynaklardan elde edilen proteinler ister doğal isterse rekombinant olsunlar, genellikle benzer saflaştırma protokolleri ve teknikleri ile saflaştırılırlar (Şekil 1.1). Özgül bir proteinin saflaştırılması için uygulanacak prosedürler ise basit tek-adımlı çöktürmeden (presipitasyon), büyük-ölçekli üretim proseslerine kadar değişebilmektedir. Genellikle istenilen saflıktaki bir ürünün elde edilmesi için birden fazla saflaştırma basamağının uygulanması gerekmektedir. Başarılı ve randımanlı bir protein saflaştırma çalışmasının anahtarı ise en uygun tekniğin seçimine, seçilen tekniğin optimizasyonuna ve verimi artırmak ve saflaştırma protokolünün basamak sayısını minimuma indirmek için seçilen tekniklerin mantıklı bir şekilde kombinasyonuna bağlıdır. Özgül bir proteinin saflaştırılması için takip edilecek protokolün ve uygulanacak tekniklerin detayı ise bazı faktörlere bağlı olarak belirlenebilir. Bu faktörler ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: i. Hedef proteinin kaynağı ve proteinin kaynaktaki lokasyonu (intrasellüler, membrana-bağlı veya ekstrasellüler). ii. Hedef proteinin ekspresyon düzeyi. iii. Hedef proteinin fizikokimyasal özellikleri. iv. Saflaştırmanın amacı. Başlangıç materyalinde bulunan kirleticilerin (kontaminantların) çeşitliliği ve derişimleri ise örnek materyalinin elde edildiği kaynağa bağlı olarak değişecektir. Şayet, saflaştırılmak istenen hedef protein intrasellüler bir protein ise protein kaynağından bu proteini de içeren ham özütün elde edilmesi için seçilecek olan hücre parçalama yöntemi, protein kaynağının özelliklerine bağlı olmalıdır. Hedef proteinin intrasellüler ya da ekstrasellüler olmasına bağlı olarak, ham özütün önsaflaştırılmasında ve yoğunlaştırılmasında uygulanacak yöntemler de değişecektir. Bunun yanı sıra, hedef proteinin ekspresyon düzeyi de saflaştırma protokolü üzerinde etkili olacaktır. Örneğin, hedef proteinin ekspresyon düzeyinin düşük olması durumunda, çok fazla miktarda protein kaynağının özütlenmesi ve daha sonra da elde edilen protein özütünün kromatografik ayrıştırması (seperasyonu) için önemli bir oranda yoğunlaştırılması gerekebilir. Bunun aksine, şayet hedef proteinin ekspresyon düzeyi yüksekse, ham protein özütünün yoğunlaştırılmasına gerek kalmayabilir. Hedef proteinin fizikokimyasal özelliklerinin saflaştırma protokolü üzerine bir etkisinin olacağı ise gayet açıktır. Çünkü, protein karışımlarındaki protein moleküllerinin fraksiyonlanmasında, bu moleküllerin çözünme özelliği, moleküler büyüklüğü, yüzey hidrofobisitesi

2



ve elektriksel yükü gibi fizikokimyasal özelliklerindeki farklılıklardan yararlanılmaktadır. Ham özütlerden bazı rekombinant proteinlerin saflaştırılması gerektiği durumlarda ise hedef proteinin saflaştırılmasında yardımcı olmak amacı ile, protein mühendisliği teknikleri kullanılarak bu proteine oldukça belirgin bir fizikokimyasal özellik kazandıran bir etiket (işaret) bağlanabilir. Bu etiket ise bu rekombinant proteinin diğer kirleticilerden çok daha kolay olarak ayrıştırılmasında kullanılabilir (bkz. kısım 1.8.2). Protein üretimi (kaynak aracılığı ile veya kaynak içinde)

Proteinlerin kaynaktan özütlenmesi

Yoğunlaştırma / Ön-saflaştırma

Yüksek çözünürlüklü kromatografik teknikler ile saflaştırma

Şekil 1.1: Protein saflaştırmada takip edilen genel bir protokol şeması. Bu protokolden farklı yaklaşımların izlenmesi de elbette mümkündür.

Saflaştırma protokolü üzerine etkisi olan diğer önemli bir faktör ise saflaştırmanın amacıdır. Şayet hedef proteinin saflaştırılması, tamamı ile akademik bir amaçla yapılıyorsa, bu durumda en önemli amaç, genellikle proteinin homojen olarak elde edilmesi olmaktadır. Bu durumda, homojen (saf) bir protein solüsyonunun elde edilmesi için gereken basamakların sayısı, prosedürün süresi, son-ürünün maliyeti ve verimliliği gibi konular ikinci planda kalmaktadır. Şayet hedef protein ticari bir uygulama amacı ile saflaştırılıyorsa, bu durumda saflaştırma prosedürünün maliyeti ve teknik faktörler çok daha önemli olmaktadır. Bunun yanı sıra hedef proteinin saflık derecesi, gerekli olan minimum düzeyde olacaktır. Saflaştırılmak istenen proteinin miktarı veya istenilen saflık derecesi de saflaştırma protokolünü etkileyecektir. Akademik amaçlı çalışmalarda, saflaştırılmış olan proteinin yapısal ve fonksiyonel çalışmalarının yapılabilmesi için genellikle birkaç yüz miligram ile 1 g arasında saf protein yeterli olmaktadır. Bunun aksine, ticari bir uygulamada kullanılmak amacı ile saflaştırılmış olan proteinlere daha fazla miktarlarda gereksimin duyulmakta ve saflık düzeyleri ise uygulama amaçlarına göre değişmektedir (Tablo 1.1). Tablo 1.1: Saf bir proteinin, akademik veya ticari amaçla kullanılması durumunda gerekli olan miktarı (Boyer,

2000). Amaç

Miktar

Kütle spektrofotometre çalışması

ng-μg düzeyinde (saf)

Protein dizileme/elektroforetik analiz

μg düzeyinde (saf)

Genel fonksiyon/fizikokimyasal çalışmalar

mg-g düzeyinde (saf)

Uygulama-araştırmaları için özel ticari proteinler

yüzlerce mg – 100 g (orta saflıkta)

In vitro diyagnostik testler için ticari enzim/antikor

g-kg düzeyinde (orta/yüksek saflıkta)

In vivo terapötik amaçlı kullanılan proteinler; Gauchers hastalığı gibi düşük-insidentli hastalıkların tedavisi

yüzlerce g – 10 kg düzeyinde (yüksek saflıkta)

In vivo terapötik amaçlı kullanılan proteinler; Diyabet ve hemofili gibi yüksek-insidentli hastalıkların tedavisi

10 kg – yüzlerce kg düzeyinde (yüksek saflıkta)

Büyük miktarlarda endüstriyel uygulamalar

>1000 kg düzeyinde (genellikle ham)

Gıda sanayi uygulamaları için/ile süt-türevi proteinlerin üretimi

>100 000 kg düzeyinde (farklı saflıkta)

1.2. Biyokimyasal Araştırmalara Genel Yaklaşım Protein çalışmalarında, genellikle kompleks bir karışımdan özel bir proteinin saflaştırılması gerekmektedir. Analitik ayrıştırmalarda amaç, proteinlerin tanımını ve küçük miktarda da olsa varlığını belirlemektir. Bu amaçla yapılan çalışmalarda, genellikle saflaştırılması gerçekleştirilen



3

proteinin geri-kazanılması gerekmez. Preparatif ayrıştırmalarda ise temel amaç, hedeflenen proteinin mümkün olduğunca saf olarak elde edilmesi ve maksimum düzeyde geri-kazanılmasıdır. Proteinin saf olarak elde edilmesi ise, daha sonra yapılacak olan fizikokimyasal ve biyolojik özelliklerinin belirlenmesi için gereklidir. İstenilen proteinin ayrıştırılması ve saflaştırılması için analitik mi yoksa preparatif ayrıştırma tekniğinin mi kullanılacağı ise genellikle, preparatif tekniğin çok fazla miktarda örneğe ihtiyaç duyması ve büyük oranda geri-kazanımını gerektiren tekniklerin kullanılmasını gerektirmesine bağlı olarak belirlenir. Analitik ayrıştırma metodu genellikle, aranan proteinin karışım içerisinde bulunup bulunmadığının kalitatif olarak belirlenmesini sağlayan, kestirme bir yol olarak kullanılmaktadır. Bir karışım içerisinde aranan bileşiğin varlığından şüpheleniliyorsa, analitik ayrıştırma işlemi esnasında bu bileşik ile aynı davranan ve özellikleri bilinen bir bileşik (standart) kullanılır (bkz. kısım 2.9). Böylece, standart ile aranmakta olan bileşiğin asseyi (reaksiyon testi), yüksek çözünürlük gösteren bir teknik aracılığı ile aynı şartlar altında ve aynı muamele ile yapıldığında, standart bileşik muhtemelen aranan bileşik ile aynı davranışı gösterecektir. Bu teknik ise, aranmakta olan bileşiğin saflaştırma işlemleri sonrasında yapısal özelliklerini belirlemek için yapılan fiziksel metotların da gerekliliğini ortadan kaldıracaktır. Şayet, biyolojik materyallerde aranmakta olan bileşiğin kendine özgü bazı özellikleri varsa, bu bileşiğin kantitatif olarak tanımlanmasını sağlamak ve derişimini belirlemek için izolasyon ve saflaştırma (pürifikasyon) gibi ön-işlemlere gerek olmayabilir. Aranmakta olan bileşiğin kendine özgü özelliklere sahip olması, bunların enzim aktivite tayinlerinin (assey) ham özütlerden, intakt hücrelerden ve organellerden de yapılmasına olanak sağlamaktadır. Şayet, aranmakta olan bileşik, kendine özgü bazı özelliklere sahip değilse ya da bu özellikler henüz bilinmiyorsa, bu molekülün analizinin yapılmadan önce saflaştırılması gerekmektedir. Saflaştırma işlemlerinde kullanılan yöntemler ise hedef bileşiğin bir miktarının kaybına yol açmaktadır. Bu nedenle, saflaştırma işlemlerinde uygulanacak olan prosedürlerin sayısının mümkün olduğunca minimumda tutulması gerekmektedir. Aynı zamanda, saflaştırma işlemlerinde kullanılacak yöntemlerin, çok az miktardaki örneklerle çalışılması durumunda dahi, yüksek oranda çözünürlük sağlaması amaçlanmaktadır. Bileşiklerin ayrıştırılmasında, yüksek çözünürlük sağlayan teknikler ise genellikle az miktardaki örneklerle sağlanabildiği için, fazla miktardaki örneklerin uygulanmasına elverişli değildirler. Preparatif ayrıştırma işlemlerinde, normal prosedürlerin ilk basamağı yüksek ayrıştırma kapasitesine sahip bir metot olmasına rağmen, bu metot genellikle düşük çözünürlükte olmaktadır. Çöktürme, diyaliz, adsorbsiyon, sıvı-sıvı kromatografisi ve dağılma (partisyon) kolon kromatografisi gibi tekniklerin her birisinin bir diğerine göre avantajı bulunmakta ve belki de fazla miktardaki örnekler ile çalışma olanakları sunmaktadırlar. İyon değiş-tokuş, jel filtrasyon ve affinite kromatografisi, HPLC ve preparatif jel elektroforezi gibi yüksek çözünürlük sağlayan metotlardan bazıları ise daha sonraki aşamalarda saflaştırma işleminin son aşaması olarak kullanılabilmektedir. Saflaştırma işlemi esnasında kullanılan yöntemlerden çoğu, saflaştırılmaya çalışılmakta olan molekülün özelliklerinden yararlanılarak seçilmektedir. Bu nedenle, hedef molekülün özelliklerinin çoğunun kullanılmasına izin veren yöntemlerin seçilmesi, bir önceki saflaştırma yöntemine oranla molekülün saflığını biraz daha artırabilmektedir. Saflaştırma işlemlerinde kullanılan kromatografik teknikler ise daha sonraki bölümlerde ayrıntılı olarak ele alınmaktadır. Bir proteini saflaştırmak istediğimizde, teorik olarak birden fazla metodun kullanılması mümkün olabilir, fakat bu metotlardan birisini tercih etmek durumunda kaldığımızda ise pratikte en uygun olan metodu seçmek gerekmektedir. Saflaştırılmak istenen proteinin ayrıştırılmasında kullanılacak yöntem seçilirken, birkaç kriterin de göz önünde bulundurulması gerekmektedir. Bu kriterler ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir:

4


i.


Ayrıştırma işlemi, analitik mi yoksa preparatif amaçlı mı olacak? Buna bağlı olarak, metodun çözünürlüğü ve kapasitesi göz önünde bulundurulmalıdır.

ii. Hedef proteinlerin çözünme özelliği, göreceli moleküler kütlesi ve elektriksel yükü gibi özellikleri göz önüne alınmalıdır. iii. Özel muameleler esnasında hedef proteinin kararlılığı göz önünde bulundurulmalıdır. iv. Literatür taraması yapılarak, başarılı şekilde uygulanmış olan saflaştırma yöntemleri göz önüne alınmalıdır. v. Uygulanacak yöntem için gerekli olan materyal ve deneyimin varlığı dikkate alınmalıdır. vi. Uygulanacak olan saflaştırma metodunun maliyeti dikkate alınmalıdır. Saflaştırma işlemine başlamadan önce, kullanılacak yöntemler incelenerek karar verilir fakat, bu arada projenin amacına uygun olan yöntemin seçilmesi kadar, elde var olan araç-gereçler de dikkate alınmalıdır. Saflaştırılmak istenen molekül ise ya in vivo ya da in vitro olarak bulunmaktadır. Buna rağmen, in vivo ve in vitro modeller arasındaki farklılıkları belirlemek oldukça zordur. In vivo tekniklerde genellikle mikroorganizmalar, multisellüler organizmalar ve bitkilerin tamamı, hayvanların tamamı ya da bu hayvanların organları kullanılmaktadır. 1.2.1. İn vivo Çalışmalar In vivo olarak biyokimyasal deneylerde, bütün bir bitkinin veya hayvanın kullanılması, hücre kültürü gibi yöntemlere alternatif olarak oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır. Hayvanlar, medikal veya klinik amaçlı çalışmalar için oldukça yaygın olarak kullanıldıkları gibi, tarımsal ve hayvancılık alanında; aşıların, antikorların ve hormonların üretiminde; kimyasal tanımlamaların yeterli olmadığı durumlarda ise ilaçların veya diğer biyolojik materyallerin test edilmelerinde kullanılmalarının yanı sıra, toksikoloji çalışmalarında da sıklıkla kullanılmaktadırlar. Hayvanlarla yapılan biyokimyasal çalışmaların çoğu yabancı maddelerin, ksenobiyotiklerin (ilaçlar ve besin katkı maddeleri gibi) metabolizmasının incelenmesi yönünde olmakla birlikte, elde edilen sonuçlar doğrultusunda, “bazı maddelerin insan üzerinde kullanılmadan önce klinik deneylerinin tamamlanmış olması”, gereği ile de hayvanlar kullanılmaktadır. Fareler, ratlar ve Gine domuzları ise üretim maliyetlerinin düşüklüğü ve denek olarak kullanımlarının kolaylığı nedeniyle, biyokimyasal çalışmalarda en çok kullanılan deney hayvanlarıdırlar. Bunun yanı sıra tavşanlar, kediler, köpekler, Marmoset maymunları ve babunlar da biyokimyasal deneylerde kullanılırlar. Son zamanlarda, bütün bir hayvanın deney amaçlı kullanılmasına olan tepkiler ve bu laboratuvar hayvanlarının yetiştirilmesi için gerekli olan harcamaların yani maliyetin yüksekliği, başka alternatif deney yöntemlerinin araştırılmasını zorunlu kılmıştır. Bunun için temel yaklaşım ise mümkün olan ve uygulanabilen durumlarda, bütün bir hayvanın yani in vivo deneylerin yerine in vitro deney koşullarının gerçekleştirilmesidir. 1.2.2. İn vitro Çalışmalar In vitro çalışmaları, biyolojik olarak üretilen materyallerin yapay, fiziksel ve kimyasal ortamlarda inkübasyonuna dayanır. In vitro terimi, enzim preparasyonları, izole edilmiş organeller, intakt mikroorganizmalar ve hayvan ve bitkilerin parçalanmış kısımları için de kullanılmaktadır. In vitro çalışmalarda ortam koşulları, hücrelerin, doku ve organ kültürlerinin, hayvan ve bitiklerin minimum düzeyde büyümeyi, farklılaşmayı ve gelişmeyi sağlayacak şekilde seçilebilir. Hücre ve doku kültürü metotlarının özel avantajı ise diğer bulaşıcı hücreler tarafından oluşturulan biyokimyasal ve fizyolojik sınırlamaları azaltmasıdır. Bu yaklaşım, biyolojik bilimlerde oldukça geniş bir uygulama alanı bulmuştur. Bu yöntemin en temel avantajı ise, hücre kültürlerinde hücrenin gelişme potansiyelinin araştırılmasına olanak sağlamasıdır. In vitro deneysel çalışmalarının



5

eleştiriye açık olan tek noktası ise, belki de in vitro koşulların gerektiği gibi tam olarak hücrelerin ihtiyaç duyduğu şekilde hazırlanamama ihtimalinin olmasıdır. 1.3. Enzimler Neden Saflaştırılmalıdır? “Don’t waste clean thinking on dirty enzymes” E. Rocker. Efraim Rocker’ın “Temiz düşüncelerinizi kirli enzimler üzerine heba etmeyin” anlamındaki sözü, enzimoloji araştırmaları için oldukça yol göstericidir. Bu deyimin açıklaması ise, bir enzimin bir maddeyi-substratı başka bir maddeye-ürüne nasıl dönüştürdüğünü detaylı olarak incelemek için yapılan çalışmalar, ta ki bu enzim hücre özütünü oluşturan diğer kirleticilerden ve enzimlerden ayrıştırılmadığı sürece, zaman kaybından başka bir şey değildir. Çünkü, bir karaciğerin, bir maya hücresinin veya bakteriyel hücrenin parçalanması sonucunda binlerce farklı enzim serbest kalmaktadır. Sadece bir enzimi, diğer enzimlerin bulunmadığı bir aşamaya kadar saflaştırabildiğimizde (homojen saflık) garanti olarak söyleyebiliriz ki, A maddesinin B maddesine dönüştürülmesi tek bir enzim tarafından katalizlenmektedir. Bu nedenle, sadece bu aşamadan sonra, yani bir enzimi saf olarak elde ettikten sonra, saflaştırılmış olan enzimin nasıl çalıştığını ve fizikokimyasal özelliklerini tam olarak öğrenebiliriz. Bir enzimi saflaştırmak için harcanan emeğin karşılığı ise, 1930’lu yıllarda Otto Warburg tarafından yayınlanan makalelerde ortaya konmuştur. O. Warburg’un Berlin-Dahlem’de (Almanya) bulunan laboratuvarlarında yapılan saflaştırma çalışmaları sonucunda, çok sayıda enzim saflaştırma teknikleri ortaya konmuş ve saflaştırılan enzimler ile solunum ve glikoz fermantasyonunda rol alan anahtar enzimler ile vitaminlerin rolleri açıklığa kavuşturulmuştur. Warburg’un çalışmaları ise 20. yüzyılın başında, Edward Büchner’in kaza eseri olarak, intakt hücrelerin bulunmadığı bir ortamda “sukrozun etanole dönüştüğünü” keşfetmesi ile ileri sürdüğü enzim fikrini daha da kuvvetlendirmiştir. İntakt hücre içermeyen ortamlardaki enzimatik reaksiyonun keşfedildiği ilk gözlemden sonraki yıllarda ise mayalardaki alkolik fermantasyon, kaslardaki glikolizis, ateş böceklerindeki lüminisans veya DNA replikasyonu gibi hücresel fonksiyonların moleküler temelleri ortaya konmuştur. Bu gözlemden sonra, hücre özütlerinin fraksiyonlanması sonucunda, enzim veya enzimler izole edilerek saf halde elde edilmeye ve bu enzimlerin fonksiyonları ortaya konmaya başlanmıştır. Saf halde elde edilen enzimlerin, katalitik fonksiyonlarını yerine getirmelerini, regülatör sinyallere karşı nasıl cevap verdiğini ve hücre içerisinde nasıl bir form ve yapıda olması gerektiğini belirleyen enzim yapısı üzerinde çalışmalar yapılabilmiştir. Çalışılmakta olan enzim preparasyonları içerisinde, hedef olan enzimin %1’i kadar dahi başka bir enzimin bulunması, reaksiyon ortamında milyonlarca yabancı molekülün oluşmasına yol açabilmektedir. Genellikle bu tipteki kirleticiler, predominant olarak tek tipte değilse ve çalışılmakta olan bileşik ile oldukça yüksek olarak aktif değilse, herhangi bir problem oluşturmayabilir. Bütün bu nedenlerin yanı sıra, saf olarak elde edilmiş proteinlerin amino asit dizilimleri (sekansları) belirlendikten sonra, bu proteinlerin sentezinden sorumlu olan genlerin izolasyonu için gerekli olan problar in vitro olarak sentezlenebilir. İn vitro koşullarda sentezlenen problar ise özgül proteinlerin sentezinden sorumlu olan genlerin izolasyonunda kullanılabilir. Ayrıca, proteinlerin biyolojik aktivitelerinden sorumlu olan üç-boyutlu yapılarının araştırılmasında, saflaştırılarak amino asit dizilimleri belirlenmiş olan proteinlerden yararlanılabilir.

6



1.4. Protein Saflaştırmada Temel Faktörler Bir proteinin fiziksel ve biyolojik özelliklerinin belirlenmesi için öncelikle bu proteinin saf olarak elde edilmesi gerekmektedir. Bir proteinin saflaştırılmasının başarılması ise öncelikle, proteinin biyolojik matriksinden serbest bırakılması (bkz. kısım 1.6) ve uygun bir fraksiyonlama prosedürü ile diğer proteinlerden seçici olarak ayrıştırılması ile sağlanabilir. Proteinin saflaştırılması için kullanılacak prosedürlerin adaptasyonu ise 3 faktöre bağlı bulunmaktadır: i. Nitelik: Saflaştırılacak olan proteinin kullanılma amacı, proteinin saflık derecesinin belirlenmesinde önemli bir etkendir. Bu nedenle, aktivite çalışmalarında %100 saflıkta protein preparasyonlarına gereksinim duyulmazken, proteinin primer yapısının belirlenmesi amacı ile yapılan çalışmalarda kullanılan protein preparasyonlarının homojen saflıkta (%100) olması gerekmektedir (bkz. Tablo 1.1). Bunun yanı sıra aktivite çalışmaları, proteinin biyolojik fonksiyonlarının korunmasını, bu nedenle de denatürasyonunun ve proteolizizinin minimuma indirilmesini gerektirirken, protein yapısına ilişkin çalışmalar denatüre proteinlerle de yapılabilmektedir. ii. Nicelik: Çalışmanın amacına uygun olarak, ne kadar saf proteine ihtiyaç duyulduğu (bkz. Tablo 1.1), bir proteinin saflaştırılması için kullanılacak olan metotların seçimini etkilemektedir. Bazı saflaştırma teknikleri, yüksek hacimli ve yüksek protein derişimli örneklerin uygulanmasına izin veren yüksek kapasiteli teknikler iken, bu tekniklerin bazıları ise sınırlı kapasitelere sahiptirler. Amonyum sülfat ile çöktürme ve adsorbsiyon kromatografisi gibi yüksek kapasiteli teknikler, saflaştırma prosedürünün erken aşamalarında kullanılırken, jel filtrasyon kromatografisi gibi düşük kapasiteli teknikler ise saflaştırma prosedürünün sonuna doğru kullanılmaktadır. iii. Maliyet: İyon değiş-tokuş kromatografisi materyalleri ve affinite kromatografisi için gerekli olan durgun fazların maliyeti, özellikle büyük-ölçekli uygulamalar için sınırlayıcı bir faktör olabilir. Bunun aksine, bu materyaller genellikle yüksek çözünürlüğe sahip olmaları nedeni ile bir proteinin saflaştırılması için gerekli adımların sayısını oldukça azaltabilirler. 1.5. Enzimlerin ve Diğer Proteinlerin Kararlılıklarının Korunması Özellikle enzimler başta olmak üzere, proteinlerin saflaştırılması ile uğraşan her araştırmacının başlıca problemi, proteinlerin doğal kaynaklarından özütlenmesinden başlayarak saflaştırılmasına kadar olan her aşamada enzimatik veya biyolojik aktivite kaybı ile karşı karşıya kalmalarıdır. Bunun başlıca nedeni ise proteinlerin, özütleme ve saflaştırma prosedürleri esnasında uygulanan yöntemler nedeni ile denatürasyona neden olan faktörlere karşı maruz kalmalarıdır. Ekstrasellüler proteinler ise doğaları gereği çok değişik çevresel faktörlerin varlığında dahi aktivitelerini göstermek üzere dizayn edilmiş olduklarından, kısmen de olsa denatürasyona neden olan faktörlere karşı daha dayanıklıdırlar. Fakat intakt bir hücre içerisindeki doğal çevre, proteinlerin özütlenmesi ve saflaştırılması esnasında uygulanan yöntemler nedeni ile proteinlerin içinde bulundukları çevreden oldukça farklıdır. Çözünebilir intrasellüler proteinler ise ister sitoplazmada (genellikle, en az 100 mg mL-1) isterse organellerde (mitokondri matriksinde 400 mg mL-1’ye kadar ulaştığı hesaplanmıştır) bulunsunlar, bulundukları ortamda oldukça yoğun protein çorbaları halinde bulunmaktadırlar. Bu proteinlerin bulundukları ortamlardaki oksijen derişimi ise genellikle oldukça düşük, hatta sıfırdır. Bunun yanı sıra sitoplazma ve organellerde, yüksek indirgeme potansiyelinin korunması amacıyla glutatyon gibi oldukça farklı indirgeyici ajanlar da bulunmaktadır. Bu ortamlarda, metabolitlerin de oldukça yüksek miktarlarda bulunması, belki de proteinlerin kararlılıklarını olumlu olarak etkilemektedir. Doğal protein kaynaklarından intrasellüler proteinlerin elde edilmesi için hücreler parçalandıklarında ise proteinler bu koruyucu çevreden uzaklaşmakta, muhtemelen oksijen ile tam olarak doymuş bulunan ekstraksiyon tamponu içinde seyrelmekte ve intakt hücre içerisinde, lizozomlarda ayrı olarak bulunan proteolitik enzimlerin de serbest kalması



7

ile bu enzimlerin etkilerine maruz kalmaktadırlar (bkz. kısım 1.5.3). Bu nedenlerle, doğal kaynaklarından özütlenen proteinlerin denatüre olarak biyolojik aktivitelerinin kaybına yol açan farklı tehditler bulunmaktadır. Bu tehditlerin başlıcaları ise aşağıdaki şeklide sıralanabilir: i. Denatürasyon. ii. Enzimlerin aktif bölgelerinin inaktivasyonu. iii. Proteoliziz ve polipeptidlerin diğer modifikasyonları. 1.5.1. Denatürasyonun Önlenmesi Proteinlerin, özütleme ve saflaştırma prosedürleri esnasında uygulanan yöntemler nedeni ile denatürasyona neden olan faktörlere karşı olan duyarlılıkları ise farklılık göstermektedir. Şayet, proteinlerin denatürasyonuna neden olan temel faktörün ne olduğu biliniyorsa, proteinlerin bu faktöre maruz kalması önlenerek, proteinlerin denatürasyonu önlenebilir. Proteinlerin denatürasyonuna neden olan başlıca faktörler ise aşırı pH koşulları, sıcaklık (CS, –N=O ve –N≡N) rotasyonuna neden olur. Dedektörün akışlı-küvetinden geçen ışının yoğunluğu ise bu ışının enerjisi, akışlı-küvetteki kimyasal bileşiklerin elektronlarının veya fonksiyonel gruplarının transisyonuna (geçişine) neden olduğu için düşer. Lambert-Beer kanununa göre absorblanan radyasyonun miktarı, akışlı-küvet içindeki kimyasal bileşiğin derişimi ve küvetin ışık yolu ile orantılıdır. Elektromanyetik spektrum ise Tablo 4.4’de görüldüğü gibi birkaç bölgeye ayrılmaktadır. Tablo 4.4: Elektromanyetik spektrumun bölgeleri. Bölge İnfrared (IR)

Dalga boyu (λ) 2 500 - 50 000 nm.

Yakın infrared

800 - 2 500 nm

Visible (görünür)

400 – 800 nm

Ultra Viole (UV)

190 – 400 nm.

Spektroskopide kullanılan elektromanyetik spektrumlar ise IR, Vis. ve UV bölgeleridir. Sıvı kromatografide hareketli faz olarak kullanılabilecek oldukça az sayıda saydam (transparant) polar sıvı olduğundan, IR spektrofotometreler sıvı kromatografide oldukça sınırlı kullanım alanına sahiptirler. UV/Vis spektrofotometreler (genellikle, 200-600 nm) ise sıvı kromatografide en yaygın kullanılan dedektörlerdir. Çünkü, organik moleküllerin analizlerinin çoğu UV/Vis dedektörlerle yapılabilmektedir ve yayınlanmış olan HPLC çalışmalarındaki analizlerin neredeyse %70’inde UV/Vis dedektörler kullanılmıştır. Absorbans (A) ise içerisinde örnek materyalinin bulunduğu küvete gönderilen ışık şiddetinin (Io), küvetten geçen ışık şiddetine (I) oranının logaritmasına eşittir (bkz. Eşitlik 4.3). Bu nedenle absorbans, Lambert-Beer kanununa uygun olarak, molar absorbtivite (molar ekstinksiyon katsayısı, ε), bileşiğin kalınlığı (örneğin, küvetin ışık yolu, d) ve bileşiğin molar derişimi (C) ile ilişkilidir.

A = log (

Io I

) =εdC

(4.3)

HPLC sistemlerinde kullanılan dedektörlerin fotodedektörleri, aslında küvetten geçen ışık şiddetini, yani I değerini ölçmektedirler. Fakat, elektronik sistemler bu sinyali bileşiğin derişimi ile orantılı olan absorbansa (A) dönüştürürler. Kromatogramın ordinatı ise dedektör sinyalini temsil eder ve genel olarak dedektör sinyali, küvet içerisindeki kimyasal bileşiğin derişimi ile orantılıdır. UV dedektörlerinin kullanılması durumunda bir absorbans birimi (A), küvete gönderilen ışığın şiddetinde %90 azalmanın olmasına karşılık gelmektedir. Molar absorbtivite (aynı zamanda molar ekstinksiyon katsayısı, ε, olarak da adlandırılır) ise 1 cm ışık yoluna sahip bir küvet içerisindeki, 1 M’lık bileşiğin absorbansıdır. Molar absorbtivite ise dalga boyuna ve kromatografik koşullara (çözücü, pH ve sıcaklık gibi) bağlıdır. Fakat özgül bir dalga boyunda bir bileşiğin molar absorbtivitesi sabittir (Tablo 4.5). Elüsyon sıvısı içerisindeki analitlerin belirlenmesi için kullanılan UV/Vis. spektroskopik dedektörler, 190 nm dalga boyuna kadar olan absorbansları ölçebilir ve bu dedektörlerin tam-ölçek sapma absorbans birimi (Absorbance Units for Full-Scale Deflection; AUFS) 0,001’e kadar düşüktür. Dalga boyu tarama dedektörleri ise her bir analitin absorbsiyon spektrumunun tamamını

84



kaydedebildiğinden, identifikasyon olanağı da sağlar. Böyle ölçüm fırsatları ise ya elüsyon sıvısının geçici olarak akışının durdurulması ile ya da diod-array tekniklerinin kullanılması ile sağlanabilir. Sıvı kromatografisinde kullanılan UV/Vis spektroskopik dedektörler ise (i) sabit dalga boylu dedektörler, (ii) değişken dalga boylu dedektörler ve (iii) diod-array dedektörleri olmak üzere 3 gruba ayrılmaktadır. Tablo 4.5: Farklı bileşiklerin özgül dalga boylarındaki molar absorbtiviteleri. Dalga boyu (nm)

Molar ekstinksiyon (ε)

Asetilid

Adı

–C = C

Kromofor

175-180

6000

Aldehid

–CHO

210

1500

Amin

–NH2

Azo

–N = N–

Bromid

–Br

Karboksil Disülfid

195

2800

285-400

3-25

208

300

–COOH

200-210

50-70

–S–S–

194

5500

Ester

–COOR

205

50

Eter

–O–

185

1000

Keton

>C = O

195

1000

Nitrat

–ONO2

270

12

Nitril

–C = N

160

–

Nitrit

–ONO

220-230

1000-2000

Nitro

–NO2

210

Kuvvetli

i. Sabit dalga boylu dedektörler: Dalga boyunun değiştirilmesine izin vermeyen dedektörler sabit dalga boylu dedektörler olarak adlandırılırlar. Bu tip dedektörler diğer tipteki dedektörlere oranla oldukça ucuz olmakla birlikte, belirli dalga boylarında çalışmaya izin vermesi nedeni ile geniş çaplı kullanıma müsait değildirler. Sabit dalga boylu dedektörlerde ışık kaynağı olarak, cıva buharlı lambalar kullanılmaktadır. Çünkü, düşük-basınçlı cıva buharlı lambalar, 253,7 nm dalga boyunda oldukça yoğun ışık sağlarlar. Bu tip bir ışık kaynağı tarafından yayılan diğer dalga boylarındaki ışınların filtreler aracılığı ile süzülmesi sonucunda, 254 nm dalga boyunda, kararlı ve oldukça duyarlı dedektörler üretilmektedir (Şekil 4.13). Bu tip dedektörler ile nanogramdan daha düşük miktardaki aromatik halka taşıyan bileşiklerin belirlenmesi sağlanabilmektedir. Bu tip dedektörlerde dalga boyu olarak 254 nm’nin seçilmesinin nedeni ise cıvalı lambanın oluşturduğu ışık yoğunluğunun büyük bir kısmının 254 nm dalga boyundaki ışınlardan oluşması ve ayrıca, UV absorbe eden bileşiklerin çoğunun bu dalda boyunda bir absorbans göstermeleridir. ii. Değişken dalga boylu dedektörler: İstenilen dalga boyuna ayarlanarak, bileşiklerin belirlenmesine izin veren dedektörler değişken dalga boylu dedektörler olarak adlandırılırlar (Şekil 4.14).

Değişken dalga boylu dedektörler özellikle üç nedenden dolayı tercih edilmektedirler: • Uygun dalga boyu seçilerek, absorbsiyon özelliğine sahip bir bileşiğin en duyarlı şekilde belirlenmesine olanak sağlar. • Farklı örnek bileşenleri farklı dalga boylarında en iyi absorbansa sahiptirler, bu nedenle operasyonun sabit bir dalga boyunda gerçekleştirilmesi, sistemin duyarlılığının azalmasına yol açar. • Dedektörün gelişmişlik derecesine (modeline) bağlı olarak dalga boyu değişikliği, manüel olarak veya hafızaya kaydedilerek zamana bağlı olarak değiştirilebilir.

4. HPLC


85

Şekil 4.13: Sabit dalga boylu dedektörlerin şematik yapısı.

Şekil 4.14: Değişken dalga boylu dedektörlerin şematik yapısı.

iii. Diod-array dedektörler: Değişken dalga boylu UV dedektörlerinin diğer bir tipi ise diodarray dedektörleridir (Şekil 4.15). Bu dedektörler, elüsyon sıvısı akışlı-küvetlerden geçerken değişik dalga boylarındaki absorbans taramalarının ve istenilen dalga boylarındaki absorbans değerlerinin hassas olarak ölçülmesine izin vermektedirler. Diod-array dedektörleri, 0,01 saniyede birçok dalga boyunda ya da bütün dalga boylarında elüsyon sıvısının absorbansının sürekli olarak ölçülmesine olanak sağladıklarından, analitlerin elüsyon zamanlarına bağlı olarak tanımlanmasının yanı sıra, analitlere ait kalitatif bilgilerin elde edilmesini de sağlamaktadırlar (Şekil 4.16).

Şekil 4.15: Diod-array dedektörlerin şematik yapısı.

86



Diod-array dedektörlerinin en önemli iki avantajı ise: • Analitlerin analizinde seçilmesi gereken en doğru dalga boyunun seçilmesini sağlamasıdır. Özellikle belirli bir analitin, farklı dalga boylarındaki molar absorbtivitelerine ait bilgi yoksa diod-array dedektörlerden elde edilen veriler analiz için çok önemlidir. • İkinci önemli avantajı ise piklerin saflığı ile ilgilidir. Çünkü, normal UV dedektörleri ile elde edilen pikler, bu piklerin oluşmasından sorumlu olan analitlerin sayısı (iki, hatta daha fazla) hakkında bir fikir vermez (bkz. Şekil 4.16). Böyle bir durumda, bir pikin tek bir analite mi, yoksa birden fazla analite mi ait olduğuna karar vermek için, farklı dalga boylarındaki absorbans oranlarının hesaplanması oldukça yayarlı olmaktadır.

Şekil 4.16: Dihidropiridin kalsiyum kanalını bloke eden lasidipin ve metabolitlerinin HPLC ile ayrıştırılması. Kolon: ODS Hypersil. Elüent: %1’lik formik asit ile pH’ı 3,5’e asitleştirilmiş Metanol/asetonitril/su (%66, %5, %29, vol.). Akış oranı: 1 mL dk–1. Kolon sıcaklığı: 40 °C. (a) Diod-array dedektör tarafından (b) UV dedektör tarafından kaydedilmiş kromatogramlar (Wilson ve Walker, 1995).

4. HPLC


87

4.12.3. Fluoresans Dedektörleri

Sıvı kromatografi sistemleri ile birlikte kullanılan modern dedektörler arasında muhtemelen en hassas olanları fluoresans dedektörleridir. Fluoresans dedektörler ile örnek küveti içerisinde bulunan ve fluoresant özellik gösteren, tek bir molekülün dahi belirlenebilmesi mümkündür. Tipik olarak UV’yi kuvvetli absorbe eden bir bileşiğin belirlenmesinde fluoresans dedektörlerin duyarlılığı, UV dedektörlerin duyarlılığına oranla 10-1000 defa daha hassastır. Fluoresans dedektörleri, diğer optik dedektörlere göre oldukça özgül ve seçicidirler. Bu nedenle, örnek materyalleri içindeki özgül bir fluoresant bileşiğin belirlenmesinde fluoresans dedektörlerinin kullanılması, bir avantaj oluşturmaktadır. Daha kısa dalga boyundaki enerji ile uyarılmış olan, fakat daha yüksek dalga boyunda radyasyon yayan fonksiyonel gruplara sahip bileşikler ise fluoresant bileşikler olarak adlandırılırlar. Genellikle, fluoresant bileşikler tarafından yayılan ışın, bileşiğe gönderilen uyarıcı ışınına göre dik bir açı oluşturacak şekilde ölçülmektedir (Şekil 4.17).

Şekil 4.17: Tipik bir fluoresans dedektörün optik şeması.

Kimyasal bileşiklerin ise kabaca %10’u fluoresant özellik göstermektedirler. Özelikle aromatik bileşiklerde konjuge pi-elektronlarının bulunması, bu bileşiklerin oldukça yoğun fluoresant aktivite göstermelerine yol açmaktadır. Ayrıca, karbonil gruplarına sahip alifatik ve alisiklik bileşikler ile konjuge çift-bağ içeren bileşikler de daha az yoğunlukta olmakla birlikte fluoresant özelliklere sahiptirler. Fluoresans yoğunluğu ise hem uyarıcı ışının hem de yayılan ışının dalga boyuna bağlıdır. Bu sayede fluoresans dedektörleri, diğer bileşikler tarafından yayılan fluoresans ışınlarının yayılması baskılanarak, bazı bileşiklerin seçici olarak belirlenmesine de olanak sağlamaktadır. Örneğin, herhangi bir bileşik, uyarıcı ışınının dalga boyu 280 nm, yayılan ışının dalga boyu 340 nm olduğunda belirlenebilirken, bu koşullarda fluoresant özellik göstermeyen diğer bileşikler dedektör tarafından belirlenemeyecektir. Modern fluoresans dedektörlerin çoğu ise monokromatörler aracılığı ile hem uyarıcı hem de yayılan ışınların dalga boylarının kontrol edilmesine ve dalga boylarının hızlı bir şekilde değiştirilmesine olanak sağladığından, örnek materyali içerisindeki fluoresant bileşiklerin tamamının belirlenmesine izin vermektedirler. UV absorbsiyonunun, fluoresans ve elektrokimyasal dedektörlerin duyarlılığının önemli bir ölçüde artırılması ise türevlendirme (derivatizasyon) teknikleri ile mümkün olabilmektedir. Türevlendirme tekniğinde ise analit, ya kolona yüklenmeden önce ya da kolondan elüsyonunun yapılmasından sonra kimyasal türevlere dönüştürülür. Analitlerin kimyasal türevlerinin bazı özellikleri ise Tablo 4.3’de verilmektedir.

88



4.12.4. Kondüktivite Dedektörleri

Elekrolitik kondüktivite dedektörlerinde, kolon elüsyon sıvısının kondüktivitesi sürekli olarak ölçülmekte ve akışlı-küvet içerisinde analitin bulunması, kondüktivitenin değişmesi ile belirlenmektedir. Kondüktivite dedektörlerinde kullanılan akışlı-küvetler ise oldukça küçük hacimli kapillerden oluşmakta olup, bu kapillere iki elektrot bağlanmıştır (Şekil 4.18). Akışlı-küvet içerisinden akmakta olan kolon elüsyon sıvısı ile birlikte analitler küvete girdiğinde, elüsyon sıvısının kondüktivitesi değişmekte ve bu değişiklikler sürekli olarak kaydedilmektedir. Kondüktivite dedektörlerinin tepkimesi ise oldukça geniş bir aralıkta derişim ile doğru orantılı olduğundan, uygun kalibrasyonların önceden yapılması durumunda dedektör çıkış sinyalinin kuantifikasyonuna da izin vermektedirler. Bu dedektörlerle en iyi sonuçlar ise izokratik elüsyonların yapıldığı kromatografik çalışmalarla sağlanmaktadır. Çünkü, gradient elüsyonlarının yapıldığı durumlarda hareketli fazın gradientinin değişmesine paralel olarak, temel-çizgide kaymalar meydana gelmektedir. Bu tip dedektörler iyon değiş-tokuş kromatografilerinde başarılı bir şekilde kullanılabilmesine rağmen yeterince kabul görmüş değildirler.

Şekil 4.18: Tipik bir kondüktivite dedektörünün akışlı-küvetinin şeması.

4.12.5. Elektrokimyasal Dedektörler

Elektro-aktif bileşikler için seçici olan elektrokimyasal dedektörlerin hassasiyeti ise potansiyel olarak oldukça yüksektir. Elektrokimyasal dedektörlerin prensipleri birbirine benzeyen iki tipi mevcuttur: amperometrik ve kolometrik. Bu tip dedektörlerde akışlı-küvete, birisi kararlı bir yer değiştirici (karşıt) elektrotu (Ag/AgCl veya calomel) diğeri ise polarlaşabilirliği oldukça yüksek olan bir hareket (çalışma) elektrotu olmak üzere iki elektrot bağlanır (Şekil 4.19).

Şekil 4.19: Tipik bir elektrokimyasal dedektörünün akışlı-küvetinin şeması.

4. HPLC


89

Hareket elektrotuna, analit akışlı-küvet boyunca geçtikçe, elektrot yüzeyindeki moleküllerin oksitlenmesini veya redüklenmesini ve sonuçta iki elektrot arasında bir akım akışının oluşumunu sağlayacak seviyede sabit bir gerilim (potansiyel) uygulanır. Yer değiştirici elektrota uygulanan gerilim (potansiyel) ise oluşan akımın kaydedicide tam ölçekli bir sapma meydana getirmesine yeterli olmaktadır. Hidrokarbonlar, aminler, amidler, fenoller, di- ve triazinler, fenotiazinler, kateşolaminler ve kuinolinler oksitlenebilen bileşiklerdir. Olefinler, esterler, ketonlar, aldehitler, eterler, azo ve nitro bileşikleri ise redüklenen bileşiklerdir. Hareketli fazda ise tâbi ki dedektörde tepkime oluşturacak bileşikler bulunmalıdır. Elektrokimyasal dedektörler ise özellikle kateşolaminlerin, vitaminlerin ve antioksidantların asseyinde kullanılır. 4.13. HPLC Uygulamaları

HPLC tekniğinin çok geniş uygulama alanına sahip olması, hızlı olması ve yüksek duyarlılık göstermesi nedeni ile bu teknik, kromatografik yöntemler arasında en çok kullanılan teknik olmaya başlamıştır. Öyle görünmektedir ki, her türlü biyomolekülün asseyi ve ayrıştırılması HPLC ile gerçekleştirilebilmektedir. Oligopeptidlerin ve proteinlerin ayrıştırılmasında ise HPLC çok etkili bir şekilde kullanılabilmektedir. Proteinlerin ayrıştırılması için geliştirilen ekipmanlar ise sonuçta hızlı protein sıvı kromatografi (Fast Protein Liquid Chromatography; FPLC) tekniğinin doğmasına yol açmıştır. FPLC’nin tek bir tekniği olmayıp, bu teknik temelde ters-faz, affinite, jel filtrasyon, hidrofobik interaksiyon, iyon değiş-tokuş kromatografisi ve kromotofokusing tekniklerine bağlıdır. Mikro-çaplı, iç cidarı cam ile sırlanmış, paslanmaz çelikten yapılmış kolonlar 10 dk gibi çok kısa bir zamanda, çok küçük miktarlarda örneklerin kullanılmasına ve ayrıştırılmasına izin vermektedirler. Bu teknik, proteinlerin tripsin ile parçalanması ve mikroorganizmaların kültür sıvıları gibi çok kompleks karışımların doğrudan kolona yüklenmesine izin vermektedir. Fakat ne yazık ki, hücre özütlerinden elde edilen protein karışımlarının bu teknik ile çalışılmasına başlanmadan önce, bir ön filtrasyondan geçirilmesine gereksinim duyulmaktadır.

90



5. JEL FİLTRASYON KROMATOGRAFİSİ (GFC)

5.1. Giriş

Jel filtrasyon kromatografisi (Gel Filtration Chromatography; GFC) ilk uygulanmaya başlanmasından itibaren binlerce enzim, polisakkarit, nükleik asit, protein ve diğer biyomoleküllerin saflaştırılmasında kullanılmıştır. Jel filtrasyon kromatografisinin başarısı, kısmen çalışılmakta olan makromoleküllerin özgül doğal yapılarına, kısmen de ayrıştırma tekniği olarak jel filtrasyon kromatografisinin uygulama kolaylığına ve güvenilirliğine bağlıdır. Biyolojik makromoleküller, çevresel koşullarda in vivo olarak meydana getirilen küçük değişikliklerle kontrol edilerek, özel fonksiyonları yerine getiren maddelerin bir sınıfını oluştururlar. pH, metal iyonlarının derişimi ve kofaktörler gibi ortam koşullarında meydana gelebilecek değişiklikler ise çalışılmakta olan biyomoleküller üzerinde oldukça önemli etkilere sahiptirler. Bu nedenle, biyomoleküllerin ayrıştırılması esnasında bu faktörleri ayrı ayrı kontrol etmeye izin veren ılımlı ayrıştırma tekniklerinin bulunması gerekmektedir. Bu ılımlı ayrıştırma koşullarını sağlayan tekniklerden birisi de jel filtrasyon kromatografisidir. Çünkü jel filtrasyon kromatografisi ile ayrıştırma işlemi, ayrıştırılması yapılacak olan molekülün özelliklerine göre zorunlu olan iyonların veya kofaktörlerin, deterjanların ve ürenin varlığında; yüksek veya düşük iyonik kuvvette ve istenilen sıcaklıkta ayrıştırma yapmaya olanak sağlamaktadır. Jel filtrasyon kromatografisinde kullanılan matriks materyallerinin oldukça kararlı olması ve deneysel koşullar altında biyopolimerlere karşı inert olması, bu ayrıştırma tekniğinin protein saflaştırmada oldukça yaygın olarak kullanılmasına yol açmıştır. Bunun yanı sıra jel filtrasyon kromatografisinin uygulanması için gerekli olan aparatlar oldukça basit olup, ilk uygulamalarda dahi oldukça iyi bir ayrıştırma ve verim elde edilebilmektedir. 5.2. GFC’nin Temel Prensipleri

Moleküllerin, molekül boyutlarına ve şekillerine dayalı olarak ayrılması, çeşitli porlu materyallerin moleküler elek olarak kullanılmasına olanak sağlamaktadır. Muhtemelen bu gibi materyallerin en yaygın olarak kullanılanları, üç-boyutlu porlardan oluşan bir ağ sistemine sahip olan ve bu nedenle, bu materyallere jel özellikleri veren bir grup organik yapıdaki polimer bileşiklerdir. Jel filtrasyonu terimi, çeşitli büyüklüklere sahip moleküllerden oluşan bir karışımdaki moleküllerin, jel materyallerinin kullanılmasıyla ayrılması işlemini tanımlamak için kullanılır. Aynı zamanda, porlu cam granülleri de moleküler elekler olarak kullanılmakta olup, kontrollü-porlu cam kromatografi terimi, bu ayrıştırma tekniğini tanımlamak için ortaya çıkmıştır. Ekslüsyon (dışlama) veya permisyon (geçirgenlik) kromatografisi terimleri ise moleküler elekler kullanılarak yapılan bütün moleküler ayrıştırma proseslerini tanımlamaktadır. Bu kısımda ise genel olarak, prensiplerinin ve uygulamalarının en iyi biçimde yayınlanmış olmasından dolayı jel filtrasyon kromatografisi üzerinde durulmaktadır. Fakat bu arada unutulmamalıdır ki, kontrollü-porlu cam kromatografisi de GFC ile birlikte kullanılan en yaygın tekniklerden birisidir.

92



Jel filtrasyon kromatografisinin temel prensibi oldukça basittir. Moleküllerin ayrıştırılması için kullanılacak olan uygun bir hareketli faz (tampon), matriks (jel) veya porlu-cam granülleri ile paketlenmiş bir kolondan ibarettir. Ayrıştırılması yapılacak olan molekülü içeren örnek materyal karışımı, bir bant oluşturacak şekilde hareketli faz ile dengelenmiş olan kolon yatağının üst kısmına yüklenir. Yüklemeyi takiben kolonun üst kısmından hareketli faz eklendikçe, örnek zonu kolon yatağının içerisine doğru hareket eder. Örnek zonunun kolon yatağı içerisine doğru hareket etmesi ile birlikte jel materyali arasındaki gözeneklere (porlara) diffüze olamayacak kadar büyük olan moleküller, jel materyalinin ara boşluklarından geçecek ve kolondan dışarıya atılan elüsyon sıvısında (elüentte) ilk olarak bu moleküller belirlenecektir. Daha küçük moleküller ise gözenekli jel materyalinin içindeki ve dışındaki hareketli faz arasında dağılacaklar ve gözenekler arasına diffüze olacaklardır. Bu nedenle gözeneklerin içerisine girebilen küçük moleküller, kolonun içerisinden daha yavaş bir hızda geçeceklerdir. Bundan dolayı, kolondan ayrılan elüent içinde en son olarak en küçük moleküller yer alacaktır. Böyle bir jel filtrasyon kolonunda bahsedilen bu üç basamak, diyagramatik olarak Şekil 5.1’de verilmektedir.

Şekil 5.1: Jel filtrasyon ile ayrıştırmanın diyagramatik olarak gösterilmesi.

Jel tarafından absorbe edilen ve bir molekül için kullanılabilir olan hareketli fazın miktarı, bir dereceye kadar jel partiküllerinin porositesine ve molekülün büyüklüğüne bağlıdır. Bu nedenle jel kolonundaki bir molekülün dağılımı, yalnızca bu molekül için kullanılabilir olan hareketli fazın toplam hacmi tarafından belirlenir. Hareketli fazın toplam hacmini ise jel partiküllerinin hem içindeki (iç hareketli faz) hem de dışındaki (dış hareketli faz) hareketli fazın miktarı oluşturur. Verilen bir jel tipi için ise özgül bir molekülün, iç hareketli faz ve dış hareketli faz arasındaki dağılma kat sayısı, Kd, bu molekülün moleküler büyüklüğünün bir fonksiyonudur. Şayet bir molekül, jel partiküllerindeki gözeneklere giremeyecek kadar büyükse ve iç hareketli fazın tamamen dışında kalıyorsa Kd = 0 olacaktır. Bunun aksine şayet molekül, jel partiküllerindeki gözeneklerin içerisine (iç hareketli faza) girebilecek kadar küçükse Kd = 1 olacaktır. Her bir jel partikülünün gözenek (por) büyüklüğünün farklılığından dolayı, ara boyutlardaki moleküller için uygun olabilen ve olmayan bir miktar iç hareketli faz olacaktır. Dolayısıyla, örnek içerisindeki faklı büyüklükteki moleküllerin Kd değerleri 0 ile 1 arasında değişecektir. Bunun sonucu olarak da bir jel filtrasyon kolonunda, birbirine oldukça yakın moleküler büyüklüğe sahip olan moleküllerin ayrıştırılmasını olanaklı kılan faktör, Kd değerlerinin bu iki limit (0 ve 1) arasındaki değişimidir. Farklı göreceli moleküler büyüklüklere ve Kd değerlerine sahip iki molekül için, K’d ve K’’d, elüsyon hacimlerindeki fark, VD, aşağıda gösterildiği gibi eşitlik 5.1’den türetilebilir:

VD = (K'd - K''d ) Vi

(5.1)

Burada Vi, Kd değeri 1’e eşit olan molekül için kullanılabilir olan jel partikülleri içerisindeki hareketli fazın hacmidir.

5. JEL FİLTRASYON KROMATOGRAFİSİ


93

Pratikte ise kolonun zayıf paketlenmesi gibi nedenlere bağlı olarak, ideal davranıştan sapmaların olduğu durumlarda, örnek hacmini VD değerinin altına indirgemek yerinde olur. Çünkü, örnek hacmi ile iç jel hacmi arasındaki oran, hem ayrıştırmanın keskinliğini hem de örneğin seyrelme derecesinin her ikisini birden etkilemektedir. Jel filtrasyon kromatografisi, tek bir cins hareketli fazın kullanımını ve izokratik elüsyonu gerektirir. Elüsyon sıvısındaki analitlerin belirlenmesi ise genellikle, UV absorbsiyon spektrofotometre dedektörleri ile yapılmaktadır. Jel filtrasyon kromatografisinde kullanılan kolonlar, diğer tipteki kromatografi kolonlarına oranla daha uzundurlar (bkz. kısım 3.2). Böylece hem durgun fazın hacmi, hem de durgun faz içindeki boşluğun (porların) toplam hacmi artırılmış olur. 5.3. Matriksler

Jel filtrasyon kromatografisinin ilk yıllarında kullanılan dekstran, poliakrilamid ve agaroz matrikslerinin en büyük dezavantajı, bu matrikslerin yumuşaklığı olmuştur. Kromatografi esnasında uygulanan ozmotik basınç da dahil olmak üzere, çok küçük basınçlar dahi bu matrikslerin biçiminin bozulmasına, düzensiz paketlemeye ve hareketli fazın akışının zayıf olmasına neden olmaktadır. Kontrollü-porlu cam matrikslerin kullanımı için yapılan girişimler ise bu tür matrikslerin adsorbsiyon etkilerinden dolayı pek de başarılı olmamıştır. Kontrollü-porlu cam matrikslerin en büyük avantajlarından birisi ise bu matrikslerin sertliğidir. Bu nedenle, paketlemede ve akış oranında, jel matrikslere göre daha az problemlerle karşılaşılmaktadır. Porlu cam matrikslerin adsorbsiyon etkilerinin de üstesinden gelinebilir. Fakat, son zamanlardaki gelişmelerle, jel yapıdaki matrikslerin de porlu cam matrikslerin sunduğu sertlik avantajını sağlaması başarılmıştır. Günümüzde ise jel filtrasyon kromatografisinde yaygın olarak kullanılan jeller (matriksler) çapraz-bağlı dekstranlar (Sephadex), agaroz (Sepharose, Superose ve Bio-Gel A), akrilamid (Trisacryl), poliakrilamid (Bio-Gel P), poliakriloilmorfin (Enzocryl Gel), dekstran-akrilamid (Sephacryl HR), vinil polimer (Fractogel TSK HW-S, Toyopearl TSK HW-M ve TSK HW-C), selüloz (Matrex Cellufine) ve polistiren (Bio-Beads S)’dir. Dekstran temelli jel materyallerinin por büyüklükleri çapraz-bağlar aracılığı ile çok dikkatli olarak ayarlanırken, agaroz temelli olan jellerin por büyüklükleri ise uygun koşullar altında kendiliğinden jelleşmesi ile sağlanmaktadır (bkz. kısım 3.3). Karışım halindeki (kompozit) jeller ise önceden hazırlanmış matrikslerin üzerine ikinci bir polimerin eklenmesi ile elde edilebilir. Örneğin Sephacryl, çapraz-bağlı allil dekstran ile N,N’-metilen bisakrilamid karışımından, Superdex ise oldukça yüksek oranda çapraz-bağ içeren agaroz jel matriksine dekstran zincirlerinin kovalent olarak bağlanması ile elde edilen kompozit birer jeldirler. Superdex jellerin yüksek oranda fiziksel ve kimyasal kararlılık göstermesinin nedeni, jelin yapısındaki agaroz matriks tarafından sağlanırken, materyalin jel filtrasyon özelliği ise dekstran zincirleri tarafından belirlenmektedir. HPLC için uygun olan kolon materyalleri ise daha önce Tablo 4.1’de verilmiş olup, LPLC için uygun olanların bazı örnekleri ise Tablo 5.1’de verilmektedir. 5.4. Deneysel Parametreler i. Örnek materyalinin özellikleri: İyi bir sonucun elde edilebilmesi için, ayrıştırılması yapılacak olan moleküllerin özelliklerinden ayrı olarak, örnek materyalinin sahip olması gereken özellikler, örnek materyalinin viskozitesi ve hacmidir. Örnek materyalinin hacmi, kullanılacak olan kolonun büyüklüğünü etkilerken, viskozitenin ise hidrodinamik kararsızlığa yol açacak kadar yüksek olmaması zorunludur. Örnek materyalinin derişiminden kaynaklanan viskozite, üst sınır olarak kullanılabilir (bkz. kısım 5.6.3.3). Örnek materyalinin pH’sı, iyonik kuvveti ve kompozisyonu ise ayrıştırılması yapılacak olan moleküllerin büyüklükleri ve kararlılıkları üzerine bir etkisi olmadığı sürece önemli değildir ve kullanılan jel materyalinin izin verdiği sınırlar arasında seçilebilir.

94



Tablo 5.1: LPLC için uygun olan bazı jel matriksleri. Polimer

Dekstran

Agaroz

Poliakrilamid

Vinil

Kompozit (dekstranpoliakrilamid)

Ticari İsim Sephadexb G10 G15 G25 G50 G75 G100 G150 G200 Sepharosb 2B 4B 6B Superoseb 12 HR 6 HR Bio-Gelc A-0,5m A-5m A-15m A-50m A-150m Bio-Gelc P2 P4 P6 P10 P30 P60 P100 P150 P200 P300 Fractogel TSKd HW-40 HW-55 HW-65 HW-75 Sephacrylb S-100 HR S-200 HR S-300 HR S-400 HR Superdexb 30 75 200

Fraksiyonlama aralığıa ( Mr, kDa) < 0.7 SOURCE 15 (15 μm) > SOURCE 30 (30 μm) > Sepharose High Performance (34 μm) > Sepharose Fast Flow / Sepharose CL-6B / Sephacel (90 μm) > Sephadex (40-125 μm, kuru formda) > STREAMLINE / Sepharose Big Beads (200 μm). Bu nedenle, SMART, FPLC ve HPLC sistemlerinde MiniBeads, MonoBeads ve SOURCE 15 gibi iyon-değiştiricilerinin kullanılması durumunda en yüksek çözünürlük elde edilebilirken, standart kolonlarla en yüksek çözünürlük ise SOURCE 30 ve Sepharose High Performance gibi iyon-değiştiricilerinin kullanılması ile elde edilebilir. iv. Proses zamanı: Belirli bir zaman diliminde ne kadar materyalin prosesten geçirileceği genellikle, kolon materyalinin kapasitesi ve akış özellikleri ile kolonun büyüklüğü tarafından belirlenir. Günümüzde ise makromoleküller için oldukça yüksek kapasiteye sahip iyon-değiştiriciler bulunmakla birlikte, bu kolon materyallerinin akış özellikleri oldukça farklılıklar göstermektedirler. Bu nedenle, SMART sistemlerle yapılacak mikropreparatif kromatografilerde MiniBeads gibi optimum akış özelliklerine sahip kolon materyalleri tercih edilirken, HPLC ve FPLC sistemlerinde MonoBeads ve SOURCE 15; laboratuvar- ve endüstriyel-ölçekli preparatif ayrıştırmalarda ise SOURCE 30, Sepharose High Performance, Sepharose Fast Flow ve Sepharose Big Beads gibi kolon materyalleri tercih edilmektedir. SOURCE gibi iyon-değiştirici kolon materyalleri uniform büyüklükteki küresel taneciklerden oluştuğu için, bu tip kolon materyalleri paketlendiğinde oldukça düşük basınç düşmeleri meydana gelmektedir. Bu nedenle, özellikle birbirine çok yakın ürünlerin ayrılması amacıyla endüstriyel çaptaki uygulamalar için ideal bir materyaldir. v. Ölçek: Genellikle büyük-ölçekli ayrıştırma işlemlerine geçmeden önce, örnek bileşenlerinin ayrılması için gerekli optimum koşulların belirlenmesi amacı ile küçük-ölçekli iyon değiş-tokuş kromatografisi uygulanır. Bu nedenle, küçük bir kolon ile başarılan ayrıştırma işlemlerinin kolayca büyük-ölçekli ayrıştırma işlemlerine de uygulanmasına izin veren bir iyondeğiştiricinin seçilmesi oldukça önemlidir. vi. Tekrarlanabilirlik: Kolon kromatografisinde sonuçların tekrarlanabilirliği, kolon içerisine paketlenmiş olan materyalin özelliklerinin ayrıştırma ve rejenerasyon işlemleri boyunca değişmeden kalmasına bağlıdır. Bu nedenle, bir iyon-değiştirici ile paketlenmiş olan kolondan elde edilen sonuçların tekrarlanabilir olması için seçilen kolon materyalinin yatak hacminde, pH ve iyonik kuvvet değişimlerine bağlı olarak bir değişikliğin meydana gelmemesi gerekmektedir. Bu amaçla MiniBeads, MonoBeads, Sepharose Fast Flow ve Sepharose Big Beads gibi daha sıkı olan iyondeğiştiricilerin seçilmesine özen gösterilmelidir.

124



6.6.1.2. Örnek Bileşiklerinin Moleküler Büyüklükleri

Örnek bileşiklerinin fonksiyonel yüklü gruplara ulaşması, iyon-değiştiricinin örnek bileşikleri için olan kullanılabilir kapasitesi tarafından belirlenir. Ticari olarak bulunan iyon-değiştiricilerin, Sephadex temelli olanlar hariç, hepsi de 1 x 106 Da moleküler büyüklüğe sahip olan globüler moleküller için dahi geçirgenlik özelliğine sahiptirler. Sterik faktörler, her bir bileşik için ayrı olan iyon-değiştiricinin kullanılabilir kapasitesini etkilediğinden, sadece yüklü bileşiklerin ayrılmasını etkilerler. Bir iyon-değiştirici seçilirken, seçilen iyon-değiştiricinin ayrılacak olan yüklü bileşikler üzerine jel filtrasyon etkisi gösterebileceği ihtimalini göz önünde bulundurmak gereksizdir. Yüklü olan örnek molekülleri, her zaman elüsyon tamponunu oluşturan bileşiklerden daha büyük olmalarına rağmen, elüsyon tamponunun bileşiklerinden daha hızlı hareket edemezler. Çünkü, yüklü olan örnek molekülleri elüsyon tamponunun bileşiklerinden hızlı hareket etseler dahi, gelmiş oldukları noktada kolon koşulları bu moleküllerin kolon matriksine yeniden bağlanmasını sağlayacak koşullardadır. Sadece yüklü olmayan örnek molekülleri, jel filtrasyon kromatografisinde olduğu gibi, moleküler büyüklüklerine uygun olarak fraksiyonlanacaklardır. Bu yüksüz moleküller ise kolon materyaline bağlanmış olan yüklü örnek moleküllerinin elüsyonu için uygulanacak olan gradientten önce, izokratik elüsyon sırasında kolondan ayrılacaklardır. Ticari olarak bulunan farklı iyon-değiştirici materyallerin geçirgenlik limitleri ise üretici firmalar tarafından belirtilmektedir. Moleküler büyüklüğü bilinmeyen örneklerle çalışıldığı durumlarda ise geçirgenlik limitleri oldukça yüksek olan MonoBeads ve Sepharose temelli iyon-değiştiricilerin tercih edilmesi bir avantaj oluşturmaktadır. 6.6.1.3. Örnek Bileşiklerinin Kararlılığı ve İzoelektrik Noktaları

Birçok biyolojik bileşik, özellikle proteinler, sadece oldukça dar pH aralıkları içinde kararlıdırlar. Dolayısıyla, seçilecek olan iyon-değiştirici, bu aralıklarda ayrıştırma yapabilmek zorundadır. Genellikle, eğer örnek molekül, izoiyonik (izoelektrik) noktasının altındaki bir pH’da net pozitif yüklü ve çok daha kararlı haldeyse, bir katyon-değiştirici kullanılmalıdır. Bununla beraber, şayet molekülün en kararlı olduğu hal, ona net bir negatif yük verecek şekilde, molekülün izoiyonik noktasının üstündeyse, bu durumda bir anyon-değiştirici kullanılmalıdır (Şekil 6.3).

Şekil 6.3: Proteinlerin net yükleri pH’ya bağlı olarak değişir.

Buna rağmen verilen bu örnekte protein, kakarlılığını ancak pH 5-8 arasında koruduğundan, bu durumda bir anyon-değiştiricinin kullanılması gerekmektedir. Çok geniş pH aralığında kararlı olabilen moleküllerin ayrıştırılmasında ise her iki tipteki iyon-değiştirici materyaller kullanılabilir.

6. İYON DEĞİŞ-TOKUŞ KROMATOGRAFİSİ


125

Güçlü ve zayıf iyon-değiştiriciler arasındaki seçim, aynı zamanda örneğin kararlılığına ve pH’nın örnek molekülün yükü üzerindeki etkisine dayanır. İyonizasyon için çok yüksek veya zayıf pH ihtiyacı gösteren zayıf elektrolitler, sadece geniş pH aralığında çalışabilen iyon-değiştirici materyaller gibi güçlü değiştiricilerle ayrılabilirler. Bunun aksine, güçlü elektrolitler için ise, örnek moleküllerinin denatürasyonuna daha az neden olmaları, zayıf yüklü safsızlıkları (kirleticileri) bağlayamamaları ve artırılmış elüsyon karakteristiklerini içeren bir takım nedenlerden dolayı, zayıf iyon-değiştiriciler daha avantajlıdırlar. Her ne kadar iyon-değiştiricinin çapraz-bağ yapma derecesi, iyon değişim mekanizmasını etkilemese de, iyon-değiştirme kapasitesini etkiler. Bu nedenle, örnek bileşiğin göreceli moleküler kütlesi ve dolayısıyla boyutu, hangi özgül iyon-değiştiricinin kullanılması gerektiğini belirler (bkz. kısım 6.6.1.3). 6.6.2. Başlangıç Koşullarının Dizaynı 6.6.2.1. Başlangıç pH’sının Seçilmesi

Başlangıç tamponunun pH’sı, örnek moleküllerin iyon-değiştiriciye bağlanmasını sağlayacak şekilde, uygun yüklere sahip olmasını sağlayacak bir değerde seçilmelidir. Bu nedenle kullanılacak tamponun pH’sı, örnek moleküllerinin iyon-değiştiriciye yeterli miktarda bağlandığından emin olmak için, anyon-değiştiricinin kullanıldığı durumlarda ayrıştırılacak bileşiğin izoelektrik noktasının en az 1 pH birimi üstünde, katyon-değiştiricilerin kullanıldığı durumlarda ise molekülün izoelektrik noktasının en az 1 pH birimi altında olmalıdır. İyon-değiştiriciye bağlanmış olan bileşikler ise genellikle, 100 mM’lık iyon kuvveti altında, kendi izoelektrik noktalarının yaklaşık 0,5 pH biriminde iyon-değiştiricilerden ayrılmaya (disosiye olmaya) başlarlar. Günümüzde ise farklı protein moleküllerinin izoelektrik noktalarını gösteren detaylı tabloları bulmak mümkündür. Bu tablolar yardımıyla, iyon değiş-tokuş kromatografilerinin dizaynı yapılabilir. Şayet, çalışılmakta olan proteinin izoelektrik noktası hakkında herhangi bir bilgiye sahip değilsek, başlangıç pH’sını belirlemek için değişik yöntemler kullanılabilir: i. Başlangıç pH’sının seçilmesinde test-tüp metodu: Şayet çalışılmakta olan proteinin izoelektrik noktası bilinmiyorsa, bu durumda başlangıç pH’sını belirlemek için basit bir deney yapılabilir:

1. 10 Adet test-tüpü (15 mL) hazırlanır. 2. Her bir test-tüpüne, kuru formdaki iyon-değiştiricilerden 0,1 g veya şişirilmiş formdaki iyondeğiştiricilerden ise 1,5 mL ilave edilir. 3. Her bir tüp içerisindeki jel, farklı pH’lardaki 500 mM’lık, 10 mL tampon (iyon değiş-tokuş kromatografisi için kullanılan tamponlar için kısım 6.6.2.3’e bakınız) ile 10 defa yıkanarak dengelenir. Kullanılan tamponun pH değerleri ise anyon-değiştiricilerin kullanıldığı durumlarda 5-9 arasında, katyon-değiştiricilerin kullanıldığı durumlarda ise 5-8 arasında olmalı ve tüpler arasındaki pH değişimi, 0,5 birimlik aralıklarla ayarlanmalıdır. 4. Her bir tüpteki jel, aynı pH değerindeki fakat daha düşük iyonik kuvvetteki (Sephadex için en düşük iyonik kuvvet 5 mM, Sepharose ve Sephacel için ise 10 mM) 10 mL tampon ile 5 defa yıkanarak dengelenir. 5. Her bir tüpe sabit miktarda örnek materyali ilave edilir. 6. Tüp içerikleri 5-10 dk süreyle karıştırılır. 7. Tüp içerisindeki jelin çökelmesine izin verilir. 8. Her bir tüpten elde edilen süzüntü, örnek molekül için test edilir. Test sonucunda elde edilen sonuçlar Şekil 6.4,a’daki gibi olabilir.

126



Şekil 6.4: İyon değiş-tokuş kromatografisi için başlangıç koşullarının seçilmesinde test-tüp metodu.

İyon değiş-tokuş kromatografisinde kullanılacak tamponun pH’sı, örnek moleküllerinin iyondeğiştiriciye bağlanmasına izin vermeli fakat, aynı zamanda bileşiklerin iyon-değiştiriciden ayrılmasını sağlayan pH değerine de mümkün olduğunca yakın olmalıdır. Şayet seçilen tamponun pH değeri, bileşiklerin iyon-değiştiriciden ayrılmasını sağlayan pH değerinden çok yüksek veya çok düşük ise bu durumda, moleküllerin elüsyonu çok daha zor olacağından, çok yüksek tuz derişimlerinin kullanılması gerekebilir. Bu durumda Şekil 6.4,a’daki hipotetik örnekte, ilgilenilmekte olan moleküllerin iyon-değiştiriciye bağlanması ve elüsyonlarının daha düşük tuz derişimlerinde yapılabilmesi için başlangıç tamponunun pH’sı 7,0 olmalıdır. ii. Başlangıç pH’sının seçilmesinde elektroforetik titrasyon eğrisi (ETE): Örnek molekülün izoelektrik noktası hakkındaki bilgi, başlangıç koşullarının seçilmesi hakkında oldukça önemli ipuçları sunmasına rağmen bu bilgi, örnek molekül üzerindeki yüklerin pH’ya bağlı olarak nasıl değiştiği (bkz. Şekil 6.3) hakkında ya da hangi pH veya iyon-değiştirici ile maksimum çözünürlüğün sağlanabileceği hakkında bilgi vermez.

Elektroforetik titrasyon eğrisi (Şekil 6.5), pH gradientinden oluşan bir ortamda bir molekülün yük/pH arasındaki ilişkisinin belirlenmesini sağladığından, iyon değiş-tokuş kromatografisi ile saflaştırılacak olan moleküller için uygun koşulların belirlenmesinde oldukça önemlidir.

Şekil 6.5: Tavuk göğüs kası proteininin elektroforetik titrasyon eğrisi (Haff ve ark., 1983).



127

Bir örnek molekülünün elektroforetik titrasyon eğrisi, örnek molekülünün, pH gradientine dik açılı olarak horizontal agaroz veya poliakrilamid plaka jelleri üzerinde elektroforezi ile elde edilebilir (Protein moleküllerinin elektroforetik olarak saflaştırılmasında ve analizinde kullanılan elektroforez yöntemleri ise “Protein Saflaştırma 2: Elektroforetik Teknikler” adı ile yayına hazırlanmaktadır). Jelin pH gradienti ise örnek yüklemeden önce izoelektrik odaklama ile oluşturulur. Bir örnek molekülünün elektroforetik titrasyon eğrisinin belirlenmesinde takip edilen adımlar ise Şekil 6.6’da şematik olarak verilmektedir.

Şekil 6.6: Elektroforetik titrasyon eğrisinin belirlenmesinde takip edilen başlıca adımlar (Anonymous, 1995).

Örnek moleküllerinin pH gradientine dikey olarak elektroforezi, her bir örnek molekülünün pH’ya bağlı olarak net yükünün farklı olması nedeniyle, bu moleküllerin göreceli elektroforetik hareketlilikleri de farklı olmaktadır. Örnek moleküllerinin göreceli elektroforetik hareketliliklerinin farklılığı nedeni ile her bir örnek molekülü için özgül olan bir seri eğri oluşmaktadır. Her bir örnek molekülüne ait eğrinin örnek yükleme hattını kestiği pH değeri ise o molekülün net yükünün sıfır olduğu pH’sını, yani izoelektrik noktasını göstermektedir. Bir karışım içerisindeki örnek moleküllerinin maksimum çözünürlüğü, kullanılmakta olan özgül pH’daki her bir örnek molekülünün yüküne bağlı olarak, seçilen iyon-değiştirici tipinde elde edilen titrasyon eğrileri arasındaki maksimum ayrıştırmanın gerçekleştiği pH’da elde edilmesi beklenir. Kullanılmakta olan bu özgül pH’da, örnek moleküllerinin elektroforetik hareketliklilerinin farklılığı ve buna bağlı olarak da net yükleri arasındaki farklılık en fazla olmaktadır. Bu prensip ise Şekil 6.7’de örneklendirilmiştir. Örnek moleküllerinin ayrıştırılması için bu koşulların uygulanmaya konmadan önce, gösterilmiş olan pH’daki proteinin kakarlılığı da göz önünde bulundurulmalıdır. Şayet, örnek moleküllerinin pozitif olarak yüklü bulundukları pH’da (örneğin, moleküllerin izoelektrik noktalarının altında) maksimum ayrışmanın meydana geldiği gözleniyorsa, maksimum çözünürlük, katyon-değiştirici materyallerin kullanılması ile sağlanabilir. Şayet ilgilenilmekte olan örnek moleküllerinin negatif olarak yüklü oldukları pH’da (örneğin, moleküllerin izoelektrik noktalarının üstünde), moleküllerin elektroforetik hareketlilikleri arasında büyük farklılıklar gözlenirse, bu durumda bir anyon-değiştirici materyal kullanılmalıdır. Şayet, örnek moleküllerinin titrasyon eğrilerinin maksimum ayrışması, örnek yükleme noktasında (örneğin, örnek moleküllerinin izoelektrik noktalarında) gerçekleşiyorsa, bu durumda maksimum çözünürlük, kromotofokusing tekniği (bkz. 7. Bölüm) ile sağlanabilir. pH’nın ölçülmesi ise yüzey elektrotlarının kullanılması ile yapılabileceği gibi, jelde pH gradientinin oluşturulması amacıyla elektroforezin birinci boyutu gerçekleştirilirken, izoelektrik noktaları bilinen standart proteinlerin jelin alt ya da üst kısmına dar bir bant şeklinde yüklenmesi ile

128



de belirlenebilir. Elektroforezin birinci boyutundan sonra jel, ikinci boyut için elektroforeze tâbi tutulmadan önce, jelin izoelektrik noktaları bilinen standart proteinleri içeren kısmı jelden ayrılarak boyanır ve her bir standart proteinin lokasyonu belirlenir. İkici boyut elektroforezinden sonra, pH değerlerinin belirlenmesi için izoelektrik noktaları bilinen standart proteinleri içeren ve boyanmış olan parça, jelin kesilen kısmına yeniden eklenir.

Şekil 6.7: Elektroforetik titrasyon eğri analizine dayalı olarak kolon materyalinin seçimi (Anonymous, 1995).

Titrasyon eğrilerinin Coomassie Blue gibi genel bir protein boyası ile boyanması, örnek moleküllerinin izoelektrik noktaları çok net olarak belirlenmediği sürece, özgül bir protein için yük/pH ilişkisi hakkında bir bilgi vermez. Herhangi bir örnek proteini için pozitif bir tanımlamanın yapılabilmesi için ise zymogram analizi (Şekil 6.8) veya immünofiksasyon gibi özgül bir belirleme tekniğinin kullanılması gerekmektedir. Elektroforetik titrasyon eğrisindeki her bir eğri, her bir örnek molekülünün farklı pH değerlerindeki yük derecelerini yansıttığından bu eğriler, kolona yüklenmiş olan moleküllerin elüsyonlarının hangi sıra ile olacakları hakkında bir tahminin yapılmasına da olanak vermektedirler. Belirli bir pH değerinde en düşük elektroforetik hareketlilik gösteren molekül, aynı zamanda en düşük yük kapasitesine de sahip olacağından bu molekülün elüsyonu, gradient elüsyonu sırasında ilk önce gerçekleşecektir. Benzer şekilde, en fazla elektroforetik hareketliliğe sahip olan molekülün yük kapasitesi de en yüksek olacağından bu molekül, zıt yüklü olan kolon materyaline en sıkı bağlanan molekül olacaktır. Bunun sonucunda da bu molekülün elüsyonu, gradient elüsyonunda en sona gerçekleşecektir. Buna rağmen, bir molekülün elektroforetik hareketliliği, o molekülün net yüküne bağlı iken, iyon değiş-tokuş kromatografisindeki davranışı ise molekülün yüzeyindeki net yüküne bağlıdır. Bu nedenle, titrasyon eğrilerine bakarak moleküllerin elüsyon sıralarını %100 doğru tahmin etmek mümkün değildir.



129

Şekil 6.8: Tavuk göğüs kasının elektroforetik titrasyon eğrisinde kreatin kinaz aktivitesinin zymogram tekniği ile belirlenmesi (Haff ve ark., 1983).

iii. Başlangıç pH’sının seçilmesinde kromatografik titrasyon eğrisi (KTE): Hızlı ayrıştırma yapmaya izin veren iyon-değiştirici tipleri için, anyon- veya katyon-değiştiricinin seçilmesi ve optimal başlangıç pH’sının belirlenmesinde kromatografik titrasyon eğrileri kullanılabilir. Özgül bir tuz gradientinde, herhangi bir molekülün kolonda alıkonması, o molekülün net yüküne ve yük yoğunluğuna bağlıdır. Molekülün net yükü ve yük yoğunluğu ise molekülün içinde bulunduğu elüsyon sıvısının pH’sına bağlıdır. Bu nedenle kromatografik titrasyon eğrisi temelde, tampon sıvısının pH’sı ile molekülün kolonda alıkonması arasındaki ilişkiye bağlıdır.

Kromatografik titrasyon eğrilerini elde etmenin metodolojisi ise oldukça basittir. Ayrıştırılacak olan örnek molekülleri, aynı tuz gradienti kullanılarak değişik pH değerlerindeki anyon- ya da katyon-değiştirici materyallerle kromatografiye tâbi tutulurlar. Şekil 6.9’da, kolon materyali olarak bir katyon-değiştirici (a, b ve c) ve bir anyon-değiştiricinin (d, e ve f) kullanılması sonucunda A, B ve C moleküllerinin aynı tuz gradientinde, fakat farklı pH’lardaki kromatogramları verilmektedir. Bu kromatogramlardan yararlanarak, her bir pik için elüsyon tuz derişimi, elüsyon zamanı veya elüsyon hacminin pH’ya göre grafiği çizilir. Bu grafik ise Şekil 6.9’da görüldüğü gibi bir eğri serisi verecektir. Elde edilen eğri serisinin analizi ise, iki veya daha fazla bileşenden oluşan karışım halindeki bileşiklerin maksimum çözünürlükle ayrıştırılmasını sağlayan pH’yı ve iyon-değiştiricinin tipini işaret edecektir. 6.6.2.2. Kuvvetli veya Zayıf İyon-değiştiricinin Seçimi

Katyon- veya anyon-değiştirici ile kullanılacak olan uygun başlangıç tamponun pH’sı seçildikten sonra, önemli olan diğer bir seçim de zayıf ve kuvvetli iyon-değiştirici materyaller arsında bir seçimin yapılmasıdır. Maksimum çözünürlüğün uç noktadaki bir pH’da elde edildiği ve örnek moleküllerinin de bu uç noktadaki pH’da kararlı olduğu durumlarda, seçilmesi gereken iyondeğiştirici bariz bir şekilde kuvvetli iyon-değiştirici olacaktır. Fakat protein moleküllerinin büyük bir çoğunluğunun izoelektrik noktalarının 5,5 ile 7,5 arasında olduğu da dikkate alındığında, bu proteinlerin saflaştırılmasında hem zayıf hem de kuvvetli iyon-değiştiricilerin kullanılabileceğini görülmektedir. Kuvvetli iyon-değiştirici materyallerin kullanılmasının sunduğu bazı avantajlar ise daha önce kısım 6.3’de ele alınmıştır.

130



Şekil 6.9: Kromatografik titrasyon eğrileri (açıklama için metgne bakınız).

6.6.2.3. Tampon Seçimi

İyon değiş-tokuş kromatografisinde iyon-değiştirici materyalin seçimi kadar, göz önünde bulundurulması gereken başka parametreler de bulunmaktadır. Bu parametreler: (i) kullanılacak tamponun pH’sı ve iyonik kuvveti, (ii) tampon bileşenlerinin seçimi ve (iii) şayet, endüstriyel-ölçekte kullanılacaksa, tamponun maliyetidir. i. Kullanılacak tamponun pH’sı ve iyonik kuvveti: İyon değiş-tokuş kromatografisinde kullanılacak olan tamponun pH seçimi, kısım 6.6.2.1’de detaylı olarak incelenmiştir. Genelde,



131

anyon-değiştiricilerle birlikte Tris, piridin ve alkilaminler gibi katyonik tamponlar; katyondeğiştiricilerle birlikte de asetat, barbiturat ve fosfat tamponları gibi anyonik tamponlar kullanılmaktadır. Başlangıç tamponunun iyonik kuvveti ise kullanılan tamponun tamponlama özelliğine bağlı olarak değişmektedir. İyon değiş-tokuş kromatografisinde kullanılabilecek bazı tamponlar ve bu tamponların tavsiye edilen başlangıç derişimleri ise Tablo 6.2’de verilmektedir. Tablo 6.2: İyon değiş-tokuş kromatografisinde kullanılabilecek tamponlar. a) Katyon değiş-tokuş kromatografisinde kullanılan tamponlar pKa (25 °C)

pH aralığı

2,00

1,5-2,5

2,88

Adı

Derişim (mM)

dpKa / °C

Değiştirilebilen-iyon

Malik asit

20

Na+

2,38-3,38

Malonik asit

20

Na+ / Li+

3,13

2,63-3,63

Sitrik asit

20

3,81

3,6-4,3

Laktik asit

50

3,75

3,8-4,3

Formik asit

50

+0,0002

Na+ / Li+

4,21

4,3-4,8

Bütanedioik asit

50

-0,0018

Na+

4,76

4,8-5,2

Asetik asit

50

+0,0002

Na / Li

5,68

5,0-6,0

Malonik asit

50

7,20

6,7-7,6

Fosfat

50

-0,0028

Na+

7,55

7,6-8,2

HEPES

50

-0,0140

Na+ / Li+

8,35

8,2-8,7

BICINE

50

-0,0180

Na+

Na+

-0,0024

Na+

+

+

Na+ / Li+

b) Anyon değiş-tokuş kromatografisinde kullanılan tamponlar pKa (25 °C)

pH aralığı

4,75

4,5-5,0

N-Metil piperazin

20

-0,015

Cl¯

5,68

5,0-6,0

Piperazin

20

-0,015

Cl¯ / HCOO¯

5,96

5,5-6,0

L-Histidin

20

6,46

5,8-6,4

bis-Tris

20

6,80

6,4-7,3

bis-Tris propan

20

7,76

7,3-7,7

Trietanolamin

20

-0,020

Cl¯ / HCOO¯

8,06

7,6-8,0

Tris

20

-0,028

Cl¯

8,52

8,0-8,5

N-Metil-dietanolamin

50

-0,028

SO2 / Cl / CH3COO

8,88

8,4-8,8

Dietanolamin

20-50*

-0,025

Cl¯

8,64

8,5-9,0

1,3-Diamino-propan

20

-0,031

Cl¯

9,50

9,0-9,5

Etanolamin

20

-0,029

Cl¯

9,73

9,5-9,8

Piperazin

20

-0,026

Cl¯

10,47

9,8-10,3

1,3-Diamino-propan

20

-0,026

Cl¯

11,12

10,6-11,6

Piperadin

20

-0,031

Cl¯

12,33

11,8-12,0

Fosfat

20

-0,026

Cl¯

*

Adı

Derişim (mM)

dpKa / °C


Cl¯ -0,017

Cl¯ Cl¯

¯

¯

Dietanolamin pH 8,4 olarak kullanıldığında 20 mM, pH 8,8 olarak kullanıldığında ise 50 mM.

¯

132



Çözelti içerisinde bulunan proteinlerin yapısal kararlılığında tuzların önemli bir rol oynadığı da düşünülürse, kullanılan tamponun iyonik kuvvetinin, proteinlerin denatürasyonunu veya çökelmesini önleyecek bir derişimde olması oldukça önemlidir. Kullanılacak olan tamponun başlangıç iyonik kuvvetinin ne olacağına ise test-tüp metoduyla karar verilebilir. Bu metodun uygulanması ise aşağıdak şekilde gerçekleştirilir: 1. 10 Adet test-tüpü (15 mL) hazırlanır. 2. Her bir test-tüpüne, kuru formdaki iyon-değiştiricilerden 0,1 g veya şişirilmiş formdaki iyondeğiştiricilerden ise 1,5 mL ilave edilir. 3. Her bir tüp içerisindeki jel, seçilmiş olan pH’daki 500 mM’lık, 10 mL tampon ile 10 defa yıkanarak dengelenir. 4. Her bir tüpteki jel, sabit pH’da (örneğin, pH 7) fakat NaCl derişimi 50 mM aralıklarla değişen (Sephadex için 50-500 mM arası NaCl, Sepharose ve Sephacel için ise 10-300 mM arası NaCl) 10 mL tampon ile 5 defa yıkanarak dengelenir. 5. Her bir tüpe sabit miktarda örnek ilave edilir. 6. Tüp içerikleri 5-10 dk süreyle karıştırılır. 7. Tüp içerisindeki jelin çökelmesine izin verilir. 8. Her bir tüpten elde edilen süzüntü, örnek molekül için test edilir. Test sonucunda elde edilen sonuçlar Şekil 6.4,b’deki gibi olabilir. Bu hipotetik örnekte, ilgilenilmekte olan moleküllerin iyondeğiştiriciye bağlanması için tamponun başlangıç iyonik kuvveti en fazla 150 mM, moleküllerin elüsyonu için kullanılacak tamponun iyonik kuvveti ise en az 300 mM olmalıdır. Tamponun doğru başlangıç pH’sı ve iyonik gücü ise örnek moleküllerinin iyon-değiştiriciye bağlanmasına izin verecek kadar olmalıdır. Buna eş olarak, moleküllerin daha sonraki elüsyonları için, başlangıçta elüsyona etki edebilecek en düşük iyonik güce sahip bir tampon kullanılmalıdır. Bu uygulama ise başlangıçta en az sayıda istenmeyen maddenin iyon-değiştiriciye bağlanmasını ve daha sonra da bu kirleticilerin maksimum miktarda kolonda kalmasını sağlar. Bir kolona uygulanabilecek örnek miktarı ise kolonun ölçülerine ve iyon-değiştiricinin kapasitesine bağlıdır. Genellikle, eğer kromatografinin uygulanması (moleküllerin kolondan elüsyonu) süresince başlangıç tamponu kullanılacaksa (izokratik elüsyon) örnek hacmi, kolon yatak hacminin %1-5’i kadar olmalıdır. Bununla beraber, şayet moleküllerin kolondan elüsyonu için gradient elüsyonu kullanılacaksa, seçilen başlangıç koşulları nedeniyle bütün örnek molekülleri iyon-değiştiriciye kolonun en üst kısmında bağlanır. Bu durumda örnek hacmi önemli değildir ve büyük hacimdeki seyreltik örnek solüsyonları kolona yüklenebilmektedir. ii. Tampon bileşiklerinin seçimi: Şayet tampon iyonları, iyon-değiştirici materyalin fonksiyonel gruplarına zıt bir yük taşıyorsa, yüklü olan bu tampon bileşikleri iyon değiş-tokuş prosesinde rol alacaklar ve lokal pH’nın değişmesine yol açacaklardır. Bu nedenle, iyondeğiştiricideki fonksiyonel yüklü gruplarla aynı tipte yüklü olan tampon bileşiklerinin kullanılması tercih edilmektedir. Bu kuralın tâbi ki bazı istisnaları da bulunmaktadır. Örneğin fosfat tamponları, genellikle anyon-değiştirici materyallerle en çok kullanılan tampon olarak literatürde sıkça yer almaktadır. Bunun yanı sıra, tampon iyonlarının kullanılan kolon matriksindeki fonksiyonel iyonik gruplarla etkileşim gösterdiği durumlarda, örnek materyalinin kolona yüklenmeden önce sistemin dengelendiğinden emin olmak için özel bir çaba gösterilmelidir. İyon değiş-tokuş kromatografisi ile saflaştırılmak istenen örnek materyali dondurularak-kurutulmuş ise bu durumda uçucu tamponların kullanılması bir avantaj oluşturmaktadır. Uçucu olan bazı tampon örnekleri ise Tablo 6.3’de verilmektedir.



133

Tablo 6.3: Uçucu tamponlar. pH

Adı


2,0

Formik asit

H+

2,3-3,5

Piridin / Formik asit

HCOO¯

3,0-5,0

Trimetilamin / Formik asit

HCOO¯

3,0-6,0

Piridin / Asetik asit

CH3OO¯

4,0-6,0

Trimetilamin / Asetik asit

CH3COO¯

6,8-8,8

Trimetilamin / HCl

Cl¯

7,0-8,5

Amonyak / Formik asit

HCOO¯

8,5-10,0

Amonyak / Asit

CH3COO¯

7,0-12,0

Trimetilamin / CO2

CO3¯

7,0-12,0

Trietilamin / CO2

CO3¯

7,9

Amonyum bikarbonat

HCO3¯

8,0-9,2

Amonyum karbonat / amonyak

CO3¯

8,5-10,5

Etanolamin / HCl

Cl¯

8,9

Amonyum karbonat

CO3¯

6.7. İyon Değiş-tokuş Kromatografisinin Gerçekleştirilmesi 6.7.1. Kolon Seçimi ve Dizaynı

İyon değiş-tokuş kromatografisinde kullanılan kolonlar, kromatografi sisteminin düşük basınç altında mı, yoksa yüksek basınç altında mı gerçekleştirileceği göz önünde bulundurularak seçilir. Düşük basınç ve yüksek basınç altında gerçekleştirilen kromatografi sistemlerinde kullanılan kolonların özellikleri ise sırasıyla kısım 3.2 ve kısım 4.5’de ele alınmış olmakla birlikte, iyon değiştokuş kromatografisinde kullanılan kolonlar genellikle kısa kolonlardır. İyon değiş-tokuş kromatografisinde kullanılan tipik bir kolonun yatak yüksekliği genellikle 5-15 cm’dir. Bu tipteki küçük-ölçekli uygulamalarda ayrıştırma için gerekli olan optimum koşullar belirlendikten sonra, kolon boyutları uygun ölçülerde artırılarak kolayca büyük-ölçekli ayrıştırma işlemleri için uygulanabilir. 6.7.2. İyon-değiştiricinin Miktarı ve Kapasitesi

Kullanılacak olan iyon-değiştirici materyalinin miktarı, kromatografiye tâbi tutulacak örnek materyalin miktarına ve kullanılan iyon-değiştiricinin örnek molekülleri için olan kullanılabilir veya dinamik kapasitesine bağlıdır. İyon değiş-tokuş kromatografisi ile en iyi çözünürlüğün elde edilebilmesi için, kolon materyalinin kullanılabilir veya dinamik kapasitesinin %10-20’den fazlasının kullanılmaması tavsiye edilmektedir. Fakat elde edilen çözünürlüğün yeterli görüldüğü durumlarda bu oran aşılabilmektedir. Her bir özgül iyon-değiştiricinin kullanılabilir ve dinamik kapasitesi ise örnek moleküllerine, kullanılan tamponun pH ve iyonik kuvvetine bağlı olarak değişmektedir. 6.7.2.1. Kullanılabilir ve Dinamik Kapasitenin Belirlenmesi

Bir iyon-değiştiricinin kullanılabilir kapasitesi, başlangıç tamponunun pH’sının belirlenmesinde (bkz. kısım 6.6.2.1) ve örnek moleküllerinin iyon-değiştiriciye bağlanması ve elüsyonu için gereken iyonik kuvvetin belirlenmesinde (bkz. kısım 6.6.2.3) olduğu gibi, test-tüp metodu (bkz. Şekil 6.4,c) ile belirlenebilir: 1. 10 Adet test-tüpü (15 mL) hazırlanır.

134



2. Her bir test-tüpüne, kuru formdaki iyon-değiştiricilerden 0,1 g veya şişirilmiş formdaki iyondeğiştiricilerden ise 1,5 mL ilave edilir. 3. Her bir tüp içerisindeki jel, uygun pH’daki (örneğin pH 7) ve uygun iyonik kuvvetteki (örneğin 100 mM), 10 mL tampon ile 10 defa yıkanarak dengelenir. 4. Her bir tüpe, seri dilüsyonu hazırlanmış olan ve bilinen miktarda protein içeren sabit hacimlerde protein örneği ilave edilir. 5. Tüp içerikleri 5-10 dk süreyle karıştırılır. 6. Tüp içerisindeki jelin çökelmesine izin verilir. 7. Her bir tüpten elde edilen süzüntü, protein derişimi için test edilir. Test sonucunda elde edilen sonuçlar Şekil 6.4,c’deki gibi olabilir. Şekil 6.4,c’deki hipotetik örnekte, ilgilenilmekte olan moleküller için iyon-değiştiricinin 1,5 mL’si veya 0,1 g kuru formu için kullanılabilir kapasitesi ≤50 μg olmalıdır. Bir iyon-değiştiricinin kullanılabilir kapasitesini belirlemenin çok daha gerçekçi bir yolu için ise dinamik bir metodun kullanılması önerilmektedir (kullanılabilir ve dinamik kapasite tanımları için ise kısım 6.5’e bakınız). Dinamik kapasitenin belirlenmesinde kullanılması gereken ekipman tipleri ise Şekil 6.10’da gösterilmektedir. Dinamik kapasitenin belirlenmesinde, FPLC sistemleri de kullanılabilmektedir.

Şekil 6.10: Bir iyon-değiştiricinin dinamik kapasitesinin belirlenmesi için kurulan deney düzeneğinde yer alan ekipmanlar.

Dinamik kapasitenin belirlenmesi için belirli bir miktardaki jel (genellikle, 1 cm yatak yüksekliği verecek miktar yeterlidir) kolona paketlenir. Paketlenen kolon, kolondan gelen elüsyon sıvısının pH’sı başlangıç tamponunun pH’sı ile aynı oluncaya kadar yeterli miktardaki başlangıç tamponu ile yıkanarak dengelenir. Kolona paketlenmiş olan jelin hacmi ise kolonun iç-çapından ve jelin yatak yüksekliğinden yararlanılarak hesaplanır. Önceden paketlenmiş olan ticari, hazır kolonların kullanıldığı durumlarda ise kolondaki jel miktarı üretici firma tarafından tanımlanarak kolon ile birlikte sağlanmaktadır.



135

Başlangıç tamponu içerisinde bulunun protein örneği (1-5 mg mL–1), örnek yükleme vanası aracılığı ile kolona yüklenir. Kolonun tamamı ile yüklendiğinden emin olmak için, kaydedici ibresinin tam ölçek değerinin %50’sine ulaşıncaya kadar örnek yükleme işlemine ara verilmemelidir (%0, başlangıç tamponunun neden olduğu sapma; %100, elüsyon sıvısının protein içerdiği zamanki sapma). Yeterli miktarda örneğin yüklendiğinden emin olduktan sonra vana, tekrar başlangıç tamponunun kolona gönderilmesini sağlayacak pozisyonuna çevrilir. Başlangıç tamponu ile yıkama işlemine, kolondan gelen tampon içerisinde neredeyse hiç protein kaydedilmeyinceye kadar (yaklaşık %0 ibre sapmasına kadar) devam edilir (Şekil 6.11).

Şekil 6.11: Dinamik kapasitenin belirlenmesi amacı ile Şekil 6.10’daki deney düzeneğinden elde edilen grafik.

Yıkama fazından sonra kolon materyaline adsorblanmış olan proteinlerin elüsyonu, basamaklı gradient uygulaması (örneğin, 2 M NaCl) ile iyonik kuvvetin veya pH’nın değiştirilmesi ile gerçekleştirilir. Fraksiyonların toplanmasına ise elüsyon sıvısının UV-absorbsiyonu, maksimum sapmanın %2’sinin üzerine düşünceye kadar devam edilir. Toplanan fraksiyonlar ise birleştirilerek, birleştirilmiş olan fraksiyonların UV-absorbansı ölçülür. Seçilmiş olan akış oranı altında, kolona adsorblanmış olan proteinin maksimum miktarı (A), eşitlik 6.1. ile hesaplanır: A=CV

(6.1)

Eşitlik 6.1’de C, birleştirilmiş olan fraksiyonlardaki protein derişimi (mg mL–1); V, birleştirilmiş olan fraksiyonların toplam hacmidir (mL). C = A280 /E

(6.2)

Eşitlik 6.2’de ise A280, 1 cm ışık yoluna sahip küvetin kullanılması durumunda solüsyonun 280 nm’deki absorbansı; E, yine 1 cm ışık yoluna sahip küvetin kullanılması durumunda standart protein solüsyonunun (1 mg mL–1) 280 nm’deki absorbansıdır. Kolonun protein kapasitesi ise eşitlik 6.3 ile hesaplanır: Kapasite = A / jel hacmi

(6.3)

Bu hesaplamada, kolon materyaline adsorblanmış olan protein elüsyonunun %100 olarak gerçekleştirildiği var sayılmaktadır. Bu durum ise kolona yüklenen protein miktarı ile kolondan gerikazanılan protein miktarı karşılaştırılarak kontrol edilebilir.

136



6.7.3. İyon-değiştiricinin Hazırlanması

Uygun iyon-değiştiricinin ve başlangıç tamponunun seçiminden sonra, örnek molekülleri paketlenmiş olan kolona yüklenmeden önce, kolon materyalinin başlangıç tamponu ile yıkanarak dengelenmesi gerekmektedir. Ticari olarak bulunan iyon-değiştiriciler kuru formda, önceden şişirilmiş formda veya paketlenmiş formda temin edilebilirler. Kuru formda temin edilen Sephadex gibi iyon-değiştiricilerin hazırlanması, şişirilmiş formda satılan veya önceden paketlenmiş olan iyondeğiştiricilerin hazırlanmasından farklıdır. i. Şişirilmiş formdaki iyon-değiştiricilerin kullanıma hazırlanması: Sepharose temelli iyon-değiştiriciler, DEAE-Sephacel ve SOURCE gibi bazı iyon-değiştiriciler önceden şişirilmiş olarak kullanıma hazır şekilde satılmaktadırlar. Bu tipteki iyon-değiştiricilerin kullanıma hazırlanması için, jelin içinde bulunduğu sıvı alınarak jelin çökelmesinden sonra oluşturduğu hacminin %75’ine karşılık %25 başlangıç tamponu ilave edilir. Şayet çok fazla miktardaki iyondeğiştiricinin dengelenmesi için zayıf bir tamponun kullanılması gerekiyorsa, bu durumda önce iyon-değiştiricinin doğru pH’daki ve 10 kuvvetindeki tampon ile dengelenmesi daha sonra da normal kuvvetteki başlangıç tamponu ile yıkanarak dengelenmesi gerekmektedir. ii. Paketlenmiş İyon-değiştiricilerin kullanıma hazırlanması: MiniBeads, MonoBeads, Sepharose Fast Flow ve Sepharose High Performance gibi bazı iyon-değiştiricileri ise önceden paketlenmiş olarak temin edilebilmektedirler. Bu tipteki önceden paketlenmiş kolonların kullanıma hazırlanması için paketleme solüsyonu içerisindeki %20’lik etanolü uzaklaştırmak amacıyla kolonun, kolon hacminin 5-misli kadar bir başlangıç tamponu ile yıkanması yeterlidir. iii. Kuru formdaki iyon-değiştiricilerin kullanıma hazırlanması: Sephadex gibi kuru formda temin edilen iyon-değiştiricileri ise paketlemeden önce şişirilmelidir. Kuru formdaki iyondeğiştiricilerin şişirilmesi ise kromatografide kullanılacak olan uygun pH’daki tampon ile yapılmalıdır. Kuru formdaki iyon-değiştiricilerin tamamen şişirilmesi, oda sıcaklığında 1-2 gün, kaynamakta olan su banyosunda (pH 7) ise yaklaşık 2 saat sürmektedir. Kuru formdaki iyondeğiştiricilerin yüksek sıcaklıkta şişirilmesi, aynı zamanda jelin havasının alınmasını da sağlamaktadır. Kuru formdaki iyon-değiştiricilerin şişirilmesi esnasında matriksin yapısına zarar vermesi nedeni ile distile su kullanılmasından ve aşırı karıştırmadan (örneğin, manyetik karıştırmadan) sakınılmalıdır. Kuru formdaki iyon-değiştiricilerin şişirilmesi, gereken miktardaki materyalin tartılarak başlangıç tamponu ile karıştırılması ile yapılır. Şişirme periyodu boyunca sıvı kısım dökülerek taze başlangıç tamponu ile birkaç defa yıkama yapılmalıdır. Yıkama işlemi, jelin çökelmesinden sonra oluşan süzüntünün dökülerek uzaklaştırılması yerine, jelin bir miktar şişirilmesinden sonra Büchner hunisi kullanılarak da yapılabilir. iv. Alternatif değiştirilebilen-iyonlar: Şayet, iyon-değiştirici materyaller firmalar tarafından temin edilen değiştirilebilen-iyonlardan (örneğin, Na veya Cl dışında) başka bir iyonla kullanılacaksa, aşağıdaki prosedür kullanılmalıdır:

1. İstenilen miktardaki iyon-değiştirici, kullanılacak olan yeni değiştirilebilir-iyonun tuzunu içeren 0,5-1,0 M’lık çözeltisi içerisinde süspanse edilir. 2. Jel çökeldikten sonra sıvı kısım dökülür. 3. Çökelen jel, kromatografi deneyinde kullanılacak olan başlangıç tamponu içerisinde yeniden süspanse edilir. Jelin tekrar çökelmesine izin verilerek başlangıç tamponu ile birkaç defa yıkanır.



137

6.7.4. Kolonun Paketlenmesi ve Kontrolü

Diğer kromatografi tekniklerinde de olduğu gibi iyon değiş-tokuş kromatografisinde kolonun paketlenme aşaması oldukça önemlidir. Çünkü kötü paketlenmiş bir kolon, hareketli fazın düzensiz olarak akışına, zon genişlemesine ve çözünürlüğün kaybolmasına yol açar. İyi bir kolon paketlemede nelere dikkat edilmesi gerektiği (bkz. kısım 3.5) ve paketlenen bir kolonun kontrol edilmesi ise (bkz. kısım 3.6) daha önce detaylı olarak incelenmiştir. 6.7.5. Örnek Materyalinin Hazırlanması ve Yüklenmesi

Kromatografik sistemlerde örnek materyallerinin hazırlanmasında dikkat edilmesi gereken örnek materyalinin derişimi, kompozisyonu, hacmi ve viskozitesi gibi parametreler iyi bir kromatografinin gerçekleştirilmesi için oldukça önemlidir. Bütün kromatografik sistemler için oldukça önemli olan bu parametreler ise kısım 3.7’de detaylı olarak incelenmiştir. Bunun yanı sıra iyon değiş-tokuş kromatografisinde örnek materyalinin hacmi, kullanılan elüsyon tipine göre değişmektedir. Örnek materyalinin hacmi: Şayet iyon değiş-tokuş kromatografisinde elüsyon, başlangıç tamponu ile gerçekleştirilecekse (izokratik elüsyon) örnek materyalinin hacmi önemlidir ve bu durumda örnek materyalinin hacmi, kolon yatak hacminin %1 ile %5’i arasında olmalıdır. Şayet bileşiklerin kolondan elüsyonunda gradient uygulaması kullanılacaksa, başlangıç koşulları ayrıştırılmak istenen bütün önemli moleküllerin kolonun üst tarafında adsorblanacak şekilde seçilmelidir. Bu durumda, kolona yüklenecek olan örnek materyalinin hacminden ziyade, örnek materyalinin kütlesi çok daha önemlidir. Bunun anlamı ise jel filtrasyon kromatografisi gibi başka bir kromatografik uygulamadan elde edilen birleştirilmiş fraksiyonlar ve hücre kültür sıvıları gibi seyreltik solüsyonların büyük hacimleri, yoğunlaştırılmadan doğrudan doğruya kolona yüklenebilir demektir. Bu anlamda iyon değiş-tokuş kromatografisi, bileşiklerin fraksiyonlara ayrılmasının yanı sıra örnek materyalinin yoğunlaştırılmasını da sağlamaktadır.

Şayet, örnek materyalinin içerisinde bulunan kirleticilerin kolon materyaline adsorblanması ve ilgilenilmekte olan bileşiklerin ise kolona tutunmadan elüsyon sıvısı ile birlikte kolondan ayrılması isteniyorsa, bu durumda örnek materyalinin hacmi kirletici miktarından çok daha az önem kazanır. Bu koşullar altında, saflaştırılmış olan bileşiklerin derişimi gerçekleştirilemeyeceği gibi diffüzyon etkisi ile bir miktar seyrelme de meydana gelecektir. LPLC veya HPLC sistemlerinde iyon değiş-tokuş kromatografisinin kullanılması durumunda, örnek materyalinin kolona yüklenmesi ile ilgili metotlar sırasıyla kısım 3.8 ve kısım 4.10’da detaylı olarak incelenmiştir. Kolona yüklenen örnek materyalinin elüsyon tipine ve kullanılan kolonun kapasitesine bağlı olarak, kolona yüklenecek olan örnek materyalinin miktarı da değişebileceği için, kullanılan örnek materyalinin hacmine uygun bir yükleme metodu seçilerek, örnek yükleme işlemi gerçekleştirilmelidir. 6.7.6. Elüsyon i. İzokratik elüsyon: Şayet başlangıç koşullarının seçimi, sadece örnek materyalinin içinde bulunan kirleticilerin kolon materyaline adsorblanmasını sağlarken, ilgilenilmekte olan moleküllerin kolon materyaline adsorbalanmadan kolondan doğrudan doğruya elüe olmasını sağlayacak şekilde seçilmiş ise elüsyon koşullarının değiştirilmesine gerek yoktur. Aynı şekilde, şayet örnek molekülleri, başlangıç koşulları altında farklı şekilde kolonda alıkonuyorsa ve ayrıştırılabiliyorsa, yine elüsyon koşullarının değiştirilmesine gerek yoktur. Bu tipteki elüsyon prosedürü ise izokratik elüsyon olarak adlandırılmaktadır. İzokratik elüsyonun gerçekleştirildiği kromatografilerde ise kolon kromatografisi başlangıç koşullarının altında yürütülmektedir. İzokratik elüsyon, gradient oluşturmak için bir gradient karıştırıcıya gereksinme duyulmaması ve şayet izokratik elüsyonla,

138



kolon materyaline adsorblanmış olan örnek moleküllerinin tamamının elüsyonu gerçekleştirilebiliyorsa, kolonun rejenerasyona gereksinim duymaması nedeni ile daha kullanışlı olabilir. ii. Gradient elüsyonu: Örnek moleküllerinin ayrıştırılması ve kolondan elüsyonu, genellikle, tamponun pH’sının veya iyonik derişiminin ya da muhtemelen her ikisinin de lineer olarak değiştirilmesi ile başarılmaktadır. Tampon pH’sının veya iyonik derişiminin lineer olarak değiştirilmesi, örnek moleküllerinin kolon materyaline adsorblanmasını sağlayan fonksiyonel yüklü gruplara karşı olan affinitelerini seçici olarak düşürmektedir. Örnek moleküllerinin fonksiyonel yüklü gruplara olan affinitelerinin seçici olarak azalması ise örnek moleküllerinin kolondan farklı zamanlarda elüe olmasına yol açmaktadır. Bu tipteki elüsyon ise gradient elüsyonu olarak adlandırılmaktadır. İyon değiş-tokuş kromatografisinde gradient elüsyonu, izokratik elüsyondan çok daha yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle, gradient elüsyonu daha detaylı olarak incelenecektir.

İyon değiş-tokuş kromatografilerinde kullanılan iyon-değiştiricinin tipine bağlı olarak, uygulanan gradientin yönü de değişmektedir. Bu nedenle genellikle, anyon-değiştiricilerle azalan pH gradienti ve artan iyonik derişim gradienti uygulanırken; katyon-değiştiriciler için ise pH ve iyonik derişim gradientlerinin her ikisi de artan gradient şeklinde uygulanır. Örnek materyalinde bulunan moleküllerin kolon materyaline olan affiniteleri, genellikle farklıdır. Bu affinite farklılıklarından dolayı, hareketli faz olarak kullanılan tamponun pH’sında veya iyonik derişiminde meydana gelen bir değişiklik, örnek moleküllerinin farklı zamanlarda elüsyonuna ve bunun sonucu olarak da örnek moleküllerinin birbirlerinden ayrılmalarına yol açmaktadır. Gradient elüsyonunun uygulanması ise ya lineer ya da basamaklı pH veya iyonik derişim gradientleri şeklindedir. Gradient elüsyonu, zonların keskinleşmesine neden olduğu için genellikle elüsyon esnasında geliştirilmiş çözünürlükle sonuçlanmaktadır. Fakat lineer gradientler, düşük pik kuyruklanması ile daha iyi çözünürlük verme eğilimindedirler (bkz. kısım 2.7). Buna rağmen, gradient elüsyonunun uygulanmasında farklı metotlar kullanılabilmektedir: a. pH gradienti ile elüsyon: Şekil 6.3’de de gösterildiği gibi bir molekülün net yükü, molekülün bulunduğu ortamın pH’sına bağlıdır. Bu nedenle, bir molekülün bulunduğu ortamın pH’sını o molekülün izoelektrik noktasına doğru değiştirmek, molekülün net yükünün sıfıra doğru yaklaşmasına ve sonuçta izoelektrik noktasındaki pH değerinde ise net yükünün sıfır olmasına yol açmaktadır. Bir molekülün net yükü sıfıra doğru yaklaştıkça, o molekülün iyon-değiştiriciye olan affinitesi azalmakta ve sonuçta adsorblanmış olduğu kolon materyalinden ayrılarak kolondan elüe olmaktadır (Şekil 6.12). Proteinlerin çoğu, kendi izoelektrik noktaları civarında minimum çözünürlüğe sahip olduklarından, kolon içerisindeki protein moleküllerinin çökelerek kolon içinde kalmamaları için gerekli önlemlerin alınması gerekmektedir. Bu amaçla, kromatografinin gerçekleştirilmesi esnasında kullanılacak olan pH ve iyonik derişimde, örnek moleküllerinin çözünürlüğü önceden test edilmelidir.

pH gradientinin uygulanması ise ya lineer ya da basamaklı gradient şeklinde gerçekleştirilir: • Lineer pH gradienti: Pratikte, kolon materyaline adsorblanmış olan protein moleküllerinin elüsyonunda lineer pH gradientinin uygulanması, genellikle iyi bir sonuç vermemektedir. Bunun nedeni ise çok yüksek bir tamponlama kapasitesinin bulunmaması durumunda, proteinler elüe olduklarında, aniden çok yüksek pH değişikliklerinin olmasıdır. pH’da meydana gelen ani değişikliklerin nedeni ise sabit bir iyonik kuvvette, lineer bir pH gradientinin oluşturulmasının oldukça zor olmasıdır. Proteinlerin elüsyonu sırasında pH’da meydana gelen yüksek değişiklik sonucunda ise ayrıştırılması yapılacak olan proteinler arasında çok az bir ayrışma meydana gelmektedir.



139

Şekil 6.12: Haemosiyanin fraksiyonlarının DEAE-Sepharose CL-6B ile ayrıştırılması. Örnek, sodyum fosfat tamponu (100 mM, pH 6,8) içerisinde kolona yüklenmiş ve elüsyon, azalan pH gradienti ile gerçekleştirilmiştir. pH değişikliğ kesikli çizgi (-----) ile gösterilmiştir (Lamy ve ark., 1979).

Lineer pH gradientlerinin oluşturulması ise iki farklı pH’daki tamponların, lineer hacim oranlarında karıştırılması ile elde edilemez. Çünkü, karışım sonucunda oluşan sistemlerin tamponlama kapasiteleri pH’ya bağlıdır. Göreceli olarak daha lineer pH gradientlerinin oluşturulması ise, daha dar pH aralıklarında (maksimum 2 pH birimi) sağlanabilir. Bunun için aynı tamponun iki ayrı solüsyonu hazırlanır. Fakat bu solüsyonlardan birisinin içeriği, tamponun pKa değerinin 1 pH birimi altında, diğerininki ise 1 pH birimi üstünde ayarlandıktan sonra, bu iki solüsyonun karıştırılması ile göreceli olarak daha lineer pH gradienti oluşturulur. Lineer pH gradienti ile yüksek çözünürlükte bir elüsyonun gerçekleştirilmesi ise tamponlama kapasitesini maksimuma çıkaran tampon sistemlerinin ve kuvvetli iyon-değiştiricilerin kullanılması ile sağlanabilir. Bu elüsyon tekniği ise kromatofokusing olarak adlandırılan ve kendi adı ile anılan bir kromatografi tekniğinin doğmasına yol açmıştır (bkz. 7. Bölüm). • Basamaklı pH gradienti: Basamaklı pH gradienti, hem gradientin oluşturulması açısından kolaydır hem de sonuçların tekrarlanabilirliği açısından, lineer pH gradientine göre daha uygundur. pH gradientleri aynı zamanda iyonik derişim gradientleri ile birlikte de kullanılabilirler. b. İyonik derişim gradienti ile elüsyon: Düşük iyonik kuvvette, moleküllerin iyondeğiştiricinin yüzeyindeki fonksiyonel iyonik gruplara karşı olan affinite rekabetleri minimumdur. Minimum affinite rekabetlerinin sonucu olarak da moleküller, iyon-değiştiriciye çok sıkı olarak bağlanırlar. İyonik kuvvetin artırılması ise moleküllerin, fonksiyonel yüklü gruplar için olan affinite rekabetlerini artırırken, moleküller ile iyon-değiştirici arasındaki etkileşimin azalmasına yol açar. Moleküller ile iyon-değiştirici arasındaki etkileşimin azalması ise moleküllerin elüsyonu ile sonuçlanır. Örneğin, E. coli tarafından üretilen β-galaktozidaz enziminin izolasyonunda, NaCl derişim gradienti kullanılmaktadır (Şekil 6.13).

İyonik derişim gradientinin uygulanması da pH gradientinde olduğu gibi ya lineer ya da basamaklı gradient şeklinde gerçekleştirilir: • Lineer iyonik derişim gradienti: İyon değiş-tokuş kromatografisinde en sık kullanılan elüsyon tipi, hazırlanmasının kolaylığı ve tekrarlanabilirliği nedeni ile lineer iyonik derişim gradientidir (bkz. Şekil 6.13,a). Farklı iyonik derişimdeki iki tampon, ki bu tamponlardan birisi başlatıcı (verici haznede bulunan) diğeri ise sonlandırıcı (alıcı haznede bulunan) tampon olarak adlandırılır, lineer olarak değişen hacim oranlarında karıştırıldığında, iyonik derişim de lineer olarak değişmektedir. Sonlandırıcı tampon, başlatıcı tampon ile aynı tampon tuzlarından ve pH’dan oluşabilir fakat, derişimi daha yüksektir veya NaCl gibi ilave tuz içerebilir.

140



Şekil 6.13: E. coli β-galaktozidazının (a) lineer ve (b) basamaklı NaCl gradienti ile ayrıştırılması. Tampon-A: 50 mM MES, pH 6,0, 1 mM MgCl2 ve 1 mM DTT’den oluşmaktadır. Lineer gradient: 30 mL tampon-A içerisinde 0-1 M NaCl ile; basamaklı gradient ise NaCl’ün 3 mL tampon-A içerisindeki 0-0,25 M, 6 mL tamponA içerisindeki 0,25 M, 7 mL tampon-A içerisindeki 0,3 M, 6 mL tampon-A içerisindeki 1 M olarak uygulanması ile gerçekleştirilmiştir. Tuz derişimi kesikli çizgi (-----) ile gösterilmiştir. Kullanılan kolon: Mono Q HR 5/5. Akış oranı: 1 mL dk–1 (Motorin ve ark., 1987).

• Basamaklı iyonik derişim gradienti: Basamaklı iyonik derişim gradienti, aynı tamponun farklı iyonik derişimlerindeki solüsyonlarının arkası arkasına bir seri oluşturacak şekilde kullanılması ile oluşturulur (bkz. Şekil 6.13,b). Basamaklı iyonik derişim gradientinin uygulanması teknik açıdan oldukça kolay olduğu gibi preparatif uygulamalarda oldukça yüksek çözünürlük de sağlamaktadır. Basamaklı iyonik derişim gradientinin uygulanmasında, basamakların hangi aralıklarla seçileceği ve pH veya iyonik derişimin aniden değişmesi nedeni ile elüe olan bileşiklerin birbirlerine oldukça yakın olabileceği de göz önünde bulundurularak, sonuçların değerlendirilmesinde dikkatli olunmalıdır. Elüsyon pikleri, keskin başlangıç hatlarına sahip olmakla birlikte, çoğunlukla birden fazla bileşik içermeleri nedeni ile kuyruklanmalar göstermektedirler. Şayet tampon değişiklikleri çok erken uygulanırsa, pik kuyruklanmaları yalancı piklerin oluşmasına da yol açabilmektedir. Bu nedenlerden dolayı, örnek bileşikleri hakkında bir fikir edinmek ve uygulanacak basamakları belirlemek amacı ile örnek bileşiklerinin ayrılmasında basamaklı gradientten önce, lineer gradientin kullanılması önerilmektedir. 6.8. Kolonun Rejenerasyonu, Temizlenmesi ve Korunması i. Rejenerasyon: Paketlenmiş olan kolon, her bir kullanımdan sonra, iyon-değiştiricinin orijinal fonksiyonunu geri-kazandırmak amacı ile rejenere edilmelidir. Rejenerasyon, kolon materyaline bağlı kalmış olan moleküllerin kolondan uzaklaştırılması amacı ile her kromatografi işleminden sonra kolonun, iyonik derişimi yaklaşık 2 M’a kadar olan tampon ile yıkanması ile sağlanır. Genellikle 2 M’lık tuz derişimi, iyon-değiştiricinin fonksiyonel yüklü gruplarına bağlanmış olan bütün moleküllerin uzaklaştırılması için yeterli olmaktadır. Rejenerasyon için kullanılan tuz ise iyon-değiştirici materyalin yeniden dengelenmesini sağlamak için değiştirilebilen-iyon (örneğin Na+ veya Cl–) da içermelidir.

Zamana bağlı olarak, kolon materyaline bağlanmış olan kirleticilerin birikmesini önlemek amacı ile kolon, belirli aralıklarla daha sert koşullarda temizlenmelidir.



141

ii. Kolonun temizlenmesi: Yerinde-temizleme olarak adlandırılan proses ile kolon sisteminde daha önceki kullanımlar nedeni ile kolon materyaline sıkı bir şekilde bağlanmış, çökelmiş veya denatüre olmuş bileşiklerin uzaklaştırılması amaçlanmaktadır. Bazı uygulamalarda, denatüre olmuş proteinler, lipoproteinler ve lipitler gibi bazı bileşikler, kolonun rejenerasyonu sırasında kolondan elüe olmak yerine, kolon yatağı içerisinde kalabilirler. Bu tipte kolon yatağı içerisinde kalan bileşikler zamanla kolonda biriktikleri zaman, kolonun ayrıştırma özelliklerini olumsuz yönde etkileyebilirler. Şayet, kolon yatağında yoğun bir kirlenme meydana gelmiş ise bu kirlenme aynı zamanda, kolonun tıkanmasına yol açarak, geri-basıncın artmasına neden olabilir. Geri-basıncın artması ise hareketli fazın kolon yatağı boyunca akış oranını etkileyecektir.

Bir kolonun yerinde-temizlenmesi için gereken protokol ise örnek materyalinin içinde bulunan kirleticilerin tipine göre dizayn edilir. Örneğin, NaOH, kolon yatağı içerisinde çökelmiş proteinlerin ve lipitlerin geri-dönüşümsüz olarak çözünür hale getirilmesi için iyi bir temizleme ajanıdır. Ayrıca NaOH, çözücülerin (%70 etanol veya %30 isopropanol) veya deterjanların (örneğin, 1 M asetik asit içinde %0,5 iyonik-olmayan deterjan) kullanıldığı temizleme metotları ile birlikte de kullanılabilmektedir. iii. Sanitizasyon: Kolon yatağında bulunan mikroorganizmaların inaktivasyonunu sağlamak için ise kolon materyalinin sanitizasyonu gerekmektedir. Sanitizasyon ise kolonun bir sanitizasyon ajanı ile yıkanması ile sağlanır. Böylece, kolondan elüe edilmiş olan örnek proteinlerinin mikroorganizmalarla kontamine olma riski azaltılabilir. Günümüzde ise kromatografik sistemlerin sanitizasyonunda en sık kullanılan metod, kolon yatağının NaOH ile yıkanmasıdır. NaOH ise hem kolon yatağının sanitizasyonu için iyi bir ajanıdır, hem de kolon yatağının temizlenmesini sağlamaktadır. iv. Sterilizasyon: Sanitizasyon ile aynı anlamda olmayan sterilizasyonda, kolon sistemi içerisinde bulunan bütün mikroorganizmaların öldürülmesi veya elemine edilmesi amaçlanmaktadır. v. Kolonun ve kolon materyalinin korunması: Kolon materyali içerisinde meydana gelen bakteriyel veya mikrobiyal büyüme, kolona yüklenmiş olan örnek materyali için tehlikeli olabileceği gibi paketlenmiş olan kolon materyalinin kromatografik özelliklerini de olumsuz olarak etkileyerek, hareketli faz akışının düzensiz olmasına yol açabilir. İyon-değiştirici materyallerin depolanması esnasında mutlaka bir anti-mikrobiyal ajan eklenmelidir. Eklenmiş olan anti-mikrobiyal ajanın elüsyonu ise, örnek materyali kolona yüklenmeden önce, kolon materyalinin dengelenmesi için yapılan yıkama sırasında gerçekleştirilebilir. Anti-mikrobiyal ajan olarak anyon-değiştirici materyaller için kolon, 200 mM’lık asetat içerisinde %20 etanol ile dengelenirken; katyon-değiştirici materyaller için kolon, 10 mM’lık NaOH içerisinde %20 etanol ile dengelenir.

Kullanılmış olan iyon-değiştiriciler ise uygun bir anti-mikrobiyal ajanın varlığında, +4 °C ile +8 °C arasında depolanmalıdır. İster kullanılmış olsun ister henüz kullanılmamış olsun, kolon materyallerinin donmasına izin verilmemelidir. Çünkü donma esnasında meydana gelen buz kristalleri, kolon materyallerinin yapılarının bozulmasına yol açabilmektedir. 6.9. IEC Uygulama Örnekleri

İyon değiş-tokuş kromatografisi, uygulanmaya başlandığı 1960’lı yıllardan bu yana biyomoleküllerin saflaştırılmasında ve fraksiyonlanmasında temel kromatografik metotlardan birisi olmuştur. Bu nedenle iyon değiş-tokuş kromatografisi, biyomoleküllerin fonksiyonlarını anlamamıza önemli bir katkı sağlamıştır. Bu kısımda ise iyon değiş-tokuş kromatografisi ile saflaştırılarak fraksiyonlanmış olan bazı biyomoleküllere örnekler verilmektedir. Özgül bir biyomolekülün ayrıştırılarak saflaştırılması için gerekli kromatografik yöntemin ve koşulların seçiminde ise literatür taraması yapılarak, başarılı bir şekilde uygulanmış olan ayrıştırma yöntemleri göz önüne alınmalıdır.

142



i. Enzimler: Enzimler gibi biyoaktif proteinlerin saflaştırılmasında, biyomoleküllerin homojen olarak saflaştırılması kadar, aktivitenin geri-kazanılması da oldukça önemlidir. Günümüze kadar yapılmış olan çalışmalar sonucunda, binlerce enzimin saflaştırılmış olarak elde edilmesinde iyon değiş-tokuş kromatografisi oldukça önemli bir rol oynamıştır. Şekil 6.14’de ise Trichoderma reesei tarafından üretilen selülaz enziminin iki adımında saflaştırılmasında iyon değiş-tokuş kromatografisinin kullanımı görülmektedir.

Şekil 6.14: Trichoderma reesei tarafından üretilen selülaz enziminin iki adımında saflaştırılmasında iyon değiş-tokuş kromatografisinin kullanımı. (a) Örnek materyal: Tampon-A içerisinde 500 μL (2,5 mg) ham T. reesei selülazı. Kolon: Mono Q HR 5/5. Akış oranı: 1 mL dk–1. Tampon-A: 20 mM Tris-HCl, pH 7,6. Tampon-B: Tampon-A + 0,5 M NACl. Gradient: 4 dk %0 B; 21 dk %0-40 B; 15 dk %40-100 B. (b) Örnek materyal: (a)’daki 3. pik. Kolon: Mono S HR 5/5. Akış oranı: 1 mL dk–1. Tampon-A: 20 mM asetat, pH 3,6. Tampon-B: Tampon-A + 0,2 M NACl. Gradient: 26 dk %0-100 B. (Anonymous, 1995).

ii. İzoenzimler: Normalde bir enzimin izomerleri, aynı moleküler büyüklüğe sahiptirler. Bu nedenle, izoenzimlerin ayrıştırılması jel filtrasyon kromatografisi ile başarılamaz. Buna rağmen izomerlerin amino asit kompozisyonlarındaki tek bir amino asit farklılığı dahi bu izomerlerin çok küçük dahi olsa farklı yük özelliklerine sahip olmasını sağlar. Farklı yük özelliklerine sahip izoenzimler ise iyon değiş-tokuş kromatografisi ile ayrıştırılabilirler (Şekil 6.15).

Şekil 6.15: Lösemili bir hücreden N-asetil β-D-glukozaminidaz enziminin izomerlerinin anyon değiş-tokuş kromatografisinde NaCl gradienti ile ayrıştırılması (Scott ve ark., 1987).



143

Hematolojik malignansinin tanımlanmasında N-asetil β-D-glukozaminidaz, çok sık araştırılmış bir enzimdir. Akut lemfoblastik lösemi vakalarında ise “intermediate 1 form” olarak adlandırılan bir izoenzim rapor edilmiştir (Scott ve ark., 1987). Önceleri sadece izoelektrik odaklama tekniği ile bileşenlerinin belirlenebildiği, fakat kromatografik yöntemlerde tek bir pik olarak görülen bu enzimin izomerleri, yüksek çözünürlüklü iyon değiş-tokuş kromatografisinin kullanılması ile ayrıştırılabilmiştir (bkz. Şekil 6.15). iii. İmmünoglobülinler: İmmünoglobülinlerin ayrıştırılmasında iyon değiş-tokuş kromatografisinden sıklıkla yararlanılmaktadır. Şekil 6.16’da, karın boşluğu sıvısından fare monoklonal IgG1’in saflaştırılması görülmektedir.

Şekil 6.16: Karın boşluğu sıvısından fare monoklonal IgG1’in iyon değiş-tokuş kromatografisi ile saflaştırılması. Örnek materyal: Fare karın boşluğu sıvısı (15 mL). Kolon: XK 16/10. Jel: Q Sepharose High –1 Performance. Akış oranı: 2 mL dk . Tampon-A: 50 mM TEA, pH 8,0. Tampon-B: Tampon-A + 0,35 M NACl. Gradient: 20 dk %0 B; 140 dk %0-70 B; 40 dk %100 B. (Anonymous, 1995).

iv. Polipeptidler: İyon değiş-tokuş kromatografisi, her türlü biyomoleküllerin ayrıştırılmasında kullanılabildiği için polipeptidler ve amino asitler gibi moleküllerin ayrıştırılmasında da sıklıkla kullanılan bir kromatografi tekniğidir. Bu nedenle, Şekil 6.17’de görüldüğü gibi iyon değiş-tokuş kromatografisi, siyanojen bromid içeren kollajen fragmentlerinin ayrıştırılmasında olduğu gibi peptidlerin ayrıştırılmasında da kullanılmaktadır.

Şekil 6.17: Kollajen tip-1’in α-zincirlerinden CNBr-peptid fragmentlerinin ayrıştırılması. Örnek materyal: 2 mL Tampon-A içerisinde 36 mg. Kolon: XK 16/10. Jel: SP Sepharose High Performance. Akış oranı: 3 mL dk–1. Tampon-A: 20 mM HCOOH, 2 M Üre, pH 3,8. Tampon-B: Tampon-A + 1 M NaCl. (Anonymous, 1995).

144



Amino asitlerin ayrıştırılması (örneğin, bir protein hidrolizatında) genellikle güçlü, asidik katyon-değiştiricilerle sağlanır. Örnek materyali içindeki bütün değişik amino asit tiplerinin kolon materyaline tamamen bağlanmasını sağlamak amacı ile örnek materyalinin kolona yüklenmesi, pH 1-2’de gerçekleştirilir. pH ve iyonik derişimi artırarak yapılan gradient elüsyonu, amino asitlerin sıra ile elüe edilmesi ile sonuçlanır. Asidik amino asitler olan aspartik ve glutamik asit, ilk başta elüe olurlar; bunu takiben glisin ve valin gibi nötral amino asitler elüe olurlar. Lizin ve arjnin gibi temel amino asitler ise net pozitif yüklerini pH 9-11 değerine kadar yitirmediklerinden en son olarak elüe olurlar. Bu prensipler ise otomatik amino asit analizatörlerinin temel çalışma prensibini oluşturmaktadır. Peptid haritalama çalışmalarında ise iyon değiş-tokuş kromatografisinin, ters-faz kromatografiyi tamamlayıcı olarak kullanılması, her iki tekniğin de yüksek çözünürlük sağlamasına rağmen, ayrıştırma parametrelerinin farklı olması nedeni ile bir avantaj oluşturmaktadır. v. Nükleik asitler ve nükleotidler: Nükleik asitler ve polinükleotidler, yüklü moleküller olmaları nedeni ile iyon değiş-tokuş kromatografisi ile fraksiyonlanarak saflaştırılabilirler. Örneğin, plazmid DNA’larının ayrıştırılmasında kullanılan geleneksel CsCl gradienti içinde santrifüjleme yöntemi yerine, pBR322 plazmidinin bakteriyel kültürlerden ayrıştırılmasıında anyon değiş-tokuş kromatografisi kullanılmıştır (Şekil 6.18). Anyon değiş-tokuş kromatografisi ile ayrıştırılması yapılan pBR322 plazmidinin elektroforetik saflığının, ligasyondaki davranışının ve transformasyonunun ise CsCl gradient yöntemi ile elde edilen plazmid ile aynı olduğu belirlenmiştir. Bunun yanı sıra, CsCl gradient yöntemi ile plazmid ayrıştırması yaklaşık 8 saat sürmesine rağmen, kromatografik yöntemle ortalama 1 saat sürmektedir.

Şekil 6.18: pBR322 plazmid DNA’sının iyon değiş-tokuş kromatografisi ile saflaştırılması. Örnek materyal: 400 mL bakteriyel kültür sıvısına karşılık gelen 2 mL pBR322 alkalin özütü. Kolon: HiLoad 16/10 Q Sepharose High Performance. Tampon-A: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,7 M NaCl, pH 8,0. Tampon-B: 10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, 0,85 M NaCl, pH 8,0. Akış oranı: 5 mL dk–1. (Anonymous, 1995).

Polipeptidlerin iyon değiş-tokuş kromatografisi ile ayrıştırılması prensibine benzer şekilde, DNA molekülünün restriksiyon enzimleri ile parçalanması sonucunda meydana gelen fragmentler, hatta her bir nükleotid dahi bu kromatografik teknikle ayrıştırılabilmektedir.

7. ODAKLAMA KROMATOGRAFİSİ (KROMATOFOKUSİNG)

7.1. Giriş

Protein moleküllerinin yüzeyindeki elektriksel yükler, proteinleri saflaştırmada kullanılan stratejilerin ve metotların dizaynında yararlanılan özgül özelliklerinden birisini oluşturmaktadır. Proteinlerin elektriksel yüklerine dayalı olarak ayrıştırılması, tamamı ile proteinlerin amino asit kompozisyonuna ve dizilimine bağlı olan asit-baz özelliklerine dayalıdır. Protein moleküllerinin yüzeyindeki elektriksel yükler ise proteinlerin içinde bulunduğu solüsyonun pH’sı tarafından etkilenmektedir. Düşük veya asidik pH’da proteinlerin çoğu net pozitif elektriksel yüke sahip olma eğiliminde iken, yüksek veya bazik pH’da ise net elektriksel yükleri genellikle negatiftir. Hem pozitif hem de negatif elektriksel yüke sahip olan proteinler ise elektriksel alanda hareket etmektedirler. Buna rağmen, proteinler belirli bir pH’da net bir elektriksel yük taşımazlar ve bu durumda iken elektriksel alanda hareket etmezler. Bir proteinin net bir elektriksel yük taşımadığı pH değeri ise o proteinin izoelektrik pH’sı veya izoelektrik nokta’sı (pI) olarak adlandırılmaktadır. Protein moleküllerinin elektriksel yük özellikleri, proteinin içinde bulunduğu solüsyonda yer alan değiştirilebilir-iyonların protein moleküllerine bağlanmasına da izin vermektedir. Aynı şekilde, elektriksel olarak yüklü bir protein molekülü de proteinin net yükünün zıttı bir yüke sahip olan reçinelerin yüzeyine veya herhangi bir destek materyaline bağlanmaktadır. Protein moleküllerinin elektriksel yük taşıma özellikleri, elektriksel olarak yüklü olan proteinlerin, elektriksel alanda göç etmeleri ve protein molekülleri arasında meydana gelen veya protein molekülleri ile reçineler arasında oluşan elektrostatik etkileşimler, protein saflaştırma ve karakterizasyonunda oldukça güçlü birer teknik olan elektroforez ve iyon değiş-tokuş kromatografilerinin geliştirilmesine yol açmıştır. Proteinlerin izoelektrik pH’larından ise proteinlerin saflaştırılması amacı ile geliştirilmiş olan izoelektrofokusing ve kromatofokusing tekniklerinde yararlanılmaktadır. Bu nedenle, özellikle protein saflaştırma işlemleri için daha yeni bir kromatografi tekniği olan kromatofokusing, prensipte izoelektrik odaklamaya (izoelektrofokusing) benzemektedir. İyon değiş-tokuş kromatografisi ile kromatofokusing veya izoelektrofokusing tekniği, ilk defa Sluyterman ve arkadaşları tarafından 1978 yılında tanımlanmıştır. Bu araştırmacılar, iyi bir tamponlama kapasitesine sahip olan bir iyon-değiştirici jel (bkz. kısım 6.3) ile paketlenmiş kolon boyunca pH gradienti oluşturulmasını amaçlamışlardır. Bir kolon içerisindeki pH gradienti ise bir kolon içerisinde oluşturulan tuz gradientine benzer mantıkla oluşturulabilir (bkz. kısım 7.2.1). Proteinlerin kolondan elüsyonu sırasında oluşturulan pH gradientinin non-lineer olması durumunda, kromatogramın bazı bölgelerinde çözünürlük oldukça zayıf olmaktadır. Bu nedenle, optimal bir çözünürlük için elüsyon esnasında lineer pH gradientinin oluşturulması gerekmektedir. Lineer bir pH gradientinin oluşturulması ise hem elüsyon tamponunun hem de iyon-değiştirici jelin, geniş bir pH aralığı boyunca düzenli bir tamponlama kapasitesine sahip olmasını gerektirmektedir.

146



Şayet, iyon-değiştirici jele bağlanmış olan proteinin elüsyonunda böyle bir pH gradienti kullanılmış ise kolondan proteinlerin elüsyonu, bu proteinlerin izoelektrik sıralarına göre olacaktır. Bu proses esnasında ise bir odaklama etkisi meydana gelecek ve bunun sonucunda da bantlarda bir keskinleşme, derişim ve farklı pI noktalarına sahip olan proteinlere ait piklerde de çözünürlüğün artmasına yol açacaktır. 7.2. Odaklama Kromatografisinin Mekanizması 7.2.1. pH Gradientinin Oluşturulması

İyon değiş-tokuş kromatografisinde pH gradienti, normalde bir gradient karıştırıcı kullanılarak oluşturulabilir. Azalan bir pH gradienti için, gradient karıştırıcının alıcı haznesi yüksek pH değerindeki bir başlangıç tamponu ile doldurulurken, verici hazneye ise daha düşük pH değerine sahip olan sınırlayıcı tampon eklenir (bkz. kısım 3.9 ve kısım 6.7.6). Alıcı hazneden çıkan solüsyon kolona gönderildikçe, verici haznedeki düşük pH’lı sınırlayıcı tamponun daha fazlası alıcı hazneye geçer ve kolondan ayrılan elüsyonun pH’sı dereceli olarak düşer (Şekil 7.1,a). Buna rağmen, sabit bir iyonik kuvvette, lineer bir pH gradientinin oluşturulması oldukça zordur (bkz. kısım 6.7.6). Kromatofokusingde, lineer bir pH gradientinin oluşturulması amacı ile pH 5-10 arasında oldukça geniş bir titrasyon aralığına sahip bir anyon-değiştirici ile birlikte, amfolitler olarak adlandırılan polimerik tamponlar kullanılmaktadır. Böylece, kolona paketlenmiş olan iyon-değiştirici jel üzerindeki yüklü grupların tamponlama kapasitesinden yararlanılarak, iyon değiştiricinin elüsyon tamponu ile titrasyonu sonucunda kolon içerisinde otomatik olarak pH gradienti oluşturulmaktadır. İyon-değiştirici jel üzerindeki yüklü grupların tamponlama kapasitesinden yararlanılarak, kolon içerisinde pH gradientinin oluşturulması ise Şekil 7.1,b’de diyagramatik olarak görülmektedir.

Şekil 7.1: (a) İyon değiş-tokuş kromatografisi ve (b) kromatofokusing esnasında, pH gradientinin oluşmasının diyagramatik açıklaması.

Örnek bir pH gradientinin oluşturulmasına ise pH 9-6 gradientinin oluşturulmasını verebiliriz. Azalan bir pH gradienti için kolonun pH’sının, elüsyon sıvısının pH’sından yüksek olması gerekir. İyon-değiştirici üzerinde bazik bir tamponlama grubuna gereksinim duyulacağından, kolon materyali olarak bir anyon-değiştirici jel seçilmelidir. Anyon-değiştirici jel olarak ise PBE 118, PBE 94, DEAE-BioGel A, DEAE-Toyopearl 650 M gibi jeller seçilebilir (bkz. kısım 7.3). Burada ele alınan örnek için ise PBE 94 jelinin seçilmesi uygun olacaktır. Kolon içerisine paketlenmiş olan PBE 94 materyali, önce pH 9’a dengelenir. Gradient karıştırıcıdaki sınırlayıcı

7. ODAKLAMA KROMATOGRAFİSİ


147

tampona denk gelen elüsyon tamponunun pH değeri ise 6 olacak şekilde ayarlanır. Bu elüsyon tamponu ise elektriksel olarak farklı yüklere sahip olan oldukça fazla sayıda türler içeren bir polimerik tampon olmalıdır. Elüsyon sıvısı içerisindeki farklı yüklere sahip olan bu türler kolondan aşağıya doğru hareket ettikçe, en asidik olan bileşikler bazik olan anyon-değiştiriciye bağlanırlar. Elüsyon işleminin ilk aşamalarında kolondan ayrılan solüsyonun pH değeri ise başlangıç pH’sına yakındır (Şekil 7.2,a). Elüsyon işlemi ilerledikçe (Şekil 7.2,b ve c), kolona daha fazla polimerik tampon eklendikçe, kolonun her bir noktasının pH’sı da dereceli olarak düşer. Elüsyonun son adımında ise (Şekil 7.2,d) neredeyse kolonun tamamı elüsyon tamponu ile dengeye ulaşacağından, kolondan ayrılan elüsyon sıvısının pH değeri, kolonun üst kısmından eklenen polimerik (elüsyon) tamponun pH değerine eşit olacaktır. Kolondan ayrılan elüsyon sıvısında meydana gelen pH gradienti ise Şekil 7.2,e’de görülmektedir.

Şekil 7.2: PBE 94 ile paketlenmiş bir kolonda, elüsyon tamponu olarak Polybuffer 96 kullanılarak oluşturulan pH gradienti (pH 9-6). (a), (b), (c) ve (d) elüsyon prosesinin farklı aşamalarını temsil etmektedir. (e) Elüsyon hacmine bağlı olarak, kolondan ayrılan elüsyon sıvısının pH değeri.

7.2.2. Proteinlerin Davranışları

Bir protein molekülü üzerindeki elektriksel yükler, bu proteinin izoelektrik noktasına ve proteinin içinde bulunduğu solüsyonun pH’sına bağlıdır. Bu nedenle, kromatofokusing prosesi esnasında pH gradientinin meydana gelmesi ile birlikte, örnek materyali içerisinde bulunan protein moleküllerinin elektriksel yük durumları da sürekli olarak değişmektedir. Böylece, azalan pH gradientinde bir protein molekülünün elektriksel yükü negatiften nötrale, nötralden ise pozitife değişmektedir. Pozitif olarak yüklü fonksiyonel gruplar taşıyan bir kolon materyali (anyon-değiştirici) ile paketlenmiş olan bir kolon, yüksek pH değerine sahip olan bir başlangıç tamponu ile dengelendiğinde ise örnek materyali içerisinde yer alan ve negatif olarak yüklü olan protein molekülleri jele adsorblanacaklardır. Daha düşük bir pH değerine sahip olan elüsyon tamponu kolondan geçirildiğinde ise kolon içerisinde bir pH gradienti meydana gelecek ve protein moleküllerinin elektriksel yükleri değişecektir. Kolonda meydana gelen pH gradienti kolonun alt kısımlarına doğru ilerledikçe, proteinlerin bulundukları çevrenin pH’sı, proteinlerin izoelektrik noktalarına eşit ya da daha küçük olduğunda ise proteinler, adsorblanmış oldukları jelden ayrılacaklardır. Jelden ayrılan proteinler ise elüsyon sıvısının akışı ile birlikte kolonun altına doğru

148



göç edeceklerdir. Buna rağmen, protein molekülleri elüsyon sıvısı ile birlikte kolonun altına doğru göç ederlerken, kolonun tepe noktasından itibaren proteinlerin içinde bulunduğu çevrenin pH değeri de artmaktadır (Şekil 7.3). Böylece, kolon boyunca pH gradientinin oluşması esnasında elüsyon tamponu ile birlikte göç eden proteinin bulunduğu çevrenin pH’sı, proteinin izoelektrik noktasından daha büyük olduğunda ise proteinin elektriksel yükü tekrar tersine dönerek jele yeniden adsorblanacaktır. Bu proses, proteinin izoelektrik noktasının çok az altındaki bir pH’da, proteinin elüe olmasına kadar sürekli olarak tekrarlanacaktır. Örnek materyali içinde bulunan ve farklı izoelektrik noktalarına sahip olan protein molekülleri ise jele adsorblanmadan önce, kolon boyunca farklı mesafelerde hareket edeceklerdir. Bu protein moleküllerinin elüsyonu ise izoelektrik noktalarının sırasına göre gerçekleşecektir (Şekil 7.3). Akış oranı

Göç oranı Protein A

+

+

+ + + + +

6

+ + +

+

Protein C

Protein B

+ 7

+

+ pH

+ + + + + + 8

+

+

+

+

9

Şekil 7.3: Protein moleküllerinin kromatofokusingdeki davranışları. Elüsyon esnasında pH, kolonun tepe noktasından altına doğru artmaktadır. pH gradientinde, kendi izoelektrik noktalarından daha büyük bir pH’da bulunan proteinler negatif olarak yüklü olduklarından jele bağlanmaktadırlar. Kendi izoelektrik noktalarından daha düşük bir pH’da bulunan proteinler ise pozitif olarak yüklü olduklarından jel tarafından itilmektedirler. Kendi izoelektrik noktalarına eşit bir pH’da bulunan proteinler ise nötral olduklarından, ne jele adsorblanırlar ne de jel tarafından itilirler. Buradaki protein A’nın hipotetik pI = 6,5; protein B’nin pI = 7,5; protein C’nin pI = 8,5’dir. Kesikli oklar, hareketli fazın akış oranı ile pI noktalarındaki proteinlerin göç hızlarını temsil etmektedir.

7.2.3. Odaklama Etkisi

Kolona yüklenmiş olan örnek materyalinin oluşturduğu zonun arkasında bulunan protein molekülleri, düşük pH’lı elüsyon tamponu ile ilk olarak titre edilecekler ve yük durumlarının değişmesi nedeni ile adsorblanmış oldukları jel tarafından itileceklerdir. Bunun sonucunda da elüsyon tamponunun akış oranının hızlı olması nedeni ile, örnek zonunun ön kısmına taşınacaklardır. Örnek zonunun ön kısmına göç eden moleküller ise daha yüksek bir pH ile karşılaşacaklardır. Daha yüksek bir pH’da ise bu proteinlerin elektriksel yükü pozitiften nötrale, nötralden ise negatife dönüşecektir. Protein moleküllerinin yükü tekrar negatife dönüştüğünde ise jele adsorblanacaklar ve tekrar örnek zonunun arkasında kalacaklardır. Örnek materyalinde bulunan protein moleküllerinin, örnek zonunun bir arkasında bir önünde yer alması ise bu proteinlerin oluşturdukları bantların kolondan elüsyonu gerçekleşinceye kadar devamlı olarak daralmasına yani odaklamaya (fokusing) yol açmaktadır. Ayrıca, proteinlerden oluşan bir karışımda her bir protein molekülü, kendisinin izoelektrik noktası doğrultusunda elüe olacağından, bu elüsyon prosesi sırasında kolonun üstünden daha fazla proteinin eklenmesi sonucunda, yeni eklenen protein molekülleri otomatik olarak başlangıçta eklenen protein moleküllerinden aynı olanlara yetişecektir (Şekil 7.4). Çünkü, daha önce yüklenmiş olan örnek içerisindeki proteinler kendi izoelektrik pH’larına geldiğinde, elüsyon sıvısının içinde elüsyon sıvısının akış oranı ile aynı hızda göç eden moleküllere göre çok daha yavaş hareket edeceklerdir. Bu nedenle, sonradan yüklenen örnek içerisindeki proteinler aynı izoelektrik noktaya



149

sahip olan birinci yüklemedeki proteinlere yetişeceklerdir. Dolayısıyla hiçbir zararlı etki oluşturmadan, odaklama etkisi meydana gelecek ve kolona büyük hacimlerin uygulanmasını olanaklı kılacaktır. Bundan dolayı kromatofokusing tekniği, yüksek bir kapasiteye sahiptir. Kromatofokusing, izoelektrik noktalarında bariz farklılıklar olması koşuluyla, oldukça kompleks olan protein karışımlarının ayrıştırılması için iyi bir çözünürlük sağlar. Çok benzer izoelektrik noktalarına sahip olan proteinler ise çok zayıf olarak ayrıştırılırlar. Akış oranı

+

+

+

+

+ + + + + +

6

+ 7

+

+ pH

+ + 8

+ + + + +

+

+

+

9

Şekil 7.4: Kromatofokusingin odaklama etkisi. Örnek zonunun arka kısmında bulunan proteinler jelin yüklü grupları tarafından itildiği için örnek zonunun önündeki moleküllere göre daha hızlı göç ederler. Şayet, birinci örneğin yüklenmesinden sonra, aynı proteini içeren ikinci bir örnek kolona yüklenirse, ikinci örnekteki proteinler birinci örnektekileri yakalayarak beraber elüe olacaklardır. Şayet birinci örnek yükleme işleminden sonra, kolona pI daha yüksek olan bir protein yüklenirse bu durumda ikinci yüklenen örnek birinci örnek zonunu geçerek daha önce elüe olacaktır. Kesikli oklar, hareketli faz ve bu faz ile birlikte göç eden pozitif yüklü proteinlerin hızı ile pI noktalarındaki proteinlerin göç hızlarını temsil etmektedir.

7.3. Materyaller ve Ekipmanlar i. İyon-değiştirici jeller: Prensipte, uygun tamponlama kapasitesine sahip olan her türlü uygun iyon-değiştirici jeller kullanılabilmektedir. Seçilen iyon-değiştirici jel suda, tuz solüsyonlarında, organik çözücülerde, denatüre edici ajanların varlığında ve çalışılan pH aralıklarında kararlı olmalıdır. Ayrıca, jel partikülleri yüksek akış oranını sağlayacak şekilde homojen olmalı ve kolon yatak hacminde değişikliklerin meydana gelmemesi için yeterince sert olmalıdır. Seçilen jel, 110-120 °C’da otoklavlanarak steril edilebilmeli, amfolitler ile özgül-olmayan etkileşimler oluşturmamalı ve uç noktalardaki pH değerlerinde hem kimyasal hem de fiziksel olarak kararlı olmalıdır.

Genellikle, geleneksel LPLC kolonlarında anyon-değiştirici olarak Polybuffer exchanger (PBE) 94 ve PBE 118, Sepharose CL, QAE-Sephadex A-25, DEAE-BioGel A ve DEAE-Toyopearl 650 M kullanılmaktadır. FPLC ve HPLC için ise sırasıyla Mono P ve SynChropak AX-300 ve AX500 kullanılmaktadır. Artan pH gradienti için (düşük veya asidik bir pH ile başlanarak) ise SPSephadex C-25 veya CM-BioGel A gibi uygun bir katyon-değiştirici kullanılabilir. İyon-değiştirici jellerin iyon-değiştirme kapasiteleri ise üretici firmalar tarafından belirtilse de arzu edilen pH aralıklarında kapasitenin deneysel olarak belirlenmesi tavsiye edilmektedir (bkz. kısım 6.7.2.1). ii. Tamponlar: Kromatofokusing tekniğinde birisi kolon materyalini dengelemek ve paketlemek için gerekli olan “başlangıç tamponu”, diğeri ise kolon jeline adsorblanmış olan protein moleküllerinin elüsyonu için gerekli olan “elüsyon tamponu” olmak üzere iki tampona gereksinim duyulmaktadır. Paketlenmiş ve dengelenmiş olan kolon boyunca pH gradientinin oluşturulmasını ise elüsyon tamponu sağlamaktadır. Başlangıç tamponu olarak, genellikle 20-30 mM amin tamponları kullanılmaktadır. Elüsyon tamponu olarak ise başlıca Polybuffer 74 ve Polybuffer 96 kullanılmaktadır. Bu tamponlar ise katyonik ve amfoterik türleri içermekte olup, ya tek başlarına ya da amfolitlerle birlikte en yaygın kullanılan tamponlardır. Asidik polimerik tamponların çoğu, jel

150



üzerindeki bazik Polybuffer-değiştirici (PBE) gruplarına bağlanarak, çevredeki H+ iyonlarını artırmakta ve pH’yı düşürmektedir. pH’nın düşmesi ise protein moleküllerinin daha fazla pozitif olarak yüklenmesine yol açar ve sonuçta, proteinlerin adsorblanmış oldukları jelden ayrılmasını sağlar. Azalan kromatofokusingde pH gradientinin üst limiti, başlangıç tamponunun pH’sı tarafından belirlenirken alt limiti, elüsyon tamponunun pH’sı tarafından belirlenmektedir. Nadir olarak da kullanılsa, kolon materyali olarak bir katyon-değiştiricinin kullanılması durumunda ise artan kromatofokusing için bu durumun tersi doğrudur. Lineer bir pH gradientinin elde edilebilmesi için, kullanılan her iki tamponun da çalıştıkları pH aralığındaki tamponlama kapasitelerinin benzer olması gerekmektedir. Başlangıç tamponunun pH değeri genellikle arzu edilen pH değerinin 0,4 pH birimi üzerinde ayarlanır. Böylece başlangıç tamponu ile elüsyon tamponunun kondüktivitesindeki küçük farklılıklar nedeni ile elüsyonun başladığı anda meydana gelen pH dalgalanmasının önüne geçilebilir. Farklı pH aralıklarında gerçekleştirilen kromatofokusing prosesleri için geliştirilmiş olan başlangıç ve elüsyon tamponlarının bir listesi ise Tablo 7.1’de verilmektedir. iii. Kolonlar: Değişik üretici firmalar tarafından üretilen oldukça değişik özelliklerde kolon ve kolon aparatlarını ticari olarak bulmak mümkündür. Kromatofokusing için 20 x 1 cm’den 60 x 1 cm’ye kadar olan açık kolonlar kullanılabilir (bkz. kısım 3.2). İyon değiş-tokuş kromatografisi ve jel filtrasyon kromatografisi gibi diğer kromatografik yöntemlerde kullanılan kolonlar, çözünürlükte belirgin bir değişiklik olmadan kromatofokusing için de kullanılabilmektedir. iv. Peristaltik pompalar: Sabit bir akış oranının sağlanabilmesi için kompak, tek kanallı olan ve gradient oluşturma özelliği olmayan bir pompaya gereksinim duyulmaktadır. Kullanılan peristaltik pompa, iyi bir çözünürlüğün sağlanabilmesi için gerekli olan düşük akış oranını sağlayabilmeli ve geri-akışı (geri-kaçırma) minimum düzeyde olmalıdır. v. Dedeksiyon: Proteinlerin, nükleik asitlerin ve peptidlerin 280 nm ve 254 nm’de dedeksiyonu için duyarlı, tercihen çift-ışınlı bir UV dedektör kullanılabilir. Kullanılan dedektör uygun bir akışlı-küvete sahip olmalıdır. Alternatif olarak her bir fraksiyonun absorbansı da ölçülebilir. Kromatografik sistemlerde kullanılan dedektörler ve fraksiyonların toplanması ise kısım 3.10 ve kısım 4.12’de daha detaylı olarak ele alınmaktadır. 7.4. Çözünürlüğü Etkileyen Faktörler

Diğer kromatografik tekniklerde olduğu gibi kromatofokusing tekniğinde de çözünürlük, elüe edilen bandın genişliği ile tanımlanır (bkz. kısım 2.8). Elüe edilen bandın oluşturduğu pikin genişliği ise birçok değişkene bağlı olup, kromatofokusing de bu değişkenler optimize edilebilir. Kromatofokusing ile herhangi bir proteinin optimum olarak ayrıştırılmasını etkileyen en önemli faktörler ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: i. Gradientin eğimi: Sığ bir pH gradienti çok daha iyi bir çözünürlük sağlamaktadır. Sığ bir pH gradientinin elde edilmesi ise yavaş ve sabit bir pH değişimi veren, düşük tampon derişimlerinin kullanılması ile sağlanabilir ve böylece, pikler arasında çok iyi bir ayrıştırma sağlanır. pH gradientinin düzgün olması ise aynı zamanda pH birimi açısından çok daha dar olan bant genişliği ile sonuçlanmaktadır. Buna rağmen, pH gradientinin çok fazla sığ olması ise elüsyonu yapılan proteinlerin elüsyon sıvısı içerisindeki derişimlerinin çok düşük olmasına neden olmaktadır. Deneysel olarak yapılan çalışmalar sonucunda, kolon yatak hacminin 10-15 misli hacmindeki pH gradientinin iyi bir sonuç verdiği belirlenmiştir. ii. Tamponlar: Kromatofokusing ile ayrıştırılması yapılan proteinlerin çoğu, polimerik tamponlar ile başarılmıştır (bkz. Tablo 7.1). Buna rağmen, polimerik tamponların yerine geleneksel tampon bileşenlerinin uygun karışımları da kullanılabilmektedir. Örneğin, başlangıç tamponu ve



151

elüsyon tamponu bileşenleri bakımından aynı olabilir. Fakat, bu tamponlardan başlangıç tamponunun pH değeri, kullanılan tamponun üst pH limitinde iken, elüsyon tamponunun pH değeri ise alt limitte olmalıdır. Tablo 7.1: Farklı pH aralıklarında kromatofokusing için kullanılan tamponlar ve jel materyalleria. pH aralığı

Jel

10,5-9d PBE 118 10,5-8

PBE 118

10,5-7

PBE 118

9-8f

PBE 94

9-7

PBE 94

9-6

PBE 94

8-7

PBE 94

8-6

PBE 94

8-5h

PBE 94

7-6

PBE 94

7-5

PBE 94

7-4

PBE 94

6-5

PBE 94

6-4

PBE 94

5-4

PBE 94

a b c d e f g h

Başlama tamponu

pH 11; 25 mM trietilamin-HCl pH 11; 25 mM trietilamin-HCl pH 11; 25 mM trietilamin-HCl pH 9,4; 25 mM etanolamin-HCl pH 9,4; 25 mM etanolamin-HCl pH 9,4; 25 mM etanolaminCH3COOH pH 8,3; 25 mM Tris-HCl pH 8,3; 25 mM TrisCH3COOH pH 8,3; 25 mM TrisCH3COOH pH 7,4; 25 mM İmidazolCH3COOH pH 7,4; 25 mM İmidazol-HCl pH 7,4; 25 mM İmidazol-HCl pH 6,2; 25 mM Histidin-HCl pH 6,2; 25 mM Histidin-HCl pH 5,5; 25 mM Piperazin-HCl

Yaklaşık hacim Toplam (kolon hacmi olarak) hacim c Ölü hacim Gradient hacmi

Elüsyon tamponu

Seyrelme faktörüb

–

–

–

–

–

1:45

1,5

11,5

13,0

1:45

2,0

11,5

13,5

1:45

1,5

10,5

12,0

1:10

2,0

12,0

14,0

1:10

1,5

10,5

12,0

1:13

1,5

9,0

10,5

1:13

3,0

9,0

12,0

1:10

2,0

8,5

10,5

1:13

3,0

7,0

10,0

1:8

2,5

11,5

14,0

1:8

2,5

11,5

14,0

1:10

2,0

8,0

10,0

1:8

2,0

7,0

9,0

1:10

3,0

9,0

12,0

e

pH 8,0; PH (pH 8-10,5)-HCl pH 7,0; PH (pH 8-10,5)-HCl pH 8,0; PH (pH 8-10,5)-HCl pH 7,0; PBg 96-HCl pH 6,0; PB 96HC3COOH pH 7,0; PB 96-HCL pH 6,0; PB 96CH3COOH pH 5,0; PB 96 (%30) + PB 74 (%70)CH3COOH pH 6,0; PB 96CH3COOH pH 5,0; PB 74HCl pH 4,0; PB 74HCl pH 5,0; PB 74HCl pH 4,0; PB 74HCl pH 4,0; PB 74HCl

Bütün tamponlar kullanılmadan önce gazları giderilmelidir. Verilen seyrelme faktörleri kritik değildir ve en iyi koşullar deneysel olarak belirlenebilir. Gradient hacmi için verilen değerler yaklaşıktır ve seçilen koşullara göre değişebilir. pH 9 ile sonlanan gradientler, Pharmalyte pH 8-10,5’in pH değerinin üzerinde olduğu için önerilmemektedir. PH: Pharmalyte için kullanılmış olan kısaltmadır. PBE 94 ve Polybuffer 96 gibi PBE 118 ve Pharmalyte pH 8-10,5 de bu aralığı kapsamaktadır. PB: Polybuffer için kullanılmış olan kısaltmadır. Karıştırma en iyi sonucu vermektedir. Tek başına kullanıldığı zaman Polybuffer 74, Polybuffer 96’dan daha iyi çalışmaktadır.

iii. İyon-değiştirici jellerin yükü: İyon-değiştirici ile bunu çevreleyen bileşenler arasında optimal bir yük farklılığının olması, izoelektrofokusingde elektriksel alan kuvvetinin zonların keskinleşmesine katkıda bulunduğu gibi, kromatofokusingde de zonların keskinleşmesine yol açmaktadır. Oldukça yüksek bir oranda dallanma gösteren Polybuffer exchanger (PBE) jelleri ise iyi bir odaklama sağlamaktadırlar. Buna ilaveten, iyonik kuvvet ve bunun sonucu olarak da tampon

152



derişimi düşük olmalıdır. Düşük derişimli bir tampon aynı zamanda, şayet pH gradienti kolon içerisinde oluşturulacaksa, sığ bir pH gradientinin elde edilmesini sağlar. iv. Kolonun paketlenmesi: Kolonun paketlenmesi esnasında meydana gelen herhangi bir düzensizlik, çözünürlük üzerine bariz bir etki göstermektedir. Özellikle kromatofokusing tekniğinde ayrıştırılması yapılan moleküllerin oluşturduğu bantlar aşırı derecede dar olduğundan, kolonun paketlenmesinde meydana gelen hatalar, çözünürlük üzerinde çok daha belirgin olumsuz etkilere sahiptir. Bu nedenle, kolonun oldukça düzenli olarak paketlenmiş olması (bkz. kısım 3.5) ve başlangıç tamponu ile eşit bir şekilde dengelenmiş olması gerekmektedir. v. İyonlar: Normal olarak kullanılan değiştirilebilen-iyon olan Cl– dışında, diğer monovalent iyonlar da kullanılabilir. Fakat, seçilen bu anyonların pKa değerleri, pH gradientinin en düşük seviyesinin en az 2 pH birimi altında olması oldukça önemlidir. Bikarbonat iyonları ise pH gradientinde dalgalanmalara neden olmaktadır. Bu nedenle, kromatofokusingde kullanılacak olan tamponların hepsinin kullanılmadan önce gazı alınmalıdır. Koşullara bağlı olarak atmosferik CO2, pH 5,5-6,5 aralığında bir platoya neden olabilir. Bu etkiler ise gradientin pH 6 ile sonlandığı Polybuffer 96’da çok daha belirgin olduğundan, Polybuffer 96 ile birlikte yer-değiştirici iyon olarak asetatın kullanılmasından kaçınılmalıdır. Diğer yandan, asetatın pKa değerinin Polybuffer 74’ünkinden çok daha yüksek olması nedeni ile Polybuffer 74 ile birlikte yer-değiştirici iyon olarak asetatın kullanılması da önerilmemektedir. vi. Kolon uzunluğu: Kısa kolonlarla iyi bir sonuç elde edilebilmesine rağmen, aynı iç-çapa sahip olan daha uzun kolonlarla, çok daha yüksek çözünürlükte sonuçlar elde edilmektedir. Buna rağmen, oldukça uzun olan kolonların (50 cm’den daha uzun) kullanılması durumunda ise elüsyon zamanı oldukça uzun sürmektedir. Bu nedenle, 20-30 cm uzunluğundaki kolonların kullanılması çok daha uygun bulunmuştur. vii. Akış oranı: Teorik olarak, akış oranının çözünürlük üzerine bariz bir etkisinin olmaması gerekmektedir. Buna rağmen, pratikte ise akış oranının oldukça düşük olması durumunda, çözünürlükte bariz bir artmanın olduğu belirlenmiştir (Şekil 7.5). İlgilenilmekte olan proteinin elüsyonuna yakın bir zamana kadar daha yüksek bir akış oranı kullanılabilir. Daha sonra ise akış oranı yaklaşık olarak 10-kat düşürülerek, hedef proteinin elüsyonu sağlanabilir ve daha sonra, akış oranı tekrar ilk hızına ayarlanabilir.

Şekil 7.5: Standart bir protein karışımının iki farklı akış oranındaki elüsyonu. Ayrıştırma koşulları; jel: PBE 118; kolon: Pharmacia SR 10/50; kolon yatak yüksekliği: 30 cm; örnek: 5 mL elüsyon tamponu içinde sitokrom c (5 mg), ribonükleaz (8 mg) ve lentil lektin (10 mg); elüsyon: başlangıç tamponu olarak trietilamin-HCl (25 mM, pH 11); elüsyon tamponu olarak ise 0,0075 mmol/pH birimi/mL Pharmalyte pH 8-10,5, pH 8,0 olacak şekilde dengelenmiştir. Lineer akış oranı: (a) 15 cm s–1; (b) 117 cm s–1 (Anonymous, 2001b).



153

7.5. Deneysel Koşulların Dizaynı

İzoelektrik odaklama (IEF) gibi kromatofokusing de, çalışılan pH aralığında (pH 3-11) izoelektrik bir noktaya sahip olan ve suda-çözünebilen bütün amfoterik moleküllerin ayrıştırılması için uygun bir kromatografi tekniğidir. Bu nedenle kromatofokusing, proteinlerin ve peptidlerin ayrıştırılması için ideal bir kromatografi tekniğidir. Kromatofokusing deneylerinin doğru olarak planlanması, diğer kromatografik sistemlerin planlanmasına benzemektedir. Bir kromatofokusing deneyinin planlanmasında göz önünde bulundurulması gereken kritik noktalar ise takip eden altkısımlarda ele alınmaktadır. 7.5.1. Jel ve Tampon Seçimi

Kromatofokusing için her türlü anyon-değiştirici jeller ve tamponların yanı sıra, kromatofokusing için dizayn edilmiş olan Polybuffer ve Polybuffer exchanger (PBE) jelleri seçilebilir (bkz. Tablo 7.1). Şayet hedef proteinin izoelektrik noktası biliniyorsa, optimal bir çözünürlüğün elde edilebilmesi için pH gradientinin 1/3 ile 1/2’sinde hedef proteinin elüsyonu sağlanacak şekilde pH gradientinin aralığı seçilebilir. Şayet hedef proteinin izoelektrik noktası bilinmiyorsa, proteinin izoelektrik noktası izoelektrofokusing tekniği ile veya iyon-değiştirici kullanılarak (bkz. kısım 6.6.2.1) basit bir deneyle belirlenebilir. İzoelektrik noktası bilinmeyen bir örnek ile çalışıldığında ise proteinlerin çoğunun pI değerleri 7-4 aralığında olduğundan, pH gradientinin aralığı pH 7-4 olarak seçilebilir. Şayet hedef proteinin pI değeri 4’den küçükse, bu protein kolona bağlanmadan elüsyon sıvısı ile birlikte kolondan ayrılacağı için kolayca elde edilebilir. Diğer yandan, şayet hedef proteinin pI değeri 7’nin üzerinde ise bu protein kolon materyaline bağlanacağından dolayı, elüsyonu kolay olmayacaktır. Böyle bir durumda ise alternatif olarak Polybuffer 96 ve PBE 94 kullanılarak, pH gradientinin aralığı pH 9-4 olarak seçilebilir. Hedef proteinin pI değeri, kullanılan pH gradientinin üst limitinden büyük olduğu durumlarda yani, jele adsorblanarak pH gradienti ile kolondan elüsyonu gerçekleştirilemeyen proteinler ise bir tuz solüsyonu ile elüe edilmelidirler. Kolon ise başlangıç tamponu ile yeniden dengelenirken, örnekler yeni bir tampon ile dengelenmelidir. Bu nedenle, hedef proteinin pI değerinin önceden biliniyor olması, bu tip problemleri önlemektedir. 7.5.2. İyon-Değiştiricinin Miktarı

Kullanılacak olan jelin miktarı, örnek materyalinin miktarına, yapısına, kirleticilere ve arzu edilen çözünürlüğün derecesine bağlıdır. Kromatofokusing ile gerçekleştirilen ayrıştırma işlemlerinin çoğu için 200 mg protein içeren örnek materyali için 20-30 mL’lik kolon yatak hacmi yeterli olmaktadır. Burada şunun unutulmaması gerekmektedir ki çözünürlük, kullanılan örnek materyalinin fazla miktarda olmasına bağlıdır. Ayrıca, kullanılacak olan jelin tam miktarı, deneysel çalışmadan elde edilmek istenen çözünürlüğe de bağlı olacağından, gerekli olan jel miktarı ancak deneysel çalışma ile belirlenebilir. 7.5.3. Jelin Hazırlanması

İyon-değiştirici jeller, örnek materyalinin yüklenmesinden önce mutlaka başlangıç tamponu ile dengelenmelidir. Kromatofokusingde kullanılabilecek uygun başlangıç tamponlarının listesi ise Tablo 7.1’de verilmektedir. İyon-değiştirici materyaller ise kolona paketlenmeden önce dengelenebileceği gibi paketlendikten sonra, kolon içerisinde de dengelenebilirler. Kolon materyallerinin hazırlanması ve dengelenmesi ise kısım 6.7.3’de daha detaylı olarak ele alınmıştır. 7.5.4. Kolonun Paketlenmesi ve Kontrolü

Diğer kromatografi tekniklerinde de olduğu gibi kromatofokusingde de kolonun paketlenme aşaması oldukça önemlidir. Çünkü, kötü paketlenmiş bir kolon, hareketli fazın düzensiz olarak akışına, zon genişlemesine ve çözünürlüğün kaybolmasına yol açar. İyi bir kolon paketlemede

154



nelere dikkat edilmesi gerektiği (bkz. kısım 3.5) ve paketlenen bir kolonun kontrol edilmesi ise (bkz. kısım 3.6) daha önce detaylı olarak incelenmiştir. Buna rağmen, iyon-değiştirici jellerle paketlenmiş bir kolonun kontrol edilmesinde kullanılacak boyaların seçiminde çok dikkatli olunmalıdır. Çünkü, boyaların çoğu kuvvetli bir şekilde elektriksel yük taşıdıklarından, kolon materyaline sıkı bir şekilde bağlanabilirler. Bu nedenle, kolonların kontrol edilmesi için önerilebilecek en iyi işaret moleküllerinden birisi bovin sitokrom c’dir. Çünkü sitokrom c, renkli olmasının yanı sıra kolaylıkla temin edilebilmekte ve kuvvetli bazik (pI = 10,5) bir protein olduğundan, jel tarafından itilerek kolondan kolaylıkla elüe olmaktadır. 7.5.5. Örnek Materyalin Hazırlanması ve Yüklenmesi

Kromatografik sistemlerde örnek materyallerinin hazırlanmasında dikkat edilmesi gereken örnek materyalinin derişimi, kompozisyonu, hacmi ve viskozitesi gibi parametreler iyi bir kromatografinin gerçekleştirilmesi için oldukça önemlidir. Bütün kromatografik sistemler için oldukça önemli olan bu parametreler ise kısım 3.7’de detaylı olarak ele alınmaktadır. Bunun yanı sıra, örnek materyalinin içinde bulunan proteinlerin sayısına bağlı olarak değişkenlik gösterse de, yaklaşık olarak 10 mL jel için 100 mg proteinin yüklenmesi uygundur. Yüklenecek olan örnek materyalinin hacmi ise kritik bir önem arz etmediğinden, hedef proteinin kolondan elüsyonu gerçekleşmeden öncesine kadar örnek materyalinin hepsi yüklenmelidir (bkz. kısım 7.2.3). Buna rağmen, örnek materyalinin hacminin kolon yatak hacminin yarısını geçmemesi en iyisidir. Örnek materyali tuz içermemeli ve kolona yüklenmeden önce, ya başlangıç tamponu ile ya da elüsyon tamponu ile dengelenmelidir. Örnek materyalinin hacminin 10 mL’den fazla olması durumunda, örneğin düzenli bir tabaka şeklinde kolona yüklenmesini garantilemek için ise kolon yatağının üst kısmına, 1-2 cm yüksekliğinde Sephadex G-25 Coarse tabakasının ilave edilmesi önerilebilir. LPLC veya HPLC sistemlerinde kromatofokusing tekniğinin kullanılması durumunda, örnek materyalinin kolona yüklenmesi ile ilgili metotlar sırasıyla kısım 3.8 ve kısım 4.10’da detaylı olarak ele alınmaktadır. Kolona yüklenen örnek materyalinin elüsyon tipine ve kullanılan kolonun kapasitesine bağlı olarak, kolona yüklenecek olan örnek materyalinin miktarı da değişebileceği için, kullanılan örnek materyalinin hacmine uygun bir yükleme metodu seçilerek, örnek yükleme işlemi gerçekleştirilmelidir. Örneklerin kolona yüklenmesinden önce kolona 5 mL elüsyon tamponu gönderilmeli, sonra örnek yüklenmeli (başlangıç veya elüsyon tamponu içinde) ve daha sonra da tekrar elüsyon tamponu gönderilmelidir. Böylece, örnek materyali içinde bulunan proteinlerin uç noktadaki pH değerleri ile karşı karşıya kalması engellenmiş olur. 7.5.6. Elüsyon

Kromatofokusing tekniğinde elüsyon işlemi esnasında, pH gradientinin kolon içerisinde otomatik olarak oluşması nedeni ile özel bir gradient aparatının kullanılmasına gerek yoktur. pH gradientinin üst limiti, kolonu dengelemekte kullanılan başlangıç tamponu tarafından belirlenirken, alt limiti ise elüsyon tamponu tarafından belirlenmektedir. Önerilen tampon kompozisyonları ise Tablo 7.1’de verilmektedir. Gradientin hacmi ise elüsyon tamponunun kuvveti tarafından belirlenmektedir. Tablo 7.1’de önerilen ölçüler ise gradientin pH limitleri arasındaki fark 3 pH birimi aralığında olacak şekilde ve kolon yatak hacminin 10-misli bir gradient hacmini verecek şekilde tasarlanmıştır. Tablo 7.1’den görülebildiği gibi genellikle, kolon yatak hacminin 1,5-3,0’ü kadar bir ölü hacim bulunmaktadır. Bu ölü hacim, elüsyon sıvısının pH değerinin düşmeye başlamasından önce kolondan geçen sıvının hacmidir. Bu nedenle, pH gradientinin oluşturulması için gereken elüsyon tamponunun hacmi, yaklaşık olarak kolon yatak hacminin 12,5 katıdır. Polybuffer ise pH gradientinin alt ve üst limitleri arasındaki farkın 3 pH biriminden daha geniş olması durumunda ise uygun değildir.



155

i. Akış Oranı: Elüsyon için seçilecek olan akış oranı, arzu edilen çözünürlüğe bağlı olarak değişmektedir. PBE jelleri çapraz-bağlı yapıda olduklarından, basınca karşı oldukça dayanıklıdırlar ve oldukça iyi bir akış oranı sağlamaktadırlar. Akış oranının ayrıştırma üzerine olan etkisi ise Şekil 7.5’de görülmektedir. Şekil 7.5’den de görülebileceği gibi akış oranının artması, çözünürlüğün bir miktar bozulmasına yol açsa da hâlâ yeterince iyi bir çözünürlük elde edilebilmektedir. Bu nedenle akış oranının belirli bir ölçüye kadar artırılması, arzu edilen çözünürlük sağlandığı sürece mümkün görülmektedir. Yapılan deneysel çalışmalar sonucunda ise 30-40 mL s–1’lik lineer bir akış oranının mütemadiyen iyi bir çözünürlük sağladığı belirlenmiştir. ii. Dedeksiyon: Kolondan ayrılan elüsyon sıvısı içerisindeki proteinlerin belirlenmesi için sıvının 280 nm veya 254 nm’de taranması gerekmektedir. Polybuffer kullanılması durumunda ise bunların 254 nm’da hafif de olsa bir absorbans göstermeleri nedeni ile dikkatli olunmalı veya 254 nm’de tarama yapılmaktan kaçınılmalıdır. Elüsyon sıvısının protein içeriğinin taranmasına ilaveten, gradient oluşumunda bir anormalliğin olmadığından emin olmak için pH taraması da yapılmalıdır. iii. Rejenerasyon: Paketlenmiş ve kullanılmış olan bir kolon, yeniden paketlemeye gerek kalmadan birkaç defa kullanılabilir. Kolonun kullanılması esnasında kolon materyaline adsorbe olarak kolondan elüe olmayan proteinlerin kolondan uzaklaştırılması için kolon, kolon yatak hacminin 2-3 misli 1 M NaCl solüsyonu ile yıkanmalıdır. Kolon materyaline çok daha kuvvetli bağlanmış olan proteinler ise 100 mM HCl ile kolondan uzaklaştırılabilir. Şayet kolonun rejenerasyonu için HCl kullanılmış ise kolonun yıkanmasından sonra, en kısa zamanda kolon yeniden yüksek pH’ya dengelenmelidir. Daha sonra kolonun dengelenmesine başlangıç tamponu ile devam edilmeli ve bu işlem kolondan ayrılan sıvının başlangıç tamponu ile aynı olmasına kadar sürmelidir. 7.6. Polybuffer ve Amfolitlerin Proteinden Ayrıştırılması

Polybuffer ve amfolitler genellikle enzimatik reaksiyonları ve amino asit analizlerini etkilemez. Aynı zamanda, Coomassie Blue içeren metotlatla protein derişimlerinin belirlenmesini de etkilememektedirler fakat, bakır iyonları ile kompleks oluşturabildiklerinden protein derişimlerinin Lowry metodu ile belirlenmesi durumunda olumsuz etkileri bulunmaktadır. Protein fraksiyonları içerisindeki Polybuffer ve amfolitlerin uzaklaştırılması için ise birkaç metot kullanılabilmektedir: i. Çökeltme: Protein örnekleri içerisindeki Polybuffer ve amfolitlerin uzaklaştırılması için kullanılan yöntemlerden en kolayı amonyum sülfat ile çökeltmedir (bkz. kısım 1.7.1). Polybuffer ve amfolitlerin uzaklaştırılmak istendiği protein fraksiyonuna katı amonyum sülfat eklenerek (%80-100 satürasyon) protein moleküllerinin çökelmesini sağlamak amacı ile 1-2 saat süreyle bekletilir. Fraksiyon içerisindeki proteinler, kolondan kendi izoelektrik pH’larındaki elüsyon sıvısı içerisinde elüe olacaklarından, amonyum sülfat ile kolayca çökelti oluşturacaklardır. Çökelmiş olan proteinler ise santrifüj yöntemi ile toplandıktan sonra doygun amonyum sülfat çözeltisi ile birkaç defa yıkanır. Alternatif olarak, hedef proteini içeren fraksiyonlar bir diyaliz tüpüne aktarılarak, doymuş amonyum sülfat çözeltisine karşı diyalize tâbi tutulur. Amonyum sülfat ile çökeltme, hem fraksiyon içerisindeki proteinin yoğunlaştırılmasını, hem kararlılığını sağlaması hem de ucuz ve kolay bir metot olması nedeni ile avantajlıdır. ii. Jel Filtrasyonu: Protein fraksiyonları içerisindeki Polybuffer ve amfolitlerin uzaklaştırılması, Sephadex G-75 kullanılarak jel filtrasyon kromatografisi ile de başarılabilmektedir (bkz. kısım 5.8). Şayet fraksiyon hacimleri yeterince küçükse, önceden Sephadex ile paketlenmiş ve tek-kullanımlık olan tuz-giderici kolonlar kullanılabilir. Şayet hedef proteinin moleküler kütlesi 15 kDa’dan küçükse, kısa kolonlar ile bu proteinlerin Polybuffer ve amfolitlerden ayrıştırılmasında bazı güçlüklerle karşılaşılabilir.

156



iii. Hidrofobik interaksiyon kromatografisi: Octyl- veya Phenyl-Sepharose CL-4B kullanılarak, hidrofobik interaksiyon kromatografisi ile amonyum sülfat çökeltmesi birlikte kullanılabilir. Kromatofokusing uygulamasından elde edilen fraksiyonlara %80 düzeyinde doygunluk sağlayacak şekilde amonyum sülfat eklenerek, hidrofobik etkileşimlerin oluşması için ortam sağlanır. Bu uygulama, hedef proteinin çökelmesi ile sonuçlanabilir. Şayet böyle bir durumla karşılaşılırsa, çökelmiş olan protein santrifüjlenerek toplanabilir ve doymuş amonyum sülfat çözeltisi ile birkaç defa yıkanır.

Alternatif bir yöntem olarak, Phenyl-Sepharose CL-4B ile paketlenmiş ve %80 amonyum sülfat ile yıkanarak dengelenmiş olan kolona, amonyum sülfat eklenmiş olan örnek materyali yüklenebilir. Şayet bağlanma gerçekleşmez ise amonyum sülfat derişimi artırılmalı veya OctylSepharose CL-4B gibi çok daha hidrofobik bir jel denenmelidir. Örnek materyali içerisindeki 10 mg protein için yaklaşık olarak 1 mL jele gereksimin duyulmaktadır. Jel, kolon yatak hacminin 2-3 misli %80 doygunluktaki amonyum sülfat ile yıkanır ve daha sonra, düşük iyonik kuvvetteki uygun bir tampon ile elüsyon gerçekleştirilir. Şayet örnek materyali liyofilize edilecekse, amonyum asetat gibi buharlaşabilen uygun bir tampon kullanılmalıdır. Kolon materyaline kuvvetli bir şekilde bağlanmış olan moleküller ise etilen glikol gibi ajanlarla uzaklaştırılabilir. Hidrofobik interaksiyon kromatografisi ise daha detaylı olarak 9. Bölümde ele alınmaktadır. iv. Affinite Kromatografisi: Fraksiyonlar içinde bulunan proteinler, protein moleküllerinin biyolojik özelliklerinden yararlanılarak Polybuffer ve amfolitlerden kolayca ayrılabilirler. Bu metotta, hedef proteini özgül olarak adsorblayan fakat, Polybuffer ve amfolitlerin kolondan akıp gitmesini sağlayan biyoselektif adsorbent içeren kolonlar kullanılmaktadır. Affinite kromatografisi ise daha detaylı olarak 8. Bölümde ele alınmaktadır. 7.7. Denatüre Edici Ajanların Varlığında Kromatofokusing

Kromatofokusing tekniği ile proteinlerin ayrıştırılması ve saflaştırılması üre, DMSO, etilen glikol gibi denatüre edici ajanların ve Nonidet P-40 (NP-40) ve Triton X-100 gibi iyonik-olmayan deterjanların varlığında dahi gerçekleştirilebilmektedir. Kromatofokusing tekniğinin bu tipteki disosiasyon ajanlarının varlığında dahi başarılı bir şekilde kullanılabilmesi, bu ajanların örnek materyal içindeki moleküller ile büyük oranda etkileşim göstermelerine bağlıdır. Örneğin, protein moleküllerinin çözünürlüğünü sağlamak için deterjanlar kullanıldığında, kritik misellenme derişimine (CMC) yaklaşan bir derişimde, protein molekülleri arasında birlik oluşabilir. Oldukça hidrofobik olan protein molekülleri için disosiasyon ve çözünürlük ise beklendiği kadar başarılı olmayabilir. Bu ise odaklama etkisini alt-üst eden bir dizi moleküler kompleks oluşumu ile sonuçlanabilir. Daha da önemlisi, bazı moleküller deterjan ile oldukça fazla miktarda sarılarak, kromatofokusing için gerekli olan elektriksel yüke bağlı etkileşimlerin etkili bir şekilde gerçekleşmesini engelleyebilir. Bu nedenle, örnek materyal içinde bulunan protein moleküllerine bağlı olarak, kullanılacak olan deterjanların derişimleri hakkında çok dikkatli olmak gerekmektedir. 7.8. Odaklama Kromatografisi Uygulamaları

Kromatofokusing tekniği, ayrıştırılmalarında oldukça fazla zorluklarla karşılaşılan βasetilheksozaminidaz izoenzimlerinin, fosfolipid transferaz enzimlerinin, fare ve insan αfoetoproteinlerinin, diğer serum proteinlerinin ve fare karaciğer histamin-N-metil transferaz enziminin (Şekil 7.6) saflaştırılmasında başarı ile kullanılmıştır. Kromatofokusing tekniği ile elde edilen çözünürlük, bazı ayrıştırma işlemlerinde preparatif izoelektrik odaklama (IEF) tekniğinin sunduğu çözünürlük kadar iyi olmaktadır. Bazı durumlarda ise diğer fizikokimyasal metotlarla ayrıştırılmaları başarılamayan proteinlerin ayrıştırılmalarının gerçekleştirilmesini sağlamaktadır.



157

Şekil 7.6: Fare karaciğer histamin-N-metil transferaz enziminin kromatofokusing elüsyon profili. Kısmi olarak saflaştırılmış olan protein (yaklaşık 130 mg protein) 5 mL Polybuffer 74, pH 3,5 içerisinde, önceden 25 mM pierazin-HCl, pH 5,5 ile dengelenmiş olan PBE 94 kolonuna (26 x 1,6 cm) yüklenmiştir. Proteinin elüsyonu ise –1 20 mL s akış oranı ile gerçekleştirilmiştir. 5 mL’lik hacimlerde toplanan fraksiyonlar ise pH (), histamin-Nmetil transferaz aktivitesi (z) ve Coommasie Brilliant Blue ile reaksiyonundan sonra 600 nm’deki absorbansları (o) için test edilmiştir (Wilson ve Walker, 1995).

Yapılan çalışmalar ise miyoglobin, karbonik anhidraz ve albümin gibi bilinen proteinlerden oluşan model karışımların, kromatofokusing tekniği ile çok iyi ayrıştırıldıklarını göstermiştir. Bunun yanı sıra, hemoglobin moleküllerinin genetiksel olarak değişikliğe uğraması sonucu görülen orak hücre anemili hastaların karboksihemoglobinlerinin oldukça dar bir pH aralığında (pH 8-7) fraksiyonlanabilmesi nedeni ile kromatofokusing, genetiksel bozukluklar nedeni ile hemoglobinlerde meydana gelen değişikliklerin çalışılması için çok uygundur. Örneğin, memeli kas hücrelerinin ekstraksiyonundan elde edilen ve oldukça kompleks olan protein karışımlarının diğer kromatografik yöntemlerle tek bir basamakta ayrıştırılmasını gerçekleştirmek zordur. Buna rağmen, bu tip örneklerin ayrıştırılması kromatofokusing tekniği ile tek bir adımda gerçekleştirilebilmektedir. Kompleks protein karışımlarının kromatofokusing yöntemi ile ayrıştırılması sonucunda oldukça iyi bir çözünürlük elde edilebilmesine rağmen, ayrıştırılması yapılacak olan moleküllerin diğer özelliklerinin kullanıldığı jel filtrasyonu veya affinite kromatografisi gibi diğer kromatografik tekniklerle kromatofokusingin tekniğinin kombinasyonu durumunda, çok daha iyi çözünürlükler sağlanabilmektedir. Kromatofokusing yönteminin çözünürlük gücünün oldukça yüksek olması, bu yöntemin diğer kromatografik yöntemlerle birlikte kullanılması durumunda, ayrıştırma protokolünün ya ortasında ya da sonunda kullanılmasının daha uygun olacağı anlamına gelmektedir.

158



8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ (AC)

8.1. Giriş

Affinite kromatografisi (Affinity Chromatography; AC) ile saflaştırma, diğer kromatografi tekniklerinin çoğunda, elektroforezde ve santrifüj tekniklerinde olduğu gibi ayrıştırılacak olan moleküllerin fiziksel özelliklerine dayanmaması nedeniyle, bu tekniklere benzemez. Bu tekniklerin aksine affinite kromatografisinde, saflaştırılacak olan biyomoleküllerin biyolojik fonksiyonlarından veya kendilerine özgü kimyasal yapılarından yararlanılmaktadır. Bunun bir sonucu olarak da affinite kromatografisi teoride, kompleks biyolojik karışımlardan dahi tek bir işlemle, homojen saflıktaki materyallerin elde edilmesini sağlama özelliğindedir. Bu nedenle affinite kromatografisi, biyomoleküllerin saflaştırılmasında eşsiz bir konuma sahiptir. Affinite kromatografi tekniğinin kullanılmasına yaklaşık olarak 40 yıl kadar önce başlanmış olmasına rağmen, bu saflaştırma tekniği günümüzde birçok laboratuvarda biyolojik materyallerin ayrıştırılmasında rutin bir prosedür olarak kullanılmaktadır. Affinite kromatografisinin oldukça farklı olan biyomolekülleri ayrıştırmak için geliştirilmiş olan adaptasyonları ise bu tekniğin, diğer teknikler ile ayrıştırılması oldukça zaman israfına neden olan ve ayrıştırılması güç, hatta mümkün olmayan materyalleri ayrıştırmada ne kadar başarılı olduğunun da bir göstergesidir. Affinite kromatografisi, adsorbsiyon kromatografisinin bir tipidir. Bu teknikte, ayrıştırılacak olan biyomolekül, kolon materyaline (matriks) kovalent olarak bağlanarak tutuklanmış (immobilize edilmiş) bir bağlama materyaline (ligand) komplamenter olarak, özgül ve geri–dönüşümlü bir şekilde adsorbe edilmektedir. Saflaştırma ise genellikle tek bir adımda birkaç bin–kat artırılmakta ve saflaştırılmak istenen molekülün geri-kazanımı ise oldukça yüksek verimlilikte olmaktadır. Affinite kromatografisi aynı zamanda, çok fazla hacimlerdeki örneklerin kolona yüklenmesine izin vermesi nedeni ile yoğunlaştırma etkisi de göstermektedir. Affinite kromatografi tekniğinde ayrıştırma işleminin oldukça özgül olarak gerçekleşmesi, ayrıştırma işleminde etkileşim gösteren moleküllerin doğal özgüllüğünden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle affinite kromatografisi, kompleks biyolojik karışımlardan biyomoleküllerin saflaştırılmasını sağladığı gibi, aynı moleküllerin doğal ve denatüre olmuş karışımlarını içeren örneklerden, doğal yapıdaki moleküllerin ayrıştırılmasını da sağlamaktadır. Aynı zamanda affinite kromatografisi, çok az miktardaki biyolojik materyalleri, fazla miktardaki kirletici materyallerden ayrıştırmakta da kullanılmaktadır. Affinite kromatografisinin ilk uygulaması, 1971 yılında, amilazın seçici olarak çözünmeyen (insolubil) nişastaya adsorbsiyonu ile olmuştur. Fakat o yıllarda, kullanışlı bir matriksin sentezine ve bu matrikse ligandın kovalent olarak bağlanmasına izin veren kompleks organik kimya tekniklerinin geliştirilememiş olması, affinite kromatografisinin biyoloji laboratuvarlarında kullanılmasını uzun bir süre geciktirmiştir. 1967 Yılında ise Axen, Porath ve Ernback tarafından yayınlanan bir makalede, birincil amino grubu içeren moleküllerin, siyanojen bromid (BrCN) ile polisakkarit matrikslere bağlandığı rapor edilmiştir. Bu rapor, günümüzde rutin olarak kullanılan affinite kromatografisinin

160



başlangıcını temsil etmektedir ve BrCN aktivasyonu ile ligandların matrikse bağlanması, günümüzde de en yaygın metot olarak hâlâ kullanılmaktadır. Başlangıçta enzimlerin saflaştırılması için geliştirilmiş olan affinite kromatografisi, daha sonraları antikorların, antijenlerin, nükleotidlerin, nükleik asitlerin, DNA–bağlayıcı proteinlerin, immünoglobilinlerin, membran reseptörlerinin ve hatta hücrelerin ve hücre fragmentlerinin saflaştırılmasında kullanılmaya başlanmıştır. 8.2. Affinite Kromatogarfisinin Temel Prensipleri

Affinite kromatografisinin prensibi Şekil 8.1’de gösterilmektedir. Başarılı bir ayrıştırmanın sağlanabilmesi, biyoözgül bir ligandın (L) varlığına ve bu ligandın kolon materyaline (matriks) kovalent olarak bağlanmasına bağlıdır. Aynı zamanda, kolan materyaline kovalent olarak bağlanmış olan (tutuklu) ligandın, ayrıştırılacak olan biyomolekül (S) ile bağlanma affinitesinin korunması, kolonda tutunmayan kirleticilerin yıkanarak kolondan uzaklaştırılmasından sonra, liganda bağlanmış olan molekülün liganddan aktif formda ayrılmasını özgül olarak sağlayan bir metodun bulunması da oldukça önemlidir. Affinite kromatografisinin yaygın olarak kullanıldığı biyolojik materyaller ve bunların ligandları ise Tablo 8.1’de verilmektedir.

Şekil 8.1: Affinite kromatografisinin prensibi. L, ligand; S, biyomolekül; M, matriks.

Tablo 8.1: Affinite kromatografisinin yaygın olarak kullanıldığı biyomoleküller ve bunların ligandları. Ayrıştırılacak molekül

Ligand

Enzim

Substrat analoğu, inhibitör, kofaktör

Antikor

Antijen, virüs, hücre

Lektin

Polisakkarit, glikoprotein, hücre yüzey reseptörü, hücre

Nükleik asit

Komplementer baz dizilimi, histonlar, nükleik asit polimeraz, bağlama proteini

Hormon, vitamin

Reseptör, taşıyıcı protein

Hücre

Hücre yüzeyi özgül protein, lektin

8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ


161

Doğru deneysel koşullar altında, saflaştırılacak olan özgül biyomolekülü içeren kompleks karışım, genellikle sıradan bir kromatografi kolonuna paketlenmiş olan ve tutuklu ligand içeren kolon materyalinin üzerine eklendiğinde, sadece ligand için özgül olan biyomoleküller ligand ile bağlanacaktır. Dolayısıyla, ligand ile bağlanmayan bütün diğer bileşikler, hareketli faz ile kolondan yıkanarak ayrılacaktır. Liganda bağlanan özgül biyomolekül ise daha sonra özel şartların uygulanması ile ligandan ayrılır ve elüsyon sıvısı ile kolondan ayrılan bileşik toplanır (Şekil 8.2).

Şekil 8.2: Affinite kromatografisi ile bir enzimin saflaştırılmasının diyagramatik olarak gösterilmesi.

Metodun planlandığı gibi başarılı bir şekilde yapılabilmesi için, saflaştırılacak olan biyomolekülün yapısının ve biyolojik özelliklerinin ayrıntılı bir biçimde önceden bilinmesi gerekir. Saflaştırılacak olan biyomolekülün bir enzim olması durumunda ligand, bu enzimin bir substratı, geri-dönüşümlü olarak enzime bağlanan bir inhibitör veya allosterik aktivatör olabilir. Seçilen koşullar, normal olarak enzim–ligand bağlanmasının optimal olduğu koşullar olmalıdır. Metodun başarısı, enzim–ligand kompleksinin geri dönüşümlü olarak oluşumuna ve k+1 ve k–1 sabitlerinin birinci dereceden oranlarının sayısal değerlerine bağlı olduğundan enzim, sürekli olarak bir kolon materyaline kovalent olarak bağlı, çözünmeyen ligand üzerine eklendiğinde, enzim molekülleri bağlanmaya teşvik edilir ve kompleksin derişimi ve bağlanma artışının gücü ile dinamik bir durum gelişir. Örnek materyalinin kolona eklenmesi sırasında etkinlikteki daimi artıştan dolayı, kolon prosedürleri kesikli–tip metotlardan daima daha başarılıdır. Yine de affinite kromatografisinin uygulanmasına yönelik alternatif formlar geliştirilmiştir ve bu alternatif formlar, özellikle büyükölçekli çalışmalar için uygundurlar. Bu alternatif formaların içeriği ise aşağıdaki şekilde özetlenebilir: i. Affinite çökeltmesi: Ligand, daha sonra (örneğin, bir pH değişikliği ile) çöktürülebilecek, çözünebilir bir taşıyıcıya bağlanır. ii. Affinite ayrıştırması: Ligand, suda çözünebilen ve ligandın bağlanmasıyla tercihen saf sıvı fazla denge durumunda olan sıvı polimer faza ayrışan (PEG gibi) bir polimere bağlıdır.

Bütün durumlarda, etkin bir kromatografi için kompleksin birleşme sabitinin (Ka) 10–4–10–8 M aralığında olması gerekir.

162



8.3. Materyaller 8.3.1. Matriks Materyalleri

Her türlü kromatografik uygulamada, uygun matriksin seçimi en önemli adımı oluşturmaktadır. Affinite kromatografisi için ideal bir matriksin aşağıdaki karakteristik özelliklere sahip olması zorunludur: i. İnert: Ligandın kovalent olarak bağlanabileceği uygun ve yeterli kimyasal grupları içermelidir, fakat matriksin kendisi saflaştırma reaksiyonlarına katkıda bulunmamalıdır. ii. Kimyasal kararlılık: Saflaştırılacak olan makromolekülün liganda bağlanması ve daha sonra bu molekülün kolondan elüsyonu sırasında kullanılan çözücülere karşı kararlı olmalıdır. Ayrıca, ligandın matrikse bağlandığı koşullar altında da kararlı olmalıdır. iii. Hidrofilik: Özgül-olmayan etkileşimleri en aza indirgeyebilmek için diğer moleküllerle etkileşimi çok zayıf olmalıdır. iv. Gözenek yapısı: Matriksin bütün bölgeleri, örnek materyal içerisindeki moleküllerin çoğu için kullanışlı olmalıdır. Bazı matriksler sadece dış yüzeylerine bağlanmaya izin vermektedirler. Bu nedenle bu tipteki matriksler, büyük moleküller ve hücrelerin ayrıştırılmasında kullanışlıdırlar. İyi akış özellikleri sergilemelidir. v. Sertlik: Matriks, paketleme, elüsyon ve yıkama esnasındaki çözücünün akış basıncına karşı dayanıklı olmalıdır.

Pratikte uniform, küresel ve sert partiküller kullanılmaktadır. Matrikslerin en yaygın olanları ise çapraz-bağlı dekstranlar (Sephacryl S), agaroz (Sepharose, Bio–Gel A), poliakrilamid jeller (Bio–Gel P), polistiren (Bio–Beads S), selüloz, porlu cam ve silikadır. 8.3.2. Ligand Seçimi ve Ayırıcı–Kol

Affinite kromatografisi için seçilecek olan ligandın yapısı, iki faktör tarafından belirlenir. Bunlardan birincisi, ligand, ayrıştırılacak olan makromolekül için özgül ve geri–dönüşümlü olarak bağlama affinitesine sahip olmalıdır. İkincisi ise ligandın, makromolekülü bağlama kapasitesinde bir değişiklik oluşturmadan, matrikse bağlanmasını sağlayacak kimyasal olarak modifiye edilebilir gruplar içermelidir. Buna göre ligandın kimyasal yapısı, saflaştırılacak olan molekülün biyolojik özgüllüğünün önceden bilinmesi ile belirlenir. Pratikte, özel bir bileşiğe karşı tam bir özgüllük gösteren çok özel bir ligandın seçimi, genellikle mümkündür. Alternatif olarak, benzer kimyasal yapıya sahip, birbirleri ile çok yakın ilişkili olan bir grup bileşiği bağlayacak grup seçiciliği gösteren bir ligandın seçimi de mümkündür (Tablo 8.2). Son bahsedilen ligand tipine örnek olarak 5’AMP verilebilir. Bu molekül, birçok NAD+–bağımlı dehidrogenazı geri-dönüşümlü olarak bağlayabilir. Çünkü bu dehidrogenazlar NAD+ molekülünün bir parçasına yapısal olarak benzerdirler. Grup– özgüllüğü gösteren ligandların affinite kromatografisindeki kullanımları ise kısım 8.7’de daha detaylı olarak ele alınmaktadır. Ligand–makromolekül kompleksinin ayrılma (dissosiasyon) sabiti (KD) ise serbest solüsyonlarda 10–4–10–8 M arasında olmalıdır. Kompleksin ayrılma sabitinde rol alan etkileşimlerin değeri, örneğin bir enzim ve bu enzimin zayıf inhibitörü arasındaki bağlama reaksiyonunda olduğu gibi, 10–4 M’dan büyük ise (10-2 M gibi) başarılı bir affinite kromatografisi için bu ligand, oldukça zayıftır. Bunun aksine, şayet kompleksin ayrılma sabitinde rol alan etkileşimlerin değeri, örneğin bir hormon ve bu hormonun reseptörü arasındaki bağlama reaksiyonunda olduğu gibi, 10–8 M’dan küçük ise (10-9 M gibi) liganda bağlanmış olan hormonun, inaktive edilmeden kolondan başarılı bir şekilde elüsyonu, oldukça zordur. Kompleksin ayrılma sabitleri bu değerlerin dışında olduğu zaman, başarılı bir affinite kromatografisinin yapılabilmesi için geliştirilmiş olan metotlar ise ilgili



163

kısımlarda yeri geldikçe verilmektedir. Şayet, bağlama kompleksinin gücü hakkında önceden herhangi bir bilgi yoksa, bu durumda deneme–yanılma yolu ile en ideal kromatografi koşulları belirlenebilir. Tablo 8.2: Affinite kromatografisinde sıklıkla kullanılan grup–özgüllüğü gösteren ligandlar. Ligand

Affinite +

5’ AMP

Kofaktör olarak NAD içeren enzimler ve ATP–bağımlı kinazlar

2’,5’ ADP

Kofaktör olarak NADP+ içeren enzimler

NAD, NADP

Dehidrogenazlar

Kalmodulin

Kalmodulin–bağlama kinazları, fosfodiesterazlar, siklik ve diğer enzimler

Avidin

Biyotin–içeren enzimler

Yağ asitleri

Yağ asidi–bağlama proteinleri

Heparin

Lipoproteinler, lipazlar, koagülasyon faktörleri, DNA polimerazlar ve restriksiyon endonükleazlar, steroid reseptör proteinler, çok sayıdaki büyüme faktörleri

Protein A ve G

İmmünoglobulinler

Konkanavalin A

Terminal olarak α–D–mannopiranozil ve α–D–glukopiranozil içeren glikoprotein kalıntıları

Soya lektini

Glikoprotein içeren N–asetil–α–(veya β)– D–galaktopiranozil kalıntıları

Fenilboronat

Glikoproteinler

Poli–A

Poli–U dizilimi içeren RNA molekülleri, bazı RNA özgül proteinler

Poli-U

Poli–A dizilimi içeren RNA molekülleri, bazı RNA özgül proteinler

Histonlar

DNA molekülleri

Lizin

r–RNA, plazminojen, çift–zincirli DNA

Arjinin

Proteazlar ve prothrombin, prekallikrein ve clostripaini de içeren zimojenler

Benzamidin

Tripsin, ürokinaz, kallikrein ve prekallikreini de içeren proteazlar

Buğday germ lektini

N–asetil–D–glukozamin

Polimiksin

Endotoksinler

Blue B

Kinazlar, dehidrogenazlar, nükleik asit bağlama proteinleri

Cibacron Blue F3G–A

Nukleotid kofaktöre sahip olan enzimler, koagülasyon faktörleri, serum albumin

Biyomoleküllerin aktif bölgeleri ise genellikle molekülün üç–boyutlu yapısı göz önüne alındığında, molekülün iç kısımlarında yer almaktadır. Bu nedenle, enzim kofaktörleri gibi küçük ligandların doğrudan doğruya matriksin yüzeyine bağlanması, matriks ile liganda bağlanacak olan makromolekül arasındaki yapısal (sterik) engellemeden dolayı düşük verimlilikle sonuçlanmaktadır. Böyle durumlarda ise ligandın matrikse bağlanması esnasında, ligandın makromolekülü bağlama yeteneğinde bir değişikliğin olmaması için, genellikle ligand ile matriks arasına bir ayırıcı–kol koymak avantajlıdır. Böylece, ligandın matriks yüzeyinden uzaklaştırılması sağlanarak, ligand ile makromolekülün etkili bir şekilde bağlanması garantilenmiş olur (Şekil 8.3). Bu ayırıcı–kolların uzunlukları ise oldukça önemlidir. Şayet ayırıcı–kolun uzunluğu çok kısa ise, bu durumda ayırıcı–kol etkisiz olacağından ligand, örnek içerisindeki özgül makromolekülünü bağlayamayacaktır. Şayet ayırıcı–kolun uzunluğu çok fazla ise, ligand ile makromoleküller arasında özgül-olmayan etkileşimler meydana gelmekte ve ayrıştırmanın seçiciliğini düşürmektedir. O’Carra ve arkadaşları (1973), çok uzun ayırıcı–kolların örnek içindeki makromolekülleri hidrofobik etkileşimler ile bağladıklarını göstermişlerdir. Affinite kromatografisinde ise özgül-olmayan

164



hidrofobik etkileşimler istenmeyen bir durumdur. Bunun yanı sıra, tutuklu hidrofobik gruplar ile proteinlerin üzerindeki hidrofobik bölgeler arasındaki etkileşim, bu proteinlerin hidrofobisitelerindeki farklılıklardan yararlanılarak ayrıştırılmasını sağlayan hidrofobik interaksiyon kromatografisinin temelini oluşturmaktadır (bkz. 9. Bölüm). Ayırıcı–kolların boyları için optimum uzunluk ise 6–10 C atomu veya bunun eşdeğerinde bir mesafedir.

Şekil 8.3: Ayırıcı–kolların prensibi. (a) Ligand, doğrudan doğruya matrikse bağlanmıştır. (b) Ligand, bir ayırıcı–kol aracılığı ile matrikse bağlanmıştır.

Bazı durumlarda bu ayırıcı–kolun kimyasal yapısı, saflaştırma işleminin başarısı için kritik öneme sahiptir. Bazı ayırıcı–kollar tamamen hidrofobiktir ve çok yaygın olarak da metilen gruplarından ibarettirler; diğerleri ise hidrofiliktir ve karbonil veya imido gruplarına sahiptirler. Sonuç olarak ayırıcı–kollar, küçük tutuklu ligandlar için çok daha önemlidir, fakat saflaştırılacak olan makromolekülü bağlama bölgeleri matriksten iyi bir şekilde uzaklaştırılabilen makromoleküler ligandlar için (örneğin, immünoaffinite kromatografisinde) gerekli değillerdir. Çok sayıda farklı ayırıcı–kollar kullanılmaktadır. Sıklıkla kullanılmakta olan ayırıcı–kollara verilebilecek bazı örnekler ise 1,6–diaminohekzan, 6–aminohekzanoik asit ve 1,4–bis–(2,3– epoksipropoksi)bütan’dır. Bu ayırıcı–kollar, ligandın bağlanabileceği ikinci bir fonksiyonel gruba sahip olmak zorundadırlar. Bu ikinci fonksiyonel gruba ligandın bağlanması ise genellikle, süksinik anhidrit ve suda çözünebilen karbodiimidin kullanımını gerektiren, organosentetik prosedürlerle gerçekleştirilir. Birçok agaroz, dekstran ve poliakrilamid tipteki destek materyali, acil kullanımlar için çeşitli ayırıcı–kollar ve ligandlarla önceden bağlanmış hazır şekilde, ticari olarak bulunabilir. Ligandların örnekleri ise Tablo 8.2’de verilmektedir. 8.3.3. Ligandın Matrikse Bağlanması

Ligandın, makromolekülle (antijen) geri-dönüşümlü olarak bağlanmasında rol almayan fakat, ligandı matrikse kovalent olarak bağlamada kullanılabilecek uygun kimyasal grupların en yaygın olanları ise –NH2, –COOH, –SH ve –OH (fenolik ve alkolik) gruplarıdır. Örneğin, amin (–NH2) grubu içeren bir enzim inhibitörü (ligand), bu amin grubu aracılığı ile matrikse tutturulduğunda, enzim ile özgül olarak bağlanabilme aktivitesini korur. Bunun yanı sıra, şayet inhibitörün yapısındaki amin grubu, bu inhibitörün enzimi ile bağlanma reaksiyonunda rol alıyorsa, inhibitörün matrikse tutturulması, enzim ile bağlanma reaksiyonunda rol almayan başka bir grup aracılığı ile gerçekleştirilir. Ligandın matrikse tutturulmasında kullanılabilecek gruplar hakkında herhangi bir bilginin olmadığı durumlarda ise sistematik deneme–yanılma yolları kullanılabilir. Ligandın matrikse bağlanmasında kullanılan en yaygın metot, matriksin önceden siyanojen bromid (BrCN) ile muamelesini gerektirir (Şekil 8.4,a). Reaksiyon koşulları ve ayıraçların göreceli oranları, her matriks molekülüne bağlanabilecek ligand molekülünün sayısını belirler. Alternatif ligand bağlama prosedürleri ise epoksilerin, N–hidroksisüksinimid esterlerinin, N,N’– karbonildiimidazolün (CDI), sülfonil kloridin, sodyum periodatın ve diklorotriazinlerin kullanımını



165

gerektirir (Şekil 8.4). Bu bağlama ayıraçları kullanılarak, önceden aktive edilmiş birçok matriksi ticari olarak bulmak mümkündür. Siyanojen bromid ile matriksin reaksiyonu, reaktif bir matriksin oluşumuyla sonuçlanır (Şekil 8.4,b). Bu reaktif matrikse ise ılımlı reaksiyon koşulları altında proteinler, nükleik asidler veya diğer polimerler, birincil amino grupları veya benzer nükleofilik grupları aracılığı ile ligand olarak (L) bağlanabilirler (Şekil 8.4,c). Siyanojen bromid, matriks üzerindeki OH grupları ile reaksiyona girer. Siyanojen bromid ile aktive edilmiş matrikslerde baskın aktif gruplar ise siyanat ester gruplarıdır. Aktive edilmiş siyanat ester grupları ise protein ve nükleik asit gibi ligandların (L) birincil amino grupları ile reaksiyona girerek izoüre bağlantısını oluşturur (Şekil 8.4,c). Örneğin, BrCN ile aktive edilmiş Sepharose 4B’ye insan hemoglobini bağlanarak, anti–hemoglobin antikorları fraksiyonlanmıştır. Bu fraksiyonlama prosesinde ise elüsyon, azalan pH ve artan asetik asit gradienti ile gerçekleştirilmiştir. (a)

M

(b)

OH + BrCN

M

O C N

M

O CH2 CH

(c)

+ NH2

M

O C NH

M

O CH2 CH CH2 NH-L

L

Siyanojen bromid

M

OH + H3C CH

CH2

CH2 O

OH

Epoksi O Cl

M

N

OH +

M

N

O

M

N

N

R N Cl Diklorotriazin

M

Cl

N

O

M

R

M

O SO2CH2CF3

O NH-L O

O

M

OH

HOOC

N

N

M M

O

C

N

N

R

OH + ClSO2CH2CF3 Tresilklorid

NH-L

N

N

N

M

M

O

C

NH-L

Karbonildiamidazol Matriksteki + fonksiyonel OH grupları

Aktivatör ajanları

Aktif Matriks (reaktif gruplar + içermektedir)

L-NH2

Tutuklu ligand (L)

Şekil 8.4: Affinite kromatografisinde ligandların (L) tutuklanması için kullanılan aktivasyon reaksiyonlarının bazı örnekleri.

Ligandın aktive matrikse bağlanması sırasında, ligandın sterik etkileri kadar ayırıcı-kolun özelliklerini de göz önünde bulundurmak gerekmektedir. Ligandın küçük bir molekül olması durumunda, yüksek derişimlerde ligand kullanımı, matriks üzerindeki bazı aktif bölgelerin bloke edilmesine ve bunun sonucunda da bağlama verimliliğinin düşük olmasına yol açar. Aynı şekilde ligandın büyük bir molekülden oluşması durumunda ise ligand, çevresindeki aktif bölgeleri bloke ederek yine bağlama verimliliğinin düşük olmasına yol açar. Ayırıcı-kol ve ligand ise ayırıcı-kolun gereğinden uzun olması durumunda, ileri-geri dalgalanarak yine matriks üzerindeki bazı aktif bölgelerin bloke edilmesine yol açabilir. Bu nedenle genel bir kural olarak, aktif matrikse bağlanacak olan ligandın miktarının matrikse oranı: 10 mg ligand/1 mL jel olmalıdır. Bu oran aynı zamanda, moleküler kütlesi ortalama 50 kDa olan proteinler için de uygulanabilir. IgG (5 mg mL–1)

166



ve IgM (1 mg mL–1) gibi daha büyük moleküller veya düşük ayrılma sabitine (KD) sahip olan moleküller için ise daha düşük miktarlar uygulanabilir. Ligand ve aktive matriks karıştırıldıktan sonra karışım, çalkalanarak karıştırılmalıdır. Karıştırma işleminde, manyetik karıştırıcıların kullanılmasından ise matriks yapısının bozulmasına yol açması nedeni ile kaçınılmalıdır. Verimli bir bağlama işleminin gerçekleştirilebilmesi için karışımı oluşturan bağlama tamponu (ligandı içermektedir) ile aktive matriksin oranı, yaklaşık 2:1 olmalıdır. Bu prosesler boyunca karışımın pH’sı, iyonik kuvveti ve iyon içeriği ise dikkatli bir şekilde kontrol edilmelidir. Bağlama reaksiyonu ise genellikle oda sıcaklığında 2-4 saatte, soğukta (4 °C) ise 16 saatte gerçekleştirilmektedir. Bağlama işleminin gerçekleştirileceği sıcaklık ve zaman ise ligandın çözünürlüğü ve işlem için sahip olunan zaman tarafından belirlenmektedir. Ligandın bağlanmasında optimum sonucun elde edilebilmesi için kullanılacak olan aktive matriksin yapısına bağlı olarak, üretici firmanın talimatları da kesinlikle göz önünde bulundurulmalıdır. Ligandın matrise bağlanması tek bir noktadan olabileceği gibi birden fazla noktadan da olabilir. Tek bir noktadan bağlanan liganda örnek olarak, ligandda bulunan tek bir primer aninin siyanojen bromid aracılığı ile matrikse bağlanması verilebilir. Bu tipteki bir bağlama, liganda en iyi esnekliği sağlamakta ve bu esneklik sayesinde ise ligand, antijenin aktif bölgesine en iyi şekilde ulaşabilmektedir. Tek noktadan bağlama ise sadece, ligand üzerinde bulunan ikincil ve üçüncül aminlerin bloke edilmesi sonucunda sağlanabilmektedir. Çoklu-noktadan bağlama ise tek noktadan bağlamaya göre daha kuvvetlidir ve bu nedenle, kolonun kullanılması esnasında ligandın kolondan akması çok daha az bir ihtimaldir. Buna rağmen, çoklu-noktadan bağlama, genellikle ligandın aktif bölgelerinin bloke olmasına yol açmaktadır. 8.3.4. Reaksiyona Girmeyen Reaktif Grupların Bloke Edilesi

Ligandın matriks ile inkübasyonundan sonra, ligandın fazlası uzaklaştırılır ve aktive matriksin reaksiyona girmeyen reaktif bölgeleri bloke edilir. Ligandın matrikse bağlanması sırasında matriksin reaktif bölgelerinin bazısı reaksiyona girmeden kalır. Reaksiyona girmeyen bu reaktif bölgeler ise örnek materyali içerisindeki hedef moleküller veya kirleticiler için özgül-olmayan potansiyel etkileşim bölgelerini oluştururlar. Bu nedenle, matriks üzerindeki reaksiyona girmeyen reaktif bölgelerin bloke edilmesi gerekmektedir. Bu bölgelerin bloke edilmesi ise en kolay yoldan, ya reaktif bölgelerin elektriksel yükünün aksi bir yüke sahip olan bileşiğin kullanılması ile ya da matrikse kovalent olarak bağlanması ile başarılabilir. Örneğin, bir ligandın aktive matrikse bağlanması için matriksin karboksil grubu (–COO–) ile ligandın amin grubundan (–NH2) yararlanılıyorsa, reaksiyona girmemiş olan reaktif bölgelerin bloke edilmesi Tris veya etanolamin solüsyonu (0,1–1 M) ile gerçekleştirilebilir. Aktive matrikse ligandın bağlanmasında matriksin amin grubundan (–NH2), ligandın ise karboksil grubundan (–COO–) yaralanılıyorsa, bu durumda reaksiyona girmemiş olan reaktif bölgelerin bloke edilmesi için ise asetik asit kullanılabilir. Aktive matriksin reaksiyona girmemiş olan reaktif bölgelerini bloke etmek için kullanılan bileşiğin derişimi, matriks üzerinde bulunan reaktif bölgelerin derişiminden fazla olmalıdır. Bu amaçla, genellikle ligand derişiminin 5-10 misli bir derişimin kullanılması yeterli olmaktadır. Bu sayede matriks üzerindeki reaksiyona girmemiş olan reaktif bölgelerin tamamının bloke edilmesi garantilenmiş olur. Affinite kromatografisi ile iyi bir saflaştırmanın sağlanabilmesi için reaktif bölgeleri bloke etmekte kullanılan solüsyonun pH’sının kontrolü de kritik bir öneme sahiptir. Çok yüksek ya da çok düşük bir pH değeri, reaktif bölgelerin bloke edilmesini önleyebilir veya matriksin, hatta matrikse bağlanmış olan ligandın dahi yapısını bozabilir. Reaktif bölgelerin bloke edilmesi genellikle oda sıcaklığında 2-4 saat arasında gerçekleştirilir fakat, soğukta (4 °C) daha uzun zaman almaktadır.



167

Reaktif bölgelerin bloke edilmesi tamamlandıktan sonra, fazla bileşiğin uzaklaştırılması için kolon materyali yıkanır ve örnek materyali yüklemeden önce kolon hacminin 5-10 misli başlangıç tamponu ile dengelenir. 8.3.5. Bağlama Verimliliğinin Taranması

Ligandın matrikse bağlanma miktarı, hem kolonun ayrıştırma verimliliğini hem de kolona yüklenecek olan örnek materyalinin miktarını, yani kolonun kapasitesini ve dolayısı ile saflaştırılmış olan örneğin miktarını belirlemektedir. Matrikse bağlanmış olan ligandın miktarı ise birkaç yoldan belirlenebilir: i. Ligandın matrikse bağlanmadan önceki ve bağlandıktan sonraki UV absorbsiyonlarının farklılığı belirlenir: a. Protein yapıdaki ligandlar için A280 değeri en iyi sonucu vermektedir. Diğer yapıdaki ligandlar için ise en iyi sonucu veren özgül dalga boyları seçilmelidir. Örneğin, heme grubu içeren ligandlar için A405 kullanılabilir. Bu arada, seçilmiş olan dalga boyunda absorbsiyon gösteren tamponların (örneğin, dithiothreitol veya Tris tamponlarının yüksek derişimleri) kullanılmasından ise kaçınılmalıdır. b. Kolorimetrik protein asseyi yapılabilir. c. Flouresans dedeksiyon yöntemi kullanılabilir (kolorimetrik yöntemden daha hassastır). ii. Ligand içeren jelin bir kısmı uygun bir tampon içinde çözündürülerek, protein asseyi, toplan azot tayini veya amino asit analizi yapılır. iii. Aktivite testi yapılabilir (küçük bir bağlama deneyi). iv. Radyoaktif madde işaretli bir ligand kullanılır veya radioimmünoassay (RIA) testi yapılır (bu durumda radyoaktif madde içeren ligandın matrikse bağlanma oranının, radyoaktif madde içermeyen ligand ile aynı oranda olduğu varsayılmaktadır). 8.4. Pratik Prosedürler

Affinite kromatografisinin prosedürü, diğer sıvı kromatografi şekillerinde kullanılanlara benzerdir. Bununla birlikte, affinite kromatografisi ile ayrıştırmada en iyi metot, saflaştırılmak istenen her bir molekülün özelliğine göre farklı olacaktır. Buna rağmen, burada ise genel bir prosedürden bahsedilerek, özgül uygulamalar için bir fikir oluşturulması amaçlanmış ve bazı özgül uygulamalara ise ilgili kısımlarda daha detaylı olarak yer verilmiştir. Affinite kromatografisinin genel prosedürlerini içeren bir şema ise Şekil 8.5’de verilmektedir. Destek materyalinin tipine özel olarak, ligandla muamele edilmiş matriks, bir kolonun içerisine normal yollarla paketlenir. Kullanılacak tampon, ligand–makromolekül etkileşimi için gerekli olan (metal iyonları gibi) kofaktörleri içermelidir. Örnek materyali kolona yüklendikten sonra, özgül-olmayan bağlanmaları ve kirleticileri uzaklaştırmak için kolon, daha fazla tamponla yıkanır. Saflaştırılmakta olan bileşik, liganddan özgül veya özgül-olmayan elüsyon yöntemlerinin birisi ile uzaklaştırılabilir. Özgül-olmayan elüsyon, pH’da veya iyonik kuvvette meydana getirilecek bir değişimle elde edilebilir. Asetik asit veya amonyum hidroksit kullanılarak yapılan pH değiştirme elüsyonu, ligand ve/veya makromolekülde, ligand–makromolekül bağlanmasında kritik olabilecek grupların iyonizasyon bölgelerinde değişime neden olur. İyonik güçteki bir değişim, pH’daki değişim ile birlikte olmasına gereksinim olmadan, ligand–makromolekül etkileşiminin bozulmasına yol açtığı için makromolekülün elüsyonuna neden olur; bu amaç için genellikle 1 M NaCl kullanılır. Şayet elüsyon, bir pH değişimi ile elde edilmiş ise ve toplanan fraksiyonların pH’ları, protein denatürasyonuna neden olabilecek sınırlar içerisinde ise bu fraksiyonların pH’ları yeniden optimize

168



edilmelidir. Saflaştırılmak istenen hedef molekülün bir enzim olması durumunda ise affinite elüsyonu uygulanabilir. Bu durumda enzimin kolondan elüsyonunun sağlanabilmesi için yüksek derişimlerde substratın veya enzime geri-dönüşümlü olarak bağlanabilen bir inhibitörün, ya da enzimin tutuklanmış liganda olan affinitesinden daha fazla affinite gösterdiği ligandların, elüsyon sıvısı içerisinde kolona ilavesi gerekir. Neticede, saflaştırılan materyal, özgül elüsyon ajanları ile ya da yüksek derişimlerde tuzla kontamine olmuş tamponlar (hareketli fazlar) içinde bulunmaktadır ve saflaştırma tamamlanmadan önce, bunların jel filtrasyonu ve diyaliz gibi tekniklerle uzaklaştırılması gerekmektedir. Grup-özgül adsorbent var mı?

EVET

Uygun Ligand seçilir

Ligandın bağlanacağı uygun matriks seçilir

Ligand matrikse tutuklanır: -Jel şişirilir ve yıkanır -Ligand jele bağlanır -Gerekli ise fazlalık aktif gruoplar bloke edilir -Jel yıkanır

Jel uygun bir kolona paketlenir

Kromotografi ekipmanı kurulur

Paketlenen kolon 2-3 kolon hacmi tampon ile dengelenir

Örnek yüklenir

Bağlanmamış moleküller ve kirleticiler yıkanarak uzaklaştırılır

Liganda bağlanan moleküllerin elüsyonu gerçekleştirilir

Fraksiyonlar diyalize tabi tutulur

Jel rejenere edilir

Ayrıştırma işleminin analizi yapılır

Deneysel koşullar optimize edilir

Şekil 8.5: Affinite kromatografisinin genel prosedürleri.

Gerekli ise jel şişirilir



169

8.5. Affinite Kromatografisinin Uygulamaları

Affinite kromatografisi ile çok geniş çeşitliliğe sahip, reseptör proteinleri ve immünoglobilinleri de içeren, enzimler ve diğer proteinler saflaştırılmıştır. Tekniğin uygulanabilirliği, sadece tutuklanmış ligandların bulunup bulunmadığı ile sınırlıdır. Affinite kromatografisinin temel prensipleri, nükleik asitlere kadar uzanmış olup, moleküler biyolojideki gelişmelere hatırı sayılır katkılarda bulunmuştur. Örneğin, poli–U Sepharose 4B üzerinde, selektif hibridizasyonla poli–A kuyruğuna sahip olan m–RNA’lar rutin olarak izole edilmektedir. Tutuklanmış tek–zincirli DNA’lar ise kendilerine komplementer olan RNA ve DNA moleküllerinin izolasyonunda kullanılabilir. DNA ve RNA moleküllerinin izolasyonu, kolonlardan elde edilebileceği gibi genellikle, nitroselüloz membranlar üzerinde tutuklanmış tek zincirli DNA veya RNA’lar (prob) kullanılarak da yapılmaktadır. Tutuklanmış nükleotidler, nükleik asit metabolizması için gereken proteinlerin izolasyonunda da kullanışlıdırlar (bkz. kısım 8.7.5). Affinite kromatografisinde önemli bir gelişme, heterojen bir hücre karışımının homojen popülasyonlar şeklinde ayrılmasında kullanılması ile ortaya çıkmıştır. Affinite kromatografisi ile hücrelerin ayrılmasında kullanılan tekniğin temeli, hücre yüzeylerinin antijenik özelliklerine veya hücre yüzeyi üzerindeki dışarıya uzanan karbonhidrat yapıların kimyasal yapısına veya bir özgül membran reseptörü–ligand etkileşimine dayanır. Affinite kromatografisinde kullanılan tutuklu ligandlardan protein-A; IgG’nin Fc bölgesi, bir lektin veya bir membran reseptörü için özgüldür (bkz. kısım 8.7.6.1). 8.6. İmmünoaffinite Kromatografisi

İmmünoaffinite kromatografisinde adsorbent olarak, sıklıkla immünoadsorbentler veya immünosorbentler olarak adlandırılan antikorlar veya antijenler kullanılmaktadır. Özellikle saflaştırılacak olan antijenin bilinen bir komplementer ligandının bulunmadığı durumlarda, monoklonal antikorlar bu tip antijenlerin saflaştırılmasında oldukça kullanışlı immünoadsorbentleri oluşturmaktadırlar. Günümüzde ise monoklonal antikorlara dayalı adsorbentler, geleneksel olan poliklonal antikorlara dayalı immünoadsorbentlerin yerini tamamen almış durumdadır. Buna rağmen, hem poliklonal hem de monoklonal antikorların kullanıldığı immünoadsorbentler bulunmaktadır. Bu immünoadsorbentler ise birbirine göre hem avantajlara hem de dezavantajlara sahiptirler. 8.6.1. Temel Prensipler

İmmünoaffinite kromatografisinin uygulanması için gerekli olan immünoadsorbentlerin elde edilmesi ve protein örneklerinin ayrıştırılması için gerçekleştirilmesi gereken temel adımlar aşağıdaki şekilde sıralanabilir: i. İmmünoadsorbentin elde edilmesi için matrikse bağlanacak olan ligandın (antikor) elde edilmesi için gerekli olan protein (antijen) diğer protein saflaştırma teknikleri ile saflaştırılır. Saflaştırılan protein ise bu proteinin elde edildiği kaynaktan evrimsel olarak farklı bir memeli hayvanın immünizasyonunda kullanılır. Monoklonal antikorların üretimi için genellikle fare (bkz. kısım 8.6.3), poliklonal antikorların üretimi için ise tavşan veya keçi kullanılır (bkz. kısım 8.6.2).

Alternatif olarak, hedef proteinin sentezinden sorumlu olan genin izolasyonu ve dizilenmesi sonucunda, bu proteinin yaklaşık 15 amino asitlik bir kısmı kimyasal olarak sentezlenir. Hedef proteinin 15 amino asitlik parçasının kimyasal olarak sentezlenmesi sırasında yapıya bir sistein eklenmesi ise kullanışlı olabilir. Çünkü peptid dizisine eklenen sistein, bu diziye bovin serum albümin veya karından ayaklı (omurgasız) hemosiyanininin eklenmesini kolaylaştırmak için reaktif bir kalıntıyı oluşturmaktadır. Bu işlemler sonucunda elde edilen konjugat ise antijen olarak kullanılır.

170



ii. Antijene karşı antikorların üretilmesi sağlanır. Poliklonal antikor üretimi için kullanılan antijenin mümkün olduğunca saf olması önemlidir (bkz. kısım 8.6.2). Aksi takdirde, eser miktarda dahi olsa kirletici olarak bulunan diğer proteinlerin antijenitesi çok daha yüksek olabilir ve sonuçta karışık özgüllükte antikor üretimine yol açabilir. Monoklonal antikor üretimi (bkz. kısım 8.6.3) için kullanılacak olan antijenin saflığı ise şayet, uygun klonların seçimi için bir tarama prosedürü kullanılacaksa, göreceli olarak daha az önemlidir. Gerçekte ise tarama prosedürleri sonucunda kirletici proteinlere ait antikor klonlarının elemine edilebilmesi nedeniyle, %1 oranında hedef protein içeren antijenlere karşı geliştirilmiş olan monoklonal antikorlar izole edilebilmektedir. iii. Antikor, tavşan serumundan (poliklonal) çökeltme veya diğer yöntemlerle (bkz. kısım 8.6.4) kısmi olarak saflaştırılır. Antikorların saflaştırılmasını sağlayan daha iyi bir prosedür ise ters (revers) immünoaffinite kromatografisidir. Bu prosedürde, tutuklanmış antijeni içeren kolon materyali ile doldurulmuş olan kolona serum yüklenir. Serumdaki özgül antikorlar tutuklu antijenlerine tutunurken, serum ve diğer kirleticiler kolondan ayrılır. iv. Saflaştırılmış olan antikorlar ise bikarbonat/karbonat tamponu (pH 8-9) ile, aktive kolon matriksine (siyanojen bromid-, tosil-, vinilsülfon-aktive v.b) bağlanır (bkz. kısım 8.3.3 ve kısım 8.6.5). v. Saflaştırılmak istenen proteini içeren örnek materyalinin ham özütü (veya kısmi olarak saflaştırılmış olması tercih edilir) kolona yüklenir. Bağlanmamış materyallerin kolondan uzaklaştırılması için uygun bir tampon ile kolon yıkanır. vi. Hedef protein kolondan elüe edilir.

İmmünoaffinite kromatografisinin uygulanmasındaki bu basmaklar arasında en zor olanlarını ise i. ii. ve vi. basamaklar oluşturmaktadır. Burada ise i. basamağın, alternatif protein saflaştırma teknikleri ile başarıldığı var sayılarak, takip eden kısımlarda antikorların üretiminden başlamak üzere diğer basamaklar ele alınmaktadır. 8.6.2. Poliklonal Antikorların (Antisera) Üretimi Poliklonal antikor terimi, bir hayvansal organizma serumunda bulunan antikorların toplam popülasyonunu belirtmektedir. Bu kompleks antikor popülasyonu ise Tablo 8.3’de özetlenen beş farklı altsınıfı içermektedir. İmmünokimyasal yöntemlerde kullanılan antikorların çoğu, uygun antijeni içeren süspansiyon veya solüsyonların bir tavşana enjekte edilmesiyle oluşturulur veya tetiklenir (indüklenir). Uygun bir zaman sonra, aşılanmış olan tavşanın kulak posterior marjinal toplar damarından 5-50 mL kan alınır (kanatma). Alınan kanın 37 °C’da bir saat bekletilmesi sonucunda çökelmesi sağlanır. Oluşan pıhtı tüpten alınarak, 4 °C’da bekletilir ve böylece hacminin küçülerek 2-25 mL serumun daha elde edilmesi sağlanır. Elde edilen serum, santrifüjlenerek hücrelerden arındırılır. Santrifüjlenen serum, 56 °C’da 45 dakika inkübe edilerek, proteazların ve komplementlerin inaktivasyonu sağlanır. Daha sonra serum, küçük hacimlere bölünerek genellikle –20 °C’da depolanır. Kontrol serum ise aynı tavşanın aşılanmadan önceki kanından elde edilir. Koyun, keçi ve atlar ise daha fazla miktarda antiserum üretiminin gerektiği durumlarda kullanılmaktadır.

Kuvvetli bir antijenik bileşiği içeren fizyolojik solüsyon ile bir defa enjekte edilmiş bir tavşanın kanında, tespit edilebilir düzeyde antikor üretimi genellikle 10 gün sonra gerçekleşir. Antikor üretimi ise enjeksiyonun yapılmasından 15-20 gün sonra maksimum düzeye ulaşır ve daha sonraki birkaç hafta içindeyse serumdaki antikor üretimi düşmeye başlar. Bu birincil humoral immün cevap olup, çoğunlukla IgM antikorlarının üretimi ile sonuçlanır. İkincil humoral immün cevap ise aynı antijenin birinci enjeksiyonundan sonra oluşturduğu birincil humoral cevaptan herhangi bir zaman sonra, antijenin aynı hayvana yeniden enjekte edilmesiyle oluşturulabilir. İkincil humoral cevap ise



171

birinciye oranla, çok daha kısa bir zamanda gerçekleştirilebilmekte ve bazı durumlarda, yüksek orandaki antikor seviyesi ise enjeksiyondan sonraki üç günü takiben tespit edilebilmekte; maksimum seviyeye ise ikinci enjeksiyondan sonraki on günlük süre sonunda ulaşmaktadır. IgM antikorlarının seviyesi ise birincil humoral cevaptaki kadar olmakta, fakat IgG seviyesi ise birincil humoral cevaba oranla 3–10 kat daha artmaktadır. Aynı antijenin iki hafta aralıklarla tekrar tekrar enjeksiyonu ise hiperimmünize tavşanın meydana gelmesine neden olur. Hiperimmünize tavşanın serumu ise özgül IgG antikorlarını çok yaygın olarak bulundurmaktadır (1-5 mg özgül IgG cm-3). Tablo 8.3: İmmünoglobilin sınıflarının fizikokimyasal ve biyolojik özellikleri. İmmünoglobilin sınıfı

IgG

IgM

IgA

IgD

IgE

Ağır zincir sembolü

γ

μ

α

δ

ε

Ağır zincir Mr (kDa)

50

70

55

65

65

γ2κ2

(μ2κ2)5; Ja

α2λ2, α2κ2

δ2κ2,

ε2κ2,

δ2λ2,

ε2λ2,

Moleküler kompozisyonu

γ2λ2

(μ2λ2)5; J

b

(α2λ2)2Sc ; J (α2κ2)2Scb; J

Fiziksel durumu

Monomer

Pentamer

Monomer

Monomer

Monomer

150

900

160-380b

180

200

Valans

2

5-10

2, 4a

2

2

Karbonhidrat içeriği (%)

3

12

7,5-10

12

12

Merkaptoetanole duyarlılık

_

+

_

_

_

Isı duyarlılığı (56 °C, 4 saat)

+

+

+

?

_

Komplement fiksasyonu

+

++

_

_

_

8-16

0,6-2

1-4

0,001

0,0003

23

5

6

3

2

Mr (kDa)

Normal serum düzeyi (mg cm–3) Yarı ömrü (gün) a b

J (Joining) zinciri: IgA ve IgM antikor moleküllerinin polimerizasyonunda rol alan bir polipeptiddir. Eksternal salgılarda dimer olarak, Sc ile gösterilen ikinci bir komponent bulundurur.

Zayıf antijenik bileşiklerin kullanılması durumunda, antiserumdaki özgül antikorların kolayca belirlenebildiği titre’ye ulaşılması için iki yaklaşım bulunmaktadır. Birincisi, ya inokülasyon miktarı ile ya da tavşana inoküle edilen antijenin tavşanda oluşturduğu antijen deposundan haftalar süren yavaş yavaş salınması ile antijene maruz kalan immün sistem süresi uzatılmalıdır. Antijen deposundan antijenin uzun süre yavaş yavaş salınması ise, partikül veya çökelti halindeki antijenin intramusküler, subkütanoz veya interdermal inokülasyonuyla başarılabilir. İkincisi ise bileşiğin antijenitesini artırmak için adjuvant kullanımıdır. Alüminyum potasyum sülfat ise tetanus ve difteri toksinleri gibi çözünebilir, proteinik antijenlerin birçok hayvansal organizma türüne inokülasyonundan önce, bu antijenlerin çökeltilmesinde kullanılan basit bir adjuvanttır. Bu teknik, antijenin yavaş yavaş serbest bırakılması ile sonuçlanan bir teknik olup, antijenin uzun süreli olarak enjeksiyonunu mimikri etmekte ve immün cevapta yer alan makrofajlar tarafından antijenin kolayca yakalanmasına ya da fagosite edilmesine neden olmaktadır. İnsan dışındaki türlerde en çok kullanılan bir adjuvant ise sıvı parafin gibi beyaz mineral yağların, mannid monooleat gibi bir emülsülfürün ve ısı ile öldürülmüş Mycobacterium

172



tuberculosis’in farmosötik bir karışımından oluşan Freund’un komple adjuvantı’dır. Genellikle, Freund’un komple adjuvantı’nın eşit bileşenlerinden ve antijen solüsyonundan oluşan karışım emülsiyonunun 1 cm3’ü 3 eşit parçaya bölünür ve her bir parça, tavşanın üç ayrı yerine inoküle edilir. Örneğin, üç eşit parçaya ayrılan emülsiyonun bir parçası subkütanoz olarak, diğer iki parçası ise tek bir büyük inokülasyon yerine iki ayrı bölgeye, arka bacak kaslarına inoküle edilebilir. Bu şekildeki bir inokülasyon, lenf nodlarının sayısını artırır ve böylece, emülsiyon damlacıkları içerisindeki antijen, lenfotik sistem kanalıyla ulaşacağı için potansiyel olarak aktif B-lenfositlerinin sayısını da artıracaktır. Emülsiyon damlacıklarındaki antijen, kan dolaşımına girdiğinde ise dalak ve kemik iliğindeki lenfositleri aktive edebilir. Emülsiyondaki antijen deposu, her inokülasyon bölgesinde kalma eğilimindedir, öldürülmüş tüberküloz basilleri ise inokülasyon bölgesinin retiküloendotelyal hücreler tarafından istila edilmesini stimüle etmektedir. Bu ise antijene karşı oluşturulan immün cevabın daha da artmasına yol açan granuloma* formasyonu ile sonuçlanmaktadır. İmmünokimyasal çalışmalar için antisera oluşturulduğunda ise kanatmanın yapılmasından önce, son bir inokülasyonun yapılması gerekmektedir. Fakat, bu son inokülasyonda kullanılacak olan Freund’un komple adjuvant’ında, tüberküloz basili bulunmamalıdır. Bu emülsiyonda tüberküloz basilinin bulunmaması ise sadece humoral immün cevabın stimüle edilmesine yol açacaktır. Muramil dipeptid (N-asetilmuramil-L-alanil-D-izoglutamin) ise M. tuberculosis’den izole edilen ve suda eriyebilen bir peptidoglikan olup, en basit adjuvant-aktif bileşiktir. Bu bileşik, Freund’un komple adjuvantına karşı immün cevabın artırılmasına yol açar ve yağ-su emülsiyonundan ziyade, sulu çözelti halinde kullanılabilmektedir. Bakteriyel hücre duvarı bileşenlerinden olan glikopeptidlerin bir analoğu olan ve sentetik olarak sentezlenebilen glikozaminilmuramil peptidi ise immün cevabın modilatörü olarak kullanılabilmektedir. Freund’un komple adjuvantına karşı bir alternatif olan, antijenik-olmayan (non-antijenik), mikrometre büyüklüğündeki β-glukan partikülleri ise vücut ateşinin yükselmesine ve granuloma formasyonuna neden olmadan belirlenebilir bir immün cevap oluşturabilmektedir. Eritrositler veya öldürülmüş bakteriler gibi bazı antijenlerin, izotonik fizyolojik solüsyonlar içinde uygun memelilerin toplar damarı içerisine enjeksiyonu sonucunda, antikorların oluşturulması kolayca başarılabilir. Antiseraların oluşturulmasında, droglar ve peptid-olmayan hormonlar gibi heptanlar kullanılmadan önce, bunların affinite kromatografi materyallerinin hazırlanmasında olduğu gibi proteinler, polisakkaritler veya koyun eritrositleri gibi antijenik yapı ile birleştirilmeleri zorunludur. Antiserum oluşturulduktan sonra, fazla miktarda taşıyıcı makromoleküllerin veya eritrositlerin antiseruma ilavesi, antikorların taşıyıcı moleküllere veya eritrositlere çökelmesine neden olur ve solüsyon içinde sadece heptan için olan antikorların kalmasına neden olur. Daha sonra yapılan santrifüjleme işlemi ile de heptan için mono-spesifik olan antiserum uzaklaştırılır. 200 Dalton’dan çok daha küçük olan heptan dahi, bir memeli organizmada 6 farklı immünoglobilin molekülünün oluşmasını indükleyebilmektedir. Oluşan bu 6 farklı immünoglobilin molekülünün her birisinin amino asit dizisi, birbirinden farklıdır ve her birisi, heptanın yüzeyinin farklı parçaları ile kombine olma yeteneğindedir. Bu nedenle, protein gibi büyük antijenlerin, çok fazla sayıda immünoglobilinlerin oluşumuna neden olması ve oluşan bu immünoglobilinlerin her birisinin, antijenin yüzeyinin çok az farklı bir epitopu** ile bağlanması, şaşırtıcı gelmemektedir. Bu ise, bir antiserum ile minimum seviyede ortak bir yapısal özelliği taşıyan antijenlerin, çok az farklılıkla çapraz reaksiyonlar oluşturmasına yol açacaktır. Antijen yüzeyindeki epitoplar arasındaki *1.

Granuloma: Çevredeki sağlam dokuya oranla sertlik gösteren granulasyon dokusundan ibaret yumru şeklindeki oluşum. 2. Vücutta, bir yabancı cisme, harabiyete veya enfeksiyona karşı savunma reaksiyonu esnasında oluşan, özellikle histiosit ve lenfositlerin oluşturduğu doku, granülasyon dokusu. ** Epitop veya antijenik determinant: Antijen üzerinde bulunan ve kendisi için özgül olan antikor ile bağlanmasını sağlayan küçük bir bölge. Bu bölge, genellikle 1-6 monosakkaritten veya amino asit kalıntısından oluşan ve birbirine kovalent olarak bağlanma zorunluluğu olmayan bölgedir.



173

etkileşimin sonucu olarak, farklı B lenfosit klonları tarafından her birisi bu epitop için özgül reseptörlere sahip olan farklı immünoglobilinler üretilecektir. Bu nedenle, oluşan antiserum poliklonal antiserum olarak adlandırılmaktadır. Böyle bir poliklonal antiserum içerisindeki her bir immünoglobilinin göreceli miktarı ise antijenin inokülasyon yoluna, türe ve inoküle edilen suşa ve inokülasyon sıklığına bağlıdır. Bu nedenle, antijen-özgül poliklonal antiserum üretiminin standardizasyonu oldukça zor olmaktadır. Çünkü, hayvansal organizmaların çoğu, çok farklı B lenfosit klonlarına sahiptirler. Bu lenfosit klonlarından her birisi, antijen yüzeyindeki farklı epitoplar ile reaksiyon göstermekte ve bu nedenle de B lenfositleri IgG üretimini indüklemekte veya indüklememektedir. Pratikte ise yıllarca çalışılmasına rağmen, poliklonal antiserumdan immünoglobilin moleküllerinin tek bir türünü içeren homojen popülasyonları elde etmek imkansızdır. Buna rağmen, ölümsüz hücre kültürleri ile B lenfositlerinin füzyonu sonucunda oluşturulan hibridomaların ve modern hücre biyolojisi tekniklerinin kullanılması sayesinde, monoklonal antikorların üretilmesine olanak sağlamıştır (bkz. kısım 8.6.3). 8.6.2.1. Poliklonal Antikorların Avantaj ve Dezavantajları Avantajları: i. Antikor popülasyonu içerisinde çoklu alt-sınıflar ve yüksek affiniteli antikorlar bulunur. ii. Çoklu özgüllük gösteren antikorlar, antijenik determinantları (epitopları) sırsı ile tanıdıkları gibi konformasyonal olarak da tanırlar. iii. Bir protein için özgül olan antikorlar, çoklu determinantları da tanımalıdırlar (bu özellik, şayet gen ekspresyon bankaları için taranıyorsa özellikle önemlidir). iv. 2D-PAGE ile tek adımda kolayca saflaştırılan proteinler için oldukça özgül olan poliklonal antiseralar kolayca geliştirilebilir. v. İmmünopresipitasyonun kullanıldığı deneylerde uyumludur. Dezavantajları: i. İstenilen özgüllüğün elde edilebilmesi için immünojenin (antijenin) oldukça saf olması gerekmektedir. ii. Çoklu antijenik determinantların poliklonal antisera tarafından tanınması nedeni ile kompleks antijenlerin her bir domaininin çalışılması oldukça zordur. iii. Antikorların miktarı, immünize hayvanın hayatı ile sınırlıdır. iv. Antikorların affinitesi, özgüllüğü ve alt-sınıflarının değişmesi nedeni ile her kanatma ayrı ayrı karakterize edilmek zorundadır. 8.6.2. Monoklonal Antikorların Üretimi

Sağlıklı bir insanın serumundan fraksiyonlanan IgG’nin elektroforetik tekniklerle ayrıştırılması sonucunda, 105-106 farklı IgG molekülünün var olduğu bulunmuştur. Buna rağmen, miyolemal hastalıklardan muzdarip olan sağlıksız bir bireyin serumundan elde edilen IgG fraksiyonu ise çok daha az sayıda IgG molekülleri içermektedir ve bu moleküllerin büyük bir çoğunluğunu ise tek bir tip IgG molekülü oluşturmaktadır. Böyle bireylerin dolaşım sistemlerinde sirküle eden lenfositlerin çoğu, miyolema hücreleridir ki bunlar, neoplastik B lenfositlerinin tek bir klonunu içermektedirler. Normal B lenfositlerine benzemeyen miyolema hücreleri ise hızlı bir şekilde bölünmeye devam eder ve hiçbir antijenin stimüle etkisi bulunmadan tek bir tip immünoglobilin molekülünü salgılarlar. Normal B lenfositleri in vitro koşullarda birkaç saatten fazla

174



canlı kalamamalarına rağmen, miyolemalar diğer neoplastik hücreler gibi hücre kültür ortamlarında ölümsüz (immortal) olarak kalabilirler. Normal memeli hücreleri iki farklı yoldan DNA moleküllerini sentezlerler: i. De novo metabolik yolu ile nükleik asitler, pürin ve pirimidin bazlarından, deoksiriboz ve inorganik fosfattan oluşturulurlar. ii. Kurtarma metabolik yolunda ise, benzer nükleotidlerin dönüştürülmesi ile doğru nükleik asitlerin sentezi sağlanır.

De novo metabolik yolu ise aminopterin ile tamamen inhibe olmaktadır. HGPRT enzimi (hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaz) içeren hücreler ise kurtarma metabolik yollunu kullanarak, aminopterin içeren besi ortamlarında canlı kalabilirler. Buna rağmen, kurtarma metabolik yolunun işletilerek canlılığın sürdürülebilmesi için ortama hipoksantin ve timidin eklenmek zorundadır. Bu maddelerin eklendiği besiyeri ise HAT besiyerleri (Hipoksantin, Aminopterin, Timidim) olarak adlandırılırlar. Böylece HAT besiyeri, HGPRT enzimi içeren hücrelerin, bu besiyerinde seçici olarak büyümelerini sağlarken; HGPRT içermeyen (HGPRT−) hücrelerin büyümelerini engelleyecektir. Fare miyolema hücrelerinin HGPRT− olan klonları seçilir ve bunlar HAT besiyerinde canlılıklarını sürdüremezler ve çoğalamazlar. HGPRT− olan miyolema klonları seçilirken bunların, istenmeyen immünoglobilinleri çok az miktarda veya hiç üretmeyenleri seçilmelidir. Günümüzde, monoklonal antikor üretiminde kullanılan standart metot ise Şekil 8.6,a’da verilmiştir. Uygun bir antijen ile aşılanmış olan farenin dalak hücreleri ise, duyarlı hale getirilmiş olan B lenfositlerinin süspansiyon kaynağı olarak kullanılır. İn vitro koşullarda büyüyen, duyarlı B lenfosit hücreleri ve HGPRT üreten miyolema hücreleri, füzyon oluşturmak amacıyla, hücrelere toksik olan %30-50 (w/v) polietilenglikol (PEG) içeren ortamda birkaç dakika süre ile karıştırılır. Daha sonra, bu füzyon karışımı ise HAT besiyeri içeren hücre kültür ortamlarına aktarılır. Lenfositler ve füzyon oluşturan lenfositler, in vitro koşullarda kültürlerinin yapılamamasından dolayı çok kısa bir sürede ölürler. Miyolema hücreleri ve füzyon oluşturmuş olan hücreleri ise HGPRT içermedikleri için HAT besiyerinde bulunan aminopterin tarafından zehirleneceklerdir. Sadece B lenfositleri ile HGPRT pozitif olan miyolema hücrelerinin füzyonları sonucunda oluşan hibridoma’lar bu ortamda canlı kalacaklardır. Çünkü, miyolema hücreleri, hibrit hücrelere in vitro koşullarda yaşama özelliğine aktarırken, B lenfositleri ise bu hibrit hücrelerin HAT besiyerlerinde üreyebilmeleri için gerekli olan HGPRT enzimini aktaracaklardır. 10-14 gün sonra ise kültür ortamında canlı kalan hücreler sadece hidridomalardan ibaret olacaklardır. Buna rağmen, bu hibridomaların birçoğu ya istenmeyen immünoglobilinleri üretebilir ya da hiçbir Ig üretmeyebilir. Ne yazık ki, bu hibridomalardan hiç Ig üretmeyenler, Ig üretenlere oranla çok hızlı büyümektedirler. Bu nedenle, hibridoma oluşumunu takip eden 7-14 gün boyunca, her bir kültürün devamlı olarak istenilen Ig’yi üretip üretmediğinin test edilmesi ve üretmeyenlerin elimine edilmesi gerekmektedir. Bunun yanı sıra, istenen ya da kullanışlı Ig üretenlerin ise alt-kültürleri hazırlanmalı ve proteinleri sıvı-azot içerisinde dondurularak saklanmalıdır. Aksi halde kültürlerin mikroorganizmalar ile kontaminasyonu sonucunda, aylarca sürdürülmüş olan çalışmalar boşa gidebilir. Son olarak, tek hücre klonları iki yoldan birisi ile elde edilir. Bu iki yoldan birincisi, kültürler dilüsyona tâbi tutularak, mikro-titre plakalarının her bir çukurunda tek bir hibridoma hücresinin bulunmasını sağlayacak şekilde, mikro-plaka çukurlarına dağıtımı yapılır. Mikro-titre plaka çukurlarına ekimi yapılan klonların büyümesini sağlamak için ise plakalardaki besi ortamlarının düzenli olarak makrofaj hücreleri gibi normal hücreleri içeren besleyici tabaka ile desteklenmesi gerekmektedir. Klonlar, tatmin edici düzeyde büyüdükten sonra, bu klonların özgül immünoglobilin üretimi için test edilmesi gerekebilir. Bu klonların özgül immünoglobilin üretiminin belirlenmesinde



175

ise radioimmünoassay (RIA) veya enzim-linked immünosorbent assay (ELISA) gibi son derece gelişmiş immünokimyasal teknikler kullanılmaktadır.

Şekil 8.6: Monoklonal antikorların üretimi. (a) Monoklonal antikor üretiminde en yaygın olarak kullanılan prosedür. (b) İlgilenilmekte olan özgül hibridomaların oluşum oranını artırmak için, B hücrelerinin antijen–özgül adezyon ile miyolema hücrelerine bağlanmasını sağlayan prosedür (Wilson ve Walker, 1995).

Tek hücreden oluşan klonların elde edilmesinde kullanılan ikinci yol ise, hibritlerin dilüsyonu yapıldıktan sonra yatık agara ekimleri yapılarak, tek bir klon halinde büyüyen hücrelerin gözlenmesi ve bu klonların pastör pipeti ile seçilmesi gerçekleştirilir. Pastör pipeti ile seçilen klonlar ise mikrotitre plakalarında büyütülür ve özgül immünoglobilinlerin üretimi için test edilir. Kullanışlı olan her bir klon ise daha ileri karakterizasyonlara tâbi tutularak, sıvı-azot içinde depolanabilirler.

176



İmmünoglobilin üretiminin doğru monoklonal antikoru üretip üretmediğinden emin olmak için, genellikle en az bir defa yeniden klonlama yapılmalıdır. Daha sonra, istenilen antikoru üreten hibridoma klonları seçilir ve bunlardan kullanılabilecek antikorların üretimi için iki yoldan birisi tercih edilir. Bu yollardan birincisinde hibridoma, in vitro koşullarda hücre kültürü ile çoğaltılır ki, bu iş pahalı ve yorucudur. Monoklonal antikorların elde edilmesinin ikinci yolu ise hibridoma hücrelerinin tek-hücre tümörü olarak büyüyebileceği uygun bir farenin peritonal (karın) boşluğunda kolayca büyüyebilen bir yere yerleştirmektir. İkinci metodun dezavantajı ise monoklonal antikorlar genellikle farenin karın boşluğu sıvısında bulunan diğer proteinler ile kontamine olur, fakat bu genellikle çok ender durumlar için önem arz etmektedir. Monoklonal antikor üretiminde kullanılan genel metodun en büyük dezavantajı ise, heterojen B lenfositlerinden oluşan hücre popülasyonu ile miyolema hücrelerinin oluşturduğu füzyonun, tamamen tesadüfi olmasıdır. Hibrit oluşumunu sağlayan füzyonun tesadüfi olması ise, hibritlerin çok fazla çeşitte immünoglobilinleri üretmesine, bundan dolayı da hibritlerin ayrı ayrı klonlar halinde büyütülmesi ve dolayısıyla immünoglobilinlerin test edilmesi için çok fazla zamana gereksinim duyulmaktadır. Şekil 8.6,b’de de gösterildiği gibi, sadece ilgilenilmekte olan antijene komplement immünoglobilinlerin üretimini gerçekleştirebilen B lenfositleri ile miyolema hücrelerinin füzyonunun gerçekleşmesini garantilemek için, alternatif prosedürlerin geliştirilmesine de çalışılmaktadır. Bu prosedürde ise kimyasal olarak miyolema hücrelerinin yüzeylerine biyotinin, ilgilenilmekte olan antijene ise avidinin bağlanması sağlanır. Avidin-antijen bileşiği ise, antijen ile immünize edilmiş bir farenin dalak hücrelerinden alınan lenfosit hücreleri ile karıştırılır. Bu karışımdaki avidin-antijen bileşiği ise özgül olarak sadece antijen reseptörlerini taşıyan B lenfositleri ile bağlanacaktır. Avidinantijen-B lenfositini içeren süspansiyon ise, miyolema (biyotinlenmiş) ve antijen-özgül B lenfositlerinin (antijen-avidin bileşiği içeren) biyotin-avidin-antijen köprüsü aracılığı ile bir arada tutulmasını garanti altına almaktadır. Daha sonra ise, bir arada bulunan miyolema-B-lenfositi hücre bileşiklerini içeren süspansiyon, bir elektriksel alana (4 kV cm–1, 5 saniye, 30 °C) maruz bırakılarak birbirine yakın olan hücreler arasında füzyon oluşumu sağlanır. Bu füzyonda ise miyolema hücreleri ile uygun immünoglobilinleri üretme yeteneğinde olan B lenfositlerinin füzyonu ile oluşan hibritlerin eldesi sağlanmaktadır. Elde edilen hibritler ise HAT besiyerine ekilerek, uygun hibritlerin seçimi yapılmakta ve daha önce tanımlandığı gibi klonlar oluşturulmaktadır. Monoklonal antikorların en büyük avantajı ise, aşırı güvenilir olmasıdır. Bu nedenle, her kim ki monoklonal antikorları kullanarak bir sonuç elde ederse bu sonuçların kesinliğini iddia edebilir. Buna rağmen, monoklonal antikorların üretimi için çok fazla zaman ve işçilik gerektiğinden maliyet de yüksek olmaktadır, maliyetin yüksek olması ise monoklonal antikorların ticari fiyatlarını da artırmaktadır. Poliklonal sera kullanımı ise monoklonal antikorların kullanılmasının çok farklı avantajlar sunmadığı her durumda kullanılmaktadır. Buna ilaveten, monoklonal antikorların çok özgül olarak, sadece tek bir epitopu tanıması ise bir dezavantajdır ve bu nedenle, poliklonal seralar çok daha fazla kullanılmaktadır. Monoklonal antikorların üretiminin pahalı ve zor olmasına rağmen birçok antijen, serum proteinleri, enzimler, hücre yüzey reseptörleri, hormonlar, droglar, tümör özgül antijenleri, virüsler ve farklılaşma antijenleri için monoklonal antikorlar hazırlanmıştır. Farklılaşma antijenleri için hazırlanan monoklonal antikorlar ise affinite kromatografisi ile hücre popülasyonlarından, T lenfositlerinin fonksiyonel alt-popülasyonları gibi hücreleri izole etmekte ve altsınıfları ayrıştırmakta, değer biçilemeyecek derecede faydalar sağlamaktadır. Monoklonal antikorların çok özgül olması ise bir klon tarafından üretilen ürünün (Ig) tek bir molekülü tanımasına neden olmaktadır. Böylece, monoklonal antikorlar daha önce bilinmeyen ya da tam olarak karakterize edilemeyen moleküllerin izole edilmesinde ve saflaştırılmasında oldukça verimli ve yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Monoklonal antikorların bazı sınırlayıcı özellikleri de bulunmaktadır. Çünkü, monoklonal antikorların sabit bölgeleri gibi değişken bölgeleri de monoklonaldır. Bu nedenle, monoklonal



177

antikorlar, antikorların potansiyel effektör fonksiyonlarının sınırlı bir sayısına sahiptirler. Örneğin, bütün monoklonal antikorlar komplement oluşturmaz, protein-A’yı bağlamaz veya antikora-bağlı hücre tarafından gerçekleştirilen sitotoksisiteyi gerçekleştiremez. Buna ilaveten, gerçekten de her özgüllükteki fare monoklonal antikorlarının üretimi oldukça kolay olmasına rağmen, bazı uygulamalar için tercih edilen insan monoklonal antikorlarının üretimi oldukça zordur. Monoklonal antikorlarda bazı sınırlamalara yol açan kalıtsal özelliklerin üstesinden gelmek için ise transfektoma’lar (transfekte hücre hatları) kullanılmaya başlanmıştır. Genetiksel olarak manipüle edilmiş antikor genlerinin, lenfosit hücrelerine transfeksiyonundan sonra, bu genlerin ekspresyonları gerçekleştirilmektedir. Heptanlara, tümör antijenlerine ve yardımcı T hücrelerinin CD4 antijenine karşı kısmi olarak monoklonal antikorların türler arasında sınırlamalar göstermesi nedeniyle de ilgili olan hibrit insan-fare antikorları üretilmiştir. Potansiyel olarak, bir antikora herhangi özgül bir bağlama özelliği, sentetik oligonükleotidlerin kullanılması ve bölge-kontrollü mutajenezis ile eklenebilmektedir. Daha da önemlisi, doğada hiç bulunmayan sabit bölgelere sahip antikorlar gibi istenilen effektör fonksiyona sahip antikorlar ve hatta enzimler gibi immünoglobilin olmayan proteinler de üretilmektedir. Hücre kültürlerinde 10-100 μg cm-3 fare hibridomaları üretilebilmektedir. Hem hücre kültür tekniğinin, hem de tek-hücre tümör kültürlerinin kullanımının büyük-çaplı üretimi ise gram hatta kilogram düzeyinde ürün elde edilmesini sağlamaktadır; fakat her ikisi de oldukça pahalı yöntemlerdir. Buna karşılık, E. coli ve S. cerevisiae hücreleri, Fab fragmentlerinin, muhtemelen de bütün bir antikor molekülünün ifadesini, birleştirilmesini ve sekresyonunu yapabilmektedirler. Gen mühendisliği uygulamalarında en çok kullanılan, genetik yapısı ve fizyolojik özellikleri çok iyi bilinen bu iki mikroorganizma ise, her türlü amaç için kullanılabilecek antikor fragmentlerinin üretiminde maliyeti düşürecek çalışmaların yapılmasında kullanılmaktadır. 8.6.3.1. Monoklonal Antikorların Avantaj ve Dezavantajları Avantajları: i. Antikor oluşumunu sağlamak için kullanılan protein (antijen) preparatının saf olması zorunlu değildir. ii. Antikor oluşumu için genellikle fare kullanıldığından, gerekli olan antijen miktarı (50 μg) oldukça düşüktür. iii. Hedef proteinin farklı antijenik determinantlarına karşı farklı antikor tiplerinden oluşan çok fazla sayıda klon bulunabilir. Bu klonlar içerisinden düşük affiniteli bağlama kapasitesine (KD değeri 10–6–10–-8 M) sahip olan antikorlar tarama prosedürü esnasında seçilebilir. Bu antikorlar ise elüsyon esnasında karşılaşılan problemleri minimuma indirgemek için immünoaffinite kromatografisinin dizaynında kullanılır. iv. Uygun klon bulunduktan sonra, bu klonun sıvı-azot içinde depolanması nedeni ile sınırsız bir kaynak sağlanabilir. Klonun depolanabilmesi nedeniyle immünize edilen hayvanın ölümü, antikor üretimini sınırlamaz. Ayrıca, immortal hücre hatlarının teorik olarak geliştirilmiş olması nedeni ile çok fazla miktarda antikor elde edilebilir. v. Monoklonal antikorlar hemen hemen saf olduklarından, matriks üzerine tutuklanan antikorların tamamı hedef protein için özgüldür. vi. Molekülün fonksiyonel domaininin çalışılmasında özgül antikor kullanılabilir. Dezavantajları: i. Prosedür pahalı ve zaman alıcıdır. ii. Doku kültürü için çok iyi teknik cihazlara gereksimim duyulur.

178



iii. Antikor tarafından tanınan epitop, ilgilenilmekte olan antijen ile ilgisi bulunmayan birçok antijen tarafından paylaşılıyor olabilir. iv. Hibridoma hücre hatları ise genellikle kromozom kayıpları nedeni ile kararsızdırlar ya da bu hatlar doku kültürlerinin kontaminasyonu ile kaybedilebilirler. 8.6.4. İmmünoglobilinlerin Serumdan Fraksiyonlanması

Antikorların, kullanılmadan önce antiserumdan kısmi olarak ayrıştırılmasının gerçekleştirilmesi arzulanır. Bu amaçla, en çok kullanılan iki yöntem ise amonyum sülfat ile çökeltme (presipitasyon) ve DEAE (dietil amino etil) kromatografisidir. Bu iki yöntemin yanı sıra, immünoglobilinlerin saflaştırılmasında kullanılan farklı yöntemler de bulunmaktadır. Bu yöntemler ise genel özellikleri ile aşağıda sıralanmaktadır: i. Amonyum sülfat ile çökeltme: Amonyum sülfat ile fraksiyonlama, basit bir yöntem olmasına rağmen, antikorların kısmi olarak saflaştırılmasında verimliliği düşüktür. Bu amaçla, 40 mL doymuş amonyum sülfat (%77,7 w/v, (NH4)2SO4; pH 7,2-7,4) yavaş yavaş 60 mL seruma karıştırılarak ilave edilir. Amonyum sülfatın tamamının seruma eklenmesinden sonra, 1 saat daha karıştırma işlemine devam edilir ve karışım daha sonra, 5 000 g’de ve 22 °C’da 20-30 dakika santrifüjlenir. Santrifüjleme işlemi sonunda elde edilen çökelti (pellet) ise minimum hacimde saf su ile yeniden süspanse edilir. Elde edilen süspansiyon ise amonyum sülfatın uzaklaştırılması için diyalize veya jel filtrasyon kromatografisine (bkz. 5. Bölüm) tâbi tutulur. ii. Polietilen glikol ile çökeltme: γ-Globülinlerin (IgG) düşük çözünürlük özelliğinden PEG kullanılarak da yararlanılabilir. %50 PEG 6 000 solüsyonunun 0,1’lik hacmi seruma eklenir ve 30 dk karıştırılır ve karışım daha sonra, 5 000 g’de ve 22 °C’da 20-30 dakika santrifüjlenir. Santrifüjleme işlemi sonunda elde edilen çökelti (pellet) ise minimum hacimde saf su kullanılarak yeniden süspansiyon elde edilir. Elde edilen süspansiyon ise PEG’ün uzaklaştırılması için fraksiyonlama aralığı minimum 6 000 Da olan jel filtrasyon kromatografisine (bkz. 5. Bölüm) tâbi tutulur. iii. İzoelektrik çökeltmesi: Bu teknik özellikle IgM moleküllerinin fraksiyonlanması için uygundur ve çökeltme koşulları, üretilen antikorun özelliklerine bağlıdır. Örneğin, hibridoma kültür süzüntüsünden IgM moleküllerinin izoelektrik çökeltmesi ile büyük-ölçekli saflaştırılması, pH 5,0’de gerçekleştirilmektedir. Fakat, protein derişiminin artırılması ancak ultrafiltrasyondan (bkz. kısım 1.7.2) sonra sağlanabilmektedir. iv. İyon değiş-tokuş kromatografisi: Kolon materyali olarak DEAE-Sephacel’in kullanıldığı iyon değiş-tokuş kromatografisi ise IgG’nin diğer Ig’lerden ve serum proteinlerinden ayrıştırılmasını sağlar. Kromatografi için i. basamakta amonyum sülfat çökeltmesi ile elde edilen örnek, fosfat tampon çözeltisine karşı (0,1 M, pH 7,4) iyi bir şekilde diyalize tâbi tutulur. Bu arada kolon materyali yani jel, 1,6 x 20 cm ebatlarındaki bir cam kolona doldurularak jelin çökelmesi beklenir. Çökelmiş olan jel materyalinin üst yüzeyinin ise kolonun üst kısmından en az 2 cm aşağıda olmasına dikkat edilmelidir. Kolon materyalinin tam olarak çökelmesinden sonra ise kolon, kolon hacmimin 3-misli hacimdeki tampon ile yıkanarak kolonun dengelenmesi sağlanmalıdır. Dengelenmiş olan kolonun üstünde bulunan 2 cm’lik boşluğa ise amonyum sülfak çökeltmesi ile elde edilen ve diyalizlenmiş olan örnekten yükleme yapılır. Örneğin yüklenmesini takiben, kolondan fosfat tamponu ile Ig’lerin elüsyonuna başlanır ve elüsyon sıvısı 8 mL’lik fraksiyonlar halinde toplanır. İlk IgG piki (birinci pik) ise elüsyon fraksiyonlarından 8-10. tüplerden elde edilir. Kolonun fosfat tamponu ile yıkanması ise hiçbir pikin yer almadığı fosfat tamponunun absorbansına kadar (arka plan absorbansı) sürdürülür. Bu aşamadan sonra tampon değiştirilerek, içerisinde 50 mM NaCl içeren 200 mM fosfat tamponu kullanılır. İkinci tampon ile kolonun yıkanması ve fraksiyonların yine 8 mL’lik hacimlerde toplanması sonucunda, ikinci IgG piki (ikinci pik) yeni toplanan fraksiyonlardan yine 8-10. tüplerde belirlenir. İkinci IgG pikinin elde edilmesinden sonra, yine tampon çözelti değiştirilerek 100 mM NaCl içeren



179

200 mM fosfat tamponu kullanılır ve bu uygulamadan elde edilen fraksiyonlarda ise IgM piki gözlenir. IgM pikinin de elde edilmesinden sonra, fosfat tamponu içerisinde 0,5-1 M NaCl gradienti oluşturularak diğer serum proteinlerinin de kolondan elüsyonu gerçekleştirilir. Daha sonra ise kolon, kolon hacminin 3-misli bir hacimdeki 200 mM fosfat tamponu (pH 7,4) ile yıkanarak kolon materyali rejenere edilir. Bunu takiben, tekrar normal fosfat tamponu ile kolon yıkanır. Elde edilen fraksiyonlarda ise IgG varlığını belirlemek için SDS-PAGE ile analizleri yapılır. v. Hidrofobik kromatografi: γ-Globülinlerin çözünürlük özelliklerinin düşük olması, bu moleküllerin göreceli olarak hidrofobik karakterlerini yansıtmaktadır. Sodyum veya amonyum sülfat varlığında γ-globülinler birçok hidrofobik adsorbente bağlanırlar. Fakat, γ-globülinler için oldukça özgül ve yüksek derecede seçici olan hidrofobik adsorbent ise Porath tarafından tanımlanan Tjel’dir. T-jel ise divinil sülfone-aktive agaroza β-merkaptoetanolün bağlanmasından oluşmaktadır. Bu adsorbent, orijinal olarak diğer hidrofobik adsorbentlerin çalışılması sırasında kontrol amacı ile geliştirilmiştir. Fakat yapılan çalışmalarda kontrolün kendisinin, 0,5 M Na2SO4 varlığında γglobülinler için oldukça özgül bir adsorbent olduğu belirlenmiştir. Adsorbsiyondan sonra γglobülinlerin elüsyonu, düşük tuz içeren tamponlarla gerçekleştirilmektedir. Fraksiyonlar ise az miktarda da olsa Na2SO4 içerebileceğinden, fraksiyonlardaki sodyum sülfatın uzaklaştırılması gerekebilir. Bunun için ise diyaliz, ultrafiltrasyon veya jel filtrasyon kromatografisinden yaralanılabilir. vi. Affinite adsorbsiyonu: Staphylococcus aureus hücrelerinin dış kılıf proteini olan proteinA’nın selüloz disklere bağlanması ile IgG’nin ayrıştırılmasında affinite çökeltmesinin yanı sıra, affinite kromatografisi de kullanılmaktadır (bkz. kısım 8.7.6.1). Her bir havyan türü ise farklı Fc bölgelerine sahip olan çeşitli immünoglobilinler üretmektedirler. Örneğin IgG1, IgG2a, IgG2b ve IgG3 alt-sınıflarından oluşan fare immünoglobilinlerinin her birisi, Protein-A affinite kromatografisi ile farklı koşullarda elüe edilmektedirler. Bazı γ-globülünler ise Protein-A’ya iyi bir şekilde bağlanmazlar. Bu durumda ise Protein G kullanılmaktadır (bkz. kısım 8.7.6.2). 8.6.5. Antikorların Tutuklanması ve Proteinlerin Elüsyonu

İmmünoglobilin moleküllerinin agaroz matrikslerine bağlanması siyanojen bromid tekniği kullanılarak gerçekleştirilebilir (bkz. kısım 8.3.3). Antikorların tutuklanmış ligand olarak kullanılmasından sonra, viral orijinli membran proteinlerini de içeren çeşitli proteinlerin izolasyonları ve saflaştırılmaları da gerçekleştirilmiştir. Proteinlerin tutuklanmış antikora bağlanması, orta düzeyde tuz derişimleri içeren nötral bir tampon solüsyonu içerisinde elde edilir. Antijen–antikor kompleksi, genellikle oldukça yüksek bir affiniteye sahiptir. Antikora (liganda) bağlanan proteinlerin elüsyonu, proteinin antikora çok güçlü biçimde bağlanmasından dolayı (KD = 10–8–10–12 M), sıklıkla güçlü koşulların uygulanmasını gerektirir ve bu koşullar ise proteinin denatürasyonuna neden olabilir. Kolondan antijenlerin (protein) elüsyonunda ise antikorların (ligand) bozulmasını önlemek amacıyla pH değeri 2-3 olan (tipik olarak glisin-HCl) tamponlar kullanılır. Fakat elüsyon sıvısının pH değerinin düşük olması, genellikle elüe edilen antijenin bir enzim olması durumunda bu enzimin inaktivasyonuna yol açmaktadır. Alternatif olarak ise hepsi de denatürasyona sebep olan elüsyon prosedürleri, bir deterjanla birlikte veya tek başına yüksek tuz derişimlerinin kullanımını ve üre, SDS veya guanidin–HCl kullanımını içerir. Tiyosiyanat, perklorat, iodid, lityum bromid ve triflorasatat gibi yıkıcı ajanların 3 M’a kadar olan derişimlerinin kullanımı, denatürasyonu önleyebilir. Elüsyon koşullarının yıkıcı olması nedeni ile kolondan toplanan fraksiyonların hemen normal koşullara döndürülmesi gerekmektedir. Bu amaçla affinite kromatografisinden elüe edilen fraksiyonlar, doğrudan jel filtrasyon kromatografisine aktarılarak yıkıcı tuzların uzaklaştırılması sağlanabilir. Ayrıca çok

180



daha etkili bir uygulama ise antijeni de içeren adsorbentin, doğrudan jel filtrasyon kromatografisinin üzerine yerleştirildikten sonra elüsyonun ve tuz uzaklaştırma işleminin aynı anda yapılmasıdır. Optimal elüsyon koşulları ise her uygulamaya göre değişmektedir ve bu koşullar, moleküllerin adsorbente bağlanma gücü ve proteinlerin kakrlılığı tarafından belirlenir. Elüsyon ise genellikle örnek materyalinin yüklendiği akış yönünün ters yönünde gerçekleştirilir. Bu sayede, liganda çok kuvvetli olarak bağlanmış olan moleküllerin kolon boyunca bulunan ligandlarla yeniden etkileşim göstermesi önlenmiş olur. Soğuk distile su kullanılarak, başarılı bir elüsyonun yapıldığına dair çalışmalar da bulunmaktadır. Bu yöntemin esası ise ligand ile antijen arasındaki hidrofobik etkileşimin düşük sıcaklık ve düşük iyonik kuvvet nedeni ile zayıflatılmasına dayanmaktadır. İmmünoaffinite kromatografisi ile gerçekleştirilen ayrıştırma çalışmalarının her birisi çalışılmakta olan özgül proteinler için geliştirilmiş olmakla birlikte, yapılan özgül bir çalışmada bu yöntemlerin denenmesi yarar sağlayabilir.

Antijenlerin elüsyonunda kullanılan diğer bir yöntem ise elektroforez yöntemidir. Bu yöntemde ise antijenin yeteri kadar elektriksel yüke sahip olduğu bir pH’da, solüsyon içindeki antijenin küçük fragmentler halinde elektroforetik göçü sonucunda liganddan uzaklaşarak, fazla seyrelmeden denatürasyona neden olan tampondan uzaklaşması sağlanır. Çok daha farklı bir elüsyon yöntemi ise kırılabilir ayırıcı-kolların kullanılmasını içermektedir. Bu yöntemde ise ligand, agaroz matrikse bir fenil ester bağı aracılığı ile bağlanmaktadır. Fenil ester bağı ise imidazol-glisin tamponu (pH 7,4) ile kimyasal olarak kırılarak, ligand-antijen kompleksinin elde edilmesi sağlanmaktadır. Ne yazık ki bu yöntemle elde edilen kompleksteki ligand, antijenden ayrılamadığı gibi kolon materyali olan adsorbent ise ancak bir defa kullanılabilmektedir. 8.7. Grup–Özgüllüğü Gösteren Ligandlarla Affinite Kromatografisi 8.7.1. Lektin Affinite Kromatografisi

Lektinler havyanlar, bitkiler ve cıvık mantarlar tarafından üretilen ve özgül şeker kalıntıları ile geri–dönüşümlü olarak bağlanma yeteneğinde olan proteinler grubudur. Bu özellikleri nedeni ile lektinler, karbonhidratları dolayısı ile de glikoproteinleri bağlayabilmektedirler. Ayrıca, eritrositlerin ve kanserli hücrelerin aglütinasyonuna da neden olurlar. Bunun sonucu olarak da tutuklanmış lektinler, glikoproteinlerin, glikolipidlerin, polisakkaritlerin, hücresel partiküllerin, hücrelerin ve deterjanla–çözündürülmüş hücre membranı bileşenlerinin izolasyon ve ayrıştırılmasında değer biçilemez bir öneme sahiptirler. Lektinler aynı zamanda, malignant veya viral transfeksiyon nedeni ile oluşan variantların ve hücre gelişmesi süresince meydana gelen yüzey glikoproteinlerindeki değişikliklerin seviyesini ve/veya kompozisyonunu belirlemek için de kullanılmaktadır. Lektinlerin çoğu, tetramerik olan polimer yapılara sahiptirler. Lektinler, tek bir özgül sakkariti tanıdıkları durumda identik alt–birimlerden veya iki farklı sakkariti tanıdıkları durumda ise iki tipli alt–birimlerden oluşmaktadırlar. Lektinlerin hepsi 40–400 kDa arasında değişen göreceli moleküler kütleye (Mr) sahiptirler. Lektinlerin özgül sakkaritleri tanımaları ve bağlamaları, bu molekülleri, glikoproteinlerin ve özellikle de membran reseptör proteinlerinin saflaştırılmasında oldukça değerli kılmaktadır. Lektin kromatografisinde en yaygın kullanıma sahip olan lektinler, bol miktarda bulunmaları nedeni ile Legüminoz bitkilerden (bezelye, soya fasulyesi, keneotu tohumu) elde edilirler. Lektinler, yaygın olarak kullanılmakta olan tekniklerle agaroz matriksler üzerine tutuklanabilirler ve çoğunu günümüzde ticari olarak bulmak mümkündür (bunlardan bazılarının örnekleri ise aşağıda verilmektedir). Eğer bir glikoproteinin sakkarit bileşeninin yapısı bilinmiyorsa, ligand olarak tercih edilecek lektin, basit bir tarama prosedürü ile seçilir. Glikoproteinler tutuklu lektine bir kez bağlandığında, bu glikoproteinlerin elüsyonu birkaç yolla sağlanabilir. Bu elüsyon yolları, lektinin



181

affinite gösterdiği basit bir monosakkaritin kullanılarak yapılabildiği affinite elüsyonunu, glikoproteinle kompleks oluşturacak bir borat tamponunun kullanımını, dikkatlice yapılacak pH değişiminden (pH 3’ün altında veya pH 10’un üzerinde olmayacak şekilde) yararlanmayı veya ligandın hidrofobik etkileşimini indirgeyecek etilen glikol gibi bir ajanın kullanımını içerir. Lektin affinite kromatografisinin bir diğer çekici tarafı da, oldukça yüksek tuz derişimlerinin bulunduğu koşullarda da yürütülebilmesidir. Çünkü etkileşim, iyonik etkileşimlere dayanmamaktadır. Bundan dolayı, lektin affinite kromatografisi prensipte, preparatların tuz ile fraksiyonlanmasından sonra, doğrudan uygulanabilir. Hücrelerin dış membranların sakkarit bileşenlerinin faklı olması özelliğinden de yararlanılarak, lektin affinite kromatografisi hücre karışımlarının ayrılmasında da kullanılmaktadır. Çoğu lektin affinite kromatografisi ise sıradan LPLC kullanılarak yürütülmektedir. Tutuklanmış lektin içeren bazı kolon materyalleri ve bu materyallerin özellikleri ise takip eden alt-kısımlarda ele alınmaktadır. 8.7.1.1. Konkanavalin A (Con A)

Bir tür fasulyeden (jacbean) elde edilen konkanavalin A, tetramerik bir metalloprotein olup α– D–mannopiranozil, α–D–glukopiranozil ve yapısal olarak benzer kalıntıları taşıyan molekülleri bağlar. Konkanavalin A’ya bağlanacak olan şeker moleküllerinin, bu moleküle bağlanabilmesi için C3, C4 ve C5 pozisyonlarında –OH gruplarını bulundurması gerekmektedir. Con A Sepharose, konkanavalin A’nın BrCN metodu ile matrikse bağlanması ile elde edilmiş bir kolon materyalidir. Con A Sepharose hazırlanırken, süspansiyon halindeki matriks, kolon hacminin en az 10-misli hacimdeki bir başlangıç tamponuyla yıkanarak dengelenmelidir. Başlangıç tamponu ise nötral pH’da olmalı ve NaCl içermelidir (örneğin, 20 mM Tris–HCl; 500 mM NaCl; pH 7,4). Ayrıştırılacak olan moleküllerin konkanavalin A’ya bağlanması ise ortamda hem Mg2+ hem de Ca2+ iyonlarının bulunmasını gerektirmektedir. Kolon materyaline (konkanavalin A’ya) bağlanmış olan moleküllerin elüsyonu ise başlangıç tamponu içerisinde α–D–metilmannozid veya α–D–metilglukozid’in 0–500 mM’lık lineer gradienti ile sağlanabilir. Konkanavalin A’ya adsorblanan moleküllerin çoğu, 100–200 mM arasında serbest kalmaktadır, fakat çok daha güçlü adsorblanan moleküllerin ayrılması için daha yüksek derişimler gerekebilir. Lipoproteinlerin Con A Sepharose ile ayrıştırılmasında ise elüsyon işlemi pH 9’da, glukoz, mannoz, metil α–D–glukozid ve metil α–D–mannozid’in sırasıyla uygulanması şeklinde başarılmaktadır. Konkanavalin A’ya çok güçlü bir şekilde adsorblanan moleküllerin elüsyonu ise düşük pH’daki tamponların kullanılmasıyla (pH 3’den aşağısı kullanılmamalıdır) veya borat tamponu (100 mM; pH 6,5) ile sağlanabilir (çünkü borat, bazı polisakkaritlerle kompleks oluşturmaktadır). Con A Sepharose ise aşağıda sıralanmakta olan amaçlar için kullanılabilecek, grup– özgüllüğü gösteren bir adsorbenttir: •

Glikoproteinlerin, polisakkaritlerin ve glikolipidlerin ayrıştırılması ve saflaştırılması.

•

Enzim–antikor komplekslerinin saflaştırılması.

•

Karbonhidrat–içeren bileşiklerin kompozisyonundaki değişikliklerin belirlenmesi. Örneğin, gelişme ve farklılaşma esnasındaki değişiklikler.

•

Deterjanla–çözündürülmüş hücre glikoproteinlerinin izolasyonu.

•

Membran veziküllerinin ayrıştırılması.

membran

bileşenlerinden,

hücre

yüzey

182



8.7.1.2. Lentil Lektin

Lens culinaris (mercimek)’den elde edilen ve bir hemaglutinin olan lentil lektin, α–D–glukoz ve α–D–mannoz kalıntılarını bağlamaktadır. Lentil Lektin Sepharose, lentil lektinin BrCN metodu ile matrikse bağlanması ile elde edilmiş bir kolon materyalidir. Lentil Lektin Sepharose da Con A Sepharose gibi genel olarak kullanılabilen grup–spesifik bir adsorbenttir. Lentil Lektin Sepharose, deterjanla–çözündürülmüş membran glikoproteinleri de dahil olmak üzere glikoproteinlerin, hücre yüzey antijenlerinin ve viral glikoproteinlerin saflaştırılmasında kullanılmaktadır. Lentil lektin, glikozil ve mannozil kalıntılarını konkanavalin A’ya oranla daha az özgüllükte ayırt edebilmektedir. Aynı zamanda lentil lektin, basit şekerleri konkanavalin A’ya oranal daha zayıf olarak bağlamaktadır. Lentil lektinin basit şekerleri bağlama gücü, sodyum deoksikolatın %1’lik derişimine kadar devam etmektedir. Bu nedenle Lentil Lektin Sepharose, özellikle deterjanla– çözündürülmüş membran proteinlerinin saflaştırılmasında oldukça önemlidir. Lentil Lektin Sepharose hazırlanırken, süspansiyon halindeki matriks kolon hacminin en az 10-misli hacimdeki bir başlangıç tamponuyla yıkanarak dengelenmelidir. Başlangıç tamponunun pH değeri ise 3–10 aralığında olmalı ve EDTA gibi metal şelat ajanlarını içermemelidir. Dengelenmiş olan kolona yüklenmiş olan ve kolon materyaline (lentil lektine) bağlanmamış olan moleküllerin ve kirleticilerin elüsyonu, kolonun yatak hacminin 10-misli kadar başlangıç tamponunun kolondan geçirilmesi ilse sağlanır. Bağlanmış olan moleküllerin elüsyonu ise metil α–D–mannozid veya glikozid gibi kompetitif inhibitörleri içeren (100–200 mM) tampon ile sağlanabilir. 8.7.1.3. Wheat Germ Lektin

Wheat germ lektin (buğday tohum lektini), N–asetil–glikozaminil kalıntılarını bağlamaktadır. Wheat Germ Lektin Sepharose ve Agaroz Wheat Germ Lektin ise glikoproteinlerin ve polisakkritlerin saflaştırılmasında kullanılan grup–spesifik adsorbentlerdir. Bu kolon materyallerinin her ikisine de buğday tohum lektininin bağlanması, BrCN metodu ile gerçekleştirilmiştir. Wheat Germ Lektin materyalleri hazırlanırken, süspansiyon halindeki matriks kolon hacminin en az 5-misli hacimdeki bir başlangıç tamponuyla yıkanarak dengelenmelidir. Bağlanmış olan moleküllerin çoğunun elüsyonu, N–asetilglikozamin (GlcNAc) içeren (100–500 mM) tampon ile lineer veya basamaklı gradient uygulaması şeklinde sağlanabilir. 8.7.1.4. Helix pomatia Lektin

Bir salyangoz olan Helix pomatia’dan elde edilen lektin, N–asetil–α–D–galaktozaminil kalıntılarını bağlamaktadır. Altı identik (eş) veya oldukça benzer olan alt–gruptan meydana gelen bu lektinin moleküler kütlesi ise 79 kDa’dur. Bu alt–gruplardan her birisi ise bir tane zincir–içi disülfid bağı, bir tane de karbonhidrat–bağlanma bölgesi içermektedir. Alt–gruplar ise ikili gruplar (dimer) oluşturacak şekilde birbirlerine disülfid bağları ile bağlanmıştır ve molekülün doğal yapısı ise bu üç dimer grubun, kovalent-olmayan etkileşimlerle bir arada tutulmasından oluşmaktadır. Helix pomatia Lektin Sepharose ise adından da anlaşıldığı gibi, Helix pomatia’dan elde edilen lektinin BrCN metodu ile matrikse bağlanması ile elde edilmiştir. Bu kolon materyali ise özellikle T–lenfositleri olmak üzere, hücre preparatlarında kullanılmaktadır. Hücrelerin affinite kromatografisi ise genellikle oda sıcaklığında ve metabolik bir inhibitör olan sodyum azid varlığında (%0,02 w/v) gerçekleştirilir. Sodyum azidin hücrelere zarar verebileceği göz önünde tutularak, hücrelerin bu inhibitöre uzun süre maruz kalmamasına özen gösterilmelidir. Ayrıca hücrelerin, hücresel bütünlüğünün korunması için en ideal sıcaklık, tampon kompozisyonu gibi parametrelerin de iyi ayarlanması gerekmektedir.



183

Helix pomatia Lektin Sepharose hazırlanırken, süspansiyon halindeki materyal kolon hacminin en az 5-misli hacimdeki bir başlangıç tamponuyla yıkanarak dengelenmelidir. Bağlanmamış olan hücreler ve kirleticiler, kolon hacminin en az 20-misli hacimdeki bir başlangıç tamponuyla yıkanarak uzaklaştırılabilir. Bağlanmış olan hücrelerin ve moleküllerin özgül elüsyonu ise ya liganda ya da hedef molekül veya hücreye kompetitif (yarışmacı) olan ajanların kullanılması ile sağlanabilir. 8.7.2. Boya–Ligand Affinite Kromatografisi

Grup–spesifik ligandların özel bir grubunu ise boyalar oluşturmaktadır. Boyaların ligand olarak kullanılması ise 1960’lı yıllarda, Amersham Pharmacia Biotech Fine Chemicals (Uppsala, İsveç) firması tarafından Cibacron Blue F3G-A olarak bilinen mavi bir boyanın, yüksek moleküler kütleli çözünür agaroza bağlanarak, jel filtrasyon kromatografisinde boşluk hacminin belirlenmesi amacı ile markır (işaret) olarak kullanılması sonucunda başlamıştır. Bu markır ile yapılan çalışmalar sonucunda ise maya hücrelerinden elde edilen pürivat kinazın, jel filtrasyon kromatografisine uygulanması esnasında enzimin boşluk hacmi içinde elüe edilmesi, oldukça şaşırtıcı gelmiştir. Pürivat kinazın kolonun boşluk hacmi içerisinde elüe edilmesi ise bu molekülün beklendiğinden daha fazla bir moleküler kütleye sahip olduğuna işaret etmektedir. Fakat, pürivat kinaz ile birlikte markır kolona yüklenmediğinde ise pürivat kinazın, kolonun boşluk hacminden sonra elüe edildiği belirlenmiştir. Pürivat kinaz, ayrıştırmadan sonra markırın uzaklaştırılması zorunlu olsa da, jel filtrasyon kromatografisine önce markırsız olarak, daha sonra ise markır ile birlikte kolona yüklenerek izole edilmiştir. Böylece, pürivat kinazın boyaya bağlandığı ortaya çıkmıştır. Blue dekstranın, standart affinite kromatografisi metotları ile agaroza bağlanması sonucunda ise yeni bir adsorbent tipi üretilmiştir. Pürivat kinazla yapılan çalışmalar ile aynı yılda yapılmış olan başka bir çalışma sonucunda ise yine maya kaynaklı olan fosfofruktokinaz enziminin de pürivat kinaza benzer davranışlar gösterdiği belirlenmiştir. Takip eden yıllarda ise özellikle dehidrogenazlar olmak üzere, diğer enzimlerin de bu boyaya karşı affinite gösterdiği belirlenmiştir. Bu çalışmalar sonucunda ise hem konjuge halkalar, hem de iyonik gruplar içeren sentetik bazı triazin boyaların, bazı proteinleri bağlama yeteneğinde oldukları belirlenmiştir. Bundan dolayı, affinite kromatografisinde ligand olarak kullanılan boyaları tanımlamak için pseudo–ligandlar terimi kullanılmıştır. Etkileşimin özgül olmamasından dolayı, özel bir proteinin herhangi bir boya–ligandına bağlanıp bağlanmayacağını önceden kestirmek mümkün değildir. Fakat, ligand–bağlayıcı domainlerin hem iyonik hem de hidrofobik güçler yoluyla etkileşimi ortaya çıkardığı düşünülmektedir. Boyaların proteinleri bağlama özelliğine sahip olması, bu boyaların triazin metodu ile Sepharose 4B gibi matrikslere bağlanarak boya–ligandlarının oluşturulmasına, bu nedenle de proteinlerin saflaştırılmasında kullanılmalarına yol açmıştır. Tekniğin çekici tarafları ise boyaların ucuz olması, yaygın olarak kullanılmakta olan kolon materyallerine kolayca bağlanabilmesi ve oldukça kararlı olmalarıdır. En yaygın kullanılan boyalar ise Cibacron Blue F3G–A ve Procion Red H-E3B’dir (Şekil 8.7). Bu boyalar, NAD+ ve NADP+ gibi doğal olarak oluşan kofaktörlere yapısal olarak benzeyen bazı özelliklere sahiptirler. Bu yapısal özellikleri sayesinde boyalar, kinazlar, dehidrogenazlar, karboksipeptidaz G, plazminojen, plazminojen aktivatörleri ve adanilil–içeren (NAD+ ve NADP+ de dahil) maddelere gereksinim duyan diğer enzimler gibi, çok sayıdaki proteini bağlama yeteneğine sahiptirler. Özel bir proteinin ayrıştırılması için kullanılacak olan boyanın seçimi, deneysel olarak elde edilir ve deneme–yanılma yoluyla belirlenir. Bu amaçla, hedef proteinin hangi tip boya ligandına bağlandığını taramak amacı ile çoklu-boya tarama kitleri geliştirilmiş bulunmaktadır. Bu tip tarama kitlerden ilki olan ve Amicon firması tarafından üretilen kit Cibacron Blue F3G-A, Procion Turquoise H-A, Procion Green H-E4BD, Procion Red H-E3B ve Procion Yellow H-A olmak üzere beş boya

184



içermektedir. Daha sonraları ise çok daha fazla sayıda boya içeren tarama kitleri geliştirilmiş bulunmaktadır. Tutuklanmış nükleotid ligandlarının yerine, tutuklanmış boya ligandlarını kullanmanın ise bazı avantajları bulunmaktadır. Bu anvantajlar ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: i. Boya ligandları, birkaç seri jel hazırlama zahmetine katlanmadan, birkaç grup proteinin saflaştırılmasında kullanılabilecek çok yönlü bir kullanıma sahiptirler. ii. Adsorbentin kimyasal kararlılığı sayesinde tekrar tekrar kullanılabilirler. iii. Depolama süresince aktivite kaybı problem değildir. O

(a) Cibacron Blue F3G-A

NH2

SO3

R1 NH

N NH

O

R2

N

NH N

R1 = H veya SO3Na

SO3

R2 = SO 3Na veya H

M

O

SO3 O3S N N

N

(b) Procion Red H-E3B

N

O3S

SO3

HO OH

NH

NH N

NH N

M M

SO3

N

N

O3S

O

NH

N N OH

Şekil 8.7: Matrikse bağlanarak ligand oluşturan Cibacron Blue F3G–A ve Procion Red H-E3B’nin kimyasal yapıları.

8.7.2.1. Boya Kolonlarından Proteinlerin Elüsyonu

Cibacron Blue F3G-A ve Procion Red H-E3B’nin triazin metodu ile agaroz matrikslere kovalent olarak bağlanması ile elde edilmiş olan kolon materyalleri, ticari olarak bulunmaktadır. Önceden şişirilmiş olarak veya toz halinde temin edilen bu kolon materyalleri hazırlanarak kolona paketlendikten sonra, kolonun dengelenmesi için başlangıç tamponu ile yıkanır. Proteinlerin tutuklu boyaya tutturulması ise genellikle pH 7–8,5’da sağlanır. Hazır hale gelen kolona örnek materyal yüklendikten sonra, liganda bağlanmayan moleküllerin ve kirleticilerin kolondan uzaklaştırılması için yıkama işlemine bir süre daha devam edilir. Bazı proteinler, boyaların yapısal olarak nükleotid kofaktörlere benzemelerinden dolayı, boyalarla biyosipesifik olarak kombine olurlar. Albümin, lipoproteinler, kan pıhtılaşma faktörleri ve interferon gibi bazı proteinler ise elektroforetik ve/veya hidrofobik etkileşimler aracılığı ile aromatik anyonik boyalara daha az özgül olarak bağlanmaktadırlar. Biyospesifik olarak adsorblanan



185

proteinlerin elüsyonu, düşük derişimlerde serbest kofaktör içeren tamponların lineer veya basamaklı gradient şeklinde uygulandığı affinite elüsyonu ile başarılabilir. Enzimlerin çoğunun elüsyonu, düşük derişimlerde (genellikle 1–20 mM) kofaktörlerin kullanılması ile sağlanabilmektedir. Genel olarak, çok daha az özgül olarak adsorbe edilen proteinlerin elüsyonu için ise daha yüksek derişimlerde kofaktör veya NaCl veya KCl tuzu (1 M’dan az) içeren tamponların kullanılması gerekmektedir. Elüsyon, pH değişimi ile de başarılabilmektedir. İnterferon gibi daha az özgül olarak adsorblanan proteinlerin elüsyonu, üre ve potasyum izotiyosiyanat gibi daha etkili ajanların kullanıldığı tamponlar ile sağlanmaktadır. Elüsyon için dioksan (%10’a kadar) ve etilen glikol (%50’ye kadar) gibi polariteyi azaltan ajanlar da kullanılabilmektedir. 8.7.2.2. Boya Adsorbentlerinin Temizlenmesi ve Korunması

Kolonun kullanılmasından sonra bazı proteinler elüe olmadan kolonda kalabilir. Ayrıca, kolon içerisinde bakteriyal büyümenin önlenmesi için kolon kullanıldıktan hemen sonra temizlenmelidir. Kolonun alkali ile muamele edilmesi, genellikle kolonda kalan bu proteinleri uzaklaştırmaktadır. Daha iyi bir temizleme sağlamak için ise 0,5 M NaOH içerisinde 6 M ürenin kullanılması sonucunda, denatüre olmuş proteinlerin dahi kolondan uzaklaştırılması sağlanabilir. Fakat, kuvvetli bir temizleyici olan alkali-üre solüsyonunun kolon içerisinde fazla kalmamasına özen gösterilmelidir. Aksi halde Agaroz matriksin parçalanmasına yol açacaktır. Yaklaşık olarak alkali-üre yıkama solüsyonunun yarısı kolon boyunca akıtıldıktan sonra, seyreltik NaCl (örneğin, 10 mM) içeren tamponla bol miktarda yıkanır ve en son olarak da kolonun bir sonraki kullanıma hazır olması için başlangıç tamponu ile yıkanarak dengelenmesi sağlanır. Şayet kolon uzun süre saklanacaksa, kolon depolanmadan önce 10 mM sodyum azid içeren hafif alkali fosfat tamponu ile yıkanmalıdır. Uzun süre depolandıktan sonra, kolonun yeniden kullanmadan (ve en iyisi her kullanımdan) önce seyreltik bir alkali tampon ile yıkanması, kolon materyalinden ayrılmış olan boyanın uzaklaştırılmasına yardımcı olmaktadır. Cibacron Blue F3GA’nın agaroz matriksten en az aktığı pH ise yaklaşık olarak 10 olarak belirlenmişse de bu boyanın, pH 4-11 aralığında minimum akma gösterdiği belirlenmiştir. Asit muamelesi ise agaroz matriksin hidrolizine yol açtığından önerilmemektedir. Cibacron Blue F3G-A’nın Trisacryl matrikste ise pH 1-9 aralığında neredeyse hiç akma göstermediği belirlenmiştir. Boya kolonlarının çoğu defalarca kullanılabilir. Fakat, kolona uygulanan örnek materyalinin ham özütlerden doğrudan elde edilmesi, kolonun ömrünü azaltabilir. Bu nedenle, kolona yüklenecek olan örnek materyalinin yüklemeden önce amonyum sülfat çökeltmesi veya filtrasyon ile temizlenmesi, kolonun ömrünü uzatmaya yardımcı olabilir. 8.7.3. Heparin Affinite Kromatografisi

Heparin, oldukça fazla çeşitlilikteki biyomolekülleri bağlama yeteneğine sahip, yüksek oranda sülfatlanmış glikozaminoglikan molekülüdür. Heparin tarafından bağlanan moleküller ise enzimler (palamut hücre proteazları, lipoprotein lipaz, koagülasyon enzimleri süperoksid dismutaz), serin proteaz inhibitörleri (anti–trombin III, proteaz neksinler), büyüme faktörleri (fibroblast büyüme faktörü, Schwann hücre büyüme faktörü, endotelyal hücre büyüme faktörü), ekstrasellüler matriks proteinleri (fibronektin, vitronektin, laminin, trombospondin, kollojenler), nükleik asit–bağlama proteinleri [başlama (δ) faktörleri, uzama faktörleri, restriksiyon endonükleazlar, DNA ligaz, RNA polimeraz], hormon reseptörleri (östrojen ve androjen reseptörleri) ve lipoproteinlerdir. İmmobilize heparin, proteinlerle temel olarak iki şekilde etkileşim göstermektedir: i. Affinite ligandı olarak: Örneğin heparinin, büyüme faktörleri ve anti–trombin III ile olan etkileşimi bu tiptedir.

186



ii. Katyon–değiştirici olarak: Heparinin yüksek oranda anyonik sülfat gruplarına sahip olması nedeni ile örneğin, heparinin nükleik asit–bağlama proteinleri ile olan etkileşimi bu tiptedir. Bu etkileşimde heparin, polianyonik olan nükleik asitlerin yapısı gibi davranmaktadır.

Heparin Sepharose CL–6B, domuz intestinal mukozasından elde edilen heparinin, BrCN metodu ile çapraz–bağlı agaroza kovalent olarak bağlanması ile elde edilmiş bir kolon materyalidir. HiTrap Heparin ise heparinin, çapraz–bağlı matrikse N–hidroksisüksinimid metodu ile kovalent olarak bağlanması ile elde edilmiş bir kolon materyalidir. Ticari olarak toz halinde temin edilen Heparin Sepharose CL–6B, şişirildikten sonra kolona paketlenir ve 10 mM sodyum fosfat tamponu (pH 7,3) ile yıkanarak kullanıma hazır hale getirilir. Şişirilmiş olan jel, 110–120 °C, pH 7,0’de 30 dk otoklavlanabilir. Proteinlerin özgül olarak heparine bağlanması ise fizyolojik pH’da gerçekleşir. Özgül-olmayan iyonik etkileşimlerin önlenmesi için, örnek materyalinin kolona yüklenmesi esnasında kullanılan tamponun iyonik gücü en azından 150 mM olmalıdır (örneğin, 150 mM NaCl içeren 10 mM NaH2PO4, pH 7,3). Buna rağmen, şayet ayrıştırılmak istenen protein(ler) heparine katyon–değişimi ile bağlanıyorsa, bu durumda örnek materyalinin kolona yüklenmesi esnasında kullanılan tamponun iyonik gücünün düşük olması gerekebilir. Kolona bağlanmamış olan moleküllerin ve kirleticilerin yıkanarak uzaklaştırılmasından sonra, özgül olarak bağlanmış olan moleküllerin elüsyonu gerçekleştirilir. Şayet heparin, affinite ligandı olarak kullanılıyorsa, özgül olarak bağlanan moleküllerin elüsyonu, 1–5 mg mL–1 heparin içeren başlangıç tamponu ile gerçekleştirilebilir. Şayet heparin, katyon–değiştirici olarak kullanılıyorsa elüsyon, NaCl, KCl veya (NH4)2SO4 kullanılarak (maksimum 1,5–2 M) lineer veya basamaklı gradient uygulaması ile gerçekleştirilebilir. 8.7.4. Kalmodulin Affinite Kromatografisi

Kalmodulin, ATP’ye bağımlı enzimler olan adenilat siklaz ve siklik nükleotid fosfodiesteraz da dahil olmak üzere, enzimleri ve nörotransmisyonda rol alan çok sayıdaki proteinleri regüle eden, oldukça korunmuş bir proteindir. Bovin testiküler kalmodulinin BrCN metodu ile agaroz matrikse kovalent olarak bağlanması ile elde edilmiş olan Kalmodulin Sepharose 4B ise bu önemli moleküllerin daha ileri aşamalardaki çalışılmalarını yapabilmek amacı ile izolasyonlarında, oldukça verimli bir kolon materyali olarak kullanılmaktadır. Proteinlerin kalmodulin tarafından bağlaması ise kalmodulinin hidrofobik bölgelerinin proteinler ile olan etkileşimleri sonucunda gerçekleşmektedir. Kalmodulinin hidrofobik bölgelerinin ortaya çıkarılması ise Ca2+ iyonlarının, ayrı bir bölgede bulunan Ca2+–bağlama bölgelerine bağlanması sonucunda meydana gelen yapısal değişiklikle meydana gelmektedir. Şayet, enzimin substratı bulunuyorsa, proteinlerin kalmoduline bağlanması artırılabilir. Enzim–substrat– kalmodulin–Ca2+ kompleksinin daha dayanıklı olduğu belirlenmiştir. Kalmodulin affinite kromatografisinin verimini artırmak için, örnek materyal içindeki proteazlar mümkün olan en kısa sürede uzaklaştırılmalıdır. Çünkü, proteinlerin kalmodulin–bağlama bölgeleri genellikle, proteazlar için oldukça duyarlıdırlar. Örnek materyal içindeki serbest kalmodulin molekülleri ise örnek materyalinin kolona yüklenmesinden önce uzaklaştırılmalıdır. Bu işlem ise örnek materyalin, kalmodulin affinite kromatografisine uygulanmadan önce, Ca2+ iyonlarının bulunduğu hidrofobik interaksiyon kromatografisi (bkz. 9. Bölüm) veya iyon değiş–tokuş kromatografisi (bkz. 6. Bölüm) ile başarılabilir. Kalmodulin affinite kromatografisi için hazır duruma getirilen örnek, 2 mM CaCl ve 50–200 mM NaCl içeren ve bağlanma için iyi bir tampon olan 50 mM Tris–HCl, pH 7,5 ile kolona yüklenir. Bazı özgül-olmayan iyonik etkileşimlerin oluşması nedeni ile düşük tuz derişiminin (50–200 mM NaCl) kullanılması, bu tipteki bağlanmaları elemine etmek için önerilmektedir.



187

Kalmoduline proteinlerin özgül olarak bağlanmaları, Ca2+ iyonlarının bulunmasına bağlı olduğundan, proteinlerin kolondan elüsyonu, Ca2+ iyonlarını bağlayarak kalmodulinin yapısının değişmesine yol açan şelat ajanları ile gerçekleştirilebilir. Şelat ajanları ile Ca2+ iyonlarının bağlanması, kalmodulinin proteinleri bağlamasını sağlayan yapısal değişikliğin ortadan kalkmasına ve bunun sonucu olarak da proteinlerin kolondan elüsyonuna yol açacaktır. Şelat ajanı olarak ise 2 mM EGTA kullanılması ideal olmakla birlikte EDTA da kullanılabilmektedir; fakat EGTA kadar verimli olmamaktadır. Ca2+ iyonlarının yer değiştirmesi, yüksek tuz derişimleri (örneğin, 1 M NaCl) ile de sağlanabilir, fakat tuzun elüsyon etkisi özgül değildir ve bu nedenle ilk tercih olarak kullanmaktan sakınılmalıdır. 8.7.5. Nükleotid Affinite Kromatografisi

Poli–U ve poli–A gibi oligonükleotidlerin ve 5’-AMP ve 2’5’-ADP gibi nükleotidlerin tutuklanması ile elde edilmiş kolon materyallerinin kullanılması ile bazı nükleik asitlerin ve proteinlerin, affinite kromatografisi ile ayrıştırılarak saflaştırılması ise günümüzde oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır. Farklı nükleotidlerin ligand olarak kullanılması sonucunda, farklı tipte nükleotid affinite kromatografi materyalleri bulunmaktadır. Bu materyaller ve kullanıldığı alanlarla birlikte özgül özellikleri ise takip eden alt-kısımlarda ele alınmaktadır. 8.7.5.1. Poli–U Affinite Kromatografisi

Poli–U Sepharose 4B, uzun bir poli–U zincirinin (yaklaşık 100 nükleotid uzunluğunda) BrCN metodu ile Sepharose matriksine kovalent olarak bağlanması ile elde edilmiş bir kolon materyalidir. Bu kolon materyaline, poli–U dizisine affinitesi olan m–RNA ve diğer nükleik asitler veya proteinler, özgül ve geri–dönüşümlü olarak bağlanmaktadırlar. Tutuklu Poli–U dizilimi ile m–RNA arasındaki etkileşim, neredeyse bütün m–RNA moleküllerinin karakteristik bir özelliği olan poli–A kuyrukları ile poli–U dizilimi arasındaki baz eşleşmesi sonucunda oluşan hibridizasyona dayanmaktadır. m–RNA molekülleri çok kısa poli–A kuyruklarına sahip olsalar dahi, poli–U ligandlarının kullanıldığı affinite kromatografileri yüksek oranda verimlilikle sonuçlanmaktadır. Poli–U Sepharose 4B matriksinin yok denecek kadar özgülolmayan adsorbsiyon göstermesi nedeni ile bu matriks, iyi bir akış oranı ve kısa bir sürede saf m– RNA moleküllerinin elde edilmesini sağlamaktadır. Toz halinde ticari olarak bulunan Poli–U Sepharose 4B, NaCl solüsyonu (100 mM; pH 7,5) ile şişirildikten sonra cam filtreden geçirilerek yıkanır (her bir gram kuru matriks için 100 mL). Jel daha sonra uygun bir kolona paketlenir ve aynı orandaki elüsyon tamponu ile yıkandıktan sonra, başlangıç tamponu ile dengelenir (%25 formamid içinde 700 mM NaCl; 50 mM Tris–HCl; 10 mM EDTA; pH 7,5). Poli–U affinite kromatografisine uygulanacak polizomal örnekler, ribonükleazların inhibisyonunu sağlamak amacı ile deterjan solüsyonları (%1 lauroyl–sarcosine; 30 mM EDTA) içinde hazırlanmalıdır. Bunun yanı sıra, diğer ribonükleaz inhibitörleri de kullanılabilir. Örnek materyal 5-kat seyreltildikten sonra kolona yüklenir. Kirleticilerin uzaklaştırılması için kolon, kolon yatak hacminin 10-misli başlangıç tamponu ile yıkanır. Poli–U ligandı ile m–RNA arasındaki biyospesifik etkileşim, H bağları aracılığı ile sağlandığından, m–RNA moleküllerinin elüsyonu da H bağlarını kıran her türlü koşulda sağlanabilir. Formamid, poli–U:poli–A hibridi arasındaki H bağlarını kırarak etkili bir ayrılma sağlamaktadır. Alternatif elüsyon prosedürü olarak sıcaklığın artırılması da kullanılabilir. m–RNA moleküllerinin elüsyonu için kullanılan tampon ise %90 formamid içinde hazırlanan, deterjan içeren bir solüsyondur (10 mM potasyum fosfat; 10 mM EDTA; %0,2 lauroyl–sarcosine; pH 7,5). m–RNA

188



moleküllerinin elüsyonu ise 254 nm’de UV spektrofotometresi ile takip edilebileceği gibi çok daha hassas olarak radyoaktif işaretleme ile de takip edilebilir. 8.7.5.2. Poli–A Affinite Kromatografisi

Poli–A Sepharose 4B, uzun bir poli–A zincirinin (yaklaşık 100 nükleotid uzunluğunda) BrCN metodu ile Sepharose matriksine kovalent olarak bağlanması ile elde edilmiş bir kolon materyalidir. Bu kolon materyaline, poli–A dizisine affinitesi olan m–RNA–bağlama proteinleri, viral RNA ve DNA’ya bağımlı aktivite gösteren RNA polimeraz gibi oldukça farklı moleküller, özgül ve geri– dönüşümlü olarak bağlanmaktadırlar. Poli–A Sepharose 4B, çok fazla sayıdaki molekül grubunun ayrıştırılmasında kullanılabileceği nedeni ile tek bir optimum prosedürün tanımlanması mümkün değildir. Buna rağmen, burada verilen metot diğer uygulamalar için bir temel oluşturmaktadır. Toz halinde ticari olarak bulunan Poli–A Sepharose 4B, NaCl solüsyonu (100 mM; pH 7,5) ile şişirildikten sonra uygun bir kolona paketlenir. Paketlenen jel, önce 100 mM NaCl solüsyonu (her bir gram kuru matriks için 100 mL) ile daha sonra da formamid tamponu ile (%90 formamid içinde 10 mM fosfat; 10 mM EDTA; pH 7,5) yıkanır. Yıkanan jel, kolon yatak hacminin 5-misli başlangıç tamponu ile dengelenir. Poli–A Sepharose 4B’nin dengelenmesi için kullanılacak başlangıç tamponları ise protein ve nükleik asit örneklerine uygun olarak hazırlanmalıdır. Protein örnekleri için kullanılabilecek başlangıç tamponu, bağlanmanın sağlanması amacı ile düşük iyonik kuvvetli olmalıdır (örneğin, 10 mM Tris–HCl; pH 7,4). Şayet gerek varsa, düşük moleküler kütleli kükürt (tiyol) bileşikleri, EDTA ve metal iyonları eklenebilir. Nükleik asit örnekleri için kullanılabilecek başlangıç tamponu, proteinlerin bağlanmasını en aza indirgediği için yüksek iyonik kuvvetli olmalıdır. Ribonükleazları inhibe etmek için ise lauroyl–sarcosine veya başka bir uygun ajan kullanılabilir. Bu amaçla, %25 formamid içinde hazırlanan 700 mM NaCl; 50 mM Tris–HCl; 10 mM EDTA; pH 7,5 uygun olmaktadır. Poli–A ligandları ile proteinlerin saflaştırılmasında dikkate alınması gereken diğer bir husus ise şayet, örnek materyal nükleik asitleri içeriyorsa, örneğin kolona yüklenmeden önce RNaz ile muamele edilmesidir. Çünkü, nükleik asitler poli–A ligandına bağlanarak kolonun verimliliğini olumsuz yönde etkileyebilir. Bunun bir sonucu olarak da, nükleik asit içeren örneklerle, nükleik asit içermeyen örneklerin elüsyon profilleri faklı olacaktır. Bu nedenle, nükleik asit içeren örnekler kolona yüklenmeden önce, RNaz ile muamele edilmelidir. Protein örneklerinin kolondan elüsyonu ise iyonik kuvvetin artırılması, formamid ile muamele, pH’nın indirgenmesi, SDS veya 7 M guanidin HCl ile muamele yöntemleri ile sağlanabilir. Nükleik asitlerin kolondan elüsyonu ise formamid ile muamele, sıcaklığın artırılması ve iyonik kuvvetin artırılması gibi, H bağlarını bozacak koşulların uygulanması ile başarılabilmektedir. 8.7.5.3. 5’ AMP ve 2’5’ ADP Affinite Kromatografisi

5’-AMP Sepharose 4B ve 2’5’-ADP Sepharose 4B, sırasıyla NAD+ (NAD+–bağımlı dehidrogenazlar ve ATP–bağımlı kinazlar) ve NADP+ (NADP+–bağımlı dehidrogenazlar ve NADP+’e affinitesi olan diğer enzimler) kofaktörlerine gereksinim duyan enzimleri ayrıştırmada kullanılan, grup–özgüllüğü gösteren adsorbentlerdir. 5’-AMP ve 2’5’-ADP ligandları, bu adsorbentlere bağlanan enzimler tarafından gereksinim duyulan doğal kofaktörlerin yapısal analoglarıdırlar. 5’-AMP Sepharose 4B ve 2’5’-ADP Sepharose 4B materyallerinin her ikisi de, enzimler ile maksimum biyospesifik etkileşimin sağlanabilmesini garantilemek amacı ile 6 C uzunluğunda ayırıcı–kollara sahiptirler.



189

Toz halinde ticari olarak bulunan kolon materyalleri şişirildikten sonra, fosfat tamponu ile cam filtreden geçirilerek yıkanır (100 mM; pH 7,0; her bir gram kuru matriks için 100 mL). Yıkanmış olan jel, uygun bir kolona paketlenir ve dengelenir. Dengelenmiş olan kolona örnek yüklendikten sonra, kirleticilerin uzaklaştırılması için yıkama yapılır. Özgül olarak liganda bağlanan moleküllerin elüsyonu ise seçici elüsyon koşullarının uygulanması ile sağlanır. Seçici elüsyon koşullarının uygulanması ise adsorbente bağlanan her bir enzimin hem tutuklu ligand için hem de elüent içindeki kofaktörler, substratlar, inhibitörler veya effektörler için göstereceği affinitenin farklı olmasından dolayı mümkündür. Tutuklu nükleotidlere bağlanan enzimlerin elüsyonu ise biyospesifik affinite elüsyonu, iyonik kuvvet gradient elüsyonu, pH gradient elüsyonu ve sıcaklık gradient elüsyonu ile yapılabilmektedir. Bunun yanı sıra, kofaktörlerin ve okside edilmiş substratların ve substrat analoglarının veya inhibitörlerin varlığında, dehidrogenazlar ile oluşturulmuş üçlü komplekslerin oluşturulması da kullanılabilir. Örneğin, NAD+ ve piruvat kullanılarak, laktat dehidrogenazın elüsyonu gerçekleştirilmiştir. 8.7.6. Protein-A ve Protein-G ile Affinite Kromatografisi

Bakteriyel kaynaklı olan protein-A (Staphylococucus aureus) ve protein-G (Streptococcus), özgül olarak poliklonal ve monoklonal IgG–tipi antikorlarının Fc bölgelerini bağlarlar. Protein-A ve protein-G’nin tutuklu formları ise monoklonal IgG–tipi antikorların saflaştırılması, poliklonal IgG’lerin izolasyonu ve fraksiyonlanması ve immün komplekslerinin izolasyon ve saflaştırılmasında yaygın olarak kullanılmaktadırlar. 8.7.6.1. Protein-A Affinite Kromatografisi

Staphylococucus aureus hücrelerinin dış membranından izole edilen protein-A, çok sayıdaki memeli türünden elde edilen IgG moleküllerinin Fc fragmentleri ile etkileşim göstermektedir (Tablo 8.4). Domuz, köpek ve kediden elde edilen bazı poliklonal IgM ve IgA moleküllerinin protein-A ile fraksiyonlanmasının yanı sıra, IgM ve IgA içeren monoklonal antikorlar da protein-A için affinite göstermektedirler. Bunun yanı sıra protein-A, insan IgG alt–sınıflarından 1, 2, ve 4’ü bağlamakta, fare IgG alt–sınıfları için ise farklı bağlama affiniteleri göstermektedir. İnsan kaynaklı immünoglobilinlerden protein-A ile en reaktif olanı IgG olsa da, bazı diğer tipteki immünoglobilinlerin de protein-A ile bağlandığı bilinmektedir. İnsan ağız sütü immünoglobilini olan IgA’nın yanı sıra, insan miyolema IgA2 de protein-A ile etkileşim göstermekte, fakat IgA1 göstermemektedir. Ayrıca, bazı insan monoklonal IgM, normal ve makroglobulinamik seralardan elde edilen IgM’ler de protein-A’ya bağlanmaktadır. Protein-A sentezinden sorumlu olan genin klonlanması sonucunda, bu proteinin oldukça farklı formları bulunmaktadır. Protein-A’nın çapraz–bağlı agaroz matrikse BrCN metodu ile kovalent olarak bağlanması ile Protein-A Sepharose, N–hidroksisüksinimid metodu ile agaroz matrikse kovalent olarak bağlanması ile de HiTrap Protein-A ve Protein-A Superose kolon materyalleri elde edilmiştir. Fizyolojik pH ve iyonik kuvvette çok sayıdaki türün IgG molekülleri ve bunların alt–sınıfları protein-A’ya bağlandığından, başlangıç tamponu olarak sodyum fosfat (10 mM), NaCl (150 mM), pH 8, kullanılabilir. Paketlenmiş olan kolon materyalinin başlangıç tamponu ile yıkanmasından sonra, kolona yüklenen örnek materyali içindeki kontaminatların ve bağlanmamış moleküllerin uzaklaştırılması için kolonun, kolon yatak hacminin 10-misli başlangıç tamponu ile yıkanması gerekir. Liganda bağlanan moleküllerin elüsyonu ise kuvvetli elüsyon koşullarında gerçekleştirilir. Kolon materyali ise pH 2–11 arasında dayanıklı olup, yüksek derişimlerdeki üre, guanidin HCl ve SCN–, CCl3COO– veya I– gibi yıkıcı tuzların nötral solüsyonlar içinde uygulanmasını tölare edebilmektedir. Bu nedenle elüsyon, genellikle pH 3 olan 1 M asetik asit, 100 mM glisin–HCl

190



tamponu veya 3 M potasyum izotiyosiyanat ile başarılmaktadır. Elüsyon koşullarının oldukça dramatik olmasından dolayı, elüe edilen fraksiyonları yaklaşık nötral pH’da toplamaya yarayacak daha yumuşak çözücüler (birkaç damla, 1 M Tris–HCl; pH 9,0) içinde toplamak gerekebilir. Tablo 8.4: Protein-A ve protein-G’nin farklı türlere ait IgG moleküllerini bağlama kuvvetleri*. Tür

Protein A

Protein G

Tavuk

–

–

İnek

+

++

Köpek

++

+

Keçi

+

++

Gine domuzu

++

+

–

++

İnsan IgG1 IgG2 IgG3 IgG4

++ ++ – ++

++ ++ ++ ++

Fare

+

+

Domuz

++

++

Tavşan

++

++

Rat

–

+

Koyun

–

++

At

*Proteinlerin antikorları bağlama şiddeti: ++ güçlü; + orta; – zayıf veya hiç.

Daha duyarlı antikorların izolasyonlarının yapıldığı durumlarda ise özgül ayrılmayı sağlayan, daha yumuşak elüsyon metotlarının kullanılması tercih edilmelidir. IgG’nin Fc fragmentlerindeki tirozin kalıntılarının protein-A ile etkileşime katıldığı bilinmektedir. Bu nedenle, elüsyon için glisiltirozin kullanılabilir. Elüsyon sırasında ise elüentin (oda sıcaklığında, 2 M NaCl; pH 7,0 içinde 100 mM glisiltirozin) akış yönü, yıkama tamponunun akış yönünün tersine çevrilir. Elüsyon sonrası toplanan IgG fraksiyonlarındaki tuz ise çeşitli yöntemlerle uzaklaştırılmalıdır. IgG’nin deformasyonuna yol açan elüsyon koşulları yüksek verimlilikle sonuçlanmasına rağmen, çok daha ılımlı olan özgül elüsyon koşulları ile saflaştırılan IgG moleküllerinin denatüre olmadıkları görülmektedir. 8.7.6.2. Protein-G Affinite Kromatografisi

Protein-A gibi protein-G de, IgG’lerin Fc bölgelerini bağlamaktadır. Buna rağmen, proteinG’ye sıkı bir şekilde bağlanan poliklonal IgG’lerin sayısı daha fazlardır ve adsorbsiyon, oldukça geniş bir pH aralığında gerçekleşmektedir. Farklı alt–sınıflara ait IgG’lerin bağlanması dikkate alındığında, protein-G’nin, insana (toplam IgG popülasyonunun yaklaşık %8’ini oluşturan IgG3’de dahil) ve fareye (fare IgG1’de dahil) ait bütün IgG alt–sınıflarını, standart tampon koşullarında eşit olarak bağladığı görülmektedir. Protein-A’ya ya hiç bağlanmayan ya da çok zayıf bağlanan koyun, inek ve at IgG’lerinin yanı sıra, rat IgG2a ve IgG2b, tutuklu protein-G ile saflaştırılabilmektedir. Antikorların çoğu ise Fab bölgeleri aracılığı ile zayıf bir affinite ile de olsa protein-G ile etkileşim göstermektedirler. İnsan miyolema IgM, IgA veya IgE’lerinin bazılarının ise protein-A ile bağlandıkları halde, protein-G ile bağlanmadıkları görülmektedir.



191

Streptococcus üyelerine ait protein-G geninin, E. coli’ye klonlanması ile üretilen rekombinant protein-G’nin üç tipi kullanılarak, Amersham Pharmacia Biotech tarafından HiTrap Protein-G, Protein-G Sepharose ve Protein-G Superose kolon materyalleri üretilmiştir. Bu kolon materyallerinde kullanılan rekombinant protein-G, doğal protein-G’nin albümin–bağlama bölgesinin genetiksel olarak çıkarılması ile elde edilmiş ve böylece, ligandın albümin ile olan istenmeyen reaksiyonları ve proteazlar ile degredasyonu önlenmiştir. Protein-G ligandları ise iki tane IgG bağlama domaini içermektedir. Bu rekombinant protein-G moleküllerinin kullanılması ile de farklı özelliklerde kolon materyalleri hazırlanmıştır. Örneğin, GammaBind G Sepharose ve GammaBind Plus Sepharose bu tipteki rekombinant protein-G’lerin ligand olarak kullanıldığı kolon matriksleridir. GammaBind G Sepharose matriksinde kullanılan protein-G’nin moleküler kütlesi 22 kDa olup, albümin–bağlama domainine sahip değildir ve proteazlar ile degredasyona dirençli olan bu protein, BrCN metodu ile matrikse bağlanmıştır. Bu rekombinant protein-G de E. coli’de üretilmiştir. Bu rekombinant protein, iki tane IgG–bağlama “B–domainleri” ve yüklü bir “C–bölgesine” sahiptir. C–bölgesi ise IgG bağlamada rol almayıp, 10 lizin kalıntısından oluşmaktadır. GammaBind Plus Sepharose matriksinde kullanılan protein-G’nin ise moleküler kütlesi 15 kDa olup, albümin–bağlama domainine sahip değildir, iki tane IgG–bağlama bölgesine sahiptir ve E. coli’de üretilmiş olan bu protein maleimid metodu ile matrikse bağlanmıştır. Çok sayıdaki türün IgG molekülleri ve bunların alt–sınıfları, fizyolojik pH ve iyonik kuvvete protein-G’ye bağlanmaktadır. Fizyolojik koşullara yakın bir bağlama (başlangıç) tamponu olarak, sodyum fosfat (10 mM), NaCl (150 mM), EDTA (10 mM), pH 7, kullanılabilir. Paketlenmiş olan kolon materyalinin başlangıç tamponu ile yıkanmasından sonra, kolona yüklenen örnek materyal içindeki kirleticilerin ve bağlanmamış moleküllerin uzaklaştırılması için kolonun, kolon yatak hacminin 10-misli başlangıç tamponu ile yıkanması gerekir. Liganda bağlanan IgG’lerin elüsyonu ise örnek materyalinin orijinine bağlı olarak, pH’nın 3–2,5 değişimi ile sağlanabilir. Örneğin, elüsyon sıvısı olarak amonyum hidroksit ile elüsyon pH’sına ayarlanmış, 500 mM asetik asit (pH 3–2,5) kullanılabilir. Elüsyon koşullarının oldukça dramatik olmasından dolayı, elüe edilen fraksiyonları yaklaşık nötral pH’da toplamaya yarayacak daha yumuşak çözücüler (birkaç damla, 1 M Tris–HCl; pH 9,0) içinde toplamak gerekebilir. 8.7.7. Küçük Ligandlar ile Affinite Kromatografisi 8.7.7.1. Benzamidin Affinite Kromatografisi

Sentetik bir inhibitör olan para–benzamidinin epoksi metodu ile matrikse kovalent olarak bağlanması (Şekil 8.8) ile elde edilmiş olan Benzamidin Sepharose, tripsin ve tripsin–benzeri proteazların yanı sıra, ürokinaz ve prekallikrein gibi zimojenlerin ayrıştırılmasında kullanılmaktadır. Bu kolon materyali, hem özgül bir proteazın izolasyonunda “pozitif” affinite kromatografisi için, hem de protein ya da peptid preparasyonlarından (örneğin, monoklonal antikor preparasyonları veya triptik parçalama) proteolitik aktivitenin uzaklaştırılması için “negatif” affinite kromatografisi olarak kullanılabilmektedir. Epoksi metodu ile matrikse bağlanmış olan ligand (Şekil 8.8), uzun bir hidrofilik ayırıcı–kolun yanı sıra, kararlı eter ve alkilamin bağları içermektedir. Süspansiyon halinde ticari olarak temin edilebilen kolon materyali, uygun bik kolona paketlenerek yıkanıp, dengelendikten sonra örnek materyal, 500 mM NaCl içeren Tris–HCl (50 mM, pH 8,0) tamponu içinde kolona yüklenir. Bağlanma, optimal olarak 4 °C’da gerçekleşirse de oda sıcaklığında da iyi sonuç vermektedir. Benzamidin–enzim etkileşiminin ekzotermik olması ve enzimatik aktivitenin baskılanması nedeni ile proteinlerin liganda bağlanması, düşük sıcaklıklarda daha iyi sonuç vermektedir. Yüklemeyi takiben, özgül-olmayan bağlanmaların ve kirleticilerin uzaklaştırılması için kolon yıkanır. Özgül

192



olarak liganda bağlanmış olan moleküllerin elüsyonu ise, rakip (yarışmacı) olarak elüsyon sıvısına serbest para–benzamidin ilavesi ile yapılabilir.

M

O

CH2

CH

CH2

O

(CH2)4 O CH2

OH

CHOH CH2 NH

H2N

C

NH

Şekil 8.8: Benzamidin ligandının kimyasal yapısı.

8.7.7.2. Lizin Affinite Kromatografisi

Lizin Sepharose, L–lizinin BrCN metodu ile kovalent olarak matrikse bağlanması ile elde edilmiş bir kolon materyalidir. Lizin ise matrikse, α–amino (–NH2) grubu aracılığı ile bağlandığından, hem ε–amino hem de α–karboksil (–COOH) grupları kromatografi esnasında örnek moleküller ile etkileşime katılmak üzere serbesttirler. Grup–özgüllüğü gösteren bir adsorbent olan Lizin Sepharose ile plazminojen ve plazminojen aktivatörlerinin izolasyonu, r–RNA moleküllerinin ayrıştırılması ve çift–zincirli DNA moleküllerinin saflaştırılması yapılabilmektedir. Ayrıştırma prosesinin mekanizması tam olarak anlaşılamamış olsa da, elektrostatik ve stereoözgül etkilerin her ikisi de izolasyona katkıda bulunmaktadır. Toz halinde ticari olarak bulunan kolon materyali 15 dakika su veya 100 mM NaCl içeren tampon (nötral pH’ya yakın) içinde şişirildikten sonra, aynı solüsyon ile yıkanır. Yıkanmış olan jel, uygun bir kolona paketlenir ve dengelenir. Dengelenmiş olan kolona örnek yüklendikten sonra, kirleticilerin uzaklaştırılması için yıkama yapılır. Daha sonra ise bağlı moleküllerin elüsyonu örnek materyale uygun bir metotla gerçekleştirilir. Lizin içeren tampon ile özgül elüsyon ise bazı durumlarda daha uygun olabilir. 8.7.7.3. Arjinin Affinite Kromatografisi

Arjinin Sepharose, L–arjininin BrCN metodu ile kovalent olarak matrikse bağlanması ile elde edilmiş bir kolon materyalidir. Matrikse bağlanmış olan ligand (Şekil 8.9), uzun bir hidrofilik ayırıcı– kolun yanı sıra, kararlı eter ve alkilamin bağları içermektedir. Arjinin ise matrikse, α–amino (–NH2) grubu aracılığı ile bağlandığından, hem guanidino hem de α–karboksil (–COOH) grupları kromatografi esnasında örnek moleküller ile etkileşime katılmak üzere serbesttirler. Grup–özgüllüğü gösteren bir adsorbent olan Arjinin Sepharose ile serin proteazların; prekallikrein, protrombin, plazminojen ve plazminojen aktivatörlerini içeren zimojenlerin saflaştırılması yapılabilmektedir. Süspansiyon halinde ticari olarak bulunan kolon materyali, uygun bir kolona paketlenir ve dengelenir. Dengelenmiş olan kolona örnek yüklendikten sonra, kirleticilerin uzaklaştırılması için yıkama yapılır. Daha sonra ise bağlı moleküllerin elüsyonu, özgül-olmayan elüsyon metodu ile gerçekleştirilebilir. Arjinin içeren tampon ile özgül elüsyon ise bazı durumlarda daha uygun olabilir.


M

O


CH2

CH

CH2

O

193

(CH2)4 O

OH

CH2 CHOH CH2 NH CH COO CH2

CH2 CH2

NH NH

C NH2

Şekil 8.9: Arjinin ligandının kimyasal yapısı.

8.8. Metal Şelat Affinite Kromatografisi

İlk defa 1975 yılında Porath ve arkadaşları tarafından uygulanan metal şelat affinite kromatografisi, günümüze kadar yavaş yavaş da olsa geliştirilerek protein saflaştırma tekniklerinden birisi olarak kullanılmaktadır. Cu2+, Zn2+, Hg2+ veya Cd2+ gibi tutuklanmış metal iyonlarının ya da Fe2+, Co2+, Ni2+ veya Mn2+ gibi geçiş (transisyon) metal iyonlarının, histidin kalıntılarının imidazol gruplarıyla, sistein kalıntılarının sülfidril gruplarıyla ve triptofan kalıntılarının ise indol gruplarıyla oluşturduğu reaksiyonlarla, proteinleri ve peptidleri seçici olarak tutuklu metal liganda bağlamak için kullanılan özel bir affinite kromatografisi şeklidir. Bu kromatografi şekli, özellikle poli–histidin, poli–sistein veya poli–triptofan füzyonları oluşturulmuş olan rekombinant proteinlerin saflaştırılmasında oldukça önemlidir (bkz. kısım 1.8.2). Metalloproteinler ise genellikle, kolon içerisindeki metal iyonlarını yakalama eğiliminde olduklarından, metal şelat affinite kromatografisi ile saflaştırmak için uygun materyaller değildirler. Bu teknikle saflaştırılmış olan proteinler arasında ise tekniğin ilk uygulaması olan Zn-TED kolonu ile serumdan α2makroglobülünlerin ayrıştırılması ve Fe3+-IDA kolonu ile kas özütlerinden fosforilaz ve laktat dehidrogenaz enzimlerinin ayrıştırılması yer almaktadır. Bunun yanı sıra, metal şelat affinite kromatografisi ile ayrıştırılması gerçekleştirilen proteinler arasında fibrinojen, süperoksit dismutaz ve histon olmayan nüklear proteinleri içeren bir grup protein de sayılabilir. 8.8.1. Matriks Materyalleri

Genellikle, bir iminodiasetat (IDA), tris(karboksimetil)–etilendiamin (TED) veya nitrilo triasetik asitin (NTA) kovalent olarak bağlandığı agaroz matriksleri, metal ligandların tutuklanmasında yaygın olarak kullanılmaktadırlar (Şekil 8.10). Metal şelat affinite kromatografisi için gerekli olan kolon materyalleri ise hem HPLC (HiTrap Chelating ve Chelating Superose) hem de LPLC (Chelating Sepharose) için bulunmaktadır. Bu kolon materyalleri, iminodiasetik asitin hidrofilik bir ayırıcı–kol oluşturacak şekilde, epoksi metodu ile çapraz–bağlı agaroz matrikse bağlanması ile elde edilmişlerdir ve pH 2–14 arasında kullanılabilirler. 8.8.2. Kolonun Hazırlanması ve Dengelenmesi

Ticari olarak temin edilen kolon materyalleri şelatlanmış metal içermediklerinden, bu matriksler kullanılmadan önce arzu edilen metal iyonu ile yüklenmelidirler. Kolon materyalinin metal iyonları ile yüklenmesi ise genellikle, 50 mM uygun metal tuzunu (ZnCl2, CuSO4 v.b.) içeren su ile kolonun yıkanması şeklinde gerçekleştirilir. Metal iyonları ile yüklenmiş olan matriks ise örnek materyalinin yüklenmesinden önce, fazla metal iyonlarının kolondan uzaklaştırılması için başlangıç tamponu ile yıkanmalıdır. Ayrıca, zayıf olarak bağlanmış metal iyonlarının aktif olarak kolondan uzaklaştırılması gerektiği durumlarda ise 1-10 mM imidazol veya 500 mM glisin gibi zayıf kompleks oluşturan ajanlarla kolonun yıkanması gerekebilir.

194



OH IDA

M

O CH2 CH

CH2 N

CH2COO CH2COO

CH2COO N

OH NTA

M

O CH2 CH

CH2COO

CH

CH2COO

CH2CH2N

OH TED

M

O CH2 CH

CH2 N

CH2COO M CH2COO

CH2COO

Şekil 8.10: İmmobilize metal iyon şelatör ligandlarından üç tipinin yapısı. IDA, iminodiasetat; NTA nitrilo triasetik asit; TED tris(karboksimetil)–etilendiamin. Her üç tipte de metal iyon şelatör ligandlarının matrikse bağlama işlemi Şekil 8.4’de gösterilen epoksi aktivasyon yöntemi ile yapılmaktadır.

8.8.3. Örnek Materyalinin Yüklenmesi ve Elüsyonu

Örnek materyal ise başlangıç tamponu içinde çözünmelidir. İyi bir bağlanmanın elde edilmesi için ise nötral veya hafif alkali pH’daki tamponların kullanılması gerekmektedir. Bu amaçla kullanılabilecek tamponlar ise tris asetat (50 mM), sodyum fosfat (20–50 mM) ve Tris–HCl (20–50 mM)’dir. Tris–HCl, bağlanmayı azaltma eğiliminde olduğundan bu tampon, sadece metal–protein affinitesinin oldukça yüksek olduğu durumlarda kullanılmalıdır. Başlangıç tamponunda yüksek derişimlerde tuz veya deterjanların bulunması, normalde proteinlerin bağlanmasını etkilemez. Bu nedenle, yüksek tuz derişimleri istenmeyen iyon–değişimi etkisinin önlenmesi için yüksek iyonik gücün (örneğin, 0,5–1 M NaCl) oluşturulmasına katkıda bulunurlar. Proteinin kolon içerisindeki tutuklanması, proteinin liganda tutturulmasına izin vermeye yetecek kadar ve liganda bağlanmamış kontaminatların elüsyonu sırasında ise proteinin kolonda alıkonmasını sağlayacak kadar kararlı, ortak bir bağın oluşturulması ile sağlanır. Kirleticilerin kolondan yıkanmasından sonra, metal–liganda bağlanan proteinin elüsyonu, birkaç yolla sağlanabilir. Bu yolların hepsinde de iyonik etkileşimlerin baskılanmasını sağlamak amacı ile elüsyon tamponu 0,5–1 M NaCl içermelidir. Bağlı moleküllerin özgül elüsyonu, ya hedef molekül ile ya da ligand ile yarışmacı (rakip) olan ajanların gradient şeklinde kolona uygulanması ile sağlanabilir. Amonyum klorid (0–150 mM), imidazol (0–50 mM) veya histamin ve glisin gibi, şelatlanmış metal için affinitesi olan diğer maddelerin artan derişimlerdeki gradientleri de kullanılabilir. EDTA (50 mM) veya diğer kuvvetli şelatlayıcılar ise metal iyonlarını ve kolona sıkıca bağlanmış olan materyallerin tamamının elüsyonuna neden olacağından, genellikle farklı proteinlerin ayrıştırılmasını sağlamazlar. Moleküllerin bağlama bölgelerindeki yüklü grupların iyonizasyon derecesi ise pH tarafından kontrol edildiği için, bağlı moleküllerin özgül-olmayan elüsyonu, pH gradienti ile sağlanabilir. Dolayısıyla, protein–metal kompleksinin zayıflatılmasıyla ya da elüsyon tamponunun iyonik gücünün artırılması ile proteinlerin elüsyonu gerçekleştirilebilir. pH değişimi ile bağlı moleküllerin ligandan ayrılması, pH’nın lineer gradient ya da basamaklı olarak düşürülmesi ile sağlanabilir. Proteinlerin çoğunun elüsyonu, pH 6,0 ile 4,2 arasında gerçekleştiğinden, pH gradientinin 7,0–4,0 arasında uygulanması normal bir sonuç vermektedir. Özgül-olmayan elüsyon koşullarının oldukça yıkıcı olmasından dolayı, elüsyonu yapılan fraksiyonların nötralizasyonunu sağlayacak daha ılımlı



195

tamponlar içinde toplanması veya tuzların uzaklaştırılması için uygun tekniklerin kullanılması gerekebilir. 8.9. Kovalent Kromatografisi

Bu kromatografi şekli, sülfidril (–SH) grubu içeren proteinlerin ve peptidlerin, disülfit grubu (S–S) içeren tutuklanmış bir ligandla etkileşiminden yararlanılarak ayrılması için, özel olarak geliştirilmiştir. Kovalent kromatografisi aynı zamanda, solid–faz peptid sentezi sırasında sentezi tamamlanmış olan peptidleri, sentezi tamamlanmamış olanlardan ayrıştırmada, civalanmış polinükleotidlerin tutklanmasında ve izolasyonunda, enzim tutuklamada ve affinite kromatografisi için başka adsorbentlerin sentezinde kullanılmaktadır. Kovalent kromatografide, izole edilecek olan sülfidril–içeren molekül, kovalent olarak kromatografik adsorbente bağlanır. Bunun başarılması ise izolasyonu yapılacak olan molekülün sülfidril gruplarının seçici olarak, sülfidril–disülfid değişimleri aracılığı ile karışık disülfid bağlarının oluşumu yoluula, sülfürlenerek aktive edilmiş matrikslere bağlanmasını gerektirir. Ayrıştırılacak olan moleküllerin sülfidril grupları ile matriksin sülfidril grupları arasındaki bağlanma geri–dönüşümlü olduğundan, kirleticiler ve matrikse bağlanmayan moleküller kolondan uzaklaştırıldıktan sonra, disülfid bağlarının indirgenmesi ile moleküllerin elüsyonu sağlanabilir. Kovalent kromatografisinin prensibi, Şekil 8.11’de şematize edilmiştir. Kovalent kromatografi için yaygın olarak kullanılan matriksler ise Activated Thiol Sepharose ve Thiopropyl Sepharose’dur. Bu adsorbentlerin her ikisi de sülfidril içeren moleküller ile ılımlı koşullar altında veya denatüre edici ajanların varlığında, kendiliğinden (spontane) ve geri–dönüşümlü olarak reaksiyona girmektedir. Activated Thiol Sepharose, 2,2’–dipiridil disülfid (aynı zamanda 2,2’–ditiyopiridin olarak da bilinmektedir) ve glutatyonun önceden BrCN ile aktive edilmiş matrikse bağlanması ile elde edilmiştir (Şekil 8.12,a). Hidrofilik glutatyon kalıntısı ise ayırıcı–kol olarak görev yapmaktadır. Thiopropyl Sepharose ise 2–tiyopiridilin kimyasal olarak kararlı bir eter köprüsü ile agaroz matrikse bağlanması ile elde edilmiştir (Şekil 8.12,b). Bu matriksteki 2–hidroksipropil kalıntısı ise hidrofilik bir ayırıcı–kol olarak görev yapmaktadır. Kovalent kromatografisi ile ayrıştırılarak saflaştırılmak istenen proteinler, disülfid formunda sistein kalıntıları içeriyorsa, bu disülfid köprüleri proteinler kolona yüklenmeden önce (örneğin, 2– merkaptoetanol kullanılarak veya alternatif yöntemlerle) indirgenmeli, böylece protein ile 2,2’– dipiridil disülfid aktivasyonu sağlanmalıdır. Toz halinde ticari olarak bulunan kolon materyali, pH 7,0 olan uygun bir tampon (kükürt, ağır metal veya indirgeyici ajanları içermeyen) içinde şişirildikten sonra, uygun bir kolona paketlenir ve dengelenir. Başlangıç tamponu olarak, NaCl içeren (100-500 mM) Tris–HCl, fosfat veya asetat gibi basit bir tampon kullanılır. Şayet gerekli görülürse, proteinlerin denatüre olmasını ve bütün sülfidril gruplarının reaksiyon için ulaşılabilir olmasını garantilemek amacı ile üre (8 M) veya guanidin HCl (6 M) eklenebilir. Kovalent kromatografi esnasında kullanılan bütün tamponlar ise serbest sülfidril gruplarının oksidasyonunu önlemek amacı ile havası alınmış tamponlar olmalıdır. Katalitik ağır metal iyonlarının uzaklaştırılması için ise EDTA (1 mM) kullanılabilir. Dengelenmiş olan kolona örneğin yüklenmesi ve elüsyonu sırasında ise genellikle akış hızının düşük olması (5–10 mL s–1) kolonun verimliliğini olumlu olarak etkilemektedir. Sülfidril içeren proteinle ligand arasındaki reaksiyon sırasında, 2–tiyopiridin serbest bırakılır (Şekil 8.11,b). Bu proses, 343 nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak takip edilebilir. Dolayısıyla, saflaştırılmak istenen proteinin absorbsiyonunun takip edilmesini de olanaklı kılmaktadır. Protein, matrikse kovalent olarak tutturulduktan sonra, sülfidril içermeyen kirleticilerin elüsyonu gerçekleştirilir ve tepki vermeyen tiyopiridil grupları ise 4 mM ditiyotreitol veya 2–merkaptoetanol kullanılarak kolondan uzaklaştırılır. Daha sonra ise kolon matriksine kovalent olarak bağlı bulunan


196


proteinlerin elüsyonu, nötral veya hafif alkali pH’da 20–50 mM ditiyotreitol, indirgenmiş glutathione veya sistein gibi sülfidril–içeren bir bileşikle yer değiştirilerek serbest bırakılır (Şekil 8.11,c). En son olarak matriks, 2,2’–dipiridil disülfit ile reaksiyona sokularak rejenere edilir (Şekil 8.11,d). Metod birçok proteinin saflaştırılmasında başarılı bir şekilde uygulanmıştır, fakat maliyeti ve diğer kromatografik tekniklere kıyasla rejenerasyon basamağının zor olması, kovalent kromatografinin kullanılmasını sınırlamaktadır. Bununla beraber, saflıktan çok uzak protein preparasyonlarına uygulanabilmektedir. N (a)

M

O

CH2

CH

CH2 S

S

OH İmmobilize 2'-piridil ligandı

P

SH

Sülfidril içeren molekül H N

N (b)

M

O

CH2

CH

CH2 S

S

+

P

S

HS

OH Kovalent olarak liganda bağlanan protein

Tiyone formu 2-Tiyopiridin 343 nm'de belirlenebilir

i. Bağlanmamış proteinler ve kontaminantların yıkanması ii. 4 mM ditiyothreitol ile reaksiyona girmeyen tiyopiridil grupları uzaklaştırılır iii. 20-50 mM ditihiothreitol ile bağlı proteinlerin elüsyonu

(c)

M

O

CH2

CH

CH2 SH +

OH

P SH Kolondan elüe edilen saf protein N

N S

S

2,2'-Dipiridil disülfid N (d)

M

O

CH2

CH

CH2 S

S

OH Rejenere edilmiş ligand

Şekil 8.11: Kovalent kromatografinin prensibi. (a)

M

NH CH

(CH2)2 C

NH CH

O

CO

COOH

CH2

S

S N

NHCH2COOH (b)

M

O

CH2 CH OH

CH2

S

S N

Şekil 8.12: (a) Aktive Thiol Sepharose’un ve (b) Thiopropyl Sepharose’un kısmi yapısı.



197

8.10. Affinite Kolonlarının Rejenerasyonu ve Saklanması

İmmünoaffinite kolonları yeniden kullanılmadan önce temizlenmelidir. Rejenerasyonun anlamı, kolon materyali içerisinde bir önceki kullanımdan kalmış olan bütün materyallerin uzaklaştırılması ve jelin başlangıç tamponu ile yeniden dengelenmesi demektir. Şayet jel içindeki bütün materyaller uzaklaştırılmazsa ve ligand uygun şekilde hazırlanmazsa, kolonun verimliliği düşecektir. Kolonun verimliliğinin düşmesi ise daha az örnek materyalinin bağlanması ve çözünürlüğün düşmesi ile sonuçlanacaktır. İmmünoaffinite jellerinin uygun şekilde korunması durumunda, bu jeller tekrar tekrar kullanılabilir. Jellerin kaç defa kullanılabileceği ise örnek materyaline, liganda ve elüsyon koşullarına bağlıdır. Jellerin temizlenmesinde ise ya özgül elüsyon sıvısının daha yüksek bir derişimi ya da sodyum klorür (0,5-1 M) gibi özgül-olmayan bir ajanın yüksek derişimleri kullanılabilir. Tuz derişiminin yükseltilmesi, genellikle özgül-olmayan bağlanmaların yanı sıra, özgül olarak bağlanmış olan, fakat elüsyon işlemi sırasında kolondan ayrılmayan bileşiklerin uzaklaştırılmasında da etkili olmaktadır. Kolonun rejenerasyonu sırasında, ligandın hasar görmemesi veya aktivitesinde bir değişikliğin olmaması için dikkatli olunmalıdır. Bazı durumlarda yüksek tuz derişimi, proteinlerin üçboyutlu yapısının değişmesine neden olabilmektedir. Bu nedenle, ligand şayet bir protein ise ligandın aktif bölgesi değişikliğe uğrayabilir ve bunun sonucu olarak da ligandın bağlama kapasitesi kısmen veya tamamen kaybolabilir ya da örnek molekül için olan affinitesini kaybedebilir. Bazı rejenerasyon prosedürleri ise neredeyse bütün jeller için yeterince naziktir. Amersham Pharmacia Biotech tarafından önerilen genel bir rejenerasyon prosedürü ise aşağıdaki şekildedir. Buna rağmen, kullanılan jel ile birlikte üretici firma tarafından bir rejenerasyon prosedürü öneriliyorsa öncelikle o prosedürün uygulanması gerekmektedir: i. Kolon, kolon yatak hacminin 10-misli hacmindeki, 0,5 M NaCl içeren Tris-HCl (100 mM, pH 8,5) ile yıkanmalıdır. ii. Kolon, kolon yatak hacminin 10-misli hacmindeki, 0,5 M NaCl içeren sodyum asetat tamponu (100 mM, pH 4,5) ile yıkanmalıdır. iii. Kolon, kolon yatak hacminin 10-misli hacmindeki, başlangıç tamponu ile dengelenmelidir. Şayet kromatografi esnasında deterjan veya denatüre edici ajanlar kullanılmış ise bunlar da ilk yıkama tamponu içinde kullanılmalıdır.

Ayrıca, ligand kararlılığı için gerekli olan katyon ve anyonlar da rejenerasyon tamponu içine ilave edilmelidirler. Örneğin, Con A (bkz. kısım 8.7.1.1) üçüncül yapısını korumak için Ca2+ ve Mg2+ veya Mn2+ iyonlarına (1-10 mM) gereksinim duymaktadır. Affinite jellerinin saklanması, genellikle hazırlandıktan sonra kolaydır. Hazırlanmış olan jellerin ideal koşullarda saklanması ise matrikse bağlanmış olan ligandın özelliğine bağlıdır. Genel olarak ise jellerin saklanması 4 °C’de yapılmaktadır. Çünkü, bu sıcaklıkta bakteriyal büyümenin azaltılması sağlanarak hem matrikse hem de liganda zarar vermesi önlenmiş olur. Genel olarak bütün affinite matriksleri klorheksidin diglukonat (veya asetat), sodyum azid ve %20 etanol gibi antimikrobiyal ajanların varlığında saklanmalıdırlar. İster kullanılmış olsun ister henüz kullanılmamış olsun, kolon materyallerinin donmasına izin verilmemelidir. Çünkü donma esnasında meydana gelen buz kristalleri, kolon materyallerinin yapılarının bozulmasına yol açabilmektedir.

198



9. HİDROFOBİK İNTERAKSİYON KROMATOGRAFİSİ (HIC)

9.1. Giriş

Günümüzde, hidrofobik interaksiyon kromatografisi (Hydrophobic Interaction Chromatography; HIC) olarak bilinen tekniğin temelini 1948 yılında Tiselius tarafından yayınlanan bir makale oluşturmaktadır. 1970’li yıllarda ise kolon materyali olarak kullanılan matrikslerin geliştirilmiş olması ve bu matrikslere arzu edilen ligandların bağlanabilmesi için geliştirilen teknikler, bu yıllara kadar ender olarak kullanılan hidrofobik interaksiyon kromatografisinin biyopolimerlerin saflaştırılmasında daha yaygın olarak kullanılmasına yol açmıştır. 1970’li yılların başında yapılan çalışmalar sonucunda sentezlenen ilk HIC adsorbentleri, iyonik-hidrofobik karışımından oluşan bir karakteristik özellik göstermişlerdir. Daha sonraki yıllarda ise Porath ve arkadaşları (1973) ile Hijérten ve arkadaşları (1974), yüksüz hidrofobik adsorbentleri sentezlemişlerdir. Yüksüz olan bu hidrofobik adsorbentlerin protein bağlama kapasitelerinin ise doğal tuzların yüksek derişimlerinde arttığı gözlenmiştir. Ayrıca, adsorbente bağlanmış olan proteinlerin elüsyonlarının, kolonun tuz içermeyen bir tampon ile yıkanması veya elüentin polaritesinin düşürülmesi ile sağlanabildiği gösterilmiştir. HIC, protein moleküllerindeki hidrofobik bölgeleri açığa çıkarmak için amonyum sülfat gibi bir tuzla çökeltilmiş (bkz. kısım 1.7.1) bileşiklerin varlığında gerçekleştirilir. Bu sebeple HIC, genellikle protein çözeltisi içinde amonyum ve sülfat iyonlarının bulunmasını sağlayan, amonyum sülfat çökeltmesinden hemen sonra uygulanır. Protein örneğinin pH’sı, proteinin izoelektrik noktasına ayarlanarak, prosesin verimliliği artırılabilir. Proteinler durgun faza adsorplandıktan sonra, adsorplanmış olan proteinlerin elüsyonu farklı yöntemlerle seçici olarak gerçekleştirilir. Bu yöntemlerde ise iyonik şiddeti kademeli olarak düşüren ya da pH’yı dereceli olarak artıran (bu da proteinin hidrofobisini artırır) bir elüent kullanarak veya durgun faza karşı olan affinitesi proteininkinden daha güçlü olan bir yer-değiştirici kullanarak elüsyon gerçekleştirilebilir. Proteinlerin kolondan elüsyonu için Tween 20 ve Triton X-100 gibi deterjanlar, bütanol ve etilen glikol gibi alifatik alkoller ve bütilamin gibi alifatik aminler kullanılabilir. Bu elüsyon yöntemlerinden bazılarının, elüsyonu yapılacak olan proteinlerin denatürasyonuna yol açması ise HIC’de potansiyel problemlerden birisidir. HIC tekniğinde karşılaşılan başka bir pratik problem ise bu tekniğin bazı proteinler için iyi çalışıp, bazıları için çalışmamasıdır. Bu problemin çözümü ise ancak deneme çalışmalarının sonuçlanması ile giderilebilir. İyi tanımlanmış olan HIC adsorbentlerinin ticari olarak bulunabilmesi ise serum proteinleri, membrana-bağlı proteinler, nüklear proteinler, reseptörler, hücreler ve rekombinant proteinler gibi oldukça farklı biyomoleküllerin ayrıştırılmalarının gerçekleştirilebilmesine yol açmıştır. Bu adsorbentler ise aynı zamanda enzimlerin ve lipozomların geri-dönüşümlü olarak tutuklanmaları için de kullanılabilmektedirler.

200



HIC matrikslerine proteinlerin adsorpsiyonunun prensibi, IEC ve GFC’ye komplementerdir. Bu nedenle HIC, proteinlerin saflaştırılması amacı ile takip edilen bir protokolde, genellikle IEC ve GFC ile bir kombinasyon oluşturacak şekilde kullanılabilmektedir (bkz. kısım 9.9). HIC aynı zamanda, protein moleküllerinin yapısal değişikliklerinin analizi amacı ile analitik bir araç olarak da kullanılabilmektedir. Ayrıca, minimum düzeyde ön-işlem görmüş olan örnek materyallerinin HIC için kullanılabilir olması, bu kromatografi tekniğinin geleneksel protein çökeltme teknikleri (bkz. kısım 1.7) ile kombinasyon halinde kullanılmasına da izin vermektedir. 9.2. HIC’nin Temel Prensipleri

Hidrofobik etkileşimler (interaksiyonlar), protein moleküllerinin üç-boyutlu yapılarının kararlılığını sağlayan en büyük güçlerden birisi olması nedeni ile biyolojik olarak oldukça önemli bir fenomendir. Hidrofobik etkileşimler, antijen-antikor ve enzim-substrat reaksiyonlarında rol almaktadır. Aynı zamanda, biyolojik membranları oluşturan lipit çift-tabakasının oluşturulmasında ve protein moleküllerinin membrana bağlanmasında da hidrofobik etkileşimlerin katkısı bulunmaktadır. Biyomoleküllerin yüzeysel hidrofobisitelerinden yararlanarak ayrıştırılmalarının sağlanabilmesi için ise hidrofobik interaksiyon kromatografisi geliştirilmiştir. Proteinlerin erişilebilir yüzey alanlarından en fazla %40-50’sinin non-polar olduğu bilinmektedir. Ilımlı tuz derişimlerinden yüksek tuz derişimlerine kadar çökeltme (salting-out) tuzlarını içeren koşullarda ise proteinlerin HIC adsorbentlerine bağlanmasında, protein yüzeyindeki polar-olmayan alanlar rol oynamaktadır. Tuz tarafından desteklenen bu etkileşimlerin kuvveti ise proteinlerin çökelme verileri ile HIC kolonundaki alıkonmaları arasındaki sıkı ilişkiden dolayı tahmin edilebilir. Fakat, proteinlerin çoğunun HIC kolonlarındaki alıkonma verilerinin her zaman hazır olmamasından dolayı, biyolojik örneklerdeki proteinlerden ilgilenilmekte olan hedef protein(ler)in bu verilerinin elde edilmesi gerekmektedir. Burada ise hidrofobik etkileşimlerin doğası hakkında kısa bir bilgi verildikten sonra, bu fenomene dayalı olarak gerçekleştirilen ayrıştırma tekniğinden bahsedilecektir. Hidrofobisite ise polar-olmayan bir bileşik ile su gibi polar bir çevre arasındaki itme olarak tanımlanabilir. Tek bir hidrofobik bileşik su içerisine konulduğunda, enerjitik olarak elverişsiz bir durum oluşur. Hidrofobik bileşik, çevredeki su moleküllerini düzenli bir yapı oluşturması için zorlar. Bu proses ise entropide bir düşme ile gerçekleşir. Şayet iki veya daha fazla polar-olmayan bileşik su içine konursa, bu bileşikler kendiliğinden agregat oluştururlar. Bu agregasyonun nedeni ise hidrofobik etkileşimlerdir. Hidrofobik etkileşimler ise entropinin artması nedeni ile enerjitik açıdan elverişlidir. Bu durum ise polar çevreye karşı daha az hidrofobik bölgenin maruz kalması sonucunda düzensizliğin artmasına yol açmaktadır. Hidrofobik etkileşimler ise ne hidrofobik grupların birbirine bağlanmasıdır, ne de kendi başlarına bir çekici güçtürler. Hidrofobik etkileşimler, polar çevreler tarafından polar-olmayan bileşikler üzerine oluşturulan zorlamadır. Hidrofobik etkileşimi oluşturan ise suyun moleküler yapısıdır. Bu bölümde ise özellikle proteinlerin saflaştırılması üzerinde durulmasına rağmen, biyomoleküllerin çoğunun belirli bir dereceye kadar hidrofobik özellik gösterdiğini de unutmamak gerekir. Proteinlerin yüzeysel hidrofobisiteleri, proteinlerin primer yapılarında yer alan polarolmayan amino asit kalıntılarının varlığıyla ilişkilidir. Proteinlerin yapısında yer alan ve hidrofobik özellikte olan amino asitler ise hidrofobisitesi en yüksekten en aza doğru triptofan, norlösin, fenilalanin, tirozin, lösin, valin, metionin ve alanin olarak sıralanmaktadır. Hidrofobik amino asit kalıntı grupları ise her bir proteine karakteristik özellikler verecek şekilde protein yüzeylerine dağılmışlardır. Hidrofobik etkileşimler, proteinlerin üçüncül ve dördüncül yapılarının kararlılığını sağlamaktadır. Buna ilaveten, hidrofobik amino asitlerin çoğu protein moleküllerinin dış yüzeyinde yer aldıklarından, doğal yapısında bulunan bir proteinin hidrofobisitesinin derecesi, bu amino asitler

9. HİDROFOBİK İNTERAKSİYON KROMATOGRAFİSİ


201

tarafından belirlenmektedir. Sulu çözeltilerde ise proteinlerin yüzeyindeki hidrofobik bölgeleri, hidrofobik grupları etkin bir şekilde gizleyen, düzenli bir su molekülleri filmi ile kapatılmış durumdadır. Bu gruplar, su moleküllerini düzenli olarak tutabilen tuz iyonlarının ilavesi ile açığa çıkarılabilirler. Açığa çıkan hidrofobik gruplar ise daha sonra birbirleriyle etkileşir. Bu olay, amonyum sülfat ile çökeltmenin (salting-out) temelini oluşturmaktadır (bkz. kısım 1.7.1). HIC’de ise hidrofobik grupları açığa çıkararak, protein-protein etkileşmesini sağlamaktan ziyade, uygun bir matrikse bağlanmış hidrofobik gruplar aracılığı ile protein-matriks etkileşimi sağlanmaktadır. En yaygın olarak kullanılan durgun fazlar ise agaroz matrikse bağlanmış alkil (heksil, oktil) veya fenil gruplarıdır. Fenil Sepherose ve Fenil SPW, düşük basınçlı HIC’de kullanılan; Bio-Gel TSK Fenil ve Spherogel TSK Fenil ise HPLC’de kullanılan ticari adsorbentlerden bazılarıdır. 9.3. HIC’yi Etkileyen Faktörler

Bir HIC adsorbentinin seçilmesi ve HIC ile ayrıştırmanın optimizasyonu esnasında göz önünde bulundurulması gereken temel parametreler aşağıdaki şekilde sıralanabilir: i. Ligand tipi ve yoğunluğu: Tutuklanmış olan ligand tipi (alkil veya aril), öncelikle HIC adsorbentinin protein bağlama seçiciliğini belirlemektedir. Genel olarak, düz-zincirli alkil (hidrokarbon) ligandları “saf” bir hidrofobik karakter göstermelerine rağmen, aril ligandları ise hem aromatik hem de hidrofobik etkileşimlerin her ikisinin de mümkün olduğu “karışık” bir davranış tarzı göstermektedirler. Aynı zamanda, matrikse bağlanmış olan ligand yoğunluğunun sabit olduğu bir durumda, alkil ligandların zincir uzunlukları artırıldıkça, HIC adsorbentlerinin protein bağlama kapasitelerinin de sabit bir oranda arttığı gösterilmiştir (Şekil 9.1,a). Yüklü HIC adsorbentleri ise hidrofobik etkileşimlere ilaveten, başka tarzlarda etkileşimler de göstermektedirler. Alkil veya aril ligandlar arasındaki seçim ise deneysel olarak yapılabilir ve her bir ayrıştırma problemi için ancak tarama yöntemi ile belirlenebilir.

HIC adsorbentlerinin protein bağlama kapasiteleri ise tutuklanmış olan ligand yoğunluğunun artırılması ile artmaktadır (Şekil 9.1,b). Ligand yoğunluğunun yeterince yüksek olduğu bir noktadan sonra, adsorbentin protein bağlama kapasitesinin sabit kaldığı (platoya ulaştığı) fakat etkileşim kuvvetinin arttığı görülmektedir. Böyle bir koşulda, adsorbente bağlanan proteinlerin elüsyonu ise proteinin liganda birden fazla noktadan bağlanmış olması nedeni ile zor olmaktadır.

Şekil 9.1: (a) Ligand yoğunluğunun aynı fakat alkil zincir uzunluklarının farklı olmasının, (b) ligand yoğunluğunun HIC adsorbentinin protein bağlama kapasitesi üzerine etkisi.

202



ii. Matriks tipi: HIC matriksi olarak en çok kullanılan destek materyalleri, çapraz-bağlı agaroz ve sentetik ko-polimer materyaller gibi kuvvetli hidrofilik olan karbonhidratlardır. Ko-polimer bir destek materyalinin seçiciliği, aynı ligandın bağlanmış olduğu agaroz destek materyalinin seçiciliği ile aynı değildir. Ko-polimer bir destek materyalinin kullanılması sonucunda elde edilen sonucun benzerini, agaroz destek materyali ile elde edebilmek için adsorpsiyon ve elüsyon koşullarının modifiye edilmesi gerekebilmektedir. iii. Tuz derişimi ve tipi: Hidrofobik etkileşimleri suyun yapısı oluşturduğundan, şayet su içerisine tuz veya organik çözücüler eklenerek suyun yapısı değiştirilirse, hidrofobik etkileşimler de bu değişiklikten etkileneceklerdir. Genel olarak, iyonik kuvvetin artması, hidrofobik etkileşimleri de artırmaktadır. Bunun sonucu olarak, tuz derişiminin belirli bir limite kadar artması, protein bağlama kapasitesinin de hemen hemen lineer olarak artması ile sonuçlanmakta ve daha yüksek derişimlerde ise protein bağlama kapasitesi eksponansiyel olarak artmaya devam etmektedir (Şekil 9.2). Tuz derişimi, proteinlerin çökelme noktalarının üzerine yükseltildiğinde ise HIC adsorbentinin adsorpsiyon kapasitesinde belirgin bir artış görülmektedir. Bu fenomen ise muhtemelen proteinlerin kolon üzerinde çökelmesinden kaynaklanmaktadır. Fakat protein bağlama kapasitesinin artması, HIC adsorbentinin seçiciliği üzerinde negatif etki oluşturmaktadır.

Şekil 9.2: Kolon dengeleme tamponu içerisindeki tuz derişimine bağlı olarak, Phenyl Sepharose High Performans’ın protein bağlama kapasitesi (Anonymous, 1993).

Hem anyonlar hem de katyonlar, hidrofobik etkileşimleri en yüksek derecede olumlu olarak etkileyenlerden, en düşük düzeyde etkileyenlere doğru sıralanabilir. Anyonların bu sıralaması PO43– > SO42– > CH3COO– > Cl– > Br– > NO3– > ClO4– > I– > SCN– olarak; katyonların sıralaması ise NH4+ > Rb+ > K+ > Na+ > Cs+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ > Ba2+ şeklindedir. Kuvvetli katotrofik tuzlar ise suyun yapısının bozulmasına yol açarak, hidrofobik etkileşimlerin kuvvetinin zayıflamasına neden olurken; anti-katotrofik tuzlar ise hidrofobik etkileşimlerin oluşması için uygun koşulları oluşturmaktadır. Suyun polaritesini değiştirmek amacıyla, organik çözücüler de sıklıkla kullanılmaktadır. iv. pH: Genel olarak pH’nın yükselmesi, hidrofobik etkileşimleri zayıflatmaktadır. Bunun nedeni ise muhtemelen yüklü grupların titrasyonunda meydana gelen artışa bağlı olarak, protein moleküllerinin hidrofilik özelliklerinin artmasıdır. Diğer taraftan, pH’da meydana gelen bir düşüş ise



203

hidrofobik etkileşimlerde görünür bir artış ile sonuçlanmaktadır. Bu nedenle, nötral pH’da HIC adsorbentine bağlanmayan proteinler, asidik pH’da bağlanmaktadırlar. Hjertén ve arkadaşları (1986) ise yapmış oldukları bir çalışmada, pH 8’in üzerinde ve/veya pH 5’in altında proteinlerin kolon içerisinde alıkonmalarının, pH 5-8,5 aralığına göre çok daha şiddetli bir şekilde değiştiğini belirlemişlerdir. Bu nedenle, HIC ile proteinlerin ayrıştırılmasının optimizasyonunda pH önemli bir ayrıştırma parametresi olup; özgül bir ayrıştırma işleminde Hjertén ve arkadaşlarının yapmış olduğu bu gözlemin uygulanabilirliğini kontrol etmekte fayda vardır. v. Sıcaklık: Su içerisindeki hidrofobik moleküllerin etkileşimleri için geliştirilmiş olan teorilere göre Hjertén (1976), proteinlerin HIC adsorbentlerine bağlanmasının entropi tarafından yürütüldüğünü [ΔG = (ΔH – TΔS) ~ –TΔS] öne sürmüştür. Bunun anlamı ise sıcaklık artışı ile etkileşimlerde de bir artışın meydana geldiğidir. İlginç olan ise hidrofobik etkileşimlerde rol alan van der Waals kuvvetlerinin de sıcaklık artışı ile birlikte artmasıdır. Buna rağmen, Visser ve Strating (1975) tarafından bu durumun tersi bir etki rapor edilmiştir. Bu da göstermektedir ki sıcaklığın HIC üzerine olan etkisi oldukça karmaşıktır. İki farklı çalışma sonucundaki bu tutarsızlık ise muhtemelen sıcaklığın, farklı protein moleküllerinin yapısal durumları ve sulu ortamlardaki çözünürlükleri üzerindeki farklı etkilerinden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, oda sıcaklığında elde edilen bir sonucun, soğuk odada elde edilen bir sonuç ile (veya tersi) aynı olmayabileceğine dikkat etmek gerekmektedir. vi. Katkı maddeleri: Su ile karışabilen alkollerin, deterjanların ve katotrofik tuzların sulu çözeltilerinin düşük derişimleri, HIC’de ligand-protein etkileşimini zayıflatmakta ve adsorplanmış olan protein moleküllerinin desorpsiyonuna yol açmaktadır. Alkollerin ve deterjanların polarolmayan bölgeleri, HIC adsorbenti üzerindeki bağlanma bölgelerine adsorplanmak için protein molekülleri ile yarışırlar ve bunun sonucunda da adsorplanmış olan protein molekülleri adsorbentten ayrılırlar. Katotrofik tuzlar ise suyun düzenli yapısı ve/veya bağlı olan protein molekülleri üzerine etki ederler. Aynı zamanda, her iki tipteki katkı maddeleri de suyun yüzey gerilim kuvvetini düşürerek, hidrofobik etkileşimlerin zayıflamasına yol açmakta ve bunun sonucu olarak da ligand-protein komplekslerinin ayrılmasına neden olmaktadırlar.

Protein moleküllerinin elüsyonu sırasında, seçiciliği sağlamak amacı ile elüsyon tamponu içerisinde katkı maddeleri kullanılabilmektedir. Fakat bu durumda, bu tipteki kimyasal maddelerin yüksek derişimlerine maruz kalmanın bir sonucu olarak, protein moleküllerinin denatürasyona uğrama veya inaktive olma riskleri de bulunmaktadır. Buna rağmen, HIC adsorbentlerine oldukça kuvvetli bir şekilde bağlanmış olan proteinlerin kolondan temizlenmesi amacı ile katkı maddelerinin kullanılması oldukça etkili bir yöntemdir. 9.4. HIC ile RPC’nin Karşılaştırılması

Teorik olarak, hidrofobik interaksiyon kromatografi (HIC) ve ters-faz kromatografi (RPC) (bkz. 10. Bölüm) birbirine oldukça benzeyen sıvı kromatografi teknikleridir. Her iki kromatografi tekniği de, biyomoleküllerin yüzeylerindeki polar-olmayan (hidrofobik) bölgeler ile matrikse kovalent olarak bağlanmış olan hidrofobik ligandlar (alkil veya aril grupları) arasındaki etkileşime dayanmaktadır. Buna rağmen, pratikte ise HIC ve RPC farklıdır. HIC matriksleri hidrofiliktir ve bu matrikslere kısa zincirli (C2-C8), polar-olmayan (hidrofobik) fenil veya oktil ligandlar kovalent olarak bağlanmıştır (bkz. Şekil 9.3). HIC matrikslerine bağlanan bu ligandların yoğunlukları, genellikle 10-50 μmol/mL jel’dir. HIC’de kullanılan hareketli faz ise genellikle sulu-tuz çözeltileridir. RPC’de kullanılan matriksler ise silikadır ve silika matrikslere bağlanmış olan ligandlar daha uzun n-alkil (C4-C18) zincirleridir. Silika matrikslere bağlanmış olan nalkil ligandların yoğunluğu ise birkaç yüz μmol/mL jel’dir. Kullanılan alkil zincirlerinin uzunlukları C4C18 arasında değişmekle birlikte, genellikle C8 (oktilsilil) ve C18 (oktadesilsilil) kullanılmaktadır.

204



RPC’de matriksin polaritesi, hareketli fazın polaritesinden daha düşüktür. RPC’de hareketli faz olarak genellikle su ve daha az polar olan bir organik değiştirici (modifikatör) karışımı kullanılmaktadır. HIC ile RPC arasındaki fark, bu iki kromatografik metotta kullanılan hareketli fazın polaritesine bağlı olarak belirlenmiştir. Matriksin silika, hareketli fazın ise hekzan gibi polar-olmayan bir çözücünün olduğu sistemler normal faz olarak adlandırılmıştır. Buna bağlı olarak, C8 veya C18 türevli silikadan oluşan durgun faza göre çok daha polar olan sulu-organik çözücülerin hareketli faz olarak kullanıldığı sistemler ise ters-faz olarak adlandırılmıştır. HIC matrikslerinin kullanılması durumunda ayrıştırma, genellikle denatürasyona yol açmayan sulu-tuz çözeltileri kullanılarak gerçekleştirilmektedir. HIC’de örnek materyali, yüksek derişimde tuz içeren tampon içerisinde matriks üzerine yüklenir; elüsyon ise azalmakta olan tuz gradienti ile gerçekleştirilir. Ligand yoğunluğunun bir sonucu olarak, proteinlerin RPC adsorbentlerine bağlanmaları genellikle çok daha kuvvetli olmaktadır. Proteinlerin RPC adsorbentlerine daha kuvvetli bağlanmaları ise bu proteinlerin elüsyonu için polar-olmayan çözücülerin kullanılmasını gerektirmektedir. Bu nedenle RPC’de elüsyon, genellikle protein moleküllerinin denatürasyonuna yol açan sulu-organik çözücü karışımları ile gerçekleştirilmektedir. Bir proteinin doğal yapısında iken hidrofobik etkileşim gösterme yeteneği, o proteinin yüzeyindeki hidrofobik bölgelere; yüzey hidrofobisitesi ise intak proteinin üçüncül ve dördüncül yapısına bağlıdır. Bu durumu ise proteinin birincil yapısına bağlı olan doğal hidrofobisitesinden ayırmak gerekmektedir. Protein moleküllerinin ayrıştırılması amacı ile hidrofobisitenin kullanılması durumunda, proteinin hidrofobisitesinin kaynağı olan proteinin üçüncül ve dördüncül yapısından kaynaklanan hidrofobisite ile proteinin birincil yapısından kaynaklanan hidrofobisite farklılığından yararlanılabilir. Bu nedenle, HIC ve RPC’de proteinlerin hidrofobisitesine yol açan bu iki farklı kaynaktan yararlanılmaktadır. HIC’de protein moleküllerinin yüzeyindeki hidrofobik bölgelerden yararlanıldığı için ayrıştırma, protein moleküllerinin bütünlüğünün korunduğu koşullarda gerçekleştirilir. RPC’de ise protein moleküllerinin doğal (birincil yapısına bağlı olan) hidrofobisitelerinden yararlanıldığı için ayrıştırma, protein moleküllerinin neredeyse bütün hidrofobik gruplarının matriks ile etkileşime girmesini sağlayan (örneğin, denatürasyona yol açan) koşullarda gerçekleştirilmektedir. Bu nedenle RPC, özellikle sulu-organik çözücüler içerisinde kararlı olan peptidlerin ve düşük moleküler kütleli proteinlerin analitik ve preparatif ayrıştırmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır (bkz. 10. Bölüm). 9.5. HIC Adsorbentleri

Farklı üretici firmalar tarafından geliştirilmiş olan çeşitli HIC adsorbentleri bulunmaktadır. Örneğin, Amersham Pharmacia Biotech tarafından geliştirilmiş olan ve yaygın olarak kullanılan durgun fazlar, çapraz-bağlı agaroz matriks (bkz. Şekil 3.2) üzerine glisidil-eter aracılığı ile hidrofobik ligandların bağlanması ile oluşturulmuştur (Şekil 9.3). Hidrofobik ligandların matrikse bağlanmasında glisidil-eter metodunun kullanılması ise yüksüz adsorbentlerin elde edilmesi ile sonuçlandığından, protein moleküllerinin adsorbente bağlanmasının sadece hidrofobik etkileşimler ile olması sağlanmaktadır. Ligand olarak fenil grubunun kullanılması (Şekil 9.3,c), aynı zamanda ππ etkileşimleri için de bir potansiyel oluşturmaktadır. Hidrofobik ligandların matrikse bağlanmasında glisidil-eter metodunun kullanılması, ayırıcı-kolun kısa olmasına yol açmaktadır. Fakat, hidrofobik olan bu kısa zincirli ayırıcı-kolların etkisi, hidrofilik-OH grupları ile nötralize olması nedeni ile oldukça sınırlı olmaktadır. HIC için yaygın olarak kullanılan durgun fazlar ise çapraz-bağlı agaroz matrikse kovalent olarak bağlanmış alkil (heksil, oktil) veya fenil gruplarıdır. Hem LPLC hem de HPLC sistemleri ile HIC’de kullanılmak üzere farklı adsorbentler geliştirilmiş bulunmaktadır. Farklı üretici firmalar tarafından üretilen HIC adsorbentlerin başlıcalarını ise Fenil Sepherose, Fenil SPW, Butyl



205

Sepharose, Octyl Sepharose, Alkyl Superose, Phenyl Superose, Bio-Gel TSK Fenil ve Spherogel TSK Fenil oluşturmaktadır. OH (a)

M

O

CH2

CH

CH2 O

(CH2)3 CH3

Butyl Sepharose 4 Fast Flow

OH (b)

M

O

CH2

CH

CH2

O

(CH2)7 CH3

Octyl Sepharose CL-4B

OH (c)

M

O

CH2

CH

CH2 O

Phenyl Superose

OH (d)

M

O

CH2

CH

CH2

O

CH2 C(CH3)3

Alkyl Superose

Şekil 9.3: Çapraz-bağlı agaroz matrikse kovalent olarak bağlanmış olan farklı hidrofobik ligandlar.

9.6. Deneysel Koşulların Dizaynı

Bu kısımda, HIC ile proteinlerin ayrıştırılmalarının söz konusu olduğu birçok durumda geçerli olan deneysel metotlara yer verilmektedir. HIC’yi etkileyen faktörlerin sayısının oldukça fazla olması (bkz. kısım 9.3) nedeni ile hedef protein(ler)in seçici olarak saflaştırılmasını sağlayan uygun kromatografik parametrelerin her durum için ayrı ayrı optimize edilmesinde fayda vardır. 9.6.1. Stratejik Noktalar

Verimli bir ayrıştırma akım şemasının oluşturulması için en önemli noktalardan birisi, ayrıştırma adımlarının sayısını mümkün olduğunca minimumda tutmaktır. En az sayıda kromatografik ayrıştırma basamağı ile mümkün olan en yüksek saflıkta örneğin elde edilebilmesi için en mantıklı yaklaşım, ayrıştırılması yapılacak olan molekülün farklı yüzey özelliklerinden yararlanabilecek kromatografik tekniklerin bir kombinasyonunun kullanılmasıdır. Buna rağmen, ayrıştırma akım şemasında kullanılacak olan tekniklerin hangi sıra ile kullanılacağını dikkatli bir şekilde planlamak gerekmektedir. Birçok uygulamada HIC’nin, IEC ve GFC ile birlikte kullanılması oldukça verimlidir. Örneğin, ayrıştırılması yapılacak olan örnek materyalinin iyonik kuvvetinin yüksek olduğu durumda HIC’nin kullanılması mantıklı bir seçimdir. Ham biyolojik materyallerin çoğunun kondüktivite değerleri ise genellikle 15-30 mS/cm’dir. Bu nedenle, ayrıştırma basamağının ilk adımı olarak IEC yerine HIC’nin kullanılması cazip bir alternatif olmaktadır. Başlangıç materyalinin kondüktivitesinin yüksek olması, iyon-değiştirici materyalin bağlama kapasitesinin düşmesine yol açar. Bu nedenle, kondüktivitesi yüksek olan örnek materyallerinin IEC basamağından önce tuz-giderimi, diyafiltrasyon veya seyreltme gibi bazı yöntemlerle işlemden geçirilmesi gerekmektedir. Bunun aksine, kondüktivitesi yüksek olan bir örnek materyali için ilk adımda HIC kullanılırsa gerekli olan tek işlem, protein moleküllerinin HIC matriksine doğru olarak bağlanmasını sağlayacak yeterli tuzun eklenmesi olacaktır. İlk adımda HIC’nin kullanılması, IEC veya diğer adsorpsiyon teknikleri gibi, seyreltik örnek materyalinin önemli bir ölçüde yoğunlaştırılmasını da sağlayacaktır.

206



Saflaştırma akım şemasında diğer önemli bir nokta ise genellikle saflaştırma işlemlerinin başında yer alan amonyum sülfat çökeltmesinden ve örnek elüsyonunun oldukça yüksek bir iyonik kuvvette gerçekleştirildiği IEC’den sonra, HIC’nin kullanılmasıdır. Bu durumda protein moleküllerinin HIC adsorbentine bağlanarak alıkonmasını sağlamak için gerekebilecek tek işlem ise örnek materyaline belki de bir miktar daha tuzun eklenmesi olacaktır. Benzer şekilde, HIC’den düşük iyonik kuvvetteki bir tampon ile elüe edilen örnek materyali, diyaliz veya tuz-giderme basamağına gerek kalmadan doğrudan doğruya IEC’ye uygulanabilir. 9.6.2. HIC Jelinin Seçimi

HIC’nin adsopsiyon basamağında, jel performansı (örneğin, seçicilik ve kapasite) üzerine tutuklanmış (immobilize) ligand tipinin, ligand yoğunluğunun, tuz tipinin ve derişiminin yanı sıra pH’nın önemli bir etkisi bulunmaktadır (bkz. kısım 9.3). Bunun da ötesinde, kullanılan matriksin tipi ve ligandın bağlanmasında kullanılan kimyasal yöntem de birçok proteinin kolon materyaline bağlanma ve elüsyon davranışları üzerine belirli bir dereceye kadar etki etmektedir. Ligand olarak oktil gruplarını içeren matrikslere bağlanmış olan kuvvetli hidrofobik proteinlerin elüsyonunun kolay olmaması nendi ile, karakterizasyonu yapılmamış bir protein için başlangıç jeli olarak fenil ligandlarını içeren matrikslerin seçilmesi genellikle en iyi seçimdir. Fenil ligandların hidrofobisitesi ise n-bütil ve n-pentil ligandların hidrofobisiteleri arasında yer almaktadır. Fenil ligandlar, π-π etkileşimleri aracılığı ile aromatik amino asit kalıntılarına bağlanmaktadır. Oktil-Sepharose CL-4B gibi oktil ligand içeren jeller ise zayıf hidrofobik proteinlerin ayrıştırılması için kullanılabilir. Aynı zamanda membran proteinlerinin ayrıştırılmaları için de oktil ligand içeren jeller kullanılabilir. Çünkü membran proteinlerinin çözünürlüğünü sağlamak amacı ile kullanılan deterjanların varlığında dahi oktil ligand içeren jeller, hidrofobik bağlama kapasitelerini korumaktadırlar. HIC jellerinin seçilmesi esnasında göz önünde bulundurulması gereken parametreler ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: i. Seçilecek olan HIC jeli, makul bir derecedeki düşük tuz derişiminde hedef proteini bağlamalıdır. Bu durum ise genellikle seçilen tuzun tipine bağlıdır. Örneğin, amonyum veya sodyum sülfat ile elde edilen sonucun NaCl ile elde edilebilmesi için NaCl derişimini, amonyum veya sodyum sülfat derişimine göre 4-kat artırmak gerekebilir. Tuz derişimi ise örnek materyal içinde bulunan diğer proteinlerin çökelmesine neden olan derişimin altında olmalıdır. Tarama çalışmaları için 1 M’lık amonyum sülfat iyi bir başlangıç noktası oluşturmaktadır. Şayet protein molekülleri (örneğin) 1 M’lık amonyum sülfat ile HIC jeline bağlanmazlarsa, bu durumda daha hidrofobik bir jel seçilmelidir. Doğru HIC jelinin seçilmesi ise genellikle, bağlama tamponu içerisindeki tuzun daha az tüketilmesine yol açmaktadır. Bu durum ise özellikle büyük-ölçekli saflaştırma proseslerinde hem ekonomik hem de çevresel avantajlar sağlamaktadır. ii. Kolon materyaline bağlanmış olan proteinin elüsyonu, tuz içermeyen tampon ile yapılabilmeli ve verimlilik yüksek (%75 veya daha fazla) olmalıdır. Şayet, proteinlerin elüsyonu için polar-olmayan çözücüler gerekiyorsa, daha az hidrofobik jellerin seçilmesi denenmelidir. iii. Adsorbsiyon aşamasında, seçiciliğin artırılması için hem başlangıç tamponunun pH’sından hem de kullanılacak olan tuz tipinden yararlanılabilir. Bunu başarmanın yolu ise farklı ligandların taranması aşamasında, değişik pH değerlerindeki ve farklı tipteki tuzlarla elde edilen adsorbsiyon verimliliklerinin kontrol edilmesinden geçmektedir. iv. Hidrofobik etkileşimlerin sıcaklığa bağlı olması nedeni ile metot geliştirme çalışmalarının, saflaştırmanın yapılacağı çalışma sıcaklığında gerçekleştirilmesi oldukça önemlidir.



207

9.6.3. Tarama Deneyleri

HIC’de tarama deneylerinin amacı, uygun HIC jelinin seçilerek, seçiciliğin optimizasyonunu sağlamak ve en önemli deneysel parametreleri kabaca belirleyebilmektir. Bu çalışmalar aynı zamanda, farklı koşullarda elde edilebilecek elüsyon profilleri hakkında da bilgi vermektedir. Tarama çalışmaları sonucunda elde edilebilecek tipik elüsyon profilleri ise Şekil 9.4’de görülmektedir. Tarama çalışmalarının gerçekleştirilmesi esnasında takip edilmesi gereken adımlar ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: i. Üretici firmanın talimatlarına uygun olarak HIC jelleri, 1-10 mL yatak hacmi oluşturacak şekilde uygun kolonlara paketlenir. Alternatif olarak, HIC Media Test Kit (Amersham Pharmacia Biotech) gibi hazır ticari kitler de kullanılabilir.

Şekil 9.4: (a) Ürün elüsyonu gradientin erken aşamasında gerçekleşmiştir; çözünürlük ise tatmin edici değildir. (b) Ürün elüsyonu gradientin sonuna yakın gerçekleşmiştir; çözünürlük ise tatmin edici değildir. (c) Ürün elüsyonu gradientin ortasında gerçekleşmiştir; çözünürlük ise tatmin edici değildir. (d) Ürün elüsyonu gradientin erken aşamasında gerçekleşmiştir; çözünürlük ise tatmin edicidir. (e) Ürün elüsyonu gradientin sonuna yakın gerçekleşmiştir; çözünürlük ise tatmin edicidir. (f) Ürün elüsyonu gradientin ortasında gerçekleşmiştir; çözünürlük ise tatmin edicidir (Anonymous, 1993).

208



ii. Paketlenmiş olan kolon, kolon yatak hacminin 2-misli dengeleme tamponu-A (50 mM sodyum fosfat; 1 M amonyum sülfat; pH 7,0) ile yıkanarak dengelenir. Kolonun dengelenmesi esnasında akış oranı sabit olmalıdır (örneğin 100 cm s–1). iii. 1 M amonyum sülfat içeren ve pH’sı 7’ye ayarlanmış olan uygun miktardaki örnek materyali kolona yüklenir ve kolon hacminin 2-3-misli tampon-A ile yıkanır veya yıkama işlemine elüsyon sıvısının UV absorbansı, temel-çizgiye yaklaşıncaya kadar devem edilir. iv. Kolon materyaline bağlanmış olan proteinlerin elüsyonu, lineer ve tampon-B’nin (50 mM sodyum fosfat tamponu, pH 7,0) 0’dan %100’e kadar ulaşması ile azalan tuz gradienti ile gerçekleştirilir (Şekil 9.4). Toplam gradient hacminin ise kolon yatak hacminin 10-misli olması genellikle yeterli olmaktadır. 9.7. Hidrofobik İnteraksiyon Kromatografisinin Gerçekleştirilmesi 9.7.1. Kolon Seçimi ve Dizaynı

HIC’de kullanılan kolonlar da diğer kromatografik tekniklerde kullanılan kolonlar gibi kromatografi sisteminin düşük basınç altında mı yoksa yüksek basınç altında mı gerçekleştirileceği göz önünde bulundurularak seçilir. Düşük basınç altında gerçekleştirilen kromatografi sistemlerinde kullanılan kolonların özellikleri kısım 3.2’de ele alınmış olmakla birlikte, HIC’de kullanılan kolonlar genellikle kısa kolonlardır (bkz. kısım 4.5). HIC’de kullanılan tipik bir kolonun yatak yüksekliği genellikle 5-15 cm’dir. Bu tipteki küçük-ölçekli uygulamalarda ayrıştırma için gerekli olan optimum koşullar belirlendikten sonra, kolon boyutları uygun ölçülerde artırılarak kolayca büyük-ölçekli ayrıştırma işlemleri için uygulanabilir. 9.7.2. Kolonun Paketlenmesi ve Kontrolü

Diğer kromatografi tekniklerinde de olduğu gibi HIC’de kolonun paketlenme aşaması oldukça önemlidir. Çünkü kötü paketlenmiş bir kolon, hareketli fazın düzensiz olarak akışına, zon genişlemesine ve çözünürlüğün kaybolmasına yol açar. İyi bir kolon paketlemede nelere dikkat edilmesi gerektiği (bkz. kısım 3.5) ve paketlenen bir kolonun kontrol edilmesi ise (bkz. kısım 3.6) daha önce detaylı olarak ele alınmıştır. Bunun yanı sıra HIC’de kullanılan kolonların, yüksek oranda çapraz-bağ içeren Sepharose Fast Flow gibi agaroz-temelli jeller ile paketlenmesi daha kolaydır. Çünkü HIC’de gerekli olan jel yatak yüksekliği, jel filtrasyon kromatografisinde gerekli olan yatak yüksekliğine oranla daha kısadır. 9.7.3. Örnek Materyalinin Hazırlanması

Kromatografik sistemlerde örnek materyallerinin hazırlanmasında dikkat edilmesi gereken örnek materyalinin kompozisyonu, hacmi, viskozitesi ve derişimi gibi parametreler, iyi bir kromatografinin gerçekleştirilmesi için oldukça önemlidir. Bütün kromatografik sistemler için oldukça önemli olan bu parametreler ise kısım 3.7’de detaylı olarak ele alınmıştır. i. Örnek materyalinin kompozisyonu: HIC’de örnek materyalinin hazırlanması için gereken işlemlerin sayısı, diğer kromatografik sistemler için hazırlanan örnek materyallerine uygulanan işlemlerin sayısına göre minimum düzeydedir. Çünkü HIC’de adsorbsiyon, yüksek tuz derişimlerinde gerçekleştirildiği için, örnek materyalinin kolona yüklenmeden önce tamponunu değiştirmek zorunlu değildir. Bu nedenle, HIC için örnek materyallerinin hazırlanması sırasında alınması gereken tek önlem, hedef moleküllerin adsorbsiyonunun sağlanabilmesi için yeterince tuz eklendiğinden ve şayet gerekli ise pH’nın ayarlandığından emin olmaktan ibarettir.

Şayet örnek materyaline eklenen tuz katı formda ise bölgesel olarak tuz derişiminin aşırı yoğun olması nedeni ile kısmi çökelme meydana gelebilir. Bu nedenle, yüksek tuz derişiminden



209

oluşan stok solüsyonların doğrudan örnek materyali üzerine eklenmesinden kaçınılmalıdır. Ayrıca örnek materyali içerisinde, guanidin hidroklorid ve üre gibi katotrofik ajanlar var ise örnek materyali kolona yüklenmeden önce, bu ajanların da uzaklaştırılması gerekmektedir. Çünkü bu ajanlar, hedef moleküllerin HIC jellerine bağlanmasını sağlayan hidrofobik etkileşimlerin oluşturulmasını kolaylaştırmak için kullanılan tuzların aksine davranmaktadırlar (bkz. kısım 9.3). Bazı ham örnek materyallerinde ise lipitler veya oldukça hidrofobik olan diğer bileşikler bulunabilir (bkz. kısım 1.6.1). Bu bileşikler ise HIC kolonu ile oldukça kuvvetli bir şekilde etkileşim oluşturarak, kolonun kapasitesini bloke edebilirler. Ayrıca, kolonun temizlenmesi ve rejenerasyonu esnasında bu bileşiklerin kolondan uzaklaştırılmaları da oldukça güç olabilir. Bu gibi durumlarda ise gerçekte kullanılacak olan HIC kolonundan hafifçe daha az hidrofobik olan bir kolonun, ön-kolon olarak kullanılması önerilmektedir. Böylece, örnek materyali gerçek HIC kolonuna girmeden önce lipit gibi kirleticilerin ön-kolon tarafından verimli bir şekilde tutulması sağlanabilmektedir. Kullanılacak olan ön-kolon ise en kuvvetli hidrofobik bileşikleri bağlarken, dengeleme koşulları altında hedef moleküllerin bu kolon materyaline bağlanmadan kolondan, geçmesine izin verecek şekilde seçilmelidir. ii. Örnek materyalinin hacmi: HIC bir adsorbsiyon yöntemi olduğundan başlama koşulları, örnek materyal içerisinde bulunan bütün önemli bileşiklerinin kolon yatağının üst kısmında adsorblanmasını sağlayacak şekilde seçilir. Bu durumda, kolona yüklenecek olan örnek materyalinin hacminden ziyade, örnek materyalinin kütlesi çok daha önemlidir. Bunun anlamı ise jel filtrasyon kromatografisi gibi başka bir kromatografik uygulamadan elde edilen birleştirilmiş fraksiyonlar ve hücre kültür sıvıları gibi seyreltik solüsyonların büyük hacimleri, yoğunlaştırılmadan doğrudan doğruya kolona yüklenebilir demektir. Bu nedenle HIC, bileşiklerin fraksiyonlara ayrılmasının yanı sıra, örnek materyalinin yoğunlaştırılmasını da sağlamaktadır.

Bununla birlikte, örnek materyalinin tuz derişimi, kolonun dengelenmesinde kullanılan hareketli fazın tuz derişiminden düşükse, örnek materyalinin hacmi önem kazanmaktadır. Böyle durumlar ise yüksek tuz derişimi nedeni ile örnek materyal içinde bulunan bileşiklerin çökelmesinden kaçınılması gibi durumlarda meydana gelmektedir. Bu gibi durumlarda, yüksek hacimde örnek materyalinin kolona yüklenmesi esnasında, kolon materyali ile etkileşimi en zayıf olan bileşiklerin kolondan elüsyonu başlayabilir. Etkileşimi en zayıf olan bileşiklerin yükleme esnasında kolondan elüsyonunu önlemek için ise büyük hacimdeki örnek materyali, birkaç parçaya ayrıldıktan sonra kolona yüklenir. Bu durumda, parçalara ayrılmış olan örnek materyalinin her bir parçasını kolona yükledikten sonra, hidrofobik etkileşimi artırmak ve erken elüsyonu önlemek için kolona dengeleme tamponunun ilavesi gerekir (Şekil 9.5). iii. Örnek materyalinin viskozitesi: Örnek materyalinin viskozitesi, kolona yüklenecek olan örnek miktarını sınırlayabilir. Örnek materyalinin viskozitesinin yüksek olması, zonların kararsız olmasına ve düzensiz akış profillerine yol açar. Ayrıca, örnek materyalinin viskozitesinin yüksek olması, özellikle partikül boyutunun küçük olduğu (örneğin, 10 μm) kolon matrikslerinin kullanıldığı durumlarda, geri-basıncın yükselmesine de yol açabilir. Bu durumda kritik olan değişken ise örnek materyalinin viskozitesinin, hareketli fazın viskozitesine olan göreceli değeridir.

Şayet örnek materyali, yüksek bileşik derişimi nedeni ile çok viskoz ise başlangıç tamponu ile seyreltilebilir. Nükleik asit kontaminasyonu nedeni ile meydana gelen yüksek viskozite ise polietilenimin veya protamin sülfat gibi poli-katyonik bir makromolekül ile çökeltme yolu ile giderilebilir. Nükleik asit nedeni ile meydana gelen viskozite, aynı zamanda endonükleazların kullanılması ile de düşürülebilir. Fakat bu tipteki katkı bileşiklerini içeren işlemler, endüstriyel uygulamalarda çok da ilgi çekici bulunmamaktadırlar. Çünkü endüstriyel proseslerde son-ürün içerisinde bu tip katkı maddelerinin bulunmadığı kanıtlanmak zorundadır (bkz. kısım 1.6.1).

210



Şekil 9.5: HIC’de örnek materyal yükleme koşullarının etkisi. Kolon: 1 mL Alkil Superose HR 5/5. Akış oranı: 0,5 mL dk–1. Tampon-A: 100 mM sodyum fosfat, pH 7,0; 2 M amonyum sülfat. Örnek materyali: 0,9 M Amonyum sülfat içerisinde fare karın boşluğu sıvısı [500 μL anti-CEA MAB (IgG1)] (115 μL karın boşluğu sıvısına eşdeğer). (a) 500 μL hacmindeki örnek materyali bir seferde kolona yüklenmiştir. Bu durumda, kolon materyali ile en zayıf etkileşim gösteren albümin moleküllerinin elüsyonu, örneğin yüklenmesi sırasında başlamıştır. (b) Toplam 500 μL’lik örnek materyali, her biri 100 μL’den oluşan beş parçaya bölünmüş ve her bir parçanın yüklenmesinden sonra kolon 1,3 mL, 2 M amonyum sülfat ile dengelenmiştir (Anonymous, 1993).

iv. Örnek materyalinin partikül içeriği: Bütün kromatografi formlarında iyi bir çözünürlüğün elde edilmesi ve kolon ömrünün uzun olması, kolona yüklenen örnek materyalinin bazı özel maddelerden yoksun olmasına bağlıdır. Bu nedenle, HIC kolonlarına yüklenecek olan örnek materyallerinin partikül içerikleri de diğer kromatografi tekniklerinde olduğu gibi oldukça önemlidir ve bu konu ise daha detaylı olarak kısım 3.7’de ele alınmıştır. 9.7.4. Örnek Materyalinin Yüklenmesi

LPLC veya HPLC sistemlerinde HIC’nin kullanılması durumunda, örnek materyalinin kolona yüklenmesi ile ilgili metotlar sırasıyla kısım 3.8 ve kısım 4.10’da detaylı olarak incelenmiştir. Kolona yüklenen örnek materyalinin elüsyon tipine ve kullanılan kolonun kapasitesine bağlı olarak, kolona yüklenecek olan örnek materyalinin miktardı da değişebileceği için, kullanılan örnek materyalinin hacmine uygun bir yükleme metodu seçilerek örnek yükleme işlemi gerçekleştirilmelidir. 9.7.5. Elüsyon

HIC kolonuna yüklenen biyomoleküllerin elüsyonu birkaç yolla gerçekleştirilebilir: i. Elüsyon tamponu içerisine değişik miktarlarda organik çözücülerin eklenmesi ile elüsyon (bkz. kısım 9.3): Bu durumda, elüsyon tamponu içerisine eklenecek olan organik çözücünün miktarının, hedef protein molekülleri üzerinde yıkıcı bir etkisinin olmadığından, yani hedef proteinlerin kullanılan organik çözücü miktarında kararlı olduğundan emin olmak gerekmektedir. Elüsyon tamponuna ilave edilen organik çözücüler ise kolon materyaline bağlanmış olan proteinlerin polaritesini veya yüzey gerilimlerini düşürmektedir. Proteinlerin polaritesinin veya yüzey gerilimlerinin düşmesi ise bileşiklerin HIC kolon materyaline bağlanma kuvvetlerini azaltmakta ve sonuçta kolona bağlanmış olan proteinlerin elüsyonuna yol açmaktadır. Bu amaçla yaygın olarak kullanılan organik çözücüler ise etilen glikol ve iso-propanol’dür. Bu organik



211

çözücüler, tuz içermeyen tampon içerisinde %40 etilen glikol veya %30 iso-propanol şeklinde kullanılırlar. Bazı uygulamalarda ise elüsyon tamponunun tuz derişimini lineer olarak düşürürken buna bağlı olarak, bu tipteki katkı maddelerinin derişimlerini ise lineer olarak artırmak avantajlı olabilmektedir. Bu son uygulama ise bazı durumlarda, HIC kolon materyaline bağlanmış olan proteinlerin elüsyonunda elde edilen ayrıştırma çözünürlüğünün artmasına da yol açabilmektedir. ii. Elüsyon tamponu içerisine nötral deterjanların (genellikle %1) eklenmesi ile elüsyon: Buna rağmen bazı deterjanlar, kolon materyaline oldukça kuvvetli bir şekilde bağlanabilmektedirler. Bu tip deterjanların kolondan yıkanarak tamamen uzaklaştırılabilmesi için ise yaygın olarak kullanılan organik çözücüler (örneğin etanol) yetersiz kalabilmektedir. Çok daha kötüsü ise bu tipteki deterjanları içeren HIC kolonlarının daha sonraki kullanımları esnasında, kolon kapasitesinin düşmesine yol açabilmesidir. Bu nedenle, protein moleküllerinin HIC kolonlarından elüsyonunda deterjanlar kullanılırken çok dikkatli olunmalıdır. iii. Lineer veya basamaklı olarak azalan tuz derişim gradienti ile elüsyon: Bu yöntem, protein moleküllerinin HIC kolonlarından elüsyonunda kullanılabilecek olan en güvenli metottur. Bu metodun uygulanması ise ya lineer ya da basamaklı gradient uygulaması şeklindedir: a. Lineer gradient elüsyonu: Tarama çalışmaları esnasında ilk seçim, genellikle basit lineer gradient elüsyonu olmaktadır. Fakat yeterli deneyime sahip olunduğu durumlarda, çözünürlüğün yetersiz olduğu kromatogram bölgelerinde daha sığ bir gradientin oluşturulması avantaj sağlayabilmektedir. Bunun yanı sıra, çözünürlüğün iyi olduğu bölgelere ise dik bir gradient uygulanabilir (Şekil 9.6). Bu tipteki kompleks gradient uygulamaları ise aynı ayrıştırma işlemi esnasında, çözünürlük ile hızın kombinasyonunun sağlanması açısından maksimum esneklik sağlamaktadır.

Şekil 9.6: Kompleks gradient uygulamasının çözünürlük üzerine etkisi. (a) Lineer gradient uygulaması. (b) Kompleks gradient uygulaması.

Lineer bir gradientin toplam gradient hacminin artırılması ile (bu durumda gradient eğimi azalacaktır), kromatogramın bütün bölümünün çözünürlüğü artırılabilir (Şekil 9.7). Bu uygulama, kromatografinin ilk amacının mümkün olduğunca çok sayıdaki pikleri birbirinden ayrıştırmak olmadığı, fakat hedef protein moleküllerinin örnek materyal içinde bulunan diğer bileşiklerden izolasyonunun sağlanması olduğu preparatif çalışmalar için genellikle en iyi yaklaşım değildir. Gradient hacminin artırılması, aynı zamanda kromatografi işleminin sonuçlanması için gereken zamanı da artıracağı gibi, elüsyonu gerçekleştirilen fraksiyonların daha da seyreltik olmasına yol açacaktır.

212



Şekil 9.7: Gradient eğiminin çözünürlük üzerine etkisi. (a) Eğimi daha dik olan bir lineer gradient uygulaması. (b) Eğimi daha sığ olan bir lineer gradient uygulaması.

b. Basamaklı gradient elüsyonu: Büyük-ölçekli preparatif uygulamalarda, genellikle basamaklı gradient elüsyonu tercih edilmektedir. Bunun başlıca nedenleri ise basamaklı gradientin uygulanmasının, lineer gradiente göre hem teknik olarak daha kolay olması hem de tekrarlanabilir olmasıdır. Bunun yanı sıra basamaklı gradient elüsyonu, hedef proteinin çok daha yoğun formda elüsyonunu sağlayabilmesi nedeni ile küçük-ölçekli ayrıştırma uygulamalarında da avantajlı olabilmektedir. Bu durumda, elüsyon tamponunun elüsyon kuvveti, hedef protein ile birlikte kolon materyaline çok daha sıkı olarak bağlanmış olan proteinlerin de elüsyonuna yol açmayacak şekilde tutulmalıdır.

Basamaklı gradient uygulamasının prensibi, hedef proteinlerin elüe oldukları bölgelerdeki çözünürlüğü artırmaktır. Şekil 9.8’de ise lineer gradient uygulaması ile iyi bir çözünürlüğün elde edilemediği elüsyon profiline karşılık, aynı hedef proteinlerin (gölgeli alan) 3-basamaklı bir gradient uygulaması sonucunda nasıl iyi bir çözünürlüğün sağlandığı görülmektedir.

Şekil 9.8: Elüsyon gradient tipinin çözünürlük üzerine etkisi. (a) Lineer gradient elüsyonu. (b) 3-basamaklı gradient elüsyonu.

Şekil 9.8,a’da elüsyon tamponunun elüsyon kuvveti ve hacmi, hedef proteinlerine göre kolon materyaline daha zayıf olarak bağlanmış olan bütün bileşiklerin elüsyonu sağlanacak şekilde optimize edilmiştir. Elüsyon tamponunun elüsyon kuvveti ve hacmi, kolon materyaline zayıf olarak bağlanmış olan bu kirletici bileşiklerin elüsyonunu sağlamaya yetecek kadar büyük olmalı, fakat hedef proteinlerin kirleticilerle birlikte elüe olmaya başladığı sınırı da aşmamalıdır. Şekil 9.8,b’de ise elüsyon tamponunun elüsyon kuvveti, hedef proteinin elüe olduğu noktaya yükseltilmiştir. Bu durumda ise elüsyon tamponunun elüsyon kuvveti, aşırı derecede seyrelmeye yol açmadan hedef proteinin elüsyonunu sağlayacak kadar kuvvetli olmalı; fakat kolon materyaline çok daha sıkı



213

bağlanmış olan kirleticilerin elüe olma sınırının da altında olmalıdır. Hedef proteinlerin kolondan elüsyonu sağlandıktan sonra, kolon içerisinde kalmış olan bütün bileşiklerin kolondan uzaklaştırılması için ise kolon, elüsyon kuvveti çok daha fazla olan elüsyon tamponu ile yıkanır. Bu durumda kolonun yıkanma süresi, elüsyon tamponunun elüsyon kuvvetinin derecesine bağlı olarak çok kısa bir süre tutabilir. 9.8. Kolonun Rejenerasyonu, Temizlenmesi ve Korunması

Jel materyalleri ile paketlenmiş olan kolonlar belirli bir süre kullanıldıktan sonra, kolon yatağı içerisinde çökelen proteinlerin ve diğer kirleticilerin uzaklaştırılması gerekmektedir. Kolonun temizlenmeye ihtiyaç duymasının belirtileri ise kolon yatak yüzeyinde renkli bir tabakanın oluşması, kolonun çözünürlük özelliklerinin kaybolması veya geri-basıncın artmasıdır. Geri-basıncın artması ise hareketli fazın kolon yatağı boyunca akış oranını etkileyecektir. Jel materyalleri ile paketlenmiş olan kolonların kullanıldıktan sonra, bir sonraki kullanıma hazırlanması için rejenerasyonu (bkz. kısım 6.8), temizlenmesi (kısım 5.7.5) ve korunması (bkz. kısım 5.7.6) ile ilgili temel konular ise daha önceki bölümlerde ele alınmıştır. 9.9. HIC Uygulama Örnekleri

HIC, proteinlerin saflaştırılması amacıyla uygulanan diğer kromatografi tekniklerinin bir tamamlayıcısı olarak araştırma laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Herhangi bir proteinin saflaştırılması için uygulanan prosedürlerin genel akım şeması ise doğal olarak seçilen ayrıştırma ekipmanlarına ve tekniklerine bağlıdır. Buna rağmen, seçilmiş olan ayrıştırma tekniklerinin hangi sıra ile kullanılacağı da oldukça önemlidir. Bu nedenle, takip eden alt-kısımlarda ise laboratuvar-ölçekli protein saflaştırma çalışmalarında, HIC’nin diğer kromatografi teknikleri ile kullanımının muhtemel kombinasyonlarına yer verilmektedir. 9.9.1. HIC’nin Amonyum Sülfat Çökeltmesi ile Birlikte Kullanılması

Protein saflaştırma prosedürlerinin erken aşamasında, kirletici proteinlerin çökeltilmesi amacı ile amonyum sülfat çökeltmesi kullanıldığında, bir sonraki basamak için HIC ideal bir tekniktir. Bu şekilde hazırlanmış bir örnek materyalindeki hedef proteinler, yüksek derişimde amonyum sülfat içeren süzüntü içerisinde yer almaktadır ve bu nedenle örnek materyal, doğrudan HIC kolonuna yüklenebilir. Bu durumda hedef proteinlerin saflaştırılması, aynı zamanda örnek materyal miktarının hacminin azalması yani yoğunlaştırma ile birlikte gerçekleşir. Örneğin, 125 kDa kütleye sahip olan ve tümörlü hücrelerin hareketini stimüle eden insan autotoksin’inin saflaştırılmasının ilk aşamalarında HIC kullanılmıştır (Stracke ve ark., 1992). Bu çalışmada, yoğunlaştırılmış hücre kültür sıvısının amonyum sülfat ile çökeltilmesi sonucunda elde edilen süzüntü, doğrudan Penyl Sepharose 4B kolonuna yüklenmiştir (Şekil 9.9). Elüsyon ise amonyum sülfat derişiminin azalan, etilen glikolün ise artan derişimlerinin kullanıldığı ikili gradient uygulaması ile gerçekleştirilmiştir. HIC uygulamasından toplanan autotoksin fraksiyonları ise daha sonraki saflaştırma basamaklarında affinite, jel filtrasyon ve iyon-değiş tokuş kromatografileri ile homojen saflıkta elde edilmiştir. 9.9.2. HIC’nin IEC ile Birlikte Kullanılması

Protein saflaştırma prosedürlerinde IEC’den sonra HIC’nin kullanılması yaygın bir uygulamadır. Her iki kromatografi tekniği de oldukça geniş bir uygulama alanına sahip olup, birbirinin tamamlayıcısı durumundadır. Daha da önemlisi, IEC kolonundan tuz gradienti ile elüe edilen örnek materyalinin, HIC kolonlarına yüklenmeden önce çok az bir ön-işlem gerektirmesidir. Bu nedenle, HIC kolonuna yüklenecek olan IEC fraksiyonlarına sadece gerekli miktarda tuzun eklenmesi yeterli olmaktadır.

214



Şekil 9.9: İnsan autotoksininin HIC ile saflaştırılması. Kolon: Phenyl Sepharose 4B, 200 mL. Örnek materyal: A2058 melanoma hücre kültürün sıvısının (200 L) yoğunlaştırıldıktan sonra, amonyum sülfat çökeltmesinden (1,2 M) elde edilen süzüntü. Tampon-A: 50 mM Tris, pH 7,5; %5 (v/v) metanol; 1,2 M amonyum sülfat. Tampon-B: 50 mM Tris, pH 7,5; %5 (v/v) metanol; %50 (v/v) etilen glikol. Akış oranı: 1 mL dk–1. Dedeksiyon: A280 (kesiksiz çizgi) ve hareketlilik (daireler). Kemotaksi, 2202 Ultraskan lazer densitometre ile belirlenmiştir (Stracke ve ark., 1992).

Örneğin, memeli hücrelerinin nükleusunda oldukça düşük derişimlerde bulunan transkripsiyon faktörlerinin ayrıştırılmasında HIC kullanılmıştır (Flores ve ark., 1992). Flores ve arkadaşları yapmış oldukları bu çalışmada HeLa S100 hücre kültür özütünden 6 farklı transkripsiyon faktörünün μg düzeyinde saflaştırılması için bir saflaştırma şeması geliştirmişlerdir. Bu şemada, HIC ile IEC’nin birbirini tamamlayıcı seçici iki kromatografik yöntem olarak kullanılması gösterilmiştir. Transkripsiyon faktörleri olan TFIIF ve TFIIH, anyon değiş-tokuş kromatografi kolonundan (DEAE-Sephacel ve DEAE-5PW olmak üzere iki farklı kolon) ve katyon değiş-tokuş kromatografi kolonundan (Phosphocellulose ve Mono S) birlikte elüe edilmiş, fakat bu iki transkripsiyon faktörünün birbirinden tam olarak ayrıştırılması ise ancak Phenyl Superose ile gerçekleştirilmiştir (Şekil 9.10). Bu iki transkripsiyon faktörünün daha ileri safhalarda saflaştırılmasında ise diğer kromatografik teknikler kullanılmıştır.

Şekil 9.10: Memeli transkripsiyon faktörü TFIIH ve TFIIF’nin HIC ile ayrıştırılması. Kolon: Phenyl Superose HR 10/10. Örnek materyal: HeLa hücre kültür özütünün Phosphocellulose, DEAE-Sephacel, DEAE-5PW ve Mono S HR 10/10 kolonlarından ayrıştırılması gerçekleştirilmiş olan fraksiyonları. Tampon-A: 20 mM Tris-HCl, pH 7,9; 0,1 M EDTA; %20 gliserol; 10 mM β-merkaptoetanol; 0,2 mM fenilmetilsülfonil florid; 1,4 M amonyum sülfat. Tampon-B: Amonyum sülfat içermeyen Tampon-A. Dedeksiyon: (Δ) TFIIF aktivitesi; (o) TFIIH aktivitesi (Flores ve ark., 1992).



215

9.9.3. HIC’nin GFC ile Birlikte Kullanılması

Adsorbsiyon kromatografisinin en önemli avantajlarından birisi, hedef moleküllerin saflığının artırılmasının yanı sıra, örnek materyal içerisinde bulunan kirletici proteinlerin hacminin azaltılmasını da sağlamasıdır. Bu nedenle, bir saflaştırma protokolünde HIC ve diğer adsorbsiyon kromatografi teknikleri, jel filtrasyon kromatografisine yüklenecek olan örnek materyalinin hacminin küçük olması nedeni ile genellikle GFC’den önce kullanılmaktadır. Örneğin, insan hipofiz prolaktini Roos ve arkadaşları (1979) tarafından Phenyl Sepharose CL-4B kolonundan %50 etilen glikol ile basamaklı olarak saflaştırılmıştır (Şekil 9.11). Bu çalışmada ise örnek materyali GFC’na yüklenmeden önce, HIC ile 300 mL’den 45 mL’ye düşürülmüş ve prolaktinin geri-kazanımı %95 olarak gerçekleşmiştir. Phenyl Sepharose CL-4B kolonundan toplanan pozitif fraksiyonlar ise daha ileri bir saflaştırmanın sağlanması için ikinci bir GFC kolonuna (Sephadex G-100) yüklenmiştir.

Şekil 9.11: İnsan hipofiz prolaktininin Phenyl Sepharose CL-4B kolonundan elüsyonu (Roos ve ark., 1979).

9.9.4. Tek-adımda Saflaştırma Tekniği Olarak HIC

Genel olarak, kompleks bir biyolojik karışımdan “tek adımda” bir proteinin homojen saflıkta elde edilebilmesi için, oldukça yüksek özgüllüğe sahip affinite tekniklerinin kullanılması gerekmektedir (bkz. 8. Bölüm). Şayet bir proteinin saflaştırılması için HIC, IEC ve GFC gibi genel teknikler seçilirse, bu proteinin homojen saflıkta elde edilebilmesi için bu tekniklerden oluşan bir kombinasyonun kullanılması gerekmektedir. Bazı durumlarda ise saf bir ürünün elde edilmesi için, bu genel tekniklerden birsinin kullanılması yeterli olabilmektedir. Örneğin, fare monoklonal antikorlarının miligram düzeyinde saf olarak elde edilmesi bu duruma verilebilecek en iyi örneklerden birisini oluşturmaktadır (Şekil 9.12). Amersham Pharmacia Biotech firması tarafından gerçekleştirilen bu çalışmada kullanılan örnek materyal içerisindeki temel proteinlerden birisi olan IgG, Alkil Superose HR 5/5 ile tek adımda homojen olarak elde edilmiştir. Bu çalışma sonucunda IgG moleküllerinin her ikisinin de (IgG1 ve IgG2a) serum proteinleri olan albümin ve transferrinlerden arınık olduğu ise SDS-PAGE ve gümüş boyama teknikleri ile kontrol

216



edilmiştir. IgG moleküllerinin kolondan elüsyonu ise Şekil 9.12’den de açıkça görülebileceği gibi, faklı pozisyonlarda gerçekleşmiştir. Bunun yanı sıra, farklı antikorların ayrıştırılması için IgG için olan ayrıştırma koşullarının modifikasyonunun gerekebileceğini de unutmamak gerekir.

Şekil 9.12: Monoklonal antikorların tek adımda HIC ile saflaştırılması. Kolon: Alkil Superose HR 5/5. Örnek materyal: Monoklonal IgG1 (a) veya IgG2a (b) içeren 100 μL fare karın boşluğu sıvısı + 100 μL tampon-A. Tampon-A: 100 mM fosfat, pH 7,0; 2 M amonyum sülfat. Tampon-B: 100 mM fosfat, pH 7,0 (Anonymous, 1993).

10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ (RPC)

10.1. Giriş

Adsorbsiyon kromatografisi, bir sıvı içinde çözünmüş olarak bulunan moleküller ile özel bir amaç için tasarlanmış olan ve kromatografi matriksine kovalent olarak bağlanmış olan ligandlar arasındaki kimyasal etkileşimlere bağlıdır. Günümüze kadar yapılan çalışmalar sonucunda, biyomoleküllerin saflaştırılması amacıyla, bu moleküllerin elektriksel yüklerinden biyolojik affinitelerine kadar değişen çok sayıdaki özelliğinden yararlanmak için çok farklı tiplerdeki ligandlar, kromatografi destek materyalleri üzerine tutuklanmışlardır. Biyomoleküllerin preparatif kromatografisi için kullanılan adsorbsiyon tekniklerine önemli bir katkı ise ters-faz sıvı kromatografi (Revers Phase Chromatography; RPC) tekniğinin geliştirilmesi olmuştur. RPC’de hareketli faz içerisindeki çözünmüş moleküllerin, durgun faz matriksine tutuklanmış olan bir n-alkil hidrokarbona veya aromatik liganda bağlanması ise hidrofobik etkileşimler aracılığı ile gerçekleşmektedir. RPC, biyomoleküllerin ayrıştırılmasında ve saflaştırılmasında, hem analitik hem de preparatif uygulama alanları bulmuştur. Proteinler, amino asitler ve nükleik asitler gibi belirli bir dereceye kadar hidrofobik özellik taşıyan moleküllerin ayrıştırılması, RPC ile çok iyi bir çözünürlük ve gerikazanım sağlanarak gerçekleştirilebilmektedir. Buna ilaveten, hareketli faz içerisinde iyon-eşleştirici modifikatörlerin kullanılması, hidrofilik proteinler ve tamamı ile korunmasız olan oligonükleotidlerin de RPC ile ayrıştırılmasına izin vermektedir. Preparatif RPC ise amino asit dizilemesi amacı ile mikro-ölçekli protein saflaştırmadan, rekombinant proteinlerin saflaştırılması amacıyla uygulanan üretim-ölçekli saflaştırmalara kadar değişen ölçeklerde kullanılabilmektedir. Bu bölümde ise RPC’nin, biyomoleküllerin ayrıştırılması amacıyla kullanılması sırasında dikkat edilmesi gereken genel prensipler ve bazı uygulama örnekleri üzerinde durulmaktadır. Bu bölümde yer verilen konular ise RPC’nin preparatif uygulamaları ile sınırlandırılmış olup, daha çok proteinlerin ve amino asitlerin saflaştırılması üzerinde durulmaktadır. 10.2. RPC’nin Temel Prensipleri

RPC’nin ayrıştırma mekanizması, hareketli faz içerisindeki biyomoleküller ile kolon matriksi üzerine tutuklanmış olan ligandlar (durgun faz) arasındaki hidrofobik bağlanma etkileşimine bağlıdır. Hidrofobik bağlanma etkileşiminin nasıl gerçekleştiğine ilişkin mekanizma üzerinde henüz tam olarak anlaşmaya varılamamış olması nedeni ile hidrofobik bağlanma etkileşiminin doğasının kendisi ise sıcak bir tartışma konusudur. Fakat mantıklı olarak kabul gören varsayıma göre hidrofobik bağlanma, elverişli entropi etkisinin bir sonucudur. RPC’de kullanılan başlangıç hareketli fazı (tampon-A veya yıkama tamponu olarak da adlandırılır) bağlama koşullarının öncelikle sulu olmasından, hem biyomoleküllerin hem de kolon matriksine tutuklanmış olan ligandların etrafı yüksek derecede düzenlenmiş su yapısı ile sarılmaktadır (Şekil 10.1). Tampon-A içerisindeki biyomoleküller, tutuklanmış olan ligandlara bağlandığında ise biyomoleküllerin çözücüye maruz kalan hidrofobik bölgeleri minimuma düşmektedir. Bu nedenle, düzenlenmiş su yapısının derecesi azalmakta ve sistemin elverişli entropisi artmaktadır. Bundan dolayı, sistemin elverişli entropisi

218



artarken, düzenlenmiş su yapısının derecesi de azalmaktadır. Bu durumda, enerji açısından, hidrofobik kalıntıların (örneğin ligand ve biyomolekül) birleşmesi avantajlı olmaktadır.

Şekil 10.1: Hareketli faz içerisindeki proteinlerin tipik bir RPC materyali ile etkileşimi. Hidrofobik bölgelere yakın olan su moleküllerinin normal sudaki moleküllere göre daha düzenli yapıda olduğu varsayılmaktadır. Hidrofobik bölgelerin etkileşimi sonucunda sistemin toplam entropisinde bir artış meydana gelirken “yapısal suyun” bir bölümü yer değiştirmektedir.

Adsorbtif bir proses olan RPC’de ayrıştırmanın etkinleşmesi, deneysel tasarım ile sağlanan dağılma mekanizmasına bağlıdır. Hareketli faz içerisinde çözünmüş olan biyomoleküller, hareketli faz ile durgun faz arasında dağılarak bir denge oluştururlar. Çözünmüş olan biyomoleküllerin iki faz arasındaki dağılımı ise kolon materyalinin bağlama özelliklerine, biyomoleküllerin hidrofobisitesine ve hareketli fazın kompozisyonuna bağlıdır. Kromatografik işlemin uygulanması esnasında başlangıç koşulları, hareketli fazın içerisindeki biyomoleküllerin durgun faza adsorblanmasını sağlayacak şekilde seçilir. Bu durumda adsorbsiyon, çözünmüş olan biyomoleküllerin dağılımının %100 durgun fazda olması nedeni ile sistem, uç noktada (ekstrem) denge durumunda kabul edilir. Daha sonra ise hareketli faz kompozisyonu, durgun faza adsorblanmış olan biyomoleküllerin durgun fazdan ayrılarak, tekrar hareketli faza geçmesini sağlayacak şekilde modifiye edilir. Bu durumda ise durgun faza adsorblanmış olan biyomoleküllerin durgun fazdan ayrılarak, tekrar %100 hareketli faz içerisinde dağılmış olması nedeni ile sistem, yine uç noktada denge durumunda kabul edilmektedir. Biyomoleküllerin RPC ile ayrıştırılmasında ise genellikle, izokratik elüsyon yerine gradient elüsyonu uygulanmaktadır. Sulu koşullar altında kolon matriksinin yüzeyine kuvvetli bir şekilde adsorblanmış olan biyomoleküllerin matriksten ayrılması ise hareketli faza ilave edilen organik modifikatörler ile sağlanmaktadır. Kolon matriksine adsorblanmış olan her bir biyomolekülün matriksten de-adsorbsiyonu ise organik modifikatör derişiminin dar bir aralığında gerçekleşmektedir. Tipik bir biyolojik materyal örneği ise benzersiz adsorbsiyon özelliklerine sahip olan yüksek moleküler kütleli biyomoleküllerin yanı sıra, adsorbsiyon affiniteleri oldukça geniş bir aralıkta yer alan çok fazla sayı ve çeşitteki biyomoleküllerden oluşmaktadır. Bu nedenle, kompleks biyolojik materyal örneklerinin RPC ile ayrıştırılması, ancak gradient elüsyonu ile sağlanabilmektedir. Özetle, RPC ile biyomoleküllerin ayrıştırılması, hareketli faz içerisinde çözünmüş olarak bulunan ve hidrofobik olan durgun faza karşı değişik derecelerde hidrofobisitelere sahip olan biyomoleküllerin, geri-dönüşümlü olarak durgun faza adsorbsiyon/de-adsorbsiyonuna bağlıdır. RPC ile biyomoleküllerin ayrıştırılmalarının gerçekleştirildiği deneysel çalışmaların büyük bir çoğunluğu, Şekil 10.2’de gösterildiği gibi beş temel basamaktan oluşmaktadır. Bu basamaklar ise ana hatları ile şu şekilde özetlenebilir: i. Paketlenmiş olan kolonun dengelenmesi: Bütün kolon kromatografisi tekniklerinde olduğu gibi RPC’de de ilk adım, kolon materyali ile uygun bir şekilde paketlenmiş olan kolonun uygun bir pH, iyonik kuvvet ve polariteye (hareketli fazın hidrofobisitesi) sahip olan başlangıç hareketli fazı (tampon-A olarak adlandırılır) ile dengelenmesidir. Tampon-A’nın polaritesi ise asetonitril gibi organik modifikatörlerin bu faz içerisine ilavesi ile kontrol edilebilir. Bu amaçla

10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ


219

trifloroasetik asit gibi iyon-eşleştirici ajanlar da uygun olabilmektedirler. Kolonu dengelemekte kullanılan tampon-A’nın polaritesi ise kısmen hidrofobik olan biyomoleküllerin tampon içinde çözünmesini sağlayacak kadar düşük, fakat aynı zamanda biyomoleküllerin RPC matriksine (durgun faz) adsorblanmasını sağlayacak kadar da yüksek olması gerekmektedir (bkz. kısım 10.5.4). ii. Örnek materyalinin kolona yüklenmesi: Bu basamakta ise ayrıştırılması gerçekleştirilecek olan biyomolekülleri içeren örnek materyali, dengelenmiş olan kolona yüklenir (bkz. kısım 3.8 ve kısım 4.10). İdeal olarak, kolona yüklenecek olan örnek materyali, birinci adımda kolonu dengelemek için kullanılan tampon-A içerisinde çözündürülür. Örnek materyalinin kolona yüklenmesi esnasında, biyomoleküllerin durgun faza bağlanmasının optimum olduğu akış oranında yükleme yapılır. Örnek materyali tamamı ile yüklendikten sonra, durgun faza bağlanmamış olan biyomoleküllerin kolondan uzaklaştırılması için kolon yeniden tampon-A ile yıkanır. i. Başlangıç koşulları

M

ii. Biyomoleküllerin adsorbsiyonu

iii. Ayrılmanın başlaması

M

M

iv. Ayrılmanın sonu

M

v. Rejenerasyon

M

Şekil 10.2: Biyomoleküllerin ayrıştırılmasında RPC’nin kullanılması durumunda uygulanan başlıca deneysel basamaklar.

iii. Biyomoleküllerin elüsyonu: Bu basamakta ise durgun faza adsorblanmış olan biyomoleküllerin, durgun fazdan ayrılarak (de-adsorbsiyon) yeniden hareketli faza (elüsyon tamponu veya tampon-B) geçmesi ve böylece kolondan elüsyonu sağlanır. RPC kolonlarından biyomoleküllerin elüsyonu ise genellikle elüsyon tamponunun polaritesinin düşürülmesi ile sağlanır. Elüsyon tamponunun polaritesinin düşürülmesi ise bu faz içerisindeki organik modifikatörün yüzdesisin kademeli olarak artırılması ile sağlanır (bkz. kısım 10.6.7). Elüsyon tamponunun pH’sı ise genellikle elüsyon işleminin başından sonuna kadar aynı kalır. Elüsyon tamponunun polaritesinin dereceli olarak düşürülmesi (veya diğer anlamda, hidrofobisitesinin dereceli olarak artırılması) ise elüsyon işlemine çok az (≤%5) veya hiç organik modifikatör içermeyen %100 tampon-A ile başlanıp, organik modifikatörün oldukça yüksek bir derişimini (≥%95) içeren %100 tampon-B ile elüsyonun tamamlanması ile başarılır. Böylece elüsyon tamponunun polaritesindeki düşme dereceli olarak sağlanacağından, durgun faza adsorblanmış olan biyomoleküller kendi hidrofobisitelerine uygun olan derecelerde elüe olacaklardır. iv. Kolonun temizlenmesi: Bu basamakta ise elüsyon işlemi sırasında kolondan ayrılmamış olan ve hâlâ durgun faza adsorblanmış olarak bulunan biyomoleküllerin kolondan uzaklaştırılması sağlanır. Bunun için ise kolon, genellikle %100’e yakın bir derişimdeki organik modifikatör ile yıkanır. Böylece kolon yeniden kullanılmadan önce, durgun faza adsorblanmış olan bütün moleküllerin kolondan uzaklaştırılması sağlanmış olur (bkz. kısım 10.6.8).

220



v. Kolonun rejenerasyonu: Bu basamakta ise temizlenmiş olan kolon, yeniden kullanım için tampon-A ile yıkanır. Böylece kolon içerisindeki tampon-B ve organik modifikatör kalıntılarının kolondan atılarak, kolonun yeniden dengelenmesi sağlanır (bkz. kısım 10.6.8).

RPC ile ayrıştırmanın temeli, örnek materyal içerisinde bulunan biyomoleküllerin hidrofobik özelliklerinin farklı olmasının bir sonucu olarak, bu moleküllerin bağlanma özelliklerinin farklılığına dayanmaktadır. Biyomoleküllerin ters-faz matriksine bağlanma dereceleri, başlangıç tamponunun hidrofobik özelliği manipüle edilmek suretiyle kontrol edilebilir. Çözünmüş bir molekülün hidrofobisitesini ölçmek zor olsa da, hidrofobik özellikleri açısından çok az da olsa farklılık gösteren moleküllerin ayrıştırılması kolayca sağlanabilmektedir. Ters-faz HPLC ise esnekliği ve sağladığı yüksek çözünürlükten dolayı çok yaygın olarak kullanılan kromatografik bir yöntemdir. RPC tekniği, biyomoleküllerin ayrıştırılmasında uygulanan koşullarda oldukça geniş bir esneklik sağlamaktadır. Bu esneklik nedeni ile ters-faz sıvı kromatografisinin uygulanmasında araştırmacılar birinci yol olarak, hedef moleküllerin durgun faza adsorblanmasını sağlarken kirletici moleküllerin ise kolona tutunmadan kolonu doğrudan terk etmesini sağlayan koşulları seçebilirler. Birinci yolun aksine, kirleticilerin durgun faza bağlanmasını sağlayan, fakat hedef moleküllerin ise kolondan doğrudan doğruya geçişine izin veren koşulları da seçebilirler. RPC uygulamalarında ise genellikle birinci alternatif olan hedef moleküllerin durgun faza adsorblanmasını sağlayan koşullar seçilmektedir. Çünkü bu yöntem, ayrıştırmanın yanı sıra hedef moleküllerini içeren örnek materyalinin yoğunlaştırılmasını da sağlamaktadır. Buna ilaveten, RPC kolonuna yüklenecek olan örnek materyalinin başlangıç derişimi kritik bir öneme sahip olmadığından, düşük derişime sahip örnek materyalinin kolona yüklenmesine de izin vermektedir. Bileşiklerin kolon materyaline adsorblanmasını (ya da serbest kalmasını) sağlayan koşullar ise deneysel koşulların dizaynı (bkz. kısım 10.5) adı altında daha detaylı olarak ele alınmaktadır. RPC matrikslerinin üzerine kovalent olarak tutuklanmış olan ve iyonlaşabilen kirleticiler nedeni ile bileşiklerin kolon materyaline adsorblanması, iyonik bağlar aracılığı ile de olabilmektedir. Hidrofobik ve iyonik bağların kombinasyonunun oluşturduğu bu etki ise karışık-tarz alıkonma davranışı olarak adlandırılmaktadır. İyonik etkileşimlerin engellenmesi için ise öncelikle çok sıkı bir denetimden geçirilerek üretilmiş olan, kaliteli RPC materyallerinin kullanılmasına özen gösterilmelidir. Ayrıca, kromatografi işlemi esnasında kullanılan hareketli faz koşullarının çok akıllıca seçilmesi ile de iyonik etkileşimler minimuma indirgenebilir. 10.3. RPC Adsorbentleri 10.3.1. RPC Matriksleri

Ters-faz sıvı kromatografisinin kolon materyallerini tanımlayan en kritik özellikleri, kromatografi matriksinin kimyasal kompozisyonu, partikül büyüklüğü, matriks üzerine tutuklanmış olan ligandların tipi, matriks üzerindeki ligand yoğunluğu, (şayet varsa) başlık grubunun kimyası ve matriksin gözenek büyüklüğüdür. Ters-faz kromatografi materyalleri, hidrofobik olan ligandların, porlu (gözenekli), çözünmeyen ve boncuk şeklinde olan bir matriks üzerine kimyasal olarak bağlanması ile elde edilmektedirler. Kullanılan matriksler ise hem kimyasal hem de mekaniksel olarak kararlı olmak durumundadırlar (bkz. kısım 3.3). Ticari olarak bulunan RPC matriksleri ise genellikle silika veya polistiren gibi sentetik organik polimerlerden oluşmaktadır (bkz. kısım 3.3). Şekil 10.3’de ise hidrofobik ligandların kimyasal olarak bağlanmış olduğu bazı silika materyallerinin yapısı görülmektedir. RPC materyali olarak ilk kullanılan polimer matriks ise silika olmuştur. RPC materyali ise orijinal olarak, küçük organik moleküllerin saflaştırılması amacı ile geliştirilmiş ve daha sonraları ise kimyasal olarak sentezlenmiş olan küçük moleküler kütleli peptidlerin saflaştırılmasında



221

kullanılmıştır. Silika ise düşük pH’da ve RPC’de tipik olarak kullanılan organik çözücülerin varlığında kararlılığını koruyan, gözenekli boncuklar şeklinde üretilmektedir.

M

O

Si

M

O O

Si O Si

Silanol grup kalıntısı

OH

Eter; silanol kaynağı CH3

M

O

Si

O

Si

(CH2)17 CH3 Oktadesil grup

CH3 CH3

M

O

Si

O

Si

CH2

CH3

C2 başlık grubu

CH3

Şekil 10.3: Silika-temelli RPC materyallerinin bazılarının tipik yüzey yapıları. RPC’de en yaygın kullanılan ligandlardan birisi ise hidrofobik oktadesil grubudur.

Silikanın, gözenekli ve fiziksel olarak kararlı olması ise yüksek kapasiteli ve verimliliği yüksek olan kolon materyallerinin hazırlanmasına izin vermektedir. Silika-temelli kolon matrikslerinin seçiciliği, büyük ölçüde ligandın özellikleri ve hareketli fazın kompozisyonu ile kontrol edilebilir olsa da, bu matrikslerin üretiminde kullanılan farklı prosedürler nedeni ile farklı ayrıştırma profilleri veren kolon materyalleri üretilmektedir. Silika jellerin kimyasal özellikleri ise farklı karbon zinciri uzunluklarına sahip olan ligandların, basitçe türevlendirilmesine izin vermektedir. Karbon içeriği, yüzey yoğunluğu ve tutuklanmış olan ligandların dağılımı ise sentez esnasında kontrol edilebilmektedir. Silika-temelli matrikslerin RPC materyali olarak kullanılmasındaki en önemli dezavantaj ise yüksek pH’larda, sulu solüsyonlardaki kararsızlığıdır. Bu nedenle, silika jel matrikslerinin çoğunun pH 7,5’in üzerindeki solüsyonlara uzun süre maruz bırakılmaması önerilmektedir. RPC materyali olarak, boncuk yapısındaki polistiren gibi sentetik organik polimerler de bulunmaktadır (Şekil 10.4). Polistiren ise geleneksel olarak, peptid sentezinde katı destek materyali olarak ve otomotize analizlerde, amino asitlerin ayrıştırılması için katyon değiş-tokuş kromatografi materyali olarak kullanılmıştır. Polistiren materyallerin en büyük avantajı ise özelikle kuvvetli asidik veya bazik koşullarda göstermiş oldukları mükemmel kararlılıklarıdır. Çünkü, silika jellerden farklı olarak polistiren, pH 1-12 aralığında kararlıdır. Bu nedenle, polistiren-temelli kolon materyallerinin kullanıldığı RPC uygulamalarında ayrıştırma, pH 7,5’in üzerinde gerçekleştirilebilir. Ayrıştırma işleminin pH 7,5’in üzerinde gerçekleştirilmesi ise biyomoleküllerin iyonizasyon derecelerinin çok daha fazla kontrol altına alınmasını sağlamakta ve bunun sonucu olarak da çok daha iyi bir alıkonma seçiciliği sağlanabilmektedir. Hidrofobik ligandlara sahip olan silika jellerin aksine, polistiren boncukların yüzeylerinin kendileri de oldukça kuvvetli hidrofobik olduğundan, türevlendirilmeden bırakıldıklarında hidrofilik bir yüzeye kaynarlar. RPC’de kullanılan bir kolon materyalinin gözenekliliği, bu materyalin biyomolekülleri bağlamak için kullanılabilir kapasitesini belirleyen önemli bir faktördür. Burada, kullanılabilir bağlama kapasitesinin; kapasite faktörü (k) olmadığına, fakat kolon materyalinin kendisinin gerçek bağlama kapasitesi olduğuna dikkat edilmelidir. Gözenek çapı yaklaşık olarak 10 nm olan kolon materyalleri, çoğunlukla küçük organik moleküllerin ve peptidlerin saflaştırılması için


222


kullanılmaktadır. Gözenek çapı 30 nm veya daha büyük olan kolon materyalleri ise RPC’nin sert koşullarına dayanan rekombinant peptidlerin ve proteinlerin saflaştırılması için kullanılmaktadır. CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

Şekil 10.4: Polistiren-temelli RPC materyalinin kısmi yapısı.

10.3.2. RPC Ligandları

RPC materyallerinin seçiciliği, büyük ölçüde kolon matriksi üzerine bağlanmış olan ligand tipinin bir fonksiyonudur. Genel olarak, RPC uygulamalarında en yaygın kullanılan ligandlar ise lineer hidrokarbon zincirlerinden (n-alkil grupları) oluşan ligandlardır. Bu tip hidrokarbon ligandlardan bazılarının yapısı ise Şekil 10.5’de görülmektedir. CH3

(a)

M

O

Si

CH2 CH3

CH3 CH3

(b)

M

O

Si

CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3

CH3 CH3

(c)

M

O

Si

CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2

CH3

CH3

Şekil 10.5: Tipik olarak kullanılan n-alkil hidrokarbon ligandlar. (a) İki-karbon başlık grubu, (b) Oktil ligand, (c) Oktadesil ligand.

Torik olarak, herhangi bir özel uygulama için hangi ligandın en iyi sonuç vereceğini önceden tahmin etmek mümkün olmasa da, birinci kural olarak “oldukça hidrofobik olan bir biyomolekülün saflaştırılması için daha az hidrofobik olan bir ligandın kullanılması gerekmektedir”. Çok daha hidrofilik olan moleküllerin ayrıştırılmalarının gerçekleştirilebilmesi için yeterli bağlanmanın sağlanabilmesi amacıyla, kuvvetli hidrofobik ligandların tutuklanmış olduğu kolon materyallerinin kullanılması gerekmektedir. Tipik olarak, kimyasal olarak sentezlenen peptidler ve oligonükleotidler çok daha hidrofobik olan C18 ligandları ile yeterince saflaştırılabilirler. Proteinler ve rekombinant



223

peptidler ise bu moleküllerin büyüklükleri nedeni ile hidrofobik moleküller olarak davranırlar ve çoğunlukla C18 ligandlarına kuvvetli bir şekilde bağlanırlar. Buna rağmen bu moleküller, C8 ligandları ile çok daha iyi saflaştırılırlar. Daha az hidrofobik olan sekiz-karbonlu alkil zincirleri ise bu ligandlara bağlanmış olan protein ve peptidlerin elüsyonunu sağlamak için daha düşük derişimlerde organik çözücüye gereksinim göstereceğinden, protein ve peptidlerin yapısını daha az bozacaktır. RPC’de kullanılan kolon materyallerinin ligand yapısına ilaveten, silika jelin yüzeyine tutuklanmış olan hidrokarbon ligandların yoğunluğu da bu kolon materyallerinin seçiciliklerini etkilemektedir. Bu nedenle, farklı partilerden elde edilmiş örnek materyallerinin RPC ile saflaştırılması esnasında tutarlı bir seçiciliğin sağlanabilmesi için silika yüzeylerinin kimyasal olarak türevlendirilmesinde tekrarlanabilir bir yöntemin kullanılması oldukça önemlidir. Hidrokarbon ligandların silika jellere tutuklanması ise silika jel yüzeyinde bulunan silanol grupları aracılığı ile gerçekleştirilir. Bu amaçla, silika jelin yüzeyinde bulunan silanol grupları ile ligandın klorotrialkilsilan formu reaksiyona sokularak, ligandın silika yüzeyine bağlanması sağlanır. Fakat bu tutuklama reaksiyonunda, C18 ve C8 ligandlarının oldukça büyük olması nedeni ile meydana gelen sterik engellemeler yüzünden, silika yüzeyinde bulunan silanol gruplarının tamamı doldurulamaz. Silika yüzeyinde türevlendirilmeden kalan silanol gruplarının ise biyomoleküllerin RPC ile saflaştırılması esnasında sıklıkla gözlenen karışık-tarzdaki iyon değiş-tokuş etkisinden sorumlu olduğuna inanılmaktadır. RPC esnasına gözlenen bu yan-etkinin indirgenmesi amacıyla ligandın tutuklanmasından sonra, silika yüzeyinde serbest kalan silanol gruplarının tamamının türevlendirilerek kapatılmasını sağlamak için silika, daha küçük olan alkilsilan (klorotrimetilsilan veya klorotrietilsilan) ayıraçları ile reaksiyona sokulur. Bu işlem ise son-başlıklama olarak adlandırılır. Son-başlıklama işlemi ise kolon materyalinin seçiciliğini etkilediğinden, kullanılan RPC kolon materyalinin iyi bir sonuç vermesi için son-başlıklama işleminin de tekrarlanabilir olması oldukça önemlidir. Silika jellerin türevlendirilmesine ilişkin reaksiyon ise Şekil 10.6’da görülmektedir. CH3

M

Si

OH +

Cl

Si CH3

CH3 (CH2)17 CH3

M

Si

O

Si

(CH2)17 CH3 +

HCl

CH3

Şekil 10.6: Monoklorodimetiloktadesilsilan kullanılarak silika jelin oktadesil zinciri (C18) ile türevlendirilmesi.

Kolon materyallerinin partikül büyüklükleri (partikülün çapı olarak ölçülür) ise kullanışlı bir kolonun paketlenebilmesi için önemli olan kolon yatak hacminin belirlenmesi ve saflaştırma işleminin verimliliği açısından oldukça önemlidir. Partikül büyüklüğü iri olan kolon materyalleri, kapasitesinin daha fazla olması ve yüksek akış oranında daha az basınca gereksinim göstermesi nedeni ile genellikle büyük-ölçekli preparatif ve endüstriyel üretim uygulamalarında kullanılır. Küçük-ölçekli preparatif ve analitik ayrıştırmalarda ise partikül çapı küçük olan kolon materyalleri kullanılmaktadır. Çünkü küçük partiküllü kolon materyallerinin sağladığı saflaştırma verimliliği daha yüksektir (bkz. kısım 2.8.2. ve kısım 2.8.3). Analitik ve küçük-ölçekli preparatif uygulamalarda genellikle 3-5 μm partikül çapına sahip kolon materyalleri kullanılırken, büyük-ölçekli preparatif uygulamalarda (pilot uygulama ve endüstriyel üretim) ise genellikle 15 μm veya daha büyük partikül çapına sahip olan kolon materyalleri kullanılmaktadır. 10.4. RPC’de Çözünürlük

Preparatif RPC uygulamalarında esas amaç, saflaştırılmış olan biyolojik materyalin gerikazanımının ve saflaştırma çözünürlüğünün yeterli bir düzeyde olmasıdır. Diğer sıvı kromatografi yöntemlerinde olduğu gibi, RPC’de çözünürlük ve çözünürlüğü kontrol eden en önemli parametreler

224



olan kapasite faktörü, verimlilik ve seçicilik ise detaylı olarak kısım 2.8’de ve bu kısmı takip eden alt-kısımlarında incelenmiştir. Bunun yanı sıra, kromatografik saflaştırma işleminin genelinin çözünürlüğü üzerine, hem kolon verimliliğinin yüksek olmasının hem de kolon materyalinin seçiciliğinin iyi olmasının önemi oldukça büyüktür. Buna rağmen, kromatografik deneylerde seçiciliği değiştirmek, verimliliği değiştirmekten daha kolaydır. Seçicilik, hareketli fazın kompozisyonunu ya da gradient şeklini değiştirmek gibi, kromatografik koşulları modifiye etmekle kolaylıkla değiştirilebilmektedir. 10.4.1. Bağlama Kapasitesi

RPC kolon materyalinin kullanılabilir bağlama kapasitesi, statik koşullar altında kolon materyalinin biyomolekülleri adsorblama yeteneğinin nicel bir ölçüdür. Dinamik bağlama kapasitesi ise özgül bir akış oranında, kullanılabilir bağlama kapasitesinin bir ölçüsüdür (bkz. kısım 6.7.2.1.). Preparatif çalışmalar için bu değerlerin her ikisi de oldukça önemlidir. Bir kolon materyaline bağlanacak olan biyomoleküllerin miktarı, kolon materyali üzenine tutuklanmış olan ligandların derişimi ile orantılıdır ve aynı zamanda, kolon materyaline adsorblanacak olan biyomoleküllerin tipine bağlıdır. Kullanılabilir ve dinamik bağlama kapasiteleri, saflaştırılacak olan biyomoleküllerin özgül kimyasal ve fiziksel özelliklerine, kolon materyalinin özelliklerine (örneğin, gözenekliliğine) ve biyomoleküllerin kolon materyaline bağlanması esnasındaki deneysel koşullara bağlıdır. Kolon materyalinin gözenekliliği, bağlama kapasitesini etkileyen önemli bir faktördür. Büyük gözenekli kolon materyallerinin hidrofobik olan yüzeylerinin tamamı biyomoleküllerin bağlanması için kullanılabilir. Küçük gözenekli kolon materyallerinin kullanılması durumunda, yüksek moleküler kütleye sahip olan biyomoleküller, kolon materyalinin dışında kalabilir ve bu durumda hidrofobik yüzeyin sadece küçük bir parçası kullanılmış olur. Maksimum bağlama kapasitesine gereksinim duyulduğunda, örnek materyali içinde bulunan hedef moleküllerin tamamının rahatça girebilecekleri gözenek büyüklüğüne sahip bir kolon materyali kullanılmalıdır. 10.5. Deneysel Koşulların Dizaynı

RPC uygulamalarında, deneysel koşulların dizaynında göz önünde bulundurulması gereken başlıca parametreler arasında kolon uzunluğu, hareketli fazın akış oranı, kromatografik işlemin gerçekleştirildiği sıcaklık, hareketli fazın kompozisyonu, gradient elüsyonu ve RPC’nin kullanım amacı bulunmaktadır. 10.5.1. Kolon Uzunluğu

RPC ile ayrıştırmada moleküler kütlesi büyük olan biyomoleküllerin çözünürlüğünün kolon uzunluğuna olan duyarlılığı, moleküler kütlesi küçük olanlara göre daha azdır. Proteinler, büyük peptidler ve nükleik asitler ise kısa kolonlarla iyi bir şekilde saflaştırılabilirler ve kolon uzunluğunu artırmak, bu moleküllerin çözünürlüğünü belirgin bir şekilde etkilememektedir. Peptidlerin parçalanması sonucunda oluşan bazı ürünler de dahil olmak üzere, küçük peptidlerin çözünürlüğü ise kolon uzunluğu artırılmak sureti ile daha da geliştirilebilir. Örneğin, karbokamidometil transferinin tipik parçalanması sonucunda oluşan ürünlerin RPC ile fraksiyonlanması sonucunda belirlenen piklerin sayısı, 5 cm uzunluğunda bir kolonun kullanılması durumunda 87; 15 cm’lik bir kolonun kullanılması durumunda 115; 25 cm’lik bir kolonun kullanılması durumunda ise 121 olarak belirlenmiştir. Yüksek kütleli biyomoleküllerin dağılma katsayıları ise hareketli fazın kompozisyonundaki çok küçük değişikliklere karşı dahi oldukça duyarlıdır ve bu nedenle, büyük biyomoleküller organik modifikatörün oldukça dar bir derişim aralığında kolon materyalinden ayrılmaktadırlar (deadsorbe



225

olmaktadırlar). Büyük moleküllerin kolonda alıkonma davranışlarının ise belki de kolon uzunluğundan etkilenmeyen bir açma/kapama mekanizması (örneğin, dağılma katsayısında meydana gelen büyük bir değişiklik) ile kontrol edildiği düşünülebilir. Organik modifikatör derişiminde meydana gelen çok küçük bir değişme, biyomoleküllerin dağılma katsayısında da çok küçük değişikliklere yol açmakta; kolon uzunluğunun artırılması ise çözünürlüğü artırmaktadır. RPC ile büyük biyomoleküllerin saflaştırılması esnasında gradient elüsyonunun kullanılması ise çözünürlük üzerine olan kolon uzunluğunun etkisini daha da azaltmaktadır. Biyolojik örneklerin çoğunun oldukça kompleks karışımlar olması ve bu tür karışımlarda yer alan biyomoleküllerin RPC kolon materyaline adsorblanmaları da oldukça değişkenlik göstermesi nedeniyle, iyi bir çözünürlüğün sağlanabilmesi için gradient elüsyonu gerekmektedir. Biyomoleküllerin adsorbsiyon affinitelerindeki bu çeşitlilik nedeni ile kolon materyaline adsorblanan moleküllerin tamamının kolondan elüe edilmesini garantilemek amacı ile elüsyonda kullanılan hareketli fazın elüsyon gücünün aralığı, oldukça geniş olmak zorundadır. Bu koşullar altında, özellikle gradient eğiminin normal olduğu koşullardan dik olduğu koşullara kadar, çözünürlük üzerinde kolon uzunluğunun kritik bir etkisi bulunmamaktadır. 10.5.2. Hareketli Fazın Akış Oranı

Küçük peptidler ve proteinlerin parçalanması sonucu oluşan ürünler de dahil olmak üzere, küçük moleküllerin RPC ile saflaştırılması esnasında, hareketli fazın akış oranının çözünürlüğü oldukça etkileyebileceği tahmin edilebilir. Buna rağmen, proteinler ve rekombinant peptidler gibi daha büyük biyomoleküllerin RPC ile saflaştırılması sırasında, hareketli fazın akış oranının çözünürlüğü etkilemediği görülmektedir. Gerçekte ise uzun kolonlar için tipik olarak kullanılan düşük akış oranı, belki de çözünürlüğü gerçekten düşürmektedir. Çünkü, büyük moleküllerin RPC ile saflaştırılması sırasında hareketli fazın akış oranının düşük olması, moleküllerin düşey diffüzyonunu artırmakta, bu da çözünürlüğü azaltmaktadır. Analitik deneylerde olmamasına rağmen, büyük-ölçekli preparatif RPC uygulamalarında, örnek materyalinin kolona yüklenmesi sırasında kullanılan akış oranı oldukça önemlidir. Çünkü kolon materyalinin dinamik bağlama kapasitesi, örnek materyalinin kolona yüklendiği akış oranına bağlı olarak değişecektir. Bir saflaştırma prosedüründe ölçek büyütülürken, örnek materyalinin kolona yüklenmesi sırasında olması gereken optimum akış oranını belirlemek için kolon materyalinin dinamik bağlama kapasitesi de tanımlanmalıdır. Dinamik bağlama kapasitesi ise kullanılan kolon materyalinin bir özelliği olup, kolon materyalinin biyomolekülleri bağlama prosesinin kinetiğini yansıtmaktadır. Bu adımın verimliliği, büyük-ölçekli preparatif bir saflaştırma prosedürünün sonuçları için oldukça önemlidir. 10.5.3. Kromatografik İşlemin Gerçekleştirildiği Sıcaklık

Özellikle kısa peptidler ve oligonükleotidler gibi düşük moleküler kütleli moleküllerin RPC ile saflaştırılması sırasında, sıcaklığın çözünürlük üzerine olan etkisi oldukça büyüktür. Kolon sıcaklığının yükseltilmesi ile birlikte, RPC’de kullanılan hareketli fazın viskozitesi düşmektedir. Saflaştırılacak olan moleküllerin hareketli faz ile durgun faz arasındaki kütle geçişi ise diffüzyonkontrollü bir prosestir. Bu nedenle, hareketli fazın viskozitesinin düşmesi genel olarak kütle geçişinin daha etkili olmasına yol açar ve buna bağlı olarak da çözünürlük artar. RPC kolonunun sıcaklığının artırılması, küçük kütleli moleküllerin yükseltilmiş sıcaklıklarda kararlı olmaları nedeni ile bu moleküllerin saflaştırma çözünürlüğünü de artırmaktadır.

226



10.5.4. Hareketli Fazın Kompozisyonu

Birçok durumda, RPC’de kullanılan hareketli faz yerine tampon terimi kullanılmaktadır. Buna rağmen, RPC’de kullanılan hareketli fazların genellikle düşük pH’daki kuvvetli asitlerle birlikte organik çözücülerin yüksek derişimlerini içermesi nedeniyle, hareketli faz solüsyonunun tamponlama kapasitesi oldukça düşüktür. Fizyolojik koşullara yakın çalışıldığı durumlarda ise yeterli tamponlama kapasitesi korunmalıdır. i. Organik çözücü: Organik çözücü (modifikatör), sulu hareketli fazın polaritesini düşürmek amacıyla bu faza eklenmektedir. RPC’de hareketli fazın polaritesinin düşürülmesi, bunun elüsyon kuvvetini yükseltir. RPC’de oldukça değişik çeşitlilikteki organik çözücüler kullanılabilmesine rağmen, patikte ise bu organik çözücülerden sadece birkaç tanesi rutin olarak kullanılmaktadır. En çok kullanılan organik çözücülerden iki tanesi ise asetonitril ve metanoldür. İsopropanol (2propanol) da kuvvetli elüsyon özellikleri nedeni ile kullanılabilir. Fakat bu çözücünün kullanımı, yüksek viskozitesinden dolayı kolon verimliğini düşürmesinden ve geri-basıncı artırmasından dolayı sınırlıdır. Asetonitril ve metanolün her ikisinin de viskozitesi ise isopropanolün viskozitesinden düşüktür (bkz. Tablo 10.1).

Bu organik çözücülerin her üçü de aslında UV ışınını geçirir. Bu özellik ise RPC kolonundan biyomoleküllerin elüsyonu esnasında genellikle UV detektörlerin kullanılması nedeni ile gerekli bir özelliktir. RPC ile peptidlerin saflaştırılmasında ise neredeyse her zaman asetonitril kullanılmaktadır. Peptidlerin çoğu UV spektrumunun sadece düşük dalga boylarını absorblarlar (tipik olarak 225 nm’den düşük). Asetonitril ise düşük dalga boylarında, yaygın olarak kullanılan diğer çözücülerin çoğuna göre daha düşük bir temel absorbans çizgisi sağlar. Herhangi bir biyomolekül için alıkonma veya kapasite faktörü (k), hareketli fazın polaritesinin bir fonksiyonudur. Biyomoleküllerin kolondan elüsyon sırası ise organik modifikatörün tipinin değiştirilmesi veya hareketli faza iyon-eşleştirme ajanlarının katılması ile değiştirilebilir. Elüsyon sırasındaki değişiklik ise organik çözücüler içerisinde denatüre olan proteinler için çok daha belirgindir. Proteinin denatürasyonu ise onun hidrofobisitesinde bir değişiklikle sonuçlanabilmektedir. ii. İyon baskılama: Peptidlerin ve proteinlerin iyonlaşabilen gruplar içermeleri nedeni ile bu biyomoleküllerin RPC kolonunda tutulması (alıkonması), hareketli faz pH’sı ile modifiye edilebilir. Bu moleküllerin iyonlaşma dereceleri ise hareketli fazın pH’sına bağlı olacaktır. RPC’de kullanılan silika-temelli kolon materyallerinin kararlılık özellikleri ise hareketli fazın pH değerinin 7,5’in altında olmasını zorunlu kılmaktadır. Peptid ve proteinlerin amino grupları ise pH 7,5’in altında yüklü hale gelmektedir. Buna rağmen, karboksilik asit grupları ise pH’nın düşmesi ile birlikte nötralize olmaktadırlar. RPC’de kullanılan hareketli faz ise genellikle trifloroasetik asit (TFA) veya ortofosforik asit gibi kuvvetli asitlerle hazırlanır. Hareketli fazdaki bu asitler ise düşük bir pH çevresinin oluşmasını ve bu çevrenin korunmasını sağlayarak, biyomoleküllerin asidik gruplarının iyonlaşmasını baskılamaktadırlar. Hareketli faz içerisindeki kuvvetli asitlerin derişimleri değiştirilerek biyomoleküllerin iyonlaşma, bunun sonucu olarak da kolonda alıkonma davranışları değiştirilebilir.

RPC’de iyon baskılamanın en büyük yararı, silika jel yüzeyinde kalan ve iyonlaşabilen silanol grupları nedeni ile meydana gelen karışık-tarzdaki alıkonma etkisinin ortadan kaldırılmasıdır. Karışık-tarzdaki alıkonma etkisinin belirtileri ise biyomoleküllerin kolonda kalma sürelerinin uzaması ve belirgin bir pik genişlemesi şeklinde gözlenir (Şekil 10.7). Karışık-tarzdaki alıkonma, silika yüzeyinde bulunan negatif yüklü silanol grupları ile biyomoleküllerin pozitif olarak yüklenen amino grupları arasındaki iyon değiş-tokuş etkileşiminden kaynaklanmaktadır. Silika-temelli RPC kolon materyallerinin yüzeyindeki silanol gruplarının ise iki temel kaynağı bulunmaktadır. Bunlardan



227

birincisi, jelin üretilmesi sırasında yetersiz bir son-başlıklama işleminin yapılmış olmasından kaynaklanmaktadır (bkz. kısım 10.3.2). Bu nedenle, RPC kolon materyalleri seçilirken karışıktarzdaki alıkonma etkisi oldukça düşük olan jellerin seçilmesi oldukça önemlidir. Silika yüzeyindeki iyonlaşabilen serbest silanol gruplarının ikinci nedeni ise kolon materyalinin eskimesidir. Silika jelin yüzeyi, kolon kullanıldığı sürece devamlı olarak aşınmakta ve bunun sonucunda da serbest silanol gruplarının ortaya çıkmasına yol açarak, kademeli olarak kolon performansının bozulmasına yol açmaktadır. Kolonun uzun süre sulu solüsyonlara maruz bırakılması ise kolonun eskimesini hızlandırmaktadır.

Şekil 10.7: Karışık-tarzdaki alıkonma davranışının tipik etkileri. Pik genişlemekte ve yamulmakta, elüsyon zamanı ise uzamaktadır.

RPC’de kullanılan tipik hareketli fazların düşük pH çevresi (genellikle pH 3,0’dan az) ise silika jelin yüzeyinde bulunan serbest silanol gruplarının iyonlaşmasını baskılamakta ve bunun sonucu olarak da karışık-tarz alıkonma etkisi ortadan kalkmaktadır. RPC’de kullanılan kolon materyallerinin polistiren-temelli veya diğer sentetik organik polimerler olması durumunda ise iyon baskılama gerekli değildir. Polistiren-temelli kolon materyalleri pH 1-12 aralığında kararlıdır ve hareketli fazın pH değerinin yüksek olduğu durumlarda, silika jellerde olduğu gibi karışık-tarz alıkonma etkisi göstermezler. iii. İyon-eşleştirme ajanları: Proteinler, peptidler ve oligonükleotidler gibi biyomoleküllerin alıkonma zamanları, hareketli faz içerisine iyon-eşleştirme ajanlarının eklenmesi ile değiştirilebilir. İyon-eşleştirme ajanları ise iyonik etkileşimler ile biyomoleküllere bağlanarak, bağlandıkları biyomoleküllerin hidrofobisitesinde değişikliğe yol açarlar. RPC’de kullanılan iyon-eşleştirme ajanlarının örnekleri ise kısım 10.6.2.3’de verilmektedir.

Saflaştırılacak olan hedef biyomoleküllerin iyonik karakterlerine ve hareketli fazın pH’sına bağlı olarak, hem anyonik hem de katyonik iyon-eşleştirme ajanları kullanılabilir (Şekil 10.8). Örneğin, peptidlerin saflaştırılması sırasında hareketli fazın pH değerinin 3,5’den az olduğu durumda, tipik olarak kullanılan iyon-eşleştirme ajanı trifloroasetik asittir. Nötral veya daha yüksek pH değerlerinde negatif bir yük taşıyan oligonükleotidler için ise tipik olarak kullanılan iyoneşleştirme ajanı trietilamindir.

228



Şekil 10.8: İyon-eşleştirme ajanları ile (a) anyonik veya (b) katyonik iyon-çifti oluşumu. M, kolon materyali.

Bazı durumlarda ise biyomoleküllerin RPC materyaline bağlanması için hareketli faz içerisine iyon-eşleştirme ajanlarının katılması bir zorunluluktur. Örneğin, tritil gibi bir koruyucu grubun eklenmediği korumasız sentetik oligonükleotidlerin kolonda alıkonması için, hareketli faza trietilamin eklenmelidir. Trifloroasetik asit gibi uygun bir iyon-eşleştirme ajanının bulunmadığı durumlarda, kolon materyaline bağlanmanın ihmal edilebilir düzeyde olduğu hidrofilik peptidler için de aynı durum söz konusudur. Hareketli faz içerisindeki iyon-eşleştirme ajanının derişimi ise genellikle %0,1 ile %0,3 arasındadır. Hareketli faz içerisinde iyon-eşleştirme ajanlarının bulunmasından kaynaklanan potansiyel problemler ise iyon-eşleştirici ajanlar tarafından UV ışınının absorblanması ve organik modifikatör derişimi ile ekstinksiyon katsayısının değişmesidir. Bu problemler ise gradient elüsyonu esnasında, temel-çizginin ya yükselmesine ya da düşmesine neden olur. 10.5.5. Gradient Elüsyonu

Biyomoleküllerin preparatif RPC ile saflaştırılması sırasında kullanılan elüsyon metodu, gradient elüsyonudur. Proteinlerin ve peptidlerin preparatif RPC kolonundan elüsyonu için tipik olarak uygulanan gradient elüsyonu ise lineer ve ikili (örneğin, iki hareketli fazın kullanılması) elüsyondur. Gradient uygulamasının ya başlangıcında ya da sonunda fazladan çözünürlük gerektiren (özellikle çok-bileşenli örnek materyallerinin analizlerinin yapıldığı) analitik uygulamalarda ise ara sıra konveks ve konkav gradient elüsyonları da kullanılmaktadır (bkz. kısım 3.9 ve Şekil 3.10,c). Başlangıç hareketli fazındaki (tampon-A) organik çözücülerin derişimi ise son hareketli fazındakinden (tampon-B) daha düşüktür. Gradient ise organik modifikatörün yüzdesinde meydana gelen tam değişikliğinden bağımsız olarak, her zaman yüksek polariteden (su içeriği yüksek, organik modifikatör derişimi düşük) düşük polariteye doğru (su içeriği düşük, organik modifikatör derişimi yüksek) gelişmektedir. RPC’de gradient şekli (lineer gradient ve izokratik koşulların kombinasyonu), gradient eğimi ve gradient hacmi göz önünde bulundurulması gereken önemli parametrelerdir. Tipik olarak, kompleks örnek materyallerinin saflaştırılmasında RPC ilk defa kullanıldığında, optimum gradient şeklini tespit etmek amacıyla, başlangıç taramasında geniş bir gradient kullanılır. Başlangıç taraması tamamlandıktan sonra, hedef biyomoleküllerin saflaştırılması için gradient şeklinin optimizasyonu yapılabilir. Bu ise genellikle hedef biyomoleküllerin elüe edildiği bölgede gradient eğiminin düşürülmesi; bu bölgeden önce ve sonra ise gradient eğiminin yükseltilmesi ile sağlanır.



229

Gradient eğiminin seçimi ise kirletici moleküllerin elüsyonunun, hedef moleküllerin elüsyonuna ne kadar yakın olarak gerçekleştiğine bağlı olarak değişecektir. Genel olarak, gradient eğiminin düşürülmesi çözünürlüğü artırmaktadır. Buna rağmen, gradient eğiminin azalması, pik hacminin ve alıkonma zamanının artmasına yol açmaktadır. Kısa kolonlara uygulanan sığ gradient eğimi ise yüksek moleküler kütleye sahip olan biyomoleküller için genellikle optimaldır. Gradient eğimi ise genellikle, birim zamanda (% Tampon-B/dk) veya birim hacimde (% Tampon-B/mL) tampon-B’nin yüzde değişimi olarak tanımlanmaktadır. Bir kromatografi sisteminin programlanması zaman modunda yapıldığında, akış oranındaki değişikliklerin gradient eğimini ve bunun sonucu olarak da çözünürlüğü etkileyeceğini unutmamak gerekmektedir. Çözünürlük, aynı zamanda toplam gradient hacminden de (gradient zamanı x akış oranı) etkilenmektedir. Optimal değerlerin belirlenmesi deneysel olarak tanımlanmak zorunda olsa da, RPC’de birinci kural, kolon hacminin yaklaşık olarak 10-20 misli bir gradient hacmi ile elüsyona başlanmasıdır. Daha sonra ise çözünürlüğün optimize edilmesi amacıyla, gradient eğimi yükseltilebilir veya düşürülebilir. 10.5.6. RPC’nin Kullanım Amacı 10.5.6.1. Tuz Giderimi

Örnek materyallerinden tuzların giderilmesi, büyük moleküler kütleye sahip hedef moleküllerinden küçük moleküler kütleye sahip olan kirleticilerin ayrıştırılması amacıyla uygulanan rutin bir laboratuvar işlemidir. Bu işlem ise bazen tampon değiştirme olarak da adlandırılmaktadır. Tampon değiştirme amacıyla uygulanan ve kromatografik olmayan tekniklerin başında ise ultrafiltrasyon (bkz. kısım 1.7.2) ve diyaliz (bkz. kısım 1.7.5) yöntemleri gelmektedir. Tuz giderme işlemleri genellikle, iyon değiş-tokuş kromatografisi gibi diğer metotlarla elde edilmiş olan fraksiyonlardan tuzların giderilerek, örnek materyalinin hazırlanması amacıyla uygulanmaktadır. Jel filtrasyon kromatografisi ile protein ve nükleik asit örneklerinden tuzların giderilmesi için Sephadex G-25; küçük peptid örneklerinden tuzların giderilmesi için ise Sephadex G-10 yaygın olarak kullanılmaktadır (bkz. kısım 1.7.4 ve kısım 5.6.2.1. Preparatif metotlar). Jel filtrasyon kromatografisi, kullanım kolaylığı ve biyomoleküllerin kararlılığını koruması nedeni ile örnek materyallerinden tuzların uzaklaştırılması amacıyla kullanılan önemli bir teknik olmasına rağmen, örnek materyalinin seyrelmesine yol açmaktadır. Proteinlerden, peptidlerden ve oligonükleotidlerden oluşan örnek materyallerindeki tuzların giderilmesi ise RPC ile güvenli bir şekilde gerçekleştirilebilmektedir. Örnek materyallerinden tuzların giderilmesi amacıyla RPC tekniğinin kullanılması durumunda, örnek materyalinin gerikazanılması sağlanmakta ve örnek hacmi küçük tutulabilmektedir. Böylece, tuz giderimi amacı ile jel filtrasyon kromatografisinin kullanılması durumunda ortaya çıkan örnek materyalinin seyrelmesi, RPC tekniğinde ortadan kalkmaktadır (Şekil 10.9). Örnek materyali, küçük bir RPC kolonundan geçirildiğinde örnek materyali içinde bulunan biyomoleküller kolon materyalinin yüzeyine bağlanırlar ve orada yoğunlaşırlar. RPC, GFC’den farklı olarak, bir adsorbsiyon tekniğidir ve örnek materyalinin hacmi sınırlayıcı bir faktör değildir. Bu nedenle RPC kolonları, örnek materyallerindeki tuzların giderilmesini sağlamanın yanı sıra, seyreltik olan büyük hacimli örnek materyallerinin yoğunlaştırılmasını da sağlamaktadır. Örnek materyalinin tamamı RPC kolonuna yüklendikten sonra, kolon materyaline bağlanmış olan biyomoleküllerin elüsyonu ise küçük hacimdeki, asetonitril gibi düşük polariteli bir hareketli faz ile gerçekleştirilir. Şayet elüsyon işleminde kullanılan çözücü, asetonitril gibi uçucu bir özelliğe sahipse, bu çözücü buharlaştırılır ve geriye kalan örnek materyali istenilen hacimdeki yeni tampon içinde çözündürülür.

230



Şekil 10.9: (a) GFC ve (b) RPC ile örnek materyallerinden tuz giderimi. GFC’de büyük olan moleküllerin elüsyonu önce olmaktadır; tuzların elüsyonu için ise hareketli fazın değiştirilmesine gerek yoktur. RPC’de ise tuzların elüsyonu önce gerçekleşmektedir; kolon materyaline bağlanmış olan proteinlerin ve diğer moleküllerin elüsyonu ise daha-düşük polariteli bir hareketli fazın kullanılmasını gerektirir (Anonymous, 1999).

10.5.6.2. Yüksek Çözünürlüklü Saflaştırma

RPC, tipik olarak yüksek çözünürlük sağlayan bir kromatografi tekniği olarak kullanılabilmektedir. Buna rağmen, bazı uygulamalar RPC’nin sağladığı çözünürlük gücünü, bu tekniğin limitlerine doğru itmektedir. Bu gibi durumlar ise preparatif uygulamaların ara basamaklarında veya kompleks bir karışımdan yapısal olarak benzer moleküllerin saflaştırılması sırasında görülmektedir. Örneğin, enzimatik parçalamalar sonucunda meydana gelen özgül peptidlerin saflaştırılması veya oligonükleotid kirleticilerin çok olduğu kompleks bir karışımdan bazı oligonükleotidlerin saflaştırılması, bu gibi durumlara verilebilecek en iyi örneklerdir. Böyle durumlarda, oldukça fazla sayıdaki piklerin birbirinden ayrılmalarının sağlanması zorunlu olduğu gibi, daha sonraki analizler için yeterli miktarda örneğin geri-kazanılması da zorunludur. Tipik olarak, partikül büyüklükleri oldukça küçük olan 3 μm ve 5 μm çapındaki RPC kolon materyallerinin kullanılmasının yanı sıra, kromatografik işlemin gerçekleştirildiği sıcaklık, gradient eğimi ve hareketli faz kompozisyonu gibi detayların da itinalı bir şekilde dikkate alınması gerekmektedir. Kısa oligonükleotidler, parçalanmış protein parçacıkları (fragmentleri) ve kısa peptidler gibi saflaştırılacak olan biyomoleküllerin moleküler kütleleri çok daha küçük olduğunda ise çözünürlüğün en yüksek düzeye sağlanabilmesi için hareketli fazın akış oranı ve kolon uzunluğu gibi diğer faktörlerin de optimizasyonu gerekmektedir. 10.5.6.3. Büyük-Ölçekli Preparatif Saflaştırma

Sentetik oligonükleotidler, rekombinant peptidler ve proteinler gibi biyomoleküllerin RPC ile büyük-ölçekli olarak saflaştırılması, hem yüksek çözünürlüklü ayrıştırmanın sağlanmasını hem de saflaştırma protokolünün ölçeğinin büyütülebilmesini gerektirmektedir. Bu gibi durumlarda, küçük partiküllü bir RPC kolon materyalinin kullanılması ve daha sonra da benzer bir seçiciliğe sahip olan, fakat daha büyük bir partikül çapına sahip olan kolon materyalinin kullanılması ile saflaştırma protokolü optimize edilerek, ölçek büyütülür. RPC’de saflaştırma ölçeğinin büyütülmesinde kullanılan teknikler, iyon değiş-tokuş kromatografisinde olduğu gibi diğer kromatografik yöntemlerdeki ölçek-büyütme tekniklerine benzemektedir. 10.5.6.4. Saflaştırma İşleminin Basamakları

İster mikrobiyal, kimyasal veya doğal olsun isterse diğer kaynaklardan olsun, biyomoleküllerin kaynağı belirlendikten ve yeterli miktarda ham örnek materyali elde edildikten



231

sonra, hedef moleküllerinin ham örnek materyali içinde bulunan diğer kirleticilerden saflaştırılması gerekmektedir. Ham bir örnek materyalinden veya özütten (ekstrakttan) bir biyomolekülün saflaştırılabilmesi için, aslında üç temel fonksiyonel basamak bulunmaktadır. Bu basamaklar ise elde etme, ara saflaştırma ve cilalama olarak adlandırılır (Şekil 10.10). RPC de dahil olmak üzere saflaştırma protokolünün herhangi bir basamağında, herhangi bir saflaştırma tekniğinin uygunluğu, her zaman saflaştırılacak olan biyomolekülün özelliğine, hedef biyomolekülün saflaştırılması esnasında karşılaşılan özgül problemlere ve saflaştırılmış olan ürünün hedeflenen kullanım alanına bağlıdır. Başlangıç örnek materyali Gereksinim Doğrudan yükleme Ham örnek yükleme toleransı Yerinde temizleme

Saflaştırma Basamağı Elde etme

Ara Saflaştırma

Çözünürlük Tekrarlanabilirlik Yerinde temizleme

Cilalama Saf ürün

Şekil 10.10: Saflaştırma protokolünün basamakları.

i. Elde etme: Saflaştırma protokolünün ilk adımını, hedef biyomoleküllerin de içinde bulunduğu ham örnek materyalinin elde edilmesi oluşturmaktadır (bkz. kısım 1.6). Bu basamakta, örnek materyalinin hacmi genellikle çok büyük olmakta, katı partiküller veya viskoz materyaller içerebilmektedir. Elde etme basamağının amacı ise ham örnek materyali içerisinde bulunan hedef biyomoleküllerin iyi bir şekilde geri-kazanımını sağlamakla birlikte, hızlı bir şekilde bu moleküllerin izolasyonunu, derişimini ve kararlılığını sağlamaktır (Şekil 10.11).

Elde etme basamağının iyi bir çözünürlük sağlaması beklenemez; fakat yine de hedef biyomolekülleri, bu moleküllerden farklı özelliklere sahip olan kirletici moleküllerden izole etmesi istenir. Bu nedenle elde etme basamağı, yüksek çözünürlüklü bir saflaştırma basamağı olmaktan ziyade, grup ayrıştırmanın gerçekleştirildiği bir basamak olarak değerlendirilir. Sonuç olarak, başarılı bir elde etme basamağında zaman, kapasite ve geri-kazanım ise çözünürlükten çok daha önemlidir. RPC, sentetik peptidlerin ve sentetik oligonükleotidlerin elde edilmesi için uygun bir metot olarak kullanılabilmektedir. Buna rağmen, biyolojik kaynaklardan peptidlerin ve proteinlerin elde edilmesi için ise RPC çok daha az uygun bir metottur. Bunun nedeni ise biyolojik kaynaklardan elde edilen örnek materyalleri içersinde lipitlerin ve kuvvetli hidrofobik olan diğer moleküllerin de bulunmasıdır. Lipitler ve kuvvetli hidrofobik olan diğer moleküller ise RPC kolon materyaline oldukça sıkı olarak bağlandıklarından, hem kolon materyalinden uzaklaştırılmaları zordur hem de hedef moleküller için var olan dinamik bağlama kapasitesinin azalmasına neden olurlar. Buna ilaveten, küçük partiküllü RPC kolon materyallerinin çoğunun verimli bir şekilde kullanılabilmesi için kolonun tıkanmasını önlemek amacıyla, örnek materyali içerisindeki katı partiküllerin uzaklaştırılması gerekmektedir. Böyle durumlarda ise hedef moleküllerinin elde edilmesi amacıyla, kolon materyallerinin partikül çaplarının 90 μm’den büyük olduğu IEC ya da HIC’nin kullanılması çok daha uygun olmaktadır.

232



Şekil 10.11: Elde etme esnasındaki basamaklar.

ii. Ara saflaştırma basamağı: Ara saflaştırma basamağında hedef moleküllerin, örnek materyali içerisinde bulunan diğer proteinler, peptidler, nükleik asitler, endotoksinler ve virüsler gibi kirleticilerin çoğundan ayrıştırılmasına odaklanılmaktadır. Bu basamakta, kirletici moleküller ile hedef moleküller çoğunlukla yapısal ve fonksiyonel özellikleri açısından birbirlerine çok benzediklerinden, kullanılan saflaştırma tekniklerinin birbirine benzer olan molekülleri ayırt edebilme yeteneği oldukça önem kazanmaktadır. Bu basamakta en önemli faktörleri ise gerikazanım ve çözünürlük oluşturmaktadır. RPC ise yüksek çözünürlüğün elde edilebilmesini sağlayabilecek bir teknik olması nedeni ile saflaştırma protokolünün ara saflaştırma basmağında kullanılabilecek uygun bir kromatografik yöntem olmaktadır. iii. Cilalama: Saf bir ürünün hazırlanmasının son adımını ise cilalama oluşturmaktadır. Cilalama adımında, elde edilen saf ürün içerisinde buluna eser miktardaki kirleticiler uzaklaştırılmaktadır. Saflaştırılmış olan biyomolekül, bu ürünün kullanılacağı amaca uygun formda olmalıdır. Cilalama aşamasında bulunan kirletici moleküller çoğunlukla hedef moleküle oldukça benzemektedirler. Tipik olarak bulunan kirleticiler ise hedef biyomolekülün “dönüşümleri” ve yapısal varyantlardırlar. Yapısal varyantlar ise dimerleri, oligomerleri, agregatları, oksitlenmiş amino asitleri, proteaz tarafından kırpılmış molekülleri, deamine amino asitleri ve benzer molekülleri içermektedir. Bunların yanı sıra, saflaştırılmış olan ürün içerisinde mikro düzeyde başka moleküller de bulunabilir. Özel işleme tâbi tutulan uygulamalarda cilalama, aynı zamanda eser miktarda bulunan endotoksinlerin, virüslerin ve filtre ile tutulabilen diğer materyallerin de uzaklaştırılmasını sağlamaktadır.

Cilalama aşamasının amacı, iki adımdan az bir işlemle %99’dan fazla bir geri-kazanım ile %100 homojen saflıkta son-ürünün elde edilmesidir. Cilalama işlemi, özellikle dimerlerin ve agregatların uzaklaştırılması gerektiği durumlarda, jel filtrasyon kromatografisi ile gerçekleştirilebilir. Buna rağmen, hedef molekülün çok küçük varyantlarının ve mikro düzeydeki diğer moleküllerin uzaklaştırılması gerektiği durumlarda ise mükemmel bir çözünürlük sağlayan RPC tekniğinin kullanılması çok daha uygun olmaktadır.



233

10.6. RPC’nin Gerçekleştirilmesi

Takip eden alt-kısımlarda ise RPC’nin planlanması ve uygulanması için gerekli olan uygun durgun fazın, hareketli fazın ve gradient koşullarının seçilmesi gibi basamaklar üzerinde durulmaktadır. Ayrıca bu kısımlarda, örnek materyalinin hazırlanmasına, organik çözücülerin kullanılması esnasında dikkat edilmesi gereken hususlara ve potansiyel tehlikelere de değinilmektedir. 10.6.1. Kolon Materyalinin Seçimi

Herhangi bir biyomolekülün RPC ile başarılı bir şekilde saflaştırılabilmesi için uygun bir kolon materyalinin seçilmesi oldukça önemlidir. Bu nedenle, bir kolon materyalinin seçimi esnasında göz önünde bulundurulması gereken bazı kriterler bulunmaktadır. Bu kriterler ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: i. Uygulama ölçeği ve hareketli faz koşulları da dahil olmak üzere, uygulamanın gereksinimleri. ii. Örnek materyal bileşenlerinin moleküler kütleleri veya büyüklükleri. iii. Örnek materyal bileşenlerinin hidrofobisiteleri. iv. Örnek materyal bileşenlerinin sınıfı. 10.6.1.1. Uygulamanın Gereksinimleri i. Çözünürlük: Bir saflaştırma işleminde seçilecek olan kolon materyali, arzu edilen saflığın elde edilmesini sağlayacak özellikte olmalıdır. Peptid haritalamasında olduğu gibi, çok-bileşenli örnek materyallerinin fraksiyonlanmasının gerekli olduğu uygulamalar ise oldukça yüksek çözünürlüklere gereksinim duymaktadırlar. Sentetik peptidlerin saflaştırılması gibi preparatif RPC uygulamalarında ise örnek materyalinin üretim aşamasından doğrudan doğruya kolona yüklenmesi (üretimden-yükleme) söz konusu olduğu için, bu gibi durumlarda çözünürlükten ziyade, prosesin hızı ve kapasitesi önem kazanmaktadır.

RPC’de çözünürlük, hem kolonun seçiciliğine hem de verimliliğine bağlıdır. Özgül bir saflaştırma işlemi için ise seçicilik, tutuklanmış olan hidrofobik ligandın doğasına, silika matriksin türevlendirilmesinde kullanılan kimyasal işleme ve hareketli fazın kompozisyonu gibi kullanılan kromatografik koşullara bağlıdır. Bir RPC kolonunun maksimum verimliliği ise kolonun paketlenmesinde kullanılan prosese (bkz. kısım 3.5 ve kısım 4.6) ve kolon materyalinin partikül büyüklüğüne bağlıdır. Bu nedenle, partikül çapı en küçük olan kolon materyallerinin (örneğin, partikül çapı 3 μm olan μRPC C2/C18 gibi) verimlilikleri en yüksek olurken, partikül çapları büyüdükçe (örneğin, Sephasil Protein 12 μm; SOURCE 15RPC ve SOURCE 30 RPC) kolon materyallerin verimlilikleri de düşmektedir. ii. Saflaştırma ölçeği: Mikro-ölçekli saflaştırma için 3 μm veya 5 μm partikül çapına sahip olan kolon materyalleri (örneğin, μRPC C2/C18) ile paketlenmiş olan dar-çaplı kolonlar veya Sephasil C8 ve Sephasil C18 gibi SMART kolonlar kullanılmalıdır. Laboratuvar-ölçekli tipik saflaştırma işlemlerinde ise 5 μm partikül çapına sahip kolon materyalleri seçilebilir. Özellikle ham örnek materyallerinin doğrudan doğruya kolona yüklenmesi gerektiği durumlarda, şayet başarılı bir saflaştırma için yüksek bir pH veya silikaya alternatif bir seçicilik gerekiyorsa, 12 μm partikül çapına sahip veya SOURCE 15RPC gibi kolon materyallerinin kullanılması çok daha uygun olabilir.

Pilot- ve endüstriyel-ölçekli uygulamalar için ise her zaman daha büyük partikül çapına sahip olan kolon materyalleri seçilmelidir. Bu tip uygulamalar için ölçek-büyütme çalışmaları yapılırken, bu kolon materyallerinin eşdeğerleri olan ve daha küçük partikül çapına sahip olan kolon

234



materyalleri kullanılır. Örneğin, önceden paketlenmiş olan RESOURCE RPC kolonlarının seçiciliği, SOURCE 30RPC kolon materyalinin seçiciliğine benzerdir. iii. Hareketli faz koşulları: RPC matriksinin seçimi, kromatografide kullanılacak hareketli fazın kompozisyonuna da bağlılık göstermektedir. Şayet örnek materyali içerisinde bulunan biyomoleküllerin çözünürlüğü ya da kararlılığı, özgül bir çözücü sisteminin kullanılmasını gerektiriyorsa, bu durumda kullanılacak olan kolon materyalinin bu çözücü sistem içerisindeki kararlılığı da göz önünde bulundurulmalıdır. Örneğin, RPC sisteminde kullanılacak olan hareketli fazın pH değeri 7,5’in üzerinde olacaksa, bu durumda SOURCE RPC gibi polistiren-temelli matriksler kullanılmalıdır (bkz. kısım 10.3.1). iv. Üretimden-yükleme ve ölçekleme: Belirli bir zamanda işlenebilen örnek materyalinin miktarı (örneğin, üretimden-yükleme), kapasite, akış özellikleri ve kolon materyalinin paketlenmiş olduğu kolonun ölçüsü gibi özellikler ile tanımlanmaktadır. Büyük-ölçekli preparatif kromatografi uygulamalarında, üretimden-yükleme amacıyla SOURCE 15RPC, SOURCE 30RPC, Sephasil Protein 12 μm ve Sephasil Peptide 12 μm gibi kolon materyalleri ise HPLC koşulları için optimize edilmiş olup, kolaylıkla ölçek-büyütmeye izin vermektedirler. 10.6.1.2. Örnek Bileşenlerinin Moleküler Kütleleri

Örnek materyalini oluşturan komponentlerin tutuklanmış olan hidrofobik ligandlara erişebilirliği, özgül bir biyomolekül için RPC kolon materyalinin kullanılabilir kapasitesini belirlemektedir. Erişilebilirlik ise büyük ölçüde, kolon materyalini oluşturan boncukların gözenek büyüklüklerine ve hacimlerine bağlıdır. Moleküler kütleleri büyük olan biyomoleküllerin saflaştırılmak istendiği durumlarda, gözenek büyüklükleri iri olan RPC kolon materyalleri tipik olarak, gözenek büyüklükleri daha küçük olan RPC kolon materyallerine göre çok daha iyi bir kapasite ve çözünürlük sağlarlar. Genel olarak, proteinlerin saflaştırılması amacıyla gözenek büyüklükleri 30 nm veya daha büyük olan RPC kolon materyalleri önerilmektedir. Peptidlerin ve oligonükleotidlerin saflaştırılması için ise gözenek büyüklükleri 30 nm’den küçük olan RPC kolon materyalleri önerilmektedir. 10.6.1.3. Örnek Bileşenlerinin Hidrofobisiteleri

IEC ve GFC gibi diğer kromatografi tekniklerinden farklı olarak, RPC’de bir biyomolekülün alıkonma zamanının tahmin etmek, şayet imkansız değilse, oldukça güçtür. Standart peptidlerin çalışılması ile hidrofobisite faktörlerine bağlı olarak alıkonma zamanının tahmin edilmesine yönelik teşebbüsler ise birkaç çalışmanın konusunu oluşturmuştur. Sakamoto ve ark. (1988) tarafından gerçekleştirilen bu çalışmalardan birisi, bir algoritma sağlamaktadır. Bu algoritma ise proteolitik parçalanmaya tâbi tutulan protein örneklerinin alıkonma davranışları ile oldukça benzer bir mimikri göstermektedir. Bu türdeki çalışmalar ise genel olarak, bağlanma prosesinin daha iyi anlaşılmasına yol açmıştır. Bir peptidin alıkonma zamanını etkileyen önemli parametrelerin ise peptidin amino asit dizisi ile birlikte, peptidin sahip olabileceği α-heliks ve β-plakalı tabaka gibi herhangi bir sekonder yapının kombinasyonu olduğu görülmektedir. Proteinler için ise üçüncül yapılarından dolayı, durum çok daha karmaşık hale gelmektedir. Bu nedenle, örnek materyal içerisinde bulunan biyomoleküllerin doğasına bağlı olarak, RPC kolon materyalinin seçimi deneysel olarak yapılmak zorundadır. Çözünürlük hakkında ise örnek materyalinin tutuklanmış olan liganda göre, göreceli hidrofobisitesinden yararlanılarak (örneğin, örnek materyalinin hidrofobisitesi yüksek, tutuklanmış olan ligandların hidrofobisitesi ise daha düşük) bazı tahminler yapılabilir. Dolayısıyla, çok daha hidrofobik olan biyomoleküllerin preparatif saflaştırmasında, C18 yerine C8 ligandına sahip olan bir kolon materyalinin kullanılması önerilmektedir.



235

RPC matriksinin seçimini, hareketli fazın kompozisyonu da etkileyebilir. RPC’de kullanılacak olan hareketli fazın pH değerinin 7,5’in üzerinde olması gerektiği durumlarda ise SOURCE RPC gibi polistiren-temelli bir matriks kullanılmalıdır (bkz. kısım 10.3.1). Örnek materyal içerisinde bulunan biyomoleküllerin kararlılığını korumak amacıyla, özgül bir çözücü sisteminin kullanılması gerektiği durumlarda ise bu çözücü sisteminde, matriksin kararlılığı da göz önünde bulundurulmalıdır. 10.6.1.4. Örnek Bileşenlerinin Sınıfı

RPC, birçok sınıftaki biyomoleküllerin saflaştırılması amacıyla kullanılmaktadır. RPC koşullarının genellikle oligonükleotidlerin ve peptidlerin kimyasal bütünlüğü üzerine olumsuz bir etkisinin olmaması nedeni ile proteinlerin kararlılıkları ve biyolojik aktiviteleri dikkatli bir şekilde sorgulanmalıdır. Polipeptidlerin hidrofobik yüzeylerle ve organik çözücülerle olan etkileşimleri genellikle üçüncül yapının bir miktar bozulmasına yol açar. Bir biyomolekülün üçüncül yapısının bozulması ise bu molekülün farklı bir konformosyonel yapıya sahip olması ile sonuçlanabilir ve bu farklı yapıdaki konformasyonların her birisi RPC materyali ile farklı bir şekilde etkileşim gösterebilir. İnsülin, büyüme hormonu, büyüme faktörleri ve daha birçok diğer rekombinant ve sentetik proteinlerin ve peptidlerin büyük-ölçekli olarak RPC ile sıkılıkla saflaştırılması, bu kromatografi yönteminin uygulanması esnasında meydana gelen denatürasyon problemlerinin üstesinden gelindiğine işaret etmektedir. Biyomoleküllerin RPC ile saflaştırılması sırasında meydana gelen yapısal bozulmalar ve bunun sonucu olarak da aktivitede meydana gelen kayıplar ise uygun muamele yöntemleri ile minimuma indirgenebilir. RPC ile saflaştırılmış olan proteinler, bu proteinlerin doğal yapılarını korudukları koşullara yeniden transfer edilerek kinetikleri geriye döndürülebilir. Bunun yanı sıra kompleks enzimler ve çok-bileşenli proteinler, küçük peptidlere veya oldukça kararlı ya da çapraz-bağlı proteinler göre, aktivitelerini daha fazla kaybetmektedirler. Buna rağmen bir protein veya peptid, birincil yapısının tanımlanması amacıyla saflaştırıldığında ise çökelme meydana gelmediği sürece, denatürasyon bir problem oluşturmamaktadır. Dolayısıyla RPC, protein ve peptidlerin amino asit dizilerinin belirlenmesi amacıyla hazırlanmasında oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır. 10.6.2. Hareketli Faz Seçimi

Biyomoleküllerin RPC ile saflaştırılması esnasında kullanılan hareketli faz, genel olarak bir “tampon”, bir organik modifikatör ve seçiciliği etkilemek amacıyla, hareketli faza ilave edilen bir iyon-eşleştirme ajanından meydana gelmektedir. Hareketli fazı hazırlamakta kullanılan suda olduğu gibi, bütün organik çözücüler, tamponlama tuzları ve iyon-eşleştirme ajanları, kimyasal olarak oldukça yüksek saflıkta olmalı ve hiçbir metal iyonu içermemelidir. Kullanılan organik çözücülerin, tuzların ve suyun yeterli saflıkta olduğunu belirtmek amacıyla “HPLC kalitesi” ile işaretlenmiş olmalıdır. Hareketli faz içerisinde bulunabilcek herhangi bir kirletici, istenmeyen ekstra piklerin, hayalet piklerin ve saflaştırılmış olan biyomolekülleri kontamine ederek, kromatografiyi etkileyebileceğinden dolayı, preparatif RPC’de kimyasal saflık oldukça önemlidir. 10.6.2.1. Organik Çözücü

Organik çözücüler, hareketli fazın polaritesini düşürmek amacıyla bu faza ilave edilirler. Düşük pH’lı sulu bir solüsyon ile asetonitril gibi farklı polaritelere sahip olan iki çözücünün karıştırılması sonucunda, karışımı oluşturan orijinal bileşenlerin her ikisinin de polaritelerinden farklı olarak, orta polaritede bir çözücü elde edilebilir. Çözücü karışımının polaritesinin düşürülmesi ise RPC’de, bu çözücü karışımının elüsyon gücünü yükseltmektedir. RPC’de kullanılabilecek çok sayıda suya karışabilen organik çözücü bulunmaktadır, fakat pratikte ise bu organik çözücülerden

236



sadece birkaçı kullanılmaktadır. RPC’de yaygın olarak kullanılan organik çözücülerin bazı özellikleri ise Tablo 10.1’de verilmektedir. Tablo 10.1: RPC’de kullanılan bazı organik çözücüler. Kaynama noktası (ºC)

UV sınırı* (nm)

Viskozite (20 ºC’de cP)

Asetonitril

82

190

0,36

Etanol

78

210

1,20

Metanol

65

205

0,60

1-Propanol (n-Propanol)

98

210

2,26

Viskoz.

2-Propanol (izo-Propanol)

82

210

2,30

Viskoz.

Su

100

Protein Saflaştırma: Kromatografik Teknikler

Protein - Protein Interaction

Protein-protein interaction

Protein - Protein Interaction

Protein Protein Interactions

Computational Protein-Protein Interactions

Protein Phosphorylation

Protein Structure

Protein Evolution

Protein condensation

Protein Biosynthesis

Protein Phosphorylation

Protein Evolution

Inhibitors of Protein Kinases and Protein Phosphates

Protein Power

Protein Turnover

Protein Methods

Protein Nanotechnology

Protein Power

Protein evolution

Protein Modules and Protein-Protein Interactions, Volume 61 (Advances in Protein Chemistry)

Protein-protein interactions in plant biology

RNA-Protein Interaction Protocols

Membrane Protein Protocols

Protein NMR Techniques

Protein Structure Prediction

Protein Kinase Protocols

RNA-Protein Interaction Protocols

Protein Purification Protocols

Protein Saflaştırma: Kromatografik Teknikler

Protein - Protein Interaction

Protein-protein interaction

Protein - Protein Interaction

Protein Protein Interactions

Computational Protein-Protein Interactions

Protein Phosphorylation

Protein Structure

Protein Evolution

Protein condensation

Protein Biosynthesis

Protein Phosphorylation

Protein Evolution

Inhibitors of Protein Kinases and Protein Phosphates

Protein Power

Protein Turnover

Protein Methods

Protein Nanotechnology

Protein Power

Protein evolution

Protein Modules and Protein-Protein Interactions, Volume 61 (Advances in Protein Chemistry)

Protein-protein interactions in plant biology

RNA-Protein Interaction Protocols

Membrane Protein Protocols

Protein NMR Techniques

Protein Structure Prediction

Protein Kinase Protocols

RNA-Protein Interaction Protocols

Protein Purification Protocols

Recommend Documents