Genes IX

BENJAMIN LEWIN

Cuando se publicó la primera edición de GENES, Benjamín Lewin establecíó el estándar de la enseñanza de la biología y genética moleculares con un abordaje unificado. La novena edición de este libro clásico continúa con dicha tradición. presenta la estructura y función de los genes en organismos eucariotos y procariotos. El Dr. Lewin mantiene el compromiso de proporcionar a los estudiantes, investigadores y educadores los conceptos actuales en este campo que cambia en forma constante. La novena edición de GENES incluye contenido actualizado y una cobertura más amplia de temas fundamentales con una nueva organi zación que le permite al estudiante enfocarse con mayor precisión en los genes y en su expresión. GENES /X también ostenta un diseño moderno, nuevo y un programa contemporáneo. Características nuevas y principales de GENES IX • Mayor cobertura en numerosas áreas, que incluye: - Replicación del DNA - Recombinación y reparación - El replicón

- Regulación de la cromatina y regulación génica -Evolución de los genes - El cromosoma Y

• Reorganización para permitir a los instructores construir conceptos críticos a lo largo del curso. • Nuevo diseño contemporáneo y un impactante programa de arte de cuatro colores. • Nuevas actualizaciones de principio a fin, que incluyen información actua l referente a la organización del genoma, replicación del DNA. regu lación génica y mucho más .

•

Educación ISBN·13; 978·970·10-8685·0 ISBN-10; 970·10·6685-5

:1 11.1nr

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Editado por

Benjamin Lewin, PhD Geneticist Cambridge University Novena edición Traducción:

Héc:tor Barrera Villa Zevallos Félix García Roig

MÉXICO • BOGOTÁ • BUENOS ArRES • CARACAS • GUATEMALA LJSBOA • MADRID • NUEVA YORK • SAN JUAN • SANTIAGO • SAO PAULO AUCKLAND • LONDRES • MILÁN • MONTREAL • NUEV/\ DELHI SAN FRANCISCO • SIDNEY • SINGAPUR • ST. LOUIS • TORONTO

Editor sponsor: Cer recuperadas del ratón muerto. 1.2 El DNA es el material genético de las bacterias

3

Tipos de Pneumoooccus

Baeterl~ s

Con capsula,

formame, se demostró que éste es ácido desoxüribonucleico (DNA, deoxyribot1udeic acid).

Inyección de células

Resultado

VIva

Muefe) _ - -

de aspecto liso (S) \

/ Sin cápsula, de aspecto

Bac;lería S muerte

VNe

Bacleña A villa

VIva

. ~ Baclerla S rnuerta ~k 'y bacteóa R viva

Múefe

rugoso (A)

Ni las bacterias tipo S asesinadas con calor ni las bacterias tipo Rvivas pueden matar a los ratones, pero la inyección simultánea de ambos Lipos de bacterias pueoe matar a los ratones de forma tan efectiva como la oacteria tipo S viva.

Ratón inyectado con bacterias S muertas

y R vlvas

/~ Bacterias S vivas recuperadas del ratón muerto \

Sé extrae el DNA

\YJ ;./

~~

>..., •

Bacteria R Tr~:~nsformaclón

Bacteria S

El DNA de la bacteria de tipo S puede transformar a la bacteria de tipo R en el mismo tipo S.

En este experimento. las bacterias S muertas fueron de ripo lil y las R vivas, de tipo ll. La cubierta de las bacterias virulenta!. recuperadas NI\ w·ogenitor porra un mare de dcmidnd ·' pesada'' porque el organismo ha , cuh ivado en un nwdío que contiene un isótopo ccuado (romn 1'N) (N del T: en otras bibliogra:: apa1clc rumo N1\ el re~to de los marcadores ;1donados en este capítulo también aparecen con :.ímero después de la letra p. ej . , plz y 5 15 ). sus cnas pueden ser ttisunguidas de las sintetizadas Jo el organismo es transf~rido a un medio que · ~ nga •sótopo!. '"ligeros· normales El J)'1A progl'nltor . son complelmnnue pe1adai " complecameute ligans. Este patrón se confirmó experimentalmente en la prueba de Meselson·S[ahl en J958, que siguió a la duplicación semiconservadora del O"\ A a través de ues generadones de cretimienw de E coll. Cuando el D~A fue extraído de la!> baut•ria) y su densidad se midió por centrHugadón 11 dcnc;iclad. pesada en las progenitoras. híbnda en la pnmera generación, y mitad h1brida y mirad Jgera en la segunda generadóu .

Las cadenas del DNA se separan en la horquilla de duplicación Conceptos principales

• La duplicación del DNA es llevada a cabo por un complejo de enzimas que separan las cadenas progenitoras y sintetizan las cadenas hijas. • La horquilla de duplicación es el punto en que se separan las cadenas progenitoras. • !..as erzlmas que sintetizan el ONA se llaman DNA polimerasas; las enllmas que smtetizan el RNA se conocen como RNA polimerasas. Las nucleasas son enzimas Que degradan a los ácidos nucleicos; 1ntluyen DNAsas y RNAsas. y pueden dividirse en endonucleasas y en exonucleasas.

La duplicact6n exige la separación de las dos cadenas de un dúplex progenHor: sin embargo, el rompimíento de la t'S[ructlll'a ~s rransitorio. y se reviene conforme se forma el tlúpl~x hijo. En algún mo1.8 Las cadenas del DNA se separan en la horquilla de duplicación

9

1

1 .J J DNA progenitor Moléculas de DNA replicadas Horquilla de duplicación

La horquilla de duplicación es la región del DNA

en la cual hay una transición del dúplex progenitor desenrollado a los dúplex hijos recientemente replicados.

Enlace roto

~ Una endonucleasa divide a un enlace en un ácido nudeico. En este ejemplo se mueslra una enzima que ataca a una cadena de un DNA dúplex.

V Una exonucleasa elimina bases, una a la vez. dividiendo el último enlace de una cadena polinudeotidica.

do sintetizada. .Las enzimas se nombran según el tipo de cadena que sintetizan: las D NA polimerasas sintetizan DNA. las RNA polimer asas, RN.A. La degradación ele los ácidos nudcicos también requiere de enzimas específicas: tas d cso x irribo n u deasas (DNAsas) degradan alDNA y las ribonuclea sas (RNAsas) degradan al RNA. Las nucleasas se incluyen en las clases generales de cxonu cleasas y e ndonucleasas: • Las endonucleasas con¡:m enlaces individuales en el incerior de las moléculas de DNA y de Rl\lA y generan ú·agmenros discretos. Algunas DNAsas dividen ambas cadenas de un DNA dúplex en el sirio diana , mienn·as que otras dividen sólo una de cUas. Las endonucleasas participan en reacciones de corte, como se observa en la • Las exooucleasas eliminan los residuos, uno a u no. a partir d el extremo de la molécu la, y generan mononucleólidos. Siempre actúan en una soJa cadena de ácido nucleico, y cada exonuclcasa avanza en una dircdón especifica, es decir, empieza e n m1 exuemo 5' o 3' para dir igirse hacia el ouo. Esráu involucradas e n reacciones J e ajuste, como se muestra en la

La información genética puede ser proporcionada por el DNA o el RNA Conceptos principales

memo, sólo un tramo pequeño del DNA dúplex se separa en cadenas individuales . La esn·uctura helicoidal ele una molécula de DNA dedicada a la duplicación se ilustra en la . La región no replicada es el dúplex progenitor que se abre hachl la región replicada, donde se han formado los dos dúplex b ijas. La esrructuru helicoidal doble se rompe en la urúón entre las dos regiones, llamada h o rqui lla de duplicaci ón . ta dupl icación irHplica el movimiento de la horqu~­ lla de duplicación a lo largo del DN'A progenitor, de modo que hay un desenrollarniemo continuo de las cadenas progenitoras y un enrollamiento de los dúplex hijos. l..a síntesis de áddos nucleicos e~ catalizada por enzimas específicas, las cuales reconocen el molde y emprenden la Larea de caLalizar la adición de subunidades a la cadena poJinude01fdica que eStá sien-

10

CAPÍTULO 1 Los genes son DNA

• Los genes celulares son DNA, pero los virus y los viroides pueden tener genomas de RNA. • El DNA se convierte en RNA por transcripción, y e( RNA puede convertirse en DNA por transcripció11 inversa. • La traducción del RNA a proteína es unidireccional.

El dogm a cen tr aJ define el paradigm a de la biología molecular. Los genes se perpetúan como secuencias de ácido nudeko, si bien ac1:úan al ser expresados en forma de proteinas. La duplicación es responsable de la hercn.cia de la información genética. La transcri pción y la traducción son responsabJes de la conversión de uua forma a otra. Eo la r se Uustran las fu nciones de la duplicación, la transcripción y la traducción desde la perspectiva del dogma central: • La perpehJadón del ácido nucleico suele implicar al DNA o el RNA corno el material gmético. Las células utilizan únicamente DNA, en tanto que algunos virus usan RNA, y la duplica-

Molde de doble

-, DNA ....C:• • • • • • • • ••

... Cadena antigua

Duplicación

~

Duplicación

Transcnpcion tnversa

ANA

...........

""'~"~"

(T

YAY,w--< \7'\9

C de DNA o RNA. y rlc· c;HJa tipo hay cmplos de doble cadena (ds. t/t)uúle .~trcmded) o de .iJena única (e;,, sin,qlt• suandrd). Los detalles del ·canismo de replicación del ácido nucleico ' 'a rían ..tre los dtferemec; c;¡~lcmas víricos. pero el prindJc duplicacion por 'itfllc.,is de cadenas comple.emilna!> si~ue stendo el mi

La cadena progenitora lndiYiduaf es utilizada para sintetizar una cadena complemontarla

indJviduales del dl'tplc:\ para sintetizar las cadt>nt1., LOmplememarias. Los viruc; con genomas de una '>Ola cadena la izan como moldl' para ~imerízat un¡¡ radeoa - '"'lplementaria, la cual. él su vez. es urilizada para

sintetizar a su compk·memo que por )upuesw. es idéntico a la cadena origina l inicial. La duplicación puede implicar la formadCln de ime11nedictrios eslallles de doble cadena o utili7ar .1cido nucleico de dnb e ladena sólo como UIM fal>t' 1ransnoria. la rc'itricción de la ttan,lrrcnciJ unidireccional de DNA a RNA no es absoluta, he:~ '>idus lpcrada por los retrovirus. cuyos gt'nomas están formados por molew las de Rl\A de una ..,ola cadena Durame el

ciclo infeccioso, el RNA -,e wnvit:rte en una cadena úntcct dr DNA por el prort:!>O dt: Lran cripción .inversa; dilha cadena. a su vc1. c~ convenida en un DNA dC' douk l>e~nda. Esre DNA duplex se convierte en parte del genoma de la ct~l ula y es heredado como cualq1 tier orro gen. rle numem qw: In rranscripcióllmversa pemute que una ~t·mwdtl de RN!J ua recu-

v 111ilizada '01111) ínjormachíll gen~uca . L,1 existencia tk la duplicación del RNA y de la Lranscripcion inversa e RNA). Aunque la

paadrl

rranscnpciou mwrsa no partinaturalizanon· también loe un,iza para ribir la pérdJda de la Clotrurtura auténtica de una :eina; é'> un término ueneral que tmpltca que la wrmación natural de una macromolécuJa se ha ~ '1>furmr1UO.) La dcsnaturall7ación dd D~A e presema en un ¡go limitado cie temperatura y dn lugar a cambios rprendemec; ~?n mutila~ l.k ~us propiedades físicas. : "1lH1ll1 mcdi(} del rango de temperatura en que la~ ~ ienas u·l DNA '>l' !it'pMan se conoce como tempe·•¡tm d~ fu,fióu (7~11, 1//l!l titlf} rempantrm;), la cuaJ de· ~ndc· dl' 111 proporci(m de pctrcs de bases G-C. Como ::la uno de esto~ pvn ·~ tkn~ tres puentes de hidró_.._no. es mas ec;table que un pat dt' bnses formado r A- T, t.>llual ~tllo nll'ntd con do'> de dichos puenf:~. Entre mas pate~o de. '>t' llama rcn at u raliza.:ión . la cual depende del .1pareamit!ntu ~pecífko e l.:¡, bases t'nlrt:' las lcldenas cumplememarias. En h se ~~b~t'rva q11P IJ reacdou tiene lugar

J

DNA

renaturalizado L;~s cadenas mdividuales de DNA desnaturalizadas pueden mnaturalizarse para formar una estructura dúplex.

l'l1 do~

Ctlmplementanao; x. A este proceso 51: ll,' llJmJ asoc iación. -;i bien la reacdón se describe de form.:t más gt>I1L'ruo~ dl·l .ít ido n itro~o conslituyen u n eje mpl o clá$ico de trathiLi6n p nr la co n versión quím ica dC:' l l l1 me proporcional al tamañr> del gen. Pero considerando los sirios de mutación de la l>ccuencia del DNA. ¿todos lo., pares de bases de un gen ~on ig siUos CpG. (la razón dt' que el efcltu no c;e¿ mayor es que ld i\I\B04 consrin.l)'e sólo uno de lo-, numt:tosos sistemas que inciden en lo~ p.HL'S t•rr6nt."o~ :.uperiores; son molécu-

enferrnt·dack~

las circulares de RNA muy pequeña~. A diferenda de los virus. cn los cua e'i el agente infeccioso es un virió n, genom.t t•map~ulado en una cubierra de protetna, t'l R/I.A 1'/r,,tt/( t'S d agcntl· mjeaioso. El vuoidt' ~'>tá lurm.1do úniccc.:l types JH\9 ::!7 tl3-159,

111

El DNA es el matenal genético de los virus

.1\'tlculos di' invest1gacrón Ht'r)hmpalme tle i!~te oara dar or'gen a un RNAm colineal rP\Ilecto del producto proteínico. • CadA R:-41\m esW fo'lllcldo por una región líder 5' no :raduc•da una región Cod1Rcadora y una región posterior 3' no traducida.

Las prote1nas actúan en trans, pero los sitios del DNA, en cis Todo\ los ;¡rodoc;os de los ge~es (R~A o proteínas) actúan en trans; pueden actua· e:- rualquie· copia de un gen en la c~l.~ta.

• Las onut<JCIOO"> ~~~ llCt.lación en C1! iden:iikan a las ~~~cu~ncias dt ON/1 que son el objPtivo de reconocimiento ce los producto~ de actuación en trons. No se eJtprt!5i!n wMo RNA m como protclna~. y afectan só!o al fragmento contiguo

d~t

DNA.

011 Resumen 23

ID Introducción El gen es la unidad funcional de la herencia que constiluye una secuencia del genoma cuya función es dar origen a un producto discreto (ya sea una proteína o un RNA) : su comportamieoro bás ico fue definido pm Mendel hace más de un siglo. Res u mido en sus dos leyes, el gen fue reconocido como un "factor de panículas" que se transmite sin cambios del progenjwr a su progenie. Un gen pt1ede existir en formas a lternas que se conocen como aletos. En los organismos cUploides, los cuales tienen dos conjumos de cromosomas, ·una copia de cada uno de eUos se hereda de cada progenitor, mismo comportamiento exhibido por los genes. Una de la!> dos copias de cada gen es el alelo paLemo (heredado del padre), el orro es el materno (heredado de lamadre) . la equivalencia condujo al descubrlmienro de que, de hecho, los cro mosomas portan a los genes. Cada cromosoma consiste en u na csrrucmra lineal de genes. Cada gen reside en una localiz.ació tl particular del cromosoma. la localización se conoce de manera más fom1al como locus . Los a leJos de un

El cromosoma contiene numerosos genes

gen son las diferentes formas que se encuen tran tn su locus. La clave para comprender la o rganización de los genes en los cromosomas fue el descubrimiento del ligamjemo genético, o tendencia de los genes de un mismo cromosoma a mantenerse juntos en la progenie, en lugar de ordenarse de manera independiente, como "Pronostkan las leyes de Mendel. U na vez que se introdujo la unidad de recombinación (reordenamiento) como medida de vinculación, fne posible consrruir mapas genélicos. La resolución deJ mapa de recombinadón de una eucariota superior está rest ringida por [o reducido de la progenie que puede obtenerse de cada cruza. La rccombinación es tan poltl e-o, IJiso, la menor canúdad procl ucidu por 1111 ,1k lo. compilrada con la de dos
~

ml

2 J Las mutaciones que se presentan en el mfsmo gen no se

pu~den

complementar

25

No se observa ningún gen de tipo si.Jvesue, por lo

ramo, el J.1.eterocigoro tiene tm fenolipo mulame. Si la mutación yace en gPnes ditere11tes, los genotipos progenitores pueden representarse como: m 1+ +m 1 m,+ Y +m 2

Cada cromosoma tiene una copia ripo silvestre de un gen (rcpresemada por el signo más) y una copia mutame del otro, de modo que la conStitución del heterocigoro será: m ,+ +rn2

en la cual los dos progenitores han proporcionado una copia de tipo silvestre de cada gen . El heterocigoto tiene el fenotipo silvesne, de modo que se dice que los dos genes se complementan. La prueba de la complememación se describe más ampliamente en la . La básica coru,isre en la comparación que se mueStra en la parte superior de la figura. Si dos mutaciones se encuentran en el mismo gen, se observa una diferencia en los fenotipos de la configuración rrans y de la configuradóncis. La configuraci6n h·ans es mutame. pues cada alelo tiene una mutació11 (diJerente). Sin embargo. la configuración cis es de tipo silvestre. debido a C)Ue un alelo liene dos mutaciones y el ou·o, ninguna. En ID parte inferior de la figura se muestra que si las dos mutaciones se encuentran en genes diferentes,

MUTACIONES EN EL MISMO GEN

cohfiguraeién cts

configuracfón trans mutante 1 Sin comptementación Fenotlpo mutan te

~ .j

t ,¡ J ,¡

¡ ,¡,¡ ¡ ~

mutante 2

t

,¡,¡ ¡J .j Un gen es de ,¡ ,¡ d ,¡ tipo silvestre ~

Fenotipo sltvestre

tipo silvestre~-0

tipo silvestre

~

liposilvestre

(configuración trans)

Com:::::~" ~ ~ gen es de

Upo.ll'""'

WWVVVV n..

~

1

~-..,.

mutante 2

El dstrón se define mediante la prueba de c.omplementación. Los genes están representados por espirales; los asteriscos rojos identifican a los sitios de mutación.

26

Conceptos ptincipales Las mutaciones recesivas son provocadas por pérdida de función del producto proteínico. Las mutaciones dominantes son resultado de una ganancia de función. • la evaluación de la esencialidad de un gen requiere de una mutación nula (que elimine por completo su función). • Las mutaciones silenciosas no tienen ningún efecto porque el cambio de base no altera la secuencia ni la cantidad de proteína. o porque el cambio de la secuencia de la proteína no tiene ningún efeclo. • Las mutadone~ rezumantes (o hipomorfas) afectan a la función del producto del gen, pero no se observan en el fenotipo porque queda actividad sufi.ciente.

Los diversos efectos pos ibl es de las mutaciones

~ ~

V\/vV .} •l V V

Las mutaciones pueden provocar pérdida o ganancia de función

~ mutantedobte

MUTACIONES EN GENES DIFERENTES

(fenotipo silvestre) Una copia de cada

siempre se observará un fenotipo silvestre. Siempre hay un alelo de tipo silvestre y un alelo mutame de cada gen, y la configmación no tiene lmportanda. La incapaddad para complementar significa que dos mutaciones son pane de la misma unidad genética . Se dice que las mutadones que o o se complernenLan forman parle del mismo grupo de complen1entación. Otro término uLilizado para describir a la unidad definida por la prueba de complementación es cistró n. que significa lo mismo que gen. Rásicamen<e estos tres términos describen a un fragmento de DNA gue funciona como una unidad que dará lugar a un RNA o u u producto proteínico. Las propiedades del gen respecto de la complerncmación se e--xplican por el hecho de que este producto es una molécula única que se comporta como una unidad fundonal.

CAPÍTULO 2 los genes codifican proteínas

en un gen se resumen en la Cuando un gen ba sido idenrjficado. en principio se puede llegar a conocer su fundón produciendo un organismo mutante que ca relea complet.amente de.l gen. Una mutac.ión que elimina por completo la función de un gen, normalmente porque el gen ha sido eliminado, se llama mutación nula, y si el geo es esencial. la mutación nula es letal. Para determjnar el efecto rlel gen en el fenotipo. es iundamemal caracterizar a unmutanre nUlo. Cuando unn mutación no afecta al fenotipo. siempre cabe la posibilidad de que se trate de una mutación rez umante, es dedr, se produce una cantidad suficiente de producto activo para que cumpla con su [unción, aunque la acLividad se reduce cuantitativamente o es cualitativamente di[erente del tipo silvestre. Sin embargo, si una n~u ta dón nula no afecta al Jenolipo, se puede concluir con toda seguridad que la función del gen no es necesaria.

Sí e;(' produce llllcl mut.lciOn rert')tva por cada cambio que impide la prntluc.ción de una prmdna activa en w gen debe habet gtan nnmt' mdican con el nombre dellocus. Una fom1a compktdmentl" defenuosa del gen (o ausenaa de knotipo) !lllele indicarse median re un supcnnd.ice 'meno~ · (-l . Para poder distinguir entre una vanedad tk illllos mmantcs con eleaos diferentes, pueden U[ihzarsl' otrm supcríndices. como tv' o w•. El alelo 11' es dominante re)peao de cualquiera otro en lo~ huan el patrón rn el tual es depositado.) Cuando !'\i\ten muchos aletos, un animal puede ser un heteroagotn 4Ul' pone dos ale1os mutanres dileremcs. y r,u tenoupo depcndera de la naturaleza de la actividad rl'\tdual dt: cada alelo. En principio. la relactÓJt l'l11te dos .:tlelo~ mu lan tes no difiere de la que se observa l'ntrt' los aletos ntutantes y los de

El gen de tipo silvestre cod1ffca a una protefna

VJ\hVJ\1'1

~

li

Una mutación silenciosa no afecta a la prote1na

VJViVOW/

l

~

Una mutación nula no

produce protelnas

WAYJVJV/

.J...

Una mutación puntual puede dañar la !unción

'WJVAIN/

¡

•

Una mutación puntual puede crear una nueva función

VJ\YJ\0\U

~

Las mutaciones que no afectan a La secuencia o a la funcion de la protema son silenciosas. en tanto que las mutaciones que eliminan toda la actividad de la proteina son nulas. Las mulac1ones puntuales que provocan pérdida de la función son reces1vas, a diferencia de las que provocan ganancia de la función, que son dominantes. la'> mut.1cíones nulas, u otras mutaciones que impiden la funCión dd gt:n (pero que no nccesariarnt>me 1,1 elimman por c.:ontpleto) se denoffilnan mutacione d ~ pé rdida d e función (o amorfas). Uua mutación de pt:•nlidc:1 de tuncion es recesiva (corno eu el ejemplo de la Figura 2.2). En ocasiones, una mut.Kión 1ic.·ne t!l decro opuesto y provoca que unn ¡uorema astán expresadas. El homocigoro 00 es nulo y no tiene ninguna acrividad, por lo tanto, ca,rece de ambos alltígenos. Ni A ni B pueden ser considerados únicamente como ele tipo silvestre porque representan acüvidadcs altemativas, más que pérdida o ganancia de función. Una situación como ésta, en la que hay rnúlliples alelos funcionales en una pobladón, se describe como polimorfismo (véase la sección 4.3, tos genomas individuales muestran una variación extensa) .

111

La recombinación ocurre por intercambio ftsico de DNA

Conceptos principales • La recombinación es resultado del entrecruzamiento en los quiasmas e involucra a dos de las cuatro cromátidas. • la recombinación ocurre por rompimiento y reunión, que tienen lugar a través de un intermediario de DNA híbrido.

Moléculas de DNA progenrtor

~., bivalente ::ottene 4 cromátidas, 2 de cada progenitor

: qulasma

provocado por

~"'lrecruzamianto

entre clos

Recombrnacton tntermedia

:e las ctomáttdas Jos aomosomas Siguen saenc1o ~:JS progen¡IOfeS (AB yab) ...os cromosomas recomblnantes ~ ~~~~=:::g ':'Ontienen material de cada orogenttor y tienen nuevas : ::=~~~~= B comblnacrones genéticas (Ab y aS). b

la formación del qu iasrna :·educción

es

responsable de la

de recombinantes.

:a rccombir1.1non g' ult.a de un imercambi o fí)ico de material cromo~ómiw leno rncno visible en el entrecru zamie nto que ocurre duranre la meiosis •división e~pcdalizada por la que se producen las células gcmnina1cs hapluak':>}. La lltdosJs empieza con una célula que ha duplicado sus cromosomas, de ral formn que po:,ct• c.u..Hro wptas de cada uno. En las primeras etapas de lt11l1t.'io)i\, e~as cuatro cop1as están mdmame me rcladonadas (en !>inapsis) eu unaesuuclllra LlantrHin biva le nte . En c~ta etapa, cada unidad a·omosómica se denominA cromá tida . Los intercambios t>n pares dt- matetiJI ocutre11 e ntre cromátidas. El n.' 'ultado visible·(]{: un evento de emrecruzarnicnto se denomina quiasm a, y se ilustra amanera de djagrrunil rn la . Un quiasma es un presenrarse a sí mismo en innumerables formas de polipéptidos. En conjunto. los diversos productos proteínicos de una céh1la asumen las actividade!l cata líticas y esLructuraks respomablt!s de establecer su fenotipo. Obviam.ente, además de las secuencias que co difican a las proteína::., el DNA rambién contiene ciertas secuencias cuya función es ser reconocidas por moléculas reguladoras, usualruellle proteíuas. En este ca~o. la ·función del DNA es de[ernúnada tlirectamente por su secuencia, no a t ravés de Lm. código interm("diaJ·io. Ambos tipos de región, los genes expresados como proteú1as y las ~ecuendas reconocidas como tales, consrituycn Ja lnformación gené tica. DI código genético es descifrado pnr 1111 mecanismo complejo qul.' interptela las secuencias de los áddos nucleicos, el cual es esencial si la inlonnación transportada en el DNJ\ lienc que ten.eJ· algún significado. En Utla región dada, sólo una de las dos cadenas de DNA codifica a u na proteína, por lo tanto, el código gen él ic-o se represen ta como una secuen· da de bases (rnás que como pares de bases). El código genético ~e lee de trt'S nudeóLidos. cada uno de los cuales represenra a un amtnoáddo; cada secuencia de [res nude6üdos se denomina codón . Un gen incluye w1a se1ie de co Jones que se lee de lorma secuencial cksde un punto de partida de UJl exlremo basta w1 pun10 final, en de dicha~

Tipo stlves1re 1 GCU GCU GCU GCU GCU GCU GCU GOU -

........._

./

Ala

Ara

Inserción

Ala

Ata Ala

Ala

Ala

Ala

A

.J GCU GCU AGC UOC UGC UGC UGC UGC'Lr Ala

Ala Sar Cys Cys Cys Cys Cys

De~dón G GCU GCU GCU GCU GCU CUG CUG CUG -

J

Al.a

Ata

Ala

Ala Ata

lau Leu Leu

Mutante dobla A

j

G GCU GCU AGC UGC UGC UCU GCU

mtnacíorws prnpoHiott.Jll t'Videncia~ reveladoras referentes a Id nalurJlezc~ del código genético. E:n 1,1 ~e iJustt an las propiedades de la~ mutaliont~ de tambio dd marco de lectura. Una inserción o una clcle\.totl camhad ltt !>t:cuencia compkta de la protema de!>"J)ttés del c;itio de la mutadón. pero la lOOlOina(i(ln de una imerdón \ tma deledón haa:- Qllt' el código 'e lea !> del st•gundo sino. En 1961 nwJranll' d ,m.ilr-.i'> gcnt>lico de las mutaoones por acriJina en la reg10n rl! del fago T6 se demu~rró qut' toda!> 1.1s mutclCIOoes podrían ser clasificadas en uno clt• dt~ con 1 b~nado n es dt· lnlHante. r a primera etapa es la transcripción. durante la cual ~e produce un.:~ wpia dt. R '\Am de u n<J cadena del D ' A. en tanto qul' la wgunda t.:l> la Lradm.dón del RNAm en u11a proteína. Mediante este proceso se lee en

1riplt:1 L'~ la '>Cl utncia de un R Am para originar la seri e de aminoácidos q t1t' en· e pccíficos. Cada enzima de restricción tiene una diana específica en el dL!plex de DNA, usualmente una secuenda específica de cuatro o seis pares de bases. La enzima corta el DNA en cada punto en que se presenta su secuencia diana. Las diferentes enzimas de restricción tienen secuencias diana diferentes, y actualmente se dispone de un amplio rango de estas actividades (obtenidas de una amplia variedad de bacterias).

l.3 Las endonucleasas de restricción son una herramienta esencial para el mapeo del DNA

39

---A B Dividir con endonucleasa de restricción

1

Hacer etectroforesis y comparar con el DNA control

1 2100

2500 2000

1400 1000 500

Tamaños de tos El control oonsisle fragmentos comparados en fragmentos de con el control tamaño conocido Los fragmentos generados al dividir al ONA con una endonucleasa de restricción pueden ser separados en función del tamaño.

1 000 200

A 1900

600

8

A

800 500

Un mapa de restricción es una secuencia lineal de sitios separados por distancias definidas en el DNA. En el mapa se identifican los sitios divididos por las enzimas Ay B, según se definen los fragmentos individuales producidos por las digestiones dobles e individuales.

ginal tal como se muestra en la . En el mapa aparecen las posiciones en que las enzimas de restricción específicas cortan el DNA; las distancias entre los sitios de cone se miden en pares de bases, de modo que el DNA se divide en una serie de regiones de longitudes definidas que yacen entre sitios reconocidos por las enzimas de restricción. Una característica importante es que se puede obtener un mapa de restricción de cualquier secuencia de DNA, a pesar de que se hayal'/ idmtiftcado mutaciones en ella, o de hecho, que se conozca, o no, algo de su función.

La organización de los genes i nterrumpidos puede conservarse Conceptos principales

Un mapa de r estricció n representa una secuencia lineal de los sitios en los cuales enzimas de restricción especificas encuentran a sus secuencias diana. En dichos mapas, las distancias corras se miden directamente en pares d e bases (bp, base pairs), en tanto que las más largas se expresan en lSteriormente, Para poner a prueba los modelos se debe preguntar si la diferencia entre los genes eucarlóticos y Jos procalióticos puede ser e xplicada por la adqu isición de intrones en el primer caso o por la pérdida de Jos mismos en el segundo. El modelo de los "imrones ancestrales" sugiere que la estructura de mosaico de los genes es un remanente del antiguo enfoque de la reconstrucción de éstos para crear nuevas proteínas. Supóngase que una célu la ancestral tenfa cierto número de secuencias codificadoras de proteínas separadas: es probable que un aspecto de su evolución haya sido la reorganización y yuxtaposición de unidades polipeptídicas diferentes para crear nuevas proteínas. Si la unidad codiÍicadora de proteínas debe ser una serie continua de codones, cada reconstrucción requerirá de una recombinación precisa de DN A para colocar ambas unidades codificadoras de proteínas en registro, extremo con extremo, en el 1nismo marco de lectura. Además, si esta combinación no es exito-

sa, la célula ha sufrido algún daño por la pérdida de las unidades originales codificadoras de proteínas. Si en una recombinación aproximada del DNA se pudiera colocar a las dos unidades codificadoras de proreínas en la misma unidad de transcripción, se podrían probar patrones de corte y empalme en el 11ivel del RNA para combinar las dos proteínas en una sola cadena pollpeptídica. Si estas combinaciones no tienen éxito, las unidades originales de codificadón de proteínas siguen disponibles para pruebas posteriores. Dicho enfoque permite esendalmente que la célula intente delecioncs controladas en el RNA sin sufrir la posible inestabLlidad dañina de aplicar el procedimiento al DNA. Este argumento se apoya en el hecho de que podemos encontrar exones relacionados en genes diferentes, como si el gen hu biera sido ensamblado mezclando y apareando exones (véase la sección 3.9, Algunos exones pueden equ iparars l por ciento; ya se .ha identificado >1 míllón. 4..3 Los genomas individuales son muy variables

57

.

El DNA tiene 3 sitios diana en la región

La mutación elimina un sitio diana

~ ~ XC~OWJ\1 1 + {}\i '\.

La diVisión genera dos fragmentos internos

La división genera un fragmento interno

fragmento A fragmento B

! ~]

rt .1 1

f.JV.'

fragmento

r

e

~

Electroforesis

Arl B

1

+

Fragmentos A + B combinados :

C

e

Una mutación puntual que afecta a un sitio de restricción se detecta por una diferencia en los fragmentos de restricción.

B

Progenitores B

3 son heterocigotos 1 es homocigoto para

e

e

e e

F1 F2 hereda A o D de un progenitor, B o del otro progenitor

e

Alelo A

Alelo S Alelo

e

AlelaD .

Los polimorfismos de los sitios de restricción se heredan según las leyes de Mendel. Hay cuatro aletos para un marcador de restricción en todas las combinaciones de pares posibles; se segregan de forma independiente en cada generación . La fotografía es cortesía de Ray White, Ernest Gallo Clinic and Research Center, University oj California, San Francisco.

Algunos polimorfismos de l genoma pueden detectarse al comparar los mapas de restricción de individuos dlferentes. El criterio es un cambio en el patrón de fragmentos producidos por división con una enzima de restrícción. En la se mues tra que cuando en el genoma de un ind ividuo hay un sitio diana y en el de otro no, la división extra en el primer genoma generará dos fragme ntos que corresponden al fragmento individual del segundo genoma. El mapa de restricción es independ iente de la función génica, de modo que en este nivel, un po58

CAPÍTULO 4 El contenido del genoma

limorfismo puede ser detectado a pesar de que el cambio de secuencia afecte al fenotipo. Probablemente muy pocos de los polimorfismos de los sitios de restricción de un genoma realmente afecten al fenotipo, la mayoría impl ican cambios de secuencia que pueden no tener efec;LO en la producción de proteínas (por ejemplo, debido a que se encuentran entre genes). Una diferencia en los mapas de restricción de dos individuos es denominado polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP, restrictlon fragment length polymorphism). Básicamente, un RFLP es un SNP localizado en el sitio diana de una enzima de restricción que puede utilizarse como marcador genético exactamente de la misma ma nera que cua lquiera otro marcador. En vez de examinar alguna característica del fenotipo, se evalúa directamente el genotipo, como lo revela el mapa de restricción. En la se observa la genealogía de un polimorfismo de restricción a través de tres generaciones; exhibe segregación mendeliana en los fragmentos de marcadores de DNA.

Los RFLP y los SNP pueden ser utilizados para el mapeo genético Cüncepto principal • Los RflP y los SNP pueden constituir la base de los mapas de ligamiento; permiten establecer relaciones entre progenitores y su progenie.

La frecuencia de recombinación puede medirse entre un marcador de restricción y un marcador feno, de tal típico visible, como se ilu:;l(a en la manera que un mapa genético puede incluir marcadores genotípicos y fenotípicos. Los marcadores de restricción no se limitan a los cambios del genoma que afectan al fenotipo, de modo que proporcionan las bases para una técnica extremadamente poderosa de identificacióp de loci genéticos en el ámbito molecular. Un problema típico concierne a una mutación con efectos conocidos en el fenotipo, en el cual elloc:us genético pertinente puede ser colocado en un mapa genético, pero de la cual se desconoce el gen o la proteína corre$pondiente. Muchas enfermedades humanas dañinas o fa tales pertenecen a esta categoría. Por ejemplo, la fib rosis quística muestra herencia mendeliana, pero se desconocía la naturaleza molecular de la función mutan te hasta que se pudo identificar como resultado de la caracterización del gen. Si los polimorfismos de restricción sonaleatOlios en el genoma, algunos deben ocurrir cerca de un gen diana específi co. Dichos marcadores de restricción se

Cruza genética

lnvesttgac1ón de los patrones de DNA de los pacientes con la enfermedad

35%

1

!

35%

Investigación de control de los patrones de DNA de las personas no afectadas

!

Tipos de progenitores ....J .....J -

La banda es la m1sma en el paciente

-

- •- -J L.

y en la persona sana

-J

-, L.

r

f-' _J---- El polimorfismo no ligado varra _Jil l en todas las muestras

u

¡

1

~

Recombinantes

;........¡

La banda es com(¡n a los pacientes La banda es comun a todas las personas no afectadas

15%

1

-e

Si un marcad::>r de restricción es asociado con una característica fenotípica, el sitio de restricción debe est ar localizado cerca del gen responsable del fenotipo. La mutación que cambia la banda común a las personas sanas en la banda común a los pac.ientes, está muy íntimamente relacionada con el gen de la enfermedad.

El marcador de restricción está a 30 unidades de mapeo del marcador de color de ojos Un polimorfismo de restricción puede ser utilizado como m¡¡rcador genético para medir la distancia de recombi nación a partir de un marcador fenotípico (como el color de los ojos). En la figura se simplifica la situación mostrando sólo las bandas de ONA que corresponden al alelo de un genoma en un diploide.

identifican gracias a su emecha vinculación con el fenotipo mutante. Si se compara el mapa de restricdón del DNA de pademes que padecen una enfermedad con el DNA de personas sanas, podría encontrarse que, en los pacientes, siempre hay un sitio de restricción en panicular (o siempre está ausente). En la ~e muestra un ejemplo hipotético que corresponde al descubrimiento de una vinculación de l 00% entre el marcador de restricdón y el fenotipo, lo cual implicaría que el marcador de resnicdón está tan cerca del gen mutante, que nunca se separa de él por recombinadón. La identificación de un marcador de tales caracrerísticas tiene dos consecuencias importantes: • Puede ofrecer un procedjmiemo diagnóstico para detectar la enfermedad. Algunas de las enfermedades humanas bien caracterizadas genéticamente pero mal definidas en función de las moléculas, no son fáciles de diagnosticar. Si un marcador de restricción está ligado con fiablemente al fenotipo, puede servir para diagnosticar la enfermedad. • Puede conducir al aislamiento del gen. El marcador de restricción debe encontrarse

relativamente cerca del gen en el mapa genético si ambo) loci rara vez se recombinan. o nunca. Lo que se considera ~ relarivamente cercaNen genética puede ser una distancia sustancial entre pares de bases de DNA; no obstante, el marcador de restricción proporciona un punto de inicio del cual partir en el DNA para localizar el gen. La frecuente presencia de SNP en el genoma humano los hace útiles para el mapeo genético. De los 1.5 x 106 SNP que hasta ahora han sido identificados. en promedio hay uno cada 1 a 2 kb, lo cual debe permitir la localiLación rápida de genes de enfermedades n uevas al ubicarlos en tre los SNP más cercanos. Según el mismo princ.:ipio, el rnapeo por RFLP ha sido utilizado durante alg(m tiempo. Una vez que se asigna uno de e llos a un grupo de ligamiento. puede colocarse en el mapa genético. En el hombre y en el rarón, esLc mapeo ha conducido a la construcción de mapas de ligamiento para ambos genomas. El ligamiento de un sitio desconocido se prueba con estos sitios y puede ser colocado rápidamenLe en el mapa. Hay menos RFLP que SNP, así que, en principio, la resolución del mapa de RFLP es más limirada. La frecuencia del polimorfismo significa que cada individuo tiene una constelación única de SNP o de RFLP. la combinación específica de los sitios encontrados en una región específica se denomina h aplotipo, un genotipo en miniatura. Si bien el concepto de haplotipo fue inLroducido originalmen-

4.4 Los RFLP y los SNP pueden ser utilizados para el mapeo genético

59

te para describir la constitución genética del locus mayor de histocompatibilidad, región que especifica proteínas considerablemente importantes del sistema inmunológico (véase Cap. 23, Diversidad inmun itaria), ahora se ha extendido a la descripción de combinadones particulares de a lelos o sitios de restricción (o cualquier otro marcador genético) de algún área definida del genoma. Mediante los SNP se creó un detallado mapa de haplo ripos del genoma humano que facilita el trazado de los mapas de los genes provocadores de enfermedades. La existencia de RFLP constituye la base de una técnica que permite establecer relaciones inequívocas entre los progenitores y su progenie. Cuando se duda de la paternidad, la comparación del mapa RFLP de una región cromosómic-d adecuada de los progenitores potenciales y del hijo permite asignar de manera absoluta el parentesco. El uso del anáUsis de restricción del DNA para la identificadón de individuos se ha denominado h uella digital del DNA. El análisis de secuencias "minisa télite" especialmente variables se utiliza en el mapeo del genoma humano (véase la sección 6.14, Los minisatélites facilitan el roa peo genético).

Plantas con flores Aves Mamíferos Reptiles Anflbios Peces óseos Peces cartilaginosos Equinodermos Crustáceos Insectos Moluscos Gusanos Mohos Algas Hongos Bacterias gram (+) Bacterias gram (-) 1 Micoplasma

11

1

••

11

106

107

108

108

101° 1011

El contenido de DNA del genoma haploi de se incrementa con la complejidad morfológica de las eucariotas i nferiores, pero varía ampliamente en algunos grupos de eucariotas superiores. El rango de los valores de DNA de cada grupo se indica mediante áreas sombreadas.

¿Por qué los geno mas so n tan grandes? Conceptos principales • No hay una buena correlación ent re el tamaño del genoma y la complejidad genética . • Hay un increment o en el tamaño mínimo del genoma necesario para formar organismos de mayor complejidad. • En numerosos filos, las dimensiones de los genomas de Los organismos varían ampliamente.

La cantidad rotal de DNA del genoma (haploide) es una característica de cada especie viviente conocida como su vaJOl· C. Hay una variación enorme en el rango de los valores C, desde l 0 1' bp en algunas plantas y algunos anfibios. En la se resume el rango de valores C encontrados en diferentes filos evolutivos. Con forme se incrementa la complejidad, aumenta el tamaño mínimo del genoma encontrado en cada grupo. Sin embargo, al incrementarse las cantidades absolutas de DNA en las eucariotas superiores, se observan amplias variaciones en las dimensiones de los genomas de algunos filos. En la , el diagrama de la cantidad mínima de DNA requerida por un miembro de cada 60

CAPÍTU LO 4 El cont enido del genoma

El gerioma mínimo encontrado en cada filo se incrementa de las procariotas a los mamíferos.

grupo sugiere que para for mar procarioras más complejas y eucarioras inferiores, es necesario que el genoma aumente de tamaño. Los Jnicoplasmas son las procariotas más pequeñas, y sus geno mas son sólo -3 veces el tamaño de un bacteriófago grande. El tamaño de las bacterias parte de -2 x 106 bp. Las eucariotas unicelulares (e u yos e >tilos de vida pueden parecerse a los de las

Filo Alga Micoplasma Bacteria Levadura Moho limoso Nematodo Insecto Ave Anfibio Mamffero

Especies

Genoma (bp)

Pyrenomas salma M. pneumoniae E. coli S. cerevtsiae D. discotdeum C. elegans D. melanogaster G. domesticus X. laevis H. sapíens

6.6X1Q5 1.0 )( 1()8 4.2 x tOS 1.3 X 107 5.4x107 8.0 X 107 1.4X10S 1.2 X 109 3.1 X 1()9 3.3 X 109

Dimensiones de los genomas de algunos organismos experimentales comunes.

procariotas) también subsisten con genomas pequeños, aunque son más grandes que los de las bacterias. El hecho de que un organismo sea euca riótico en sí, no impli ca un gran incremenLo en cuanto a l ramaüo del genoma; una levadura puede Lener un genof!la de -1.3 x 107 bp, el cual es apenas dos veces el tamaño de un genoma bacteriano promedio. Orro doble incremento en d tamaño del genom.a es adecuado para respaldar al moho limoso Dictyostelium discoideum, que puede vivír tanto en la modalidad unicelular como en la multicelular. Es necesario otro incremento en la complejidad para dar lugar a los primeros organismos completamente multicelulares; el nematodo Camorhabdilis elegans tiene un DNA de 8 x 101 bp. Asimismo, en el listado de la se observa el incrememo constante del Lamati.o del genoma de acuerdo con la complejidad de algunos de los organismos más comúnmente anaiLzados. Es n ecesario que aumente el tamaño del genoma para que se formen insectos, aves, anfibios y mamíferos. Sin embargo, después de este punto no hay una buena relación entre tas dimensiones del genoma y la complejidad morfológica del organismo. Se sabe que Jos genes son mucho más grandes que las seruendas necesarias para codificar proteínas porque los exones (regiones codificadoras) pueden incluir sólo una pequeña parte de la longitud total de un gen, lo cual explica la razón de que haya mucho más DNA del n ecesario para propordonar marcos de lectura para todas las proteínas del organismo, pues grandes segmentos de un gen interrumpido pueden no estar relacionados con la codificación de proteínas. Adicionalmente puede haber fragmentos significativos de DNA entre los genes, de modo que no es posible hacer deducciones respecto del número de genes a partir del tamaño tota l del genoma. La paradoj a del valor C se refiere a la falta de correlación entre el ramaño del genoma y la comple jidad genética. Hay algunas variaciones muy curiosas

respectO del tamaño del geno ma. En el sapo Xenop~tS y el hombre, los genomas son esencialmente del mismo tamaño, sin embargo. ¡se supone que el hombre es más complejo en cuanto a desarrollo genético! En algunos filos, las variaciones en contenido de DNA entre organismos que no difieren mucho en cuanto a complejidad extremadamente grandes (véase la Fig. 4.5). (Esto es especialmenre notable en insectos, anfibios y plantas, no así en aves. reptiles ni mamíferos. los cuales muestran pocas variaciones dentro del grupo, con un rango de dimensiones de genoma de -2 veces). Un grillo tiene un genoma 11 veces mayor que el de una mosca de la fruta. En los anfibios, Jos genoxnas más pequeños son de< l 09 bp, mientras que los más grandes son de- LO ' ' bp. Es poco probable que se .necesite una gran diferencia en el oúmero de genes para especificar a esws anfibios. No se sabe por qué la selección natural permite esta variación, ni si tiene consecu encias evolutivas.

Los genomas eucarióticos contienen secuencias de DNA repetitivas y no repetitivas Conceptos principales • La cinética de la reasociación del ONA después de que un genoma ha sido desnaturalizado distingue a las secuencias por La frecuencia con se repiten en el genoma. • En el DNA no repetitivo, los genes generalmente son codificados por secuencias localizadas. • Los genomas más grandes de un filo no contienen más genes, pero tienen cantidades mayores de DNA repetitivo. _. Gran parte del DNA repetitivo puede estar formada por transposones.

Las características generaks del genoma eucariótico pueden evaluarse por la cinética de reasociadón del DNA desnaturali7.ado, Lécnica ampliamente utilizada antes de que fuera posible la secuendación de1 DNA a gran escala. Con la cinética de reasociación se identifican dos tipos generales de secuencias genómicas: • El D NA no repetitivo consta de secuen cias únicas: sólo hay una copia en un genoma haploide. • El DNA repetitivo consta de secuencias presentes en más de una copia en cada genoma. El DNA repetitivo con frecuencia se divide en dos Lipes generales: • El DNA moderadamente repetitivo consiste en secuencias relativameme canas que se repiten Lípicamenre de 10-1000 veces en el genoma, dispersas a lo largo de éste; son

6 Los genomas eucarióticos contienen secuencias de DNA repetitivas y no repetitivas

61

1010 66% 58%

109

E o

33""

10%

e:

O)

41%

25%

111

Ql

54%

108

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7% 5%

70'!1. 83"~

"'oas

17%

IC:

7 E 10

111

f-

106

100"-

3'!4

1

c'Zi

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_..._o<j

~·

.S~

o1 Mb? Una estrategia colosal cuya eficacia ha sido demostrada con algunos genes de importancia médica, consiste en detectar en fragmentos rela tivamente cortos de la región las dos propiedades esperadas de un gen conservado. Primero se intenta identificar fragmentos sometidos a hibridación cruzada con los genomas de otras especies y después se examinan dichos fragmentos para detectar marcos de lectura abienos. El primer criterio se aplica al realizar una zoo· transferencia, para lo cual se utilizan fragmentos conos de la región como sondas (radioactivas) para evaluar la presencia de DNA relacionado en una variedad de especies a través de la hibridación de Southern. Si se encuentran fragmentos de hibridación relacionados con el de la sonda en numerosas especies -la sonda suele ser humana-, ésta se conviene en candidato para un exón del gen. Los candidatos van en secuencia y, si contienen marcos de lectura abiertos. se utilizan para aislar a las regiones genómicas circundantes. Si parecen ser parte de un exón, posteriormente podrán sec utilizados para identificar al gen completo, aislar a l

Las moléculas de DNA de pacientes con DMD presentan delaciones en la reglón de la caminata

~ }

El DNA hacia la derecha se elimina

El DNA hacia lao { izquierda se elimina

o

y Delación interna El gen implicado en la distrofia muscular de Duchenne fue detectado mediante un mapeo cromosómico y "caminando'' hacía una región en la cual se pueden identificar deleciones cuando se presenta la enfermedad.

DNAc o al RNAm correspondiente y. por último, para identificar a la proteína.

Esta estrategia es particularmente importante 90% de cada genoma se encuentra en bloques sinténicos cuyo tamaño varía (de 300 kb a 65Mb). Hay un total de 342 segmentos sinténicos, con una longitud promedio de 7Mb (0.3% del genoma). El99% por ciento de los genes del ratón tiene un homólogo en el genoma humano~ para el96% de dichos genes, ese homólogo se encuentra en una región sinténica. La comparación de los genomas proporciona información interesante con respecto de la evolución de las especies. El número de familias de

111 10 20 30 40 50 60 70 80

Concepto~

Cromosoma i del ratón

2 14 5

2

Los organelos contienen DNA

1!!!11 ~!!!

6 8

Cromosomas humanos correspondientes

El cromosoma 1 del ratón tiene 21 segmentos de 1 a 25 Mb que son sinténicos con regiones que corresponden a partes de seis cromosomas humanos. :;enes de los genomas de l ratón y del humano es e mismo, y una diferencia importante entre las especies es la expansión diferencial de familias es"'ecíficas en uno de los gen o mas, lo cual es par:!cu larme nte no ta ble e n los genes qt¡e afectan a .:aracte rísticas fenotípicas únicas ele las especies. En ~l ra tón, de las 25 fami lia s en las cuales se ha ob5!'rvado aumento de tamaño, 14 contienen genes =')pecíficameme implicados en la reproducción de .os roedores y cinco, genes específicos del sistema ~'"lmunológico.

Una validación de la imporrancia de los bloques ; iménlcos proviene de comparaciones de pares de os genes comen idos en ellos. Al buscar seudogenes ~milares sobre la base de comparaciones de secuen.:ias, para un gen que no está en una localización ;1ménica (esto es, su contexto es diferente en las Jos especies) hay el doble de probabilidades de que :.::-a un seudogén. En otras palabras, la transloca.:ión lejos del Jocus original tiende a asociarse con la ;:read ón de seudogenes, por lo tamo, la falta de un _?en relacionado en una posición sinténica despierta ~vspecha s de que un supuesto gen puede realmen:e ser un seudogén. En total, >10% de los genes ..Jentificados inicialmente en el análisis del genoma -rrobablememe resulten seudogenes. Como regla genera L las comparaciones entre genomas incrementan significa llvamente la cerre:.a del pronóstico génico. Cua ndo se conservan ca::-aaerísticas de la secuencia que condu cen a genes ~ctivos, por ejemplo, emrc el hombre y el ratón, se ncrememan las probabilidades de que identifiquen :: homólogos activos. La identificación de genes que codifican RNA :5 más complicada porque no es posible utilizar el (Titerio del marco de lectura abierto. También es · erdad que con el análisis comparativo del genoma ~ incrementó el rigor del análisis. Por ejemplo, al .;'ializar el genoma del humano o del ratón se iden:"..fican -500 genes que codifican RNAt, pero la com-.aración de características sugiere que 1O veces más rápida que la tasa de la globina . Dicha tasa generará la divergencia observada en un periodo evolutivo de 140000 a 280000 años, lo cual implica que la raza h umana desciende de una sola hembra que vivió en África hace -200 000 años.

Los genomas de los organelos son moléculas circulares de DNA que codifican proteínas de los organelos Conceptos principales • Los genomas de los organelos suelen ser moléculas circulares de ONA (pero no siempre). • Los genomas de los organelos codifican algunas de las proteínas que se encuentran en el organelo, pero no a todas. La mayoría de los genomas de los organelos asumen la forma de una sola molécula circular de DNA de secuencia única (ll amada DNAmt en la mitocondria y DNAct en el doroplasto). Hay pocas excep-

ciones en las que el DNA de la m.itocondria es una molécula lineal; estas estructuras generalmente se presentan en las eucariotas inferiores. En general. en un organelo hay numerosas copias del genoma, y en cada célula hay mú ltiples organelos, de modo que son numerosos Jos genoma~ de organelos por célula. Aunque el genoma de los organelos es único, constituye una secuencia repetitiva respecto de cualquier secuencia nuclear no repetitiva. Los genomas de los cloroplastos son relativamente grandes, casi siempre - 140 kb en las plantas superiores y terrestres codifica a cuatro moléculas de RNAr. 30 molécula~ de RNAt y -60 proteína s.

=

oli } subunidades de ATPasa sensible a la aap ollgomicina oxi = subunidades del citocromo e

box = citocromo b par =funciones desconocidas var =subunidad proteínica ribosómica pequeña

El genoma mitocondrial de 5. cerevisioe contiene genes codificadores de proteínas, genes de RNAr y genes de ~NAt interrumpidos y continuos (no se indican las posiciones) . ..as flechas indican la di rección de la transcripción.

31.aterial genérico adicional de las levaduras miro: ondriales representa a otras proteínas, quizá rela.:ionadas con la regulación, o no se expresa? El mapa de la representa al RNA -·rindpal y los productos proteínicos de la mitoconiria de la levadura, en el cual la característica más !lOtable es la dispersión de los loci. Los dos más promi nentes son los genes inte:rumpidos box (que codifican al citocromo b) y oxi3 que codifica a la subunidad 1 de la citocromo oxiiasa), que juntos son ¡casi ran largos como el geno""'1a mitocondrial entero de los mamíferos! Muchos .!e los inrrones largos de estos genes tienen marcos de .ccrura abiertos en registro con el exón precedente ·:éase la sección 27.5, Algunos intrones del grupo codHican endonucleasas que promueven la moviJad), fenómeno que agrega numerosas proteínas, '"Idas sintetizadas en cantidades bajas, al comple:::nemo de la mitocondria de la levadura. Los genes restantes son ininterrumpidos y co-:-esponden a otras dos subunidades de la citocro-:o oxidasa codificadas por la mitocondria, a la(s) Jbunidad(es) de la ATPasa y (en el caso del gen - rJ) a una proteína ribosómica mirocondrial. Es co probable que el número total de genes mitondriaJes de las levaduras exceda de -25.

El genoma de los cloroplastos codifica a numerosas proteínas y moléculas de RNA Conr.epto principill • Los genomas de los cloroplastos varian en cuanto a tamaño, pero son lo suficientemente grandes como para codificar de 50 a 100 proteínas, asl como a los RNAr y los RNAt.

¿Qué genes ponan los cloroplasws? Las moléculas de DNA de los cloroplastos varían en longitud de 120 a 190 kb. Los genomas secuenciados de doroplastes (> 1O en total) tienen de 87 a 183 genes. En la se resumen las funciones codificadas por el genoma de los cloroplastos de las plantas te rrestres. Hay más variaciones en los geno mas de los cloroplastos de las algas. En general, la situación es similar a la de las mirocondrias, excepto que hay más genes implicados. El genoma del cloroplasto codifica a todas las especies de RNAr y de RNAt necesarias para la síntesis de proteínas. El ribosoma incluye dos moléculas de RNAr pequeñas, además de las especies principales_ El conjunto de RNAt puede incluir todos los genes necesarios. El genoma de los cloroplastos codifica a -50 proteinas. incluidas la RNA polimerasa y las proteínas ribosórnicas. También en este caso, la regla es que los genes de Jos organelos son transcritos y traducidos por el mecanismo del organelo. Cerca de la mitad de Jos genes de los cloroplastos codifican a proteínas implicadas en la síntesis de proteínas. El origen endosimbiótico de los cloroplastos resalta por las relaciones entre estos genes y sus

4. 12 EL genoma de los cloroplastos codi fica a numerosas proteínas y moléculas de RNA

71

contrapartes en las bacterias. La organizadón de Jos genes de RNAr en particular está íntimamente relacionada con la de una cianobacteria, la cual define con mayor precisión al último ancestro común de doroplasros y bacterias. Intrones y cloroplastos caben en dos clases generales; los que se encuentran en los genes de RNAt suelen estar en el lazo anticodón (aunque no inevitablemente), como los intrones localizados en los genes de RNAt nucleares de las levaduras (véase la sección 26.14, El corte y empalme del RNAt de las levaduras implica procedimientos de cotte y empalme). Los intrones localizados en los genes codificadores de proteínas se asemejan a los de los genes mitocondriales (véase Cap. 27, El RNA catalítico), por Jo que el evento endosimbiótico se ubica en un periodo de la evolución anterior a la separación de las procariotas con genes ininterrumpidos. La función de los doroplastos es la fotosíntesis. Muchos de sus genes codifican a proteú1as de Jos complejos localizados en las membranas de los rilacoides, cuya constitución muestra un balance diferente del de los complejos rnitocondriales. Si bien algunos de estos complejos son similares a los mitocondria les debido a que algunas subuni.dades son codificadas por el genoma de tos organelos y oLras por el nuclear, otros complejos de doroplastos son codificados completamente por un genoma.

Las mitocondrias evolucionaron por endosi mbiosis ¿Cómo evolucionó una situación en la cual un organelo contiene información genética para algunas de sus funciones, mientras que otras son codificadas en el núcleo? En la se ilustra e l modelo de ta endosimbiosis de la evolución de las mitocondrias, durante la cuaL células primitivas capnnaron a bacterias que proporcionaron las funciones y las es[ructuras que evolucionaron hacia mitocondrias y ctoroplastos, En ese momento. el proto-organelo debe haber contenido todos los genes necesarios para especificar sus funciones. Las homologías secuenciales sugic1;en que mitocondrias y cloroplastos evolucionaron separadamente a partir de linajes comunes a las eubacterias, pero las mitocond.rias comparten su origen con las bacterias púrpura a y los clorop lastos, con las cianobacterias. Entre las bacterias, el pariente de las mitocondrias más cercano que se conoce es Rickettsia (agente causal de tifus), parásito intracelular obligado gue probablemente desdende de bacterias de vida libre, hipótesis que refuerza la idea de que las mirocondrias se originaron en un evento endosim72

CAPÍTULO 4 El contenido del genoma

Bacteria

Célula primitiva

Endosimbíosis

La bacteria evoluciona y se transforma en una mitocondria, de modo que pierde genes necesarios para la vida independiente Los genes son transferidos de la rnitocondria al núcleo

Las mitocondrias se originaron por un evento endosimbiótico en el cual una bacteria fue capturada por una célula eucariótica.

biótico en que también estuvo lnvolucríldO unancestro común. Deben haber ocurrido dos cambios, conforme las bacterias se integraron en la célula recipiente y evolucionaron hacia mitocondrias (o cloroplastas). Los organelos tienen mucho menos genes que una bacteria independiente y han perdido muchas de las funciones _gén.icas necesarias para la vida independiente (como las rutas metabólicas) . La mayoría de los genes que codifican funciones de los organelos se localizan de hecho en el núcleo, por lo tanto, estos genes deben haber sido transferidos ahí desde el organelo. La Lransferencia de DNA entre organelo y núcleo ha ocurrido a lo largo de la evolución, y aún continúa. La velocidad de transferencia puede medirse directamente al inLroducir en un organelo un gen que sólo puede funcionar en el núcleo, porque, por ejemplo, contiene un intrón nuclear o la proteína debe funcionar en e l citosoL Respecto de la provisión del material necesario para la evolución, la veloddad de transferencia del organelo al núcleo equivale aproximadamente a la de una mutación génica única. El DNA introducido en las mitocondrias

es transferido al núcleo a una tasa de 2 x 10-> por generación. los experimentos para medir la transfe:-encia en dirección opuesta, del núcleo a la rrútoconjria, sugieren que la tasa es mucho más baja, . Obviamente, la transferencia de un gen de un "'rgan elo al núcleo requiere de movimiento físico ;el DNA, pero la expresión exitosa también implica .:ambios en la secuencia codificadora. Las proteínas je organelos codificadas por genes nucleares tienen ~ecuenci as especia les que les permiten ~e r importa:!as al interior de l organe\o después de ha ber sido ~:n t e tizadas en el citoplasma (véase la sección 10.16, :a inserción postransduccional de la membrana de~nde de secuencias líder). Estas secuencias no son -ecesarias para las proteínas sintetii'adas dentro del rganelo. Quizá el proceso de transferencia e[ec: va de genes tuvo lugar en un periodo en el cua 1 r.; compartimientos se definían de forma menos -!gida, de modo que era más fácil que se reubicara ::. DNA y que las proteínas se incorporaran en el •rganelo, independientemente del sitio en que se s.ntetizaran. Los mapas filogenéticos muestran que las trans~rendas de genes han sido mdepen Resumen ..as secuencias de DNA que componen a un genoma -:Jcariótico pueden ser clasificadas en tres grupos: • secuencias no repetitivas únicas; • secuencias moderadamente repetitivas que se dispersan y repiten pocas veces respecto de copias no idénticas; • secuencias muy repeütivas, que son conas y suelen repetirse tn forma de secuencias en tándem. Las proporciones de los tipos de seruendas son ::.;racterísricas de cada genoma, aunque más exten-

sos tienden a tener una proporción menor de DNA no repetitivo. Aproximadamem~ el 50% del genoma humano consta de secu~ncias repetitivas, y la vasta mayoría corresponde a secuencias de transposones. La mayoría de lo!> genes estructurales se localiza en el DNA no repetitivo. La cantidad de DNA no repetitivo refleja rr.ucho mejor la complejidad del organismo que el tamaño total del genoma; la mayor cantidad de DNA no repelitivo en los geno mas es -2 x 109 bp. La herencia no mendeliana se explica por la presencia de DNA en organelos del citoplasma. Las mitocondrias y los cloroplastos son sistemas delimi · tados por membranas en los cuales algunas proteínas son sintetizadas en el organelo, mientras que orras son importadas. En genera l, el genoma de Los o rganelos es una molécula ci rcular de DNA que co· dífica a todas las moléculas de RNA y a algunas de las proteínas rcq ueridas por el organelo. Los genomas m itocondriales varían enorme· mente de tamaño, de 16 kb en e l genoma mini· roalista de Jos mamíferos, a 570 kb en el de plan · tas superiores. Los gcnomas más grandes pueden codificar funciones adicionales. Los genomas de los cloroplastos fluctúan entre 120 y 200 kb; en los secuenciados, la organización y las funciones codi· ficadoras son similares. En las mitocondrias y los cloroplasto!i, muchas :::le las proteínas principales conrienen algunas subunidades sintetizadas en el organelo y otras importadas del citosoL En la~ levaduras, las reestructuraciones son muy frecuentes en el DNA mllocondrial, y se ha encontrado recombinación entre los genomas mitecondriales o los genomas de los cloroplastos. Se han observado transferencias de DNA entre los genomas de los cloroplastOs o de las mítocondrias y los genomas nucleares.

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Monaco. A. P., Bertelson, C. J., Midd lesworth, W.. ColletLi, C. A ., Aldridge, J., Pischbeck, K. H., BarLlett, R., PericaJ. Parte de la información más reveladora provie...e de la comparación de secuencias de genomas. :::on las secuencias del genoma humano y del geno~ a del chimpancé de que se dispone actualmente, ~posibl e empezar a abordar algunos de los aspecs de la interroga nte sobre qué bace (micos a los uman os.

500 genes Bacteria extracelular (parasitaria)

1500 genes Bacteria de vida libre

.,

5000 genes Eucariota unicelular

13 000 genes Eucarlota multlceluiar

25 000 genes Plantas superiores

25 000 genes Mamíferos

El número mínimo de genes requerido por cualquier tipo de organismo incrementa con su complejidad. Fotografía de bacteria extracelular cortesía de Gregory P. Henderson and Grant J . Jensen, California Institute of Technology. Fotografía de célula de vida libre cortesía de Karl O. Stetter, Universitat Regensburg. Fotografía de eucariota unicelular cortesía de Eishi Noguchi, Drexel University College of Medicine. Fotografía de eucariota multicelular cortesía de Carolyn B. Marks and David H. Hall, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY. Fotografía de planta superior cortesía de Keith Weller/USDA. Fotografía de mamífero o Photodisc.

El número de genes bacterianos abarca un rango de un orden de magnitud Los intensos estudios actuales han permitido la secuenciación de numerosos genomas, entre otros, los incluidos en la , en la cual se describe el tamaño de algunos de e llos, que va de 0.6 x 106 bp del micoplasma a 3.3 x 10 9 bp del genoma humano; se incluyen numerosos animales experimentales importantes, como la:. levaduras, la mosca de la fruta y un gusano nematodo.

5 2 El número de genes bacterianos abarca un rango de un orden de magnitud

77

:

Genomas

...... Loci letales

Especies

(Mb)

Genes

Mycop/asma genitalium

0.58

470

Rickettsia prowazekii

1. t t

834

Haemophilus influenzae

1.83

1 743

Methanoooccus ¡annaschii

1.66

1 738

B. subtilis

4.2

4 100

E. col/

4.6

4288

t 800

S. cerevlsiae

13.5

6 034

1 090

S.pombe

12 .5

4 929

A thaliana

119

25 498

O. saliva (arroz)

466

-30 000

D. melanogaster

165

13 601

C. e/egans

97

18 424

H. sapiens

3 300

-300

3 100

- 25 000

En numerosos organismos se conocen los tamaños de los genomas y los números de genes a partir de secuencias completas. Los loci letales se estiman a partir de bases de datos genéticos.

6 000 s principales • Las secuencias repetidas (presentes en más de una copia) representan >50% del genoma humano. • la mayor parte de las secuencias repetidas está formada por copias de transposones no funcionales. • Hay numerosas duplicaciones de extensas regiones cromosómicas.

.:Los genes se distribuyen uniformemente en el genoma? Algunos cromosomas cuentan con pocos

Exones-1%

lntrones = 24%

El componente más grande del genoma está formado por transposones. Otras secuencias repetitivas incluyen duplicaciones extensas y repeticiones sencillas.

genes y >25% de sus secuencias son "desiertos", o regiones de más de 500 kb en las que no hay genes. hasta> lO% de las secuendas de los cromosomas con más genes lo son. Así, en total, -20% del genoma humano consiste en desiertos carentes de genes. las secuencias repetitivas representan a >50% del genoma humano, como se observa en la . Las secuendas repetitivas se agrupan en cinco clases: • Los uansposones (activos o inactivos) constituyen la gran mayoría (45% del genoma); todos se encuentran en múltiples copias. • Los seudogenes procesados (-3000, constituyen -0. 1% del DNA total). (Son secuencias que surgen por inserción de una copia de u na secuencia de RNAm en el genom a; véase la secdón 6.6, Los seudogenes son los callejones sin sali da de la evolu ción.) • Repeticiones de secuencias simples (DNA muy repetitivo, como el (CA)n que representa -3%). • Las duplicaciones segmentarías (bloques de 1Oa 300 kb duplicados en una nueva región) representan a -5%. Sólo una minoría de esras duplicadones se encuentra en el mismo cromosoma; en los otros casos. las duplicadones están en cromosomas diferentes. • Las repeticiones en tándem forman bloques de un tipo de secuencia (especialmente en los centrómeros y los telómeros). La secuencia del genoma humano subraya la importancia de los transposones (que tienen la capacidad de replicarse a sí mismos e insertarse en una ubicación direrentc, además de que pueden funcio nar exclusivamente como elementos del DNA [véase

5 6 ¿Cómo se distribuyen los genes y otras secuencias en el genoma?

85

Cap. 21, Los tra nsposones] o tener u na forma activa RNA [véase Cap. 22, Retrovirus y retroposones]. Su distribución en el geooma humano se resume en la Fig. 22.18). la mayoría de los transposones que se encuentran en el genoma humano no son funcionales; muy pocos están realmente activos. sin embargo, la gran propordón del genoma ocupada por estos elementos indica que han partidpado activamente en el moldeo del genoma. Una característica importante es que algunos genes presentes se originaron como transposones y evolucionaron hasta llegar a su condición actual después de perder la capacidad de transponerse. Cerca de 50 genes pa recen haberse originado de esta manera. La duplicación de segmentos en su forma más sencilla implica la duplicación en tándem de alguna región de un cromosoma (habitualmente debido a un evento de rccombinación aberrante durante la meiosis; véase la sección 6. 7, El emrecruzamiento desigual reorganiza a los agrupamientos de genes). Sin embargo, en muchos casos, las regiones duplicadas se encuentran en cron1osomas diferentes, lo cual implica que originalmente hubo una duplicación en tándem seguida de la translocadón de una copia a un sitio nuevo. o que la duplicación se debió a mecanismos totalmente diferentes. El caso extremo de la duplicación de segmentos se observa cuando se duplica todo el gcooma, en cuyo caso, el genoma diploide inicialmente se conviene en terraploide. Conforme las copias duplicadas desarrollan diferendas, el genoma puede convenirse en diploide nuevamente de forma gradual y efecriva, no obstante que las homologías enrrc las copias divergentes dejan evidencias del evento, fenómeno particularmente común en los genom¡¡s de las plantas. El estado actual del análisis del genoma humano identifica numerosas regiones duplicadas, pero no indica si h ubo una duplicación completa del genoma en el linaje de los vertebrados. Una característica intrigante del genoma h u mano es la presencia de secuencias que parecen no tener funciones codificadoras, pero que muestran una conservación evo lutiva superior a la del nivel de fondo . Como se detectó mediante la comparación con orros genomas (inicialmenre con el del raLón), dichas secuencias represcman aproximadameme el 5% del genoma total. ¿Están coneCLadas funcionalmenee con las secuencias codificadoras de proteínas? Su densidad en el cromosoma 18 es la misma que en cualquier otra región del genoma, aunque el cromosoma 18 tiene una concentración de genes codificadores de proteínas significativamente menor. lo cual sugiere indirectamente que su función no está relacionada con la esnuctura ni con la expresión de los genes codificadores de proteínas.

86

CAPÍTULO 5 Secuencias genómicas y números de genes

ID

El cromosoma Ytiene varios genes específicos

de la masculinidad Conceptos principales • El cromosoma Ytiene ...(i0 genes que se expresan específicamente en los testículos. Los genes específicos de la masculinidad están en múltiples copias de segmentos cromosómicos repetidos. • La conversión g~nica entre copias múltiples permite el mantenimiento de los genes activos durante la evolución. La secuenciación del genoma humano ha amplia-

do significativamente los conocimientos sobre la función de los cromosomas sexuales. En general se piensa que los cromosomas X y Y desci.en den de un auwsoma común (muy antiguo). Su desarrollo ha implicado un proceso en el cual el cromosoma X ha retenido la mayor parte de los genes o riginales. mientras que el Y. ha perdido casi rodas. El cromosoma X se comporta como los autosomas en la medida en que las hembras tienen dos copias, y entre ellas puede tener lugar la recombínación. La densidad de genes localizados en el cromosoma X es comparable a la de otros cromosomas. El cromosoma Y es mucho más pequeño que el X y tiene muchos menos genes. Su única función resulta de que sólo los machos portan el cromosoma Y, del cual sólo hay una copia, por lo tanto, los loci ligados a este último son efectivamente haploides y· no diploides, como e l resto de los genes humanos. Durante muchos años se pensó que el cromosoma Y casi no portaba genes, excepto uno (o más) de los que determinan el sexo y definen la masculinidad. Gran parte del cromosoma Y (>95°1!, de su secuencia) no experimenta enl recruzamiento con e l cromosoma X, lo cual condujo a J.a perspectiva de que podía no contener genes activos porque no habría manera de evitar la acumu lación de mutadones deletéreas. Esta región está flanqueada por regiones seudoautosómícas cortas que se intercambian frecuentemente con el cromosoma X durante la meiosis masculina. Originalmente, a esta región se le llamó no recombinante, pero ahora se le conoce como región específica determinante de la masculinidad. La secuenciación detallada del cromosoma Y muestra que dicha región contiene tres tipos de regiones, como se ilustra en la • Las secue11cias X trallSpuestns están formadas por un toLal de 3.4 Mb que forman bloques grandes resultado de una transposición de la banda q21 en el cromosoma

Yp

Centrómero

PS

P7 P6

P5 P4

P3 P2

P1

Regtones ampltconicas

Palíndromos de las reglones amplicónicas

Genes de muchas copias

Regiones X transpuestas

Regiones seudoautosómicas

Genes de una sola copia

Reglones X degeneradas

Cenlrómero y heterocromatina

Yq

El cromosoma Y está formado por regiones Xtranspuestas, regiones Xdegeneradas y amplicones. Las regione~ Xtranspuestas y degeneradas tienen dos y 14 gene~ únicos, respectivamente. Los amplicones tienen ocho palíndromos extensos (P1 -P8), los cuales contienen a nueve Familias de genes. Cada familia contiene por lo menos dos copias.

X hace aproximadameme tres o cuatro millones de años, lo cual es específico del linaje humano. Estas secuencias no se recombinan con el cromosoma X y prácticamente se han desactivado. ahora contienen sólo dos genes activos. • Los segmentos X degenerados del cromosoma Y son secuencias que comparten un ori gen común con el cromosoma X (retorno al autosoma común del cual dcsdcnden los cromosomas X y Y) y contienen genes o seudogenes relacionados con el cromosoma X. Hay 14 genes acLivos y l3 seudogenes. En cierta forma, los activos han desafiado la tendencia a ser eliminados de las regiones cromosómicas que no pueden recombinarse durante la meiosis. • Los segmenlos amplicóy¡icos tienen una longitud total de 10.2 Mb y se repiten internamente en el cromosoma Y. Hay ocbo bloques palíndromos grandes que incluyen a nueve fam ilias de genes codificadores de proteínas; el número de copias por familia fluctúa enLre 2 y 35. "El nombre "ampticón" refleja el hecho de que las secuencias han sido amplificadas internamente en el cromosoma Y. Sumando los genes que se encuentran en estas =es regiones, el cromosoma Y comiene muchos más :~lo que se hubiera esperado, hay 156 unidades de :anscripción, de las cuales la mitad representa a ge- .:-s codificadores de proteínas y la müad representa · s:eudogenes. La presencia de los genes activos se explica por hecho de que la existencia de copias de genes _·imamente relacionados en los segmentos ampli !ücos permite que la conversión génica entre las ~.8

copias múltiples de un gen sea usada para regenerar copias activas. Las necesidades más comunes de las copias múltiples de un gen son cuantitativas (proporcionar más producto pro1eínico) o cualitativas (codificar proteínas con propiedades ligeramente distintas o expresadas en tiempos o lugares diferentes), aunque en este caso, la función esen cial es evolutiva. De hecho, la existencia de copias múltiples permite la rccombinación en elllÚsmo cromosoma Y para sustituir a la diversidad evolutiva que suele ser proporcionada por recombinación entre Jos cromosomas alélicos. La mayoría de los genes codificadores de proteínas en los segmentos amplicónicos se expresa específicamente en los testículos, y probablemente estén implicados en el desarrollo de la masculinidad . Si hay -60 de dichos genes en un conj unto total de -25 000 genes humanos, la diferencia genética cnrre varones y mujeres es de -0.2% .

111 Las especies más complejas evo lucionan al agregar nuevas funciones génicas Conceptos principales • la comparación de diferentes genomas muestra un incremento constante en el número de genes conforme se añaden genes adicionales para formar eucariotas, organismos multicelulares, animales y vertebrado~. • La mayor'ía de los genes únicos de los vertebrados están relacionados con el sistema nervioso o el inmunológico.

La comparadón de la secuencia del genoma humano con secuencias enconlradas en otras especies es reveladora respecto del proceso de evolución. En

las especies más complejas evolucionan al agregar nuevas funciones génicas

87

Incremento de la complejidad

mExtracelular

Todas las Sólo procariotas y vertebrados las eucariotas 22% 21% Sólo vertebrados y animales 24%

Sólo euoariotas

Compartimientos celulares

1 500

Mullicelularidad

32% 1 000

Los genes humanos pueden clasificarse según la amplitud de la distribución de sus homólogos en otras especies.

O Transcripción/ traducción • Plegamiento proteínico O Replicación o Transporte O Metabolismo

Las proteínas eucarióticas comunes están relacionadas con fu nciones celulares esenciales.

la se analizan los genomas humanos de acuerdo con la amplitud de su distribución en la naturaleza. Partiendo del más común (esquina superior derecha de la figura), el 2 l % de los genes es común a eucariotas y procariotas, y tienden a codificar proteínas esenciales para todas las formas vivas, tipicamente para el metabolismo básico, la replicación, la transcripción y la traducción . Avanzando en el sentido de las manecillas del reloj, se agrega otro 32% de los genes a las eucariotas en general, por ejemplo, pueden encontrarse en las levaduras. Estos genes tienden a codificar proteínas implicadas en funciones generales de las células eucarióticas, pero no de las bacterias; podrían relacionarse, por ejemplo, con la especificación de organelos o con los componentes del citoesqueleto. Otro 24% de los genes son necesarios para la especificación de los animales, entre otros, los genes para la multicelularidad y el desarrollo de diferentes tipos de tejidos. Veintidós por cienw de los genes son únicos de vertebrados, y codifican principalmente a proteínas del 88

1!1! Transmembrana '!Intracelular

CAPÍTULO 5 Secuencias genómicos y números de genes

5 00

El incremento de la complejidad de las eucariotas se acompaña de la acumulación de proteínas nuevas para desempeñar funciones transmembrana y extracelulares.

sistema inmunológico y del nervioso, pero a muy pocas enzimas, lo cual coincide con la idea de que el origen de las enzimas es muy antiguo y que las rutas metabólicas se originaron al principio de la evolución. Por lo tanto, se observa que el avance de las bacterias a los vertebrados implica agregar grupos de genes que representan a las nuevas func iones necesarias en cada etapa. Una manera de definir las proteínas comúnmente necesarias es identificar las que se encuentran en todos los proLeomas. Comparando detalladamente el proteoma humano con los proteomas de otros organismos, 46% del de las levaduras, 43% del de los gusanos y 61% del de las moscas están representados en el humano; un grupo clave de - 1 300 proteínas está presente en los cua tro proteomas. Las proteínas comunes son proteínas domésticas básicas necesarias para funciones esenciales que corresponden a los tipos resumidos en la . Las funciones principales están relacionadas con la transcripción y la traducción (35% ), el metabolismo (22%), el transporte (12%), la replicación y modificación del DNA ( 10%), el plegamiento y la degradación de proteínas (8%) y los procesos celulares (6%). Una de las sorprendentes características del proteoma humano es que tiene muchas proteínas nuevas respecto de otras eucariotas, pero relativamente pocos dominios protemicos nuevos. La mayoría de los dominios proteínicos parecen ser comunes al rei-

animal. Sin embargo. hay muchas arquitecturas reínicas recientes definidas como combinaciones t"vas de dominios. En la se muestra -:el mayor incremento tiene lugar en las proteítransmembrana y las extracclulares. En las le-Juras, la vasta mayoría de las arquitecturas tiene =ver con las proteínas intracel ulares. En las mos(0 los gusanos) hay aproximadamente el doble .arquitecturas intracelulares. pero hay un incre. nto sorprendente de proteínas transmembrana y •acelulares. como es de esperar de la adición de -:dones necesarias para las interacciones entre las _,las de un organjsmo multicclular. El incremen!n las arquitecturas inrracelulares necesario para ~ar un vertebrado (hombre) es relativamente :ueño, pero también en este caso se incrementan _?ran medida la arquitectura transmembrana y la ::acelular. Desde hace mucho tiempo se sabe que la diencía genética enrre el hombre y el chimpancé Jestro pariente más cercar1o) es muy pequeña, - 9% de los genomas son idénticos. Hoy día, la se~ncia del genoma del chimpancé permite investí_;· con más detalle ese 1% de difercndas y detectar ..as características responsables de Nlo humano_rden ser idemificadas. La comparación muestra " >e J 0 6 sustituciones de nucleótidos ( 1.2% de direnda globaJ en la secuencia), 5 X 106 deJeciones nsercioncs (dejando en -l. 5% de la secuencia _.:rmná tica, específica de cada especie) y muchas !Strucwraciones cromosómicas. las proteínas co.:spondicntes suelen ser muy similaie'i; 29% son -=micas y entre especies. en la mayoría de los casos • .- sólo una o dos diferencias en los ammoácidos ::: la proteína. De hecho. las sustituctones de nu• ~ridos son menos frecuentes en lo:. genes codifi.: !ores de proreínas que en los que tienden a estar olucrados en rasgos específicamente humanos, cual sugiere que la evolución de las proteínas es un efecto imponame en las diferencias entre '1 umano y el chimpancé. lo cual deja como po- iiidades principales a los cambios de estructura .• '1ica en gran escala y los de la regulación. El 25% -:as sustituciones de nudeótidos ocurre en los di... dcóridos CpG (entre los cuales hay muchos sitios -:-uladores potendales) .

¿Cuántos genes

son esenciales? 1

Cooceptu~ plincipal•~!.

'lo todos los genes son esenciales. En las levaduras y .as moscas, las deleciones de E o e Q)

O>

a; -o

~ o

10

Los genes esenciales de las levaduras se encuentran en todas las clases. Las barras azules muestran la proporción t otal de cada clase de genes, en tanto que las rojas muestran a los esenciales.

O 90% efectos no detectables 13 70% no viables

O 1.6% fenotipos posembrionarios

O 1.6% defectos del desarrollo

En un análisis sistemático de pérdida de función que se realizó en 86% de los genes del gusano se demostró que sólo el 10% tiene efectos detectables en el fenotipo. 90

CAPÍTULO 5 Secuencias genómicas y números de genes

análisis previo, sólo 12% fueron letales y otro 14° impedía el crecimiento. La mayor parle de las inserciones (70%) no tuvo ningún efecto. En un sonde( más sistemático, basado en la deledón completa dL cada uno de los 5 916 genes (>96% de los identi· ficados), se muestra que sólo el 18.7% es esencia. para el crecimiento en un medio de cultivo rico er nutrientes. En la se observa que las levaduras incluyen genes en todas las categorías. La única concentración notable de defectos está en lo~ que codifican a productos implicados en la símesi~ proteínica, en cuyo caso, ~ 50% son esenciales. Obviamente, en este método se subestima el númerc de genes esenciales para que la levadma viva en su hábitat natural, cuando no está tan bien provista de nutrientes. En la se resumen los resultados de un análisis sistemático de los efectos de la pérdida de función génica en el gusano C. elegans. Las secuencias de genes individuales fueron pronosticadas a partir de la secuencia del genoma, y al dirigir un RNA inhibidor contra estas secuencias (véase la sección 13.1 O, La interferencia de RNA está reladonada con el silenciamiento de genes), se creó un conjunto grande de gusanos en el cual se impidió el funcionamiento de un gen (pronosticado) en cada gusano. Los efectos detectables en el fenotipo se observaron sólo en l 0% de estos organismos con genes desactivados, lo cual sugiere que la mayoría de los genes no tiene funciones esenciales. La proporción de genes esenciales es mayor (21%) entre los genes de gusanos que tienen conLrapartes en otras eucariotas, lo cual sugiere que los genes ampliamente conservados tienden a desempeñar funciones más básicas. También se incrementa la proporción de genes esenciales entre los que se presentan individualmente en cada genoma haploide, respecto de los genomas que tienen muchas copias de genes relacionados o idénticos, lo cual sugiere que muchos de los genes múltiples pueden ser duplicaciones relativamente recientes que pueden sustiLu ir mutuamente sus funciones·. En Drosophila se han realizado análisis extensos del número de genes esenciales e n una eucariota superior mediante intentos de correlacionar los aspectos visibles de la estructura cromosómica con el número de unidades genéticas funci onales. La idea de que esto pueda ser posible provino originalmente de la presencia de bandas en los cromosomas politénicos de D. melanogaster. (Estos cromosomas se encuentran en deLerminadas etapas del desarrollo y representan una forma física in usualmente amplia, en la cua l son evidentes una serie de bandas [denominadas más formalmente cromómeros]; véase la sección 28. 1O, tos cromosomas politénicos forman bandas.) A partir del concepto anterior de que

bandas pueden represemar un orden lineal de se ha llegado al intento de correlacionar la rganización de los genes con la organización de las Jndas. En el conjunto baploidc de D. melanogaster "-Y -5 000 bandas cuyo tamaño varía en más de ;: orden de magnitud. pero en promedio hay -20 • de DNA por banda. El método básico consiste en saturar una región _omosómica con mutaciones, las cuales suelen ser :-:1ci llamente reunidas como letales. sin analizar ' causa de ello. Cualquier mutación letal se toma .na identificar a un locus que esencial para el or__znismo. En ocasiones, las mutaciones provocan t'Ctos deletéreos visibles pero no letales, en cuyo -so, también se toman en consideración para idencar un locus esencial. Cuando las muracjone.s se .ocan en grupos de complememación. el número Jede ser comparado con el número de bandas de la =~ión, o incluso, cada grupo de complementación ~e de ser asignado a bandas indjviduales. El propó. • de estos experimentos ha sido determinar si hay a relación coherente entre las bandas y los genes, r ejemplo, ¿cada ba nda tiene un solo gen? Agrupando los análisis realizados en los úlri, s 30 años. el número de grupos de complemen· · :ión letales es -70% del número de bandas; aún desconoce si esta relación tiene algún sigruficafuncional. Independiemememe de la causa, la -.Jivalencia constituye un estimado razonable de - ~ 600 genes letales; desde cualquier pumo de vista, • Jrosophlia, el número de loci letales es significari~meme menor que el número total de genes. Si la proporción de genes esencia les humanos similar a Ja observada en otras cucariotas, se - ·m asticaría un rango de 4000 a 8000 genes en - que las mutaciones sedan letales o producirían «ros evidentemente dañinos. Actua lmente se han -·nriñcado 1300 genes en los cuales las mutaciones - '' 'ocan defectOs evldemes. proporción sustancial .. total esperado, particu larmente en vista de que _chos genes le tales pueden actuar tan precoz· ~nte que nunca veríamos sus efectos. Este tipo de ."Sgos también suele explicar los resultados de la . en la cual se observa que la mayoría de , defectos genéticos conocidos se debe a mutacioc,. puntuales (en donde es más probable que haya ~-mdo menos alguna función residual del gen). ¿Cómo se explica la supervivencia de genes ·a dcleción parece no tener efecto alguno? La -.licadón más probable es que el organismo tiene :-mas allernas de cumplir con la misma función. _.:. posibilidad más sencilla es la re dundancia, y • .: hay muchas copias de algunos genes, lo cual jeno en algunos casos. cuando muchos genes - acionado~) deben ser desactivados para producir decto. En u n escenario un poco más complejo, .1>

-~nes,

J

un organismo puede tener dos rutas independientes susceptibles de proporcionar cierta actividad. La desactivación de cualquiera de ellas no seria dañina, pero la ocurrencia simultánea de mutaciones en los genes de ambas sería dclctérea. Este tipo de situaciones puede evaluarse combinando mutaciones. Para empezar, en la misma cepa se introducen dcleciones en dos genes, ninguna letal de por sí, pero si el mutame doble muere, la cepa se denomina letal sintética. Esta técnica ha resultado muy efectiva en las levaduras, en las cuales puede automatizarse e l aislamiento de mLttantes dobles. procedimiento denominado aná lisis de matriz genética sintética (SGA, synthetic genetic array análisis). En la se resume el resultado de un análisis en el cual se realizó una SGA en cada una de las 132 delcciones viables para detectar si puede sobrevivir en combinación con cualquiera de las 4 700 deleciones viables. Cada uno de los genes de prueba tuvo por lo menos un compañero con el cual la combinación fue letal, y en la mayor parte de los genes de prueba fue ese el caso; la mediana es de -2 5 compañeros, y el número mayor se observó en un gen de prueba que tuvo 116 compañeros letales.

Sentido erróneo/sin sentido Corte y empalme Reguladoras

58% 10% 50 k.b hacia la derecha. El tipo Hb Lepore proporciona la clásica evidencia de que la deleción puede resultar de un entrecruzamiento desigual entre genes ligados. Los genes ~ y B difieren únicamente -7% en sus se.::uencias. La recombínación desigual elimina material emre los genes, fusionándolos (véase Fig. 6.13). El gen fusionado produce una cadena individual 1ipo P formada por la secuencia terminal N de B. uoida a la secuenda terminal C de p. Acrualmente se conocen numerosos tipos de Hb :..epore, y la diferencia radica en el punto de transidón de las secuencias de B a ~. así que cuando los genes B a P se aparean por entrecruzamiento desigual, el pumo exacto de recombinación determina :a posición en que sucede cambio de secuencia oa 3 en la cadena de aminoácidos.

ljl~ IVCt ljiCX

........ .... et2

Ct 1

9

a-taJ-2L a-tai-2R cx-lal-1-Tailandesa

Borrado

Restante

las talasemias ce resultan de varias deleciooes en el agrupamiento de genes de globina ce.

Hb Lepare

G.,Ay HPFH G-¡Ay HPFH Hb Kenia

yj3 tal

bina

~

Las deleciones del agrupamiento del gen de glocausan varios tipos de talasemias.

El recíproco de este evento ha sido encontrado en la forma de Hb anti-Lepore, producida por un gen que riene la parte terminal N de ~ y la parte terminal e de EL gen fusionado está entre los genes y P normales. La evidencia de que pueden presentarse entrecruzamientos desiguales entre genes cuya relación es lejana proviene de la identificación de la Hb K enía, otra hemoglobina fusionada, la cual contiene la secuencia terminal N del gen""( y la secuencia terminal e del gen ~·La fusión debe haber resultado del entrecruzamiento desigual entre "'y y ~. cuyas secuencias difieren -20%.

o

o.

ó.7 Mediante entrecruzamiento desigual se reestructuran los agrupamientos de genes

111

A partir de las diferencias entre los agrupamientos de genes de glohina de varios mamíferos se observa que la duplicació n seguida (algunas veces) de la variación ha sido un elemento importante en la evolución de cada agrupamiento. las deleciones talasémicas humanas demuestran que el entrecruzamiento desigual sigue ocurriendo en amJ?os agrupamiemos de genes de globinas. Cada vez que un evento de esta nawrale1.a genera una duplicación y una deleción. debe tomarse en cuenta el futuro de los loci reco mbinantes de la población. Las deleciones también pueden ocurrir (en principio) por recombínación enn·e secuencias homólogas que se encuentran en el mismo cromosoma, fenómeno que no genera una duplicación correspondiente. Es difícil calcular la frecuencia natural de estos eventos porque las fuerzas selectivas ajustan rápidamente los niveles de los diversos agrupamientos de la población. En general. una conrracdón en el número de genes tiende a ser nociva y descartada a favor de otra, sin embargo, algunas poblaciones pueden Lener una ventaja compensadora quemantenga a la forma eliminada en una frecuencia baja. Las estructuras de los agrupamientos humanos actuales muestran varías Liuplicaciones que dan res1imonio de la importancia de tales mecanismos. Las secuencias funcionales incluyen dos genes a. que codifican a la misma proteína, bastante bien relacionados con los genes ~ y S, y dos genes y casi idénlicos. Estas duplicaciones independientes comparativameme reciem es han sobrevivido en la población, sin mencionar a las duplicaciones más distantes que originalmente generaron los diversos tipos de genes de globina. Otras duplicaciones pueden haber dado lugar a seudogenes o se han perdido. Es de esperar que la duplicación y la deleción continuas sean características de todos los agrupamkntos de genes.

Los genes del RNAr forman repeticiones en tándem l:tlnceptos principales • El RNA ribosómico es codificado por un número considerable de genes idénticos que se repiten en tandem para formar uno o más agrupamientos. • Los agrupamientos de DNAr se organizan de manera tal, que las unidades de transcripción que resultan en un precursor unido a los RNAr principales alternan con espaciadores no transcritos. En los casos descritos hasta ahora, hay diferencias entre los miembros individuales de un agrupamien tO de genes que permiten que la presión selectiva

112

CAPÍTULO 6 Agrupamientos y repeticiones

actúe de manera independiente en cada gen, y hay. por e l contrario, dos casos de agrupamientos grandes de genes que contienen varias copias idénticas del mismo gen o genes. La mayoría de los organismos contienen múiLíplcs copias de los genes para las hisronas, que son un componente fundamental de los cromosomas, y casi siempre hay varias copias de los genes que codifican a los RNA ribosómicos; Jo que plantean interrogantes evolutivas de inrerés. El RNA ribosómico es el productO predominante de la transcripción, pues constituye del 80 at 90% de la masa LOta! del RNA celular de las eucariotas y las procariotas. El número de genes mayores de RNAr fluctúa entre 7 de E. co!i, lOO a 200 de las eu cariotas inferiores y varios cientos en las eucariotas superiores. Los genes que codifican al RN,Ar grande y al pequeño (encontrados en las subunidades grandes y pequeñas del ribosoma, respecLivamente) suelen formar un par en tándem (la única excepción son las milocondrias de las levaduras). La ausencia de una variación detectable en las secuencias de las moléculas de RNAr implica que todas las copias de cada gen deben ser idénticas, o cuando menos sus diferencias deberán estar por debajo del nive l de detección del RNAr (-1 %). Un punto de gran interés son los mecanismos utilizados para evitar que las variaciones se acumulen en las secuencias individuales. En las bacterias, los múltiples pares de genes de RNAr están dispersos, míemras que en la mayoría de los núcleos eucarióticos están contenidos en agrupamientos en tándem, regiones que suelen llamarse D N Ar. (En algunos casos, la proporción de DNAr en el total del D~A aunada a su composición básica atípica, es lo suficicmemente importante como para aislarse como fracción independiente. directamente del DNA genómico cortado.) Una característica cliagnóslica importante de un agrupamiento en tándem es que genera un mapa de restricción eirculaL como se muestra en la Supongamos que cada unidad de repetición tiene tres sitios de restricción. Cuando se mapean esws fragmentos por medios convenciona les, se observa que A está j unto a B, que está junto a C. que está j umo a A, generando un mapa circular. Si el agrupamiento es grande, los fragmentos internos (A, B y C) estarán presentes en cantidades mucho mayores que los terminales (X y Y), mismos que conectan al agrupamiento con el DNA adyacente. En un agrupamiento de l 00 repetidones. X y Y estarían presentes al l % del nivel de A. B y C. lo cual puede dificultar la obtención de los extremos de un agrupamiento de genes con fines de mapeo. La región del núcleo donde sucede la síntesis del RNAr tiene un aspecw característico, con un núcleo

1

Organización lineal del agrupamiento Repetición 1

Repetición 2

Espaciador no transcrito

Repetición 3

Repetición 4

Unidad de transcripción

1

1

~\/.'~\..lA~

~

~'VJVA:/"\J

~

~

Sitios de división por restricción

X

A

8

e

A

e

8

A

8

e

A

8 Y

Mapa de restrtccfón

e

A 8

Un agrupamiento de genes en tándem presenta alternancias en las unidades de transcripción y los espaciadores no transcritos y genera un mapa de restricción circular.

de naturaleza fibrilar rodeado de una corteza granular. El núcleo fibrilar es donde se transcribe e! RNAr a partir del molde de DNA, y la corteza granular está formada por partículas ribonucleoprotemicas en las cuales se ensambla el RNAr. El área completa se llama nucleolo, y su morfología característica es obvia en la Las regiones cromosómicas paniculares asociadas con un nucleolo se llaman organizadores nucle ola r es, cada uno de los cuales corresponde a un agrupamiento de genes de RNAr repetidos en tándem en un cromosoma. La concen tración de dichos genes, aunada a su muy inLensa transcripción, es la causa de la morfología característica de los nucleolos. El par de RNAr mayores es tra nscrito como el único precursor, tanto en los núcleos de las bacterias como de las eucariotas. Después de la transcripción. el precursor se divide para liberar a las moléculas individuales de RNAr. La unidad de transcripción es más pequeña en las bacterias y más larga en los mamíferos (en cuyo caso se conoce como RNA 455, según su velocidad de sedimentación). Un agrupamiento de DNAr contiene muchas unidades de transcripción. cada una separada de la siguiente por un espaciador no transcrito. La alternancia de una unidad de transcripción y el espaciador no transcrito es observable directamente en micrografías electrónicas. El ejemplo de la proviene del tritón Notopthalmus viridescens, en e! que cada unidad de transcripción se expresa intensa-

El centro nucleolar identifica a los DNAr en proceso de transcripción, y la corteza granular circundante consta de unidades ribosómicas ensambladas. Esta sección delgada muestra el nucleolo de la nutria Notopthalmus viridescens. Imagen cortesía de Osear Miller.

mente, de manera que varias polimerasas de RNA panicipan simultáneamente en la transcripción de una unidad de repetición. Las polimerasas están tan cercanas que los transcritos de RNA forman una matriz característica que muestra una longitud eredente a lo largo de la unidad de transcripción. 5 8 Los genes del RNAr forma n repeticiones en tándem

113

La transcripción de agrupamientos de DNAr genera una serie de matrices, cada una de las cuales corresponde a una unidad de transcripción separada de la siguiente por el espaciador no transcrito. Imagen cortesía de Osear Miller.

Región repetitiva 1

-500 bp

Región Transcripción Región repetitiva 3 repetitiva 2 Islote Islote Islote Bam Bam Bam

-300 bp

Longitud variable repeticiones de 97 bp

-300 bp

Longitud variable repeticiones de 60181 bp

2 300-5 300 bp

Longitud variable repeticiones de 60{81 bp

)1

EL espaciador no transcrito del DNAr de X. laevis tiene una estructura que se repite internamente y es La causa de sus variaciones de Longitud. Los islotes Bam son secuencias constantes cortas que separan a las regiones repetitivas.

Los genes repetidos de RNAr mantienen una secuencia constante Conceptos pt in ei pale;, Todos los genes de un agrupamiento de DNAr tienen secuencias idénticas. • Los espaciadores no transcritos consisten en unidades repetidoras más cortas cuyo número varia, de modo que la longitud de cada espaciador es diferentes.

La longitud del espaciador no transcrito varía mucho emre especies y (en ocasiones) dentro de una misma especie. Las levaduras tienen un espaciador no transcrito corto cuya longitud es relativamente constante. En D. melanogaster se observa una variación casi del doble emre diferentes copias de la unidad de repe[ición. En X. laevis la situación es similar. En cada uno de estos casos. todas las unidades de repetidón están presentes a manera de un solo agrupamiento en tándem individual en un cromosoma específico. (En el ejemplo de D. melanogaster, ésre re114

CAPÍTULO 6 Agrupamientos y repeticiones

sulta ser el cromosoma sexual. El agrupamiento del cromosoma X es más grande que el del cromosoma Y, así que las moscas hembra tienen más copias de los genes de RNAr que las moscas mad1o.) En los mamíferos. la unidad de repetición es mucho más extensa, y comprende la unidad de transcripción de -13 kb y un espaciador no transcrito de -30 kb. Normalmente, los genes forman numerosos agrupamientos dispersos, en el caso del hombre y del ratón, los agrupamientos residen en cinco y seis cromosomas, respectivamente. Una pregunta interesante (pero sin respuesta) es cómo puede funcionar el mecanismo corrector que, presumiblemente funciona en un solo agrupamiento y garantiza la constancia de la secuencia del RNAr, cuando hay varios agrupamiemos. J~as dife rencias de longitud del espaciador no transcrito de un solo agrupamiento de genes contrasta con la conservación de la secuencia de la unidad de transcripción. A pesa r de esta variación, las secuencias de los espadadores no transcritos más extensos siguen siendo iguales a las de Jos espadadores no transcritos más corros, lo cual implica que cada espaciador no transcrito es internamente repetitivo, de modo que la variación en longilud resulta de los cambios en el n(•mero de repeticiones de alguna subunidad. Las características generales de los espaciadores no Lranscri[OS se ilustran con el ejemplo de X. laevis en la . Las regiones cuya longitud es fija, alternan con Las de longitud variable. Cada una de las tres regiones repetitivas comprende un número variable de repeticiones de una secuencia más bien cona. Un tipo de región repetitiva tiene repeticiones de una secuenda de 97 bp; el otro. presente en dos ubicaciones, tiene una unidad de repetición en dos forma s, de 60 bp y de 81 bp de largo. La valiación eo el número de unidades de repelición en las regiones repetitivas representa la variación total en la longitu d de los espaciadores. Las regiones repetitivas están separadas por secuencias constantes más cortas, llamadas is lotes Bam. (Su nombre se debe a que para el aislamiento se u tilizó la enzima de resuicción BamHT.) A partir de este tipo de organización. se observa que el agrupamiento ha evolucionado por duplicaciones en que está impli cada la región promotora . Es necesario explicar la falta de variaciones en las copias expresadas de los genes repetidos. Un modelo supondría la demanda cuantitativa de determinado número de secuencias "buenas'', pero esto permitiría que las secuencias mutadas se acumularan a tal pumo, que su porción en el agrupamiento sería lo suficiemcmente grande como para que fuera ejercida la presión selectiva. Es posible excluir

estos modelos por la ausencia de dicha variación en d agrupamientO. La falta de variación implica una presión selectiva insensible, en cicna forma, a las variaciones ' ndividuales. Un modelo '>ttpondría que el agru:-•amiemo entero es regenerado periódicamente a partir de uno o de varios miembros. De hecho, en .:ada generación. prácticamente en cualquier me:anismo necesita estar involucrada la regeneración. :=ste tipo de modelos puede ser excluido porque un .3grupamiento regenerado no mo~rraría variaciones =n las regiones no transcritas de las repeticiones in dividuales. Lo cual plantea un dilema. La va1iación en las ~egiones no transcritas sugiere frecuentes emrecruz.a.mientos desiguales. con lo cual cambiará el tama :lo del agrupamjento. pero no las propiedades de las ~pe ti ci ones individuales. ¿Entonces cómo se evita .a acumu lación de mutaciones? En la próxima sec..:i.ón se verá que la contracción y la expansión con:inuas de un agrupamiento suelen proporcionar u n :neca nismo para la homogenización de sus copias.

. • La fijación entrecruzada podría ma ntener repeticiones idénticas Conceptos pnncipale!i

• Un entrecruzamiento desigual cambia el tamaño de un agrupamiento de repeticiones en tándem. las unidades de repetición pueden eliminarse o repartirse entre los agrupamientos.

El mism o problema se encuentra siempre que un ~en ha sido duplicado. ¿Cómo imponer la selección . .:~ ra evitar la acumu lación de ID1.Jtadones dele té:t:as? La d uplicación de un gen probablemente resulte ::n u na relajación inmediata de la presión evolutiva obre su secuencia. Ahora qu e hay dos copias idén~cas, un cambio en la secuencia de una no privará z organismo de una proteína funcional. porque la ~ ::cuencia original de Jos aminoácidos sigue siendo .....Uficada por la Olra copia. Después, la presión se:,:tiva se difunde en ambos genes, hasta que uno -~ellos mura lo suficientemente lejos de su función =-iginal como para enfocar toda la presión selectiva _ . el otro. Inmediatamente después de la duplicación de -:i gen, los cambios pueden acumularse más rápida::nte en una de las copias, llevando eventualmente : :Jna nueva función (o a la obsolescencia en forma -:: seudogén). Si se desarrolla una nueva función, .:onces el gen evoluciona a la misma velocidad,

más lema, característica de la fundón original. Pro bablemente ést~ sea el tipo de mecanismo causante de la separación de las funciones entre los genes de globina embrionarios y Jos adultos. Aún así. hay instancias en que los genes duplica dos conservan la misma !unción. codificando proteínas idénticas o casi idénticas. Las proteínas idénticas son codificada~ por dos genes de globlna ahwnanos y sólo difiere un aminoácido entre las dos proteínas de globina y. ¿Cómo se ejerce la presión selectiva para mamener la idcnúdad de la secuencia? La posibilidad más obvia es que, de hecho, dos genes no tienen fuodones idénticas, sino que difieren en algunas propiedades (no detectadas), como el tiempo o el lugar de expresión. Orra posibilidad es que la necesidad de dos copias sea cuantitativa, dado que ninguna produce, de por sí, suficiente cantidad de proteín a. De cua lquier forma, en casos más extremos de repetición es imposible evitar la con clusión de que ninguna de las copias del gen es esencial. Cuando hay varias, los efectos in media Los de la mu tación en cualquiera de ellas deben ser muy leves. Las consecuencias de una mutación individual se diluyen por el gran número de copias del gen que conservan la secuencia de tipo silvestre, pueden acumularse muchas copia!. mutantes antes de que se genere un efecto letal. La letalidad se torna cuantitativa, conclusión que se refuerza por la observación de que la mitad de las unidades del agrupamiento de DNAr de X . laevis o de D. melanogaster pueden ser borradas sin efecros adversos. ¿Cómo se impide, entonces, que estas unidades act1mulen gradualmente mutaciones delctéreas? ¿Qué posibilidades hay de que la rara mmadón favorable muestre sus ventajas en el agrupamiento? El principio básico de los modelos para explicar la conservación de la idcnridad entre copias rep etidas es suponer que los genes no a lélicos no se h eredan de manera independiente, sino que deben ser regenerados continuamente de una de las copias de una generación precedente. En el caso m6s sencillo de dos genes idénticos, cuando en una copia ocurre una mutación, o es eliminada de forma aleawria (porque la secuencia de la otra copia toma el control), o se extiende a ambos duplicados {porque la copia mutante se convierte en la versión dominanre). La dispersión expone a la mutación a la selección. El resultado es que los dos genes evolucionan jumos. como si existiera un solo locus, fenómeno conocido como evolución coincid en tal o e volución concerta da (ocasionalmente, coevolución), que puede aplicarse a un par de genes idénticos (con suposiciones posredores) o a un agrupamiento que comenga numerosos genes.

ó. IO La fijación entrecruzada podría mantener repeticiones idénticas

l

115

Un mecanismo supone que las secuencias de los ge nes no alélicos se comparan direct-amente }' son homogeneizadas por las enzimas que detectan cualquier diferencia. Esto se logra por el inrexcambio de cadenas individuales para formar genes, una de cuyas cadenas deriva de una copia y la otra, de la otra copia. Cualesquiera diferencias se revelan como bases apareadas impropiamente, lo cual atrae la atención de las enzimas susceptibles de escindir y remplazar una base, de modo que sólo los pares A-T y G-C sobreviven. A este tipo de evento se le llama conversión génica y se relaciona con la recombinación genética. Debería ser posible comprobar el alcance de tales eventos al comparar las secuen cias de genes duplicados, pero si están sujetos a la evolución concertada, no debería verse la acumulación de sustitu ciones de s irios silenciosos (porque el proceso de bomogeneización se aplica tanro para éstos como p.;~ra los sitios de remplazo) . Se sabe que la extensión del mecanismo de mantenimiento no debe rebasar al gen mismo, puesto que hay casos de genes duplicados cuyas secuencias flanqueantes son enteramente distintas. De hecho, podrían verse límites abruptos que marcan los extremos de las secuencias homogeneizadas. Cabe recordar que la existencia de dichos me canismos puede jnvalidar la determinación de la historia de genes de ese tipo a uavés de su divergencia, puesto que la divergencia refleja sólo el tiempo

transcurrido desde el último evento de homogemización/ regeneración, no la duplicaciÓ11 original. El modelo de f ijación cruzada supone que un agrupamiento entero esrá sujeto a reestructuración continua por el mecanismo de entrecruzamiento desigual. Dichos evenws suelen explicar la evolución concertada de múltiples genes si el entrecruzamiento desigual provoca que todas las copias sean regeneradas físicamente a partir de una copia. Siguiendo el tipo de evento ilustrado en la Figura 6.13, por ejemplo, el cromosoma que porta un locus triple podría sufrir la deleción de uno de los genes. De los dos resta rnes, l l/2 representa la secuencia de una de las copias originales; sólo la mitad de la secuencia de la otra copia origjnal ha sobrevivido" Cualquier mutación de la primera región ahora exisTe en ambos genes y está sujeta a la presión selectiva. El agrupamiento en tándem proporciona oportunidades frecuentes de "apareamiento errón eo'' de genes cuyas secuenCias son las mismas, pero que ocupan diferentes posiciones en sus agrupamientos. Mediante la expansión y contracció n constantes del número de unidades por entrecruzamiento desiguaL es posible que rodas las unidades de un agrupamiento sean derivadas de una proporción bastante pequeña de las de un agrupamiento ancestral. 116

CAPÍTULO 6 Agrupamientos y repeticiones

Las variaciones en la Jongiwd de los espadadores coinciden. con la idea de que los eventos de entrecruzamiento desigual suceden en los espaciadores apareados internamente de manera errónea, lo cual explícaría la homogeneidad de los genes comparada con la variabilidad de los espaciadores. Los genes son expuestos a la selección cuando unidades de repetición específicas son -amplificadas en el agrupamiento, pero los espacirtesía de Mary Lou Pardue and Joseph G. Gall, Carnegie Ins:itution.

aplica una solución que contenga DNA o RNAmar.::ado radioactiva mente. La sonda se híbrida con sus .:omplememos en el genoma desnaturalizado. La .ocalizadón de los sitios de hibridación puede determinarse por amorradiografía (véase la Fig. 28.19). Los DNA satélite se encuentran en regiones de heterocromatina, término. este último, utilizado ?ara describir a las regiones de los cromosomas permanentemente enrolladas con firmeza y que son nertes, a diferencia de la eucromatina, que repre·enta la mayor pane del genoma (véase la sección ~8.7, La cromatina se divide en eucromatina y he~erocromatina). la heterocromatina se encuentra :omúnmenre en los centrómeros (regiones en que -e forman los cinetocoros durante la mitosis y la .a eiosis para controlar el desplazamientO del cro-nosoma). La locación centromérica del DNA satéJte sugiere que tiene alguna función estructural en el cromosoma. la cual podría estar relacionada : m el proceso de segregación del mismo. En la se muema un ejemplo de Jo~alización del DNA satélite para el complemento ::-omosómico del ratón. En este caso. un extremo :e cada cromosoma está etiquetado porque es donde J S centrómeros se localizan en los cromosomas Mus ·:usculus.

Los satélites de los artró podos tienen repeticiones idénticas muy cortas Concepto principal La longitud de las unidades de repetición de los DNA satélite de los artrópodos es de sólo unos cuantos nucleótidos. La mayoría de las copias de la secuencia son idénticas.

En los artrópodos, tipificados por insectos y cangrejos, cada DNA satélite parece bastante homogéneo. Normalmen te, una unidad de repetición individual muy con a representa a >90% de los satélites, lo cua l hace relativamente senci lla la determinación de la secuencia . Drosophila virilis tiene tres satélites principales y un salélite críptico, que juntos representan >40% del genoma. Las secuencias de los satélites se resumen en la . Las secuencias de los tres satéliles principales están íntimamente relacionadas. la sustitudón de una sola base es suficiente para generar el satélite .O o el ID de la secuencia del satélite l. La secuencia de este último se encuentra en otras especies de Drosophi/a relacionadas con vin'lis, de modo que pueden haber precedido a la evoludón de las especies. Las secuencias de los satélites n y lli parecen específicas de D. virilis, así que pueden haber evolucionado del satélite I después de la evolución de las especies . La característica principal de estos satélites es su unidad de repe tición tan cona, de sólo 7 bp. En o tras especies se encuentran satélites similares. D. melanogasLer tiene varios satélites, muchos de los cua les tienen unidades de repetición m uy cortas (de 5, 7, 10 o 12 bp) . En los cangrejos se encuentran satélites comparables. La estrecha relación entre las secuencias de los satélites de D. virilis no es necesariamente una característica de otros genomas, en los cuales, las secuencias de los satélites podrían no estar relacionadas. Cada satélite surge de una ampliación lacera/ de una secuencia muy corta. la cual podría representar una variante de un satélite ya existente {como en D. virilis), o tener otro origen. Los satélites se generar y eliminan continuamente del genoma, lo cual dificulta establecer las relaciones evolutivas, ya que un satélite actual puede haber evolucionado de uno anterior, ya perdido. La característica importante de estos satélites es que representan fragmentos muy largos de DNA con secuen-

6.1l Los satelites de los artrópodos tienen repeticiones identicas muy cortas

i

119

cías poco complejas, dentro de los cuales se puede mantener u11a secuencia constante. Una de las características de muchos de estos satélites es una pronunciada asimetría en la orientación de los pares de bases de las dos cadenas. En el ejemplo de los satélites de D. virilis que se muestra en la Figura 6.22. una de las cadenas es mucho más rica en bases T y Gen cada uno de los sarélires mayores, con lo cual aumenta su densidad boyame, de manera que en la desnaturalización, esra ca d ena p ~sada (H. heavy) puede ser separada de la cadena ligera (L, liglzt) complcmemaria, procedimiemo que facilita la determinación de la secuencia del satélite.

1111

Los satélites de los mamíferos constan de repeticiones jerárquicas

Concepto plindpal El DNA satélite del ratón ha evolucionado por duplícadón y mutación de una unidad de repetición corta para dar origen a una unidad de repetición básica de 234 bp en la que pueden ser reconocidas la mitad, la cuarta parte y la octava parte de la repetición original.

En los mamíferos, tipificados por varios roedores, las secuencias que componen cada satélite muestran divergencias apreciables en las repeticiones en tándem. Las secuencias conas comunes se reconocen por su preponderancia entre los fragmentos de oligonucleótidos liberados por tratamiento químico o enzimático, si bien la predominante suele constituir una escasa minoría de las copias. Las secuencias cortas restantes se reladona n con la secuencia predominante por una variedad de sustituciones, deleciones e inserciones. Sin embargo, una serie de las variantes de la unidad corta puede constituir una unidad de repetición más larga, que a su vez. se repite en tándem con dertas variaciones, de modo que Jos DNA satélite de los mamíferos se consrruyen a partir de una jerarquía de unidades de repetidón. Estas unidades de repetición más largas constituyen las secuencias que se renaturalizan en el análisis de reasociación, las cuales también pueden ser reconoddas mediante digestión con enzimas de restricción. Cuando un DNA satélite es digerido con una enzima que tiene un sitio de reconoámiento en su unidad de repetición, se obtendrá un fragmento para cada unidad de repetición en la que se presente el sitio. De hecho, cuando el DNA de un genoma eucariótico es digerido con una enzima de restricción, la mayor parte de él produce una mancha generalizada debido a la distribución aleatoria de 120

CAPÍTULO 6 Aqrupamientos y repeticiones

los sitios dt división. No obstante, el DNA satéli te genera bandas agudas porque un gran número de fragmentos del mismo tamaño, o casi, son creados por división en los sitios de restricción separados por una distancia regular. La determinación de la secuencia del DNA satélite puede ser dificil. Usando las bandas discretas generadas por la división por restricción. se puede imemar directamenre la obtención de una secuencia, pero si hay una divergencia apreciable entre las unidades de repetición, en la misma posición, pero en repe[iciones distin[as. se presentarán diferentes nucleótidos, de manera que los geles de secuenciación serán oscuros. Si la divergencia no es considerable. digamos en el rango del -2%, será posible determinar una secuencia de repetición promedio. Se pueden insertar segmentos individuales del satélite en plásmidos, para su clonación. aunque un problema es que, en e l hospedador bacteriano, las secuencias satélite Lienden a ser escindidas del plásmido quimérico por recomb inadón. No obstante, cuando la clonación es exitosa, permite determinar sin ambigüedades la secuencia del segmento clonado. A pesar de que así se obtiene la secuencia de la unidad de repetición, o de las unidades. se necesitan varias de estas secuencias individuales para recons· truir como un lodo el tipo de divergencia úpico de Jos satélites. Mediante cualquier método de secuendación, la información que se puede obtener depende de la distancia analizable en un conjunto de geles de secuenda. La repetición de copias en tándem divergentes hace imposible la reconstrucción de secuencias más largas mediante superposiciones de fragmentos de restricción individuales. Bl DNA satéli1 e del ratón M. musculus es divicüdo por la enzima EcoRIT en unn serie de bandas, incluido un fragmemo mo11omérico predominante de 234 bp. Esta secuencia debe repetirse con pocas variantes en el 60% a 70% del satélite, que es dividido en la banda monomérica. Esta secuencía se puede analizar en función de las unidades de repetición constituyentes. cada vez más pequeñas. En la se ilustra la secuencia en cuanto a dos medias repeticiones. Al escribir la secuencia de 234 bp de manera que los primeros Ll 7 bp se alineen con los segundos, se observa que ambas mitades están basrantc bien relacionadas. aunque difieren co 22 posidones, lo cual con:esponde a una divergencia del 19%, es decir, que la unidad de repetición actual de 234 bp debe haberse generado en algún momento del pasado por duplicación de una un idad de repelición de 1 17 bp, y después se acumularon diferencias emre los duplicados. En la unidad de 117 bp se identifican dos sub· unidades más, cada una de las cuales corresponde a

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

~~GGAATATGGOGAGAAAACTGAAAATCACGGAAAATGAGAAATACACACTTTAGGACGTGAAATATGGCGAG~AAACTGAAAAAGGTGGAAAATT~GAAATGTCCACTGTA ~TGGAATATGGCAAGAAAACTGAAAATCATGGAAA~TGAGAAACATCCACTTI3ACGACTTGAAAAATGACGAAATCACTAAAAAAOGTGAAAAATGAGAAATGCACACTGAA

- ¿~

- ~ :e5

130

140

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la unidad de repetición del DNA satélite del ratón contiene dos mitades de repetición. alienadas para mostrar las identi(en color azul).

10

20

30

40

50

GGACCTGGAATATGGOGAGAAAACTGAAAATCACGGAAAATGAGAAATACACACTTTA 60

70

80

120

130

90

11 o

100

G T GGACGTGAAATATGGCGAGAAAACTGAAAAAGGTGGAAAATTAGAAATGTCCACTGTA 140

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170

GGACGTGGAATATGGCAAGAAAACTGAAAATCATGGAAAATGAGAAACATCCACTTGA 180

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220

230

CGACTTGAAAAATGACGAAATCACTAAAAAACGTGAAAAATGAGAAATGCACACTGAA El alineamiento de los cuartos de repetición identifica homologías entre la primera y la segunda mitad de cada mitad de repetición. Las posiciones que son las mismas en todos los cuartos de repetición se muestran en color gris; las identidades que abarcan sólo tres de los cuartos de repetición se indican con letras negras en el área verde.

. - cuarto de repetición, respecto del satélite enteLos cuatro cuanos de repetición aparecen ali=ados en la . Las dos líneas superiores ~:;:> reseman a la primera mitad de repetición de la - .=,ura 6.24, las dos inferiores, a la segunda mitad _ repetición; es obvio que la divergencia entre los arro cuartos de repetición ha aumentado a 23 de - posiciones, o 40 por ciento. En cierta forma. los -""! \eros tres cuartos de repetición están mejor re- j onados, y gran parte de la divergencia se debe a _...,bios en el último cua rto de repetición. Observando cada cuarto de repetició n, se ve -~ cada uno consta de dos subunida des relaciona -z "> t un octavo de repetición), marcadas como se~ncias ex y~ en la . Todas las secuencias ::enen una inserción de C, en tanto que las ~ in ­ _\·en la inserción de un trinucleótido. respecto de -~ secuencia de consenso común. Esto sugiere que : uarro de repetición se originó por duplicación - u na secuencia como la secuencia de consenso. :·>;¡ués de lo cual ocurrieron cambios para gene- - los componentes que ahora observamos como p. Entre las secuencias cxp repetidas en tándem <eron lugar cambios posteriores para generar los ,:;tos y las mitades de la repetición origina] que ~~en hoy. Entre los octavos de repetición, la di -~encia actual es de 19/ 31 =61%. :.a sewencia de consenso se analiza d.irectamen en la , en la cual se demuestra que la . tienda satélite actual puede ser considerada como

un derivado de una secuencia de 9 bp. En el satélite se identifican tres variantes de esta secuenda. según se indica en la pane inferior de la figura. Si en una de las repeticiones se loma la siguiente base más frecuente en dos posiciones, y no la más frecuente, se obtienen tres secuendas de 9 bp bien relacionadas:

GAAAAACGT GAAAAATGA

GAAAAAACT El origen del satélite muy bien podría estar en una amplificación de u no de estos tres nonámeros. La secuencia de consenso general del satélite actual es GAA./\AA~~ T, que efectivamente es una amalgama de las eres repeticiones de 9 bp. La secuencia promedio del fragmento monomérico del DNA satélite del ratón explica sus propiedades. La unidad de repetición más larga. de 234 bp, se identifica mediante división por restricción. La unidad de reasociación entre las cadenas individuales del DNA satélite desnaturalizado es probablemente la mitad de la unidad de repetición de 117 bp porque los fragmentos de 234 bp pueden asociarse ambos en un registro y en medio regisuo (en el último caso, la primera mitad de repetición de una cadena se renaturaJiza con la segunda mitad de repetición de la otra). Hasta aquí se ha tratado al satélite presente como formado por copias idénticas de la unidad de reperición de 234 bp. y si bien esta unidad represen -

6.13 Los satélites de los mamíferos constan de repeticiones jerárquicas

121

GGACeTGGAATATGGeGAGA A

AAeTGAA

~

AATCAeGGAAAATGA

GAAATAeAeAeTTTA

~

GGAeG T GAAATATGGeGAGRA

~2

A A AG G T G GA A A A T TTA G A A A T G Te e A C T G T A

~

GGAeGTGGAATATGGeAAGAA

p3

A A T e A T G GA A AA T G A G A AA e A T e e A e T T G A

~

eGAeTTQAAAAATGAeGAAAT

~

AAAeGTGAAAAATGA

AAeTGAA AAeTGAA eAeTAAA

GAAATGeAeAeTGAA

GAAAT ........................................................... .

¿Ancestral? A A A e G T G A A A A A T G A G A A A T G e Ae Ae T G A A El alineamiento de los octavos de repetición muestra que cada cuarto de repetición consiste en una mitad o: y una ~· La secuencia consenso proporciona la base más común en cada posición. La secuencia "ancestral" muestra una secuencia muy estrechamente relacionada con la secuencia consenso, que pudo haber sido el predecesor de las unidades o. y p. (La secuencia satélite es continua, de manera que con el fin de deducir la secuencia consenso, se puede tratar como permutación circular, según indica la unión del último triplete GAA con los primeros 6 bp.)

tala mayor pane del satélite, también hay variantes de éste, algunas de las cuales están distribuidas aleatOriamente en el satélite y otras están agrupadas. la existencia de variantes se deriva de que el material iolcial para el análisis de secuencia haya sido descrito como fragmento "monomérico". Cuando el satélite es digerido por una enzima que tiene un sitio de división en la secuencia de 234 bp, también genera d(meros, trímeros y tetrámeros relativos al fragmento de 234 bp, los cuales surgen cuando una unidad de repetición ha perdido el sitio de división de la enzima como resultado de una mutación. La unidad monomérica de 234 bp es generada cuando dos repeticiones adyacentes tienen cada una un sitio de reconocimiento. El dímero se crea cuando una unidad ha perdido al sitio, un trímero cuando dos unidades adyacentes han perdido dicho sitio, y así sucesivamente. Con algunas enzimas de restricción, la mayor parte del satélite se divide en un miembro de sus series de repetición, como se muestra en el ejemplo de la . La declinación del número de d[meros. lrimeros, etc, muestra que hay una distribución alea toria de las repeticiones en la cual el sirio de reconocimiento de la enzima ha sido eliminado por mutación. En otras enzimas de restricción se observa un tipo diferente de comportamiento con el DNA satélite, pues siguen generando las mismas se1ies de bandas. De cualquier forma, dividen sólo una pe queña proporción del DNA, digamos de S% a 10%, lo cual implica que determinada región del satélite contiene una concenttación de unidades de repeti12 2

CAPÍTULO 6 Agrupamientos y repeticiones

ción con este sitio de restricción panicular. Presumiblemente, todas las series de repeticiones de este dominio se derivan de una variante ancestral que poseyó a este sitio de reconocimiento (si bien en el modo com{m, algunos miembros lo han perdido desde entonces, por mutación). Un DNA satélite experimenta una recombinación desigual que tiene otras consecuendas cuando en la un idad de repeüciónhay una repetición interna. Volviendo al agrupamiento formado por repeticiones "ab", y suponiendo que los componentes "a" y "b" de la unidad de repetición tienen una reladón suficientemente estrecha como para aparearse, los dos agrupamientos podrán alinearse en medio registro, con la secuencia "a'' de un grupo alineada con la secuencia "b" del otro. La frecuencia con que esto ocurra, dependerá de la cercanía de la relación entre ambas mitades de la unidad de repetición. In vitro, en el DNA satélite del ratón, la reasociación entre las cadenas de DNA satélite desnaturalizado suele tener lugar en el medio registro. Cuando un evento de recomb inación sucede fuera de registro, cambia la longitud de las unidades de repeLición involucradas en la reacción:

xababababababababababababababababy X

xababababababababab,.¡oahabattflOi!baby

l xababababababababaababababababababy +

xababababababababbabababababababy

G G G G G T G G G G G G G A

G G G A A T A G A A A A A A G A A A

A e e A T G A A e T e A A T G

A T e A G G A e A T A T A G AG A A A A A A A A G G A A A A TT A A A T"e A T A G G A e G A A T A T A A T A A A

A G G A A G G A G A A T G A G A A G A A A A A

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e

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2

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A A A A e A A T e A A A A T G A e· e A e e G A e T A A A T G

Tamaño.

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A A T e A e T A A A e G T G A A A A A T G A G A A A e A e T G A A

e

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G20A1sA:!1~A12A17 Ta G11As T7

Cs As

Cg Tts

~ • indica un triplete insertado en la secuencia ~

e en la posición 10 es una base extra en la secuencia a La existencia de una secuencia de consenso ge.,eral se muestra al escribir la secuencia satélite según una -~petición de 9 bp.

En el agrupamiento recombinante superior, :..na unidad "ab" ha sido remplazada por una u nidad aab", en tanto que en el inferior, la un idad "ab" ha >ido remplazada por una unidad "b" . Este tipo de evento exp1ica una característica J.cl extracto, digerido por enzimas de restricción, J el DNA satélite del ra tón. En la Figura 6.28 se ob-erva una serie desvanecida de bandas en los frag"':lentos de 1h , l lh, 21h y 3 !1.! unidades de repetición, .:demás de las repeticiones de fragmentos integrales ~ás fuertes. Supóngase que en el ejemplo precejcnte, "ab" representa a la repetición de 234 bp del .J)JA satélite del ratón, generada por división en .1..11 sitio del segmento "b". Los segmentos "a" y "b" : Los minisatélites facilita n el mapeo genético

123

. 1-

,;:,.:rnmn ;n.mh, (1I!iiJXI[Ji!ilJE11

1

repetición de 64 bp y se distribl.lye en la población de la manera siguiente:

Llill· l111!...,

Progenitores

GGGCAGGAXG CCCGTCCTXC División

No. de repetición

.

7% de ll% de 43% de 36% de 4% de

.

División Progenitor 1 y

y

6 ~

· ..-r->1'

................... .. . . .. ... 5 .... .... .... .... . 9 ............. .... .... ... ... ... .. ... .. 6 •• ••• ••• • . . ;'!.. ,!. 9

Progenitor 2• • • • • • • • • • • •. ~

;-o-

7

Progenie

.

,¡¡¡¡, ,¡¡;;;;,

7

-.... ... ... ~

.

~ ,.-.,.-,.

'(

..,...

...,.....,....~~!1 !1!~

7

6

9 8

•••• •>

5

.. .

7 6 5 j

Los aletos pueden diferir en cuanto al número de repeti· cienes en ellocus de un minisatélite, de modo que la división de cada lado genera fragmentos de restricción que difieren en longitud. Se puede seguir el patrón de herencia utilizando un minisatélite con alelas que difieren entre los progenitores.

Las secuencias que parecen satélites por su constitución de repeticiones en tándem de una unidad corta, pero que en general son mucho más cortas, por ejemplo, de 5 a 50 reperidones, son comunes en los genomas de Jos mamíferos y fueron descubiertas por casualidad como fragmentos cuyas cliroensíon es son muy variables en las genotecas del DNA humano . La variabilidad resalta cuando una población contiene fragmcmos de muchos tamaños diferentes que representan la misma región genómíca, y al examinar a los individuos, resulta que hay gran polimorfismo y que pueden encontrarse muchos alelas diferente>. El apelativo de microsatélite se utiliza en general cuando la longitud de la unidad de repetición es secuemementc asumidas por las proteínas, con e consiguiente incremento de la versatilidad y, pro· bablemente, la eficiencia. . en la producComo se resume en la ción de las proteínas participan directameme tre: clases principales de RN A: • EJ RNA mensajero (RNAm, messenger RNA constituye un intermediario que porta le. copia de una secuencia de DNA que representa proteínas. • Los RNA de transferencia {RNAt, transfe· RNA) son moléculas pequeñas de RNA utilizadas para suministrar los aminoácidos correspondientes a cada codón específico de RNAm. • Los RNA ribosómicos (RNAr, ribosoma~ RNA) son componentes del ribosoma, com~ piejo ribonucleoproreínico de gran tamañc q ue contiene numerosas proteínas y sus: compon entes de RNA, los cuales propor• donan el mecanismo para polimerizar a los aminoácidos en una cadena polipeptídica. El tipo de función del RNA en cada caso es distinto. En el RNA mensajero, su secuencia es la característica imponame: cada triplere de nucleótido$ de la región codificadora del RNAm representa e un aminoácido en la proteína correspondiente. Sin embargo, la estructura del RNAm, en particular las secuencias localizadas a ambos lados de la región codificadora, puede ser importante para el contro: de su actividad y, por lo tanto, de la cantidad dt proteína producida a partir de él. En el RNAt se observan dos de los temas co· m unes gue rigen el uso del RNA: su estructure. tridimensional es imponante y tiene la capacidac de aparearse con otro RNA (RNAm). La estructurG.

Jirnensiona l se reconoce primero por una enzima _: constituye una diana apropiada para el víncu.:on un aminoácido espeáfico que crea un amj.acil-RNAt, identificado como la estructura que :Hiliza para la síntesis proteínica. La especifici-.: de uso de un aminoacii-RNAt se controla por :pareamiemo de las bases, cuando una secuencia ,tete cona (a n ticodón) se aparea con el triplete de .deóridos que representa a su aminoácido. En el RNAr se observa otro tipo de actividad; ..i de sus funciones es escructural. de manera que oporcionando un marco en el que se adhieren proteínas ribosómicas, además de que participa ·eaameme en las actividades del ribosoma . Una las actividades principales de este ú ltimo es su --·acidad para catalizar la formación de un enlace . Jrídico mediante el cual se incorpora un arruno- do a una p rorefna. Esta actividad reside en uno :os RNAr. Lo importante de este antecedente es que, al .templar la función del RNA en la síntesis pro~ica, se debe analizar como un componente que :empeña una función acciva y que puede ser . eto de regulación tanto por proteínas como por as moléculas de RNA; n o se debe olvidar, por otra :"í.e, que los RN/\ pueden haber sido las bases del '"':3Tato original. El tema constante en todas las acdades del RNA. ramo en la síntesis de prorefuas "!lo en otras partes, es que sus funciones depen~ fundamentalmente del apareamiento de bases ; :-a formar su estructura sccu ndaria y para imerac- ~r específicamente con olras moléculas de RNA. ~.u nción codHicadora del RNAm es única, si bien ~~At y el RNAr son ejemplos de una clase mucho .JS amplia de moléculas de RNA no codificadoras n djversas funciones en la expresión génica.

EL RNAm se produce por transcripción y se traduce 1

~cepto

codificadora relacionada con una secuencia proteínica a Lravés del código genético: cada triplete de nuclcótidos (codón) de la regjón codificadora representa a un aminoáddo . Sólo una de las cadenas de un DNA dúplex se transcribe en un RNA mensajero. Las dos cadenas de DNA se di!>tinguen ~egún se ilusua en la • La cadena de DNA que dirige la síntesis de RNAm por el aparcamiento complementario de bases se denomina cadena molde o ca d en a anticodificadora. (Antisentido es el término general para describir una secuencia de DNA o de RNA complementaria al RNAm) .

• La otra cadena de DNA tiene la misma secuencia que e l RNAm (excepto por T, en lu gar de U) y se le denomina cadena codificadora o cadena con sentido. En este capítulo se describe el RNA.m y su fun ción de molde para la síntesis proteínica. En el Capítulo 8, Síntesis proteínica, se analizará el proceso por el cual se sinteliza una proteína, en tanto que en el 9, Utilización del código genético, se describirá la forma en que se utiliza el código genético para interpretar el significado de una secuencia de RNAm. En el Capítulo lO, Localización de las proreínas, el enfoque está en la interrogante sobre cómo encuentra una proteína su localizadón apropiada en la célula durame la síntesis o después de ser sintetizada.

Transcripción

principal

Sólo una de las dos cadenas de DNA se transcribe en RNA.

-= expresión génica tiene lugar mediante un pro..... ú

de dos etapas. • La transcripción genera un RNA de cadena únka con una secuencia idéntica a la de una de las cadenas del dúplex de DNA. • La traducción convierte a la secuencia de nucleótidos del RNAm en una secuencia de aminoácidos que forman una p roteína. No todo el RNAm se traduce, pero cada RNAm contiene por lo menos una región

Traducción

La transcripción genera un RNA complementario a la cadena molde del DNA y tiene la misma secuencia que la cadena codificadora del DNA. La traducción interpreta cada triplete de bases y le asigna un aminoácido. Tres vueltas de una molécula de DNA duplohelicoidal contienen 30 bp, que codifican a 10 aminoácidos.

7.2 El RNAm se produce por transcri pción y se traduce

129

-Aminoácido

Conceptós pñncipales

AminoácidO ligado al extremo 3' del RNAt

--Aminoácido

El brazo está lormado por: • Tallo de bases apareadas • Lazo de cadena individual .--h]'.;¡ ""

El RNA de transferencia forma una hoja de trébol

~

,5' '

z: __,.

J . ;

-;:

~ ~

~-.f!>

\,._,.•» .,_,"'";;

Un RNAt tiene una secuencia de 74 a 95 bases que se dobla para formar una estructura secundaria de hoja de trébol con cuatro brazos constantes (y un brazo adicional en los RNAt más largos). El RNAt se carga para formar un aminoacil-RNAt y da lugar a un enlace éster del grupo OH 2' o 3' del ácido adenílico en el extremo del brazo aceptor del grupo COOH del aminoácido. La secuencia del anticodón nada más es responsable de la especificidad del aminoacil-RNAt.

•

~---f~

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'J.

'-!u)

~ . ~ --3. '~¡.- ..."';.. Apareamiento---- .. codón-anticodón ..}.~'J. '- ~ RNAm

Un RNAt tiene las propiedades duales de un adaptador que reconoce al aminoácido y al anticodón. La adenosina 3' está ligada de forma covalente a un aminoácido. El anticodón se aparea con el codón del RNAm.

El RNA mensajero se distingue del mecanismo responsable de su 1raducción mediante sistemas sin células para sinteTiza r p roteínas in vitro. Con un sistemr.

de síntesis de proteínas a partir de un tipo de células se puede traducir el RNAm de otro para demostrar que el códíg: genético y el mecanismo de traducción son universales. Cada triplete de nucleótidos del RNAm representa un aminoácido. La incongruencia estructura entre un trinucleótido y un aminoácido conduce inmediatamente a preguntarse cómo se aparea cada codón con su aminoácido específico. El Hadaptador es el RNA de transferencia (RNAt), que tiene dm propiedades clave: • Representa a un solo aminoácido, al cual se

une de forma covalente.

A

e e

7'?> 1 72 11 .3 70 4 '69 5 68

Brazo aceptor- 2 Brazo D

l

16 Pu \ 9 u· 17 A G" 1312Py10 G

ea

6 67 7 66

A 2223Pu25 26

l

Brazo TwC

1

Py59 65646362 o A" Pu 49505152G e Py

47

T

'1

l

27 43444546 28 42 29 41 30 40

3139 Py" 38 U

Brazo extra

Pli"

34

35

Anticodón

38

J

La hoja de trébol de RNAt tiene bases invariables. bases semiinvariables y un conjunto conservado de interacciones de apareamiento de bases.

130

CAPÍTULO 7 El RNA mensajero

• Contiene una secuencia de tres nudeótidos el anticodón , que es complementaria delcodón que representa a su aminoácido. El amicodón permite al RNAt reconocer e l codón por el apareamiento de bases complementarias. Todas las molécu las de RNAt tienen estructura5 secundarias y terciarias comun es. La estructura secundaria del RNAt puede describirse como una hoja de trébol, ilustrada en la , en la cual e· aparcamiento de bases complementarias forma los t a l los de los lazos de cadena única. Las estrucLuras tallo-lazo se denominan brazos de RNAt, y sus secuencias incluyen bases "inusuales" generadas por la modificación de las cuatro bases esLándar después de la síntesis de la cadena polinudeoúdica. La construcción de la hoja de trébol se ilustra en más detalle en la . Los cuatro brazos mayores reciben su nombre de acuerdo con su estructura o función: • El brazo acep tor consta de un tallo formado por bases apareadas que rermina en una secuencia no apareada cuyo grupo 2'- o 3'- 0H puede ligarse a un aminoácido. • El brazo TI¡IC se llama así por ese triplete. (\V representa a la seudouridina, una base modificada).

• En el brazo anticodón. el amicodón siem pre está en el centro del lazo. • El brazo D debe su nombre a que contiene la base díhidrouridina (otra de las bases modificadas del RNAt). • El brazo extra yace entre el T\jiC y el anticodón, y su extensión fluetúa entre tres y 21 base!>. El sistema de numeración del RNAt ilustra la astancia de su estructura. Las posiciones se nu~ran de 5' a 3' de acuerdo con la estructura del :At más común, el cual üene 76 residuos. El ranwtal de longitud de sus moléculas es de 74 a 95 : es, y la variación se debe a diferendas esrructues en el brazo D y en el extra. El apareamiento de bases que mantiene la es..mtra secundaria se muestra en la Figura 7.4. en - RNAt dado, la mayoría de los apareamiemos de es son asociaciones convencionales de A-U y -.:, aunque también se encuentran pares ocasio .:...es de G- U, G-'lf o A-ljl. Los tipos adicionales de =es de bases son menos estables que los regulares, -=-o de cualquier forma permiten que se forme una :ucrura duplo-he1icoidal en el RNA. Cuando se comparan las secuencias de las dife-:es moléculas de RNAt, las bases que se encuen.r. en determinadas posiciones son invariables (o servadas); casi siempre una base especíAca se :uemra en la misma posición. Algunas posidones ·escriben como semi-invariables (o semi-con-~a das ) porque están restringida!> a un tipo de (purina frente a pirimidina), pero puede haber ..: quier base del ripo correspondiente. Cuando un RNAt está cargado con el amino- que corresponde a su amicodón. se le llama -inoacil- RNAt y el aminoácido se liga mediante enlace éster que va del grupo carboxilo al hi-.ilo 2' o 3' de la ribosa de la base terminal 3' del -1.1 (que siempre es adenina). El proceso de carga ..n RNAt es catali7.ado por una enzima esped~a aminoacil-RNAt sintetasa. Hay (cuando - '"~s) 20 de ellas, y cada una reconoce a un solo ' )ácido y a todos los RNAl en los cuales puede - _Jlocado de manera legítima. :i.ay cuando menos un RNAt (pero en general ::tás) para cada aminoácido. Un RNAt se nomJtilizando como superíndice la abreviatura de .erras de cada aminoáddo, y si hay más de un -~para el mismo aminoáddo, se utilizan subín-: numéricos para distinguirlos. Así, dos RNAt _.J. Lirosina se describen como RNAt ;" y RJ"'{At/"· 1 .... XAL que transporta un aminoáddo, es decir, ':ninoacii-RNAt, se indica mediante un prefijo ~entifica al ami.noáddo, de modo que Ala-.RJ.'IAt ale a RNAtA1• que porta a su aminoácido.

?H Cisterna

células eucarióticas superiores son más grandes ,;uelen sedimentarse a -80S. El ribosoma es una partícula r i bonu cleoproe íni ca compacta formada por dos subunidades, -da una de las cuales üen e un componeme de -.'\A, incluida una molécula muy larga de RNA y ~merosas proteínas. La relación entre un riboso.; y sus subunidades se ilustra en la -.l.S dos subunidades se disocian in vitro cuando se ..jucc la concentración de iones de Mg2+. En cada ..:so, la s ubunida d grande tiene una masaaproxiadamente dos veces mayor que la subunidad _equeña. Los ribosomas bacterianos (70S) tienen ..:.bunidades que se sedimentan a 50S y a 30S. Las J bunidades de los ribosomas citoplásmicos euca"-t icos (80S) se sedimentan a 60S y a 40S. Las s subunidades operan juntas como pane del risoma completo; sin embargo. cada una asume ~acciones distintas en la síntesis proteínica. Todos los ribosomas de un compartimiento ce:ar dado son idénticos y asumen la síntesis de di-

-

~ntes pr01eÍ11t1S asociándose con diferentes RNAnz que ,·vorcionan las secumcias codificadoras en sí.

El ribosoma crea el ambiente que controla el renocimiemo entre un codón de RNAm y un anticon de RNAt. Al interpretar el código genético como .,a selie de tripletes adyacentes, la símesís proteí.::a procede del inicio de una región codificadora _ :loa l. Una protefna se ensambla por adicíón secuencial

- aminoácidos er1 dirección del terminal N al terminal C :fvrme el ribosoma se desplaza a lo largo del RNAm. Un ribosoma empieza la traducción en el ex.:mo 5' de u na región codiRcadora y traduce cada j ón en un aminoácido conforme procede hacia extremo 3'. En cada codón, el aminoacil-RNAt . ~apia do se relaciona con el ribosoma y dona su - jiJloácido a la cadena polipeptídica. En cualquier 1mento, el ribosoma puede albergar dos amiacil-RNAt que corresponden a codones sucesivos, crmitiendo que se forme un enlace peptídico ene los dos aminoácidos correspondientes. En cada ;so. la cadena polipeptídica creciente se alarga un tJnoácido más.

A una molécula de RNAm se unen numerosos ribosomas -. 3 000 copias de cada RN Al, y todas la moléculas de RNAt, juntas, son casi lO veces ma., numerosas que los ribosomas; la mayor parte es¡.: en forma de aminoacil-RNAt, listo para utilizarse d. inmediato en la síntesis proteínica. Dada su inestabilidad, es difícil calcular el número de molécula de RNAm, pero un cálculo razonable sería -150 en diferentes estados de síntesis y descomposidóHay - 600 tipos de RNAm en una bacteria, lo cu.: sugiere que, en general, hay sólo de dos a tres ce· pias de cada RNAm por cada una de ellas que, epromedio, codifican quizá a -3 proteínas. Si h2 1850 proteínas solubles diferentes, debe haber upromedio de > l 000 copias de cada proteína en ur.~ bacteria.

Elcic~~taldelRNA

mensajero de las bacterias ::._.,,reptos principales En (as bacterias, la transcripción y la traducción ocurren simultáneamente, pues los ribosomas empiezan a traducir un RNAm antes de que su síntesis esté completa. El RNAm bacteriano es inestable y su vida media es de sólo unos cuantos minutos. Un RNAm bacteriano puede ser policistrónico, con varias regiones codificadoras que representan a diferentes genes.

!t.~A

mensajero tiene la misma función en todas células, pero con diferencias importantes en los =·~lles de la síntesis y la estructura del RNAm eu.:..,ótico y del procariótico. Una diferencia importante en la producción del -A.m depende de dónde ocurran la transcripción .: rraducción: • En las bacterias, el RNAm se transcribe y se traduce en el companimiento celular único; los dos procesos están tan íntimamente relacionados que son simultáneos. Los ribosomas se adhieren al RNAm bacteriano incluso antes de que haya terminado su transcripción, de modo que el polisoma tiende a adherirse al DNA. El RNAm bacteriano suele ser inestable, y por lo tanto se traduce en proteínas durante sólo algunos minutos. • En una célula e ucariótica, la símesis y la maduración del.RNAm tienen lugar exclu sivamente en el núcleo, y sólo después de terminados dichos eventos. el RNAm es exportado al citoplasma, donde es traduddo por los ribosomas. El RNAm eucariótico es relativamente estable y sigue traduciéndose durante muchas horas. En la se muestra que en las bacterias - anscripción y la traducción están íntimamente ..=donadas. La primera empieza cuando la enzima ·"' polimerasa se une al DNA y posteriormente se "'laza formando una copia de una cadena. Tan mo se inicia la transcripción, los ribosomas se .eren al extremo 5' del RNAm y comienza la tra.::ión, incluso antes de que el resto del mensaje se ~sintetizado. Un grupo de ribosomas se mueve !argo del RNAm mientras éste es sintetizado. ~.tremo 3' del RNAm se genera cuando termina -~nscripción, en tamo que los ribosomas siguen _Jciendo el mRNA mientras sobrevive. pero se ;:ada en la dirección general 5'-43' con bastante

Componente Pared Membrana

Masa celular deshidratada (%)

Tipos Copias de Wo!éculas/célula diferentes cada tipo 1

10 10

ONA

1 2

2

1.5

RNAm RNAt RNAr Proternas ribosómicas

1 3 16

1500 200000 38000

9

10"

Proteínas solubles Moléculas pequeñas

46

2.0 x 10•

7.5 x to•

3

600

60 2 52

1850 800

2-3 >3000 19000 19000

>1 000

Análisis de E. coli en función de sus componentes maero moleculares.

Omin

Empieza la transcripción

PPP ~ El extremo 5' está trifosfatado

0.5 min

los ribosomas mielan la traducción

1.5 min

la degradación emp•eza en el extremo 5'

2.0

La ANA polímerasa termina

3.0 min

en el extremo 3'

la degradación continúa, los ríbosomas

terminan la traducetón

degrada

Sinopsis: el RNAm se transcribe, se traduce y se en las bacterias.

simult~neamente

7. 7 El ciclo vital del RNA mensajero de las bacterias

135

En las bacterias pueden observarse las unidades de

transcripción. Imagen cortesía de Osear Miller. rapidez. El RNAm es sintetizado, traducido por los ribosomas y se degrada, todo en rápida sucesión. Una molécula individual de RNAm sobrevive si aca· so, unos minutos. La transcripción y la traducción bacteriana tie nen lugar a velocidades similares. A una tempera tu· ra de 37°C la transcripción del RNAm ocurre a -40 nucleótidos/segundo, velocidad muy cercana a la de la síntesis proteínica, que es aproximadamente de 15 aminoácidos por segundo, de modo que se necesitan -2 minutos para transcribir y traducir a un RNAm completo de 5 000 bp, que corresponden a 180 kD de proteína. Cuando se inicia la expresión de un nuevo gen, su RNAm suele aparecer en lacélula en -2.5 minutos. La proteína correspondiente aparecerá quizás en medio minuto más. La traducción bacteriana es muy eficiente, y la mayoría de las moléculas de RNAm son traducidas por muchos ribosomas empacados de forma compacta. En un caso (trp RNAm), se inician aproximadamente 15 transcripciones por minuto y cada una de las 15 moléculas de RNAm probablemente sea traducida por - 30 ribosomas en el in tervalo que mectia entre su uanscripción y su degradación. La inestabilidad de la mayor parte del RNAm bacteriano es sorprendente. La degradación del RNAm sigue de cerca a su traducción y quizá empieza en un lapso de un minuto desde el inicio de la transcripción. El extremo 5' del RNAm comienza a degradarse anres de que el 3' haya sido sintetizado o traducido. La degradación parece seguir al último ribosoma del convoy del RNAm, pero la degradación procede con mayor lenrirud, tal vez aproximadamente a la mitad de la velocidad de la transcripción o la traducción. La estabilidad del RNAm influye de manera importante en la canridad de proteína que se produce; 136

CAPÍTULO 7 El RNA mensajero

suele expresarse en fun ción de la vida media.: RNAm que representa a un gen específico tiene e" vida media característica, pero el promedio es de- minutos en las bacterias. Obviamente, esta serie de eventos sólo es í' sible porque la transcripción, la traducción y la e gradación ocurren en la misma dirección. En la r; crografía de electrones de la se descut la dinámica de la expresión génica en delito flagrai' En estas unidades de transcripción (desconocida• varias moléculas de RNAm están en proceso síntesis simultáneamente y cada una porta nu~ rosos ribosomas implicados en La traducción. (Es corresponde a la etapa que se muestra en el segun panel de la Figura 7.13.} Un RN A euya s-íntesis aL no ha concluido con frecuencia se denomina R1'i naciente. Las moléculas de RNAm bacteriano varíeenormemente e11 cuanto al número de proteínas las cuales codifican. Algunos RNAm representan un sólo gen, son monocistrónicos, en tanto qL otros (la mayoría) portan secuencias que codifi.cz a numerosas proteínas y son policistrónicos. :: estos casos. una sola molécula de RNAm se transe- be a partir de un grupo de genes adyacentes. (Die!"' agrupamiento de genes constituye un operón co trotado como una unidad genética única; véase Capítulo 12. El operón.) Todos los RNAm constan de dos tipos de r e giones; la codificadora está formada por una ser de codones que representa a la secuencia de am noácidos de una proteína, empieza (n ormalmente con AUG y termina con un codón de terrninació~ No obstante. el RNAm siempre es más largo qu la región codificadora por la presencia de rcgione adicionales localizadas en ambos extremos. Una !kcuencia adicional en el extremo 5' que precede : inicio de la región codificadora se describe com líder o región 5' UTR (región no n·aducida). La secuencia adiciona l que sigue a la señal de terminaci-0-1;'-ü-eH

H~W'C:......N/

Presente en el casquete 1

o CH3

9

O-P-O-eH

o·

Presente en el casquete 2

El casquete bloquea el extremo 5' del RNAm y puede ser metilado en varias posiciones.

levaduras, en las cuales oscila entre l y 60 minutos. En las eucariotas superiores, hay un incremento 138

CAPÍTULO 7 El RNA mensajero

La transcripción empieza con un nucleósido trif fatado (casi siempre una purina, A o G). El prim nucleótid o retie ne a su grupo fosfato 5' y fo rre! enlace fo sfodiéster usual de su posición 3' a 5' del siguiente nucleólido. La secuencia inicial e transcritO puede representarse como: 5'pppAfGpNpNpNp ... Sin embargo, cuando el RNAm maduro es tr.: tado in vitro con enzimas que deben degradarlo t. nucleótidos individuales, el extremo 5' no origi:cl nucleósido tri fosfatado esperado, en cambio, co; tiene dos nucleótidos conectados por una ligadu 5' -5' tri fosfatO, e incluso ostenta grupos metilo. ::.. base terminal siempre es una guanina que se agref a la molécula de RNA original después de la tran cripción. La adición de la G 5' terminal es catalizada p· una enzima nuclea r, la guanilil transferasa. La rea.:ción tan poco después de iniciada la transcripdór que es imposib le detectar más que rastros del e'tremo 5' trifosfato en el RNA nuclear. La reacdóglobal puede representarse como una condensació.entre el GTP y el trifosfato terminal 5' del RNA. Pe> lo tanto 5'

5' + pppApNpNp . , .

.!. 5'- 5' ')ppApNpNp .. . + r , + p

El residuo de G nuevo adherido al extremo dé RNA se encuentra en orientación inversa respec: de los otros nucleótidos. A esta estructura se le denomina ca squ e t e, qu. es un sustrato de muchos eventos de metilación. Ela se observa la estructura completa d.: un casquete después de que se han agregado todc

' ::rupos metilo posibles. Los tipos de casquetes se ~.nguen por el número de roetilaciones de este - • ocun·idas: • La primera metilación ocurre en todas las eucar.iotas y consis te en la adición de un grupo met.ilo en la posición 7 de la guanina terminal. Un casquete que posee este gntpo metilo único se conoce como casquete O. La reacción procede hasta este punto en las eucariotas unicelulares, y la enzima responsable de esta modificación se denornina guanina-7 -metiltransferasa. • El siguiente paso es agregar otro grupo metilo en l.a posición 2' -0 de la penúltima base (que de hecho era la primera base original del transcrito ames de que se hicieran modificaciones), reacción catalizada por o tra em.ima, la 2' -0-metil-transferasa. A un casquete con dos grupos metilos se le denomi n a casqu ete 1, que es ellipo predominante en las eucariotas, excepto en los organismos unicelulares. • En u na pequeña minoría de eucariotas su periores, a. la segunda base se agrega otro grupo meülo, pero sólo cuando la posición es ocupada por adenina; la reacción implica la adición de un grupo metilo en la posición N6 . La enzima responsable actúa sólo en un sustrato de adenosina que ya tiene el grupo metilo en la posición 2' -0. • En algunas especies se agrega un grupo metilo a la tercera base del RNAm que cuente con casquete. El sustrato de esta reacción es el RNAm con casquete 1 que ya tiene dos grupos metilo. La modificación de la tercera base siempre es una metilación de una ribosa en Ja posición 2' -0, lo cual da lugar al casquete 2. En general. este caso representa menos del 10% all5 % de la población total con casquete. En una población de RNAm eucarióticos, todas molécuJ~ poseen casquete, y la proporción co;;pondieme a cada tipo es característica de cada ;.mismo. No se sabe si la estrucwra de una mo._ ..:a específica de RNAm es invariable o si puede · ~r más de un tipo de casquete. Además de la metilación implicada en el proceso :.a adidón del casquete, sólo en el RNAm de las :3Fiotas superiores ocurre una mettlación interna :'aja frecuencia merced a la generación de reside N6 metiladenina a una frecuencia de aproxi2al.cllileote una modificación por cada l 000 bases. - una o dos metiladeninas en un RNAm eucari ó:-ípico, aunque su presencia no es obligatoria; --nos RNAru no tienen ninguna de estas molé.....::5.

El extremo 3' está poliadenilado rrmccptos principales • Después de la transcripción se agrega un fragme nto de poli(A) de - 200 nucleótidos a un transcrito nuclear. • El poli(A) está un]do a una proteína específica (PABP). • EL poli(A) estabiliza al RNAm contra la degradación.

El fragmento 3' tcrmjnal de residu os de A con frecuencia se describe como cola de poli(A)¡ al RNAm con esta caracte1istica se Je denomina poli(A)+. La secuencia las modificaciones de ambos extremos det RNAm lo protegen contra la degradación mediada por las exonucleasas. las .secuencias específicas de un RNAm pueden producir efectos estabilizadores o desestabilizadores. • la desestabilización puede ser activada por la pérdida de poli(A).

Las características principales del RNAm relacionadas . Tancon su estabilidad se resumen en la to la estructura como la secuencia son importantes. Las estructuras terminales 5' y 3' protegen contra

7.1l La estabilidad del RNAm depende de su estructura y .su secuencia

141

El casquete protege contra la exonucleasa 5'-3'

Los codones sin sentido activan el sistema de vigilancia

La endonucleasa ataca ala secuencia desestabilizadora

UM UAG UGA

....15'

5' UTR

xxxx

Región codificadora

3' /WW!AA

El poli(A) protege contra la exonucleasa 3' -5'

1

3'UTR

Las modificaciones de los extremos del RNAm lo protegen contra la degradación. Secuencias internas pueden activar a los sistemas de degradación.

í

(AUUUAI

--~

Proteina de unión a la secuencia ARE

~

Poli(A) ribonucleasa

~

CAOUOAín

Una ARE en una región no traducida 3' inicia la degradación del RNAm.

La protefna de unión ai iRE se une al IRE en ausencia de hierro

(A}n La prote!na de unión aiiRE se disocia en presencia de hierro

(A)n

Un IRE localizado en la región no traducida 3' controla la estabilidad del RNAm.

la degradación, y secuencias específicas del RNAm pueden [uncionar como ruanas para desencadenar la degradación o conferir protección contra ésta: • Las modificaciones de los extremos 5' y 3' de l RNAm rienen funciones importantes en la prevendón del ataque de las exonudea142

CAPÍTULO 7 El RNA mensajero

sas, de modo que el casquete evira qe .. exonudeasas 5'-3' ataquen el extrem y el poli(A} que las exonucleasas 3' -5 quen el extremo 3'. • Los elementos específicos de la secue:. del RNAm pueden esrabilizarlo o desebilizarlo. La localización más común dt elementos desestabil izadores se encue-:en la región no traducida 3'. La presend .; dicho elemento acorta la vida del RNAr • En la región codificadora, las mutaciones crean codones de terminación activar sistema de vigilancia que degrada al R.'\_(véase la secdón 7 .14, Las mutaciones sentido activan un sistema de vigilancia En numerosas moléculas de RNAm de las Jt. duras se han encontrado elementos desestabiliza.: res, aunque wdavía no se han observado secu cias comunes o no se sabe cómo desestabilizar RNAm. No necesariamente acrúan de forma dire:(proporcionando dianas para las endonucleas.o pero pueden 'funcionar de manera indirecta, qt.fomentando la dcsadenilación. El criterio para _ finir a un elemento desestabilizador de secuer:es que su introducción en un RNAm nuevo put-_ provocar su degradación, si bien la eHminadón un elementO de un RNAm no necesariamente lo e tabi]jza, lo cual sugiere que cada uno de ellos pue_ tener más de un elememo desestabi lizador. Una característica común de algunas molécu _ de RNAm inestables es una secuencia rica en AL': -50 bases (denominada ARE) en la regió11 rem _ que 3'. La secuencia de consenso de la ARE es_ pentanudeótido AUUUA, repetido varias veces. =.la se muestra que la ARE desencade:la desesrabilización por un proceso en dos etapa primero es desadenilado el RNAm y posteriormer.·se degrada. La desadenUación podría ser necesa:-' porque da lugar a la pérdida de la proteína de unióal poli(A), cuya presencia estabiliza a la región : (véase la sección 7 .1 3, La degradación del RNA.!: involucra múltiples actividades}. En algunos casos, un RNAm puede ser esrallilizado al inhibir específicamenre la función de u~ elemento desestabilizador. El RNAm de la transferrina contiene una secuencia denominada elemem de respuesta al hierro (IRE, iron-responsive elemen ~ que controla la respuesta del RNAm a los cambio, de concentración del mismo y que se localiza e: la región 3' no traducida, además de que contient' estructuras tallo-lazo que se unen a proteínas cuya afinidad por e l RNAm se controla por medio de. hierro. En la se muestra que la unión de la proteína con el IRE estabiliza al RNAm al inh.ibi~ la función de secuencias desestabilizadoras cercanas (no identificadas}. Éste es un modelo general de la

.:abilización del RNAm, es decir, la estabilidad es ;,ferida por la inhibición de la función de secuen3.5 desestabilizadoras. La eliminación del casquete y la degradación drten en complejos protemicos grandes localiza:s como unidades ciroplásmicas discretas denomi-.:ias cuerpos-P, en los cuales pueden localizarse :as enzimas implicadas en la producción o el me -~olismo del RNAm. De hecho. dichos cuerpos puen secuestrar a cualquier molécula de RNAm que esté involucrada activamente en la traducción.

Casquete 1

Poii(A)/PABP 1

AAAAAAAAAAAA

~ Desadenilación Ccr4 Dcp1

~ Eliminación del casquete

La degradación del RNAm im plica múltiples actividades 1 :.oJnceptos

XRN1

principales

Para la degradación del RNAm de las levaduras se requiere de la eliminación del casquete 5' y del poli(A) 3'. Una ruta de las levaduras implica la degradación exonucleolítica en dirección 5'~3'. Otra ruta de las levaduras utiliza un complejo de 1umerosas exonucleasas que funcionan en dirección 3'~5'.

..a desadenilasa de las células animales puede unirse directamente con el casquete

s·.

-: ia degradación del RNAm de las levaduras es de ~ue más se sabe. Básicamente hay dos rutas que ~pieza n con la eliminación de la cola de poli(A), :~racción cata lizada por una desadenilasa especí.2 que probablemente funciona como parte de un :!!piejo proteínico vasw. (La subunidad catalítica .a exonucleasa Ccr4 en las levaduras, así como - cxonucleasa PARN en los vertebrados, que está .a.:ionada con la RNAasa D.) La acción enzin1ática . ' regresiva, una vez que ha empezado a degradar - sustrato específico de RNAm, sigue desensam·'ldolo, base por base. La ruta de degradación principal se resume en la . La desadenilación del extremo 3' activa :Jminación del casquete del extremo 5'. La base .5ta relación es que la presencia de la PABP (pro· -.:de unión a poli(A)) en el poli(A) impide que la .=ma responsable de la eliminadón del casquete _:ta al extremo 5'. La PABP se libera cuando la ptud del poli(A) está por debajo de 1O a 15 resi- ;;, La eliminación del casquete ocurre al separar .=.se metilada del extremo S' para dejar un mono· 3W en la reacción: m 7 GpppX ... ~m7 GDP + pX... :-'1zíma requiere del grupo 7 -metilo. :::ada extremo del RNAm influye en los eventos • Jcurren en el otro extremo, lo cual se explica - 'Je ambos extremos del RNAm se mantienen

La desadenilación permite la eliminación del casquete, lo cual provoca la división endonucleolítica a partir del extremo 5~

unidos por los factores implicados en la síntesis proteínica (véase la sección 8.9, Las eucaríotas utilizan un complejo formado por numerosos factores de iniciación). El efecto de la PABP en la eliminación del casquete permite que el extremo 3' incida en la estabilización del extremo 5'. Asimismo, hay una conexión entre la estructura del extremo 5' y la degradación del extremo 3'. La desadenilasa se une directamente al casquete 5', interacción necesaria para su ataque exonucleolítico contra el poli(A). ¿Cuál es el fundamento de la conexión enue los eventos que ocurren en ambos extremos de una molécula de RNAm? Quizá sea necesario asegurarse de que el RNAm no permanezca en un estado (teniendo la estructura de un extremo, pero no la del orro) que pueda competir con el RNA.m activo por las proteínas que se unen a los extremos. La eliminación del casquete activa la ruta de degradación 5'·3', en la cual el RNAm es degradado rápidamenre a partir del extremo 5' mediante la exonucleasa 5 ' · 3' XRN l. La enzima responsable de la eliminación del casquete se concentra en locicitOplásmicos discretos, los cuales pueden ser "cuerpos de procesamiento" en que el RNAm es desadenilado y posteriormente degradado. después de eliminarse el casquete. En la segunda ruta, las moléculas de RNAm desadeniladas de las levaduras pueden ser degradadas por la actividad 3' -5' de la exonucleasa del exosoma, un complejo de >9 exonucleasas. El exosoma también participa en el procesamiento de precursores de moléculas de RNAr. La adición de las exonucleasas individuales al complejo del exosoma puede des7. d La degradación del RNAm i1nplica múltiples actividades

143

Las mutaciones sin sentido activan un sistema de vigilancia

Desadenilación

Conceptos pñncipales

Degradación endonucleolítica

Degradación exonucleolltica 5'-3'

• Las mutaciones sin sentido provocan la degradación del RNAm. • En las levaduras y los gusanos se han encontrado genes que codifican al sistema de degradación.

-

'~----------~~~~·

La desadenilación puede provocar directamente

la división endonucleolítica y la división exonucleolítica desde los extremos 3'.

El RNAm de tipo silvestre tiene una estabilidad normal Traducción -+

5'~

,c~ s·

Una mutación sin sentido acliva la degradación Traducción - - .

, -r

s· Terminación prematura /

Se inicia la degradación

Las mutaciones sin sentido pueden provocar la degradación del RNAm.

encadenar las actividades exonucleolíticas 3'- 5' para que sean conLroladas coordinadamente. De igual forma. el exosoma puede degradar a fragmentos de RNAm liberados por división endonucleolítica. En la se muestra que la ruta de degradación 3'-5' puede de hecho implicar combinaciones de actividad endonucleolítica y exonucleolílica. El exosoma también se encuentra en el núcleo. donde degrada a precursores de RNAm no empalmados. Los mu tantes de levaduras que carecen de cual quiera de las rutas exonucleolíticas degradan a su RNAm más lentamente. pero la pérdida de ambas rutas es leta l. 144

CAPÍTULO 7 El RNA mensajero

Otra ruta de degradación se identifica por la d egradación d e l RNAm m ediada por mutacion es sin sentido. En la se observa q ue la introducció n de una mutación sin sentido cor frecuencia in crementa la degradación del RNAm Corno puede esperarse de la dependencia de un codón de terminación, la deg radación ocurre e ~ el citoplasma, y podría representar un control de calidad o un sistema de vigilancia para eliminamoléculas de RNAm no funcionales. El sistema de vigilancia ha si.do mejor estudiadf' en las levaduras y en C. elegans, pero también puede ser importante en las células animales. Por ejemplo, durante la formación de inmunoglobulinas : de receptores de células Ten las células del sistema inmunológico. los gene~ son modificados por recombinación somática y mutación (véase el Cap. 23 La diversidad inmunitaria) , suceso que genera ur número signiCicativo de genes no funcionales cuyos productos de RNA son eliminados por un sistema de vigilancia. En las levaduras. la degradación requiere deelementos de secuencia (denominados DSE) de flujc descendente a panir de la mutación sin sentido. La posibilid ad más sencilla sería que se trata de elementos deses tabilizadores y que la traducción suprime su uso . Sin embargo, cuando se bloquea la traducción. el RNAm se estabiliza. lo cual sugiere que el proceso de degradación está vinculado de alguna forma directa con la traducción del RNAm o con el even to de terminación. Los genes necesarios para el proceso han sido identificados en S. cerevisiae (loci upf) y en C. elegans (loci smg) mediante la detección de supresores de degradación mediada por mutaciones sin sentido. Las mutaciones de estos genes estabilizan a las moléculas aberrantes de RNAm. pero no afectan la estabilidad de la mayoría de los transcritos de tipo silvestre. Uno de estos genes se conserva en las eucariotas (upfllsmg2) y codifica a una helicasa dependiente de ATP (enzima que desenrolla los áddos nucleicos de doble cadena para formar cadenas individua les). Esto implica que d reconocimiento del RNAm como objetivo apropiado para la degradación requiere de un cambio de estructura.

El gen Upfl interactúa con los (actOres de libe--ón (eRFl y cRF3) que catalizan la terminación. _~ es probablemente la forma en que reconoce el emo de terminación. Posteriormente puede "es-"""''iñar" aJ RNAm desplazándose hacia el extremo UGA>UAG.

los codones de terminación son reconocidos por factores proteínicos • Los codones de terminacióA son reconocidos por factores de liberación de protelnas, no por moléculas de aminoacil-RNAt. • Las estructuras de los factores de liberación clase 1 son semejantes a las del aminoacil-RNAt-EF-Tu y del EF-G. • Los factores de liberación clase 1 responden a codones de terminación especificas e hidrolizan la ligadura polipéptido-RNAt. • Los factores de liberación clase 1 son asistidos por los factores de liberación clase 2 que dependen del GTP. • El mecanismo es similar en las bacterias (que tienen dos tipos de factores de liberación clase 1) y en las eucariotas (que tienen sólo un factor de liberación cl.lse 1).

• Virtualmente todas las proteínas ribosómicas están en contacto con el RNAr. • la mayor parte de los contactos entre las subunidades ribosómicas se realiza entre los RNAr 16S y 23S.

tos ribosomas tienen numerosos centros activos • las interacciones en que está implicado el RNAr son clave para la función del ribosoma. • El ambiente de los sitios de unión al RNAt depende ampliamente del RNAr.

El RNAr 165 desempeña un papel activo en la síntesis proteínica • El RNAr 16S desempeña un papel activo en las funciones de la subunidad 30S, pues interactúa directamente con la subunidad SOS y con los anticodones de las moléculas de RNAt localizadas en los sitios P y A.

Olil El RNAr 235 tiene actividad peptidil transferasa •

La actividad peptidil transferasa reside exclusivamente

en el RNAr 23$.

m:l Las estructuras ribosómicas cambian cuando se unen las subunidades • La cabeza de la subunidad 30S gira en torno al cuello cuando se forman los ribosomas completos. • El sitio activo peptidil transferasa de la subunidad 50S tiene mayor actividad en los ribosomas completos qlle en las subunidades individuales 50S. • La interfase entre las subunidades sos y 30S es muy rica en contactos disociables.

Resumen

El RNA ribosómico abarca ambas subunidades ribosómicas • Cada RNAr tiene muchos dominios distintos que se doblan de manera independiente.

Introducción Un RNAm contiene una serie de codones que interactúan de tal manera con los anticodones de los aminoacii-RNAt que la serie correspondiente de am inoácidos es incorporada a una cadena polipeptídica. El ribosoma proporciona el ambiente necesario para controlar la interacción entre el RNAm y el aminoacil-RNAL al compo:narse como una pequeña fábrica migraloria que viaja a lo largo del molde conduciendo ciclos rápidos de síntesis de enlaces peptídicos. Los aminoacil-RNAt entran y salen de la panícula a una velocidad impresionante mientras depositan am.inoáddos, y cienos facrores de elongación se asocian y disocian cíclicamente de ellos. Junto con sus factores accesorios, el ribosoma proporciona el rango completo de actividades necesarias para Lodos los pasos de la síntesis proteínica. En la se muestran las dimensiones relaLivas de los componentes del mecanismo de la síntesis proteínica. El ribosoma está formado por 152

CAPiTULO 8 Síntesis proteínica

dos subunidades que tienen funciones específicas en la símesis de proteínas. El RNA mensajero está asociado con la subunidad pequeña, de modo que -30 bases de l RNAm están comprometidas en uo momento dado. El RNAm se desliza por la superfide, cerca de la unión de la subunidades. Dos moléculas de RJ'\At presentan actividad en la síntesis proteínica en todo momento, de modo que la elongacióu del polipéptido implica reacciones que suceden (aproximadamente) dos de los 1O codones que abarca el ribosoma. Los dos RNAr se insertan en sitios internos que se extienden por las subunidades. Antes de ser reddada, una tercera molécula de RNAt puede permanecer en el riboc;oma después de haber sido utilizada en la síntesis proteínica. La forma básica del ribosoma se ha conservado durante la evolución, sin embargo, hay variaciones apreciables en el tamaño general y en las proporciones de RNA y de proteínas en los ribosomas de las bacterias, del citoplasma eucariótico y de los organelos. En la se comparan los componen-

..:e los ribosomas bacterianos y de los mamíferos, en ambos casos son partículas ribonucleoproteí-5 que contiene una mayor cantidad de RNA que -:-oteínas. Las proteínas ribosómicas se conocen

!

o proteínas r. Cada una de las subunidades ribosómicas con-:e un RNAr importante y cierta cantidad de eínas pequeñas. La subunidad grande también -:!e tener una o más moléculas pequeñas de ..... En E. coli, la subunidad pequeña (30$) esrá -.ada por RNAr l6S y 21 proteínas r, en tanto en la grande (SOS) se encuentran el RNAr 23$, ~XA pequeño SS y 31 proteínas. Excepto por - .ie la cual hay cua[ro copias por cada ribosoma, nay una copia de cada proteína. Las moléculas res de R..T\l'A constituyen la parte principal de la - .; del ribosoma bacteriano; su presencia es penee y, de hecho. todas o casi rodas las proteínas '~micas contactan al RNAr, de modo que los -:mayores constituyen lo que en ocasiones se dera como la columna vertebral de cada sub-~d. una hebra continua cuya presencia domina ~ estructura y determina las posiciones de las =:nas ribosómicas. :_:~s ribosomas citoplásmicos de las eucariotas ~ores son más grandes que los de las bacterias. ~renido total de RNA y de proteínas es mayor; Dléculas mayores de RNA son más largas (se ':linan RNAr 18$ y 28S) y hay más proteínas. ~vlememe la mayor parte de las proteínas, si _ ..¡oc todas, están presentes en camjdades es•métricas. El RNA sigue siendo el componente '1linante por masa. - s ribosomas de los organelos son distintos de o:.. citosol y asumen diversas formas, de mane...:. en algunos casos son casi del tamaño de los _-:anos y tienen 70% de RNA, mientras que en >ólo son de 60S y tienen ribosomas 70S están en _.ibrio dinámico respecto de las subunidades 50S

.S La iniciación de la síntesis proreí;zica no es una _,_:n de los ribosomas intactos, la asumen las subuni:s independientes, las cuales se reasodan durante 3Cción de la iniciación. En la se resu- =:ciclo de las subunidades ribosómicas durante ~tesis proteínica de las bacterias. :.a iniciación tiene lugar en una secuencia es.Jl localizada en el RN Am denominada sitio e unión con e l ribo soma, que es una secuencia -~de bases que precede a la región codifi cadora -~e la Fig. 8. 1). Las su b unidades grande y peque-: asocian en el sitio de unión con el ribosoma, · !ormar un ribosoma intacLO, medlame tma ren en dos pasos: • El rcconodrniemo del RNAm ocurre cuando se une una subunidad pequeña para formar un complejo de iniciación en el siúo de unión con el ribosoma. • Una subunidad grande se une al complejo para formar un ribosoma completo. -.-.~nque la subunidad 30S está involucrada en :iadón, no es susceptible de asumir por sí mis> reacdoncs que unen el RNA.m con el RNAt, ~ cual se necesitan proteínas adicionales deladas fa ctores de iniciación (IF, initiation "5), los cuales se encuentran sólo en las sub: 1es 305 y se liberan cuando éstas se asocian con unidades 50S para formar los ribosomas 70S.

Este comportamiento djstingue a los factores de iniciación de las proteínas estructurales del ribosoma. Los factores de iniciadón panicipan únicamente en la formación del complejo de iniciadón, no forman parte de los ribosomas 70S y no desempeñan rúnguna función en las etapas de elongación. En la se re~umen las etapas de la iniciación.

.........

Factores de iniciación

J

: Subunldades : 30S con : factores de

--+~

Subunidades separadas

•....

Banco de : rlbosomas • libres :

I'"'' II--------,

.

Á

......

Iniciación

Elongación

Terminación

La iniciación requiere de subunidades ribosómicas libres. Cuando los ribosomas son liberados en la terminación, la subunidad 305 se une a factores de iniciación y se disocia para generar subunidades libres. Cuando las subunidades se reasocian para formar un ribosoma funcional en la iniciación, liberan a tos factores.

1 La subunidad 30S se une al RNAm \f·J \f• 7

2 EIIF·2 acarrea al ANAl al sitio P \f·.?

l,,.;'·' 1/-l!'H..

....,

3 Los lF son liberados y se adhiere la unidad SOS

los factores de iniciación estabilizan a las subunidades 30$ libres y unen al RNAt iniciador con el complejo 305-RNAm.

a... la iniciación en las bacterias requiere de subunidades 30$ y de factores accesorios

15 7

Banco de Subunidades ribosomas 70S libres Equilibrio dinámico

__..,.

.__

l

""',;

La subunidad 30S con eiiF-3 puede unirse al RNAm, a diferencia de la subunidad SOS -.......,~

El IF-3 debe ser liberado antes de que la subunidad SOS pueda unirse

1

~ •• ••

La iniciación requiere de subunidades 305 que portan IF-3. Las bacterias utilizan tres factores de iniciación, denominados IF-1, IF-2 e IF-3, que el RNAm y el RNAt necesitan para entrar al complejo de iniciación: • El IF-3 permite que las subunidadcs 30S se unan específicamente a los sitios de iniciación del RNAm. • El TF-2 se une a un RNAt iniciador especial y controla su entrada al ribosoma. • El IF- 1 se une a las subunidades 30S sólo como pane del complejo de iniciación completo. Se une al sitio A y evita que entre el aminoacil-RNAt. Su localización también puede impedir que la subunidad 30S se una a la subunidad 50S. EllF-3 tiene múltiples funciones; primeramente es necesario para estabilizar a las subunidadcs 30S (libres); después las habilita para que se unan al RN/Vn y, como parte del complejo 30S-RNAm, inspecdona la exaclitud del reconocimiento del primer aminoacilRNAt (véase la sección 8.6, El uso del fMet-RNAtr es controlado por el IF-2 y por el ribosoma). La primera función del IF- 3 es controlar el equilibrio entre Jos estados ribosómicos. como se muestra en la . Este factor de iniciación se une a las subunidades 30S libres que son liberadas del banco de ribosomas 70S; su presencia evita que la subunidad 30S vuelva a asociarse con la subunidad SOS. La reacción entre el IF-3 y la subunidad 30S es esLcquiométrica: una molécula de IF-3 se une a cada subunidad. La cantidad de IF· 3 es relativamente escasa. por lo tanto. su disponibilidad determina eJ número de subunidades 30S libres.

158

CAPÍTULO 8 Síntesis proteínica

El IF-3 se une a la superficie de la subunida 30S cerca del sitio A. Hay una superposición sign1ficativa entre las bases del RNAr L6S protegido pC1· el lf- 3 y las protegidas por la unión de ia subunidad 50S, lo cual sugiere que evita físicamente unión de las subunidades. de modo que el IF-3 s compona como un factor ami-asociativo que hac que una subunidad 30S permanezca en el banco d_ subunidades libres. La segunda función del IF-3 es controlar la capacidad de las subunidades 30S para unirse al RNAn Las subunidades pequeñas deben tener IF-3 par: formar complejos de iniciadón con el RNAm, fact1 · que debe ser liberado del complejo 30S-RNAm par. permitir que se una la subunidad 50S; una vez · · berado, inmediatamente se recicla a l en contrar otr_ subunidad 30S. EllF-2 tiene una actividad GTPasa dependjen:: de ribosomas, pues fomenta la hidrólisis de GTP e· presencia de ribosomas. liberando la energía alm.;· cenada en el enlace de alta energía . E l GTP es hidP !izado cuando se une la subunidad 50S para gener2 un ribosoma completo. La división del GTP podr estar implicada en el cambio de conformación d ribosoma. de modo que las subunidades unidas seatransformadas e n un ribosoma 70S activo.

111

Un RNAt iniciador especial empieza la cadena polipeptidica

Conceptos principales • La síntesis proteínica empieza con una metionina usualmente codificada por el tri plete AUG. • Los diferentes RNAt de metionina están implicados en la iniciación y la elongación. • El RNAt iniciador tiene características estructurales únicas que lo distinguen del resto de los RNAt. El grupo NHl de la metionina unida al RNAt iniciador bacteriano está formilado. La síntesis de todas las proteínas empieza con el xr mo aminoácido, la metionina. La señal para inió: una cadena polipeptídica es un codón de iniciado especial que marca el principio del marco de lectu;dicho codón de inidación suele ser el triple[e Al: : aunque en las bacterias también se utilizan los e dones GUG o UUG. Et codón AUG representa a la metionina, arr noácido que puede ser transportado por dos tiP' de RNAt. uno utilizado para la iniciación y el O!:'" para el reconocimiento de los codones AUG duran· la elongación.

En las bacterias y los organelos eucarióticos, el iniciador transporta una metionina formilada :n su grupo amino y poder formar una molécu := de N-fo rmil-metio n ii-RNAt, conocido como tL'lAtte1 _ El nombre del aminoacii-RNAt generalLente se abrevia como fMet-RNAt,. El RNAt iniciador adquiere a su aminoácid o odificado en una reacción de dos etapas, primero =carga con e l aminoácido para generar Met-RNAr1 posteriormente, la reacción de formilación ilus~da en la bloquea al grupo NH2 libre. -.Jnquc el grupo aminoáddo bloqueado evitará que iniciador participe en la elongación de la cade l no interfiere con la capacidad para iniciar una ·oteína. Este HNAt se miliza sólo para la iniciación, re:wce a los codones AUG o GUG (en ocasiones, a l _.,.J G). Dicho reconocimiento no es tan bueno en 11bos casos, la extensión de la Lniriación dJsm.inuye roximadamente a la mitad cuando el codón AUG remplazado por el GUG y nuevamente a la mirad ..::~ndo se utiliza el codón UUG. La especie responsable del reconocimiento de ~ codones AUG en loca lizaciones internas es el ~..'JAtmMel, el cual responde únicamente a los eones AUG internos. ¿Qué características distinguen al fMet-RNAt 1 ctador del Mer-RNAtm utilizado en la elongadón? ;unos rasgos característicos de la secuencia del _·At son importantes, como se resume en la , pues son necesarias para evitar que el inidador ..J utilizado en la elongación, mientras que otras m1iten su funcionamiento en la iniciación: • La formiladón no es estrictamente necesaria porque el Met·HNAr1 no formilado puede funcionar como iniciador, pero incrementa la el1ciencia con la cual es utilizado porque es una de las características reconocidas por e l TF-2 que se une a l RNAl iniciador. • Las bases que se enfrentan una a otra en la ú ltima posición del ta llo, a las cuales se conecta el aminoáddo, están apareadas e n todos los RNA t. excepto en el HNAt1Me•. Las mutadones que crean un par de bases en esta posición del RNAtte• le permiten actuar en la elongación, de modo que su ausencia es importante para evitar que el RNAtt•• sea utilizado en la elongadón; también es necesario para la reacción de la formilación. • En el RNAtrM•• hay una serie exclusiva de tres pares G-C en el tallo que precede al lazo que contiene al anticodón, los cuales son necesarios para permitir que el fMet-RNAr, se Lnsene directamente en e l sitio P. ~.XAl

El N-formil-metionil-RNAt (fMet-RNAt,) iniciador es generado por la formilación del metionil-RNAt utilizando al formil-tetrahidrofolato como cofactor.

Aminoácido formllado

Sin apareamrento de bases

e G

e

Necesario pata la íonnifación

G

G G

.e;

Gs "CGAG GCÚC

3 pares de bases G-C

El fMet- RNAt, tiene características únicas que lo distinguen como RNAt iniciador. En las bacterias y en las mitOcondrias, el resi duo formüo localizado en la rnetionina in iciadora es eliminado por una enzima desformilasa especifica para generar un grupo NH 2 terminal normaL Si la metionina resulta ser el aminoácido terminal N de la prmdna, este paso será el único necesario. Más o menos en la mitad de las proteínas, la merionina localizada en el extremo es eliminada por una aminopeptidasa, la cual crea una terminación nueva de~ (origina lmente el segundo aminoácido incorporado en la cadena). Cuando ambos pasos son necesarios, son secuendales. Las reacciones de eliminación son bastante rápidas, probablemente cuando la cadena polipeptídica naciente ha alcanzado u na longitud de 15 aminoácidos.

8 ; Un RNAt iniciador especial empieza la cadena polipeptídica

159

El uso del fMet-RNAtF es controlado por el IF-2 y por el ribosoma Concepto principal • EL IF-2 se une al fMet-RNAt1 iniciador y le permite entrar al sitio P parcial de la subunidad 30S.

El significado de los codones AUG y GUG depende de su contexto. Cuando AUG se utiliza para la iníciaci6n. se lee como formil -metionina. pero en la región codificadora represema a la metionina. Por oLra parte. el significado del codón GUG depende aún más de su localización, de modo que cuando se presenta como primer codón, mediame la reacción de iniciación se lee como formil-metionina, pero si está dentro de tm gen, es lefdo por el Val-RNAt, uno de los miembros regulares del conjunto del RNAL, para proporcionar valtna conforme Jo exija el código genético. ¿Cómo se interpreta el con texto de los codones AUG y GUG? En la se Uustra el papel decisivo del ribosoma cuando actúa en conjumo con los factores accesorios.

IF-2

!Mel

' os

Sólo el fMet-RNAt1 entra al sitio P parcial de la subunidad unida al RNAm

1M el

Sólo aa-RNAt entra al sitio A en el ribosoma 70S ~ completo ~

EF-Tu

aa

•'

.

Sólo el fMet-RNAt 1 puede ser utilizado por las

subumdades 30S para la iniciación; los otros aminoacil-RNAt (aa-RNAt) deben ser utilizados para la elongación por los ribosomas 70S.

160

CAPÍTULO 8 Síntesis proteínica

En un complejo de iniciación, sólo La subunidac pequeña está unida al RNA y el codón de iniciaciór se encuemra en la parte de l sitio P que porra 1 Iniciación

Iniciación

1

1

Primera región codlfi~adora

Segunda región cpdificadora

la iniciación ocurre de manera independiente en cada cistrón de un RNAm policistrónico. Cuando la región intercístrónica es más larga que la extensión del ribosoma, la disociación en el sitio de terminación es seguida por otra reiniciación independiente en el siguiente cistrón.

162

CAPÍTULO 8 Síntesis proteínica

Cuando termina l.a síntesis de la primera proteína los ribosomas abandonan el RNAm y se disocian er subunidades, y a continuación, debe ensamblarseun ribosoma n uevo en la siguiente región codificadora para empeza r a traducir el siguiente cistrón. En algunas moléculas de RNAm bacteriano, !4Uete metilado que marca el extremo 5'. Los -:-n,5. y es homólogo a su contraparte eucariótica. ~gua! que su contraparte en la iniciación (IF-2 ). :=F-Tu se asocia con el ribosoma sólo en el proceso =ntrada del arninoacil-RNAt, y una vez en su lu-- abandona al ribosoma para funcionar de nuevo :. otro aminoacil-RNAt, de manera que exhibe ~adón y disociación cíclica del ribosoma, una . ?aerística distintiva de los factores accesorios. ~a ruta de entrada del aminoadl-RNAt al sirio - e ilustra en la . El EF-Tu porta una _; :üna. El factor es una proteína G monoméri:-.Jya actividad es controlada por el estado de la _:;:.ina: • En presencia de GTP, el factor se encuentra en su estado activo. • Cuando el GTP es hidrolizado a GDP, el factor se desactiva.

• La aclividad se restaura cuando el GDP es remplazado por GTP. El complejo binario formado por EF-Tu-GTP se une al aminoacil-RNAt para formar un complejo ternario constituido por aminoacil-RNAt-EF-TuGTP, e l cual se une sólo con el sitio A de Jos ribosomas cuyos sitios P ya están ocupados por un peptidil- RN At. Esra es reacción es crítica para asegurar que el arrunoacil-RNAt y el peptidil-RNAt estén correctamente posicionados para la formación del enlace peptídico. El aminoaci l-RNAr es cargado en el sitio A en dos etapas; primero, el extremo anticodón se une con el sitio A de la subunidad 305, y posteriorme nte, el reconocimiento codón-anticodón desencadena un cambio en la conformación del ribosoma, fenómeno que estabiliza la unión del RNAt y provoca que elEF-Tu hidrolice a su GTP. El extremo CCA del RNAt ahora entra al sitio A de la subunidad 505 y es liberado el complejo binario EF-Tu-GDP. Esta forma de EF-Tu está desactivada y no se une al aminoadlRNAt de forma efectiva. Otro factor, el EF-Ts, media la regeneración de la forma utilizada, EF-Tu-GDP aEF-Tu-GTP. Primero, el EF-Ts desplaza al GDP del Ef-Tu para formar, así, el factor combinado EF-Tu-EF-Ts. que a su vez será desplazado por el GTP. para reconstituir el EF-TuGTP. El complejo binario activo se une al aminoacilRNAt y el EF-Ts liberado puede ser redclado.

8.10 El factor de elongación Tu carga al aminoacil-RNAt en el sitio A

167

Hay -70 000 moléculas de EF-Tu por bacteria (-5% de l total de las proteínas de la bacteria), cifra

que se aproxima al número de moléculas de aminoacil-RNAt. Esto implica que la mayor parte de los aminoacil-RNAr tiendan a presemarse en complejos ternarios. Hay sólo - 1O 000 moléculas de EF-Ts por célula (más o menos el mismo número de ribosomas). La cinética de la interacción entre EF-Tu y EF-Ts sugiere que el complejo EF-Tu-EF-Ts existe sólo transiLoriamente, de manera que el EF-Tu se convierte muy rápidamente en la 'forma unida a GTP y después en un complejo ternario. La función del GTP en el complejo ternario ha sido estudiada sustimyéndolo con un análogo que no pueda ser hidrolizado. Et compuesto GMP-PCP tiene un puente metilénico en vez del oxígeno que se liga a los fosfatos ~ y y del GTP. En presencia de GMP-PCP puede formarse un complejo ternario que une el aminoacil-RNAt con e l ribosoma, pero no puede formarse el enlace pepLídico, de manera que se necesira GTP para que el aminoacil-RNAt se una al sitio A; la hidrólisis no es necesaria hasta después. La kirromicina e s un antibiótico que inhibe la función del EF-Tu. Cuando este último se une a la kirromicina, sigue siendo susceptible de unir e l aminoacil-RNAt con e. pero el complejo EF-TuGDP no puede liberarse del cromosoma. su presencia continua evita la formación del enlace peptídico entre el peptidil-RNAt y el aminoacil-RNAt. de tal forma que el ribosoma se queda "atascado" en el RNAm, frenando la síntesis proteínica . Este efecto de la kirromicina demuestra que la inhibición de uno de los pasos de la síntesis proteínica bloquea el siguiente porque la presencia continua del EF-Tu impide que el extremo am.inoacilo del

Cadena peptfdica, J t!_-6o

~\

·===~HN=~ ~ =

La formación del enlace peptidico se debe a la reacción que ocurre entre el polipéptido del peptídíl-RNAt en el sitio P y el aminoácido del aminoacii-RNAt en el sitio A.

168

CAPÍTULO 8 Síntesis proteínica

aminoacil-RNAt entre al sitio A de la subunidad 50S (véase la Fig. 8 .31), de modo que para que el ribosoma lleve a cabo la formación del enlace peptídico. es necesaria la liberación del complejo EF-Tu-GDP. El mismo principio se observa en otras etapas de la símesis proteínica: una reacción debe terminar de forma adecuada antes de que pueda tener lugar la siguiente. La imeracción con EF- Tu también desempeña una función en el control de calidad. Los aminoacilRNAt son innoducidos en el sitio A sin saber si sus amicodones corresponderán con el codón. La hidió!isis del .EF-Tu-GTP es relalivamente lenta¡ el tiempo que necesita un aminoacil-RNAt para disociarse del sitio A es mayor del necesario, por lo tanto, lamayor parte de las especies incorrectas son eliminadas en esta etapa. La liberación del EF-Tu -GDP después de la hidrólisis también es lema, así que cualquier aminoadl-RNAL incorrecto, sobreviviente, puede disociarse en esta etapa. El principio básico es que las reacciones que involucran a 1 EF- Tu ocurren con la lemirud suficiente como para permitir que los RNAt incorrectos se disocien antes de que queden atrapados en la síntesis proteínica. En las eucariotas, el factor erf es el responsable de acarrear el anunoacil-RNAt al ribosoma, también en una reacción que implica la división de un enlace de aira energía del GTP, que igual que su homólogo procariótico (EF-Tu), es una proteína abundante. Después de la hidrólisis del GTP, la forma activa es regenerada por el factOr eEFl~y. contraparte del EF-Ts.

La cadena polipeptídica se transfiere al ami noacil-RNAt Conceptos principales • La subunidad 50S tiene actividad peptidi l transferasa. • La ca.dena poUpeptídica naciente se transfiere del peptidii-RNAt del sitio P al aminoacil-RNAt del sitio A. • La síntesis de enlaces peptídicos genera RNAt desacilado en el sitio P y peptidil-RNAt en el sitio A.

El ribosoma se mantiene en posición m ientras la cadena polípeptíd.ica se a larga al transferir el polipéprido adherido a l RNAt en el sitio P al aminoacil-RNAt del sitio A. La reacción se ilustra en la . La actividad responsable de la síntesis del enlace peptídico se llama peptidil transferasa. La naturalez.a de la reacción de trans[erencia es revelada por la capacidad del antibiótico puromicina, asemeja a un am inoácido adherido a la adenosina terminal del RNAt. para jnhibir la síntesis proteínica. En la se muestra que dicho antibiótico tiene un N en vez del O que une un

noácido al RNAt. y es tratado por el ribosoma ·o si fuera un aminoacU-RNAt entrante. después = 'cual el polipéptido adherido al peptidil-RNAt .:-ansferido al grupo NHl de la puromicina. La porción de puromicina no está anclada al A del ribosoma, por lo que de éste es überado el lucro poüpeptidil -puromidna. Esta terminadón :natura de la síntesis proteínica es la causa de la ón letal del anlibiótico. la peptidil transferasa es una función de la subiad ribosómica grande (SOS o 60S). La reacdón ; esencadena cuando el EF-Tu libera el exrremo .noacilo de su RNAt, que después se traslada a 5itio cercano al extremo del peptidil-RNJ\t cuya - ·;idad peptidi! transferasa asegura esendalmente ransJerencia rápida de la cadena pepríclica al arniacil-RNAt. El RNAr y las proteínas de la subuni50S son necesarias para dicha actividad, pero la .1Hsis es una propiedad del .RNA ribosómico de la anidad SOS (véase la sección 8.19, El RNAr 23$ -.e actividad peptidil transfcrasa).

aminoacil-RNAt

Aminoácido

Puromicina

La puromicina imita al aminoacil-RNAt porque - -:mejante a un aminoácido aromático ligado a una porción _:¡¡·-base.

liD

La translocación mueve al ribosoma

Concepto!> principales • La translocación ribosómica desplaza al RNAm tres bases a lo largo del ribosoma. • La transloccción lleva al RNAt desac1lado al interior del sitio E y al peptidil-RNAt al interior del sitio P. además de vaciar el sitio A. • El modelo del estado híbrido propone que La translocación ocurre en dos etapas, en las cuales la subunidad 505 se mueve respecto de la subunidad 305, y posteriormente ésta se desplaza a lo largo del RNAm para restaurar la conformación original.

El ciclo de adición de aminoácidos a la cadena polipeptídica creciente culmina con la tran slocación , cuando el ribosoma avanza tres nucleótjdos a lo largo del RNAm. En la se observa que la transJocadón expele al RNAt descargado del sitio P para que pueda emrar el nuevo pepticlil-RNAt, de modo que el ribosoma tiene un sitio A vaáo listO para la entrada del aminoacil-RNAt correspondiente al siguiente codón. Como se muestra en la figura, en las bacterias, el RNAt descargado es transferido del sjrio P al E (del cual es expelido hacia el citOplasma). En las eucariotas se expulsa düectameme al citosoL Los sitios A y P se extienden a ambos lados, hasta abarcar la subunidad grande y la pequeña; el sitio E (en Las bacterias) se locaUza principalmente en la subunidad 50S, pero tiene algunos contactos en la 30S. Casi todas las ideas en torno a la translocación se guían por el modelo de estado híbrido, el cual propone que tiene dos etapas. En la se muestra que primero hay un cambio de la subunidad 50S respecro de la 30S, segu ido de un segundo cambio que tlene lugar cuando la subun idad se mueve a lo largo del RNAm para restaurar la conformación original. La base de este modelo fue la observación de que el patrón de contactos del RNAt con el ribosoma (medidos por la impresión química de las huelJas) cambia en dos etapas. Cuando se agrega puromicina a un ribosoma que tiene un RNAt am1noacilado en el ~itio P, los contactos del Rl"'Al en la subunidad SOS cambian del sitio P al sido E, pero los contactos con la subunidad 30S no cambian, lo cual sugiere que la subunidad 50S se ha despla?ado a un estado de postransferencia. si bien la subunidad 30S no ha cambiado. La interpretación de estos resultados sugiere que los extremos aminoacilo de los RNAt {loca lizados en la subtmidad 50S) se mueven primero a sitios nuevos (mientras que los extremos anti codón permanecen unidos a sus a nticodones en 8.12 La translocación mueve al ribosoma

169

$rlioE

S•ho A SitioP

La subunidad SOS se desplaza respecto de la subunidad 305 Pretranslocación: El peptidii-RNAI se encuentra en el sitio P:

elemlooaoii·ANAI e~l'" al slllor

lf

El ANAl descargado sale a través del sitio E \

.J>.,' :!

\r._ "V\/

!

Postranslocación: El ANAl desacilado se mueve al sitio E; el peptidii-RNAI se desplaza al sitio P

Un ribosoma bacteriano tiene tres sitios de unión con el RNAt. El aminoacil-RNAt entra al sitio A de un ribosoma que tiene peptidil-RNAt en el sitio P. La síntesis del enlace peptídico desacila al RNAt del sitio P y genera peptidilRNAt en el sitio A. La translocación mueve al RNAt desacilado al interior del sitio E y desplaza al peptidil-RNAt al interior del sitio P.

la subunidad 305). En esta etapa, los RNAt están u nidos efectivamente a si ti os híbridos, formados por los silios 505E/30S P y 50SP/305 A. Después, el movimiento se extiende a las subunidades 305. de manera que la región de apareamiento anticodón-codón se encuentra en el sitio correcto. El medio más probable para crear el estado híbrido es el movimiento de una subunidad ribosómica respecto de la otra, de manera que la translocación efectivamente implica dos etapas y la restauración de la estructura normal del ribosoma sucede d u rante la segunda. El ribosoma enfrenta un dilema interesante en la translocación, pues tiene que romper muchos de sus contactos con el RNAt para permitir el movimiento, pero al mismo tiempo debe mantener el 170

CAPÍTULO 8 Sintesis protelnica

aa-ANAl entrante

Los modelos de translocación constan de dos etapas. Primero, en la formación del enlace peptídico, el extremo aminoacilo del RNAt localizado en el sitio Aes reubicado en el P. En la segunda etapa, el extremo anticodón del RNAt se traslada al sitio P.

aparcamiento entre el RNAr y el amicodón (rompiendo el aparearnienro del RNAr desacilado en el momento preciso). Una posibilidad es que el ribosoma cambie entre conformaciones alternas y discre tas. El cambio puede consistir en variaciones en el apareamiento de bases del RNA r. La precisión de la traducción depende de ciertas mutaciones que influyen en el aparcamiento alterno de las bases de las secuencias. La interpretación más probable es que el efecto es mediado por la estrechez de la unión de las conformaciones alternas con el RNAt.

E

Los factores de elongación se unen alternativamente al ribosoma

Conceptos principales • La translocación requiere del EF-G, cuya estructura es semejante a la del complejo aminoacii-RNAt-EF-Tu-GTP. • La unión de EF-Tu y de EF-G al ribosoma es mutuamente exclusiva. • La translocación requiere de la hidrólisis de GTP, la cual desencadena un cambio en la estructura del ribosoma.

_: uanslocaci6n requiere de GTP y de otro factor elongación, denominado EF-G, el cual es uno de .actores constituyentes mayoritarios de la célula, ::-s hay -J copia por ribosoma (20 000 moléculas -célula). Los ribosomas no pueden unirse al EF-Tu y al ---G simultáneamente, de modo que la síntesis .eínica sigue el ciclo ilustrado en la Figura 8.31, -::1 cual los factores se unen al ribosoma y se libede él alternativamente, por lo tanto, el complejo -~--:-u-GDP debe ser liberado antes de que el EF-G -=da unirse; después. el EF-G debe ser liberado .::s de que pueda unirse al complejo aminoacil-\t-EP-Tu-GTP. ¿La capacidad que Liene cada factor de elonga:: para excluir a otro se basa en un efecto alos-co sobre la conformación total del ribosoma o a competcnda directa por sirios de unión su ?uestos? En la se observa una simld extraordinaria entre las estructuras del com- ) t.ernario de aminoacil-RNAt-EF-Tu-GDP y el .:. - -G. La estructura de este último es similar a la -uctu ra global del EF-Tu unido al tallo aceptor aminoácido del aminoadl-RNAt de donde la -.·erura inmediata de que completan el mismo de unión (presumiblemente en las cercanías sitio A). La necesidad de cada factor de ser libeantes de que el otro pueda unirse, garantiza :: los eventos de la síntesis proteínica proceden ':lanera ordenada. Ambos factores de elongación son pmteínas .•oméricas de unión al GTP las que se activan jasa éste, pero están inactivas cuando se unen :::>P. Para la unión al ribosoma se necesita la for: ·aifosfatada para asegurar que cada factor tenga :eso al ribosoma sólo en compañía del GTP que .esita para cumplir con su función. El EF-G se nne al ribosoma para promover la .:ulocación y es liberado después del movimiento 1bosoma. El EF-G aún puede unirse al ribosoma ~· GMP-PCP es sustituido por GTP; por Jo tamo. ·a la unión es necesaria la presencia de guanina, que su hidrólisis no es absolutamente esencial ·:la translocación (si bien la rranslocadón es m u- más lenta sin la hidrólisis del GTP). La hidrólisis üTP es necesaria para liberar al EF-G. ~a necesidad de la liberación del EF-G se desnó por los efectos del ácido fusídico, antibiótico :-:oideo que "atascaN al ribosoma en ese estado .erior a la translocación {véase la ). P)resencia de ácido fusídico ocurre un ciclo de -·locación: el Ef-G se une al ribosoma, el GTP es ·olizado y el ribosoma se mueve tres nudeóridos. embargo, el ácido fusidico estabiliza el complejo soma -EF-G-GDP, de manera que el EF-G y el ? permanecen en el ribosoma en lugar de ser

Aminoacii·RNAt·EF·Tu·GTP

La estructura del complejo ternario aminoacilRNAt-EF-Tu-GTP (izquierda) es semejante a la del EF-G (derecha). La estructura conservada de los dominios del EF-Tu y del EF-G se encuentran en color rojo y verde; el RNAt y el dominio del EF-G semejante a él es púrpura. Imagen cortesía de Poul Nissen, University of Aarhua, Denmark.

Unión del aminoacii·RNAt EF-Tu-GTP· aminoacO·RNAt

Hidrólisis de GTP

Sfntesls del enlace pep!ldlco

Translocactón EF·G/GTP

Hidrólisis de GTP - - - -.... EF·G +GDP

la unión de los factores EF· Tu y EF-G se alterna conforme los ribosomas aceptan nuevos aminoacil-RNAt, forman los enlaces peptídicos y se transfieren a otra posición.

S.l3 Los factores de elongación se unen alternativamente al ribosoma

17 1

liberados, de modo que este úlrimo no puede unirse al aminoadi-RNAt y no se agregan más aminoácidos a la cadena. La translocación es una propiedad intrínseca del ribosoma que requiere de un cambio mayor en la estructura (véase la sección 8.17, Los ribosomas tienen numerosos centros acüvos), sin embargo, es activada por el EF-G aunado a la hidrólisis del GTP, que ocurre ames de la translocación y acelera el movimiento del ribosoma. El mecanismo más probable consiste en que la hidrólisis de GTP provoca un cambio en la estructura del EF-G, eJ cual a su vez (uerza un cambio en la estructura del ribosoma. En la translocación tiene lugar una reorientación del EF-G que, ames de ésta, se encuentra unido mediante las dos subunidades ribosómicas. Lamayor parte de sus contactos con la subunidad 305 depende de una región llamada dominio 4, que se insena en el sitio 1\ y que puede ser responsable de desplazar al RNAt. Después de la translocacion, el dominio 4 estará, por el contrario. orientado hada la subunidad 50S. La contraparte eucariólica del EF-G es la proteína eEf-2, la cual funciona de forma similar a una translocasa dependiente de la hidrólisis de GTP cuya acción también es inhibida por el ácido fusídico. Es posible aislar un complejo estable formado por eEF2 y GTP. en tamo que el complejo puede unirse a los ribosomas con la consiguiente hidrólisis de su GTP. Una reacción única del eEF2 es su susceptibilidad a la toxina diftérica, que utiliza dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD, nicotinamide admine dinucleotide) como cofactor para transferir una porción de ribosil-adenosina difosfato (ADPR. adenosine diphosphare ribosyl) al eEF2. El conjugado ADPR-eEF2 está inactivo en lo síntes.i.s proteínica . El sustra to al que se un e d icho conjugado es un aminoácido inusua l que se produce al mollificar u na histidina; es común al eEF2 de muchas especies. la ribosilación del ADP provoca los efectos leta les de la toxina d iftérica. La reacción es extremadamente efectiva, pues una sola molécula puede modificar suficiemes moléculas de eEF2 como para matar una célula.

La síntesis proteínica termina con tres codones Conceptos principales • los codones UAA (ocre), UAG (ámbar) y UGA terminan la síntesis proteínica. .. En las bacterias se utilizan muy a menudo con frecuencias relativas UAA>UGA>UAG.

172

CAPtTULO 8 Síntesis proteínica

Sólo 61 rrípletes son asignados a aminoácidos, o tros tres so n codones d e terminación (o codc. nes de parada) con los que concluye la sínte• proteínica cuyos nombres informales provienen la historia de su descubrimiento. Eltriplete UAG llamado codón ámbar, el UAA es el codón ocre y secuencia UGA suele denominarse codón ópalo. En un principio, las características de estos t:pletes se demostraron mediante un análisis genétL por el que se distinguieron dos tipos de mutacion.: puntuales: • La mutación puntual que modifica a un e dón de manera que represente a un am noácido difcrenre se denomina mutación o...,ceptos principales

Los puntos de contacto entre los RNAr están localizados en dos dominios de RNAr 16$ y en uno de RNAr 235. Reproducida de Yusupov, M. M. 2001. Science. 292: 883-896. © 2001 AAAS. Imagen cortesía de Harry Noller, University of California, Santa Cruz .

..as interacciones en que está implicado el RNAr son :lave para la función del ribosoma. ~ . ambiente de los sitios de unión al RNAt depende .ampliamente del RNAr.

::1ensaje básico que no debe olvidarse sobre el · ;oma es que se trata de una estructura coopea que depende de cambios en las relaciones en; us sitios activos durante la síntesis proteínica . .hos sitios no son regiones discretas y pequeñas - o los centros activos de las enzimas, son regioextensas cuya construcción y cuyas activida~ueden depender tamo del RNAr como de las .eínas ribosómicas. Las estructuras cristalinas .:1s subunidades individuales y de Jos ribosomas -~rianos proporcionan una buena impresión de : ganización general y subrayan la función del -J. La estructura más reciente, a una resolución ::.5 Á, identifica claramente la ubicación de los -.:y de los sitios funcionales, ele modo que ahora ' Sible dar cuenta de muchas funciones ribosó~ ' en función de su estructura. ..as funciones ribosómicas giran en torno a la in_:a ón con los RNAt. En la se mueStra - _:->soma 70S con las posiciones de los RNAt en -:és sitios de unión, en los sitios A y P están casi z..~los; todos se alinean con sus lazos anticodón .os al RNAm en el surco de la subunjdad 30$ y ~o de cada RNAt se une a la subun.idad SOS. El _eme que rodea a cada RNAt es proporcionado ::palmente por el RNAr. En cada sitio, el RNAr 3 cta al RNAt en partes de la estructura univercote conservadas. s,cmpre ha sido un gran enigma cómo dos -:voluminosos pueden acomodarse uno al lado :ro en codones adyacentes de lectura. la es...ra cristalina muestra un doblez de 45° en el

Los contactos entre las subunidades ribosómicas son principalmente de RNA (en color púrpura}. Los contactos que implican proteínas se identifican con color amarillo. Las dos subunidades se han rotado para alejar una de otra y mostrar las caras en que tienen lugar Los contactos; desde un plano perpendicular a la pantalla, la subunidad 505 ha sido girada 90° en dirección contraria a las manecillas del reloj, en tanto que la 305 ha sido rotada 90° en dirección de Las manecillas del reloj (aquí muestra al contrario de la orientación usual}. Imagen cortesía de Harry Noller, University of California, Santa Cruz.

RN/\m, entre los sitios P y A, que permite que los RNAL embonen, según se ve en la ampliación de la . Los RNAr de los sirios P y A se ubican en un ángulo de 26• respecro de ellos mismos, en sus anticodones. La aproximadón mayor entre las columnas vertebrales del RNAt ocurre en los extremos 3', donde convergen con una separación 5 Á (perpendicular al plano de la pantalla), lo cual permite que la cadena peptídica sea transferida del peptidilRNAt del sitio P al aminoacil-RNAt del sitio A. Para que el EF-Tu hidrolice al GTP y sea liberado del ríbosoma, es necesario que el aminoacilRNAt sea insertado en el sitio A por el EF-Tu y que se aparé e con el codón (véase la sección 8.10, El factor de elongación Tu carga al aminoacil-RNAt en el sitio A). Para empezar. el EF-Tu coloca al aminoacil8.!} Los ribosomas tienen numerosos centros activos

177

El ribosoma 70S está formado por la subunidad 50S (blanco) y la 30S (púrpura), con tres moléculas de RNAt localizadas superficialmente: representadas con color amarillo en el sitio A, azul en el sitio P y verde en el E. Imagen cortesía de Harry Noller, Uníversity of California, Santa Cruz.

Las tres moléculas de RNAt tienen orientaciones distintas en el ribosoma. El RNAm gira entre los sitios P y A para permitir que los aminoacil-RNAt se unan a codones adyacentes. Imagen cortesía de Harry Noller, University of California, Santa Cruz.

RNAt en la subunidad pequeña, donde el anticodón se aparea con el codón. Es necesario que el RNAtse mueva para que penen·e totalmente en el sitio A, ruando su extremo 3' entra al centro peptidil transferasa en la subunidad grande. Hay diferentes modelos que explican cómo ocurre este proceso. Uno de ellos exige que el RNAt completo gire, de manera que el codo de la estructura en forma deL formada por los brazos D y T"PC entre en el ribosoma para que el brazo T"PC se aparée con el Rl'IAr. En otro se requiere que la estructura interna del Rl'iAt cambie y urilice el lazo anticodón como bisagra para que el resto del RNAt rote de una posición en la cual está apilado en el lado 3' del lazo anticodón, a una en que esté apilado en el lado 5' . Después de la rransi118

CAPÍTULO 8 Síntesis proteínica

ción, el EF-Tu hidroliza al GTP para que proceda Ja síntesis proteínica. La rranslocación implica movimientos amplio$ en las posiciones de los R At en el ribosoma. E. extremo amicodón del RNAt se mueve -28 Á de. sitio A al P, y posteriormente otros 20 A del P al E Como resuhado del ángulo de cada RNA respecte del amicodón, el volumen del RNAt avanza distancias mucho más grandes: 40 Á del sitio A al P, y 55 del P al E, lo cual sugiere que la translocación exige: una importante reorganización de la estructura. Durante muchos años se pensó que la translocación podía ocurrir sólo en presencia del facto; EF-G, sin embargo, el antibiótico esparsomidna (que inhibe la actividad de la peptidil Lransferasa) )¡; desencadena. Esto sugiere que la energía necesaria para conducir la translocación de hecho es almacenada en el ribosoma después de que se ha formad o e l enlace peptídico. En general, el EF-G actúa en e. ribosoma para liberar esa energía y permitirle conducir la translocació n, no obstame La esparsomicina p uede tener la misma función. La esparsomicina inhibe la peptidiltransferasa al unirse al peptidil-Rl'\A: al bloquear su interacdón con e l aminoacii-RNAt Probablemente crea una conformadón semejanrt a la conformación postranslocación usual, que as~ vez, favorece el movimiemo del peptidil-RNAL Lr importante es que la translocadón es una propiedac intrínseca del ribosoma. El modelo de estados híbridos sugiere que la translocación puede suceder en dos etapas, con un.: unidad ribosómica desplazándose respecto de la otrc? para dar lugar a un a etapa intermedia en la cua. hay sitios de unión al RNAt híbridos (SOSE /305 P ~ SOSP/305 A) (véase la Fig. 8.29). La comparación de la estructura del ribosoma entre el estado previo y el posterior a la tra nslocación y de la conformación del RNAr 16$ entre las subunídades 30S libres y Jos ribosomas 70S, sugie re que la m.otilidad de la estructura es especia lmente obvia en las regiones dt la cab~za y de la plataforma de la subunidad 305. Una perspectiva interesante del modelo de estados híbridos proviene de que numerosas bases del RNAr implicadas en la asociación de las subunidadcs están cerca de bases involucradas en la interacción con el RNAt, fenómeno que sugiere que los sitim de unión con el RNAt están próximas a la interfa se entre las subunidades e implica que cienos cambios en la interacción entre éstas tengan reladón con e. movimiento del RNAt. Gran pane de la estructura del ribosoma es ocupada por sus centros activos. La perspectiva esquemática de los sitos ribosómicos de la muestra que constituyen unos dos tercios d
J

GGG

Todos los codones tienen significado; 61 representan a aminoácidos y tres inducen la terminación (ALTO) .

Leu.

m

e

'Qj

E

a. J2 e

(/)

o => 'O ·¡¡; ~ Q)

8

6

Lis ,

• Val lle .

XIsn..

• Treo Pro

Ser.

Arg.

Phe•

4

Tir •

Cl>

'ro

eo

• Ala • Gli

ASR·

'O

e:Cl>

Glu .

2

Met . His Cis . Trp.

ll.

2

3 4 5 Número de codones

__ 6

___.

El número de codones para cada aminoacido no estrechamente con la frecuencia de uso en las

se correlaciona proteínas.

tados por más codones. de modo que no parece que el código genético haya sido optimizado respecro del uso de los aminoácidos. Los tres codones (UAA, UAG y UGA) que no represeman a aminoácidos se utilizan específicamente para terminar la símesis proteínica. Uno de los cadones de terminación marca el final de cada gen. ¿El código genético es el mismo en rodos los organismos vivientes? La comparación de las secuencias de DN/\ con las secuencias proteínicas correspondienres revela que se utiliza un conjunto idéntico de asignación

9.2 Los codones relacionados representan a aminoácidos relacio nados

191

de codones en el citoplasma e ue divide en 20 grupos .:ceptores, y cada grupo es su:>ceptible de ídenti-, a su sintetasa panicu.lru·. Los RNAt son identificados por sus sintetasas illame contactos que reconocen a un número _~ -r cido de bases. en general, de una a cinco. 1\or- rnenre se uúlizan tres tipos de características: • Generalmente (pero no siempre). se reconoce cuando menos una base del anticodón. En ocasiones todas las posiciones del anúcodón son importantes. • Con frecuencia se reconoce uno de los tres últimos pares de base~ del tallo aceplbr. Un caso extremo lo representa el Ala-RNAt, identificado sólo por un par de bases único en el tallo aceptar. • La así llamada base discriminadora. que se encuenua enrre el tallo aceptar y el CCA terminaL nunca varía en Jos RNAr ic;oaceptores. ~inguna de estas características consüruye un -~io único para distinguir 20 conjuntos de mo.as de RNAt ni proporciona suficiente especiad. de modo que, aparentemente, el recono--emo de Jos RNAt es idiosincrásico, y cada uno ~ ~ su s reglas. .Xumerosas sintetasas pueden cargar de mane ipecífica una "mini -héliceH formada sólo por el _ J aceptor y el T\¡1 C (equ ivalentes a un brazo .; molécula en Iorma de L) con el aminoácido -ecto. En ciertos RNAt, la especiftcidad depende ..;sivamente del tallo aceptar. pero es obvio que 'ariaciones significativas entre los RNAt y que, 1.gunos casos, la región anticodón es importan_as mutaciones del anticodón pueden afectar el nacimiento por la Phe-RNAt simetasa clase Ir, ~eden estar implicadas muchas características; 11ini-hélices del RNAtv•l y del RNAtM« (de los es sabemos que el amicodón es importante in pueden reaccionar específicamente con sus crasas. Así pues, el reconocimiento depende de una in_.;-dón entre varios puntos de contacro del RNAt, ..:entrados en las extremidades, y unos cuantos .. 1oácidos que constituyen el sirio activo de la .eina. La importancia relativa de las funciones :allo aceptar y del amicodón difiere en cada in .: :dón RNAt-sintetasa.

Las aminoacil-RNAt sintetasas se clasifican en dos grupos Concepto principal • Las aminoacil-RNAt sintetasas se dividen en clase 1 y clase II de acuerdo con su secuencia y sus similitudes estructurales.

A pesar de c;u función común, las sintetasas constiruyen un grupo de proteínas más bien variado. Las subunidades fluctúan entre 40 y 110 k.D, y las enzimas pueden ser monoméric.as. diméricas o tetramé1ícas, y es raro que se pare7can. Obviamente, el siúo activo que reconoce al RNAt comprende una parte bastante pequeña de ln molécula, y es interesrulle comparar los sitios activos de diferentes stmetasas. Las sintetasa~ se han dividido en dos grandes grupos, cada uno l'ot·mado por 1O enzimas, con base en la estructura del dominio que contiene a] sitio se Uu~tra un tipo general de aclivo. En la organización aplicable a ambos grupos. El dominio catalítico incluye a los sitios de unión con el ATP y al aminoácido. y se distingue por ser una región extensa interrumpida por la inserción del dominio que se une a la hélice aceptara de RNAt. lo cual coloca a.l extremo del RNAt cerca del sitio catalítico. Un dominio independiente se une a la región anticodón del RNAt. La~ simetasas mulliméricas rambién poseen un dominio de oligomerización . Las sintetasas clase I poseen un dominio caialítico terminal N que se identifica por dos secuencias cortas de aminoácidos parcialmente conservadas que en ocasiones se denominan "secuencias distintivas''_ El dominio catalítico asume la forma de un rasgo llamado pliegue de unión con el nucleótido (que también se encuentra en otras clases de enzimas que se unen a nucleótictos). Dicho pliegue

Domimo catalltlco: Unión de la Unfón con Formación sitios del ATP y hélíce aceptara antlcodón del del aminoác•do de RNAI del ANAl oligómero Pliegue nuoleóhdo (clase 1) Hélice a o lámina ~ antiparalela (clase 11) o barril ~ Clase 1principalmente monómeros, algunos homodlmeros

Clase 11 principalmente homodlmeros, 2 tetrámeros

Una aminoacii-RNAt sintetasa contiene tres o cuatro regiones con funciones distintas. (Sólo las síntetasas multiméricas poseen un dominio de oligomerización.)

9.1C Las aminoacil-RNAt sintetasas se clasifican en dos grupos

201

Las estructuras cristalinas muestran que las aminoacilRNAt sintetasas de clase I y II se unen a caras opuestas de sus sustratos de RNAt. El RNAt se muestra en color rojo y la proteína en color azul. Imagen cortesía de Di no Moras, Institute of Genetics and Molecular and Cellular Biology.

Se interrumpe er par de bases U1-A72 /

U1~;2 / El tallo aceptar se

' / encuentra en una cavidad profunda de ~ la proteína o. .. •'--El ATP se une cerca del tallo aceptar

-

El lazo anticodón se distorsiona en U35-U36

Gln-RNAt slntetasa

Una RNAt sintetasa de clase I contacta al RNAt en el surco menor del tallo aceptar y en el anticodón.

está formado por cadenas J3 paralelas y hélices a; la secuencia distintiva forma pane del sitio de unión con el ATP. La inserción que hace contacto con la hélice aceptora del RNAt difiere ampliamente entre enzimas de clase l. Los dominios terminal C de las sintetasas clase 1, que incluyen el domino de unión con el amicodón del RNAt, y con cualquier dominio de oligomerización, también difieren bastame uno de otro. Las enzimas clase Il comparten en sus dominios catalíticos tres similitudes de secuencia bastante generales. El sitio activo contiene una gran lámina p 202

CAPÍTULO 9 Utilización del código genético

anúparalela rodeada de hélices a. También en t: caso, el dominio de unión con la hélice aceptora interrumpe el dominio catalítico tiene una estruc ra que depende de la enzima individuaL El dom de unión con el anticodón tiende a ser termina~ La localización de los dominios de oligomerizaC' es muy variable. El hecho de que aparentemente no haya Lrelación entre los dos grupos de sintetasas es enigma, quizás evolucionaron de manera indepc diente, incluso parece posible que existiera una ; ma de vida ancestral con proteínas formadas s por los lO aminoácidos codificados por uno u 1 tipo de sinterasas. Un modelo general de la unión de las RNAt s. retasas sugiere que la proteína se acopla al RNAt el "lado" de la molécula con forma deL, y el mis:principio general se aplica a todas las uniones de • RNAL sintetasas: la adhesión al RNAt tiene lugar :: bre wdo en sus dos extremidades, y la mayor pade la secuencia del RNAt no participa en el rececimiento por medio de una sintetasa. Sin embar _ la naturaleza detallada de la interacción difiere tre las enzimas clase i y clase JI, como se obse:en los modelos de la , que se basan estructuras cristalinas. Ambos tipos de enzima~ aproximan. al RNAL por lados opuestos, lo cual h;; que los modelos RNAt-protefna luzcan casi coimágenes en espejo. Una enzima clase I (Gln-RNAt sintetasa) abo: ellado del lazo D del RNAt, reconoce el surco mer: del tallo aceptor localizado en un extremo del si: de unión e interactúa con el lazo anticodón del m extremo. La es un diagrama de la esrru.:.tura cristalina del complejo RNAt
zción de Jos efectos de la proteína S J 2 y de la

rptomicina en la estructura del RNAr explica el ~:portamiento de mutantes diferentes de la S12, . _nos de Jos cuales incluso hacen aJ ribosoma de..:;'iente de la estreptomicina para realizar la tra · ....ctón correcta. ?or la estructura cristalina del ribosoma ahora . .:-mos que el RNAr 16S se encuentra en posición - -~ formar contactos con el aminoacU-RNAt. Dos .....--s del RNAr 16S pueden hacer contacto con el :o menor de la hélice formada por el aparea eme entre el anticodón del RNAt y las dos pri· .-a proteínas localizadas de forma postraduccional son liberadas en el citosol después de ser sintetizadas en los ribosomas libres. Algunas tienen señales de asignación a organelos como el núcleo o como las mitocondrias. Las proteínas así localizadas se asocian con la membrana del ER durante la síntesis, de modo que sus ribosomas están "unidos a la membrana". las proteínas pasan al interior del retículo endoplásmico a un lado del aparato de Golgi y después a través de la membrana plasmática, a menos que posean señales para ser retenidas en alguna de las etapas de la ruta. Incluso pueden ser dirigidas a otros organelos, como los endosomas o los lisosomas.

• Las proteínas atraviesan las membranas por estructuras proteínicas especializadas insertadas en la membrana. Los sustratos proteínicos interactúan directamente con el sistema de transporte del ER, las mitocondrias o los cloroplastos, pero requieren de proteínas acarreadoras para interactuar con los peroxisomas. • Para el transporte dentro del núcleo es necesario un mecanismo mucho más grande y complejo.

220

CAPÍTULO 10 Localización de las proteínas

receso de inserción de una proteína en la memtravés de ella se denomina t ranslo d ón proteínica. El mismo dilema debe resolverse a cada situación en la que una proteína atraviesa .a membrana. La superficie de la proteína es hi:mca, pero la membrana es hidrófoba, y como ~5ua y el aceite, ambos componentes preferirían :nezclarsc, de modo que la solución es crear una -uctura especial en la membrana para que pase ~otcína. Hay tres tipos diferentes de distribución ·a dichas estructuras. El retículo endoplásmico, las mirocondrias y doroplastos contienen estructuras proteínicas :tlstadas en sus membranas que permiten que ~rotdnas pasen a través de ellas sin entrar en -~:acto con los llpidos hidrófobos circundantes. En se muestra que un sustrato proteínico ::te directamente a la estructura, es transportado · eUa al otro lado y posteriormente, liberado. ....os peroxisomas también cuentan con dichas :Jcturas en sus membranas, pero los sustratos - •roteínas no se unen directamente a ellas. En se observa que más bien se unen a ·eínas transportadoras localizadas en el cirosol, :uales son acarreadas por el canal al interior del •~isoma y, posteriormente. el sustrato proteíni-:. liberado. ?ara el transporte hacia el interior del núcleo -:iliza una estructura mucho más grao de y más ¡>leja, el poro nuclear. En la se mues:me aunque dicho poro proporciona el ambiente -permite que un sustrato entre (o salga) del núde hecho no proporciona un sistema que se - a los sustratos proteínicos y los desplace. Este .,;anismo incluye proteínas transportadoras que <en a los sustratos y los transportan a través del • hacia el otro lado. ~'1a o el paso a

La translocación de las proteínas puede ser después de la traducción o durante ella 1

1 Protefna Las proteínas entran al ER o a una mitocondria al unirse a un traslocón que las transporta a través de la membrana.

1 Acarreador

.!;.,eptos principales

_:.s proteínas que son importadas al interior de los : ·ganelos citoplásmicos se sintetizan en los ribosomas ·:~res del cito sol. 2s proteínas que son importadas al interior del :'stema ER-Golgi se sintetizan en los ribosomas que ;;.srán asociados al ER. _35 proteínas se asocian con las membranas por medio :: secuencias de aminoácidos especificas denominadas ::cuencias de señal. .2s secuencias de señal con mayor frecuencia son deres localizados en la terminal N. ..as secuencias de señal terminal N usualmente son ;.;paradas de la proteína durante el proceso de inserción.

10

j

Las proteínas son transportadas al interior de los peroxisomas por una proteína acarreadora que se une a ellas en el citosol, pasa con ellas a través del canal de La membrana y las libera en el otro lado.

Hay dos maneras de que una proteína haga su contactO inicial con una membrana : • La proteína naciente puede asociarse con el mecanismo de rranslocación mientras sigue siendo sintetizada en el ribosoma, proceso conocido como t rans locació n co traducciona l.

La translocación de las proteínas puede ser después de la traducción o durante ella

221

La localización de un ribosoma depende de que la proteína que está siendo sintetizada esté asociada de manera cotraduccional con una membrana: • Las proteínas que entran al retículo endoplásmico (ER, endoplasmicreticulum) utilizan translocación corraduccional. La consecuencia de esta asociación es que el ribo soma está en la superficie del ER. Los ribosomas se asocian con las membranas del ER durante la síntesis de estas proteínas, por lo tanto, se encuentran en fracciones de membrana de la célula, por lo que suelen decirse de ellos que están "unidos a la membrana". • El resto de los ribosomas están en el cito-

t Proteína

sol,

Acarreador

t Las proteínas entran al núcleo al atravesar poros nucleares bastante amplios. El mecanismo de transporte es distinto del poro e incluye com ponentes que transportan a la proteína a través del poro.

Organelo

Señal de Tipo localización

Longitud de la señal

Mitocondria Cloroplasto Núcleo Peroxisoma

Terminal N Terminal N Interna Terminal C

12-30 >25 4-9

Hélice antipática Cargada Básica o bipartita Péptido corto

3-4

Las proteínas sintetizadas en los ribosomas libres del citosol son dirigidas después de su liberación a destinos específicos por medio de elementos de señal cortos.

• La proteína puede ser liberada de un ribosoma una vez terminada la traducción. Posteriormente, la proteína completa se difunde a la membrana apropiada y se asocia con el mecanismo de translocación. A esto se le denomina translocación postraduccional . 222

CAPÍTULO 10 Localización de las proteínas

y

como no esrán asociados con ningún

organelo y se fraccionan separadamente de las membran as, en ocasiones se les denomina "ribosomas libres", los cuales sintetizan a todas las proteínas, excepto las sometidas a tran.slocación cotraducciona l. Las proteínas son liberadas en el citosol mientras se completa su síntesis. Algunas de estas proteínas permanecen libres en el citosol en fmma casi soluble, mientras que otras se asocian con estructuras macromoleculares citosólicas, como filamentos, microtúbulos, centríolos, etc., son transportadas al núcleo o se asocian con organelos unidos a membranas por translocación postraduccional. Para asociarse con una membrana (o con cualquier otro tipo de estructura), una proteína requiere de una señal apropiada, habitualmente un fragmento de secuencia que hace que ésta sea reconodda por un sistema de translocación (o sea ensamblada en una esu·uctura macromolecular). En la se resumen algunas señales uti1izadas por las proteínas liberadas de los ríbosomas citosólicos.la importación al interior del núcleo resulta de la presencia de una variedad de secuen cias más bien cortas en el interior de las proteínas. Estas "señales de localización nuclear" les penni ten pasar a través de los poros nucleares. Un tipo de seña l que determina el transporte al perox.isoma es una secuencia terminal C muy corta. Las proteínas mitOcondriales y de los doroplastos se sintetizan en los ribosomas "libres"; después de su liberación en el dtosol, se asocian con las membranas de los organelos por medio de secuencias terminales N de -25 aminoácidos de longitud reconocidas por receptores localizados en la envoltura del organelo . Las proteú1as que residen dentro del sistema retículoendotelial entran al ER mientras están siendo sintetizadas. El principio de la translocadón cotra duccional se resume en la . Una característica importante de este sistema es que la proteína naciente es responsable del reconocimiemo del me-

''"~ismo

de translocación, para lo cual se necesita -'! la señal para la translocación corraduccional for· - pane de laptoteína que se sintetiza primero y, de ..:bo, usualmente se loc:aliza en el extremo N. Las proteínas que utilizan secuencias terminales · · para ser transportadas de forma cotraduccional :=Ro postraduccional a las mitocondrias o los do"TTlastos tienen una característica común. La se-r:-nda terminal N incluye un líder que no forma .!rte de la proteína madura. La proteína que porta ;:-ste líder se denominada prepr oteí na y es un ~ecursor transitorio de la proteína madura. El líder - separado de la proteína durante la translocación -lteinica.

CITOSOL

/

Las proteinas pueden entrar a la ruta ER-Golgi sólo asociándose con el retículo endoplásmico mientras están siendo sintetizadas.

Los ch aperones pueden ser necesarios para el plegamiento de las proteínas 1

Parche hidrófobo

:onceptos principales Se uice que las proteínas que pueden adquirir su cwnformación de manera espontánea se auto· ensamblan. • Con frecuencia, las proteínas pueden ensamblarse en estructuras alternas. Un chaperón dirige a una proteína a una ruta particular al excluir rutas alternativas. Los chaperones evitan la formación de estructuras incorrectas al interactuar con proteínas no plegadas para impedir que se plieguen de manera incorrecta.

·...gunas proteínas son susceptibles de adquirir su _· nformación madura de forma espontánea, y una -11nera de probarlo consiste en desnaturalizada y : '1 determinar si se renaturaliza en la forma actic:. Esta capacidad se denomina autoensamblaje. -'1S proteínas con esta capacidad pueden plegarse o :plegarse en el estado activo a partir de otras con:maciones, incluido el estado en que inicialmente ~ sintetizó, lo cual implica que las interacciones in~ :-nas se dirijan intrínsecamente a la conformación rrecta. El caso clásico es el de la ribónucleasa; en .: Jécada de 1970 se demostró que, cuando la enzia es desnaturalizada, puede renaturalizarse in vitro n la conformación correcta. Más recientememe el ~ >ceso del plegamiento intrfuseco ha sido descrito . detalle para algunas proteí.nas pequeñas. Cuando no tiene lugar el p legamiento correcto iu elen ocurrir conjuntos alternos de interacciones, .a proteína puede quedar atrapada en una canforación estable que no es la forma final pretendida, _ cuyo caso no puede autoensamblarse, y para ad.:irir la estructura apropiada requiere de la asistena de un chaperón.

\ .t'

Las regiones hidrófobas de las proteínas in· teractúan intrínsecamente, y a menos que se les impida, se agregarán entre sí cuando una proteína sea sintetizada (o desnaturalizada).

El plegamiento de las proteínas se debe a interacciones entre superficies reactivas que, en generaL están formadas por cadenas laterales hidrófobas expuestas cuyas interacciones forman un centro hidrófobo. La reactividad intrínseca de estas superficies significa que las interacciones podrían ser incorrectas, a menos que el proceso sea controlado. En la se ilustra este caurbuja dentro de la polimerasa de RNA se muestra en la imagen ampli. Conforme la polimerasa ficada de la de RNA se desplaza a lo largo del molde de DNA,

11.2 lq transcripción ocurre por medio de apareamiento de bases en una ''burbuja" de DNA no apareado

259

últimos 25 ribonucleótidos agregados a una cader: creciente se encuentran formando un complejo co el DNA o con la enzima en un momento dado.

1111

La reacción de La transcripciór

consiste en t res etapas Conceptos principales • La polimerasa de RNA inicia la transcripción después d;, unirse a un sitio promotor en el DNA. • Durante la elongación la burbuja de transcripción se desplaza a lo largo del DNA y la cadena de RNA se extiende en dirección 5'-3'. • Cuando la transcripción se detiene, el dúplex de DNA se vuelve a formar y la polimerasa de RNA se disocia e.un sitio de terminación.

La transcripción tiene lugar en una burbuja, en la cual se sintetiza RNA por medio de apareamiento de bases con una cadena de DNA en la región desenrollada de manera transitoria. Conforme progresa la burbuja, el DNA dúplex se reconstituye detrás de ella, desplazando al RNA en forma de una cadena polinucleotídica individual.

Movimiento de la enzima Punto de enrollamien~na codihcadora de DNA Punto de desenrollamiento

Durante la transcripción, la burbuja se mantiene dentro de la polimerasa de RNA bacteriana, la cual desenrolla y enrolla al DNA y sintetiza RNA.

desenrolla al DNA dúplex frente a la burbuja (en el punto de desenrollamiento) y enrolla al DNA por detrás (en el punto de rebobinado). La longitud de la burbuja de transcripción es de -12 a 14 bp, pero la longitud de la región del híbrido de RNA-DNA dentro de ella es más cona. Hay un cambio importante en la topología del DNA que se extiende cerca de una vuelta. pero no es evidente qué porción de esta región está de hecho pareada con el RNA en un momento dado. Sin duda el híbrido de RNA·DNA es cono y es transitorio. Conforme se desplaza la enzima, se reconstituye el DNA dúplex y el RNA es desplazado como una cadena polinucleotídica libre. Aproximadamente los 260

CAPÍTULO 11 Transcripción

La reacción de la transcripción puede dividirse t"' las etapas que se ilustran en la , en ,cuales se crea una burbuja, comienza la síntesis RNA, la burbuja se desplaza a lo largo del DNA por último la burbuja es terminada: • El reconocimiento del molde comienza con unión de la polimerasa de RNA a un pr motor localizado en el DNA de doble c.: dena para formar un "complejo cerradt> Después las cadenas de DNA se separa para formar el "complejo abierto" que de: la cadena molde disponible para realizar ~ aparcamiento de bases con Jos ribonucleó< dos. La burbuja de transcripción se crea p un desenrolla miento local que comienza t"el sitio en el que se une la polimerasa G RNA. • La iniciación describe la síntesis de los pr meros en la ces de nucleótidos en el RNA. t· enzima permanece en el promotor miertras sintetiza los primeros nueve enlacr de nucleótidos, aproximadamente. La fa de iniciación se prolonga por los episodi abortivos que tienen lugar, en los cuales enzima forma transcritos cortos, los libe y después reinicia la síntesis de RNA. ~ fase de iniciación termina cuando la enzi.rr logra extender la cadena y libera al pr motor. La secuencia de DNA necesaria pa que la polimerasa de RNA se una al moldr

logre la reacción de iniciación se denomina pr motor. Es probable que la iniciación abo tiva comprenda la síntesis de una cade:de RNA que abarque la tOtalidad del sif' activo. Si se libera al RNA, la iniciación ~ cancelada y debe iniciar de nuevo. La ir dación se logra siempre y cuando la enzirr. se desplace a lo largo del molde para lle\·¿

la siguiente región del DNA al interior del sitio activo. • Durante la elongació n la enzima se desplaza a lo largo del DNA y extiende la cadena creciente de RNA. A medida que la enzima se desplaza, desenrolla la hélice de DNA para exponer un segmento nuevo del molde en una condición de hélice individual. Los nucleótidos son agregados de forma covalente al extremo 3' de la cadena creciente de RNA, lo que forma un híbrido de RNA-DNA en la región desenrollada. Atrás de la región desenrollada, la cadena de DNA que funciona como molde se aparea con su pareja original para volver a formar la doble hélice. El RNA emerge como una cadena indiv idual libre. La elongación comprende el movimiento de la burbuja de transcripción por una interrupción de la estructura del DNA, en la cual la cadena molde de la regi6n desenrollada de manera Lransitoria se aparea con el RNA nacimte en el punto de crecimiento. • La terminación implica el reconocimiento del punto en el cual no deben agregarse más bases a la cadena. Para terminar la transcripción, la formación de enlaces fosfodiéster debe cesar y el complejo de transcripción debe separarse. Cuando se agrega la última base a la cadena de RNA, la burbuja de transcripción se colapsa a medida que el híbrido de RNA-DNA se disocia, el DNA adquiere de nuevo su estado dúplex y la en zima y el RNA son liberados. La secuencia de

Reconocimiento del molde: La pollmerasa de ANA se une al DNA dúplex

la transcripción sucede en cuatro etapas: la enzima se une al promotor y desnaturaliza al ONA, permanece estacionaria durante la iniciación, se desplaza a lo largo del molde durante la elongación y se disocia en la terminación.

DNA necesaria para estas reacetones se denomina terminador. la elongación tradicionalmente se aprecia como proceso monótono, en el cual la enzima se des.ua hacia adelante un par de bases a lo largo del -A por cada nucleótido agregado a la cadena de ·.-\. En ciertas circunstancias ocurren cambios en ·~ pa trón, sobre rodo cuando la pol imerasa de • -A hace una pausa. Un tipo de patrón consiste en e el "extremo frontal " de la enzima permanezca -acionario mientras el "extremo posterior" coníe moviéndose, comprimiendo así la impresión a huella en el DNA. Después del movimiento largo de numerosos pares de bases, el "extreiromal" es liberado, con lo que se restaura una resión de huella de longitud total. Esto da pie ~odelo de transcripción de la "oruga geómetra" geometrino"), en el cual la enzima avanza de .:nera interrumpida, comprimiendo y liberando :nanera alternada la impresión de huella del :\. Sin embargo, puede ser que estos episodios .:riban una situación aberrante en vez de la transción normal.

1111

La poli merasa de RNA del fago T7 es un sistema de modelos útil

Conceptos principales • Las polimerasas de RNA de los fagos T3 y T7 son polipéptidos individuales con actividades mínimas en et reconocimiento de un pequeño número de promotores de fagos. • Las estructuras cristalinas de la polimerasa de RNA T7 con ONA identifican la región de unión al ONA y el sitio activo.

La existencia de polimerasas de RNA muy pequeñas, que constan de cadenas polipepúdicas individuales codificadas por cienos fagos, ofrece una idea del mecanismo "mínimo" necesario para la transcripción. Estas polimerasas de RNA reconocen sólo unos cuantos promotores en el DNA de los fagos, y no tienen la capacidad de cambiar el conj unto de promotores a los cuales responden. Proporcionan

t l 4 la polimerasa de RNAdel fago T7 es un sistema de modelos útil

261

La lámina de especifícidad 13 se une en un surco amplio

Movimiento de la enzima ----+

la polimerasa de RNA T7 tiene un lazo de especificidad que se une a !.as posiciones del promotor que se encuentran entre -7 y -11, mientras las posiciones -1 a -4 entran al sitio activo.

La poHmerasa de RN A T7 reconoce su secuenct: diana en el DNA uniéndose a bases en el surco mz. yor en una posición que se ubica en flujo ascende1 · te desde el punto de inicio, como se muesLra en . La enzima utiliza un lazo de espedflddr que se forma por un listón ~· Esta característica e-única de la polimerasa de RNA (no se observa e: las polimerasas de DNA). La ca¡.acn:ristiEa..~omú~ de todas las polimerasas de RNA es que la enzirm reconoce bases específicas del DNA en el flujo a5cendente de la secuencia que es transcrita. Ct1ando comienza la transcripción, la conformación de la enzima permanece esencialmen• igual mientras se agregan numerosos nucleótidos la cadena molde transcrita es "rriturada" en el siti activo. El siúo activo puede contener un transcrit de seis a nueve nucleótidos. La transición de la iniciación a la elongación se define como el punro erel cual la enzima comienza a despla1.arse a lo larg . del DNA. Esto ocurre cuando el transcrito naciemo: rebasa el sil io activo e interactúa con el lazo de especificidad. El RNA emerge a la superfide de la enzim.cuando se han sintetizado de 12 a 14 nudeótido~ Estas características son similares a aqueUas exhib-das por la polimerasa de RNA bacteriana.

1111

La estructu ra cristalina sugiere un modelo de desplazamiento enzimático

Conceptos principales Las subunidades ~ (en color azuloso) y W(en color rosa) de la polimerasa de RNA tienen un canal para el molde de DNA. la síntesis de un transcrito de RNA (en color cobre) acaba de iniciar; ta cadena molde (en color rojo) y la cadena codificadora (en color amarillo) de DNA son separadas en una burbuja de transcripción. Fotografía cortesía de Seth Darst, Rockefeller University.

sistemas de modelos simples para caracterizar la unión de la polimerasa de RNA al DNA y la reacción de iniciación. Las polimerasas de RNA codificadas por los fagos relacionados T3 y T7 son cadenas poüpepúdicas individuales de< l 00 kD cada una. Sintetizan RNA a una velocidad de -200 nucleóúdos/s a 37°(, mayor que la de la polimcrasa de RNA bacLeriana. la polimerasa de RNA del fago T7 es homóloga a las polimerasas de DNA y tiene una estructura similar, en la cual el DNA yace en una "palma" rodeada de "dedos" y de un "pulgar" (véase la Figura 18.7). Ahora se tiene una vista directa del sitio activo a partir de la estruclura cristalina de una polimerasa de RNA del fago T7 realizando la transcripción. 262

CAPÍTULO 11 Transcripción

• Et DNA se desplaza por un surco de la polimerasa de RNA de las levaduras que forma una vuelta pronunciada en el sitio activo. • Un puente proteínico cambia la conformación para controlar la entrada de los nucleótidos al sitio activo. A11ora se tiene bastante información sobre la estructura y la función de la polimerasa de RNA, como eresultado de las estructuras cristalinas de las em:i.ma: de las bacterias y de las levaduras . Las dimension~ totales de la polimerasa de RNA bacteriana son -9( x 95 x 160 Á; la polimerasa de RNA eucariótica e.: más grande pero menos alargada. El análisis estructural muestra que companen un tipo de estructuré común, en el cual hay u n "canal" o surco en la superficie de - 25 Á de ancho que podría ser la ruta de. DNA. En la se muestra un ejemplo de este canal en la polimerasa de RNA bacteriana. u longitu d del surco podría contener 16 bp en la en7lma bacteriana y -25 bp en la enzima eucariótka pero este represenra sólo una parte de la longüut total del DNA unido durante la transcripción. L; superficie de la enzima tiene cargas negativas en su

•r parte, pero el surco está revestido con cargas :Jvas, lo que le permite interactuar con los gru osfato del DNA cargados negativamente. :.a enzima de las levaduras es una estructura :'1sa con 12 subunidades (véase la sección 24.2, olimerasas de RNA eucarióticas están formadas :1umerosas subunidades). Se han localizado lO .:n idades de la polim erasa ele RNA Tl de las le Jras en la estructura cristalina, como se muestra 3 . El sitio cata lítico se forma por una didura entre las dos subunidades grandes (#l ~2), la cual sujeta al DNA en flujo descendente un par de "mandíbulas" a medida que entra - polimerasa de RNA. Las subunidades cuatro y :e están ausentes en esta estructura; forman un .complejo que se disocia de la enzima completa. - lo general, la estructura es similar a la de la ·irnerasa de RNA bacteriana. Esto p uede obser:se con mayor claridad en la escrucw ra cristalina - .a . la polimerasa de RNA rodea al _ ·A, como se observa en la . En el si activo se encuentra un ion catalítico de Mg2 •. El ;A es pinzado en posición en el sitio activo por las ~unidades 1, 2 y 6. La muestra que :>NA es for1.ado a dar una vuelta en la entrada al ..o debido a la presencia de una pared adyacente : protefna. La longitud del híbrido de RNA está -1itada por otra obstrucdón proteínica, denomi na - timón (o guía). Es probable que los nucleótidos ""'tren al sitio activo desde abajo, por los poros que ·aviesan la estructura. La imagen ampliada del sitio activo en la muestra que la burbuja de transcripción inclu~ nueve pares de bases del híbrido de RNA·D~A. =~donde el DKA da la vuelta, las bases que se en..lentran en flujo descendente giran hacia afuera de ~ hélice de DNA. A medida que la enzima se despla:, a lo largo del DNA, la base que se encuentra en la :adena molde al inicio de la vuelta será girada para "'ue ap ume al sitio de entrada de los nucleótidos. ~1 ex tremo 5' del RNA es forzado a abandonar al :>SA cuando choca con el timón de proteína (véase .3 Figura 11.12). Una vez que el DNA ha sido desnawralizado, .as cadenas individuales adquieren una estructura .exible en la burbuja de transcripción. Esto permite JI DNA dar la vuelta en el sitio activo . No obstante, .;mes de que comience la transcripción. el DNA de joble cadena es una estructura recta relativam~nte :igida. ¿Cómo entra esta estructura a la ~etasa ;in ser bloqueada por la pared? La respuesta es que Jebe ocurrir un gran cambio de conformación en .a enzima. Adyacente a la pared hay una pinza. ~la forma libre de la polimerasa de RNA. esta pinza 5e balancea para alejarse de la pared y permitir que -:!l DNA siga una ruta direcra a través de la enzima .

9 2

12.

-.o '~

11

8

\1.

/

Mandfbula

(/

Sitio activo

6

A partir de la estructura cristalina de la polimerasa de RNA se ubican 10 subunidades. Los colores de las subunidades son los mismos que los de las estructuras cristalinas de las figuras siguientes.

La vista desde arriba de la estructura cristalina de la polimerasa II de RNA de las levaduras muestra que el DNA es sujetado en sentido descendente por un par de mandíbulas y es oinzado en la oosición adecuada en el sitio activo, el cual contiene un 10n de Mg-. Fotografía cortesía de Roger Kornberg, Stanford University School of Medicine.

la vista desde el extremo de la estructura cristalina de la polimerasa II de RNA de las levaduras muestra que el DNA es rodeado por proteína en un área de -270°. Fotografía cortesía de Roger Kornberg, Stanford University School of Medicine.

ll.S La estructura cristalina sugiere un modelo de desplazamiento enzimático

263

La polimerasa comacta al ácido nucleico Molde

EIDNA entra alas mandíbulas

~~"!!"'!'~!fll:r~ron

Se agrega una base nueva y 'Se rompen los enlaces

Nucleótidos

El DNA es forzado a dar una vuelta en el sitio activo por una pared de proteína. los nucleótidos pueden entrar al sitio activo a través de un poro localizado en la proteína.

La burbuJa de

La vista amplificada del sitio activo muestra la vuelta pronunciada que se encuentra en el camino del ONA.

Después de que el DNA ha sido desnaturalizado para crear la burbuja de transcripción, la pinza debe balancearse y regresar a su posición contra la pared. Uno de los clilemas de cualquier polimerasa de ácido nucleico es que la enzima debe formar contactos estrechos con el sustrato de ácido nucleico y con el producto, pero debe romper estos contacros y rehacerlos en cada ciclo de adición de n ud eótidos. Considérese la situación que se ilustra en la . Una polimerasa hace una serie de contactos específicos con las bases, en posiciones particulares. Por ejemplo, el contacro "1" se hace con la base que se encuentra en el extremo de la cadena creciente y el contacto "2" se hace con la base que se encuentra en la cadena molde que es complementaria a la siguiente base que será agregada. Obsérvese. sin embargo. que las bases que ocupan estas ubicaciones en las cadenas de ácido nucleico cambian cada vez que se agrega un nucleótido. 264

CAPÍTULO 11 Transcripción

La enzima s e desplaza y reconstituye los enlaces

El movimiento de una polimerasa de ácid o ~ __ cleico requiere el rompimiento y la reconstitución de e n la c~ de ácidos nucleicos en posiciones fijas en relación con la ~ tructura de la enzima. Los nucleótidos que se encuentran ;;r estas posiciones cambian cada vez que la enzima se mueve L-' base a lo largo del molde.

Los segmentos superio r e inferior de la figu ;-· muestran la misma situación: una base está por s~... agregada a la cadena creci.en te. La diferencia es q¡· ~ esta cadena creció una base en el segmento infe· rior de la figura. La geometría de ambos complej• es exactamente la misma, pero los contactos "l" "2" en el segmento inferior se hacen con bases elas cadenas de ácido nucleico que se localizan ur.;; posición más lejos a lo largo de la cadena. El sesmento del centro muestra que esto debe significa· que, después de que la base es agregada (y antes d que la enzima se mueva en relación con el ácid nucleico), los contactos establecidos con posicioné" específicas deben romperse para que p uedan reh.=cerse con las bases que ocupan dichas posiciont después del desplazamiento. La estructura de la polimerasa de RNA sugiere una idea de cómo la enzima mantiene comac; con su sustrato mientras rompe y restaura enlac~ Una estructura ubicada en la proteína denominaa · puente es adyacente al sitio activo (véase la Figurz 11 .12). Esta característica se observa en las enzima de las bacterias y deJas levaduras, pero tiene forma diferentes en las estructuras cristalinas distintas. E-

está doblada y en la otra es recta. La sugiere que el cambio de conformación de la :"..lctura del puente se relaciona de manera cerca- .:on la rranslocación de la enzima a lo largo deJ l nudeico. Al inicio del ciclo de translocación, el pueme e una conformación vertical y se encuentra ad~tnre al snio de enrrada de los nucleótidos. Esto -nite que el siguiente nucleótido se una en el sile entrada de los nucleótidos. El puente está en :acto con el nucleótido que acaba de agregarse. "'lUés la proteína se desplaza un par de bases a lo =- del sustrato. El puente cambia su conformación dobla para mantener comacto con el nucleótido en agregado. En esta conformación. el puente .:Jea el sitio de entrada de los nudeótidos. Para .=.:zar el ciclo. el puente regresa a su conformación - ral c.:on Jo que permite de nuevo el accrso al sitio "1trada de los nucleótidos . El puente actúa com o :inquete que libera a las cadenas de DNA y de para la translocación al tiempo que se sujeta al :'IDO de la cadena creciente. .J

La poli merasa de RNA bacteriana está form ada por múltiples subunidades

Puente proteína

ANA Sito de entrada de los nu aminoácidos separados por tres a cuatro >iciones se encuentran en la misma cara de una ~lice o. y, por lo tanto, están en una posición en o que pueden establecer contacto con los pares de ,;ses adyacentes. La muestra que los ~inoácid os que se encuenrran a lo largo de una ..;ra ele la región 2.4- de la h élice a contactan a las 3Ses de las posiciones - 12 a -10 de la secuencia ·omoLOra - lO. La región 2.3 es semejanre a las proteínas que ~ unen a ácidos nucleicos de cadena individual y -srticipa en la reacción de desnaturalización. Las ~iones 2.l y 2.2 (las cuales forman la pane más - •nservada del [acwr o) intervienen en la interacón con la enzima central. Se asume que todos los ..:¡crores cr se unen a las mismas regiones de la poli terasa central, lo cual garantiza que las reacciones .ean compet itivas. La región terminal N de cr70 tiene funciones re_¡Jladoras importantes. Si es retirada , la proleína -conada adquiere la capacidad de unirse de manera "'pecífica a secuencias promotoras. Esto sugiere que ; región rerminal N actúa como un dominio de au1inh.ibición. Ocluye los dominios de unión al DNA ·¡ando cr7ú está libre. La asociación con la enzima .:entra! cambia la conformación de cr, de tal mane :a que la inhibición es liberada y Jos dominios de m ión al DNA pueden hacer contacto con el DNA. La esquematiza el cambio de con. Hmación del factor o en Ja formación de un com ,Jejo abierto. Cuando el factor cr se une a la polime·asa central. el domino terminal N se balancea -20 \y se aleja de los dominios de unión al DNA, y los .:ominios de unión al DNA se separan uno de otro -15 Á. al parecer para adquirir una conformación ~men10~

Posición

-1~12-11-lo-9-a-7

los aminoácidos de la hélice a 2.4 de cr'0 hacen contacto con bases específicas en la cadena codificadora de la secuencia promotora -10.

Dominios de unión al DNA La región terminal N se une a los dom1nios de unión al DNA en etlaclor a libre Reglón termmal N

El DNA desplaza al extremo N cuando se forma el complejo con eiDNA Reg1ón lerm1nal N

El extremo N de cr impide que las regiones de unión al DNA se unan al DNA. Cuando se forma un complejo abierto, el extremo N se separa 20 Áy las dos regiones de unión al DNA se alejan 15 A.

más alargada, apropiada para hacer contacto con el DNA. Las mutaciones en cualquiera de las secuencias -35 o -1 O impiden que un facror o 70 (grupo terminal N eliminado) se una al DNA, lo cual sugiere que cr10 comacta ambas secuendas de manera simultánea. Esto implíca que d factor cr debe tener una estructura bastante alargada, que rebase los -68 Á de dos vueltas de DNA. En la holoenzima libre. el dorrúnio terminal N se localiza en el sitio activo de los componentes de la enzima central, esendalmenre imitando la localización que el DNA ocupará cuando se forme un complejo de tramcripción. Cuando la holoenzima forma un complejo abierto en el DNA, el dominio terminal N cr es desplazado del sitio activo. Su relación con el resto de la proreína es. por lo tanto. muy flexible; la relación cambia cuando el factor cr se une a la enzima central y de nuevo cuando la holoemima se w1e al DNA. Las comparaciones de las estructuras cristalinas de la enzima central y de la holoenzima muestran que el factor o se encuentra sobre todo en la superfi-

11.17 los factores cr entran en contacto de manera directa con el DNA

281

o-

Enzima centr~l

El factor cr tiene una estructura alargada que se extiende por la superficie de las subunidades de la enzima central cuando se forma la holoenzima.

de transcripción dirigido por cr 54 requiere que otros aclivadores se uóah a silios que están bastante distantes del promotor. Esto contrasta con los otro~ tipos de promotores bacterianos. para los cuales lo~ sitios reguladores están siempre muy cerca del promotOr. El comportamiento de crs4 es diferente al de otros facrores cr. sobre todo en lo que se refiere a su capacidad para unirse al DNA independientementt de la polimerasa central. En este aspecto, cr 5'1 es m~ parecido a los reguladores eucarióticos que se analizan en el Capítulo 24, Promotores y potenciadores. que a los reguladores procarióricos típicos que se abordan en el Capüulo 12, El operón.

Los fa ctores cr pueden organizarse en cascadas Conceptos IJrincipJles Una cascada de factores cr se crea cuando un factor cr es necesario para transcribir al gen que codifica al siguiente factor cr. Los genes tempranos del fago SPOl son transcritos por una potimerasa de RNA hospedadora. • Uno de los genes tempranos codifica un factor cr que hace que la polimerasa de RNA transcriba los genes intermedios. • Dos de los genes intermedios codifican subunidades de un factor cr que hacen que la polimerasa de RNA transcriba los genes tardfos.

El DNA en un inicio entra en contacto con el factor a (en color rosa) y con la enzima central (en color gris). Se desplaza más hacia el interior de la enzima central para formar contactos con la secuencia -10. Cuando a es liberado, la anchura del pasaje que contiene al DNA aumenta. Reproducida de Vassylyev, O. G., et at. Nature. 2002. 417: 712-719. Fotograña cortesía de Shigeyuki Yokoyama, The University of Tokyo.

cie de la enzima centraL La muestra que tiene una estructura alargada que rebasa el sitio de urúón al DNA. Esto lo coloca en una posición que le permitehacercomacto con el DNA durante la unión inicial. La hélice de DNA tiene que desplazarse unos 16 Á a partir de la posición inicial para entrar al sitio activo. La ilustra este movimiento. visto en cone transversal a lo largo del eje heJicoidal del DNA.

En el factor crH se observa una diferencia interesante de comportamiento. Esto provoca que la polimerasa de RNA reconozca los promoLOres que tienen una secuencia de consenso distinta, con un elemento conservado en -12 y con otro en la cercanía ubicado en -24 (expuesto en la columna "'-35H de la Figura ll.32). Por lo tanto, la geometría del complejo poümerasa-promotor es difere::nte bajo la dirección de este factor cr. Otra diferencia en el mecanismo de regulación es que un nivel alto 282

CAPÍTULO 11 Transcripción

Los factores cr se utilizan de manera amplia para controlar la iniciación de la transcripción en la bacteria B. subtilis, en la cual se conocen -lO factores e distintos. Algunos se encuentran en las células vegetativas; otros se producen sólo en circunstancia' especiales de infecciones por fagos o en el cambh. de crecimiento vegerativo a esporulación. La pri.ndpal polimerasa de RNA observada en la~ células de B. sub tilis que participan en el crecimient vegetativo normal Lienc la misma estructura que 1? polimerasa de RNA de E. coli, a2 ~Wcr. Su factor e (descrito como crH o cr") reconoce promotOres cor las mismas secuencias de consenso urilizadas por la enzima de E. coli bajo la dirección de cr70 • Much ~ variantes de la polimerasa de RNA que conriene:otros factores cr se encuentran en cantidades much más pequeñas. Las enzimas variantes reconoce~ promotores distintos con base en las secuencias dt consenso localizadas en -35 y en - 10. La transición de la expresión de un conjunt de genes a la expresión de otro conjunto es un: característica común de la infección por bacteriófagos. En todos las casos, excepro en los que son m u simples, el desarrollo del (ago comprende cambie en el patrón de transcripdón durante el ciclo infec-

tSO. Esros cambios pueden lograrse gracias a la ..tesis de una polimerasa de RN A codificada por los !!OS o a los esfuerzos de los factores accesorios coleados por los fagos que controlan Ja polimerasa - RNA bacteriana. Un ejemplo bien caracterizado . :: comrol mediante la producción de factores cr _evos ocurre dura me la infección por el fago SPO 1 : B. subcilis. El ciclo infeccioso de SPO 1 pasa por tres eta~, de expresión génica. En cuanto tiene lugar la ..:ección se transcriben los gen es t empranos del -?O. Después de 4 a 5 min, cesa la transcripción de s genes tempranos y comienza la transcripción =los genes interm edios. A los ocho a 12 min, la -:mscripción de los estos genes es remplazada por -transcripción de los genes tardíos. Los genes tempranos son transcri tos por la he enzima de la bacteria hospedadora. En esencia, . imposible distinguirlos de los gene~ hospedado-S cuyos promotores tienen la capacidad intrín.:ca de ser reconocidos por la polimerasa de RNA

Temprano Los promotores del lago son reconocidos por la holoenzima bacteriana

0

El gen temprano 28 codifica a un factor a nuevo que desplaza al factor a bacteriano

Intermedio La enzima central-gp28 transcribe a los genes intermedios del faso

-~wcr·u.

La expresión de los genes de los fagos es indiscnsable para las transiciones a la transcripción de 5 genes intermedios y tardíos. Tres genes regulares, 28, 33 y 34, controlan el curso de la transcrip~·n. Sus funciones se resumen en la parrón de reguladón crea una cascada, en la cual - enzima hospedadora transcribe un gen tcmpracuyo producto es necesario para transcribir los nes intermedios. Después de esta transcripción, s de los genes intermed ios codifican productos - jispensables para transcribir los genes tardíos. Los organismos con mutaciones en el gen tem-ano 28 no pueden transcribir los genes interme)$ . El producro del gen 28 (denominado gp28) una proteína de 26 kD que remplaza al factor - hospedador en la enzima central. Esta sustitución d único hecho requerido para hacer la transición de -expresión de los genes tempranos a la expresión de los zes intermedios. Esto crea una holoenzima que ya puede transcribir más los genes del hospedador .:'O cambio transcribe de manera específica los ge mutaciones localizadas en el operador provocan la expresión constitutiva de los tres genes estructurales loe. • Estas mutaciones act(Jan en configuración cis y afectan sólo a aquellos genes que se encuentran en el fragmento contiguo de DNA.

la regulación negativa, una proteína represora se une a operador para evitar que se exprese un gen. la regulación positiva es necesario que se una un factor transcripción al promotor para permitir a la polimerasa RNA iniciar la transcripción.

Los agrupamientos de genes estructurales son controlados de manera coordinada • Los genes que codifican protelnas que funcionan en la misma ruta pueden ser adyacentes y ser controlados como una unidad individual que se transcribe en un RNAm policistrónico.

Los genes lac son controlados por un represor

•

• la transcripción del agrupamiento de genes locZYA es conttolada por una proteína represora que se une a un operador que se superpone al promotor en el inicio del agrupamiento. • la protelna represora es un tetrámero formado por subunidades idénticas codificadas por el gen loeJ.

•

El operón lac puede ser inducido

•

• Las moléculas pequeñas que inducen a un operón son idénticas al sustrato en lo que se refiere a sus enzimas, o están relacionadas con ét. • Los galactósidos p son los sustratos para las enzimas codificadas por lacZYA. • En ausencia de galactósidos p, el operón loe se expresa sólo en un nivel (basal) muy bajo. • la adición de galactósidos p especlficos induce la transcripción de los tres genes del operón. • El RNAm loe es muy inestable; como resultado, la inducción puede revenirse con rapidez. • Los mismos tipos de sistemas que permiten a los sustratos inducir a los operones que codifican enzimas metabólicas pueden ser utilizados para permitir a los productos finales reprimir a los operones que codifican las en2imas biosintéticas.

El represor es controlado por una pequeña molécula inductora • Un inductor funciona al convertir a la proteína represora en una forma con menor afinidad por el operador. El represor tiene dos sitios de unión, uno para el operado¡ y otro para el inductor. • El represor es desactivado por una interacción alo>térica en la cual la unión del inductor a su sitio cambia las propiedades del sitio de unión al ONA.

300

Las mutaciones de actuación en trans identifican el gen regulador

•

Las mutaciones localizadas en el gen lacl actúan en configuración trons y afectan la exoresión de todos los agrupamientos loclYA en la bacteria. las mutaciones que eliminan la función de lad provocan expresión con;titutiva y son recesivos. las mutaciones que se encuentran en el sitio de unión al ONA deltepresor son constitutivas debido a que el represor no puede unirse al operador. las mutaciones que se localizan en el sitio de unión al inductor del represor le impiden ser desactivado e impiden la inducibilidad. Las mutaciones de los promotores son no inducibles y de actuación en ds.

Las proteínas multiméricas tienen propiedades genéticas especiales • Un represor activo es un tetrámero formado por subunidades idénticas. • Cuando se presentan subunidades muta11tes y silvestres, una sola subunidad mutante lacJ·4 puede inactivar a un tetrámero cuyas subunidades restantes sean silvestres. • las mutaciones lad·j ocurren en el ;itio de unión al DNA. Su efecto se explica porque la actividad del represor requiere de todos los sitios de unión al ONA en el tetrámero para que sea activo.

HE El monómero represor tiene numerosos dominios • Una subunidad represora individual puede ser dividida en un dominio terminal Nde unión al ONA, una biS<Jgra y el nlícleo de la proteína. • El dominio de unión al DNA contiene dos regiones helicoidales a cortas que se unen al surco mayor del ONA. • La región de la bisagra se inserta en el surco menor como una hélice a corta y plegada. • El sitio de unión al inductor y las regiones responsables de la formación de los multimeros se localizan en el núcleo.

La inducción reduce la afinidad por el operador a 10• veces la de los sitios de baja afinidad, por lo que sólo 3'1'o de los operadores están unidos. • La inducción provoca que el represor se mueva del operador a un sitio de baja afinidad por desplazamiento directo. • Estos parámetros podrían cambiarse con un incremento o reducción de la concentración efectiva de DNA in viva.

Un represor es un tetrámero formado por dos dímeros • Los monómeros forman un dímero al hacer contactos entre los dominios nucleares 1 y 2, y es posible que ent.re las hetices de oligomerización. • Los dlmeros forman un tetrámero por medio de interacciones entre Las hélices de oligomerización.

La unión al DNA es regulada por un cambio alostérico en la conformación

La represión puede suceder en múltiples loci • Un represor actuara en todos los loci que tengan una copia de su secuencia operadora diana.

• El dominio de unión al DNA de cada monómero dentro de un di mero se inserta en el surco mayor de\ DNA, La hélice bisagra se inserta en el surco menor del DNA operador. • Un represor activo tiene una conformación en la cual los dos dominios de union al DNA de un dímero pueden insertarse en vueltas sucesrvas de 1a doble hélice, • La unión del inductor interrumpe la hélice bisagra y c~mbia la conformación de tal manera que los dos sitios de unión al DNA no se encuentran en la geometña correcta para hacer contactos simultaneas.

El AMP cíclico es un efector que activa al factor CRP para que actúe en múltiples operones • CRP es una proteina activadora que se une a una secuencia diana en un promotor. • Un dímero de CRP es activado por una sola molécula de AMP cíclico.

El factor CRP funciona de formas diferentes en operones diana distintos

Los fenotipos mutantes se correlacionan con la estructura del dominio

CRP introduce un giro de 90° en el DNA en su sitio de unión. Los sitios de unión al CRP se encuentran en ubicaciones muy variables con respecto al promotor. CRP interactúa con la potimerasa de RNA, pero los detalles de la interacción dependen de las ubicaciones relativas del sitio de unión al CRP y del promotor.

• Diferentes tipos de mutaciones ocu11en en dominios distintos de la subunidad del represor.

La proteína represora se une al operador • La proteína reoresora se une a la secuencia de DNA de doble cadena del operador. • El operador es una secuencia palindrómica de 26 bp. • Cada repetición invertida del operador se une al sitio de unión al DNA de una subunidad represora.

La traducción puede ser regulada • Una proteína represora puede regular la traducción al impedir que un ribosoma se una a un codón de iniciación. • la accesibilidad a los codo nes de iniciación en un RNAm polidstrónico puede ser controlada por medio de cambios en La estructura del RNAm. los cuales ocurren como resultado de la traducción .

La unión del inductor libera al represor del operador • La unión del inductor provoca un c¡¡mb ro en la

conformación del represor que reduce su afinidad por el DNA y lo libera del operador.

La síntesis de Las proteínas r es controlada por medio de regulación autógena

El represor se une a tres operadores e interactúa con la polimerasa de RNA • Cada dímero localizado en un tetrámero represor puede unirse a un operador, de tal manera que el tetrámero puede unirse a dos operadores de forma simultánea. • La represión total requiere que el represor se una a un operador adicional localizado en flujo descendente o ascendente así como al operador en el promotor lacl. • La unión del represor al operador estimula la unión de la polimerasa de RNA al promotor, pero im pióe la transcripción.

El represor siempre está unido al DNA • Las proteínas que tienen gran afinidad por una secuencia especifica de DNA también tienen una afinidad baja por otras secuencias del DNA. • Cada par de bases localizado en el genoma bacteriano es el inicio de un sitio de unión de baja afinidad para el represor. El gran número de sitios de baja afinidad garantiza que toda la proteína represora esté unida al DNA. El represor se une al operador al desplazarse desde un sitio de baja afinidad en vez de hacerlo al equilibrarse en la solución.

La traducción de un operón de protelna r puede ser controlada por un producto del operón que se une a un sitlo localizado en el RNAm policistr6nico.

lEfa

La p32 del fago T4 es controlada por un circuito autógeno p32 se une a su propio RNAm para impedir la Iniciación de la traducción.

La reg ulación autógena se utiliza a menudo para controlar la síntesis de ensambles macromoleculares El precursor de los microtúbulos, la proteína tubulina libre. inhibe la traducción del RNAm de .a tubulina.

Resumen

El operador compite con los sitios de baja afinidad para unirse al represor En ausencia de inductor. el operador tiene una afinidad por el represor que es 101 veces mayor que la de un s1tio de baja afinidad. El nivel de 10 tetrámeros represores por células asegura que el operc1dor esté unido al represor 96% del tiempo.

CAPÍTULO 12 El operón

301

La expresión génica puede ser controlada en cualquiera de las múltiples etapas, las cuales se dividirán en términos generales en transcripción, procesamiento y traducción: • La transcüpción a menudo es controlada en la etapa de iniciación. La transcripción casi nunca se controla en la elongación, pero puede ser controlada en la terminación para determinar si a la polimerasa de RNA se le permite dejar atrás un terminador y avanzar al gen o a los genes que se encuentran después de él. • En las células eucarióticas, el procesamien -

secuencias de actuación en cis (por lo general sir,ios en el DNA). En términos más formal es: • Un gen es una secuencia de DNA que codifica un producto capaz de difundirse. Este producto puede ser una proteina (corn1 en la mayor parte de los genes) o puede ser RNA (como en los genes que cod ifica~ RNAt y RNAr). La característica fundamema. es que el producto se difunde lejos del sitio de s1. síntesis y actúa en otra ubicación. Cua lquier producto génico que es libre de difundirse para encontrar su objetivo se describe coml de acLuación en trans. • La descripción del concepto actuación en cis se aplica a cualquier secuencia de DNA

ro del producto de RNA puede ser regulado

que no es transformada a ninguna otra for-

en la etapa de modificación, en la de corte y empalme, en la de transporte o en la de estabilidad. En las bacterias, un RNAm en principio está disponible para la traducción tan pronto ha sido sintetizado, e incluso durante su síntesis, pero durante este periodo las etapas de conrrol no están disponibles. • la traducción puede ser regulada, por lo general en las etapas de iniciación y de terminación (como la transcripción) . La regulacíón de la iniciación es formalmente análoga a la regulación de la transcripción: el sistema de circuitos puede ilustrarse en términos similares para regulación de la iniciación de la transcripdón en el DNA o de la iniciación de la traducción en el RNA. El conceptO básico que explica cómo se controla la transcripción en las bacterias lo proporcionó la formulación clásica del modelo para el control de la expresión génica elaborado por Jacob y Monod en 1961. Ellos distinguieron dos tipos de secuencias en el DNA: las secuencias que codifican los productos de actuación en trans y las secuencias de actuación en cisque funcionan de manera exclusiva dentro del DNA. La actividad génica es reg1Jlada por las imeraccioncs específicas de los productos de actuación en trans (por lo general proteínas) con las

ma, pero que funciona de manera exclusiva como una secuencia de DNA in situ, que afecta sólo al DNA al cual está ffsicamentt: ligado. (En algunos casos, una secuencia de. actuación en cis funciona en un RNA en vez de hacerlo en una molécula de DNA.) Para ayudar a distinguir entre los componente~ de los circuitos reguladores y los genes a los cuales regulan, en ocasiones utílízamos los términos ger. estructural y gen regulador. Un gen estructural e· tan sólo ut1 ge11 que codifica un producto proteínkc (o un RNA). los genes estructurales representan una enorme variedad de funciones y estructuras proteínicas, como las proteínas estructurales, las enzimas con actividades catalíticas y las proteínas reguladoras. Un gen regulador simplemente descl'ibe a un gen que codifica una proteína (o una molécula de RNA) que interviene en la regulación de la expresión de otros genes. la forma más sencilla del modelo regu lador se ilustra en la : un gen regulador codifica una proteína que controla la transcripción al unirse a un sitio particular del DNA. o a varios. Esta interacción puede regular a un gen diana de forma positiva (la interacción activa al gen) o de forma negativa (la interacción d·csactiva al gen). Los sitios delDNA casi siempre (pero no de forma exclusiva) se localizar. enseguida del gen diana, en sentido ascendente. Las secuencias que indican el inicio y el fin de la unidad de transcripción, el promotor y el terminador, son ejemplos de sitios de actuación en cis. Un promotor sirve para iniciar In transcripción sólo dC' gen o de los genes que están conectados físicamente a él et; el mismo fragmento de DNA. En la misma forma, ur terminador puede finalizar la transcripción só lo por medio de una po)imerasa de RNA que ha atrave sado al gen o a los genes precedentes. En su forme más simple, los promotores y los terminadores sor elementos de actuación en cis que son reconocidos por la misma especie de actuación en trans, es decir

Introducción

Gen regulador

¡

RNAm

¡

-

Plotelna reguladora

\. ~ Sitio diana

~ Gen estructural

Un gen regulador codifica una proteína que actúa en un sitio diana del DNA.

302

CAPITULO 12 El Operón

. la polimerasa de RNA (aunque otros factores '"'1bién participan en cada sitio). Hay otros sitios reguladores de actuadón en cis ~e a menudo están yuxtapuesros al promotor o eminados en él. Un promotor bacteriano puede ner uno o más de dichos sitios localizados en la ;cania, es dedr, en la vecindad inmediata del punde inicio. Un promoror eucariótico es probable .le tenga un número mayor de sitios dispersos en '"'!a distancia más larga.

Promotor/operador de actuaciOn en cls precede a los genes estructurales Promotor operador

r

Gen 8/lcendido: la poi rnerasa de RNA inrcia en el promotor

La regulación puede

ser positiva o negativa \ onceptos principales En La regulación negativa, una proteína represora se une a un operador para evitar que se exprese un gen. En la regulación positiva, es necesario que se una un factor de transcripción al promotor para permitir a la polimerasa de RNA iniciar la transcripción.

_·n modelo clásico del control en las bacterias es igatívo: una proteína represora impide que un gen ca expresado. La muestra que el "estao predeterminado" de dicho gen es ser expresado través del reconocimiento de su promotor por la olimerasa de RNA. Cerca del promotor se encuen,.a otro sitio de actuación en cis denominado opera' or, el cual es el objerivo de la proteína represora. ":uando el represor se une al operador, se le impide · la polimerasa de RNA iniciar la transcripción y. orlo tanto, la expresi6n génica es desactivada. Hay un modelo alternativo de control positivo. ~5te se uriliza en las baCLerias (probablemente) con _na frecuencia casi igual a la del control negativo ·es la forma de control más común en las eucario.as. Un factor de transcripción es necesario para Jyudar a la polimerasa de RNA en la iniciación en d promotor. La muestra que el estado redeterminado típico de un gen eucariólico es inlctivo: la polimerasa de RNA no puede iniciar por sí llisma la transcripción en e l promotor. Numerosos .actores de actuación en trans tienen sitios diana •calizados en la vecindad del promotor y la unión .4r:? algunos o de todos estos factores permite a la polímerasa ir:? RNA iniciar la transcripción. El rema unificador es que las proteínas regulado~as son factores de actuación en trans que reconocen dernenros de actuación en ds (por lo general) locali::ados en sentido ascendente con respecto al gen. Las :onsecueneias de este reconocimiento son la activajón o la represión del gen, según el tipo individual .:e proteína reguladora. Una característica típica es ~ue la proteína funciona al reconocer una secuencia '!IUy corta localizada en el DNA, casi siempre con

El gen es apagado cuando el represor se une al Of)erador Represor 1

En el control negativo un represor de actuación en trans se une al operador de actuación en cis para apagar la transcripción.

GEN APAGADO EN FORMA PREDETERMINADA Punto de lnrcro ,;..;..;....;.;;......;¡¡.;• Gen Promotor '( GEN ENCENDIDO POR LOS ACTIVAOORES Los factores Interactúan con la poltmerasa de RNA

ANA

En el control positivo, los factores de actuación en trans deben unirse a Los sitios de actuación en cis para que la polimerasa de RNA inicie la transcripción en el promotor.

una longitud <JO bp, aunque la proteína de hecho se une a un fragmento del DNA un tantO mayor. El promotOr bacteriano es un ejemplo: la polimerasa de RNA cubre >70 bp del DNA enia inidación, pero las secuencias cruciales a las cuales reconoce son los hexámeros centrados en las posidones -35 y -10. Una diferencia significativa en la organización de los genes entre las procariotas y las eucariotas es que los genes estructurales de las bacterias están organizados en agrupamientos, mientras que los de las eucariotas se presentan de manera individual. El agrupamiento de los genes estructurales les permite ser controlados de forma coordinada por medio de interacciones en un solo promotor: como resuLl i ? La regulación puede ser positiva o negativa

303

tado de estas interacciones. el conjunto completo de genes se transcribe o no se transcribe. En este capítulo se anali7.a esta forma de control y su uso por parte de las bacterias. Los medios empleados para coordinar el control de los genes eucarióticos dispersos se abordan en el Capítulo 25, Activación de la transcripción.

Los agrupamientos de ge nes estructurales so n controlados de manera coordi nada Concepto pñncipal • Los genes que codifican proteínas que funcionan en La misma ruta pueden ser adyacentes y ser controlados como una unidad individual que se transcribe en un RNAm policistrónico.

Los genes estructura les bacterianos con frecuencia están organizados en agrupamientos que incluyen genes que codifican proteínas cuyas funciones están relacionadas. A menudo los genes que codifican las enzimas de una ruta metabólica están organizados en uno de esws agrupamientos. Además de las enzimas que intervienen en la ruta, la unidad de control coordinado puede incluir otras actividades relacionadas; por ejemplo, la proteína encargada de transportar la molécula peque1ia (sustrato} al interior de la célula. El agrupamiento de los tres genes estructurales Lac, lacZYA, es típico. La resume la organización de los genes estructurales, sus elementos reguladores asociados de actuación en cis y el gen regulador de actuación en traJ1S. La característica

principal es que el agrupamiento se transcribe en U/1 solo RNAm policistrónico a partir de un promotor en el cual se regula la iniciación de la transcripción. Los productos pro refnicos permiten a las células absorber y metabolizar los galactósidos p, como la

p

la el

PO

1 040

82

ONA

lactosa. Las funciones de los tres genes estructurales son: • El gen /acZ codifica la enzima galacwsidasa ~~ cuya forma activa es un tetrámero de -500 kD. La enzima separa un galactósido p en sus azúcares constitutivas. Por ejemplo, la lactosa es dividida en glucosa y galactosa (las cuales son metabolizadas posterionncnte). Esta enzima también elabora un subproducto importante, la alolactosa P-1, 6, la cual tiene cierta función en la regulación. • El gen lacY codifica la permcasa de galactósido p, una proteína de -30 kD unida a la membrana, componente del sistema de transpone. Ésta transporta a los galactósidos Pal imerior de la célula. • El gen lacA codifica la transacetilasa de galactósido ~ . una enzima que transfiere un grupo acetilo de la acetil-CoA a Jos galactósidos p. Las mutaciones en lacZ o en /acYpueden crear el genotipo lac, en el cual las células no pueden urilizar la lactosa. (La descripción genotípica HlacH sin un calificativo indica pérdida de la función.) Las mu taciones JaeZ eliminan la actividad enzimática e impiden de manera directa el metabolismo de la lactosa. Los mutames lacY no pueden absorber la lactosa del medio. (Ningún dcfeno es idemificable en Jas células lacA. lo cual es desconcertante. Es posible que la reacdón de acetilación proporcione una ventaja cuando las bacterias crecen en presencia de cienos análogos de Jos galactósidos ~que no pueden ser metabolizados, debido a que la modificación da origen a la desintoxicación y la excreción.) El sistema completo, incluidos los genes estructurales y los elementos que controlan su expresión. forma w1a unidad común de regulación denominada operón. La actividad del operón es controlada por el gen o los genes reguladores cuyos productos proteínicos interactúan con los elememos de control de actuación en cis.

JaeZ ~q rr.

facY

,-,

,

3510

780

825

l

l

l

RNAm

Proleina

l

Represor

Galactosldasa ~

EL operón loe ocupa -6 000 bp del DNA. En el lado izquierdo el gen /acl tiene su propio promotor y su propio terminador. EL extremo de La región lac es adyacente al promotor, P. El operador, O, ocupa los primeros 26 bp de la unidad de transcripción. El gen largo lacl comienza en la base 39 y es seguido por los genes lacY y lacA y por un terminador.

304

CAPÍTULO 12 El Operón

,

Los genes loe son controlados por un represor

Punto de inicio

/.JIVJMtviM'WV~

.

Conceptos principales La transcripción del agrupamiento de genes lacZYA es controlada por una proteína represora que se une a un operador que se superpone al promotor en el inicio del agrupamiento. l1l proteina represora es un tetrámero formado por subunidades idénticas codificadas por el gen /acl.

~

Desenrollamiento -so -40 -30 -2o -1o

1

1

10

---+

..

20 30

•---Promotor se une a ra polimerasa de RNA +Operado~+

se une al represor

.: pueden distinguir los genes estructurales de los :-enes reguladores por los efectos de las mmadones. _na mutación en un gen estructural priva ella célula e la proteína particular a la cual codifica el gen. ,,n embargo, una mmación en un gen regulador .:1fluye en la expresión de rodos los genes esuuctu 11es a los cuales controla. Las consecuencias de una tutación en un gen regulador revelan el tipo de egulación. La transcripción de los genes lacZY.4 es controada por una proteína reguladora sintetizada por el :en lacl. Sucede que lacl esrá localizado al lado de los -enes estTuctura les, pero comprende una unidad de :-anscripción independiente con su propio promo'r y con su propio terminador. En principio, la el no -eccsita localizarse cerca de los genes estructurales ebido a que especifica a un producto que se dífun.:e. Puede funcionar muy bien si es transportado a .. ~tal qu ier o Lro sitio, o puede estar contenido en una .lOlécula de DNA independiente (la prueba clásica ;ara un regulador de actuación en trcms). Los genes lac son controlados por medio de re-

gulación negativa: son transcritos a menos que sean ·vagados por la proteína reguladora. Una mutadón _ue desactiva al regulador hace que los genes es.;ucturales permanezcan en la condición expresada. _:::¡ producto de lacl se denomina represor Lac, debido =que su función es impedir la expresión de los ge•es estructurales. El represor es un tetrámero de subunidades Jémicas de 38 kD cada una. Hay ~ 1O tetrámeros ~ n LLna célula de tipo silvestre. El gen regulador no ·s con trolado por la disponibilidad de la lactosa. Se =-anscribe en un RNJ\m monocísrrónico a una velo.Jdad que parece ser gobernada tan sólo por la afini;.ad de su promotor por la polim erasa de RNA. El represor funciona uniéndose a un operador ...-uyo símbolo formal es 0 1oc) localizado al inicio del 1grupamienro IacZYA . El operador se ubica entre el :-omotor (?1~veces. La afinidad por las secuencias generales

318

CAPÍTULO 12 El Operón

del DNA permanece sin alteraciones. Por lo tanto, la especifiddad ahora es de sólo 10'1, la cual es insuficiente para capturar al represor contra la competencia con el exceso de 4.2 x 106 de los sitios de baja afinidad. Sólo 3% de los operadores estarían unidos en estas condiciones. • Las mutaciones que reducen 20 o 30 veces la afinidad del operador por el represor tienen el efecto suficiente para ser constitutivas. Dentro del genorna, los operadores mutantes pueden ser superados por la preponderancia de los sitios aleatorios. La ocupación del operador disminuye a -50% si la especificidad del represor se red u ce - 1O veces. La consecuencia de estas afinidades es que, en una célula no inducida, un tetrámero represor suele estar unido al operador. Todos, o casi todos, los te trámeros resta ntes están unidos de manera aleatoria a otras regiones del DNA, corno se ilustra en la . Es probable que haya muy pocos o ningún tetrámero represor libre dentro de la célula. La adición del inductor inhibe la capacidad de! represor para unirse de manera específica al ope rador. Aquellos represores unidos al operador son liberados y se unen a sitios a leatorios (de baja afinidad) . Por lo tanto, en una célula inducida, los tetrá meros está n "almacenados" en sitios aleatorios del DNA. En una célula no inducida, un tetrámero está unido al operador. mientras que las moléculas represoras restantes se unen a sitios no específicos. Por lo tanto, el efecto de la inducción es cambiar la distribución del represor en el DNA, en vez de generar represor libre. Cuando el inductor es retirado, e1 represor recupera su capacidad para unirse en forma específica a) operador y lo hace con mucha rapidez. Esto debe ínvolucrar su desplazamiento a partir de un sitio de "almacenaje" no específico en el DNA. ¿Qué mecanismo se utiliza para este desplazamiento rápido? La capacidad de unirse al operador en forma rápida no es congru ente con el tiempo que se necesitará para realizar mú ltiples ciclos de disociación y de reasodación con los sitios no específicos del DNA. La discrepancia excluye a Jos mecanismos de impactos aleatorios para encontrar al operador. Jo cua: sugiere que el represor puede moverse de manera directa desde un siúo aleatorio del DNA hasta e: operador. Esta es la misma situación que se observéo antes con la capacidad de la poli.merasa de RNA para encontrar sus promotores (véanse la Figura 11. 22 y la Figura 11.23). La misma solución es probable: e. movimiento puede lograrse si se reduce la dimensionalidad de la búsqueda al deslizarse a lo largo de: DNA o por desplazamiento directo de un sitio a otro

•roo se indica en la Figura 12.24). Una reacción desplazamienLO puede facilitarse con la presen- de más sitios de unión por tetrámero (cuatro) de que son de hecho necesarios para contactar al ·A en un momento dado (dos). Los parámetros implicados en la localización de operado r de alra afinidad en competencia con _chos sitios de baja afinidad plantean un dilema ;a el represor. En condiciones de represión, debe ::>~r una especificidad alta por el operador. Sin .:>argo, en condiciones de inducción, esta e~pe­ .:idad debe eliminarse. Por ejemplo, supóngase . La muestra que el RNAtTrp no cargado se une al RNAm de una proreína denominada antiTRAP (AT). Ésta suprime la formación de una horquilla de renninadón en el RKAm. El RNAtTrp no cargado también incrementa la traducción del RNAm. El resultado combinado de estas dos acciones incremema la síntesis de antiTRAP, la cual se une a la TRAP y le impide reprimir al operón de triptófano. Por medio de esta serie de sucesos complejos. la ausencia de triptófano genera RNAt 334

CAPÍTULO 13 RNA regulador

antiTRAP

l

En condiciones normales {en presencia de¡-· tófano) la transcripción termina antes que el gen antiTP• Cuando no hay triptófano, el RNAtT•p se aparea con el R -antiTRAP, lo que impide la formació n de la horquilla term·· dora y provoca la expresión de antiTRAP.

no cargado, el cual provoca la síntesis de antiTR-.Éste a su vez impide la función de la TRAP, la C<provoca la expresión de los genes del triptófan0 Por lo tanto, la expresión de los genes tr¡: ~ B. subtilis es controlada por el triptófano y po; RNAtT.,, Cuando hay Lriprófano, no necesita ser~ tetizado. Esto se logra cuando el triptófano an la TRAP e inhibe así la expresión de las en zi!:4 que sintetizan elLriptófano. La presencia de RNA no cargado indica que hay escasez de triptófano RNAt no cargado activa la anriTRAP y, por lo tar. activa la transcripción de los genes trp.

El operón triptófano de Escherichia coli es controlado por medio de atenuación

Sólo se transcrlbeelllder .,.__ Uder ...._...... . . . -Región codificadora---. Terminador 1 Terminador 2 Promotor~ TRADUCCIÓN + TERMINACIÓN

, ~11ceptos principales Un atenuador (terminador intñnseco) se localiza entre

el promotor y el primer gen del agrupamiento trp. la ausencia de triptófano suprime la terminación y ocasiona que la transcripción aumente 10 veces. Horquilla de terminación

E. coli se uriliza un sistema regulador complejo !l el cual se descubrió por primera vez la aren u a n). Los cambios de la estructura secundaria que !ltrolan la atenuación son determinados por la 5ición del ribosoma en el RNAm. La _restra que la terminación requiere que el riboso.: pueda traducir un segmento líder que precede a los :l!s trp en el RNAm. Cuando el ribosoma traduce :egión líder se rorma una horquilla de termina m en el terminador l. Sin embargo, cuando se le .pide al ribosoma traducir el líder. la horquilla de =rminación no se forma y la polimerasa de RNA ·3nscribe la región codificadora. En consecuencia. este :ranismo de antiterminación depende de la posibilidad : que las circunstancias externas influyan en el movi;mto del ribosoma en la región líder. El operón trp está formado por cinco genes es~ c tura l es ordenados en una serie contigua, los .ttales codifican las tres enzimas que transforman el :ido corísmico en triptófano. La mues·a que la transcripción inicia en un promotor que oe encuentra en el extremo izquierdo del agrupaniemo. La expresión del operón trp es controlada "lr dos mecanismos independientes. La represión e la expresión la ejerce una proteína represora .:odificada por el gen trpR no ligado) que se une a ...n operador adyacente al promotor. La atenuación .:'O nu·ola el progreso de la polimerasa de RNA en el perón al regular la posibHidad de que la terminaj ón ocurra en un sitio que precede al primer gen t stru ctu ra l. La atenuación se descubrió por primera vez :uando se observó que la deleción de una secuen:ia localizada entre el operador y la región codi:!cadora trpE puede aumentar la expresión de los .senes estructurales. Este efecto es independiente i e la represión: los niveles de transcripción basal \" deprimida se incrementan. Por lo tanto, este sitio i.llfluye en los sucesos que tienen Jugar después de que la polirnerasa de RNA ha salido del promotor •a pesar de las condiciones que prevalecen en la .niciación). Entre el promotor y el gen trpE se localiza un

3tenuador (terminador .intrínseco). Éste proporciona

TRADUCCIÓN Y TERMINACIÓN AUSENTES Se ~ranscribe la reglón

Terminador 1

Promotor..,...

codttrcadora Terminador 2

__..

~ EJ'bn asoma estactonano cam b'ta 1

.

.

la estructura secundaria del RNAm

La terminación puede controlarse con los cambios en la estructura secundaria del RNA determinados por el movimiento ribosómíco.

Proteína Gen

Sintetasa de antranilato

trpE

Slntetasa de Sintetasa de triptófano indol-glicerol Cadena B Cadena A

t•pD

trpC

trpB

Líder

Atenuador

rrpA t t'

Reglón de control

~ '-•·o'"''"

pppN AUGAMGCMUUUOOGUACU:GAMCiGUIXlGV.t;GCGc;ACUUCCVGAN43~~1.8iJ.!lll.!UU 26 Péptido lfder

0

t·J 'O

MetLysAiallePheValleuLysGiyTrpTrpArgThrSer

)

Horquilla rica en G·C/cadena individual nca en U

El operón trp está formado por cinco genes estructurales contiguos precedidos por una región de control que incluye el promotor, el operador, la región codiñcadora del péptido Líder y el atenuador.

una barrera a la transcripción en los genes estntctura les. La polimerasa de RNA termina ahí. in vivo o in vitro, para producir un transcrito de b ase 140. La terminadón en el atenuador responde al n > ve! de triptófano. como se ilustra en la La terminación es eficienre en presencia de cantidades suficientes de triptófano. Sin embargo, en

13.4 El operón triptófano de Escherichia coli es controlado por medio de atenuación

335

TRANSCRIPCIÓN DE LA REGIÓN LIDER Promotor

~~

Pausa

Atenuador

trpE

la atenuación permite que casi todas las polimerasas continúen. J unto con el incremento de 70 veces en la iniciació n de la transcripción que se deriva de la liberación de la represión, esto permite un intervalo de regulación del operón de unas 700 veces.

La atenuación puede ser

controlada por la traducción Conceptos principales TRIPTÓFANO AUSENTE: LA TRANSCRIPCIÓN CONTINÚA EN El OPERÓN

~

La polimerasa experimenta elongación

l/\il

TRIPTÓFANOPRESENTE: LA TRANSCRIPCIÓN TERMINA EN ElATENUADOR

la polimerasa termina

Un atenuador controla la progresión de la polimerasa de RNA en Los genes trp. la polimerasa de RNA inicia en el promotor y después prosigue a la posición 90, en donde hace una pausa antes de seguir adelante hasta el atenuador que se encuentra en la posición 140. En ausencia de triptófano, La polimerasa de RNA continúa en Los genes estructurales (trpE comienza en +163). En presencia de triptófano hay una probabilidad de ~90% de que la terminación libere el RNA líder de la base 140.

ausencia de triptófano, la polimerasa de RNA puede continuar en los genes estructurales. La represión y la atenuación responden de la misma manera al nivel de uiprófano. Cuando éste está presente, el operón es reprimido y la mayor parte de las polimerasas de RNA que escapan del promotor termina después en el arenuador. Cuando el triptófano es retirado, la polimerasa de RNA tiene acceso libre al promotOr y también deja de ser obligada a terminar en forma anticipada. La atenuación tiene un efecto de aproximadamente lO veces sobre la transcripción. Cuando el triptófano está presente, la terminación es efectiva y el atenuador permite que sólo -10 % de las polimerasas de RNA prosigan. En ausencia de triptófano, 336

CAPÍTULO 13 RNA regulador

• la región Líder del operón trp tiene un marco de lectura abierto de 14 codones que incluye dos codones de triptófano. .. la estructura de RNA localizada en el atenuador depende de la traducción de este marco de lectura. En presencia de triptófano, el líder es t raducido y el atenuador es capaz de formar la horquilla que provoca la terminación. En ausencia de triptófano, el ribosoma se atasca en los codones de triptófano y la estructura secundaria alternativa impide la formación de La horquilla, por lo que la transcripción continúa.

¿De qué forma puede responder la terminación de la transcripción en el atenuador al nivel de trip tó(ano? La secuencia de la región líder sugiere un mecanismo. Tiene una secuencia codificadora cona que podría representar a un pép tid o líd er de 14 aminoácidos. La Figura 13.6 muestra que contiene un sitio de unión ribosómica cuyo codón AUG es seguido por una región codificadora cona que contiene dos codones sucesivos de triptófano. Cuando a la célula se le termina el triptófano, los ribosomas inician la traducdón del péptido líder. pero se detienen cuando alcanzan los codones de tríptófano. La secuencia del RNAm sugiere que esta det en ción de los ribosomas influye en la terminación en el atenuador. La secuencia líder puede escribirse en estructuras apareadas de n1anera alternativa. La capaddad del ribosoma de proseguir por la región líder controla las transiciones entre estas estructuras. La estructura determina si el RNAm puede proporcionar las características necesarias para la terminación. La ilustra estas estructuras . En la primera, la región uno se aparea con la región dos, y la región tres se aparea con la región cuatro. El apareamiento de las regiones tres y cuatro genera la horquilla que precede a la secuencia U3 : ésta es la señal esencial de la terminación intrínseca. Es probable que el RNA adquiera esta estructura en ausencia de cualquier intervención externa. Si se le impide a la región uno aparearse con la región dos. se forma una estructura diferente. En

un oe oU eA

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Las regiones tres y cuatro ESTRUCTURAS AlTERNATIVAS Las reg1ones dos y tres se se aparean para formar la la reglón dos es complementaria de las regiones uno y tres aparean; la región terminadora La reglón tres es complementaria de fas regiones dos y cuatro es de cadena individual horquílla terminadora

La región líder trp puede existir en otras conformaciones apareadas. El centro muestra las cuatro regiones que :: ~eden aparearse. La región uno es complementaria de la región dos, la cual es complementaria de la región tres, que a su ez es complementaria de la región cuatro. En el lado izquierdo se encuentra la conformación que se produce cuando la re;ión uno se aparea con la región dos y La región tres se aparea con la región cuatro. En el lado derecho está la conformación ~:quirida cuando la región dos se aparea con la región tres y deja las regiones uno y cuatro sin aparear.

·e caso, la región dos es libre de aparearse con la ;ión tres. Entonces, la región cuatro no tiene un m pañero de apareamiento disponible, por lo que bLigada a permanecer como cadena individual. ·- ::-onsccuenda, la horquilla terminadora no podrá -:narse. La muestra que la posición del ri;oma puede determinar qué estructura se forma, :al manera que la terminación es atenuada sólo ausencia de triptófano. La característica cruda} .a posición de los codones de Trp en la secuencia Jificadora del péptido líder. Cuando hay triptófano, los ribosomas son capade sintetizar el péptido líder. Aquéllos continúan :la sección líder del RNAm al codón UGA, el cual encuentra entre las regiones uno y dos. Como se .,.¡estra en la parte inferior de la figura, al progre- a este punto, los ribosomas se extienden a la ;:ón dos e impiden que se realice el apareamiento :bases. El resultado es que la región tres queda "'oible para aparearse con la región cuatro, lo - ~genera la horquilla terminadora. Por lo tanto, ::Stas condidoncs, la polimerasa de RNA termina en l:enuador. Cuando no hay triptófano, los ribosomas se de"len en los codones de Trp, los cuales son parte ~ a región uno, como se muestra en la parte su_.or de la figura. Por lo tanto. la región uno es .Jestrada dentro del ribosoma y no puede formar ·es de bases con la región dos. Esto significa que :egiones dos y tres se aparean ames de que se :!1scriba la región cuatro. Esto obliga a la región

TAIPTÓFANO AUSENTE

o A U U A

G O

u e

Trp Trp

a e A A e G G e

'U1UUUUU

e

UGG\UGGCGAACUUCCUGAAAC G ~

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e

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~

CUAAUGAG

El ribosoma se detiene en los oodones Trp

'

TRIPTÓFANO PRESENTE

El rlbosoma avanza -+-o~

Trp Trp

U A

UGGUGGCGAAeUUCCUGAAAeGGGeAauH

1

El movimiento del ribosoma Interrumpe el apareamiento 2:3

é

~ uuuuuu

g8

gg GC e.&A El apareamiento 3:4 forma _ _ J u

la horquilla de terminación

AA

Las alternativas de la polimerasa de RNA en el atenuador dependen de La localización del ribosoma, el cual determina si las regiones tres y cuatro se pueden aparear para formar la horquilla terminadora. 1.}.5 La atenuación puede ser controlada por la traducción

L

337

bacterianos? Se usa en al menos seis operones que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis de aminoácidos. Por lo tanto, la retroalimentación desde eJ nivel de aminoácido disponible para la síntesis proteínica (como lo representa la disponibilidad de: RNAr aminoacilado) hasta la producción de las enzimas puede ser común. El uso del ribosoma para controlar la esLn..tctu.ra secundaria del RNA en respuesta a la disponibilidad de RN'At aminoacilado establece una relaciór inversa entre la presencia de RNAt aminoacUado ~ la transcripción del operón, la cual es equivalente a la situación en la cual el RNAt aminoaciladc funciona como correpresor de la transcripción. mecanismo regulador es me26 nucleólidos

-; ~

l !

,,

-·

siRNA se dlnge al RNAm complementario

PKR

2',5'AS

RNAm degradado

eiF2a 1'

RNAasa L

X La slntesis proteínica ......-"-n ..i'"'" no puede iniciarse íV Degradación de todo el RNAm

El dsRNA inhibe la síntesis proteínica, desencadena la degradación de todos los RNAm en las células de los mamíferos y también tiene efectos específicos de secuencia.

qlle reprimen un gen. El primer nivel de conrrol. y el más frecuente, tiene lugar en la iniciación de la Lranscripción, pero la terminación de la transcripción también puede ser controlada. La traducdón puede ser regida por medio de reguladores que interactúan con el RNAm. Los productos reguladores pueden ser proteínas. las cuales son controladas a menudo por interacciones alosréricas en respuesta al ambiente, o moléculas de RNA, las cuales funcionan al aparearse con el RNA diana para cambiar su estructura secundaria. Las redes reguladoras pue den crearse al ligar reguladores de tal manera que la producción, o la actividad, de un regulador es controlada por oLro. La arenuación es un mecanismo que se sustenta en la regulación de la terminación para controlar la transcripción a través de los operones bacterianos. Se utiliza a menudo en los operones que codifican las enzimas implicadas en la biosímesis de un aminoácido. El RNAm policistrónico del operón comienza con una secuencia que puede for mar estructuras secundarias alternativas. Una de las esrrucruras tiene una horquilla que constituye un terminador intrínseco localizado en sentido ascendente con respecto a los genes estructurales; la esuucrura alternativa cart::ce de la horquilla. Varios tipos de imeracción determinan si se forma la horquilla. Una interacción sucede cuando una proteína se une al RNAm para impedir la formación de la estructura alternativa. En el operón crp de 8 . subtilis la TRAP tiene esta función; es controlada por el antiTRAP cuya producción es controlada a su vez por el nivel de R.NArrrp aminoacilac.lo sin carga. En los operones U .l l Resumen

345

trp (y el1 otros operones) de E. coli. la elección de la estructura que se forma es controlada por el progreso de la traducción a través de una secuencia líder cona que incluye los codones del aminoácido, o de los aminoácidos, que son el producw del sistema. En p resencia de RNAt aminoacilado que porra dicho aminoácido (o dichos aminoácidos), los ribosomas traducen el péplido líder, el cual permite que se forme una estructura secW1daria que respalda la terminación. En ausencia de este RNAt aminoacilado el ribosoma se detiene, lo cual da como resultado una estructura secundaria nueva en la cual la horquilla indispensable para la terminación no puede Iormarse. El abastecimiento del RNAt aminoacilado, por lo tanto, controla (de manera inversa) la biosíntesis de los aminoácidos. Los RNA reguladores peque1i.os se encuentran en las bactexias y en las eucariotas. E. coli tiene -17 especies de sRNA. El sRNA oxyS controla unos 10 loci diana en el nivel postraduccional; algunos de ellos son reprimidos en tanto que otros son activados. la represión es provocada cuando el sRNA se une a un RNAm diana para formar una regíón dúplex que incluye el siLio de unión al ribosoma. Los microRNA tienen una longitud de -22 bases y se producen en numerosas eucariotas por medio de la división de un transcrito más largo. FW1cionan al realizar apareamiento de bases con los RNAm diana para formar regiones dúplex que son susceptibles a la división mediada por las endonudeasas. La degradación del RNAm impide su expresión. La técnica de la interferencia del RNA se ha convertido en el método de elección para desactivar los genes e ucarióticos. Dicha técnica utiliza la introducción de secuencias cortas de dsRNA con una cadena complementaria al RNA diana y funciona al inducir la degradación de las dianas. Este método puede estar relacionado con un sistema de defensa natura l de las p lan tas denominado silenciamiento de RNA.

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IIIJ

Artkulo 3e revisión Yanofsky, C. (1981). Aucnuation in the control of expression of bacterlal operons. Nature 289. 751-75 -

La atenuación puede ser controlada por la traducción Articulos de revisión Bauer, C. E., Carey, J., T tempranos deben seguir expresándose (véase la ). A menudo, la expresión de Jos genes hospedadores disminuye. En conjunto, los dos grupos de genes tempranos representan todas las [unciones requeridas por el fago, excepto aquellas necesarias para el ensamblaje de la envolmra y para la lisis de la célula. Cuando la replicación de l DNA del fago comienza, es el momento indicado para que los genes 1 .

El desarrollo litico es controlado por una cascada

353

SIGUIENTE INICIACIÓN

El control en la iniciación utiliza unidades de transcripción independientes, cada una con su propio promotor y con su propio terminador, las cuales producen moléculas de RNAm independientes. Las unidades de transcripción no necesitan localizarse cerca una de la otra.

-

Reglón 1emprana -

- Reg1on siguiente+ Terminador

ANTITERMINACIÓN

El control en la terminación requiere unidades adyacentes, de modo que la transcripción pueda leer desde el primer gen hasta el interior del siguiente gen. Esto produce un solo RNAm que contiene ambos conjuntos de genes.

t ardíos sean expresados. Su transcripción en esta etapa por lo general se organiza al incrustar un gen regulador más demro del conjunto de genes previo (temprano retrasado o intermedio). Este regulador puede ser otro factor de amiterminación (como en A) o puede ser otro factor cr (como en SPO l ). Una infección lítica a menudo se divide en tres etapas, como se muestra en la Figura 14.4. La primera etapa consiste en la transcripción de los genes tempranos por la polimerasa de RNA hospedadora (en ocasiones los reguladores son los únicos productos 354

CAPÍTULO 14 Estrategias de los fagos

presentes en esta etapa). La segunda etapa consü en la transcripción de los genes bajo la dirección regulador producido en la primera etapa (lama. parte de esws genes codifican enz.imas indisper... bies para la replicación del DNA del fago). La eta final consiste en la transcripción de los genes ~ codifican los componentes del fago bajo la direcc de un regulador sintetizado en la segunda etapa. El uso de estos conh·oles sucesivos, en los cuales ce conjunto de genes contiene un regulador que es necesc para la expresión del siguiente conjunto, crea una case.; en la cual Los grupos de genes son activados (y en oca: nes desactivados) en momentos determinados. Los med: utilizados para construir cada cascada fágica son ~ ferentes, pero los resultados son similares, come rnuescra en las secciones siguientes.

Bit La cascada lítica es controladc por dos tipos de sucesos reguladores (onc~plo

prin(ipat

• Las proteínas reguladoras utilizadas en las cascadas dE los fagos pueden facilitar la iniciación en promotores nuevos (de fagos) o provocar la ultra lectura de los terminadores de la transcripción por parte de la polimerasa hospedadora.

En cada etapa de la expresión fágica, uno o más C! los genes activos es un regulador indispensable pa · la etapa siguieme. El regulador puede adquirir forma de una polimerasa nueva, de un factor cr qrpresión de los genes de clase D (lo!. cua les intervienen sobre todo en las funciones de la síntesis de DNA) y de los genes de dase rn (los cuales tienen que ver con el ensamble de la panícula fágica madura). El fago T4 tiene uno de los genomas fágicos más largos (165 kb), el cual está organizado en agrupamientos funcionales extensos de genes. La presenta su mapa genético. Los genes ~senciales están numerados: una mu1ación en cualquiera de estos loci impide que se complete el ciclo lítico. Los genes no esenciales se indican con abreviaturas de tres letras. {Se definen como no e::senciales conforme a las condiciones habituales de la infección. En reali · dad no se entiende porqué se incluyen tantos genes no esenciales, pero al parecer confieren una ventaja selectiva en algunos de los hábitat del fago T4. En genomas [ágicos más pequeños. la mayor parte o lodos los genes son esenciales.) Hay tres fases de expresión gén.ica. En la se muestra un resumen de las [unciones de los genes expresados en cada etapa. Los genes tempranos los transcribe la polimerasa de RNA hospedadora. Los genes intermedios también son transcritos por la polimerasa de RNA hospedadora, pero también se necesitan dos productos fágicos codificados. MotA y AsiA. Los promotores intermedios carecen de secuencia de consenso en la posición - 30 y en cambio tienen una secuencia de unión para el producto MotA. La protefna fágica es un activador que compensa la deficiencia del promotor al ayudar en la unión de la polimcrasa de RNA hospedadora. {Este mecanismo es similar al utilizado por el fago A., el cual se üusrra después en la rigura 14.30). Los genes tempranos e intermedios representan casi todas las funciones tlel fago implicadas en la síntesis de DNA, la modificación de la esrrucrura celular y la transcripción y traducción de los genes del fago.

14.5 los genomas de los fagos T4 y T7 presentan agrupación funcional

355

RNA tardfo 55 RNA tardlo 45 42 43 62 44 polimerasa de DNA. etc. cabeza 40

sa ot

lk cinasa de timldina denV endonucleasa V /p/1, /p/1/ protefnas internas e lisozima 57 fibra de la coJa 1 clnasa de dNMP 3 terminador de la lámina 2 conclusión de la cabeza 50 conclusión de la cabeza 65 conclusión de la cabeza 80 5 conector de la plataforma

40

41

primase de DNA topoisomerasa 3S riJA, r/IB topolsomerasa 52

o kb

6 7 8 9 10 12 cuña de la plataforma

160

38 37 36 35 34 fibras de la cola

3 H 16 17 waccabeza

120

33 Id ANA tardfo slntetasa de dTMP ligasa de DNA 30 plataforma 54 48 27 51 26 26 conector de la plataforma

78 1ámina 19 cola 20676821222324 hoc inh cabeza

El mapa del fago T4 es circular. Hay un agrupamiento extenso de los genes que codifican los componente.> procesos del fago, como la replicación del DNA, pero también hay dispersión de los genes que codifican una variedad de fun: enzimáticas, entre otras. Los genes esenciales se indican con números. Los genes no esenciales están representados con le~: el mapa se muestran sólo algunos genes representativos del fago T4.

Los dos genes esenciales demro de la categoría de la "transcripción" ejercen una función reguladora: sus productos son necesalios para la expresión de los genes tardíos. La infección por el fago T4 depende de una relación mecánica entre la replicación y la expresión de los genes tardíos . Sólo el DNA que está siendo replicado en forma activa puede utilizarse como molde para la transcripción de los genes tardíos. La conexión se genera al introducir un factor cr nuevo y también al hacer otras modificaciones en la polimerasa de RNA hospedadora. de modo que sea activa sólo con un molde de DNA en replicación. Este víncu lo establece una correlación entre la síntesis de los componentes proteínicos del fago y el número de genomas disponibles para el empaqueramienLo .

Los genes 'A tempranos inmediatos y tempranos retrasados son indispensables

para la lisogenia y para el ciclo lítico Conceptos principales

El fago A. t iene dos genes tempranos inmediatos, N y ero, los cuales son transcritos por la polimerasa de RNA hospedadora. El gen N es necesario para expresar los genes tempranos retrasados. Tres de los genes tempranos retrasados son reguladores, • La lisogenia necesita los genes tempranos retrasados cll y clll.

356

CAPÍTULO 14 Estrategias de los fagos

El ciclo lítico requiere el gen temprano inmediato cr el gen temprano retrasado Q.

Una de las cascadas más intrincadas se obsen:: el fago A.. La cascada para el desarrollo lítico d~o cho es bastante sencilla, con dos reguladores controlan las etapas sucesivas del desarrollo embargo, el circuito del ciclo lítico está entrela ~ con el circu ito utilizado para establecer la lisog · como se resume en la Cuando el DNA del fago A. entra a una nueY.:. lula hospedadora, las rutas lítica y Jisogénica in. · de la misma manera. Ambas requieren la expre de los genes tempranos inmediatos y temprana... trasados, pero después divergen: el desarrollo ~ continúa si Jos genes tardíos son expresados, lisogenia tiene lugar si se establece la síntesis represor. El fago A. tiene sólo dos genes temprano mediatos, los cuales transcribe de manera indediente la polimerasa de RNA hospedadora: • El gen N codifica el factor de antiten:r ci6n cuya acción en los sitios nutpermittproceda la transcripción en los genes :. pranos retrasados (véase la sección l. : La amiterminación requiere sitios que independientes de los terminadores). • El gen ero tiene dos funciones: imph. síntesis del represor (una acción neceo.. · si procede el ciclo lítico) y desactiva b presión de los genes tempranos inmedu (los cuales no son necesarios después ~ ciclo lítico}.

CASCADA LÍTICA ETAPAS TEMPRANA E INTERMEDIA SÍNTESIS DE DNA Replicación 17 genes esenciales 7 genes no esenciales Modificación 3 genes no esenciales ~ECUASORES

DE DNA

Rompimiento del DNA hospedador 2 genes esenciales 5 genes no esenciales de nucleótidos 3 genes esenciales 1O genes no esenciales

~>tabollsmo

:=STRUCTUAA CELULAR 1clones de la membrana 12 genes no esenciales

Lisls 2 genes no esenciales EXPRESIÓN GÉNICA

ESTABLECIMIENTO

L••• ••••••• ••• •• :~~~~~~~~?

r FASETARDfA ENSAMBLE DE LA CABEZA Cabeza y cuello 2 genes esenciales 1 gen no esencial Componentes de la cápside 7 genes esenciales 1 gen no esencial Ensamble de la cápside 5 genes esenciales 4 genes no esenciales Empaque del DNA 3 genes esenciales 2 genes no esenciales ENSAMBLE DE LA COLA Componentes de la plataforma 13 genes esenciales Ensamble de la plataforma 5 genes esenciales 2 genes no esenciales

Traducción

Tubo y lámina

'2 genes no esenciales

4 genes esenciales

Transcripción 2 genes esenciales 5 genes no esenciales

Fibras de la cola 7 genes esenciales 1 gen no esencial

la cascada lítica del fago T4 se divide en dos

-:s: las funciones tempranas se relacionan con la sínte.sis y !. :'esión del DNA; las funciones tardías tienen que ver con =--sambte de la partícula.

:..os genes tempranos retrasados incluyen dos .:s de replicación (indispensables para la infeclítica), siete genes de recombinación (algun os JCad.os en la recombinación durante la infección : y dos necesarios para integrar el DNA A en el .osoma bacteriano para la lisogenia) y tres ge :-eguladores. Los reguladores tienen funciones ,..arias: • Los reguladores el/ y clll son necesarios para establecer la síntesis del represor. • El regulador Q es un factor de antiterminadón que permite que la polímerasa de RNA hospedadora transcriba los genes tardíos. Por lo tanto, los genes tempranos retrasados olen dos propósiws: algunos son necesarios para d fago entre en lisogcnia y los demás tienen que :on el control del orden del ciclo lítico.

represión

Tempranos inmediatos ero= regulador negativo N = antiterminador

:

.... . represión :

y

Tempranos retrasados el/, el// reguladores

7 genes de recombmación 2 genes de replicación Q antitenninador

·activación · ·'' ' ·>

••• ... .. .....

represor e(•,

. v Tardros 10 genes de la cabeza 11 genes de la cola 2 genes de lisis

MANTENIMIENTO LISOGÉNICO

PROGENIE DEL FAGO la cascada lítica del fago A. está entrelazada con el circuito de la lisogenia.

El ciclo lítico depende de la antitermi nación Conceptos principales • pN es un factor de antiterminación que permite a la polimerasa de RNA continuar la transcripción después de tos extremos de los dos genes tempranos inmediatos. • pQ es el producto de un gen temprano retrasado y es un antiterminador que permite a la polimerasa de RNA transcribir los genes tardíos. • El DNA A. forma un círculo después de la infección; como resultado, los genes tardíos constituyen una sola unidad de transcripción .

Para desenredar las dos rutas, se considerará primero sólo el ciclo lítico. La muestra el mapa del DNA del fago A. Un grupo de genes que intervienen en la regulación es rodeado por los genes necesarios para la recombinación y para la replicación. Los genes que codifican los componentes estructurales del fago están agrupados. Todos los genes necesarios para el ciclo lítico se expresan en transcritos policistrónicos a partir de los tres promotores. 14.7 El ciclo lítico depende de la antiterminación

357

Promotores del ciclo lítico Genes de la cabeza Genes de la cola Recombinación Regulación Repllcación Lisis AWBCNu3DEFl ZUVGTHMLK/J att int xisC'J.~ye/11 N el ero el/O P QSR 11

Indispensables para: lisogenia el// mantiene o// llsogenia y lisis N activa los tempranos retrasados lisogenia el es un represor lisogénico lisis oro apaga el represor lisogenia el/ enciende el represor lisis Q activa los tardíos El mapa del fago /, muestra el agrupamiento de funciones relacionadas. El genoma mide 48 514 bp.

f.. tiene unidades de 1ranscripción a la derecha y a la

izquierda ~Unidad de transcripción -

a la izquierda ~Retrasada · ,._Inmediata -

Promotores Terminadores

PL

VJ\; Vl\l.J\.t.:\Ylfv~/i\.IJ\FIWVI IL1

N

PR

ero

'Rl

• Inmediata ~ • Retrasada._ _ Unidad de transcripción + derecha

Etapa temprana inmediata: sólo N y ero son transcritos RNAmN

El fago A. tiene dos unidades de t ranscri pción temprana. En la unidad "que se dirige a la izquierda", la cadena "superior'' se transcribe hacia la izquierda; en la unidad ''que se dirige a la derecha", la cadena "inferior" se transcribe hacia la derecha. los genes N y ero son los elementos tempranos inmediatos y están separados de los genes tempranos retrasa· dos por los terminadores. La sí ntesis de la proteína N permite que la poli me rasa de RNA deje atrás a los terminadores tu a la izquierda y a los t R1 a la derecha.

La muestra que los dos genes Lempranos inmediatos, N y ero, son transcritos por la polimerasa de RNA hospedadora. El gen N se transcribe hacia la izq uierda y el gen ero hacia la derecha. Cada transcritO es terminado en el extremo del 358

CAPÍTULO 14 Estrat egias de los fagos

gen. El regulador pN permite que la transcripdór continúe en los genes tempranos retrasados. Es ur factor de antiLerminadón que suprime el uso eL los terminadores ll y tR (véase la sección 11.25, Le_ factores de terminación y de antiterminación interactúan con la polimerasa de RNA}. En presend.; del regulador pN, la transcripción con tinúa hacia k izquierda del gen N dentro de los genes de recorP-· binación y hacia la derecha del gen ero dentro de ll ' genes de replicación. El mapa que se muestra en la Figura 14. 1 muestra la organización del DNA A. como exisie en la particula del fago . No obstante, poco despue~ de la infección los extremos del DNA se unen pa:-¿ formar un círculo. La muestra el verdadero estado del DNA A. durante la infección. L•. genes tardíos están soldados en un solo grupo, ~ cual contiene los genes de lisis S-R a partir del extremo derecho del DNA 1íneal y los genes de la cabeu y de la cola A-Ja partir del extremo izquierdo. Los genes tardíos se expresan como una so-: unidad de transcripción, comenzando desde un pr acción colaboradora enrre los dímeros, como de formaci ón del dímero entre subunidades. La muestra que involucra a ambas subunidacL de cada dímero, es decir, cada subunidad contac: a su contraparte en el otro dímero y se forma u-_ estructura tetramérica. Una consecuencia de la unión colaboradora ~ el incrememo de la afinidad efectiva del repres por el operadm en concemraciones fisiológicas. Es. permite la presencia de una concentración men de represor para lograr la ocupación del operadC'Ésta es una co nsideración importante en un sisterr en el cual la liberación de la represión tiene come

-

S1tio de union de la pol1merasa de RNA PRM - - -

~-:5Ina represora

-reo Ser Met NH2 1\CACGAGUAppp "' o\mdect

--.TGTGCTCATACGTTAAATCTATCACCGCAAGGGATAAATATCTAACACCGTGCGTGTTGACTATnTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGC -~CACGAGTATGCAATTTAGATAGTGGCGTTCCCTATTTATAGATTGTGGCACGCACAACTGATAAAATGGAGACCGCCACTATTACCAACG

pppAUG -

RNAmde ero Sitio de unión de la pollmerasa de RNA PR- - +

CAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGAGCACATCA GTCTATTGGTAGACGCCACTATTTA ATAGAGACCGCCACAACTGTATTTATGGTGJICCGCCACTATGACTCGTGTAGT pppAUCA RNAmdeN

-

Sit1o de unión de la pollmerasa de RNA PL----.

Cada operador contiene tres sitios de unión al represor y se superpone al promotor al cual se une la polimerasa de Se ha invertido la orientación de 01 con respecto a lo habitual para facilitar la comparación con 01 •

El represor en OR2 interactúa con la polimerasa de RN A en el P RM Conceptos pñncipales • la región de unión al DNA del represor en OR2 contacta a la polimerasa de RNA y estabiliza su unión al PR,..

• Ésta es la base del control autógeno del mantenimiento del represor. Cuando los dos dímeros represores de A. se unen :Jlaboraci6n, cada una de las subunidades de un dímero :~ ~ontacto con una subunidad del otro dímero.

=ncias irreversibles. En un operón que coctifica :imas metabólicas, la imposibilidad de reprimir 5Ólo permitirá la síntesis innecesaria de enzimas. embargo, la incapacidad de reprimir al profago rovocará la inducción del fago y la lisis de la .IIa. Por las secuencias ilustradas en la Figura 14.23, uedc observar que 0 1 1 y ORl se encuentran más _en os en el centro de los sitios de unión de la :.merasa de RNA de P1 y de PR. respectivamente. -,o tanto, la ocupación de 0 1 1-0L2 y de OR1-0R2 .;uea en términos físicos el acceso de la polime~ de RNA a los promotores correspondientes.

En la transcripción de el, se observa una relación difereme entre OR y el promotor PPM' El sitio de unión de la polimerasa de RNA es adyacente a OR2. Esto explica la manera en la que el represor regula de forma autógena su propia smtesis. Cuando dos dímeros están unidos a O"R I-OR2. el dímero que se encuentra en OR2 interactúa con la polimerasa de RNA (véase la Figura 14.26 de la sección 14.15, El represor mantiene un circuito autógeno). Este efecto reside en el dominio amino terminal del represor. Las mutaciones que eliminan el control positivo se mapean en el gen el. los miembros de una clase interesante de mutames mantienen la capacidad de unirse al operador para reprimir la transcripción, pero no pueden estimular a la polimerasa de RNA para que transcriba desde PR....,. Se mapean entre un

14."4 El represor en OR2 interactúa con la polimerasa de RNA en el PR"'

365

dio de una interacción electrostática con una regi básica en la polimerasa de RNA. La ubicación de estas "mULaciones de com: positivo" en el represor se indica en la Se encuentran en un sitio localizado en el repres que esrá cerca de un grupo fosfato del DNA, el et también está cerca de la polimerasa de RNA. F lo tamo, el grupo de aminoácidos del represor q participa en el control positivo se encuentra en t..:' posición que le permite entrar en contacto cor polimerasa. El principio importante es que las in Las mutaciones de control positivo identifican una región minúscula de la hélice 2 que interactúa de manera directa con la polimerasa de RNA.

..................

LISOGENIA •

•• 1

•••• 1

••••• •

••• •

dfmero represor

..

t monómero represor

.. ..

OLIPL

RNAmdeN

..

la pollmerasa de El represor tmpíde ANA se une a Pm., que la polimerasa de y 1ranscrtbe el ANA se una a PR CICLO LÍTICO

t

La pallmerasa de RNA inicia en Pt. ANAm deCro

La lisogenia se mantiene por medio de un circuito autógeno (sección superior). Si este circuito es interrumpido, el ciclo lítico comienza (sección inferior).

pequeño grupo de aminoácidos que se localizan en el exterior de la hélice 2 o en la vuelta que se encuentra entre la hélice 2 y la hélice 3. Las mutadones reducen la carga nega(iva de la región; por el contrario, las mutaciones que incrementan la carga negativa intensifican la activación de la polimerasa de RNA. Esto sugiere que el grupo de aminoácidos constituye una ''zona ácida" que funciona por me366

CAPÍTULO 14 Estrategias de los fagos

El sitio diana de la polirnerasa de RNA que co tacta el represor está en la subunidad cr70, der.· de la región q ue h ace co ntacto con la región del promotor. La in teracción entre el represor' polimerasa es indispensable para q ue la polimer.; efectúe la rransición de un complejo cerrado a complejo abierto (véase también la Figura 14. 31 Esto explica la manera como los niveles bajos_ represor regulan en forma positiva su propia sín-sis. Siempre que haya suficiente represor para ller· a On2, la polimerasa de RNA continuará transCi' hiendo al gen el de PRM'

El represor mantiene un circuito autógeno

RNAmdecl

El represor omplde que la palimeresa de ANA se una a PL

acciones proteína-proteína pueden liberar energía qlh aprovecha para ayudar a iniciar la transcripción.

Conceptos principales • La unión del represor a gen N del PL.

ol bloquea la transcripción de

• La unión del represor a O~ bloquea la transcripción de ero, pero es indispensable para la transcripción de el. • Por lo tanto, la unión del represor al operador bloquez la entrada al ciclo litico al tiempo que faci lita su pro¡:-, síntesis.

El represo r se une de manera independiente a dos operadores. Tiene una sola función en OL2, pt tiene funciones dobles en OR. Éstas se ilustran er región superior de la En Ov el represor tiene el mismo tipo de efe.:que se analizó en muchos otros sistemas: imp que la polimerasa de RNA inicie la transcripc' en PL. Esto detiene la expresión del gen N. P utilizado en todos los episodios de transcripción los genes tempranos a la izquierda; como resulta.. esta acción impide la expresión de toda la unidad transcripción temprana a la izquierda. Por lo La

el ciclo lítico es bloqueado antes de que pueda prosegz. las fases posteriores a la etapa iemprana. En OR 1, la unión del represor impide el uso PR. De este modo, ero y los otros genes tempra.r a la derecha no pueden ser expresados. (Más a

e se analizará porqué es importante impedir la de ero durante el mantenimiento de la

r~sión

;o;!nia.) 5in embargo, la presencia del represor en OR L orro efecto. El promotor de la síntesis del re"'l r, PRM' es adyacente al operador ORa la dere- Resulta que la polimerasa de RNA P'tede iniciar

Ot1

ro:

N

--+

_;nera eficiente en P RM sólo cuando el represor está ·:-a OR. El represor actúa como una proteína

- _¡adora positiva necesaria para la transoipción ~en el (véase la sección 14. 14, El represor en :. ~ meractúa con la polimerasa de RNA en dPRM). "!71resor es el producto del gen el; por lo tanto, esta .Jcción crea un circuito autógeno positivo, en el cual