CITOHISTOPATOLOGÍA PROCEDIMIENTOS BÁSICOS
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CITOHISTOPATOLOGÍA PROCEDIMIENTOS BÁSICOS
Herminia Casandra Rodiles Martínez Lic. Tecnología de la salud en citohistopatología Profesora auxiliar Lic. Juana Elena Campanón Logaz Lic. Tecnología de la salud en citohistopatología Profesora instructora Lic. Celinda Laza Caballero Lic. Tecnología de la salud en citohistopatología Profesora instructora
La Habana, 2008 3
Rodiles Martínez, Herminia Casandra et al. Citohistopatología. Procedimientos básicos. / Herminia Casandra Rodiles Martínez, Juana Elena Campanón Logaz, Celinda Laza Caballero. La Habana: Editorial Ciencias Médicas, 2008. [vi], 62 p. : il. Bibliografía al final de la obra. ISBN 978-959-212-281-9
Edición: Dra. Giselda Peraza Rodríguez Diseño: Tec. Yisleidy Real llufrío Emplane: Dunia Maritza Herrera Arozarena
© Herminia Casandra Rodiles Martínez; Juana Elena Campanón Logaz y Celinda Laza Caballero, 2008 © Sobre la presente edición Editorial Ciencias Médicas, 2008
Editorial Ciencias Médicas Centro Nacional de Información de Ciencias Médicas Calle I No. 202, esquina Línea, Vedado, Ciudad de La Habana, 10400, Cuba Correo Electrónico:
[email protected] Teléfonos: 838 3375, 832 5338
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Contenido Parte I Introducción/ 1 CAPÍTULO 1.
Introducción al Programa de Procedimientos Básicos/ 2
Reseña histórica en la formación de técnicos/ 2 Conceptos importantes en el Programa de Procedimientos Básicos/ 3 Nuevas ramas especiales de la técnica/ 4 Trabajo asistencial, docente y científico del Servicio de Citohistopatología/ 4 CAPÍTULO 2.
Programas de prevención del cáncer/ 6
Generalidades de los programas de detección del cáncer/ 6 CAPÍTULO 3.
Laboratorio de citodiagnóstico/ 8
Citopatología / 8 Procedencia del material citológico/ 8 Tipos de muestras en citopatología exfoliativa/ 8 Clasificación de las muestras citológicas/ 9 Funciones del laboratorio. Su organización/ 10 CAPÍTULO 4.
Laboratorio de histopatología/ 11
Introducción al laboratorio/ 11 Procedencia del material biológico y citológico/ 12 Recepción del material biológico y citológico/ 12 Procesamiento del material citológico/ 13 Métodos de la anatomía patológica / 14 CAPÍTULO 5.
Procedimientos de la técnica histopatológica/ 17
Generalidades/ 17 Fijación de los tejidos/ 17 CAPÍTULO 6.
Procesamiento del material biológico y citológico/ 24
Sustancias deshidratadoras/ 24 Aclaración o desalcoholización/ 25 Infiltración de tejidos/ 26 Procesador automático de tejido/ 27 5
CAPÍTULO 7.
Medios de inclusión/ 28
Preparación de los medios de inclusión/ 28 Inclusión con moldes de Leuckart/ 28 Equipo que se utiliza en la inclusión/ 29 CAPÍTULO 8.
Corte de los tejidos/ 30
Micrótomos de tejidos/ 30 Equipos necesarios durante del corte de los tejidos/ 34
Parte II Introducción/ 37 CAPÍTULO 9.
Bioseguridad en los laboratorios de citohistopatología/ 38
Introducción a la bioseguridad/ 38 Conceptos más utilizados en bioseguridad/ 38 Principios de bioseguridad en los laboratorios/ 41 CAPÍTULO 10.
Técnica de la toma de muestras citológicas/ 42
Generalidades/ 42 Interrogatorio/ 42 Recolección de la muestra cervicovaginal/ 44 Extensión y fijación del material citológico/ 48 CAPÍTULO 11.
Cristalería del laboratorio/ 51
Generalidades de la cristalería/ 51 Clasificación de la cristalería/ 51 Limpieza de la cristalería/ 52 CAPÍTULO 12.
Coloraciones en las técnicas histológicas y citológicas/ 53
Coloración/ 53 Coloración de rutina o de información general/ 55 Coloración en citología/ 58 Medios de montaje/ 60
Bibliografía/ 61
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PARTE I Introducción El texto aborda, en esta primera parte, el estudio de los fundamentos técnicos y manipulaciones necesarias para llevar a cabo el estudio mediante el análisis de muestras de células y tejidos, de seres vivos y fallecidos. Estas muestras proceden de individuos o animales sanos y enfermos, y permiten el diagnóstico o investigación causal de la enfermedad o de la muerte. Los límites tecnológicos de esta ciencia (citohistopatología) se ampliaron para dar cabida a diferentes métodos de estudios biológicos que emplean técnicas cada vez más sofisticadas, como son: los cultivos celulares, la inmunohistoquímica, la biología molecular, la inmunofluorescencia, la microscopia electrónica, etc.; las cuales se tratan en otros manuales, ya que el presente libro responde a la necesidad de aprendizaje de los estudiantes que cursan el primer ciclo, de primer año, del perfil de citohistopatología.
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Introducción al Programa de Procedimientos Básicos Reseña histórica en la formación de técnicos Antes del triunfo de la Revolución no existía disciplina que aplicara en sus contenidos las técnicas de citohistopatología. En todo el país existían 13 laboratorios de anatomía patológica construidos entre 1929 y 1950. El personal técnico estaba integrado por 22 trabajadores de origen empírico. Por primera vez en Cuba, en 1951, se formó la Escuela de Técnicos Generales en el Instituto “Dr. Carlos J. Finlay” en Ciudad de La Habana, con cursos de 1 año de duración. Posterior al triunfo de la Revolución, en 1966, se inicia la formación de cursos de Anatomía Patológica y Citología con 1 año de duración en Ciudad de La Habana y provincias capitales. Después se extiende a 2 años con nivel de ingreso de 9no. grado. En l971 se comienzan a formar citotécnicos en cursos de 3 años, convalidándose a los técnicos auxiliares de ambas especiales en 1972 por Resolución Ministerial. Tras un período de 5 años recesan los cursos en La Habana, no así en otras provincias. Se reanuda en 1980 con un perfil más amplio: Citohistopatología. Se modifica el nivel de ingreso con 12mo. grado en 1984. La Licenciatura en Tecnología de la Salud, perfil de Citohistopatología surge en 1989, con 5 años de duración y cursos por encuentros. Este nuevo modelo que se establece permite formar un perfil profesional con tres ciclos de formación de egresados. Se propone una reestructuración de los conocimientos de los laboratorios de citohis-topatología, pues responden a una particular necesidad de contar con un personal capacitado, lo suficiente, para resolver con máxima calidad problemas técnicos y profesionales, permitiendo la formación del licenciado en tres ciclos: un primer ciclo, con un año de duración egresando como técnico básico, un segundo ciclo por dos años, egresando como técnico medio y un tercer ciclo con dos años de duración, egresando como licenciado. En el primer ciclo, con la asignatura de Procedimientos Básicos, el propósito es brindar los elementos esenciales que le permitan estar preparados 2
para asumir su labor como técnico básico con el máximo de calidad; con la capacidad de: 1. Realizar los procedimientos básicos de inclusión de tejido, corte de bloque y coloraciones habituales. 2. Realizar la toma de muestra en citología cervicovaginal. 3. Realizar la recepción y clasificar las muestras citológicas de las diferentes áreas de salud. 4. Aplicar las normas éticas y de bioseguridad en los laboratorios.
Conceptos importantes en el Programa de Procedimientos Básicos Salud-enfermedad. El concepto de enfermedad se debe entender vinculado de forma estrecha al concepto de salud, que consiste en el equilibrio estable. El concepto de enfermedad surge de la situación que se conoce como: estado de salud que, según la definición de la Organización Mundial de la Salud (OMS), consiste en el perfecto equilibrio psíquico, físico y biosocial del individuo con respecto al medio. La ruptura del equilibrio en cualquiera de estas esferas de la vida, si no es restituido de manera adecuada, origina la enfermedad. Según la procedencia de los tejidos y la finalidad de sus estudios es posible distinguir entre material histológico y material anatomopatológico. Material histológico. Toda muestra de tejido obtenida de un individuo o animal sano, con la finalidad de investigar su estructura y composición normales, y se obtienen por lo habitual a partir de cada ser. Material anatomopatológico. Toda muestra procedente de individuos o animales enfermos utilizados para el diagnóstico o investigación causal de la enfermedad. Para la mejor compresión sobre las diferentes funciones que se realizan en los laboratorios de citohistopatología es necesario el dominio de ciertas terminologías como: 1. Anatomía. Es la ciencia que estudia la forma y estructura del cuerpo, sus partes, sus órganos y, de estos, su forma, color, tamaño, peso, posición y su relación con otros órganos. Esta anatomía según el estudio que se va realizar de divide en: a) Anatomía macroscópica. Es la encargada de estudiar las estructuras distinguibles a simple vista (forma, color, tamaño, etc.). b) Anatomía microscópica. Se encarga del estudio de las estructuras internas no visibles a simple vista (cortes de tejidos por medio del microscopio). 3
2. Patología. Proviene del griego Pathos, enfermedad o dolencia y logos tratado, es también una rama de las ciencias naturales que estudia las causas, los mecanismos y efectos de la enfermedad en cualquier ser vivo. 3. Anatomía patológica. Estudia las alteraciones morfológicas y estructurales de los órganos, tejidos y células en el transcurso de la enfermedad. 4. Citología. Es la rama de la biología que se dedica al estudio de las células, como una entidad morfológica y fisiológica, en la estructura de los seres vivos. Estudia las células que normalmente se desprendan de cavidades o conductos del cuerpo humano y, que se pueden encontrar, formando parte en líquidos corporales (orina, jugo gástrico, líquido ascítico, pleural, secreciones mamarias, esputos, secreciones cervicovaginal, etc.).
Nuevas ramas especiales de la técnica Con el desarrollo de la ciencia y la técnica, y el trabajo multidisciplinario en hospitales y centros de investigación, nuevas ramas de las ciencias naturales se incorporan a la anatomía patológica, y aportan métodos de estudios, experiencias y resultados para abordar la investigación de la enfermedad como son: la bioquímica, la inmunología, la microbiología y la radiología, con lo cual se profundizan y completan los conocimientos sobre los diferentes procesos patológicos. De igual manera, se aplican ramas especiales de la técnica, como son: la histoquímica, la microscopia electrónica, la microscopia de fluorescencia, el cultivo de tejidos y la historradiografía, con los cuales se amplía de forma constante el campo de observación y demostración de muchas enfermedades.
Trabajo asistencial, docente y científico del Servicio de Citohistopatología Por todo lo anterior expuesto ya se está en condiciones de valorar la importancia de la especialidad tanto en el trabajo asistencial como en el docente y científico. 4
El trabajo asistencial permite estudiar, con todo rigor, las alteraciones estructurales que ocasionan las enfermedades para llegar a un diagnóstico preciso, con lo cual se puede establecer un tratamiento efectivo a los pacientes y determinar el pronóstico de las enfermedades. El aspecto docente permite formar al personal técnico y licenciado de la salud, con una idea objetiva y cierta de la base estructural de las enfermedades, facilitando su compresión y dominio. Desde el punto de vista científico, es un elemento de ayuda y de control para aspirar a la máxima calidad del trabajo y posibilitar la labor científica investigativa por medios más rigurosos, en el que las relaciones causaefecto y estructura-función, están presentes de manera permanente en el estudio de cada enfermedad. La citohistopatología es una especialidad médica básica y pertenece al grupo de las que reciben la denominación de “medios de diagnóstico” o “patología clínica”. Consta de las secciones de trabajo siguientes: 1. Secretaría y archivo. 2. Laboratorio de histopatología o anatomía patológica. 3. Laboratorio de citodiagnóstico o citología. 4. Morgue. 5. Diagnóstico.
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Programas de prevención del cáncer Generalidades El cáncer es un problema de primer orden en la salud pública mundial, representa la segunda causa de muerte en la mayoría de los países desarrollados, solo precedida por las enfermedades vasculares. Durante los próximos 25 años, el ritmo de incremento del cáncer, tanto en su incidencia como en la mortalidad indica que se deben producir 300 millones de casos nuevos y 200 millones de muertes por esta causa. Las dos terceras partes de estos casos, se pronostica que ocurran en países en desarrollo, de igual forma se estima que para el año 2020 se deben producir 20 millones de casos nuevos cada año (los valores absolutos de incidencia mundial han pasado de 6 millones en 1975 a 7,5 millones en l995 y más de 10 millones en el 2000). Quienes lo padecen, 70 % viven en países que cuentan con menos de 5 % de los recursos para el control del cáncer. En la actualidad se diagnostican poco más de 6 millones de casos nuevos al año. Los tumores de mama, pulmón, cérvix, próstata y colon están entre los cánceres más frecuentes y agrupan más de 50 % de los casos nuevos diagnosticados cada año en países de la región. La detección temprana incluye dos aspectos fundamentales: la educación para la alerta o sospecha (tanto a la población general como a los profesionales de la salud) y el pesquizaje activo, para lo cual existen diferentes políticas, como por ejemplo: detección como parte de la práctica médica específica y programas organizados de pesquisa.
Programa de la cavidad bucal las 1. 2. 3.
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El Programa de prevención del cáncer de la cavidad bucal consiste en acciones siguientes: Realizar examen una vez al año, a la población de 35 años y más. Educar a la población en el autoexamen bucal. Remitir al estomatólogo, los pacientes con lesiones premalignas diagnosticadas por medio del examen clínico.
Programa de detección de cáncer de mama 1. 2. 3. 4.
Este Programa consiste en las acciones siguientes: Autoexamen de las mamas. Examen físico de las mamas por un personal bien entrenado. Mamografía a las mujeres de 50 años o más, cada 2 o 3 años. Combinación.
Programa Nacional de Diagnóstico Precoz del Cáncer Cervicouterino Las acciones generales del Programa de Diagnóstico Precoz del Cáncer Cervicouterino se abordan en la segunda parte de este libro. Para profundizar en el tema ver el folleto: Programa nacional de diagnóstico precoz del cáncer cervicouterino, Colectivo de Autores, año 2001.
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Laboratorio de citodiagnóstico Citopatología La citopatología es la parte de la anatomía patológica que, mediante diversos procedimientos, estudia las alteraciones morfológicas de las células desprendidas libremente en los epitelios de revestimientos o extraídos de distintas zonas del cuerpo.
Procedencia del material citológico El material citológico para estudio tiene varios lugares de procedencia, estos son: 1. Consultorio del médico de la familia. 2. Policlínico sin médico de la familia. 3. Hospitales rurales que realizan acciones de atención primaria de salud. 4. Consulta de toma de muestra a pacientes en estudio y seguimiento de la consulta de patología de cuello. 5. Salón de operaciones. 6. Consulta de biopsia por aspiración con aguja fina (BAAF), punción por aspiración por aguja fina (PAAF) o citología por aspiración con aguja fina (CAAF), según países. 7. Otros estudios (orina, esputo, líquidos de la cavidad oral, cefaloraquídeo, plural, ascítico, etc.)
Tipos de muestras en citopatología exfoliativa Existen varios tipos de muestras en citopatología exfoliativa, dependen de la técnica que se utilice para obtenerlas y la región u órgano que se explore, como se relacionan a continuación: 1. Por exfoliación forzada, mediante frotamiento o raspado con diversos instrumentos en la epidermis y los epitelios que son continuación de esta. 8
2. Aprovechamiento de líquidos que transportan los elementos descamados de forma espontánea (esputo, orina, secreciones, etc.). 3. Mediante instrumentos de exploración o punción, como es la punción por aguja fina que extraen el componente líquido con células en suspensión procedente de zonas orgánicas internas (tracto respiratorio, tubo gastrointestinal, cavidades serosas), de esta manera, los territorios orgánicos que con mayor frecuencia se estudian mediante citología exfoliativa son: a) Aparato genital femenino. b) Árbol respiratorio. c) Aparato digestivo. d) Vías urinarias. e) Piel. f) Cavidades orgánicas: peritoneal, pleural, pericárdica, raquídea y articular. En la actualidad, el desarrollo de esta ciencia se ha beneficiado de la utilización, a gran escala, de la punción con aguja fina, la continua ampliación de esta modalidad a diferentes territorios orgánicos, y su empleo dirigido a través de la visión por ecografía o mediante tomografía computarizada que ha posibilitado el acceso a zonas más profundas del organismo.
Clasificación de las muestras citológicas Esta clasificación como establece el Programa Nacional de Diagnóstico Precoz del Cáncer Cervicouterino se aplica, según el caso, en las áreas de salud y a cargo de la jefa del Programa a esa instancia, que tiene la responsabilidad del control y seguimiento en cuanto a la asistencia a consulta de patología de cuello, y a la repetición de la prueba en caso de pacientes con citología anormal o no útil para diagnóstico. La clasificación es la siguiente: 1. Caso nuevo: aquella mujer objeto del Programa, que se realiza por primera vez en su vida la prueba citológica, sea cual sea el resultado de esta. 2. Reexamen: se le realiza reexamen a las mujeres que: a) Sean objeto del programa, cuyo resultado anterior fue negativo y desde la fecha de este hacia la actualidad han pasado 36 meses o más. b) Mujeres, cuya prueba anterior fue no útil y ha transcurrido más de 1 año de dicho resultado. 9
3. Repetición de no útil: examen citológico que se realiza a la mujer cuya muestra anterior fue no útil para diagnóstico, antes de los 12 meses posteriores de dicho resultado. 4. Fuera de Programa, consiste en: a) Examen citológico que se realiza fuera de la unidad de detección, a la cual corresponde la paciente. b) Examen que se realiza a una mujer que tenga menos de 25 años de edad.
Funciones del laboratorio. Su organización Está dirigido por un citopatólogo el cual mediante actividades técnicas controla el cumplimiento de las normas establecidas, para obtener el máximo de calidad en el trabajo de laboratorio, que incluye: la recepción, procesamiento y diagnóstico de los diferentes estudios citológicos. Las funciones son: 1. Recepción de las muestras. 2. Inscripción en el libro de registro. 3. Rotulación. 4. Coloración de las muestras. 5. Informe de resultados. 6. Preparación de los lotes para su envío a los lugares de procedencia. 7. Preparación de reactivos y colorantes (si fuese necesario). 8. Relación con los policlínicos y los jefes de programas. 9. Mantener: a) El archivo de láminas patológicas. b) El archivo de láminas revisadas en el control de la calidad.
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Laboratorio de histopatología Introducción al laboratorio El departamento de citohistopatología es el lugar donde los patólogos realizan sus actividades de diagnóstico de forma conjunta con un colectivo de trabajadores que incluye: licenciados, técnicos, técnicos evisceradores (morgue) o tanatólogos, personal secretarial y de servicio. Por lo tanto consta de las secciones de trabajo siguientes: 1. Secretaría y archivo. 2. Laboratorio de histopatología. 3. Laboratorio de citodiagnóstico. 4. Sección morgue. 5. Sección de diagnóstico. En el laboratorio es donde se realiza la técnica histopatológica y citológica que consiste en métodos y procedimientos que tienen por objeto la preparación de los tejidos y las células para su observación al microscopio, que permita realizar un diagnóstico. Las diferentes secciones del laboratorio tienen las tareas siguientes: 1. Procesamiento de los tejidos. 2. Procesamiento de líquidos corporales. 3. Inclusión de los tejidos. 4. Corte de los tejidos. 5. Técnicas de coloración general o de rutina. 6. Técnicas de coloración para evidenciar las estructuras de los diferentes tejidos. 7. Técnicas para demostrar sustancias químicas conocidas (histoquímica). 8. Técnicas por congelación. 9. Técnicas especiales (inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, microscopia electrónica, etc.).
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Procedencia del material biológico y citológico El trabajo de rutina en el laboratorio comienza desde que llega el material biológico y citológico, objeto de estudio, puede tener diferentes procedencias como son: 1. Quirúrgicos (salón de operaciones). 2. Consultas externas. 3. De consultas específicas (patología de cuello, consultas de piel, etc.). 4. De la morgue (en el caso de los fallecidos). 5. De las salas de los distintos servicios (medicina interna, nefrología, dermatología, proctología, etc.). 6. Cirugía menor. 7. De otras unidades asistenciales donde no se brinde el servicio de anatomía patológica.
Recepción del material biológico y citológico La recepción consiste en darle entrada en los libros de registros que se encuentran habilitados para estos, como son los libros para: las biopsias, necropsias y líquidos o material citológico.
Sección de secretaria y archivo La secretaria es la encargada de inscribir en los libros correspondientes todos los estudios realizados en el servicio, digitalizar o mecanografiar todos los resultados y enviarlos a las distintas dependencias del hospital. Además, debe archivar copias de todos los informes, de modo que todo el material manejado en el departamento esté en función de la asistencia, la docencia y la investigación. Una vez que están identificadas las muestras de tejido o de órganos, de forma correcta, se les realiza la descripción macroscópica, o examen macroscópico, que no es más que describir de manera exacta el tipo de material remitido para estudio, incluidas sus dimensiones, lesiones que contiene, así como, especificar su morfología, aspecto, coloración y en el caso de las piezas quirúrgicas, sus relaciones con estructuras vecinas. También tiene como objetivo, seleccionar de manera detallada las áreas sobre las que se va a realizar el estudio microscópico, esto es de 12
gran importancia, ya que una selección errónea puede traer consecuencias muy graves. Esta descripción macroscópica se realiza por el personal facultativo de este servicio (médicos residentes y patólogos) y posteriormente se le entrega al personal técnico para el procesamiento del material biológico.
Procesamiento del material citológico Los líquidos citológicos para su preservación se deben, inmediatamente colocar en la centrífuga; equipo eléctrico que se utiliza para apresurar la sedimentación de sustancias suspendidas en los líquidos. El material suspendido se precipita por orden según su peso. Procedimiento para centrifugar. Consiste en varios pasos, los cuales son los siguientes: 1. Extraer los portatubos del cabezal. 2. Colocar el líquido en los tubos de ensayo cónico, con igual proporción en cada uno. Si no tienen la misma medida se añade agua, a uno de estos, hasta equilibrarlos. 3. Situar los portatubos, que contienen los tubos en posición diametralmente opuestas, en la centrífuga y tapar esta última. 4. Conectar el motor, aumentando de forma gradual y progresiva la velocidad hasta que alcance el número de revoluciones por minuto deseado. 5. Cuando se ha centrifugado el tiempo requerido, desconectar el motor y dejar que la centrífuga se detenga sola. Nunca apresurar con la mano la detención de la centrífuga. Recordar siempre que: se deben balancear los portatubos; no aumentar la velocidad en forma brusca y no apresurar la detención manualmente. El sedimento es el que se extiende por medio de un pincel en la lámina portaobjeto, y se fija en alcohol absoluto o 95 %. El tiempo que se debe centrifugar depende del líquido, como se explica a continuación: 1. Orina: 30 min. 2. Pleural: 15 min. 3. Cefalorraquídeo: 5 min. 4. Ascítico: 5 min.
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Métodos de la anatomía patológica En anatomía patológica existen procedimientos o métodos de estudios generales de investigación, estos son: 1. Biopsias. 2. Exámenes citológicos. 3. Necropsias. 4. Métodos experimentales.
Método de la biopsia La biopsia (del griego bios, vida, y opsia, observar) es un procedimiento por medio del cual se obtiene un fragmento de tejido de un ser vivo, con el objetivo de someterlo a un estudio microscópico y establecer un diagnóstico. El término de biopsia se aplica a todo un proceso que comprende: 1. Obtención o toma de la muestra. 2. Procesamiento mediante técnicas histológicas. 3. Observación microscópica y su diagnóstico. El objetivo fundamental o más frecuente de la biopsia es llegar al diagnóstico cierto del proceso o enfermedad que se estudia, o confirmarlo si se sospecha; pero también se puede hacer para determinar la respuesta o evolución de una enfermedad. El estudio biópsico tiene gran importancia, ya que es un método de investigación y diagnóstico riguroso y confiable, con el cual se obtiene la información para poder definir una terapéutica ya sea medicamentosa, por radiaciones o quirúrgica y establecer un pronóstico para el enfermo. Los tipos de biopsia son los siguientes: 1. Por incisión: consiste en la extirpación de un fragmento de la lesión. 2. Por aspiración: es la obtención de un cilindro de tejido por medio de un trocar que se introduce en el órgano que se necesita estudiar. Este tipo de biopsia es útil en órganos profundos, o no accesibles, como el riñón, el hígado, el pulmón, la próstata, etc. 3. Por excisión: es la extirpación de toda la lesión, junto con un margen adecuado de tejidos periféricos sanos. 4. Transoperatoria o por congelación: es la biopsia que se realiza durante el acto quirúrgico, congelando el tejido, de modo que es posible llegar a un diagnóstico rápido, para la toma de una decisión sobre el tratamiento a seguir. 5. Posoperatorio: es otro tipo de estudio mediante biopsia que se le hace a las piezas u órganos que se extirpan, con el objeto de confirmar el diagnóstico. 14
Muestras o exámenes citológicos La obtención de muestras para realizar diagnósticos se realizan mediante las vías o métodos siguientes: 1. Recolección de secreciones y excreciones. 2. Aspiración, biopsia por aspiración con aguja fina: citopunción. 3. Impronta (secreción mamaria). 4. Líquidos corporales, ejemplos: bronquial, cavidades serosas (ascítico, pleural cefalorraquídeo), esófago, estómago, orina, etc. 5. Cavidad oral (raspado): se dice que estos exámenes son variedades de biopsia, pues se estudian las células de un ser vivo.
Métodos de la necropsia o autopsia La necropsia (del griego nekros, cadáver, y opsis, visión u observación) significa, etimológicamente, investigar por uno mismo, y consiste en el estudio de un cadáver mediante su observación cuidadosa, debe incluir la apertura de sus cavidades y el examen de todos sus órganos y tejidos, con el propósito de investigar en sus órganos la causa de la muerte o la enfermedad fundamental que tuvo que ver con este proceso. Los tipos de necropsias son los siguientes: 1. Necropsia clínica: se realiza en los casos de muerte natural, cuando el paciente llega a la etapa final de una enfermedad. La autopsia clínica, pone el máximo interés en analizar los hallazgos observados con la finalidad de conocer la historia natural de la enfermedad que provocó la muerte. 2. Necropsia médico legal: se realiza en los casos de muerte violenta (homicidios, suicidios, accidentes) o sospechoso de tal. Trata de investigar el origen de un fallecimiento cuando existen implicaciones penales o civiles en la causa o en las circunstancias de este; la realiza el médico forense. Lo que se espera de esta necropsia es que ayude a determinar el momento y las circunstancias de la muerte; información que se puede emplear como prueba en el proceso de la acción judicial.
Método de la citología exfoliativa Es un método de investigación que se emplea con frecuencia en la práctica médica, y consiste en la obtención de muestras de exudados, secreciones o líquidos de cualquier parte del organismo, para su examen microscópico, con el objetivo de llegar a un diagnóstico mediante el estudio celular. 15
Igual que la biopsia, se utiliza en cualquier alteración o enfermedad de diversos aparatos, tejidos u órganos, como son: las cavidades serosas, la mucosa cervicovaginal, la cavidad oral, la orina, la secreción mamaria, etc. La indicación fundamental de los exámenes citológicos es el diagnóstico del cáncer y, sobre todo, de sus formas precoces o preclínicas en cualquier tejido.
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Procedimientos de la técnica histopatológica Generalidades El trabajo diario de rutina en un laboratorio de histopatología se puede resumir en pasos fundamentales, como son: 1. Fijación. 2. Procesamiento de los tejidos (deshidratación, desalcoholización, imbibición o infiltración en parafina líquida). 3. Inclusión. 4. Corte, coloración y montaje.
Fijación de los tejidos La muerte es el nivel metabólico a partir del cual las células que componen esos organismos no son capaces de recuperar las funciones vitales que les son propias. Los tejidos frescos sufren grandes alteraciones al poco tiempo de haber sido tomados, siendo una de las principales tareas, la de impedir el desarrollo post mórtem de estos procesos o cambios que pueden ser putrefactivos debido a la invasión bacteriana de los tejidos muertos y autolíticos, provocados por la acción de enzimas de las propias células. La autólisis es el proceso por el cual, después de la muerte, se produce la autodigestión enzimática celular, tras la salida del contenido lisosómico al citoplasma por rotura de la membrana delimitante de estos organelos. La putrefacción es el efecto ejercido por determinadas toxinas y enzimas bacterianas sobre los tejidos. Los microorganismos que originan esta acción son de carácter saprofito y complementan el efecto lítico de la autólisis hasta conseguir la total destrucción celular. A mayor temperatura ambiente, mayor velocidad de autólisis y putrefacción, ya que la temperatura óptima para la actividad enzimática y bacteriana oscila entre 37 y 42 °C. Los tejidos ricos en enzimas digestivas, como el páncreas, o que fisiológicamente contienen gran cantidad de gérmenes, como el intestino, sufren con mayor intensidad estos fenómenos. 17
Este primer paso, de gran importancia para la mayoría de los estudios, se denomina fijación, y consiste en someter al tejido a la acción de sustancias llamadas fijadores, que interrumpen los procesos de degradación que aparecen tras la muerte celular, para de esta forma conservar la arquitectura y composición tisular lo más próxima posible a como se encontraba en el organismo vivo. Produce una estabilización del tejido, con detención de la degradación y coagulación de las proteínas celulares, lo que permite su estudio posterior en condiciones muy parecidas a la estructura viva.
Principios generales de la fijación La fijación de los tejidos debe cumplir determinados principios para que se obtengan resultados satisfactorios, estos son los siguientes: 1. No existe un método universal de fijación, o lo que es igual, un agente fijador adecuado para un tejido puede no serlo para otro. 2. No todos los fijadores conservan de manera indefinida el tejido, por lo que fijación no equivale a conservación tisular. 3. Un defecto de fijación jamás puede ser corregido. 4. Es inútil realizar un estudio histológico sobre un material con graves defectos de fijación.
Elección, acción y efecto del fijador Es importante que el fijador seleccionado reúna las condiciones necesarias, sobre todo, en dependencia de la técnica que después se va a emplear sobre el tejido. Para las técnicas de rutina este debe tener una rápida acción, se debe poder utilizar con eficacia para un gran número de tejidos y, además, que se puedan utilizar distintas técnicas de coloración. El uso del fijador original determina lo que se puede o no hacer con el tejido más tarde. De gran importancia es la capacidad de difusión del líquido fijador, la cual puede variar según sea uno u otro el órgano que se fije. Si el líquido fijador penetra poco a poco en la materia, este se debe dividir en fragmentos de poco espesor, pues, en el caso contrario, pueden sufrir mayores o menores alteraciones los elementos que se encuentran en el interior de las piezas antes de que llegue a estos la acción fijadora. El volumen del líquido fijador, como orientación general debe ser de 10 a 20 veces el volumen de la pieza que se ha de fijar. La duración de la fijación varía según sea la composición del líquido y la naturaleza del objeto. Con frecuencia penetra el fijador en el material 18
con relativa lentitud, por lo cual no se deben sacar las piezas del líquido demasiado pronto, pero tampoco conviene prolongar de manera indefinida la acción del fijador, pues muchos líquidos hacen el tejido quebradizo, dificultan su coloración, lo maceran, lo contraen o lo hinchan a medida que pasa el tiempo. Es preciso casi siempre lavar la pieza que se fija después de eliminar el exceso de líquido. El lavado se realiza mediante agua.
Efectos de la fijación El efecto más marcado de la fijación es la desnaturalización de las proteínas, esto trae como consecuencia que los tejidos se hagan más resistentes a los efectos del procedimiento subsiguiente. También los tejidos se hacen más permeables que en su estado fresco natural. Algunos fijadores tienen la desventaja de inhibir e interferir con las reacciones de los colorantes, mientras que otros fijadores actúan como mordientes que aseguran cierto resultado de coloración.
Fijadores físicos y químicos Los fijadores se clasifican según su mecanismo de acción, en dos grupos, físicos y químicos: Fijación por métodos físicos. Es el método de elección para realizar estudios morfológicos o funcionales en las que se requiera conservar intacta la estructura antigénica del tejido o su contenido enzimático, se emplea el enfriamiento por congelación del tejido como método para detener la autólisis y putrefacción tisular. La clave de una correcta fijación del tejido por congelación radica en que su realización sea instantánea, ya que un enfriamiento lento provoca la formación de microcristales intratisulares de hielo, susceptibles de agregarse con el paso del tiempo y de producir rotura y dilaceración tisular que pueden dificultar el diagnóstico. El procedimiento idóneo para fijar tejidos por congelación consiste en utilizar isopentano a menos 50 °C como agente de congelación. Otros métodos físicos son: 1. La desecación: se emplea en los extendidos o frotis de sangre, líquidos de punción, etc. Si se realiza de forma rápida, detiene las alteraciones debidas a los procesos enzimáticos post mórtem y permite el empleo ulterior de los fijadores químicos. 2. El calor seco que se utiliza a menudo en bacteriología sobre frotis desecados es poco empleado en histología. 19
Fijadores químicos. Por lo general son líquidos que actúan desnaturalizando e insolubilizando las proteínas tisulares, lo cual bloquea la autólisis por inactivación enzimática; además, algunos de estos líquidos fijadores impiden el crecimiento bacteriano. Pueden ser fijadores: simples y compuestos. Las características fundamentales, que debe poseer el líquido fijador ideal, son las siguientes: 1. Capacidad para bloquear de inmediato la autólisis: cuanto mayor sea esta capacidad mejor es el agente fijador. El efecto del fijador depende en específico de su poder para producir la desnaturalización o floculación proteica, de forma que la actividad enzimática del tejido quede paralizada. 2. Efecto microbicida: que impida la acción bacteriana que es la responsable de la putrefacción. 3. No provocar sobre el tejido retracciones o distorsiones que determinen anomalías en su arquitectura. 4. Inducción de cambios en la textura y composición tisular que favorezca la inclusión, corte y coloración del material histológico. La primera cualidad se relaciona, fundamentalmente, con la velocidad de penetración, que no es más que la rapidez con que se difunde el líquido fijador en el interior de un tejido. El tamaño de la pieza que se ha de fijar debe estar en proporción directa a la velocidad de penetración. La velocidad de penetración no es lo mismo que velocidad de fijación. Un fijador puede penetrar muy rápido en el tejido y sin embargo fijarlo de forma lenta, esto es debido a que el proceso de fijación es un fenómeno químico determinado por el tiempo que cada fijador tarda en precipitar y estabilizar los componentes químicos de los tejidos. La capacidad de un fijador para provocar fenómenos de retracción o distorsión tisular depende, con frecuencia, de los cambios inducidos sobre la presión osmótica de los tejidos. En condiciones normales, la presión osmótica de los tejidos es de 300 mOsm y se relaciona de forma directa con su contenido en sales y proteínas. Por este motivo cuando se somete un tejido a la acción de un fijador y la presión osmótica de ambos no es coincidente, se establece un flujo de agua entre el fijador y el tejido, en función de un fenómeno de ósmosis, hasta que las dos presiones se equilibran. Si la presión del tejido es superior a la del fijador, el agua es arrastrada hacia el interior del tejido, produciéndose tumefacción. En el caso contrario, el agua fluye hacia el fijador y ocurre una retracción tisular. Las reglas generales que se deben considerar en el empleo de líquidos fijadores son las siguientes: 1. Para evitar la autólisis, el tejido se debe colocar lo más rápido posible en el líquido fijador. 20
2. El tejido debe estar seccionado en lámina de 0,5 µ de espesor máximo. 3. El volumen necesario de fijador está determinado por el tejido que se va a fijar. La relación entre el volumen del fijador y el de la pieza debe ser de 20 a 1. 4. La presión osmótica del fijador y la del tejido deben ser equivalentes, si es necesario, se debe compensar la del primero utilizando disoluciones salinas como agente de disolución. 5. El pH del fijador se debe aproximar al pH fisiológico, salvo que en su composición deba contener ácido. 6. El tiempo de fijación es específico para cada fijador, pero existe un tiempo máximo de fijación y no se debe sobrepasar. 7. El lavado después de la fijación tiene como objetivo eliminar los residuos del agente fijador para impedir que interfiera en los demás pasos de la técnica de histología.
Líquidos fijadores simples Formol. El que más se usa es el formol a 10 %, es el fijador por excelencia en anatomía patológica, ya que permite una buena conservación de todos los detalles histológicos del tejido, y realizar diversas técnicas especiales. En estado puro se trata de un gas tóxico y muy irritante para la mucosa, que se disuelve con facilidad en el agua. En este estado en concentraciones entre 35 y 40 % y estabilizado con metanol, se denomina formalina pura o formol. Las ventajas de este fijador son las siguientes: 1. Es el fijador más barato, y es el elegido para trabajos de rutina. 2. Conserva la estructura tisular. 3. Por ser buen desinfectante y no endurecer de manera excesiva los tejidos, es un medio óptimo para conservar y almacenar biopsias y piezas quirúrgicas. 4. Provoca escasa retracción tisular. 5. Posee una velocidad de penetración intermedia. 6. Es un excelente fijador para el tejido adiposo y para lípidos en general, así como para el tejido nervioso. 7. El proceso de fijación puede ser acelerado o retardado, sin graves inconvenientes, modificando la temperatura. En temperatura ambiente se consigue una fijación completa a partir de las 36 h, a 35 °C entre 12 y 24 h, y a 55 °C en solo 3 h. 8. Es compatible con la mayor parte de las tinciones que se utilizan en el laboratorio. 21
Las desventajas son las siguientes: 1. Produce abundantes vapores irritantes sobre la conjuntiva y mucosa nasal. 2. Por acción de la luz y del O2 atmosférico se transforma de manera progresiva en ácido fórmico. Esta sustancia tiene la propiedad de disolver la cromatina nuclear muy rápido, por eso con el tiempo los núcleos celulares adoptan un aspecto “fantasma”. Para evitar esto, el formol se debe guardar en frascos opacos. Alcohol etílico. Es un líquido transparente, inflamable, muy volátil, y de olor agradable, se encuentra puro, llamado absoluto (100 %). Como fijador se utiliza a 70; 90 y 95 %. Las ventajas son las siguientes: 1. Preserva el glucógeno. 2. Se emplea en las extensiones citológicas. 3. Fija y deshidrata el tejido a un tiempo. 4. Gran velocidad de penetración. 5. Es un agente bactericida y, por tanto, buen conservante.
1. 2. 3. 4.
Las desventajas que tiene este fijador son las siguientes: Es un fuerte reductor, por consiguiente, incompatible con fijadores oxidantes como el dicromato potásico y el peróxido de osmio. Endurece y contrae de manera excesiva los tejidos. Disuelve las grasas. A medida que realiza la fijación se diluye, al incorporar el agua que extrae de los tejidos, por lo que pierde actividad poco a poco.
Acetona. Líquido transparente, inflamable, muy volátil y de olor dulzón. Su empleo como fijador simple está, en la práctica, limitada a los métodos histoquímicos e inmunohistoquímicos que preserva la estructura antigénica y la actividad enzimática de estos. Se emplea, por lo general, sin diluir a 4 °C. Tiene las ventajas siguientes: 1. Se utiliza en las técnicas enzimáticas. 2. Se emplea en la inmunohistoquímica. Las desventajas que presenta son las siguientes: 1. Provoca contracción tisular y, por tanto, graves artefactos que suelen hacer inútil su empleo en microscopia óptica convencional. 2. A temperatura superior de 40 °C, disuelve las grasas. 22
Alcohol metílico. Se emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, médula ósea, ganglios, bazo, líquidos extraídos por punción, etc.). Ácido ósmico. Tetraóxido de osmio en disolución a 1 o 2 %, conserva muy bien las estructuras. Tiñe de negro las grasas y es poco penetrante. El bicloruro de mercurio en disolución saturada y el bicromato de potasio a 3 %, son fijadores que actúan como oxidantes, rara vez son utilizados solos.
Fijadores compuestos Son los que en su composición utilizan más de una sustancia química. Es la combinación de diversos fijadores simples en disoluciones complejas que pretende sumar las ventajas de cada uno, amortiguando sus inconvenientes, estos son los siguientes: Zenker. Se utiliza para la fijación del hígado y del tejido linfoide. Está formado por: Agua destilada: 1000 mL. Cloruro de mercurio: 50 g. Bicromato de potasio: 2,5 g. Sulfato de sodio: 10 g. Bouin. Formado por: Disolución saturada de ácido pícrico (1 o 2 %) en agua destilada: 75 mL. Formol (37 o 40 %): 25 mL. Ácido acético glacial: 5 mL. Se debe preparar antes de usar Otros. El líquido de Carnoy, el Duboscq-Brasil, etc. Bouin alcohólico (fijador de Duboscq-Brasil). Es una alternativa válida a la mezcla clásica de Bouin, cuando la pieza que se debe fijar es algo voluminosa (posee una velocidad de penetración mucho más elevada) y cuando se precisa una fijación específica de sustancias hidrosolubles, como el glucógeno que evita su disolución. Está formada por: Alcohol (80 %): 150 mL. Formol (10 %): 60 mL. Ácido acético: 15 mL. Ácido pícrico: 1 g. Se utiliza en la fijación de biopsias renales y para el glucógeno. Todos los fijadores tienen ventajas y desventajas que se deben tener en cuenta en el momento de su utilización. Tras la fijación, lavar con abundancia en alcohol a 70 % hasta la decoloración de la muestra para asegurar la total eliminación del ácido pícrico. Una vez que se fija se puede almacenar el tejido en etanol a 80 %. Tiempo de fijación: de 4 a 24 h, en función del tamaño. 23
Procedimientos de la técnica histopatológica Generalidades El trabajo diario de rutina en un laboratorio de histopatología se puede resumir en pasos fundamentales, como son: 1. Fijación. 2. Procesamiento de los tejidos (deshidratación, desalcoholización, imbibición o infiltración en parafina líquida). 3. Inclusión. 4. Corte, coloración y montaje.
Fijación de los tejidos La muerte es el nivel metabólico a partir del cual las células que componen esos organismos no son capaces de recuperar las funciones vitales que les son propias. Los tejidos frescos sufren grandes alteraciones al poco tiempo de haber sido tomados, siendo una de las principales tareas, la de impedir el desarrollo post mórtem de estos procesos o cambios que pueden ser putrefactivos debido a la invasión bacteriana de los tejidos muertos y autolíticos, provocados por la acción de enzimas de las propias células. La autólisis es el proceso por el cual, después de la muerte, se produce la autodigestión enzimática celular, tras la salida del contenido lisosómico al citoplasma por rotura de la membrana delimitante de estos organelos. La putrefacción es el efecto ejercido por determinadas toxinas y enzimas bacterianas sobre los tejidos. Los microorganismos que originan esta acción son de carácter saprofito y complementan el efecto lítico de la autólisis hasta conseguir la total destrucción celular. A mayor temperatura ambiente, mayor velocidad de autólisis y putrefacción, ya que la temperatura óptima para la actividad enzimática y bacteriana oscila entre 37 y 42 °C. Los tejidos ricos en enzimas digestivas, como el páncreas, o que fisiológicamente contienen gran cantidad de gérmenes, como el intestino, sufren con mayor intensidad estos fenómenos. 17
Este primer paso, de gran importancia para la mayoría de los estudios, se denomina fijación, y consiste en someter al tejido a la acción de sustancias llamadas fijadores, que interrumpen los procesos de degradación que aparecen tras la muerte celular, para de esta forma conservar la arquitectura y composición tisular lo más próxima posible a como se encontraba en el organismo vivo. Produce una estabilización del tejido, con detención de la degradación y coagulación de las proteínas celulares, lo que permite su estudio posterior en condiciones muy parecidas a la estructura viva.
Principios generales de la fijación La fijación de los tejidos debe cumplir determinados principios para que se obtengan resultados satisfactorios, estos son los siguientes: 1. No existe un método universal de fijación, o lo que es igual, un agente fijador adecuado para un tejido puede no serlo para otro. 2. No todos los fijadores conservan de manera indefinida el tejido, por lo que fijación no equivale a conservación tisular. 3. Un defecto de fijación jamás puede ser corregido. 4. Es inútil realizar un estudio histológico sobre un material con graves defectos de fijación.
Elección, acción y efecto del fijador Es importante que el fijador seleccionado reúna las condiciones necesarias, sobre todo, en dependencia de la técnica que después se va a emplear sobre el tejido. Para las técnicas de rutina este debe tener una rápida acción, se debe poder utilizar con eficacia para un gran número de tejidos y, además, que se puedan utilizar distintas técnicas de coloración. El uso del fijador original determina lo que se puede o no hacer con el tejido más tarde. De gran importancia es la capacidad de difusión del líquido fijador, la cual puede variar según sea uno u otro el órgano que se fije. Si el líquido fijador penetra poco a poco en la materia, este se debe dividir en fragmentos de poco espesor, pues, en el caso contrario, pueden sufrir mayores o menores alteraciones los elementos que se encuentran en el interior de las piezas antes de que llegue a estos la acción fijadora. El volumen del líquido fijador, como orientación general debe ser de 10 a 20 veces el volumen de la pieza que se ha de fijar. La duración de la fijación varía según sea la composición del líquido y la naturaleza del objeto. Con frecuencia penetra el fijador en el material 18
con relativa lentitud, por lo cual no se deben sacar las piezas del líquido demasiado pronto, pero tampoco conviene prolongar de manera indefinida la acción del fijador, pues muchos líquidos hacen el tejido quebradizo, dificultan su coloración, lo maceran, lo contraen o lo hinchan a medida que pasa el tiempo. Es preciso casi siempre lavar la pieza que se fija después de eliminar el exceso de líquido. El lavado se realiza mediante agua.
Efectos de la fijación El efecto más marcado de la fijación es la desnaturalización de las proteínas, esto trae como consecuencia que los tejidos se hagan más resistentes a los efectos del procedimiento subsiguiente. También los tejidos se hacen más permeables que en su estado fresco natural. Algunos fijadores tienen la desventaja de inhibir e interferir con las reacciones de los colorantes, mientras que otros fijadores actúan como mordientes que aseguran cierto resultado de coloración.
Fijadores físicos y químicos Los fijadores se clasifican según su mecanismo de acción, en dos grupos, físicos y químicos: Fijación por métodos físicos. Es el método de elección para realizar estudios morfológicos o funcionales en las que se requiera conservar intacta la estructura antigénica del tejido o su contenido enzimático, se emplea el enfriamiento por congelación del tejido como método para detener la autólisis y putrefacción tisular. La clave de una correcta fijación del tejido por congelación radica en que su realización sea instantánea, ya que un enfriamiento lento provoca la formación de microcristales intratisulares de hielo, susceptibles de agregarse con el paso del tiempo y de producir rotura y dilaceración tisular que pueden dificultar el diagnóstico. El procedimiento idóneo para fijar tejidos por congelación consiste en utilizar isopentano a menos 50 °C como agente de congelación. Otros métodos físicos son: 1. La desecación: se emplea en los extendidos o frotis de sangre, líquidos de punción, etc. Si se realiza de forma rápida, detiene las alteraciones debidas a los procesos enzimáticos post mórtem y permite el empleo ulterior de los fijadores químicos. 2. El calor seco que se utiliza a menudo en bacteriología sobre frotis desecados es poco empleado en histología. 19
Fijadores químicos. Por lo general son líquidos que actúan desnaturalizando e insolubilizando las proteínas tisulares, lo cual bloquea la autólisis por inactivación enzimática; además, algunos de estos líquidos fijadores impiden el crecimiento bacteriano. Pueden ser fijadores: simples y compuestos. Las características fundamentales, que debe poseer el líquido fijador ideal, son las siguientes: 1. Capacidad para bloquear de inmediato la autólisis: cuanto mayor sea esta capacidad mejor es el agente fijador. El efecto del fijador depende en específico de su poder para producir la desnaturalización o floculación proteica, de forma que la actividad enzimática del tejido quede paralizada. 2. Efecto microbicida: que impida la acción bacteriana que es la responsable de la putrefacción. 3. No provocar sobre el tejido retracciones o distorsiones que determinen anomalías en su arquitectura. 4. Inducción de cambios en la textura y composición tisular que favorezca la inclusión, corte y coloración del material histológico. La primera cualidad se relaciona, fundamentalmente, con la velocidad de penetración, que no es más que la rapidez con que se difunde el líquido fijador en el interior de un tejido. El tamaño de la pieza que se ha de fijar debe estar en proporción directa a la velocidad de penetración. La velocidad de penetración no es lo mismo que velocidad de fijación. Un fijador puede penetrar muy rápido en el tejido y sin embargo fijarlo de forma lenta, esto es debido a que el proceso de fijación es un fenómeno químico determinado por el tiempo que cada fijador tarda en precipitar y estabilizar los componentes químicos de los tejidos. La capacidad de un fijador para provocar fenómenos de retracción o distorsión tisular depende, con frecuencia, de los cambios inducidos sobre la presión osmótica de los tejidos. En condiciones normales, la presión osmótica de los tejidos es de 300 mOsm y se relaciona de forma directa con su contenido en sales y proteínas. Por este motivo cuando se somete un tejido a la acción de un fijador y la presión osmótica de ambos no es coincidente, se establece un flujo de agua entre el fijador y el tejido, en función de un fenómeno de ósmosis, hasta que las dos presiones se equilibran. Si la presión del tejido es superior a la del fijador, el agua es arrastrada hacia el interior del tejido, produciéndose tumefacción. En el caso contrario, el agua fluye hacia el fijador y ocurre una retracción tisular. Las reglas generales que se deben considerar en el empleo de líquidos fijadores son las siguientes: 1. Para evitar la autólisis, el tejido se debe colocar lo más rápido posible en el líquido fijador. 20
2. El tejido debe estar seccionado en lámina de 0,5 µ de espesor máximo. 3. El volumen necesario de fijador está determinado por el tejido que se va a fijar. La relación entre el volumen del fijador y el de la pieza debe ser de 20 a 1. 4. La presión osmótica del fijador y la del tejido deben ser equivalentes, si es necesario, se debe compensar la del primero utilizando disoluciones salinas como agente de disolución. 5. El pH del fijador se debe aproximar al pH fisiológico, salvo que en su composición deba contener ácido. 6. El tiempo de fijación es específico para cada fijador, pero existe un tiempo máximo de fijación y no se debe sobrepasar. 7. El lavado después de la fijación tiene como objetivo eliminar los residuos del agente fijador para impedir que interfiera en los demás pasos de la técnica de histología.
Líquidos fijadores simples Formol. El que más se usa es el formol a 10 %, es el fijador por excelencia en anatomía patológica, ya que permite una buena conservación de todos los detalles histológicos del tejido, y realizar diversas técnicas especiales. En estado puro se trata de un gas tóxico y muy irritante para la mucosa, que se disuelve con facilidad en el agua. En este estado en concentraciones entre 35 y 40 % y estabilizado con metanol, se denomina formalina pura o formol. Las ventajas de este fijador son las siguientes: 1. Es el fijador más barato, y es el elegido para trabajos de rutina. 2. Conserva la estructura tisular. 3. Por ser buen desinfectante y no endurecer de manera excesiva los tejidos, es un medio óptimo para conservar y almacenar biopsias y piezas quirúrgicas. 4. Provoca escasa retracción tisular. 5. Posee una velocidad de penetración intermedia. 6. Es un excelente fijador para el tejido adiposo y para lípidos en general, así como para el tejido nervioso. 7. El proceso de fijación puede ser acelerado o retardado, sin graves inconvenientes, modificando la temperatura. En temperatura ambiente se consigue una fijación completa a partir de las 36 h, a 35 °C entre 12 y 24 h, y a 55 °C en solo 3 h. 8. Es compatible con la mayor parte de las tinciones que se utilizan en el laboratorio. 21
Las desventajas son las siguientes: 1. Produce abundantes vapores irritantes sobre la conjuntiva y mucosa nasal. 2. Por acción de la luz y del O2 atmosférico se transforma de manera progresiva en ácido fórmico. Esta sustancia tiene la propiedad de disolver la cromatina nuclear muy rápido, por eso con el tiempo los núcleos celulares adoptan un aspecto “fantasma”. Para evitar esto, el formol se debe guardar en frascos opacos. Alcohol etílico. Es un líquido transparente, inflamable, muy volátil, y de olor agradable, se encuentra puro, llamado absoluto (100 %). Como fijador se utiliza a 70; 90 y 95 %. Las ventajas son las siguientes: 1. Preserva el glucógeno. 2. Se emplea en las extensiones citológicas. 3. Fija y deshidrata el tejido a un tiempo. 4. Gran velocidad de penetración. 5. Es un agente bactericida y, por tanto, buen conservante.
1. 2. 3. 4.
Las desventajas que tiene este fijador son las siguientes: Es un fuerte reductor, por consiguiente, incompatible con fijadores oxidantes como el dicromato potásico y el peróxido de osmio. Endurece y contrae de manera excesiva los tejidos. Disuelve las grasas. A medida que realiza la fijación se diluye, al incorporar el agua que extrae de los tejidos, por lo que pierde actividad poco a poco.
Acetona. Líquido transparente, inflamable, muy volátil y de olor dulzón. Su empleo como fijador simple está, en la práctica, limitada a los métodos histoquímicos e inmunohistoquímicos que preserva la estructura antigénica y la actividad enzimática de estos. Se emplea, por lo general, sin diluir a 4 °C. Tiene las ventajas siguientes: 1. Se utiliza en las técnicas enzimáticas. 2. Se emplea en la inmunohistoquímica. Las desventajas que presenta son las siguientes: 1. Provoca contracción tisular y, por tanto, graves artefactos que suelen hacer inútil su empleo en microscopia óptica convencional. 2. A temperatura superior de 40 °C, disuelve las grasas. 22
Alcohol metílico. Se emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, médula ósea, ganglios, bazo, líquidos extraídos por punción, etc.). Ácido ósmico. Tetraóxido de osmio en disolución a 1 o 2 %, conserva muy bien las estructuras. Tiñe de negro las grasas y es poco penetrante. El bicloruro de mercurio en disolución saturada y el bicromato de potasio a 3 %, son fijadores que actúan como oxidantes, rara vez son utilizados solos.
Fijadores compuestos Son los que en su composición utilizan más de una sustancia química. Es la combinación de diversos fijadores simples en disoluciones complejas que pretende sumar las ventajas de cada uno, amortiguando sus inconvenientes, estos son los siguientes: Zenker. Se utiliza para la fijación del hígado y del tejido linfoide. Está formado por: Agua destilada: 1000 mL. Cloruro de mercurio: 50 g. Bicromato de potasio: 2,5 g. Sulfato de sodio: 10 g. Bouin. Formado por: Disolución saturada de ácido pícrico (1 o 2 %) en agua destilada: 75 mL. Formol (37 o 40 %): 25 mL. Ácido acético glacial: 5 mL. Se debe preparar antes de usar Otros. El líquido de Carnoy, el Duboscq-Brasil, etc. Bouin alcohólico (fijador de Duboscq-Brasil). Es una alternativa válida a la mezcla clásica de Bouin, cuando la pieza que se debe fijar es algo voluminosa (posee una velocidad de penetración mucho más elevada) y cuando se precisa una fijación específica de sustancias hidrosolubles, como el glucógeno que evita su disolución. Está formada por: Alcohol (80 %): 150 mL. Formol (10 %): 60 mL. Ácido acético: 15 mL. Ácido pícrico: 1 g. Se utiliza en la fijación de biopsias renales y para el glucógeno. Todos los fijadores tienen ventajas y desventajas que se deben tener en cuenta en el momento de su utilización. Tras la fijación, lavar con abundancia en alcohol a 70 % hasta la decoloración de la muestra para asegurar la total eliminación del ácido pícrico. Una vez que se fija se puede almacenar el tejido en etanol a 80 %. Tiempo de fijación: de 4 a 24 h, en función del tamaño. 23
Procesamiento del material biológico y citológico Sustancias deshidratadoras La deshidratación es el proceso que tiene por finalidad la eliminación completa del agua del tejido o muestra tisular para que se pueda embeber de forma adecuada el tejido en los medios de inclusión que no sean hidrosolubles, como por ejemplo la esponja que tiene la capacidad de absorber el líquido. La deshidratación se puede realizar utilizando cualquier reactivo capaz de absorber el agua de los tejidos. El más utilizado es el alcohol etílico, en tantos por cientos de menor a mayor, ejemplos: 70; 80 y 90 %, hasta alcoholes absolutos. La deshidratación debe ser gradual, ya que los tejidos llevados de manera directa del agua o de una disolución acuosa al alcohol concentrado o viceversa, sufren la distorsión de los elementos tisulares debido a las corrientes producidas por la mezcla de alcohol y del agua. Las desventajas son las siguientes: 1. Un tiempo prolongado en el deshidratador produce endurecimiento del tejido. 2. El tratamiento muy largo en concentraciones más altas de alcohol (por encima de 80 %) hace el tejido quebradizo y difícil de cortar. 3. El tratamiento muy largo en concentraciones más bajas de alcohol (por debajo de 70 %), macera los tejidos.
Para diluir un alcohol Se hace, por lo general, diluyendo un alcohol de alta graduación con agua corriente o destilada. De manera que para obtener un alcohol de un porcentaje determinado, se sustrae el porcentaje requerido del porcentaje del alcohol que se va a diluir y la diferencia es la cantidad de agua que se debe utilizar por ejemplo: si el alcohol requerido es de 50 % y el que se tiene es de 95 %, se toman 50 mL del alcohol que se dispone (es decir de 95 %) y se añade agua corriente o destilada hasta completar 95 mL. El alcohol obtenido de esta manera es de 50 % de graduación. 24
Los deshidratadores utilizados en el laboratorio son los siguientes: Alcohol etílico. Es el que con mayor frecuencia se usa para la deshidratación de los tejidos. Actúa rápido, no es tóxico y es confiable. Puede haber alguna distorsión del tejido debido al encogimiento producido por el alcohol. La inmersión prolongada en concentraciones altas de alcohol etílico se debe evitar. El alcohol absoluto, en específico, causa sobreendurecimiento de los tejidos. Alcohol metílico. Es tóxico, como es un deshidratante, se emplea para las preparaciones de frotis e improntas de sangre o tejidos. Alcohol isopropílico. Sustituto excelente del alcohol etílico. Es miscible con agua, xilol, cloroformo, alcohol, éter y aceite de cedro. Dioxan. Es un reactivo incoloro, algo tóxico, que se puede usar también en el proceso de infiltración. Es capaz de deshidratar y aclarar de forma directa desde el agua, es miscible con la parafina. Cuando se usa el alcohol absoluto como el deshidratador final, el tejido se debe desalcoholizar (por lo general en xilol) antes de la infiltración con parafina, debido a que el alcohol absoluto no es fácilmente miscible con esta.
Aclaración o desalcoholización La desalcoholización, se refiere a la extracción del alcohol, mientras que el término aclaración se refiere de manera especial a la de hacer transparentes los elementos titulares. Muy a menudo el mismo reactivo se puede utilizar para ambos propósitos y en consecuencia el término aclaración actualmente se emplea en ambos sentidos. Los líquidos que se emplean para estos propósitos no son siempre intercambiables, ya que no todos los agentes desalcoholizadotes se pueden utilizar como aclaradores y no todos los agentes aclaradores son solventes en las resinas usadas como medio de montaje.
Sustancias aclaradoras Después que los tejidos han sido deshidratados con el alcohol, se emplean sustancias aclaradoras, cuya función es desalcoholizar de forma consecuente. Estas se deben mezclar sin dificultad con el alcohol. También debe ser un disolvente de la parafina, de manera que facilite la penetración de este medio de infiltración. En otras palabras, se sustituye el deshidratador por un líquido que después se mezcla con la parafina. 25
Las sustancias aclaradoras más utilizadas en el laboratorio son las siguientes: Xilol. Es un líquido incoloro, y es el agente aclarador que con mayor frecuencia se emplea en la actualidad. Se utiliza para aclarar, tanto en el proceso de infiltración, como en el proceso de montaje, sin embargo, el tratamiento prolongado con xilol en el proceso de infiltración se debe evitar, dado que endurece demasiado los tejidos. Estos son aclarados mejor a partir del alcohol absoluto. El xilol es algo rápido en el desplazamiento del alcohol y es fácilmente miscible con la parafina. El cerebro se endurece demasiado, si se utiliza el xilol en el proceso de infiltración. Es preferible el toluol para procesar los cortes del cerebro. Benzol. Tiene el inconveniente de que se evapora muy rápido en el baño de parafina. Produce un mínimo de encogimiento. Por lo que se debe evitar su empleo, de ser posible. Algunos autores lo prefieren como un aclarador en el proceso de infiltración porque penetra y aclara los tejidos muy rápido. Cloroformo. No es inocuo del todo, por lo que su empleo se debe evitar en lo posible. Se utiliza para aclarar los tejidos en el proceso de infiltración, su penetración es más lenta que el xilol, no hace el tejido tan quebradizo como este, pero produce algún endurecimiento. Toluol. Sus propiedades son similares a las del xilol. Aclara menos rápido que este o que el cloroformo, pero no endurece los tejidos. Por tanto, es un buen agente aclarador, en el cual se pueden dejar los tejidos durante la noche en caso de necesidad. Es un líquido incoloro y fácilmente miscible con la parafina. Aclara mejor a partir del alcohol absoluto. Se utiliza para aclarar, tanto durante la infiltración, como durante el montaje.
Infiltración de tejidos Después que los tejidos se aclararon por completo con un agente aclarador (xilol, cloroformo, dioxan, etc.), es necesario infiltrarlos con un medio de soporte o sostén para poder tomar los cortes histológicos.
Medios de imbibición e inclusión Los tejidos fijados no son lo suficientemente firmes, o adherentes como para permitir su corte sin algún medio de soporte para que se mantengan las células y estructuras intercelulares en su propia relación unas con otras. Para este fin, se cuenta con medios de imbibición e inclusión, siendo el que más se utiliza la parafina. También la celoidina aunque no se usa con frecuencia, y el carbowax (cera soluble en agua). 26
La parafina es un hidrocarburo saturado, blanco y homogéneo, producto de la destilación del petróleo. Existen dos tipos de parafinas, la blanda (de 45 a 50 °C) y la dura. La parafina que se utiliza en el trabajo diario es la dura con un punto de fusión entre 56 y 62 °C, ya que permite obtener cortes más finos, suministra un mejor apoyo o sostén a los objetos duros y es adecuada para temperaturas del laboratorio. También existen otras sustancias que se pueden utilizar para infiltrar e incluir que son la celoidina y la gelatina, pero son muy costosas.
Procesador automático de tejido El procesador automático de tejido es un equipo eléctrico automático que consta de 12 vasos, de una plataforma circular que sostiene los vasos de cristal para los distintos líquidos utilizados, un brazo vertical central que sostiene las tapas de los vasos, un rotor que hace girar un cesto en el cual van colocados los fragmentos de tejidos y un mecanismo de reloj el cual hace que el brazo central se eleve a intervalos prefijados y gire para hacer pasar el cesto de un vaso a otro. Los primeros 6 vasos de alcoholes ascendentes, 3 de estos con graduaciones de: 70; 80 y 90 %) y 3 vasos de alcohol absoluto, que deshidratan completamente el tejido. A continuación le siguen 4 vasos de xilol, cuya función es extraer el alcohol de los tejidos, ya que este no es miscible con la parafina. Esta función recibe el nombre de desalcoholización y las sustancias que se emplean para esta finalidad reciben el nombre de aclaradores, y entre estos se tiene el xilol, que es el más utilizado. Este equipo posee 2 vasos de parafina líquida, cuya función es infiltrar el tejido para darle consistencia interna. Su temperatura se regula mediante el termostato, la cual debe estar por encima de 2 o 3 °C del punto de fusión de la parafina que se utiliza, y se prepara el tejido para el siguiente paso de la técnica histológica que es la inclusión.
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Medios de inclusión Preparación de los medios de inclusión La inclusión consiste en sustituir el agua tisular por un medio líquido capaz de solidificarse en las condiciones adecuadas de temperatura, en este caso parafina, a fin de proporcionar a la muestra la consistencia y homogeneidad adecuadas para obtener secciones translúcidas muy delgadas, mediante un instrumento denominado micrótomo. Este término de medios de inclusión se designa a todos los materiales utilizados por los técnicos para sostener y rodear los tejidos que después han de ser seccionados en cortes finos, siendo esta su función. Por necesidad, los medios de inclusión deben ser sustancias capaces de ser convertidas, con facilidad, del estado líquido al sólido. La parafina es sólida a la temperatura ambiente normal, el calor la hace líquida o fluida, de manera tal, que puede penetrar (infiltrar) los tejidos. Existen dos tipos de parafina, la blanda y la dura. La blanda se utiliza en histoquímica, ya que las enzimas se destruyen a los 55 oC y esta tiene un punto de fusión que oscila entre los 45 y 55 oC.
Inclusión con moldes de Leuckart El procedimiento consta de cinco pasos o etapas, que se explican a continuación: 1. Primero se colocan los moldes de Leuckart sobre una superficie lisa y plana, de manera que forme un rectángulo o un cuadrado, para lo que hay que tener en cuenta el tamaño del fragmento. 2. Se llena el espacio con parafina líquida y se coloca el número de identificación en uno de los lados del bloque en la parte superior de este (utilizar pinzas calientes). 3. Se introduce en el fondo y centro del molde el fragmento de tejido, colocándolo por la superficie más lisa hacia el fondo, se hace una ligera presión sobre la superficie del tejido con el objetivo de que en el momento de obtener el corte, este se obtenga completo. 28
4. Se deja enfriar hasta que la parafina se endurezca, o lo que es lo mismo, esté solidificada por completo y se retiran los moldes de Leuckart para liberar el bloque con el tejido incluido. 5. Una vez formados los bloques, se le retira el exceso de parafina de los lados para evitar daño a la cuchilla al pasar al corte de tejidos. así 1. 2. 3. 4.
La piel y órganos tubulares se incluyen de forma vertical, para que se puedan observar todas las capas que constituyen a estos tejidos. Las ventajas de la parafina son las siguientes: Se pueden obtener cortes histológicos muy finos. El procesamiento es muy rápido. Es fácil conseguir cortes histológicos seriados. Los bloques se pueden almacenar por tiempo indefinido.
Las desventajas de la parafina son las siguientes: 1. La parafina muy caliente lleva al tejido a ponerse vidrioso o quebradizo, lo que dificulta su corte. 2. El tratamiento prolongado en parafina causa arrugas y el endurecimiento del tejido. 3. Los tejidos difíciles de infiltrar (huesos, dientes, ojos, cerebro, etc.) necesitan un tiempo más largo de inmersión, de otra forma se rompen al cortarlos. Sin embargo, un tiempo largo en inmersión con parafina trae como consecuencia una distorsión tisular producida por el calor. 4. El procedimiento de infiltración con la parafina elimina la grasa, debido a que los deshidratantes y aclaradores utilizados son disolventes de las grasas.
Equipo que se utiliza en la inclusión En la inclusión se utiliza el dispensador de parafina que es un equipo eléctrico en cuyo interior se deposita la parafina con la que se a de incluir los tejidos. Este tiene la función de mantener la parafina líquida y a la temperatura ideal. La temperatura se debe verificar de forma regular por medio de un termómetro.
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Corte de los tejidos Micrótomos de tejidos Los cortes de los tejidos se realizan con instrumentos mecánicos de precisión, que permiten obtener cortes finos con un espesor de 2 a 3 µ. Los instrumentos destinados para los cortes de tejidos reciben el nombre de micrótomos de parafina. Estos pueden ser de dos tipos: 1. Micrótomo horizontal o de desplazamiento: está formado por: el cuerpo del micrótomo, portacuchilla con sus prisioneros, portabloques con sus prisioneros, y por el tornillo macrométrico y micrométrico. 2. Micrótomo vertical o rotatorio (Fig. 8.1): posee las mismas partes que el micrótomo horizontal con la diferencia que en el micrótomo horizontal el bloque está fijo y se mueve la cuchilla, y en el rotatorio la cuchilla se mantiene fija y el que se mueve es el bloque. En este micrótomo cada corte se adhiere al siguiente y salen en forma de cintas (Fig. 8.2). Estos micrótomos utilizan en los cortes cuchillas de acero inoxidable, para su cuidado deben ser afiladas y acentuadas una vez acabado el corte, cada una de estas deben tener un lomo, un mango y una caja que lo proteja.
Fig. 8.1. Se observa un micrótomo.
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Fig. 8.2. En este micrótomo cada corte se adhiere al siguiente y salen en forma de cintas.
Cuchillas del micrótomo Las cuchillas se elaboran con acero de gran dureza y calidad (Fig. 8.3). Se clasifican de la forma siguiente: 1. Plano-cóncava: una cara es plana y la otra cóncava. 2. Semicóncava-plana: una cara es algo cóncava y la otra plana. 3. Plano-plano: ambas caras son planas. 4. Bicóncava: ambas caras son cóncavas. Las cuchillas vienen provistas con un lomo que garantiza el ángulo correcto, y de un mango que se atornilla en la base de la cuchilla. Este lomo debe ser exclusivo de una cuchilla y no se utiliza nunca para otra cosa.
Fig. 8.3. Muestra la cuchilla, confeccionada con acero.
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Afilador automático Este equipo ahorra mucho tiempo y esfuerzo en el afilado de las cuchillas, y entre otras ventajas que presentan se puede plantear que con estos el filo de la cuchilla permanece recto, en contraste con la cuchilla afilada a mano, que se desgasta más en el centro que en los extremos, hasta que se hace curvo. El afilador automático consiste, en esencia, en un sujetador de la cuchilla y en un disco afilador, con un mecanismo para mover uno con relación al otro, y otro mecanismo para virar la cuchilla por la otra cara a intervalos regulares. El asentado de la cuchilla tiene como objeto agudizar el filo de esta. Si la cuchilla solo ha perdido el filo sin mellarse, basta con asentarla, por lo que un asentador de cuero fijo sobre una base de madera, es preferible.
Montaje de los cortes histológicos con albúmina de Mayer Las láminas portaobjetos deben estar limpias, las cuales son cubiertas con una gota de albúmina de huevo de manera fina y uniforme. Las láminas se deben marcar en este momento con la identificación correcta. Las dificultades que se pueden encontrar en los cortes de tejidos son las siguientes: 1. Fallo en la formación de cintas de un bloque, causado por: a) El bloque no se encuentra paralelo al borde de la cuchilla. b) Cuchilla no afilada. c) Parafina muy dura. d) Cuchilla demasiado inclinada. e) Los cortes histológicos son muy gruesos. 2. Cintas desiguales o fragmentadas causadas por: a) Bloques en forma de cuña o rebajados de manera irregular. b) El borde del bloque no se encuentra situado de forma paralela con el borde de la cuchilla. c) Irregularidad en el borde de la cuchilla. d) La parafina no es homogénea. 3. Cortes histológicos comprimidos, arrugados o apelotonados, causados por: a) La cuchilla no está afilada. b) El bloque de parafina está demasiado caliente. c) Hay parafina en el borde de la cuchilla. 32
d) Los cortes histológicos son muy finos. e) Los tornillos del micrótomo están flojos. f) Inclinación de la cuchilla muy vertical. 4. Rasgaduras o arañazos a lo largo de la cinta, causados por: a) Borde de la cuchilla sucio. b) Demasiado ángulo de la cuchilla. c) Arenillas, polvos, cristales de cloruro de mercurio, calcio, suturas o cuerpos extraños en la parafina o en el tejido. d) Mellas en el borde de la cuchilla. 5. Desgarraduras y desmoronamiento de los cortes histológicos, causados por: a) Fijación incompleta de los tejidos. b) Deshidratación o aclaración incompleta de los tejidos. c) Infiltración incompleta del tejido por la parafina. d) La parafina estaba demasiado caliente durante la infiltración, la inclusión o durante ambos. 6. Resalto de la cuchilla sobre el bloque, causado por: a) Ángulo de la cuchilla demasiado vertical. b) Cuchilla embotada o de filo romo. c) Parafina muy suave o habitación muy calurosa. 7. Cortes adherentes a la cuchilla, causados por: a) Electricidad estática. b) Borde de la cuchilla sucio. c) Ángulo de la cuchilla demasiado vertical. 8. Cortes de grosores variables, causados por: a) Tornillos de fijación del bloque o de la cuchilla flojos. b) Ángulo insuficiente de la cuchilla. c) Bloques muy grandes. d) Bloques muy duros. e) Micrótomo no ajustado de manera correcta.
Tejido quebradizo o duro de cortar Un tejido se hace quebradizo o duro de cortar (Fig. 8.4) por cualquiera de las causas siguientes: 1. Tratamiento prolongado en ciertos fijadores. 2. Inmersión prolongada en concentraciones altas de alcohol etílico. 3. Tratamiento prolongado en ciertos agentes aclaradores. 33
4. Tratamiento prolongado en parafina derretida o infiltración en parafina sobrecalentada. 5. Desecación de los tejidos antes de ser colocados en el fijador, por ejemplo: biopsias dejadas en el salón de operaciones. 6. Fallo en darle un procesamiento especial a algunos tejidos, los cuales, cuando son tratados con métodos rutinarios, se tornan duros y quebradizos.
Fig. 8.4. Muestra un ejemplo de tejido quebradizo y duro de cortar.
Equipos necesarios durante el corte de los tejidos Baño histológico. Es un equipo eléctrico, que puede ser de forma redonda, cuadrada o rectangular, que se utiliza para hacer flotar los cortes de parafina, de manera que se extiendan y puedan ser tomados con una lámina portaobjetos. Está constituido específicamente por un recipiente que contenga agua. Este recipiente descansa sobre una base que posee resistencias eléctricas que permiten calentar el agua. La temperatura se controla con un termostato, el cual mantiene el calor deseado y estable, entre los 40 y 45 oC. Los cortes se recogen con láminas portaobjeto y se llevan a la estufa, para esto, los medios que se utilizan para adherir el corte a la lámina son: 1. Albumina de Mayer: a) Clara de huevo: 50 mL. b) Glicerina: 50 mL. 34
Se unen ambas disoluciones, se filtra y se le agrega timol para evitar el hongo. 2. Gelatina: este producto se le agrega al agua y se disuelve mediante el calor, removiendo el agua antes de comenzar a cortar, se sirve como pegamento al corte una vez que se coloca en la estufa. Estufa u horno de parafina. Es la encargada de adherir los cortes a las láminas mediante el calor, es un equipo eléctrico que mantiene una temperatura uniforme que debe ser regulada algo por encima (de 2 a 3 °C) del punto de fusión de la parafina que se utiliza. Este tipo de horno no necesita exceder la temperatura de 80 °C, ya que el punto de fusión de las distintas parafinas nunca excede esta temperatura, por lo que se hace innecesario un horno de más calor. La temperatura debe ser chequeada de forma periódica y el horno se mantiene limpio de parafina. La parafina licuada se guarda en el horno en cantidades suficientes para la inclusión y además para la infiltración, cuando los vasos de parafinas del procesador estén rotos. El horno posee entrepaños ajustables a distinta altura, para guardar la parafina y, además, para colocar las láminas portaobjetos con los tejidos recién cortados para utilizar.
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PARTE II Introducción En esta parte, se le brinda al estudiante los conocimientos con relación a los fundamentos técnicos y a las manipulaciones en la técnica de la toma de muestra, teniendo en cuenta las modificaciones del cuello uterino que pueden cambiar las particularidades de dichas técnicas. Se estudia la cristalería del laboratorio, que no es más que un conjunto de elementos de diferentes formas, tamaño y función, fabricados de manera exclusiva con vidrio, y tienen determinadas características, como son: la resistencia a las acciones mecánicas, químicas y térmicas. Se aborda también su clasificación. Las estructuras contenidas en las preparaciones histológicas y citológicas poseen poco o ningún contraste, por lo que no se pueden distinguir; este inconveniente queda resuelto por la propiedad que tienen los distintos componentes de las células y tejidos de incorporar y fijar, con intensidad variable, determinadas materias colorantes, y que se conoce como afinidad para el tinte. Por lo tanto, también se le brinda al estudiante los conocimientos sobre la coloración, proceso que se logra por medio de técnicas y procedimientos, para lo que se utilizan sustancias colorantes o tintes que hacen que las estructuras adquieran color y sean visibles al microscopio.
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Bioseguridad en los laboratorios de citohistopatología Introducción a la bioseguridad Se define como bioseguridad al conjunto de medidas técnico-ingenieras y científicas, encargadas de proteger de los riesgos al hombre, la comunidad y al ambiente. En el desarrollo de la ciencia actual, fue necesario instaurar la bioseguridad como una rama de esta, para que asuma las funciones de preservar la salud de los trabajadores y para establecer las normas generales y específicas de bioseguridad, con la finalidad de prevenir accidentes, enfermedades y patologías generadas por la exposición a factores de riesgo biológico, así como, encargarse de la preservación y cuidado del medio ambiente, tan importante en los días actuales. Su objetivo de acción son los medios donde se puedan establecer riesgos físicos, químicos, ambientales y biológicos que incluyen al humano. Para de esta forma proteger a los trabajadores, a los usuarios y a la comunidad. Su sujeto es el personal expuesto de forma directa o indirecta a estos riesgos.
Conceptos más utilizados en bioseguridad Accidente de trabajo. Hecho repentino, relacionado casualmente con la actividad laboral, que produce lesiones al trabajador o incluso su muerte. Incidentes de trabajo. Hecho que ocurre con frecuencia durante el trabajo y que tiene una connotación imperceptible en cuanto al riesgo aparente. Riesgo. Se entiende por riesgo: la posibilidad de sufrir un daño, estar expuesto a un peligro, tener un accidente, etc.; que pueden ser por diversas causas y en cualquier medio donde se encuentre una persona. Los tipos de riesgo son: físico, biológico, químico, y condicionados por factores humanos y ambientales. 38
Riesgo físico Son los agentes físicos que pueden provocar daño considerable o mortal al ser humano, entre estos se pueden considerar: mecánicos, térmicos, eléctricos, radiaciones y fuego: 1. Mecánicos: objetos que interfieren el movimiento, mal ubicados en el laboratorio; objetos en movimiento (motores, centrífugas, compresores, etc.), con energía potencial (balones de gases) y los sometidos a diferentes presiones. 2. Térmicos: altas temperaturas (mecheros en mal estado que puedan provocar quemaduras) y bajas temperaturas (cámaras frías, ambiente muy frío que provocan hipotermia). 3. Riego de fuego: incendios que ocurren ocasionados por accidentes químicos y eléctricos debido a: mala ubicación de sustancias inflamables y explosivas, manipulación incorrecta de sustancias químicas, mal estado de cables eléctricos o falsos contactos, toma eléctrica defectuosa y equipos eléctricos deficientes.
Riesgo biológico Se presentan en los trabajadores de centros asistenciales y de investigaciones, ya sean: biológicas, médicas o afines. El riesgo principal es el biológico y esto puede traer como consecuencia el sufrir una enfermedad infecciosa, la cual se adquiere mediante el contagio con un agente patógeno. Estas enfermedades constituyen en la actualidad un amplio sector de la medicina, no obstante, aún conservan un valor fundamental en las patologías del individuo, independientemente del rápido progreso alcanzado en sus estudios. Dentro de las causas de riesgo biológico se encuentran: accidentes por punción, derrames de sustancias contaminadas, producción de aerosoles, cristalería rota contaminada, aspiración por pipeteo bucal, trabajo con centrífugas de forma incorrecta, etc. La Organización Mundial de la Salud (OMS), en correspondencia con lo anterior, clasificó los laboratorios en distintos niveles de seguridad, estos son los siguientes: 1. Laboratorios básicos (nivel de bioseguridad I): se utilizan en actividades de enseñanza básica. Se trabaja con agentes del grupo de riesgo I (escaso riesgo individual y comunitario). 2. Laboratorios básicos (nivel de bioseguridad II): se utilizan en los servicios primarios de salud y en la enseñanza universitaria. Se trabaja con agentes del grupo de riesgo II (riesgo individual moderado y limitado para la comunidad). 39
3. Laboratorio de contención (nivel de bioseguridad III): se utilizan para el diagnóstico especializado e investigaciones. Se trabaja con agentes del grupo de riesgo III (riesgo individual elevado y bajo para la comunidad en general). 4. Laboratorio de máxima contención (nivel de bioseguridad IV): se utilizan para actividades especializadas. Se trabaja con agentes del grupo de riesgo IV (riesgo individual y comunitario elevado). los 1. 2. 3.
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Las medidas de protección ante la posibilidad de riesgo químico en laboratorios de citohistopatología son las siguientes: Control del personal que debe permanecer en el laboratorio. Control estricto y almacenamiento adecuado de los productos. Organizar el trabajo que se ha de realizar durante la manipulación de sustancias químicas en el laboratorio, teniendo en cuenta: a) Cuando se mezclan disoluciones y se utilizan ácidos concentrados, siempre hay que agregar el ácido al agua con mucho cuidado y en cantidades pequeñas. b) Las disoluciones que despidan olores o vapores fuertes y desagradables, mezclar dentro de extractores de vapores o en lugares ventilados a favor de la corriente del aire. c) No dejar caer gotas o derramar líquidos en superficies sólidas. d) No soplar la última gota de la pipeta. e) No dejar caer el contenido de la pipeta directamente en un líquido, sino dejarlo rodar por las paredes del recipiente. f) No homogenizar con la pipeta soplando e inhalando después. g) Evitar la formación de aerosoles peligrosos. Reducirlos y contenerlos. h) Abrir con cuidado los frascos de las sustancias químicas y no acercarlos a la cara. i) Al pesar reactivo en polvo evitar las corrientes de aire y protegerse para evitar contaminación e inhalación de las partículas de los reactivos. j) Lavarse las manos con frecuencia. k) En el caso de contacto con la piel, los ojos o mucosas lavar con abundante agua y buscar asistencia médica si fuera necesario. l) No comer ni maquillarse en ningún laboratorio. m)Utilizar guantes para trabajar con reactivos que por sus características lo requieran.
4. Tener al alcance y conocer el uso adecuado de los medios de protección contra incendio.
Riesgo condicionado a factores humanos y ambientales Adicionalmente existe un grupo de riesgo fundamental constituido por factores humanos y ambientales, los cuales pueden incrementar considerablemente el riesgo de los otros factores y que pueden estar relacionados con: las aptitudes y habilidades para el trabajo, el estado físico y psicológico del trabajador, su capacidad intelectual y su entrenamiento laboral, así como, la organización general del laboratorio y las condiciones ambientales de este.
Principios de bioseguridad en los laboratorios Los principios de bioseguridad son: chequear y organizar el trabajo que se ha de realizar y precauciones con el personal expuesto, de forma directa o indirecta a los riesgos, como se explica a continuación: 1. Chequear y organizar el trabajo que se ha de realizar: a) Chequear diariamente los equipos de trabajo. b) Control del personal que debe permanecer en el laboratorio. c) Mantener el laboratorio limpio y organizado, entre otros. 2. Precauciones con el personal expuesto de forma directa o indirecta a los riesgos: a) No se debe poner las manos en la cara, ojos y boca durante el trabajo. b) Prohibido el pipeteo bucal, uso de guantes para manipular muestras o material infeccioso. c) Cambio de guantes según lo requiera el trabajo. d) Para evitar accidentes, no ingerir o guardar alimentos en el local del laboratorio.
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Técnica de la toma de muestras citológicas Generalidades El médico patólogo doctor George N. Papanicolaou (1917), con la colaboración del doctor Herbert Trau, ideó la valoración del material celular de la vagina y del cuello uterino para el diagnóstico del cáncer cervicouterino. La técnica de recolección se mejora con la creación de la espátula de madera por el doctor Ernest Ayre (1947), con la que se puede raspar la superficie del cuello y obtener células de ambos epitelios, así como, de la pared vaginal para el estudio de la función ovárica. Es decir, que de acuerdo con la descamación de células en el extendido, se consideran dos tipos de estudios: la citología orgánica y la citología funcional: 1. La citología orgánica: comprende el estudio de las condiciones inflamatorias, premalignas y malignas del epitelio del órgano en cuestión. 2. La citología funcional: permite el estudio, con gran margen de seguridad, de la función ovárica por medio de la exfoliación celular de las paredes vaginales.
Interrogatorio Al llegar la paciente a la consulta se le debe interrogar sobre: 1. Si ha sido sometida a exploración bimanual, si ha mantenido relaciones sexuales, o ha utilizado duchado vaginal las 24 h antes, lo que es una contraindicación para tomar la muestra. 2. Si ha utilizado medicamentos por vía vaginal durante la semana anterior, tampoco se debe recoger la muestra. 3. Si ha sido sometida a manipulación sobre el cuello uterino: legrado, colocación o retiro de dispositivo intrauterino (DIU), etc., se debe esperar al menos 2 semanas. 4. Si se han utilizado tratamientos destructivos, esperar no menos de 4 meses (antes de este tiempo constituye una contraindicación para la valoración del estudio citológico). 42
Datos generales y clínicos Se adquieren mediante el interrogatorio en concordancia con el estudio que se ha de evaluar, teniendo en cuenta: 1. Nombre y apellidos. 2. Edad. 3. Dirección. 4. Fórmula menstrual. 5. Última menstruación. 6. Partos, abortos. 7. Tratamiento hormonal, tipo y tiempo. 8. Enfermedades de transmisión sexual. Dentro de los síntomas y trastornos menstruales más frecuentes que se deben explorar están los siguientes: 1. Leucorrea o flujo vaginal: es el producto de la exudación anormal de los genitales, es la exageración de un fenómeno normal producido por agentes biológicos, u otros procesos. Es importante señalar que en la vagina existe un exudado normal producto de la secreción de glándulas mucosas cervicales, secreción de glándulas vestibulares, etc.; cuyo volumen no excede 1 mL en 24 h. 2.Prurito: picazón, comezón, molestia, irritación, escozor, que puede llegar a ser intenso, lo que produce enrojecimiento en la vulva y en la vagina. 3. Dolor: impresión penosa que se produce en un órgano o parte de este, transmitida al cerebro por los nervios sensitivos. 4. Metrorragia: hemorragia permanente, irregular, no periódica, casi nunca expresión de una menstruación normal, sino de una verdadera hemorragia, consecuencia de algún trastorno. 5. Hipomenorrea: cuando la disminución de la menstruación afecta, tanto el número de días, como la cantidad de pérdida por días. 6. Oligomenorrea: menstruación que sucede de forma regular, cada 4 semanas, de intensidad normal, pero de duración, en lugar de 3 a 5 días, es de 1 a 2 días. 7. Opsomenorrea: menstruación, que sin llegar a faltar, se espacia, transcurriendo, de una a otra, más de 4 semanas. 8. Hiperpolimenorrea: cuando la hemorragia es mayor de lo normal en intensidad y dura más de 5 días. 9. Amenorrea: ausencia de la menstruación permanente o temporal. 10. Menopausia: período que se inicia con el cese de la actividad cíclica del ovario y se manifiesta en la clínica por la ausencia de la menstruación, por lo general posterior a los 45 años de edad. 43
Recolección de la muestra cervicovaginal El material e instrumental necesario en la técnica de la toma de la muestra se debe esterilizar de forma correcta; estos se relacionan a continuación: 1. Espéculo (Fig. 10.1). 2. Citospray o alcohol absoluto o 95 %. 3. Láminas portaobjetos con extremo esmerilado o sin este. 4. Aplicador montado (Fig. 10.2). 5. Aplicador sin montar o citobruch (Fig. 10.3). 6. Espátulas (Fig. 10.4). 7. Guantes. 8. Lápiz grafito o lápiz diamante.
Fig. 10.1. Diferentes tipos de espéculos.
Fig. 10.2. Aplicadores montados.
Fig. 10.3. Cepillo o citobruch.
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Fig. 10.4. Distintos tipos de espátulas.
Después del interrogatorio y estar la paciente en condiciones para realizarle la muestra, esta se realiza con la secuencia siguiente: 1. Colocar la paciente en posición ginecológica. 2. Colocar el espéculo sin el uso de lubricantes y exponer el cuello uterino (Fig. 10.5).
Fig. 10.5. Se observa el espéculo desprovisto de lubricante y en la posición que debe quedar si estuviera en la vagina. También se puede ver la utilización de guantes por el técnico.
3. Retirar el exceso de secreción o mucus, si fuese necesario, sin tocar la superficie del cuello. 4. El raspado se debe realizar en la línea de unión escamocolumnar (EC), donde se unen los dos epitelios, y se realiza de la forma siguiente: a) Cuando esta línea coincide con el orificio externo del cuello (OE), se introduce el remo saliente de la espátula de Ayre en el orificio y se gira 360° en el sentido de las manecillas del reloj, esto se realiza con cierta presión. 45
b) Cuando no se ve la unión escamocolumnar, por encontrarse dentro del canal endocervical, la toma de la muestra se hace con la espátula de Ayre de igual forma a la descrita, si fuera necesario se puede utilizar un aplicador sin montar o citobrush, se introduce este en el canal y se hace un giro de 360°.
Cepillado de canal La utilización de cepillo o citobruch es una forma práctica y fácil de rastrear la zona de transformación del endocérvix, siempre y cuando el orificio cervical sea permeable. Es posible también el uso de aplicadores sin montar en casos donde el orificio es muy estrecho, proporcionando, de igual forma, la observación de los elementos de las zonas antes mencionadas. Para la recolección de la muestra se debe realizar el procedimiento siguiente: 1. Colocar a la paciente en posición ginecológica. 2. Colocar el espéculo sin el uso de lubricantes y exponer el cuello uterino. 3. Retirar el exceso de secreción o mucus cervical. 4. Introducir el extremo o escobilla en el orificio y hacer un giro rápido de 180° en sentido de las manecillas del reloj. Nota: contraindicado en pacientes embarazadas.
Extensión del material del canal cervical Se realiza la extensión sobre el portaobjeto, desenrollando (Fig. 10.6), en contra de las manecillas del reloj, ya que facilita la extensión del material dado el carácter mucoide de este en esa zona, después se procede a la fijación inmediata.
Fig. 10.6. Extensión del material citológico con el cepillo o citrobuch, desenrollando en contra de las manecillas del reloj.
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Condiciones del cuello que modifican la técnica de toma de la muestra Con respecto a la técnica de la toma de muestra, existen condiciones del cuello que la modifica, ejemplarizados en los casos siguientes: 1. La ectopia: que es la presencia del epitelio cilíndrico hacia el exocérvix, el desplazamiento de este se produce más allá del orificio externo, en la observación macroscópica impresiona como un enrojecimiento alrededor del orificio cervical que, en ocasiones, cuando es extensa o está inflamada, puede sangrar. En este caso donde la unión escamocolumnar se encuentra fuera del orificio externo la técnica de la toma de la muestra se hace en este sitio con la parte redondeada de la espátula. 2. Cuello puntiforme: se observa con frecuencia en pacientes sin partos o partos por cesárea. En este caso se debe auxiliar de un aplicador sin montar o citobruch para obtener material de la zona de transformación, ya que la estrechez del orificio no permite el paso de la espátula de Ayre. 3. Prolapso uterino: es el descenso o caída de la matriz (útero) relacionado con los ligamentos del órgano, proyectándose por la vagina hasta salir fuera de la vulva. En este caso se debe humedecer el cuello y la espátula con suero fisiológico, y proceder con la técnica habitual de la toma de la muestra, antes explicada. 4. Pólipo endocervical: formación blanda, por lo general pediculada, que se desarrolla en una membrana mucosa, a expensas de algunos de los elementos de esta. La técnica de la toma en este caso es raspar alrededor del orificio y tomar muestra de todo del pólipo, incluso de la base. En ocasiones, ante lesiones sangrantes de cuello, con zona de erosión y pérdida de tejido, es difícil visualizar la zona escamocolumnar; en estos casos la técnica de la toma de la muestra se debe realizar en la zona de menos necrosis. 5. Sangramiento (relacionado con neoplasias de cuello): el raspado del cuello o de la lesión exofítica, no se extiende en la lámina portaobjeto de la forma habitual, sino que con la espátula, se dan golpecitos en toda la línea de extensión de esta, para así desprender las células y demás materiales sólidos que quedan adheridos a la espátula. 6. Histerectomía abdominal: operación de extirpar de forma parcial o total por vía vaginal o abdominal el útero o matriz. En caso de
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histerectomía subtotal o parcial, se extirpa el cuerpo del útero, y queda el cuello uterino. La toma de muestra se realiza de la forma siguiente: a) Histerectomía total por enfermedad maligna: se obtiene la muestra de los pliegues de la cúpula, con la espátula en su parte redondeada, se procede de la forma habitual para la extensión y fijación de la muestra. b) Histerectomía subtotal: se realiza la toma de muestra de la forma habitual, extensión y fijación.
Extensión y fijación del material citológico La extensión se realiza sobre la lámina portaobjeto, rápido y en un solo sentido, para evitar que las células se sequen o dañen, debe ser un extendido amplio, ni muy fino ni muy grueso, y se trata de ocupar 80 % de la superficie de la lámina (Fig. 10.7).
Fig. 10.7. Extensión del material citológico, en un solo sentido, con la utilización de una espátula sobre la lámina portaobjeto.
La fijación es un método que tiene como función preservar la morfología y composición química de la célula y conservar, de manera exquisita, la arquitectura íntima celular (Fig. 10.8). Esto es posible cuando el fijador logra: 1. Penetrar la membrana celular. 2. Precipitar las proteínas en la forma más fina, para que el aspecto celular no se modifique. 48
Fig. 10.8. Se observa el método de fijación de la muestra citológica, con la utilización del citospray.
Lo anterior, por tanto, es requisito indispensable en los exámenes citológicos, y los errores cometidos hacen inadecuada la preparación. Las sustancias fijadoras que se utilizan son las siguientes: 1. Aerosol (citospray). 2. Alcohol etílico por encima de 90 %. 3. Alcohol-éter a partes iguales. El tiempo mínimo de fijación debe ser 15 min y el tiempo máximo de fijación 10 días. Se extiende sobre el preparado pulverizando el fijador que es de plástico hidrosoluble. Se seca inmediatamente de forma que las extensiones fijadas pueden permanecer así durante largo tiempo, incluso, varios años, pudiendo ser transferidas por correo de un centro a otro sin problemas.
Defectos de fijación La fijación se puede afectar por las razones siguientes: 1. La fijación prolongada: deteriora la capacidad celular para la posterior captación de los colorantes. 2. Situar el nebulizador a menos de 15 cm del portaobjeto: provoca que el gas impacte las células y adquiera un aspecto reticular con áreas sin células y con zonas donde los elementos celulares se sitúan en grupos muy gruesos. 3. Tanto si se utilizan nebulizadores o líquidos fijadores, fijar de inmediato es imprescindible, ya que su retraso produce cambios celulares por desecación, estos cambios son: degeneración celular, aumento del tamaño 49
1. 2. 3. 4.
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y aspecto borroso de los núcleos que impide su correcta evaluación. Los defectos de extensión del material (canal, cérvix) son los siguientes: Extensiones muy finas o estiradas. Extensiones muy gruesas. Extensiones en forma circular, remolino o zig zag. Extensiones donde se ha pasado más de una vez por el mismo sitio.
Cristalería del laboratorio Generalidades de la cristalería La cristalería del laboratorio no es más que un conjunto de elementos de diferentes formas, tamaños y función, fabricadas de forma exclusiva con vidrio. Estos elementos o unidades se fabrican con boroscilicato, que es un material que tiene determinadas características muy importantes, como son: la resistencia a las acciones mecánicas, químicas y térmicas.
Clasificación de la cristalería La cristalería se clasifica en dos grandes grupos: 1. Cristalería general: a) Cristalería de trabajo. b) Cristalería de almacenamiento. 2. Cristalería de medición: a) Cristalería volumétrica. b) Cristalería no volumétrica. Ejemplos: 1. Cristalería general de trabajo: mortero, embudo, Koplin, tubos de ensayo, láminas portaobjetos, placas de Petri. 2. Cristalería general de almacenamiento: están todos los frascos que sirven para almacenar reactivos, colorantes y diferentes disoluciones; estos pueden ser de color ámbar o transparente. 3. Cristalería de medición volumétrica: los recipientes de medición volumétrica son vasijas de formas y tamaños muy diversos que se utilizan para medir diferentes volúmenes de líquido, ejemplos: probetas graduadas, pipetas, copas graduadas. 4. Cristalería de medición no volumétrica: reciben el nombre de recipientes aforados, solo permiten medir la capacidad de volumen, ejemplo: matraz y erlenmeyer. 51
Limpieza de la cristalería Se simplifica realizando, de manera inmediata, enjuague con agua corriente después de utilizarla. Después se debe lavar con detergente y abundante agua corriente, y por último con agua destilada.
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Coloraciones en las técnicas histológicas y citológicas Coloración Las estructuras contenidas en las preparaciones histológicas y citológicas poseen poco contraste o carecen de este por completo, lo que hace que no se puedan distinguir. Este inconveniente queda resuelto por la propiedad que tienen los distintos componentes de las células y tejidos de incorporar y fijar con intensidad variable determinadas materias colorantes y que se conoce como afinidad para el tinte. La coloración es un proceso en el cual, por medio de las técnicas y procedimientos, se utilizan sustancias colorantes o tintes, lo que hace que las estructuras adquieran el color y sean visibles al microscopio. Los colorantes se clasifican por su origen de la forma siguiente: 1. Colorantes naturales (animal y vegetal): a) La hematoxilina se extrae del palo de campeche, planta leguminosa arborescente que procede de América Central. Se presenta en forma de cristales, es incolora o algo amarillenta, poco soluble en agua y más en alcohol. La hematoxilina por sí sola no es una sustancia colorante, pero cuando se oxida da lugar a la hemateína, que sí ofrece propiedades para los tintes, y que constituye el proceso de maduración. Se acelera cuando se agregan medios químicos o sustancias oxidantes como el óxido de mercurio rojo, o por la exposición al aire. La maduración espontánea comienza unas 2 semanas después de preparado el colorante y se prolonga de 2 a 3 meses, transcurridos los cuales pierde de manera paulatina su afinidad para el tinte. b) La hemateína tampoco colorea el tejido, si no se une con una base, como: el alumbre de aluminio o potasio o con el amonio, con la que forma una sal denominada laca, por lo que es necesario filtrarla todos los días. c) El carmín es un colorante natural animal de color escarlata hecho de los cuerpos triturados de escarabajos o cochinillas. También se utiliza en combinación con el aluminio que es una base. 53
2. Colorantes artificiales (también llamados colorantes sintéticos o de anilina (colorantes ácidos, básicos y neutros). Son numerosos, se fabrican en grandes industrias, pero tienen el inconveniente de que son inestables, brindan un cambio amplio, tanto en color como en acción. La anilina es un derivado incoloro del alquitrán de hulla, es la base con la cual son hechos muchos colorantes sintéticos.
Función de las sustancias colorantes Las sustancias colorantes tienen la propiedad de transmitir su color a otros elementos y permiten el contraste entre estructuras vecinas, por su afinidad para el tinte.
Composición química de los colorantes o las combinaciones colorantes Los colorantes tienen un grupo iónico portador o responsable del color en la sustancia colorante que recibe el nombre de grupo cromógeno. Atendiendo a este grupo cromógeno, los colorantes artificiales se clasifican en: 1. Colorantes ácidos: son sales cuya propiedad colorante o ion cromógeno está unido al componente ácido (anión) de su molécula, y el componente básico es incoloro, ejemplo: la eosina (citoplasma de las células rico en proteínas). 2. Colorantes básicos: son sales cuya propiedad colorante o ion cromógeno está unido al componente básico (catión) de su molécula y el componente ácido es incoloro, ejemplo: la hematoxilina (núcleo rico en ácidos nucleicos). 3. Colorantes neutros o indiferentes: son sales cuyas propiedades colorantes van unidas a dos componentes: a una base colorante y a un ácido colorante. Por lo tanto, cualquiera de sus iones cromógenos es responsable de la coloración. Las sales son sustancias iónicas, unas positivas (cationes) y otras negativas (aniones).
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Coloración de rutina o de información general Esta coloración da una visión, en conjunto, de la estructura de un tejido o de la arquitectura de una lesión. La técnica que se emplea es fácil y rápida, los colorantes de rutina que, prácticamente en la mayoría de los casos, establecen un diagnóstico histopatológico correcto, son la hematoxilina y la eosina.
Coloración de hematoxilina y eosina Hematoxilina de Harris: esta coloración está compuesta por: Hematoxilina: 5 g. Alcohol absoluto: 50 mL. Alumbre de potasio o amonio: 100 g. Agua destilada: 1000 mL. Oxido rojo de mercurio: 2,5 g. Se disuelve la hematoxilina en el alcohol absoluto, y el alumbre de potasio en el agua destilada con ayuda del calor. Una vez disuelto se retira del fuego y se le agrega la hematoxilina que está disuelta en el alcohol; se coloca nuevamente al fuego y cuando comience a hervir se retira de este y se le agrega poco a poco el óxido rojo de mercurio, cuando este está disuelto, se coloca nuevamente al fuego hasta que hierva y tome un color púrpura; se retira del fuego y se enfría en cubeta con hielo. La hematoxilina se debe filtrar diariamente para eliminar el precipitado que produce la hematoxilina, debido al óxido de mercurio que se agrega en su preparación. Eosina acuosa: está compuesta por: Eosina: 1 g. Agua destilada: 80 mL. Alcohol (95 %): 20 mL. Eosina alcohólica: está compuesta por: Eosina: 1 g. Agua destilada: 20 mL. Alcohol (95 %): 80 mL. La diferencia entre la eosina acuosa y la alcohólica es que la eosina acuosa tiene la propiedad de teñir el tejido de diversas tonalidades, desde
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el rojo hasta el rosado, o sea, permite una diferenciación entre un tejido y otro, mientras que la eosina alcohólica tiñe al tejido de una sola tonalidad, ya sea rojo o rosado. El colorante hematoxilina se debe filtrar diariamente antes de comenzar a realizar el procedimiento, para eliminar el precipitado que se forma en la superficie, debido al óxido de mercurio. El procedimiento es el siguiente: 1. Desparafinar en tres cambios de xilol, en este paso la función que realiza el xilol es eliminar toda la parafina existente en el porta objeto y en el tejido. 2. Hidratación, no es más que suministrarle agua, poco a poco, al tejido mediante alcoholes descendentes, alcohol absoluto, alcohol a 90 %, alcohol a 80 %, alcohol a 70 % y agua corriente, que es donde verídicamente se completa la hidratación. Hay que recordar que después del xilol se coloca un alcohol absoluto, al no contener agua ambos líquidos son miscibles y así el alcohol arrastra el xilol del tejido, lo cual permite que pase el alcohol de 90 % sin que las láminas ni tejidos sufran daño ya que el xilol no es miscible con ninguna sustancia que contenga agua y el alcohol a 90 % contiene 10 % de agua. 3. Del agua corriente pasa a la hematoxilina que es un colorante nuclear, en este paso el núcleo se sobrecolorea y para darle el tono que se desea obtener, este se diferencia en alcohol clorhídrico 1 %, sumergiendo rápidamente las láminas en el agua para parar la diferenciación producida por la sustancia ácida, los núcleos se azulean en el agua grasa a las sales minerales que contiene el agua, si el agua no es potable se introduce en una solución de carbonato de litio para que azulee al núcleo, esto es posible porque esta solución es una base. 4. Se pasa a la eosina que colorea el citoplasma de color rojo a rosado en un tiempo de 15 a 30 s. 5. Se pasa a los alcoholes ascendentes o alcoholes deshidratadores, en este paso los alcoholes tienen la función de ir arrastrando el agua, poco a poco, del tejido por alcoholes de 70; 80 y 90 % y tres absoluto, lo que evita cambios bruscos en el tejido en el momento de la deshidratación. Hay que recordar que para que exista una buena aclaración los alcoholes absolutos deben estar en buen estado, o sea, que no contengan agua, para que ambos líquidos sean miscibles. También el xilol brinda cierta transparencia al tejido y sirve como medio de montaje, esto es debido a que el medio de montaje es sintético. Los resultados que se deben obtener son los siguientes (Fig. 12.1): 1. Núcleos: azules. 2. Citoplasma: de rojo a rosado. 56
Fig. 12.1. Resultado de la coloración de hematoxilina-eosina.
Colorantes metacromáticos El término metacromasia indica un cambio de color. Los colorantes metacromáticos son casi todos de carácter básico, ejemplos: azul de toluidina, azul de metilo, la tionina, el azura, etc. Para explicar de manera adecuada el fenómeno de la metacromasia, conviene destacar algunas de las peculiares propiedades que muestran estos colorantes en disolución. Cuando el disolvente no es agua, sino alcohol, acetona, etc., todos estos poseen un tinte constante y se comportan como ortocromáticos, pero en solución acuosa, la coloración de la solución se torna variable en función de la temperatura y la concentración. En soluciones muy diluidas o a temperatura elevada, los colorantes se comportan como ortocromáticos; en soluciones concentradas como metacromáticos. Estos hechos demuestran que en el paso de la forma ortocromática de un colorante a la metacromasia (variación en la absorción de determinadas longitudes de onda de la luz blanca) se puede provocar por pequeños factores, entre los cuales figura la unión de determinadas sustancias a través de mecanismos de atracción electrostática. Son sustancias colorantes que tienen la valiosa propiedad de colorear diversas estructuras en el tejido en tonos o colores diferentes, al propio de la sustancia colorante.
Colorantes policromáticos Son sustancias colorantes compuestas, o una mezcla de colorantes que contiene los componentes de diferentes colores. 57
Tipos de coloración Coloración regresiva. El tejido o las células son primero sobreteñidas y después decoloradas de forma parcial, utilizándose una disolución diferenciadora que es la encargada de remover el colorante, arrastrando el exceso de este, lo que permite dejar el tono deseado. Este proceso se frena pasándolo rápido por el agua. La diferenciación se obtiene por lo general con alcohol ácido, alcohol etílico u otras diluciones. Este proceso se debe controlar de forma visual por el examen microscópico. Coloración progresiva. Una vez que el colorante se toma por el tejido no se remueve, es decir, la coloración se detiene en el momento en que se obtiene el color deseado. No necesita disolución diferenciadora.
Coloración en citología El procedimiento es el siguiente (Fig. 12.2): 1. Hidratar las láminas en agua corriente. 2. Colorear introduciendo en el colorante nuclear la hematoxilina de Harris. 3. Eliminar el exceso de colorante en agua corriente. 4. Diferenciar en solución acuosa de ácido clorhídrico a 0,5 %. 5. Detener el proceso de diferenciación mediante el agua corriente. 6. Deshidratar en tres vasos de alcohol absoluto. 7. Colorear introduciendo en colorante citoplasmático OG6. 8. Utilizar dos vasos de alcohol que eliminan el exceso de colorante y deshidratan al a la vez. 9. El EA50 que es el colorante policromoplasmático. 10. Eliminar el exceso de colorante y deshidratar con cuatro vasos de alcohol absoluto. 11. Utilizar el xilol que le da claridad y brillantez a la célula. 12. Montaje en bálsamo o resina Danmar para la preservación de los elementos celulares.
Coloración de Papanicolaou (PAP) Es un método de tinción policromático que consta de una sustancia colorante nuclear (hematoxilina de Harris) y dos sustancias colorantes citoplasmáticos, el naranja G y la llamada mezcla policroma (EA) de Papanicolaou, compuesta por verde luz, pardo Bismark y eosina (EA36 o EA50) (Fig. 12.3 y 12.4). 58
Fig. 12.2. Se muestran los recipientes que contienen los pasos para utilizar en la coloración de Papanicolaou.
Fig. 12.3. Resultado de la coloración de Papanicolaou donde se observan las células intermedias.
Fig. 12. 4. Resultado de la coloración de Papanicolaou donde se observan células superficiales eosinófilas.
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1. 2. 3. 4.
Los objetivos de la coloración son los siguientes: Definir bien los detalles nucleares. La transparencia del citoplasma. Buen contraste entre el núcleo y el citoplasma. Diferenciación de las células.
El tipo de coloración es regresiva, se sobretiñe el núcleo de la célula con una hematoxilina no acidificada y luego se remueve el exceso de tinción con disolución de ácido clorhídrico a 0,5 % (diferenciador). Tiempo excesivo en los alcoholes (decoloración).
Sustancias colorantes citoplasmáticas Orange G: es una tinción monocromática, que colorea naranja brillante la queratina en el citoplasma, penetrando rápido en este. La queratina no se encuentra en condiciones normales en el epitelio, por lo que su presencia se puede atribuir a algún tipo de trastorno o anormalidad. Los factores que dificultan la tinción son: 1. Antes de la toma de muestra, la paciente se ha puesto productos vaginales, que por su composición química dificultan la coloración. 2. Fijación inadecuada. 3. Extendidos gruesos. 4. Alto contenido de cloro en el agua, sobre todo cuando el colorante nuclear es pálido. 5. No filtración de las sustancias colorantes.
Medios de montaje Los medios de montaje son los encargados de mantener transparentes las preparaciones, sin dañar la estructura y coloración de estas, por lo menos durante el tiempo de su observación. Las sustancias permiten un índice de refracción necesario para que se observen todos los detalles histológicos y citológicos. Los medios de montaje se dividen en dos grupos: acuosos y sintéticos.
Acuosos El uso de estos es menos corriente, porque su empleo es más delicado, debido a sus propiedades conservadoras limitadas y su rendimiento óptico débil, por lo que prácticamente solo sirven para montar cortes por congelación, estos son: 1. Glicerina. 2. Gelatina. 60
3. Glicerina y gelatina. 4. Bon Apaty.
Sintéticos Estas resinas sintéticas son químicamente neutras, secan rápido y son de uso fácil. Garantizan la buena conservación de la mayoría de las coloraciones y tienen la característica de ser permanentes, estas son: 1. Bálsamo del Canadá. 2. Resina Danmar.
Bibliografía Colectivo de Autores (1981): Temas de ginecología. Editorial Ciencias Médicas, La Habana, pp. 11-12, 27. Colectivo de Autores (1982): Texto para la formación de técnicos de citohistopatología. Texto provisional. Editorial Ciencias Médicas, La Habana, tomo I, pp. 153, 176, 251, 264. Colectivo de autores (2001): Programa Nacional de Diagnóstico Precoz del Cáncer Cervicouterino. Editorial Ciencias Médicas, La Habana, pp. 30-33. Takahashi, M. (1982): Atlas a color. Citología del cáncer, 2da. Ed., pp. 78-80.
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