Федеральное агентство по образованию Омский государственный университет им. Ф.М. Достоевского
УДК 557.1 ББК 28.072 М422...
12 downloads
306 Views
554KB Size
Report
This content was uploaded by our users and we assume good faith they have the permission to share this book. If you own the copyright to this book and it is wrongfully on our website, we offer a simple DMCA procedure to remove your content from our site. Start by pressing the button below!
Report copyright / DMCA form
Федеральное агентство по образованию Омский государственный университет им. Ф.М. Достоевского
УДК 557.1 ББК 28.072 М422 Рекомендовано к изданию редакционно-издательским советом ОмГУ М422 Медицинская биохимия: Лабораторный практикум (для студентов III курса специальности «Медицинская физика») / сост.: Е.В. Бескровная, Е.Ю. Мосур, В.И. Ямковой / под ред. проф. Н.А. Семиколеновой. – Омск: Изд-во ОмГУ, 2005. – 76 с. ISBN 5-7779-0598-6 УДК 557.1 ББК 28.072
МЕДИЦИНСКАЯ БИОХИМИЯ Лабораторный практикум (для студентов III курса специальности «Медицинская физика»)
ISBN 5-7779-0598-6 Изд-во ОмГУ
Омск 2005
© Омский госуниверситет, 2005
I. ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В БИОХИМИИ
Лабораторная работа №1 Определение константы ионизации цитидина спектрофотометрическим методом
Представляет собой длинные иглоподобные кристаллы или белый кристаллический порошок. Цитидин хорошо растворим в воде, гигроскопичен; молекулярная масса 243,2 г/моль. В водных растворах цитидин ионизируется по схеме: Ka BH + ←⎯→ B+H+.
(1) Термодинамическая константа диссоциации Ka по определению равна
aH + aB
Цель работы: изучение процесса ионизации цитидина при помощи спектрофотометрического метода.
Ka =
Приборы, принадлежности и реактивы: спектрофотометр СФ-56, кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см, pH-метр Mettler Toledo MP2220, дозирующие диспенсеры Biohit Proline, мерные колбы на 50 мл, химические стаканы на 50 мл, пробирки, раствор цитидина 6,6⋅10-5 М, раствор NaOH 0,2 М, раствор HCOOH 0,4 М, раствор HCl 0,1 М, дистиллированная вода.
где aH + , a B , a BH + – активности H+, B, BH+, соответственно.
Ионизация цитидина Цитидин (цитозинрибозид) – один из нуклеозидов, входящий в состав рибонуклеиновых кислот. Он состоит из гетероциклического основания – цитозина, соединенного N-гликозидной связью с углеводным остатком рибозы (рис. 1).
N N
О
OH
OH
O
Рис. 1. Структурная формула цитидина
3
,
(2)
Способность нуклеозидов к ионизации определяет их химические и физические свойства, в частности, реакционную способность. Ионизация оснований влияет также на вторичную структуру нуклеиновых кислот и полинуклеотидов. В настоящей работе ионизация цитидина изучается спектрофотометрическим методом, позволяющим работать с малыми концентрациями изучаемого вещества. В случае достаточно разбавленных растворов константа ионизации связана со степенью диссоциации α, pH раствора и средним коэффициентом активности ионов в этом растворе формулой: 1−α (3) pK a = pH + lg − lg γ ± ,
α
NH2
HOCH2
a BH +
где pKa=–lgKa. Для одновалентных ионов при 200C принимается следующее соотношение: lg γ ± = −
0,505 µ 1 + 1,6 µ
.
Ионная сила раствора µ определяется по формуле: 1 µ = ∑ mi zi2 , 2 i 4
(4)
(5)
где mi – концентрация i-го иона (моль/л); zi – заряд i-го иона в электронных единицах.
ванного и неионизированного цитидина при длине волны λ; mBH + ,
mB – соответствующие концентрации.
Определение степени диссоциации цитидина Анализ кислотно-основных равновесий представляет одну из наиболее важных областей приложения спектрофотометрии. Количественная спектрофотометрия основана на уравнении Фирордта:
Aλ = ε λ m l ,
λ λ где ε BH + , ε B – миллимолярные показатели поглощения ионизиро-
(6)
Концентрации BH+ и B связаны соотношением:
mBH + + mB = m0 , где m0 – исходная концентрация цитидина. Степень диссоциации цитидина определяется по формуле:
α=
где Aλ – оптическая плотность исследуемого раствора при длине волны λ; ε λ – миллимолярный показатель поглощения анализируемого вещества при длине волны λ; m – концентрация анализируемого вещества в растворе; l – толщина светопоглощающего слоя. В соответствии с принципом аддитивности Фирордта оптическая плотность смеси n химических соединений, подчиняющихся закону Ламберта–Бугера–Бера и не вступающих в химическое взаимодействие, равна сумме парциальных оптических плотностей, отвечающих поглощению света каждым из соединений:
Aλ = ε 1λ m1l + ε 2λ m2 l + ... + ε nλ mn l = l ∑ ε iλ mi .
(7)
λ
λ
λ
A = ε BH + mBH + l + ε B mB l ,
(8)
mB . m0
Для нахождения искомого соотношения
mB из (9) выражаем m0
λ λ Aλ = ε BH + (m0 − m B )l + ε B m B l .
(11)
λ Неизвестные миллимолярные показатели поглощения ε BH + ,
ε Bλ найдем, используя однокомпонентные растворы, каждый с общей концентрацией m0 . Оптическая плотность данных растворов: λ λ Aкисл = ε BH + m0 l ,
(12)
λ Aщел = ε Bλ m0l .
(13)
λ λ Выражая из (12) и (13) ε BH + и ε B , после подстановки в (11)
получаем:
Aλ =
λ λ mB (m0 − mB ) + Aщел Aкисл . m0 m0
(14)
С учетом формулы (10) выражение (14) принимает вид: λ λ (1 − α ) + Aщел Aλ = Aкисл α.
5
(10)
mBH + и подставляем в (8):
i
Вода и водные растворы некоторых сильных минеральных кислот и щелочей не поглощают свет в видимой и УФ-областях спектра. Это обстоятельство значительно упрощает применение спектрофотометрии к анализу кислотно-основных равновесий. Поэтому смесь BH+, B, H+ можно считать двухкомпонентной и ее оптическая плотность Aλ при длине волны λ будет выражаться следующим образом:
(9)
6
(15)
Из (15) выражаем степень диссоциации путем несложных алгебраических операций:
α=
λ Aкисл − Aλ . λ Aкисл − Aщелλ
(16)
Таким образом, значения α находят посредством измерений оптической плотности буферных растворов с известным значением pH. Определив для одного и того же раствора значения α и µ , мы можем рассчитать значения pKa по формуле (3). Методика измерений Для приготовления трех буферных растворов (HCOONaHCOOH) с одинаковой концентрацией формиата натрия (0,1 М) и pH, равным соответственно 4,0, 4,2, 4,4, необходимо в три стакана на 50 мл налить по 25 мл 0,2 М раствора NaOH, затем оттитровать каждый 0,4 М муравьиной кислотой до соответствующего pH, после чего общий объем каждого раствора довести в мерной колбе до 50 мл дистиллированной водой. Анализируемые растворы могут быть подготовлены следующим образом. К исходному раствору цитидина 6,6⋅10-5 М добавляем растворы, указанные в нижеследующей таблице. Номер раствора
Характеристика раствора
Объем раствора цитидина, мл
Добавляемый раствор
1
кислый
9
1 мл 0,1 М HCl
2
щелочной
9
1 мл 0,1 М NaOH
3
буферный
9
4
буферный
9
5
буферный
9
7
1 мл буфера pH=4,0 1 мл буфера pH=4,2 1 мл буфера pH=4,4
Растворы сравнения готовятся аналогично, только вместо раствора цитидина необходимо использовать такое же количество дистиллированной воды. Контроль значений pH осуществляется с помощью pH-метра Mettler Toledo MP2220. Измерение оптической плотности исследуемых растворов производится посредством автоматического спектрофотометра СФ56 в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см. Порядок выполнения работы 1. Ознакомиться с устройством и принципом работы спектрофотометра СФ-56. 2. Приготовить буферные растворы. 3. Приготовить анализируемые растворы и растворы сравнения. 4. Измерить спектры поглощения всех анализируемых растворов относительно соответствующих растворов сравнения в оптическом диапазоне 240÷310 нм с шагом 1 нм. Результаты измерения представить в следующем виде: Длина волны, нм
Оптическая плотность растворов 1 2 3 4 5
5. По спектрам поглощения растворов № 1–5 определить характеристическую и изобестическую (точка пересечения всех спектральных кривых) длины волн. 6. Вычислить степень диссоциации (значения оптической плотности следует брать при характеристической длине волны) и ионную силу для растворов № 3–5. Затем рассчитать среднее значение pKa и Ka. Результаты оформить в виде таблицы:
8
Номер рас- pH твора 3
4,0
4
4,2
5
4,4
µ lgγ±
λ λ Aщел Aкисл
A
α
lg((1α)/α)
pKa pKa сред- Ka нее
λ λ где Aкисл , Aщел – оптическая плотность при характеристической
длине волны растворов № 1–2, соответственно.
ным.
7. Полученное значение pKa цитидина сравнить с литератур-
Рекомендуемый библиографический список 1. Ямковой В.И. Практикум по биохимии: Учебное пособие. Часть I. Методы физической химии в биохимии. Новосибирск: НГПУ, 2002. 2. Ямковой В.И. Курс лекций по биохимии: Учебное пособие: В 2 ч. Омск: ОмГУ, 2003. 3. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1992. 4. Берштейн И.Я., Каминский Ю.Л. Спектрофотометрический анализ в органической химии. Л.: Химия, 1986.
Лабораторная работа №2 Определение констант ионизации трис-оксиметиламинометана и уксуснокислого натрия методом потенциометрического титрования Цель работы: изучение основ потенциометрии и метода потенциометрического титрования; определение констант ионизации исследуемых веществ. Приборы, принадлежности и реактивы: pH-метр Mettler Toledo MP2220, дозирующие диспенсеры Biohit Proline, магнитная мешалка, химические стаканы на 50, 100, 250 мл, колба на 1 л, воронка, боек, стандартные буферные растворы, раствор титранта – 0,1 M HCl, дистиллированная вода, трис-оксиметиламинометан («трис»), уксуснокислый натрий безводный. Потенциометрия Потенциометрический метод анализа основан на измерении электродного потенциала и нахождении зависимости между его величиной и концентрацией, точнее, активностью потенциалопределяющего компонента в растворе. Возникновение электродного потенциала связано с электрохимическим процессом, происходящим на границе раздела металл/раствор. При погружении, например, индифферентного электрода из благородного металла в раствор, содержащий окислительно-восстановительную (редокс) систему (пару), устанавливается динамическое равновесие, которое может быть выражено следующим уравнением: Ок + ne ⇔ Вос , а электрод приобретает так называемый равновесный потенциал (Eр). Математическое выражение его зависимости от активности
9
10
компонентов рассматриваемой редокс-системы дается уравнением Нернста: 0 E р = E Ок/Вос +
ϑ n
lg
aОк , aВос
0 E р = E Ок/Вос +
где E0 – стандартный потенциал редокс-системы, равный Eр, когда активности всех участвующих в электрохимической реакции компонентов равны единице; n – число электронов, принимающих участие в данной электрохимической реакции; ϑ =(RT/F)2,303=0,0001983T=0,0591±0,0002 (t=250С); R – газовая постоянная (8,31 Дж/(К•моль)); F – постоянная Фарадея (~96500 Кл). В общем случае, когда электрохимическая реакция выражена равновесием aA + bB + cC + ... + e ⇔ m M + pP + qQ + ... ,
уравнение можно изобразить в виде 0 E р = E А, В,С/М, Р, Q +
a a a b a c ... RT ln mA Bp Cq . nF aM aP aQ ...
(*)
Компонентами, участвующими в реакции, могут быть ионы окислителя, восстановителя, водорода и др., молекулы растворителя (например, воды), твердая фаза (металл, оксид металла или малорастворимый электролит) и газообразные вещества (например, H2, O2, Cl2, и пр.). При этом в уравнении (*) не фигурируют те компоненты, активность которых постоянна или равна единице. К таким компонентам относятся твердая фаза, газообразное вещество, если раствор насыщен им при давлении 1 атм, а также растворитель вследствие большой его концентрации и тем самым малых изменений его активности в процессе реакции. Учитывая, что aОк=γОк[Ок]; aВос=γВос[Вос] и [Ок]=αОксОк; [Вос] = αВос сВос, где γОк и γВос – коэффициенты активности, зависящие только от ионной силы раствора и отражающие электростатическое взаимодействие всех присутствующих в растворе ионов; αОк и αВос – коэффициенты «побочных» реакций; [Ок] и [Вос] – равновесные концентрации потенциалопределяющих компонентов; сОк и 11
сВос – их общие концентрации, можно записать уравнение (*) в следующем виде:
ϑ n
lg
г Ок ϑ α Ок ϑ сОк ϑ с + lg + lg = E ф + lg Ок , г Вос n α Вос n сВос n сВос
где Eф – реальный или формальный потенциал, измеренный при сОк=сВос и являющийся постоянной величиной только в конкретных условиях. Практически невозможно измерять потенциалы отдельного электрода. Поэтому необходимо составить гальванический элемент (электролитическую ячейку) из двух электродов, между которыми возникает разность потенциалов, при этом потенциал одного электрода постоянен и заранее известен. Такие электроды, относительно которых определяют потенциал индикаторного электрода, носят название электродов сравнения. По международному соглашению в качестве стандартного электрода сравнения принят стандартный водородный электрод (с. в. э.). Но так как водородный электрод малопригоден в обычных условиях работы (трудоемкость его приготовления), то на практике используют другие электроды сравнения, например насыщенный каломельный электрод (нас. к. э.) или хлорсеребряный (х. с. э.). ЭДС, возникшую между индикаторным электродом и электродом сравнения, можно измерить различными способами. Наиболее распространенным и надежным способом измерения ЭДС гальванических элементов является компенсационный метод Поггендорфа. Определение констант ионизации кислот и оснований Одной из наиболее важных задач потенциометрии является определение концентрации и активности ионов водорода, а также потенциометрическое титрование – наиболее удобный и быстрый метод определения констант ионизации кислот и оснований. Рассмотрим процесс ионизации. Для кислот он может быть представлен в следующем виде: T
Ka HA ←⎯ ⎯→ H + + A − ,
12
(1)
где
K aT =
aH + a A −
(2)
a HA
Учитывая (9), уравнения (6) и (7) можно написать в следующем виде:
pK aT = pH + lg
есть константа ионизации кислоты НА. Для оснований состояние ионного равновесия также можно описать кислотной константой ионизации: +
K Ta
+
BH ←⎯ ⎯→ H + B , где
K aT =
aH + aB a BH +
есть константа ионизации сопряженной с основанием В кислоты ВH+. Константы ионизации – величины малые, и поэтому удобнее пользоваться их отрицательными логарифмами
pK aT = −lgK aT .
(5)
pK aT = pH + lg
кислот – и оснований – где
pK aT
pK aT = pH + lg
aBH aB
pH = −lg a H + .
+
(6)
− lg γ n =
(7) (8)
Далее перейдем от активностей к концентрациям, приняв во внимание, что активности неионизированных кислот НА и оснований В в разбавленных растворах практически равны их концентрациям, а зависимость активности любого иона от его концентрации выражается уравнением an=mnγn, (9) где γn – коэффициент активности иона, а mn – его молярная концентрация.
13
m BH + mB
+ lgγ BH + .
0,505Z n2 µ
(11)
1 + 1,6 µ
,
(12)
где µ – ионная сила раствора, вычисляемая по формуле
µ=
1 m n Z n2 . ∑ 2
(13)
Для однозарядного иона уравнение (12) можно написать в виде
− lg γ n = ,
(10)
Согласно теории Дебая-Гюккеля, коэффициент активности иона с зарядом Zn определяется формулой
Прологарифмировав выражения (2), (4) и поменяв знаки на обратные, получим следующие уравнения для pK aT :
a = pH + lg HA aA−
-
−
(3) (4)
mHA - lgγ A , mA
0,505 µ 1 + 1,6 µ
,
(14)
а для растворов 0,01 М и более разбавленных знаменателем в уравнении (14) можно пренебречь, и в этом случае оно еще более упрощается:
− lg γ n = 0,505 µ .
(15)
Таким образом, для разбавленных водных растворов одновалентных кислот и оснований можно написать следующие уравнения для определения pK aT :
pK aT = pH + lg
mHA + 0,505 µ , mA −
14
(16)
pK aT = pH + lg
m BH + mB
- 0,505 µ .
(17)
Константы ионизации, полученные из этих уравнений, являются истинными или термодинамическими, не зависящими от концентраций кислот и оснований. При определении констант ионизации методом потенциометрического титрования часто пренебрегают поправкой на коэффициент активности и получают так называемые смешанные константы ионизации:
pK aC = pH + lg
mHA , mA
(18)
mBH . mB
(19)
В связи с тем, что все соли в растворе полностью ионизированы, величина m K + равна В, т. е. концентрации КОН с учетом разбавления ее раствором. Исходную концентрацию кислоты можно определить через концентрацию оставшейся кислоты и концентрацию образовавшейся соли (концентрацию аниона A − ):
a = m HA + m A − .
В любой момент титрования раствор должен быть электронейтральным, т. е. сумма концентраций отрицательных ионов должна быть равна сумме концентрации положительных ионов:
−
pK aC = pH + lg
+
Смешанные константы ионизации незначительно отличаются от термодинамических при условии, что концентрации кислот и оснований не превышают 0,01 М. Однако, если решено внести термодинамическую поправку в эти величины, то достаточно близкое приближение можно получить с помощью уравнений: для кислот –
pK aT = pK aC + 0,505 µ ,
(20)
для оснований –
pK aT = pK aC − 0,505 µ ,
(21)
где µ – ионная сила раствора в средней точке титрования; а K
C a
–
(23)
откуда
m A − + m OH − = m K + + m H + ,
(24)
m A − = m K + − m OH − + m H + = B − m OH − + m H + .
(25)
Решая совместно уравнения (23) и (25), получим
m HA = a − B + m OH − − m H + .
(26)
Разделив почленно (26) на (25), получим следующее отношение:
m HA a − B + m OH − − m H + . = m A− B − m OH − + m H +
(27)
Уравнение (27) совместно с уравнением (16) позволяет рассчитывать pK aT слабой одноосновной кислоты, титруемой КОН.
среднее значение pK из серии результатов, полученных в одном эксперименте. В качестве примера рассмотрим процесс титрования слабой одноосновной кислоты НА раствором сильного однокислотного основания КОН:
Если результаты титрования лежат в области pH=4÷10, то поправкой на ионы водорода и гидроксила можно пренебречь, а уравнение (27) в этом случае можно записать в виде
HA + KOH → KA + H2O.
В кислой и щелочной областях уравнение (27) запишется соответственно
C a
(22)
Обозначим: a – исходная концентрация кислоты (моль/л), B – количество добавленной щелочи в пересчете на концентрацию в получившемся растворе (моль/л). 15
m HA a − B при 4