Биологические эффекты токсических соединений

Министерство образования Российской Федерации Новосибирский государственный университет Университет Калифорнии, Дэвис, США

Р. Х. Райс, Л. Ф. Гуляева

Биологические эффекты токсических соединений

Курс лекций

Новосибирск 2003

УДК 577.2:616-006 + 577.29:615 ББК Е070я73-1 + Р284я73-1 Г94 Райс Р.Х, Гуляева Л.Ф. Биологические эффекты токсических соединений: курс лекций / Новосиб. гос. ун-т. Новосибирск, 2003. 208 с. Курс лекций «Биологические эффекты токсических соединений» представляет собой развернутый материал (текст лекций, таблицы и рисунки) по современной молекулярной токсикологии. Сюда включены следующие основные разделы: метаболизм чужеродных соединений- токсинов, ткане- и органо-специфичные эффекты токсинов, современные представления о механизмах канцерогенеза и механизмах защиты от токсического действия химических соединений. В курсе также имеется раздел о молекулярных мишенях для токсических соединений. В этом разделе рассматриваются основные пути передачи клеточных сигналов, роль протоонкогенов и раковых супрессорных генов в механизмах трансформации

клетки. Рассматриваются также механизмы программированной клеточной гибели клетки – апоптоза. Данный курс лекций предназначен студентам – молекулярным биологам и медицинским биологам, а также студентам других биологических и химических специальностей, изучающих проблемы токсикологии.

Рецензент Проф., д-р биол. наук Г.М. Дымшиц © Новосибирский государственный университет, 2003

Ведение Не секрет, что окружающая среда в наши дни находится под большим стрессом. Состояние экосистем ухудшается по мере роста популяции. Синтетические химические вещества находят повсеместно, часто в высоких локальных концентрациях. В 70-ые годы выяснилось, что так как большинство этих веществ являются новыми, очень сложно предугадать их эффект на организм человека и каков будет ответ организма. Многие из этих агентов появились из-за использования человеком различных источников энергии. К примеру, использование нефтепродуктов в процессе индустриальной революции катастрофически возросло. В течение многих лет деятельность человека не проходит бесследно, так выработка различных металлов приводит к попаданию в атмосферу различных опасных элементов (мышьяк, ртуть, хром и т. д. ). Еще во времена второй мировой войны в нашу жизнь вошли изделия из различного пластика, многие их компоненты находят в воздухе и в водоемах повсеместно. Экспериментально доказано, что в высоких концентрациях они приводят к раку, например фтолатовые эфиры. Пестициды – еще один класс синтетических химических веществ, широко используемых последние 50 лет. Один из первых пестицидов –ДДТ ныне запрещен в США, но, тем не менее, широко применяется во всем мире, особенно в развивающихся странах. Эффекты вредного воздействия новых синтетических веществ могут быть обнаружены не сразу, причем к моменту обнаружения бывает уже слишком поздно. К примеру, число курящих в США с 1920 г. до 1950 г. росло катастрофически, а предупреждение Минздрава о вреде курения появилось лишь в 1964 году. В последние годы прикладная химия добилась больших успехов. Даже малейшие загрязнения легко обнаруживаются. С другой стороны, практически все, с чем мы соприкасаемся в нашей жизни, содержит те или иные токсичные вещества. К примеру, арахисовое масло содержит канцероген Афлатоксин В1. Все это привело к многочисленным дебатам о том, что же считать безопасной дозой? На данный момент ученые опираются на результаты экспериментов на животных, если нет никакой дополнительной информации о данном токсическом агенте. Безопасной считается доза, составляющая 1% от дозы, приводящей к видимой реакции на канцероген организма. В такой оценке много неточностей, но на данный момент она самая оптимальная.

Еще один тревожный фактор – быстрый рост популяции, а также количества мусора, отходов и различных загрязнений с еще большей скоростью. Экосистема не имеет достаточной емкости, чтобы перерабатывать отходы, производимые в таком объеме. Существенная часть (10%) твердых отходов являются токсичными. Если взять 1980 год, всего около 10% этих токсичных отходов хранилось как полагается, остальная же часть даже не вывозилась с места производства и хранилась практически на открытом воздухе. Было выявлено 5 миллионов известных веществ, воздействию которыми может подвергаться человек. Из них для исследования было взято около 65.000 и поделено на группы (пестициды, фармацевтические препараты, косметика, пищевые добавки, вещества, используемые в коммерческих товарах), с целью понять, насколько много известно об их свойствах. Для оценки какого либо токсического агента всегда производится сборка всей доступной информации, что включает физические и химические свойства (реакционную способность, летучесть, устойчивость), оценка воздействия на человека или на экосистему в целом, механизмы взаимодействия с объектом влияния и последствия этого влияния. Полезно также знать путь попадания вещества в организм, ткань-мишень, метаболизм реакций, способных активировать или инактивировать процесс, насколько вредные последствия могут зависеть от возраста, образа жизни, заболеваний и т. п. Особый интерес ученых вызывает также зависимость чувствительности к токсичным агентам от генетического полиморфизма. В токсикологических тестах используются специальные линии животных, с низкой вариабельностью в ответах, что стало возможным, благодаря исключению генетического полиморфизма. Методики по определению степени вреда испытуемого агента включают в себя эксперименты над животными, коротковременные тесты (мутагенез бактерий) и эпидемиология (полевые наблюдения за последствиями воздействия). Каждый метод имеет свои реимущества, но и по-своему ограничен. Последний – наиболее убедительный, так как наблюдает за популяциями находящимися под реальным воздействием, хотя дорого наблюдать небольшие эффекты в большой популяции в течение долгого времени. Кратковременные эксперименты – способ относительно не дорогой и быстрый и дает механистическую информацию, но многое об агенте должно быть известно заранее (ткань-мишень, механизмы защиты), чтобы результаты были достоверными. Эксперименты с животными показывают воздействия токсичных агентов на все органы, но этот вид исследований дорогой и медленный, к тому же чувствительность животных к токсинам различна. Исследования продуктов питания, проведенные в США, показали, что многие из них являются канцерогенными, но риск заболевания не так велик: примерно 1 из миллиона (106). Если такие продукты запрещать, то пришлось бы запретить, например, горчицу. По тем же причинам не был запрещен декафеинированный кофе, но запрещен винил хлорид для использования в распылителях. Основная цель токсикологии – выявить риск данной популяции или экосистемы при влиянии на них химического агента. Ответ того или иного вида на низкие дозы агента сложно проследить, поэтому обычно мы располагаем информацией о влиянии больших доз - это приводит к неточностям в анализе. К тому же, в естественных условиях происходит множественное воздействие различных агентов. Эксперименты по выявлению токсичности комплекса агентов выполнимы, но они сложны и дороги и направлены на понимание механизмов действия основных токсичных агентов в зависимости от их дозы и комбинации. Рассмотрим основные механизмы действия токсических соединений на живые организмы.

Глава 1. Метаболизм чужеродных соединений Биотрансформации ксенобиотиков представляет собой принципиальный механизм поддержания гомеостаза во время воздействия на организм чужеродных соединений. В системе биотрансформации принято выделять две фазы метаболизма . К 1-й фазе относятся реакции гидролиза, восстановления и окисления субстрата. Обычно они приводят к

внедрению или образованию функциональной группы типа –OH, -NH2, -SH, -COOH, что несколько увеличивает гидрофильность исходного соединения.

1.1 Ферменты 1-й фазы метаболизма ксенобиотиков

1.1.1. Цитохромы Р450. Структура и функция

Среди ферментов 1-й фазы ведущее место занимает система цитохрома Р450 (P450 или CYP) с точки зрения каталитической активности в отношении огромного числа ксенобиотиков. Наибольшая концентрация цитохрома Р450 обнаруживается в эндоплазматическом ретикулуме гепатоцитов (микросомах). Печеночные микросомальные цитохромы Р450 играют важнейшую роль в определении интенсивности и времени действия чужеродных соединений и ключевую - в детоксикации ксенобиотиков, а также в активации их до токсичных и/или канцерогенных метаболитов. Цитохрома Р450-зависимые монооксигеназы – мультиферментная электрон-транспортная система. Все цитохромы Р450 - гемсодержащие белки. Обычно гемовое железо находится в окисленном состоянии (Fe3+). Восстанавливаясь до состояния Fe2+, цитохром Р450 способен связывать лиганды, такие как кислород или монооксид углерода. Комплекс восстановленного цитохрома Р450 с СО имеет максимум поглощения 450 nм, что и явилось основанием для названия этих ферментов. Основная реакция, которую катализируют цитохромы Р450 – монооксигеназная, в которой один атом кислорода взаимодействует с субстратом (RH), а другой восстанавливается до Н2О. В качестве восстановителя в реакции участвует НАДФН: RH (субстрат)+О2 + НАДФH + H+ --> ROH (продукт) + Н2О + НАДФ+ Механизм, благодаря которому цитохром получает электрон от НАДФH, зависит от внутриклеточной локализации цитохрома Р450. В ЭПР, где расположено большинство гемопротеидов, участвующих в биотрансформации ксенобиотиков, электрон передается через флавопротеин, называемый НАДФH-Р450 редуктаза. Одна молекула редуктазы может доставлять электроны на несколько различных молекул Р450. В митохондриях, где расположены итохромы Р450, участвующие в биосинтезе стероидных гормонов и метаболизме витамина D, электрон переносится с помощью 2-х белков: ферродоксина или ферродоксин-редуктазы. На рис. 1 показан каталитический цикл цитохрома Р450. 1-я часть цикла заключается в активации кислорода, 2-я – в окислении субстрата. Схема действия микросомальной монооксигеназной системы впервые была описана Эстабруком с соавт., в настоящее время она подтверждена многими исследователями. Эта схема такова: первая стадия состоит во взаимодействии субстрата с окисленной формой Р450. При связывании Р450 с субстратами

происходит переход гемового железа из низкоспинового в высокоспиновое состояние. Вторая стадия состоит в восстановлении образовавшегося фермент-субстратного комплекса первым электроном, который поступает с НАДФН-специфичной цепи переноса от НАДФН через флавопротеид I (НАДФН-цитохром Р450 редуктазу). Третья стадия состоит в образовании тройного комплекса: восстановленный цитохрома Р450-субстрат-кислород. Четвертая стадия представляет собой восстановление тройного комплекса вторым электроном, который, как полагают, поступает из НАДН-специфичной цепи переноса электронов, состоящей из НАДНцитохром b5 редуктазы или флавопротеида II и цитохрома b5 . Пятая стадия состоит из нескольких процессов, включающих внутримолекулярные превращения восстановленного тройного комплекса и его распад с образованием гидроксилированного продукта и воды. На этой стадии цитохром Р450 переходит в исходную окисленную форму.

Цитохромы Р450 катализируют следующие типы реакций: гидроксилирование алифатического или ароматического атома углерода; эпоксидирование двойной связи; окисление атома (S, N, I) или N-гидроксилирование; перенос окисленной группы; разрушение эфирной связи; дегидрогенирование. Некоторые реакции, катализируемые цитохромом Р450, представлены на рис. 2 и 3. Несколько классов реагентов хорошо иллюстрируют реакции фазы 1. Например, алканы гидроксилируются цитохромом Р450. Обычно гидроксилируется последний углерод в цепи, так называемое омега- гидроксилирование. Так же бывает внутреннее гидроксилирование в нескольких позициях (позиции -1,- 2).

Это приводит к множеству различных вариантов продуктов даже с таким простым алканом, как гексан. Заметим, что циклические углеводороды тоже подвергаются гидроксилированию. В реакции гидроксилирования сначала образуется полуацеталь, который потом превращается в спирт и альдегид. При окислении алкенов цитохромом Р450 образуются двуатомные окиси. Они отличаются по своей стабильности и могут являться высоко реакционноспособными. Например, винилхлорид метаболически переходит в окись, которая затем превращается в хлорацетальдегид – мутаген, действующий непосредственно на ДНК. Эти исследования привели к запрету на использование винилхлорида в распылителях. Винильная группа стерина (винилбензол) известна своими канцерогенными свойствами, но организм человека способен нейтрализовать его, переводя окись с помощью фермента эпоксигидролазы в диол. Но эпоксигидролаза помогает не всегда. Например, цитохром Р450 синтезирует эпоксид Афлотоксина В1 in vivо. Это соединение – высоко реакционноспособный электрофил, не стабилен и быстро формирует аддукт с ДНК. К тому же диол, образующийся из эпоксида, так же нестабилен и высоко реакционноспособен. Окисление ароматических соединений цитохромом Р450 так же дает эпоксиды, но они быстро переходят в фенол. В результате гидроксилирования бензола, полученный фенол может опять гидроксилироваться, переходя в катехол или гидрохинон. Заметим, что катехол и гидрохинон могут реагировать с кислородом, подавляя аналогичные реакции с хинонами и супероксидами, которые являются токсинами. Такое известное соединение как 2,3,7,8-тетрахлордибензолдиоксин (ТХДД) не подвержен гидроксилированию и устойчив (период полураспада в организме человека – год и более).

1.1.2. Множественные формы цитохрома Р450 Цитохром Р450 обнаруживается во всех организмах, начиная от бактерий. Полагают,

что в процессе эволюции этот фермент появился для конверсии инертных углеводородов окружающей среды до продуктов, используемых с энергетической и пластической целью, либо для удаления токсичных гидроперекисей у примитивных организмов, использующих кислород в клеточном дыхании. В результате процессов дупликации, конверсии, мутации генов образовалось множество изоформ цитохрома Р450, осуществляющих окислительный, восстановительный метаболизм стероидов, жирных кислот, ретиноидов, желчных кислот, биогенных аминов, лейкотриенов, а также экзогенных соединений, в том числе лекарств, загрязняющих агентов из окружающей среды, химических канцерогенов. В настоящее время известно, что цитохромы Р450 млекопитающих представляют собой структурно и функционально различные изоферменты. Они кодируются суперсемейством генов. В 1987 г. была разработана классификация Р450, основанная на дивергентной эволюции и гомологии нуклеoтид/аминокислотной последовательностей. Суперсемейство разделено на семейства, подсемейства и индивидуальные гены. Цитохромы Р450, имеющие более 40% гомологии аминокислотных последовательностей объединяют в одно семейство, а имеющие более 59% гомологии – в одно подсемейство. При составлении номенклатуры не учитывалась каталитическая активность цитохромов, поэтому члены различных подсемейств могут иметь перекрывающуюся субстратную специфичность. Независимо от структуры и хромосомной локализации, цитохромы P450 подразделяют на конститутивные и индуцибельные. Конститутивные изоформы Р450 постоянно продуцируются клеткой, независимо от условий роста. В отличие от конститутивных форм, экспрессия индуцибельных ферментов может контролироваться химическими соединениями. Специфическая индукция отдельных форм Р450 – одно из важнейших свойств этих ферментов, приобретенных в процессе эволюции. В настоящее время описано 36 семейств генов Р450, из них 12 обнаружено у млекопитающих. Некоторые формы цитохрома Р450 человека представлены в таблице 1.

Табл. 1. Цитохромы Р450 человека, окисляющие ксенобиотики Место экспрессии

Типичные субстраты

Индукторы

Вне печени, 1A1 другие ткани

Полициклические ароматические углеводороды, Бензо[a]пирен, ТХДД

Полициклические ароматические углеводороды,курение

1A2 Печень, легкие

Гетероциклические амины, ариламины, Полициклические ароматические амины, пищевые мутагены, ароматические углеводороды, афлатоксин В1 курение

2A6 Печень, легкие

Гетероциклические амины, ариламины, ароматические амины, пищевые мутагены, афлатоксин В1

2B6 Печень, другие

Лекарства (циклофосфамид)

2С8 Печень

Бензо[a]пирен, толбутамид, R-мефенитоин Барбитураты

2С9 Печень

Толбутамид, R- и S-мефенитоин варфарин Барбитураты

2С18 Печень

R- мефенитоин

2С19 Печень

R- и S-мефенитоин

2Е1 Печень, другие

Хлорзоксазон, N-итрозодиметиламин, этанол

2F1 Легкие, другие

Тестостерон, нафтиламин

CYP

3A3

Тонкий кишечник,

Нифедипин

Барбитураты

Этанол

Барбитураты

печень, другие 3А4 Печень, другие

Нифедипин, Тестостерон (6в), циклоспорин

3А5 Печень

Нифедипин

3А7 Печень

Тестостерон (6в),

Наиболее важными ферментами метаболизма канцерогенов являются представители семейства 1 и 2. Цитохромы Р450 семейства 2 и 3 осуществляют главным образом метаболизм лекарств. В настоящее время практически для всех членов суперсемейства цитохрома Р450 извесны специфические субстраты, что позволяет использовать их для выявления той или иной формы цитохрома Р450.

1.1.3. Способность цитохромов Р450 к индукции Одним из важнейших свойств компонентов монооксигеназной системы, в частности цитохрома Р-450, является способность к индукции под действием внешнего стимула, в роли которого могут выступать ксенобиотики, определенные физические воздействия, стресс. В отдельных случаях экзогенные вещества индуцируют ферменты (в том числе цитохромы Р-450) своего метаболизма, что важно иметь в виду при приеме лекарств, побочным действием которых является индукция ферментов собственного метаболизма. Феномен индукции цитохромов Р450 является важнейшей составляющей адаптивного ответа на чужеродные соединения, попадающие в клетку. Это приводит к усилению детоксификационной функции организма с последующим выведением ксенобиотика. Хроническое введение крысам барбитуратов постепенно уменьшало время сна от этих препаратов из-за усиления их метаболизма. Отсюда было сделано заключение, что данные метаболические изменения вызваны индукцией определенных форм цитохрома Р450. Процесс индукции цитохромов Р450 синтетическими или природными соединениями зарегистрирован у млекопитающих, птиц, рыб, беспозвоночных, растениях, дрожжах и бактериях. Все это свидетельствует о биологической важности этого явления. Некоторые цитохромы P-450 являются высоко индуцибильными: например, экспрессия Р450 1А1 может увеличиваться более чем в сто раз в печени и многих других тканях под действием 2,3,7,8,-тетрахлородибензо-р-диоксина, 3-метилхолантрена или других полициклических ароматических углеводородов (ПАУ). Экспрессия Р-450 2Е1 в печени возрастает под воздействием этанола, ацетона, изониазида, имидазола и других веществ, а экспрессия цитохромов подсемейства 4А в печени и почках вызывается клофибратом и другими пероксисомальными пролифераторами. Эффективными индукторами Р-450 подсемейства 3А являются макролидные антибиотики, синтетические стероиды (например, дексаметазон), и фенобарбитал (ФБ). ФБ вместе с большой группой структурно различных химических соединений, может также увеличивать экспрессию индивидуальных членов подсемейств подсемейств цитохромов Р-450 2А, 2В и 2С как у лабораторных животных, так и у людей (например, индукция цитохромов Р-450 2С под действием ФБ в культурах человеческих гепатоцитов). Параметры индукции некоторых цитохромов Р450 приведены в табл. 2.

Табл. 2 Индукция цитохромов Р450 различными соединениями Форма Р450

Типичные индукторы

Механизм первичной индукции

1А1

Диоксин (ТХДД), 3-

Активация транскрипции лиганд-активируемых Ah-

метилхолантрен

рецептором

1А2

3-метилхолантрен

Стабилизация мРНК

2В1/2

Фенобарбитал

Активация транскрипции под действием CARрецептора

2Е1

Этанол, ацетон, изониазид

Стабилизация белка

3А1

Дексаметазон

Активация транскрипции под действием PXRрецептора

3А1

Триацетилолиндомицин

Стабилизация белка

Как видно из таблицы, ряд цитохромов Р450 активируется при участии специфичных рецепторов. Лишь для Р-450 1А1 и, соответственно, Ah-рецептора известен детальный механизм действия. Для остальных Р450, как правило, идентифицирован специфичный рецептор, но механизм действия к настоящему времени детально не описан (соответствующие ссылки – в табл. 2). Кроме транскрипционного механизма индукции для цитохромов Р450 известны также посттранскрипционные (стабилизация мРНК) и пострансляционные (стабилизация белка, модификация фермента) механизмы. Последние характерны для цитохромов Р450 1А2, 2Е1 и 3А1.

1.1.4. Механизм индукции цитохрома Р450 1А1

Важность изучения цитохромов Р450 1А подсемейства у человека и экспериментальных животных обусловлена их ролью в химически индуцированном канцерогенезе. Именно эти ферменты осуществляют метаболическую активацию многих кацерогенных соединений, включая полициклические ароматические углеводороды, гетероциклические амины, ароматические амина и другие соединения. У большинства видов млекопитающих 1А подсемейство состоит из 2-х членов: 1А1 и 1А2 . CYP1A1 не обнаруживается в нормальной печени, а экспрессируется лишь под воздействием ксенобиотиков-индукторов, к которым относятся ПАУ. Цитохромы Р450 1А1 и 1А2 осуществляют биоактивацию следующих прооксидантов и проканцерогенов: Р450 1А1 – бенз[а]пирена и других ПАУ, Р450 1А2 – ПАУ, ароматических аминов, нитрозоаминов, парацетамола, гетероциклических аминов. Для CYP1А1 характерен генетический полиморфизм индуцибельности среди инбредных линий мышей. Некоторые линии (например, C57Bl/6) чувствительны к индукции ПАУсоединениями, тогда как другие (DBA/2) не отвечают на введение этих соединений. Такой полиморфизм связан с генетическим локусом AhR (Aryl Hydrocarbon Recеptor), который кодирует белок, названный Ah-рецептором. С этим белком связывается химический индуктор. Канцерогенные ПАУ соединения, такие как МХ, - типичные индукторы CYP1А1 (см. рис. 4).

Рис. 4. ПАУ-соединения - типичные индукторы CYP1А Лигандами для AhR яляются планарные молекулы типа ПАУ. Позднее был найден еще более мощный индуктор, 2,3,7,8- тетрахлордибензо-р-диоксин (ТХДД), способный из-за высокой аффинности к Ah-рецептору вызывать индукцию в дозах, на порядок меньших, чем для других ПАУ. Наличие в клетке рецептора для соединения, произведенного человеком относительно недавно, остается загадкой для исследователей. Возможно, что ТХДД мимикрирует какое-то эндогенное природное соединение, способное связываться с Ahрецептором. Такие соединения были найдены в некоторых растениях. Как показали эксперименты с нокаутными мышами, возможно также существование и эндогенного лиганда, схожего по структуре с ТХДД.

Рис. 5. Схема индукции цитохрома Р4501А1 Общепринятая на сегодняшний день схема активации гена CYP1А1 приведена на рис. 5. В отсутствие индуктора Ah-рецептор связан с белком теплового шока hsp90, который представляет собой компонент системы шейперонов, регулирующих стероид - и диоксинзависимые пути передачи сигнала. В этом случае взаимодействия белок-белок осуществляются через PAS-домен Ah-рецептора. Точная роль hsp90 в индукции CYP1А1 не определена, хотя полагают, что он поддерживает конфигурацию Ah-рецептора в состоянии, способствующем взаимодействию с лигандом. В цитоплазме Ah-рецептор и hsp90 также взаимодействуют с белком 37-38кД, гомологичным FK506-связывающим белкам, имеющим три тетратрикопептидных повтора. Усиление экспрессии этого белка сопровождается почти 2-х кратным усилением индукции CYP1А1. Роль этого белка в индукции CYP1А1 также неясна. Возможно, он может влиять на взаимодействие Ah-рецептора с лигандом и/или способствовать его транслокации в ядро. Ah-рецептор относится к семейству факторов транскрипции, названных “helix-loop-helix/PAS”, т.е. спираль-петля-спираль, содержащих PAS домен, благодаря которому осуществляется взаимодействие с другим белковым фактором ARNT (Ah Receptor Nuclear Translocator), что необходимо для активации транскрипции гена CYP1А. В результате гетеродимеризации этих белков, которая происходит в ядре, образуется ДНК связывающий фактор транскрипции. ARNT экспрессируется во многих тканях. Нокаутные по этому белку мыши погибали на 10-ый день развития, что, возможно, отражает участие ARNT как фактора транскрипции в сигнальной трансдукции. Гетеродимеризации ARNT и Ah-рецептора осуществляется через HLH и PAS домены, в результате чего положительно заряженные области белков могут распознать XRE элементы ДНК. Исследование ДНК-белковых взаимодействий показало, что ARNT связывается с 5’ GTG 3’ областью ХRЕ, а Ah – с соседним нуклеотидом. Промотор содержал несколько сайтов связывания для базальных факторов транскрипции, включая ТАТА-связывающие белки (ТВР). Анализ мутаций в области промотора показал, что ТВР-связывающие сайты также необходимы для транскрипции гена CYP1А1. Когда энхансеры неактивны, промотор не функционирует, следовательно, взаимодействие белков с проксимальными элементами гена является индуцибельным и зависит от активации Ah-рецептора и ARNT белка. Эти результаты представляются интересными, так как из них следует несколько важных выводов: 1. Промотор находится под контролем энхансера; 2. Должен существовать механизм, поддерживающий промотор в неактивном состоянии; 3. Взаимодействие энхансера с

промотором является необходимым этапом в активации транскрипции гена CYP1А1. Таким образом, Ah-рецептор и ARNT белок усиливают транскрипцию гена CYP1А1. Показано также, что с XRE могут взаимодействовать также молекулы, не относящиеся к рецепторам. К настоящему времени сформировалось представление о том, что события, следующие после связывания комплекса с-Src-Ah-рецептор с лигандом, могут протекать в двух независимых направлениях: 1. Этот комплекс может транслоцироваться в ядро, как это уже было описано выше, и связываться со специфическими XRE (DRE)-элементами; 2. Активация Ah-рецептора усиливает активность тирозинкиназ, в результате чего возрастает транспорт глюкозы, усиливаются процессы фосфорилирования, а также активность липопротеинлипазы. Этот, так называемый DRE-независимый путь играет существенную роль в развитии токсических процессов, вызванных диоксинами и другими ПАУ-соединениями. Cуществует также негативная регуляция, в том числе в различных тканях и видах животных. Было показано, что некоторые ДНК-связывающие белки могут конкурировать за связывание с цис-активными элементами. Обнаружены также цис-активные негативные элементы, которые ингибируют конститутивную и индуцируемую транскрипцию гена CYP1А1. Молекулярные механизмы этого явления остаются невыясненными. Помимо того, что Ah-рецептор регулирует экспрессию генов CYP1А, он также определяет токсичность многих ПАУ-соединений. Исследования по изучению зависимости структура-активность с использованием инбредных линий мышей, различающихся по чувствительности к индукции этими соединениями, показали, что многие галогенированные полициклические углеводороды, связываясь с Ah-рецептором, индуцируют не только CYP1А, но и проявляют высокую токсичность. Эти данные, дополненные экспериментами с Ahнокаутными мышами, которые оказались устойчивыми к токсическому действию ТХДД, подтвердили гипотезу, что ксенобиотики, подобные ТХДД, реализуют биохимические и токсические эффекты через Ah-рецептор. Наличие этого белка, содержание которого широко варьирует для многих видов животных и во многих тканях, а также его способность связываться с лигандами и активировать экспрессию многих генов, дало возможность предположить, что токсическое действие ПАУ осуществляется через изменение экспрессии генов в чувствительных клетках.

1.1.5. Конститутивная экспрессия цитохрома Р450 1А2 и его индукция

При индукции ПАУ-соединениями в печени экспериментальных животных наряду с CYP1А1 регистрируется другой белок этого подсемейства – цитохром Р450 1А2. CYP1А2, в отличие от CYP1А1, конститутивно экспрессируется в печени экспериментальных животных и человека и, следовательно, метаболизирует многие химические соединения без индукции. Cубстратами для CYP1А2 являются гетероциклические амины, ариламины и нитрозоамины. В последнее время появились доказательства участия этого фермента в метаболизме эндогенных соединений, в том числе стероидов. Под действием таких индукторов, как ТХДД, МХ или бензантрацен происходит индукция CYP1А2, что сопровождалось заметным увеличением уровня мРНК, количества белка, определенного иммуноферментным анализом, а также усилением фенацетин-О-деэтилазной активности. Показана роль Ah-рецептора и ARNT белка в активации транскрипции гена CYP1А2. СYР1А2, как и CYP1A1 может быть активирован через Ah-рецептор. В 5’-фланкирующей области данного гена найдены элементы, с которыми связывается Ah-рецептор в комплексе с Arnt. Для этого гена также были идентифицированы негативные и позитивные элементы. В экспериментах с мышами, нокаутными по Ah-рецептору (генотип AhR-/-) показано снижение

конститутивного уровня мРНК СYР1А2 на 80% . Механизм конститутивной экспрессии остается неизвестным. Возможно, существует эндогенный лиганд, взаимодействующий с данным рецептором, поскольку в экспериментах in vitro показано, что в отсутствие лиганда Ahрецептор не способен связываться с ДНК. С другой стороны, имеются данные о том, что ксенобиотики, не являющиеся высокоаффинными лигандами, или вообще не являющиеся лигандами, например омепразол, могут изменять экспрессию гена СYР1А2. Возможно, в подобных случаях Ah-рецептор активируется без прямого связывания, предположительно генерируя метаболиты с очень коротким временем жизни. В настоящее время накапливаются доказательства общего сигнального пути запуска транскрипции генов CYP1А различными соединениями. Механизм активации конститутивной экспрессии этого гена через Ah-рецептор остается неизвестным. Одним из возможных объяснений может быть существование эндогенного лиганда, который взаимодействует с данным рецептором. С другой стороны, появляется все больше сообщений о том, что индукция CYP1А2 может осуществляться не только через Ah-рецептор. Точный механизм этого явления остается на сегодняшний день неизвестным. Предполагается, что в таких случаях активизируются посттранскрипционные механизмы стабилизации мРНК или пострансляционная стабилизация белка через образование комплекса фермент-индуктор.

1.1.6. Механизм индукции цитохромов Р450 2В и 2С барбитуратами

Цитохромы Р450 2В подсемейства катализируют метаболизм многих лекарственных препаратов и других ксенобиотиков с самой разнообразной химической структурой. Идентифицированы такие гены этого подсемейства, как: CYР2В1, CYР2В2, CYР2В3, CYР2В8, CYР2В14, CYР2В14Р; у кроликов: CYР2В4, CYР2В4Р, CYР2В5; у мышей: Cyр2b-9, Cyр2b-10, Cyр2b-13, у человека: CYР2В6 и псевдоген CYР2В7Р. В метаболизме ксенобиотиков участвуют главным образом CYР 2В1 и 2В2 белки. Каталитические свойства этих ферментов и регуляция экспрессии генов существенно различаются. CYP2В1 активно метаболизирует широкий спектр липофильных лекарств и стероидов. CYP2В2 может метаболизировать те же субстраты, что и CYP2В1, однако, скорость метаболизма заметно ниже. Оба белка состоят из N-терминального гидрофобного участка порядка 20 аминокислот, который служит для закрепления в мембране; цис/гем связующего пептида; субстрат-связующего участка и района, который взаимодействует с НАДФН-цитохром Р450 редуктазой. Фенобарбитал является прототипом большой группы структурно неродственных индукторов (органические растворители, пестициды, хлорированные бифенилы и лекарства), которые оказывают влияние на многие клеточные процессы и вызывают усиление экспрессии различных генов. Механизм индуцирующего действия ФБ широко дискутируется и пока до конца не ясен. Кроме этого, неизвестно, является ли действие индукторов ФБ-типа универсальным, как это описано для полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), которые имеют планарное строение. ФБ-подобными индукторами являются изосафрол, транс-стильбен оксид, аллилизопропилацетамид, хлордан и другие хлорорганические пестициды, различные фенотиазины, неплоские галогенированные бифенилы, и канцерогены, такие как ацетиламинофлуорен. При сравнении ФБ с близкими барбитуратами уровень индукции тесно коррелирует со временем полураспада барбитурата в плазме; вещества с низким уровнем метаболизма и соответственно большим временем полураспада являются более мощными индуцирующими агентами. В случае ФБ, именно исходное вещество, а не его основной метаболит, р-гидроксифенобарбитал, по-видимому, является индуктором. Фенобарбиталом индуцируются следующие подсемейства цитохромов: CYP2A, CYP2B, CYP2C, CYP2H, CYP3A, CYP6A, CYP102/106. Индукция цитохрома Р450 барбитуратами напрямую связана со временем

полужизни лекарства в плазме крови. ФБ индуцирует не только цитохромы Р450, но и другие ферменты, участвующие в метаболизме ксенобиотиков: альдегид-дегидрогеназу, эпоксидгидролазу, НАДФН-цитохром Р450 редуктазу, УДФ-глюкуронилтрансферазу и некоторые глютатион S-трансферазы. При этом усиливается также пролиферация гладкого ЭПР, увеличивается вес печени. Кроме того, ФБ является промотором рака. Все перечисленное выше говорит о плейотропном действии этого лекарства на многие ферментативные системы клетки, но индуцируются наиболее эффективно цитохромы Р450 подсемейства 2В.

Рис. 6. Схема активации генов Р450 фенобарбиталом В противоположность генам CYP1А, в механизм индукции генов CYP2В вовлечены так называемые орфановые рецепторы, физиологические лиганды для которых остаются неизвестными. Эти белки принадлежат к семейству ядерных стероидных рецепторов. Недавно был идентифицирован новый орфановый рецептор САR, который участвует в активации генов CYP2В. Показано, что этот рецептор связывается с PBRE цис-активными элементами гена CYP2В2 лишь в виде гетеродимера с ретиноидным рецептором RXR. Предполагается, что активация ДНК-связывающей способности CAR белка может происходить за счет фенобарбитала, который может стимулировать транслокацию рецептора в ядро и его связывание с PBRE-элементами. Общепринятая на сегодняшний день схема индукции фенобарбиталом, разработанная американским ученым Негиши, представлена на рис. 6. Возможно также существование другого механизма, согласно которому CAR белок может находиться в ядре, а ФБ лишь усиливает его ДНК-связывающую способность. Примеры для обоих типов регуляции показаны для других ядерных рецепторов Найдены регуляторные участки генов - ФБ-ответственные элементы (PBRs), с которыми взаимодействуют факторы транскрипции. Основной принцип этого механизма состоит в том, что при ФБ-индукции происходит дерепрессия гена CYP через освобождение белкарепрессора. Этот белок держит в связанном состоянии участок ДНК размером 17 п.о., названный Барби-бокс (Barbie box). Интересен тот факт, что подобная область с характерным мотивом АААГ была найдена в генах ФБ-индуцируемых цитохромов Р450 млекопитающих: CYP 2В1, 2В2, 3А2, 2С1

1.2 II-я фаза метаболизма ксенобиотиков

Ко второй фазе биотрансформации ксенобиотиков (II фаза) относятся реакции глюкуронидации, сульфатирования, ацетилирования, метилирования, конъюгации с глютатионом (синтез меркаптуровой кислоты) и конъюгация с аминокислотами, такими как глицин, таурин, глутаминовая кислота. Кофакторы этих реакций реагируют с функциональными ферментами 1-й фазы. За исключением метилирования и ацетилирования, реакции 2-й фазы приводят к значительному увеличению гидрофильности ксенобиотика, что способствует их экскреции из организма. Большинство ферментов 2-й фазы локализовано в цитозоле, кроме уридиндифосфоглюкуронозилтрансфераз (УДТ), которые являются микросомальными. Реакции 2-й фазы обычно протекают намного быстрее, чем реакции 1-й фазы, катализируемые цитохромом Р-450. Поэтому скорость элиминирования ксенобиотика в большой степени зависит от скорости, с которой протекает реакция 1-й фазы.

1.2.1. Уридин дифосфатглюкуронозил трансферазы (УДT) Глюкуронидация является основным путем биотрансформации ксенобиотиков у многих видов млекопитающих за исключением семейства кошачьих. Типичная реакция представлена на рис.7. В качестве кофактора эта реакция требует присутствия уридиндифосфоглюкуроновой кислоты (УДФ-глюкуроновая кислота). УДT локализуется в эндоплазматическом ретикулуме клеток печени и других тканей (почки, тонкий кишечник, селезенка, кожа, мозг и т.д.). Сайтом глюкуронидации обычно является электрон-богатый нуклеофильный атом кислорода, азота или серы. Субстраты для УДТ содержат такие функциональные группы как

карбоксигруппу, спиртовую или фенольную (в результате реакции формируется О-

глюкуроновый эфир), первичные или вторичные аминогруппы (N-глюкурониды) или свободную сульфгидрильную группу (S-глюкурониды). Субстратами для УДТ могут служить эндогенные соединения, типа билирубина, стероидных и тиреоидных гормонов. Глюкуроновые конъюгаты являются полярными соединениями, которые легко экскретируются с мочой или желчью, что зависит от размера агликона. Например, у крыс глюкурониды экскретируются с мочой, если молекулярная масса агликона менее 250 Да и с желчью, – если более 350 Да. Кофактор -конфигурацию, чтосинтезируется из глюкозо-1-фосфата и глюкуроновой кислоты и имеет -глюкуронидазами. В ходе нуклеофильной атаки на электрон-защищает его от гидролиза богатый атом кислорода, азота или серы происходит инверсия конфигурации, и разовавшиеся -конфигурацию.метаболиты имеют C-конец всех УДT содержит мембранно-связанный домен, который выполняет функцию якоря, закрепляя фермент в эндоплазматическом ретикулуме. Поскольку фермент обращен в сторону просвета эндоплазматического ретикулума, а синтез УДФ-глюкуроновой кислоты происходит в цитоплазме, то возникает проблема транспорта кофактора через эндоплазматический ретикулум. Постулируется, что транспорт УДФ-глюкуроновой кислоты в просвет ЭПР и УДФ в цитозоль происходит по челночному механизму. Глюкуронидация ксенобиотиков печеночными микросомами может быть стимулирована детергентами, которые разрывают липидный бислой, что обеспечивает УДT свободный доступ к УДФ-глюкуроновой кислоте. Однако, высокая концентрация детергента может ингибировать УДT, разрушая взаимодействия между ферментом и фосфолипидами. Недоступность кофактора может ограничить скорость глюкуронидации лекарств, назначаемых в высоких дозах. УДТ экспрессируется двумя генными семействами, УДT1 и УДT2, имеющими менее 50% гомологии аминокислотной последовательности. Ферменты, принадлежащие к 1-му семейству, участвуют в конъюгации фенолов, ариламинов, включая некоторые канцерогены, лекарств типа ацетаминофена, и билирубина, а ферменты 2-го семейства – стероидов. Члены 1-го семейства формируются путем альтернативного сплайсинга единственного гена. Множество ферментов, представляющих собой продукт УДT1-локуса, конструируются путем соединения отдельных субстрат-связывающих сайтов (кодируемых множественными копиями 1-го экзона), расположенных в N-концевой части, размером примерно в 280 аминокислотных остатков, с константной частью фермента, кодируемой экзонами 2-5. Константная область кодирует Сконцевую часть в 245 аминокислотных остатков, которая отвечает за связывание кофактора и размещение в мембране. Таким образом, мутация в константной области может привести к синтезу абнормальных форм всех УДТ, кодируемых локусом 1. Например, показано, что у крыс Gunn мутация кодона 415 локуса 1 может приводить к преждевременному появлению стопсигнала. При этом синтезируются укороченные и функционально неактивные формы УДТ. Известно, что у крыс локус 1 кодирует УДT, индуцируемую 3-метилхолантреном и ТХДД. УДT1А6 включается в конъюгацию ПАУ, ацетаминофена и ариламинов. В экстрапеченочных тканях обнаружена конститутивная экспрессия этого фермента. Регуляция активности этого фермента может осуществляться, по крайней мере, двумя способами, включая тканеспецифичную и AhR-контролируемую экспрессию. В регуляторной области 1А6 обнаружен XRE, который связывается с AhR и Arnt–белками. Члены 2-го семейства кодируются двумя отдельными генами, причем 2А экспрессируется в кожном эпителии, а 2В – в микросомах печени. Субстратами для них являются стероидные гормоны. Кроме того, показано, что УДТ 2В семейства могут участвовать в метаболизме ряда ксенобиотиков, включая морфий, а также метаболитов канцерогенов, 2-ацетиламинофлуорена и бенз[а]пирена. У крыс 2 фермента из семейства 2В индуцируются ФБ. Глюкуронидация обычно представляет собой детоксикационный процесс, однако стероидные гормоны, которые взаимодействуют с глюкуронидом по Д-кольцу (но не по А-) могут приводить к возникновению холестазии. Индукция УДT может влиять на возникновение рака щитовидной железы у грызунов. В некоторых случаях глюкуронидация может усилить токсичность ксенобиотика. Например, ароматические амины типа 2-аминонафталена и 4аминобифенила N-гидроксилируются в печени с последующей N-глюкуронидацией N-гидрокси

метаболита. N-глюкурониды подвергаются почечной фильтрации, накапливаясь в полости мочевого пузыря, где при кислых значениях рН происходит их гидролиз до соответствующих канцерогенных N-гидроксиариламинов. В таком случае усиление глюкуронизации может способствовать возникновению рака мочевого пузыря.

1.2.2. Глютатион-S-трансферазы (ГSТ)

Глютатион (ГSH) представляет собой трипептид, состоящий из глицина, цистеина и -карбоксильную группу. Вглутаминовой кислоты, которая связана с цистеином через результате нуклеофильной атаки глютатион тиолат аниона на электрофильный атом углерода, кислорода, азота или серы ксенобиотика, формируется тиоэфир. Конъюгация ксенобиотиков с глютатионом катализируется суперсемейством глютатион-Sтрансфераз (ГSТ). Эти белки

обнаружены в большинстве тканей, а именно в печени, почках, тонком кишечнике, легких и т.д. 95% от общего содержания фермента локализовано в цитоплазме и около 5% - в эндоплазматическом ретикулуме. Субстратами для ГSТ обычно являются гидрофобные соединения, содержащие электрофильный атом способные реагировать с глютатионом неферментативно. На рис. 8 представлена типичная реакция, катализируемая ГST. Однако, из-за стереоселективности реакций с ксенобиотиками, в основном они протекают при участии ГST. Механизм, с помощью которого ГST усиливает скорость конъюгации, состоит в депротонировании ГSH до ГS- . В этой реакции принимает участие тирозинат Tyr-O- , расположенный в активном центре. Субстраты для глютатионовой конъюгации можно разделить на две группы: 1) достаточно электрофильные для осуществления прямой конъюгации, 2) требующие активации до реакции конъюгации. 2-я группа соединений включает в себя оксиарены, эпоксиды алкенов, ионы нитрония, ионы карбония и свободные радикалы. ГST представляет собой димер, составленный из комбинации 2-х идентичных или неидентичных субъединиц. Описаны следующие генные семейства ГST, кодирующие цитозольные ферменты: alpha, mu, theta, pi, zeta. Классификация построена на основе структурных, иммунологических и функциональных свойств. Показано, что ГST, принадлежащие к различным классам, могут обладать перекрывающейся субстратной специфичностью. Субъединицы, принадлежащие к различным классам, имеют менее 50% гомологии аминокислотной последовательности. Субъединицы в пределах одного класса имеют около 70% гомологии. Гедеродимеры могут формироваться только при участии субъединиц, принадлежащих к одному классу. Семейства цитозольных ГST имеют общее эволюционное происхождение, причем -классу. Микросомальные формы фермента возникли изпредковый ген наиболее близок к отдельной эволюционной ветви. ГST представлены суперсемейством мультифункциональных изоферментов, которые

способствуют процессам детоксикации, используя различные механизмы, включая 1) каталитическую инактивацию широкого спектра ксенобиотиков через конъюгацию с ГSH; 2) некаталитическое связывание определенных ксенобиотиков; 3) восстановление липид- и ДНКгидропероксидов через экспрессию активности ГSH-пероксидазы 2. ГST играют важную роль в детоксикации Афлатоксин В1-8,9-эпоксида. Показано, что у грызунов отсутствие фермента, отвечающего за катализ этой реакции, связано с повышенной чувствительностью к раку печени. Интенсивно изучается метаболизм известного ПАУ – бенз[а]пирена (БП). Показано, что ГST печени человека обладают каталитической активностью по отношению к реактивному метаболиту БП – БП-4,5-оксиду. Это соединение дает позитивный ответ в тесте на мутагенность, хотя и не вовлекается напрямую в канцерогенез. Кроме метаболизма канцерогенов, ГST детоксицирует широкий спектр других ксенобиотиков, например фосфорорганические инсектициды, гербициды, пестициды, химиотерапевтические лекарства. Дополнительно к защитным свойствам, ГST участвует в биосинтезе биологически активных молекул, включая лейкотриены и простагландины.

1.2.3. N-ацетилтрансферазы N-ацетилирование – основной путь биотрансформации для ароматических аминов или ксенобиотиков, в том числе и лекарств, содержащих гидразогруппу (R-NH-NH2), которые превращаются в ароматические амиды (R-NH-COCH3) или гидразиды (R-NH-NH-COCH3), соответственно. Первичные алифатические амины редко подвергаются N-ацетилированию за исключением цистеиновых конъюгатов, образующихся из глютатионовых, которые, в свою очередь, путем N-ацетилирования в почках превращаются в меркаптуровую кислоту. Многие Nацетилированные метаболиты менее, чем исходные соединения, растворимы в воде. Однако в отдельных случаях, например, для изониазида, N-ацетилирование облегчает экскрецию метаболитов с мочой. Реакция N-ацетилирования катализируется ферментами, называемыми Nацетилтрансферазы (NAT) и требует присутствия ацетил-кофермента А (Ац-КоА) в качестве кофактора. Реакция протекает в два последовательных шага. Первым этапом ацетильная группа Ац-КоА переносится к цистеиновому остатку внутри активного центра фермента с высвобождением кофермента А: E-SH + КoA-COCH3 →E-S-COCH3 + КoA-SH Вторым шагом ацетильная группа Ац-КоА переносится с ацетилированного фермента на аминогруппу субстрата. Для сильноосновных аминов скорость N-ацетилирования определяется первым шагом , тогда как для слабоосновных – вторым. В определенных случаях NAT могут катализировать реакцию О-ацетилирования. NAT – цитозольные ферменты, которые были найдены в печени и многих других тканях у большинства видов млекопитающих, за исключением лис и собак, неспособных к Nацетилированию ксенобиотиков. У кроликов, мышей экспрессируется две формы NAT, обозначаемых NAT1 и NAT2. По последним данным у человека идентифицировано, кроме этих двух классов, еще 3 класса ферментов: арилалкин-N-ацетилтрансфераза (AANAT), L1-протеин-регулятор адгезии клеток (L1 CAM) и гомолог Saccharomyces cerevisiae N- ацетилтрансферазы у человека (ARD1). NAT1 и NAT2 являются близкими по первичной структуре (79-95% гомологии аминокислотной последовательности, в зависимости от вида). У всех белков в активном центре присутствует цистеин (Cys68). Оба белка кодируются генами, не содержащими интронов. Гены NAT хотя и расположены на одной хромосоме, но регулируются независимо друг от друга. NAT1 экспрессируется в большинстве тканей организма, тогда как NAT2, повидимому, только в печени и кишечнике. Эти ферменты отличаются по субстратной специфичности, хотя и имеется перекрывание. Субстратами, предпочтительно Nацетилируемыми человеческой NAT1, являются парааминосалициловая кислота,

парааминобензойная кислота, сульфаметоксазол. Субстраты, преимущественно N-цетилируемые при участии NAT2, включают изониазид, гидралазин, сульфаметазин, дапсон. Некоторые ксенобиотики, например, 2-аминофлуорен одинаково хорошо метаболизируются обоими ферментами. Генетический полиморфизм N-ацетилирования показан у хомяков, мышей, кроликов. Вариации в NAT2-локусе отвечают за классический полиморфизм ацетилирования, подразделяющий индивидуумов на «быстрых», «средних» и «медленных» ацетиляторов. Определенные вариации NAT1-локуса приводят к усилению активностей N-, О- или N,Оацетилирования по сравнению с диким типом. Серия клинических наблюдений, проведенных в 50-х годах, установила существование так называемых ««медленных»» ацетиляторов антитуберкулезного лекарства изониазида. Встречаемость этого фенотипа довольно высокая на Среднем Востоке (около 70% в Египте и Саудовской Аравии), средняя в Европе, на Кавказе, в Америке и Австралии (около 50%), низкая в азиатской популяции (менее 25% в Китае, Японии, Корее). В настоящее время варианты по статусу ацетилирования описаны и у человека и у животных. Фенотип медленного ацетилирования возникает в результате мутаций NAT2 гена, которые приводят либо к снижению активности фермента, либо к снижению его стабильности. Например, точковая мутация в 341 нуклеотиде приводит к аминокислотной замене Ile114 - Thr и снижает максимальную скорость N-ацетилирования (Vmax) без изменения Кm для связывания субстрата или стабильности фермента. Эта мутация часто встречается среди кавказской популяции, но редко среди азиатской. Внутри фенотипа медленного ацетилирования существуют значительные вариации в скорости ацетилирования ксенобиотиков, поскольку различные мутации оказывают различное действие на активность и/или стабильность NAT2. У «медленных» ацетиляторов значительным оказывается Nацетилирование “NАT2-субстратов” при помощи NAT1. Генетический полиморфизм NAT2 оказывает токсикологическое и фармакологическое влияние на метаболизм лекарств, которые N-ацетилируются этим ферментом. Например, фармакологический эффект антигипотензивного лекарства гидралазина является более продолжительным у «медленных» ацетиляторов, тогда как медленные ацетиляторы предрасположены к различным лекарственным отравлениям. «Медленные» ацетиляторы, которые к тому же дефицитны по глюкозо-6-фосфатдегидрогеназе, особенно склонны к гемолизу под действием определенных сульфонамидов. «Быстрые» ацетиляторы предрасположены к миелотоксическим эффектам амонафидов, поскольку N-ацетилирование замедляет выведение этих антинеопластических лекарств.

1.2.4. Сульфотрансферазы

Многие ксенобиотики, подвергающиеся О-глюкуронидации, подвергаются и сульфатной конъюгации. Сульфатные конъюгаты представляют собой хорошо водорастворимые эфиры серной кислоты. Реакция катализируется сульфотрансферазами, группой ферментов обнаруженных в печени, почках, кишечнике, легких, мозге. Кофактором реакции служит 3’-фосфоаденозин-5’фосфосульфат (PAPS), который в организме синтезируется из АТФ и неорганического сульфата. Сульфатная конъюгация алифатических спиртов и фенолов протекает по следующей схеме: R-OH + фосфоаденозин-ОРО2 SO4 --> ROSO3- + фосфоаденозин-О-РО32- + Н+ Сульфатная конъюгация включает перенос SO3- от PAPS к ксенобиотикам. Субстраты для реакции не ограничиваются спиртами и фенолами, которые часто являются продуктами реакции 1-й фазы. К ксенобиотикам, не требующим предварительной активации ферментами 1й фазы относятся первичные и вторичные спирты, желчные кислоты, катехолы, определенные ароматические амины, например, анилин и 2-аминонафтален, конъюгирующие с PAPS с

образованием соответствующих сульфаматов. N-гидроксиариламины также являются субстратами для сульфотрансфераз. Во всех случаях реакция включает нуклеофильную атаку атомов кислорода или азота на атом серы в PAPS с расщеплением фосфосульфатной связи. Сульфатные конъюгаты ксенобиотиков экскретируются в основном с мочой. Метаболиты, экскретируемые с желчью могут быть гидролизованы арилсульфатазами, присутствующими в микрофлоре кишечника, что способствует энтеропеченочной циркуляции ксенобиотика. Сульфатазы присутствуют и в эндоплазматическом ретикулуме и в лизосомах, где преимущественно гидролизуют сульфаты эндогенных соединений. Некоторые сульфатные конъюгаты подвергаются дальнейшей биотрансформации. Например, андростен 3,17-диол-3,17-гидроксилируется с участием цитохрома Р450 2С12, специфичного длядисульфат далее 15 самок крыс фермента. Сульфатирование благоприятствует дейодированию тироксина и трийодтирозина и может определять скорость элиминирования тиреоидных гормонов. Относительно низкая концентрация PAPS в клетке (около 75мкМ, для сравнения – концентрация УДФ-глюкуроновой кислоты составляет около 350мкМ) ограничивает возможности сульфатирования ксенобиотиков. В целом этот путь биотрансформации представляется высокоспецифичным, но низкоемким. Ряд соединений одновременно являются субстратами и для сульфотрансфераз и для УДФ-глюкуронозилтрансфераз, при этом выбор пути метаболизма может зависеть от концентрации субстрата, доступности кофакторов и т.д. Например, относительное содержание продуктов метаболизма ацетаминофена зависит от дозы препарата: при низких дозах преобладают сульфатные конъюгаты, а с увеличением дозы происходит насыщение метаболического пути и, возможно, за счет ингибирования активности сульфотрансфераз, снижение относительного количества сульфатных конъюгатов по сравнению с глюкуроновыми. Обнаружены множественные формы сульфотрансфераз, которые являются членами одного суперсемейства. Суперсемейство подразделяется на ряд подсемейств: 1А, 1В, 1С, 1Е, 2А, 2В и 3А исходя из гомологии аминокислотной последовательности. Номенклатура индивидуальных форм ферментов не разработана окончательно, поэтому иногда сульфотрансферазы подразделяют на 5 классов исходя из субстратной специфичности: арилсульфотрансферазы - сульфатируют большое количество фенольных ксенобиотиков; алкогольсульфотрансферазы - метаболизируют первичные и вторичные спирты, включая неароматические гидроксистероиды; эстрогенсульфотрансфераза – ароматические гидрооксистероиды; тирозинсульфотрансфераза – тирозин метиловые эфиры, желчные кислоты. У человека в цитозоле печени обнаружено 3 вида сульфотрансфераз: два изофермента фенольной сульфотрансферазы и одна стероид/желчная сульфотрансфераза, называемая также дегидроэпиандростерон-сульфотрансфераза (DHEA-ST). Фенольные сульфотрансферазы отличаются по термостабильности – одна из форм является термостабильной, а вторая – термолабильной. Исследование роли сульфотранфераз в биоактивации 4-аминобифенила показало, что N-OH-аминобифенилсульфотрансферазная активность в печени и кишечнике коррелировала с активностью термостабильной ST, но не с активностями термолабильной ST или DHEA-ST. Используя арилсульфотрансферазную пробу мРНК (HAST1), была продемонстрирована заметная сульфотрансферазная экспрессия в толстом и тонком кишечнике, легком, желудке и печени человека. В целом, сульфатирование эффективно снижает фармакологическую и оксикологическую активность ксенобиотиков. Однако в некоторых случаях сульфатирование увеличивает токсичность чужеродных соединений, поскольку отдельные сульфатные конъюгаты химически нестабильны и деградируют, формируя сильные электрофильные соединения. Сульфоконъюгация является необходимым этапом активации многих проканцерогенов, таких как ацетиламинофлуорен, ариламины, эстрадиол и др. Многие N-гидроксиариламины и гидроксамовые кислоты обладали мутагенным эффектом в присутствии сульфотрансферазной активности. Для детектирования мутагенного эффекта важно, что сульфатирование имеет место внутри клеток-мишеней, поскольку сульфатные конъюгаты из-за своего заряда не могут проникнуть сквозь клеточные мембраны.

1.2.5. Эпоксидгидролаза

Эти ферменты катализируют трансформацию многих реактивных и специфических эпоксидов в дигидродиолы, которые для многих соединений являются неактивными. Но в некоторых случаях, например, для ПАУ, образуются особо опасные эпоксид-дигидродиолы. Гидролазная реакция (рис. 9) трансформирует эпоксид в диол. Фермент катализирует нуклеофильную атаку водой или ОН- с противоположной стороны эпоксидного кольца.

Рис. 9. Реакция, катализируемая микросомальной эпоксидгидролазой Образующиеся диолы имеют транс-конфигурацию. Фермента много в почках и печени. Извесно 5 форм эпоксидгидролазы: холестериновая, лейкотриеновая, гепоксилиновая, микросомальная и растворимая. Две последние участвуют в метаболизме ксенобиотиков. Микросомальная эпоксидгидролаза гидрирует монозамещенные, 1,1-дизамещенные и цис-1,2дизамещенные эпоксиды и эпоксиды на циклических системах. Она инактивирует эпоксиды после ферментов 1-й фазы. Водорастворимая эпоксидгидролаза гидрирует широкий спектр эпоксидов, но не циклические системы.

Глава 2. Распределение, накопление и элиминация токсинов Все чужеродные соединения, попадая в организм человека или животных, распределяются в различных тканях, накапливаются, подвергаются метаболизму и выводятся. Все эти процеccы требуют отдельного рассмотрения.

2.1. Органо- и тканеспецифичность в распределении токсинов

Компартменты. Тело человека состоит в основном из воды, которая распределяется среди нескольких компартментов. Объем крови у взрослого человека

составляет около 3-х литров. Объем внеклеточной жидкости, омывающей внутренние органы, достигает 15 литров. Включая количество воды внутри клеток, общий объем жидкости составляет приблизительно 42 литра. Лекарства и токсичные соединения по-разному распределяются среди этих компартментов, знания о которых могут быть важны для понимания последствий экспозиции. Предположим, что в кровь поступает 1г. соединения. Если оно остается в крови полностью (например, как антикоагулянт гепарин), то его концентрация будет составлять приблизительно 333 мг/литр. Напротив, если вещества распространяются во внеклеточной жидкости (например, альбумин или ионы хлора), то их концентрация в крови может быть всего 67 мг/литр. Если же вещество распределяется между вне- и внутриклеточной жидкостью (как этанол), то его концентрация в крови будет составлять около 24 мг/литр. Заметим, что объем распределения (Vd) находится в обратной зависимости от концентрации крови. Чем более свободно внутривенная доза соединения распространяется по телу, тем ниже его остаточная концентрация в крови. Параметр Vd может быть рассчитан как отношение вводимой дозы к концентрации в крови. Vd зависит от химических свойств соединения, является константой для данного вида и может быть определен спериментально. Подсчет Vd может быть полезен для определения нагрузки на организм, особенно для соединений, которые выводятся медленно. Эта информация может быть необходимой при проведении антидот терапии. Для некоторых соединений подсчитанные величины Vd являются очень большими, много больше, чем суммарный объем жидкости организма (т.е. 1000 литров). Такие величины кажутся противоестественными. Обычно такие соединения локализуются не в крови, а в других компартментах организма. Например, йод концентрируется в щитовидной железе. ТХДД - в жире, стронций – в костях. В жировой ткани обычно откладываются гидрофобные соединения, что препятствует их биотрансформации до более водорастворимых производных. Связывание с белками. Некоторые соединения в крови могут изолироваться путем связывания с белками. Альбумин, высокая концентрация которого обнаруживается в крови, имеет сайты связывания для гидрофобных соединений и способствует повышению растворимости соединений, которые иначе откладываются на стенках кровеносных сосудов или в тканях. Такое связывание может быть основным путем усиления экскреции. Хорошим примером является транспорт производных билирубина из поврежденных эритроцитов в печень. Трансферрин связывает железо, регулирует его доставку в клетки и предотвращает взаимодействие с восстанавливающими соединениями и кислородом, который генерирует токсичные высоко реакционноспособные производные. Стероидные гормоны связываются с определенными глобулинами, а витамин А и тиреоидные гормоны – с белком трансферитин. Будучи частью макромолекулярного комплекса, витамины и гормоны не фильтруются в почках, таким образом, предотвращается их потеря в результате фильтрации. В идеале скорость фильтрации соединения в почках, а, следовательно, время полувыведения, должно быть обратно пропорционально количеству соединения, связанного с белком в любой момент времени. Предположим, что соединение полностью не связано с белком и его время полувыведения составляет 3 часа. Если соединение свободно на 10% и на 90% связано в комплексе, слишком большом, чтобы фильтроваться, его ожидаемое время полувыведения увеличивается до 30 часов. В качестве примера можно привести 2,4-D (дихлорфеноксиуксусную кислоту). У камбалы это соединение является свободным на 30%, а время полувыведения составляет 5 часов, тогда как у крыс и собак свободно 10% и 3%, а соответствующее время полувыведения увеличивается до 14 и 87 часов. Белковое связывание в крови также ограничивает принятие органических ионов (типа 2,4-D) специальными транспортными системами в клетках проксимальных канальцев почек и их экспорт внутрь нефронов. Это может снизить скорость элиминирования даже больше, чем снижение скорости фильтрации. Изоляция соединений при помощи белков крови может ограничить их действие на клетки, поскольку свободная концентрация может быть значительно ниже, чем общая. Клетки часто разрабатывают специальные компенсаторные пути для поглощения некоторых питательных веществ. У индивидов, получавших большую дозу соединения, которое замещает

связанное вещество, наблюдались токсические реакции. Например, когда антибиотики только начинали использовать, обнаружилось, что сульфониламиды замещают билирубин из альбумина плазмы. Когда большие дозы сульфониламидов назначали младенцам, наблюдалось ухудшение развития гематоэнцефалического барьера, а высвобождающийся билирубин вызывал повреждения мозга. Тетрациклин, не замещающий билирубин, может быть использован как альтернативный препарат. Разграничение слабых кислот/оснований. Многие лекарства и токсичные соединения являются слабыми кислотами или основаниями, что может сильно влиять на их распределение среди клеточных мембран. Следующее обсуждение предлагает упрощенный подход, без учета реакций биотрансформации и транспортных механизмов. Обычно обладающие зарядом ксенобиотики не диффундируют сквозь мембраны, в отличие от незаряженных. Поскольку рН сильно влияет на степень ионизации слабых кислот и оснований, этот фактор является критическим при определении, каким образом будут распределяться такие соединения. Предположим, была поглощена бензойная кислота (рКа≈5). В желудке (рН ≈2) она почти полностью будет находиться в незаряженной (кислотной) форме, способной пройти сквозь мембраны клеток желудка и достичь кровяного русла. Напротив, слабое основание анилин (рКа≈5) в желудке находится в заряженной форме, и не может пройти через мембраны. По аналогии, если есть подозрение, что человека отравили стрихнином, то медикам-экспертам следует в первую очередь проверить содержимое желудка. Cтепень ионизации при данном рН можно подсчитать, используя отношение ХендерсонаХассельбелча (Henderson-Hasselbalch). Если слабая кислота (А) теряет протон, давая основание (В), то соотношение между этими формами и рН может быть выражено как рН - рКа = log[B]/[A]. Это соотношение можно использовать при подсчете относительной концентрации соединения в компартменте при разных рН. На примере анилина в желудке можно вычислить, что отношение незаряженной (основной) формы к заряженной (кислотной) составляет приблизительно 1/1000. В крови (рН ≈7), напротив, это соотношение 1/0,01. Количество незаряженной формы принято за 1 для удобства, поскольку она находится в равновесии между мембранами кровяного русла и желудка. Для подсчета относительной концентрации в крови и желудке в состоянии равновесия можно сравнить суммы форм в каждом компартменте в относительных единицах: в желудке = 1 + 1000 = 1001; в крови = 1 + 0.01 = 1.01. Таким образом, концентрация вещества в желудке ≈ в 1000 раз больше, чем в крови. Это очень грубое приближение, но оно дает представление, что вещество накапливается в том компартменте, где оно наиболее заряжено. Органы экскреции Кишечник (тонкая и ободочная кишка). Нижние отделы желудочно-кишечного тракта могут оказывать значительное влияние на биотрансформацию и судьбу ксенобиотика в организме. Критическим фактором здесь оказывается состояние кишечной микрофлоры. Популяция бактерий незначительна в желудке и проксимальных отделах кишечника и достаточно велика в дистальных отделах. Исследования позволили идентифицировать несколько сотен видов бактерий, но вероятно это только меньшая часть. Большинство из них являются облигатными анаэробами, особенно те, которые обитают в ободочной кишке. Полагают, что токсический ответ обусловлен генетическим полиморфизмом микрофлоры. Межиндивидуальные различия в состоянии микрофлоры предположительно обусловлены различиями в диете и окружении. Члены одной семьи обычно имеют сходный состав микрофлоры. Микрофлора нижних отделов желудочно-кишечного тракта участвует в реакциях биотрансформации, обратных к тем, которые протекают в печени и других аэробных участках. Важным примером является деконъюгация, удаление сульфата и глюкуроновой кислоты и деградация глутатиона. Результатом этих реакций является внепеченочная циркуляция отдельных соединений, например билирубина. После того как глюкуроновая кислота (присоединенная в печени) отделяется в кишечнике, она всасывается в кровь и вновь захватывается печенью и экскретируется с желчью, которая вбрасывается в кишечник. Другим примером является активация ксенобиотиков деконъюгацией. Циказин, соединение

растительного происхождения, конъюгат с глюкозой, в некоторых странах присутствует в рационе питания. При удалении глюкозы остается производное диметилгидразина, нестабильное соединение, генерирующее метильные радикалы. Диметилгидразин, который вызывает рак ободочной кишки у крыс, часто метаболизируется аэробно с образованием сходных продуктов. CH3-N=N-CH2-O-глюкоза → СH3-N=N-CH2OH → [CH3-N=N]+ ↓ ↓ O O Другим примером обратной реакции в микроокружении нижних отделов кишечника является реакция восстановления, например превращение диазо- соединений в амины, которое нашло практическое применение. В 1938 г. за разработку пронтозила, предшественника сульфониламидного антибиотика, была присуждена Нобелевская премия. При оральном приеме пронтозил восстанавливается в кишечнике до триаминобензена, что ведет к выработке сульфаниламидной активности. Другой пример – инкапсулированный инсулин (обычно инсулин инактивируется при оральном приеме). Было предложено создать полимерную форму типа R-C6H4-N=N-C6H4-R. При оральном приеме таких таблеток, инсулин будет высвобождаться в кишечнике, где он может взаимодействовать со слизью кишечника и поступать в кровяное русло. К отрицательным примерам относятся ароматические амины, которые используются как пищевые красители. Показано, что их прием с пищей вызывал рак мочевого пузыря у животных. Исследования показали, что сама микрофлора может являться источником ксенобиотиков, вызывающих рак ободочной кишки. В работах исследовался класс соединений, называемых фекалинами. Это соединение обладало сильным мутагенным и канцерогенным эффектом в бактериальных тестах. Такие наблюдения приводят к предположению о возможности эндогенного происхождения некоторых форм рака ободочной кишки. Мочевой пузырь. Основной причиной рака мочевого пузыря при определенных видах деятельности (например, производство красителей) являются ароматические амины. То, что существует корреляция между степенью экспозиции ароматическими аминами и раком мочевого пузыря, было замечено еще в 1895 г. В 1938 г. для исследования этого явления начали использовать собак. В 1953 г. эпидемиологические исследования показали, что среди 4622 рабочих, занятых на производстве красителей, зарегистрировано более 300 случаев рака.мочевого пузыря, умерло от этой болезни 127 человек. Метаболизм ароматических аминов, приводящий к раку мочевого пузыря, достаточно хорошо описан. Вначале амины N-гидроксилируются, рослее чего конъюгируют с глюкуроновой кислотой в печени, а затем в результате циркуляции накапливаются в моче. Моча человека имеет рН=5, а в этих условиях глюкурониды нестабильны и гидролизуются (конъюгаты могут также распадаться благодаря активности фермента глюкуронидазы в моче). Образовавшиеся Nгидроксиламины могут захватываться эпителиальными клетками мочевого пузыря и Оацетилироваться или сульфатироваться, причем оба конъюгата нестабильны и распадаются с образованием высоко реакционноспособного арилнитрониум иона, способного атаковать макромолекулы клетки. В 1970-х годах предметом постоянных обсуждений служил сахарин натрия. Этот искусственный подсластитель вызывал рак мочевого пузыря у самцов крыс, но не у мышей, хомячков или обезьян. Соединение не метаболизировалось, не взаимодействовало с ДНК, не являлось мутагеном, однако в больших дозах избыточную пролиферацию (умеренную гиперплазию) эпителия мочевого пузыря, что, очевидно, является стимулом для образования опухоли. На основе этих данных сахарин был запрещен к употреблению, однако под действием общественного протеста Конгресс отклонил запрет. Последующие исследования не подтвердили, что избыток потребления сахарина вызывает рак. Недавно обнаружено, что большие дозы сахарина приводят к формированию кристаллов силиката вокруг α2микроглобулина в мочевом пузыре самцов крыс. Кристаллы не формируются у тех видов животных, у которых уровень этого белка невысок. Кристаллы действуют как абразив, повреждая клетки эпителия, способствуя усилению пролиферации.

2.1.1. Печень Печень, как основной метаболический орган тела, играет центральную роль в токсикологии. Это крупнейшая железа, составляющая приблизительно 2% массы тела взрослого человека, и выполняющая множество физиологических функций. Это и расщепление углеводов и регуляция уровня глюкозы в крови, запас витамина А, секреция альбумина и широкого спектра других экзокринных и эндокринных продуктов. Печень получает значительную фракцию (25%) сердечного выброса. 5% от этого количества поступает напрямую из артериального русла, остальные 20% - из портальной вены. Венозная кровь обогащена питательными веществами, которые всасываются из пищеварительного тракта. Они поступают в печень для обработки, прежде чем они поступят в основной круг кровообращения. Таким образом, токсические соединения, принимаемые орально, не попадают в кровяное русло, поскольку они удаляются на «первом перевале метаболизма». По этой причине у рызунов печень является главной мишенью для токсичных соединений. У более крупных животных и человека в том числе, первичный метаболизм в печени не настолько важен, поскольку мишенью могут являться и другие периферические ткани. Печень состоит из долек, так чтобы экспозиция гепатоцитов плазмой стала максимальной. Каждая из 106 долек имеет диаметр 1 мм и содержит в центре капилляр, отходящий от центральной вены, для сбора крови, после того, как она перколирует между гепатоцитами. Гепатоциты располагаются в виде связок, разделяемых синусоидальными капиллярами в которых эндотелиальные клетки формируют прерывистый барьер (в отличие от большинства других органов, где эти клетки плотно соединены). С одной стороны каждый гепатоцит омывается плазмой крови, с другой стороны имеется микровиллярная мембрана, которая формирует границу. Каналикулы (малые каналы) несут желчь, содержащую плохо растворимые продукты, назад к краю дольки, т.е. туда, где желчные канальцы локализуются вблизи ответвлений печеночной артерии и портальной вены. Среди других типов клеток, обнаруживаемых в печени, наиболее подходящими для токсикологии являются фибробласты. Клетки этого типа являются составляющими соединительной ткани, секретируют коллаген и эластин (структурные фибриллярные белки), которые поддерживают должное расположение клеток. В печени они обычно немногочисленны, однако при определенных болезнях некоторых органов, они появляются в пространстве, обычно занятом другими типами клеток. Такое патологическое состояние принято называть фиброзом. Гипоксия. Патологические эффекты кислородного голодания не ограничиваются печенью, а имеют место в большинстве тканей. Гепатоциты чувствительны к гипоксии. Среди многих случаев гипоксии, наиболее распространенным является воздействие монооксидом углерода (подобным же образом действует сульфид водорода). Этот газ хорошо связывается с гемоглобином, вытесняя кислород. В результате ткани испытывают кислородное голодание, митохондриальное дыхание замедляется или останавливается, запас АТФ в клетках истощается. Это приводит к тяжелым последствиям. Клетки способны генерировать некоторое количество энергии анаэробным гликолизом, при этом образуется молочная кислота. Тем временем ионные насосы, необходимые для поддержания надлежащего ионного состояния, инактивируются, что приводит к разбуханию клетки, нарушению рН регуляции и остановке белкового синтеза. Уровень кальция в цитоплазме (в норме 0,1 µМ) достигает 1мМ, активируя ферменты деградации. Происходит утечка содержимого лизосом. Результатом длительного кислородного голодания является смерть клетки (некроз). Отметим, что критическим признаком патологической гипоксии является потеря надлежащего ионного состояния. Действие ряда токсинов, направленное на ионные каналы, может приводить к такому же результату. Цианиды. Основной макромолекулярной мишенью для цианидов является цитохром оксидаза, компонент митохондриальной цепи транспорта электронов. Ингибирование этого фермента приводит к остановке клеточного дыхания и синтеза АТФ, и в результате к гибели

клетки. Летальность для организма имеет место при относительно низких дозах (LD50 для человека LD50 1мг/кг). Человек может подвергнуться воздействию различными способами, включая диету (высвобождение из цианогенных гликозидов, содержащихся в миндале). Цианид выделяли из фруктовых косточек, который являлся активным веществом в малоэффективном, но некогда популярном антираковом препарате – “Laetrile”. Эффект воздействия цианидов можно наблюдать и в дикой природе, например в нескоординированном поведении малиновки, после съедания определенных ягод. Организм человека способен детоксифицировать низкую дозу цианидов путем превращения в тиоцианат, который легко экскретируется. Это происходит с помощью фермента роданазы, который переносит серу тиосульфата на цианид. Хотя эндогенный запас этого соединения быстро истощается, он может быть восполнен инъекцией тиосульфата в кровь. Такие инъекции действительно применяются при отравлениях цианидами. Однако, митохондрии выдерживают блокаду лишь в течение очень короткого времени, а затем клетки погибают. Таким образом, необходим способ удаления цианида из цитохром оксидазы, до того как родазана закончит его превращение в тиоцианат. Этого можно достичь путем инъекции жертве нитрита натрия одновременно с тиосульфатом натрия. Нитрит реагирует с оксигемоглобином (содержащим гем с окисленным атомом железа) превращая его в метгемоглобин (атом железа в восстановленном состоянии). Метгемоглобин связывается с цианидом и удаляет его из цитохром оксидазы. Более чем 40% гемоглобина может быть превращено в метгемоглобин без последствий (хотя для обычной терапии это 25%). Известны случаи, когда простая инъекция нитрита помогала вернуть сознание жертве. Однако, поскольку метгемоглобин способен быстро превратиться обратно в оксигемоглобин и вновь связаться с цитохром оксидазой, инъекции тиосульфата имеют большое значение для более интенсивного удаления цианида. Сообщалось, что эта комбинация увеличивает LD50 для овец в 16 раз. Фактором, ограничивающим лечение, является эффективность удаления цианида из центральной нервной системы. Холестазия. Желчь служит основным источником выведения плохо растворимых продуктов отхода, включая продукты реакции II- фазы метаболизма. Желчь содержит соли и глюкозу приблизительно в той же концентрации, что и плазма, а концентрация производных холестерола с функциональными группами карбоксильных кислот является в 100 раз выше, чем в крови. В желчи они оказывают эффекты подобные детергентам, и в кишечнике (где желчные протоки пустые) они эмульгируют жиры и способствуют усвоению гидрофобных витаминов. Время жизни эритроцитов составляет приблизительно 120 дней, после чего их содержимое деградирует. Это приводит к образованию значительного количества плохо растворимого гемина (из гемоглобина), который удаляется с желчью. Гемин окисляется с образованием билирубина, который связывается с альбумином и в таком виде переносится кровью и откладывается в печени. В гепатоцитах происходит конъюгация билирубина с глюкуроновой кислотой и секреция в желчные каналы. Конъюгаты деградируют с помощью кишечной микрофлоры и в основном (80-90%) экскретируются. Остаток вновь всасывается в кровяное русло через портальную вену (некоторые ксенобиотики также подвергаются такой энтеропеченочной циркуляции). Застой желчного потока приводит к ухудшению распределения билирубина, который начинает накапливаться и откладываться в селезенке, костном мозге, почках и коже. Последнее приводит к появлению желто-оранжевого цвета кожи, указывающего на желтуху. Причиной желтухи может стать усиление выработки билирубина (как при гемолитической анемии) либо слабая конъюгация с глюкуроновой кислотой (желтуха новорожденных). Токсичные соединения часто вызывают холестазию, нарушая секреторный процесс в каналикулярной мембране и выведение конъюгатов из гепатоцитов в желчь. Секреция желчных солей также нарушается, что приводит к внутриклеточному накоплению этих детергентоподобных соединений и в дальнейшем к повреждению клеточных мембран. Как сообщалось, в число соединений, вызывающих холестазию, входят некоторые анаболики и стероиды-контрацептивы. Накопление триглицеридов в печени само по себе не опасно и этот процесс легко

обратим. Это неспецифический симптом неспособности гепатоцитов секретировать липопротеины такие как VLDL (липопротеины очень низкой плотности) в силу различных причин. Например, ингибирование (специфическое или вторичное) белкового синтеза может вызвать дефицит белковых компонентов этого комплекса, предотвращая секрецию липидов. Аналогично, холин-дефицитная диета может привести к дефициту фосфолипидных компонентов комплекса. Ряд соединений (оротовая кислота) ослабляют секрецию, которая очевидно является очень чувствительной к токсичному инсульту. Основной причиной ожирения печени является усиление всасывания или образования жирных кислот. Например, повышенное потребление этанола приводит к избытку ацетата и NADH благодаря действию алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы. CH3CH2OH --> CH3CHO --> CH3COOH --> АцетилКоА (ЦТК) НAД+ + H+ --> НAДH При поступлении в цикл трикарбоновых кислот ацетат увеличивает образование жирных кислот, а НAДH замедляет превращение жирных кислот в ацетат. Заметим, что образование карбоксикислот может также иметь место в этой цепочке. Микробы потенциально являются полезными в распределении жира, катализируя первоначальное гидроксилирование алканов, на которые затем действуют алкоголь- и альдегиддегидрогеназы. Кровь освобождается от этилового спирта в основном (75%) при помощи его метаболизма в печени. У индивидов с высокой концентрацией крови скорость метаболизма универсальна и составляет порядка 10гр/час, независимо от концентрации алкоголя. Метаболизм других соединений может происходить двумя способами. С одной стороны этанол индуцирует активность цитохромов Р450. С другой стороны – этанол является предпочтительным субстратом для некоторых изоферментов, особенно в высоких концентрациях, приводя к снижению скорости метаболизма некоторых фармацевтических препаратов и вызывая эффект передозировки. Например, исследования показали, что при потреблении пережаренного мяса в крови у добровольцев регистрировался диметилнитрозоамин только лишь при употреблении мяса совместно с алкоголем. Иначе нитрозоамины удаляются в печени за одну стадию метаболизма. Цирроз. Долговременное действие этанола на печень может привести к хроническому состоянию, когда свойственные печени функции угнетаются. В основе этой болезни лежит ослабление гепатоцитов, вероятно из-за накопления ацетальдегида, который является продуктом действия алкогольдегидрогеназы. Это высоко реакционноспособное соединение, которое может формировать основание Шиффа с аминогруппами белков и возможно с ДНК, что приводит к некрозу. Недавно было показано, что ацетальдегид в присутствии избытка этанола ускоряет формирование как долгоживущих ацетатов c основаниями ДНК, что, возможно, объясняет корреляцию между потреблением алкоголя и случаями рака. В ответ на это стимулируется регенерация и деление выживших гепатоцитов для восстановления их количества. Однако когда эти процессы происходят хронически, тонкая архитектура долек теряется. Фибробласты являются относительно устойчивыми к токсическим эффектам алкоголя и могут замещать гепатоциты, нарушая поток крови и желчи, образуя полосу рубцовой ткани (расположение коллагена). Печеночные клетки регенерируют в узелки, которые не столь хорошо перфузируются. Таким образом, они не могут эффективно удалять токсичный материал и выполнять нормальные регуляторные и гомеостатические функции. Цирроз характеризуется некрозом и фиброзом с узелковой регенерацией. Когда повреждения накапливаются в достаточном количестве, это состояние приводит к фатальному исходу. При низком уровне всасывания этанола, образование ацетальдегида не является серьезной проблемой. Однако, у некоторых индивидов, особенно в определенных этнических группах, активность ацетальдегид дегидрогеназы очень низка, так что даже всасывание небольшой дозы алкоголя приводит к болезненному состоянию. Этот синдром часто наблюдался в индустриальных районах. Исследования показали, что некоторые рабочие

подвергались воздействию соединения, которое является ингибитором алкоголь дегидрогеназы. Это антиоксидант («Disulfirame» или “Antabuse”), который ранее использовался для лечения алкоголиков, чтобы предотвратить всасывание этанола и, следовательно, вредные последствия его действия (т.е. цирроз). Пациенты должны находиться под наблюдением, поскольку прием алкоголя во время лечения весьма опасен. Канцерогенез печени. В отсутствие убедительных эпидемиологических доказательств, химическое соединение может быть отнесено к классу канцерогенов, если оно вызывало рак у подопытных животных. Не все соединения, дающие положительную реакцию в бактериальных тестах на мутагенность, оказываются канцерогенами животных. Проведение стандартных тестов на животных требует больших затрат ($0.5 млн. и более) и занимает около 2-х лет. Чтобы снизить затраты и ускорить получение результатов, разрабатывают тесты по инициации/ промоции. В таких тестах обычно использовали кожу мышей, но полезно также использование печени крыс, поскольку этот орган является основной мишенью для химических соединений. Когда тесты на животных только начинали применяться, в дозозависимых экспериментах на крысах, получавших единственную дозу канцерогена, например диэтилнитрозоамина, было продемонстрировано, что число случаев рака является нелинейной функцией от дозы канцерогена. Обычно число случаев рака пропорционально дозе в степени n, где n=3 и более. Оказалось, что вероятность развития рака выше, если дозы канцерогена достаточно чтобы вызвать некроз органа-мишени. Таким образом, повреждение клеток и клеточная смерть дает некоторое преимущество редким раковым клеткам и способствует развитию опухоли. Предполагалось, что некроз стимулирует процессы регенерации клеток, в которых выжившие клетки размножаются, чтобы заполнить образовавшиеся пробелы. В печени, где в норме клетки не делятся, этот процесс позволяет нестабильным клеткам, с мутациями в ДНК, увеличивать степень отклонения от нормы, приобретать черты агрессивного роста, и окончательно формировать опухоль. Эти наблюдения привели к разработке модели, основанной на крысиных гепатоцитах, для тестирования соединений, способствующих инициации и промоции опухолей. Крысы подвергались частичной гепатоэктомии, при которой половина или более печени удалялась. Это стимулировало синтез ДНК в оставшихся гепатоцитах. Спустя 12 часов крысы получали низкую дозу канцерогена, которая сама по себе не приводила к развитию опухоли. Этот шаг являлся «инициацией». Поскольку синтез ДНК продолжался, полученные повреждения с большей вероятностью приводили к появлению мутаций, чем в неделящихся клетках. В отсутствии частичной гепатоэктомии, клетки способны успешно репарировать большее количество повреждений ДНК, и количество возникающих опухолей будет значительно ниже. Как только повреждение ДНК зафиксировано (т.е. индуцированы мутации), следующим шагом является стимулирование (промотирование) опухолей печени. Подопытные крысы получали тетрахлорид углерода (CCl4) с питьевой водой. Это соединение подвергается восстановлению в печени при участии цитохрома Р450, с образованием хлорид-иона (безвредного) и трихлорметил радикала (.CCl3). Последний очень токсичен, атакует ненасыщенные липиды, удаляя радикал .Н. Липидные радикалы связываются с О2, приводя к формированию пероксидов липидов, которые в свою очередь формируют радикалы в цепной реакции. В тех клетках, где защита недостаточна, это приводит к смерти. Крысы продолжают пить воду с CCl4 в течение 10-12 недель, что обеспечивает условия, стимулирующие клеточное деление и восполнение потерь от некроза. Использование опухолевых промоторов, таких как CCl4, иллюстрирует «устойчивость гепатоцитарной модели». Используемый промотор для проявления токсичных свойств нуждается в метаболизме цитохромом Р450. Модель имеет ряд преимуществ, характерных для инициированных гепатоцитов. По неясным причинам в инициированных гепатоцитах экспрессия цитохромов Р450 значительно снижается, а экспрессия ферментов 2-й фазы увеличивается. В таких клетках не происходит эффективный, с образованием радикалов, метаболизм CCl4, в отличие от неинициированных клеток, а сами клетки будут иметь селективное преимущество. Они будут расти лучше, чем окружающие клетки, которые постепенно повреждаются под действием активности цитохромов Р450. Не все промоторы действуют таким образом. Вместо добавления CCl4 в воду, стимулировать опухоли можно при помощи холин- или метионин-дефицитной

диеты. Это затрудняет метилирование ДНК и, следовательно, изменяет экспрессию генов, возможно благоприятным образом для генов, ответственных за стимуляцию роста. ТХДД также является соединением, стимулирующим канцерогенез в печени крыс. Он не метаболизируется, но изменяет экспрессию генов, опосредованную Ah-рецептором. Механизм его действия малопонятен. Конечным результатом схемы инициации/промоции является рак печени, который можно наблюдать у подопытных животных через несколько месяцев. Можно наблюдать за постепенным развитием опухолей. Спустя несколько недель после стимулирования, в дольках печени крыс обнаруживаются очаги в количестве 1000 и более на печень. Центрами очагов являются группы клеток, предположительно одного происхождения, которые отличаются от нормальных клеток обычно по размеру, но могут отличаться и по другим критериям. Например, в этих клетках может быть значительно увеличена или снижена активность определенных ферментов. С увеличением времени обработки канцерогеном размер очагов увеличивается, однако лишь небольшой процент (около 1%) со временем развивается в опухоль. Клетки очагов, особенно на поздних стадиях развития, обнаруживают черты типичных раковых клеток, таких как абнормальное число хромосом, абберантные или поврежденные хромосомы или митозы. Иногда внутри большого очага можно обнаружить малый участок, причем клетки малого очага более абнормальны, чем окружение. Окончательно некоторые очаги перерастают в автономные узелки, продолжая рост уже без дополнительных внешних стимулов, приобретая злокачественный характер. Модель с использованием печени крыс может быть использована для тестирования химических соединений по их действию в качестве инициатора или промотора рака. Потенциальные инициаторы могут быть также проверены в бактериальных тестах на генотоксичность, однако эти тесты менее определенны. Предположим, кто-либо хочет проверить является ли соединение Х промотором рака в этой системе. Крыс можно обработать низкой дозой известного инициатора рака, например диэтилнитрозоамина (после соответствующей гепатоэктомии), а затем добавить соединение Х в питьевую воду. Спустя месяц подсчитывается число очагов или опухолей в печени (заметим, что таким образом было показано, что эстроген стимулирует опухолеобразование в печени крыс). Во время появления первых противозачаточных таблеток, у некоторых женщин наблюдалось развитие доброкачественной аденомы печени, которое прекращалось после отмены таблеток. В таких тестах важно подобрать подходящий контроль. Обычно крысы обрабатываются либо известным инициатором, либо известным промотором или же соединением Х высокой, но толерантной дозы (что обычно определяется заранее) вместе или без известного инициатора или промотора, в зависимости от целей теста. В целом полагают, что доза инициатора влияет на число очагов, а длительность применения промотора определяет, насколько сильно эти очаги будут развиваться. Применение промотора позволяет обнаружить очаги, а изучение дозо-зависимости позволяет достичь линейности. Модель устойчива к развитию некрозов, которые обычно имеют место при высокой дозе инициатора. Ограничением применения моделей на основе печени крыс и кожи мышей является то, что соединения могут обнаруживать тканеспецифичность действия. Так бензо[а]пирен и эфиры форбола могут использоваться в модели только с мышиным эпителием. Диэтилнитрозоамин и тетрахлорид углерода не метаболизируются клетками эпидермиса мышей, в отличие от печени крыс. Понимание тканеспецифичности помогает глубже понять механизм действия соединений и область их применения. В качестве примера можно привести развитие карциномы слизистой оболочки носа крыс под действием фенацетина (производное ацетаминофена, образуется in vivo). Фенацетин метаболизируется клетками эпителия с образованием токсичного иминохинона. Высокая доза фенацетина приводит к некрозу клеток и усилению деления выживших клеток, что предположительно является причиной возникновения рака. Проблема экстраполяции результатов, полученных на одном виде животных на другой вид (или на человека), далеко не тривиальна. Например, более 25 лет назад было замечено, что некоторые соединения способствуют увеличению внутриклеточного содержания пероксисом в печени крыс с 2 до 25% объема. Эти органеллы связаны с мембраной клетки и содержат окислительные ферменты, импортируемые из цитоплазмы. В отличие от митохондрий

они не содержат ДНК, РНК или рибосом и не реплицируются автономно. Пероксисомы включают ферменты катализирующие окисление липидов, Р450, которые катализируют окисление алканов, определенные оксидазы (Д-амино кислот), образующие пероксид. Некоторые соединения (клофибрат) индуцируют пролиферацию пероксисом в печени крыс, и их применение в количестве 1 грамма в день снижает уровень липидов в крови. Другой класс соединений включает пластмассы типа ди-(2-этилгексилфталата),

Рис. 10. Предположительный механизм индукции пролиферации пероксисом ксенобиотиками. широко распространенного в окружающей среде. Содержание фталата в пластмассе может доходить до 40%, и это соединение легко вымывается в воде. Соединение дает отрицательный ответ в тесте на генотоксичность, однако действует как промотор рака в печени крыс. Согласно одной из гипотез, фтален стимулирует пролиферацию пероксисом, что приводит к увеличению уровня пероксида. В подтверждение этой теории показано, что назначение антиоксидантов может ингибировать развитие рака под действием фталена. Несмотря на стимулирование пероксисомной пролиферации у крыс, эти соединения неэффективны в отношении других видов (собак, морских свинок, резус-макак, человека). Поэтому результаты тестов, основанных на использовании крысиной печени неприменимы для человека. Недавние исследования показали, что эффект пероксисомной пролиферации опосредован рецептором, который действует в ядрах клеток, стимулируя пролиферацию органелл. Рис. 10 иллюстрирует механизм действия, который аналогичен действию Ahрецептора или семейства стероидных рецепторов, стимулирующих транскрипцию генов. Соединение, стимулирующее пролиферацию пероксисом (пероксисомный пролифератор, РР) попадая в клетку путем диффузии через плазменную мембрану, связывается со специфическим белком-рецептором (R), который в свою очередь обладает высокой

аффинностью к специфичным сайтам ДНК. Это означает, что пероксисомный пролифератор запускает транскрипцию батареи генов (РР-домен или плейотропный ответ). Показано, что такие пероксисомные пролифераторы как клофибрат, ципрофибрат и ди-(2-этилгексил)-фталат увеличивают скорость транскрипции генов, кодирующих ферменты, отвечающие за βокисление жирных кислот. Увеличение уровня специфичных мРНК ведет к усилению синтеза специфичных ферментов, которые накапливаются в каналах гладкого ЭПР, что приводит к формированию многочисленных пероксисом. Структура соединений (рис. 11), стимулирующих пролиферацию пероксисом, настолько различна, что трудно допустить, что их действие опосредовано рецептором. Рецепторы обычно обнаруживают значительную стереоспецифичность по отношению к лигандам. Сейчас полагают, что с рецептором связываются метаболиты, которые более сходны по свойствам. Возможно, эти соединения имеют сходство с некими эндогенными лигандами (липидами), взаимодействие которых с рецептором приводит к модулированию дифференциации и функций клеток. Возникает также предположение, что стимуляторы пролиферации могут нарушать функции клеток каким-то иным способом, а не стимулированием пролиферации пероксисом.

Рис. 11 Химическая структура некоторых соединений, стимулирующих пролиферацию пероксисом. (a) клофибрат: (этил-а-р-хлорфеноксиизобутарат), (b) нафенопин: (2-метил-2-[р-(1,2,3,4-тетрагидро-1-нафтил)- фенокси]-пропионовая кислота, (с) ципрофибрат: (2-[4-(2,2-дихлорциклопропил)фенокси]-2-метил пропионовая кислота, (d) Wy-14643: ([4-хлор-6-(2,3-ксилидино)2-пиримидинилтио] уксусная кислота, (е) тибриковая кислота: (2-хлор-5-(3,5- метилпипердиносульфонил)бензойная кислота, (f) ди(2-этилгексил)фталат. Клофибрат и его структурные аналоги условно обозначены как класс 1 или клофибрат-подобные пролифераторы пероксисом. Пероксисомные пролифераторы, подобные Wy-14643, тибриковой кислоте и ди(2-этилгексил)фталату, которые не обладают структурными сходствами с клофибрат- подобными соединиями, классифицированы как класс 2.

2.1.2. Почки Функции. Основной функцией почек является очищение крови от продуктов жизнедеятельности, в основном от малых водорастворимых молекул. Функциональной единицей почки является нефрон, небольшая трубка, связанная с кровеносной системой, для образования и выделения мочи. Почка состоит приблизительно из миллиона нефронов (Sобразных трубок), которые совместно фильтруют около 180 литров плазмы в день, образуя около литра мочи. Нефрон начинается капсулой Боумена, покрытой сетью капилляров, образующих так называемый мальпигиев клубочек. Из мальпигиева клубочка в верхние отделы почечного канальца фильтруется первичная моча, которая собирается при помощи гломерул, которые представляют собой воронки, препятствующие всасыванию белков с молекулярной массой более 60 кДа (например, альбумин). Малые молекулы (также как и небольшие белки) проходят через это сито, если только они не связаны с альбумином или другими белками большого размера, которые удерживаются в крови. Дополнительно к удалению отходов жизнедеятельности, клетки окаймляющие трубку, должны восстанавливать существенные компоненты плазмы, такие как вода, глюкоза, соли и аминокислоты. Малые белки реабсорбируются или деградируют до аминокислот, которые также всасываются назад в плазму. Позади гломерул располагается проксимальный каналец. Внутри канальца из фильтрованной жидкости реабсорбируются некоторые соединения, а также вода, что приводит к уменьшению объема жидкости на 80%. Здесь же происходит обратный процесс – секреция органических кислот и оснований. Заметим, что органические кислоты типа гербицида 2, 4-D секретируются, тогда как аминокислоты (которые тоже являются органическими) реабсорбируются. Реабсорбция и секреция являются энергозависимыми процессами. Клетки проксимального канальца отличаются высоким содержанием митохондрий, для обеспечения требуемого количества АТФ. Кроме того, в почках, в основном в проксимальных канальцах, наблюдается высокий уровень экспрессии цитохрома Р450, составляющий приблизительно 10-20% от того количества, которое экспрессируется в печени. Таким образом, этот орган также участвует в реакциях биотрансформации. Эти признаки помогают вычислить чувствительность проксимального канальца к токсическим эффектам. Дистальные канальцы, напротив, реже являются мишенью для токсических соединений. Однако существуют два хорошо известных соединения, которые воздействуют на них – это этанол и кофеин. В результате их действия снижается реабсорбция воды и усиливается секреция мочи. Заметим, что объем жидкости, входящей в нефрон, к времени выхода из него снижается на 99%. Эта цифра существенна, поскольку почки являются мишенью для некоторых соединений. Например, антигрибковый препарат амфотерицин В имеет очень узкий диапазон концентраций, при которых он эффективен, но еще не токсичен для клеток животных. Этот препарат применяется лишь в случаях тяжелых инфекций, поскольку у 80% пациентов после его применения развивается почечная токсичность. Аминогликозидные антибиотики. Применение больших доз антибиотиков при бактериальных инфекциях является обычной практикой. Поскольку эти соединения могут накапливаться, почки подвергаются воздействию высоких концентраций. Это может привести к серьезным побочным эффектам. По оценкам, антибиотики являются причиной приблизительно 10% острых почечных нарушений. Токсический потенциал антибиотиков пропорционален содержанию аминогрупп. Тогда наиболее нежелательным является неомицин, который содержит 6 аминогрупп. Следующим является гентамицин с 5 аминогруппами, каннамицин с 4 и стрептомицин с 3. Предположительным объяснением токсического ответа является то, что положительный заряд облегчает связывание антибиотиков с клеточной мембраной, из-за присутствия фосфолипидов обладает отрицательным зарядом. Антибиотики поглощаются эндоцитозом и переносятся в лизосомы. Там они не только не деградируют, но и напротив, накапливаются, что ведет к утечке ферментов деградации из лизосом и в итоге к

клеточной смерти. Другим возможным объяснением состоит в том, что мишенью антибиотиков являются бактериальные рибосомы. Несмотря на то, что в ходе эволюции митохондрии отделились от прокариотических организмов достаточно давно, их рибосомы могли сохранить остаточную чувствительность к антибиотикам. Таким образом, воздействие высоких концентраций антибиотиков на почки ведет к потере функций митохондрий, прекращению выработки энергии и нарушениях проходимости ионных каналов. Конечным результатом этого процесса является некроз проксимальных канальцев. Тяжелые металлы. Ртуть, свинец, цинк, кадмий, золото, цис-платина (антираковое химиотерапевтическое соединение) и барий (используется в радиоконтрастной смеси для рентгеновских лучей) являются примерами металлов, которые вызывают некроз почек. Тяжелые металлы атакуют сульфгидрильные группы белков и таким образом инактивируют ключевые ферменты и структурные белки. Это вызывает повреждения как в поверхностных клеточных мембранах (включая конститутивные ионные каналы), так и во внутриклеточных структурах, таких как митохондрии, приводя к нарушениям в транспорте электронов и образовании энергии. Свободные сульфгидрильные группы, например глутатиона, являются защищенными. Известен белок, металлотионин, который парадоксальным образом усиливает токсическое действие тяжелых металлов на почки. Это небольшой белок размером около 10кДа, индуцируется в печени под действием некоторых металлов, таких как кадмий и цинк. Белок секретируется в кровь, где и взаимодействует с металлами, уменьшая их воздействие на клетки. Однако из-за малого размера белок свободно проходит сквозь гломерулы и поступает в проксимальный каналец. Там он всасывается эндоцитозом и деградирует в лизосомах, высвобождая связанные ионы металлов, которые повреждают клетку. Углеводороды нефти. Стратегии, направленные на оптимизацию тестов на токсичность, часто фокусируются на соединениях, под воздействие которых человек попадает особенно часто. Множество людей подвергаются воздействию углеводородов, поэтому с начала 1970-х г. для нефтеперерабатывающей промышленности разрабатывались и внедрялись тестирующие программы. В середине 1970-х существовало множество краткосрочных тестов, с применением различных видов животных, и эти тесты давали разные результаты. Однако в конце 1970-х результаты тестирований на канцерогенез у мышей и крыс показали, что бензин вызывает рак почек у самцов крыс. Этот эффект не был обнаружен у самок крыс и мышей обоих полов. В состав бензина входит более чем 200 углеводородов (алканы, парафины, нафталены, ароматика и т.д.). Оказалось, что насыщенные алканы, особенно изооктановые, оказывают вредное воздействие. Начальные симптомы воздействия изооктанов на почки самцов крыс включали накопление белковых глобул (так называемых гиалиновых капель) в клетках проксимальных канальцев, некроз, отшелушивание и регенерацию клеток. Оказалось, что критическую роль в этом ответе играет небольшой белок, секретируемый печенью, α2-микроглобулин. Синтез этого белка стимулируется андрогенами, поэтому его концентрация в крови самцов много выше, чем у самок. Этот белок имеет размер около 20кДа и легко входит в гломерулы, после чего реабсорбируется в проксимальном канальце и обычно деградирует с высвобождением аминокислот, которые могут быть использованы вновь. При экспозиции самцов крыс бензином, белок, по-видимому, связывается с изооктанами в крови и становится устойчивым к деградации в лизосомах клеток проксимальных канальцев. Это ведет к накоплению гиалиновых капель, нарушениям функций лизосом и гибели клеток. Если при экспозиции самок крыс бензином ввести α2-микроглобулин, то в клетках проксимальных канальцев у них начнут накапливаться гиалиновые капли, что ведет к аналогичным последствиям. Исследование канцерогенеза почек на самцах крыс закономерно привело к возникновению вопроса, является ли реакция человека на экспозицию бензином фактором риска? Такая оценка требует внимательного рассмотрения механизмов канцерогенеза. В результате действия одних элементов этого процесса возникает некроз, что приводит к усилению регенерации. Этот процесс можно рассматривать как общий для развития рака, поскольку он ведет к значительному увеличению скорости клеточного цикла. Клетки большинства материнских тканей, таких как почечная ткань, в норме имеют низкую скорость роста. Но некроз и последующий рост выживших клеток увеличивают эту скорость. Чем быстрее клетки

растут, особенно если это поврежденные клетки, тем выше вероятность ошибок репликации ДНК, что является предрасположенностью к неопластическому росту. Действительно, у самцов крыс подвергавшиеся последовательному воздействию некоторых нитрозаминов, а затем бензина, значительно увеличивались темпы развития рака почек. Таким образом, если почки человека (или теоретически другой ткани) отвечает на экспозицию бензином усилением некроза и регенерации, то это может быть фактором риска развития рака. Однако этого не наблюдается. Мыши, морские свинки, собаки и обезьяны также обнаружили устойчивость к подобному исходу. Мы можем объяснить устойчивость у самок крыс более низким уровнем α2-микроглобулина, чем у самцов, но как объяснить это явление у самцов других видов? Возможно, лишь у самцов крыс уровень этого белка настолько высок, причем α2-микроглобулин у других видов обладает низкой аффинностью к изооктану, или же у других видов комплекс не является устойчивым к деградации. В таком случае бензин является фактором риска развития рака почек только для самцов крыс. Подобное явление касается риска развития рака мочевого пузыря под действием сахарина. Обнаружено, что самцы крыс являются чувствительными, а самки крыс и оба пола других видов резистентными. Дальнейшие эксперименты показали, что инъекции большой дозы натриевых (но не калиевых) солей сахарина ведет к формированию кристаллов с α2микроглобулином, которые высаливаются в моче. Эти кристаллы вызывают абразию эпителия мочевого пузыря, что в свою очередь провоцирует усиление клеточного роста. Таким образом, сахарин натрия действует как промотор опухолеобразования у самцов крыс. Анальгетики. Обезболивающие средства, такие как ацетаминофен широко используются в медицинской практике и в норме являются безопасными. Однако иногда они назначаются в больших количествах в течение длительного срока (годы). В таких случаях может наблюдаться почечная токсичность и даже развиваться рак почек. В ходе метаболизма обычно осуществляется конъюгация по фенол-гидроксильной группе, такие метаболиты легко выводятся. Существует минорный путь метаболизма, это гидроксилирование аминогруппы с последующим восстановлением. При этом образуется иминохинон, электрофильное соединение, способное формировать аддукты с ДНК или белками. Таким образом, введение больших доз анальгетика может вызвать некроз, усиление регенерации и спровоцировать неоплазию. Исследования показали, что повышенная (по сравнению с крысами) чувствительность мышей к токсическим эффектам ацетаминофена может быть связана с двумя факторами. Во-первых, изофермент цитохрома Р450, ответственный за гидроксилирование аминогруппы, у мышей экспрессируется на более высоком уровне, что приводит к образованию большего количества иминохинона. Вовторых, клетки крыс содержат большее количество глутатиона, который может реагировать по двойной углевод-углеводной связи, устраняя электрофильность молекулы иминохинона. β-лиаза. Определенные углеводороды могут стать причиной некроза почек в результате реакций биотрансформации, которые происходят в этом органе (хроническая экспозиция может приводить к катаракте хрусталика, где также экспрессируется β-лиаза. Детали реакции зависят от специфики соединения и вовлекаемого атома галогена. Например, существует 2 пути метаболизма перхлорэтилена (рис.12). Слева – окислительный путь (формирование эпоксида), в результате образуется ацилхлорид, соединение способное формировать аддукты с нуклеофилами. Справа – тиол глутатиона замещает хлорид на концевом углероде, образуя глутатионовый конъюгат, из которого глутаминовая кислота и глицин удаляются в результате пептидазной активности. Но не вся меркаптуровая кислота образуется при помощи ацетилирования. Неацетилированная форма реабсорбируется клетками проксимального канальца и служит субстратом для βлиазы. Этот фермент отрезает серу от цистеина, давая молекулу перхлорэтилена, кроме того, что хлорид замещен на сульфгидрильную группу (-SH). Результирующая молекула теряет HCl образуя электрофил, способный к образованию аддуктов с макромолекулами. Ацетилированная меркаптуровая кислота активно секретируется в проксимальных канальцах, после чего деацетилируется и расщепляется β-лиазой.

Рис. 12. Метаболизм перхлорэтилена 2.1.3. Кожа Кожный покров является важным барьером, защищающим нас от влияния окружающей среды и токсичных веществ. Этот орган является объектом для разнообразных неблагоприятных эффектов. Воздействия на кожу могут быть очень сильными и длиться продолжительный период. Для понимания этих эффектов полезно рассмотреть гистологию кожного покрова. Защитную функцию кожного покрова главным образом выполняет эпидермис. Эпидермис – это внешние дифференцированные (мертвые) клетки, содержащие нерастворимый белок – кератин, окруженный слоем гидрофобного липида. Это обеспечивает превосходный барьер от водо-растворимых веществ, но этот барьер не является совершенным. Гидрофобные вещества способны растворяться в липиде и медленно диффундировать через мертвые клетки, достигая нижний слой живых клеток. Затем они быстро диффундируют через слой живых клеток, попадая в кровяные сосуды, которые располагаются между эпидермисом и дермисом. Небольшие молекулы диффундируют быстрее, чем большие молекулы, поэтому проникают внутрь намного быстрее. Обычно малое количество вещества может быть опасным. Способность небольших гидрофобных молекул проникать через кожу также может быть использовано в фармацевтике для нашей пользы. Медленная диффузия через кожный покров обеспечивает низкий уровень воздействия. Разрушение ороговевшего слоя может происходить из-за физической травмы, либо из-

за воздействия химикатов. К последним относятся органические растворители, которые растворяют липидный барьер, едкие вещества, которые разрушающие мертвые клетки, а также моющие вещества, которые могут действовать по обоим механизмам. После повреждения кожного покрова, проникновение через барьер может значительно возрасти, вызвав опасную ситуацию. Химические соединения, проникнувшие через ороговевший слой, могут наносить вред живым клеткам. Тесное взаимодействие этих клеток может разрушаться под таким воздействием, что приводит к накоплению жидкости. Важное свойство кожного покрова заключается в наличии потовых желез. Насчитывается порядка 3 млн. таких маленьких насосов в нашем кожном покрове, которые помогают нам охлаждаться при испарении пота. Соленая вода, выступающая из потовых желез, воздействует на токсичные вещества. Во-первых, пот может растворять сухие вещества, с которыми мы контактируем. Например, может происходить выщелачивание краски из нашей одежды или разрушение полимеров в резине. Во-вторых, продолжительное воздействие влаги на ороговевший слой приводит к разбуханию мертвых клеток, тем самым, увеличивая проникновение гидрофильных веществ через эпидермис. Это работает не в нашу пользу, когда мы купаемся или моемся в загрязненной воде. В разбавленном растворе акваионов скорость, с которой органические растворители проникают в кожу, пропорциональна их концентрации в воде. Эпидермис является наиболее распространенным местом для возникновения рака у людей. Статистические данные на наиболее часто встречающиеся формы рака кожи такие же неполные, как и для других типов рака, которые часто бывают фатальными. Типы рака кожи Карцинома основных клеток. Это наиболее часто встречающаяся форма (60-70% от общей встречаемости рака кожи). Повреждения не метастатические, несмотря на то, что являются опасными. Предположительно, некоторые патологии в значительной степени развиваются из волосяных фолликул, сальных и потовых желез. Карцинома чешуйчатых клеток. Насчитывается порядка 30% от общей встречаемости. Как правило, повреждения заключаются в расхождении клеток по размеру и в видоизменении структуры, что приводит к изменению формы. Разрушения являются агрессивными, но с медленным метаболизмом, обычно требующие нескольких лет, возможно из-за того, что они плохо растут как индивидуальные клетки или являются сильно зависимыми от взаимодействия с соседним дермисом. Этот тип раковых клеток может встречаться в других анатомических органах, покрытых наслоившимися чешуйками эпителия (пищевод, ротовая полость) или в тканях с метаплазией без физиологического контроля (шейка матки). Меланома. Этот тип раковых клеток, развивающихся из меланоцитов, обычно 10%), чем приведенные ранее, но является более опасным. Некоторыевстречается реже ( формы быстро метастазируют, плохо подвергаются прогнозированию. Однако за долгие годы детекция на ранних стадиях была улучшена. Число случаев с 1950 года ежегодно возрастает на 6%, вероятно, отражая увеличивающееся воздействие солнца на население. Химиотерапия рака часто основывается на специфических свойствах раковых клеток, из-за которых клетки делаются чувствительными для уничтожения. Предложенное лечение меланомы иллюстрирует стратегию и ограничения. Предполагаемые клетки меланомы обрабатываются тригидроксифенилаланином. Клетки поглощают это соединение через транспорт ароматических аминокислот. Тригидроксисоединения являются объектом легкого автоокисления, в результате которого образуются супероксиды и хиноны:

Образовавшиеся электофилы могут быть объектом для атаки внутриклеточными нуклеофилами. Недостатком является то, что тригидроксифенилаланин может подвергаться ферментативному декарбоксилированию и, как аналог допамина – нейропереносчика, может быть включен в нейрон:

Поэтому было бы более эффективно использовать соединение, которое позволило бы решить эту проблему. Другим подходом является использование реакции, которая происходит в меланоцитах: гидроксилирование тирозина до 3,4-гидроксифенилаланина тирозин-гидроксилазой. Это является начальной стадией в синтезе меланина. Синтез некоторых других соединений, например антоцианов в цветах растений, происходит также по этому механизму.

Клетки можно обрабатывать 2,4-дигидроскифенилаланином. Это соединение, захваченное меланоцитами через транспорт ароматических аминокислот, затем может быть гидроксилировано тирозиназой с образованием 2,4,5-тригидроскифенилаланина, который может автоокисляться и убивать клетки. Отмечено, что другие клетки, испытывающие недостаток этого фермента, не могут быть разрушены. Пока еще этот метод не используется в практике. Эксперименты на культуре клеток показали, что 2,4-дигидроксифенилаланин селективно убивает клетки меланомы. К сожалению, пока не показано, что произойдет с

нормальными меланоцитами. Их уничтожение может привести к серьезной проблеме. Подобный вопрос возникает касательно меланин-продуцирующих клеток в надпочечниках и мозге. Разрушение последних химическими веществами вызывает болезнь Паркинсона. В химиотерапии цель специфична, но избежать побочных эффектов и рецидивов, к несчастью, не удается. Некоторые химиотерапевтические вещества сами являются канцерогенами. Лечение ими молодых пациентов может вызывать рак через много лет, даже при успешном излечении. Агенты вызывающие рак кожи. Ионизирующая радиация. С открытием радиоактивных элементов стало понятно, что рентгеновские лучи могут вызывать карциномы кожного покрова. Однако через несколько лет ионизирующая радиация была использована для лечения разнообразных кожных заболеваний. К несчастью, исследователи натолкнулись на неоплазию, как на побочный эффект. Вторым побочным эффектом была атрофия дермиса, называющая радиодерматит. Ультрафиолетовый свет. В наши дни наиболее часто встречающейся формой радиации является солнечный свет. Считается, что это главная причина рака кожного покрова по всему миру, вызывающая образование пиримидиновых димеров в ДНК. В США случаи возникновения рака кожи у белого населения выше, чем у афроамериканцев. К тому же, рак кожи чаще встречается у населения тропических стран и риск выше у тех, кто загорает больше. Люди, у которых наблюдается дефекты в репарации ДНК, должны избегать воздействия солнечных лучей, чтобы не было рака кожи. Даже если солнечные лучи не вызывают рак, то их воздействие приводит к преждевременному старению кожи. Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). Отмечено, что эти соединения метаболизируются цитохромом Р4501А1, который является наиболее важной формой цитохромов в эпидермисе. ПАУ являются основными продуктами сгорания. О том, что они вызывают рак кожи известно уже на протяжении двух столетий. В начале 20-го столетия ученые стремились идентифицировать вещества в продуктах сгорания, которые вызывают рак. Точно такой же подход применили к табаку с целью выяснения таких веществ и создания безопасных сигарет. Для идентификации активных компонентов использовали кожный покров мышей и кроликов. Этот подход позволил идентифицировать несколько соединений, относящихся к ПАУ, которые являлись канцерогенами для кожи мышей и кроликов. При моделировании канцерогенеза мыши подвергались воздействию ПАУ. Опухоль не развивалась, пока не была произведена серия воздействий через определенный интервал времени (например, два раза в неделю). Отмечено, что относительно большая доза ПАУ увеличивает риск рака кожи после соответствующего периода воздействия (несколько месяцев), а маленькая доза не увеличивает. Ответная реакция на величину дозы не всегда линейна. Одним из объяснений этого феномена является то, что большая доза сильнее повреждает ДНК в клетках, предназначенных для формирования опухоли. Также этот токсин убивает и другие клетки, чем стимулирует регенерацию поврежденных клеток, что может стимулировать клетки, дестабилизированные повреждением исходной ДНК. Это общепринятая концепция, однако, она оставляет без ответа многие вопросы о специфике развития опухоли. С возникновением в 1970-х годах исследований мутагенеза у бактерий появилась надежда на искоренение мутагенов и канцерогенов. Однако, к огромному сожалению мутагены были найдены везде, где только возможно. Некоторые исследователи надеются, что изучение механизмов действия этих веществ сделает эту цель реальной.

2.1.4. Легкие Легкое – орган идеально подходящий для выполнения главной функции – аэрации крови. На вершине воздухоносных путей трахея раздваивается, и легкие разделяются на 2 доли. Внутри каждой доли разветвление происходит еще 23 раза, причем с каждым разом

уменьшается диаметр воздухоносных путей, окончательно образуя 10-20 х 106 респираторных бронхиол. К каждому из них прикреплено около десятка альвеол (воздушных мешочков) с диаметром приблизительно 0,25мм. Для сравнения – печень состоит из 106 функциональных единиц, почки – из 106 нефронов, кожа содержит около 3х106 потовых желез. Легкие содержат 300х106 альвеол, общая поверхность которых составляет 70м2 (площадь поверхности кожи – 1м2). Процесс аэрации крови требует постоянной вентиляции легких. Обычно мы вдыхаем около 1.5 литра воздуха 4 раза в минуту, в день это составляет 10-20 х103 литров. Таким образом, даже низкая концентрация токсинов в воздухе может приводить к значительной экспозиции при вдохе. Заметим, чтобы получить эквивалентное количество соединения из питьевой воды (из расчета 2 литра воды в день), концентрация веществ должна быть в 10 000 раз выше. От эластичности легких зависит эффективность удаления воздуха при выдохе. Потеря эластичности поддерживающих тканей, например из-за фиброза, приводит к пропорциональному ухудшению вентиляции и газообмена. Свойство аэрации подразумевает свободную диффузию газов (О2, СО2) между кровью и альвеолами. Барьер между ними обычно составляет от 1 до 0.1 µм. Повреждения и утолщения барьера приводят к ухудшению газообмена. Другим критическим параметром является капиллярная перфузия. Скорость потока крови, который прокачивается через легкие, составляет около 60 л/мин. Воздухоносные пути на всем протяжении погружены в жидкость. По этой причине, место токсичного действия газов сильно зависит от его растворимости в воде. Поскольку NH3 и HCl хорошо растворимы, то они проникают в окружающую жидкость в верхних отделах дыхательной системы, вскоре после вдоха и повреждают клетки, с которыми контактируют, изменяя локальный рН. Оксид серы и хлор умеренно растворимы и реагируют с терминальными бронхиолами и альвеолами. Каждый из них может соединяться с водой с образованием сильной кислоты, как показано ниже. Аналогично сульфат фтора (SO2F2), пестицид, соединяясь с водой, образует H2SO4 и HF. Хлор может образовывать слабую гипохлористую кислоту, ионной формой которой является гипохлорит, оксидант (в бытовых целях применяется для отбеливания). SO2 + H2O → H2SO3 Cl2 + H2O → HCl + HOCl SO2F2 + 2H2O → H2SO4 + 2HF Озон и оксида азота слаборастворимы, поэтому они достигают альвеол и могут вызвать окислительный стресс. Повреждения эпителиальных клеток, особенно в нижних отделах ослабляет плотность их соединения. Значительная экспозиция приводит к разрушению межклеточных контактов и к кровоизлияниям. Химически инертные газы не повреждают эпителий, однако, вызывают асфиксию. Газы типа N2 могут делать это пассивно, просто в отсутствии кислорода, а H2S и CO вытесняют кислород из гемоглобина, поэтому вызывают асфиксию в более низких концентрациях. Распределение вдыхаемых частиц зависит от их аэродинамических характеристик (форма, размер, вязкость). Большие частицы удаляются еще в верхних отделах дыхательного тракта, включая носовые пазухи и зев, а мелкие (менее 1µм в диаметре) могут проходить по воздухоносным путям и попадать в альвеолы. Удлиненные частицы (волокна) застревают в бифуркациях бронхов. Гигроскопичные частицы могут увеличиваться в размере. Существует 2 пути удаления оседающих в легких частиц. Это образование слизи в верхних отделах. У человека слизь экскретируется клетками, окаймляющими трахеи и верхние отделы бронхов, и транспортируется по направлению ко рту с помощью мерцающих ресничек со скоростью около 5см/час. Частицы, впечатанные в слизь, окончательно отхаркиваются и/или попадают в желудочно-кишечный тракт. Этот процесс могут затормозить вещества, парализующие мерцательное движение (цианид) или вещества, стимулирующие выработку слизи (раздражители). Табачный дым содержит и цианиды, и раздражители и препятствует выведению частиц. Эксперименты показали, что время полувыведения частиц красного железняка (гематит, Fe3O4) из легких некурящих индивидов составляет около 2 месяцев, а из легких курящих 11 месяцев. Второй способ выведения – с помощью макрофагов. Эти клетки покрывают до 1% поверхности альвеол. Они поглощают частицы фагоцитозом и затем

мигрируют в верхние дыхательные пути, где и отхаркиваются. Для повседневной жизни этих способов оказывается достаточно, чтобы сохранять легкие чистыми и стерильными. Однако большое количество вдыхаемых частиц может сокрушить эту защиту. Известно три болезненных состояния, связанных с профессиональной деятельностью: черное легкое (уголь), белое легкое (асбест), коричневое легкое (хлопок). Некоторые вещества являются вредоносными не только потому, что встречаются в большом количестве, но и потому что повреждают механизм удаления. Примерами могут служить песок и асбест, причем последний является волокнистым кремнеземом. Вдыхаемые частицы песка могут проникнуть глубоко в легкие, а асбест обычно оседает в местах бифуркаций в бронхах. В каждом случае макрофаги пытаются удалить частицы, однако минералы оказываются токсичными для этого типа клеток, вызывая их лизис. В результате высвобождаются токсичные производные кислорода, такие как супероксид радикал, которые являются более токсичными для эпителиальных клеток, чем для подстилающих их фибробластов. Кроме этого высвобождаются факторы роста фибробластов, и факторы, привлекающие фибробласты к данному участку. Если повреждения происходят продолжительное время, это может привести к усилению роста фибробластов (фиброз) и к потере эластичности легких. Повреждения легких минеральной пылью (например, кремниевой) являлось профессиональной болезнью более столетия. Асбест способствует возникновению не только бронхогенной карциномы, но и мезотелиомы. Широкое использование асбестовой изоляции вело к эпидемии мезотелиомы среди тех, кто по роду занятий подвергал себя воздействию, а иногда и среди членов семей, на которых действовала пыль, принесенная домой с рабочей одеждой. Окислительный процесс способствует индукции фиброза. Примером может служить гербицид паракват (используется для уничтожения марихуаны), который селективно откладывается в альвеолярных клетках, даже если экспозиция продолжается месяц. Это органическое основание подвергается процессу циклического восстановления и окисления, генерируя супероксид радикал, как показано на рис. 13. В результате этого процесса альвеолярные клетки погибают, а свободные места заполняются активно пролиферирующими фибробластами, а фатальный итог наступает спустя несколько недель.

Рис. 13. Цикл окисления-восстановления параквата Озон является намного менее специфичным, чем паракват, но встречается более часто. Он генерируется в нижних слоях атмос- феры под действием солнечных лучей и оксидов азота на углеводороды. Известно, что значительная часть популяции (около 25%) является чувствительной к эффектам озона, обычно это люди с предшествующими болезнями – астмой, эмфиземой, бронхиты, или даже люди, вдыхающие большое количество воздуха через рот (заметим, что большинство лабораторных животных обладают облигатным носовым дыханием). Эпидемиологические исследования продемонстрировали эффект загрязнения воздуха на чувствительных индивидов, включая приступы астмы, снижение легочной функции у детей. Хронически низкий уровень экспозиции озоном ведет к утолщению тканей подстилающих эпителий нижних путей. В легких также осуществляются реакции биотрансформации, что в некоторых случаях приводит к токсичным эффектам. Доля активности цитохромов Р450, приходящейся на ткани легких, невелика по сравнению с печенью (хотя это орган наиболее активный после почек). Большая часть активности приходится на клетки Клара. Эти клетки являются

мишенью для 2-х типов соединений – CCl4 и 4-ипомеанола. Первое, так же как и в печени, активируется восстановлением, а последнее – эпоксидированием с участием Р450 (рис. 14).

Рис. 14. Реакция окисления 4-ипомеанола 4-ипомеанол является микотоксином, присутствующим в некоторых сортах сладкого картофеля, вызывающим респираторные отравления. В экспериментах на мышах была показана специфичная деструкция Клара клеток. Когда действие подобных соединений только начинали изучать, было неясно, в печени или в легких локализованы цитохромы Р450, отвечающие за их активацию. Полагали, что соединения активируются в печени, а затем переносятся в легкие, где их эффекты оказываются токсичными, в то время как печень имеет адекватную защиту. Однако ряд экспериментов подтверждал, что легкие обладают собственной метаболической активностью. Во-первых, препараты цитохромов Р450 из легких способны метаболизировать 4-ипомеанол. Во-вторых, при введении животным радиоактивного 4-ипомеанола, его аддукты регистрировались в клетках Клара. В-третьих, индукторы цитохромов Р450 печени, фенобарбитал или 3-метилхлорантрацен снижали токсичность для легких. Кроме того, показано, что у птиц отсутствует легочный метаболизм 4-ипомеанола и отсутствует легочная токсичность, тогда как метаболизм в печени приводит к токсическому эффекту. В настоящее время охарактеризовано несколько изоформ цитохромов Р450 легких человека и лабораторных животных

2.1.5. Нервная система Нервная система является также мишенью токсичных веществ. Американским институтом гигиены подсчитано, что из 588 токсичных соединений 28% главным образом действуют на нервную систему. Эта чувствительность возникает из-за сложного строения нервной системы и ее первостепенной функции для всего организма. Повышенная чувствительность в период развития плода отражает продолжительный период, требующийся для сортирования клеток, запланированного истощения и создания соответствующего взаимодействия. К тому же, так как клетки нервной системы существенным образом не размножаются после рождения, повреждение, приводящее к гибели клетки или потери функции, является кумулятивным и может вызвать появление симптомов через много лет после незначительного воздействия. Открытие веществ, которые могут вызывать появление симптомов Паркинсонизма, привели к размышлению о том, что хроническое воздействие веществ из окружающей среды является причиной увеличения встречаемости этих симптомов и других заболеваний нервной системы. На сегодняшний день произведена оценка влияния 70000 коммерческих химических соединений на нервную систему. Центральная нервная система (головной и спиной мозг) управляют периферической нервной системой и управляет ее функциями. Периферическая нервная система является запутанной сетью, содержащей в себе большое разнообразие потенциальных сайтов для воздействия токсичных веществ. Центральная нервная система защищается от заурядных

воздействий с помощью специализированных, тесно соединенных эндотелиальных клеток, выстилающих кровяные капилляры. Сетчатка глаза и некоторые компоненты периферической нервной системы также защищены. Этот барьер более эффективен для заряженных соединений и менее эффективен для липофильных веществ. При рождении этот барьер формируется не полностью, и у недоношенных детей может быть разрушен с помощью веществ, которые позднее проникнуть не смогут. Нейроны выполняют основные функции нервной системы. Найдено большое разнообразие нейронов, которые выполняют специализированные функции. Основные биосинтетические функции клетки, такие как синтез белков, происходят в теле клетки. Передаваемая информация принимается дендритами. Когда эта информация достигает достаточного уровня, она передается по- средством электрического импульса по аксону. Аксоны формируют разветвления на конце, которые соединяются с другими нейронами или мышечными клетками, которые принимают этот импульс. Нейроны обычно имеют избыток отрицательного заряда на внутренней стороне. Этот заряд нейрона поддерживается благодаря ионным насосам, для работы которых необходима энергия (АТФ). Самым важным насосом является натрий-калиевый АТФ-зависимый насос, который поддерживает концентрацию калия снаружи клетки приблизительно в 20 раз выше, чем внутри, а концентрация натрия внутри составляет только одну десятую концентрации снаружи. Концентрация хлорида снаружи выше, чем внутри. Из-за дифференцированного заряда возникает электрический потенциал, равный приблизительно 70 мВ. Так как разноименные заряды разделены маленьким расстоянием, то электрическое поле достаточно велико, порядка 100 кВ/см. Особенностью аксона является высокая частота натриевых канальцев в плазматической мембране. Конформация этих белков (канальцев) зависит от электрического поля. При обычном потенциале они находятся в закрытом состоянии и не дают ионам натрия входить и выходить из клетки. Однако когда вольтаж возрастает до критического уровня (~30 мВ), обеспечивается движение катионов через каналец, белок которого находится в открытой конформации. Когда в клетку поступает достаточная концентрация натрия, полярность в данном натриевом канальце изменяется на противоположную. Каналец закрывается и остается короткое время в инактивированном состоянии. Тем временем, изменившееся напряжение открывает калиевый каналец, позволяющий ионам калия выходить из клетки, таким образом, помогая восстанавливать первоначальный потенциал, а затем он закрывается. В пределах короткого промежутка времени, миллисекунды или около того, каналец восстанавливает способность передавать потенциал действия. Это означает, что аксон способен передавать тысячу импульсов в секунду. Абсолютное количество ионов, переносимых во внутрь и наружу, мало по сравнению с общим количеством в клетке. Аксоны очень разнообразны по длине: они могут быть короткими (менее 1 мм) или очень длинными (более 1 м). Когда потенциал достигает разветвления на конце аксона, импульс может перейти на другой нейрон или на мышечные клетки посредством синапса. Эта передача происходит с использованием ионных канальцев, конформация которых зависит от лиганда. Канальцы являются рецепторами для маленьких молекул – нейропереносчиков. Связывание лиганда заставляет их перейти от закрытого в открытое состояние. Активированные нейропередатчиками ионные канальцы в синапсах в открытом состоянии позволяют перемещаться ионам, тем самым, изменяя потенциал мембраны. Хорошо изученный вид синапса, когда он выполняет роль нейромышечного соединения, используя для этого ацетилхолин как нейропередатчик. В соединении на плазматической мембране (постсинаптическом терминале) мышечных клеток найдено огромное количество ацетилхолиновых рецепторов, расположенных напротив пресинаптического терминала аксона. Когда потенциал достигает конца аксона, открываются потенциалзависимые кальциевые канальцы на плазматической мембране, позволяя ионам кальция устремляться в цитоплазму. Концентрация кальция снаружи клетки 1-2 мМ, а в цитоплазме 0,1 мкМ. Ионы кальция индуцируют миграцию маленьких цитоплазматических пузырьков, каждый из которых содержит порядка 10 тыс. молекул ацетилхолина, к

пресинаптической мембране. Молекулы ацетилхолина, высвободившись из пузырька, быстро диффундируют в постсинаптическую область и в течение 0,1 мсек активируют рецепторы. Ацетилхолиновые рецепторы быстро открываются (1 млсек), способствуя движению катионов (особенно натрия), которые деполяризуют постсинаптическую мембрану и затем закрываются. еполяризация открывает натриевые канальцы, распространяющие потенциал, который деполяризует целую плазматическую мембрану мышечной клетки. Это открывает кальциевые канальцы в плазматической мембране, а затем в саркоплазматической сети. Затем ионы кальция вызывают сокращение мускулатуры. Эта система предназначена не только для превращения сигнала из нейрона в мышечную активность, но также для предотвращения сверхактивности. Ацетилхолин, производимый потенциалом нейрона, обычно не вызывает продолжительную стимуляцию мышечной ткани, так как он быстро удаляется из синаптической трещины. Однако нейроны имеют специализированные транспортеры, предназначенные для возращения освобожденных нейропередатчиков, так как большинство из них могут быть возвращены в пузырьки и снова участвовать в цикле. Этот процесс может иметь затруднения, когда в нейрон может попадать токсикант, близкий по структуре с нейропередатчиком, что впоследствие может привести к нарушению нейрона. В случае ацетилхолина, нейромышечное соединение также содержит ацетилхолинэстеразу, которая гидролизует сложный эфир, образуя ацетат и холин. Функцию нейромедиаторов выполняют многие маленькие молекулы, включая аминокислоты, пептиды и другие разнообразные соединения. Нейропередатчик связывается с ионным канальцем в постсинаптической мембране, тем самым, обеспечивая движение ионов. Ацетилхолиновые рецепторы также найдены в синапсе между нейронами и центральной не рвной системой. Как уже было сказано ранее, ацетилхолиновым рецептором в нейромышечном соединении является катионовый каналец, который обеспечивает деполяризацию мембраны в открытом состоянии. Это приводит к открыванию натриевых канальцев, которые распространяют деполяризацию. Катионовые канальцы, которые связываются с другими нейропередатчиками, такими как серотонин или глутамат, обладают такой же функцией. Но некоторые лиганд-зависимые канальцы специфичны для перемещения хлорид-ионов. Когда они открыты, хлорид-ионы заходят в клетку в результате градиента концентрации и таким образом увеличивают поляризацию. Если открыто несколько катионовых канальцев, но их недостаточно для достижения порога, потенциал не будет перемещаться. Хлоридные канальцы являются ингибиторами, и если эти канальцы будут блокированы стрихнином, то могут возникнуть конвульсии и смерть. Рецепторы нейропередатчиков обычно не функционируют как отдельная молекула белка. Они являются специфичными мультисубъединичными комплексами, чаще всего из неодинаковых мономеров. Более того, каждый вид субъединиц может существовать в нескольких формах, образованных отличающимися генами или в результате альтернативного сплайсинга. Показательным примером является ацетилхолиновый рецептор. Рецепторы, располагающиеся в постсинаптической мембране нейромышечншго соединения, являются чувствительными к никотину, поэтому они известны как никотиновый субтип. Другой вид ацетилхолинового рецептора является намного более чувствительным к искусственному лиганду, мускариновой кислоте, поэтому он известен как мускариновый субтип. Такое разнообразие помогает объяснить различающуюся чувствительность рецепторов к токсичным агентам. Например, яд курраре инактивирует никотиновые рецепторы, в то время как атропин инактивирует мускариновые рецепторы. Токсины, влияющие на возбуждение. Глутаминовая кислота является важнейшим передатчиком возбуждения в нервной системе. Некоторые субтипы глутаминовых канальцев обнаруживались в экспериментах с искусственными аналогами глутаминовой кислоты. Около 30 лет назад было обнаружено, что введение глутаминовой кислоты или некоторых ее аналогов новорожденным крысам может привести к смерти некоторых нейронов. Последующие исследования показали, что когда эти нейропередатчики были введены в мозг, близлежайшие нейроны погибли, хотя аксонам, берущим начало из клеток, находящихся снаружи этого окружения, не был причинен вред.

Эта работа породила идею о том, что высокие уровни стимуляторов возбуждения могут быть вредоносными. Эти исследования привели также к размышлению о том, что хроническое воздействие агентов окружающей среды, аналогов нейропереносчиков, может приводить к заболеваниям, связанным с разрушением нервной системы, таким как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера. Нейролатеризм, известный с давних времен и характеризующийся частичным параличем, является результатом воздействия токсинов возбуждения. Эта болезнь обнаружена по всему миру, включая Европу, но сейчас в большинстве случаев она встречается в очень бедных странах, в частности в Индии, Бангладеш и Эфиопии. Причина заболевания заключается в горохе из бобовых Lathyrus savita. Это выносливое, дикорастущее растение, буйно растущее независимо от погодных условий. Их зерна содержат (порядка 0,5% от веса) необычную аминокислоту β-оксалиламиноаланин, которая является потенциальным лигандом для АМРА субтипа глутаминового рецептора. Побеги, которые содержат такой же уровень аминокислоты, также употребляются в пищу. После употребления порядка 100 г/день зерен в течение нескольких лет, у некоторых людей обнаруживаются ранние симптомы латиризма. Последующее употребление приводит к необратимой слабости в ногах с болями и судоргами, а так же с последующими трудностями при хождении. Продолжительное употребление в пищу приводит к смерти, но механизм этого не известен. Другим аналогом нейропереносчика, содержащимся в пищевых продуктах и разрушающим нервную систему, является домоиковая кислота. Большие дозы этого вещества, введенные крысам или обезьянам, вызывают апоплексический удар. У людей это вещество в низких дозах вызывает диарею и потерю памяти. Домоиковая кислота аккумулируется в ракообразных, которые питаются диатомовыми водорослями, синтезирующими это вещество во время цветения. Поэтому перед употреблением в пищу ракообразные проходят тестирование на содержание домоиковой кислоты. Это является предупредительной мерой. Такими анализами занимается аналитическая химия, но это достаточно сложная задача, так как существует одиннадцать изомеров этого соединения. Недавно для анализа стали применять биохимические методы с использование клонированных рецепторов. Это позволило определять активность образца без определения отдельных изомеров. Многие высокотоксичные вещества, вызывающие невропатологии у людей, синтезируются водорослями и могут аккумулироваться в рыбах и моллюсках. Некоторые из них подавляют возбуждение в результате связывания с ионными канальцами аксонов, которые обеспечивают передачу электрических импульсов и их инактивацию. Однако некоторые из таких веществ могут использоваться в фармакологии, вызывая гиперполяризацию и ингибируя передачу электрических импульсов. Бензодиазопины являются популярными транквилизаторами, подавляющими беспокойство. Они связываются с GABA рецепторами, хлоридными канальцами и увеличивают ионный поток, таким образом, увеличивая натуральное ингибирование активности. Эти соединения являются эффективными, имеют высокий терапевтический индекс и не вызывают привыкания. Однако некоторые вещества в этом классе имеют высокую гипнотическую активность и могут вызывать кратковременную потерю памяти. Одним из таких веществ является флунитразепам, который не одобрен в США к использованию по этой причине. Тяжелые металлы. Ртуть попадает в окружающую среду по нескольким механизмам. Существенное количество попадает из минералов. Такое же количество (порядка 5 млрд г в год) поступает в результате горения ископаемого топлива, которое содержит ртуть в концентрации 1ppm. Ионы ртути могут метилироваться микроорганизмами и накапливаться в липидах. Недавно внимание заострилось на содержании ртути в организме человека. Ртуть может воздействовать в виде ионной и метилированной формы, а также в виде паров. Соли ртути являются растворимыми, поэтому они чаще всего воздействуют на почки. Вдыхание паров ртути вызывает воспаление легких. Ранние симптомы включают: усталость, уменьшение концентрации внимания, потеря аппетита и тахикардия. Сильное воздействие может приводить к спазмам, потери памяти, повышенной возбудимости, депрессии и галлюцинациям.

Метилированная ртуть накапливается в коре головного мозга. У плода метилированная форма ртути накапливается в 20 раз интенсивнее, чем ионы ртути, что было показано воздействием ртутью на беременных животных. К тому же концентрация ртути у плода в два раза выше, чем у матери, а ртуть нарушает функции мозга у новорожденных. Воздействие ртути в зрелом возрасте приводит к целому спектру симптомов, включая потерю чувствительности, слуха и зрения, а в некоторых случаях даже к смерти. Воздействие ртути на человека является вездесущим. Горение и добыча ископаемых приводит к выбросам ртути в воздух. Некоторые люди получают высокую концентрацию через краску (особенно дети) или пищу, приготовленную в керамической посуде, покрытой глазурью, которая содержит ртуть. У старых людей порядка 95% ртути в организме сосредоточено в костях, где в течение жизни накапливается 200-500 мг ртути. Основная часть находится в красных кровяных тельцах, что укорачивает их жизнь. Почки также накапливают ртуть, в результате чего разрушаются проксимальные трубочки, что приводит к фиброзу. Уменьшение выделения уриковой кислоты является результатом ослабления функций почек. Уриковая кислота кристаллизуется и вызывает подагру. Ртуть также может приводить к нарушению репродуктивной функции, включая стерилизацию, а также может вызывать смерть новорожденных. Нервная система является наиболее серьезной мишенью воздействия ртути. Сильное воздействие приводит к разрушению мозга (энцефалопатии), характеризующееся раздражительностью, вялостью, потерей аппетита, атаксией и даже эпилепсией. Наиболее чувствительными являются дети. Исследования показали линейное уменьшение коэффициента IQ от содержания ртути в крови в диапазоне 0,05-0,35 мкг/мл. Токсины микроорганизмов. Люди подвергаются воздействию огромного количества токсинов, вырабатываемых бактериями, которые специфично воздействуют на разнообразные ткани. Токсины холеры, столбняка, дифтерии и ботулизма имеют схожие механизмы воздействия. Они все синтезируются как одинарные полипептидные цепи, которые способны формировать димеры, связанные дисульфидными мостиками. Тяжелая цепь в димере отвечает за тканеспецифичность и за проникновение токсина в клетку. Внутри клетки дисульфидные мостики разрушаются, после чего легкая цепь становится активированной. Легкие белковые цепи у столбняка и ботулизма являются цинк-зависимыми. Они приводят к нарушению секреции нейропереносчиков, которые обеспечивают взаимодействие с плазматической мембраной в синапсе. В случае ботулизма отсутствие секреции нейропереносчиков приводит к частичной парализации конечностей, так как токсин действует на спинной мозг. Для сравнения, при столбняке возникает спастическая парализация. Известно семь изоформ токсина ботулизма, которые различаются по протеолитической специфичности. Однако три изоформы взаимодействуют с одним и тем же белком, но разрезают его в разных местах. Видовые различия в чувствительности к ботулизму (человек и мышь в 1000 раз более чувствительны, чем крыса) определяются аминокислотными последовательностями в белках. Яды. Хищники должны обладать методами поимки и обездвиживания своих жертв. Многие используют для этой цели яды. Змеи вводят своим жертвам различные деградирующие ферменты, включая фосфолипазы, протеазы и нуклеазы. Наиболее эффективными обездвиживающими жертву компонентами являются небольшие белковые токсины (порядка 7 кДа), которые связывают и инактивируют ацетилхолиновые рецепторы в нейромышечных соединениях. Соединения этого класса имеют очень высокое сродство к рецептору в диапазоне 0,01-1 нМ. Вместо ингибирования ацетилхолинового рецептора, яд африканской древесной змеи содержит пептидный компонент, который связывает и инактивирует ацетилхолинэстеразу. Этот яд также содержит токсин, инактивирующий ворота калиевых канальцев, которые деполяризуют аксон между импульсами. Яды, которые воздействуют на ионные канальцы, часто состоят из смеси компонентов, одни из которых блокируют определенные канальцы в открытом состоянии, а другие - в закрытом. Яды актиний и пчел содержат пептиды, которые действуют на калиевые

канальцы, а так же пептиды, которые действуют на натриевые канальцы. Морские улитки обездвиживают своих жертв (включая рыб по размерам больших, чем они сами) концентратами пептидов, которые содержат компоненты действующие на калиевые, натриевые и кальциевые канальцы, а так же другие пептидные ингредиенты, являющиеся нейротоксинами. Многие токсины ядов достаточно специфичны и поэтому нашли широкое применение для использования в экспериментах по изучению активностей ионных канальцев нервной системы млекопитающих, включая человека. Инсектициды. При производстве достаточного количества пищи для растущего населения мы стали зависимыми от разнообразных инсектицидов. Они, как правило, воздействуют на нервную систему и, следовательно, их действие протекает быстро. Главной целью инсектицидов являются хлоридные канальцы (γаминобутариковая кислота, циклодиены), натриевые канальцы (ДДТ) и ацетилхолинэстераза (органофосфаты). Широкое применение этих веществ привело к развитию устойчивости насекомых. Одиночные точечные мутации, повышающие устойчивость к циклодиенам, найдены у некоторых видов (тараканы, москиты, комнатные мухи, плодовые мушки, алейродиды, хрущак каштановый). Точечные мутации, повышающие устойчивость натриевых канальцев к ДДТ, найдены у шести видов (комнатные мухи, москиты, тараканы, тля персиковая, моль капустная, табачная листовертка-почкоед). Одна из нескольких дополнительных точечных мутаций может также привести к суперустойчивости. К счастью для нас, наша нервная система является нечувствительной к действию таких инсектицидов как циклодиены и ДДТ. Однако мы очень чувствительны к органофосфатам, которые первоначально разрабатывались как отравляющие вещества для ведения войны. Органофосфаты синтезируются в виде тиоформы (R3P=S), которая является относительно стабильной. Когда это соединение попадает в насекомое (или в человека), оно переходит в оксоформу (R3P=O), которая быстро взаимодействует с ацетилхолинэстеразой. Эти соединения вызывают смерть не только при вдыхании, но и при взаимодействии с кожным покровом. Изучение биохимии ацетилхолинэстеразы демонстрирует, что активные сайты остатков серина участвуют в гидролизе ацетилхолина, образуя интермедиат О-ацетилсерин, который быстро гидролизуется. Таким образом, органофосфаты инактивируют ферменты, тем самым, замедляя гидролиз. Злоупотребление наркотиками. Ядра accumbens были открыты как своего рода центры удовольствия в мозге, где рост уровня допамина-нейропереносчика воспринимался как удовольствие (эйфория, блаженство). Множество признаков указывает на злоупотребление наркотиками (включая никотин), как на стимуляторы уровня допамина в организме, который (уровень) отвечает за чувства удовольствия, вызываемые наркотиками. Экспериментальные животные будут добровольно сами принимать эти наркотики, что говорит о взникновении привыкания к наркотическим препаратам. У людей и животных привыкание или уменьшение чувствительности к таким агентам происходит так, что требуются для получения соизмеримого удовольствия большие дозы. Дозы наркотика могут стократно возрастать, что выходит далеко за пределы того, что изначально являлось летальным воздействием. Окончательное прекращение потребления наркотиков впоследствие вызывает дисфорию (в противоположность эйфории), так как тело реадаптируется к нехватке экзогенных агентов. Наркоманы в это время идут на то, чтобы продолжать принятие наркотиков в еще больших дозах. Реабилитация наркоманов – это долгий процесс, обычно длящийся долгие годы. Наркотическая зависимость была сравнима в масштабах с хроническими заболеваниями, такими, как: диабет, астма и повышенное кровяное давление. Многие исследования в области злоупотребления наркотиками направлены на понимание молекулярной основы действия наркотика, толерантности организма и реакцию отказа от наркотиков на их воздействие. Один из подходов к пониманию действия наркотиков был направлен на поиск их рецепторов. Это первый шаг в понимании путей сигнальной трансдукции. Последние работы указывают на важность серотониновых путей в возбуждении при наркотическом воздействии, а также на важность глутаматовых путей, особенно рецепторов NMDA, в развитии тяги к большему количеству наркотиков. Фармакологические свойства опиоидов известны с древних времен. Выделение

наиболее активного компонента - морфина было впервые описано в 1803. Героин (диацетилморфин), который имеет более высокую скорость проникновения в мозг, был синтезирован в 1874. Морфин и его активные природные аналоги, такие как кодеин, вызывают не только эйфорию, но также являются хорошими анальгетиками и высоко эффективны в борьбе с диареей. Много усилий было положено на попытки сделать производные этих соединений, которые вызывают только обезболивание без эйфории, но до сих пор только с ограниченным успехом. Однако был разработан эффективный антагонист (для лечения передозировок), такой же долгоживущий, хотя гораздо менее эффективный, производное (метадон), которое полезно в реабилитации. Несмотря на то, что он не вызывает эйфории (преимущество в лечении), он достаточно силен, чтобы избежать синдромов ломки. Допустимо прописывать его для раковых больных в целях облегчения боли, что также устраняет потребность в марихуане. Изучение рецепторов привело к выявлению трех основных подтипов рецепторов морфия, которыми оказались G-белки (Gi). Они сдерживают образование аденил-циклазы в целевых нейронах, таким образом, увеличивая проводимость каналов калия, уменьшая проводимость каналов кальция и вызывая гиперполяризованное состояние. Как именно это приводит к обезболиванию неясно; пациенты, находящиеся на лечении для избавления от наркотической зависимости, говорят, что боль не ушла и даже не уменьшилась, они просто больше не воспринимают ее как нечто, вызывающее отвращение. Эндогенные лиганды для рецепторов, два из которых являются пентопептидами, выведенными из предшественников, были обнаружены и названы эндорфинами (эндогенный морфин). Амфетамин был впервые синтезирован в 1887. Он относится к фармокологически активным компонентам некоторых растений Восточной Африки и Китая и известен своими целебными свойствами. Раньше этот препарат прописывался в таблетках для лечения нарколепсии (внезапный сон) в 1935 и был отдан военным в 1940-ых для поддержания боевой готовности. В 50-ые и 60-ые годы он принимался студентами и дальнобойщиками для поддержания активности без сна и отдыха. Препарат медленно поглощается при оральном принятии, но когда вводится внутривенно или (особенно метамфетамин) ингаляцией, то вызывает чувство удовольствия, ведущее к злоупотреблению «скоростными чудачествами». Агенты класса амфетамина перемещаются допаминергическими нейронами, препятствуя реабсорбции допамина и ускоряя выбрасывание допамина из внутриклеточных пазух. Так как действие препарата проходит быстро, то лица, злоупотребляющие наркотиками, могут принимать дозы с двух часовыми интервалами в течение нескольких дней, а потом «ломаются» (спят в течение долгого периода). Привыкание возникает быстро, требуя увеличения доз, а последующее воздержание характеризуется вялостью, депрессией и, в основном, неприятными чувствами. Продолжительное употребление может вызвать галлюцинации и психозы, напоминающие параноидную шизофрению. Амфетамины запрещены для занятий спортом, потому что они улучшают исполнение. Но его производные все еще используются для борьбы с потерей веса для улучшения аппетита (включая фенолпропаноламин в Дексатриме и в Риталине) и для лечения гиперактивного дефицита внимания у детей.

Амфетамин

Метамфетамин Кокаин впервые был обнаружен в кустарнике Южной Америки. В период завоевания этого континента, испанцы впервые наложили запрет на привычку местных жителей жевать листья этого растения, но затем заметили, что рабы работали усерднее и дольше, когда им позволили жевать листья. Кокаин был добавлен в Кока-колу, производимую в 1886 г., пока он не был устранен в 1906 г. Позднее напитки с кокаином продавались в качестве альтернативы алкоголю как часть движения за трезвость. В 1914 г. федеральное правительство США установило запрет на продажу кокаина и опиума, как составляющих лекарственных препаратов, в аптеках. Такая практика ни к чему хорошему не привела. По оценкам экспертов в США насчитывается около полмиллиона наркоманов. Для достижения желаемого эффекта важен способ введения, обычно это ингаляции или внутривенные инъекции. Эйфория от кокаина длится в течение получаса, гораздо меньшее время, чем от амфетамина, а с увеличе нием дозы ведет к агрессии. Так же, как и с амфетамином, основа достижения удовольствия заключается в уменьшении реабсорбции допамина через дофаминергические нейроны. Недавно также было сообщено о роли серотонина в развитии наркотического эффекта. В больших концентрациях, однако, кокаин может также подавлять определенный рецепторы нейропереносчиков и даже блокировать аксонные натриевые каналы. Это способность была задействована в разработке производных, таких как прокаин и лидокаин, которые широко используются как местные анастетики. Ниже даны их структуры:

Кокаин

Лидокаин Один из наиболее часто употребляемых наркотиков получен из растения марихуаны. Основным составляющим марихуаны является ∆9-тетрагидроканнабинол (ТНС):

Поглощение достаточного количества ТНС обычно вызывает чувство эйфории, которое может длиться несколько часов. Оно может сопровождаться беспорядочными мыслительными процессами и психомоторными проявлениями (координация, время реакции), которые длятся полдня, так что следует воздержаться от вождения автомобиля. Уменьшение чувствительности к доставляющим удовольствие эффектам приходит с повторяющимися высокими дозами за короткие интервалы времени. Однако невозможно продемонстрировать психическую зависимость на животных или людях в соответствии с условиями обычного употребления. Употребление сильных антагонистов показало, что могут появиться симптомы ломки, однако такие симптомы обычно незаметны, потому что время полужизни ТНС в крови достаточно высоко (приблизительно день). Недавно с помощью радиоактивного лиганда рецепторы для ТНС были определены как члены надсемества G-белков. Это привело к идентификации эндогенного лиганда, названного анандамидом (санскрит для «блаженства»), который оказался производным арахидоновой кислоты – компонента липидной мембраны. Любопытно, что анандамид является растворимым липидом, он не хранится в везикуле, подобно другим нейропереносчикам. Это позволяет предположить существование другого класса лигандов. Рецепторы ТНС обнаружены в двух изоформах, одни – в центральной нервной системе, и другие – в клетках иммунной системы, такие как макрофаги, потенциально обеспечивающие основу для некоторых реакций, которые могут влиять на иммунные функции из-за употребления марихуаны. Связанный с рецепторами ТНС уменьшает производство сАМР в нейронах, приводя к уменьшению активности кальциевых и калиевых каналов. Как именно это приводит к возникновению удовольствия неясно, но недавно было показано, что введение ТНС крысам приводит к высвобождению допамина в ядрах accumbens, подобно высвобождению эндрофинов.

2.1.6. Репродуктивная система Известно, что многочисленные химические вещества оказывают влияние на репродуктивные функции мужчин и женщин. В некоторых случаях репродуктивная система поражается механизмами, которые не специфичны, а относятся к другим тканям (например металлы, которые связывают белки или разрушают клеточные мембраны). В других случая репродуктивная система является первоначальной мишенью, но точный механизм не известен. Подход в этом представлении концентрируется на гормональных механизмах токсичности, корые более изучены. Для некоторых соединений будет проиллюстрировано влияние метаболизма, хотя они действуют не через гормональный механизм. Взгляд на физиологию и эндокринологию процесса репродукции помогает рационализировать действие многих токсикантов, влияющих на репродукцию. Главный участник в поддержании гормонального баланса – гипофиз, расположенный в основании мозга. Эта главная эндокринная железа секретирует разнообразные гормоны, которые регулируют секрецию других желез. Например, стероидный стимулирующий гормон (FSH) стимулирует тиреоидную железу для производства стероидного гормона Т3. Адренокортикотропный гормон (АСТН) стимулирует надпочечники для производства гидрокортизона. Пролактин стимулирует молочную железу для производства составных частей молока. Гормон роста стимулирует печень для производства соматомединов. Одной из важнейших частей репродукции является секреция гипофизом фолликуло-стимулирующего

гормона и LH-гормона, которые действуют на гонады для стимулирования созревания клеток зародыша и половых стероидов, соответственно. Гипоталамус является центральной частью «гипоталамо-гипофизарно-гонадной цепи». Гипоталамус, реагирующий на сигналы мозга, секретирует разнообразные гормоны, которые взаимодействуют со специфичными типами клеток в гипофизе для высвобождения других гормонов. Гонадотропный гормон (GnRH) стимулирует центральные клетки гипоталамуса для секреции FSH и LH. Далее FSH стимулирует клетки в семяносных канальцах мужской половой железы, поддерживая, таким образом, производство спермы. Тем временем LH стимулирует клетки в мужской половой железе для синтеза тестостерона. Этот гормон входит в цикл и влияет на функции вторичных мужских половых органов (простаты, семенного пузырька). Он также участвует в петле негативной обратной связи, которая регулирует секрецию гормонов из гипоталамуса и гипофиза, так что уровни половых стероидов поддерживаются на нормальном уровне. Сценарий у женщин аналогичен. У женщин матка и молочные железы являются вторичными половыми органами, на которые действуют эстроген и прогестерон. Цепь обратной связи, включающая в себя гипофиз и гипоталамус, точно такая же, но более сложная. Овуляция. При рождении у новорожденной содержится 3-4*105 незрелых фолликул, но к половой зрелости половина теряется самопроизвольно и к 30 годам их количество составляет порядка 25 тысяч. В течение репродуктивного времени жизни женщины 200-300 из них созревает. В каждом цикле несколько фолликул разрушается, но обычно только одна из них выпускается в яйцеклетку (рис 30-15). После освобождения, остаток фолликул секретируют прогестерон для приготовления слизистой оболочки матки к беременности. Если яйцеклетка оплодотворяется, эмбрион секретирует хорион-гонадотропный гормон (hCG). Это стимулирует оставшиеся фолликулы продолжать секретирование прогестирона до тех пор пока плацента сможет принять на себя эту функцию. Для понимания естественного цикла овуляции и того, как он может быть нарушен токсичными веществами или умышленно контрацептическими веществами было сделано исследование гормональных влияний на этот процесс. В начале цикла FSH ведет к созреванию нескольких фолликул в яичнике и к увеличению эстрогена. Когда уровень эстрогена возрастает до критического уровня, гипофизом секретируется LH, который вызывает овуляцию, продолжая значительно увеличивать уровень прогестерона. Если оплодотворение не происходит, то уровень полового стероидного гормона уменьшается до начального значения. Отмечено, что гормональные сигналы являются эффективными. Ткани у женщин и мужчин должны чувствовать уровни половых стероидов и других гормонов по средством их соответственных рецепторов на поверхности клеток, для таких полипептидов как FSH и LH, или цитоплазматических рецепторов для стероидов. Контрацепция. В прошлом веке ученые подтвердили, что секреция из яичника предотвращает овуляцию в течение беременности. Согласно с этим в 1927г было опубликовано, что кормление грызунов экстрактами яичников и плаценты вызывало временное бесплодие. К 1937г прогестерон был изолирован из яичника. Также было обнаружено, что он может быть контрацептивом для кроликов и крыс. В 1950-х годах была показана способность прогестерона прекращать овуляцию у людей при проведении клинических испытаний. В 1970-х годах доза была понижена для избежания побочных эффектов. Также было обнаружено, что эстроген действует совместно с прогестероном, так что маленькая доза синтетического эстрогена была включена в производстве таблеток. Это давало эффективное подавление FSH и LH маленькой дозой стероидов. Более поздняя работа в 1981г по синтезу половых стероидов привела к разработке вещества под названием RU484. Это вещество является лигандом для прогестеронового рецептора, блокирующим его функцию (антогонист). Таким образом, если принимать его в период первых девяти недель беременности, то это изменяет подготовку утробного содержимого и вызывает отчуждение эмбриона. RU484 используется во Франции с 1988г для терапевтических абортов. Продолжаются попытки ввести это вещество в применение в США. Терапевтические эстрогены. Обычно после менопаузы уменьшение эстрогена приводит к ощущению дискомфорта. Уменьшение эстрогена также приводит к остеопорозу

(утоньшению костей) в 25% случаев у женщин после менопаузы, поэтому они имеют высокую вероятность перелома бедра при незначительном происшествии. Для смягчения этих симптомов предпринимается эстроген-замещающая терапия, которая имеет выгодную сторону, понижая сердечно-сосудистые заболевания. Первоначально использовались чрезмерно большие дозы, однако это влекло за собой повышение риска внутриматочной карциномы в 5-15 раз. Сейчас используется комбинированная гормон-замещающая терапия, которая обеспечила понижение эстрогеновых доз и включает низкие дозы прогестина, который ингибирует размножение внутриматочных клеток.

Диэтилстилбестрол Синтетический эстроген DES (диэтилстилбестрол) является примером терапевтического гормона,который при употреблении беременными женщинами вызывает серьезные разрушающие эффекты в половых органах младенцев обоих полов. Он также вызывает редкие случаи рака половых органов у младенцев женского пола. Это обстоятельство повлекло за собой запрет на использование этого гормона в течение беременности. Эстрогены из окружающей среды. Примерно с середины 20-го века известно, что растения содержат имитаторы гормонов млекопитающих, которые могут нарушать репродукцию у домашних животных. Первые заключались в том, что определенный тип клевера, растущий в Австралии, содержит по крайней мере пять фитоэстрогенов, влияние которых при употреблении в пищу мешает репродукции овец. Подобные наблюдения были сделаны и у других домашних животных и у диких видов, употребляющих клевер в пищу. Тестирование экстрактов растений на активность первоначально показало способность эстрогеновых соединений вызывать увеличение половых путей у грызунов женского пола. После биоисследования грызунов, позволившего идентифицировать такие соединения (коуместрол), аналитические тестирования показали, что большенство жидких белковых концентратов, содержащих фитоэстрогены, не вызывают проблем.

Коуместрол В начале изучения рецепторов для гормонов исследователи были поражены совершенной стереоселективностью этих белков: малейшие изменения в структуре лиганда обычно вызывали драматические эффекты, влияющие на их свойства и последующую активность. Удивительно было обнаружить, что химические соединения из окружающей среды, которые не были близко похожи на эстроген, были способны связываться с этими рецепторами, хотя и слабо, а также имели незначительное гормональное действие.

o, p’-DDT Среди первых пестицидов это качество было открыто у о, р’-DDT. Позднее у таких веществ была обнаружена способность вызывать губительные эффекты на дикую природу (включая птиц и рыб), а также и у людей в случаях высокого уровня воздействия. После этого, для многих веществ была показана способность быть слабыми лигандами для эстрогенового рецептора. В многочисленных поселениях Европы, благодаря индустриальным загрязнителям речных вод, мужские особи рыб аккумулируют в печени белки, называемые вителлогенинами, которые являются компонентами яйцеклеток женских особей. Эти белки появляются в результате стимулирования эстрогеном. Были замечены гормональные нарушения у мужских особей пантер во Флориде, которые предположительно вызываются загрязняющими веществами, состав которых остается невыясненным. Такие наблюдения повысили тревогу среди некоторых ученых, которые считают, что эстрогены из окружающей среды являются вероятной причиной ежегодного увеличения рака грудной железы приблизительно на 1% в США с 1940-х годов, а также случаев раннего полового созревания у девушек. Другие ученые скептичны и считают, что низкие уровни эстрогенов в окружающей среде являются достаточными для вызывания эффектов у всего населения, хотя чувствительные индивиды и те, кто живет в сильно загрязненных регионах, наиболее подвержены риску. Мишени в мужских половых органах. Семенные канальцы мужских половых желез генерируют порядка 106 сперматозоидов в день. Этот процесс требует надлежащую функцию клеток, расположенных между канальцами. Эти клетки стимулируются LH-гормоном для синтеза тестостерона, который необходим для стимулирования клеток Сертоли и других органов вне мужских половых желез. Надлежащая функция этих клеток, найденных на внутренней части канальцев, требует FSH-гормона. Клетки Сертоли – это оберегающие клетки для сперматогоний, помогающие им разделяться и созревать. По этой причине вещества, которые уменьшают количество этих клеток, вызывают сопутствующее уменьшение количества спермы. Два токсина, n-гексан и 1,3-динитробензол, влияют на репродуктивные функции мужчин. Мишенями для этих токсинов являются клетки Сертоли, но причины этого не ясны. Оба соединения становятся токсичными в результате реакций метаболизма. Для каждого случая возможно появление нескольких метаболитов. При метаболизме 1,3-динитробензола происходит удаление одной из его нитрогрупп с образованием нитрозил-анион радикала. Затем образуется нитрозопроизводное, затем гидроксиламин, и в конце образуется амин. Считается, что нитрозил-радикал и гидроксиламин неустойчивы и могут окисляться, образуя супероксиды. При высоких уровнях воздействия, цикл удаления и окисления производит больше супероксидов, чем клетка может подвергнуть детоксикации, в результате чего происходит разрушение.

2.2. Токсикокинетика Четырьмя главными факторами, описывающими взаимодействие организма с токсичными веществами, являются абсорбция, распределение, метаболизм и выведение. Взаимодействие

между этими свойствами схематически показаны на рис.15. При рассмотрении в кинетике токсичного воздействия, эти факторы часто анализировались в моделях, целью которых являлось дать возможность лучшей экстраполяции результатов среди видов, доз и химических соединений (смесей). Первые разработанные концепции, связанные с терапевтическими веществами, создают основу для фармакокинетического и токсико-кинетического моделирования. Множество примеров, встречающихся в литературе, касаются терапевтических лекарств, но легко могут быть отнесены к токсичным веществам. Действительно, избежание токсичных эффектов лекарственной передозировки является важным аспектом фармакокинетики. Изучение ферментативной кинетики в биохимических реакциях обеспечило полезную умозрительную основу возможности удаления токсичных веществ. Выражение МихаэлисаМэнтона [2] устанавливает связь первоначального темпа или скорости реакции (v) фермента (Е), производимого продукт (P) и концентрации субстрата [S] для простой биохимической реакции [1], как показано ниже. Vmax - максимальная скорость образования продукта. KM - мера сродства фермента к субстрату. [1] E+S-->ES-->EP-->E+P [2] v/Vmax=[S]/(Km+[S]) Эти константы характеризуют внутренние свойства фермента. Из этих формул следует, что, когда [S] много больше, чем Km, то v приблизительно равно Vmax. Это означает, что ферменты производят продукты с максимальной скоростью, когда концентрация субстрата велика (фермент, так сказать, насыщен). Это имеет интуитивный характер. С другой стороны, заметим, что, если [S] меньше KM, то v=(Vmax/KM)[S]. В этом режиме скорость реакции пропорциональна концентрации субстрата. Это также имеет

Рис. 15. Распределение токсинов смысл, когда фермент находится в большом избытке. Эти соотношения показаны на рис. 16, который также иллюстрирует, что скорость реакции равна половине максимальной, когда концентрации субстрата равна Km.

Рис. 16 Ферметативная кинетика Михаэлиса-Ментена. Гиперболическое взаимодействие между скоростью ферментативной реакции и концентрацией субстрата (М), описываемое ферментативной кинетикой Михаэлиса-Ментена. КМ – концентрация субстрата (М), при которой скорость реакции равна 0,5 Vmax Исключение токсичных веществ из организма может включать в себя некоторое количество процессов, а не только единственную биохимическую реакцию. Вопреки возможным, лежащим в основе, сложностям, скорость выведения обычно может быть описана кинетикой Михаэлиса-Мэнтона. Простейший случай, названный «нулевым порядком», соответствует режиму с высокой концентрацией, когда происходит насыщение ферментами метаболизма, и другие процессы удаления также работают с наивысшей скоростью. При этом условии, выведение является постоянной величиной, как функция, зависящая от времени. Таким образом, график концентрации в крови линеен все время. Часто встречающимся примером является этанол, который имеет максимальную скорость выведения, приблизительно равную 10мл/час. Как показано в таблице 3, выведение 50 мл этанола из человеческой кровеносной системы занимает около 5 часов. Таким образом, человек, который быстро выпьет два глотка крепкого спиртного напитка и затем по глотку каждые 2 часа, будет оставаться в умеренном интоксикационном состоянии. Отмечается, что 50 мл алкоголя распределяется по всему организму, создавая уровень в крови порядка 1 мг/мл (или 0,1%), при этом вождение транспорта является опасным.

Время, час

Остаток этанол, мл Устраненный этанол, мл Устраненный этанол от оставшегося, мл

0

50

0

0

1

40

10

20

2

30

10

25

3

20

10

33

4

10

10

50

5

0

10

100

Табл. 3. Выведение этанола, обладающего нулевым порядком в кинетике Большинство токсичных и фармацевтических веществ выводится со скоростью, которая пропорциональна их количеству в крови. Так называемый «первый порядок» соответствует состоянию, описанному выше, в котором ферменты метаболизма находятся в избытке и образование продуктов лимитируется наличием субстрата. Отношение между концентрацией субстрата и временем (t) может быть описано математически с помощью простого дифференциального выражения dC/dt = - keC. Это выражение можно записать в виде: dC/C = - kedt, которое после интегрирования дает: C = C0exp(-Ket). Это отношение может быть представлено графически в логарифмических координатах, давая линейную зависимость между пролагорифмированной концентрацией vs и временем (logC = logC0-ket). Отмечено, что при выведении этанола может получаться прямая линия на линейном графике и выпуклая - на полулогарифмическом. В первом порядке выведения постоянная доля вещества удаляется через единицу времени, позволяя делать измерения в половинном времени (аналог радиактивному полураспаду). Период полувыведения может быть определен при исследовании подходящего полулогарифмического графика концентрации от времени. Отметим, что неверно 1/2 в нулевом или других порядках процесса выведения, кроме первогорассматривать порядка. Иногда графики логарифмированной концентрации от времени не линейны при высоких концентрациях, но со временем становятся таковыми. Последний участок дуги затем 1/2.становится поддающимся для анализа Способ введения может значительно влиять на кинетику распространения и выведения соединений. Многие лекарства вводятся в кровеносную систему внутривенными инъекциями и вливаниями. Инъекция обеспечивает дозу, которая распространяется через кровь в течение нескольких секунд, что является мгновенным для достижения наших целей. Для сравнения, оральный прием обеспечивает более медленное попадание вещества в кровеносную систему, так как сначала он должен абсорбироваться через пищеварительный тракт. Различия в кинетике проиллюстрированы на рис. 16.

Рис. 16. Концентрация лекарства в плазме после внесения различными путями одинаковой концентрации. Оральное введение может также понизить эффективность дозы, доставленной в кровеносную систему в случае, если вещество значительно инактивировано первой стадией метаболизма в печени. Вещества, введенные в мышечную ткань, часто абсорбируются в кровеносную систему с низкой скоростью, в зависимости от их растворимости, которая может оказаться быстрее, чем при оральном введении, как показано на рис. 15., или медленнее. Ингаляционное введение газообразных веществ быстрее обеспечивает их попадание в кровеносную систему и помогает избежать первой стадии метаболизма. Кожное нанесение применимо для веществ, для которых медленное и равномерное введение является преимущественным. На сегодняшний день появилось большое количество лекарств в виде кожных повязок. Для токсичных веществ наиболее уместными способами введения, конечно, являются оральный, ингаляционный и кожный. Скорость абсорбции и распределения в организме является важным фактором в достижении фармакологической эффективности лекарств в определенных тканях. Соответствующая фармацевтическая терапия может быть проиллюстрирована на рис. 17, где лекарства, о которых идет речь, принимались орально и достигали минимально эффективной концентрации (МЭК) в крови за 8-9 часов. В данном случае приема, как показано, не достигается критическая минимальная концентрация токсинов (МКТ). Для лекарств, которые принимаются в течение долгого времени, периодическое введение соответственной дозы будет достигать терапевтического уровня, но не токсичного. На рис. 17 показана зависимость концентрации в крови от времени для гипотетического лекарства, принимаемого периодическими дозами. Отмечено, что лекарство накапливается в организме до тех пор, пока удаляемая доля не становится равной вводимой дозе во временной интервале. Отмечено, что наиболее часто повторяющийся интервал изменяется меньше. Если двойная

доза вводится в двойном интервале, то изменения уровней в крови между максимальной и минимальной концентрацией будут удвоены; однако, передозировки для части интервала возможно избежать. Если очень важно поддержать постоянный уровень в крови (минимальная концентрация токсинов близка к минимально эффективной концентрации), то может быть использовано влияние лекарств путем внутривенного введения. Устранение значительного отставания времени достигается постоянством состояния, это может быть названо «дозой насыщения».

Рис. 17. Зависимость концентрации лекарства в крови от времени Ее можно сосчитать из объема распределения (Vd) для лекарства и желаемой концентрации в плазме крови (Cp), что показывает, какое количество лекарства может быть введено путем инъекции (напомним, что Vd=доза/Cp). Многочисленные фармацевтические и токсичные вещества (например, этанол) без труда распространяются по организму, который можно рассматривать как изолированную систему. С другой стороны, многие вещества накапливаются в определенных органах или тканях. Для таких веществ удобно, может быть, смоделировать организм, в котором содержатся две системы с концентрациями С1 и С2, как показано ниже. Доза --> Центральная система С1 --> Периферическая система С2 Центральная система обычно состоит из крови и органов, с которыми быстро уравновешивается вещество на том же уровне, что и в крови. Периферическая система состоит из тканей, в которых концентрируется вещество или, где уравновешивание происходит медленно. Это обычно жировые ткани для липидо-растворимых веществ, костная ткань для стронция или ткани щитовидной железы для йода. После внутривенной дозы вещества, концентрация в центральной системе падает быстрее, нежели после инъекции. Концентрация в периферической системе растет и может превышать концентрацию в центральной системе. Затем вещество выводится с одинаковой скоростью из обеих систем. Для веществ, которые накапливаются, выведение обычно лимитируется скоростью, с которой вещество перераспределяется из периферической в центральную систему. Отмечено, что фактическая кривая концентрации в крови в зависимости от времени может быть принята как 1/2, чемпроцесс первого порядка выведения (распределения) с более коротким в более поздних процессах первого порядка, которые могут доминировать в результате перераспределения.

Главной целью моделирования является помощь в прогнозировании фармакологических и токсических эффектов. Сюда также включено обеспечение большей точности и систематичности. Заложенные в основе физиологические модели более непонятны. В различных моделях системы различаются (например, система для бензола включает легкие для выделения) и потоки жидкости приспосабливаются к важным особенностям процесса для каждого вещества. Ключевой особенностью таких моделей является включение разделительных коэффициентов, которые обеспечивают приспособление для различающихся способностей задерживания веществ каждой системой. В принципе, эти модели могут позволять экстраполяцию эффектов от одной начальной дозы до другой или от одного вида к другому. Важность разделительных коэффициентов можно увидеть на рис. 18. Отмечается, что вдыхаемые газы с большими разделительными коэффициентами кровь/воздух хорошо аккумулируются в крови. Более того, вещества, имеющие высокий коэффициент, например, жировая ткань/кровь хуже аккумулируются в крови, т.к. требуется больше времени, чтобы их концентрация стала максимальной.

Рис. 18. Эффект разделительного коэффициента на концентрацию в крови у крыс. Уровень изучаемого вещества в крови в зависимости от времени часто является критерием, по которому судят об успешности модели. Уровень вещества в крови является наиболее доступным для измерения, но реальной целью часто являются другие ткани или молекулярный рецептор где-нибудь еще. Остается актуальным, что уровень вещества в крови будет пропорционален уровню в какой-нибудь данной ткани. Вдобавок, уровень в ткани затем будет пропорционален концентрации доступной клеткам-мишеням или рецепторам. Если вещество подвергается метаболизму, частично лимитирующего его стабильность, то ситуация более сложная. Но, в принципе, в этом случае можно применить ту же линию рассуждений, учитывая скорость и метаболические процессы, распространение, время жизни и разделительный коэффициент. В итоге можно было бы предсказывать концентрацию дозы основного токсина в конкретной ситуации, затем провести межвидовую экстраполяцию

2.3. Токсикология развития

Феномен рождения людей с дефектами озадачивал людей с древности. Влияние генетических факторов и факторов окружающей cреды стали рассматриваться в эмбриологии приблизительно за последние два столетия. В конце 19-го века работа с цыплятами, как главным предметом исследования дефектов глаз, сердца, нервной системы и скелета, вызывало недовольство у физиков и химиков. Поэтому работа проводилась на рыбах, амфибиях и рептилиях. Эмбрионы млекопитающих, обладающих пороками, стали рассматриваться для таких манипуляций не раньше 1930-х годов. Затем были предложены к рассмотрению существенные недостатки в питании (например, недостаток витамина А) и различные химические соединения как причины анатомических дефектов. В данное время найдено приблизительно около тысячи химических соединений, которые вызывают развитие аномалий у лабораторных животных. Первое убедительное доказательство того, что рождение людей с дефектами могло быть вызвано влиянием окружающей среды, появилось в 1940-х годах. Эпидемия инфекции вируса Рубелла в Австрии совпала с увеличением случаев дефектов глаз, сердца, ушей и с увеличением умственных отклонений среди детей, матери которых были инфицированы в течение беременности. Корреляция типа дефекта со временем инфицирования в течение беременности показала, что аномалии сердца и глаз появлялись главным образом в результате инфицирования в течение первых двух месяцев беременности, тогда как аномалии слуха и речи, а также умственные отклонения появлялись в результате инфицирования в течение третьего месяца беременности. Также незначительный относительный риск аномалий существует при инфицировании на более поздних стадиях беременности. Только в США насчитывается 20 000 детей, страдающих дефектами, которые вызваны вирусом Рубелла, что стимулирует программу иммунизации для предотвращения распространения этого потенциального бедствия. В конце 1950-х годов в Японии стало ясно, что воздействие метилированной ртути из окружающей среды может вызывать серьезные нарушения человеческого здоровья. Загрязнение залива Минамата этим веществом в промышленных стоках привело к высокой концентрации метилированной ртути в рыбах и моллюсках и высокому потреблению метилртути неподозревающими семьями, проживающими вблизи, для которых рыба была главным ингредиентом в рационе. В 1956 г. были описаны симптомы внутриутробных аномалий, таких как нарушения нервной системы (нарушение чувствительности и координации, общий паралич, после чего может наступить смерть). В тоже время, было зарегистрироны 7% случаев “идиотизма” среди новорожденных, получивших метилртуть посредством передачи через плаценту от матерей, подвергавшихся влиянию этого соединения. Полученная доза затем пополнялись новой дозой новорожденным через материнское молоко. Обследование школьников через несколько лет в старших группах, которые подвергались сильному внутриутробному воздействию, показало широкое распространение серьезного умственного отставания (18-30%). Последующие эпизоды с другими веществами показали, что некоторые химические соединения вызывали серьезное развитие проблем в случае доз, безопасных для матерей. Коварная проблема появления токсичных свойств у лекарств вышла в свет после трагедии, связанной с лекарством салидомидом, шокировавшей мир в начале 1960-х годов. Салидомид был разработан немецкой компанией и прописывался в Европе для предотвращения тошноты во время беременности. Этот препарат не продавался в США, так как FDA официально предупредила, что он обладает случайным побочным эффектом на периферическую нервную систему и поэтому нуждается в более глубоком изучении. В 1959 г. клиника в Гамбурге столкнулась с одним случаем, который был впоследствие назван салидомидный синдром (отсутствие конечностей или их сильное повреждение, часто происходящее при сопутствии дефектов сердца, глаз, ушей, почек, кишечника). В 1960 г. наблюдалось уже 30 случаев, а в 1961 г. в этой клинике зарегестрировано 154 случаев. Хотя до этого, в 1948-1958 годах не было зарегестрировано ни одного случая. Когда была обнаружена причина происходящего, лекарство было немедленно изъято, и синдром исчез, оставив 5850 жертв по всему миру. Ретроспективный анализ показал, что риск

неправильного формирования плода был высоким, в частности, потому, что критический период (6-7 недель беременности) был сильно близок ко времени использования препарата. Эта эпидемия привела к развитию тестирования вторичного токсического влияния, принятого на федеральном уровне. Было посчитано количество инцидентов неправильного развития у детей в США. Большая доля эмбрионов, порядка 31%, погибла. Среди рожденных детей 4% имели серьезные дефекты при рождении. Картина изменялась до 6-7% к концу первого года. Незначительные дефекты составляли 14%, низкий вес у младенцев был в 7% случаев, нарушения в функциях нервной системы в 16-17%. Смертность младенцев в течение первого года жизни, обусловленная неправильным развитием, была меньше 1%. Эта картина показывает, что дефекты при рождении являются серьезной проблемой в обществе. Причины дефектов при рождении вызывают интенсивный интерес. Предполагается, что приблизительно 20% таких случаев вызвано генетическими причинами, возникающими либо при наследовании от родителей, либо из-за ошибок в репликации ДНК в прериод развития. Неустойчивость в материнской среде окружающей плод, возникающая из-за неправильного питания, приводит к 4% случае, а инфицирование матерей к 3% случаев. Низкая доля (1-2%) деформаций может возникать из-за физических причин (например, ампутация пуповины). Менее чем один процент случаев дефектов вызван химическими соединениями, а оставшиеся 65% или более случаев возникают из-за неизвестных причин. Устанавливать механизм действия яда в человеческом организме достаточно сложно, фактически известно только около 50 таких веществ. Главной проблемой является то, как вычесть фоновое увеличение дефектов. Поэтому характерный пример высокого риска возникновения дефектов после лечения, как в случае с салидомидом, облегчает идентификацию. Для нового вещества можно обнаружить случайное увеличение специфичных дефектов или синдромов, которые могут быть связаны с лечением в течение ранних стадий беременности. Дальнейшее исследование развития дефектов у животных может дать ясное представление в будущем. Для предотвращения рождения детей с аномалиями, тестирование животных на развитие дефектов сейчас является частью стандартной программы исследования новых химических соединений. Однако ранние исследования соответствующих моделей на млекопитающих показали, что разные виды значительно различаются по своей чувствительности. Последние исследования изотретинона (производного витамина А) показали, что люди в 25 раз более чувствительны к его тератогенному действию, чем кролики и в 250 раз чувствительнее мышей. Обезьяны приблизительно в 10 раз менее чувствительны, чем мы. Наблюдается также различие в чувствительности в зависимости от ткани. Даже среди приведенных видов наблюдаются разительные различия в чувствительности. В случае триамциполона (производное гидрокортизона), резистентная линия мышей продемонстрировала более быстрый метаболизм вещества, чем чувствительная линия, так что эмбриону досталось намного меньше вещества, которое приводит к формированию характерного дефекта вкуса. Можно представить, таким образом, большое влияние полиморфизма ферментов на индивидуальную чувствительность. В виду больших и часто непрогнозируемых видовых различий в чувствительности, приближение результатов тестирования животных к человеку является трудной задачей. Последний обзор тестирования животных показал, что из 38 известных человеческих тератогенов, только 20% были положительны для тестируемых лабораторных животных. Из 165 соединений считающихся нетератогенами для человека, 40% дало положительный результат при тестировании в более чем одном виде лабораторных животных. Все это свидетельствует о серьезности проблемы. Было отмечено, что даже если бы программа тестирования была сделана вовремя, когда разрабатывали салидомид, этот препарат все равно могли бы разрешить использовать. Трудности при интерпретации результатов для разных видов важно учитывать при изучении механизмов действия токсикантов, хотя это нелегкая задача. Механизм действия салидомида, например, до сих пор неизвестен. Как отмечалось ранее, внутриматочная cреда может быть источником проблем. Двумя

важными примерами являются диабет и фенилкетонурия. Инсулин-зависимые диабетики могут адаптироваться к содержанию глюкозы в крови в пределах 150-250 мг/дл, но они могут не осозновать, что уровень сахара должен быть в значительной степени понижен до 95-120 мг/дл для предотвращения дефектов при рождении. В противном случае ребенок может страдать дефектами сердца и нервной системы. В идеальном случае уровень сахара в крови проверяется 4-8 раз в сутки, в том числе и ночью. Фенилкетонурия была выявлена в 1934 г., тем самым была найдена причина умственного отставания детей. Эта болезнь вызывается отсутствием фермента фенилаланин гидроксилазы. Когда фенилаланин не превращается в тирозин, создается его высокая концентрация в крови, что является токсичным для мозга новорожденного. Специальная диета с низким содержанием фенилаланина была разработана в 1953 г., в результате чего появилась возможность избежать умственного отставания, если начать вовремя ее применять. Проверка новорожденных началась в 1963г., так что младенцы с этой болезнью могут немедленно начать получать специальный рацион. Этот подход был настолько успешен, что сейчас люди, страдающие фенилкетонурией, имеют семьи. К несчастью, женщины с этим синдромом, которые не контролировали свою диету, рождают детей с врожденным умственным отставанием и аномалиями сердца. Фенилаланин передается от матери к ребенку через плаценту, так что плод может подвергаться воздействию. Симптомы могут быть значительно уменьшены тщательным контролем за диетой матери, но и это не гарантирует избежание эффекта. Экспериментальные исследования пороков развития на животных и эпидемиологические исследования на человеческой популяции показали, что определенное время воздействия в период беременности, особенно начало средней стадии, было критическим для формирования дефектов. Эти наблюдения могут быть рационализированы путем рассматривания стадий эмбрионального развития. На восьмой клеточной стадии, если произошло изолирование от других клеток, каждая клетка проявляет способность образовать эмбрион. Последующие деления дают увеличение бластоцисты, содержащей жидкость, заполняющей впадины тысячами клеток, большинство из которых предназначены для формированя поддерживающих тканей и только небольшая доля будет формировать плод. За малым исключением, обработка токсичным веществом на ранних стадиях обычно наносит вред жизнеспособности эмбриона или понижает темп роста, но не дает анатомических дефектов. В течение следующей фазы развития, внутренняя клеточная масса проходит гаструляцию, что предполагает формирование трех эмбриональных слоев (эктодермы, эндодермы, мезодермы), из которых развиваются различные ткани. Избирательная часть клеток имеет высокий темп размножения и формирует структуры, которые обнаруживаются в системах главных органов. Некоторые группы клеток мигрируют по эмбриону и участвуют в формировании различных структур. Зачатки органов формируются в течение первых 3-х – 8-ми недель. Клетки могут проявлять очень различающуюся чувствительность к токсичным веществам. Если определенные клетки селективно утрачены или даже если не происходит их миграции, то возникает большая вероятность развития порока, часто даже более чем в одной ткани. К восьмой недели беременности система органов в основном оказывается сформированной. После этого, главным образом, происходит быстрое увеличение числа клеток и полное развитие тонкой структуры ткани. Таким образом, воздействие токсичными химическими соединениями на определенные типы клеток в течение этого времени, как правило, вызывает морфологические аномалии и функциональные дефициты. Важнейшим примером могут быть изменения взаимодействия нервных окончаний. Когда нервные окончания запускают процесс, они связываются с нервными и многими другими клетками. Некоторые из этих взаимосвязей усиливались в течение последующего развития, в то время как другие взаимодействия были утеряны за ненадобностью. Этот процесс может быть изменен химическими соединениями, в результате чего могут даже возникать дефекты поведения. Эти дефекты могут не проявляться до определенного времени после рождения. Функциональные изменения иммунной системы, сердца, легких и печени также могут не проявляться сразу после рождения. Задержка роста и смертность являются главными явлениями в течение первых двух недель, до тех пор, пока клетки подвергаются специализации и происходит формирование зачатков эмбриональных органов. Последующее

время, когда разнообразные системы органов являются восприимчивыми, проявляются значительные и незначительные дефекты. Воздействие в более позднее время ведет к функциональным изменениям. Отмечено, что нервная система имеет более долгий чувствительный период. Подобные зависимости могут существовать и для других видов, но время беременности (18 дней у мышей и 21 день у крыс, например) и чувствительные периоды могут быть разными. Эта информация может быть важной для открытия тестов и интерпретирования результатов. Плацента имеет решающие функции во время беременности, являясь проводником питания для внутриутробного плода. После разделения кровеносных систем матери и плода питательные вещества должны поступать через стенки кровяных сосудов матери, вступая во взаимодействия с тканями и стенками кровяных сосудов эмбриона. Это может являться барьером для перемещения токсичных веществ, однако, этот барьер не очень селективный. Например, гидрофобные соединения (например, метилированная ртуть) быстро проходят через него. Плацента проявляет способность метаболизировать токсические соединения. Курение матери стимулирует активность бензпирен-гидроксилазы, которая может активировать, либо инактивировать токсичные вещества, в то время как никотин в крови матери легко передается через плаценту и стимулирует скорость сердечного ритма у эмбриона. Сама плацента может наносить ущерб плоду. Так, у крыс кадмий является токсичным на средних и поздних стадиях беременности, несмотря на низкий эффект воздействия. Это связано с тем, что кадмий понижает поток крови между плацентой и транспортом питательных веществ через нее. Список известных токсикантов, действующих на развитие плода, продолжает расти. Случай с диэтилстильбензолом (DES) известен из прошлого. Этот синтетический эстроген был впервые синтезирован в 1938 г и в течение 10 лет прописывался беременным женщинам для предотвраащения выкидышей. В период с 1948 по 1971 г был проведен контроль 4 млн. женщин, что составило 7% от общего числа беременных. Общий режим дневной дозы составлял 5 мг в начале шестой недели беременности и увеличивался до 150 мг на 36-й недели. В 1971 г в Бостонской клинике восьми женщинам в возрасте от 15 до 22 лет была удалена аденомокарцинома влагалища. В литературе еще не было описано так много случаев. Причины были найдены в применении DES. После этого FDA запретило использовать DES в период беременности. К 1995 г было зарегистрировано 367 аналогичных случаев, которые продолжали появляться каждый год. Этот вид рака возникает редко, приблизительно один случай на тысячу женщин, подвергшихся воздействию DES, как инициатора опухоли. Дефецит питательных веществ или избыток витамина А известны с 1950-х гг., что внесло вклад в развитие токсикологии. В моделях на животных (мышах, хомяках) использование ретиноидной кислоты (активной формы витамина А) может вызывать неправильное образование лица, конечностей, сердца, нервной системы и скелета. Ретиноидная кислота изменяет экспрессию гена через специфичный рецепторный белок, который так же действует на Аh рецептор и экспрессируется во многих тканях. Этот механизм может иметь сильные эффекты, которые можно наблюдать при развитии цыпленка. В 1982 г фармацевтический препарат 13-цис-ретиноидной кислоты стал примененяться для удаления угревой сыпи у подростков. Несмотря на предупреждения врачей и на надписи на упаковке, весь следующий год сообщали об отклонениях в развитии младенцев у женщин, которые использовали это вещество. Изучение 115-ти беременных, которые принимали 13цис-ретиноидную кислоту, показало, что у 18% женщин наблюдался самопроизвольный аборт, а у 26% родились дети с пороками развития. Другое исследование показало, что половина детей имели IQ меньше чем 85. Для уменьшения инцидентов токсичного отравления в будущем, были сделаны рекомендации по лимитированию его распространения среди женщин, имеющих сыпь, которые не имеют других альтернативных терапевтических средств. Наркотики являются наиболее известными химическими токсикантами. Потребление алкоголя во время беременности вызывает эмбриональный алкогольный синдром, характеризующийся замедленным ростом до и после рождения и характерным нарушением функций центральной нервной системы. Этот синдром, выявленный в начале 1970-х гг., отслеживался с 1979 г. Сейчас в США встречаемость этого синдрома составляет 2.2 случая

на 10000 новорожденных, т.е. произошло увеличение в 4 раза со времени обнаружения. Синдром с высокой частотой встречается у детей, матери которых страдают алкоголизмом (2.5%). Порог потребления алкоголя для избежания синдрома не известен, но подсчитано, что потребление 1 гр. алкоголя в день вызывает уменьшение веса у новорожденных на 160 гр. Были предложены многочисленные механизмы для действия алкоголя как токсиканта. Вероятно, продукт метаболизма - высоко токсичный ацетальдегид, является решающим фактором. Однако, этанол сам изменяет функции одного из важнейшего нервнотрансмиссионного рецептора, тем самым нарушая нервную активность и, вероятно, сигналы нервной системы в период беременности. Употребление кокаина вызывает преждевременные роды, низкий вес у новорожденных, проблемы поведения и синдром неожиданной смерти у младенцев. Это вещество сужает кровеносные сосуды в плаценте, создавая тем самым дефицит питательных веществ у плода. Оно также влияет на нервные функции блокированием натриевых каналов, используемых в проводимости импульсов. Эффекты этого вмешательства становятся явными после рождения. Хотя кокаин вызывает серьезные проблемы со здоровьем, полагают, что влияние никотина до рождения при использовании табака ведет к более серьезным проблемам. Употребление табака в 25% случаев беременности ведет к низкому весу новорожденных, синдрому смертности младенцев и к устойчивым нарушениям при учебе и в поведении. В моделях на животных испытывалось влияние курения. Было отмечено замедление роста клеток и изменение синаптической активности. В дополнение к попыткам уменьшить использование табака, эти открытия также вызывают серььезные беспокойства о никотиновой замене для прекращения курения во время беременности.

2.4. Методы тестирования биологических эффектов токсинов Эпидемиологи делают выводы о причинах болезней из популяционных исследований. Для токсикологов интересны индивидуальные исследования для выяснения механизма действия конкретного агента. Напротив, молекулярные эпидемиологи проводят мониторинг окружающей среды или используют биомаркеры. Примером этого могут быть анализ загрязнения воды, выявление пестицидов в пище и молоке, токсины водорослей в рыбе, определение уровня ДНКаддуктов в тканях-мишенях. Потребность в таких измерениях высока и требует больших возможностей. Традиционные аналитические методы являются дорогими и требуют специального обучения. В ситуации, когда известен предполагаемый загрязнитель, традиционными методы являются вполне подходящими. С другой стороны, для образцов, в которых идентифицируется одно соединение или класс соединений, предпочтительными являются иммунохимические методы. Они быстры, недороги, многие образцы можно исследовать параллельно, и эти методы работают при минимальной подготовке. Пример этому может быть тестирование беременности. Традиционный анализ ТХДД стоит 50$ по сравнению с 10$ иммунохимического метода. Антитела. Критическими реагентами для иммунохимических методов являются антитела. Среди 5-ти классов антител IgM обычно синтезируется первым в ответ на антиген, затем он заменяется на IgG. Функции IgA схожи с IgG, но последний присутствует в секреторных жидкостях, IgE опосредует гиперчувствительность реакций, таких как сенная лихорадка и анафилактический шок. Функция IgD пока недостаточно изучена. В иммунохимическом анализе используются антитела, которые продуцируются в больших количествах и присутствуют в плазме в значительных концентрациях (75% от общего содержания антител). Эти антитела состоят из 4-х полипептидных цепей, две из которых имеют м.м. 50 кД, а две других - 25 кД (вместе 150 кД). Они соединяются друг с другом через бисульфидную связь. Это очень стабильные молекулы, что важно для их функций и использования в иммунологических методах. Очень часто они представлены в виде Y-формы,

когда сайт распознавания антигена расположен на конце двух из 3-х рукавов. Таким образом, IgG дивалентны, что позволяет им нековалентно и перекрестно связывать антигены и образовывать иммунопреципитаты. Аминокислотная последовательность вблизи антиген распознающего сайта называется вариабельной областью, так как она различается для каждого специфического антитела, тогда как оставшаяся часть последовательности является константной. Последняя весьма важна в регуляторной функции иммунного ответа. IgG секретируются В-лимфоцитами в ответ на стимуляцию антигеном. Для образования антитела на малую молекулу ее необходимо в качестве гаптена пришить с помощью химического линкера на большую белковую молекулу-носитель. Когда такой поливалентный антиген вводится животным (обычно кроликам), стимулируется образование большого количества Влимфоцитов с выходом антител. Каждый лимфоцит имеет на своей поверхности рецептор для данного эпитопа (сайт распознавания антигена). По оценкам, можно получить до миллиона эпитопов, так как В-лимфоциты проявляют широкий спектр рецепторов различной специфичности. Когда данный лимфоцит стимулируется связыванием антигенного сайта (эпитопа) со своим рецептором, это событие сопровождается секрецией большого количества антител, которые распознают эпитоп. Обычно кроликам проводится инициирующая инъекция антигена и одна или более разрешающих (усиливающих) инъекций. Через месяц после инициирующей инъекции антигена стимулируется Т память В-лимфоцитов, которые появились изначально. Иммунный ответ поддерживается несколько месяцев. Следует подчеркнуть, что для индукции иммунного ответа требуется небольшое количество антигена. Также для образования антител на малую молекулу (3000

>300

перорально

5051

Диоксин является мощным индуктором цитохрома Р450 1А1 и токсичен для репродуктивной системы. Репродуктивные эффекты ТХДД имеют особое значение. Около 20 лет назад было показано, что незначительная доза ТХДД с пищей приводит к бесплодию у резус-макак. У самок резус-макак, получавших ТХДД, развивался эндометриоз, причем эндометриальные клетки обнаруживались и вне матки, в брюшной полости. ТХДД предотвращает эстроген-зависимый рост клеток карциномы молочной железы в культуре. В отсутствие твердых доказательств и информации о механизме действия приходится допускать значительный разброс в оценке риска. Используя правдоподобную оценку эффективности ТХДД как канцерогена у грызунов и производя линейную экстраполяцию для подсчета риска возникновения рака у человека, можно получить величину дневной дозы ≈ 10пкг. Напротив, если существует пороговая величина для действия ТХДД (характерная для промоторов рака), то уровень допустимой дневной дозы может составлять ≈ 500пкг. В настоящее время известно, что ТХДД связывается со специфическим рецепторным белком (Ah рецептор) в цитоплазме клетки, который затем мигрирует в клеточное ядро и стимулирует транскрипцию определенных генов (возможно репрессируя транскрипцию других). Показано, что этот внутриклеточный рецептор взаимодействует с гормонами (эстроген, прогестерон, тестостерон, гидрокортизон и другие), витаминами (A, D) и другими малыми молекулами (некоторые липиды), причем каждое соединение взаимодействует специфичным образом. Принимая это во внимание, можно предположить, что ТХДД стимулирует синтез таких соединений или белков, которые меняют поведение клетки, что в итоге ведет к появлению ответа на токсичность. Идентификация таких белков, которые могут сильно варьировать в зависимости от ткани, может быть большим шагом вперед. ТХДД может оказывать негативные эффекты на здоровье не прямо, а через метаболическую чувствительность. Этот сценарий действия отличается от транскрипционного. Во многих тканях ТХДД стимулирует синтез CYP1A1, 1A2, 1B1 и, возможно, других изоферментов цитохромов Р450. Они, в свою очередь, метаболизируют имеющиеся субстраты, приводя к появлению токсичных интермедиатов, которые повреждают ДНК и меняют поведение клетки. Исходя из этого, можно объяснить чувствительность самок, но не самцов крыс к развитию рака печени. У самок цитохромы Р450 1А1 и 1В1 метаболизируют эстроген с образованием катехолов, которые далее могут окисляться до хинонов и образовывать супероксид. Хиноны могут формировать аддукты с ДНК, а супероксид (как и другие реакционноспособные радикалы кислорода) могут окислять основания ДНК. Известно, что сам хинон чувствителен к окислению, и, действительно, введение ТХДД приводит к повышению уровня окисленного хинона в печени самок, но не самцов крыс. Также было отмечено, что предварительная обработка ТХДД культур клеток делает их чувствительными к токсичным эффектам проканцерогенов, активируемых цитохромами Р450, но которые сами по себе являются слабыми индукторами. Для объяснения некоторых эффектов ТХДД был предложен альтернативный сценарий, включающий Ah-рецептор, но не транскрипция генов напрямую. Так, лиганд-рецепторный комплекс с некоторыми гормонами может влиять на генную экспрессию, стимулированную другими факторами транскрипции. Этот эффект имеет место на уровне белковых факторов, связывающихся друг с другом. Такой подход представляется правдоподобным, поскольку внутриклеточные рецепторы часто существуют в виде гетеродимеров (например, тиреоидный гормон обычно связывается с рецептором, состоящим из 2-х субъединиц, одна из которых непосредственно связывает гормон, а вторая –

ретиноевую кислоту). Сообщалось, что в культурах клеток ТХДД препятствовал нормальному связыванию не только гидрокортизона, но и ретиноевой кислоты. Некоторые исследователи полагают, что ТХДД дополнительно может запускать определенные метаболические пути с участием киназ, влияющих на многие свойства клетки. И хотя некоторые детали механизма, благодаря которому комплекс ТХДД-Ah-рецептор оказывает токсичное действие, еще предстоит уточнить, знания о том, что эффекты ТХДД опосредуются рецептором, позволяют уточнить дозо-зависимые отношения. Степень ответа регулируется степенью занятости Ahрецептора лигандом (т.е. ТХДД). Согласно определению, рецептор занят на 50%, когда концентрация лиганда равна константе диссоциации (Kd) рецептора. Исследования на стероидных гормонах, действие которых опосредовано рецептором, показали, что изменения концентрации гормона более чем в 10 раз превышающие Kd, оказывают слабый биологический эффект вследствие насыщения рецептора. Аналогично, когда концентрация гормона составляет одну десятую или менее от величины Kd, количество занятых молекул рецептора недостаточно для оказания заметного биологического эффекта. Центром области концентраций, при которых наблюдаются ожидаемые эффекты, является величина Kd, а границы области составляют величины от 10 раз больше до 10 раз меньше Kd. Для Ahрецептора человека величина Kd составляет 0.1-1нМ. Следовательно, доза ТХДД, составляющая менее 1пкМ, которая дает эффективное связывание с рецептором, не окажет вреда. Такую дозу можно определить, эмпирически, исследуя отношение между вводимой дозой и индукцией Р450 1А1 на животных. Проводя такого рода анализ, необходимо помнить о сделанных допущениях. Во-первых, предположение, что лиганд в количестве ниже, чем 10% от Kd биологически неактивен, иногда сомнительно. В некоторых системах (ацетилхолиновый рецептор в нейро-мышечном синапсе) по-видимому, существуют «резервные» рецепторы. Это предположение исходит из наблюдений, что кривая зависимости ответа от дозы сдвигается к более низким, чем ожидалось концентрациям. Максимальный ответ получался с единственной занятой фракцией рецептора, и более низкая концентрация имеет пропорционально больший эффект, чем ожидалось. Эту проблему следует принимать во внимание при оценке риска. Во-вторых, можно допустить, что не все эффекты ТХДД требуют участия рецептора, хотя наиболее значимые действительно являются опосредованными. Делается заключение, что ТХДД является столь эффективным ввиду того, что он обладает высокой аффинностью по отношению к Ah-рецептору и долго не выводится из клетки. Другой продукт сгорания - хлорированный дибензофуран обладает такими же свойствами. Существует множество других лигандов для Ah-рецептора, среди которых полициклические углеводороды и планарные полихлорированные бифенилы. Однако, существуют и менее известные соединения, которые связываются с рецептором и активируют транскрипцию цитохрома Р450 1А1, включая индол-3-карбинол, который встречается в некоторых употребляемых в пищу растениях. Существует множество тестов для оценки специфичности связывания с Ahрецептором. По аналогии со стероидными гормонами оказалось, что действие многих токсичных соединений (к их числу относятся и лекарства в случае неправильного употребления) направлено на определенные рецепторы. Некоторые исследователи высказывают предположения о существовании эндогенных лигандов к Ah-рецептору. Полагают, что этот рецептор необходим для функционирования клеток в норме, поскольку нокаутные по этому рецептору мыши имели дефекты печени и возможно других тканей. Поиск эндогенных лигандов и их идентификация помогут пролить свет на механизм действия ТХДД.

3.9. Курение Врачи указывают на табак как наиболее важную причину смертности в США. Рак легких убивает порядка 100000 американцев в год. Из этой цифры 90% случаев обусловлено

курением. Но наиболее распространенная причина смерти (200 тыс. случаев в год), связана с сердечно-сосудистыми заболеваниями, которые вызваны курением. Пагубные эффекты табака на здоровье человека известны в медицинской литературе с давних пор. В 1845 году французский врач сделал заявление, что из 68 его пациентов, страдающих раком ротовой полости, 67 курят табак. В 1927 году английский врач отметил, что почти все его пациенты с раком легких были курящими. В 1936 году 90% случаев рака легких было вызвано курением. Исследования в 1930, 1950 и 1952 годах обеспечили прочную основу для вывода, что курение вызывает рак, но так как данные были ретроспективные, они были отклонены. В последующих исследованиях, выполняемых британскими и американскими врачами в 1956 и 1958 годах, соответственно, наблюдения велись в течение нескольких лет. Полученные результаты не отличались существенным образом от имеющихся ранее. В 1961 году американское общество по изучению рака, американская общественная ассоциация здоровья, а также другие здравоохранительные организации потребовали, чтобы новоизбранный президент Кеннеди предпринял шаги для защиты американского общества против угрозы, исходящей от табака. Как результат, в 1962 году появились голубые ленточные щиты с обзорами медицинской литературы и рекомендациями. Увеличение употребления табака в США началось после Второй мировой войны, частично из-за изобретения механизма. увеличивающего объем производства сигарет, и частично изза пагубной привычки вернувшихся солдат, которые получали сигареты в пайках во время войны. Резкое увеличение случаев рака легких произошло с запозданием на 15-20 лет. Это позволило медикам предположить причинную взаимосвязь, но этого было недостаточно для убедительности. Например, вместе с увеличением курения, увеличилось пользование телефонами, но мы не считаем, что это приводит к увеличению случаев рака легких. Исследования показали, что люди, которые курят сигареты регулярно, имеют большой риск умереть от рака легких, чем некурящие люди. Исключая эффект загрязнения воздуха в городах, ученые анализировали риск смерти, вызываемой раком легких от плотности курящего населения. В результате была получена высокая положительная корреляция между жителями города и случаями рака легких. Более того, риск возникновения рака легких увеличивался почти линейно с количеством выкуриваемых сигарет в день и медленно уменьшался после прекращения курения, достигая фонового уровня через десять лет. Риск смерти от коронарных заболеваний, как было показано, тоже увеличивается в несколько раз с увеличением потребления табака. Частота смертельных случаев из-за рака легких у мужчин в США увеличилась почти в 20 раз с 1930 по 1965 год, у женщин только в 3 раза. Исследования в 1965 году показали, что максимальный возраст для рака легкого у курящих мужчин составляет 65-75 лет. Частота заболевания у женщин ниже по сравнению с мужчинами. Это заинтересовало нескольких исследователей. Либо женщины более стойкие к воздействию табака, либо теория о том, что табак вызывает заболевания, не верна. Впоследствие поняли, что женщины начинают курить намного позже, чем мужчины. Исследования показали, что эффект у женщин запаздывает на 20 лет по сравнению с мужчинами. Количество заболеваний раком легких у женщин значительно возросло в 1970-1980-е годы. Как результат, к 1990-му году в США смертность среди женщин от рака легких превысила смертность от рака молочной железы. Курение оказывает чрезвычайно губительное воздействие на здоровье человека. Материал для изготовления табачных изделий имеет высокое содержание полициклических ароматических соединений, которые являются мутагенами и канцерогенами. Ариламины также широко распространены и, возможно, увеличивают риск возникновения раковых клеток у курильщиков. Летучие составляющие табачного дыма включают в себя не только нитрозамины, но также и другие токсичные вещества (цианид, формальдегид, акролин, ацетальдегид). Отличительной особенностью табачного дыма является высокое содержание специфических нитрозаминов: никотина и родственных ему алкалоидов:

Норникотин

Никотин

Анатабин После того как эпителий дыхательных путей подвергается воздействию канцерогенов, различные типы клеток способны сформировать опухоли. Аденокарцинома формируется из нескольких типов клеток, включая слизистые, бронхиальные и реснитчатые клетки. Хроническое раздражение курением разрушает эпителиальные клетки трахей и верхних бронхов. Из разнообразия типов раковых клеток, которые образуются в легких, только один найден у курильщиков. Этот вид раковых клеток возникает из маленьких гранул – эндокринных клеток. Все карциномы обычно диагностируются на поздних стадиях, когда они не оперируются и являются фатальными. Ввиду того, что курение в общественных местах запрещается, табачная индустрия придает собое значение продажам бездымного табака, жевательного и нюхательного. Таким образом, потребитель избегает табачного дыма, но, к сожалению, не нитрозаминов алкалоидного происхождения. Исследования показали, что потребители нюхательного табака имеют в 30 раз больший риск образования раковых клеток в ротовой полости, чем люди, не употребляющие табак. Эти исследования обеспечили доказательства того, что нитрозамины, содержащиеся в табаке, являются канцерогенами для человека. Курение вызывает хронические заболевания легких по нескольким путям. При возникновении хронического бронхита, частицы табачного дыма стимулируют секрецию слизи, которая засоряет бронхиальные каналы и ослабляет очистку вдыхаемых газов от токсикантов. Это приводит к спазмам, что вызывает кашель. При возникновении эмфиземы частицы табачного дыма активируют макрофаги, которые начинают секретировать протеазы. Более того, оксиданты в дыме превращают метионин в α1-антитрипсине в сульфоксид, инактивируя, таким образом, этот белок. Результатом является дезорганизация основного слоя, потеря перегородки и уменьшение альвеолярного пространства. Курильщики, которые испытывают недостаток в α1-антитрипсине, заболевают эмфиземой в более раннем возрасте (20-30 лет), чем обычно (50-60 лет). Коварство курения заключается в развитии привычки, виновником которой является

никотин. Никотин долгое время был известен в качестве агониста для подкласса адренергического рецептора, но механизм, посредством которого образуется зависимость, еще не ясен. Сегодня уровень никотина в сигаретах жестко лимитируется, так как высокое содержание никотина вызывает тошноту, в то время как небольшое количество может не вызывать зависимость и не способно удовлетворить тягу, когда зависимость уже присутствует. Исследования показывают, что качество табака снижается из-за смол, содержащихся в нем. Также было показано, что для заядлых курильщиков необходима большая доза никотина. Из-за меньшей переносимости женщин существуют специальные легкие марки (например “Virginia Slims”) с пропорционально низким уровнем никотина. Никотиновая зависимость становится такой же сильной, как наркотическая и алкогольная, но в отличие от их вредного воздействия на поведение, данная зависимость не является таковой. При уменьшении влияния никотиновой зависимости увеличивается вес тела, что является фактором, усиливающим привычку. Хорошо известно неблагоприятное влияние курения на репродуктивную способность. При курении табака поглощается большое количество монооксида углерода, который имеет более высокое сродство с гемоглобином, чем кислород. Для некурящих содержание комплекса гемоглобина с монооксидом углерода в норме составляет менее 1% от всего количества гемоглобина. Уровень 5-10% оказывает неблагоприятное воздействие на центральную нервную систему, а также на сердечно-сосудистую систему. Этот уровень легко достижим у курильщиков и может расти до 15% и более. К сожалению, гемоглобин у эмбриона имеет большее сродство с СО, чем гемоглобин взрослого человека. В результате этого возможно возникновение недостатка кислорода, благодаря чему появляются препятствия для нормального развития плода. Дети курящих родителей страдают от увеличения риска респираторных заболеваний и других болезней легких из-за поражающего воздействия курения. Некурящие люди, хронически поглощающие табачный дым, страдают от различных респираторных и аллергических заболеваний. Таким образом, неудивительно, что дети, более восприимчивые к влиянию токсичных веществ, чем взрослые, становятся жертвами своих курящих родителей. Тем не менее, влияние никотина на центральную нервную систему развивающегося плода не было объяснено как результат курения матери в течение беременности. Однако этот факт можно не учитывать, так как никотин-ацетилхолиновые рецепторы были замечены в нейронах в определенных частях мозга. Дети курящих отцов имеют большую вероятность дефектов при рождении, возможно, из-за последствий окислительного разрушения ДНК в сперме. Более того, рак у детей более распространен среди детей курящих родителей. Вероятность возникновения лейкемии, лимфомы и опухолей мозга у таких детей выше в 3-4 раза. Поразительным является совместное действие курения и некоторых других агентов, вызывающих рак. Например, рак пищевода случается у некурящих людей, которые употребляют алкоголь. Курильщики имеют повышенный риск, как и люди, употребляющие большое количество алкоголя. Но у алкоголиков, которые к тому же много курят, риск этого заболевания увеличивается в 100 раз выше. У курильщиков также в значительной степени увеличен риск рака легких при воздействии на них асбестовой пыли. У женщин детородного возраста удвоен риск возникновения болезней сердца, если они принимают оральные контрацептивы. Курение увеличивает этот риск в 10 раз. Мы приводим только малую долю примеров неблагоприятного воздействия от употребления табака. С каждым днем открывается все больше и больше неблагоприятных эффектов. Но так как эти эффекты являются распространенными, они могут быть вызваны другими причинами, не связанными с курением, что усложняет исследования. Однако болезни, вызванные курением, являются столь распространенными, что имеют тенденцию перекрывать другие проблемы. Одной из причин отсутствия многозначительного ответа на эпидемиологию заболеваний, вызванных курением, является то, что табак содержит все наиболее опасные токсиканты.

Глава 4. Повреждение ДНК и репарация

Разнообразные повреждения ДНК могут возникать спонтанно либо под действием внешних факторов. Клетки нуждаются в высокоэффективных способах репарации, поскольку целостность ДНК существенна для выживания клетки и ее нормального функционирования, а повреждения возникают постоянно. ДНК, содержащая приблизительно 3х109 пар оснований (у человека) и 2х1011 ковалентных связей, представляет собой огромную мишень для различного рода повреждающих факторов. Исходя из известной энергии связей, можно подсчитать, что ДНК типичной клетки каждый день претерпевает спонтанно около 10 000 депуринизаций (потеря А или G оснований), 500 депиримидинизаций (потеря С или Т оснований) и 160 дезаминирований цитидина (превращение С в Т). Основным типом экзогенных повреждений ДНК является димеризация пиримидиновых оснований. Это происходит под влиянием ультрафиолетового света в эпидермисе и приводит к образованию тимидиновых димеров (связанных циклобутановым кольцом) или тимидинцитидиновых димеров. Такие повреждения репарируются к исходным основаниям путем фотореактивации с помощью фермента фотолиазы, использующего в качестве кофактора реакции видимый свет. Кроме того, такие повреждения могут устраняться тем же способом, что и объемные аддукты (описывается далее). Ряд экзогенных факторов приводит к образованию ДНК-аддуктов, которые подразделяются на малые и объемные. Малые повреждения включают метилирование и этилирование, вызываемые, например, нитрозоаминами (DEN) и нитрозоамидами (MNNG), как обсуждалось ранее. Обычно сайт для такой модификации – это О6-позиция гуанина и О4-позиция тимина. Эти атомы кислорода обычно находятся в кетоконфигурации для правильного спаривания оснований. Однако этилирование фиксирует эти атомы в енольной конфигурации, таким образом, дестабилизируя обычное углеродное связывание между основаниями в противоположных цепях, что часто приводит к возникновению точечной мутации. Эти аддукты могут быть удалены белком, первоначально идентифицированном как метилтрансфераза. В каталитическом центре фермента имеется остаток цистеина, на который переносится алкильная группа (метильная более часто, чем этильная) с О6- и О4- Т. Впервые этот фермент был обнаружен у бактерий, где он участвовал в метилировании ДНК. Обработка бактерий малыми дозами MNNG может защищать их при последующих введениях больших доз, которые иначе могут оказаться летальными. Такой метод репарации является «дорогим», поскольку фермент необратимо инактивируется переносом алкильной группы. Таким образом, клетке необходимо затратить много энергии на создание нового белка при удалении каждого аддукта таким способом. Алкилирующие соединения также могут формировать аддукты с фосфатным остовом (рис. 29). Поскольку образовавшиеся фосфотриэфиры являются нестабильными, может произойти гидролиз одной из трех фосфо-кислородных связей. Если разрывается связь с дезоксирибозой, то это приводит к разрыву последовательности. Если разрывы в каждой из цепей расположены рядом, то это может привести к разрыву хромосомы. Пути снижения дестабилизирующего эффекта алкилирующих соединений на хромосомы включают транспозицию, обмен сестринскими хроматидами, разрушение или измельчение хромосом.

Рис. 29. Механизм действия алкилирующих соединений Полициклические ароматические углеводороды, гетероциклические амины, афлатоксины и ряд других соединений могут формировать объемные аддукты, которые не удаляются простой реакцией переноса. N2- и N7-позиции гуанина являются особенно чувствительными к атаке электрофильного углевода таких соединений, а ионы нитрониума из аминов обычно атакуют С8-позицию гуанина. В обоих случаях формирование C-N-связи предпочтительно. Независимо от позиции, такой аддукт сильно нарушает комплементарное спаривание оснований между цепями и, следовательно, нарушает спиральную структуру ДНК, причем эти искажения узнаются аппаратом репарации. Удаление объемных аддуктов путем вырезания начинается с внесения эндонуклеазного разрыва в той же самой цепи рядом с аддуктом. Затем с помощью экзонуклеазной активности, удаляется 15-20 оснований, включая поврежденное, после чего пробел застраивается ДНК-полимеразой и лигируется для удаления разрыва. С другой стороны, поврежденное основание может удаляться репарирующей гликозилазой. Как и в случае спонтанной депуринизации, утерянное основание узнается как структурное нарушение

и репарируется путем вырезания. Существует несколько типов аддуктов, которые не удаляются так легко. Во-первых, кислородные радикалы могут приводить к связыванию клеточных белков с ДНК. Например, ионизирующее излучение (включая космические лучи) производят гидроксил-радикалы, которые ковалентно связывают белки друг с другом и с ДНК. Полагают, что ряд металлов, таких как никель и хром, могут восстанавливаться внутри клетки. В ходе этих процессов могут вырабатываться высоко реакционноспособные разновидности кислорода, которые повреждают мембраны, белки и ДНК. Модифицированные основания ДНК могут быть использованы в качестве маркеров окислительных процессов в клетке или окислительного стресса. Второй тип трудно репарируемых ДНК-аддуктов – это образование поперечных сшивок между цепями ДНК, так называемые «кросслинки». Бифункциональные агенты, которые вызывают такие нарушения, используются в химиотерапии рака, например, циклофосфамиды. Опасность этого типа повреждений состоит не только в разрушении нормальных водородных связей, но и в том, что затрудняется отделение двух цепей ДНК в ходе репликации. Другой класс соединений, вызывающих поперечные сшивки, представляет псорален и его производные, которые используются для экспериментального лечения псориаза. В целом, под действием таких соединений возможны как внутрицепочечные, так и межцепочечные поперечные сшивки. Кроме точечных мутаций, могут иметь место хромосомные сшивки, разрывы и сдвиг рамки считывания. Различные химические соединения, типа бромистого этидия (который используется для визуализации ДНК в ходе гель-электрофореза) и акридина, встраиваются между основаниями и искажают двойную цепь. Во время репликации происходят ошибки в работе полимеразного комплекса, приводящие к вставке или делеции оснований. Если такая ошибка произошла в кодирующей области для какого-либо белка, происходит мутация со сдвигом рамки, т. е. изменяется рамка трансляции и считывание всех аминокислот, кодируемых после сайта мутации. В целом, последствия таких мутаций более серьезны, чем последствия точечных мутаций. Замена единственной аминокислоты может быть критична, но чаще всего нет. Кроме того, приблизительно 1/3 точечных мутаций (обычно в третьей позиции кодона) не приводит к аминокислотной замене. Однако сдвиг рамки может привести к замене большого числа аминокислот, часто приводящей к денатурации или преждевременной терминации белковой цепи. Вышеописанные повреждения ДНК имеют разнообразные вредные последствия. Клетки, находящиеся в состоянии покоя, имеют больше шансов на репарацию повреждений и, следовательно, могут избегать серьезных трудностей. Если геном не может быть репарирован, клетки могут быть уничтожены, когда войдут в стадию репликации. Инактивация генов, кодирующих определенные «критические» белки, может предотвратить репликацию, совместно или нет со смертью клетки, снизить скорость клеточного роста, изменить выживаемость. Однако, в редких случаях рост клетки, напротив, стимулируется. За последние 50 лет стало известно, что повреждения ДНК ассоциированы с неоплазией. Известно, что хромосомные транслокации и даже отдельные точечные мутации способны привести к активации онкогена, а инактивация генов раковых супрессоров дает возможности неконтролируемого клеточного роста. Поэтому для анализа потенциальных канцерогенов разрабатываются специальные тесты, с помощью которых оцениваются повреждения ДНК. Прямой тест на хромосомные повреждения состоит в том, что клетки культуры в логфазе обрабатываются химическим соединением, а затем исследуются изменения в сестринских хроматидах. Существуют типы клеток, особенно чувствительных к хромосомным разрывам, появившимся в результате обработки. Второй тип теста состоит в измерении уровня «внеплановой» ДНК-репарации. В этом случае обработанные клетки находятся в состоянии покоя (нет репликации ДНК). Таким образом, включение [3Н]- тимидина в ДНК, возникающее в ходе репарации с вырезанием, является пропорциональным формированию ДНКаддуктов. Большинство широко используемых методов анализа повреждений ДНК основано на измерении мутагенеза у бактерий. Первый и наиболее широко известный пример такого теста - тест Эймса, названный по имени разработчика (Dr. Bruce Ames, Berkeley, USA). Тест состоит в том, что некоторые штаммы бактерии Salmonella, ауксотрофные по гистидину, выращиваются на агаровой среде, содержащей гистидин. Бактерии растут в виде

редких разбросанных колоний. Спонтанно колонии ревертантных бактерий, способных синтезировать собственный гистидин и, следовательно, расти на среде только с глюкозой, возникают редко, однако количество таких мутантов можно повысить, обработав клетки мутагенными химическими соединениями. При низких дозах, количество ревертантов, способных формировать видимые колонии, пропорционально количеству внесенного химического соединения и его эффективности. Высокие дозы мутагена приводят к возникновению столь обширных повреждений ДНК, что снижается жизнеспособность всех клеток, включая мутантные. Кривая дозового ответа является бифазной, вначале возрастающая, затем снижающаяся. Наиболее достоверные измерения эффективности химического соединения обычно получают при относительно низких дозах, нормализуя число мутантов к числу выживших клеток (измеряется параллельно на среде, содержащей гистидин). Существуют специальные штаммы Salmonella, чувствительные к мутагенам, вызывающим сдвиг рамки (интеркалирующие агенты), также как и вызывающим точковые мутации. Интересным свойством ДНК-репарации у бактерий, которое присуще некоторым штаммам Salmonella, является снижение точности репарации при высокой степени повреждения. Обширные повреждения репарируются, но точность такой репарации снижается, что приводит к увеличению скорости возникновения мутаций. Полагают, что такой ответ ведет к возникновению и эволюции белков с измененными функциями. Это может способствовать адаптации организма или выживанию в неблагоприятных условиях. Тест Эймса широко используется для первого скрининга канцерогенов. Промышленная разработка химических или фармакологических препаратов может быть приостановлена из-за высокого мутагенного потенциала, обнаруженного в этом тесте. Однако экстраполяция результатов этого теста применительно к животным и, особенно к человеку, представляется затруднительной. С одной стороны у бактерий отсутствует ферментативная система метаболизма ксенобиотиков и, следовательно, они взаимодействуют лишь с соединениями, не требующими активации цитохромами Р450. Чтобы расширить применение этой системы для широкого спектра соединений, необходимо осуществить биотрансформацию ксенобиотиков. Для этого ксенобиотики обрабатываются экстрактом печени крыс, когда они добавляются к бактериям (крысы предварительно обрабатываются мощными индукторами цитохромов Р450). К таким соединениям, требующим предварительной активации, относятся полициклические ароматические углеводороды или нитрозамины, которые иначе не обнаруживают мутагенного потенциала. Несмотря на это, защитные пути, существующие в клетках человека, не воспроизводятся полностью в этом тесте. Когда тест Эймса впервые был разработан и популяризован, 90% соединений, дающих позитивную реакцию в этом тесте, оценивалось как канцерогены для животных. По настоящим оценкам эта цифра составляет приблизительно 60% (соответствие между крысиными и мышиными канцерогенами оценивается как приблизительно 70%). Несмотря на это, тест привлекателен из-за его низкой стоимости и быстроты выполнения. Некоторые исследователи предполагают, что более точно предсказать канцерогенность соединения можно с использованием нескольких краткосрочных тестов. Например, подразумевается, что соединение является потенциальным мутагеном, если оно дает положительный ответ на бактериях, клетках дрозофилы и животных, а также вызывает высокий уровень обмена между сестринскими хроматидами. Интересно, что увеличение количества тестов лишь незначительно улучшает результаты самого по себе теста Эймса. Ранние обзоры по мутагенности с привлечением теста Эймса и последовательный анализ с использованием различных технологий показали, что мы действительно окружены мутагенами: многие продукты (пережаренное мясо) и другие продукты потребления (краски для волос), ультрафиолетовый свет, радон в болотном газе, космические лучи, количество которых удваивается при авиа перелетах на большой высоте. Таким образом, сохранение нашего здоровья напрямую зависит от эффективности процессов репарации ДНК. К сожалению, для индивидуумов, дефицитных по некоторым ферментам, важность репарации еще более усиливается. Например, при синдроме пигментации ксеродермы (Хeroderma pigmentosium syndrome) репарация повреждений от ультрафиолета нарушается. Такие люди вынуждены избегать солнечного света, у них с высокой частотой развивается рак кожи. Согласно последним исследованиям репарация настолько важна, что некоторые ее пути являются

встроенными в процесс репликации.

Глава 5. Сигнальная трансдукция

5.1. Онковирусы, онкогены и раковые супрессорные гены

Многие типы рака возникают как результат множественных событий: активаций протоонкогенов (ПО) и инактиваций раковых супрессорных генов (РСГ). Так как нормальная клетка имеет множественные механизмы регуляции клеточного роста, необходимо несколько изменений для нарушения его контроля. Доказательством этого является обнаружение в раковых клетках генов с мутациями. На сегодняшний день найдены гены, мутация в которых строго вызывает предрасположенность к раку, то есть они предоставляют одно из необходимых событий канцерогенеза. Активация протоонкогенов с трансформационным потенциалом может не быть достаточной для появления рака, однако их изучение помогает понять природу этих событий. Редко образование раковой опухоли связано с активацией одного онкогена. Как правило, необходимо совместное действие нескольких генов. Так, например, среди трансгенных мышей несущих v-myc рак развивается лишь у 10% особей, среди трансгенных мышей несущих v-ras - у 40% особей, а у трансгенных мышей несущих оба активных гена – у всех особей. Среди протоонкогенов довольно часто встречаются белки, регулирующие клеточную дифференцировку. Остановка дифференцировки ведет к продолжению пролиферации, что дает большие возможности для появления мутаций в онкогенах. Во многих случаях существует строгая корреляция между активацией онкогенов и ростом опухоли, но природа инициирующего события остается неизвестной. Можно надеяться, что изучение клеточных онкогенов поможет ее понять. Основное свойство высших эукариот – определенное время жизни организма. Это свойство поддерживается в индивидуальных соматических клетках, чей рост и деление строго регулируемый процесс. Исключение из этого правила составляет рак, который возникает при потере контроля роста. При перерождении нормальной клетки в раковую может проявляться 3 типа изменений: 1. Увековечивание или иммортализация – свойство неопределенного роста без изменений в фенотипе клетки, связанное с изменениями в контроле роста, которые не описаны в терминах молекулярной биологии. 2. Трансформация – потеря контроля роста, например, трансформированная клетка становится независимой от факторов, которые ей обычно необходимы. Причины, которые вызывают трансформацию, довольно неплохо описаны молекулярными и клеточными терминами. 3. Метастазирование – поражение раковыми клетками нормальных тканей, появление новых колоний раковых клеток в различных частях тела. Молекулярные события, вовлеченные в метастазирование, такие как секреция протеаз, только сейчас начинают описываться в терминах молекулярной биологии. Чтобы охарактеризовать абберантные события, которые приводят к потере контроля роста и возникновению опухоли, нужно сравнить характеристики роста нормальных и трансформированных клеток in vitro. Трансформированные клетки в культуре могут расти постоянно, тогда как для нормальной клетки это практически не возможно. В культуре клетки растут около 50 делений (число Хейфлика), затем наступает кризис, когда большинство клеток погибает. Выживают лишь иммортализованные клетки, то есть клетки, способные делиться неопределенно, но их свойства изменились в результате кризиса.

Природа этого явления остается непонятной, в частности, природа молекулярных изменений, которые адаптируют клетку к росту в культуре. Ограниченность времени жизни клеток кризисом ставит нас перед двумя направлениями для изучения нетрансформированных клеток. 1. Первичные клетки, взятые сразу в культуру, которые имитируют жизнь in vivo до кризиса. 2. Клетки, которые прошли через кризис и достигли формирования клеточной культуры (нераковые клетки). Их свойства изменены и будут изменяться во время адаптации к культуре. Эти изменения могут частично напоминать образование опухоли. Сформировавшиеся последним образом клетки по определению становятся иммортализованными, но не раковыми. Такие линии остаются под клеточным контролем. Их свойства близки к первичной культуре, то есть: - им необходим носитель, с которым они соприкасаются - необходимо наличие факторов роста в среде - плотность расположения клеток контролируется межклеточными контактами - клетки растут монослоем и разветвлены При росте клеток в культуре существует лишь приближение к условиям in vivo. Изучая факторы роста на таких линиях, нужно помнить, что в культурах есть изменения в комплементарности хромосом, то есть клетки, как правило, не диплоидные, а анеуплоидные. Трансформированные клетки растут в не столь строгой манере: им не нужен твердый носитель, вместо монослойного расположения они складываются в тонкую массу клеток, называемую фокусом. И, наконец, они способны индуцировать образование опухоли, когда вводятся животным. Не существует единого механизма, описывающего переход клетки от нормального фенотипа к злокачественному. К образованию опухоли может привести большое число изменений в клетке. Объединение процессов иммортализации и трансформации клеток в культуре может обеспечить парадигму образования опухоли in vivо. Можно надеяться, что при сравнении трансформированных клеток с нормальными удастся идентифицировать генетическую основу образования опухоли и найти понимание фенотипических изменений, происходящих при конверсии. Определенные события конвертируют нормальные клетки в трансформированные. Эти события могут запускаться факторами внешней среды (канцерогены) или генетическими изменениями. Возникновение рака у человека в зависимости от возраста предполагает 6-7 молекулярных событий в течение 20-40 лет. Агентами, увеличивающими частоту конверсии нормальных клеток в трансформированные, являются канцерогены. В зависимости от стадии развития рака их делят на инициаторы и промоторы. К настоящему времени известно два класса генов, мутации в которых вызывают трансформацию: протоонкогены и раковые супрессорные гены. Впервые онкогены были обнаружены в вирусах, вызывающих рак. Позднее оказалось, что основная часть из них имеет клеточных двойников, которые выполняют обычные клеточные функции. Клеточные гены называются протоонкогенами и в определенных случаях мутации в них вызывают развитие опухоли. К настоящему времени идентифицировано более ста протоонкогенов. Они разделены на несколько групп, от генов, кодирующих трансмембранные белки, до генов, кодирующих факторы транскрипции. Онкогены могут изменять свои свойства следующим образом: 1. Постоянной активацией их функции, которая в норме должна быть подавлена. 2. Экспрессия гена в клетке, в которой он обычно не экспрессируется 3. Переэкспрессия в обычной ткани, что может быть результатом мутации Раковые супрессорные гены выявлены в форме делеций или других инактивирующих мутаций. Наиболее ярким доказательством их онкогенности являются некоторые разновидности рака, возникающие при потере обоих аллелей этих генов. Известно несколько десятков РСГ. Их функцией является сдерживание клеточного цикла и роста клеток.

5. 2. Вирусы, вызывающие рак Одной из причин, вызывающей трансформацию клеток, может быть вирусная инфекция. Существует множество раковых вирусов, содержащих как ДНК, так и РНК. Примеры трансформирующих вирусов и их свойства представлены в таблице 7: Класс вируса

Тип вируса

Размер генома т.п.н

Онкогены

Происхождение онкогена

Действие онкогена

Вирус полиомы

дцДНК

5-6

Т-антигены

Ранний вирусный ген

Инактивация РСГ

Вирус папилломы дцДНК (HPV)

8

Е6 и Е7

Ранний вирусный ген

Инактивация РСГ

Аденовирус

дцДНК

37

Е1А и Е1В

Ранний вирусный ген

Инактивация РСГ

Ретровирус

оцРНК

6-9

Индивидуальные Клеточное

Вирус ЭпштейнаБарра

дцДНК

160

BNLF-1

Активация ПО

Летальный вирусный Инактивация ген РСГ

В зависимости от ответа на вирусную инфекцию клетки делятся на два класса: 1. Пермиссионные (позволяющие) клетки продуктивно инфицируются, то есть в них происходит полный жизненный цикл вируса, сопровождающийся репликацией вируса, лизисом клетки и выходом наружу вирусных частиц. 2. Непермиссионные клетки подавляют репликацию вируса. При этом может происходить интеграция вирусного генома в клеточный, что может сопровождаться трансформацией. Трансформацию клеток онкогенными вирусами объединяет общий механизм. Рассмотрим их более подробно. Вирус полиомы – малый ДНК-содержащий вирус, найденный у мышей. Его аналоги найдены у макаки резус (вирус SV40) и человека (вирусы BK и JC). В пермиссионных клетках естественных хозяев они не вызывают трансформации. Например, вирусы ВК и JC онкогенны для грызунов, но не человека. Геном вирусов разделен на две части – раннюю и позднюю в соответствии со временем ее активной экспрессии в жизненном цикле вируса. В ранней области закодированы два белка – большой и малый Т-антиген (Tumor), транскрибируемые с одного гена в результате альтернативного сплайсинга. В пермиссионных клетках они инициируют репликацию вирусной ДНК и стимулируют синтез ДНК и экспрессию генов хозяина, в том числе и контролирующих пролиферацию. В непермиссионных клетках, где репликация вируса подавлена, повышенная пролиферация может приводить к трансформации. Вирус папилломы – малый ДНК вирус, вызывающий эпителиальные опухоли. Известно 75 видов вируса HPV (Human Papilloma Virus), многие из которых связаны с доброкачественным ростом, например, возникновением бородавок. Некоторые же из этих вирусов вызывают рак. В частности, цервикальный рак может быть связан с экспрессией вирусных белков Е6 и Е7, иммортализующих клетку путем подавления активности Rb и р53 соответственно. Аденовирус человека был изолирован из аденоидов. Сходные вирусы найдены у других млекопитающих. Это большая группа близкородственных вирусов, состоящая из более 80 индивидуальных членов. Наиболее охарактеризованы аденовирусы человека, так как они вызывают простудные заболевания. Эти вирусы способны инфицировать большое число клеток.

Клетки человека являются пермиссионным, и, следовательно, продуктивно инфицируются. Все аденовирусы способны трансформировать лишь непермиссионные клетки, к которым относятся клетки некоторых грызунов. Наиболее эффективно трансформирующее действие аденовируса проявляется на новорожденных грызунах. Трансформирующее действие аденовируса аналогично действию вируса полиомы и связано с подавлением действия Rb и р53 продуктами ранних генов Е1А и Е1В. Вирус Эпштейна-Барра (EBV) – один из представителей семейства вирусов герпеса, связанный со многими болезнями человека (мононуклеозис, назофарингальная карцинома, лимфома Беркита и другие лимфопролиферативные болезни). В-лимфоциты человека инфицируются этим вирусом in vitro и становятся иммортализованными. Вирусную ДНК находят и в трансформированных клетках. Остается до конца неизвестным, какие гены EBV вызывают трансформацию. Идентифицирован белок BNLF-1, который, видимо, активирует определенные клеточные гены. Ретровирусы кардинально отличаются от вирусов, упомянутых ранее, по их способности переносить генетическую информацию не только горизонтально, но и вертикально. Горизонтальный перенос – это нормальный процесс вирусной инфекции, при котором увеличивается число пораженных клеток у одного хозяина. Вертикальный перенос связан с интеграцией вируса в половые клетки в качестве эндогенного провируса. Он наследуется по законам Менделя. Жизненный цикл вируса осуществляется при помощи обратной транскрипции: РНК- оцДНК-дцДНК – интеграция в геном- инфекционная РНК. Интеграция в геном приводит к вертикальной трансмиссии провируса. Экспрессия провируса может генерировать ретровирусные частицы, которые передают генетическую информацию горизонтально. По способности вызывать рак опухолевые ретровирусы делятся на две большие группы: 1. Недефективные вирусы, которые имеют обычный для ретровирусов жизненный цикл. Они имеют длинный латентный период и часто связаны с возникновением лейкемий. Существует две классические модели: FeLV (Feline leukemia virus) и MMTV (mouse mammary tumor virus). Опухолеобразование не связано с определенными вирусными ПО, а со способностью вируса активировать клеточные ПО. 2. Быстро трансформирующие вирусы передают новую для клетки генетическую информацию в виде ПО. Если в вирусе не содержится онкоген, то вирус не представляет опасности. ПО становится оригинальным клеточным геном. Быстро трансформирующие вирусы быстро вызывают рак и могут трансформировать клетки in vitro. Ретровирус захватывает клеточный ген путем обмена своей собственной последовательности на клеточную. Такая трансдукция вируса имеет два очень важных свойства: 1. Такой вирус, содержащий клеточный ген, обычно не может сам реплицироваться, так как вирусным генам для репродукции не нужен обмен с клеточным геном. Все такие вирусы дефектны, но они могут инфицировать с помощью «помощника» – вируса дикого типа, который обеспечивает функции, потерянные при рекомбинации. 2. Во время инфекции трансдуцирующий вирус несет клеточные гены, которые получены им в результате рекомбинантных событий и их экспрессия может повреждать фенотип инфицированной клетки. Вирус, несущий информацию о росте клетки, имеет преимущество в будущем цикле инфекции. После захвата вирусом клеточного гена, в нем может случиться мутация и его влияние на фенотип клетки усилится. Конечно, трансфекция не является единственным механизмом влияния ретровируса на клетку хозяина. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1 или HIV-1) инфицирует и убивает Т лимфоциты, снижая таким образом активность иммунной системы и индуцируя СПИД. ВИЧ не трансформирует клетки, однако больные часто страдают некоторыми видами рака, в частности лимфомами и саркомой Капоши. В вирусах идентифицировано более 30 клеточных онкогенов. Обычно вирусы несут один онкоген. Вирусный онкоген обозначают как v-onc, а клеточный – c-onc. Существует две модели, объясняющие различие между вирусными и клеточными онкогенами. Количественная модель предполагает, что вирусные онкогены качественно не отличаются от клеточных, но их экспрессия повышена или ее не возможно

выключить. Качественная модель предполагает, что клеточные онкогены действительно теряют онкогенные свойства, но могут быть конвертированы мутацией в онкоген. Каждый онкоген может вести себя в соответствии с какой-либо из этих двух моделей. Об онкогенном потенциале трансформирующих вирусов свидетельствуют следующие факторы: 1. Мутации в вирусных онкогенах понижают их трансформационную активность 2. Обнаружены события, при которых клеточный онкоген становится онкогеным. Например, это происходит при изменении последовательности клеточного онкогена. Прямые доказательства того, что экспрессия вирусных онкогенов сопровождается трансформацией, получены на примере вируса саркомы Рауса. Чувствительные к температуре мутации в v-src при повышении температуры возвращали клетки от трансформированного фетотипа к нормальному, тогда как понижение температуры реверсировало трансформированный фенотип. Src – пример гена, свойства которого напоминают c-onc. V-src онкогенен при низких уровнях экспрессии белка, c-src – при высоких (более 10 от нормы). Некоторые ПО слабо онкогенны при повышении их экспрессии, но найденные изменения в v-onc или появляющиеся изменения в c-onc обладают более эффективной трансформирующей способностью (Например, ras и myc). В некоторых случаях v-onc образуются при потере последовательностей, кодирующих С-конец или N-конец (или оба), вероятно, в результате рекомбинантных процессов. Потеря этих областей может устранять регуляторный контроль над v-onc, который в норме лимитирует активность c-onc. Такие изменения в последовательности необходимы для src. V-src – онкоген при низкой концентрации, c-src – не онкоген даже при относительно высоком содержании белка (в десять раз больше нормы). Концепция, что ОГ активируются от ПОГ – важная парадигма для рака животных. У человека в большинство событий вирусные интермедиаты не вовлечены в процесс трансформации.

5. 3. Протоонкогены и онкогены Можно исследовать c-onc в опухолях. Если есть специфический ген, то он должен трансформировать клетки. Часто в модельных экспериментах используется культура фибробластов мыши 3Т3. При их трансформации появляется фокус. Трансформирующая сила гена может характеризоваться эффективностью появления фокусов. Высокоэффективный ген – больше 100 фокусов/нг ДНК/106 клеток. Низкоэффективный – меньше 10 фокусов/нг ДНК/106 клеток. Трансформирующая ДНК изолируется лишь из опухолей. Рассмотрим некоторые примеры. В семейство c-ras входят три гена H-ras, K-ras, N-ras и один псевдоген. Они отличаются от вирусного гена по тремсеми аминокислотам. У человека наиболее часты мутации в 12 и 61 кодоне, причем в с-H-ras и с-K-ras генах в 12 позиции часто обнаруживается мутация. Это предполагает, что Ras белки имеют высокий потенциал конвертировать в опухолеродные формы через мутацию в одном или нескольких кодонах у крысы и у человека. Следует заметить, что нахождение этих мутаций в опухоли еще не доказательство их причастности к ее возникновению. Во многих случаях работает общий принцип – аминокислотная замена может конвертировать клеточный ПО в ОГ. Практически любая мутация в 12 и 61 кодоне может конвертировать ras ПО в активный онкоген. Все три гена ras в 12-ой позиции имеют глицин. Если in vitro его заменить на любую аминокислоту кроме пролина, то клеточная культура будет трансформироваться. В 61-ой позиции находится глютамин. Его замена приводит к аналогичному результату (кроме замены на пролин и глютамат). Некоторые c-ras имеют мутацию в

интроне, в результате скорость процессинга мРНК возрастает в десять раз. Есть раковые культуры с амплифицированным ras геном. Ras белки могут трансформировать клетки, но количественный эффект их действия до сих пор не описан. Не всегда трансформация связана со структурной частью онкогена. Есть примеры, связанные со вставкой ретровируса в клеточный геном рядом с c-myc геном. Ген cmyc состоит из трех экзонов и длинного транслирующего участка. Элемент LTR вируса работает как промотор, и транскрипция гена cmyc может многократно усилиться. В этом случае кодирующая последовательность c-myc не изменяется, а онкогенные свойства появляются из-за увеличения экспрессии и потери контроля над ней. Другим механизмом активации ПО является транслокация, сопровождающаяся повреждением ПО в точке разрыва. Подобное происходит при лимфоме Беркита – появлении недифференцированных Влимфоцитов. В этом случае чаще всего c-myc из хромосомы 8 переносится в IgH локус хромосомы 14. Такая комбинация вызывает усиление экспрессии c-myc, так как клетка активно производит иммуноглобулины, что и приводит к задержке лимфоцитов в незрелом состоянии. У трансгенных мышей с c-myc геном, находящимся под контролем энхансера IgH, развивается лимфома. Трансгенные мыши, несущие c-myc под контролем LTR ретровируса, имеют опухоли и в других органах. Это предполагает, что при увеличении экспрессии c-myc трансформируется тот тип клеток, в которых этот эффект присутствует. То есть трансформирующая активность c-myc зависит от механизма его активации, а не от его внутренних свойств. Нужно отметить, что транслокация не всегда приводит к тому, что поврежденный ген становится онкогенным. Транслокация может действовать как энхансер, активирующий другие гены по соседству. Найдено множество трансформаций в Т и В-лимфоцитах, в которых идентифицированы другие онкогены. В некоторых случаях транслокация генерирует гибридные гены, в которых активная единица транскрипции разрушается. В результате экзоны первого гена могут быть связаны с другими генами. В таких случаях существуют две потенциальные причины онкогенности: 1. Онкогенная часть белка может активироваться независимо от другой части. Переэкспрессия под новым управлением – это модель cmyc. 2. Другой партнер в гибридном гене может иметь усиливающий эффект, который вызывает выход из функции в части белка, кодируемого ПО. Примером такой транслокации может служить Филадельфийская хромосома, которую находят при хронической миелогенной лейкемии (CML). Это транслокация 5000 kb области от конца хромосомы 9, несущей c-abl, на область bcr (break-point claster region) хромосомы 22. Последний обнаруживается при другой болезни – острой лимфобластной лейкемии (ALL), когда в транслокацию вовлечен ген bcr. При CML образуется смешанный белок массой 210 кДа, из них часть bcr составляет 70 кДа. При ALL, соответственно, 185кДа и 45кДа. Остальную часть этих белков составляет c-abl с потеряной Nконцевой частью. Часть белка bcr, закодированная в первом экзоне, обладает серин/треонин киназной активностью. Белок фосфорилирует сам себя, и фосфорилированная часть обладает способностью взаимодействовать с SH2 доменом c-abl. Возможно, происходит изменение конформации abl и активация его онкогенного потенциала.

Изменения в N-концевой области вызывают онкогенность v-abl, трансформирующей версии гена, найденной в ретровирусах. С-abl кодирует тирозин киназу, активность которой необходима для трансформирующего потенциала в онкогенных вариантах. Делеция или замена N-конца усиливает как киназную активность, так и трансформирующие способности. Таким образом, N-концевой домен регулирует киназную активность, а его потеря вызывает ее активацию. Приведем примеры других протоонкогенов, экспрессия которых увеличивается при трансформации. Белок v-rel идентифицирован как трансформирующий фактор вируса птичьего (индюк) ретикулоэндотелиоза. Он высоко онкогенен для цыплят и вызывает Вклеточную лимфому. V-rel является укороченной версией c-rel, потерявшей 100 аминокислотных остатков на С-конце и имеет малое число точечных мутаций в оставшейся последовательности. Семейство генов rel регулирует транскрипцию при созревании лимфоцитов. NFkB – фактор транскрипции, представляющий собой димер субъединиц р65 и р50. Его регуляция осуществляется I-kB. Когда I-kB фосфорилируется, происходит освобождение NF-kB, который идет в ядро и активирует гены, в промоторе или энхансере которых имеется kB мотив. 5. 4. Основные пути сигнальной трансдукции.

К настоящему времени известно три основных сигнальных каскада. Первый каскад стимулируется митогенами и факторами роста : Ras-Raf-MEK-ERK. Второй и третий каскад стимулируются цитокинами, гормонами и различными факторами стресса - белками из Rho семейства (Rho, Rac, CDC42). Как их различить? МАР киназный компонент, который фосфорилируется уникальными киназами по тирозину и треонину в одном трех мотивов Thr-Glu-Thr, Thr-Phe-Tyr или Thr-Glu-Tyr, что зависит от трех путей. Для активации одного из этих путей инициирующий стимул может также мобилизовать другие сигнальные молекулы: изоформы протеин киназы C, киназы фосфолипидов, альфа- и беттасубъединицы G-белков, фосфолипазы, внутриклеточный Са2+. Сигнал завершается двумя путями: 1. Фосфорилирование ниже стоящих молекул верх стоящими киназами. 2. Компоненты возвращаются в дефосфорилированное состояние. Все три пути могут пересекаться.

5.4.1. Факторы роста и их рецепторы

Эпидермальный фактор роста (EGF) и тромбоцитарный фоктор роста (PDGF ) представляют собой небольшие полипептиды, стимулирующие рост особого типа клеток. Они вызывают множество эффектов, в том числе инициируют или стимулируют клеточный цикл. Рецепторы этих лигандов имеют общее строение - большой экстраклеточный домен и цитоплазматический домен. Рецепторы EGF и PDGF состоят из одной полипептидной цепи. Рецептор инсулина - димер. Эти рецепторы являются протеин киназами. Поиск специфических молекул-мишеней для токсических соединений в конечном счете свел все к изучению рецепторов. Обычно рецептор - это протеин, связывающий лиганд, в результате чего меняется его функция вместе с сигнальной трансдукцией. Важная

особенность рецептора - высокая специфичность естественного лиганда. Это особенно важно для ответа рецептора на нужный лиганд и никакой другой. Это помогает связать две клетки в разных частях организма. Было показано, что даже нонамолярная концентрация гормона оказывает нужное влияние на клетку- мишень. Еще одно важное свойство - обратимость связи рецептора и лиганда. В животной клетке присутствует три основные категории рецепторов. Рецептор функционирует как одна из частей сигнального механизма. Первая группа рецепторов находится на поверхности клетки и связывается с крупными лигандами, которые не могут проникнуть в клетку (полипептидные гормоны). Второй вид рецепторов - стероидные, которые являются факторами транскрипции, чья способность влиять на экспрессию генов изменяется после связи с лигандом. Третья категория рецепторов состоит из ионных каналов. Они находятся на поверхности клетки, что позволяет ионам двигаться по градиенту концентрации, после того как рецептор свяжется с лигандом. Например, хорошо изученный G-белок стимулирует аденилат-циклазу, которая превращает АТР в АМР. Другой Gбелок ингибирует аденилат- циклазу. Этот процесс очень важен, так как АМР влияет на многие функции клеток. Многие токсичные агенты повреждают рецепторы, так, например, доказано, что токсин холеры связывается со стимулирующим G-белком и необратимо активизирует его. Это приводит к неспособности всасывать воду эпителием кишечника, что, в конечном итоге, приводит к смерти от обезвоживания.

5.4.2. Механизм действия ras белка

Ras принадлежит к большому семейству малых GTP-связывающих белков и регулирует клеточный рост и дифференцировку. В активном состоянии Ras связан с молекулой GTP, а в неактивном - с GDP. Обмен GDP на GTP стимулируется белковым фактором обмена гуанин нуклеотида (GEF, guanine nucleotide exchange factor). Гидролиз связанного с ras GTP до GDP осуществляется GTPаза активирующим белком (GAP, GTPase activating protein). Кроме того, белковый ингибитор диссоциации гуанин нуклеотида (GDI, guanine nucleotide dissociation inhibitor) способен поддерживать Ras в неактивном состоянии, ингибируя обмен гуанин нуклеотидов. Активация Ras опосредуется рецепторной тирозин киназой. После связывания ее рецепторной экстраклеточной части тирозин киназы с фактором роста и ее димеризации происходит взаимное фосфорилирование ее внутриклеточных доменов. Фосфорилирование создает благоприятную конформацию киназы для связывания с цитозольным белком Grb2 содержащим SH2 домен. Посредством этого домена Grb2 связан с GEF. Таким образом, GEF оказывается у внутренней поверхности клеточной мембраны, с которой связан Ras посредством гидрофобного остатка фарнезила. Происходит образование активного комплекса ras-GTP. Этот комплекс взаимодействует с серин/треонин киназой raf. Интересно, что RasGTP не повышает каталитическую активность raf, а просто привлекает ее из цитозоля к мембране, где она фосфорилирует другие связанные с мембраной белки. Эти события вызывают активацию ERK. При процессинге белка ras происходит его фарназилирование по аминокислотному остатку Cys-186, отщепление следующей после Cys-186 C-концевой части. Cys-186 становится C-концевым остатком ras и метилируется. Обратимое пальмитилирование других остатков цистеина ближе к С-концу ras повышает его сродство к мембране. Наиболее частыми онкогенными мутациями ras являются мутации в 12 и 61 кодонах. Мутация в 12 кодоне затрагивает GTP-связывающий сайт. 61 кодон входит в состав L4 домена, который изменяет свою конформациюпри гидролизе GTP. Белок ras фосфорилирует Raf белок, который в свою очередь активирует МЕК. Последний обладает двоякой специфичностью - фосфорилирует треонин и тирозин. Его мишень - ERK МАР киназа. Оба типа необходимы для активации МАР киназ.

5.4.3. МАР киназы Митоген активированные белки или МАР киназы играют важную роль в клеточных ответах, включая пролиферацию, генную экспрессию, ответ на гипертермию, УФ-излучение, повышение осмомолярности и т.д. МАР киназы являются серин/треонин киназами. Классические МАР киназы проходят в ядро где фосфорилируют свои мишени - факторы транскрипции. Альтернативеым путем является фосфорилирование цитоплазматических факторов. У дрожжей имеется четыре МАР киназных пути, которые функционально не зависят и регулируются разными каскадами киназ. Каждый из них регулируется уникальной киназой МАР киназы (МКК или МЕК). Кроме того, существуют и киназы киназы МАР киназы МЕКК. МАР киназы разделены на три подсемейства: 1. Внеклеточные сигнал регулируемые киназы ERK - осуществляют передачу сигнала внутрь клетки. 2. Стресс-активируемые протеин киназы или c-Jun NH2 терминальные киназы SAPK/JNK. 3. р38 киназа - играет критическую роль в воспалительном ответе. МАР киназы активируют работу многих генов, включая клеточный рост и дифференцировку. ERKs фосфорилируют и регулируют активность определенных ферментов, включая фосфолипазу A2 и р90 и ядерных факторов р62FCF и Elk-1, контролирующего несколько генов, включая c-fos. Белки JNKs фосфорилируют аминотерминальный трансактивированный домен c-Jun и ATF2. Они активируются различными стимулами, отличными от ERKs сигналов: тепловой шок, повышение осмомолярности, УФ-излучение. JNKs также могут активироваться агентами, взаимодействующими с рецепторами на клеточной поверхности: ФНОа, интерлейкин-1 или EGF. Более того, существуют доказательства того, что в то время как Ras контролирует активацию ERKs, члены Rho семейства (небольшие GTPсвязывающие белки) - Rac1 и Cdc42 регулируют активность JNKs. Свойством Ras/MAPK пути является то, что они активируются под действием различных сигналов, но результат может быть различным. Когда клетки РС12 обрабатывали NGF (фактором роста нервов), то они дифференцировались, становились нейроноподобными и останавливали деление. После обработки EGF они получали сигнал для продолжения пролиферации. В обоих случаях в сигнальную трансдукцию вовлечены ERK MAPK. Различия, которые наблюдались в результате, можно объяснить еще не открытыми сигнальными путями. Однако основным различием является то, что NGF вызывает пролонгированное повышение RasGTP, тогда как EGF стимулирует только транзитный эффект. Но все же главная роль принадлежит ERK-MAPK мутации, при которой конститутивно активированные MEK вызывают дифференцировку клеток РС12. В последние годы был достигнут значительный прогресс в исследовании сигнальной трансдукции при развитии, где объектом исследования служили нематоды С.elegans и дрозофила. Для анализа формирования вульвы C.elegans и фоторецепторных клеток глаз дрозофилы была использована комбинация биохимических и генетических методов. Эти системы были изучены так подробно, что считалось, что больше в них нельзя обнаружить ничего нового. Но в 1995 была открыта система KSR-1. Потеря функции Ras или другого компонента вызывает потерю вульвы при формировании гермафродитных червей, тогда как увеличение функции приводит к формированию избыточных вульв (мультивульварный фенотип). Этот Ras путь не единственный, но малейшие его нарушения меняют развитие вульвы. Найден новый белок - супрессор KSR-1, который действует параллельно или ниже. KSR (киназный супрессор Ras) - новая протеин киназа, необходимая для Ras сигнальной трансдукции. У дрозофилы обнаружено два гена, чьи продукты необходимы для активации Ras в сигнал с нормальной эффективностью. Первый кодирует бетта-субъединицу геранил- трансферазы типа I в плазматической мембране. Деффект в этом гене блокирует Ras-изопренизацию. Второй ген кодирует протеинкиназу, которую назвали киназный супрессор Ras (KSR). Она функционирует во многих рецепторных тирозин киназных путях. KSR был обнаружен и у

млекопитающих. Основные пути сигнальной трансдукции у разных организмов представлены в табл. 8 C.elegans

Drosophila

Млекопитающие

лиганд--> рецептор лиганда Lin15 Lin3--> let23??? boss--> sevenless EGF--> EGFR адаптор--> ???? фактор

let23-->?

DRK-->SOS

GRb-2-->SOS

GAP

let60-->

Ras1-->

Ras-->

MAPKK--> MAPK

lin-45--> Sur1 Mpn1

D-Raf--> Rolled Raf--> Erk

На их регуляцию могут влиять непосредственно вирусные онкогены, такие как v-rel. Его продукт идентифицирован как высоко онкогенный белок, вызывающий ретикулоэндотелиоз у индюков.р50 и c-rel имеют 60% гомологии. NF-kB - один из плейотропных факторов транскрипции - генеральный вторичный мессенджер. Его активируют многие стимулы. Как же действует v-rel? По одной из гипотез v-rel формирует димер с клеточным аналогом c-rel. Этот димер неактивен, что предотвращает NF-kB или другие ФТ от функционирования. V-rel - исключительно ядерный белок, так как он потерял участок, необходимый для его транспорта в цитоплазму. AP1 отвечает на промоторы ТРА. АР1-связывающий сайт индуцируется ТРА в гене-мишени. Канонический AP1 - димер c-Jun и c-Fos. Мутации в них понижают ДНК связывающую активность и понижают онкогенный потенциал.

5.5. Оксидативный стресс

Генерация кислородных радикалов (ROS) изучена слабо за исключением некоторых специализированных клеток. В фагоцитах под действием различных факторов активируется НАДФН-оксидазный комплекс, состоящий из четырех белков. Этот комплекс ответственен за перенос электронов с НАДФН на O2 c последующей генерацией супероксиданиона О2-, который спонтанно или ферментативно дисмутирует в Н2О2. В нейтрофилах активность НАДФНоксидазного комплекса регулируется G-белком (GTP связывающим белком) Rac2, а в макрофагах - Rac1. Таким образом, Rac белки регулируют уровень активных форм кислорода (ROS) в клетке. Генерация ROS играет существенную роль в стимуляции факторов роста и цитокинов. Перекись водорода может участвовать в сигнальной трансдукции. Она активирует МАРК и c-Jun- стресс-активируемую протеин киназу (JNK/SAPK), а МАРК регулируется Ras белками. Rac1 регулирует JNK/SAPK. Принято считать, что эффекты ROS осуществляются посредством ковалентной модификации сульфгидрильных остатков критических белков. Если это так, то спектр их регуляторной деятельности широк: от активации тирозиновых фосфатаз до ФТ. Существует два пути действия ROS: 1. Модификация функции белка через фосфорилирование тирозиновых остатков 2. Модификация функции белка окислительно-восстановительными реакциями цистеиновых остатков

5.6. Теломераза

Теломераза представляет собой рибонуклеопротеин, который синтезирует GC-богатые теломерные повторы (TTAGGC) на концах хромосом. Она компенсирует постепенное укорочение 5'концов линейной молекулы ДНК при репликации. Укорочение происходит из-за того, что РНК-затравку на 5' конце невозможно заменить на ДНК, так как ДНКполимераза обладает лишь 5'>3' полимеразной активностью. Таким образом, теломераза вносит вклад в стабильность хромосом. Было предположено, что укорочение теломер может лежать в основе работы митотических часов, которые регулируют лимит нормальных клеточных делений и старение. Реактивация теломеразы может быть критической для пролиферации опухоли, позволяющая клеткам избежать старения. Современная модель клеточного старения предполагает, что теломеры соматических клеток укорачиваются до тех пор, пока они достигнут стадии М1, в которой длина теломеры препятствует дальнейшему клеточному делению, а теломераза больше не активна. Митотическое старение во многих клетках опосредована р53 и Rb генами. Когда пройден М1 барьер, дальнейшая пролиферация приводит к укорочению хромосом, что в конце концов приводит к хромосомной нестабильности, р53-зависимой остановке клеточного цикла и клеточной смерти (М2). 5.7. Раковые супрессорные гены.

Эти гены обычно доминантны по отношению к ПО. Мутация, которая инактивирует один аллель, может привести к трансформации. Опухоли могут образовываться по другому механизму: потери двух аллелей в локусе онкогенности. Мутации могут наследоваться через половые клетки, либо быть результатом соматических изменений. Развитие рака происходит из-за потери функции РСГ. Наиболее охарактеризованными РСГ являются р53 и Rb.

5.7.1. RB белок

Ретинабластома - рак сетчатки, встречающийся у детей. Он передается по наследству, либо возникает спорадически. Заболевание связано с инактивацией обеих копий гена Rb и, как следствие, с отсутствием в клетке белкового продукта. Инактивация происходит в результате делеции локуса q14 тринадцатой хромосомы, несущего данный ген. Признак является рецессивным и проявляется в потомстве, если оба родителя несут хотя бы по одной инактивированной копии гена. Ненаследственная форма ретинобластомы крайне редка, так как для ее возникновения необходимо произойти мутациям в обеих копиях гена Rb. Кроме ретинобластомы инактивация Rb вызывает многие опухоли легких, мочевого пузыря и молочной железы. Как уже упоминалось выше, инактивация Rb на белковом уровне может осуществляться продуктами генов раковых вирусов, таких как SV40, аденовирус и вирус папилломы. Rb является фосфопротеином, играющим важную роль в регуляции перехода клетки из G1 в S фазу (Рис. 31 ).

Рис. 31. Белок RB в регуляции клеточного деления Центральную роль в этом переходе играет E2F, фактор транскрипции некоторых генов, необходимых для синтеза ДНК в S фазе. Он так же стимулирует транскрипцию генов циклина А, циклина Е и своего собственного гена. Белок pRb ингибирует E2F, связываясь с последним в G1 фазе. Факторы роста стимулируют транскрипцию циклина D. Происходит накопление комплексов циклин D - Cdk4, которые начинают фосфорилировать Rb, что приводит к его диссоциации от E2F. Высвободившийся E2F стимулирует транскрипцию своего гена и гена циклина Е. Образующийся вследствие этого комплекс CDK2-цЕ, еще активнее фосфорилирует pRb. Таким образом, сеть эффектов через петлю положительной обратной связи приводит к быстрому возрастанию E2F зависимой транскрипции и переходу клетки в начало S фазы. В конце митоза рRb дефосфорилируется. Переэкспрессия Rb препятствует клеточному росту. Это продемонстрировано на примере клеточной линии остеосаркомы, которая потеряла этот ген. При внесении гена Rb в культуру ее рост прекращается. Были обнаружены сходные с Rb белки, способные взаимодействовать с другими представителями семейства факторов транскрипции E2F.

5.7.2.Белок р53

Р53 - раковый супрессорный ген. Он получил свое название по молекулярной массе белкового продукта. Ген наследуется как аутосомная доминанта при синдроме Ли-Фраумени редкой форме наследственного рака. У больных этим синдромом развивается рак различных органов, что связано с мутациями в гене р53. Изучение этих мутаций открыло новые свойства р53 и объяснило его связь с возникновением рака. P53 - ядерный фосфопротеин, который открыли в SV40 трансформированных клетках, в которых он связан с Т-антигеном. Повышенная экспрессия р53 была обнаружена во многих раковых клеточных линиях. В ранних экспериментах вставка клонированного р53 была найдена в иммортализованных клетках, в связи с чем его назвали онкогеном с обычной доминантной функцией. Но все трансформирующие формы р53 выключались в мутантных формах белка. И тогда они попали в категорию доминантных негативных мутантов, которые

функционируют через подавление функции в диком типе. Наиболее общее формой доминантного негативного мутанта является та, которая формирует гетеродимерный белок, объединяющий субъединицу мутировавшего и дикого типа, в котором субъединица дикого типа не функционирует. Вероятно, р53 существует как тетрамер. Трансформированный фенотип образуется либо делецией обоих аллелей или точечной мутацией в одном из аллелей, которая продуцирует доминантный негативный фенотип . Обе ситуации найдены в раковых опухолях человека. Мутации р53 накапливаются во многих во многих типах рака человека, вероятно из за того, что потеря р53 стимулирует рост клетки, а для остановки роста нужен дикий тип р53. Многообразие видов рака дает основания предполагать, что р53 не тканеспецифичен, то есть он вовлечен в общий контроль пролиферации и потеря этого контроля может быть вторичным событием, которое стимулирует рост многих опухолей. Такая интерпретация предполагает, что нормальные клетки растут в сдержанной манере, которая обычно ингибируется р53. Какова функция р53 на молекулярном уровне? р53 был открыт как белок, связывающийся с большим Т-антигеном вируса SV40. В отличие от дикого типа, мутантные формы белка не способны связывать Т- антиген. Связывание дикого типа р53 с Т-антигеном коррелирует с его способностью стимулировать репликацию вируса. Одна возможность - р53 дикого типа связывается с клеточными аналогами Т-антигена, при этом ингибируется активность последнего. У мутантных форм такая способность теряется. Белок р53 является ДНК связывающим белком, узнающим специфичный мотив из 10 п.о. в активном промоторе, который содержит этот мотив. Для некотоых генов р53 может быть супрессором. р53 также регулирует экспрессию генов, контролирующих клеточный цикл. Этот белок связывается с последовательностью ДНК PuPuPuC(A/T)(T/A)GpyPyPy, которая содержится в некоторых промоторах. Сам белок р53, состоящий из 392 аминокислот, состоит из шести доменов: 1.N-концевой домен (1-50 амк.) вовлечен в транскрипционную активацию генов-мишеней (р21- ингибитор Cdk и другие гены, участвующие в остановке клеточного цикла, GADD45, 143-3-d, Bax). Он же ответственен за взаимодействие с Mdm2 - ингибитором р53. В этом участке находятся 7 остатков серина и треонина, являющиеся мишенями для киназ. 2.Дополнительный транскрипционный домен (43-73 амк.) для активации генов-мишеней. 3. Гибкий пролин-богатый домен (73-97амк.), в котором выявлены элементы РххР, важен для полного проявления супрессорной активности. Участвует в запуске апоптоза. Мишени TBP, TFIID, SpII, HIF-1, STAT-5, Bcl-2, MDR-1, рецептор тироидного гормона. 4. Центральный домен (100-300 амк.), который узнает специфические последовательности ДНК. Именно в этом районе обнаружено большинство мутаций в раковых опухолях. 5. Участок, отвечающий за ядерную локализацию р53 (305-323амк.). альфа-спираль - участок, отвечающий за тетрамеризацию (323-356амк.). 6. Основный домен (363-392амк.) является мишенью для модифицирующих ферментов (киназ, ацетилаз, гликозилаз). В немодифицированной форме он препятствует образованию комплекса с ДНК. Кроме того, С-конец может может неспецифически связываться с одноцепочечной ДНК, непарными основаниями и концама ДНК, что указывает на его участие в узнавании повреждений ДНК и запуске репарации. Р53 называют "стражем генома". Он активируется в ответ на различные виды стресса и останавливает пролиферацию, а вслучае более серьезных повреждений запускает программу апоптоза - гибели клетки. Около 50% опухолей человека имеют дефектный р53. Большинство мутаций р53 возникает в позициях, где аминокислоты высококонсервативны. Это предполагает, что эти мутации связаны с консервативными функциями. Охарактеризованные мутации р53 вызывают эффекты, связанные с изменениями свойств белка, включая его время полужизни от 20 минут до нескольких часов, изменения его конформации, изменения его клеточной локализации от ядерной к цитоплазматической, изменения способности связываться с ДНК или Т-антигеном. Такая плейотропность делает затруднительным определить, какой из них связан с супрессией рака. Кроме Rb и р53 существует множество других генов супрессоров опухолей. В частности, к ним относятся р21, p16 и р27 - ингибиторы Cdk, которые будут рассмотренные в следующей

главе, WT1 - супрессор транскрипции некоторых факторов роста и онкогенов bcl-2 и c-myc, NF1 - подавляет активность ras за счет активации ГТФаз. Глава 6. Регуляция клеточного деления. Циклины и циклин-зависимые киназы Основное свойство высших эукариот - определенное время жизни организма. Это свойство поддерживается в индивидуальных соматических клетках, чей рост, деление и гибель точно регулируемый процесс. Сбой регуляции приводит к неконтролируемому клеточному росту - раку. Одним из ключевых событий в жизни соматической клетки является ее деление на две дочерних - митоз. Период между двумя делениями называется интерфазой. Интерфаза и митоз представляют собой хорошо организованную последовательность событий, известную как клеточный цикл. Разграничением между клеточными циклами являются стадии митоза. Важным свойством клеточного цикла является его сложная регуляция.

6.1. Периоды клеточного цикла

Клеточный цикл разделяется на четыре периода: G1 фаза (от "gap 1", то есть интервал 1) - период высокой метаболической активности и роста клетки между митозом и репликацией ДНК. * S фаза (от "synthesis") - период синтеза (репликации ДНК). Количество ядерной ДНК увеличивается в два раза от 2n до 4n. * G2 фаза ("gap 2") - период подготовки к митозу. Продолжается клеточный рост и синтез необходимых белков * M фаза (от "mitosis") - деление клетки на две дочерние с уменьшением в них количества ДНК от 4n до 2n. Митоз - сложный процесс, в ходе которого происходит конденсация хроматина с образованием узнаваемых хромосом, перемещение центриолей в противоположные части клетки, реорганизация и реконструкция микротрубочек в веретено деления, разрыв ядерной оболочки, вызванный деполимеризацией поддерживающих ее структуру белков - ламинов (профаза), прикрепления микротрубочек к кинетохорам хромосом(прометафаза), выстраивание хромосом по клеточному экватору (метафаза), расхождение сестринских хроматид к противоположным полюсам клетки(анафаза), реорганизация ядерных оболочек и непосредственное деление цитоплазмы (телофаза) и клетки (цитокинез). Типичные быстро делящиеся клетки человека (клетки костного мозга, слизистой оболочки кишечника, волосяных фолликул и др.) проходят клеточный цикл за 24 часа. Быстро делятся клетки эмбриона - сразу после оплодотворения яйцеклетки. Они проходят клеточный цикл за 30 мин, однако при этом не происходит клеточный рост, то есть зигота делится на большое количество маленьких клеток. Некоторые клетки взрослого организма либо прекращают делиться вообще (например, нервные клетки), либо делятся случайно, для замены погибших или поврежденных в результате ранения клеток при получении сигнала извне (например, фибробласты кожи). Такие клетки вышли из фазы G1 в фазу покоя G0, оставаясь при этом метаболически активными. Клеточный цикл других клеток может остановиться и в G2 фазе. В диплоидном мире эти клетки в дальнейшем обычно остаются тетраплоидными, как это бывает, например, на некоторых стадиях эмбриогенеза насекомых. В гаплоидном мире остановка клеточного цикла в G2 фазе происходит всегда, так как это *

позволяет предохранять ДНК от повреждений из-за наличия в клетке двух ее копий, вместо одной копии в G1 фазе.

6.2. Понятие ограничительной и сверочных точек

Способность клетки надолго задерживаться в G0 фазе свидетельствует о наличии регуляторного механизма, который принимает решение о выходе из клеточного цикла или его продолжении. Точка клеточного цикла, в которой принимается соответствующее решение, получила название ограничительной точки (restriction point) у высших эукариот и СТАРТ (START) у почкующихся дрожжей S.cerevisiae. Пройдя эту точку клеточного цикла клетка необратимо выходит из G1 фазы и проходит все остальные его фазы вплоть до следующей точки, где принимается новое решение. У дрожжей переход через СТАРТ регулируется размером клетки и наличием во внешней среде питательных веществ. Переход через ограничительную точку высших эукариот в основном зависит от наличия во внешней среде факторов роста. Так, например, выход фибробластов кожи из фазы покоя и запуск их клеточного цикла осуществляется под действием тромбоцитарного фактора роста (PDGF), который появляется во внешней среде при свертывании крови в зоне ранения. По мере прогрессии клеточного цикла должны существовать механизмы проверки правильности выполнения его событий. Такая проверка осуществляется в нескольких точках клеточного цикла получивших название сверочных точек (checkpoint). Эти точки расположены в концах G1, G2 и М фаз. В первой точке осуществляется проверка наличия повреждений ДНК, во второй наряду с повреждениями ДНК проверяется завершенность репликации, в третьей проверяется правильность расхождения хромосом в митозе. Если обнаруживается какое-либо из вышеперечисленных нарушений, то происходит остановка клеточного цикла, что дает время для их исправления. Если исправление оказывается невозможным, то происходит запуск механизма апоптоза - программируемой клеточной смерти.

6. 3. История изучения клеточного цикла

Картина регуляции клеточного цикла стала проявляться лишь последнее десятилетие в результате сотрудничества исследователей ооцитов амфибий и генетиков дрожжей. Эксперименты, проведенные в начале 1970-х показали, что яйца взрослых лягушек Xenopus laevis производят фактор, который будучи введенным в незрелые ооциты, находящиеся в G2 фазе, запускает в них мейоз, таким образом, готовя их для оплодотворения. Обычно, это "взросление" вызывает прогестерон. Фактору, который достоверно не был прогестероном, дали имя maturation-promoting factor или MPF. Так называемый "анализ лягушачьих ооцитов" позволил проверить многие клеточные экстракты на наличие MPF. Успех анализа зависел от появления в течение взросления белого пятна, которое появляется, потому что митотическое веретено перемещается из центра клетки на новую позицию, на которой обычно находятся пигменты. Экстракты из многих клеток от дрожжей до человека имели MPF активность, но она проявлялась не на всех стадиях клеточного цикла. Экстракты из клеток в G1 и S фазе не содержали MPF. Однако когда клетка приближалась к митозу, активность появлялась, а после деления резко исчезала. Вторым направлением исследований была генетика дрожжей с различными мутациями, изменяющими нормальное течение клеточного цикла. Делящиеся дрожжи S.pombe оказались удобным объектом исследования. Было выделено множество мутантных штаммов с нарушенным клеточным циклом. Одна из мутаций, сdc2 (сell division cycle), была обнаружена в начале 1980-х Paul Nurse. Продукт гена cdc2 играет важную роль в работе молекулярного

аппарата клеточного цикла. Теперь известно, что это протеин киназа с молекулярным весом 34000д. Очень близкая к ней протеинкиназа, являющаяся продуктом гена CDC28, с аналогичной функцией была обнаружена Lee Hartwell у почкующихся дрожжей S. cerevisiae. Эти киназы обозначаются вместе как р34. В дальнейшем они и их гомологи, выделенные из других организмов были названы Cdk (Cyclin dependent kinase), то есть циклин-зависимыми киназами. В 1983 году Tim Hunt изучал контроль белкового синтеза в яйцах морского ежа и обнаружил, что через 10 минут после оплодотворения появился новый белок. Белок появлялся и исчезал с каждым клеточным делением, из-за чего его назвали циклином. Выделение и очищение MPF было очень долгим процессом. В 1988 году было обнаружено, что MPF состоит из двух белков с молекулярными массами 34000 и 45000д. Анализ первого белка антителами к р34 дрожжей показали, что это одинаковые белки. Дальнейшая работа показала, что второй компонент MPF - циклин. В 2001 году Paul Nurse, Tim Hunt и Lee Hartwell за свои революционные исследования регуляции клеточного цикла получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине.

6. 4. Циклин-зависимые киназы и циклины

Циклин зависимые киназы (Cdk) - это клеточные машины, которые запускают события клеточного цикла и являются своеобразными часами этих событий. Кроме того, они выполняют функцию информационных процессоров, которые интегрируют внеклеточные и внутриклеточные сигналы для тонкой координации событий клеточного цикла. Изучение Cdk необходимо для понимания фундаментальных механизмов контроля клеточного цикла. Каталитическая активность Cdk обеспечивается высокоспецифичными сайтами связывания, что позволяет двум субстратам правильно расположиться относительно друг друга и произвести перенос фосфата АТФ на кислород ОН группы белка-субстрата. Типичная каталитическая субъединица чуть больше, чем минимальный протеинкиназный домен. Члены семейства Cdk состоят из примерно 300 остатков аминокислот. Из них 35-65% идентичны прототипу cdc2/cdc28. Каталитические субъединицы Cdk не действуют в одиночку. Их способность включать события клеточного цикла полностью зависит от взаимодействия с циклиновыми субъединицами. Отсюда и происходит название cyclin dependent kinase. Хотя связывание с циклином и является определяющим, существуют дополнительные регуляторные субъединицы и протеин киназы, которые модулируют активность CDK, распознавание субстрата и субклеточную локализацию. Cdk определяются как белковые киназные каталитические субъединицы. Продукт cdc2 гена, р34, считается прототипом циклин-киназной единицы и служит эталоном для сравнения других циклин-киназ. В регуляции клеточного цикла дрожжей участвует всего одна циклин зависимая киназа р34. В разные периоды клеточного цикла она активируется присоединением соответствующего циклина и фосфорилирует специфические для этого периода субстраты (рис. 32). Видно, что периоды активностей Cdk перекрываются. У позвоночных открыто более десяти белков подобных cdc2/cdc28. Большинство Cdk являются некритическими регуляторами клеточного цикла. Лишь Cdk1 и Cdk2, структурные гомологи cdc2/cdc28, выполняют в нем главную роль. В настоящее время известно восемь циклинов, обозначаемых латинскими буквами от А до Н. Все циклины имеют общую последовательность длиной 100-150 аминокислотных остатков, называемую циклиновым боксом, которая необходима для связывания с CDK. На основании анализа кристаллической структуры циклин А1 состоит из двух компактных центральных доменов, каждый из которых представлен пятью спиралями, и двух дополнительных спиралей у С- и N-конца.

Рис. 32. Движение по клеточному циклу определяется последовательной активацией различных комплексов циклин-CdK. Большинство из них - мишени активирующего действия онкогенов или ингибирующего действия опухолевых супрессоров. Эти данные позволяют предположить, что пятиспиральный домен является ядром всех циклинов. Циклин подобные домены имеют некоторые pRb белки (р35) и фактор транскрипции TFIIB. 6.5. Регуляция активности Cdk

Известно по крайней мере четыре механизма регуляции активности Cdk: 1. Первичный механизм активации - связывание с субъединицей циклина. 2. Полная активация Сdk путем фосфорилирования с помощью циклин активирующей киназы CAK (cyclin activating kinase) 3. Ингибирование активной Cdk путем связывания с регуляторной субъединицей CKI (cyclin kinase inhibitor). 4. Ингибирование Cdk фосфорилированием ингибирующего сайта. Рассмотрим эти механизмы. 1.Связывание с циклином. По определению, активация Cdk требует его связывания с циклином. На рис. 33 представлен такой комплекс. Ясно, что все Cdk не связывают все циклины, так как в их взаимодействии есть значительная специфичность. Биохимические свойства Cdk-циклин взаимодействия варьируют в различных комплексах. Некоторые комплексы, как например циклин В - Cdk1, циклин А - Cdk2 и циклин Е - Cdk2, взаимодействуют с высокой активностью в отсутствии каких-либо дополнительных компонентов или модификаторов. Другие, например циклин А - Cdk2 и циклин Н - Cdk7, не взаимодействуют до тех пор, пока субъединица Cdk не будет фосфорилирована по треониновому остатку. В необычных случаях требуется третья субъединица - Mat1.

Рис. 33. Структура Cdk2-циклин А1-АТФ комплекса человека. Cdk2 расположена слева. Циклин А - справа. Т-петля обозначена черной стрелкой. Связывание Cdk2 и циклина А включает взаимодействие между спиралью PSTAIRE Cdk-2 и спиралями 3 и 5 циклина А, а также между спиралью N циклина А и С-терминальной областью Cdk2. Связывание циклина вызывает значительные конформационные изменения в Cdk2. Спираль 1.12 Т-петли расположена в ?-цепи, позволяя спирали PSTAIRE двигаться вовнутрь, чтобы корректировать расположение участка цепей, участвующих в ориентировке фосфата АТФ. Т-петля является уплощенной относительно ее позиции в мономере. 2.Активирующее фосфорилирование Cdk. Связывание циклина А с Cdk2 увеличивает киназную активность последней на несколько порядков. Это объясняется конформационными измененими Cdk. В основном изменения касаются Т-петли Cdk. В несвязанном состоянии Тпетля закрывает сайт связывания с белком-субстратом, что препятствует его взаимодействию с АТФ. Кроме того, небольшая спираль на конце петли (Helix L12) вызывает конформационные изменения АТФ-связывающего сайта, что не позволяет фосфату ориентироваться правильно относительно белка субстрата (Рис. 33). Образование циклинкиназного комплекса происходит благодаря взаимодействию спирали PSTAIRE киназы со спиралями 3 и 5 циклина, а также С-концевой доли киназы и спирали N циклина. При этом спираль L12 распрямляется и превращается в бета-складку, что позволяет спирали PSTAIRE переместиться ближе к АТФ связывающему центру. Перемещение спирали PSTAIRE исправляет конформацию АТФ - связывающего сайта, делая его активным, так как теперь фосфат ориентирован правильно. Кроме того, Т-петля выравнивается, становясь плоской, и сайт связывания с белком-субстратом становится доступным. Дополнительное фосфорилирование треонина-161 Т-петли CAK (cyclin activating kinase) приводит к дополнительной активации Cdk2 в 80-300 раз. Механизм этой активации следующий: фосфат треонина-161 встроен в катионный карман под Т-петлей и действует как центральный узел для сети водородных связей, стабилизирующих взаимодействие Cdk2 и циклина А. При этом Т-петля выравнивается в одной плоскости еще сильнее и приближается к циклину, что приводит к конформационным изменениям формы связывающего белок центра. Других конформационных изменений не происходит. Следовательно, фосфорилирование Cdk необходимо лишь для улучшения связывания с белковым субстратом. К CAK (cyclin activating kinase) высших эукариот относится тримерный комплекс

Cdk7-циклин Н-Mat1. Он способен связываться с TFIIH - фактором репарации, а также фактором транскрипции, участвующим в работе РНК полимеразы II. Активность Cdk7 не является регулятором клеточного цикла у позвоночных. 3 Ингибиторы Cdk. Существует два основных семейства CKI (cyclin kinase inhibitor) белков, осуществляющих ингибирование Cdk. Представители первого семейства Cip/Kip (CDK inhibitory protein) - р21, р27 и р57, ингибируют Cdk2 и Cdk4/6 циклиновые комплексы, осуществляя G1 и G1/S контроль. Представители второго семейства INK4 (inhipitor of kinase 4) - р15, р16, р18 и р19, узкоспецифичны для CDK4/6-цD комплексов и осуществляют аналогичные функции. Лучше всего изучена структура молекул семейства Cip/Kip. Эти белки содержат два мотива: короткий мотив на N-конце для связывания с циклином и более сложный сегмент у Сконца для связывания с CDK. Получена кристаллическая структура комплекса Cdk2-циклин Ар27. Структура р27, связанного с комплексом Cdk2-цА, представлена на рис. 34. Малая спираль на С-конце р27 помещается в центр связывания АТФ, чем и объясняется его ингибирующая активность.

Рис. 34. Структура связи комплекса cdk2-циклин А1 с усеченным пептидом р27. Циклин А1 и cdk2 расположены как на рис. 33. Пептид р27 (затемнен) протянут через вершину комплекса, причем N-конец связан с циклином А1, а С-концевая область на некотором протяжении взаимодействует с субъединицей Сdk2, разрывая ?-складку малой доли и внедряя малую спираль в АТФ-связывающий сайт. Сdk2 в этом комплексе фосфорилирована киназой CAK по Thr160 Т-петли. Представленная структура иллюстрирует эффект фосфорилирования, что приводит к дальнейшему сплющиванию Т-петли относительно ее позиции в нефосфорилированном комплексе. Последовательности, близкие к циклин связывающим мотивам для р21 и р27, были найдены в факторе транскрипции E2F и pRb, которые взаимодействуют с циклином А. Таким образом, Cip/Kip, по-видимлму, ингибируют фосфорилирование этих субстратов, конкурируя с ними за связывание с циклином. Как следует из функциональных особенностей CKI, их активация происходит, когда дальнейшее продолжение клеточного цикла нежелательно. Так, например, лишение клеток питательных веществ приводит к увеличению уровня р27, а внеклеточный ингибитор роста

TGF- вызывает увеличение уровня р15. Повреждения ДНК активирует транскрипцию р21 под действием белка р53. Белок p21 способен ингибировать белок PCNA, принимающий участие в репликации ДНК. Таким образом, осуществляется остановка клетки в сверочной точке G1 фазы, что позволяет клетке репарировать повреждения ДНК.

6.6. Ингибирующее фосфорилирование.

Cdk могут также ингибироваться фосфорилированием. Ингибиторное фосфорилирование вносит вклад в отсчет времени митоза. До митоза комплекс циклин В-cdc2 (Cdk1) инактивирован фосфорилированием по треонину-14 и тирозину-15. Фосфорилирование остатков у позвоночных осуществляется Myt1 и Wee1 соответственно. К концу G2 резкое дефосфорилирование этих двух остатков активирует cdc2 и запускает митоз. Дефосфорилирование осуществляется фосфатазами семейства CDC25. Во время митоза Myt1, Wee1 и CDC25 фосфорилированы. Это уменьшает активность Myt1, тогда как активность CDC25 увеличивается, что способствует активации cdc2. Интересно, что циклин В-cdc2 может непосредственно активировать CDC25. Такая прямая обратная связь и обеспечивает резкое дефосфорилирование. Кроме циклин В-cdc2 в фосфорилировании CDC25 принимают участие представители семейства Polo киназ (Polo like kinase 1 - Plk1 у млекопитающих).

6.7. Регуляция циклинов

Регуляция циклинов осуществляется на двух уровнях: транскрипции генов и деградации белка. Регуляция транскрипции генов циклинов у высших эукариот изучена на примере перехода ограничительной точки клеточного цикла. Центральную роль в этом переходе играет E2F, фактор транскрипции некоторых генов, необходимых для синтеза ДНК в S фазе. Он стимулирует также транскрипцию генов циклина А, циклина Е и своего собственного гена. Белок pRb ингибирует E2F, связываясь с последним в G1 фазе. Факторы роста стимулируют транскрипцию циклина D через Ras-Raf-MAP сигнальный каскад или под действием цАМФ. Происходит накопление комплексов циклин D-Cdk4, которые начинают фосфорилировать Rb, что приводит к его диссоциации от E2F. Освободившийся E2F стимулирует транскрипцию своего гена и гена циклина Е. Образующийся вследствие этого комплекс CDK2-цЕ, еще активнее фосфорилирует pRb. Таким образом, сеть эффектов через петлю положительной обратной связи приводит к быстрому возрастанию E2F зависимой транскрипции и переходу клетки в начало S фазы. Вскоре после этого в клетке появляются комплексы Cdk2-цА, которые фосфорилируют E2F, уменьшая его способность связываться с ДНК. Другим способом регуляции циклинов является их разрушение протеолизом. Таким образом контролируется, например, выход из митоза. Деструкция митотических циклинов необходима для начала телофазы и подготовки к следующему циклу. Возле N-конца митотические циклины А и В несут небольшую последовательность, называемую боксом деструкции. Эта последовательность необходима для конъюгации циклина с убиквитином, который является маркером для узнавания циклина протеазой. Большая часть цитозольного протеолиза осуществляется протеосомами. Протеосомы - это нелизосомальные мультикаталитические протеиназы, обнаруженные у эукариот, широко распространенные в цитоплазме. Они обладают 20S каталитическим ядром (М = 700 кд) которое осуществляет АТФзависимую деградацию убиквитинированных белков. 20S протеосома состоит из 14 субъединиц, представляющих собой различные протеазы. Они образуют бочкообразную структуру с активными центрами внутри. Большие протеазные комплексы, по крайней мере,

из десяти различных полипептидов образуют дно и крышку такой бочки. Из роль, видимо, заключается в транспорте убиквитинированных белков в центр бочки. Ключевым регуляторным компонентом в деструкции митотических циклинов является мультисубъединичный комплекс APC (anaphase promoting complex) или циклосома. Этот комплекс осуществляет присоединение убиквитина к циклинам и другим субстратам. Комплекс имеет различную субстратную специфичность в переходе метафаза-анафаза и выходе из митоза, так как связан в эти периоды с двумя различными регуляторными белками - Сdc20 и Hct1 соответственно. Одним из субстратов ACP-Сdc20 является комплекс белков секурина и сепарина, который удерживает вместе сестринские хроматиды хромосомы. APC-Сdc20 способствует разрушению секурина, под действием освободившегося сепарина сестринские хроматиды расходятся, то есть осуществляется переход в анафазу. Комплекс APC-Hct1 осуществляет убиквитинирование циклина В. АСР активируется после длительного лагпериода посредством циклин А-Cdk2 и инактивируется под действием G1 циклинов. Таким образом, молекулярные механизмы, которые запускают все события клеточного цикла, должны работать по принципу "все или ничего", действуя необратимо и постоянно. Клеточный цикл можно рассматривать как продукт программы резкого возрастания и падения активности Cdk. Активация одного циклин-киназного комплекса должна быть не только триггером событий клеточного цикла, но и должна инициировать активацию следующего циклин-киназного комплекса. Таким образом, запрограммированная последовательность передачи сигнала от одного комплекса к другому представляет собой часы клеточного цикла. Классическим примером автономного колебания активности Cdk является колебание активности комплекса циклин В-cdc2 (MPF) в раннем эмбрионе лягушки Xenopus. После деструкции комплекса циклин А-cdc2 и выхода из S фазы постоянный синтез циклина В приводит к его накоплению и, следовательно, образованию комплексов циклин В-cdc2. Первоначально эти комплексы неактивны, так как они ингибированы фосфорилированием по треонину-14 и тирозину-15 киназой Wee1. Однако по мере их накопления достигается порог концентрации, при котором они могут фосфорилировать CDC25 и Wee1, вызывая соответственно их активацию и ингибирование. Фосфорилированная CDC25 дефосфорилирует и активирует циклин-киназный комплекс. Положительная обратная связь этих двух процессов вызывает резкое возрастание киназной активности циклин В-cdc2. Повышенная киназная активность вызывает переход клетки к митотическому статусу через фосфорилирование различных клеточных субстратов. После слабо изученной лаг-фазы активированный циклинкиназный комплекс инициирует деградацию циклина под действием убиквитин-зависимого протеолиза. Разрушение циклина вызывает потерю киназной активности и выход из митоза.

Глава 7. Механизмы запрограммированной клеточной гибели. Апоптоз В настоящее время известно, что в основе механизмов трансформации клетки лежит изменение контроля пролиферации или апоптоза. Апоптоз - это генетически запрограммированный путь клеточной смерти, необходимый в развитии многоклеточного организма и участвующий в поддержании тканевого гомеостаза. Этот механизм, как известно, вызывается различными сигналами: связыванием с рецепторами специфических киллерных лигандов, нехваткой факторов роста/выживания, повреждениями ДНК и разрушениями цитоскелета, гипоксией и другими неблагоприятными условиями.

7.1. Морфология апоптоза.

С начала фенотипического описания апоптоза было замечено, что этот процесс встречается в большинстве, если не во всех, типах клеток организма. В основе этой гипотезы лежало морфологическое сходство в клетках различных тканей, вступающих на этот путь. Для таких клеток характерны изменения, среди которых одними из первых является сжатие клетки и потеря ею контактов с окружающими клетками и межклеточным матриксом. На ранних стадиях апоптоза плазматическая мембрана умирающей клетки остается интактной. Клетка посылает сигналы, и окружающие клетки узнают и фагоцитируют ее. Одним из таких сигналов является экспозиция на поверхности фосфатидилсерина. Это происходит до снижения митохондриального трансмембранного потенциала и высвобождения цитохрома С, об этих событиях будет сказано ниже. Для облегчения своего поглощения апоптотическая клетка уменьшает свой объем, выкачивая ионы (К , С1-, органические осмолиты), и сокращается, перестраивая цитоскелет. Кроме того, плазматическая мембрана клетки начинает образовывать пузырьки, что в отсутствие фагоцитоза приводит к формированию апоптозных телец, содержащих конденсированные или морфологически не измененные органеллы. Также сокращение клетки обычно сопровождается уплотнением ядерного содержимого. Происходит агрегация хроматина и фрагментация ядра. Было показано, что после индукции апоптоза расщепление ДНК начинается с образования высокомолекулярных фрагментов длиной 50-300 т.п.н, что близко по размеру длине ДНК в петлях хромосом. Затем эти фрагменты обычно распадаются до нуклеосом и их олигомеров. Большинство из вышеперечисленных изменений можно легко заметить под микроскопом. Апоптоз имеет свои отличительные морфологические признаки, как на светооптическом, так и на ультраструктурном уровне. При окраске гематоксилином и эозином апоптоз определяется в единичных клетках или небольших группах клеток. Апоптотические клетки выглядят как округлые или овальные скопления интенсивно эозинофильной цитоплазмы с плотными фрагментами ядерного хроматина. Поскольку сжатие клетки и формирование апоптотических телец происходит быстро и также быстро они фагоцитируются, распадаются или выбрасываются в просвет органа, то на гистологических препаратах он обнаруживается в случаях его значительной выраженности. К тому же апоптоз - в отличие от некроза никогда не сопровождается воспалительной реакцией, что также затрудняет его гистологическое выявление. В табл. 9 приведены данные по сравнительной характеристике некроза и апоптоза Табл. 9. Сравнительная характеристика некроза и апоптоза Апоптоз

Некроз

Распространенность

Одиночная клетка

Группа клеток

Индукция

Активируется физиологическими/или патологическими стимулами

Различная в зависимости от повреждающего фактора

Биохимические изменения

Энергозависимая фрагментация ДНК эндогенными эндонуклеазами Лизосомы интактные

Нарушение или прекращение ионного обмена. Из лизосом высвобождаются ферменты

Распад ДНК

Внутриядерная конденсация с расщеплением на фрагменты

Диффузная локализация в некротизированной клетке

Признак

Целостность клеточной Сохранена мембраны

Нарушена

Морфология

Набухание и лизис клеток

Сморщивание клеток и фрагментация

Воспалительный ответ Нет

Обычно есть

Удаление погибших клеток

Поглощение (фагоцитоз) нейтрофилами и макрофагами

Поглощение (фагоцитоз) соседними клетками

Апоптоз отличается от некроза по количеству вовлеченных в процесс клеток, по основным биохимическим и морфологическим показателям. При апоптозе сохраняется целостность плазматической мембраны и отсутствует воспалительный ответ. Изменение морфологических признаков более четко выявляют электронномикроскопическим исследованием. Для клетки, подвергающейся апоптозу характерно: Сжатие клетки. Клетка уменьшается в размерах; цитоплазма уплотняется; органеллы, которые выглядят относительно нормальными, располагаются более компактно. Предполагается, что нарушение формы и объема клетки происходит в результате активации в апоптотических клетках трансглютаминазы. Этот фермент вызывает прогрессивное образование перекрестных связей в цитоплазматических белках, что приводит к формированию своеобразной оболочки под клеточной мембраной, подобно ороговевающим клеткам эпителия. Конденсация хроматина. Это наиболее характерное проявление апоптоза. Хроматин конденсируется по периферии, под мембраной ядра, при этом образуются четко очерченные плотные массы различной формы и размеров. Ядро же может разрываться на два или несколько фрагментов. Механизм конденсации хроматина изучен достаточно хорошо. Он обусловлен расщеплением ядерной ДНК в местах, связывающих отдельные нуклеосомы, что приводит к развитию большого количества фрагментов, в которых число пар оснований делится на 180200. При электрофорезе фрагменты дают характерную картину лестницы. Эта картина отличается от таковой при некрозе клеток, где длина фрагментов ДНК варьирует. Фрагментация ДНК в нуклеосомах происходит под действием кальций чувствительной эндонуклеазы. Эндонуклеаза в некоторых клетках находится постоянно (например, в тимоцитах), где она активируется появлением в цитоплазме свободного кальция, а в других клетках синтезируется перед началом апоптоза. Однако еще не установлено, каким образом после расщепления ДНК эндонуклеазой происходит конденсация хроматина. Формирование апоптотических телец. В апоптотической клетке первоначально формируются глубокие впячивания поверхности с образованием полостей, что приводит к фрагментации клетки и формированию окруженных мембраной апоптотических телец, состоящих из цитоплазмы и плотно расположенных органелл, с или без фрагментов ядра. Фагоцитоз апоптотических клеток или телец осуществляется окружающими здоровыми клетками или макрофагами. Апоптотические тельца быстро разрушаются в лизосомах, а окружающие клетки либо мигрируют, либо делятся, чтобы заполнить освободившееся после гибели клетки пространство. Фагоцитоз апоптотических телец макрофагами или другими клетками активируется рецепторами на этих клетках: Они захватывают и поглощают апоптотические клетки. Один из таких рецепторов на макрофагах - рецептор витронектина, который является ?3-интегрином и активирует фагоцитоз апоптотических нейтрофилов.

7.2. Молекулярно-генетические аспекты апоптоза.

Существует несколько путей реализации апоптоза. 1. Важное место занимает путь, опосредованный физиологическими индукторами, действие которых реализуется через клеточные рецепторы, специально предназначенные для включения программы апоптоза. Этот путь передачи сигнала запрограммированной клеточной смерти схематически можно изобразить следующим образом: индукторы ==> рецепторы ==> адаптеры ==> инициирующие каспазы ==> регуляторы ==> эффекторные или казнящие каспазы. Так, рецептор, обозначаемый Fas, взаимодействуя с соответствующим лигандом (лигандом FasL), трансмембранным белком Т-киллера, активируется и запускает программу смерти клетки, инфицированной вирусом. Тем же путем при взаимодействии с лигандом FasL на

поверхности ТН-1-лимфоцитов или с антителом к Fas-рецептору погибают ставшие ненужными выздоровевшему организму В лимфоциты, продуценты антител, несущие Fas-рецептор. FasLлиганд, относящийся к многочисленному семейству фактора некроза опухолей (TNF - tumor necrosis factor). Это семейство гомотримерных лигандов, кроме FasL и TNFa , включает TNFb (лимфотоксин), TRAIL (Apo2L), CD40L, CD27L, CD30L, OX40L. Fas - член семейства рецепторов TNF. Все они представлены трансмембранными белками, которые внеклеточными участками взаимодействуют с тримерами лигандов-индукторов. Взаимодействие рецептора и лиганда приводит к образованию кластеров рецепторных молекул и связыванию их внутриклеточных участков с адаптерами. Адаптер, связавшись с рецептором, вступает во взаимодействие с эффекторами, пока еще неактивными предшественниками протеаз из семейства инициирующих каспаз. Взаимодействие адаптера с рецептором и эффектором осуществляется через гомофильные белок-белковые взаимодействия небольших доменов: DD (death domain - домен смерти), DED (death-effector domain - домен эффектора смерти), CARD (caspase activation and recruitment domain - домен активации и рекрутирования каспазы). Все они имеют сходную структуру, содержат по шесть a-спиральных участков. Домены DD участвуют во взаимодействии рецептора Fas c адаптером FADD (Fas-associated DDprotein) и во взаимодействии рецепторов TNFR1 и DR3 (death receptor 3) с адаптером TRADD (TNFR1-associated DD-protein). Домены DED участвуют во взаимодействии адаптера FADD с прокаспазами 8 и 10. Адаптер RAIDD (RIP-associated Ich-1/CED-3 homologous protein with a death domain, RIP - receptor interacting protein) связывается с прокаспазой-2 через CARD-домены. Наиболее подробно охарактеризована прокаспаза-8 (FLICE/MACH/Mch5), рекрутируемая рецептором Fas через адаптeр FADD. Образуются агрегаты FasL - Fas - FADD - прокаспаза-8. Подобные агрегаты, в которых происходит активация каспаз, называются апоптосомами, апоптозными шаперонами, или сигнальными комплексами, индуцирующими смерть (DISC - death-inducing signaling complex). Каспазы - семейство цистеиновых протеиназ, расщепляющих свои субстраты по остаткам аспартатовой кислоты. Каспазы присутствуют в цитоплазме в виде проэнзимов и активируются до полностью функциональных протеаз путем расщепления проэнзима на большую и малую субединицы и дальнейшего отщепления от них N-концевых доменов. Затем субъединицы собираются в тетрамер с двумя активными центрами. Расщепление прокаспаз могут осуществлять различные протеазы, в том числе и другие каспазы. По выполняемой каспазами функции их можно разделить на две основные группы: инициаторные каспазы (8, 9 и10) и вторая группа эффекторные каспазы (3, 6 и 7). После того, как каспазы из первой группы активируют эффекторные каспазы, процесс, запущенный программой смерти, оказывается необратимым. Расщепление 3, 6 и 7 каспазами ряда ключевых субстратов, в частности DFF45/ICAD ингибитора нуклеазы DFF40/CAD (осуществляется каспазой 3), ламинов - ядерных цитоскелетных белков (осуществляется каспазой 6) и т.д., приводит к фрагментации ДНК и деструкции клетки. Существуют другие пути активации каспазы-8 - с участием рецепторов TNFR1 и DR3. Однако эти пути, включаемые одним и тем же адаптером TRADD, конкурируют с параллельными путями активации ядерных факторов транскрипции NF-єB (nuclear factor kappa B) и JNK/AP1 (JNK, Jun-N-концевая киназа, является компонентом митоген-активируемого киназного пути, ведущего к активации фактора транскрипции AP-1), зависимыми от адаптеров RIP и TRAF (TNFR1-associated factor), под контролем этих факторов транскрипции находится синтез белковых регуляторов, которые блокируют TNF- или Apo3L-индуцированную активацию каспазы-8. Предполагаются следующие пути передачи про- и антиапоптозных сигналов:

2. Существует путь передачи сигнала апоптоза с участием эндоплазматического ретикулума (ЭР). В ЭР локализована прокаспаза-12. Нарушение внутриклеточного Ca2+гомеостаза добавкой тапсигаргина или Ca2+-ионофорного антибиотика А23187 ведет к апоптозу клеток, вызванному превращением прокаспазы-12 в каспазу-12. ЭР-зависимый апоптоз связан с болезнью Альцгеймера: кортикальные нейроны мышей, дефицитных по каспазе-12, устойчивы к апоптозу, индуцированному І-амилоидным белком, но не к апоптозу с участием рецепторов плазматической мембраны или митохондриального цитохрома С. 3. Цитотоксические лимфоциты, Т-киллеры, могут вызывать апоптоз у инфицированных клеток с помощью белка перфорина. Полимеризуясь, перфорин образует в цитоплазматической мембране клетки-мишени трансмембранные каналы, по которым внутрь клетки поступают TNFb , гранзимы (фрагментины) - смесь сериновых протеаз. Существенным компонентом этой смеси является гранзим В - протеолитический фермент, превращающий прокаспазу-3 в активную каспазу-3. 4. Высвобождаемый из митохондрий цитохром С вместе с цитоплазматическим фактором APAF-1 (apoptosis protease activating factor-1) участвует в активации каспазы9. APAF-1 - белок с молекулярной массой 130 кДа, содержащий CARD-домен (caspase activation and recruitment domain) на N-конце и 12 повторяющихся аминокислотных WD-40последовательностей (WD - дипептид из триптофана и аспартата) на С-конце, образует комплекс с прокаспазой-9 в присутствии цитохрома С и dATP или АТР. К наиболее охарактеризованным WD-белкам относится ?-cубъединица G-белков. Из этих субъединиц собираются жесткие, симметричные структуры, наподобие веера или пропеллера. WD-повторы свойственны белкам, участвующим в регуляции деления и дифференцировки эукариотических клеток, транскрипции генов, модификации мРНК, трансмембранной передачи сигналов, слияния мембранных везикул. Среди прокариот WD-белки обнаружены у цианобактерий. APAF-1 играет роль арматуры, на которой происходит аутокаталитический процессинг каспазы-9. Предполагается, что в результате зависимого от гидролиза dATP (или АТР) конформационного изменения APAF-1 приобретает способность связывать цитохром С. Связав цитохром С, APAF-1 претерпевает дальнейшее конформационное изменение, способствующее его олигомеризации и открывающее доступ CARD-домена APAF-1 для прокаспазы-9, которая тоже содержит CARD-домен. Так образуется конструкция, называемая тоже апоптосомой, с молекулярной массой > 1,3 млн дальтон, в составе которой - не менее 8 субъединиц APAF1. Благодаря гомофильному CARD-CARD-взаимодействию с APAF-1 в эквимолярном соотношении связывается прокаспаза-9, а затем прокаспаза-9 связывает прокаспазу-3. Пространственное сближение молекул прокаспазы-9 на мультимерной арматуре из APAF-1-цитохром-Скомплексов, по-видимому, приводит к межмолекулярному протеолитическому процессингу прокаспазы-9 с образованием активной каспазы-9. Сходный механизм предложен для активации прокаспазы CED-3 у нематоды Caenorhabditis elegans - аналога прокаспазы-9 млекопитающих. Альтернативный вариант - прокаспаза-9, связавшись с апоптосомой, может

принять конформацию, которая приводит к внутримолекулярному процессингу (самоактивации). Зрелая каспаза-9 затем расщепляет и активирует прокаспазу-3. Мутантный APAF-1, лишенный WD-40-повторов, активирует прокаспазу-9, но не способен к рекрутированию и активации прокаспазы-3. Флавопротеин AIF, будучи добавленным к изолированным ядрам из клеток HeLa, вызывает конденсацию хроматина и фрагментацию ДНК, а при добавлении к изолированным митохондриям печени крыс - высвобождение цитохрома С и каспазы-9. Микроинъекция AIF в интактные фибробласты крыс приводит к конденсации хроматина по переферии ядра, разрыву ДНК на крупные фрагменты длиной 50 т.п.н. и больше, снижению мембранного потенциала в митохондриях и переходу фосфатидилсерина из внутреннего слоя цитоплазматической мембраны в наружний. Ни один из этих эффектов AIF не предотвращается пептидным ингибитором каспаз N-бензоилоксикарбонил-Val-Ala-Asp.трифторметилкетоном (Z-VAD.fmk), который предотвращает апоптоз, индуцированный микроинъецированным цитохромом С. Эти данные показывают, что AIF является митохондриальным эффектором апоптоза у животных, действующим независимо от каспаз (Susin S. A. et al, 1999). Кроме рассмотренных компонентов, при нарушении наружной мембраны митохондрий из межмембранного объема выделяется термолабильный фактор, вызывающий необратимое превращение ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу. Фактор устойчив к ряду испытанных ингибиторов протеаз, включая каспазы, сериновые и металлопротеазы. Ксантиндегидрогеназа катализирует зависимое от NAD+ окисление ксантина до гипоксантина и последующее окисление гипоксантина до мочевой кислоты. Ксантиноксидаза катализирует те же реакции, но не с NAD+, а с О2 в качестве акцептора электронов. При этом образуются О2A, Н2О2, а из них - и другие активные формы кислорода (АФК), которые разрушают митохондрии и являются мощными индукторами апоптоза. Механизмы образования АФК, конечно, не ограничиваются ксантиноксидазной реакцией. Главным источником АФК в клетках являются митохондрии. Резкое увеличение АФК происходит при возрастании мембранного потенциала в митохондриях, когда снижено потребление ATP и скорость дыхания лимитируется ADP. Доля электронного потока через дыхательную цепь митохондрий, идущая на образование О2A, достигает 1-5 %. Цитоплазматическая мембрана макрофагов и нейтрофилов, как уже отмечалось, содержит О2A - генерирующую NADPH-оксидазу. В зависимости от пути, по которому осуществляется активация каспаз, различают несколько типов клеток. Клетки типа I (в частности, линия лимфобластоидных В-клеток SKW и T-клетки линии Н9) подвергаются программированной гибели по пути, зависимому от апоптозных рецепторов плазматической мембраны без участия митохондриальных белков. Клетки типа II (например, линии Т-клеток Jurkat и СЕМ) погибают по пути апоптоза, зависимому от митохондриального цитохрома С. Запрограммированная клеточная смерть, вызванная химиотерапевтическими соединениями, УФ- или ?-облучением, по-видимому, напрямую связана с апоптозной функцией митохондрий: клетки, лишенные генов белка APAF-1 или каспазы-9, устойчивы к химио- и радиационной обработке, но погибают при индукции Fas-рецептора. Некоторые клетки, например, клетки эмбриональной нервной системы, включают механизмы апоптоза, если они испытывают дефицит апоптозподавляющих сигналов (называемых также факторами выживания) от других клеток. Физиологический смысл процесса - в элиминации избыточных нервных клеток, конкурирующих за ограниченное количество факторов выживания. Эпителиальные клетки при отделении от внеклеточного матрикса, вырабатывающего факторы выживания, тоже обречены на гибель. Факторы выживания связываются соответствующими цитоплазматическими рецепторами, активируя синтез подавляющих апоптоз агентов и блокируя стимуляторы апоптоза. Некоторые вещества (например, стероидные гормоны) оказывают дифференцированный эффект на различные типы клеток - предотвращают апоптоз одних типов клеток и индуцируют его у других. 5. Взаимодействие клеток с внеклеточным матриксом осуществляется с помощью интегринов. Интегрины - большое семейство гетеродимерных мембранных белков, которые участвуют в адгезии клеток, связывая внутриклеточный цитоскелет с лигандами внеклеточного матрикса. Нарушение адгезии клеток индуцирует апоптоз. Большинство

интегринов специфически взаимодействует с трипептидным RGD (аргинин-глицин-аспартат)мотивом, входящим в состав белков внеклеточного матрикса. Растворимые низкомолекулярные RGD-содержащие пептиды являются эффективными индукторами апоптоза: проникая в клетки, они активируют латентную каспазу-3. Ряд каспаз, включая каспазу-3, содержит RGDпоследовательность вблизи активного центра фермента. В молекуле прокаспазы эта последовательность, вероятно, вовлечена во внутримолекулярное взаимодействие, придающее молекуле профермента такую конформацию, при которой протеазная активность не может проявиться. Предположительно RGD-последовательность взаимодействует с последовательностью DDM (аспартат-аспартат-метионин), локализованной вблизи участка протеолитической активации прокаспазы-3. Низкомолекулярный RGD-пептид, проникая в клетку и вступая в конкурентные взаимоотношения с RGD-последовательностью прокаспазы-3, вытесняет ее из сферы взаимодействия с DDM-последовательностью молекул профермента и индуцирует изменение их конформации, олигомеризацию и аутопроцессинг прокаспазы-3 с образованием активной каспазы-3.

7.3. Характеристика белков Вcl-2

Белки семейства Bcl-2 играют центральную роль в выборе между жизнью и смертью клетки. Bcl-2 гомолог белка CED-9 у Caenorhabditis еlegans, первоначально был открыт как протоонкоген, обнаруженный в результате хромосомной транслокации t(14;18) в случае В-клеточной лимфомы. У Bcl-2 первого была обнаружена способность предотвращать апоптоз, индуцированный отсутствием итерлейкина-3 в культуре В-лимфоцитов человека. С тех пор были обнаружены многочисленные гомологи Bcl-2. Это семейство структурно сходных белков включает более двух десятков членов, в том числе продукты протоонкогенов Bcl-2 и Bcl-x, обладающие способностью блокировать апоптоз, и опухолевый супрессор Bax, наоборот, индуцирующий апоптоз. Семейство Bcl-2 белков можно разделить на три основные группы: 1. Антиапоптогенные молекулы, такие как Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, A1(Bfl-1) и Boo. Все они обладают противоапоптозной активностью и имеют четыре группы гомологичных последовательностей BH1, ВН2, ВН3 и ВН4 домены, хотя у некоторых из них ВН4 домен отсутствует. 2. Проапоптогенные молекулы Bax, Bak, Bad, Mtd(Bok) и Diva имеют гомологичные последовательности BH1, ВН2и ВН3, а ВН4 домен у них отсутствует. 3. Проапоптогенные белки, содержащие только ВН3 домен: Bik, Bid, Bim, Hrk(DP5), Blk и Bnip3, Bnip3L. Было показано, что ВН1-3 домены играют важную роль в формировании гетеро- и гомодимеров между проапоптогенными и антиапоптогенными членами семейства, и клеточные уровни этих димеров могут сыграть определяющую роль в судьбе клетки. Гетеродимеризация происходит посредством взаимодействия BH-3 домена проапоптогенного белка с гидрофобным комплексом, образованным BH-1, BH-2 и BH-3 доменами антиапоптогенных белков. Важно то, что домены BH-1 и BH-2, BH-4 необходимы для антиапоптогенной активности белка, в то время как BH-3 домен необходим и достаточен для проапоптогенной активности. Белок Bcl-2 один может связывать, по крайней мере, пять членов семейства, и эта его функция может быть, кроме того, дополнена возможностью посттрансляционной модификации с помощью фосфорилирования. Близкий ген, bcl-x, кодирует два белка, различающихся сплайсингом РНК, Bcl-xL и Bcl-xS. Также как Bcl-2, белок Bcl-xL ингибирует апоптоз, в то время как белок Bcl-xS оказывает негативный эффект на функцию Bcl-2 и Bcl-xL. Повышенная экспрессия генов этих белков может приводить к устойчивости к большинству вызывающим апоптоз стимулам, так как к этим белкам сходится множество путей апоптоза. Большинство антиапоптогенных членов семейства Bcl-2 содержат на С-концевом участке гидрофобную последовательность, которая необходима для связывания с внутриклеточными мембранами.

Таким образом, проапоптогенные и антиапоптогенные члены семейства Bcl-2, в отсутствие сигналов смерти, локализованы в различных внутриклеточных компартментах. Антиапоптогенные молекулы представляют собой мембранные белки, которые находятся в митохондрии, эндоплазматическом ретикулуме и в ядерной мембране. Проапоптогенные молекулы семейства Bcl-2 в основном локализованы в цитозоле или связаны с цитоскелетом. Механизм, с помощью которого белки семейства Bcl-2 регулируют митохондриальнозависимый апоптоз, остается спорным. Недавно было установлено, что VDAC (Voltagedependent anion channel) является одним из функциональных мишеней этих белков. Белки семейства Bcl-2, такие как Bax, Bak, Bcl-2 и Bcl-XL могут взаимодействовать с двумя компонентами РТ (permeability transition) пор, с VDAC, локализованным на наружной митохондриальной мембране, и с ANT (adenine nucleotide translocator), на внутренней мембране. Bcl-2 и Bcl-XL закрывают VDAC-каналы, через которые осуществляется выброс цитохрома С и/или AIF. Bax и Bak, находящиеся в норме в определенных компартментах цитоплазмы, при апоптогенных сигналах перемещаются в митохондриальные мембраны, где они, взаимодействуя с интегральным белком наружной митохондриальной мембраны VDAC, стимулируют открытие канала. Кроме того, Bax образует гетеромерные комлексы с белками Bcl-2, Bcl-x, что, возможно, открывает закрытые до этого каналы. Таким образом, баланс между про- и антиапоптогенными членами семейства Bcl-2 играет решающую роль в судьбе клетки. Заключение

К настоящему времени известно несколько миллионов химических соединений как природного, так и антропогенного происхождения. Многие из них являются токсическими для животных и человека. Большинство токсических веществ подвергаются метаболизму, который осуществляется, главным образом, в печени. Ключевую роль в метаболизме ксенобиотиков играют ферменты 1-й фазы (цитохром Р450) и 2-фазы (трансферазы). Однако наряду с реакциями детоксификации в клетке могут осуществляться реакции токсификации. Этот процесс связан с образованием высоко активных "реактивных" метаболитов, способных связываться с нуклеофильными сайтами макромолекул, в том числе и с ДНК. Существуют системы защиты от ДНК-повреждающих агентов. Идентифицировно множество систем репарации ДНК, начиная с бактерий и заканчивая человеком. Дефекты репарации, нарушение репликации ДНК могут привести к возникновению и фиксации мутаций. Особенно опасным является ситуация, когда мутация произошла генах-мишенях, регулирующих такие жизненно важные процессы, как клеточная дифференцировка, клеточное деление, программированная клеточная гибель. Наше понимание основных механизмов действия токсических соединений на живые системы поможет нам не только понять причины возникновения многих болезней (в том числе и рака), но и научиться бороться с ними.

Библиографический список

1. Гуляева Л.Ф., Гришанова А.Ю. и др. Микросомная монооксигеназная система живых организмов в биомониторинге окружающей среды. Аналитический обзор. ГПНТБ, Новосибирск, 1994 - 98 с. 2. Гуляева Л.Ф., Вавилин В.А., Ляхович В.В. Ферменты биотрансформации ксенобиотиков

в химическом канцерогенезе. Аналитический обзор. ГПНТБ, Новосибирск, 2000 - 90 с. 3. Claassen C.D. " Toxicology . The basic Science of poisons". l New York, Chicago, Toronto, London. Sixth Edition, 2001 - 1236p. 4. McKinnell R.G., Parchment R.E., Perantoni A.O., Pierce G.B. "The Biological Basis of Cancer", Cambridge University Press, 1998 - 378p. 5. David P. Josephy. "Molecular Toxicology", Oxford University Press, 1997 - 367 p. 6. Lewin "Gene", Oxford University Press, 2000 - 990p. 7. В.Д. Самуилов, А.В. Алескин, Е.М., Лагунова. Программированная клеточная гибель. Обзор. Биохимия, 2000, т. 65, вып. 8, с. 1029-1046. 8. Обзорные статьи по биохимии рака. Биохимия, 2000, т. 65, вып. 1, с. 3 -139 9. Robert H. Rice. Biological effects of toxoc compounds. Syllabus. University of California, Davis, 2002. - p. 150