РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ На правах руко...
125 downloads
214 Views
2MB Size
Report
This content was uploaded by our users and we assume good faith they have the permission to share this book. If you own the copyright to this book and it is wrongfully on our website, we offer a simple DMCA procedure to remove your content from our site. Start by pressing the button below!
Report copyright / DMCA form
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ На правах рукописи
ОБОЛЬСКИЙ ОЛЕГ ЛЬВОВИЧ
МОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ АЛИМЕНТАРНЫХ ФАКТОРОВ НА МЕТАБОЛИЗМ ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛА (ВОМИТОКСИНА) У КРЫС
03.00.04. - Биохимия
Д И С С Е Р Т А Ц И Я на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель доктор медицинских наук, академик РАМН, профессор В.А. ТУТЕЛЬЯН
Москва - 2001
ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................................
1
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................................
6
1.1. ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛ И ДРУГИЕ ТРИХОТЕЦЕНОВЫЕ МИКОТОКСИНЫ
6
1.1.1. физико-химические свойства трихотеценовых микотоксинов......
6
1.1.2. Распространенность ДОН и других фузариотоксинов в природе..
8
1.1.3. Токсическое действие трихотеценовых микотоксинов....................
12
1.2. ОСНОВНЫЕ ПУТИ БИОТРАНСФОРМАЦИИ И ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ..................................................................................................
15
1.2.1. Общие сведения........................................................................................
15
1.2.2. Основные пути биотрансформации и детоксикации трихотеценовых микотоксинов............................................................
20
1.2.2.1. Биотрансформация дезоксиниваленола......................................
22
1.3. ВЛИЯНИЕ АЛИМЕНТАРНЫХ ФАКТОРОВ НА МЕТАБОЛИЗМ И ТОКСИЧНОСТЬ КСЕНОБИОТИКОВ..................................................................................................
25
1.3.1. Селен...........................................................................................................
25
1.3.2. Пищевые волокна....................................................................................
30
1.3.3. Пробиотики...............................................................................................
35
1.3.4. Биотрансформация и детоксикация чужеродных соединений при их комбинированном поступлении..............................................
37
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.............................................................................
40
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................................................
40
2.1.1. Животные и их содержание...................................................................
40
2.1.1.1. Экспериментальные рационы......................................................
40
2.1.1.2 Условия эксперимента по изучению метаболизма ДОН............
44
2.1.2. Реактивы и материалы, используемые в работе...............................
45
2.1.3. Физико-химические методы исследования........................................
46
2.1.3.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография..................
46
2.1.3.2. Масс- и хроматомасс-спектрометрия.......................................
47
2.1.4. Метод определения ДОН и его метаболитов в моче крыс...............
47
2.1.5. Статистическая обработка результатов..............................................
48
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.............................................................................
49
2.2.1. Модификация метода количественного определения ДОН и его метаболитов в моче и кале крыс................................................
49
2.2.1.1. Подбор системы для элюирования ДОН и ДОМ-1 с адсорбционной колонки..............................................................
49
2.2.1.2. Определение формы нанесения экстракта образца на колонку............................................................................................
50
2.2.1.3. Определение сульфатных конъюгатов ДОН и ДОМ-1..............
51
2.2.1.4. Модифицированный метод анализа ДОН и его метаболитов в экскретах крыс...................................................
54
2.2.2. Изучение распределения экскретируемых метаболитов ДОН в моче и кале крыс Вистар........................................................................
58
2.2.3. Влияние индукторов ферментов метаболизма ксенобиотиков на метаболизм ДОН у крыс...................................................................
60
2.2.4. Влияние уровня селена в рационе на метаболизм ДОН у крыс........
68
2.2.4.1. Влияние обогащения рациона селеном на метаболизм ДОН у крыс..............................................................................................
68
2.2.4.2. Влияние дефицита селена в рационе на метаболизм ДОН у крыс..............................................................................................
74
2.2.5. Влияние обогащения рациона пектином на метаболизм ДОН у крыс.........................................................................................................
80
2.2.6. Влияние пробиотиков на метаболизм ДОН у крыс..........................
86
2.2.7. Изучение комбинированного действия ДОН и зеараленона на метаболизм ДОН у крыс.........................................................................
93
3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................................
100
4. ВЫВОДЫ............................................................................................................................
105
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................................
106
-1ВВЕДЕНИЕ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ К природным контаминантам продовольственного сырья и пищевых продуктов, представляющих реальную опасность для здоровья человека, относятся микотоксины, что связано с их высокой токсичностью, наличием у большинства из них иммунодепрессивных свойств и у многих — мутагенных, канцерогенных или коканцерогенных свойств [Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985; IARC, 1993; Miller J.D., 1998]. Микотоксины являются продуктами жизнедеятельности повсеместно распространенных микроскопических (плесневых) грибов, способных поражать продовольствие на всех этапах его производства, переработки и хранения. Полагают, что не менее 25% всех продовольственных ресурсов подвержены загрязнению микотоксинами или повреждающему действию плесневых грибов [Pohland A.E., 1998]. Исследования, проведенные как за рубежом, так и в нашей стране, показали, что наиболее часто обнаруживаемыми микотоксинами являются микотоксины, продуцируемые грибами рода Fusarium — трихотеценовые микотоксины (ТТМТ), зеараленон и фумонизины [Саркисов А.Х., 1954; Scott P.M., 1990; Miller J.D., 1995 a; Bhat R., 1999]. В отличие от других микотоксинов, накопление которых в пищевых продуктах является, главным образом, результатом нарушений условий хранения или технологических условий производства продукта, фузариотоксины накапливаются в зерне в процессе его созревания, и интенсивность их синтеза в клетках мицелия зависит в значительной степени от климатических и погодных условий. Необходимо отметить, что проблема загрязнения продовольствия фузариотоксинами имеет выраженную тенденцию к нарастанию по степени риска для здоровья человека. Это определяется отсутствием устойчивости зерновых культур к поражению грибами рода Fusarium, отсутствием перспектив создания сортов, устойчивых к этим видам грибов и отсутствием в настоящее время достаточно эффективных в отношении грибов Fusarium фунгицидов [Львова Л.С. и др., 1992, 1994; Riley R.T., Norred W.R., 1999; Edwards S.G. et al., 2001]. Среди фузариотоксинов широкой распространенностью выделяются дезоксиниваленол (вомитоксин) и зеараленон, а своими выраженными токсическими свойствами — Т-2 токсин [Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985; IARC, 1993]. Дезоксиниваленол (ДОН) в настоящее время, несомненно, является наиболее часто обнаруживаемым в мире микотоксином. ДОН выявляют в качестве контаминанта зерновых культур и, в первую очередь, пшеницы в большинстве регионов мира. Частота обнаруже-
-2ния ДОН в пшенице в разные годы в Канаде, США, в большинстве стран Европы и ряде стран Азии, Африки и Южной Америки достигает 50–100% [Ueno Y., Tanaka T., 1987; Scott P.M., 1989, 1990, 1997; Tutelyan V.A. et al., 1990]. Результаты наших предыдущих исследований [Соболев В.С. и др., 1990; Захарова Л.П. и др., 1994, 1995; Кравченко Л.В. и др., 1998; Tutelyan V.A., 1998] показали, что в период 1986–1999 гг. в некоторых регионах России, относящихся к основным производителям зерна, ежегодная частота контаминации ДОН заготавливаемого зерна пшеницы варьирует от 60 до 100%. Имеются сообщения о высокой частоте (до 41–50 случаев) обнаружения Т-2 токсина в отдельные годы в зерне пшеницы, ячменя и овса в европейских странах — Польше, Германии, Финляндии [Hietaniemi V., Kumpulainen J., 1991; Müller H.M., Schwadore K., 1993; Müller H.M. et al., 1998; Grabarkiewicz-Szczesna J. et al., 2001]. Результаты эпидемиологических наблюдений свидетельствуют, что алиментарные микотоксикозы и, в первую очередь, фузариотоксикозы как у людей, так и у сельскохозяйственных животных, являются обычно следствием поступления с пищей (кормом) нескольких микотоксинов, среди которых один или два являются доминирующими. Так, в описанных в последние годы случаях массовых отравлений в Индии [Bhat R.V. et al., 1989] в пшеничной муке были обнаружены наряду с ДОН еще три трихотеценовых микотоксина — Т-2 токсин, ниваленол и ацетил-ДОН. В Китае, в 35 случаях массовых отравлений, связанных с контаминацией зерна пшеницы и кукурузы микотоксинами, в качестве загрязнителей были обнаружены ДОН и зеараленон [Luo X.Y., 1988]. Практически во всех странах Европы, в Северной и Южной Америке, в ряде стран Азии неоднократно выявляли ДОН вместе с зеараленоном в пшенице, ячмене, овсе [Hietaniemi V., Kumpulainen J., 1991; Yoshizawa T., Jin Y.Z., 1995; Müller H.M. et al., 1998]. Результаты исследований, проведенных в НИИ питания РАМН, показали возможность накопления двух фузариотоксинов — ДОН и зеараленона — в зерне из ареала фузариоза (Краснодарский край) [Львова Л.С. и др., 1994; Кравченко Л.В. и др., 1998]. В связи с тем, что практически невозможно полностью предотвратить заражение сельскохозяйственной продукции микроскопическими грибами и загрязнение их микотоксинами, основной мерой защиты организма от неблагоприятного воздействия этих токсинов является гигиеническое регламентирование их содержания в продовольственном сырье и пищевых продуктах. Как показали результаты наших предыдущих исследований, даже при наличии в достаточной степени налаженной системы
-3контроля за безопасностью продовольственного зерна и пищевых продуктов, сохраняется вероятность постоянного поступления с пищей микотоксинов (главным образом ДОН) в количествах, которые в настоящее время нельзя считать абсолютно безопасными для здоровья человека [Захарова Л.П., 1994, 1995; Кравченко Л.В. и др., 1998]. В связи с этим, наряду с мероприятиями, направленными на предотвращение попадания микотоксинов в организм, важное значение приобретает изыскание путей снижения токсичности поступивших в организм токсинов. К числу наиболее перспективных направлений относится использование пищи и ее компонентов как мощного фактора регуляции процессов токсикокинетики чужеродных соединений, включая этапы всасывания, печеночно-кишечной циркуляции, биотрансформации и детоксикации [Тутельян В.А. и др., 1987; Galvano F. et al., 2001]. Особое внимание привлекают биологически активные компоненты пищи, которые находят широкое применение не только для коррекции структуры питания населения, но и в профилактических целях, для повышения резистентности организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды. Большинство ферментов, занимающих ключевое место в процессах биотрансформации и детоксикации ксенобиотиков и в том числе ТТМТ, являются компонентами мембран, и их активность определяется в значительной степени функциональным состоянием мембран. Кроме того, в единичных исследованиях in vitro показана возможность восстановления эпоксидного кольца трихотеценовых микотоксинов ферментами микрофлоры желудочно-кишечного тракта. В связи с этим особый интерес представляют компоненты пищи, способные оказывать стабилизирующее влияние на мембраны (антиоксиданты) и улучшающие микробиологический баланс кишечника (пробиотики, пищевые волокна). Цель работы состояла в изучении влияния на основные пути биотрансформации и детоксикации ДОН у крыс алиментарных факторов — биологически активных компонентов пищи. Были поставлены следующие задачи: − изучить распределение свободных и конъюгированных форм экскретируемых метаболитов ДОН; − изучить роль микросомальных UDP-глюкуронозилтрансфераз в детоксикации ДОН; − изучить влияние различных уровней селена в рационе на метаболизм ДОН; − изучить влияние обогащения рациона пектином на метаболизм ДОН; − изучить влияние пробиотиков на метаболизм ДОН;
-4− изучить метаболизм ДОН при одновременном поступлении с кормом двух фузариотоксинов — ДОН и зеараленона. НАУЧНАЯ НОВИЗНА − Получены новые данные, подтверждающие, что основными путями детоксикации ДОН у крыс является образование его деэпоксида — ДОМ-1 и конъюгатов ДОН и ДОМ-1. − Впервые показана возможность образования у крыс наряду с глюкуроновыми конъюгатами сульфоконъюгатов ДОН и ДОМ-1. − Впервые получены данные об участии в образовании глюкуроновых конъюгатов ДОН и ДОМ-1 изоформ UDP-глюкуронозилтрансферазы, относящихся к семействам 1А и 2В. − Показано, что как дефицит селена в рационе, так и обогащение рациона селеном приводит к усилению образования и выведения глюкуроновых конъюгатов ДОН, которое
сопровождается
возрастанием
активности
микросомальной
UDP-
глюкуронозилтрансферазы в печени крыс. − Показано, что обогащение рациона крыс пектином усиливает не только экскрецию ДОН, но и образование и выведение его глюкуроновых конъюгатов, что коррелирует с возрастанием в печени крыс активности UDP-глюкуронозилтрансферазы. − Впервые показано, что in vivo пробиотики могут влиять на токсикокинетику ксенобиотиков. − Установлено, что длительное поступление с кормом двух фузариотоксинов — ДОН и зеараленона — в дозах, близких к недействующим для крыс, не оказывает какого-либо влияния на метаболизм ДОН. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Данные об отсутствии изменения метаболизма ДОН у крыс при длительном поступлении с кормом двух фузариотоксинов — зеараленона и ДОН — в дозах, близких к недействующим для крыс, свидетельствуют, что одновременное присутствие в пище двух фузариотоксинов в пределах установленных регламентов не представляет дополнительную опасность для здоровья человека и не требует изменения гигиенических регламентов. Получены новые данные по научному обоснованию использования биологически активных добавок к пище (БАД), содержащих микронутриенты, пробиотики и
-5пищевые волокна, для повышения неспецифической резистентности организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, в частности таких приоритетных загрязнителей пищевых продуктов как микотоксины.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные результаты диссертационной работы были представлены на Первом международном научном конгрессе «Традиционная медицина и питание: Теоретические и практические аспекты» (Москва, 1994), 1-м съезде токсикологов России (Москва, 1998), Международной конференции «Региональные проблемы профилактической медицины» (Великий Новгород, 1999). ПУБЛИКАЦИИ По результатам выполненных исследований опубликовано 6 печатных работ в научных журналах и сборниках научных трудов. ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, двух глав экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 31 таблицу и 14 рисунков. Список литературы включает 294 источника, из которых 239 — иностранных авторов.
-61. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛ И ДРУГИЕ ТРИХОТЕЦЕНОВЫЕ МИКОТОКСИНЫ
Трихотеценовые микотоксины (ТТМТ) — группа близких по химической структуре соединений сесквитерпенового ряда, которые являются вторичными метаболитами микроскопических грибов рода Fusarium. Первым из ТТМТ, выделенным в чистом виде, был трихотецин, полученный из культуры Trichotecium roseum в 1948 г. В настоящее время известно более 40 представителей микотоксинов этой группы. ТТМТ являются наиболее широко распространенными в мире микотоксинами. Среди трихотеценов широкой распространенностью выделяется дезоксиниваленол (ДОН), а своими выраженными токсическими свойствами — Т-2 токсин. Основными грибамипродуцентами ДОН являются F. graminearum и F. culmorum, а Т-2 — F. sporotrichiella и F. poae. 1.1.1. физико-химические свойства трихотеценовых микотоксинов Большинство токсинов, продуцируемых микроскопическими грибами рода Fusarium, относится к производным 12,13-эпокситрихотец-9-ена. В основе структуры трихотеценовых микотоксинов лежит система сопряженных колец, называемое трихотеканом [Godtfredsen W.O., et al., 1967] (рис. 1). Природные трихотецены содержат двойную связь в положении С-9–С-10 и эпоксидную группу при 12 и 13 углеродных атомах [Bamburg J.R., Strong F.M., 1971].
Рис. 1. Структура трихотекана. По своей химической структуре трихотецены разделяются на 4 группы: A, B, C и D [Ueno Y., 1977]. В группу A входят соединения, содержащие при С-8 атом водорода, гидроксил либо сложноэфирную группу (основной представитель Т-2 токсин). Представители группы B имеют при С-8 кетогруппу (основной представитель ДОН).
-7Группа С включает макроциклические трихотецены. Дополнительный макроцикл образован при С-4 и С-15. Группа D представлена соединениями, содержащими вторую эпоксидную группу при С7-С8 (рис. 2).
A
B
C
D
Рис. 2. Структура различных групп трихотеценов. В чистом виде трихотецены представляют собой бесцветные вещества кристаллической природы, оптически активные, нелетучие при обычных условиях. Представители группы А наиболее хорошо растворимы в апротонных растворителях, таких как хлороформ, этилацетат, ацетон. ТТМТ группы В лучше растворяются в более полярных растворителях (спирты, ацетонитрил, вода). На растворимость оказывает влияние степень гидроксилирования молекулы вещества: с увеличением количества гидроксильных групп возрастает растворимость в полярных растворителях [Cole R.G., Cox R.H., 1981; Ueno Y., 1983]. Трихотецены, за исключением некоторых макроциклических соединений, не обладают собственной флуоресценцией и для их обнаружения методом тонкослойной хроматографии используют обработку пластин различными реагентами, образующие с ТТМТ окрашенные или флуоресцирующие комплексы [Scott P.M., 1982; Pohland A.E., et al., 1984; Pohland A.E., et al., 1986].
-8Трихотеценовые микотоксины отличаются высокой химической устойчивостью и термической стабильностью. В природных условиях на них практически не влияют естественные факторы окружающей среды [Львова Л.С., 1985]. Процессы обычной кулинарной и технологической обработки пищи также не приводят к разрушению ТТМТ [Wolf-Hall C.E. et al., 1999]. Такая устойчивость ТТМТ связана с высокой стабильностью эпоксида в структуре токсина, поэтому для раскрытия этого кольца, являющегося основным фактором токсичности, требуются жесткие условия [Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985]. Наиболее эффективными из способов детоксикации являются автоклавирование зерна при повышенном давлении в растворе бисульфита натрия [Young J.C., et al., 1987], обработка концентрированными кислотами и щелочами [Рухляда В.В., 1993]. Однако такие методы детоксикации исключают возможность дальнейшего использования продовольственного сырья. В молекуле всех трихотеценовых микотоксинов имеются две основные функциональные группы, ответственные за токсические свойства этого класса соединений: 12,13-эпоксигруппа и, в меньшей степени, двойная связь С-9 - С-10 [Grove J.F., Mortimer P.H., 1969]. Если восстановление двойной связи С-9 - С-10 приводит к незначительному снижению токсичности, то размыкание эпоксидного кольца и трансформация его в двойную связь С-12 - С-13 вызывает почти полную потерю биологической активности [Bamburg J.R., Strong F.M., 1971; Smalley E.B. et al., 1973; Bamburg J.R., 1976; Grove M.D. et al., 1984; Swanson S.P. et al., 1988]. Кроме того, важную роль в токсичности трихотеценов играет свободная 3α-ОН группа в молекуле ТТМТ групп А и В [Bergmann F. et al., 1988]. На токсичность ТТМТ влияют также боковые ацетильные группы в молекуле некоторых представителей групп А (Т-2 токсин, диацетоксискирпенол и др.) и В (фузаренон-Х, ацетилДОН), изовалериловый радикал при С-8 у Т-2 токсина и некоторых его гомологов (группа А) [Madhyastha M.S. et al., 1994] и наличие макроцикла между углеродными атомами С-4 и С-15 (ТТМТ группы С). ТТМТ групп А и В с гидроксильными группами более токсичны, чем их аналоги с атомом водорода в том же положении [Thompson W.L., Wannenmacher R.W., 1986]. 1.1.2. Распространенность ДОН и других фузариотоксинов в природе Накопленный за последние десятилетия фактический материал позволяет сделать вывод о повсеместном распространении как продуцентов ТТМТ, так и самих токсинов [Scott P.M., 1990; Miller J.D., 1995 a]. Наиболее часто грибы рода Fusarium по-
-9ражают злаковые сельскохозяйственные культуры в регионах с влажным и умеренно теплым климатом как в нашей стране, так и за рубежом. Вспышки фузариоза зерновых культур неоднократно отмечались в разных странах мира, в частности в Канаде, США, Японии, Китае, Индии, странах центральной Европы, а так же на территории бывшего СССР [Scott P.M., 1989, 1990; Левитин М.М., 1994; Фузариоз колоса..., 1992; Захарова Л.П. и др., 1994; Miller J.D., 1995 а]. ДОН является основным микотоксином, загрязняющим зерно, в России, США, Канаде, Австрии, Италии, Великобритании, Северной Африке и ряде других стран [Tutelyan V.A. et al., 1990; Hietaniemi V., Kumpulainen J., 1991; Scott P.M., 1997; Hochsteiner W., Schuh M., 2001]. Чаще всего он обнаруживается в пшенице, реже — в ячмене, ржи и других злаковых культурах, пораженных фузариозом. По данным американских ученых, в некоторых странах мира концентрация ДОН в пшенице, пораженной F. graminearum, варьировала от 2,8 до 44 мг/кг [Bai G. et al., 1999]. В исследованиях Gereis M. et al. (1989) ДОН был обнаружен в 90% изученных образцов из 12 европейских стран, причем максимальный уровень токсина составил 43,8 мг/кг зерна. В Швеции в зерне пшеницы урожая 1984 г. обнаруживаемые концентрации ДОН находились в диапазоне 0,05-1,18 мг/кг, а в 1982 г. — 0,04-2,60 мг/кг [Pettersson H., et al., 1986]. При исследовании зерна пшеницы урожаев 1987-1988 гг. в Финляндии было показано, что более 90% образцов содержали ДОН в количестве от 0,007 до 0,03 мг/кг [Hietaniemi V., Kumpulainen J., 1991]. В пшенице из Венгрии, собранной в 1998 г., концентрация ДОН достигала 4,3 мг/кг [Fazekas B. et al., 2000]. В США и Канаде в отдельные годы уровни контаминации пшеницы этим токсином достигали 2,65-8,53 мг/кг при частоте выявления 47-100% [Wood G.E., Carter L., 1989; Scott P.M., 1990, 1997]. В 1991 г. в пшенице из США уровни ДОН достигали 9,33 мг/кг при среднем уровне контаминированных образцов 1,57 мг/кг [Fernandes C. et al., 1994]. В Аргентине 80% урожая 1993/94 гг. были контаминированы ДОН, уровни которого варьировались от 0,3 до 4,5 мг/кг [Dalcero A. et al., 1997]. 93,3% исследованных образцов аргентинской пшеницы содержали ДОН в количестве от 0,1 до 9,25 мг/кг [Pacin A.M. et al., 1997]. Имеются данные об обнаружении ДОН в ячмене Уругвая [Pineiro M.S. et al., 1995-96]. Уровень ДОН в пшенице Венесуэлы достигал 3,2 мг/кг [Contreras M.M.C. et al., 2000]. Широко распространены микромицеты рода Fusarium в странах ЮгоВосточной Азии. В северо-восточных провинциях Китая вспышки фузариоза пшени-
- 10 цы повторяются каждые 3-4 года. В образцах хлебных злаков обнаруживали ДОН в количестве 0,34-92,8 мг/кг зерна [Wei R.Y., 1986; Luo X.-Y., et al., 1987]. Сильное поражение микромицетами рода Fusarium продовольственной пшеницы наблюдалось в 1987 г. в Индии (Кашмир): содержание ДОН в некоторых образцах достигало уровня 8,38 мг/кг [Bhat R.V., et al., 1989]. Обнаруживался ДОН также в зерне из Индонезии (до 0,032 мг/кг) [Sardjono A.N. et al., 1998]. Особенностью продуцентов фузариотоксинов является их способность синтезировать одновременно несколько микотоксинов [Смирнов В.В. и др., 2000]. Наиболее часто наряду с ДОН в пораженном фузариозом зерне обнаруживается зеараленон, обладающий выраженными эстрогенными свойствами. О высокой частоте обнаружения ДОН и зеараленона в пшенице и кукурузе, пораженных F. graminearum, сообщают [Nesh G.A. et al., 1983]. Также сообщалось о совместном присутствии ДОН и зеараленона в кукурузе из Новой Зеландии [Lauren D.R., Ringrose M.A., 1997], Одновременное присутствие ДОН и зеараленона выявлено в зерновых, собранных в Аргентине [Gonzalez H.H. et al., 1999] и Индонезии [Sardjono A.N. et al., 1998]. Зеараленон определялся в контаминированном ДОН овсе из Германии урожаев 1987, 1989-1992 гг. [Müller H.M., Schwadore K., 1993; Müller H.M. et al., 1998]. Имеются сведения о совместном присутствии ДОН и зеараленона в пшенице и ячмене из Японии [Yoshizawa T., Jin Y.Z., 1995], ячмене из Уругвая [Pineiro M.S. et al., 1995-96], а также в пшенице из Польши [Perkowski J., et al., 1990] и Финляндии [Hietaniemi V., Kumpulainen J., 1991]. Также во многих странах наряду с ДОН в контаминированном зерне обнаруживали другие трихотецены: ацетилаты ДОН, ниваленол, Т-2 токсин, НТ-2 токсин [Teich A.H., et al., 1987; Tanaka T. et al., 1988; Hietaniemi V., Kumpulainen J., 1991; Sardjono A.N. et al., 1998; Grabarkiewicz-Szczesna J. et al., 2001]. Показано, что 3ацетилДОН чаще встречается в Европе и Азии, в то время как 15-ацетилДОН преобладает в Северной и Южной Америке [Miller J.D., 1995 а]. В странах Юго-Восточной Азии (Япония, Китай, Корея, Тайвань) ниваленол, обнаруживаемый совместно с ДОН, иногда присутствует в бо´ льших количествах, чем ДОН [Yoshizawa T., 1984; Tanaka T., et al., 1986 б; Miller J.D., 1995 б]. Результаты эпидемиологических наблюдений свидетельствуют, что алиментарные микотоксикозы и, в первую очередь, фузариотоксикозы как у людей, так и у сельскохозяйственных животных, являются обычно следствием поступления с пищей (кормом) нескольких микотоксинов, среди которых один или два являются домини-
- 11 рующими. Так, в описанных в последние годы случаях массовых отравлений людей в Индии [Bhat R.V. et al., 1989] в пшеничной муке были обнаружены наряду с ДОН (в концентрации до 8,38 мг/кг) еще три трихотеценовых микотоксина — Т-2 токсин (в концентрации 0,55–0,8 мг/кг), ниваленол и ацетил-ДОН (в количестве до 2,4 мг/кг). В Китае, в 35 случаях массовых отравлений, связанных с контаминацией зерна пшеницы и кукурузы микотоксинами, в качестве загрязнителей были обнаружены ДОН (в концентрации до 92,8 мг/кг) и зеараленон (в количестве до 0,59 мг/кг) [Luo X.Y., 1988]. В России основным ареалом фузариоза является Северо-Кавказский регион [Львова Л.С. и др., 1992; Захарова Л.П. и др., 1994, 1995]. Результаты мониторинга содержания ДОН в свежеубранном зерне за последние 11 лет выявили постоянный высокий уровень загрязнения ДОН зерна пшеницы в этом регионе. Обращает на себя внимание высокий уровень контаминации ДОН пшеницы урожаев 1989, 1992 и 1993 гг., когда практически все изученные образцы пшеницы из Северо-Кавказского региона содержали ДОН [Tutelyan V.A., 1998]. В 1992 г. 92% всех исследованных партий зерна пшеницы содержали ДОН в количестве, превышающем ПДК*, а в 1993 г. уровень ДОН превышал ПДК в 69% исследованных образцов. В 1992 г. концентрация ДОН в зерне пшеницы достигала 8,05 мг/кг при среднем уровне контаминации 1,96 мг/кг зерна [Захарова Л.П. и др., 1994, 1995]. Во все годы прослеживается четкая корреляция между концентрацией ДОН в пшенице и уровнем поражения ее фузариозом [Львова Л.С. и др., 1994; Захарова Л.П. и др., 1994, 1995]. Частота обнаружения ДОН в продовольственном зерне пшеницы коррелировала с частотой контаминации заготавливаемого зерна и была наиболее высокой в 1989, 1992 и 1993 гг. — 26, 38 и 23% соответственно, причем количество образцов с содержанием ДОН выше ПДК варьировало от 9 до 20%. Анализ потребления контаминированного ДОН зерна пшеницы показал, что наибольшее количество содержащей ДОН пшеницы потребляется в СевероКавказском регионе. В 39% изученных образцов выявляли ДОН, причем 24% образцов содержали ДОН выше ПДК. Расчетная суточная нагрузка ДОН на человека в среднем по России в период 1989–1995 гг. различалась по годам и варьировала от 0,07 до 1,40 мкг/кг массы тела. В Северо-Кавказском регионе эти величины в течение всего периода наблюдения были выше, чем в других регионах, и в период с 1992 по 1995 гг. варьировали от 0,29 до 4,10 мкг/кг массы тела, превышая допустимую суточную дозу — 3 мкг/кг массы тела [Кравченко Л.В. и др., 1998].
- 12 В результате исследований, проведенных в НИИ питания РАМН, показана возможность накопления в отдельные годы в зерне пшеницы наряду с ДОН другого фузариотоксина — зеараленона. Так в 69% исследованных партий заготавливаемой пшеницы урожая 1992 г. обнаруживали зеараленон в концентрациях от 0,01 до 1,48 мг/кг. В 1993 г. из 154 исследованных партий пшеницы в 3-х случаях (2%) было установлено наличие зеараленона в количестве до 0,28 мг/кг [Львова Л.С. и др., 1994; Кравченко Л.В. и др., 1998]. В виду повсеместного распространения ДОН и отсутствия эффективных способов детоксикации в ряде стран установлены предельно-допустимые концентрации (ПДК) ДОН в зерне. В США ПДК ДОН составляет 1 мг/кг в продуктах переработки пшеницы. В Канаде допустимый уровень ДОН в неочищенной пшенице составляет 2 мг/кг. Установленная в Китае ПДК ДОН в пшенице равна 1 мг/кг зерна [FAO, 1996]. В России ПДК ДОН в пшенице установлена на уровне 0,7 мг/кг, а в ячмене — 1 мг/кг [СанПиН, 1997]. 1.1.3. Токсическое действие трихотеценовых микотоксинов Токсическое действие дезоксиниваленола, Т-2 токсина, ниваленола, как и большинства других ТТМТ, характеризуется поражением желудочно-кишечного тракта, кроветворных и иммунокомпетентных органов. Общим симптомом острого отравления являются рвота и понос, отказ от корма; при длительном воздействии ТТМТ развивается лейкопения. Т-2 токсин обладает дерматотоксическими свойствами. ТТМТ являются сильными иммунодепрессантами. Алиментарные микотоксикозы, вызванные пищевыми продуктами и кормами, пораженными микроскопическими грибами продуцентами ТТМТ, относятся к наиболее рано описанным микотоксикозам человека и сельскохозяйственных животных. Алиментарная токсическая алейкия (АТА) — заболевание, наблюдавшееся в отдельные годы, вплоть до 1955 г., на территории СССР и связанное с употреблением в пищу продуктов переработки перезимовавшего под снегом зерна проса, пшеницы, ячменя [Рубинштейн Ю.И., Лясс Л.С., 1948; Joffe A.Z., 1983]. Заболевание характеризовалось локализацией в сельской местности, выраженной очаговостью, сезонностью, неравномерностью вспышек в разные годы и бесспорным доказательством связи с *
До 1995 г. ПДК ДОН в пшенице сильных и твердых сортов составляла 1,0 мг/кг и во всех остальных сортах — 0,5 мг/кг.
- 13 употреблением в пищу зерна, пораженного микроскопическими грибами F. sporotrichiella [Саркисов А.Х., Квашнина Е.С., 1948; Билай В.И., 1977], в последствии идентифицированных как продуценты ТТМТ, главным образом Т-2 токсина [Билай В.И. и др., 1983; Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985]. В легких случаях заболевание протекало по типу гингивита, стоматита, глоссита, реже — по типу гастроэнтерита, с тошнотой, рвотой, головной болью, головокружением и длилось 3-5 дней. При длительном потреблении загрязненных продуктов доминирующим симптомам становилась прогрессирующая лейкопения, переходящая в особо тяжелых случаях в алейкию и сопровождающаяся геморрагическими диатезами, носовыми кровотечениями, кровотечениями из десен, некрозами зева и глотки (ангинозный синдром) [Саркисов А.Х., Квашнина Е.С., 1948; Билай В.И., Пидопличко Н.М., 1970]. Синдром «пьяного хлеба» — заболевание человека и животных, связанное с употреблением зерновых продуктов, пораженных грибами F. graminearum, известных в настоящее время как продуценты ДОН, ниваленола, зеараленона. Впервые это заболевание наблюдали на Дальнем Востоке в 1882 г. [Саркисов А.Х., 1954; Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985]. Случаи отравления отмечались также в Италии, Германии, Швеции, Финляндии и Франции [Matossian M.K., 1989]. У людей симптомы отравления появлялись вскоре после приема в пищу продуктов (главным образом хлеба) из пораженного («пьяного») зерна: через 30-60мин появлялась рвота, боли в области живота, понос, возникало чувство слабости, тяжести в конечностях, скованность походки. Через день наступало состояние, похожее на состояние после тяжелого опьянения: сильные головные боли, головокружение. При длительном потреблении «пьяного хлеба» у людей наблюдалось истощение, потеря зрения, явления нарушения психики. У заболевших домашних животных характерными симптомами явились отказ от корма и рвота [Саркисов А.Х., 1985]. Известны случаи массовых отравлений в Китае [Luo X.Y., 1988] и Индии [Bhat R.V. et al., 1989] заплесневелой пшеницей и кукурузой с высоким содержанием ДОН. Симптомы отравления — тошнота, рвота, боли в животе, понос, головокружение и головная боль, появлялись через 5-30 мин после приема пищи. В случаях присутствия наряду с ДОН Т-2 токсина у большинства заболевших были жалобы на першение в горле. Акакаби-токсикоз, или болезнь, вызванная пораженным красной плесенью зерном, начиная с 1890 г. периодически отмечается у людей и сельскохозяйственных
- 14 животных в Японии и Корее. Вспышки заболевания наблюдаются в годы с обильными дождями в период цветения, созревания и сбора урожая зерновых и связаны с поражением зерна некоторыми штаммами F. graminearum — продуцентами ДОН, ниваленола и фузаренона-Х. У людей заболевание протекает по типу пищевого отравления — вскоре после приема пищи появляются тошнота, рвота, боли в животе, реже — понос, головная боль, озноб [Kuiper-Goodman T., 1994]. Нередко одновременно болеют домашние животные, у которых основными симптомами являются отказ от корма, рвота, понос [Ueno Y., 1986; Kubena L.F. et al., 1997; Hughes D.M. et al., 1999]. Основными органами-мишенями действия ТТМТ являются кроветворные и иммунокомпетентные органы. Внутрибрюшинное или per os введение ДОН или Т-2 токсина мышам вызывало дозозависимую атрофию тимуса и селезенки, связанную с гибелью клеток вследствие апоптоза [Ihara T., et al., 1997; Islam Z. et al., 1998; Zhou H.-R. et al., 2000]. В экспериментах, проведенных в НИИ питания РАМН, также отмечалось дозозависимое снижение относительной массы тимуса при введении крысам Т-2 токсина или ДОН per os [Кравченко Л.В. и др., 2000]. Дегенеративные и некротические изменения иммунокомпетентных и кроветворных органов сопровождаются проявлением иммуносупрессорной активности ТТМТ [Борисов В.А., 1988 б; Pariza M.W.,1996; Bondy G.S., Pestka J.J., 2000] и гематологическими изменениями (лейкоцитопения, анемия, тромбоцитопения и др.) [Lutsky I., Mor N, 1981; Rotter B.A. et al., 1994, 1996]. По своему механизму ТТМТ относятся к ингибиторам синтеза белка. Некоторые трихотецены (Т-2 токсин, НТ-2 токсин, неосоланиол, ниваленол, диацетоксискирпенол, фузаренон-Х и др.) ингибируют процесс инициации трансляции, включаясь на этапе перед образованием комплекса между рибосомой, информационной РНК, метионил-тРНК. Другие ТТМТ, такие как трихотецин, трихотеколон, веррукарол, дезоксиниваленол подавляют процесс элонгации и терминации, т.е. ингибируют процесс связывания тРНК с рибосомами, а также процессы транслокации, или препятствуют освобождению пептидов от рибосом. ТТМТ, подавляющие инициацию трансляции, обладают более выраженными токсическими свойствами, чем токсины, влияющие на более поздние стадии синтеза белка на рибосомах [Ueno Y., 1983; Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985]. Также получены данные, показывающие, что наряду с блокированием синтеза белка некоторые ТТМТ (Т-2 токсин, ниваленол, дезоксиниваленол, диацетоксискирпенол)
обладают
способностью
ингибировать
синтез
ДНК
- 15 [Cundlife E. et al., 1974; Тутельян В.А., 1985; Thompson W.L., Wannemacher R.W., 1990; Atroshi F. et al., 1995]. Важным компонентом биологической активности ТТМТ является их повреждающее воздействие на мембраны субклеточных структур [Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985]. Одним из механизмов токсичности ТТМТ может являться индукция процесса образования свободных радикалов и инициация реакции перекисного окисления липидов. Показано, что Т-2 токсин индуцирует перекисное окисление липидов в печени и в тканях других органов [Khachatourians G.G., 1990; Mezes M. et al., 1999]. Однократное введение крысам per os ДОН и Т-2 токсина приводило к усилению процессов перекисного окисления липидов на 21 и 268% соответственно [Rizzo A.F. et al., 1994]. Во многих случаях продукция свободных радикалов может служить дополнительным механизмом токсичности, более существенным, чем прямое повреждение клеток [Atroshi F. et al., 2000]. 1.2. ОСНОВНЫЕ ПУТИ БИОТРАНСФОРМАЦИИ И ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ
1.2.1. Общие сведения Многочисленные ферменты метаболизма ксенобиотиков с различными, но частично перекрывающимися каталитическими свойствами играют ключевую роль в процессе биотрансформации и детоксикации чужеродных веществ в организме. Эти ферменты сформировались в процессе эволюции и позволили различным видам выжить и прогрессировать в сложных условиях окружающей среды [Lang M., Pelkonen O., 1999]. Биотрансформация чужеродных соединений в организме происходит по двум главным направлениям (фазам метаболизма). Реакции I фазы обусловливают специфическую перестройку в молекуле субстрата с образованием функциональных групп. Эти реакции обычно предшествуют реакциям второй фазы, хотя иногда сразу имеют место последние. Кроме того, в некоторых случаях продукты реакций I фазы могут выводиться из организма, минуя дальнейшие превращения. Реакции II фазы приводят к образованию конъюгатов чужеродных соединений с высокополярными эндогенными субстратами. В результате этих метаболических процессов образуются более полярные и водорастворимые производные чужеродных веществ, которые могут с
- 16 большей легкостью выводиться из организма. Как правило, биотрансформация также ведет к образованию менее токсичных соединений [Meydani M., 1987; Sitkiewicz D., 2000]. Оба этих процесса осуществляются под воздействием ферментных систем печени и других органов (желудочно-кишечного тракта, почек, легких, крови и др.). Существенную роль в биотрансформации играют также ферментные системы микрофлоры желудочно-кишечного тракта [Sheline R.R., 1968]. Биохимические превращения первой фазы метаболизма по видам реакций можно разделить на окислительные, восстановительные и гидролитические. Продукты этой фазы в дальнейшем могут подвергаться конъюгации с последующим выделением, но могут выводиться без дальнейших изменений [Парк Д.В., 1973]. Окислительные реакции протекают под влиянием микросомальных монооксигеназ. Эти ферменты играют ключевую роль в биотрансформации и детоксикации большого
числа
различных
ксенобиотиков,
катализируя
реакции
их
С-
гидроксилирования в алифатической цепи, в ароматическом и ациклических кольцах и в
алкильных
боковых
цепях,
N-гидроксилирования,
О-дезалкилирования,
S-
дезалкилирования, N-дезалкилирования, окислительного дезамидирования и дезаминирования, десульфирования и эпоксидирования [Belinsky S.A. et al., 1987]. Важнейшим компонентом микросомальной монооксигеназной системы, ответственным за активацию молекулярного кислорода и связывание субстрата является цитохром Р-450. В настоящее время известно более 700 изоформ цитохрома Р-450 [Archakov A.I., Degtyarenko K.N., 1993; Omiecinski C.J. et al., 1999]. Многообразием изоформ определяется субстратная специфичность цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ. Реакции восстановления катализируются микросомальными ферментами печени — редуктазами, коферментами которых являются NADH или NADPH. Эти реакции обратимы и приводят к восстановлению кетонов в соответствующие спирты и ароматических нитро- и азозоединений в амины. Реакции гидролиза приводят к разрушению сложноэфирной связи в молекуле чужеродных эфиров и амидов. Эти реакции катализируются рядом гидролитических ферментов — эстераз, — локализующихся как в печени, так и в плазме крови. Некоторые из этих ферментов локализуются в микросомах печени [Krisch K., 1963]. В результате отщепления боковых заместителей ксенобиотики приобретают реактивные группы OH, NH2, COOH, SH. Образующиеся таким путем метаболиты легко вступают
- 17 в реакции конъюгации с образованием малотоксичных высокополярных соединений, которые выводятся из организма с мочой, желчью и калом [Голиков С.Н. и др., 1986]. Важную роль в гидролитической биотрансформации ксенобиотиков, содержащих эфирные и амидные связи, играет карбоксилэстераза (КФ 3.1.1.1.). Карбоксилэстеразы млекопитающих представляют собой большую группу ферментов, локализованных в эндоплазматическом ретикулуме клеток многих тканей (печени, почках, селезенке и др.) [Satoh T., Hosokawa M., 1998]. Другим ферментом, гидролизующим связь углерод–кислород в эпоксидном кольце, является эпоксидгидролаза (КФ 3.3.2.3). Она локализована в эндоплазматическом ретикулуме клеток печени, почек, легких и кишечника и является ключевым ферментом детоксикации высокотоксичных и реакционноспособных эпоксидсодержащих соединений как экзогенного, так и эндогенного происхождения [Oesch F. et al., 2000]. Реакции конъюгации составляют вторую фазу биотрансформации ксенобиотиков, которые в первой фазе при действии микросомальных монооксигеназ получили нуклеофильные группы. Химические соединения, изначально имеющие в своем составе реакционноспособные группы (OH, NH2, COOH, SH), могут вступать в реакции конъюгации без предварительных превращений с участием монооксигеназ печени. В организме животных и человека основными являются следующие реакции конъюгации: глюкуроновая, сульфатная, глутатионовая, глутаминовая, аминокислотная, метилирование, ацетилирование. Поскольку перечисленным реакциям может подвергаться большинство ксенобиотиков, а продукты их, как правило, нетоксичны и быстро экскретируются из организма [Принципы и методы оценки токсичности химических веществ, 1981], эти реакции рассматриваются как один из основных компонентов общих механизмов детоксикации. Конъюгация с глюкуроновой кислотой является доминирующим механизмом конъюгации и осуществляется у всех млекопитающих. Этот процесс происходит наиболее активно в печени, в меньшей степени в почках, желудочно-кишечном тракте и коже [Anthony Y. H. Lu., 1979; Stenlake J.B., 1979; Ritter J.K., 2000]. Ферментом, катализирующим процесс присоединения к молекуле ксенобиотика остатка глюкуроновой кислоты, является UDP-глюкуронозилтрансфераза (уридиндифосфатглюкуронозилтрансфераза, UDP-ГТ; КФ 2.4.1.17). UDP-глюкуронозилтрансфераза имеет гетерогенный характер, то есть представляет собой группу изоформ, объединенных в семейства 1А и 2В, каждая из которых катализирует взаимодействие с глюкуроновой кислотой определенных
- 18 соединений в зависимости от вариации их функциональных групп [Голиков С.Н. и др., 1986; Burchell B. et al., 1995; Radominska-Pandya A. et al., 1999; Strassburg C.P. et al., 1999]. Полиморфизм этого фермента и низкая специфичность отдельных изоформ к разным субстратам определяет способность UDP-глюкоронозилтрансферазы катализировать образование глюкуронидов широкого ряда соединений [Tephly T.R., Burchell B., 1990]. У человека известно 15 изоформ этого фермента [Tukey R.H., Strassburg C.P., 2000]. У крыс обнаружено 8 изоформ UDP-глюкуронозилтрансферазы: 6 представителей семейства 1А и 2 представителя семейства 2В [Li Y.Q. et al., 1999; Grams B. et al., 2000]. Глюкурониды ксенобиотиков в организме животных образуются в несколько стадий. Сначала синтезируется активированный интермедиат UDP-глюкуроновая кислота (UDP-ГК): UDP-α-D-глюкоза + 2NAD + Н2О → UDP-α-D-глюкуроновая кислота + 2NADН2. Фермент, катализирующий эту реакцию, — UDP-глюкозодегидрогеназа (КФ 1.1.1.22) — локализован в растворимой фракции печени. Затем глюкуроновая кислота переносится от UDP-ГК на субстрат [Головенко Н.Я., Карасева Т.Л., 1983]: UDP-α-D-глюкуроновая кислота + R–OH → R–O–β-D-глюкуроновая кислота + UDP + Н2О. На реакцию конъюгации с глюкуроновой кислотой влияют различные факторы, такие как возраст [Gradinaru D. et al., 1999], пол, некоторые патологические состояния печени [Little J.M. et al., 1999], многие гормоны [Li Y.Q. et al., 1999]. У крыс-самцов образуется больше конъюгатов, чем у самок, возможно, потому, что тестостерон стимулирует образование глюкуронидов. Напротив, эстрадиол снижает экскрецию глюкуронидов
у
самцов
[Лакин К.М.,
Крылов Ю.Ф.,
1981].
Известно,
что
3-
метилхолантрен индуцирует преимущественно изоформы фермента, входящие в семейство 1А. Активирование проходит по механизму связывания индуктора с Ah-рецептором, контролирующим экспрессию некоторых ферментов метаболизма ксенобиотиков [Saarikoski S.T. et al., 1998]. У крыс основными изоформами, индуцируемыми 3-метилхолантреном, являются 1А1 и 1А6 [Emi Y. et al., 1996; Jemnitz K. et al., 2000]. Фенобарбитал является индуктором преимущественно изоформ семейства 2В UDPглюкоронозилтрансферазы [Oguri K. et al., 1996]. Показано, что у крыс Вистар основной индуцируемой фенобарбиталом изоформой является 2В1 [Ishii Y. et al., 1997].
- 19 Еще одним важным механизмом конъюгации чужеродных веществ является сульфатная конъюгация — связывание молекулы ксенобиотика с ацилсульфатом. Эта реакция катализируется сульфотрансферазой. Синтез сульфатов протекает в три стадии∗: АТФ + SO42+ ←→ АФС + P2O74– АФС + АТФ ←→ ФАФС + АДФ R–OH + ФАФС ←→ ROSO3 + АМФ Эти реакции катализируют соответственно аденозинтрифосфат-сульфурилаза (АТФ-сульфурилаза) (КФ 2.7.7.4), аденозинфосфосульфат-киназа (АФС-киназа) (КФ 2.7.1.25) и сульфотрансфераза (КФ 2.8.2.1), способствующая взаимодействию «активного сульфата» аденозин-3'-фосфат-5-фосфосульфата (ФАФС) с гидроксильной группой молекулы субстрата. АТФ-сульфурилаза и АФС-киназа локализованы в цитозоле клеток [Головенко Н.Я., Карасева Т.Л., 1983]. Сульфотрансфераза является цитозольным ферментом, обладающим полиморфизмом. У человека обнаружено 11 изоформ этого фермента, которые существенно различаются по распределению в различных тканях и субстратной специфичности [Glatt H., 2000]. Отмечено дозозависимое соотношение образования глюкуроновых и сульфатных конъюгатов в организме. При увеличении количества поступающего в организм ксенобиотика преобладает глюкуроновая конъюгация; при достаточно больших дозах конъюгация с сульфатом может прекратиться вовсе. Возможно, в организме существует конкуренция за арилгидроксилы между глюкуроновой и серной кислотами, и в силу того, что общий запас сульфатов в организме мал, при увеличении дозы ксенобиотика экскреция возрастает лишь за счет глюкуронида. Значительную роль в детоксикации ксенобиотиков играет их конъюгация с глутатионом. Эту реакцию катализирует фермент глутатионтрансфераза, обладающая, как и многие другие ферменты метаболизма ксенобиотиков, полиморфизмом. У млекопитающих можно выделить 4 семейства цитозольных и 2 семейства мембрансвязанных изоформ фермента, отличающихся селективностью к ряду субстратов. Глутатионовые конъюгаты могут экскретироваться с желчью или превращаться посредством дальнейших ферментативных реакций в меркаптуровые кислоты и выводиться из организма с мочой [Seidegard J., Ekstrom G., 1997].
- 20 В организме человека и животных β-глюкуроновые конъюгаты могут подвергаться гидролизу, катализируемому ферментом β-глюкуронидазой (КФ 3.2.1.31). Этот фермент обнаруживают в большинстве тканей животных, особенно в печени, почках, селезенке, кишечном тракте. Выделяемые в желчь глюкурониды могут гидролизоваться кишечной β-глюкуронидазой, а образовавшиеся в результате этого соединения реабсорбируются, что приводит к увеличению их печеночно-кишечной циркуляции. Как и конъюгаты с глюкуроновой кислотой, сульфаты гидролизуются специфической ферментной системой. Известно несколько типов специфических сульфатаз (стероидсульфатаза, арилсульфатаза), широко представленных в тканях животных различных видов. Наибольшее значение имеют арилсульфатазы (КФ 3.1.6.1), стеролсульфатазы (КФ 3.1.6.2), гликосульфатазы (КФ 3.1.6.3) и хондроитинсульфатазы (КФ 3.1.6.4). Арилсульфатаза I находится в микросомах печени человека и животных. Часто этот фермент называют сульфатазой С. Арилсульфатаза II представляет собой лизосомальный белок, делящийся на формы А и В [Головенко Н.Я., Карасева Т.Л., 1983]. Конъюгаты ксенобиотиков, в том числе глюкуроновые и сульфатные, могут выделяться с желчью в кишечник, подвергаться там дальнейшей биотрансформации, реабсорбироваться в кровь и вновь поступать в печень. Затем эти соединения выделяются с мочой или повторно поступают с желчью в кишечник и выделяются с калом. В такой процесс печеночно-кишечной циркуляции вовлекаются ксенобиотики, имеющие определенную молекулярную массу. Для крыс она составляет 325, а для человека — 500 Д [Голиков С.Н. и др., 1986]. В кишечнике животных и человека ксенобиотики также претерпевают метаболические превращения под воздействием ферментов микроорганизмов. К числу таких превращений относятся реакции гидролиза, восстановления и конъюгации, протекающие с участием бактериальных эстераз, редуктаз, ацетилтрансфераз, деацетилаз, деметилаз и других ферментов [Головенко Н.Я., Карасева Т.Л., 1983; Cheng Z. et al., 1999]. Гидролиз глюкуронидов — один из наиболее важных метаболических процессов, протекающих под влиянием кишечной микрофлоры. Опыты показывают, что у крыс гидролиз происходит в слепой и толстой кишках, но не в тощей. Глюкурониды гидролизуются главным образом анаэробными микроорганизмами. Определенное участие в этом процессе принимают E. coli в нижней части кишечника, также, воз∗
АТФ — аденозинтрифосфат; АДФ — аденозиндифосфат; АМФ — аденозинмонофосфат; ФАФС — аденозин-3'-фосфат-5-фосфосульфат; АФС — аденозинфосфосульфат.
- 21 можно, в проксимальной части тонкой кишки (в этом отношении обнаружены значительные различия у разных видов животных). 1.2.2. Основные пути биотрансформации и детоксикации трихотеценовых микотоксинов Процессы биотрансформации трихотеценов в настоящее время изучены очень слабо. Имеющиеся сведения касаются главным образом Т-2 токсина. Эти ферментативные реакции можно подразделить на гидролитические (деацилирование), окислительные (гидроксилирование), восстановительные (деэпоксидирование) и реакции конъюгации [Swanson S.P., Corley R.A., 1989]. Деацилирование представляет собой гидролиз ацетильных остатков. Этой реакции могут подвергаться молекулы трихотеценов, имеющие боковые ацетильные группы: 3-ацетилДОН, триацетилскирпентриол, Т-2 токсин, НТ-2 токсин и др. [Udell M.N., Dewick P.M., 1989; Ueno Y., 1986; Yagen B., Bialer M., 1993]. Установлено, что ферментом, катализирующим этот тип реакций, является микросомальная неспецифическая карбоксилэстераза [Ohta M. et al., 1977, 1978]. Т-2 токсин, введенный животным per os, подвергался реакции гидроксилирования атома С-3 3-метилбутирилоксигруппы. 3’-гидроксилированные метаболиты Т-2 токсина образовывались в микросомальной фракции в присутствии NADPH [Yoshizawa T. et al., 1984]. Аналогичный результат был получен в экспериментах in vitro, в которых Т-2 токсин подвергался воздействию печеночных ферментных систем животных [Yoshizawa T. et al., 1982; Yagen B., Bialer M., 1993]. Предполагается, что в реакции гидроксилирования Т-2 токсина принимают участие цитохром Р-450зависимые монооксигеназы. Третий метаболический путь трихотеценов — деэпоксидирование 12,13эпоксикольца. В результате этой реакции эпоксигруппа превращается в винильную связь. Деэпоксид ДОН был выявлен как при оральном введении ДОН крысам [Yoshizawa T., et al., 1983], так и при инкубировании ДОН in vitro с желудочной жидкостью коров [Cote L.-M., et al., 1986 a; Yoshizawa T., et al., 1986]. Деэпоксипроизводные Т-2 токсина и его метаболитов обнаруживались в экскрементах и тканях животных после введения им Т-2 токсина [Yagen B., Bialer M., 1993]. Имеется предположение, что деэпоксидирование катализируется ферментными системами кишечной микрофлоры.
- 22 Реакция конъюгации приводит к образованию глюкуронового конъюгата дезоксиниваленола, а также глюкуронидов Т-2 токсина и его метаболитов в организме животных [Ueno Y., 1986; Yagen B., Bialer M., 1993]. Ферментом, ответственным за образование глюкуронидов, является UDP-глюкуронозилтрансфераза. В результате таких метаболических превращений молекула токсина становится более полярной и гидрофильной, что ускоряет ее выведение из организма. Кроме того, в молекуле микотоксина появляются новые функциональные группы, что, как правило, приводит к потере токсических свойств: деэпоксидирование влечет за собой размыкание эпоксидного кольца, что приводит к практически полной потере токсичности, конъюгация ведет к блокированию таких функциональных групп, как –СООН и –ОН, что также дезактивирует молекулу [Тутельян В.А.,1985]. Исследования, проведенные с рядом ТТМТ показали, что эти токсины быстро всасываются из желудочно-кишечного тракта, обнаруживаясь через 30-60 мин. в максимальных концентрациях в крови, подвергаются метаболизму и в течение 24-72 часов практически полностью выводятся из организма [Beasley V.R. et al., 1986; Suneja S.K. et al., 1988; Lee R.C. et al., 1990]. 1.2.2.1. Биотрансформация дезоксиниваленола Для ДОН выделен только один структурный метаболит, впервые описанный в 1983 г. [Yoshizawa T., et al., 1983] (рис. 3). При введении ДОН внутрижелудочно крысам в моче, кале и в небольшом количестве в плазме крови и тканях печени было обнаружено его производное, в котором эпоксидное кольцо превращалось в винильную связь. Новый метаболит, 3α,7α,15-тригидрокситрихотец-9,12-диен-8-он, был назван ДОМ-1. Деэпоксидирование осуществляется, по-видимому, за счет ферментных систем микрофлоры желудочно-кишечного тракта. При инкубировании ДОН с содержимым рубца in vitro в реакционной смеси обнаруживался ДОМ-1 [King R.R., et al., 1984; Hedman R., Pettersson H., 1997]. Поскольку эпоксигруппа в эпокситрихотеценовых микотоксинах является одним из главных факторов их токсичности, очень вероятно, что такая реакция прямо связана с детоксикацией этих ксенобиотиков [King R.R., et al., 1984; Ueno Y., 1986]. Кроме того, в экскретах и тканях лабораторных животных, получивших ДОН, обнаруживали глюкуроновые конъюгаты как ДОН (рис. 4), так и ДОМ-1. Предполагается, что основным местом образования глюкуронидов является печень; ферментом, катализирующим процесс конъюгации с остатком глюкуроновой кислоты, является
- 23 UDP-глюкуронозилтрансфераза, представляющая собой группу изоформ [Kasper Ch., Henton D., 1980; Голиков С.Н. и др., 1986; Radominska-Pandya A. et al., 1999; Strassburg C.P. et al., 1999].
ДОН
ДОМ-1
Рис. 3. Структура ДОН и ДОМ-1.
Рис. 4. Структура глюкуронового конъюгата ДОН. Изучение метаболизма ДОН у крыс показало, что через 96 ч. после введения однократной оральной дозы ДОН с радиоактивной меткой (14С) 25% радиоактивности было экскретировано с мочой и 64% с калом. За 24 ч. с мочой выводилось 6,2% введенного токсина в виде свободного ДОН и 2,5-3,2% в виде свободного ДОМ-1; количество токсина, выводимого с калом за 24-48 ч. в виде свободных ДОН и ДОМ-1 было около 3% и 6,4-8,3% соответственно [Lake B.C., et al., 1987]. По другим данным у крыс за 72 ч. с мочой выводилось в виде свободного ДОН 4,5% орально введенной дозы и в виде свободного ДОМ-1 — 4,4%; с калом экскретировалось 0,3% в виде свободного ДОН и 5,6% в виде свободного ДОМ-1 [Yoshizawa T., et al., 1983]. Важно отметить, что при введении ДОН per os крысам, предварительно получавшим антибиотики, по-
- 24 давляющие их кишечную микрофлору, наблюдалось значительное снижение образования и экскреции ДОМ-1 как с калом, так и с мочой. В то же время инкубирование ДОН с анаэробным препаратом кишечного содержимого крыс приводило к образованию ДОМ-1, а при инкубировании ДОН с гомогенатом печени образования ДОМ-1 не наблюдали. Из этого можно заключить, что деэпоксидирование ДОН происходит под влиянием ферментных систем микроорганизмов желудочно-кишечного тракта [Worrell N.R. et al., 1989]. При введении ДОН свиньям per os в моче и кале наряду с неизмененным токсином обнаруживали его глюкуронид и деэпоксид [Bauer J., 1995]. Присутствие ДОН выявляли в плазме крови и спинномозговой жидкости [Prelusky D.B., et al., 1990]. Внутривенно введенный токсин исчезал из крови через 11-17 ч., а в моче переставал обнаруживаться через 20-30 ч. после введения. За 24 ч. с мочой выделялось от 28,1 до 57,2% дезоксиниваленола. [Coppock R.W., et al., 1985]. При введении ДОН овцам per os экскреция с мочой достигала максимума через 6-9 ч. и завершалась через 28-30 ч. после введения. Кроме исходного токсина (2,1% от введенной дозы) с мочой экскретировался конъюгированный ДОН (3,6%), ДОМ-1 (0,06%) и конъюгированный ДОМ-1 (1,2%). Еще 0,11% введенного ДОН выводилось с желчью, преимущественно в виде конъюгированного ДОМ-1, а также 54-75% экскретировалось с калом [Prelusky D.B., et al., 1986]. Токсин обнаруживался также в плазме крови. Причем лишь 14-37% от общего ДОН, выявленного в плазме, соответствовали свободному ДОН, 60-84% приходилось на глюкуроновый конъюгат ДОН и еще 1,82,8% — на ДОМ-1 [Prelusky D.B., et al., 1985]. При внутривенном введении ДОН овцам в крови обнаруживался глюкуроновый конъюгат ДОН в количестве 15-23% общего количества ДОН, выявленного в плазме. Доля ДОМ-1 составила 1,4-1,7% от общего ДОН в плазме [Prelusky D.B., et al., 1985]. С мочой выводилось 63% всего введенного ДОН в виде свободного ДОН (24,1%), глюкуронового конъюгата ДОН (21,2%), ДОМ-1 (0,5%) и глюкуронового конъюгата ДОМ-1 (17,2%). Кроме того, 3,5% введенного ДОН выделялось с желчью, почти полностью в виде глюкуронида ДОМ-1. Однако значительная часть введенного ДОН (33,5%) остается неучтенной, возможно, превращаясь в неидентифицированные метаболиты. [Prelusky D.B., et al., 1986]. Изучение метаболизма внутривенно введенного овцам ДОН с радиоактивной меткой (14С) показало, что 91% введенного токсина выводился с мочой, а 6% обнаруживалось в желчи; 67% всего экскретированного токси-
- 25 на выходило в виде глюкуронидов ДОН (54%) и ДОМ-1 (13%), доля неизмененного токсина составила 11% от введенной дозы; оставшаяся часть (18%) состояла из ДОМ1 (6%), сульфатных конъюгатов ДОН (2%) и трех неидентифицированных метаболитов, содержащих радиоактивную метку (10%) [Prelusky D.B. et al., 1987]. У коров, получавших ДОН с кормом в течение 5 дней, приблизительно 20% потребленного токсина было выведено с мочой и калом в несвязанных формах, таких как ДОН (4%) и ДОМ-1 (96%). При инкубировании образца мочи с β-глюкуронидазой концентрация ДОН увеличивалась в 1,6-3,0 раза, а ДОМ-1 — в 7-16 раз, т.е. основная часть токсинов выводится в виде глюкуроновых конъюгатов [Cote L.-M., et al., 1986a]. Таким образом, основными путями биотрансформации ДОН в организме являются его конъюгация с глюкуроновой кислотой и образование его деэпоксипроизводного, значительная часть которого также выводится в виде глюкуронида. Глюкуроновая конъюгация происходит при участии UDP-глюкуронозилтрансферазы, локализованной главным образом в печени, в то время как образование деэпоксипроизводного связано, по-видимому, с ферментными системами микрофлоры желудочно-кишечного тракта. 1.3. ВЛИЯНИЕ АЛИМЕНТАРНЫХ ФАКТОРОВ НА МЕТАБОЛИЗМ И ТОКСИЧНОСТЬ КСЕНОБИОТИКОВ
Влияние пищевых факторов на процессы биотрансформации чужеродных веществ можно рассматривать с нескольких основных позиций. Во-первых, пищевые вещества выполняют структурную функцию и непосредственно образуют или являются кофакторами ферментных систем метаболизма ксенобиотиков. Во-вторых, нутриенты и непищевые компоненты пищевых продуктов оказывают модифицирующее влияние на активность процессов метаболизма ксенобиотиков, индуцируя или ингибируя монооксигкназную систему и ферменты конъюгации. В третьих, пищевые вещества являются предшественниками эндогенных доноров-субстратов конъюгации, а также субстратами ПОЛ или, напротив, антиоксидантами [Anderson K.E. et al., 1982; Тутельян В.А. и др., 1987]. К настоящему времени накоплен большой фактический материал по влиянию отдельных компонентов пищи и их соотношения на токсикокинетику и ферментные реакции биотрансформации чужеродных веществ [Goldberg I., 1994]. Являясь модуляторами активности ферментных систем как собственно организма, так и микрофлоры же-
- 26 лудочно-кишечного тракта, макро- и микронутриенты играют важную роль в снижении токсических свойств поступающих в организм ксенобиотиков [Meydani M., 1987]. Следует также принимать во внимание, что компоненты пищи помимо биотрансформации влияют также и на другие этапы токсикокинетики ксенобиотиков: всасывание, мембранный транспорт, распределение, депонирование и экскрецию [Тутельян В.А. и др., 1987]. К числу интенсивно изучаемых природных модуляторов разных этапов токсикокинетики ксенобиотиков, и в том числе их биотрансформации и детоксикации, относятся селен, пищевые волокна и пробиотики [Galvano F. et al., 2001]. 1.3.1. Селен Селен представляет собой незаменимый в питании человека и животных микроэлемент, являющийся важным фактором для нормальных процессов жизнедеятельности. В организме человека и животных бо´ льшая часть селена находится в двух формах. Одна из них — селенометионин, который замещает метионин в различных белках; другая — селеноцистеин в селенопротеинах, таких как глутатионпероксидаза (GPX), йодтирониндейодиназа и селенопротеины Р и W. Селенометионин поступает с пищей, т.к. не способен синтезироваться в организме, не регулируется селеновым статусом и может рассматриваться как форма резервирования селена [Levander O.A., Burk R.F., 1996; Гореликова Г.А. и др., 1997]. Основная биологическая роль селена у человека и животных связана с ферментом глутатионпероксидазой (КФ 1.11.1.9), компонентом которой он является. Этот фермент катализирует распад перекиси водорода или разложение гидроперекисей липидов, стероидов, полиеновых жирных кислот и других, образующихся в клетке [Levander O.A., Burk R.F., 1996]. Известно несколько типов глутатионпероксидаз: GPX-I, II, III и IV. GPX-I представляет собой белок, образованный четырьмя одинаковыми субъединицами молекулярной массой 23 кД, организованными в комплекс квадратной формы. Каждая субъединица содержит 1 атом селена в составе селеноцистеина. Этот фермент катализирует разложение перекиси водорода в эритроцитах [Swanson C.A. et al., 1991]: H2O2 + 2GSH = GSSG + 2H2O
- 27 Другая форма — GPX-II — обезвреживает гидроперекиси липидов. Она представляет собой тканевый фермент, локализованный преимущественно в печени и сердце, имеет молекулярную массу 22 кД и в естественных условиях мономерна. GPX-II катализирует следующую реакцию [Гмошинский И.В. и др., 2000]: ROOH + 2GSH = GSSG + ROH + H2O GPX-III — фермент плазмы крови. По специфичности GPX-III сходна с GPX-I. Это тетрамер из 4 субъединиц по 23 кД, но в отличие от GPX-I является гликопротеином. GPX-IV по специфичности тождественна с GPX-II [Kelner M.J., Montoya M.A., 1998]. Результаты многочисленных исследований показали тесную зависимость между количеством поступающего с рационом селена и активностью глутатионпероксидазы в тканях лабораторных животных [Hafeman D.G. et al., 1974; Olsson U. et al., 1993; Гореликова Г.А. и др., 1997]. При крайне низких (ниже 0,02 мг/кг рациона) синтез глутатионпероксидазы практически полностью подавлен. У изначально нормально обеспеченных селеном крыс его прием на уровне 0,1 мг/кг рациона достаточен для поддержания активности фермента [Hill K.E. et al., 1987]. Литературные данные по влиянию обогащения рациона селеном на активность глутатионпероксидазы противоречивы. Активность фермента при обогащении селеном рациона лабораторных животных зависит от многих факторов, в частности от изначального селенового статуса животных, от источника селена и от вводимых доз селена [Селен, 1989; Кравченко Л.В. и др., 1991]. Отмечено, что у крыс количество селена в рационе, превышающее 1 мг/кг, вызывает возрастание активности глутатионпероксидазы в печени, однако при введении токсических доз селена (5 мг/кг рациона и более) активность фермента в печени снижается, одновременно наблюдаются повреждения печени [Julius A.D. et al., 1980]. Важным селеноэнзимом является 5’-йодтирониндейодиназа (КФ 1.11.1.8), ответственная за обмен тиреоидных гормонов. Роль селена в функционировании тканевых дейодиназ свидетельствует о наличии связи обмена этого элемента с обменом йода [Zinoni F. et al., 1987; Никитина Л.П. и др., 1995]. Селенопротеины P и W также выполняют функции антиоксидантов на тканевом уровне, но их механизм защиты организма от воздействия перекисей иной, нежели в случае глутатионпероксидазы [Hill K.E., Burk R.F., 1997; Yeh J.Y. et al., 1997; Sun Y. et al., 2001].
- 28 Защитное действие селена проявляется в снижении токсического действия многих контаминантов окружающей среды природного и антропогенного происхождения, в частности тяжелых металлов: способствует детоксикации метилртути, солей кадмия, висмута, таллия, серебра [Гореликова Г.А. и др., 1997]. Известна способность селена повышать устойчивость организма к ряду бактериальных и вирусных инфекций [Селен, 1989]. Кроме того, селен играет заметную роль в терапии ряда патологических состояний, связанных с накоплением гидроперекисей [Ip C., 1986; Combs G.F., Combs S.B., 1986; Parnham M.J., Graf E., 1987]. Показана ингибирующая активность селена на процессы канцерогенеза. Отмечено уменьшение частоты возникновения спонтанных и химически индуцируемых опухолей у лабораторных животных при введении селена, а также снижение уровня этого микроэлемента в организме онкологических больных. Установлена отрицательная корреляция между частотой поражения населения онкологическими заболеваниями и содержанием селена в продуктах питания, организме и среде [Гореликова Г.А. и др., 1997; McLeod R. et al., 1997]. Селен снижал частоту возникновения опухолей в печени крыс, вызванных 2ацетиламинофлуореном [Harr J.R. et al., 1972], 3-метил-4-диметиламиноазобензолом, диэтилнитрозамином, афлатоксинами, а также уменьшал вероятность возникновения рака других органов (кишечника, молочной железы), индуцированного различными химическими агентами [Shamberger R.J., 1984]. Показано, что введение в корм крыс обогащенного селеном чеснока оказывало защитное действие по отношению к раку молочной железы, индуцированного 7,12-диметилбенз[а]антраценом [Ip C. et al., 1992]. Селен также ингибировал развитие у крыс опухолей вирусного происхождения [Milner J.A.,1985]. Особого внимания заслуживает защитное действие селена от неблагоприятного воздействия на организм трихотеценовых микотоксинов. Принимая во внимание, что инициация свободнорадикального окисления липидов — один из возможных механизмов токсического действия ТТМТ, введение селена может играть значительную роль в ослаблении их токсических свойств. При однократном введении крысам Т-2 токсина per os наблюдалось снижение уровня белка в печени, а также достоверное повышение активности аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы и щелочной фосфатазы. Добавление в рацион селена и витамина Е снижало токсическое действие Т-2 токсина, что проявлялось в отсутствии столь резких изменений вышеупомянутых показателей [Atroshi F. et al., 2000]. Введение крысам ДОН или Т-2 ток-
- 29 сина после содержания на рационе с дефицитом селена и витаминов С и Е вызывало увеличение перекисного окисления липидов на 33 и 307% соответственно. При включении в диету антиоксидантов эти показатели составляли 21 и 268% [Rizzo A.F. et al., 1994]. Внутрижелудочное введение мышам селенита натрия снижало острую летальную токсичность Т-2 токсина [Yazdanpanah H. et al., 1997]. Было показано протекторное действие селена при фузарио- и Т-2 токсикозе у свиней с обеспечением 100%-й сохранности поголовья при летальности в группе без селенотерапии до 25% [Борисов В.А., 1988 а]. Под влиянием селена повышается уровень естественной резистентности животных, сниженный действием фузариотоксинов, к возбудителю сальмонеллеза [Борисов В.А., 1988 б]. Защитные эффекты селена связывают, во-первых, с его антиоксидантной активностью в качестве компонента глутатионпероксидазы, и, во-вторых, с его влиянием на активность ферментов метаболизма ксенобиотиков. Дефицит потребления селена может приводить к резкому снижению уровня селенопротеинов и, как следствие — к оксидативному стрессу, что влечет за собой различные патологические состояния [McLeod R. et al., 1997; Sakaguchi S. et al., 2000; Reddi A.S., Bollineni J.S., 2001]. Полагают, что один из механизмов участия селена в регуляции активности ферментов метаболизма ксенобиотиков — обеспечение стабильности мембран эндоплазматической сети, что обеспечивает оптимальные условия для функционирования ферментов, участвующих в детоксикационных процессах [Meydani M., 1987; Schrauzer G.N.,1992], а также с влиянием этого элемента на гомеостаз печеночного гема [Correia M.A., Burk R.F., 1976; Mackinnon A.M., Simon F.R., 1976]. Один из механизмов противоракового действия селена основан на препятствии взаимодействия канцерогенов с макромолекулами, в частности с ДНК. Введение селена в корм снижало образование аддуктов афлатоксина В1 и ДНК у цыплят [Thompson H.J., 1984], но имело обратный эффект у крыс [Chen J. et al., 1982]. Другим механизмом антиканцерогенного действия селена может служить стимулирование активности ферментов, обеспечивающих детоксикацию канцерогенов [Martin S.E., Schillaci M., 1984]. Обнаружено, что селен усиливал гидроксилирование кольца, но подавлял гидроксилирование атома азота 2-ацетиламинофлуорена, способствуя детоксикации этого соединения и снижая его активность [Besbris H.J. et al., 1982]. Метаболиты N,N-диметилаланина, 7,12-диметилбенз[а]антрацена, 2-аминофлуорена, бенз[а]пирена, образующиеся ферментами печени крыс, потреблявших высокие дозы селена, про-
- 30 являли меньшую мутагенную активность, чем исходные соединения [Combs J.F., Combs S.B., 1986]. Противораковая активность селена может проявляться и благодаря его антиоксидантным свойствам, в силу которых селен препятствует окислительному повреждению клеточных мембран канцерогенами. Отмечено, что добавление селена в рацион препятствует подавлению активности глутатионпероксидазы, вызываемое некоторыми канцерогенами [Kauppila A. et al., 1984]. Показано, что уровень селена в рационе лабораторных животных в значительной степени влияет на активность ферментов метаболизма ксенобиотиков. У крыс и мышей, получавших рацион с дефицитом селена, наблюдалось значительное возрастание активности изоформ UDP-глюкуронозилтрансферазы семейства 1А в микросомах печени [Chen J. et al., 1982; Reiter R., Wendel A., 1983]. Кроме того, сообщается о двукратном снижении активности сульфотрансферазы — фермента, ответственного за образование сульфоконъюгатов, — у мышей, содержащихся на рационе с дефицитом селена. Это может означать, что дефицит селена в рационе может способствовать снижению образования сульфоконъюгатов ксенобиотиков [Reiter R., Wendel A., 1983]. Дефицит селена в рационе крыс приводил к возрастанию активности некоторых изоформ важного фермента II фазы метаболизма ксенобиотиков — глутатионтрансферазы (2.5.1.18) [Combs J.F., Combs S.B., 1986; Olsson U. et al., 1993; McLeod R. et al., 1997]. Сходные результаты были получены в опытах на мышах [Reiter R., Wendel A., 1983]. Было установлено, что обогащение рациона крыс селеном в концентрациях, превышающих физиологические потребности, оказывает индуцирующее действие на активность ключевых ферментов метаболизма ксенобиотиков. Высокой чувствительностью
к
избытку
селена
отличались
микросомальные
рНФ-UDP-
глюкуронозилтрансфераза (семейство 1А) и эпоксидгидролаза. Показан дозозависимый эффект в изменении активности этих ферментов. В то же время обогащение рациона крыс селеном не оказывало значительного влияния на активность ГБФ-UDPглюкуронозилтрансферазы и цитозольной глутатионтрансферазы, а также на содержание цитохрома Р-450 в микросомах печени [Кравченко Л.В. и др., 1990; 1991]. В другом исследовании [Ip C., Lisk D.J., 1997] также обнаружено возрастание активности UDP-глюкуронозилтрансферазы в печени крыс при обогащении рациона селеном, но в этом случае отмечалось также увеличение активности глутатионтрансферазы. Было показано, что обогащенный селеном рацион снижает токсичность Т-2 токсина у крыс, что связано с усилением процесса конъюгации Т-2 токсина, и это в определенной сте-
- 31 пени коррелирует с изменением активности ферментов, участвующих в его метаболизме [Кравченко Л.В. и др., 1990; 1991]. 1.3.2. Пищевые волокна Пищевые волокна представляют собой комплекс биополимеров, включающий полисахариды (целлюлозу, гемицеллюлозы, пектиновые вещества), а также лигнин (высокомолекулярное соединение ароматической природы) и связанные с ними белковые вещества. Пищевые волокна формируют стенки растительных клеток и отличаются резистентностью к действию пищеварительных ферментов [Тутельян В.А. и др., 1987; Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф., 1998 в]. Пищевые волокна можно разделить на однородные, т.е. сформированные из биополимеров одного вида (целлюлоза, лигнин, пектин и др.) и неоднородные, включающие биополимеры нескольких видов (холоцеллюлоза, целлолигнин, белково-полисахаридные комплексы и др). Одним из основных свойств пищевых волокон, определяющих их поведение в желудочно-кишечном тракте, является их растворимость в воде. К водорастворимым пищевым волокнам относятся пектин, альгиновые кислоты, камеди, слизи и др. Малорастворимые или нерастворимые — это целлюлоза, лигнин, некоторые виды гемицеллюлоз [Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф., 1998 б]. Роль пищевых волокон в питании многообразна. Главными их функциями являются регуляция функциональной активности кишечника, адсорбция токсичных веществ, а также влияние на активность ферментов кишечной микрофлоры [Златкина А.Р., 1994; Prosky L., 2001]. Недостаток пищевых волокон в питании может способствовать развитию ряда заболеваний, таких как атеросклероз, гипертоническая болезнь, диабет и др. [Kritchevsky D., 1986]. Многие исследователи в качестве одного из факторов, способствующих развитию рака толстой кишки и некоторых других онкологических заболеваний, называют недостаточное потребление пищевых волокон [Higginson J., 1984; Ohta M., 1987]. Экспериментально было показано, что обогащение рациона пищевыми волокнами снижало токсическое действие полихлорированных бифенилов, нитрозаминов, полиэтиленгликоля, тяжелых металлов, некоторых микотоксинов и ряда других токсических и канцерогенных соединений экзогенного и эндогенного происхождения [Debethizy J.D., et al.,1985; Kritchevsky D., 1985; Тутельян В.А. и др., 1987;
- 32 Southgate D.A.T., et al.,1990; Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф., 1998 а]. Важно отметить защитное действие пищевых волокон при неблагоприятном влиянии на организм трихотеценовых микотоксинов. Эксперименты показали, что введение в рацион крыс лигносорба (препарат пищевых волокон типа лигнина, выделенный из подсолнечника) снижало токсическое действие Т-2 токсина [Тутельян В.А. и др., 1994]. Неоднократно показано, что введение пищевых волокон в пищу или корм лабораторных животных оказывало профилактический и лечебный эффект при различных патологических состояниях человека и животных. Пищевые волокна оказывали благоприятное влияние на клинические проявления желчнокаменной болезни [Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф., 1998 а], снижали уровень холестерина в крови, липопротеинов высокой плотности и триглицеридов [Hazan A., Madar Z., 1993; Groudeva J. et al., 1997; Bobek P. et al., 2000], способствовали профилактике и лечению атеросклероза [Оганов Р., Киселева Н., 1998] и сахарного диабета [Голубев В.Н., Шелухина Н.П., 1995; Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф., 1998 а]. Отмечаются антиканцерогенные [Ohkami H. et al., 1995; Reddy B.S., 1999; Bobek P. et al., 2000; Jenab M., Thompson L.U., 2000], радиопротекторные [Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф., 1998 а] свойства пищевых волокон, а также их способность восстанавливать нормальное состояние кишечника после химически индуцированного энтероколита [Mao Y. et al., 1996; Deng G.-Y. et al., 1999, 2000]. Действие пищевых волокон на процессы токсикокинетики ксенобиотиков реализуется посредством нескольких механизмов. Первый и самый очевидный из них заключается в усилении перистальтики кишечника, что вызывает ускорение прохождения содержимого кишечника и тем самым сокращает время контакта ксенобиотика со слизистой оболочкой кишечника [Конышев В.А. и др., 1984]. Другой механизм влияния пищевых волокон на токсикокинетику ксенобиотиков связан с их адсорбционными и катионообменными свойствами. Связывание токсинов переводит их в неабсорбируемую форму, снижает действующую концентрацию и ускоряет выведение с калом. В частности, предполагается, что противораковая активность пищевых волокон основана на их свойствах адсорбировать канцерогены [Ferguson L.R., Harris P.J., 1996], а также эстрогены, повышенный уровень которых является основной причиной рака некоторых органов эндокринной системы [Rao J.N., 1996]. Адсорбционная способность пищевых волокон зависит от их источника. Так на примере 1,2-диметилгидразина экспериментально показано, что наиболее эффективным
- 33 адсорбентом являются пшеничные отруби, а пектин цитрусовых обладает минимальной связывающей способностью [Smith-Barbaro P., et al., 1981]. При связывании фенола лигнин и целлолигнин из жмыха виноградных семян значительно превосходят целлюлозу. По способности связывать ионы свинца целлюлоза значительно уступает другим биополимерам жмыха виноградных семян [Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф., 1998 а]. Третий важный механизм состоит во влиянии пищевых волокон на ферментные системы как собственно организма, так и кишечной микрофлоры, которые принимают участие в биотрансформации ксенобиотиков. Была показана способность пищевых волокон изменять активность отдельных изоформ цитохрома Р-450 в печени, причем как снижать, так и повышать их активность. Добавление 20% пшеничных отрубей в корм крыс значительно повышало активность изоформы CYP3A2 цитохрома Р-450, но несколько снижало активность изоформ CYP1A1 и CYP1A2 [Helsby N.A. et al., 2000]. Пищевые волокна из какао-бобов существенно увеличивали количество изоформ CYP1А2, CYP2В1 и CYP2В2 цитохрома Р-450 и снижало образование изоформы CYP2С11 в печени крыс [Nugon-Baudon L. et al., 1996]. Было отмечено снижение активности глутатионтрансферазы и UDPглюкуронозилтрансферазы в печени крыс при введении в их корм большого количества пшеничных отрубей [Helsby N.A. et al., 2000]. По другим данным, введение пищевых волокон из какао-бобов в рацион крыс не влияло на активность печеночной глутатионтрансферазы и способствовало возрастанию активности UDP-глюкуронозилтрансферазы в печени [Nugon-Baudon L. et al., 1996]. Введение в рацион целлюлозы или волокон столовой свеклы индуцировало активность печеночных глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы [Bobek P. et al., 2000]. Показано, что введение пищевых волокон в рацион крыс снижало степень индукции цитохрома Р-450 и UDP-глюкуронозилтрансферазы в печени, вызванной глюкозинолатами [Roland N. et al., 1996]. Обнаружено, что обогащение рациона крыс лигносорбом приводило к возрастанию активности в слизистой тонкой кишки микросомальной карбоксилэстеразы — одного из ключевых ферментов биотрансформации микотоксина Т-2 токсина [Тутельян В.А. и др., 1994]. В ряде сообщений отмечают, что влияние пищевых волокон на ферменты метаболизма ксенобиотиков в кишечнике отличалось от такового в печени лабораторных животных. Пшеничные отруби значительно увеличивали активность глутатионтрансферазы в толстом кишечнике крыс, одновременно снижая активность этого фермента в печени [Helsby N.A. et al., 2000]. Введение пищевых волокон в рацион крыс не влия-
- 34 ло на активность UDP-глюкуронозилтрансферазы и глутатионтрансферазы в кишечнике, при том, что в печени активность UDP-глюкуронозилтрансферазы возрастала [Nugon-Baudon L. et al., 1996]. Отмечалось, что пшеничные отруби снижали уровень индукции цитохрома Р-450 CYP1А1 в слизистой толстой кишки, вызванной 3метилхолантреном [Kawata S. et al., 1992]. Пищевые волокна повышали индуцирующее влияние глюкозинолатов на активность глутатионтрансферазы в печени и толстом кишечнике, но не влияли на уровень индукции этого фермента в тонком кишечнике, а также не влияли на вызванное глюкозинолатами снижение активности цитохрома Р-450 и UDP-глюкуронозилтрансферазы в тонком кишечнике [Roland N. et al., 1996]. Влияние пищевых волокон на токсикокинетику ксенобиотиков проявляется также в изменении состава кишечной микрофлоры и активности микробных ферментов, участвующих в метаболизме чужеродных веществ или их конъюгатов. Известно, что некоторые виды пищевых волокон, являются субстратами для кишечной микрофлоры [Тутельян В.А. и др., 1987; Мухина Ю.Г., 1999]. Так при включении в рацион крыс целлюлозы, каррагинина, смолы гуара или пектина наблюдалось в разной степени выраженное ингибирование β-глюкуронидазы микрофлоры кишечника [Shiau S.-Y., Chang G.W., 1983; Ohkami H. et al., 1995; Manoj G. et al., 2001]. Ингибирующее действие на активность β-глюкуронидазы кишечной микрофлоры людей оказывали овсяные и пшеничные отруби [Reddy B.S. et al., 1992]. Введение в корм крыс каррагинана также приводило к снижению активности β-глюкуронидазы в кишечнике [Mallett A.K. et al., 1985]. Ингибирование активности β-глюкуронидазы кишечной микрофлоры препятствует гидролизу глюкуроновых конъюгатов ксенобиотиков, что выключает их из печеночно-кишечной рециркуляции и способствует скорейшему выведению из организма с калом. Однако, по другим сообщениям пектин способен активировать β-глюкуронидазу микрофлоры кишечника у людей [Ross J.K., et al., 1981] и экспериментальных животных [Bauer H.G., et al., 1979; Rowland I.R. et al., 1983]. При изучении влияния пищевых волокон на токсикокинетику ТТМТ обнаружено, что включение в рацион лигносорба приводит к значительному возрастанию суммарной экскреции метаболитов Т-2 токсина с калом при одновременном снижении их выведения с мочой. Также существенно менялся характер распределения свободных и конъюгированных форм экскретируемых метаболитов Т-2 токсина: возрастало общее количество выделяемого Т-2 токсина, в том числе его глюкуронидов — в 4 раза; экскреция Т-2 триола увеличивалась в 9 раз, а неосоланиола — в 10 раз. Уменьшалась
- 35 общая экскреция Т-2 тетраола, однако в кале количество свободного Т-2 тетраола возрастало. К числу наиболее вероятных механизмов обнаруженных изменений следует отнести связывание токсинов в просвете кишечника, подавление их печеночнокишечной циркуляции и ускорение выведения с калом [Тутельян В.А. и др., 1994]. Известно, что в состав комплекса пищевых волокон помимо биополимеров, определяющих непосредственно термин «пищевые волокна» (лигнин, целлюлоза, пектин, гемицеллюлозы) входят сопутствующие вещества, количество и соотношение которых в исходном сырье и выделенных препаратах пищевых волокон различно [Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф., 1998 а]. Эти естественные включения невозможно полностью удалить современными технологическими методами. Существует предположение, что некоторые эффекты, проявляющиеся при введении пищевых волокон в организм, вызываются именно этими дополнительными компонентами. Одним из таких компонентов является фитиновая (инозитгексафосфорная) кислота, обладающая хемопротекторными и антиоксидантными свойствами [Reddy B.S., 1999]. Эксперименты показывают, что свойство пшеничных отрубей уменьшать апоптоз клеток и подавлять процесс канцерогенеза в толстой кишке проявляется благодаря содержанию в них фитиновой кислоты [Jenab M., Thompson L.U., 2000]. Другими биологически активными соединениями в составе пектинов, влияющими на активность ферментов, являются лигнаны и биофлавоноиды. Таким образом, в результате совокупной реализации разных механизмов снижения токсичности ксенобиотиков, ведение в рацион пищевых волокон оказывается одним из наиболее перспективных естественных способов защиты организма от неблагоприятного воздействия токсикантов. 1.3.3. Пробиотики Данные последних лет убедительно продемонстрировали, что в процессе детоксикации различных соединений, попадающих извне или образующихся в пищеварительном тракте, наряду с печенью большое участие принимает микрофлора желудочно-кишечного тракта. Процессы детоксикации с участием микрофлоры идут по пути микробной биотрансформации химических соединений в нетоксические конечные продукты или в соединения, более легко и быстро разрушающиеся в печени или экскретирующиеся с калом из организма.
- 36 Микрофлора кишечника представляет собой сложный комплекс аэробных и анаэробных бактерий, взаимно влияющих друг на друга и на весь организм. Она выполняет ряд жизненно важных функций: синтез витаминов, аминокислот, ферментов, гормонов, ацетилхолина; ферменты микрофлоры участвуют в расщеплении пищевых веществ и в детоксикации чужеродных соединений; продукты жизнедеятельности бактерий оказывают положительное влияние на вегетативную нервную систему, а также стимулируют иммунную систему; в условиях нормально функционирующего кишечника они способны подавлять и уничтожать различные патогенные микробы [Richardson D., 1996]. В последние годы большое внимание уделяется разработке и созданию принципиально новых препаратов, получивших название «пробиотики» — это препараты на основе живых микроорганизмов, оказывающие при естественном способе введения благоприятное действие на гомеостаз посредством нормализации баланса микрофлоры в кишечнике. Наиболее изученными пробиотиками являются молочнокислые бактерии, особенно Lactobacillus sp. и Bifidobacterium sp. Кроме того, в качестве пробиотиков используются и другие микроорганизмы: Escherichia coli, Streptococcus sp., Enterococcus sp., Bacteroides sp., Bacillus sp., Propionibacterium sp. Некоторые препараты пробиотиков содержат смеси бактериальных штаммов [Kalantzopoulos G., 1997; Rolfe R.D., 2000]. Показано, что позитивные эффекты пробиотических микроорганизмов — прежде всего молочнокислых бактерий и бифидобактерий, связаны с их способностью поддерживать и восстанавливать нормальный баланс кишечной микрофлоры, с их стимулирующим действием на иммунную систему и способностью синтезировать витамины, ферменты и др. регуляторные факторы [Gibson G.R., Roberfroid M.B., 1995; Richardson D., 1996]. Благоприятный эффект пробиотиков проявляется в повышении устойчивости организма к воздействию потенциально вредных микроорганизмов и токсичных соединений [Шендеров Б.А., 1998 а, 1998 б; Macfarlane G.T., 1999]. Пробиотики способствуют нормализации повышенной или пониженной секреции соляной кислоты в желудке. Они повышают эффективность усвоения ряда микронутриентов, как кальций, цинк, железо, марганец, медь и фосфор [Мухина Ю.Г., 1999]. Пробиотики способствуют снижению уровня холестерина в крови, играют определенную роль в предупреждении остеопороза, снижают проявления печеночной энцефалопатии [Macfarlane G.T., 1999; Erickson K.L., Hubbard N.E., 2000], в том числе путем повыше-
- 37 ния в крови уровня гамма-интерферона, обладают антиаллергическим действием [Hunter B.T., 1993]. Пробиотики обладают антиканцерогенной активностью. Показано, что молочнокислые бактерии подавляли канцерогенез в толстом кишечнике мышей, индуцированный 1,2-диметилгидразином, а также ингибировали рост опухолей в печени и молочной железе крыс [Macfarlane G.T., 1999]. Обнаружено, что пробиотики ингибировали кишечные бактериальные ферменты, способствующие активации канцерогенов [Rolfe R.D., 2000]. Имеются сообщения об эффективности длительной терапии молочнокислыми бактериями при опухолях толстой кишки у людей [Hunter B.T., 1993]. Таким образом, лактобациллы являются значимым фактором детоксикации чужеродных веществ посредством детерминирования микробного состава пищеварительного тракта. В основе клинической эффективности молочнокислых бактерий может лежать продукция антибиотических веществ, подавляющих рост микроорганизмов — молочной кислоты, этилового спирта и лизоцима [Мухина Ю.Г., 1999]. Наряду с этим молочнокислые бактерии способны изменять активность ряда микробных ферментов, таких как β-глюкуронидаза, β-глюкозидаза, нитроредуктаза, уреаза [Goldin B.R., Gorbach S.L., 1984; Goldin B.R. et al., 1992; Ling W.H. et al., 1994; Morotomi M., 1996], что также влияет на метаболизм и выведение токсинов из организма. Еще около 20 лет тому назад было показано, что Lactobacillus acidophilus снижали активность βглюкуронидазы [Ayebo A.D. et al., 1980]. Этот факт был подтвержден более поздними исследованиями, которые показали, что Lactobacillus GG снижали активность βглюкуронидазы и нитроредуктазы в кишечнике [Ling W.H. et al., 1994]. У безмикробных крыс было отмечено снижение активности β-глюкозидазы и β-глюкуронидазы, индуцированное L. acidophilus. Такой эффект, однако, не вызывали бифидобактерии Bifidobacterium adolescentis [Cole C.B. et al., 1989]. Отмечается, что пробиотики могут воздействовать на микрофлору ЖКТ лишь при определенной их концентрации, которая находится в пределах между 106 и 108 клеток/г кишечного содержимого [Richardson D., 1996]. Эксперименты показывают, что введение пробиотических штаммов микроорганизмов в количестве 108–109 клеток приводит к значительным изменениям микрофлоры кишечника человека [Gmeiner M. et al., 2000]. Эти изменения касаются состава микрофлоры и ее влияния на различные биохимические процессы. Терапевтическая доза пробиотиков для мышей определена на уровне 5·108 клеток [Мальцев В.Н. и др., 1978; Коршунова В.М. и др., 1980].
- 38 -
1.3.4. Биотрансформация и детоксикация чужеродных соединений при их комбинированном поступлении Пища является носителем большого числа как природных, так и антропогенных токсикантов. Есть основания предполагать, что существует взаимодействие между поступающими в организм ксенобиотиками, влияющее на их биотрансформацию. Характер взаимодействия при комбинированном поступлении ксенобиотиков определяется структурной близостью ксенобиотиков, наличием близких (общих) путей метаболизма, общими (если имеются) органами-мишенями, одинаковыми путями выведения [Groten G.P. et al., 2000]. Для проявления возможного взаимодействия поступающие в организм дозы ксенобиотиков должны находиться в пределах диапазона возникновения реакции для каждого химического вещества [Feron V.J. et al., 1995]. Кроме того, важно, чтобы продолжительность и величина суммарного потребления были токсикологически значимыми [Principles for the safety..., 1987]. Возможными эффектами комбинированного действия ксенобиотиков на организм могут являться как усиление токсичности (суммирование эффектов или синергическое усиление), так и ослабление (антагонизм) [Casse F.R. et al., 1998]. Ферменты, ответственные за метаболизм ксенобиотиков, обычно характеризуются низкой специфичностью, но высоким потенциалом. Ксенобиотики, в биотрансформации которых участвует один и тот же фермент, могут взаимодействовать при конкуренции за фермент, но такая конкуренция может возникнуть лишь при поступлении в организм ксенобиотиков в достаточных количествах, насыщающих процесс взаимодействия с ферментом. При превышении этих количеств взаимодействие ксенобиотиков носит дозозависимый характер. Также может иметь место взаимодействие, при котором одно чужеродное соединение выступает ингибитором или индуктором ферментов биотрансформации другого соединения. Наиболее часто индукции или ингибированию ксенобиотиками подвергаются изоферменты цитохрома Р-450 и некоторые ферменты, ответственные за реакции конъюгации [Лакин К.М., Крылов Ю.Ф., 1981; Ренвик А.Г., 2000]. Установлено, что грибы-продуценты микотоксинов в природных условиях способны синтезировать одновременно несколько микотоксинов. Так, имеются многочисленные данные о совместном присутствии двух и более токсинов в контаминированном грибами Fusarium зерне. Наряду с ДОН часто обнаруживали другие трихо-
- 39 тецены — ацетилДОН, ниваленол, Т-2 токсин [Teich A.H., et al., 1987; Tanaka T., et al., 1986 a; Miller J.D., 1995 а], а также афлатоксины [Sardjono A.N. et al., 1998]. Наиболее часто обнаруживаемым наряду с ДОН фузариотоксином является зеараленон, выявленный во многих странах Европы [Perkowski J., et al., 1990; Hietaniemi V., Kumpulainen J., 1991; Müller H.M. et al., 1998], Северной и Южной Америки [Pineiro M.S. et al., 1995-96; Gonzalez H.H. et al., 1999], Новой Зеландии [Lauren D.R., Ringrose M.A., 1997], Японии [Yoshizawa T., Jin Y.Z., 1995] и др. В странах ЮгоВосточной Азии совместно с ДОН постоянно обнаруживается ниваленол, иногда в бо´ льших количествах, чем ДОН [Yoshizawa T., 1984; Tanaka T., et al., 1986 б; Miller J.D., 1995 б]. По результатам наших исследований в 1992 г. 69% проанализированных партий свежеубранного зерна пшеницы одновременно с ДОН содержали зеараленон [Львова Л.С. и др., 1994]. Имеющиеся данные о возможности высокой частоты загрязнения зерна двумя фузариотоксинами ставят вопрос о взаимоотношениях и возможном синергизме действия микотоксинов при их совместном поступлении с пищей. Сведения о таком взаимодействии фузариотоксинов практически отсутствуют, однако единичные исследования показывают, что в большинстве случаев загрязненное в природных условиях смесью микотоксинов продовольственное сырье оказывается более токсичным, чем можно было бы ожидать от действия индивидуальных микотоксинов [Trenholm H.L. et al., 1994; Smith T.K. et al., 1997]. Результаты эпидемиологических наблюдений свидетельствуют, что поступление с пищей (кормом) нескольких микотоксинов является причиной алиментарных микотоксикозов и, в первую очередь, фузариотоксикозов как у человека, так и у сельскохозяйственных животных. Описаны случаи массовых отравлений людей в Индии, где наряду с ДОН в пшеничной муке были обнаружены в высоких концентрациях Т-2 токсин, ниваленол и ацетил-ДОН [Bhat R.V. et al., 1989], и в Китае, где в качестве загрязнителей пшеницы и кукурузы микотоксинами одновременно присутствовали ДОН и зеараленон [Luo X.Y., 1988]. ДОН, поступая с кормом в организм свиней в составе естественно контаминированной микромицетами Fusarium пшеницы, оказывал более сильное воздействие на животных, чем введенное с кормом эквивалентное количество чистого препарата ДОН. [Trenholm H.L. et al., 1994]. Т-2 токсин усиливал неблагоприятное действие ДОН на свиней, выражающееся в снижении прироста массы тела и потребления корма
- 40 [Friend D.W., et al., 1992]. Естественно встречающиеся сочетания Т-2 токсин – диацетоксискирпенол,
диацетоксискирпенол – ДОН
и
диацетоксискирпенол –
фузаренон-Х демонстрировали синергическое усиление действия микотоксинов у лабораторных животных [Schiefer H.B., et al., 1986; Bhavanishankar T.N., et al., 1988]. Комбинированное действие ДОН и Т-2 токсина на крыс в дозах, превышающих неэффективные дозы, характеризуется дозозависимым усилением токсичности индивидуальных микотоксинов. Комбинированное действие ДОН и Т-2 токсина в неэффективных
дозах
характеризуется
отсутствием
каких-либо
проявлений
токсичности [Кравченко Л.В. и др., 2000]. Таким образом, первостепенное значение для проявления комбинированного действия фузариотоксинов имеет их доза, также как и при взаимодействии других поступающих в организм ксенобиотиков.
- 40 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1.1. Животные и их содержание Исследования проводили на крысах линии Вистар — самцах и самках (в эксперименте по изучению комбинированного действия ДОН и зеараленона на метаболизм ДОН), выращенных в Питомнике лабораторных животных РАМН «Столбовая», с массой тела от 130 до 250 г в зависимости от эксперимента. В эксперименте по изучению влияния уровня селена в рационе на метаболизм ДОН использовали растущих крыс массой 50 г и крысят-отъемышей. Всего в работе было использовано 182 крысы. Животные получали соответствующие эксперименту рационы, а также воду без ограничений. Животных содержали в стандартных условиях вивария Института питания РАМН, в помещениях с температурой +20–24°С. 2.1.1.1. Экспериментальные рационы В зависимости от поставленных задач были использованы рационы, приведенные в табл. 1–8. 1. Общевиварный рацион, разработанный Институтом питания РАМН Таблица 1. Состав общевиварного рациона (на 1 крысу массой 130-240 г) Ингредиент Подсолнечник (семена) Овес Хлеб 2 сорта пшеничный Каша пшенная Творог нежирный Рыбная мука Мясо 2 к. Морковь Зелень (салат) Рыбий жир Дрожжи NaCl ИТОГО:
Масса, г
Белок, г
Жир, г
Углеводы, г
Ккал
3,700
0,760
1,900
0,114
22,100
10,300
1,030
0,630
4,900
25,800
4,000
0,340
0,050
1,830
9,320
2,500 2,000 0,500 4,000 8,000 8,000 0,100 0,100 0,150 43,350
0,270 0,360 0,230 0,800 0,104 0,120 0 0,050
0,340 0,012 0,027 0,390 0,008 0,016 0,099 0,010
1,560 0,036 0 0 0,670 0,250 0 0,083
10,500 1,760 1,170 6,720 2,400 1,360 0,900 0,085
4,060
3,480
9,440
82,120
- 41 2. Полусинтетический рацион, разработанный Институтом питания РАМН. Таблица 2. Состав полусинтетического рациона Продукты
Масса продуктов в г на
Масса крыс в граммах 40–60
60–90
90–120
24,0
2,400
3,150
3,580
4,800
5,100
1,0
0,100
0,130
0,150
0,200
0,210
58,8
5,880
7,750
8,770
11,760
12,500
5,0
0,500
0,650
0,740
1,000
1,000
Лярд
5,0
0,500
0,650
0,740
1,000
1,000
Солевая смесь (табл. 4)
4,0
0,400
0,520
0,590
0,800
0,800
Витамины ж/р (табл. 5)
0,2
0,020
0,020
0,024
0,030
0,036
Целлюлоза
2,0
0,200
0,200
0,200
0,200
0,200
100 г смеси Казеин Витаминная смесь (табл. 3) Крахмал Масло растительное
120–200 200–280
Таблица 3. Состав витаминной смеси для приготовления полусинтетического рациона Института питания РАМН (на 1000 г смеси) Витамины
Количество, мг
В1 (тиамин)
400
В2 (рибофлавин)
600
В6 (пиридоксин)
400
Никотинамид
1500
Пантотенат кальция
1500
Фолиевая кислота
200
Витамин К
100
Биотин
10
В12
3
Фитин Сахароза
5000 до 1000 г
- 42 Таблица 4. Состав солевой смеси для приготовления полусинтетического рациона Института питания РАМН Название солей
Формула
Количество, г
NaCl
58,500
KHPO4
163,300
Сернокислый магний
MgSO4 · 7H2O
24,100
Углекислый кальций
CaCO3
160,200
FeSO4 · H2O
11,100
KJ
0,322
Сернокислый марганец
MnSO4 · 2H2O
1,870
Сернокислый цинк
ZnSO4 · 7H2O
0,230
Сернокислая медь
CuSO4 · 5H2O
0,200
Хлористый кобальт
CoCl2 · 6H2O
0,010
Фтористый натрий
NaF
0,210
KAl(SO4)2 · 12H2O
0,047
Хлористый натрий Фосфорнокислый калий однозамещенный
Сернокислое железо (закисное) Йодистый калий
Алюмокалиевые квасцы ИТОГО:
420,089 Таблица 5.
Состав смеси жирорастворимых витаминов для приготовления полусинтетического рациона Института питания РАМН Витамины Е (токоферол)
на 1кг рациона 60 мг
А (ретинол)
800 МЕ
D (эргокальциферол)
700 МЕ
3. Полусинтетический рацион, дефицитный по селену. При проведении эксперимента по изучению влияния дефицита селена в рационе крыс на метаболизм ДОН готовили специальный полусинтетический безселеновый рацион. При создании модели селеновой недостаточности у крыс за основу был взят метод, предложенный Burk R.F. (1987), но вместо дрожжей Torula в качестве источника белка использовали дрожжи А/О «Алко» (Финляндия) с содержанием селена не более 0,04 мг/кг. Общее содержание селена в рационе составляло менее 0,02 мг/кг. В качестве источника углеводов использовали сахар и крахмал, не содержащие селен. Со-
- 43 левая и витаминная смеси были составлены с учетом химического состава использованных дрожжей и не содержали селен. Контрольный полусинтетический рацион включал дополнительно к «безселеновой» дрожжевой муке обогащенную селеном дрожжевую муку с содержанием селена (селенометионина) 450±8 мг/кг в количестве, обеспечивающем концентрацию селена не менее 0,5 мг/кг рациона. Для приготовления рациона и в качестве питьевой использовали дважды дистиллированную воду. Таблица 6. Состав полусинтетичекого рациона, дефицитного по селену Продукты
Количество (г/100 г рациона)
Дрожжевая мука*
30,0
Крахмал
26,5
Сахар
26,5
Масло растительное
5,0
Лярд
5,0
Солевая смесь (табл. 7)
4,0
Витаминная смесь
1,0
Метионин
0,3
Целлюлоза
2,0
Витамины ж/р
0,2 мл
* содержание белка в дрожжевой муке – 50%. Таблица 7. Состав солевой смеси для эксперимента с дефицитом селена Название солей
Формула
Количество, г
KCl
121,80
NaHPO4
286,40
Сернокислый магний
MgSO4 · 7H2O
71,40
Углекислый кальций
CaCO3
380,40
FeSO4 · H2O
26,40
KJ
0,77
Сернокислый марганец
MnSO4 · 2H2O
4,55
Сернокислая медь
CuSO4 · 5H2O
0,48
Фтористый натрий
NaF
0,21
Хлористый калий Фосфорнокислый натрий однозамещенный
Сернокислое железо (закисное) Йодистый калий
ИТОГО:
892,41
- 44 4. Полусинтетический рацион с включением контаминированного микотоксинами зерна Таблица 8. Состав полусинтетического рацион для изучения комбинированного действия ДОН и зеараленона на метаболизм ДОН Продукты Пшеничная крупа Казеин Крахмал Масло растительное Лярд Витаминная смесь* Солевая смесь** Витамины ж/р***
Количество (г/100 г рациона) 50,0 12,0 27,0 3,0 3,0 1,0 4,0 0,2 мл
*, **, *** — витаминную смесь, солевую смесь и смесь жирорастворимых витаминов использовали как в стандартном полусинтетическом рационе Института питания РАМН. 2.1.1.2. Условия экспериментов по изучению метаболизма ДОН В экспериментах по изучению метаболизма ДОН крысы содержались в индивидуальных металлических обменных клетках
Ô
с сетчатым дном. Каждая клетка оснащалась металлической воронкой для сбора экскрементов, под которой располагались стеклянная воронка и колба-приемник для мочи. Кал задерживался пластиковой сеточкой, размещенной в стеклянной воронке. Моча и кал собирались раздельно каждый час (за исключением ночного времени) в течение 48 часов. По окончании эксперимента клетка и металлическая воронка омывались 10-15 мл дистиллированной воды, смыв присоединялся к собранной моче. Мочу фильтровали и замеряли ее объем. Кал высушивали в термостате при температуре 63°С до постоянного веса и измельчали в фарфоровой ступке. Образцы мочи и кала хранились до проведения анализа при температуре -18°С.
В каждом конкретном эксперименте животные получали корм, соответствующий этому эксперименту.
- 45 2.1.2. Реактивы и материалы, используемые в работе Ацетонитрил («Криохром», Россия) для ВЭЖХ и приготовления стандартного раствора ДОН использовали квалификации “ос.ч.”, ацетонитрил («Криохром», Россия) для экстракции образцов и промывания адсорбционной колонки — “х.ч.”. Бензол (ПО «Азот», Россия) и этилацетат («Реактив», Украина) для приготовления стандартных растворов ДОН и ДОМ-1 использовали квалификации “х.ч.”. Растворители для приготовления стандартных растворов микотоксинов очищали перегонкой. Рабочие растворы ДОН и ДОМ-1 для ВЭЖХ готовили в метаноле “х.ч.” фирмы “MERCK” (Германия) Изопропанол (Шосткинский з-д химреактивов, Украина) для упаривания экстрактов и для приготовления подвижной фазы для ВЭЖХ соответствовал квалификации “ос.ч.”. Подвижную фазу для ВЭЖХ при идентификации и определении степени чистоты выделенных ДОН и ДОМ-1 готовили с использованием гексана (Новочеркасский з-д синтетических продуктов, Россия) квалификации “х.ч.”. Для приготовления растворов для экстракции токсинов, элюирования колонок и подвижной фазы ВЭЖХ использовали бидистиллированную воду. При очистке активированного угля применяли уксусную кислоту “х.ч.” (Ереванский з-д химреактивов, Армения), этиловый спирт-ректификат (ГОСТ 18300) и ацетон “ос.ч.” (ОАО «Синтез», Россия). Для гидролиза конъюгированных форм ДОН и ДОМ-1 использовали препарат ферментов β-глюкуронидазы (7,8 ед./мл) и арилсульфатазы (12,1 ед./мл) (“Serva”, Германия). В эксперименте по изучению влияния индукторов ферментов метаболизма ксенобиотиков на метаболизм ДОН использовали фенобарбитал фирмы “Serva” (Германия), 3-метилхолантрен и транс-стильбеноксид фирмы “Sigma” (США). Активированный уголь, используемый для очистки экстракта, готовили по следующей схеме. 200 г нейтрального активированного угля БАУ (Россия) измельчали на лабораторной мельнице, помещали в цилиндрическую вакуумную воронку с бумажным фильтром и последовательно промывали под слабым вакуумом 2 л дистиллированной воды, 1 л 2% уксусной кислоты, 2 л дистиллированной воды, 1 л этилового спирта и 1 л ацетона. Промытый уголь переносили на металлический лоток и оставляли в сушильном шкафу при температуре 120 °С на 15 часов. Очистку образцов биологического материала методом препаративной ТСХ проводили на стеклянных хроматографических пластинках фирмы “MERCK” (Герма-
- 46 ния) размером 10 х 10 см с толщиной слоя силикагеля 0,2 мм и размером пор 6 нм. Визуальное наблюдение флуоресцирующих пятен токсинов проводили в УФ-боксе фирмы “Camag” (Швейцария) при длине волны 366 нм. Препараты микотоксинов Для введения крысам и приготовления стандартного раствора в эксперименте использовали коммерческий препарат ДОН фирмы “Sigma” (США), а также ДОН, полученный нами по методике [Тутельян В.А. и др., 1991]. Структуру выделенного токсина подтверждали методом масс-спектрометрии с использованием хроматомассспектрометра “Finnigan-3200F” (США)*. Идентификацию и степень чистоты проводили методами ТСХ, а также нормально- и обращеннофазной ВЭЖХ. Содержание ДОН в полученном препарате составило не менее 96-98%. ДОМ-1 был получен по методике [Cote L.-M. et al., 1986 б] при инкубации ДОН с содержимым рубца бычка с последующим выделением метаболита методом хроматографии на колонке с силикагелем и препаративной обращеннофазной ВЭЖХ**. Идентификацию и степень чистоты выделенного токсина проводили методами ТСХ и ВЭЖХ. Степень чистоты полученного препарата ДОМ-1 составляла 97%. Структура выделенного ДОМ-1 была подтверждена масс-спектрометрически на хроматомассспектрометре “Finnigan-3200F” (США)*. Для приготовления стандартных растворов навески токсинов растворяли в смеси бензол-ацетонитрил (98:2) (ДОН) и в этилацетате (ДОМ-1). Стандартные растворы токсинов хранили в стеклянной герметичной посуде при температуре -10 °С. Перед введением в хроматограф стандартные растворы упаривали в токе азота и перерастворяли в метаноле; рабочие растворы имели концентрации СДОН=9,715 нг/мкл и СДОМ-1=12,5 нг/мкл. 2.1.3. Физико-химические методы исследования 2.1.3.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография Определение содержания ДОН и ДОМ-1 в биологическом материале проводили методом ВЭЖХ на хроматографе “Altex” модель 110 А (США) с УФ-детектором *
Масс-спектрометрические исследования проводились совместно с Ф.А. Медведевым (НИИ питания РАМН), за что автор выражает ему искреннюю признательность. ** Получение ДОМ-1 проводилось В.С. Соболевым и Л.П. Захаровой (НИИ питания РАМН), за что автор выражает им глубокую благодарность.
- 47 “Kratos-757” (США) при длине волны 224 нм. Хроматографическая колонка “Силасорб SPH С18” 3 х 250 мм, размер частиц 6 мкм. В качестве подвижной фазы использовали 8% ацетонитрил. Расход подвижной фазы 0,7 мл/мин. Предел обнаружения метода для ДОН и ДОМ-1 в моче и кале крыс составил 50 нг/г, относительное стандартное отклонение — 0,05–0,1. Идентификацию и степень чистоты выделенных токсинов проводили методом нормально- и обращеннофазной ВЭЖХ на хроматографе “Altex-110A” (США) с УФдетектором “Kratos-757” (США) при длине волны 224 нм. В нормальнофазном варианте ВЭЖХ использовали колонку “Ultrasphere-Si” (“Beckman”, США) 4,6 х 250 мм с размером частиц 5 мкм, подвижная фаза гексан-изопропанол-вода (85:25:1,5), расход подвижной фазы 1,5 мл/мин. При обращеннофазной ВЭЖХ применяли колонку “Ultrasphere-ODS” (“Beckman”, США) 4,6 х 250 мм с размером частиц 5 мкм, в качестве подвижной фазы использовали 30% водный метанол, расход подвижной фазы 1,0 мл/мин. 2.1.3.2. Масс- и хроматомасс-спектрометрия Структуру выделенных токсинов подтверждали методом масс-спектрометрии*. Спектры исходных соединений и их ТМС-производных были сняты на хроматомассспектрометре “Finnigan-3200F” (США) при ионизирующем напряжении 70 э/в, температуре источника ионов 120°С, в диапазоне массовых чисел 39-520 а.е.м. Хроматографическое разделение ТМС-производных токсинов проводили на кварцевой капиллярной колонке с фазой SE-30 при температуре от 30°С до 290°С. Температура инжектора составляла 270°С. 2.1.4. Метод определения ДОН и его метаболитов в кале и моче крыс ДОН и его метаболиты в моче и кале крыс определяли по методу, разработанному в Институте питания РАМН [Тутельян В.А. и др., 1991], в нашей модификации. В полиэтиленовую колонку диаметром 9 мм с пористым тефлоновым фильтром последовательно помещали смесь 0,1 г нейтрального активированного угля и 0,15 г целита, 0,1 г нейтрального оксида алюминия (для хроматографии по Брокману II). Сверху помещали кусочек ваты. Колонку последовательно промывали 3–5 мл 2% водного раствора уксусной кислоты, 3–5 мл ацетонитрила, 5 мл воды в слабом вакууме водоструйного насоса. *
См. стр. 46.
- 48 1 мл мочи наносили на колонку, промывали 3 мл воды. ДОН и ДОМ-1 элюировали 3 мл смеси ацетонитрил-вода (4:1). Из элюата удаляли основную массу ацетонитрила упариванием в токе азота на водяной бане, к остатку (до 1 мл) добавляли 4–5 мл насыщенного водного раствора хлорида натрия, токсины четырежды экстрагировали этилацетатом порциями по 5 мл. Объединенные экстракты упаривали на ротационном испарителе досуха. К образцу кала добавляли равную массу целита 545 и тщательно гомогенизировали в фарфоровой ступке; навеску гомогенной массы, соответствующую 3 г цельного кала, экстрагировали 20 мл смеси метанол-вода (1:1) в течение 1 ч, затем добавляли равный объем ацетона и фильтровали через складчатый бумажный фильтр, отбирали аликвоту 15 мл, упаривали в вакууме до объема 3–3,5 мл, наносили на колонку и элюировали, как это описано для мочи. Глюкуроновые конъюгаты ДОН и ДОМ-1 определяли, используя ферментную реакцию с β-глюкуронидазой. К 1 мл мочи добавляли 4 мл ацетатного буфера (рН 5,0) и 10 мг г β-глюкуронидазы (“Serva”, США) с активностью 51 ед/г (920000 ед. Фишмана/г), инкубировали в течение 16–18 ч при 37°С, наносили на колонку и элюировали, как описано выше. Для определения глюкуронидов в кале навеску смеси кала с целитом экстрагировали смесью метанол-вода (1:1) в течение 1 ч, фильтровали. Аликвоту фильтрата, соответствующую 0,7 г, упаривали в вакууме досуха, перерастворяли в 4 мл ацетатного буфера. Ферментную реакцию и последующую очистку на колонке проводили как описано для мочи. Сухие остатки растворяли в метаноле и анализировали методом ВЭЖХ. 2.1.5. Статистическая обработка результатов Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием компьютерных программ “Statgraphics” (США) и “Excel” (“Microsoft”, США). Достоверность отличия от контроля средних показателей опытных групп рассчитывали с использованием t-критерия Стьюдента. Полученные экспериментальные показатели представляли в виде M±m. Различия считали достоверными при P