Диагностические возможности регистрации спонтанной биоэлектрической активности

ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ШАПКИН Андрей Григорьевич ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ РЕГИСТРАЦИИ СПОНТАННОЙ БИОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И МЕХАНИЗМЫ ИЗМЕНЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ СПИННОГО МОЗГА ПРИ ПОВРЕЖДЕНИИ (экспериментально-клиническое исследование) 14. 00. 28 - нейрохирургия 14. 00. 16 - патологическая физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители: Доктор медицинских наук, Г.З. Суфианова. Доктор медицинских наук, А.А. Суфианов.

Иркутск - 2005

2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АТФ - аденозин-5`-трифосфорная кислота ИЦВ – интрацеребровентрикулярный КТ – рентгеновская компьютерная томография МРТ – ядерная магнитно-резонансная томография РД – распространяющаяся депрессия УПП – уровень постоянного потенциала ФС – функциональное состояние ЦНС – центральная нервная система ЭКГ – электрокардиография, электрокардиограмма ЭМГ – электромиография, электромиограмма ЭСГ – электроспинография, электроспинограмма ЭЭГ – электроэнцефалография, электроэнцефалограмма

3

СОДЕРЖАНИЕ Стр. ВВЕДЕНИЕ ………………………………………………………….…..

6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………….….

12

1.1. Спонтанная электрическая активность спинного мозга……….…

12

1.1.1. Медленная электрическая активность спинного мозга…….…..

12

1.1.2. Уровень постоянного потенциала спинного мозга………….….

17

1.2. Общие представления о механизмах повреждения нервной ткани спинного мозга. ……………………………………………………....

20

1.3. Электрические явления в спинном мозге при повреждении….….

25

1.3.1. Распространяющаяся депрессия……………………………….....

25

1.3.2. Изменения спонтанной биоэлектрической активности спинного мозга при повреждении………………………………………...….....

28

1.4. Пуриновые и пиримидиновые рецепторы. Механизмы нейропротекторного действия АТФ……………………………………….….

33

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ……………………………….…..

40

2.1. Общая характеристика экспериментальных исследований….….

40

2.1.1.Объекты исследования……………………………………….…...

40

2.1.2. Методы моделирования повреждения спинного мозга…….…..

41

2.1.2.1. Перерезка спинного мозга .………………………………….…

41

2.1.2.2. Компрессионное повреждение спинного мозга……………....

41

2.1.2.3. Ишемическое повреждение спинного мозга……………….….

42

2.1.2.4. Моделирование внутричерепной гипертензии…………….….

44

2.1.3. Методика изготовления и вживления электродов для исследования функционального состояния спинного и головного мозга…….

44

2.1.4. Методика оценки функционального состояния спинного и головного мозга………………………………………………………….…

45

2.1.5. Исследование неврологического статуса экспериментальных животных при моделировании повреждения спинного мозга………..

46

4

2.1.6. Изучение влияния АТФ на функциональное состояние нервной ткани в норме и при повреждении………………………………...

49

2.2. Общая характеристика клинических исследований...…………..

50

2.3. Методы статистической обработки результатов…………………

53

Глава 3. ИЗМЕНЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ СПИННОГО МОЗГА ПРИ ПОВРЕЖДЕНИИ…………………….…...

54

3.1 Нормальная электроспинограмма крысы……………………….….

54

3.2. Неврологические и электрофизиологические изменения при перерезке спинного мозга………………………………………………….

58

3.3. Неврологические и электрофизиологические изменения при локальном компрессионном повреждении спинного мозга…………….

64

3.4. Неврологические и электрофизиологические изменения при ишемическом повреждении спинного мозга……………………….….

70

3.5. Неврологические и электрофизиологические изменения при моделировании внутричерепной гипертензии…………………………....

79

Глава 4. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЗАЩИТНОГО ДЕЙСТВИЯ АТФ ПРИ ЛОКАЛЬНОМ КОМПРЕССИОННОМ ПОВРЕЖДЕНИИ СПИННОГО МОЗГА………………………………………..

86

4.1. Изменения УПП и медленной электрической активности головного мозга при интрацеребровентрикулярном введении АТФ…….....

86

4.2. Изменения УПП и медленной электрической активности спинного мозга при интрацеребровентрикулярном введении АТФ.............

91

4.3. Защитное действие АТФ при локальном компрессионном повреждении спинного мозга……………………………………………...

94

Глава 5. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ РЕГИСТРАЦИИ СПОНТАННОЙ БИОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРИ ПОЗВОНОЧНО-СПИННОМОЗГОВОЙ ТРАВМЕ ……..………

102

5.1. Методика регистрации спонтанной биоэлектрической активности спинного мозга с поверхности кожи …………………………..…..

102

5

5.2. Спонтанная биоэлектрическая активность спинного мозга у пациентов контрольной клинической группы.………………………...…

104

5.3. Изменения функционального состояния спинного мозга при позвоночно-спинномозговой травме у пациентов основной клинической группы …………..…………..…………..…………..……………...

107

Глава 6. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ………….

117

ВЫВОДЫ…………………………………………………………………

130

Практические рекомендации……………………………………………

131

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………….

132

6

ВВЕДЕНИЕ По данным эпидемиологических исследований, распространенность спинальной травмы в РФ составляет около 50-60 случаев на миллион. Эта патология встречается преимущественно у молодых людей трудоспособного возраста, в 2,5-3 раза чаще у мужчин, чем у женщин; 5-10% случаев повреждения спинного мозга отмечают у детей. Исход в полный паралич при этой патологии составляет 65%, а летальность около 20%. Несмотря на успехи современной нейрохирургии и реаниматологии, частота и тяжесть повреждений спинного мозга не только не уменьшается, но и возрастает. Отмечено, что в течении XX века, наблюдался рост спинального травматизма более чем в 200 раз [Луцик А.А. и соавт., 1989; Фомичев Н.Г. и соавт., 1990; Акшулаков С.К., Керимбаев Т.Т., 2002; Гайдар Б.В. и соавт., 2002; Шлапак И.П. и соавт., 2002; Леонтьев М.А., 2003; Tator C.H., 2002]. Высокая социальная значимость и развитие новых методов лечения спинальных повреждений определяют необходимость детального изучения механизмов изменения и разработки новых методов прямой нейрофизиологической диагностики функционального состояния спинного мозга [Ступак В.В. и соавт., 1998; Шабалов В.А. и соавт., 2004]. В тоже время, достаточно простых и неинвазивных методических подходов для решения этой задачи не разработано. Существующие методы диагностики функционального состояния спинного мозга основаны в основном на регистрации электрических реакций периферических нервных волокон и позволяют проводить только косвенную оценку центральных процессов [Костюк П.Г., 1964]. Оптимальным решением этого вопроса является регистрация спонтанной электрической активности спинного мозга в виде электроспинограммы (ЭСГ) и уровня постоянного потенциала (УПП) [Оноприенко А.П., 1984, 1987]. Однако регистрация ЭСГ у человека не нашла широкого клинического применения. Большинство работ, посвященных изучению этой проблемы, выполнены на открытом спинном мозге или с использованием пункционной методики отведения биопотенциалов

7

[Pool J.L., 1946; Бассин Ф.В. и соавт., 1951; Штарк М.Б., 1959; Puletti F., Blomquist A.J., 1967; Hitchcock E., Lewin M., 1969; Fujita S., Cooper I.S., 1976; Майорчик В.Е., Храпов В.С., 1962], что сопряжено с наличием определенных технических трудностей [Shimoji K. et al., 1972]. В доступной нам литературе мы встретили только единичные указания на возможность регистрации ЭСГ у человека с поверхности кожи [Оноприенко А.П., 1984; Dzialek E., 1975]. Кроме того, мы не обнаружили ссылок на работы, посвященные изучению УПП спинного мозга человека. Немногочисленные подобные исследования были выполнены преимущественно на животных [Сорохтин Г.Н., Темпер Ю.Б., 1959; Сорохтин Г.Н., Андриайнен О.А., 1966; Лупандин Ю.В., 1966; Lothman E.W., Somjen G.G., 1975; Sato I. et al., 1979; Rosenthal M. et al., 1979; Goodman R.M. et al., 1985; Jimenez I. et al., 1987; Czeh G., Somjen G.G., 1990; Murai H. et al., 1991]. Несмотря на высокую диагностическую чувствительность метода регистрации ЭСГ при повреждении спинного мозга, необходимо отметить, что в настоящее время нет однозначных представлений об изменении спонтанной электрической активности спинного мозга при повреждении. Одни и те же по своей природе воздействия, по данным разных авторов, могут вызывать различные ЭСГ и УПП ответы [Штарк М.Б., 1959; Dzialek E., 1975; Molt J.T. et al., 1978; Rossini P.M. et al., 1980; Greco F. et al., 1981; van Gestel M.A., 1986; Оноприенко А.П., 1984, 1987]. Кроме отсутствия единого мнения в понимании механизмов повреждения и восстановления спинного мозга, необходимо признать, что данная патология остается малоизученной и в плане терапевтического воздействия. Перспективным направлением в терапии повреждений спинного мозга являются агонисты аденозиновых рецепторов [Суфианова Г.З., 2003; Von Lubitz D., Jacobson K.A., 1994; Chen J-F. et al., 1999; Fricker J., 2000]. Непосредственные электрофизиологические механизмы действия природного аналога аденозина — АТФ изучены еще недостаточно. Первичные эффекты этого препарата могут быть связаны с активацией P2X и P2Y рецепторов, вторичные эффекты — с ферментативной деградацией до аденозина, действующего

8

через P1 рецепторы [Illes P., Ribeiro J.A., 2004]. При этом может проявляться двойственный эффект, что приводит к неоднозначным выводам о терапевтичекой эффективности АТФ при повреждении нервной ткани [Amadio S. et al., 2002; Kharlamov A. et al., 2002; Ortinau S. et al., 2003; Luthardt J. et al., 2003; Zhang J.M. et al., 2003]. Это определяет необходимость дополнительного детального изучения влияния этого препарата на функциональное состояние нервной ткани с использованием новых методических подходов. Цель работы. Целью настоящего исследования было изучение генеза электрофизиологических и неврологических нарушений, а также диагностических возможностей регистрации ЭСГ и УПП при повреждении спинного мозга в эксперименте и клинической практике; исследование электрофизиологических механизмов миелопротекторной активности АТФ. Задачи: 1. Разработать методику вживления электродов в эпидуральное пространство спинного мозга крыс и оценить диагностические возможности одновременной регистрация УПП и ЭСГ для оценки функционального состояния спинного мозга в эксперименте. 2. Изучить характер и возможные механизмы электрофизиологических и неврологических изменений на моделях локального (перерезка и компрессионное повреждение спинного мозга) и распространенного (ишемия спинного мозга и повышение внутричерепного давления) повреждений спинного мозга. 3. Разработать методику одновременной регистрации ЭСГ и УПП спинного мозга с поверхности кожи у человека и оценить диагностические возможности этого метода в клинике при повреждении спинного мозга. 4. Исследовать влияние интрацеребровентрикулярного введения АТФ на функциональное состояние головного и спинного мозга. 5. Изучить электрофизиологические проявления миелопротекторной активности АТФ с учетом механизма его действия при локальном компрессионном повреждении спинного мозга.

9

Научная новизна. Впервые в условиях эксперимента показана высокая информативность одновременной регистрации УПП и ЭСГ для оценки функционального состояния спинного мозга при его повреждении и изучения новых нейропротекторных препаратов. Продемонстрирована эффективность метода одновременной регистрации ЭСГ и УПП спинного мозга с поверхности кожи у человека для ранней неинвазивной диагностики тяжести и локализации повреждения нервной ткани. Выявлены электрофизиологические механизмы неврологических нарушений при локальных и распространенных спинальных повреждениях. Впервые изучено влияние интрацеребровентрикулярного введения АТФ на функциональное состояние нервной ткани головного и спинного мозга. На модели локального компрессионного повреждения спинного мозга выявлен миелопротекторный эффект АТФ и исследованы его возможные электрофизиологические механизмы. Разработаны новые модели повреждения спинного мозга (патенты № 2212058, 2212059). Научно-практическая значимость. Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что в патогенезе повреждения спинного мозга существенную роль играет ишемическая деполяризация нервной ткани. Распространенность и выраженность деполяризационных процессов зависит от интенсивности и длительности действия альтерирующего фактора. Установлено, что одновременная регистрация УПП и медленной электрической активности спинного мозга позволяет более точно дифференцировать изменения функционального состояния нервной ткани. Выявлена взаимосвязь изменений функционального состояния спинного мозга и клинических проявлений в острый период повреждения. Представленная методика одновременной регистрации ЭСГ и УПП спинного мозга с поверхности кожи у человека обладает существенной диагностической чувствительностью для ранней неинвазивной диагностики повреждения этого отдела нервной системы. С использованием электрофизиологической методики патогенетически обоснован нейропротекторный эффект интрацеребровентрикулярного введения АТФ. Предлагаемая комплексная методика функциональной оценки состояния

10

спинного мозга расширяет возможности направленного поиска и изучения новых миелопротекторных препаратов. Положения, выносимые на защиту. 1. Повреждение спинного мозга, независимо от первичных механизмов, сопровождается развитием деполяризационных изменений в нервной ткани, распространенность которых связана с объемом и длительностью патогенного воздействия. 2. Одновременная регистрация УПП и ЭСГ является эффективным и неинвазивным методом диагностики повреждения спинного мозга, позволяющим оценить изменение функциональной активности нейронов в очаге повреждения и смежных областях. 3. АТФ обладает выраженным миелопротекторным эффектом на модели локального компрессионного повреждения спинного мозга, что обосновывает и определяет возможность целенаправленного применения АТФ и других аналогов аденозина, уже использующихся в клинической практике, по новому назначению — как миелопротекторов. Внедрение в практику. Материалы диссертации используются при чтении лекций по курсам «фармакология», «нормальная физиология» и «патологическая физиология» для студентов Иркутского государственного медицинского университета, «физиологии и психофизиологии» для студентов Иркутского государственного университета и внедрены в практическую работу Восточно-Сибирского научно-практического центра малоинвазивной нейрохирургии ГУ НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН. Апробация работы. Материалы диссертации представлялись и обсуждались на VI Конгрессе Евроакадемии по Мультидисциплинарной Нейротравматологии (Москва, 2001, первая премия за лучшую научную работу в постерной сессии), Всероссийской конференции «Пластичность и функциональная взаимосвязь коры и подкорковых образований мозга» (Москва, 2003), 2-м Съезде Российского Научного Общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии» (Москва, 2003), I Всероссийской Кон-

11

ференции по детской нейрохирургии (Москва, 2003), 7 конгрессе Европейской федерации неврологических обществ (Хельсинки, Финляндия, 2003), конкурсе научных работ на соискание премии губернатора Иркутской области по науке и технике (Иркутск, 2003), Всероссийской конференции «Человек и здоровье» (Иркутск, 2004), XIX Конгрессе Европейского общества детских нейрохирургов (Рим, Италия, 2004), Всероссийской конференции «Механизмы синаптической передачи» (Москва, 2004), XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004). Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 3 статьи в отечественных журналах и 3 международные публикации. Получено 2 патента на изобретения. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты экспериментальных и клинических исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 47 рисунками и 14 таблицами. Список литературы содержит 293 источника, из них 64 отечественных и 229 зарубежных.

12

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1.

Спонтанная электрическая активность спинного мозга

1.1.1. Медленная электрическая активность спинного мозга В 1891 г английские исследователи Gotch F.A. и Horsley V. сообщили о колебаниях тока в спинном мозгу обезьян, собак, кроликов и кошек во время раздражения седалищного нерва. Учитывая сложность регистрации ЭСГ в хроническом эксперименте, наслоение артефактов связанных с электрической активностью сердца и мышц, первые исследования, посвященные проблеме регистрации спонтанной электрической активности спинного мозга, были выполнены на амфибиях. Было установлено, что фоновая электрическая активность спинного мозга амфибий характеризуется низкоамплитудной ритмикой (25-30 мкВ) с наличием быстрых и медленных колебаний потенциала, соответствующих тета, альфа и бета ритмам ЭЭГ [Ten Cate J., 1950; Gerard R.W., Young J.Z., 1931; Бериташвили И.С., Цкипуридзе Л.Р., 1941]. Bremer F. (1941) зарегистрировал электрическую активность с дорзальной и вентральной поверхностей спинного мозга кошки в виде неправильных волн амплитудой 10-30 мкВ и группы волн с частотой около 10 в секунду. Автор не отмечал существенных качественных отличий в происхождении спонтанной электрической активности спинного мозга и других отделов ЦНС. Сходные результаты были получены в опытах Marsan C.A и Fuortes M.G.F (1949), согласно которым фоновая электрическая активность спинного мозга собаки характеризовалась неправильной ритмикой малой амплитуды с частотой около 10 Гц. Для регистрации ЭСГ в хронических экспериментах на интактных животных исследователи использовали различные методики. В 1955 г. Liss H.R. et al. подробно описали методику вживления электродов в спинной мозг кошки. Баклаваджян О.Г. (1961) для регистрации биоэлектрической актив-

13

ности спинного мозга у собак проводил трепанацию дужки позвонка с последующим ввинчиванием в трепанационное отверстие плексигласовых пробок, в каналы которых вводились цилиндрики с электродами. Оганесян А.А. (1950) регистрировал ЭСГ непосредственно с поверхности спинного мозга, а также с электродов, специальным образом укрепленных в позвонках у кошек, кроликов и собак в условиях хронического эксперимента. Потенциалы спинного мозга, зарегистрированные таким образом от поясничного утолщения, проявлялись в виде 2х типов волн: быстрых и медленных колебаний, с частотой 15-25 Гц, амплитудой до 100 мкВ, составляющих основной фон. Автор отмечал искажение формы ЭСГ зарегистрированной от грудных сегментов вследствие наслоения дыхательных волн и потенциалов ЭКГ [Оганесян А.А., 1957]. Было отмечено, что спонтанная электрическая активность спинного мозга имеет место уже с первых дней после рождения. Другие исследователи также выделяли в спонтанной ЭСГ, зарегистрированной с дорзальной поверхности спинного мозга, два типа электрической активности – медленные низкоамплитудные (10 Гц, 25 мкВ) и остроконечные волны амплитудой до 50 мкВ [Gasteiger E.L., Ichikawa S., 1963; Brust-Carmona H. et al., 1968; Levitan H. et al., 1968; Brust-Carmona H. et al., 1969; Kasprzak H., Gasteiger E.L., 1970]. Латаш Л.П. (1958, 1960, 1962) с использованием пункционного метода отведения биопотенциалов, в пояснично-крестцовом отделе спинного мозга кролика зарегистрировал медленные колебания потенциала, соответствующие частотным диапазонам дельта и тета ритмов ЭЭГ, амплитудой 10-20 мкВ, а также колебания потенциала с периодом от 1 до 7 секунд (сверхмедленные колебания) и высокоамплитудные пики с частотой от 8-14 до 25-30 в сек и амплитудой 40-60 мкВ. Иногда подобные пики регистрировались с мышц, поэтому автор связывал их с синхронизированным разрядом мотонейронов. Автор также отмечал на ЭСГ, зарегистрированной на нижнегрудном уровне, колебания, соответствующие ритму дыхания, артефакты ЭМГ и ЭКГ. Медленные «дыхательные» волны, по мнению

14

исследователя, были связаны с непосредственной активностью нервного аппарата дыхания [Латаш Л.П., 1959]. Показано, что биоэлектрическая активность спинного мозга лучше выражена в сегментах, в которых замыкается относительно большое число рефлекторных связей [Клевцов В.И., 1970]. Наблюдалась высокая корреляция между функциональной активностью спинного мозга и его кровообращением. В опытах на кошках было установлено, что амплитуда электроплетизмограмм и ЭСГ была наибольшей в одних и тех же областях спинного мозга, т.е. в шейных, нижнегрудных и поясничных сегментах. Наибольшая величина пульсовых зубцов регистрировалась в области 1 шейного позвоночного сегмента, затем наблюдалось значительное снижение к 5 грудному сегменту, увеличение к 10 грудному и постепенное снижение ко 2 крестцовому позвонковому сегментам [Клевцов В.И., 1970]. При пропускании постоянного тока (катод в верхних отделах спинного мозга, анод на моторных корешках) отмечалось тетаническое усиление фоновой электрической активности передних рогов серого вещества. При обратном направлении тока регистрировалось некоторое подавление спонтанной электрической активности спинного мозга [Marsan C.A. et al., 1951]. Высокая перерезка, кураризация, более глубокие стадии наркоза приводили к снижению амплитуды ЭСГ [Bremer F., 1941]. Различные афферентные раздражители (раздражение периферических нервов, пассивное растяжение мышц конечностей и др.) вызывали выраженное увеличение амплитуды и частоты как быстрой, так и медленноволновой активности спинного мозга [Бериташвили И.С., Цкипуридзе Л.Р., 1941; Horsten G.P.M., 1948; Оганесян А.А., 1957]. При снижении афферентного притока (перерезка афферентных корешков), спонтанная электрическая активность спинного мозга снижалась или полностью исчезала [Ten Cate J. et al., 1947; Ten Cate J. et al., 1958; Kasprzak H., Gasteiger E.L., 1970]. В 1946 г Pool J.L., и позже, Sawa M. (1947) опубликовали результаты исследований медленной электрической активности спинного мозга у человека. Для регистрации ЭСГ, авторы использовали пункционную внутриканальную

15

методику. Активный электрод вводился в просвет пункционной иглы при поясничном и грудном проколе. ЭСГ, зарегистрированная с помощью этой методики, характеризовалась наличием регулярного альфа-подобного низкоамплитудного ритма и быстрых колебаний потенциала с частотой 50-100 Гц [Бассин Ф.В. и соавт., 1951]. Амплитуда колебаний не превышала 50 мкВ. По данным ряда авторов, наблюдалось снижение выраженности ЭСГ по мере удаления от головного мозга [Shimoji K. et al., 1971; Shimoji K. et al., 1972; Shimoji K. et al., 1973; Sarica Y. et al., 1983]. Отмечалось, что электрическая активность спинного мозга человека была подобна ЭСГ животных [Ertekin C. et al., 1983]. Штарк М.Б. (1959) с использованием методики введения электродов в перидуральную щель, зарегистрировал ЭСГ у 72 пациентов. Автор наблюдал колебания с частотой 6-11 Гц и 16-18 Гц, амплитудой 10-100 мкВ, и колебания с частотой 3-5 Гц и амплитудой 20-60 мкВ. Кроме того, регистрировались быстрые «пикоподобные» импульсации с частотой 7-25 в сек и амплитудой до 100 мкВ. По мнению Штарка М.Б., «пики»- адекватные показатели рефлексов спинального автоматизма, связанные с синхронными разрядами нескольких вставочных нейронов [Штарк М.Б., 1959]. Большинство исследователей, использующих пункционную методику, отмечали в ЭСГ примесь мышечных токов, ЭКГ, а также «дыхательных» волн [Бассин Ф.В. и соавт., 1951; Штарк М.Б., 1959; Ertekin C. et al., 1983]. Майорчик В.Е. и Храпов В.С. (1962) зарегистрировали спонтанную ЭСГ с открытого спинного мозга человека во время нейрохирургических операций. Авторы наблюдали колебания потенциала с частотой 4-8 Гц. Результаты регистрации ЭСГ во время нейрохирургических операций были также представлены в работах других исследователей [Puletti F., Blomquist A.J., 1967; Hitchcock E., Lewin M., 1969; Fujita S., Cooper I.S., 1976]. Пункционная ЭСГ не нашла широкого клинического применения в связи с наличием определенных технических трудностей и инвазивностью методики [Shimoji K. et al., 1972].

16

В 1975 г Dzialek E. произвел запись биопотенциалов спинного мозга у человека пункционным методом и, параллельно, через неповрежденную кожу. Электрическая активность спинного мозга была подобна ЭЭГ. Автор отмечал, что по мере извлечения электрода из субарахноидального пространства амплитуда ЭСГ постепенно снижалась. Оноприенко А.П. (1984) сообщил о регистрации ЭСГ с помощью 18 канального электроэнцефалографа с применением поверхностных электродов у 96 пациентов (электроды фиксировались в межостистых промежутках, пассивный электрод помещался на мочке уха). При регистрации ЭСГ с шейного отдела наблюдались колебания с частотой 8-14 Гц и амплитудой 50-60 мкВ, в поясничной области колебания характеризовались меньшей амплитудой (до 5 мкВ), но большей частотой (1630 Гц). На грудном уровне регистрировались низкоамплитудные колебания с наслоением комплексов ЭКГ и дыхательных волн. Большинство исследователей полагают, что спинной мозг способен генерировать электрическую активность врожденного характера [Mark V.H., Gasteiger E.L., 1953]. Генез спонтанной электрической активности связывают с интернейронной активностью серого вещества спинного мозга [Бассин Ф.В. и соавт., 1951; Bremer F., 1941; Ertekin C. et al., 1983; Штарк М.Б., 1959; Mark V.H., Gasteiger E.L., 1953; Morrison G. et al., 1975; Molt J.T. et al., 1978; Оноприенко А.П., 1987], возможно, определенный вклад вносит также и мотонейронная активность [Ten Cate J. et al., 1958; Visser P. et al., 1958; Латаш Л.П., 1962]

«Пикоподобные» колебания потенциала объясняются синхрон-

ными разрядами нескольких интернейронов [Штарк М.Б., 1959]. Регистрируемые медленные «дыхательные» волны могут быть связаны как с механическими артефактами [Ройтбак А.И., Хечинашвили С.Н., 1952], так и с непосредственной активностью нервного аппарата дыхания [Латаш Л.П., 1959]. По мнению большинства исследователей, регистрация ЭСГ может служить чувствительным методом для ранней неинвазивной диагностики повреждения спинного мозга, а также для оценки эффективности различных методов лечения [Штарк М.Б., 1959; Dzialek E., 1975; Molt J.T. et al., 1978;

17

Rossini P.M. et al., 1980; Greco F. et al., 1981; van Gestel M.A., 1986; Оноприенко А.П., 1984, 1987]. 1.1.2. Уровень постоянного потенциала спинного мозга Изменения степени поляризации нервной ткани играют важную биологическую роль в механизмах функционирования головного и спинного мозга, как в норме, так и при патологии. Установлено, что постоянные биоэлектрические потенциалы участвуют в межклеточных электротонических взаимодействиях, предполагается их роль в морфогенезе, регенерации и синхронизации работы нервных клеток позвоночных [Bennett M.V., 1973; Becker R.O, 1974; Patel N., Pоo M.M., 1982; Fehlings M.G., Tator C.H., 1992; Korn H., Faber D.S., 1980]. В связи с этим, одним из перспективных направлений изучения функционального состояния нервной ткани является регистрация электрической активности в виде уровня постоянного потенциала (УПП) [Швец Т.Б., 1958; Старобинец М.Х., Пшедецкая А.Д., 1971; Caspers H., Speckmann E.-J., 1974; Пономарева Н.В., 1986; Фокин В.Ф., Пономарева Н.В., 2003; Суфианова Г.З., 2003]. В тоже время, по причинам технического характера, этот метод не получил широкого клинического распространения. УПП можно определить как устойчивую разность потенциалов, существующую между мозгом и электрически индифферентными точками или между разными областями мозга. В настоящее время предполагается, что УПП является интегративным показателем поляризованности мозговых структур, возникающий, главным образом, за счет суммации мембранных потенциалов нейроцитов и глиальных клеток [Caspers H., Speckmann E.-J., 1974; Kaminogo M. et al., 1999; Аладжалова Н.А., 1962; Русинов В.С. и соавт., 1969]. От уровня мембранного потенциала зависит один из основных показателей функционального состояния (ФС) мозга - возбудимость [Ходоров Б.И., 1975].

18

Гипотезы о происхождении УПП можно условно разделить на 2 основные группы: клеточную (мембранную) и метаболическую концепции. Согласно первому предположению, УПП возникает за счет суммации потенциалов нервных клеток [Libet B., Gerard R.W., 1941; Caspers H., Speckmann E.-J., 1969; Caspers H., Speckmann E.-J., 1974]. Эта гипотеза основывается на результатах параллельного измерения мембранных потенциалов нейронов и УПП коры головного мозга [O`Leary J.-L., Goldring S., 1964]. Определенную роль в генерации УПП может играть суммация постсинаптических потенциалов [Goldring S., O`Leary J.-L.,1957]. Существуют данные о взаимосвязи УПП и мембранных потенциалов глиальных клеток [Ройтбак А.И., 1965; Somjen G.G., 1973]. Большинство авторов связывают положительные сдвиги уровня постоянного потенциала с развитием поляризационных процессов (гиперполяризации или реполяризации), а негативные отклонения УПП – деполяризационных [Беритов И.С., 1949; Libet B., Gerard R.W., 1941; Каштоянц О.Х., 1962; Murik S.E., 1998]. Фокин В.Ф. и соавт. (2003) связывают изменения УПП с изменением энергетического метаболизма и накоплением кислых продуктов обмена на границе гематоэнцефалического барьера. Гипотезы о метаболической природе постоянного потенциала [Аладжалова Н.А., 1979; Фокин В.Ф., Пономарева Н.В., 2003; Nita D.A. et al., 2004] не получили широкого признания, хотя и не лишены логики, так как изменения уровня метаболической активности нервной ткани закономерно сопровождается изменениями УПП. Изменения УПП и медленной электрической активности могут быть взаимосвязаны [Caspers H., Speckmann E.-J., 1969; Gloor, 1963; Мурик С.Э. и соавт., 2003], однако эта зависимость носит сложный характер [Щуранова Ж.П., 1965; Илюхина В.А. и соавт., 1981]. При позитивизации УПП, как правило, отмечается снижение функциональной активности нервной ткани [Старобинец M.Х., 1967; Мурик С.Э. и соавт., 2003]. Негативизация постоянного потенциала, при гипоксии, ишемии, распространяющейся депрессии и других влияниях, первоначально сопровождается увеличением, а затем депрес-

19

сией амплитуды медленной электрической активности [Ichijo M., Ochs S., 1970; Аладжалова Н.А., 1962]. На основании результатов одновременной регистрации УПП и медленной электрической активности можно судить о развитии в данный момент времени одного из трех возможных функциональных состояний нервной ткани: гиперполяризационного торможения, экзальтации и деполяризационного торможения нервной ткани [Васильев Л.Л., 1957; Мовчан Н.П., 1971; Мурик С.Э. и соавт., 2003; Sufianov A.A. et al., 2003]. Исследованию изменений постоянных поляризационных потенциалов спинного мозга посвящено незначительное количество публикаций. В 1841 г. Дюбуа-Реймон сообщил о произведенной им регистрации демаркационных токов в спинном мозгу [цит. по Латаш Л.П., 1952]. Сеченов И.М. (1882) наблюдал отрицательное колебание тока, отводимого от поверхности спинного мозга при раздражении двигательных и чувствительных нервов. В 1889 г. Вериго Б.Ф. отмечал развитие электронегативности в возбужденном участке спинного мозга. Самопроизвольное движение конечностей сопровождалось негативизацией потенциала в плечевом или поясничном утолщениях. Аналогичные наблюдения были выполнены Миславским Н.А. в 1894 г., Деловым В.Е. и Лапицким Д.А. в 1935 г. [цит. по Сорохтин Г.Н., Темпер Ю.Б., 1959]. Sato I. и соавт. (1979) исследовали влияние ряда препаратов на УПП спинного мозга кошки. Lothman E.W. и Somjen G.G. (1975) в опытах на децеребрированных кошках, при стимуляции афферентных периферических нервов наблюдали негативизацию УПП до 2,5±0,5 мВ. Изменения УПП связывались авторами с увеличением внеклеточной концентрации калия (до 4 мМ) и деполяризацией нейроглии. При активации ретикулоспинальных и руброспинальных волокон, а также при стимуляции чувствительных нервов у кошек отмечались негативные сдвиги УПП спинного мозга, что связывалось исследователями с

активацией специфических интернейронных путей

[Jimenez I. et al., 1987]. Подобные изменения УПП при стимуляции дорзальных корешков или афферентных нервов сопровождались увеличением локального кровотока [Rosenthal M. et al., 1979].

20

Ограничение нисходящей супраспинальной импульсации (низкая хордотомия) приводило к развитию в спинном мозге пассивной гиперполяризации на 0,5-1 мВ [Сорохтин Г.Н., Андриайнен О.А., 1966; Лупандин Ю.В., 1966]. Более подробно изменения УПП спинного мозга при патологических состояниях будут рассмотрены в соответствующем разделе. Исследований, посвященных изучению изменений УПП спинного мозга у человека в норме и при различных патологических состояниях, а также данных об одновременной регистрации УПП и ЭСГ человека и животных в доступной нам литературе, мы не встретили. Локальность и высокая амплитуда изменений постоянного потенциала предполагают высокую диагностическую чувствительность этого метода в клинической практике. 1.2. Общие представления о механизмах повреждения нервной ткани спинного мозга Согласно современным представлениям, развитие повреждения нервной ткани претерпевает ряд стадий, приводящий к гибели нервных клеток и стойкому морфологическому и функциональному дефекту. Несмотря на некоторые различия в структурно-функциональной организации спинного и головного мозга, фундаментальные механизмы повреждения нервной ткани в ЦНС весьма сходны. Выделяют первичные и вторичные механизмы повреждения спинного мозга. Под первичными механизмами подразумеваются различные (острые или хронические) воздействия механической или ишемической природы, приводящие к массивной гибели нейронов и глиальных клеток [Tator C.H., 1995; Шевелев И.Н. и соавт., 2000; Park E. et al., 2004]. Существенное значение для нарушения функции спинного мозга при повреждении играют сопутствующие ликвородинамические нарушения и повреждение белого вещества [Шлапак И.П. и соавт., 2002; Moosa A., et al., 2004; Stys P.K., 2004]. Меха-

21

низмы

первичного

повреждения,

как правило,

связаны

с

анатомо-

физиологическими особенностями спинного мозга: его локализацией, структурой и особенностями кровоснабжения. Повреждение нервной ткани не ограничивается локальным разрушением структур, а запускает цепь реакций, приводящих к вторичной гибели изначально неповрежденных клеток. Ключевым моментом этого процесса является нарушение микроциркуляции, гипоксия и ишемия нервной ткани [Tator C.H. 1991; Dumont R.J. et al., 2001]. В зависимости от степени нарушения кровотока, при повреждении ткани мозга, выделяют 3 области, характеризующиеся различной степенью кровоснабжения [Heiss W.D., Graf R., 1994]. Центр или ядро инфаркта («core») имеет показатели менее 15% от исходного кровотока [Nedergaard M., et al., 1986; Duverger D., MacKenzie E.T., 1988]. Мозговая ткань в области инфаркта, окружающая ядро, в которой отмечаются преимущественно функциональные сдвиги и имеющая уровень кровоснабжения менее 40 % от исходного, называется зоной ишемической полутени (penumbra) [Ginsberg M.D., Pulsinelli W.A., 1994; Hossmann K.A., 1994; Back T., 1995]. Область пенумбры может быть значительно большей, чем объем повреждения при действии альтерирующего механизма, длительность существования этой области определяет границы так называемого «терапевтического окна». В течение этого временного периода терапевтические мероприятия наиболее эффективны [Astrup J. et al., 1981; Hakim A.M., 1987]. Окружающая пенумбру ткань, с более высокой интенсивностью кровотока, называется экстрапенумброй или периинфарктной областью [Heiss W.D., Graf R., 1994]. Степень нарушения энергетического метаболизма зависит от функционального состояния нервных клеток до повреждения, продолжительности и силы травматического воздействия. По данным ряда авторов в ядре инфаркта уровень АТФ уже через 5 мин снижается до 25% от исходного значения [Folbergova J. et al., 1992; Welsh F.A. et al., 1991]. В области ишемической полутени, уровень АТФ составляет примерно 50-70% от нормального.

22

На ранних стадиях ишемии повышено использование глюкозы [Back T. et al., 1995; Nedergaard M. et al., 1986], но через 4-5 часов оно падает до 50% от нормы, как и в ядре инфаркта. Отмечается диссоциация между уровнем кровоснабжения ишемизированной области и интенсивностью обмена веществ: снижение уровня кровотока больше, чем понижение обмена глюкозы и макроэргических соединений фосфора [Ginsberg M.D. et al., 1985; Levy D.E., Duffy T.E., 1977]. Изменение ионного гомеостаза при ишемии вызвано преимущественно нарушением активного энергозависимого трансмембранного переноса ионов против электрохимического градиента и стимуляцией глутаматных рецепторов на поверхности плазмолеммы нейронов. При ишемии перераспределение ионов происходит в сторону повышения внутриклеточной концентрации Са2+ и Na+ и внеклеточной концентрации К+, что сопровождается деполяризацией мембраны нервных клеток и негативизацией УПП нервной ткани [Gido G. et al., 1997; Harris R.J., Symon L., 1984; Young W., Koreh I., 1986; Kristian T., Siesjo B.K., 1998]. Через 2 часа после реперфузии концентрация внеклеточного K+ возвращается к исходному уровню. Через 3-5 минут ишемии, аноксическая деполяризация имеет максимальную выраженность, приобретая характеристику распространяющейся депрессии (см. раздел 1.3.1.). В области пенумбры наблюдается транзиторная ишемическая деполяризация [Mies G. et al., 1994; Ginsberg M.D., Pulsinelli W.A., 1994; Leybaert L., De Ley G., 1994]. Предполагается, что аноксическая деполяризация может быть главным и универсальным физиологическим проявлением повреждения нервной ткани [Kaminogo M. et al., 1999; Hossmann K.A., 2003], так как существует высокая корреляция между степенью патоморфологических изменений и периинфарктными сдвигами УПП [Kubota M. et al., 1989; Mies G. et al., 1993]. Факторы уменьшающие степень деполяризационных сдвигов (антагонисты глутаматных рецепторов, гипотермия, А1-агонисты, блокаторы NO-синтазы) также уменьшают и размер инфаркта в области ишемической полутени. [Hossmann K.A., 1994, 2003; Shimizu-Sasamata M. et al., 1998; Суфианова Г.З.

23

и соавт., 2003]. И наоборот, дополнительная деполяризация (аппликация ионов К+, электростимуляция, повышение концентрации глутамата) увеличивает размер инфаркта [Busch E. et al., 1996; Back T. et al., 1996]. Причина повреждающего действия деполяризации неизвестна, хотя в интактной (неишемизированной) области подобная величина и продолжительность деполяризации (например, при индукции распространяющейся депрессии) не вызывает повреждения нервных клеток [Nedergaard M., Hansen A.J., 1993]. Предполагается, что на фоне ухудшения субстратного снабжения ткани при ишемии, дополнительная метаболическая нагрузка, вызванная деполяризацией способствует увеличению морфологического повреждения [Back T. et al., 1996; Hossmann K.A., 2003]. Поэтому высказывается мнение, что подавление стойкой деполяризации – рациональный подход, направленный на уменьшение объема инфаркта [Mies G. et al., 1993; Hossmann K.A., 2003]. Необходимо отметить, что роль деполяризации в механизмах повреждения спинного мозга изучена недостаточно. Дефицит АТФ и деполяризация мембраны клетки вызывает пассивный отток K+ из клетки и приток Ca2+ внутрь клетки. Высокая концентрация Ca2+ в нейронах, в результате соединения этого иона с рецептором кальмодулином, запускает каскад Са2+ — зависимых метаболических процессов, что ведет к активации кальмодулинзависимых протеинкиназ, липаз и эндонуклеаз, которые вызывают деградацию белков цитоскелета и освобождение свободных жирных кислот и их продуктов [Kristian T., Siesjo B.K., 1998]. В результате увеличения внутриклеточной концентрации Са2+ происходит активация Са2+/кальмодулин NOS и интенсивное образованию NO и пероксинитрита (ONOO-), являющегося непосредственной причиной гибели клеток. В настоящее время предполагается, что одним из возможных ведущих механизмов повреждения нервной ткани является механизм глутаматной эксайтотоксичности. Впервые гипотезу о цитотоксическом действие возбуждающих нейромедиаторов выдвинул Olney J.W. в 1978 г. [Olney J.W. ,1978]. В настоящее время эта концепция клеточной гибели является доминирующей

24

[Choi D.W. et al., 1987; Choi D.W., 1988; Bullock R. et al., 1998; Svendsen C.N., Smith A.G., 1999; Hossmann K.A., 2003; Park E. et al., 2004; Krenz N.R., Weaver L.C., 1998]. Установлено, что уровень глутамата в тканях мозга значительно повышается при ишемическом и травматическом его повреждении [Benveniste H. et al, 1984 ; Bullock R.,et al., 1998; Park E. et al., 2004; Krenz N.R., Weaver L.C., 1998; McAdoo D.J. et al., 2000]. Была продемонстрирована связь между выбросом глутамата при ишемии с размерами инфаркта мозга [Takagi K. et al, 1993]. Повреждающий эффект глутамата связан со стимуляцией NMDA, АМРА/каинатных, квисквалатных и метаботропных рецепторов глутамата [Cunningham M.D. et al., 1994]. Развитие патобиохимического каскада в итоге приводит к клеточной гибели по механизму некроза и апоптоза [Wagner F.C.Jr. et al., 1978; Kawata K., et al., 1993; Beattie M.S. et al., 2002; Park E. et al., 2004]. В посттравматическом периоде отмечается два пика гибели клеток спинного мозга по механизму апоптоза. В первые 3 суток после травмы наблюдается апоптоз нейронов, микроглии и в меньшей степени олигодендроглии вблизи от очага некроза. Второй пик отмечается через 7-14 суток, при этом волна апоптоза (преимущественно олигодендроцитов) развивается на отдалении от первичного очага [Liu X.Z. et al., 1997; Beattie M.S. et al., 2002]. Апоптоз глиальных клеток является причиной распространенной аксональной дегенерации [Abe Y. et al., 1999; Beattie M.S. et al., 2002], что может препятствовать развитию регенерации в посттравматический период. Процесс регулированной клеточной гибели условно может быть разделен на несколько различных фаз: фаза инициации апоптоза, проведение сигнала, активация каспаз, активация эндонуклеаз и специфическая деградация ДНК, в результате чего наступает гибель клетки [Yakovlev A.G., Faden A.I., 2001]. За развитие апоптоза при ишемическом повреждении нервной ткани ответственны некоторые гены, среди которых есть как его индукторы – Fas/apo-1, p53 [Sakurai M. et al., 1998; Saito N., et al., 2000], так и ингибиторы – bcl-2, bcl-x, bax [Li G.L. et al., 1996; Gillardon F. et al., 1996]. Подробно механизмы апоптоза представлены в спе-

25

циальных обзорах [Macaya A., 1996; Борщенко И.А. и соавт., 2000; Eldadah B.A., Faden A.I., 2000; Lowrie M.B., Lowson S.J., 2000]. Таким образом, не зависимо от механизма повреждения спинного мозга, развивающаяся ишемическая деполяризация нервных клеток и выброс возбуждающих нейромедиаторов (т.н. «эксайтотоксическая» теория) запускают сложный патобиохимический каскад, который включает внутриклеточное накопление кальция, повышение синтеза NO и экспрессию генов ведущих к синтезу цитокинов и ферментов, что приводит к образованию свободных радикалов и повреждению субклеточных структур. Итогом является формирование инфаркта, происходящего по двум механизмам – некротической смерти клетки и апоптоза. 1.3. Электрические явления в спинном мозге при повреждении 1.3.1. Распространяющаяся депрессия

Впервые явление, которое получило название – «распространяющаяся депрессия» (spreading depression) было описано Leão в 1944 г. [Leao A.A.P., 1944]. Распространяющаяся депрессия (РД) представляет собой медленно распространяющуюся волну транзиторной деполяризации, что проявляется первоначальным увеличением и последующим угнетением нейрональной активности [Аладжалова Н.А., 1962], гиперемией, выраженным изменением метаболизма и ионного гомеостаза нервной ткани [Gorji A., 2001]. Степень деполяризации варьирует от 10 до 40 мВ [Sunami K. et al., 1989; Lauritzen M., Hansen A.J., 1992]. Скорость распространения корковой РД, измеренная различными методами, составляет от 3 до 8 мм/мин [Aitken P.G. et al., 1998; Somjen G.G., 2001]. Во время волны РД отмечается повышение уровня энергетического метаболизма нервных клеток [Kocher M. et al., 1990; Mayevsky A., Weiss H.R., 1991]. Согласно данным Lauritzen M. et al. (1990) в течение негативного изменения УПП при РД повышается свободная концентрации

26

арахидоновой кислоты, уменьшается концентрация фосфокреатина (на 38%), повышается уровень АДФ (на 38%), уменьшается концентрация глюкозы (на 37%) и увеличивается концентрация лактата (на 105%). Установлено, что при прохождении волны РД в коре головного мозга, вследствие деполяризации нейроглиальной сети, отмечается развитие гиперемии с последующей длительной гипоперфузией [Goadsby P.J., 1992; Seitz I. et al., 2004]. При РД отмечается увеличение проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), что объясняется активацией генов ММP (преимущественно ММР-9) [GursoyOzdemir Y. et al., 2004]. Значительное число исследований показывают возможную роль РД и РД-подобной деполяризации в патогенезе многих заболеваний нервной системы, таких как ишемические и травматические повреждения нервной ткани, эпилепсия, повышение внутричерепного давления, мигрень [Gorji A., 2001; Lauritzen M., 2001; Rogatsky G.G. et al., 2003]. Предполагается роль деполяризации при РД, как главного механизма, лежащего в основе индукции генов при повреждении нервной ткани. Это может играть роль в отсроченной гибели нейронов, или наоборот, способствовать нейропротекции (механизм толерантности) и развитию функциональной компенсации при гипоксии и ишемии [Kury P. et al., 2004; Rangel Y.M. et al., 2001; Yrjanheikki J. et al., 2000; Yanamoto H. et al., 2000; Jander S. et al., 2001; Hermann D.M. et al., 1999]. Показана роль деполяризации в механизмах экспрессии нестина – белка содержащегося в реактивных и менее дифференцированых клетках ЦНС [Holmin S. et al., 2001]. Возможно, деполяризация также играет роль в механизмах глиальной пролиферации при повреждении мозга [Amos B.J. et al., 1998]. В норме, РД не вызывает повреждения нервной ткани, альтерирующее действие деполяризации связано с резким увеличением метаболической нагрузки при ишемии, что приводит к несоответствию между потребностью в энергетических субстратах и их поступлением в ткань [Hossmann K.A., 2003; Jarvis C.R. et al., 2001; Tatlisumak T. et al., 2000]. Первоначально распространяющаяся депрессия Леао была описана во всех регионах ЦНС, кроме спинного мозга [Somjen G.G., 2001]. В 1959 г. Со-

27

рохтин Г.Н. и Чумакова Т.А. наблюдали развитие экзальтационного состояния, в виде возрастания рефлекторной возбудимости и величины рефлексов, или прогрессивное повышение порогов и угнетение рефлекторной возбудимости спинного мозга в ответ на аппликацию калия хлорида при хордотомии у лягушек. Было показано, что эти явления связаны с деполяризацией спинного мозга, что выражалось в негативизации УПП [Сорохтин Г.Н., Чумакова Т.А., 1959; Гольдфельд И.Л., 1966]. В работах многих исследователей также приводятся наблюдения негативизации УПП, повышения внеклеточной концентрации калия и увеличение локального кровотока в спинном мозгу в ответ на стимуляцию [Rosenthal M. et al., 1979; Lothman E.W., Somjen G.G., 1975]. Buchert-Rau B. и Sonnhof U. (1982) описали специфические электрические осцилляции мотонейронов в спинном мозгу лягушки, которые они рассматривали как РД. Somjen G.G. и Czeh G. в опытах на изолированном спинном мозге мышей в течении гипоксии наблюдали резкое увеличение внеклеточной концентрации калия, сопровождающееся отрицательным изменением УПП, напоминающее РД в структурах головного мозга [Somjen G.G., Czeh G., 1989; Czeh G., Somjen G.G., 1990]. Было показано, что РД в спинном мозге выражается в обратимом увеличении концентрации калия во внеклеточной жидкости до 21,1±4,6 мМ и негативным отклонением УПП до 17,3±4,9 мВ, продолжительностью 1,2±0,5 мин, скорость распространения депрессии составляет 12±4,7 мм/мин [Streit D.S. et al., 1995]. В настоящее время предполагается, что РД может играть роль в механизмах повреждения спинного мозга, спинального шока и нейропатической боли [Gorji A. et al., 2004]. Таким образом, распространяющаяся депрессия (РД) представляет собой универсальное явление, лежащее в основе многих физиологических и патологических состояний нервной ткани [Аладжалова Н.А., 1962; Somjen G.G., 2001; Gorji A. et al., 2004]. Очевидно, что продолжение исследований РД и РД-подобной деполяризации перспективно для изучения патофизиологических механизмов повреждения спинного мозга [Gorji A. et al., 2004].

28

1.3.2. Изменения спонтанной биоэлектрической активности спинного мозга при повреждении Изучение изменений УПП спинного мозга при повреждении были выполнены преимущественно на животных. После повреждения спинного мозга у крыс на уровне Th8 отмечалось значительное увеличение концентрации внеклеточного калия, сопровождающееся негативизацией УПП до 10,7 мВ. В области повреждения наблюдалось снижение потребления глюкозы. По мере удаления от зоны травмы степень нарушения метаболизма уменьшалась [Murai H. et al., 1991]. Было показано, что в зоне повреждения спинного мозга УПП более негативен, относительно интактных отделов [Goodman R.M. et al., 1985]. При гипоксии, также отмечалось увеличение внеклеточной концентрации калия и негативизация УПП спинного мозга, напоминающее распространяющуюся депрессию в структурах головного мозга [Czeh G., Somjen G.G., 1990]. Одним из представляющих интерес, вариантов повреждения является его перерезка на разных уровнях. Подобное воздействие, в отличие от других моделей, не сопровождается распространенным повреждением спинного мозга, однако приводит к ограничению нисходящей супраспинальной импульсации и развитию спинального шока. В исследовании Сорохтина Г.Н. и Темпер Ю.Б. (1959) было установлено, что высокая хордотомия у лягушек в 39% случаев сопровождалась нарастанием поляризации спинного мозга и снижением рефлекторной возбудимости. Позитивный сдвиг потенциала соответствовал по времени продолжительности спинального шока (в среднем 2,9 мин). В 18% случаев авторы наблюдали кратковременное повышение поляризации (около 30 сек), после чего отмечалась нарастающая деполяризация спинного мозга. При этом развивалась арефлексия, паралич дыхания и гибель животных. В ряде случаев, относительная деполяризация спинного мозга сопровождалась преимущественным повышением рефлекторной возбудимости.

29

Полученные в ходе экспериментов на животных данные позволили выделить авторам три функциональных состояния спинного мозга, развивающиеся после хордотомии [Сорохтин Г.Н., Чумакова Т.А., 1959]: 1. «Спинальный шок» - характеризуется гиперполяризацией спинного мозга, что выражается в позитивизации УПП и снижении рефлекторной возбудимости. 2. Состояние «экзальтации» - развивается сразу после хордотомии или после восстановления от спинального шока и характеризуется негативизацией УПП, нарастанием рефлекторной возбудимости, снижением порога и возрастанием величины рефлексов. 3. Состояние «травматического шока» – характеризуется развитием выраженной деполяризации на разных уровнях ЦНС, прогрессивным повышением порогов и угнетением рефлекторной возбудимости. Предполагается, что причиной спинального шока является ограничение нисходящей супраспинальной импульсации, что приводит к развитию пассивной гиперполяризации мотонейронов дистальнее области повреждения [Сорохтин Г.Н., Андриайнен О.А., 1966; Schadt J.C., Barnes C.D., 1980]. После прохождения спинального шока отмечалась большая активность электромиограммы, чем до хордотомии, что связывалось авторами с развитием экзальтационного состояния [Сорохтин Г.Н. и соавт., 1960]. По данным разных исследователей, изменения медленной электрической активности спинного мозга были менее специфичными. В зависимости от степени травмы отмечалось либо увеличение, либо угнетение спонтанной электрической активности. Было установлено, что гипоксия и начальная стадия асфиксии спинного мозга сопровождаются увеличением фоновой электрической активности [Bremer F., 1941; Brandon A., 1956] . В опытах на кошках отмечалось, что повреждение спинного мозга вызывало увеличение амплитуды и частоты ЭСГ [Morrison G. et al., 1975]. Увеличение амплитуды ЭСГ было пропорционально степени повреждения спинного мозга [Molt J.T., 1978]. Введение конвульсантов (стрихнин, хлористый аммоний) и фарадиза-

30

ция также вывали повышение амплитуды, частоты и регуляризацию спонтанной электрической активности спинного мозга [Bremer F., 1941]. Эффект конвульсантов объяснялся прямым действием этих веществ на спинной мозг [Marsan C.A., Fuortes M.G.F., 1949; Marsan C.A. et al., 1949; Marsan C.A. et al., 1950]. Выраженное повреждение и гибель препарата спинного мозга сопровождались снижением электрической активности. При этом в начале подавлялись быстрые, а затем медленные колебания потенциала [Ten Cate J. et al., 1947; Ten Cate J., 1950; Ten Cate J. et al., 1958]. При перерезке спинного мозга также регистрировались неоднозначные сдвиги медленной электрической активности. Bremer F. (1941), Horsten G.P.M. (1948) наблюдали снижение электрической активности спинного мозга в каудальном отделе. В исследованиях Оганесяна А.А. (1950) отмечалось резкое снижение амплитуды медленных колебаний и исчезновение быстрых волн ниже места перерезки спинного мозга, выше области повреждения имело место повышение амплитуды ЭСГ. По мере восстановления функций спинного мозга электрической активность в обоих направлениях выравнивалась. Подобные изменения в ЭСГ не наблюдались у новорожденных животных. При гемисекции, отмечалось подавление фоновой электрической активности как на ипсилатеральной, так и на противоположной стороне [Оганесян А.А., 1957]. Mark V.H. и Gasteiger E.L. (1953), Morrison G. et al. (1975) в опытах на кошках наблюдали увеличение амплитуды и частоты ЭСГ ниже места перерезки. При нембуталовом наркозе, во время повреждения спинного мозга, изменений медленной электрической активности не отмечалось [Mark V.H., Gasteiger E.L. , 1953], что косвенно свидетельствует о деполяризационной природе этих изменений. Visser P. et al. (1958) после перерезки спинного мозга наблюдали небольшое снижение электрической активности, иногда отмечалось повышение или отсутствие сдвигов в ЭСГ. Исследования изменений медленной электрической активности при повреждении спинного мозга у человека были впервые опубликованы Pool J.L в 1946 г. Дж. Л. Пуль наблюдал своеобразные «пикоподобные» волны у паци-

31

ентов с нижней параплегией, которые он связывал с проявлениями «субклинической спинальной эпилепсии». Штарк М.Б. (1959, 1962) при регистрации ЭСГ человека пункционным методом, также наблюдал быстрые «пикоподобные» импульсации с частотой 7-25 в сек и амплитудой до 100 мкВ, которые он связывал с синхронизированным разрядом интернейронов. Миэлитический очаг характеризовался медленными колебаниями потенциала (7-8 Гц) низкой амплитуды. При отдалении от очага нормальный ритм ЭСГ восстанавливался, исчезали характерные «пикоподобные» импульсации. Dzialek E. (1975) отмечал уменьшение частоты колебаний до 2-3 Гц и увеличение амплитуды ЭСГ до 70 мкВ у больных с опухолями спинного мозга. Сходные изменения электрической активности наблюдались также в исследованиях других авторов. Ertekin C. et al. (1983) отмечали у пациентов с повреждением верхних сегментов спинного мозга значительное увеличение амплитуды и частоты ЭСГ, при этом у пациентов с повреждением периферических нервов, корешков и нижележащих отделов спинного мозга, амплитуда и частота ЭСГ была снижена. У пациентов со спастическим парапарезом афферентные стимулы вызывали более значимые изменения на ЭСГ чем у здоровых. В исследовании Оноприенко А.П. (1984), при поражении спинного мозга различного генеза (сирингомиелия, опухоли) ниже области повреждения наблюдалось снижение частоты колебаний до 5-6 Гц и повышение амплитуды волн с 15 до 80 мкВ. Штарком М.Б. (1962) было установлено, что заболевания, сопровождающиеся постоянным гипертензионным синдромом, характеризуются сходными изменениями и динамикой ЭСГ. Наблюдалась характерная обратная параболическая зависимость амплитуды ЭСГ от величины субдурального давления. При повышение давления от 200 до 500 мм вод. ст., амплитуда ЭСГ увеличивалась от 30 до 90 мкВ. Дальнейшее увеличение давления сопровождалось депрессией ЭСГ (рис. 1). Штарк М.Б. отмечал, что при наличии блока в субарахноидальном пространстве спинного мозга, с электродов, расположенных выше регистрируется ЭСГ, характерная для повышения ликворного давления.

32

Рис.1. Соотношение субдурального давления и амплитуды ЭСГ [Штарк М.Б., 1962]. Обобщая результаты электрофизиологических исследований, можно сделать вывод, что повреждение спинного мозга, независимо от альтерирующего механизма, сопровождается негативными сдвигами УПП и увеличением спонтанной электрической активности спинного мозга. При этом выраженное повреждение вызывает угнетение спонтанной ЭСГ, что возможно связано со значительным ухудшением функционального и метаболического состояния спинного мозга, развитием деполяризации и массивной гибелью нервных клеток. Ограничение нисходящей супраспинальной импульсации при локальном повреждении спинного мозга может сопровождаться развитием гиперполяризационного состояния нервной ткани в нижележащих отделах, что возможно объясняет природу спинального шока [Сорохтин Г.Н., Чумакова Т.А., 1959].

33

1.4. Пуриновые и пиримидиновые рецепторы. Механизмы нейропротекторного действия АТФ В настоящее время, согласно общепринятой классификацией, выделяют P1 и P2 пуринорецепторы (таблица 1) [Abbracchio M.P., Burnstock G., 1994]. Таблица 1. Классификация пуриновых рецепторов Тип/подтип рецептора Связь с G белками Эффекты

P1

P2

A1

A2a

A2b

A3

Gi

Gs

Gs, Gq

Gi, Gq

↓цАМФ ↑ИФ3 ↑Ki+ ↓Са i2+

↑цАМФ

↑цАМФ ↑ИФ3

↓цАМФ ↑ИФ3

P2X (7 подтипов) -

P2Y (9 подтипов) Gi, Gq

↑ Са i2+

↓цАМФ ↑ИФ3

Естественными агонистами P1 рецепторов являются аденозин и в меньшей степени АТФ и АДФ. P1-пуринорецепторы подразделяются на 4 подтипа: А1, А2a, А2b и А3. Все аденозиновые рецепторы связаны с G белками и состоят из 7 трансмембранных доменов [Olah M.E. et al., 1992]. А1 рецепторы широко распределены в тканях организма [Reppert S.M. et al., 1991; Stehle J.H. et al., 1992; Dixon A.K. et al., 1996]. В ЦНС высокая концентрация этих рецепторов обнаружена в коре головного мозга, гиппокампе, мозжечке, таламусе, стволе мозга и в спинном мозгу [Reppert S.M. et al., 1991; Dixon A.K. et al., 1996]. А2а рецепторы имеют более ограниченное распределение в тканях организма. Эти рецепторы обнаружены на тромбоцитах, в ЦНС, на гладкомышечных клетках и эндотелии. В ЦНС наибольшая концентрация рецепторов этого типа обнаружена в областях богатых дофаминовыми рецепторами [Ongini E., Fredholm B.B., 1996; Svenningsson P. et al., 1997].

34

А2b рецепторы обнаружены практически во всех тканях и органах, однако для их активации требуются высокие концентрации аденозина. Было показано наличие этих рецепторов практически во всех отделах ЦНС [Stehle J.H. et al., 1992; Dixon A.K. et al., 1996]. А3 рецепторы имеют широкое распределение в организме, но их физиологическая роль изучена недостаточно [Zhou Q.Y. et al., 1992; Salvatore C.A. et al., 1993; Linden J., 1994; Dixon A.K. et al., 1996]. Самые высокие концентрации мРНК А3 рецепторов у человека обнаружены в легких, печени и с более низкими уровнями в аорте и головном мозге [Salvatore C.A. et al., 1993]. Биологическая роль аденозиновых (P1) рецепторов в норме и в патогенезе многих заболеваний изучена достаточно хорошо. В ЦНС А1 рецепторы расположены пре- и постсинаптически на телах нейронов, аксонах и вызывают торможение синаптической передачи. Агонисты А1 рецепторов уменьшают выпуск нейротрансмиттеров, гиперполяризуя мембраны клеток, уменьшают возбудимость и подавляют спонтанную импульсную активность нейронов головного мозга [Елисеев В.В, Полтавченко Г.М., 1991; Nikodijevic O. et al., 1991; Stone T.W, 1989; Malhotra J., Gupta Y.K., 1997]. Аденозин выполняет функцию регулятора внутриклеточного Са(2+), изменяя возбудимость клетки, а также регулирует проницаемость для ионов К(+) [Schubert P., Kreutzberg G.W., 1987; Елисеев В.В., Полтавченко Г.М., 1991]. А-агонисты

значительно изменяют электрофизиологическую актив-

ность ЦНС. Аденозин и селективные агонисты А1 рецепторов вызывают позитивизацию УПП головного мозга и выраженную депрессию суммарной мощности ритмов ЭЭГ [Елисеев В.В., Полтавченко Г.М., 1991; Суфианова Г.З. и соавт., 2003]. Активация А1 рецепторов в сегментах спинного мозга уменьшает синаптическую передачу. Одновременная активация A1 и A2 аденозиновых рецепторов облегчает торможение постсинаптического нейрона [Brooke R.E. et al., 2004]. Возможно, что А1 рецепторы также участвуют в модуляции ноци-

35

цептивной информации в спинном мозге и на периферии [Reeve A.J., Dickenson A.H., 1995; Karlsten R. et al., 1992; Ocana M., Baeyens J.M., 1994]. При интрацеребровентрикулярном и интратекальном введении, аденозин и его производные оказывали выраженное антиноцицептивное действие. Эти эффекты были связаны со стимуляцией А1 рецепторов [Herrick-Devis K. et al., 1989; de Lander G.E., Hopkins C.J., 1986]. Анальгетический эффект аденозина при интратекальном введении показан в опытах на животных и у людей с хронической нейропатической болью [Eisenach J.C. et al, 2002; Obata H. et al., 2004; Bantel C. et al., 2002]. Существует множество исследований, в которых установлен выраженный нейропротекторный эффект аденозина и его аналогов. Защитное действие аденозина связывают с активацией преимущественно А1 рецепторов. [Von Lubitz D., Jacobson K.A., 1994; Dora C.D., et al., 1998; Zhang Q. et al., 2000; Kitagawa H., et al., 2002; Суфианова Г.З., 2003]. В ряде работ был показано седативное и противосудорожное действие агонистов А1 рецепторов [Nikodijevic O. et al., 1991; Jain N. et al., 1995; Malhotra J., Gupta Y.K., 1997; Елисеев В.В., Полтавченко Г.М., 1991]. Эффекты активации А2а рецепторов, особенно в центральной и периферической нервной системе противоположны эффектам А1 агонистов. Учитывая влияние А2а агонистов на каталептическую активность [Kafka S.H., Corbett R.,1996], антагонисты этих рецепторов рассматриваются как возможные препараты при лечении шизофрении [Rimondini R. et al., 1997]. Активация А2а рецепторов может защищать от воспаления в период реперфузии после ишемии [Jordan J.E. et al., 1997]. Стимуляция А2b рецепторов на гладкомышечных клетках и эндотелии сосудов опосредует вазодилятацию, которая не связана с активацией А2а рецепторов [Szentmiklosi A.J. et al., 1995; Rubino A. et al., 1995]. Стимуляция А3 рецепторов сопровождается снижением артериального давления [Fozard J.R., Hannon J.P., 1994]. Однако гипотоническая реакция при этом может быть связана с вторичным выбросом гистамина при актива-

36

ции А3 рецепторов тучных клеток [Hannon J.P. et al., 1995]. Системное введение А3 агониста N6-(3-йодобензил)-59-(N-метилкарбомоил) аденозина (3IB-MECA) понижало двигательную активность у мышей, что предполагает участие этих рецепторов в модуляции поведения [Jacobson K.A. et al., 1993]. Активация А3 рецепторов на эндотелиальных клетках, кардиомиоцитах, гладкомышечных клетках активизирует клеточную антиоксидантную защиту, увеличивая активность супероксид-дисмутазы, каталазы и глутатионредуктазы [Maggirwar S.B. et al., 1994]. Р2 рецепторы подразделяются на 2 основных класса: Р2Х рецепторы, представляющие собой семейство катион селективных ионных каналов, и P2Y — группу связанных с G-белками рецепторов. В настоящее время индентифицировано 7 подтипов P2X и 9 подтипов P2Y рецепторов [Abbracchio M.P., Burnstock G., 1994; Khakh B.S., 2001]. Семейство P2X рецепторов состоит из 7 различных субъединиц, каждая из которых имеет два трансмембранных домена, N и С-концы которых расположены внутри клетки. АТФ связывающий сайт локализован вблизи трансмембранного домена, второй трансмембранный домен P2X субъединицы формирует пору канала [Khakh B.S., 2001]. P2X рецепторы опосредуют быстрый (в пределах 10 мс) трансмембранный перенос катионов (Na+, K+, Ca2+), вызывая увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ и деполяризацию клеточной мембраны [Bean B.P., 1992; Dubyak G.R., el-Moatassim C., 1993]. P2Y рецепторы представляют собой семейство рецепторов пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов связанных с G-белками. Эти рецепторы состоят из 7 трансмембранных доменов и их структура соответствует другим подобным рецепторам [Van Rhee A.M. et al., 1995]. Большинство эффектов P2Y рецепторов опосредуются через активацию фосфолипазы С, что приводит к увеличению концентрации ИФ3 и накоплению внутриклеточного Сa2+ [Waldo G.L. et al., 1991; Maurice D.H. et al., 1993]. Кроме того, активация некоторых P2Y рецепторов может сопровож-

37

даться ингибированием аденилатциклазы [Pianet I. et al., 1989; Valeins H. et al., 1992; Webb T.E. et al., 1996]. В центральной нервной системе P2Y рецепторы опосредуют медленные изменения мембранного потенциала в ответ на несинаптический выпуск АТФ или взаимодействуют с рецепторами для других нейротрансмиттеров [Illes P., Ribeiro J.A., 2004]. P2X2, P2X4, P2X6 и P2Y1 рецепторы преимущественно нейронального типа. Эти рецепторы локализуются постсинаптически или пресинаптически. Постсинаптические Р2 рецепторы в основном возбуждающие, пресинаптические — могут быть как возбуждающие (P2X) так и тормозные (P2Y). Таким образом, выпуск АТФ может сопровождаться как возбуждением многих нейронов, так и их торможением [Tokuyama Y. et al., 1995]. В большинстве кровеносных сосудов P2Y1 рецепторы присутствуют на эндотелии и опосредуют вазодилятацию через Са2+ зависимую активацию эндотелиальной NO синтазы и продукции эндотелиальных факторов, вызывающих вазодилятацию [Thapaliya S. et al., 1999]. Эндотелиальная продукция простациклинов также стимулируется активацией P2Y1 рецепторов. Стимуляция P2Y рецепторов на гладкомышечных клетках сосудов сопровождается их гиперполяризацией [Kennedy C., Burnstock G., 1985; Liu S.F. et al., 1989; You J. et al., 1999]. P2X рецепторы экспрессируются на переферических и центральных терминалях первично-афферентных нейронов. В настоящее время предполагается роль P2X (преимущественно P2X3) рецепторов в болевой чувствительности [Gu J.G., 2003; Cook S.P., McCleskey E.W., 2002; Kennedy C. et al., 2003]. Биологические эффекты агонистов пуриновых рецепторов зависят от селективности и концентрации агониста, распределения рецепторов в тканях и органах. АТФ и АДФ первично действуют на P2 пуринорецепторы, вторичные эффекты АТФ связаны с ферментативной деградацией до аденозина, действующего через P1 рецепторы [Illes P., Ribeiro J.A., 2004].

38

Показано, что у людей ионофорез АТФ вызывает слабую боль. У крыс и людей этот эффект зависит от присутствия медиаторов воспаления [Hamilton S.G, McMahon S.B., 2000]. Участие P2X рецепторов в болевой чувствительности подтверждается антиноцицептивной активностью Р2 антагонистов [Wu Y. et al., 2004]. Гипералгезия связывается с активацией Р2X рецепторов микроглии [Inoue K. et al., 2003; Wu Y. et al., 2004]. Роль P2Y рецепторов в болевой чувствительности изучена не так хорошо как P2X рецепторов. Экспрессия этих рецепторов в сенсорных нейронах также предполагает возможную терапевтическая эффективность агонистов P2Y рецепторов в лечении боли [Kennedy C. et al., 2003]. Предполагается, что антиноцецептивный эффект АТФ при активации P2Y рецепторов связан со снижением выброса глутамата из терминалей нейронов и блокадой Са2+ каналов в спинном мозге [Gerevich Z. et al., 2004; Yoshida K. et al., 2002]. В тоже время, в опытах in vitro показано, что ATФ может действовать как медиатор «клеточной гибели» в различных отделах нервной системы, вызывая апоптоз и некроз клеток [Amadio S. et al., 2002]. Подобные эффекты связаны с активацией P2X (преимущественно P2X3 и P2X7) рецепторов нейронов и глиальных клеток [Kharlamov A. et al., 2002]. Стимуляция этих рецепторов сопровождается повышением концентрации внутриклеточного Са2+, деполяризацией и увеличением выброса глутамата [Wang X. et al., 2004; Matsumoto N. et al., 2004; Nakatsuka T. et al., 2003; Illes P., Ribeiro J.A., 2004]. Установлено, что активация P2X рецепторов α,β-метилен-АТФ увеличивает выпуск глутамата на 80% в первичных сенсорных синапсах спинного мозга крысы [Nakatsuka T. et al., 2003]. Антагонисты NMDA рецепторов блокируют цитотоксические эффекты АТФ [Amadio S. et al., 2002]. Во многих работах показан нейропротекторный эффект антагонистов P2 рецепторов при ишемии, гипоксии, гипогликемии и глутамат-опосредованной нейротоксичности на моделях in vitro [Krugel U. et al., 2001; Kharlamov A. et al., 2002; Wang X. et al., 2004; Cavaliere F. et al., 2001; Volonte C. et al., 1999].

39

В исследованиях других авторов установлено, что АТФ может подавлять глутаматную эксайтотоксичность [Ortinau S. et al., 2003] Этот эффект вероятно связан со стимуляцией пресинаптических P2Y1 рецепторов [Luthardt J. et al., 2003; Zhang J.M. et al., 2003]. В спинном мозге, активация P2Y рецепторов снижает выпуск глутамата из терминалей нейронов заднекорешковых ганглиев [Gerevich Z. et al., 2004]. Возможно, что нейропротекторный и антиноцицептивный эффект АТФ может быть связан с дополнительной активацией А1 рецепторов [Illes P., Ribeiro J.A., 2004]. Таким образом, физиологические эффекты АТФ связаны с первичной активацией Р2 пуринорецепторов в тканях организма. При этом может проявляться двойственный эффект. С одной стороны стимуляция ионотропных Р2X рецепторов в ЦНС способствует выбросу возбуждающий нейромедиаторов и активации нервной ткани, что приводит к усилению болевых стимулов и увеличивает повреждение нервной ткани, с другой стороны, стимуляция метаботропных P2Y рецепторов сопровождается развитием торможения в структурах нервной системы. Возможно участие этих рецепторов в угнетении болевой импульсации и потенциальном нейропротекторном эффекте пуринов. Вторичные эффекты АТФ связаны с ферментативной деградацией до аденозина, действующего через P1 рецепторы. В доступной нам литературе мы не обнаружили ссылок на проведение прямых электрофизиологических исследований влияния АТФ на функциональное состояние нервной ткани, что определяет актуальность исследования механизмов действия этого препарата с использованием новых методических подходов.

40

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В настоящей главе дана общая характеристика материалов и методов. С целью более логичного изложения, отдельные методические моменты представлены в начале соответствующих разделов.

2.1. Общая характеристика экспериментальных исследований

2.1.1.Объекты исследования

Работа проведена на 73 здоровых беспородных крысах-самцах, весом 180-220 гр. Экспериментальные животные были получены из вивариев Иркутского государственного медицинского университета и Иркутского государственного университета. До экспериментов животных содержали в лабораторном виварии при температуре помещения 18-22 oС и естественном световом режиме; использовали стандартную диету, состоящую из брикетированного корма, овощей и воды. Опыты на животных осуществляли согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ Минздрава СССР N 755 от 12.08.1977 г.). Вживление электродов, а также перерезка, локальная компрессия, ишемическое повреждение спинного мозга и изучение нейропротекторного действия АТФ на модели локального компрессионного повреждения проводились под адекватным обезболиванием этаминал-натрием (40 мг/кг внутрибрюшинно). Моделирование внутричерепной гипертензии и исследование электрофизиологических эффектов АТФ, учитывая малоинвазивность метода интрацеребровентрикулярного введения препаратов, проводилось без дополнительной анестезии.

41

2.1.2. Методы моделирования повреждения спинного мозга

2.1.2.1. Перерезка спинного мозга Перерезка спинного мозга осуществлялась у 6 крыс на уровне Th11Th12 с помощью бритвенного лезвия. С этой целью, перед вживлением электродов, проводилась частичная резекция дужек Th11 и Th12 позвонков. Для изучения изменений УПП и ЭСГ при этой экспериментальной патологии, активные электроды вживлялись на уровнях Th9, Th11, Th12 и L2. Запись биоэлектрической активности начинали за 5-10 минут до повреждения и продолжали в течение 25 минут после перерезки спинного мозга. 2.1.2.2. Компрессионное повреждение спинного мозга Локальное компрессионное повреждение спинного мозга моделировали у 13 крыс по оригинальной адаптированной методике, путем дозированного сдавления спинного мозга [Watanabe S. et al., 2001; Суфианова Г.З., 2003]. С этой целью выполняли ламинэктомию Th10 и обнажали твердую мозговую оболочку спинного мозга. После чего проводили вживление электродов на уровне Th8, Th12 и L2. Для предотвращения дыхательных движений позвоночника во время эксперимента, крысу фиксировали в стереотаксическом аппарате за выступы быстротвердеющей пластмассы. Для одновременной регистрации электрофизиологических параметров и проведения компрессии мозга использовался электрод специальной конструкции (рис. 2). Электрод крепился в манипуляторе стереотаксического аппарата и устанавливался на поверхность спинного мозга. Повреждение создавалось путем 15 минутного погружения этого электрода на глубину 1 мм. Запись биоэлектрической активности начинали за 5-10 минут до повреждения и продолжали во время периода компрессии (15 минут) и в течение 20 минут после декомпресии. После завершения эксперимента на место костного дефекта помещалась

42

тефлоновая пластинка с установленным обычным электродом. Вся конструкция фиксировалась быстротвердеющей пластмассой.

Рис. 2. Схема электрода для создания компрессии мозга и регистрации ЭСГ: 1 – пластмассовый циллиндр для фиксации в манипуляторе стереотаксического аппарата; 2 – пластмассовый циллиндр для создания компрессии мозга (диаметр основания 2 мм); 3 – хлорсеребрянная регистрирующая часть электрода; 4 – проводящая часть электрода. 2.1.2.3. Ишемическое повреждение спинного мозга Изучение функциональных сдвигов при ишемии спинного мозга проводилось у 10 животных. Для регистрации биоэлектрической активности спинного мозга активные электроды вживлялись на уровнях Th8, Th10, Th12 и L2. Ишемию спинного мозга моделировали по оригинальной методике путем тотальной интравазальной окклюзии брюшной аорты и ее ветвей (рис. 3). С этой целью проводилось выделение бедренных и левой общей сонной артерий. На первом этапе в бедренные артерии до уровня диафрагмы вводились окклюдеры изготовленные из хромированного кетгута (3.0), через 5 минут, для усиления ишемии спинного мозга, в левую общую сонную артерию, по направлению к окклюдерам вводилось 0,4 мл феракрила. Подробно методика описана в работе Суфиановой Г.З. и соавт. (2002).

43

Продолжительность ишемии спинного мозга составляла 30 минут, после чего окклюдеры извлекались. Запись биоэлектрической активности начинали за 5-10 минут до ишемии и продолжали в течение умеренной ишемии (5 минут), вызванной введением окклюдеров, после внутриартериального введения феракрила (30 минут) и в течение 30 минут после реперфузии.

Рис. 3. Схема моделирования ишемии спинного мозга у крыс: 1 – левая общая сонная артерия; 2 – подключичная артерия; 3 – артерия Адамкевича; 4 – почечная артерия; 5 – 2-я поясничная артерия; 6 – общая подвздошная артерия; 7 – подвздошно-поясничная артерия; 8 – наружная подвздошная артерия; 9–внутренняя подвздошная артерия; 10–латеральная крестцовая артерия.

44

2.1.2.4. Моделирование внутричерепной гипертензии Моделирование внутричерепной гипертензии осуществляли по оригинальной методике у 8 крыс, путем интрацеребровентрикулярного введения 0,05 мл 1% раствора феракрила [Суфианов А.А. и соавт., 2003]. Продолжительность электрофизиологического эксперимента составляла 60 минут. Учитывая однонаправленный характер изменений, функциональное состояние спинного мозга при этом виде патологии оценивали путем усреднения биоэлектрических параметров по всем 4 отведениям. Электроды располагали на уровнях Th8, Th10, Th12 и L2.

2.1.3. Методика изготовления и вживления электродов для исследования функционального состояния спинного и головного мозга

Хлорсеребряные электроды для электрофизиологических экспериментов (рис. 4а) изготовлялись из серебряной проволоки диаметром 200 мкм. Длина активной части электрода составляла 1 мм. Хлорирование электрода осуществляли током 18 мА/см2 в 0,1 н растворе соляной кислоты в течение 30 минут со сменой направления тока 3 раза [Пономарева Н.В.,1986]. Для регистрации электрофизиологических параметров спинного мозга, за 2-3 суток до основного эксперимента, под адекватным обезболиванием (этаминалнатрий, 40 мг/кг) осуществляли вживление электродов в эпидуральное пространство спинного мозга. С этой целью животное фиксировали на препаровочном столике. Продольно разрезали кожу дорсальной поверхности спины и выделяли остистые отростки и дужки грудных и поясничных позвонков. В остистых отростках нескольких грудных и поясничных позвонков просверливались отверстия, в которые вводились проволочные крепления (рис. 4б). В соответствии с конкретными условиями опыта в дужках различных позвонков высверливались 4 отверстия, диаметром 300-500 мкм, в которые

45

вводились электроды. Индифферентный электрод крепился на остистых отростках L5-S1 позвонков. Крепление электродов осуществлялось с помощью быстроотвердевающей пластмассы («Акродент») (рис. 4в). Для исследования функционального состояния головного мозга, вживление хлорсеребряных электродов осуществляли под кости черепа над лобной и теменной корой правого и левого полушарий. С этой целью в черепе высверливались отверстия диаметром 300-500 мм. Индифферентный электрод крепился в носовых костях черепа. Крепление электродов также осуществлялось с помощью быстроотвердевающей пластмассы. Расположения отверстий под электроды показано на рис. 5. В экспериментах, в которых осуществлялось интрацеребровентрикулярное введение препаратов, согласно известным координатам [Суфианов А.А., Суфианова Г.З., 1994], проводилось наложение дополнительного трефинационного отверстия в правой теменной кости. 2.1.4. Методика оценки функционального состояния спинного и головного мозга Для оценки функционального состояния головного и спинного мозга в эксперименте использовали одновременную регистрацию медленной электрической активности (ЭЭГ или ЭСГ), как показателя функциональной активности, и УПП, отражающего уровень поляризации нервной ткани. Запись электрофизиологических показателей осуществлялась непрерывно

после

стабилизации электрограммы, не ранее чем через 20 минут после начала исследования. Регистрация биоэлектрической активности проводилась по униполярной методике с помощью 4-х канального усилителя постоянного тока с входным сопротивлением 1 МОм.

Полученные данные оцифровывались с

частотой 128 Гц и вводились в компьютер для дальнейшей математической обработки.

46

Построение амплитудного спектра ЭЭГ и ЭСГ осуществлялась с помощью алгоритма быстрого преобразования Фурье [Blackman R.B., Tukey J.W., 1958] с использованием оригинальной прикладной программы. Эпохи анализа данным методом составляли 1 сек. Для математической обработки брались только безартефактные участки. Значения амплитудного спектра усреднялись по 5 частотным диапазонам: дельта-1 (0,5-0,78 Гц), дельта-2 (0,783,88 Гц), тета (3,88-7,75 Гц), альфа (7,75-12,4 Гц) и бета (12,4-32,6 Гц). Суммарная амплитуда медленной электрической активности рассчитывалась путем усреднения амплитуд всего диапазона анализируемых частот.

2.1.5. Исследование неврологического статуса экспериментальных животных при моделировании повреждения спинного мозга

Исследование неврологического статуса у крыс при перерезке, моделировании локального компрессионного повреждения и ишемии спинного мозга осуществляли в течение всего периода травматического воздействия через 5 минутные интервалы по 5 бальной шкале (таблица 2). Учитывая особенности клинических проявлений, оценка неврологического статуса в острый период моделирования внутричерепной гипертензии проводилась в течение 90 минут через 5 минутные интервалы по специальной 5 бальной шкале (таблица 3). На 3 сутки после повреждения спинного мозга неврологический статус исследовался по 7 бальной шкале (таблица 4) [Суфианова Г.З., 2003].

47

а

б

в

г

Рис. 4. Этапы вживления электродов для регистрации биоэлектрической активности спинного мозга. Объяснение в тексте.

0 1

.. . 2 х ▫ 3 4 . .

Рис. 5. Расположение трефинационных отверстий на поверхности черепа крысы: а. Общая схема: 0 – локализация референтного электрода; 1,2,3,4 – локализация активных электродов; х – локализация отверстия для интрацеребровентрикулярного введения препаратов; б. Фотография скальпированной поверхности черепа крысы, подготовленной для вживления электродов.

48

Таблица 2. Шкала для оценки неврологического дефицита в острый период повреждения спинного мозга балл 4. 3. 2. 1. 0.

Неврологические нарушения Умеренная гиперестезия и гиперрефлексия. Норма. Гипестезия, гипорефлексия, снижение мышечного тонуса. Выраженное снижение чувствительности и мышечного тонуса. Отсутствие реакции на раздражения, атония. Таблица 3.

Шкала для оценки неврологического статуса в острый период моделирования внутричерепной гипертензии балл 0. 1. 2. 3. 4.

Неврологические нарушения Отсутствие изменений. Незначительный тремор головы и передних конечностей или умеренное повышение мышечного тонуса, незначительное расширение зрачка. Умеренные генерализованные тонико-клонические судороги, учащение дыхания, мидриаз. Выраженные тонико-клонические судороги, резкое учащение дыхания, мидриаз. Опистотонус, частое «свистящее» дыхание, мидриаз, экзофтальм. Таблица 4.

Шкала для оценки неврологического дефицита в последующие сутки после моделирования повреждения спинного мозга балл 3. 2. 1. 0. -1. -2. -3.

Неврологические нарушения Параплегия, анестезия, атония Выраженный нижний парапарез и гипестезия. Умеренный нижний парапарез, снижение мышечного тонуса, незначительная гипестезия Норма. слабовыраженный гипертонус, подвижность животного существенно не нарушена. тонус мышц ощутимо повышен, способность к передвижению ограничена, гиперестезия выраженная ригидность, гибель животного

49

2.1.6. Изучение влияния АТФ на функциональное состояние нервной ткани в норме и при повреждении Во всех экспериментах использовался фармакопейный 1% раствор натриевой соли аденозин-5`-трифосфорной кислоты (АТФ) (ГП «Львовдиалек», Украина), pH раствора 7,0-7,3. Препарат вводился интрацеребровентрикулярно в объеме 0,05 мл. Для исследования электрофизиологических механизмов действия АТФ были выполнены 2 серии экспериментов. В первой серии (N=18) мы изучали изменения медленной электрической активности и УПП коры головного мозга. Во второй серии (N=18) исследовалось влияние этого препарата на ЭСГ и УПП спинного мозга. Часть эксперименртальных животных из этой серии (N=6), в дальнейшем использовались для изучения миелопротекторной активности АТФ. После введения препарата, регистрация биоэлектрической активности осуществлялась непрерывно в течение 30 минут. Учитывая однонаправленный характер изменений, функциональное состояние спинного и головного мозга оценивали путем усреднения биоэлектрических параметров по всем 4 отведениям. Электроды для исследования биоэлектрической активности спинного мозга располагали на уровнях Th8, Th10, Th12 и L2. Нейропротекторный эффект АТФ исследовался на модели локального компрессионного повреждения спинного мозга. С этой целью, препарат вводился интрацеребровентрикулярно за 30 минут до компрессии спинного мозга. В течение всего эксперимента проводилась непрерывная регистрация УПП и медленной электрической активности спинного мозга. Дополнительно, в течение периода компрессии и на 3 сутки после повреждения исследовался неврологический статус (таблица 2,4). Полученные результаты сравнивались с контрольной группой (см. раздел 2.1.2.2.).

50

2.2. Общая характеристика клинических исследований В настоящем разделе работы проанализированы результаты обследования 32 пациентов, госпитализированных в Восточно-Сибирский центр малоинвазивной нейрохирургии ГУ НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН (руководитель, д.м.н. Суфианов А.А.) в период с 2002 по 2005 г. В соответствии с целями исследования, все больные были разделены на две клинические группы. Первую (контрольную) группу (n=20) составили пациенты, без клинических и морфологических признаков повреждения спинного мозга. Во вторую (основную) клиническую группу (n=12) были включены пациенты с травматическим повреждением спинного мозга. В работе проведен анализ результатов динамического обследования пациентов этой группы в острый (до 3 мес.) и промежуточный (3–12 мес.) периоды позвоночно-спинномозговой травмы. Распределение больных по полу и возрасту представлено на рис. 6. Средний возраст пациентов в основной клинической группе составлял 9,0±1,6 лет, в контрольной группе – 8,3±0,9 лет. Статистический различий между группами по этому критерию не наблюдалось (P>0,1). Для решения поставленных задач необходимо было оценить характер неврологического дефицита у пациентов, провести морфологическую верификацию уровня повреждения спинного мозга и сравнить полученные данные с исследованием УПП и медленной электрической активности (ЭСГ) спинного мозга. С этой целью были использованы следующие методы исследования: клинико-неврологический, нейрорентгенологический (обзорная рентгенография позвоночника в 2х проекциях, рентгенконтрастные методы, компьютерная томография) и МРТ спинного мозга. Клинико-неврологическая диагностика включала оценку анамнестических данных, а также соматического и неврологического статусов.

51 12

количество

10 8 6 4

10

8

10 4

2 0 муж

жен

основная группа

8

контрольная группа

количество

7 6 5 4 3

6

2 1

4 2

3

6

7

3 1

0 0-3

4-6 основная группа

7-10 контрольная группа

11-18 возраст, лет

Рис. 6. Распределение пациентов по полу и возрасту. Неврологическое обследование спинальных пациентов проводили согласно международным стандартам неврологической и функциональной классификации повреждений спинного мозга. Классификация тяжести травмы спинного мозга в острый период проводилась согласно шкале повреждения спинного мозга, разработанной американской ассоциацией спинальной травмы (АSIA) [Maynard F.M. Jr. et al., 1997]. Рентгенологическое обследование включало выполнение обзорной рентгенографии позвоночника в 2х проекциях, миелографии и компьютер-

52

ной томографии. При проведении рентгеноконтрастных исследований, в качестве контрастного вещества использовали омнипак. Компьютерную томографию позвоночника осуществляли на аппаратах "Somatom - 2" и "Somatom - CR" фирмы "Siemens" (ФРГ) в условиях отделения радиологических методов исследования Иркутской Областной детской клинической больницы. Исследование проводили на аппаратах фирмы Siemens (Германия) с напряженностью магнитного поля 0,2 Т и 0,5 Т на базе Иркутской больницы Восточно-Сибирской железной дороги и Иркутского диагностического центра. Из дополнительных методов исследования выполнялись ЭМГ, УЗС органов брюшной полости и почек, ЭКГ, общий и биохимический анализ ликвора. У всех больных с позвоночно-спинальной травмой (основная клиническая группа) был диагностирован ушиб спинного мозга. У 5 пациентов ушиб спинного мозга сочетался с компрессионным повреждением. Распределение больных по степени нарушения проводимости спинного мозга согласно шкале ASIA было следующим: А–9, B–2, С–1, D–0 и E–0 пациентов. Травма шейного и верхнегрудного отделов спинного мозга была выявлена у 8, и нижнегрудного – у 4 пациентов. По характеру повреждения позвоночника, переломы тел позвонков отмечались у 7 пациентов, переломовывихи и вывихи позвонков – у 5, и без повреждения – у 2х больных. У всех пациентов основной клинической группы в острый период наблюдалась клиника спинального шока, что проявлялось в виде синдрома частичного (3 пациента) или полного (9 пациентов) нарушения проводимости спинного мозга. Трофические расстройства были выявлены у 7 пациентов. В промежуточный (восстановительный) период у 8 пациентов наблюдалось формирование спастической формы пареза, у 3х пациентов (с повреждением шейного отдела) отмечалось развитие верхнего вялого парапареза и нижней спастической параплегии. Тазовые нарушения (автономный мочевой пузырь) были выявлены у 10 больных, кожно-трофические рассторойства – у 4 пациентов. У 3х больных отмечалось развитие болевого синдрома.

53

У пациентов контрольной группы расстройств чувствительности, двигательных и вегетативно-трофических нарушений не наблюдалось. Пациенты этой группы обследовались в основном с целью решения вопроса о возможности регистрации УПП и ЭСГ с поверхности кожи и определения нормальных показателей спонтанной биоэлектрической активности спинного мозга у человека. 2.3. Методы статистической обработки результатов Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ МS Office и Statistica 6.0. Для оценки статистической значимости полученных результатов использовались параметрический критерий t — Стьюдента и непараметрический критерий U — Уилкоксона-Манна-Уитни. Результаты представлены в виде M ± m , где M — среднее арифметическое, а m — ошибка средней. Связь между клиническими и электрофизиологическими изменениями оценивалась с использованием коэффициента корреляции Спирмена [Налимов В.В., 1960; Закс Л., 1976]. Результаты математического и статистического анализа приведены в виде таблиц и рисунков. Различия считали значимыми при Р