Cong ngh? t? bao

§¹I HäC KHOA HäC Tù NHI£N §¹I HäC QuèC GIA Hµ NéI

NG¤ GIANG LI£N

C¤NG NGHÖ TÕ BµO ( Bµi gi¶ng l­u hµnh néi bé)

hµ néi 2004

Môc lôc Néi dung

Ch­¬ng 1: C«ng nghÖ nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo Kh¸i niÖm vÒ c«ng nghÖ tÕ bµo 1.1 Kü thuËt nu«i cÊy tÕ bµo 1.1.1 TÕ bµo ®éng vËt 1.1.1.1 Ph¸t minh ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy tÕ bµo ®éng vËt 1.1.1.2 C¸c ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy 1.1.1.3 Kü thuËt nu«i cÊy tÕ bµo invitro vµ t¹o dßng tÕ bµo 1.2 TÕ bµo gèc 1.3 TÕ bµo thùc vËt 1.4 Nu«i cÊy tÕ bµo ë møc ®é c«ng nghiÖp

Ch­¬ng 2: Kü thuËt tÕ bµo trÇn 2.1 Kü thuËt tÕ bµo trÇn 2.1.1 CÊu t¹o cña thµnh tÕ bµo vi sinh vËt 2.1.2.1 Thu nhËn tÕ bµo trÇn ë vi sinh vËt 2.1.1.2.1 Thu nhËn tÕ bµo trÇn tõ vi khuÈn 2.1. 1. 2.2 Thu nhËn tÕ bµo trÇn tõ nÊm. 2.1.1.2.3. Thu nhËn tÕ bµo trÇn tõ x¹ khuÈn 2.1.2 Sù phôc håi tÕ bµo trÇn. 2.1.3. øng dông cña kü thuËt t¹o tÕ bµo trÇn. 2.2 Dung hîp tÕ bµo trÇn 2.2.1. §iÒu kiÖn ®Ó dung hîp tÕ bµo trÇn 2.2.2 KiÓm tra sù dung hîp tÕ bµo trÇn 2.3 HiÖn t­îng mÊt plasmid trong qóa tr×nh t¹o tÕ bµo trÇn. 2.4. Mét sè kÕt qu¶ nghiªn cøu øng dông kü thuËt tÕ bµo trÇn ë ViÖt Nam 2.5 Lai tÕ bµo soma 2.6 øng dông tÕ bµo lai

Ch­¬ng 3. ChuyÓn gen 3.1 Giíi thiÖu chuyÓn gen 3.2 ChuyÓn gen ë ®éng vËt 3.3 C¸c nguyªn lý cña qu¸ tr×nh chuyÓn gen 3.3.1 Môc ®Ých yªu cÇu 3.3.2 BiÓu hiÖn cña c¸c s¶n phÈm chuyÓn gen 3.4 C¸c b­íc t¹o ®éng vËt chuyÓn gen 3.5 X¸c ®Þnh vµ ®¸nh gi¸ c¸c gen ph©n lËp mong muèn 82

Trang 1-22 1 1 1 1 5 6 12 13 20 2323 23 23 26 32 35 36 39 43 43 45 47 48 49 49 50 50 54 54 54 55 57 57

3.6 ThiÕt kÕ vµ biÓu hiÖn gen vµo vËt mang 3.6.1 C¸c lo¹i vËt mang ( nh©n tè chuyÓn gen) 3.6.2 ChuyÓn gen vµo vËt mang 3.7 Thu nhËn tÕ bµo 3.8 ChuyÓn vËt mang vµo tÕ bµo nhËn 3.9 Ph©n tÝch hiÖu qu¶ cña viÖc chuyÓn gen 3.9.1 Ph­¬ng ph¸p nh©n gen 3.9.2 Ph­¬ng ph¸p Southern blot. 3.9.3 Ph­¬ng ph¸p Dot blot và slot blot. 3.9.4 C¸c ph­¬ng ph¸p ph¸t hiÖn mARN 3.9.5 C¸c ph­¬ng ph¸p ph¸t hiÖn protein 3.10 Taä dßng ®éng vËt chuyÓn gen 3.11 ChuyÓn gen b»ng kü thuËt vi tiªm 3.12 §iÒu kiÖn c¬ b¶n ®Ó thùc hiÖn vi tiªm 3.13 Quy tr×nh t¹o ®éng vËt chuyÓn gen 3.14 Nh÷ng thiÕt bÞ yªu cÇu cho thao t¸c vi tiªm 3.15 C¸c gen dïng ®Ó chuyÓn vµo ®éng vËt 3.16 øng dông cña chuyÓn gen th«ng qua vi tiªm 3.17 kh¶ n¨ng øng dông t¹i ViÖt Nam 3.18 ChuyÓn gen ë thùc vËt 3.18.1.ChuyÓn gen qua Agrobacterim. 3.18.2 ChuyÓn gen trùc tiÕp tõ ADN Tµi liÖu tham kh¶o Môc lôc

83

58 59 60 59 59 62 62 63 63 64 65 65 66 66 67 68 69 70 76 77 77 78 81 82-83

Ch­¬ng 1: C«ng nghÖ nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo Kh¸i niÖm vÒ c«ng nghÖ tÕ bµo C«ng nghÖ tÕ bµo lµ kü thuËt dïng tÕ bµo lµm ®¬n vÞ ®Ó t¹o ra c¸c c¬ thÓ míi hoÆc c¸c s¶n phÈm míi theo nhu cÇu cña c«ng nghiÖp ng­êi. §iÓn h×nh lµ c«ng nghÖ nh©n gièng c©y trång b»ng nu«i cÊy m« tÕ bµo. Ngoµi ra c¸c kü thuËt dung hîp tÕ bµo trÇn, nu«i cÊy h¹t phÊn, bao phÊn, lai tÕ bµo vµ s¶n xuÊt c¸c kh¸ng thÓ ®¬n dßng còng lµ thµnh tùu cña c«ng nghÖ tÕ bµo. 1.1 Kü thuËt nu«i cÊy tÕ bµo 1.1.1 TÕ bµo ®éng vËt 1.1.1.1 Ph¸t minh ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy tÕ bµo ®éng vËt Tõ n¨m 1907, Harison lµ ng­êi ®Çu tiªn ®· nu«i cÊy mét m¶nh m« cña ph«i Õch trong dÞch b¹ch huyÕt. §Õn n¨m 1923, Carel ®· hoµnthiÖn ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy tÕ bµo trong b×nh thñy tinh, dÔ tiÖt trïng vµ t¹o ®iÒu kiÖn cho bÕ bµo ph¸t triÓn tèt. Nh­ng ph¶i chê ®Õn nh÷ng n¨m 1960, khi hoµn thiÖn ®­îc m«i tr­êng nu«i cÊy nh©n t¹o th× kü thuËt nu«i cÊy tÕ bµo ®éng vËt míi ®­îc ph¸t triÓn m¹nh. Trong ®iÒu kiÖn nu«i cÊy ng­êi ta cã thÓ nu«i bÊt kú tÕ bµo nµo cña c¬ thÓ vµ chän ®­îc nhiÒu dßng tÕ bµo b»ng ph­¬ng ph¸p cÊy chuyÒn theo mÎ. VÊn ®Ò quan träng lµ trong nu«i cÊy tÕ bµo ®éng vËt ph¶i cã m«i tr­êng dinh d­ìng ®ñ chÊt vµ nh©n tè sinh tr­ëng, ®ång thêi ph¶i gi¶i phãng c¸c s¶n phÈm trao ®æi ®éc h¹i ®Ó tÕ bµo cã thÓ sèng vµ ph¸t triÓn ®­îc. M«i tr­êng nu«i cÊy ph¶i ®ñ chÊt dinh d­ìng vµ ®é pH còng nh­ nång ®é muèi æn ®Þnh.

1

- M«i tr­êng hãa chÊt: §­îc s¸ng t¹o tõ nh÷ng n¨m 1950 ®· thay thÕ cho c¸c dÞch sinh häc nh­ dÞch chiÕt tõ ph«i gµ huyÕt t­¬ng… dÔ bÞ nhiÔm trïng. M«i tr­êng hãa chÊt x¸c ®Þnh dÔ tiÖt trïng, tr¸nh l©y nhiÔm cho mÎ cÊy, dÔ cÊt gi÷, dÔ thay thÕ hoÆc thªm bít c¸c chÊt cÇn thiÕt, cã thÓ ®iÒu chÕ hµng lo¹t víi sè l­îng lín. + C«ng thøc pha chÕ m«i tr­êng gåm phøc hîp c¸c chÊt hydrat cacbon, c¸c axit amin, c¸c vitamin, c¸c muèi, c¸c hoocmon vµ nh©n tè sinh tr­ëng. VÝ dô: m«i tr­êng Eagle hoÆc m«i tr­êng Dulbecco. Nång ®é mu«i ph¶i lµ ®¼ng tr­¬ng (isotonic) ®Ó duy tr× c©n b»ng thÈm thÊu. Ng­êi ta dïng bicacbonat ®Ó t¹o hÖ ®Öm (buffer system) kÕt hîp víi hÖ lµm giµu CO 2 m«i tr­êng (5 - 10% CO 2 /95% kh«ng khÝ) trong ®ã tÕ bµo ®­îc nu«i. §é pH thÝch hîp lµ 7,4. Ng­êi ta th­êng thªm ®á phenol ®Ó chØ pH. NÕu m«i tr­êng chuyÓn dÇn dÇn tõ ®á sang vµng cam lµ tÕ bµo mäc tèt, nÕu tõ ®á chuyÓn nhanh sang mµu vµng nh¹t lµ m«i tr­êng bÞ nhiÔm khuÈn. C¸c chÊt glucoz vµ ghutamin lµ c¬ chÊt ®Ó cung cÊp n¨ng l­îng th­êng cã nång ®é cao, cßn vitamin vµ hoocmon lµ c¸c cofactor hoÆc nh©n tè sinh tr­ëng th× cã nång ®é thÊp. + Serum hoÆc kh«ng cÇn serum. Th­êng th­êng ®Ó nu«i cÊy ph¸t triÓn cÇn cho thªm serum vµo m«i tr­êng (5 - 10% v/v), nh­ng dïng serum cã nhiÒu bÊt lîi v× serum chøa phøc chÊt kh«ng x¸c ®Þnh nªn dÔ bÞ thay ®æi tïy mÎ cÊy, h¬n n÷a serum ®­îc chiÕt xuÊt tõ ph«i thai bß rÊt ®¾t tiÒn. V× vËy, c¸c nhµ nu«i cÊy tÕ bµo ®· cã nhiÒu cè g¾ng t¹o m«i tr­êng víi Ýt serum hoÆc kh«ng dïng serum. Ng­êi ta cã thÓ dïng chÊt bæ trî ®Ó thay serum nh­ dïng insulin, transferin, ethanolamin… cho thªm vµo m«i tr­êng.

2

+ C¸c chÊt kh¸ng sinh dïng víi môc ®Ých phßng chèng nhiÔm khuÈn vµ vi nÊm cho mÎ cÊy. C¸c kh¸ng sinh th­êng dïng lµ penicillin, streptomicin hoÆc amphotericin B. Dïng kh¸ng sinh còng cã ®iÒu bÊt lîi v× chóng ®Òu cã tÝnh ®éc tè tÕ bµo, v× vËy ph¶i kÕt hîp víi kü thuËt tiÖt trïng thËt chu ®¸o. - §Æc tÝnh cña tÕ bµo ®éng vËt trong nu«i cÊy Cã thÓ sö dông c¸c tÕ bµo ë d¹ng tÕ bµo tù do nh­ b¹ch cÇu, tÕ bµo limpho, hoÆc c¸c tÕ bµo cña m«. M« ®­îc c¾t thµnh m¶nh nhá cho vµo m«i tr­êng tiÖt trïng vµ ®­îc xö lý b»ng enzym (trypsin ch¼ng h¹n) kÕt hîp víi kü thuËt nghiÒn m« (homogenisa - teur) ®Ó thu ®­îc tÕ bµo huyÒn phu. Dïng kÝnh hiÓn vi ®Ó kh¶o s¸t c¸c d¹ng tÕ bµo. VÝ dô c¸c fibroblast lóc ®Çu cã d¹ng trßn, sau khi b¸m vµo ®¸y b×nh trë thµnh d¹ng kÐo dµi. §a sè tÕ bµo cña m« ph¸t triÓn b¸m vµo bÒ mÆt ®¸y thµnh líp, cßntÕ bµo cña m« láng nh­ m¸u, b¹ch huyÕt th× ph¸t triÓn ë d¹ng huyÒn phï l¬ löng. Ng­êi ta cã thÓ dïng c¸c nguyªn liÖu tÕ bµo cña mÎ cÊy ®Çu cho c¸c mÎ cÊy tiÕp b»ng c¸ch chÝch tÕ bµo tõ mÎ ®Çu cho vµo m«i tr­êng míi. NÕu lµ mÎ b¸m th× ph¶i sö dông enzym ®Ó t¸ch riªng tÕ bµo. Khi sö dông enzym (trypsin) ph¶i lµm nhanh, kh«ng ®Ó qu¸ 15 phót v× enzym cã thÓ g©y h¹i cho tÕ bµo. + §êi sèng cña tÕ bµo ®éng vËt trong nu«i cÊy Hayflick vµ Moorhead (1961) khi nu«i cÊy bµo ph«i ng­êi ®· ph¸t hiÖn lµ c¸c tÕ bµo ®­îc cÊy chuyÒn qua 50 thÕ hÖ trong vµi th¸ng, sau ®ã chóng ®i vµo qu¸ tr×nh tho¸i hãa vµ sè l­îng tÕ bµo gi¶m dÇn. C¸c tÕ bµo ®éng vËt cã vó ®Òu thÓ hiÖn ®Æc tÝnh nµy.

3

Thêi gian sèng cña tÕ bµo tïy thuéc vµo m« mµ ta lÊy tÕ bµo. §èi víi m« cña ph«i, kh¶ n¨ng sinh tr­ëng dµi h¬n so víi tÕ bµo tõ c¸c m« cña c¬ thÓ tr­ëng thµnh. Tuy vËt, trong nu«i cÊy ng­êi ta cã thÓ t¹o nªn c¸c dßng tÕ bµo “bÊt tö”, tøc lµ chóng cã thÓ sinh tr­ëng v« h¹n ®Þnh b»ng sù biÕn ®æi vÒ di truyÒn, ®­îc gäi lµ sù chuyÓn d¹ng (transformation) lµ qu¸ tr×nh dÉn tíi t¹o thµnh “dßng tÕ bµo liªn tôc”. Sù chuyÓn d¹ng lµm cho tÕ bµo cã nhiÒu thay ®æi vÒ ®é nh¹y c¶m víi c¸c t¸c nh©n kÝch thÝch, mÊt ®Æc tÝnh b¸m bÒ mÆt,biÕn ®æi trongbé thÓ nhiÔm s¾c - bé l­ìng béi trë thµnh bé lÖch béi (aneuploid)… Sù chuyÓn d¹ng ®­îc g©y nªn do virut hoÆc do c¸c t¸c nh©n g©y ®ét biÕn, hoÆc do c¸c oncogen (gen g©y ung th­ nh­ gen myc, ras). NhiÒu dßng tÕ bµo ®­îc chÝch tõ c¸c m« ung th­ cã thÓ ph¸t triÓn “bÊt tö” in vitro, vÝ dô c¸c tÕ bµo HeLa (tõ m« ung th­ cæ d¹ con chÞ Henrietta Lack) hoÆc tÕ bµo Namalawa (tÕ bµo ung th­ lymphomacña chÞ Namalwa), hoÆc c¸c dßng tÕ bµo cña mét sè ®éng vËt cã vó nh­ chuét, chuét Hamster Trung Quèc, khØ xanh ch©u Phi… + Sù sinh tr­ëng cña tÕ bµo ®éng vËt in vitro. Sù sinh tr­ëng in vitro tr¶i qua 3 pha: + Pha chËm (lag phase): Lµ giai ®o¹n tõ 0 khi tÕ bµo ®­îc cho vµo m«i tr­êng. Thêi gian tïy vµo d¹ng m« chÝch tÕ bµo vµ tïy tr¹ng th¸i chuyÓn hãa cña chóng. + Pha tiÕn triÓn (exponential growth): Lµ giai ®o¹n tÕ bµo nh©n ®«i liªn tôc - b×nh th­êng tÕ bµo ®éng vËt nh©n ®«i qua thêi gian 15 - 25giê. Sinh tr­ëng kÐo dµi trong nu«i cÊy theo mÎ tõ 1 - 2x106 tÕ bµo/cm3 lµ nång ®é tÕ bµo chuÈn trong m«i tr­êng æn ®Þnh.

4

+ Pha dõng (stationary phase): Lµ giai ®o¹n sau pha sinh tr­ëng, lµ giai ®o¹n trong ®ã sè l­îng tÕ bµo kh«ng thay ®æi, tøc lµ khi c¸c chÊt dinh d­ìng bÞ nghÌo dÇn vµ tÝch lòy c¸c s¶n phÈm trao ®æi g©y øc chÕ trong m«i tr­êng. XuÊt hiÖn hiÖn t­îng tù ho¹i tÕ bµo (apoptosis) thÓ hiÖn ë chç ADN bÞ ®øt m¶nh vµ t¹o thµnh c¸c blebs ®Æc tr­ng trªn bÒ mÆt tÕ bµo. NÕu muèn tÕ bµo tiÕp tôc sinh tr­ëng ph¶i tiÕp tôc b»ng mÎ cÊy chuyÒn víi m«i tr­êng míi (xem H.2). Sè mÎ cÊy chuyÒn (pasage number) cña mét dßng tÕ bµo ®­îc tÝnh lµ sè mÎ cÊy ®­îc chuyÒn liªn tôc tõ mÎ nu«i ®Çu tiªn. Sè mÎ cÊy chuyÒn cã liªn quan tíi sè thÕ hÖ cña dßng tÕ bµo, ®iÒu nµy phô thuéc vµo tû lÖ split (split ratio) lµ sè lÇn nu«i cÊy míi ®­îc triÓn khai ë mçi giai ®o¹n cÊy chuyÒn. Tr­êng hîp ®¬n gi¶n nhÊt lµ khi mét mÎ nu«i kÕt hîp ®­îc cÊy chuyÒn thµnh 2 mÎ míi, tøc lµ tû lÖ split b»ng 2. Trong tr­êng hîp nµy sè thÕ hÖ sÏ lµ sè mÎ cÊy chuyÒn. Nh­ vËy: Sè thÕ hÖ = sã mÎ cÊy chuyÒn x tû lÖ split/2. Trong nu«i cÊy theo mÎ chÊt dinh d­ìng bÞ nghÌo vµ tÝch lòy chÊt ®éc. Trong cÊy chuyÒn liªn tôc m«i tr­êng ®­îc ®æi míi. 1.1.1.2 C¸c ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy Ph­¬ng thøc ®¬n gi¶n nhÊt lµ nu«i cÊy theo mÎ (batch culture), trong ®ã tÕ bµo ®­îc cho vµo mÎ cÊy vµ gi÷ trong vµi ngµy cho tíi khi sinh tr­ëng dõng l¹i. §©y lµ hÖ thèng nu«i cÊy kÝn v× kh«ng cã g× thªm vµo vµ kh«ng cã g× lÊy ®i khái m«i tr­êng. §iÒu kiÖn chuÈn: nu«i l­îng tÕ bµo 105 /cm3 vµ nu«i trong 3 ngµy khi tÕ bµo t¨ng tíi 106/cm3. CÇn khuÊy l¾c ®Ó huyÒn phï tÕ bµo vµ chÊt dinh d­ìng ph©n bè ®Òu trong m«i tr­êng. Tuy nhiªn m«i tr­êng sÏ nghÌo dÇn chÊt dinh d­ìng

5

vµ tÝch lòy chÊt ®éc (s¶n phÈm chuyÓn hãa cña tÕ bµo), do ®ã tÕ bµo sÏ ®i vµo tho¸i hãa. Ng­êi ta cã thÓ kÐo dµi thêi gian vµ sè l­îng tÕ bµo sÏ t¨ng cao h¬n khi ¸p dông ph­¬ng thøc nu«i cÊy theo mÎ dinh d­ìng (fedbatch system), trong ®ã c¸c chÊt dinh d­ìng ®­îc tiÕp tÕ thªm vµo m«i tr­êng qua thêi gian,do vËy tÕ bµo cã ®ñ chÊt dinh d­ìng ®Ó sinh tr­ëng, nh­ng ®Õn mét thêi gian nhÊt ®Þnh sinh tr­ëng sÏ dõng l¹i v× tÝch lòy c¸c ®éc tè nh­ ammonia hoÆc lactat. Ph­¬ng thøc nu«i cÊy liªn tôc b»ng cÊy chuyÒn sÏ gi¶i quyÕt ®­îc vÊn ®Ò v× m«i tr­êng lu«n ®­îc ®æi míi vµ chÊt ®éc bÞ lo¹i bá còng t­¬ng tù nh­ ë in vitro. Cã hai c¸ch nu«i cÊy liªn tôc: c¸ch thø nhÊt lµ dïng hÖ thèng tiÕp liÖu chÊt dinh d­ìng nh­ng vÉn duy tr× tÕ bµo trong b×nh cÊy cho ®Õn ®¹t sè l­îng 107/cm3; c¸ch thø hai lµ ®ång thêi thªm hÖ thèng liªn tôc rót bít m«i tr­êng cïng víi tÕ bµo ra khái b×nh cÊy, nh­ vËy hÖ sè t¨ng tr­ëng tÕ bµo sÏ tû lÖ víi hÖ sè ®æi míi dßng ch¶y vµo vµ ra, ®­îc gäi lµ hÖ æn hãa (chemostat) lµ mét d¹ng nèi lªn men ®Ó nu«i cÊy liªn tôc. 1.1.1.3 Kü thuËt nu«i cÊy tÕ bµo invitro vµ t¹o dßng tÕ bµo * S¶n xuÊt kh¸ng thÓ ®¬n dßng §Ó c¶i tiÕn chÊt l­îng s¶n phÈm vËt nu«i, h­íng sö dông ADN t¸i tæ hîp lµ rÊt ®a d¹ng nh­ng th­êng tËp trung vµo c¸c lÜnh vùc sinh s¶n, b¶o vÖ søc khoÎ, t¨ng sè l­îng vµ chÊt l­îng c¸c s¶n phÈm vËt nu«i. Trong c¸c lÜnh vùc cã yªu cÇu cÊp thiÕt nµy, c¸c ph­¬ng ph¸p ®Òu nh»m t¨ng chøc n¨ng míi (nh­ t¨ng miÔn kh¸ng); thay gen ( nh­ ®a gen Booroola vµ c¬ thÓ cõu ®Ó t¨ng sinh s¶n, theo Bindon, 1984); ghÐp gen míi vµo c¬ thÓ nhËn thµnh c«ng hay kh«ng? Nh÷ng ph­¬ng h­íng vµ ph­¬ng ph¸p ®ã ®Òu lµ nh÷ng tiÕn bé ®i

6

truyÒn thêi ®¹i, ®ång thêi còng lµ kÕt qu¶ cña sù th«i thóc vÒ nhu cµu c¶i thiÖn ®êi sèng con ng­êi, cã nhiÌu s¶n phÈm hµng ho¸ chÊt l­îng cao. Tuy nhiªn ë n­íc ta, chóng ta chØ míi b¾t ®Çu tËp trung øng dông kÜ thuËt gen, sö dông ADN t¸i tæ hîp trong lÜnh vùc vi sinh vËt, cßn ®èi víi lÜnh vùc ®éng vËt cao cÊp chØ míi ë giai ®o¹n më ®Çu.

* Tæng hîp hoocm«n sinh tr­ëng b»ng kü thuËt di truyÒn HiÖu qu¶ thËt sù lµ rÊt “khæng lå” ®èi víi lo¹i s¶n phÈm sinh häc ®Æc hiÖu, rÊt quan träng, cã ho¹t tÝnh sinh häc rÊt cao mang tªn somatostatin lµ lo¹i hoocm«n ®Æc biÖt th­êng ®­îc tæng hîp trong n·o ®éng vËt vµ ng­êi, t¹i vïng d­íi ®å thÞ, víi mét hµm l­îng cùc k× nhá bÐ somatostatin cã vai trß ®iÒu hoµ hoocm«n sinh tr­ëng vµ insulin ®i vµo m¸u kiÓm tra sù tæng hîp hai lo¹i hoocm«n nµy. N¨m 1977, Itakura, H.boyer(NhËt) ®· thµnh c«ng tæng hîp ®­îc hoocm«n somatostatin trong tÕ bµo vi khuÈn. D©y truyÒn s¶n xuÊt lo¹i s¶n phÈm sinh häc ®Æc biÖt quý nµy còng bao gåm c¸c c«ng ®o¹n chñ yÕu sau ®©y: - Ng­êi ta tiÕn hµnh tæng hîp nh©n t¹o gen m· ho¸ somatostatin, tæng hîp trong èng nghiÖm. - TiÕp ®ã, cho g¾n gen nµy vµo ADN vßng cña plasmit ®Ó dïng plasmit lµm vect¬ t¸ch dßng, ®Ó chuyÓn gen vµo “nhµ m¸y s¶n xuÊt”, tøc tÕ bµo vi khuÈn nhËn. Plasmit ADN t¸i tæ hîp tøc plasmit “lai” cã mang gen somatostatin ®­îc ®a vµo tÕ bµo trùc khuÈn ®7

­êng ruét E.Coli. Mçi mÎ 7.5 lÝt vi khuÈn E.Coli nu«i cÊy sÏ cho ra 5 mlg somatostatin nguyªn chÊt. Khèi l­îng hoocm«n nµy tríc ®©y muèn cã, ph¶i tiÕn hµnh c¶ n¨m, trªn nguyªn liÖu lÊy tõ nöa triÖu n·o cõu.

H×nh 2: Quy tr×nh s¶n xuÊt hocmon sinh tr­ëng bß b»ng kü thuËt di truyÒn * S¶n xuÊt interferon Tõ n¨m 1957, Ideki vµ Linderman, ng­êi Anh, lÇn ®Çu tiªn ph¸t hiÖn, trong c¸c tÕ bµo bÞ nhiÔm virut, cã mét hîp chÊt ®Æc biÖt mang tªn interferon. Tõ ®ã, ng­êi ta nhËn thÊy, trong c¬ thÓ ng­êi m¾c bÖnh do bÊt k× virut nµo, còng ®Òu thÊy cã xuÊt hiÖn interferon. Ngµy nay, ng­êi ta x¸c ®Þnh interferon lµ mét lo¹i pr«tªin ®Æc biÖt, ®­îc tæng hîp trong tÕ bµo ®éng vËt cã x­¬ng sèng khi cã virut x©m nhËp, cã vai trß b¶o vÖ c¬ trß b¶o vÖ c¬ thÓ ®éng vËt khi bÞ nhiÔm bÖnh do virut , ®Ó chèng l¹i sù x©m nhËp cña virut.

8

Interferon lµ lo¹i pr«tªin t­¬ng ®èi ®¬n gi¶n, chÞu ®­îc nhiÖt ®é tíi 65oC, lµ s¶n phÈm cña tÕ bµo sèng, nªn b¶n th©n nã kh«ng ®éc. Ch­¬ng tr×nh sinh tæng hîp tù nhiªn interferon ®­îc m· ho¸ trong gen, nh­ng sù tæng hîp nµy chØ x¶y ra khi cã virut x©m nhËp c¬ thÓ. C¸c thµnh tùu cña c«ng nghÖ sinh häc hiÖn ®¹i, kÜ thuËt di truyÒn, vi thao t¸c gen b¹ch cÇu, gen tÕ bµo nguyªn sîi, gen hÖ miÔn dÞch .v.v… ®· më ra mét cuéc c¸ch m¹ng trong nghiªn cøu cÊu tróc vµ ho¹t ®éng cña interferon. Ng­êi ta ®· ph©n biÖt ®­îc 3 lo¹i interferon: •

Interferon – anpha (): do b¹ ch hÇu s¶n sinh khi cã virut x©m nhËp

•

Interferon – bªta () : do nguyªn sî i (fibroblast) s¶n sinh khi cã virut x©m nhËp.

•

Interferon – gamma () : do b¹ ch cÇu s¶n sinh qua ph¶n øng cña hÖ miÔn dÞch.

VÒ c¬ chÕ, interferon kh«ng t¸c ®éng trùc tiÕp lªn virut, mµ t¸c ®éng lªn c¸c tÕ bµo, ®Ó c¸c tÕ bµo nµy tæng hîp ra lo¹i pr«tªin ®Æc biÖt, cã kh¶ n¨ng k×m h·m sù ph¸t triÓn cña virut x©m nhËp c¬ thÓ. HiÖn nay, ng­êi ta ph¸t hiÖn ®­îc 5 lo¹i pr«tªinterferon nµy. Khi virut x©m nhËp å ¹t vµo c¬ thÓ, nh­ khi cã n¹n dÞch virut, th× interferon tù nhiªn kh«ng ®ñ ®Ó chèng l¹i virut. Tr­íc ®©y, ng­êi ta ph¶i dïng m¸u, t¸ch interferon tõ b¹ch cÇu ®Ó chèng cóm, ch÷a viªm gan do virut, nh­ng rÊt ®¾t. NÕu t¸ch tõ m¸u ra ®Ó lÊy interferon, th× dï cã t¸ch tõ m¸u toµn bé loµi ng­êi còng kh«ng ®ñ ®Ó ch÷a bÖnh cho mét ng­êi bÖnh cho mét ng­êi. Interferon ®ù¬c ph¸t hiÖn tõ n¨m 1957, nh­ng ph¶i dÕn 1982, cuéc c¸ch m¹ng vÒ interferon míi ®a l¹i kÕt qu¶, s¶n xuÊt hµng lo¹t interferon b»ng kÜ thuËt di truyÒn vµ b¸n trªn thi tr­êng.

9

Gen interferon lµ c«ng tr×nh cña C. Weissman, Thôy SÜ. Ng­êi ta t¸ch ®ù¬c c¸c gen cña c¸c chÊt kÝch thÝch miÔn dÞch gåm interferon – gamma (interferon - ) vµ interferon– 2. D©y truyÒn s¶n xuÊt interferon quy m« lín l¹i ®­îc tiÕn hµnh trong lo¹i nhµ m¸y “tÝ hon”, tÕ bµo vi khuÈn ®­êng ruét E.Coli. Ng­êi ta t¸ch gen interferon tõ c¬ thÓ sèng, t¹o dßng, vµ dïng vect¬ t¸ch dßng, ®· gen nµy vµo vi khuÈn E.Coli, ®Ó vi khuÈn nµy s¶n xuÊt interferon, víi n¨ng suÊt lín, do ®ã mµ thµnh tùu nãi trªn ®· trë thµnh cuéc c¸ch m¹ng vÒ interferon. Interferon –  hiÖn nay ® ­îc dïng cã hiÖu qu¶ nhÊt ®Ó trÞ bÖnh viªm gan C, nh­ng cßn qu¸ ®¾t. cïng víi viªm gan do virut A vµ B, ngµy nay viªm gan do virut C (tøc viªm gan C) ®ang lµ mèi tai ho¹ lín trªn thÕ giíi ë phÇn lín bÖnh nh©n bÞ viªm gan C, virut lµm tª liÖt hÖ thèng miÔn dÞch sau ®ã cã thÓ dÉn tíi x¬ gan vµ ë mét sè, trë thµnh. * Tæng hîp v¨cxin kü thuËt gen v¨cxin thÕ hÖ míi bao gåm: 1. v¨cxin kh¸ng nguyªn nh©n t¹o 2. v¨cxin rib«x«m 3. v¨cxin c¸c m¶nh cña virut ( c¸c tæ phÇn). Thuéc lo¹i nµy cã v¨cxin chèng cóm, sö dông Lip«pr«tªin cña virut 4. v¨cxin kÜ thuËt gen. S¶n xuÊt v¨cxin kÜ thuËt gen lµ mét lÜnh vùc ph¸t triÓn m¹nh hiÖn nay cña c«ng nghÖ di truyÒn vµ kÜ thuËt di truyÒn. §©y lµ mét v¨cxin chÕ tõ vi khuÈn 10

mµ nã ®· ®­îc truyÒn gen m· ho¸ tæng hîp mét pr«tªin kh¸ng nguyªn cña mét virut hay mét vi khuÈn g©y bÖnh nµo ®Êy. C¸c lo¹i v¨cxin kÜ thuËt gen hiÖn nay bao gåm v¨cxin viªm gan B, v¨cxin d¹i kiÓu míi, v¨cxin t¶ kiÓu míi, v¨cxin sèt rÐt, phong. §èi víi thó y, cã v¨cxin chèng bÖnh toi gµ ( Newcastle), v¨cxin lë måm long mãng ë tr©u, bß, lîn, cõu. Virut viªm gan B cã vá ngoµi lµ Lip«pr«tªin. kh¸ng nguyªn bÒ mÆt lµ pr«tªin chÝnh cña vá ngoµi, ®­îc ph¸t hiÖn trong m¸u ng­êi bÞ bÖnh. Ng­êi ta lÊy gen tæng hîp kh¸ng nguyªn cña virut viªm gan B, gÐp vµo vi khuÈn E. Coli sau ®ã nh©n lªn ë quy m« c«ng nghiÖp c¸c vi khuÈn Coli mang gen t¸i tæ hîp nµy, biÕn Coli thµnh nhµ m¸y s¶n xuÊt kh¸ng nguyªn, lµm v¨cxin. BÖnh toi gµ do virut g©y ra ë gia cÇm, chim, ®Æc biÖt lµ gµ. virut nµy thuéc nhãm Paramyxoviridae ( hä nµy bao gåm c¶ virut g©y bÖnh lîn g¹o). virut cã kh¶ n¨ng lµm ng­ng kÕt hång cÇu, th«ng qua mét lo¹i pr«tªin F cña nã. Lo¹i pr«tªin nµy cã kh¶ n¨ng g©y miÔn dÞch vµ ®­îc dïng lµm v¨cxin. BÖnh lë måm long mãng lµ lo¹i bÖnh do virut, l©y lan rÊt nhanh, g©y bÖnh ®­îc cho kho¶ng 30 loµi ®éng vËt mãng guèc, ®Æc biÖt nguy hiÓm ®èi víi tr©u, bß, lîn, cõu. Khi cã dÞch, ®Ó tr¸nh bÖnh l©y lan, ngêi ta tiªu diÖt hµng lo¹t gia sóc nhiÔm bÖnh, thùc hiÖn biÖn ph¸p c¸ch li nghiªm ngÆt. Tê tin tøc c«ng nghÖ di truyÒn ë Anh 5- 1983, ®· c«ng bè thµnh tùu dïng enzim trypsin xö lÝ vá pr«tªin, nhËn thÊy mét trong sè c¸c pr«tªin vá cña nã cã thÓ t¹o ®­îc miÔn dÞch, kÝch thÝch s¶n sinh kh¸ng thÓ. 1985 ng­êi ta x¸c ®Þnh gen m· ho¸ pr«tªin nµy, t¸ch dßng gen nµy trong tÕ bµo E.Coli, ®· biÕn 11

Coli thµnh nhµ m¸y s¶n xuÊt pr«tªin nãi trªn vµ khi tiªm vµo bß, lîn th× chóng trë nªn miÔn dÞch virut g©y bÖnh lë måm long mãng. C«ng nghÖ sinh häc hiÖn ®¹i còng theo ph¬ng híng trªn, ®· gãp phÇn n©ng cao hiÖu qu¶ s¶n xuÊt chÊt kh¸ng sinh. C¸c chÊt kh¸ng sinh phÇn lín do c¸c x¹ khu¶n tæng hîp nªn, nhng x¹ khuÈn l¹i sinh s¶n chËn, nªn kh¸ng sinh s¶n xuÊt ra gi¸ thµnh ®¾t. Ngêi ta ®· ghÐp gen tæng hîp kh¸ng sinh cña x¹ khuÈn vµo c¸c chñng vi khuÈn dÔ nu«i vµ sinh s¶n nhanh h¬n, do ®ã chÊt kh¸ng sinh ®îc s¶n xuÊt nhiÒu, nhanh , rÎ.

1.2 TÕ bµo gèc Kh¸i niÖm TÕ bµo gèc lµ tÕ bµo trong nu«i cÊy cã kh¼ n¨ng ph©n chia liªn tôc t¹o ra nh÷ng tÕ bµo míi gièng nh­ quÇn thÓ ban ®Çu vµ cã kh¶ n¨ng biÕn ®æi thµnh mét sè lo¹i tÕ bµo kh¸c. §Æc ®iÓm cña tÕ bµo gèc TÕ bµo gèc cã kh¶ n¨ng ph©n chia vµ tù ®æi míi, trong mét thêi gian dµi t¹o rÊt nhiÒu tÕ bµo ( hµng triÖu tÕ bµo ). Nh÷ng tÕ bµo nµy cã thÓ tån t¹i l©u dµi ë tr¹ng th¸i ch­a biÖt ho¸. NÕu ®iÒu kiÖn vµ c¸c nh©n tè cho phÐp c¸c tÕ bµo ch­a biÖt ho¸ nµy cã thÓ trë thµnh c¸c tÕ bµo biÖt ho¸. C¸c nhµ khoa häc ®· tËn dông ®Æc ®iÓm nµy ®Ó nghiªn cøu c¸c tÕ bµo gèc trong phßng thÝ nghiÖm nu«i cÊy ®Ó cã thÓ chñ ®éng ®iÒu khiÓn chóng trë thµnh nh÷ng tÕ bµo chuyªn ho¸. H­íng nghiªn cøu míi nµy ®É më ra triÓn väng to lín ®oãi víi ngµnh. Thùc tÕ , TÕ bµo gèc ®· ®­îc dïng thµnh c«ng trong viÖc t¹o ra gi¸c m¹c m¾t dïng trong ®iÒu trÞ ghÐp gi¸c m¹c, cã thÓ nu«i cÊy thµnh tÕ bµo c¬ tim cïng trong ®iÒu trÞ vÕt th­¬ng sau tai biÕn, cã thÓ thay thÕ tÕ bµo tuû

12

x­¬ng trong ®iÒu trÞ ung th­ m¸u…. vµ hy väng trong t­¬ng lai kh«ng xa cã thÓ gióp phôc håi ®­îc c¸c m¹ch thÇn kinh bÞ h­ h¹i trong ®iÒu trÞ b¹i liÖt hoÆc bÖnh Alzheimer. Ng­êi ta cßn hy väng nu«i tÕ bµo gèc thµnh c¸c c¬ quan nh­ gan, thËn,… phôc vô cho viÖc cÊy ghÐp c¸c c¬ quan.

1.3 TÕ bµo thùc vËt Ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy tÕ bµo thùc vËt in vitro ®­îc ph¸t triÓn m¹nh vµ hoµn thiÖn tõ nh÷ng n¨m 60 cña thÕ kû 20, sau khi ®· cã ®­îc m«i tr­êng nu«i cÊy chuÈn, ®Æc biÖt lµ sö dông c¸c chÊt hocmon sinh tr­ëng thùc vËt nh­ auxin, cytokinin, giberilin… vµo m«i tr­êng nu«i cÊy, sö dông c¸c tÕ bµo trÇn ®Ó nu«i cÊy huyÒn phï, sö dông kü thuËt lai soma in vitro, kü thuËt chuyÓn gen… Ngµy nay ng­êi ta cã thÓ nu«i cÊy tÕ b¸o thùc vËt cña bÊt kú lo¹i c©y nµo vµ nh©n b¶n v« tÝnh caya in vitro ®Ó vi nh©n gièng, t¹o gièng míi theo môc tiªu dù ®o¸n, hoÆc ®Ó s¶n xuÊt c¸c chÕ phÈm sinh häc mong muèn. Tuy nhiªn, cã loµi dÔ thùc hiÖn nh­ khoai t©y, thuèc l¸, cßn ®èi víi c¸c loµi c©y th¶o, c©y l­¬ng thùc th× khã h¬n, ®Æc biÖt ®èi víi c¸c loµi c©y gç cµng khã thùc hiÖn, ®ßi hái nhµ s¶n xuÊt kh«ng chØ ph¶i cã kü thuËt mµ cßn ph¶i hiÓu biÕt s©u s¾c vÒ sinh häc ph¸t triÓn, vÒ sinh lý, vÒ di truyÒn… cña c¸c loµi c©y ®ã. Trong kü thuËt nu«i cÊy, m«i tr­êng dinh d­ìng lµ rÊt quan träng. M«i tr­êng dinh d­ìng dïng ®Ó nu«i cÊy tÕ bµo thùc vËt ph¶i gåm ®ñ c¸c chÊt ®a l­îng nh­ NH 4 , NO 3 , SO 4 , Ca, Cl, K, Na… c¸c chÊt vi l­îng nh­ Fe, Mg, Mn, Zn, BO 3 , I, M 0 O 4 , Cu… Nguån cacbon th­êng dïng lµ ®­êng glucoz hoÆc saccaroz. Ngoµi ra cÇn cã c¸c chÊt hocmon ®iÒu chØnh sinh tr­ëng, th­êng lµ chÊt auxin vµ cytokinin víi tû lÖ thÝch hîp tïy yªu cÇu. NÕu tû lÖ auxin/cytokinin > 1 sÏ kÝch thÝch ph¸t triÓn rÔ, nÕu tû lÖ 13

trªn < 1 sÏ kÝch thÝch ph¸t triÓn chåi. C¸c hocmon thùc vËt cßn cã t¸c ®éng kÝch thÝch sù tæng hîp nhiÒu s¶n phÈm sinh häc quan träng. Nång ®é c¸c axit zmin, c¸c khÝ oxy, CO 2 , ethylen, ®é pH (chuÈn lµ 5 - 7), ®é chiÕu s¸ng, thêi gian chiÕu s¸ng, nhiÖt ®é (th­êng gi÷ ë 250 - 270C)… ®Òu g©y ¶nh h­ëng lªn sù sinh tr­ëng cña tÕ bµo thùc vËt vµ sù tæng hîp c¸c s¶n phÈm. ë c¸c giai ®o¹n sinh tr­ëng vÒ sau trong nu«i cÊy th­êng tÝch lòy c¸c s¶n phÈm trao ®æi do tÕ bµo tiÕt ra cã t¸c dông k×m h·m sù sinh tr­ëng, do ®ã ®iÒu kiÖn nu«i cÊy tèi ­u lµ ph¶i gi÷ cho qu¸ tr×nh ®ång hãa cao h¬n dÞ hãa b»ng c¸ch ®æi míi m«i tr­êng, ®æi míi mÎ cÊy b»ng ph­¬ng ph¸p cÊy chuyÒn hoÆc nu«i cÊy trong c¸c lß ph¶n øng sinh häc æn hãa. §èi t­îng ®Ó nu«i cÊy th­êng lµ c¸c tÕ bµo cña m« ph©n sinh, lµ m« ch­a ph©n hãa cã trong c¸c phÇn sinh tr­ëng cña rÔ, th©n, l¸…, lµ m« kh«ng nhiÔm bÖnh (®Æc biÖt kh«ng nhiÔm virut) vµ trong ®iÒu kiÖn in vitro sÏ sinh tr­ëng cho ra nh÷ng khèi m« non, hay m« sÑo (callus), tõ c¸c tÕ bµo m« sÑo ng­êi ta cã thÓ t¸i sinh ®­îc c¸c chåi c©y vµ c©y toµn vÑn mang tÝnh ®ång nhÊt di truyÒn, gäi lµ dßng nh©n b¶n v« tÝnh. §èi t­îng nu«i cÊy cã thÓ lµ c¸c tÕ bµo trÇn, lµ c¸c tÕ bµo cña bÊt kú bé phËn nµo cña c©y ®· ®­îc xö lý c¬ häc hoÆc xö lý b»ng enzym ®Ó t¸ch bá líp vá xenluloz. C¸c tÕ bµo trÇn (protoplast) cã líp mµng sinh chÊt, cã tÕ bµo chÊt chøa c¸c bµo quan, cã nh©n chøa bé m¸y di truyÒn toµn n¨ng, v× vËy ng­êi ta cã thÓ nu«i cÊy chóng ë d¹ng huyÒn phï dÔ dµng thùc hiÖn cÊy chuyÒn theo mÎ liªn tôc, chóng cã thÓ nh©n b¶n v« tÝnh vµ biÖt hãa cho ra c¸c m« vµ c¸c c¬ quan ®Ó t¸i sinh ra c©y toµn vÑn, hoÆc ®iÒu khiÓn cho chóng s¶n xuÊt c¸c chÕ phÈm sinh häc mong muèn, hoÆc dïng ®Ó lµm nguyªn liÖu t¹o gièng b»ng g©y ®ét biÕn thùc nghiÖm, hoÆc b»ng ph­¬ng ph¸p lai soma vµ chuyÓn gen.

14

Ngµy nay ng­êi ta sö dông ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy tÕ bµo trong nhiÒu c«ng nghÖ sinh häc, ®Æc biÖt lµ c«ng nghÖ vi nh©n gièng vµ c«ng nghÖ s¶n xuÊt c¸c chÕ phÈm sinh häc cã gi¸ trÞ kinh tÕ cao. ViÖc nu«i cÊy m« ph©n sinh vµ t¸i sinh c©y tr­ëng thµnh ®­îc thùc hiÖn thµnh c«ng tõ nh÷ng n¨m 50 cña thÕ kû 20, t¹o ®­îc c¸c gièng s¹ch bÖnh, rót ng¾n thêi gian thu ho¹ch nh­ khoai t©y, cµ chua, khoai sä, chuèi, cñ mì, t¸o, nho, d©u t©y, mÝa, nhiÒu lo¹i lan, cóc… C¸ch nh©n gièng in vitro ®em l¹i gi¸ trÞ kinh tÕ cao v× c¸c gièng lai h÷u tÝnh th­êng bÞ nhiÔm bÖnh thÊt thu tõ 10 - 70%, cßn c¸c gièng ®­îc nh©n v« tÝnh in votro th­êng s¹ch bÖnh, h¬n n÷a cã thÓ cung cÊp mét sè l­îng gièng lín trong thêi gian ng¾n. VÝ dô tõ 1 cñ khoai t©y qua 8 th¸ng nh©n gièng in vitro cã thÓ ®­îc l­îng cñ cung cÊp trång cho 40 ha, hoÆc tõ 1 c©y taisinh tõ 1 mÈu m« l¸ c©y cä dÇu qua mét n¨m nh©n gièng v« tÝnh ta cã thÓ s¶n xuÊt ®­îc 500.000 c©y con ®ång nhÊt cã ®Æc tÝnh kh¸ng bÖnh cao vµ cho n¨ng suÊt tê 6 tÊn dÇu trªn mét ha, nhiÒu h¬n hµng chôc lÇn so víi h­íng d­¬ng, ®Ëu t­îng hoÆc l¹c. §Æc biÖt lµ tõ nh÷ng n¨m 60 cña thÕ kû 20, khi c¸c nhµ t¹o gièng in vitro nhËn thÊy r»ng c¸c chåi con ®­îc t¸i sinh cã thÓ ®­îc c¾t nhá thµnh nhiÒu ®o¹n vµ chóng l¹i t¸i sinh thµnh c©y con, nÕu ®em c¾t ®o¹n mét lÇn n÷a, c¸c ®o¹n ®­îc nu«i cÊy l¹i sÏ t¸i sinh cho c©y con vµ liªn tiÕp thùc hiÖn quy tr×nh ®ã sÏ cho chóng ta v« vµn c©y con gièng ®ång nhÊt vµ s¹ch bÖnh, quy tr×nh t¹o gièng c©y nh­ vËy ®­îc gäii lµ c«ng nghÖ vi nh©n gièng (micropropagation). Nh­ vËy, c¸c nhµ s¶n xuÊt ®· t¹o ra mét “Ng©n hµng gièng” cã chÊt l­îng cao trong phßng thÝ nghiÖm. C«ng nghÖ vi nh©n gièng cã ý nghÜa kinh tÕ cao ®èi víi c¸c loµi c©y sinh s¶n chËm nh­ mét sè c©y hoa, hoÆc c©y rõng, v× sö dông

15

ph­¬ng ph¸p vi nh©n gièng míi cã thÓ cung cÊp ®ñ gièng ®¸p øng yªu cÇu cña thùc tiÔn s¶n xuÊt trong thêi gian ng¾n. Ta h·y lÊy mét vÝ dô ®Ó so s¸nh, muèn nh©n gièng caya hãa hång b»ng ph­¬ng ph¸p dïng c¸c ®o¹n cã m¾t ghÐp tõ c©y mÑ th× tèi ®a mét n¨m ta chØ cã thÓ nh©n gièng ®­îc kho¶ng 20 - 50 c©y, nh­ng b»ng ph­¬ng ph¸p vi nh©n gièng, c¸c nhµ s¶n xuÊt cã thÓ s¶n xuÊt ®­îc 200.000 ®Õn 400.000 c©y gièng trong mét n¨m, nghÜa lµ theo kiÓu s¶n xuÊt c«ng nghiÖp. HiÖn nay hµng lo¹t gièng c©y trång: c©y l­¬ng thùc, thùc phÈm, c©y d­îc th¶o, c©y hoa, c©y ¨n qu¶, c©y l©m nghiÖp ®ang vµ sÏ ®­îc s¶n xuÊt c«ng nghiÖp b»ng ph­¬ng ph¸p vi nh©n gièng. Tuy nhiªn, c«ng nghÖ vi nh©n gièng cßn nhiÒu vÊn ®Ò ph¶i gi¶i quyÕt vÒ mÆt lý thuyÕt vµ c«ng nghÖ, ®ßi hái c¸c nhµ nghiªn cøu ph¶i cè g¾ng t×m tßi, s¸ng t¹o nhiÒu. §©y còng lµ ®Ò tµi chê ®ãn c¸c b¹n thanh niªn cã lßng say mª nghÒ n«ng, mu«n muèn x©y dùng n«ng th«n ngµy cµng giµu ®Ñp. - Ngoµi ph­¬ng ph¸p nu«i cÊu c¸c tÕ bµo cña m« ph©n sinh, tøc lµ c¸c tÕ bµo soma l­ìng béi ®Ó vi nh©n gièng ra c¸c c©y gièng l­ìng béi, ng­êi ta cßn nu«i cÊy c¸c tÕ bµo h¹t phÊn (giao tö ®ùc) vµ no·n (giao tö c¸i) ®¬n béi vµ t¸i sinh thµnh c¸c c©y ®¬n béi. Nh÷ng c©y ®¬n béi th­êng lµ bÊt thô, nh­ng cã thÓ dïng chóng nh­ lµ nguyªn liÖu nguån ®Ó g©y ®ét biÕn (vÝ dô ®ét biÕn ®a béi) t¹o ra c¸c d¹ng l­ìng béi, ®a béi thuÇn chóng trong mét thêi gian ng¾n h¬n nhiÒu so víi ph­¬ng ph¸p dßng thuÇn b»ng lai t¹o cæ ®iÓn. B»ng ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy h¹t phÊn, ng­êi ta ®· t¹o ®­îc hµng chôc gièng lóa míi, lóa m× míi, c¶i t¹o ®­îc nhiÒu gièng lóa lai, ng« lai cã n¨ng suÊt cao còng nh­ c¸c gièng c©y cao su to cao h¬n, gièng mÝa cã hµm l­îng ®­êng nhiÒu h¬n.

16

* C¶i t¹o gièng b»ng dung hîp tÕ bµo trÇn TÕ bµo thùc vËt kh¸c víi tÕ bµo ®éng vËt ë hai ®Æc tÝnh c¬ b¶n lµ chóng cã chøa lôc l¹p lµ n¬i diÔn ra qu¸ tr×nh quang hîp vµ tÕ bµo cña chóng ngoµi mµng sinh chÊt cßn cã v¸ch xenluloz t¹o cho tÕ bµo cã ®é cøng ch¾c. V¸ch xenluloz h¹n chÕ sù trao ®æi chÊt, h¹n chÕ sù sinh tr­ëng cña c¸c tÕ bµo thùc nu«i c©y in vitro. Tõ nh÷ng n¨m 60 cña thÕ kû 20, ng­êi ta ®· t¹o ®­îc c¸c tÕ bµo trÇn - tøc c¸c tÕ bµo thùc vËt ®· bÞ ph¸ bá v¸ch xenluloz - do ®ã chóng sèng vµ sinh tr­ëng trong m«i tr­êng in vitro gièng nh­ tÕ bµo ®éng vËt, tõ ®ã ngµnh c«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt ph¸t triÓn rÊt m¹nh vµ ®¹t nhiÒu thµnh tùu to lín. §Ó t¹o c¸c tÕ bµo trÇn, ng­êi ta cã thÓ dïng ph­¬ng ph¸p c¬ häc (bãc, t¸ch), hoÆc hãa häc (xö lý b»ng enzym nh­ pectinaza hoÆc xenlulaza….), chóng ®­îc nu«i cÊy theo d¹ng líp máng hoÆc d¹ng huyÒn phï víi nhiÒu môc ®Ých kh¸c nhau nh­ ®Ó nghiªn cøu sù trao ®æi chÊt, sù h×nh thµnh v¸ch xenluloz (vÝ sau khi bÞ mÊt v¸ch th× sau 4 ngµy nu«i cÊy mét v¸ch míi ®­îc t¸i sinh); nh­ ®Ó chän dßng v« tÝnh (tËp ®oµn tÕ bµo ®ång nhÊt vÒ di truyÒn xuÊt ph¸t tõ sinh tõ sinh s¶n v« tÝnh cña mét tÕ bµo gèc); nh­ ®Ó dung hîp tÕ bµo trÇn t¹o c¸c dßng tÕ bµo lai soma; nh­ ®Ó thùc hiÖn kü thuËt chuyÓn gen vµ nghiªn cøu sù biÓu hiÖn cña gen l¹, s¶n xuÊt c¸c chÕ phÈm sinh häc quý; hoÆc ®Ó nghiªn cøu qu¸ tr×nh x©m nhiÔm g©y bÖnh cña virut trong tÕ bµo… - Sö dông tÕ bµo trÇn nu«i cÊy ®Ó vi nh©n gièng sÏ lµm t¨ng hiÖu qu¶ lªn nhiÒu lÇn vÒ ph­¬ng diÖn chän dßng v« tÝnh vµ t¸i sinh sè l­îng gièng c©y, v× chØ tõ mét l¸ c©y ta cã thÓ t¹o ra hµng triÖu tÕ bµo trÇn, vµ tõ mçi tÕ bµo ta cã thÓ chän ®­îc hµng chôc ngh×n dßng, cho t¸i sinh hµng chôc ngh×n c©y gièng mang c¸c ®Æc tÝnh tèt.

17

- Tõ tÕ bµo trÇn ®Õn c©y lai soma. Nh­ ta ®· biÕt, lai h÷u tÝnh chØ thùc hiÖn kÕt qu¶ khi lai gi÷a c¸c c¸ thÓ gi÷a loµi, nÕu lai c¸c c¸ thÓ kh¸c loµi th­êng dÉn tíi bÊt thô, do ®ã ®Ó t¹o gièng lai th­êng gÆp khã kh¨n vµ tèn kÐm. NÕu thùc hiÖn ph­¬ng ph¸p lai ë møc ®é tÕ bµo th× ng­êi ta cã thÓ t¹o ra c¸c tÕ bµo lai vµ tõ ®ã c¸c c©y lai tõ c¸c c¸ thÓ thuéc c¸c loµi (thËm chÝ thuéc c¸c chi, bé vµ hä kh¸c nhau) cã thÓ tËp hîp vµo trong mét gièng c¸c ®Æc ®iÓm di truyÒn cña c¸c gièng kh¸c theo mong muèn cña nhµ t¹o gièng. Tr­íc ®©y vµ c¶ hiÖn nay, c¸c nhµ lµm v­ên rÊt quen víi ph­¬ng ph¸p ghÐp c©y nh»m môc ®Ých lîi dông tÝnh chÊt khoÎ m¹nh, chÞu ®ùng cña mét c©y nµo ®ã (dïng lµm gèc ghÐp) ®Ó t¹o cho cµnh ghÐp sèng khoÎ m¹nh, ph¸t triÓn tèt, cho s¶n phÈm chÊt l­îng tèt. VÝ dô ghÐp cµnh cam vµo gèc b­ëi, kh«ng nh÷ng cho cam ph¸t triÓn tèt, s¶n l­îng nhiÒu mµ qu¶ cam cßn cã h­¬ng vÞ cña b­ëi, v× vËy mµ nhiÒu nhµ thùc vËt cho r»ng ®· cã sù lai t¹o gi÷a cam vµ b­ëi qua ph­¬ng ph¸p ghÐp cµnh. NhiÒu nghiªn cøu vÒ di truyÒn häc vµ tÕ bµo häc ®· chøng minh r»ng qua ghÐp cµnh in vitro rÊt khã x¶y ra lai v« tÝnh, nghÜa lµ sö dung hîp gi÷a tÕ bµo cam vµ b­ëi, v× lÏ r»ng c¸c tÕ bµo thùc vËt cã v¸ch xenluloz ng¨n c¶n kh«ng cho phÐp c¸c tÕ bµo lai víi nhau; cßn cam cã h­¬ng vÞ cña b­ëi vµ v× mét sè s¶n phÈm chuyÓn hsoa cña b­ëi cã thÓ khuyÕch t¸n vµo tÕ bµo cam vµ tÝch lòy vµo cam. C¸c h¹t thu ®­îc tõ qu¶ cña cµnh ghÐp nÕu ®em gieo sÏ cho ra cam kh«ng cßn h­¬ng vÞ b­ëi, nghÜa lµ trong tÕ bµo cam kh«ng hÒ cã yÕu tè di truyÒn cña b­ëi. §iÒu nµy hoµn toµn kh¸c víi tÕ bµo trÇn v× c¸c tÕ bµo trÇn in vitro dÔ dµng hîp víi nhau t¹o nªn c¸c tÕ bµo lai v« tÝnh. Tõ nh÷ng n¨m 70 cña thÕ kû 20, ng­êi ta ®· dung hîp ®­îc vµ t¹o ®­îc tÕ bµo lai soma tõ 2 loµi thuèc l¸ Nicotina glauca vµ Nicotina Langsdorrtii, ®· t¸i sinh

18

®­îc c©y lai trän vÑn, khi ph©n tÝch bé nhiÔm s¾c thÓ ng­êi ta ®· chøng minh ch¾c ch¾n r»ng ®ã lµ c©y lai thùc sù. §iÒu ®Æc biÖt ®¸ng quan t©m lµ khi 2 tÕ bµo trÇn dung hîp víi nhau t¹o nªn mét tÕ bµo lai thèng nhÊt, trong ®ã mµng sinh chÊt, tÕ bµo chÊt vµ c¶ nh©n ®Òu mang ®Æc tÝnh cña 2 loµi, nh­ng trong bé nhiÔm s¾c thÓ cña tÕ bµo lai x¶y ra hiÖn t­îng mÊt ®i mét sè nhiÔm s¾c thÓ cña c¶ 2 loµi vµ t¸i t¹o l¹i bé nhiÔm s¾c thÓ l­ìng béi b×nh th­êng trong tÕ bµo lai; trong tÕ bµo chÊt còng cã sù tæ hîp l¹i ADN cña ty thÓ vµ lôc l¹p. Nh÷ng hiÖn t­îng ®ã ®Æt ra cho c¸c nhµ di truyÒn tÕ bµo nh÷ng vÊn ®Ò lý thó nh­ x¸c ®Þnh ®­îc c¸c gen quy ®Þnh c¸c tÝnh tr¹ng cña c©y ®Þnh khu trong nhiÔm s¾c thÓ nµo (lËp b¶n ®å en), sù biÓu hiÖn cña gen, sù t¸i tæ hîp gen vµ c¸c nhµ t¹o gièng cã thÓ chän dßng tÕ bµo lai ®Ó vi nh©n gièng theo c¸c ®Æc tÝnh mµ m×nh mong muèn, vÝ dô t¹o ra c¸c dßng chèng chÞu bÖnh tËt, chèng chÞu thuèc diÖt cá, hoÆc chän c¸c dßng hÊp thô ®ùc b»ng ph­¬ng ph¸p lai h÷u tÝnh rÊt khã kh¨n, l©u dµi vµ tèn kÐm. Tr­êng hîp ®iÓn h×nh lµ t¹o c©y bÊt thô ®ùc ë c¶i dÇu, c¸c nhµ khoa häc Ph¸p ®· mÊt rÊt nhiÒu c«ng søc b»ng ph­¬ng ph¸p lai h÷u tÝnh gi÷a c©y c¶i cñ bÊt thô ®ùc víi c¶i vµ c¶i dÇu, thu ®­îc c©y c¶i dÇu bÊt thô ®ùc nh­ng chóng kh«ng cã søc sèng; cßn víi ph­¬ng ph¸p lai tÕ bµo soma in vitro, hä ®· nhanh chãng t¹o ®­îc c©y lai mang c¶ 3 th«ng tin di truyÒn; nh©n vµ lôc l¹p cña c¶i dÇu, cßn ty thÓ lµ cña c¶i cñ. Nh÷ng c©y lai nµy lµ c©y bÊt thô ®ùc cã søc sèng b×nh th­êng. B»ng ph­¬ng ph¸p lai tÕ bµo soma in vitro, ng­êi ta dÔ dµng t¹o ®­îc c©y lai “Pomat” tõ c¸c tÕ bµo cña khoai t©y (Pomme de terre) vµ tÕ bµo cña cµ chua (Tomate), c©y lai tõ tÕ bµo cµ rèt vµ mïi t©y… HiÖn nay, sö dông c«ng nghÖ t¹o gièng b»ng lai tÕ bµo soma kh«ng chØ ®­îc thùc hiÖn ë thuèc l¸, khoai t©y, cµ chua… mµ c¶ ë nh÷ng c©y l­¬ng

19

thùc nh­ lóa, ng« vµ c¸c c©y hoa t¹i nhiÒu C«ng ty t¹o gièng trªn thÕ giíi, trong ®ã cã c¶ ViÖt Nam. 1.4 Nu«i cÊy tÕ bµo ë møc ®é c«ng nghiÖp S¶n xuÊt kh¸ng thÓ ®¬n dßng Kh¸ng thÓ ®¬n dßng hay kh¸ng thÓ ®¬n cl«n ( monoclonal antibodies) lµ nh÷ng kh¸ng thÓ do mét dßng tÕ bµo lymph« sinh ra ®Ó chèng l¹i mét lo¹i “ quyÕt ®Þnh kh¸ng nguyªn” nµo ®ã. N¨m 1975, lÇn ®Çu tiªn K«lª vµ Minstªn ( Kohler va Milstein kh¸m ph¸ ra ph­¬ng ph¸p s¶n xuÊt c¸c kh¸ng thÓ ®¬n dßng ë ngoµi c¬ thÓ b»ng kü thuËt liªn kÕt tÕ bµo myªl«ma víilymph« bµo B ho¹t ho¸ ®Ó t¹o ra c¸c tÕ bµo lai, sau ®ã nu«i cÊy cho chóng ph¸t triÓn lªn trong m«i tr­êng nh©n t¹o ®Æc biÖt. TÕ bµo myªl«ma lÊy tõ c¸c c¬ thÓ bÖnh nh©n m¾c bÖnh u tuû ( bÖnh myªl«ma) cã kh¶ n¨ng sinh s«i n¶y në rÊt nhanh chãng. Sau khi t¹o ra ®­îc tÕ bµo lai. Chóng sÏ ph©n chia liªn tiÕp t¹o ra mét dßng ( clon) tÕ bµo cã kh¼ n¨ng tiÕt ra mét lo¹i “quyÕt ®Þnh kh¸ng nguyªn” nµo ®ã. Ng­êi ta gäi lo¹i kh¸ng thÓ nµy lµ kh¸ng thÓ ®¬n dßng (hay ®¬n clon) Ngay sau khi t×m ra c¸ch s¶n xuÊt kh¸ng thÓ ®¬n dßng ng­êi ta ®· t×m thÊy v« vµn øng dông quan träng cña nã. Khi muèn t¸ch interferon ( lo¹i protein ®Æc biÖt cã kh¶ n¨ng chèng ung th­ vµ chèng bÖnh virut) ng­êi ta dïng hçn hîp kh¸ng nguyªn chøa interferon ®Ó g©y miÔn dÞch vµ kh¸ng thÓ ®¬n dßng. Sau khi thu ®­îc kh¸ng thÓ ®¬n dßng chèng interferon ng­êi ta g¾n c¸c kh¸ng thÓ nµy víi c¸c h¹t tr¬ ®Ó t¹o ra chÊt hÊp phô miÔn dÞch. Cho hçn hîp interferon di qua c¸c cét chøa chÊt

20

hÊp phô nµy ta t¸ch ®­îc interferon ra khái hçn hîp ( cã thÓ t¸ch ®­îc kho¶ng 97% so víi tæng sè interferon)

Còng b»ng c¸ch nµy ng­êi ta ®· t¸ch ®­îc nh÷ng kh¸ng nguyªn h÷u hiÖu tõ vi khuÈn hoÆc tõ kÝ sinh trïng ®Ó t¹o v¨cxin. Ph­¬ng ph¸p s¶n xuÊt kh¸ng thÓ ®¬n dßng cßn cho phÐp ph¸t hiÖn ®Ô dµng vµ nhanh chãng c¸c kh¸ng nguyªn ch­a biÕt trªn bÒ mÆt tÕ bµo. 21

Dïng kh¸ng thÓ ®¬n dßng cã tÝnh ®Æc hiÖu cao do ®ã sÏ lo¹i bít ®­îc c¸c hiÖn t­îng d­¬ng tÝnh gi¶ trong c¸c thö nghiÖm miÔn dÞh cùc nh¹y, ch¼ng h¹n thö nghiÖm miÔn dÞch phãng x¹ hoÆc thö nghiÖm ELISA ( rÊt phæ biÕn ®Ó x¸c ®Þnh bÖnh SIDA)

22

Ch­¬ng 2: Kü thuËt tÕ bµo trÇn 2.1 Kü thuËt tÕ bµo trÇn Kü thuËt tÕ bµo trÇn ®­îc b¾t ®Çu tõ nh÷ng n¨m 70, khi ph¸t hiÖn ra kh¶ n¨ng h÷u hiÖu cña dung hîp tÕ bµo trÇn. §ã lµ nh÷ng nh÷ng nghiªn cøu vÒ t¸i tæ hîp di truyÒn b»ng dung hîp tÕ bµo trÇn ë Bacillus ( Food K., Alfloldi L., 1976 ) vµ Streptomyces ( Hopwood, 1977 ). Song, víi c¸c vi khuÈn Gram ©m, v× cÊu tróc cña thµnh tÕ bµo khã ph©n huû, nªn t¹o tÕ bµo trÇn khã kh¨n h¬n/ §Ó thu nhËn tÕ bµo trÇn, ph¶i dùa vµo c¸c ®Æc tÝnh cña loµi, mµ tr­íc hÕt lµ cÊu tróc cña thµnh tÕ bµo. 2.1.1 CÊu t¹o cña thµnh tÕ bµo vi sinh vËt Tõ n¨m 1875, Coln ®· quan s¸t thÊy tÕ bµo vi khuÈn cã tÝnh ®Ò kh¸ng nhÊt ®Þnh ®èi víi dung dÞch kiÒm hoÆc axit vµ ®· gi¶ thiÕt r»ng tÕ bµo vi khuÈn ®­îc bao bäc bªn ngoµi b»ng mét líp thµnh tÕ bµo kh¸ v÷ng ch¾c. VÒ sau, b»ng ph­¬ng ph¸p g©y co nguyªn sinh, ng­êi ta ®· thÊy râ h¬n sù tån t¹i cña thµnh tÕ bµo. Thµnh tÕ bµo b¶o vÖ tÝnh toµn vÑn cña tÕ bµo. Khi cã sù thay ®æi cña ®iÒu kiÖn bªn ngoµi, kÓ c¶ t¸c ®éng cña ¸p suÊt thÈm thÊu, cïng víi mµng sinh chÊt, thµnh tÕ bµo t¹o thµnh mét mµng b¸n thÊm. Sau khi thµnh tÕ bµo bÞ ph¸ vì, tÕ bµo chÊt sÏ tho¸t ra ngoµi vµ nhanh chãng co l¹i thµnh mét khèi h×nh cÇu ( spheroplast ). B»ng nhiÒu ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu kh¸c nhau, ngµy nay ®· biÕt ®­îc kh¸ râ cÊu tróc ph©n tö cña thµnh tÕ bµo vi sinh vËt. Th«ng qua c¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu vÒ thµnh tÕ bµo, ng­êi ta ®· hiÓu thªm vÒ c¬ chÕ t¸c dông cña mét sè chÊt kh¸ng sinh.

23

Mét hîp phÇn quan träng tham gia vµo cÊu tróc cña thµnh tÕ bµo vi khuÈn vµ x¹ khuÈn lµ glycopeptit. Hµm l­îng glycopeptit trong thµnh tÕ bµo biÕn ®éng trong ph¹m vi kh¸ réng, chiÕm 95% träng l­îng kh« ë mét sè vi khuÈn Gram d­¬ng ®Õn 5 - 10% vi khuÈn Gram ©m. Muèn t¸ch vµ nghiªn cøu tõng thµnh phÇn cña glycopeptit, cã thÓ sö dông mét sè enzym nh­ lysozym, peptidaza,… S¶n phÈm thuû ph©n cña glycopeptit lµ c¸c gèc N - axetylglucozamin, axit N axetylmuramic vµ mét sè lo¹i amino axit. Theo Saltor dùa trªn cÊu t¹o cña thµnh tÕ bµo, vi khuÈn ®­îc chia lµm 4 nhãm Nhãm 1: Gåm c¸c vi khuÈn cã mét mµng. VÝ dô nh­ Mycoplasma vµ mét sè vi khuÈn kh¸c ( Halobacterium halobium vµ H. salinarum ). Nhãm 2: Gåm c¸c vi khuÈn Gram d­¬ng, thµnh tÕ bµo máng­êi. Nhãm 3: Gåm c¸c vi khuÈn Gram ©m, thµnh tÕ bµo gåm nhiÒu líp, thµnh phÇn ho¸ häc vµ cÊu tróc ®a d¹ng. Nhãm 4: Gåm c¸c vi khuÈn cã líp vá bÒ mÆt phøc t¹p nh­: Lampropedia hyolina, Micrococcus radioduraus. Thµnh phÇn ho¸ häc cña thµnh tÕ bµo vi khuÈn Gram d­¬ng vµ Gram ©m cã sù kh¸c nhau ( b¶ng1 ): B¶ng1. Thµnh phÇn ho¸ häc cña thµnh tÕ bµo vi khuÈn

Thµnh phÇn

Vi khuÈn

Vi khuÈn Gram ©m

Gram d­¬ng

Líp cøng

24

Líp ngoµi

Peptidoglycan

+

+

-

Axit techoic

+

-

-

Polysaccharit

+

-

-

Protein

+ hoÆc -

-

+

Lipopolysaccharit -

-

+

Lipopolyprotit

+hoÆc -

+

+: Cã ;

-

-: Kh«ng cã

Thµnh tÕ bµo cña vi khuÈn Gram d­¬ng lµ mét cÊu tróc ®ång nhÊt, dµy kho¶ng 14 - 18 nm thµnh phÇn ho¸ häc chÝnh lµ peptidoglycan, chiÕm 40 - 90% chÊt kh«. Ph©n tö peptidoglycan lµ nh÷ng chuçi polysaccharit song song nèi víi nhau b»ng nh÷ng cÇu nèi peptit ng¾n. Mét thµnh phÇn n÷a chØ cã ë thµnh tÕ bµo vi khuÈn Gram d­¬ng lµ axit teichoic, liªn kÕt víi glycopeptit b»ng liªn kÕt photphodiester. Khi líp peptidoglycan bÞ ph¸ huû, thµnh tÕ bµo bÞ ®øt vµ tÕ bµo tho¸t ra ngoµi. Ph­¬ng ph¸p lµm cho tÕ bµo bÞ mÊt thµnh tÕ bµo gäi lµ ph­¬ng ph¸p t¹o tÕ bµo trÇn. §Ó ph¸ huû thµnh tÕ bµo, cã thÓ dïng c¸c men ph©n huû hoÆc c¸c chÊt kh¸ng sinh ®Ó ng¨n chÆn sù tæng hîp thµnh tÕ bµo nh­: penixilin, baxitraxin, novobioxin. Thµnh tÕ bµo cña vi khuÈn Gram ©m máng h¬n chØ dµy kho¶ng 10 nm vµ cã cÊu t¹o nhiÒu líp: trong cïng lµ líp glycopeptit, trªn líp nµy lµ mét líp dµy h¬n, ®­îc cÊu t¹o tõ nhiÒu ph©n tö protein s¾p xÕp

25

láng lÎo. Líp nµy ®­îc che phñ bëi mét líp lipopolysaccharit, trªn líp nµy lµ mét líp lipoproteit. 2.1.1.2 Thu nhËn tÕ bµo trÇn ë vi sinh vËt ViÖc lùa chän ph­¬ng ph¸p t¹o tÕ bµo trÇn, tr­íc hÕt ph¶i dùa vµo cÊu tróc vµ thµnh phÇn ho¸ häc cña thµnh tÕ bµo. §Ó thu nhËn tÕ bµo trÇn tõ vi sinh vËt, cã thÓ sö dông 2 ph­¬ng ph¸p c¬ b¶n: 1. Dïng enzym ®Ó ph©n huû líp cøng cña thµnh tÕ bµo. 2. Sö dông c¸c t¸c nh©n øc chÕ tæng hîp b×nh th­êng c¸c polyme c¬ b¶n cña thµnh tÕ bµo. 2.1.1.2.1 Thu nhËn tÕ bµo trÇn tõ vi khuÈn * Vi khuÈn Gram d­¬ng C¸c quan s¸t ®Çu tiªn theo dâi sù h×nh thµnh c¸c cÊu tróc t­¬ng tù tÕ bµo trÇn ë vi khuÈn ®· ®­îc A. Fischer tiÕn hµnh tõ n¨m 1900. ¤ng ®· m« t¶ hiÖn t­îng “rß rØ plasma” ë Bacillus anthracis vµ Vibrio proteus vµo m«i tr­êng xung quanh khi trén chóng vµo dung dÞch ­u tr­¬ng. N¨m 1952, hai t¸c gi¶ Tomcsik vµ Gnex - Holzer ®· sö dông lysozym ph©n gi¶i thµnh tÕ bµo, t¹o ra cÊu tróc t­¬ng tù nh­ tÕ bµo trÇn ë Bacillus. Qua kÝnh hiÓn vi ®èi pha, c¸c t¸c gi¶ quan s¸t thÊy d­íi t¸c dông cña lysozym, c¸c tÕ bµo phång lªn, thµnh tÕ bµo bÞ tan ®i mét c¸ch nhanh chãng. Nguyªn sinh chÊt cña vi khuÈn cã d¹ng h×nh cÇu. Tuy nhiªn trong tr­êng hîp nµy thÓ cÇu còng kh«ng bÒn v÷ng vµ rÊt dÔ bÞ ph¸ huû. §Ó tr¸nh hiÖn t­îng nµy, Weibull ®· xö lý tÕ bµo b»ng lysozym trong dung dÞch saccharoza ­u tr­¬ng - m«i tr­êng thÈm thÊu bÒn v÷ng, vµ ®· thu ®­îc c¸c thÓ h×nh cÇu, kh«ng cã thµnh tÕ bµo, cã tÝnh mÉn c¶m thÈm thÊu cao vµ bÒn v÷ng. T¸c gi¶ gäi chóng lµ protoplast ( tÕ bµo trÇn ). ThuËt ng÷ protoplast ®· ®­îc nhiÒu nhµ nghiªn cøu chÊp nhËn ngay. 26

§èi víi c¸c vi khuÈn Gram d­¬ng, ®Ó t¹o tÕ bµo trÇn, chØ cÇn xö lý tÕ bµo trÇn víi lysozym trong dung dÞch ­u tr­¬ng. D­íi t¸c dông cña lysozym, líp peptidoglycan cña thµnh tÕ bµo bÞ ph©n huû, trong ®iÒu kiÖn ®ã, nång ®é lysozym tèt nhÊt dao ®éng tõ 10 - 1000 µg/ml vµ ë møc ®é nµo ®ã phô thuéc vµo mËt ®é tÕ bµo trong m«i tr­êng. TÝnh nh¹y c¶m cña thµnh tÕ bµo vi khuÈn víi lysozym kh«ng gièng nhau ë c¸c loµi kh¸c nhau, thËm chÝ c¶ trong cïng mét chñng. C¸c chÊt t¸c dông lªn ho¹t tÝnh cña lysozym ®­îc sö dông lµm chÊt æn ®Þnh thÈm thÊu. Wiame vµ cs dïng NaCl 0,25M - 0,5M ®Ó æn ®Þnh tÕ bµo trÇn cña B. subtilis vµ nhËn thÊy t¸c ®éng cña lysozym lªn tÕ bµo bÞ øc chÕ. HiÖn t­îng nµy kh«ng quan s¸t thÊy khi sö dông saccharoza 0,65M. Hydratcrabon ®­îc xem lµ chÊt æn ®Þnh tèt nhÊt ®Ó t¹o tÕ bµo trÇn ë vi khuÈn. Th«ng th­êng ng­êi ta hay sö dông saccharoza ( 0,2 - 0,6M ), glucoza ( 0,3M), rafinoza( 0,15M ), melibioza ( 0,15M ). Trong qu¸ tr×nh t¹o tÕ bµo trÇn, thµnh phÇn dung dÞch ®Öm, ®Æc biÖt lµ sù cã mÆt cña c¸c ion Na + , Mg +2 , Ca +2 còng cã ¶nh h­ëng rÊt lín. NÕu kh«ng Mg +2 trong dung dÞch ®Öm th× sè l­îng tÕ bµo trÇn t¹o ra Ýt vµ rÊt dÔ bÞ vì. Cßn nÕu nång ®é c¸c ion ®ã lín h¬n 3mM th× qu¸ tr×nh t¹o tÕ bµo trÇn x¶y ra tèt vµ ng¨n chÆn ®­îc viÖc ph¸ vì tÕ bµo trÇn [ 151 ]. Nh÷ng t¸c ®éng cña c¸c ®iÒu kiÖn kh¸c nhau lªn sù h×nh thµnh tÕ bµo trÇn còng ®· ®­îc nghiªn cøu kü trªn Cellulomonas sp. KÕt qu¶ cho thÊy hiÖu suÊt lín nhÊt ( 75% tÕ bµo trÇn ) t¹o thµnh víi sucxinat natri 0,5M lµm chÊt æn ®Þnh thÈm thÊu ( thay thÕ saccharza g©y ®«ng vãn tÕ bµo ) ®­îc bæ sung thªm víi MgCl 2 20mM, lysozym 200 µg/ml vµ EDTA 0,01M ë pH 7,4. Sinh khèi thu ë gi÷a pha logarit lµ thÝch hîp nhÊt cho t¹o tÕ bµo trÇn. Thêi gian xö lý víi lysozym cã

27

thÓ thay ®æi ë c¸c chñng kh¸c nhau vµ g©y hiÖu qu¶ biÕn ®æi còng kh¸c nhau. Víi mét sè chñng, nÕu kÐo dµi thêi gian xö lý víi lysozym, tÕ bµo trÇn cã thÓ bÞ ph©n huû ( ®Æc biÖt lµ trong dung dÞch ®Öm L.). NÕu ®iÒu ®ã x¶y ra cã thÓ dïng dung dÞch ®Öm P. ®Ó thay thÕ, hoÆc lµ h¹ thÊp nhiÖt ®é, hoÆc lµ rót ng¾n thêi gian ñ. Tuy nhiªn ®iÒu kiÖn tèi ­u ®Ó t¹o tÕ bµo trÇn ë mçi chñng kh¸c nhau ®Òu cã tÝnh chÊt ®Æc tr­ng riªng. * Vi khuÈn Gram ©m §Ó t¹o tÕ bµo trÇn tõ c¸c vi khuÈn Gram ©m, viÖc xö lý víi lysozym Ýt cã hiÖu qu¶ h¬n. Thµnh tÕ bµo vi khuÈn Gram ©m cã mét líp peptidoglycan máng, ®­îc bao bäc bªn ngoµi b»ng mét líp cÊu t¹o tõ c¸c ph©n tö lipoproteit, phospholipit, lipopolysaccharit, do ®ã líp peptidoglycan kh«ng bÞ t¸c ®éng bëi lysozym. §Ó lysozym tiÕp xóc víi c¬ chÊt, cÇn ph¶i ph¸ huû hoµn toµn líp thµnh tÕ bµo. Nh­ vËy, ®èi víi c¸c tÕ bµo Gram ©m ®Ó t¹o tÕ bµo trÇn kh«ng ph¶i lµ sù hoµ tan líp peptidoglycan ®Ó t¹o ra thÓ cÇu ( spheroplast ) mµ lµ lo¹i trõ líp mµng ngoµi vµ chuyÓn d¹ng tõ thÓ cÇu thµnh tÕ bµo trÇn thùc thô. Mét nguyªn t¾c ®Ó thu nhËn tÕ bµo trÇn ë vi khuÈn Gram ©m lµ cÇn ph¶i lµm t¨ng ®é mÉn c¶m cña thµnh tÕ bµo víi lysozym b»ng nhiÒu ph­¬ng ph¸p kh¸c nhau. Nu«i cÊy s¬ bé tÕ bµo trong m«i tr­êng kiÒm ( pH 8,0 - 9,0 ) hoÆc trong m«i tr­êng cã nång ®é ®­êng cao ( 0,5M ) xö lý tÕ bµo víi c¸c hîp chÊt chelat, vÝ dô Na 2 EDTA hay víi c¸c cation ho¸ trÞ 1 vµ 2 lµm ®«ng l¹nh ban ®Çu råi lµm tan b¨ng c¸c tÕ bµo. TÊt c¶ c¸c qu¸ tr×nh nµy ®Òu lµm t¨ng tÝnh mÉn c¶m cña c¸c tÕ bµo Gram ©m víi lysozym. Trong c¸c ph­¬ng ph¸p trªn, ph­¬ng ph¸p do Repaske ®Ò xuÊt ®¹t kÕt qu¶ tèt h¬n. Trªn tÕ bµo cña

28

E. coli vµ mét sè loµi Gram ©m kh¸c, t¸c gi¶ ®· chøng minh kh¶ n¨ng t¹o tÕ bµo trÇn d­íi t¸c dông t¹i chç cña lysozym vµ EDTA, trong m«i tr­êng pH 7,8 - 8,0. Tuy nhiªn c¬ chÕ t¸c dông cña EDTA lªn tÕ bµo vÉn ch­a ®­îc hiÓu râ t­êng tËn. Cã gi¶ thiÕt cho r»ng EDTA rót c¸c cationb ho¸ trÞ 2 tõ thµnh tÕ bµo ra vµ tr­íc hÕt nã kÝch thÝch gi¶i phãng c¸c phospholipit vµ protein - polysaccharit phøc hîp. N¨m 1976, Weiss ®Ò xuÊt ph­¬ng ph¸p t¨ng nhanh tèc ®é t¹o tÕ bµo trÇn ë trùc khuÈn ®­êng ruét, b»ng c¸ch sö dông EDTA thay cho ph­¬ng ph¸p cña Repaske. T¸c gi¶ kh«ng cho EDTA vµ lysozym t¸c dông lªn tÕ bµo cïng mét lóc, mµ cho t¸c dông c¸i tr­íc, c¸i sau. Qua kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö, x¸c ®Þnh ®­îc 95% tÕ bµo bÞ mÊt thµnh. §Ó t¹o tÕ bµo trÇn ë vi khuÈn nèt sÇn Rhizobium meliloti, Philatova vµ cs ®· ¸p dông ph­¬ng ph¸p cña Weiss, nh­ng cã thay ®æi: gi¶m nång ®é lysozym vµ EDTA xuèng 5 lÇn vµ thay ®æi thø tù t¸c dông cña chóng (tr­íc tiªn lµ cho Na 2 EDTA, sau lµ lysozym ), dïng sorbit lµm chÊt æn ®Þnh. C¸c thÓ cÇu rÊt mÉn c¶m víi sèc thÈm thÊu vµ khi chuyÓn vµo n­íc cÊt sÏ bÞ ph¸ huû. §Ó lµm râ tÝnh chÊt thay ®æi cña líp vá, c¸c t¸c gi¶ ®· ph©n tÝch trªn kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö vµ thÊy râ thµnh tÕ bµo bÞ mÊt tÝnh chÊt nhiÒu líp, c¸c tÕ bµo trÇn chØ ®­îc bao quanh b»ng mét mµng sinh chÊt. DÊu hiÖu nµy cho phÐp c¸c t¸c gi¶ kÕt luËn r»ng c¸c thÓ cvÇu thu ®­îc chÝnh lµ c¸c tÕ bµo trÇn. Trong c¸c c«ng tr×nh nghiªn cøu t¹o tÕ bµo trÇn ë Az«tbacter c¸c t¸c gi¶ ®· sö dông ®ång thêi 2 t¸c nh©n lµ lysozym ( 100µg/ml) vµ Na 2 EDTA ®Ó t¸c ®éng lªn tÕ bµo. Sau 15 phót kÓ tõ lóc b¾t ®Çu t¸c dông, ®a sè c¸c tÕ bµo d¹ng ovan chuyÓn thµnh thÓ cÇu vµ nhanh chãng bÞ ph©n ly khi chuyÓn vµo n­íc cÊt. Tuy nhiªn theo ph­¬ng

29

ph¸p nµy, tû lÖ phÇn tr¨m tÕ bµo trÇn phôc håi rÊt thÊp (3%). Trong khi ®ã, víi c¸c loµi Gram ©m kh¸c, vÝ dô nh­ trùc khuÈn ®­êng ruét, tû lÖ phôc håi ®¹t ®­îc kh¸ cao. Gi¶i thÝch cho kÕt qu¶ nµy, c¸c t¸c gi¶ cho r»ng ®ã lµ do t¸c dông ®éc h¹i cña phøc hîp EDTA vµ thµnh phÇn nit¬ trong m«i tr­êng khi t¹o tÕ bµo trÇn. §iÒu nµy còng nãi lªn r»ng vÒ cÊu tróc thµnh tÕ bµo cña Az«tbacter, cã c¸c cÊu tö mµ chõng mùc nµo ®ã, kh¸c víi trùc khuÈn ®­êng ruét, mÆc dï c¶ hai ®Òu thuéc nhãm vi khuÈn Gram ©m. Mét ph­¬ng ph¸p t¸c ®éng kh¸c lªn líp ngoµi cña thµnh tÕ bµo vi khuÈn Gram ©m lµ tr­íc khi xö lý víi lysozym, tÕ bµo ®­îc röa nhiÒu lÇn víi dung dÞch cña mét sè ion cã nång ®é x¸c ®Þnh (Na + 0,125M,K + 0,05M, NH 4 0,05 M, Ca +2 0,02 mM). §éng th¸i cña qu¸ tr×nh t¹o tÕ bµo trÇn sÏ bÞ ph¸ vì khi t¨ng hoÆc gi¶m nång ®é c¸c ion nµy. §Ó lµm cho thµnh tÕ bµo vi khuÈn Gram ©m mÉn c¶m h¬n víi t¸c dông ph©n gi¶i cña lysozym, cã thÓ dïng ph­¬ng ph¸p ®«ng l¹nh tan b¨ng. Nhò dÞch c¸c tÕ bµo ®· röa trong dung dÞch ®Öm tris - HCl 0,02 M ( pH 7,8) ®­îc hoµ trén víi EDTA 5 mM, saccharoza 0,25 M vµ lysozym 0,5µg/ml trong mét b×nh cÇu, sau ®ã lµm ®«ng l¹nh nhò dÞch vµ nhÊn ch×m b×nh cÇu vµo n­íc nãng. KÕt qu¶ lµ qu¸n s¸t thÊy sù ph©n gi¶i thµnh tÕ bµo vµ sù h×nh thµnh tÕ bµo trÇn. Ph­¬ng ph¸p thø hai ®Ó t¹o tÕ bµo trÇn ë vi sinh vËt lµ øc chÕ tæng hîp thµnh tÕ bµo. Sù rèi lo¹n chuyÓn ho¸ trong khi tæng hîp thµnh tÕ bµo x¶y ra trong 2 ®iÒu kiÖn : 1. Do ®ét biÕn gen tham gia tæng hîp c¸c lolyme cña thµnh tÕ bµo; 2. Trong khi rèi lo¹n tæng hîp thµnh tÕ bµo d­íi t¸c dông cña c¸c t¸c nh©n ng¨n ngõa sù h×nh thµnh chuçi muc«plyme.

30

Mét ph­¬ng ph¸p ®­îc sö dông réng r·i nhÊt ®Ó t¹o tÕ bµo trÇn ë vi khuÈn Gram ©m lµ ph­¬ng ph¸p Penixilin [105]. Ph­¬ng ph¸p nµy dùa trªn tÝnh chÊt cña mét sè chÊt kh¸ng sinh, ®Æc biÖt lµ penixioin, lµm rèi lo¹n tæng hîp peptidoglycan. LÇn ®Çu tiªn vµo n¨m 1956, Ledermeister vµ Kellenberger dïng penixilin ®Ó t¹o thÓ cÇu mÉn c¶m thÈm thÊu ë vi khuÈn, nh­ng c¸c thÕ cÇu nµy nhanh chãng bÞ ph©n huû v× trong m«i tr­êng kh«ng cã chÊt æn ®Þnh ¸p lùc thÈm thÊu. Còng trong n¨m ®ã Lederberg J. ®· thµnh c«ng trong viÖc t¹o tÕ bµo trÇn ë trùc khuÈn ®­êng ruét, khi nu«i cÊy tÕ bµo trong m«i tr­êng cã penixioin (100 - 1000 µg/ml, saccharoza ( 5 - 20%) vµ sulff©tmnhe ( 0,1 - 0,2%). Ph­¬ng ph¸p penixilin t¹o tÕ bµo trÇn kh«ng cã hiÖu qu¶ trong c¸c tr­êng hîp khi trong tÕ bµo cã sù k×m h·m tæng hîp tÕ bµo chÊt, vÝ dô tÕ bµo bÞ t¸c ®éng bëi chloramphenicol, streptomyxin hay clotraxyclin. Nh­ vËy penixilin t¸c dông lªn tÕ bµo ®ang ph¸t triÓn vµ diÔn ra sù tæng hîp m¹nh mÏ thµnh tÕ bµo. T¸c dông cña penixilin lµ øc chÕ sù chuyÓn ho¸ peptit sang giai ®o¹n tæng hîp peptidoglycan. §èi víi c¸c vi khuÈn Gram d­¬ng, sö dông ph­¬ng ph¸p penixilin ®Ó t¹o tÕ bµo trÇn kÐm hiÖu qu¶. §iÒu nµy ®­îc gi¶i thÝch lµ líp mucoplyme cña thµnh tÕ bµo kh«ng cã mét líp phô b¶o vÖ nh­ ë c¸c vi khuÈn Gram ©m, vµ khi nu«i cÊy víi kh¸ng sinh, c¸c tÕ bµo th­êng bÞ ph©n gi¶i. Tuy nhiªn còng cã tµi liÖu nãi vÒ sù thµnh c«ng trong viÖc t¹o tÕ bµo trÇn ë vi khuÈn Gram d­¬ng b»ng ph­¬ng ph¸p penixilin vµ ®· ®¹t ®­îc hiÖu suÊt rÊt cao 99%. VÒ thùc chÊt, c¸c tÕ bµo trÇn thu ®­îc tõ c¸c vi khuÈn Gram d­¬ng vµ Gram ©m cã cÊu tróc bÒ mÆt kh¸c nhau. Sù kh¸c nhau nµy ®· ®­îc Martin m« t¶ b»ng h×nh vÏ.

31

Khi chuçi muc«plyme cña thµnh tÕ bµo vÞ t¸c ®éng ph©n huû cña lysozym hoÆc c¸c pherment ph©n huû kh¸c, c¸c vi khuÈn Gram d­¬ng h×nh thµnh thÓ cÇu vµ chØ gåm mét mµng sinh chÊt bao bäc xung quanh, thµnh tÕ bµo cña chóng bÞ mÊt hoµn toµn. ThÓ cÇu cña nhãm vi khuÈn Gram d­¬ng ®­îc gäi lµ pr«tplast (tÕ bµo trÇn), ë vi khuÈn Gram ©m, thµnh tÕ bµo cã cÊu t¹o phøc t¹p, gåm nhiÒu líp.

Quan s¸t qua kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö, nh÷ng l¸t c¾t máng cña c¸c thÓ cÊu nh©n ®­îc d­íi t¸c dông cña lysozym vµ EDTA hoÆc khi nu«i cÊy trong m«i tr­êng cã penixilin cho thÊy cã sù t­¬ng ®ång trong cÊu tróc líp cßn l¹i cña thµnh tÕ bµo, mÆc dï chóng chÞu t¸c ®éng cña c¸c t¸c nh©n kh¸c nhau. D­íi t¸c ®éng cña lysozym vµ EDTA, chØ cã líp muc«plyme bÞ ph©n huû, cßn c¸c h¹t protein cña líp cøng vÉn ®­îc gi÷ nguyªn. Nh­ vËy, víi thÓ cÇu, xö lý víi lysozym vÉn cßn

l¹i

phÇn

líp

líp

lipoprotein,

c¸c

h¹t

protein

vµ

líp

lipopolysaccharit kh«ng bÞ ph¸ vì. ThÓ cÇu cña nhãm vi khuÈn Gram ©m ®­îc gäi lµ spheroplasst (h¹t cÇu). 2.1. 1. 2.2 Thu nhËn tÕ bµo trÇn tõ nÊm. Trong c«ng tr×nh nghiªn cøu cña Giaza vÒ lÜnh vùc nµy, ®· chØ ra r»ng dÞch tiªu ho¸ ë trong ruét cña èc sªn (Helix pomatia) cã kh¶ n¨ng hoµ tan thµnh tÕ bµo cña nÊm men. Ph©n tÝch thµnh phÇn ho¸ häc cña dung dÞch nµy cho thÊy ®ã lµ mét phøc hÖ gåm 30 lo¹i enzyin: glucanza, mananaza, proteaza, lipana, polygalactironaza vµ nhiÒu lo¹i kh¸c. Nhê tËp hîp nhiÒu enzym, nªn phøc hîp cã kh¶ n¨ng

32

t¸c ®éng trªn phæ réng, hoµ tan thµnh tÕ bµo cña nhiÒu lo¹i nÊm men vµ nÊm sîi. N¨m 1957, Eddy vµ Williamson ®· t¹o ®­îc tÕ bµo trÇn ®Çu tiªn ë Saccharomyces d­íi t¸c dông cña dÞch tiªu ho¸ cña èc sªn. Sau ®ã, ®· cã nhiÒu tµi liÖu c«ng bè vÒ sù t¹o thµnh tÕ bµo trÇn tõ nÊm sîi. Song ngay tõ tr­íc khi c«ng bè c¸c c«ng tr×nh nµy, n¨m 1956, Necas ®· lµm mét cuéc quan s¸t kh¸ lý thó trong c¸c ®iÒu kiÖn nu«i cÊy nhÊt ®Þnh (tuæi gièng, nhiÖt ®é, thµnh phÇn dinh d­ìng), c¸c tÕ bµo Saccharomyces cerevisiae trë nªn mÉn c¶m víi sèc nh­îc tr­¬ng. §iÒu nµy chøng tá, t¸c gi¶ ®· t¹o ®­îc tÕ bµo b»ng c¸ch ph¸ vì thµnh tÕ bµo trong m«i tr­êng nh­îc tr­¬ng, kh«ng cã sù tham gia cña ennym phÇn gi¶i trong m«i tr­êng dinh d­ìng. Tuy nhiªn, chØ sau khi c«ng bè c«ng tr×nh nghiªn cøu vÒ sö dông dÞch tiªu ho¸ cña èc sªn ®Î hoµ tan thµnh tÕ bµo cña nÊm, th× viÖc nghiªn cøu míi b¾t ®Çu ®i s©u ®Ó t¹o tÕ bµo trÇn ë trªn nhiÒu loµi nÊm kh¸c nhau. Qu¸ tr×nh h×nh thµnh tÕ bµo trÇn ë nÊm men vµ ë nÊm sîi kh¸c víi qu¸ tr×nh nµy ë vi khuÈn. ë nÊm, trong ®iÒu kiÖn cã t¸c dông cña c¸c ennym ph©n gi¶i thµnh tÕ bµo, sÏ h×nh thµnh c¸c lç nhá, qua ®ã tÕ bµo chÊt tho¸t ra m«i tr­êng ngoµi vµ d­íi ¶nh h­ëng cña chÊt æn ®Þnh ¸p lùc thÈm thÊu vµ do bÒ mÆt mµng tÕ bµo c¨ng ra mµ cã d¹ng h×nh cÇu - tÕ bµo trÇn ®­îc h×nh thµnh. C¸c lç xuÊt hiÖn ë trªn tÕ bµo nÊm men th­êng ë mét cùc hoÆc ë vïng xÝch ®¹o .

33

Tèc ®é t¸c ®éng cña ennym còng nh­ tèc ®é h×nh thµnh tÕ bµo trÇn, phô thuéc vµo nhiÒu yÕu tè; cÊu tróc vµ thµnh phÇn ho¸ häc cña thµnh tÕ bµo, pha ph¸t triÓn thµnh phÇn vµ ho¹t lùc có t¸c nh©n ph©n gi¶i, nhiÖt ®é khi diÔn ra t¸c ®éng cña ennym, thµnh phÇn c¬ chÊt nu«i cÊy, pH cña m«i tr­êng vµ c¸c yÕu tè kh¸c. Trong c¸c thÝ nghiÖm ®Çu tiªn t¹o tÕ bµo trÇn ë nÊm men. Eddy vµ Williamson ®· nhËn thÊy r»ng, nÕu t¨ng nhiÖt ®é cña m«i tr­êng ph¶n øng th× tèc ®é h×nh thµnh tÕ bµo trÇn còng t¨ng lªn. ë nhiÖt ®é phßng, thêi gian t¹o tÕ bµo trÇn ë Saccharomyces cerevisiae lµ 18 giê, cßn khi ë 25 0 C, thêi gian h×nh thµnh lµ 5 giê. Long ley vµ es còng chØ ra r»ng ë nÊm mem Saccharomyces, khi t¨ng nhiÖt ®é ho¹t ®éng cña dÞch tiªu ho¸ èc sªn lªn tíi 30 0 C, th× qu¸ tr×nh h×nh thµnh tÕ bµo trÇn diÔn ra kh¸ nhanh, hÇu hÕt tÕ bµo chuyÓn thµnh thÓ cÇu trong 3 giê. Dung dÞch ®Öm citrat phosphat hay tris - HCl víi thang pH kh¸ réng (5,8 - 8,0) th­êng ®­îc dïng lµm dung dÞch ®Öm ®Ó röa c¸c tÕ bµo sau khi cÊy trong m«i tr­êng dinh d­ìng hoÆc hoµ tan c¸c ho¸ chÊt ph©n gi¶i kh«. DÞch tiªu ho¸ cña èc sªn còng ®­îc sö dông ®Ó t¹o tÕ bµo trÇn ë nÊm sîi rÊt cã hiÖu qu¶. Sù gi¶i phãng c¸c tÕ bµo trÇn tõ nÊm sîi còng diÔn ra qua lç thñng ë thµnh tÕ bµo do t¸c dông cña ennym. Lç thñng h×nh thµnh ë ®Çu mót cña sîi nÊm. Vïng nµy nh¹y c¶m h¬n víi ennym. Khi ennym t¸c dông l©u hoÆc ho¹t tÝnh cña ennym cao h¬n, c¸c lç thñng sÏ xuÊt hiÖn ë ®Çu xa cña nÊm. §a sè c¸c nhµ nghiªn cøu cho r»ng glucanaza cã vai trß chñ yÕu trong viÖc ph©n gi¶i thµnh tÕ bµo cña nÊm. C¸c nghiªn cøu sau nµy còng l­u ý ®Õn kh¶ n¨ng cña glucanaza ®éc lËp ph©n gi¶i thµnh tÕ bµo cña nÊm bëi chÝnh glucan lµ mét trong c¸c thµnh phÇn chÝnh cña

34

thµnh tÕ bµo nÊm men. Tuy nhiªn, ®Ó ph©n gi¶i thµnh tÕ bµo nÊm, ng­êi ta th­êng sö dông toµn bé phøc hîp ennym mµ kh«ng chØ dïng mét lo¹i ennym nµo. D­íi ®ång t¸c dông cña nhiÒu ennym biÓu hiÖn hiÖu qu¶ tèt h¬n. C¸c cuéc thö nghiÖm t¹o tÕ bµo trÇn tõ nÊm sîi b»ng c¸ch sö dông chÊt kh¸ng sinh hay chÊt diÖt nÊm (fungicide) ®Òu kh«ng ®em l¹i hiÖu qu¶. D­íi t¸c dông cña c¸c chÊt trªn, chØ lµm cho thµnh tÕ bµo kh¸c th­êng, biÕn ®æi tÝnh thÊm, kh«ng cã kh¶ n¨ng h×nh thµnh tÕ bµo trÇn. TÕ bµo trÇn cßn cã thÓ thu ®­îc tõ bµo tö ®Ýnh. Trong tr­êng hîp nµy, ng­êi ta dïng ennym cña èc sªn, hoÆc ennym cã nguån gèc tõ vi sinh vËt lµm phøc hîp ennym ph©n gi¶i. C¸c chÊt æn ®Þnh ¸p lùc thÈm thÊu nh­: hydratcarbon, c¸c muèi kho¸ng cã ¶nh h­ëng tíi hiÖu qu¶ t¹o tÕ bµo trÇn. Chóng cã thÓ t¸c ®éng tíi ho¹t tÝnh cña ennym ph©n gi¶i, cã thÓ lµm t¨ng hoÆc gi¶m ho¹t tÝnh. Nång ®é chÊt æn ®Þnh trong m«i tr­êng ph¶n øng còng gi÷ mét vai trß nhÊt ®Þnh. Theo nghiªn cøu cña c¸c t¸c gi¶ Bartnicki - Garcia vµ Lippman, chÊt æn ®Þnh tèt nhÊt cña saccharoza vµ mannit víi nång ®é tèi ­u lµ 0,4 ®Õn .,6 M. 2.1.1.2.3. Thu nhËn tÕ bµo trÇn tõ x¹ khuÈn. N¨m 1971, lÇn ®Çu tiªn Sagara vµ cs ®· c«ng bè vÒ viÖc thu nhËn tÕ bµo trÇn ë Streptomyces. C¸c t¸c gi¶ ®· nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña glyxin lªn sù h×nh thµnh tÕ bµo trÇn vµ x¸c ®Þnh r»ng khi bæ sung hîp chÊt nµy vµo m«i tr­êng nu«i cÊy ®· lµm cho thµnh tÕ bµo mÉn c¶m h¬n víi t¸c ®éng cña lysozym. Ph­¬ng ph¸p t¹o tÕ bµo trÇn cña c¸c t¸c gi¶ nµy ®­îc x©y dùng dùa trªn nh÷ng tµi liÖu ®· 35

®­îc c«ng bè tõ nhiÒu n¨m tr­íc ®©y lµ sù ph¸t triÓn cña vi khuÈn trong m«i tr­êng cã nång ®é glyxin cao cã thÓ g©y ra hiÖn t­îng mÊt thµnh tÕ bµo. HiÖn t­îng nµy, ngµy nay ®· ®­îc hiÓu râ lµ do glyxin ®· thay thÕ cho D-alnanin trog ph©n tö peptidoglycan lµm cho lysozym ®Ó t¸c ®éng vµo mèi liªn kÕt glycozit. Song mét ®iÒu nhËn thÊy râ lµ Streptomyces nu«i c©y trong m«i tr­êng cã glyxin sÏ ph¸t triÓn chËm h¬n vµ mÉn c¶m h¬n víi lysozym mµ m«i tr­êng kh«ng cã glyxin. Okanish vµ chÝnh s¸ch ®· t×m ®­îc nång ®é glyxin tèi ­u lµ 0,8% vµ 2% cho hai loµi S.griseus vµ S. venezuelae. §èi víi S.kanamyceticus, hiÖu suÊt t¹o tÕ bµo trÇn cao nhÊt ë nång ®é glyxin 0,5%-1%, cßn ë nång ®é trªn 1% sù ph¸t triÓn cña tÕ bµo sÏ bÞ øc chÕ. Sau nµy, Hopwood vµ cs ®· ®¬n gi¶n ho¸ qu¸ tr×nh b»ng c¸ch cho glyxin vµo ngay giai ®o¹n ®Çu nu«i cÊy. Rodicio vµ cs ph¸t hiÖn ë mét sè loµi, khi khuÈn ty cßn non, tÕ bµo trÇn vÉn ®­îc h×nh thµnh ngay c¶ khi kh«ng bæ sung glyxin vµo m«i tr­êng nu«i cÊy, trong khi víi c¸c khuÈn ty giµ h¬n, ®Ó t¹o ®­îc tÕ bµo trÇn nhÊt thiÕt ph¶i ph¸t triÓn trong m«i tr­êng cã glyxin. Qu¸ tr×nh h×nh thµnh tÕ bµo trÇn cña x¹ khuÈn phô thuéc vµo c¸c yÕu tè nh­ thµnh phÇn cña m«i tr­êng, thêi gian vµ nhiÖt ®é nu«i cÊy tÕ bµo, nång ®é lysozym, trong ®ã yÕu tè quan träng nhÊt lµ thêi gian nu«i cÊy gièng. Theo nghiªn cøu cña Baltz hiÖu suÊt t¹o tÕ bµo trÇn cao nhÊt cña S.tradiae lµ thêi kú chuyÓn tõ pha logarit sang pha c©n b»ng . Cßn ë S. coelicolor vµ S. Lividans th× hiÖu suÊt tÕ bµo trÇn cao nhÊt vµo thêi kú b¾t ®Çu h×nh thµnh s¾c tè. Víi S. griseus, nÕu sinh khèi thu ë gi÷a pha logarit th× qóa tr×nh t¹o tÕ bµo trÇn xay ra tèt nhÊt.

36

Theo kÕt qu¶ nghiªn cøu cña nhãm t¸c gi¶ Yrulin vµ cs th× víi S. k©nmyceticus, søc sèng cña tÕ bµo trÇn ®¹t tõ 60%-70% khi chung ®­îc thu nhËn tõ c¸c sîi nÊm thu ë pha c©n b»ng, c¸c tÕ bµo cµng giµ cµng khã ph©n gi¶i. §Æc biÖt nh÷ng tÕ bµo tuÇn t¹o thµnh tõ nh÷ng khuÈn ty giµ th­êng gi¶m kh¶ n¨ng sèng. 2.1.2 Sù phôc håi tÕ bµo trÇn. Víi c¸c c«ng tr×nh nghiªn cøu di truyÒn häc b»ng kü thuËt dung hîp tÕ bµo trÇn hay biÕn ADN - plasmid, phôc håi tÕ bµo trÇn cã hiÖu qu¶ lµ ®iÒu rÊt quan träng ®Ó xÐt c¸c ®Æc ®iÓm di truyÒn ë thÕ hÖ con ch¸u. Nghiªn cøu qu¸ tr×nh phôc håi tÕ bµo trÇn ë x¹ khuÈn, Okanishi vµ cs ®· nhËn thÊy: sù bÒn v÷ng cña tÕ bµo trÇn tû lÖ thuËn víi hiÖu suÊt phôc håi chóng. Còng theo t¸c gi¶ trªn th× hiÖu suÊt phôc håi tÕ bµo trÇn cña cña hai loµi S. griseus vµ S.venezuelae cã thÓ ®¹t tíi trªn50%. Cßn theo kÕt qu¶ nghiªn cøu cña Ikeda vµ cs trong mét sè tr­êng hîp, hiÖu suÊt phôc håi tÕ bµo trÇn cã thÓ ®¹t tíi 100%. Tuy nhiªn, kh«ng ph¶i víi tÊt c¶ mäi tr­êng hîp, hiÖu xuÊt phôc håi tÕ bµo trÇn ®Òu cao. Theo Hopwood vµ cs víi chñng S. coelicolor, hiÖu suÊt phôchåi chØ ®¹t ®­îc tõ 1 ®Õn 10%. HiÖu xuÊt phôc håi tÕ bµo trÇn ¬ x¹ khuÈn phô thuéc vµo nhiÒu yÕu tè kh¸c nhau nh­: nhiÖt ®é, ¸p suÊt thÈm thÊu, thµnh phÇn vµ ®é Èm cña m«i tr­êng phôc håi, trong ®ã nhiÖt ®é ®ßi hái nghiªm ngÆt h¬n c¶, bao gåm c¶ nhiÖt ®é cho sù ph¸t triÓn cña tÕ bµo vµ nhiÖt ®é cho sù ph¸t triÓn cña tÕ bµo vµ nhiÖt ®é phôc håi tÕ bµo trÇn [54]. Víi ®a sè chñng x¹ khuÈn, tÕ bµo nu«i cÊy ë 08 0 C - 29 0 C lµ tèt nhÊt cho qu¸ tr×nh phôc håi tÕ bµo trÇn, mÆc dï khuÈn tuy vÉn cã thÓ ph¸t triÓn tèt ë nhiÖt ®é 40 0 C hoÆc cao h­n. Nh­ vËy, tr¹ng th¸i sinh lý cña tÕ bµo cã ý nghÜa quan träng cho sù phôc håi tÕ bµo trÇn cã hiÖu qu¶,

37

song cc c¬ chÕ cã liªn quan ®Õn vÊn ®Ò nµy hiÖn nay vÉn ch­a ®­îc kh¸m ph¸. Theo nghiªn cøu cña Baltz vµ maushima nhiÖt ®é cña tÕ bµo vµ phôc håi tÕ bµo trÇn còng ¶nh h­ëng nhiÒu tíi tÇn suÊt t¸i tæ hîp trong quÇn thÓ phôc håi. ë nhiÖt ®é thÊp, kh«ng nh÷ng hiÖu suÊt phôc håi tÕ bµo trÇn gi¶m mµ tÇn suÊt t¸i tæ hîp còng gi¶m. TÕ bµo trÇn còng rÊt nh¹y c¶m víi nhiÖt ®é cao. Mét trong nh÷ng ®iÒu kiÖn ®Ó lµm t¨ng hiÖu suÊt phôc håi lµ gi÷ tÕ bµo trÇn trong ®iÒu kiÖn nhiÖt ®ä thÊp. Cïng víinhiÖt ®é, qu¸ tr×nh almf m¸t n­íc cña m«i tr­êng phôc håi còng lµm t¨ng hiÖu suÊt phôc håi. Còng theo nghiªn cøu cña Baltz vµ cs c¸c tÕ bµo trÇn phôc håi trong m«i tr­êng ®· lµm mÊt n­íc, tÇn suÊt phôc håi cã thÓ t¨ng tíi 10%. C¸c t¸c gi¶ nhËn thÊy, c¸c tÕ bµo trÇn phôc håi trong m«i tr­êng ®· lµm kiÖt n­íc, cã thÓ lo¹i trõ hoµn toµn ®­îc sù tù øc chÕ trong giai ®o¹n phôc håi vµ lµm gi¶m tèi thiÓu sù ph©n gi¶i tÕ bµo trÇn. Sù gia t¨ng ¸p suÊt thÈm thÊu cña m«i tr­êng phôc håi (vÝ dô nh­ sö dông nång ®é ®­êng c¸o h¬n nång ®é th«ng th­êng lµ 0,3M) còng lµm t¨ng hiÖu suÊt phôc håi ë mét sè loµi. Ngoµi viÖc chän c¸c ®iÒu kiÖn vËt lý, viÖc tèi ­u ho¸ thµnh phÇn m«i tr­êng phôc håi còng rÊt quan träng cho viÖc phôc håi tÕ bµo trÇn ë x¹ khuÈn. Trong c¸c c«ng tr×nh nghiªn cøu vÒ dung hîp tÕ bµo trÇn ë Bacillus, mét sè t¸c gi¶ ®· x©y dùng ®­îc c¸c ph­¬ng ph¸p ®Ó phôc håi tÕ bµo trÇn. §èi víi loµi B.megaterium, c¸c tÕ bµo trÇn ®­îc r¶i trªn m«i tr­êng th¹ch mÒm, sau ®ã r¶i lªn m«i tr­êng giµu chÊt dinh d­êng. Tr¸i l¹i, víi loµi b.subtilis, c¸c tÕ bµo trÇn ®­îc tr¶i trùc tiÕp lªn trªn bÒ mÆt cña m«i tr­êng. HiÖn nay, c¸c ®iÒu kiÖn tèi ­u cho

38

phôc håi tÕ bµo trÇn ë B.subtilis ®· ®­îc nghiªn cøu kü vµ ®· ®¹t ®­îc tû lÖ phôc håi gÇn 100%. Theo nghiªn cøu cña Gabor vµ Hotchkiss viÖc sö dông mét sè chÊt æn ®Þnh nh­ albumin, huyÕt thanh trong dÞch treo, gelatin trong m«i tr­êng phôc håi còng lµm t¨ng hiÖu suÊt phôc håi tÕ bµo trÇn. Okanishi vµ

cs lÇn ®Çu tiªn ®· nghiªn cøu mét c¸ch cã hÖ

thèng sù phôc håi tÕ bµo trÇn cña 2 loµi Streptomyces spp. C¸c t¸c gi¶ ®· sö dông 2 m«i tr­êng kh¸c nhau cho 2 loµi vµ ®· ®¹t ®­îc tû lÖ phôc håi trªn 50%. Víi 2 m«i tr­êng ®ã, cã thÓ sö dông 1 trong 2 m«i tr­êng, kh«ng cã sù söa ®æi hoÆc cã c¶i tiÕn theo c¸ch riªng biÖt ®Ó nghiªn cøu víi nhiÒu chñng kh¸c nhau. Trong mét sè tr­êng hîp, ®iÒu kiÖn ®· ®­îc thay ®æi mét c¸ch tèi ­u ®Ó ®¹t ®­îc tÇn suÊt phôc håi cao nhÊt. Tuy nhiªn, kh«ng ph¶i víi tÊt c¶ mäi tr­êng hîp, vÝ dô nh­ víi S.coelicolor, tû lÖ phôc håi chØ dao ®éng trong kho¶ng tõ 1 ®Õn 10%. §Ó ®¸nh gi¸ tÇn suÊt phôc håi, mét ®iÒu cÇn biÕt tr­íc lµ ph¶i x¸c ®Þnh ®­îc sè khuÈn l¹c ë trªn m«i tr­êng phôc håi, ®­îc mäc lªn tõ c¸c tÕ bµo vÉn cßn vá (Walled cell).

Trong nhiÒu c«ng tr×nh

nghiªn cøu vÒ di truyÒn ®· c«ng bè tû lÖ c¸c ®¬n vÞ phi tÕ bµo trÇn (non protoplast) kh«ng cao h¬n 1-2%. TÇn sè phôc håi ®­îc ®¸nh gi¸ b»ng nhiÒu c¸ch, th«ng th­êng ®­îc tÝnh b»ng tû sè gi÷a tæng sè c¸c tÕ bµo trÇn ®­îc phôc håi trªn tæng sè tÕ bµo trÇn ®Õm ®­îc trong buång ®Õn hång cÇu. Trªn m«i tr­êng th¹ch. Okanishi vµ cs ®· quan s¸t thÊy c¸c tÕ bµi trÇn phôc håi l¹i tr¹ng th¸i sîi b×nh th­êng, Sù phôc håi cña c¸c tÕ bµo trÇn chÞu ¶nh h­ëng rÊt lín cña nång ®é MGCL 2 , CaCL 2 , muèi phosphat vµ axitamin, còng nh­ chÞu t¸c ®éng cña nång ®é

39

saccharoza, b¶n chÊt cña nguån nit¬ vµ lo¹i dung dÞch ®Öm. §Ó ®¹t ®­îc tû lÖ phôc håi cao, b»ng c¸ch ñ cc tÕ bµo trÇn trªn mét c¸ch thÝch hîp gi÷a nång ®é MGCL 2 , CaCL 2 , ®ång thêi axitamin còng lµm t¨ng tû lÖ phôc håi vµ tû lÖ pt cña tÕ bµo trÇn. Tõ c¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu nµy, c¸c t¸c gi¶ ®· x©y dùng ®­îc 2 m«i tr­êng R1 vµ R2 ®Ó phôc håi tÕ bµo trÇn ë Streptomyces. 2.1.3. øng dông cña kü thuËt t¹o tÕ bµo trÇn. Ph­¬ng ph¸p thu nhËn tÕ bµo trÇn t­¬ng ®èi dÔ vµ cã kh¶ n¨ng phôc håi, nªn tÕ bµo trÇn lµ ®èi t­îng ®Ó nghiªn cøu c¸c ®Æc ®iÓm vÒ sinh lý, h×nh th¸i, di truyÒn vµ chän gièng vi sinh vËt. MÆt kh¸c, do tÝnh mÉn c¶m thÈm thÊu cao, tÕ bµo trÇn còng ®­îc sö dông lµm nguån ®Ó t¹o ra c¸c thµnh phÇn d­íi tÕ bµo (mµng, nh©n, ty l¹p thÓ) cho c¸c nghiªn cøu sinh ho¸. TÕ bµo trÇn còng më ra con ®­êng míi ®Ó nghiªn cøu vÒ vai trß c¶u mµng tÕ bµo trong sinh häc tÕ bµo, nghiªn cøu vÒ qu¸ tr×nh t¸i t¹o thµnh tÕ bµo. Sù phôc håi tÕ bµo trÇn trë vÒ d¹ng tÕ bµo ban ®Çu cho phÐp hiÓu ®­îc c¸c c¬ chÕ, qu¸ tr×nh kiÓm so¸t, tu sö© vµ b¶o vÖ tÝnh toµn vÑn cña tÕ bµo. Do kh«ng cã thµnh tÕ bµo, viÖc nghiªn cøu vai trß thÈm thÊu c¸c chÊt qua tÕ bµo, nghÜa lµ mèi quan hÖ gi÷a tÕ bµo víi m«i tr­êng bªn ngoµi - sù hÊp thô c¸c chÊt dinh d­ìng vµ sù bµi tiÕt c¸c s¶n phÈm chuyÓn ho¸ cã nhiÒu thuËn lîi. MÆt kh¸c, tÕ bµo trÇn cßn cã kh¶ n¨ng dung hîp, nªn cã thÓ xem tÕ bµo trÇn lµ ®èi t­îng ®Ó truyÒn ®¹t th«ng tin di truyÒn cã ­u thÕ h¬n h¼n so víi c¸c ph­¬ng ph¸p ®· biÕt tr­íc ®©y nh­ biÕn n¹p, t¶i n¹p vµ tiÕp hîp. Nhê ph­¬ng ph¸p thÈm thÊu ph©n gi¶i tÕ bµo trÇn, cã thÓ nhËn ®­îc c¸c cÊu tróc d­íi tÕ bµo kh«ng bÞ tæn th­¬ng, cho phÐp ®¸nh gi¸

40

b¶n chÊt vµ cÊu tróc cu¶ c¸c thµnh phÇn d­íi tÕ bµo mét c¸ch chÝnh x¸c h¬n. TÕ bµo trÇn lµ ®èi t­îng thÝch hîp trong nghiªn cøu ®Ó x¸c ®Þnh vÞ trÝ cña c¸c chÊt trong tÕ bµo. ViÖc x¸c ®Þnh vÞ trÝ khu tró cña mét sè chÊt nh­ enzym, kh¸ng nguyªn, ®éc tè vµ mét sè s¶n phÈm kh¸c trong tÕ bµo vi khuÈn cã mét ý nghÜa khoa häcvµ thùc tiÔn rÊt lín. Víi môc ®Ých nµy, ng­êi ta ly t©m ph©n líp vµ x¸c ®Þnh c¸c chÊt nãi trªn trong c¸c thÓ phi tÕ bµo. Tr­íc ®©y, thµnh tÕ bµo vi khuÈn, ®­îc coi lµ tr¬ víi ho¹t tÝnh cña enzym, ¸p dông kü thuËt t¹o tÕ bµo trÇn cho phÐp kh¸m ph¸ ®­îc mèi quan hÖ cña nhiÒu lo¹i enzym víi thµnh tÕ bµo. VÝ dô, ng­êi ta ®· x¸c ®Þnh râ rµng trang thµnh tÕ bµo cã c¸c enzym tån t¹i thµnh c¸c chuçi toµn vÑn nh­ invertaza, glucoamylaza, α - amylaza vµ nhiÒu enzym kh¸c. §Æc biÖt ®èi víi nÊm, viÖc t¹o tÕ bµo trÇn rÊt cã ý nghÜa cho viÖc nghiªn cøu chän läc di truyÒn , nhÊt lµ d¹ng nÊm sîi kh«ng t¹o thµnh qu¶ thÓ. Kü thuËt tÕ bµo trÇn ®­îc øng dông ®Ó t¹o dßng nÊm v« tÝnh. Ph­¬ng ph¸p nµy ®· ®­îc x¸c nhËn trªn loµi Sclerotinia - lo¹i s¶n phÈm ra men ph©n gi¶i pectin vµ ®· nhËn ®­îc chñng cã ho¹t tÝnh ph©n gi¶i pectin cao h¬n 1,5-4 lÇn so víi chñng gèc. Dung hîp tÕ bµo trÇn ®­îc xem nh­ mét ph­¬ng ph¸p cña di truyÒn häc. TruyÒn th«ng tin di b»ng ph­¬ng ph¸p dung hîp tÕ bµo kh«ng chØ hîp nhÊt ®­îc 2 bé gen cña bè mÑ mµ c¶ tÕ bµo chÊt còng ®­îc hîp nhÊt. Thø hai, trong mét tÕ bµo cã thÓ hîp nhÊt kh«ng chØ 2 bé gen mµ cã thÓ lµ 3 vµ h¬n n÷a , ®iÒu nµy rÊt cã lîi ®Ó c¶i thiÖn c¸c chñng gièng dïng trong c«ng nghÖ vi sinh. GÇn ®©y, kü thuËt tÕ bµo trÇn ®· ®­îc sö dông réng r·i trong c«ng nghÖ vi sinh ®Ó lµm t¨ng ho¹t tÝnh kh¸ng sinh cña nhiÒu chñng 41

s¶n. Theo kÕt qu¶ nghiªn cøu cña Blumonerova sau khi phôc håi, ho¹t tÝnh kh¸ng sinh cña Streptomyces cã thÓ t¨ng lªn tõ 2 - 3 lÇn vµ ho¹t tÝnh cña c¸c chñng s¶n sinh ra c¸c kh¸ng sinh nhãm macrolid còng ®­îc t¨ng lªn: spiramyxin t¨ng hai lÇn, tylosin - 3 lÇn vµ crramyxin 5lÇn. Theo h­íng nghiªn cøu sö dông kü thuËt dung hîp tÕ bµo trÇn ®Ó c¶i tiÕn vµ n©ng cao ho¹t tÝnh kh¸ng sinh cña chñng s¶n, ®· cã nhiÒu t¸c gi¶ thµnh c«ng. Chudackova vµ Pickova b»ng kü thuËt dung hîp tÕ bµo trÇn gi÷a c¸c loµi S. aureofacius - loµi s¶n sinh chlotetraxyclin, ®· ph©n lËp ®­îc dßng cã ho¹t tÝnh kh¸ng sinh cao h¬n vµ kh¸ng sinh thùc khuÈn thÓ. Nhãm t¸c gi¶ Yoshimoto vµ cs ®· nhËn ®­îc dßng t¸i tæ hîp, s¶n sinh ra lo¹i kh¸ng sinh cã häat tÝnh chèng l¹i c¸c tÕ bµo ung th­ m¸u, cao h¬n bè mÑ. Mét h­íng nghiªn cøu kh¸c còng ®­îc nhiÒu t¸c gi¶ ®Æc biÖt quan t©m lµ sö dông kü thuËt dung hîp tÕ bµo trÇn ®Ó t×m ra nh÷ng kh¸ng sinh míi. Tõ 2 loµi S. chrysomallus vµ Streptomyces sp Orlova ®· nhËn ®­îc dßng t¸i tæ hîp s¶n sinh ra phøc hîp kh¸ng sinh diÖt nÊm. C¸c t¸c gi¶ Malanicheva vµ cs b»ng kü thuËt dung hîp tÕ bµo trÇn còng nhËn ®­îc dßng lai s¶n sinh ra c¸c chÊt kh¸ng sinh míi lµ albofunging vµ chloralbofungin. Nhê sù ph¸t triÓn m¹nh mÏ cña nhiÒu ngµnh khoa häc cã liªn quan, ®Æc biÖt lµ sù ph¸t triÓn cña sinh häc phÇn tö, tÕ bµo trÇn cßn ®­îc dïng trong kü thuËt dung hîp mµ cßn ®­îc dïng trong c¸c kü thuËt biÕn n¹p rÊt cã hiÖu qu¶ trong viÖc c¶i t¹o vµ chän gièng vi sinh vËt. TËp thÓ c¸c t¸c gi¶ Godany vµ cs sö dông kü thuËt biÕn n¹p b»ng tÕ bµo trÇn ®· ®­îc nhËn c¸c dßng lai cã ho¹t tÝnh kh¸ng sinh cao h¬n gÊp 4 lÇn so víi bè mÑ. Sö dông kü thuËt biÕn n¹p tÕ bµo trÇn b»ng ADN - plasmid, Hussain vµ Ritchie - ®· c¶i tiÕn dßng S.niveus, lµm t¨ng s¶n l­îng, novobiocin. KÕt hîp víi kü thuËt g©y ®ét biÕn, nhãm 42

t¸c gi¶ Holmalahti vµ cs ®· s¶n xuÊt ®­îc chÊt kh¸ng sinh diÖt nÊm lµ heptaene polyne, sö dông rÊt hiÖu qu¶ trong ®Êu tranh sinh häc. Míi gÇn ®©y, Decker còng b»ng kü thuËt biÕn n¹p tÕ bµo trÇn ®· nhËn ®­îc dßng t¸i tæ hîp lµ S. fradiae Tue, s¶n sinh ra mét kh¸ng sinh hoµn toµn míi lµ tetracenomyxin C cïng nhiÒu s¶n phÈm trung gian kh¸c víi s¶n l­îng 10 mg/l. Sö dông kü thuËt dung hîp tÕ bµo trÇn ®Ó lËp b¶n ®å gen còng lµ mét h­íng nghiªn cøu øng dông tÕ bµo trÇn. B»ng kü thuËt nµy, c¸c t¸c gi¶ ®· lËp ®­îc b¶n ®å gen hoµn chØnh cña S. antibioticus chñng s¶n sinh ra chÊt kh¸ng sinh oleandomyxin vµ S. griseus 773 thÓ s¶n sinh ra kh¸ng sinh streptomyxin. Dung hîp tÕ bµo trÇn còng lµ ph­¬ng ph¸p thÝch hîp cho viÖc di chuyÓn c¸c c¬ quan cña tÕ bµo (nh©n, ty thÓ, l¹p thÓ) thËm chÝ c¶ virus vµ cc plasmid tõ mét tÕ bµo nµy sang tÕ bµo kh¸c. Sù di chuyÓn c¸c plasmid trong qu¸ tr×nh dung hîp tÕ bµo trÇn cã mét ý nghÜa lín bëi v× c¸c plasmid th­êng mang c¸c th«ng tin di truyÒn quan träng cho c¬ thÓ. §Æc biÖt lµ ®iÒu nµy x¶y ra víi c¸c chñng cã ý nghÜa c«ng nghiÖp. 2.2 Dung hîp tÕ bµo trÇn. 2.2.1. §iÒu kiÖn ®Ó dung hîp tÕ bµo trÇn. Kao vµ cs lµ nh÷ng ng­êi ®Çu tiªn ®· sö dông PEG lµm t¸c nh©n dung hîp (fusogen). C¸c t¸c gi¶ ®· tiÕn hµnh c¸c cuéc kh¶o s¸t quan träng vÒ viÖc sö dông PEG vµ ®· thu ®­îc mét sè kÕt qu¶: - dung dÞch PEG ®Ëm ®Æc (50%) cã hiÖu qu¶ cao h¬n dung dÞch lo·ng (25%) c¸c dung dÞch PEG cã träng l­îng ph©n tö kh¸c nhau (1540 vµ 4000) cã hiÖu qu¶ ngang nhau ë cïng mét nång ®é.

43

N¨m 1976, cïng mét lóc, t¹i hai phßng thÝ nghiÖm ë Ph¸p vµ Hungari, c¸c t¸c gi¶ Scheaffer vµ cs Fordor vµ Alfoldi ®· nhËn ®­îc nh÷ng b»ng chøng vÒ dung hîp tÕ bµo trÇn ë vi khuÈn (B. subtilis vµ B. megaterium) víi sù t¸c ®éng cña polyethy leng lycol (PEG). KÕt qu¶ cña dung hîp ®· cho thÊy r»ng c¸c tÕ bµo trÇn kh«ng nh÷ng cã thÓ phôc håi ®­îc thµnh tÕ bµo b×nh th­êng mµ cßn h×nh thµnh c¸c thÕ hÖ lai. Trong c¸c yÕu tè gióp cho dung hîp tÕ bµo trÇn cã kÕt qu¶, th× thêi gian xö lý, nång ®é tèi ­u vµ träng l­îng ph©n tö cña PEG ®¸ng ®­îc th¶o luËn. §èi víi vi khuÈn, nång do ®è vµ träng l­îng ph©n tö cña PEG t­¬ng ®èi x¸c ®Þnh, chØ sè nµy lµ 40% vµ 6.000. §èi víi nÊm chØ sè nµy lµ 25% vµ 4.000 (®Õn 6000). Pontecorvo khi tiÕn hµnh dung hîp tÕ bµo trÇn ë ®éng vËt, d· sö dông PEG 6000, 50%. Sau nµy c¸c t¸c gi¶ ®· dïng PEG 1000 ®Ó thay thÕ vµ ph¸t hiÖn thÊy r»ng: dimethyllsulfoxide (DMSO) ë kho¶ng 15% sÏ n©ng cao hiÖu qu¶ dung hîp, víi sù tham gia cña PEG nång ®é thÝch hîp (41-47%). Víi c¸c loµi thuéc Streptomyces, thÝ nghiÖm ®­îc tiÕn hµnh dËp theo quy tr×nh Hales mét c¸ch chÝnh x¸c ®· tá ra cã hiÖu qu¶ ®Æc biÖt (PEG 1540 ®­îc dïng thay cho PEG 4000) cho tû lÖ t¸i tæ hîp xÊp xØ 50% so víi lý thuyÕt. Sau nµy c¸c t¸c gi¶ ®· th¨m dß vµ x¸c ®Þnh ®­îc c¸c ®iÒu kiÖn tèi ­u mét c¸ch hÖ thèng h¬n vµ tÇn suÊt t¸i tæ hîp ®¹t hiÖu qu¶ cao nhÊt ë nång ®é PEG 1000, 50% hay thÊp h¬n mét tÝ, víi t¸c ®éng nhÑ cña DMSO. Víi PEG 1000 vµ trªn 50%, tÇn suÊt t¸i tæ hîp sÏ gi¶m, dï kh«ng ®ét ngét. HIÖn t­îng nµy ®· ph¶n ¸nh sù kiÕt dÝnh tÕ bµo trÇn x¶y ra khã kh¨n, kÐm hiÖu qu¶ vµ kh«ng nhanh chãng trong dung dÞch PEG cã ®é nhít cao. Sù tiÕp xóc gi÷a

44

c¸c tÕ bµo trÇn víi PEG trong thêi gian rÊt ng¾n, chØ mét phót ®· nhËn ®­îc tÇn suÊt t¸i tæ hîp tèi ®a. KÕt qu¶ nµy còng phï hîp víi kÕt qu¶ thùc nghiÖm trªn tÕ bµo trÇn thùc vËt vµ ®éng vËt. Theo kÕt qu¶ nghiªn cøu cña Baltz, khi dïng PEG 6000 ë nång dodä 36%, ®· ph¸t hiÖn thÊy cã kho¶ng 0,3% sè khuÈn l¹c ®ang phôc håi trong thÕ t¶i tæ hîp. TÇn sè nµy thÊp h¬n tÇn sè t¸i tæ hîp ®· m« t¶ ë trªn. §iÒu nµy ®· ph¶n ¸nh ®é nhít cao cña dung dÞch PEG 6000. Sau nµy c¸c t¸c gi¶ ®· thu ®­îc tÇn suÊt t¸i tæ hîp cao h¬n b»ng c¸ch t¨ng nång ®é PEG 6000 hay b»ng sö dông PEG 1000. C¸c t¸c gi¶ Ochi vµ Katz l¹i nhËn ®­îc tÇn suÊt cao (10-15%) c¸c khuÈn l¹i t¸i tæ hîp b»ng sö dông PEG 4000 ë 42%. Nh×n chung, kÕt qu¶ cña c¸c c«ng tr×nh nghiªn cøu ë trªn Streptomyces còng phï hîp víi nhau vµ ®Òu ®i ®Õn mét thèng nhÊt chung lµ ®Ó ®¹t ®­îc tÇn suÊt dung hîp tèi ®a, cÇn sö dông nång ®é PEG cao h¬n 40% vµ träng l­îng ph©n tö kh«ng cao h¬n 4000 ®Ó tr¸nh ®é nhít qu¸ møc. Víi c¸c chñng Gram ©m, Tsenin vµ cs lÇn ®Çu tiªn ®· nghiªn cøu dung hîp tÕ bµo trÇn vµ t¸i tæ hîp di truyÒn ë E. coli theo ph­¬ng ph¸p cña Weiss. C¸c t¸c gi¶ ®· sö dông PEG 6000, nång ®é thÊp h¬n 40%. GÇn ®©y Hopwood vµ Wright ®· chøng minh lµ víi PEG 1000, 50% cho tÇn suÊt t¸i tæ hîp cao nhÊ (10-20%) ®èi víi S. coelicolor. §Æc biÖt, víi S. venezuelae - mét chñng s¶n sinh cloramphenicol, Anne vµ cs ®· x¸c nhËn ®­îc ®iÒu kiÖn tèi ­u cho phôc håi vµ biÕn n¹p tÕ bµo trÇn cã hiÖu qu¶. YÕu tè cã ¶nh h­ëng nhÊt tíi sù biÕn n¹p lµ tuæi cña tÕ bµo, nång dodä enzym vµ sè l­îng tÕ bµo trÇn trong m«i tr­êng biÕn n¹p (tèt nhÊt lµ d­íi 100.000). Sè l­îng thÓ biÕn n¹p thu ®­îc trung b×nh lµ 3,3 triÖu /µg DNA. Saccharoza hoÆc manitol lµ

45

chÊt æn ®Þnh thÈm thÊu tèt nhÊt. Sù biÕn n¹p cã hiÖu qu¶ khi sö dông PEG 4000 hay 6000 víi nång ®é t­¬ng øng lµ 28,5% vµ 36% . 2.2.2 KiÓm tra sù dung hîp tÕ bµo trÇn Th«ng th­êng, ng­êi ta kiÓm tra sù dung hîp tÕ bµo b»ng c¸ch ph¸t hiÖn ra c¸c marker trong c¸c thÓ t¸i tæ hîp di truyÒn. Trong c¸c c«ng tr×nh nghiªn cøu ë trªn B.megaterium vµ E.coli, c¸c t¸cc gi¶ ®· cÊy trùc tiÕp c¸c tÕ bµo trÇn dung hîp trªn m«i tr­êng phôc håi chän läc, thiÕu Ýt nhÊt mét yÕu tè sinh tr­ëng cÇn thiÕt theo mçi dßng bè mÑ. Nh­ vËy, sù ph¸t triÓn cña c¸c khuÈn l¹c trªn m«i tr­êng chän läc phô thuéc vµo kiÓu gen bè mÑ n»mg trong c¸c thÓ dung hîp bæ sung cho nhau, ®Ó cho kiÓu gen t¸i tæ hîp ph¸t triÓn ®­îc trong m«i tr­êng ®· chän. Nghiªn cøu trªn B.subtilis vµ Providencia sù phôc håi tÕ bµo trÇn diÔn ra trªn m«i tr­êng kh«ng chän läc sau chuyÓn sang m«i tr­êng chän läc ®Ó ph¸t hiÖn ra c¸c thÓ t¸i tá hîp. TÇn suÊt t¸i tæ hîp di truyÒn ®­îc ®¸nh gi¸ mét c¸ch ®éc lËp. §Ó tÝnh to¸n tÇn suÊt t¸i tæ hîp, Baltz vµ chÝnh s¸ch ®· sö dông kü thuËt "pha lo·ng hµng lo¹t". C¸c t¸c gi¶ ®· cÊy trùc tiÕp c¸c tÕ bµo trÇn dung hîp lªn m«i tr­êng phôc håi kh«ng chän läc vµ trªn m«i tr­êng cã chän läc. TÇn suÊt t¸i tæ hîp ®­îc x¸c ®Þnh lµ tû lÖ c¸c khuÈn l¹c ph¸t triÓn trªn m«i tr­êng chän läc trong tæng sè khuÈn l¹c ph¸t triÓn trªn m«i tr­êng kh«ng chän läc ( m«i tr­êng ®Çy ®ñ) (ph­¬ng ph¸p 1) hoÆc tû lÖ c¸c khuÈn l¹c ph¸t triÓn trªn m«i tr­êng chän läc trªn tæng sè tÕ bµo trÇn dung hîp (ph­¬ng ph¸p 2). Ph©n tÝch di truyÒn c¸c thÓ t¸i tæ hîp sau dung hîp tÕ bµo trÇn, ®­îc tiÕn hµnh ®Çu tiªn trªn S.coelicolor. Sù dung hîp ®­îc thùc hiÖn gi÷a c¸c tÕ bµo trÇn cña 2 dßng bè mÑ kh¸c nhau vÒ 6 marker ®· biÕt ®Ó lµm t¨ng tèi ®a sè l­îng thÓ t¸i tæ hîp trong quÇn thÓ phôc håi.

46

C¸c tÕ bµo trÇn dung hîp ®­îc phôc håi trªn m«i tr­êng kh«ng chän läc. Qu¸ tr×nh phôc håi tÕ bµo trÇn ®­îc Okanishi vµ chÝnh s¸ch ph¸t hiÖn qua kÝnh hiÓn vi ®èi pha. Sù phôc håi tÕ bµo trÇn th­êng b¾t ®Çu tõ hiÖn t­îng tr­¬ng phång cña tÕ bµo trÇn, tiÕp sau ®ã lµ sù ph¸t triÓn cña c¸c khuÈn ty thµnh khuÈn l¹c C«ng tr×nh nghiªn cøu trªn B.megaterium, tÕ bµo trÇn dung hîp ®­îc nu«i trªn m«i tr­êng phôc håi chän läc, thiÕu Ýt nhÊt mét yÕu tè t¨ng tr­ëng cÇn thiÕt, c¸c t¸c gi¶ nhËn thÊy c¸c ®Æc ®iÓm cña bè mÑ ®­îc t¸i hiÖn trong sè c¸c khuÈn l¹c con ch¸u. Víi loµi S. subtilis, còng cã nhiÒu c«ng tr×nh nghiªn cøu ph©n tÝch di truyÒn sau dung hîp trong c¸c c«ng tr×nh nµy, sù phôc håi diÔn ra trªn m«i tr­êng kh«ng chän läc vµ c¸c thÓ t¸i tæ hîp ®­îc ph¸t triÓn nªn m«i tr­êng chäc läc. 2.3 HiÖn t­îng mÊt plasmid trong qóa tr×nh t¹o tÕ bµo trÇn. C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu gÇn ®©y cho thÊy nhiÒu hoÆc tÊt c¶ c¸c marker di truyÒn cã trong c¸c plasmid ë trªn Salmonella typhimurium ®· bÞ mÊt ®i trong qu¸ tr×nh t¹o vµ phôc håi tÕ bµo trÇn, mÆc dï Novick vµ chÝnh cs ®· chØ ra tÝnh kh«ng æn ®Þnh vÒ cÊu tróc cña plasmid h¬n lµ sù mÊt m¸t. Ngµy nay, ®· cã b»ng chøng vÒ c¸c plasmid "®· ®­îc söa ch÷a" sau sù h×nh thµnh vµ phôc håi tÕ bµo trÇn ë 2 loµi Gram d­¬ng lµ Staphylococcus autreus vµ S. coclicolor. C¸c kÕt qu¶ quan s¸t cho thÊy sù mÊt plasmid th­êng x¶y ra trong giai ®o¹n phôc håi nhiÒu h¬n trong giai ®o¹n h×nh thµnh tÕ bµo trÇn, v× kh«ng ph¸t hiÖn ®­îc ADN - plasmid trong líp næi cña dÞch tÕ bµo trÇn. RÊt cã thÓ sù sao chÐp vµ ph©n chia ADN - plasmid cho c¸c tÕ

47

bµo con bÞ x¸o trén trong qu¸ tr×nh ph©n chia tÕ bµo x¶y ra trong giai ®o¹n sím cña qu¸ tr×nh phôc håi tÕ bµo trÇn. Víi loµi S. coelicolor, cã tíi 15-25% khuÈn l¹c phôc håi tõ tÕ bµo trÇn bÞ mÊt plasmid. HiÖn nay ch­a cã thùc nghiÖm nµo ®­îc lµm ®Ó kh¼ng ®Þnh sù mÊt plasmid trong giai ®o¹n h×nh thµnh tÕ bµo trÇn hay trong giai ®o¹n phôc håi tÕ bµo trÇn, mÆc dï còng ®· cã b»ng chøng vÌ viÖc nhiÒu vËt thÓ th­êng bÞ mÊt ®i trong qu¸ tr×nh thµnh tÕ bµo trµan kÓ c¶ mÊt plasmid. Do ®ã, sau phôc håi tÕ bµo trÇn bÞ mÊt plasmid lµ mét kh¶ n¨ng cã thÓ. 2.4. Mét sè kÕt qu¶ nghiªn cøu øng dông kü thuËt tÕ bµo trÇn ë ViÖt Nam . Trªn thÕ giíi, ng­êi ta nghiªn cøu øng dông kü thuËt tÕ bµo trÇn tõ nh÷ng n¨m 70 vµ ngµy cã nhiÒu thµnh tùu trong c«ng nghÖ sinh hoc jcòng nh­ øng dông. ë ViÖt Nam, kü thuËt tÕ bµo trÇn trong nghiªn cøu vi sinh vËt chØ míi ®­îc b¾t ®Çu trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y. C¸c c«ng tr×nh nghiªn cøu chØ míi dõng l¹i ë møc t×m hiÓu c¸c ®iÒu kiÖn ®Ó h×nh thµnh vµ phôc håi tÕ bµo trÇn. ViÖc nghiªn cøu øng dông kü thuËt tÕ bµo trÇn ®Ó n©ng cao n¨ng suÊt cña chñng gièng cßn rÊt h¹n chÕ. Tuy nhiªn, nh÷ng nghiªn cøu nµy ®· gãp phÇn to lín trong nghiªn cøu kü thuËt gen, mét vÊn ®Ò cßn míi mÎ ë n­íc ta. ViÖn c«ng nghÖ sinh häc thuéc trung t©m khoa häc tù nhiªn vµ c«ng nghÖ quèc gia ®· cã mét sè c«ng tr×nh nghiªn cøu vÒ tÕ bµo trÇn ë trªn x¹ khuÈn. Nghiªn cøu vÒ c¸c ®iÒu kiÖn h×nh thµnh, phôc håi tÕ bµo trÇn, nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña c¸c qu¸ tr×nh nµy ®Õn kh¶ n¨ng sinh tæng hîp chÊt kh¸ng sinh [2], sö dông tÕ bµo trÇn trong kü thuËt biÕn n¹p, ®Ó biÕn n¹p thÓ kh¸ng neomyxin tõ S. ftradiae vµo S. lividans. Nh÷ng kÕt qu¶ nµy lµm tiÒn ®Ò cho nh÷ng nghiªn cøu tiÕp

48

theo vµ më ra mét h­íng míi ®Çy triÓn väng vÌe viÖc sö dông kü thuËt tÕ bµo trÇn trong nghiªn cøu di truyÒn x¹ khuÈn ë ViÖt Nam 2.5 Lai tÕ bµo soma Tõ n¨m 1960 ng­êi ta ®· t¹o ra ®­îc nhiÒu tÕ bµo lai b»ng c¸ch trén lÉn haidßng tÕ bµo soma cïng loµi hay kh¸c loµi trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy invitro. TÕ bµo lo¹i nµy chøa bé gen cña hai dßng tÕ bµo bè vµ mÑ nh­: tÕ bµo cña chuét nh¾t víi tÕ bµo cña chuét ®ång, tÕ bµo cña chuét nh¾t víi tÕ bµo cña gµ con, tÕ bµo cña chuét víi tÕ bµo cña ng­êi Ng­êi ta gäi tÕ bµo lai ®­îc hinh thµnh tõ c¸c tÕ bµo cïng mét khëi nguån lµ tÕ bµo ®ång nh©n ( homocaryon) vµ c¸c tÕ bµo ®­îc ®­îc h×nh thµnh tõ c¸c tÕ bµo kh¸c c¬ thÓ kh¸c nhau vÒ thø bËc ph©n lo¹i nh­ loµi ,gièng, hä, bé, … la tÕ bµo lai dÞ nh©n (heterocaryon) 2.6 øng dông tÕ bµo lai X¸c lËp b¶n ®å gen trªn NST ViÖc t¹o tÕ bµo còng gióp cho viÖc x¸c lËp b¶n ®å nhiÔm s¾c thÓ cña tÕ bµo nguån. Nhê sö dông virut nh­ virut Xende (Sendai), virut chøa ADN vµ virut chøa ARN lµm t¸c nh©n kÝch thÝch sù kÕt hîp cña cña c¸c tÕ bµo lai ( qua cÇu nèi) tÕ bµo l¹i h×nh thµnh hai thÓ nh©n, sau ®ã hai thÓ nh©n nµy hoµhîp víi nhau t¹o thµnh mét thÓ nh©n chøa nhiÔm s¾c thÓ cña c¶ bè vµ mÑ. Sau vµi chôc thÕ hÖ nu«i cÊy ë tÕ bµo lai chØ cßn mét trong hai bé nhiÔm s¾ thÓ cña tÕ bµo nguån. VÝ dô ë tÕ bµo lai gi÷a chuét ®ång víi chuét nh¾t sau nhiÒu thÕ hÖ ph©n chia chØ cßn l¹i bé nhiÔm s¾c thÓ cña chuét nh¾t vµ rÊt Ýt (mét vµi nhiÔm s¾c thÓ ) cña chuét ®ång.Dùa vµo hiÖn t­îng nµy ng­êi ta cã thÓ x¸c lËp ®­îc b¶n ®å nhiÔm s¾c thÓ cñamét trong hai tÕ bµo la

49

Ch­¬ng 3. ChuyÓn gen 3.1 Giíi thiÖu chuyÓn gen 3.2 ChuyÓn gen ë ®éng vËt Trong những cố gắng không ngừng của con người trong việc nâng cao sức khoẻ, sự tiến bộ của nền khoa học hiện đại bao gồm công nghệ gen và công nghệ chuyển gen đã phát hiện ra những liệu pháp gen mới dựa trên việc sản xuất protein tái tổ hợp có trong sữa của bò chuyển gen. Phương pháp này cung cấp một nguồn protein an toàn, có giá trị cao và không thể sản xuất bằng các phương pháp khác. Chuyển gen là việc di chuyển các gen từ cấu trúc di truyền ban đầu gọi là thể cho (donor) tới một cấu trúc di truyền khác có khả năng dung nạp gen đó gọi là thể nhận (recipient) thông qua một vector, một phương tiện kỹ thuật hay bằng các kích thích là các nhân tố chuyển gen như nhân tố sinh học, lí-sinh, hoá- sinh, hoặc bằng cách tự vận động của gen. Đây là một trong những kỹ thuật phức tạp nhất và cũng hứa hẹn mang lại lợi ích to lớn nhất của kỹ thuật di truyền. Động vật chuyển gen là những con vật mang những gen lạ (khác loài hoặc những gen tái tổ hợp) mà những gen này được đưa vào hệ gen của nó có chủ ý dưới sự can thiệp của con người. Gen chuyển phải được di truyền theo mô hình của Menden và cho phép tạo ra một đàn gia súc theo các phương pháp lai tạo truyền thống. Sử dụng động vật biến đổi gen có hàng loạt những ưu điểm, đó là: chúng có khả năng sinh sản được để tạo ra thế hệ động vật chuyển gen tiếp theo; Khả năng sản xuất linh động, sản lượng của chúng phụ thuộc vào số lượng con vật sản xuất; Chúng có khả năng tự duy 50

trì nguồn nguyên liệu và năng lượng cho bản thân chúng; và, Trong hầu hết các sản phẩm thuốc được chế tạo từ vật nuôi, sản phẩm được tạo ra tiện lợi nhất đó là ở dạng sữa. 1.

Nghiên cứu những gen gây bệnh như gen gây loạn dưỡng cơ tim, ung thư, tự miễn dịch, hồng cầu lưỡi liềm. Dùng phương pháp chuyển gen để tạo động vật thí nghiệm mà bị loại bỏ hoặc khoá các gen nào đó để xác định chức năng của gen.

2.

Tạo ra các loại protein, hóc môn, yếu tố sinh trưởng dùng trong trị liệu

3.

Thay đổi cấu trúc giải phẫu, sinh lý cơ quan, nội tạng ( đưa một số gen mới, loại bỏ một số gen) nhằm phục vụ mục đích cấy ghép nội tạng.

Ở thực vật, kỹ thuật chuyển gen đã được phát triển khá mạnh mẽ và đã tạo được nhiều các sản phẩm chuyển gen như một số giống cây chịu hạn, chịu lạnh, chống bệnh sản xuất kháng sinh… Chỉ tính riêng năm 2001, Hoa Kỳ có 35,7 triệu hecta đất trồng các giống cây GM, Canada có 3,2 triệu hecta, Argentina có 11,8 triệu hecta và ít nhất là 1,5 triệu hecta ở Trung Quốc. Trong hai tính trạng được sử dụng phổ biến hiện nay thì các cây trồng kháng thuốc diệt cỏ được canh tác trên 77% toàn khu vực, cây trồng có khả năng sản sinh độc tốt là 15% và cây trồng mang cả hai tính trạng này có mặt trên 8%. Hầu hết sản phẩm sau thu hoạch được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi. Đối với thực phẩm biến đổi gen, các cuộc tranh luận về những ưu điểm và nhược điểm vẫn còn chưa ngã ngũ. Những người ủng hộ cho rằng, kỹ thuật di truyền có thể góp phần: • cung cấp nguồn lương thực cần thiết trong tương lai; • tăng cường chất lượng thực phẩm; • loại trừ thực phẩm có mang các chất độc hoặc các chất gây dị ứng; 51

• tạo ra cây trồng sản sinh năng lượng, sau đó nuôi cấy thu sinh khối để chuyến thành năng lượng (như cây liễu) và nhiên liệu sinh học (biodiesel và bioethanol) có thể thay thế được các nhiên liệu hoá thạch và dầu khoáng; • sản xuất nhiều loại hoá chất, trong đó chủ yếu là các loại dầu chiết từ hạt lanh, cải dầu và hướng dương; • tạo ra các chất hoá học đặc biệt như các dược phẩm, mỹ phẩm và thuốc nhuộm; • sản xuất các hợp chất sinh học đặc biệt như sợi sinh học tổng hợp (chủ yếu bắt nguồn từ sợi gai dầu và sợi lanh); keo lignocellulose, các chất tán sắc, phân bón và phụ gia, nhựa; • sinh học, giấy và bìa có nguồn gốctừ tinh bột; • tăng khả năng chăm sóc sức khoẻ; • sản xuất ra các dược phẩm có thể chống được các căn bệnh đặc biệt ở những bệnh nhân nhất định; • tạo ra các chất hoá học ít gây ô nhiễm môi trường và dễ kiểm soát; • làm thay đôi lợi nhuận thu được từ các hoạt động nông và công nghiệp, giảm bớt sự ô nhiễm môi trường; • đem lại những lợi ích đáng kể cho môi trường, trong đó tạo ra các khả năng mới trong việc giám sát, và quản lý những ảnh hưởng đối với môi trường. Ngược lại, các đối tượng chỉ trích cho rằng: • công nghệ sinh học hiện đại vượt qua những điều con người lẽ ra không nên làm; • hiện nay, có rất ít bằng chứng khẳng đinh sản lượng nông nghiệp đã tăng lên;

52

• rất nhiều ví dụ về các ứng dụng GM đã bị thất bại do sự hạn chế vốn có của công nghệ và sự phức tạp trong giải quyết các vấn đề, ví dụ: sản xuất lúa không gây dị ứng; lợn tăng trưởng nhanh bổ sung thêm các gen hormone và vi sinh vật phân huỷ các chất ô nhiễm trong đất; • về khía cạnh y tế, hiện nay không có đủ thông tin liên quan đến độc tố và chất gây dị ứng trong các sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ các GMO; • một trong những vấn đề quan trọng là ảnh hưởng đối với môi trường khi giải phóng các GMO ra môi trường, đặc biệt là những ảnh hưởng đối với đa dạng sinh học; • hoạt động nông và công nghiệp đã bị thay đổi theo chiều hướng bất lợi như tăng độ ô nhiễm môi trường, trong một số trường hợp các thể nghiêm trọng tới mức chúng cần bi cấm; • các hậu quả kinh tế - xã hội cũng có nguy cơ cao, ví dụ việc loại bỏ các cây trồng thu hoa lợi hoặc các cây trồng truyền thống và gây đình trệ hệ thống nông trại quy mô nhức đang thịnh hành ở các nước đang phát triển; • không thể chấp nhận được một số công ty liên quan đến công nghệ sinh học nông nghiệp và các tổ chức quản lý hoá chất và hạt giống; • cũng không thể chấp nhận việc đăng ký sáng chế đối với các sinh vật sống, gen và/ hoặc các nguyên liệu di truyền, đặc biệt: • nông dân cần được giữ hạt giống của mùa vụ này cho mùa vụ gieo trồng sau; cần phải cấm việc quyền sở hữu trí tuệ bảo hộ gen hoặc các trình tự axit nucleic không thuộc các sáng chế thực sự.

53

Ở Việt nam, việc tạo động vật chuyển gen vẫn còn là vấn đề mới mẻ. Việc nghiên cứu mới được bắt đầu vài năm gần đây và mới thực hiện được ở trên đối tượng là cá, đầu tiên là cá vàng và cá chạch là những cá có kích thước nhỏ, thời gian sinh trưởng và thành thục ngắn, rất thuận tiện cho công tác nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. Tiếp theo là những nghiên cứu trên đối tượng cá kinh tế, mục đích là tạo được cá chuyển gen có tốc độ lớn nhanh, hiệu quả kinh tế cao, phục vụ cho nuôi trồng thuỷ sản. Thành công của những nghiên cứu này không những mang lại hiệu quả kinh tế lớn cho sản xuất và mở rộng cho những nghiên cứu tiếp theo trên đối tượng động vật bậc cao mà còn khẳng định được sự tiến bộ vượt bậc của ngành khoa học công nghệ nước ta. 3.3

Các nguyên lý sinh học của quá trình chuyển gen.

3.3.1 Mục tiêu, yêu cầu Mục tiêu của kỹ thuật chuyển gen là phải đưa một đoạn gen vào hệ gen nhân của tế bào nhận, có khả năng biểu hiện và di truyền ổn định… Để đạt được điều đó, chúng ta phải làm thoả mãn và đạt được các mục tiêu, yêu cầu sau: • Gen được chuyển phải xâm nhập vào tế bào của sinh vật chuyển gen. Do các tế bào của cơ thể nhận có xu hướng tự chọn lọc và ngăn cản sự xâm nhập của các yếu tố lạ, do vậy chúng ta phải có một số biện pháp sinh lý, sinh hoá hoặc cưỡng bức để đưa các thành phần lạ vào trong tế bào làm tăng hiệu suất chuyển gen. • Tế bào thể nhận phải tiếp nhận gen lạ vào hệ gen nhân. Không phải tất cả các tế bào trong cơ thể đều có thể tiếp nhận các thành phần lạ, các cơ thể không giống nhau phản ứng khác nhau với sự xâm nhập của một gen lạ. Thậm chí, các mô khác nhau trong một cơ thể hay các tế

54

bào khác nhau của cùng một mô cũng có khả năng tiếp nhận sự biến nạp một cách khác nhau. • Gen được chuyển phải được biểu hiện sau khi tiếp nhận vào hệ gen nhân. Vấn đề quan trọng là sau khi đoạn gen được đưa vào trong tế bào và được tế bào đó chấp nhận nhưng vấn đề gen đó có khả năng biểu hiện không và biểu hiện như thế nào lại là một vấn đề khác. Có khoảng 1% của tế bào phôi chuyển gen có chứa gen cần chuyển nhưng không phải bất cứ tế bào phôi nào cũng phát triển bình thường. Khi một gen nào đó chuyển vào trong tế bào phôi mới thụ tinh, do tính chất ngẫu nhiên nên đoạn gen có thể chèn vào một gen cấu trúc nào đó và có thể gây lên hiện tượng gián đoạn chức năng bình thường của cơ thể đẫn đến hiện tượng khiếm khuyết, phát triển kém, ung thư, viêm khớp hoặc hàng loạt các loại bệnh khác. • Tế bào chứa gen biến nạp phải có khả năng tái sinh (ở thực vật) hoặc có khả năng chuyển lại cho đời sau. Đây là cơ sở cho việc duy trì cơ thể chuyển gen để chọn lọc, tăng số lượng của cơ thể chuyển gen. 3.3.2 Biểu hiện các sản phẩm chuyển gen. Sử dụng động vật chuyển gen như một nhà máy dược phẩm là một lựa chọn mang lại lợi nhuận cao thay cho việc nuôi cấy tế bào. Đối với một số protein phức tạp (có chứa các phân tử đường, cấu trúc bậc 2, bậc 3…) thì đây là một biện pháp tối ưu. Những động vật này trở thành một phương tiện sản xuất có nhiều lợi ích như dễ dàng duy trì, tái sản xuất bằng sinh sản, năng suất thay đổi linh hoạt qua số lượng vật nuôi, giá thành thấp và đặc biệt, sản phẩm được biểu hiện qua sữa là một dạng dễ sử dụng và tiện lợi. Thực tế có khá nhiều cách để thu được sản phẩm chuyển gen của cơ thể như thu hoạch từ máu, từ nước tiểu hoặc từ sữa. Hemoglobin từ lợn

55

chuyển gen này là một loại protein được tạo ra và thu hoạch từ máu vơi hy vọng tìm ra nguồn thay thế máu người. Một số loại protein được thu lại từ nước tiểu của động vật chuyển gen () và họ cho rằng, có một số lợi thế khi tạo động vật chuyển gen sản xuất protein qua nước tiểu như khong cần đợi đến khi động vật sinh sản, sản xuất liên tục, không theo chu kỳ… Tuy nhiên, bàng quang, thận không phải là cơ quan có thể sản xuất một lượng lớn và liên tục protein và việc sản xuất thuốc (proein) qua đường này cần tiếp tục nghiên cứu. Một con đường chủ yếu các công ty dược phẩm và các nghiên cứu tập trung vào đó là sản suất protein qua sữa. Vậy, làm thế nào để chuyển một gen vào cơ thể và protein của gen đó được tổng hợp trong quá trình tạo sữa và bài tiết theo đường sữa. Như chúng ta đã biết, để một gen hoạt động thì nó cần phải có gen chỉ huy, gen khởi động, gen điều hoà, gen cấu trúc. Muốn protein nào đó được tổng hợp trong quá trình tạo sữa thì gen cấu trúc của nó cần phải được đưa vào 1 promotor điều khiển hoạt động và mã hoá protein ở tuyến sữa và như vậy nó sẽ hoạt động trong quá trình tạo sữa. Vì vậy, gen đó có ở mọi mô bào nhưng nó chỉ hoạt động ở tuyến sữa và được bài tiết vào trong sữa. Các gen, promoter của gen k-casein hoặc b-lactoglobunin là những promoter đích cần chèn vào. Sản xuất protein qua tuyến sữa có rất nhiều lợi thế, bao gồm: -Tuyến sữa của động vật có vú là một cơ quan sản xuất sinh học thích nghi với việc sản xuất protein và bài tiết sữa; -Nhiều protein được sản xuất ở tuyến sữa của động vật có vú; -Sự biểu hiện gen ở tuyến sữa của động vật có vú là chính xác về thời gian; Sản lượng sữa được tiết ra ở động vật có vú là khá lớn. 56

3.4

Các bước tạo động vật chuyển gen Thông qua chuyển gen, ADN cho một loại protein hay dược phẩm nào

đó có thể chuyển vào động vật để sản xuất một số lượng lớn dược phẩm nào đó, bao gồm: 3.5

Xác định, đánh giá và phân lập gen mong muốn. Để bắt đầu chuyển gen, chúng ta phải xác định gen cần chuyển, đặc

tính mong muốn là gì và gen điều khiển tính trạng đó là gen nào, nằm ở đâu trong hệ gen của vật cho. Ví dụ, với mục đích sản xuất protein hemoglobin của người vào lợn, người ta phải xác định tính trạng cần chuyển là protein hemoglobin ở người, tiếp theo, người ta phải xác định gen tổng hợp lên hemoglobin là gen nào, trình tự gen đó là gì và sau đó là phải phân lập được gen đó. Mục đích là tìm được gen cấu trúc của tính trạng mình mong muốn. Để một gen hoạt động được thì nó cần phải có gen chỉ huy, gen khởi động, gen điều hoà, gen cấu trúc. Vùng điều hoà có chiều dài khoảng 100 bp kết hợp với các nhân tố điều hoà cis- hoặc trans- để tham gia vào quá trình phiên mã, để khởi động hoặc kết thúc quá trình phiên mã của một gen. Để tìm được gen cấu trúc người ta có thể đi từ nhiều hướng khác nhau như từ ADN nhân, hoặc các sản phẩm biểu hiện của nó là từ ARN thông tin (mARN) hoặc từ protein. Khi tìm được một gen cấu trúc cần thiết rồi, người ta cần phân phân lập gen cấu trúc đó và kết hợp với một promotor đã được xác định để tạo ra một tổ hợp gen cấu trúc và promotor. Đoạn gen cấu trúc trong tổ hợp này có thể được phân lập trực tiếp từ ADN của hệ gen, nó bao gồm cả vùng intron và vùng exon do vậy kích thước của nó khá dài. Gen cần chuyển có thể được tổng hợp từ mARN để tạo ra cADN. Kích thước đoạn cADN ngắn hơn nhiều so với kích thước đoạn gen phân lập tử ADN hệ gen, do trong mARN chỉ có 57

đoạn mang mã (exon)(hình 1). Tuy nhiên, theo kinh nghiệm của nhiều tác giả thì hiệu quả chuyển gen từ ADN hệ gen cao hơn nhiều so với chuyển gen từ cDNA.

Hình 1. So sánh 2 loại ADN đích có thể được sử dụng trong chuyển gen vào phôi non.

Hình 2. Sơ đồ cấu trúc của một tổ hợp gen cần chuyển 3.6

Thiết kế và biểu hiện gen vào vật mang.

3.6.1 Các loại vật mang(nhân tố chuyển gen) Các loại vector dùng trong kỹ thuật chuyển gen là: Plasmid( nhóm plasmid tự nhiên, plasmid nhân tạo..), phage, cosmide, virus của eukaryote (SV40, adenovirus, retrovirus, herpes virus..), nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men và động vật có vú. Các đặc tính cần thiết của một vector: -Có khả năng sao chép tích cực và độc lập trong tế bào vật chủ; -Vector phải có kích thước càng nhỏ càng tốt để thu nhận ADN ngoại lai có kích thước tối đa;

58

-Vector phải cho phép phát hiện dễ dàng so với tế bào không mang vector này (thường là kháng kháng sinh hoặc sản sinh enzyme βgallactosidase); -Vector phải có khả năng tồn tại trong tế bào chủ trong nhiều thế hệ; -Vector phải có vị trí nhận biết duy nhất (tồn tại vị trí cho mỗi enzyme giới hạn, càng nhiều loại enzyme càng tốt) 3.6.2 Chuyển gen vào vật mang Sau khi đã tạo được tổ hợp gen biểu hiện, chèn tổ hợp này vào vector thích hợp có thể là plasmid hoặc phage để tạo dòng trong tế bào vi khuẩn. Sự chuyển nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn có thể được kiểm tra bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường chọn lọc sử dụng kháng sinh tương ứng với gen kháng kháng sinh có trong plasmid đó. Số lượng tổ hợp gen chuyển và plasmid sẽ được khuếch đại lên theo sự phân chia của tế bào vi khuẩn. Hàng triệu plasmid sẽ được tách khỏi vi khuẩn và đoạn gen mong muốn sẽ dược cắt khỏi plasmid bằng enzyme giới hạn. Sau khi cắt khỏi plasmid, tổ hợp gen biểu hiện có thể thu lại được bằng cách thôi gel sau khi điện di. Tổ hợp plasmid mang gen chuyển cũng được biến nạp vào tế bào eukaryote nuôi cấy để đánh giá sự biểu hiện của gen. Đoạn gen ngoại lai sau khi tinh sạch từ gel agarose được hoà tan trong đèm chuyên dùng cho vi tiêm (đệm TRIS-EDTA). Dung dịch ADN dùng cho vi tiêm có nồng độ từ l-5 µg/ml 3.7

Thu nhận tế bào nhận. Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là trứng ở

giai đoạn tiền nhân (pronucleus), giai đoạn mà nhân của tinh trùng và trứng chưa dung hợp với nhau. Ở giai đoạn này tổ hợp gen lạ có cơ hội xâm nhập

59

vào hệ gen của động vật nhờ sự tái tổ hợp ADN của tinh trùng và của trứng. Do tế bào phôi chưa phân chia và phân hóa nên tổ hợp gen lạ được biến nạp vào giai đoạn này sẽ có mặt ở tất cả các tế bào kể cả tế bào sinh sản của động vật trưởng thành sau này. Đối với động vật có vú, trứng chín được thu nhận bằng phương pháp sử dụng kích dục tố để gây siêu bài noãn theo chương trình đã được xây dựng cho mỗi loài hoặc bằng phương pháp nuôi cấy trứng trong ống nghiệm (in-vitro). Sau đó thụ tinh nhân tạo để tạo ra trứng tiền nhân. Đối với tế bào tiền thân, việc nuôi cấy để thu được một số lượng tế bào tiền thân trong ống nghiệm 3.8

Chuyển vật mang vào tế bào nhận. Tổ hợp gen ngoại lai có thể được chuyển vào tế bào nhận theo nhiều

cách khác nhau như, các phương pháp chính bao gồm: 1. Vi tiêm (microinjection), là một phương pháp sử dụng các thiết bị vi thao tác cực nhạy với vi kim được thực hiện dưới kính hiển vi để tiêm một đoạn ADN trong dịch tiêm vào phôi non của động vật. 2. Chuyển gen bằng sử dụng tế bào gốc(stem cell). Các tế bào phôi ở giai đoạn 16-32 tế bào là các tế bào đa năng (totipotent) nghĩa là có thể phân hóa thành bất kỳ loại mô nào. Người ta đã tiến hành nuôi cấy và biến nạp gen vào những tế bào này bằng cách nhiễm với vector virus. Sau khi chọn ra những tế bào đã được biến nạp gen lạ người ta đưa nó vào phôi khác ở giai đoạn phôi nang để tạo ra động vật chuyển gen thể khảm. Tỉ lệ các phôi sống sót sau thao tác là khá cao (80%), trong số đó 90% biểu hiện tính trạng mới. Tiếp theo, người ta lai tạo qua các đời để thu được động vật đồng hợp tử về các tính trạng mà ta chuyển vào.

60

3. Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun), là biện pháp chuyển gen xuất hiện cuối những năm 1980. Biện pháp này sử dụng các hạt bụi volfram hoặc bụi vàng trộn lẫn ADN (tổ hợp gen cần chuyển) và bắn vào khối mô, tổ chức cần nhận nhờ áp lực khí helium (3500 psi). Đây là biện pháp chuyển gen có nhiều ưu điểm và hiệu quả, ở Việt nam đã có một số cơ quan nghiên cứu áp dụng kỹ thuật này như Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Công nghệ sinh học nhưng kỹ thuật này chỉ chủ yếu tiến hành đối với mô thực vật 4. Phương pháp xung điện (electroporation). Phương pháp này tạo cho các màng sinh học dễ thấm và dễ dung hợp nhờ sự kích thích của điện trường, Một yếu tố khác đó là, xung điện tạo ra những lỗ thủng nhỏ trên bề mặt của màng tế bào, nhờ vậy rất nhiều loại plasmid có thể chuyển qua được. Phương pháp này có hiệu quả cao, phù hợp cho việc biến nạp với số lượng lớn tế bào. Tuy nhiên tỷ lệ tế bào chết cũng khá nhieù và một một loại tế bào cũng cần đòi hỏi biện pháp tiền xử lý thích hợp. 5. Qua trung gian virus(virus mediated), là biện pháp chuyển gen khá đặc hiệu để chuyển gen vào đối tượng nhận. Nguyên lý của phương pháp này khá đơn giản. Khi xâm nhập vào tế bào vật chủ, virus thường chuyển một đoạn gen cỉa nó vào tế bào chủ và bắt tế bào chủ phải tổng hợp nguyên vật liệu cho nó. Phương pháp này mở ra một triển vọng cũng như là một thách thức đối với khoa học để điều khiển và lợi dụng các đặc điểm có lợi để sửa chữa khuyết tật di truyền trong liệu pháp gen. Chuyển gen sử dụng trung gian virus (retrovirus- là loại virus không gây bệnh) có lợi thế là không làm thay đổi hoạt động của gen cũ của cơ thể nhưng gây nên mối nghi ngại việc tạo ra virus mới,

61

lan truyền các thành phần của virus để tạo ra một loại virus mạnh hơn, nguy hiểm hơn. 6. Chuyển qua trung gian tinh trùng (sperm mediated), là một phương pháp chuyển gen sử dụng tinh trùng ủ với liposome có chứa ADN plasmide và dùng thụ tinh nhân tạo. Phương pháp này được thực hiện khá thành công ở thỏ. Phương pháp này cũng đang được nghiên cứu và áp dụng đối với chuyển gen ở lợn, nhằm tạo ra nguồn cơ quan, tổ chức phục vụ cho cấy ghép. 3.9

Phân tích hiệu quả của việc chuyển gen. Để khẳng định động vật có được chuyển gen lạ vào hay không người

ta phải kiểm tra xem gen lạ có xâm nhập vào được bộ máy di truyền của động vật và có biểu hiện được hay không. Đây là công việc đòi hỏi nhiều thời gian và công sức, các phương pháp xác định bao gồm: 3.9.1 Phương pháp nhân gen Phương pháp để sàng lọc sơ bộ trước tiên là phản ứng nhân gen (PCR ) sử dụng cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn gen được chuyển. Phương pháp PCR cho phép nhân rất nhanh (hàng triệu lần trong một hai giờ) và chính xác từng đoạn ADN riêng biệt. Đây thật sự là phương pháp khá hiện đại, kinh tế và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác tương dối cao. Sự có mặt của băng ADN với kích thước mong muốn khi điện di sản phẩm PCR chứng tỏ sự có mặt của gen ngoại lai trong hệ gen vật chủ. Tuy nhiên, đây là một phương pháp có độ nhạy cao. do đó kết quả có thể bị nhiễu vì PCR nhân các đoạn gen không phân biệt đó là ADN ngoài nhiễm sắc thể hay không hoặc có thể bị lây nhiễm ADN trong quá trình thao

62

tác. Do tính phức tạp của hệ gen vật chủ, cặp mồi cũng có thể bắt cặp với những đoạn không đặc hiệu trong hệ gen vật chủ tạo nên kết quả dương tính không chính xác. Để nâng cao tính chính xác của việc xác định sự hội nhập của gen ngoại lai, người ta còn sử dụng phương pháp Southern blot. Đây là một phương pháp khá tốn kém nhưng là một phương pháp rất hữu hiệu để xác định sự có mặt của gen ngoại lai và có thể phát hiện số lượng bản sao của gen hội nhập. Trong phần lớn các phòng thí nghiệm, người ta sử dụng PCR để sàng lọc sơ bộ hàng trăm thậm chí hàng nghìn cá thể được chuyển gen sau đó sử dụng các phương pháp khác để xác nhận lại kết quả PCR mà cho dương tính. 3.9.2 Phương pháp Southern blot. Đây là phương pháp sử dụng để định vi những trình tự đặc biệt trên ADN hệ gen. ADN mẫu được cắt bằng các loại enzyme giới hạn sau đó được điện di trên gel (agarose hoặc polyacrylamide), tiếp theo mẫu được làm biến tính và chuyển lên màng lai nitrocellulose, ở đó, ADN dò có đánh dấu phóng xạ (hoặc không phóng xạ) được sử dụng để lai ghép. Tiếp theo, kết quả được phân tích và đánh giá. 3.9.3 Phương pháp Dot blot và slot blot. Hai phương pháp này được áp dụng để định lượng tương đối một loại ADN đặc trưng nào đó cũng bằng phương pháp lai phân tử và đánh dấu phóng xạ hoặc không phóng xạ. Tuy gen chuyển có thể hội nhập vào hệ gen vật chủ nhưng có thể biểu hiện hoặc không. Các phương pháp trên cho phép kiểm tra sự có mặt của gen chuyển ở trong cơ thể vật chuyển gen, nhưng sự biểu hiện của gen là

63

bước cuối cùng và quan trọng nhất để đánh giá động vật chuyển gen. Có hai cách đánh giá sự biểu hiện của gen ngoại lai trong cơ thể vật chủ là phát hiện sự có mặt của mARN hoặc sự có mặt của protein do gen đó qui định được tổng hợp. 3.9.4 Các phương pháp phát hiện mARN Để xác định gen chuyển có được hoạt động không, người ta có thể xác nhận sự biểu hiện của gen thông qua sự có mặt của mARN bằng Northem blot, ARN dot blot (kỹ thuật lai phân tử mà đối tượng là mARN), RT-PCR (PCR ngược) . . . Trong các phương pháp trên thì RT-PCR là phương pháp nhạy và nhanh hơn cả. Chỉ cần một lượng ARN khuôn rất nhỏ để tổng hợp nên sợi cDNA đầu tiên bằng enzyme phiên mã ngược. Sợi cDNA sau đó được khuếch đại lên nhờ PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen ngoại lai đó. 3.9.5 Các phương pháp phát hiện protein Một cách khác để theo dõi thế hệ sau của động vật chuyển gen có gen lạ xuất hiện không tức là có tổng hợp ra protein mới hay không, trong trường hợp có sẵn kháng thể kháng protein, kỹ thuật lai thấm protein (Westem blotting) có thể được sử dụng để phát hiện sự biểu hiện của gen đó. Nội dung của phương pháp này có thể tóm tắt như sau: Điện di protein tổng số trên gel SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) để tách các protein theo trọng lượng phân tử khác nhau. Chuyển protein sang màng lai (nitrocellulose). Lai với kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) có đánh dấu phóng xạ. Phản ứng dương tính nói lên protein của gen lạ đã được tổng hợp. Người ta có thể sử dụng kỹ thuật miễn dịch enzyme (ELISA) hoặc kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA) để phát hiện protein lạ trong động vật. 64

3.10 Tạo dòng động vật chuyển gen Động vật chuyển gen có thể sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban đầu để tạo dòng động vật chuyển gen. Con vật mới được tạo ra gọi là Fo (foundation animal) khi có những biểu hiện gen được chuyển. Lai ghép để nhân lên dòng chuyển gen có gen chuyển ở một vị trí (locus) nào đó) và là đồng hợp tử. Thông thường, khi chuyển gen thì kết quả ban đầu sẽ là gen được chuyển vào nhiều vị trí trong hệ gen và ở trạng thái dị hợp tử và cũng không thể điều khiển được số lượng vị trí kết hợp. Các vị trí kết hợp khác nhau có những biểu hiện khác nhau, nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, có sự khác biệt đáng kể giữa các con của thế hệ sau của động vật chuyển gen. Và hy vọng rằng, sự di truyền các gen đó tuân theo các định luật Menden.

3.11 Chuyển gen bằng kỹ thuật vi tiêm. Việc chuyển gen bằng vi tiêm vào phôi non của động vật được tiến hành nhờ sự trợ giúp của các máy móc và thiết bị vô cùng chính xác và chuyên dụng. Trong số các biện pháp chuyển gen, cho đến nay, vi tiêm là biện pháp hiệu quả nhất trong việc chuyển gen vào tế bào động vật đặc biệt là phôi của động vật có vú. Trường hợp vi tiêm và phôi non để tạo ra động vật chuyển gen thành công đầu tiên là của Gordon trên chuột. Tuy nhiên, gen đó đã không biểu hiện mặc dù tổ hợp gen được thiết kế trên cấu trúc tái tổ hợp của virus. Trường hợp quan sát thấy thay đổi về kiểu hình đầu tiên ở chuột chuyển gen hocmoon sinh trưởng được mô tả năm 1982 nhờ công trình của Palmiter và cộng sự và đến nay, hàng trăm bài báo liên quan đến việc chuyển gen bằng kỹ thuật vi tiêm được xuất bản hàng năm. 65

Kỹ thuật vi tiêm lượng ADN thuần khiết vào phôi non của động vật tạo ra việc kết hợp đoạn gen đó vào trong bộ nhiễm sắc thể của trứng mới thụ tinh. Nếu nguyên liệu di truyền đó được dung hợp vào nhiễm sắc thể thì con non sinh ra sẽ có bản copy thông tin di truyền ở tất cả các tế bào. ADN ngoại lai cần phải được kết hợp vào bộ gen của tế bào chủ trước khi được phân bào lần đầu tiên, nếu không, ta sẽ thu được con vật chuyển gen thể khảm. Chính vì vậy, gen cần phải được chuyển vào ở giai đoạn sớm nhất có thể được ví dụ như giai đoạn nhân non, lý tưởng nhất là một vài giờ sau khi thụ tinh, khi đó nhân của tinh trùng và nhân của trứng có thể quan sát được dưới kính hiển vi. Gen chuyển có thể được tiêm vào bất cứ nhân nào, tuy nhiên, nhiễm sắc thể X và Y cũng có thể tiếp nhận gen chuyển và có thể cho kiểu hình khác nhau, như vậy chúng ta có thể lựa chọn tiền nhân thích hợp. Bình thường nhân đực to hơn và gần phía ngoài hơn là nhân cái. (hình )

Pipet dùng để giữ tế bào

Micropipet

tiền nhân cái

tiền nhân đực

3.12 Điều kiện cơ bản để thực hiện vi tiêm. Brinster và các cộng sự (1985) đã thông báo về những thay đổi trong phương pháp luận đối với chuyển gen thông qua vi tiêm vào phôi chuột và

66

kết quả cuối cùng chỉ ra rằng cần có những điều kiện cơ bản để tăng tần số hoà nhập của ADN ngoại lai vào tế bào thể nhận. Có một vài nhân tố quan trọng nhất, đó là: • Nồng độ ADN được tiêm: Nồng độ ADN được tiêm có thể là một nhân tố hạn chế đối với hiệu quả hoà nhập. Nồng độ tối ưu là 1-2 ng/µl, tức là khoảng 100-1000 bản sao của đoạn ADN. • Tạo đầu dính (non-blunt end): Một phân tử ADN mạch thẳng sẽ được tiêm vào hiệu quả hơn nếu được cắt bởi enzym endonuclease tạo ra hai đầu dính. • Vị trí tiêm ADN vào trong tế bào: Tiêm ADN ngoại lai vào nhân thường cho hiệu quả cao hơn vào tế bào chất. • Kiểu tế bào được tiêm: Tiêm ADN lạ vào nhân trứng hoặc nhân tinh trùng cũng làm thay đổi kiểu gen và kiểu hình của hợp tử do trứng hoặc tinh trùng này tạo ra. Một cách khác cho hiệu quả cao hơn là tiêm vào nhân của hợp tử. Tuy nhiên, bằng cách này người ta tiến hành ở bò và cừu thì hiệu quả cũng chỉ đạt 0. 2-2%. Sau đó những tiến bộ đã được thông báo trong lĩnh vực nghiên cứu các tế bào cuống phôi (ES) và nguyên bào tinh, nguyên bào noãn (PGC). Những dòng tế bào này đã cho phép sự hoà nhập của ADN lạ vào hệ gen của động vật một cách có hiệu quả cao. • Nguồn vật liệu di truyền được tạo phôi: Hiệu quả gắn kết ADN lạ vào genome của phôi lai giữa các nòi cho hiệu quả cao hơn vào genome của phôi đối với các dòng cận huyết. 3.13 Quy trình tạo động vật chuyển gen

67

(1) Gen có chức năng nào đó được lựa chọn và phân lập trong phòng thí nghiệm. (2) Một con vật cho được gây siêu bài noãn và thu hoạch phôi từ ống dẫn trứng. (3) Gen được đưa vào trứng được thụ tinh bằng kỹ thuật vi tiêm. (4) Phôi chuyển gen được đưa vào con vật nhận mà có thể cho ra đời con non có gen đã chuyển. (5) Kiểm tra con non đối với gen mới chuyển, lai tạo để tạo con non có tính ổn định di truyền về tính trạng mới.

3.14 Những thiết bị yêu cầu cho thao tác vi tiêm. Gía thết bị cần thiết cho thao tác chuyển gen bằng vi tiêm khoảng 50ngàn-80 ngàn USD và bao gồm: • Hệ thống kính hiển vi độ phân giải cao với vật kính Nomarski hoặc Hoffman(Kính hiển vi soi ngược) với thị kính là 10x-15x và vật kính 20x hoặc 40x để quan sát nhân non. 68

• Tủ ấm CO 2 , để duy trì nhiệt độ là 37-38oC với nồng độ CO 2 là 5%-6%. • 1 cặp vi thao tác Litz hoặc tương đương có tác dụng điều khiển kim vi tiêm và kim giữ; • Cặp syringe điều khiển lượng dung dịch trong kim vi tiêm và kim giữ • Thiết bị giữ và điều khiển syringe, • Các thiết bị chế tạo và gia cố kim • ống capillary dùng đế chế tạo kim vi tiêm, kim giữ và kim nạp • Dầu parafin, agar và các hoá chất cần thiết khác . • Bàn chống rung, kính hiển vi soi nổi, dụng cụ phẫu thuật và vi phẫu thuật,

3.15 Các gen dùng để chuyển vào động vật. Cho đến nay, người ta đã chuyển khá nhiều gen lạ có nguồn gốc từ người, động vật, thực vật và vi sinh vật vào các loại động vật như chuột, thỏ, cá và các loại vật nuôi như bò, cừ, dê, lợn , gà, chim thậm chí cả vào muỗi. Động

vật Gen và chức năng của chúng

nhận Cá

-Gen sinh trưởng và yếu tố sinh trưởng (fGH, hGH, bGH) δcrystallin (gà), β-gallactosidase, kháng hygromycine, protein chống đông lạnh, ÀP, α-globin, neomicine, phosphats-transferase, liciferase

Lợn

-Các loại gen hóc môn sinh trưởng và yếu tố sinh trưởng (mMT, hGH, mMT-bGH, PRL-bGH, mMT-hGRF, alb-hGRF, mMT-hGF và mMT-bGH

69

Chuột

hGH, rGH, hGRF, gen mã hoá luciferase

Cừu

(mMT, hGH, mMT-bGH, PRL-bGH, mMT-hGRF, alb-hGRF, mMT-hGF ), smt-sGH5, sMT-sGH9. α1-antitripsin (trong điều trị viêm phổi), tạo albumin, yếu tố trong quá trình đông máu.

Bò

b-GH

Dê

3.16 Ứng dụng của chuyển gen thông qua vi tiêm. Ngày nay, chuyển gen nói chung và vi tiêm ADN nói riêng như là một cuộc cách mạng trong ngành chăn nuôi trên thế giới. Mục tiêu chính của chăn nuôi là tăng khả năng sinh sản, tăng hiệu quả chăn nuôi, tăng năng suất sản phẩm và tăng khả năng chống bệnh Do chuyển gen làm thay đổi cấu trúc vật chất di truyền nên có thể tạo ra bước nhảy vọt vế khả năng của vật nuôi mà trong tự nhiên không có được. Những thành tựu và ứng dụng tạo động vật chuyển gen nhờ vi tiêm như sau: 1. Tăng cường khả năng sinh trưởng và thay đổi đặc tính cơ thể: Khả năng sinh trưởng và chất lượng sản phẩm động vật cao do sự kiểm soát bởi các gen tăng cường sinh trưởng. Việc chuyển gen hoocmon

Ví dụ về chuột được chuyển gen hormon sinh trưởng (theo Bringster R.L và Hammer R.E)

70

sinh trưởng của chuột hoặc người vào động vật đã tăng tỉ lệ và kích thước cơ thể lên hai lần. Lợn được chuyển gen 9 tháng tuổi nặng hơn 28% so với lợn không được chuyển gen và có mức hoocmon sinh trưởng gấp 50 lần do sự dịch mã gen dung hợp MLP.

2. Tăng sản lượng và chất lượng sữa: Machlin (1979) thấy rằng nếu tăng hoocmon sinh trưởng HGH có nguồn gốc ngoại sinh làm tăng 18% sản lượng sữa. Nếu bò được chuyển gen hoocmon sinh trưởng làm tăng lượng hoocmôn sinh trưởng trong cơ thể và tăng sản lượng sữa mà không gây tác dụng xấu như tiêm nhiều hoocmon sinh trưởng. 3. Tạo các biệt dược, mô và phủ tạng thay thế cho người: Người ta đã tan ra những con cừu chuyển gen mà trong sữa của chúng có chứa protein lactofein có tác dụng như chất kháng sinh. Một loài dê chuyển gen đũng đã được tạo ra mà trong máu của chứng chứa chất antitrombine ỉa một loại ~glycoprotein có chức năng điều hoà sự đông máu. Người ta cho rằng phủ tạng của linh trưởng là nhóm gần người có thể dùng ghép cho người nhưng thục tế rất khó khăn: Ngày nay dùng phủ tạng lợn vì dễ từn và có kích thước tương tự như của người. Tuy nhiên, người ta dùng phủ tạng lợn gặp khó khăn vì trong màng tế bào của chứng có enzym galactose (người không có) đã làm trở ngại cho việc ghép. Vì thế, các nhà khoa học (1998) đã nghiên cứu và tạo ra giống lợn không có galactose do chuyển hai. hoặc ba gen của người cho lợn và bước đầu giải quyết được khó khăn trên. 4. Tạo các sản phẩm kinh tế khác:.

71

Chuyển gen làm tăng hàm lượng systein, làm tăng tốc độ mọc lông, làm tăng tổng hợp collagen và làm tăng độ bền của da. Người ta đã tạo ra được giống cừu chuyển gen mà có thể tự thay bộ lông khi ăn một loại thức ăn đạc biệt mặc dù không cần cắt xén lông. Một giống cừu chuyển gen khác có thời gian cho lông chỉ bằng 1/3 so với cừu không được chuyển gen. Tạo dược phẩm. 4. Sản xuất được dược phẩm theo yêu cầu ở mức độ cao mà không ảnh hưởng đến sức khoẻ của bản thân nó; 5. Chuyển khả năng sản xuất dược phẩm sang đời sau.

Các loại dược phẩm được sử dụng gần đây có nguồn gốc từ động vật chuyển gen. Động vật

Dược

Sử dụng

chuyển

phẩm/protein

gen Máu và hệ tuần hoàn Lợn

Hemoglobin người

ở Năm 1991, 3 lợn chuyển gen được tạo ra từ phôi 1 ngày tuổi tại TTCNSH NewJersey. Gen được chuyển la tạo hemoglobin của người, có khả năng vận chyển oxy như bình thường.

Cừu, Lợn, Yếu Bò

tố

chống Điều trị bệnh ưa chảy máu và giảm nguy cơ phản

đông máu VIII, ứng truyền máu. IX.

Cừu, Bò

Fibrinogen

Bò

Albumin

Điều trị vết thương huyết Duy trì thể tích máu và chống sốc khi mất máu 72

thanh người Dê

Chất chống đông Protein chống đông máu nhóm III xuất hiện máu nhóm III

thường xuyên trong cơ thể và nó có vai trò đông máu. Công ty CNSH Massachusess đã tạo ra dê chuyển gen này, mỗi con hàng năm tạo ra 500-800 lít sữa, mỗi lít chứa 28 g protein.

Cừu

Alpha-1-anti

Thiếu hụt dẫn tới hội chứng “Emphysema”.

tripsin

Protein này giúp tăng quá trình vận chuyển qua màng của dưỡng khí cũng như chất thải. Các nhà KH ở Scottlen đã tạo ra cừu biến đổi gen sản xuất >35g alpha-1-antitripsin trong 1 lít sữa=1/5 nhu cầu điều trị cho 1 bệnh nhân/năm. Tuy nhiên, vào tháng 6 năm 2003, công ty này đã phải từ bỏ công trình do chi phí quá tốn kém cho việc tinh chế protein từ sữa cừu.

Cừu, lợn, Yếu tố hoạt hoá Enzyme chống đông vón sử dụng điều trị một số dê

plasminogen của bệnh tim mạch, ngẽn mạch mô bào

Điều trị và phòng chống lây nhiễm Dê

Pro542

Dê, cừu

Yếu

Điều trị HIV tố

chuyển

vận xuyên

màng Bò

Alpha-

Chống nhiễm trùng

lactabumin Bò

Colagen I và II

Sửa chữa mô bào, điều trị thấp khớp

73

Kháng thể Gà

Kháng

thể, Trứng với hàm lượng dinh dưỡng phù hợp với nhu máu, cầu con người

Protein dinh dưỡng Chuột

Kháng thể người Kháng thể động vật có phản ứng quá mẫn nhưng kháng thể người được tổng hợp từ chuột thì không.

Gà, bò, dê Kháng thể đơn Các loại vaccine được tạo ra như vaccine viêm gan dòng

B.

Các loại khác Dê

Protein

chống Năm 1998, 1 báo cáo cho rằng, sữa dê có chứa 1

bệnh số rét

loại protein giống với protein của ký sinh trùng số rét, vì vậy sữa này có thể được dùng như một loại vaccine chống bệnh sốt rét.

Thỏ

Alpha-

Chống bệnh Pompe’s, bệnh rối loạn tế bào gan->

glucosidase

không có khả năng chuyển hoá glycogen –> đái đường.

Bò

loại protein này giúp con vật non hấp thụ Fe2+, có

Lactoferin

tác dụng chống nhiễm khuẩn, chống thiếu máu, chống viêm khớp. Dê

Acide Glutamic Điều trị tiểu đường nhóm 1 decarboxylase

Chuột

Hoocmôn

sinh

trưởng ở người

74

Giá trị thương mại Có khoảng 10-30% số trường hợp cấy chuyển gen ở chuột thành công, trong khi đó, chỉ có dưới 5% số trường hợp của Bò, dê, cừu thành công. Việc tạo một con vật chuyển gen trong giai đoạn hiện tại còn đắt (100.000 -200.000 USD năm 1999) và hy vọng trong vài năm nữa, chi phí cho một ca chuyển gen chỉ khoảng 5000 USD. Nhưng hiệu quả đem lại của nó khá cao, công ty Winscosin dự tính một con bò chuyển gen trong vòng đời của nó có thể tạo ra 200-300 triệu USD trị giá dược phẩm. Giá một số sản phẩm thuốc được tạo ra bởi công ty ‘Animal Pharming’ Thuốc

Động vật

Gía/Động vật/năm

AAT (α-1 antitrypsin, thiếu hụt di truyền dẫn tới Cừu

15.000 USD

hội chứng emphysema) TPA(tissue Plasminogen activator, điều trị đông Dê

75.000 USD

máu) Yếu tố VIII ( yếu tố đông máu, điều trị ưa chảy Cừu

37.000 USD

máu XI) Hemoglobin (máu thay thế)

Lợn

3.000 USD

Lactoferin (chất thay thế bỏ sung cho trẻ nhỏ)

Bò

20.000 USD

CFTR (Cystic fibrosis transmenbrane conductant Cừu, chuột, regulator, điều trị nang xơ.

75.000 USD

dê

Human Protein C, chống đông máu, điều trị đông Lợn máu (giá thị trường hiện thời sản xuất trên một động vật)

75

1.000.000 USD

3.17 Khả năng ứng dụng tại Việt nam. Động vât chuyển gen đã và đang trở thành một xu hướng nghiên cứu và phát triển thay vì chỉ cung cấp thực phẩm đơn thuần. Việc nghiên cứu và tạo động vật chuyển gen để tạo ra các dược phẩm và các sản phẩm của chúng đang thực hiện ở nhiều nước trên thế giới. Nhu cầu thị trường thế giới đối với các dược phẩm đặc hiệu chỉ có thể tạo ra bằng con đường chuyển gen. Việc chuyển gen và tạo sản phẩm chuyển gen cho đến nay tỷ lệ thành công còn thấp, chi phí còn cao nhưng chi phí đã giảm nhiều trong những năm gần đây và còn giảm nhiều trong những năm tới. Động vật chuyển gen sẽ là một xu hướng phát triển tất yếu phục vụ nhu cầu ngày càng tăng của con người. Triển vọng của động vật chuyển gen hầu như không có giới hạn. Tuy nhiên, để đạt tới một tiềm năng như thế dường như là một quá trình lâu dài và khó khăn trong một số trường hợp, nhưng triển vọng thật là rõ ràng và ngày càng có nhiều sự đầu tư về kinh phí và chất xám vào lĩnh vực này. Lĩnh vực đang phát triển nhất hiện nay là tạo động vật chuyển gen sản xuất thuốc, sản xuất các protein quí qua con đường tiết sữa. Mặc dù các ứng .dụng động vật chuyển gen trong nông nghiệp hiện tại còn chưa được khai thác, song trong tương lai nó cũng hứa hẹn sẽ mang lại lợi nhuận không nhỏ. Việc chuyển gen vào động vật đã làm nảy sinh những vấn đề về pháp luật và đáo đức Trong khi tạo động vật chuyển gen đã và sẽ mang lại rất nhiều lợi nhuận nhưng cũng có những quan điểm trái ngược, lo sợ rằng tạo động vật chuyển gen đe dọa phá vỡ sự cân bằng hệ sinh thái hoặc động vật chuyển gen có khả năng sinh sản thấp, nếu lai với động vật tự nhiên có thể làm giảm khả năng sinh sản, giảm số lượng, de dọa sự tồn tại của loài. Một số trường hợp động vật chuyển gen có khả năng kháng bệnh kém hoặc có 76

biểu hiện bệnh lý. Thêm vào đó, động vật chuyển gen sử dụng làm thực phẩm cũng không đạt được nhiều sự ủng hộ của tuyệt đại công chúng. Có một số quan điểm cho rằng thực phẩm chuyển gen có thể có những tác hại đối với con người như gây dị ứng. Người ta lo lắng đến những vấn đề về sức khoẻ khi sử dụng những loại thực phẩm này. Tuy nhiên, cho đến nay, cơ quan quản lý về thực phẩm và thuốc của Mỹ FDA (food Drug Administration) vẫn cho phép những thực phẩm chuyển gen được lưu hành trên thị trường với điều kiện sản phẩm phải được dán nhãn sản phẩm chuyển gen để người tiêu dùng có thể lựa chọn và nhà sản xuất phải cam kết sản phẩm đó không gây dị ứng cũng như các phản ứng tiêu cực. Trong khi đó, những ứng dụng trong y học của động vật chuyển gen dễ dàng được chấp nhận hơn bởi khi đối mặt với những bệnh tật hiểm nghèo người ta sẽ lựa chọn giải pháp ít rủi ro hơn. Trong tương lai không xa, các nhà khoa học hy vọng sẽ làm tăng nhận thức của công chúng và sự chấp nhận những sản phẩm chuyển gen. . 3.18 ChuyÓn gen ë thùc vËt HiÖn nay, kü thuËt chuyÓn gen ë thùc vËt ®Ó t¹o gièng c©y biÕn ®æi gen ®­îc thùc hiÖn b»ng 2 ph­¬ng thøc chñ yÕu: mét lµ, chuyÓn gen qua vi khuÈn ®Êt Agrobacterium: hai lµ, chuyÓn gen b»ng ADN trùc tiÕp vµo tÕ bµo nhê c¸c biÖn ph¸p vËt lý hoÆc hãa häc. 3.18.1. ChuyÓn gen qua Agrobacterim. Agrobacterim tumefaciens vµ A.rhizogenes lµ 2 loµi vi khuÈn g©y bÖnh c©y cã chøa c¸c plasmit. Plasmit ®­îc cÊu t¹o tõ ADN cã trong tÕ bµo chÊt cña vi khuÈn tån t¹i ®éc lËp víi nhiÔm s¾c thÓ cña vi khuÈn. ADN plasmit mang mét sè gen quy ®Þnh mét sè tÝnh tr¹ng ®Æcthï cña vi khuÈn nh­ tÝnh chèng chÞu thuèc kh¸ng sinh. Ngoµi ra plasmit cßn cã

77

®Æc tÝnh lµ chóng cã thÓ chuyÓn tõ tÕ bµo nµy sang tÕ bµo kh¸c vµ cã thÓ g¾n nhËp vµo ADN cña hÖ gen tÕ bµo chñ. Khi vi khuÈn Agrobacterim x©m nhiÔm vµo c©y qua mét vÕt th­¬ng ë rÔ th× mét ®oan ADN cña plasmit vi khuÈn x©m nhËp vµo c¸c tÐ bµo ngo¹i vi cña vÕt th­¬ng, di chuyÓn ®Õn tËn nhiÔm s¾c thÓ vµ g¾n nhËp vµo ADN cña nhiÔm s¾c thÓ cña c©y. VÒ sau, c¸c gen trong ADN plasmit ho¹t ®éng, cho ra c¸c protein, c¸c enzym do nh÷ng gen plasmit quy ®Þnh, to¹ nªn c¸c bÖnh môn cæ rÔ (tr­êng hîp nhiÔm A.tumefaciens), hoÆc bé rÔ tãc (tr­êng hîp nhiÔm A.rhizogenes). Lîi dông tÝnh chÊt chuyÓn gen qua Agrobacterim, c¸c nhµ kü thuËt gen ®· t¹o ra c¸c ADN plasmit mang c¸c gen cã lîi nh­ gen chèng chÞu c¸c chÊt ®éc, chÊt thuèc, gen cè ®Þnh ®¹m… vµo tÕ bµo thùc vËt th«ng qua Agrobacterim ®Ó t¹o nªn c¸c gièng c©y biÕn ®æi gen cã ®Æc tÝnh mong muèn. Mét trong c¸c môc tiªu quan träng cña c¸c nhµ t¹o gièng lµt¹o ®­îc c¸c gièng c©y trång kh«ng thuéc hä ®Ëu nh­ lóa, ng«, cã kh¶ n¨ng cè ®Þnh ®¹m cña kh«ng khÝ (tøc lµ biÕn ®æi N 2 cña kh«ng khÝ c¸c hîp chÊt h÷u c¬ chøa nit¬) b»ng ph­¬ng ph¸p chuyÓn c¸c gen cè ®Þnh ®¹m chøa trong plasmit cña vi khuÈn cè ®Þnh ®¹m céng sinh trong nèt sÇn cña rÔ c¸c c©y hä ®Ëu vµo c¸c tÕ bµo c©y chñ, tõ ®ã t¸i sinh vi nh©n gièng ra c¸c gièng lóa, ng« cã kh¶ n­ang cè ®Þnh ®¹m tõ N 2 kh«ng khÝ. 3.18.2 ChuyÓn gen trùc tiÕp tõ ADN §Ó chuyÓn ADN t¸i tæ hîp ngo¹i lai cã mang c¸c gen ®­îc thiÕt kÕ theo c¸c tÝnh tr¹ng mong muèn vµo tÕ bµo trÇn, ng­êi ta cã thÓ sö dông c¸c biÖn ph¸p hãa häc nh­ sö dông chÊt polytetylen glycol (PEG) v× chÊt nµy lµ biÕn ®æi mµng sinh chÊt t¹o ®iÒu kiÖn cho ADN x©m nhËp vµo tÕ bµo vµ vµo nhiÔm s¾c thÓ, hoÆc sö dông c¸c thÓ mì (liposome), tøc lµ c¸c h¹t cÇu cã cÊu t¹o mµng lipoproteit, trong ®ã chøa ADN t¸i tæ

78

hîp cÇn chuyÓn; c¸c h¹t liposome dÔ dµng x©m nhËp qua mµng sinh chÊt cña tÕ bµo trÇn ®Ó vµo trong tÕ bµo vµ g¾n vµo nhiÔm s¾c thÓ. Mét kü thuËt míi nhÊt vµ t­¬ng ®èi cã hiÖu qu¶ ®Ó ®­a ADN trùc tiÕp vµo tÕ bµo chñ lµ kü thuËt ®iÖn ®ôc lç, hay cßn gäi lµ ®iÖn thÈmthÊu, ®ã lµ kü thuËt cho mét tËp hîp tÕ bµo trÇn trong nu«i cÊy chÞu mét lo¹i xung ®éng ®iÖn trong thêi gian ng¾n víi ®iÖn thÕ cao, ®iÖn tr­êng sÏ lµm biÕn ®æi mµng sinh chÊt, t¹o nªn c¸c lç siªu vi ®Ó ph©n tö ADN cã thÓ x©m nhËp vµo trong tÕ bµo qua c¸c lç, sau ®ã mµng sÏ ®­îc kh«i phôc l¹i tr¹ng th¸i ban ®Çu vµ cctÕ bµo ®­îc chuyÓn ADN cã kh¶ n¨ng sèng vµ ph¸t triÓn. Kü thuËt chuyÓn gen nµy ®­îc ¸p dông cã kÕt qu¶ cho nhiÒu d¹ng c©y trång nh­ lóa, lóa m×, ng«, thuèc l¸, cµ chua… ®Ó t¹o c¸c gièng biÕn ®æi gen. §Ó chuyÓn gen vµo trong c¸c tÕ bµo t¹i c¸c m« in vitro, mµ kh«ng cÇn t¹o tÕ bµo trÇn, ng­êi ta sö dông ph­¬ng ph¸p b¾n “®¹n ADN” trùc tiÕp xuyªn qua v¸ch xenluloz vµ mµng sinh chÊt vµo tÕ bµo. “§¹n ADN” cã thÓ lµ c¸c viªn bi rÊt nhá b»ng vµng hoÆc b»ng tungsten bao bäc ADN cÇn chuyÓn. Ph­¬ng ph¸p nµy chuyÓn dÔ dµng ADN vµo trùc tiÕp c¸c m« trong c©y mµ kh«ng g©y hñy ho¹i cho tÕ bµo nhËn, nh­ vËy phÐp nghiªn cøu sù hiÓu biÓu hiÖn cña gen l¹ ngay trong c¸c c©y nhËn ë c¸c m« kh¸c nhau, hoÆc chuyÓn ADN trùc tiÕp vµo c¸c m« sÑo trong nu«i c©y, tõ ®ã t¸i sinh ra c©y biÕn ®æi gen. Ph­¬ng ph¸p b¾n “®¹n ADN” trùc tiÕp vµo m« ®­îc thùc hiÖn cã kÕt qu¶ ë nhiÒu lo¹i c©y trång nh­ ®Ëu t­¬ng, ng«, lóa, m×, ng«… Ngoµi ra, nhiÒu kü thuËt chuyÓn gen kh¸c còng ®­îc nghiªn cøu vµ ¸p dông nh­ ph­¬ng ph¸p vi tiªm, siªu ©m m«, thÊm m«…

79

Víi ký thuËt chuyÓn gen, c¸c nhµ t¹o gièng ®· t¹o hµng lo¹t gièng c©y biÕn ®æi gen cã n¨ng suÊt cao, phÈm chÊt tèt, ®¸p øng nhu cÇu ngµy cµng cao cña thÞ tr­êng, ®Õn møc ngµy nay khi nghe ®Õn thuËt ng÷ “s¶n phÈm biÕn ®æi gen”, ng­êi ta võa mõng võa lo. Mõng lµ ®­îc dïng c¸c s¶n phÈm ngon, rÎ, nhiÒu,nh­ng lo r»ng liÖu s¶n phÈm biÕn ®æi gen cã h¹i ®Õn søc khoÎ tr­íc m¾t vµ l©u dµi kh«ng, v× ®· cã mét sè tr­êng hîp sau khi ¨n s¶n phÈm biÕn ®æi gen (vÝ dô b¸nh bét ng« chuyÓn gen) ®· bÞ dÞ øng mét mái ph¶i tíi bÖnh viÖn ®iÒu trÞ. Tuy nhiªn, vÒ mÆt khoa häc vµ y häc ch­a cã c«ng tr×nh nµo chøng minh ch¾c ch¾n r»ng s¶n phÈm biÕn ®æi gen lµ cã h¹i cho søc khoÎ, mÆc dÇu trong mét sè s¶n phÈmbiÕn ®æi gen cã chøa mét sè protein ®Æc biÖt mµ hÖ enzym tiªu hãa kh«ng ph©n gi¶i ®­îc, cã thÓ ®i vµo m¸u g©y dÞ øng nh­ng t¸c ®éng cña chóng còng chØ gièng nh­ c¸c t¸c nh©n g©y dÞ øng kh¸c cã thÓ cã trong c¸c s¶n phÈm b×nh th­êng. §©y lµ mét sè tr­êng hîp c©y trång biÕn ®æi gen ®iÓn h×nh vµ ®· ®­îc ¸p dông vµo s¶n xuÊt: lóa (kh¸ng virut); ng« (kh¸ng s©u, kh¸ng thuèc diÖt cá, kh¸ng rirut, bÊt thô ®ùc, hµm l­îng axit amin; lyzin vµ triptophan cao); lóa m× (kh¸ng thuèc trõ s©u); c¶i dÇu (kh¸ng thuèc diÖt cá, thay ®æi thµnh phÇn axit bÐo vµ axit amin nh­ lyzn, metionin, bÊt dôc ®ùc, s¶n xuÊt enkephalin); h­íng d­¬ng (thay ®æi thµnh phÇn axit amin; metionin, zystein, kh¸ng thuèc diÖt cá); ®Ëu t­¬ng (kh¸ng thuèc diÖt cá, thay ®æi thµnh phÇn axit amin; metionin, xystein); c¶i cñ (kh¸ng thuèc diÖt cá vµ vi rót); khoai t©y (kh¸ng s©u, virut, kh¸ng thuèc diÖt cá, t¨ng hµm l­îng tinh bét, s¶n xuÊt anbumin huyÕt thanh ng­êi); cµ chua (kh¸ng s©u, virut, chÝn chËm); rau diÕp (kh¸ng vi rut); d­a chuét (kh¸ng virut); d­a t©y (kh¸ng virut vµ thuèc diÖt cá, chÝn chËm); thuèc l¸ (kh¸ng s©u, thuèc diÖt cá vµ rirut, s¶n xuÊt globulin miÔn dÞch), cá linh l¨ng (kh¸ng virut, thay ®æi thµnh phÇn axit amin: 80

metionin); hång (thay ®æi mµu s¾c c¸nh hãa); cóc (thay ®æi mµu s¾c canh hoa); liÔu (kh¸ng thuèc diÖt cá).

Tµi liÖu tham kh¶o 1. Andrea Satre, 2002, Transgenic Animals and Pharmaceutical production, Sience and Education. 2. Transgenic Animal Sicence: Principles and Methods, 3. Breekveldt J. Jongerden J. ,1998, Transgenic Animal inpharmaceutical production, Biotechnology and Development mornitor. No 36: 19-22. 4. http://www.pharming.com 5. Santanu

Banik.

2003.

Animal

pharming-protential

and

applications.Theory Manual- Genome analysis using molecular markers in farm animals 6. Kaul Gautam. 2003. Transgenesis: Technology and application.Theory Manual- Genome analysis using molecular markers in farm animals 7. H.Lodish and all 2000 Molecular cell Biology. 4 th Ed. Scientific American book Inc.New York 8. T.A. Brown. 1999 Genomes. John Whiley& Sons (ASIA) PTELTD. Singapo, New York

81