Министерство образования Российской Федерации Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. ...
40 downloads
246 Views
2MB Size
Report
This content was uploaded by our users and we assume good faith they have the permission to share this book. If you own the copyright to this book and it is wrongfully on our website, we offer a simple DMCA procedure to remove your content from our site. Start by pressing the button below!
Report copyright / DMCA form
Министерство образования Российской Федерации Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова
Кафедра химии и технологии тонких органических соединений
Н.А. Брагина, А.Ф. Миронов
МЕМБРАНОЛОГИЯ
Учебно-методическое пособие
Москва 2002 г.
2
99
Учебно-методическое пособие
УДК 547.9(075.8)
Брагина Н.А., Миронов А.Ф. "Мембранология". - Учебно-методическое пособие. Рецензент: Академик РАН, профессор, Д.х.н. Мирошников А.И. / ИПЦ МИТХТ, 2002, стр.98, рис. 46.
Брагина Наталья Александровна Миронов Андрей Фёдорович
Представлен курс лекций и контрольные вопросы по специальной дисциплине "Мембранология" магистерской программы 550528 “Химия и технология биологически активных веществ”. Учебно-методическое пособие предназначено магистрам для подготовки к занятиям и экзаменам, а также студентам высшей инженерной школы для самообразования и бакалаврам для осознанного выбора профиля специальной подготовки на третьей ступени высшего образования.
МЕМБРАНОЛОГИЯ
Главный редактор В.Д. Капкин Компьютерная верстка Д.В. Брагин
ЛР код 221 серия ИД № 03507
ISBN 5 – 230 – 22694 – 3 Утверждено БИК МИТХТ им. М.В. Ломоносова.
Подписано в печать __________. Формат 60×90/16.
Печать ризограф. Тираж 100 экз. Заказ № ____________. © МИТХТ им. М.В. Ломоносова, 2002, ISBN 5 – 230 – 22694 – 3 Издательско-полиграфический центр МИТХТ им. М.В. Ломоносова. 117571 Москва, пр. Вернадского, 86.
98
ЛИТЕРАТУРА Основная: 1. Геннис Р. Биомембраны: молекулярная структура и функции. – М.: Мир, 1997. 2. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. – М.: Просвещение, 1988. 3. Введение в биомембранологию. Под ред. А.А. Болдырева. – М.: Издво МГУ, 1990. 4. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К., Уотсон Дж.. Молекулярная биология клетки. В 5-ти т. - М.: Мир, 1987. 5. Ленинджер А. Основы биохимии. В 3-х т. - М.: Мир, 1988. 6. Чупин В.В. Роль липидов в структурной организации мембран и взаимодействии с белками. Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук. – М., 1997. 7. Бергельсон Л.Д. Мембраны. Молекулы. Клетки. - М.: Наука, 1982. Дополнительная: 1. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н.. Динамическая структура липидного бислоя. - М.: Наука, 1981. 2. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Липидный бислой биологических мембран. - М.: Наука, 1982. 3. Котык А., Яначек К. Мембранный транспорт. - М.: Мир, 1980. 4. Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками. - М.: Наука, 1986. 5. Липосомы в биологических системах. Под ред. Г. Грегориадиса, А. Аллисона. - М.: Медицина, 1983.
3
Содержание 1. Введение: основные типы и роль мембранных структур в клетке ........ 4 Необходимость присутствия биологических мембран в клетке ........... 4 Типы клеточных мембран......................................................................... 5 Функции биомембран................................................................................ 8 Методы выделения биологических мембран ......................................... 8 Состав биологических мембран ............................................................ 10 2. Мембранные липиды: структура и свойства ......................................... 10 2.1. Основные классы липидов биологических мембран .................... 11 Минорные компоненты ........................................................................... 17 2.2. Структурообразование липидов ..................................................... 18 3. Искусственные мембраны: условия их образования и использование в качестве модельных систем................................................................. 32 Мономолекулярные слои на границе раздела фаз воздух-вода........ 33 Плоские бислойные мембраны (БЛМ) .................................................. 36 Липосомы................................................................................................. 37 4. Структура биологических мембран ........................................................ 40 Жидкостно-мозаичная модель строения биомембран ........................ 40 Асимметрия биомембран ....................................................................... 44 5. Мембранные белки .................................................................................. 46 Принципы структурной организации мембранных белков .................. 46 Выделение и очистка мембранных белков........................................... 47 Характеристика очищенных интегральных мембранных белков. ...... 52 Определение молекулярной массы мембранных белков................... 52 Определение вторичной и третичной структуры мембранных белков .................................................................................................................. 56 Третичная и четвертичная структура мембранных белков................. 61 6. Электрические свойства мембран.......................................................... 65 7. Мембранный транспорт........................................................................... 68 7. 1 Пассивный транспорт через мембраны......................................... 69 7.2. Активный транспорт через мембраны. .......................................... 80 7.3 Мембранный транспорт макромолекул и частиц ........................... 83 8. Участие мембран в передаче межклеточной информации ................. 88 ЛИТЕРАТУРА ............................................................................................... 98
4
97
1. Введение: основные типы и роль мембранных структур в клетке
Таким образом, за проведение нервного импульса отвечает изменение проницаемости мембраны аксона. + Экспериментальные данные подтвердили тот факт, что катионы Na + и K проходят через мембрану нерва по разным каналам. Так, действие яда тетродотоксина, парализующего проведение нервного импульса, + блокирует проводимость Na -каналов, в то время как проводимость ио+ + нов K не затрагивается. Было подсчитано число Na -каналов в аксонах 2 кролика – оно не превышает 75 каналов на 1 мкм , скорость движения + Na соответствует механизму простой диффузии через белковый канал 8 -1 + (10 с ). Установлено, что число K -каналов много больше, но меньше проводимость этих ионов, что соответствует механизму транспорта ио+ нов K с помощью специальных переносчиков.
Биологические мембраны представляют собой специальные полупроницаемые барьеры, отделяющие внутриклеточное содержимое и содержимое внутриклеточных органелл от окружающей среды. Все биологические мембраны построены по единым принципам, а особенности структурной организации и функционирования обусловлены различиями в химическом составе мембран и специфичности межмолекулярных взаимодействий мембранных компонентов.
Необходимость присутствия биологических мембран в клетке В клетках прокариот (бактерии, риккетсии, микоплазмы) внутриклеточная дифференциация, а, следовательно, и внутриклеточные мембраны отсутствуют. Внутриклеточные органеллы характерны для клеток эукариот (растения, животные). Полагают, что одна из причин такого рода различий состоит в том, что линейные размеры клеток эукариот, как правило, на порядок больше размеров клеток прокариот. Вследствие этого удельная поверхность плазматической мембраны эукариот заметно меньше по сравнению с прокариотами. Развитая сеть внутриклеточных мембран позволяет увеличить удельную поверхность мембран в клетках эукариот и, таким образом, обеспечить оптимальные условия для протекания биохимических процессов на поверхности мембран и внутри отдельных компартментов. С химической точки зрения разделение клетки на отдельные отсеки исключительно выгодно для координированного и эффективного осуществления биохимических реакций. Во-первых, скорость ферментативных реакций увеличивается за счет локализации во внутриклеточных органеллах, внутренний объем которых значительно меньше общего объема клетки. Это приводит к увеличению концентрации ферментов и субстратов и, как следствие этого, скорости химических реакций. Во-вторых, мембраны внутриклеточных органелл могут физически разделять в пространстве прямые и обратные реакции метаболического цикла. Втретьих, большинство клеточных ферментов работают на поверхности мембран, что в значительной степени повышает эффективность катализа, так как трехмерная диффузия реагирующих веществ заменяется на двумерную. В-четвертых, в обычных условиях мембраны непроницаемы
5
4. После этих событий первоначальное значение потенциала очень быстро (тысячные доли секунды) восстанавливается, и аксон вновь готов к дальнейшему проведению импульса.
для многих веществ, в том числе для низкомолекулярных ионов, что позволило в процессе эволюции создать специальные механизмы преобразования энергии и передачи информации с использованием потенциальной энергии трансмембранного градиента концентраций некоторых веществ и ионов.
Мембранный потенциал, мВ
96
0
Типы клеточных мембран
Потенциал действия
Потенциал покоя
-70 0
1
2
3
Время, мс
Рис.46. Потенциал действия Аксон изолирован слоем шванновских клеток, подобных изоляционной ленте вокруг проводника, эта миелиновая оболочка не пропускает катионы. В результате перехода внутрь аксона большого количества ио+ + нов Na , в аксоне возникают продольные токи, т.е. ионы Na мигрируют в следующий соседний отсек аксона, находящийся в состоянии покоя. Потенциал в этом отсеке повышается, при достижении его значения + – 60 мВ открываются Na -каналы, потенциал достигает максимального значения и повторяется вся приведенная выше цепь событий в аксоне. Таким образом, по всей длине аксона распространяется волна потенциала действия. Этот процесс аналогичен тому, как огонь бежит по бикфордову шнуру. Скорость распространения - от 1 до 100 м/с в зависимости от типа аксона. Потенциал действия достигает конца аксона и дает сигнал для выброса в синаптическую щель нейромедиатора, который в следующей клетке возбуждает ту же цепь событий. После проведения импульса система возвращается в первоначальное равновесное состояние, гра+ + диенты концентраций катионов Na и K восстанавливает фермент + + Na ,K -АТФаза.
Эукариотические клетки содержат различные мембранные органеллы, причем каждая мембрана уникальна по своему составу, особенностям структурной организации и по характеру выполняемых функций. Рассмотрим кратко основные типы клеточных мембранных структур (рис.1). Плазматическая мембрана образует границу, на которой осуществляется контакт клетки с ее окружением. Она содержит компоненты, участвующие в межклеточных контактах и взаимодействиях, в системах гормонального ответа и транспорта как малых, так и больших молекул из клетки и внутрь нее. Плазматическая мембрана чрезвычайно эластична, благодаря чему животные клетки могут довольно сильно изменять свою форму без разрыва мембраны. Большинство растительных и бактериальных клеток, в отличие от животных, не способно менять свою форму, так как они окружены толстой, прочной и малоупругой оболочкой – клеточной стенкой. Плазматическая мембрана неоднородна по своему составу, она состоит из специализированных участков (апикальный, базолатеральный и синусоидный) которые имеют различное окружение. Плазматическая мембрана может иметь и специализированные структуры, например, микроворсинки, которые значительно увеличивают площадь поверхности мембраны, в результате чего повышается эффективность мембранного транспорта. Ядерная мембрана состоит из двух мембран, расстояние между которыми составляет от 40 до 70 нм. В некоторых местах наружная и внутренняя мембраны ядра смыкаются; здесь имеются поры, диаметр которых достигает 80 нм. Интересно, что расположение пор меняется на протяжении жизни клетки: в фазе роста они распределены беспорядочно по всей поверхности ядра, в остальных фазах клеточного цикла собираются в определенных местах, а во время деления – вовсе исчезают. Полагают, что поры позволяют комплексам мРНК-белок переходить из ядра в цитоплазму, а регуляторным белкам в обратном направлении. Ядерная мембрана выполняет не только защитную роль, но и служит передатчиком информации между ядром и остальной частью клетки.
6
95
тельно, и многие нейроны проводят сигналы пассивно, без усиления. Однако, для дальней связи такого пассивного распространения сигнала недостаточно, и поэтому у нейронов с длинными отростками в ходе эволюции выработался активный сигнальный механизм. Электрический стимул, сила которого превышает определенную пороговую величину, вызывает взрыв электрической активности, распространяющийся с большой скоростью вдоль плазматической мембраны нейрона. Эту бегущую волну возбуждения называют потенциалом действия или нервным импульсом. Потенциал действия передает информацию с одного конца нейрона на другой без затухания со скоростью до 100 м/с, а в некоторых случаях еще быстрее.
Рис.1. Схематическое изображение органелл эукариотических клеток животных и растений на основании данных электронной микроскопии Митохондрии осуществляют окислительное фосфорилирование, в результате чего в ходе окисления субстратов (NADH, сукцинат) образуется АТФ. Эти органеллы являются субклеточными частицами, которые образованы двумя мембранами – наружной и внутренней, разделенны-
Механизм передачи нервного импульса. 1. В состоянии покоя (при отсутствии возбуждения) между внутренней и наружной сторонами плазматической мембраны аксона поддерживается разность потенциалов (трансмембранный потенциал ∆Ψ), называемая потенциалом покоя, при котором суммарный ток различных ионов, пересекающих мембрану, равен нулю. Внутри мембраны присутствует отрицательный электрический заряд, ∆Ψ = – 70 мВ. При повышении потенциала до значения –60 мВ происходит возбуждение аксона, откры+ + + ваются потенциалзависимые каналы для катионов Na и K (Na -канал + считается быстрым, а K -канал медленным). 2. В начальный момент в мембрану аксона проникают в основном + ионы Na , что приводит к резкому увеличению мембранного потенциала и достижению его максимального значения (рис.46). Теперь для даль+ нейшего проникновения внутрь аксона ионам Na пришлось бы преодо+ левать градиент потенциала, поэтому поступление Na из наружной + среды прекращается и в этот момент Na -канал как бы закрывается. + + 3. Через K -канал во внешнюю среду вытекают ионы K по своему концентрационному градиенту до тех пор, пока внутри аксона не восстанавливается первоначальный отрицательный потенциал. Однако, про+ цесс поступления K во внешнюю среду продолжается несколько дольше, чем требовалось бы, и поэтому потенциал падает до уровня меньшего, чем значение потенциала покоя (рис.46). В этот момент аксон становится невозбудимым, т.е. лишается способности проводить нервный импульс.
94
7
Между смежными сегментами миелиновой оболочки остаются небольшие открытые участки аксона длиной около 1 мкм – перехваты Ранвье. Сигналы, проводимые нейронами, передаются от одной клетки к другой в местах контакта, называемых синапсами (места плотного контакта) (рис.45). Изменение электрического потенциала в пресинаптической мембране приводит к высвобождению нейромедиатора, который выходит через синаптическую щель и связывается с рецептором на постсинаптической мембране, что приводит к изменению электрофизиологического состояния постсинаптической клетки. Происходит превращение электрического сигнала в химический и далее химического – вновь в электрический.
ми некоторым промежутком. Наружная мембрана – гладкая, ее толщина равна примерно 7 нм, тогда как внутренняя мембрана образует многочисленные складки (кристы) и содержит ферменты, участвующие в транспорте электронов и синтезе АТФ. Внутренняя область митохондрий называется матриксом. Эндоплазматический ретикулум (ЭР) – это сложная сеть цистернообразных или трубчатых структур, которая занимает значительную часть внутреннего объема клетки. Основная роль ЭР состоит в том, что он служит местом биосинтеза белков (шероховатый ЭР, где расположены рибосомы), которые затем секретируются, включаются в лизосомы или в плазматическую мембрану. Области ЭР, не содержащие рибосом, называют гладким ЭР. Здесь протекают реакции детоксикации, биосинтез стеролов, десатурация жирных кислот. Аппарат Гольджи представляет собой сеть уплощенных мешков (цистерн), собранных в стопки. Основная его функция заключается в посттрансляционной модификации гликопротеинов, синтезированных в ЭР и предназначенных для секреции, включения в плазматическую мембрану или доставки в лизосомы. Эти органеллы содержат ферменты гликозидазы и гликозилтрансферазы, которые вступают в действие последовательно, по мере того как белок, подвергаемый процессингу, перемещается от начала аппарата Гольджи (цис-область) до его конца (транс-область). Фактически аппарат Гольджи состоит из совокупности отдельных мембран, образующих цистерны. Лизосомы ответственны за деградацию макромолекул и содержат ряд гидролитических ферментов, таких как протеазы и липазы. В лизосомах происходит также расщепление клеточных компонентов в ходе их жизненного цикла. Пероксисомы содержат окислительные ферменты, участвующие в деградации малых молекул, таких, как аминокислоты, ксантин, жирные кислоты. Их название связано с присутствием в них фермента каталазы, которая разлагает перекиси, образующиеся как побочные продукты при окислении. Хлоропласты – это органеллы, содержащие фотосинтетический аппарат. Они имеют наружную оболочку, образуемую двумя мембранами, и внутреннюю область – строму. В строме находятся тилакоидные мембраны, где локализованы компоненты системы фотосинтеза.
Окончание аксона нейрона А (пресинаптической клетки) Пузырьки, содержащие нейромедиатор Высвобождаемый нейромедиатор
Пресинаптическая мембрана Синаптическая щель Постсинаптическая мембрана Дендрит нейрона Б (постсинаптической клетки)
Рис.45. Синаптическая передача Причина возникновения электрического сигнала состоит в изменении электрического потенциала на плазматической мембране нейрона. Передача сигналов основана на том, электрическое возмущение, возникшее в одном участке клетки, распространяется на другие участки. Если нет дополнительного усиления, эти возмущения затухают по мере удаления от их источников. На коротких расстояниях затухание незначи-
93
8
Функции биомембран Основные функции, присущие биомембранам в клетке, состоят в следующем: 1. Мембраны представляют собой полупроницаемые барьеры – защитная функция для клеток и внутриклеточных органелл. 2. Мембраны осуществляют избирательный транспорт различных веществ внутрь клетки и из нее. 3. Передача информации посредством гормонов, медиаторов, нервного импульса. 4. Преобразование энергии (синтез АТФ осуществляется на внутренних мембранах митохондрий за счет энергии трансмембранного градиента концентраций протонов.) 5. Процессы молекулярного узнавания происходят на мембранах клеток, где располагаются рецепторы гормонов, молекулы иммунной системы. 6. Ферментативная деятельность мембран связана с координацией всех биохимических реакций, протекающих в клетке. Кроме основных, существуют и другие специальные функции мембран (мембраны кишечника, органов чувств, хлоропластов).
ками – нейронами. Существуют нейроны двух видов: чувствительные (передают высшим центрам нервной системы импульсы, возникающие на рецепторных мембранах под влиянием внешних раздражителей) и двигательные (передают импульсы от высших центров нервной системы к мышечным клеткам и секреторным органам). Любая нервная клетка состоит из тела и отростков различной длины. Тело клетки содержит все органеллы, присущие эукариотическим клеткам (ядро, митохондрии, ЭПР и др.), и служит биосинтетическим центром. Дендриты представляют собой систему ветвящихся отростков различной длины, которые отходят от тела нейрона и увеличивают поверхность, способную принимать сигналы от других клеток (рис.44).
Аксон (длина от долей миллиметра до метра и более)
Методы выделения биологических мембран Исследование мембран начинается с их выделения из природных источников и очистки от других клеточных компонентов. Для каждого типа клеточных мембран нужно подобрать условия препаративного выделения и очистки. 1. Процесс выделения клеток начинается с разрушения тканей и клеток, обычно путём гомогенизации. При работе с животными клетками этот процесс проводят в гомогенизаторах со стеклянными стенками и тефлоновым пестиком. При этом клетки разрушаются за счет сдвиговых усилий при продавливании суспензии через узкий зазор между пестиком и стенкой гомогенизатора. При такой обработке “срывается” плазматическая мембрана и разрушаются связи между различными органеллами при сохранении их целостности. Для разрушения клеток, имеющих стенку (таких как бактерии, клетки грибов и растительные клетки), требуются более жесткие условия. Например, обработка ферментами и буферами, растирание клеток в присутствии абразивных материалов, обработка ультразвуком и экструзия. Большое значение при разрушении клеток имеет правильный выбор среды. Для того чтобы сохранить целостность
Тело нейрона
Дендриты
Концевые веточки аксона
Рис.44. Строение нервной клетки Самый длинный из отростков называется аксоном; в процессе развития нервной клетки один из ее отростков начинает расти до тех пор, пока не достигает той точки, с которой ему предстоит поддерживать контакт. Длина аксона достигает размеров от долей миллиметра до 1.5 м (у человека). Аксон подобен телеграфному кабелю тем, что он хорошо изолирован. Изоляцию вокруг аксона создают специальные клетки, называемые шванновскими. Плазматическая мембрана этих клеток концентрическими слоями (до 100 слоев) плотно наматывается на аксон, образуя сегмент миелиновой оболочки длиной около 1 мм. Миелиновая оболочка состоит из липидно-белковых мембран, плохо пропускающих ионы, что практически полностью предотвращает утечку тока из аксона.
92
9
2+
биомембран для этого иона и постоянной работой ферментов Cа 2+ АТФаз. Резкое изменение в клетке концентрации ионов Cа происходит за счет специальных кальциевых каналов, которые в ответ на внешний 2+ стимул (например, деполяризацию) открываются и высвобождают Cа из внеклеточного пространства или из внутриклеточных депо, которыми служат цистерны ЭПР и иногда мембраны митохондрий. Белки-эффекторы. Синтез вторичных мессенджеров вызывает ответ биологической системы, который формируется через биохимическую модификацию специализированных молекул-эффекторов (рис.42). Ряд белковэффекторов осуществляет свои функции в результате реакций фосфорилирования своих субстратов цАМФ-зависимыми протеинкиназами. Молекула протеинкиназы состоит из двух субъединиц: регуляторной и каталитической. цАМФ связывается с регуляторной субъединицей, после чего происходит отделение каталитической субъединицы и фосфорилирование соответствующего белка. Диацилглицерины инициируют механизмы, в результате которых активируются два типа протеинкиназ: протеинкиназа С и цГМФ-зависимая киназа. Известно, что цГМФ активирует так называемые G-киназы, вызывающие фосфорилирование определенных белков, физиологическая роль которых пока не установлена. Таким образом, механизмы передачи информации в живых системах также универсальны, как передача генетического кода или трансформация энергии. Все громадное разнообразие сигналов, полученное различными рецепторами, преобразуется по единым механизмам за счет идентичности второй и третьей стадий передачи информации через мембрану (рис.42). Нервный импульс, синаптическая передача Природа создала два принципиально различных способа межклеточной сигнализации. Один из них состоит в том, что сообщения передаются при помощи электрического тока; во втором используются молекулы, передаваемые от одной клетки к другой (гормоны). В обоих случаях передача сигнала зависит от проницаемости мембран. Электрическая система передачи информации служит для передачи нервного раздражения и осуществляется специальными нервными клет-
мембранных органелл, следует использовать среду, изоосмотичную их внутреннему содержимому. Чаще всего для этого используют раствор 0.25 – 0.30 М сахарозы. 2. Разделение мембран в настоящее время чаще всего осуществляют различными методами центрифугирования. Мембранные частицы можно разделить по скорости их седиментации или по плавучей плотности. Первый метод называют зональным центрифугированием, и разделение происходит в соответствии со значениями коэффициента седиментации S; а второй – изопикническим центрифугированием, и разделение происходит в условиях равновесной плотности. На практике обычно применяют некий гибрид этих двух методов. Для выделения мембран из клеточных гомогенатов используют и другие методы: - Фазовое распределение. Разделение мембранных частиц происходит в соответствии с их поверхностными свойствами – с этой целью формируют два или три несмешивающихся слоя водных растворов различных полимеров (полиэтиленгликоля, декстрана, фиколла), и мембранные частицы разделяются в соответствии с их сродством к этим фазам. - Непрерывный электрофорез в свободном потоке. В этом случае разделение мембранных частиц происходит в соответствии с их электрическим зарядом. - Аффинная адсорбция. Разделение основано на биоспецифическом взаимодействии между мембранными компонентами и твердой фазой, к которой ковалентно присоединены антитела. Чаще всего метод используют для выделения мембранных белков. - Использование микрогранул силикагеля. Этот подход разработан специально для выделения плазматических мембран. Катионизированные микрогранулы силикагеля прочно адсорбируются на наружной поверхности плазматической мембраны интактных клеток, и фракция плазматических мембран, связанных с гранулами, легко отделяются в градиенте плотности сахарозы от других мембран за счет более высокой плотности гранул. 3. Определение чистоты мембранных фракций: наиболее объективным критерием чистоты выделенной мембранной фракции является присутствие в ней какого-либо уникального компонента, который содержится только в этой мембране или является в ней преобладающим. Обычно такими компонентами служат ферменты, называемые в этом случае маркерами. В ряде случаев более удобными мембранными мар-
10
91
керами являются специфические рецепторы лектинов, гормонов, токсинов или антител. Кроме того, если мембранная система хорошо охарактеризована, о чистоте можно судить по ее белковому составу. В некоторых случаях препарат характеризуют с помощью электронной микроскопии; а также по содержанию холестерина.
заны со стимулирующими рецепторами (Rs), а Gi-белки – с ингибирующими рецепторами (Ri). Взаимодействие сигнала с рецептором приводит к изменению конформации рецептора. Эта перестройка конформации рецептора передается G-белку, который в свою очередь изменяет конформацию и приобретает способность связывать ГТФ. Связывание G-белка ГТФ приводит к его активации, после чего он становится способен взаимодействовать с аденилатциклазой. При этом Gs-белки активируют аденилатциклазу, а Gi-белки, наоборот, ингибируют активность этого фермента. Аденилатциклаза осуществляет перевод АТФ в цАМФ, при этом две из трех фосфатных групп отделяются, а третий фосфат образует цикл с молекулой рибозы, соединяясь с ней через атомы кислорода (рис.43). Канал передачи информации включается при взаимодействии Gбелка с ГТФ и этого комплекса с аденилатциклазой. В ответ на это включение в клетке увеличивается или уменьшается концентрация вторичного мессенджера цАМФ, в результате чего информация проходит через мембрану. Согласно второму пути (рис.42), внешний сигнал после взаимодействия с рецептором через G-белок активирует фермент фосфодиэстеразу (фосфолипазу С), которая гидролизует фосфатидилинозитол-4,5дифосфат с образованием диацилглицерина и инозитолтрифосфата. 2+ Инозитолтрифосфат вызывает освобождение ионов Cа из мембран эндоплазматического ретикулума, по-видимому, связываясь со специальным рецептором. Несмотря на то, что процесс выброса ионов 2+ Cа из внутриклеточных депо под действием фосфоинозитидов обнаружен в целом ряде клеток, механизм, с помощью которого он открывает внутриклеточные кальциевые каналы, окончательно не выяснен. 2+ Кроме этого, для активации ионов Cа в клетке часто используется цАМФ. Так, адреналин приводит к повышению концентрации в клетках миокарда цАМФ, который открывает кальциевый канал, а вход в миоцит 2+ ионов Cа усиливает сокращение сердечной мышцы. Аналогичный механизм обнаружен в ряде мышечных клеток, в секреторных и нервных 2+ клетках. В настоящее время Cа признан универсальным вторичным мессенджером, участвующим практически во всех регуляторных процессах – от мышечного сокращения и нервного проведения сигнала до передачи митогенного стимула в клетках иммунной системы. Низкая кон2+ центрация ионов Cа в клетке поддерживается низкой проницаемостью
Состав биологических мембран Все биологические мембраны содержат липиды, белки и углеводы. Основными компонентами мембран являются белки и липиды, а на долю углеводов может приходиться около 10% массы мембран. При этом углеводы всегда входят в состав гликопротеинов или гликолипидов. Кроме того, еще одним химическим компонентом биологических мембран является вода, молекулы которой прочно связываются с поверхностью мембран и образуют слой так называемой мембраносвязанной воды. Соотношение между белками и липидами в составе различных мембран может варьировать в достаточно широких пределах. Так, миелиновая мембрана выполняет роль изолятора, и содержание белков в ней невелико (около 18 %), а внутренняя мембрана митохондрий, где протекают многие биохимические процессы, характеризуется значительно более высоким содержанием белков (до 80 %).
2. Мембранные липиды: структура и свойства Совершенно очевидно, что липидный состав различных мембран не является случайным, однако точного объяснения этому феномену пока не найдено. Наиболее поражает в мембранных липидах их огромное разнообразие – любая конкретная мембрана может содержать более ста разных типов липидных молекул. Становится все более очевидным, что липиды активно участвуют в процессах, протекающих в мембранах, однако причины их разнообразия все-таки не ясны. Основная функция мембранных липидов состоит в формировании бислойного матрикса, с которым взаимодействуют белки.
11
90
Роль вторичных мессенджеров выполняет небольшое число молекул. В настоящее время известно всего лишь два пути передачи сигнала, отличающихся по участию различных вторичных мессенджеров (рис.42). В первом случае это циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) (рис.43). Во втором случае действует комбинация трех вторичных мессенд2+ жеров: Cа , инозитолтрифосфата и диацилглицерина. Два последних вещества образуются из мембранных фосфолипидов. Кроме того, полагают, что в клетках нервной ткани роль вторичного мессенджера может играть циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ) (рис.42). NH2
АТФ
O
N
N
O
O
NH2
цАМФ
N
N
N
N
-
O P O P O P O CH2 -
O
-
O
-
O
Структура O
OH
O P
+
CH2OCOR1
O
Название
H
O OH
Глицерофосфолипиды – это наиболее распространенные полярные липиды в мембранах. Одна из гидроксильных групп глицерина связана с полярной группировкой, содержащей фосфат, а две другие – с гидрофобными остатками. Номенклатура глицеридов основана на системе стереоспецифической нумерации (sn–система): если глицерин изобразить в проекции Фишера, так что центральная группа будет расположена слева, то атомы углерода будут нумероваться так, как показано на рис 2. В литературе встречается несколько систем стереоспецифических обозначений: sn, D/L и R/S. Природные фосфолипиды обычно имеют R- (или D)-конфигурацию. У большинства фосфоглицеридов фосфатная группа находится в sn-3положении глицерина; она обычно связана с какой-либо из групп (холиновой, этаноламиновой, мио-инозитольной, сериновой или глицериновой), представленных на рис.2.
CH2
аденилатциклаза
O
N
N
2.1. Основные классы липидов биологических мембран
OH
-
O
R 2OCO C H CH2
(ФК) (ФХ)
CH2CH2N (CH3)3
Фосфатидилхолин
CH2CH2NH2
Фосфатидилэтаноламин (ФЭА)
CH2 CH COOH
Фосфатидилсерин
(ФС)
Фосфатидилглицерин
(ФГ)
Фосфатидилинозит
(ФИ)
-
NH2 CH CH2OH
O
Рис.43. Химическая структура цАМФ Активация вторичных мессенджеров, как правило, связана с химическими реакциями переноса и рекомбинации фосфатных групп. Предшественниками вторичных мессенджеров являются высокофосфорилированные соединения. Так, усилительный фермент аденилатциклаза превращает аденозинтрифосфат (АТФ) в цАМФ, а другой усилительный фермент – фосфолипаза C (фосфодиэстераза) – расщепляет фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат на диацилглицерин и инозитолтрифосфат. ГТФ превращается в цГМФ с помощью фермента гуанилатциклазы, которая в отличие от аденилатциклазы не связана с мембранными рецепторами. Было установлено, что G-белки образуют две группы: Gстимулирующие белки (Gs) и G-ингибирующие белки (Gi); Gs-белки свя-
O O P O
Фосфатидовая кислота
CH2
OH OH
OH OH
OH
OH O CH2 O P O CH2
CH2OCOR 1 R2OCO C H CH2
O
CHOH
-
O H C OCOR 2 Дифосфатидилглицерин (ДФГ)
O P O CH2 -
O
Рис.2. Глицерофосфолипиды
CH2OCOR 1
(Кардиолипин)
12
89
Длинные углеводородные цепи, находящиеся в sn-1- и sn-2положениях глицерина, могут присоединяться за счет сложноэфирной и простой эфирной связей. Эти цепи значительно различаются по длине, разветвленности и степени ненасыщенности. Жирные кислоты почти всегда содержат четное число атомов углерода в пределах от 14 до 20. Наиболее распространены кислоты С16, С18 и С20. Степень ненасыщенности может быть разной, но чаще всего встречаются ненасыщенные кислоты 18:1, 18:2, 18:3 и 20:4. Почти все природные кислоты характеризуются цис-конфигурацией двойных связей, эти связи являются несопряженными. Углеводородная цепь в цис-конфигурации имеет излом, что нарушает упаковку липидных молекул в бислое. В молекуле природных фосфолипидов обычно имеется одна насыщенная и одна ненасыщенная цепи. В случае животных клеток ненасыщенные цепи располагаются в sn-2-положении глицерина. В фосфолипидах некоторых бактериальных мембран обнаружены разветвленные цепи, а также цепи, содержащие циклы (например, циклопропан), и гидроксильные группы в βположении. У археобактерий глицерофосфолипиды имеют обращенную стереоконфигурацию, при которой фосфорильные группы находятся в sn-1-положении глицеринового остатка. Простейший представитель глицерофосфолипидов – фосфатидовая кислота (ФК), в которой фосфатная группа этерифицирована только остатком глицерина. Фосфатидовая кислота найдена во многих природных источниках – тканях животных, растений и микроорганизмах; ее содержание невелико (1-5% от общего количества фосфолипидов). ФК является предшественником в биосинтезе других фосфолипидов. Фосфатидилхолин (ФХ) является основным мембранным компонентом клеток высших животных и растений, его содержание достигает более 50% от суммы фосфолипидов. В бактериальных клетках ФХ не содержится. Фосфатидилэтаноламин (ФЭА) содержится в тканях животных и растений в меньших количествах, чем ФХ (15 –30% от общего количества фосфолипидов), но является одним из основных компонентом мембран бактериальных клеток. Фосфатидилсерин (ФС) является, как правило, минорным мембранным компонентом, но входит в состав мембран практически всех прокариотических и эукариотических клеток. Больше всего ФС найдено в мозге млекопитающих (около 15 % от суммы фосфолипидов), в тканях сердца, печени, почек содержание ФС составляет менее 10%. ФС участ-
В ответ на получение сигнала происходит биохимическая модификация специализированных молекул-эффекторов, через которые и формируется ответ биологической системы (рис.42). Следующий этап – передача информации в центр переработки с помощью вторичных мессенджеров (посредников). Именно по такому принципу функционируют нервная, гормональная и иммунная системы животных, на такие же стадии могут быть разложены и фотобиологические процессы, протекающие как в организмах животных, так и в растениях. Общий принцип действия всех систем приема и передачи информации – не только химическая модификация мембранных белков, но и изменение концентрации заряженных ионов внутри и вне клетки, формирование трансмембранного потенциала. В последнее время выяснилось, что этот процесс играет важную физиологическую роль не только в нервной ткани, но и при переработке информации в тромбоцитах, лимфоцитах, тучных клетках. Первым компонентом в схеме, представленной на рис.42, является рецептор. Рецептор, как правило, представляет собой интегральный белок. На поверхности мембраны он имеет своеобразное “приемное устройство”, способное распознавать сигнал и взаимодействовать с ним. При этом сам сигнал, будь это химическое вещество (гормон) или квант света, обычно не проникает внутрь клетки, а преобразуется в результате модификации мембранных белков, которая приводит к активации молекул посредников – вторичных мессенджеров. В общем виде передача сигнала через мембрану может быть сведена к трем основным стадиям: 1) взаимодействие рецептора с сигналом; 2) конформационная перестройка и изменение функции специализированных мембранных белков-посредников; 3) активация вторичных мессенджеров – сравнительно небольших молекул и ионов, диффузия которых в клетке к определенным субклеточным структурам обеспечивает стремительное распространение сигнала. G-белки и вторичные мессенджеры. От первого звена - рецептора (R) сигнал поступает на так называемые N- или G-белки – мембранные белки, активирующиеся при связывании гуанозинтрифосфата (ГТФ). G-белки способны передавать информацию “усилительному” ферменту, который, функционируя на внутренней стороне мембраны, активирует вторичные мессенджеры.
88
13
8. Участие мембран в передаче межклеточной информации
вует в процессах биосинтеза, а также является регулятором активности ряда мембраносвязанных ферментов. Фосфатидилинозит (ФИ) присутствует почти во всех животных и растительных тканях, а также в ряде микроорганизмов. Больше всего ФИ содержится в мозге млекопитающих и в нервных тканях. Фосфатидилглицерин (ФГ) является основным компонентом бактериальных мембран (70% от суммы фосфолипидов). Много ФГ (20-30%) содержится также в растениях, в животных тканях ФГ найден в минорных количествах (преимущественно в митохондриях). Дифосфатидилглицерин (ДФГ), называемый также кардиолипином, имеет в своем составе три остатка глицерина, четыре остатка жирных кислот и две фосфатные группы. ДФГ содержится в большом количестве во внутренней мембране митохондрий, в мембране хлоропластов и в некоторых бактериальных мембранах, но редко встречаются в других мембранах. Гликоглицеролипиды – это нейтральные липиды, у которых в sn3-положении глицерина находится углевод, присоединенный с помощью гликозидной связи, например, галактоза (рис.3). Гликоглицеролипиды широко представлены в мембранах хлоропластов растений (моногалактозилдиглицерид составляет половину от всех липидов тилакоидной мембраны), они обнаружены также в заметных количествах в сине-зеленых водорослях и бактериях. Для мембран грамположительных бактерий характерны гликоглицеролипиды с большим разнообразием сахаров. В мембранах животных клеток гликоглицеролипиды встречаются редко.
Важное свойство всех живых существ – способность воспринимать, перерабатывать и передавать информацию при помощи биологических мембран. Несмотря на громадное разнообразие различных систем получения и переработки информации, функционирующих в животных и растительных организмах, все они основаны на едином принципе. Процесс получения информации, как правило, начинается с взаимодействия сигнала (химического агента, кванта света, механического воздействия и т.п.) с рецептором – мембранным белком.
Рис.42. Схема трансмембранной передачи сигнала в клетке
87
14
Структура
H2COH O
HO
Название
O CH2 CHOCOR2
OH
Моногалактозилдиглицерид (МГДГ)
CH2OCOR1 OH H2COH O
HO OH
O
Дигалактозилдиглицерид
CH2 O
OH HO
O CH2
(ДГДГ)
CHOCOR2
OH
CH2OCOR1 OH H2C
SO3H O
OH
Сульфолипид
OH
O CH2 OH
CHOCOR2 CH2OCOR1
Рис.3. Гликоглицеролипиды Сфинголипиды также являются важными мембранными компонентами. Они представляют собой производные С18-аминоспирта – сфингозина, имеющего транс-конфигурацию двойной связи. N-ацилированное производное сфингозина принято называть церамидом. Церамид (гидрофобная часть) может быть связан с различными полярными головками, поэтому сфинголипиды разделяют на фосфосфинголипиды и гликосфинголипиды (рис.4).
но поглощать крупные частицы. Эту роль у млекопитающих выполняют 2 класса лейкоцитов – макрофаги и полиморфноядерные лейкоциты, защищая организм от вторгшихся микроорганизмов. Макрофаги также утилизируют старые или поврежденные клетки и клеточные обломки. Важная особенность как экзоцитоза, так и эндоцитоза состоит в том, что секретируемые или поглощаемые макромолекулы локализуются в мембранных пузырьках и не смешиваются с другими макромолекулами или органеллами клетки. С помощью неизвестного механизма каждый пузырек сливается только со специфическими мембранными структурами, что гарантирует правильный перенос макромолекул. Экзоцитоз и эндоцитоз не повторяют друг друга в обратном порядке из-за наличия стадии слипания бислоев, и благодаря такому различию, по-видимому, могут регулироваться независимо друг от друга. Вопросы для самостоятельной работы. 1. Как осуществляется пассивный транспорт гидрофобных и гидрофильных веществ? 2. Что такое облегченная диффузия? 3. Опишите механизм работы белков-переносчиков? 4. Что такое ионофоры, какой принцип их действия? 5. Опишите облегченную диффузию с участием мембранных каналов. 6. Приведите примеры каналообразующих ионофоров. 7. Какие источники энергии для активного транспорта используют клетки? + + 8. Назовите функции Na ,K -насоса в клетке. + + 9. Опишите механизм работы Na ,K -насоса в клетке. 10. Приведите другие примеры активного транспорта в клетке. 11. Что такое экзоцитоз и эндоцитоз? 12. В чем особенности индуцированного экзоцитоза? 13. Что такое адсорбционный эндоцитоз? Приведите примеры. 14. Что такое фагоцитоз и какова его роль в организме?
15
86
каймой. Окаймленные ямки и пузырьки обеспечивают протекание процесса, называемого опосредуемый рецепторами эндоцитоз или адсорбционный эндоцитоз: поглощаемые молекулы связываются со специфическими белками-рецепторами, локализованными в окаймленных ямках (рис.41). Этот процесс представляет собой избирательный концентрирующий механизм, позволяющий клеткам захватывать большие количества специфических лигандов без поглощения соответственно большого объема внеклеточной жидкости.
Название
Структура
Церамид (Сеr) Фосфосфинголипиды
H
O
+
CH3(CH2)12 CH CH CH OH CH3(CH2)n
C O
P OCH2CH2N (CH3)3 Сфингомиелин -
O O
NH C H CH2 O
Cer-1-фосфорилэтаноламин
P OCH2CH2NH2 -
O
Гликосфинголипиды β
D Gal
β
D Glc
Галактозилцерамид Глюкозилцерамид
Ганглиозиды Glc Glc
Gal
NeuNAc
Gal
GalNAc
GM3 GM2
NeuNAc Glc
Gal
GalNAc
NeuNAc
Gal
GM1
Рис.4. Сфинголипиды Рис.41. Схема адсорбционного эндоцитоза холестерина Примером данного процесса служит поглощение животными клетками холестерина из внеклеточной среды, за счет этого обеспечивается большая часть потребности клеток в холестерине для синтеза мембран. Если этот процесс по какой-то причине заблокирован, то холестерин накапливается в крови и увеличивает риск атеросклероза. Основная часть холестерина переносится кровью в виде комплексов с белком, которые известны под названием - ЛНП - липопротеины низкой плотности. Эти комплексы представляют собой большие сферические частицы (22 нм в диаметре), каждая из которых имеет сердцевину, заполненную 1500 молекулами холестерина, связанного сложноэфирными связями с длинными цепями жирных кислот. Сердцевина ЛНП окружена липидным бислоем, содержащим белок одного-единственного типа. Фагоцитоз у простейших организмов представляет собой форму питания, у млекопитающих большинство клеток не способно эффектив-
Фосфосфинголипиды имеют такие же полярные головки, как и глицерофосфолипиды, а их гидрофобная часть представлена церамидом. В плазматических мембранах животных клеток широко распространен сфингомиелин (церамид-1-фосфорилхолин). Основными жирнокислотными компонентами в миелине являются кислоты 24:1 и 24:0. В мембранах растительных и бактериальных клеток фосфосфинголипиды встречаются редко. Кроме сфингомиелина известны и другие фосфосфинголипиды, например церамид-1-фосфорилэтаноламин, церамид-1фосфорилинозитол и церамид-1-фосфорилглицерин. Гликосфинголипиды содержат углеводы, присоединенные с помощью гликозидной связи к концевой гидроксильной группе церамида. Их классифицируют в соответствии с размером углеводной части, которая может быть представлена всего лишь одним моносахаридным остатком или сложным углеводным полимером. Моногликозилцерамиды обычно называют цереброзидами. Среди них наиболее распространены галакто- и глюкоцереброзиды. Цереброзиды, в отличие от фосфолипи-
16
85
дов, являются нейтральными липидами, они найдены в тканях животных, растений и микроорганизмах. Ганглиозиды представляют собой класс анионных гликосфинголипидов - церамид связан с олигосахаридом, в состав которого входит один или несколько остатков сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты, NeuNAc). Структура ганглиозидов GM1, GM 2, GM 3 (всего обнаружено свыше 60 ганглиозидов) показана на рис.4. Впервые ганглиозиды были обнаружены в ганглиях, откуда и произошло их название. Наиболее богат ганглиозидами мозг, были обнаружены они и в других тканях (почки, печень, легкие и т.д.). Биологическое значение ганглиозидов до настоящего время установлено далеко не полностью. Ганглиозиды локализуются в плазматических мембранах и отвечают за контактное торможение, адгезию и электрофоретическую подвижность клеток, а также участвуют в процессах избирательного транспорта ионов и обладают иммунной активностью.
Эндоцитоз – клетки способны также поглощать макромолекулы и частицы, используя в обратной последовательности сходный механизм: поглощенное вещество постепенно окружается небольшим участком плазматической мембраны, которая сначала впячивается, а затем отщепляется, образуя внутриклеточный пузырек, содержащий захваченный клеткой материал (рис.40). В зависимости от размера образующихся пузырьков различают 2 типа процесса эндоцитоза: 1) пиноцитоз – поглощение жидкости и (или) растворенных веществ с помощью небольших пузырьков; 2) фагоцитоз – поглощение больших частиц, таких как микроорганизмы или обломки клеток. Большинство эндоцитозных пузырьков в конце концов сливается с первичными лизосомами. При этом образуются вторичные лизосомы, в которых переваривается большая часть макромолекулярного содержимого пузырьков. После этого основная часть мембранных компонентов пузырьков каким-то образом возвращается в плазматическую мембрану. Эндоцитоз
HO
HO
Холестерин
Ситостерин Рис.40. Схема эндоцитоза
HO
HO
Стигмастерин Рис.5. Стеролы
Эргостерин
Эндоцитоз, также как и экзоцитоз, представляет собой локальную ответную реакцию плазматической мембраны. Большинство животных клеток непрерывно осуществляют эндоцитоз фрагментов своей плазматической мембраны. Таким путем поглощается также внеклеточная жидкость и растворенные в ней вещества. При эндоцитозе одни пузырьки образуются из гладких участков плазматической мембраны, а другие – из ее окаймленных участков, называемых окаймленными ямками. Согласно данным электронной микроскопии эти участки со стороны цитоплазмы окружены щетинообразной
84
17
Например, для секреции инсулина клетки упаковывают его во внутриклеточные пузырьки, которые сливаются с плазматической мембраной и открываются во внешнеклеточное пространство, высвобождая при этом молекулы инсулина. Во всех эукариотических клетках имеются специальные везикулы, переносящие аналогичным образом от аппарата Гольджи к плазматической мембране ее вновь синтезированные компоненты. Таким образом, путь синтезированных в клетке молекул – это адсорбция на поверхности клетки в качестве ее новых компонентов, либо экзоцитоз в интерстициальную жидкость или в кровь питательных веществ и сигнальных молекул. Процесс слияния двух мембран состоит из двух фаз и начинается с того, что эти мембраны приходят в близкое соприкосновение друг с другом (слипание бислоев). Электронная микрофотография регистрирует при этом появление пятислойной мембранной структуры, однако ее существование кратковременно. Затем слипшиеся бислои быстро перестраиваются и объединяются, образуя одну непрерывную мембрану, вследствие чего секреторные пузырьки открываются во внеклеточное пространство. Процессы слипания и объединения бислоев представляют собой фундаментальные процессы, лежащие в основе эндоцитоза и экзоцитоза, деления и слияния клеток. Индуцированный экзоцитоз. Было установлено, что одни вещества непрерывно секретируются клетками, тогда как другие запасаются в секреторных пузырьках и высвобождаются только после получения клеткой соответствующего сигнала извне. Этот сигнал к секреции часто представляет собой химический медиатор, например, гормон, связывающийся с рецепторами на поверхности клетки. В результате происходит активация рецепторов, которая вызывает обычно кратковременное повышение концентрации сво2+ бодных ионов Cа в цитозоле, а это в свою очередь индуцирует про2+ цесс экзоцитоза. Представляется вероятным, что ионы Cа действуют в ограниченной области секретирующей клетки, инициируя локальный ответ части цитоплазмы и располагающейся над ней плазматической мембраны. Этот вывод был сделан в опытах с тучными клетками, секретирующими гистамин в ответ на связывание специальных лигандов с рецепторами на их поверхности. Если тучные клетки инкубировали в среде, содержащей растворенный стимулятор, то экзоцитоз наблюдался по всей клеточной поверхности. В другом случае стимулятор был закреплен на подложке, и экзоцитоз ограничивался местом контакта с подложкой.
Стеролы являются нейтральными липидами, которые присутствуют во многих мембранах растений, животных и микробов. Самым распространенным из стеролов является холестерин (рис.5). Его молекула состоит из компактного, жесткого гидрофобного ядра, а полярной головкой служит гидроксильная группа. Холестерин содержится в плазматических мембранах животных клеток (около 30 % общей массы липидов), в лизосомах, эндосомах, аппарате Гольджи. В высших растениях обнаружены другие стеролы, чаще всего ситостерол и стигмастерол. В мембранах дрожжей и других эукариотических микроорганизмов часто содержится эргостерол (рис.5).
Минорные компоненты В мембранах присутствуют также и другие липиды, которые относят к разряду минорных вследствие их малого содержания в мембранах. В очень малых количествах обнаруживаются свободные жирные кислоты и лизофосфолипиды. Минорными компонентами также являются моноацил- и диацилглицерины (выполняют функцию вторичных посредников в передаче сигнала через мембрану). В мембранах обычно присутствуют и полиизопреноидные липиды, к которым относятся убихиноны и менахиноны – компоненты цепи электронного транспорта в мембранах. Вопросы для самостоятельной работы. 1. Объясните необходимость присутствия биологических мембран в клетках эукариот. 2. Укажите основные органеллы животных и растительных клеток и выполняемые ими функции. 3. Назовите основные этапы и методы выделении клеточных мембран. 4. Что такое мембранные маркеры? 5. Перечислите основные функции биомембран. 6. Каковы особенности состава биологических мембран? 7. Назовите основные классы мембранных липидов. 8. Приведите примеры полярных и нейтральных липидов. Какие функции выполняют эти липиды в мембранах? 9. В чем особенности жирнокислотного состава мембранных липидов? 10. Перечислите минорные компоненты биомембран.
18
83
+
2.2. Структурообразование липидов Поведение липидов в воде Наличие в молекуле липидов двух частей - гидрофильной полярной головки и длинных гидрофобных углеводородных заместителей определяет способность этих соединений к структурообразованию в воде. Липиды - амфифильные вещества, они плохо растворимы как в полярных, так и в неполярных растворителях. Самым энергетически выгодным состоянием является мономолекулярный слой на границе раздела между полярной и неполярной средой. Если поместить липиды в водную среду, их молекулы образуют агрегаты – мицеллы, в которых полярные головки липидов обращены наружу, а неполярные углеводородные цепи упрятаны внутрь. В неполярной среде мицеллы оказываются вывернутыми наизнанку, такие мицеллы называют обращенными (рис.6). При увеличении концентрации липидов в воде мицеллы слипаются, и при этом возникает плоский бимолекулярный слой (сокращенно бислой). Характерный признак липидов, которые образуют бислой – исклю-10 чительно низкая критическая константа мицеллообразования – 10 М. Толщина липидного бислоя определяется длиной углеводородных цепей и составляет 4-5 нм, но зависит от плотности упаковки липидных молекул в бислое. Неполярный растворитель + следы воды Полярная головка
Вода
+
нов H . Градиент концентраций H возникает на отдельных этапах транспорта электронов в процессе окислительного фосфорилирования у бактерий и в митохондриях высших организмов или фотосинтеза в хлоропластах растений, а также с помощью фотоактивируемого протонного насоса (бактериородопсина) у Halobacterium.
7.3 Мембранный транспорт макромолекул и частиц Транспортные белки обеспечивают проникновение через клеточные мембраны многих полярных молекул небольшого размера, однако они не способны транспортировать макромолекулы, например, белки, полинуклеотиды или полисахариды. Тем не менее, в большинстве клеток определенные макромолекулы могут проходить в двух направлениях через плазматические мембраны, а некоторые клетки даже способны поглощать большие клеточные частицы. Механизмы этих процессов значительно отличаются от механизмов транспорта небольших молекул или ионов. Экзоцитоз представляет собой механизм секреции макромолекул из клетки во внешнюю среду. При переносе макромолекул во внешнюю среду происходит последовательное образование и слияние окруженных мембраной пузырьков (везикул) с плазматической мембраной (рис.39): Экзоцитоз
H 2O n
Обращенная мицелла
Углеводородный хвост, Липид
Цитоплазма
Мицелла классического типа
Рис.6. Липидные мицеллы в воде и неполярных растворителях
Рис. 39. Схема экзоцитоза
19
82
3 Na
+
Участок связывания + K и уабаина
Градиент концентрации ионов натрия
Градиент концентрации ионов калия
ATP Участок + связывания Na
ADP + PI +
2 K
ЦИТОПЛАЗМА +
+
Рис.38. Схематическое изображение работы фермента Na ,K -АТФ-азы +
+
Работающий Na ,K -насос можно воссоздать из очищенного фермента АТФ-азы. Для этого АТФ-азу солюбилизируют в избытке детергента, подвергают очистке и смешивают с соответствующими фосфолипидами. После удаления детергента диализом образуются мембранные 2+ + пузырьки, которые в присутствии АТФ и Mg перекачивают катионы Na + и K в противоположных направлениях. + + Таким образом, биологическая функция Na ,K -насоса состоит в гидролитическом расщеплении АТФ и использовании высвобождающей+ ся при этом свободной энергии для перекачивания ионов K из окру+ жающей среды внутрь клетки, а ионов Na - из клетки во внешнеклеточное пространство. В различных клеточных мембранах важную роль играют АТФ-азы, + 2+ транспортирующие другие катионы (Н , Са ). + Н -АТФ-синтетазы. В плазматических мембранах аэробных бактерий и во внутренних мембранах митохондрий и хлоропластов эукариотических клеток присутствуют ферменты АТФ-синтетазы, которые катализируют синтез АТФ из АДФ и фосфата. Этот процесс осуществляется благодаря наличию на этих мембранах градиента концентраций прото-
При дальнейшем увеличении концентрации липидов в воде бислои, наслаиваясь друг на друга, образуют многослойные липидные структуры. Если такую взвесь осторожно перемешивать, то происходит замыкание этих структур с образованием частиц более или менее сферической формы – липосом. Липосомы состоят из ряда концентрических бимолекулярных липидных слоев, разделенных водным пространством; расстояние между слоями составляет 15-20 Å, диаметр липосом 5-50 мкм. Движущей силой образования липидМультиламеллярная фаза ных агрегатов в водной среде являются гидрофобные взаимодействия. Гидрофобными взаимодействиями называют спеДобавление воды цифический эффект, проявляющийся в водных средах при наличии в молекулах гидрофобных групп. Контакт с молекулами воды гидрофобных радикалов “невыгоден” молекулам воды, которые образуют воМоноламеллярные дородные связи межМногослойные липосомы липидные везикулы ду собой и другими гидрофильными групРис.7. Структуры, образуемые липидными пами в растворе. Побислоями в избытке воды этому термодинамически более выгодно в водном растворе объединение гидрофобных радикалов в агрегаты для сведения к минимуму их контактов с водой. К другим факторам, стабилизирующим гидратированные липидные агрегаты, относятся: -Ван-дер-ваальсовы силы - слабые короткодействующие силы притяжения между соседними гидрофобными цепями. Притяжение возникает за счет взаимодействия между индуцированными диполями.
20
81
-Водородные связи – образуются между полярными головками некоторых липидов (например, между молекулами ФЭА). В ряде случаев мостики между отрицательно заряженными липидами образуются с помощью двухвалентных катионов. Однако все эти силы по своей стабилизирующей способности значительно уступают гидрофобным взаимодействиям.
Na ,K -насос - Na ,K -АТФ-аза Натриево-калиевые насосы, имеющиеся в плазматических мембранах всех животных клеток, работают по принципу антипорта, активно вы+ + качивая катионы Na из клетки, а K - в клетку против градиентов их кон+ центраций (а в случае Na и против электрического градиента). + + + + Градиенты концентраций ионов Na и K , поддерживаемые Na ,K насосом, ответственны в клетке не только за ее мембранный потенциал (цитоплазма клетки заряжена отрицательно по отношению к внешнеклеточному пространству), но и за регуляцию клеточного объема (явление осмоса), а также за активный транспорт сахаров и аминокислот по механизму симпорта. + + Механизм работы Na ,K -насоса. Экспериментально установлено и до+ + казано, что источником энергии для работы Na ,K -насоса служит гид+ + + + ролиз АТФ. Na ,K -насос представляет собой фермент - Na ,K -АТФазу. Этот фермент состоит из 2-х субъединиц: трансмембранной, обладающей каталитической активностью (100000 Д), и ассоциированного с ней гликопротеина (45000 Д). Каталитическая субъединица имеет участ+ ки связывания на наружной поверхности цитоплазмы для ионов Na и + АТФ, а на внутренней – для ионов K и ингибитора фермента – уабаина (рис.38). Функция гликопротеина остается пока невыясненной. + + Установлено, что работа Na ,K -насоса происходит следующим образом (рис.38): + - Концевая фосфатная группа АТФ в присутствии ионов Na переносится на остаток аспарагиновой кислоты в молекуле фермента + + + Na ,K -АТФ-азы. Na -зависимое фосфорилирование, вероятно, изменяет конформацию АТФ-азы, что каким-то образом приводит к вы+ ведению катионов Na из клетки. - Связавшаяся с ферментом фосфатная группа затем гидролизуется в + присутствии ионов K (именно этот процесс ингибируется уабаином). + - K -зависимое дефосфорилирование, вероятно, обусловливает + транспорт K внутрь клетки и возвращение АТФ-азы в первоначальное состояние.
Фазовый переход гель-жидкий кристалл В зависимости от температуры липидный бислой может находиться в двух основных фазовых состояниях – кристаллическом (гелевая Lβфаза) и жидкокристаллическом (Lα-фаза). Иногда эти состояния называют “твердым” и “жидким”, имея в виду, что физический смысл перехода между ними заключается в плавлении или замораживании углеводородных цепей липидных молекул. Переход бислоя из кристаллического в жидкокристаллическое состояние (и обратно) происходит при строго определенной температуре, характерной для данного липида и называемой температурой фазового перехода гель–жидкий кристалл (Тф.п.). Температура фазового перехода зависит как от строения углеводородных цепей липидных молекул, так и от природы их полярных головок. Как правило, чем длиннее углеводородные цепи в молекуле, тем выше о Тф.п. (в гомологичном ряду Тф.п. возрастает на 15 – 20 С при увеличении длины насыщенной цепи на 2 метиленовых звена). Введение цисэтиленовой связи даже в одну углеводородную цепь липида резко понижает Тф.п. Различия в строении полярных головок липидов также существенно сказываются на Тф.п. Например, при одних и тех же углеводоо родных цепях Тф.п. для ФХ на 20 С ниже, чем для ФЭА. В случае отрицательно заряженных фосфолипидов Тф.п. зависит от степени ионизации полярных групп (обычно Тф.п. падает по мере увеличения степени 2+ ионизации) и присутствия двухвалентных катионов, особенно Са , в 2+ водной среде (как правило, связывание Са повышает Тф.п.). Современные представления о механизме фазовых переходов в мембранах основаны на рассмотрении молекулярной подвижности компонентов бислоя, и прежде всего, подвижности углеводородных цепей липидных молекул. При Т < Тф.п. углеводородные цепи липидных молекул
+
+
+
+
21
80
7.2. Активный транспорт через мембраны. Для перемещения вещества через мембрану против градиента его концентраций должна затрачиваться химическая энергия: ∆G=RTln C2/C1 В живых организмах градиенты концентраций некоторых ионов между двумя сторонами клеточных мембран (трансмембранные градиенты) очень сильно варьируют (рис.37): Ион Катионы + Na + K 2+ Mg Ca H
2+ +
Анионы Cl
Внутриклеточная концентрация, мМ
Внеклеточная концентрация, мМ
5–15 140 30 1–2 -7 (в свободном состоянии ≤ 10 м) 4·10-5 -7,4 (10 М или рН 7,4)
145 5 1–2
4
имеют максимально вытянутую трансоидную конформацию и находятся в состоянии наиболее плотной упаковки. Подвижность цепей в гелевой фазе бислоя очень ограничена, и они претерпевают лишь слабые торсионные колебания. При увеличении температуры Т > Тф.п. наблюдается резкое усиление вращательной и колебательной подвижности углеводородных цепей за счет повышения вероятности гош-трансизомеризации и, как следствие этого, возникновение кинков (изгибов) в цепях (рис.8). Такие кинки воздействуют на структуру бислоя, вызывая укорочение цепей и увеличение расстояния между отдельными липидными молекулами. Результатом этого является уменьшение толщины бислоя, сопровождающееся его латеральным растяжением.
Нагревание
2,5–5 (10
-7,4
4·10-5 М или рН 7,4)
Охлаждение
110
Рис.37. Сравнение концентраций ионов внутри и снаружи типичной клетки млекопитающего На создание таких градиентов клетка затрачивает до 50% энергии, потребляемой с пищей. Источниками энергии для активного транспорта в клетке могут быть: - Солнечный свет (бактериородопсин); + - Ионные градиенты (Na -зависимый симпорт глюкозы); - Гидролиз АТФ; - Векторный или направленный перенос групп (активный транспорт сахаров у некоторых бактерий происходит путем фосфорилирования этих веществ при переносе через плазматическую мембрану, в результате этой модификации сахара приобретают заряд и накапливаются в клетке).
Гелевое, или "кристаллическое", состояние липидного бислоя
Жидкокристаллическое состояние липидного бислоя
Рис.8. Термотропный переход липидного бислоя гель-жидкий кристалл В пределах плоскости липидного бислоя молекулы липидов способны свободно перемещаться. Такая миграция липидов вдоль поверхности бислоя называется латеральной диффузией. В жидкокристаллическом состоянии скорость латеральной диффузии очень высока: ее коэффи-9 -7 2 циент лежит в пределах 10 –10 см /с, т.е., за 1с молекула липида совершает от 1000 до 100 000 скачков с размером шага, равным ее поперечному сечению (1 нм). В гелевом состоянии скорость латеральной диффузии резко падает. В отличие от латеральной диффузии, миграция липидов с одной стороны бислоя на другую происходит чрезвычайно медленно. Этот процесс перескока липидов на противоположную сторо-
22
79
ну бислоя называется флип-флоп (flip–flop). Полупериод флип-флопа составляет величину порядка от нескольких часов до нескольких дней при толщине липидного бислоя 4-5 нм. Причина этого исключительно медленного перескока молекул заключается в том, что энергетически невыгодно переносить полярную головку липида через гидрофобную область бислоя. В ряде случаев скорость флип-флопа может возрастать под действием ряда факторов (необычная структура липидов, неустойчивое фазовое состояние и т.д.).
OH
OH
HO -
O
OC
OH
OH
OH
O
Методы изучения фазовых переходов гель-жидкий кристалл 1. Дифракция рентгеновских лучей и нейтронов. Принцип метода: рентгеновские лучи отражаются атомами, и если атомы расположены неким упорядоченным образом, то отражение от повторяющихся слоев атомов будет либо конструктивным (отраженные волны повторяются через равные интервалы), либо деструктивным, когда отраженные волны возникают хаотично, погашая друг друга. Конструктивная интерференция происходит, когда рассеиваемые волны (отраженные от слоев атомов) смещаются на кратное число длин волны (закон Брэгга): nλ = 2d sinθ, где n – целое число, λ - длина волны, нм d – расстояние между повторяющимися слоями, нм θ - угол дифракции. Измеряя углы рассеяния (θ) и зная длину волны λ (λ и d должны быть сопоставимы по величине), можно определить форму и размеры повторяющейся единицы кристалла образца. Бислойные структуры являются достаточно упорядоченными структурами для использования данного метода анализа. Образцы готовят в виде мультибислойных липосом в воде. Данные РСА позволили найти толщину бислоя, расстояния между углеводородными цепями. При переходе из гелевой фазы в жидкокристаллическую происходит уменьшение толщины углеводородной области бислоя, и это регистрируется дифракционными методами. Затем строят зависимость d=f(T) и по скачкообразному изменению величины d определяют Тф.п. (рис.9).
CH3
O
O
HO
Амфотерицин В +
H3N
OH
(а) (б) Рис.36. Модель мембранной поры, образованной молекулами амфотерицина В (а) и стеринов (б) Аламетицин и родственные соединения (содержащие остатки αаминомасляной кислоты и фенилаланинола) представляют собой особую группу каналообразователей. Аналогично амфотерицину В и GRA, аламетицин образует в мембранах серию ион-проводящих агрегатов с числом молекул антибиотика от 6 до 10. Агрегаты меньшего размера проводят только одновалентные катионы; в крупных агрегатах с радиусом 1.5 нм появляется анионная проводимость. Характерной особенностью этих каналов является работа в потенциал-зависимом режиме: канал открывается, когда приложен трансмембранный потенциал, при отсутствии потенциала канал закрыт. Аламетициновый канал представляет собой простейшую модель ионных каналов возбудимых мембран. Молекулярная структура этого канала до сих пор окончательно не установлена.
78
23
Предположительно, выключение GRA канала, т.е. его переход в непроводящее состояние, связано с изменением толщины мембраны: при увеличении толщины бислоя димер “голова к голове” диссоциирует до мономера, а двойная спираль частично расплетается. Экспериментально было установлено, что время жизни GRA канала увеличивается при уменьшении средней толщины мембраны (рис.35).
2. Метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Метод ДСК позволяет определить термодинамические параметры перехода гель-жидкий кристалл для модельных и биологических мембран: Температуру, соответствующую началу перехода. Среднюю температуру перехода. Энтальпию перехода ∆Н – количество тепла, необходимое для его осуществления в расчете на количество вещества образца. Теплоемкость перехода Ср – количество тепла, необходимое для повышения температуры 1 моль образца на 1 градус. Принцип метода: Инертный стандарт и образец (помещенный в таблетку, изготовленную из этого же инертного стандарта) независимо друг от друга нагревают с постоянной скоростью таким образом, чтобы их температура была одинаковой. При этом регистрируют количество тепла для нагревания образца и стандарта. Количество тепла, необходимое для совершения эндотермического перехода бислоя из гелиевого в жидкокристаллическое состояние, превышает количество тепла, затрачиваемое для поддержания инертного стандарта при такой же температуре. Это отражает зависимость разности потоков тепла от температуры, исходя из которой определяют Тф.п. (рис.10). Площадь под пиком соответствует значению энтальпии фазового перехода ∆Н ф.п..
Рис.35. Возможные структурные перестройки грамицидина А в мембране Амфотерицин В – полиеновый антибиотик-макролид, образует в мембранах достаточно селективные поры с радиусом 0.4 нм, которые проницаемы для воды, ионов двухвалентных металлов, некоторых анионов, небольших нейтральных молекул. Амфотерицин В образует канал, состоящий из двух стыкующихся внутри мембраны полупор, каждая из которых представляет собой агрегат из чередующихся молекул амфотерицина В и стерина, ориентированных осями своих молекул перпендикулярно поверхности мембраны. В образовании полупоры участвует 8-16 молекул этого антибиотика, она стабилизирована внутри мембраны водородными связями (рис.36).
d, нм
∆Н
5
∆Н ф.п..
4 3 2
0
Т ф.п.
0
Т, С
Рис.9. Определение Тф.п. методом дифракции рентгеновских лучей
Т ф.п. средняя
0
Т, С
Рис.10. Определение Тф.п. методом ДСК
24
77
3. Спектроскопия Н-ЯМР. Наиболее полные сведения о динамических свойствах липидных бислоев можно получить при помощи методов ЯМР и ЭПР. 1 Принцип метода Н-ЯМР: Образцы – везикулы липидов в D2O (малый размер, увеличение разрешения). Осуществляют регистрацию спектров 1 H-ЯМР при различной температуре: T > Тф.п. Т < Тф.п. и Т = Тф.п.. Проводят отнесение сигналов в спектре, затем для каждого типа сигналов строят зависимость величины ∆ν1/2 - ширины сигнала на половине высоты пика от температуры ∆ν1/2=f(Т). Скачкообразное изменение величины ∆ν1/2 позволяет определить Тф.п.
Грамицидин A (GRA) представляет собой линейный пептид из 15 аминокислот с блокированными концевыми группами и чередующимися L- и D-конфигурациями аминокислотных остатков.
1
4. Методы с использованием молекулярных зондов (флуоресцентных и спиновых). Флуоресцентные зонды представляют собой полициклические ароматические соединения, которые ковалентно присоединяют к молекуле липида. Флуоресцентные характеристики оказываются очень чувствительными к молекулярному окружению и фазовому состоянию липидного бислоя. При Тф.п. происходит резкое, скачкообразное изменение параметров флуоресценции, что позволяет определить Тф.п. Для определения Тф.п. также используют метод ЭПР. Принцип этого метода сходен с методом ЯМР, но сигналы регистрируют только от парамагнитных зондов (липиды являются диамагнитными веществами). Спиновые метки представляют собой стабильные радикалы, имеющие неспаренный электрон. Энергия, поглощаемая зондом, регистрируется в виде сигнала, интенсивность и форма которого зависит от микроокружения парамагнитного зонда. При фазовом переходе гель-жидкий кристалл резко увеличивается вращательная способность зонда, и амплитуда сигнала резко возрастает. Это позволяет определить Тф.п. Метод ЭПР обладает высокой чувствительностью, поскольку магнитный момент электрона в 1000 раз превышает магнитный момент ядра. К недостаткам методов с использованием зондов можно отнести следующее: введение зондов искажает систему; информацию получают непосредственно только о микроокружении зонда.
2.3 нм М- ион металла OHC–L-Val–Gly–L-Ala–D-Leu–L-Ala–D-Val–L-Val–D-Val–L-Trp–D-Leu–LГрамицидин А Trp–D-Leu–L-Trp–D-Leu–L-Trp–NHCH2CH2OH Рис.34. Димерная структура грамицидина A в бислое GRA формирует в липидном бислое димерную структуру, похожую на α-спираль, своеобразный полый цилиндр с внутренним диаметром 0.3 нм, достаточным для внедрения катионов металлов. Гидрофобные аминокислотные остатки расположены снаружи спирали, а все карбонильные и амидные группы пептидной цепи участвуют в образовании внутри- и межмолекулярных водородных связей (рис.34). Установлено, что в бислое GRA участвует в сложном конформационном равновесии между образованием мономеров и одно- и двухтяжевых спиральных димеров. В плоскости липидного бислоя молекулы GRA могут свободно двигаться; в некоторый момент времени 2 молекулы GRA сближаются и образуют димер, по которому происходит транспорт ионов. Производительность одиночного канала GRA очень велика – до 9 10 ионов/с, что значительно превышает соответствующие показатели 5 для антибиотиков-переносчиков (10 ионов/с).
76
25
ность диффундировать через липидный бислой, и транспорт прекращается. Наличие подобной температурной зависимости для какого-либо ионофора позволяет относить его к подвижным переносчикам.
Биологическое значение фазового перехода гель-жидкий кристалл
Облегченная диффузия с помощью мембранных каналов. Мембранные каналы в клетке могут каналообразователи, а также ионофоры.
образовывать
белки-
Белки-каналообразователи формируют трансмембранные гидрофильные каналы, через которые молекулы растворенных веществ соответствующих размеров и заряда могут проходить через бислой путем простой диффузии. В отличие от транспорта, опосредуемого переносчиками, пассивный транспорт через белковые каналы представляет собой процесс, не достигающий насыщения и не имеющий Vmax. Транспорт через каналы может осуществляться с большей скоростью, чем облегченная диффузия (рис.30). Интересно, что одни каналы, сформированные транспортными белками, открыты постоянно, тогда как другие открываются только на короткое время (имеют “ворота”). Механизм открывания канала может срабатывать в ответ на связывание внешнеклеточного лиганда со специфическими поверхностными рецепторами клетки; изменение (понижение) мембранного потенциала; изменение внутриклеточной концентрации 2+ определенных ионов (например, Са ). Довольно часто каналы, снабженные воротами, имеют механизмы самозакрывания, с помощью которых канал может быстро захлопнуться, несмотря на то, что фактор, который вызвал их первоначальное открывание, еще действует. Пример – нервно-мышечное соединение, в котором импульс, идущий по нерву, стимулирует мышцу к сокращению. Этот процесс происходит менее чем за 1 с и состоит из последовательного открывания и закрывания по крайней мере 4 различных наборов каналов, имеющих ворота. Каналообразующие ионофоры. Наиболее хорошо изучены антибиотики-каналообразователи, среди них – грамицидин А, амфотерицин в, аламетицин.
Явление термотропного фазового перехода гель-жидкий кристалл имеет решающее значение для нормального функционирования биомембран в клетке. Для выполнения клеткой своих функций липидный бислой мембран должен находиться в жидкокристаллическом состоянии. Это необходимо, в первую очередь, для поддержания оптимальной активности мембранных белков-ферментов и обеспечения транспорта через мембраны. Было показано, что при замене ненасыщенных липидов на насыщенные в мембранах бактерий скорость прохождения веществ через мембрану уменьшалась в 20 раз. Клетки очень чутко реагируют на изменения температуры среды, и в процессе эволюции были выработаны определенные механизмы поддержания клеточных мембран в “жидком состоянии”. Так, прокариоты, клетки растений и впадающих в спячку млекопитающих при понижении температуры окружающей среды заменяют насыщенные липиды в мембранах на ненасыщенные. Теплокровные млекопитающие обеспечивают жидкое состояние своих мембран путем поддержания строго определенной температуры тела за счет обмена веществ. Полиморфизм липидов в водной среде Под термином полиморфизм понимают способность какого-либо вещества образовывать агрегаты различного строения. Фосфолипиды в водной среде могут образовывать не только бислойные, но и другие структуры, и это явление принципиально важно для функционирования биомембран. Липиды в водной среде формируют жидкие кристаллы, для них возможны следующие переходы: HI ↔ L ↔ HII (рис.11). L - ламеллярная фаза, в зависимости от температуры может находиться в жидкокристаллическом (Lα) и гелевом состояниях (Lβ). Именно в этой фазе находится основная масса липидов в биологических мембранах. HI - гексагональная фаза типа I: липидные молекулы формируют цилиндрические структуры, поверхность которых образована полярными головками и контактирует с водой. Сами цилиндры также упаковываются с образованием гексагональной решетки. В природных липидах этот тип структуры почти не встречается.
26
75
HII – гексагональная инвертированная фаза типа II: липиды также образуют цилиндры, но в этом случае полярные группы обращены внутрь цилиндра и формируют водный канал. Упаковка самих цилиндров также является гексагональной. Эта структура характерна для некоторых мембранных липидов. Многие очищенные мембранные липиды не образуют стабильных бислоев, а предпочитают находиться в гексагональной фазе HII. В качестве примера можно представить ненасыщенные ФЭА, а также моногалактозилдиглицерид. L
Валиномицин способен избирательно увеличивать проницаемость + + + липидных бислоев для ионов щелочных металлов (K , Rb , Cs ), но + 4 6 очень слабо взаимодействует с ионами Na (слабее в 10 – 10 раз). Это связано с его пространственным строением: депсипептидная цепь валиномицина формирует “ионную ловушку”, по размерам точно подогнан+ ную под ионы K (r=0.133 нм). Наружная часть молекулы валиномицина гидрофобна, что обеспечивает беспрепятственное передвижение ионофора через липидную мембрану (рис.33). Комплексы валиномицина с + + ионами K в любых средах сохраняют конформацию браслета, ион K во внутренней полости молекулы связывается с шестью карбонильными группами при помощи ион-дипольных взаимодействий.
HI
HII
HII Рис.11. Полиморфные структуры липидов в воде
Физические методы изучения липидного полиморфизма 1. Электронная микроскопия. А) Метод замораживания-скалывания. Приготовление образцов включает в себя несколько этапов: 1) липиды уравновешивают в условиях, подходящих для формирования необходимой структуры; 2) после этого быстро замораживают, чтобы организация этой структуры не успела измениться; 3) при помощи специальо ного ножа раскалывают образец при низкой температуре (-100 С) в глубоком вакууме, при этом обнажается внутренняя поверхность бислоя о (рис.12). На поверхность скола под углом 45 напыляют платину, а под
(а) (б) + Рис.33. Конформация валиномицина (а) и его K -комплекса (б) Установленный впервые на примере валиномицина принцип функционирования ионофоров оказался универсальным не только для мембранных переносчиков, но и для других типов молекулярных ловушек и катализаторов, которые широко используются в химии и технике. Аналогично валиномицину функционируют и другие антибиотики+ + ионофоры: циклические (энниатиновая группа, переносят ионы K , Na , + Cs ), с незамкнутыми структурами (моненсин, нигерицин, кальцимицин + + переносят ионы Са , Na ), макротетралиды (нонактин, монактин). Для данного типа ионофоров важное значение имеет температура мембраны. При температуре ниже значения температуры фазового перехода мембранных липидов подвижные переносчики теряют способ-
74
2) Ионофоры мембран бактериальных клеток. Ионофоры – это небольшие гидрофобные молекулы, которые растворяются в липидных бислоях и повышают их проницаемость для ионов. Большинство ионофоров синтезируется микроорганизмами, некоторые из них используются как антибиотики. Эти соединения широко применяют в мембранологии для повышения проницаемости мембран к определенным ионам в исследованиях на модельных бислоях, клеточных органеллах и интактных клетках. Ионофоры действуют, экранируя заряд транспортируемого иона таким образом, чтобы он мог свободно преодолеть гидрофобную область липидного бислоя. Ионофоры не связаны с источниками энергии, а лишь позволяют двигаться ионам по их электрохимическим градиентам. Классическим примером мембранных ионофоров является антибиотик депсипептидной природы валиномицин (выделен в 1955 г., строение как циклододекадепсипептида установлено М.М. Шемякиным и сотрудниками в 1963 г.). Молекула валиномицина построена из 3-х идентичных фрагментов, в каждый из которых входят остатки D-Val, L-молочной кислоты, L-Val, Dгидроксиизовалериановой кислоты. Конформация самого валиномицина в неполярных средах напоминает собой браслет, стабилизированный 6 внутримолекулярными водородными связями (С=О….N-H); в более полярных средах реализуется форма лишь с 3-мя водородными связями, а в водных растворах существует открытая форма, лишенная таких связей (рис.32).
Рис.32. Система внутримолекулярных водородных связей валиномицина в неполярных средах (а), в средах средней полярности (б) и в воде (в)
27
о
Рис.12. Раскалывание мембраны по методу замораживания-скалывания
углом 90 – углерод в качестве подложки. Платиново-углеродная реплика отражает рельеф мембраны, являясь ее точной копией. Таким образом для каждой фазы получают характерные микрофотографии: жидкокристаллическая ламеллярная фаза (Lα) выглядит всегда как гладкая поверхность; гелевая ламеллярная фаза (Lβ) – гладкая поверхность с некоторыми дефектами из-за плотной упаковки; гексагональная инвертированная (HII) – стопка цилиндров.
Б) Метод негативного контрастирования. Приготовление образцов состоит в том, что суспензию мембран наносят на медную сеточку, покрытую полимерной пленкой. На эту пленку напылён углерод в качестве подложки. Нанесенный образец обрабатывают контрастирующим раствором соли тяжелого металла (урана или вольфрама), излишки раствора удаляют. Метод достаточно быстрый – за 30 мин можно приготовить один образец. Метод может использоваться для наблюдения за трехмерной структурой мембранных белков. В) Криоэлектронная микроскопия. Приготовление образцов аналогично предыдущему методу, затем сеточку быстро замораживают, опуская в жидкий этан. Образец поддерживают при температуре жидкого азота и наблюдают под электронным микроскопом. Метод позволяет непосредственно визуально исследовать биологический материал и исключить артефакты. 2. Метод 31Р-ЯМР. Физические основы метода. Основными структурными элементами бислоя в мембранах являются фосфолипиды, которые содержат в своем составе, по крайней мере, один атом фосфора в полярной части молекулы (ФХ, ФЭА и др.). Некоторые фосфолипиды, такие как кардиолипин, ди- и трифосфоинозитиды содержат несколько атомов фосфора. Поэтому атом фосфора является идеальной природной меткой в соста31 ве фосфолипидов для использования метода Р-ЯМР при изучении 31 природных и модельных мембран. Метод Р -ЯМР обладает высокой
28
73
чувствительностью и имеет широкий диапазон химических сдвигов (около 700 м.д.). В составе бислоя молекулы фосфолипидов обладают высокой латеральной и вращательной подвижностью. В протяженных бислоях латеральное движение в пределах плоскости бислоя не сопровождается изменением ориентации фосфатных групп относительно любой заданной оси, включая линии напряженности магнитного поля ЯМР31 спектрометра. В данном случае сигнал в спектре Р -ЯМР характеризуется пиком в слабое поле и имеет плечо, направленное в сторону сильного поля (рис.13а). Наблюдаемая анизотропия химического сдвига, т.е. расстояние между пиком и плечом сигнала, составляет величину 40-50 м.д. При переходе в гексагональную фазу происходит изменение анизотропии движения липидных молекул, что находит отражение в спектрах 31 Р -ЯМР (рис.13б).
щью белков-переносчиков не может составлять их трансмембранное перемещение. Для объяснения этого процесса предложен особый механизм, названный "пинг-понг": при переносе транспортируемых молекул через бислой трансмембранные белки претерпевают обратимые конформационнные изменения (рис.31): Транспортируемое вещество
А
А "Понг"
А
А
А
Градиент концентрации А
А
a
Бислой
"Пинг"
Транспортный белок, осуществляющий облегчённую диффузию
А
А
А
Рис.31. Механизм транспорта "пинг-понг" с участием белка-переносчика
Гексагональная (H II)
б
- 50 ppm - Hz 31
Рис.13. Спектры Р -ЯМР в составе ламеллярной (а) и гексагональной (б) фаз
В ходе этого процесса белок-переносчик связывает вещество, находящееся в растворе с его высокой концентрацией по одну сторону мембраны, после чего в молекуле белка происходит изменение конформации ("понг" – "пинг"), в результате которого вещество А высвобождается по другую сторону мембраны. Свободный переносчик возвращается в исходное состояние ("пинг" - "понг") и цикл завершается. В организме облегченную диффузию регулируют гормоны путем изменения числа доступных белков-переносчиков. Инсулин регулирует интенсивность транспорта глюкозы в ткани, индуцируя поступление ее переносчиков, а также увеличивает поступление аминокислот в печень и другие ткани. Гормон роста отвечает за транспорт аминокислот во все клетки организма, а эстрогены стимулируют этот процесс в матке. Интересно, что в животных клетках существует, по меньшей мере 5 различных систем переносчиков аминокислот, каждая из которых специфична к определенной группе близкородственных аминокислот и может сущест+ вовать как система симпорта с ионами Na .
29
72
Скорость транспорта
V max Диффузия с помощью белка переносчика
V max/2
Диффузия с помощью каналообразующего белка
Концентрация транспортируемых молекул KM Рис.30. Кинетика диффузии с помощью каналообразующего белка и при участии белка-переносчика Процессы транспорта с участием переносчиков описываются законом, аналогичным уравнению ферментативной кинетики (рис.30): I = Imax∆c/(K+∆c), где Imax- максимально достигаемый поток вещества через мембрану; ∆c – градиент концентраций переносимого вещества; К – константа, описывающая сродство между переносчиком и переносимым веществом. Механизм действия переносчиков на молекулярном уровне 1) Белки-переносчики. Асимметричное распределение белков в мембране между внутренней и внешней частью бислоя достаточно стабильно (абсолютная асимметрия белков), т.е. основу механизма облегченной диффузии с помо-
В составе бислоя и инвертированной HII-фазы вращательные усредняющие внутримолекулярные движения липидных молекул одинаковы. Отличие между этими фазами состоит в том, что в составе HII -фазы латеральное движение липидных молекул представляет собой вращение вокруг оси цилиндров HII -фазы. Эти движения сопровождаются изменениями ориентации фосфатной группы, что приводит к уменьшению величины анизотропии химического сдвига в 2 раза и изменению сигна31 ла в спектрах Р -ЯМР. Сигнал липидов в составе HII -фазы имеет пик в сильном поле и плечо, направленное в слабое поле (рис.13). Полиморфные превращения различных классов фосфолипидов Полиморфизм фосфолипидов можно объяснить согласно следующей теории: структура мезофазы определяется динамической формой молекулы липида. Таким образом, зная геометрические размеры молекул липидов, можно предсказать, какие структуры будут образовывать в водной фазе данные липиды. Геометрические размеры молекул липидов описывает критический параметр упаковки v/(l·So), где v/l –площадь поперечного сечения углеводородной области молекулы (vмолекулярный объем углеводородной области молекулы; lмаксимальная длина углеводородной цепи), So – площадь поверхности для размещения полярной головки фосфолипида. Рассмотрим для примера сферическую мицеллу радиусом R, содержащую M молекул. Полная поверхность мицеллы может быть выра2 3 жена как M·Sо=4πR . Полный объем мицеллы составляет M·v=4/3πR . Выразив отсюда значение радиуса мицеллы R, получаем: R=3v/Sо. Поскольку значение радиуса мицеллы не может быть больше величины l (R≤ l), то условием упаковки липидов в сферические мицеллы будет следующее значение критического параметра упаковки: V/(l·So) ≤ 1/3 Аналогичные расчеты для мицелл цилиндрической формы приводят к значению v/(l·So) =1/2, а для бислойных структур - v/(l·So)= 1. Данные для различных классов липидов представлены на рис.14.
30
Липид
Фаза
71
Форма Молекулы
Лизофосфолипиды Детергенты Мицеллярная Фосфатидилхолин Сфингомиелин Фосфатидилсерин Фосфатидилинозитол Фосфатидилглицерол Фосфатидная кислота Кардиолипин Дигалактозилдиглицерид Фосфатидилэтаноламин (ненасыщенный) 2+ Кардиолипин – Са Фосфатидная кислота – 2+ Са (рН