Гемостаз

ОТЕЧЕСТВЕННОЕ И ИМПОРТНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова Российский НИИ гематологии и трансфузиологии

Гемостаз Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний Учебное пособие Под редакцией: проф. Н.Н.Петрищева проф. Л.П.Папаян Санкт-Петербург 1999

УДК 616-005.2:616.151.5-07 Авторский коллектив: Т.В. Вавилова, О.Г. Головина, М.С. Зайнулина, В.И. Иванов, И.В. Миндукшев, Л.П. Папаян, Н.Н. Петрищев, А.С. Шитикова, В.Л. Эмануэль. Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. /Под ред. Н.Н.Петрищева, Л.П.Папаян. ISBN 0340-6245 В учебном пособии изложены современные представления о механизмах гемостаза, описаны наиболее доступные методы исследования тромбоцитарных, плазменных и сосудистых компонентов системы гемостаза, а также ряд информативных методов, которые еще не нашли широкого применения в клинических лабораториях. Большое внимание уделено алгоритмам диагностики нарушений гемостаза и вопросам обеспечения качества лабораторных исследований. Пособие предназначено для врачей-лаборантов, специализирующихся в области гемостазиологии, а также может быть полезным и врачам других специальностей. УДК 616-005.2:616.151.5-07 ISBN 0340-6245 © Издательство СПбГМУ, 1999 © Коллектив авторов, 1999 Настоящее пособие рассчитано на тех, кто решил ознакомиться с физиологией и патологией системы гемостаза и основными методами её исследования. Эти знания требуются не только врачам клинической и лабораторной диагностики. Они необходимы клиницистам любого профиля, поскольку нет такой специальности, при которой врач не сталкивался бы с больными, страдающими кровоточивостью или тромбозами. Понимание основ гемостаза позволяет лечащему врачу назначить больному адекватное лабораторное исследование и соответственно патогенетическое лечение. Преподавание основ физиологии и патологии гемостаза, практическое обучение методам оценки сосудисто-тромбоцитарных и коагуляционных реакций проводятся на специальном цикле "КЛИНИЧЕСКАЯ ГЕМОСТАЗИОЛОГИЯ" факультета постдипломного образования СПб Государственного Медицинского Университета им. акад. И.П. Павлова. Обучение

проходит на базе лаборатории свертывания крови Российского НИИ гематологии и трансфузиологии. После окончания цикла слушатели получают удостоверение о повышении квалификации; сдавшим сертификационный экзамен выдается сертификат врача по клинической и лабораторной диагностике. Продолжительность цикла 2,5 мес., для иногородних слушателей возможно очно-заочное обучение. ЗАПИСЬ НА ОБУЧЕНИЕ – ПО ТЕЛ. 277-35-82 (ЛАБОРАТОРИЯ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ). На базе лаборатории свертывания крови Российского НИИ гематологии и трансфузиологии проводится также исследование больных, с целью установления причины повышенной кровоточивости или повышенной склонности к развитию тромбозов (тромбофилии). Запись на исследование системы гемостаза проводится по телефону 27735-82 с 10 до 16 часов по рабочим дням. ПОМНИТЕ, ЧТО КАЧЕСТВЕННАЯ ДИАГНОСТИКА – ОСНОВА ЭФФЕКТИВНОГО ЛЕЧЕНИЯ!

МЕХАНИЗМЫ ГЕМОСТАЗА Тромбоцитарное звено гемостаза Адгезия и агрегация тромбоцитов Остановка кровотечения при повреждении стенки сосуда начинается с сосудисто-тромбоцитарных реакций. Уже через доли секунд после травмы в зоне повреждения наблюдается спазм сосудов и развивается цепь реакций кровяных пластинок, которая приводит к образованию тромбоцитарной пробки. Прежде всего, происходит прилипание (адгезия) тромбоцитов к коллагеновым волокнам, находящимся в сосудистой стенке, к другим адгезивным белкам субэндотелия (фактору Виллебранда, фибронектину, витронектину, ламинину, тромбоспондину), а также к поступающему из плазмы фибриногену (рис. 1). Из адгезировавших тромбоцитов высвобождается аденозиндифосфат (ADP) - важнейший индуктор агрегации кровяных пластинок. Под влиянием ADP циркулирующие кровяные пластинки присоединяются к уже фиксированным на раневой поверхности и друг к другу (агрегируют). Процесс агрегации вызывается также всеми активными субстанциями, которые высвобождаются в области повреждения не только из стимулированных при адгезии тромбоцитов, но и из форменных элементов крови и эндотелия (например, ADP из гемолизированных эритроцитов, активирующий пластинки фактор - PAF и ADP из стенки сосудов). Агрегация индуцируется и первыми малыми количествами тромбина, генерируемого по внешнему и внутреннему пути коагуляции. В результате в процесс вовлекается все большее число тромбоцитов, поступающих в зону повреждения. Однако на данной стадии, определяемой как стадия обратимой или первичной агрегации, связи между тромбоцитами еще не прочные, и часть из них может отрываться током крови. Позже на стадии необратимой или вторичной агрегации агрегаты уплотняются, становятся непроницаемыми для крови и плотно закрывают имеющийся дефект в сосудах малого и среднего размера. Таким путем достигается первичный гемостаз, т.е. ранняя начальная остановка кровотечения за счет спазма сосудов и образования тромбоцитарной пробки. Поэтому первичный гемостаз называют также сосудисто-тромбоцитарным. Уже на ранних стадиях тромбоцитарных реакций стимулируется коагуляционная активность тромбоцитов - в плазматической мембране становятся доступными коагуляционно активные фосфолипиды, которые принимают существенное участие во внутреннем пути свертывания крови. В связи с этим в дальнейшем на основе тромбоцитарной пробки формируется фибриновый сгусток. Тромбоцитарно-фибриновая гемо-статическая пробка может противостоять повышенному кровяному давлению после восстановления тока крови в поврежденных сосудах среднего размера. Таким образом, на этой стадии осуществляется окончательный, или вторичный

гемостаз. Необходимо остановиться на основных функциональных, биохимических и молекулярных процессах, которые развиваются в ходе осуществления тромбоцитарного гемост аза, поскольку без понимания механизма гемостатических реакций, протекающих в организме, невозможно адекватно интерпретировать результаты исследований при патологии. В фазе адгезии прилипание кровяных пластинок к субэндотелиальным структурам, прежде всего к коллагену (рис.1), различается по своему механизму в зонах циркуляции с малой скоростью тока (и низким напряжением сдвига) и с большой скоростью тока крови (и высоким напряжением сдвига). При низком напряжении сдвига (в случае повреждения стенок крупных артерий, вен) тромбоциты присоединяются к коллагену непосредственно через коллагеновые рецепторы их плазматической мембраны - гликопротеины la-lla (GPIa-lla). При высоком напряжении сдвига (при повреждении мелких артерий и артериол) прилипание кровяных пластинок к коллагену опосредовано высокомолекулярным кофактором адгезии - фактором Виллебранда (vWF), который в зоне повреждения поступает из плазмы, высвобождается из эндотелия, секретируется тромбоцитами. vWF при большой скорости тока крови способен соединяться, с одной стороны, с коллагеном, а с другой, - с тромбоцитарным рецептором GPIb. Таким путем формируется «ось адгезии»: коллаген -vWF - GPIb. Генетически обусловленное отсутствие или снижение числа названных адгезивных рецепторов в тромбоцитарной плазматической мембране приводит к развитию геморрагического диатеза из-за нарушения адгезии (и как следствие - последующих стадий первичного гемостаза). Однако подобные мембранные дефекты (дефицит GPIb при болезни Бер-нара-Сулье и особенно дефицит GPIa-lla) наблюдаются достаточно редко. В отличие от этого нарушение фазы адгезии из-за недостаточности или дефекта кофактора адгезии (vWF) является причиной наиболее часто встречающегося врожденного геморрагического заболевания - болезни Виллебранда.

Рис. 1. Тромбоцитарное звено гемостаза Сокращения, применяемые в рис.1: АА-арахидоновая кислота ADP - аденозиндифосфат Са2+е - ионы кальция экзогенные по отношению к тромбоцитам Са2+, - свободный цитоплазматический Са2+ тромбоцитов COG - циклооксигеназа DG-диацилглицерол DTS- плотная тубулярная система Fbg - фибриноген FN - фибронектин GP - гликопротеины: GP llb-llla,GP la-lla,GP Ib 5НТ - серотонин 1Рз- инозитол 1,4,5-трисфосфат MLCK - киназа легкой цепи миозина Р47 - плекстрин PC - фосфатидилхолин

РЕ - фосфатидилэтаноламин PG - простагландины (G2н2) PI - фосфатидилинозитол PIP - фосфатидилинозитол 4-фосфат РIР2 - фосфатидилинозитол 4,5-бифосфат РКС - протеинкиназа С PLA2-фосфолипаза А2 PLC - фосфолипаза С PS - фосфатидилсерин TFPI -ингибитор пути тканевого фактора TSP - тромбоспондин ТХА2 - тромбоксан A2 TXSyn - тромбоксансинтетаза VN - витронектин vWF фактор Виллебранда I , II , III - положительные обратные связи активации тромбоцитов Для оценки реакций адгезии тромбоцитов в зонах с высоким напряжением сдвига протекающей крови используют антибиотики ристомицин и ристоцетин, которые по своим адгезивно-агрегационным свойствам оказались близкими к субэндотелиальным структурам сосудов, т.е. для взаимодействия их с тромбоцитами необходим и vWF. и GPIb. Поэтому состояние основных компонентов, участвующих в адгезии в области микроциркуляции, может быть оценено на основании агрегации кровяных пластинок in vitro с этими антибиотиками - она снижена или отсутствует как при болезни Виллебранда, так и при болезни Бернара-Сулье. Участие мембранных GPIa-IIa во взаимодействии с коллагеном в зонах с низким напряжением сдвига может быть определено в агрегационных исследованиях с коллагеном. Следующая стадия тромбоцитарных гемостатических превращений первичная агрегация - является результатом последовательных реакций активации кровяных пластинок в зоне повреждения. Стимуляция их вызывается и химическими, и физическими воздействиями на плазматическую мембрану. Тромбоциты могут активироваться при действии на их поверхность гемодинамических сил, возникающих при турбулентном токе или при повышении скорости движения крови в местах сужения просвета сосуда. Но большее значение имеет химическая мембранная активация, опосредованная рецепторами. Так, описанное взаимодействие субэндотелиальных субстанций с рецепторами пластинок в фазе адгезии приводит к дальнейшей передаче сигнала активации внутрь клетки. Кроме того, как указывалось выше, тромбоциты активируются при действии на них целого ряда растворимых естественных агонистов, которые присутствуют в зоне повреждения. Важно подчеркнуть, что способностью стимулировать кровяные пластинки обладают в основном те субстанции, для которых в плазматической мембране имеются соответствующие рецепторы. Исключением являются немногие вещества, способные проникать через

мембрану - арахидоновая кислота, ионофор А23187. Естественные агонисты разделяют на сильные и слабые, отличающиеся по механизму вызываемых ими реакций активации. К сильным агонистам относят коллаген и тромбин в больших дозах. Для осуществления их стимулирующего действия не нужны дополнительные линии усиления активации - так называемые положительные обратные связи (рис.1). Напротив, для эффекта слабых агрегирующих агентов, т.е. всех остальных естественных агонистов при больших и средних дозах (а также сильных агонистов в малых дозах) необходимы эти сложные обратные пути активации. Взаимодействие слабых агрегирующих агентов со своими рецепторами плазматической мембраны, прежде всего, приводит к развитию доступности фибриногеновых рецепторов - GPIIb-IIIa. После этого фибриноген, который является симметричной молекулой, в присутствии ионов Са2+ связывается с рецепторами двух близлежащих тромбоцитов. Необходимое для осуществления связей столкновение отдельных пластинок достаточно часто происходит в условиях тока крови в организме или в перемешиваемой плазме в агрегометре. При соблюдении всех этих дополнительных условий именно образование фибриногеновых мостов между рецепторами тромбоцитов обусловливает первичную агрегацию. Поэтому основными причинами ее нарушения являются снижение (или отсутствие) в тромбоцитарной мембране GPIIb-IIIa (при врожденном наследственном заболевании - тромбастении Гланцмана) и полное отсутствие фибриногена плазменного кофактора агрегации (при врожденной афибриногенемии). Тромбоцитарная секреция и вторичная агрегация. Первичная агрегация - это только одна из начальных ступеней в цепи гемостатических реакций тромбоцитов, и она не способна обеспечить эффективный гемостаз. Для этого необходимо осуществление всех последующих стадий и финальных функциональных реакций клетки - реализации ее коагуляционной активности, секреции, образования вторичных консолидированных агрегатов, непроницаемых для крови. Стимулы слабых агонистов для этого не достаточно сильны и для завершения гемостаза требуется включение ряда дополнительных механизмов активации с развитием положительных обратных связей, что «происходит следующим образом (рис.1). Изменения, вызываемые в плазматической мембране при взаимодействии рецепторов с экзогенными слабыми агонистами, при контакте мембран в процессе первичной агрегации и связи их с фибриногеном, в результате последующего начального повышения уровня свободного ионизированного 2+ цитоплазматического кальция (Са ) приводят к активации мембранной фосфолипазы А2 (PLA2). PLA2, в свою очередь, индуцирует цепь реакций простагландин-тромбоксановой системы, которая начинается с высвобождения из мембранных фосфолипидов арахидоно-вой кислоты и завершается образованием таких активных продуктов как лабильные простагландины (PGG2,PGH2) и особенно тромбоксан А2 (ТХА2). Последний является вазоконстриктором, ионофором и эндогенным агонистом агрегации.

Выделяясь из тромбоцитов и связываясь с рецепторами плазматической мембраны (как данной клетки, так и других кровяных пластинок, приносимых током крови), ТХА2 и PGG2 с PGH2 осуществляют первую положительную обратную связь, т.е. рекрутируют дополнительное количество фибриногеновых рецепторов, расширяют плацдарм агрегации и усиливают сигнал активации, передаваемый к внутренним эффекторным структурам клетки. При этом большое значение имеет способность ТХА2 активировать фосфолипазу С (PLC) и включать полифосфоинозитидный путь активации. ТХА2 является также ионофором и вызывает выделение в цитоплазму ионов Са2+ из плотной тубулярной системы (DTS), где они находятся в интактных кровяных пластинках. Повышение уровня Са2+ создает необходимые условия для всех Са2+-опосредованных ферментных реакций финальных стадий тромбоцитарного гемостаза. К этим реакциям прежде всего относится стимуляция тромбоцитарной актомиозиновой системы. Для последней, помимо повышения концентрации Са2+, необходима стимуляция процессов фосфорилирования белков этой системы, что также является результатом полифосфоинозитидного пути активации (рис.1). Этот путь начина-.ется со стимуляции фосфолипазы С (PLC) и завершается активацией протеинкиназы С (РКС) с образованием инозитолтрисфосфата (1Р3), способного, как и ТХА2, повышать уровень Са2+. PLC может быть стимулирована как в процессе первичной агрегации, так и прямо при взаимодействии сильных агонистов с их рецепторами в плазматической мембране. Необходимо отметить, что следующая обратная связь осуществляется именно через взаимодействие сильнейшего тромбоцитарного активатора - тромбина, который генерируется по внутреннему пути с участием фосфолипидов тромбоцитов. Фосфорилирование белков тромбоцитарной сократительной системы с участием активированной РКС, энергетическое обеспечение процесса и само сокращение актомиозина принципиально осуществляются теми же механизмами, что и в сократительной системе гладкомышечных клеток. Сокращение тромбоцитарного актомиозина имеет два важнейших последствия - благодаря этому процессу осуществляются секреторные реакции кровяных пластинок и происходит уплотнение тромбоцитарно-фибриновой пробки. Тромбоцитарные секреторные реакции имеют большое значение для завершения эффективного гемостаза. Сокращение актомиозина обеспечивает передвижение гранул хранения, контакт их мембран с мембранами открытой канальциевой системы (OCS) и плазматической, а также повышение внутриклеточного давления и выброс содержимого этих гранул в окружающую среду. Из 8 гранул (плотных телец) высвобождаются гемостатически активные субстанции, необходимые для усиления активации и агрегации тромбоцитов в зоне сосудистого повреждения. Через секрецию ADP, серотонина, адреналина после их связи с соответствующими мембранными рецепторами пластинок реализуется важнейшая вторая положительная обратная связь, которая вместе с первой, делает возможной развитие

вторичной агрегации при действии слабых агонистов. Из а гранул секретируется более 30 протеинов, которые играют большую роль не только в гемостатических реакциях, но и в других физиологических и патологических процессах организма. Такие белки этих гранул как фибриноген, фактор V, XIII, тромбоцитарный фактор 4 и др., принимают участие в процессах коагуляции; адгезивные протеины (фибриноген, фактор Виллебранда, тромбоспондин, фибронектин, витронек-тин) в дальнейшем развитии процесса адгезии и укреплении фибрино-геновых связей агрегировавших тромбоцитов; фактор роста тромбоцитов (PDGF platelet derived growth factor) - в репарации поврежденных стенок сосудов, а в патологических условиях - в развитии атеросклероза. Из у гранул (лизосом) высвобождаются лизосомальные энзимы, принимающие участие в реканализации сосуда после завершения гемостаза. Итак, на основании изложенного понятно, почему рассмотренная фаза агрегации называется вторичной (в основе ее лежит более позднее высвобождение из тромбоцитов агрегирующих агентов) и необратимой (тромбоциты не могут отделяться от агрегата, поскольку они максимально сближены вследствие сокращения актомиозиновых структур, а фибриногеновые связи укреплены секретированными адгезивными протеинами). Фазу необратимой агрегации называют также фазой секреции и необратимой вторичной агрегации, т.к. секреторные реакции достигают в это время своей кульминации и являются основой развития этой фазы агрегации. О значении фазы секреции может, свидетельствовать нередко наблюдаемая и приводящая к кровоточивости недостаточность секреторного процесса, которая особенно часто бывает приобретенной, т.е. возникает в результате инфекционных, токсических, лекарственных, иммунных, радиационных воздействий. Среди тромбоцитопатий высвобождения выделяют два основных вида: функциональную тромбоцитопатию высвобождения при нарушении внутриклеточной передачи сигнала активации, чаще всего в простагландин-тромбоксановой системе, и структурную, связанную с неполноценностью гранул хранения - со снижением их числа и/или наполнения хранимыми в них субстанциями. Определение механизма нарушения секреции достаточно сложно, т.к. требует проведения тонких биохимических исследований. В клинических условиях факт нарушения тромбоцитарной секреции обычно устанавливают с помощью агрегометра на основании оценки характера агрегационных кривых с несколькими индукторами агрегации. О снижении или отсутствии секреции свидетельствует уменьшение или отсутствие второй волны агрегации с оптимальными средними дозами всех агрегирующих агентов и единственной волны агрегации с коллагеном, т.к. эти агрегационные феномены опосредованы секреторным процессом. Поскольку актомиозиновые филаменты пересекают всю цитоплазму тромбоцита и с внутренней стороны мембраны связаны с теми же трансмембранными гликопротеинами IIb-IIIa, с которыми с наружной стороны соединены межтромбоцитарные фибриногеновые (фибриновые)

мосты связи, то сокращение актомиозина в каждой кровяной пластинке, включенной в тромбоцитарно-фибриновую сеть, приводит к сокращению системы в целом, т.е. к уплотнению тромбоцитарных агрегатов и к ретракции тромбоцитарно-фибриновой пробки. Таким образом, завершается эффективный гемостатический процесс. Плазменно-коагуляционное звено гемостаза Внутренний и внешний пути свертывания крови Процесс свертывания крови важен для окончательного гемостаза, обеспечиваемого образованием вторичной гемостатической пробки. В этом процессе принимают участие плазменные белки, факторы свертывания крови, обозначаемые римскими цифрами (табл. 1). В ин-тактном сосуде факторы свертывания крови циркулируют в неактивной форме в виде проферментов сериновых протеаз. Повреждение сосудистой стенки вызывает цепь протеолитических процессов, в которых факторы свертывания трансформируются в свою активную форму (рис.2). Процесс свертывания крови представляют в виде каскадной реакции, которая начинается с первичного небольшого стимула и усиливается на каждой последующей стадии. В результате образуется большое количество конечного фермента, тромбина, который превращает фибриноген в фибрин. Фибрин стабилизирует первичную тромбоцитарную пробку и таким образом способствует окончательному гемостазу. Кроме этой ключевой функции, тромбин играет жизненно важную роль главного регуляторного фермента, регулирующего процесс свертывания крови с помощью ряда реакций положительной и отрицательной обратной связи. Существенно то, что в физиологических условиях тромбин генерируется быстро и только в месте повреждения сосудистой стенки. Принято считать, что субэндотелиальные субстанции, обнажившиеся в месте повреждения сосудистой стенки, взаимодействуют с циркулирующими коагуляционными факторами, начиная тем самым процесс активации свертывания через две взаимодействующие системы, известные под названием внешний и внутренний путь коагуляции. Как при внешнем, так и при внутреннем пути активация факторов свертывания крови происходит на фосфолипидных мембранах поврежденных клеток или активированных тромбоцитов, играющих роль матриц, где формируются протеазные комплексы. Помимо ускорения активации, формирование связанных с мембраной энзимных комплексов способствует регулированию процесса свертывания посредством защиты активированных протеаз от циркулирующих ингибиторов. В каждом из этих путей соответственно выделяют внешний и внутренний путь генерации Ха и общий путь коагуляции (см. ниже). При активации процесса свертывания крови по внешнему пути роль фосфолипидной матрицы выполняет тканевый фактор (тканевый тромбопластин), в состав которого входит апопротеин III и фосфолипид.

Тканевый тромбопластин высвобождается из поврежденных тканей, в том числе из стенки сосуда, в виде липопротеидных осколков клеточных мембран, то есть поступает в кровь извне, отсюда и название - внешний путь. При активации свертывания крови по внутреннему пути роль фосфолипидной матрицы выполняют фосфолипиды на наружной мембране активированных тромбоцитов. Последние являются составными частями крови, отсюда название - внутренний путь. Условно процесс свертывания крови можно разделить на три фазы: 1 - образование протромбиназы (активатора протромбина) - протеазного комплекса из активированных форм факторов Ха, Va, ионов кальция на поверхности фосфолипидов; 2 - образование тромбина 3 - образование нерастворимого фибрина. Отличительной особенностью первой фазы является участие различных факторов в образовании активной формы фактора X (Ха) при активации свертывания крови по внешнему или внутреннему пути. Оба пути замыкаются на факторе X и далее протекают одинаковым образом с неизменным набором факторов и обозначаются как общий путь свертывания крови (рис.2). Образование протромбиназы по внешнему пути запускается тканевым тромбопластином, на поверхности которого происходит трансформация неактивной формы фактора VII в активную (Vila). Далее активный комплекс, состоящий из тканевого тромбопластина и фактора Vila, при участии ионов кальция, активирует фактор X. Механизм активации фактора X па внутреннему пути представляет собой цепь последовательных реакций активации другой группы факторов, а именно факторов XII, XI, IX и VIII, и вызывается контактом крови с внутренними субэндотелиальными компонентами поврежденной сосудистой стенки. Начинается он с активации, так называемого, фактора контакта, фактора XII. Активированный фактор ХНа трансформирует пре-калликреин в калликреин, который по принципу положительной обратной связи еще больше усиливает активацию фактора XII. Фактор ХИа в присутствии высокомолекулярного кининогена (ВМК) активирует фактор XI. На этом заканчивается контактная фаза свертывания по внутреннему пути, которая в отличие от последующих не требует присутствия ионов кальция. Далее фактор Х1а на фосфолипидной поверхности активированных тромбоцитов в присутствии ионов кальция отщепляет пептид от фактора IX, образуя IXa. IXa вместе с фактором Villa и фосфолипидами образуют ферментный комплекс в присутствии ионов кальция. Этот комплекс, называемый теназой, превращает неактивную форму фактора X в активный Ха. Разделение на внешний и внутренний пути активации свертывания чисто условное, поскольку в организме оба процесса тесно взаимосвязаны, например, через активацию фактора IX активным фактором VII, а также посредством плазменного калликреина, который одновременно активирует

факторы XII и VII. Однако подобное разделение на внутренний и внешний пути активации значительно упрощает интерпретацию тестов, используемых для оценки состояния свертывания крови, в которых искусственно создаются условия для активации фактора X или по внутреннему, или по внешнему пути, что будет рассмотрено далее. Таблица 1 Фак Синоним тор

I II III V VII VIII IX X XI XII

Факторы свертывания крови Молеку Содержа Период Минималь Участие в лярная ние в полуный коагуляции по: масса плазме жизни в уровень, внутрен- внешн м кг/мл крови необходим нему ему ый для пути пути гемостаза 330.000 3000 4-5 дней 0,8 г/л + + 72.000 100 2-4дня 30% + + 220.000 0 7 ? +

Фибриноген Протромбин Тканевый тромбопластин Проакцелерин 330 000 Проконвертин 50.000 Антигемофиль 330.000 ный глобулин Фактор 56.000 Кристмаса Фактор 58.000 СтюартаПрауэра РТА-фактор 160.000 Фактор 80.000 Хагемана, фактор контакта

XIII Фибрин-стаби- 320.000 лизирующий фактор

10 0,5 0,1

24-34ч 2-4ч 12-184

10-15% 10% 20 - 35%

+ +

+ + -

5

20 -30 ч

20 - 30%

+

-

8

48 -56 ч

10-20%

+

+

5 30

60ч ? 50-70 ч снижение уровня кровоточи вость не вызывает Около 3 -5% 4-5 дней

+ +

-

+

+

10

Активированная форма фактора X вместе с фактором Va (акцелератором процесса), фосфолипидами в присутствии ионов кальция образует ферментный комплекс - протромбиназу. Под влиянием протромбиназы от протромбина отщепляются фрагменты 1+2 (F1+2), уровень которых определяет количество образовавшегося тромбина). После этого одноцепочная молекула протромбина трансформируется в мейзотромбин, а затем в двухцепочный активный фермент тромбин (фактор На). Далее под

действием тромбина происходит превращение фибриногена в фибрин.

Рис.2. Плазменно-коагуляционный гемостаз Процесс образования фибрина, в свою очередь, можно разделить на три стадии. В первую, протеолитическую, стадию тромбин отщепляет от молекулы фибриногена фибринопептиды А от а(А) и фибринопептиды В от р(В)-цепей, оставляя соответственно а- и бета-цепи, входящие в состав образующегося фибрин-мономера. Повышение в плазме фибрино-пептидов А и В свидетельствует об активации свертывающей системы крови и служит маркером тромбинемии. В следующую, полимеризационную, стадию мономерные молекулы соединяются друг с другом бок в бок и конец в конец, вначале образуя димеры, затем тетрамеры и более крупные олигомеры, которые по мере дальнейшего укрупнения трансформируются в волокна фибрина, (растворимый фибрин), который может быть растворен в 5М растворе мочевины. Полимеризация фибрин-мономеров происходит с постоянной скоростью. В условиях тромбинемии, когда образуется большее, чем в норме количество фибрин-мономеров, последние образуют комплексы, в том числе с фибриногеном, фибринопептидами А и В и ранними продуктами деградации фибрина (ПДФ), так называемые растворимые фибрин-мономерные комплексы, которые легко взаимодействуют с 50% этанолом и раствором бета-нафтола в 50% спирте и выпадают в осадок. Этот феномен обозначается как феномен паракоагуляции и используется для диагностики тромбинемии. В последнюю, стабилизационную, стадию фибриновая сеть стабилизируется ковалентными связями под действием фермента -фибринстабилизирующего фактора, фактора XIII, благодаря чему фибрин становится нерастворимым. Активация фактора XIII осуществляется тромбином в присутствии ионов Са.

Снижение уровня факторов свертывания (изолированный дефект при врожденных коагулопатиях или множественный при приобретенных коагулопатиях, например, при диссеминированном внутрисосудистом свертывании крови) приводит к выключению, нарушению, соответствующих ступеней коагуляционного каскада. В результате нарушается образование вторичной гемостатической пробки, что клинически проявляется у больных повышенной склонностью к кровотечениям по коагуляционному типу (см. раздел алгоритм диагностики). Исключение составляет лишь дефицит фактора Хагемана (фактора XII), который характеризуется исключительно лабораторными нарушениями - удлинением времени свертывания крови и других тестов, характеризующих внутренний путь свертывания крови. При этом клинически у людей с этим дефектом никогда не бывает геморрагических проявлений, в силу чего данное состояние получило название «гемофилия-без гемофилии». Физиологические антикоагулянты и регуляция свертывания крови Установлено, что при свертывании 1 мл крови образуется тромбин в количестве, достаточном для коагуляции всего фибриногена в 3 литрах крови. Этого фатального эффекта в организме не происходит, благодаря действию определенных противосвертывающих систем, в которые входят клеточные и гуморальные компоненты. К клеточным компонентам, обеспечивающим поддержание крови в'жидком состоянии в циркуляции, прежде всего, относятся клетки РЭС и гепатоциты, которые специфически удаляют активированные факторы свертывания крови и фибриноген без какого либо влияния на их предшественники. Гуморальный компонент состоит из физиологических антикоагулянтов, которые тем или иным путем инактивируют (ингибируют) активные факторы свертывания крови (табл.2). Среди них наиболее значимыми для практики являются антитромбин III, протеины С и S. Антитромбин III инактивирует серино-вые протеазы, а именно, тромбин и все предшествующие его образованию активные факторы (за исключением факторов ViIIa и Va), путем образования с ними неактивных комплексов. Инактивация факторов Villa и Va - сильнейших катализаторов образования тромбина, осуществляется другими белками, так называемой системой протеинов С и S, которая активируется комплексом, образующимся при взаимодействии тромбина с тромбомодулином (специфическим рецептором сосудистой стенки). Активированный этим комплексом плазменный протеин С в присутствии своего кофактора протеина S протеолитически расщепляет факторы Villa и Va и таким образом прерывается реакция образования активного фактора X и тромбина. Указанные антикоагулянты синтезируются в печени. Но в отличие от антитромбина III, синтез протеинов С и S зависит от витамина К. При лечении непрямыми антикоагулянтами в первую очередь происходит снижение уровней протеинов С и S. И, если в исходном состоянии у больного имелся дефицит этих антикоагулянтов, то на фоне терапии имеющийся дефект

антикоагулянтов усугубляется. В результате у таких больных могут развиться рецидивирующие тромбозы. Снижение уровня естественных антикоагулянтов, как правило, сопровождает венозные тромбозы и может быть как следствием генетических нарушений (врожденные тромбофилии), так и результатом их потребления, например, во время диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови. Таблица 2 Основные физиологические антикоагулянты (Баркаган З.С., Введение в клиническую гемостазиологию, Из-во «Ньюдиамед-АО» Москва 1998) Наименование Механизмы действия антикоагулянта Антитромбин III Прогрессивно действующий ингибитор тромбина, (AT III) фактора X и в меньшей степени других ферментных факторов свертывания, плазменный кофактор гепарина Гепарин Сульфатированный полисахарид, образующий комплексы с AT III, переводящий последний в быстродействующий антикоагулянт Кофактор Слабый антикоагулянт, действие которого выявляется в гепарина II присутствии гепарина после удаления из плазмы AT III Протеин С

Витамин К-зависимая серинамидаза, инактиви-рующая факторы Villa и Va; эндогенный активатор плазминогена. Активируется комплексом «тромбомодулин-тромбин» Витамин К-зависимый кофактор протеина С

Протеин S

Ингибитор Ингибитор комплекса «тканевый фактор-фактор Vila тканевого пути фактор Ха - Са++ свертывания (TFPI) Антитромбопласт Ингибиторы комплекса факторов III-ViIa ины а.2 - Слабый ингибитор тромбина, плазмина, калликреина макроглобулин си. антитрипсин I Ингибитор тромбина, факторов IXa, XIa, XIIa, плазмина Ингибитор комплемента (Анти-СI)

Тоже I

Наряду с компонентами, проявляющими ингибиторное действие, гуморальная система включает также и фибринолитический механизм, направленный на растворение фибринового сгустка (фибринолиз). Активным ферментом фибринолиза является плазмин, который образуется из плазминогена, неактивного предшественника, циркулирующего в плазме крови.

Аналогично системе свертывания различают два пути активации плазминогена с образованием плазмина: внешний и внутренний. Активация по внешнему пути осуществляется за счет тканевого активатора плазминогена (t-PA), который синтезируется в клетках эндотелия, выстилающего сосуды. Секреция t-PA из клеток эндотелия происходит постоянно и усиливается при действии разных стимулов: тромбина, ряда гормонов и лекарственных препаратов (адреналина, вазопрессина и его аналогов, никотиновой кислоты и др.), физической нагрузки, стресса, шока, тканевой гипоксии, хирургической травмы и др. Плазминоген и t-PA -оба обладают выраженным сродством к фибрину. При появлении фибрина плазминоген и его активатор связываются с ним с образованием тройного комплекса (фибрин, плазминоген, t-PA), все составляющие которого расположены так, что происходит эффективная активация плазминогена. Таким образом, плазмин образуется прямо на поверхности фибрина, который далее подвергается протеолитической деградации. Пусковым механизмом активации фибринолиза по внутреннему пути является, как и в системе коагуляции, контакт с чужеродной поверхностью, в результате которого образуется фактор ХИа и калликреин. И фактор XIla, и калликреин активируют плазминоген с образованием плазмина. Калликреин, в свою очередь, активирует фактор XII, а появившийся плазмин переводит в активное состояние и фактор XII, и прекалликреин, что приводит к значительному усилению первоначальной реакции. Таким образом, происходит одновременная активация системы свертывания и фибринолиза, что способствует поддержанию необходимого баланса между коагуляцией и лизисом фибрина. Кроме этого активация плазминогена может происходить за счет активатора урокиназного типа (и-РА), который, в отличие от тканевого активатора, не имеет сродства к фибрину, но связывается со специфичными рецепторами на поверхности различных клеток, имеющих также рецепторы для плазминогена. Таким образом, образование плазмина происходит на поверхности клеток, в частности, эндотелия и ряда форменных элементов крови, непосредственно участвующих в образовании тромба. Плазмин - активный фермент, который приводит к протеолизу не только фибрина, но и фибриногена, факторов свертывания V, VIII и целого ряда других белков плазмы. Контролируют действие плазмина несколько ингибиторов, основным из которых является быстродействующий а2антиплазмин, синтезируемый в печени. Он образует неактивный комплекс со свободным плазмином, попавшим в циркуляцию. Поэтому в плазме в физиологических условиях свободный плазмин практически не обнаруживается. Плазмин, образованный на фибрине или на поверхности клеток защищен от действия ингибитора. Ингибиция фибринолиза осуществляется также на уровне активаторов плазминогена. Наиболее физиологически значимым является ингибитор активатора плазминогена эндотелиального типа (PAI-1). Он инактивирует как тканевой, так и урокиназный типы активаторов, синтезируется в клетках сосудистого эндотелия,

обнаружен также в тромбоцитах, моноцитах и многих других клетках. Секреция усиливается при действии тканевого активатора плазминогена, тромбина, цитокинов, медиирующих воспаление, бактериальных эндотоксинов и др. Повышенное содержание этого ингибитора сопровождает венозные тромбозы, отмечается при инфарктах миокарда, ряде других состояний, связанных с тромботическими проявлениями, что позволяет считать РАМ важной составляющей в регуляции баланса между коагуляцией и фибринолизом. При действии плазмина на фибрин и фибриноген образуются продукты деградации фибрина (ПДФн) или фибриногена (ПДФг), соответственно. Различают ранние и поздние ПДФ. Ранние ПДФ образуются на первых этапах протеолиза и отличаются более высоким молекулярным весом. Дальнейшая их деградация плазмином приводит к образованию поздних ПДФ с меньшим молекулярным весом, устойчивых к протеолизу. В случае деградации фибриногена ранние ПДФг обозначают как фрагменты X и Y, поздние - фрагменты D и Е. При деградации фибрина образуются значительно более сложные комплексы фрагментов, отличительной особенностью которых является наличие так называемых D-димеров участков молекул фибриногена, связанных прочной ковалент-ной связью в процессе образования нерастворимого фибрина, которая не разрушается под действием плазмина. D-димеры и D-фрагменты можно дифференцировать с помощью иммунологических методов, что и лежит в основе определения наличия ПДФн или ПДФг, образующихся при различных патологических состояниях. ПДФ оказывают определенное действие на все звенья гемостаза сосудистое, тромбоцитарное и коагуляционное. Мелкие пептиды, высвобождаемые в начале процесса расщепления, обладают вазоактивным действием. Они вызывают нарушение микроциркуляции, транскапиллярного обмена, увеличивают проницаемость сосудов, что приводит к выходу форменных элементов крови и белков плазмы за пределы сосудов. Кроме того, ранние ПДФ ингибируют полимеризацию фибрин-мономеров, вступая во взаимодействие с ними, благодаря чему нарушается образование фибрина. ПДФ обладают также выраженным антитромбиновым действием. Поздние ПДФ блокируют рецепторы мембраны тромбоцитов, вызывая их дисфункцию. Обнаружение повышенного уровня ПДФ всегда свидетельствует о наличии плазминемии, т.е. об активации фибринолиза. Таким образом, реакции фибринолиза, обусловленные взаимодействием различных активаторов и ингибиторов, находятся в тесной взаимосвязи с реакциями гемостаза и направлены на деградацию фибрина с целью поддержания равновесия между его образованием и лизисом для сохранения целостности и проходимости сосудов. Резюмируя вышеизложенное, можно заключить, что любое повреждение целостности сосудистой стенки,является мощным стимулом для активации системы гемостаза. Однако, благодаря приспособительным реакциям человеческого организма в нормальных условиях будет достигнуто

полное равновесие, которое позволит остановить кровотечение и при этом не разовьется состояние гиперкоагуляции. Несомненно, что нарушение равновесия, вследствие поломки в том или ином звене гемокоагуляции, может привести либо к развитию гиперкоагуляции, либо к гипокоагуляции. Роль эндотелия в тромбогенности и тромборезистентности сосудов Все вещества, секретируемые эндотелием и участвующие в гемостазе и тромбозе, можно, в известной степени условно, разделить на две группы тромбогенные и атромбогенные (рис.3). К веществам, индуцирующим адгезию и агрегацию тромбоцитов, относятся фактор Вил-лебранда (vWF), фактор активации тромбоцитов (PAF), аденозин ди-фосфорная кислота (ADP), тромбоксан А2 (ТХА2). Адгезия тромбоцитов к эндотелию и субэндотелиальному матриксу - начальный этап гемостаза и тромбоза. В норме адгезии тромбоцитов к неповрежденному эндотелию не происходит, а в условиях патологии адгезия ограничивается как правило зоной прилежащей к области повреждения сосудистой стенки. Это связано с образованием эндотелиальными клетками простациклина, оксида азота (NO), экто-АОР-азы и других факторов, ингибирующих адгезию и агрегацию тромбоцитов.

Рис.3. Тромборегуляторы, образующиеся в сосудистой стенке Адгезия и агрегация тромбоцитов приводит к образованию тромбоцитарного тромба, который в нормальных условиях прочно связан с сосудистой стенкой. Этот этап гемостаза связан с активацией плазменных прокоагулянтов и образованием тромбина - ключевого фермента системы свертывания крови, под влиянием которого фибриноген превращается в фибрин. В эндотелии при определенных условиях образуется тканевый фактор (ТФ), инициирующий внешний (быстрый!) путь свертывания крови. Ингибиторы тромбиногенеза (ингибитор ТФ, тромбомодулин, протеогликаны и др.) предотвращают избыточное фибринобразование на луминальной поверхности сосудов при повреждении сосудистой стенки, а также (вместе с плазменными ингибиторами тромбиногенеза) драматическое

внутрисосудистое„свертывание крови. И, наконец, в эндотелии образуются активаторы и ингибиторы фибринолиза, процесса имеющего большое значение в «судьбе» тромба. При всем разнообразии в строении и механизмах действия тромбогенных и атромбогенных факторов есть общие закономерности в их образовании и участии в гемостазе и тромбозе. Многие из этих факторов, образующихся в эндотелии, выполняют функцию тромборегуляторов. Различают ранние и поздние тромборегуляторы. Тромборегуляторы не являются веществами строго специфичными с точки зрения их образования и действия; они оказывают влияние не только на гемостаз, но и на другие процессы: проницаемость, вазомоторные реакции (простациклин, NO, TXA2), ангиогенез, клеточную пролиферацию (тканевой активатор плазминогена) и т.д. Источниками тромборегуляторов при определенных условиях могут быть лейкоциты, макрофаги, клетки опухолей и другие клетки. Эндотелиальные клетки сосудов различных органов и тканей гетерогенны не только в плане структуры, но и секреции тромборегуляторов. Так, образование vWF в сосудах разных областей существенно различается: в легких, сердце, скелетных мышцах выявлен высокий уровень т-РНК vWF, а в почках и печени - низкий. Экспрессия t-PA ограничена in vivo приблизительно 3% васкулярного эндотелия, в эндотелии вен меньше образуется простациклина, чем в эндотелии артерий и т.д. На луминальной поверхности эндотелия имеются рецепторы ко многим биологически активным веществам циркулирующим в крови, а также к тромборегуляторам. Через взаимодействие их с рецепторами эндотелия осуществляется пара- и аутокринная регуляция их образования и секреции. Кроме того, на поверхности эндотелия имеются места связывания плазменных прокоагулянтов, антикоагулянтов и других плазменных белков. Тромборегуляторы эндотелиального происхождения, имеющие сравнительно большой период биологического полураспада, оказывают не только локальное, но и системное действие на клетки крови и кровеносные сосуды. Это относится прежде всего к тканевому фактору, простацикпину, тканевому активатору плазминогена и егомнгибитору. Вещества, секретируемые эндотелием, оказывают как прямое влияние на гемостаз (vWF, тромбомодулин и др.), так и опосредованное (эндотелии 1, супероксидный анион и др.) В регуляции гемостатической функции эндотелия большое значение имеют гормоны, цитокины, гемодинамические факторы. В физиологических условиях образование атромбогенных веществ в эндотелии преобладает над образованием тромбогеных, что обеспечивает сохранение жидкого состояния крови при повреждениях сосудистой стенки, в том числе незначительных, случайных, которые могут иметь место в норме. Секреция атромбогенных веществ определяет тромборе-зистентность кровеносных сосудов.

Эндотелий, адгезия и агрегация тромбоцитов В эволюционном плане наиболее древним механизмом гемостаза является адгезия клеток, содержащихся в гемолимфе и крови, к эндотелию. У беспозвоночных эту функцию выполняют блуждающие клетки – амебоциты, а у позвоночных, начиная с круглоротых - тромбоциты. Образование гемостатической пробки как уже отмечалось начинается с контакта тромбоцитов с тромбогенной поверхностью (адгезия); последующий рост гемостатической пробки (тромба) зависит от взаимодействия тромбоцитов друг с другом (агрегация). На поверхности тромбоцитов имеются рецепторы адгезии, относящиеся к семейству интегринов класса бета3 и бета1 и взаимодействующие с адгезивными экстрацеллюлярными белками (фибронектин, коллаген, фибриноген, тромбоспондин, ламинин, фактор Виллебранда и др.). vWF, который опосредует начальный контакт тромбоцитов с субэндотелием, синтезируется в эндотелии и мегакариоцитах; vWF секретируется в плазму и субэндотелий, а также депонируется в тельцах Weibel-Palade в эндотелиоцитах. Ген vWF локализован в 12-й хромосоме. При повреждении сосудистой стенки, вышедший из эндо-телиоцитов vWF связывается с субэндотелиальным матриксом (1-й этап), подвергается конформационным изменениям (2-й этап) и связывается с рецептором (GP Ib) тромбоцитов (3-й этап). Это связывание, которое является началом адгезии тромбоцитов, приводит к увеличению входа Са2+ и экспрессии рецепторов GP llb/llla, vWF взаимодействует с этими рецепторами; этот этап завершается распространенной, необратимой адгезией и агрегацией тромбоцитов. Особо следует отметить значение гемодинамических факторов для адгезии тромбоцитов с участием vWF. Адгезия тромбоцитов, опосредованная vWF, происходит наиболее интенсивно при высоких скоростях сдвига, т.е. в артериях. При многих заболеваниях, сопровождающихся острым и хроническим повреждением эндотелия (сахарный диабет, атеросклероз, опухоли различной локализации, гестоз и т.д.) уровень vWF в крови значительно повышается, что рассматривается как показатель дисфункции эндотелия. Увеличение синтеза и секреции vWF наблюдается под влиянием адреналина,вазопрессина. К факторам, стимулирующим адгезию и агрегацию тромбоцитов и образующимся в эндотелии, относятся также фактор активации тромбоцитов (PAF), ADP, ТХА2. Фактор активации тромбоцитов, образующийся в эндотелии, взаимодействует с соответствующими рецепторами тромбоцитов, вызывает экспрессию рецепторов GP IIb/ IIIa с последующей активацией адгезии и агрегации. Кроме того, PAF проявляет вазомоторную активность, является медиатором воспаления. Аденозиндифосфорная кислота (ADP), выделяющаяся из поврежденных эндотелиоцитов и других клеток, ковалентно связывается с рецепторами тромбоцитов. Под влиянием ADP увеличивается концентрация

внутриклеточного Са2+, что и лежит в основе его индуцирующего агрегацию действия. Тромбоксан А2 - продукт метаболизма арахидоновой кислоты. Взаимодействуя с рецепторами тромбоцитов в конечном счете вызывает увеличение внутриклеточной концентрации Са2+, их активацию и агрегацию. В отличии от простациклина ТХА2 имеет очень короткий период биологического полураспада, поэтому его эффект в основном местный. Как и PAF тромбоксан А2 оказывает вазоконстрикторное действие. К факторам, игибирующим адгезию тромбоцитов и их агрегацию относятся простациклин, оксид азота, экто-АОР-аза. Простациклин (PGI2) - продукт метаболизма арахидоновой кислоты. Синтез PGI2 в эндотелии происходит постоянно, но он не депонируется, а секретируется через луминальную поверхность в кровь. В отличие от других простагландинов PGI2 не разрушается полностью, проходя через легкие, и поэтому в случае локального увеличения его синтеза могут наблюдаться системные эффекты. Простациклин как тромборегулятор ингибирует адгезию и агрегацию тромбоцитов, активируя систему аденилатциклаза - цАМФ. Кроме этого PGI2 оказывает вазодилататорное действие, потенцирует эффекты гистамина, кининов. Увеличение продукции PGI2 наблюдается при повреждении эндотелия, гипоксии, под влиянием вазоактивных веществ (адреналин, гистамин, брадикинин, ан-гиотензин 2, эндотелии 1), цитокинов, тромбина, гемодинамических факторов. Оксид азота (NO), постоянно образуется и выделяется из эндотелия. Синтез NO определяется активностью эндотелиальной NO-синтетазы. Ацетилхолин, гистамин, эндотелии 1, ангиотензин 2, брадикинин, вазопрессин, эстрогены, тромбин усиливают синтез NO. Базальный уровень синтеза и секреции NO определяется напряжением сдвига, то есть зависит от скорости кровотока и вязкости крови. Продукты, выделяющиеся из тромбоцитов при их агрегации (ADP, серотонин), являются стимуляторами синтеза NO. Быстрое увеличение синтеза и выделения оксида азота наблюдается при активации эндотелия, сопровождающимся повышением концентрации внутриклеточного Са2+. Оксид азота, диффундирующий через луминальную поверхность эндотелиоцитов, препятствует адгезии и агрегации тромбоцитов через активацию системы гуанилатциклаза - ц-ГМФ. Период биологического полураспада NO меньше 1 секунды, он быстро инактивируется, связываясь с оксигемоглобином и особенно О2—, поэтому его биологические эффекты локальны. Однако в крови NO образует S-нитрозотиоловые и металлнитрозиловые комплексы циркулирующие в крови. По-видимому, при определенных условиях освобождающийся из этих соединений NO может оказывать системное действие. Экто-АОР-аза - представитель эндотелиальных экто-аденозиновых фосфатаз. Значение этого фермента в гемостазе заключается в том, что он расщепляет ADP, являющийся индуктором агрегации, до аденозина, который, напротив, ингибирует агрегацию и является к тому же вазоди-

лататором. Расмотренные эндотелиальные тромборегуляторы (vWF, PAF, ADP, ТХА2, PGI2, NO) влияют на тромбообразование на раннем этапе, еще до образования тромбина и поэтому их относят к группе ранних тромборегуляторов. Прокоагулянтная и антикоагулянтная активность эндотелия В норме на поверхности эндотелия не происходит свертывание крови (во всяком случае, бесспорных данных о непрерывном процессе фибринообразования нет). Трансформация поверхности эндотелия из антикоагулянтной в прокоагулянтную индуцируется тканевым фактором (ТФ), который активирует ф.\Л1, ускоряет активацию фактора X и таким образом запускается «внешний» путь свертывания крови. На поверхности эндотелия, как уже отмечалось ранее, имеются места связывания с плазменными прокоагулянтами. В норме в неповрежденном эндотелии ТФ не образуется. При повреждении сосудов, а также при гипоксии, действии цитокинов, эндотоксина, напряжении сдвига, под влиянием окисленных липопротеидов и других факторов происходит экспрессия синтеза ТФ. Через луминальную поверхность эндотелиоцитов ТФ секретируется и связывается с поверхностью эндотелия, а также циркулирует в крови. Источником ТФ в случае его увеличения в крови могут быть не только эндотелиоциты, но и другие клетки. Активация «внешнего пути» завершается образованием тромбина, на образование которого и активность влияют атромбогенные факторы, секретируемые эндотелием: ингибитор ТФ, тромбомодулин, протеогли-каны и др. Ингибитор тканевого пути свертывания (TFPI) синтезируется различными клетками, но основным его^источником является эндотелий. На поверхности эндотелиоцитов он связан с протеогликанами и мобилизуется под влиянием гепарина. TFPI связывается с ф.Ха внутри комплекса ТФА/Иа/Ха и ингибирует начальный этап гемокоагуляции - образование протромбиназы. Наряду с тромбомодулином, протеинами С, S, антитромбином и гепарином TFPI относится к естественным антикоагулянтам. Матрикс, окружающий эндотелий, содержит гепаран-сульфат, дерматан-сульфат и другие гликозаминогликаны, которые повышают активность связанного с клеткой /матриксом антитромбина III (ATIII) и гепаринкофактора II, тем самым ограничивая тромбиногенез. Тромбомодулин - гликопротеин в составе мембраны эндотелия, образует комплексное соединение с тромбином. Продукт взаимодействия превращает протеин С в активную форму, которая разрушает фА/Ша и ф-Va и тем самым ингибирует образование тромбина. Активность активированного протеина С увеличивается его кофактором протеином S, который образуется в эндотелии и в других клетках. В эндотелиоцитах также экспрессируются рецепторы для активированного протеина С.

Таким образом система тромбомодулин-протеин С выполняет антикоагулянтную функцию. Более того, модифицированный при взаимодействии с тромбомодулином, тромбин теряет способность превращать фибриноген в фибрин и вызывать агрегацию тромбоцитов. При повреждении сосудистой стенки тромбомодулин «отделяется» от эндотелия и поступает в кровь. Увеличение его в крови наблюдается у больных с претромботическими состояниями, васкулитами и т.д. Степень увеличения тромбомодулина в крови имеет диагностическое и прогностическое значение. Эндотелий и фибринолиз В эндотелии образуется и секретируется тканевой активатор плазминогена (t-PA) и его ингибитор - PAI-I (plasminogen activator inhibitor -I). t-PA, подобно vWF, секретируется постоянно, но «выброс» его из эндотелиоцитов может резко увеличиваться в определенных ситуациях (физическая нагрузка, катехоламинемия, венозная окклюзия и т.п.). PAI-I также постоянно продуцируется и секретируется эндотелиоцитами, причем находится в клетке в большом избытке по отношению к t-PA. В крови и субклеточном матриксе PAI-I связан с адгезивным гликопротеидом витронектином. В этом комплексе период биологического полураспада PAI-I увеличивается в 2-4 раза. Благодаря этому возможна концентрация PAI-I в определенном регионе и локальное угнетение фибринолиза. Ли-попротеиды очень низкой плотности, окисленные липопротеиды стимулируют продукцию РАМ. Некоторые цитокины (ИЛ-1, ФИО) и эндотелии подавляют фибринолитическую активность главным образом за счет увеличения синтеза и секреции РАМ. При воспалении, ишемической болезни сердца, идиопатическом тромбозе глубоких вен и многих других патологических процессах и заболеваниях содержание РАМ в крови увеличено. На поверхности эндотелиальных клеток имеются рецепторы к плазминогену и t-PA, что благоприятствует местной активации фибринолиза. Липопротеид (а) блокирует рецептор плазминогена и тем самым снижает фибринолитический потенциал. Из эндотелиальных клеток выделен белок с М 40000 (аннексии II), который взаимодействуя с t-PA, увеличивает его способность активировать плазминоген. t-PA, связанный с поверхностью эндотелиоцитов, «защищен» от действия его фибринолитического ингибитора PAI-I. Протеолитическая система плазминоген- t-PA-PAI-1 имеет значение не только для фибринолиза, но и вовлекается во многие другие физиологические и патологические процессы: ангиогенез, овуляция, болезни соединительной ткани, сепсис, опухолевый рост, тромболитические и геморрагические расстройства и т.д. Нарушение участия эндотелия в регуляции фибринолиза является важным звеном в патогенезе многих заболеваний, в том числе атеросклероза, и оказывает существенное влияние на динамику тромбоза.

Гемодинамические факторы и секреция тромборегуляторов Эндотелиальные клетки постоянно испытывают воздействие гемодинамических факторов: силы трения (пристеночное напряжение сдвига), трансмуральное давление, напряжение и изгибы в связи с пульсацией. Имеются убедительные доказательства влияния гемодинамических факторов на тромбогенные свойства и тромборезистентность сосудов. Так, известно, что в зонах высокого давления выше тромбопластиновая и антиагрегантная активность сосудов, при перемещении фрагмента вен протеидов и других факторов происходит экспрессия синтеза ТФ. Через луминальную поверхность эндотелиоцитов ТФ секретируется и связывается с поверхностью эндотелия, а также циркулирует в крови. Источником ТФ в случае его увеличения в крови могут быть не только эндоте-лиоциты, но и другие клетки. Активация «внешнего пути» завершается образованием тромбина, на образование которого и активность влияют атромбогенные факторы, секретируемые эндотелием: ингибитор ТФ, тромбомодулин, протеогли-каны и др. Ингибитор тканевого пути свертывания (TFPI) синтезируется различными клетками, но основным его^источником является эндотелий. На поверхности эндотелиоцитов он связан с протеогликанами и мобилизуется под влиянием гепарина. TFPI связывается с ф.Ха внутри комплекса ТФ/Vlla/Xa и ингибирует начальный этап гемокоагуляции - образование протромбиназы. Наряду с тромбомодулином, протеинами С, S, антитромбином и гепарином TFPI относится к естественным антикоагулянтам. Матрикс, окружающий эндотелий, содержит гепаран-сульфат, дерматан-сульфат и другие гликозаминогликаны, которые повышают активность связанного с клеткой /матриксом антитромбина III (ATIII) и гепаринкофактора II, тем самым ограничивая тромбиногенез. Тромбомодулин - гликопротеин в составе мембраны эндотелия, образует комплексное соединение с тромбином. Продукт взаимодействия превращает протеин С в активную форму, которая разрушает ф.УШа и ф-Va и тем самым ингибирует образование тромбина. Активность активированного протеина С увеличивается его кофактором протеином S, который образуется в эндотелии и в других клетках. В эндотелиоцитах также экспрессируются рецепторы для активированного протеина С. Таким образом система тромбомодулин-протеин С выполняет антикоагулянтную функцию. Более того, модифицированный при взаимодействии с тромбомодулином, тромбин теряет способность превращать фибриноген в фибрин и вызывать агрегацию тромбоцитов. При повреждении сосудистой стенки тромбомодулин «отделяется» от эндотелия и поступает в кровь. Увеличение его в крови наблюдается у больных с претромботическими состояниями, васкулитами и т.д. Степень увеличения тромбомодулина в крови имеет диагностическое и прогностическое значение.

Эндотелий и фибринолиз В эндотелии образуется и секретируется тканевой активатор плазминогена (t-PA) и его ингибитор - PAI-I (plasminogen activator inhibitor -I). t-PA, подобно vWF, секретируется постоянно, но «выброс» его из эндотелиоцитов может резко увеличиваться в определенных ситуациях (физическая нагрузка, катехоламинемия, венозная окклюзия и т.п.). PAI-I также постоянно продуцируется и секретируется эндотелиоцитами, причем находится в клетке в большом избытке по отношению к t-PA. В крови и субклеточном матриксе PAI-I связан с адгезивным гликопротеидом витронектином. В этом комплексе период биологического полураспада PAI-I увеличивается в 2-4 раза. Благодаря этому возможна концентрация PAI-I в определенном регионе и локальное угнетение фибринолиза. Ли-попротеиды очень низкой плотности, окисленные липопротеиды стимулируют продукцию РАН. Некоторые цитокины (ИЛ-1, ФИО) и эндотелии подавляют фибринолитическую активность главным образом за счет увеличения синтеза и секреции РАН. При воспалении, ишемической болезни сердца, идиопатическом тромбозе глубоких вен и многих других патологических процессах и заболеваниях содержание РАН в крови увеличено. На поверхности эндотелиальных клеток имеются рецепторы к плазминогену и t-PA, что благоприятствует местной активации фибринолиза. Липопротеид (а) блокирует рецептор плазминогена и тем самым снижает фибринолитический потенциал. Из эндотелиальных клеток выделен белок с М 40000 (аннексии II), который взаимодействуя с t-PA, увеличивает его способность активировать плазминоген. t-PA, связанный с поверхностью эндотелиоцитов, «защищен» от действия его фибринолитического ингибитора РАН. Протеолитическая система плазминоген- t-PA-PAI-1 имеет значение не только для фибринолиза, но и вовлекается во многие другие физиологические и патологические процессы: ангиогенез, овуляция, болезни соединительной ткани, сепсис, опухолевый рост, тромболитические и геморрагические расстройства и т.д. Нарушение участия эндотелия в регуляции фибринолиза является важным звеном в патогенезе многих заболеваний, в том числе атеросклероза, и оказывает существенное влияние на динамику тромбоза. Гемодинамические факторы и секреция тромборегуляторов Эндотелиальные клетки постоянно испытывают воздействие гемодинамических факторов: силы трения (пристеночное напряжение сдвига), трансмуральное давление, напряжение и изгибы в связи с пульсацией. Имеются убедительные доказательства влияния гемодинамических факторов на тромбогенные свойства и тромборезистентность сосудов. Так, известно, что в зонах высокого давления выше тромбопластиновая и антиагрегантная активность сосудов, при перемещении фрагмента вен в артерию продукция t-

PA и PGI2 увеличивалась, скорость тока крови в венулах влияет на размеры тромба и т.д. Наибольшее значение придается напряжению сдвига, который зависит от скорости кровотока и вязкости. Градиент сдвига, больше чем сама по себе его величина, влияет на реакции эндотелия; в регионах с высоким и низким напряжением сдвига градиент сдвига может быть одинаковым. Каким образом под влиянием гемодинамических факторов может изменяться синтез и секреция тромбогенных и тромборезистентных веществ? В настоящее время сформировалось представление о наличии в эндотелии чувствительных «механосенворов». Они могут быть расположены на поверхности эндотелиоцита, в цитоскелете, в местах адгезии или межклеточных соединений. При увеличении напряжения сдвига развиваются быстрые (< 1 мин) реакции (выделение NO, PGI2) и медленные (1-6 часов) реакции (увеличение образования NO-синтазы, t-PA, ТФ, тромбомодулина и других факторов). В механизме быстрых реакций большое значение имеют активация калиевых каналов (в течение миллисекунд), гиперполяризация мембраны эндотелиоцита, увеличение инозитолтрифосфата, диацилглице-рола, 2+ изменение Са , активация G-белков. Медленные реакции являются генопосредованными и отражают увеличение синтеза тромборегуляторов. В реальных условиях кровотока эндотелий одновременно испытывает воздействие гемодинамических и других факторов, которые модулируют эффекты друг друга. Так, например, под влиянием ИЛ-1 и ФИО в эндотелии вен и артерий происходит экспрессия ТФ, но при больших скоростях сдвига (т.е. только в артериях) одновременно усиливается продукция ингибитора ТФ и тромбомодулина. Следовательно, при одном и том же воздействии вероятность тромбоза вен значительно больше. При сдвиговом напряжении 15-20 дин/см2 секреция t-PA увеличивается, a PAI-1 - не изменяется. Повышение скорости сдвига (особенно в стенозированных сосудах) ведет к увеличению продукции NO и PGI2; при уменьшении скорости сдвига (застойные явления в венозном русле) уменьшается секреция эндотелина. Гемодинамические факторы при определенных условиях могут нарушать структуру и функцию эндотелия, т.е. действовать как патогенетические факторы, приводящие в конечном счете к нарушению баланса между тромбогенностью и тромборезистентностью, увеличению проницаемости эндотелия для макромолекул, аккумуляции липопротеидов, адгезии тромбоцитов, лейкоцитов и т.д. Таким образом, образование и выделение тромбогенных и атромбогенных веществ эндотелием - нормальный, постоянно протекающий во всех сосудах процесс. Однако в их количестве и соотношении имеются существенные различия как региональные, так и в различных отделах сосудистой системы в пределах одного региона. Различие гидродинамических характеристик в сосудах разной принадлежности, калибра и локализации определяет в значительной степени уровень их тромбогенности и тромборезистентности. Увеличение продукции и выделения тромбогенных

веществ - неспецифическая реакция на повреждение и активацию прежде всего эндотелия. При некоторых патологических процессах эта реакция сопровождается депрессией атромбогенных механизмов. Согласно общепринятой точке зрения, в физиологических условиях образование и выделение атромбогенных веществ преобладает над тромбогенными, и это является обязательным условием тромборезистентности сосудов. Если бы этого не было, даже незначительные изменения реологических свойств крови сопровождались бы адгезией тромбоцитов, активацией тромбиногенеза и нарушением кровотока прежде всего в сосудах микроциркуляторного русла. Поскольку тромборези-стентность обязательное условие нормальной микроциркуляции, ат-ромбогенные вещества должны образовываться постоянно. При функциональных нагрузках на сосуды и при активации или повреждении эндотелия образование и выделение оксида азота, простациклина, активатора плазминогена и, возможно, других факторов тромборезистентности возрастает, и это рассматривается как неспецифическая реакция. Уменьшение образования атромбогенных веществ - фактор риска тромбоза, но увеличение - еще не гарантия обратного. Атромбогенные вещества сосудистой стенки, ингибируя тромбиногенез, инактивируя прокоа-гулянты, активируя фибринолиз, препятствуя адгезии и агрегации тромбоцитов, не препятствуют гемостазу при повреждении сосудов, но ограничивают процесс тромбообразования, и в этом заключается значение тромборезистентности. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА Исследование плазменного звена гемостаза Тесты, характеризующие «внутренний» путь свертывания крови Время свертывания венозной крови по Ли -Уайту Время свертывания венозной крови оценивает общую коагуляционную активность цельной крови по скорости образования в ней сгустка. Тест малочувствителен, так как результаты его будут в пределах нормы, например, при уровне фактора VIII 5% от нормы. Техника исследования. Сухой иглой без шприца из локтевой вены, выпустив первые капли крови на ватный тампон, берут кровь по 1 мл в 2 сухие стеклянные пробирки. Включают секундомеры сразу при соприкосновении крови с пробирками. Пробирки с кровью помещают в водяную баню при 37°С (возможно определение и при комнатной температуре). Через 2 минуты после получения крови, а затем каждые 30 секунд, пробирки осторожно наклоняют под углом 60-45°. При этом, если кровь не свернулась, то она растекается по стенке пробирки. Свертывание считается законченным, когда кровь не выливается при переворачивании пробирок вверх дном. Время свертывания выражается в минутах (среднее значение из 2-х

определений). Пределы нормальных колебаний: 4 мин 55 с -11 мин 55 с (Х= 8 мин 25 с). Возможные ошибки: Необходимо учитывать, что значительные колебания температуры помещения, если определение времени свертывания венозной крови проводится при комнатной температуре, влияют на результаты исследования. При низкой температуре время свертывания удлиняется. Изменение объема крови в пробирках также влияет на результаты определения. При большом объеме крови время свертывания ее замедляется, а при малом - ускоряется. Частый и значительный наклон пробирок приводит к ускорению свертывания вследствие быстрой активации фактора контакта. Большое значение имеет состояние стенки пробирки. Если стенки пробирок поцарапаны при обработке, плохо отмыты, то время свертывания ускоряется. Следующие исследования проводят с использованием цитратной плазмы. Для этого иглой без шприца берут кровь из локтевой вены в Центрифужную пробирку со стабилизатором - 3,8% раствором основного Цитрата натрия в соотношении 9 частей крови и 1 часть раствора Для исключения попадания тканевого тромбопластина первые капли крови сливают на ватный тампон и только после этого подставляют пробирку с цитратом натрия. Сразу после получения крови производят тщательное ее перемешивание со стабилизатором, переворачивая 2 раза пробирку, закрытую полиэтиленовой пробкой. Далее стабилизированную кровь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин. Полученную плазму переносят в другую пробирку и в процессе работы хранят при комнатной температуре. Время рекальцификации плазмы Время рекальцификации плазмы - это время свертывания цитратной плазмы в термостатированных условиях (37°) после добавления к ней хлорида кальция, оно характеризует общую коагуляционную активность плазмы. Удлинение времени рекальцификации плазмы отмечается при значительных нарушениях в любой из фаз свертывания крови. В отличие от времени свертывания венозной крови это более чувствительный тест, благодаря отсутствию в плазме форменных элементов (эритроцитов, лейкоцитов), обладающих тромбопластической активностью Серьезными недостатками метода являются трудности, связанные со стандартизацией условий контактной активации и различным содержанием в плазме тромбоцитов, что приводит к значительному разбросу получаемых результатов. Техника исследования. Пробирку, содержащую 0,1 мл исследуемой цитратной плазмы и 0,1 мл 0,85% раствора хлорида натрия, прогревают 1 минуту при 37°С. Затем добавляют 0,2 мл 0,277% раствора хлорида кальция, включают секундомер и определяют время появления фибри-нового сгустка,

периодически наклоняя пробирку в водяной бане. Время рекальцификации плазмы - выражается в секундах (среднее значение из 2-х определений) Пределы нормальных колебаний: 84 с -122 с (Х=103 с.) Возможные ошибки. Несоблюдение стандартных условий центрифугирования при получения плазмы может привести к удалению из плазмы значительного числа тромбоцитов, что проявляется удлинением времени рекальцификации. Каолиновое время свертывания плазмы Каолиновое время свертывания плазмы, как и два предыдущих теста, относится к общим коагуляционным тестам. Присутствие каолина обеспечивает стандартную активацию факторов контактной фазы (факторов XII и XI), что обеспечивает большую чувствительность метода по сравнению с тестом определения времени рекальцификации. Техника исследования. В пробирке смешивают 0,1 мл тестируемой плазмы, 0,1 мл веронал-ацетатного буфера и 0,1 мл 5% суспензии каолина, инкубируют 2 минуты при 37°С. После этого добавляют 0,2 мл 0,277% раствора хлорида кальция, включают секундомер и определяют время образования фибринового сгустка. Каолиновое время свертывания плазмы выражается в секундах (среднее значение из 2-х определений) Пределы нормальных колебаний: 65с - 90 с (Х=77, 5 с) Возможные ошибки. Те же, что и при определении времени рекальцификации плазмы. На результаты определения, кроме того, оказывает влияние качество суспензии каолина. При грубодисперсной суспензии каолина может отмечаться ускорение образования фибринового сгустка. Активированное парциальное тромбопластиновое время, АПТВ Активированное парциальное тромбопластиновое время, АПТВ, определяет общую коагуляционную активность плазмы при стандартных условиях контактной активации. Благодаря добавлению препарата парциального тромбопластина (заменителя тромбоцитарных фосфолипи-дов), тест АПТВ, в отличие от каолинового времени свертывания плазмы, оценивает лишь участие факторов свертывания крови в образовании теназного и протромбиназного комплексов без влияния тромбоцитарных фосфолипидов исследуемого пациента. Удлинение АПТВ отмечается при активности факторов VIII=25-35%, 1Х=15-25 %, Xl=50-60 %, ХИ=50-60 %. Влияние на АПТВ других факторов (I, II, X) варьирует. Техника исследования. В пробирке смешивают 0,1 мл исследуемой плазмы, 0,1 мл АПТВ-реагента, инкубируют 2 минуты при 37°С. После этого добавляют 0,1 мл 0,277% раствора хлорида кальция, включают секундомер и

определяют время образования фибринового сгустка. Исследование проводят в двух параллельных пробах и рассчитывают среднее значение из 2-х определений. Результат оценивается в виде индекса АПТВ, как отношение АПТВ в исследуемой плазме к АПТВ в контрольной нормальной плазме. Пределы нормальных колебаний: 0,8 -1,1 (Х=0,95) Возможные ошибки. Результаты исследований зависят от качества суспензии каолина и парциального тромбопластина. Тест, характеризующий «внешний» путь свертывания крови Протромбиновое (тромбопластиновое) время Метод основан на том, что при наличии избытка тромбопластина и оптимального содержания кальция время образования сгустка в плазме зависит от активации свертывания по внешнему пути, преимущественно от активности факторов протромбинового комплекса - VII, V, X, II. При снижении активности одного или нескольких из перечисленных факторов, время образования сгустка в плазме замедляется. При достаточном содержании факторов удлинение протромбинового времени отмечается при лечении прямыми антикоагулянтами (гепарином) и при снижении содержания фибриногена ниже 1г/л, что подтверждается исследованием тромбинового времени и концентрации фибриногена. Техника исследования. В пробирке смешивают 0,277% раствор хлорида кальция и суспензию тромбопластина в соотношении 2:1. Полученную смесь (или разведенную в соответствии с рекомендацией фирмы изготовителя тромбопластин-кальциевую смесь) помещают на водяную баню при +37° С и оставляют там до окончания работы. 0,1 мл исследуемой плазмы прогревают в стеклянной пробирке при температуре 37°С. Через 60 сек добавляют 0,2 мл прогретой тромбопластин кальциевой смеси, включают секундомер и определяют время свертывания. Исследование проводят в двух параллельных пробах и вычисляют среднее значение из 2-х определений (разница времени в пробах не должна превышать 1 сек). Результат оценивают в секундах и выражают обычно в виде протромбинового индекса (ПИ) по следующей формуле: ПИ, % = (ПВ контрольной плазмы / ПВ больного) х 100 Пределы нормальных колебаний:_ 93 % -108 % (Х=100%) На результаты определения протромбинового индекса в значительной степени влияет чувствительность используемого тромбопластина, что нередко приводит к несопоставимости данных, полученных с разными партиями реагента. В настоящее время с целью унификации результатов определения протромбинового теста предложено оценивать их в виде

международного нормализованного отношения (MHO, INR) в единицах по формуле: MHO =(ПВ больного / ПВ контрольной плазмы)мич При данном способе расчета учитывается чувствительность тромбопластина, выраженная международным индексом чувствительности МИЧ, ISI, (указан в маркировке фирмой изготовителем). Нормальное MHO близко к 1,0 и меньше 1,4. Увеличение MHO свидетельствует о нарастании гипокоагуляции. Разберем пример расчета MHO. Протромбиновое время плазмы больного составляет 24 сек. Протромбиновое время контрольной плазмы 12 сек. МИЧ (или ISI), указанный в инструкции к тромбопластину -1,08. Отсюда MHO для данного больного = (24 : 12) 1'08=2,11 Такой способ оценки протромбинового теста особенно важен при обследовании больных, получающих непрямые антикоагулянты, для которых недопустимы колебания показателей в зависимости от применяемых реагентов. Кроме того, определение MHO, в сравнении с протром-биновым индексом, позволяет более точно подобрать дозу антикоагулянта и уменьшить риск кровотечений, связанных с его передозировкой. В тех случаях, когда не приведен индекс чувствительности тромбопластина, может быть применен расчет протромбинового теста в процентах с использованием калибровочной кривой, построенной по результатам измерения протромбинового времени в разведениях контрольной нормальной плазмы. Калибровочная кривая, при этом, должна строиться для каждой новой серии тромбопластина. Тесты, характеризующие общий (конечный) путь свертывания крови Тромбиновое время Принцип метода основан на определении времени, необходимого для образования сгустка в плазме после добавления стандартного раствора тромбина. Тромбиновое время характеризует течение конечного этапа свертывания крови (скорость превращения фибриногена в фибрин) и зависит от содержания фибриногена и ингибиторов, блокирующих действие тромбина и превращение фибриногена в фибрин. Техника исследования. Пробирку с 0,1 мл исследуемой плазмы и 0,05 мл физиологического раствора прогревают на водяной бане при 37°С в течение 30 секунд. Добавляют 0,1 мл раствора тромбопластина с активностью 30 сек, включают секундомер и определяют время появления сгустка. Повторяют определение не менее двух раз и вычисляют среднее значение. Результаты выражают в секундах . Пределы нормальных колебаний: 20,3 с - 31,5 с (Х= 29,9 с) Возможные ошибки. Использование раствора тромбина с активностью меньше или больше указанной. Для предотвращения этого обязателен контроль раствора тромбина на контрольной нормальной плазме или на

смеси плазм здоровых людей. Определение содержания фибриногена Для определения фибриногена в плазме используют различные методы, показания которых могут существенно отличаться друг от друга, особенно при гипо- или гиперфибриногенемии. Гравиметрический метод (по Р.А.Рутберг) Образующийся после свертывания плазмы фибрин быстро высушивается и по весу сгустка определяют содержание фибриногена. Техника исследования. 1,0 мл плазмы смешивают с 0,1 мл 5% хлорида кальция. Смесь инкубируют на водяной бане при 37° С. Через 20 минут после свертывания, образовавшийся сгусток переносят на фильтровальную бумагу и высушивают путем тщательного отжатия до тех пор, пока на фильтре не перестанут определяться следы влаги. Затем его взвешивают на торзионных весах. У здорового человека вес сгустка, полученного из 1,0 мл плазмы составляет -12 мг. Для определения содержания фибриногена в плазме вес полученного сгустка в мг умножают на коэффициент 0,2. Пределы нормальных колебаний: 2,0 - 4,0 г/л (Х= 3,0 г/л) Возможные ошибки. Ошибки метода могут быть связаны с потерей части сгустка на фильтре, недостаточным высушиванием фибрина, что ведет к завышению результатов; либо пересушиванием сгустка с ошибочным сдвигом в сторону снижения уровня фибриногена. Метод мало информативен, когда образуется рыхлый сгусток (при ДВС синдроме), при замедлении свертывания крови, например, при гемофилии, лечении гепарином или гирудином. Недостатком метода также является большой расход крови исследуемого больного. Хронометрический метод (по Клауссу) Определение содержания фибриногена по методу Клаусса производится согласно инструкции, прилагаемой к набору, который в России выпускают фирмы «Ренам», Москва и «Технология-Стандарт», Барнаул. Принцип метода основан на определении времени свертывания разведенной плазмы избытком высокоактивного тромбина. Время свертывания плазмы при этом зависит от концентрации в ней фибриногена. Концентрация фибриногена определяется по стандартной калибровочной плазме с известным содержанием фибриногена. Данный метод, в отличие от предыдущего, является более чувствительным и информативен при всех состояниях, при которых гравиметрический метод, как указывалось, дает ошибочные результаты Определение активности фактора XIII, фибрин-стабилизирующего фактора Определение активности фактора основано на учете времени рас-

творения в оксалате мочевины сгустка фибрина, полученного путем рекальцификации плазмы, к которой добавляют монойодуксусную кислоту для ингибиции активности ф.ХШ (фибриназы). Чем дольше не происходит растворение сгустка, тем выше активность фибриназы, физиологическая роль которой заключается в полимеризации фибрина. У больных, имеющих удлиненное время свертывания крови, время превращения фибриногена в фибрин замедлено. В связи с этим будет ускорено и растворение последнего в оксалате мочевины. С целью устранения влияния дефицита факторов «внутреннего пути» коагуляции в исследуемую плазму добавляют раствор тканевого тромбопластина. Техника исследования. К 0,2 мл плазмы добавляют 0,1 мл тканевого тромбопластина (ЮОмг/Юмл), используемого для определения протромбинового теста, 0,3 мл 0,277% раствора хлорида кальция и 0,1 мл 0,3% раствора монойодуксусной кислоты. Испытуемую смесь инкубируют на водяной бане при 37°С, через 20 минут добавляют 2,0 мл кислого ок-сапата мочевины и определяют время растворения сгустка фибрина. Активность фактора XIII выражают в процентах к норме, то есть к усредненному значению показателя времени растворения сгустка фибрин-мономера у здоровых лиц. Пределы нормальных колебаний: 70% -120 % (33 с - 49 с) (Х=100 %, 41 с) Исследование тромбоцитарного звена гемостаза Определение числа тромбоцитов Определение числа тромбоцитов в капиллярной, венозной крови, плазме должно проводиться с помощью соответствующих приборов или микроскопически в счетной камере Горяева. При последнем определении методом выбора является способ Брехера и соавторов с использованием фазовоконтрастного микроскопа (или фазовой насадки КФ-1, КФ-4) и разведением крови 1:100 гемолизирующим 1,5%-ным раствором ок-салата аммония. Разведение рекомендуется проводить в пробирке с помощью микродозаторов или микропипеток на 0,01 или 0,02 мл. В данном методе разрушение эритроцитов путем гемолиза не только облегчает подсчет тромбоцитов, уменьшая ошибку метода, но и позволяет в случае значительного изменения числа тромбоцитов при повторном исследовании больного делать в пробирке более адекватные разведения, а именно, 1:251:50 - при значительной тромбоцитопении и 1:300-1:500 - при тромбоцитозе и тромбоцитемии. Фиксация кровяных пластинок оксала-том аммония дает возможность осуществить достаточно полное их осаждение в камере Горяева без сопутствующего разрушения части клеток. Метод подсчета тромбоцитов в счетной камере должен сочетаться с оценкой морфологии кровяных пластинок в мазке крови. Нередко, пренебрегая этим, не выявляют такие диагностически важные данные как резкое

увеличение размера тромбоцитов при болезни Бернара-Сулье, появление крупных агранулированных («серых») пластинок при синдроме серых тромбоцитов, микроформ при синдроме Вискотта-Олриджа, почти полное отсутствие агрегатов тромбоцитов и отростков в пластинках при тромбастении Гланцмана. Предотвращение возможных ошибок. Для отличия тромбоцитов от частичек различных загрязнений, от дефектов на стекле счетной камеры необходимо пользоваться неповрежденными новыми камерами Горяева и обеспечить чистоту всех используемых средств (камер, пипеток, пробирок, раствора оксалата аммония и стабилизаторов крови при определении числа тромбоцитов в венозной крови). Забор крови в мерную пипетку или дозатор должен проводиться максимально быстро: из венозной крови немедленно после поступления в силиконированную или полиэтиленовую пробирку, из капиллярной -сразу после удаления первой выступившей из ранки капли крови. После разведения крови нужно хорошо перемешать суспензию клеток, переворачивая пробирку приблизительно 10 раз. Для обеспечения полного оседания тромбоцитов камеру Горяева помещают в увлажненную чашку Петри не менее чем на 20 минут. Точность метода зависит от площади счетной камеры, на которой подсчитываются тромбоциты. Лодсчет нужно производить на площади 25 больших квадратов в каждом из двух разведений, отдельно приготовленных в двух пробирках. Такая точность особенно необходима в функциональных тестах, основанных на определении разности содержания клеток в двух пробах (например, в ретенционных тестах, при определении индекса внутрисосудистой агрегации в методе Wu и Hoak). Для определения числа тромбоцитов в 1 мм3 (1 мкл) исходного образца (крови, плазмы) необходимо учитывать основные параметры камеры: ее высоту - 0,1 мм (поэтому подсчитанное в камере число тромбоцитов всегда нужно умножать на 10) и площадь 25 больших квадратов, равную 1 мм2 (поэтому числом подсчитанное на большей или меньшей площади, должно быть отнесено именно к 1 мм2, с помощью второго множителя). Третьим множителем является поправка на примененное при подсчете разведение, и обычно он равен 100, но может изменяться от 25 до 500. Методы определения длительности кровотечения Длительность кровотечения является скрининговым тестом для выявления нарушений первичного гемостаза. Метод основан на определении времени кровотечения из нанесенной на поверхности кожных покровов небольшой ранки стандартного размера. Это время зависит от способности сосудисто-тромбоцитарных гемостатических механизмов останавливать кровотечение из поврежденных мелких сосудов и капиллля-ров и поэтому его продолжительность может характеризовать состояние первичного гемостаза. Оно может быть нарушено вследствие дефектов сосудистого

звена, неполноценности функциональных свойств кровяных пластинок или дефицита/дефекта плазменных кофакторов тромбоцитарных реакций (фибриногена, фактора Виллебранда), выраженной тромбоцитопении. При снижении числа тромбоцитов менее 100х109/л имеется прямая связь между степенью тромбоцитопении и удлинением времени кровотечения. Длительность кровотечения коррелирует также с геморрагическими тенденциями при тромбоцитопатиях и болезни Виллебранда. Увеличение времени кровотечения наблюдается и при тяжелой анемии (Ht