Метод. рекомендации к вып. работ по курсу Биофизический практикум

1

Московский ордена Трудового Красного Знамени инженернофизический институт (государственный университет) Министерства высшего и профессионального образования РФ.

Качановский Е.А., Ушаков В.Л.

Методические рекомендации к выполнению работ по курсу “Биофизический практикум”

Москва – 2002 г.

Учебное пособие “Методы исследования биологических объектов”

2

Содержание. I) Выделение молекул ДНК из клетки, определение степени ее очистки, конформации и концентрации в растворе. II) Дополнение к лабораторной работе № 9 “Реакция Белоусова - Жаботинского”. Качественные периодические реакции. III) Оптическая активность биологических молекул. IV) Количественное определение белка в растворе.

3

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №1 Выделение ДНК. Цель работы: познакомиться с основными принципами и практическими приемами выделения и очистки ДНК из тканей животного и растительного происхождения.

Введение Теоретическая часть работы взята из УСПЕХИ СОВРЕМЕННОМ БИОЛОГИИ ТОМ 91, (1981), ВЫП. 1, с.49 – 59/ СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ВЫСШИХ РАСТЕНИИ Мирошниченко Г. П., Дьяченко Л. Ф. К настоящему времени мы располагаем довольно большим набором методов экстракции и очистки растительных ДНК, причем эти методы продолжают совершенствоваться и модифицироваться применительно к новым объектам исследования. Использование того или иного метода выделения ДНК диктуется, во-первых, спецификой изучаемого материала, а во-вторых, тем, какая преследуется цель: получение суммарной, ядерной, хлоропластной ДНК или других ее препаратов. Ядерная ДНК, как правило, представляет наибольший интерес, поскольку служит матрицей для транскрипции генов. В приложении 5 приведена схема регуляции транскрипции генов. Метод выделения ДНК должен быть относительно простым, хорошо воспроизводимым и давать возможность быстрого получения достаточных количеств удовлетворительно очищенных препаратов ДНК. В связи с разнообразием живых объектов универсальных методов выделения ДНК (а тем более из высших растений) не существует. При выделении ДНК из растений приходится сталкиваться с целым рядом методических сложностей, связанных с низким содержанием ДНК в растительном материале, трудностью разрушения клеток, а также с большим количеством примесей (полисахаридов, пигментов, дубильных веществ), затрудняющих очистку ДНК. При этом надо учитывать структурные особенности и регуляцию функционирования внутриклеточных ферментативных систем. Например, внутри лизосом, где происходит расщепление протеинов и липидов, для работы протеаз создается за счет работы протонных насосов кислый pH=4, в то время, как внутрицитоплазменный порядка 7,2. Роль основных внутриклеточных посредников и их вид приведены в приложении 7. В приложении 8 указаны примеры рецепторов-протеинкиназ, механизм действия которых основан на регуляции активности белков за счет их фосфорилирования. Выход ДНК зависит от природы исходного материала и обусловлен содержанием ДНК в данной ткани, а также наличием и характером примесей, препятствующих очистке ДНК. Для растительных объектов выход ДНК обычно ниже, чем для тканей животных (например, при выделении ДНК из свежих листьев ценой больших усилий удается получить до 0,1 мг/г листьев). Качество получаемого препарата ДНК определяется задачами дальнейшей работы. В любом случае ДНК должна содержать минимальное количество примесей полисахаридов и белков (не более 2—3%), что отражается на так называемых спектральных характеристиках препаратов ( А260/А230 ≥ 2,0; А260/А280 ≥ 1,8—1,9). Содержание РНК в чистых препаратах ДНК также не должно превышать 2—3%. Любой полученный препарат ДНК должен соответствовать определенным критериям чистоты, нативности и полимерности. Получение ДНК из митохондрий и пластид растительной клетки достаточно специфично. В данной работе приведено рассмотрение методов, используемых для выделения и очистки препаратов суммарной ДНК, а также ядерных ДНК из тканей высших растений. Удобнее всего выделять ДНК из молодых тканей и органов высших растений (например, из проростков или луковиц). В ряде случаев наиболее доступным в больших количествах растительным материалом служат листья. Однако уже перечисленные трудности получения высокоочищенных препаратов ДНК из растений встречаются прежде всего при работе именно с листьями. При выделении препаратов суммарной ДНК из листьев необходимо учитывать, что

4

при этом часть ДНК будет представлена хлоропластной ДНК (см. приложение 1). Как показали авторы, крупные листья содержат вдвое большее количество хлоропластной ДНК по сравнению с ядерной. Для средних листьев количество хлоропластной ДНК примерно одинаково с ядерной ДНК, для малых листьев треть всей ДНК листа находится в хлоропластах. Предпочтительно выделять ДНК из свежего растительного материала, который сразу замораживают жидким азотом, что способствует ингибированию ДНКаз. Замороженные жидким азотом ткани и органы растений иногда хранят до выделения ДНК при -20°С. Замороженный материал можно также размельчить до порошкообразного состояния, лиофилизировать и хранить при комнатной температуре без доступа влаги. Разработан даже способ выделения ДНК из растительных объектов, фиксированных спиртом. Начальный этап процесса выделения ДНК - разрушение клеточных оболочек. Существующие способы разрушения тканей можно разделить на три группы: 1) механическое растирание, размалывание, гомогенизация; 2) применение ферментов, специфически расщепляющих компоненты клеточных стенок; 3) сочетание механического разрушения с ферментной деградацией. Для гомогенизации тканей используют специальные измельчители с ножами, вращающимися при высоких скоростях: 10-40 тыс. об/мин. Этот способ предпочтительно применять для молодых, легко разрушающихся растительных тканей. Фиксированный материал гомогенизируют в присутствии этанола. Удовлетворительного механического разрушения тканей удается достичь при растирании их в охлажденной ступке с отмытым соляной кислотой кварцевым песком, порошкообразной окисью алюминия, измельченным стеклом. Метод широко применяется для разрушения различных тканей, в частности вегетативных и генеративных органов гороха, мышиного горошка, табака, яблони, ландыша, меристематических тканей лука, проростков салата. Его используют также и для разрушения лиофилизированного материала. Меньшее распространение получил способ разрушения клеток различными прессами. В последнее годы начали интенсивно развиваться ферментативные методы разрушения клеточных оболочек, приводящие к получению протопластов. Несомненное их преимущество - отсутствие нежелательных жестких механических воздействий, приводящих к деградации высокополимерных молекул ДНК. Это весьма существенно, если для дальнейшей работы требуется высокополимерная ДНК, например для изучения репликации ее в клетке. Кроме того, при использовании протопластов увеличивается выход ДНК за счет снижения потерь на различных этапах очистки от полисахаридов, что дает возможность уменьшить количество исходного материала до нескольких граммом. Однако при всех своих достоинствах этот метод выделения ДНК из протопластов сопряжен с трудностью получения самих протопластов. Учитывая химический состав клеточных стенок, для их лизиса используют различные пекто- и целлюлолитические ферменты. Сначала ткань мацерируют, используя пектиназы. Самая активная среди известных пектиназ - мацерозим, выделенный из гриба Rhyzopus, несколько менее активен препарат пектинол R-10. Разрушение клеточных стенок проводят в среде, содержащей 0,4-0,7М маннит или сорбит, с помощью так называемых целлюлазных комплексов - сложных систем ферментов, в состав которых входят С1-фермент и Схфермент, а также целлобиаза, гидролизующие различные типы связей в молекулах полисахаридов. Эффективность действия целлюлазного комплекса зависит от наличия в нем всех трех, а возможно, и большего количества отдельных компонентов. Целлюлазные комплексы, выделенные из различных источников, известны обычно под своими фирменными названиями. Широко используются, например, препараты «Оnozuka R-10» (Япония) и «Сеllulysin» (США), полученные из Trichoderma viride, «Сеllulase» (США) - из Aspergillus niger; отечественная промышленность производит ферментные препараты целлокандин, целловиридин, целлолигнорин, а также ксиланигрин и ксиланазу, выделяемые из различных микроорганизмов. Эти препараты также могут быть использованы для получения протопластов из высших растений.

5

Как правило, для успешного лизиса клеточных стенок экспериментально для каждой ткани подбирают состав и концентрацию растворов, рН, состав и концентрации ферментов, время и температуру инкубации. Для целого ряда тканей уже разработаны оптимальные условия получения протопластов. По данным литературы, выход протопластов составляет более 95%. Протопласты легко разрушаются осмотическим шоком или детергентами. При этом в гомогенат переходят интактные ядра и различные клеточные органеллы. Лизис протопластов можно также проводить в присутствии детергентов, например, тритона Х-100, нонидета Р-40. Получение растительных протопластов используется как промежуточный этап препаративного выделения хлоропластной и ядерной ДНК. При этом лизат протопластов центрифугируют в градиенте плотности сахарозы для разделения субклеточных органелл и получения из них чистых препаратов ДНК. Следует отметить, что требования к протопластам, предназначенным для выделения из них ДНК, отличаются от требований, предъявляемых при необходимости их дальнейшего культивирования, когда на первый план выступает проблема сохранения жизнеспособности протопластов. Суммируя сказанное выше, можно заключить, что выбор метода разрушения растительной ткани определяется конечной задачей работы, спецификой ткани и другими причинами. Для разрушения нежных эмбриональных тканей удобно использовать гомогенизацию, растирание в ступке. Фиксированный материал или ткани с прочными клеточными оболочками следует измельчать в ступках или мельницах при замораживании жидким азотом. Для выделения отдельных типов ДНК (ядерной, хлоропластных) наиболее целесообразны ферментативные методы разрушения клеточных оболочек. Для получения высокополимерного препарата ДНК необходимо ингибировать освобождающиеся при разрушении клеток нуклеазы. Примерный состав клеток приведен в приложении 2. Для снижения активности нуклеаз процесс выделения проводят на холоду (от 0° до +2°С), в неоптимальной для их действия щелочной среде. При гомогенизации тканей в среду вводят ингибиторы: ЭДТА, цитрат натрия и другие соединения, связывающие ионы Мg2+, необходимые для действия ДНКаз. В разной степени ДНКазы подавляют ион арсената, фторид и хлорид натрия в высокой концентрации, фенол, парааминосалициловая кислота (4амино-2-гидроксибензойная кислота), детергенты, бентонит. Активным ингибитором ДНКаз служит ауринтрикарбоновая кислота в концентрациях 10-50 мМ. Кроме того, вследствие термолабильности ДНКазы частично денатурируют в результате прогревания лизатов тканей при 55-60°С. Для получения препарата суммарной ДНК после разрушения ткани проводят лизис клеточных и ядерных мембран. В качестве лизирующего агента чаще всего применяют додецилсульфат натрия (SDS) (н-С12Н25SО4Nа) в концентрациях 1-5%. SDS способствует лизису мембран и ядер, увеличивает выход и улучшает депротеинизацию ДНК. Депротеинизирующий эффект SDS заключается в том, что при связывании его с белком образуются растворимые комплексы. SDS интенсивно разрушает водородные и гидрофобные связи в молекулах белков, растворяет многие ранее не растворимые белки. Комплексы белка с SDS приобретают значительный отрицательный заряд из-за сульфогрупп иона додецилсульфата.

6

Мембрана Гидрофильный участок белка

Солюбилизированный белок Рис. 1. Действие детергента при солюбилизации мембранного белка. В зависимости от соотношения белка и детергента в растворе солюбилизированный белок может находиться в состоянии, показанном на рисунке, или образовывать с детергентом более сложную мицеллу.

Кроме SDS, для лизиса тканей применяют и другие детергенты: 1%-ный триизопропилнафталинсульфонат (изо-С3Н7)3С10Н4SО3Nа, 1%-ный цетилтриметиламмоний бромид (С16Н24(СН3)3N+Br-) (цетавлон), 4%-ный додецилсаркозинат натрия (С11Н21СОN(СН3)СН2СООNа) (саркозил). Каждый из них обладает своими достоинствами и недостатками. SDS выпадает в осадок на холоду и в присутствии калия. Саркозил растворим на холоду, но образует нерастворимые соли с Мg2+и Мn2+. Триизопропилнафталинсульфонат активно ингибирует нуклеазы, но также образует нерастворимые соли с магнием и марганцем. Кроме того, последние два детергента интенсивно поглощают свет при 260 нм. Додецилсаркозинат натрия применяют в том случае, когда планируется дальнейшая очистка ДНК в хлориде цезия, так как в отличие от SDS он растворим в этой соли. Помимо детергентов, в лизирующие смеси иногда вводят протеолитические ферменты бактериального происхождения, не теряющие активности при повышенной температуре (до 60°С). Особенно эффективна протеиназа К («Sigma», США), которая обладает очень широкой субстратной специфичностью. Активация этого фермента более чем в 7 раз в присутствии мочевины и SDS обусловлена главным образом денатурацией белковсубстратов в этих условиях. В литературе описаны некоторые приемы, используемые в ряде случаев при лизисе и обеспечивающие на последующих этапах выделения ДНК из растений ее очистку от окрашенных примесей. Характерная особенность высших растений - наличие в их тканях большого количества полифенольных соединений, к которым относятся водорастворимые пигменты и дубильные вещества. Лизис клеток сопровождается окислением полифенолов за счет активации клеточных полифенолоксидаз. В результате возникают окрашенные продукты, которые наряду с имеющимися в клетках водорастворимыми растительными пигментами способны необратимо связываться с ДНК, препятствуя ее дальнейшей очистке. Окрашенные примеси в препаратах ДНК могут влиять на результаты количественного определения ДНК в препарате химическими методами, на определение РНК в ДНК орциновым методом и белка по Лоури, а также на величину отношения А260/А280, т. е. характеристики окрашенных препаратов ДНК не будут отражать их истинных свойств. Универсальных методов очистки растительных ДНК от окрашенных примесей, к сожалению, не существует. Имеются указания на эффективность обработки размельченных растительных тканей диметилсульфоксидом ((СН3)2SО2) при - 40°С для удаления пигментов

7

и нуклеаз перед экстракцией ДНК. На последних этапах выделения очищенную от полисахаридов и белков окрашенную ДНК можно пропустить через сефадекс G-50. При этом пигменты выходят из колонки после ДНК. Желтую и коричневую окраску препаратов ДНК иногда удается устранить обработкой 2-метоксиэтанолом на последних этапах очистки. Одновременно удаляются некоторые полисахариды и белки. Однако при использовании 2метоксиэтанола наблюдаются значительные потери ДНК. Более эффективная очистка от окрашенных примесей достигается, если для предотвращения окисления полифенольных соединений в лизирующую смесь добавляют антиокислители (например, аскорбиновую кислоту в восстановленной форме, 2-меркаптоэтанол, дитиотреитол или 8-оксихинолин). С этой же целью при лизисе используют диэтилдитиокарбамат ((С2Н5)2NCSSNa), ингибирующий полифенолоксидазы. Иногда его применяют в сочетании с поливинилпирролидоном, который связывает полифенольные соединения. Таким способом можно получать чистые препараты ДНК из растений, отличающихся высоким содержанием дубильных веществ (например, из хвощей и папоротников). Иногда помимо добавления в лизирующую смесь поливинилпирролидона и диэтилдитиокарбамата требуется дальнейшая очистка ДНК от пигментов, например методом гель-фильтрации. Однако следует отметить, что без использования вышеупомянутых соединений на начальных этапах выделения все попытки очистить ДНК от пигментов на последующих стадиях могут оказаться безрезультатными. После лизиса обычно проводят многократную депротеинизацию полученного лизата. При этом происходит разрушение химических связей, поддерживающих третьичную и четвертичную структуру белка (виды и энергия связей в биологических молекулах приведены в приложении 3). Для этого к нему добавляют различные соединения, обеспечивающие диссоциацию нуклеопротеидных комплексов (NаС1, NаС1О4, мочевину), а затем агенты, денатурирующие белки. Выбор депротеинизирующих агентов определяется конкретными условиями и задачами дальнейшей работы с выделяемыми препаратами ДНК. Несмотря на широкое распространение, методы депротеинизации ДНК фенолом и хлороформом обладают рядом серьезных недостатков. Один из них состоит в разрушении высокополимерных молекул ДНК на фрагменты при механическом встряхивании с этими депротеинизирующими агентами. Кроме того, имеются сведения, что фенол избирательно экстрагирует сателлитную ДНК АТ-типа, вызывает увеличение потерь ДНК при выделении. Обработка фенолом на 10% снижает вязкость ДНК, понижает температуру плавления, приводит к изменениям богатых ГЦ-парами участков. При использовании хлороформа могут происходить потери связанной с мембранами или гетерохроматиновой ДНК. При количественном определении потерь нуклеиновых кислот за счет двукратной обработки фенолом и хлороформом оказалось, что теряется примерно четвертая часть ДНК. При двукратной обработке хлороформом потери ДНК составляют 16%. Хлороформ избирательно экстрагирует однонитчатую ДНК: ~54% при трех обработках. Потерь ДНК, вызываемых обработкой фенолом или хлороформом, удается избежать при использовании препаративных градиентов СsСl. Ультрацентрифугирование в градиенте плотности дает возможность получать высокоочищенные препараты ДНК. Наличие СsСl в высокой концентрации (2-4 М) вместе с 5 М мочевиной иногда приводит к полной диссоциации нуклеопротеидных комплексом. Принцип метода очистки состоит в том, что ДНК и примеси (РНК, белки, полисахариды) различаются по плавучей плотности. Плотность СsСl и условия центрифугирования подбирают так, чтобы РНК осаждалась на дно, белок всплывал на поверхность, а ДНК располагалась близко к центру пробирки. Этот метод не является простым или экономичным в смысле времени и оборудования, однако ценность его заключается в том, что он очень эффективен при наличии малых количеств исходного материала. После очистки равновесным центрифугированием в СsСl препараты ДНК содержат