Нитевидные фаги E. coli - молекулярные векторы генетической инженерии

БИОЛОГИЯ НИТЕВИДНЫЕ ФАГИ E. coli – МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВЕКТОРЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ С. Н. ЩЕЛКУНОВ Новосибирский государственный университет

ВВЕДЕНИЕ

FILAMENTOUS PHAGES E. coli – MOLECULAR VEHICLES OF GENETIC ENGINEERING S. N. SHCHELKUNOV

The development of a genetic engineering system of molecular vehicles on the basis of the circular DNA of filamentous viruses (phages) of bacteria Escherichia coli is reviewed.

© Щелкунов С.Н., 2001

Рассмотрен вопрос о том, как была разработана генно-инженерная система молекулярных векторов на основе кольцевой ДНК нитевидных вирусов (фагов) бактерии Escherichia coli.

2

www.issep.rssi.ru

В генетической инженерии в качестве клонирующих векторных молекул используют широкий спектр плазмидных и вирусных двухцепочечных ДНК [1]. Однако в ряде случаев, например: при определении последовательности нуклеотидов, выделении комплементарной РНК, направленном мутагенезе и некоторых других, необходимо манипулировать с одной цепью ДНК. При этом приходится разделять цепи ДНК, что не всегда можно сделать достаточно просто. Поэтому клонирование ДНК в одноцепочечных векторах является привлекательным объединением в одном эксперименте процедур изолирования целевой последовательности ДНК, ее размножения (амплификации) и разделения цепей исходно двухцепочечного фрагмента ДНК. НИТЕВИДНЫЕ ФАГИ Нитевидные вирусы М13, fd, f1 бактерии Escherichia coli (кишечной палочки), называемые обычно бактериофагами или просто фагами, наиболее подходят для создания одноцепочечных векторных молекул ДНК. Частицы этих фагов представляют собой трубочку (1000 х 6 нм) из гидрофобного фагового белка pVIII, внутри которой содержится молекула кольцевой одноцепочечной ДНК. На одном из концов фаговой частицы молекула ДНК взаимодействует с несколькими молекулами фагового белка pIII, называемого белком-лоцманом [2]. Последовательность нуклеотидов фаговой ДНК расшифрована (6407 нуклеотидов для фага M13, 6408 для фага fd). Нитевидные фаги адсорбируются на половых ворсинках клеток E. coli (белковых трубочках, предназначенных для переноса ДНК из клетки в клетку; рис. 1, а), и одноцепочечная кольцевая ДНК фага в комплексе с белкомлоцманом проникает в цитоплазму клетки (рис. 1, б ), где происходит достройка второй цепи фаговой ДНК. Образовавшаяся двухцепочечная кольцевая молекула ДНК (рис. 1, в), называемая репликативной формой (РФ), реплицируется, достигая 200–300 копий на клетку. Затем репликация этих молекул ДНК в основном

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 8 , 2 0 0 1

БИОЛОГИЯ

г

в

д

Белок pV б

е Цитоплазматическая мембрана

Клеточная стенка

а

Белок pIII Половая ворсинка

ДНК Белок оболочки pVIII

Рис. 1. Схема цикла развития нитевидного фага [2]: а–е – этапы развития. Объяснения в тексте

осуществляется асимметрично и синтезируется большое количество одной из двух цепей (обозначается как (+)-цепь), которая покрывается димерами фагового белка pV (рис. 1, г) и взаимодействует с белком-лоцманом pIII (рис. 1, д). При выходе фаговой ДНК из клетки через плазматическую мембрану белок pV постепенно замещается на белок оболочки pVIII, находящийся на клеточной мембране (рис. 1, е). Образующиеся при инфекции фаговые частицы постоянно секретируются из клеток без лизиса (разрушения) последних. Длина вирионов зависит от величины фагового генома и может варьировать в широких пределах. Скорость роста клеток E. coli, зараженных нитевидным фагом, на 25–50% ниже, чем неинфицированных. Поэтому при титровании на твердой агаризованной среде нитевидные фаги образуют на бактериальном газоне мутные бляшки. При размножении данных фагов их геном в бактериальной клетке одновременно присутствует в виде большого числа копий двухцепочечной кольцевой плазмиды и одноцепочечной ДНК в составе вирионов. На одноцепочечной вирионной ДНК обычные генно-инженерные эксперименты невыпол-

нимы [1]. Однако их с успехом можно осуществить на репликативной форме генома нитевидных фагов. Все это обусловило использование данных фагов для создания клонирующих векторов. ФАГ М13 В КАЧЕСТВЕ КЛОНИРУЮЩЕГО ВЕКТОРА Наличие в фаговом геноме области, несущественной для его жизнедеятельности, является важным условием использования этого фага для конструирования гибридных молекул ДНК. У нитевидных фагов существует лишь межгенная область размером 500 нуклеотидов, в которой могут быть произведены изменения (делеции, вставки) без нарушения жизнеспособности фага. Репликативная форма фаговой ДНК не имеет участков узнавания многих рестриктаз, образующих при гидролизе липкие концы, а кроме того, фаговый геном не содержит генетических маркеров, которые позволили бы легко выявлять гибридные фаги. Поэтому конструирование векторных нитевидных фагов включает в себя прежде всего введение в геном селективных маркеров и

Щ Е Л К У Н О В С . Н . Н И Т Е В И Д Н Ы Е ФА Г И E . c o l i – М О Л Е К УЛ Я Р Н Ы Е В Е К Т О Р Ы Г Е Н Е Т И Ч Е С К О Й И Н Ж Е Н Е Р И И

3

БИОЛОГИЯ уникальных участков расщепления определенными рестриктазами.

небольшими молекулами) он теряет способность образовывать комплекс с оператором.

Первый гибридный фаг M13 был описан Мессингом с соавторами в 1977 году. Репликативная форма ДНК фага M13 гидролизуется рестриктазой BsuRI на 10 фрагментов, имеющих тупые концы. Чтобы получить полный фаговый геном в линейной форме, РФ гидролизовали ограниченным количеством рестриктазы BsuRI так, что каждая молекула ДНК в среднем расщеплялась лишь в одном из участков действия BsuRI. Линейные молекулы размером в полный фаговый геном выделили электрофоретически и к ним добавили HindII-фрагмент лактозного оперона E. coli, имеющий размер 789 пар нуклеотидов (пн) и содержащий часть гена lacI, промоторно-операторную область и начальную часть гена lacZ, кодирующую 145 N-концевых аминокислот β-галактозидазы (рис. 2). Полученные фрагменты сшили по тупым концам с помощью ДНКлигазы фага T4 и провели трансфекцию клеток E. coli. Для понимания принципа осуществленного затем отбора гибридных фагов рассмотрим строение лактозного оперона E. coli.

Наибольший интерес для молекулярных биологов в lac-опероне представляет ген lacZ. Продукт этого гена – β-галактозидаза (β-Gal) – катализирует расщепление лактозы на глюкозу и галактозу и легко определяется по специфической ферментативной активности. Наиболее популярный способ фенотипического выявления активности β-Gal состоит в том, что в агаризованную питательную среду, на которой выращивают колонии E. coli, добавляют 5-бром-4-хлор-3-индолилβ-D-галактозид (обозначаемый Xgal). Данное соединение само по себе бесцветно. Однако при его гидролизе β-галактозидазой образуется ярко-синий 5-бром-4хлориндиго. Поэтому колонии E. coli lacZ+ в присутствии Xgal окрашиваются в синий цвет, а мутантные lacZ− варианты формируют белые колонии. Рассматриваемый фермент обладает уникальными свойствами. В 1968 году была описана так называемая α-комплементация β-галактозидазы, которая относится к внутрицистронной (внутригенной) комплементации и состоит в том, что в результате нековалентной ассоциации различно измененных мутантных форм или фрагментов одного и того же белка образуется функционально активный фермент. Полипептид β-Gal состоит из 1021 аминокислотного остатка. Ферментативной активностью обладает белок, состоящий из четырех таких субъединиц (тетрамер с суммарной молекулярной массой 460 кДа). При изучении различных мутантов по гену lacZ были выявлены неактивные формы β-галактозидазы, обозначенные M15 и M112 и имеющие соответственно делеции аминокислот с 11-й по 41-ю (11–41 АК) и с 23-й по 31-ю (23–31 АК). Оказалось, что эти

Лактозный оперон (lac-оперон) E. coli состоит из трех генов, с которых транскрибируется единая полицистронная мРНК (рис. 3). Синтез мРНК lac-оперона регулируется белком, называемым репрессором. Этот белок кодируется геном lacI. В активной форме репрессор связывается на ДНК с операторным участком (о) lac-оперона и блокирует транскрипцию мРНК с промотора P. Блокированный таким образом оперон называют репрессированным. При инактивации репрессора (в результате мутации или связывания с определенными HindII lac'I PO

HindII lacZ'

IR

α-Донор Неполный гидролиз BsuRI II IR

“X” M13

“X” V VII

M13 mp1

Мутагенез

Z' OP 'I M13 mp2

VIII

IV I

V IV

ДНК-лигаза фага Т4

Z' OP 'I IR

EcoRI

II

III VI

VII VIII

I VI

III

Рис. 2. Схема создания гибридных фагов М13: IR – межгенная область фагового генома; римскими цифрами обозначены гены фага

4

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 8 , 2 0 0 1

БИОЛОГИЯ Репрессия синтеза

lacI

P O

lacZ

lacY lacA

Репрессор Индукция синтеза Репрессор

мРНК

Индуктор Рис. 3. Схема лактозного оперона E. coli. P – промотор, O – оператор. Объяснения в тексте

мутантные белки не образуют тетрамерной структуры, а являются димерами. Более того, было обнаружено, что если к препарату β-Gal M15 или M112 добавить пептид 3-92 АК, то происходит комплементация – восстанавливается ферментативная активность. Такой фермент, подобно нативному, имеет тетрамерную структуру. Неактивные белки с делецией в N-концевой последовательности β-Gal получили название α-акцепторы, а комплементирующие их пептиды или мутантные формы белка – α-доноры. В более поздних исследованиях было показано, что пептид 3-41 АК также является полностью активным α-донором по отношению к β-Gal M15. Таким образом, возвращаясь к экспериментам Мессинга с соавторами, подчеркнем, что гибридный фаг M13, содержащий встраиваемый HindII-фрагмент лактозного оперона, должен детерминировать в клетках E. coli синтез полноценного α-донора (1-145 АК) β-галактозидазы. Наиболее простой способ выявления такого синтеза состоит в использовании в качестве хозяина мутантного штамма E. coli, синтезирующего α-акцептор β-Gal. В этом случае in vivo будет происходить α-комплементация и фенотип Lac− исходных клеток изменится в инфицированных клетках на Lac+. Одним из наиболее простых методов тестирования такого изменения фенотипа является, как указывалось выше, цитохимическая реакция, происходящая в агаризованной среде, содержащей хромогенное соединение Xgal. Газон реципиентных клеток E. coli, синтезирующих α-акцептор β-Gal (обычно используют мутант lacZ M15), на среде с Xgal будет белого цвета, а окрашивание в синий цвет должно выявляться только в районах скопления клеток, инфицированных гибридным фагом M13 (бляшках). При этом исходный фаг формирует бесцветные бляшки. Отобранный на среде с Xgal гибридный фаг, синтезирующий α-донор β-галактозидазы, обозначили M13mp1 (см. рис. 2). Однако этот фаг еще нельзя было использовать в качестве векторного, так как в нем отсутствовали единичные места гидролиза рестриктаза-

ми в межгенной области. Поэтому была предпринята попытка образовать рестрикционное место, используя мутагены, специфично действующие на одноцепочечную ДНК. Из известной к тому времени нуклеотидной последовательности начала структурного гена lacZ следовало, что если гуанин в положении 13 заменить на аденин, то образуется специфичная последовательность, узнаваемая рестриктазой EcoRI (рис. 4). После мутагенеза ДНК вводили в клетки E. coli и индивидуальные фаговые клоны подвергали проверке на наличие участка гидролиза рестриктазой EcoRI на РФ фаговой ДНК. В результате такой работы выделили мутант фага M13mp1, имеющий участок узнавания рестриктазы EcoRI. Мутантный фаг обозначили M13mp2 (см. рис. 2). В полученном фаге в аминокислотной последовательности синтезируемого фрагмента β-галактозидазы в пятом положении произошла замена аспарагиновой кислоты на аспарагин. При этом α-комплементация β-Gal M15 не нарушилась, так как данная область α-донора для комплементации несущественна. При встройке чужеродных фрагментов ДНК по EcoRI-месту M13mp2 в большинстве случаев прекращается синтез функционального α-донора. В результате такие гибридные фаги образуют при инфекции мутантных клеток E. coli на среде с Xgal бесцветные бляшки, в то время как исходный фаг M13mp2 формирует бляшки синего цвета. Как видим, полученный фаг M13mp2 уже является клонирующим вектором, позволяющим осуществлять прямой отбор гибридов. Для расширения возможностей клонирования различных фрагментов в векторном фаге M13mp2 в его ДНК по EcoRI-месту встроили синтетические двухцепочечные фрагменты ДНК (обычно называемые полилинкерами), которые содержат разные комбинации уникальных участков гидролиза различных рестриктаз. Исходный α-пептид

H2N-Thr-Met-Ile-Thr-Asp-Ser- …

M13mp1 (+) цепь после …5' ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-GAT-TCA-CT … метилирования CH3 …3' TAC-TGG-TAC-TAA-TGC-TTA-AGT-GA … Комплементарная (−) цепь после ошибочной репликации …5' ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-AAT-TCA-CT … M13mp2 (+) цепь (потомство мутантного EcoRI фага) Экспрессируемый мутантный α'-пептид

H2N-Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser- …

Рис. 4. Схема мутационного введения участка действия рестриктазы. EcoRI в ДНК фага M13mp1

Щ Е Л К У Н О В С . Н . Н И Т Е В И Д Н Ы Е ФА Г И E . c o l i – М О Л Е К УЛ Я Р Н Ы Е В Е К Т О Р Ы Г Е Н Е Т И Ч Е С К О Й И Н Ж Е Н Е Р И И

5

БИОЛОГИЯ BamHI HaeII XhoI SmaI BamHI PvuI r Km HindIII fd 106 BamHI

HaeII

BamHI HaeII BamHI

BamHI BamHI Cmr

PvuI fd 101

Ap

r

HaeII

PstI

HaeII BamHI

fd 103

r

Cm

EcoRI

HaeII

Apr

Kmr

HaeII XhoI SmaI PvuI HaeII HindIII

1 2 3

EcoRI

PvuI PstI

HaeII

Рис. 5. Рестрикционные карты репликативных форм ДНК векторных фагов fd. Обозначены фрагменты ДНК: 1 – фага fd; 2, 3 – различных плазмид. Apr, Kmr, Cmr – гены устойчивости к антибиотикам ампициллину, канамицину и хлорамфениколу соответственно

Созданные фаги получили названия M13mp7, M13mp8, M13mp9 и др. Используя данный набор векторных нитевидных фагов, можно решать большой спектр генноинженерных задач. ДРУГИЕ НИТЕВИДНЫЕ ФАГИ ТОЖЕ МОЖНО ИСПОЛЬЗОВАТЬ В КАЧЕСТВЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЕКТОРОВ Кроме векторов на основе фага M13 получены векторы на основе фагов fd и f1. На рис. 5 приведены структуры нескольких векторных вариантов фага fd, которые были сконструированы по стратегии, разработанной при получении фага M13mp1. В данном случае векторные фаги обусловливают устойчивость к антибиотикам, и поэтому инфицированные ими клетки способны расти на питательной среде с соответствующим антибиотиком. Расширить возможности использования одноцепочечных векторов удалось путем совмещения генетических элементов плазмид и нитевидных фагов в составе одной молекулы ДНК. Дотто с соавторами в 1981 году по EcoRI-участку плазмиды pBR322 встроили фрагмент репликативной формы ДНК фага f1 размером 1,3 тыс. пн, включающий все элементы генома, необходимые для инициации репликации и морфогенеза фага, и показали, что при суперинфекции фагом f1 клеток E. coli, содержащих созданную плазмиду pD4, примерно половина секретируемых в культуральную среду вирионов несет одноцепочечную ДНК фага f1, а другая половина – одноцепочечную ДНК гибридной плазмиды. В дальнейшем был получен большой набор таких плазмид, которые часто называют фагмидами (phagemid) вследствие возможной двоякости их существования.

6

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Из проведенного выше рассмотрения видно, что векторная система нитевидных фагов разработана достаточно хорошо. Это обусловливает все более активное применение в последние годы данных векторов для расшифровки нуклеотидной последовательности (секвенирования) клонированных фрагментов ДНК, для направленного мутагенеза клонированных генов. Все чаще векторные производные нитевидных фагов используют для экспрессии чужеродных генов в клетках E. coli. На основе использования генно-инженерно реконструированных нитевидных фагов сформулировано и интенсивно развивается новое направление молекулярно-биологических исследований, получившее название фаговый дисплей. ЛИТЕРАТУРА 1. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия: Учеб. пособие: В 2 ч. Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та, 1994–1997. 2. Лурия С., Дарнелл Дж., Балтимор Д., Кэмпбелл Э. Общая вирусология. М.: Мир, 1981. 680 с.

Рецензент статьи Л.И. Корочкин *** Сергей Николаевич Щелкунов, доктор биологических наук, профессор кафедры молекулярной биологии факультета естественных наук Новосибирского государственного университета, зав. отделом молекулярной биологии геномов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии “Вектор” (Кольцово Новосибирской обл.), член-корреспондент РАЕН. Область научных интересов – структурно-функциональная организация и эволюция вирусных геномов, противовирусные вакцины, генетическая инженерия. Автор трех монографий и двухтомного учебного пособия для вузов “Генетическая инженерия”.

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 8 , 2 0 0 1