Фотодвижение клеток Dunaliella Teod. (Dunaliellales, Chlorophyceae, Viridiplantae)

Н.П. МАСЮК, Ю.И. ПОСУДИН, Г.Г. ЛИЛИЦКАЯ

ФОТОДВИЖЕНИЕ КЛЕТОК Dunaliella Teod. (Dunaliellales, Chlorophyceae, Viridiplantae)

-1-

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ БОТАНИКИ им. Н.Г. ХОЛОДНОГО НАЦИОНАЛЬНЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Н.П. Масюк, Ю.И. Посудин, Г.Г. Лилицкая

ФОТОДВИЖЕНИЕ КЛЕТОК Dunaliella Teod. (Dunaliellales, Chlorophyceae, Viridiplantae) Киев 2007

NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF UKRAINE M.G. KHOLODNY INSTITUTE OF BOTANY NATIONAL AGRICULTURAL UNIVERSITY

Маssjuk N., Posudin Yu., Lilitskaya G.

PHOTOMOVEMENT OF THE CELLS OF Dunaliella Teod.

(Dunaliellales, Chlorophyceae, Viridiplantae)

Kyiv 2007

-2-

Об авторах Масюк Надежда Прохоровна, доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник Института ботаники им. Н.Г. Холодного Национальной академии наук Украины. Много лет изучает водоросли (биоразнообразие, флора, систематика, экология, география, происхождение, эволюция, филогения, место в системе органического мира, прикладная альгология). Проблемами фотодвижения интересуется в связи с исследованиями разнообразия, филогении фитофлагеллят, вопросами их классифицирования, биотехнологии выращивания каротиноносных водорослей и получения из них препаратов каротина. Автор 260 научных работ. Посудин Юрий Иванович, профессор, доктор биологических наук, заведующий кафедрой биофизики Национального аграрного университета. Закончил в 1969 г. радиофизический факультет Киевского государственного университета им. Т. Шевченко. Основные научные интересы исследование фотобиологических реакций высших и низших растений, неразрушающий контроль качества сельскохозяйственной продукции. Автор 15 книг и свыше 100 статей.

Лилицкая Галина Георгиевна, ведущий инженер Института ботаники им. Н.Г. Холодного Национальной академии наук Украины. Закончила биологический факультет Киевского государственного университета им. Т. Шевченко в 1986 г. Имеет около 40 публикаций по фотодвижению водорослей, биоразнообразию и флоре.

-3-

УДК581.188.12 ББК 28.571я73 П63 Масюк Н.П., Посудин Ю.И., Лилицкая Г.Г. Фотодвижение клеток Dunaliella Teod. (Dunaliellales, Chlorophyceae, Viridiplantae). - Киев, 2007. - 264 с.

В монографии представлен обзор исторического развития и современного состояния фундаментальных исследований фотодвижения водорослей. Рассмотрены вопросы терминологии и логические основы классификации фотодвижения микроорганизмов, приведена детальная характеристика рода Dunaliella Teod. как основного объекта исследований. Освещены результаты экспериментальных исследований параметров фотодвижения двух видов Dunaliella и влияния на них абиотических факторов, процессов фоторецепции, сенсорного преобразования поглощенного фоторецепторными молекулами кванта света в сигнал, управляющий работой жгутикового аппарата, особенностей работы жгутиков. Рассмотрена возможность использования видов Dunaliella как тест-объектов, а параметров фотодвижения – в качестве тест-функций в процессе биотестирования водных сред на содержание поверхностно-активных веществ, солей тяжелых металлов, пестицидов. Перспективным для биотестирования признан метод лазерной допплеровской спектроскопии. Для оценки влияния токсикантов предложен векторный метод биотестирования водных сред. Обсуждается возможность использования полученных данных для совершенствования биотехнологии утилизации каротиноносных штаммов Dunaliella. Сделана попытка оценки значения данных о фотодвижении водорослей для эволюционной биологии, филогенетики, систематики и таксономии, экологии и географии водорослей. Предлагается программа дальнейших исследований в области фотобиологии движения фитофлагеллят. Рассчитана на альгологов и протистологов широкого профиля, гидробиологов, биофизиков, физиологов, экологов и биотехнологов, преподавателей, аспирантов и студентов биологических факультетов высших учебных заведений. У монографії наведено огляд історичного розвитку і сучасного стану фундаментальних досліджень фоторуху водоростей. Розглядаються питання термінології і пропонуються логічні основи класифікації фоторуху мікроорганізмів. Подано детальну характеристику роду Dunaliella Teod. як основного об’єкта досліджень. Викладено результати експериментального вивчення основних параметрів фоторуху Dunaliella та впливу на них абіотичних факторів, процесів фоторецепції, сенсорного перетворення поглинутого фоторецепторними молекулами кванта світла у сигнал, що керує роботою джгутикового апарату, особливостей роботи джгутиків. Розглянута можливість використання видів Dunaliella як тест об’єктів, а параметрів їх фоторуху як тест-функцій для біотестування водного середовища, що містить поверхневоактивні речовини, солі важких металів, пестициди. Перспективним для біотестування визнано метод лазерної допплерівської спектроскопії. Для оцінки впливу токсикантів розроблено векторний метод біотестування водного середовища. Обговорюється можливість використання одержаних даних для удосконалення технології отримання препаратів каротину з каротиносних штамів Dunaliella salina. Зроблено спробу оцінити значення даних про фоторух водоростей для еволюційної біології, філогенетики, систематики і таксономії, екології і географії водоростей. Пропонується програма подальших досліджень в галузі фотобіології руху фітофлагелят. Розрахована на альгологів та протистологів широкого профілю, гідробіологів, біофізиків, фізіологів, екологів та біотехнологів, викладачів, аспірантів та студентів біологічних факультетів вищих навчальних закладів. Утверждено к печати Ученым советом Института ботаники им. Н.Г. Холодного НАН Украины Рецензенты: чл.-кор. НАН Украины, профессор Г. В. ДОНЧЕНКО д-р биол. н., профессор Ю.П. ГОРГО

Электронный макет монографии Н.П. Масюк, Ю.И.Посудин, Г.Г. Лилицкая Фотодвижение клеток Dunaliella Teod. (Dunaliellales, Chlorophyceae, Viridiplantae) подготовлен в Электронном издательстве «Аналитическая микроскопия» (рег. Свидетельство Эл № 776072 Министерства РФ по делам печати, телерадиовещания и средств массовой информации от 4 февраля 2002 г.). Электронный макет подготовила ред.1 кат. Шатурная Н.В.Гл. ред. Проф. А.Ю.Буданцев Ó Электронное издательство “Аналитическая микроскопия” Пущино, 2007 г.

ISBN 000000 ©Ин-т ботаники им. Н.Г. Холодного НАН Украины, 2007 ©Национальный аграрный университет, 2007

©Академпериодика, 2007 -4-

СОДЕРЖАНИЕ Введение ГЛАВА 1. Фотодвижение водорослей – история исследований и современное состояние проблемы ГЛАВА 2. Вопросы терминологии и логические основы классификации светозависимого поведения свободноподвижных микроорганизмов (фототаксисов) 2.1. Состояние вопроса 2.2. Параметрический принцип классификации фотодвижения организмов Заключение ГЛАВА 3. Род Dunaliella Teod.: морфология, способы размножения, экология, эволюция, географическое распространение, вопросы систематики 3.1. История открытия и описания рода Dunaliella 3.2. Морфология 3.3. Способы размножения 3.4. Экология и географическое распространение 3.5. Положение рода Dunaliella в системе зеленых водорослей 3.6. Внутриродовая классификация ГЛАВА 4. Исследование фотодвижения Dunaliella 4.1. Объекты исследований 4.2. Методы исследований фотодвижения Dunaliella 4.2.1. Экспериментальная установка 4.2.2. Измерение скорости движения клеток водорослей 4.2.3. Измерение фототопотаксиса 4.2.4. Фурье-преобразование углового распределения клеток 4.3. Результаты исследования фотодвижения Dunaliella и их обсуждение 4.3.1. Фотокинез и фотокинетические реакции 4.3.2. Фототопотаксис 4.3.3. Фурье-преобразование углового распределения клеток Заключение ГЛАВА 5. Влияние абиотических факторов на фотодвижение Dunaliella 5.1. Влияние температуры 5.2. Влияние электрических полей 5.3. Влияние рH среды 5.4. Одновременное влияние нескольких внешних факторов 5.5. Влияние ультрафиолетового излучения 5.6. Влияние ионизирующего излучения Заключение ГЛАВА 6. Структура фоторецепторной системы 6.1. Проблемы фоторецепции у водорослей 6.2. Структура фоторецепторных систем зеленых водорослей 6.3. Структура фоторецепторной системы Dunaliella 6.3.1. Стигма у изученных видов Dunaliella 6.3.2. Выяснение структуры фоторецептора Dunaliella 6.3.3.Использование техники облучения суспензии клеток водоросли двумя потоками света Заключение ГЛАВА 7. Идентификация фоторецепторных пигментов 7.1. Характеристика фоторецепторных пигментов 7.2. Идентификация фоторецепторных пигментов Euglena gracilis 7.2.1. Дискуссия относительно фоторецепторных пигментов Euglena gracilis 7.2.2. Выделение пигментов 7.2.3. Микроспектрофотометрия и микрофлуориметрия пигментов -5-

7.2.4. Определение спектра действия фотобиологических реакций 7.2.5. Биохимические методы 7.2.6. Изучение влияния специфических химпрепаратов 7.2.7. Использование заместителей фоторецепторных пигментов 7.3. Идентификация фоторецепторных пигментов у зеленых водорослей 7.4. Идентификация фоторецепторных пигментов у Dunaliella 7.4.1. Анализ спектра действия фототопотаксиса Dunaliella 7.4.2. Использование латерального ультрафиолетового излучения Заключение ГЛАВА 8. Механизмы фоторецепции и фотоориентации Dunaliella 8.1. Известные механизмы фоторецепции и фотоориентации водорослей 8.2. Диффракционный механизм фоторецепции и фотоориентации Dunaliella 8.3. О роли белков в механизмах фоторегуляции движения жгутиковых водорослей Заключение ГЛАВА 9. Сенсорное преобразование у Dunaliella 9.1. Методы исследования сенсорного преобразования 9.2. Сенсорное преобразование у Euglena gracilis 9.3. Сенсорное преобразование у зеленых водорослей 9.4. Сенсорное преобразование у Dunaliella 9.4.1. Методы исследований 9.4.2. Влияние ионов кальция 9.4.3. Влияние ионофора А23187 9.4.4. Влияние оуабаина 9.4.5. Влияние ионов кобальта 9.4.6. Влияние циннаризина и изоптина 9.4.7. Влияние азида натрия Заключение ГЛАВА 10. Работа жгутикового аппарата 10.1. Структура жгутикового аппарата 10.2. Особенности биения жгутиков 10.2.1. Биения жгутика Euglena gracilis 10.2.2. Биения жгутиков Chlamydomonas reinhardtii 10.2.3. Биения жгутиков Dunaliella 10.3. Регистрация биений жгутиков 10.3.1. Высокоскоростная микрокинематография 10.3.2. Лазерная допплеровская спектроскопия 10.3.3. Метод светорассеяния 10.3.4. Метод фотометрии Заключение ГЛАВА 11. Прикладные аспекты исследования фотодвижения Dunaliella. биотестирование водных сред 11.1. Водоросли рода Dunaliella как тест-объекты 11.2. Параметры фотодвижения Dunaliella как тест-функции 11.3. Влияние поверхностно-активных веществ (пав) на фотодвижение Dunaliella 11.3.1. Характеристика поверхностно-активных веществ 11.3.2. Влияние различных типов ПАВ, их комбинаций и продолжительности действия на скорость движения клеток Dunaliella 11.4. Исследование влияния тяжелых металлов на фотодвижение Dunaliella с помощью лазерной допплеровской спектроскопии 11.5. Векторный метод биотестирования 11.6. Использование векторного метода биотестирования водных сред на основе регистрации параметров фотодвижения Dunaliella 11.6.1. Зависимость вектора 11.6.2. Зависимость вектора 11.6.3. Зависимость вектора

v Rv от типа и концентрации ПАВ Rv от типа и концентрации тяжелых металлов R от типа и концентрации пестицидов

-6-

11.6.4. Преимущества векторного метода биотестирования Заключение ГЛАВА 12. Dunaliella как объект биотехнологии 12.1. Каротиноиды, b-каротин и его стереоизомеры. Биосинтез b-каротина 12.2. Dunaliella salina – источник промышленного получения b-каротина Заключение Общие итоги и перспективы дальнейших исследований Summary Литература Указатель латинских названий Указатель основных терминов

-7-

«… амебы пролежали полтора часа под действием этого луча и получилось вот что: в то время как в диске вне луча зернистые амебы валялись вяло и беспомощно, в том месте, где пролегал красный заостренный меч, происходили странные явления. В красной полосочке кипела жизнь». М. Булгаков, 1925 “The only generalizаtion that can be made for photomovement is its diversity” W. Haupt, 1983

ВВЕДЕНИЕ Фотодвижение - это движение или изменение движения организмов, вызванное светом. Фотодвижение является результатом фоторегуляции движения - совокупности элементарных процессов, индуцированных световым стимулом, а именно: фоторецепции, первичных реакций фоторецепторных пигментов, сенсорного преобразования светового стимула в физиологический сигнал, управляющий работой двигательного аппарата, реализующего фотоориентацию организма. Проблема фотодвижения и фоторегуляции движения микроорганизмов в последнее время привлекает все больше внимания, что объясняется важной биологической ролью этого явления, его связью с такими фундаментальными процессами жизнедеятельности организмов, как фотосинтез, фоторецепция, трансформация энергии, перенос веществ через мембранные структуры клетки. Изучение процессов фотодвижения и его фоторегуляции имеет непосредственное отношение к выявлению общих принципов регуляции внутриклеточных процессов метаболизма, онтогенеза, эмбриогенеза, морфогенеза. Эти исследования имеют немаловажное значение для экологии и биоценологии, поскольку свет - важный фактор распределения организмов в пространстве и времени, выполняющий самостоятельную роль и вместе с тем несущий информацию о сопряженном с ним комплексе факторов среды обитания, таких, как температура, рН, содержание биогенных элементов, кислорода, наличие других организмов и пр. [Крицкий, 1982, Синещеков, Литвин, 1982]. Исследование механизмов фотодвижения биологических объектов небезынтересно также с точки зрения бионики, эволюционной биологии и морфологии, филогенетики и систематики. Известно, например, что в альгологии строение локомоторного и фоторецепторного аппаратов, характер движения жгутиков - важные систематические признаки на уровне высших таксонов - отделов и классов [Седова, 1977; Топачевский, Масюк, 1984; Масюк, 1993; Масюк, Костіков, 2002]. Это позволяет предположить возможное существование специфичности в процессах фоторецепции и механизмах фоторегуляции движения у представителей различных отделов (классов) водорослей. Наконец, исследования закономерностей фотодвижения могут иметь практический выход в связи с проблемами биоиндикации состояния водных объектов и биотестирования водных сред, биотехнологии, повышения продуктивности ценных в хозяйственном отношении микроорганизмов и т.д. Вторая половина ХХ и начало ХХI века ознаменовались появлением ряда обзоров, посвященных фотодвижению микроорганизмов [Halldal, 1958, 1961; Haupt, 1959, 1983; Bendix, 1960; Hand, Davenport, 1970; Nultsch, 1975; Wolken, 1977; Lenci, Colombetti, 1978; Nultsch, Häder, 1979, 1988; Diehn, 1979; Feinleib, 1980; Colombetti, Lenci, 1982; Lenci, 1982; Poff, Hong, 1982; Синещеков, Литвин, 1982а, 1988; Häder, 1987а, 1987b, 1987c; 1994; 1996a, Lenci et al., 1984; Colombetti, Petracchi, 1989; Donk, Hessen, 1996; Häder, Lebert, -8-

2000; Lebert, Häder, 2000; Sineshchekov, Govorunova, 2001a; Hegemann, Deininger, 2001; Hegemann et al., 2001]. Кроме того, освещению основных достижений в фундаментальных исследованиях фотодвижения микроорганизмов в значительной мере способствуют регулярно проводимые научные конференции и школы: "Biophysics of Photoreceptors and Photobehaviour of Microorganisms" (Pisa, 1975), "Photoreception and Sensory Transduction in Aeural Organisms" (N.Y., 1980), "Sensory Percеption and Transduction in Aeural Organisms" (N.Y., 1985), "Biophysics of Photoreceptors and Photomovement in Microorganisms" (Tirrenia, 1990), "Light as Energy Source and Information Carrier in Plant Photophysiology" (Volterra, 1994); Международные конференции «Актуальные проблемы альгологии» (Черкассы, 1987; Киев, 1999); “Photosensory Receptors & Signal Transduction” (Ventura, 2004). С каждым годом растет ассортимент штаммов подвижных микроорганизмов, пригодных для исследования фотодвижения. Cовершенствуется экспериментальная техника, предназначенная для исследования фотодвижения микроорганизмов, которая в настоящее время имеет на вооружении такие современные методы и средства как видеомикрография, фототаксиграфия, допплеровская лазерная спектроскопия, скоростная кинематография, электрофизические измерения. Разработаны автоматизированные системы регистрации разнообразных параметров фотодвижения, сбора и обработки информации; находят применение все новые методические приемы, позволяющие исследовать отдельные этапы фотодвижения организмов. В то же время, разработка и использование новых экспериментальных методов наряду с исследованием новых объектов, демонстрирующих фотодвижение, представляют большой интерес. Следует отметить, что исследование фотодвижения микроорганизмов сопровождается рядом трудностей, связанных с большим разнообразием фотореакций, наличием различных типов фоторецепторных систем, как в пределах одного микроорганизма, так и у разных микроорганизмов, перекрыванием спектров поглощения фоторецепторных пигментов, сложностью изолирования этих пигментов и многими другими проблемами. Исследование процесса сенсорного преобразования кванта света, поглощенного молекулой пигмента, в сигнал, управляющий движением клетки, также затруднительно; именно поэтому процессы фоторегуляции движения микроорганизмов представляются своеобразным "черным ящиком" с нераскрытыми до сих пор тайнами (рис. В1). И если для таких хорошо изученных фотобиологических процессов как фотосинтез или биофизика зрения многие детали обобщены для больших групп организмов, то совершенно иная ситуация наблюдается в изучении фотодвижения микроорганизмов. Учитывая огромное разнообразие микроскопических объектов, следует подчеркнуть, что даже, если у одного типа микроорганизмов процессы фоторегуляции движения будут изучены с начала и до конца, это совсем не означает применимость полученных выводов для других микроорганизмов. «Единственным обобщением, которое может быть сделано для фотодвижения, является признание его разнообразия» - эти слова принадлежат одному из ведущих фотобиологов современности В. Хаупту [Haupt, 1983].

В

-9-

Рис. 1. В1 Процессы фоторегуляции движения микроорганизмов - своеобразный "черный ящик" с нераскрытыми до сих пор тайнами. На рисунке представлено юмористическое изображение всех трудностей, сопровождающих исследователей фотодвижения водорослей (Из [Brookhaven Lecture Series No. 9; BNL 699(T-241)])

Настоящая работа посвящена результатам, проводимых нами с 1980 г. исследований теоретических, экспериментальных и прикладных проблем, связанных с фотодвижением одноклеточных зеленых водорослей из рода Dunaliella Teod., в частности, двух видов - D. salina Teod. и D. viridis Teod. Интенсификация исследований в каком-либо направлении, как правило, приводит к обогащению, пересмотру и изменению старой терминологии, в прокрустово ложе которой не укладывается новая информация. Этот процесс происходит в настоящее время и в области изучения фотодвижения микроорганизмов. Вот почему вопросам терминологии и классификации фотодвижения микроорганизмов в данной работе уделяется особое внимание. В экспериментальном и методическом планах предметом нашего интереса было изучение местоположения и структуры фоторецепторных систем, состава фоторецепторных пигментов, механизмов фоторецепции и фотоориентации, процессов сенсорного преобразования поглощенного фоторецепторными молекулами кванта света в сигнал, управляющий работой жгутикового аппарата. Сравнение параметров фотодвижения двух видов одного рода представляет интерес и с точки зрения таксономии. Именно поэтому авторы настоящего исследования постарались осветить применение основных методических и экспериментальных приемов, которые бы позволили приблизиться к пониманию процессов фотодвижения мало изученных в этом плане представителей жгутиковых водорослей. Интерес представляют вопросы взаимодействия водорослей рода Dunaliella с окружающей средой, в частности, влияние внешних факторов (излучения видимого и ультрафиолетового диапазонов, температуры, рН, электрических и электромагнитных полей) на фотодвижение этих водорослей. Оба вида водорослей, избранные в качестве модельных объектов наших исследований, интересны как потенциальные датчики и тестобъекты, которые реагируют на разнообразные внешние факторы и состав водной среды, а также как возможные источники промышленного получения каротина (провитамина А), аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот, глицерина, корма для рыбоводческих хозяйств; именно поэтому вопросы прикладного использования явления фотодвижения для целей биомониторинга окружающей среды и биотехнологии также нашли свое отражение в данной работе. Естественно, привлекательной задачей является сравнительный анализ фотодвижения жгутиковых водорослей, т.е. выявление общих и специфических закономерностей в процессе фотодвижения у представителей различных таксонов водорослей. Основная цель настоящей работы – исследование фотодвижения одноклеточных зеленых водорослей из рода Dunaliella. Задачами работы являются: 1) обзор исторического развития и современного состояния фундаментальных исследований фотодвижения водорослей; 2) рассмотрение вопросов терминологии и классификации параметров фотодвижения микроорганизмов; 3) экспериментальное измерение параметров фотодвижения двух видов Dunaliella и исследование влияния на них абиотических факторов; 4) экспериментальное изучение процессов фоторецепции - местоположения и структуры фоторецепторных систем, состава фоторецепторных пигментов, механизмов фоторецепции и фотоориентации двух видов Dunaliella; 5) экспериментальное изучение процессов сенсорного преобразования поглощенного фоторецепторными молекулами кванта света в сигнал, управляющий работой жгутикового аппарата двух видов Dunaliella; 6) рассмотрение возможности прикладного использования фотодвижения двух видов Dunaliella для целей биомониторинга окружающей среды и биотехнологии; 7) сравнительно-систематический анализ процессов фотодвижения водорослей у представителей разных таксонов. Авторы выражают глубокую благодарность проф. Ф.Ф. Литвину (Московский государственный - 10 -

университет) и проф. Б.В. Громову (С.-Петербургский государственный университет) за постоянный интерес, проявленный к нашим исследованиям фотодвижения Dunaliella и плодотворные дискуссии при обсуждении результатов; проф. Ф. Ленчи и д-ру Дж. Коломбетти (Институт биофизики, Пиза, Италия), профессорам Д.-П. Хэдеру (Университет Фридриха-Александра, Эрланген, Германия), А. Флоресу-Мойа (Университет г. Малага, Испания), Х. Каваи (Университет г. Кобе, Япония), Х. Виенке и Д. Хэнелту (Институт полярных и морских исследований, Бремерхафен, Германия) за предоставленную возможность проведения исследований в области фотобиологии и фотодвижения водорослей на базе соответствующих учреждений, руководимых ими лабораторий, а также проф. Бен-Амотцу (Национальный Институт Океанографии, Израиль) за любезно предоставленный для публикации иллюстративный материал.

- 11 -

ГЛАВА 1 ФОТОДВИЖЕНИЕ ВОДОРОСЛЕЙ – ИСТОРИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ И СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ Раскрыть тайну движения живого пытались еще в глубокой древности. Первые труды в этой области принадлежат Аристотелю (384-322 до н.э.), которого интересовали закономерности движения наземных животных и человека. Проблемам механики движения организмов (биомеханики) уделяли внимание Леонардо да Винчи (1452-1519), Джованни Борелли (1608-1679) - ученик Галилея и автор первой книги по биомеханике “О движении животных”, вышедшей в свет в 1679 г. Природа движения живого, механизмы управления им занимали умы многих известных ученых: И.М. Сеченова (1829-1905), И.П. Павлова (1849-1936), П.Ф. Лесгафта (1837-1930), А.А. Ухтомского (1875-1942), Н.А. Бернштейна (1896-1966) и др. С тех пор, как в 1674 г. Антони ван Левенгук впервые наблюдал посредством созданного им микроскопа движение эвглены и вольвокса [цит. по: Wolken, 1975], продолжается неуклонный рост интереса к проблеме двигательного поведения микроорганизмов. Первой работой, посвященной исследованию фотодвижения водорослей, можно считать статью Л. Тревирануса [Treviranus, 1817], в которой описана способность зооспор Draparnaldia glomerata и Ulothrix subtilis накапливаться вблизи края освещаемого сосуда или на его противоположной стороне. Позднее выходит работа К. Эренберга [Ehrenberg, 1838] с описанием красного глазка (eyespot) или стигмы Eиglena - органеллы, которая играет не последнюю роль в фотодвижении водорослей. В 1859 г. Чарльз Дарвин писал: "…некоторые низшие организмы, у которых не обнаружены нервы, способны воспринимать свет, и вполне вероятно, что определенные чувствительные элементы … могут агрегироваться и образовывать нервы, характе-ризующиеся специфической чувствительностью" [цит. по: Wolken, 1971]. В ранних экспериментах Ф. Кона [Cohn, 1865] было обнаружено, что зооспоры некоторых водорослей, а также клетки Euglena sp. демонстрируют фототаксис в синезеленой, но не в красной области спектра. Таким образом была выявлена спектральная чувствительность микроорганизмов в процессе фотодвижения. В 1866 г. появляется работа А.С. Фаминцына "Действие света на водоросли и некоторые другие близкие к ним организмы" (С.-Петербург), за которую ему была присуждена ученая степень доктора ботаники. В ней автор различает два типа передвижений простейших организмов - снабженных ресничками (зооспоры) или псевдоподиями (амебоидные организмы). К первому типу относятся также жгутиковые водоросли: Volvox, Gonium, Stephanosphaera, Euglena, Chlamydomonas и др. Фаминцын (1887а, с. 19) так характеризует это явление: «Давно уже было замечено, что при одностороннем освещении сосуда с жидкостью, в которой зооспоры плавают, они скопляются вдоль края сосуда, образуя зеленую полоску». Этим автором установлено, что индуцированное светом движение водорослей зависит от интенсивности света, температуры, состава водной среды [Famintzin 1867a, b; Фаминцын, 1887а]. В 80-е годы XIX ст. появляются статьи с результатами исследования фотодвижения десмидиевых и синезеленых водорослей. Уже в этот период начинаются дискуссии относительно механизмов фотоориентации организмов. Е. Страсбургер утверждал, что различные микроорганизмы могут использовать различные механизмы фотоориентации [Strasburger, 1878]. Он считал, что зооспоры Haematococcus реагируют на световые градиенты, тогда как подвижные репродуктивные клетки Botrydium - на направление распространение света. Именно Страсбургеру принадлежит первенство в использовании термина "фототаксис" для того, чтобы отличить вызванные светом перемещения подвижных (фототаксисы) и прикрепленных (фототропизмы) организмов. Он же первым стал различать положительный и отрицательный фототаксисы. Страсбургер впервые использовал цветные стеклянные фильтры для - 12 -

выяснения спектральных особенностей фотодвижения зооспор. Кроме того, он сделал важное открытие: способность бесцветных микроорганизмов реагировать на свет. Значительный вклад в исследование фотодвижения водорослей был внесен Т. Энгельманном [Engelmann, 1882a, b]. Ему принадлежит авторство в реализации техники "проецируемого микроспектра", позволяющей снимать зависимость фотореакции микроорганизмов от длины волны стимулирующего света. Эти ранние эксперименты, носившие качественный характер, позволяли грубо определять спектр действия фотореакций микроорганизмов. Энгельманн установил спектральную чувствительность Euglena viridis в области 470-490 нм. Используя луч света, Энгельманн установил шоковые реакции у Euglena, обнаружив бóльшую чувствительность передней (там, где расположена стигма) части клетки по сравнению с остальной [Engelmann, 1882a, b]. Цикл работ, опубликованных в конце ХIX ст., посвящен исследованию влияния внешних физических факторов на фотодвижение водорослей: электрических полей [Vervorn, 1889], температуры [Wildeman, 1893] и рентгеновского излучения [Shaudinn, 1899] (цит. по: Jаhn, Bovee, 1968). В начале ХХ ст. появляется ряд работ, авторы которых рассматривают вопросы терминологии фотодвижения [Rothert, 1901; Nagel, 1901; Pfeffer, 1904]. В 1910 г. Лоеб и Максвелл [Loeb, Maxwell, 1910] обнаружили способность клеток Chlamydomonas скапливаться в синей области спектра. Классическим объектом исследований фотодвижения водорослей становится Euglena gracilis. Именно эвглене принадлежит пальма первенства в привлечении интереса многочисленных исследователей к выяснению механизмов фоторецепции и фото-ориентации. Дебатируются вопросы морфологии стигмы: дискретная цветная пластида чашеобразной формы [Francé, 1893], гексагонально упакованные слои стержней [Wolken, 1956] или агрегированные в различной степени пигментированные гранулы или глобулы [Hall, Jahn, 1929; Gojdics, 1934] (все авторы цитируются по: Jahn, Bovee, 1968). В этот же период появляются работы, посвященные выяснению возможных механизмов фотоориентации Euglena [Jennings, 1906; Mast, 1911]. Была установлена способность Euglena двигаться по направлению к источнику света и к фотофобическим реакциям ("Schreckbewegung" [Engelmann, 1882a, b] или "avoiding reaction" [Jennings, 1906]). Обнаружена чувствительность клеток Euglena к свету синей области спектра. В 1911 г. Маст предположил, что фоточувствительные пигменты Euglena находятся в области стигмы [Mast, 1911]. Этот же автор впервые акцентировал внимание на необходимость использования "спектрально чистого" (монохроматического) света и его калибровки с целью оценки относительной стимулирующей эффективности света на различных длинах волн (эту процедуру сейчас называют регистрацией "спектра действия"). Он также измерил оптическое пропускание стигмы Euglena; интересно отметить, что полученные им результаты (пропускание стигмы t = 0,28) мало отличаются от полученных исследователями спустя полстолетия (t = 0,32) [Wolken, 1967]. В 1927 г. Маст измерил спектр действия фототаксиса Euglena, характеризующийся полосой в области 410-540 нм с максимумом при 485 нм; возможными фоторецепторными пигментами Маст считал каротиноиды [Mast, 1927]. Что касается функций стигмы Euglena, В.М. Арнольди высказал следующее мнение: "Его (глазка) функция до сих пор остается загадочной, но он имеет известное сходство с глазным пятном у некоторых простейших животных, являющимся у них зачаточным органом чувств" [Арнольди, 1908]. Начиная с пионерской работы А. Фишера [Fisher, 1894, цит. по: Jahn, Bovee, 1968], в которой описывается морфология жгутиковой системы Euglena, наблюдается все возрастающее количество исследований структуры и функций локомоторного аппарата водорослей, которые продолжаются и в наше время по мере развития и использования современной техники. Попыткам установить причинно-следственные связи между световым стимулом и откликом микроорганизмов посвящены работы [Buder, 1917; Mainx, Wolf, 1929]. Существенный вклад в разработку представлений о механизме фотоориентации Euglena внес Т. Будер [Buder, 1917], который первым предложил локализацию фоторецептора в паражгутиковом теле Euglena (гипотеза, сохранившаяся до наших дней). Т. Будер первым также осознал возможное влияние света конденсора микроскопа на результаты - 13 -

измерения параметров фотодвижения; им подчеркнута необходимость учета спектрального состава света и введено понятие "schwaches, tief rubinrotes licht" (слабый, глубокий рубиново-красный свет), который должен быть использован при микроскопировании подвижных микроорганизмов. Т. Будер сформулировал задачи детального количественного анализа фотодвигательных реакций, изучения жгутиковой активности в процессе фототаксиса и фотофобических реакций, выяснения возможной локализации фоточувствительной системы клетки, установления связи между биениями жгутиков и положением стигмы относительно источника света. На многие вопросы, поставленные Будером, еще не получены ответы до сих пор. Вопросам фотодвижения синезеленых (Oscillatoria geminata Menegh. и Synechococcus aeruginosus Naeg.) и диатомовых (Pinnularia streptoraphe Cl. и Anomoeoneis sculpta Pfitzer) водорослей и, в частности, их спектральной чувствительности посвящены исследования Б.В. Перфильева (1915, с. 283), который высказал предположение, что “…движение является, по-видимому, общим свойством синезеленых водорослей...". Б.В. Перфильев наблюдал фотодвижение синезеленых водорослей в красной, а диатомовых - в синей областях спектра. О роли света в поведении зеленых, диатомовых и десмидиевых водорослей упоминается в работе А.А. Еленкина (1925); он же отмечает способность хлоропластов Mougeotia genuflexa перемещаться в клетке под воздействием света. В 30-е годы появляются работы А. Лунтца, посвященные определению спектров действия фототаксиса водорослей Eudorina, Volvox, Chilomonas, Chlamydomonas reinhardtii [Luntz, 1931 а, b]. Отличительной особенностью этих исследований была попытка точного измерения абсолютных значений световой энергии. Полученные спектры действия фототаксиса зеленых жгутиконосцев Eиdorina, Volvox и Chlamydomonas имели максимум при 492 нм; бесцветная криптофитовая водоросль Chilomonas демонстрировала чувствительность к свету с длиной волны менее 366 нм. Попытки выяснения функций фотоориентационного аппарата Eиglena были предприняты С.С. Чахотиным в 1936 г. с помощью техники ультрафиолетового микрооблучения, которая была разработана им еще в 1912 г. [цит. по: Посудин, 1995]. Клетку Euglena помещали в освещенную часть кварцевого капилляра. Перемещаясь вдоль капилляра, клетка при достижении границы "свет-тень" тотчас двигалась в обратном направлении. При ультрафиолетовом облучении участка клетки со стигмой Euglena возбуждалась, сокращаясь несколько раз подряд; но, оправившись от микрооблучения, двигалась вдоль капилляра и пересекала на этот раз границу "свет-тень" без изменения направления движения. Такое поведение свидетельствовало о нарушении работы фотоориентационного механизма. Возбуждение стигмы монохроматическим светом различных длин волн показало чувствительность ее к сине-фиолетовой области спектра. На основе проведенных экспериментов Чахотин пришел к выводу о том, что стигма является примитивным органом зрения Euglena, управляющим ее фотодвижением; ультрафиолетовое облучение "ослепляло" клетку, причем передняя часть клетки оказалась более чувствительной к микрооблучению, чем задняя. В начале 60-х годов выходит фундаментальная работа П. Хэллдела, посвященная регистрации спектров действия водорослей – представителей Volvocales, Dinophyceae, а также гамет Ulva sp. [Halldal, 1958]. В этой работе впервые были исследованы спектры действия водорослей рода Dunaliella: D. salina Teod., D. viridis Teod. и D. cf. еuchlora Lerche. Несмотря на то, что техника «проецируемого спектра», использованная автором, не отличалась высокой точностью, ему удалось показать, что спектры действия фототаксиса Dunaliella sp. характеризовались максимумом при 493 нм и небольшим плечом при 435 нм. Автор пришел к выводу о непосредственном участии стигмы в фотоориентации клеток водорослей. В 60-70-е годы намечается переход от натуралистических описаний явления фотодвижения микроорганизмов к его более глубокому фотохимическому объяснению [Clayton, 1964; Haupt, 1966; Tollin, 1969; Nultsch, 1970; Feinleib, Carry, 1967; Hand, Davenport, 1970]. Появляются работы Д. Уолкена [Wolken, Shin, 1958; Wolken, 1967, 1971, 1977], посвященные детальному изучению фотодвижения эвгленофитовой водоросли Euglena gracilis, в частности, исследованию зависимости скорости и направления движения от внешних факторов, регистрации спектров действия фотореакций, попытке выяснения природы - 14 -

фоторецепторных пигментов и анализу работы жгутикового аппарата. Очевидно, начиная именно с этого периода Euglena gracilis становится классическим объектом изучения фотодвижения водорослей. В это же время появляется один из первых обзоров исследований фотодвижения подвижных микроорганизмов, в котором рассматриваются вопросы терминологии, экспериментальные и методические подходы, используемые при изучении фоторецепции и сенсорного преобразования светового сигнала [Diehn, 1979]. Во второй половине ХХ ст. исследования фотодвижения проводятся на индивидуальном и популяционном уровнях [Feinleib, 1977; Ascoli et al., 1978; Barghigiani et al., 1979; Colombetti, Lenci, 1982]. Исследования на уровне отдельных индивидов более трудоемки и сложны, но они позволяют определять все двигательные реакции и параметры фотодвижения, а также однозначно связывать специфические двигательные ответы на специфические характеристики светового стимула. Преимущество популяционных подходов заключается в получении данных с очень высокой степенью достоверности, т.к. регистрируется передвижение миллионов клеток; однако, из-за отсутствия данных о двигательном поведении отдельных индивидов интерпретация этих результатов может быть неоднозначной. Дальнейшие десятилетия вплоть до наших дней характеризуются повышенным интересом к проблемам фотодвижения водорослей. Можно констатировать формирование школ в различных странах мира под эгидой ведущих фотобиологов, которые начали свою деятельность ранее. Представитель немецкой школы фотобиологов В. Нулч (Марбург, Германия) концентрирует свои усилия на изучении фотодвижения еще одного классического объекта - зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii [Nultsch, 1962, 1970, 1983]. Ему принадлежат серьезные обзоры с анализом экспериментальных и методических подходов к исследованию фотодвижения водорослей [Nultsch, 1975, 1980; Nultsch, Häder, 1979, 1988]. В. Нулч отмечает наличие в литературных источниках существенной неразберихи (considerable confusion) в вопросах терминологии, касающейся фотодвижения водорослей [Nultsch, 1973, 1975]. Сферой научных интересов еще одного представителя немецкой школы В. Хаупта (Эрланген, Германия) является изучение подвижных откликов на свет организмов, клеточных органелл, фототропических и фотонастических движений растительных организмов. В. Хаупт является автором первых детальных обзоров, в которых подчеркивается разнообразие фотобиологических реакций водорослей различных видов и уделяется внимание терминологии в сфере фотодвижения водорослей [Physiology …, 1979; Haupt, 1983, 1986; Haupt, Seitz, 1984; ]. Продолжателем исследований Хаупта является Д.-П. Хэдер (Эрланген, Германия). Группа, которую он возглавляет, изучает фотодвижение и гравитаксис различных водорослей, но особое внимание уделяется Euglena gracilis. Д.П. Хэдеру (в том числе и с соавторами) принадлежат обзоры экспериментальных исследований в области фотодвижения [Häder, 1979a, b, 1987a, b, 1996а, Häder, Lebert, 2000, Lebert, Häder, 2000]. В экспериментальном плане группа Хэдера использует компьютеризированную систему микровидеографии для количественного анализа параметров фотодвижения водорослей [Häder, 1994]. Хэдер и Леберт являются авторами монографии «Photomovement» (2001). Еще один представитель немецкой школы – П. Хэгеманн (Рэгенсбург). Возглавляемая им научная группа занимается исследованием светочувствительных процессов у зеленых водорослей. Особое внимание в исследованиях уделяется Chlamydomonas reinhardtii. Использование оптических, спектральных и электрофизиологических приемов ставит своей целью выяснение природы фоторецептора этой водоросли. Хэгеманну (с соавторами) принадлежат обзоры [Hegemann, 1997; Hegemann, Harz, 1998; Hegemann, Fisher, 2001; Hegemann, Deininger, 1999, 2001; Hegemann et al., 2001]. Итальянскую школу представляют сотрудники Института биофизики Центра Национальных исследований (Пиза) Ф. Ленчи, Дж. Коломбетти, Ф. Гетти, П. Гуалтиери и др. [Lenci, 1982; Lenci, Colombretti, 1978; Gualtieri, 2001]. Среди различных фоторегулируемых биологических явлений особое внимание эта группа уделяет изучению способности микроорганизмов использовать свет как носителя информации, влияющего на их двигательное поведение в зависимости от окружающих световых условий; исследуются основные молекулярные процессы фоторецепции и сенсорного преобразования принятого - 15 -

фоторецептором кванта света в сигнал, управляющий движением микроорганизма. Основным объектом исследований этой группы в 90-е годы была эвгленофитовая водоросль Euglena gracilis. Для исследования фоторецепторных пигментов используется техника флуоресцентной микроспии, позволившая обнаружить флуорeсцирующую органеллу у основания жгутика водоросли [Benedetti, Сheccucci, 1975]. Следует отметить блестящий методический прием, использованный для идентификации фоторецепторных пигментов водоросли: на паражгутиковое тело (ПЖТ) E. gracilis было направлено сфокусированное посредством микроскопа излучение лазера на красителях, частота которого перестраивалась. Данная техника позволила определить in vivo спектр возбуждения флуоресценции ПЖТ E. gracilis и после сопоставления его со спектрами поглощения флавинов подтвердить участие именно этих пигментов в фотодвижении водорослей [Colombetti et al., 1980; Ghetti et al., 1985]. К современным методам исследования подвижности водорослей можно отнести разработанную в Институте биофизики в Пизе технику лазерной допплеровской спектроскопии, позволившую определять поступательную скорость движения, частоту вращения и частоту биений жгутиков водорослей [Ascoli et al., 1978]. В настоящее время группа занимается исследованием фотодвижения простейших. Представительница польской школы Е. Миколайчик особое внимание уделяла исследованию фотофобических реакций Euglena gracilis, в частности, влиянию на эти реакции длины волны светового стимула и условий культивирования. Кроме того, она исследует фотодвижение бесцветных эвгленофитовых водорослей Astasia longa и Peranema trichophorum [Mikolajczyk, 1984 a, b, 1986]. Американская школа представлена М. Фейнлейб, посвятившей себя изучению фотодвижения Chlamydomonas reinhardtii [Feinleib, 1977, 1978, 1980, 1985], и Пил-Сун Сонгом, занимающимся исследованием молекулярных механизмов сенсорного преобразования простейших (в первую очередь, Stentor coeruleus) с особым акцентом на выяснении фоторегуляторных функций стенторина и блефаризмина [Song, 1983, 1985]. Японская школа фотобиологов, исследующих фотодвижение водорослей, использует уникальный измерительный комплекс – Большой спектрограф Окадзаки [Watanabe et al., 1982]. Созданный в 1980 г., спектрограф предназначен для регистрации спектров действия разнообразных фотобиологических реакций в области 250-1200 нм с высокой (0,8 нм/см) разрешающей способностью. Объектами исследований были криптофитовые - Cryptomonas sp., Cryptomonas rostratiformis, Chroomonas nordstedtii, Chroomonas coerulea [Watanabe, Furuya, 1982] и зеленые водоросли - Chlamydomonas reinhardtii [Kondo et al., 1988] и Dunaliella salina [Wayne et al., 1991]. Исследованием природы фоторецепторных пигментов гамет и зооспор золотистых и бурых водорослей на основе микроспектрофлуориметрии жгутикового аппарата занимается группа исследователей, возглавляемая Х. Каваи [Kawai, 1988, 1989, 1992; Kawai et al., 1991, 1996]. Российская школа (Ф.Ф. Литвин, О.А. Синещеков, Е.Г. Говорунова и др.) использует электрофизиологические подходы к изучению процессов индуцированного светом возбуждения фоторецептора водоросли, которое вызывает каскад быстрых электрических событий на клеточной мембране. Измерение фоторецепторных электрических токов дает возможность идентифицировать фоторецепторные пигменты зеленых водорослей (Haematococcus pluvialis, Chlamydomonas reinhardtii), которые, по мнению авторов, имеют родопсиновую природу [Синещеков, Литвин, 1982, 1988; Sineshchekov, Govorunova, 1999, 2001b]. Украинская школа (Ю.И. Посудин, Н.П. Масюк, Г.Г. Лилицкая) сформировалась в 1980 г.; основными направлениями научной активности являются обсуждение вопросов терминологии и логических основ классификации фотодвижения микроорганизмов, экспериментальные исследования фотодвижения зеленых водорослей из рода Dunaliella Teod. (в частности, двух видов – D. salina Teod. и D. viridis Teod.) и влияния на них абиотических факторов; изучение процессов фоторецепции - местоположения и структуры фоторецепторных систем, природы фоторецепторных пигментов, механизмов фоторецепции и фотоориентации; процессов сенсорного преобразования поглощенного фоторецепторными молекулами кванта света в сигнал, управляющий работой жгутикового аппарата; а также прикладные аспекты использования параметров фотодвижения этих водорослей для целей биотестирования водных сред и биотехнологии. - 16 -

Таким образом, в настоящее время систематическое изучение фотодвижения водорослей проводится в различных странах Европы (Германия, Италия, Польша, Россия, Украина), Азии (Япония) и Северной Америки (США). Модельными объектами этих исследований являются представители различных отделов цианопрокариот - Cyanophyta (Oscillatoria geminata, Synechococcus aeruginosus) и эукариотических водорослей: Euglenophyta (Euglena gracilis, Astasia longa, Peranema trichophorum), Dinophyta (Perіdinium gatunense), Bacillariophyta (Pinnularia streptoraphe, Anomoeoneis sculpta), Cryptophyta (Cryptomonas spp., Chroomonas spp.), Chlorophyta (Dunaliella salina, D. viridis, Chlamydomonas reinhardtii, Chloromonas sp., Haematococcus pluvialis, Stephanosphaera sp., Gonium sp., Eudorina sp., Volvox sp.) а также споры и гаметы зеленых (Chlorophyta), золотистых (Chrysophyta), желтозеленых (Xanthophyta), красных (Rhodophyta) и бурых (Phaeophyta) водорослей. Особое внимание исследователей привлекают механизмы фоторецепции и фоторегуляции движения, природа фоторецепторного и локомоторного аппаратов; не прекращаются дискуссии по вопросам терминологии и классификации различных двигательных реакций микроорганизмов в ответ на различные параметры световых стимулов.

- 17 -

ГЛАВА 2 ВОПРОСЫ ТЕРМИНОЛОГИИ И ЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ КЛАССИФИКАЦИИ СВЕТОЗАВИСИМОГО ПОВЕДЕНИЯ СВОБОДНОПОДВИЖНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ (ФОТОТАКСИСОВ) Как в зарубежной, так и в отечественной литературе вопросам терминологии и классификации явлений, связанных с двигательным фотоповедением микроорганизмов, уделяется большое внимание [Halldal, 1958; Jahn, Bovee, 1968; Nultsch, 1973, 1975, 1980; Diehn et al., 1977; Feinleib, 1977, 1978, 1980; Lenci, Colombetti, 1978; Diehn, 1979; Häder, 1979a, 1979b, 1987a, 1987b, 1996a, 1996b; Nultsch, Häder, 1979; Посудин, 1982, 1985; Синещеков, Литвин, 1982; Colombetti, Lenci, 1982; Colombetti et al., 1982; Lenci, 1982; Haupt, 1983; Burr, 1984; Lenci et al., 1984; Посудин и др., 1988, 1990, 1991, 1992a, 1992б, 1993, 1995, 1996; Масюк и др., 1988; Масюк, Посудин, 1991a; Witman, 1994; Kreimer, 1994; Мартыненко и др., 1996; Посудин, Масюк, 1996; Lenci et al., 1997; Hegemann, Harz, 1998; Sineshchekov, Govorunova, 1999; Lebert, Häder, 2000; Kawai, Kreimer, 2001; Gualtieri, 2001; Häder, Lebert, 2001; Hegemann, Fischer, 2001; Hegemann et al., 2001; Massjuk, Posudin, 2002]. Однако определение понятий и употребление терминов всё ещё остаются неоднозначными. Нередко старым устоявшимся терминам (например, “фототаксис”) придают новый смысл; одни и те же термины (например, “фотокинез”) разные авторы толкуют по-разному (например, Diеhn et al., 1977 и Nultsch, Häder, 1979) или, наоборот, термины, обозначающие разные явления, употребляются как синонимы, например: “фотодвижение”, “фоторегуляция движения”, “фотореакция”, “двигательные реакции организмов в ответ на световой стимул”, “фотоиндуцированное двигательное поведение клеток”, “behavioural responses”, “behavioural light response”, “light controlled cell motility”, “light controlled movement”, “light induced responses of freely moving microorganisms”, “light response”, “light-induced behavioural response”, “locomotive and motile response”, “motile behaviour”, “motile response to light”, “movement behaviour”, “photic response”, “photobehaviour”, ”photobehavioural response”, “photoinduced behaviour”, “photomotile response”, “photomotion”, “photomovement response”, “photomovement”, “photoorientation”, “photoreaction”, “photoregulation of movement”, “photoresponse”, “response strategies”, “responses to light”, “response type” [Посудин, 1982, 1985; Синещеков, Литвин, 1982; Wayne, 1991; Kreimer, 1994; Hegemann, 1997; Holland et al., 1997; Matsuda, 1998; Horigushi et al., 1999; Sineshchekov, Govorunova, 1999; Lebert, Häder, 2000; Govorunova et al., 2000, 2001; Haupt, 2001; Photomovement, 2001; Tahedl, Häder, 2001]. На сегодняшний день существует несколько терминологических систем, описывающих двигательное поведение организмов (см. Burr, 1984); разнообразие этих систем является источником терминологической путаницы. Кроме того, существующие классификации и определения терминов страдают рядом логических ошибок. Всё это препятствует взаимопониманию учёных, работающих в этой области. Целью данной главы является обсуждение логических основ классификации явлений, связанных с фотодвижением подвижных микроорганизмов (независимо от их структуры и систематического положения) и уточнение соответствующей терминологии. 2.1. СОСТОЯНИЕ ВОПРОСА

История вопроса имеет истоки в начале прошлого века, когда впервые были отмечены двигательные реакции организмов в ответ на световой стимул [Treviranus, 1817]. Е. Страсбургер [Strasburger, 1878] был первым, предложившим различать двигательные фотореакции свободно движущихся (фототаксисы) и прикреплённых (фототропизмы) организмов. Таким образом, в трактовке Страсбургера, который первым предложил этот термин, фототаксис – это любое перемещение в пространстве подвижных организмов под действием света. В таком первоначальном понимании термин “фототаксис” прочно занял определённое место в системе других терминов, обозначающих перемещение в пространстве свободно движущихся - 18 -

микроорганизмов под влиянием различных факторов среды: химического (хемотаксис), температурного (термотаксис), гравитационного (геотаксис), механического (механотаксис) и др. Именно в такой первоначальной трактовке этот термин получил строго определённое место в системе терминов, обозначающих фотобиологические или функционально-физиологические реакции [Конев, Волотовский, 1979]. Термин “фототаксис” образован от двух слов греческого происхождения [jwtόx - родительный падеж слова jvx (свет) и tάxiz (порядок, расположение)]. В начале ХХ ст. этот термин стали использовать в более узком понимании для определения движения, ориентированного относительно источника света [Nagel, 1901], что, по словам Нулча [Nultsch, 1975], привело к значительной неразберихе в области терминологии. Для определения ориентированного движения микроорганизмов одновременно был использован термин “строфический фототаксис” (“strophic phototaxis”), а для реакции на изменение интенсивности света – “апобатический фототаксис” (“apobatic phototaxis”) [Rothert, 1901]. Реакцию на изменение интенсивности света определяли как “дискриминационнную чувствительность” (“discrimination sensitivity”) [Nagel, 1901]. В. Пфеффер [Pfeffer, 1904] предложил для определения ориентированного перемещения организмов специальный термин “фототопотаксис”, который был принят многими исследователями и широко использовался на протяжении многих десятилетий (см., например, Halldal, 1958). В 1940 г. было предложено различать первичную фоториентацию организмов в пространстве и во времени (при отсутствии стимула) и вторичную ориентацию, связанную с изменением положения организма и направления его движения по отношению к окружающим стимулам [Fraenkel, Gunn, 1961]. Авторы этой классификации ориентированное относительно стимула движение называют таксисом; в случае одновременного движения к стимулу и от него (билатерального движения) тропотаксисом: при отсутствии билатеральности используют термин телотаксис. Если направленное относительно стимула движение включает изгибы, повороты и пространственные изменения движения организма, то в таком случае используют термин клинотаксис. В 70-е годы Б. Дин [Diеhn, 1970], отказавшись от специального термина “фототопотаксис”, опять обновил узкую трактовку термина “фототаксис” как фотоориентированного перемещения организмов. В. Нулч в своих более ранних работах [Nultsch, 1975, с. 31] также отмечал, что “греческое слово “фототаксис” в своём первоначальном смысле означает лишь любое построение организмов в пространстве, вызванное светом, и поэтому не может быть ограничено ориентированным по отношению к источнику света движением”1. Однако в последующих работах [Nultsch, Häder, 1979; Nultsch, 1980 и др.] он всё же принял это ограничение. Суженная трактовка термина “фототаксис” как движения, ориентированного по отношению к источнику света, принимается в настоящее время многими авторами [Fraenkel, Gunn, 1961; Diehn et al., 1977; Feinleib, 1977, 1978, 1980; Lenci, Colombetti, 1978; Mikolajczyk, Diehn, 1978, 1979; Häder, 1979; Синещеков, Литвин, 1982; Посудин, 1982, 1985; Burr, 1984: Kawai, Krеimer, 2001; Flores-Moya et al., 2002]. Следует отметить, что суженная трактовка термина, который имеет более широкий смысл, является нарушением требований формальной логики, вследствие чего возникает терминологическая путаница. Изменение первоначального содержания термина “фото-таксис” вызвало появление множества разнообразных эквивалентов, пытающихся заполнить образовавшуюся терминологическую брешь: “двигательные реакции организмов в ответ на световой стимул”, “фотоиндуцированное двигательное поведение”, “фото-поведение”, “фоторегуляция движения”, “photomovement, “photomotion”, “photobehaviour”, “motile behaviour”, “motility”, “behaviour pattern”, “motility behaviour patterns”, “light induced responses of freely moving organisms”, “phototactic reactivity”, “phototactic response”, и т.д. [Halldal, 1958; Nultsch, 1973, 1983; Feinleib, 1977, 1980; Lenci, Colombetti, 1978; Nultsch, Häder, 1979; Посудин, 1982, 1985; Синещеков, Литвин, 1982; Kuznicki, Mikolajczyk, 1982; Morel-Laurens, Feinleib, 1983; Pfau et al., 1983; Häder, Lebert, 1998; Horiguchi et al., 1999; Lebert, Häder, 2000; Yoshihara et al., 2000].

1

В переводе Ю.И. Посудина.

- 19 -

Обилие терминов само по себе нежелательно. Кроме того, новые обозначения либо слишком громоздки, либо недостаточно точны и определенны и могут быть истолкованы как в более широком (включая фототропизмы, фоторегуляцию движения и т.д.), как и в более узком смысле. Наряду с авторами, употребляющими эти термины как синонимы, другие различают фоторегуляцию (control) и его следствие (photomovement, photomotion), фотореакции (responses) и фотоповедение (behavioural consequences). Терминологическая путаница препятствует взаимопониманию учёных, работающих в данной области. Исходя из сказанного выше, мы предлагаем сохранить за термином “фототаксис” его первоначальную трактовку – любое перемещение свободно движущихся организмов, вызванное светом. А для определения фотоориентированного перемещения организмов целесообразно и в дальнейшем использовать предложенный ранее термин “фототопотаксис”. Именно в таком смысле указанные термины употребляются далее в нашей работе. Различают два варианта фототопотаксиса: положительный – по направлению к источнику света и отрицательный – от источника света [Halldal, 1958; Nultsch, 1975; Feinleib, 1980] или три: положительный, отрицательный и поперечный (transverse) т.е. перпендикулярный к направлению распространения света [Diehn et al., 1977; Diehn, 1979; Häder, 1979]. Принимая последнюю точку зрения, любое поступательное движение организмов можно рассматривать как ориентированное относительно направления распространения света. Лишь в отсутствии такого направления (в случае диффузного света или одновременного освещения объекта со всех сторон) можно констатировать отсутствие фотоориентации у отдельных организмов. Термин “фотодвижение” (”photomovement”) имеет более широкий смысл и включает как фототаксисы, так и фототропизмы. Наше понимание не противоречит определению этого термина, приведённому В. Нулчем и Д. Хэдером [Nultsch, Häder, 1979]: фотодвижение – любое движение или изменение движения, вызванное светом. Таким образом, понятия “фотодвижение” и “фототаксис” с точки зрения формальной логики являются совместимыми, но не тождественными; фотодвижение – понятие подчиняющее, фототаксис – подчинённое. Совершенно очевидно, что фоторегуляция движения (control) и фотодвижение микроорганизмов (photomovement) - различные процессы, находящиеся в причинно-следственной связи: фотодвижение является результатом фоторегуляции движения. Последняя осуществляется путём взаимодействия внешних факторов (световой стимул, его интенсивность, спектральная характеристика, направление светового потока и пр.) и внутренних фоторегуляторных механизмов биологического объекта (фоторецепция, преобразование светового стимула в физиологический сигнал, передача его на двигательный аппарат). В результате такого взаимодействия и происходит фотодвижение – перемещение организма в пространстве. Таким образом, с точки зрения формальной логики фотодвижение и фоторегуляция движения – понятия нетождественные и несовместимые. Е. Страсбургер [Strasburger, 1878] впервые описал реакции микроорганизмов на внезапное изменение интенсивности света; эти реакции получили в первой редакции название “Schreckbewegung” (движение испуга). Т.В. Энгельманн [Engelmann, 1882], наблюдая резкое изменение направления движения микроорганизмов под влиянием внезапного увеличения интенсивности света, назвав эту реакцию “фобической” от греческого слова jóybόx (страх). Энгельманн впервые наблюдал возобновление подвижности при включении светового стимула у неподвижных в темноте микроорганизмов, назвав это явление “фотокинезом”`(от греческого слова kinhsiz (движение)). Указанные термины сохранились до настоящего времени, претерпев, однако, значительные изменения в их толковании. В частности, существует по крайней мере четыре трактовки термина “кинез”, а также существенные разногласия в толковании терминов “фототаксис” и “фотофобическая реакция” (см. Burr, 1984; Масюк, Посудин, 1991а). В литературе можно встретить такие синонимы термина “фотофобическая реакция” как “light induced stop response”, “phobic behavioural response”, “photophobic response”, “photophobic, stop or ecclitic response”, “photophobotaxis”, “photoshock cell response”, “photoshock response”, “photoshock”, “Schreckbewegung”, “shock reaction”, “stop response” [Beckmann, Hegemann, 1991; Hegemann et al., 1991; Govorunova et al., 1997; Holland et al., 1997; Sineshchekov, Govorunova, 1999; Lebert, Häder, 2000; Photomovement, 2001]. - 20 -

Последующие годы принесли богатый урожай новых терминов, появление и трактовка которых в историческом аспекте подробно рассмотрены в обзорной статье В. Нулча [Nultsch, 1975]. Как отмечает этот автор, терминологический разнобой приводил к ошибкам и недоразумениям, а создание новых терминов не проясняло, а ещё более запутывало ситуацию. Это вызвало необходимость создания специальной терминологической комиссии по выработке терминологии поведенческих реакций микроорганизмов. Такая комиссия была сформирована в январе 1976 г. на конференции по сенсорному преобразованию у микроорганизмов в Калифорнии (Санта-Барбара). Результаты работы комиссии были опубликованы в дискуссионном порядке за подписью нескольких ведущих фотобиологов из разных стран мира (Diehn et al., 1977). В этой публикации авторами выделены три раздела: 1) стимулы; 2) реакции и 3) поведенческие последствия. Стимул определен в первом разделе как некоторое количество энергии или вещества, которые при взаимодействии с организмом могут (но не всегда) вызывать его отклик. Предлагается в зависимости от природы стимула, вызывающего двигательную реакцию у микроорганизмов, присоединять к названию реакции

соответствующие

префиксы,

а

именно:

фото-

(стимулом

является

световая

энергия,

воздействующая на специфические рецепторные молекулы), термо- (стимул – тепловая энергия), гальвано(ионный электрический поток), электро (электрическое поле), гео- (гравитационные силы), механо(механические воздействия), магнето- (магнитное поле), хемо- (молекулярные виды воздействия на специфические рецепторные молекулы). Эти рекомендации соответствуют требованиям формальной логики, возражений не вызывают и в настоящее время могут считаться общепринятыми (см. Burr, 1984; Масюк, Посудин, 1991а). Авторы подчёркивают важность точного определения природы стимула, так как иногда некоторые физические факторы (например, излучение, электрическая энергия) могут вызывать образование химических веществ, непосредственно воздействующих на организм в качестве прямых стимулов. Предлагается различать реакции на увеличение (“step-up”)

и уменьшение (“step-down”)

интенсивности стимула. Реакция определена во втором разделе как любое индуцированное стимулом изменение активности двигательного аппарата организма, которое может (хотя и не всегда) вызвать изменение подвижности или ориентации организма [Diehn et al., 1977]. Реакции могут быть классифицированы как: 1) кинезы – отклики, при которых стационарная скорость активности контролируется абсолютной величиной интенсивности стимула. При положительном кинезе скорость активности в присутствии стимула превышает таковую в отсутствии стимула; при отрицательном кинезе скорость активности в присутствии стимула меньше, чем в отсутствии стимула. Среди кинетических откликов наиболее часто исследуется скорость поступательного движения организма в зависимости от интенсивности стимула. Предлагается следующее подразделение понятия кинез: ортокинез – изменение скорости поступательного движения, вызванное стимулом; клинокинез – влияние стимула на частоту пространственных изменений движения организма; 2) фотофобические реакции – изменения активности организма под влиянием изменений интенсивности стимула. Таким образом, при обсуждении типов двигательных реакций речь идет не об активности кинетического аппарата, а об уровнях двигательной активности организма в целом [Diehn et al., 1977]. Следовательно, рекомендованное комиссией определение термина “реакция” (”response”) несоразмерно определяемому понятию. Авторы [Diehn et al., 1977; Diehn, 1979] предлагают делить двигательные реакции на постоянные (кинезы) и мимолётные (фобические реакции). Оба типа реакций могут проявляться как в изменении скорости, так и в смене направления движения. Первые контролируются абсолютной величиной интенсивности стимула, вторые – временным градиентом последнего. Как видно, трактовка этих терминов претерпела изменения по сравнению с первоначальной [Engelmann, 1882а]. Кроме того, в соответствии с замечанием самих авторов [Diehn et al., 1977], по длительности адаптационного периода фобические - 21 -

реакции не всегда отличимы от кинезов. Таким образом, с точки зрения формальной логики предложенное деление реакции на фобические и кинетические не имеет единого чётко сформулированного основания деления, а определения некоторых терминов не соразмерны определяемым понятиям. Деление реакций на адаптирующиеся и не адаптирующиеся не удовлетворяет также зоологов [Burr, 1984]. Непонятно, почему авторы, определяя типы двигательных фотореакций организмов, учитывают только один из параметров светового стимула – его интенсивность (абсолютную величину и градиент во времени), игнорируя остальные его параметры (например, спектральный состав, поляризацию и т.д.). Ведь в других своих публикациях эти же авторы широко используют такие понятия, как “спектр действия фотокинеза” [Nultsch, 1973; Nultsch, Häder, 1979; Colombetti et al., 1982], что свидетельствует о наличии зависимости скорости движения организмов от длины волны света. В третьем разделе авторы, к сожалению, не дают определение понятию “поведенческие последствия” (”behavioural consequenses”), которому он посвящён. Поэтому не совсем понятно, какие критерии лежат в основе деления на “реакции” и “последствия”. Авторы рассматривают два типа “последствий”. Первый (таксисы) касается индивидуальных организмов и сводится к активной ориентации организма по отношению к источнику стимула. Второй (аккумуляция/рассеивание) касается группы (популяции) микроорганизмов и может выражаться либо в их аккумуляции в районе с наиболее высокой интенсивностью стимула, либо в дeаккумуляции, рассеивании из этого района. Другими словами, результат двигательных реакций микроорганизмов в ответ на воздействие стимула может рассматриваться либо на уровне отдельных микроорганизмов (микроэффект), либо на уровне их популяции (макроэффект). Предлагается использовать приставки для определения зависимости параметра движения (всех кинезов и фобических реакций) от действия стимула [Diehn, 1979]: орто- - линейная скорость (например, положительный ортофобический отклик – увеличение линейной скорости движения микроорганизма под воздействием стимула); клино- - скорость случайных пространственных изменений микроорганизма; строфо- - скорость оборотов или вращения микроорганизма; морфо- - скорость изменений формы или контура микроорганизма. Таким образом, в понимании Б. Дина [Diehn et al., 1977; Diehn, 1979], таксис – не реакция в прямом смысле, а результат реакции или серии реакций моторного аппарата. Нашу точку зрения о нецелесообразности изменения первоначальной трактовки термина “фототаксис” мы уже обосновали выше. Хотя рассмотренная нами публикация [Diehn et al., 1979], как уже отмечалось, была результатом коллективного творчества комиссии из шести ведущих фотобиологов мира, в дальнейшем лишь один из её авторов [Diehn, 1979] полностью последовал предложенным в ней рекомендациям. Остальные [Feinleib, 1978, 1980; Lenci, Colombetti, 1978; Nultsch, 1980; Lenci, 1982; Colombetti, Lenci, 1982; Haupt, 1983; Lenci et al., 1984], хотя и ссылаются на эту публикацию, фактически принимают классификацию, предложенную В. Нулчем [Nultsch, 1975], которой в настоящее время следует большинство научных групп, работающих в данной области [Синещеков, Литвин, 1982]. В наиболее сжатом виде эта классификация изложена в обзорной статье В. Нулча и Д. Хэдера [Nultsch, Häder, 1979]. Авторы предлагают рассматривать три типа фотореакций подвижных микроорганизмов: фотокинез (влияние интенсивности света на скорость движения), фототаксис (движение, ориентированное по отношению к направлению света), фотофoбическая реакция (реакция, вызванная временным изменением интенсивности света, dI/dt, часто выражающаяся в остановке, за которой следует изменение направления движения). Прежде всего следует подчеркнуть, что эта классификация не имеет ничего общего с той, которая была принята терминологической комиссией, в состав которой входили и авторы этой статьи. Фототаксис (в узком смысле) рассматривается не как результат фотореакций микроорганизмов на индивидуальном уровне [Diehn et al., 1977], а как фотореакция, обладающая своим собственным механизмом. В разрез с рекомендациями комиссии [Diehn et al., 1977] изменена также трактовка термина “фотокинез” и смысловая нагрузка термина “фотофобическая реакция”. Классификация, предложенная В. Нулчем [Nultsch, 1975; Nultsch, Häder, 1979], несомненно страдает рядом логических ошибок. Прежде всего, в определениях терминов “фотокинез” и “фототаксис” не - 22 -

выдержаны требования формальной логики к определению понятий через род и видовые отличия. Так, фотокинез определяется не как тип реакции, а как “влияние”, фототаксис – не как тип реакции, а как “движение”. Таким образом, предлагаемые определения выводят термины “фотокинез” и “фототаксис” за пределы делимого понятия (фотореакции), так как эти термины определяются через род других понятий (“влияние”, “движение”). Нетрудно заметить, что в рассматриваемой классификации отсутствует единое основание деления, члены деления не исключают друг друга (например, определение фотофобической реакции перекрывает определение фототаксиса), допущен скачёк в делении (например, фототаксис – понятие другого уровня, чем фобическая реакция). Поэтому дискуссии по вопросам классификации двигательного поведения организмов и соответствующей терминологии продолжаются. 2.2. ПАРАМЕТРИЧЕСКИЙ ПРИНЦИП КЛАССИФИКАЦИИ ФОТОДВИЖЕНИЯ ОРГАНИЗМОВ

Следует отметить, что классификации, разработанные микробиологами, были подвергнуты довольно убедительной критике со стороны зоологов [Burr, 1984]. В частности, А. Бурр пишет: “Изучая литературу, посвящённую двигательному поведению организмов, я был поражён количеством неувязок и путаницей в терминах” [Burr, 1984, с. 1832]. Бурр впервые обратил внимание на необходимость учёта влияния различных параметров светового потока на каждый тип двигательного поведения микроорганизмов, однако, к сожалению, он не довёл эту мысль до логического завершения в предложенной им новой классификации. Считая невозможным строго разделять адаптивные и неадаптивные реакции (поскольку период адаптации может быть очень длительным), А. Бурр предлагает использовать термины независимо от адаптивных характеристик двигательного поведения биологических объектов. Принимая эти предложения А. Бурра, под светозависимыми двигательными реакциями (фотореакции, photoreactions, photoresponses), мы подразумеваем любые немедленные отклики свободно подвижных микроорганизмов на любые изменения светового стимула (появление или исчезновение источника света, изменение его спектрального состава, интенсивности или направления светового потока и т.д.). Светозависимое поведение (behaviour) свободно подвижных микроорганизмов в нашем понимании – термин более широкий. Он включает любые индуцированные светом перемещения подвижных микроорганизмов в пространстве (т.е. он эквивалентен фототаксису в первоначальном широком смысле) независимо от того, происходят изменения характеристик светового стимула во времени или нет. Таким образом, в нашем понимании cветозависимое двигательное поведение свободно подвижных микроорганизмов (фототаксис) и фотореакции – понятия, хотя и совместимые, но не тождественные: первое является подчиняющим, второе – подчиненным. Светозависимое двигательное поведение биологических объектов является частным случаем более широкого физического явления – движения. Поэтому, как и любое движение, его можно oписать

r

r

известными физическими параметрами движения: скоростью ( V ), направлением ( r ), траекторией ( l ). Каждый из этих параметров может служить основанием для деления светозавиcимого двигательного поведения свободно подвижных микроорганизмов (фототаксисов) или их мгновенных фотореакций на классы. Так, скорость движения микроорганизмов может быть линейной и угловой. Конкретные классы линейной и угловой скорости движения микроорганизмов могут быть выделены на основании конкретных лимитов скорости, наблюдаемых у различных микроорганизмов. Кроме того, скорость перемещения организмов (как линейная, так и угловая) может быть постоянной, увеличивающейся или уменьшающейся во времени.

2

В переводе Н.П. Масюк.

- 23 -

Направление движения может быть ориентированным или не ориентированным по отношению к источнику света, а ориентация – положительной (по направлению к источнику света) или отрицательной (от источника света). Траектория движения бывает прямолинейной, криволинейной – параболической, зигзагообразной, спиралевидной, круговой (вращение вокруг собственной оси, продольной или поперечной, или вокруг оси, находящейся за пределами микроорганизма) и т.д. Световой стимул, в свою очередь, характеризуется такими параметрами, как интенсивность ( I ), r направление распространения света ( s ), его спектральный состав ( l ), поляризация ( P ), длительность и частота световых импульсов и т.д. Как и параметры движения, световые параметры могут подразделяться. Так, интенсивность света характеризуется абсолютной величиной ( I ), градиентом последней в пространстве ( dI/dx ) и во времени ( dI/dt ). Поскольку и фотодвижение микроорганизмов, и возбуждающий их световой стимул описываются несколькими параметрами, классификация фототаксисов, по нашему мнению, должна иметь параметрический характер. Мы попытались представить её в виде таблиц 2.1 и 2.2. В табл. 2.1 представлены фототаксисы индивидуальных микроорганизмов (так называемые единичный, индивидуальный или микроэффект), в табл. 2.2 – фототаксисы популяций микроорганизмов (групповой или макроэффект). В отдельных ячейках таблиц с помощью формул выражены зависимости параметров движения микроорганизмов от параметров светового стимула. Эти зависимости могут быть прямыми (положительными) или обратными (отрицательными), хотя не во всех случаях обе формы связи выявлены. Число параметров, характеризующих световой стимул и движение, может быть увеличено как за счёт введения дополнительных параметров (например, ритмика светового потока, постоянный или импульсный его характер), так и за счёт возможных взаимодействий различных параметров (например, длина волны и интенсивность света, одновременное изменение скорости и направления движения и т.д.). Некоторые из приведённых в табл. 2.1 и 2.2 зависимостей хорошо изучены и обозначены

r

специальными терминами. Например, V ( I ) – это зависимость скорости движения отдельных организмов от абсолютной величины интенсивности светового стимула, т.е. фотокинез по В. Нулчу и Д. Хэдеру r r [Nultsch, Häder, 1979]; r (s ) – зависимость направления движения организмов от направления распространения светового потока, т.е. фототаксис по В. Нулчу и Д. Хэдеру [Nultsch, Häder, 1979]. На основании вышеизложенного мы предлагаем следующую терминологию [Масюк та ін., 1988; Масюк, Посудин, 1991а; Massjuk et al., 1991; Massjuk, Posudin, 2002]: Фотодвижение - это движение или изменение движения организмов, вызванное светом. Фототаксис - любое, вызванное светом движение или изменение характера движения свободно подвижных (неприкрепленных) организмов, не обязательно ориентированное по отношению к источнику света. Фоторегуляция движения - совокупность элементарных процессов, индуцированных световым стимулом, а именно: фоторецепции, первичных реакций фоторецепторных пигментов, сенсорного преобразования светового стимула в физиологический сигнал, управляющий работой двигательного аппарата, реализующего фотоориентацию и скорость движения организма. Фотокинез – зависимость скорости движения отдельных организмов или их групп от любых параметров светового стимула. Фототопотаксис – зависимость направления движения отдельных организмов или их групп от любых параметров светового стимула. В пределах последних двух понятий возможна более детальная классификация указанных зависимостей. Некоторые зависимости, приведенные в табл. 2.1 и 2.2, пока не обозначены специальными терминами: например, зависимость траектории движения организмов от параметров светового стимула l ( I r ), l ( dI/dx ), l ( dI/dt ), l ( s ); иные зависимости (например, n (l ), n ( P ), L ( P ) и др.) пока лишь

- 24 -

предполагаются, они ещё не обнаружены, но, по-видимому, могут быть исследованы при измерении соответствующих параметров света и движения организмов или совокупностей последних. Таким образом, предлагаемый параметрический принцип классификации проявлений светозависимого двигательного поведения подвижных микроорганизмов позволяет не только упорядочить существующие на сегодняшний день терминологию и данные о взаимосвязи некоторых характеристик светового стимула с особенностями движения живых объектов, но и наметить конкретные пути дальнейших исследований, развитие которых позволит конкретизировать представленную схему и завершить классификацию фототаксисов на строго логической основе. Предложенный принцип может быть использован и для других типов таксисов, обусловленных иными физическими факторами. Таблица 2.1. Параметрическая классификация светозависимого движения (фототаксисов) отдельных организмов

Параметры светового стимула Параметры движения

Интенсив-

Градиент интенсивности

Направление

ность

I

dI/dt

r s

dI/dx

Длина волны

l

Поляризация

P

Скорость движения r индивидов:

n n

линейная V

r V (I)

r V (dI/dt)

r V (dI/dx)

n(I)

n(dI/dt)

r r (I) l(I)

угловая n (частота пространствен-

r V (l)

r V (P)

n(dI/dx)

r r V (s ) r n( s )

n(l)

n(P)

r r (dI/dt)

r r (dI/dx)

r r r (s )

r r (l)

r r (P)

l(dI/dt)

l(dI/dx)

l( s )

l (l)

l(P)

ных изменений траектории индивидов: колебаний, вращений, поворотов, рысканий) Направление движения индивидов

r r

Траектория движения индивидов l

r

Таблица 2.2. Параметрическая классификация светозависимого движения (фототаксисов) совокупностей микроорганизмов Параметры светового стимула Параметры движения

Интенсив

Градиент интенсивности

-ность

Концентрация индивидов (оптическая плотность) в популяции, колонии N

в популя-ции, колонии S Траектория движения популяции, колонии L Относительное число индивидов, проявляющих фотореакции N/N0

- 25 -

Длина волны

Поляризация

I

dI/dt

dI/dx

r s

N (I)

N (dI/dt)

N (dI/dx)

N( s )

S (I)

S (dI/dt)

S (dI/dx)

S( s )

L(I)

L(dI/dt)

L(dI/dx)

L( s )

N/N0(I)

N/N0(dI/dt)

N/N0(dI/dx)

N/N0( s )

Форма (пространст-венное распределение) индивидов

Направление

l

r

r

r

r

P

N(l)

N(P)

S (l)

S(P)

L (l)

L(P)

N/N0 (l)

N/N0(P)

Что же касается фотореакций, то они как и фототаксисы, могут проявляться: в изменении скорости движения (фотокинетическая реакция), изменении направления и траектории (фотовекторная реакция) или одновременном изменении скорости и направления движения (фотофобическая реакция). Таким образом, мы предлагаем отличать понятия фотодвижение (photomovement) и фоторегуляция (control) движения, а в границах фотодвижения – фототропизмы и фототаксисы (в исходном, более широком понимании). Для классификации светозависимого двигательного поведения неприкрепленных организмов (фототаксисов) предлагается использовать параметрический принцип как на индивидуальном, так и на групповом уровнях. В границах более широкого понятия “фототаксис” выделяется подчиненное ему понятие фотореакция с тремя феноменологическими типами (кинетическим, векторным и фобическим). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Критическое рассмотрение терминологии и классификации разных типов фотоиндуцированного поведения свободноподвижных организмов показало, что существование различных классификационных систем является источником терминологической путаницы (Масюк, Посудин, 1991а). Мы разработали параметрическую классификацию свето-зависимого поведения как отдельных подвижных клеток (индивидуальный или микроэффект, табл. 2.1), так и их совокупностей (групповой или макроэффект, табл. 2.2). За термином фототаксис (phototaxis) мы сохраняем его первоначальное значение: любое перемещение свободнодвижущихся организмов в пространстве, вызванное светом (Масюк та ін., 1988). Под светозависимыми реакциями подвижных организмов (photoresponse, photoreaction) мы подразумеваем любые немедленные двигательные отклики этих организмов на любые изменения светового стимула. Светозависимое двигательное поведение биологических объектов – это частный случай общего физического феномена – движения. Поэтому движение организмов может быть описано такими хорошо

r

известными параметрами, как скорость ( V ), направление ( r ) и траектория ( l ). Световой стимул, в свою очередь, характеризуется такими параметрами, как интенсивность ( I ), r направление ( s ), спектральный состав ( l ), поляризация света ( P ), продолжительность, частота и форма световых импульсов. Принимая во внимание параметрический характер обеих величин (света и движения), мы считаем, что классификация зависимости движения (фототаксисов) микроорганизмов от света должна основываться на параметрическом принципе (см. табл. 2.1, 2.2). Любую зависимость скорости движения отдельных организмов или их групп от любых параметров светового стимула мы предлагаем называть фотокинезом (photokinesis), а зависимость направления движения отдельных организмов или их групп от каких-либо параметров света именуем фототопотаксисом (phototopotaxis) (Масюк та ін., 1988; Масюк, Посудин, 1991а). В указанном смысле мы применяем эти термины в последующем тексте. Предложенная классификация может быть детализирована путем учета добавочных параметров движения и света, возможности их взаимодействия (например, длины волны и интенсивности света, скорости и направления движения), или уточнения некоторых параметров. Предложенные принципы позволяют не только упорядочить существующую терминологию, но и предвидеть еще не изученные связи и запрограммировать дальнейшие исследования.

- 26 -

ГЛАВА 3 РОД DUNALIELLA TEOD. МОРФОЛОГИЯ, СПОСОБЫ РАЗМНОЖЕНИЯ, ЭКОЛОГИЯ, ГЕОГРАФИЧЕСКОЕ РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ВОПРОСЫ СИСТЕМАТИКИ 3.1. ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ И ОПИСАНИЯ РОДА DUNALIELLA

Задолго до описания рода Dunaliella было известно загадочное явление красного “цветения” рапы соленых водоемов, расположенных в низких широтах на всех контенентах земного шара. В 1836 г. Парижская Академия Наук поручила академику Пайену выяснить причины этого явления. Пайен предположил, что красная окраска рапы зависит от массового развития ракообразного Artemia salina, которое под влиянием высоких концентраций солей разрушается, окрашивая рапу и соль в красный цвет и придавая им характерный запах фиалки. Однако Дюналь [Dunal, 1838, цит. по: Масюк, 1973] выразил сомнение относительно выводов Пайена. В соленых болотах у Монпелье на юге Франции он обнаружил микроскопические водоросли, описанные им под названием Protococcus salinus Dunal и Haematococcus salinus Dunal, массовое развитие которых он считал причиной красной окраски рапы. Специальная комиссия в составе академиков Сент-Илера, Тюрпена и Дюма подтвердила выводы Дюналя. Однако дискуссия по поводу красной рапы продолжалась еще почти сто лет, обогащаясь новыми предположениями и гипотезами. Что касается открытых Дюналем водорослей, то их систематическое положение из-за отсутствия адекватных иллюстраций и достаточно полных описаний долгое время оставалось спорным. Жоли [Joly, 1840, цит. по: Масюк, 1973] объединил описанные Дюналем виды под названием Monas dunalii Joly. Кон [Cohn, 1865, цит. по: Масюк, 1973] поместил этот вид в род Chlamydomonas, под названием C. dunalii Cohn. Гансгирг [Hansgirg, цит. по: Teodorescu, 1905] считал эту водоросль разновидностью Sphaerella lacustris var. dunalii Hansg., а Дюжарден [Dujardin, цит. по: Teodorescu, 1905] отнес ее к роду Diselmis, как D. dunalii Duj. В 1905 г. были опубликованы результаты исследований Теодореску [Teodorescu, 1905], который пришeл к выводу, что возбудители красного “цветения” рапы – одноклеточные водоросли, лишенные клеточной оболочки, делящиеся и копулирующие в подвижном состоянии, должны быть отнесены к семейству полиблефаридовых в качестве нового рода, названного им в честь М. Дюналя Dunaliella Teod. Типовым видом этого рода стал единственный известный в то время вид Dunaliella salina (Dunal) Teod. Год спустя был описан еще один вид – Dunaliella viridis Teod. [Teodorescu, 1906, цит. по: Масюк, 1973]. В 70-е годы прошлого века род Dunaliella уже насчитывал более 30 видовых и внутривидовых названий; некоторые из них оказались nomen nudum и были переведены в синонимы. Dunaliella cordata Pascher et Jahoda, занимавшая в системе рода Dunaliella изолированное положение [Масюк, 1973], была выделена в самостоятельный род Papenfussiomonas Desikachari. В настояще время род Dunaliella насчитывает 28 видов, представленных 33 внутривидовыми таксонами, включая те, которые содержат номенклатурный тип вида (табл. 3.1)3.

3

Здесь не учтена Dunaliella bardawil (Ben-Amotz et al., 1982a), поскольку в доступных нам литературных источниках мы не нашли ни описания, ни диагноза этого вида, являющегося таким образом nomen nudum. Х.Р. Прайзиг (Dunaliella ..., 1992) считает это название синонимом D. salina Teod.

- 27 -

Таблица 3.1 . Внутриродовые таксоны Dunaliella Teod.4

Таксон

Размеры клеток (длина ´ ширина, мкм)

Базионимы, синонимы

1

2

3

Подрод Pascheria Massjuk Dunaliella acidophila (Kalina) Massjuk D. flagellata Skvortzov

7,6-12,7 ´ 1,7-2,3

Spermatozopsis acidophila Kalina

15,0 ´ 19,0

D. lateralis Pascher et Jahoda

7,0-11,0 ´ 4,0-6,0

D. obliqua (Pascher) Massjuk

9,0-14,0 ´ 6,0-9,0

D. paupera Pascher

9,0-12,0 ´ 7,0-9,0

Apiochloris obliqua Pascher

Подрод Dunaliella Секция Tertiolectae Massjuk Dunaliella maritima Massjuk

5,0-19,0´2,5-15,0

D. polymorpha Butcher

7,0-9,0´4,0-6,0

D. primolecta Butcher

5,0-18,0´3,0-13,0

D. quartolecta Butcher

7,0-9,0 ´ 4,0-6,0

D. tertiolecta Butcher

5,0-18,0´4,5-14,0

Dunaliella parva sensu Butcher, non Lerche; D. parva f. eugameta Lerche

Секция Dunaliella D. parva Lerche D. pseudosalina Massjuk et Radchenko

9,9-16,0´4,0-10,0 11,0-23,0´6,0-16,0

окончание табл. 3.1 1

Dunaliella salina Teodorescu

2

5,0-29,0´2,5-21,0

- ssp. salina

5,0-29,0´4,0-21,0

-- f. salina

5,0-23,0´4,0-19,0

-- f. magna Lerche

7,5-29,0´7,5-21,0

-- f. oblonga Lerche

7,0-28,0´5,0-13,0

- ssp. sibirica Massjuk et Radchenko

6,0-24,0´2,5-20,0

3

Haematococcus salinus Dunal, Protococcus salinus Dunal, Monas dunalii Joly, Diselmis dunalii Dujardin, Chlamydomonas dunalii Cohn, Sphaerella lacustris var. dunalii Hansgirg, Dunaliella kermesiana sensu Labbe, D. bardawil 5

Секция Virides Massjuk

4 5

D. baas-beckingii Massjuk D. bioculata Butcher

16,0-20,0´4,0-6,0 6,5-13,0 ´ 3,5-8,0

D. carpatica Massjuk

10,0-19,0´7,0-13,0

D. gracilis Massjuk

32,0-40,0´4,0-5,0

D. granulata Massjuk

5,0-18,0´3,0-15,0

D. media Lerche

10,0-20,0´3,0-5,0

Dunaliella sp. 5 (Ruinen, 1938) D. marina nomen nudum (Kombrink, Wöber, 1980) Dunaliella sp. 3 (Ruinen, 1938)

Таблица составлена по материалам монографии Масюк, 1973. См. сноску 1 на с. 32.

- 28 -

D. minuta Lerche

3,0-13,0´1,5-10,0

D. minutissima Massjuk

2,8-6,0

Dunaliella sp. 2 (Ruinen, 1938)

D. ruineniana Massjuk

24,0-28,0 ´ 12,0

Dunaliella sp. 4 (Ruinen, 1938)

D. terricola Massjuk

3,5-13,0 ´ 2,0-6,5

D. viridis Teodorescu

3,0-18,0´2,0-15,2

D. salina f. viridis (Teod.) Butcher

- var. viridis - - f. viridis

5,1-17,0 ´3,0-15,2

- - f. euchlora (Lerche) Massjuk

3,0-17,8´2,0-11,4

- var. palmelloides Massjuk

9,0-12,0 ´ 5,0-7,0

D. euchlora Lerche 1937

Секция Peirceinae D. asymmetrica Massjuk

6,0-13,0 ´ 3,5-9,0

D. jacobae Massjuk

6,0-12,0 ´ 4,0-5,0

D. peircei Nicolai et Baas-Becking

7,0-25,0´3,0-12,0

D. turcomanica Massjuk

4,0-12,7 ´ 3,0-9,0

Dunaliella sp. 1 (Ruinen, 1938)

3.2. МОРФОЛОГИЯ

Род Dunaliella объединяет одноклеточные зеленые водоросли с двумя изоконтными, изоморфными, изодинамичными жгутиками. Гетеродинамичные жгутики наблюдаются у единственного вида – Dunaliella jakobae [Масюк, 1973]. Клеточная оболочка отсутствует. На поверхности плазмалеммы имеется слизистый покров, видимый в световом микроскопе в препаратах с раствором туши. На тонких срезах в электронном микроскопе вокруг клеток ряда видов (D. salina, D. primolecta, D. tertiolecta, D. acidophila, D. lateralis, D. bioculata) отчетливо виден покрывающий плазмалемму электронно плотный слой нерегулярной толщины, некристаллической фибриллярной структуры. Составляющие его фибриллы длиной от 25 до 200 нм имеют гликопротеидную природу с примесью N-ацетилглюкозамина [см. обзор: Dunaliella..., 1992]. Поверхность клеток Dunaliella несет негативный электрический заряд [Chardard, 1987, 1990]. Из-за отсутствия прочной клеточной оболочки клетки легко изменяют свою форму, которая может метаболировать у одного и того же вида и даже индивида в широких пределах (рис. 3.1). Вместе с тем форму, которую приобретает большинство свободно движущихся клеток данного вида в благоприятной для него среде, можно считать типичной для этого вида (рис. 3.2-3.6, фото 1). У большей части видов Dunaliella, в том числе у D. salina и D. viridis, типичная форма клеток радиально-симметричная (эллипсоидная, яйцевидная или обратнояйцевидная, грушевидная, цилиндрическая, веретеновидная или шаровидная, на поперечных срезах по всей длине клетки круглая) см. рис. 3.3-3.5. Такая радиальносимметричная форма клеток характерна для представителей секций Tertiolectae, Dunaliella, и Virides. У некоторых видов (представителей секции Peirceinae) типичная форма клеток может быть уплощенной по всей длине клеток или только спереди, билатеральносимметричной, иногда дорзовентральносогнутой или слегка спирально скрученной (см. рис. 3.6). В этом случае поперечные срезы по всей длине клетки или только спереди имеют форму более или менее вытянутого, правильного или неправильного овала. Во всех случаях полярность клеток определяется апикально прикрепленными жгутиками. В интерфазе клетки имеют единственное ядро, расположенное в передней половине клетки, в вырезке хлоропласта (рис. 3.7). Оно одето двухмембранной пористой оболочкой и содержит ядрышко, окруженное глыбками гетерохроматина [см. обзор: Dunaliella ..., 1992]. Хлоропласт один, большей частью чашевидный или блюдцевидный, иногда корытовидный (D. acidophila), с утолщенной базальной частью и более или менее развитыми боковыми стенками (см. рис. 3.23.6, фото 1), иногда фрагментированный по всему объему (D. parva) или только по переднему краю (D. maritima), редко редуцированный и перфорированный (D. carpatica) до сетчатого (D. flagellata), на - 29 -

поверхности гладкий, реже гранулированный (D. pseudosalina), в старых клетках, особенно в экстремальных условиях, перед образованием бесполых цист – сильно гранулированный. У Dunaliella sp. [Pascher, Jahoda, 1928, цит. по: Масюк, 1973] хлоропласт в виде тонкой центральной звездчатой пластинки.

Рис. 3.1. «Гомогологичские ряды» модификационной изменчивости формы клеток у видовDunaliella (I - D. salina Teod.; II - D. granulata Massjuk; III - D. asymmetrica Massjuk; IV - D. ViridisTeod. var. viridis f. euchlora (Lerche) Massjuk; V - D. minuta Lerche): 1 – сферическая; 2 эллипсоидная; 3 – яйцевидная; 4– грушевидная; 5 – дорзовентральная; 6 – гантелевидная; 7 –цилиндрическая; 8 – с волосковидно оттянутым задним концом; 9 – плоская с псевдоподиальными выростами; 10 – полигональная форма клеток (по Масюк, 1973).

Тилакоиды собраны в плотные пачки, число их в пачке может достигать 10 (особенно при высокой концентрации солей в окружающей среде [см. обзор: Dunaliella ..., 1992]). Единственный пиреноид обычно располагается в утолщенной базальной части хлоропласта в окружении многочисленных зерен крахмала (см. рис. 3.3-3.6). У некоторых видов пиреноид центральный (D. ruineniana, Dunaliella sp.), боковой (D. lateralis), или же он отсутствует (D. paupera, D. flagellata). Обычно парные тилакоиды заходят в пиреноидный матрикс на небольшое расстояние, но они никогда не пронизывают его насквозь [см. обзоры: Масюк, 1973; Dunaliella ..., 1992].

- 30 -

Рис. 3.2. Пресноводные виды Dunaliella, подрод PasheriaMassjuk: 1,2 - D. paupera Pascher; 3 - D. flagellata Skvortzov.; 4,5- D. Obliqua (Pascher) Massjuk; 6 - D. lateralis Pascher et Jahoda;7-10 - D. acidophila (Kalina) Massjuk (1, 2, 4, 5 – по Пашеру; 3 –по Скворцову; 6 – по Пашеру и Ягоде; 7-10 – по Калина)

У некоторых видов в экстремальных условиях в строме хлоропласта накапливается большое количество капель масла, с растворенными в них каротиноидами (см. фото 1, 1), преимущественно bкаротином (D. salina, D. parva) или кантаксантином (D. pseudosalina). При этом клетка последовательно приобретает желто-бурую, оранжевую и кирпично-красную окраску. Такие кирпично-красные клетки обычно содержат каротиновые липидные глобулы и за пределами хлоропласта, непосредственно в цитоплазме. В клетках D. bardawil (= D. salina) с каротиновыми глобулами ассоциируются специфические белки (Katz et al, 1995). “Красная форма” D. salina доминирует в гипергалинных водоемах юга Украины. Однако при рассолаживании рапы, при низкой освещенности, в условиях, благоприятных для роста и размножения этого вида, красные клетки быстро теряют каротин и зеленеют, превращаясь в “зеленую форму” (см. фото 1). Остальные виды Dunaliella в отличие от названных не обладают способностью к гиперсинтезу каротиноидов в экстремальных условиях и поэтому всегда сохраняют зеленый цвет (см. фото 1, 4). В условиях лабораторных культур, благоприятных для роста и размножения, все виды Dunaliella имеют зеленую окраску.

Рис. 3.3. Морские виды Dunaliella из секции Tertiolectae, подрода Dunaliella: 1 - D. tertiolecta Butcher; 2 - D. primolecta Butcher; 3 - D. quartolecta Butcher; 4 - D. polymorpha Butcher; 5 - D. maritima Massjuk (1-4 – по Батчеру; 5 – по Масюк).

Стигма, как и у всех зеленых водорослей, является частью хлоропласта. Она расположена под оболочкой хлоропласта, в непосредственной близости от плазмалеммы и состоит из одного, реже двух слоев - 31 -

окрашенных в оранжевый цвет липидных глобул (Владимирова, 1978). Обычно они не различаются по размерам, плотно упакованы в одной плоскости и от взаимного давления приобретают гексагональную форму, но иногда липидные глобулы, образующие стигму, лежат в строме пластиды свободно, имеют шаровидную форму и могут различаться по своим размерам. Число липидных глобул в стигме увеличивается с возрастом. У D. salina и D. bioculata стигма более тесно связана с тилакоидами, чем у D. tertiolecta и D. primolecta [см. обзор: Dunaliella ..., 1992]. Обычно каждая клетка Dunaliella имеет одну стигму; та половинка клетки, где она расположена, называется цис-половиной, другая обозначается как транс-половина. В клетках D. bioculata имеется по две стигмы. У D. paupera стигма отсутствует. Митохондриальные профили на тонких срезах видны в разных частях клетки. Они постоянно присутствуют вблизи базальных тел жгутиков, в периферических областях клетки между хлоропластом и плазмалеммой, а также вокруг ядра. Митохондриальные профили могут формировать сеть, передняя доля которой всегда тесно связана с жгутиковым аппаратом. Число и размеры митохондрий могут изменяться на разных стадиях клеточного цикла [Dunaliella ..., 1992]. Диктиосомы (аппарат Гольджи) присутствуют в количестве от двух до четырех; число цистерн в каждой из них колеблется от 10 до 15. Диктиосомы всегда располагаются между передним краем ядра и базальными телами жгутиков (парабазальное положение), причем формирующая поверхность обращена к плазмалемме и связана с элементами эндоплазматической сети [Melkonian, Preisig, 1984; Dunaliella ..., 1992]. Эндоплазматический ретикулум (ЭР) подстилает почти всю внутреннюю поверхность плазмалеммы, отдельные его элементы связывают ядерную оболочку с базальными телами жгутикового аппарата [Melkonian, Preisig, 1984]. В периоды кратковременных гиперосмотических стрессов наблюдается увеличение объема ЭР. Предполагается, что в эти периоды ЭР резервирует избыточный мембранный материал, образующийся в результате съеживания клеточных органелл [см. обзор: Dunaliella ..., 1992].

Рис. 3.4. Гипергалобные виды Dunaliella из секции Dunaliella, подрода Dunaliella: 1 – D. parva Lerche; 2 – D. salina Teodorescu ssp. salina f. salina; 3,4 – D. salina Teod. ssp. salina f. magna Lerche; 5 - D. salina Teod. ssp. salina f. oblonga Lerche; 6 - D. salina Teod. ssp. sibirica Massjuk; 7 – D. pseudosalina Massjuk et Radch. (1 – по Лерхе; 2-7 – по Масюк).

В клетках Dunaliella имеются вакуоли разных типов. Пульсирующие вакуоли наблюдаются лишь в клетках пресноводных видов (см. рис. 3.2, 1, 2, 4-9), у морских и гипергалобных видов они отсутствуют. Непульсирующие вакуоли могут содержать мембранный материал, пузырьки, гранулы, нитевидные структуры, маленькие липидные глобулы, подобные тем, которые содержатся в хлоропластах. Они составляют заметную ультраструктурную часть цитоплазмы. В последней содержатся также большие липидные глобулы, вакуоли с электронноплотным содержимым (см. рис. 3.3-3.5), в составе которых - 32 -

обнаружены силиций, фосфор, сера, хлориды. Некоторые вакуоли лишены видимых структурных элементов. В живых клетках хорошо заметны преломляющие свет (рефрактивные) гранулы. Возможно, они соответствуют светлым вакуолям на тонких срезах (см. рис. 3.3).

Рис. 3.5. Гипергалобные виды Dunaliella из секции Viridis порода Dunaliella: 1 – D. vireis Teodorescu var. viridis f. viridis; 2 – D.viridis Teodorescu var. viridis f. euchlora (Lerche) Massjuk;3,4 – D.viridis Teod. var. palmelloides Massjuk (3 - монадная стадия; 4 - первая стадия образования пальмеллы); 5 – D. Minuta Lerche; 6 – D. terricola Massjuk; 7 – D. media Lerche; 8 – D. ruineniana Massjuk; 9 – D. gracilis Massjuk; 10 – D. baasbeckingi iMassjuk; 11 – D. minutissima Massjuk; 12 – D. granulata Massjuk; 13 - D. carpatica Massjuk; 14 – D. bioculata Butcher (1- 6; 11-13 - по Масюк; 7 - по Лерхе; 8-10, 14 - по Батчеру).

Тонкая структура жгутикового аппарата типична для Chlorophyceae. Два базальных тела (БТ), если смотреть спереди, расположены друг против друга со смещением по часовой стрелке в положение 1/7 (рис. 3.7, А). Если смотреть сбоку, БТ образуют V-образную фигуру (рис. 3.7, Б). Угол между ними колеблется в небольших пределах (90°-130°). Таким образом, в отличие от Chlamydomonas reinhardtii P.A. Dang. угол между БТ у видов Dunaliella более жестко детерминирован. БТ связаны друг с другом большим поперечно исчерченным дистальным волокном и меньшими не исчерченными проксимальными волокнами. Периодичность поперечной исчерченности дистального волокна изменяется с изменением угла между БТ. Чем меньше угол, тем короче расстояние между соседними полосами. Считают, что сокращение и расслабление дистального волокна регулирует ориентацию БТ, связанных с ними жгутиков и направление движения клетки [см. обзор: Dunaliella ..., 1992]. Иногда присутствуют два дополнительные БТ, не связанные с жгутиками. Такое расположение БТ, обозначенное М. Мелконианом [Melkonian, 1980; Melkonian, Preisig, 1984] как типичное для Chlorophyceae, обнаружено у Dunaliella bioculata, Dunaliella sp., D. primolecta, D. tertiolecta и D. salina [Melkonian, Preisig, 1984; см. обзор: Dunaliella ..., 1992].

- 33 -

Рис.3.6. Гипергалобные виды Dunaliella из секции Peirceinae, подрода Dunaliella: 1 ,2 – D. peircei Nicolai et Baas-Becking (клетка с широкой и узкой стороны); 3, 4 – D. turcomanica Massjuk (клетка с широкой и узкой стороны); 5, 6 – D. jacobae Massjuk (клетка в разных положениях); 7, 8 – D. Asymmetrica Massjuk (7 – вид клетки сбоку; 8 – вид клетки с брюшной стороны) (1, 2 - по Лерхе; 3, 4, 7, 8 - по Масюк; 5, 6 - по Руинен).

БТ Dunaliella несут крестообразную корешковую систему типа Х-2-Х-2, характерную для большой группы жгутиконосцев из классов Chlorophyceae и Prasinophyceae. Каждое БТ несет два микротрубочковых корешка, один из которых состоит из двух микротрубочек (МТ), другой - из четырех (см. рис. 3.7). Оба корешка снизу подстилаются волокнистыми структурами (системой волокон І). У Chlamydomonas такие волокнистые структуры обнаружены только на двухтрубочковых корешках, причем они покрывают МТ сверху, а не подстилают их снизу [Melkonian, Preisig, 1984]. МТ всех жгутиковых корешков Dunaliella, располагаясь под плазмалеммой, достигают заднего конца клетки, причем МТ одного из корешков проходят в непосредственной близости от стигмы, между плазмалеммой и наружной мембраной хлоропласта. Жгутик, связанный одним из своих микротрубочковых корешков со стигмой, обозначают как цис-, другой - как транс-жгутик. Подстилающая микротрубочковые корешки система волокон І заканчивается где-то на полпути, примерно посередине клетки, не достигая ее заднего конца (см. рис. 3.7, Б). Как и у многих других зеленых водорослей, волокна системы І поперечно исчерчены с периодичностью от 25 до 32 нм [Melkonian, 1980, 1989]. При изоляции жгутикового аппарата D. bioculata волокна системы І отделяются от сопровождаемых ими МТ, и картина их исчерченности изменяется [Dunaliella ..., 1992].

Рис. 3.7. Схема расположения базальных тел, микротрубочковых и волокнистых корешков у видов Dunaliella: A - вид спереди, базальные тела в положении 1/7 (сдвиг по часовой стрелке); Б – вид сбоку; БТ – базальное тело; Д – дистальное волокно; ЖГ – жгутик; П – проксимальное волокно; Я – ядро; 2-тр. – двухтрубочковый корешок; 4-тр. – четырехтрубочковый корешок; І – система волокон І; ІІ – система волокон ІІ (ризопласт).

- 34 -

Кроме волокон системы І, в клетках D. salina обнаружена также система исчерченных волокон ІІ с периодичностью 80-90 нм (см. рис. 3.7, Б). Они образуют мощный волокнистый корешок (ризопласт), соединяющий БТ с ядром и тесно прилегающий к митохондриальному профилю. Такой мощный ризопласт у других видов Dunaliella длительное время не отмечался, но во время раннего митоза у D. bioculata наблюдалась связь между ядром и БТ, названная Марано “нейромоторным аппаратом” [см. обзор: Dunaliella ..., 1992]. Наличие такого “нейромоторного аппарата” обнаружено и в клетках Chlamydomonas [Salisbury, 1988]. Системы волокон І и ІІ различаются по химическому составу и, повидимому, выполняют разную функцию. Установлено, что большое дистальное волокно и ризопласты, соединяющие БТ с ядром, у видов Chlamydomonas, Dunaliella, Tetraselmis и многих других жгутиконосцев содержит специальный белок центрин, являющийся Ca2+-связывающим фосфопротеином [McFadden et al., 1987; Huang et al., 1988; Salisbury, 1988; Melkonian, 1989]. Все волокнистые структуры, содержащие центрин, способны к периодическим сокращениям/расслаблениям, регулируемым раствором, содержащим Ca+ и АТФ. Предполагается, что у Dunaliella, как и у Chlamydomonas, происходят индуцированные ионами кальция сокращения волокнистых структур клеток, приводящие в движение БТ и управляющие ориентацией клеток, причем частота биения жгутиков от ориентации БТ не зависит [см. обзор: Dunaliella ..., 1992].

Фото 1. Объекты исследования фотодвижения: 1, 2 Dunaliella salina Teod. из солесадочного бассейна Крымского содового завода (1 - красная форма; 2 зеленая форма); 3 - D. salina Teod., штамм из солесадочного бассейна Сакского завода; зеленая форма в начальной стадии накопления каротина; 4 D. viridis Teod., штамм 42 (1, 2, 4 - оригинальные рисунки Г.Г. Лилицкой; 3 - по Н.П. Масюк).

БТ D. bioculata погружены в аморфный электронноплотный материал, из которого исходит система МТ, образующих регулярный остов клетки - цитоскелет, расположенный под плазмалеммой. МТ расположены на расстоянии 60 нм параллельно друг другу. Цитоскелет Dunaliella представляет собой интегрированную систему, в которой БТ и окружающий их аморфный электронноплотный материал составляют центральный элемент, повидимому, играющий роль МТОЦ. Микротрубочковый цитоскелет поддерживает определенную специфическую для каждого вида Dunaliella форму клетки. Тонкая структура БТ и переходной зоны жгутиков у видов Dunaliella не отличаются от таковых Chlamydomonas. В частности, в переходной зоне жгутиков Dunaliella на поперечном срезе имеется характерная для Chlorophyceae звездчатая структура, на продольном - Н-образная [см. обзор: Dunaliella ..., - 35 -

1992]. У представителя другого класса зеленых водорослей (Сhlorodendrophyceae) - Tetraselmis - в переходной зоне жгутиков, кроме звездчатой структуры, имеется также переходная спираль. Считают, что сокращение центрина, содержащегося в переходной зоне жгутиков Chlamydomonas, под влиянием ионов кальция может вызывать аутотомию жгутиков. В отличие от Ch. reinhardtii и Tetraselmis subcordiformis (Wille) Hazen аутотомия жгутиков Dunaliella tertiolecta наблюдается лишь при концентрации этанола, вызывающей гибель клеток; ионы кальция аутотомию жгутиков у этого вида не вызывали [Huber, Lewin, 1987]. Таким образом, суммируя приведенный выше обзор морфологических особенностей Dunaliella, следует подчеркнуть, что этот род отличается от Chlamydomonas не только отсутствием клеточных оболочек и наличием своеобразного клеточного покрова, не только отсутствием пульсирующих вакуолей (у гипергалобных видов), но и более четко фиксированным углом между базальными телами, парабазальным положением диктиосом, тесной связью ризопласта с митохондриальным профилем, иным расположением волокнистых структур системы волокон І и др. Поэтому можно сделать вывод, что клетки Dunaliella не просто “голый эквивалент” клетки Chlamydomonas [ср: Melkonian, Preisig, 1984; Melkonian, 1990]. Роды Dunaliella и Chlamydomonas (во всяком случае та часть последнего, которую представляет наиболее полно изученный вид C. reinhardtii), возможно, принадлежат к различным эволюционным ветвям в системе зеленых водорослей. 3.3. СПОСОБЫ РАЗМНОЖЕНИЯ

Бесполое размножение Dunaliella в жидкой среде происходит путем продольного деления клеток в подвижном состоянии [см. обзоры: Lerche, 1937; Масюк, 1973; Ettl, 1983; Dunaliella ..., 1992]. Митоз и цитокинез имеют черты, характерные для Chlorophyceae: коллапсирующее телофазное веретено и фикопласт. В профазе ядро мигрирует в переднюю часть клетки, к базальным телам. В конце профазы наблюдается разрыв большого дистального и проксимальных волокон, соединяющих БТ родительской клетки и созревание пробазальных тел. Особенностью видов Dunaliella является то, что во время митоза жгутики остаются соединенными со своими БТ и поэтому позволяют легко отличить старые БТ от новых. Две образовавшиеся пары БТ разделяются, причем каждая пара состоит из одного старого и одного нового БТ. Различия в зрелости БТ может обусловить развитие функционально различных жгутиков. В течение профазы ядерная оболочка сохраняется, развивается внутриядерное веретено. В метафазе в ядерной оболочке появляются полярные окна, между которыми располагается ядерное веретено. Две новые пары БТ функционируют как центросомы, способствующие удлинению ядерного веретена. В это время перед ранней телофазой появляются новые пробазальные тела, созревающие к ранней профазе следующего митотического раунда. Такая полуконсервативная дупликация и бифазное развитие БТ характерны для многих жгутиконосцев, они ведут к асимметрии БТ в молодых дочерних клетках. В телофазе тесный контакт между БТ и ядром утрачивается. В поздней телофазе ядерная оболочка замыкается вокруг дочерних ядер, возвращающихся в интерфазное положение, а ядерное веретено коллапсирует. Цитокинез осуществляется с помощью борозды деления, с участием фикопласта – пучка МТ, расположенных в плоскости деления. Первые признаки деления хлоропласта появляются еще в профазе в виде делящегося пиреноида. Полное разделение хлоропласта имеет место только во время цитокинеза. Новые жгутики вырастают только после завершения цитокинеза [см. обзоры: Масюк, 1973; Dunaliella ..., 1992]. Последовательность деления различных органелл легко нарушается и может задерживаться на определенных стадиях, особенно в старых культурах. При этом образуются уродливые формы, размножающие либо жгутики, либо пиреноиды, либо глазки. Часто наблюдаются клетки с двойным количеством всех органелл, напоминающие промежуточные стадии копуляции [см. обзор: Масюк, 1973]. - 36 -

На последних стадиях деления дочерние клетки в течение некоторого времени остаются соединенными своими боковыми поверхностями, постепенно вытягивающимися в более или менее короткий, узкий мостик, заполненный бесцветной цитоплазмой. Мостик, соединяющий две новообразованные дочерние клетки, может удлиняться, превращаясь в тонкую эластичную нить. Обычно обе еще не разъединившиеся дочерние клетки вращаются во взаимно противоположных направлениях, причем одна из клеток проявляет большую активность. При этом соединяющий их цитоплазматический мостик постепенно удлиняется, утоньшается и в конце концов разрывается. Разрыв мостика может происходить посередине или вблизи одной из дочерних клеток; в результате обе или только одна из новообразованных клеток несут на своей боковой поверхности бесцветный тонкий отросток, впоследствии втягивающийся внутрь. Чем энергичнее движение, тем быстрее происходит разрыв [Масюк, 1973]. Весь процесс деления в зависимости от условий окружающей среды может длиться от 30 мин. до 3,5 часов [Teodorescu, 1905; Масюк, 1973]. На твердом субстрате (агаризованная питательная среда) наблюдается разобщение процессов деления клеточных органелл и цитокинеза. В результате образуются гиганские клетки с большим числом пиреноидов и других клеточных органелл, которые затем последовательно или одновременно делятся на большое число дочерних клеток с образованием колоний; иногда наблюдается почкование [Масюк, 1973]. В неблагоприятных условиях (бессолевые или, наоборот, очень концентрированые среды) некоторые виды Dunaliella (D. salina, D. viridis) способны переходить в пальмеллевидное состояние. При этом клетки втягивают жгутики, округляются, выделяют обильную слизь, в которой многократно делятся, образуя большие скопления зеленых клеток неправильной или полигональной формы. В таком неподвижном состоянии водоросли могут сохранять жизнеспособность неопределенно долго. При подходящих условиях они снова вырабатывают жгутики, восстанавливают обычную форму и подвижность [Масюк, 1973]. В цикле развития D. viridis var. palmelloides пальмеллевидная стадия является доминирующей [Масюк, 1973]. Одной из форм перенесения неблагоприятных условий является образование бесполых цист, существование которых у видов Dunaliella, было поставлено под сомнение [Lerche, 1937]. Однако впоследствии наличие у D. salina бесполых цист, по содержанию ДНК не отличающихся от вегетативных клеток, было доказано [Loeblich, 1969]. Они образуются при резком опреснении природной рапы или при кристаллизации солей в насыщенных растворах, при высушивании и в других неблагоприятных условиях [см. обзоры: Масюк, 1973; Dunaliella ..., 1992]. Цисты представляют собою неподвижную покоющуюся стадию и имеют вид шаровидных толстостенных клеток с мелкозернистой поверхностью и гранулированным содержимым темнокрасного цвета. Перед прорастанием цисты зеленеют, их содержимое делится с образованием 2-4 клеток, которые освобождаются через отверстие в оболочке [Масюк, 1973]. Половой процесс гологамного типа наблюдали у ряда видов Dunaliella (D. salina, D. parva, D. peircei, D. viridis var. euchlora, D. minuta). Гаметангии у видов Dunaliella отсутствуют. Большинство изученных видов гомоталличны, лишь D. salina оказалась гетероталличным видом. Внешне половой процесс Dunaliella напоминает изогамию многих хламидомонад, так как копулирующие клетки Dunaliella не отличаются между собой своими размерами. Слияние их сопровождается склеиванием жгутиков и образованием специальных копуляционных структур. Зиготы – неподвижные шаровидные клетки, окруженные толстой гладкой оболочкой. Содержимое их может быть зеленым, красным или наполовину красным и наполовину зеленым (в зависимости от окраски копулирующих клеток). После периода покоя они прорастают с образованием до 32 клеток, при этом происходит мейоз. Дочерние клетки освобождаются через отверстие в оболочке материнской клетки [см. обзоры: Масюк, 1973; Dunaliella ..., 1992]. Таким образом, в отличие от Chlamydomonas Dunaliella не имеет специализированных клеток для бесполого (зооспоры, апланоспоры) и полового (гаметы) размножения. Отсутствуют также спорангии и гаметангии, цикл развития гаплобионтный.

- 37 -

3.4. ЭКОЛОГИЯ И ГЕОГРАФИЧЕСКОЕ РАСПРОСТРАНЕНИЕ

Небольшой по объему род Dunaliella, имеет широкую экологическую амплитуду. Виды этого рода обитают, как в водной среде (преимущественно), так и в наземных условиях - в почве (Dunaliella terricola), или на поверхности кристаллов NaCl на солончаках и солеразработках (D. salina, D. viridis, D. turcomanica). Виды, населяющие водные среды, приспособлены к разным условиям солености (от олиго- до гипергалинных) и к амплитуде рН от 1 до 11. Обитатели пресноводных водоемов: D. lateralis, D. paupera, D. obliqua, D. flagellata и D. acidophila - крайне редкие, эндемичные, реликтовые виды, встречающиеся большей частью единично и не играющие большой роли в природе. Род Dunaliella широко известен благодаря галобным, прежде всего гипергалобным видам, развивающимся в гипергалинных водоемах всего мира в массовом количестве и вызывающим красное и зеленое “цветение” рапы. Они принадлежат к числу тех немногочисленных видов, представленных большим числом особей, которые населяют крайние экологические ниши с экстремальными условиями существования. Гипергалобные виды Dunaliella - обитатели исключительно гетерогенной группы минерализованных водоемов, разнообразных по происхождению (морские и континентальные), характеру донных отложений (корневые и грязевые), степени обводненности (сухие и рапные), минерализации (миксогалинные, эвгалинные, гипергалинные), по химическому составу рапы (карбонатные, сульфатные, хлоридные, натриевые, хлормагниевые, поликальциевые, олигокальциевые, содовые и др.). Нередко одни и те же виды (чаще всего D. salina и D. viridis) обитают в соленых водоемах различных типов. Они распространены в причерноморских, приазовских и прикаспийских водоемах морского происхождения, в карстовых озерах Донецкой области, в континентальных сибирских озерах, соленых водоемах Карпат и Кавказа с родниковым питанием. Они обнаружены в пересыхающих крымских “засухах” и среднеазиатских “шорах”, на соляных горах солеразработок, нередко окрашенных в зеленоватый или розовый цвета, в естественных и искуственных солесадочных басейнах (солеварнях), в рапных озерах и лиманах [см. обзор: Масюк, 1973]. Типичные гипергалобы D. salina, D. viridis и др. в природных условиях развиваются при общей концентрации солей до 330 г/л, до 30-32° по Боме и при плотности рапы (d) до 1,285. Однако такие условия солености не являются оптимальными для данных видов, которые не принадлежат к числу стеногалобных организмов. Отсутствие массовых вегетаций этих видов в слабо минерализованных, миксо- и эвгалинных водоемах объясняется не их облигатной гипергалобностью, а, по всей вероятности, их низкой конкурентоспособностью в условиях водоемов с пониженой соленостью [Масюк, 1973]. Наблюдения в природе и экспериментальные данные свидетельствуют о широкой солевыносливости, как гипергалобов (D. salina, D. viridis, D. peircei, D. media D. minuta и др.), так и некоторых эвгалобов (например, D. tertiolecta), что позволяет отнести их к эвригалобным организмам [Масюк, 1973]. Галобные виды Dunaliella весьма толерантны к изменениям химического состава рапы, что объясняет возможность их вегетации в хлоридных озерах Эльтон и Баскунчак на Поволжье, в Мертвом море Израиля, в сульфатных водоемах Прикаспия, Средней Азии и Западной Сибири, калиевых сточных водах Калушского комбината Ивано-Франковской области, производственных бассейнах Крымского содового завода, натриевых, магниевых, поликальциевых и олигокальциевых водоемах всего мира [см. обзор: Масюк, 1973]. Благодаря способности к активному движению, клетки Dunaliella в природных бассейнах могут изменять свое местопребывание в процессе поисков оптимальных условий освещения, температуры и газового режима. В теплое время года, днем клетки гелиофильного вида D. salina обычно скапливаются у поверхности рапы, ночью опускаются в придонные слои. Зимой большинство вегетативных и покоящихся клеток Dunaliella пребывают на дне водоема, где аккумулируется наиболее концентрированная и теплоемкая рапа. Ранней весной именно в придонных слоях рапы начинается оживленная вегетация водорослей, окрашивающих их в зеленый или розовый цвета, в то время как поверхностные слои еще долгое - 38 -

время остаются прозрачными, неокрашенными. Летом, когда степень освещенности крымских водоемов достигает 100000 лк и более, наблюдается своеобразное распределение Dunaliella в толще рапы. Красные, богатые каротином клетки D. salina скапливаются у ее поверхности, а зеленые клетки этого вида и клетки некаротиноносных видов парят в более глубоких придонных слоях рапы. В Мертвом море вегетативные клетки D. viridis были обнаружены на глубине 50 м. В конце лета – начале осени в солесадочных бассейнах во время выпадения в осадок хлористого натрия значительная часть клеток Dunaliella осаждается на дно вместе с кристаллами солей [см. обзор: Масюк, 1973]. Сезонная динамика D. salina описана на примере испарительных бассейнов Сакского и СасыкСивашского солепромыслов в Крыму. В условиях этих водоемов вегетативные клетки этого вида наблюдались в рапе в подвижном состоянии в течение всего года при колебаниях температуры воздуха от 15° до +35 °С. Максимальная продукция биомассы приходилась на теплое время года (от поздней весны до поздней осени) и совпадала с красным “цветением” рапы. Зимой и ранней весной этот вид был представлен в рапе единичными зелеными клетками [Масюк, 1973]. В минерализованных водоемах разных типов в зависимости от степени минерализации, химического состава рапы и других факторов виды Dunaliella входят в состав разных биоценозов. Нередко в планктоне соленых и горькосоленых сульфатных и хлоридных водоемов (например, в солесадочных бассейнах на юге Украины и в Калифорнии) они доминируют в виде “монокультуры” одного-двух видов. Для планктона олигокальциевых хлоридных водоемов с соленостью 140-280‰ (например, оз. Эльтон) характерна ассоциация D. salina + Asteromonas gracilis Artari. Дно таких водоемов покрыто синезелеными водорослями. Для близких к биологической смерти хлор-магниевых крымских озер типа Перекопских и Сакского в его наиболее концентрированной части характерна ассоциация D. viridis + D. salina с разрастанием синезеленых водорослей на дне. В мелких пересыхающих лужах с перенасыщенными рассолами на солончаках Средней Азии обнаружена ассоциация D. asymmetrica + D. pseudosalina + D. turcomanica с примесью Pedinomonas tenuis Massjuk. На засухах и засоленных почвах Азербайджана и Средней Азии доминирует D. terricola. При уменьшении солености ниже 25°Bé разнообразие флористических комплексов увеличивается. К видам Dunaliella присоединяются Tetraptera halophila Razumov, Tetraselmis tetrathele (G.S. West) Butcher, Asteromonas gracilis, Carteria sp., Raciborskiella salina Wislouch., Chlamydomonas spp., Cryptomonas salina Wislouch, ряд видов синезеленых и диатомовых водорослей. Для некоторых водоемов с соленостью 16-25°Bé (Мойнакское озеро в Крыму, Артемовские соленые водоемы Донецкой области) характерен биоценоз D. viridis + Artemia salina с примесью диатомовых и синезеленых водорослей. Вода Карабогаза “кишит” бактериями и водорослями, среди которых массового развития достигает Aphanothece salina Elenk. et Danil., Dunaliella salina и D. viridis. В Антарктиде (пролив Мак-Мерфо) Dunaliella sp. вместе с видами диатомовых водорослей входила в состав доминантов флоры льда. С уменьшением солености и увеличением флористического богатства роль видов Dunaliella в биоценозах уменьшается [см. обзор: Масюк, 1973]. Род Dunaliella распространен на шести континентах земного шара, включая Антарктиду; каждый вид имеет свой характерный для него географический ареал. Более 50% всех видов составляют эндемики. Узкоэндемичный характер имеют все пресноводные виды, для каждого из них известно по одному местонахождению в центральной Европе (D. lateralis, D. paupera, D. obliqua, D. acidophila) или в Восточном Китае (D. flagellata). К числу эндемов следует отнести также большинство морских видов (норвежский эндем D. tertiolecta, английские – D. polymorpha, D. quartolecta и D. primolecta), а также ряд гипергалобных видов (калифорнийские эндемы D. peircei и D. media, австралийские – D. baas-beckingii, D. ruineniana и D. gracilis, туркменские – D. pseudosalina и D. turcomanica). В некоторых случаях (морские эндемичные виды) эндемизм может быть кажущимся, условным, в других - он может быть обусловлен разными причинами. Среди эндемов отмечены как палеоэндемы (главным образом пресноводные виды), так и неоэндемы (гипергалобные калифорнийские, австралийские и туркменские эндемы) [Масюк, 1973].

- 39 -

Наиболее широко распространены гипергалобные виды D. salina и D. viridis, обладающие наиболее высокоразвитым полиморфизмом; они относятся к ксеромеридиональному элементу с мультирегиональным типом ареалов. Эти виды найдены в Европе (Средиземноморье, побережье Черного, Азовского и Каспийского морей), Азии (степная зона Западной Сибири, Казахстан, Средняя Азия, Индия, Ява), Северной и Южной Америке (США: штаты Калифорния, Невада и Юта; Венесуэла, Бразилия, Чили), Северной Африке (Алжир, пустыня Сахара), Австралии. Повсюду, на всех континентах за исключением Антарктиды эти виды распространены в аридных зонах, т.е. в условиях, способствующих образованию водоемов с высокой степенью минерализации воды. К ксеромеридиональному элементу принадлежат и другие гипергалобные виды (D. parva, D. minuta, D. minutissima, D. jacobae) с евразийскоавстралийским типом ареалов, а также D. terricola и D. asymmetrica, имеющие более ограниченные ареалы евразийского типа. Всем гипергалобным видам Dunaliella свойственны прерывистые ареалы, обусловленные прерывистым распределением на поверхности Земли соленых водоемов. Обширные географические ареалы свидетельствуют о больших адаптационных возможностях видов в сочетании с их большой древностью. 3.5. ПОЛОЖЕНИЕ РОДА Dunaliella В СИСТЕМЕ ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ

В течение ХХ ст. взгляды на систематическое положение рода Dunaliella претерпели существенные изменения. Первоначально этот род был отнесен к семейству Polyblepharidaceae [Teodorescu, 1905], которое помещали в отдельный порядок Protococcales, объединявший зеленые водоросли монадной, коккоидной, пальмеллоидной и даже нитчатой структуры [Printz, 1927, цит. по: Масюк 1973]. Вест и Фритч [West, Fritsch, 1927; Fritsch, 1935, цит. по: Масюк 1973] впервые отнесли его к порядку Volvocales, объединявшему водоросли монадной и пальмеллоидной структуры. Пашер [Pascher, 1927, цит. по: Масюк 1973] впервые ограничил порядок Volvocales зелеными водорослями монадной организации. Первоначально считали [Dill, 1895, цит. по: Масюк 1973], что семейство Polyblepharidaceae объединяет наиболее примитивные, лишенные клеточных оболочек зеленые жгутиковые водоросли – ближайшие родственники гипотетических жгутиковых предков зеленых растений. Фритч [Fritsch, 1929, 1935, цит. по: Масюк 1973], наоборот, полагал, что лишенные клеточных оболочек зеленые жгутиконосцы являются вторично упрощенными, производными от хламидомонадовых. Пашер [Pascher, 1932, цит. по: Масюк 1973] впервые выдвинул гипотезу о параллелизме зеленых жгутиковых, покрытых клеточными оболочками и без них, впоследствии развитую Эттлом (Ettl, 1981, 1983, цит. по: Масюк 1973). Параллельно с пополнением семейства Polyblepharidaceae все новыми родами и разрастанием его объема кристаллизовалось убеждение 1) о его бóльшей отграниченности от других Volvocales и 2) о его гетерогенности. Это привело к повышению таксономического ранга полиблефаридовых водорослей до уровня подпорядка Polyblepharidineae [Huber-Pestalozzi, 1961, цит. по: Масюк 1973], порядка Polyblepharidales [Коршіков, 1938] или даже класса Protoblepharidineae [Skuja, 1948, 1964, цит. по: Масюк 1973]. Этот процесс завершился, наконец, расчленением полиблефаридовых sensu lato между двумя подклассами: Protochlorineae и Eu-Volvocineae [Коршіков, 1938] или тремя классами: Prasinophyceae, Loxophyceae и Chlorophyceae [Christensen, 1962, 1966, цит. по: Масюк 1973]. Поскольку семейство Polyblepharidaceae вместе с типовым родом Polyblepharides P.A. Dang. перешло в класс Prasinophyceae, а род Dunaliella, оставленный в пределах класса Chlorophyceae, сохраняет в нем достаточно обособленное положение, его помещают в отдельное семейство Dunaliellaceae T.A. Chr. [Christensen, 1962, цит. по: Масюк, 1973] и порядок Dunaliellales H. Ettl 1983. В понимании разных авторов [Ettl, 1983; Melkonian, 1990] объем этого порядка разный. Несомненным является ближайшее родство Dunaliella и Asteromonas Artari, что подтверждается данными молекулярной кладистики [Friedl, 1997; Proschold et al., 2001]. Таким образом, согласно современным представлениям, род Dunaliella Teod. относится к семейству Dunaliellaceae, порядку Dunaliellales, классу Chlorophyceae, отделу Chlorophyta царства Viridiplantae. - 40 -

3.6. ВНУТРИРОДОВАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ

На основании морфологоэкологического и физиологобиохимического критериев род Dunaliella разделяют на два подрода: Dunaliella и Pascheria Massjuk и четыре секции: Dunaliella, Tertiolectae Massjuk, Virides Massjuk и Peirceinae Massjuk [Масюк, 1973]. Ниже приводятся определьные таблицы для идентификации внутриродових таксонов в пределах рода Dunaliella. Таблица для определения подродов и секций рода Dunaliella І. Вегетативные клетки с пульсирующими вакуолями............................................................. ..Подрод 1. Pascheria. ІІ. Пульсирующие вакуоли в вегетативных клетках отсутствуют.......... ….Подрод 2. Dunaliella. 1. Вегетативные клетки всегда зеленые. Ростовой оптимум солености 2-4% (поли- и эвгалобные виды)................................................. ………………….Секция 1. Tertiolectae. 2. Вегетативные клетки способны в экстремальных условиях изменять зеленую окраску на бурую, оранжевую или кирпично-красную. Ростовой оптимум солености 6-12% (гипергалобные виды)..................................................................…Секция 2. Dunaliella. 3. Вегетативные клетки всегда зеленые. Ростовой оптимум солености 6-10% (гипергалобные виды) А. Клетки радиально-симметричные............................ ....………………………Секция 3. Virides. Б. Клетки билатерально-симметричные, дорзовентрально согнутые или слегка асимметричные.............................................................................….Секция 4. Peirceinae.

Таблица для определения видов подрода Pascheria І. Хлоропласт без пиреноида 1. Клетки радиально-симметричные, яйцевидные. Глазок отсутствует……………………..1. D. paupera. 2. Клетки радиально-симметричные, шаровидные. Глазок в передней четверти клетки....................................................................................................................................2. D. flagellata. 3. Клетки грушевидные, дорзовентрально-согнутые. Глазок вентральный, почти посередине клетки. ................................................................................................................3. D. obliqua. ІІ. Хлоропласт с пиреноидом. 1. Клетки веретеновидные, дуговидно согнутые. Пиреноид базальный...........................................................................................................4. D. acidophila. 2. Клетки яйцевидные или эллипсоидные. Пиреноид латеральный………………………....5. D. lateralis. Таблица для определения видов подрода Dunaliella I. Секция Tertiolectae 1. Цитоплазма без гранул. Хлоропласт на переднем крае фрагментирован..................…6. D. maritima. 2. Гранулы в цитоплазме присутствуют. Хлоропласт не фрагментирован. А. Мелкие бесцветные светопреломляющие гранулы рассеяны по всей цитоплазме.................................................................................................................7. D. tertiolecta. Б. Гранулы локализированы в определенных частях клетки а. Многочисленые темные неправильной формы гранулы в виде плотной линейной или U-образной зоны в передней части к…….......................... .8. D. polymorpha. б. 4-6 больших сферических гранул на дне вырезки хлоропласта................... .9. D. primolecta. в. 3-10 мелких светопреломляющих гранул в апикальной части клетки................................................................................................................10. D. quartolecta. II. Секция Dunaliella

1. Стигма диффузная, плохо заметная .................................................................................. ..11. D. salina. 2. Стигма с отчетливаыми контурами, хорошо заметная. А. Стигма маленькая, эллипсоидная .....................................................................................12. D. parva. Б. Стигма крупная, палочковидная ...........................................................................13. D. pseudosalina. - 41 -

III. Секция Virides І. Клетки с двумя стигмами................................................................................................................14. D. bioculata. ІІ. Клетки с одной стигмой 1. Хлоропласт тонкий, перфорированный..........................................................................15. D. carpatica. 2. Хлоропласт массивный, на переднем крае фрагментированный.................................16. D. granulata. 3. Хлоропласт не перфорированный и не фрагментированный А. Клетки шаровидные.................................................................................................17. D. minutissima. Б. Клетки эллипсоидные или грушевидные, с расширенным задним концом ..............................................................................................................................................18. D. viridis. В. Клетки цилиндрические а. Длина клетки до 13 мкм.................................................................................................19. D. minuta. б. Длина клетки 16-20 мкм.....................................................................................20. D. baas-beckingii. Г. Клетки расширены посередине, спереди и сзади сужены а. Длина клетки 24-28 мкм, ширина 12 мкм..............................................................21. D. ruineniana. б. Длина клетки 32-40 мкм, ширина 4-5 мкм...... ............................................................22. D. gracilis. Д. Клетки расширены спереди, сзади сужены а. Задний конец клетки постепенно сужен и закруглен. Длина клетки 3-13 мкм .......................................................................................................................................23. D. terricola. б. Задний конец клетки резко сужен и оттянут. Длина клетки 10-20 мкм ...........................................................................................................................................24. D. media. IV. Секция Peirceinae 1. Клетки плоские. билатерально-симметричные А. Клетки уплощенные только на переднем конце. Длина клетки 4-13 мкм ...................................................................................................................................25. D. turcomanica. Б. Клетки уплощены по всей длине. Длина клетки 7-25 мкм ……………………….... 26. D. peircei. 2. Клетки дорзовентральные или слегка асимметричные А. Стигма маленькая. Жгутики гетеродинамичные .......................................................27. D. jacobae. Б. Стигма большая. Жгутики гомодинамичные.......................................................28. D. asymmetrica. Таблица для определения внутривидовых таксонов Dunaliella salina І. Клетки яйцевидные, широко эллипсоидные или почти цилиндрические, спереди суженные. ..............................................................................................................................................Ssp. salina. 1. Клетки до 29 мкм длиной и до 21 мкм шириной.... ...............................................................F. magna. 2. Клетки меньших размеров А. Клетки яйцевидные или широко эллипсоидные.................................................................F. salina. В. Клетки цилиндрические ......................................................................................................F. oblonga. ІІ. Клетки обратнояйцевидные, иногда расширенные посередине.....................................................Ssp. sibirica. Таблица для определения внутривидовых таксонов Dunaliella viridis І. В цикле развития преобладает пальмеллевидная стадия ........................................................Var. palmelloides. ІІ. В цикле развития преобладает монадная стадия ..............................................................................Var. viridis. 1. Клетки грушевидные. Средний объем клеток превышает 200 мкм3 ……………………....F. viridis. 2. Клетки эллипсоидные. Средний объем клеток менее 200 мкм3.........................................F. euchlora.

- 42 -

ГЛАВА 4 ИССЛЕДОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВ ФОТОДВИЖЕНИЯ DUNALIELLA 4.1. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Характеристика водорослей. Объектами исследований были альгологически чистые культуры двух видов Dunaliella Teod.: D. salina Teod., штамм № 10 и D. viridis Teod., штамм № 42 из коллекции Института ботаники им. Н.Г. Холодного НАН Украины [Масюк, Терещук, 1983]. Наиболее полные сведения о роде Dunaliella можно найти в монографии Н.П. Масюк (1973), где представлена обширная библиография по разным направлениям исследований этого рода (см. также гл. 3 в настоящем издании). Характерной особенностью Dunaliella spp. по сравнению с другими зелеными жгутиковыми, фотодвижение которых изучали до настоящего времени, является отсутствие клеточной стенки; клетки окружены лишь тонкой бесцветной цитоплазматической мембраной (плазмалеммой), покрытой снаружи нерегулярным слоем гликопротеидной природы [Melkonian, Preisig, 1984]. В связи с отсутствием плотных клеточных покровов форма клеток может изменяться в процессе движения (см. рис. 3.1). На переднем конце клетки находятся два изоконтных, изоморфных и изодинамических жгутика, совершающих одновременные плавные веслообразные движения. Они вызывают поступательное и одновременно вращательное движения клеток. Базальные тела жгутиков у видов Dunaliella связаны дистальным поперечнополосатым соединительным волокном. Предполагается, что функция его сводится к координации биений жгутиков (см. рис. 3.7) [Melkonian, Preisig, 1984]. От базальных тел жгутиков Dunaliella spp. отходит система жгутиковых корешков (4-2-4-2), выполняющих функции цитоскелета, равномерно распределяющего по всей клетке напряжение, вызванное биением жгутиков [Melkonian, Preisig, 1984]. Существует гипотеза, согласно которой жгутиковые корешки определяют расположение клеточных органелл, например стигмы, относительно жгутикового аппарата [Melkonian, 1978]. Стигма (глазок) находится в передней трети клетки. Она является частью хлоропласта и расположена у его верхней боковой поверхности. У D. viridis стигма всегда хорошо заметна, крупная, выпуклая, с отчетливыми контурами, яркокрасная; у D. salina стигма слабо окрашена, бледнорозового цвета, с неотчетливыми контурами. Исследуемые виды Dunaliella различаются по форме и размерам клеток (см. табл. 3.1, см. рис. 3.4, 2 и 3.5, 1, фото 1). Длина жгутиков у D. salina примерно равна длине клетки, у D. viridis превышает ее в 1,3 раза. Культивирование. Используемые в экспериментах водоросли выращивали на основной питательной среде, содержащей соли (в г/л): NaCl - 116; MgSO4×7H2O - 50; KNO3 - 2,5; K2HPO4 - 0,2. Плотность среды при таком наборе солей составляла 1,1 г/см3; рН 6-7 (рН регулировали с помощью концентрированной щелочи) [Масюк, 1973]. Температура воздуха при выращивании составляла 21 ± 1 0С. В экспериментах изучали культуры 3-6-дневного возраста. 4.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПАРАМЕТРОВ ФОТОДВИЖЕНИЯ DUNALIELLA 4.2.1. Экспериментальная установка

Фотодвижение Dunaliella исследовали на созданной с этой целью экспериментальной системе видеомикрографии, в которой микроскоп был соединен с видеокамерой и монитором (рис. 4.1, фото 2). Излучение источника 1 белого света (лампа накаливания мощностью 300 Вт) формировали в параллельный пучок света с помощью коллиматора 2. Затем пучок света пропускали через стеклянный 3 и жидкостный 4 инфракрасные фильтры, а при необходимости регистрации световых кривых - также через интерференционный фильтр 5. После этого свет под углом 30° направляли на плоскость предметного стекла с нанесённой на него суспензией водорослей, которое находилось на предметном столике 6 микроскопа 12. При исследовании спектральных зависимостей фототопотаксиса использовали галогенную лампу 7 (типа КГ - 43 -

24 х 250), излучение которой пропускали через монохроматор 8 (типа УМ-2). Действие поляризованного света изучали, используя источник света 9, конденсор 10, поляризатор 11. Параметры фотодвижения оценивали с помощью системы регистрации, состоящей из видеокамеры 13, блока сопряжения 14 и монитора 15 (см. рис. 4.1). Интенсивность света фиксировали с помощью измерителя мощности ИМО-2, освещенность образца определяли люксметром Ю-116.

Фото 2. Внешний вид экспериметальной системы видеомикрографии, предназначенной для исследования фотодвижения клеток Dunaliella (разработка авторов).

Рис.4.1. Схема системы видеомикрографии для исследования фотодвижения водорослей: 1 – источник белого света; 2 – коллиматор; 3-стеклянный инфракрасный фильтр; 4 жидкостный инфракрасный фильтр; 5- интерференционный фильтр; 6 – образец напредмет номстолике микроскопа; 7 - галогенная лампа; 8 – монохроматор; 9 – источник света; 10 – конденсор; 11 – поляризатор; 12 – микроскоп; 13 – видеокамера; 14 – блок сопряжения; 15 - монитор [Posudin et al., 1992].

4.2.2. Измерение скорости движения клеток водорослей

Скорость движения отдельных клеток оценивали путем фиксирования с помощью секундомера времени прохождения ими определенного (142 мкм) расстояния на калибровочной сетке, отображенной на экране и отградуированной с помощью объект микрометра. Каждая точка на графиках зависимости скорости движения клеток от какого-либо параметра светового стимула представляет собой результат усреднения нескольких (от 10 и более) измерений скорости движения разных клеток для одного образца суспензии. При изменении интересующего нас параметра светового стимула использовали свежий образец культуры, находящейся в стандартных условиях. Таким образом, точки на графиках представляют собой средние значения скорости поступательного движения клеток (n ³ 10), а разноски по оси ординат среднеквадратические отклонения. Воспроизводимость результатов измерений скорости движения клеток при данных условиях опыта составляла около 98,5 %. Фотокинетической реакцией клеток на изменение интенсивности света следует считать (в относительных единицах) величину R1 = (V1 - V0)/V0, где V1 и V0 скорости движения клеток при данной и минимальной (< 1 Вт/м2) интенсивности света соответственно [Посудин и др., 1988].

- 44 -

4.2.3. Измерение фототопотаксиса

Траектории движения клеток наносили на полиэтиленовую пленку, размещенную на экране телевизора. Траекторию движения каждой клетки оценивали с помощью вектора, длина которого равна расстоянию, которое в среднем проходила клетка на протяжении 1 с, а направление образовывало с проекцией направления распространения света в площади предметного стекла определенный угол. Все зафиксированные на протяжении 5 мин после включения света векторы распределяли в 12 секторах полярной диаграммы, координатами которой были угол aі , образованный центральной осью каждого сектора с проекцией направления стимулирующего света на плоскость предметного стекла и количество клеток Ni, размещенных в каждом секторе (рис. 4.2) [Посудін та ін., 1991]. Статистический анализ регистрируемого таким образом углового распределения клеток проводили с помощью теста Релея, V-теста, c2-критерия и метода моментов [Mardia, 1972; Batschelet, 1981; Häder et al., 1981]. Количественную оценку углового распределения клеток, двигающихся под воздействием светового стимула, оценивали с помощью r вектора R , компоненты которого представляют собою средние значения сумм синусов и косинусов измеряемых углов aі :

1 N

å sin a

i

;

1 N

å cos a

i

,

где N – число исследуемых клеток. Этот вектор характеризуется величиной r и направлением q, которые определяются [Mardia, 1972] по формуле:

æ å sin a i r= ç ç N è

å cos a i 2 2 arccos ö æ å cos a i ö N ÷ +ç ÷ ; q= . ( 4.1 ) ÷ ç ÷ N R ø è ø

Метод, основанный на сравнении величины z = Nr2 с табличным значением zr, называется тестом Релея; этот тест позволяет оценить существенность отличия наблюдаемого углового распределения клеток от изотропного распределения. V-тест предусматривает оценку величины

V=

2 Nrcos(q - q0): N

при V > 0 фототопотаксис – положительный; при V < 0 – отрицательный. Возможность определения знака фототопотаксиса является преимуществом метода. Для оценки относительного количества клеток, которые двигаются в заданном направлении под действием бокового света, полярную диаграмму разбивали на три группы. В первую входили клетки, которые двигались в направлении распространения стимулирующего света (в границах сектора 60°), во вторую – клетки, которые двигались в противоположном направлении (в том же секторе), в третью – клетки, которые двигались во всех других направлениях. При изотропном распределении относительное количество клеток, которые двигаются в упомянутых трёх направлениях, составляла бы соответственно 25, 25, и 50 %. Степень отклонения фактического распределения клеток от изотропного, т.е. относительное количество клеток, которые двигаются в заданном направлении, оценивали с помощью критерия c2 [Рокицкий, 1973; Batschelet, 1981].

- 45 -

Рис.4.2. Геометрия взаимодействия света, направленного под углом 30° к плоскости предметного стекла, с клетками водорослей, которые размещены на нем: N1 – количество клеток, зарегистрированных в i-том секторе; ai– угол, образованный центральной осью данного сектора с проекцией направлении распространения света на плоскости предметного стекла.

Поскольку при неизменной интенсивности освещенности разные клетки обоих исследуемых видов Dunaliella способны одновременно двигаться в двух направлениях (к источнику света и от него), для оценки степени бимодальности такого распределения, тоесть относительного количества клеток, которые двигаются во взаимно противоположных направлениях, использовали метод моментов [Mardia, 1972]. Суть метода заключается в оценке относительного числа m клеток, двигающихся по направлению к источнику света или от него. Величина m определяется из уравнения [Mardia, 1972]: (2 m - 1)А(К) = С cos l 0 S sin l 0 ( 4.2 ) , где А(К) – табличная величина [Mardia, 1972];

C =

1 N

å cosa ; i

S =

1 N

å sin a ; l i

0

=

1 arctg ( S / C ) . 2

Спектр действия фототопотаксиса количественно определяли с помощью параметра F(l), характеризующего относительное число клеток, способных ориентироваться относительно направления распространения стимулирующего света, т.е. двигаться к источнику света или в противоположном направлении. Этот параметр определяется как F(l) = R(l) ¤ N(l), где R(l) = (n¯ - n­)/(n¯ + n­), где n¯ и n­ число клеток, которые двигаются к источнику света или от него на протяжении 5 минут с момента включения источника света (в границах сектора 60°) [Häder et al., 1981]; N(l) - число квантов стимулирующего света, которые попадают на препарат, причем N(l) ~ I×l, где I - интенсивность стимулирующего света, l - длина световой волны. Определению спектра действия фототопотаксиса предшествовало установление зависимости параметра F от интенсивности стимулирующего света для разной длины волны и определение интервала, в границах которого эта зависимость имеет линейный характер. В наших исследованиях этот интервал не превышал 1 Вт¤м2. 4.2.4. Фурье-преобразование углового распределения клеток При построении гистограмм углового распределения движущихся в ответ на световой стимул микроорганизмов

приходится

сталкиваться

со

следующим

обстоятельством.

Помимо

клеток,

демонстрирующих собственно ориентацию относительно направления распространения стимулирующего света, вклад в угловое распределение вносят и те клетки, которые движутся по случайным законам (например, за счет рассеянного света, столкновений и т.д.), создавая на фоне распределения своеобразный «шум». Избавиться от этого «шума» можно с помощью Фурье-анализа углового распределения движущихся микроорганизмов [Emerson, 1980; Zimmermann, 1981; Häder, 1986a; Häder, Lipson, 1986; Häder, Grienbow, 1987]. Суть данного метода сводится к построению углового распределения клеток; реализации быстрого Фурьепреобразования, предусматривающего разложение сложного сигнала в набор гармоник, образующих - 46 -

дискретный спектр в зависимости от частоты; осуществлению процедуры сглаживания, в результате которой в спектре остаются гармоники с низкой частотой (или с большей амплитудой); проведению обратного преобразования (Фурье-синтеза), с помощью которого можно построить избавленное от «шумов» угловое распределение и оценить истинные тенденции в движении микроорганизмов. В этих опытах траектории движущихся клеток отмечали на полиэтиленовой пленке, расположенной на экране телевизора. Все поле зрения микроскопа при этом было разделено на 48 секторов по 7,5° каждый; траектория каждой клетки заносилась, в зависимости от угла, который она составляла с направлением распространения стимулирующего света, в соответствующий сектор. Совокупность числа таких траекторий представляет

собой

реальное

угловое

распределение

клеток,

сопровождающееся

случайными

погрешностями измерений («шумами»), затрудняющими анализ полученных результатов и выявление закономерностей движения клеток.

Затем

реальное распределение клеток подвергалось Фурье-

преобразованию. Основной вклад в угловое распределение клеток вносят гармоники первых порядков, тогда как гармоники более высоких порядков обусловливают «шумы». Отсюда вытекает необходимость в обратном Фурье-преобразовании данных, полученных

после удаления гармоник высших порядков

[Посудин и др., 1991]. Число гармоник N, которыми мы ограничивались в процессе Фурье-преобразования, составляет 7; при меньших значениях N гистограмма слишком огрубляется, при больших значениях - резко возрастает влияние «шумов», которые искажают форму гистограммы [Посудін та ін., 1991]. 4.3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗМЕРЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ ФОТОДВИЖЕНИЯ DUNALIELLA 4.3.1. Фотокинез и фотокинетические реакции

Целью данного этапа исследований являлось экспериментальное изучение фотокинеза и фотокинетических реакций двух видов Dunaliella, проявляющихся в средней скорости поступательного и вращательного движения клеток и их зависимости от изменения характеристик светового стимула. Зависимость средних значений скорости поступательного движения клеток исследуемых видов Dunaliella от интенсивности белого света представлена на рис. 4.3. Максимальные значения средних скоростей поступательного движения при температуре 20 0С, составляющие (48 ± 2) мкм/с для D. salina и (36 ± 2) мкм/с для D. viridis, достигались в интервале освещенностей образца 150-550 лк, что соответствует интенсивности света 0,3-0,7 Вт/м2 [Посудин и др., 1988]. Установлено, что дальнейшее увеличение освещенности приводит к уменьшению поступательной скорости. Эти результаты близки к аналогичным величинам, зарегистрированным для Euglena gracilis (оптимальная освещенность, вызывающая максимальную скорость движения клеток E. gracilis, - 300 лк) [Wolken, Shin, 1958], но существенно ниже оптимальной освещенности в случае фотокинеза Anabaena variabilis (1000 лк) [Nultsch,1975]. В целом скорость движения клеток обоих видов Dunaliella на один-два порядка выше скорости движения синезеленых и красных водорослей [Nultsch, 1980], не обладающих жгутиковым аппаратом, но несколько ниже, чем у Chlamydomonas reinhardtii [Racey et al., 1981] и E. gracilis [Bovee, 1968; Haupt, 1959]. Вместе с тем, следует отметить, что жгутиковые эукариотические водоросли движутся со скоростью того же порядка, что и жгутиконосные бактерии, обладающие иным типом строения жгутиков [Громов, 1985] и использующие в процессе движения иной источник энергии [Евтодиенко, 1985] (табл. 4.1).

- 47 -

Таблица 4.1 . Скорость поступательного движения клеток некоторых микроорганизмов

Таксон

Скорость движения клеток, мкм/с

Литература

Porphyridium cruentum

0,05

Nultsch, 1980

Anabaena variabilis

0,5

“

Dictyostelium discoideum

0,1

“

Micrasterias denticulata

1,0

“

Pinnularia nobilis

2,8

“

Nitzschia palea

6,0

“

Navіcula peregrina

18,0

“

Dunaliella salina

48±2

Посудин и др., 1988

Dunaliella vіridis

36±2

“

Chlamydomonas sp.

200,0

Racey et al., 1981

Euglena gracilis

160

Wolken, Shin, 1958

Euglena gracilis

84

Bovee, 1968

Euglena rubra

20

“

Thiospirillum jenense

87

“

Chromatium okenii

46

“

Pseudomonas aeruginosa

56

“

Escherichia coli

16

“

Bacillus licheniformis

21

“

Sporosarcina urea

28

“

Нами обнаружено, что скорость движения клеток при постоянной интенсивности света не изменяется существенно в процессе измерений, которые составляли несколько минут для данного образца; в то же время клетки достаточно быстро реагируют на любое изменение интенсивности стимулирующего света. Фотокинетические реакции обоих видов на изменение интенсивности белого света идентичны (см. рис. 4.3). Нами не обнаружены также статистически достоверные изменения скорости поступательного движения клеток обоих видов при воздействии на них поляризованного света по сравнению с белым неполяризованным светом той же интенсивности (см. рис. 4.3), что свидетельствует о некристаллической недихроичной природе фоторецепторов у этих видов. Зависимость скорости поступательного движения двух видов Dunaliella от длины волны стимулирующего света нами не установлена; в отношении других водорослей имеются противоречивые данные: одни авторы [Ascoli, 1975; Häder, Häder, 1989b] объясняют такую зависимость участием фотосинтетических пигментов в фотокинетической реакции Euglena gracilis (хлорофилла b и/или bкаротина), хотя против этой гипотезы свидетельствует демонстрация позитивной фотокинетической реакции Astasia longa – водоросли, у которой отсутствует фотосинтетический аппарат [Mast, 1911]; другие авторы сообщают о сильном влиянии синего света на фотокинетические реакции E. gracilis [Diehn, 1973].

- 48 -

Рис. 4.3. Зависимость средних значений скорости поступательного движения Dunaliella salina(1)и D. viridis (2) от интенсивности белого неполяризованного (сплошные разноски) и поляризованного (штриховые разноски) света и фотокинетические реакции R(I) обоих видов (3) на изменение интенсивности белого света. По оси ординат: слева – скорость поступательного движения клеток, справа – фотокинетическая реакция. По оси абсцисс – интенсивность света I, освещенность образца Е и изменение интенсивности света DI [Посудин и др., 1988].

Противоречивыми остаются на сегодняшний день и данные о фотокинетических реакциях Chlamydomonas reinhardtii – согласно данным одних авторов [Feinleib, Carry, 1967] у этой водоросли отсутствуют фотокинетические

реакции,

тогда

как

в

других

исследованиях

обнаружена

положительная

фотокинетическая реакция Chlamydomonas после длительной темновой адаптации [Nultsch, Throm, 1975]. До сих пор остается невыясненным, с какими фоторецепторами связаны фотокинетические реакции Euglena gracilis и Chlamydomonas reinhardtii – фотосинтетическими (как это имеет место у прокариот [Häder, 1979а]) или специализированными рецепторами синего света. Количественные оценки скорости вращательного движения клеток двух видов Dunaliella вокруг собственной продольной оси свидетельствует о том, что максимальные значения этого параметра составляли 0,52±0,04 об/с для D. salina и 0,54±0,04 об/с для D. viridis, которые наблюдались в области освещенности 150-550 лк (рис. 4.4). Клетки Dunaliella могут вращаться не только вокруг своей продольной оси, но двигаться по спиральной траектории.

Рис. 4.4 Зависимость скоростивращательного движения n клеток Dunaliella viridis (-·-) и D. Salina (o -) от освещенности Е образца белым светом/

- 49 -

4.3.2. Фототопотаксис

Целью исследований было установление количественных характеристик фототопотаксиса двух видов Dunaliella в зависимости от интенсивности и спектрального состава светового стимула с применением различных статистических методов оценки экспериментальных данных. Результаты статистической обработки данных измерений углового распределения подвижных клеток двух видов рода Dunaliella при разной (в диапазоне 0-40 000 лк) освещенности (рис. 4.5) представлены в табл. 4.2. и 4.3, где НС отклонение от изотропного распределения клеток несущественно; С - отклонение от изотропного распределения клеток существенно. Согласно с тестом Релея, существенные отклонения углового распределения клеток обоих видов от изотропного имеют место при освещенности 500 лк и 40000 лк, а для D. viridis - еще и при 30 лк (уровень значимости составлял Р = 0,05). Подобные результаты получены также с помощью V-теста, который, однако, позволил повысить степень вероятности анизотропного распределения клеток для D. viridis (освещенность 30 лк, Р = 0,01, табл. 4.3) и выявить его для другого вида - D. salina (освещенность 30 лк, Р = 0,05, табл. 4.2). Спектр действия фототопотаксиса F(l) исследуемых видов Dunaliella находится в пределах 400-520 нм и имеет два максимума - при длине световой волны 410-415 нм и при 465-475 (рис. 4.6) [Посудін та ін., 1991]. Форма спектра действия фототопотаксиса для D.salina и D.viridis идентична. В этих же границах (400-520 нм) находится спектр действия фототопотаксиса D.salina, наблюдавшийся в работе других авторов [Wayne et al., 1991]. Отмеченное в последней работе расположение максимумов при 460 нм и 520 нм можно объяснить использованием в качестве объекта исследования другого штамма этого вида [Wayne et al., 1991]).

Рис. 4.5. Диаграмма углового распределения подвижных клеток Dunaliella salina (зеленая форма) (а) и D. viridis (б) при разных освещенностях образца (стрелка указывает направление распространения стимулирующего света) [Посудін та ін., 1991].

- 50 -

Рис. 4.6. Спектр действия фототопотаксиса двух видов Dunaliella Teod. По оси абсцисс – длина световой волны, нм; по оси ординат – параметр F(l), отн. ед. [Посудін та ін., 1991].

Таким образом, проведенные нами эксперименты позволили выяснить зависимость характера углового распределения подвижных клеток двух видов Dunaliella под влиянием бокового стимулирующего света от интенсивности освещенности в диапазоне 0-40 000 лк (рН 6-7, температура 21 0С). Позитивный фототопотаксис обоих видов наблюдался при освещенности 30 лк и 500 лк. Более высокая степень освещенности вызывала более интенсивный фототопотаксис. D. viridis оказалась более чувствительной к низкому уровню освещенности (30 лк), чем D. salina. При 1 500 лк у обоих видов наблюдался переход от позитивного к негативному фототопотаксису, при 40000 лк оба вида в условиях лабораторной культуры проявляли негативный фототопотаксис. Интересно сравнить полученные нами экспериментальные данные по зависимости фототопотаксиса двух видов Dunaliella от уровня освещенности исследуемых образцов с литературными данными относительно других видов подвижных водорослей. Максимум фототопотаксиса Ochromonas danica наблюдался при освещенности 1,25 лк [Häder et al., 1981], Euglena gracilis - 50 лк [Häder et al., 1981], Phormidium ambiguum – 50-200 лк [Nultsch, 1962], Nitzschia communis - 200 лк [Nultsch, 1971], Chlamydomonas reinhardtii – 500-1000 лк [Feinleib, 1977; Nultsch et al., 1971]. Переход от позитивного к негативному фототопотаксису у O. danica имел место при освещенности 12,5 лк [Häder et al., 1981], у E. gracilis – при 250 лк [Häder et al., 1981], у Ph. ambiguum – 1000-10000 лк [Nultsch, 1971], у Micrasterias denticulata – 4000 лк [Neuscheler, 1967], а у Ch. reinhardtii – при 100000 лк [Nultsch et al., 1971]. Итак, полученные нами характеристики фототопотаксиса клеток лабораторных популяций Dunaliella salina и D. viridis находятся в границах, установленных и для других водорослей. Среди них наибольшей фоточувствительностью отличается золотистая водоросль O. danica, наибольшей фотовыносливостью – зеленая водоросль Ch. reinhardtii. Близкими к последнему виду по высокой степени фотовыносливости выступают природные популяции D. salina (так называемая «красная форма», клетки которой богаты каротином и глицерином) [Масюк, 1973]. Таблица 4.2.

Результаты статистической обработки различными методами экспериментальных данных,

касающихся зависимости углового распределения подвижных клеток Dunaliella salina от уровня освещенности образца боковым стимулирующим светом (рН 6–7, температура 21 0С). Здесь и в табл. 4.3 N – число наблюдаемых клеток Е, лк Параметры оценки фототопотаксиса

1

0

30

500

40000

N 105

112

144

104

591

2

3

4

5

6

Тест Релея Параметры вектора

- 51 -

1500

r R:

угол q (градусы)

-

171

190

174

251

длина, r (отн.ед.)

0,09

0,12

0,27

0,08

0,27

0,75

44,56

Значение параметра z=Nr2: фактическое

0,85

1,59

10,73 табличное:

при Р = 0,05

2,95

при Р = 0,01

4,57 Степень вероятности:

для Р = 0,05

НС

НС

С

НС

С

для Р = 0,01

НС

НС

С

НС

С

1

2

3

4

5

6

V-тест Значения параметра V: фактическое

-1,30

1,78

+4,63

+1,22

-8,51

табличное: для Р = 0,05

1,64

для Р = 0,01

2,32 Степень вероятности:

для Р = 0,05

НС

НС

С

НС

С

для Р = 0,01

НС

НС

С

НС

С

1,83

16,5

c -критерий 2

Значения c2(число степеней свободы n=2): фактическое

3,73

4,59

18,75 табличное:

для Р = 0,05

5,99

для Р = 0,01

9,21 Степень вероятности:

для Р=0,05

НС

НС

С

НС

С

для Р=0,01

НС

НС

С

НС

С

Метод моментов Значения параметр m

0,50

0,63

0,76

0,60

0,71

Сопоставление результатов двух тестов (Релея и V-теста) для двух исследуемых видов рода Dunaliella дает возможность сделать вывод, что в условиях лабораторного эксперимента D. viridis начинает проявлять способность к фотоориентации при более низких уровнях освещенности (30 лк), чем D. salina, что согласуется с нашими наблюдениями в природе [Масюк, 1973]. Преимуществом V-теста является то, что он позволяет отличить позитивный фототопотаксис (V > 0) от негативного [Mardia, 1972; Häder et al., 1981]. Итак, согласно V-тесту, оба исследуемые вида Dunaliella при освещенности 30 и 500 лк проявляют позитивный, а при освещенности 40000 лк – негативный (см. рис. 4.5, табл. 4.2, 4.3) фототопотаксис. Изотропность углового распределения клеток при освещенности 1500 лк можно объяснить переходом части клеток к негативному фототопотаксису, причем количество клеток, двигающихся в направлении к источнику света и от него, приблизительно одинаково. - 52 -

Таблица 4.3. Результаты статистической обработки различными методами экспериментальных данных, касающихся зависимости углового распределения подвижных клеток Dunaliella viridis от уровня освещенности образца боковым стимулирующим светом (рН 6–7, температура 21 0С)

Параметры оценки фототопотаксиса 1

0

30

500

105

112

144

2

3

Е, лк 1500 N 104

4

Тест Релея Параметры вектора угол q (градусы)

-

140

147

длина, r (отн.ед.)

0,10

0,15

0,24

40000 591

5

6

82

441

0,15

0,19

2,88

2,18

r R:

2

Значение параметра z = Nr : фактическое

1,11

3,01

9,12 табличное:

при Р = 0,05

2,99

при Р = 0,01

4,57 Степень вероятности:

для Р = 0,05

НС

НС

С

НС

С

для Р = 0,01

НС

НС

С

НС

С

V-тест Значенияпараметра V: фактическое

+1,49

+2,46

-0,74

+4,27

-4,82

табличное: для Р = 0,05

1,64

для Р = 0,01

2,32 Степень вероятности:

для Р = 0,05

НС

С

для Р = 0,01

НС

С

С

НС

С

С

НС

С

c -критерий 2

Значения c (число степеней свободы n = 2): 2

фактическое 1

8,38 2

4,82 3

12,25

3,26

4

13,95

5

6

табличное: для Р = 0,05

5,99

для Р = 0,01

9,21 Степень вероятности:

для Р = 0,05

НС

НС

С

НС

С

для Р = 0,01

НС

НС

С

НС

С

Метод моментов Значения параметра

m

0,50

0,63

0,68

0,38

0,67

Следует отметить, что в условиях природных гипергалинных водоемов юга Украины, где интенсивность освещенности на поверхности рапы достигает 100000 лк и выше, постоянные их обитатели – - 53 -

исследуемые нами виды Dunaliella – ведут себя по-разному: зеленые клетки D. viridis сосредотачиваются в более затененных придонных слоях рапы, а красные клетки D. salina – собираются на ее поверхности, которая освещена наиболее ярко [Масюк,1973]. Правда, природные и исследуемые нами лабораторные популяции D.salina отличаются окраской клеток (соответственно, красной и зеленой). Очевидно, накопление каротина и глицерина вегетативными клетками D. salina в природных условиях значительно повышает толерантность этого вида к яркому освещению. В природных популяциях D. salina не наблюдался переход от позитивного к негативному фототопотаксису даже при уровне освещенности, который в 100 раз превышал установленный нами в лабораторных исследованиях порог этого перехода [Масюк, 1973]. Возможно, уникальное поведение красных клеток D. salina объясняется не только фототолерантностью в связи с гиперсинтезом каротина, но и способностью клеток этого вида накапливать значительное количество глицерина [Ben-Amotz et al., 1982а; Enhuber, Gilmmer, 1980; Wegmann, 1979], что повышает их плавучесть и, возможно, как и каротин, играет защитную роль. Механизмы, которые обуславливают особенности фотоповедения красных клеток D. salina в природных водоемах, еще требуют специальных исследований. Применение критерия c2 (табл. 4.2 и 4.3) в общем подтверждает выводы, сделанные на основании использования двух предыдущих тестов: существенное отклонение фактического распределения подвижных клеток обоих видов Dunaliella под влиянием бокового освещения от изотропного наблюдается при освещенности 500 и 40000 лк. Вместе с этим такой подход позволяет получать дополнительную информацию и с высокой степенью вероятности (Р = 0,05 для D. salina и Р = 0,01 для D. viridis) оценить относительное количество клеток, двигающихся в заданном стимулирующим светом направлении. Дополнительную информацию также можно получить, применяя метод моментов, который позволяет оценить бимодальность углового распределения подвижных клеток видов Dunaliella под влиянием бокового стимулирующего света, т.е. определить относительное число клеток водорослей, которые двигаются в противоположных направлениях: к источнику света и от него. Результаты применения этого метода также подтверждают выводы, сделанные на основании трех предыдущих тестов: максимальные значения параметра µ, которые характеризуют относительное число клеток, двигающихся в противоположных направлениях, соответствуют уровням освещенности 500 и 40000 лк (табл. 4.2, 4.3). Таким образом, применение вышеупомянутых статистических методов оценки полученных нами экспериментальных данных позволило с высокой долей достоверности определить основные доминирующие направления в процессе фототопотаксиса Dunaliella, степень анизотропности углового распределения клеток при боковой освещенности образца (тест Релея), знак фототопотаксиса (V-тест), а также оценить относительное количество клеток, которые двигаются в заданном направлении (c2 критерий) и дать количественную оценку бимодальности углового распределения клеток (метод моментов). В целом, для полной характеристики углового распределения подвижных клеток целесообразно использовать совокупность всех перечисленных выше статистических методов, которые дополняют друг друга. Наличие некоторых различий параметров фотодвижения двух видов Dunaliella в зависимости от внешних условий дает возможность использовать эти параметры для выявления экологического своеобразия этих видов, что представляет интерес для их аутэкологии, таксономии и может найти применение в практике. 4.3.3. Результаты Фурье-преобразования углового распределения клеток Dunaliella

Процедура Фурье-преобразования углового распределения клеток D. salina для различных уровней освещенности образца дает возможность разложить полученные из реальных гистограмм данные в дискретный набор гармоник, характеризующихся амплитудами и фазами колебаний (причем, амплитуда соответствует числу клеток, двигающихся в определенном направлении, которое определяется соответствующей фазой) и реализовать обратное Фурье-преобразование данных, позволяющее удалить гармоники высших порядков, т.е. избавиться от “шумов”, обусловленных случайными факторами. - 54 -

При отсутствии светового стимула (освещенность Е = 0 лк) гистограмма реального распределения клеток D. salina (рис. 4.7, а) характеризуется пиками практически во всех направлениях; амплитуды первых 7 гармоник также не демонстрируют каких-либо существенных отличий (рис. 4.7, б). Фазы этих гармоник (рис. 4.7, г) свидетельствуют о движении клеток по направлениям, характеризующимся углами 135°, 235°, 180°, т.е. вряд ли можно выделить в данной ситуации какое-либо доминирующее направление движения клеток (рис. 4.7, в). Включение источника бокового освещения, обеспечивающего освещенность 500 лк, вызывает появление ярко выраженных пиков в реальном распределении движущихся клеток (рис. 4.8, а). Можно выделить амплитуды первой и второй гармоник (рис. 4.8, б), фазы которых свидетельствуют о направлении движения клеток в области 270°, т.е. по направлению к источнику света (рис. 4.8, г). Результаты обратного Фурье-преобразования свидетельствуют о наличии доминирующего направления движения клеток к источнику света, т.е. положительного фототопотаксиса (рис. 4.8, в).

Рис. 4.7. Результаты Фурье-преобразования углового распределения движущихся клеток Dunaliella salina Teod. при отсутствии светового стимула (Е = 0). Здесь и далее: а – реальные гистограммы углового распределения; б – амплитуды гармоник (А); в – гистограммы обратного Фурье-преобразования для семи основных гармоник; г – фазы гармоник; n – номер сектора в угловом распределении [Посудин и др., 1991].

Рис. 4.8. То же, что и на рис. 4.7, при освещенности образца 500 лк. Здесь и далее направление распространения света указано стрелками [Посудин и др., 1991].

- 55 -

Рис. 4.9. То же, что и на рис. 4.7, при освещенности образца 40000 лк [Посудин и др., 1991].

Использование бокового освещения образца, обеспечивающего освещенность 40000 лк, вызывает появление по крайней мере пяти интенсивных пиков в реальном распределении (рис. 4.9, а). Из семи гармоник Фурье-разложения можно выделить отличающиеся по амплитуде первые четыре гармоники (рис. 4.9, б), фазы которых близки к нулю (рис. 4.9, г). Реконструированная для основных гармоник гистограмма (рис. 4.9, в) свидетельствует об отрицательном фототопотаксисе клеток D. salina. Таким образом, метод Фурье-преобразования позволяет исследовать зависимость углового распределения клеток Dunaliella от степени освещенности образца боковым белым светом. Достоинством метода является возможность построения гистограмм углового распределения, избавленных от случайных факторов и дающих представление об истинных доминирующих направлениях движения клеток в ответ на световой стимул различной интенсивности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Виды Dunaliella подобно другим жгутиковым водорослям проявляют способность к свободному перемещению в жидкой среде под воздействием света, т.е. к фотодвижению (фототаксису). Виды Dunaliella способны к фотокинетическим и фотовекторным реакциям (наличие фотокинетических реакций у Chlamydomonas в литературе оспаривается). Что касается фотофобических реакций, то у видов Dunaliella в отличие от Chlamydomonas и Euglena нам не удалось их наблюдать, хотя литературные данные (Wayne et al., 1991) свидетельствуют о возможности таких реакций и у Dunaliella. Средняя скорость поступательного движения клеток гипергалобных видов Dunaliella при оптимальной для фотокинеза этих видов степени освещенности составляла 48±2 мкм/с (D. salina) и 36±2 мкм/с (D. viridis). Эти значения на 1-3 порядка превышают таковые микроорганизмов, не обладающих жгутиковым аппаратом, и находятся в пределах, известных для других жгутиконосцев, как про-, так и эукариотических. Однако средние скорости движения гипергалобных видов Dunaliella ниже (иногда на порядок) чем таковые морских (Dunaliella bioculata) и пресноводных видов (Chlamydomonas reinhardtii, Euglena gracilis), что, по всей вероятности, связано с разной вязкостью среды обитания. Средние скорости вращательного движения видов Dunaliella 0,52±0,04 об/с (D. salina) и 0,54±0,04 об/с (D. viridis) ниже, чем у пресноводных жгутиконосцев, что может быть связано с вязкостью среды - 56 -

обитания. Зависимость поступательной и вращательной скорости движения клеток Dunaliella от длины волны падающего света не установлена. Максимальные значения средних скоростей поступательного и вращательного фотодвижения клеток Dunaliella наблюдались в пределах интенсивности белого света 10-20 вт/м2, освещенности 150-550 лк. Фотокинетические реакции обоих видов на изменение интенсивности белого света и спектрального состава света были идентичными - максимальные значения фотокинетических реакций обоих видов наблюдались в интервале освещенностей около 250 лк. Статистически достоверные отличия скорости поступательного движения обоих видов Dunaliella при воздействии на них поляризованного света по сравнению с белым неполяризованным светом той же интенсивности не обнаружены. Это свидетельствует о некристаллической недихроичной природе фоторецепторов у этих видов (Посудин и др., 1988). Характер углового распределения траекторий движения клеток обоих гипергалобных видов Dunaliella в лабораторных культурах при воздействии латерально направленного белого света зависит от освещенности образца; максимальная анизотропия этого распределения достигается при 500 лк (положительный фототопотаксис); при освещенности порядка 1 500 лк наблюдается переход от положительного фототопотаксиса к отрицательному; последний отмечали при освещенности 40 000 лк. Эти показатели находятся в границах, известных для других водорослей. Однако пороги чувствительность к слабой и сильной освещенности, перехода от положительного к отрицательному фототопотаксису у разных видов водорослей отличаются в значительной степени и позволяют судить об их теневыносливости, солнцелюбивости и устойчивости к высокой освещенности. D. viridis более, чем D. salina, чувствительна к слабому (30 лк) и интенсивному (до 100000 лк) свету, что соответствует особенностям поведения этих двух видов в природе. Оба вида в лабораторной культуре более чувствительны к высокой освещенности, чем Chlamydomonas reinhardtii, переход которого к отрицательному фототопотаксису отмечается при 100 000 лк. Однако, в условиях крымских гипергалинных водоемов с высокой степенью освещенности (свыше 100 000 лк) природные популяции D. salina, представленные так называемой “красной формой”, демонстрируют отсутствие отрицательного фототопотаксиса. Таким образом, гипергалобные виды D. salina и D. viridis отличаются по степени их чувствительности, как к высокой, так и к низкой интенсивности света, что обусловлено особенностями занимаемых ими в природе экологических ниш. Переход видов Dunaliella от положительного фототопотаксиса к отрицательному осуществляется иным способом, чем у хламидомонад. В отличие от последних у видов Dunaliella не наблюдается изменение характера биения жгутиков от цилиарного (гребного) к ундуляторному (волнообразному), а нарушается лишь частота биения одного из жгутиков, в результате чего происходит поворот клетки и движение ее в противоположную от источника света сторону. Спектр действия фототопотаксиса двух гипергалобных видов Dunaliella идентичен; он находится в пределах 400-520 нм и имеет два максимума: при 410-415 нм и при 465-475 нм. Спектр действия фототопотаксиса Dunaliella несколько отличается от такового Chlamydomonas reinhardtii и Haematococcus pluvialis, демонстрирующих широкую полосу в области 400-550 нм с основным максимумом при 500 нм, что может свидетельствовать о различиях в составе фоторецепторных пигментов.

- 57 -

ГЛАВА 5 ВЛИЯНИЕ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА ПАРАМЕТРЫ ФОТОДВИЖЕНИЯ DUNALIELLA В процессе фотодвижения подвижные микроорганизмы подвергаются воздействию ряда абиотических факторов: механических (механических шоков, гидростатических давлений), гравитационных, тепловых, электромагнитных (излучений ультрафиолетового, видимого, инфракрасного и радиочастотного диапазонов, электрических и магнитных полей) и ионизирующих. Кроме того, на фотодвижение микроорганизмов оказывают влияние химический, газовый и ионный состав водной среды, в которой они обитают, рН среды, наличие в ней биогенных элементов и других организмов [Jahn, Bovee, 1968; Крицкий, 1982; Синещеков, Литвин, 1982; Colombetti et al., 1982]. Влияние света на параметры движения двух видов Dunaliella были рассмотрены в главе 4. Подвижные микроорганизмы реагируют на разнообразные абиотические факторы окружающей среды в поисках оптимальных условий существования и роста популяций. Среди этих факторов следует отметить тепловые [Poff, 1985] и химические [Berg, 1985] градиенты, гравитационные [Häder, 1987b], электрические [Mast, 1911] и магнитные [Esquivel, de Barros, 1986] поля, оптическое излучение [Nultsch, Häder, 1988]. В данной главе будет рассмотрено влияние таких абиотических факторов как температура, электрические поля, рН среды, ультрафиолетовое и ионизирующее излучение, а также одновременное воздействие нескольких внешних физических факторов (оптического излучения, температуры и электрического поля) на параметры фотодвижения двух видов Dunaliella. 5.1. ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ Методика измерений. Определение температурной зависимости скорости движения клеток осуществляли изменением температуры (в пределах от 16 до 35 0С) термостата, в котором размещали микроскоп с исследуемым образцом. Как показали измерения температуры суспензии водорослей с помощью терморезистора СТЗ-14, относительное изменение температуры образца при включении стимулирующего фотокинетические реакции света не превышает сотых долей градуса. Это свидетельствует об отсутствии существенного нагрева образца со стороны источника стимулирующего света [Посудин и др., 1988]. Кинетическая реакция на изменение температуры определялась как Ri = (Vi- V0)/V0, где Vi и V0 скорости движения клеток при исследуемой t1 и начальной t0 (в наших опытах 16 0С) температуре соответственно [Посудин и др., 1988]. Время установления температуры (2-3 мин) определялось инерционностью термостата. Результаты и обсуждение. Изменение средней скорости поступательного движения обоих видов Dunaliella в зависимости от температуры воздуха свидетельствует о том, что максимальные значения скорости наблюдаются при температуре от 20 до 30 0С. Температурный оптимум для скорости поступательного движения клеток обоих видов составляет 25 0С. Кинетические реакции этих видов на изменение температуры (относительно начальной температуры 16 0С) идентичны (рис. 5.1). Величина кинетической реакции на повышение температуры в пределах 16-25 0С возрастает до R(t) = 0,19, причем наиболее быстрое увеличение R(t) происходит в интервале от 16 0С до 20 0С.

- 58 -

Рис.5.1. Зависимость среднихзначений скорости поступательного движения D. salina (1) и D. viridis (2) от температуры кинетические реакции R(t) обоих видов (3) на изменениетемпературы. По оси ординат: слева – средня яскорость поступательного движения клеток, справа – кинетическая реакция. По оси абсцисс – температура t воздуха и ее изменение D t [Посудин и др., 1988].

Дальнейшее повышение температуры до 35 0С приводит к снижению величины кинетической реакции до R (t) = 0,12 (см. рис. 5.1). Зависимость скорости поступательного движения клеток от температуры можно связать с возможным уменьшением вязкости среды при нагревании среды от 16 до 25 0 С и постепенным ингибированием жгутикового аппарата в области температур 25-35 0С. Температура в испытуемых пределах не влияет существенно на фототопотаксис водорослей. 5.2. ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ ПОЛЕЙ Методика измерений. Использована специальная кювета с прямоугольным углублением для суспензии Dunaliella salina и позолоченными электродами, расположенными параллельно друг другу на расстоянии 30 мм, связанными с источником постоянного (не более 3 В) напряжения. Для предотвращения процесса электролиза суспензии электроды были отделены от углубления буферными зонами, заполненными желатином и 0,3 М раствором KCl [Посудин и др., 1991а]. При исследовании степени подавления фотопотаксиса внешними электрическими полями был использован метод прямого Фурье-преобразования, позволяющий представить угловое распределение подвижных клеток как набор гармоник с определенными амплитудами (количеством клеток, двигающимися в определенном направлении) и фазами (направлениями движения клеток), также как и метод обратного Фурье-преобразования, дающий возможность избавиться от высших гармоник, обусловленных случайными «шумами», и оставить основные гармоники, характеризующие фотодвижение клеток. Результаты и обсуждение. Приложение электрического поля напряженностью 10-20 В/м вызывало подавление фототопотаксиса водоросли D. salina при ее боковом освещении белым светом (освещенность Е = 500 лк). На рис. 5.2 приведены гистограммы углового распределения клеток в отсутствии и при включении электрического поля напряженностью 20 В/м (регистрацию фототопотаксиса клеток осуществляли через 2 мин после включения поля). Использование метода Фурье-преобразования позволило оценить степень уменьшения амплитуд основных гармоник (первой – в 3 раза, второй – в 3,7 раза и т.д.). В целом гистограмма углового распределения демонстрирует ингибирование фототопотаксиса D. salina при включении внешнего электрического поля напряженностью 20 В/м и восстановление фототопотаксиса через 2 мин после его выключения.

- 59 -

Рис.5.2. Влияние внешнего электрического поля, напряженностью 20 В/м, приложенного к суспензии водорослей, на угловое распределение клеток и интенсивность фототопотаксиса D. salina: 1 – поле выключено; 2 – поле включено. Стрелка указывает направление распространения стимулирующего света (освещенность 500 лк).

.Внешние электрические поля оказывают определенное влияние на движущиеся под воздействием света микроорганизмы. Это объясняется участием биоэлектрических процессов в различных типах фотодвижения микроорганизмов, что подтверждается результатами ряда работ [Marbach, Mayer, 1971; Litvin et al., 1978; Nultsch, Häder, 1979; Синещеков, Литвин, 1982; Dolle, Nultsch, 1988]. Так, метод экстраклеточной регистрации биопотенциалов на одиночной клетке позволил связать биоэлектрические реакции с фотодвижением зеленой водоросли Haematococcus pluvialis [Litvin et al., 1978]. Приложение внешнего

постоянного

фотофобические

реакции

или

низкочастотного

синезеленой

электрического

водоросли

Phormidium

поля

ингибирует

uncinatum

[Nultsch,

отрицательные Häder,

1979].

Фототопотаксис Chlamуdomonas reinhardtii обратимо подавляется при наложении электрического поля [Nultsch, Häder, 1979]. В. Нулч [Nultsch, 1983] выдвинул гипотезу, согласно которой после поглощения фоторецепторной

молекулой

кванта

света

происходит

ее

возбуждение,

что

сопровождается

конформационными изменениями фоторецепторных белков. Это, в свою очередь, приводит к отпиранию кальциевых каналов в области плазматической мембраны, покрывающей стигму, и потоку ионов кальция внутрь клетки. Плазматическая мембрана локально деполяризуется, что вызывает соответствующее отпирание кальциевых каналов в жгутиковой мембране, поток ионов кальция к аксонеме жгутиков и биение последних.

Ингибирование

фотопототаксиса

Сhlamydomonas

внешним

электрическим

полем

интерпретируется как результат изменения мембранного потенциала, участвующего в сенсорном преобразовании [Marbach, Mayer, 1971], или как конкуренция фототопотаксиса и гальванотаксиса [Ekelund et al., 1988]. Подобная связь фотореакций и изменений фотоиндуцированных мембранных потенциалов обнаружена также у бактерий и простейших. Анализ полученных нами результатов по исследованию влияния электрических полей на фотодвижение Dunaliella и данных, касающихся Chlamydomonas [Marbach, Mayer, 1971; Dolle, Nultsch, 1988] и Haematococcus [Litvin et al., 1978], позволяет заключить, что, по всей вероятности, этим водорослям присуще участие электрических потенциалов (в частности, потенциала действия, возникающего в ответ на световой стимул) в процессах фоторегуляции движения водорослей; наложение внешнего электрического поля вызывает нарушение распространения этих потенциалов от рецептора до жгутикового аппарата и, как следствие, подавление фототопотаксиса.

- 60 -

5.3. ВЛИЯНИЕ рН СРЕДЫ Активная реакция среды, зависящая от концентрации водородных ионов (Н+) и измеряемая в единицах рН, - один из наиболее фундаментальных факторов жизнедеятельности организмов в разных ее проявлениях. Существует обширная литература, освещающая влияние рН на рост, развитие, темпы размножения, продукцию биомассы в культурах водорослей (Масюк, Юрченко, 1962; Wegmann,1968; Wegmann, Metzner, 1971; Malis-Arad et al., 1980; Goldman et al., 1982а, 1982б; Ghazi et al., 1983; De Busk, Ryther, 1984; Gimmler, Weis, 1992; Lustigman et al., 1995) и их распространение в природе (Масюк, 1973; LopezArchilla, Amils, 1999; Lopez-Archilla et al., 2001; Topics, http://www.bio.uni-potsdam.de/oeksys/ fsvte.htm), на синтез пигментов (Ghazi et al., 1983), интенсивность фотосинтеза (Wegmann, 1968; Wegmann, Metzner, 1971; Gimmler, Weis, 1992), активность ферментов (Миронюк та ін.,1980), транспорт ионов (Балнокин и др., 1983; Lukas et al., 1986; Pick, 1992), на скорость движения цитоплазмы [Masashi, Teruo, 1982]. Изучают соотношение рН среды обитания и концентрации водородных ионов внутри клеток водорослей (Beardall, Entwisle, 1984; Braun, Hegemann, 1999), в цитозоле и вакуолях с клеточным соком (Кuchitsu et al., 1989), трансмембранный электрический потенциал ацидофильных видов (Remis et al., 1992) и роль трансмембранного протонового насоса в регуляции внутриклеточного рН (Sanders et al., 1981). В последнее время особое внимание уделяют механизмам, обеспечивающим гомеостаз Н+ в цитозоле ацидофильных и гипергалобных видов водорослей, в т.ч. на молекулярном уровне (Sekler et al., 1991, 1994; Gimmler, Weis, 1992; Pick, 1992, 1999; Weiss, Pick, 1996; Ohta et al., 1997; Messerli et al., 2005; Topics…, http://www.bio.unipotsdam.de/oeksys/fsvte.htm; Pick et al., http://www.weizmann.ac.il/ Biological_Chemistry/ scientist /Pick/uri_pick.html;Pick et al., http://bioinformatics. weizmann.ac.il/ _Is/uri_pick/uri_pick.html). Вместе с тем, данные о влиянии рН на параметры фотодвижения водорослей, в частности гипергалобных видов Dunaliella, весьма скудны. Установлены лимиты рН, за пределами которых клетки D. salina (Масюк, Юрченко, 1962] и D. viridis Teod. (Baas-Becking, 1930) теряли подвижность и вскоре погибали. Однако зависимости степени подвижности этих водорослей, скорости движения их клеток и фoтотопотакcиcа от рН среды в указанных интервалах остаютcя неизученными. В данном разделе освещены результаты исследования зависимости различных параметров фотодвижения гипергалобного каротиноносного вида D. salina от значений рН среды (Масюк, Посудин, 2007). Зависимость параметров фотодвижения D. salina (скорости поступательного движения клеток V, мкм/м; фототопотакcиса F и относительного числа подвижных Nm/N0, % или неподвижных Nim/N0, % клеток) от рН среды исследовали, варьируя рН среды от 2,95 до 9,50 c помощью концентрированных щелочи (КОН) или кислоты (НСl). Градиент рН в незабуференной среде задавали в начале опыта и далее не корректировали. Измерения рН среды производили рН-метром рН340 в конце первых, седьмых и двадцатых суток после внесения инокулята. К концу первых суток после посева клетки D. salina проявляли подвижность в области 2,95 < рН £ 9,50. В первом варианте с начальным рН 2,95 в конце первых суток все клетки были неподвижными (Nim/N0 = 100 %), деформированными и впоследствии полностью разрушились. В остальных вариантах водоросли проявляли способность к фотодвижению в разной степени, причем рН-оптимумы для разных параметров фото-движения были неодинаковыми (рис. 5.3). Оптимум рН для подвижности клеток Nm/N0 = 100 %; Nim/N0 = 0) отмечен при рН 6,8; для фототопотаксиса (F = 0,7) - при рН 7,35; для скорости поступательного движения клеток (V = 47 ± 2 мкм/с) - при рН 8,00 (см. рис. 5.3). Область значений рН, при которых число подвижных клеток D. salina составляла не менее 80 % (а неподвижных не прeвышало 20 %), была довольно широкой: 3,26 £ рН £ 9,32. За пределами этой области числo неподвижных клеток резко возрастало. Область значений рН, при которых скорость поступательного движения клеток D. salina составляла не менее 80 % максимальных значений, находится в интервале 5,30 £ рН £ 8,40, a для фототопотаксиса эта область еще уже: 5,70 £ рН £ 8,20 (см. рис. 5.3). За пределами указанных интервалов скорость поступательного движения клеток постепенно снижалась (более медленно в сторону низких значений рН, быстрее - в сторону высоких), а способность к - 61 -

фототопотакcису резко падала. Таким образом различные параметры фотодвижения обладают не только разными рН-оптимумами, но и разной чувствительностью к воздействию экстремальных значений этого фактора: наиболее чувствительным оказался фототопотаксис (F), наименее - подвижность (Nm/N0); скорость поступательного движения клеток (V) занимает по этому признаку промежуточное положение между двумя другими параметрами. Полученные данные свидетельствуют в пользу нашего предположения (Посудин и др., 1992, 1995, 2004; Масюк и др,, 2006) о том, что регуляция различных параметров фотодвижения может осуществляться разными путями и обладать различными механизмами.

Рис.5.3. Зависимость скорости V поступательного движения (1), фототопотаксиса F (2) и относительного числа Nim/N0 (3) неподвижных клеток Dunaliella salina от рН среды в конце первых суток после начала опыта. На вертикальной оси слева - значения скорости V поступательного движения (мкм/с) и уровни фотопотаксиса F (отн. ед.); справа относительное число Nim/N0 неподвижных клеток; на горизонтальной оси - значения рН.

Довольно широкие пределы толерантности D. salina к первоначально заданным рН незабуференной среды (2,95 £ рН £ 9,50) объясняются, с одной стороны, наличием внутриклеточных механизмов, обеспечивающих гомеостаз концентрации Н+ в цитозоле клеток этого вида на уровне рН 7,1 независимо от рНсредывизвестныхпределах(Рicketal.,http://www.weizmann.ac.il/Biological_Chemistry/scientist/Pick/uri_pick.h tml). С другой стороны, в процессе культивирования D. salina происходят изменения первоначально заданных значений рН среды (табл. 5.1). Как видно из табл. 5.1, в кислых, нейтральных и слабо щелочных средах значение рН увеличивалось, в щелочных и сильно щелочных, наоборот, уменьшалось. Наибольшие изменения рН (разница +2,20 и -1,08 единицы рН) наблюдались в крайних вариантах с кислой или высокощелочной средами, наименьшее - в варианте с начальным значением рН 8,1 (0,05) (см. табл. 5.1). В результате этих изменений к концу 20-х суток опыта значения рН в разных вариантах устанавливались в пределах 6,50-8,47, пригодных для жизнедеятельности данного вида. Примерно в этих пределах рН 6,5-9,5 зафиксирована вегетация D. salina в природе (Масюк, 1973).

- 62 -

Таблица 5.1. Изменения рН среды в процессе культивирования Dunaliella salina в течение 20-суточного эксперимента

Время контроля, сутки

Значения рН

1 -е

2,9 5

4,30

5,30

6,29

6,80

7,35

8,10

8,25

8,35

9,15

9,40

9,50

7-е

-

5,10

6,00

6,70

7,20

7,70

8,10

8,20

8,30

8,25

9,10

9,20

20-е

-

6,50

7,25

7,70

7,87

8,07

8,15

8,15

8,17

8,35

8,47

8,42

-

2,20

1,95

1,50

1,07

0,72

0,05

-0,10

-0,18

-0,8

-0,93

-1,08

Разниа значений рН в конце 20-х и 1х суток

П р и м е ч а н и е : прочерки означают отсутствие подвижных клеток водоросли.

Оптимумы рН для подвижности и фототопотаксиса D. salina не совпадают с таковыми для роста культуры этого вида (Масюк, Юрченко, 1962) и активности каталазы D. salina (Миронюк и др., 1980); рНоптимум для скорости поступательного движения клеток (8,00) наблюдается в варианте, претерпевающем наименьшие изменения рН в ходе культивирования и находится в пределах ростового оптимума 8-9 (Масюк, Юрченко, 1962). Очевидно, именно эти показатели (скорость поступательного движения клеток, минимальные изменения первоначально заданного рН незабуференной среды наряду с ростовым оптимумом рН) могут быть полезными критериями при подборе оптимальных условий для промышленного культивирования гипергалобных каротиноносных водорослей. Таким образом, клетки гипергалобного вида Dunaliella salina проявляют подвижность в области первоначально заданных рН незабуференной среды 2,95 < рН £ 9,50. В процессекультивирования во всех вариантах, кроме крайнего (рН 2,95) наблюдается саморегуляция среды, в пределах рН 6,5-8,47, благоприятных для роста культуры и подвижности клеток водорослей. Степень чувствительности к концентрации водородных ионов и оптимумы рН для разных параметров фотодвижения не совпадают, что подтверждает возможность существования разных механизмов управления этими параметрами. Параметры фотодвижения, в первую очередь, скорость поступательного движения клеток, могут быть полезными критериями пригодности сред для промышленного культивирования каротиноносных жгутиковых водорослей (Масюк, Посудин, 2007). 5.4. ОДНОВРЕМЕННОЕ ВЛИЯНИЕ НЕСКОЛЬКИХ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ Поскольку подвижные микроорганизмы, демонстрирующие фотодвижение, испытывают в природных условиях одновременное воздействие нескольких внешних факторов, исследование и учет их совместного влияния на параметры фотодвижения представляет актуальную задачу. Методика измерений. Цель экспериментов - исследование зависимости скорости V поступательного движения и фототопотаксиса F двух видов Dunaliella от одновременного воздействия освещенности клеток белым светом, температуры воздуха и напряженности внешнего электрического поля. Для этого кювету с суспензией клеток водоросли, оснащенную двумя электродами (описание ее дано в разд. 5.2), размещали на предметном столике микроскопа, который, в свою очередь, помещали в термостат. Термостат был оборудован окном для пропускания белого света, который направляли под углом 30 0 к поверхности предметного стекла с суспензией водорослей. Контроль температуры в термостате с точностью ±1 0С осуществляли с помощью электроконтактного термометра типа ТПК-3П-128. - 63 -

Величины внешних факторов варьировали на двух дискретных уровнях – минимальных (освещенность l = 100 лк; температура t = 18 0С; напряженность электрического поля е = 0 В/м) и максимальных (освещенность L = 500 лк; температура T = 30 0С; напряженность электрического поля E = 2,4 В/м). Измерения параметров V и F проводили для всех возможных комбинаций внешних факторов: l-e-t, L-e-t, l-E-t, L-E-t, l-e-T, L-e-T, l-E-T, L-E-T. Для обработки полученных нами экспериментальных данных [Мартыненко и др., 1996; Martynenko et al., 2000] был использован метод множественной регрессии, позволяющий учесть влияние отдельных внешних факторов и их комбинаций на параметры фотодвижения [Мельников и др., 1972; Mosteller et al., 1978]. Анализ данных проводили в рамках линейной регрессионной модели; значимость коэффициентов модели оценивали при помощи критерия Фишера, а адекватности – критерия Кохрена. Уравнения регрессии содержали члены со статистически значимыми коэффициентами. Результаты и обсуждение. Результаты измерений скорости V поступательного движения клеток и параметра F, характеризующего фототопотаксис двух видов Dunaliella, в зависимости от всех возможных комбинаций внешних факторов представлены в табл. 5.2–5.5, где Х1 – уровень освещенности, Х2 – напряженность электрического поля, Х3 – температура, < V > и < F > – средние значения параметров фотодвижения, SV и SF – их среднеквадратичные отклонения. Зависимость скорости V поступательного движения клеток двух видов Dunaliella от внешних параметров (уровня освещенности L, температуры T и напряженности электрического поля E) описывается следующими регрессионными уравнениями: D. salina: V = 34,8 + 0,6L – 0,62E – 1,66T + 1,3(L´E) – 0,6(L´Т) – 0,8(L´E´T); ( 5.1 ) D. viridis: V = 37,6 – 0,6L + 2,0T – 2,6(E´T) + 0,53(L´E´T).

( 5.2 )

Как видно, наибольший вклад в данные уравнения вносит свободный член (собственная скорость движения клеток), не зависящий от внешних факторов и равный 34,8 для D. salina и 37,6 для D. viridis. Весовые коэффициенты при переменных L, E и T определяют вклад каждого из факторов в изменение скорости движения V. Как видно из уравнения ( 5.1 ), наибольшее влияние на скорость движения клеток D. salina оказывает температура, причем ее возрастание в указанных выше пределах приводит к уменьшению скорости (коэффициент равен –1,66). Освещенность и электрическое поле выступают в роли альтернативных факторов: скорость D. salina возрастает при увеличении освещенности (+0,6) и уменьшается при увеличении напряженности электрического поля (-0,62). Взаимодействие этих двух факторов также оказывается существенным (+1,3) и приводит к увеличению скорости движения клеток. Эффекты взаимодействия освещенности и температуры (-0,6) и тройного взаимодействия света, электрического поля и температуры (-0,8) направлены на уменьшение скорости движения, т.к. входят в уравнение регрессии с отрицательным знаком. Таким образом, для культуры D. salina эффекты взаимодействия указанных факторов являются статистически значимыми и соизмеримыми с влиянием отдельных факторов. Как видно из уравнения (5.2), кинетические реакции D. viridis на те же внешние факторы иные, чем у D. salina. Повышение температуры (в указанных пределах) не замедляет, а ускоряет движение клеток; освещенность выступает в качестве альтернативного фактора: при возрастании освещенности движение клеток замедляется. Наиболее существенное влияние оказывает возрастание температуры, приводящее к увеличению скорости (весовой коэффициент равен +2,0), и взаимодействие напряженности электрического поля и температуры, которое приводит к замедлению скорости движения клеток этого вида (весовой коэффициент равен -2,6). Уровень освещенности направлен на уменьшение (–0,6), а тройное взаимодействие освещенности, напряженности электрического поля и температуры – на увеличение скорости движения (+0,5). Таким образом, для культуры D. viridis эффекты взаимодействия факторов также являются статистически значимыми и соизмеримыми с влиянием отдельных факторов, однако их - 64 -

воздействие на скорость движения клеток D. viridis противоположно тому, что наблюдается в культуре D. salina. Полученные данные свидетельствуют о том, что в условиях одного природного водоема эти близкие виды могут занимать различные экологические ниши, что подтверждает наши наблюдения в природе [Масюк, 1973]. Зависимость фототопотаксиса F клеток двух видов Dunaliella от внешних факторов представлена следующими регресионными уравнениями: D. salina: F = 0,07 – 0,07E + 0,09(E´T); ( 5.3 ) D. viridis: F = 0,07 – 0,125Е + 0,079Т + 0,148(E´T). ( 5.4 ) Таблица 5.2. Зависимость скорости V поступательного движения клеток D. salina от совместного действия внешних факторов: освещенности Х1, напряженности Х2 электрического поля и температуры Х3 Х1

Х2

Х3

V1

V2

V3



SV

L

e

t

38,200

39,900

37,30

38,467

1,743

L

e

t

45,800

35,700

37,100

39,533

2,994

L

E

t

40,900

31,700

32,700

35,100

2,548

L

E

T

40,400

37,800

38,000

38,733

2,093

L

e

T

35,300

33,200

33,000

33,833

1,623

L

e

T

33,800

32,000

32,700

32,833

0,823

L

E

T

33,700

32,300

31,200

32,400

1,570

L

E

T

33,200

33,600

33,700

33,500

0,070

Таблица 5.3. Зависимость скорости V поступательного движения клеток D. viridis от совместного действия внешних факторов: освещенности Х1, напряженности Х2 электрического поля и температуры Х3 Х1

Х2

Х3

V1

V2

V3



SV

L

e

t

30,900

32,000

34,900

32,600

4,270

L

e

t

33,200

33,100

31,700

32,667

0,703

L

E

t

36,700

40,600

39,900

39,067

4,323

L

E

T

38,000

36,900

38,600

37,833

0,743

L

e

T

44,200

42,300

43,000

43,500

0,390

L

e

T

39,900

40,600

40,100

40,200

0,130

L

E

T

37,700

38,000

36,900

37,533

0,323

L

E

T

36,909

38,000

36,700

37,200

0,490

Из уравнения (5.3) видно, что определяющим для фототопотаксиса D. salina фактором является напряженность электрического поля, повышение которой оказывает ингибирующее действие (коэффициент равен –0,07); повышение температуры снимает ингибирующий эффект электрического поля и стимулирует фототопотаксис D. salina (+0,09). Вместе с тем, для этого вида влияние температуры на фототопотаксис не является определяющим.

- 65 -

Уравнение (5.4), полученное для D. viridis, показывает, что как и в случае D. salina, электрическое поле ингибирует фототопотаксис (-0,125). В отличие от D. salina, повышение температуры положительно влияет на фототопотаксис D. viridis (+0,079). Наибольший эффект оказывает взаимодействие обоих факторов (+0,148): при напряженности электрического поля, равной 2,4 В/см, и возрастании температуры до 30 0С фототопотаксис возрастает. Такой сложный характер воздействия внешних факторов на параметры фотодвижения двух видов Dunaliella можно объяснить, на наш взгляд, следующим образом. Как показано в наших предыдущих исследованиях, скорость движения клеток обоих видов зависит от освещенности суспензии водорослей Dunaliella, причем максимум двигательной активности клеток приходится на область150-550 лк [Посудин и др., 1988]. Зависимость скорости движения клеток от температуры также характеризуется максимальным значением скоростей в области температур 20-30 0С (там же). Таблица 5.4. Зависимость фототопотаксиса F клеток D. salina от совместного действия внешних факторов: освещенности Х1, напряженности Х2 электрического поля и температуры Х3 Х1

Х2

Х3

F1

F2

F3

< F>

SF

L

e

t

0,110

0,190

0,240

0,180

0,004

L

e

t

0,310

0,360

0,270

0,313

0,002

L

E

t

0,160

0,030

-0,180

0,003

0,029

L

E

T

-0,140

-0,250

-0,097

-0,162

0,006

L

e

T

0,140

-0,150

0,200

0,063

0,035

L

e

T

0,000

0,060

-0,090

-0,010

0,006

L

E

T

0,020

0,120

0,160

0,100

0,005

Таблица 5.5. Зависимость фототопотаксиса F клеток D. viridis от совместного действия внешних факторов: освещенности Х1, напряженности Х2 электрического поля и температуры Х3 Х1

Х2

Х3

F1

F2

F3

< F>

SF

L

e

t

0,240

0,260

0,200

0,233

0,001

L

e

t

0,250

0,270

0,180

0,233

0,002

L

E

t

-0,280

-0,330

0,140

-0,250

0,010

L

E

T

-0,570

-0,360

-0,190

-0,373

0,036

L

e

T

0,100

0,330

-0,110

0,107

0,048

L

e

T

-0,050

0,500

0,260

0,087

0,025

L

E

T

0,210

0,200

0,200

0,203

0,000

Максимальные значения положительного фототопотаксиса достигаются при освещении образца белым светом 500 лк; при освещенности 1500 лк фототопотаксис отсутствует, а при дальнейшем повышении освещенности он становится отрицательным [Посудін та ін., 1991]. Приложенное к образцу электрическое поле (см. разд. 5.2) ингибирует фототопотаксис. - 66 -

Используемые в наших экспериментах пределы изменения освещенности образца (100 и 500 лк) и температуры (18 и 30 0С) находятся, как видно, вблизи максимальных точек зависимости параметров фотодвижения исследуемых видов водорослей от внешних факторов, которые могут конкурировать и друг с другом, и с электрическим полем, усиливая или ослабляя воздействие других факторов на параметры фотодвижения при совместном действии. Подобные конкурирующие и зачастую противоположные действия внешних факторов объясняют различия в экологии и поведении этих видов в условиях естественных бассейнов [Масюк, 1973]. 5.5. ВЛИЯНИЕ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ Солнечное излучение является одним из важнейших внешних факторов, влияющих на жизнедеятельность и поведение высших и низших растений. Cпектральный состав солнечного излучения характеризуется наличием ультрафиолетового (200-400 нм), видимого (400-800 нм) и инфракрасного (800 нм - 50 мкм) диапазонов. Солнечное излучение существенно воздействует на подвижных обитателей водных экосистем, в частности, на параметры фотодвижения водорослей – подвижность, фототопотаксис и скорость движения клеток. Ультрафиолетовое излучение делят на три спектральные области в зависимости от характера воздействия этого излучения на биологические объекты [Foster, Lüning, 1996]: УФ-А (320-400 нм), УФ-В (280-320 нм) и УФ-С (200-280 нм). В природных условиях ультрафиолетовое излучение в области УФ-С, которое характеризуется наименьшей длиной волны и, следовательно, обладает наибольшей энергией, достаточной для стимулирования ионизационных процессов в верхней атмосфере, не достигает земной поверхности за счет поглощения слоем атмосферного озона. Что же касается ультрафиолетового излучения в УФ-В области, то оно достигает поверхности Земли, причем интенсивность излучения существенно зависит от широты местности, высоты стояния Солнца, облачности, отражательной способности поверхности и толщины озонового слоя. Именно истощение последнего приводит к увеличению интенсивности падающего на земную поверхность УФ-В излучения, которое чрезвычайно пагубно действует на живые организмы, что объясняется поглощением излучения молекулами нуклеиновых кислот и белков [Häder, 1996b]. Поглощение более длинноволнового УФ-А излучения осуществляется в основном молекулами с двойными сопряженными связями, циклическими и полициклическими структурами, к которым относятся изопреноиды, флавины, хиноны, алкалоиды, а у фототрофных организмов – хлорофилл [Garcia-Pichel, 1996]; таким образом, воздействие ультрафиолетового излучения в диапазоне 320-400 нм приводит к подавлению фотосинтеза, обесцвечиванию фотопигментов и, следовательно, к уменьшению первичной продукции [Häder, 1991, 1995, 1996b; Häder et al., 1995; Ekelund, 1996]. Ингибирующее действие искусственного УФ-В излучения на водоросли усиливается с уменьшением длины волны и, соответственно, с увеличением энергии излучения. Ультрафиолетовое излучение (как природное, так и искусственное) также оказывает существенное влияние на поведенческую стратегию и продуктивность водорослей. Имеются данные об ингибирующем действии природного и искусственного ультрафиолетового излучения на фотосинтетическую активность и ориентационное поведение водорослей, в частности, на подвижность и фототопотаксис Euglena gracilis [Häder, 1985; Häder, 1986a; Häder, Häder, 1988]; фотосинтез, белковый и пигментный состав Euglena gracilis [Gerber, Häder, 1992], гравитаксис Euglena gracilis [Häder, Shi-Mei Liu, 1990], подвижность Astasia longa [Häder, Häder, 1989a], фотоориентацию, подвижность и пигментацию Peridinium gatunense [Häder et al.,1990], и Cryptomonas sp. [Häder, Häder, 1989b, 1990, 1991], фотодвижение и пигментацию Gyrodinium - 67 -

dorsum [Ekelund, Bjorn, 1990], подвижность Phormidіum uncinatum [Häder et al., 1986], фотосинтез Laminaria digitata [Foster, Lüning, 1996] и Dictyota dichotoma [Flores-Moya et al., 1999], подвижность Dunaliella bardawil [Jimenez et al., 1996], жгутиковый аппарат Chlamydomonas reinhardtii [Donk, Hessen, 1996], фиксацию неорганического углерода морской водорослью Dunaliella tertiolecta [Beardall et al., 2002]. Мы исследовали зависимость фототопотаксиса двух видов Dunaliella от длины волны стимулирующего бокового излучения [Посудин и др., 1990]. Для сопоставления наших результатов с полученными П. Хэллдэлом для Tetraselmis hazenii (= Platymonas subcordiformis) – водоросли, спектр действия фототопотаксиса которой простирается и в ультрафиолетовую область [Halldal, 1961], мы также изучали другой вид того же рода - Tetraselmis viridis (Rouch.) Norris et al. (= Platymonas viridis Rouch.). Было показано отсутствие фототопотаксиса у двух видов Dunaliella в ультрафиолетовой области спектра, где флавины имеют два интенсивных максимума поглощения и сделан вывод, что не флавины, а каротиноиды являются фоторецепторными пигментами, ответственными за фототопотаксис двух видов Dunaliella; в то же время, фототопотаксис в ультрафиолетовой области спектра присущ, по всей вероятности, роду Tetraselmis [Посудин и др., 1990]. В данном разделе освещаются результаты исследования влияния предварительного облучения суспензии водорослей из рода Dunaliella искусственным ультрафиолетовым изучением различной интенсивности, длины волны и продолжительности облучения с последующим измерением параметров фотодвижения под действием бокового белого света; освещенность образца составляла 500 лк, температура в процессе измерений равнялась 18-20 0С [Посудин и др., 2004]. Использование искусственных источников ультрафиолетового излучения позволит приблизиться к пониманию роли природного ультрафиолетового излучения для жизнедеятельности и фотоповедения Dunaliella в поисках оптимальных условий существования. Методика измерений. В данных исследованиях в качестве источника ультрафиолетового излучения был использован осветитель ОРК-21, спектр излучения которого занимает область 250-350 нм. Изучали зависимость параметров фотодвижения двух видов Dunaliella, в частности, скорости V поступательного движения, фототопотаксиса F и относительной подвижности Nm /N0 (где Nm – количество подвижных клеток, N0 – общее число клеток) от интенсивности предварительного ультрафиолетового излучения, которую регулировали в пределах от 0,76 до 11 Вт/м2 путем изменения расстояния между источником излучения и объектом исследования. Интенсивность ультрафиолетового излучения оценивали с помощью дозиметра ДАУ-81. Зависимость параметров фотодвижения водорослей от времени облучения исследовали в пределах от 0 до 10 мин. Спектральную чувствительность параметров фотодвижения Dunaliella определяли с помощью интерференционных фильтров, которые размещали между источником ультрафиолетового излучения и объектом. Максимумы пропускания этих фильтров приходились на такие длины волн (нм): 248, 280, 302, 313, 334 и 365. Продолжительность облучения культуры водорослей в этом случае была 5-10 мин. Контролем во всех экспериментах служили параметры фотодвижения клеток необлученных культур Dunaliella spp. в условиях освещения боковым белым светом при освещенности образца 500 лк и температуре окружающего воздуха 18-20 0С [Посудин и др., 2004].

- 68 -

Рис. 5.4. Зависимость скорости V поступательного движения (а) и фототопотаксиса F (б) клеток двух видов Dunaliella от интенсивности (І) предварительного нефильтрованного ультра-фиолетового излучения (в диапазоне длин волн 250-350 нм) продолжительностью 5 мин. (-●- - Dunaliella salina; -▲- - Dunaliella viridis; К – контроль).

Все измерения повторяли по три раза для определения средних величин измеряемых параметров и погрешностей измерений. Результаты и обсуждение. Зависимость скорости V поступательного движения и фототопотаксиса F клеток двух видов Dunaliella от интенсивности І нефильтрованного ультрафиолетового излучения представлена на рис. 5.4; видно, что значения скорости V поступательного движения обоих видов не изменяются при увеличении интенсивности излучения в указанных пределах, тогда как фототопотаксис F подавляется высокими (в пределах от 2 до 11 Вт/м2) интенсивностями ультрафиолетового излучения. Зависимость скорости V поступательного движения, фототопотаксиса F и относительной подвижности Nm/N0 клеток двух видов Dunaliella от продолжительности t облучения нефильтрованным ультрафиолетовым излучением интенсивностью до 10 Вт/м2 представлена на рис. 5.5.

- 69 -

Рис. 5.5. Зависимость скорости V поступательного движения (а), фототопотаксиса F (б) и относительной подвижности Nm /N0 (в) клеток двух видов Dunaliella от продолжительности t предварительного воздействия нефильтрованого ультрафиолетового излучения (в диапазоне длин волн 250-350 нм) интенсивностью 10 Вт/м2 (-●- D. salina; -▲- -D. viridis; К – контроль).

В сравнении с контрольным образцом скорость V подвижных клеток обоих видов не изменяется при предварительном облучении в течение 10 мин, не выходя за пределы ошибок измерения, тогда как фототопотаксис F и относительная подвижность Nm /N0 ингибируются на протяжении 7-10 мин облучения. Это свидетельствует о различиях механизмов, управляющих скоростью поступательного движения (параметр V), с одной стороны, фотоориентацией (параметр F) и подвижностью клеток (параметр Nm/N0) - с другой стороны. Нельзя исключить возможные различия в структуре и размерах фоторецепторных систем, ответственных за скорость поступательного движения и фотоориентацию клеток. Эти данные согласуются с результатами наших исследований, посвященных влиянию рН среды и ионизирующего излучения на параметры фотодвижения Dunaliella [Посудин и др., 1992; Масюк, Посудин, 2007] (см. разд. 5.3 и 5.6). В литературе имеются данные о влиянии природного солнечного и ультрафиолетового излучений на скорость поступательного движения и фототопотаксис Euglena gracilis [Häder, 1986а]: средняя скорость - 70 -

поступательного движения клеток E. gracilis составляла 120 мкм/с; лишь через 1,5-2 часа воздействия солнечного излучения и подвижность, и фототопотаксис, и скорость движения клеток уменьшались до нуля. Использование искусственного озонового фильтра (кюветы, заполненной озоном в концентрации 45 мкг/мл), который уменьшал на 5 % интенсивность УФ-В (290-320 нм) компоненты солнечного излучения (по оценкам автора интенсивность УФ-В компоненты составляет 1,2 Вт/м2), приводило к увеличению жизнеспособности клеток (через 3 часа после облучения оставалось 50 % подвижных клеток) и к уменьшению скорости поступательного движения за этот промежуток времени до 80 % от начальной величины. Если же кювету с суспензией водорослей покрывали стеклом (которое не пропускает ультрафиолетовое излучение), то фототопотаксис E. gracilis достигал значений, типичных для контрольных, необлучаемых образцов [Häder , 1986а]. Такую зависимость параметров фотодвижения E. gracilis нельзя объяснить избыточным поглощением световой энергии хлорофиллом, поскольку клетки Astasia longa, лишенные пигментов, и E. gracilis, обесцвеченные в темноте, демонстрировали такую же реакцию на ультрафиолетовое облучение [Häder, 1986а]. Ингибирование подвижности и скорости поступательного движения при воздействии солнечного нефильтрованного излучения в течение нескольких часов демонстрируют также водоросли Peridinium gatunense, Cryptomonas spp., Gyrodimium dorsum, Cyanophora paradoxa [Häder, 1991]. Воздействие нефильтрованного солнечного излучения приводило к иммобилизации клеток Сryptomonas maculata через 140 мин, а нефильтрованного искусственного ультрафиолетового излучения – через 60 мин [Häder, Häder, 1991]. Различие полученных нами данных с результатами исследований, приведенными выше, можно объяснить тем, что в наших экспериментах использовалось нефильтрованное ультрафиолетовое излучение более высокой (до 10 Вт/м2) интенсивности. Тот факт, что фототопотаксис F и относительная подвижность Nm /N0 ингибируются на протяжении 10 мин УФ облучения свидетельствует о том, что, вероятно, решающим фактором, оказывающим влияние на параметры фотодвижения водорослей, является доза D облучения, которая определяется как D = I×t, где I - интенсивность ультрафиолетового излучения, а t - его продолжительность: для упомянутых выше водорослей использованная доза D = 1 Вт/м2×120 мин была одного порядка с дозой D = 10 Вт/м2×10 мин в наших экспериментах.

Рис. 5.6.Зависимость скорости V поступательного движения (а,в) и фототопотаксиса F (б, г) клеток Dunaliellasalina (а, б) и D. viridis (в, г) от длины волны l ультрафиолетового излучения (интенсивностьизлучения 2 Вт/м2; продолжительность облучения 5 минут; к – контроль).

Что касается скорости поступательного движения Dunaliella, отличие наших результатов от данных Хэдера [Häder, Häder, 1991] возможно объясняется тем, что мы измеряли скорость индивидуальных клеток, сохранявших подвижность, а не среднюю скорость клеток в суспензии, которая оценивается системой видеомикрографии; в наших опытах даже при небольшом количестве оставшиеся подвижными клетки сохраняли скорость на постоянном уровне.

- 71 -

Зависимость скорости V поступательного движения и фототопотаксиса F клеток двух видов Dunaliella от длины волны ультрафиолетового излучения (интенсивностью 2 Вт/м2) представлена на рис. 5.6 (продолжительность предварительного облучения 5 мин) и рис. 5.7 (продолжительность предварительного облучения 10 мин).

Рис. 5.7. Зависимость скорости V поступательного движения (а, в) и фототопотаксиса F (б, г) клеток Dunaliella salina (а, б) и Dunaliella viridis (в, г) от длины волны l ультрафиолетового излучения (интенсивность излучения 2 Вт/м2; продолжительность облучения 10 мин; к – контроль).

Нами не установлена зависимость скорости V поступательного движения D. salina (рис. 5.6, а) и D. viridis (рис. 5.6, в) от длины волны ультрафиолетового излучения. В то же время, воздействие монохроматического излучения ультрафиолетовой области спектра на фототопотаксис F двух видов Dunaliella неоднозначно – 5-минутное облучение приводит к уменьшению уровня фотоориентации (параметра F) ниже контрольных значений вплоть до появления отрицательных значений фототопотаксиса F: в области 248-334 нм у D. salina (рис. 5.6, б) и 248 нм у D. viridis (рис. 5.6, г). Более продолжительное (в течение 10 мин) облучение двух видов Dunaliella приводит к полному ингибированию фототопотаксиса: в области 248-280 нм у D. salina (рис. 5.7, б) и 248-334 нм у D. viridis (рис. 5.7, г). Ультрафиолетовое облучение в области 302-365 нм (D. salina) и 365 нм (D. viridis) в течение 10 мин вызывает у обоих видов отрицательный фототопотаксис. Мы не встречали в литературных источниках сведений о преобразовании положительного фототопотаксиса водорослей в отрицательный под воздействием ультрафиолетового облучения с последующим ингибированием фототопотаксиса при увеличении продолжительности облучения. Исследования спектральной чувствительности водоросли Euglena gracilis к ультрафиолетовому излучению показали, что излучение в полосе 295 нм и ниже также является ингибирующим для подвижности и фотоориентации клеток водоросли [Häder, 1985]. Следует отметить, что значения параметра F восстанавливаются до контрольных значений на всех исследуемых длинах волн (кроме 248 нм) через два часа после прекращения облучения интенсивностью 2 Вт/м2 (рис. 5.8). Способность к восстановлению фототопотаксиса через 24 часа после прекращения совместного воздействия в течение 10 часов излучения видимого и ультрафиолетового диапазонов демонстрируют также клетки Dunaliella bardawil; интенсивность излучения составляла 26,01 Вт/м2 для комбинации видимого и УФ-А излучений и 39,72 Вт/м2 для комбинации видимого, УФ-А и УФ-В излучений [Jimenez et al., 1996].

- 72 -

Существует несколько гипотез относительно воздействия ультрафиолетового излучения на водоросли. Согласно одной из них основной мишенью воздействия ультрафиолетового излучения является молекула ДНК; в пользу этого суждения свидетельствует совпадение спектра поглощения ДНК и спектра действия ингибирования подвижности Euglena gracilis [Yammamoto et al., 1983]. Однако, как было показано позднее [Häder, 1991], тонкая структура спектра действия ингибирования подвижности E. gracilis характеризуется наличием основного максимума при 270 нм, который входит в УФ-С область, небольшого максимума при 305 нм и плеча при 290 нм (входящими в УФ-В область) и не соответствует спектру поглощения ДНК [Jagger, 1983]. Кроме того, против участия ДНК как УФ-мишени свидетельствует слишком быстрое подавление подвижности клеток E. gracilis. Еще одна гипотеза основывается на возможном разрушении клеток за счет фотодинамического эффекта, вызванного совместным действием оптического (в данном случае – ультрафиолетового) излучения и химических соединений. Предполагается, что ультрафиолетовое излучение поглощается соответствующей молекулой фоторецептора, которая переходит с основного состояния в возбужденное; если возбужденная молекула не затрачивает свою энергию на фотохимические реакции или теплоту, то возможна передача ее энергии молекуле фотосенсибилизатора, что сопровождается образованием синглетного кислорода 1О2 [Maurette et al., 1983] или свободных радикалов [Spikes, 1977], обладающих сильными реактивными свойствами и участвующих в разрушении мембран и других клеточных компонентов. Однако, против этой гипотезы свидетельствуют результаты экспериментов с использованием специфических диагностических реагентов и тушителей синглетного кислорода и свободных радикалов, которые не увеличивали жизнеспособность облученных клеток водорослей [Häder et al., 1986; Häder, Häder, 1988b]. Более того, добавление тяжелой воды D2O, которая увеличивает время жизни синглетного кислорода на порядок, не повлияло на ингибирующее действие ультрафиолетового излучения [Häder, 1991], что также исключает механизм фотосенсибилизации.

Рис. 5.8. Фототопотаксис Dunaliella salina (а) и D. viridis (б) спустя 2 часа после прекращения 10минутного

ультрафиолетового

облучения

2

интенсивностью 2 Вт/м .

Возможным приемлемым механизмом воздействия ультрафиолетового излучения на фотодвижение водорослей можно считать воздействие этого излучения на белки, связанные с двигательным аппаратом водоросли, управляющим биениями жгутиков, или/и с фоторецепторной системой. Об этом - 73 -

свидетельствуют повреждения белков, выделенных из паражгутикового тела E. gracilis (предполагаемого фоторецептора водоросли), при воздействии на них солнечного или ультрафиолетового излучения [Häder, 1991]. В пользу этой гипотезы в наших исследованиях свидетельствуют различные уровни воздействия ультрафиолетового излучения на параметры фотодвижения Dunaliella - скорость поступательного движения V и фототопотаксис F, что можно связать с возможными различиями в структуре и размерах фоторецепторных систем, ответственных за скорость поступательного движения и фотоориентацию клеток. Зависимость фототопотаксиса и подвижности клеток исследуемых водорослей от интенсивности, длины волны ультрафиолетового излучения и продолжительности облучения свидетельствует о возможности использования этих водорослей для биотестирования природного ультрафиолетового излучения. 5.6. ВЛИЯНИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ Методика измерений. В данном разделе освещаются результаты воздействия g-излучения на суспензию клеток двух видов Dunaliella с последующим анализом дозовых кривых для скорости и направления движения клеток, облученных в пределах 0-1000 Гр. В качестве источника ионизирующего излучения использовали 60Со (установка МРХ-g-25 “Исследователь” с мощностью дозы 0,2 Гр/с). Суспензию клеток водорослей помещали в пробирках в поле излучения источника. После облучения пробирки вынимали из установки, водоросли переносили в лабораторию для измерения скорости поступательного движения и оценки фототопотаксиса. Для выяснения степени повреждения клеток в процессе облучения суспензию обоих видов (облученную и необлученную) пропускали через проточную ячейку цитофлуориметра “Соulter Erics C”, регистрируя дифракцию лазерного излучения на клетках и флуоресценцию движущихся клеток. Запись и обработка на компьютере измерений большого числа клеток позволяет построить моно- и бипараметрические гистограммы частот, с которыми встречаются клетки одного размера. На этих гистограммах амплитуда сигнала заносится на ось абсцисс, а количество клеток одного и того же размера, давших одинаковую амплитуду сигнала, - на ось ординат. Для получения статистически достоверных результатов были использованы для каждого вида три колбы суспензии, из которых брали по три пробы для облучения и определения параметров V и F. Дозы облучения составляли 30, 600 и 1000 Гр. Освещенность колб в процессе культивирования - 1200 ± 50 лк; температура воздуха в культуральном шкафу 23 ± 1 0С, в процессе микроскопирования 17 ± 1 0С. Скорость V движения клеток и параметр F, характеризующий направление движения клеток, определяли как результат усреднения данных, полученных для 9 образцов (три колбы, по три пробы) в условиях определенного режима облучения. Измерения V и F проводили через 1, 2, 7 и 11 суток после облучения. Для выяснения степени влияния облученной среды культуру Dunaliella в одном из вариантов сразу после облучения разбавляли свежей средой в соотношении 1:19; измерения параметров V и F проводили на 1-е сутки и через 16 суток после разбавления [Посудин и др., 1992]. Результаты и обсуждение. В первые сутки после воздействия ионизирующего излучения скорость V клеток D. salina изменяется линейно лишь в пределах погрешности измерений вплоть до 600 Гр, уменьшаясь на 20 % по сравнению с контролем (рис. 5.9, а). При дозе 1000 Гр наблюдается резкий спад скорости до нулевых значений. Что же касается параметра F, то зависимость его от дозы также является линейной вплоть до 600 Гр, однако угол наклона этой зависимости отличается от такового для параметра V. Дозы свыше 600 Гр (в наших экспериментах до 1000 Гр) резко ингибируют как скорость, так и фототопотаксис. Для D. viridis зависимость параметра V от дозы сохраняется линейной вплоть до 1000 Гр; угол наклона примерно такой же, как в случае D. salina в пределах ошибок измерений. Однако параметр F уменьшается до 10%-ного уровня, соизмеримого со случайными значениями F, уже при дозе 30 Гр (рис. 5.9, б). Возможно, такое различие в зависимости параметра F от дозы у разных видов связано с различными размерами клеток двух видов. На вторые, седьмые и одиннадцатые сутки характер дозовых кривых практически не изменялся, что свидетельствует о необратимых воздействиях ионизирующего излучения. Что касается культуры, которую после облучения разбавили свежей средой, то здесь мы не обнаружили особых отличий в численных значениях параметров V и F по сравнению с культурой, не разбавленной - 74 -

свежей средой (сравнение проводили вплоть до 16 суток). Это может свидетельствовать об отсутствии ингибирующего действия облученной водной среды после воздействия ионизирующего излучения на параметры фотодвижения клеток водоросли. В результате воздействия ионизирующего излучения, по всей вероятности, имеет место изменение размеров (или формы) клеток и содержания в них хлорофиллов. Об этом свидетельствует смещение пиков и изменение амплитуды гистограмм, характеризующих как рассеяние лазерного излучения на клетках, так и флуоресценцию хлорофилла, присутствующего в клетках у облученных образцов по сравнению с контрольными для обоих видов Dunaliella (рис. 5.10, 5.11). Таким образом, приведенные гистограммы (рис. 5.10, 5.11) подтверждают возможное необратимое повреждение клеток D. salina и D. viridis и их фотосинтетического аппарата под воздействием g-облучения в указанных дозах.

Рис. 5.9. Зависимость скорости V поступательного движения (1) и параметра F, характеризующего фототопотаксис (2), от дозы ионизирующего излучения в первые сутки после облучения: а D. salina; б - D. viridis. По оси абсцисс – доза облучения, Гр.

Рис. 5.10. Гистограммы, характеризующие соотношение между рассеянием лазерного излучения клетками и флуоресценцией клеток Dunaliella salina (а); флуоресценцию клеток (б); рассеяние лазерного излучения на клетках (в) и рассеяние под углом 900 (г) для D. salina: 1 - до g-облучения; 2 – после g-облучения.

- 75 -

Рис. 5.11. Гистограммы, характеризующие соотношение между рассеянием лазерного излучения клетками и флуоресценцией клеток Dunaliella viridis (а); флуоресценцию клеток (б); рассеяние лазерного излучения на клетках (в) и рассеяние под углом 900 (г) для D. viridis: 1 - до g-облучения; 2 – после g-облучения.

Одним из основополагающих аспектов проблемы фотодвижения водорослей является изучение местоположения и природы фоторецептора, ответственного за прием кванта света и преобразование его в сигнал, управляющий биениями жгутиков. В отношении таких зеленых водорослей как Chlamydomonas существует мнение, что фоторецепторная система расположена у поверхности клетки, в плазмалемме [Nultsch,1983]. У эвгленофитовой водоросли Euglena gracilis фоторецептор, как известно, находится внутри клетки, у основания жгутика, в паражгутиковом теле [Colombetti et al., 1982]. Что же касается Dunaliella, то данные о расположении фоторецептора у видов этого рода отсутствуют. Логика наших рассуждений такова: пусть фоторецептор, определяющий способность клетки ориентироваться относительно направления распространения света, расположен у Dunaliella у поверхности клетки (как у Chlamydomonas); если системы, ответственные за скорость и направление движения клеток, имеют различную локализацию, это определит также различный характер дозовых кривых для параметров V и F соответственно. Основным результатом, полученным в наших исследованиях по изучению влияния ионизирующего излучения на параметры фотодвижения Dunaliella, является установление различного наклона дозовых кривых для параметров V и F движущихся клеток Dunaliella (см. рис. 5.9). По нашему мнению, это свидетельствует о различиях механизмов, управляющих скоростью поступательного движения (параметр V) и фототопотаксисом (параметр F) клеток. Нельзя исключать возможности потери при воздействии - 76 -

ионизирующего излучения белковыми молекулами плазмалеммы конформационных свойств. Как считают авторы работы [Посудин, Супрун,1992], белки, входящие в состав клеточной мембраны, принимают участие в селективном пропускании ионов (как правило, Са2+) в зависимости от условий освещения. Процесс фоторецепции можно рассматривать как возбуждение мембранных белков при поглощении молекулой фоторецептора кванта света, при котором имеют место конформационные изменения белков, приводящие к активации ионных каналов мембраны. Изменение концентрации ионов Са2+ в окружающем пространстве приводит к биению жгутиков и фотоориентации клетки. Воздействие ионизирующего излучения, по всей вероятности, вызывает изменение конформационных свойств белков в клеточной мембране и потерю клетками способности ориентироваться относительно источника света. Повреждающее действие gизлучения на скорость движения и фототопотаксис Dunaliella различно; очевидно, фоторецептор Dunaliella, ответственный за фотоориентацию клеток, в большей степени подвержен действию ионизирующего излучения, чем аппарат, управляющий скоростью поступательного движения клеток. Следует также отметить некоторые отличия в дозовых кривых для параметра F у двух видов Dunaliella – D. salina и D. viridis, которые, по всей вероятности, можно связать с различными размерами фоторецепторных систем у представителей двух видов и неодинаковой их чувствительностью к ионизирующему излучению. Линейный характер дозовых кривых (например, для параметра V) свидетельствует о возможности использования водорослей в качестве биологических датчиков (в наших опытах –до 1000 Гр) для биотестирования ионизирующего излучения. Кроме того, концепция мишени, предполагающая структурно-функциональную гетерогенность клетки для воздействующего ионизирующего излучения, позволяет реализовать оценки объема и массы мишеней, ответственных за поражение той или иной реакции. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, изучено влияние освещенности, температуры, рН, напряженности электрических полей, ультрафиолетового и ионизирующего излучений на параметры фотодвижения двух видов Dunaliella: подвижность (относительное число подвижных клеток от общего числа клеток, Nm /N0, %), скорость (V, мкм/с) и направление движения клеток (F, отн. ед.), а также взаимодействие некоторых факторов окружающей среды (освещенности, температуры, напряженности электрических полей) при их одновременном воздействии на фотодвижение водорослей. Максимальные значения подвижности, скорости движения клеток, положительного и отрицательного фототопотаксиса отмечены при температуре 20-30 0С и наблюдались в пределах рН 6,50-8,47, причем оптимумы рН для различных параметров фотодвижения неоднозначны. Неодинакова также чувствительность разных параметров фотодвижения к предельным значениям рН среды. Приложение электрических полей подавляло фототопотаксис Dunaliella, как и других водорослей (Chlamydomonas reinhardtii, Haematococcus pluvialis), что свидетельствует об участии биоэлектрических потенциалов в этом процессе. Повышение температуры от 18 до 30 0С снимает ингибирующее влияние напряженности электрического поля и стимулирует фототопотаксис обоих гипергалобных видов Dunaliella. Используемые в наших экспериментах пределы изменения освещенности образца (100 и 500 лк) и температуры (18 и 30 0С) находятся, как видно, вблизи максимальных точек зависимости параметров фотодвижения исследуемых видов водорослей от внешних факторов, которые могут конкурировать и друг с другом, и с электрическим полем, усиливая или ослабляя влияние других факторов при совместном действии. Подобными конкурирующими и зачастую противоположными действиями внешних факторов можно объяснить также различия в экологии и поведении видов Dunaliella в условиях естественных бассейнов [Масюк, 1973]. Ионизирующее и ультрафиолетовое излучения ингибируют фототопотаксисD. salina и D. viridis. Ингибирующий эффект зависит от дозы облучения, а в случае использования УФ излучения - и от длины волны. Ионизирующее в пределах до 600 Гр, а также ультрафиолетовое излучения не влияют на скорость движения клеток Dunaliella. Впервые у видов Dunaliella под влиянием УФ облучения обнаружено - 77 -

преобразование положительного фототопотаксиса в отрицательный с последующим ингибированием его до нулевых значений. В пределах доз, испытанных в опытах, воздействие ультрафиолетового излучения обратимо; ионизирующее излучение подавляет способность клеток Dunaliella к фотодвижению необратимо, причем два вида этого рода проявляют неодинаковую чувствительность к ультрафиолетовому и gизлучению. Один из параметров фотодвижения - относительное число подвижных клеток (Nm/N0) в популяциях Dunaliella колеблется от 0 до 100 % и демонстрирует те же зависимости от характеристик светового стимула и условий окружающей среды, что и фототопотаксис, существенно отличаясь по наличию/отсутствию и степени таких зависимостей от ряда факторов (рН, интенсивность и длина волны падающего света, доза предварительного ионизирующего и ультрафиолетового облучения) от фотокинеза, что свидетельствует о возможных различиях в структуре и размерах фоторецепторных систем, ответственных за разные параметры фотодвижения у одного и того же и разных видов.

- 78 -

ГЛАВА 6 СТРУКТУРА ФОТОРЕЦЕПТОРНОЙ СИСТЕМЫ 6.1. ПРОБЛЕМЫ ФОТОРЕЦЕПЦИИ У ВОДОРОСЛЕЙ Проблема фоторецепции у водорослей имеет несколько аспектов: 1) местоположение и структура фоторецепторной системы; 2) состав фоторецепторных пигментов; 3) механизмы фоторецепции. Длительное время – в течение почти 100 лет считали, что функцию фоторецепции в клетках жгутиковых водорослей выполняет стигма («светочувствительное пятно», «глазок», «вічко», «еyespot», «Augenflecke») [см. обзоры: Dodge, 1973; Седова, l977; Ettl, 1980; Масюк, Посудин, 1991б]. Предположение о фоторецепторной роли стигмы впервые было высказано в конце прошлого столетия [Engelmann, 1982a, b]. Косвенно это предположение подтвердили многочисленные известные факты ее наличия в подвижных окрашенных вегетативных и репродуктивных клетках водорослей, ее исчезновения в материале, длительное время хранящемся в темноте, и восстановления при перенесении на свет [Kivic, Vesk, I972, 1974]. Сохранение стигмы в неподвижных клетках многих тетраспоральных водорослей рассматривается как пример атавизма, что подтверждается ее полным исчезновением на коккоидном уровне организации вегетативного тела водорослей. Вместе с тем известны многочисленные случаи отсутствия стигмы в подвижных клетках водорослей (Raphidophyta, многие Haptophyta; зооспоры Chlorhormidium flaccidum (Kütz.) Fott, Coleochaete Bréb., Urospora penicilliformis (Roth) Aresch., подвижные жгутиковые мужские гаметы Bacillariophyta, Bryopsis hypnoides Lamour.). Эти случаи трудно объяснимы с позиций гипотезы фоторецепторной функции стигмы, поскольку лишенные стигмы клетки этих водорослей способны реагировать на свет. В начале ХХ ст. была высказана еще одна гипотеза, согласно которой функцию фоторецептора в подвижных клетках водорослей выполняет особая область у основания одного из жгутиков, воспринимающая сигналы стигмы [Mast, 1927]. В настоящее время можно считать доказанным, что стигма играет вспомогательную роль модулирующего свет устройства в процессах фоторецепции жгутиковых водорослей. Таким образом, фоторецепторные системы у этих водорослей, как правило, состоят из собственно фоторецептора и модулирующей свет стигмы. Фоторецепторные системы жгутиковых водорослей из разных отделов и классов различаются по структуре, местоположению и принципам действия [Foster, Smyth, 1980; Kivic, Walne, 1983; Greuet, 1987 и др.]. Детальное рассмотрение этих систем в пределах различных высших таксонов водорослей приведено в работе [Масюк, Посудин, 1991б]. Здесь мы ограничимся сравнительным анализом фоторецепторных систем зеленых водорослей. 6.2. СТРУКТУРА ФОТОРЕЦЕПТОРНЫХ СИСТЕМ ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ Фоторецепторная система зеленых жгутиковых водорослей состоит из обычно хорошо заметной стигмы и фоторецептора, местоположение и структура которого с точностью не установлены. Стигма является частью хлоропласта, расположена у его поверхности, непосредственно под двухмембранной оболочкой хлоропласта, тесно примыкающей к плазмалемме. Она состоит из одного или нескольких (до девяти) слоев пигментированных глобул. В многослойных стигмах указанные слои разделены промежутками, в которых находится бесцветная строма хлоропласта, а иногда заходят также фотосинтетические ламеллы или отдельные тилакоиды, обычно лишенные пигментов [Foster, Smyth, 1980]. Стигма зеленых водорослей принадлежит к типу А по классификации Дж. Д. Доджа [Dodge, 1973] (рис. 6.1).

- 79 -

Рис.6.1.Различныетипы стигм, обнаруженные в клетках эукариотических водорослей: 1 – Chlamydomonas Ehrenb. (тип А); 2 –Dino- bryon Ehrenb. (тип В); 3 –Euglena Ehrenb. (тип С); 4 –Glenodinium (Ehrenb.) Stein (типД); 5 – Nematodinium (тип Е); а хлоропласт; б – стигма; в – пластинчатое тело; г – линзовидное тело; д – ретиноид; е – пигментированные тела; ж – паражгутитковое тело (по Dodge, 1973).

Ещё С.О. Маст [Mast, I927] заметил, что при освещении прямыми лучами солнечного света глазки колониальных зеленых водорослей Pandorina Bогу и Eudorina Ehrenb. отражают зеленоватоголубой свет, причем более крупные передние глазки отражают больше света, чем задние, более мелкие. В трансмиссионном световом микроскопе этот эффект незаметен, так как отраженный свет не достигает глаза. Маст впервые высказал предположение, что описанный феномен имеет значение в фототопотаксисе этих водорослей. Впоследствии описанное Мастом явление было подтверждено с помощью современных технических средств и зафиксировано на фотопленке [Foster, Smyth, 1980]. В рефлектирующих глазках зеленых водорослей пигментированные глобулы в пределах каждого слоя располагаются плотно, в гексагональном порядке (рис. 6.2); расстояния между центрами глобул колеблются от 75 до 100 нм [Nakamura et al., 1973; Bray et al., 1974]. Используя электронномикроскопическую фотографию среза четырехслойной стигмы Chlamydomonas reinhardtii P.A. Dang., изготовленную с помощью специальной методики [Linder, Staehelin, 1979], максимально сохраняющей структуру объекта (рис. 6.3), К. Фостер и Д. Смис [Foster, Smyth, 1980] измерили толщину пигментированных (69,0 нм) и непигментированных (77,7 нм) слоев, а также толщину окруженного мембраной тилакоида (15,4 нм), прилегающего к внутренней поверхности каждого пигментированного слоя стигмы. Учитывая эти данные и различия в индексах преломления пигментированного и непигментированного слоев стигмы, К. Фостер и Д. Смис рассчитали с помощью компьютера, что отражательные свойства такой стигмы очень близки к таковым четвертьволновой пластины (рис. 6.4)

- 80 -

Рис. 6.2.Тонкая структура стигмы уChlamydomonas Ehrenb.: 1 -Двухслойная стигма Ch.reginae Ettl et Green, продольный срез через два слоя пигментированных глобул, между которыми видны тилакоиды; 2 - стигма того жевидасповерхности;3-одослойная стигма С. moewusii Gerloff продольный срез; 4 стигматого же вида при болеесильном увеличении с поверхности; 1, 2 - по Ettl,Green, 1973; 3, 4 - по Walne, Arnott, 1967.

Используя опубликованные в литературе микрофотографии стигм других видов зеленых водорослей (Volvulina pringsheimii Starr, Platydorina caudata Kofoid, Volvox aureus Ehrenb., V. tertius Meyer, Pteromonas tenuis Belcher et Swale, Pyramimonas montana Geitl., Eudorina illinoisensis (Kofoid) Pascher), К. Фостер и Д. Смис пришли к выводу, что и у этих видов стигмы построены по принципу четвертьволновой пластины [Foster, Smyth, 1980], выполняя функцию интерференционного рефлектора. Ультраструктурное исследование поверхности прилегающих к стигме мембран (плазмалеммы и мембран хлоропласта) у безоболочкового мутанта Chlamydomonas reinhardtii методом замораживанияскалывания обнаружило высокую степень их специфичности. Плазмалемма в районе стигмы хактеризуется более плотным расположением внутримембранных частиц по сравнению с остальной ее поверхностью (рис. 6.5). Здесь преобладают более мелкие частицы диаметром 8-12 нм, а более крупные (I6-20 нм) находятся за пределами прилегающей к стигме зоны. Аналогичная картина обнаружена на наружной мембране хлоропластной оболочки в районе стигмы, однако здесь внутримембранные частички еще мельче (2-6 нм). Плазмалемма и наружная мембрана хлоропластной оболочки в районе стигмы тесно скреплены друг с другом, промежуток между ними составляет 20-30 нм. Предполагается, что специализированные участки обеих мембран принимают участие в процессах фоторецепции и первичных сенсорных преобразований, связанных с фототопотаксисом [Melkonian, Robenek, 1980]Таким образом, фоторецептор зеленых водорослей, по всей вероятности, находится на мембранах, расположенных между стигмой и прилегающей частью клеточной оболочки.

82

Рис.

6.3.

Продольный

срез

через

стигму

Chlamydomonas reinhardtii на котором видны 4 слоя пигментированных глобул с подстилающими их изнутри двойными тилакоидными мембранами [Foster, Smyth, 1980]

Рис. 6.4. Интерференционный рефлектор, типа четвертьволновой

пластины,

состоящей

из

чередующихся слоев, толщина которых равна ¼ длины волны, с высоким (В) и низким (Н) показателями преломления. Волнистые стрелки показывают прохождение и отражение световой волны

в

различные

Вертикальные максимальной

промежутки

стрелки

времени.

показывают

интенсивности

света

зоны [Foster,

Smyth, 1980

83

Рис. 6.5. Высокая плотность иквазикристаллическое расположение мелких внутримембранных частиц на обращенной к цитоплазмеповерхности плазмалеммыChlamydomonasreinhardtiiР. А. Dang. в районе,прилегающем к стигме (очерчено линией), (фото М. Мелкониана, из: Nultsch, 1983).

Структурная специализация внутримембранных частиц на цитоплазматической поверхности (PF, protoplasmic face, согласно терминологии [Branton et al., 1975]) плазмалеммы в области глазка обнаружена у всех исследованных видов. Показано, что плазмалемма Chlamydomonas reinhardtii в районе глазка специализирована также в отношении химического состава протеинов и липидов [Melkonian, 1981; Melkonian, Robenek, 1984]. Что касается наружной мембраны хлоропластной оболочки, то здесь выявлены разнообразные варианты от полного отсутствия структурной специализации до ее отчетливой выраженности. На внутренней мембране хлоропластной оболочки и тилакоидных мембранах специализация внутримембранных частиц в районе глазка не обнаружена [см. обзор: Melkonian, Robenek, 1984]. Если световые лучи попадают на боковую часть клетки, где расположена стигма, фоторецептор получаетсигнал, усиленной интенсивности равной сумме интенсивностей падающего и отраженного света. Если освещается противоположная сторона клетки, сигнал полученный фоторецептором, ослабляется благодоря абсорбции света внутренним содержимым клетки и стигмой, а также отражением от стигмы. Таким образом, модулируя свет, стигма образует антенну, определяющую местоположение источника света.

84

Описанный эффект усиливается, благодаря чередованию в стигме нескольких пигментированных и непигментированных слоев с периодичностью примерно равной 1/4 длины волны востринимаемого света. При освещении клетки со стороны стигмы в результате интерференции падающего и отраженного света несколькими пигментированными слоями стигмы образуется несколько максимумов интенсивности, местоположение которых совпадает с расположением плазмалеммы и тилакоидных мембран, находящихся внутри стигмы. При освещении клетки с противоположной стороны возникают несколько минимумов в тех же положениях внутри стигмы, что усиливает контраст в восприятии света, падающего с двух противоположных сторон. На основании этих данных предполагается, что фоторецепторные пигменты локализированы, как на наружных мембранах (плазмалемме и наружной мембране хлоропластной оболочки), так и на тилакоидных мембранах [Foster, Smyth, 1980]. Подобные предположения высказывались и ранее. Возможность расположения фоторецептора на плазмалемме в районе стигмы аргументировалась тем, что такая локализация обеспечивает прямую связь фоторецептора с локомоторным аппаратом, так как плазмалемма непосредственно переходит в мембрану, окружающую жгутики [Arnott, Brown, 1967; Walne, Arnott, 1967]. Связь внутренних мембран с жгутиками не столь очевидна. Однако, для многослойных стигм, где создается несколько зон интерференционных контрастов, предположение о локализации фоторецепторных пигментов не только на наружных мембранах, но и внутри стигмы, на поверхности тилакоидных мембран, представляется весьма вероятным. Использование наряду с наружными (плазматической и хлоропластной) мембранами внутренних тилакоидных может увеличивать площадь фоторецепции и усиливать ее эффективность [Foster, Smyth, 1980]. Следует заметить, что у криптофитовых водорослей фоторецептор также находится внутри хлоропласта. Структура фоторецепторного ("глазкового") аппарата изучена примерно у 90 видов зеленых водорослей по более 30 различным признакам (см. обзор: Melkonian, Robenek, I984), причем обнаружены значительные пределы вариабельности этих признаков. По своей форме глазки бывают эллипсоидными, яйцевидными, палочковидными, округлыми или неправильными, иногда треугольными Их наружная поверхность в зависимости от количества слоев пигментированных глобул может быть плоской, вогнутой или выпуклой. Размер глазков колеблется от 0,28 мкм2 (в зооспорах Chlorosarcinopsis gelatinosa Chantanachat et Bold) до 9 мкм2 в передних вегетативных клетках Volvox (L.) Ehrenb. и в женских гаметах Bryopsis lyngbye Lyngb. = B. plumosa (Hudson) C.Ag.). Количество пигментированных глобул в одном глазке варьирует от 25 (в зооспорах Pleurastrum sp.) до 2000 (Volvox sp.). Размеры глобул обычно находятся в пределах 80-130 нм, иногда достигают 200 нм. Обычно размер глобул в глазках зеленых водорослей довольно постоянен, однако иногда наблюдаются различия даже в пределах одного глазка - в разных слоях или даже в одном слое. В последнем случае различия в размерах пигментированных глобул коррелируют с нарушением правильной плотной гексагональной их упаковки. У некоторых празинофициевых (Nephroselmis olivacea Stein, Mamiella gilva (Parke et Rayns) Moestrup) в глазках, составленных из разновеликих глобул, гексагональная упаковка глобул не наблюдается. По своей электронной плотности глобулы глазка отличаются от других осмиофильных глобул в том же хлоропласте (пластоглобул, пиреноглобул), что свидетельствует о различиях в их химическом составе. Иногда наблюдаются различия в электронной плотности глобул в пределах глазка. У Nephroselmis Stein периферические глобулы более плотные, чем внутренние, а в зооспорах Fritschiella Iyengar и Cylindrocapsa Reinsch глобулы разной плотности беспорядочно расположены в пределах одного слоя. В стигмах различных представителей зеленых водорослей наблюдаются разные варианты взаимного расположения слоев пигментированных глобул и тилакоидных мембран (рис. 6.6). Различают три основных типа. 1. Тип Chlamydomonas Ehrenb. Между слоями пигментированных глобул находится единственный тилакоид тесно прижатый к тыльной стороне глобулярного слоя (рис. 6.3, 6.6, 1). Между этим тилакоидом и последующим слоем глобул находится довольно обширное пространство, заполненное гранулированным веществом. При удачной фиксации материала этот промежуток выглядит электроннопрозрачным. Такой тип - 84 -

строения наблюдается в многослойных стигмах двужгутиковых хламидомонадовых (Chlamydomonadaceae) и четырехжгутикового Hafniomonas Ettl et Moestrup [Foster, Smyth, I980; Ettl, Moestrup, I980; Melkonian, Robenek, 1984]. 2. Тип Tetraselmis Stein. Между слоями пигментированных глобул находится слегка раздутый единственный тилакоид, контактирующий с обоими смежными глобулярными слоями (см. рис. 6.6, 3). Такой тип строения наблюдается в двухслойных стигмах видов Tetraselmis Stein и Carteria Dies., а также зооспор Schizomeris leibleinii Kütz., Uronema belkae, Ulothrix zonata Kütz., гамет Acetabularia mediterranea Lamour. [Manton, Parke, 1965; Parke, Manton, 1965, 1967; Crawley, 1966, I970; McLachlan, Parke, 1967; Birkbeck et al., 1974; Melkonian, Robenek, 1979, 1984; Foster, Smyth, 1980; Hertz et al., 1981]. 3. Тип Pyramimonas Schmarda. Тилакоиды между слоями пигментированных глобул отсутствуют (см. рис. 6.6, 5), Промежутки между пигментированными слоями электроннопрозрачные, однако содержат волокнистое вещество, связанное с тыльной поверхностью глобулярных слоев.

Рис. 6.6.Схема возможных комбинаций слоев пигментированных глобул и тилакоидных мембра в стигмах зеленых водорослей, функционирующих по принципу четвертьволновой пластины; 1 - тип Chlamydomonas Ehrenb., тилакоиды подстилают слои пигментированных глобул тыльной (внутренней) стороны; 2 - тип, до сих по не обнаруженный, тилакоиды прилегают к наружной поверхности слоев, пигментированных глобул; 3 - тип Tetraselmis Stein, мешковидно раздутые тилакоиды контактируют одновременно с двумя слоями пигментированных глобул; 4 структура, ошибочно приписываемая некоторым видам Carteria Dies. и Chlamydomonas, слои пигментированных глобул находятся внутри тилакоидов; 5 - тип Pyramimonas Schmarda, тилакоиды между слоями пигментированных глобул отсутствуют [Foster, Smyth, 1980].

Этот тип строения наблюдается только у видов одного рода окрашенных жгутиконосцев, если не считать бесцветных представителей Polytoma Ehrenb. и Polytomella Aragao, стигмы которых расположены в лейкопластах, вообще лишенных тилакоидов. В двухслойных глазках Pyramimonas orientalis Butcher [Moestrup, Thomsen, 1974] тыльная сторона второго слоя глобул связана с тилакоидами или с противоположной стороной хлоропластной оболочки, поскольку они расположены в очень тонких передних долях хлоропласта. В многослойных глазках P. parkeae Norris et Pearson [Norris, Pearson, 1975] даже самый внутренний глобулярный слой не контактирует с тилакоидами. Однако, различные глобулярные слои связаны друг с другом непрерывными переходами на их краях. Благодаря этому образуется жесткая конструкция с постоянными промежутками между отдельными слоями при отсутствии каких-либо посторонних опорных структур (например, в виде тилакоидов) между слоями [см. обзор: Melkonian, Robenek, 1984]. В литературе обсуждается еще один тип структуры стигмы, в которой глобулярные слои якобы находятся внутри тилакоидов (см. рис. 6.6, 4). Однако, этот вариант, повидимому, возник в результате ошибочной (по мнению [Foster, Smyth, 1980]) интерпретации опубликованных микрофотографий глазков Carteria turfosa Fott [Joyon, Fott, 1964], C. crucifera Korsch. [Lembi, Lang, 1965] и необычной морской - 85 -

хламидомонады - Chlamydomonas reginae Ettl et Green [Ettl, Green, 1973]. В действительности глазки этих видов по своей структуре принадлежат к типу Tetraselmis Stein [Melkonian, Robenek, 1984]. У многих зеленых водорослей стигма содержит только один слой пигментированных глобул, расположенный у самой поверхности хлоропласта, который в этом месте тесно соприкасается с плазмалеммой. Однослойные стигмы такого типа наблюдаются у Mantoniella squamata (Manton et Parke) Desikach., Monomastix Scherff., Nephroselmis Stein, ряда видов Chlamydomonas, в подвижных репродуктивных клетках многих представителей Chlorococcales, Chlorosarcinales, Bryopsidales, Ulvales, Ulotrichales, Chaetophorales [см. обзоры: Foster, Smyth, 1980; Melkonian, Robenek, 1984]. В однослойных стигмах пигментированные глобулы подстилаются либо ламеллами хлоропласта (см. рис. 6.2, 3), либо бестилакоидным гранулярным веществом (рис. 6.7).

Рис. 6.7. Однослойная стигма Chlamydomonas stigmatica, подстилаемая бестилакоидным гранулярным матриксом, масштаб 0,5 мкм [Deason, Floyd, 1987].

Cчитают, что несмотря на различия в морфологии и тонкой структуре стигм зеленых водорослей, все они функционируют по принципу простого или четвертьволнового интерференционного рефлектора [см. обзоры: Foster, Smyth, I980; Melkonian, Robenek, 1984]. Между наружной мембраной хлоропластной оболочки и тесно связанной с ней в районе стигмы плазмалеммой постоянно сохраняется промежуток, толщина которого у разных видов (измерено около 50 видов [Melkonian, Robenek, 1984]) колеблется в пределах 10-53 нм, среднее значение – 24,5 нм. У одноклеточных из родов Pedinomonas Korsch., Mesostigma Lauterborn, Nephroselmis это расстояние шире (3040-53 нм), в подвижных репродуктивных клетках многоклеточных из порядков Microthamniales, Ulotrichales и Ulvales оно значительно уже (10-17 нм). В этом промежутке отсутствуют рибосомы и другие органеллы, обычно также микротрубочки. Если микротрубочки присутствуют, они принадлежат жгутиковой корешковой системе. Лишь у видов Hafniomonas Ettl et Moestrup и Pyramimonas Sсhmarda в этой зоне могут наблюдаться вторичные цитоскелетные микротрубочки. В промежутке между наружной мембраной хлоропластной оболочки и плазмалеммой в районе стигмы иногда наблюдается скопление фибриллярного материала, причем отдельные фибриллы могут образовывать поперечные связки между этими двумя мембранами. У ряда водорослей (Microthamniales, некоторые Ulotrichales и Ulvales) узкое пространство между этими мембранами в области стигмы заполнено веществом с высокой электронной плотностью. Иногда плазмалемма, покрывающая стигму, слегка утолщена [см. обзор: Melkonian, Robenek, 1984]. Стигма зеленых водорослей всегда расположена у поверхности клетки. Она может находиться в плоскости биения жгутиков или может быть смещена в ту или иную сторону под разным углом от этой плоскости (если рассматривать клетку спереди). Стигма может быть передней, медиальной или задней. Она может занимать разное положение по отношению к месту прикрепления жгутиков. Различают следующие типы размещения стигмы в клетках зеленых водорослей [Melkonian, Robenek, 1984]. Тип I. Стигма расположена напротив места прикрепления жгутиков и не связана с микротрубочковыми жгутиковыми корешками (рис. 6.8, 1, 2). Этот тип наблюдается у некоторых Prasinophyceae (Mantoniella Desikach., Mamiella Moestrup) с латеральным положением одного или двух - 86 -

жгутиков, работающих волнообразно (Mantoniella, Mamiella) или Mesostigmatophyceae, где жгутик работает по типу гребного удара (Mesostigma). Фоторецепторный аппарат направлен перпендикулярно к направлению движения клетки, функционируя в качестве пространственной антенны. Тип 2. Стигма расположена напротив места прикрепления жгутика, между двумя микротрубочковыми жгутиковыми корешками (рис. 6.8, 3), Этот тип наблюдается только у видов Pedinophyceae. Единственный, направленный назад и работающий волнообразно жгутик прикреплен латерально на узкой стороне уплощенной клетки, а на противоположной узкой стороне клетки находится фоторецепторный аппарат, расположенный перпендикулярно к направлению движения клетки. У Pedinomonas minor Korsch. стигма находится посредине между двумя жгутиковыми корешками с двумя и тремя микротрубочками с некоторым смещением в сторону трехтрубочкового корешка [Ettl, Manton, 1964]. Тип 3. Стигма находится сбоку от места прикрепления апикальных жгутиков и не связана с жгутиковыми микротрубочковыми корешками (рис. 6.8, 4-6). Этот тип наблюдается у Chlorodendrophyceae и Prasinophyceae с четырехжгутиковыми клетками (Tetraselmis и Pyramimonas). У видов Tetraselmis четыре жгутика сгруппированы парами и работают по типу гребного удара практически в одной плоскости, у видов Pyramimonas они также работают по типу гребного удара, но раздельно в двух взаимно перпендикулярных плоскостях. У изученных видов обоих родов стигма может находиться в плоскости биения жгутиков или может быть смещена в ту или иную сторону под разными углами к этой плоскости. Она может быть передней, медиальной или задней. Стигма не связана с микротрубочковыми корешками, но у видов Tetraselmis находится вблизи от дистального конца волокнистого жгутикового корешка (ризопласта, системы II волокон). Во всех случаях фоторецепторный аппарат расположен латерально, перпендикулярно по отношению к направлению движения клетки. У некоторых видов Pyramimonas (P. tetra-rhynchus Schmarda, P. orientalis Butcher) наблюдаются по два глазка, расположенных в соседних долях хлоропласта и, повидимому, функционирующих в качестве единой фоторецепторной системы. Тип 4. Стигма расположена сбоку от места прикрепления латеральных жгутиков и связана с уникальным микротрубочковым жгутиковым корешком, гомологичным двухтрубочковому корешку системы X-2-X-2 (рис. 6.9, 1). Этот тип свойственен роду Nephroselmis (Prasinophyceae). У всех изученных видов этого рода стигма расположена в передней части клетки, под более коротким из двух гетероконтных и гетеродинамичных жгутиков. Во время движения клетки этот жгутик направлен вперед, слегка согнут и неподвижен, а второй более длинный, направлен назад и производит волнообразные движения. Стигма связана с необычным 10-12-трубочковым жгутиковым корешком, который в единственном числе отходит от одного из базальных тел (от другого базального тела, как обычно, отходят два микротрубочковых корешка), проделывая изогнутый путь и проходя между плазмалеммой и хлоропластом через фоторецепторный аппарат. Тип 5. Стигма расположена сбоку от места прикрепления апикальных жгутиков и связана с микротрубочковым корешком Х-типа ("левый" корешок по терминологии М. Мелкониана [Melkonian, 1984]) крестообразной корешковой системы Х-2-Х-2 (рис. 6.9, 2, 3). Этот тип наблюдается у многих зеленых водорослей из классов Chlorophyceae sensu Mattox et Stewart, Ulvophyceae Stewart et Mattox, а также из порядка Microthamniales sensu Melkonian. Жгутики этих водорослей работают по типу гребного удара, а стигма обычно

- 87 -

Рис. 6.8. Расположение стигмы (черное пятно) и направление движения клетки (стрелка) у разных видов, зеленых жгутиковых водорослей: 1 – Mamiella gilva (слева - клетка в продольном разрезе, справа - вид сбоку, со стороны, несущей жгутики); 2 – Mesostigma viride (слева - вид клетки со стороны, несущей жгутики, положение стигмы на противоположной стороне клетки обозначено пунктиром; справа - клетка в продольном разрезе); 3 – Pedinomonas minor (слева - клетка в продольном разрезе, справа - со стороны несущей единственный жгутик, рядом с которым находится второе базальное тело; положение стигмы на противоположной стороне клетки обозначено пунктиром); 4 – Tetraselmis cordiformis (слева - вид клетки с широкой стороны,

на которой расположена стигма, справа -

поперечный разрез через клетку в районе жгутиковой ямки; точками обозначено положение жгутиков, пунктиром стигму); 5 – Pyramimonas tetrarhynchus (слева - вид клетки с боковой cтороны, на которой находятся две стигмы, справа поперечный разрез через клетку в районе стигм, расположенных в двух соседних долях хлоропласта; точками обозначено положение четырех жгутиков в районе жгутиковой ямки и у наружных боковых поверхностей клетки); 6 – Pyramimonas grossii (слева - вид клетки сбоку, справа - в поперечном разрезе через переднюю часть в районе стигмы и жгутиковой ямки [Melkonian, Robenek, 1984].

- 88 -

Рис. 6.9. Схема взаимосвязанного расположения стигмы и двигательного аппарата в клетках разных видов зеленых водорослей: 1 – Nephroselmis olivacea (Prasinophyceae), слева - клетка с широкой стороны, справа - с узкой, стигма (черное пятно) находится под более коротким жгутиком; 2 – поперечный разрез через клетку двужгутиковой зеленой водоросли типа Chlamydomonas (Chlorophyceae), стигма расположена между микротрубочками левого корешка типа Х, отходящего от базального тела № 1 (терминология Melkonian, 1984); 3 – поперечный разрез через репродуктивнную клетку Ulvophyceae

(включая Microthamniales); стигма находится у одного края левого

микротрубочкового корешка типа Х, отходящего от базального тела № 1; 4 – поперечный разрез через женскую гамету

бриопсидальной

водоросли

(Bryopsis,

Caulerpa);

стигма

находится

между

левым

и

правым

микротрубочковыми корешками, отходящими от базального тела № 1; темная прямая стрелка указывает направление поступательного движения клетки; темные изогнутые стрелки – направление вращательного движения клетки; светлые стрелки – плоскость биения жгутиков [Melkonian, Robenek, 1984].

смещена от плоскости биения жгутиков на 20-45º по часовой стрелке. В области стигмы микротрубочки Хкорешка прикрепляются к наружной мембране хлоропластной оболочки, располагаясь следующим образом по отношению к стигме. У двужгутиковых зеленых водорослей типа Chlamydomonas микротрубочковый корешок в области стигмы разделяется на две части: с одной стороны стигмы проходит одна микротрубочка, с другой – три или четыре (см. рис. 6.9, 2). У четырехжгутковых Chlorophyceae, Ulvophyceae и двужгутиковых Microthamniales все микротрубочки Х-корешка проходят монолитной группой вдоль одного края стигмы (см. рис. 6.9, 3). В тех случаях, когда стигма очень велика (как, например, в женских гаметах некоторых Bryopsidales), она может располагаться между двумя микротрубочковыми корешками, правым и левым, отходящими от одного и того же базального тела (см. рис. 6.9, 4). Характер пространственной взаимосвязи стигмы с жгутиковыми корешками не зависит от того, где расположена стигма, спереди, посредине клетки или сзади, так как корешки проходят вдоль всей длины клетки. Расположение стигмы вдоль продольной оси клетки может варьировать даже в пределах одной популяции (например, в зооспорах Microthamnion kuetzingianum Näg. [Watson, 1975]). Все же у большинства представителей Chlorophyceae стигма обычно передняя или медиальная, у Ulvophyceae – медиальная или задняя. Во всех случаях фоторецепторный аппарат расположен перпендикулярно к направлению движения клетки. Фоторецепторный аппарат зеленых водорослей в ходе деления их клеток может передаваться дочерним клеткам тремя способами. Он может делиться надвое бороздой деления. Этот способ наблюдается - 89 -

у всех тех празинофициевых водорослей, у которых стигма не связана с микротрубочковыми жгутиковыми корешками (типы 1-3); она всегда располагается в плоскости деления клетки [Barlow, Cattolico, 1980; Melkonian, Robenek, 1984]. Если стигма связана с микротрубочковым жгутиковым корешком (типы 4, 5), то во время деления она либо остается в одной из дочерних клеток, а в другой формируется de novo (Nephroselmis, Chlamydomonas и др.), либо стигма материнской клетки перед ее делением исчезает, а дочерние клетки образуют новые стигмы (неподвижные зеленые водоросли, формирующие подвижные репродуктивные клетки, всегда образуют стигмы de novo; как это происходит, неизвестно). Предполагают, что в образовании стигмы de novo принимают участие пиреноглобулы, мигрирующие к поверхности хлоропласта [Melkonian, 1981; Melkonian, Robenek 1984]. Считают, что жгутиковые корешки определяют место формирования новых стигм и стимулируют начало этого процесса [Melkonian, Robenek, 1984]. Сложность и разнообразие строения и локализации фоторецепторных систем зеленых водорослей обусловливают возможность использования этих данных в систематике и филогенетике. Наиболее полезны для этих целей следующие признаки: форма и место локализации стигмы в клетке, количество и размер глобул, характер их расположения в слоях, количество слоев, специализация фоторецепторных мембран, способ наследования фоторецепторных систем дочерними клетками [Melkonian, Robenek, 1984]. Наиболее разнообразны фоторецепторные системы в пределах класса Prasinophyceae, что коррелирует с их разнообразием по другим ультраструктурным признакам (строение локомоторного аппарата, механизмы митоза и цитокинеза) и свидетельствует в пользу гетерогенности этого таксона. Даже в пределах одного рода Pyramimonas наблюдаются 4 разных типа строения фоторецепторных систем, согласующиеся с разными типами чешуек на поверхности клеток и типами чешуйчатых резервуаров, с особенностями строения жгутиковой корешковой системы, с наличием или отсутствием эджективных органелл. Такая корреляция, несомненно, свидетельствует о высоком филогенетическом весе указанных признаков. Совершенно обособленное положение в системе зеленых водорослей по целому комплексу морфологических и ультраструктурных признаков (включая особенности строения, локализации и способа наследования фоторецепторной системы) занимают Pedinophyceae. Своеобразный тип фоторецепторной системы наблюдается у представителей Microthamniales [Melkonian, Robenek, 1984]. Разные типы фоторецепторных систем обнаружены у близких родов Carteria и Chlamydomonas. Различия в строении стигм отмечены также у видов одного рода (Chlamydomonas reinhardtii, Ch. moewusii Gerloff), отличающихся одновременно по структуре клеточной оболочки, жгутикового аппарата и поведению при спаривании [см. обзор: Melkonian, Robenek, 1984]. Все эти данные следует учитывать при обсуждении путей эволюции и принципов классификации зеленых водорослей. К сожалению, функциональное значение выявленных структурных типов фоторецепторных систем зеленых водорослей до настоящего времени не раскрыто, так как сведения о фотоповедении зеленых водорослей касаются лишь немногих модельных объектов. В частности, особый интерес в этом плане представляют мелкие асимметричные зеленые жгутиконосцы, рассматриваемые в качестве исходных в эволюции зеленых водорослей [Mattox, Stewart, 1984; Melkonian, 1984]. Несмотря на скудность имеющихся данных, сделана первая попытка рассмотреть вероятную историю развития фоторецепторных систем и фотоповедения зеленых водорослей в процессе их эволюции, имеющая в значительной степени спекулятивный характер [Melkonian, Robenek, 1984]. Считают, что фоторецепторные пигменты (типа родопсина или бактериородопсина [Foster, Smyth, 1980; Foster et al., 1984]), беспорядочно рассеянные в плазмалемме, были свойственны предкам зеленых водорослей еще до эндосимбиотического приобретения ими пластид (бактериородопсин, рассеянный в цитоплазматической мембране, имеется уже у прокариотической Halobacteria, принадлежащей к группе Archaebacteria, которую ныне считают связанной с предшественниками эукариот [Fox et al., 1980; George et al., 1983; Schnabel et al., 1983]). Такие бесцветные жгутиконосцы с одним или двумя задними жгутиками, производящими волнообразные движения и содержащие рассеянные в плазмалемме фоторецепторные пигменты, способны были к осуществлению простейших фотофобических реакций [Melkonian, 1983, 1984]. В дальнейшем произошла концентрация фоторецепторных пигментов, что привело к усилению светового сигнала, и локализация их на стороне, противоположной месту прикрепления жгутиков. Стигма, содержащая - 90 -

каротиноидные пигменты с абсорбционными свойствами, подобными таковым родопсина, а также способность к фототопотаксису возникли после эндосимбиотического включения хлоропластов. Фоторецепторная система, обеспечивающая расположение фотосинтетической органеллы в оптимальных световых условиях, по-видимому, возникла очень рано в эволюции зеленых водорослей. Первоначально она включала один слой пигментированных глобул, затеняющих фоторецептор и увеличивающих разницу в степени его освещенности в различные моменты времени при разных положениях организма относительно источника света. Этот слой, по-видимому, образовался из присутствующих в хлоропласте липидных глобул (пластоглобул) и на первых порах не имел фиксированного положения. Затем размер глобул и расстояние между ними и фоторецептором стали строго фиксированными - возникла фоторецепторная система. Перемещение жгутиков в апикальное положение, изменение характера их движения (от волнообразного к движению по типу гребного удара) вызвало перемещение фоторецепторной системы вдоль плоскости деления клетки в боковое по отношению к месту прикрепления жгутиков и перпендикулярное по отношению к направлению движения клетки. Дальнейшим событием в эволюции фоторецепторной системы зеленых водорослей было возникновение связи с микротрубочковой корешковой системой, обеспечивающей ее фиксированное положение по отношению к плоскости биения жгутиков, а затем возникновение многослойных стигм. Последние события, по-видимому, были неоднократными в эволюции зеленых водорослей. Возможна также вторичная утрата фоторецепторных систем подвижными репродуктивными клетками многих зеленых водорослей (в том числе представителями целого класса Charophyceae sensu Stewart at Mattox), особенно в связи с переходом к наземному образу жизни или развитием оогамии [Melkonian, Robenek, 1984]. В изложенном гипотетическом ходе эволюции фоторецепторных систем зеленых водорослей многие положения основаны на догадках, нуждаясь в проверке и подтверждении. Нельзя отрицать возможность неоднократного возникновения фоторецепторных систем зеленых водорослей в различных эволюционных ветвях монофилетического царства зеленых растений Viridiplantae. В пользу последней возможности свидетельствуют факты нахождения фоторецепторных систем такого же типа, как у зеленых водорослей, в пределах других отделов эукариотических водорослей (например, Dinophyta). Судя по различиям в тонкой структуре хлоропластов и составе фотосинтетических пигментов, независимое возникновение таких фоторецепторных систем в этих отделах вполне вероятно. Научная ценность подобных спекуляций заключается в том, что они позволяют сознательно подойти к выбору модельных объектов, к обоснованию программы дальнейших исследований, которые в будущем приведут к уточнению или изменению исходных позиций. 6.3. СТРУКТУРА ФОТОРЕЦЕПТОРНОЙ СИСТЕМЫ DUNALIELLA 6.3.1. Стигма у изученных видов Dunaliella

Как и большинство других зеленых фитомонад, виды Dunaliella (исключая D. paupera Pascher) обладают фоторецепторной системой, состоящей из стигмы и фоторецептора, местоположение которого не установлено. Несмотря на различия в морфологии и тонкой структуре стигм зеленых водорослей, предполагают, что все они функционируют по принципу простого или четвертьволнового интерференционного рефлектора (см. обзоры [Foster, Smyth, I980; Melkonian, Robenek, 1984]). У изученных видов Dunaliella стигма одно- или двухслойная с размером пигментированных глобул 100-200 нм. Количество глобул может возрастать в онтогенезе. Стигма расположена в субапикальной, субплазмалеммной, свободной от тилакоидов части стромы хлоропласта, но иногда некоторые глобулы располагаются между ламеллами [Eyden, 1975; Hoshaw, Maluf, 1981]. Таким образом, по своему местоположению и тонкой структуре стигма Dunaliella не отличается от стигм других зеленых водорослей.

- 91 -

6.3.2. Выяснение структуры фоторецептора Dunaliella

Одной из основных задач, подлежащих решению в процессе исследования фотодвижения водорослей, является выяснение структуры фоторецептора исследуемой водоросли. Молекулы фоторецептора содержат разноименно заряженные частицы и могут обладать дипольным моментом. Если все молекулы фоторецептора ориентированы одинаково относительно продольной оси клетки, можно говорить о дихроизме фоторецепторной системы. Является ли фоторецептор Dunaliella дихроичным, можно решить, исследуя фотодвижение клеток водоросли в поляризованном свете, который воздействует на образец через конденсор микроскопа и поляризатор. При этом анализируется наличие доминирующих направлений в гистограммах углового распределения клеток и их зависимость от поворота плоскости поляризации света. Результаты применения поляризованного света при исследовании фототопотаксиса можно интерпретировать следующим образом. Если фоторецепторная система дихроична, то имеет место поглощение света только в том случае, если дипольный момент фоторецепторных молекул параллелен плоскости колебаний электрического вектора стимулирующего света; при перпендикулярной ориентации дипольного момента поглощение отсутствует (рис. 6.10). Максимальное поглощение света имеет место при движении клетки параллельно направлению распространения света [Creutz, Diehn,1976]. Подобный дихроизм был обнаружен у эвгленофитовой водоросли Euglena gracilis [Häder, 1987b].

Рис. 6.10. Схема взаимной ориентации дипольных моментов фоторецепторных молекул в пределах фоторецептора Ф (вертикальные стрелки) относительно r направления n стимулирующего света, в rслучае: rа – неполяризованного света (векторы Ех и Е у – перпендикулярны дипольным r моментам); б – неполяризованного света (вектор rЕ х – перпендикулярный дипольным моментам, а вектор Е z –r параллелен им); в – поляризованного света (вектор Е у перпендикулярный дипольным моментам); г – поляризованного света (вектор r Е z параллельный этим моментам). а и в: поглощение отсутствует (А = 0); б: поглощается одна компонента из двух (А = 0,5); г: поглощается единственная компонента (А = 1).

Анализ углового распределения клеток Dunaliella, двигающихся в поляризованном свете, электрический вектор которого параллелен плоскости, в которой движутся клетки, показал, что это распределение клеток носит случайный характер; доминирующих направлений движущихся клеток, изменяющихся при повороте плоскости поляризации стимулирующего света, замечено не было [Посудин, 1992]. Ранее, в разделе 4.3.1, сообщалось, что нами не были обнаружены статистически достоверные изменения скорости поступательного движения обоих видов при воздействии на них поляризованного света по сравнению с белым неполяризованным светом той же интенсивности (см. рис. 4.3). То же можно сказать об относительном числе Nm/N0 подвижных клеток - оно не зависит от плоскости поляризации света. - 92 -

Отсутствие доминирующих направлений в гистограммах углового распределения клеток Dunaliella в поляризованном свете, зависимости этих гистограмм, скорости поступательного движения клеток и относительного числа подвижных клеток от поворота плоскости поляризации свидетельствует о недихроичной природе фоторецепторной системы водоросли; вполне очевидным является действие иной фоторецепторной системы, отличающейся по своей структуре от таковой Euglena gracilis. 6.3.3. Использование техники облучения суспензии клеток водоросли двумя потоками света

Одним из методических приемов исследования структуры фоторецептора является облучение водорослей двумя взаимно перпендикулярными световыми потоками. С этой целью использовали два источника света, действующих на образец во взаимно перпендикулярных направлениях под углом 300 к поверхности предметного стекла. В зависимости от структуры фоторецепторной системы и механизмов фотоориентации клетки исследуемых водорослей могут двигаться в поле двух световых потоков или по направлениям каждого потока, или по результирующему направлению. Результаты воздействия двух источников света, освещающих образец во взаимно перпендикулярных направлениях (Е1 = Е2 = 500 лк), с использованием Фурье-преобразования свидетельствуют о сосредоточении большинства пиков распределения в секторе 90-1800 (рис. 6.11, а). Максимальной (на фоне остальных) амплитудой характеризуется первая гармоника (рис. 6.11, б) с фазой, соответствующей направлению 1350. Этот факт, также как и результаты обратного Фурье-преобразования, свидетельствуют о движении клеток одним потоком по результирующей направлений распространения света обоих источников в процессе положительного фототопотаксиса (рис. 6.11, в, г). Увеличение освещенности образца до Е1=10000 лк и Е2=60000 лк приводит к возникновению ярко выраженных пиков распределения в области 0-450 (свет направлен от 1800 к 00 и от 2700 к 900; рис. 6.12, а). Об этом свидетельствуют и результаты Фурье-разложения: первые четыре гармоники, выделяющиеся своими амплитудами (рис. 6.12, б), характеризуются фазами, соответствующими направлениям 0-450 ( рис. 6.12, в, г). В данной ситуации клетки Dunaliella проявляют ярко выраженный отрицательный фототопотаксис (рис. 6.12, в), двигаясь единым потоком по результирующей направлений распространения света обоих источников. Сопоставление полученных нами данных с результатами исследований фототопотаксиса другой водоросли – Euglena gracilis [Lebert, 1985; Häder, 1986b; Lebert, Häder, 2000] свидетельствует о различиях в фотодвижении Dunaliella salina и Euglena gracilis. Под действием двух источников света клетки Dunaliella salina движутся единым потоком по результирующей направлений распространения света обоих источников, тогда как клеткам Euglena gracilis присуще движение двумя потоками по обоим направлениям. При высоких значениях освещенности образца клетки обоих видов Dunaliella salina и Euglena gracilis проявляют отрицательный фототопотаксис, двигаясь единым потоком по результирующей двух направлений. Обнаруженные нами отличия свидетельствуют о различных механизмах фоторецепции света умеренной интенсивности у этих видов. Dunaliella salina присущ, скорее всего, типичный для зеленых фитомонад механизм периодического усиления или ослабления светового сигнала с помощью стигмы. Ее фоторецепторная система расположена перпендикулярно поверхности клетки, направлению ее движения и имеет недихроичную природу.

- 93 -

Рис. 6.11.Результаты Фурье-анализа углового распределения клеток D. salina при освещении образдвумя источниками света умеренной интенсивности (Е1= Е2= 500 лк). Здесь и на рис. 6.12 направления световых потоков обозначены стрелками; а – реальные гистограммы углового распределения клеток; б – амплитуды гармоник (А); в – 0 гистограммы обратного Фурье-преобразования для семи (N = 7) основных гармоник; г – фазы гармоник ( j ); n – номер сектора в угловом распределении [Посудини др., 1991].

Рис. 6.12. Результаты Фурьеанализа углового распределения клеток D. salina при освещении образца двумисточниками света высокой интенсивности (Е1= 10000 лк, Е2= 60000 лк) [Посудин и др., 1991].

- 94 -

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Фоторецепторная система видов Dunaliella, как и других зеленых водорослей, состоит из фоторецептора, предположительно расположенного в плазмалемме и в мембранах хлоропластной оболочки (в области, прилегающей к стигме) и стигмы, состоящей у разных видов из одного-двух слоев липидных глобул, расположенных в периферической зоне пластиды. Впервые показано, что в отличие от некоторых других водорослей (Euglena gracilis) виды Dunaliella не имеют дихроичной структуры фоторецептора. Как было показано в предыдущей 5 главе, результаты использования ионизирующего и ультрафиолетового излучений свидетельствуют о различиях механизмов, управляющих скоростью поступательного движения и фототопотаксисом клеток Dunaliella, и возможном существовании двух различных фоторецепторов, ответственных за разные параметры фотодвижения.

- 95 -

ГЛАВА 7

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФОТОРЕЦЕПТОРНЫХ ПИГМЕНТОВ

7.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ФОТОРЕЦЕПТОРНЫХ ПИГМЕНТОВ Типичными пигментами, которые могут участвовать в фоторецепции и фотодвижении эукариотических водорослей, являются родопсин, флавины, птерины и каротиноиды [Lenci, 1975, 1995; Haupt, Häder, 1994; Kreimer, 1994; Lebert, 2001]. Родопсин представляет собой комплекс белка (опсина), липида и хромофора (ретиналя). Спектр поглощения родопсина характеризуется максимумами при 231 и 278 нм (опсин), при 350 и 500 нм (ретиналь). Родопсин флуоресцирует в видимой области с максимумом при 580 нм (в дигитониновом растворе) с квантовым выходом 5×10-3 [Конев, Волотовский, 1979]. Флавины являются изоаллоксиновыми производыми. Известны три биохимически важных формы флавинов – рибофлавин (РФ), флавин мононуклеотид (ФМН) и флавинаденин динуклеотид (ФАД). Спектр поглощения окисленных неионизованных флавинов в водных растворах характеризуется четырьмя полосами – при 220 нм, 265, 375 и 445. Максимум излучения флуоресценции находится при 520 нм для всех флавинов; квантовый выход флуоресценции составляет 0,29 (РФ), 0,25 (ФМН) и 0,038 (ФАД) [Lenci, 1975]. Птерины представляют собою амфотерные молекулы со слабыми кислотными и основными свойствами. В спектре поглощения птерина обычно присутствуют три (иногда два) максимума, один из которых расположен в видимой области спектра. На положение максимумов влияют заместители – 240, 285 и 340 нм у лейкоптерина, 255 и 391 нм у ксантоптерина, 252 и 385 у хризоптерина, 240, 310 и 475 нм – у еритроптерина [Бриттон, 1986]. Каротиноиды как растительные пигменты представляют собой тетратерпены, образованные восьмью изопреновыми единицами. Спектральные свойства каротиноидов характеризуются широкой полосой поглощения в области 350-500 нм с тремя максимумами при 425 нм, 450 и 475 нм. Квантовый выход флуоресценции каротиноидов очень мал – менее 10-5 [Нобел, 1973]. Природу фоторецепторных пигментов водорослей можно определить с помощью таких методических приемов как выделение пигментов, микроспектрофотометрия и микрофлуориметрия пигментов, определение спектра действия фотобиологической реакции, изучение влияния специфических химпрепаратов и заместителей. Рассмотрим, как эти приемы позволяют приблизиться к пониманию природы фоторецепторных пигментов наиболее изученных с точки зрения фотодвижения объектов – эвгленофитовой водоросли Euglena gracilis и зеленых водорослей Сhlamydomonas reinhardtii и Haematococcus pluvialis.

7.2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФОТОРЕЦЕПТОРНЫХ ПИГМЕНТОВ EUGLENA GRACILIS 7.2.1. Дискуссия относительно фоторецепторных пигментов Euglena gracilis

Относительно фоторецепторных пигментов эвгленофитовой водоросли Euglena gracilis в научной литературе разгорелась дискуссия. Одни авторы [Lenci, 1975; Colombetti, Lenci, 1980; Photomovement, 2001] считают, что возможными кандидатами на роль фоторецепторных пигментов у этого вида являются флавины и птерины. Другие [Gualtieri et al., 1992] отдают предпочтение родопсину. Опсиноподобные гены идентифицированы у широкого круга позвоночных и беспозвоночных, в том числе одноклеточных организмов [Martin et al., 1986]. Несмотря на все разнообразие фоторецепторных систем, все они оснащены - 96 -

сходными зрительными преобразователями, функции которых выполняют родопсиноподобные белки, состоящие из 7 трансмембранных a-спиральных рецепторов, соединенных с ретиналем как хромофором. Специфическими характеристиками ретиналь-опсиновых комплексов являются: интенсивное поглощение света в области 380-640 нм, способность ретиналя подвергаться изомеризации под влиянием света, структурные изменения (движения a-спирали), вызванные изомеризацией ретиналя. Целесообразно рассмотреть соображения, которые выдвигают обе дискутирующие стороны в пользу тех или иных фоторецепторных пигментов E. gracilis на основе использования разнообразных методических приемов. 7.2.2. Выделение пигментов

Процедура сводится к изолированию клеточных структур, содержащих (или могущих содержать) фоторецепторные пигменты. Впервые процедура изолирования паражгутикового тела (ПЖТ) E. gracilis была реализована авторами работы [Rosenbaum, Child, 1967]. Некоторым авторам [Gualtieri et al., 1986, 1988; Gualtieri, 2001] удалось извлечь паражгутиковое тело и отделить жгутиковый аппарат E. gracilis с помощью высококонцентрированного раствора CaCl2. Сопоставление спектров поглощения ПЖТ и родопсина с максимумом при 500 нм позволило предположить наличие в ПЖТ белка родопсиновой природы. Извлечение ретиналя из интактных и лишенных мембран клеток дает, по мнению авторов, дополнительное подтверждение родопсиновой природы фоторецептора [Gualtieri et al., 1992]. 7.2.3. Микроспектрофотометрия и микрофлуориметрия пигментов

Суть микроспектрофотометрии пигментов заключается в пропускании сфокусированного луча света с изменяющейся длиной волны через исследуемую органеллу. Использование метода флуоресцентной микроспектрофлуориметрии для исследования in vivo ПЖТ E. gracilis [Benedetti, Checcucci, 1975; Benedetti, Lenci, 1977; Ghetti et al., 1985] позволило прийти к выводу о присутствии флавинов в этой органелле. В пользу флавинов свидетельствуют результаты микроспектрофлуориметрии in vivo паражгутикового тела (ПЖТ) E. gracilis: спектр возбуждения флуоресценции ПЖТ по форме напоминает спектр поглощения флавинов [Colombetti et al., 1980; Коломбетти и др., 1981]. В работе [Galland et al., 1990] было подтверждено присутствие флавинов и птеринов в этой органелле. Препараты, приготовленные из жгутиков E. gracilis и содержащие ПЖТ водоросли, демонстрируют флуоресценцию с максимумом при 520 нм, характерным для флавинов, и с максимумом при 450 нм, свойственным птеринам (спектры излучения флуоресценции стандартных птеринов, изготовленных методом тонкослойной хроматографии, имели подобную форму). Результаты измерения флуоресценции изолированного ПЖТ E. gracilis, возбужденной на разных длинах волн, также показали присутствие более чем одного (флавины и птерины) фоторецепторного пигмента в ПЖТ водоросли [Sineshchekov et al., 1994]. Использование флуоресцентной спектроскопии показало наличие переноса энергии между птеринами (пигментами, поглощающими в ультрафиолетовой области спектра) и флавинами [Sineshchekov et al., 1994]. Помимо флуоресценции в области 440-520 нм, авторы наблюдали длинноволновую флуоресценцию при 580 нм (длина волны возбуждения 520 нм) и при 620 нм (длина волны возбуждения 550 нм). Природа длинноволновой флуоресценции не выяснена; по мнению авторов, возможно присутствие третьего фоторецепторного пигмента (причем, участие родопсина исключается в силу незначительного квантового выхода флуоресценции, известного для всех родопсинов [Sineshchekov, Litvin, 1987]). Против предположения о родопсиновой природе фоторецептора E. gracilis свидетельствуют результаты сравнения временной кинетики флуоресценции родопсина, регистрируемой на длине волны 397 нм при возбуждении ультрафиолетовым (365 нм) излучением, которая характеризуется фотоциклом длительностью около 18 с [Barsanti et al., 1997] с реально наблюдаемой периодичностью кинетики флуоресценции с частотою 1-2 Гц, которая может быть вызвана вращением клеток [Ascoli et al., 1978]. - 97 -

Флавины найдены не только в ПЖТ, но и в стигме E. gracilis [Sperling et al., 1973]. Однако, против участия стигмы в фоторецепции свидетельствует отсутствие зависимости поглощения стигмы от плоскости поляризации стимулирующего света [Benedetti et al., 1977], тогда как фототопотаксис водоросли чувствителен к изменению плоскости поляризации [Bound, Tollin, 1967]. Все упомянутые выше экспериментальные и методические приемы, использованные сторонниками флавинптериновой гипотезы, позволяют прийти к выводу, что: 1) ПЖТ E. gracilis - местоположение фоторецептора водоросли; 2) стигма не является фоторецептором; 3) первичными хромофорами, обеспечивающими фоторецепцию, являются флавины; 4) птерины играют роль «световой антенны» для флавинов. В то же время, по мнению других авторов [Gualtieri et al., 1988], также использовавших технику микроспектрофотометрии паражгутикового тела E. gracilis, ответственным за фоторецепцию является родопсин. В пользу этого суждения послужило сходство спектра поглощения паражгутикового тела E. gracilis со спектром поглощения родопсина с максимумом при 500 нм [Gualtieri et al., 1989; James et al., 1992]. Интенсивность полосы поглощения ПЖТ зависела от относительной ориентации плоскости поляризации света и продольной оси клетки. Это дало основание исследователям [Gualtieri et al., 1989; James et al., 1992] предположить, что фоторецепторным пигментом водоросли является родопсиновый белок, расположенный в квазикристаллической структуре ПЖТ. Ограничением этой техники является то, что другие клеточные органеллы, попадающие в область действия светового луча, могут внести свой вклад в поглощение. Кроме того, в видимой области спектра полосы поглощения практически всех пигментов перекрываются (рис. 7.1).

Рис.7.1.Спектры поглощения фоторецепторных пигментов: Ф– флавинов [Бриттон, 1986], Р - родопсина [Bensasson, 1980], K-каротиноидов [Bensasson, 1975], П – птеринов [Бриттон, 1986]

Выделение ретиналя из интактных клеток и фоторецептора, изолированного из лишенных мембран клеток подтвердило правомочность гипотезы относительно родопсиновой природы фоторецептора E. gracilis [Gualtieri et al., 1992]. Было установлено присутствие фотохромного пигмента в ПЖТ E. gracilis, демонстрирующего реверсию флуоресценции [Barsanti et al., 1997]. Таким образом, ПЖТ водоросли характеризуется оптической бистабильностью – первичной нефлуоресцирующей формой и вторичной флуоресцирующей формой, возникающей после возбуждения светом. Эти данные позволили авторам предположить, что именно ПЖТ является фоторецептором E. gracilis. Однако, с учетом того, что в составе фоторецептора или расположенных вблизи него органелл могут присутствовать другие флуорофоры, вполне понятна осторожность, с которой исследователи должны подходить к проблеме идентификации флуоресцирующих пигментов.

- 98 -

7.2.4. Определение спектра действия фотобиологических реакций

Суть метода заключается в определении зависимости параметра, характеризующего фотодвижение (скорости, направления движения и т.д.), нормированного к интенсивности стимулирующего света или к числу падающих фотонов, от длины волны света. Спектр действия отрицательного фототопотаксиса E. gracilis характеризуется двумя основными максимумами при 385 нм и 460 нм, а также небольшими максимумами при 410 нм и 490 нм [Häder, Reinecke, 1991]; по мнению авторов, такая форма спектра отражает абсорбционные свойства флавинсодержащих протеинов. В целом, эксперименты по измерению спектров действия фотодвижения E. gracilis [Wolken, 1960, 1977; Bensasson, 1975; Lenci, 1975; Nultsch, Häder, 1979, 1988; Colombetti, Lenci, 1980; Galland et al., 1990] позволили установить присутствие более одного фоторецепторного пигмента у E. gracilis, среди которых следует отметить флавины, каротиноиды и птерины. В принципе, спектральная чувствительность фотореакции отражает поглощающие свойства пигментов. Но на практике, анализ пигментов затрудняется возможным участием пигментов, присутствующих в затеняющих структурах (в первую очередь в стигме), а также наличием более чем одного пигмента в фоторецепторной структуре. Кроме того, спектры действия фотореакций характеризуются недостаточно высоким разрешением; зачастую пигменты (как рецепторные, так и затеняющие фоторецептор) могут иметь совпадающие в видимой области спектра полосы поглощения, вследствие чего очень сложно разобраться, какому фоторецепторному пигменту соответствует спектр действия фотодвижения водоросли. Наконец, процедура выявления фоторецепторных пигментов предусматривает сопоставление спектров действия параметров фотодвижения со спектрами поглощения пигментов, которые in vivo претерпевают существенные изменения за счет окружения.

7.2.5. Биохимические методы

Биохимический анализ изолированого ПЖТ E. gracilis подтвердил наличие четырех типов белков, три из которых содержат птерины и один – флавины [Brodhun, Häder, 1990, 1995]. Эти же авторы показали, что ультрафиолетовое излучение (где флавины и птерины демонстрируют интенсивное поглощение) ингибирует фототопотаксис E. gracilis. По мнению авторов, это можно пояснить высоким уровнем поглощения флавинов и птеринов в коротковолновой ультрафиолетовой области спектра. Биохимический анализ подтвердил, что белки ПЖТ разрушаются ультафиолетовым излучением. Именно белки ПЖТ играют важную роль в рецепции светового стимула, ответственного за фототопотаксис. 7.2.6. Изучение влияния специфических химпрепаратов

Дополнительное подтверждение флавиновой природы фоторецепторных пигментов было получено в результате использования специфических препаратов, воздействующих на возбужденные состояния флавинов – например, иодистого калия. Хотя, здесь следует отметить некоторую противоречивость результатов, полученных разными авторами: если Миколайчик и Дин [Mikolajczyk, Diehn, 1975] наблюдали действие КJ только на положительный фототопотаксис E. gracilis, в исследованиях Ленчи с соавторами [Lenci et al., 1983] отмечается сильное воздействие препарата как на положительный, так и отрицательный фототопотаксис водоросли. Такие противоречивые результаты объясняются влиянием на фотодвижение водоросли циркадных ритмов и возраста культуры [Photomovement, 2001]. Между тем, результаты использования никотина (ингибирующего биосинтез ретиналя) и гидроксиламина (реагирующего как со свободным, так и со связанным с опсином ретиналем), вызывающих ингибирование формирования ПЖТ E. gracilis и фотоориентации клеток, привели к предположению о присутствующем в ПЖТ ретинале как фоторецепторном пигменте E. gracilis [Barsanti et al., 1992, 1993]. Однако, К. Фостер [Foster, 2001] считает, что факт ингибирования формирования ПЖТ еще не подтверждает - 99 -

участия родопсина в фоторецепции; в качестве доказательства он приводит пример ингибирования фототопотаксиса Chlamydomonas никотином и норфлуразоном. Хотя родопсин присутствует в клетках Chlamydomonas, это, по мнению Фостера, совсем не означает, что он является фоторецепторным пигментом водоросли, так как действие специфических ингибиторов на клетки может происходить различными путями. В случае Euglena формирование ПЖТ может быть попросту зависимым от родопсина. Кроме того, более тщательный анализ показал отсутствие влияния препарата на положительный и отрицательный фототопотаксис водоросли при продолжительном (более 6 месяцев) действии никотина, в то время как ретиналь был обнаружен в клетках E. gracilis посредством методов хроматографии [Gualtieri et al., 1992]. 7.2.7. Использование заместителей фоторецепторных пигментов

Еще один методический прием предполагает использование заместителей фоторецепторных пигментов. Так, вместо природных флавинов (в первую очередь, рибофлавина) в ПЖТ предлагается использовать розеофлавин, который отличается смещенным в красную сторону максимумом поглощения (вплоть до 600 нм) по сравнению с рибофлавином (с максимумом поглощения при 500 нм). Если спектр действия фототопотаксиса необработанных клеток E. gracilis не простирается в область свыше 520 нм, то обработанные розеофлавином клетки E. gracilis (клетки росли в культуре с добавленным розеофлавином в течение 30 дней) демонстрируют смещенную в красную область (550-580 нм) спектральную чувствительность фототопотаксиса [Häder, Lebert, 1998]. Как видно, обе стороны – сторонники флавиновой и родопсиновой природы фоторецептора E. gracilis, используя комплексы разнообразных методов и подходов, а также весьма весомые аргументы, продолжают дискуссию относительно природы фоторецепторных пигментов E. gracilis, которая все еще далека от завершения. 7.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФОТОРЕЦЕПТОРНЫХ ПИГМЕНТОВ У ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ Спектр действия положительного фототопотаксиса Chlamydomonas reinhardtii демонстрирует широкую полосу в области 400-600 нм с максимумом при 500 нм [Foster, Smyth, 1980], что дало основание авторам предположить участие в фоторецепции ретиналя. Так, замещение природного фоторецептора Chlamydomonas эндогенными ретиналевыми аналогами приводит к смещению спектров действия фототопотаксиса водоросли, что свидетельствует в пользу родопсиновой природы фоторецептора Chlamydomonas. Это подтверждают результаты измерения эффективного сечения поглощения s = 0,8×10-20 м2 (для флавинов величина этого параметра составляет 0,48×10-21 м2, для родопсина – 1,5×10-20 м2) [Sineshchekov, 1991b]. Исследованиями ряда авторов, проведенными в течение последних десятилетий, получено подтверждение родопсиновой природы фоторецептора у таких зеленых водорослей как Ch. reinhardtii и Haematococcus pluvialis [Sineshchekov et al., 1991a,b; 1994; Kröger, Hegemann, 1994;]. Данные о фоторецепторе Ch. reinhardtii получены на основе сравнения фотодвижения нормальных клеток и клеток, лишенных каротиноидных пигментов; что же касается H. pluvialis, то представления о природе фоторецептора у этого вида получены на основе анализа спектра действия фотореакций. Основным методическим приемом в исследовании фоторецепторных систем этих водорослей было изучение мембранных потенциалов или электрических токов, протекающих через мембраны одиночных клеток с использованием присасывающихся пипеток. Ионы, которые перемещаются через мембраны, несут электричний заряд, благодаря которому в мембране образуются электрические токи величиною порядка 1012 А. Измерить эти токи можно с помощью микроэлектродов, выполненных из вытянутых тонких стеклянных трубок. Эта техника получила название пэтч-клемп-метода, который заключается в установлении тесного контакта отполированного стеклянного микроэлектрода (микропипетки) диаметром - 100 -

0,5–1,0 мкм с мембраной, которая окружает изолированный протопласт (клетку, лишенную клеточной оболочки). Такой тесный контакт достигался благодаря легкому присасыванию. Название этой техники происходит от английских слов “patch” – латка, пластырь (небольшая область в зоне контакта микропипетки с мембраной) и “clamp” – закреплять. Измерения производят или с закрепленным целым протопластом, или с той его частью, которая остается в отверстии микропипетки (рис. 7.2).

Рис. 7.2. Принцип кетч-клемп-метода мембранных потенциалов (пояснения в тексте).

регистрации

В последнем случае латка размещается в физиологическом растворе, который окружает ее извне и подается через пипетку. Малые диаметры микропипетки позволяют измерять токи через отдельные ионные каналы. Характерной особенностью измерения мембранных потенциалов у Chlamydomonas reinhardtii и Haematococcus pluvialis являются величины входного сопротивления: 200-250 МОм (106 Ом) для Chlamydomonas reinhardtii и несколько сот МОм для Haematococcus pluvialis, тогда как типичные для биологических клеток значения входного сопротивления при использовании традиционного пэтч-клемпметода составляют сотни Гом (109 Ом). Эта техника позволила в сочетании с микрооблучением клетки установить, что фотоиндуцированные электрические сигналы появляются лишь тогда, когда освещается область стигмы, что свидетельствует о наличии фоторецептора именно в этой области [Ristori et al., 1981; Sineshchekov et al., 1991a]. Кроме того, эта техника позволила измерить спектр действия генерации электрического сигнала. Авторы пришли к следующим выводам: 1) величина генерируемого электрического сигнала зависит от ориентации клетки и ее фоторецептора относительно светового стимула; величина отношения сигналов, полученных при освещении фоторецептора и задней части клетки, составляла около 8 для Chlamydomonas reinhardtii и 3 для Haematococcus pluvialis [Harz et al., 1992] (различия объясняются структурными особенностями стигмы – четырехслойной у Chlamydomonas reinhardtii и однослойной – у Haematococcus pluvialis); 2) стигма Chlamydomonas выполняет функции четвертьволновой пластины, обеспечивающей усиление светового сигнала за счет отраженных от слоев стигмы световых волн и их интерференции; 3) спектр действия генерации электрических сигналов по форме напоминает спектр поглощения родопсина; тонкая структура спектра свидетельствует о жестком размещении хромофора в белковом окружении и возможном участии более чем одного фоторецепторного пигмента.

- 101 -

7.4. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФОТОРЕЦЕПТОРНЫХ ПИГМЕНТОВ У DUNALIELLA 7.4.1. Анализ спектра действия фототопотаксиса Dunaliella

Спектры действия фототопотаксиса обоих видов Dunaliella занимают область 400-520 нм и демонстрируют два максимума при 410-415 нм и 465-475 нм [Посудін та ін., 1991]. Спектры действия фототопотаксиса эвгленофитовых (Euglena gracilis [Häder, Reinecke, 1991]), зеленых (Chlamydomonas reinhadtii [Nultsch, 1971], Platymonas subcordiformis = Tetraselmis subcordiformis, Stephanoptera gracilis [Halldal, 1958]) и динофитовых водорослей (Peridinium trochoideum (Stein) L., Goniaulaх catenella Whedon et Kofoid [Halldal, 1958]) имеют общие черты: водоросли демонстрируют максимальную чувствительность в синезеленой (440–520 нм) области спектра и очень малую (если не нулевую) чувствительность к свету с длиной волны свыше 560 нм. Исключение составляет Prorocentrum micans Ehrenb. (Dinophyta) с eго максимальной чувствительностью в красной (640 нм) области спектра. Представители криптофитовых водорослей (Cryptomonas sp. CR-1, C. rostratiformis, C. nordstedtii) характеризуются спектром действия положительного фототопотаксиса с максимумом в желтой (560 нм) области спектра, что авторы связывают с участием фоторецептора неустановленной природы [Watanabe, Erata, 2001]. Сравнивая спектры действия фототопотаксиса двух видов Dunaliella со спектрами поглощения известных природных пигментов, можно допустить, что функцию фоторецепторов у видов Dunaliella могут исполнять каротиноиды, флавины, птерины или родопсин. Для более точной идентификации фоторецепторных пигментов необходимо продолжить их исследование другими методами. 7.4.2. Использование латерального ультрафиолетового излучения

Один из первых этапов наших исследований фоторецепторной системы Dunaliella был связан с использованием латерального ультрафиолетового излучения. Реакция водорослей на ультрафиолетовое излучение дает возможность выяснить участие в фоторецепции таких пигментов, которые поглощают в ультрафиолетовой области спектра (например, флавинов). Известно, что фотореакции на ультрафиолетовое излучение демонстрировали водоросли из рода Tetraselmis Stein. - Tetraselmis hazenii (= Platymonas subcordiformis (Wille) Hazen )[Halldal, 1961]. Для сопоставления наших результатов исследования фотодвижения Dunaliella с получеными П. Хэллдэлом для Tetraselmis hazenii мы, кроме видов Dunaliella, исследовали фотодвижение при ультрафиолетовом облучении другого вида того же рода – Tetraselmis viridis (Rouch.) Norris et al. (= Platymonas viridis Rouch.) штамм № 68 из коллекции Института ботаники НАН Украины. Методы исследований. В качестве источника стимулирующего света использовали осветитель ЛОС-2 с ксеноновой лампой мощностью 1 кВт, спектр излучения которой сходен со спектром солнечного излучения, достигающего поверхности Земли. Излучение источника направляли под углом 30 0С на исследуемый объект, расположенный на предметном столике микроскопа Биолам, через инфракрасный фильтр (слой дистиллированной воды) и один из интерференционных фильтров с максимумами пропускания при 249, 279, 304, 310, 335, 364, 407, 434, 497, 541 и 655 нм. Кроме того, использовали фильтр УФС с полосой пропускания в области 240–410 нм. Спектральные характеристики этих фильтров в сопоставлении со спектрами поглощения флавинов и каротиноидов представлены на рис. 7.3. Отличительной особенностью этих опытов было использование в качестве покровного стекла кварцевой пластинки толщиной 1,75 мм (кварц характеризуется пропусканием в ультрафиолетовой области спектра) [Посудин и др., 1990]

- 102 -

Рис. 7.3. Спектры поглощения пигментов (1 – флавины; 2 – каротиноиды) и спектры пропускания (3) интерференционных фильтров (цифры соответствуют максимумам пропускания) в УФ- и видимой областях спектра; D – поглощение пигментов, Т – пропускание фильтров [Посудин и др., 1990].

Результаты исследований. Результаты измерений фототопотаксиса двух видов Dunaliella и контрольного образца Tetraselmis viridis (табл. 7.1) свидетельствуют о том, что при воздействии стимулирующего света с длинами волн 249, 279 и 310 нм значения параметра F, полученные для обоих видов Dunaliella, существенно отличаются от таковых, полученных для Tetraselmis [Посудин и др., 1990]. В области 304 нм значения этого параметра примерно одинаковы для всех трех исследуемых водорослей, что можно объяснить совпадением в этой области минимумов поглощения как флавинов, так и каротиноидов. В ближней ультрафиолетовой (335 и 364 нм) и видимой (407–655 нм) области спектра существенных отличий параметра F для исследуемых водорослей не обнаружили. Данные исследований фотодвижения Dunaliella в ультрафиолетовой области спектра указывают на то, что в пределах ошибок измерений оба вида не демонстрируют сколь-либо существенных максимумов зависимости параметра F от длины световой волны l в ультрафиолетовой области спектра, где имеют место максимумы поглощения флавинов и родопсина. В то же время T. viridis присущи значительные увеличения параметра F в ультрафиолетовой области спектра (249, 279 и 310 нм). Об этом свидетельствуют и результаты, полученные при использовании широкополосного (240–410 нм) фильтра УФС (табл. 7.1). Сопоставление полученных нами результатов со спектрами действия параметров фотодвижения других водорослей (Chlamydomonas reinhardtii [Foster, Smyth, 1980], Haematococcus pluvialis [Sineshchekov, 1988], Tetraselmis hazenii (= Platymonas subcor-diformis) [Halldal, 1961] и Euglena gracilis [Foster, Smyth, 1980] представлены на рис. 7.4. Таблица 7.1. Результаты измерения фототопотаксиса исследуемых видов водорослей в ультрафиолетовой и видимой областях спектра

l, нм

І, Вт/м2

R(l) D. s.

R(l) D. v.

R(l) T. v.

F(l) D. s.

F(l) D. v.

F(l) T. v.

Ультрафиолетовая область 249

0,17

-0,05

0,05

0,35

-11,81±0,01

11,81±0,01

82,68±0,02

279

0,19

-0,08

0,01

0,19

-15,09±0,01

1,89±0,02

35,84±0,02

304

0,21

0,07

0,08

0,08

10,96±0,05

12,53±0,10

12,53±0,15

310

0,18

0,02

0,05

0,12

3,58±0,15

8,24±0,07

21,50±0,02

335

0,27

0,03

0,01

0,05

3,32±0,02

0,66±0,03

5,53±0,10

364

0,28

0,08

0,07

0,07

7,85±0,10

6,87±0,10

6,87±0,13

0,02

0,02

0,33

-

-

-

УФС

- 103 -

Видимая область 407

0,37

0,15

0,20

0,16

9,96± 0,13

13,28 ±0,05

10,62± 0,08

434

0,37

0,10

0,12

0,29

6,23± 0,07

7,47 ±0,02

23,04± 0,02

497

0,41

0,42

0,37

0,45

20,61± 0,09

18,15 ±0,10

22,08 ±0,04

541

0,44

0,07

0,06

0,02

2,94 ±0,01

2,52± 0,03

0,84 ±0,04

655

0,47

-0,09

-0,07

-0,09

-2,87 ±0,01

-2,24± 0,03

-2,88 0,03

П р и м е ч а н и е : R(l) - относительное число клеток, двигающихся по направлению распространения света; F(l) - параметр, характеризующий фототопотаксис клеток на данной длине волны l стимулирующего света; І - интенсивность стимулирующего света; D .s. - D. salina; D. v. - D. viridis; T. v. - Tetraselmis viridis.

Обсуждение результатов. Сопоставление наших результатов измерения параметра F в ультрафиолетовой области спектра для двух видов Dunaliella и Tetraselmis viridis с результатами, полученными Хэллдэлом (1961), позволяет предположить, что наличие фототопотаксиса в этой области присуще только видам рода Tetraselmis. Оставляя в стороне дискуссию о возможных фоторецепторных пигментах, участвующих в фототопотаксисе Tetraselmis (Хэллдэл считает, что функции этих пигментов выполняют каротенопротеины), на наш взгляд, полное отсутствие фототопотаксиса обоих видов Dunaliella в ультрафиолетовой (240–400 нм) области спектра дает право исключить флавины и родопсин из числа возможных пигментов, ответственных за фоторецепцию у видов Dunaliella [Посудин и др., 1990]. Данные по исследованию фотодвижения Dunaliella в ультрафиолетовой области спектра [Посудін та ін., 1991; Posudin et al.,1992] свидетельствуют, что в пределах ошибок измерений оба вида не демонстрируют сколь-либо существенных максимумов зависимости фототопотаксиса от длины световой волны l в ультрафиолетовой области спектра,

Рис.7.4.Спектры действия:1-положительного фототопотаксиса Platymonas sub-cordiformis [Halldal, 1961]; 2–фототопотаксиса Chlamydomonas reinhardtii [Nultsch et al., 1971]; 3 – фото-топотаксиса Dunaliella spp. [Посудін та ін., 1991]; 4 – фотоиндукции потенциала фототопотаксиса Haemato-coccu spluvialis [Синещеков ,Литвин, 1988]; 5 – Euglena gracilis [Foster, Smyth, 1980].

где имеют место максимумы поглощения флавинов, птеринов и родопсина; отсутствие фототопотаксиса обоих видов Dunaliella в ультрафиолетовой (240–400 нм) области спектра наряду со спектром действия фототопотаксиса водорослей в видимой (400-520 нм) области спектра, полученным нами ранее, свидетельствуют о возможном участии в качестве фоторецепторных пигментов каротиноидов, спектр поглощения которых занимает область 350-500 нм. Напомним, что авторы исследований фотодвижения D. salina [Wayne et al., 1991] предположили участие в фоторецепции каротенопротеинов или родопсина . ЗАКЛЮЧЕНИЕ Спектр действия фототопотаксиса двух гипергалобных видов Dunaliella идентичен; он находится в пределах 400–520 нм и имеет два максимума: при 410–415 нм и 465–475 нм. Спектр действия фототопотаксиса Dunaliella spp. несколько отличается от таковых Chlamydomonas reinhardtii и - 104 -

Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) (см. рис. 7.4), демонстрирующих широкую полосу в области 400– 550 нм с максимумом при 500 нм, и существенно отличается от спектров действия фототопотаксиса Tetraselmis viridis (Chlorodendrophyceae) (см. рис. 7.4) и Euglena gracilis (Euglenophyta) (см. рис. 7.4). В отличие от представителей Chlorophyceae Tetraselmis viridis проявляет способность к фототопотаксису и в ультрафиолетовой области спектра. Euglena gracilis демонстрирует фототопотаксис в области 300–550 нм с двумя основными максимумами при 385 нм и 460 нм и двумя небольшими максимумами при 410 и 490 нм. Таким образом, представители разных родов, классов и отделов существенно отличаются по спектрам действия фототопотаксиса, что свидетельствует о различии в наборах фоторецепторных пигментов.

- 105 -

ГЛАВА 8 МЕХАНИЗМЫ ФОТОРЕЦЕПЦИИ И ФОТООРИЕНТАЦИИ DUNALIELLA 8.1. ИЗВЕСТНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ФОТОРЕЦЕПЦИИ И ФОТООРИЕНТАЦИИ ВОДОРОСЛЕЙ Общие и специфические особенности фоторецепторных систем жгутиковых водорослей с точки зрения их структурного и химического разнообразия, присущего представителям различных таксонов водорослей, рассмотрены нами ранее [Масюк, Посудин,1991б; см. также главы 6,7 в настоящей работе]. Целью данного раздела является рассмотрение возможных механизмов фоторецепции и фотоориентации Dunaliella. В литературе [Foster, Smyth,1980; Kreimer,1994] освещены известные механизмы фоторецепции и фотоориентации водорослей, среди которых можно выделить следующие. Периодическое освещение и затенение стигмой фоторецептора. В процессе вращения клетки вокруг своей продольной оси возникает амплитудная модуляция света, попадающего на фоторецептор, величина которой зависит от направления движения клетки по отношению к направлению распространения стимулирующего света (рис. 8.1). Стигма может либо выполнять функции только модулятора, не отражая света (Euglenophyceae) [Colombetti et al., 1982; Lebert, Häder, 2000], либо сочетать модуляцию с фокусировкой отраженного света на фоторецептор (Chrysophyceae, Phaeophyceae, некоторые виды Dinophyceae, репродуктивные клетки Eustigmatophyceae) [Kreimer, 1994]. Поскольку у всех подвижных жгутиковых эукариотических водорослей поступательное движение сопровождается вращением клетки вокруг собственной оси, модуляционный механизм фоторецепции присущ всем этим объектам. По всей вероятности, он унаследован ими отпрокариот или общих с ними предшественников и является первичным механизмом фоторецепции всех жгутиковых эукариотических водорослей и их монадных репродуктивных клеток. Кроме общего модуляционного механизма, у разных таксонов выявлены дополнительные (вторичные) механизмы, усиливающие модуляционный эффект. Волноводный механизм. Предполагается распространение бокового света, перпендикулярного продольной оси клетки, через спаренные тилакоиды, расположенные перпендикулярно к плоскости пигментированного слоя стигмы и продольной оси клетки. Эти хлоропластные тилакоиды обладают высоким коэффициентом преломления по сравнению со светлоокрашенными промежутками между ними и образуют специфический волновод для распространяющегося по ним света (рис. 8.2). Таким образом, клетка реагирует на световой стимул при условии попадания его на определенную, брюшную часть боковой поверхности. Такой механизм обнаружен у криптофитовых водорослей Chroomonas Hansg. и Cryptomonas Ehrenb. [Foster, Smyth, 1980].

Рис. 8.1. Модуляционный механизм фотоориентации Euglena gracilis: в процессе вращения клетки вокруг её продольной оси возникает амплитудная модуляция интенсивности света (a), попадающего на фоторецептор сбоку, которая изменяется от максимального значения (Imax) до нулевого (I0) с последующим биением жгутика; если свет направлен параллельно продольной оси (б), модуляция света и биение жгутика отсутствуют [Colombetti et al., 1982].

- 106 -

Рис. 8.2. Схема строения и расположения фоторецепторной системы Chroomonas Hansg.: 1 – вырост хлоропласта, в котором находится слой крупных пигментированных глобул (стигма) и спаренные тилакоиды с фоторецепторными пигментами, направленные перпендикулярно к плоскости стигмы и к продольной оси клетки; 2 – местоположение фоторeцепторной системы внутри клетки Chroomonas; р – пиреноид; с – хлорoпласт [Foster, Smyth, 1980].

Оцеллоидный механизм. Подобный механизм присущ представителям динофитовых водорослей из семейства Warnowiaceae [Foster, Smyth, 1980]. Фоторецепторная система этих водорослей представлена особой специализированной органеллой - оцеллоидом, состоящим из трех основных частей: гиалосомы, меланосомы и разделяющей их оцеллоидной камеры. Оцеллоид достигает 20 мкм длины и 6-15 мкм в диаметре. Ультраструктура оцеллоида изучена у трех родов: Nematodium, Warnowia и Erythropsidinium [Francis, 1967; Mornin, Francis, 1967; Greuet, 1987]. Рассмотрим в качестве примера строение оцеллоида Nematodium и Erythropsidinium (рис. 8.3). Гиалосома ГС представляет собой фокусирующую систему, соответствующую кристаллику в зрительном анализаторе высших животных. Состоит гиалосома из периферической зоны, напоминающей роговую оболочку глаза, и слоистого центрального кристаллоидного тела КТ, имеющего грушеобразную форму и образующегося путем откладывания плоских эндоплазматических пузырьков, содержащих бесцветное, преломляющее свет вещество с коэффициентом преломления 1,52 [Francis, 1967]. Кристаллоидное тело лежит на базальной пластинке БП, вдоль заднего края которой расположены исчерченные волокна ИВ; между базальной пластинкой и плазмалеммой находится тело Т. Вокруг гиалосомы находятся сжимающее кольцо СК, которое контактирует с периоцеллоидной галереей ПГ. Оцеллоидная камера ОК представляет собой пространство, соединяющееся с внешней средой с помощью оцеллоидного канала К, который открывается в продольную бороздку на поверхности клетки. Дно камеры покрыто волокнистым фибриллярным слоем Ф, который может характеризоваться паракристаллическим строением. Меланосома МС имеет форму чаши и состоит из ретиноидного тела РТ и пигментированного кольца ПК. Ретиноидное тело состоит из ламелл Л, которые контактируют с пузырчатым слоем ПС, связано с митохондрионом М и ответвлениями эндоплазматической сети (см. рис. 8.3). Свет, попадая на оцеллоид, фокусируется кристаллоидным телом КТ на ламеллярном слое ретиноидного тела, играющего роль пластинчатого волновода и граничащего с отражающим пузырчатым слоем, содержащим пигментные глобулы, построенным по типу четвертьволновой пластины. Таким образом, в оцеллоидной системе имеют место несколько оптических процессов: фокусировка света линзой, ограничение светового потока пластинчатым волноводом, преломление и интерференция световых волн с помощью пузырчатого слоя ретиноидного тела (см. рис. 8.3).

- 107 -

Рис.8.3.Схема строения оцел лоида Nematodium(а) и Erythr- opsidinium (б): БП - базальная плстинка; ГС гиалосома; ИВ -исчерченные волокна; К - оцеллоидный канал; КТ - кристаллоидное тело; Л ламеллы ретиноидного типа; М митохондрион; МС - меланосома; ОК - оцеллоиднаякамера; ПГпериоцеллоиднаягалерея; ПКпигментированное кольцо; ПС пузырчатый слой ретиноидного тела; СК - сжимающие кольца; Т тело; Ф фибриллярные (волокнистые) образования на дне оцеллоидной камеры [Greuet, 1987].

Интерференционный механизм. Результаты исследования четырехслойной стигмы (Foster, Smith, 1980; Feinleib,1985) освещены нами в главе 6 (см. рис. 6.3, 6.4). Согласно выводам Фостера и Смита (Foster, Smith, 1980), стигма, которая состоит из нескольких чередующихся пигментированных и непигментированных слоев (некоторые зеленые водоросли имеют до девяти таких пигментированных слоев), и предположительно расположена под фоторецептором, выполняет функции многослойной четвертьволновой (интерференционной) пластины. Фостер и Смит, предложившие интерференционный механизм фоторецепции у зеленых водорослей, рассматривали слой пигментированных глобул как один сплошной пигментированный слой, окруженный непигментированными промежутками. Особенно важно в их гипотезе то, что эти слои являются сплошными. Если световые лучи попадают на боковую часть клетки, где расположена стигма, фоторецептор получает сигнал усиленной интенсивности, равной сумме интенсивностей падающего и отраженного от каждого слоя света. Если освещается противоположная сторона клетки, сигнал, получаемый фоторецептором, ослабляется благодаря поглощению света внутренним содержимым клетки и стигмой, а также отражением от стигмы. Таким образом, модулируя свет, стигма образует антенну, определяющую местоположение источника света. Описанный эффект усиливается благодаря чередованию в стигме нескольких пигментированных и непигментированных слоев с периодичностью примерно равной 1/4 длины волны воспринимаемого света. При освещении клетки со стороны стигмы в результате интерференции падающего и отраженного света несколькими пигментированными слоями стигмы образуется несколько максимумов интенсивности, местоположение которых совпадает с местоположением плазмалеммы и тилакоидных мембран, находящихся внутри стигмы. При освещении клетки с противоположной стороны возникает несколько минимумов в тех же положениях внутри стигмы, что усиливает контраст в восприятии света, падающего с двух противоположных сторон. Предполагается, что подобный механизм присущ представителям Chlorophyceae, Prasinophyceae и некоторым видам Dinophyceae [Foster, Smyth,1980; Hegemann, Fischer, 2001], обладающим многослойными стигмами. В случае равенства толщины слоев и промежутков между ними четверти длины световой волны имеет место усиление света [Hegemann, Harz, 1998]. Естественно, что такой четвертьволновый интерференционный механизм предусматривает наличие в стигме нескольких сплошных пигментированных слоев.

- 108 -

8.2. ДИФРАКЦИОННЫЙ МЕХАНИЗМ ФОТОРЕЦЕПЦИИ И ФОТООРИЕНТАЦИИ DUNALIELLA Существенным возражением против интерференционного механизма, предложенного Фостером и Смитом, является то, что в природе не встречаются стигмы в виде сплошных пигментированных слоев. Стигма зеленых водорослей состоит из отдельных сферических глобул (рис. 8.4, а) или из плотно упакованных вследствие взаимного сдавливания глобул сферической (рис. 8.4, б) или гексагональной (рис. 8.4, в) формы. У многих зеленых водорослей стигма состоит из единственного слоя пигментированных глобул. Из 66 исследованных видов зеленых водорослей 40 имеют однослойную стигму [Melkonian, Robenek, 1984]. Однослойные стигмы наблюдаются у празинофициевых (Mantoniella squamata (Manton et Parke) Desikach., Monomastix Scherff., Nephroselmis Stein [Melkonian, Robenek, 1984]). Они обнаружены у ряда видов Chlamydomonas, например, у Chlamydomonas moewusii Gerloff [Walne, Arnott,1967]. Количество пигментированных глобул в стигме варьирует от 18 (Dunaliella salina Teod.) до 2000 (Volvox sp.); размеры глобул колеблются обычно от 80 до 130 нм, достигая иногда 200 нм в диаметре [см. обзор: Масюк, Посудин, 1991б]. Нами впервые предложен возможный дифракционный механизм фоторецепции у одноклеточных зеленых жгутиковых водорослей, обладающих стигмой с одним или несколькими слоями неплотно расположенных или гексагонально упакованных пигментированных глобул [Посудин, Масюк, 1996; Posudin, Massjuk, 1996]. Предложенный дифракционный механизм фоторецепции основывается на том факте, что пигментированные глобулы стигмы являются периодическими структурами, которые выполняют функции дифракционной решетки. При взаимодействии световой волны с такими периодическими структурами имеет место дифракция света, сопровождаемая образованием дифракционных максимумов. Интенсивность и пространственное положение этих максимумов зависит от геометрии дифракционной решетки (в нашем случае – размеров глобул и интервалов между ними, общего количества глобул), а также от угла падения света на решетку и длины световой волны. В зависимости от степени совпадения дифракционного максимума с местонахождением фоторецептора, предположительно расположенного в плазмалемме, непосредственно над стигмой, изменяется величина светового сигнала, попадающего на фоторецептор, управляющий биениями жгутиков и приводящий к фотоориентации клетки. Рассмотрим взаимодействие света с периодически расположенными пигментированными глобулами стигмы, образующими дифракционную решетку с периодом d = D + s, где D – диаметр глобулы; s – промежуток между глобулами. При падении света с длиной волны l под углом q0 на такую дифракционную решетку, состоящую из N глобул диаметром D, разделенных промежутками s, происходит взаимодействие волн, отраженных от различных глобул (лучи 2 и 3 на рис. 8.4). В результате после отражения света от решетки образуются дифракционные максимумы, положение которых определяется уравнением [Борн, Вольф, 1973]: p = d(sinq - sinq0) = ml,

( 8.1 )

где р - параметр дифракции; q - угол между нормалью к решетке и направлением на дифракционный максимум (угол дифракции); m – целое число (m = 0; ±1; ±2;…), равное количеству длин волн, на которое волна от некоторого элемента данного промежутка отстает от волны, исходящей от такого же элемента соседнего промежутка, или опережает ее. Интенсивность дифракционного максимума m-го порядка сложным образом зависит от параметра дифракции р, который, в свою очередь, зависит от угла q дифракции и длины волны l падающего света.

- 109 -

Рис. 8.4. Схематическое изображение оптических явлений, происходящих при взаимодействии света с периодической структурой, образованной отдельными сферическими глобулами стигмы (а) или глобулами, соединенными в сплошной слой (б, в). Здесь q0 и qm – углы падения и дифракции света; d = D + s период дифракционной решетки, образованной глобулами диаметром D, разделенными промежутками s; 1 – падающий луч света; 2, 3–лучи света, отраженные от глобули взаимодействующие друг с другом [Посудин, Масюк, 1996; Posudin, Massjuk, 1996].

Для количественной оценки эффективности дифракционного механизма в конкретном случае мы использовали литературные данные, полученные с помощью электронной микроскопии и характеризующие строение однослойной стигмы зеленой водоросли Dunaliella salina [Владимирова, 1978]: диаметр пигментированных глобул ( D ) равен 91,5 нм; среднее расстояние между глобулами ( s ) – 3,5 нм; количество глобул ( N ) – 18. Подобные количественные оценки размеров глобул стигмы характерны для других зеленых водорослей [Melkonian, Robenek, 1984]. Параметры D, s и N были использованы нами для вычисления на компьютере зависимости интенсивности света, дифрагировавшего на периодической структуре, от параметра р дифракции (угла q) и длины волны l [Борн, Вольф, 1973]. Зависимость интенсивности дифракционных максимумов F(p) от параметра р, а следовательно, и угла дифракции для случая нормального падения (q0 = 0) света и для длины волны l = 480 нм представлена на рис. 8.5.

Рис.8.5.Зависимость интенсивности дифракционных максимумов F от дифракционного параметра р = sinq для случая нормального падения света на дифракционную решетку (q0 = 0). Использованы параметры стигмы Dunaliella salina Teod.: N = 18; D = 91,5 нм (диаметр глобул); s – 3,5 нм (расстояние между глобулами); l = 480 нм (длина волны) [Посудин, Масюк, 1996; Posudin, Massjuk, 1996].

- 110 -

Положение дифракционных максимумов определяется значениями параметра р = l/d; 2l/d; 3l/d и т.д. Зависимость интенсивности дифракционного максимума первого порядка (m = 1) от параметра р для случая нормального падения (q0 = 0) света для различных длин волн l падающего света представлена на рис. 8.6, из которого видно, что положение максимумов, определяемое параметром р, существенно зависит от длины волны l. Таким образом, приведенные расчеты подтверждают возможность действия дифракционного механизма фоторецепции у подвижных организмов, обладающих стигмой с периодической структурой. Этот механизм может обеспечить их реагирование на угол падения светового потока и длину световой волны. При изменении направления движения организма угол падения света на стигму изменяется, что приводит к изменению интенсивности и пространственного положения дифракционных максимумов, изменению освещенности фоторецептора и коррекции направления движения организма, т.е. к фотоориентации.

Рис.8.6. Зависимость интенсивности дифракционного максимума (F) первого порядка(m=1) отдифракционного параметра (р) для различных длин волн света. Обозначения те же, что и на рис.8.5 [Посудин, Масюк, 1996;Posudin,Massjuk,1996].

Предложенный дифракционный механизм, по-видимому, является универсальным для всех монадных биологических объектов, обладающих периодической структурой стигмы, однако он не исключает одновременного дополнительного действия у разных объектов других механизмов: модуляционного, интерференционного, дихроичного и др., усиливающих световой сигнал и увеличивающих точность фотоориентации. 8.3. О РОЛИ БЕЛКОВ В МЕХАНИЗМАХ ФОТОРЕГУЛЯЦИИ ДВИЖЕНИЯ ЖГУТИКОВЫХ ВОДОРОСЛЕЙ Немаловажную роль в фоторегуляции движения жгутиковых водорослей играют белковые молекулы, входящие в состав как фоторецепторных систем, так и жгутикового аппарата и, в частности, конформационные изменения, которые претерпевают эти молекулы. В основе биения жгутика лежат процессы динамики a-спиральных белков, обусловленные их возбуждением [Костюк и др., 1988]. Могут быть реализованы два типа возбуждения: экситонное или солитонное [Давыдов, Супрун, 1974]. Экситон возбуждается оптическим излучением видимого или инфракрасного диапазонов; при этом все возбуждение равномерно распределено по возбужденному объекту. Такой тип возбуждения реализуется либо непосредственно в мембранных белках, которые перестраивают свою пространственную конфигурацию при непосредственном воздействии излучения по схеме: свет ® возбуждение экситонного состояния в a-спирали ® конфигурационная перестройка мембранного белка, либо посредством фоторецептора по схеме: свет ® возбуждение экситона в - 111 -

фоторецепторе ® передача экситонного возбуждения на a-спираль мембранного белка и его возбуждение ® конфигурационная перестройка молекулы белка. Солитон, в отличие от экситона, возбуждается не оптическим путем а за счет неупругого рассеяния фосфатных групп на a-спиральных участках белков жгутикового аппарата. Солитонные возбуждения интересны тем, что они локализованы в небольшой области a-спирали и могут переносить возбуждение или заряд без диссипации, с околозвуковой скоростью и на большие расстояния в пределах a-спирали [Давыдов, Супрун, 1974]. Известно, что и экситонные, и солитонные состояния реализуются в виде симметричных и антисимметричных возбуждений. При симметричном возбуждении все три пептидные цепи в a-спирали симметрично сокращаются, а расстояния между ними сим-метрично увеличиваются, т.е. вся молекула как бы сокращается и утолщается. При солитонных возбуждениях эти процессы происходят локально, в небольшой области (рис. 8.7, а). При антисимметричном возбуждении одна пептидная цепь не деформируется, тогда как две другие сокращаются, что приводит к изгибу молекулы в целом при экситонных возбуждениях и к локальным изгибам при солитонных возбуждениях (рис. 8.7, б). Именно эти деформации вызывают локальные и общие изменения конфигурации белковых молекул, приводящие в каждом конкретном случае к соответствующим проявлениям, рассмотренным выше – активации ионных каналов в мембране и последующим биениям жгутиков.

Рис. 8.7. Деформация пептидных групп при: а – симметричном; б – антисимметричном возбуждении [Давыдов, Супрун, 1974].

Таким образом, функционирование мембраны связано с активностью мембранных белков, при возбуждении которых происходит перестройка их конфигурации таким образом, что в них образуются ионные каналы, через которые ионы кальция достаточно свободно диффундируют внутрь клетки, стимулируя двигательную активность водорослей. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Учитывая особенности фоторецепторных систем водорослей, в частности, строение стигмы, можно полагать, что всем монадным жгутиковым водорослям за исключением тех, у которых отсутствует стигма, свойственен наиболее древний, первичный модуляционный механизм фоторецепции, унаследованный от прокариот или общих с ними предков; у некоторых зеленых водорослей могут одновременно функционировать три механизма (модуляционный, дифракционный и интерференционный), повышающие интенсивность поглощаемого фоторецептором светового сигнала. Немаловажную роль в фоторегуляции движения жгутиковых водорослей играют белковые молекулы, входящие в состав как фоторецепторных систем, так и жгутикового аппарата и, в частности, конформационные изменения, которые претерпевают эти молекулы под влиянием стимулирующего света.

- 112 -

ГЛАВА 9 СЕНСОРНОЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЕ 9.1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СЕНСОРНОГО ПРЕОБРАЗОВАНИЯ Исследования фоторегуляции движения водорослей связаны с выяснением того, каким образом поглощенный молекулой фоторецептора квант света преобразуется в сигнал, управляющий деятельностью двигательного аппарата. Совокупность событий, связывающих фоторецепцию и работу двигательного аппарата водоросли, называют сенсорным преобразованием принятого кванта света в физиологический сигнал (в дальнейшем мы будем использовать для краткости термин «сенсорное преобразование»). К методическим приемам, позволяющим приблизиться к пониманию механизмов сенсорного преобразования, следует отнести: 1) исследование влияния ионов кальция на фотодвижение водорослей и изучение действия препаратов, изменяющих проницаемость клеточной мембраны для ионов кальция (блокаторы кальциевых каналов, ионофоры); 2) применение разнообразных химических препаратов, специфически действующих на отдельные этапы процесса фоторегуляции движения (например, оуабаина - ингибитора Na+-K+-АТФазы и ионов химических элементов); 3) использование электрофизиологических подходов, позволяющих регистрировать электрические явления на клеточном уровне или воздействовать на них посредством внешних электрических полей. Рассмотрим основные методические и экспериментальные подходы, позволяющие приблизиться к пониманию основных этапов сенсорного преобразования на примере достаточно изученных в этом отношении водорослей. 9.2. СЕНСОРНОЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЕ У EUGLENA GRACILIS В отношении сенсорного преобразования у Euglena gracilis существует гипотеза [Tollin, 1969, 1973], согласно которой изменения интенсивности света, падающего на фоторецептор, могут активизировать образующийся в процессе фотосинтеза поток АТФ к двигательному аппарату водоросли (жгутику), вызывая при этом изменения биений жгутика с последующим изменением направления движения. Однако, на основании этой гипотезы не представляется возможным объяснить проявление фотодвигательных реакций обесцвеченными в темноте клетками и клетками, лишенными хлоропластов, которые выполняют защитные функции при воздействии высоких интенсивностей света [Checcucci et al., 1976]. Авторы работы [Jahn, Bovee, 1968] предположили, что паражгутиковый стержень аксонемы и паражгутиковое тело (ПЖТ) E. gracilis являются пьезоэлектрикамквазикристаллами, в которых при сжатии или растяжении в определенных направлениях возникает электрическая поляризация даже в отсутствии электрического поля. За счет пьезоэлектрической активности возникает поток ионов вдоль жгутика, что вызывает его изгиб и биение. Фоторецептор (ПЖТ) выполняет функции накопителя зарядов, высвобождающего их при освещении. Несмотря на реальность предлагаемого процесса сенсорного преобразования, эта гипотеза до сих пор не получила экспериментального подтверждения.

- 113 -

Рис. 9.1. Модель сенсорного преобразования в клетке Euglena gracilis: изменения интенсивности света передаются от фотопигментов фоторецептора некоему гипотетическому «компаратору», который сравнивает сигнал, полученный от фоторецептора, с сигналом, прошедшим синаптическое соединение в области между плазматическими мембранами основного и короткого жгутиков. Здесь: ПЖТ – паражгутиковое тело; С – стигма; ОЖ – основной жгутик; КЖ – короткий жгутик; К – компаратор; Э – эффектор, управляющий работой жгутикового аппарата [Piccini, Omodeo, 1975].

Существует предположение [Piccini, Omodeo, 1975], согласно которому сигналы фоторецептора (ПЖТ) пропорциональны степени обесцвечивания фоторецепторных пигментов. Изменения интенсивности света передаются от фотопигментов, содержащихся в ПЖТ, некоему гипотетическому «компаратору» (от англ. compare – сравнивать), который сравнивает сигнал, полученный от фоторецептора, с сигналом, прошедшим синаптическое соединение в области между плазматическими мембранами основного и короткого жгутиков (рис. 9.1). Сигнал сравнения передается эффектору – компоненту гипотетической модели, управляющему биением жгутиков и расположенному предположительно у края резервуара, в котором находится жгутик. Для того, чтобы выяснить, имеется ли связь между фотодвижением и фотосинтетической активностью E. gracilis, был проведен эксперимент по изучению препаратов, влияющих на индуцированное светом выделение кислорода и вызывающих разрушение хлоропластов – 3(3/,4/-дихлорфенил)-1,1-диметил мочевины (ДХММ), 2,4-динитрофенола (ДНФ) и азида натрия (NaN3). Было показано [Barghigiani et al., 1979], что эти препараты не влияют на фотофобические реакции E. gracilis при увеличении концентрации вплоть до таких уровней, при которых клетки теряют подвижность и претерпевают серьезные морфологические изменения. Отсутствие действия азида натрия на фотофобические реакции E. gracilis свидетельствует о том, что фотосинтетическая активность и фотосенсорная система водоросли не связаны друг с другом. В работе [Colombetti et al., 1982] сообщается о существенном подавлении отрицательного фототопотаксиса E. gracilis азидом натрия в концентрации 5×10-5 М; положительный фототопотаксис при этом не изменяется. Авторы работы [Barghigiani et al., 1979] отмечают, что после внесения азида натрия в концентрации 3×10-5 М в суспензию E. gracilis число подвижных клеток уменьшается до 40 %, а скорость их движения – до 86 %. По мнению авторов, фототопотаксис и фотофобические реакции водоросли не связаны между собой, а положительный и отрицательный фототопотасисы реализуются посредством различных цепей сенсорного преобразования. В то же время можно допустить участие ионного транспорта в сенсорном преобразовании E. gracilis. В пользу этого утверждения свидетельствуют эксперименты по исследованию влияния ионов химических элементов на фотодвижение водоросли: показано, что максимальную подвижность клетки E. gracilis демонстрируют в присутствии ионов Mg2+, Ca2+ и K+, тогда как ионы Ni2+ вызывают иммобилизацию клеток. Увеличение концентрации ионов Ca2+, Mn2+ Ba2+ приводит к соответствующему увеличению частоты пространственных изменений положения клеток; продолжительность фотофобических реакций E. gracilis увеличивается в присутствии дивалентных ионов в последовательности 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ Ca >Ba >Mn >Co >Mg >Ni . Увеличение длительности фотофобических реакций E. gracilis вызывают также NaCl и оуабаин (ингибитор Na+-К+ -ионного транспорта через мембрану). В присутствии ионофора А23187 ионы кальция индуцируют специфический, независимый от света и зависимый от концентрации Ca2+ отклик E. gracilis, проявляющийся в беспрерывном кувыркании клеток.

- 114 -

Для E. gracilis не установлено какое-либо влияние электрических полей на фототопотаксис клеток [Häder, 1986b], что позволяет предположить отсутствие влияния электрических мембранных потенциалов на фотоориентацию E. gracilis. В пользу этого предположения свидетельствует отсутствие влияния на фотоориентацию E. gracilis липофильного катиона ТРМР+, который проникает через мембрану и уменьшает ее электрический потенциал [Nultsch, Häder, 1988]. В попытке обобщить результаты упомянутых выше экспериментов авторы работ [Doughty, Diehn, 1979; Doughty et al., 1980] предлагают гипотетическую модель процессов сенсорного преобразования у E. gracilis, согласно которой переориентация жгутика водоросли управляется увеличением концентрации ионов Ca2+ в околожгутиковом пространстве. В процессе сенсорного преобразования светового стимула в двигательную реакцию водоросли квант стимулирующего света поглощается молекулой хромофора (флавина), находящегося в паражгутиковым теле E. gracilis; энергия возбуждения хромофора активизирует работу Na+-K+-насоса жгутиковой мембраны, регулирующего поток моновалентных (K+ и Na+) и дивалентных (Ca2+) ионов через жгутиковую мембрану (рис. 9.2). Na+-K+-насос отвечает за поддержание высокой концентрации K+ и низкой концентрации Na+ внутри клетки по сравнению с внешней средой. Активный транспорт ионов Na+ и K+ необходим для транспорта ионов кальция. Считается [Костюк и др., 1988], что ионы натрия служат движущей силой, вызывающей обширный поток ионов кальция через плазматическую мембрану. Деятельность Na+-K+-насоса активизируется светом и подавляется оуабаином.

Рис.9.2. Гипотетическая модель сенсорного преобразования в клетке Euglena gracilis (Lencietal.,1984):1–ПЖТ (паражгутиковое тело), содержащее хромофор (флавин); 2 – Na+-K+-насос, активируемый фотоном с энергией hn и блокируемый оуабаином; 3 - Na+-канал; 4 – Ca2+-канал, открываемый ионами Na+; 5 - Ca2+-канал, ответственный за выход ионов кальция изклетки;6– жгутик, переориентирующийся при увеличении концентрации Ca2+ (приуменьшении интенсивности стимулирующего света); ОЖ–основание жгутика; жгутик находится в состоянии покоя при концентрации ионов кальция С < 10-8 М, тогда как при превышении этой концентрации происходит биение жгутика.

В результате стимулированной светом активности Na+-K+-насоса в клетке водоросли накапливаются ионы Ca2+, что является необходимым предварительным условием суммарного действия потока этих ионов на жгутик, вызывающего его биение и соответствующую переориентацию клетки по отношению к источнику света. Таким образом, согласно данной гипотетической модели, изменения в фотоповедении и фоточувствительности E. gracilis индуцируются моновалентными и двувалентными катионами, потоки которых управляются активируемым светом (и блокируемым оуабаином) Na+-K+-насосом. В то же время, недостаток экспериментальных данных и отсутствие знаний об основных этапах цепи сенсорного преобразования E. gracilis позволяет рассматривать эту цепь как своеобразный «черный ящик» [Lebert, Häder, 2000].

- 115 -

9.3. СЕНСОРНОЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЕ У ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ В результате многочисленных исследований установлена несомненная роль ионов кальция и связанных с ними мембранных явлений в сенсорном преобразовании Chlamydomonas reinhardtii: фотостимуляция осуществляется за счет потока ионов Ca2+ через клеточную мембрану, вызывая изменение внутиклеточной концентрации этих ионов [Marbach, Mayer, 1971; Stavis, Hirshberg, 1973; Stavis, 1974; Schmidt, Eckert, 1976; Nichols, Rikmenspoel, 1978; Hyams, Borisy, 1978; Nultsch, 1979; Marangoni et al., 1996]. Экспериментальные измерения фотодвигательных реакций или фотоиндуцированных электрических токов в присутствии различных уровней ионов кальция во внешней среде [Hegemann et al., 1990] или различных концентраций ингибиторов кальциевых каналов [Nultsch et al., 1986; Hegemann et al., 1990] подтвердили мнение о том, что ионы кальция играют основную роль в фотооткликах зеленых водорослей Ch. reinhardtii и Haematocoсcus pluvialis. Фототопотаксис и фотофобические реакции водорослей постепенно подавлялись в присутствии таких блокаторов кальциевых каналов как w-конотоксин и пимозид [Hegemann et al., 1990], которые селективно ингибируют кальциевые каналы. По-видимому, существует еще один тип кальциевых каналов, который участвует в фототопотаксисе, но не связан с фотофобическими реакциями. Этот канал блокируется верапамилом [Hegemann et al., 1990]. Электрический сигнал, генерируемый одиночной клеткой, зависит от концентрации внеклеточных ионов кальция [Sineshchekov, 1991a]. Хотя участие ионов кальция в сенсорном преобразовании у обоих видов водорослей очевидно, четкое представление о процессах, участвующих в этом преобразовании, отсутствует. Исследование влияния специфических препаратов на фототопотаксис Ch. reinhardtii [Stavis, Hirshberg, 1973; Stavis, 1974] показало отсутствие связи между фотодвижением и фотосинтезом водоросли. Полное подавление фототопотаксиса Ch. reinhardtii отмечается при концентрации азида натрия -4 3,5×10 М; при этом число подвижных клеток составляло 62 % от общего числа клеток, а скорость движения клеток уменьшается до 93 % [Stavis, 1974]. Внесение азида натрия в концентрации 10-5 М в суспензию Ch. reinhardtii вызывает уменьшение фототопотаксиса на 80 %, и подвижности – на 30 % [Pfau et al., 1983]. Обе водоросли, Ch. reinhardtii и Haematocoсcus pluvialis, демонстрируют фотоиндуцированные мембранные потенциалы, которые можно измерить с помощью микроэлектродной техники. Обнаружены два типа потенциалов – положительный, отражающий поверхностные свойства мембраны, и отрицательный, трансмембранный. Кроме того, выявлены строго периодические изменения положительного потенциала под действием света и обратимые быстрые изменения его уровня [Синещеков и др., 1976]. Применение электрофизиологических методов (микроэлектродная регистрация электрических сигналов на поверхности протопласта) позволило обнаружить высокочастотные ритмические процессы, связанные с изменениями электрического потенциала у H. pluvialis с продолжительностью периода в несколько десятков секунд, имеющие тесную связь с метаболизмом этого фототрофного жгутиконосца [Sineshchekov, Govorunova, 2001а]. Это позволило авторам выдвинуть интересную гипотезу о регуляторном значении этих ритмических процессов в фотодвижении водорослей. Возможна связь периодических процессов с функционированием сократительных вакуолей. У Сhlamydomonas reinhardtii две сократительные вакуоли расположены вблизи базальных тел жгутиков. Их поведение у клеток, удерживаемых на микропипетке, проанализировано с помощью видеомикрографии. Интервал между двумя сокращениями вакуоли составляет около 30 с. Сокращение обеих вакуолей происходит с близкими частотами, но сдвинутыми по фазе относительно друг друга. Величина этого сдвига периодически меняется [Sineshchekov, Govorunova, 2001а]. Авторы предполагают, что эти периодические процессы играют роль в регуляции движения клетки. При длительной регистрации траекторий движения индивидуальных клеток Haematocoсcus pluvialis и Сhlamydomonas reinhardtii наблюдаются периодические спонтанные изменения направления их движения, которые отличаются теми же свойствами, что и периодические изменения электрического потенциала поверхностей их клеток и микродвижений протопласта, что указывает на их общее происхождение - 116 -

[Sineshchekov, Govorunova, 2001а]. При оптической регистрации биения жгутиков клетки H. pluvialis, фиксированной на микропипетке, наблюдаются спонтанные кратковременные (1-2 с) изменения плоскости биения жгутиков со средним периодом 20-40 с, что, по всей вероятности, и обусловливает изменение направления движения свободной клетки. Наблюдаются также спонтанные периодические изменения характера биения жгутиков с ресничного на ундулирующий. Подобные изменения типа биения жгутиков наблюдаются при фотофобической реакции в ответ на электрическую реакцию, запускаемую открыванием потенциалзависимых кальциевых каналов в мембране жгутиков [Синещеков и др., 1978; Beck, Uhl, 1994; Holland et al., 1997]. Авторы высказали предположение, что взаимодействие двух осцилляторов клетки, функции которых выполняют сократительные вакуоли, лежит в основе механизма регуляции знака фототопотаксиса [Sineshchekov, Govorunova, 2001a]. Показано, что два жгутика демонстрируют различные по интенсивности реакции на свет (изменение частоты и плоскости биения) [Sineshchekov, 1991a, b]. У свободно движущихся клеток преимущественная реакция цис-жгутика (расположенного на стороне фоторецептора) должна привести к повороту от источника света (негативный фототопотаксис), а преимущественная реакция трансжгутика (удаленного от фоторецептора) – к повороту в сторону источника света (позитивный фототопотаксис). При длительной регистрации траектории движения индивидуальной клетки обнаружено, что клетка движется попеременно то в направлении к источнику света, то от него. Частота этих изменений сопоставима с частотою электрических импульсов на поверхности клетки. Знак фототопотаксиса определяется величиной сдвига фаз между ритмами двух осцилляторов - пульсирующих вакуолей. Эта величина зависит от многих факторов: интенсивности освещения, степени аэрации, ионного состава среды, возраста культуры и т.д. Она обусловлена, по-видимому, различной чувствительностью осцилляторов к этим факторам [Sineshchekov , Govorunova, 2001a]. 9.4. СЕНСОРНОЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЕ У DUNALIELLA 9.4.1. Методы исследований

В ходе наших исследований были использованы ионы кальция (соль СаСl2×6Н2О); ионофор А23187; оуабаин; азид натрия; ионы кобальта (СоСl2); блокаторы кальциевых каналов циннаризин и изоптин. Препараты испытывали в концентрациях: СаСl2×6Н2О - 10-6 М - 10-2 М; ионофор А23187 - 10-5 М; СоСl2 и циннаризин - (10-6 -10-3) М; изоптин - (10-7-10-4) М и азид натрия - (10-7-10-3) М. Параметры V и F измеряли в трех повторностях (три образца, взятые из одной колбы с исследуемой культурой водорослей). Каждая точка на графиках зависимости параметров V и F от концентрации упомянутых выше препаратов представляет собой средний результат измерений не менее трех образцов. Измерения проводили через один час после введения препарата в исследуемую суспензию. Исследования положительного фототопотаксиса Dunaliella проводили при освещенности образца белым светом 500 лк, отрицательного при 40000 лк. В задачи исследований входило сравнение действия упомянутых выше препаратов на фотодвижение двух видов Dunaliella [Посудин и др., 1993].

9.4.2. Влияние ионов кальция

Результаты исследований. Зависимость параметров фотодвижения клеток Dunaliella (скорости V поступательного движения и фактора F) от концентрации С содержащихся в среде ионов кальция (соль СаСl2×6Н2О), которая изменялась от 10-6 М до 10-2 М, представлена на рис. 9.3, а - для D. salina и рис. 9.3, б для D. viridis. Максимальные значения F приходятся на область концентрации кальция (10-6-10-4) М для обоих видов; при высоких (порядка 10-2 М) концентрациях величина параметра F уменьшается до 80-90 % - 117 -

относительно контрольных значений, регистрируемых при отсутствии ионов кальция в среде. В то же время мы не установили каких-либо существенных отличий скорости V клеток от контрольных значений во всей исследуемой области концентрации кальция.

Рис.9.3. Зависимость параметров фотодвижения F и V двух видов Dunaliella (а – D. salina и D.viridis) от концентрации CaCl2×6H2O [Посудин и др., 1993].

Обсуждение результатов. Несмотря на то, что роль кальция в фотодвижении водорослей очевидна (активация кальциевых каналов, управление ионными насосами, изменение проницаемости клеточных мембран), многие аспекты этой проблемы еще требуют своего разрешения. Зависимость параметров фотодвижения двух видов Dunaliella от концентрации ионов кальция характеризуется наличием максимума параметра F в области концентраций СаСl2×6Н2О (10-6-10-4) М; в то же время, не установлена зависимость скорости движения V от концентрации ионов кальция. Наши данные по исследованию влияния ионов кальция на фотодвижение Dunaliella совпадают с данными, полученными в работе [Avron, BenAmotz, 1992], согласно которым подвижность, скорость движения и линейность траектории движения D. salina и D. bioculata слабо зависят или вообще не зависят от концентрации кальция в среде, и частично совпадают с результатами, полученными рядом авторов для Chlamydomonas reinhardtii. Так, оптимальная (с точки зрения достижения максимальных значений фототопотаксиса клетками этой водоросли) область концентраций кальция составляет 5×10-5 М [Dolle et al.,1987; Nultsch, 1979, 1983]; при концентрации 10-5 М уровень фототопотаксиса снижается до 50 %, а при концентрации 2×10-4 М - до 25 % относительно контрольных значений фототопотаксиса. При концентрации 10-3 М фототопотаксис клеток Chlamydomonas полностью подавляется. Зависимость фототопотаксиса Chlamydomonas от содержания кальция в среде весьма чувствительна к интенсивности стимулирующего света [Dolle et al., 1987; MorelLaurens, 1987]. В то же время, следует отметить зависимость скорости движения клеток Chlamydomonas от концентрации ионов кальция в среде и от интенсивности стимулирующего света [Morel-Laurens,1987]. Виды Dunaliella отличаются от Chlamydomonas тем, что скорость движения их клеток не зависит от концентрации ионов кальция в испытанных пределах.

- 118 -

9.4.3. Влияние ионофора А23187

Результаты исследований. Ионофоры - это вещества, которые связывают различные ионы в растворах и обеспечивают проницаемость биологической мембраны для связанного иона. Результаты использования ионофора А23187, который повышает проницаемость клеточной мембраны для ионов кальция, представлены на рис. 9.4, а, б для обоих видов Dunaliella (концентрация СаСl2×6H20 в среде составляла 10-4 М). Внесение ионофора в среду в концентрации 10-5 М вызывает практически полное подавление фототопотаксиса D. salina и D. viridis. Восстановление параметра F до начальных (контрольных) значений достигается лишь через 12 ч для D. salina и через 24 ч для D. viridis. Добавление кальция (10-3 М) через 24 ч после внесения ионофора не изменяет величины параметра F. Изменений скорости движения клеток в этих опытах нами обнаружено не было. Обсуждение результатов. Результаты добавления ионофора А23187 в концентрации 10-5 М в среду свидетельствуют о столь обширном поступлении кальция внутрь клетки, при котором фототопотаксис Dunaliellа практически мгновенно подавляется; скорость движения клеток при этом существенно не изменяется. Такие результаты можно объяснить тем, что ионофор А23187 повышает проницаемость мембраны для ионов кальция. Даже если соли кальция отсутствуют в составе среды, предназначенной для культивирования Dunaliellа, ионы кальция могут присутствовать в воде, используемой для приготовления среды; источниками этих ионов могут быть предметные и покровные стекла (по оценкам, представленным в работе [Dolle et al., 1987]). Тот факт, что скорость движения Dunaliellа не изменяется, является отличительным признаком действия препарата на параметры фотодвижения водоросли по сравнению с другой зеленой водорослью – Chlamydomonas [Pfau et al., 1983], у которой в результате применения ионофора А23187 в концентрации 10-5 М ингибируется и фототопотаксис, и скорость движения клеток.

Рис. 9.4.Временная зависимость параметров фотодвижения F и V двух видов Dunaliella (а - D. salina и б - D. viridis) от добавления в среду ионофора А23187 (момент добавления указан стрелкой) [Посудин и др., 1993].

Авторы этих исследований объясняют ингибирующее действие ионофора на скорость движения клеток Chlamydomonas возможным сокращением (или сбрасыванием) жгутиков с последующим их восстановлением (или регенерацией). Сравнительный анализ различий и сходств в действии ионофора на параметры фотодвижения представителей двух родов (Dunaliellа и Chlamydomonas) свидетельствует о - 119 -

наличии у Dunaliellа более высоких адаптивных способностей, проявляющихся в экстремальных условиях. Можно предположить также специфическое действие ионофора на различные параметры фотодвижения водорослей, представляющих разные таксоны, – направление движения клеток у Dunaliellа, направление и скорость движения клеток у Chlamydomonas, частоту и длительность пространственных кувырканий у Euglena gracilis [Doughty, Diehn, 1979]. 9.4.4. Влияние оуабаина

Результаты исследований. В наших экспериментах внесение оуабаина в концентрациях от 10-7 до 10-4 М не привело к каким-либо ощутимым изменениям параметров V и F фотодвижения Dunaliella.Обсуждение результатов. Использование оуабаина - ионотропного препарата, ингибирующего Na+-K+-АТФазу, вызывает увеличение длительности кувырканий клеток Euglena gracilis при изменении интенсивности света и скорости аккумулирования клеток в освещенной области [Doughty et al., 1980]. Подобное влияние оуабаина можно объяснить ингибированием потока одновалентных ионов натрия (из клетки) и калия (внутрь клетки), что сопровождается изменениями электрических градиентов на клеточной мембране, влияющими на поступление двухвалентных ионов кальция внутрь клетки. А это, в свою очередь, приводит к переориентации жгутиков E. gracilis [Meyer, Hildebrand, 1988]. Отсутствие влияния оуабаина на параметры V и F фотодвижения Dunaliella позволило предположить, что поступление ионов кальция внутрь клетки Dunaliella управляется не с помощью Na+-K+-насоса, как в случае Euglena, а, вероятно, за счет непосредственного, индуцированного светом, поступлением ионов кальция внутрь клетки, как это имеет место у Chlamydomonas [Nultsch,1983]. 9.4.5. Влияние ионов кобальта

Результаты исследований. Наши исследования показали, что добавление кобальта в среду в концентрации (10-6-10-3) М СоСl2 влияет на фототопотаксис Dunaliella, в то время как скорость движения клеток при концентрации СоСl2 (10-6-10-4) М практически не изменяется (рис. 9.5, а, б). На протяжении пяти суток после внесения ионов кобальта в среду их ингибирующее действие сохраняется. Добавление ионов кальция в концентрации 10-3 М восстанавливает параметр F до значений, присущих контрольным образцам, выращенным в среде без добавления СоСl2 и СаСl2×6H20. Обсуждение результатов. Известно, что ионы кобальта, лантана, марганца и никеля являются блокаторами кальциевых токов через мембрану, вызывающими реверсивные, изменяющие направление движения клеток биения жгутиков Chlamydomonas [Schmidt, Eckert, 1976; Doughty, Diehn, 1982]. Такая зависимость фотодвижения Chlamydomonas от блокаторов кальциевых каналов свидетельствует об участии ионов кальция и кальциевых каналов в процессах сенсорного преобразования у водоросли. Подобная зависимость пространственных и временных изменений поведения (фотофобических реакций) клеток в присутствии двухвалентных ионов кальция, бария, марганца, кобальта и магния наблюдалась у Euglena gracilis [Colombetti et al., 1982]. Наблюдаемое нами ингибирующее действие ионов кобальта на фототопотаксис Dunaliella позволяет предположить участие кальциевых токов через жгутиковую мембрану в сенсорном преобразовании у водорослей этого рода и, таким образом, наличие ионной природы сенсорного преобразования у Dunaliella.

- 120 -

Рис.9.5.Зависимость параметров фото-движения F и V двухвидовDunaliella (а - D. salina и б -D. viridis) от концентрации CoCl2 [Посудин и др., 1993].

9.4.6. Влияние циннаризина и изоптина

Результаты исследований. Использование циннаризина, являющегося блокатором кальциевых каналов, показало, что при концентрации циннаризина (10-6-10-4) М имеет место ингибирование обоих (V и F) параметров фотодвижения Dunaliellа. Лишь при концентрации циннаризина 10-3 М у обоих видов оба параметра полностью ингибируются (рис. 9.6, а, б). Мы не замечали восстановления параметров фотодвижения Dunaliella в течение 24 ч после внесения циннаризина в среду. Другой используемый нами блокатор кальциевых каналов - изоптин также ингибирует оба параметра фотодвижения: при концентрации изоптина 10-4 М фототопотаксис обоих видов Dunaliella уменьшается до 60-70%, а скорость движения - до 75-90 % относительно контрольных значений (рис. 9.7, а, б). Обсуждение результатов. Использование этих препаратов, являющихся блокаторами кальциевых каналов, показало, что они ингибируют оба (V и F) параметра фотодвижения у обоих видов Dunaliellа. Интересно сравнить полученные нами результаты исследований с циннаризином и изоптином с данными других авторов, использовавших такие блокаторы кальциевых каналов как флунаризин, верапамил, дилтиазем и нимодипин [Nultsch et al., 1986].

- 121 -

Рис.9.6. Зависимость параметров фотодвижения F и V двух видов Dunaliella (а- D salina и б-D. viridis) отконцентрации циннаризина [Посудин и др., 1993].

Обнаружено что увеличение концентрации флунаризина от начального уровня 10-6 М вызывает уменьшение фототопотаксиса и подвижности Chlamydomonas [Nultsch et al., 1986]; при концентрации 5×10-5 М оба параметра ингибируются полностью, что дает право авторам не считать подобный эффект специфическим (т.е. вызывающим подавление одного лишь фототопотаксиса). Микроскопический анализ убеждает в том, что потеря подвижности клетками вызывается укорочением или даже отделением жгутиков, как это наблюдалось при воздействии азида натрия или ионофора А23187 [Pfau et al., 1983]. Через 6 часов после воздействия флунаризина и фототопотаксис, и подвижность клеток Chlamydomonas восстанавливались, что связано с регенерацией жгутиков. Верапамил в концентрации 2×10-5 М ингибирует фототопотаксис и подвижность клеток в различной степени - до 40 % фототопотаксис, до 50-60 % - подвижность, что связывают с постепенным отделением жгутиков Chlamydomonas [Nultsch et al., 1986]. Через 10 часов после воздействия препарата подвижность восстанавливается до 20 % от начального уровня, тогда как фототопотаксис вообще не восстанавливается, что свидетельствует о специфическом действии верапамила на фототопотаксис Chlamydomonas. Дилтиазем и нимодипин влияют на фототопотаксис Chlamydomonas, не затрагивая при этом подвижности клеток. В концентрации 2×10-5 М оба препарата вызывают ингибирование фототопотаксиса до 30-35 %. В данном случае также наблюдается восстановление фототопотаксиса до начального уровня через 6 ч при использовании дилтиазема и через 10 ч после воздействия нимодипина.

- 122 -

Таким образом, действие таких блокаторов как верапамил, дилтиазем и нимодипин на параметры фотодвижения Chlamydomonas можно считать специфичным, т.е. влияющим в различной степени на фототопотаксис и подвижность клеток. Циннаризин и изоптин, использованные нами в настоящих исследованиях, действуют и на скорость движения, и на фототопотаксис: при высоких (порядка 10-3 М) концентрациях препаратов полностью подавляется скорость движения и фототопотаксис. 9.4.7. Влияние азида натрия

Результаты исследований. Из рис. 9.8 видно, что в пределах использованных концентраций азида натрия скорость движения клеток обоих видов Dunaliella практически не изменялась как при умеренных (500 лк), так и при высоких (40000 лк) значениях освещенности образца белым светом; уровень средних значений скорости движения клеток исследуемых видов Dunaliella зависел лишь от освещенности образца (рис. 9.8, 1, 2).

Рис. 9.8. Зависимость параметров фотодвижения F и V двух видов Dunaliella (а - D. salina и б D. viridis) от концентрации азида натрия. Здесь: 1 и 2 – скорость поступательного движения при освещенности образца белым светом 500 лк и 40000 лк соответственно; 3 и 4 –фототопотаксис при освещенности образца белым светом 500 лк и 40000 лк соответственно. Вертикальные разноски – погрешности измерений [Посудин и др., 1995].

Отмечено полное подавление положительного фототопотаксиса двух видов Dunaliella при концентрациях азида натрия C ³ 10-4 М, а отрицательного – при концентрациях C ³10-5 М для D. salina и C ³10-4 М для D. viridis (рис. 9.8, 3, 4). Таким образом, азид натрия избирательно действовал на фототопотаксис двух видов Dunaliella, не влияя при этом на скорость движения их клеток. Обсуждение результатов. В наших экспериментах установлено избирательное действие азида натрия на фототопотаксис двух видов Dunaliella; при этом препарат не влияет на скорость движения клеток. Сравним действие азида натрия на параметры фотодвижения Dunaliellа и других водорослей. Из работ [Stavis, Hirschberg, 1973; Pfau et al.,1983] известно, что препарат ингибирует положительный фототопотаксис Chlamydomonas reinhardtii при концентрациях того же порядка (3,5×10-4-10-4) М, что и в наших экспериментах с Dunaliellа. Что касается подавления отрицательного фототопотаксиса азидом натрия, то - 123 -

оно известно для эвгленофитовой водоросли Euglena gracilis (5×10-5 М) [Colombetti et al., 1982] и синезеленой водоросли Anabaena variabilis (10-3 М) [Nultsch et al., 1983]. На положительный фототопотаксис этих водорослей препарат не влияет. Мы не отмечали действия азида натрия на скорость движения клеток двух видов Dunaliellа, что наблюдали также для A. variabilis при интенсивном освещении [Nultsch et al., 1983]. Для других водорослей, таких как E. gracilis [Barghigiani et al., 1979], A. variabilis при слабом освещении [Nultsch et al., 1983], Phormidium uncinatum [Nultsch, Häder, 1979], известно, что добавление азида натрия снижает скорость движения клеток. Такое действие препарата объясняют появлением внутриклеточных структурных изменений у E. gracilis [Barghigiani et al., 1979] и воздействием на процессы нециклического фотосинтетического переноса электронов у A. variabilis [Nultsch et al., 1983]. Влияние азида натрия на подвижность клеток Ch. reinhardtii связывают [Pfau et al., 1983] с возможным укорочением или отделением жгутиков. Избирательное действие азида натрия на способность клеток Dunaliellа spp. осуществлять направленное движение относительно направления распространения света при отсутствии влияния препарата на скорость движения клеток свидетельствует о существовании двух отдельных каналов в цепи сенсорного преобразования светового сигнала у этих водорослей: один из них зависит от действия азида натрия и управляет ориентацией клеток относительно источника света, другой не зависит от действия препарата и управляет скоростью движения клеток. Это предположение согласуется с результатами gоблучения клеток Dunaliellа, продемонстрировавшими различный наклон дозовых кривых для фототопотаксиса и фотокинеза [Посудин и др., 1992]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, отмечаются некоторые отличия в действии использованных препаратов (например, ионофора А23187) на различные виды водорослей, принадлежащиe к одному роду Dunaliella. В отличие от Chlamydomonas reinhardtii, во многих случаях реагирующего на введение в среду обитания веществ, стимулирующих или блокирующих ионные каналы неспецифически (аутотомия жгутиков), клетки Dunaliella в этих условиях жгутики не сбрасывают, поэтому их двигательные реакции можно считать специфическим ответом на блокирование/стимулирование ионных процессов. Наблюдаемые нами отличия в действии специфических препаратов на параметры фотодвижения гипергалобных видов Dunaliella и обитателей пресноводных водоемов Euglena gracilis и Ch. reinhardtii позволяют предположить более высокую толерантность исследуемых гипергалобных видов Dunaliella к внешним ингибиторам. Максимальные значения фототопотаксиса гипергалобных видов Dunaliella наблюдаются при наличии в среде обитания CaCl2×6H20 в концентрациях 10-5-10-3 М. Повышение концентрации хлористого кальция до 10-2 М подавляло фототопотаксис на 10-20 %. Внесение в среду ионофора А23187, повышающего проницаемость клеточной мембраны для ионов кальция, вызывало полное ингибирование фототопотаксиса как у D. salina, так и у D. viridis. Внесение в среду CoCl2, блокирующего мембранные кальциевые каналы, в концентрации 10-6-10-3 М ингибирует фототопотаксис видов Dunaliella. Подобное действие на фототопотаксис Dunaliella оказывают и такие блокаторы кальциевых каналов как циннаризин и изоптин, а также азид натрия - ингибитор цитохромоксидазы. Оаубаин, стимулирующй Na+-K+-АТФазу, не влияет на фототопотаксис Dunaliella. Вместе с тем, указанные препараты в использованных концентрациях не влияют на скорость движения клеток Dunaliella. Обобщая полученные нами результаты использования препаратов, специфически действующих на параметры фотодвижения Dunaliella, можно сделать вывод о том, что процесс сенсорного преобразования у видов Dunaliella, как и у Chlamydomonas, имеет ионную природу, а фоторегуляция процессов, управляющих скоростью движения клеток и фототопотаксисом, происходит по различным каналам цепи сенсорного преобразования принятого фоторецептором кванта света в сигнал, который управляет биением жгутиков. Отсутствие влияния оуабаина на параметры движения Dunaliella spp. позволяет исключить участие Na+-K+-АТФазы в процессах фоторегуляции движения этих водорослей. - 124 -

ГЛАВА 10 РАБОТА ЖГУТИКОВОГО АППАРАТА 10.1. СТРУКТУРА ЖГУТИКОВОГО АППАРАТА

Жгутики являются органеллами, которые в большинстве случаев расположены на апикальном (переднем по ходу движения) конце клетки; обычно длина жгутиков равна, несколько короче или превышает длину клетки [Масюк, 1973]. Каждый жгутик представляет собой бичевидное образование диаметром около 0,2 мкм. Благодаря активным изгибам жгутики обычно производят тянущее или толкающее воздействие на клетку, обеспечивая ее поступательное движение с одновременным ее вращением вокруг собственной продольной оси. Жгутик, расположенный ближе к стигме, называется цис-жгутиком, а удаленный от нее транс-жгутиком. Жгутиковый аппарат водорослей состоит из трех основных частей – собственно жгутика (Ж), базального тела (БТ) и структур, ассоциированных с базальными телами (связок и жгутиковых корешков). Жгутик, в свою очередь, состоит из трех частей: жгутиковой верхушки (flagellar top), жгутикового ствола (flagellar shaft) и жгутикового переходного района (flagellar transition region) [Melkonian, 1984] (рис. 10.1). Жгутик ограничен мембраной, представляющей продолжение клеточной плазмалеммы. Под мембраной расположена аксонема (стержень жгутика) – система микротрубочек (9+2), погруженная в аморфный матрикс. Базальные тела обоих жгутиков образуют V-образную фигуру, связанную исчерченным дистальным и проксимальным волокнами (рис. 10.2). Базальные тела соединяются с жгутиковыми корешками - системой микротрубочек и микрофибрилл; пучки таких микротрубочек крестообразно отходят от так называемой плотной пластины (см. рис. 10.2) и располагаются под клеточной мембраной [Ringo, 1967; см. обзор: Melkonian, 1984]. Аксонема состоит из девяти периферических дублетов микротрубочек ПТ и двух центральных ЦТ (структура, условно обозначаемая 9+2). Внешние дублеты содержат по два компонента – А и В трубочки, связанные поперечными мостиками. Трубочка А имеет в поперечном сечении округлую форму, а трубочка В – серповидную форму. Оба типа трубочек имеют общую часть их поверхности. Трубочки А снабжены парами боковых ручек, ориентированными в плоскости поперечного сечения жгутика к соседнему дублету по часовой стрелке, и радиальными спицами (рис. 10.3). Среди основных белков, входящих в состав жгутикового аппарата, следует отметить тубулин, основной материал жгутиковых и цитоплазматических микротрубочек, и динеин, находящийся в боковых ручках. В периферических связках обнаружен белок нексин. В составе жгутикового аппарата зеленых водорослей обнаружен также белок центрин, способный к сокращению и релаксации, вызывающих биения жгутиков. Динеин характеризуется АТФ-фазной активностью; молекулы динеина ответственны за химикомеханические преобразования. Взаимодействие между внешними динеиновыми ручками трубочки А и соседней с ней трубочкой В обуславливает изгиб жгутика [см. обзоры: Квитко и др., 1978; Melkonian, 1984].

- 125 -

Рис. 10.1. Схема тонкой структуры жгутикового аппарата: І - наружная часть жгутикового аппарата (собственно жгутик); ІІ - внутриклеточная часть жгутикового аппарата (базальное тело жгутика); А - вершина жгутика; Б ствол жгутика; В - переходная зона; Г - базальное тело; 1 - продольный разрез через жгутиковый аппарат; 2-11 десять поперечных сечений через жгутик и базальное тело в различных местах, обозначенных соответствующими цифрами на продольном разрезе; ЖМ - жгутиковая мембрана; ПТ - периферические дублеты микротрубочек; ЦТ центральная пара микротрубочек (по Ringo, 1967, из: Ettl, 1980).

Рис. 10.2.Схема жгутикового аппарата Chlamydomonas: Ж – жгутики, ПР –переходной район, БТ – базальное тело, 1 – проксимальная и 2 – дистальная исчерченная связка, 3 – плотная пластина [Ringo, 1967].

- 126 -

Рис.10.3. Схематическое изображение деталей строения аксонемы жгутика. Показана взаимосвязь между элементами структуры на разных уровнях: а – на конце жгутика, б – в средней части, в на уровне базального тела; 1 – микротрубочки А; 2,3 – центральный дублет микротрубочек; 4 – центральная оболочка; 5 – радиальная спица; 6 – динеиновая ручка микротрубочки А; 7 – микротрубочка В; 8 – нексиновый мостик; 9 – микротрубочки С [Квитко и др., 1978].

10.2. ОСОБЕННОСТИ БИЕНИЯ ЖГУТИКОВ 10.2.1. Биения жгутика Euglena gracilis

Изгибы жгутика Euglena gracilis в процессе биений характеризуются спиралеобразной формой, хотя, строго говоря, структура биений больше соответствует серии изгибов, каждый из которых представляет собой часть спирали. Разделены эти спиралеобразные участки прямолинейными отрезками жгутика (рис. 10.4). Это дало основание назвать такую форму жгутика в процессе биения «прерванною спиралью» (“interrupted helix”) [Jahn, Bovee, 1968].

Рис. 10.4. Схематическое изображение структуры биений жгутика Euglena gracilis, представляющей собою серию изгибов (“прерванную спираль”), каждый из которых (1, 2) представляет собой часть спирали; разделены эти спиралеобразные участки прямолинейными отрезками жгутика (а, б) [Jahn, Bovee, 1968]. Здесь стрелки указывают направление распространения изгибов; пунктирные линии соответствуют границам изгибов.

Биения жгутика E. gracilis обеспечивают движение клетки по спиралеобразной траектории. Клетка совершает при этом обороты вокруг своей продольной оси с частотою 2 Гц (около 0,32 об/с = 19 об/мин). - 127 -

10.2.2. Биения жгутиков Chlamydomonas reinhardtii

Жгутики Chlamydomonas reinhardtii демонстрируют синхронные биения симметричной формы относительно продольной оси тела в одной плоскости. Движение жгутиков состоит из двух этапов. Первый этап - движение жгутиков спереди назад в распрямленном состоянии (силовой удар - “power stroke”), второй - возвращение жгутиков в исходное состояние благодаря их плавному изгибанию, начиная от их основания; волна изгиба распростроняется от основания жгутика к его концу (возвратный удар - “return stroke”) (рис. 10.5, а, б, в) [Ringo, 1967]. Если во время силового удара жгутиков клетка толчком продвигается вперед, то во время возвратного удара - слегка сдает назад. Такой характер движения клетки Д.Л. Ринго назвал “плаванием стилем брасс”, а движение жгутиков отнес к цилиарному типу (такое веслообразное биение характерно для цилий инфузорий) [Ringo, 1967; Квитко и др., 1978]. Движение клетки назад во время фотофобической реакции обеспечивается волнообразным движением жгутиков, причем волна распространяется от дистального конца жгутиков к их основанию (рис. 10.5, г) [Colombetti, Marangonu, 1991].

Рис.10.5. Биения жгутиков Chlamydomonas reinhardtii: а движение клетки вперед обеспечивается распрямленными жгутиками, которые расходятся в стороны (силовой удар, power stroke); б - возвратный удар (return stroke) [Ringo, 1967]; в - цилиарное (веслообразное) движение жгутиков при плавании стилем “брасс”; г - волнообразное (ундуляторное) движение жгутиков при движении клетки назад во время фобической реакции [Colombetti, Marangoni, 1991]. Стрелки указывают направление движения клетки.

Во время поступательного движения клетка вращается вокруг своей продольной оси с частотою 2 Гц [Rüffer, Nultsch, 1985]. Поворот клетки Ch. reinhardtii по направлению к источнику света происходит таким образом [Rüffer, Nultsch, 1990; Nultsch, 1991]: свет детектируется фоторецептором, расположеном в плазмалемме напротив стигмы асимметрично по отношению к продольной оси клетки. Освещение фоторецептора сопровождается потоком ионов кальция через мембрану жгутиков. В ответ на поступление ионов кальция ближайший к стигме жгутик (цис-жгутик) производит биения большей амплитуды, чем удаленный от стигмы жгутик (транс-жгутик). Такой дифференциальный отклик двух жгутиков на изменение концентрации кальция во внутрижгутиковом пространстве вызывает изменение направления движения клетки по направлению к источнику света, т.е. фототопотаксис. Подобную особенность работы жгутикового аппарата, характеризующегося поступлением разных потоков ионов кальция к цис- и транс-жгутикам, демонстрирует Haematococcus pluvialis [Sineshchekov, 1991a]. - 128 -

10.2.3. Биения жгутиков Dunaliella

Dunaliella bioculata. В процессе своего движения клетка D. bioculata движется по синусоидальной траектории, вращаясь вокруг своей продольной оси против часовой стрелки. В процессе биения каждый жгутик движется спереди назад и располагается вдоль тела клетки; возвратное биение восстанавливает первоначальное положение жгутика за счет распространяющихся вдоль него изгибов. Отличительной особенностью работы жгутикового аппарата Dunaliella по сравнению с Chlamydomonas является то, что при изменении направления движения клетки один из жгутиков кратковременно становится неподвижным, тогда как другой обеспечивает поворот клетки, после чего клетка движется в новом направлении с двумя работающими жгутиками [Dunaliella …, 1992]. Кроме того, частота биений двух жгутиков Dunaliella bioculata неодинакова (50 и 60 Гц), что приводит к появлению некоторого угла между плоскостями биений жгутиков. Это вызывает вращение клетки и ее движение по синусоидальной траектории [Shoevaert et al., 1988]. 10.3. РЕГИСТРАЦИЯ БИЕНИЙ ЖГУТИКОВ 10.3.1. Высокоскоростная микрокинематография

Высокоскоростная микрокинематография (100-500 кадров/с) позволяет проанализировать кадр за кадром движение клеток водорослей. Для Chlamydomonas reinhardtii были оценены параметры движения клеток: поступательная скорость при комнатной температуре 100-200 мкм/с (максимальное значение 240 мкм/с); скорость вращательного движения 1,4-2 Гц (0,22-0,32 об/с) при максимальном значении 2,5 Гц (0,4 об/с); частота биения жгутиков, которые обеспечивают спиралеобразное движение клетки, от 45 до 62-70 Гц у жгутика, находящегося на внешней стороне спирали, и 45 Гц у жгутика, находящегося на внутренней стороне спирали [Rüffer, Nultsch, 1985]. Благодаря использованию метода высокоскоростной киносъемки были определены скорость поступательного движения Dunaliella bioculata, которая составила 105 ± 10 мкм/с [Dunaliella …, 1992], и частота биения жгутиков (50 и 60 Гц) этого вида [Shoevaert et al., 1988]. 10.3.2. Лазерная допплеровская спектроскопия

Суть эффекта Допплера заключается в том, что при облучении объекта, который движется со скоростью V, светом определенной частоты l имеет место рассеивание света, причем частота (длина волны) рассеянного света зависит от скорости движения объекта. Допплеровское смещение Df частоты света зависит от угла рассеяния q света объектом, скорости движения V объекта и от угла j между направлением движения объекта и направлением распространения света [Ascoli et al., 1980]: Df =

2V q sin cos j l 2

.

( 10.1 )

Воздействуя на клетки жгутиковых водорослей лазерным излучением и регистрируя допплеровские сдвиги частоты, Ц. Асколи с сотрудниками удалось оценить скорости поступательного и вращательного движений (для E. gracilis скорость поступательного движения составила 100 мкм/с, а частота вращения клетки около 2 Гц), а также частоту биения жгутиков [Ascoli et al., 1978, 1980]. Использование техники допплеровской спектроскопии дало возможность оценить скорость поступательного движения Dunaliella bioculata, которая составила 109 ± 5 мкм/с [Dunaliella …, 1992]. Tипичные допплеровские спектры, позволяющие оценить частоту биения жгутиков для разных водорослей, представлены на рис. 10.6. Как видно, частота биения жгутиков D. salina находится на уровне около 25 Гц.

- 129 -

10.3.3. Метод светорассеяния

Суть метода светорассеяния поясняется рис. 10.7. Инфракрасный компонент излучения источника 1, проходя через инфра-красный фильтр 2 и темнопольный конденсор 3, попадает на исследуемую суспензию 4 водорослей. Вспышка света, которая подается на суспензию, не попадает в объектив за счет темнопольного конденсора. Однако, модули-рованный за счет биения жгутиков сигнал собирается объективом 5 и регистрируется фотоприемником 6, выходной сигнал которого подается на спектроанализатор 7, сопряжен-ный с компьютером 8 [Ascoli, Petracchi, 1991]. Экспериментальная система дает возможность проводить измерения, накапливая с помощью компьютера данные через каждые 300 мс в шестикратной повторности. Используя технику быстрого Фурьепреобразования, можно сравнить начальный спектр интенсивности для совокупности исследуемых клеток с теми, которые получены при различных временных задержках относительно вспышки света, и получить представление об эволюциях частоты биения жгутиков водоросли.

Рис. 10.6. Типичные допплеровские спектры, позволяющие оценить частоту биения жгутиков для разных водорослей [Ascoli et al., 1980]. Здесь: P(n) – интенсивность рассеянного на движущимся объекте сигнала, регистрируемого на частоте n.

Техника светорассеяния выгодно отличается от методов допплеровской спектроскопии, поскольку позволяет использовать традиционные источники некогерентного белого света. Будучи промодулированным по интенсивности за счет подвижных клеток, свет формирует сигнал, который регистрируется фотоприемником; на выходе последнего фототок изменяется по закону [Ascoli, Petracchi, 1991]: I(t) = bI(1 +Mf cos2pnft + Mr cos2pnrt, ( 10.2 ) где b – квантовая эффективность фотоприемника; I – среднее значение интенсивности рассеянного на клетках излучения, попадающего в объектив; Mf и Mr – коэффициенты, зависящие от биения жгутиков и вращения клетки соответственно; nf – частота биения жгутиков; nr – частота вращения клетки. Средние значения интенсивности рассеянного света дополняются модуляционными членами, величина которых зависит от движения клеток и анизотропии рассеяния [Ascoli, Petracchi, 1991]. Зависимость распределения интенсивности рассеянного света клетками от частоты биений жгутиков, полученное нами при работе с клетками D. salina, представлено на рис. 10.8, а для малой (1 мВт/см2) и на рис. 10.8, б – для высокой (10 мВт/см2) интенсивности света. Как видно из рисунков, характер распределения интенсивности, индуцированного вспышками света, не приводят к спектральным сдвигам максимумов распределения до и после вспышки.

- 130 -

Рис.

10.7.Схема

предназначенной

экспериментальной для

регистрации

установки,

светорассеяния

(пояснения в тексте) [Angelini et al., 1986].

Не влияет на характер распределения интенсивности рассеянного света и изменение интенсивности света. Это свидетельствует об отсутствии у D. salina фотофобической реакции. 10.3.4. Метод фотометрии

В основе фотометрических методов лежит регистрация абсолютных или относительных значений потоков излучения, прошедших через основания подвижных жгутиков: перемещающиеся в пространстве основания жгутиков модулируют световой поток, регистрируя который можно получить информацию о частоте биения жгутиков.

Рис. 10.8 а. Спектры интенсивности рассеянного клетками Dunaliella salina света при малых (1 мВт/см2) уровнях интенсив-ности вспышки света: а - до вспышки света; б - в момент вспышки света; в - через 10 с после вспышки света. Здесь вертикальная линия соответствует максимуму распределения интенсивности рассеянного света в зависимости от частоты биения жгутиков; t0 - момент вспышки света; tmax - момент времени, соответствующий образованию максимума распределения интенсивности рассеянного света [Посудин, 1992а].

- 131 -

Рис. 10.8 б. Спектры интенсивности рассеянного клетками Dunaliella salina света при высоких (10 мВт/см2) уровнях интенсивности вспышки света: а - до вспышки света; б - в момент вспышки света; в - через 10 секунд после вспышки света. Обозначения те же, что и на рис. 10.8 а [Посудин, 1992а].

В процессе фотометрирования клетка исследуемой водоросли закрепляется между предметным и покровным стеклами, после чего к основанию жгутиков подводят зонд микроскопа (нами был использован микроскоп ЛЮМАМ И3). Процедура измерений сводилась к следующим операциям: 1) модуляции светового потока биениями жгутиков;2) регистрации модулированного светового потока фотоэлектронным умножителем микроскопа; 3) подаче выходного сигнала фотоэлектронного умножителя на вход усилителяпреобразователя; 4) фильтрации сигнала в диапазоне от 3 до 100 Гц усилителемпреобразователем; 5) обработке сигнала с помощью триггера Шмидта (который вырабатывает стандартный импульс определенной длительности при превышении сигналом заданного уровня) и синхронизирующего триггера; 6) запуску счетчика импульсов; 7) аналогоцифровому преобразованию регистрируемого сигнала. Таким образом, система регистрации, используемая в данном методе, позволяла преобразовать частоту биения жгутиков в аналоговую форму и регистрировать ее на самописце. Значения частоты биения жгутиков двух видов Dunaliella, измеренные методом фотометрии, находятся в пределах 20-50 Гц (наши неопубликованные данные). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Зеленые водоросли в процессе фотодвижения различаются по характеру биения жгутиков. Движение клетки Chlamydomonas вперед осуществляется с помощью цилиарного биения жгутиков; во время фотофобической реакции клетки двигаются назад благодаря ундуляторному (волнообразному) биению жгутиков. Поскольку у гипергалобных видов Dunaliella отсутствуют фотофобические реакции, у них не наблюдается ундуляторное биение жгутиков. Повороты клеток Chlamydomonas происходят благодаря неравной амплитуде и частоте биения цис- и транс-жгутиков; клетки Dunaliella при поворотах приостанавливают биение одного из жгутиков. Частота биения жгутиков у морских и гипергалобных видов Dunaliella (20-50 Гц) примерно того же порядка, что и у пресноводных Haematococcus и Chlamydomonas.

- 132 -

ГЛАВА 11

ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ФОТОДВИЖЕНИЯ DUNALIELLA. БИОТЕСТИРОВАНИЕ ВОДНЫХ СРЕД Наблюдение за состоянием биотической компоненты биосферы, ее реакцией на антропогенные воздействия, отклонения от нормального природного состояния на разных уровнях (молекулярном, клеточном, организменном, популяционном и биоценотическом) называется биологическим мониторингом. Биотестирование – использование для мониторинга окружающей среды организмов или совокупности организмов, у которых содержание определенных элементов или соединений, а также морфологическая, гистологическая или клеточная структура, метаболические и биохимические процессы, поведение и популяционная организация позволяют дать количественную оценку качества окружающей среды или изменений этой среды. Тест-объект – организм или совокупность организмов, по степени воздействия на которые судят о качестве (например, степени токсичности) среды. Тест-реакция – физиологический или поведенческий отклик организма на изменение качества среды. В качестве тест-объектов используют бактерии, грибы и актиномицеты, водоросли, простейшие, беспозвоночные, рыбы, растения [Крайнюкова, 1988; Методическое ..., 1991]. Тест-реакциями, которые могут быть использованы во время биотестирования, могут служить интенсивность размножения, иммобилизация клеток, двигательная активность, фотосинтетическая активность, проницаемость мембраны, биолюминесценция, импеданс суспензии, биоэлектрическая реакция и т.д. [Баренбойм, Маленков, 1986; Крайнюкова, 1988]. Преимуществом метода биотестирования является высокая чувствительность, быстрота, надежность, возможность создания автоматизированных систем сбора и обработки информации. К недостаткам можно отнести отсутствие количественной оценки каждого из токсичных веществ, присутствующих в среде, и возможного взаимодействия отдельных компонентов токсичных соединений, которые находятся в смеси. Если организмы используются в природных условиях, методы биотестирования называются пассивными, если в лабораторных – активными. 11.1. ВОДОРОСЛИ РОДА DUNALIELLA КАК ТЕСТ-ОБЪЕКТЫ Среди используемых в качестве тест-объектов живых организмов особое место занимают монокультуры одноклеточных водорослей, которые представляют собой однородные, удобные для количественных оценок разнообразных воздействий объекты. Рассмотрим, как используются в качестве тест-объектов монокультуры зеленых водорослей, принадлежащих к роду Dunaliella.. Виды этого рода – представители зеленых водорослей (Chlorophyta), близких родственников высших растений. Они могут служить модельными объектами, представляющими наиболее обширное и важное для практических нужд человечества царство зеленых растений Viridiplantae. Микроскопические размеры, высокие темпы размножения, способность к активному движению, свойственные видам этого рода, – большие преимущества этих организмов как модельных тест-объектов. Представители этого рода изменяют свое поведение и показатели развития при значительных колебаниях солености воды и освещенности и действии разнообразных токсикантов. Так, в работе Ф. Пейса и др. [Расе еt а1., 1977] представлены результаты исполь-зования Dunaliella salina, D. bioculata, D. tertiolecta для диагностики тяжелых металлов (меди и свинца) по выделению кислорода, фотосинтетической активности, потере клетками калия, росту культуры и пигментному составу клеток. Рост культуры D. salina в присутствии меди, свинца, кадмия и ртути, а также распределение - 133 -

металлов в культуре были исследованы с помощью полярографического метода в работах [Barghigiani et al., 1981, 1983; Serritti et al., 1981]. Влияние бора на выделение кислорода при фотосинтезе D. tertiolecta, а также его потребление в процессе дыхания исследовано в работе А.М. Ахме-да и др. [Ahmed et а1., 1988]. Тушащее действие меди на индукцию флуоресценции D. tertiolecta установлено в работе Дж. Сэмсона и др. [Samson еt а1., 1988]. Некоторые авторы [Балаян, Стом, 1988] предлагают использовать в качестве тестфункции потерю подвижности клетками D. salina в присутствии токсиканта. В этом случае показателем токсичности была выбрана концентрация, вызывающая 90 %-ную иммобилизацию клеток. Клетки D. viridis, D. tertiolecta и др. были использованы для биотестирования наличия тяжелых металлов (Нg, Сu, Сd, Рb), хлорорганических соединений и нефтепродуктов в воде [Цвылев, Ткаченко, 1981]. Чувствительность водорослей к действию металлов определяли по интенсивности замедленной флуоресценции и скорости ассимиляции 14С. В работе [Orme, Kegley, 2004] сообщается об использовании клеток D. salina для анализа уровня токсичности ряда пестицидов; основными тест-функциями при этом были подвижность клеток, биохимические показатели, изменения размеров клеток, содержание хлорофилла, скорость роста численности популяции, биомасса. Появились сообщения об использовании в качестве тест-функции скорости движения и ориентации клеток водорослей [Паршикова та ін., 1990; Stallwitz, Нädеr, 1993]. В настоящее время ведутся интенсивные поиски новых методов диагностики неотложных хирургических состояний человеческого организма, которые требовали бы небольшого количества исследуемого материала и могли бы обеспечить быструю оценку степени тяжести состояния пациента. Доказана целесообразность использования монокультуры Dunaliella viridis в качестве тест-системы для оценки наличия цитотоксических соединений в сыворотке крови и в других биологических жидкостях человека. В качестве тест-функции в числе других показателей избрана относительная подвижность клеток [Дмитриев и др., 2005]. 11.2. ПАРАМЕТРЫ ФОТОДВИЖЕНИЯ DUNALIELLA КАК ТЕСТ-ФУНКЦИИ Большинство известных методов биотестирования наличия химических соединений в водных средах основано на регистрации одного параметра, изменяющегося под воздействием этих соединений. Однако регистрация только одной тест-функции существенно ограничивает возможности биотестирования, поскольку различные химические соединения, присутствующие в водной среде, могут производить одинаковое действие на регистрируемый параметр. Увеличение числа регистрируемых тест-функций приводит к повышению уровня качественной и количественной оценки токсикантов, присутствующих в среде. Мы предлагаем использовать в качестве тест-функции несколько (от двух и выше) одновременно регистрируемых параметров фотодвижения водорослей. Присутствующие в водной среде токсиканты могут оказывать специфическое воздействие на различные параметры фотодвижения (поступательную и вращательную скорости движения клеток, относительное число подвижных клеток, фототопотаксис, частоту биения жгутиков и т.д.), зависящее от вида и концентрации токсиканта, механизма его взаимодействия с водорослями. Предполагается, что одновременное использование нескольких регистрируемых параметров фотодвижения водорослей позволит увеличить чувствительность метода биотестирования. Целью настоящего исследования было обоснование целесообразности использования в качестве тест-функций в процессе биотестирования водных сред нескольких одновременно регистрируемых параметров фотодвижения водорослей (на примере зеленых водорослей рода Dunaliella) и апробация векторного метода обнаружения токсикантов в водных средах. В качестве тест-объектов были апробированы альгологически чистые культуры зеленых водорослей D. salina штамм № 10 и D. viridis, штамм N 42 из коллекции Института ботаники им. Н.Г. Холодного НАН Украины [Масюк, Терещук, 1983]; в качестве тест-функций – такие параметры фотодвижения водоросли как скорость V поступательного движения их клеток, скорость n вращательного движения клеток, фототопотаксис F и относительная подвижность Nm/N0 клеток (Nm – число подвижных клеток, N0 – общее

- 134 -

количество клеток). Описание экспериментальной установки и методики измерений параметров фотодвижения водорослей на основе видеомикрографии представлены в разделе 4.2. В опытах были использованы такие поверхностно-активные вещества (ПАВ): катионактивное (КПАВ) - катамин, анионактивное (АПАВ) - натриевая соль додецилсульфокислоты, неионноактивное (НПАВ) - гидропол, а также природное соединение полисахаридной природы (ППАВ), выделенное из синезеленых водорослей, возбудителей «цветения» води. Концентрацию ПАВ варьировали в пределах от 1 мг/л до 40 мг/л. Влияние различных типов ПАВ, их комбинаций и продолжительности действия на скорость движения клеток водорослей оценивали с помощью дисперсионного анализа трехфакторных неортогональных комплексов. Данные по скорости движения клеток (от 0 до 55 мкм/с) группировали по 11 разрядам и обрабатывали с использованием биометрических методов [Лакин, 1973]. Исследовано два трехфакторных комплекса. В первом изучали степень влияния на скорость движения клеток таких факторов как тип ПАВ (КПАВ, АПАВ, НПАВ), их комбинаций (КА - катионактивное-анионактивное ПАВ, КН катионактивное-неионактивное ПАВ, АН - анионактивное-неионактивное ПАВ, КАН - катионактивноеанионактивное-неионактивное ПАВ), вид водорослей (D. salina, D. viridis) и продолжительность влияния на них ПАВ (через 0,5; 1; 2; 3 и 4 ч после внесения ПАВ). Во втором комплексе изучали влияние разных концентраций ПАВ (1; 5; 10; 20; 30 и 40 мг/л), типа ПАВ (КПАВ, АПАВ, НПАВ, ППАВ) и вида водорослей (D. salina, D. viridis). Влияние пестицидов на параметры фотодвижения изучали с такими препаратами: ацетал (55 %), ацетазин (50 %), алахлор (45 %), арилон (75 %), баста (20 %), дуал (96 %), ДПЦ (20 %), гармони (75 %) и текто (45 %). Концентрацию пестицидов варьировали в пределах (10-7 -10-2) М. Программу исследований с тяжелыми металлами осуществляли с солями меди (CuSO4×5H2O), кадмия CdCl2 и свинца Pb(NO3)2. Диапазон изменения концентраций солей тяжелых металлов составлял (107 -10-2) М. 11.3. ВЛИЯНИЕ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ФОТОДВИЖЕНИЕ DUNALIELLA 11.3.1. Характеристика поверхностно-активных веществ

Поверхностно-активные вещества (ПАВ) относятся к химическим соединениям, широко распространенным в водоемах. Их накопление осуществляется вследствие действия как антропогенных факторов, так и природных процессов. Синтетические ПАВ поступают в окружающую среду за счет загрязненных стоков легкой, металлургической, нефтедобывающей, нефтеперерабатывающей, химической и др. отраслей промышленности. Так, содержание ПАВ в сточных водах текстильных фабрик достигает 2500 мг/л, а в продуктах органического синтеза – 10000 мг/л [Ставская, 1981]. Процесс удаления ПАВ из сточных вод достаточно сложный, в результате чего большая часть ПАВ попадает в окружающую среду: так, например, из 27000 т катионактивных ПАВ, выпущенных в Германии в 1980 г., 23000 т попало в водоемы [Таранова, 1987]. ПАВ различной химической природы найдены в воде практически во всех регионах мира, а в некоторых водоемах содержание ПАВ достигает почти 5 мг/л [Филенко, 1988]. Природные ПАВ создаются в процессе метаболизма многими организмами: они найдены в некоторых бактериях [Margaritis et al., 1979; Cooper, Zajic, 1980; Duvnjak et al., 1982], зеленых, синезеленых и диатомовых водорослях [Chamberlain, 1976; Сиренко, Козицкая, 1988], клеточных культурах высших растений [Вахмистров, Богоров, 1987]. К сожалению, химическая природа биологических ПАВ и их роль в метаболизме выяснены недостаточно. Существенный интерес представляет изучение мембранотропного действия ПАВ, обусловливающего проявление бактерицидного [Калиниченко и др., 1986; En-Zanfeily, Nawar, 1980] и фунгицидного [Злочевская и др., 1981] эффектов, а также негативного влияния ПАВ на рост культур, - 135 -

формирование состава пигментов и фотосинтетическую активность водорослей [Брагинский, 1986; Паршикова, 1988; Паршикова, Пахомова, 1988]. Доказано [Лєнова та ін., 1989] токсическое действие одного из анионактивных ПАВ (додецилсульфата натрия) на культуру Dunaliella viridis и влияние его на распределение клеток D. viridis по размерам в зависимости от концентрации действующего вещества. Вместе с тем известно, что некоторые ПАВ используются как стимуляторы роста водорослеймакрофитов в аквакультуре [Калугіна-Гутник, Бєляєв, 1987]. Такое действие ПАВ представляет существенный практический интерес с учетом развития промышленного культивирования различных видов макроводорослей. Таким образом, целесообразно изучить взаимодействия различных ПАВ с водорослями в связи с возможным влиянием этой группы химических соединений на рост и поведение этих организмов не только в природных условиях, но и в процессе культивирования. 11.3.2. Влияние различных типов ПАВ, их комбинаций и продолжительности действия на скорость движения клеток Dunaliella

Результаты измерений. Результаты трехфакторного дисперсионного анализа, оценивающего влияние различных факторов на скорость движения клеток разных видов Dunaliella, представлены в табл. 11.1 и 11.2. Результаты, представленные в табл. 11.1 и 11.2, свидетельствуют, что независимое и суммарное влияние таких факторов как тип ПАВ, их концентрация и продолжительность действия на скорость движения клеток водоросли статистически достоверны, чего нельзя сказать о влиянии вида водорослей и комбинации «концентрация ПАВ - тип ПАВ - вид водорослей» (рис. 11.1, 11.2). Как видно из рис. 11.1, а, КПАВ и АПАВ в концентрации 1 мг/л одинаково стимулирующе действуют на фототопотаксис, а в более высоких (до 20 мг/л) концентрациях подавляют фототопотаксис видов Dunaliella путем приостановления движения клеток и изменения направления их движения, тогда как НПАВ и ППАВ в области 1-10 мг/л стимулирующе действуют на фототопотаксис, а в концентрации 40 мг/л через 4 часа после контакта уменьшают фототопотаксис более чем вдвое (рис. 11.1, б) Таблица

11.1. Данные трехфакторного дисперсионного анализа, оценивающего влияние продолжительности действия ПАВ на скорость движения клеток разных видов водорослей

Фактор

Число степеней свободы

Среднеквадратичное отклонение, s2

Критерий достоверности, FФ

Т1

5

204,3

В

1

t

р = 0,05

типа

и

р = 0,01

FS

Степень достоверности

387,4

2,2

Д

3,0

Д

0,97

1,8

3,9

НД

6,7

НД

2

124,0

235,1

3,0

Д

4,6

Д

Т1В

5

10,8

20,4

2,2

Д

3,0

Д

Т1t

10

6,4

12,2

1,8

Д

2,3

Д

Вt

2

9,9

18,8

3,0

Д

4,6

Д

Т1 Вt

10

2,9

5,6

1,8

Д

2,3

Д

FS

Степень достоверности

П р и м е ч а н и е . Т1 – тип ПАВ; В – вид водорослей; t - продолжительность действия ПАВ на водоросли; Т1В, Т1t, Вt и Т1 Вt - комбинации действия разных факторов [Паршикова та ін., 1990].

- 136 -

Таблица 11.2. Данные трехфакторного дисперсионного анализа, оценивающего влияние различных факторов на скорость движения клеток различных видов водорослей р = 0,05

Число степеней свободы

Среднеквадратичное отклонение, s2

Критерий достоверности, FФ

5

295,5

Т2

3

В

Фактор

р = 0,01

FS

Степень достоверности

FS

244,2

2,2

Д

3,0

Д

612,3

506,1

2,6

Д

3,8

Д

1

3,8

3,1

3,9

НД

6,7

НД

СТ2

15

31,0

25,6

1,7

Д

2,0

Д

СВ

5

5,1

4,2

2,2

Д

3,0

Д

Т2В

3

29,4

24,3

2,6

Д

3,8

Д

С Т2В

15

0,5

0,4

1,7

НД

2,0

НД

С

Степень достоверности

П р и м е ч а н и е . С – концентрация ПАВ; Т2 – тип ПАВ; В – вид водорослей; СТ2, СВ, Т2В и СТ2В - комбинации действия разных факторов [Паршикова та ін., 1990].

Рис. 11.1. Зависимость фототопотаксиса двух видов Dunaliella от концентрации: а – КПАВ и АПАВ; б – НПАВ и ППАВ. Контакт – в течение 4 часов. Влияние типа ПАВ и их концентрации на фототопотаксис

для

обоих

[Паршикова та iн., 1990].

- 137 -

видов

Dunaliella

одинаково

Рис. 11.2. Зависимость скорости движения двух видов Dunaliella от концентрации: а – КПАВ и АПАВ; б – НПАВ и ППАВ. Контакт – в течение 4 часов. Влияние типа ПАВ и их концентрации на скорость поступательного движения для обоих видов Dunaliella одинаково [Паршикова та iн., 1990].

На рис. 11.2, а показано ингибирующее действие КПАВ и АПАВ на скорость поступательного движения клеток видов Dunaliella при увеличении концентрации ПАВ до 20 мг/л; ингибирующее действие НПАВ и ППАВ проявляется в меньшей степени; скорость движения клеток уменьшается примерно до 50 % от первоначальных значений. Изучение зависимости параметров фотодвижения клеток от продолжительности влияния различных типов ПАВ и их комбинаций (в концентрации 10 мг/л) показало, что токсичное действие ПАВ на подвижность (Nm/N0) клеток видов Dunaliella уменьшается в такой последовательности: КПАВ > КПАВ + АПАВ > АПАВ > КПАВ + НПАВ > АПАВ + НПАВ > КПАВ + АПАВ + НПАВ > НПАВ > НПАВ + ППАВ > ППАВ. Первое соединение (КПАВ) обусловливает полную остановку движения клеток через 1 ч после их контакта с веществом; остальные (НПАВ и ППАВ) приводят к уменьшению подвижности клеток на протяжении 3 ч после контакта только на 30 %. Обсуждение результатов. Таким образом, исследуемые типы ПАВ влияют на подвижность, скорость и направление движения клеток двух видов Dunaliella. Характер действия ПАВ зависит от химического состава соединения, его концентрации и продолжительности действия на клетки. КПАВ, которые дают положительно заряженные ионы, в концентрации 1-20 мг/л уменьшают и полностью останавливают фотодвижение клеток. АПАВ, которые дают негативно заряженные ионы, а также НПАВ и ППАВ, которые вообще не создают ионов, вызывают меньшие изменения скорости и направления движения клеток, чем КПАВ. Максимальная чувствительность клеток к положительно заряженным ионам КПАВ указывает на возможное влияние ПАВ на x-потенциал клеток и связанные с ним двигательные реакции. Однако, имеющихся экспериментальных данных недостаточно для полного понимания механизмов этого взаимодействия. 11.4. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА ФОТОДВИЖЕНИЕ DUNALIELLA С ПОМОЩЬЮ ЛАЗЕРНОЙ ДОППЛЕРОВСКОЙ СПЕКТРОСКОПИИ Метод лазерной допплеровской спектроскопии рассмотрен нами в разделе 10.3.2. В данном разделе будут освещены результаты использования этого метода для диагностики тяжелых металлов в водной среде на основе регистрации таких параметров фотодвижения как подвижность и скорость поступательного движения клеток. - 138 -

Методика измерений. Допплеровский корреляционный спектрометр состоит из лазера, измерительной кюветы в термостате, фотоприемника, коррелятора и компьютера (рис. 11.3). В эксперименте были использованы два вида Dunaliella – D. salina и D. viridis. Процедура измерений сводилась к облучению суспензии контрольного и опытного образцов с внесенным токсикантом с последующей регистрацией флуктуаций

рассеянного движущимися клетками света. О токсическом

действии внесенного в суспензию препарата судят по изменению величины энергозатрат W - параметра, 2 характеризующего отношение средней кинетической энергии всех клеток в опытном m V îï

2

m V ê2 2

и контрольном

образцах, умноженного на отношение числа Nm подвижных клеток к числу Nim неподвижных [Бегма

m Vîï2 2 и др., 1989]: W = m V ê2

2

Vоп × N m Nm , = 2 N im Vк × N im

( 11.1 )

2 где Vоп и Vк – средние значения скорости движения клеток в опытном и контрольном образцах соответственно. Результаты измерений. На рис. 11.4 представлена зависимость энергозатрат совокупности клеток Dunaliella от времени воздействия токсиканта (Cu2+) в концентрации 10 мг/л. Видно, что параметр W, характеризующий энергозатраты, претерпевает существенные изменения по сравнению со своим первоначальным значением и может быть использован в качестве критерия количественной оценки действия препарата.

Рис. 11.3. Допплеровский корреляционный спектрометр: 1 – лазер, 2 – источник питания, 3 – диафрагма, 4 – линза, 5 – измерительная камера, 6 – термостат,7– фотоприемник, 8 – диафрагма, 9 – блок питания, 10 – усилитель, 11 – коррелятор, 12 – компьютер, 13 – таймер, 14 – цифропечатающее устройство [Бегма и др., 1989].

Зависимость параметра W для D. salina от концентрации токсикантов (Cu2+ и тритона Х-100) представлена на рис. 11.5. Отличия величины параметра W в опытных образцах по сравнению с контрольными очевидны. Обсуждение результатов. Метод лазерной допплеровской спектроскопии, принцип действия которой заключается в регистрации изменений частоты оптического излучения, рассеянного движущимся объектом, позволяет быстро и с большой точностью реализовать оценки токсического действия химических веществ на подвижные клетки водорослей в водной среде.

- 139 -

Рис. 11.4.Зависимость энергозатрат W совокупности клеток Dunaliella от времени действия токсиканта (Cu2+, 10 мг/л): 1 – D. salina, 2 – D. viridis [Бегма и др., 1989].

11.5. ВЕКТОРНЫЙ МЕТОД БИОТЕСТИРОВАНИЯ

Рис. 11.5.Зависимость энергозатрат W совокупности клеток Dunaliella salina от концентрации: 1 – ионов меди и 2 – тритона Х-100 в суспензии [Бегма и др., 1989]. Здесь С – концетрация, г/л.

Для оценки действия присутствующих в водной среде тяжелых металлов был использован "векторный" метод биотестирования [Посудин, 1992а, б; Посудин и др., 1996; Posudin et al., 1996]. Тестобъекты помещали в опытную (с токсикантом) и контрольную (без токсиканта) среды в кюветы экспериментальной системы видеомикрографии, с помощью которой одновременно регистрировали несколько параметров фотодвижения (поступательную V и вращательную n скорости движения клеток, фототопотаксис F, число неподвижных Nim клеток относительно их общего числа N0). Затем оценивали величины и направление r вектора R , проекции которого на оси координат в N-мерном пространстве определяются как P1 /P1k, Р2/Р2k, ..., PN /PNk, где P1, P2, .... , РN - параметры фотодвижения тест-объектов в опытном образце; P1k, P2k, ..., PNk параметры фотодвижения тест-объектов в контрольном образце. Величину r и направление, задаваемое r углом q вектора R , построенного в двухмерной системе координат (см. рис. 11.6), предлагаем определять по формулам: r=

[( P / P 1

1k

]

) 2 + ( P2 / P2k ) 2 ;

q = arctg [(Р1/Р1k)/(Р2/Р2k)],

( 11.2 ) ( 11.3 )

где Рi – параметр фотодвижения тест-объектов в опытном образце (і = 1, 2, 3, …, N); Рk – параметр фотодвижения тест-объектов в контрольном образце. - 140 -

r

В трехмерной системе координат (N = 3), эволюции вектора R характеризуются величиной r и направлением, задаваемым углами q1 и q2, которые (рис. 11.7) можно найти с помощью выражений: r=

[( P / P 1

1k

) 2 + ( P2 / P2k ) 2 + ( P3 / P3k ) 2

]

q1 = arccos [Р1/Р1k)/r];

( 11.5 )

q2 = arctg [(Р3/Р3k)/(Р1/Р1k)].

( 11.6 )

( 11.4 )

r

Величина r и направления (q1, q2 и q3) вектора R в четырехмерной системе координат (N = 4) определяются с помощью таких уравнений: r=

[( P / P 1

1k

]

) 2 + ( P2 / P2k ) 2 + ( P3 / P3k ) 2 + ( P4 / P4k ) 2 ; ( 11.7 ) Р1/Р1k = rcosq1;

( 11.8 )

Р2/Р2k = rsinq1cosq2;

( 11.9 )

Р3/Р3k = rsinq1sinq2cosq3;

( 11.10 )

F4/F4k = rsinq1sinq2sinq3.

( 11.11 )

Подобные подходы возможны и для N-мерного пространства при одновременной регистрации Nпараметров фотодвижения организмов (в наших экспериментах число одновременно регистрируемых параметров фотодвижения варьировало от 2 до 4). Однако при N > 4 графическое построение вектора r

R становится невозможным: величина и направление его задается численными значениями, которые

табулируются.

Рис. 11.6.Величина r и направление, задаваемое углом q, r вектора R , построенного в двухмерной системе координат (V/Vk; F/Fk). Здесь и далее (рис. 11.6-11.12) индекс « k » относится к контрольным образцам [Posudin et al., 1996]

- 141 -

Рис.11.7.Величина r r и направление, задаваемое углами q1 и q2, вектора R , построенного в трехмерной системе координат (V/Vk; F/Fk; (Nim/N0)/ (Nim/N0)k) [Posudin et al., 1996].

11.6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВЕКТОРНОГО МЕТОДА БИОТЕСТИРОВАНИЯ ВОДНЫХ СРЕД НА ОСНОВЕ РЕГИСТРАЦИИ ПАРАМЕТРОВ ФОТОДВИЖЕНИЯ DUNALIELLA 11.6.1. Зависимость вектора

r R от типа и концентрации ПАВ

Результаты измерений. Данные по исследованию влияния ПАВ на параметры фотодвижения D. viridis представлены в табл. 11.3. В ней приведены средние значения параметров r фотодвижения и среднеквадратичные отклонения. Зависимость величины r и направления q вектора R , построенного в двухмерной системе координат, от типа и концентрации ПАВ представлена на рис. 11.8.r Видно, что увеличение концентрации ПАВ приводит к уменьшению величины r и повороту вектора R по часовой стрелке в плоскости двух координат (V/Vk) и (F/Fk). Обсуждение результатов. Увеличение концентрации ПАВ вызывает уменьшение как скорости V движения клеток, так и фототопотаксиса F клеток Dunaliella, однако скорость V движения клеток уменьшается быстрее по сравнению с фототопотасисом F. Следует отметить, что разные типы ПАВ поразному влияют на параметры фотодвижения D. viridis. Например, при концентрации ПАВ 10 мг/л r величина r и направление q вектора R принимают такие значения: r = 1,15; q = 21,90 (КПАВ); r = 1,22; q = 26,60 (АПАВ); r = 1,30; q = 39,70 (НПАВ); r = 1,39; q = 44,10 (ППАВ). Эти данные согласуются с результатами, освещенными в разделе 11.3.2; они подтверждают влияние ПАВ на двигательные реакции клеток D. viridis.

r

Рис. 11.8.Зависимость величины r и направления q вектора R , построенного в двухмерной системе координат (V/Vk; F/Fk), от типа и концентрации ПАВ. Здесь: КПАВ - катионактивное ПАВ - катамин; АПАВ - анионактивное ПАВ натриевая соль додецилсульфокислоты; НПАВ - неионноактивное ПАВ - гидропол; ППАВ - природное соединение полисахаридной природы, выделенноеrиз синезеленых водорослей; концентрации ПАВ: 1, 5, 10, 20, 30, 40 мг/л. Здесь и далее (рис.11.9-11.10,11.14-11.16) Rk соответствует контрольному образцу [Посудин и др., 1996; Posudin et al., 1996].

- 142 -

- 143 -

r

Рис. 11.9.Зависимость величины r и направления q вектора R , построенного для Dunaliella viridis в двухмерной системе координат (V/Vk; F/Fk), от вида и концентрации солей тяжелых металлов: а – CuSO4×5H2O; б – CdCl2; в Pb(NO3)2 . Числа 10-3; 10-4; 10-5; 10-6 обозначают концентрацию солей (М) [Посудин и др., 1996; Posudin et al., 1996].

11.6.2. Зависимость вектора

r R от типа и концентрации тяжелых металлов

Результаты измерений. Зависимость параметров фотодвижения – скорости V поступательного движения, фототоптаксиса F, относительного числа Nim/No неподвижных клеток и скорости n вращательного движения D. viridis от вида и концентрации тяжелых металлов, использованных в эксперименте, представлена в табл. 11.4. В ней приведены средние значения параметров фотодвижения и среднеквадратичные отклонения. Графически описываемые зависимости изображены на рис. 11.9. Эти данные были использованы для r построения вектора R в двух-, трех-, и четырехмерной системах координат. r Зависимость величины r и направления q вектора R , построенного в двухмерной системе координат, от вида и концентрации солей тяжелых металлов представлена в табл. 11.5. Причем при воздействии на суспензию водорослей меди регистрировали все возможные пары параметров фотодвижения D. viridis. r На рис. 11.10 показаны величины и направления вектора R при действии на водоросли разных солей тяжелых металлов в одной и той же (10-4 M) r концентрации. Графически показаны также погрешности измерений величины r и направления q вектора R . r Поведение вектора R зависит от степени воздействия токсиканта на тот или иной параметр фотодвижения. На рис. 11.11 представлена двухмерная система координат (при одновременном измерении скорости движения и фототопотаксиса клеток), в которой пока-

r

Рис. 11.10.Зависимость величины r и направления q вектора R , построенного в двухмерной системе координат, от вида солей тяжелых металлов [CuSO4×5H2O, CdCl2 и Pb(NO3)2] в одной и той же (10-4M) концентрации [Посудин и др., 1996; Posudin et al., 1996].

- 144 -

r

Таблица 11.5. Зависимость величины r и направления q вектора R , построенного в двухмерной системе координат (при одновременной регистрации двух параметров фотодвижения Dunaliella viridis ) от вида и концентрации солей тяжелых металлов [Posudin et al., 1996] Концентрация соли, М Соль

СuSO4×5H2O

СuSO4×5H2O

СuSO4×5H2O

Pb(NO3)2

CdCl2

Параметры фотодвижения

V/Vk и F/Fk

V/Vk и (Nim/No)/ (Nim/No)k

rи q

0(контроль)

10-7

10-6

10-5

10-4

10-3

10-2

r

1,41

1,35

1,22

1,17

0,97

0,52

0

q

45,0

46,5

52,3

52,6

70,8

82,3

-

r

1,41

1,48

1,52

2,03

2,85

5,42

-

q

45,0

41,7

37,8

27,3

18,8

5,5

-

n/nk и (Nim/No)/ (Nim/No)k

r

1,41

1,50

1,58

2,08

2,91

5,59

0

q

45,0

47,4

49,3

60,0

68,0

75,0

-

V/Vk и F/Fk

r

1,41

1,35

1,31

1,26

1,20

0,99

0,78

q

45,0

47,1

47,8

49,8

52,1

68,1

76,7

r

1,41

1,36

1,30

1,19

1,02

0,91

0

q

45,0

46,8

48,7

62.5

79,0

82,6

-

V/Vk и F/Fk

П р и м е ч а н и е . Здесь и далее в табл. 11.6-11.7: V – скорость поступательного движения, F – фототопотаксис, Nim/No – относительное число неподвижных клеток, n – скорость вращательного движения клеток в образце с тяжелым металлом, Vk – скорость поступательного движения, Fk – фототопотаксис, (Nim/No)k – относительное число неподвижных клеток, nk – скорость вращательного движения клеток в контрольном образце; прочерк означает неопределенность угла q при нулевом значении величины r .

r

заны основные тенденции изменения величины и положения вектора R : при уменьшении обоих параметров, причем первый (Р1/Рк) уменьшается быстрее, чем второй (Р2/Рк) (см. рис. 11.11, а); при увеличении первого параметра и уменьшении второго (см. рис. 11.11, б); при уменьшении первого параметра и увеличении второго (см. рис. 11.11, в); при уменьшении обоих параметров, причем первый уменьшается медленнее, чем второй (см. рис. 11.11, г); при увеличении обоих параметров, причем первый увеличивается быстрее, чем второй (см. рис. 11.11, д); при увеличении обоих параметров, причем первый увеличивается медленнее, чем второй (см.r рис. 11.11, е). Результаты построения вектора R в трехмерной системе координат при одновременном измерении трех параметров фотодвижения водоросли (F/Fk, V/Vk и (Nim/No)/(Nim/No)k) приведены в табл. 11.6. Построенные в соответствии с данными, представленными в таблице, графики трехмерного пространства позволяют сравнить действие различных видов металлов (рис. 11.12), проследить зависимость r величины и направления вектора rR от концентрации металла (рис. 11.13), изучить тенденции изменения величины и направления вектора R при уменьшении одного из параметров фотодвижения и одновременном увеличении другого (рис. 11.14) или при одновременном увеличении двух параметров фотодвижения (рис. 11.15) в ответ на увеличение концентрации тяжелого металла. r Зависимость величины r и направления (q 1, q 2 и q 3) вектора R в четырехмерной системе координат от вида и концентрации тяжелых металлов при одновременном измерении четырех параметров фотодвижения водоросли D. viridis F/Fk, V/Vk, (Nim/No)/ (Nim/No)k и n/nk приведены в табл. 11.7. Обсуждение результатов. На примере изменения параметров фотодвижения водорослей при добавлении в суспензию соли тяжелого металла можно проследить основные тенденции в поведении

r

вектора R в зависимости от концентрации соли. Так, если с увеличением концентрации соли два параметра (Р1/Р1k) и (Р2/Р2k) уменьшаются (причем уменьшение Р1/Р1k идет быстрее, чем Р2/Р2k, то величина r вектора

r

уменьшается, а направление q изменяется так, что вектор R отклоняется от оси параметра, уменьшающегося более быстрыми темпами (см. рис. 11.11, а). Если один из параметров (Р1/Р1k) - 145 -

увеличивается с увеличением концентрации соли, а другой (Р2/Р2k) уменьшается, причем изменения обоих параметров происходит в одном темпе, т.е. на сколько увеличивается один параметр, на столько

r

уменьшается другой, то величина r вектора увеличивается, а направление q изменяется так, что вектор R приближается к оси увеличивающегося параметра (см. рис. 11.11, б, в).

Рис. 11.11. Основные тенденции изменения величины r и направления q вектора

r R в двухмерной системе координат

(Р1/Р1k; Р2/Р2k) в зависимости от изменений значений двух избранных параметров фотодвижения: а - оба параметра уменьшаются, но первый уменьшается быстрее; б - первый параметр увеличивается, а второй уменьшается; в первый параметр уменьшается, а второй увеличивается; г - оба параметра уменьшаются, но первый уменьшается медленнее; д - оба параметра увеличиваются, но первый увеличивается быстрее; е - оба параметра увеличиваются, но первый увеличивается медленнее [Посудин и др., 1996; Posudin et al., 1996].

- 146 -

Таблица 11.6. Зависимость величины r и направления (q 1 и q 2) вектора

r R , построенного в трехмерной системе

координат при одновременной регистрации трех параметров фотодвижения Dunaliella viridis от типа и концентрации соли тяжелых металлов [Posudin et al., 1996] Соль

Параметры фотодвижения

Концентрация соли, М

r,q1и q2 0 (контроль)

СuSO4×5H2O

V/Vk, F/Fk и (Nim/No)/(Nim/No)k

V/Vk, F/Fk и Pb(NO3)2

(Nim/No)/(Nim/No)k

V/Vk, F/Fk и CdCl2

(Nim/No)/(Nim/No)k

10-7

10-6

10-5

10-4

10-3

10-2

r

1,73

1,74

1,79

2,14

2,87

5,42

-

q1

54,69

55,72

57,20

64,25

71,72

84,49

-

q2

44,90

49,68

60,00

68,37

83,26

89,25

-

r

1,73

1,77

1,83

2,86

4,20

5,52

6,90

q1

54,69

56,01

57,99

70,39

76,94

86,73

89,08

q2

44,90

51,16

60,25

72,50

82,27

88,54

89,75

r

1,73

1,68

1,64

1,54

2,13

3,38

-

q1

54,69

54,02

53,30

51,32

64,09

75,44

-

q2

44,90

43,88

49,26

65,42

84,61

88,07

-

Рис. 11.12. График трехмерного пространства, на котором сравнивается действие различных видов металлов на параметры фотодвижения Dunaliella viridis: относительную скорость поступательного движения клеток V/Vk; относительный фототопотаксис F/Fk и относительную подвижность (Nim/N0)/ (Nim/N0)k клеток [Посудин и др., 1996; Posudin et al., 1996].

- 147 -

Рис. 11.13. r Графики трехмерного пространства, на которых представлена зависимость величины r и направления q вектора R от концентрации соли металла: а – CuSO4×5H2O; б – CdCl2; в – Pb(NO3)2. Здесь К – контроль (отсутствие соли); цифры –7, –6, –5, соответствуют концентрациям cолей 10-7, 10-6, 10-5,10-1 (М). По осям координат отложены относительная скорость поступательного движения клеток V/Vk; относительный фототопотаксис F/Fk и r относительная подвижность (Nim/N0)/(Nim/N0)k клеток. Здесь К соответствует Rk контрольного образца [Посудин и др., 1996; Posudin et al., 1996].

Рис.11.14.r Изменение величины r и направления q вектора R при уменьшении одного из параметров движения (V/Vk) и одновременном увеличении другого ((Nim/N0)/Nim/N0)k) в ответ на увеличение концентрации меди (10-6; 10-4; 10-3 М CuSO4×5H2O) [Посудин и др., 1996; Posudin et al., 1996].

- 148 -

Рис. r 11.15. Изменение величины r и направления q вектора R при одновременном увеличении двух параметров фотодвижения - относительной скорости вращательного движения n/nk и относительной подвижности (Nim/N0)/(Nim/N0)k в ответ на увеличение концентрации CuSO4×5H2O (10-6; 10-4; 10-3 М) [Посудин и др., 1996; Posudin et al., 1996].

Если оба параметра уменьшаются, но первый (Р1/Р1k) уменьшается r медленнее, то величина r вектора уменьшается, а направление q изменяется так, что вектор R отклоняется от оси параметра, уменьшающегося более быстрыми темпами (см. рис. 11.11, г). Одновременное увеличение значений обоих параметров фотодвижения (Р1/Р1k) и (Р2/Р2k) (причем первый увеличивается быстрее) с ростом концентрации соли r приводит к увеличению величины r, причем направление q вектора изменяется так, что вектор R удаляется от оси медленнее увеличивающегося параметра, т.е. (Р2/Р2k) (см. рис. 11.11, д). Одновременное увеличение значений обоих параметров фотодвижения (Р1/Р1k) и (Р2/Р2k) (причем первый увеличивается медленнее) с ростом концентрации соли приводит к увеличению величины r, причем направление q вектора r изменяется так, что вектор R удаляется от оси медленнее увеличивающегося параметра, т.е. (Р1/Р1k) (см. рис. 11.11, е). Таблица 11.7. Зависимость величины r и направления (q 1, q

2

r R

и q 3) вектора

в четырехмерной системе

координат от вида и концентрации солей тяжелых металлов при одновременном измерении четырех параметров фотодвижения водоросли Dunaliella viridis [Posudin et al., 1996] Концентрация соли, М Соль

Параметры фотодвижения

V/Vk, F/Fk, СuSO4×5H2O (Nim/No)/(Nim/No)k и n/nk

- 149 -

10-7

10-6

10-5

10-4

10-3

10-2

r

2,00

2,01

2,06

2,38

3,07

5,61

-

q1

60,00

60,90

61,90

67,05

72,55

84,68

-

q2

54,73

56,86

56,86

71,10

71,10

83,73

-

q3

45,24

41,58

41,58

29,77

29,77

21,97

-

r

2,00

2,04

2,11

3,05

4,31

5,63

7,01

q1

60,00

61,04

62,59

71,63

77,26

80,60

83,78

и n/nk

q2

54,73

58,97

61,98

73,75

79,86

96,18

88,52

q3

45,24

41,82

39,27

22,35

22,35

11,52

10,04

r

2,00

1,96

1,93

1,86

2,38

3,55

-

(Nim/No)/(Nim/No)k

q1

60,00

59,74

59,65

58,88

66,97

76,14

-

и n/nk

q2

54,73

56,68

58,91

71,70

85,28

88,17

-

q3

45,24

45,01

45,48

43,86

28,96

18,35

-

V/Vk, F/Fk, CdCl2

0 (контроль)

(Nim/No)/(Nim/No)k

V/Vk, F/Fk, Pb(NO3)2

r, q 1,q 2

Степень точности оценки действия тяжелого металла при увеличении числа регистрируемых параметров повышается. Использование векторного метода в условиях нашего эксперимента позволяет дать сравнительную оценку токсичности трех исследованных тяжелых металлов (Рb > Сu > Cd) и наиболее токсичных концентраций их солей (10-2 М для СuSO4×5H2O и CdCl2, 10-1 M для Pb(NO3)2). Использованные в наших экспериментах концентрации (10-4-10-1) М солей тяжелых металлов (СuSO4×5H2O; CdCl2; Pb(NO3)2) встречаются лишь в сточных водах, причем токсическое действие оказывают не сами металлы, а ряд соединений, выступающих в качестве антагонистов или синергистов. Нельзя не принять во внимание и возможное формирование комплексов металлов, приводящее к потере токсичности.

Таблица11.8 Влияние вида и концентрации пестицидов на параметрыфотодвижения Dunaliella viridis [ Posudin et al., 1996] ПараМетры фотодви жения и вектора R V F R θ V F R θ V F R θ V F R θ V F R θ V F R θ V F R θ V F R θ V F R θ

0 (контроль)

10-9

10-8

10-7

10-6

10-5

10-4

43± 5 0,35±0,03 1,41 45 49±3 0,31±0,03 1,41 45 48±5 0,32±0,04 1,41 45 48±5 0,42±0,04 1,41 45 44±5 0,44±0,05 1,41 45 44±5 0,44±0,05 1,41 45 46±5 0,44±0,05 1,41 45 42±3 0,26±0,05 1,41 45 48±4 0,37±0,04 1,41 45

43±4 0,30±0,04 1,31 49,3 48±4 0,30±0,04 1,38 45,3 46±5 0,26±0,04 1,26 49,8 47±4 0,33±0,05 1,25 51,5 44±5 0,32±0,05 1,23 53,9 44±3 0,33±0,04 1,41 45 46±3 0,12±0,04 1,41 45 42±5 0,24±0,04 1,36 49,6 48±4 0,37±0,01 1,41 45

43±5 0,20±0,05 1,15 60,3 47±4 0,25±0,04 1,26 49,8 45±4 0,22±0,05 1,17 53,7 46±4 0,25±0,04 1,13 58,4 43±4 0,27±0,04 1,15 58,1 44±4 0,32±0,05 1,39 45,9 46±4 0,12±0,05 1,41 45 42±4 0,22±0,04 1,31 49,6 48±4 0,37±0,04 1,41 45

42±4 0,05±0,04 1,02 81,9 42±4 0,15±0,04 1,05 54,6 43±5 0,11±0,05 0,95 69,1 41±6 0,12±0,07 0,89 71,8 41±6 0,10±0,05 0,96 76,1 42±3 0,27±0,03 1,28 50,1 43±4 0,03±0,04 0,96 90 35±5 0,19±0,04 0,83 65,4 48±4 0,30±0,05 1,04 50,9

38±5 0 0,88 90 28±5 0,15±0,04 0,55 49,9 42±3 0,05±0,04 0,88 79,6 31±3 0,05±0,04 0,65 79,4 40±3 0 0,91 40±5 0,08±0,05 0,94 75,2 40±5 0 0,87 90 30±4 0,05±0,04 0,73 75,0 48±5 0,20±0,07 1,00 87,1

37±6 0 0,86 90 0 0 40±5 0 0,83 90 0 0 35±5 0 0,79 0 0 0 0 27±2 0 0,64 90 27±2 0 0,64 90

Дуал

V F R θ

48±4 0,41±0,05 1,41 45

48±4 0,38±0,04 1,07 47,1

47±3 0,35±0,04 1,04 49,1

43±4 0,10±0,04 1,07 74,3 46±4 0,19±0,05 1,16 54,1 44±5 0,14±0,04 1,02 64,4 45±4 0,18±0,04 1,03 65,4 42±7 0,17±0,06 1,03 67,7 43±5 0,27±0,03 1,28 50,1 45±5 0,05±0,04 1,07 66,8 40±4 0,17±0,04 1,15 55,6 48±5 0,32±0,05 1,05 49,3 46±4 0,33±0,04 1,02 50,5

41±4 0,30±0,05 1,02 50,5

33±3 0,24±0,06 0,73 49,9

0 0 -

ДПХ

V F R θ

46±5 0,38±0,04 1,41 45

46±5 0,38±0,04 1,41 45

46±5 0,38±0,04 1,41 45

46±5 0,38±0,04 1,41 45

46±5 0,38±0,04 1,41 45

46±5 0,38±0,04 1,41 45

46±6 0,33±0,04 1,32 48,9

Гармони

V F R θ

45±5 0,40±0,05 1,41 45

45±5 0,04±0,05 1,41 45

45±5 0,40±0,05 1,41 45

45±5 0,40±0,05 1,41 45

45±5 0,40±0,05 1,41 45

45±5 0,40±0,05 1,41 45

45±4 0,35±0,04 1,32 48,9

Вид пестицида

Арилон

Фураре

Эрадикан

Ацетазин

Текто

Ацетал

Алахлор

Ладок

Баста

Концентрация пестицидов, М

- 150 -

11.6.3. Зависимость вектора

r R от вида

и концентрации пестицидов

Результаты. Влияние пестицидов различных видов в различных концентрациях на параметры фотодвижения D. viridis r представлено в табл. 11.8. Типичные примеры зависимости величины r и направления q вектора R , построенного в двухмерной системе координат (при одновременной регистрации двух параметров фотодвижения D. viridis) от вида и концентрации пестицидов представлены на рис. 11.16.

r

Рис. 11.16. Зависимость величины r и направления q вектора R , построенного в двухмерной системе координат (при одновременной регистрации двух параметров фотодвижения Dunaliella viridis) от вида и концентрации (10-9; 10-8; 107 ; 10-6; 10-5; 10-4; 10-3; 10-2 М) пестицидов. По осям координат отложены относительная скорость поступательного движения клеток V/Vk и относительный фототопотаксис F/Fk [Посудин и др., 1996; Posudin et al., 1996].

Обсуждение результатов. Клетки D. viridis демонстрируют различную чувствительность к разным видам пестицидов. Отклик параметров фотодвижения клеток на некоторые пестициды начинается с концентраций 10 -4 М (ДПХ, гармони), тогда как на другие (арилон, эрадикан, ацетазин, текто) – с 10-9 М. Интересно отметить специфическое действие некоторых пестицидов (алахлор, арилон) на фототопотаксис D. viridis, который подавляется в концентрациях, при которых скорость движения клеток остается без r изменений. Как правило, с ростом концентрации пестицида поведение вектора R в координатах (V/Vk, F/Fk) r характеризуется уменьшением величины r и поворотом вектора R против часовой стрелки (см. рис. 11.16). 11.6.4. Преимущества векторного метода биотестирования

Увеличение числа измеряемых одновременно параметров фотодвижения водорослей и их обработка с помощью векторного метода позволят выявить более отчетливые различия в реакции тест-объектов на действие различных токсикантов. Количественную оценку концентраций конкретного токсиканта можно производить путем сравнения полученных опытных числовых данных с калибровочными, соответствующими определенной концент-рации данного токсиканта. Это сравнение можно производить с помощью компьютера на основании заложенных в его память данных. Предложенный метод позволяет также приблизиться к качественной оценке токсикантов, т.е. к их идентификации. Дальнейший прогресс в проведении подобных исследований авторы видят в использовании векторного метода и оценке его чувствительности при разных уровнях истинного загрязнения природных (пресных и морских) вод. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Высокая чувствительность видов Dunaliella к факторам окружающей среды обусловливает возможность их использования в качестве тест-объектов в процессах ее биомониторинга. Большим преимуществом этих объектов является их микроскопические размеры, высокие темпы размножения, способность к активному движению, фотокинетическим и фотовекторным реакциям, а также их солеустойчивость и эвригалобность.

- 151 -

В наших экспериментах изучена чувствительность различных параметров фотодвижения Dunaliella salina и D. viridis к наличию в среде обитания поверхностноактивных веществ (ПАВ: катионактивного катамина, анионактивного - натриевой соли додецилсульфокислоты, неионоактивного - гидропола, природного соединения полисахаридной природы, выделенного из синезеленых водорослей - возбудителей “цветения” воды в днепровских водохранилищах, а также их комбинаций при концентрациях от 1 до 40 мг/л), солей тяжелых металлов (CuSO4•5H2O, CdCl2 и Pb(NO3)2 в концентрациях 10-7-10-2 M и пестицидов (ацетал 55 %, ацетазин 50 %, алахлор 45 %, арилон 75 %, баста 20 %, дуал 96 %, ДПЦ 20 %, гармони 75%, текто 45 % в концентрациях от 10-9 до 10-2 M). Полученные данные свидетельствуют о возможности использования подвижности, скорости поступательного и вращательного движения клеток, частоты биения их жгутиков, величины фототопотаксиса видов Dunaliella в качестве тест-функций в биологическом мониторинге водных сред. Впервые предложено использование нескольких одновременно регистрируемых параметров фотодвижения водорослей, что позволяет увеличить чувствительность метода биотестирования. Для оценки действия градиента концентраций разных токсикантов в водной среде на несколько (от двух и более) одновременно регистрируемых параметров движения предложен векторный метод биотестирования, облегчающий обработку большого числа измерений, открывающий возможность приблизиться к количественной оценке концентрации токсикантов, а также к их качественной идентификации.

- 152 -

Г Л А В А 12

DUNALIELLA КАК ОБЪЕКТ БИОТЕХНОЛОГИИ Исследуемые нами виды Dunaliella интересны с научной и практической точки зрения как модельные объекты для изучения механизмов устойчивости к экстремальным условиям солености, к высоким и низким температурам, к широкой амплитуде рН, как источники генов, кодирующих белки связанные с преодолением экстремальных условий существования, необходимых для получения трансгенных сортов устойчивых растений. Эти виды – объекты массовой культуры, источники промышленного получения bкаротина (провитамина А), аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот, глицерина, корма для рыбоводческих хозяйств и пр. [Масюк, 1973]. Dunaliella salina богатейший источник b-каротина [Дрокова, 1961; Ben-Amotz et al., 1982a], используемого для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, артритов, рака (кожи, печени, желудка и лейкемии), макулярной дегенерации, астмы. Препараты, изготовленные из этих водорослей и содержащие b-каротин, способствуют повышению аппетита, избавлению от бессонницы. Возможности использования биомассы Dunaliella, выращенной в водоемах, для производства корма, богатого b-каротином, или раствора b-каротина в масле, который широко используeтся в пищевой и фармацевтической промышленности, отражены в ряде работ [Масюк, 1966, 1967, 1973; Масюк, Абдула, 1969; Ben-Amotz, Avron, 1982, 1989, 1990; Borowitzka et al., 1984, 1986; Moulton et al., 1987; Borowitzka, Borowitzka, 1988, 1990; Mohn, Contreras, 1990; Dunaliella ..., 1992; Borowitzka, 2005]. 12.1. КАРOТИНОИДЫ, b-КАРОТИН И ЕГО СТЕРЕОИЗОМЕРЫ. БИОСИНТЕЗ b-КАРОТИНА Каротиноиды - это желтые, оранжевые, красные или коричневые пигменты алифатического или алициклического строения, состоящие из изопреновых остатков и сильно поглощающие в сине-фиолетовой области. Они широко распространены в природе. Молекулы каротиноидов представляют собой длинные полиизопреноидные цепи, обладающие системой сопряженных двойных связей. На концах этих молекул находятся ненасыщенные замещенные циклогексановые кольца. Каротиноиды разделяют на две основные группы: каротины и ксантофиллы. Каротины - это углеводороды, большую часть которых составляют тетратерпены (С40-соединения). Самым распространенным и самым важным из них является b-каротин. Позвоночные в процессе пищеварения способны расщеплять молекулу b-каротина на две молекулы витамина А. Поэтому b-каротин называют также провитамином А. Ксантофиллы по химическому строению очень близки к каротинам и отличаются от них только тем, что содержат кислород. Поэтому их называют окисленными дериватами каротина. Вопросам изоляции, синтеза, идентификации, химии, стереохимии, свойствам, функциям, распространению каротиноидов посвящена огромная литература, суммированная в ряде монографий [Goodwin, 1980, 1988; Bauernfeind, 1981; Britton, 1988 и др.]. Химический синтез b-каротина был осуществлен в 1956 г. Формула b-каротина С40Н56, молекулярный вес 536,9. В кристаллическом виде он имеет фиолетовокрасную окраску, в масляном растворе – от желтой до оранжевой. Стоимость синтетического b-каротина 500 долларов США/кг. Однако потребность в b-каротине из природных источников возрастает с каждым годом [Borowitzka, Borowitzka, 1990]. Особенностью каротиноидов является цис-транс стереоизомеризационный феномен. Теоретически каждая двойная связь b-каротиновой алифатической цепи может существовать в двух конфигурациях, в результате чего может образоваться 272 цис-/транс- изомера b-каротина; только 12 из них реально известны [Ben-Amotz, Shaish, 1992, in: Dunaliella ..., 1992]. Специфическая абсорбционная кривая каротиноидов в - 153 -

связи с изомеризацией изменяется. Например, цис-стереоизомеры характеризуются сдвигом абсорбционного максимума с цис-пиком в ультрафиолетовой области. Считалось, что в большинстве случаев каротиноиды встречаются в природе в виде транс-форм. Однако в настоящее время показано, что природный b-каротин, экстрагированный из разных источников, содержит много различных моно-, би- и поли-цис-форм [Dunaliella ..., 1992]. Содержание b-каротина в растениях варьирует в пределах от 0,01 до 10 мг/100 г. Богатыми растительными источниками b-каротина являются зеленые листья петрушки, шпината, брокколи, желтооранжевые плоды мандарин, манго, груш и некоторые овощи: морковь, тыква и др. Большие количества b-каротина аккумулируют отдельные виды микроорганизмов: гриб Phycomyces blakesleanus, дрожжи Rhodotorula (5 и 0,5 мг/г сухого вещества соответственно). Эти природные источники обычно содержат смесь различных каротиноидов, каротиноидных эфиров, каротиноидных изомеров вместе с варьирующим количеством b-каротина. Dunaliella salina может накапливать в своих клетках огромное количество b-каротина и является самым богатым из известных в настоящее время природных источников провитамина А [Дрокова, 1961; Милько, 1963; Aansen et al., 1969; Ben-Amotz et al., 1982a; Loeblich, 1982]. b-каротин, накапливемый в клетках D. salina, состоит главным образом из двух стереоизомеров, соотношение которых зависит от количества света, поглощаемого в течение одного клеточного цикла [Ben-Amotz et al., 1982a, 1987, 1988; Tsukida et al., 1982]. Dunaliella salina - удобный модельный объект для изучения процессов биосинтеза каротина. Биосинтез b-каротина в клетках D. salina протекает в четыре этапа: 1) образование геранилгеранил пирофосфата из мевалоновой кислоты, 2) конденсация с образова-нием фитоина, 3) десатурация фитоина в ликопин и 4) циклизация ликопина с образованием b-каротина. В качестве промежуточных предшественников b-каротина были идентифицированы фитоин, фитофлюин, x-каротин, нейроспорин, bзеакаротин, ликопин, g-каротин, представленные двумя стереоизомерами каждый [Ben-Amotz et al., 1987; Ben-Amotz, Shaish, 1992, in: Dunaliella ..., 1992]. В условиях, благоприятных для роста и размножения, клетки D. salina имеют зеленую окраску и содержат лишь около 0,3 % b-каротина, т.е. столько же сколько листья растений и клетки других некаротиноносных водорослей. Только в условиях, задержи-вающих рост и размножение клеток, в последних акумулируется b-каротин в виде оранжевых масляных глобул расположенных в межтилакоидных промежутках хлоропласта. Среди параметров, регулирующих процессы роста, размножения и каротинообразования, первоочередное значение имеют интенсивность света, концентрация осмотически действующих солей, температура и содержание в среде биогенных элементов [Милько, 1963; Масюк, 1966, 1973; Масюк, Абдула, 1969; Семененко, Абдуллаев, 1980; Ben-Amotz et al., 1982a; Loeblich, 1982]. Чем выше освещенность, тем медленнее рост культуры D. salina, тем интенсивнее каротинообразование. Избыточному накоплению b-каротина в ее клетках способствуют также повышенная концентрация осмотически действующих солей в среде обитания (до 5 М NaCl), экстремальные температуры (выше или ниже ростового оптимума), недостаток биогенных элементов в питательной среде (особенно голодание по азоту). Таким образом, биосинтез b-каротина в клетках микроскопичаской водоросли Dunaliella salina легко регулируемый процесс. Предполагается, что себестоимость b-каротина, получаемого из водорослей, выращенных в нестерильных условиях под открытым небом в будущем будет снижаться на основе дальнейшего совершенствования технологического процесса [Borowitzka, Borowitzka, 1990; Borowitzka, 1990, 2005]). Вместе с тем, не исключается целесообразность массового культивирования D. salina в закрытых установках с жестко контролируемыми условиями с целью промышленного получения препаратов природного b-каротина для специального назначения, прежде всего фармацевтической промышленности.

- 154 -

12.2. DUNALIELLA SALINA – ИСТОЧНИК ПРОМЫШЛЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ b-КАРОТИНА В результате поисковых исследований, проведенных в Украине в 1958-1960 гг. группой сотрудников Института ботаники и Института биохимии Национальной академии наук Украины, впервые установлено, что D. salina является самым богатым природным растительным источником b-каротина – провитамина А (до 1100 мг % воздушно-сухого веса водоросли) [Дрокова, 1960, 1961; Масюк, 1961а, б; Вендт, 1963; Гелескул, 1964а, б, 1966, цит. по: Масюк, 1973]. Было показано, что D. salina в массовых количествах вегетирует в соленых водоемах Украины, вызывая красное “цветение” рапы. Естественные запасы этой водоросли в водоемах Крыма в июле–августе 1960 г. составляли около 40 т. [Масюк, 1961б]. Морфологические особенности этой водоросли (отсутствие клеточной оболочки) облегчало задачи извлечения каротина из клеток данного объекта. Все это послужило основанием для постановки вопроса об использовании естественных запасов D. salina для промышленного получения каротина [Дрокова, 1961; Масюк, 1961 а, б; Вендт, 1963, цит. по: Масюк, 1973]. Таким образом, впервые было установлено, что D. salina благодаря своим биохимическим, физиологическим, экологическим и морфологическим особенностями является новым перспективным источником для получения b-каротина [Дрокова, 1960, 1961; Масюк, 1961 а, б; Вендт, 1963; Гелескул, 1964 а, б, 1966, цит. по: Масюк 1973; Гелескул, 1968]. Дальнейшие исследования показали, что D. salina является перспективным объектом для искусственного культивирования с целью промышленного получения b-каротина [см. обзор: Масюк, 1973]. Эвригалобность, эвритермность, гелиофильность и теневыносливость, устойчивость к колебаниям химического состава питательной среды, в т. ч. к содержанию основных биогенных элементов и концентрации гидроксильных ионов – все это делает D. salina удобным объектом биотехнологии. Типичный гипергалоб, D. salina обеспечена от конкуренции с преобладающим большинством других организмов и поэтому часто в открытых природных бассейнах развивается в виде монокультуры [Масюк, 1961а, б]. Это значительно упрощает ее культивирование в бассейнах под открытым небом. Было показано, что концентрационные, температурные и световые оптимумы роста и размножения клеток D. salina, с одной стороны, и биосинтеза в них каротина, с другой, различны (рис. 12.1) [Милько, 1963; Юркова, 1965; Масюк 1965б, в, 1966, 1967; Масюк, Абдула, 1969]. Исходя из того, что основные биологические процессы, обеспечивающие высокий урожай каротина (размножение клеток водоросли и биосинтез в них b-каротина) требуют для своего осуществления различных условий, был впервые предложен двухэтапный метод выращивания каротиноносных водорослей; на первом этапе, на фоне двухмолярной (по NaCl) среды с добавлением биогенных элементов, при температуре 25-30 °C и освещенности 5-6 тыс. лк идет накопление биомассы водорослей, на втором - в открытых бассейнах при концентрации NaCl 4-5 М и температуре 35-40 °С, освещенности до 100 тыс. лк, без добавления биогенных элементов, – биосинтез каротина [Масюк, 1965а, б, в, 1966, 1967; Масюк, Абдула, 1969, 1971]. Метод впервые был апробирован в 1963-1965 гг. под открытым небом в окрестностях Киева [Масюк, 1966], где, исходя из средней продукции каротина (24 мг/м2 в сутки), был впервые рассчитан возможный выход каротина за вегетационный сезон (5 месяцев в условиях Киева) – свыше 30 кг/га за сезон. Предложенный метод массового культивирования D. salina с целью полупромышленного получения b-каротина был впервые положен в основу создания экспериментального каротинового хозяйства площадью 0,5 га на базе Сакского химического завода в Крыму с использованием дешевых хлормагниевой рапы и удобрений (суперфосфат, аммиачная селитра, калийная соль и др.) Опытное хозяйство располагало пятнадцатью 200-литровыми пластиковыми лотками, четырьмя однокубовыми и четырьмя пятикубовыми бетонированными бассейнами, в которых размножали посевной материал, а также рядом промышленных бассейнов с земляным дном (рис. 12. 2), в которых проходил второй этап – накопление каротина. Опыты, проведенные в этом хозяйстве в 1965-1968 гг., показали возможность получения на юге Украины до 120 кг каротина/га за вегетационный сезон (7 месяцев) [Масюк, Абдула, 1969; Масюк и др., 1970; Масюк, 1973].

- 155 -

Была также продемонстрирована возможность неоднократного повторного использования отработанной рапы в циклическом производстве каротина [Масюк, 1973].

Рис.12.1. Накопление биомассы во- дорослей и каротина в массовой культуре Dunaliella salina: 1 – плотность клеток; 2 – содержание каротина в клетках водорослей; 3 – содержание каротина в 1 л суспензии [Масюк, 1973].

и инженерные параметры [Borowitzka, Borowitzka, 1990]. Параллельно была разработана оригинальная технология получения препаратов каротина в растительном масле, состоявшая из следующих этапов: 1) механическое разрушение клеток водорослей; 2) флотация клеточных осколков с каротином; 3) соосаждение последних с гидратом окиси железа и отделение осадка от рапы; 4) экстрагирование пигмента органическими растворителями и получение препаратов каротина [Вендт и др., 1965; Гелескул, 1966, цит. по: Масюк 1973]. К сожалению, по независимым от авторов причинам эти разработки не были доведены в Украине до промышленного внедрения. Однако с прекращением исследований каротиноносных водорослей в Украине интерес к D. salina как продуценту b-каротина в мире не угас. В 70-е годы эти исследования были продолжены в Израиле, США, Австралии, Китае и других странах. Внимание ученых было сосредоточено на изучении механизмов солеустойчевости, осморегуляции, биосинтеза глицерина и b-каротина [Ben-Amotz et al., 1982a, b; см. обзоры: Borowitzka, Borowitzka, 1990; Dunaliellа …, 1992]. В конце 70-х гг. возможностью получения b-каротина из D. salina заинтересовались коммерческие компании, что значительно ускорило исследования и создание экспериментальных каротиновых заводов на базе полупромышленного культивирования D. salina. В начале 80-х гг. в Западной Австралии, южнее тропика Козерога, в 100 км севернее Перта на базе морской лагуны, расположенной на 280 южной широты, было заложено экспериментальное каротиновое хозяйство и к 1982 г. построены первые опытные пруды площадью 10, 100, 250 и 600 м2. В 1986 г. были построены еще пять промышленных прудов, в 5 раз превышающих размеры опытного хозяйства, а в конце 1986 г. официально открыт завод по производству каротина. В 1988 г. число прудов удвоили. Параллельно с расширением производственных площадей проводились исследования, совершенствовались биотехнологические

- 156 -

Рис.12.2. Экспериментальное каротиновое хозяйство на сырьевой базе Сакского химзавода, Крым, Украина, 19651969 гг.: А – лотки и бетонированные бассейны, в которых осуществляется первый этап выращивания Dunaliella salina; Б - промышленные бассейны с земляным дном [Масюк, 1973].

Одним из наиболее сложных, трудоемких и дорогостоящих этапов в технологии получения каротина из микроскопических водорослей является отделение биомассы водорослей от жидкой среды обитания. Были испытаны методы фильтрации, центрифугирования, флотации и флоккуляции, осаждения, концентрирования клеток в градиенте солености и т.д. [Вендт и др., 1965; Гелескул, 1966, цит по: Масюк, 1973; Borowitzka, Borowitzka, 1990; Mohn, Contreras, 1990]. В числе других был испробован также метод, основанный на фотодвижении (фототопотаксисе) водорослей [Kessler, 1982, цит. по: Borowitzka, Borowitzka, 1990]. Оптимальной признана технология, базирующаяся на комплексе методов [Borowitzka, Borowitzka, 1990]. В дальнейшем биомасса Dunaliella salina перерабатывается с получением: 1) капсулированного 1,64 % раствора b-каротина в растительном масле, рекомендованого в качестве добавки при диетическом питании; 2) 30 % суспензии кристаллического b-каротина в растительном масле, используемого как красителя в пищевой промышленности; 3) сухого продукта, содержащего 2-3 % b-каротина, для использования в качестве кормовой добавки в животноводстве [Borowitzka, Borowitzka, 1990]. Подобные каротиновые хозяйства были созданы также в Южной Австралии, США (Калифорния); более мелкие фирмы, производящие b-каротин из водоросли D. salina, имеются также в Израиле (см. фото 3, 4), Чили и Великобритании [Borowitzka, 1990; Borowitzka, Borowitzka, 1990; Mohn, Contreras, 1990], однако ведущее положение на мировом рынке b-каротина занимает Австралия.

Фото 3.

Фото 4.

Общий вид реактора (фото 3) и деталь реактора (фото 4) для получения биомассы Dunaliella вблизи города Эйлат, Израиль

- 157 -

В последнее время интерес к b-каротину неизмеримо возрос в связи с открытием его противоопухолевой активности и его роли как антиоксиданта в питании человека. В настоящее время D. salina как источник b-каротина культивируют в индустриальных масштабах в Австралии, США, Японии, Тайване, Китае, Индонезии [Borowitzka, 2005]. Препараты b-каротина Австралия экспортирует в Японию, США, Корею, Тайвань и другие страны. Общий экспорт b-каротина только в Японию и США в 1990 г. принес 2 миллиона австралийских долларов прибыли [Borowitzka, 1990]. Себестоимость b-каротина из D. salina, по оценкам австралийских производителей, в 90-е годы составляла 50-100 австралийских долларов за кг, а цена природного b-каротина на мировом рынке в это же время колебалась в пределах 500-1000 долларов за 1 кг. Побочными продуктами производства каротина из водоросли D. salina могут быть глицерин, составляющий до 30 % сухой биомассы водоросли, высококачественный белок, остающийся после экстракции b-каротина, аскорбиновая и дегидроаскорбиновая кислоты, а также другие ценные природные биологически активные органические соединения [Масюк, 1973; Ben-Amotz et al., 1982a, b; Borowitzka, Borowitzka, 1990; Dunaliella …, 1992]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Виды Dunaliella - продуценты b-каротина, аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот, глицерина и других ценных органических соединений, а также генов, кодирующих белки, связанные с устойчивостью к экстремальным условиям среды, – перспективные объекты биотехнологии. Массовые культуры Dunaliella используются в качестве источника корма в рыбоводческих хозяйствах для выращивания ценных пород осетровых. Dunaliella salina - самый богатый природный источник b-каротина. Массовое культивирование штаммов этого вида производится в ряде стран с целью промышленного получения препаратов b-каротина, используемых в пищевой, фармацевтической промышленности и медицине для предупреждения и лечения онкологических, сердечно-сосудистых, офтальмологических заболеваний, авитаминозов, артрозов и других болезней. Изучение закономерностей фотодвижения видов Dunaliella может помочь в решении ряда технологических проблем производства каротина из этих водорослей.

- 158 -

ОБЩИЕ ИТОГИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Критическое рассмотрение терминологии и классификации разных типов фотоиндуцированного поведения свободно подвижных организмов показало, что существование различных классификационных систем является источником терминологической путаницы. Разработана параметрическая классификация светозависимого поведения как отдельных подвижных клеток (индивидуальный или микроэффект), так и их совокупностей (групповой или макроэффект). За термином фототаксис (phototaxis) мы сохраняем его первоначальное значение: любое светозависимое перемещение свободно подвижных организмов в пространстве, вызванное светом. Под светозависимыми реакциями (photoresponse, photoreaction) подразумеваются любые немедленные двигательные отклики организмов на любые изменения светового стимула. Подвижность биологических объектов - частный случай общего физического феномена движения. Поэтому подвижность организмов может быть описана такими параметрами, как скорость (V ), направление (r) и траектория (l ) движения. Световой стимул, в свою очередь, характеризуется такими параметрами, как интенсивность (I), направление ( S ), спектральный состав ( l ), поляризация ( P ) , продолжительность, частота и форма световых импульсов. Принимая во внимание параметрический характер обеих величин (света и движения), мы считаем, что классификация фототаксисов должна основываться на параметрическом принципе. Любую зависимость скорости движения отдельных организмов или их групп от любых параметров светового стимула мы предлагаем называть фотокинезом (photokinesis), а зависимость направления движения отдельных организмов или их групп от каких-либо параметров света именуем фототопотаксисом (phototopotaxis) [Масюк та ін., 1988; Масюк, Посудин, 1991а]. Предложенная классификация может быть детализирована путем учета добавочных параметров движения и света, их взаимодействия, или уточнения некоторых параметров. Классификация фототаксисов, основанная на параметрическом принципе, позволяет упорядочить существующую классификацию и терминологию, предвидеть еще не изученные связи, а также программировать дальнейшие исследования. Феноменология фотодвижения. Виды Dunaliella подобно другим жгутиковым водорослям проявляют способность к свободному перемещению в жидкой среде под воздействием света, т.е. к фотодвижению (фототаксису). Фотодвижение Dunaliella осуществляется в виде поступательного движения клетки, которое сопровождается вращением клетки вокруг ее продольной оси, поворотами в стороны от основного направления, а также в виде колебательных движений (“топтания на месте”). Иногда клетка прикрепляется дистальными концами жгутиков к субстрату, судорожно дергаясь вокруг места прикрепления, в результате чего отрывается от субстрата и продолжает свободное плавание. В отличие от Chlamydomonas reinhardtii [Квитко и др., 1978; Mitchell, 2000] и Euglena gracilis [Jahn, Bovee, 1968] у видов Dunaliella в процессе фотодвижения наблюдался только цилиарный (гребной или веслообразный) тип движения жгутиков. Лишь в исключительных случаях, при наличии механических преград, когда клетка Dunaliella salina оказывалась зажатой в очень тонком препарате между покровным и предметным стеклами, отмечался возврат к более древнему реликтовому ундуляторному (волнообразному) типу движения жгутиков. Траектория поступательного движения клетки синусоидальная, проекция ее на плоскости неравномерно зигзагообразная. Предполагается, что подобно Chlamydomonas [Colombetti, Marangoni, 1991] Dunaliella осуществляет вращательные движения клетки вокруг ее продольной оси благодаря биению ее жгутиков в трехмерном пространстве. Движение по синусоиде – результат, хотя и почти синхронного, но неравного числа биения двух жгутиков одной клетки [Shoevaert et al., 1988]. В отличие от Chlamydomonas [Ringo, 1967] при смене направления движения один из жгутиков в клетке Dunaliella прекращает биения, а

- 159 -

второй продолжает гребные удары, в результате чего клетка поворачивается; после этого первый жгутик возобновляет биения и клетка продолжает двигаться в новом направлении [Dunaliella …, 1992]. Фотореакции. Виды Dunaliella способны к фотокинетическим и фотовекторным реакциям (наличие фотокинетических реакций у Chlamydomonas в литературе оспаривается [Feinleib, Carry, 1967; Nultsch, Throm, 1975]. У видов Dunaliella в отличие от Chlamy-domonas и Euglena нам не удалось наблюдать фотофобических реакций, хотя литературные данные [Wayne et al., 1991] свидетельствуют о возможности таковых и у Dunaliella. Фотокинез. Скорость перемещения клеток Dunaliella зависит от интенсивности светового стимула и условий окружающей среды: температуры [Посудин и др.,1988; Посудин, Масюк, 1993], рН Масюк, Юрченко, 1962; Масюк, Посудин, 2007], напряженности электрического и электромагнитного поля [Зельниченко и др., 1988, Посудин, 1992а], дозы ионизирующего излучения [Посудин и др., 1992], концентрации блокаторов кальциевых каналов, изоптина и циннаризина [Посудин и др., 1993], азида натрия [Посудин и др., 1995], поверхностно активных веществ [Паршикова та ін., 1990], солей тяжелых металлов и пестицидов [Posudin et al., 1996], а также от комбинации нескольких факторов [Мартыненко и др., 1996]. Однако скорость движения отдельных клеток Dunaliella в условиях наших опытов не зависела от длины волны падающего света [Посудин и др., 1988], от дозы предварительного УФ облучения [Посудин и др., 2004], от концентрации ионов кобальта и кальция, внесения в среду ионофора, повышающего проницаемость клеточной мембраны для ионов кальция, а также ионотропных препаратов, стимулирующих Na+-K+-АТФазу [Посудин и др., 1993]. Средняя скорость поступательного движения клеток гипергалобных видов Dunaliella составляла 48±2 мкм/с (D. salina) и 36±2 мкм/с (D. viridis) [Посудин и др., 1988]. Средние скорости движения двух близких видов D. salina и D. viridis в разных опытах колебались в довольно широких пределах, нивелирущих различия между указанными видами по данному показателю [Посудин и др., 1988; Posudin et al., 1992; Посудин и др., 1993; 1995]. Модальное значение средней скорости движения морского вида D. bioculata 105±5 мкм/с [Dunaliella , 1992]. Эти значения на 1-3 порядка превышают таковые микроорганизмов, не обладающих жгутиковым аппаратом [Nultsch, 1980], и находятся в пределах, известных для других жгутиконосцев, как про - так и эукариотических [Громов, 1985; Евтодиенко, 1985; Посудин и др., 1988]. Однако средние скорости движения гипергалобных видов Dunaliella ниже (иногда на порядок), чем таковые морских (Dunaliella bioculata [Dunaliella , 1992]) и пресноводных видов (Chlamydomonas reinhardtii [Racey et al., 1981; Rüffer, Nultsch, 1985], Euglena gracilis [Haupt, 1959; Bovee, 1968]), что, по всей вероятности, связано с разной вязкостью среды обитания. Средние скорости вращательного движения клеток гипергалобных видов Dunaliella были практически одинаковыми [Посудин, 1992а]: 0,52±0,04 оборота/с (D. salina] и 0,54±0,04 об./с (D. viridis) и вместе с тем ниже таковой пресноводного Chlamydomonas reinhardtii [Rüffer, Nultsch, 1985]. Максимальные значения средних скоростей поступательного и вращательного фотодвижения клеток Dunaliella наблюдались в пределах интенсивности белого света 10-20 Вт/м2, освещенности 150-550 лк, температуры 20-30 °С, рН 8,00 [Посудин и др., 1988; Масюк, Посудин, 2007]. Если ритмической активностью Haematococcus pluvialis, регулирующей движение клетки, управляют периодические импульсы, предположительно связанные с функционированием сократительных вакуолей [Photomovement, 2001], то у гипергалобных видов Dunaliella пульсирующие вакуоли отсутствуют, а ритм биения жгутиков, по-видимому, связан с другими осцилляторами. Частота биения жгутиков гипергалобных видов Dunaliella (25-50 Гц) того же порядка, что и у пресноводного Chlamydomonas reinhardtii (до 64 Гц) [Rüffer, Nultsch, 1985]. Фототопотаксис. Направление движения клеток Dunaliella по отношению к источнику света (фототопотаксис) зависит от параметров светового сигнала (интенсивности света, его спектрального состава, градиентов интенсивности в пространстве и времени) и условий окружающей среды – температуры [Посудин и др., 1991], рН [Масюк, Посудин, 2007], напряженности электрического и электромагнитного полей [Зельниченко и др., 1988; Посудин, 1992а], дозы ионизирующего [Посудин и др., 1992] и - 160 -

ультрафиолетового излучения [Посудин и др., 2004], концентраций Са2+, Со2+, циннаризина, изоптина [Посудин и др., 1993], азида натрия [Посудин и др., 1995], поверхностно активных веществ [Паршикова та ін., 1990], солей тяжелых металлов и пестицидов [Posudin et al., 1996], а также от комбинации некоторых из них [Мартыненко и др., 1996]. Однако фототопотаксис видов Dunaliella не зависит от внесения в среду обитания ионотропных препаратов, стимулирующих Na+-K+-АТФазу [Посудін та ін., 1991]. Фототопотаксис обоих гипергалобных видов Dunaliella в лабораторных культурах наблюдался при освещенности 500 лк (положительный) и 40000 лк (отрицательный). Переход от положительного фототопотаксиса к отрицательному зафиксирован при 1500 лк. Эти показатели находятся в границах, известных для других водорослей. Однако пороги чувствительности к слабой и сильной освещенности, перехода от положительного к отрицательному фототопотаксису у разных видов водорослей отличаются в значительной степени и позволяют судить об их теневыносливости, солнцелюбивости и устойчивости к высокой освещенности. D. viridis более, чем D. salina, чувствительна к слабому свету (30 лк) [Посудін та ін., 1991], что соответствует особенностям поведения этих двух видов в природе. Оба вида в лабораторной культуре более чувствительны к высокой освещенности (Посудін та ін., 1991], чем Ch. reinhardtii, переход которого к отрицательному фототопотаксису отмечается при 100000 лк [Rüffer, Nultsch, 1990]. Переход видов Dunaliella от положительного фототопотаксиса к отрицательному осуществляется иным способом, чем у хламидомонад [Rüffer, Nultsch, 1990]. В отличие от последних [Rüffer, Nultsch, 1990] у видов Dunaliella не наблюдается изменение характера биения жгутиков от цилиарного (гребного) к ундуляторному (волнообразному), а нарушается лишь частота биения одного из жгутиков, в результате чего происходит поворот клетки и движение ее в противоположную от источника света сторону [Dunaliella , 1992; наши наблюдения]. В условиях крымских гипергалинных водоемов с высокой степенью освещенности (свыше 100000 лк) природные популяции Dunaliella salina, представленные так называемой “красной формой”, демонстрируют отсутствие отрицательного фототопотаксиса [Масюк, 1973]. Таким образом гипергалобные виды D. salina и D. viridis отличаются по степени их чувствительности, как к высокой, так и к низкой интенсивности света, что обусловлено особенностями занимаемых ими в природе экологических ниш. Максимальные значения положительного и отрицательного фототопотаксиса отмечены при температуре 20-30 0С [Посудін та ін., 1991; Posudin et al., 1992] и рН 7,35 [Посудин, 1992а; Масюк, Посудин, 2007]. Приложение электрических полей подавляло фототопотаксис Dunaliella, как и других водорослей (Chlamydomonas reinhardtii [Nultsch, Häder, 1979], Haematococcus pluvialis [Litvin et al., 1978]), что свидетельствует об участии биоэлектрических потенциалов в этом процессе. Повышение температуры от 18° до 30 °С снимает ингибирующее влияние напряженности электрического поля и стимулирует фототопотаксис обоих гипергалобных видов Dunaliella [Зельниченко и др., 1988; Посудин, 1992а]. Ионизирующее и ультрафиолетовое излучения ингибируют фототопотаксис D. salina и D. viridis [Посудин и др., 1992; Посудин и др., 2004]. Ингибирующий эффект зависит от дозы облучения, а в случае использования УФ излучения – и от длины волны. Впервые у видов Dunaliella под влиянием УФ облучения обнаружено преобразование положительного фототопотаксиса в отрицательный с последующим ингибированием его до нулевых значений [Посудин и др., 2004]. Фоторецепторная система. Фоторецепторная система видов Dunaliella, как и других зеленых водорослей, состоит из фоторецептора, предположительно расположенного в плазмалемме и в мембранах хлоропластной оболочки (в области, прилегающей к стигме), и стигмы, состоящей у разных видов из одного-двух слоев липидных глобул, расположенных в периферической зоне пластиды (см. обзор: Масюк, Посудин, 1991б). Впервые показано, что в отличие от некоторых других водорослей (Euglena gracilis [Häder, 1987]) виды Dunaliella не имеют дихроичной структуры фоторецептора [Посудин и др, 1991]. Механизмы фоторецепции. Фоторецепция Dunaliella, как, по-видимому, и некоторых других подвижных микроорганизмов, обладающих жгутиками, базируется на взаимодействии нескольких - 161 -

механизмов: модуляционного, дифракционного и интерференционного. Модуляционный механизм осуществляется в результате вращательного движения клетки вокруг ее продольной оси, во время которого стигма модулирует световой сигнал, попадающий на фоторецептор [Colombetti et al., 1982b; Kreimer, 1994; Lebert, Häder, 2000]. При наличии в стигме более, чем одного, слоя пигментированных глобул возможен (как у хламидомонад) интерференционный механизм фоторецепции [Foster, Smyth, 1980; Меlkonian, Robenek, 1984; Feinleib, 1985; Hegemann, Harz, 1998; Hegemann, Fischer, 2001]. Впервые предложенный нами дифракционный механизм фоторецепции [Посудин, Масюк, 1996; Posudin, Massjuk, 1997], по нашему мнению, универсален для всех жгутиконосцев, обладающих глобулярной структурой стигмы [Посудин, Масюк, 1996]. Таким образом, в фоторецепции некоторых жгутиковых, в т.ч. Dunaliella, наблюдается кооперативный эффект одновременного функционирования нескольких механизмов повышения уровня светового сигнала [Посудин, Масюк, 1996; Posudin, Massjuk, 1997]. Полученные нами данные свидетельствуют, что в составе фоторецепторных пигментов Dunaliella преобладают не флавины (как у Euglena gracilis [Lenci, 1975; Colombetti, Lenci, 1980; Photomovement, 2001]) и не родопсин (как у E. gracilis [Gualtieri et al., 1992), Chlamydomonas reinhardtii и Haematococcus pluvialis [Sineshchekov et al., 1991a, b, 1994; Kröger, Hegemann, 1994]), а, вероятно, другие каротиноиды и каротинобелки [Посудин и др., 1990], хотя некоторые авторы [Wayne et al., 1991] допускают возможное участие и родопсина в фоторецепции Dunaliella salina. Что касается механизмов фоторецепции, авторы принимают гипотезу В. Нулча [Nultsch, 1983], согласно которой поглощение фоторецепторной молекулой кванта света сопровождается ее возбуждением и конформационными изменениями фоторецепторных белков. В развитие этой гипотезы предложена модель фоторегуляции движения жгутиковых водорослей на основе конформационных изменений белковых молекул, входящих в состав, как фоторецепторной системы, так и жгутикового аппарата. Согласно этой модели при поглощении света фоторецепторными молекулами происходит возбуждение экситонных или солитонных состояний в a- спиральных участках мембранных белков, сопровождающееся перестройкой их конфигурации с образованием ионных каналов, через которые ионы кальция свободно диффундируют внутрь клетки, стимулируя двигательную активность водоросли [Давыдов, Супрун, 1974; Посудин, Супрун, 1992]. Выявление сократительного белки центрина в волокнистых структурах жгутикового аппарата Dunaliella свидетельствует о его возможном участии в фотоориентации базальных тел этих водорослей, как это имеет место у других жгутиконосцев [Salisbury, 1988; МcFadden et al., 1988; Huang et al., 1988; Melkonian, 1989; Dunaliella , 1992; Bhattacharya et al., 1993; Ko J.-H., Lee S.-H., 1996; Koblenz et al, 2003]. Наши опыты с наложением электрических полей [Посудин и др., 1991] свидетельствуют, что в процессах фоторецепции у видов Dunaliella, как и других зеленых водорослей [Marbach, Mayer, 1971; Litvin et al., 1978; Nultsch, Häder, 1979; Синещеков, Литвин, 1982; Ekelund et al., 1988], определенную роль играют светоиндуцированные изменения мембранных потенциалов. Сенсорное преобразование светового сигнала. Сенсорное преобразование поглощенного кванта света в двигательную реакцию, как свидетельствуют опыты с ионами кальция, кобальта и веществами, блокирующими или стимулирующими ионные каналы, по всей вероятности, у видов Dunaliella, как и у других зеленых водорослей, имеет ионную природу, подтверждая первостепенную роль Са2+ в этих процессах. Вместе с тем, участие Na+-K+-АТФазы в фоторегуляции движения клеток Dunaliella следует исключить. Отсутствие влияния оуабаина на параметры фотодвижения Dunaliella [Посудин и др., 1993] позволило предположить, что поступление ионов кальция внутрь клеток этих водорослей управляется не с помощью Na+-K+-насоса, как в случае Euglena gracilis [Colombetti et al., 1982b], а, вероятно, непосредственно, через индуцированные светом мембранные каналы, как это имеет место у Chlamydomonas [Nultsch, 1983]. В отличие от Chlamydomonas reinhardtii, во многих случаях реагирующего на введение в среду обитания веществ, стимулирующих или блокирующих ионные каналы неспецифически (аутотомия жгутиков) [Pfau et al., 1983], клетки Dunaliella в этих условиях жгутики не сбрасывают, поэтому их

- 162 -

двигательные реакции можно считать специфическим ответом на блокирование/стимулирование ионных процессов. Впервые нами показано, что разные параметры фотодвижения Dunaliella (фототопотаксис и относительное число подвижных клеток, с одной стороны, фотокинез с другой) управляются различными механизмами [Посудин, Масюк, 1993]. Об этом свидетельствует наличие (отсутствие) или разная степень зависимости этих параметров от таких факторов окружающей среды, как рН среды, длина волны падающего света, доза предварительного ионизирующего и ультрафиолетового облучения, концентрация ионов кальция, кобальта, соединений, стимулирующих или блокирующих кальциевые каналы, и др.) [Посудин и др., 1988; 1991; 1992; 1993; 1995; 2004; Massjuk et al., 2005; Масюк и др., 2006; Масюк, Посудин, 2007]. Значение данных о фотодвижении водорослей для смежных областей науки. Результаты изучения процессов фотодвижения микроорганизмов представляют интерес не только для фотобиологии, но и для смежных областей науки: эволюционной биологии, филогенетики, систематики, экологии, прикладных аспектов биологии. Сравнительное изучение фотодвижения двух близких видов одного рода – D. salina и D. viridis показало, что эти виды большей частью не отличаются друг от друга по основным параметрам этого процесса. Это свидетельствует в пользу идентичности структуры их фоторецепторных систем и механизмов фоторегуляции движения их клеток, возникшей в результате длительного процесса их совместной эволюции. Вместе с тем эти виды различаются по их чувствительности к белому свету слабой и высокой интенсивности, а также порогу перехода от положительного к отрицательному фототопотаксису. Поразному реагируют также эти два вида на взаимодействие некоторых факторов, включающих свет (температура, напряженность электрического поля, интенсивность света). В отличие от D. viridis в условиях природных гипергалинных водоемов D. salina не демонстрирует отрицательного фототопотаксиса при освещенности свыше 100000 лк, благодаря защитной функции накапливающегося в ее клетках β-каротина. Разная чувствительность двух видов Dunaliella к свету – результат их адаптации к биотопам, различающимся по фактору света. Такая адаптация обусловливает возможность их сосуществования в одних и тех же водоемах, но в разных нишах: на ярко освещенной поверхности рапы (D. salina) и в ее более затененных придонных слоях (D. viridis). Неодинакова чувствительность D. salina и D. viridis и к ионизирующему излучению, что по всей видимости, связано с различными размерами их фоторецепторных систем, являющихся мишенями, ответственными за поражение двигательных реакций. Таким образом, различия на внутриродовом уровне не затрагивают структурных особенностей фоторецепторных систем, а также механизмов фоторецепции и сенсорного преобразования светового сигнала в двигательные реакции, а являются результатом либо экологических адаптаций, либо связаны с размерными характеристиками клеток и их органелл. Немаловажную роль играет также способность одного из видов к избыточному накоплению b-каротина, выполняющего защитные функции. Более существенны отличия в фотоповедении представителей различных родов, принадлежащих к разным порядкам зеленых водорослей из класса Chlorophyceae – видами Dunaliella (Dunaliellales), с одной стороны, и Chlamydomonas reinhardtii, Haematococcus pluvialis (Chlamydomonadales), с другой. Так, отличия в спектрах действия и максимумах фототопотаксиса позволяют предположить наличие разных наборов фоторецепторных пигментов: каротиноидов и каротинобелков у Dunaliella [Посудин и др., 1990] и родопсина как основного фоторецепторного пигмента у Chlamydomonas reinhardtii и Haematococcus pluvialis [Sineshchekov et al., 1991a, b, 1994; Kröger, Hegemann, 1994]. Учитывая различия в структуре стигмы у изученных нами видов Dunaliella и Chlamydomonas reinhardtii, можно полагать, что в фоторецепции Dunaliella, кроме модуляционного механизма, существенную роль играет дифракция света [Посудин, Масюк, 1996; Posudin, Massjuk, 1997], а у Chlamydomonas reinhardtii – интерференция светового потока [Foster, Smyth, 1980; Feinleib, 1985; Hegemann, Harz, 1998; Hegemann, Fischer, 2001]. - 163 -

Внесение в среду обитания химических соединений, стимулирующих или блокирующих мембранные ионные каналы, у видов Dunaliella вызывает специфическую, а у Chlamydomonas reinhardtii – неспецифическую (сбрасывание жгутиков) двигательные реакции [Pfau et al., 1983]. У видов Dunaliella не наблюдаются характерные для хламидомонад фотофобические реакции, с другой стороны, подвергается сомнению наличие у Chlamydomonas фотокинетических реакций [Feinleib, Carry, 1967; Nultsch, Throm, 1975], хорошо выраженных у Dunaliella. Chlamydomonas и Dunaliella в процессе фотодвижения отличаются по характеру биения жгутиков. Поступательное движение клетки хламидомонады осуществляется с помощью цилиарного биения жгутиков, назад клетки двигаются благодаря ундуляторному (волнообразному) биению жгутиков [Квитко и др., 1978; Mitchell, 2000]. Поскольку клетки Dunaliella не способны к фотофобическим реакциям, у них не наблюдается ундуляторное биение жгутиков. Повороты клеток хламидомонад происходят благодаря неравной частоте биения цис- и трансжгутиков [Nultsch, 1991]; клетки Dunaliella при поворотах приостанавливают биение одного из жгутиков [Dunaliella, 1992]. Кроме того, у представителей разных порядков зеленых водорослей отмечены различия в скорости поступательного и вращательного движения клеток [Racey et al., 1981; Dunaliella , 1992; Rüffer, Nultsch, 1990], по всей вероятности, обусловленные разной вязкостью среды обитания гипергалобных видов Dunaliella и пресноводного Chlamydomonas reinhardtii. Таким образом, виды Dunaliella отличаются от Chlamydomonas reinhardtii комплексом фундаментальных особенностей, касающихся состава фоторецепторных пигментов, механизмов фоторецепции, некоторых деталей сенсорного преобразования светового сигнала в двигательную реакцию, наличия/отсутствия фотофобических и фотокинетических реакций, работы жгутикового аппарата и др. Полученные результаты согласуются с данными молекулярной кладистики [Buchheim et al., 1990, 1997; Friedl, 1997; Proschöld et al., 2001], свидетельствующими, что представитель гетерогенного рода Chlamydomonas – Ch. reinhardtii принадлежит к той группе хламидомонад (близкой колониальным Volvocales), которая отстоит от другой группы хламидомонад, близкой Dunaliella (например, Chlamydomonas applanata Pringsh.], на расстояние сравнимое с таковым между соей и цикадами [Buchheim et al., 1990]. Возможно, дальнейшее накопление, обобщение и таксономическая интерпретация комплекса морфологических (включая ультраструктурные), физиолого-биохимических, фотобиологических и молекулярно-биологических данных приведет к созданию классификации зеленых водорослей, в которой Dunaliella spp. и Chlamydomonas reinhardtii окажутся в разных классах, представляющих разные эволюционные направления в пределах Chlorophyta. Интересны данные, касающиеся фотодвижения Tetraselmis viridis (Roukhiyajnen) Norris et al. [Halldal, 1961], представляющего отдельный класс зеленых водорослей - Chlorodendrophyceae [Масюк, 2006]. Фотодвижение в ультрафиолетовой области спектра и наличие в этой области максимумов фототопотаксиса свидетельствуют о возможном присутствии в составе фоторецепторных пигментов этого вида флавинов и/или птеринов [Посудин и др., 1990]. Таким образом, в различных ветвях филогенетического древа зеленых растений эволюция фоторецепторных систем, в частности, состава фоторецепторных пигментов могла происходить разными путями. Еще более глубокие отличия, касающиеся структуры фоторецептора, обнаружены между Dunaliella spp. и Euglena gracilis Klebs – представителя отдела Euglenophyta6. Dunaliella отличается от Euglena не только меньшей скоростью движения клеток, большей чувствительностью к низкой и высокой интенсивности света, более низким порогом перехода положительного фототопотаксиса в отрицательный, что, видимо, связано с экологическими особенностями на уровне видов. До сих пор только у видов Dunaliella под воздействием предварительного

По мнению некоторых авторов, Euglena и Dunaliella относятся к разным царствам: Euglenozoa Cavalier-Smith, 1981, Euglenobionta Kussakin et Drozdov и Plantae Leedale, 1974, Viridiplantae Cavalier-Smith, 1981 соответственно, либо даже к разным надцарствам живой природы: Discicristata (Mirabdullaev) Leontiev et Akulov (Леонтьев, Акулов, 2002) ex Zmitrovich 2003 и Lamellicristata (Taylor) Starobogatov (Старобогатов, 1986) emend. Zmitrovich (Змитрович, 2003).

- 164 -

ультрафиолетового облучения наблюдали переход положительного фототопотаксиса в отрицательный с последующим полным подавлением фототопотаксиса [Посудин и др., 2004]. Различия в спектрах действия фототопотаксиса [Foster, Smyth, 1980] позволяют предположить неидентичность наборов фоторецепторных пигментов. Вместе с тем, обнаружены различия и в структуре фоторецептора: кристаллического, дихроичного у Euglena [Häder, 1987] и некристаллического, недихроичного у Dunaliella [Посудин и др, 1991]. Учитывая особенности фоторецепторной системы эвгленофитовых водорослей, в частности, строения стигмы, можно полагать, что им свойственен лишь наиболее древний, первичный модуляционный механизм фоторецепции, унаследованный от прокариот или общих с ними предков, в то время как у зеленых водорослей могут одновременно функционировать три механизма (модуляционный, дифракционный и интерференционный), повышающие интенсивность поглощаемого фоторецептором светового сигнала [Посудин, Масюк, 1996]. Хотя процессы сенсорного преобразования светового сигнала в двигательную реакцию, по всей вероятности, у всех жгутиковых водорослей имеют ионную природу [Nultsch, 1983], в отличие от зеленых водорослей, у Euglena gracilis в управлении этими процессами участвует Na+-K+-насос [Colombetti et al., 1982]. Euglena отличается от видов Dunaliella и Chlamydomonas reinhardtii также своеобразным характером работы жгутикового аппарата: во время биения жгутик Euglena gracilis приобретает вид “прерваной спирали” [Jahn, Bovee, 1968]: спиральные участки жгутика прерываются прямыми отрезками жгутика; типичные для зеленых водорослей цилиарный и ундуляторный типы движения жгутика у эвглен не наблюдаются. Таким образом, с возрастанием филогенетической дистанции между таксонами увеличиваются и углубляются различия в их фотоповедении, структуре и механизмах функционирования фоторецепторных систем, сенсорного преобразования светового сигнала в двигательные реакции разного типа, в работе жгутикового аппарата. Поэтому сведения об особенностях фотодвижения водорослей могут быть использованы в качестве дополнительных дифференциальных критериев в эволюционной биологии, филогенетике, систематике и таксономии водорослей. Наряду с указанными различиями в процессах фотодвижения и его фоторегуляции у представителей разных таксонов жгутиконосцев имеются общие черты: структура фоторецепторной системы, за немногими исключениями состоящая из фоторецептора и стигмы, первичный модуляционный механизм фоторецепции, с которым у представителей разных таксонов, в зависимости от структуры стигмы могут быть скооперированы дополнительные механизмы (дифракционный, интерференционный), ионная природа фоторецепции и сенсорного преобразования светового сигнала в двигательную реакцию при главенствующей роли в этих процессах ионов кальция, возможное участие в этих процессах индуцированных светом изменений мембранных электрических потенциалов, конформационные изменения белковых молекул, как основа фоторецепции и сенсорного преобразования, участие центрина в фотоориентации базальных тел и др. Вместе с тем следует признать, что экспериментальные данные относительно особенностей фотодвижения водорослей – представителей разных таксонов – еще слишком неполны, охватывают небольшое число модельных объектов. К сожалению, эти исследования не всегда проводятся по единому плану на должном методическом уровне. Поэтому результаты, полученные на разных объектах, представителями разных школ фотобиологов в разных странах, не всегда сравнимы, и сделанные нами выводы имеют лишь предварительный характер. Это всего лишь необходимый этап подведения промежуточных итогов в процессе продолжающихся исследований, которые могут эти выводы уточнить, изменить или опровергнуть. Изучение особенностей фотодвижения водорослей представляет несомненный интерес для экологии и географии водорослей, в частности для аутэкологии, так как позволяет уточнить характеристики отдельных видов, касающиеся их отношения к параметрам света, определить оптимумы, максимумы и минимумы факторов окружающей среды для параметров фотодвижения разных видов, способствует

- 165 -

разделению их на группы тенелюбивых и светолюбивых, теневыносливых и светоустойчивых организмов, а также более глубокому пониманию закономерностей их распределения на планете Земля. Прикладное значение результатов изучения параметров фотодвижения у видов Dunaliella определяется, прежде всего, принадлежностью этого рода к обширному царству зеленых растений (Viridiplantae), доминирующему на нашей планете и играющему решающую роль в обеспечении практических нужд человечества. Гипергалобные виды Dunaliella – классические модельные объекты для изучения механизмов солеустойчивости, осморегуляции, проницаемости мембран. процессов биосинтеза каротина у растений и фотодвижения. Благодаря способности к гиперсинтезу b-каротина, осмотически действующих соединений стратегического назначения, высокому содержанию других физиологически активных веществ виды Dunaliella являются ценными объектами биотехнологии [Масюк, 1973; Dunaliella …, 1992]. Высокая чувствительность к факторам окружающей среды обусловливает возможность их использования в качестве тест-объектов в процессах ее биомониторинга. Большим преимуществом этих объектов является их микроскопические размеры, высокие темпы размножения, способность к активному движению, фотокинетическим и фотовекторным реакциям. Изучена чувствительность различных параметров фотодвижения Dunaliella salina и D. viridis к наличию в среде обитания поверхностно-активных веществ (ПАВ), солей тяжелых металлов и пестицидов (Посудин и др., 1996; Posulin et al., 1996). Полученные данные свидетельствуют о возможности использования скорости поступательного и вращательного движения клеток, частоты биения их жгутиков, величины фототопотаксиса видов Dunaliella в качестве тест-функций в биологическом мониторенге водных сред. Впервые предложено использование нескольких одновременно регистрируемых параметров фотодвижения водорослей, что позволяет увеличить чувствительность метода биотестирования. Для оценки действия градиента концентраций разных токсикантов на несколько одновременно регистрируемых параметров движения предложен векторный метод биотестирования, облегчающий обработку большого числа измерений, позволяющий приблизиться к количественной оценке концентрации токсинов, а также к их качественной идентификации (Посудин и др., 1996; Posudin et al., 1996). Виды Dunaliella – продуценты b-каротина, аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот, глицерина и других ценных органических соединений – перспективные объекты биотехнологии, которые культивируют во многих странах [Масюк, 1965, 1966, 1967, 1973; Масюк, Абдула, 1969; Ben-Amotz, Avron, 1982, 1989, 1990; Borowitzka et al., 1984, 1986; Borowitzka, Borowitzka, 1988, 1990; Mohn, Contreras, 1990; Dunaliella …, 1992]. Массовые культуры Dunaliella используются в качестве источника корма в рыбоводческих хозяйствах для выращивания ценных пород осетровых. Dunaliella salina – самый богатый природный источник b-каротина. Массовое культивирование штаммов этого вида производится в ряде стран с целью промышленного получения препаратов b-каротина, используемых в пищевой, фармацевтической промышленности и медицине для предупреждения и лечения онкологических, сердечно-сосудистых, офтальмологических заболеваний, авитаминозов, артрозов и других болезней. Изучение закономерностей фотодвижения видов Dunaliella может помочь в решении ряда технологических проблем производства каротина из этих водорослей. Дальнейшее развитие исследований в области фотобиологии движения микроскопических жгутиковых водорослей мы видим в следующих направлениях: 1. Расширение состава модельных объектов среди водорослей – представителей таксонов разного таксономического ранга, занимающих различное положение в системе органического мира [Масюк, Костіков, 2002; Масюк, 2006], с последующим использованием полученных данных для целей эволюционнной биологии, филогенетики, таксономии и систематики, экологии и географии водорослей. Особого внимания заслуживают представители царства зеленых растений (Viridiplantae) – ближайшие родственники высших растений, представляющие наибольший научный и практический (хозяйственный) интерес для человека. Это, в первую очередь, представители совершенно неизученых в этом плане классов Pedinophyceae, Prasinophyceae (Chlorophyta) и Mesostigmatophyceae (Streptophyta), а также слабо изученных Chlorodendrophyceae и Chlorophyceae (Chlorophyta). При наличии больших гетерогенных, подвергающихся ревизии с позиций молекулярной филогенетики родов (например, Chlamydomonas Ehrenb., Chloromonas Gobi), не следует ограничиваться единственным модельным объектом (таковым для первого из них - 166 -

является Chlamydomonas reinghardtii P.A.Dang.). Подбор модельных объектов в этом случае следует производить с учетом новейших данных, полученных на молекулярном уровне. Кроме зеленых фитомонад, большой интерес представляют другие жгутиконосцы с пластинчатыми митохондриальными кристами из отделов Glaucocystophyta и Cryptophyta, занимающие неопределенное систематическое положение в филеме органического мира трубчатокристные Haptophyta, а также другие жгутиконосцы с трубчатыми митохондриальными кристами, в первую очередь, лишенные глазков Raphidophyta, совершенно не изученные Dictyochophyta и Xanthophyta, слабо изученные Chrysophyta, обладающие разнотипными, в т.ч. исключительно сложно построенными фоторецепторными системами Dinophyta. Группа эукариот с дисковидными митохондриальными кристами хорошо представлена в фотобиологических исследованиях такими модельными объектами как Euglena gracilis Klebs и Astasia longa Pringsh. Заслуживают также продолжения работы по изучению фотодвижения монадных репродуктивных клеток водорослей (гамет, зооспор) из разных систематических групп. Небезынтересны наблюдения над фотодвижением водорослей в условиях природных водоемов. Наряду с природными объектами большой интерес представляют также полученные в лабораторных условиях мутанты, дефицитные на определеные пигменты и органеллы. 2. Увеличение числа изучаемых параметров фотодвижения (например, угловой скорости движения индивидов, ритмичности движения клеток, формы и частоты биения жгутиков, концентрации и пространственного распределения индивидов в популяции, траектории движения индивидов и популяций и др.) и параметров светового стимула (например, градиента интенсивности света в пространстве и времени, направления, ритмичности светового потока и др.) в стационарном и переменном режимах. В последнем случае особое внимание следует уделить изучению кинетических, векторных и фотофобических реакций. 3. Расширение числа испытуемых абиотических и биотических экзогенных фактров, предположительно оказывающих воздействие на процессы фотодвижения (например, изучение влияния сил гравитации, магнитного и электрического полей, концентрации биогенных и осмотически действующих элементов в окружающей среде, вязкости последней, плотности клеток в суспензии, наличия посторонних организмов и продуктов их жизнедеятельности и т.д.). Следует расширить диапазон значений испытуемых факторов для определения граничных и оптимальных для разных параметров фотодвижения концентраций и доз. Большой интерес представляет также изучение влияния эндогенных факторов, влияющих на процессы фотодвижения, в частности физиологического состояния клетки на разных этапах онтогенетического цикла и в зависимости от условий окружающей среды. Одной из первоочередных задач является изучение влияния процессов биосинтеза каротина, глицерина и их содержания в клетках Dunaliella salina на фотоповедение и фотобиологические реакции этой водоросли. Полученные данные, несомненно, будут представлять существенный интерес не только для фотобиологической науки, но также для экологии (в первую очередь, аутэкологии) водорослей и прикладной альгологии. 4. Дальнейшее изучение особенностей структуры фоторецепторных систем, состава фоторецепторных пигментов, механизмов фоторецепции и передачи светового сигнала на двигательный аппарат водорослей у представителей разных таксонов на базе расширения комплекса современных экспериментальных методов: электрофизиологических (измерение мембранных потенциалов с помощью микроэлектродов и пэтчклемп метода), спектроскопических (флуоресцентная спектроскопия, допплеровская спектроскопия), лазерной техники, ядерного магнитного резонанса, электронной и флуорeсцентной микроскопии, техники цифровой высокоскоростной кинофотосъемки для регистрации частоты и формы биения жгутиков и траектории движения клеток, а также применения новых препаратов, специфически действующих на разные этапы фотодвижениея. Исключительно интересны с точки зрения механизмов и эффективности фоторецепции водоросли, лишенные глазков или, наоборот, обладающие двумя-тремя глазками. Неотложной задачей является установление точного местоположения фоторецептора у зеленых водорослей. 5. Совершенствование методов тестирования состояния и эффективности охраны окружающей среды, биотехнологии наиболее перспективных объектов с использованием результатов изучения фотодвижения водорослей в природоохранной, хозяйственной и производственной деятельности человека. - 167 -

6. Совершенствование и унификация понятийного аппарата, касающегося фотодвижения свободно подвижных микроорганизмов на базе координации усилий фото-биологов мира.

PHOTOMOVEMENT OF DUNALIELLA TEOD.

Summary The senior author of the present work started her studies of the genus Dunaliella Teod. at the N.G. Kholodny Institute of Botany of the National Academy of Science of Ukraine in the late 1950s in the context of projects on surveying algae for perspective sources of b-carotene (provitamin A). In the 1960s-1970s the species composition and ecology of this genus in watersheds of the Ukraine, the Trans-Caucasian region, Central Asia, and the Far East was investigated in detail, issues of phylogeny and taxonomy of the genus were discussed, the collection of Dunaliella strains was created, peculiarities of their morphology, physiology and biochemistry were investigated, and methods of their laboratory and their semi-industrial commercial cultivation [Масюк, 1973] were developed. In the 1980s the species of Dunaliella as possible model organisms for studying photomovement had attracted attention of a biophysicist who applied a complex of optical, spectroscopic, laser methods [Posudin et al., 1992]. The experimental laboratory equipped with original instrumentation for studying the photomovement of cells of Dunaliella was created at the Department of Biophysics of the National Agricultural University in Kiev. The main objective of the present work is to summarize our research of photomovement of Dunaliella and to compare our results with data of other authors who have investigated other organisms, revealing both common and specific peculiarities of photomovement in representatives of various taxa, depending on their phylogenetic relations. Experimental studies were preceded by analysis of previous results of the photobiological community on studying photomovement of flagellates. During that survey we paid attention to the existing discrepancies concerning the terms designating various aspects of photomovement of microorganisms. Problems of terminology Critical considerations on terminology and classification of different types of light-induced behavior of freely motile organisms have shown that the available diverse classification systems represent a terminological confusion. We have developed a parametrical classification of light-dependent behavour of either individual motile cells (individual effect or microeffect, Table 2.1) or their aggregations (group effect or macroeffect, Table 2.2). We retained the original meaning of the term phototaxis: any light-induced movement of freely motile organisms in space. We mean light-dependent reactions of motile organisms (photoresponse, photoreaction) as any immediate motion responses of these organisms to any changes of the light stimulus. Motility of biological objects is a special case of the general physical phenomenon of movement (mobility). Therefore, motility of organisms can be described by such well known parameters as speed or velocity (V), direction (r) and trajectory (l) of movement. The light stimulus, in turn, is characterized by such parameters as intensity (I), direction (s), spectral composition (l), and polarization (P) of light; duration, frequency, and the shape of light pulses. Considering parametrical characteristics of both factors (light and movement), we believe that any classification of dependence of movement (phototaxis) of microorganisms on light should be based on a parametrical principle (Tables 2.1, 2.2). We propose to call photokinesis any dependence of speed of individual organisms or their groups on any parameters of light stimulus; we call phototopotaxis any dependence of the direction of movement of individual organisms or their groups on any parameters of light. The proposed classification can be further developed into details by accounting for additional parameters of movement and light (for example, the rhythm of a light flux), their possible interactions (for example, wavelength and intensity of light, velocity and direction of movement), or specific features of some parameters (for example, the velocity of movement can be linear or angular, the light intensity can be characterized by its absolute value (I) or its gradient in - 168 -

space (dI/dx) and time (dI/dt)). The suggested principles not only promote some improvement of the existing terminology but also enable us to plan further research. Phenomenology of photomovement Species of Dunaliella, as well as other flagellate algae, demonstrate their ability to move freely in the aquatic environment under the influence of light or their photomovement (phototaxis). Photomovement of Dunaliella is performed as translational movement of a cell accompanied by rotation of the cell around its longitudinal axis and by sidewise turns from the main direction, and also as oscillatory movements ("staying in one place"). Sometimes the cell is attached by the distal ends of flagella to the substratum convulsively twitching around the attachment site; consequently the cell becomes detached from the substratum and continues its free "navigation". In contrast to the pattern observed in Chlamydomonas reinhardtii and Euglena gracilis, only the ciliary type of movement of flagella was observed in species of Dunaliella during their photomovement. Only in unusual cases, when mechanical obstacles are present and/or when the cell of Dunaliella salina becomes constrained in a very thin preparation between the cover glass and the slide, we observed its switching to a more ancient relict undulating type of movement of flagella. The trajectory of locomotion of a cell resembles a sine wave; its plane projection looks like a non-uniform zigzag. It is supposed that, similar to Chlamydomonas, Dunaliella performs rotary movements of its cell around its longitudinal axis due to beating of its flagella in the three-dimensional space. The sinusoid movement is a result of almost synchronous but unequal numbers of beatings of two flagella of the same cell. In contrast to the pattern observed in Chlamydomonas, when change occurs in the movement direction, one flagellum of the Dunaliella cell ceases its beating, and the second flagellum continues the beatings; therefore, the cell turns. After that, the first flagellum renews its beating and the cell continues to move in a new direction. Photoreactions Species of Dunaliella are capable of photokinetic and photovector reactions, while photokinetic reactions in Chlamydomonas were challenged in the literature. As to photophobic reactions, we failed to observe them in species of Dunaliella (in contrast to Chlamydomonas and Euglena), though the literary data indicate some possibility of such reactions in Dunaliella also. Photokinesis The locomotion velocity of Dunaliella cells (photokinesis) depends on the intensity of a light stimulus and environmental conditions, such as temperature, strength of electric and electromagnetic fields, dozes of ionizing radiation, concentration of blockers of calcium channels, isoptin and cinnarizine, sodium aside, surfactants, salts of heavy metals, and pesticides, and also depends on a combination of several factors. However, the locomotion velocity of separate cells of Dunaliella, under conditions of our experiences, did not depend on the wavelength of falling light, the doze of preliminary UV-irradiation, concentration of cobalt and calcium ions, introduction in the medium of ionophore raising the permeability of the cellular membrane for calcium ions, and also ionotropic preparations stimulating Na +-K+-ATPase. An average velocity of translational movement of cells of hyperhalobic species of Dunaliella was 36 ± 2 mm/s (D. viridis) and 48 ± 2 mm/s (D. salina). Average velocity of movement of two closely related species, D. salina and D. viridis, in different experiments varied over a wide range, thus erasing distinctions between the mentioned species by the given parameter. The modal value of an average velocity of movement of the marine species D. bioculata was 105 ± 5 mm/s. These values exceed by 1-3 orders of magnitude those in microorganisms not possessing the flagellar apparatus and are within the limits known for others flagellates, both prokaryotic and eukaryotic. - 169 -

However, average locomotion velocity of hyperhalobic species of Dunaliella is lower (sometimes by the order of magnitude) than those in marine D. bioculata and freshwater species (Chlamydomonas reinhardtii, Euglena gracilis). It is caused, most likely, by different viscosity values of the medium. Average velocity values of rotary movement of cells in hyperhalobic species of Dunaliella were nearly identical: 0.52±0.04 rotations (revolutions) per second in D. salina and 0.54±0.04 rotations per second in D. viridis. At the same time, these values were lower than in freshwater Chlamydomonas reinhardtii. The maximal values of average velocity of forward and rotary photomovement of cells of Dunaliella were observed within the limits of white-light intensity of 10-20 W/m 2, illumination of 150-550 lx, temperatures of 20-30 °C, and pH 8. The rhythmic activity of Haematococcus pluvialis regulating its cell movement is operated by rhythmic pulses presumably connected to the functioning of contractile vacuoles. However, in hyperhalobic species of Dunaliella the contractile (pulsating) vacuoles are absent, and the beating rhythm of flagella is apparently related to other oscillators. The flagellar beating frequency in hyperhalobic species of Dunaliella is 25-50 Hz while in freshwater Chlamydomonas reinhardtii is about up to 64 Hz. Phototopotaxis The direction of movement of cells of Dunaliella in relation to a light source (phototopotaxis) depends on parameters of a light signal (light intensity, its spectral composition, gradients of intensity in space and time, polarization of light) and environmental conditions, such as temperature, intensity of electric fields, doses of ionizing and UV radiation, concentrations of Ca 2+, Co2+, cinnarizine, isoptin, sodium aside, surfactants, salts of heavy metals and pesticides, and also with a combination of some of these factors. However, phototopotaxis of Dunaliella species does not depend on the addition of ionotropic preparations stimulating Na +-K+-ATPase. Phototopotaxis of both hyperhalobic species of Dunaliella in laboratory cultures was observed at an illuminance of 500 lx (positive) and 40,000 lx (negative). Transition from positive to negative phototopotaxis was observed at 1,500 lx. These parameters are within the limits known for other algae. However, sensitivity thresholds to weak and strong illuminance, transitions from positive to negative phototopotaxis differ substantially in different species of algae. They allow judging of shade-tolerance, sun-tolerance, and resistance to high-level light exposure of these species. Dunaliella viridis is more sensitive to weak light (30 lx) than D. salina, which corresponds to behavioral peculiarities of these two species in nature. Both species in laboratory culture are more sensitive to high illuminance than Chlamydomonas reinhardtii; in the latter the transition to negative phototopotaxis was registered at 100,000 lx. Transition of Dunaliella species from positive to negative phototopotaxis occurs in a way different from that in chlamydomonads. In contrast to chlamydomonads, the change of the flagellar beating from ciliary to undulate mode was not observed in species of Dunaliella; the beating of one flagellum only was observed, and it caused a turn of the cell and its movement in the direction opposed to the light source. Under conditions of Crimean hyperhaline watersheds with high illuminance values (above 100,000 lx) the natural populations of Dunaliella salina, represented by the so-called "red form", show the complete absence of negative phototopotaxis. Thus, hyperhalobic species D. salina and D. viridis differ by the degree of their sensitivity to both high- and low-light intensity, which is caused by peculiarities of ecological niches occupied by these species in nature. The maximal values of positive and negative phototopotaxis were registered at temperatures of 20-30 °C. Maximal value of positive phototopotaxis was at pH 7.35. Electric fields suppressed phototopotaxis in Dunaliella as well as in other algae, which indicates some participation of bioelectric potentials in this process. A rise of temperature from 18 °C up to 30 °C removes the inhibitory influence of the electric field density and stimulates phototopotaxis of both hyperhalobic species of Dunaliella. Ionizing and UV irradiations inhibit the phototopotaxis in D. salina and D. viridis. The inhibiting effect depends on a dose of irradiation, while in the case of UV-irradiation it depends on a wavelength too. For the first time - 170 -

in species of Dunaliella, we discovered the transformation of positive phototopotaxis into the negative one under the influence of UV-irradiation, with subsequent inhibition of phototopotaxis down to zero values. The maximal values of phototopotaxis of hyperhalobic species of Dunaliella are observed at presence of CaCl2×6H2O in the medium in concentrations (10-5-10-3) M. The raising of the calcium chloride concentration up to 10-2 M suppressed phototopotaxis by 10-20 %. Adding to the medium of A23187 ionophore that raises permeability of the cellular membrane for calcium ions caused complete inhibition of phototopotaxis both in D. salina and D. viridis. Adding of CoCl2 blocking membrane calcium channels in concentrations of (10-6-10-3) M suppresses phototopotaxis in species of Dunaliella. Other blockers of calcium channels, such as cinnarizine, isoptin, and sodium aside demonstrate a similar action upon phototopotaxis of Dunaliella. Ouabain that stimulates Na+-K+-ATPase does not influence phototopotaxis in Dunaliella. The spectrum of phototopotaxis action of two hyperhalobic species of Dunaliella is identical; it is within the limits of 400-520 nanometers (nm) and has two maxima: at 410-415 nm and 465-475 nm. The spectrum of phototopotaxis of Dunaliella somewhat differs from those in Chlamydomonas reinhardtii and Haematococcus pluvialis, showing a wide band in the range of 400-600 nm, with the maximum at 500 nm. In contrast to the situation observed in representatives of the class Chlorophyceae, Tetraselmis viridis (Chlorodendrophyceae) shows its ability to phototopotaxis also in the UV-area of the spectrum. Euglena gracilis (Euglenophyta) shows phototopotaxis in the range of 300-550 nm with two basic maxima at 385 nm and 460 nm and two smaller maxima at 410 nm and 490 nm. Thus, representatives of different genera, classes and divisions essentially differ in their ranges of phototopotaxis spectrum action, which indicates some differences in their photoreceptor systems and composition of photoreceptor pigments. Motility One of parameters of photomovement, motility of cells or a relative number of motile cells (Nm/N0), where Nm number of motile cells, and N0 - the total number of motile and non-motile cells, in populations of Dunaliella varies from 0 up to 100% and shows the same dependence on characteristics of the light stimulus and environmental conditions as phototopotaxis, essentially differing by the presence/absence and a degree of such dependence on some factors (wavelength of light, a dose of preliminary ionizing and UV irradiation, concentration of compounds opening or blocking calcium channels, etc.) from the third parameter of photomovement, the velocity of individual cells (photokinesis). Photoreceptor system The photoreceptor system of species of Dunaliella, as well as that of other green algae, consist of a photoreceptor presumably located in plasmalemma and membranes of the chloroplast (in the area near the stigma), and of the stigma consisting in different species of one-two layers of lipid globules located in the peripheral zones of plastid. It has been shown that, in contrast to some other algae, such as Euglena gracilis species of Dunaliella do not possess the dichroic structure of the photoreceptor. Mechanisms of photoreception Photoreception in Dunaliella, probably as well as in some other motile microorganisms with flagella, is based on the interaction of several mechanisms: modulation, diffiraction and interference ones. The modulation mechanism is realized as a result of rotary movement of a cell around of its longitudinal axis during which the stigma modulates the light signal affecting the photoreceptor. At the presence of more than one layer of pigmented globules in the stigma, the interference mechanism of photoreception is possible (similar to that in chlamydomonads). The diffraction mechanism of photoreception that we suggested in our opinion, is universal for all flagellates having the globular structure of the stigma. Thus, in photoreception of some flagellates, including Dunaliella, the cooperative effect of - 171 -

simultaneous functioning of several mechanisms for increasing the efficiency level of the light signal is observed. The data we obtained provide evidence that the composition of photoreceptor pigments of Dunaliella prevail neither flavins (as in Euglena gracilis) nor rhodopsin (as in Euglena gracilis, Chlamydomonas reinhardtii and Haematococcus pluvialis), but another carotenoids and carotenoproteins, though some authors [Wayne et al., 1991] suppose probable participation of rhodopsin in photoreception of Dunaliella salina. As to photoreception mechanisms, the authors accept Nultsch's hypothesis (1983) according to which absorption of the quantum of light by a photoreceptor molecule is accompanied by its excitation and conformational changes of photoreceptor proteins. We proposed a model of photoregulation of movement of flagellate algae as further development of this hypothesis that is based on conformational changes of protein molecules as components of either the photoreceptor system or the flagellar apparatus. According to this model, the absorption of light by photoreceptor molecules is accompanied by the excitation of exciton or soliton conditions in a-spiral sites of membrane proteins, which is related to some reorganization of their configuration with formation of ion channels, through which ions of calcium freely diffuse inside the cell thus stimulating the locomotory activity of an alga. The discovery of the contractile protein centrin in fibrous structures of the flagellar apparatus of Dunaliella indicates its possible participation in photo-orientation of basal bodies of these algae, as it occurs in other flagellates. Our experiments with imposing electric fields provide evidence that in the processes of photoreception in species of Dunaliella, as well as in other green algae, a certain role is played by light-induced changes of membrane potentials. Sensory transduction of a light signal As it has been shown in experiments with ions of calcium, cobalt, and substances blocking or stimulating ion channels, sensory transduction of the absorbed quantum of light into the locomotory reaction in species of Dunaliella, as well as in other green algae, is most likely of ionic nature, thus confirming the paramount role of Ca2+ in these processes. At the same time, participation of Na+-K+-ATPase in photoregulation of locomotion of Dunaliella cells should be excluded. Ouabain has no effect on the parameters of photomovement of Dunaliella; it is assumed that the intake of calcium ions into the cells of these algae is controlled not by the Na+-K+ pump, as it is the case in Euglena gracilis, but probably directly, through the lightinduced membrane channels, as it occurs in Chlamydomonas. In contrast to Chlamydomonas reinhardtii, in many cases, reacting non-specifically (autotomy of flagella) to the introduction of substances stimulating or blocking ionic channels into the medium, cells of Dunaliella under these conditions never lose flagella; therefore, their locomotory reactions can be regarded as the specific response to blocking/stimulation of ionic processes. We showed for the first time that different parameters of photomovement of Dunaliella (phototopotaxis and a relative number of motile cells, on the one hand, and photokinesis, on the other hand) are controlled by different mechanisms. It is confirmed by the presence/absence or different degrees of dependence of these parameters on such environmental factors as the wavelength of incident light, dose of preliminary ionizing and UVirradiation, concentration of ions of calcium, cobalt, compounds stimulating, or blocking calcium channels, etc. Importance of data on photomovement of algae for related fields of science Results of studies of photomovement processes in microorganisms are of interest not only for photobiology but also for related fields of science, such as evolutionary biology, phylogenetics, systematics, ecology, and applied aspects of biology. Comparative studies of photomovement of two closely related species of one genus, Dunaliella salina and D. viridis, have shown that these species mostly do not differ from each other in key parameters of this process. They also give evidence in support of the identity of the structure of their photoreceptor systems and photoregulation mechanisms of locomotion of their cells, which developed as a result of a long process of their joint evolution. At the same time, these species differ in their sensitivity to white light of weak and high intensity and also to the threshold of transition - 172 -

from positive to negative phototopotaxis. These two species also react differently to the interaction of some factors correlated with light (temperature, electric field, and intensity of light). In contrast to Dunaliella viridis, D. salina under conditions of natural hyperhaline watersheds does not show negative phototopotaxis at an illuminance above 100,000 lx due to the protective function of b-carotene accumulated in its cells. Different sensitivity of the two species of Dunaliella to light is a result of their adaptation to the ecological niches differing by the light factor. Such adaptation provides an opportunity of coexistence of these species in the same reservoirs but in different niches: on the brightly illuminated surface of the salt solution (D. salina) and in more shaded benthic layers (D. viridis). Sensitivity of D. salina and D. viridis to ionizing radiation is also different, which is most likely caused by different sizes of their photoreceptor systems as targets responsible for effects upon locomotory reactions. Thus, differences at the intrageneric level do not affect structural features of photoreceptor systems and mechanisms of photoreception and sensory transformation of a light signal into locomotory reactions. These differences are results of ecological adaptations or are caused by dimensional characteristics of cells and their organelles. The important role is played also by the ability of one species to accumulate large quantities of b-carotene performing protective functions. More essential are differences in photobehaviour of representatives of various genera belonging to different orders of green algae of the class Chlorophyceae: species of Dunaliella (Dunaliellales) on the one hand, and Chlamydomonas reinhardtii and Haematococcus pluvialis (Chlamydomonadales), on the other hand. Thus, differences in the action spectra and maxima of phototopotaxis leads to the assumption of the presence of different sets of photoreceptor pigments: carotenoids and carotenoproteins in Dunaliella and rhodopsin as the basic photoreceptor pigment in Chlamydomonas reinhardtii and Haematococcus pluvialis. Taking into account the differences in the stigma structure in the species of Dunaliella and in Ch. reinhardtii, we may assume that in photoreception of Dunaliella, in addition to the modulation mechanism, the essential role is played by light diffraction, and in Ch. reinhardtii the essential mechanism is connected to interference of the light flux. Introduction to the medium of chemical compounds stimulating or blocking membrane ionic channels causes in species of Dunaliella specific locomotory reactions, while in Ch. reinhardtii these reactions are nonspecific (autotomy of flagella). In species of Dunaliella the characteristic for Chlamydomonas photophobic reactions have not been observed, while the presence of photokinetic reactions, so well expressed in Dunaliella, is questionable in Chlamydomonas. Chlamydomonas and Dunaliella, in the process of photomovement, differ by the mode of beats of flagella. Progressive movement of a cell of Chlamydomonas is performed through ciliary beating of flagella, and backward movement of cells is observed by undulate beating of flagella. Since cells of Dunaliella are not capable of photophobic reactions, the undulate mode of flagella beating has not been observed in that genus. Turns of Chlamydomonas cells occur due to unequal frequencies of beating of cis- and trans-flagella; cells of Dunaliella temporary cease of beating of one flagellum. Thus, species of Dunaliella differ from Chlamydomonas reinhardtii in a complex of fundamental features concerning the composition of their photoreceptor pigments, mechanisms ot photoreception, some details of sensory transduction of the light signal into the locomotory reaction, presence/absence of photophobic and photokinetic reactions, functioning of the flagellar apparatus, etc. The results obtained correlate with data of molecular cladistics. The data of molecular phylogeny demonstrate that Ch. reinhardtii, as a representative of the heterogeneous genus Chlamydomonas, belongs to the group of chlamydomonads (which is closely related to colonial Volvocales) that is very distant from another group that is closer to Dunaliella (for example, Chlamydomonas applanata Pringsh.). The evolutionary distance between these two groups is comparable with the distance between a soybean plant and cycads. Interesting data are available on photomovement of Tetraselmis viridis (Roukhiyajnen) Norris et al., a representative of a separate class of green algae, Chlorodendrophyceae [Maсюк, 2006]. Photomovement in the ultraviolet area of the spectrum and presence of phototopotaxis maxima in that area is evidence of a possible presence of flavins and/or pterins in the composition of photoreceptor pigments of this species. Thus, evolution of photoreceptor systems, in particular, sets of photoreceptor pigments may probably occur in different ways in various branches (clades) of the phylogenetic tree of green plants. Even deeper differences in the structure of the photoreceptor were found between Dunaliella spp. and - 173 -

Euglena gracilis Klebs, a representative of the division Euglenophyta. According to some authors, Euglena and Dunaliella belong to different kingdoms: Euglenozoa Cavalier-Smith, 1981, or Euglenobionta Kussakin et Drozdov, and Plantae Leedale, 1974, or Viridiplantae Cavalier-Smith, 1981, respectively. Other authors place them in different superkingdoms of the organic world: Discicristata (Mirabdullaev) Leontiev et Akulov (2002) ex Zmitrovich, 2003 and Lamellicristata (Taylor) Starobogatov (1986) emend. Zmitrovich (2003). Dunaliella differs from Euglena not only in a low speed of cell movement, in higher sensitivity to low and high intensity of light, lower threshold of transition from positive to negative phototopotaxis, which is probably partly explained by ecological peculiarities at the species level. Until now the transition from positive to negative phototopotaxis with the subsequent complete suppression of phototopotaxis under the influence of preliminary UV irradiation was observed only in species of Dunaliella. Differences in spectra of phototopotaxis action assumes the nonidentity of sets of photoreceptor pigments. At the same time, distinctions were revealed also in the structure of the photoreceptor: crystal and dichroic in Euglena and non-crystal and non-dichroic in Dunaliella. Taking into account the peculiarities of the photoreceptor system of euglenoid algae, in particular, their stigma structure, it is possible to believe that they possess only the most ancient, primary modulation mechanism of photoreception inherited from prokaryotes or common ancestors of these groups, while in green algae three mechanisms (modulation, diffraction and interference) can function simultaneously, thus raising the level of the light signal absorbed by a photoreceptor. Though processes of sensory transduction of the light signal into a locomotory reaction are most likely of an ion nature in all flagellate algae, in Euglena gracilis, in contrast to green algae, theNa+-K+-pump participates in control of these processes. Euglena differs from species of Dunaliella and Chlamydomonas reinhardtii also in an original functioning of its flagellar apparatus: during beating the flagellum of E. gracilis looks like a "broken (interrupted) spiral": spiral parts of the flagellum are interrupted by its straight parts; neither typical ciliary type nor undulate type of beating of the flagellum are observed in euglenids. Thus, the greater the phylogenetic distance between taxa, the greater and deeper are distinctions and differences in their photobehaviour, structure and mechanisms of functioning photoreceptor systems, sensory transduction of a light signal into locomotory reactions of different types, and functioning of the flagellar apparatus. These data make it possible to use the peculiarities of photomovement of algae as additional diagnostic criteria in evolutionary biology, phylogenetics, systematics, and taxonomy of algae. Along with the mentioned differences in photomovement processes and its photoregulation, representatives of different taxa of flagellates have common features: the structure of the photoreceptor system (which, with a few exceptions, consists of the photoreceptor and stigma), primarily modulation mechanism of photoreception (which in representatives of different taxa, depending on the stigma structure, can be associated with additional mechanisms, such as diffraction and interference ones), the ionic nature of photoreception and sensory transduction of the light signal into a locomotory reaction at the predominant role of calcium ions in these processes, possible participation in these processes of light-induced changes in electric potentials of membranes, conformational changes of protein molecules, as the basis of photoreception and sensory transduction, participation of centrin in photoorientation of basal bodies. At the same time, we have to admit that experimental data on photomovement of algae (representatives of different taxa) are still too incomplete; they cover only a small number of model organisms. Unfortunately, these studies are not carried out according to a coherent plan at the required methodical level. Therefore, the results obtained in studies of different model organisms, by representatives of different photobiology schools in various countries, are not always comparable, and the conclusions made by us here are only preliminary. It is only a necessary preliminary stage of summing up some intermediate results of ongoing studies, and these studies can add to, change, or even disagree with our conclusions. Studies of peculiarities of photomovement in algae are definitely of interest for ecology and geography of algae, in particular, for autecology, because these studies allow specifying characteristics of some species concerning their reactions to parameters of light, determining optimum, maximum and minimum values of these parameters for different species, promoting their subdivision into groups of shade-preferring, shade-resistant and photophilous and light-resistant organisms, and also enhancing our deeper understanding of laws of their distri- 174 -

bution on the planet Earth. Applied importance of data on photomovement of algae The applied importance of results of studying photomovement parameters in species of Dunaliella is determined mainly by the position of that genus in the great kingdom of green plants (Viridiplantae) dominating our planet and playing the main role in fulfilling the everyday needs of mankind. Hyperhalobic species of Dunaliella are classical models for studying the mechanisms of salt tolerance, osmotic regulation, permeability of membranes, and processes of biosynthesis of carotene in plants, and photomovement. Due to their ability to hypersynthesis of the bcarotene, osmotically active compounds of strategic importance and high contents of other physiologically active substances, species of Dunaliella are valuable organisms for biotechnology. Their high sensitivity to environmental factors provides an opportunity of their use as tests objects in biomonitoring. The great advantages of these organisms are their microscopic sizes, high rates of reproduction, active motility, photokinetic and photovector reactions. In our experiments we studied the sensitivity of various parameters of photomovement in Dunaliella salina and D. viridis to the presence of surface-active substances in the environment (surfactants: cation-active catamin, anion-active sodium dodecylsulfonate, non-ionactive hydropol, a natural polysaccharide compound isolated from bluegreen algae, agents "water bloom" in the Dnieper reservoirs, and also their combinations in the concentration range from 1 mg/L to 40 mg/L), salts of heavy metals (CuSO4×5H2O, CdCl2 et Pb(NO3)2 in the concentration range (10-7-10-2) M and pesticides (Acetal 55 %, Acetazine 50 %, Alachlor 45 %, Arilon 75 %, Basta 20 %, Dual 96 %, Harmony 75 %, Tecto 45 % in concentrations from 10-7 to 10-2 M). The obtained data reveals the possibility of using the velocity of forward and rotary movement of cells, frequencies of their flagella beating, and phototopotaxis values in species of Dunaliella as tests parameters in biological monitoring of the aquatic environment. The use of several simultaneously registered parameters of photomovement of algae that allows increasing the sensitivity of the biotesting method is proposed. The vector method of biotesting is proposed for assessment of action of the concentration gradient of various toxicants in the aquatic environment upon some (two and more) simultaneously registered parameters of movement. This method facilitates processing of data of large-scale measurements, opens an opportunity to approach the task of quantitative estimation of toxicant concentration, and also their qualitative identification. Species o£ Dunaliella as producents of b-carotene, ascorbic and dehydroascorbic acids, glycerin and other valuable organic compounds are perspective organisms for biotechnology. Mass cultures of strains of that genus are performed in many countries for industrial production of b-carotene preparations used in food and pharmaceutical industries and in medicine for the prevention and treatment of tumor, cardiovascular, ophthalmic diseases, avitaminoses, arthrosis, and other pathologies. Studying photomovement regularities and peculiarities of Dunaliella species can help in solving some technological problems of carotene production from these algae. The main tendencies and perspectives of further investigations in photomovement of flagellates are discussed.

- 175 -

ЛИТЕРАТУРА Арнольди В.М. Введение в изучение низших организмов. – Харьков, 1908. Артари А. К вопросу о влиянии среды на форму и развитие водорослей. – М., 1903. - 93 с. Балаян А.Э., Стом Д.И. Метод биотестирования по обездвижению клеток водоросли Dunaliella // Методы биотестирования вод. - Черноголовка, 1988. - С. 21-23. Балнокин Ю.В., Медведев А.В., Боднар И.В. Системы транспорта калия в клетках галофильных водорослей Dunaliella // Физиология раст. – 1983. – 30, № 5. – С. 955-963. Баренбойм Г.М. Маленков А.Г. Биологически активные вещества. Новые принципы поиска. - М.: Наука, 1986. - 363 с. Бегма А.А., Власенко В.В., Мацкивский В.И., Пеньков Ф.М., Посудин Ю.И., Фролов Г.В. Способ оценки токсического действия химических веществ, содержащихся в водной среде // А. с. 1482887 СССР. МКИ3 А61К31/52, № 4260249/30-13; Заяв. 10.06.87; Опубл. 30.05.89, Бюл. № 31. - 10 с. Борн М., Вольф Э. Основы оптики. - М., 1973. – 789 c. Брагинский Л.П. Некоторые закономерности и механизмы реагирования пресноводной экосистемы на воздействие пестицидов и поверхностно-активных веществ // Эксперим. вод. токсикология. - 1986. - № 2. - С. 12-18. Бриттон Г. Биохимия природных пигментов. - М.: Мир, 1986. - 422 с. Булгаков М.А. Дьяволиада. - М.: Недра, 1925. Вахмистров Д.Б., Богоров Л.В. Выделение поверхностно-активных веществ растительными клетками // Докл. АН СССР. - 1987. - 297, № 5. - С. 1273-1275. Владимирова М.Г. Ультраструктурная организация клетки Dunaliella salina Teod. и ее функциональные изменения в зависимости от интенсивности света и температуры // Физиол. раст. – 1978. – 25, № 3. – С. 571-583. Воскресенский К.А. Артемия – ценный корм в промышленном рыборазведении. – М.: Изд-во МГУ, 1960. – 7 c. Гелескул Ю.Ф. Производство каротина из водоросли дюналиелла соленоводная и получение из него препаратов для животноводства // Использование гидробиологических ресурсов Черного моря на корм сельскохозяйственных животных. - Одесса, 1968. - С. 57-58. Громов Б.В. Строение бактерий. - Л.: Изд-во ЛГУ, 1985. - 191 с. Давыдов А.С., Супрун А.Д. Конфигурационные изменения и оптические свойства a-спиральных белковых молекул // Укр. физ. журнал. - 1974. - 19. - С. 44-50. Дмитриев Ю.В., Климова Е.В., Бойко В.В. Использование Dunaliella viridis Teod. в качестве тест-системы при оценке патологических состояний организма // Актуальные проблемы современной альгологии: Матлы ІІІ Междунар. конф., Харьков, 20-23 апреля 2005 г. – Харьков, 2005. – С.47-48. Дрокова І.Г. Дослідження водоростей на вміст b-каротину // Укр. ботан. журн. - 1960. - 17, № 2. - С 39-42. Дрокова І.Г. Водорість Dunaliella salina Teod. як джерело одержання b-каротину // Укр. ботан. журн. - 1961. - 18, № 4. С. 110-112 Евтодиенко Ю.В. Проблемы биоэнергетики. - М.: Знание, 1985. - С. 3. Еленкин А.А. Биология низших растений. – Л.:, 1925. - 220 с. Зельниченко А.Т., Ковальчук В.С., Посудин Ю.И. Влияние электромагнитных полей на движение микроорганизмов // Биофизика. - 1988. - 33, № 5. - С. 841-844. Злочевская И.В., Абсалямов С.Я., Галимова Л.М. и др. К изучению механизма фунгицидного действия четвертичных аммониевых соединений // Науч. докл. высш. шк. Биол. науки. - 1981. - № 3. - С. 82-87. Змитрович И.В. Ревизия филогенетического древа эукариот: вариант эвгленозойного предка // Альгология. - 2003. - 13, № 3. - С. 227-268. Калиниченко Н.Ф., Старобинец З.Г., Бирюкова С.В. и др. Антибактериальная активность ПАВ // Микробиологическая эпидемиология и клиника инфекционных болезней. - Харьков, 1986. - С. 99-103. Калугина-Гутник О.А., Беляєв Б.М. Розвиток інтенсивної аквакультури водоростей-макрофітів на Чорному морі // Вісн. АН УРСР. - 1987. - № 1. - С. 48-54. Квитко К.В., Матвеев В.В., Чунаев А.С. Двигательная и поведенческая формы активности хламидомонады и их изменения, вызванные мутациями // Движение и поведение одноклеточных животных. - 1978. - Вып. 2. - С. 130-158. Коломбетти Дж., Гетти Ф., Ленчи Ф., Полакко Е., Посудин Ю.И., Кампани Э. Лазерная микроспектрофлуориметрия фотопигментов in vivo // Квант. электроника. – 1981. - 8, № 12 (114). - С. 2680-2683. Конев С.В., Волотовский И.Д. Фотобиология. - Минск: Изд-во Белорус. ун-та, 1979. - 383 с. Коршіков О.А. Volvocineae / Визначник прісноводних водоростей УРСР, 4. – К.:: Вид-во АН УРСР, 1938. - 184 с. Костюк П.Г., Гродзинский Д.М., Зима В.Л., Магура И.С., Сидорик Е.П., Шуба М.Ф. Биофизика / Под общ. ред. П.Г. Костюка. – Киев: Высш. шк., 1988. - 504 с.

- 176 -

Крайнюкова А.Н. Биотестирование в охране вод от загрязнения // Методы биотестирования вод. - Черноголовка, 1988. С. 4-14. Красновский А.А. Механизм образования и роль синглетного кислорода в фотобиологических реакциях // Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения. - М.: Наука, 1988. - С. 23-41. Крицкий М.С. Фоторегуляция метаболизма и онтогенеза у гетеротрофных микроорганизмов // Усп. микробиологии. 1982. - 17. - С. 41-61. Кусакин О.Г., Дроздов Ф.Л. Филема органического мира. Ч. 2. Прокариоты и низшие эукариоты. - С.-Петербург: Наука, 1998. - 478 с. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высш. шк., 1973. - 343 с. Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М. Электродинамика сплошных сред. - М.: Изд-во АН СССР, 1959. – 263 с. Леонтьев Д.В., Акулов А.Ю. Революция в мегатаксономии: предпосылки и результаты // Журн. общ. биол. - 2002. - 63. - С. 158-176. Лєнова Л.Й., Борисова О.В., Лукінов Д.І., Вассер С.П. Вивчення динаміки розподілу клітин за розмірами для характеристики стану популяції мікроводоростей // Доп. АН УРСР. Сер. Б. - 1989. - № 5. - С. 67-69. Мартыненко А.И., Посудин Ю.И., Масюк Н.П., Лилицкая Г.Г. Влияние внешних факторов на фотодвижение водорослей рода Dunaliella Teod. // Альгология. - 1996. - 6, № 2. - С. 150-156. Масюк Н.П. Исследование Dunaliella salina в природе и в условиях лабороторной культуры // Всесоюз. совещ. по культ. одноклет. водорослей (6-11 марта 1961 г.): Тез. докл. - Л., 1961 а. - С. 70-71. Масюк Н.П. Каротиноносна водорість Dunaliella salina Teod. у солоних водоймах Кримської обл. // Укр. ботан. журн. 1961 б. - 18, № 4. - С. 100-109. Масюк Н.П. Пути обогащения естественных запасов дюналиеллы как источника получения каротина в промышленных масштабах // Вопр. гидробиологии. І Съезд Всесоюз. гидробиол. о-ва, Москва, 1-6 февраля 1965 г.: Тез. докл. М.: Наука, 1965а. - С. 282-283. Масюк Н.П. Вплив йонів Na, Mg, Cl та SO4 на ріст, розмноження та каротиноутворення водорості Dunaliella salina Teod. // Укр. ботан. журн. - 1965 б. - 22, №5. - С. 3-11. Масюк Н.П. Карбонати та бікарбонати як стимулятори росту і нагромадження каротину в культурі Dunaliella salina Teod. // Укр. ботан. журн. - 1965 в. - 22, № 6. - С. 18-22. Масюк Н.П. Масова культyра каротиноносної водорості Dunaliella salina Teod. // Укр. ботан. журн. - 1966. - 23,№ 2. С. 12-19. Масюк Н.П. Оцінка придатності ропи сакських водойм для вирощування каротиноносних водоростей // Укр. ботан. журн. - 1967. - 24, № 4. - С. 37-43. Масюк Н.П. Морфология, систематика, экология, географическое распространение рода Dunaliella Teod. - К.: Наук. думка, 1973. - 242 с. Масюк Н.П. Эволюционные аспекты морфологии эукариотических водорослей. - Киев: Наук. думка, 1993. - 256 с. Масюк Н.П. Chlorodendrophyceae class. nov. (Chlorophyta, Viridiplantae) у флорі України. I. Обсяг, філогенетичні зв`язки, систематичне положнення // Укр. ботан. журн. – 2006. – 63, № 5. – C. 662-675. Масюк Н.П., Абдула Є.Г. Перший досвід вирощування каротиноносних водоростей в напівпромислових умовах // Укр. ботан. журн. - 1969. - 26, № 3. - С. 21-27. Масюк Н.П., Абдула Є.Г. О результатах и перспектитвах искусственного выращивания каротиноносных водорослей в полупромышленных условиях // Матлы I конф. по изучению споровых растений Украины. - Киев: Наук. думка, 1971. - С. 82-83. Масюк Н.П., Абдула Є.Г., Радченко М.Й. Вплив деяких сторонніх організмів на культуру Dunaliella salina Teod. в напівпромислових умовах // Укр. ботан. журн. - 1970. - 27, № 4. - С. 456-461. Масюк Н.П., Костіков І.Ю. Водорості в системі органічного світу. - К.: Академперіодика, 2002. - 178 с. Масюк Н.П., Посудин Ю.И. Логические основы классификации поведения подвижных микроорганизмов. - Киев: Издво УСХА, 1991а. - 36 с. Масюк Н.П., Посудин Ю.И. Фоторецепторные системы монадных водорослей. - Киев: Изд-во УСХА, 1991б. - 61 с. Масюк Н.П., Посудин Ю.И. Влияние рН среды на параметры фотодвижения Dunaliella salina Teod. (Chlorophyta) // Альгология. - 2007. - 17, № 1. – С. 14-20. Масюк Н.П., Посудін Ю.И., Радченко М.Й., Шейко О.М. Логічні основи класифікації світозалежної поведінки рухливих організмів // Укр. ботан. журн. - 1988. - 45, № 5. - С. 1-7. Масюк Н.П., Терещук О.А. Коллекция культур водорослей Института ботаники им. Н.Г. Холодного АН УССР // Культивирование коллекционных штаммов водорослей. - Л.: 1983. - С. 104-114. Масюк Н.П., Юрченко В.В. Вплив концентрації водневих іонів на водорість Dunaliella salina Teod. // Укр. ботан. журн. 1962. - 19, № 4. - С. 91-95.

- 177 -

Мельников С.В., Алешкин В.Р., Рощин П.М. Планирование эксперимента в исследованиях сельскохозяйственных процессов. - Л.: Колос, 1972. - 199 с. Методическое руководство по биотестированию воды РД 118-02-90. – М., 1991. – 70 с. Милько Е.С. Влияние освещенности и температуры на пигментообразование Dunaliella salina // Микробиология. - 1963. - 32, № 4. - С. 307. Миронюк В.І., Масюк Н.П., Акопянц Н.С. Вплив рН і деяких інгібіторів на активність каталази оліго- та гіпергалобних водоростей // Укр. ботан. журн. - 1980. - 39, № 3. - С. 60-62. Нобел П. Физиология растительной клетки (физико-химический подход). - М.: Мир, 1973. - 287 с. Паршикова Т.В. Влияние поверхностно-активных веществ различной химической природы на выживаемость природных популяций водорослей. Ред. Гидробиол. журн. - Киев, 1988. - 13 с. Деп. в ВИНИТИ 26.04.88, № 3216-В88. Паршикова Т.В., Липницька Г.П., Лілицька Г.Г., Посудін Ю.І. Вплив ПАР на фоторух та флуоресценцію хлорофілу двох видів Dunaliella Teod. // Укр. ботан. журн. - 1990. – 47, № 5. - С. 60-63. Паршикова Т.В., Пахомова М.Н. Чувствительность различных видов водорослей к действию поверхностно-активных веществ. Ред. Гидробиол. журн. - Киев, 1988. - 13 с. Деп. в ВИНИТИ 26.04.88, № 3215-В88. Перфильев Б.В. О движении синезеленых водорослей Synechoсоccus // Журн. микробиологии. - 1915. - 2. - С. 283-293. Посудин Ю.И. Фотоповедение Euglena gracilis // Усп. соврем. биологии. – 1982. – 93, вып. 2. – С. 230-235. Посудин Ю.И. Лазерная микрофлуориметрия биологических объектов. – Киев: Вища шк., 1985. – 110 с. Посудин Ю.И. Лазерная фотобиология. – Киев: Вища шк., 1989. – 248 с. Посудин Ю.И. Оптические методы исследования фотобиологических реакций высших и низших растений. Дисс. докт. биол. наук. - СПб., 1992а. - 433 с. Посудин Ю.И. Способ биотестирования наличия химических соединений в водной среде // А.с. 173992288, № 4737382, Заяв. 13.9.1989. Опубл. 5.2.1992 Посудин Ю.И. Биофизик Сергей Чахотин. - Киев: Изд-во НАУ, 1995. - 92 с. Посудін Ю.І. Вимірювання гравітаксиса водоростей як засіб біомоніторингу водних середовищ // Наук. вісн. НАНУ. 1998. - № 3. - С. 15-21. Посудин Ю.И., Конончук В.Р., Масюк Н.П., Лилицкая Г.Г. К изучению механизмов фоторецепции Dunalilla salina Teod. // Альгология. - 1991. - 1, № 3. - С. 24-34. Посудин Ю.И., Масюк Н.П. Фотодвижение Dunaliella Teod. // Биол. науки. - 1993. - № 2. - С. 28-32. Посудин Ю.И., Масюк Н.П. Диффракционный механизм фоторецепции одноклеточных зеленых жгутиковых водорослей // Альгология. – 1996. - 6, № 4. - С. 368-376. Посудин Ю.И., Масюк Н.П., Лилицкая Г.Г. Влияние ионов кальция на фотодвижение двух видов рода Dunaliella Teod. // Альгология. - 1993. - 3, № 3. - С. 16-23. Посудин Ю.И., Масюк Н.П., Лилицкая Г.Г. Векторный метод биотестирования водных сред // Альгология. – 1996. - 1, № 1. - С. 15-25. Посудин Ю.И., Масюк Н.П., Лилицкая Г.Г. Влияние ультрафиолетового излучения на фотодвижение двух видов Dunaliella Teod. // Альгология. - 2004. - 14, № 2. - С. 113-126. Посудин Ю.И., Масюк Н.П., Лилицкая Г.Г., Голубкова М.Г. Воздействие ионизирующего излучения на фотодвижение водорослей // Радиобиология. - 1992. - 32, вып. 2. - С. 292-298. Посудин Ю.И., Масюк Н.П., Лилицкая Г.Г., Радченко М.И. Фототопотаксис двух видов Dunaliella Teod. в ультрафиолетовой области спектра // Биофизика. - 1990. - 35, вып. 6. - С. 968-971. Посудін Ю.І., Масюк Н.П., Ліліцька Г.Г., Радченко М.Й. Фототопотаксис двух видів Dunalialla Teod. // Укр. ботан. журн. - 1991. - 48, № 4. - С. 48-53. Посудин Ю.И., Масюк Н.П., Лилицкая Г.Г., Шевченко А.И. Влияние азида натрия на фотодвижение двух видов Dunaliella Teod. // Физиол. раст. - 1995. - 42, № 3. - С. 432-434. Посудин Ю.И., Масюк Н.П., Радченко М.И., Лилицкая Г.Г. Фотокинетические реакции двух видов Dunalialla Teod. // Микробиология. - 1988. - 57, вып. 6. - С. 1001-1006. Посудин Ю.И., Супрун А.Д. К вопросу о механизме фоторегуляции движения жгутиковых водорослей // Биол. науки. 1992. - № 11-12. - С. 27-33. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. - Минск: Вышейш. шк., 1973. - 320 с. Седова Т.В. Основы цитологии водорослей. - Л.: Наука, 1977. - 172 с. Семененко В.Е., Абдуллаев А.А. Параметрическое управление биосинтезом b-каротина в клетках Dunaliella salina // Физиол. раст. - 1980. - 27. - С. 22. Синещеков О.А., Литвин Ф.Ф. Фоторегуляция движения микроорганизмов // Усп. микробиологии. - 1982. - 17. - С. 6287. Синещеков О.А., Литвин Ф.Ф. Механизмы фототаксиса микроорганизмов // Молекулярные механизмы биологи-ческого действия оптического излучения. - М.: Наука, 1988. - С. 212-227.

- 178 -

Синещеков О.А., Синещеков В.А., Литвин Ф.Ф. Фотоиндуцированные биоэлектрические реакции при фототаксисе одноклеточной жгутиковой водоросли // ДАН СССР. - 1978. - 239. - С. 471-474. Сиренко Л.А., Козицкая В.Н. Биологически активные вещества водорослей и качество воды. - Киев: Наук. думка, 1988. - 254 с. Ставская С.С. Биологическое разрушение анионных ПАВ. - Киев: Наук. думка, 1981. - 114 с. Старобогатов Я.И. К вопросу о числе царств эукариотных организмов // Тр. Зоол. Ин-та. - 1986. - 144. - С. 4-25. Таранова Л.А. Біологічне руйнування катіонних поверхневоактивних речовин // Вісн. АН УССР. - 1987. - № 8. - С. 4050. Топачевский А.В., Масюк Н.П. Пресноводные водоросли Украинской ССР. – Киев: Вища шк., 1984. - 334 с. Фаминцын А.С. Действие света на водоросли и некоторые другие близкие к ним организмы. - С.-Петербург, 1866. - 56 с. Фаминцын А.С. Действие света и темноты на расположение зерен хлорофилла в листьях Mnium // Натуралист. - 1887а. - № 13-20. - С. 194-197. Фаминцын А.С. Учебник физиологии растений. - С.-Петербург, 1887б. - 304 с. Филенко О.Ф. Водная токсикология. - Черноголовка: Изд-во Моск. ун-та, 1988. - 156 с. Цвылев О. П., Ткаченко В. Н. Использование одноклеточных водорослей для биологического анализа. - М.: Легкая и пищ. пром-сть, 1981. - 108 с. Юрина Е.В. Опыт культивирования галобионтных водорослей Asteromonas gracilis Artari и Dunaliella salina Teod. // Вест. МГУ, сер. 4 (Биол. почв.). - 1966. - № 6. - С. 76-83. Юркова Г.Н. Вплив температурного фактора на Dunaliella salina Teod. // Укр. ботан. журн. - 1965. - 22, № 6. - С. 51-57. Aansen A.J., Eimhjellen K.E., Liaaen-Jensen S. An extreme source of b-carotene // Acta Chem. Scand. - 1969. - 23. - P. 2544. Ahmed A.M., Zidan M.A., Adam M.S. Effects of high boron levels on growth and some metabolic activities of the halotolerant Dunaliella tertiolecta // Biol. Plantarum (Praha) - 1988. - 30, N 5. - P. 357-361. Arnott H.J., Brown R.M. Jr. Ultrastructure of the eyespot and its possible significance in phototaxis of Tetracystis excentrica // J. Protozool. - 1967. - 14. - P. 529-539. Ascoli C. New techniques in photomotion methodology // Biophysics of Photoreceptors and Photobehaviour of Microorganisms / G. Colombetti (ed.). - Pisa: Lito Felici, 1975. - P. 109-120. Ascoli C., Barbi M., Frediani C., Mure A. Measurement of Euglena motion parameters by laser light scattering // Biophys. J. 1978. - 24. - P. 585-599. Ascoli C., Frediani C. Quasi-elastic light scattering in the measurement of the motion of flagellated algae // Light scattering in liquids and macromolecular solutions / V. Degiorgij, Corti M., Giglio M. (eds.). – Plenum Press Corporation, 1980. P. 183-198. Ascoli C., Petracchi D. Light scattering techniques in studying photoresponses // Biophysics of Photoreceptors and Photomovement in Microorganisms / F. Lenci, F. Ghetti, G. Colombetti, D.-P. Häder, Song P.-S. (eds.). - New York: Plenum Press, 1991. - P. 111-123. Baas-Becking L.G.M. Observations on Dunaliella viridis Teod. // Contr. to Mar. Biol.: Stanford Univ. Press, 1930. – P. 102-114. Barghigiani C., Colombetti G., Lenci F., Banchetti R., Bizzaro M.P. Photosensory transduction in Euglena gracilis: Effect of some metabolic drugs on the photophobic response // Arch. Microbiol. - 1979. - 120. - P. 239-245. Barghigiani C., Ferrara R., Ravera O., Serritti A. Biological effects under laboratory conditions // NATO-ASI workshop on trace element specification in surface waters and its ecological implications. Genova, 2-4 May, 1981. - P. 44. Barghigiani C., Maserti E., Serritti A., Ferrara R. Accumulation and release of Cu and Pb by Dunaliella salina // Proc. Intern. Conf. «Heavy Metals in Environment», Heidelberg, 1983. - P. 634-637. Barlow S.B., Cattolico R.A. Fine structure of the scalecovered green flagellate Mantoniella squamata (Manton and Parcke) Desikachary // Br. Phycol. J. - 1980. - 15. - P. 321-333. Barltrop J., Martin B.B., Martin D.F. Ptychodiscus brevis as a model system for photodynamic action // Microbios. - 1983. - 37. - P. 95-103. Barsanti L., Passarelli V., Lenci F., Gualtieri P. Elimination of photoreceptor (paraflagellar swelling) and photoreception in Euglena gracilis by means of the carotenoid biosynthesis inhibitor nicotine // J. Photochem. Photobiol. - 1992. - 13. P. 135-144. Barsanti L., Pasarelli V., Lenci F., Walne P.L., Dunlap J.R., Gualtieri P. Effects of hydroxylamine, digitonin and triton X-100 on photoreceptor (paraflagellar swelling) and photoreception in Euglena gracilis // Vision Res. - 1993. - 33. - P. 20432050. Barsanti L., Pasarelli V., Walne P.L., Gualtieri P. In vivo photocycle of the Euglena gracilis photoreceptor // Biophys. J. - 1997. - 72. - P. 545-553. Batschelet E. Circular Statistics in Biology. - New York etc.: Acad. Press, 1981. - 371 p.

- 179 -

Bauernfeind J.C. Carotenoids. Colorants and Vitamin A Precursors, Technological and Nutritional Applications. - New York: Acad. Press, 1981. Beardall I., Entwisle L. Internal pH of the obligate acidophile Cyanidium caldarium Geitler (Rhodophyta) // Phycologia. – 1984. - 23, N 3. - P. 397-399. Beardall I., Heraud Ph., Roberts S., Shelly K., Stojkovic S. Effects of UV-B radiation on inorganic carbon acquisition by the marine microalga Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) // Phycologia. - 2002. - 41, N 3. - P. 268-272. Beckmann M., Hegemann P. In vitro identification of rhodopsin in the green alga Chlamydomonas // Biochemistry. - 1991. - 30. - P. 3692-3697. Ben-Amotz A., Avron M. The potential use of Dunaliella for the production of glycerol, b-carotene and high protein feed // Biosaline Research: A Look to the Future / San-Pietro (ed.). - New York: Plenum Publ. Corp., 1982. - P. 207-214. Ben-Amotz A., Avron M. The biotechnology of mass culturing Dunaliella for products of commercial interest // Algal and Cyanobacterial Biotechnology / R.C. Cresswell, T.A. Rees, N. Shah (eds.). - London: Longman Sci. Tech. Press, 1989. Chapter 4. Ben-Amotz A., Avron M. The biotechnology of cultivating the halotolerant alga Dunaliella // Trends in Biotechnol. - 1990. - 8. - P. 121. Ben-Amotz A., Gressel J., Avron M. Massive accumulation of phytoene induced by norflurazon in Dunaliella bardawil (Chlorophyceae) prevents recovery from photoinhibition // J. Phycol. – 1987. - 23. - P. 176. Ben-Amotz A., Gressel J., Avron M. Stereoisomers of b-carotene and phytoene in the alga Dunaliella bardawil // Plant Physiol. - 1988. - 86. - P. 1286. Ben-Amotz A., Katz A., Avron M. Accumulation of b-carotene in halotolerant algae: purification and characterisation of bcarotene-rich globules from Dunaliella bardawil (Chlorophyceae) // J. Phycol. - 1982 a. - 18. - P. 529. Ben-Amotz A., Sussman I., Avron M. Glycerol production by Dunaliella // Experientia. - 1982 b. - 38, N 1. - P. 49-52. Bendix S.W. Phototaxis // The Botanical Review. - 1960. - 26. - P. 145-208. Benedetti P.A., Checcucci A. Paraflagellar body (PFB) pigments studied by fluorescence microscopy in Euglena gracilis // Plant Sci. Lett. - 1975. - 26. - P. 315-318. Benedetti P.A., Lenci F. «In vivo» microspectrofluorometry of photoreceptor pigments in Euglena gracilis // Photochem. Photobiol. - 1977. - 26. - P. 315-318. Bensasson R.V. Spectroscopic and biological properties of carotenoids // Biophysics of Photoreceptors and Photobehaviour of Microorganisms. Proc. of the Intern. School of the CNR of Italy. Badia Fiesolana (Firenze), 1-5 September, 1975. - P. 146-163. Berg H.C. Physics of bacterial chemotaxis. // Sensory Perception and Transduction in Aneural Organisms / Colombetti G., Lenci F., Song P.-S. (eds.). - New York: Plenum Press, 1985. - P. 19-30. Bhattacharya D., Steinkotter J., Melkonian M. Molecular cloning and evolutionary analysis of the calcium-modulated contractile protein, centrin, in green algae and land plants // Plant Mol. Biol. - 1993. - 23, N 6. - P. 1243-1254. Biochemistry and Physiology of Protozoa / M.Levandowsky, S.H. Hutner,eds. – New York etc.: Acad. Press, 1981. – 4. – P. 664. Birkbeck T.E., Stewart K.D., Mattox K.R. The cytology and classification of Schizomeris leibleinii (Chlorophyceae). II. The structure of quadriflagellate zoospores // Phycologia. - 1974. - 13. - P. 71-79. Borowitzka L.J. Status of the Australian Algal Biotechnology Industry in 1990 // Austr. J. Biotechnol. - 1990. - 4, N 4. - P. 239-240, 250. Borowitzka L.J., Borowitzka M.A. Commercial production of b-carotene by Dunaliella salina in open ponds // Bull. Mar. Sci. 1990. - 47, N 1. – P. 244-252. Borowitzka L.J., Borowitzka M.A., Moulton T.P. The mass culture of Dunaliella salina for fine chemicals: from laboratory to pilot plant // Hydrobiologia. – 1984. - 116/117. - P. 115-134. Borowitzka L.J., Moulton T.P., Borowitzka M.A. Salinity and the commercial productivity of beta-carotene from Dunaliella salina // Nova Hedw. - 1986. - 83. - P. 224-229. Borowitzka M.A. Caltivation of microalgal from village level to industrial scale // Phycologia. - 2005. - 44, N 4. - P. 11-12. Borowitzka M.A., Borowitzka L.J. Dunaliella // Microalgal biotechnology / Borowitzka M.A., Borowitzka L.J. eds. Cambridge, 1988. - P. 27-58. Bound K.E., Tollin G. Phototactic response of Euglena gracilis // Nature. - 1967. - 216. - P. 111-114. Bovee E.C. Movement and locomotion of Euglena // The Biology of Euglena. Vol. III. Physiology / D.E. Buetow (ed.). - New York: Acad. Press, 1968. - P. 143-168. Braun F.-J., Hegemann P. Direct measurement of cytosolic calcium and pH in living Chlamydomonas reinhardtii cells // Eur. J. Cell Biol. – 1999. – 78. – P. 199-208. Branton D., Bullivant S., Gilula N.B., Karnovsky M.J., Mühlethaler K., Northcote D.H., Packer L., Satir B., Satir P., Speth V., Staeheilin L.A. Steere R.L., Weinstein R.S. Freeze-etching nomenculature // Science. - 1975. - 190. - P. 54-56.

- 180 -

Bray D.F., Nakamura K., Costerton J.W., Naganaar E.B. Ultrastructure of Chlamydomonas eugametos as revealed by freezeetching: cell wall plasmalemma and chloroplast membrane // J. Ultrastr. Res. - 1974. - 47. - P. 125-141. Britton G. Biosynthesis of carotenoids // Plant Pigments / T.W. Goodwin (ed.). - New York: Acad. Press, 1988. Chapter 3. – P. 133-180. Buchheim M.A., Buchheim J.A., Chapman R.L. Phylogeny of Chloromonas (Chlorophyceae): a study of 18S ribosomal RNA gene sequences // J. Phycol. - 1997. - 33. - P. 286-293. Buchheim M.A., Turmel M., Zimmer E.A., Chapman R.L. Phylogeny of Chlamydomonas (Chlorophyta) based on cladistic analysis of nuclear 18S rRNA sequence data // J. Phycol. - 1990. - 26. - P. 689-696. Buder J. Zur Kenntnis der phototaktischen Richtungsbewegungen // Jhb. Wiss. Bot. - 1917. - 58. - P. 105-220. Burkholder P.R. Movement in the Cyanophyceae: effect of pH upon movement of Oscillatoria // J. Gen. Physiol. - 1933. - 16. P. 875-881. Burr A.H. Photomovement behaviour in simple invertebrates // Photorecept. and Vision Invertebr. – Proc. Nato Adv. Study Inst., Lennoville – New York, London, 1984. - P. 179-215. Cavalier-Smith T. Eukaryote Kingdoms: seven or nine? // BioSystems. - 1981. - 14. - P. 461-481. Chamberlain A.H.L. Algal settlement and secretion of adhesive materials // Proc. 3rd Intern. Biodegrad. Symp. Kingston, 1975. London, 1976. - P. 424-426. Chardard R. L’infrastructure du plasmalemme de Dunaliella bioculata (Algue verte). Mise en évidence d´un cell-coat; essai de localisation des charges négatives // Crypt. Algol. - 1987. - 8, N 3. - P. 173-189. Chardard R. Nouvelles observations sur la structure et la composition du cell-coat de Dunaliella bioculata (Algae verte) // Cryptogam. Algol. - 1990. - 11, N 2. - P. 137-152. Checucci A., Colombetti G., Ferrara R., Lenci F. Action spectra for photoaccumulation of green and colorless Euglena: Evidence for identification of receptor pigments // Photochem. Photobiol. - 1976. - 23. - P. 51-54. Clayton R.K. Phototaxis in microorganisms // Photophysiology / A.C. Giese (ed.). - New York, London: Acad. Press, 1964. - 2. - P. 51-77. Clegg M.R. Behavioural responses of phytoplanktonic flagellates to the quantity and quality of light and their ecological implications // Phycologia. - 2005. - 44, N 4. Suppl. - P. 22. Cohn F. Ueber die Gesetze der Bewegung Mikroskopischer Tiere und Pflanzen unter Einfluss des Lichtes // Jber. Schles. Ges. Vaterl. Kult. - 1865. - 42. - P. 35. Colombetti G., Ghetti F., Lenci F., Polacco E., Posudin Yu., Campani E. Microspettrometria laser di fotopigmenti «in vivo» // II Congr. Naz. «Elettronica quantistica e plasmi», 20-22 Maggio 1980. - Palermo, 1980. - P. 223-227. Colombetti G., Häder D.-P., Lenci F., Quaglia M. Phototaxis in Euglena gracilis: effect of sodium azide and triphenyl-methyl phosphonium ions on the photosensory transduction chain // Curr. Microbiol. - 1982. - 7. - P. 281-284. Colombetti G., Lenci F. Identification and spectroscopic characterisation of photoreceptor pigments // Photoreception and Sensory Transduction in Aneural Organisms / F. Lenci and G. Colombetti (eds.). - 1980. - P. 173-188. Colombetti G., Lenci F. Photoreception and sensory responses in microorganisms // Medicine, Biologie, Environment. - 1982. 10. - P. 319-325. Colombetti G., Lenci F., Diehn B. Responses to photic, chemical and mechanical stimuli // The Biology of Euglena / Buetow (ed.). - New York: Acad. Press, 1982. – Vol. 3. - P. 169-195. Colombetti G., Marangoni R. Mechanisms and strategies of photomovement in Flagellates // Biophysics of Photoreceptors and Photomovement in Microorganisms / F. Lenci, F. Ghetti, G. Colombetti, D.-P. Häder, Song P.-S. (eds.) - New York: Plenum Press, 1991. - P. 53-71. Colombetti G., Petracchi D. Photoresponse mechanisms in flagellated algae// Crit. Rev. Plant. Sci. - 1989. - 8. - P. 309-355. Cooper D.G., Zajic J.E. Surfaceactive compounds from microorganisms // Adv. Appl. Microbiol. - 1980. - N 26. - P. 240-244. Cosens D.J., Nultsch W. Phototaxis and photokinesis // Primitive Sensory and Communication Systems: The Taxes and Tropisms of Microorganisms and Cells / M.J. Carlile (ed.). - New York, San Francisco: Acad. Press, 1975. - P. 29-90. Crawley J.C.W. Some observations on the fine structure of the gametes and zygotes of Acetabularia // Planta. - 1966. - 69. - P. 365-376. Crawley J.C.W. The fine structure of the gametes and zygotes of Acetabularia // Biology of Acetabularia / J. Brachet and S. Bonotto (eds.). - New York: Acad. Press, 1970. - P. 73-83. Creutz C., Diehn B. Motor responses to polarized light and gravity sensing in Euglena gracilis // J. Protozool. - 1976. - 23. - P. 552-556. De Busk T.A., Ryther J.H. Effects of seawater exchange, pH and carbon supply on the growth of Gracilaria tikvahiae (Rhodophyceae) in largescale cultures // Bot. Mar. – 1984. - 27, N 8. - P. 357-362. Deason T.R., Floyd G.L. Comparative ultrastructure of three species of Chlorosarcina (Chlorosarcinaceae, Chlorophyta) // J. Phycol. - 1987. - 23. - P. 187-195.

- 181 -

Diehn B. Mechanism and computer stimulation of the phototactic accumulation of Euglena in a beam of light // Photochem. Pholobiol. - 1970. - 11. - P. 407-413. Diehn B. Phototaxis and sensory transduction in Euglena // Science. - 1973. - 181. - P. 1009-1015. Diehn B. Photic responses and sensory transduction in Protists // Handbook of Sensory Physiology, Comparative Physiology and Evolution of Vision in Invertebrates. VII/6A. / H. Autrum (ed.). – Berlin etc.: Springer–Verlag, 1979. - - P. 23-66. Diehn B., Feinleib M., Haupt W., Hildebrand E., Lenci F., Nultsch W. Terminology of behavioural responses of motile microorganisms // Photochem. Photobiology. - 1977. - 26. - P. 559-560. Dodge J.D. The fine structure of algal cells. - London: Acad. Press, 1973. - 261 p. Dodge J.D., Crawford R.M. Observations on the fine structure of the eye-spots and associated organelles in the dinoflagellate Glenodinium foliaceum // J. Cell Sci. - 1969. - 5. - P. 479-493. Dolle R., Nultsch W. Effects of calcium and calcium channel blocker [3H] verapamil to membrane fractions of Chlamy-domonas reinhardtii // Arch. Microbiol. - 1988. - 101. - P. 18-23. Dolle R., Pfau J., Nultsch W. Role of calcium ions in motility and phototaxis of Chlamydomonas reinhardtii // J. Plant Physiol. - 1987. - 126. - P. 467-473. Donk E., Hessen D.O. Loss of flagella in the green alga Chlamydomonas reinhardtii due to in situ UV-exposure // Underwater Light and Algal Photobiology / F.L. Figueroa, C. Jimenez, J.L. Perez-Llorens, F.X. Niell (eds.). - Malaga: Scientia Marina, 1996, 60 (Suppl. 1). - P. 107-112. Doughty M.J., Diehn B. Photo sensory transduction in the flagellated alga, Euglena gracilis: I. Action of divalent cations, Ca2+ antagonists and Ca2+ ionophore on motility and photobehaviour // Biochem. Biophys. Acta. - 1979. - 588. - P. 148168. Doughty M.J., Diehn B. Photosensory transduction in the flagellated alga, Euglena gracilis: III. Induction of Ca2+-dependent responses by monovalent cation ionophores // Biochem. Biophys. Acta. - 1982. - 682. - P. 32-43. Doughty M.J., Diehn B., Grieser R. Photosensory transduction in the flagellated alga, Euglena gracilis: II. Evidence that blue light effects alteration in Na+/K+ permeability of the photoreceptor membrane // Biochem. Biophys. Acta. - 1980. 602. - P. 10-23. Dunal F. Extrait d’un mémoire sur les algues qui colorent en rouge certains eaux des marais salants méditerranéens// Ann. Sc. Nat. Bot. 2 Ser., 1838, 9: 172. Dunaliella: Physiology, Biochemistry and Biotechnology / M.Avron, A.Ben-Amotz (eds.). - Boca Raton etc.: CRC Press, 1992. - 240 p. Duvnjak Z., Cooper D.G., Kosaric N. Production of surfactant by Arthrobacter paraffineus ATCC 19558 // Biotechnol. and Bioeng. - 1982. - 24, N 24. - P. 170-174. Ehrenberg C.G. Die Infusoriensthierchen als vollkommen Organismen. - Leipzig, 1838. Ekelund N.G.A. Effects of protein synthesis inhibitors on photoinhibition by UV-B (280-320 nm) radiation in the flagellate Euglena gracilis // Underwater Light and Algal Photobiology / F.L. Figueroa, C. Jimenez, J.L. Perez-Llorens and F.X. Niell (eds.) - Malaga: Scientia Marina, 1996. - 60 (Suppl.1). - P. 95-100. Ekelund N.G.A., Bjorn L.O. Ultraviolet radiation stress in dinoflagellates in relation to targets, sensitivity and radiation climate. // «Proceedings of Workshop», Scripps Institution of Oceanography, University of California, San Diego, La Jolla, 1990. Ekelund N.G.A., Dolle R., Nultsh W. Phototactic responses of Chlamydomonas reinhardtii in electric field // Physiol. Plant. 1988. - 73. - P. 265-270. Emerson P.L. Fast Fourier transform fundamentals and applications // Creative Computing. - 1980. - 6. - P. 58-63. Engelmann T.W. Über die Licht und Fasbenperzeption niederster Organismen // Pflugers Arch. Ges. Physiol. - 1882a. - 29. - P. 387-400. Engelmann T.W. Über Sauerstoffausscheidung von Pflanzellen im Mikrospectrum // Bot. Ztg. - 1882b. - 26. - P. 419-426. Enhuber G., Gimmler H. The glycerol permeability of the plasmalemma of the halotolerant green alga Dunaliella parva (Volvocales) // J. Phycol. - 1980. - 16, N 4. - P. 524-532. En-Zanfeily H.T., Nawar S.S. Degradation of anionic surfactants and the effect on bacterial indices of pollution // Zbl. Bacteriol. Parasitenk., Infektionskrankh. und Hyg. 2-Naturwiss. Abt. - 1980. - 135, N 8. - P. 486-488. Esquivel D.M.S., de Barros H.G.P.L. Motion of magnetotactic microorganisms // Exp. Biol. - 1986. - 121. - S. 153. Ettl H. Grundriß der allgemein Algologie. - Jena: Fischer, 1980. - 549 S. Ettl H. Die neue Klasse Chlamydophyceae, eine natürliche Grouppe der Grünalgen (Chlorophyta) // Plant Syst. Evol. - 1981. 137. - S. 107-126. Ettl H. Chlorophyta I. Phytomonadina / Sübwasserflora von Mitteleuropa. Bd.9. - Jena: Fischer, 1983. - 807 S. Ettl H., Green J.C. Chlamydomonas reginae sp. nov. (Chlorophyceae), a new marine flagellate with unusual chloroplast differentiation // J. Mar. Biol. Ass. U.K. - 1973. - 53. - P. 975-985. Ettl H., Manton I. Die feinere Struktur von Pedimonas minor Korschikoff // Nova Hedwigia. – 1964. - 8. - P. 421-451.

- 182 -

Ettl H., Moestrup Æ. Light and electron microscopical studies on Hafniomonas gen. nov. (Chlorophyceae, Volvocales), a genus resembling Pyramimonas (Prasinophyceae) // Pl. Syst. Evol. - 1980. - 135. - P. 177-210. Eyden B.P. Light and electron microscope study of Dunaliella primolecta Butcher (Volvocida) // J. Protozool. - 1975. - 22, N 3. - P. 336-344. Famintzin A.S. Die Wirkung des Lichtes auf Algen und einige andere ihnen nahe verwandte Organismen // Jb. Wiss. Bot. 1867a. - 6. - P. 1-48. Famintzin A.S. Die Wirkung des Lichtes auf die Bewegung der Chlamydomonas pulvisculus Ehr., Euglena viridis Ehr. und Oscillatoria insignis Tw. // Bull. Acad. Sci. (St.-Petersbourg.) - 1867b. - 10. - P. 534-548. Feinleib M. Photomovement in microorganism’s strategies of response. // Research in Photobiology / A. Castellani (ed.). - New York: Plenum Publ. Co., 1977. - P. 71-84. Feinleib M . Photomovement of microorganisms // J. Photochem. Photobiology. - 1978. - 27. - P. 849-854. Feinleib M. Photomotile responses in flagellates // Photoreception and sensory transduction in aneural organisms / F. Lenci, G. Colombetti, eds. - New York: Plenum Press, 1980. - P. 45-68. Feinleib M. Behavioural studies of free-swimming photoresponsive organisms // Sensory perception and transduction in aneural organisms / G. Colombetti, P.-S. Song, eds. - New York: Plenum Press Corp., 1985. - P. 119-146. Feinleib M., Carry G.M. Methods for measuring phototaxis of cell population and individual cells // Physiol. Plant. - 1967. - 20. - P. 1083-1095. Flores-Moya A., Hanelt D., Figueroa F.-L., Altamirano M., Vinegla B., Salles S. Involvement of solar UV-B radiation in recovery of inhibited photosynthesis in the brown alga Dictyota dichotoma (Hudson) Lamouroux // J. Photochem. Photobiology. - 1999. - 49. - P. 129-135. Foster K.W. Action spectroscopy of photomovement // Photomovement / D.-P. Häder, M. Lebert (eds.). - Elsevier Sci. B.V. 2001. - P. 55-115. Foster K.W., Saranak J., Zarilli G., Okabe. M., Kline T., Nakanishi K. A rodopsin is the functional photoreceptor for phototaxis in the unicellular eukaryote Chlamydomonas // Nature. - 1984. - 311. - P. 756-759. Foster K.W., Smyth R.D. Light antennas in phototactic algae // Microbiol. Rev. - 1980. - 44. - P. 572-630. Foster R.M., Lüning K. Photosynthetic response of Laminaria digitata to ultraviolet A and B radiation // Underwater Light and Algal Photobiology / F.L. Figueroa, C. Jimenez, J.L. Perez-Llorens, F.X. Niell, eds. - Malaga: Sci. Marina, 1996. – 60 (Suppl. 1). - P. 65-67. Fox G.E., Stackebrandt E., Hespell R.B. et al. The phylogeny of prokaryotes // Science. - 1980. - 309. - P. 457-463. Fraenkel G.S., Gunn D.L. The Orientation of Animals. Kineses, Taxes and Compass Reactions. – New York: Dover Publ. Inc., 1961. - 376 p. Francis D. On the eyespot of the dinoflagellate, Nematodium // J. Exp. Biol. – 1967. – 47. – P. 495-501. Freeman H. On the ecoding of arbitrary geometric configurations. V.EC-10 // IRE Trans. – 1961. - P. 260-268. Friedl Th. The evolution of the Green Algae // Origins of Algae and their Plastids / D. Bhattacharya (ed.). - Wien: Springer, 1997. - P. 87-114. Galland P., Keiner P., Dörnemann D., Senger H., Brodhum B., Häder D.-P. Pterin- and flavin-like fluorescence associated with isolated flagella of Euglena gracilis // Photochem. Photobiol. - 1990. - 51. - P. 675-680. Garcia-Pichel F., The absorption of ultraviolet radiation by microalgae: simple optics and photobiological implications // Underwater Light and Algal Photobiology / F.L. Figueroa, C. Jimenez, J.L. Perez-Llorens, F.X. Niell (eds.). - Malaga: Scientia Marina, 1996. - 60 (Suppl. 1). - P. 73-79. George D.G., Hunt L.T., Dayhoff M.O. Sequence evidence for the symbiotic origins of chloroplasts and mitochondria // Endocytobiology II. / H.F.A. Schenk, W. Schwemmler (eds). – Berlin, New York: De Gruyter, 1983. - P. 845-861. Gerber S., Häder D.-P. UV effects on photosynthesis, proteins and pigmentation in the flagellate Euglena gracilis: Biochemical and spectroscopic observations // Biochem. System. and Ecology. - 1992. - 20, N6. - P. 485-492. Ghazi A., Rudik V., Oswald W.J. Effect of pH on Dunaliella bardawil biomass and production // News Quarterly. - 1983. - 33, N 2. - P. 1-3. Ghetti F., Colombetti G., Lenci F., Campani E., Polacco E., Quaglia M. Fluorescence of Euglena gracilis photoreceptor pigment: an in vitro microspectrofluorometric study // J. Photochem. Photobiology. - 1985. - 42. - P. 29-33. Giese A.C. Photosensitization by natural pigments // Photophysioiology / A.C. Giese, ed. - New York: Acad. Press, 1971. – Vol. 6. - P. 77-129. Gimmler H., Weis U. Dunaliella acidophila – life at pH 1,0 // Dunaliella: Physiology, Biochemistry and Biotechnology / M. Avron, A. Ben-Amotz, eds. - Boca Raton etc.: CRC Press, 1992. - P. 99-133. Goldmann I.C., Azov Y., Riley C.B., Dennett M.R. The effect of pH in intensive microalgal cultures. I. Biomass refugation // J. Exp. Mar. Biol. and Ecol. – 1982. - 57, N 1. - P. 1-13. Goldmann I.C., Riley C.B., Dennett M.R. The effect of pH in intensive microalgal cultures. II. Species competition // J. Exp. Mar. Biol. and Ecol. - 1982. - 57, N 1. - P. 15-24.

- 183 -

Goodwin T.C. Algal Pigments. - New York: Acad. Press, 1988. – 362 p. Goodwin T.W. The Biochemistry of Carotenoids. Vol. 1., 2nd ed. Plants. - London: Chapman and Hall, 1980. – 377 p. Govorunova E.G., Altschuler I.A., Häder D.-P., Sineshchekov O.A. A novel express bioassay for detecting toxic substances in water by recording rhodopsin-mediated photoelectric responses in Chlamydomonas cell suspensions // J. Photochem. Photobiology. - 2000. - 72, N 3. - P. 320-326. Govorunova E.G., Sineshchekov O.A., Gärtner, Chunaev A.S., Hegemann P. Photoreceptor current and photoorientation in Chlamydomonas mediated by 9-demethylchlamyrhodopsin // Biophysical J. - 2001. - 81. - 2897-2907. Govorunova E.G., Sineshchekov O.A., Hegemann P. Desensitization and dark recovery of the photoreceptor current in Chlamydomonas reinhardtii // Plant Physiol. - 1997. - 115. - P. 633-642. Greuet C. Complex organelles // The Biology of Dinoflagellates / F.J.R. Taylor (ed.). – Oxford: Blackwell, 1987. - P. 119-142. Gualtieri P. Rhodopsin-like-proteins: light detection pigments in Leptolyngbya, Euglena, Ochromonas, Pelvetia // Photomovement / D.-P. Häder, M. Lebert (eds.). - Elsevier Sci. B.V., 2001. - P. 283-294. Gualtieri P., Barsanti L., Passarelli V. Absorption spectrum of a single isolated paraflagellar swelling of Euglena gracilis // Biochim. Biophys. Acta. - 1989. - 993. - P. 293-296. Gualtieri P., Barsanti L., Passarelli V., Verni F. Morphological investigations of the Euglena gracilis isolated paraflagellar body // Micron and Microscopica Acta. - 1988. - 19, N 4. - P. 241-246. Gualtieri P., Barsanti L., Rosati G. Isolation of the photoreceptor (paraflagellar body) of the phototactic flagellate Euglena gracilis // Arch. Microbiol. - 1986. - 145. - P. 303-305. Gualtieri P., Pelosi P., Passarelli V., Barsanti L. Identification of a rhodopsinic photoreceptor in Euglena gracilis // Biochim. Biophys. Acta. - 1992. - 1117. - P. 55-59. Häder D.-P. Control of locomotion // Physiology of movements / W. Haupt, M.Feinleib (eds.). – Berlin etc.: Springer-Verlag, 1979. - P. 268-309. Häder D.-P. Effect of UV-B on motility and photobehavior in the green flagellate, Euglena gracilis // Arch. Microbiol. - 1985. 141. - P. 159-163. Häder D.-P. Effects of solar and artificial UV irradiation on motility and phototaxis in the flagellate, Euglena gracilis // Photochem. Photobiol. - 1986a. - 44, N5. - 651-656. Häder D.-P. New evidence for the mechanisms of phototactic orientation of Euglena gracilis // Curr. Microbiol. - 1986b. - 14. - P. 157-163. Häder D.-P. Photomovement in eukaryotic microorganisms // Photobiochem. Photobiophys. Supp. – 1987 a. - P. 203-214. Häder D.-P. Polarotaxis, gravitaxis and vertical phototaxis in the green flagellate, Euglena gracilis // Arch. Microbiol. – 1987 b. – 147. – 179-183. Häder D.-P. Movement // Blue Light Responses: Phenomena and Occurence in Plants and Microorganisms / H. Senger (ed.). Boca Raton: CRS Press, 1987 c. - P. 101-133. Häder D.-P. Effects of enhanced solar ultraviolet radiation on aquatic ecosystems // Biophysics of Photoreceptors and Photomovement in Microrganisms / F.Lenci et al. (eds.). - New York: Plenum Press, 1991. - P. 157-172. Häder D.-P. Real-time tracking of microorganisms // Binary. - 1994. - 6. - P. 81-86. Häder D.-P. Mechanisms of photoreception: energy and signal transducers // Light and Energy Source and Information Carrier in Plant Physiology. - New York: Plenum Press, 1996a. - P. 185-194. Häder D.-P. Effects of enhanced solar UV-B radiation on phytoplankton // Underwater Light and Algal Photobiology / F.L. Figueroa, C. Jimenez, J.L. Perez-Llorens, F.X. Niell (eds.). - Malaga: Sci. Marina, 1996b. - 60 (Suppl. 1). - P. 59-63. Häder D.-P. Oben oder unten – Schwerkraftperzeption bei dem einzelligen flagellaten Euglena gracilis // Microkosmos. - 1997. - 86. - P. 351-356. Häder D.-P., Colombetti G., Lenci F., Quaglia M. Phototaxis in the flagellates, Euglena gracilis and Ochromonas danica // Arch. Microbiol. - 1981. - 130. - P. 78-82. Häder D.-P., Grienbow K. Versatile digital image analysis by microcomputer to count microorganisms // EDV in Med. und Biol. - 1987. – 18 (2-3). - P. 37-42. Häder D.-P., Häder M.A. Inhibition of motility and phototaxis in the green flagellate, Euglena gracilis, by UV-B radiation // Arch. Microbiol. - 1988. - 150. - P. 20-25. Häder D.-P., Häder M.A. Effects of solar radiation on photoorientation, motility and pigmentation in a freshwater Cryptomonas // Botanica Acta. – 1989a. - 102. - P. 236. Häder D.-P., Häder M.A. Effects of solar UV-B irradiation on photomovement and motility in photosynthetic and colorless flagellates // Environ. Exp. Bot. - 1989b. - 29. - P. 273-282. Häder D.-P., Häder M.A. Effects of solar radiation on photoorientation, motility and pigmentation in the marine Cryptomonas maculata // J. Photochem. Photobiol. - 1990. - 5. - P. 105. Häder D.-P., Häder M.A. Effects of solar and artificial U.V. radiation on motility and pigmentation in the marine Cryptomonas maculata // Env. Exp. Botany. - 1991. - 31, N1. - P. 33-41.

- 184 -

Häder D.-P., Häder M.A., Liu S.-M., Ullrich W. Effects of solar radiation on photoorientation, motility and pigmentation in a freshwater Peridinium // BioSystems. – 1990. - 23. - P. 335. Häder D.-P., Lebert M. The photoreceptor for phototaxis in the photosynthetic flagellate Euglena gracilis // Photochem. Photobiol. - 1998. - 68. - P. 260-265. Häder D.-P., Lebert M. Photoreception and phototaxis in flagellated algae // Res. Adv. in Photochem. Photobiol. - 2000. - 1. P. 201-226. Häder D.-P., Lipson E.D. Fourier analysis of angular distributions of motile microorganisms // Photochem. Photobiol. - 1986. 42. - P. 657-663. Häder D.-P., Porst M., Tahedl H., Richter P., Lebert M. Gravitactic orientation in the flagellate Euglena gracilis // Micrograv. Sci. Technol. - 1997. - 10. - P. 53-57. Häder D.-P., Reinecke E. Phototactic and polarotactic responses of the photosynthetic flagellate, Euglena gracilis // Acta Protozool. - 1991. - 30. - P. 13-18. Häder D.-P., Vogel K. Simultaneous tracking of flagellates in real time by image analysis // J. Math. Biol. - 1991. - 30. - P. 6372. Häder D.-P., Watanabe M., Furuya M. Inhibition of motility in the cyanobacterium, Phormidium uncinatum, by solar and monochromatic UV irradiation // Plant Cell Physiol. - 1986. - 27, N 5. - P. 887-894. Häder D.-P., Worrest R.C., Kumar H.D., Smith R.C. Effect of increased solar ultraviolet radiation on aquatic ecosystems // Ambio. - 1995. - 24, N3. - P. 174-180. Halldal P. Action spectrum of phototaxis and related problems in Volvocales, Ulva-gametes and Dinophyceae // Physiol. Plant. 1958. - 11. - P. 118-153. Halldal P. Ultraviolet action spectra of positive and negative phototaxis in Platymonas subcordiformis // Physiol. Plant. - 1961. 14. - P. 133-140. Hand W.E.G., Davenport D. The experimental analysis of phototaxis and photokinesis in flagellates // Photobiology of Microorganisms / P. Halldal (ed.). - London: Wiley, 1970. - P. 253-282. Happel J., Brenner H. Low Reynolds Number Hydrodynamics. Rev. 2nd ed. – Leyden: Noordhoff Int., Gröningen, 1973. – 569 p. Harz H., Nonnengässer C., Hegemann P. The photoreceptor current of the green alga Chlamydomonas // Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. – 1992. - 338. - P. 39-52. Haupt W. Die Phototaxis der Algen. Handbuch der Pflanzenphysiologie / W. Ruhland (ed.). - Berlin: Springer, 1959. - 17. - P. 318-370. Haupt W. Phototaxis in Plants // Int. Rev. Cytol. - 1966. - 19. - P. 267-299. Haupt W. Photoreception and photomovement // Phil. Trans. Soc. London. B. - 1983. - 303. - P. 467-478. Haupt W. Photomovement // Photomorphogenesis in Plants / R.E. Kendrick and G.H.M. Kronenberg (eds.). – Dordrecht: M. Nijhoff, Dr. W. Junk Publ., 1986. - P. 415-441. Haupt W. Photomovement: past and future // Photomovement / D.-P. Häder, M. Lebert (eds.). – Amsterdam: Elsevier Sci. B.V., 2001. – P. 1-14. Haupt W., Häder D.-P. Photomovement. In: Photomorphogenesis in Plants. 2nd Ed. / R.E. Kendrick, G.H.M. Kronenberg, G.Colombetti (eds.). – Netherlands: Kluwer Acad. Publ., 1994. – P. 707-732. Haupt W., Seitz K. Physiology of movement // Progress in Botany. – Berlin; Heidelberg: Springer-Verlag, 1984. - P. 172-182. Hegemann P. Vision in microalgae // Planta. - 1997. - 203. - P. 265-274. Hegemann P., Deininger W. Algal eyes and their rhodopsin photoreceptors // Comprehensive Series in Photoscience. – Elsevier Press, 1999. Hegemann P., Deininger W. Algal eyes and their rhodopsin photoreceptors // Photomovement / Häder D.-P., Lebert M. (eds.). Elsevier Sci., 2001. - P. 229-243. Hegemann P., Fischer M. Algal Eyes // The Encyclopedia of Life Science. – Macmillan, 1999. - P. 1-6. Hegemann P., Fischer M. Algal Eyes // Encyclopedia of Life Science. - Nature Publ. Group, 2001. - P. 1-6. Hegemann P., Fuhrmann M., Kateriya S. Algal sensory photoreceptors // J. Phycol. - 2001. - 37. - P. 668-676. Hegemann P., Harz H. How microalgae see the light // Microbial Response to Light and Time. - Cambridge: Univ. Press., 1998. - P. 95-105. Hegemann P., Neumeier K., Hegemann U., Kuelnle E. The role of calcium in Chlamydomonas movement responses as analysed by calcium channel inhibitors // Photochem. Photobiol. - 1990. - 52. - P. 575-578. Hertz W., Heck B., Koop H.U. The flagellar root system in the gamete of Acetabularia mediterranea // Protoplasma. - 1981. 109. - P. 257-269. Holland E.M., Harz H., Uhl R., Hegemann P. Control of phobic behavioral responses by rhodopsin-induced photocurrents in Chlamydomonas // Biophysical J. - 1997. - 73. - P. 1395-1401. Horigushi T., Kawai H., Kubota M., Takahashi T., Watanabe M. Phototactic responses of four marine dinoflagellates with different types of eyespot and chloroplast // Phycol. Res. - 1999. - 47. - P. 101-107.

- 185 -

Hoshaw R.W., Maluf L.Y. Ultrastructure of the green flagellate Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae, Volvocales) with comparative notes on three other species // Phycologia. - 1981. - 20, N 2. - P. 199-206. Huang B., Watterson D.M., Lee V.D., Schiller M.J. Purification and characterization of a basal body-associated Ca2+-binding protein // J. Cell Biol. - 1988. - 107, N1. - P. 121-131. Huber M.E., Lewin R.A. Ethanol-induced flagellar autotomy in Dunaliella tertiolecta Butcher (Chlorophyta: Volvocales) // Phycologia. - 1987. - 26, N 1. - P. 138-141. Hyams J.S., Borisy G.G. Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterisation of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro // J. Cell. Sci. - 1978. - 33. - P. 235-253. Jagger J. Effects of near-UV radiation on bacteria. // Photochemical and Photobiological Reviews / Smith K.C. (ed.). - New York: Plenum Press, 1983. - P. 1. Jahn T.L., Bovee B.C. Locomotive and motile response in Euglena // The Biology of Euglena / D.E. Buetow (ed.). - N.Y.: London: Acad. Press, 1968. – Vol. 1. - P. 45-107. James T.W., Crescitelli F., Loew E.R., McFarland W.N. The eyespot of Euglena gracilis: a microspectrophotometric study // Vision Research. - 1992. - 32. - P. 1583-1591. Jennings H.S. Behaviour of the lower organisms. – New York: Columbia Univ. Press., 1906. Jimenez C., Figueroa F.L., Aguilera J., Lebert M., Häder D.-P. Phototaxis and gravitaxis in Dunaliella bardawil: Influence of UV radiation // Acta Protozoologica. - 1996. - 35. - P. 287-295. Joyon L., Fott B. Quelques particularités infrastructurales du plaste des Carteria (Volvocales) // J. Microsc. (Paris). - 1964. - 3. - P. 159-166. Katz A., Jimez C., Pick U. Isolation and characterization of aprotein associated with carotene globuls in the alga Dunaliella bardawil // Plant. Physiol. - 1965. - 108, N4. - P. 1657-1664. Kawai H. A flavin-like autofluorescent substance in the posterior flagellum of golden and brown algae // J. Phycol. - 1988. – 24. – P. 171-184. Kawai H. Flagellar autofluorescence in forty-four chlorophyll c-containing algae // Phycologia. - 1989. - 28. - P. 222-227. Kawai H. Green flagellar autofluorescence in brown algal swarmers and their phototactic responses // Bot. Mag. Tokyo. - 1992. - 105. - P. 171-184. Kawai H., Kreimer G. Sensory mechanisms – phototaxis and light perception in algae // The Flagellates / B.S.C. Leadbeater and J.C. Green (eds.). - London: Taylor and Francis, 1992. - P. 124-146. Kawai H., Kubota M., Kondo T., Watanabe M. Action spectra for phototaxis in zoospores of the brown alga Pseudochorda gracilis // Protoplasma. – 1991. - 161. - P. 17-22. Kawai H., Nakamura S., Mimuro S., Furuya M., Watanabe M. Microspectrofluorometry of the autofluorescent flagellum in phototactic brown algal zoids // Protoplasma. - 1996. - 191. - P. 172-177. Kessler J.O., Hill N.A., Häder D.-P. Orientation of swimming flagellates by simultaneously acting external factors // J. Phycol. 1992. - 28. - P. 816-822. Kivic P.A., Vesk M. Structure and function in the euglenoid eyespot apparatus: the fine structure, and response to environmental changes // Plants. - 1972. - 105. - P. 1-14. Kivic P.A., Vesk M. Structure of the eyespot apparatus in bleached strains of Euglena gracilis // Cytologie. - 1974. - 10, N 10. - P. 88-101. Kivic P.A., Walne P.L. Algal photosensory apparatus probably represent multiple parallel evolutions // BioSystems. - 1983. 16. - P. 31-38. Ko J.-H., Lee S.-H. Nucleotide sequence of a cDNA (Accession No. U53812) encoding a contractin-like protein from Dunaliella salina // Plant Physiology. - 1996. - 112. - P. 445. Koblenz B., Schoppmeier J., Grunow A., Lechtreck K.-F. Centrin deficiency in Chlamydomonas causes defects in basal body replication, segregation and maturation // J. Cell Sci. - 2003. - 116. Kombrink E., Wöber G. Preparation of intact chloroplasts by chemically induced lysis of the green alga Dunaliella marina // Planta. - 1980. - 149. - P. 123-129. Kondo T., Kubota M., Aono M., Watanabe M. A computerized video system to automatically analyse movements of individual cells and its application to the study of circadian rhythms in phototaxis and motility in Chlamydomonas // Protoplasma. - 1988. - 1. - P. 185-192. Kreimer G. Cell biology of phototaxis in flagellates algae // Int. Rev. Cytol. - 1994. - 148. - P. 229-310. Kroger P., Hegemann P. Photophobic responses and phototaxis in Chlamydomonas are triggered by a single rhodopsin photoreceptor // FEBS Lett. - 1994. - 341. - P. 5-9. Kuchitsu K., Katsuhara M., Miyachi Sh. Rapid cytoplasmic alkalization and dynamics of intracellular compartmentation of inorganic phosphate during adaptation against salt stress in a halotolerant unicellular green alga Dunaliella tertiolecta: 31 P-nuclear magnetic resonance study // Plant and Cell Physiology. - 1989. - 30, N 3. - P. 407-414.

- 186 -

Kuznicki O.L., Mikolajczyk E. Motility and behaviour: Contributed paper session in memory of professor Theodore L. Jahn // Progress In Protozoology. Proc. VI Intern. Congr. Protozoology Spec. Congr. Vol. of Acta Protozoologica, Part I. 1982. - P. 149-157. Labbé A. Les cycles biologiques des Dunaliella // Arch. Anat. Microsc. - 1925. - 21. - P. 313. Lauger P. Mechanistic properties of ion channels and pumps // Information and Energy Transduction in Biological Membranes. Proc. of the Int. Cong. on Biol. Membranes, Switserland, 1984. - P. 133-138. Lebert M. Phototaxis of Euglena gracilis – flavins and pterins // Photomovement / D.P. Häder and M. Lebert (eds.). – Amsterdam: Elsevier Sci. B.V., 2001. - P. 299-341. Lebert M., Häder D.-P. How Euglena tells up from down // Nature. - 1996. - 379. - P. 590. Lebert M., Häder D.-P. Photoreception and phototaxis in flagellated algae // Res. Adv. Photochem. Photobiol. - 2000. - 1. - P. 201-226. Lebert M., Richter P., Häder D.-P. Signal perception and transduction of gravitaxis in the flgallate Euglena gracilis // J. Plant Physiol. - 1997. - 150. - P. 685-690. Leedale G.F. How many are kingdoms of organisms? // Taxon. - 1974. - 23. - P. 261-270. Lembi C.A., Lang W.J. Electron microscopy of Carteria and Chlamydomonas // Amer. J. Bot. - 1965. - 52. - P. 464-477. Lenci F. Photochemistry of flavins // Biophysics of Photoreceptors and Photobehaviour of Microorganisms / Proc. of the Intern. School of the CNR of Italy. Badia Fiesolana (Firenze), 1-5 September, 1975. - P. 164-183. Lenci F. Photomovement of microorganisms // Trends in Photobiology / C. Helene (ed.). - N.Y., London: Plenum Press, 1982. P. 421-435. Lenci F., Colombetti G. Photobehaviour of microorganisms: a biophysical approach // Ann. Rev. Bioeng. - 1978. - 7. - P. 341361. Lenci F., Häder D.-P., Colombetti G. Photosensory responses of freely motile microorganisms // Membrane and Sensory Transduction / F. Lenci, G. Colombetti (eds.). - N.Y., London: Plenum Press, 1984. - P. 199-229. Lenci F., Sgarbossa A., Angelini N. Molecular basis in photomotile microorganisms // Proc. of the Intern. School of Biophysics «Biophysics of Photoreception. Molecular and Phototransductive Events», Casamicciola, Napoli, Italy, 10-16 October, 1994. - 1997. - P. 25-37. Lerche V. Untersuchungen über Entwicklung und Fortpflanzung in der Gattung Dunaliella // Arch. Protistenk. - 1937. - 88. - S. 236-268. Linder J.C., Stachelin L.A. A novel model for fluid secretion by the trypanosomatid contractile vacuole apparatus // J. Cell Biol. - 1979. - 83. - P. 371-382. Litvin F.F., Sineshchekov O.A., Sineshchekov V.A. Photoreceptor electric potential in the phototaxis of the alga Haematococcus pluvialis // Nature (London). - 1978. - 271. - P. 476-478. Loeb S., Maxwell S.S. Further proof of the identity of heliotropism in animals and plants // Univ. Calif. Pub. Physiol. - 1910. 3. - P. 195. Loeblich L.A. Aplanospores of Dunaliella salina (Chlorophyta) // J. Protozool. - 1969. - 16 (Suppl.). Loeblich L.A. Photosynthesis and pigment influenced by light intensity and salinity in the halophilic Dunaliella salina (Chlorophyta) // J. Mar. Biol. Ass. U.K. - 1982. - 62. - P. 493. López-Archilla A.I., Amils R. A comparative ecological study of two acidic rivers in southwestern Spain // Microb. Ecol. 1999. - 38. - P. 146-156. López-Archilla A.I., Marin I., Amils R. Microbial community composition and ecology of an acidic aquatic environment: The Tinto River, Spain // Microb. Ecol. - 2001. - 41. - P. 20-35. Lukas W.I., Keifer D.W., Pesacreta T.C. Influence of culture medium pH on charosome development and chloride transport in Chara corallina // Protoplasma. - 1986. - 130, N 1. - P. 5-11. Luntz A. Untersuchungen über die Phototaxis. I. Die absoluten Schwellenwerte und relative Wirksamkeit von Specktralfarben bei grünen und farblosen Einzelligen // Zeit. Vergl. Physiol. - 1931a. - 14. - P. 68-92. Luntz A. Untersuchungen über die Phototaxis. II. Lichtintensität und Schwimmgeschwindigkeit bei Eudorina elegans // Zeit. Vergl. Physiol. - 1931b. - 15. - P. 652-678. Lustigman B., Lee L.H., Weiss-Magasic C. Effects of cobalt and pH on the growth of Chlamydomonas reinhardtii // Bull. Environ. Contam. Toxicol. – 1995. – 55. – P. 65-72. Mainx F., Wolf H. Reaktionsintensität und Stimmungsänderung in ihrer Bedeutung für eine Theorie der Phototaxis // Arch. Protistenk. - 1929. - 68. - P. 105-176. Malis-Arad Shoshana, Freidlander M., Ben-Aris B., Richmond A.E. Alcalinity-induced aggregation in Chlorella vulgaris . I. Changes in cell volume and cell-wall structure // Plant and Cell Physiology. - 1980. - 21, N 1. - P. 27-35. Manton I., Parke M. Observations on the fine structure of two species of Platymonas with special reference to flagellar scales and the mode of origin of the theca // J. Mar. Biol. Ass. U.K. - 1965. - 45. - P. 743-754.

- 187 -

Marangoni R., Lorenzini E., Colombetti G. Photosensory transduction in flagellated algae // Light and Energy Source and Information Carrier in Plant Physiology. - New York: Plenum Press, 1996. - P. 263-274. Marbach J., Mayer A.M. Effect of electric field on the phototactic response of Chlamydomonas reinhardtii // Isr. J. Bot. - 1971. - 20. - P. 96-100. Mardia K.V. Statistic of directional data. - New York, London: Acad. Press, 1972. - 357 p. Margaritis A., Kennedy K., Zajic J.E. et al. Biosurfactant production by Nocardia erythropolis // Develop. Ind. Microbiol. Vol. 20. – Proc. 35th Gen. Meet. Soc. Ind. Microbiol. (Houston, Tex., 1978), Arlington, 1979. – 5a. - P. 424-428. Martin R.L., Wood C., Baehr W., Applebury M. Visual pigment homologies refealed by DNA hybridization // Science. - 1986. - 232. - P. 1266-1269. Martynenko A.I., Posudin Yu.I., Massjuk N.P., Lilitskaya G.G. Effect of external factors on photomovement of microorganisms // Algologia. - 1996. - 6, N 2. - P. 150-155. Masashi T., Teruo S. Artificial control of cytoplasmic pH and its bearing on cytoplasmic streaming, electrogenesis and excitability of Characeae cells // Bot. Mag. Tokyo. - 1982. - 95, N 1038. - P. 147-154. Massjuk N.P., Posudin Yu.I. Rigorous fundamentals of classification of light-induced behaviour from freely motile microorganisms // Acta Botanica Malacitana. - 2002. - 27. - P. 147-158. Massjuk N.P., Posudin Yu.I., Radchenko M.I., Sheiko A.N. The parametrical principle of the classification of photomovement of organisms // J. Photochem. Photobiol. - 1991. - 10. - P. 269-271. Mast S.O. Light and Behavior of Organisms. - New York: John Wiley and Sons; London: Chapman and Hall, 1911. – 392 p. Mast S.O. The structure and function of the eye-spot in unicellular and colonial organisms // Arch. Protistenk. - 1927. - 60, N 2. - P. 197-220. Matsuda A., Yoshimura K., Sineshchekov O.A., Hirono M., Kamiya R. Isolation and characterization of novel Chlamydomonas mutants that display phototaxis but not photophobic response // Cell Motility and the Cytoskeleton. - 1998. - 41. - P. 353-362. Mattox K.R., Stewart K.D. Classification of the green algae: A concept based on comparative cytology // Systematics of the Green Algae / D.E.G. Irvine, D.M. John (eds.). - London etc.: Acad. Press, 1984. - P. 29-72. Maurette M.T., Oliveros E., Infelta P.P., Ramsteiner K., Braun A.M. Singlet oxygen and superoxide: experimental differentiation and analysis // Helv. Chim. Acta. – 1983. - 66. - P. 722-733. McLachlan J., Parke M. Platymonas impellucida sp. nov. from Puerto Rico // J. Mar. Biol. Ass. U.K. - 1967. - 47. P. 723-733. Melkonian M. Structure and significance of cruciate flagellar root systems in green algae: comparative investigations in species of Chlorosarcinopsis (Chlorosarcinales) // Plant Syst. Evol. - 1978. - 130. - P. 265-292. Melkonian M. Ulrtastructural aspects of basal body associated fibrous structures in green algae: a critical review // BioSystems. 1980. - 12. - P. 85-103. Melkonian M. Fate of eyespot lipid globules after zoospore settlement in the green alga Pleurastrum terrestre Fritsch et John // Br. Phycol. J. - 1981. - 16. - P. 247-255. Melkonian M. Evolution of green algae in relation to endosymbiosis // Endocytobiology II / H.N.A. Schenk, W. Schwemmler (eds.). - Berlin, New York: De Gruyter, 1983. - P. 1003-1007. Melkonian M. Flagellar apparatus ultrastructure in relation to green algae classification // Systematics of the Green Algae / D.E.G. Irvine, D.M. John (eds.). - London: Acad. Press, 1984. - P. 73-120. Melkonian M. Centrin-mediated motility: a novel cell motility mechanism in eucaryotic cells // Botanica Acta. - 1989. - 102. P. 3-4. Melkonian M. Phylum Chlorophyta. Class Chlorophyceae // Handbuch of Protoctista / Margulis L. et al. (eds.). - Boston: Jones and Bartlett Publ., 1990. - P. 608-616. Melkonian M., Preisig H.R. Ultrastructure of the flagellar apparatus in the green flagellate Spermatozopsis similis // Pl. Syst. Evol. - 1984. - 146. - P. 145-162. Melkonian M., Robenek H. The eyespot of the flagellate Tetraselmis cordiformis Stein (Chlorophyceae): structural specialization of the outer chloroplast membrane and its possible significance in phototaxis of green alga // Protoplasma. - 1979. 100. - P. 183-197. Melkonian M., Robenek H. Eyespot membranes of Chlamydomonas reinhardtii: A freeze-fracture study // J. Ultrastr. Res. 1980. – 72. - P. 90-102. Melkonian M., Robenek H. The eyespot apparatus of flagellated green algae: a critical review // Progress in Phycol. Res. - 1984. - 3. - P. 195-268. McFadden G.J., Schulze D., Surek B., Salisbury J.L., Melkonian M. Basal body reorientation mediated by a Ca2+-modulated contractile protein // J. Cell Biol. - 1987. - 105. - P. 903-912. Melkonian M., Schulze D., McFadden G.J., Robenek H. A polyclonal antibody (anticentrin) distinguishes between two types of fibrous flagellar roots in green algae // Protoplasma. - 1988. - 144. - P. 56-61.

- 188 -

Messerli M.A., Amaral-Zettler L.A., Zettler E., Jung S.K., Smith P.J.S., Sogin M.L. Life at acidic pH imposes an increased energetic cost for a eukaryotic acidophile // J. Exp. Biol. - 2005. - 208. – P. 2569-2579. Metzner P. Bewegungstudien an Peridineen // Z. Bot. - 1929. - 22. - P. 287-299. Meyer R., Hildebrand E. Phototaxis of Euglena gracilis at low external calcium concentration // J. Photochem. Photobiol., B: Biology. - 1988. - 2. - P. 443-453. Mikolajczyk E. Photophobic responses in Euglenina. I. Effects of excitation wavelength and external medium on the step-up response of light- and dark-grown Euglena gracilis // Acta Protozool. - 1984a. - 23. - P. 1-10. Mikolajczyk E. Photophobic responses in Euglenina. II. Sensitivity to light of the colorless flagellate Astasia longa in low and high viscosity medium // Acta Protozool. - 1984b. - 23. - P. 85-92. Mikolajczyk E. Na+/K+ transport and photosensitivity of the colorless flagellate Peranema trichophorum (Euglenida) // Photochem. Photobiol. - 1986. - 43. - P. 455-459. Mikolajczyk E., Diehn B. Morphological alterations in Euglena gracilis induced by treatment with CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) and Triton X-100: correlations with effects on photophobic behavioural responses // J. Photozool. - 1978. - 25. - P. 461-470. Mikolajczyk E., Diehn B. Mechanosensory responses and mechanoreception in Euglena gracilis // Acta Protozoologica. - 1979. - 18. - P. 591-602. Mitchell D.R. Chlamydomonas flagella // J. Phycol. – 2000. - 36. - P. 261-273. Mohn F.-H., Contreras O.C. Harvesting of the alga Dunaliella: some considerations concerning its cultivation and impact on the production costs of b-carotene // Antofagasta, Chile: Forschungszentrum Jüllich, 1990. - 55 p. Moestrup Ø., Thomsen H.A. An ultrastructural study on the flagellate Pyramimonas orientalis with particular emphasis on Golgy apparatus activity and the flagellar apparatus // Protoplasma. - 1974. - 81. - P. 247-269. Morel-Laurens N. Calcium control of phototactic orientation in Chlamydomonas reinhardtii: Sign and strength of response // Photochem. Photobiol. - 1987. - 45. - P. 119-128. Morens H.M.L., Feinleib M. Photomovement in an “eyeless" mutant of Chlamydomonas // Photochem. Photobiology. - 1983. 37. - P. 189-194. Mornin L., Francis D. The fine structure of Nematodium armatum, a naked Dinoflagellate // J. Microsc. – 1967. – 6. – P.759772. Mosteller F., Tukey J.W. Data Analysis and Regression. - Massachusets: Addison-Wisley Publ. Comp. Inc., Reading., 1978. Moulton T.P., Borowitzka L.J., Vincent D.J. The mass culture of Dunaliella salina for b-carotene: from pilot plant to production plant // Hydrobiologia. - 1987. - 151/152. - P. 99-105. Nagel W.A. Phototaxis, Photokinesis und Unterschiedsempfindlichkeit // Bot. Ztg . – 1901. - 59. - P. 287-299. Nakamura K., Bray D.F., Costerton J.W., Wagenaar E.B. The eyespot of Chlamydomonas eugametos: a freezeetch study // Can. J. Bot. - 1973. - 51. - P. 817-819. Neuscheler W. Bewegung und Orientierung bei Micrasterias denticulata Bréb. im Licht. I. Zur Bewegungs- und Orientierungsweise // Z. Pflanzenphysiol. - 1967. - 57. - S. 46-59. Nichols K.M., Rikmensoel R. Control of flagellar motion in Chlamydomonas and Euglena by mechanical microinjection on Mg2+ and Ca2+ and by electric current injection // J. Cell Sci. - 1978. - 29. - P. 233-247. Norris R.E., Pearson B.R. Fine structure of Pyramimonas parkeae, sp. nov. (Chlorophyta, Prasinophyceae) // Arch. Protistenk. 1975. - 117. - S. 192-203. Nultsch W. Phototactische Actionsspectren von Cyanophyceen // Ber. Dtsch. Bot. Ges. - 1962. - 75. - S. 43-453. Nultsch W. Photomotion of microorganisms and its interaction with photosynthesis // Photobiology of microorganisms / P.Halldal (ed.) - London, New York: Wiley, 1970. - P. 213-251. Nultsch W. Phototactic and photokinetic action spectra of the diatom Nitzschia communis // Photochem Photobiol. - 1971. - 14. - P. 705-712. Nultsch W. Relation between photomotion and photosynthesis // Primary Molecular Events in Photobiology / A. Checcucci and R.A. Weale (eds.). – NATO Advanced Study Institute, Badia Fiesolana, 4-16 September, 1972. – Amsterdam: Elsevier Sci. Publ. Comp., 1973. - P. 245-273. Nultsch W. Phototaxis and photokinesis // Primitive Sensory and Communication Systems: The Taxes and Tropisms of Microorganisms and Cells / M.J. Carlile (ed.). - N.Y., San. Francisco: Acad. Press, 1975. - P. 29-90. Nultsch W. Effect of external factors on phototaxis of Chlamydomonas reinhardtii. III. Cations // Arch. Microbiol. - 1979. 123. - P. 93-99. Nultsch W. Photomotile responses in gliding organisms and bacteria // Photoreception and Sensory Transduction in Aneural Organisms / F. Lenci, G. Colombetti (eds.). - New York: Plenum Press, 1980. - P. 69-88. Nultsch W. The photocontrol of movement of Chlamydomonas // The Biology of Photoreception / D.J. Cosens, D. Vince-Price (eds.). – Soc. Experiment. Biology, Symp. XXXVI, 1983. - P. 521-539.

- 189 -

Nultsch W. Photosensing in cyanobacteria // Sensory Perception and Transduction in Aneural Organisms / G. Colombetti, F. Lenci, Pill-Soon Song, (eds.). - New York, London: Plenum Press, 1985. - P. 147-164. Nultsch W. Survey of photomotile responses in microorganisms // Biophysics of Photoreceptors and Photomovement in Microrganisms / F. Lenci et al. (eds.). - New York: Plenum Press, 1991. - P. 1-5. Nultsch W., Häder D.-P. Photomovement of motile microorganisms // Photochem. Photobiol. - 1979. - 29. - P. 423-437. Nultsch W., Häder D.-P. Photomovement in motile microorganisms II // Photochem. Photobiol. - 1988. - 47. - P. 837-869. Nultsch W., Pfau J., Dolle R. Effects of calcium channel blockers on phototaxis and motility of Chlamydomonas reinhardtii // Arch. Microbiol. - 1986. - 144. - P. 393-397. Nultsch W., Schuchart H., Koenig F. Effects of sodium azide on phototaxis of the blue-green alga Anabaena variabilis and consequences to the two-photoreceptor systems-hypothesis // Arch. Microbiol. - 1983. - 134. - P. 33-37. Nultsch W., Throm G. Effect of external factors on phototaxis of Chlamydomonas reinhardtii // Arch. Microbiol. - 1975. - 103. - P. 175-179. Nultsch W., Throm G., Rimscha I. Phototactische Untersuchungen an Chlamydomonas reinhardtii Dangeard in homokontinuierlicher Kultur // Arch. Microbiol. - 1971. - 80. - P. 351-369. Ohta H., Shirakowa H., Uchida K., Yoshida M., Matuo Y., Enami I. Cloning and sequencing of the gene encoding the plasma membrane H+-ATPase from an acidophilic red alga, Cyanidium caldarium // Biochim. Biophys. Acta. – 1997. – 1319. – P. 9-13. Omodeo P. Morphology of the phototactic apparatus in eucaryotic flagellated cells // Biophysics of Photoreceptors and Photobehaviour of Microorganisms. Proc. of the Intern. School of the CNR of Italy. Badia Fiesolana (Firenze), 1-5 September, 1975. - P. 24-50. Orme S., Kegley S. PAN pesticide database // Pesticide Action Network / P.-S. Song (ed.). - San Francisco: CA Plenum Publ. Corp., 2004. - P. 119-146. Pace F., Ferrara R.., Del Corratore G. Effects of sub-lethal doses of copper sulphate and lead nitrate on growth and pigment composition of Dunaliella salina Teod. // Bull. Environm. Contam. Toxicology. - 1977. -17. - P. 679-685. Parke M., Manton I. Preliminary observations on the fine structure of Prasinocladus marinus // J. Mar. Biol. Ass. U.K. - 1965. 45. - P. 525-536. Parke M., Manton I. The specific identity of the algal symbiont in Convoluta roscoffensis // J. Mar. Biol. Ass. U.K. - 1967. - 47. - P. 445-464. Pfau J., Nultsch W., Ruffer U.A. A fully automated and computerized system for simultaneous measurement of motility and phototaxis in Chlamydomonas // Arch. Microbiol. - 1983. - 135. - P. 259-264. Pfeffer W. Pflanzenphysiologie. Vol. II. 2nd ed. - Leipzig: Engelmann, 1904. Photomovement / D.-P. Häder, M. Lebert (eds.) – Amsterdam: Elsevier Sci. B.V., 2001. – 925 p. Physiology of Movements / W. Haupt, M.E. Feinleib (eds.). – Berlin etc.: Springer, 1979. - P. 268-309. Piccini E., Omodeo P. Photoreceptors and phototactic programs in protista // Boll. Zool. - 1975. - 42. - P. 57-79. Pick U. ATPases and ion transport in Dunaliella // Dunaliella: Physiology, Biochemistry and Biotechnology / M. Avron, A. BenAmotz (eds.). - Boca Raton etc.: CRC Press, 1992. - P. 63-93. Pick U. Dunaliella acidophila – a most extreme acidophilic alga // Enigmatic Microorganisms in Extreme Environments / J. Seckbach (ed.). – Dordrecht / The Netherlands: Kluwer Acad. Press, 1999. – P. 465-476. Pick U., Bannet G., Fisher M., Katz A., Weiss M., Zchut S. Molecular mechanisms of adaptation to extreme conditions in the alga Dunaliella //http://www.weizmann.ac.il/Biological Chemistry/Pick/uripick.html Pick U., Katz A., Levin E., Paz K., Ventrela R., Weiss M. Molecular basis of salinity tolerance in the halotolerant alga Dunaliella //http://www.weizmann.ac.il/Biological Chemistry/scientist/Pick/uri_pick.html Poff K.L. Temperature sensing in microorganisms // Sensory Perception and Transduction in Aneural Organisms / G. Colombetti, F. Lenci, P.-S. Song (eds.). - New York: Plenum Press, 1985. - P. 299. Poff K.L., Hong C.B. Photomovement and photosensory transduction in microorganisms // Photochem. Photobiol. - 1982. - 36. - P. 749-752. Posudin Yu.I., Massjuk N.P. Diffraction mechanism of photoreception in green unicellular flagellated algae // Hydrobiol. J. 1997. - 33, N 6. - P. 124-131. Posudin Yu.I., Massjuk N.P., Lilitskaya G.G. Photomovement parameters as test-functions during biomonitoring // Polish J. Env. Sci. - 1996. - 5, N3. - P. 51-57. Posudin Yu.I., Massjuk N.P., Lilitskaya G.G., Radchenko M.I. Photomovement of two species of Dunalialla Teod. (Chlorophyta) // Algologia. - 1992. - 2, N 2. - P. 37-47. Proschöld Th., Marin B., Schlösser U.G., Melkonian M. Molecular phylogeny and taxonomic revision of Chlamydomonas Ehrenberg and Chloromonas Gobi, and description of Oogamochlamys gen. nov. and Lobochlamys gen. nov. // Protist. - 2001. - 152. - P. 265-300.

- 190 -

Racey T.J., Hallett F.R., Nickel B. A quasi-elastic light scattering and cinematographic investigation of motile Chlamydomonas reinhardtii // Biophys. J. - 1981. - 35. - P. 557-571. Remis D., Simonis W., Gimmler H., Measurments of the transmembrane electrical potential of Dunaliella acidophila by microelectrodes // Arch. Microbiol. – 1992. – 158. – P. 350-355 . Rhiel E., Häder D.-P., Wehrmeyer W. Diaphototaxis and gravitaxis in a freshwater Cryptomonas // Plant Cell Physiol. - 1988. 29. - P. 755-760. Richter P., Lebert M., Tahedl H., Häder D.-P. Calcium is involved in the gravitactic orientation in colorless flagellates // J. Plant. Phys. – 2001. - 158. - P. 689-697. Ringo D.L. The arrangement of subunits in flagellar fibers // J. Ultrastruct. Res. – 1967. – 17. – P. 266-277. Ristori T., Ascoli C., Banchetti R., Parrini P., Petracci D. Localization of photoreceptor and active membrane in the green alga Haematococcus pluvialis // Proc. of the Sixth Int. Congress on Protozoology. - Warsaw, 1981. - P. 314. Rosenbaum J.L., Child F.M. Flagellar regeneration in protozoan flagellates // J. Cell Biol. – 1967. - 147. - P. 179-183. Rothert W. Beobachtungen und Betrachtungen über taktische Reizerscheinungen // Flora (Jena). - 1901. - 88. - P. 371-421. Rüffer U., Nultsch W. High-speed cinematographic analysis of the movement of Chlamydomonas // Cell Motility. – 1985. – 5. – 251-263. Rüffer U., Nultsch W. Flagellar responses of Chlamydomonas cells held on micropipettes: change in flagellar beat frequency // Cell Mot. Cytoskel. - 1990. - 15. - P. 162-167. Ruinen J. Notizen über Salzflagellaten. II. Über die Verbreitung der Salzflagellaten // Arch. Protistenk. - 1938. - 90. - S. 210258. Salisbury J.L. The lost neuromotor apparatus of Chlamydomonas: rediscovered // J. Protozool. - 1988. - 35, N 4. - P. 574-577. Samson G., Morisette J.-C., Popovich R. Copper quenching of the variable fluorescence in Dunaliella tertiolecta. New evidence for a copper inhibition effect on PSII photochemistry // Photochem. Photobiol. - 1988. - 48. -P. 329-332. Sanders M.A., Boron A.T., Salisbury J.L. Flagellar excitation in Chlamydomonas reinhardtii II: Centrin-mediated microtubule severing // Abstr. 31st Annu. Meet. Amer. Soc. Cell Biol., Boston, Mass., 8-12 Dec., 1991. Sanders D., Hansen U.P., Slayman C.L. Role of the plasma membrane proton pump in pH regulation in non-animal cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. – 1981. – 78. – P. 5903-5907. Schmidt J.A., Eckert R. Calcium couples flagellar reversal to photostimulation in Chlamydomonas reinhardtii // Nature. - 1976. - 262. - P. 1824-1827. Schnabel R., Huet J., Thomm M. et al. Phylogeny of the archaebacteria and eukaryotes: homology of the DNA-dependent RNA polymerases // Endocytobiology. – H.E.A. Schenk and W. Schwemmler (eds.). - Berlin, New York: Du Gruyter, 1983. - P. 895-912. Sekler I., Glaser H.-U., Pick U. Characterization of a plasma membrane H+-ATPase from the extremely acidophilic alga Dunaliella acidophila // J. Membr. Biol. – 1991. – 121. – P. 51-57. Sekler I., Weiss M., Pick U. Activation of the Dunaliella acidophila plasma membrane H+-ATPase by tripsin cleavage of a fragment that contains a phosphorylation sity // Plant Physiol. – 1994. – 105.– P. 1125-1132. Sensory Perception and Transduction in Aneural Organisms / Colombetti G., Lenci F., Song P.-S. (eds.). – New York: Plenum Press, 1985. – 330 p. Serritti A., Ferrara R., Barghigiani C. et al. A preliminary study on the distribution of ionic cadmium in batch cultures of Dunaliella salina by differential pulse anodic stripping voltammetry // Thalassia Jugoslavica. - 1981. - 17. - P. 55-59. Shoevaert D., Krishnaswamy S., Couturier M., Marano F. Ciliary beat and cell motility of Dunaliella: computer analysis of high speed micro-cinematography // Biol.Cell. - 1988. - 62. - P. 229. Sineshchekov O.A. Electrophysiology in flagellated algae // Biophysics of Photoreceptors and Photomovement in Microorganisms / F. Lenci, F. Ghetti, G. Colombetti, D.-P. Häder, Song P.-S. (eds.). - New York: Plenum Press, 1991a. - P. 191-202. Sineshchekov O.A. Photoreception in unicellular flagellates: bioelectric phenomena in phototaxis // Light in Biology and Medicine. Vol. II. Proc. Of the III Congress of the Eiropean Society for Photobiology. Budapest / H.R.H. Duglas (ed.). - New York: Plenum Press, 1991b. - P. 523-532. Sineshchekov O.A., Geib D., Sineshchekov V.A., Galland P., Senger H. Fluorometric characterization of pigments associated with isolated flagella of Euglena gracilis: evidence for energy migration // J. Photochem. Photobiol. - 1994. - 23. - P. 225-237. Sineshchekov O.A., Govorunova E.G. Rhodopsin-mediated photosensing in green flagellated algae // Trends in Plant Science. 1999. - 4. - P. 58-63. Sineshchekov O.A., Govorunova E.G. Electrical events in photomovement of green flagellated algae // Photomovement / D.-P. Häder, M. Lebert (eds.). – Amsterdam: Elsevier Science B.V. - 2001a. - P. 245-280. Sineshchekov O.A., Govorunova E.G. Rhodopsin receptors of phototaxis in green flagellate algae // Biochemistry. - 2001b. 66, N 11. - P. 1300-1310.

- 191 -

Sineshchekov O.A., Lebert M., Häder D.-P. Effects of light on gravitaxis and velocity in Chlamydomonas reinhardtii // J. Plant. Physiol. - 2000. - 157. - P. 247-254. Sineshchekov O.A., Litvin F.F. Fluorescence of hodopsin and its connection with the primary processes of light energy transformation // Biofisika. - 1987. - 32. - P. 540-555. Song P.S. Protozoans and related photoreceptors: Molecular aspects // Ann. Rev. Biophys. Bioeng. - 1983. - 12. - P. 35-68. Song P.S. Primary molecular events in aneural cell photoreceptors // Sensory Perception and Transduction in Aneural Organisms / G. Colombetti, Pill-Soon Song (eds.). - New York: Plenum Publ. Corp., 1985. –Vol. 89. - P. 47. Sperling P.G., Walne P.L., Schwarz O.J., Triplet L.L. Studies on characterization of pigments from isolated eyespots of euglenoid flagellates // J. Phycol. Suppl. - 1973. - 9. - P. 20. Spikes J.D. Photosensitization // The Science of Photobiology / Smith K.C. (ed.). - New York: Plenum Press, 1977. – P. 87-112. Stallwitz E., Häder D.-P. Motility and phototactic orientation of the flagellate Euglena gracilis impaired by heavy metal ions // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. - 1993. - 18. - P. 67-74. Stavis R.L. The effect of azide on phototaxis in Chlamydomonas reinhardtii // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1974. - 71, N 5. P. 1824-1827. Stavis R.L., Hirschberg R. Phototaxis in Chlamydomonas reinhardtii // J. Cell Biol. - 1973. - 59, N 2. - P. 367-377. Strasburger E. Wirkung des Lichtes und der Wärme auf Schwärmsporen // Jena Z. Naturw. - 1878. - 12. - P. 551. Tahedl H., Häder D.-P. Automated biomonitoring using real time movement analysis of Euglena gracilis // Ecotoxicol. and Environ. Safety. - 2001. - 48. - P. 161-169. Teodorescu E.C. Organization et développement du Dunaliella, nouveau genere de Volvocacée. – Polyblepharidée // Beih. Bot. Centralbl. - 1905. - 18. - P. 215-232. Teodorescu E.C. Observation morphologiques et biologiques sur le genre Dunaliella//Rev. Gén. Bot.,1906, 18: 353-371. Tollin G. Energy transduction in algal phototaxis // Current Topics in Bioenergetics. 1969. - 3. - P. 417-446. Tollin G. Phototaxis in Euglena gracilis. II. Biochemical aspects // Behavior of Microorganisms / A. Perez-Miravete (ed.). New York: Plenum Press, 1973. - P. 91-105. Topics of current research. Extremely acidic mining lakes (pH