Молекулярная неврология

УДК 616-055.5/7:577.2 Б Б К Р252.215

Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е. А., Красильников В. В. Молекулярная неврология.Часть 1. Заболевания нервно-мышечной системы. СПб, "Интермедика", 2000 - 320 стр. ISBN 5-89720-026-2

Предлагаемая читателю обзорная монография является одной из первых попыток систематизации накопленной к настоящему времени информации в области молекулярной неврологии. Первая часть моно­ графии посвящена анализу молекулярно-генетических основ нервно-мы­ шечных заболеваний. Основное внимание в книге уделено тем наследст­ венным болезням нервной системы, для которых расшифрована природа первичного молекулярного дефекта. После клинического описания каж­ дого заболевания, подробно представлена история картирования и иден­ тификации мутантного гена, дана его молекулярная характеристика; опи­ саны типы и распростанённость мутаций, идентифицированных у паци­ ентов, с указанием используемых в клинической практике методов мо­ лекулярной диагностики данного патологического состояния; дан обзор существующих модельных генетических линий животных. Особое внима­ ние уделено описанию первичного биохимического дефекта, лежащего в основе патогенеза заболевания. Рассмотрены подходы к разработке патогенетических методов терапии, включая генную терапию. Книга ад­ ресована врачам, преподавателям и студентам, специализирующимся в области неврологии, а также педиатрам и медицинским генетикам. Мо­ нография может быть использована в качестве справочного руководст­ ва при составлении специализированных учебных циклов по молекуляр­ ной неврологии для студентов медицинских вузов и слушателей системы последипломного образования.

© В.Н. Горбунова О Оформление "Интермедика" ISBN 5-89720-026-2

Посвящается памяти основателя отечественной нейро/енетнки академика Сергея Николаевича Да виден ко ва

При подготовке рисунков 1, 2, 4, 5, 16, 17, 18 и 19 использо­ вали Color atlas of genetics (Passarge E., 1995). Рисунок 7 подго­ товлен по иллюстрациям двух статей (Nigro et al., 1996; Vainzof et al.f 1996). Рисунок 9 взят из работы (Chamberlain J.S., 1999). Рисун­ ки 10 и 11 любезно предоставлены профессором В. С. Барановым. При подготовке рисунков 12 и 13 использовали работы (Bonnemann et al., 1996) и (McNally et al., 1996), соответственно. Рисунок 15 взят из работы (Nowak et al., 1999). Рисунок 20 подготовлен по работе (Harris et al., 1996). Рисунок 21 подготовлен по работе (Bulman D. Е., 1997). Рисунки 22 и 23 взяты из работы (Tanaka et al., 1996).

ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ

11

Глава 1 БОЛЕЗНИ МЫШЦ. МЫШЕЧНЫЕ ДИСТРОФИИ И МИОПАТИИ

19

1.1. Общая характеристика

19

1.2. Миодистрофия Дюшенна/Беккера и дюшенно-подобные аутосомно-рецессивные миопатии

зо

а) Псевдогипертрофическая мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера (MIM: 310200) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7 8. 9. 10.

31

Клиническая характеристика заболевания 31 Картирование и идентификация гена DMD 34 Мутации в гене DMD и их диагностика 36 Структура и функции дистрофина 44 Регуляция транскрипции и сплайсинга гена DMD, апо-дистрофины 49 Дистрофин-ассоциированный комплекс белков 53 Анализ корреляций генотип-фенотип. Дюшенно-подобные аутосомно-рецессивные миопатии 59 Семейство DMD-родственных генов 67 Линии мышей, моделируюшие миодистрофию Дюшенна/Беккера 72 Генотерапия миодистрофии Дюшенна/Беккера 80

б) Мышечная дистрофия врожденная прогрессирующая с умственной отсталостью, тип Фукуяма (MIM: 253800) 85 1.3. Конечностно-поясные мышечные дистрофии

87

а) Миодистрофия конечностно-поясная аутосомнодоминантная, типы: 1A (MIM:159100); 1В; 1С; аутосомно-рецессивная, типы: 2A(MIM:253600); 2В (MIM:253601); 2С (MIM:253700); 2D (ОМ1М:600119); 2Е (OMIM:600900); 2F (OMIM: 601400) 88

1. 2. 3. 4. 5.

Общая генетическая характеристика 89 Конечностно-поясная миодистрофия, аутосомнодоминантная, форма LGMD1C 90 Конечностно-поясная миодистрофия, аутосомнорецессивная, форма LGMD2A 91 Конечностно-поясная миодистрофия, аутосомнорецессивная, форма LGMD2B 93 Конечностно-поясная миодистрофия, аутосомнорецессивная, формы LGMD2C-2F (саркогликанопатии) ....95

6) Мышечная дистрофия плечевого и тазового пояса с буллезным эпидермолизом (MIM: 226670) 100 1.4. Лице-лопаточно-плечевая мышечная дистрофия Ландузи-Дежерина (MIM: 158900) 102 1.5. Миодистрофии, обусловленные дефектами белков ядерной ламины (эмеринопатии) 107 а) Мышечная дистрофия с контрактурами, тип Эмери-Дрейфуса, Х-сцепленная (MIM: 310300).... 108 1. 2. 3. 4. 5.

Клиническая характеристика заболевания Картирование и идентификация гена EMD Структура гена STA и типы мутаций Структура и функции эмерина Лопаточно-перонеальные синдромы (SP- синдромы)

108 108 110 112 114

б) Скапуло-илио-перонеальная атрофия с кардиопатией (MIM: 181350) 115 1.6. Врожденные непрогрессирующие миопатии

117

а) Мышечная дистрофия врожденная мерозин-дефицитная (MIM: 156225) 118 б) Миопатия врожденная, обусловленная недостаточностью а 7 интегрина Ы D 121 в) Нитчатая (немалиновая) миопатия, тип 1 (MIM: 161800); тип 2 (MIM: 256030) 122 1. 2. 3. 4.

Клиническая характеристика заболевания 122 Роль а-актинина и а-тропомиозина в патогенезе немалиновой миопатии 123 Молекулярные основы аутосомно-рецессивной медленно прогрессирующей немалиновой миопатии 125 Актиновая миопатия 126

г) Болезнь центрального стержня (MIM: 117000)

130

д) Миотубулярная миопатия (MIM: 310400) е) Миопатия Бетлема (MIM: 158810)

132 137

1.7. Миопатии с цитоплазматическими и ядерными включениями в мышечных клетках а) Миопатия окулофарингеальная (MIM: 164300) б) Миопатия дистальная с накоплением десминовых включений (MIM: 125660). Десмин-родственная миопатия (OMIM: 601419) в) Миопатия с инклюзионными тельцами, аутосомно-доминантная (MIM: 147420); аутосомно-рецессивная (OMIM: 601073) 1.8. Митохондриальные миопатии

140 141

144

146 147

а) Миопатии митохондриальные с делециями и дупликациями митохондриальной ДНК (MIM: 550000, 160550); синдром Кернса-Сейра (MIM: 530000) 154 1.9. Метаболические миопатии

157

а) Гликогеноз 5 типа, гликогеноз мышечный, Мак-Ардла болезнь (MIM: 232600) 158 б) Миопатия с дефицитом карнитин пальмитоилтрансферазы I (MIM: 255110) 160 в) Миопатия напряжения (MIM: 102770) 161 г) Миопатия, обусловленная недостаточностью фосфоглицератмутазы (MIM: 261670) 162

ГЛАВА 2 БОЛЕЗНИ МЫШЦ. МИОТОНИЧЕСКИЕ СИНДРОМЫ И ПЕРИОДИЧЕСКИЕ ПАРАЛИЧИ

165

2.1. Общая характеристика

165

2.2. Миотонические синдромы

169

а) Миотоническая дистрофия (MIM: 160900)

169

1 2. 3. 4. 5. 6.

Клиническая характеристика заболевания Картирование и идентификация гена DM Молекулярная природа мутаций в гене DM Механизмы экспансии CTG-повтора в гене DM Биохимическая характеристика продукта гена DM Молекулярные основы патогенеза миотонической дистрофии 7 Характеристика других генов, участвующих в патогенезе миотонической дистрофии 8. Модельные линии животных

169 170 170 173 174 176 178 179

Ь) Врожденная миотония Томсена (MIM: 160800), болезнь Беккера (MIM: 255700) 181 2.3. Периодические параличи

185

а) Периодический паралич II, гиперкалиемического типа (MIM:170500; 168300; 168350; 170600) 185 б) Периодический паралич I, гипокалиемического типа (MIM: 170400) 188 в) Периодический паралич III, нормокалиемического типа (MIM: 170600) 190

ГЛАВА 3 БОЛЕЗНИ С ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫМ ПОРАЖЕНИЕМ ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО ДВИГАТЕЛЬНОГО НЕВРОНА

191

3.1. Общая характеристика

191

3.2. Спинальные мышечные атрофии

198

а) Проксимальные детские спинальные мышечные атрофии. Тип 1, болезнь Верднига-Гоффмана (MIM: 253300). Тип 2, промежуточный (MIM: 253550). Тип 3, мягкая спинальная амиотрофия Кугельберга-Веландер (MIM: 253400) 199 1. Клиническая характеристика заболевания 2. Картирование гена SMA и генетическая характеристика SMA-области 3. Идентификация и молекулярная характеристика гена SMN

199 206 208

4. Идентификация мутаций у пациентов со спинальной мышечной атрофией 210 5. Характер экспрессии гена SMN 211 6. Функции белка выживания двигательных нейронов 213 7 Молекулярная диагностика спинальной мышечной атрофии 215 8. Вклад в патогенез спинальных мышечных атрофии других генов, расположенных в SMA-области 216

б) Спинально-бульбарная мышечная атрофия, болезнь Кеннеди (MIM: 313200) 219 3.3. Наследственные полинейропатии 225 а) Болезнь Шарко-Мари-Тус тип IB (MIM: 118200; 159440; 145900) 229 б) Болезнь Шарко-Мари-Тус тип IA (MIM: 118220; 145900); нейропатия наследственная со склонностью к развитию парезов вследствие сдавления ствола нерва (MIM: 162500) 231 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Картирование гена СМТ1А 231 Молекулярно-генетическая характеристика СМТ1А-области 231 Нейропатия наследственная со склонностью к развитию парезов вследствие сдавления ствола нерва 233 Идентификация гена РМР22 234 Мутации в гене РМР22 236 Генетические модели болезни Шарко-Мари-Тус IА типа 237

в) Х-сцепленная моторная и сенсорная нейропатия (MIM: 302800 -304040;302801; 302802; 310490) г) Болезнь Шарко-Мари-Тус, нейронального типа II (MIM: 118210, 600882,158580, 601472) д) Нейропатия Шарко-Мари-Тус, тип IV (MIM: 214400; 601382; 601596) е) Наследственная сенсорная нейропатия, тип1(М1М: 162400) 3.4. Боковой амиатрофический склероз (MIM: 105400) 1. 2.

Клиническая характеристика заболевания Метаболизм глутамата при боковом амиотрофическом склерозе

238 241 242 244 245 245 247

3. 4. 5. 6. 7.

Картирование и идентификация гена ALS1 Мутации в гене SOD1 Модельные линии животных Патогенетические механизмы действия мутаций в гене SOD1 Другие генетические формы бокового амиотрофического склероза

248 250 251 252 255

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

256

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

257

СЛОВАРЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ТЕРМИНОВ

зоз

ВВЕДЕНИЕ В последние десятилетия достигнуты впечатляющие успехи в области молекулярной генетики человека, позво­ лившие от формального описания генов и менделевских за­ конов наследования перейти к их детальной идентификации. Определена организация основных элементов генома чело­ века, построены подробные цитогенетические карты, являю­ щиеся основой для выявления, изоляции и анализа индиви­ дуальных генов человека. Проведено секвенирование пол­ ной нуклеотидной последовательности молекулы ДНК чело­ века, длина которой достигает 3.5 миллиарда пар основа­ ний. Это означает, что в ближайшие годы будут открыты все гены человека, число которых по разным оценкам составля­ ет от 80 до 100 тысяч. В настоящее время известна цитогенетическая локализация около 30 ООО генов человека и рас­ шифрована молекулярная природа более 10 000 этих генов. Около 1000 из них связаны с моногенными наследственны­ ми заболеваниями. Открытие гена означает не только нахождение в гено­ ме человека определенного участка ДНК, собственно и яв­ ляющегося геном, но обязательную изоляцию и определение нуклеотидной последовательности полноразмерной кодиру­ ющей области гена, так называемой молекулы комплемен­ тарной ДНК (кДНК). Клонирование кДНК, то есть ее введе­ ние в бактериальную или дрожжевую систему, позволяет по­ лучать неограниченное количество копий этой молекулы и осуществлять различные манипуляции in vitro, направленные на расшифровку структурной и функциональной организации гена. Именно клонированная кДНК получила название «гена в пробирке». Определение экзон-интронной структуры гена, ответственного за развитие определенного наследственного заболевания, и секвенирование нуклеотидной последователь­ ности его кодирующих и регуляторных областей создают ос­ новы для молекулярной идентификации мутаций у пациен­ тов и разработки программ, направленных на профилактику

11

данного состояния на базе досимптоматической и пренатальной диагностики. Кроме того, знание нуклеотидной последо­ вательности гена позволяет прогнозировать аминокислотную последовательность кодируемой полипептидной цепи и ре­ конструировать третичную структуру, доменную организацию и функциональные свойства белка, являющегося первичным биохимическим дефектом при соответствующем наследствен­ ном заболевании. Небольшие фрагменты этого белка могут быть получены путем искусственного синтеза полипептидных молекул или путем клонирования кодирующих участков гена в экспрессионных системах. В дальнейшем эти фрагменты могут быть использованы для конструирования антител, с помощью которых проводится не только исследование тканеспецифического распределения белкового продукта гена в норме и при патологии, но также изоляция этого белка в препаративных количествах для прямого биохимического анализа. Таким образом, открытие гена создает реальные предпосылки для изучения молекулярных основ этиологии и патогенеза наследственного заболевания, а также для раз­ работки патогенетических методов терапии. Идентификации гена человека часто предшествует опи­ сание гомологичного гена у экспериментальных животных, в частности у мышей. И наоборот, если гомологичный ген мыши не был известен, его идентификация проводится вскоре пос­ ле описания соответствующего гена человека. На следую­ щем этапе появляется возможность искусственного констру­ ирования модельных линий трансгенных животных путем направленного разрушения гомологичного гена в ранних за­ родышах мышей («нокаут») или введения в этот ген специ­ фических мутаций. Отбор особей, содержащих модифици­ рованный ген в зародышевых клетках, и последующая се­ лекционная работа завершаются созданием генетической линии животных со специфическими мутациями в заданном гене. Подобные трансгенные линии мышей являются очень удобными обьектами для изучения молекулярных и биохи­ мических основ патогенеза наследственных заболеваний 12

человека, а также для разработки специфических методов предупреждения и лечения таких состояний. Одним из важнейших итогов проводимых исследова­ ний является определение молекулярных основ клинической и генетической гетерогенности. Оказалось, что один и тот же клинический фенотип может быть обусловлен мутациями в разных генах. С другой стороны, различные мутации одного и того же гена могут приводить к различному течению забо­ левания и даже реализоваться в нозологически самостоя­ тельные типы болезней, образующие так называемые аллельные серии. В настоящее время точная диагностика, а значит профилактика и терапия многих наследственных болезней возможна только с учетом данных молекулярно-генетического анализа. Эти положения могут быть проиллюстрированы на при­ мере многих сотен наследственных заболеваний. Данная монография посвящена описанию молекулярно-генетических основ наследственных болезней нервной системы. Моногра­ фия состоит из пяти частей, каждая из которых будет выпу­ щена в виде отдельного издания. При делении материала на части мы руководствовались не только клиническими, но так­ же и молекулярно-генетическими принципами. Первая часть посвящена заболеваниям нервно-мышечной системы и вклю­ чает: болезни мышц —мышечные дистрофии, миопатии, миотонические синдромы и периодические параличи, а также заболевания с преимущественным поражением перифери­ ческого двигательного неврона — проксимальные спинальные мышечные атрофии, полинейропатии, боковой амиатрофический склероз. В настоящее время известно более 5000 моногенных заболеваний. В значительном проценте случа­ ев моногенные болезни сопровождаются различными дефек­ тами нервной системы. Разумеется, рамки настоящего изда­ ния не позволяют остановиться на всех наследственных за­ болеваниях с поражением нервной системы. Основное вни­ мание будет уделено тем болезням, для которых мутантные гены уже открыты и расшифрована природа первичного мо13

пекулярного дефекта. Мы коротко остановимся на клинике каждого из этих заболеваний, подробно опишем историю кар­ тирования и идентификации гена, ответственного за разви­ тие заболевания, представим его молекулярную характери­ стику, типы и распространенность мутаций, идентифициро­ ванных у пациентов, методы молекулярной диагностики дан­ ного состояния, дадим обзор существующих модельных ге­ нетических линий животных. Особое внимание будет уделе­ но описанию первичного биохимического дефекта, лежаще­ го в основе патогенеза заболевания; в тех случаях, когда это возможно, остановимся на разрабатываемых программах генной терапии. Краткость клинического описания рассматриваемых заболеваний обусловлена существованием в отечественной литературе достаточного количества посвященных этим во­ просам монографий, руководств и обзоров (Давиденков, 1925; Калмыкова, 1976; Гехт, Ильина, 1982; Бадалян и др., 1988; Гринио, Агафонов, 1997; Лобзин и др., 1998; Вельтищев, Темин, 1998). Однако во всех этих изданиях практичес­ ки отсутствуют сведения о молекулярно-генетических осно­ вах заболеваний нервной системы. Наиболее полно генети­ ческие аспекты освещены в руководстве по наследственным болезням нервной системы, выпущенном в 1998 году под редакцией академика РАМН Ю. Е. Вельтищева и профессо­ ра П. А. Темина. Современный обзор по молекулярным ос­ новам прогрессирующих миодистрофий опубликован в жур­ нале Неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова (Иллариошкин, Иванова-Смоленская, 1998). Тем не менее в целом сведения по молекулярной неврологии в русскоязычной ли­ тературе носят чрезвычайно фрагментарный характер. В то же время молекулярная неврология — это одна из наиболее динамично развивающихся областей медицинской генетики, в которой накоплен огромный фактический материал. Этот материал, по нашему мнению, достаточен для определен­ ных обобщений. Мы не претендуем на полноту охвата всех исследований, проводимых в области молекулярной невро14

логии, но постарались отразить основные тенденции в раз­ витии этой науки. Большая часть результатов, изложенных в данной монографии, имеет фундаментальное значение, хотя часть сведений может устареть уже к моменту выхода книги из печати. В мировой литературе имеются расхождения в назва­ нии многих моногенных болезней, существуют определенные трудности в их клинической диагностике, а некоторые ред­ кие заболевания, выделяемые в самостоятельные формы лишь на базе молекулярно-генетического анализа, отечест­ венным специалистам практически неизвестны. С учетом этого в большинстве случаев после названия каждого опи­ сываемого заболевания мы указали его энциклопедический номер (MIM), соответствующий составленному В. Мак-Кьюсиком каталогу генов и моногенных болезней человека («Mendelian inheritance in man. Catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes»). Исключение составляют только те заболевания, которые были выделены в самостоятельные нозологические формы после выхода последнего издания каталога в 1997 г. Номера MIM позволя­ ют, на наш взгляд, избегать путаницы в определении конкрет­ ного моногенного заболевания. Обозначения генов также соответствуют каталогу В. Мак-Кьюсика. В большинстве слу­ чаев рядом с названием гена в скобках мы даем расшифров­ ку его обозначения, подчеркивая те буквы, которые входят в аббревиатуру. В монографии использована одна из универсальных систем обозначения мутаций, рассчитанная на запись ами­ нокислотных замен в белках. При этом каждая аминокислота обозначается однобуквенным символом (табл. 1). Располо­ женный в центре номер соответствует месту замены в це­ почке первичного продукта трансляции, слева записывается нормальный вариант аминокислоты, справа — мутантный. Например, запись C283Y означает замену цистеина на тиро­ зин в 283 положении белка. Так записываются различные варианты аминокислотных замен при миссенс мутациях. Бук15

вой X обозначается место остановки синтеза полипептидной цепи при нонсенс мутациях. Например, запись R49X означа­ ет прекращение трансляции на месте аргинина в 49 положе­ нии белка. Таблица 1 Символы аминокислот Аминокислоты Алании Аргинин Аспарагин Аспарагиновая кислота Asn и/или Asp Цистеин Глутамин Глутаминовая кислота Gin и/или Glu Глицин Гистидин Изолейцин Лейци Лизин Метионин Фенилаланин Пролин Серин Треонин Триптофан Тирозин Валин

Трехбуквенный символ Ala Arg Asn Asp Asx Cys Gin Glu Glx Gly His He Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val

Однобуквенный символ A R N D В С Q E Z G H I L К M F P S T

w Y V

Книга адресована врачам-неврологам, педиатрам, ме­ дицинским генетикам, преподавателям и учащимся медицин­ ских вузов, а также слушателям факультетов усовершенст­ вования врачей, специализирующимся в области невроло­ гии. Чтение монографии требует знания основ молекуляр16

ной генетики человека в объеме учебных пособий — В. Н. Горбунова, В. С. Баранов «Введение в молекулярную диаг­ ностику и генотерапию наследственных заболеваний» (СПб.: «Специальная литература», 1997) или В. Н. Горбунова «Мо­ лекулярные основы медицинской генетики», (СПб.: «Интер­ медика», 1999). Для облегчения восприятия материала кни­ га снабжена словарем генетических терминов, составленным в алфавитном порядке.

Глэвэ 1 БОЛЕЗНИ МЫШЦ. МЫШЕЧНЫЕ ДИСТРОФИИ И МИОПАТИИ 1.1. Общая характеристика Наследственные заболевания, в основе которых лежит первичное нарушение мышечной ткани, объединены в боль­ шую группу, именуемую миопатиями. В основе клиники ле­ жит атрофия мышц, мышечная слабость, снижение глубоких рефлексов. Типичны системность поражения поперечно-по­ лосатых мышц и прогрессирующий характер течения заболе­ вания. Миопатии — наиболее часто встречающаяся патоло­ гия в большой группе наследственных нервно-мышечных за­ болеваний. Будучи сходными по клиническим признакам, ми­ опатии являются разнородными заболеваниями, отличающи­ мися типом наследования, особенностями мышечного мета­ болизма, иногда специфическими изменениями структуры мышечного волокна. Сходство клинических проявлений ми­ опатии, в первую очередь, относится к особенностям пере­ движения больных, их типичной походке, моторике верхних конечностей, туловища, обусловленных начальным вовлече­ нием в патологический процесс мышц тазового и плечевого пояса, проксимальных отделов конечностей, туловища. Ат­ рофии мышц, сопровождающиеся прогрессирующей мышеч­ ной слабостью, постепенно усиливаются, вовлекая в симме­ тричный процесс всё новые мышечные группы. Дегенератив­ ные изменения, происходящие в мышечной ткани, ведут к развитию мышечных и сухожильных ретракций, усиливающих Деформации конечностей. Особенно опасны для жизни боль­ ного поражения сердечной мышцы и мускулатуры, участву­ ющей в процессе дыхания. Сходство клинической картины миопатии относится только к кардинальным признакам. Каж­ дое из нозологически самостоятельных заболеваний имеет

19

клинические особенности, позволяющие с достаточной точ­ ностью установить диагноз. За последние годы в изучении наследственной мышеч­ ной патологии отмечены существенные сдвиги, благодаря внедрению современных методов анализа тонкой структуры мышечной ткани и особенностей ее метаболизма. Но наибо­ лее значительные успехи связаны с разработкой современ­ ных генетических технологий, позволяющих осуществлять поиск и идентификацию дефектных генов с последующей воз­ можностью проведения молекулярной диагностики мутаций у пациентов и описанием первичных биохимических нару­ шений, лежащих в основе развития патологических процес­ сов. В свете этих достижений более оптимистичными пред­ ставляются подходы к рациональному лечению некоторых форм миопатии, включая перспективы использования ген­ ной терапии. Общим свойством генов, дефектных при миопатиях, является их экспрессия в скелетных мышцах. С использова­ нием современных молекулярно-генетических технологий построена предварительная карта генов, экспрессирующихся в скелетных мышцах человека (Pallavicini et al., 1997). В процессе построения этой карты были идентифицированы 1945 индивидуальных генов, 725 из которых не имели гомо­ логии с уже известными генами человека. Затем была опре­ делена хромосомная локализация 267 этих неизвестных ге­ нов. Кроме того, для построения геномного транскрипцион­ ного профиля скелетных мышц человека была использова­ на информация о положении на карте дополнительных 242 экспрессирующихся последовательностей^ соответствующих известным генам. Оказалось, что некоторые гены кластерированы на разных хромосомах. Хромосомы 17, 19, 21 и X значительно обогащены генами, экспрессирующимися в мыш­ цах, по сравнению с другими хромосомами. Избирательная концентрация экспрессирующихся генов в некоторых хромо­ сомах и в специфических районах отдельных хромосом мо­ жет быть обусловлена существованием батарей генов, нахо20

дящихся под контролем одних и тех же механизмов, прини­ мающих участие в регулировании тканеспецифической экс­ прессии генов. В табл. 2 представлены данные по локализации генов, ответственных за наследственные миопатии, указаны пер­ вичные биохимические дефекты и дана краткая функциональ­ ная характеристика этих белков. Таблица 2 Молекулярно-генетическая характеристика наследственных миодистрофий и миопатии Нозологическая форма, MIM Миодистрофия Дюшенна; -Беккера, Х-сцепленная, 310200

Миодистрофия врожден­ ная, прогрессирующая с умственной отсталостью, тип Фукуяма, аутосомнорецессивная, 253800 Миодистрофия конечностно-поясная, аутосомнодоминантная 1А, 159100 Миодистрофия конечностно-поясная, аутосомнодоминантная 1В Миодистрофия конечностно-поясная, аутосомнодоминантная 1С Миодистрофия конечностно-поясная, аутосомнорецессивная 2А, 253600

Ген,

Белок, функции

локализация DMD Хр21.2

FCMD, MUSC?

дистрофии - сарколеммный белок цитоскелета, связы­ вающий актин с экстракле­ точным матриксом через дистрофин-ассоциированный комплекс белков; аподистрофины рецепторная тирозинкиназа?

9q31-q33 LMNB1?

ламин В1? белок ядерной ламины

5q22.3-q31.3 LMNA?

ламин А/С? белок ядерной ламины

1q11-q21 CAV3

кавеолин-3 - дистрофинассоциированный белок мышечных кавеол

Зр25 CAPN3

15q15.1-q21 1

кальпаин-3 - мышечная протеаз

Продолжение Табл.2 Миодистрофия конечностно-поясная, аутосомно-рецессивная 2В, 253601; миопатия дистальная Миоши, 254130 Миодистрофия конечностно-поясная, аутосомно-рецессивная 2С, 253700 Миодистрофия конеч­ ностно-поясная, аутосомно-рецессивная 2D, 253700; первичная адхалинопатия, 600119

DYSF, ММ

2р13.3-2р13.1 SGG, ySG

13q12 ADL, DAG2, SGA, ctSG 17q21

Миодистрофия конеч­ ностно-поясная, аутосомно-рецессивная 2Е, 600900

SGB, PSG

Миодистрофия конеч­ ностно-поясная, аутосомно-рецессивная 2F, 601411

SGD, 8SG

Миодистрофия плечевого и тазового пояса с буллезным эпидермолизом, аутосомнорецессивная,226670 Лице-лопаточно-плечевая миодистрофия ЛандузиДежерина, аутосомнодоминантная IA, 158900

4q12

5q33 PLEC1

у-саркогликан белок дистрофинассоциированного комплекса а-саркогликан, адхалин белок дистрофинассоциированного комплекса р-саркогликан белок дистрофинассоциированного комплекса 8-саркогликанбелок дистрофинассоциированного комплекса плектин - белок соединяющий цитоскелет клетки с мембраной

8q24.13-qter FSHD1

4q35-qter

Миодистрофия ЭмериДрейфуса, Х-сцепленная, 310300

EMD, STA

Миодистрофия ЭмериДрейфуса, аутосомнодоминантная, 181350

EDMD-AD, LAMA 1q11-q23

Миодистрофия врожден­ ная мерозин-дефицитная, аутосомно-рецессивная, 156225

дисферлин - цитоплазмат ческий белок, взаимодей­ ствующий с ядерной и плазменными мембранами

эмерин - ядерный ламинаассоциированный белок

Xq28

LAMA2

6q22-q23

ламин А/С- белок ядерной ламины мерозин, ламинин 2 белок базальной ламины, связанный с дистрофинассоциированным комплексом белков

Продолжение Табл.2 Миопатия врожденная, интегрина7рЮдефицитная, аутосомнорецессивная

ITGA7

Миопатия немалиновая, волокнистая, аутосомнорецессивная, 256030

NEB

12q13

2q21.2-q22

Миопатия немалиновая, волокнистая, аутосомнодоминантная, 161800

NEM1, TPM3

Миопатия немалиновая, аутосомно-доминантная; миопатия актиновая

АСТА1

Болезнь центрального стержня; злокачествен­ ная гипертермия, аутосомно-доминантная, 117000

RYR1

Миопатия миотубулярная 1, Х-сцепленная, 310400 Миопатия Бетлема, аутосомно-доминантная, 158810; (120220; 120240; 120250)

Миопатия окулофарингеальная, аутосомнодоминантная, 164300 Миопатия дистальная с накоплением десмин вых включений, аут сомно-доминантная, 125660 Миопатия десминРодственная, аутосомноДоминантная,601419 Миопатия с инклюзионными тельцами, ауто­ сомно-рецессивная, 601073

интегрин p1D, ot7 - рецептор ламинина 2

1q23-q25.1

1q42

19q12-q13.2 MTM1, CG2

небулин - интегральный компонент тонких и толстых нитей саркомера тропомиозин-3 - главный белковый компонент латеральных Z-дисков а-актин - основной белковый компонент тонких нитей саркомера рецептор 1 рианодина кальций высвобождающий канал саркоплазматического ретикулума скелетных мышц миотубулярин - мышечная тирозин-серин-фосфатаза

Xq28 COL6A1,

а 1, 2 и 3 субьединицы микрофибриллярного кол­ лагена VI типа мышц, COL6A3, 21q22.3, 2q37 выполняющего роль моста между клетками и внеклеточным матриксом. COL6A2

OPMD, PABP2 14q11.2-q13 DES

поли(А)-связывающий белок 2 десмин - белок семейства промежуточных филамент типа III

2q35 CRYA 11q21-q23 IBM2

9p1-q1

аВ-кристаллин - мажорный белок хрусталика, присутствующий в мышцах

Продолжение Табл.2 МакАрдла болезнь, аутосомно-рецессивная; гликогеноз V типа, 232600

PYGM

Миопатия, обусловленная СРТ-дефицитом аутосомно-рецессивная; гипераммониемия 255110

СРТ1

Миоаденилат дезаминазы дефицит, аутосомнодоминантная; миопатия напряжения, 102770 Миопатия, обусловленная PGAM М-дефицитом, аутосомно-рецессивная, 261670

фосфорилаза мышечная

11q13 карнитин-палмитоилтрансфераза 1

1р13-р11 AMPD1

АМФ-дезаминаза-1, мышечная

1р21-р13 PGAMM, PGAM2

фосфоглицератмутаза, мышечная М

7р13-р12.3

Значительная часть генов, связанных с наследствен­ ными болезнями мышщ, кодирует белки, ассоциированные с мембранами мышечных волокон. Одной из основных функ­ ций подобных белков является стабилизация мембраны за счет связывания цитоскелета мышечной клетки с внеклеточ­ ным матриксом. Это, в первую очередь, относится к стержневидному белку дистрофину, дефектному при миодистофиях Дюшенна и Беккера, получивших общее название дистрофинопатий. Дистрофии — полифункциональный белок, при­ надлежащий к спектрин/ос-актининовому суперсемейству бел­ ков цитоскелета. Он участвует в поддержании целостности мембраны мышечного волокна при его сокращении и в фор­ мировании нейромышечного синапса. Дистрофин является якорным белком для актиновых филамент, обеспечивающих жесткость цитоскелета миотубул. Располагается дистрофин под сарколеммой мышечного волокна. Его связь с экстра­ клеточными белками осуществляется через комплекс транс­ мембранных дистрофин-ассоциированных белков. При миодистрофии Дюшенна/Беккера, так же как при аутосомно-рецессивных дюшенно-подобных и при некоторых формах конечностно-поясных миодистрофий происходит разрушение 24

дистрофин-ассоциированного комплекса белков, причем в по­ следних двух случаях первичным биохимическим дефектом часто оказывается один из белков дистрофин-ассоциирован­ ного саркогликанового субкомплекса: у-, а-, р- или 8-саркогликан. Подобные миодистрофии объединяют в группу саркогликанопатий. Следует подчеркнуть, что разрушение дистрофинового комплекса является одним из центральных звеньев в этио­ логии дилатационных кардиомиопатий. При этом наследст­ венные формы подобных заболеваний могут быть связаны с определенными дефектами как в гене дистрофина, так и в других генах, кодирующих белки дистрофин-ассоциирован­ ного комплекса, такие как а-дистрогликан, а- и у-саркогликаны (Towbin, 1998). Не исключено, что и приобретенные формы дилатационной кардиомиопатий, индуцированные энтеровирусами, в определенной степени обусловлены нарушением нормальной работы дистрофина и ассоциированного с ним комплекса белков (Badorf et al., 1999). Все эти факты свиде­ тельствуют о центральной роли дистрофин-ассоциированного комплекса белков в функционировании миоцитов и кардиомиоцитов. Еще одна тяжелая форма миодистрофии плечевого и тазового пояса обусловлена дефектом другого белка, ассоциированного с дистрофином и также локализованного в сарколемме мышечных волокон — кавеолина-3. Мутации в гене CAV3 нарушают образование кавеол в плазматической мембране мышечных клеток. Неожиданным оказалось обнаружение не структурного, а энзиматического дефекта в специфической мышечной протеазе — кальпаине-3 — при более м я г к о й форме данной миодистрофии. Наиболее простым объяснением может быть возможность участия этой протеазы в деградации или дестабилизации структурных компонентов цитоскелета, экстраклеточного матрикса или Дистрофинового комплекса. Не исключается также вероятная роль этого белка в слиянии миобластов и в контроле генной экспрессии. При другой мягкой форме конечностно-поясной 25

м и о д и с т р о ф и и д е ф е к т н ы м о к а з ы в а е т с я дисферлин — ц и т о п л а з м а т и ч е с к и й белок с н е и з в е с т н о й ф у н к ц и е й , способный взаимодействовать с ядерной мембраной и с мембранами сарко- и эндоплазматического ретикулума. Нарушение работы плектина — большого структурного якорного белка, соединяющего в кератиноцитах и в скелетных мышцах ц и т о с к е л е т к л е т к и с м е м б р а н о й , п р и в о д и т к необычной форме миодистрофии, сочетающейся с буллёзным эпидермолизом. В предлагаемом руководстве в отдельную группу заболеваний выделены миопатии, обусловленные дефектами белков, ассоциированных с ядерной ламиной. Эмерин — белок, ассоциированный с ламинином ядерной м е м б р а н ы , о к а з ы в а е т с я дефектным при Х-сцепленной форме м ы ш е ч н о й дистрофии с к о н т р а к т у р а м и Э м е р и Дрейфуса. Более редкая аутосомно-доминантная форма этого з а б о л е в а н и я с в я з а н а с д е ф е к т о м в гене LMNA, кодирующим два белка ядерной ламины — ламин А и С. Эти белки являются продуктами альтернативного сплайсинга гена LMNA и они активно взаимодействуют с э м е р и н о м . Н е и с к л ю ч е н о , что а у т о с о м н о - д о м и н а н т н а я форма мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса является аллельным вариантом одной из доминантных форм конечностно-поясной миодистрофии, ген которой LGMD1B картирован в той же области 1q11-q23, где расположен ген LMNA. А к т и в н о обсуждается возможность участия гена L M N B 1 , кодирующего еще один белок семейства ядерных ламинов — В 1 , в контроле другой аутосомно-доминантной формы конечностно-поясной миодистрофии — LGMD1A, так как оба мутантных гена расположены в одной и той же области 5q23.3-q31.3. Миопатии, обусловленные дефектами белков ядерной ламины, иногда объединяют в группу эмеринопатий. В самостоятельную клиническую группу выделяют врож­ денные непрогрессирующие миопатии, при которых дефект­ ными, как правило, оказываются гены, экспрессирующиеся 26

в раннем эмбриогенезе и кодирующие белки, участвующие в процессах роста, дифференцировки и пролиферации миобластов. Две из них обусловлены дефектами белков базальной ламины. Так, в основе развития врожденной миопатии, сочетающейся с гипомиелинизацией белого вещества моз­ га, лежит дефект мышечного белка ламинина 2, связанного с субсаркомерным цитоскелетом посредством олигомерного комплекса дистрофин-ассоциированных белков. Еще одна редкая форма врожденных миопатии связана с недостаточ­ ностью рецептора ламинина в мышцах. Патологические процессы при некоторых врожден­ ных миопатиях сопровождаются накоплением в клетках не­ растворимых включений. Так, при немалиновой миопатии в мышечных клетках пациентов присутствуют нитеобраз­ ные патологические фибриллярные структуры, причиной образования которых является латеральная экспансия Zдисков. Эти экспансии могут возникать вследствие дефек­ тов различных белковых компонентов тонких и толстых нитей саркомера скелетных мышц. Одна из доминантных форм заболевания связана с мутациями в гене тропомиозина В. Наиболее частая аутосомно-рецессивная медлен­ но прогрессирующая немалиновая миопатия обусловлена мутациями в гене гигантского интегрального белка сарко­ мера — небулина. При наиболее тяжелых доминантных формах заболевания, часто заканчивающихся летальным исходом в младенческом возрасте, дефектным оказыва­ ется ген мышечного ос-актина. Определенные гистологические аномалии в мышеч­ ных клетках характерны также для пациентов с болезнью Центрального стержня и с миотубулярной миопатией. В обоих случаях дефектными оказываются белки, участвую­ щие в контроле дифференцировки мышечных волокон. Мембранным мышечным белком является рецептор рианодина 1, нарушение работы которого приводит к разви­ тию болезни центрального стержня/злокачественной гипер­ термии. Рецептор рианодина функционирует как кальций27

высвобождающий канал саркоплазматического ретикулу. ма скелетных мышц. Он необходим для нормального раз* вития и созревания мышц, а также его функции связаны с сокращением-расслаблением миофибрилл. Первичным биохимическим дефектом при миотубулярной миопатии, также сопровождающейся нарушениями нормального про­ цесса созревания мышц, является миотубулярин — один из новых членов семейства тирозинфосфатаз, участвую­ щих в регуляции роста, пролиферации и дифференцировки клеток. Различные варианты миопатии Бетлема обус­ ловлены дефектной структурой микрофибриллярного кол­ лагена VI типа, выполняющего в эндомизии и перимизии скелетных мышц роль моста между клетками и внеклеточ­ ным матриксом. Предполагается, что дефекты коллагена типа VI могут оказывать влияние на процессы дифференцировки миобластов либо, что более вероятно, на струк­ турную организацию внеклеточного матрикса. При целом ряде миопатии причиной дистрофических процессов является накопление в цитоплазме и/или в ядрах м ы ш е ч н ы х клеток г и с т о л о г и ч е с к и идентифицируемых включений, молекулярные механизмы формирования которых могут быть совершенно р а з л и ч н ы м и . Так при окулофарингеальной миопатии тубулофиламентные включения образуются за счет небольшого увеличения полиаланиновой цепочки в поли(А)-связывающем белке 2, присутствующем в клетках главным образом в димерной или в олигомерной формах. Показано, что полиаланиновые олигомеры чрезвычайно устойчивы к химической денатурации и энзиматической деградации. Возможно, олигомеры поли(А)связывающего белка 2, составленные из достаточного числа мутантных молекул, могут накапливаться в ядрах в качестве филаментных включений и вызывать гибель клеток. Подобная агрегация мутантных белков с удлиненными полиглютаминовыми треками обнаружена в ядрах нейронов по крайней мере при четырех нейро-дегенеративных заболеваниях, о б у с л о в л е н н ы х э к с п а н с и е й C A G - п о в т о р а : при хорее 28

Гентингтона, двух формах спиноцеребеллярной атаксии и при денторубральной паллидо-люисовой атрофии (данные нозологические формы будут рассмотрены во второй части монографии). Накопление в саркоплазме сердечной и скелетных мышц плотных гранулофиламентных агрегатов, содержащих десмин, является причиной развития аутосомно-доминантной миопатии, дебютирующей во взрослом возрасте слабос­ тью проксимальных и дистальных мышц конечностей в соче­ тании с кардиомиопатией и катарактой. Десмин принадлежит семейству промежуточных филамент типа III, участвующих в поддержании структурной целостности мышц. Образование патологических десмин-содержащих агрегатов может быть следствием аномалий в самом десмине или во взаимодей­ ствующем с ним белке — аВ-кристаллине. Это мажорный бе­ лок хрусталика, присутствующий также в сердечной и в ске­ летных мышцах. Описаны и другие формы миопатии с филаментными включениями в мышечных волокнах. Однако мо­ лекулярная природа образования этих включений остается пока неизвестной. Мутации мтДНК, в том числе делеции и дупликации, приводящие к дефициту одного или нескольких ферментов в митохондриальной респираторной цепи, а также мутации в генах тРНК ответственны за наследственные заболевания, получившие название митохондриальных энцефаломиопатий. Мышечная слабость часто выступает в качестве одного из ведущих симптомов при этих болезнях, которые, как прави­ ло, носят мультисистемный характер. Митохондриальные энцефаломиопатий не обязательно обусловлены дефектами в мтДНК, а могут быть связаны как с доминантными, так и с рецессивными мутациями в аутосомных генах. И наконец, недостаточность активности ряда мышеч­ ных ферментов служит причиной развития относительно до­ брокачественных метаболических миопатии. Остановимся более подробно на каждом из перечис­ ленных выше заболеваний. 29

1.2. Миодистрофия Дюшенна/Беккера и дюшенно-подобные аутосомно-рецессивные миопатии Миодистрофия Дюшенна и аллельный ей вариант мио­ дистрофии Беккера — наиболее частая и хорошо изученная форма тяжелой нервно-мышечной патологии. Ген, ответст­ венный за эти два заболевания, был открыт методами обрат­ ной генетики около 15 лет тому назад. Это открытие сопро­ вождалось не только идентификацией белка, дефектного при миодистрофии Дюшенна/Беккера и получившего название дистрофин, но и выявлением целой серии его укороченных изоформ — апо-дистрофинов, способных выполнять в раз­ личных типах клеток спецализированные функции, отличные от функций дистрофина. Вслед за открытием дистрофина было описано более десятка других до этого неизвестных белков, тесно связанных с дистрофином и образующих так называе­ мый дистрофин-ассоциированный комплекс. Оказалось, что основной причиной развития патологических процессов при дюшенно-подобных миопатиях является разрушение транс­ мембранного дистрофин-ассоциированного комплекса бел­ ков. Подобная деструкция может происходить вследствие генетических дефектов либо в самом дистрофине, как это наблюдается у больных с миодистрофией Дюшенна/Беккера, либо в других белках дистрофин-ассоциированного комплек­ са и это в свою очередь может явиться причиной развития гораздо более редких аутосомно-рецессивных дюшенно-по­ добных миопатии. Однако мутации в генах, кодирующих бел­ ки дистрофин-ассоциированного комплекса, сопровождающи­ еся, как правило, частичным или полным его разрушением, не всегда реализуются в форме таких миопатии, а часто мо­ гут приводить к различным вариантам конечностно-поясных и некоторых других мышечных дистрофий, о чем речь пой­ дет ниже. В большинстве случаев точная диагностика ауто­ сомно-рецессивных дюшенно-подобных миопатии возможна только на базе молекулярно-генетического анализа. 30

Не исключено, что разрушение дистрофин-ассоцииро­ ванного комплекса белков может происходить не только в оезультате генетических дефектов, но и вследствие вирус­ ных инфекций. Это, в частности, доказано в отношении виру­ са Коксаки, способного разрушать дистрофии и ассоцииро­ ванный с ним комплекс белков в кардиомиоцитах, и это, повидимому, является одним из начальных молекулярных ме­ ханизмов патогенеза наиболее частой приобретенной фор­ мы дилатационной кардиомиопатий. Учитывая особую значимость миодистрофии Дюшенна и дистрофинопатий среди нервно-мышечных заболеваний, мы постарались дать наиболее полный обзор молекулярногенетических исследований, проводимых в последние годы в этой области неврологии. На примере дюшенно-подобных миодистрофии особенно отчетливо может быть прослежена связь между открытием гена и расшифровкой молекулярных основ патогенеза, а значит, и разработкой методов точной диагностики (включая пренатальную), профилактики и тера­ пии моногенных заболеваний.

а) Псевдогипертрофическая мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера (MIM: 310200) 1. Клиническая характеристика заболевания Х-сцепленная рецессивная псевдогипертрофическая мышечная дистрофия Дюшенна, впервые подробно описан­ ная G.Duchenne в 1868 г., — одна из наиболее частых и зло­ качественных форм нервно-мышечной патологии детского возраста, характеризующаяся началом клинических прояв­ лений в первом пятилетии жизни, прогредиентным течением заболевания с последующей инвалидизацией и летальным исходом, как правило, в конце второго — начале третьего Десятилетия жизни. Обобщенные данные о распространенн ° с т и миодистрофии Дюшенна в разных популяциях указы­ вают на относительно высокую частоту этой формы, колеб­ лющуюся от 9,7 до 32,6 случаев на 100 000 родившихся живь, м и мальчиков. Для Санкт-Петербурга она составляет не 31

менее 18,9 на 100 ООО (Красильников, 1989). Примерно 1/з единичных случаев миодистрофии Дюшенна должна быть обусловлена вновь возникшими мутациями (при условии ра­ венства частоты мутирования в мужских и женских гаметах, а также нулевой фертильности больных). Последнее обсто­ ятельство имеет принципиальное значение для оценки по­ вторного риска при медико-генетическом консультировании соответствующих семей. Долгое время в литературе обсуж­ дался вопрос о взамоотношении миодистрофии Дюшенна и мышечной дистрофии Беккера (Беккера-Кинера), впервые описанной в 1955 г. (Becker, Kiener, 1955), протекающей со сходной клинической картиной, но отличающейся относитель­ но доброкачественным течением. К настоящему времени получены данные, однозначно указывающие на то, что обе формы являются результатом мутаций в одном и том же локусе. Так называемые женские случаи миодистрофии Дюшен­ на/Беккера возможны у девочек с Х-аутосомной транслока­ цией либо числовой аномалией Х-хромосомы (моносомия X). Сходные с миодистрофией Дюшенна клинические проявле­ ния могут отмечаться у лиц женского пола с дюшенно-подобными аутосомно-рецессивными формами миопатии (см. ниже). В части случаев субклинические проявления мио­ дистрофии Дюшенна/Беккера в виде «малой болезни» от­ мечаются у гетерозиготных носительниц мутантного гена. На наличие «малых признаков» у женских родственников больных миодистрофией Дюшенна указывал еще С. Н. Давиденков (Давиденков, 1934). Клиническая симптоматика носительства может проявляться умеренным снижением мы­ шечной силы и сухожильных рефлексов, утолщением (за счет псевдогипертрофии) икроножных мышц, поясничным гипер­ лордозом, варусной деформацией стоп, другими симпто­ м а м и . Данное обстоятельство хорошо объясняется гипо­ тезой Л а й о н , предполагающей случайную инактивацию одной из Х-хромосом в ж е н с к о м зачатке в раннем эмбрио­ генезе и соответственно преобладанием в подобных слу-

32

чаях среди функционально активных Х-хромосом, несущих м утантный аллель. Клиническая картина миодистрофии Дюшенна достаточ­ но хорошо изучена (Дрознина, 1970; Гринио, 1976). Заболева­ ние характеризуется сравнительно ранним началом и относи­ тельно быстрым прогрессированием процесса. Первые призна­ ки заболевания в виде мышечной слабости появляются в воз­ расте 2—5 лет. У части детей отмечается задержка темпов мо­ торного развития уже на 1—2-м году жизни. Дети начинают ис­ пытывать затруднения при ходьбе по лестнице, вставании с пола, перестают бегать. Очень типичной становится переваливающа­ яся («утиная») походка, заключающаяся в раскачивании в та­ зобедренных суставах. Рано возникают псевдогипертрофии за счет разрастания жировой и соединительной ткани, захватыва­ ющие главным образом икроножные, дельтовидные и ягодич­ ные мышцы. В последующем постепенно появляются гипотро­ фии мышц бедер и тазового пояса, нередко внешне скрытые из-за развитой подкожной жировой клетчатки. Процесс носит отчетливо восходящий характер: мышечная слабость и гипотро­ фии распространяются на мышцы спины, плечевого пояса, про­ ксимальных отделов верхних конечностей. Характерны «кры­ ловидные лопатки», симптом «свободных надплечий». Из-за уси­ ливающейся слабости к 9—12 годам дети, как правило, пере­ стают ходить, постепенно превращаясь в «кресельных пациен­ тов». Становятся заметными вторичные деформации скелета, усиливаются атрофии и сухожильные ретракции. Наиболее ран­ ние изменения обнаруживаются в ахилловых сухожилиях, при­ водящие в последующем к патологической деформации стоп. Возможны контрактуры в локтевых, коленных и тазобедренных оуставах. Первым из глубоких рефлексов исчезает коленный, затем—рефлексы с двуглавой и трехглавой мышц. Дольше дру­ гих сохраняется ахиллов рефлекс. Для миодистрофии Дюшенн а типично поражение сердечной мышцы в виде кардиомиопа^ и . При ЭКГ-исследовании обнаруживаются углубление зубца ' П а т ология зубца R, блокада ножки пучка Гиса. Особеннос­ тью данной формы миопатии является нередко наблюдаемая Заказ № ПО

33

умственная отсталость, как правило, неглубокая. Причиной ле­ тального исхода являются обычно пневмонии, которые боль­ ные не в силах перенести из-за включения в процесс дыхатель­ ной мускулатуры. Лабораторная диагностика миодистрофии Дю­ шенна/Беккера включает использование различных методов: электрофизиологических, биохимических, гистологических, а в последние годы — гистохимических и молекулярно-генетических. Электромиографическое исследование, а также изучение мышечных биоптатов обнаруживает признаки первично-мышеч­ ного поражения. Удобным и информативным тестом является определение сывороточной креатинкиназы, уровень активнос­ ти которой в случае миодистрофии Дюшенна в десятки раз пре­ вышает нормальные значения. Следует подчеркнуть, что дан­ ный тест может быть использован в до- или субклинической ста­ дии заболевания. 2. Картирование и идентификация гена DMD Ген миодистрофии Дюшенна — DMD (Duchenne muscular dystrophy) — один из первых генов человека, идентифициро­ ванных методами позиционного клонирования. Успешному кло­ нированию гена предшествовало описание достаточно редких пациентов, имеющих в области локализации гена цитогенетически идентифицируемые структурные перестройки — транс­ локации и делеции. Так, в частности, у нескольких девочек, стра­ дающих заболеванием, сходным по клинике с миодистрофией Дюшенна, были обнаружены различные реципрокные Х-аутосомные транслокации, причем во всех случаях точка разрыва Х-хромосомы оказалась локализована в области р21 (Burghes et al., 1987; Boyd et al., 1988; Bodrug et al., 1989). Было высказа­ но предположение, нашедшее подтверждение в последующих исследованиях, что клиника миодистрофии Дюшенна у этих де­ вочек развивается вследствие разрушения транслоцированного гомолога DMD-гена, локализованного в области Хр21, в со­ четании со специфическим характером лайонизации нормаль­ ной Х-хромосомы. На следующем этапе изолированные после­ довательности ДНК, примыкающие к точкам разрывов Х-хро34

мосомы при транслокациях или отсутствующие у пациентов с делециями, были использованы в качестве зондов для поиска и анализа полиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с геном миодистрофии Дюшенна. Одним из первых таких зондов была последовательность RC8, локализованная методами соматиче­ ской гибридизации в области Хр22.3-р21 на расстоянии около 10сМ от DMD-гена (Murrey et al., 1982). В дальнейшем была изо­ лирована целая серия подобных последовательностей ДНК. Среди них фрагмент гена орнитинтранскарбомилазы (ОТС), зонды р754, XJ1-8, а также внутригенные зонды серии pERT (Francke et al., 1985; Bakker et al., 1985; Kunkel et al., 1985). С помощью этих ДНК-зондов было обнаружено большое число полиморфных сайтов рестрикции, ассоциированных с DMD-reном, и определены генетические расстояния между ними. В табл. 3 показано расположение некоторых полиморфных мар­ керов относительно DMD-гена и суммированы результаты не­ скольких исследовательских групп по оценке частот рекомби­ нации между этими локусами (Murray et al., 1982; Boyd et al., 1988; Chen et al., 1989; Abbs et al., 1990). Таблица 3 Расположение полиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с геном дистрофина Локус

ДНК-зонд

DXS84

р754

DXS206

рХЛ-8

Границы гена

Расстояния в сМ

3.7 + 0 . 6

DYS MSA *) DXS142

PERT84

DXS164

PERT87

5' DMD

1.0 + 0 . 4

3' DMD

1.9+ 0 . 6

МР1Р *) DXS41

р99-6

DXS270

J-Bir

DXS28

1 2 . 0 + 1.1

*) микросателлитные маркеры, фланкирующие ген дистрофина.

Описание большого количества полиморфных марке­ ров, сцепленных с DMD-геном, и точное физическое карти­ рование области его локализации способствовало изоляции специфической мРНК из скелетных мышц плода, клонирова­ нию и секвенированию полноразмерной кДНК длиной в 14 тысяч пар нуклеотидных оснований (Koenig et al., 1987; Monaco, Kunkel, 1988). DMD — самый крупный из известных в настоящее время генов, его размер 2.5 миллиона пар ос­ нований, и он занимает около 2% Х-хромосомы. Кодирую­ щая часть гена DMD разделена на 79 экзонов и составляет менее 1% геномной области (Roberts et al., 1992с; 1993). 3. Мутации в гене DMD и их диагностика Более чем в 60% случаев у больных мальчиков с мио­ дистрофией Дюшенна/Беккера обнаруживаются протяженные делеции в гене DMD, захватывающие от одного до несколь­ ких соседних экзонов и сосредоточенные обычно в двух «го­ рячих» районах — в области 5'-конца гена (экзоны 6—19) и в З'-конце (экзоны 40—53), при этом 30% делеций локализо­ ваны в проксимальной части гена и 7 0 % — в дистальной (Koenig et al., 1989; Dunnen et al., 1989; Liechti-Gallati et al., 1989; Oudet et al., 1992). Считается, что в 30% семей с еди­ ничными случаями миодистрофии Дюшенна/Беккера болезнь развивается вследствие спонтанного возникновения в гаме­ тах мутаций в DMD-гене и матери таких больных не являют­ ся гетерозиготными носителями этих мутаций. В подобных семьях риск повторного рождения больного ребенка мини­ мален и не превышает общепопуляционной частоты. В ос­ тальных 7 0 % семей матери больных мальчиков гетерозигот­ ны по мутациям DMD-гена, и при каждой беременности та­ ких женщин риск повторного рождения больного сына состав­ ляет 50%. Очень часто концы делеций локализованы в цент­ ральной части гена DMD. Так, в интроне 44, протяженностью 160—180 кб, расположено около 4 0 % точек разрыва всех де­ леций. Проксимальные делеции возникают, по-видимому, в раннем эмбриогенезе и имеют больше шансов стать «семей-

36

ными» мутациями. Дистальные делеции возникают позднее и чаще встречаются как изолированные случаи. Считается, что повторный риск рождения больного ребенка с прокси­ мальной вновь возникшей делецией составляет 30%, тогда как с дистальной — только 4% (Passos-Bueno et al., 1992). По-видимому, значительная часть делеций в гене DMD возникает при мейотической рекомбинации. Частота мейотической рекомбинации в гене дистрофина составляет 10%, что в 4 раза больше, чем можно было ожидать на основании длины гена (Qudet et al., 1992). С использованием 10 внутригенных полиморфных маркеров показано существование двух горячих точек рекомбинации в гене DMD. Одна из них между экзонами 44 и 51 с пиком в 44-м интроне, другая между ни­ троном 7 и 5'-концом DMD. Локализация горячих точек ре­ комбинации очень сходна с распределением точек разрывов делеций у пациентов с миодистрофией Дюшенна/Беккера. Эти результаты дают основание предполагать участие одного и того же молекулярного механизма, лежащего в основе об­ разования делеций и повышения частоты рекомбинации в гене DMD. В нескольких случаях показано, что один из концов де­ леций, локализованных в интроне 43, расположен внутри ТНЕ1 элемента, принадлежащего семейству ретротранспозонов (Pizzuti et al., 1992). Эти элементы, размером 2.3 кб, фланки­ рованные 350-нуклеотидными длинными терминальными по­ вторами (LTR), встречаются в геноме человека около 10 ООО раз. Гипотеза о том, что нестабильность гена DMD вы­ звана присутствием транспозоно-подобного элемента, при­ влекается также для объяснения нескольких случаев обна­ ружения различий в молекулярном дефекте у пациентов, при­ надлежащих одной и той же родословной, у которых предпо­ ложительно должна быть мутация общего происхождения (Miciak et al., 1992). В некоторых случаях удалось проследить присутствие Alu-элементов, локализованных в точках разры­ вов внутригенных структурных перестроек. Так, при секве­ стровании концевых участков дупликаций в гене DMD в 2 слу37

чаях из 8 были обнаружены Alu-элементы (Ни et al., 1989). В остальных 6 случаях рекомбинация осуществлялась между негомологичными последовательностями. Делеции в гене DMD часто возникают в процессе про­ лиферации зародышевых клеток, следствием чего является гонадный мозаицизм — появление нескольких генераций половых клеток (ооцитов) с мутантными и нормальными ал­ лелями (Darras et al., 1988; Bakker et al., 1989). Гонадный мо­ заицизм представляет серьезную проблему для диагностики гетерозиготного носительства и, следовательно, для медикогенетического консультирования семей с миодистрофией Дюшенна. Предполагается, что такие мутации могут возни­ кать еще на уровне первичных половых клеток, то есть на ранних стадиях внутриутробного развития будущей матери. По ориентировочным оценкам примерно 6—7% всех спора­ дических случаев являются следствием гонадного мозаицизма у матери. Оценить величину аберрантного клона ооцитов практически не представляется возможным. В связи с этим прогноз в отношении здоровья следующего ребенка в семь­ ях, в которых у матери больного миодистрофией Дюшенна не удается определить гетерозиготное носительство, весьма затруднен. Эмпирически определено, что при наличии спо­ радического случая рождения ребенка с миодистрофией Дюшенна и при отсутствии прямых молекулярных доказа­ тельств гетерозиготного носительства мутации в гене дистро­ фина у матери риск повторного рождения больного ребенка может достигать 14% (Essen et al., 1992). Мутации возникают преимущественно в оогенезе (Bakker et al., 1989), несмотря на то, что теоретическая вероятность отцовского происхож­ дения делеций в гене дистрофина выше за счет большего числа репликаций ДНК, происходящих в процессе созрева­ ния мужских половых клеток (Giannelli, 1988). Отмечены особенности паттерна делеций в разных европейских популяциях (Beggs et al., 1990; Abbs et al., 1991) и в популяциях России и стран СНГ (Baranov etal., 1993). Так, в результате объединенных межлабораторных исследований 38

показано, что соотношение делеций в 3'- и в 5'-районах «гооячих» точек возникновение мутаций в различных популя­ циях Западной Европы составляет 3.5:1, тогда как в России только 2:1. У некоторых пациентов может быть делетирован не только весь ген дистрофина, но достаточно протяженные соседние области. Прямой корреляции между тяжестью те­ чения заболевания и длиной делеций не отмечается, но раз­ личия между формами Дюшенна и Беккера в общем случае связаны с наличием или отсутствием сдвига рамки считыва­ ния (Malhotra et al., 1988; Koenig et al., 1989). При миодистро­ фии Дюшенна делеций сопровождаются сдвигом рамки счи­ тывания и вследствие этого преждевременной терминацией трансляции, тогда как при форме Беккера такого сдвига не происходит. Поэтому у пациентов с миопатией Дюшенна про­ дукт гена либо полностью отсутствует, либо деградирует вско­ ре после синтеза. У больных с формой Беккера такой белок, как правило, присутствует, хотя и в измененном, чаще всего в укороченном виде. Эта гипотеза оказалась справедливой для 94% делеций с картированными точками разрывов. Ис­ ключения из этого правила связаны со сложным характером экспрессии гена DMD.

Рис. 1. Расположение кДНКовых зондов гена дистрофина После клонирования гена появилась возможность ис­ пользовать кДНКовые зонды для анализа изменчивости внут Ригенных полиморфных сайтов рестрикции. На рис. 1 пока­ зано расположение этих зондов относительно кДНК-гена дист Рофина. кДНКовые зонды явились прекрасными маркера­ ми для выявления делеций в DMD-гене (Dunnen et al., 1989). табл. 4 указаны некоторые полиморфные сайты рестрикЧии » выявляемые с помощью этих кДНК-овых зондов. Распо39

ложение относительно гена DMD геномных районов, гибридизующихся с некоторыми геномными и кДНКовыми зонда­ ми, после рестрикции ДНК редкощепящей эндонуклеазой Sfj I изображено на рис. 2.

Рис. 2. Расположение относительно гена дистрофина геномных районов, гибридизирующихся с некоторыми геномными и кДНКовыми зондами, после рестрикции ДНК редкощепящей эндонуклеазой Sfi 1 Таблица 4 кДНКовые полиморфные сайты рестрикции Аллели (кб) минорная мажорная 2.0 2.1

Районы кДНК

Рестриктаза

0-2а

Xmn1

ЗЬ-5а

EcoR1

9.4

9.7

5Ь-7

EcoRY EcoR1 Xmn1 EcoRY Pvu11 Taq1

7.3 10.5 4.7 12 9.3 2.1

10 13 4.4 14 11 1.7

9 -10

разработаны очень эффективные методы диагностики делеций в гене DMD, основанные на мультиплексной (мно­ жественной) полимеразной цепной реакции (Chamberlain et al., 1988а; 1990; Beggs et al., 1989; 1990;. Abbs et al., 1991). Одновременная амплификация 18 экзонов и промоторной части гена позволяет выявить до 98% всех протяженных де­ леций гена (рис. 3). На этом рисунке у пациентов под номе­ рами 1—5 делетированы соответственно экзоны 51-60, 4244,47-52,43-60 и 13-19. Идентификация делеций в гене DMD у больного является бесспорным подтверждением диагноза миодистрофии Дюшенна/Беккера. Кроме того, в семьях с генотипированной делецией возможна прямая пренатальная диагностика заболевания, которая обычно проводится в пер­ вом триместре беременности. В некоторых случаях делеций в DMD находят у пациентов, клинически отнесенных к дру­ гим формам миопатии: аутосомно-рецессивной миодистро­ фии Фукуяма (Arahata et al., 1989; Francke et al., 1989), спи­ нальной амиотрофии (Clarke et al., 1989), тазовопоясной ми­ одистрофии Лейдена-Мебиуса (Arikawa et al., 1991). Во всех этих случаях проводится корректировка диагноза в пользу миодистрофии Дюшенна/Беккера.

ГЧ

Ри

I

с

о

м

14

О

Э

с 3. Идентификация делеций в гене дистрофина методом множественной полимеразной цепной реакции

Однако для обнаружения гетерозиготного носительства делеции у матери больного ребенка метод мультиплексной ПЦр не может быть использован. В ряде случаев носительство деле­ ции удается установить по появлению фрагментов ДНК необыч­ ного размера (junction fragments) при проведении блот гибриди­ зации рестрицированной геномной ДНК с внутригенными кДНКзондами. Однако такие фрагменты обнаруживаются не более чем в 17% случаев делеций в гене DMD. Для выявления гетеро­ зиготного носительства делеций, дупликаций или инсерций в гене DMD в общем случае был разработан метод обратной ПЦР (RT PCR), основанный на изоляции специфической мРНК, обрат­ ной транскрипции и использования образовавшейся кДНК в качестве матрицы для проведения мультиплексной амплифи­ кации всей кодирующей области гена (Roberts et al., 1990). По­ сле электрофоретического разделения продуктов амплифика­ ции фрагменты ДНК необычного размера образуются при лю­ бых структурных внутригенных перестройках, находящихся как в гемизиготном, так и в гетерозиготном состоянии. Таким обра­ зом, обратная ПЦР является наиболее эффективным методом молекулярной диагностики делеций не только у пациентов с миодистрофией Дюшенна/Беккера, но и у их родственников. Ген миодистрофии Дюшенна может быть вовлечен так­ же в другие структурные перестройки (Ни et al., 1989). Так, у 5% пациентов наблюдаются дупликации одного или несколь­ ких экзонов. В относительно небольшом проценте случаев у больных обнаружены микроделеции, захватывающие от 1 до нескольких нуклеотидов, а также много нонсенс-мутаций, повидимому, из-за присутствия в гене DMD большого количе­ ства глютаминовых триплетов, мутации в которых часто при­ водят к образованию стоп-кодонов. Крайне редки миссенсмутации (Roberts et al., 1992а; 1992b). Молекулярная диагностика мутаций неделеционного типа чаще всего осуществляется косвенными методами. В началь­ ный период исследований для этих целей использовали внутригенные полиморфные сайты рестрикции (табл. 3 и 4). В даль­ нейшем в гене миодистрофии Дюшенна были обнаружены мно42

^численные микросателлитные гипервариабельные последоаательности, отличающиеся очень высоким уровнем информа­ тивности (Beggs, Kunkel, 1991; Feener et al., 1991). В табл. 5 пред­ ставлена характеристика полиморфных микросателлитных по­ второв, локализованных в гене DMD. Наиболее удобными для пренатальной диагностики миодистрофии Дюшенна являются аллельные варианты динуклеотидных СА повторов в интронах 49 и 50 — STR-49; STR-50 (Chen et al., 1989; Abbs et al., 1990; 1991;Beggs etal., 1989; 1990; 1991; Clemens etal., 1991;Oudet etal., 1991; Евграфов, Макаров, 1991). Таблица 5 Микросателлитные полиморфные маркеры гена дистрофина Повтор

Маркер

DYSI DYSII DYSIII DYSIV DYSMSB DYSMSA DMD-44 DMD-45 UMD-49

Уровень гетерозиготности (PIC) 5'-нетранслируемая 0.586 - 0.786 область Локализация

(ТА)11(СА)6 (СА)23 (ТА)11(СА)10 TACA(TG)5(TA)4TG 5'-нетранслируемая 0.25 (TG)29 область 0.57 интрон 1 (TG)21 (CA)n (CA)n (CA)n (CA)n (CA)n (CA)8TA(CA)7 (TTGA)n

интрон 44 интрон 45 интрон 49 интрон 50 З'-нетранслируемая область З'-нетранслируемая область

>0.8 >0.8 >0.8 >0.8 0.35 0.46

З'-нетранслируемая 0.17 область

Для всех представленных в табл. 5 вариабельных по* второв разработана простая и эффективная система их ге* нотипирования с помощью ПЦР, то есть для всех этих сайтов подобраны системы праймеров из уникальных смежных об* ластей ДНК. Для того чтобы избежать ошибок косвенной диагностики, связанных с возможностью внутригенной реком­ бинации, необходимо использовать несколько полиморфных маркеров, фланкирующих ген DMD. 4. Структура и функции дистрофина Основным продуктом гена DMD в мышцах является структурный белок с молекулярной массой в 427 кД — дис­ трофин, имеющий стержневидную форму с длиной около 125 нм. Это полифункциональный белок, участвующий в форми­ ровании нейромышечного синапса и в поддержании целост­ ности мембраны мышечного волокна при его сокращении (Sealock, Froehner, 1994). Дистрофин относится к числу минорных белков, его со­ держание по отношению к общему белку мышц составляет всего 0.002% и поднимается до 5% среди мембранных бел­ ков цитоскелета. В мышцах дистрофин локализован на цитоплазматической поверхности сарколеммы. В нейромышечных соединениях он является компонентом постсинаптической мембраны и участвует в синаптогенезе. В мышечно-сухожильных соединениях дистрофин ко-локализован с талином, винкулином и утрофином — продуктом аутосомного го­ молога гена DMD (см. ниже).Мышечно-сухожильные соеди­ нения являются основным сайтом силовой трансмиссии. Это также место локализации контакта между актиновым цитоскелетом и внеклеточным матриксом, при этом дистрофин и утрофин концентрируются именно в точках данных специа­ лизированных контактов. Дистрофин принадлежит к спектрин/ос-актининовому суперсемейству белков цитоскелета (Koenig et al., 1988). Он состоит из 4 отдельных доменов (рис. 4), обнаружива­ ющих много общих черт со спектрином и ос-актинином. Так,

44

isl-концввой домен дистрофина имеет сходство с большим семейством актинсвязывающих белков, и в частности — с isi-концевыми доменами а-актинина и р-спектрина. Во всех типах клеток эти белки выполняют структурную роль при физиологических, статических и динамических клеточных процессах. Наиболее крупный домен, обеспечивающий гибкость молекулы, имеет структуру трехгранного стерж­ ня. Он образован 24 слегка повторяющимися сегментами, каждый из которых содержит около 110 аминокислотных остатков, а-актинин содержит четыре подобных повтора, а спектрины — 17 или более. Следующий за стержневым участком цистеин-богатый домен, состоящий из 150 ами­ нокислот, сходен с СООН-фрагментом А-актинина и содер­ жит два неполных Са 2 + -связывающих мотива. Для послед­ него 420-аминокислотного С-концевого домена не найде­ но гомологии с другими белками. Последовательности цистеин-богатого и С-концевого доменов дистрофина высо­ коконсервативны, что указывает на их особую функцио­ нальную значимость. В С-концевом домене обнаружены многочисленные потенциальные сайты фосфорилирования, в том числе для МАР-киназы, p34cdc2-, СаМ- и казеино­ вой киназы. Это предполагает возможность участия дис­ трофина в трансдукции сигналов через сарколемму мы­ шечного волокна (Michalak et al., 1996).

Рис. 4. Модель молекулы дистрофина ст

После расшифровки аминокислотной последовательнои белка была предложена схема его функционирования,

45

согласно которой дистрофин в цитоплазме клетки распоп^ гается под сарколеммой мышечного волокна в виде перепле* тенного антипараллельного димера (рис. 5). N-конец дистро. фина связан с цитоплазматическим актином, причем имеет большее сродство (аффинитет) не с саркомерным, а с немы* шечным F-актином. Таким образом, дистрофин не связан напрямую с сократительным аппаратом мышечного волок­ на, а соединен с субмембранной сетью цитоплазмы, образо­ ванной н е м ы ш е ч н ы м а к т и н о м (Ervasti, Campbell 1991; Monaco, 1989). Точнее, дистрофин взаимодействует с G-актиновыми мономерами и способствует G->F актиновой транс­ формации, которая стимулируется Са + -зависимым присутст­ вием кальмодулина (Fabbrizio et al., 1995b). Дистрофин явля­ ется якорным белком для актина и таким образом он вовле­ чен в контроль деформации поверхности клеточной мембра­ ны и в развитие F-актиновой сети, обеспечивающей жест­ кость цитоскелета миотубул.

Рис. 5. Расположение дистрофина под сарколеммой мышечного волокна С-конец дистрофина соединен с трансмембранным комплексом, состоящим из белков с молекулярными веса­ ми 156, 59, 50, 43, 35 и 25 кД (Ervasti, Campbell, 1991). Эти 46

* ки получили название дистрофин-ассоциированных белков (DAP) или дистрофин-ассоциированных гликопротеинов (DAG). Дистрофин-гликопротеиновый комплекс уча­ ствует в регуляции внутримышечного уровня кальция, обес­ печивая связь кальциевого комплекса с цитоскелетом клет­ ки, и не исключено, что сам этот комплекс является каль­ циевым каналом. 156DAG, 50DAG, 43DAG и 35DAG содер­ жат аспарагин-связанные олигосахариды, то есть являют­ ся гликопротеинами. 156DAG дополнительно содержит тер­ минально сиализированные серин/треонин-связанные оли­ госахариды, что, по-видимому, обеспечивает его повышен­ ную устойчивость к действию протеаз. При этом сам дис­ трофии и 59DAP относятся к элементам цитоскелета, 156DAG располагается на внешней стороне мембраны, в то время как остальные белки комплекса интегрированы с мембраной. У больных с миодистрофией Дюшенна/Бекке­ ра и с другими аутосомно-рецессивными дюшенно-подобными миодистрофиями, а также с некоторыми формами конечностно-поясных миодистрофии этот комплекс оказы­ вается частично или полностью разрушенным. Дистрофии способен взаимодействовать с рядом дру­ гих белков, не входящих в описанный выше комплекс. Так, лигандом для дистрофина служит ацикулин — неэнзиматический белок, родственный фосфоглюкомутазе первого типа. В мышцах ацикулин ведет себя подобно типичному дистрофин-связанному белку, располагаясь в сарколемме. Недавно было показано, что дистрофии ассоциирован так­ же с синтетазой окиси азота нейронального типа — nNOS (Brenman et al., 1995). В скелетных мышцах nNOS соеди­ няется с сарколеммой через дистрофин-гликопротеиновый комплекс белков. Еще одним ассоциированным с дистроФином белком является мышечный кавеолин-3 — сарколеммный белок, являющийся главным компонентом каве0Л плазменных мембран. Сконструированы антитела на различные антигенные Детерминанты дистрофина, нашедшие широкое примене47

ние для его иммунодетекции непо­ средственно в белковом лизате мышц и на г и с т о л о г и ч е с к и х п р е п а р а т а х (Hoffman et al., 1989а; 1989b; Arahata et al., 1989). В последнем случае спе­ цифическая о к р а с к а на дистрофин а. располагается по периферии клеток (рис. 6). Как правило, у больных с ми­ одистрофией Дюшенна либо вовсе не обнаруживается иммунореактивных форм белка, либо мутантный белок обнаруживается лишь при использо­ вании определенных антисывороток, чаще всего на аминотерминальную часть белка. В мышцах гетерозигот наблюдаются локальные области от­ сутствия иммуноокрашивания на дис­ трофин. При форме Беккера биохими­ ческие аномалии дистрофина выявля­ ются в виде прерывистого характера окрашивания мышц, что свидетельст­ вует о дефектах в структуре цитоске­ лета миофибрилл. Иммунологический Рис. 6. Иммуноанализ является наиболее простым гистохимический анализ дистрофина способом диагностики гетерозиготно­ го носительства мутаций в гене DMD в мышечных у родственниц пробанда. Однако для клетках его осуществления необходимо про­ водить биопсию мышц. В настоящее а — норма, б — миодистрофия время иммуногистохимические мето­ ды анализа с применением антисыво­ Дюшенна, роток на разные районы дистрофина в — гетерозиготы активно используются не только при (стрелками медико-генетическом консультирова­ показаны зоны нии и проведении пренатальной диа­ отсутствия гностики (Bieber et al., 1989; Ginjaar дистрофина). 48

etal., 1989; Bulman et al., 1991), но и при изучении молеку­ лярных основ патогенеза миодистрофии (Hurko etal., 1989). У некоторых пациентов с миопатией Дюшенна при иммуногистохимическом окрашивании мышц обнаруживают­ ся редкие дистрофин-положительные волокна. При этом в случае использования антител с антигенными детерминан­ тами, кодируемыми делетированным участком гена, окра­ шивания не происходит, и это позволяет отвергнуть гипо­ тезу соматического м о з а и ц и з м а . Наиболее вероятный механизм такого явления — возникновение второй сома­ тической делеций в мышечной ткани, компенсирующей едвиг рамки считывания, происходящий вследствие основ­ ной делеций. В результате мутантный локус может цели­ ком транскрибироваться и транслироваться с образовани­ ем стабильного, хотя и аномального дистрофина (Klein et al., 1992). 5. Регуляция транскрипции и сплайсинга гена DMD. аподистрофины В соответствии с современными представлениями ог­ ромный ген DMD находится под контролем сложной системы регуляции транскрипции и сплайсинга (Ahn, Kunkel, 1993). Показано, что транскрипция DMD осуществляется со сред­ ней скоростью 2.4 кб в минуту, так что для образования пол­ норазмерного РНК-транскрипта требуется 16 часов (Tennyson et al., 1995). Одновременно до окончания синтеза РНК, то есть ко-транскрипционно, начинается сплайсирование пер­ вичного РНК-транскрипта. При этом скорость накопления "Фанскриптов на З'-конце гена уменьшается по сравнению с бЧонцом, возможно, за счет преждевременной терминации транскрипционных комплексов. По крайней мере, восемь независимых промоторов осуществляют альтернативную специфическую транскрипцию ° M D В разных тканях и на разных стадиях эмбрионального Развития (табл. 6).

Таблица 6 Изоформы дистрофина Изоформы Размер дистрофина мРНК(кб)

Локализаци промотора

Экспрессия

мышечный

14

мозговой

14

5'-UTR область сердечная и скелетные мышцы кора и гиппокамп 1 интрон

мозговой 1 - Dp71

14 4.5-4.8

1 интрон 63 интрон

клетки Пуркинье повсеместно, кроме мышц

2-Dp116

5.5

56 интрон

периферические нервы

3 - Dp40

2.2

Dpi 40 Dp260

7.5

повсеместно, кроме мышц 44 интрон

эмбриональные нейроны сетчатка

Один промотор мышечного типа (М) и два мозгового, активные в кортикальном отделе мозга (С) и в клетках Пур­ кинье (Р) соответственно, экспрессируют полноразмерную молекулу дистрофина, в то время как пять других промото­ ров (среди них R, ВЗ, S, G) обеспечивают экспрессию по­ следних доменов взаимоисключающим способом, главным образом в немышечных и в немозговых тканях. Основным продуктом DMD в сердечной и скелетных мышцах является 14-кб РНК-транскрипт. В различных отделах мозга продуци­ руются три полноразмерные формы дистрофина с разных промоторов, а соответствующие транскрипты различаются по первому экзону (Chamberlain et al., 1988b; Nudel et al., 1989; Boyce et al., 1991). Один из промоторов мозгового типа (С) расположен в первом интроне DWD на расстоянии более 90 кб от мышечного промотора (Celly et al., 1990; Gorecki et al., 1992). 14-кб мРНК — продукты дистрофинового гена мышеч-

50

н ого и мозгового типа, различающиеся по структуре первого экзона, одновременно присутствуют в нейронах коры и гиппокампа, и дополнительный полноразмерный транскрипт иден­ тифицирован в клетках Пуркинье. В последнем случае транс­ крипт также отличается от двух известных продуктов по струк­ туре первого экзона, который оказался локализован в большом интроне между мышечным промотором и вторым экзоном гена. Все образующиеся при этом формы дистрофина имеют неболь­ шие отличия в N-концевом участке белка. В немышечных тканях и в клеточных линиях найдено множество укороченных форм дистрофина — апо-дистрофинов, образующихся за счет альтернативной транскрипции — Dp40, Dp71, D p i 16, D p i 4 0 , Dp260. Цифры в названии этих белков соответствуют молекулярным весам соответствующих апо-дистрофинов. Dp71, или апо-дистрофин-1, по-видимому, является основным продуктом гена DMD в немышечных тка­ нях, включая ткани мозга (Lederfein et al., 1993а; 1993b; Bar etal., 1990). В Dp71 присутствует С-концевой домен дистро­ фина и часть цистеин-богатого, а также 7 дополнительных аминокислот на N-конце белка. Содержание этого белка в некоторых тканях сопоставимо с количеством дистрофина в мышцах, и особенно обильно он представлен в клетках Шванна, где дистрофии отсутствует (Blake et al., 1992). В скелет­ ных мышцах взрослых Dp71 отсутствует, тогда как в мышцах плода наряду с дистрофином экспрессируется и апо-дистрофин-1. Уровень мРНК Dp71 в культуре дифференцирующих­ ся миобластов сохраняется стабильным, тогда как содержа­ ние белка в процессе дифференцировки значительно возра­ стает, что указывает либо на его большую стабильность по сравнению с полноразмерным дистрофином, либо на возмож­ ность изменений в эффективности трансляции (Tennyson et a '-i 1996). мРНК-транскрипт Dp71 более устойчив по сравне­ нию с полноразмерным транскриптом, так как период его полураспада составляет около 20 часов, тогда как для мРНК Дистрофина — только 16 часов (Tennyson et al., 1995). Иден­ тифицированы различные изоформы апо-дистрофина-1, об-

51

разующиеся за счет альтернативного сплайсинга последних экзонов гена DMD. Характерным для Dp71 является сплайсирование экзона 78. D p i 16 и D p i 4 0 и Dp260 в дополнение к С-концевым доменам имеют дистальные области стержневого домена дистрофина различной протяженности. Все эти белки так­ же связаны с клеточными мембранами, однако их функ­ ции остаются в значительной степени неясными. Апо-дистрофин-2 — D p i 16, преимущественно экспрессируется у взрослых в периферических нервах. Размер мРНК самого маленького апо-дистрофина-3 (Dp40) составляет 2.2 кб (Tinsley et al., 1993). Чисто нейрональной изоформой дис­ трофина является D p i 4 0 (Morris et al., 1995). Наиболее интенсивная экспрессия этого белка в мозге наблюдается в эмбриональном периоде. Трансляция D p i 4 0 начинается с 51 э к з о н а гена дистрофина, а промотор и первый экзон этой последовательности локализованы в 44 интроне гена DMD. Показано, что снижение интеллекта, которое харак­ терно для части больных с миодистрофией Дюшенна, до­ стоверно коррелирует с делециями в районе экзонов 4052 гена DMD. Эти делеции могут затрагивать синтез или функции D p i 4 0 . В плексиформном слое сетчатки глаза избирательно э к с п р е с с и р у е т с я изоформа дистрофина Dp260. Этот апо-дистрофин участвует в контроле нормаль­ ной электрофизиологической функции сетчатки (D'Souza et al., 1995). Апо-дистрофины, так же как и полноразмер­ ные дистрофины, способны взаимодействовать с белками дистрофин-ассоциированного комплекса. Однако из-за отсутствия в их структуре N-терминальной части дистро­ фина эти белки не способны взаимодействовать с акти­ ном и потому их функции не связаны с поддержанием це­ лостности мембран мышечных волокон. Уровень транскрипции полноразмерного мышечного дистрофина в процессе дифференцировки миобластов воз­ растает примерно в 10 раз. Однако активность мышечного промотора в зрелых миофибриллах в 30 раз ниже, чем в 52

незрелых мышечных волокнах — миотубулах, что указы­ вает на существование дополнительных транскрипционных элементов, вовлеченных в регуляцию экспрессии гена DMD s мышцах (Klamut et al., 1996). Одним из них является 5-кб энхансер, локализованный внутри первого мышечного интрона. Этот элемент специфическим образом активирует­ ся в мышцах. В генно-инженерных опытах in vitro было по­ казано, что мышечный DMD-энхансер обеспечивает повы­ шенный уровень экспрессии генов-репортеров независи­ мо от своего положения и ориентировки. По-видимому, существуют и дополнительные подобные элементы в дру­ гих частях гена DMD. Высококонсервативные последовательности шести экзонов, кодирующих С-конец дистрофина, альтернативно сплайсируются, образуя несколько структурно различающих­ ся изоформ дистрофина, осуществляющих различные функ­ ции. Очевидно, что продукты дистрофинового гена могут вза­ имодействовать со множеством различных белков и не толь­ ко в мышечных и нейрональных тканях (Monaco, 1989). В настоящее время функции многочисленных изоформ дистро­ фина, обильно экспрессирующихся в различных специали­ зированных тканях и способных взаимодействовать со мно­ жеством белков и не только мышечного или нейронального происхождения, изучены явно недостаточно. 6. Риртрпфин-ассоииированный комплекс белков Связь цитоскелета мышечной клетки с экстраклеточ­ ным матриксом осуществляется за счет взаимодействия полноразмерного дистрофина с дистрофин-ассоциированным комплексом белков. При разрушении этого комплек­ са мышечные волокна теряют свою структурную целост­ ность и погибают. Кроме того, связывание различных изоФ°рм дистрофина с сарколеммой необходимо для их нор­ мального функционирования в центральной нервной сис­ теме. Оказалось, что дистрофин-ассоциированный к о м ­ плекс белков имеет гораздо более сложную структуру, чем

53

это представлялось вначале, и в нем могут быть выделены три отдельных субкомплекса — дистрогликановый, саркогликановый и синтрофиновый (рис. 7).

Рис.

7. Дистрофин-ассоциированный комплекс белков

В первый субкомплекс входят два гликопротеина, яв­ ляющиеся коровыми белками для всего комплекса — боль­ шой экстраклеточный белок ct-дистрогликан (156DAG) и не­ посредственно взаимодействующий с ним трансмембранный р-дистрогликан (43DAG или АЗа). Заякоревание дистрофина на внутренней поверхности сарколеммы обеспечивается за счет его связывания с цитоплазматическим хвостом р-дистрогликана (Suzuki et al., 1994). а-дистрогликан, взаимодей­ ствуя с компонентом базальной мембраны ламинином 2 (или мерозином), обеспечивает связь между внеклеточным матриксом и сарколеммой, а через дистрофин — и с цитоскелетом клетки. Ламинин-связанный а-дистрогликан, соединен­ ный с экстраклеточным участком р-дистрогликана, форми54

рует дистрогликановый субкомплекс (Suzuki et al., 1995). Уча­ сток связывания дистрофина с р-дистрогликаном, начинаю­ щийся в цистеин-богатом районе дистрофина и захватываю­ щий часть концевого С-домена, имеет огромное значение для функционирования полноразмерных и укороченных изоформ дистрофина. Так, одна из редких миссенс-мутаций в гене DMD — C3340Y, сопровождающаяся заменой консерватив­ ного цистеина в дистрогликан-связывающем домене, приво­ дит к тяжелой форме миодистрофии Дюшенна в комплексе с умственной отсталостью и отсутствием b-волны на электроретинограмме (Lenk et al., 1996). Участок связывания дис­ трофина с р-дистрогликаном содержит три пептидных моти­ ва, найденных в других неродственных дистрофину белках — WW, EF, ZZ. Эти мотивы кодируются экзонами (63), (65-66), (68-69), соответственно. Интересно, что р-дистрогликан спо­ собен связываться с src-гомологичным доменом SH3 одного из адапторных белков (Grb2). SH3 — высококонсервативная некаталитическая последовательность, участвующая в обра­ зовании стабильного комплекса между scr-киназами и дру­ гими сигнальными молекулами, включая рецепторы. Пред­ полагается, что b-дистрогликан взаимодействует с WW-участ­ ком дистрофина посредством атипичных ЭНЗ-связывающих модулей (Yang et al., 1995). EF-последовательность может уча­ ствовать в связывании кальция. ZZ-мотив способен связывать бивалентные катионы металлов, в частности цинка. Показано, что а- и р-дистрогликаны являются альтер­ нативными продуктами одного гена DAG1, картированного в области 3р21 (Ibragimov-Beskrovnaya et al., 1992; 1993). Со­ ответствующий белковый продукт, транслирующийся с мРНК размером 5.5 кб, расщепляется на две нековалентно-ассоЦиированные субъединицы — а и р . Ген DAG1, состоящий из Двух разделенных большим интроном экзонов, экспрессирувтся во множестве типов тканей. В опытах на мышах пока­ зан высокий уровень экспрессии этого гена в раннем эмбри­ огенезе. Дистрогликаны обнаруживаются в децидуальной ткан и уже на периимплантационной стадии развития (Yotsumoto 55

et al., 1996). По-видимому, в этот период они выполняют роль медиаторов для адгезии между децидуальными клетками или между децидуальными и трофобластными клетками. Присут­ ствие дистрогликанов необходимо для формирования одной из первых оболочек зародыша — Рейхеротовской мембра­ ны (Williamson et al., 1997). Роль дистрогликанов в различных специализированных тканях во многом остается неясной. В нейромышечных соединениях а-дистрогликан явля­ ется функциональным рецептором для агрина — нейронально секретируемого гликопротеина, индуцирующего кластерирование ацетилхолиновых рецепторов и последующую реор­ г а н и з а ц и ю п о с т с и н а п т и ч е с к о г о цитоскелета (Sealock, Froehner 1994). В ряде работ было показано, что в культиви­ руемых миотубулах антидистрогликановые антитела ухудша­ ют кластерирование ацетилхолиновых рецепторов (Campanelli et al., 1994; Gee et al., 1994). Показано, что домен агрина, ответственный за кластерирование ацетилхолиновых рецеп­ торов, физически отделен от домена, осуществляющего связь с дистрогликаном (Gesemann et al., 1996). Поэтому представ­ ляется более вероятным, что дистрогликан трансдуцирует сигнал от агрина для начала кластерирования ацетилхолино­ вых рецепторов через промежуточный белок, которым, по всей видимости является перлекан (Peng et al., 1999). Не ис­ ключено, что именно через эту связь осуществляется учас­ тие дистрофина в синаптогенезе. Другой саркогликановый субкомплекс формируется четырьмя трансмембранными белками и включает а-саркогликан (50DAG или адхалин или А2), р-саркогликан (43DAG или АЗЬ), у-саркогликан (35DAG или А4) и 5-саркогликан (35DAG). В этот субкомплекс, по-видимому, входит 25DAP (А5 или саркоспан). Связь саркогликанового субкомплекса с дистрофином осуществляется посредством его взаимодействия с цитоплазматическим участком 35DAG. Для сохранения ста­ бильности всего саркогликанового комплекса особое значе­ ние имеет карбокси-терминальный район у-саркогликана. В настоящее время все гены, кодирующие саркогликаны, кар56

тированы и клонированы. Мутации в саркогликановых генах являются причиной развития различных аутосомно-рецессивн ь 1 Х дюшенно-подобных и конечностно-поясных миодистрофии. Третий синтрофиновый субкомплекс образован четырь­ мя ассоциированными с дистрофином цитоплазматическими белками — тремя 59DAP, получившими название синтрофинов или А1 триплета (а-А1, р1 -А1 и р2-А1), а также минор­ ными белками комплекса, относящимися к группе дистробревинов (АО). Синтрофины связываются с участком С-кон­ цевого домена дистрофина, кодируемым экзонами 73-74, альтернативно сплайсирующимися во многих типах тканей на разных стадиях развития (Suzuki et al., 1994; Ahn, Kunkel, 1995). В частности, р1-синтрофин специфически связывает­ ся с расположенной в концевом С-домене последовательно­ стью из 53 аминокислот, кодируемой 74 экзоном дистрофи­ на. а-синтрофин связывается с другим участком дистрофи­ на, локализованным в непосредственной близости от сайта связывания р1-синтрофина (Suzuki et al., 1995). Возможно, дистробревин участвует в связи между дистрофином и саркогликановым субкомплексом. Синтрофины, по-видимому, являются сигнальными медиаторами, так как они содержат протеин-связывающие домены (PDZ). Они могут опосредо­ вать соединение дистрофин-ассоциированного комплекса белков с киназами, натриевыми каналами и nNOS. Предпо­ лагается также их участие в пострансляционных модифика­ циях DAP-комплекса в мышцах в ответ на изменение меха­ нического стресса. Синтрофины, локализованные в нейромышечных соединениях, и в первую очередь р2-синтрофин, по-видимому, принимают участие в синаптогенезе. Дистробревины относятся к семейству дистрофинРодственных белков. Их гомология с дистрофином в обла­ сти цистеин-богатого домена достигает 57%. Ген дистробРевина картирован в области 18q12.1-12.2 и кодирует се­ мейство белков, главными изоформами которых в мышЧах являются дистробревин-1 (94 кД), дистробревин-2 (62 КД) и дистробревин-3 (42 кД) (Sadoulet-Puccio et al., 1996; 57

Metzinger et al., 1997). Обнаружено не менее 5 различных транскриптов гена дистробревина, три из которых присут­ ствуют в м о з г е . Фосфорилированный по тирозину дистробревин с молекулярной массой 94 кД имеет 9 0 % гомоло­ гии с 87 кД постсинаптическим белком электрического ска­ та Torpedo (Wagner et al., 1993). He исключено участие дистробревинов в синаптогенезе, так как они вычищаются в к о м п л е к с е с ацетилхолиновыми р е ц е п т о р а м и . Хотя у Torpedo дистробревин также ассоциирован с синтрофинами и дистрофином, прямого взаимодействия между этим к о м п л е к с о м и ацетилхолиновыми рецепторами не обнару­ жено. Иммуногистохимические исследования показывают, что уровни дистробревина в сарколемме пациентов с мио­ дистрофией Дюшенна и, в меньшей степени, Беккера рез­ ко с н и ж е н ы . Однако присутствия дистрофина недостаточ­ но для правильной локализации дистробревинов в сарко­ л е м м е , так как аналогичное снижение наблюдается и у пациентов с конечностно-поясными мышечными дистро­ ф и я м и , обусловленными дефектами в саркогликановых генах. В целом организация дистрофин-гликопротеинового комплекса очень сходна со структурой кадхеринов или интегринов, а сам этот комплекс является важнейшим эле­ ментом архитектуры мышечных клеток. Очевидно, что во многих типах клеток позвоночных белки дистрофинового семейства выполняют критическую роль в поддержании ас­ социированных с мембраной комплексов в местах меж­ клеточных контактов. Но на этом их функция не ограничи­ вается. Наличие многочисленных сайтов фосфорилирования в цистеин-богатом домене, присутствующем во всех дистрофин-родственных белках, и возможность его связы­ вания с кальцием, магнием и кальмодулином доказывают активное участие этих белков в передаче сигналов через мембрану мышечного волокна (Michalak et al., 1996).Для большинства дистрофин-ассоциированных белков выпус­ каются в настоящее время коммерческие антитела. 58

На рис. 8 схематически изображены связи между бел­ ками дистрофин-ассоциированного комплекса.

Рис. 8.

Связи между белками дистрофин-ассоциированного комплекса

7. Анализ корреляций генотип-фенотип. Дюшенно-подобные аутосомно-реиессивные миопатии Анализ корреляций между клиническим течением ми­ одистрофии Дюшенна/Беккера и делециями без сдвига рам­ ки считывания, затрагивающими специфические домены белкового продукта DMD, позволяет строить своеобразную «патофункциональную» карту дистрофина (Ahn, Kunkel, 1993). Показано, что N-концевые делеций приводят к гете­ рогенным, но достаточно серьезным формам Б е к к е р а . Делеций проксимальной части стержневого домена связа­ ны с очень м я г к и м или атипичным фенотипом, тогда как Дистальные делеций этого же домена дают типичные фор-

59

мы Беккера. За некоторым исключением делеции двух Сконцевых доменов реализуются в виде миодистрофии Дю­ шенна. У больных с миодистрофией Дюшенна/Беккера коли­ чественное содержание всех белков гликопротеинового комплекса, в том числе и внеклеточного альфа-дистрогликана (156DAG), значительно понижено и одновременно повышен уровень кальция скелетных мышц, "аким обра­ з о м , аномальная экспрессия дистрофина может оказывать влияние на внешние компоненты мышечных вогокон вслед­ ствие разрушения дистрофин-ассоциированно'о комплек­ са, нарушения целостности или эластичности сарколеммы, ведущего либо к ее механическому повреждению, либо к изменению механизмов регуляции кальция. Потеря экс­ траклеточного гликопротеина является, по-видимому, пер­ вым шагом в молекулярной цепи патогенеза данных форм миодистрофии. Не исключено, что делеции в некодируюдих облас­ тях DMD, специфическим образом нарушающее экспрес­ сию определенных изоформ дистрофина вследствие изби­ рательного разрушения промоторных областей для соот­ ветствующих транскриптов, могут реализоваться в сцеп­ ленные с полом заболевания, не сопровождающиеся мы­ шечной дистрофией. Так, было показано, что делеции об­ ласти локализации мышечного промотора, а также точковые мутации в 5'-сайте сплайсинга первого экзона DMD являются причиной одной из форм тяжелой Х-сцепленной дилатационной кардиомиопатии, протекающей без прояв­ лений симптомов мышечной слабости (Muntoni etal., 1995а; Milasin et al., 1996). Распространенность дилатационной кардиомиопатии в США составляет 36.5 на 100 000. При­ мерно для 2 0 % подобных случаев показано менделевское наследование различного типа — аутосомно-доминантное, аутосомно-рецессивное и сцепленное с полом. При этом не наблюдается никаких клинических различий между се­ мейными и спорадическими случаями заболевания. Гене60

тический анализ семей, в которых наблюдалась сегрега­ ция по сцепленной с полом форме дилатационной кардио­ миопатий, показал, что ген, ответственный за развитие заболевания, локализован в той же области Х р 2 1 , где на­ ходится ген DMD (Towbin et al., 1993). Спустя некоторое время у ряда больных с семейной Х-сцепленной формой дилатационной кардиомиопатий, так же как и в нескольких спорадических случаях у мужчин, были идентифицирова­ ны мутации в гене DMD. Это были либо делеции,затрагивающие регуляторную область и первый экзон DMD, либо сплайсинговые мутации, локализованные в начале перво­ го интрона гена дистрофина (Yoshida et al., 1993; Muntoni et al., 1995b; Milasin et al., 1996). У трех пациентов с Х-сцеп­ ленной дилатационной кардиомиопатией из двух неродст­ венных японских семей была обнаружена уникальная инсерция транспозоно-подобного элемента L1 в первом экзоне гена DMD (Yoshida et al., 1998). В дальнейшем были определены начальные этапы молекулярного патогенеза подобных форм дилатационной кардиомиопатий. Оказа­ лось, что идентифицированные мутации приводят к полно­ му отсутствию мышечной изоформы дистрофина у боль­ ных. Кроме того, в миокарде пациентов отсутствует экс­ прессия двух других полноразмерных изоформ мРНК дис­ трофина, транскрибирующихся с промоторов мозгового типа. В отличие от этого, в скелетных мышцах наблюдает­ ся достаточно высокий уровень двух полноразмерных изо­ форм дистрофина мозгового типа и потому сохраняется дистрофин-гликопротеиновый комплекс. В сердечной мыш­ це не происходит компенсаторной экспрессии дистрофина с альтернативных промоторов и дистрофин-гликопротеино­ вый комплекс полностью разрушен, несмотря на присутст­ вие там апо-дистрофина-1. В результате у пациентов раз­ вивается дилатационная кардиомиопатия без каких-либо проявлений слабости скелетной мускулатуры. п

Вскоре вслед за описанием молекулярного дефекта Ри Х-сцепленной дилатационной кардиомиопатий у боль61

ных с аутосомно-рецессивными формами заболевания были обнаружены мутации в двух группах генов. Одни гены оказались связаны с белками дистрофин-ассоциированного комплекса, такими как а-дистрогликан, а- и у-саркогликаны, другие гены — с белками цитоскелета мышечной клет­ к и : метавинкулином, актином, мышечным белком, участ­ вующим в позитивной регуляции миогенеза, так называе­ мым LIM-белком (Towbin, 1998). Примечательно, что иден­ тифицированные у пациентов мутации в актиновом гене приводили к дефекту того домена актина, который участ­ вует во взаимодействии с дистрофином. Дефект 5-саркогликана найден в линии хомячка BI014.6 с кардиомиопатией. Все эти факты свидетельствуют о центральной роли дис­ трофин-ассоциированного комплекса в функционировании кардиомиоцитов. Не исключено, что и приобретенные фор­ мы дилатационной кардиомиопатии, доля которых дости­ гает 3 0 % от общего числа дилатационных кардиомиопатии, связана с нарушением нормальной работы дистрофина. Энтеровирусы, и в частности вирусы К о к с а к и , способны индуцировать дилатационную кардиомиопатию. Оказалось, что единственным белком человека, который расщепляет­ ся вирусной протеазой 2А, является дистрофин. Это было предсказано на базе компьютерного анализа и подтверж­ дено в опытах in vitro (Badorf et al., 1999). Дистрофин так­ же расщепляется в культивируемых миоцитах, зараженных вирусом К о к с а к и , и in vivo в сердечной мышце инфициро­ ванных мышей. При этом в инфицированных миоцитах от­ сутствует не только дистрофин, но и ассоциированные с ним гликопротеины — а-саркогликан и р-дистрогликан. Очевидно, что разрушение дистрофинового комплекса яв­ ляется одним из центральных звеньев в этиологии дилата­ ционных кардиомиопатии. Экспрессия дистрофина и Dp260 обнаружена во внеш­ нем плексиформном слое сетчатки глаза, где фоторецепторные клетки взаимодействуют с нейронами ганглиев, в то время как другой апо-дистрофин — Dp71 — экспресси62

пуется на внутренней ограничивающей мембране сетчат­ ки и на ее сосудах (Fillers et al., 1993; Howard et al., 1998). у некоторых пациентов с миодистрофией Дюшенна /Бек­ кера и у мышей генетических линий mdx с мутациями в гене Dmd выявлен аномальный характер электроретинограмм, причем степень аномалий зависит от типа мутаци­ онных повреждений.У трансгенных мышей с направленно разрушенным экзоном 52 гена Dmd и отсутствием экспрес­ сии Dp260 изменена локализация р-дистрогликана и обна­ руживаются аномалии на электроретинограмме ( К а т е у а et al., 1998). Показано, что присутствие каждого из двух аподистрофинов — Dp71 и Dp260 — необходимо для пра­ вильной локализации р-дистрогликана, а это взаимодейст­ вие, в свою очередь, имеет важное значение для исполне­ ния нормальной электрофизиологической функции сетчат­ ки. Не исключено, что некоторые мутации в гене DMD, со­ провождающиеся образованием дефектных форм дистро­ фина и аподистрофинов Dp71 и Dp260, могут быть ответ­ ственны за развитие Х-сцепленной формы ночной слепо­ ты, ген которой также картирован в области Х р 2 1 . Кроме того, полноразмерный дистрофии и его укоро­ ченная форма D p i 16 активно экспрессируются во внутрен­ них и внешних волосковых клетках улитки, где эти белки преимущественно располагаются на латеральной поверх­ ности и в синаптических районах (Dodson et al., 1995). Ген, ответственный за развитие одной из моногенных форм нейросенсорной тугоухости, также картирован в области Хр21 недалеко от DMD (Lalvani et al., 1994). Возможно, дистрофины участвуют в трансдукции акустического сигнала в нейрональный и некоторые их дефекты или дефекты дист Рофин-гликопротеинового к о м п л е к с а ответственны за °пределенные типы нейросенсорной тугоухости. Не исклю­ чено также, что делеций в 44-м интроне, «горячей» точке Вн Утригенной рекомбинации, специфически разрушающие п Ромоторную область для наиболее интенсивно экспресСи Рующегося в раннем эмбриогенезе нейронального апо63

дистрофина D p i 4 0 , могут приводить к одной из форм Х-сцепленной изолированной умственной отсталости, ген которой также локализован в области Х р 2 1 . Предполагается, что среди семей с миодистрофией дюшенновского типа в 6.8% случаев наследование осуществ­ ляется по аутосомно-рецессивному типу (Zatz et al., 1989). По оценкам этих же авторов, доля мальчиков с аутосомнорецессивным типом наследования среди изолированных слу­ чаев миодистрофии Дюшенна составляет 2.5-4%. Аномалии дистрофин-связанных белков в сарколемме — первый об­ щий шаг в патологическом процессе, ведущем к некрозу мы­ шечных клеток, не только при Х-сцепленной форме миодист­ рофии Дюшенна, но и при тяжелых аутосомно-рецессивных дюшенно-подобных миодистрофиях, так же как и при миоди­ строфии Фукуяма. Дюшенно-подобные формы миодистрофии представ­ ляют собой генетически гетерогенную группу аутосомнорецессивных заболеваний. Чаще всего такие семьи выяв­ ляют потому, что в них наблюдаются девочки с клиникой миодистрофии Дюшенна. При этом у больных девочек не находят каких-либо структурных аномалий, затрагивающих Х-хромосому. В частности, необычно высокая частота тя­ желой прогрессирующей мышечной дистрофии с аутосомно-рецессивным характером наследования описана в Ту­ нисе (Ben Hamida et al., 1983). Из 93 диагностированных пациентов 75 принадлежали 17 семьям, в которых присут­ ствовали больные обоих полов, и 18 принадлежали 11 се­ мьям, в которых больными были только девочки. Оказа­ лось, что в большинстве случаев аутосомно-рецессивные дюшенно-подобные формы миодистрофии обусловлены мутациями в генах, кодирующих белки дистрофин-ассоци­ ированного комплекса. В табл. 7 суммированы данные по локализации таких генов и их связи с наследственными заболеваниями.

Таблица 7 Связь генов, кодирующих белки дистрофин-ассоциированного комплекса, с наследственными заболеваниями Ген

Белок а-саркогликан, адхалин

SGA, aSG,

Заболевание

Лока­ лизация 17q21

первичная адхалинопатия; SCARMD*); конечностнопоясная миодистрофия 2D; дилатационная кардиомиопатия

ADL, DAG2

р- саркогликан

SGB,

pSG

4q12

конечностно-поясная миодистрофия 2Е; ARMD**

у-саркогликан

SGG,

ySG

13q12

конечностно-поясная миодистрофия 2С; SCARMD; дилатационная кардиомиопатия

S-саркогликан

SGD, 8SG

5q33

конечностно-поясная миодистрофия 2F

а- дистрогликан

DAG1

3p21

дилатационная кардиомиопатия

р- дистрогликан Дистробревин

DAG1

3p21

не найдено

DRP3

18q12.1-1 не найдено 2.2

Ламинин 2, мерозин

LAMA

6q22-q23

*)

миодистрофия врожденная мерозин дефицитная

S C A R M D — т я ж е л а я детская а у т о с о м н о - р е ц е с с и в н а я

мышечная дистрофия. **)

ARMD

аутосомно-рецессивная

мышечная дистрофия

Дюшенновского типа.

В ряде семей с тяжелой формой детской аутосомноРецессивной мышечной дистрофией (SCARMD), впервые описанной в большой тунисской семье, при сохранении нор­ мальных уровней дистрофина наблюдали выраженный дефи­ цит a-саркогликана, называемого иначе адхалином или 50DAG (Matsumura etal., 1992; Piccolo et al., 1995). Во многих

5

^ к а з № 170

65

таких семьях этот дефект является вторичным. В относитель­ но небольшом проценте семей подобный дефект является первичным, то есть обусловлен мутациями в гене а-саркогликана -aSG или ADL, картированном в области 17р21 (McNally et al., 1994). Такая форма очень варьирующей по степени тяжести аутосомно-рецессивной мышечной дистрофии получила на­ звание первичной адхалинопатии. Для пациентов с первич­ ной адхалинопатией характерным является преимуществен­ ное поражение проксимальных мышц, высокие уровни сыво­ роточной креатинкиназы, нормальное содержание дистрофи­ на, сохранный интеллект. Дебют и степень выраженности клинических симптомов могут варьировать от ранних и тя­ желых форм до поздних с минимальными проявлениями мышечной слабости. Примерно в 25% случаев у больных с первичной адхалинопатией обнаруживается однотипная миссенс-мутация R77C в гене ADL (Roberds et al. 1994). Пациен­ ты с этой мутацией были найдены в семьях различного этни­ ческого происхождения из Франции, Германии, Африки, США. В дальнейшем эта форма миопатии была классифицирова­ на, как один из генетических вариантов конечностно-поясных миодистрофии, обусловленных наследственными дефек­ тами белков саркогликанового комплекса. Аномально низкий уровень экспрессии саркогликанов и дистрогликанов обнаружен у пациентов в Японии с врож­ денной аутосомно-рецессивной прогрессирующей мышеч­ ной дистрофией типа Фукуяма, сочетающейся с умствен­ ной отсталостью (см. ниже). Однако и в данном случае эти дефекты являются вторичными, так как прослежено сцеп­ ление заболевания с маркерами длинного плеча хромосо­ мы 9 (9q31-q33). Картированы и клонированы гены, кодирующие другие белки саркогликанового субкомплекса. Мутации в этих генах сопровождаются разрушением этого субкомплекса и реали­ зуются либо в виде различных форм миодистрофии плечево­ го и тазового пояса (Lim et al., 1995), либо в виде аутосомно66

рецессивной мышечной дистрофии (ARMD) дюшенновского типа (Bonnemann et al., 1995). DAG1 рассматривался в качестве кандидатного гена при различных аутосомно-рецессивных формах миодистрофии. Однако до сих пор в этом гене не обнаружено никаких мута­ ций, приводящих к наследственным миопатиям. По-видимо­ му, важная роль дистрогликанов в формировании оболочек плода приводит к тому, что большая часть мутантов по DAG1 гену погибают в раннем эмбриогенезе. Мы уже упоминали о том, что дефекты в а-дистрогликане обнаруживаются у неко­ торых пациентов с аутосомно-рецессивными формами дила­ тационной кардиомиопатий. При иммуногистохимическом анализе биоптатов мышц более 500 пациентов с различными формами миопатии, у которых был сохранен нормальный уровень дистрофина, в 10% случаев наблюдали отсутствие окрашивания на ос-саркогликан (Duggan et al., 1997). В 60% этих случаев были об­ наружены мутации в саркогликановых генах. Большая часть из них (58%) оказалась локализована в гене адхалина, 27% и 13% в генах р- и у-саркогликанов, соответственно. Чаще все­ го такие мутации обнаруживаются у пациентов с тяжелыми дюшенно-подобными формами миодистрофии, дебютирующи­ ми в детском возрасте. Среди проксимальных форм с поздним началом подобные мутации были найдены в 6% случаев. 8. Семейство DMD-родственных генов Обнаружен аутосомный гомолог гена DMD, локализо­ ванный в области 6q24, — ген UTRN или DRP1, кодирующий дистрофин-родственный белок с молекулярной массой в 395 кД — утрофин (табл. 8). Показано, что утрофин в ряде случа­ ев может выступать в качестве функционального гомолога Дистрофина. Геномная область, занимаемая UTRN, почти втрое меньше гена DMD и составляет 900 кб. Размеры РНК"Фанскриптов этих двух генов близки — величина мРНК DMD составляет 14 кб, a UTRN — 13 кб (Blake et al., 1996). Ген UTRN активно экспрессируется в нейромышечных и в мы-

67

шечно-сухожильных соединениях, в мозге и в дополнение к этому во многих других висцеральных тканях, в первую оче­ редь — в легких. Интересно подчеркнуть, что регуляция экс­ прессии генов DMD и UTRN осуществляется, по-видимому, аналогичным образом. Так, обнаружен 5.5-кб транскрипт это­ го гена, преимущественно экспрессирующийся в сенсорных ганглиях и в мозге, кодирующий 113 кД белок G-утрофин, го­ мологичный апо-дистрофину периферических нервов D p i 16 (Blake et al., 1995). Описан также 80 кД утрофин, который, п о - в и д и м о м у , является а у т о с о м н ы м г о м о л о г о м Dp71 (Fabbrizio et al., 1995a). Кроме того, в области Xq22 идентифицирован другой небольшой ген, гомологичный З'-концу DMD — DRP2 (Roberts et al., 1996). Этот ген занимает 45 кб геномной ДНК, его ко­ дирующая область разделена на 24 экзона. Продуктом гена DRP2 является 110-кД белок, состоящий из 956 аминокислот. Ген DRP2 преимущественно экспрессируется в головном и в спинном мозге, и его продуктом является белок, родствен­ ный D p i 16. Прослежена эволюционная связь между дистрофин-родственными генами млекопитающих и их предшест­ венниками у беспозвоночных (Roberts,Bobrow, 1998). По-ви­ димому, у большинства беспозвоночных имеется один ген, кодирующий высококонсервативный дистрофин-родственный белок, в дополнение к гену дистробревина (DRP3), имеюще­ му более отдаленное сходство с дистрофином. Дистрофинродственный ген и ген дистробревина произошли от гена-пред­ шественника путем более ранней дупликации. У позвоноч­ ных дистрофин-родственный ген подвергался серии дупли­ каций, приведших к образованию покрайней мере трех от­ дельных генов (DMD, UTRN и DRP2), способных выполнять различные специализированные функции. Недавно был изолирован ген морского ежа, который, по-видимому, является предшественником генов дистрофи­ на и утрофина (Wang et al., 1998). Более чем 300-кД продукт этого гена содержит покрайней мере 3 из четырех доменов дистрофина. В этом гене также обнаружено несколько про68

моторов и его наименьший продукт, по-видимому, родстве­ нен D p i 16. Предложена модель, согласно которой ген DRP2, кодирующий Ор116-родственный белок, также эволюциони­ ровал от этого гена-предшественника путем дупликации его небольшой части. В настоящее время никаких мутаций в ге­ нах UTRN, DRP2 и DRP3 не описано. Таблица 8 Семейство DMD-родственных генов Ген DMD

Размер Основной Локализация Размер продукт гена (кб) мРНК (Кб) Хр21 2500 14 дистрофии

UTRN, DRP1

6q24

900

13

утрофин

DRP2

Xq22

45

2.8

дистрофин-родственный белок 2

DRP3

18q12.1-12.2

дистробревин

395-кД утрофин также относится к спектрин/а-актининовому семейству белков. Он имеет доменную организацию, гомологичную дистрофину. При этом сходство его актин-связывающего, цистеин-богатого и С-концевого доменов с соот­ ветствующими доменами дистрофина достигает 85—88%. На­ ибольшие различия касаются стержневого домена, состоя­ щего в утрофине из 22 повторяющихся спектрин-подобных сегментов, прерванных двумя петлеобразными районами. G-утрофин содержит уникальный N-конец, небольшой фраг­ мент стержневого домена, включающий два спектрин-подоб­ ных повтора и последний петлеобразный район, а также цистеин-богатый и С-концевой домены утрофина. Показано, что утрофин подобно дистрофину способен взаимодействовать с компонентами дистрофин-гликопротеинового комплекса и

69

выполнять сходные функции, то есть дистрофин и утрофин, по-видимому, являются функциональными гомологами. Дру­ гой дистрофин-родственный белок, кодируемый геном DRP2, содержит короткий пролин-богатый район, два спектрин-подобных повтора стержневого домена и последовательность, гомологичную последующим доменам дистрофина и утрофина — цистеин-богатому и С-концевому. Найдено большое сходство между D p i 16 изоформой дистрофина и дистрофинродственным белком drp2 (Roberts et al., 1996). Хотя точные функции G-утрофина и drp2 неизвестны, они могут подобно апо-дистрофинам связываться с р-дистрогликаном. В раннем эмбриогенезе утрофин присутствует в сарко­ лемме скелетных мышц, занимая сходное с дистрофином положение (Clerk et al., 1993). По-видимому, высокая скорость деления клеток в этот период не позволяет транскрибиро­ ваться такому крупному гену, как DMD. Однако в дальней­ шем дистрофин постепенно замещает утрофин в сарколем­ ме мышц и начиная с 26 недель беременности утрофин там уже не обнаруживается, а экспрессируется только в нейромышечных и мышечно-сухожильных соединениях, причем его локализация в этих сайтах отлична от локализации дистро­ фина. В сердечной мышце утрофин находят в интерколярных дисках, тогда как дистрофин располагается преимущест­ венно по периферии кардиоцитов. Можно считать доказанным участие утрофина в синаптогенезе. Показано, что взаимодействие сс-дистрогликана с агрином и перлеканом, стимулирующее в дальнейшем клас­ терирование ацетилхолиновых рецепторов, осуществляется в тех случаях, когда этот гликопротеин находится в комплек­ се с утрофином. На рис. 9 изображена структура утрофинассоциированного комплекса белков в нейромышечных со­ единениях. Оказалось, что утрофин, в отличие от дистрофи­ на, способен взаимодействовать с рапсином, содержащим 43кД цинк-фингерный домен и принимающим непосредствен­ ное участие в перекрестной сшивке ацетилхолиновых рецеп­ торов с образованием микрокластеров (Phillips et al., 1993). 70

Индукция образования больших кластеров происходит с уча­ стием а-дистрогликана, по-видимому, посредством его взаи­ модействия с ламинином (Chamberlain, 1999). Утрофин мо­ жет играть роль стабилизатора подобных кластеров для уста­ новления точечных контактов между рецепторными агрега­ тами и цитоскелетом. Трансгенное разрушение рапсинового гена у мышей сопровождается образованием аберрантных нейромышечных соединений в результате потери способно­ сти к кластерированию ацетилхолиновых рецепторов, что и приводит к ранней гибели животных (Gautam et al., 1995). Таким образом, рапсин обеспечивает связь между ацетилхолиновыми рецепторами и агрин-связанным утрофин-ассоциированным гликопротеиновым комплексом (Apel et al., 1995). Еще одним отличием утрофин-ассоциированного ком­ плекса белков является его ассоциация с микротрубочками, осуществляемая посредством взаимодействия цистеин-богатого домена утрофина со специфической серин/треонинкиназой (MAST).

Рис. 9. Структура утрофин-ассоциированного комплекса белков в нейромышечных соединениях

Интересно подчеркнуть, что з мышцах пациентов с миодистрофией Дюшенна утрофин присутствует в сарко­ лемме, причем в положениях, характерных для дистрофи­ на. Это связано с посттрансляционными изменениями, а не с увеличением скорости его транскрипции. Подобные нарушения в регуляции распределения утрофина наблю­ даются при дерматомиозитах и полрмиозитах. По-видимо­ му, перераспределение утрофина возникает при регене­ рации мышцы и может служить компенсаторным механиз­ м о м , частично защищающим мышечное волокно от даль­ нейших раундов дегенерации и регенерации. 9. Линии мышей, моделирующие миодистоофию Дюшенна/Беккера Успешному анализу особенностей организации гена дистрофина и изучению молекулярных основ патогенеза миодистрофии Дюшенна способствовали параллельные ис­ следования, выполненные на модельной линии мышей — mdx. Эта модель была получена в результате отбора мута­ ции, спонтанно возникшей в одной из линий мышей дикого типа (Bulfield et al., 1984). В мышцах и в мозге у мышей этой линии резко снижено количестЕО Dmd-мРНК и не об­ н а р у ж и в а ю т с я и м м у н о л о г и ч е с к и е формы дистрофина. Идентифицирована нонсенс-мутация в экзоне 23 гена Dmd у животных линии mdx, в результате (CUN). Интересным представляется вопрос о причинах возник­ новения делеций в мтДНК. В ряде случаев делеции возника­ ют вследствие мутаций в ядерных генах и наследственная передача соответствующих заболеваний подчиняется зако­ нам Менделя. Однако возникновение других делеций может быть связано со структурными особенностями митохондриального генома. Так, показано, что у некоторых пациентов с синдромом Кернса-Сейра точки разрывов делеций локали­ зованы внутри прямого канонического повтора длиной от 13 до 18 нуклеотидов, расположенного в различных районах митохондриального генома (Johns et al., 1989). Иногда ока­ зывается, что последовательности, граничащие с делециями, способны образовывать шпилечные структуры, что также рассматривается как фактор дестабилизации мтДНК. Выска­ зано предположение, что делеции в мтДНК являются резуль156

татом более сложных генетических перестроек (Poulton et al., 1994). Оказалось, что у многих пациентов с синдромом Кернса-Сейра в мтДНК наряду с делециями присутствуют опре­ деленные дупликации, причем эти дуплицированные облас­ ти часто отсутствуют у пациентов с прогрессирующей офталь­ моплегией (СЕРО). По-видимому, баланс между перестрой­ ками в мтДНК является центральным звеном в патогенезе этой уникальной группы заболеваний. Несмотря на то что в мышечной ткани пациентов с син­ дромом Кернса-Сейра процент мутантной мтДНК достаточ­ но высок, в культуре сателлитных клеток, полученных из биоптатов тех же самых мышц пациентов, мутантные митохон­ дрии обнаруживаются редко (Shoubridge et al. 1998). Выска­ зано предположение, что восстановление нормального гено­ типа мтДНК в мышцах больных может быть достигнуто путем стимуляции регенерации мышечных волокон, так как имен­ но сателлитные клетки ответственны за этот процесс. Для испытания этой гипотезы была проведена повторная биопсия одного и того же участка мышц больного с синдромом Керн­ са-Сейра. Оказалось, что в регенерирующих волокнах, обра­ зовавшихся после первой биопсии, наблюдается гомоплазмия по мтДНК дикого типа, тогда как в большинстве нерегенерирующих волокон процент мутантной мтДНК сохранется на прежнем уровне. Эти результаты позволяют надеяться на возможность улучшения функции мышц у подобных пациен­ тов путем инкорпорации сателлитных клеток в мышечные волокна.

1.9. Метаболические миопатии Наследственные дефекты различных мышечных фер­ ментов являются причиной развития относительно доброка­ чественных метаболических миопатии. В качестве примера мы рассмотрим миопатии, обусловленные недостаточностью мышечной фосфорилазы (болезнь Мак-Ардла), карнитин пальмитоилтрансферазы I, миоаденилат дезаминазы (миопатия Спряжения) и фосфоглицератмутазы. 157

а) Гликогеноз 5 типа, гликогеноз мышечный, МакАрдла болезнь (MIM: 232600) Гликогеноз 5 типа, или болезнь Мак-Ардла, проявля­ ется уже в детском возрасте прогрессирующей мышечной слабостью, патологической утомляемостью мышц, а также болезненными тоническими судорогами, возникающими при утомлении. Тонические спазмы возникают чаще при физической нагрузке в условиях ишемии. Тоническое со­ кращение может быть генерализованным и сопровождать­ ся побледнением, сердцебиением, повышенным потоотде­ лением. Течение заболевания медленно прогрессирующее, приводящее к формированию мышечных контрактур. Био­ химической основой заболевания является дефицит мы­ шечной фосфорилазы, составляющей 5% всего раствори­ мого белка мышц. При этом мышечная фосфорилаза у ча­ сти больных может присутствовать, хотя активность ее, как правило, резко снижена. Найдена очень низкая концент­ рация пиридоксина в мышцах больных. Пиридоксинфосфат — ковалентно связанный кофактор гликогенфосфорилазы, одна молекула витамина связывается с лизиновым остатком каждой субьединицы фермента. Хромосомная принадлежность гена PYGM (ghosphorylase glycogen muscle) была установлена путем гибридизации геномной ДНК, изолированной из отдельных хромосом, с олигонуклеотидными ДНК-зондами, соответ­ ствующими карбокси-терминальному району мышечной фо­ сфорилазы. Хромосомы отбирали методом лазерного сортинга из клеточных линий, содержащих различные транс­ локации. Таким образом удалось показать, что ген PYGM расположен в 11-й хромосоме (Lebo et al., 1984). В даль­ нейшем локализация гена была уточнена методом сомати­ ческой гибридизации. При этом был использован набор кле­ точных клонов, содержащих различные терминальные де­ леции 11-й хромосомы. Метод флюоресцентной гибриди­ зации in situ позволил уточнить локализацию гена PYGM в проксимальном районе 11 q 13 (Lebo et al., 1990). Одновре158

менно из тканеспецифической экспрессионной библиоте­ ки генов мышц человека были выделены кДНКовые клоны мышечной фосфорилазы и с их помощью изолирована спе­ цифическая мРНК размером 3.4 кб (Gautron et al., 1987). Определена интрон/экзонная структура гена PYGM (Burko et al., 1987). ВЗ'-области гена PYGM найден полиморфизм по сайту рестрикции для M s p 1 , информативность которого оказалась достаточна для проведения пренатальной диа­ гностики в 7 5 % семей высокого риска. Затем были описа­ ны более информативные внутригенные мини- и микроса­ теллитные повторы, легкогенотипируемые методом ПЦР (Iwasaki et al., 1992). При гликогенозе 5 типа мРНК гена PYGM либо отсут­ ствует, либо ее содержание значительно снижено. В по­ следнем случае равмер транскрипта чаще всего нормаль­ ный. По-видимому, крупные делеций и другие структурные перестройки в области PYGM гена встречаются нечасто. При молекулярном обследовании 40 неродственных паци­ ентов с синдромом Мак-Ардла в гене PYGM были иденти­ фицированы 3 различные точковые мутации, одна нонсенс типа — R49X и 2 миссенс — G204S и K542W (Tsujino et al., 1993а). Все три мутации встречались неоднократно у раз­ ных пациентов и в разных сочетаниях. Нонсенс-мутация R49X, возникающая в результате замены тимина на гуа­ нин в 49-м кодоне первого экзона и приводящая к образо­ ванию стоп-кодона на месте аргинина в белке, оказалась наиболее мажорной. 18 пациентов из 40 исследуемых были гомозиготны по этой мутации. Две другие миссенс-мутации в экзонах 5 и 14 соответственно также могут быть от­ несены к классу мажорных. Так, 6 из 40 пациентов были компаунд-гетерозиготами по трем известным мутациям и у 11 пациентов был идентифицирован один из этих трех мутантных аллелей. Только у пяти больных мутации в PYGM гене не были обнаружены. В дальнейшем было идентифи­ цировано еще несколько точковых мутаций в гене PYGM у больных с синдромом Мак-Ардла (Tsujino et al., 1995). 159

б) М и о п а т и я с д е ф и ц и т о м к а р н и т и н п а л ь м и т о и л т р а н с ф е р а з ы I (MIM: 255110) Заболевание относится к группе метаболических ауто­ сомно-рецессивных миопатии с недостаточностью карнитин пальмитоилтрансферазы I — фермента энергетического ме­ таболизма, участвующего в митохондриальном бета-окисле­ нии длинноцепочечных жирных кислот путем их конъюгации с L-карнитином. Этот шаг необходим для прохождения жир­ ных кислот через мембрану митохондрий. При недостаточ­ ности фермента у больных наблюдаются мышечные боли в сочетании с миоглобинурией, часто индуцируемые физичес­ кими упражнениями, голодом или жирной пищей. В зависи­ мости от дебюта клинические проявления заболевания мо­ гут быть различными. Для взрослых пациентов характерны мышечная слабость с периодическими нарушениями поход­ ки, судорожные сокращения мышц (типа крампи), миоглобинурия. При дебюте заболевания в детском возрасте у боль­ ных развивается гипераммониемия, наблюдается повышен­ ный уровень сывороточных трансаминаз и свободных жир­ ных кислот плазмы, гепатомегалия, некетонная гипоглицемия и кома. Недостаточность по карнитин пальмитоилтрансферазе I — одно из немногих наследственных заболеваний, которые коррегируются диетой, содержащей среднецепочечные триглицериды. Клонирована и секвенирована полноразмерная кДНК гена СРТ1 (carnitine palmitoyltranferase I ) , кодирующая белок, состоящий из 658 аминокислот, включая 25 остатков лидерного МН2-пептида (Finocchiaro et al., 1991). С использовани­ ем кДНКовых зондов ген СРТ1 был картирован методами соматической гибридизации и флюоресцентной гибридиза­ ции in situ в области 1р13-р11 (Minoletti et al., 1992). Идентифицированы две мажорные миссенс мутации в СРТ1 гене у больных, страдающих недостаточностью карни­ тин пальмитоилтрансферазы I. Одна из них — замена С на Т в 439 положении, приводящая к замене серина на лейцин в 113 положении белка. Эта мутация обнаруживается у взрос160

лых пациентов с относительно поздним началом заболева­ ния (Taroni et al., 1993). Вторая мутация, найденная при дет­ ской форме заболевания, заключается в замене аргинина на цистеин в 631 положении белка (Taroni et al., 1992). Инте­ ресно отметить, что эта мутация часто обнаруживается в со­ четании с двумя другими мутациями в СРТ1 гене — G1203A и V368I, которые сами по себе не приводят к заболеванию, а являются относительно редкими формами полиморфизмов. Однако эти же полиморфные мутации с повышенной часто­ той встречаются и при взрослых формах заболевания. Повидимому, сами эти замены не инактивируют фермент, но способны усиливать эффект мутаций, повреждающих актив­ ность фермента.

в) Миопатия напряжения (MIM: 102770) Наследственная недостаточность АМФ-дезаминазы является причиной одной из форм миопатии напряжения, характеризующейся икроножными болями и слабостью верх­ них конечностей после упражнений. Миоаденилат дезаминаза, или аденозинмонофосфат (АМФ) дезаминаза, играет важ­ ную роль в пуриновом нуклеотидном цикле. Ее дефицит, повидимому, является наиболее общей причиной метаболиче­ ских миопатии у человека и особенно состояний, провоциру­ емых физической нагрузкой. Уровень фермента на порядок выше в скелетных мышцах, чем в других тканях. Обобщен­ ный опыт показывает, что в 1—2% исследуемых мышечных биоптатов наблюдается дефицит АМФ-дезаминазы. В норме активность АМФ-дезаминазы на 95% ингибируется ГТФ. Ге­ нетически детерминированное снижение чувствительности фермента к этому ингибированию, по-видимому, является основой развития наследственной первичной подагры. Тканеспецифические изоформы АМФ-дезаминазы об­ разуются за счет дифференциальной экспрессии двух генов в сочетании с альтернативным сплайсингом первичного транскрипта одного из этих генов. С использованием мето­ дов соматической гибридизации и гибридизации in situ ген

AMPD1 (adenosine monophosphate deaminase 1) локализован в области 1p21-p13 (Sabinaetal., 1990). Ген состоит из 16 эк­ зонов, расположенных в участке геномной ДНК размером 20 тысяч пар оснований. В 0.6—2% мРНК гена AMPD1, экспрессирующегося в скелетных мышцах взрослых, в резуль­ тате альтернативного сплайсинга отсутствует экзон 2. Одна­ ко образующаяся при этом делетированная форма фермен­ та функционально активна. У большинства пациентов с миопатией напряжения, обусловленной недостаточностью АМФ-дезаминазы, одновре­ менно присутствуют две мутации в гене AMPD1 в cis-положении (Morisaki et al. 1992). Одна из них — нонсенс-мутация в 12-м кодоне второго экзона, приводящая к преждевремен­ ной терминации синтеза фермента, что согласуется с отсут­ ствием иммунореактивных форм белка у обследованных па­ циентов. Вторая — миссенс-мутация в 48-м кодоне третьего экзона. Этот полиморфный мутантный аллель встречается с частотой 12% среди представителей белой расы, с частотой 19% среди американцев африканского происхождения и пол­ ностью отсутствует среди японцев. Популяционная частота этого аллеля может обьяснить 2% зарегистрированных слу­ чаев дефицита АМФ-дезаминазы в биоптатах мышц. Присут­ ствие в гомозиготном состоянии полиморфной миссенс-мутации у неродственных пациентов с недостаточностью АМФдезаминазы, одновременно гомозиготных по нонсенс-мута­ ции, по-видимому, является результатом «эффекта основате­ ля», приведшего к распространению в Западной Европе этой комбинации аллелей в гене AMPD1. Клиническая гетерогенность недостаточности АМФ-дезаминазы частично может быть свя­ зана с изменчивостью в характере сплайсинга первичного РНК транскрипта в скелетных мышцах (Morisaki et al., 1993).

г) Миопатия, обусловленная недостаточностью фосфоглицератмутазы (MIM: 261670) К основным клиническим признакам данной формы миопатии можно отнести следующие: мышечная слабость, 162

миалгия (часто по типу крампи), провоцируемая физически­ ми нагрузками, миоглобинурия, повышенная активность сы­ вороточной креатинкиназы, почечная недостаточность. Фосфоглицератмутаза — димер, две изоформы кото­ рого — медленно мигрирующая мышечная (М) и быстро миг­ рирующая мозговая (В) содержатся в различных тканях в разных пропорциях. Эти изоформы кодируются разными ге­ нами. Семейство включает также бифосфоглицератмутазу. Полноразмерная кДНК мышечной субъединицы фер­ мента клонирована (Shanske et al., 1987). Блот гибридизация по Саузерну геномной ДНК с кДНКовыми зондами выявила существование мультигенного семейства PGAM в геноме человека, причем в разных тканях происходит специфичес­ кая транскрипция различных PGAM генов. В-субьединица преимущественно экспрессируется в красных клетках кро­ ви, в печени и в мозге, тогда как М-субъединица — в мышцах и обе субъединицы экспрессируются в сердце. Ген мышеч­ ной фосфоглицератмутазы — PGAMM (gihosphoglycerate rnutase М) картирован в области 7р13-р12 (Mattei et al., 1989). Ген содержит 3 экзона, распределенных на площади 2.83 кб геномной ДНК. Бифосфоглицератмутазный (BPGM) ген кар­ тирован в области 7q22-q34 и имеет высокий процент гомо­ логии с PGAMM-геном и одинаковое количество и располо­ жение интронов. При сравнении генов, кодирующих мышеч­ ные ферменты, обнаружена консервативная последователь­ ность из 9 пар оснований в 5'-нетранслируемой области (GGGGCTGGG). По-видимому, эта последовательность свя­ зана с экспрессией мышечных ферментов. Идентифицировано три точечных мутации в PGAMMгене у больных с миопатией, обусловленной недостаточнос­ тью фосфоглицератмутазы (Tsujino et al. 1993). При этом одна из них — нонсенс-мутация в 78-м кодоне, преимущественно встречается среди пациентов афро-американского происхож­ дения. Первый зарегистрированный пациент европейского происхождения оказался гомозиготен по миссенс-мутации в 90-м кодоне гена PGAMM. 163

ГЛАВА 2 БОЛЕЗНИ МЫШЦ. МИОТОНИЧЕСКИЕ СИНДРОМЫ И ПЕРИОДИЧЕСКИЕ ПАРАЛИЧИ 2.1. Общая характеристика В данной группе болезней мышц будут рассмотрены миотоническая дистрофия, миотония Томсена и периодичес­ кие параличи. Для всех заболеваний, включенных в группу миотоний, специфичен феномен миотонии, состоящий в не­ произвольном тоническом спазме мышц, возникающем вслед за резким произвольным сокращением. Расслабление насту­ пает лишь через несколько секунд (до 30 сек.). Описанный феномен типичен для начального («стартового») движения. Повторные сокращения этих мышечных групп совершаются с меньшим затруднением, а затем вообще нормализуются. Медленные, слабые движения, как правило, не сопровожда­ ются миотоническим спазмом. Периодические параличи характеризуются своеобраз­ ными клиническими проявлениями в виде внезапной, при­ ступообразной утраты способности производить активные движения. При этом мышцы утрачивают способность к со­ кращению. Страдает вся скелетная мускулатура. В зависи­ мости от содержания калия в сыворотке крови различают гипер-, гипои нормокалиемические формы заболевания. Следует подчеркнуть, что уровень калия в сыворотке крови меняется только во время пароксизма. При всех формах периодического паралича наблюдаются специфические из­ менения морфологии мышечной ткани в виде дегенерации центральной части миофибрилл с последующим образовани­ ем вакуолей. В табл. 10 представлена общая характеристика генов, ответственных за миотонические синдромы и периодические параличи. 165

Таблица 10 Молекулярно-генетическая характеристика миотонических синдромов и периодических параличей Нозологическая форма, MIM Миотоническая дистрофия, 160900

Белок, функции Ген, локализация миотонин-протеинкиназа DM, DMPK цАМФ-зависимая серии/ треонинкиназа +

DMAHP 19q13.2-q13.3 Миотония врожденная CLC1 Томсена, 160800; Беккера болезнь, 255700 5q12.2-q13 Паралич HYPP, периодический SCN4A гиперкалиемический II, 170500; парамиотония Эйленбурга, 168300; атипичные не индуцируемые холодом миотонии, 17q23.1-q25.3 168350; 170600 Паралич HOKPP, периодический CACNL1A гипокалиемический I, 1q31-q32 170400

гомеодоменны транскрипционный фактор хлорный канал скелетных мышц

натриевый канал тип 4, альфа

кальциевый канал 1_типа, альфа 1

С генетической точки зрения миотоническая дистро­ фия относится к группе болезней экспансии. Подобные за­ болевания обусловлены динамическими мутациями — уве­ личением (или экспансией) выше допустимого критичес­ кого уровня числа копий повторяющихся элементов в мес-

166

тах локализации микрои минисателлитных последователь­ ностей. Если подобные последовательности расположены в значимых областях генов, их экспансия может сопровож­ даться нарушением регуляции работы гена или образова­ нием аномального продукта, обладающего определенной агрессивной функцией по отношению к тем клеткам, в ко­ торых этот ген экспрессируется. И то и другое может явить­ ся причиной развития патологических процессов и реали­ зоваться в виде наследственных заболеваний. Подробная характеристика болезней экспансии будет представлена во второй части монографии. Миотонии, не сопровождающиеся мышечной дистро­ фией, и периодические параличи обусловлены мутациями в генах ионных каналов: в хлорном канале скелетных мышц при миотонии Томсена, в вольтаж-зависимых натриевом и кальциевом каналах L-типа при гипери гипокалиемических периодических параличах соответственно. Вольтаж-за­ висимые ионные каналы являются частью семейства мак­ ромолекул, функции которых включают контроль и поддер­ жание внутриклеточного электропотенциала, секрецию и сигнальную трансдукцию (Bulman, 1997). На рис. 19 изоб­ ражена структура трансмембранных вольтаж-зависимых калиевых и натриевых ионных каналов. Фундаментальной особенностью эволюционно родственного суперсемейст­ ва вольтаж-зависимых К+, Na+ и Са2+ каналов является присутствие ряда из шести трансмембранных сегментов (S1-S6), формирующих отдельный домен. Один такой до­ мен представлен в калиевых каналах и четыре подобных домена образуют альфа1 субъединицы натриевых и каль­ циевых каналов. Предполагается, что сегмент 4 обладает вольтаж-сенсорной функцией и в каждом третьем или чет­ вертом положении этого сегмента присутствует основная аминокислота. Отдельные каналы высококонсервативны. Кроме того, в различных ионных каналах также присутст­ вуют консервативные районы, что является признаком их эволюционно родственного происхождения.

167

Рис. 19. Структура трансмембранных вольтаж-зависимых ионных каналов Характерным для генов ионных каналов является то, что мутации, затрагивающие разные участки этих белков, могут приводить к такому различному течению заболева­ ний, что клинически они могут быть отнесены к разным нозологическим формам. Так, разные мутации в одном и том же гене, кодирующем альфа-субъединицу мышечного натриевого канала, могут быть причиной развития семи клинически самостоятельных форм гипери гипокалиемической пароксизмальной миоплегии, парамиотонии и миотонии. Это в полной мере относится и к генам кальциевых каналов. Мутации в гене альфа-субъединицы кальциевого канала скелетных мышц являются п р и ч и н о й развития гипокалиемического периодического паралича. В то же в р е м я р а з н ы е м у т а ц и и в гене альфа1 А-субъединицы нейронального Са2+-канала P/Q-типа могут реализоваться в виде таких разных заболеваний, как спиноцеребеллярная атаксия типа 6, наследственная эпизодическая атаксия и семейная гемиплегическая мигрень. 168

2.2. Миотонические синдромы а) Миотоническая дистрофия (MIM: 160900) 1. Клиническая характеристика заболевания Клиническая картина миотонической дистрофии пред­ ставляет собой сочетание миотонии, миопатии, сердечно­ сосудистых нарушений и эндокринно-вегетативных расст­ ройств. Начало заболевания относится к детскому возрасту, хотя более типичен дебют на втором-третьем десятилетии жизни. Первая клиническая симптоматика определяется при­ знаками миотонического спазма и затруднения разгибания пальцев рук при резких, быстрых движениях. Симптом мио­ тонического «ровика», обусловленный повышенной механи­ ческой возбудимостью, легче получить на дельтовидной, ик­ роножной и мышцах языка. Течение болезни неуклонно про­ грессирующее. На фоне усиливающегося миотонического синдрома развивается мышечная слабость и атрофические проявления, сходные с миопатиями. Однако, в отличие от последних, формула распределения мышечной слабости иная. Слабеют мышцы лица, в частности круговая мышца глаза, мышца, поднимающая веко, жевательные мышцы, а также сгибатели шеи, плечелучевая и перонеальная на конечнос­ тях. Атрофии мышц ладоней приводят к своеобразной «обе­ зьяньей лапе». Мышечная слабость и атрофии возникают од­ новременно. Постепенно из-за снижения мышечной силы миотонический синдром становится менее ярким. Глубокие рефлексы постепенно снижаются и в дальнейшем угасают. Достаточно типично наличие катаракты, та или иная степень интеллектуальной недостаточности. Нередко миотонической дистрофии сопутствуют различные эндокринные и вегетатив­ ные нарушения. В разных популяциях заболевание встречается с час­ тотой 1 на 8—40 тысяч, наследуется по аутосомно-доминантному типу и характеризуется высокой пенетрантностью му­ тантных аллелей и феноменом антиципации — более ран169

ним началом и нарастанием тяжести симптомов заболева­ ния в семье в последующих поколениях. Мужчины болеют в три раза чаще женщин. 2. Картирование и идентификация гена DM Ген м и о т о н ч е с к о й д и с т р о ф и и DM ( d y s t r o p h i a myotonica) — один из первых аутосомных генов человека, для которого методами генетического анализа была иденти­ фицирована группа сцепления (Eiberg et al., 1983; O'Brien et al., 1983). Он расположен в области 19q13.2-q13.3 и его бли­ жайшими проксимальными маркерами являются гены аполипопротеина С2 (АРОС2) и мышечной креатинкиназы (СКММ) (Harley et al., 1991). Микросателлитный маркер D19S63 наиболее информативен для проведения пренатальной и досимптоматической диагностики миотонической дис­ трофии (Cobo et al., 1992). Ген миотонческой дистрофии со­ стоит из 15 экзонов, распределенных на площади в 13 кб ге­ номной ДНК. Эта область ДНК полностью просеквенирована (Shaw et al., 1993; Mahadevan et al., 1993). Ген DM активно экспрессируется во всех типах мышечных клеток, а также в других тканях, дефектных при миотонической дистрофии, в частности в мозге и в сердце. Обнаружено несколько раз­ личных изоформ мРНК гена DM в мышцах плода и новорож­ денных, что доказывает возможность альтернативного сплай­ синга первичного РНК-транскрипта. 3. Молекулярная природа мутаций в гене DM Как мы уже отмечали, миотоническая дистрофия отно­ сится к группе так называемых болезней экспансии, так как в подавляющем большинстве случаев молекулярной основой заболевания служат значительные экспансии числа копий тринуклеотидного CTG-повтора, расположенного в З'-нетранслируемой части гена DM. Впервые предположение о моле­ кулярных основах заболевания было высказано после обна­ ружения у больных с миотонической дистрофией необычно­ го рестрикционного EcoRI-фрагмента, гибридизующегося с 170

одним из геномных ДНК-зондов, изолированных из области локализации гена DM (Harley et al., 1992). При проведении с использованием этого зонда блот гибридизации по Саузерну в норме обнаруживаются два рестрикционных фрагментам то время как у большинства пациентов один из этих фраг­ ментов замещен на более крупный. Размеры этого необыч­ ного фрагмента могут варьировать у разных пациентов и даже в тех случаях, когда больные принадлежат одной семье. На­ блюдается достоверная положительная корреляция между тяжестью течения, а также более ранним началом заболева­ ния и длиной этого фрагмента. Одновременно методами по­ зиционного клонирования был идентифицирован микросателлитный CTG-повтор, локализованный в З'-нетранслируемой области гена DM. Длина этого повтора оказалась значитель­ но больше у больных с миотонической дистрофией (Brook et al., 1992). Этот повтор при рестрикции геномной ДНК эндонуклеазой EcoRI попадал именно в тот из фрагментов, гибридизующихся с использованным ДНК-зондом, длина кото­ рого оказывалась большей у больных. Таким образом, была расшифрована природа необычного рестрикционного EcoRIфрагмента. Изолированный CTG-повтор в популяции также отли­ чается крайней нестабильностью — количество копий в кла­ стере варьирует от 5 до 30—37 При этом для многих популя­ ций характерен двухвершинный характер распределения ал­ лелей. Так, в отечественных популяциях доминируют аллели с 5 (42.5%) и с 11—13 (37%) повторами (Малышева и др., 1998). Однако у больных с миотонической дистрофией мини­ мальное количество триплетов значительно больше и состав­ ляет не менее 50 при наиболее мягких формах болезни, от 100 до 1000 у пациентов с классическим течением и с дебю­ том во взрослом возрасте, в то время как при врожденных формах заболевания количество CTG-триплетов может до­ стигать трех тысяч. Определение размера CTG-повтора методами ПЦР или блот-гибридизации по Саузерну позволяет проводить прямую 171

молекулярную диагностику миотонической дистрофии. Око­ ло 90% хромосом с экспансированными CTG-повторами в отечественных популяциях имеют одинаковый гаплотип по двум внутригенным полиморфным сайтам рестрикции. Этот же гаплотип характерен для 9 1 % хромосом с CTG(5) и для подавляющего большинста хромосом с CTG(15) (Малышева и др., 1998). Интересно отметить, что транскрибируемый не­ стабильный CTG-(5-30) мотив в З'-нетранслируемой области гена DM обнаружен только в геноме человека, несмотря на то что фланкирующие нуклеотиды присутствуют в гомологич­ ном гене мыши. Недавно в геноме человека был идентифицирован еще один нестабильный патогенетический транскрибируемый, но не транслируемый CTG-повтор (Koob et al., 1999). Этот по­ втор расположен в области 13q21, и его экспансия является причиной развития одной из генетических форм спиноцеребеллярной атаксии (SCA8). Это неожиданная находка, так как до сих пор все доминантные спиноцеребеллярные атаксии были связаны с экспансиями CAG-повторов, кодирующих полиглютаминовые треки, входящие в состав различных бел­ ков. Удлиненные полиглютаминовые треки способны изби­ рательно индуцировать образование устойчивых к протеолизу ядерных агрегатов в определенных типах нейронанальных клеток, чаще всего в клетках Пуркинье мозжечка. Накопле­ ние подобных ядерных включений оказывает цитотоксический эффект и является причиной развития специфических нейродегенеративных процессов, приводящих к различным формам спиноцеребеллярных атаксий. Очевидно, что пато­ генетический механизм действия экспансированного нетранслируемого CTG-повтора при форме 8 спиноцеребеллярной атаксии совершенно иной и он, по-видимому, сходен с меха­ низмом действия таких же динамических мутаций при мио­ тонической дистрофии. Для этих двух заболеваний характе­ рен сопоставимый уровень экспансий CTG-повтора и очень высокая митотическая и мейотическая нестабильность экспансированных повторов, особенно заметная при прохожде172

нии мутантного аллеля через женский гаметогенез. Эти осо­ бенности отличают форму 8 от других типов спиноцеребеллярных атаксий. Различия в фенотипических проявлениях экспансий CTG-повторов, приводящих к таким клинически разным заболеваниям, как миотоническая дистрофия и спиноцеребеллярная атаксия, обусловлены особенностями функ­ ционирования тех генов, работа которых нарушается вслед­ ствие возникновения этих мутаций. 4. Механизмы экспансии CTG-повтора в гене DM Итак, мутационным механизмом миотонической дистро­ фии является амплификация CTG-повтора в З'-нетранслируемой области гена DM. По-видимому, начальным предраспо­ лагающим к мутационному событию фактором служит пере­ ход от аллеля с пятью CTG-повторами к аллелям, состоящим из 19—30 триплетов. Популяционная частота этого гетеро­ генного класса аллелей — (CTG)-19—30 — достигает 10% и, по-видимому, эти аллели составляют резерв для повторных мутаций. У больных отмечается также черезвычайно высо­ кая соматическая нестабильность CTG-повтора (Ashizawa et al., 1993), что согласуется сданными о различном характере экспансии у некоторых однояйцовых близнецов (Fu et al., 1992). В эмбриональном периоде подобная нестабильность особенно заметна между 13 и 16 неделями беременности. Наибольшая экспансия характерна для сердечной мышцы, при этом степень гетерогенности не коррелирует с началь­ ной величиной экспансированного CTG-повтора (Martorell et al., 1995). В отличие от мышц, в клетках перифирической кро­ ви больных наблюдается большая нестабильность (CTG)-noвтора в сторону его экспансии (Martorell et al., 1995). Даль­ нейший анализ нестабильности CTG-повтора, проведенный на протяжении 1—7 лет на клетках крови 111 пациентов с варьирующим течением миотонической дистрофии, показал прямую зависимость уровня гетерогенности от времени и на­ чальной длины повтора (Martorell et al., 1995). Не исключено, что определенный вклад в формирование соматического мо173

заицизма вносят индивидуальные генетические факторы, а также факторы окружающей среды. Хорошо прослеживаемой клинической особенностью болезней экспансии, и в частности миотонической дистро­ фии, является антиципация. Расшифрована молекулярная природа этого явления. Оказалось, что аллели, связанные с относительно небольшими экспансиями CTG-повтора, при которых отсутствуют или наблюдаются лишь слабые клини­ ческие проявления заболевания, обладают высокой мейотической нестабильностью. Их прохождение через гаметогенез сопровождается дальнейшим значительным нарастанием числа триплетов в нестабильных повторах и в следствие это­ го более резким снижением функции соответствующего гена (Buxton et al., 1992). Еще одной особенностью наследования бопезней экспансии является геномный импринтинг — раз­ ное течение заболевания в зависимости от того, получил боль­ ной мутантный аллель от матери или от отца. Так, при миото­ нической дистрофии амплификация CTG-области встречается в материнском гаметогенезе значительно чаще, чем в отцов­ ском. Это особенно справедливо для тяжелых врожденных форм заболевания. В опытах in vitro с использованием геномных клонов, содержащих локус DM с экспансированными CTG-повторами, исследовали роль одного из ключевых ферментов репа­ рации — мутазы S2 (продукта гена MSH2), в нестабильности тринуклеотидных повторов, ответственных за целый ряд тя­ желых нейродегенеративных болезней (Pearson et al., 1997). Оказалось, что мутаза S2 способна специфическим образом связываться со структурами, образованными смещением комплементарных нитей ДНК в области локализации таких повторов и, таким образом, может принимать участие в их экспансии. 5. Биохимическая характеристика продукта гена DM Ген миотонической дистрофии кодирует белок, получив­ ший название миотонин-протеинкиназы — Mt-PK, и поэтому 174

ген DM обозначается иногда как DMPK (dystrophia myotonica grotein kinase). Этот белок (Mt-PK), состоящий из 624 амино­ кислот, относится к семейству серин/треонин протеинкиназ, родственных цАМФ-зависимым протеинкиназам (Fu et al., 1992). Молекулярный вес полноразмерной изоформы Mt-PK, транслируемой с первого AUG-кодона гена DMPK, составля­ ет 72 кД (Timchenko et al., 1995). Наиболее консервативен каталитический домен этого белка, содержащий специфиче­ скую киназную и нуклеотид-связывающую конценсусные по­ следовательности. Значительно менее консервативен боль­ шой N-терминальный домен. Промежуточный домен с высо­ ким содержанием альфа-спиралей имеет небольшое сходст­ во с филаментными белками. По-видимому, миотонин-протеинкиназа, подобно другим протеинкиназам данного типа, играет критическую роль в регуляции клеточной дифферен­ цировки и в репликации ДНК, а сам ген DMPK имеет функ­ ции рецессивного супрессора опухолей. Это согласуется с данными о повышенной частоте у пациентов с миотоничес­ кой дистрофией пиломатриксом (опухолей тканей, производ­ ных нервного гребня), паратиреоидных аденом и небольших карцином кишечника (Harris et al., 1996). С использованием набора моноклональных антител на каталитический и альфа-спиральный домены Mt-PK в скелет­ ных мышцах человека обнаружены три изоформы миотонинпротеинкиназы — основная с м.в. 55 кД и минорные с м. в.72 и 80 кД (Pham et al., 1998). 5 типов антител на каталитичес­ кий и 5 на альфа-спиральный домены идентифицировали толь­ ко минорные изоформы, причем 72-кД белок присутствовал во всех исследованных тканях, тогда как 80-кД изоформа белка с варьирующей экспрессивностью обнаруживалась главным образом в скелетных мышцах и в интеркалярных дисках сердечной мышцы. Два типа моноклональных анти­ тел на каталитический домен обнаруживали только мажор­ ную 55-кД изоформу белка, присутствующую исключительно в скелетных мышцах. Ни один из типов моноклональных ан­ тител не подтвердил ко-локализации Mt-PK с ацетилхолино175

выми рецепторами в нейромышечных соединениях. Метода­ ми субклеточного фракционирования и седиментационного анализа показано, что основная часть Mt-PK в скелетных мышцах и в мозге имеет цитозольную локализацию. 6. Молекулярные основы патогенеза миотонической дистрофии У больных, по крайней мере со взрослой формой забо­ левания, наблюдается уменьшение экспрессии гена DMPK как на уровне мРНК, так и на белковом уровне (Fu et al., 1993). В опытах, проведенных на культурах клеток, показа­ но, что в соматических гибридах, содержащих 19-ю хромосо­ му с экспансированным CTG-повтором, снижен синтез пер­ вичного РНК-транскрипта гена DMPK и нарушен его процессинг (Carango et al., 1993). Наиболее вероятным представля­ ется, что экспансия CTG-повтора влияет не на транскрип­ цию как таковую, а на посттранскрипционную модификацию мРНК гена DMPK. Обнаружение повышенных уровней удли­ ненных транскриптов гена DMPK в ядрах клеток пациентов с миотонической дистрофией позволяет предполагать возмож­ ность нарушения каких-то этапов процессинга мутантного первичного РНК-транскрипта, таких как полиаденилирование или транспорт мРНК из ядра в цитоплазму (Wang et al., 1995b; Taneja et al., 1995). Доминантный характер наследования миотонической дистрофии, по-видимому, связан с дефици­ том дозы зрелого продукта гена DMPK. Не исключено, что повышение количества или активности миотонин-протеинкиназы может оказывать терапевтический эффект на взрос­ лых пациентов. Однако в целом данные по влиянию экспансированного CTG-повтора на экспрессию гена DMPK носят противоречивый характер. Более привлекательной кажется другая гипотеза, каса­ ющаяся молекулярных механизмов патогенного действия динамических мутаций при миотонической дистрофии. По­ казано, что экспансированные CTG-повторы формируют на­ иболее сильные из известных естественных элементов ук176

ладки нуклеосом (Wang, Griffith, 1995). При этом эффектив­ ность образования нуклеосом возрастает с увеличением дли­ ны повтора. Можно предположить, что экспансированные блоки повторов способны менять локальную структуру хро­ мосом, что, в свою очередь, может сопровождаться наруше­ нием экспрессии DMPK и/или других близко расположенных генов. Это предположение нашло экспериментальное под­ тверждение. Так, недалеко от CTG-повтора была идентифи­ цирована последовательность, гиперчувствительная к дей­ ствию ДНКазы I. При обработке ДНКазой I нормальной ДНК в этом сайте происходит разрыв. Однако мутантные после­ довательности ДНК с большими экспансированными CTGповторами оказываются устойчивы к действию фермента (Often, Tapscott, 1995). Наиболее простым объяснением дан­ ного феномена является то, что увеличение длины CTG-по­ втора в гене DMPK нарушает локальную структуру хромати­ на, вследствие чего этот гиперчувствительный сайт стано­ вится недоступен для действия ДНКазы I. Предложены и не­ которые другие гипотезы для объяснения механизма повреж­ дающего действия экспансированного CTG-повтора. В опытах in vitro идентифицирована группа белков, спо­ собных специфически связываться с CTG-повторами, нахо­ дящимися как в однонитевой, так и в двунитевой форме (Yano Yanagisawa et al., 1995; Richards et al., 1993; Timchenko et al., 1996). При этом белки, связывающиеся с двунитевыми зон­ дами, имеют, как правило, ядерную локализацию. Кроме того, обнаружен цитоплазматический белок, специфически взаи­ модействующий с РНКовыми CUG-триплетами — CUG-BP (Timchenko et al., 1996). Возможно, именно этот белок вовле­ чен в патогенез миотонической дистрофии. Несмотря на значительные успехи в расшифровке при­ роды мутаций при миотонической дистрофии, остается неяс­ ным, происходит ли дисфункция или приобретение новой функции гена DMPK на уровне взаимодействия ДНК со струк­ турой хроматина и/или на уровне регуляции процессинга пер­ вичного РНК-транскрипта. По-видимому, в разных тканях

12 Заказ № 170

177

определяющими могут быть различные нарушения, которые в комплексе и формируют плейотропный фенотип заболевания. 7. Характеристика других генов, участвующих в патогенезе миотонической дистрофии Сложность клинического фенотипа миотонической дистрофии в сочетании с противоречивыми данными, ка­ сающимися действия GTG-экспансии на экспрессию DMPK локуса, привели к необходимости исследования соседних генов, которые могут быть вовлечены в этиологию заболе­ вания. Область локализации гена DMPK насыщена актив­ но транскрибирующимися последовательностями. У чело­ века, так же как и у мыши, в непосредственной близости от гена DMPK в проксимальной области расположен ак­ тивный ген — DMR-N9, обозначаемый иногда геном 59 — рис. 20 (Jansen et al., 1992; Jansen et al., 1995). Этот ген экспрессируется главным образом в мозге и в testis. Функ­ ция белкового продукта DMR-N9 неизвестна. Высказано предположение, что экспансия CTG-повтора влияет на аль­ тернативную экспрессию генов DMPK и DMR-N9.

Рис. 20. Структурная организация DM-района Более вероятным представляется участие в контро­ ле м и о т о н и ч е с к о й дистрофии гена DMAHP (dystrophia myotonica associated homeodomain protein) (или STX5), pac-

178

положенного в непосредственной близости с З'-конца от DMPK и кодирующего так называемый DM-ассоциированный гомеодоменный белок. DMAHP экспрессируется во многих типах тканей, включая скелетные мышцы, фибробласты, лимфоциты, сердце и мозг. Известно, что родст­ венные гомеодоменные белки дрозофилы являются транс­ крипционными факторами, регулирующими экспрессию генов как на транскрипционном уровне, так и на уровне трансляции посредством их связывания с ДНК и/или с РНК соответственно. CTG-повтор локализован внутри CpG-ocтровка в З'-нетранслируемой области гена DMPK, и не ис­ ключено, что разрушение этого элемента за счет экспан­ сии повтора может нарушать экспрессию ассоциирован­ ного с этим островком гена(ов). Ранее идентифицирован­ ный гиперчувствительный сайт для ДНКазы I почти цели­ ком расположен в промоторной области этого гена и изме­ нения в этом сайте, вызванные экспансией CTG-повтора, могут изменять экспрессию DMAHP. Это предположение было подтверждено при обнаружении в этом сайте энхансера, регулирующего транскрипцию DMAHP (Klesert et al., 1997). При анализе экспрессии DMAHP в клетках пациентов с миотонической дистрофией, в которых отсутствует гипер­ чувствительный сайт ДНКазы I, обнаружено 2—4-кратное снижение устойчивых DMAHP-транскриптов по сравнению с контролем, причем уровень снижения коррелирует с дли­ ной экспансированного повтора. Не исключено, что нару­ шение работы двух соседних генов DMPK и DMAHP фор­ мирует сложный фенотип миотонической дистрофии. 8. Модельные линии животных Предположение об участии нескольких соседних ге­ нов в контроле миотонической дистрофии согласуется с данными по трансгенному разрушению гомологичного гена Dmpk у мышей. У нулевых мутантов ( Dmpk(-/-)) 72-кД изоформа миотонин-протеинкиназы полностью отсутствует. У таких животных в позднем возрасте развивается прогрес-

179

сирующая миодистрофия с патологическими чертами, сход­ ными с теми, которые характерны для пациентов с мягким течением миотонической дистрофии (Jansen et al., 1996; Reddy et al., 1996). У взрослых особей наблюдаются ульт­ раструктурные изменения в мышцах, варьирующая вели­ чина мышечных волокон, с повышенной частотой дегене­ рации и фиброзов. Частота дегенерирующих волокон у взрослых мутантов повышена на 5 0 % по сравнению с мо­ лодыми животными. У мышей с гиперэкспрессией DM-npoтеинкиназы, полученных путем трансгеноза нормального гена DMPK человека в ранние зародыши Dmpk(-/-) мутан­ тов, развивается изолированная гипертрофическая кардиомиопатия, несмотря на то что 72-кД изоформа миотонинпротеинкиназы присутствует в большом количестве. Одна­ ко во всех подобных моделях отсутствуют ведущие симп­ томы миотонической дистрофии, включая атрофию мышеч­ ных волокон, миотонию, катаракту и мужское бесплодие. Эти результаты показывают, что продукт гена DMPK необ­ ходим для поддержания нормальной структуры и функцио­ нирования скелетных мышц. Однако инактивация или из­ менение характера экспрессии DMPK-гена не являются единственными критическими условиями, необходимыми для развития заболевания. В опытах на трансгенных животных показано, что вве­ дение геномных областей, содержащих районы DM локуса человека с экспансированным CTG-повтором, не приво­ дит к фенотипу, сходному с миотонической дистрофией. Однако в соматических и зародышевых клетках трансген­ ных мышей наблюдается гипермутабильность введенного повтора как в сторону экспансий, так и в сторону делеций (Gourdon et al., 1997; Monckton et al., 1997). При этом не­ стабильность была умеренной при введении 45-кб конст­ рукции, включающей наряду с мутантным геном DMPK с 55 CTG-повторами два фланкирующих гена — DMR-N9 и DMAHP. Значительно более выраженная мутабильность наблюдалась в трансгенных линиях мышей, полученных в 180

результате введения в ранние зародыши З'-нетранслируемой области DMPK с более длинным повтором, состоящим из 162 триплетов. Для этих линий характерны также эф­ фекты, связанные с родительской передачей мутантного аллеля и нарушением сегрегации. Половые и межлиней­ ные различия в мутационной активности указывают на су­ ществование в геноме человека d s n trans-действующих генетических элементов, модулирующих устойчивость этой области. Показано, что соматическая нестабильность CTGповтора увеличивается с возрастом трансгенных живот­ ных, но не зависит от тканеспецифического уровня транс­ крипции любого из трех генов — Dmahp, Dmpk и Dmr-n9, а также не зависит от пролиферативной способности различ­ ных тканей (Lia et al., 1998).

b) Врожденная миотония Томсена (MIM: 160800), болезнь Беккера (MIM: 255700) Врожденная миотония Томсена — относительно ред­ кое заболевание, встречающееся с частотой 0.3—0.7 на 100 000. Начальные симптомы болезни могут относиться как к раннему детству (1—3 года), так и к школьному воз­ расту (8—10 лет). Нередко начальные признаки болезни просматриваются родителями ребенка, так как он не все­ гда может ощутить недостаток своей моторики. К ранним симптомам относится болезненное сведение икроножных мышц при охлаждении и мышечной нагрузке. Первыми страдают мышцы нижних конечностей, затем к ним присо­ единяются верхние, могут вовлекаться в процесс жеватель­ ные мышцы, мышцы языка, шеи. Весьма специфичен симп­ том повышенной мышечной механической возбудимости: миотонический «ровик», который возникает в мышце при нанесении удара молоточком. Особенно хорошо феномен «ровика» выражен при ударе молоточком по мышцам язы­ ка. Своеобразен внешний вид больного, обусловленный хо­ рошо развитой мышечной системой, что придает телосло­ жению черты атлетического. При этом у больных опреде-

181

ляется мышечная слабость. Сухожильные рефлексы обыч­ но снижены, может наблюдаться их миотоническая харак­ теристика. Течение заболевания медленно прогрессирую­ щее. Больные приспосабливаются к своему дефекту и при правильной профессиональной ориентации приобретают специальность и социально адаптируются. Витальный про­ гноз благоприятный. Врожденная миотония включает аутосомно-доминантную форму — болезнь Томсена, и аутосомно-рецессивную форму — болезнь Беккера. Согласно классификации Беккера, выделяют пять различных типов доминантных миотоний (Becker, 1977). Тип I — классическая болезнь Томсена. Тип II характеризуется мышечными болями и флюктуирующим те­ чением. При типе III заметна миотоническая чувствительность к холоду, особенно круговой мышцы глаза и круговой мышцы рта. Эта форма отличается от врожденной парамиотонии от­ сутствием холод-индуцируемого паралича. Тип IV характери­ зуется промежуточным течением и меньшей вовлеченнос­ тью мышц лица. Тип V — изолированная перкуссионная мио­ тония языка. Считается, что рецессивная форма врожден­ ной миотоний — болезнь Беккера, встречается чаще и про­ текает тяжелее, чем форма Томсена. Как правило, эта фор­ ма диагностируется в возрасте 4—12 лет, причем у мальчи­ ков еще позднее — до 18 лет. Болезнь дебютирует с пораже­ ния мышц нижних конечностей, достигая через несколько лет верхних конечностей, мышц лица, включая жевательную му­ скулатуру. Чувствительность по отношению к холоду менее выражена, чем при доминантной форме заболевания. Описание генетической линии мышей ard, являющей­ ся естественной моделью врожденной миотоний, способ­ ствовало идентификации гена человека, ответственного за миотонию Томсена. Оказалось, что у мутантных мышей от­ сутствует мембранный белок мышц, выполняющий функ­ ции хлорного канала. Примечательно, что и у пациентов с врожденной миотонией значительно снижена хлорная про­ водимость в сарколемме биоптатов межреберных мышц. 182

Ген, кодирующий главный хлорный канал скелетных мышц млекопитающих, был клонирован в 1991 году (Steinmeyer et al., 1991а). У мышей ген хлорного канала С1с-1 локали­ зован в хромосоме 6 в районе, синтенном области 7 q 3 1 q35 генома человека. Показано, что в линии ard произош­ ло разрушение мышиного гена С1с-1 в результате внедре­ ния в кодирующую область транспозоно-подобного элемен­ та семейства ETn (Steinmeyer et al., 1991b). Таким обра­ з о м , было доказано, что дефект хлорного канала мышц является первичным в патогенезе данной формы миото­ нии у мышей. Вслед за этим, по гомологии с геном главно­ го хлорного канала скелетных мышц крысы, из экспрессионной библиотеки мышц человека был изолирован кДНКовый клон, содержащий около 8 0 % кодирующей последо­ вательности соответствующего гена человека — CLC1 (С! channel 1) (Koch et al., 1992). Методом соматической гиб­ ридизации ген CLC1 был картирован в области 7q32-qter. С учетом описанных выше обстоятельств был выпол­ нен анализ сцепления врожденной миотонии в семьях с доминантной и рецессивной формами заболевания с вы­ сокополиморфными динуклеотидными повторами гена Тклеточного рецептора В (TCRB), локализованного в длин­ ном плече хромосомы 7 (Adballa et al., 1992). Оказалось, что оба мутантных гена THD (Thomsen disease) и MCR (myotonia congenita, recessive), ответственных за форму Томсена и Беккера соответственно, картируются в том же районе 7 q 3 1 , где расположен гена муковисцидоза — CFTR. Ген CFTR кодирует белок, также являющийся хлорным ка­ налом. Этот белок участвует в регуляции хлорного потока через апикальные мембраны эпителиальных клеток. Од­ нако было показано, что миотония Томсена и Беккера не связаны с мутациями в гене CFTR. Этот ген расположен по отношению к генам THD и MCR на расстоянии более 24 сМ. В настоящее время можно считать доказанным, что обе формы заболевания являются аллельными варианта­ ми и обусловлены мутациями в гене хлорного канала ске-

183

летных мышц — C L C 1 . При рецессивных формах функция этого хлорного канала полностью иьактивирована. Доми­ нантный эффект мутаций при болезни Томсена обьясняется гомомультимерной структурой канала, при которой субъ­ единица, кодируемая мутантным аллелем, связывается с функциональной субъединицей, кодируемой нормальным аллелем, и таким образом ее инактивирует. В 15% хромосом пациентов с болезнью Беккера об­ наруживается миссенс-мутация в гене CLC1, вызванная T-G трансверсией и сопровождающаяся заменой фенилаланина на цистеин в трансмембранном домене D8 хлорно­ го канала. Эта мутация может быть легко диагностирова­ на методом рестрикционного анализа (Koch et al., 1993). Описаны и другие рецессивные миссенс-мутации в гене CLC1 — V236L, G285E, I556N (Kubisch et al., 1998). При болезни Томсена также были идентифицированы миссенсмутации в гене C L C 1 . Первая из HVX — G-A транзиция, сопровождающаяся заменой глицина на глютаминовую кислоту в 180 позиции белка (George et al. 1993). Во всех известных белках, функционирующих как хлорные каналы, положение этого глицина консервативно, что указывает на его функциональную значимость. Затем была описана це­ лая серия других доминантных миссенс-мутации — V286A, F307S, А313Т (Kubisch et al., 1998). Анализ экспрессии мутаций на модельной системе Xenopus показал, что доминантные мутации сдвигают воль­ таж-зависимость хлорного канала в сторону положитель­ ных потенциалов. Подобный сдвиг сохраняется и для гетеромерных каналов, образующихся из мутантных и нормаль­ ных субъединиц и присутствующих у пациентов с болезнью Томсена. Этим и объясняется доминантно-негативный эф­ фект подобных мутаций. Рецессивные мутации также сдви­ гают чувствительность хлорного канала в сторону положи­ тельных значений. Однако в этом случае при ко-экспрессии в системе in vitro мутантных и нормальных аллелей гена CLC1 подобного сдвига в работе хлорных каналов не на184

блюдается. Таким образом, вольтаж-зависимость гетеромерных хлорных каналов далеко не всегда занимает про­ межуточное положение между значениями, характерны­ ми для соответствующих гомомерных каналов, и это хоро­ шо коррелирует с уровнем пенетрантности и характером наследования различных форм врожденных миотонии.

2.3. Периодические параличи Периодические параличи представляют собой группу наследственных заболеваний, обусловленных мутациями в генах вольтаж-зависимых ионных каналов.

а) Периодический паралич II, гиперкалиемического типа (MIM: 170500; 168300; 168350; 170600) Гиперкалиемическая форма пароксизмальной миоплегии возникает при повышении уровня сывороточного калия. Начало заболевания относится к первому пятилетию жизни. Приступам мышечной слабости могут предшествовать ощу­ щения тяжести в конечностях. Пароксизм миоплегии разви­ вается в течение нескольких минут и длится на протяжении 30 минут. Более продолжительные приступы встречаются редко. В миоплегический синдром может включаться мими­ ческая и артикуляционная мускулатура. В отличие от гипокалиемического пароксизма, при гиперкалиемическом при­ ступы возникают днем. Голодание, переохлаждение, физи­ ческое переутомление способствуют возникновению мио­ плегии. Провоцировать приступ может прием внутрь раство­ ра хлористого калия. В редких случаях уровень экстракле­ точного калия поднимается настолько высоко, что могут воз­ никнуть кардиологические проблемы. Частота приступов сни­ жается у пациентов, достигших 35—40-летнего возраста. Вы­ деляют три типа адинамического эпизода: в комбинации с миотонией, без каких-либо признаков миотонии и в комби­ нации с парамиотонией. Ранее последнюю форму обознача­ ли в качестве самостоятельной нозологической единицы —

185

врожденной парамиотонии Эйленбурга. В тяжелых случаях продолжительность эпизодов параличей может достигать нескольких месяцев. При снижении частоты параличей на­ блюдается тенденция к прогрессирующей миопатии. В опытах in vitro было показано, что небольшое увели­ чение содержания внеклеточного калия может оказывать триггерный эффект на тетродотоксин-чувствительный натри­ евый канал в дефектных мышцах больных, страдающих гиперкалиемическими параличами в сочетании с миотонией (Lehmann-Horn et al., 1987). В норме эти концентрации калия могут быть недостаточны для переключения канала. Ген альфа-субъединицы мышечного натриевого канала взрослых SCN4A— (sodium channel 4 alpha) картирован в длинном пле­ че хромосомы 17 в области 17q23.1-q25.3 (Fontaine etal., 1990; George et al., 1991). Он распределен на площади в 35 кб ге­ номной ДНК и кодирует белок размером в 1836 аминокислот (Wang et al., 1992; George et al., 1992). При генетическом анализе семей с гиперкалиемическими параличами было показано тесное сцепление, а чаще полное отсутствие рекомбинации, между мутантным геном HYPP (hyperkalemic geriodic paralysis) и ДНК-маркерами, расположенными в непосредственной близости или внут­ ри гена SCN4A(Ptacek et al., 1991; 1992; Koch et al., 1991; McClatchey et al., 1992). Подтверждением того, что гиперкалиемические периодические параличи и врожденная парамиотония Эйленбурга являются аллельными заболе­ ваниями, обусловленными генетическими нарушениями работы натриевого канала мышц, явилась молекулярная идентификация мутаций в гене SCN4A. В настоящее вре­ мя у пациентов с гиперкалиемическими параличами иден­ т и ф и ц и р о в а н ы 4 р а з л и ч н ы е м и с с е н с - м у т а ц и и в гене SCN4A, две из которых — Т704М и M1592V, по-видимому, являются мажорными (Ptaceketal., 1991; McClatchey et al., 1992; Feero et al., 1993). Кроме того, описано 10 миссенсмутации у пациентов с парамиотонией Эйленбурга и все

186

они приводят к заменам аминокислот либо в четвертом домене белка, либо в области между шестым сегментом третьего домена и четвертым доменом (Lehmann-Horn et al., 1993). Интересно отметить, что мутации в гене SCN4A, идентифицированные при холод-индуцируемой врожденной парамиотонии, являются первыми температур-чувствительными мутациями у человека, описанными на молекуляр­ ном уровне. Врожденную парамиотонию без холод-индуцируемых параличей также выделяли раньше в самостоятельную группу. Однако обнаружение у подобных пациентов из Гер­ мании однотипной миссенс-мутации в гене SCN4A—V1293I явилось доказательством аллельной природы данной фор­ мы заболевания, парамиотонии Эйленбурга и гиперкалиемической пароксизмальной миоплегии (Koch et al., 1995). Аллельными вариантами являются также атипичные не холод-индуцируемые миотонии — флюктуирующая, перма­ нентная и ацетозольамид-чувствительная, так как при каж­ дом из этих заболеваний описаны различные миссенс-му­ тации в гене SCN4A. Недавно показано, что некоторые формы гипокалиемических периодических параличей так­ же могут быть аллельными вариантами гиперкалиемической пароксизмальной миоплегии (Bulman, 1997). Таким образом, различные мутации в одном и том же гене SCN4A могут быть причиной развития семи клинически самосто­ ятельных форм гипери гипокалиемической пароксизмаль­ ной миоплегии, парамиотонии и миотонии. На рис. 21 по­ казана локализация идентифицированных у пациентов с перечисленными выше типами заболеваний миссенс-мутаций в гене SCN4A, приводящих к аминокислотным заме­ нам в различных доменах натриевого канала мышц. Моле­ кулярный анализ причин наблюдаемой фенотипической изменчивости является основой для физиологического анализа функционирования данного ионного канала.

187

Рис. 21. Распределение мутаций в альфа-субъединице натриевого канала скелетных мышц при различных формах наследственных параличей и парамиотоний Имеется аутентичная модель гиперкалиемического периодического паралича на определенной породе лоша­ дей (Quarter), одним из определяющих свойств которых является гипертрофия мускулатуры. При этом описана миссенс-мутация в гомологичном гене натриевого канала мышц, частота которой среди данной породы лошадей до­ стигает 3 0 % (Rudolph et al., 1992).

б) Периодический паралич I, гипокалиемического типа (MIM: 170400) Наиболее часто встречается гипокалиемическая пароксизмальная миоплегия или гипокалиемический перио­ дический паралич. Начало заболевания колеблется от 3 до 20 лет, чаще это второе десятилетие жизни. Приступы ми-

188

оплегии обычно возникают утром или ночью. Проснувшись, больной не в состоянии совершить активное движение. Реже плегия носит характер не общий, а гемипаретический, то есть имеет место очаговая слабость. Парезы носят признаки периферических. Снижается мышечный тонус, угасают глубокие рефлексы. Чувствительность не претер­ певает каких-либо нарушений. Длительность миоплегии от нескольких часов до 3—4 суток. Сознание никогда не утрачивается. Выход из миоплегии происходит посте­ пенно, начиная с дистальных отделов к о н е ч н о с т е й . В к а ч е с т в е факторов, провоцирующих п а р о к с и з м г и п о к а лиемической миоплегии, называют прием обильной пищи, богатой углеводами, переохлаждение, физичес­ кие н а г р у з к и . Для м у ж ч и н характерна полная пенетрантность, тогда как вероятность проявления заболевания у женщин составляет лишь 5 0 % . Анализ сцепления мутантного гена с микросателлитными ДНК-маркерами, проведенный в семьях различного этнического происхождения с гипокалиемическим перио­ дическим параличом, позволил локализовать ген НОКРР (hypokalemic periodic garalysis) в длинном плече хромосо­ мы 1 в области 1q31-q32 (Fontaine et al., 1994). В этой же районе расположен ген CACNL1 A3 (Са cannal, type LJ_, alpha 3), кодирующий альфа-субъединицу дигидропиридин-чувствительного кальциевого канала скелетных мышц. Предпо­ ложение об идентичности генов НОКРР и CACNL1A3 на­ шло подтверждение при обнаружении у пациентов с гипокалиемической пароксизмальной миоплегией трех различ­ ных миссенс-мутаций в гене CACNL1A3 (Ptaceket al., 1994; Jurkat-Rott et al., 1994). Однако не во всех семьях с гипо­ калиемическим периодическим параличом прослеживает­ ся сцепление мутантного гена с маркерами длинного пле­ ча хромосомы 1 (Plassart et al., 1994). Как уже указыва­ лось, в одной из семей обнаружена новая миссенс-мута­ ция в гене SCN4A, затрагивающая высококонсервативный остаток в вольтаж-чувствительном сегменте S4 альфа-субъ189

единицы натриевого канала скелетных мышц (Bulman, 1997). Таким образом, некоторые формы этого заболева­ ния могут быть аллельными вариантами гиперкалиемической пароксизмальной миоплегии.

в) Периодический паралич III, нормокалиемического типа (MIM: 170600) Нормокалиемическая форма миоплегии начинается в первом десятилетии жизни. Тяжесть миоплегического паро­ ксизма весьма вариабельна, включение при пароксизме жевательной и мимической мускулатуры непостоянно. Уро­ вень калия в сыворотке крови во время приступа миопле­ гии, до и после него не отклоняется от нормы. Клиническая картина характеризуется довольно типичными миоплегическими пароксизмами, длительность которых составляет от нескольких часов до нескольких недель. При электронно-ми­ кроскопическом анализе скелетных мышц больных наблю­ дается расширение саркоплазматического ретикулума. Дан­ ная форма является наиболее редкой. Наследуется заболе­ вание по аутосомно-доминантному типу. Локализация мутантного гена пока неизвестна.

ГЛАВА 3 БОЛЕЗНИ С ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫМ ПОРАЖЕНИЕМ ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО ДВИГАТЕЛЬНОГО НЕВРОНА 3 . 1 . Общая характеристика В данную группу заболеваний включены проксималь­ ные детские спинальные амиотрофии, спинально-бульбарная мышечная атрофия позднего возраста, или болезнь Кенне­ ди, наследственные полинейропатии и боковой амиотрофический склероз. Общая молекулярно-генетическая характе­ ристика этих болезней представлена в табл. 11. Таблица 11 Молекулярно-генетическая характеристика болезней с преимущественным поражением периферического двигательного неврона Нозологическая форма, Ген, MIM локализа­ ция SMN1 Спинальная амиотрофия, тип I, болезнь Верднига-Гоффмана, 253300; тип II, хроническая, + 253550; NAIP тип III, болезнь Кугельберга-Веландер, 253400 +

Белок, функции

белок выживания двигательных нейронов - белок РНП-комплекса, участвующий в метаболизме и процессинге мРНК +

ингибитор нейронального апоптоза

белок сплайсинга H4F5 5q12.2-q13

Спинально-бульбарная мышечная атрофия (болезнь Кеннеди); синдром тестикулярной феминизации, 313200 Болезнь Шарко-Мари-Тус тип 1 В, 118200;159440; синдром Дежерин-Сотта, 145900 Болезнь Шарко-Мари-Тус тип IА, 118220; синдром Дежерин-Сотта, 145900 Нейропатия наследственная со склонностью к парезам, 162500 Болезнь Шарко-Мари-Тус Х-сцепленная, 302800; 304040 Боковой амиотрофически склероз, 105400

Продолжение табл. 11 андрогеновый рецептор

AR

Xq11-q12 СМТ1В, MPZ, МРР, 1q23-q25 СМТ1А, РМР22

17р11.2 HNPP, РМР22

главный структурный белок периферического миелина Р(0)

Ртр-22 - интефальный белок компактного миелина периферической нервной системы

периферический белок миелина 22

17р11.2 СМТХ1, СХ32

коннексин 32

Xq13-q21 ALS1, SOD1

Cu/Zn-супероксид-дизмутаза

21q22.1-q22.2

Клинически выделяют три типа спинальной мышечной атрофии. Первый тип детской спинальной амиотрофии — бо­ лезнь Верднига-Гоффмана, II тип — хронический или промежу­ точный и III тип — болезнь Кугельберга-Веландер. Оказалось, что клинически гетерогенная группа проксимальных детских спинальных амиотрофии представляет собой аллельные вари­ анты мутаций одного или, точнее, группы тесно сцепленных ге­ нов, локализованных в необычной чрезвычайно нестабильной области генома человека, получившей название SMA (spinal

192

muscular atrophy) области. SMA-область в длинном плече хро­ мосомы 5 размером около 850 кб характеризуется присутстви­ ем различных повторяющихся низкокопийных элементов, мно­ жественных копий отдельных генов, необычных экспрессируещихся интрон-содержащих псевдогенов, функциональные копии которых разбросаны по всему геному. Около 93% больных со спинальной мышечной атрофией любого типа несут гомозиготные делеций в гене выживания двигательных нейронов — SMN1, расположенном в SMA-области. Остальные пациенты содержат подобные делеций в гете­ розиготном состоянии, при этом в гомологичной хромосоме у них обнаруживаются либо сплайсинговые мутации, либо миссенс-мутации, локализованные, как правило, в З'-конце гена SMN1. Белок выживания двигательных нейронов присутствует в цитоплазме и в ядрах клеток, причем ядерная форма белка найдена в структурах, ассоциированных с гетерогенными ядер­ ными рибонуклеопротеиновыми частицами, предположительно участвующими в метаболизме и процессинге мРНК. Мутантные формы белка утрачивают способность к олигомеризации. Наличие гомозиготных делеций или повреждающих мута­ ций в SMN1 является необходимым, но недостаточным услови­ ем для развития болезни, так как в небольшом проценте случа­ ев гомозиготные делеций в гене SMN1 присутствуют у асимптоматичных родственников больных. В непосредственной близо­ сти от SMN1 идентифицированы еще три гена, часто вовлекае­ мые в делеций у пациентов с различными формами спинальных амиотрофий. По-видимому, два из них имеют отношение к патогенезу заболевания. Это ген ингибитора нейронального апоптоза — NAIP — и ген H4F55. Продукт гена H4F55, так же как белок выживания двигательных нейронов, ко-локализован с малыми ядерными рибонуклеопротеиновыми комплексами, участвующими в процессе сплайсинга. Гены NAIPn H4F55 делетированы соответственно у 50% и у 90% больных с I типом за­ болевания. Нельзя исключить вклад в патогенез спинальной мышечной атрофии и экспрессирующегося гена SMN2, гомоло­ гичного SMN1 и также расположенного в SMA области.

Согласно современным представлениям, для развития спинальной мышечной атрофии необходима утрата или му­ тационное повреждение хотя бы в одном из трех генов SMN1, NAIP и H4F5. Болезнь возникает при гомозиготном состоя­ нии мутаций (обычно — делеций) в гене SMN1, при этом раз­ личия между клиническими формами спинальной мышечной атрофии определяются тремя основными факторами: нали­ чием или отсутствием гомозиготных делеций в генах NAIP и H4F5 (или иных мутаций, существование которых в настоя­ щее время не может быть исключено) и числом центромерных копий гена SMN2 (две — в случае типа I и от трех до пяти — в случае болезни II и III типа). По некоторым оценкам, до 30% взрослых форм спинальных мышечных атрофии не связаны с мутациями в SMA-области. Особенно отчетливо отсутствие такой связи просле­ живается на аутосомно-доминантных вариантах заболевания. Среди них мышечная атрофия Шарко-Мари-Тус, обозначае­ мая также как дистальная наследственная моторная нейропатия типа II (MIM 158590). Ген НММ2,ответственный за это заболевание картирован в длинном плече хромосомы 12 в области 12q24e 13-сМ интервале между маркерами D12S86 и D12S340 (Timmerman et al., 1996). К спинальным мышечным атрофиям позднего возрас­ та относится болезнь Кеннеди — спинально-бульбарная мы­ шечная атрофия. Это сцепленное с полом нейродегенеративное заболевание обусловленно увеличением длины микросателлитного CAG-повтора, расположенного в гене адренорецептора(АР) и кодирующего цепочку из полиглютаминов. Подробная молекулярно-генетическая характеристика подоб­ ных заболеваний, относящихся к группе болезней экспансии, будет представлена во второй части монографии. Для болез­ ней, вызванных экспансией CAG-повтора, характерна мед­ ленно прогрессирующая деградация нейронов в специфиче­ ских отделах мозга. Дегенеративным процессам предшест­ вует накопление в ядрах нейронов нерастворимых устойчи­ вых к протеолизу белковых агрегатов. Наличие подобных 194

ядерных и/или цитоплазматических включений доказано в отношении по крайней мере шести подобных заболеваний, включая спинально-бульбарную мышечную атрофию. Эти образования, состоящие из гранул и филамент, окрашивают­ ся специфическими антителами только на те участки соот­ ветствующих белков, которые содержат полиглютаминовые треки. По-видимому, процессинг мутантных белков при бо­ лезнях, вызванных экспансией CAG-повтора, сопровожда­ ется образованием укороченных фрагментов с удлиненны­ ми полиглютаминами, способных транспортироваться в ядра и накапливаться там в составе белковых агрегатов. Ядерные включения окрашиваются также антителами наубикитин, что доказывает их устойчивость к убикитин-опосредованному протеолизу. Накопление подобных агрегатов в нейрональных клетках индуцирует апоптоз и является одной из основных при­ чин развития специфических нейродегенеративных процессов. Наследственные полинейропатии включают в себя раз­ личные формы болезни Шарко-Мари-Тус и синдрома Дежерин-Сотта. Это большая генетически гетерогенная группа за­ болеваний со сходной клинической картиной. Перонеальная мышечная атрофия, — или болезнь Шарко-Мари-Тус, — наи­ более распространенная наследственная периферическая нейропатия у человека. Известны аутосомно-доминантные, аутосомно-рецессивные и сцепленные с полом формы забо­ левания. Чаще встречается I тип моторной и сенсорной нейропатии с аутосомно-доминантным характером наследова­ ния. При II типе полинейропатии с аутосомно-доминантными и аутосомно-рецессивными формами наследования болезнь дебютирует в более позднем возрасте. Ill аутосомно-доминантный тип наследственной сенсорной и моторной нейропатии идентифицируют с болезнью Дежерина-Сотта. Выде­ ляют также моторные и сенсорные нейропатии с Х-сцепленным доминантным и рецессивным типом наследования. Молекулярный анализ показал, что существуют две генетические формы заболевания со сходной клинической картиной полинейропатии I типа — 1А и 1В. Более чем в 195

половине случаев болезнь развивается вследствие гипер­ продукции интегрального мембранного белка компактного миелина периферической нервной системы, получившего название Р т р - 2 2 — периферический миелиновый белок22. Гиперпродукция белка происходит вследствие дупли­ каций области локализации гена РМР22, присутствующих у 7 0 — 9 0 % пациентов с типом IA болезни Шарко-Мари-Тус. Таким о б р а з о м , это заболевание является уникальным случаем наследуемой частичной трисомии, при которой идентифицирован главный и, возможно, единственный ген, связанный с данной патологией. В гораздо более редких случаях у пациентов обнаруживаются гетерозиготные му­ тации в гене РМР22, также приводящие к клинике мотор­ ной и сенсорной нейропатии I типа. Интересно отметить, что гипопродукция периферического миелинового белка22, происходящая вследствие делеции области локализа­ ции гена РМР22, является причиной другой формы доми­ нантной нейропатии с в о з м о ж н ы м р а з в и т и е м парезов вследствие сдавления ствола нерва. Вторая генетическая форма полинеропатий I типа — IB связана с дефектами главного структурного белка пе­ риферического миелина — Р(0). Р(0) составляет более 5 0 % всего белка, присутствующего в оболочках периферичес­ ких нервов. В центральной нервной системе Р(0) не обна­ ружен. Это интегральный мембранный белок, связываю­ щий соседние ламеллы посредством гомофильных взаимо­ действий, что обеспечивает компактизацию и стабилиза­ цию всего миелинового комплекса. Большинство мутаций, идентифицированных у пациентов с формой IB болезни Шарко-Мари-Тус, сопровождаются заменой или потерей одной из аминокислот во внеклеточном домене Р(О), иг­ рающем значительную роль в миелиновой мембранной адгезии. В то же время синдром Дежерина-Сотта не явля­ ется генетически самостоятельной нозологической фор­ мой, а представляет собой аллельные варианты болезни Шарко-Мари-Тус двух разных типов 1А и 1В. 196

Из всех доминатно наследуемых форм болезни ШаркоМари-Тус около 2 0 % составляет II тип нейрональной поли­ нейропатии, также представляющий генетически гетероген­ ную группу заболеваний. II тип болезни Шарко-Мари-Тус вклю­ чает по крайней мере четыре формы — 2A-2D. Несмотря на клиническое сходство аксональных и нейрональных форм заболевания, между ними, по-видимому, существуют фунда­ ментальные различия, поскольку СМТ2-гены не является аллельными вариантами ни одного из СМТ1-генов, картиро­ ванных к настоящему времени. Х-сцепленная доминантная форма болезни ШаркоМари-Тус обусловлена мутациями в гене бета коннексина 32 (Сх32), активно экспрессирующемся в периферической нерв­ ной системе. Коннексины участвуют в образовании межкле­ точных каналов за счет совмещения мембранных пор. По этим каналам может осуществляться прямой обмен неболь­ шими молекулами и ионами между соседними клетками и роль таких контактов особенна важна в синаптической передаче. Недавно было показано, что наследственные дефекты дру­ гих бета коннексинов 26 и 31 лежат в основе развития двух различных форм изолированной нейросенсорной тугоухости. В связи с этим уместно вспомнить, что тугоухость как симптом часто входит в комплекс невральной полинейропатии. Идентификация других генов, ответственных за наслед­ ственные формы полинейропатии, пока не проведена, одна­ ко не исключено, что один из аутосомно-рецессивных вари­ антов болезни Шарко-Мари-Тус связан с дефектом белка 2 периферического миелина. Последним из заболеваний в этой главе мы рассмотрим боковой амиотрофический склероз, который в 10% случаев носит семейный характер с чертами аутосомно-доминантного наследования с неполной пенетрантностью. В значительном проценте семейных случаев заболевания первичным биохими­ ческим дефектом оказывается Cu/Zn-связывающая супероксиддисмутаза (СОД1). Предложено несколько возможных механиз­ мов для объяснения патогенного действия мутаций в гене SOD1 197

и избирательной гибели двигательных нейронов при семейном боковом амиотрофическом склерозе. Наиболее вероятным кажется предположение о том, что дестабилизация конформационной структуры мутантной СОД1 сопровождается ее агре­ гацией и формированием комплексов, преципитирующих в дви­ гательных нейронах. Такая возможность не исключена, если учесть, что Cu/Zn-связывающая супероксиддисмутаза относит­ ся к числу мажорных белков, составляющих от 0.5% до 1 % всех цитоплазматических белков нейронов. Более того, в астроцитах и клетках Шванна спинного мозга некоторых пациентов, умерших от бокового амиотрофического склероза, обнаружи­ ваются внутриклеточные включения, подобные тельцам Леви, обладающие СОД1 -иммунореакгивностью. Эти находки позво­ ляют предполагать единый патогенетический механизм для та­ ких разных заболеваний, как боковой амиотрофический скле­ роз, болезни мышц, обусловленные накоплением цитоплазма­ тических и/или ядерных включений, нейродегенеративные за­ болевания, вызванные экспансией полиглютаминового трека, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, прионовые болез­ ни. Данную проблему мы предполагаем обсудить более подробно в заключительной, пятой части монографии.

3.2. Спинальные мышечные атрофии Наследственно обусловленное поражение мышечной си­ стемы вторичного характера, возникающее в результате денервационного процесса, относят к группе мышечных атрофии. Денервация при спинальных амиотрофиях происходит на уров­ не моторных клеток передних рогов спинного мозга или в соче­ тании с их аналогами — двигательными ядрами черепных нер­ вов. Отмеченная локализация патологического процесса обус­ ловливает развитие вялых параличей, составляющих основу клинического синдрома. Детские спинальные мышечные атро­ фии в зависимости от особенностей клинических проявлений и преимущественной локализации параличей делят на прокси­ мальные и дистальные. Более редкая детская дистальная спинальная амиотрофия в настоящей работе не обсуждается в связи с отсутствием сведений о характере молекулярного дефекта. 198

Достаточно изученной и более многочисленной явля­ ется группа проксимальных детских спинальных амиотрофий. Выделяют три типа детских спинальных амиотрофий. Все три типа объединяет аутосомно-рецессивный характер наследо­ вания, локализация патологического процесса в моторных клетках передних рогов спинного мозга, симметричные пе­ риферические параличи конечностей, прогрессирующее те­ чение болезни, ранняя инвалидизация и летальный исход, обусловленный вовлечением в процесс мышечной системы, обеспечивающей дыхание. Дети, страдающие спинальными амиотрофиями, отличаются нормальным интеллектом. Параклинические методы, используемые для диагнос­ тики заболевания и определения уровня поражения перифе­ рического отдела нервной системы, дают сходные результа­ ты. Исследование мышечных биотоков (ЭМГ-показатели) чет­ ко определяют локализацию процесса в моторных клетках передних рогов спинного мозга. Учитывая системность про­ цесса, любая из исследуемых скелетных мышц обнаружива­ ет специфические изменения. Данные мышечной биопсии указывают на характерную для спинального процесса пучко­ вую мышечную атрофию. Биохимические исследования, на­ правленные на определение активности сывороточных фер­ ментов, участвующих в мышечном метаболизме, определя­ ют вторичный характер поражения скелетных мышц.

а) Проксимальные детские спинальные мышечные атрофии. Тип 1, болезнь Верднига-Гоффмана (MIM: 253300). Тип 2, промежуточный (MIM: 253550). Тип 3, мягкая спинальная амиотрофия КугельбергаВеландер (MIM: 253400) 1. Клиническая характеристика заболевания Общая частота спинальных мышечных атрофии —1 на 6—10 тысяч новорожденных. Распространенность заболева­ ния: от 2 до 3.3 на 100 000 населения. Частота гетерозигот­ ного носительства:1 на 40—60. Это второе после муковисци199

доза наиболее частое сублетальное моногенное заболева­ ние с аутосомно-рецессивным типом наследования. Извест­ ны ранние формы, проявляющиеся с рождения, а также состо­ яния, симптомы которых возникают в более поздний период с относительно мягким прогрессированием. Особенности клини­ ки детской спинальной амиотрофии хорошо представлены в оте­ чественной литературе (Савельева—Васильева,1972). Различают три типа спинальной мышечной атрофии. Первый тип детской спинальной амиотрофии известен как болезнь Верднига-Гоффмана. В связи с быстрым прогресси­ рованием заболевание получило название «острая форма детской спинальной амиотрофии». Иногда ее называют «ран­ няя или врожденная детская спинальная амиотрофия». Пер­ вые признаки болезни могут проявить себя уже во внутриут­ робном периоде недостаточно активным шевелением плода. В этих случаях мышечная слабость и гипотония отмечаются с первых дней жизни. Неврологический статус ребенка укла­ дывается в широкое понятие «вялый ребенок», не ограни­ ченное спинальной амиотрофией. Как правило, с первых дней жизни вялые парезы всей поперечно-полосатой мускулату­ ры (мышцы шеи, туловища, конечностей) снижают физиоло­ гическую мышечную гипертонию конечностей, обусловлива­ ют угнетение рефлексов новорожденных. Даже жизненно важные защитный и сосательный рефлексы могут быть сни­ жены или отсутствовать. Своеобразна поза больного. Она напоминает позу лягушки. Верхние конечности отведены в плечевых суставах, слегка согнуты в локтевых и пронированы в лучезапястных. Нижние конечности отведены в тазобе­ дренных суставах, согнуты в коленных и голеностопных. Сто­ пы согнуты, отведены. Грудная клетка обычно деформирова­ на. Она имеет вид «колокола» — верхняя апертура умень­ шена в размере, нижняя расширена. Типична деформация грудины. Она может иметь килевидную или воронкообраз­ ную форму. Мышечный тонус диффузно снижен, активные движения конечностей ограничены. Ограничение касается как проксимальных, так и дистальных отделов. Нет четкой 200

диссоциации между парезами верхних и нижних конечнос­ тей. Парезы всегда симметричны. Пассивно поднятые конеч­ ности падают. При пассивном удержании ребенка в верти­ кальном положении отсутствует опора на нижние конечнос­ ти. Лежа на спине больной ребенок никогда не принимает типичную для раннего возраста позу с поднятыми вверх ниж­ ними конечностями. Глубокие рефлексы — коленные и ахил­ ловы, как правило, отсутствуют. Если сохраняются рефлек­ сы на верхних конечностях, то они бывают очень низкими. Мышечные атрофии при достаточно хорошо развитом под­ кожном жировом слое могут быть не видны. Мышечная сла­ бость распространяется и на дыхательную мускулатуру. Ос­ лабление функции межреберных мышц и диафрагмы в ка­ кой-то мере компенсируется активным участием в дыхании мускулатуры живота. Включение в патологический процесс диафрагмы ведет к ослаблению экскурсии грудной клетки. Полный паралич диафрагмы обуславливает парадоксальное дыхание и угрожает жизни ребенка. Характерен тихий голос пациентов. Вовлечение в процесс двигательных ядер череп­ но-мозговых нервов затрудняет акт сосания. Отчетливее других можно наблюдать поражение XII пары, в виде атро­ фии языка и фибриллярных подергиваний. Недостаточная функция мимической мускулатуры находит свое выражение в своеобразном «кукольном» лице ребенка. Психическое раз­ витие не страдает. Течение болезни носит неуклонно прогрес­ сирующий характер. Иногда кратковременная остановка на­ растания параличей ошибочно принимается за улучшение. Темпы моторного развития резко отстают от нормаль­ ных критериев. Дети плохо удерживают голову. Не способны самостоятельно поворачиваться в постели, вставать на ноги и стоять. В тех случаях, когда ребенок сидит, будучи поса­ женным, он опирается на руки, а позвоночник кифозируется. Деформация позвоночника в начале болезни ликвидиру­ ется при изменении позы. В дальнейшем же сколиоз, кифоз, кифосколиоз грудного и поясничного отделов становятся фиксированными. Продолжительность жизни больных неве201

лика. Обычно они погибают на первом гс>ДУ жизни. Причиной смерти является дыхательная недостаточность на фоне по­ вторных пневмоний и ателектазов. ИВЛ продлевает жизнь на короткое время. Следует отметить, что хорошие условия жизни, тщательный уход за больным ребенком способны про­ длить его жизнь на месяцы, но не на годы. II тип детской спинальной амиотрофии именуется хро­ ническим или промежуточным. Его отличают чуть более позднее начало, относительно медленное прогрессирование, лучшая жизнеспособность и ряд клинических призна­ ков. Внутриутробное развитие плода не вызывает беспо­ койства. Шевеление, как правило, наступает своевремен­ но и продолжается достаточно активно на протяжении всей беременности. Дети рождаются доношенными. В периоде новорожденное™ и в первое полугодие ж и з н и темпы пси­ хомоторного развития соответствуют возрастным критери­ ям. Доречевое развитие оказывается нормальным. Пер­ вые признаки болезни в виде мышечной слабости возни­ кают постепенно и не всегда сразу улавливаются родите­ лями. Начало болезни следует отнести к 6—14 месяцам жизни и крайне редко позднее. Можно отметить опреде­ ленную последовательность в развитии парезов. Сперва страдают проксимальные отделы нижних конечностей, а затем в процесс вовлекаются верхние конечности, муску­ латура шеи и туловища. Преимущественное поражение ног остается на протяжении всей жизни пациента. В типичном случае начало заболевания относится ко второму полуго­ дию первого года ж и з н и . Ребенок утрачивает те движения, которые он ранее выполнял без труда. Так, если он само­ стоятельно садился, вставал на ноги, переступал, то эти функции, требующие хорошей мышечной силы, постепен­ но утрачиваются, и новые не приобретартся. В начальном периоде болезни атрофии не определяРтся, костные де­ формации не выражены. Глубокие рефлексы снижаются. Вначале угасает коленный рефлекс. На первый план вы­ ступает мышечная слабость и гипотония. В тех случаях, 202

когда ходьба возможна (самостоятельная или с посторон­ ней помощью), походка раскачивающаяся, с опорой на вну­ тренние поверхности стоп. Бег невозможен. В разверну­ том периоде болезни клиническая симптоматика становит­ ся выраженной и достаточно стандартной. Заболевание носит системный характер — страдает симметрично вся поперечно-полосатая мускулатура. Однако преимущест­ венное поражение определенных мышечных групп созда­ ет типичные деформации конечностей, грудной клетки, по­ звоночника. Так, в нижних конечностях отмечаются сгибательные контрактуры в тазобедренных и коленных, разгибательные и отводящие в голеностопных суставах. Нижние конечности принимают вид Х-образных. На верхних конеч­ ностях из-за контрактур ограничивается разгибание пред­ плечья и супинация кисти. Слабость мышц спины ведет к деформации позвоночника в виде кифосколиоза, иногда с ротаторным компонентом. Грудная клетка принимает фор­ му воронкообразной, реже — килеобразной («куриной»). Весьма характерным клиническим п р и з н а к о м является тремор верхних конечностей, усиливающийся при актив­ ных движениях. Тремор может быть выражен очень слабо, и его не всегда замечают родители. В этом периоде болез­ ни дети не способны ходить, садятся с посторонней помо­ щью, опора на ноги отсутствует. Мышечные атрофии ста­ новятся отчетливыми. Они охватывают мускулатуру ниж­ них и верхних конечностей, грудной клетки и живота. Утра­ чиваются все глубокие рефлексы. Черепно-головная ин­ нервация поражается незначительно. Преимущественно вовлекаются в процесс ядра XII, XI и в меньшей степени VII пары. Мускулатура лица грубо не страдает, можно от­ метить лишь недостаточную мимическую активность. Поч­ ти всегда можно обнаружить признаки атрофии языка и фибриллярные подергивания. Голос и плач больных не громкий, что можно объяснить не столько слабостью голо­ совых связок, сколько недостаточной функцией дыхатель­ ной мускулатуры. Последняя является причиной частых 203

пневмоний, которые переносит ребенок на протяжении жизни и приводят к летальному исходу. Интеллект больно­ го никогда не страдает, что отличает детскую спинальную амиотрофию от некоторых других ранних форм нервномышечных заболеваний. На всем протяжении заболева­ ния характерен общий гипергидроз. В процессе заболева­ ния усиливаются парезы, нарастают атрофии, становятся более грубыми костные деформации как результат нару­ шения трофики. Наряду с мышечными атрофиями умень­ шается подкожный жировой слой, становятся заметнее фасцикулярные подергивания мышц. Значительно реже в процессе усиливающихся атрофии увеличивается подкожножировой слой, тогда атрофии преимущественно можно наблюдать только в языке. Течение заболевания неуклон­ но прогрессирующее. Продолжительность жизни может до­ стигать 15—18 лет. Любая интеркуррентная инфекция утя­ желяет течение болезни. Ill тип детской спинальной амиотрофии известен как болезнь Кугельберга-Веландер. Заболевание рассматри­ вается как мягкая форма. Это относится к клиническим проявлениям, более медленному прогрессированию и боль­ шей продолжительности жизни. Начальные проявления мы­ шечной слабости отмечаются на втором году ж и з н и , хотя эти сроки могут быть более поздними. Периферические парезы нижних конечностей обнаруживаются тогда, когда к движениям ребенка предъявляются достаточно высокие требования. Это — ходьба, бег, прыжки, вставание с пола, подъем по лестнице. Нагрузка оказывается подчас непо­ сильной. Изменяется походка, ребенок раскачивается при ходьбе, опирается на внутренние поверхности стоп. Опо­ ра при ходьбе осуществляется на выпрямленные в колен­ ных суставах конечности. Сгибание ног в коленных суста­ вах, очень легкое приседание ведут к падению. Использу­ ются вспомогательные движения при вставании, переме­ не положения из горизонтального в вертикальное. Утрачи­ вается способность прыгать и бегать, если она ранее име204

лась. В развернутой стадии болезни дети отличаются осо­ бенностями телосложения. Широкое межлопаточное про­ странство дополняется крыловидными лопатками. Как пра­ вило, усилен поясничный лордоз, выпячен вперед живот, уплощена в передне-заднем направлении грудная клетка. Эти деформации выражены не столь грубо, как подобное имеет место при предыдущих формах. Парезы конечнос­ тей и мускулатуры шеи и туловища носят симметричный генерализованный характер. Порядок вовлечения мышеч­ ных групп стереотипен. Первыми страдают проксимальные отделы нижних конечностей и мышцы таза. Далее слабость охватывает мышцы проксимальных отделов верхних конеч­ ностей и плечевого пояса. Постепенно становится замет­ ной слабость остальных мышц конечностей, спины, живо­ та. Ранее других угасают коленные рефлексы, затем двухи трехглавых мышц верхних конечностей. Брюшные и подош­ венные рефлексы могут длительное время быть сохран­ ными или незначительно сниженными. Стопы имеют склон­ ность к плосковальгусной деформации. Атрофии мышц но­ сят диффузный характер. Фасцикулярные подергивания наблюдаются в различных мышечных группах, наиболее ча­ сто в области надплечий, спины, груди. Гипотония опреде­ ляется во всех мышечных группах, что способствует избы­ точным движениям в суставах. Контрактуры в конечнос­ тях появляются только в поздних стадиях заболевания, в период, когда самостоятельное передвижение больных ста­ новится невозможным. Респираторные инфекции у боль­ ных могут наблюдаться на протяжении всей ж и з н и . Череп­ ные нервы грубо не страдают, могут иметь место легкая атрофия языка и фасцикуляции. Продолжительность жиз­ ни больных более высокая, чем в предыдущих группах и достигает 2—3 десятилетий. Подтверждение диагноза лю­ бого из трех типов детской спинальной амиотрофий дают показатели электрофизиологического и морфологическо­ го исследований мышц. Электромиограмма свидетельству­ ет о патологическом процессе в моторных клетках перед205

них рогов спинного мозга. В мышечных биоптатах обнару­ живается т а к называемая пучковая атрофия. 2. Картирование гена SMA и генетическая характеристика SMA-обпасти Локус, ответственный за развитее всех трех форм дет­ ской спинальной мышечной атрофии, картируется в районе 5q12.2-q13, и сами эти заболевания представляют собой аллельные варианты мутаций одного или, точнее, группы тесно сцепленных генов (Daniels et al., 1992)- Картированию гена SMA (spinal muscular atrophy) способствовало обнаружение его тесного сцепления с высокоинформативным динуклеотидным микросателлитным повтором, локализованным в длинном плече хромосомы 5 (Lein et Э1. 1991). Фланкирую­ щими маркерами SMA, расположенными на расстоянии око­ ло 2 сМ друг от друга, являются с дистальной стороны ДНКмаркер D5S6 и с проксимальной — геИ МАР1 В, кодирующий белок, ассоциированный с микротруб