Современные методы исследований в биохимии: Методические указания к выполнению СРС

Федеральное агентство по образованию

Восточно-Сибирский государственный технологический университет

УДК 577.1:543.5(075.8) Битуева А.В. Методические указания к выполнению СРС по курсу «Современные методы исследований в биохимии». - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2006. – 72 с. Рецензент: д.б.н., профессор кафедры «Биоорганическая и пищевая химия» Жамсаранова С.Д.

Методические указания к выполнению СРС по курсу «Современные методы исследований в биохимии» для студентов направления 260100 «Технология продуктов питания», магистерская программа разработана на основе ГОСВПО по направлению 260100 регистр. №187 от 23 марта 2000 г

Составитель Битуева А.В.

Дисциплина «Современные методы исследований в биохимии» относится к циклу дисциплин по выбору для студентов направления 260100 «Технология продуктов питания», обучающихся по магистерской специализированной программе «Развитие новых технологий на основе рационального использования белков». Методические указания к выполнению СРС по курсу «Современные методы исследований в биохимии» содержат теоретическое обоснование хроматографических методов исследования, масс-спектрометрии, методы ДНКдиагностики, а также вопросы для самопроверки знаний, включающие вопросы текущего контроля знаний, теоретических коллоквиумов. Методические указания составлены в соответствии рабочей программой курса и рекомендуются магистрантам, начинающим аспирантам.

Табл. 7, рис. 6, библиогр.: 16

Издательство ВСГТУ Улан-Удэ, 2006

ВСГТУ, 2006 г.

СОДЕРЖАНИЕ 1. 2. 2.1. 2.2. 2.3. 2.4 2.5. 2.6. 2.7. 3. 3.1. 3.2. 3.3. 4. 4.1. 5. 6. 7.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ДИСЦИПЛИНЫ Современные методы анализа, применяемые в биохимии Хроматографические методы определения веществ Оптимизация условий фракционирования Тонкослойная и бумажная хроматография Колоночная хроматография Жидкостная хроматография низкого давления Высокоэффективная жидкостная хроматография Газовая хроматография Атомно-абсорбционная спектрометрия, атомноэмиссионная спектрометрия с индуктивносвязанной плазмой в биохимическом анализе Основные принципы атомной спектрометрии Атомно-эмиссионная спектрометрия с индуктивносвязанной плазмой Атомно-абсорбционная спектрометрия Масс-спектрометрия элементного анализа Разновидности масс-спектрального анализа Методы ДНК-диагностики ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПРОВЕРКИ ЗНАНИЙ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5 6 6 11 19 24 27 29 33 36 37 38 41 43 47 50 65 71

ВЭТТ ТСХ ВЭЖХ ГХ ТЖХ ЖЖХ ГЖХ РГХ ААС АЭС-ИСП АЭС ОЭС ЖХ/МС ГХ/МС МС/МС ПЦР –

высота, эквивалентная теоретической тарелке тонкослойная хроматография высокоэффективная жидкостная хроматография газовая хроматография Твердожидкостная хроматография Жидкожидкостная хроматография Газожидкостная хроматография (распределительная) реакционной газовой хроматографии атомно-абсорбционная спектрометрия атомно-эмиссионная спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой атомно-эмиссионной спектрометрии (другое название метода — оптико-эмиссионная спектрометрия) жидкостная хроматография с массспектрометрией - метод газовая хроматография с масс-спектрометрией тандемная масс-спектрометрия Полимеразная цепная реакция

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ДИСЦИПЛИНЫ Биологическая химия как наука, занимающаяся выяснением химической природы веществ, входящих в состав живых организмов, их превращения, а также связь этих превращений с деятельностью клеток, органов и тканей организма в целом, использует для их изучения разнообразные методы исследований. Целью обучения по дисциплине «Современные методы исследований в биохимии» является • совершенствование навыков работы по выделению и экстрагированию биологически активных веществ из различных субстратов с использованием методов хроматографии; • определение количественного содержания биологически активных веществ, содержащихся в изучаемых объектах, флюорометрическими методами; • качественная оценка пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников, методом полимеразной цепной реакции; • обучение студентов технике современного биохимического анализа, методам оценки и выбора методов анализа, адекватных поставленной задаче; • освоение современных методик, позволяющих выполнить будущую магистерскую диссертацию на достаточно высоком уровне. Предметные цели обучения включают следующие уровни усвоения знаний: Студент должен иметь представления: • об элементах теории хроматографических методов; • о хроматографическом процессе; • о материалах матриц сорбентов и обменников; • о методах ДНК – диагностики в пищевой промышленности;

• новейшие научные и практические достижения в области биологической химии; Студент должен знать: • классификацию хроматографических методов; • о принципах действия метода полимеразной цепной реакции; Студент должен уметь: • выбирать параметры хроматографического процесса; • оптимизировать условия эксперимента; • проводить подготовку эксперимента на анализаторе жидкости «Флюоорат-02»; • проводить выделение ДНК, амплификацию и электрофоретический анализ продуктов амплификации.

2. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В БИОХИМИИ В настоящих методических указаниях рассматриваются современные физико-химические методы, используемые в биохимии: разные виды хроматографии, атомно-абсорбционная спектрометрия, атомно-эмиссионная спектрометрия с индуктивно связанной плазмой, масс-спектрометрия, методы ДНК-диагностики. 2.1. Хроматографические методы определения веществ В современных химико-биологических исследованиях наиболее часто применяют различные типы хроматографических методов: тонкослойную хроматографию (ТСХ), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), газовую хроматографию (ГХ).

Физико-химические основы хроматографии Хроматографией называется разделение веществ, основанное на распределении компонентов смеси между неподвижной (стационарной) и подвижной (мобильной) фазами. Молекулы разделяемых веществ диффундируют через поверхность раздела фаз и в зависимости от химической природы удерживаются той или иной фазой по-разному. При продвижении компонентов смеси в разделяющей среде диффузия между фазами осуществляется многократно, причем каждый раз достигается небольшое разделение. Чем выше эффект разделения, тем точнее конечный результат анализа. Хроматографию сравнивают с ректификацией и пользуются понятием «теоретическая тарелка». Однако если для оценки эффективности ректификационной колонки используют понятие «число теоретических тарелок», то в хроматографии для оценки эффективности системы применяют понятие «высота, эквивалентная теоретической тарелке» (ВЭТТ). ВЭТТ соответствует расстоянию между двумя соседними теоретическими тарелками. Лабораторные установки для ректификации имеют обычно 10—100 теоретических тарелок. В ТСХ — наиболее простом варианте хроматографии используют хроматографические пластинки эффективностью несколько тысяч теоретических тарелок. Современная хроматография (в частности ВЭЖХ) располагает высококачественными сорбентами, позволяющими готовить хроматографические колонки эффективностью несколько десятков тысяч теоретических тарелок. В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы различают жидкостную и газовую хроматографию (табл. 1). В основе газовой хроматографии лежат процессы распределения и адсорбции. Свойства подвижной фазы (газа-

носителя) имеют второстепенное значение для процесса разделения. В ТЖХ и ЖЖХ процесс разделения в значительной степени определяется составом подвижной фазы. В качестве подвижной фазы используется множество веществ, поэтому для каждого специального случая можно подобрать подходящую систему разделения. ГЖХ применяют главным образом для аналитических целей, а жидкостную хроматографию чаще используют для препаративных целей. Таблица 1. КЛАССИФИКАЦИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПО АГРЕГАТНОМУ СОСТОЯНИЮ ПОДВИЖНОЙ И НЕПОДВИЖНОЙ ФАЗ Неподвижная фаза

Подвижная фаза жидкость

Твердая

Твердожидкостная хроматография (ТЖХ) (адсорбционная, ионообменная, аффинная)

Жидкая

Жидкожидкостная хроматография (ЖЖХ) (распределительная)

газ Газоадсорбционная хроматография (ГАХ)

Газожидкостная хроматография (ГЖХ) (распределительная) Выбор принципа разделения зависит от информации о свойствах анализируемых веществ. Так, например, только данные о растворимости целевых веществ позволяют сделать выводы о возможной схеме исследования (табл. 2). Если имеется какая-либо предварительная информация о свойствах анализируемых веществ, то, руководствуясь

данными, приведенными в табл. 3, можно выбрать принцип разделения. Анализируемые вещества распределены по полярности функциональных групп (возрастает слева направо). Неполярные вещества разделяют при помощи нормально-фазовой хроматографии.

В дихлорметане и гептане

Таблица 2. ВЫБОР ПРИНЦИПА РАЗДЕЛЕНИЯ И ТИПА СОРБЕНТА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ РАСТВОРИМОСТИ ЦЕЛЕВОГО ВЕЩЕСТВА

Таблица 3. ПРИНЦИП РАЗДЕЛЕНИЯ ДЛЯ КСЕНОБИОТИКОВ РАЗНЫХ ХИМИЧЕСКИХ КЛАССОВ

Растворимость целевого

Принцип

вещества

разделения

Только в воде

Ионообмен Гельхроматография

В воде и этаноле

В этаноле и дихлорметане (хлористом метилене)

Распределение

Гельхроматография Адсорбция или распределение Гельхроматография

Сорбент хроматография хроматография низкого давления высокого давления Дауэкс, сефадекс, Ионообменники ионообменная на основе целлюлоза силикагеля Сефадекс G, Пористое стекло биогель, гидрогель, (CPG),TSK-гель сефакрил, агароза Целлюлоза или Силикагель модифицированный декстран (сефадекс LH),элюент: малополярный + сильнополярный растворитель Сефадекс LH Порагель, пористое стекло Силикагель, Модифицирован сефадекс LH кизельгель -NO2, -CM) Сефадекс LH Полистирагель (например, стирагель)

Неполярные соединения Углеводороды и их производные RH RX RNO2

Нормальнофазовая хроматография

Адсорбция или гельхроматография

Силикагель, оксид алюминия Полистирагель (например, биобедс)

Силикагель Полистирагель (например, стирагель)

Полярные соединения Кислородсодержа щие соединения О О О О II II II II ROR RC-OR RCR RCH RCNHR

Обращеннофазовая хроматография

Доноры Ионогенные протонов (ОН- соединения и NH-кислоты) + RNH2 ROH NH3-R-CO2ArOH RCO2H Распредели- Ионообментельная ная хроматохроматография графия

Выбор системы элюентов определяется рядом факторов. В гель-хроматографии вещества должны хорошо растворяться в элюенте, а вязкость элюента и раствора пробы должна быть минимальной. Селективность ионообменной хроматографии зависит не только от ионной силы буфера, но и от природы противоионов буфера. В адсорбционной хроматографии в большинстве случаев подходят системы метанол—вода или ацетонитрил—вода. Вторая система предпочтительнее, так как вязкость элюента по мере возрастания концентрации ацетонитрила убывает. Сопротивление колонки для системы метанол—вода выше, чем для системы ацетонитрил—вода.

Влага существенно влияет на селективность неполярной системы растворителей. После того как определен принцип разделения, подобраны элюент и размеры частиц сорбента, необходимо определить, какое разрешение должно быть достигнуто, какое количество вещества необходимо разделить и насколько важен фактор времени. На практике все параметры взаимосвязаны и условия хроматографического разделения можно оптимизировать только по одному из трех параметров. 2.2. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ В большинстве случаев перед хроматографическим процессом стоит задача надежного разделения двух или более заранее известных компонентов исходной смеси. Если хроматографическая система уже определена, то в распоряжении экспериментатора еще остается возможность выбора целого ряда физических параметров процесса с целью оптимизации условий разрешения зон (пиков) в этой системе. Последовательно рассмотрим следующий ряд параметров: геометрия колонки, размер гранул, набивка колонки, скорость элюции, загрузка колонки. Рассмотрение возможно с позиции улучшения разрешения и одновременно уменьшения продолжительности хроматографического процесса. Геометрия колонки Длина колонки учитывается для поддержания оптимальной скорости элюции. Для слишком длинной колонки поддержание оптимальной скорости элюции может потребовать очень большого перепада давлений. С этой

точки зрения необходимо оценить возможности имеющегося насоса и опасность деформации гранул используемого сорбента. Диаметр колонки теоретически не должен сказываться ни на одной из характеристик хроматографического процесса: ни на скорости миграции, ни на форме зон, ни на разрешении. Например, колонку, площадь сечения которой в 100 раз превышает площадь сечения другой колонки (при идентичности всех прочих параметров, включая длину), можно рассматривать как 100 колонок меньшего диаметра, собранных параллельно, в один «пучок». В реальных случаях выбор сечения колонки сказывается на характеристиках хроматографического процесса. С одной стороны, диаметр колонки должен не менее чем в 50 раз превышать диаметр гранул, иначе упомянутое ранее влияние стенок колонки может вызвать заметное расширение зоны. С другой стороны, колонки диаметром более 2 см отличаются худшими характеристиками за счет неоднородностей тока жидкости в них, так как при набивке их сорбентом трудно обеспечить равномерность его распределения по всему сечению. Эти трудности особенно сильно выражены при гель-фильтрации, где зоны движутся очень близко друг за другом. Тем не менее диаметр колонки нередко заметно увеличивают ради большей загрузки препаратом, с тем чтобы при этом сохранить малой ширину исходной зоны. Размер гранул С уменьшением диаметра гранул d условия хроматографии заметно улучшаются: уменьшается высота теоретической тарелки, дисперсия зон, увеличивается разрешение, повышается оптимальная скорость элюции. Однако при этом происходит сильный рост необходимого перепада давления (АР). Необходимый перепад давления растет пропорционально третьей степени уменьшения

диаметра гранул (например, при уменьшении диаметра втрое перепад давлений необходимо увеличить в 27 раз). Это предъявляет новые, повышенные требования к конструкции насосов, колонок, подводящих трубок и их сочленений, а также к жесткости самих гранул (сжатие гранул ведет к их деформации, заполнению свободной площади сечения и закупориванию колонки). Как только возникла необходимость убыстрения хроматографического анализа (например, для экспресс-анализа в заводских условиях), указанные повышенные требования были осуществлены при разработке новой техники хроматографии при высоком давлении, которую условились обозначать ЖХВД. Диаметр гранул для ЖХВД оказалось возможным снизить 5 —10 мкм, что позволило использовать колонки диаметром 2—5 мм и уменьшить продолжительность хроматографического разделения до десятков минут; при этом используют перепады давления порядка сотен атмосфер. Существенного снижения эффективного размера гранул неподвижной фазы и улучшения разрешения без необходимости очень сильного повышения давления можно добиться путем использования в качестве неподвижной фазы сплошных (не пористых) гранул с сорбированным или химически закрепленным на них тонким слоем жидкости. Но при этом происходит снижение емкости колонки. Набивка колонки Практические исследования показывают, что в случае ненабухающих (и несжимаемых) гранул на основе спликагеля или пористого стекла наилучшие результаты нередко дает заполнение колонки сухими гранулами. Колонку при этом следует потряхивать или постукивать по ней. Первое заполнение ее жидкостью следует вести снизу вверх, вытесняя воздух. Матрицы и сорбенты на основе

целлюлозы или сефадекса нельзя вносить в сухом виде — им следует предварительно дать набухнуть. Для заполнения предпочтительно использовать суспензию гранул в воде или буфере в виде густой кашицы. Во всех случаях следует избегать свободного осаждения гранул из суспензии во время заполнения колонки, так как это приведет к распределению частиц по размерам как в продольном направлении, так и по сечению колонки, что обусловливает неоднородность последующего тока подвижной фазы. После заполнения фазам в колонке надо дать уравновеситься при рабочей скорости элюции и соответствующем перепаде давления.

Скорость элюции С помощью теории миграции хроматографической зоны можно получить выражение для оптимальной скорости элюции uопт; в первом приближении оно сводится к очень простой зависимости uопт ≈ Dm/d, где Dm — коэффициент диффузии вещества в подвижной фазе, a d — средний диаметр гранул. Для низкомолекулярных веществ в водных растворителях можно принять, что Dm≈10-5cm2/c. Тогда для колонки, заполненной гранулами со средним диаметром 80 мкм, uопт составит 1,25·10-3 см/с или 4,5 мл/ч на 1 см2 сечения колонки. Рабочую скорость элюции можно брать в 5 — 6 раз выше, чем uопт , т. е. примерно 20—30 мл/ч·см3. Для колонок ЖХВД с гранулами диаметром 10 мкм рабочую линейную скорость можно увеличить до 5· 10 2 см/с, т. е. до 3 см/мин. При обычной высоте колонки (25 см) это позволяет проводить хроматографическое фракционирование за 8—10 мин.

Загрузка колонки В целях наилучшего использования разрешающей возможности колонки ширина исходной зоны должна быть минимальной. Это не обязательно означает, что объем раствора препарата, вносимого на колонку, должен быть мал. Такое заключение справедливо только для гельфильтрации, где сорбция препарата в неподвижной фазе отсутствует. Если же сродство хроматографируемого вещества к неподвижной фазе велико, как, например, при ионообменной хроматографии, то узкая исходная зона на верхнем конце колонки образуется сама в процессе нанесения препарата даже из большого объема разбавленного раствора. С другой стороны, следует проявлять осторожность при внесении на колонку препарата в виде концентрированного раствора. Помимо проблемы повышенной вязкости такого раствора, не исключено, что условия в исходной зоне будут неблагоприятно влиять на разрешении пиков. В результате зона разрешения деформируется (ее передний фронт будет становиться все более крутым, а задний — растянется) и приобретет профиль с образованием размытого «хвоста», что достаточно часто встречается в хроматографической практике. Эта деформация может быть следствием перегрузки зоны, а также в случае слишком большой скорости элюции, разрешение этой альтернативы возможно за счет уменьшения скорости элюции при той же загрузке колонки. ХРОМАТОГРАФИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ Макромолекулы отличаются от малых молекул не только размерами, но и лабильностью, которая в первую очередь связана с тем, что биологическая активность многих

из них (например, белков) обусловлена третичной структурой, в образовании которой решающую роль играют слабые силы взаимодействия между достаточно удаленными друг от друга участками полипептидной или полинуклеотидной цепи. Кроме того, биологические макромолекулы являются полиэлектролитами, что в случае ионных взаимодействий с сорбентом приводит к многоточечному контакту. Часто на их поверхности мозаично расположены гидрофобные и гидрофильные участки, а также центры сорбции. Биологическая активность многих ферментов связана с сохранением четвертичной структуры, когда белковая молекула состоит из нековалентно связанных между собой субъединиц. Термином «денатурация» обычно обозначают утрату макромолекулами четвертичной, третичной или вторичной структурных организаций. Такая утрата может происходить в ходе самого хроматографического процесса — как в результате воздействия элюента (экстремальные значения рН, высокие концентрации соли, возможность окисления), так и вследствие многоточечной сорбции, когда макромолекулы как бы «распластываются» на поверхности сорбента. При этом слабые связи между участками их цепей разрываются. Денатурация, как правило, приводит к увеличению молекулярного объема и к экспонированию гидрофобных участков, особенно у белков, где эти участки в большинстве своем укрыты от контакта с водно-солевой средой клетки, располагаясь внутри белковых глобул. Такие изменения при денатурации влияют на распределение макромолекул между подвижной и неподвижной фазами. Это влияние нередко бывает неблагоприятным, поскольку развернутые полипептидные или полинуклеотидные цепи склонны очень прочно, а иногда и необратимо

сорбироваться в неподвижной фазе. Даже при отсутствии какой-либо сорбции, например при гель-фильтрации, увеличение молекулярного объема при денатурации может приводить к задержанию молекул внутри гранул, откуда они в нативном состоянии могли свободно диффундировать. Экспонирование гидрофобных участков может приводить к нежелательному взаимодействию фракционируемых молекул с самим материалом матрицы (полимерной сетки), образующей каркас гранул неподвижной фазы. Для уменьшения опасности денатурации нередко приходится вести хроматографию белков при пониженной температуре или вводить в состав элюента глицерин в качестве консерванта, что приводит к увеличению вязкости жидкостей подвижной и неподвижной фаз, требует повышения рабочего давления и нередко ухудшает разрешение за счет затруднения диффузии. С уменьшением коэффициентов диффузии снижается и допустимая скорость элюции, увеличивается продолжительность хроматографического процесса, а вместе с ней — и вероятность денатурации. Следовательно, расширение зон и ухудшение разрешения пиков при хроматографии макромолекул обусловлены главным образом трудностью установления равновесия обмена между фазами. Это обстоятельство, в свою очередь, требует уменьшения скорости элюции. В тех случаях, когда (при достаточно малых размерах гранул) скорость элюции за счет повышенного давления удается увеличить, не следует забывать о возможности денатурации макромолекул в результате их сжатия под высоким давлением. Важное для хроматографии различие между малыми молекулами и биологическими макромолекулами обусловлено полиэлектролитным характером последних. Наличие нескольких точек связывания макромолекулы с

сорбентом в случае обычной адсорбции или в ионообменной системе приводит к ряду специфических особенностей взаимодействия вещества с сорбентом. Во-первых, начинает сказываться стерическое соответствие между ними, например близость средних расстояний между взаимодействующими (сорбционными, ионогенными) группами на поверхности макромолекулы и на сорбенте, что диктует определенную конформационную избирательность процесса. Во-вторых, переход от прочной, почти полной сорбции вещества в неподвижной фазе к его преимущественному нахождению в подвижной может быть очень резким. Этот переход выражен тем резче, чем больше среднее число точек закрепления, связывающих макромолекулу с сорбентом. Постепенное увеличение силы элюента (например, концентрации вытесняющей соли) может длительное время оставаться без видимого эффекта, так как уменьшение среднего числа точек фиксации молекулы еще ее не освобождает. Затем, при достижении критического значения данного параметра элюции, происходит быстрое перераспределение вещества в пользу подвижной фазы. Это означает, в частности, что фракционирование макромолекул путем изократической элюции в большинстве случаев имеет мало шансов на успех. Подавляющее большинство макромолекул при данном выборе элюента либо уже будет находиться в подвижной фазе, либо окажется слишком прочно связанным с неподвижной фазой. Непрерывная линейная градиентная элюция здесь удобнее, так как она для одного белка за другим создает ситуацию, отвечающую быстрой десорбции. Сопоставляя непрерывную и ступенчатую градиентные элюции макромолекул, можно заключить, что первая из них, как правило, дает лучшее и более полное разрешение всех компонентов фракционируемой смеси — в результате

весьма заметного растягивания задних фронтов хроматографических пиков (из-за неравновесного распределения между фазами). Ступенчатая элюция, наоборот, позволяет получить острые пики с очень хорошим выходом, но нередко за счет качества разрешения близких по своим свойствам компонентов, особенно если «высота» ступеней велика и их расположение не слишком удачно. Еще одна особенность хроматографии макромолекул связана с проблемой доступности всего объема неподвижной фазы внутри гранул. Ограничение такой доступности вследствие статистического разброса размеров пор пространственной сетки гранул используется для фракционирования макромолекул по размерам в методе гельфильтрации, однако в других вариантах хроматографии ограничение доступности не только уменьшает емкость системы, но и существенно затрудняет установление равновесия в неподвижной фазе. В этом плане обычные микропористые обменники на основе силикагеля, стекла и полистирола существенно уступают крупнопористым матрицам из целлюлозы и даже декстрана.

2.3. Тонкослойная и бумажная хроматография Методы тонкослойной и бумажной хроматографии (ТСХ и БХ) основаны на различии скоростей перемещения компонентов анализируемой смеси в плоском тонком слое сорбента при движении растворителя (элюента). Растворитель перемещается под действием капиллярных или гравитационных сил. Разница между этими методами заключается лишь в способе формирования рабочего слоя. В ТСХ слой сорбента наносят на поддерживающую подложку (пластинку, пленку). В БХ роль рабочего слоя играет лист специальной бумаги для хроматографии. Преимущество ТСХ заключается в том, что

при небольших затратах можно быстро и эффективно разделять различные смеси.

Рис.1. Пластинка ТСХ. 1—фронт растворителя; 2 — пятно целевого вещества; 3 — стартовая точка; L — расстояние старт—фронту ' — расстояние старт—пятно целевого вещества.

Разделение в ТСХ осуществляется вследствие многократного пересечения молекулами веществ границы фаз твердая — жидкая или жидкая — жидкая, т.е. вследствие многократного распределения вещества между подвижной и неподвижной фазами (рис. 1). Неподвижной фазой служит либо сухой сорбент (адсорбционная хроматография), либо сорбент, покрытый жидкой фазой (распределительная хроматография). Систему растворителей подбирают в соответствии со свойствами разделяемых веществ. Полярные вещества следует разделять в полярных растворителях, малополярные — в менее полярных или неполярных растворителях. В различных системах растворителей вещества обладают различной подвижностью. Количественно подвижность выражается величиной Rf — фактором удерживания, равным отношению расстояний от

стартовой точки до середины пятна вещества (I) и от стартовой точки до линии фронта растворителя (L). Значение Rf практически не зависит от длительности проявления, но зависит от множества других факторов (в том числе и от влажности воздуха) и, следовательно, представляет собой лишь предварительную ориентировочную характеристику. Большинство химических соединений бесцветно, и для их обнаружения на пластинке используют различные физические и химические методы. Многие ароматические соединения имеют собственную флуоресценцию при 360 нм, при такой длине волны они обнаруживаются в виде желтых флуоресцирующих пятен на темном фоне. Большинство готовых ТСХ-пластинок содержит люминофоры; при облучении ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 254 нм наблюдается равномерное желто-зеленое свечение. Вещества, поглощающие свет в ультрафиолетовой области, обнаруживаются в виде темных пятен на светлом фоне. Сорбенты, применяемые в тонкослойной хроматографии На ТСХ-пластинках сорбенты закрепляют при помощи неорганических или органических связующих материалов. Такой слой держится достаточно прочно, на нем можно даже делать пометки мягким карандашом. Результаты разделения хорошо воспроизводятся. Сорбционный слой поглощает летучие вещества из воздуха, поэтому пластинки нужно хранить соответствующим образом. Для большинства экспериментов вполне подходят стандартные пластинки. Пластинки высшего качества (высокоэффективные ТСХ-пластинки или ВЭТСХпластинки) используют лишь при количественном анализе. Свойства наиболее важных сорбентов для ТСХ приведены в таблице 4.

Таблица 4. СОРБЕНТЫ ДЛЯ ТСХ И ИХ ХАРАКТЕРИСТИКИ Сорбент Силикагель

Область Разделение неполярных веществ; выделение веществ, обладающих основными свойствами; рекомендуется использовать элюенты с основными свойствами Оксид алюминия Разделение слабополярных основных веществ Модифицирован Разделение полярных ный силикагель веществ в условиях обращенно-фазовой хроматографии (ОФХ) Полиамид

Разделение веществ, образующих с амидными группами сорбента водородные связи

Примечания Неполярные вещества разделяют методом распределительной хроматографии

Поверхность сорбента сильнополярная Поверхность покрыта химически связанными углеводородными группами Элюирующие свойства растворителей возрастают в ряду: вода< метанол