Восприятие сигналов биологическими мембранами: сенсорные белки и экспрессия генов

БИОЛОГИЯ ВОСПРИЯТИЕ СИГНАЛОВ БИОЛОГИЧЕСКИМИ МЕМБРАНАМИ: СЕНСОРНЫЕ БЕЛКИ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ Д. А. ЛОСЬ Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва

ВВЕДЕНИЕ

PERCEPTION OF SIGNALS BY BIOLOGICAL MEMBRANES: SENSOR PROTEINS AND EXPRESSION OF GENES D. A. LOS

The role of stress-induced transformations in membrane structure, and the changes in the functional state of membrane receptors resulting from such transformations, are reviewed. These changes initiate, in turn, the induction of adaptive gene programs.

© Лось Д.А., 2001

Рассмотрены роль изменений в структуре мембран при стрессовых воздействиях и индукция этими изменениями функционального состояния мембранных рецепторов, что приводит к индукции генов адаптивных программ.

14

www.issep.rssi.ru

Самые разные изменения в окружающей среде, в режиме питания, возрастные изменения метаболизма, опухолевые заболевания, инфекции приводят к изменениям в структуре мембран, которые, в свою очередь, вызывают нарушения нормального функционирования клеток. Поэтому изучение структуры мембран привлекает к себе внимание исследователей. Мембраны обладают свойством текучести, которая, изменяясь под действием различных физических и химических воздействий, обеспечивает адаптивные перестройки в мембране и изменение активности мембраносвязанных белков, воспринимающих и передающих внешние сигналы. К числу таких молекул относятся рецепторные протеинкиназы и другие сенсоры, ионные каналы, белки – переносчики различных молекул. Изменение функционального состояния сенсорных белков влияет на экспрессию генов, отвечающих за адаптацию клеток к стрессовым условиям. РЕГУЛЯЦИЯ ДИНАМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЕМБРАН В ОТВЕТ НА ИЗМЕНЕНИЯ ОСМОТИЧЕСКОГО ДАВЛЕНИЯ И ТЕМПЕРАТУРЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ Молекулы липидов в мембране образуют двойной слой, в котором гидрофобные концы жирных кислот (ЖК) обращены друг к другу, а гидрофильные головки образуют заряженный слой на поверхности мембран (рис. 1). При нормальной температуре и оптимальной концентрации веществ в окружающей среде (осмотическом давлении) мембрана представляет собой жидко кристаллическую структуру [1, 2], обладающую определенной степенью текучести. Термин “текучесть” (противоположный “вязкости”) используется для описания степени неупорядоченности и физической подвижности внутри липидного бислоя мембран. Однако ни один из терминов не может охватить все различные динамические

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 9 , 2 0 0 1

БИОЛОГИЯ а

Нормальная температура или нормальные осмотические условия А1

А2

Жидкокристаллическая фаза

Зона фазового перехода

Пониженная температура или гиперосмотический стресс А3

Рис. 1. а – изменение структуры и свойств мембран при изменении температуры окружающей среды и осмотического давления. А1 – в норме мембрана находится в жидкокристаллической фазе. При снижении температуры в мембране могут возникать зоны разделения фаз и в конечном счете мембрана может перейти в фазу геля; А2 , А3 – сближение полярных головок липидов также наблюдается при гиперосмотическом стрессе, когда происходят уменьшение объема клеток и сжатие мембран; А4 – при повышении температуры может произойти полная или частичная дезинтеграция мембран с их хаотичным слиянием и образованием инвертированных фаз внутри; б – схематическое изображение молекулярной геометрии липидов мембран при изменении температуры; Б2 – при снижении температуры молекулы жирных кислот сближаются и их подвижность и радиус свободного вращения уменьшаются; Б3 – при повышении температуры происходит обратный процесс – подвижность и радиус вращения молекул жирных кислот возрастают

разом, характеризующих состояние мембраны на разных уровнях заглубления. Фаза геля

А4

Повышенная температура или гипоосмотический стресс

Дезинтеграция и нарушение структуры мембраны б Б2

Б1

Б3

характеристики мембраны, такие, как диффузия в горизонтальном монослое липидов, вращение молекул, вращение цепей длинных ЖК с различной степенью ненасыщенности [3]. Тем не менее текучесть мембран может быть оценена некоторыми физическими методами, основанными главным образом на измерении флуоресценции маркерных молекул, способных проникать в мембраны на различную глубину и, таким об-

Текучесть биологических мембран играет важную роль в восприятии сигналов об изменении температуры окружающей среды или ее осмотических свойств. Если температура снижается либо клетки попадают в среду с повышенной концентрацией осмотически активных веществ (гиперосмотический шок), молекулы ЖК приближаются друг к другу (см. рис. 1). По сути это означает сжатие мембраны, то есть уменьшение ее текучести или увеличение вязкости. При определенных условиях может наступить критический момент, когда большая часть липидов потеряет свою подвижность настолько, что произойдет так называемый фазовый переход из жидко-кристаллического состояния в состояние геля (см. рис. 1). Если клетка не способна адаптировать свои мембраны и поддерживать их на определенном уровне текучести, то фазовый переход означает смерть клетки. Главными причинами смертельного исхода являются уменьшение подвижности белков в липидном бислое, их неспособность к изменению конформации и как следствие – полная потеря своих функций (перенос электронов и веществ, синтез АТФ, транспорт ионов). При отклонении температуры от нормальной в сторону ее повышения либо при гипоосмотическом шоке, возникающем при сильном разбавлении внешнего раствора, мембраны растягиваются, то есть возрастает подвижность липидных молекул в бислое и текучесть мембран увеличивается (см. рис. 1). Этот процесс может привести к разделению липидной фазы и полному разрушению мембранных структур. Обычно клетки обладают защитными системами для контроля над состоянием своих мембран и в момент изменения условий среды активируют эти системы,

Л О С Ь Д . А . В О С П Р И Я Т И Е С И Г Н А Л О В Б И О Л О Г И Ч Е С К И М И М Е М Б РА Н А М И : С Е Н С О Р Н Ы Е Б Е Л К И И Э К С П Р Е С С И Я Г Е Н О В

15

БИОЛОГИЯ чтобы сохранить состояние мембран на уровне, обеспечивающем физиологическую активность клеток. Так, при снижении температуры активируется синтез десатураз жирных кислот, которые отвечают за образование двойных связей (десатурацию). Десатурация вызывает увеличение подвижности жирнокислотных хвостов в липидах и вследствие этого повышение текучести мембран [3]. При повышении температуры, что ведет к увеличению подвижности липидов в мембране и может привести к разрушению липидного бислоя, степень десатурации липидов в клетке снижается, клетки стремятся уплотнить свои мембраны, растекающиеся под действием высоких температур. Кроме того, при повышении температуры активируется синтез так называемых белков теплового шока, часть из которых связывается с липидами и также предотвращает их растекание. При осмотических стрессах клетки пытаются либо избавиться от избыточного количества воды в цитоплазме, либо синтезировать вещества-протекторы (глицерин, пролин, глицин-бетаин), которые позволяют им регулировать свой объем. Так или иначе, запуск адаптивных систем, защищающих клетки от стрессовых воздействий, связан с восприятием сигналов о том, что снаружи что-то произошло. Одними из наиболее интересных вопросов современной биологии являются поиск и определение механизмов восприятия сигналов клетками. Очевидно, что сенсорные системы в описанных выше случаях так или иначе связаны с мембранами, поскольку именно физическое воздействие на мембраны приводит к запуску стрессовых ответов. ОСМОТИЧЕСКИЙ СТРЕСС Осмотическим стрессом можно назвать те неприятности, которые испытывают клетки из-за резкого изменения концентраций растворенных веществ в окружающей среде и цитоплазме. При повышении осмотического давления внешнего раствора клетки теряют воду и уменьшаются в объеме. При снижении накачивают воду внутрь и увеличиваются в объеме. В том и другом случае клетки активируют мембранные белки-переносчики, а также генные блоки, отвечающие за адаптацию и в норме, как правило, молчащие. Наиболее интересными вопросами в изучении восприятия клетками осмотического стресса являются обнаружение сенсорных белков в цитоплазматической мембране, которые чувствуют изменения свойств мембраны во время гипо- или гиперосмотического стресса, а также выяснение механизмов последующей передачи сигналов, приводящих к активации адаптационных систем. В этих процессах значительную роль играют регуляторные белки – киназы, свойством которых является присоединение фосфатной группы к другим белкам-

16

регуляторам (фосфорилирование) либо к определенным аминокислотам в составе собственной молекулы (автофосфорилирование). Добавление фосфатной группы обычно кардинальным образом меняет свойства белков, превращая их из неактивной в активную форму. Особую роль в восприятии сигналов играют киназы, относящиеся к семейству гистидин-киназ, в которых (авто)фосфорилируются определенные остатки гистидина. Одним из известных белков, воспринимающих изменения осмотического давления – осмосенсоров, в клетках прокариот является гистидин-киназа KdpD, связанная с цитоплазматической мембраной. Ген kdpD, кодирующий этот белок, входит в оперон, состоящий из шести генов. Опероном называют близко расположенные гены, отвечающие за определенный признак или функцию и транскрибируемые под общим контролем одного регуляторного элемента в ДНК – промотора. Этот оперон, называемый kdpFABCDE, кодирует систему переноса ионов калия, которые сами по себе или во взаимодействии с глутаминовой кислотой участвуют в регуляции объема и ионного баланса в цитоплазме клеток при гиперосмотическом стрессе. Четыре гена этого оперона кодируют АТФазу, транспортирующую ионы К+ (рис. 2). Кроме того, в состав оперона входят два гена, выполняющие регуляторные функции. Так, регуляцию экспрессии этого оперона осуществляет гистидин-киназа KdpD. Под действием гиперосмотического стресса она может фосфорилировать определенный остаток гистидина в своей молекуле и затем передавать фосфатную группу на регулятор ответа KdpE (кодируемый геном kdpE ), что приводит к его активации [4]. Регулятор KdpE, в свою очередь, связывается с регуляторной областью промотора рассматриваемого нами оперона, что приводит к его активации. Это ведет к усилению синтеза К+-АТФазы и ускоренному транспорту ионов калия в клетки (см. рис. 2), что помогает им адаптироваться к новым осмотическим условиям. Таким образом, данная регуляторная цепь относится к классу бикомпонентных систем восприятия и передачи сигналов, широко распространенных у бактерий, грибов и растений. Первый компонент этой системы – сенсор, являющийся гистидиновой протеин-киназой (KdpD). Второй компонент – регулятор ответа (response regulator) KdpE, выполняющий роль трансфактора, включающего транскрипцию оперона kdpFABCDE. Транскрипция регуляторных генов kdpDЕ находится под контролем двух промоторов, один из которых является общим промотором для всего оперона и активируется регулятором ответа KdpE при гиперосмотическом стрессе. Второй промотор (так называемый внутренний) находится в кодирующей части оперона и, видимо, обеспечивает постоянный низкий уровень транскрипции только генов kdpDЕ.

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 9 , 2 0 0 1

БИОЛОГИЯ Периплазма 1 KdpD в неактивной форме

Мембрана Цитоплазма 1

C

His

N

2 KdpD в активной форме

1

C

His

N

P

3 KdpE в неактивной форме

Asp Домен получения сигнала (Asp)

Участок связывания с регуляторной областью оперона P Asp

Запуск транскрипции

4 KdpE в активной форме

5' Регуляторный F участок оперона

A

B

C

Гены К+-АТФазы

D

E

5 3' ДНК

Ген Ген сенсорной регулятора киназы ответа

KdpFABCDE оперон Рис. 2. Регуляция экспрессии оперона kdp. А – сенсорная гистидин-киназа KdpD четырьмя трансмембранными доменами пронизывает цитоплазматическую мембрану клетки, находясь в неактивной форме (1 ). При гиперосмотическом стрессе мембрана сжимается, трансмембранные домены киназы сближаются, что приводит к изменению конформации KdpD и автофосфорилированию гистидинового остатка. Таким образом, KdpD переходит в активную форму (2 ). Далее фосфатная группа переносится с KdpD на остаток аспартата, находящегося в домене получения сигнала растворимого белка – регулятора KdpE. Этот белок также имеет участок связывания с регуляторной областью оперона kdp, но в нефосфорилированном виде не связывается с ДНК (3 ). После фосфорилирования KdpE переходит в активную форму (4) и связывается с регуляторным участком (промотором) оперона kdp, активируя его транскрипцию. Гены, входящие в оперон kdpFABCDE, отвечают за следующие функции: KdpFABC кодирует К+-АТФазу, в которой KdpF является низкомолекулярной субъединицей, предположительно стабилизирующей К+-АТФазу. KdpA – трансмембранная К+-связывающая и транспортирующая субъединица. KdpB – трансмембранный гомолог АТФазы Р-типа. KdpC – субъединица, собирающая весь комплекс. KdpD-мембраносвязанная сенсорная гистидин-киназа. KdpE – регулятор ответа оперона. 5 – схематическое изображение оперона kdpFABCDE и включение его транскрипции с помощью активированного белка KdpE

Молекулярные механизмы, приводящие к автофосфорилированию сенсорной киназы KdpD, остаются неясными, однако предполагается, что она воспринимает либо изменение в напряжении мембраны, связанное с осмотическим стрессом, либо изменение ионной силы в цитоплазме. Было обнаружено, что оперон kdpFABCDE можно индуцировать не только осмотическим шоком,

но и при нормальных осмотических условиях с помощью химических реагентов прокаина и хлорпромазина, которые реагируют с полярными группами мембранных липидов и вызывают изменение текучести мембран. Эти же реагенты стимулируют фосфорилирование другой сенсорной киназы – EnvZ, вовлеченной в осморегуляцию, а также вызывают перенос фосфатной

Л О С Ь Д . А . В О С П Р И Я Т И Е С И Г Н А Л О В Б И О Л О Г И Ч Е С К И М И М Е М Б РА Н А М И : С Е Н С О Р Н Ы Е Б Е Л К И И Э К С П Р Е С С И Я Г Е Н О В

17

БИОЛОГИЯ группы с гистидинового остатка киназы EnvZ на остаток аспарагиновой кислоты в регуляторе ответа OmpR, который относится к тому же семейству регуляторов, что и KdpE [4]. Эти данные свидетельствуют о том, что осмосенсоры KdpD и EnvZ могут регулироваться через изменение физического состояния мембранных липидов и благодаря этим изменениям запускать сигналы, приводящие к активации генов, необходимых для адаптации клетки к стрессу. Недавние работы, посвященные осморегуляции АВС-переносчика (от англ. ATP-binding cassette) глицин-бетаина OpuA (от англ. Osmoprotectant uptake) из бактерии Lactococcus lactis, демонстрируют зависимость активности этой системы от текучести цитоплазматической мембраны [5]. Глицин-бетаин (бетаин или триметилглицин) является так называемым осмопротектором – веществом, накапливающимся в цитоплазме клеток и позволяющим регулировать их объем и тургорное давление при гиперосмотическом стрессе, когда в окружающей среде повышается концентрация осмотически активных веществ. OpuA представляет собой основную систему клеток, отвечающую за транспорт

глицин-бетаина внутрь клеток и, таким образом, защищающую их от гиперосмотического стресса (рис. 3). В то время как обычные АВС-переносчики состоят из пяти субъединиц (две АТФ-связывающие, две трансмембранные и одна рецепторная), OpuA из L. lactis состоит из четырех субъединиц (две АТФ-связывающие субъединицы OpuAA и две гибридные субъединицы OpuABC, представляющие собой слитые в один полипептид трансмембранный и рецепторный белки). В случае обычного АВС-переносчика глицин-бетаина субстратсвязывающая субъединица OpuAC, являющаяся гидрофильным белком и присутствующая в периплазме в избытке, взаимодействует с субстратом и доставляет его транспортирующему комплексу OpuAB. Гидролиз АТФ субъединицей OpuAA обеспечивает однонаправленный транспорт глицин-бетаина внутрь клетки (см. рис. 3). В случае L. lactis гибридная трансмембранная субъединица OpuABC отвечает за узнавание, связывание и транспорт субстрата. Исследование OpuA L. lactis в интактных клетках и системе искусственных фосфолипидных мембран показало, что эта система необходима и достаточна для активации транспорта

А Оперон opuA (A1) и кодируемый им белковый комплекс OpuA (A2) (Классический ABC-переносчик)

Б Оперон opuA (Б1) и кодируемый им белковый комплекс OpuA L. lastic (Б2) Б1

A1 OpuAB

OpuAC

5'

OpuAA 3'

ТрансГены: АТФ-связывающей мембранной субъединицы субъединицы

Субстратсвязывающей субъединицы

OpuABC

5'

3' Трансмембранной и субстратсвязывающей субъединиц

Гены: АТФ-связывающей субъединицы

A2

Б2 Периплазма

Мембрана

OpuABC

OpuAB

OpuAB

OpuAС

OpuABC

OpuAA

Цитоплазма OpuAA

OpuAA

Рис. 3. Сравнение структуры переносчика OpuA Lactococcus lactis с классическими бактериальными переносчиками ABC-типа. А1 , Б1 – последовательность генов в оперонах, кодирующих АВС-переносчики; А2 , Б2 – белковые комплексы АВС в мембране, обеспечивающие перенос субстрата через мембрану; A2 – классический ABC-переносчик: субъединица OpuAC связывает субстрат (глицин-бетаин) и направляет его к домену переносчика, состоящему из двух идентичных или гомологичных субъединиц OpuAB и двух АТФ-связывающих субъединиц OpuAA. Гидролиз АТФ обеспечивает однонаправленный транспорт субстрата через мембрану; Б2 – OpuA переносчик L. lactis: трансмембранный домен OpuABC представляет собой гибридный полипептид, состоящий из субстратсвязывающей и переносящей субъединиц (в остальном переносчик организован по тому же типу, что А2)

18

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 9 , 2 0 0 1

БИОЛОГИЯ

Природу сигналов, активирующих OpuA, исследовали с использованием реагентов, изменяющих текучесть мембран. При этом было обнаружено, что катионные соединения тетракаин и хлоропромазин, а также анионный дипиримидин, взаимодействующие с полярными группами фосфолипидов, что должно менять их текучесть, активируют OpuA в нормальных изоосмотических условиях в такой же степени, как и гиперосмотический стресс. И хотя текучесть мембран не была напрямую измерена в этих работах, представленные данные позволяют предположить, что активация OpuA происходит в результате изменения физического состояния (текучести) мембран. НИЗКОТЕМПЕРАТУРНЫЙ СТРЕСС Когда бактерии, растения или рыбы подвергаются воздействию низких температур, липиды их мембран становятся более вязкими, однако эти организмы способны увеличивать текучесть мембран посредством образования двойных связей (десатурации) ЖК мембранных липидов. Гипотеза о восприятии сигналов о снижении температуры демонстрируется на рис. 4, А. При снижении температуры уменьшается текучесть мембран, что воспринимается мембраносвязанным сенсором. Сигнал об изменении температуры передается через гипотетические переносчики к промоторам генов десатураз. Вследствие этого индуцируется экспрессия этих генов, что приводит к усиленному синтезу десатураз в клетке и к ускорению синтеза полиненасыщенных ЖК в мембранных липидах. В конечном итоге восстанавливаются исходная текучесть мембран и физиологическая активность связанных с ними ферментных систем. Эта гипотеза была экспериментально подтверждена на клетках цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 (далее Synechocystis), которая имеет четыре гена, кодирующие различные десатуразы ЖК: desC (∆9-десатураза), desA (∆12-десатураза), desB (ω3-десатураза) и desD (∆6-десатураза). Среди этих четырех генов три (desA, desB и desD ) индуцируются низкими температурами [3]. Было установлено, что индукция генов десатураз зависит не от абсолютной температуры, а от разницы температур преадаптации и индукции. Так, если клетки выращивали при пониженных температурах, то они характеризовались повышенным содержанием полиненасыщенных ЖК и индукция генов десатураз наблюдалась при более низких температурах, чем в клетках, выращенных в нормальных температурных условиях.

А

Б 36°C

Снижение температуры 100 Уменьшение текучести мембран Восприятие сигнала сенсором Передача сигнала Индукция генов десатураз Синтез десатураз de novo Десатурация липидов мембран Восстановление текучести мембран Восстановление физиологической активности клетки

22°C

Б1

80 Относительное количество мРНК desA, %

глицин-бетаина внутрь клеток, что обеспечивает устойчивость клеток к гиперосмотическому стрессу. Видимо, OpuA работает как бифункциональная система, являясь одновременно и осмосенсором и осморегулятором.

60 40 20 0 36°C Б2 100 гидрогенизация 80 60 40 20 0

0 30 60 Время инкубации, мин

Рис. 4. Регуляция физического состояния мембран с помощью десатураз жирных кислот: А – гипотетическая схема ответа клеток на снижение температуры окружающей среды; Б – влияние снижения температуры и каталитической гидрогенизации липидов мембран на экспрессию гена desA, кодирующего ∆12-десатуразу в Synechocystis; Б1 – изменение количества мРНК гена desA при снижении температуры с 36 до 22°С; Б2 – изменение количества мРНК гена desA под действием гидрогенизации липидов цитоплазматической мембраны при 36°С

Роль текучести мембран в регуляции экспрессии генов десатураз была показана в опытах с прямым насыщением водородом двойных связей между атомами углерода в ЖК мембранных липидов (гидрогенизация). Это осуществлялось при нормальной температуре с помощью водорастворимого платино-палладиевого комплекса в качестве катализатора реакции. Таким способом текучесть цитоплазматической мембраны была снижена при нормальной температуре роста клеток in vivo. Гидрогенизация привела к активации транскрипции гена desA, причем степень активации была идентичной той, которая наблюдалась при снижении температуры (рис. 4, Б ). Поскольку и каталитическая гидрогенизация при нормальной температуре и снижение температуры окружающей среды приводили к снижению текучести мембран и активации экспрессии гена

Л О С Ь Д . А . В О С П Р И Я Т И Е С И Г Н А Л О В Б И О Л О Г И Ч Е С К И М И М Е М Б РА Н А М И : С Е Н С О Р Н Ы Е Б Е Л К И И Э К С П Р Е С С И Я Г Е Н О В

19

БИОЛОГИЯ десатуразы, вероятно, что изменение температуры воспринимается клеткой за счет изменения текучести цитоплазматической мембраны, в результате чего в клетке возникает сигнал, приводящий к активации экспрессии генов десатураз [3]. Вероятно также, что сенсор этих изменений локализован в цитоплазматической мембране. При изменении физических свойств мембраны сенсорный белок в мембране может менять конформацию и/или проходить через циклы фосфорилирования–дефосфорилирования в качестве первичных событий при передаче внутрь клетки сигнала об изменении температуры. Мы предположили, что сенсорный белок, локализованный в мембране и запускающий экспрессию генов десатураз, может обладать свойствами гистидин-киназы в случае некоторых описанных выше осмосенсоров (KdpD и EnvZ) или хемосенсоров, обнаруженных в E. coli и других организмах. Для выяснения возможной природы температурного сенсора в клетках штамма Synechocystis мы провели систематическую инактивацию генов, кодирующих гипотетические сенсорные гистидин-киназы (всего 43 гена). Опыты проводили на штамме, трансформированном введением в его геном гена люциферазы под контролем промотора одного из генов десатураз, desB, индуцируемого низкими температурами. При снижении температуры происходила индукция транскрипции гена люциферазы за счет активации промотора гена desB. Как следствие в клетках накапливалась люцифераза, что выражалось более интенсивным свечением, испускаемым клетками. Инактивировав генно-инженерным путем гены гистидин-киназ (с помощью встраивания в них гена устойчивости к спектиномицину), мы наблюдали за изменением люминесценции в мутантных штаммах. Таким способом были идентифицированы две гистидин-киназы (мембраносвязанная Hik33 (от англ. Histidine kinase) и растворимая Hik19), инактивация которых приводила к утрате низкотемпературной индукции промотора гена десатуразы [6]. Эти результаты были также подтверждены с помощью другого метода, называемого случайным картриджным мутагенезом, данного штамма с помощью гена устойчивости к антибиотику. Суть метода заключается в том, что ген устойчивости к антибиотику известной нуклеотидной последовательности встраивается случайным образом в геном организма, при этом инактивируя гены со случайной выборкой. Таким способом получается библиотека мутантных штаммов, в геном каждого из которых встроено по одной копии гена устойчивости к антибиотику. Задачей при этом является выявление функциональных нарушений в организме и определения места мутации, а следовательно, и гена, поврежденного в результате подобного встраивания. Среди

20

нескольких сот мутантных клонов цианобактерии, гены которых были повреждены за счет случайного встраивания в них гена устойчивости к спектиномицину, у большинства штаммов с нарушенной экспрессией люциферазы под контролем промотора desB были обнаружены повреждения в локусах, кодирующих Hik33 и Hik19. Кодируемый геном hik33 белок Hik33 имеет консервативный гистидин-киназный домен на карбоксильном конце белковой молекулы (С-конец), два трансмембранных домена в амино-концевом участке (N-конец молекулы), специфический линкер (последовательность аминокислот, связывающая разные функциональные участки молекулы белка), “лейциновую молнию” (последовательность аминокислот, состоящая в основном из остатков лейцина) в середине полипептидной последовательности белка и так называемый PAS-домен (сигнальная консервативная последовательность аминокислот, встречающаяся во всех группах организмов и отвечающая за восприятие изменений в освещенности, концентрации некоторых молекул и общего энергетического баланса клетки) (рис. 5, A ). Специфический линкер характерен для множества эукариотических сенсорных белков. Он расположен обычно между участком белка, отвечающим за восприятие сигнала, и протеинкиназой, которую принятый сигнал активирует. Предполагается, что уплотнение мембраны при снижении температуры приводит к сближению димеров Hik33, что ведет к изменению конформации линкерных участков, сопровождающемуся активацией гистидин-киназы и автофосфорилированием Hik33 (рис. 5, Б ). Кроме того, с помощью случайного мутагенеза был обнаружен ген белка – регулятора ответа Rer1 (Response regulator), инактивация которого также приводила к утрате клетками способности индуцировать промотор гена десатуразы desB. Предполагается, что система восприятия сигнала о снижении температуры клетками цианобактерий является либо бикомпонентной (Hik33 и Rer1), либо трехкомпонентной (Hik33, Hik19 и Rer1). Однако точного ответа на этот вопрос пока не получено. ВЫСОКОТЕМПЕРАТУРНЫЙ СТРЕСС Концепция влияния текучести мембран на регуляцию температурозависимой экспрессии генов подтверждается наблюдениями за экспрессией гена теплового шока Hsp90 (от англ. heat shock protein) в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Напомним, что при повышенных температурах происходит повышение текучести мембран, которому способствует десатурация ЖК липидов и препятствует насыщение двойных связей в их молекулах. Клетки дрожжевых мутантов, дефектных по

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 9 , 2 0 0 1

БИОЛОГИЯ TM 2 Ли нк Le ер u PA S

TM 1

А Гистин-киназный домен

N–

–C

Б Периплазма Мембрана Цитоплазма

P

Неактивная форма

P

Активная форма

Рис. 5. Гипотетическая схема активации температурного сенсора – гистидин-киназы Hik33: А – схематическое изображение доменов Hik33. ТМ1 и ТМ2 – трансмембранные домены, специфическая линкерная последовательность, Leu – “лейциновая молния”, PAS-домен, гистидин-киназный домен; Б – возможный механизм активации Hik33. При нормальной температуре димер Hik33 находится в неактивной форме. При снижении температуры текучесть мембран уменьшается и за счет сближения молекул липидов происходит сближение трансмембранных доменов Hik33 (показано стрелками). Это приводит к конформационным изменениям на участке белка, соответствующего линкеру. В результате происходит автофосфорилирование сенсорного белка. Далее фосфатная группа передается на белок – регулятор ответа, которым, возможно, является Rer1 (см. текст)

гену ∆9 десатуразы, были трансформированы этим геном под контролем промоторов различной силы. Мембранные липиды трансформантов отличались между собой по содержанию насыщенных и ненасыщенных ЖК. Уровень экспрессии гена Hsp90 при нормальной температуре (36°С) был тем выше, чем выше содержание ненасыщенных ЖК. Эти результаты показывают, что экспрессия гена теплового шока зависит от степени насыщенности ЖК в липидах мембран, то есть от текучести мембран [7]. Другим подтверждением участия мембран в регуляции генов белков теплового шока являются данные по исследованию стрессового ответа гена hspA, кодирующего низкомолекулярный белок теплового шока HspA в Synechocystis. Данный белок индуцируется при повышении температуры и связывается с липидами мембран, предотвращая таким образом их дезинтеграцию. Экспрессия гена hspA активировалась как тепловым воздействием, так и размягчителем мембран бензиловым спиртом при нормальной температуре. Таким

образом, показано, что при увеличении текучести мембран, вызванном либо высокими температурами, либо химическими агентами, происходит активация экспрессии генов теплового шока, некоторые из которых, как, например, ген hspA, кодируют белки, предотвращающие дезинтеграцию мембран при тепловом шоке [7]. Тем не менее сенсорные белки, отвечающие за восприятие сигнала о повышении температуры, пока не идентифицированы. ДРУГИЕ СИГНАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ Непосредственное влияние физического состояния мембран на восприятие или передачу сигналов об изменении параметров окружающей среды было показано на примере активации генов десатураз, некоторых белков теплового шока и осмосенсоров. Однако существует множество работ, показывающих, что мембраны могут быть вовлечены в широкий спектр путей восприятия и передачи сигналов в клетках. Так, изменение текучести мембран приводит к изменениям активности

Л О С Ь Д . А . В О С П Р И Я Т И Е С И Г Н А Л О В Б И О Л О Г И Ч Е С К И М И М Е М Б РА Н А М И : С Е Н С О Р Н Ы Е Б Е Л К И И Э К С П Р Е С С И Я Г Е Н О В

21

БИОЛОГИЯ ассоциированной с рецептором фосфолипазы С в клетках сердечной мышцы крыс. Активность специфической протеин-киназы, называемой протеин-киназой С, участвующей в термоадаптации дрожжей, также регулируется через текучесть мембран. Кроме того, показано, что физические свойства мембран определяют регуляцию входа и мобилизацию ионов кальция в клетках сердечной мышцы лягушки и концентрацию цАМФ (циклический аденозинмонофосфат, являющийся одной из основных регуляторных молекул в разных типах клеток и отвечающий за активацию множества генных систем) в культивируемых человеческих клетках. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Участие мембран в восприятии температурных и осмотических сигналов через белки-сенсоры в разных группах организмов является в настоящее время общепринятым фактом, позволяющим расширить и углубить наши представления о механизмах адаптации клеток и целых организмов к меняющимся условиям окружающей среды. Тем не менее остается множество вопросов, ожидающих своего разрешения. Предстоит определить домены и аминокислотные остатки сенсорных белков, которые распознают изменения физического состояния липидов мембран, и выяснить, каким образом меняется конформация сенсорной молекулы при восприятии сигнала. Вполне вероятно, что сенсорные белки ассоциированы со специфическим набором липидных молекул, состав которых может заметно отличаться от общего липидного состава клеток как по набору заряженных групп, так и по составу ЖК. Все эти вопросы

22

важны для понимания молекулярных механизмов адаптации и ждут своих исследователей. ЛИТЕРАТУРА 1. Чиркова Т.В. Клеточные мембраны и устойчивость растений к стрессовым воздействиям // Соросовский Образовательный Журнал. 1997. № 9. С. 12–17. 2. Чизмаджев Ю.А. Мембранная биология: От липидных бислоев до молекулярных машин // Там же. 2000. Т. 6, № 8. С. 12–17. 3. Лось Д.А. Десатуразы жирных кислот: Адаптивная экспрессия и принципы регуляции // Физиология растений. 1997. Т. 44. С. 528–540. 4. Wood J.M. Osmosensing by bacteria: Signals and membrane-based sensors // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. Vol. 63. Р. 230–262. 5. Heide T. van der, Poolman B. Osmoregulated ABC-transport System of Lactococcus lactis Senses Water Stress Via Changes in the Physical State of the Membrane // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97. P. 7102–7106. 6. Suzuki I., Los D.A., Kanesaki Y., Mikami K., Murata N. The Pathway for Perception and Transduction of Low-temperature Signals in Synechocystis // EMBO J. 2000. Vol. 19. P. 1327–1334. 7. Vigh L., Maresca B., Harwood J.L. Does the Membrane's Physical State Control the Expression of Heat Shock and Other Genes? // Trends Biochem. Sci. 1998. Vol. 23. P. 369–374.

Рецензент статьи О.Н. Кулаева *** Дмитрий Анатольевич Лось, доктор биологических наук, зав. отделом внутриклеточной регуляции и биотехнологии фотоавтотрофных биосинтезов Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Область научных интересов – молекулярная биология мембран, молекулярные механизмы адаптации, биотехнология микроводорослей. Автор 100 печатных работ.

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 9 , 2 0 0 1