Дезинтеграция клеток в биотехнологии. Учебное пособие

Федеральное агентство по образованию УДК 621.926.47 ББК 30.16:28.4я

Восточно-Сибирский государственный технологический университет

Рецензент: С.Н. Балдаев, зав. кафедрой органической и биологической химии сельскохозяйственной академии им. П.С.Филиппова Э.Г. Шапхаев, В.Ж. Цыренов, Е.И. Чебунина

Ш248 Шапхаев Э.Г., Цыренов В.Ж., Чебунина Е.И. Дезинтеграция клеток в биотехнологии: Учебное пособие/ ВСГТУ. - Улан-Удэ. 2001г.

ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ 5. Дезинтеграция микробных клеток

В настоящем конспекте лекций дано пояснение термина «дезинтеграция» микробных клеток, определены механические свойства клеток микроорганизмов, описаны основные области применения дезинтеграции. Дана краткая характеристика современных методов дезинтеграции клеток, рассмотрен комплекс лабораторных дезинтеграторов микроорганизмов. Приведены примеры некоторых разработок дезинтеграционных биотехнологических процессов.

Печатается по решению редакционно-издательского совета Восточно-Сибирского государственного технологического университета

Издательство ВСГТУ Улан-Удэ, 2005

3

4

Дезинтеграция клеток - это большая проблема современной биотехнологии. Её основные объекты - живая клетка и дезинтегратор, аппарат для разрушения клеток и тканей. Дезинтеграция представляет собой комплекс биологических и биотехнологических процессов, она позволяет изучить субклеточную организацию биологических объектов, а также использовать в прикладной биотехнологии фунционально активные и структурно интактные популяции субклеточных компонентов живой клетки. Таким образом, дезинтеграция клеток является важным научным направлением в биотехнологии и связана с проблемой комплексной переработки микробной биомассы для получения белковых веществ пищевого и кормового назначения, ряда биологически активных и важных для медицины и народного хозяйства продуктов микробиологического синтеза.

Предисловие Дезинтеграция - это процесс измельчения различных материалов и создание на ее основе эффективных аппаратов. Измельчение - типовой химико-технологический процесс, относящийся к группе механических процессов [1]. Термин «Дезинтеграция » в биотехнологии означает: 1) процесс необратимого анатомического нарушения целостности клеток; 2) измельчение, раздробление, разложение на части; 3) дезинтеграция вируса – распад вириона на составные части, наступающий в процессе вирусной инфекции, или под действием физических факторов, противомикробных веществ, прежде всего ПАВ [19]. В настоящее время дезинтеграция имеет большое народнохозяйственное значение и распространение во многих отраслях промышленности, в том числе и в микробиологической. Методы дезинтеграции клеток играют значительную роль в области фундаментальных исследований, затрагивают важнейшие прикладные и технологические аспекты современной биотехнологии и связанные с ней различные отрасли микробиологической промышленности. Клетки микроорганизмов характеризуются такими параметрами, как геометрические размеры, плотность, прочность и упруго-вязкие свойства оболочки. Величины этих параметров влияют на вероятность их разрушения при дезинтеграции, а особенно на прочностные характеристики клеток. В зависимости от прочности клеток для их разрушения могут быть использованы различные методы дезинтеграции. К наиболее распространенным можно отнести следующие: механические, ультразвуковые, экструзионные, десорбционные и др. Описание этих методов является важным для решения практических задач биотехнологии. 5

6

При этом основной задачей дезинтеграции является извлечение функционально активных структур и биополимеров. Первое и отчасти второе направление в большей степени традиционны. Аналогом первого направления может быть процесс пищеварения, в ходе которого вещество подвергается ряду последовательных обработок (как дезинтеграция организмов, тканей и клеток, деструкция и распад внутриклеточных структур и биополимеров). Конечным продуктом являются молекулярные вещества, пригодные для питания живого организма. Подобные процессы могут происходить также внутри отдельных клеток, причем клетка осуществляет роль дезинтегратора по отношению к другой живой клетке. Такой пищеварительный процесс происходит у человека, причем в основном внеклеточно. Живая или предварительно инактивированная пища подвергается комплексному внеклеточному дезинтегрирующему разрушению (механическому, химическому и энзиматическому), а затем продукты распада (дезинтеграты) используются для биосинтеза. При этом важно отметить, что процессы пищеварения осуществляются при нормальной температуре, т.е. в условиях «холодного» гидролиза, при котором сохраняют свои исходные свойства образующиеся в процессе расщепления низкомолекулярные вещества. Аналогичные дезинтеграционные принципы обработки биомассы используются в современных технологиях крупномасштабного производства продуктов питания, кормов и некоторых материалов технического назначения. Второе направление применяет методы, в том числе биологические, направленные на тотальное уничтожение или полное, желательно необратимое, прекращение жизнедеятельности вредных и болезнетворных микроорганизмов и других вредителей различной природы. Они могут приме-

1. Основные направления развития дезинтеграции клеток и области её применения В природных условиях дезинтеграция клеток и клеточных систем вызывается внутриклеточными (внутренними) и внешними причинами. К внутренним причинам можно отнести факторы генетической природы. Различные внешние воздействия действуют на внутренние структуры клеток. К ним можно отнести физические, физикохимические, химические и биологические факторы. Причем любой из этих факторов при достаточной интенсивности и продолжительности может стать дезинтегрирующим. Вызванную действием внешних факторов дезинтеграцию обычно определяют как естественную. Наряду с естественной дезинтеграцией бывает искусственная (насильственная). Последняя целенаправленно применяется человеком и часто используется в научной и производственной деятельности. 1.1. Классификация методов дезинтеграции клетки Искусственная дезинтеграция. В настоящее время можно определить три направления практического применения методов искусственной дезинтеграции клеточных систем: 1. Дезинтеграция живого вещества (животной, растительной и микробной биомассы) для производства продуктов пищевого, кормового и технического назначения. 2. Дезинтеграция как способ стерилизации и инактивации живых систем. 3. Дезинтеграция как инструмент для искусственного вскрытия клеток и клеточных систем. 7

8

няться для консервации и хранения продуктов, в борьбе с инфекционными болезнями, для обеззараживания различных сред и материалов. Третье направление получило название инструментальной дезинтеграции клеток и осуществляется с помощью специальных технических средств - дезинтеграторов. Особенно интенсивное развитие инструментальная дезинтеграция получила в период бурного развития современной экспериментальной биологии, которая подошла к изучению и расшифровке молекулярно-метаболической организации живой клетки. Это потребовало создания инструментальных средств и методов для искусственного вскрытия клеток и выделения содержащихся в ней биоструктур и макромолекулярных компонентов. Инструментальная дезинтеграция клеток возникла сравнительно недавно и встретила определенные трудности. В случае дезинтеграции некоторых клеток растений и микроорганизмов наблюдается исключительно высокая механическая прочность клеточных стенок, предел прочности которых равен 108 дин/см, что примерно соответствует пределу прочности стали. Для разрушения таких структур необходимы высокоинтенсивные воздействия порядка 108 с -1 и более. Применение таких воздействий приводит к крайне нежелательным явлениям инактивации, модификации и деградации извлекаемых из дезинтегрируемой клетки целевых компонентов. В этом заключается одна из основных проблем инструментальной дезинтеграции. В начальный период конструирование механических дезинтеграторов клеток оставалась в русле сугубо эмпирического поиска. Основные усилия ученых были направлены на адаптацию существующих и широко применяемых для измельчения материалов различных устройств. При этом возникла острая необходимость в научных подходах к проблеме дезинтеграции .

1.2. Область использования инструментальной дезинтеграции, её задачи и цели Области практического применения дезинтеграционных методов в научных исследованиях и биотехнологии показаны в табл.1.1. Таблица 1.1 Основные области применения методов в инструментальной дезинтеграции клеток в научных исследованиях Область применения 1

Аналитические исследования Аналитикоморфологические исследования Ультраструктурные исследования Цитологические исследования Биофизические исследования Биохимические исследования Молекулярнобиологические и генетические исследова-

9

10

Задачи и цели исследований 2

Выделение субклеточных структур и биополимеров клетки для химического, структурного и функционального анализа. Идентификация ферментативных активностей и определение их локализации и распределения в клетке; изучение типов связей с субклеточными структурами, особенностей их компартментализации. Физическое препарирование (расчление) клеток и их компонентов; изучение процессов морфо- и биогенеза биологических структур. Исследование циклов развития, структурной дифференциации механизмов репарации и регенерации клеток и клеточных структур, процессов экзо- и эндоцитоза, лизиса, аутодезинтеграции, секреции и экскреции, аутолиза и др. Изучение влияния физических, механических и химических воздействий на клетку и её субклеточные структуры; количественное определение механических свойств клетки и её структур.. Приготовление бесклеточных микробных препаратов, фракций индивидуальных субклеточных структур и биополимеров для изучения in vitro метаболических путей, последовательностей ферментативных реакций и механизмов их регуляции Получение бесклеточных систем для осуществления процессов биосинтеза in vitroа белка и других биополимеров и их моделирование, выделение и изучение носителей генетической информации; создание новых типов информационных молекул; экспериментальная гибридизация.

1

ния Генетическая инженерия Клеточная инженерия

Иммунологические исследования Микробиологические исследования

Экспериментальная биология

логически активные и ценные для народного хозяйства соединения В последние годы резко возрос интерес крупномасштабной дезинтеграции, производимой с целью получения белковых веществ пищевого, кормового и технического назначения. Сейчас это один из перспективных путей восполнения существующего в мире белкового дефицита.

2

Выделение и фрагментирование ДНК для получения рекомбинантных молекул; разработка методов искусственного введения ДНК в клетку; получение протопластов; разработка процессов по их слиянию и др. Выделение интактных органелл; создание гибридов; получение сферо- и протопластов; осуществление микрохирургических операций на клетках с целью их слияния; извлечение органелл и трансплантация; получение клеточных гибридов, клонирование и др. Выделение и идентификация антигенов, определение их локализации в клетке, изучение антигенных и иммуногенных свойств клеток и их структур.Конструирование и получение вакцин и диагностикумов, адъювантов, иммунодепрессантов; моделирование процессов фагоцитоза внутриклеточного паразитизма; создание гибридом и клонирование антител. Разработка новых принципов и методов культивирования микроорганизмов; одноклеточная изоляция и получение чистых клонов; селективное разрушение клеток в смешанных популяциях; селекционные, генетические и гибридизационные исследования; изучение процессов микробиологической трансформации органических соединений, разработка иммобилизованных клеточных систем и др. Дезинтеграция тканей и органов животных и растений, эмбрионов, одноклеточных организмов; разработка методов клонирования организмов; искусственное конструирование клеток и клеточных систем

2. Механические свойства микробных клеток. При исследовании принципов и механизмов жизнедеятельности микробных клеток возникла биомеханика новое направление в биотехнологии. Она рассматривает механику микробных оболочек, изучает закономерности нагружения, деформации, разрушения, формообразования этих объектов. Оболочка клеточной системы обеспечивает целостность и автономность от окружающей среды, устойчивость к осмоактивным факторам, упругость, газо- и водопроницаемость, проницаемость для большого числа веществ различной природы, распределение на клеточной поверхности электрических зарядов, ферментов, специальных структур и образований. Микробная оболочка, представляется очень сложным по структуре межфазным граничным образованием, которая постоянно адаптируется к изменению внутри- и внеклеточной сред.

Инструментальная дезинтеграция клеток применяется не только для решения научных и аналитических задач, но существенным образом затрагивает современную биотехнологию, особенно производство бактерийных и вирусных препаратов, где она широко используется. Далее методы дезинтеграции стали обязательным элементом процессов и технологий, связанных с крупномасштабным получением различных веществ, локализованных в клетке и жестко связанных с её мембранами и другими надмолекулярными структурами, препятствующими их свободному выходу в культуральную среду. К таким веществам относятся белки, пептиды, ферменты, полисахариды, липиды и другие био-

2.1. Геометрическое описание оболочек живых микроорганизмов Геометрическое описание микробных оболочек складывается из определения форм и размеров. На рисунке 2.1. прведены основные морфотипы микробных оболочек [7]. Такие геометрические описания подобного рода имеют ценность в качестве коррелирующего признака с другими геометрическими характеристиками, как например раз11

12

мер, срединный радиус, толщина оболочки. Причем распространенной геометрической характеристикой является безразмерное отношение δ, которое равно R/2h (R - средний радиус, h - толщина оболочки). Необходимо отметить, что в механике под оболочкой понимается тело, радиус которого примерно в 100 и более раз превышает его толщину h. Величины δ для микробных и других клеток различных видов, находящихся в различных фазовых состояниях приведены в табл.2.1. Важно, что величина δ принимается как ведущая геометрическая характеристика оболочки и присутствует во

Животная клетка Кишечная палочка Растительная клетка Дрожжи Грибы Бактериальные споры: Все виды клеток, включая растительные и животные

Кишечная палочка Растительная клетка Кокки

обычное обычное обычное

замороженные

К=

многих формулах, описывающих её поведение под механической нагрузкой. Для анализа механического поведения Таблица 2.1 Величина δ для микробных клеток Состояние

сухие   зам о рож енны е свеж ие 

100-3000 50-200 100-1000 15-50 10-50 1/2-1 1/2

также рассматривается дополнительная геометрическая характеристика как «концентратор напряжений», под которой понимаются различные неправильности и дефекты формы, и локальные неоднородности материала оболочки. Некоторые виды концентраторов приведены на рис.2.2 [7]. Учет концентраторов напряжений намного повышает эффективность анализа механических характеристик, клеточных оболочек. Роль концентраторов напряжений может также играть неоднопородность состава (возраста), структуры и текстуры её материала, что отмечено на рис.2.2. Для учета действия около- и внутриклеточных физических полей различной природы - диффузионных, капиллярно-химических, электрических, тепловых и т.д. на форму клеточной оболочки вводится геометрическая характеристика оболочки К-кривизна, которая равна обратимой величине её радиуса:

Рис.2.1. Геометрическая классификация форм микробных оболочек: 1 - округлая, овоидная; 2 - цилиндрическая; 2′многокамерная; 3 - палочковидная; 4 - удлиненная; 5 - сферическая; 6 - цепочка сферических оболочек; 7 - гифа; 8 - несущая аскоспоры; 9 - округлая с почками; 10 - амебовидная.

Вид клеток

обычное протопласт протопласт обычное обычное

1 . R

Нужно указать, что величина К входит в уравнения, описывающие физико-химические параметры среды вблизи искривленной межфазной поверхности раздела. К таким параметрам можно отнести: - капиллярное давление; - дополнительная разность концентрации; - разность электрических потенциалов;

δ = R/2h

10-30 50-300 2-10

13

14

- разность химических потенциалов; - разность температур и т.п. при этом возникают различия кривизны внешней и внутренней поверхности микробной оболочки. Под воздействием указанных выше параметров (капиллярное дакление и др.) происходит изменение формы оболочек, появляются различные кривизны их поверхности Иногда неоднородность кривизны характеризуется гауссовой кривизной поверхности оболочки К равной произведению кривизны в одной точке, взятой в двух взаимно перпендикулярных направлениях (К|, К||):

К = К || ⋅ K | =

1 R | ⋅ R ||

числа разнообразных видов микробных клеток. При этом были использованы биохимические и электронномикроскопические методы, методы репликации, химической обработки срезов, фотоупругости, реологии, авторадиографии, различные виды травления (ионное, ферментативное, химическое), инструментальные методы - рефрактометрия, реодинамика, инфракрасная спектроскопия, гидроэкструзия, выпячивание, малоугловое рентгеновское рассеяние, криовоздействие. Микробная оболочка представляет собою сложно структурированную систему с тремя уровнями структурной организации. Микробную оболочку можно разделить на три группы по уровню структурной организации.(рис.2,3)

.

Рис.2.3. Схема строения оболочки грамотрицательной бактериальной клетки 1 – химическая группа, 2 – супрамолекулярнотекстурная группа; 3 – архитектоническая группа

Первая группа - химическая , включает подверженные механической и механоэнзимной активации химические связи: в матриксе оболочки и его внутренних связях - жидкой, гелеобразной, находящейся в адсорбированном на матриксе виде. Связи могут находиться в боковых группах, внутри мономеров, между ними, в боковых цепях или образовывать водородные мостики между молекулярными цепями. Вторая группа - это супрамолекулярно-текстурные уровни организации, которые охватывают механоактивируемые связи между отдельными супрамолекулярными образованиями

Рис.2.2. Концентраторы напряжений в микробных оболочка

Гауссова кривизна определяет ряд особенностей проявления деформационной устойчивости оболочек, включая их поведение при деформации. 2.2. Структурное материаловедение микробной клетки В настоящее время получены данные [7] о составе, структуре, текстуре и архитектонике оболочек огромного 15

16

с напряженно-деформированным состоянием оболочек, так и с присутствием в их теле ферментов.

(глобулы, полиферментные комплексы, микрофибриллы, каналовидные ультраструктуры), благодаря которым возникает текстура матрикса. Степень упорядоченности текстуры может быть различной: от квазиоднородной случайно ориентированной текстуры до высокоупорядоченной квазикристаллической. Третья группа - это архитектоническая, которая охватывает субструктуры, определяющие сложное строение оболочки, композитообразующие структуры, пронизывающие или соединяющие под оболочки. К этой группе уровней необходимо отнести и целооболоченный архитектурно-геометрический остов определяющий конструкционные эффекты упругости, прочности, а также и деформационной устойчивости оболочки. Реологическая модель материала микробной оболочки представлена на рис.2.3, на которой указаны все три группы уровней и которые могут взаимодействовать независимо от природы механического воздействия на оболочку. Для описания реологической модели материала оболочек важны как простейшие характеристики, реализующиеся при бесконечно малых деформациях, так и «макроскопические» характеристики, проявляющиеся при очень больших деформациях оболочек, имеющих место при смене фаз жизненного цикла клеток, насильственной дезинтеграции и т.п. Микробные оболочки содержат наряду со структурными белками и полисахаридами значительные количества ферментов, обеспечивающих полимеризацию, деполимеризацию, изомеризацию, пришивку боковых ветвей, образование поперечных связей и другие многообразные химические превращения структуры и состава вещества ригидного тела оболочки. Далее в отличие от реологического поведения полимеров, компонентами которого являются упругость, вязкость и пластичность, поведения полимеров микробных оболочек осложнено механическими и механобиохимическими трансформациями, причем природа их связана

2.3. Упругость и прочность микробной оболочки Для определения упругости и прочности микробной оболочки применяют особую экспериментальную технику и методы (табл.2.2) [7]. Важно отметить, что наибольшей универсальностью обладает измерительная ячейка Шарни, которая пригодна для исследования прочности оболочек микробных клеток животных и растений. В основном известны три метода определения модулей упругости вещества клеточных стенок микроорганизмов. Прямой метод с применением микроманипуляционной техники для микроорганизмов мицеллиального строения. Оптический метод, основанный на регистрации изменений светорассеяния микробных суспензий, вызванных изменениями размеров клеток под влиянием контролируемого осмотического давления среды. Метод инородных включений состоит в том, что исследуемые клетки помещаются в желатиноглицериновые пленки с заданными упругими характеристиками. Внесение клеток изменяет их упругие свойства. При этом модули упругости вещества клеточной стенки могут быть определены по этим изменениям. В табл. 2.3. представлены немногочисленные имеющиеся результаты по определению модулей упругости клеточных оболочек. При разрушении клеток в реальном дезинтеграторе предел прочности вещества клеточных стенок является дезинтеграционной характеристикой клетки. Весьма распространенным методом определения предела прочности клеточной стенки является метод «медленной жидкостной экструзии». Сущность метода заключается в том, что исследуемые клетки помещаются в желатиногли17

18

цериновую среду, которая потом продавливается через узкую (≈ 200 мкм) щель постоянной ш ирины. При этом клетки разрушаются под действием сил со стороны неравномерно движущейся внеклеточной среды. Скорость продавливания составляла около 0,1 см3/мин. Концентрация глицерина и вязкость среды подбирается в зависимости от давления на входе в щель, чтобы данная скорость сохранялась. Предел прочности вещества клеточных стенок оценивается, используя критерий максимальных касательных напряжений. Были получены значения предела прочности вещества клеточных стенок Saccharomyces pombe равные: на полюсе клетки σпр1 = 44,5 F0 ; на экваторе клетки σпр2 = 95 Fе

1 трузия

2

3

микроманипулятор с микроиглой

выделенная оболочка дрожжевой клетки

- с акустическими колебаниями

микроманипулятор

животная клетка

- с нагревом иглы

горячая микроигла

дрожжи

- с генерацией микропотоков вблизи иглы

акуститечская микроигла

дрожжи, вирусы

- втягивающая микропипетка Экструзионный метод: - быстрая гидроэкс-

микроманипулятор с микропипеткой

эритроцит

измерительный

микроорганизмы

- метод градиента скорости в жидкости

ячейка с градиентным потоком

-медленный Фильтрационные методы: -с использованием естественного пористого материала (уголь) -с использованием искусственного пористого материала Методы с раздавливанием клеток: -между наковальнями

4 «ригидность»

-в баллистическом дезинтеграторе Метод инородных включений с использованием растягивающей машины Метод механического резонанса

термоупругость бактерии,

экструзионный дезинтегратор ИБФМ-1

-быстрый

Методы определения упругости и прочности оболочек микробных клеток Механическая ИнструментальОъект характеристика Метод ная техника оболочки 1 Метод микроиглы: с контактным взаимодействием

- медленная гидроэкструзия

Газодекомпрессионные методы: -взрывной

Таблица 2.2

прочность (F0) прочность молекулярная упругость

Метод фотоупругости

всех

19

20

2 шариковый клапан (по Шарпи)

ударная труба, дезинтегратор с лопающейся мембраной газодекомпрессор

3 систематических групп, животные клетки

4 прочность (F0)

S.pombe, E.coli

прочность (F0)

вирусы ВТМ эритроциты дрожжи, кишечная палочка, кокки

прочность

водородные бактерии метанокислящие бактерии

прочность прочность

бомба с медленным выпуском газа стенд для испытания образцов углей на проницаемость

метанокисляющие бактерии

прочность

экспериментальный диспергатор дезинтегратор

метанокисляющие бактерии

прочность

измерительная ячейка с прозрачными наковальнями планетарный дезинтегратор растягивающая машина с тензометром микровибратор с перестраиваемой частотой колебаний (до 12кГц) поляризационный микроскоп

ооцит

упругость, прочность

дрожжи S.pombe

прочность, термопрочность

бактерии, дрожжи

упругость

яйцо морского ежа

упругость

растительная клетка (ацетабулярия)

упругость, дуль сдвига

мо-

1 Метод светорассеивания Метод растяжения клетки в культуральной микрокамере

2 осмотический шок в кювете нефелометра растягивающая микромашина (кимограф) с клеточной мембраной

3

Для клеточной стенки Saccharomyces pombe были получены: V0-24 ккал/моль; на полюсе клетки γп = 2 ккал⋅мм2/моль⋅кг; на экваторе клетки γэ = 1 ккал⋅мм2/моль⋅кг. Приняв Va= 2⋅10-23см3, для коэффициента перенапряжения получим: на полюсе клетки q1 =70; на экваторе клетки q2=35. Для сравнения в табл. 2.4 и 2.5 даны значения V0 , γ и q для некоторых полимеров [7]. Таблица 2.4

4

кишечная палочка

упругость

растительная клетка

упругость, предел прочности

где F0 - прочностная характеристика вещества клетки (оптимальная прочность клетки в рассматриваемом способе разрушения), равная для клеток Saccharomyces pombe (5,04 ± 0,08)⋅106 дин/см2 и для клеток E.coli В 2,4⋅106 дин/см2. Отсюда σпр1 = 2,2 ⋅108 дин/ см2 σпр2 = 4,8 ⋅108 дин/ см2

Значение первоначальной энергии активации разрушения некоторых полимеров Полимер U0, ккал/моль

Таблица

Триацитатцеллюлоза Поликапроамид Нитроцеллюлоза Полистирол Полиметилметакрилат Полиэтилен

2.3 Вид клеток Кишечная палочка Золотистый стафилококк S. pombe Дрожжи Эритроцит Яйцо морского ежа

Модули упругости клеточных оболочек Метод исследования оболочек

Модуль Юнга

Измерение светорассеяния при осмотическом шоке

5 ⋅ 108 - 5 ⋅ 109

Измерение упругости пленок геля с включенным в него клетками Измерение светорассеяния при осмотическом шоке

5 ⋅ 109

Экструзия геля с включенными клетками Помол при различных температурах Контактный метод

2,6 ⋅ 107 2,6 ⋅ 107

Контактный метод

49 45 38 33 31 25

Таблица 2.5

4 ⋅ 109

Значения U0, γ и q для поликапроамида (капрон) Поликапроамид U0, ккал/моль γ, ккал⋅мм2/моль⋅кг

106-108

Неориентирован Ориентирован УФ облучен Пластифицирован

103-104

Используя кинетическую теорию прочности были определены прочностные характеристики вещества клеточных стенок Saccharomyces pombe. К ним относятся: V0 - первоначальная энергия активации разрушения; γ - прочностная характеристика; γ - Vа⋅q; Va= (2÷3)⋅10-23см3 - элементырный объем активации; q - коэффициент перенапряжения.

45 45 45 45

1,78 0,28 0,81 0,43

q 60 9,5 28 15

Различные значения q1 и q2 на полюсе и экваторе клетки показывают, что строение клеточной стенки Saccharomyces pombe более упорядочено на экваторе клетки по сравнению с его строением на её полюсе (табл. 2.6). Таблица 2.6 Предел прочности клеточных оболочек Вид клеток Раститель-

21

22

Метод исследования Растяжение в измерительном

Предел прочности, дин/см2 3⋅1011 - 1012

ные волокна Мышечное волокно S.pombe E.coli S.pombe

приборе Растяжение приборе

в

измерительном

Помол в жидкой среде Экструзия геля с включенными в него клетками

родностей в структуре льда, мелких частиц абразива и клеток. При этом считается, что основной причиной разрушения клеток в экструзионных и истирающих дезинтеграторах является сдвиговое течение твердой среды при температурах не ниже -350С. в дробилках и мельницах, работающих при более низкой температуре преобладает разрушение пластично-хрупкого и чисто хрупкого характера.

5⋅103 – 104 (19÷37)⋅106 (при 930С) (19÷37)⋅106 (при 930С) 44,5⋅F0 на полюсе (2,2⋅108) 95⋅F0 на экваторе (4,8⋅108) (⋅F0 =5⋅106 дин/см2)

2.4. Механизм разрушения клеточной оболочки В данном разделе рассматривается последовательность явлений, приводящих к разрушению клеточных оболочек. На процесс разрушения оказывает влияние окружающая среда. Она может выступать как пассивный передатчик энергии (механической, тепловой) от дезинтегратора к клетке, и как активный элемент процесса, интенсивно воздействующий на клеточные оболочки (химическое, химикоэкстрактивное, энзиматическое и различные анизоосмотические воздействия). В эту среду выходят после разрушения оболочки целевые клеточные компоненты и претерпевают в ней изменения. Рассмотрим влияние окружающей среды в условиях сдвиговых и шоковых воздействий.

Сдвиг реологически сложной среды. В настоящее время применяются рабочие органы и мелющие тела дезинтеграторов из полимерных материалов. Разрушение клеток происходит в местах фрикционного контакта мелющих тел из полимеров вязко-упругой реологии. В работе [8] исследовано разрушение клеток во встряхивающем высокоскоростном дезинтеграторе, через рабочую камеру которого барботируется газ: кавитация, ударное разрушение, режущее и истирающее действия, удар клеток друг о друга и о поверхности камеры и пластиковых тел. В основном разрушение происходит за счет вязко-упругого сдвига. Также примером дезинтеграции клеток за счет сдвигового течения реологически сложной среды может быть метод экструдирования в желатиновом геле. Жидкий сдвиг. Этот вид сдвига часто рассматривают для объяснения причин дезинтеграции микробных клеток, фрагментации их органелл и макромолекул, внешних образований типа фибрилл, мембран, капсул и т.п. примером является работа гидроэкструзионного дезинтегратора, принцип действия которого основан на жидком сдвиге. Напротив в жидкостном экструдере высокого давления считается, что истинной причиной дезинтеграции клеток является декомпрессионный шок [7].

2.4.1. Сдвиг Клетка во льду. Применение ступок с абразивом, шаровых мельниц, дробилок и экструдеров высокого давления для разрушения замороженных микроорганизмов указывает, что причины разрушения клеток и микрочастиц твердых тел во многом подобны. В теории измельчения считается общепринятым, что разрушение частицы твердого тела происходит под действием сил удара, раздавливания и среза. Истирание и экструзия замороженных клеток качественно рассматривается с точки зрения «твердого сдвига». При экструзии происходят фазовые переходы льда I в лед II, а также во внимание принимается абразивная роль неодно-

2.4.2. Шоковые воздействия 23

24

Осмотический шок. Применяется для дезинтеграции клеток, имеющих малопрочную и высокопроницаемую клеточную оболочку. При этом происходит солевой шок, оболочка клеток, органелл, вирусов разрывается давлением воды, проникающей внутрь клетки. Температурные шоки. Применяется при резко контрастных температурных воздействиях на клетки в диапазонах от 0 до 370С и от -1000С до 00С. Газодекомпрессионный шок. Установлено, [10] что при резком снижении давления газа (азот, СО2) над свободной поверхностью сатурированной суспензии происходит либо резкое набухание клеток, за счет выделения из них некоторого количества водорастворимого белка и низкомолекулярных компонентов, либо разрыв оболочки. Аналогичные процессы могут наблюдаться и при медленном снижении давления газа над сатурированной суспензией. Механические и термомеханические шоки. Механическое деформирование клеточной оболочки приводит к значительному уменьшению её объема (например, в 2 раза) за счет отжима воды из клетки, при этом концентрация солей и других низкомолекулярных метаболитов в протоплазме повышается и клеточная оболочка может разрушаться под действием тургорного давления. При этом энергия, идущая на уменьшение объема клетки, расходуется на преодоление сил осмотического давления. В работе [11] рассмотрена работа в баллистическом дезинтеграторе (термомеханический шок), характеризующаяся высокими градиентами скоростей и температур рабочей жидкости, в которой взвешена микробная клетка. В этих условиях клеточная оболочка разрушается также и за счет сил тургорного давления. Дегидратационный и регидратационный шоки. Объяснение причин дезинтеграции клеток при значительном изменении содержания свободной воды связывается с процессами замораживания, лиофилизации, испарения (замерза-

ния) околоклеточной среды и основывается на физически содержательных аналогиях между замораживанием и высушиванием микроорганизмов. При этом явления, протекающие в клетке при дегидратации и регидратации, приводят к шоковым воздействиям и лизису. К дополнительным причинам возникновения шоковых процессов, приводящих к лизису клеток, можно отнести и различные виды экзогенного химического воздействия (химические шоки), а также резкие нарушения в метаболлизме клеток (метаболитные шоки) субстратного происхождения или обусловленные изменениями метаболлитного пула клеток.

2.5. Распределение напряжений в клеточной оболочке Дезинтеграция «высокопрочных» микробных клеток требует интенсивных механических воздействий. Такие воздействия наблюдаются в механических дезинтеграторах микроорганизмов, где они обычно достигают высокой интенсивности и протекают с большими скоростями. Причем в основном имеем дело с оводненными клетками. При этом клетка представляет собой сферическую однослойную оболочку, заполненную однородной псевдожидкой средой с модулем сдвига, равным нулю, и находящуюся в жидкости. Всего можно представить шесть квазистатистических механизмов разрушения оводненных клеток (см. табл. 2.7). Наиболее интересным из них является механизм «градиент скоростей» [6]. На рис. 2.5. представлены согласно табл. 2.7. распространенные механизмы дезинтеграции клеток. Силы, действующие при неоднородном движении окружающей клетки жидкости (на единицу поверхности клетки), обусловлены неравномерным движением жидкости, 25

26

реализующимся при быстром сбросе давления на выходе из рабочей щели дезинтегратора. В зависимости от характера движения жидкости на клетку могут быть задействованы силы, отличающиеся как по величине, так и по характеру действия (нормальные, тангециальные, импульсные и т.д.), которые представлены на рис. 2.6,2.7. Наличие замкнутых полупроницаемых оболочек у ряда внутриклеточных органелл дает возможность использовать положения теории медленных и быстрых механизмов дезинтеграции для описания физико-химических процессов, протекающих в этих органеллах при фрагментаци. Кроме рассмотренных выше механизмов дезинтеграции клеток, основанных на деформационных и прочностных свойствах клеточных оболочек, имеет значение разрушение, реализующееся за счет проницаемости клеточной оболочки. При этом центральным механизмом в этой группе является осмотический, реализующийся в интервале 10-100с. Целесообразно разделить все механизмы дезинтеграции клеток на две большие группы - на быстрые (10-10 1с), при протекании которых проницаемостные свойства оболочки не успевают проявиться в дезинтеграционных процессах, и на медленные, в которых проницаемость по низкомолекулярным веществам играет определяющую роль.

Рис. 2.5. Схемы механизмов дезинтеграции: 1 - «прокол», 2 «раздавливание»; 3 - «капилляр»; 4 - «гидростат»; 5 - «сильфон»; 6 - «кручение»; 7 - «резонанс»; 8 - действие поперечного градиента скорости на нитевидные образования различной длины: а) поворот в потоке, б) скользящий перегиб (однократный), в) скользящий перегиб (двухкратный), г) - встречное скручивание концов нитей; 9 - действие градиента скорости на структуру мицелия: А- исходная структура, В - текстуризованная структура

Природа медленных механизмов дезинтеграции клеток гораздо сложнее, чем таковая у быстрых, имеющих биомеханическую основу. Медленные механизмы требуют одновременного изучения в соответствующих моделях клетки проницаемостных, диффузионных, тепловых и других характеристик. Таблица 2.7 Основные квазистатические механизмы дезинтеграции № п/п

1 1

27

28

Название механизма 2 «Прокол»

Оценка напряжений в оболочке

Условия реализации

3

4 а) прокол микроиглой б) оттягивание небольшого участка оболочки каппиляром с пониженным давлением в) захлопывание кавитационного пузырька вблизи оболочки

f σ= h( Rh) 1/ 2

1 2

2 «Гидростат», «сильфон»

3

3

«Раздавливание»

область А, см. «прокол» область Б, см. «гидростат»

4

«Каппиляр»

Поверхность 1:

σϕϕ

R = σθθ = ∆P ⋅ = δ ⋅ ∆P 2h

σϕϕ = σθθ = ⋅

P1 − P3 R ⋅ 2 2h

область 1 см. «прокол» поверхность 2

σϕϕ = σθθ = ⋅ 5

Кручение

4 а) взрывная газовая декомпрессия б) гидроэкструзионная дезинтеграция а) дезинтеграция в валковом дезинтеграторе б) дезинтеграция в малоскоростных и пристальтических дезинтеграторах а) дезинтеграция при продавливании через каппилярнопорситое тело б) вакуум - декомпрессионная дезинтеграция

Рис. 2.6 Механизмы нагружения цилиндрических оболочек

P2 − P3 R 2h

область

σϕϕ = σθθ = 0 R θ − (sin2θ ) / 2 σϕθ = P ⋅ (θ π θ0 ) h 2 sin2 θ R θ − (sin2θ0 ) / 2 σϕθ = P ⋅ ⋅ 0 (θ ≥ θ0 ) h 2sin2 θ0

Имеет место во всех случаях неоднородного нагружения оболочки и является компонентом всех иных механизмов

 ∂V ∂V  Fi = P ⋅ ni + η  i + k  n k |s  ∂x k ∂x k  6

Градиент скоростей

где: F - сосредоточенная сила, P - давление в среде, η - вязкость среды, Vi скорость движения среды, ni - единичный вектор нормали к поверхности клеток, s - поверхность клетки

Дезинтеграция в условиях резко неоднородного распределения скоростей и давлений в рабочей среде дезинтегратора - жидкой или вязкоупругой

Рис. 2.7. Модель двуслойной оболочки (ригидный слой + мембрана)

.При этом механизмы медленных процессов могут быть вскрыты и проанализированы с помощью аппарата неравновесной термодинамики. При этом изученные принципы создают благоприятные перспективы расчетов дезинтеграто-

ров узкоспециального назначения, например для извлечения органелл. 2.6. Быстрые и медленные механизмы дезинтеграции клеток Рассмотрим роль проницаемостных свойств оболочки при дезинтеграции клеток и её связь с деформационными и прочностными факторами клеточных оболочек. Можно представить микробную клетку как открытую систему и по29

30

лагать, что дезинтеграция клеток происходит в условиях, приближенных к равновесным при определенных температурах, концентрации и давлении. Тогда, можно выразить трансмембранный поток воды, играющий основную роль в дезинтеграции оводненных клеток следующим уравнением: S I в = ( A∆P + B∆C + C∆T ) , (1) ∆ где Iв - объемный поток воды через мембрану, S - площадь поверхности мембраны, ∆ - толщина мембраны, А, В, С условные коэффициенты переноса, зависящие от средней температуры системы и (в меньшей степени) от среднего давления в системе: А - коэффициент фильтрации, В - коэффициент осмотической фильтрации, ∆P, ∆С, ∆Т - перепады давления, концентрации и температуры на цитоплазматической мембране клетки; с – коэффициент термоосмотической фильтрации. При оводнении или обезвоживании клетки в мембране возникают добавочные напряжения σ, которые стремятся возвратить её в равновесное положение. По закону Гука эти напряжения в клетке сферической формы прямопропорциональны относительному изменению клеточного объема: σ = ξχ (2) V −V где χ = 0 , а V0 - объем равновесной формы; ξ - модуль V упругости. При небольших отклонениях объема от равновесного ξ можно считать постоянным. При чем при обезвоживании клетка стремиться деформироваться путем изгиба при минимальном растяжении мембраны, что энергетически выгодно. Возникающие при этом напряжения в мембране должны быть значительно меньшими, чем при растяжении в условиях постоянного изменения клеточного объема. Основываясь на уравнении (2) зависимость модуля уп-

ругости от клеточного объема для реальной мембраны имеет вид, показанный на рис. 2.8.

Рис. 2.8. К расчету медленного (осмотического) механизма нагружения оболочки: зависимость модуля упругости мембраны от относительного изменения объема клетки

Рис.2.8.К расчету медленного (осмотического) механизма нагружения оболчки: зависимость модуля упругости мембраны от относительного изменения объема клетки

Применяя соотношение (1) можно вывести ряд оценочных формул, позволяющих иллюстрировать механизмы медленной дезинтеграции оводненных клеток при различных видах воздействия на них. В табл. 2.8. представлены обозначения используемых величин.

2.6.1. Осмотический шок Уравнение (1) для случая осмотического шока имеет простейший вид: S I в = B ⋅ ∆C , (3) ∆ где Iв - объемный поток воды через мембрану; S - площадь поверхности мембраны; ∆ - толщина мембраны; В - коэффициент осмотической фильтрации; ∆С - перепад концентраций. Откуда определяются коэффициент осмотической фильтрации Таблица 2.8 Соотношение между равновесными и неравновесными параметрами клетки и среды Клетка в равновесном состоянии

31

32

Клетка в неравновесном состоянии в мо-

Соотношения между разностными величинами

мент дезинтеграции 2 Vкр - критический объем

1 V0 - объем клетки С0 - концентрация растворенного «чужеродного» компонента в протоплазме Р0 -тургорное (осмотическое) давление в клетке Т0 - равновесная температура ξ - модуль упругости σм - предел прочности мембраны

В=

Ск - концентрация низкомолекулярного «чужеродного» компонента в протоплазме Сср - концентрация низкомолекулярного «чужеродного» компонента во внеклеточной жидкости Рср - осмотическое давление Ткр - неравновесная температура протоплазмы Тср - температура внеклеточной среды Jв -приведенные поток воды через мембрану ∆t - время воздействия термодинамической силы

I в = A∆P + B∆C , (5) где А - коэффициент фильтрации, ∆Р - перепад давлений, В - коэффициент осмотической фильтрации, ∆С - перепад концентраций. По закону Генри-Дальтона объем газа, растворенного в клетке при условиях дезинтеграции (Vг) будет определяться: V Г = αV0 ∆PГ , (6) где V0 - объем клетки, Pг - давление газа в бомбе, α - коэффициент адсорбции протоплазмы для рабочего газа в условиях дезинтеграции.

3

χ кр =

Vкр − V0 V0

=

1 2

∆С = С0 − Сс р ∆Р = Р0 − Рс р ∆Т = Т 0 − Т с р ∆Т 1 = Т к р − Т с р ∆V = Vк р − V0 = J в ⋅ ∆t ≅ V0 / 2

χ к р ⋅ V0 Iв ⋅ ∆ ∆ = ⋅ , S ⋅ ∆C S ⋅ ∆C ∆t

∆t =

χ к р ⋅ V0 Jв

Принимая, что Iв = Iмех + Iосм, где Iмех = A∆P, а Iосм В∆С, можно после ряда простых преобразований переписать уравнение (1) следующим образом:

[

]

I в = A∆P + BβV0 Pв (α п − α в ) + α п ∆Р ,

(7)

где β - постоянный коэффициент, Рв - давление газа в воде, окружающей клетку; αп и αв- коэффиценты адсорбции протоплазмы и воды, окружающей клетку. Первое и второе слагаемое данного уравнения (7) могут давать различные вклады в общий поток воды в зависимости от величины коэффициента фильтрации А и коэффициента осмотической фильтрации В. Причем явления быстрой газовой декомпрессии находит свое отражение в первом слагаемом, а медленная во втором слагаемом выражении для объемного потока воды.

(4)

где V0 - объем клетки; χкр - относительный критический Vк р − V0 ; ∆t - время воздействия. χкр - вычисобъем равный V0 ляется по σкр и модулю упругости, взятых из экспериментальных работ по [12].

2.6.3. Холодовой удар клеток. Ультразвуковая дезинтеграция В работе [14] проанализировано распределение температур в клетке при её охлаждении и на примере эритроцитов человека показано, что оболочка разрушается термостатическим потоком воды, проникающим в клетку через

2.6.2. Медленная газовая декомпрессия В случае малых тепловых эффектов при медленной газовой декомпрессии (∆t=10c) выражение (1) примет следующий вид [13]: 33

34

сти, клетка, нагревшись, и выйдя из рабочей зоны, попадает в холодную жидкость и разрушается по схеме холодового удара. В завершении главы можно отметить, что несмотря на модельный характер теории, она позволяет осмыслить современные данные по биофизике дезинтеграции клеток, правильно охарактеризовать течение процессов дезинтеграции и качественно и полуколичественно изучить их механизмы. Теория механизмов дезинтеграции микробных клеток позволяет вычленить физико-механические процессы, которые представляют собой совокупность явлений физической, физико-химической, физико-механической, химической и биохимической природы. Данная теория намечает, некоторые пути к созданию теоретических основ инженерных расчетов основных видов физико-механических дезинтеграторов клеток. Поскольку теория описывает процессы в клетках и их органеллах, появляются благоприятные перспективы расчетов и конструирования дезинтеграторов на основе изученного принципа его действия, причем дезинтеграторов узкоспециального назначения, например для извлечения органелл. Наконец можно сказать, что изложенная теория позволяет впервые на единой научной основе обобщить значительный по объему эмпирический опыт физикомеханической дезинтеграции и разрозненные экспериментальные исследования по биофизике дезинтеграции клетки, а также представить эти научно-практические данные в виде, удобном для инженерной практики.

мембрану. Для случая холодного удара выражение (1) имеет вид: (8) I в = С∆Т , где С - коэффициент термостатической фильтрации, ∆Т период температуры. Причем величина и знак скачка температуры на мембране зависят от размера клеток, скорости охлаждения суспензии и теплопроводности и начальной температуры протоплазмы. При малоинтенсивной (докавитационная интенсивность) ультразвуковой обработки клеток, важным является вязкость протоплазмы, как фактора разогрева клетки и среды ультразвуком, а также упругие свойства клеточных стенок. Для случая обработки клеток «докавитационным» ультразвуком было получено k ⋅ N s ⋅ tπR 2 ∆Т = (9) mп Сп где ∆Т - прирост температуры протоплазмы, k- калорический эквивалент работы, NS - плотность потока мощности ультразвуковой волны, t - время обработки, R - радиус клетки, mn - масса протоплазмы, Сn - теплоемкость протоплазмы. Полученное значение скачка температуры определяет тепловой микромасштабный эффект, который обычно является быстропротекающим и может иметь место при иных методах дезинтеграции. Они могут играть важную роль в баллистических и ультразвуковых методах дезинтеграции, при использовании которых клетка может находиться в резко неоднородных полях температур и скоростей. То же можно отметить и в случае гидроэкструзионной дезинтеграции клеток. Микробная клетка в рабочей щели гидроэкструзионного дезинтегратора пребывает весьма короткое время ∼10-6 с, но благодаря интенсивному воздействию со стороны неоднородно движущейся рабочей жидко-

2.7. Некоторые трибологические особенности процесса деформации и разрушения микробных оболочек под действием внешних факторов.

35

36

призваны наметить пути к созданию дезинтеграторов третьего поколения.

Для механической дезинтеграции микробных клеток и измерения упругих характеристик их оболочек чаще всего необходимую интенсивность воздействия создают путем специальной организации процессов внешнего и внутреннего трения твердых тел или жидкостей. Именно для таких процессов характерны высокие показатели скорости течения среды и поперечного её градиента, резко неоднородное распределение температур, давлений и концентраций в тонкослойных (1-100мк) течениях жидкой и твердой фаз (содержащих микробные клетки) в зонах фрикционных контактов и сдвиговых деформаций. Техническая теория трения, выделившаяся в отдельную научно-техническую дисциплину, играет важную роль в создании теоретических основ дезинтеграции. Можно отметить, некоторые трибологические закономерности: эффект гидравлического клина, определяющий зависимость силы трения от скорости смешения трибоэлементов; подшипник Зоммерфельда; эффекты макрогидроупругого трения при взаимодействии упругих трибоэлементов в присутствии жидкой смазки; модели трения с износом; модели контактного взаимодействия паров и др. Наиболее общие черты многочисленных моделей простейших трибосистем описаны в так называемой элементарной трибосистеме, предложенной Х.Чихосом [15], которая позволяет изучать сложные по своей природе процессы трения. Для дезинтеграторов первого поколения, т.е. устройств с невысокой степенью организации процессов, трибологическая подсистема характеризует лишь элементарный акт его работы. Для дезинтеграторов второго поколения, рабочая зона которого компактна и совпадает с зоной интенсивного трения, трибологическая подсистема характеризует его принцип действия, устройство и одновременно процессы износа в нем. Результаты в исследованиях и разработках дезинтеграторов первого и второго поколений,

3. Методы дезинтеграции микроорганизмов 3.1. Основные понятия и определения Под дезинтеграцией микробных клеток можно понимать процесс необратимого нарушения анатомической целостности клеток. С практической точки зрения необходимым и достаточным является разрыв клеточной оболочки, который может быть вызван различными повреждающими факторами - физическими, механическими, химическими, энзиматическими, биологическими. Причем дезинтеграция предшествует фракционированию и очистке субклеточных компонентов и в большой степени предопределяет качество конечного препарата. Воздействия большой интенсивности могут привести к крайне нежелательным явлениям инактивации, модификации и деградации внутриклеточных компонентов. Получаемый в результате дезинтеграции материал правильнее называть дезинтегратом. После удаления из дезинтеграта оставшихся целых клеток он становится бесклеточным экстрактом. Последующее фракционирование и очистка бесклеточных экстрактов позволяет получить те или иные фракции или популяции индивидуальных субклеточных структур (органелл, мембран) и биополимеров, в целом именуемых бесклеточными препаратами. Дальнейшую обработку этих препаратов с целью дополнительного измельчения (рассечения) субклеточных структур и выделения субчасти следует обозначить как «фрагментацию». При этом термин «дезинтеграция» сохра-

37

38

Однако, применение таких сильных воздействий не всегда рекомендуется, т.к. параллельно они могут вызвать процессы деструкции и фрагментации менее устойчивых субклеточных структур и инактивации ферментов. Поэтому одна из главных проблем дезинтеграции состоит в том, чтобы разрыв оболочки не вызвал повреждения внутриклеточных структур.

няется лишь для клеточного уровня. Примерами процедуры измельчения субклеточных структур могут быть: механическая фрагментация ДНК, выделение митохондриальных субчастиц, фрагментация мембран и жгутиков и др. Наконец, можно отметить, что дезинтеграция затрагивает как операциональные, так и концептуальные аспекты проблемы выделения субклеточных структур микроорганизмов. В настоящее время для дезинтеграции микроорганизмов (ДМ) используется больше сила различных физических, механических, химических, энзиматических и биологических методов и их модификаций (см. табл. 2.9).

3.1.2. Химические и энзиматические методы. Нейтральные соли, органические соединения, хелатные агенты, детергенты и др. способны повреждать и при некоторых условиях разрушать оболочку микробной клетки. В ос нове данного метода лежат различные механизмы нарушения межмолекулярной и химической связи между структурными элементами клеточной стенки. Обработку клеток химическими реагентами используют как подготовительный этап, предшествующий энзиматической дезинтеграции.

3.1.1. Физические методы Наиболее популярными физическими и механическими методами являются: баллистические, гидро- и криоэкструзионные, ультразвуковые, декомпрессионные и др. Дезинтгацию, осуществляемую физическими и механическими методами, можно рассматривать, как сверхтонкий помол твердых тел. Особенно близки эти процессы для крио или ксеродезинтеграции клеток. при этом нужно дезинтеграцию провести таким образом, чтобы сохранить морфологическую интактность и биохимическую активность выделяемых субклеточных структур. Как уже отмечалось выше, клеточные стенки микроорганизмов отличаются исключительно высокой механической прочностью. Предел прочности клеточной оболочки составляет величину порядка 109 дин/см2, что соответствует пределу прочности некоторых сортов стали. Для разрушения столь прочных субмикроскопических структур необходимы сильные механические воздействия, которые вызывают гидродинамические градиенты порядка 108с-1 и более (рис.2.9).

Таблица 2.9 Классификация дезинтегрирующих воздействий по их природе Физические механические

39

40

Химические немеханические

Энзиматические

Биологические

Баллистические Экструзионные: гидроэкструзионные твердофазная экструзия Ультразвуковые Газодекомпресиионные Электрогидроударные Гидроударные Комбинированные методы

осмотический шок тепловой шок холодовой шок замораживание - оттаивание замораживание - высушивание дегидрадация регидрадация медленная газовая декомпрессия фазовые переходы при высоких давлениях

действие щелочей действие кислот действие солей действие детергентов действие антибиотиков действие ингибиторов действие хелатных агентов действие органических растворителей

действие бактериолитических ферментов действие дрожжелитических ферментов действие миколитических ферментов действие иммобилизованных литических ферментов

действие фагов действие бактериоцинов и других «кайлеров» действие внутриклеточных паразитов ингибирование синтеза клеточной оболочки действие плазмидоподобных факторов автолиз

Для энзиматической ДМ используют широкий набор ферментов и ферментных комплексов бактериологического, миколитического и дрожжелитического действий. Причем энзиматическая ДМ нашла особое широкое применение в научных исследованиях, где её используют для холодного выделения малоустойчивых субклеточных структур, изучения особенностей строения и состава клеточных стенок, исследования путей и механизмов их биосинтеза и регенерации Особенно перспективным является применение иммобилизованных литических ферментов. Рис. 2.9. Схема эффективных областей гидродинамических градиентов для дезинтеграции клеток различных групп микрорганизмов и фрагментации субклеточных структур

3.1.3. Биологическая дезинтеграция Процессы биологической микроорганизмов (ДМ) довольно часто встречаются в природе. Они могут быть вызваны различными агентами: колицинами и бактериоцина41

42

биомассу в непрерывном режиме с производительностью порядка сотен литров в час при эффективности дезинтеграции, близкой к 100%.

ми, плазмидоподобными факторами, фагами, внутриклеточными паразитами. Биологическая ДМ может быть результатом генетических и метаболических нарушений, а также следствием структурных перестроек, связанных с циклами развития и процессами дифференциации у микроорганизмов. Для практических задач интерес представляет возможность биосинтеза микробных популяций с дефективными клеточными стенками. Получение таких популяций позволило бы решить вопрос производства биологически активных веществ из микроорганизмов для пищевых и кормовых целей.

3.2. Обзор конструкций баллистических дезинтеграторов Количество описанных в научной и патентной литературе баллистических дезинтеграторов достигает уже 150, куда входят простейшие, такие как ступки и гомогенизаторы, так и сложные высокопроизводительные автоматизированные установки для выполнения опытноэкспериментальных и промышленных работ. Для всех баллистических дезинтеграторов содержательным представляется критерий способа передачи энергии от рабочих органов дезинтегратора к клетке: непосредственно, при механическом контакте или через рабочую срезу или мелющие тела. Исходя из этого и учитывая вид взаимодействия рабочих органов друг с другом, всю совокупность баллистических дезинтеграторов можно разделить на несколько групп: I – Дезинтеграторы истирающего и раздавливающего действий с непосредственной передачей энергии от рабочих органов к клетке. II – Дезинтеграторы со свободными мелющими телами, опосредующими передачу энергии от рабочих органов к клетке. Эта группа наиболее многочисленна. III. Дезинтеграторы с агрегированными мелющими телами, в которых передача энергии клетке от рабочих органов может быть и непосредственной, и опосредованной рабочей средой, в зависимости от того, куда преимущественно вводится энергия – в рабочие органы или в рабочую среду. IV – Дезинтеграторы ударного действия, характеризующиеся отсутствием свободных мелющих тел при высокой плотности потока энергии, отдаваемой рабочими орга-

3.1.4. Микробиологическое производство Методы ДМ используются во многих процессах и технологиях, связанных с крупномасштабным выделением различных внутриклеточных веществ из микроорганизмов и особенно ферментов. Современное производство микробных ферментов связано с выделением экзоферментов, которые применяются в катализе гидролитических реакций и процессов деградации. Микроорганизмы вырабатывают также большое количество разнообразных внутриклеточных ферментов, называемых эндоферментами. Эти ферменты обычно жестко связаны с субклеточными частицами и мембранами и образуют крупные агрегаты, полиферментные комплексы. Выделение таких ферментов невозможно без предварительного разрушения клеточных оболочек, а затем разрыва и фрагментации –субклеточных частиц и мембраны, с которыми эти ферменты связаны. Методы ДМ, пригодные для выделения внутриклеточных ферментов при аналитических и лабораторных работах, становятся непригодными для крупномасштабных промышленных процессов, к наиболее пригодным относятся баллистические дезинтеграторы, (например, ФУГ-1) позволяющие дезинтегрировать дрожжевую или бактириалную 43

44

рые допускают масштабное моделирование, к которым можно от нести Дино-мельница, ФУГ-1, Polytron R, Tekmar. Данные устройства выпускаются от маленьких приборов аналитическо-лабораторного назначения до крупных полупромышленных установок.

нами клетке при непосредственном контакте и заметно меньшей – в присутствии рабочей среды, играющей роль передатчика энергии клетке. V. Коллоидные мельницы, в которых в зависимости от характера взаимодействия рабочих органов друг с другом передача энергии клетке может быть и непосредственной, и опосредованной средой. Таким образом, использование в качестве критерия способа передачи энергии от рабочих органов к клетке в известной мере указывает и на принцип действия устройств, и на микромасштабную организацию потока энергии в дезинтеграторе, что облегчает исследование принципа его действия. Также наряду с критерием способа передачи энергии необходимо использовать критерий производительности. Примерные градации этого критерия представлены в табл. 3.

3.2.1. Баллистический дезинтегратор микроорганизмов ФУГ-1 Дезинтегратор представляет собой автоматизированный лабораторно-технологический прибор многоцелевого назначения (рис. 3). Он может быть использован для дезинтеграции микроорганизмов, а также для измельчения, гомогенизации, эмульгирования и экстрагирования термочувствительных органических и биологических материалов в жидких средах. Принцип его действия основан на послойном перемешивании загрузки полимерных мелющих микрошариков, движущихся в мощном поле центробежных сил (до 1000 g, g –ускорение свободного падения). Дезинтегрирующее и измельчающее фрикционным контактом мелющих тел, выполненных из антифрикционных полимеров. При попадании микробных клеток в зону контакта двух мелющих тел они одновременно вминаются в их поверхности и при взаимном проскальзывании мелющих тел разрушаются срезающими усилиями (рис. 3.1.). При этом литая плотность мелющих тел подбирается равной плотности рабочей жидкости, что резко снижает энергозатраты на перемешивание и сводит к минимуму тепловыделение при работе прибора. Специальная конфигурация помольной камеры прибора обеспечивает сфокусированную пространственновременную организацию процессов дезинтеграции, измельчения и перемешивания, при этом время нахождения отдельной частицы в рабочей зоне может быть задано в пре-

Таблица 3 Классификация баллистических дезинтеграторов по производительности Масштаб дезинтегратора, его назначение

Производительность, кг/ч

Аналитико-препаратный Лабораторный Крупнолабораторный Полупромышленный Промышленный

0,001 – 0,1 0,1 - 1,0 1,0 – 10,0 10 – 100 100 - 1000

Совокупность данных двух выбранных критериев позволяет легко провести классификацию всей известной ныне баллистической аппаратуры (табл. 3.1. Прил.1). Обзор выполнен в виде таблицы, которая отвечает выбранным выше критериям классификации. Причем наиболее прогрессивными являются те конструкции современных баллистических дезинтеграторов микроорганизмов, кото45

46

делах от 0,002 до 1,5 мин. На рис.3.1 показана упрощенная схема камеры, которая обеспечивает эффективный теплоотвод от всего её объема.

Конструкция прибора блочно-модульная (рис. 3.2). В состав прибора входят следующие узлы и блоки: 1. Баллистическая дезинтеграционная камера; 2. Регулируемый тирристорный электропривод дезинтегратора (привод); 3. Блок протока (стерилизуемое); 4. Термостат; 5. Блок управления, сигнализации и аварийной блокировки; 6. Насадка для экспресс-дезинтеграции замороженных проб исходного материала (криоприставка); 7. Проточная планетарная насадка для дезинтеграции и измельчения (планетарная приставка). Прибор позволяет проводить обработку в режимах с ручным манипулированием, а также с полностью автоматизированным местным или дистанционным программированием и контролем параметров процесса. Дезинтегратор обеспечивает полную безопасность при работе с микроорганизмами и материалами, вредно действующими на организм человека, малошумны. В табл. 3.2. представлены основные технические характеристики прибора. К настоящему времени разработаны дезинтеграционные камеры прибора ФУГ-1, имеющие диаметры 100, 150, 170 и 200 мм. Рассчитаны также камеры диаметром 240 и 300 мм, которые уже требуют некоторых конструктивных изменений. К дезинтегратору также прилагается криоприставка и проточная планетарная приставка. Первая предназначена для дезинтеграции порций замороженных блоков биомассы любой концентрации, а вторая – для дезинтеграции микро-

Рис. 3. Общий вид баллистического дезинтегратора ФУГ-1

С помощью специальных кольцевых вставок в помольную камеру её объемы могут быть изменены в 10-15 раз.

Рис. 3.1. Схематическое изображение срезающих усилий при динамическом фрикционном контакте мелющих тел

47

48

выгрузки мелющих тел; 16 – заглушка; 17 – привод; 18 – трубка для слива дезинтеграта; 19 – резервуар для дезинтеграта.

организмов в суспензиях с др. биоматериалами. Описываются также функциональные возможности прибора.

Таблица 3.2 Основные характеристики дезинтегратора ФУГ-1 Производительность В диапазоне 1-100 л/ч и более Эффективность дезинтеграции микроорганизмов 90-100% Режимы дезинтеграции порционный, перфузионный, церкуляционный Температура обрабатываемого материала: при охлаждении камеры проточной водой (+10°С) не выше 15°С при охлаждении камеры хладоагентом (-5°С) 6-8°С хладоагентом 0-4°С Питание от сети переменного тока: 380 В напряжение 50 Гц частота Потребляемая мощность не более 2 кВт Вес (масса) 200 кг Габариты дезинтегратора с приводом 600×650×1200 мм Исполнение прибора блочно-модульное, герметичное, автоматизированное с повышенной безопасностью

Рис. 3.2. Блок-схема баллистического дезинтегратора ФУГ-1

3.2.2.Функциональные возможности дезинтегратора Дезинтеграция микроорганизмов 1. Разрушение оболочек высокопрочных клеток дрожжей, грибов, хлореллы для извлечения интактных клеточных органелл (митохондрии, ядра, мембраны, рибосомы) и биополимеров (белки, ферменты, нуклеиновые кислоты, липиды и др.).

Рис. 3.1. Рабочая камера баллистического дезинтегатора ФУГ-1 (в разрезе): 1 – корпус камеры; 2 – крышка камеры; 3 – входное отверстие камеры; 4 – согласующий раструб; 5 – входной штуцер; 6 – трубка для подачи суспензии; 7 – резервуар для суспензии; 8 – выходная щель; 9 – коллекторная полость; 10 – выходный шнуцер; 11- перемешивающий диск; 12 - отверстие в ступице перемешивающего диска; 13 – приводной вал; 14 – мелющие тела; 15 – канал для

49

50

2. Получение бесклеточных экстрактов в крупнолабораторном масштабе (впервые). 3. Ускоренная экстракция различных веществ из микробных клеток в крупнолабораторном и полупромышленном масштабах. 4. Отделение высококондиционных оболочек (теней) дрожжевых и грибных клеток. 5. Фрагментация фракций субклеточных структур (мембраны, ДНК, жгутики, реснички). 6. Тотальная и селективная дезинтеграция клеток в текучих средах. 7. Получение механических лизатов дрожжей и других микроорганизмов для приготовления питательных сред. 8. Комплексная переработка микробной биомассы. 9. Получение микробного белка пищевого назначения. 10. Производство микробных добавок кормового назначения.

в) экстрагирование компонентов сырья и субстратов; г) скоростное экстрагирование и смешение дезинтегратов выращиваемых клеток для биохимической и химической обработки.

Сверхтонкое измельчение биологических материалов 1. Дезинтеграция и гомогенизация растительных и животных клеток. 2. Ускоренное экстрагирование пищевого и лекарственного сырья. 3. Гомогенизация и смешение пищевых продуктов. 4. Механическая стерилизация текучих пищевых сред. 5. Эмульгирование пищевых сред. Культивирование клеток Работа дезинтегратора в системах типа ферментердезинтегратор: а) сверхтонкое (субмикронное) измельчение кристаллических и иных твердофазных труднорастворимых субстратов; б) эмульгирование и гомогенизация жидкотекучих, высоковязких и комковато-студенистых субстратов;

2. 3. 4. 5.

1. 2. 3. 4. 5.

1.

1. 2. 3. 4.

51

52

Обработка при 0°С÷2°С и термочувствительных материалов Сверхтонкое измельчение при околонулевых температурах. Эмульгирование Гомогенизация Смешение с изоляцией от атмосферы Экстракция Приготовление иммунологических и вакцинных препаратов Выделение бактериальных антигенов (капсульных, жгутиковых и стенкоклеточных). Выделение мембран и фракций «цельной» цитоплазмы. Приготовление «рибосомальных» вакцин. Выделение нуклеиновых кислот. Выделение вирусов. Другие возможные области применения баллистического дезинтегратора микроорганизмов ФУГ –1 Производство косметических товаров. Производство строительных или иных пигментов. Производство растительного и животного сырья в легкой и пищевой промышленности. Обработка жидких сред медицинского назначения в условиях стерильности и (или) асептики.

рирующих факторов и определяет глубокое противоречие между основной целью дезинтеграции и возможностью её инженерной реализации. Сказанное в полной мере можно отнести и к ультразвуковой дезинтеграции. К основным положительным особенностям ультразвукового дезинтегрирующего воздействия на микробные клетки следует отнести удобство и относительную легкость его организации. Энергонапряженность и производительность процесса могут быть выбраны в весьма широких пределах. Причем приборы и установки могут быть рассчитаны на создание ультразвуковых полей практически любых необходимых конфигураций, размеров, в широком диапазоне объемов, с приемлемыми частотами и амплитудами колебаний, с самыми различными составами жидкой и газо - жидкостной рабочей среды и т.п.

5. Переработка отходов легкой и пищевой промышленности для нужд микробиологической и химической промышленности. 6. Приготовление лаков, красок, клеев. 7. Приготовление тончайших абразивных паст, кремов и суспензий. Область практических применений прибора может быть существенно расширена за счет увеличения его производительности в 10-30 раз. Такое увеличение масштаба устройства возможно без принципиальных изменений в его конструкции и в средствах автоматизации. 3.3. Ультразвуковая дезинтеграция микроорганизмов

3.3.1. Введение в ультразвуковую дезинтеграцию В последние годы дезинтеграция микроорганизмов (ДМ) приобрела исключительно большое прикладное значение, в связи с проблемой комплексной переработки микробной биомассы для получения белковых веществ пищевого и кормового назначения и ряда других биологически активных и важных для медицины и различных отраслей народного хозяйства продуктов микробиологического синтеза (16). Современная инструментальная техника дезинтеграции микробных клеток насчитывает сотни способов, среди которых особое место занимает ультразвуковая дезинтеграция. Разрыв между минимальными интенсивностями воздействий, необходимых для дезинтеграции клеток, и воздействий достаточных для необратимого разрушения их внутриклеточных структур, исключительно велик и составляет примерно 3-5 десятичных порядков. Именно такой большой разрыв между устойчивостью самих клеток и их внутренних структур к действию разнообразных дезинтег-

3.3.2. Характеристика процессов в локальном околоклеточном объеме ультразвукового дезинтегратора Ультразвуковое воздействие, приводящее к разрушению микробной оболочки, обусловлено разнообразными физическими и физико-химическими явлениями, имеющими кавитационную природу. Под кавитацией понимается образование и рост газовых пузырьков в жидкости, насыщенной звуковым полем. Затем происходит движение пузырьков с различной скоростью, которое сопровождается физическими эффектами (17). Кавитация – это комплексное явление, включающее в себя ряд взаимосвязанных процессов: высокоградиентные потоки, ударные волны, локальные скачки давления и температуры, возбуждения люминесценции и рождения свободных радикалов. Важнейшим свойством кавитации является то, что перечисленные выше процессы локализуются в очень малых областях порядка нескольких микрометров. Причем вблизи пузырьков происхо53

54

3.3.3. Обзор конструкций ультразвуковых дезинтеграторов Дезинтегратор микроорганизмов – это устройство, аппарат для получения дезинтегратов микробных клеток. Важнейшей характеристикой дезинтегратора микроорганизмов является количество получаемого с его помощью дезинтеграта и содержание в дезинтеграте целевых клеточных компонент с ожидаемым уровнем качества. Конструкция дезинтегратора микроорганизмов призвана организовать сопряжение управляемых параметров – расход, средняя по объему рабочей камеры температура, концентрация клеток и т.п. – с неуправляемыми параметрами явлений и процессов, как кавитация, микропотоки, высокоградиентные микротечения, ударные волны, образование и поглощение свободных радикалов, механохимия и др. Более полное представление о диапазоне масштабов производительности, разнообразии процессов и экспериментов, реализуемых на ультразвуковой аппаратуре, дает таб. 3.3. Там же даются некоторые сведения о вспомогательном техническом оснащении ультразвуковых дезинтеграторов микроорганизмов. Основным узлом ультразвукового дезинтегратора является камера, разновидности которой представлены на рис. 3.3-4.2, причем в таблице 3.3 указан рисунок, на котором описана камера данного дезинтегратора.

дит локальное концентрирование (на 3-4 порядка) акустической энергии, охватывающее области пропорциональные размеру микробной клетки. Акустическая кавитация происходит в два этапа. На первом этапе пузырек увеличивается на величину, меньшую своего радиуса, а на втором пузырек растет на величину, большую своего радиуса. Поведение пузырька определяется интенсивностью и частотой ультразвука, составом и свойствами жидкости, в основном, радиусом пузырька. Газовый пузырек в жидкости представляет собой резонансную систему. В диапазоне частот 105-106 Гц резонансные размеры лежат в области единиц и десятков мкм. Важным является также концентрация пузырьков резонансного размера, которая зависит от наличия в среде кавитационных зародышей, от насыщения жидкости растворенным газом. Поэтому для повышения эффективности процесса дезинтеграции в обрабатываемую среду вносятся различные твердые включения, содержащие в своих порах газовые микропузырьки, имеющие гидрофобные поверхности, способствующие возникновению и затем росту кавитационных зародышей. Резонансный пузырек резко увеличивает амплитуду своих колебаний, вызывая вокруг себя интенсивные микромасштабные движения жидкости, так называемые микропотоки, которые охватывают область протяженностью всего лишь в несколько мкм вблизи колеблющегося пузырька. Градиент скорости микропотока определяет основные наблюдаемые механические эффекты при кавитации. Сдвиговые напряжения, возникающие в микропотоках жидкости и ответственные за разрушение клеточной стенки пропорциональны произведению градиента скорости на вязкость среды. Таким образом, за счет явления кавитации происходит разрушение клетки. 55

56

1 ры с УЗ иглами Аналитикопрепаративные дезинтеграторы Лабораторные дезинтеграторы микроорганизмов Рис. 3.4. Микроманипулятор с УЗ иглой. Схема установки для визуального наблюдения и микрокиносъемки акустических течений в суспензиях микроорганизмов: 1 – объектив микроскопа; 2 – плоский капилляр; 3 – предметный столик; 4 – пьезокерамический диск; 5 – игла; 6 – позиционер.

Таким образом, аппаратная концентрация УЗ дезинтегратора микроорганизмов позволяет компактно отразить и формализовать накопленный исторический опыт конструирования аппаратуры, сформулировать тенденцию её развития, быстро отыскивать оптимальные варианты конструкций камер и рабочих наконечников. Таблица 3.3 Ультразвуковые дезинтеграторы микроорганизмов Страна, ДезинтеНазначение и краткое описание фирма, граторы марка

Схема

Крупнолабораторные дезинтеграторы микроорганизмов

1 2 3 4 А. Дезинтеграторы с электронным побудителем УЗ колебаний излучателей в жидкости Микрома- Приборы для дезинтеграции оди- СССР нипулято- ночных микробных и других клеток экспери-

57

58

2 в микроорбъемах, для прочих микроманипуляционных работ с клетками и колониями в экспериментальной микробиологии Дезинтегратор с щуповидным наконечником для дезинтеграции клеток микроорганизмов в пробирках. Плотность потока мощности до 1200 Вт/см2 Приборы универсального назначения для микробиологических лабораторий с мощностью излучения УЗ колебаний до 150 Вт. Имеют сменные рабочие наконечники самых разнообразных форм и размеров применительно к различным условиям проводимых процессов. Объемы сменных камер 1-100 см3. Снабжены индикаторами, регуляторами и стабилизаторами уровня излучаемой мощности или специальными следящими системами; рабочие камеры имеют специальную теплоотводящую арматуру, приспособление для барботирования газов через суспензии, пробоотборники и т.п. Приборы снабжаются вспомогательным оборудованием, повышающим культуру и безопасность труда: звукозащитными кабинами, приспособлениями, предотвращающими утечку аэрозолей при работе приборов. Установка с повышенной доя 400800 Вт мощностью излучателей для обработки микробных суспензий и биомасс с увеличенной производительностью. Объемы проточных камер до 300-500 см3, камеры снабжены теплоотводящими рубашками,

3 ментальные приборы США США Contes Glass

4

1

Полупромышленный дезинтегратор микроорганизмов Промышленный дезинтегратор микроорганизмов

2 питаемыми от внешних термостатов. Комплектуются таймерами и перистальтическими насосами Универсальная крупнолабораторна установка с автоматикой, отслеживающей температуру и вязкость обрабатываемой микробной суспензии. Упрощенная полупромышленная модель мощностью излучения 1200 Вт и 2400 Вт Камера проточная

3

4

1 и промышленная аппаратура

2 3 4 ных и химических процессов Гидродинамический акустический сместитель Роторно-пульсационный аппарат РОПАН-2 Машина Silverson В. измерительные УЗ дезинтеграторы и подобные им приборы Лаборатор- Прибор –приставка для УЗ дезинтеный изме- грации в малых объемах рительный прибор Лаборатор- Прибор для имитационного измереный изме- ния нагрузочной характеристики рительный мощного УЗ излучателя прибор Установка для изучения кинетики выделения белка из дрожжей при облучении их ультразвуком

Автоматизированная дезинтеграционная установка с отдаваемой мощностью кольцевого излучателя до 1 кВт. Предназначена для производства ветеринарных вакцин на биофабриках. Регуляция протока и температуры биомассы автоматическая Б. Дезинтеграторы с механическими или гидромеханическими побудителями УЗ колебаний в жидкости Аналитико- Зубчато-коллоидная мельница для препарадезинтеграции обезвоженной миктивные и робной биомассы в среде легкокилаборатор- пящего органического растворителя ные дезинтеграторы микроорганизмов Крупнола- Машины Виллемса бораторные Диспергатор для дезинтеграции микприборы роорганизмов в суспензиях. Имеет дополнительно к набору непроточных камер проточную с охлаждаемой рубашкой Гомогенизатор для животных тканей ПолупроАппарат с роторным излучателем УЗ мышленная для интенсификации массообмен-

59

60

Рис. 3.7. Камеры УЗ дезинтегратора фирмы MSE (Англия): а – непроточная камера; б –порционно-проточная камера; в – проточная камера

Рис. 3.4. Схема УЗ микроманипулятора для работ с микроколониями .

Рис. 3.5. Щуповидный наконечник для обработки микроорганизмов в пробирках (фирма Contes Class, США)

Рис. 3.6. Ультразвуковой диспергатор УЗДН-1

Рис. 3.8. Схема камеры УЗ дезинтеграторов Labsonic 1510 и B.Braun Melsungen с теплоотводящими петлями.

61

62

Рис. 4.1. Диспергатор IKA.

3.3.4. Ультразвуковой дезинтегратор UDM-10. Представляется интересным осветить советскопольскую разработку универсального ультразвукового дезинтегратора микроорганизмов UDM-10, в в конструкции которого использованы ряд новых решений (рис. 4,4, 4,5).

Рис. 3,9. Камера промышленного ультразвукового дезинтегратора микроорганизмов с кольцевым вибратором (СССР): 1 – магнитостриктор (вибратор); 2, 8 – верхний и нижний фланцы со смотровыми стеклами; 3, 10 – электроклапаны; 4, 9 – ячейки для измерения уровня; 5 – рубашка охлаждения; 6 – корпус с изоляцией; 7 – датчик температуры.

Рис. 4.2. рабочий орган лабораторного дезинтегратора Polytron с механической генерацией ультразвука фирмы Willems (ФРГ) (вид снизу).

В табл. 3,4. представлены технические характеристики данного дезинтегратора, которые показывают, что он пригоден для реализации самых разнообразных режимов дезинтеграции микробиологических и других объектов, вклю-

Рис. 4. Зубчато-коллоидная мельница ИНЭОС АН СССР.

63

64

вых. Тем не менее они могут находить применение при стерилизации жидкостей, тотальной дезинтеграции.

чая специальные режимы, при которых реализуются новые биофизические явления. В 1983-84 гг. испытаны были опытные образцы универсального ультразвукового дезинтегратора UDM-10, концентрация которого разработана в русле основных требований, действующих в области разработок дезинтеграторов микроорганизмов. 4. Электрогидроударные дезинтеграторы

Исключительно высокая биомеханическая прочность оболочек микробных клеток заставляет при создании механической дезинтеграционной аппаратуры изыскивать источники все более интенсивных дезинтегрирующих воздействий, к которым можно отнести ударные волны и комплекс факторов, сопровождающих их распространение в жидкостях (скачки отрицательных давлений, кавитация, свечение, тепловая и химическая релаксация упругой энергии). Данные табл. 3,5 показывают, что для дезинтеграции микроорганизмов используют самые различные типы генераторов ударных волн, позволяющих генерировать мощные импульсы давлений и кумулятивные струи со значительной концентрацией энергии. Причем процесс в разработке электрогидроударных дезинтеграторов всецело зависит от успехов материаловедения и электротехники. Принципиальная электричсекая схема и варианты конструкции камеры представлена на рис. 4,3. Электрический разряд происходит при подаче импульса высокого напряжения порядка 60-100 кВт на электроды погруженные в микробную суспензию с дистанцией 8-10 мм друг от друга. Технико-экономические показатели у гидроударных дезинтеграторв ниже, чем у баллистических и ультразвуко-

Рис. 4.3. Общий вид дезинтегратора UDM-10 (без вспомогательного оборудования).

Рис. 4.4. Рабочие наконечники и камеры дезинтегратора UDM -10

65

66

1 2 3 Наложение внешнего гидростатического давления Барботирование дезинтегрируемой + + суспензии Рабочий наконечник (совместиК1, К2 К1 мость с камерами) Патроны с волокнистым наполнителем: для разрушения клеток, в том числе высокопрочных + для разрушения клеток и дефлоккуляции дезинтеграта + для фрагментации субклеточных органелл + 10. Дистанционное управление генератором логическими сигналами: включение выключение

Таблица 3.4. Технические данные ультразвукового дезинтегратора микроорганизмов UDM-10 1. Максимальная электрическая мощность на выходе генератора, Вт 2. Автоматическая регулировка выходной мощности 3. Рабочая частота, кГц 4. Стабилизация амплитуды колебаний рабочих наконечников в жидкой среде с точностью 5. Плавная регуляция уровней стабилизации амплитуды колебаний рабочих наконечников (устанавливается оператором), мкм: наконечник №1 наконечник №2 наконечник №3 наконечник №4

1500±10%

21±5% ±10%

5÷50 5÷50 5÷50 5÷50

6. Автоматическая настройка генератора на механический резонанс рабочего наконечника в сборе с камерой 7. измерение амплитуды колебаний излучающей поверхности рабочих наконечников К1, К2, К3, К4: диапазон измерений, мкм погрешность измерений, % 8. Измерение выходной электрической мощности: диапазон измерений, Вт погрешность измерений, % 9. Характеристика рабочих камер Технические данные

№1 - 500

5 -

+

-

К1

К2

+

+

11. Специальный рабочий наконечник для дезинтеграционной обработки в лабораторных пробирках со специальным ограничителем выходной мощности генератора 12. Электронная блокировка со световой сигнализацией блока питания (по макс. Току) звукоизолирующего кабинета (при отрывании дверцы) электромеханического преобразователя (по допустимой температуре) 13. Характеристика рабочих наконечников: К1 – для работы с камерами №1-500, №2 –100, №3 –50 К2 – для работы с камерой №4 –10-5-3 К3 – для работы со стандартными лабораторными пробирками 14. Напряжение питания, В, Гц

0÷100 ±5 0÷2000 ±5

Тип камеры №2 - 100 №3 - 50

4 +

15. Потребляемая мощность от сети, ВА 16. Работа сразу после включения 17. Время непрерывной работы (цикл – 60 мин работа, 30 мин перерыв в нагрузке) 18. Класс защиты (стандарт ПНР) 19. Уровень радиоэлектрических помех (стандарт ПНР)

№4 – 10 –53

1 Рабочий объем, мл Режим проточный непроточный Термостатирование Измерение температуры суспензии при обработке Герметизуемость камеры Регулирование рабочего объема

2 500

3 100

4 50

5 10-5-3

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ -

+ -

+ -

Возможность отбора проб в процессе обработки

+

+

+

+ ступенчатое +

20. Уровень шума (акустического), дБ 21. Размеры дезинтегратора (без блока управления температурой и протоком), мм 700× 22. Масса дезинтегратора (без блока управления температурой и протоком), кг

67

68

+ +2,4 В +0,4 В

220±10% , 50±2% 2000 8ч первый «уровень N»