Методическое пособие по курсу биохимии растений для студентов биолого-почвенного факультета, обучающихся по специальности ''Почвоведение и агрохимия''

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РФ ГОУ ВПО «РОСТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

А.О. Кучеренко, В.С. Шугалей

МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ по курсу биохимии растений для студентов биолого-почвенного факультета, обучающихся по специальности «Почвоведение и агрохимия»

Ростов-на-Дону 2004

2

Печатается по решению кафедры биохимии и микробиологии биологопочвенного факультета Ростовского государственного университета Протокол № 7 от 6

Авторы:

февраля 2004 года.

А.О. Кучеренко – кандидат биологических наук, ассистент кафедры биохимии и микробиологии РГУ; В.С. Шугалей – доктор биологических наук, профессор кафедры биохимии и микробиологии РГУ.

3

СОДЕРЖАНИЕ Расширенная программа по общему курсу биохимии растений

4

План лекций по курсу биохимии растений

7

План практических и семинарских занятий

7

Контрольные задания по биохимии растений

8

Вопросы для подготовки семинарских занятий

9

Техника безопасности при работе в биохимической лаборатории

11

Занятие № 1. Качественные реакции на белки и аминокислоты

13

Занятие № 2. Изучение действия ферментов и их свойств

16

Занятие № 3. Количественное определение аскорбиновой кислоты по методу Тильманса

18

Занятие № 4. Количественное определение содержания глюкозы

20

Занятие № 5. Выделение рибонуклеопротеидов и качественные реакции на их компоненты

23

Рекомендуемая литература

25

4

Настоящее методическое пособие предназначено для студентовпочвоведов, изучающих курс биохимии растений. Оно включает расширенную программу курса, планы лекций и семинарских занятий, технику безопасности и подробное изложение практических занятий. Практические занятия, предлагаемые студентам, по возможности охватывают разные области биохимии. При их выполнении студенты знакомятся со структурой и свойствами белков, ферментов, витаминов и нуклеиновых кислот. Часть курса биохимии растений рассматривается на семинарских занятиях. РАСШИРЕННАЯ ПРОГРАММА ПО ОБЩЕМУ КУРСУ БИОХИМИИ РАСТЕНИЙ 1. Предмет и задачи биохимии. Роль растений в круговороте органического вещества в природе. Значение растений и микроорганизмов в формировании почв. Основные биоорганические вещества, входящие в состав живых организмов. Химический состав и функции структурных компонентов цитоплазмы. Субклеточные органеллы клетки (ядро, вакуоли, пластиды, хлоропласты, митохондрии, пероксисомы, микросомы, рибосомы, эндоплазматический ретикулум) и их функции. 2. Белки – основа жизни. Основные функции белков. Состав белков. Аминокислоты, их строение и классификация. Кислотно-основные свойства аминокислот. Качественные реакции на отдельные аминокислоты. Аминокислоты – амфотерные электролиты. Стереоспецифичность аминокислот. Способ связи аминокислот в молекуле белка. Пептидная связь. Качественные реакции на белки. Пространственная структура белковых молекул. Типы химических связей, участвующих в образовании белковой молекулы.

5

Классификация белков. Полноценные и неполноценные белки в питании человека и животных. 3. Ферменты – белковые катализаторы. Природа ферментов. Свойства ферментов. Зависимость ферментативной реакции от условий среды (оптимум рН, температурный оптимум, активаторы и ингибиторы). Строение ферментов. Одно- и двухкомпонентные ферменты. Коферменты, их связь с витаминами. Строение активного центра простых и сложных ферментов. Механизм действия ферментов. Специфичность ферментов. Регуляция ферментативной активности. Классификация ферментов. 4. Углеводы и липиды в растительных организмах. Строение и основные свойства углеводов. Моно-, ди- и полисахариды. Продукты превращения углеводов – спирты и кислоты. Значение углеводов. Классификация липидов. Строение нейтральных жиров. Жирные кислоты, фосфолипиды, терпены, стероиды, воска. Значение липидов. 5. Источники энергии в живых организмах. Химическая энергия, возможности ее использования в живом организме. Макроэргические соединения. Биологическое окисление – основной путь превращения энергии и вещества в живых организмах. Окисление углеводов. Анаэробные пути окисления глюкозы. Эволюция живых организмов от анаэробиоза к аэробиозу. Дыхание, его основные биохимические этапы. Путь углерода, путь водорода, образование АТФ. Окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты. Образование ацетил-коэнзима А. Цикл трикарбоновых кислот. Роль цикла, ключевые реакции цикла, связанные с образованием СО2 и НАДН2. Связь цикла трикарбоновых кислот с обменом углеводов, липидов, аминокислот. Дыхательная цепь переноса электронов в митохондриях. Образование Н2О и трансформация энергии с образованием макроэргических соединений в виде АТФ. Механизм окислительного фосфорилирования. Взаимосвязь дыхания и брожения. Энергетическая эффективность брожения и дыхания.

6

6. Фотосинтез. Способы получения энергии у автотрофов и гетеротрофов. Биологическая роль фотосинтеза. Природа процессов фотосинтеза. Источники энергии для фотосинтеза. Использование энергии света. Природа первичных этапов фотосинтеза. Поглощение квантов света хлорофиллом. Фотосинтетическое фосфорилирование. Электронтранспортная цепь фотосинтеза. Механизм фотодиссоциации воды. Происхождение кислорода, выделяющегося при фотосинтезе. Образование НАДФН2. Химизм процесса фотоассимиляции СО2. Первичные акцепторы СО2 и продукты фотосинтеза. Образование стабильных продуктов фотосинтеза. Пути повышения интенсивности фотосинтеза. Дыхание и фотосинтез. Роль фотосинтеза и дыхания в обмене веществ в зеленых растениях. 7. Использование энергии в живых организмах. Синтез углеводов. Источники глюкозы в растительном организме. Центральная роль глюкозо-6фосфата в синтезе и превращениях глюкозы. Пути синтеза глюкозы у растений, использование АТФ и УТФ. Синтез сахарозы. Синтез полисахаридов. Синтез липидов. Роль ацетил-коэнзимаА. Путь синтеза жирных кислот и глицерина. Взаимопревращение углеводов и липидов у растений. Пути образования запасных форм углеводов и липидов. 8. Синтез азотсодержащих соединений. Формы азота, усвояемые растением. Образование аммиака в почве. Пути дезамидирования азотсодержащих соединений в почве. Азотфиксирующие организмы. Механизм фиксации атмосферного азота. Пути усвоения азота у высших растений (восстановление нитратов, использование запасных форм азота амидов и аминокислот). Пути синтеза основных аминокислот. Роль реакций переаминирования. Взаимосвязь процессов обмена азота с дыханием и фотосинтезом. Биологически активные вещества – производные аминокислот. 9. Биосинтез белка – основной синтетический процесс в живых организмах. Условия, необходимые для биосинтеза белка: информация, материал

7

для синтеза, энергия, наличие рибосом. Нуклеиновые кислоты – носители генетической информации. ДНК и РНК, их строение, локализация в клетке. Биологический код. Основные этапы биосинтеза белка. Образование в ядре матричной РНК. Активация аминокислот – необходимый этап биосинтеза. Роль транспортных РНК. Образование полипептидной цепи в рибосомах. Регуляция биосинтеза белка, роль растительных гормонов в регуляции. Взаимосвязь белков, липидов и углеводов в обмене веществ в зеленом растении. ПЛАН ЛЕКЦИЙ ПО КУРСУ БИОХИМИИ РАСТЕНИЙ 1. Белки – основа жизни. 2. Ферменты – белковые катализаторы. 3. Источники энергии в живых организмах. 4. Фотосинтез. 5. Использование энергии в живых организмах. Биосинтез углеводов и липидов. 6. Формы азота, необходимые растениям. Синтез аминокислот у растений. 7. Нуклеиновые кислоты – носители генетической информации. 8. Синтез белка – основной синтетический процесс в живых организмах. ПЛАН ПРАКТИЧЕСКИХ И СЕМИНАРСКИХ ЗАНЯТИЙ 1. Качественные реакции на белки и аминокислоты. 2. Изучение действия ферментов и их свойств. 3. Количественное определение аскорбиновой кислоты по методу Тильманса 4. Семинар 1. Аминокислоты, белки и ферменты. 5. Количественное определение содержания глюкозы. 6. Семинар 2. Источники энергии в живых организмах.

8

7. Выделение рибонуклеопротеидов и качественные реакции на их компоненты. 8. Семинар 3. Фотосинтез и пути биосинтеза белков. КОНТРОЛЬНЫЕ ЗАДАНИЯ ПО БИОХИМИИ РАСТЕНИЙ 1. Заполнить таблицу: Уровень структурной

Тип связи и взаимо-

Механизм возникно-

организации белка

действий

вения связи

2. Заполнить таблицу: Название

Название кофер-

Тип катализируе-

Примеры

витамина

ментной формы

мой реакции

ферментов

3. Заполнить таблицу: Название класса ли-

Структурные компо-

пидов

ненты

Функции в клетке

Простые липиды Сложные липиды 4. Принцип комплементарности в организации живых систем. 5. Сравните, сколько молекул АТФ получит клетка при аэробном и анаэробном окислении глюкозы. 6. Образование ацетил-коэнзима А и пути его метаболизма в клетке. 7. Принципы синтеза аминокислот в растениях. 8. Биосинтез белка.

9

ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ СЕМИНАРСКИХ ЗАНЯТИЙ Семинар 1. Аминокислоты, белки и ферменты 1. Строение и кислотно-основные свойства аминокислот. Классификация аминокислот. 2. Способ связи аминокислот в молекуле белка. Свойства пептидной связи. Пептиды – биологически активные соединения. 3. Уровни структурной организации белковой молекулы. Типы связей и взаимодействий, участвующие в образовании конформации белка. 4. Сходства и различия между химическими и биологическими катализаторами. 5. Свойства ферментов: зависимость их активности от рН, термолабильность, специфичность. 6. Структура ферментов. Одно- и двухкомпонентные ферменты. Понятие о холоферменте, апоферменте и коферменте. Строение активного центра. 7. Характеристика витаминов, выполняющих функции коферментов. 8. Кинетика ферментативного катализа. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата. Константа Михаэлиса. 9. Механизм действия ферментов. Снижение энергии активации. Образование фермент-субстратного комплекса. Теории Фишера и Кошланда. 10. Регуляция активности ферментов. Активаторы и ингибиторы. Аллостерические ферменты. Изоферменты. Мультиферментные комплексы. Семинар 2. Источники энергии в живых организмах 1. Окисление органических веществ - основной путь преобразования химической энергии в живом организме. Энергия химических связей – основной источник энергии в живых системах. Макроэргические соединения. 2. Анаэробный путь окисления глюкозы. Гликолиз и брожение. Активация глюкозы. Подготовительный этап гликолиза.

10

3. Ключевые реакции анаэробного пути окисления глюкозы. Конечные продукты гликолиза и брожения. Субстратное фосфорилирование. 4. Эволюция живых организмов от анаэробиоза к аэробиозу. Дыхание растений и его этапы. 5. Окислительное декарбоксилирование ПВК. 6. ЦТК. Ключевые реакции, связанные с образованием НАДН2 и ФАДН2. 7. Источники ацетил-коэнзима А. Связь цикла Кребса (ЦТК) с обменом углеводов, липидов и аминокислот. 8. Цепь переноса электронов. Ее компоненты. Окислительно-восстановительный потенциал. Образование воды при биологическом окислении. 9. Сопряжение окисления с фосфорилированием. Механизм образования АТФ. Хемиосмотическая теория Митчела. АТФ-синтетаза. 10. Энергетический баланс анаэробного и аэробного путей окисления. Семинар 3. Фотосинтез и пути биосинтеза белков 1. Способы добывания энергии у автотрофов и гетеротрофов. Биологическая роль фотосинтеза. 2. Основные процессы, протекающие при фотосинтезе. Стадии фотосинтеза. 3. Фотосистема I и фотосистема II. Поглощение квантов света. Трансформация световой энергии в химическую. Фотосинтетическое образование АТФ. Фотолиз воды. Восстановление коферментов НАДФН2. 4. Темновая стадия фотосинтеза. Путь углерода при фотосинтезе: источники углерода, образование первичных органических веществ. Фотосинтез с образованием 3-х и 4-х углеродных соединений. 5. Нуклеиновые кислоты. Уровни структурной организации ядерной и цитоплазматической ДНК. Упаковка ядерной ДНК на уровне хроматина. 6. Структура и биологическая роль транспортной РНК.

11

7. Считывание информации с ДНК. Образование матричной РНК. Этапы транскрипции информации (преинициация, инициация, элонгация и терминация). 8. Генетический код, его свойства. 9. Структура рибосом. 10. Активирование и транспорт аминокислот к рибосомам. 11. Трансляция информации в рибосомах. Этапы процесса биосинтеза белка: инициация, элонгация, терминация. ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ В БИОХИМИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ Общие сведения. Запрещается вход в лабораторию в верхних вещах. Работа в биохимической лаборатории допускается только в специальном халате, так как вероятна возможность загрязнения, порчи одежды при попадании на нее едких реактивов. Обращение со стеклом. Химическая посуда - в большинстве случаев тонкостенная и хрупкая - поэтому при небрежном обращении с ней ее можно разбить и порезаться. Посуду следует держать в руках осторожно, не сжимая сильно пальцами. Химическую посуду нельзя резко ставить на стол. В случае пореза стеклом нужно вначале осмотреть ранку и извлечь из нее осколки стекла, если они есть, а затем обмыть пораненное место, смазать йодом и заклеить лейкопластырем или завязать бинтом. Обращение с реактивами. Все концентрированные кислоты и щелочи должны находиться в вытяжном шкафу. Наливать или насыпать реактивы следует только над столом. Не следует оставлять открытыми банки с реактивами. Пролитые или рассыпанные реактивы нужно немедленно удалить со стола, вытерев стол тряпкой и обмыв водой. Пролитые концентрированные кислоты следует засыпать песком, а затем собрать песок дощечкой. Облитое

12

место необходимо обмыть раствором соды и вытереть тряпкой. При работе с органическими растворителями (спирты, эфиры, ацетон, бензин, дихлорэтан и др.) нельзя определять вещества по запаху, так как может произойти отравление их парами. Наполнение пипеток растворами веществ проводят только при помощи груши, так как при набирании этих веществ ртом они могут попасть в ротовую полость и вызвать ожоги или даже отравление. В случае попадания на кожу концентрированных кислот облитое место нужно вначале обмыть большим количеством воды, а затем разбавленным раствором соды. При попадании растворов щелочей на кожу пораженное место нужно вначале обмыть разбавленным раствором кислоты, а затем водой. Обращение с нагревательными приборами. На практических занятиях по биохимии часто приходится пользоваться спиртовками. Зажигать спиртовку нужно только спичкой. Нельзя нагревать вещества в толстостенной посуде. В пробирке можно нагревать только небольшие количества вещества, жидкость должна занимать не более 1/3 объема пробирки. Отверстие пробирки при нагревании в ней жидкости следует направлять в сторону от себя и рядом находящихся людей. Нельзя наклоняться над спиртовкой. Вначале пробирку с веществом следует слегка прогреть всю, а затем нагревать в нужном месте, не вынимая из пламени спиртовки. Нельзя нагревать пробирку долго в одной точке, так как теплопроводность стекла низкая, жидкость быстро закипит и выплеснется из пробирки. Нагревать пробирку нужно ниже уровня жидкости в ней. После нагревания следует сразу погасить спиртовку, накрыв пламя фарфоровым колпачком. Работа с водяной баней осуществляется только под тягой. Перегоревшие электроплитки нужно сразу же выключить, вынув вилку из штепсельной розетки. При неосторожной работе могут быть ожоги нагретой стеклянной посудой. При ожогах на обожженное место нужно положить ватку, смоченную раствором марганцевокислого калия.

13

Занятие № 1. КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ И АМИНОКИСЛОТЫ Техника безопасности. На занятии предусматривается работа с концентрированной азотной кислотой и работа со спиртовками. Задачи занятия: 1. Доказать наличие пептидной связи в растворах белков. 2. Провести качественные реакции на аминокислоты. 3. Определить наличие некоторых аминокислот в составе белков. 1. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА БЕЛКИ Принцип метода. Биуретовая реакция - качественная реакция на пептидную связь. Реакция основана на образовании внутрикомплексного соединения ионов меди с двумя пептидными связями, выступающими в роли полидентатных лигандов. В щелочной среде раствор белка при добавлении разбавленного раствора сульфата меди окрашивается в розово-фиолетовый цвет: H2N−CH−CO−NH−CH−CO−NH−CH−CO−NH−CH−C=O + 2NaOH + Cu(OН)2 ⎜ ⎜ ⎜ ⎜ \ R2 R3 R4 OH R1

⎯→

R2 O ⎮ ⎢⎢ ...−NH−CH−C=N−CH−C−N−CH−C−... ⎢ ⎢ ⎢ ⎢⎢ R1 O R3 O Cu R4 O R6 O ⎢ ⎢⎢ ⎢ ⎢⎢ ... −NH−CH−C−N−CH−C=N−CH−C−... ⎢ ⎢ R5 O

2− ⎯

∗ 2Na+

Реакция называется биуретовой, так как она характерна и для биурета, состоящего из 2 молекул мочевины (NH2-CO-NH-CO-NH2). Ход работы. В 2 пробирки наливают по I мл растворов: альбумина

14

(белка пшеницы) и зеина (белка кукурузы), добавляют 1 мл 10 % р-ра NаОН и 2 капли 1 % р-ра СиS04. После перемешивания при наличии пептидной связи в исследуемых растворах появляется фиолетовое окрашивание. 2. КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА АМИНОКИСЛОТЫ 2.1. КСАНТОПРОТЕИНОВАЯ РЕАКЦИЯ НА АРОМАТИЧЕСКИЕ АМИНОКИСЛОТЫ Принцип реакции. При нагревании с концентрированной азотной кислотой растворы белка дают желтое окрашивание при наличии в белках циклических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана) вследствие образования нитропроизводных этих аминокислот: OH

OH O 2N

NO2

+ 2HNO3 ⎯→ CH2 ⎢ NН2-СН-СООН

+ 2Н2О CH2 ⎢ NН2-СН-COOH

тирозин динитротирозин Ход работы. В 3 пробирки наливают по I мл растворов: в 1-ю - тирозина, во 2-ю - альбумина, в 3-ю – зеина. Затем во все пробирки добавляют по 35 капель концентрированной азотной кислоты. При этом во 2 и 3 пробирках появляется осадок свернувшегося белка. Содержимое всех пробирок нагревают до появления ярко-желтого окрашивания, осадок при этом постепенно растворяется (происходит гидролиз белка). 2.2. РЕАКЦИЯ ФОЛЯ НА ЦИСТЕИН Принцип реакции. Растворы цистеина и белков, имеющих в своем составе цистеин, дают с нитропруссидом натрия пурпурное окрашивание. Ход работы. В 3 пробирки наливают по I мл растворов: в 1-ю цистеина, в остальные 2 пробирки - альбумина и зеина, добавляют 1 мл насыщенного р-

15

ра (NH4)2SO4 и 2-3 капли 5 % р-ра нитропруссида натрия. Затем раствор подщелачивают несколькими каплями 30 % раствора NаОН. Раствор приобретает пурпурный цвет. 2.3. РЕАКЦИЯ САКАГУЧИ НА АРГИНИН Принцип реакции. Реакция обусловлена присутствием в молекуле аминокислоты аргинина гуанидиновой группировки. В щелочном р-ре в присутствии гипохлорита натрия гуанидиновая группа аргинина окисляется. Окисленный продукт, соединяясь с α-нафтолом, образует продукт конденсации розово-красного цвета:

ОН

2H2N− C−NH−(CH2)3− CH− COOH + 3NaClO + 2 ⎢⎢ ⎢ NH NH2 аргинин α-нафтол

2 O=

⎯→

=N−C−NH−(CH2)3−CH−COOH + 3NaCl + 3H2O ⎢⎢ ⎢ NH NH2

нафтохинонимин

Ход работы. В одну пробирку наливают I мл раствора аргинина, в остальные 2 пробирки - по I мл растворов альбумина и зеина, добавляют 1-2 капли 10 % р-ра NaOH, затем 1-2 капли спиртового раствора α-нафтола. Перемешивают, приливают 1-2 капли гипохлорита натрия и вновь перемешивают. Развивается розово-красное окрашивание. Оформление работы. Результаты занятия оформляют в виде таблицы: Название р-ции Принцип (уравнение) Условия р-ции (реак- Наблюдаемые р-ции эффекты тивы, t°, время) 1. 2. 3. 4.

16

Занятие № 2. ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ И ИХ СВОЙСТВ Техника безопасности. На занятии предусматривается пользование спиртовками. Быть внимательными при нагревании пробирок с реактивами. Задачи занятия: 1. Изучить действие ферментов на примере пероксидазы. 2. Показать влияние тепловой денатурации на активность фермента. 3. Доказать, что ферменты обладают субстратной специфичностью. 1. ДЕЙСТВИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ Пероксидаза растений выполняет две функции: пероксидазную, то есть окисление веществ с участием перекиси водорода и оксидазную, то есть катализирует окисление субстратов за счет молекулярного кислорода без участия перекиси водорода. Этот фермент проявляет пероксидазную активность в отношении практически всех фенолов(пирокатехин, пирогаллол, гваякол и др.), ароматических аминов, аскорбиновой кислоты, нитритов и т.д. Определение активности пероксидазы используют для оценки метаболизма ростовых веществ, лигнина и других вторичных продуктов обмена в растениях. Принцип метода. Пероксидаза катализирует реакцию окисления ароматического амина – бензидина с участием перекиси водорода. При этом образуется бензидиновая синь, окрашенная в синий цвет. Ход работы. Навеску 100 мг растительного материала растирают в ступке, прибавляя порциями 20 мл дистиллированной воды. Содержимое настаивают 10 минут, затем сливают в пробирки и центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин. К 1 мл водной вытяжки пероксидазы добавляют 1 мл 0,1 М ацетатного буфера (рН 5,4) и 1 мл 0,1 % раствора бензидина. Вносят в пробирку 1 мл 0,03

17

% раствора Н2О2 и наблюдают появление синей окраски.

2. ТЕРМОЛАБИЛЬНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ Свойства большинства ферментов ингибироваться при кипячении является характерной особенностью, отличающей биологические катализаторы от химических, и называется термолабильностью. Принцип метода. Фермент сахараза катализирует реакцию гидролитического расщепления дисахарида сахарозы с образованием глюкозы и фруктозы. Наличие конечного продукта реакции глюкозы определяют с помощью реакции Троммера, основанной на восстанавливающей способности глюкозы. Благодаря наличию свободной альдегидной группы глюкоза окисляется до альдоновой кислоты (или соли), восстанавливая сульфат меди до CuOH (желтый осадок) или Cu2O (красный осадок). C5H11O5COH + 2CuSO4 + 5NaOH ⎯→ C5H11O5COONa + 2CuOH↓ + 2Na2SO4 + 2H2O;

2CuOH ⎯→ Cu2О + Н2О

Ход работы. В 2 пробирки наливают по 1 мл раствора сахаразы (вытяжки из дрожжей). В 1-й пробирке раствор доводят до кипения, во 2-й - оставляют без кипячения. Затем в обе пробирки добавляют по 2 мл сахарозы, перемешивают. Через 10 минут с содержимым каждой пробирки проводят качественную реакцию на глюкозу - пробу Троммера. К содержимому пробирки прибавляют 4-5 капель 10 % р-ра NaOH, 5-7 капель 7 % р-ра CuSO4 и нагревают до кипения. В присутствии глюкозы выпадает желтый осадок, который затем переходит в красный. Полученные результаты объясняют.

3. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ Каждый фермент действует только на определенный субстрат (абсолютная специфичность) или на группу сходных по строению субстратов (групповая специфичность). При абсолютной специфичности незначительные

18

изменения в структуре субстрата приводят к тому, что фермент не оказывает действия на этот субстрат. Принцип метода: Субстратом для уреазы является мочевина, а тиомочевина, отличающаяся наличием атома серы, уреазой не расщепляется. Уреаза расщепляет мочевину с образованием аммиака и СО2: NH2-CO-NH2 ⎯→ NH3 + CO2 NH2-CS-NH2 (тиомочевина) Ход работы. В 2 пробирки наливают по 2 мл р-ра уреазы и по 4 капли 1 % спиртового р-ра фенолфталеина. Затем в 1-ю добавляют 1 мл 5 % р-ра мочевины, во 2-ю 1 мл 5 % р-ра тиомочевины. Все пробирки оставляют на 15 мин при комнатной температуре. Содержимое пробирок с мочевиной окрашивается в розовый цвет. Полученные результаты объясняют. Оформление работы. Результаты занятия оформляют в виде таблицы: Название Принцип р-ции (уравнение) рции 1. 2. 3.

Условия р-ции (реактивы, t°, время)

Наблюдаемые эффекты

Объяснение

Занятие № 3. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ ПО МЕТОДУ ТИЛЬМАНСА Задачи занятия: 1. Научиться определять количество витамина С в пищевых продуктах методом титрования. 2. Сравнить полученные данные с теоретическими. Принцип метода. Метод основан на способности аскорбиновой кисло-

19

ты окисляться 2,6-дихлорфенолиндофенолом до дегидроаскорбиновой кислоты. В щелочной среде 2,6-дихлорфенолиндофенол имеет синюю окраску, в кислой - красную, а при восстановлении обесцвечивается. Ход работы: Взвешивают 1 г пищевых продуктов на технических весах. Навеску тщательно растирают в фарфоровой ступке с песком. К растертой массе прибавляют 9 мл 2 % раствора соляной кислоты. Через 10 минут содержимое перемешивают и фильтруют. Для количественного определения 3 мл фильтрата отмеряют в коническую колбу и титруют 0,0005 М раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола, помещенным предварительно в бюретку, до появления розовой окраски, сохраняющейся в течение 30 с. Отмеряют количество 2,6-дихлорфенолиндофенола, израсходованного на титрование. Расчет. Рассчитывают концентрацию аскорбиновой кислоты (в мг на 100

г

продукта),

учитывая,

что

1

мл

0,0005

М

раствора

2,6-

дихлорфенолиндофенола соответствует 0,088 мг аскорбиновой кислоты. Сравнивают полученные данные с теоретическими по таблице:

Содержание витамина С (в мг/100 г продукта)

Наименование продукта

Количество аскорбиновой кислоты

Капуста белокачанная

30-40

Лук репчатый

2-10

Картофель лежалый

7-10

Яблоки: кислые сладкие

20-40 5-17

20

Занятие № 4. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ГЛЮКОЗЫ Техника безопасности. На занятии предусматривается работа с водяной баней. Задачи занятия: 1. Изучить феррицианидный микрометод определения глюкозы по Хагедорну-Йенсену. 2. Определить содержание глюкозы в растительном объекте. Принцип метода. Глюкоза окисляется красной кровяной солью в щелочной среде до глюконовой кислоты, при этом красная кровяная соль восстанавливается до желтой: С6Н12О6 + 2К3Fe(CN)6 + 3Na2CO3 + H2O —→ C5H11O5COONa + 2K3NaFe(CN)6 + 3NaHCO3

Реакция доходит до конца лишь в присутствии Zn2+. Образуется нерастворимый цинк - железистосинеродистый калий: 2К4Fe(CN)6 + 3ZnSO4 = K2Zn3[Fe(CN)6]2 + 3K2SO4

Избыток красной кровяной соли, не израсходованный на окисление глюкозы, определяется йодометрическим путем: 2К3Fe(CN)6 + 2KJ = 2K4Fe(CN)6 + J2↑

Выделившийся йод оттитровывают тиосульфатом натрия (гипосульфитом): J2 + 2Na2S2O3 = 2NaJ + Na2S4O6. Ход работы. 250 мг проростков семян пшеницы растирают с 20 мл дистиллированной воды и фильтруют. К 1 мл фильтрата добавляют 2 мл щелочного раствора 0,005 н красной кровяной соли (отмеряют точно!) и помещают в кипящую водяную баню на 15 мин для протекания реакции восстановления. Пробу охлаждают и определяют в ней остаток непрореагировавшей красной кровяной соли. Для этого добавляют 2 мл 3% СН3СООН и 3 мл трой-

21

ного раствора, состоящего из NaCl и ZnSO4 (для связывания K4Fe(CN)6) и KI (для реакции с K3Fe(CN)6. Раствор желтеет, выделяется свободный йод, который сразу связывают крахмалом (появляется синяя окраска) и оттитровывают 0,005 н Na2S2O3 из микробюретки до исчезновения окраски. Параллельно в другой пробирке проводят опыт с контрольной пробой, в которую вместо фильтрата берут 1 мл дистиллированной воды. Далее делают тоже, что с опытной пробой, кроме кипячения. Расчет.

Для расчета содержания глюкозы пользуются специальной

таблицей (см. стр. 22), составленной для 0,005 н р-ра гипосульфита. Например, на титрование опытной пробы израсходовано 1,29 мл гипосульфита, на титрование контрольной пробы - 1,92 мл. По таблице: 1,29 мл соответствует 0,125 мг глюкозы, а 1,92 мл - 0,014 мг. Содержание глюкозы в 1 мл оттитрованной вытяжки = 0,125-0,014=0,111 мг. Далее рассчитывают содержание глюкозы в 1 г проростков семян пшеницы.

22

Таблица. Содержание глюкозы в 0,1 мл вытяжки, в мг

Гипосульфит, мл

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,0

0,385

0,382

0,379

0,376

0,373

0,370

0,367

0,364

0,361

0,358

0,1

0,355

0,352

0,350

0,348

0,345

0,343

0,341

0,338

0,336

0,333

0,2

0,331

0,329

0,327

0,325

0,323

0,321

0,318

0,316

0,314

0,312

0,3

0,310

0,308

0,306

0,304

0,302

0,300

0,298

0,296

0,294

0,292

0,4

0,290

0,288

0,286

0,284

0,282

0,280

0,278

0,276

0,274

0,272

0,5

0,270

0,268

0,266

0,264

0,262

0,260

0,259

0,257

0,255

0,253

0,6

0,251

0,249

0,247

0,245

0,243

0,241

0,240

0,238

0,236

0,234

0,7

0,232

0,230

0,228

0,226

0,224

0,222

0,221

0,219

0,217

0,215

0,8

0,213

0,211

0,209

0,208

0,206

0,204

0,202

0,200

0,199

0,197

0,9

0,195

0,193

0,191

0,190

0,188

0,186

0,184

0,182

0,181

0,179

1,0

0,177

0,175

0,173

0,172

0,170

0,168

0,164

0,164

0,163

0,161

1,1

0,159

0,157

0,155

0,154

0,152

0,150

0,148

0,146

0,145

0,143

1,2

0,141

0,139

0,138

0,136

0,134

0,132

0,131

0,129

0,127

0,125

1,3

0,124

0,122

0,120

0,119

0,117

0,115

0,113

0,111

0,110

0,108

1,4

0,106

0,104

0,102

0,101

0,099

0,097

0,095

0,093

0,092

0,090

1,5

0,088

0,086

0,084

0,083

0,081

0,079

0,077

0,075

0,074

0,072

1,6

0,070

0,068

0,066

0,065

0,063

0,061

0,059

0,057

0,056

0,054

1,7

0,052

0,050

0,048

0,047

0,043

0,042

0,041

0,039

0,038

0,036

1,8

0,034

0,032

0,031

0,029

0,027

0,025

0,024

0,022

0,020

0,019

0,017

0,015

0,014

0,012

0,010

0,008

0,007

0,005

0,003

0,002

1,9

23

Занятие № 5. ВЫДЕЛЕНИЕ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИДОВ И КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА ИХ КОМПОНЕНТЫ

Техника безопасности. На занятии предусматривается работа с концентрированными кислотами и работа с водяной баней. Задачи занятия: 1. Провести гидролиз РНП (рибонуклеопротеидов) дрожжей. 2. Определить компоненты РНП с помощью качественных реакций. Большая часть нуклеиновых кислот в клетках встречается в виде комплексов с основными белками. Такие комплексы называют нуклеопротеидами. Для изучения компонентов нуклеопротеидов удобно использовать растительный объект – пекарские дрожжи, содержащие рибонуклеопротеиды (РНП). В результате кислотного гидролиза РНП распадаются на составляющие их компоненты: пуриновые и пиримидиновые основания; рибозу; фосфорную кислоту; пептиды. 1. ПОЛУЧЕНИЕ ГИДРОЛИЗАТА ДРОЖЖЕЙ Ход работы. В пробирку помещают 1 г свежих пекарских дрожжей, наливают 8 мл 10 % р-ра Н2SO4. Пробирку закрывают пробкой, в которую вставлен обратный холодильник (стеклянная трубка длиной 20-30 см), и ставят на водяную баню на 35 минут. Гидролизат после охлаждения отфильтровывают и используют для проведения качественных реакций. 2. МОЛИБДЕНОВАЯ ПРОБА НА ФОСФОРНУЮ КИСЛОТУ Принцип реакции: Фосфорная кислота образует с молибденовым реактивом (раствор молибдата аммония в азотной кислоте) желтый кристаллический осадок фосфорномолибденовокислого аммония: H3PO4 +12(NH4)2MoO4 +21HNO3 → (NH4)3PO4.12MoO3↓ +21NH4NO3 +12H2О Ход работы: К 1 мл гидролизата прибавляют 1 мл молибденового ре-

24

актива и помещают на 10 минут на водяную баню. В присутствии фосфорной кислоты появляется желтое окрашивание. При охлаждении выпадает желтый кристаллический осадок комплексного соединения. 3. РЕАКЦИЯ ТРОММЕРА НА УГЛЕВОДНЫЙ КОМПОНЕНТ Ход работы: К 0,5 мл гидролизата дрожжей добавляют 1 мл 30 % р-ра NaOH и 3 капли 7 % р-ра CuSO4. Пробирку нагревают до кипения. Происходит окисление рибозы и выпадает желтый осадок CuOH или красный осадок Cu2O в результате восстановления Cu2+ до Cu+. 4. БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ НА ПОЛИПЕПТИДЫ Ход работы: К 0,5 мл гидролизата добавляют 1 мл 10 % раствора NaOH и 0,5 мл 1% раствора CuS04. Наблюдают появление окраски. Оформление работы. Результаты работы представляют в виде таблицы: № 1. 2. 3. 4.

Название этапа работы

Условия реакции (реактивы, t°С, время, уравнение реакции)

Наблюдаемые Эффекты

Вывод

25

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 1. Физиология и биохимия сельскохозяйственных растений / Под ред. Н.Н. Третьякова. – М.: Колос, 2000. – 640 с. 2. Биохимия: Учебник / Н.Е. Кучеренко, Ю.Д. Бабенюк, А.Н. Васильев и др. – К.: Изд-во при КГУ «Выща шк.», 1988. – 432 с. 3. Кретович В.Л. Биохимия растений. – М.: Высшая школа, 1980. – 446с. 4. Электронный учебник по биохимии http://biochemistry.vov.ru 5. Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии. - Ростов-на-Дону: Издво “Феникс”, 1999. - 544 с. 6. Практикум по биохимии: Учеб. пособие / Под ред. С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. - М.: Изд-во МГУ, 1989. - 509 с.