Флюоресцентная диагностика в стоматологии: Учебное пособие

Министерство образования и науки Российской Федерации НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЯДЕРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ «МИФИ»

С.А. Гончуков, А.В. Сухинина

ФЛЮОРЕСЦЕНТНАЯ ДИАГНОСТИКА В СТОМАТОЛОГИИ Учебное пособие

Москва 2010

УДК 535.37: 616-07(075) ББК 51.1(2)2я7 Г 65 Гончуков С.А., Сухинина А.В. Флюоресцентная диагностика в стоматологии: Учебное пособие. М.: НИЯУ МИФИ, 2010. – 32 с.

Рассмотрены строение и состав самой твердой биологической ткани человека – зубов в норме и при патологиях. Изложены основы формирования оптических спектров молекул. Описаны принцип и техника флюоресцентной спектроскопии при исследовании основных стоматологических заболеваний – кариеса и пародонтита. Приведены результаты практического применения флюоресценции для диагностики начального кариеса и детектирования зубного камня. Предназначено для студентов НИЯУ МИФИ, специализирующихся в области медицинской физики, а также для широкого круга читателей, интересующихся применением современных оптических методов в медицине.

Рецензенты:

д-р физ.-мат. наук В.М. Ермаченко, д-р физ.-мат. наук С.В. Киреев

ISBN 978–5–7262–1332–3 © Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ», 2010

Редактор М.В. Макарова

Подписано в печать 06.09.2010 Формат 60х84 1/16 Печ. л. 2,0 Уч.- изд.л. 2,0 Тираж 200 экз. Изд. № 063–1 Заказ № 275

Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ». Типография НИЯУ МИФИ. 115409, Москва, Каширское ш., 31

СОДЕРЖАНИЕ ПРЕДИСЛОВИЕ..............................................................................4 1. СТРОЕНИЕ И ЭЛЕМЕНТНЫЙ СОСТАВ ЗУБОВ................4 2. ПРИЧИНЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ И МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ КАРИЕСА И ПАРОДОНТИТА ................................6 2.1. Кариес .................................................................................7 2.2. Пародонтит.........................................................................9 3. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ............................10 4. ЯВЛЕНИЕ ФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ ..........................................13 5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ ....................................................................19 5.1. Источники возбуждения .................................................19 5.2. Волоконно-оптический спектрометр ЛЭСА .................20 5.3. Диагностика начального кариеса ...................................23 5.4. Детектирование зубного камня ......................................25 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................30 СЛОВАРЬ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТЕРМИНОВ ...........................31

3

ПРЕДИСЛОВИЕ Вряд ли кто-либо из взрослых людей может сказать с уверенностью, что его зубы в полном порядке. Каждому приходится обращаться к стоматологу неоднократно в течение жизни. Воспоминания об этих визитах обычно нельзя отнести к приятным, особенно, если болезнь запущена. К наиболее распространенным стоматологическим заболеваниям относятся кариес и пародонтит. Развитие этих болезней чревато не только потерей зубов, но и провоцирует заболевания полости рта, уха, носа, органов пищеварения. Современные методы лечения позволяют полностью исключить развитие кариеса и пародонтита, если они диагностированы на самой ранней стадии. Стоматологи говорят, что надо посещать их примерно раз в полгода. Но все ли мы следуем этому совету? Это зависит индивидуально от каждого и связано с культурой в широком смысле этого слова, неотъемлемой частью которой является образование. Ясное представление о механизмах развития основных стоматологических болезней и методах борьбы с ними – вот то, чему может быть полное доверие образованного читателя. Этому вопросу и посвящено данное издание. 1. СТРОЕНИЕ И ЭЛЕМЕНТНЫЙ СОСТАВ ЗУБОВ Зубы относятся к самым твердым биологическим тканям организма. Всего у взрослого человека 32 зуба. Они отличаются по форме: резцы, клыки, малые и большие коренные (премоляры и моляры). Различают три анатомических части: коронку, шейку и корень (рис. 1.1,а, на третьей странице обложки). Шейка – место перехода коронки в корень. Коронка имеет эмалевый покров, который у шейки прикреплен к слизистой оболочке десны. Тем самым создается непрерывность покровных биотканей. Корень погружен в альвеолу челюсти и представляет опорную часть зуба. По количеству корней различают одно-, дву- и трехкорневые зубы. Основную массу зуба составляет дентин. В коронке дентин покрыт эмалью, а в шейке и корне – цементом. Внутри зуба имеется 4

полость – корневой канал, заполненный зубной мякотью, или пульпой, обеспечивающей питание и рост зуба. Пульпа состоит из рыхлой соединительной ткани, содержащей нервные окончания, кровеносные и лимфатические сосуды. Сформировавшаяся эмаль – самая твердая эпителиальная ткань организма. Она состоит из плотно прилегающих друг к другу тонких волокон – эмалевых призм диаметром от 3 до 6 мкм. Призмы ориентированы в основном радиально и проходят сквозь толщу эмали. Твердость эмали 5 по шкале Мооса. Эмаль развивается из эктодермы, остальные же ткани имеют мезенхимальную природу. В процессе созревания эмали накапливаются минеральные компоненты, клетки эмали (энамелобласты) отмирают, и зрелая эмаль становится очень твердой бесклеточной структурой, не содержащей регуляторных белков. По химическому составу эмаль представляет собой ткань, наиболее богатую во всем организме неорганическими солями (около 97%, главным образом фосфорно- и углекислые соединения извести). Органических соединений в эмали около 2%. С возрастом происходит постепенное стирание эмали, а затем и дентина. Дентин образуется клетками одонтобластами, которые в течение всей жизни формируются из клеток пульпы. Дентин уступает эмали по твердости, но значительно плотнее и тверже цемента и кости. 65% его массы составляют минеральные соли, а на долю органических соединений приходится примерно 28%, остальное – вода. Дентин пронизан канальцами, в которых находятся отростки одонтобластов. Канальцы выстланы оболочкой, стойкой к кислотам и щелочам. Цемент обеспечивает непосредственную связь зуба с тканью альвеолы через пограничную мембрану. Вырабатывается цементобластами, которые, погружаясь в цемент, превращаются в цементоциты. Клетки содержатся в слоях цемента, расположенных в области корня зуба. В области шейки слои цемента более тонкие и клеток не содержат. Структурно цемент представляет собой волокна, ориентированные перпендикулярно к поверхности зуба. Химический состав цемента: органические вещества – около 30%, фосфорнокислый кальций – 57%, углекислый кальций – 8%. Несмотря на различия, у твердых тканей много общего. Их минеральную основу составляют апатиты, имеющие общую формулу 5

Ca10(PO4)6X2, где X представлен анионами OH– (гидроксиапатит) или F– (фторапатит). Гидроксиапатит редко встречается в неживой природе, но в биологических объектах является главным компонентом минеральной фазы твердых тканей (≥ 75%). Апатиты минерализованных тканей обладают огромной суммарной поверхностью, что позволяет им сорбировать как заряженные частицы, так и нейтральные молекулы. На рис. 2.1 представлен элементный состав эмали зуба, полученный с помощью лазерного масс-спектрометра. Как видно, содержание кальция в твердой ткани является преобладающим. Что касается органической основы, то в тканях мезенхимального происхождения (дентин и цемент) это главным образом коллаген (≥ 90%), протеогликаны (около 1%), неколлагеновые белки и фосфолипиды (до 8%) и цитрат (около 1%). Если говорить образно, то прочность тканей зубов можно сравнить с железобетоном. Кристаллы гидроксиапатита играют роль жесткого каркаса, а коллаген и протеогликаны отвечают за эластичность. 2. ПРИЧИНЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ И МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ КАРИЕСА И ПАРОДОНТИТА Изучением причин и условий появления болезней занимается этиология. По словам И.П. Павлова: «Этиология – самый слабый отдел медицины». Это объясняется чрезвычайно сложным уровнем биохимических процессов, протекающих в живом организме, и трудностью экспериментального исследования этих процессов, особенно на начальной стадии развития патологии. Этиология кариеса и пародонтита также в полной мере не выяснена, хотя они относятся к самым распространенным заболеваниям у людей. Так, по данным ВОЗ пародонтитом страдает в большей или меньшей степени все население Земли. Мало найдется людей, которые бы не обращались к врачу по поводу кариеса. Коварство этих заболеваний связано с тем, что они развиваются вначале без болевых ощущений и внешних проявлений. Применение современных терапевтических методов позволяет полностью остановить развитие кариеса и пародонтита. Чем раньше обнаружена болезнь, тем эффективнее лечение. Поэтому вопрос ранней диагностики заболеваний играет первостепенную роль. 6

2.1. Кариес Установлено, что кариес является результатом разрушающего действия микроорганизмов зубного налета. В образовании зубного налета на поверхности зубов участвуют как микроорганизмы, обитающие в полости рта, и продукты их жизнедеятельности, так и белки слюны и клетки слущенного эпителия. В формировании зубного налета есть несколько этапов: от раннего этапа (начиная с 2 часов после чистки зубов) до зрелого состояния (3 – 7 суток). Разделяют следующие слои налета: первый слой – приобретенная пелликула, связывающая налет с поверхностью эмали; второй слой – нитевидные микроорганизмы; третий слой включает колонии других видов бактерий; четвертый, поверхностный, слой состоит преимущественно из коккообразных микроорганизмов. Подсчитано, что в одном миллиграмме налета присутствует 800 млн бактерий. С развитием кариеса микроорганизмы проникают в пульпу и вызывают ее воспаление – пульпит. Эта стадия кариеса сопровождается сильной болью. Обращение к врачу становится неизбежным. Организм имеет собственные средства борьбы с образованием зубного налета. В первую очередь это слюна – прозрачный вязкий секрет слюнных желез, выделяемый в ротовую полость. Антибактериальное действие слюны реализуется через систему иммуноглобулинов, препятствующих колонизации бактерий и, по-видимому, усиливающих бактериальный фагоцитоз. Другим фактором защиты являются секреторные белки слюны, которые покрывают поверхность зубов защитным белковым слоем. Однако по мере накопления зубного налета влияние слюны на эмаль ослабевает, а влияние метаболитов зубного налета возрастает. Накопившаяся молочная кислота растворяет связующее вещество между призмами эмали, образуются микрощели, позволяющие бактериям проникнуть внутрь эмали. Чем быстрее образуется зубной налет, тем выше кариесогенность. Вероятность кариеса увеличивается при недостаточном поступлении в организм белков, витаминов, минеральных солей, ряда микроэлементов, а также при избыточном потребление легко расщепляемых углеводов и длительной задержке остатков пищи в полости рта. С развитием кариеса эмаль теряет N, F, Zn, S, Sr, Al, Cu и Cr, в то время как содержание Cl, K, Ti и Mn заметно увеличивается 7

(рис. 2.1). Хотя содержание Ca практически не изменяется, существенно, что в результате диссоциации органических кислот, продуцируемых микроорганизмами, появляются мобильные ионы водорода. Они активно взаимодействуют с кристаллами гидроксиапатита, замещая другие ионы, в первую очередь ионы кальция. В результате такой деминерализации структура эмали разрушается.

Рис. 2.1. Элементный состав здоровой (светло-серый цвет) и кариозной (темно-серый цвет) эмали

Итак, очаг кариеса находится внутри эмали (рис. 1.1,б на третьей странице обложки). Вначале он не затрагивает дентин и внешнюю поверхность коронки зуба. Со временем проявляется очаговая деминерализация эмали – белые или коричневые меловые пятна на поверхности. Такое состояние принято считать ранним кариесом, хотя это название вряд ли можно считать удачным, поскольку кариес уже вышел на поверхность зуба. Лечение на этой стадии требует уже «ремонтно-восстановительных работ», то есть деструктивного воздействия на эмаль и последующего пломбирования. Более же ранняя – начальная стадия кариеса не идентифицируется 8

визуально и традиционными способами диагностики. Необходимость разработки чувствительных эффективных средств диагностики начального кариеса очевидна, так как применение современных реминерализирующих средств на самой начальной стадии развития болезни позволяет полностью остановить развитие кариеса. 2.2. Пародонтит Пародонтит – инфекционно-воспалительное заболевание пародонта, приводящее к разрушению зубодесневого соединения и межальвеолярных перегородок. Этиология пародонтита до сих пор полностью не выяснена. Однако хорошо известно, что развитие пародонтита сопровождается ростом камней на зубах (рис.1.1,в на третьей странице обложки). Небольшие области внутри зубного камня содержат микроорганизмы, жизнедеятельность которых приводит к нарушению целостности пародонта и даже к потере зуба. При этом чаще всего страдают передние нижние зубы. С развитием пародонтита наблюдаются нарушения зубодесневых соединений, воспалительная инфильтрация десны, рассасывание костной ткани, приводящее к образованию пародонтального кармана, обнажаются шейки и даже корни зубов. В результате возникает кровоточивость десен, появляется патологическая подвижность зубов, запах изо рта. Формирование зубного камня начинается с зубного налета в районе шейки, из которого образуется органическая матрица. Увеличение количества нитевидных микроорганизмов и формирование центров отложения минералов приводит к кальцификации органической матрицы. Вначале камень непрочный и легко удаляемый, состоящий в основном из брушита (CaHPO4·2H2O). Затем идет послойное отложение минеральных солей и их кристаллизация. По мере старения камня его состав меняется, и появляются другие виды кристаллов. Различают наддесневой и поддесневой зубной камень. Камни отличаются как по локализации, так и по химическому составу, что, в частности, определяет их цвет. Поддесневой камень, как правило, темный, в то время как наддесневой камень может быть как темным, так и белым. Неорганические вещества составляют основную часть зубного камня (70-90% сухого веса). Темный содержит 9

больше минералов, чем светлый зубной камень. Органическую основу составляют белки, аминокислоты, углеводы, липиды, ферменты. В светлом наддесневом камне содержание белка достигает 2,5%, в темном наддесневом камне оно снижается до 0,5%, а в поддесневом зубном камне составляет всего 0,1- 0,3%. Хотя наличие зубного камня не является первоначальной причиной пародонтита, современная терапия заболевания заключается в полном удалении камня с поверхности зубов. Эту процедуру, очевидно, надо выполнять, не разрушая примыкающие к камню здоровые ткани зуба. Однако потенциальный риск всегда есть, так как процесс удаления камня должен быть точно остановлен на границе раздела «камень – зуб». Особую сложность представляет процедура диагностики и удаления зубного камня, скрытого десной. 3. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Диагностика кариеса и пародонтита основана на изменении физических характеристик биоткани при развитии патологий. Отличие по структуре и химическому составу позволяет использовать различные методы исследования. В начале обследования врач традиционно использует визуальный и тактильный способы. Реже применяется метод селективного окрашивания кариозных пятен, основанный на повышенной проницаемости деминерализованной эмали для молекулярных веществ. В настоящее время для этой цели используют 2%-ный раствор метиленового синего. Применяется также точечный метод электродиагностики, основанный на увеличении электропроводности в очаге поражения. Эти способы обследования не обладают точностью, необходимой для диагностики заболевания на ранней стадии его развития. По этой причине исследования и разработки, направленные на выяснение возможностей других подходов в стоматологической диагностике, ведутся до настоящего времени. Известны работы по применению ультразвука и рентгена, радиографии, визуализации в инфракрасном и терагерцовом диапазонах, оптической когерентной томографии, комбинационного рассеяния света. Эти подходы не получили распространения в медицинской практике, поскольку сложны, дороги и не всегда обладают необходимой точностью. 10

Обоснованно перспективным считается метод флюоресцентной спектроскопии, поскольку является чувствительным и недорогим. Он находит широкое применение в медицине при диагностике самых различных заболеваний. Хотя флюоресценция по интенсивности меньше возбуждающего излучения на три-четыре порядка, она легко детектируется и очень информативна. При этом для возбуждения флюоресценции можно использовать как лазеры, так и нелазерные источники света низкой интенсивности. Поэтому такой метод является еще и неинвазивным. Флюоресцентная диагностика в стоматологии базируется на анализе спектров флюоресценции тканей зуба в норме и при патологиях. Основное вещество, из которого состоят ткани зуба, – гидроксиапатит. Гидроксиапатит и другие кристаллы входят в состав зубного камня. Это диэлектрики, которые, как известно, в чистом виде не флюоресцируют. Однако наличие примесей и дефектов приводит к их флюоресценции. Микроорганизмы, органические вещества, продукты распада также дают характерные спектры флюоресценции. Структура и химический состав твердой ткани зависят от многих факторов, включая возраст, пол, расу, социальное положение, традиционное питание, курение, хронические заболевания и т.д. В результате спектры флюоресценции могут существенно отличаться у пациентов. Детальный анализ спектров позволяет выбрать оптимальные для диагностики длины волн возбуждения и регистрации флюоресценции. В фотобиологии различают эндо- и экзогенную флюоресценцию. Эндогенная флюоресценция или аутофлюоресценция присуща нативному состоянию исследуемого объекта, а экзогенная – объекту после его окрашивания красителями. Как показывают последние исследования, для достоверной флюоресцентной диагностики стоматологических заболеваний не требуется применение дополнительных красителей. Поэтому, для краткости, термин «аутофлюоресценция» мы заменяем флюоресценцией. Эндогенные флюорофоры весьма многочисленны. В табл. 3.1 приведены характерные длины волн возбуждения и излучения флюоресценции основных биологических молекул.

11

Таблица 3.1 Молекула

Длина волны возбуждения, нм

Длина волны флюоресценции, нм

Триптофан

275

350

Белки

Коллаген

335

390

Соединительная биоткань

Эластин

360

410

Соединительная биоткань

405, 540, 630

635

Микроорганизмы

Порфирины

Происхождение

Возможности возбуждения и регистрации флюоресценции зависят от степени прохождения излучения через твердые ткани в рассматриваемом оптическом диапазоне длин волн. Процессы поглощения и рассеяния света в эмали и дентине существенно отличаются. Эмаль является более прозрачной тканью, чем дентин. На длине волны 633 нм коэффициенты поглощения и рассеяния эмали равны 0,97 и 1,1 см−1, в то время как у дентина эти коэффициенты равны 6,0 и 1200 см−1 соответственно. Основными рассеивателями света являются кристаллы гидроксиапатита, а поглотителями – органические молекулы. При переходе в ультрафиолетовый диапазон коэффициенты поглощения и рассеяния возрастают настолько, что глубина проникновения излучения в твердую ткань не превышает 0,1-0,3 мм. Для примера на рис. 3.1 приведен спектр поглощения дентина в диапазоне от 300 до 3000 нм. Таким образом, вклад во флюоресценцию от основных флюорофоров, кроме порфиринов, будет отражать изменения на поверхности биотканей. Порфирины же эффективно возбуждаются и излучают в видимом диапазоне длин волн. Они должны хорошо детектироваться в спектрах флюоресценции в присутствии микроорганизмов, поскольку содержатся преимущественно в митохондриях их клеток и продуктах жизнедеятельности. 12

Рис. 3.1. Спектр поглощения дентина (см–1) в диапазоне от 300 до 3000 нм

4. ЯВЛЕНИЕ ФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ Согласно квантовой механике малые частицы (атомы, молекулы, ионы) могут принимать и отдавать энергию дискретными порциями – квантами. Изменению энергии соответствуют переходы между энергетическими состояниями (уровнями), структура которых индивидуальна для данной элементарной системы частицы. В зависимости от характера взаимодействия в системе энергетический спектр может быть дискретным (как у осциллятора), непрерывным (как у свободной частицы) либо смешанным (как, например, у возбужденных атомов). Полная потенциальная энергия молекулы E (без учета ее движения как целое) складывается из энергии электронного возбуждения Eэ, энергии колебания Eк и энергии вращения Eв молекулы: E = Eэ + Eк + Eв.

(1)

Для величин этих энергий выполняется примерное соотношение: 13

Eэ : Eк : Eв = 1 : (m/M)1/2 : m/M = = 1-10 эВ : 10–2-10–1 эВ : 10–5-10–3 эВ,

(2)

где m и M – массы электрона и молекулы соответственно. В отличие от свободных атомов потенциальная энергия молекулы зависит от расстояния r между ядрами молекулы. Для многоатомной молекулы энергетический спектр представляет собой поверхность в многомерном пространстве. Для двухатомной молекулы он имеет вид, представленный на рис. 4.1,а. Здесь приведены только основное и два нижних возбужденных электронных состояния. Каждому электронному состоянию, вид которого определяется внутримолекулярным взаимодействием, соответствует своя система колебательных уровней, а каждому колебательному – своя система вращательных уровней. Последние на рисунке не показаны, так как их энергии малы. Минимум потенциальной энергии соответствует равновесному, наиболее вероятному расстоянию между ядрами, определяемому равенством между силами притяжения (dE/dr > 0) и отталкивания (dE/dr < 0). Для основного электронного состояния это расстояние обозначено на рис. 4.1,а как r0. С ростом электронного возбуждения равновесное расстояние немного увеличивается, так как внутримолекулярная связь ослабляется. При увеличении Eк горизонтальные отрезки в пределах электронного состояния подымаются вверх и их размер растет, поскольку растет «размах» колебаний молекулы. В отсутствие возбуждения молекула старается занять самое низкое по энергии состояние. В реальных условиях положительной температуры (T > 0) вероятность перехода молекул в возбужденное состояние за счет тепловой энергии определяется распределением Больцмана: N = N0 exp (–ΔE/kT),

(3)

где N и N0 – число молекул в возбужденном и основном состояниях; ΔE – разность энергий этих состояний; k – постоянная Больцмана. Если по той или иной причине молекулы перешли в неравновесное состояние, то тепловое равновесие с окружающей средой 14

устанавливается в течение следующих 10–12 с и распределение молекул по энергетическим уровням определяется формулой (3).

Рис. 4.1. Схема формирования энергетических состояний (а) и спектров поглощения, флюоресценции и фосфоресценции (б)

Согласно принципу Франка–Кондона за время электронного перехода (~ 10–15 с) не происходит заметного изменения в положении ядер. Поэтому переходы между электронными состояниями можно изображать вертикальными стрелками, которые, очевидно, должны начинаться и заканчиваться в местах максимальной вероятности нахождения ядер. Из-за колебательной релаксации молекула очень быстро занимает низший в пределах данного электронного состояния уровень. При возбуждении молекулы ее колебания в пределах соответствующего горизонтального отрезка можно описать синусоидой. Поэтому для возбужденных колебательных уровней наи15

большая вероятность нахождения ядер соответствует местам касаний горизонтальных отрезков с кривой электронного состояния, а для основного колебательного уровня – вблизи их равновесного положения. Электронные переходы как снизу вверх (поглощение), так и сверху вниз (испускание) представлены на рис. 4.1,а соответствующими вертикальными стрелками. Перевод молекулы в возбужденное, т.е. неравновесное, состояние возможен разными способами (рентгеновскими лучами, быстрыми частицами, электрическим полем, с помощью химической реакции и др.). В нашем случае будет рассматриваться возбуждение светом – фотовозбуждение. Диссипация полученной избыточной энергии может быть как безызлучательной (перенос энергии на молекулярное окружение, колебательная релаксация, внутренняя конверсия между электронными состояниями, переход в кинетическую энергию), так и излучательной. Во втором случае происходит преобразование поглощенной энергии в собственное излучение. Общее название этого явления – люминесценция – излучение, представляющее собой избыток над тепловым излучением тела и продолжающееся в течение времени, значительно превышающего период световых колебаний. Понятие явления люминесценции применимо к атомам и молекулам, находящимся в состоянии, близком к равновесному. Заметим, что в видимом диапазоне спектра тепловое излучение становится заметным при температурах ≥103 К, а люминесценция может наблюдаться при любых температурах. Поэтому люминесценцию называют еще холодным свечением. По механизмам элементарных процессов различают резонансную, спонтанную и вынужденную люминесценцию. При резонансной люминесценции поглощение и испускание происходит между одними и теми же уровнями, и длины волн люминесценции и возбуждения совпадают λL = λexc. Наиболее часто наблюдается спонтанная люминесценция, когда часть энергии растрачивается безызлучательно на тепло. Тогда уровень испускания лежит ниже уровня возбуждения и λL > λexc. Это стоксова люминесценция. Возможен также менее вероятный процесс, когда молекула получает дополнительную энергию от теплового движения или от других молекул. Тогда λL < λexc, и люминесценция называется антистоксовой. Вынужденная люминесценция является более сложным процессом, в 16

который включен переход на промежуточный метастабильный уровень и требуется дополнительная энергия для перехода на уровень испускания. Такой вид люминесценции наблюдается в сложных молекулах при низкой температуре. Традиционно принято разделять люминесценцию на флюоресценцию и фосфоресценцию. Под флюоресценцией понимается излучение, быстро (за ~10–9 с) затухающее после прекращения возбуждения. Фосфоресценцией считается свечение, продолжающееся от микросекунд до секунд и более после возбуждения. Такое разделение устарело и носит чисто качественный характер. Длительность люминесценции определяется временем жизни возбужденного состояния. Из закона сохранения энергии следуют правила отбора, которые накладывают запрет на некоторые переходы. Для электронных переходов правила отбора связаны с мультиплетностью 2S + 1 (S – спиновое квантовое число) и запрещают переходы с изменением спина. Мультиплетность характеризует число возможных ориентаций в пространстве полного спина атомной системы. При 2S + 1 = = 1, 2, 3, 4, … уровни энергии называют синглетными, дублетными, триплетными, квартетными и т. д. Таким образом, приведенные на рис. 4.1,а синглет-синглетные переходы разрешены, а триплетсинглетные переходы запрещены. Основное состояние почти всех молекул с четным числом электронов таково, что молекулярные орбитали заполнены парами электронов. Согласно принципу Паули такие пары электронов должны иметь противоположно направленные спины. Следовательно, основное состояние является синглетным, так как S = 0. Реально запрет на переходы с изменением спина снимается благодаря спин-орбитальному взаимодействию. Однако из-за запрета вероятность такого перехода мала, триплетный уровень на рис. 4.1,а является метастабильным и его распад происходит медленно. Излучение при триплет-синглетных переходах и есть фосфоресценция (рис. 4.1,б). В данном издании рассматриваем возможность использования оптического метода диагностики, когда воздействующее и регистрируемое излучения относятся к видимой и ближней ультрафиолетовой области спектра. Связь изменения энергии квантовой системы с излучением при поглощении и испускании определяется формулой Планка 17

ΔE = hν,

(4)

где h – постоянная Планка; ν – частота электромагнитных колебаний. Учитывая энергию кванта излучения (1-3 эВ) и соотношение (2), процессы поглощения и излучения должны соответствовать переходам между электронными состояниями, как показано на рис.4.1,а. Энергетические уровни молекулы имеют свою индивидуальную структуру и спектроскопические параметры, что определяет характерный вид ее спектров поглощения и испускания. Для каждого перехода спектральная линия поглощения или излучения имеет конечную ширину. Механизмы уширения спектральных линий разнообразны. Естественное или радиационное уширение определяется конечным временем жизни элементарной частицы в возбужденном состоянии. Меньше радиационного уширение быть не может. Процессы теплового движения частицы и ее взаимодействия с окружающими частицами и кристаллической решеткой дают дополнительный, обычно основной, вклад в уширение. Для конденсированных сред, в том числе и для биологических тканей, ширина спектральной линии составляет, как правило, около 10% от центральной частоты. Поэтому у молекулы спектральные линии, связанные с переходами между близко расположенными колебательными уровнями электронных состояний, полностью или частично, как показано на рис. 4.1,б, перекрыты. В формировании спектров флюоресценции имеются свои особенности. После поглощения кванта света и быстрой колебательной релаксации испускание флюоресценции всегда происходит с нижнего колебательного уровня возбужденного состояния. Таким образом, спектр флюоресценции не зависит от длины волны возбуждающего излучения (правило Каши). Другая особенность связана с тем, что структура и вероятности переходов на колебательные уровни близки у молекулы в основном и возбужденном электронном состоянии. Иными словами, структурная организация молекулы в основном и возбужденном состояниях мало отличается. Следствием этого является зеркальная симметричность спектров поглощения и стоксовой флюоресценции относительно длинноволновой границы поглощения (правило Левшина). Эта особенность хорошо проявляется на рис. 4.1,б при сравнении спектров поглощения и флюоресценции на шкале частот. 18

Спектр флюоресценции несет важную информацию о структуре и химическом составе исследуемого объекта. Выбор оптимальных длин волн возбуждения и регистрации флюоресценции позволяет идентифицировать патологические изменения в тканях зуба на ранних стадиях развития заболеваний. 5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ 5.1. Источники возбуждения Для фотовозбуждения флюоресценции можно применять различные источники света. Чтобы свет эффективно поглощался молекулой, длина волны излучения должна совпадать с той или иной спектральной линией поглощения. К ширине спектра возбуждающего излучения жестких требований не предъявляется, но она не должна пересекать длинноволновую границу спектра поглощения молекулы. В противном случае трудно детектировать слабую стоксову флюоресценцию на фоне интенсивного возбуждающего излучения. Поэтому на практике используемые мощные лампы снабжаются светофильтрами или монохроматорами. В последнее время для возбуждения флюоресценции широко используются лазеры и светодиоды. По своим пространственным и яркостным характеристикам, а также монохроматичности (5-15 нм) светодиоды, конечно, уступают лазерам. Однако технология изготовления светодиодов непрерывно совершенствуется. Они имеют малые габариты, низкую цену и высокую долговечность. Весьма существенно, что в отличие от лазеров у светодиодов имеется возможность широкого выбора длин волн излучения. Тем не менее лазеры не уступают своих позиций. Узкий спектр излучения (~ 10–2 нм) лазеров позволяет довольно просто отсечь их излучение от флюоресценции. Кроме того, поскольку лазерное излучение узконаправленное, а спонтанное излучение флюоресценции «светит» в 4π стерадиан, то регистрация флюоресценции под углом дает дополнительную возможность для ослабления засветки от возбуждающего излучения. Что касается цены и габаритов, то многие приемлемые для работы маломощные лазеры могут быть вполне сравнимы со светодиодами. 19

Далее приводятся результаты наших исследований, в которых для возбуждения флюоресценции применялись газовые, твердотельные и полупроводниковые непрерывные лазеры, а также светодиоды. Излучение источников в совокупности охватывало диапазон от 337 до 658 нм. Мощность их выходного излучения не превышала 10 мВт. 5.2. Волоконно-оптический спектрометр ЛЭСА К настоящему времени разработан ряд удобных спектрометров, адаптированных к применению в биофотонике. Мы используем здесь результаты наших исследований, выполненных с помощью одного из них – волоконно-оптического спектрометра ЛЭСА-5 (ЗАО «Биоспек», Россия). Действие спектрометра основано на пространственном разложении исследуемого излучения по длинам волн с помощью дифракционной решетки и регистрации этого излучения на ПЗС линейке. Работа спектрометра поддерживается специальным программным обеспечением. Спектры регистрируются в реальном времени и отображаются на экране монитора компьютера. Спектральное разрешение около 8 нм, рабочий диапазон от 290 до 1100 нм. Как во всяком спектральном приборе, регистрируемый спектр I'(λ) отличается от исходного спектра I(λ), поскольку коэффициент передачи K(λ) прибора зависит от длины волны: I'(λ) = I(λ)ּK(λ).

(5)

Зависимость коэффициента передачи от длины волны обусловлена соответствующими зависимостями у всех оптических и фотоэлектронных составляющих спектрометра. В первую очередь это касается ПЗС линейки и дифракционной решетки. Весьма существенным здесь является интерференция анализируемого излучения на тонком просветляющем покрытии ПЗС линейки, которая приводит к значительной периодической модуляции регистрируемого спектра по амплитуде. Неравномерность коэффициента передачи спектрометра можно учесть с помощью вспомогательного опорного источника с известным спектром излучения I0(λ). На практике в качестве такого ис20

точника удобно использовать обычную вольфрамовую лампу накаливания. Ее спектр близок к спектру излучения абсолютно черного тела. Излучение стандартной вольфрамовой лампы можно считать практически не зависящим от длины волны в видимом диапазоне. Небольшой монотонный спад (около 10%) интенсивности с длиной волны не сказывается сколько-нибудь существенно на результатах. Таким образом, влияние неравномерности коэффициента передачи на исследуемый спектр может быть практически исключено, если предварительно зарегистрировать спектр опорного сигнала I'0(λ) = I0(λ)ּK(λ) и затем разделить I'(λ) на I'0(λ): I(λ) = {I'(λ)/I'0(λ)}I0(λ),

(6)

где I0(λ) ≈ const. Эта операция выполняется программно. Спектрометр ЛЭСА-5 снабжен оптоволоконным трактом, состоящим из семи кварцевых волокон диаметром 200 мкм. По центральному волокну к исследуемому объекту подается излучение от возбуждающего источника. Шесть других, окружающих центральное волокно, предназначены для сбора флюоресценции и подачи ее на спектрометр. С одной стороны, моноволокна объединены в единый регулярный жгут, образуя зондирующий торец, с другой, – центральное волокно и остальные шесть волокон разветвлены и соединены с источником возбуждения и спектрометром соответственно. Схема экспериментальной установки для спектральных исследований приведена на рис. 5.1. Интенсивность флюоресценции вообще и ее стоксовых компонент, в частности, на порядки меньше интенсивности возбуждающего излучения. Для отсечки рассеиваемого объектом возбуждающего излучения применяются отрезающие светофильтры. На рис. 5.2 приведены для примера спектральные характеристики пропускания трех абсорбционных светофильтров, используемых при возбуждении флюоресценции на длинах волн 381, 532 и 633 нм. Светофильтры устанавливаются на входе спектрометра.

21

2

1

3

6 4

5

Рис. 5.1. Схема экспериментальной установки для спектральных исследований: 1 – источник возбуждения, 2 – спектрометр, 3 – оптическое волокно, 4 – предметный столик с объектом исследования, 5 – компьютер, 6 – контроллер

Рис. 5.2. Спектры пропускания светофильтров ЖС-10 (1), ОС-12 (2) и КС-17 (3)

22

5.3. Диагностика начального кариеса В разд. 5.3 и 5.4 приводятся основные результаты наших исследований in vitro с десятками зубов, удаленных по причине пародонтита. Интенсивность флюоресценции тканей зубов в норме и при патологиях падает в видимом диапазоне спектра с увеличением длины волны возбуждающего излучения при прочих равных условиях. На рис.5.3 представлены типичные спектры флюоресценции коронки здорового зуба при облучении лазером на длине волны λвозб = 473 нм. Как видно, интенсивность флюоресценции Iф зависит от пространственного положения исследуемого участка. Флюоресценция более интенсивная там, где толщина прозрачной эмали мала (фиссура и шейка зуба) и, как следствие, обратное рассеяние от дентина велико. Такое поведение Iф имеет место при всех λвозб и должно учитываться при диагностике, базирующейся на изменении интенсивности флюоресценции.

Рис. 5.3. Спектры флюоресценции коронки здорового зуба для различных участков на его поверхности при λвозб = 473 нм. Зависимости 1 – 6 соответствуют участкам 1 – 6 на рисунке зуба

23

С развитием кариеса спектр флюоресценции изменяется главным образом по интенсивности. При этом для развитого кариеса Iф(λ) от пораженных участков зуба всегда меньше, чем от здоровых участков при любых λвозб. В случае трудно детектируемого начального кариеса соотношение между Iф(λ) от кариозного и здорового участков зависит от λвозб. Причем интенсивность флюоресценции при λвозб < 400 нм выше у здоровой эмали, чем у эмали, пораженной кариесом, а при λвозб > 400 нм наоборот (рис. 5.4, а, б и в). Процентный вклад во флюоресценцию от здоровой и кариозной эмали иллюстрирует рис. 5.4, г. Такой характер поведения флюоресценции зависит, главным образом, от изменения оптических свойств твердых тканей зуба (поглощения и рассеяния) при кариесе.

Рис. 5.4. Спектры флюоресценции эмали в норме (сплошная линия) и при раннем кариесе (пунктир) для λвозб = 369 нм (а), 406 нм (б) и 473 нм (в). Процентный вклад во флюоресценцию от здоровой и кариозной эмали (г)

24

Итак, скрытый внутри эмали участок зуба, пораженный начальным кариесом, можно идентифицировать излучением в желтозеленой части спектра или ближним ультрафиолетом. Отличие лишь в том, что в первом случае это будет светлое пятно, а во втором – темное. Однако контраст пятна будет существенно выше при облучении ультрафиолетом, так как интенсивность флюоресценции падает с ростом λвозб. При λвозб < 400 нм контраст настолько высок, что темные пятна начального кариеса детектируются невооруженным глазом. Рис. 5.5 (на третьей странице обложки) иллюстрирует такую возможность. На рисунке приведено также изображение внутренней структуры зуба, полученное с помощью оптического когерентного томографа (ОКТ). Использование томографа позволило подобрать два подходящих зуба с начальным кариесом, так как начальная форма кариеса еще не затрагивает внешнюю поверхность эмали и не обнаруживается визуально. 5.4. Детектирование зубного камня Диагностика зубного камня, как и кариеса, основана на отличие флюоресценции здоровых тканей зуба от его патологий. Спектры флюоресценции камня и зубных тканей имеют куполообразную зависимость от длины волны (рис. 5.6). Только при возбуждении камня в сине-зеленой области спектра наблюдаются характерные для порфиринов спектральные линии, которые указывают на присутствие микроорганизмов (см. рис. 5.6, б, в). Аналогичные спектры с характерными линиями наблюдаются при анализе развитого кариеса при возбуждении флюоресценции в сине-зеленой области. Учитывая локализацию и цвет камней, для оценки были выбраны отношения между интенсивностями флюоресценции «темный камень-корень» R1 = Iтк/Iк, «темный камень-эмаль» R2 = Iтк/Iэ и «светлый камень-эмаль» R3 = Iск/Iэ. Оптимальная длина волны регистрации флюоресценции λрег в зависимости от λвозб не зависит от цвета камней и может быть представлена одной кривой (рис. 5.7). Ошибка на этом рисунке обусловлена разбросом значений для разных пациентов. Значение λрег не является точным оптимальным значением, так как зависимость λрег(λ) имеет монотонный характер, и спектральная полоса на уровне 20 нм вполне приемлема для диагностики. 25

  Рис. 5.6. Типичные спектры флюоресценции темного (1) и светлого (2) камня, дентина (3) и эмали (4) при λвозб = 337 нм (а), 473 нм (б), 532 нм (в) и 633 нм (г)

26

Рис. 5.7. Зависимость оптимальной длины волны регистрации от длины волны возбуждения

Очевидно, что оптимальный спектральный диапазон регистрации должен определяться зависимостью Ri(λвозб). Как видно на рис. 5.8, наиболее приемлемыми для детектирования камня являются спектральные диапазоны 620-645 и 340-370 нм. Отношения R1 и R2 достигают почти два порядка в этих диапазонах. Надо заметить, что флюоресценция камня превышает по интенсивности флюоресценцию от тканей зуба при возбуждении красным светом. При возбуждении ультрафиолетом ситуация – противоположная. Этот факт непринципиален, так как важным является отличие сигналов флюоресценции. Возбуждение красным излучением подходит для идентификации как поддесневого, так и наддесневого камня, в то время как ультрафиолет больше подходит для идентификации поддесневого камня. Казалось бы возбуждение красным более перспективно для диагностики камня, чем ультрафиолетовым светом. Однако окончательное заключение может быть сделано только 27

после точного учета рассеяния и поглощения на выбранных длинах волн, так как именно это будет определять пространственное разрешение на границе «камень-зуб».

Рис. 5.8. Зависимости R1 (1), R2 (2) и R3 (3) от длины волны возбуждения

Химический состав (см. разд. 2) объясняет характер спектров флюоресценции на рис. 5.6-5.8 и, в частности, тот факт, что Iк > Iтк , Iэ > Iтк , Iэ > Iск и Iк > Iэ при возбуждении ультрафиолетом. Эти соотношения противоположны при возбуждении видимым светом, что в основном объясняется влиянием минеральных компонент. На основании полученных результатов может быть реализован простой метод детектирования зубных камней без использования дорогого спектрометра. Исследуемый зуб облучается лазером или светодиодом непосредственно или с помощью оптического волокна, а флюоресценция регистрируется фотодетектором после абсорбционного отрезающего светофильтра. Усредненные результа28

ты измерений, выполненные с помощью спектрометра и простым методом, приведены в табл. 5.1. Как видно, приведенные результаты отличаются, что объясняется различным вкладом флюоресцирующих линий в информативный сигнал. Важно, что достоверность диагностики темного, в первую очередь поддесневого камня, многократно выше в случае простой реализации, чем при измерениях на спектрометре. Таблица 5.1 Вид детектирования Измерения на ЛЭСА-5 Простая реализация

R1–1 при R2 при R2–1 при R3 при R3–1 при R1 при λвозб = λвозб = λвозб = λвозб = λвозб = λвозб = = 633 нм = 369 нм = 633 нм = 369 нм = 633 нм = 369 нм 50 85 50 52 41 6 145

90

195

300

27

12

И, наконец, отметим, что использование амплитудной модуляции возбуждающего излучения и узкополосной регистрации флюоресценции позволяют снизить величину интенсивности облучения до 1 Вт/см2, что не превышает интенсивность лазерного излучения, применяемого в низкоинтенсивной терапии. В заключение авторы выражают искреннюю благодарность главному врачу стоматологической поликлиники № 62 ЮАО г. Москвы, заслуженному врачу РФ, канд. мед. наук О.И. Харченко, аспирантам Д.Н. Бахмутову и О.В. Войтенок за плодотворное сотрудничество в диагностических исследованиях. В данной работе использованы результаты исследований, выполненных при поддержке РФФИ, грант № 09-02-00515.

29

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Боровский Е.В., Иванов В.С., Максимовский Ю.М., Максимовская Л.Н. Терапевтическая стоматология. М.: Медицина, 1998. 2. Основы стоматологической биохимии. Учебное пособие. М.: МГМСУ, 2000. 3. Вавилова Т.П., Марокко И.Н., Петрович Ю.А. Основы стоматологической биохимии. М.: РХТУ им. Д.И.Менделеева, 2000. 4. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: ДРОФА, 2006. 5. Левшин Л.В., Салецкий А.М. Люминесценция и ее измерения. М.: Изд-во МГУ, 1989. 6. Руководство по оптической когерентной томографии. М.: Физматлит, 2007. 7. Sinyaeva M., Mamedov A., Vasilchenko S., Volkova A., Loschenov V. // Laser Physics. 2004. V. 14. № 8. P. 1132. 8. Tuchin V. Laser and fiber optics in biomedical study (SSU, Saratov, 1998). 9. Roth K., Duczynski E., Van den Heide H-J., Struve B. // Proc. SPIE. 1993. V. 2080. P. 20. 10. Bakhmutov D., Gonchukov S., Kharchenko O., Nikiforova O., Vdovin Yu. // Laser Physics Letters. 2004. V. 1. № 11. P. 565. 11. Бахмутов Д.Н., Войтенок О.В., Гончуков С.А. // Альманах клинической медицины. 2008. Т. 17. Ч. 1. С. 35. 12. Bakhmutov D., Gonchukov S., Kharchenko O., Voytenok O., Zubov V. // Laser Physics Letters. 2008. V. 5. № 5. P. 375. 13. Bakhmutov D., Gonchukov S., Sukhinina A. // Laser Physics Letters. 2010. V. 7. № 5. P. 384. 14. Бахмутов Д.Н., Гончуков С.А., Сухинина А.В., Янушевич О.О. // Ортодонтия. 2010. № 1. С. 22. 15. Бахмутов. Д.Н., Гончуков С.А., Сухинина А.В., Янушевич О.О. // Стоматология. 2010. Т. 89. № 3. С. 27. 16. Gonchukov S., Biryukova T., Sukhinina A., Vdovin Yu. // Laser Physics Letters. 2010. V. 7. № 11. P. 812. 17. Chiou L.-J., Yang Y.-H., Hung H.-C., Tsai C.-C., Shieh T.-Y., Wu Y.-M., Wang W.-C., Hsu T. // J. Periodont. Res. 2010. V. 45. P. 16.

30

СЛОВАРЬ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТЕРМИНОВ Альвеолы – углубления в челюстях, в которых помещаются корни зубов у млекопитающих. Коллаген – фибриллярный белок, составляющий основу соединительной ткани и обеспечивающий ее прочность. Липиды – жироподобные вещества, входящие в состав живых клеток; основной компонент биологических мембран. Мезенхима – соединительная ткань зародыша многоклеточных животных, закладывающаяся на ранних стадиях их развития. Метаболиты – промежуточные продукты при ферментативных превращениях веществ в клетках. Неинвазивный метод – невозмущающий метод взаимодействия с объектом, не приводящий к его деструктивному или иному заметному изменению структуры и состава. Пародонт – биологическая ткань, окружающая зубы и обеспечивающая их фиксацию в челюстной кости. Пелликула – тонкий защитный слой протоплазмы на поверхности тела. Протеоглиганы – углевод-белковые компоненты биоткани, в которых полисахаридные цепи ковалентно связаны с белком. Тактильный способ – осязательный, «на ощупь», способ обследования. Фагоцитоз – поглощение и переваривание инородных объектов (бактерий, фрагментов клеток, твердых частиц) специализированными защитными клетками организма – фагоцитами. Фиссура – естественные углубления на коронке зуба. Фосфолипиды – природные липиды, содержащие в молекуле остаток фосфорной кислоты. Цитраты – соли и эфиры лимонной кислоты. Эктодерма – наружный слой зародыша многоклеточных животных на ранних стадиях его развития. Этиология – раздел медицины, изучающий причины и условия возникновения болезней.

31