Основы физиологии роста и культивирования микроорганизмов

Пущинский государственный университет Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина

Шкидченко А.Н.

ОСНОВЫ ФИЗИОЛОГИИ РОСТА И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Пущино, 2008

Содержание Введение.................................................................... 3 Глава 1. Периодические культуры............................................. 5 Глава 2. Проточные культуры................................................ 21 2.1. Теория хемостатного культивирования................................... 21 2.2. Аутостабилизация лимитирующих рост факторов в открытых системах.. . . . . .24 Глава 3. Методы культивирования микроорганизмов............................ 32 3.1. Периодическое культивирование......................................... 32 3.2. Отъёмно-доливной метод................................................ 33 3.3. Турбидостат........................................................... 34 3.4. рН-стат............................................................... 37 3.5. Теплостат............................................................. 38 3.6. Квазинепрерывный способ............................................... 41 3.7. Методы синхронизации культур.......................................... 45 3.8. Батарейный многоступенчатый способ.................................... 46 Глава 4. Аппаратура для культивирования.................................... 52 Глава 5. Кислород, абсорбция его питательными средами, методы измерения и действие на микробные популяции............................................ 66 5.1. Растворимость кислорода в жидких средах............................... 66 5.2. Устройства и способы измерения концентрации растворенного кислорода.. .67 5.3. Влияние величины рО2 на микробный метаболизм.......................... 73 Глава 6. .................................................................. 76 6.1. Влияние углекислого газа на микроорганизмы............................ 76 6.2. Влияние повышенной температуры на микроорганизмы......................84 6.3. Влияние рН и Eh на микробные культуры................................. 93 Глава 7. Лимитирование роста микроорганизмов компонентами питательной среды 96 7.1. Лимитирование источником углерода..................................... 96 7.2 Лимитирование роста фосфатами......................................... 105 7.3 Лимитирование микроорганизмов источниками азота....................... 112 Глава 8. Скорость протока среды – как фактор физиологического воздействия. 120

2

Введение Физиология является наукой о питании, росте и прочих жизненных отправлениях организмов, в данном случае - микроорганизмов. Вопрос об обмене веществ микроорганизмов особенно важен еще и потому, что по своему значению в природе и практике человека микробы являются чем-то вроде живых химических реакторов и по интенсивности биохимической деятельности не имеют себе равных. В основе физиологических функций лежит непрерывный обмен веществ, включающий в себя питание и выделение. Поэтому изучение закономерностей обмена веществ между организмом и средой является основным путем к овладению работой этой «живой машины». Бактериальная клетка может переработать за сутки количество пищи, превышающее в 30 – 40 раз ее собственный вес. Необходимо также учесть необычно быстрое размножение микроорганизмов. Биомасса некоторых бактерий удваиваются за полчаса и, следовательно, через каждые 5 часов численность их возрастает в 1000 раз. В условиях нелимитированного роста светящиеся бактерии размножались с фантастической скоростью (средняя продолжительность генерации 5 минут), а кишечная палочка со средним временем генерации около 10 минут! Согласно гипотетическим расчетам при таких скоростях роста микроорганизмы в считанные дни и недели могли бы заполнить всю солнечную систему. Однако в природе этого не происходит, поскольку рост микробных популяций всегда ограничен лимитом внешних факторов. В почве, илах и воде за счет деятельности микроорганизмов непрерывно протекают процессы распада растительных и животных остатков, сложных синтетических соединений до минеральных веществ и газообразных продуктов. Микроорганизмы используются в процессах биосинтеза самых различных продуктов, а также в работе очистных сооружений, что. учитывая повышенные требования к охране окружающей среды, делает это направление их применения особенно важным. Целью настоящего курса является ознакомление студентов и магистрантов с основами

физиологии

Культивирование

управляемого

микроорганизмов

"газ - жидкость - твердое тело

культивирования

осуществляется

(клетки)"

с

в

меняющимися

микроорганизмов.

трехфазных по

ходу

системах процесса

реологическими свойствами, что существенно затрудняет познание закономерностей развития микроорганизмов. Культивирование микроорганизмов, как в лабораторных, так и в промышленных условиях все еще относится скорее к области искусства, чем науки; иначе говоря, эта работа больше связана с интуицией, чем с логикой. Поставленная задача достигается изложением вопросов физиологии роста, культивирования микроорганизмов

3

и дается оценка тех возможностей, которые представляют различные способы периодического и непрерывного культивирования для изучения влияния внешних факторов на поведение микробных популяций, подразумевая под этим совокупность физиологических, биохимических и других изменений в ответ на внешнее воздействие. Рассматриваются вопросы аппаратурного оформления процессов культивирования в зависимости от решаемых задач и особенностей роста микроорганизмов, Решение проблемы управляемого культивирования невозможно без глубокого знания физиологии микроорганизмов, развивающихся в условиях непрерывного культивирования, и реакций микробных популяций на внешние воздействия. Курс предназначен для микробиологов, биологов, биотехнологов и может быть полезен для экологов.

4

Глава 1. Периодические культуры Любой процесс выращивания микроорганизмов в ограниченном объеме питательной среды следует относить к периодическому

культивированию. При периодическом

культивировании рост культуры условно разделяют на несколько фаз: лаг-фаза; фаза ускорения роста; экспоненциальная фаза; фаза замедления роста; стационарная фаза и фаза

лизиса

(рис. 1).

Под

влиянием

изменяющихся

условий

среды

культура

последовательно переходит от одной фазы к другой.

Рис. 1. Фазы роста периодической культуры. I – лаг-фаза; II – фаза ускорения роста; III – фаза экспоненциального роста; IV – фаза замедления роста; V – стационарная фаза; VI – фаза лизиса

Лаг-фаза не является обязательной для роста всех микроорганизмов и ее длительность зависит от состава среды и условий, в которых находилась культура до перенесения в свежую питательную среду. Отсутствие роста в лаг-фазе не означает состояния покоя: клетки увеличиваются в размерах, «оводняются», в них происходят определенные внутриклеточные перестройки, предваряющие процесс клеточного деления. В фазе ускорения роста клетки начинают размножаться, и число делящихся клеток постепенно увеличивается. Далее следует экспоненциальная фаза, наиболее полно характеризующая способность культуры к размножению. Концентрация компонентов питательной среды и продукты метаболизма не ограничивают скорость роста, и размножение идет с максимально возможной скоростью, генетически заложенной в клетке. В этой фазе роста дрожжей продукты метаболизма могут вообще не выделяться в окружающую среду. Быстро растущие клетки потребляют из среды питательные вещества, среда обедняется, постепенно накапливаются продукты метаболизма и культура переходит в стадию замедления роста. Эта фаза представляет для экспериментаторов максимальный интерес, так как в ней достигается наибольший суммарный прирост биомассы, в культуральной среде накапливаются значительные количества продуктов метаболизма,

5

увеличивается активность ряда ферментов. Размножение клеток в этой фазе существенно замедляется, но и к концу фазы замедления в популяции обнаруживается всего 10 % размножающихся клеток. В стационарной фазе скорость роста популяции уравнивается со скоростью отмирания и некоторое время популяция поддерживается в состоянии подвижного равновесия. Длительность стационарной фазы роста зависит от наличия источников энергии. Возможно также, что в стационарной фазе роста клетки находятся некоторое время в состоянии «переживания» не размножаясь, но и не отмирая. В фазе лизиса скорость отмирания клеток увеличивается, снижается вес биомассы и культура гибнет. Визуально,

при

микроскопировании

образцов

микрофлоры

в

процессе

культивирования, можно определить в какой фазе роста находиться культура. На рис. 2 представлены данные по скорости роста и количеству почкующихся клеток дрожжей Torulopsis latvica. Если в фазе ускорения и фазе замедления роста количество почкующихся клеток

составляет порядка 40 % от общей численности, то в

экспоненциальной фазе роста достигает 80 % и более. При этом характер изменения удельной скорости роста дрожжей совпадает во времени с количеством почкующихся клеток.

Рис. 2. Динамика удельной скорости роста и почкования дрожжей Torulopsis latvica при периодическом культивировании: 1 – биомасса; 2 – удельная скорость роста; 3 – количество почкующихся клеток.

6

Периодическая

культура

представляет

собой

популяцию

одного

вида

микроорганизмов. Под популяцией понимается совокупность особей определенного вида, в течение достаточно длительного времени (большого числа поколений) населяющих определенное пространство, внутри которого практически осуществляется та или иная степень

вегетативного

размножения.

Величина

популяции

определяется

либо

численностью ее, т.е. числом всех особей, составляющих данную популяцию, либо ее суммарным весом. Возрастная структура популяции – это соотношение между клетками, находящимися на разных фазах цикла развития и между клетками, прошедшими различное количество делений. При этом к «молодым культурам» относят ранние фазы развития, а к «старым» стационарную фазу и фаз отмирания. Эти термины неточны по своей сути, так как популяционный возраст легко обратим, стоит перенести популяцию

в новые,

благоприятные для роста условия. В популяциях микроорганизмов имеет место мутационный процесс, заключающийся в неточной передаче наследственной информации. Чистые клоновые культуры микроорганизмов, поддерживаемые путем пересевов большого числа клеток на свежие питательные среды, всегда содержат в себе целый ряд мутантных форм, т.е. являются генетически гетерогенными. Это связанно с тем, что частота спонтанных мутаций на клетку составляет в среднем 10-4 – 10-8 за генерацию, а численность природных и промышленных популяций микроорганизмов велика и может составлять 10 6 – 1018 клеток (Печуркин, 1978). Чистые культуры являются гетерогенными во всех отношениях после того, как численность популяций достигнет величины около 108 клеток. Физиологическое состояние микробной популяции обычно характеризуют рядом морфологических и физиолого-биохимических параметров. Скорость размножения одноклеточных организмов судят по тому, как часто они делятся или почкуются. Отрезок времени, в течение которого освободившаяся молодая клетка вырастает до максимальной величины и приступает в свою очередь к делению, называется продолжительностью генерации. Время генерации рассчитывается по формуле: g=

0,693 μ

где μ – удельная скорость роста микробной популяции. Удельная скорость роста выражает количественную связь между концентрацией субстрата и скоростью размножения микроорганизмов, измеряется в единицах, обратных времени (1/t). Для описания этой связи общее признание получила уравнение Моно (Monod, 1950): µ = µ max

S , KS + S

7

где μmax – максимальная удельная скорость роста в данных условиях; S – концентрация субстрата; KS – концентрация субстрата, обеспечивающая реализацию половины μmax. Экономический коэффициент Y выражают в граммах выросшей биомассы на грамм потребленного субстрата или в граммах генного субстрата. Субстрат может учитываться любой, но в первую очередь для характеристики культур важен экономический коэффициент

использования

источника

углерода.

Экономический

коэффициент

рассчитывают по формуле: Y=

dX ∗ 100% , dS

где Y – экономический коэффициент; x – концентрация биомассы в граммах; S – концентрация потребленного субстрата в граммах. Если внешние условия в бактериальной культуре поддерживаются постоянными, то экономический коэффициент тоже будет постоянной, количественно воспроизводимой величиной. В качестве динамических характеристик физиологического состояния микробной

популяции

используют

такие

характеристики

как

метаболический

коэффициент и дыхательный коэффициент. Удельная скорость потребления субстрата характеризуется метаболическим коэффициентом qм и выражается аналогично удельной скорости роста: qm =

1 dS . ∗ x dt

Дыхательный коэффициент характеризует отношение образованного в процессе ассимиляции источника углерода углекислого газа к потребленному кислороду и является величиной безразмерной: qД =

Дополнительной

характеристикой

dCO 2 . dO2

физиологического

состояния

микробной

популяции может служить дыхательная активность, зависящая от фазы роста и наличия источника углерода в среде. Для определения дыхательной активности аэрацию ферментера, снабженного датчиком pO2, отключают на 5 – 10 минут, не меняя остальных параметров культивирования микроорганизмов. Величина pO2 (парциального давления кислорода в жидкости) за счет потребления кислорода микробной популяцией снижается (рис. 3). По линейному участку кривой pO2 определяют tgα угла наклона. А дыхательную активность выражают в относительных единицах как 1/tgα. В процессе измерения не следует допускать снижения pO2 ниже 20 % насыщения среды кислородом.

8

Рис. 3. Измерение дыхательной активности микроорганизмов.

Наиболее полно изменения роста и развития микробной популяции можно проследить в закрытой системе, где скорость роста биомассы должна стремиться к нулю ввиду истощения питательной среды и накопления продуктов метаболизма во времени. При этом культура проходит все фазы роста от лаг-фазы до фазы лизиса и, по мере "старения" популяции, появляется возможность исследовать изменения основных параметров роста и развития. Естественно, что понятие "старения" в микробной популяции не следует понимать как возрастной термин, а лишь как изменение соотношения размножающихся и неразмножающихся клеток. Изучение физиологии роста дрожжей при периодическом культивировании осложняется непрерывно изменяющимися условиями окружающей среды, изучение действия на культуру какого-либо одного фактора крайне сложно ввиду наличия большого числа переменных. Однако, при культивировании на сбалансированной питательной среде, процесс роста можно рассматривать как лимитированный по углероду. Динамика физиологических характеристик роста в периодической культуре Рассмотрим физиолого-биохимические изменения биомассы дрожжей на примере Candida utilis. При периодическом культивировании дрожжей C. utilis на среде с глюкозой максимальное накопление биомассы наблюдалось на 7 – 8 часах культивирования с переходом культуры в стационарную фазу роста и составляло 10,03 г/л по сухому весу. На рис. 3 кривая роста построена по данным измерения оптической плотности микробной суспензии, а коэффициент пересчета на сухой вес, определенный в серии дополнительных экспериментов составляет 0,76. Экономический коэффициент процесса в этих условиях составлял 50 %. Концентрация глюкозы в питательной среде снижалась по мере

9

потребления и к 7 часу культивирования составляла 70 мг/л (рис. 4). Концентрация растворенного в среде кислорода снижается в момент выхода культуры из лаг-фазы и к 7 часу культивирования составляет 40 % насыщения, а затем, постепенно возрастает, представляя, таким образом, переменную величину в разных фазах роста микробной популяции.

Рис. 4. Некоторые характеристики роста дрожжей C. utilis при периодическом культивировании: 1 – биомасса, 2 – концентрация растворенного кислорода, 3 – концентрация глюкозы; 4 – концентрация углерода продуктов метаболизма.

О наличии продуктов клеточного метаболизма в культуральной жидкости судим по разнице между суммарным углеродом и углеродом глюкозы, определенным в той же пробе. Содержание продуктов метаболизма в среде постепенно возрастало и достигало максимума к 6 часу культивирования. Наличие в культуральной жидкости 1,33 г/л углерода продуктов обмена соответствует 3,32 г органических веществ (коэффициент пересчета, 2,5 взят по глюкозе). После исчерпания глюкозы в среде происходит частичная утилизация продуктов обмена, вследствие чего возникла необходимость оттитровывания освобождающейся щелочи, первоначально использованной для оттитровки кислых продуктов обмена при рН-статировании ферментера. Скорость потребления глюкозы постепенно возрастает при переходе культуры от лаг-фазы к фазе экспоненциального роста и достигает максимального значения в 5,0 г/л/час на 5 часу культивирования, а затем резко снижается в течение 2 часов при исчерпании глюкозы в среде (рис. 4). Но при этом следует учитывать, что скорость потребления глюкозы рассчитывалась по разнице её концентраций во времени, определяемой аналитически. Определение скорости потребления глюкозы по разнице её концентраций в среде еще не позволяет делать выводы о фактической утилизации её как

10

источника углерода, так как в среде накапливались продукты клеточного метаболизма и фактическая утилизация глюкозы была несколько ниже, чем полученная расчетным способом по разнице концентраций во времени. Обращает на себя внимание тот факт, что концентрация глюкозы в среде некоторое время поддерживается на уровне 70 мг/л при одновременном снижении концентрации углеродсодержащих продуктов метаболизма в среде (рис. 5).

Рис. 5. Динамика потребления глюкозы и выделение СО 2 дрожжами C. utilis при периодическом культивировании: 1 – биомасса; 2 – глюкоза; 3 - СО2.

Динамика выделения углекислого газа при периодическом культивировании хорошо коррелирует со скоростью потребления глюкозы, но следует отметить довольно высокую скорость выделения СО2 после исчерпания глюкозы в среде (рис. 5). По-видимому, это происходит за счет потребления части продуктов метаболизма, концентрация которых в это время несколько снижается. Удельная скорость роста дрожжей достигает 0,54 час-1 в экспоненциальной фазе роста, а затем, несмотря на наличие в питательной среде глюкозы, резко снижается до 0,07 час-1 (рис. 6). На S-образной кривой роста этот участок выглядит в виде ступеньки линейного роста. Затем скорость роста возрастает и снова снижается ввиду исчерпания в среде глюкозы. Возможно, причина замедления роста популяции в экспоненциальной фазе роста заключается не в изменении условий культивировании, а в исчерпании либо снижении активности внутриклеточных компонентов, ответственных за интенсивность биосинтетических процессов. Возможны и другие причины замедления роста популяции в экспоненциальной фазе роста, такие как накопление внутриклеточных метаболитов или синхронизация деления клеток в результате перепада концентрации элементов питания в среде.

11

Рис. 6. Характеристики роста дрожжей C. utilis: 1 – биомасса; 2 – dCO2/dx; 3 – μ, час-1.

Удельная скорость выделения углекислого газа достигает максимума на 3 часу культивирования и составляет 179 мг/г сухой биомассы, а затем постепенно снижается. Максимумы удельных скоростей роста и выделения углекислого газа не совпадают по времени. Исследованные и описанные физиологические характеристики роста дрожжей C. utilis при периодическом культивировании обусловлены изменениями в составе среды в процессе

исчерпания

источника

углерода

и,

по-видимому,

внутриклеточными

перестройками, происходящими в процессе роста и развития популяции. Одной из характеристик внутриклеточного состояния дрожжей может служить величина фракции подвижной воды, неудаляемой при лиофилизации биомассы. Согласно данным, полученным с помощью метода спинового эха ядерного магнитного резонанса (ЯМР), в клетках высушенных дрожжей различных видов сохраняется фракция подвижной воды. Устойчивость этой фракции воды к дальнейшей сушке может быть объяснена её изоляцией от непосредственного воздействия неблагоприятных факторов внешней среды в клетках дрожжей в целом или в отдельных внутриклеточных структурах. Сохранение воды в таких структурах является одним из необходимых условий для сохранения жизнеспособности того или иного штамма дрожжей после лиофилизации. Дополнительные сведения о природе и состоянии подобных внутриклеточных структур после высушивания могут дать исследования фракции подвижной воды в клетках дрожжей, лиофилизированных на различных фазах роста. Фракция подвижной воды способна характеризовать степень завершенности мембранных структур клеток дрожжей в зависимости от фазы роста.

12

Исследование высушенной биомассы дрожжей методом спинового эха ЯМР показало, что клетки устойчивы к лиофилизации и сохраняют определенное количество жидкой воды после лиофилизации. Об этом свидетельствует наличие медленной компоненты спада спинового эха от протонов с Т 2 = 20Мсек, то есть с параметрами, близкими компонентам спада от подвижной воды для других видов дрожжей. Вместе с тем её амплитуда обнаруживает значительную зависимость от фазы роста и развития культуры. На рис. 7 приведены результаты одного из опытов для дрожжей, взятых в конце экспоненциальной фазы и в фазе замедления скорости роста. Видно, что амплитуда сигналов

спинового

эха

возрастает

в

несколько

раз

при

переходе

от

фазы

экспоненциального роста к стационарной фазе. При этом время релаксации Т 2, характеризующее подвижность воды, оставшейся в клетках дрожжей, практически не меняется. Следовательно, доля структур, заключающих в себе подвижную воду в клетках высушенных дрожжей, существенно зависит от фазы роста дрожжей, тогда как подвижность этой воды на молекулярном уровне остается практически постоянной.

Рис. 7. Кривые спада амплитуды спинового эха для лиофилизированных дрожжей C. utilis взятых из различных фаз роста: 1 – 5часов культивирования; 2 – 7час.; 3 – 8час.; 4 – 9час.; 5 – 10час. (Кривая роста дана на рис. 18)

Количество подвижной воды, остающейся в клетках дрожжей Candida utilis после лиофилизации, а следовательно, и доля структур, заключающих в себе эту воду, претерпевает изменение не только в стадии экспоненциального роста. На рис. 8 представлены сводные данные для ряда опытов по количеству подвижной воды, остающейся в высушенной биомассе (в % от её веса) дрожжей C. utilis, начиная от инокулюма и кончая стационарной фазой роста. Максимальное количество подвижной воды в высушенной биомассе остается в клетках инокулюма - 3,5 – 4 %. Это количество близко к доле подвижной воды для ряда видов дрожжей, выращенных на плотной питательной среде. Но уже в лаг-фазе наблюдается постепенное падение доли подвижной воды, а в экспоненциальной фазе роста она падает на порядок - до нескольких десятых

13

долей процента от веса высушенной биомассы. Снижение скорости роста дрожжей при исчерпании в среде глюкозы сопровождается увеличением доли подвижной воды и в ранней стационарной фазе роста она достигает 2,5 % от веса высушенной биомассы.

Рис. 8. Изменение относительных прочностных свойств и содержание подвижной воды в лиофилизированных дрожжах C. utilis в зависимости от фазы роста: 1 – биомасса; 2 – подвижная вода; 3 – время разрушения клеток.

Изменение количества подвижной воды в высушенной биомассе дрожжей C. utilis наблюдается и на фазах, следующих за достижением стационарной фазы роста, то есть в фазе отмирания. На рис. 9 приведены данные исследования для водной компоненты в лиофилизированной биомассе после выхода культуры в стационарную фазу роста. Приведены два возможных варианта: опыт с быстрым отмиранием клеток (рис. 9а) и опыт с длительным поддержанием стационарного уровня (рис. 9б). Как видно из рисунка, уменьшение концентрации биомассы за счет лизиса культуры вызывает быстрое падение доли подвижной воды в высушенных дрожжах, заключенной во внутриклеточных структурах. Реальное падение количества подвижной воды, по-видимому, происходит еще быстрее, так как в исследованиях использовалась осажденная биомасса, а при центрифугировании осаждаются в первую очередь целые клетки.

14

Рис. 9. Изменение содержания подвижной воды в лиофилизированных дрожжах C. utilis в стационарной фазе роста: 1 – фаза отмирания; 2 – длительной поддержание стационарной фазы роста.

Уменьшение доли подвижной воды в фазе отмирания культуры, по-видимому, отражает разрушение внутриклеточных мембранных структур, в результате чего изолированная подвижная вода может извлекаться из клеток дрожжей при высушивании. Определенные изменения в мембранных структурах, по-видимому, наблюдаются и на других фазах роста. Дополнительные сведения о них дает исследование прочностных свойств клеток дрожжей. На рис. 8 приведены данные по относительным прочностным свойствам клеток дрожжей C. utilis на различных фазах роста культуры. Прочностные характеристики клеток в ходе роста и развития популяции изменяются примерно в полтора раза, причем наиболее чувствительными к действию ультразвука оказались клетки в экспоненциальной фазе роста. Об этом же свидетельствует и значительно более высокий выход белка из клеток на экспоненциальной фазе роста по сравнению с лаг-фазой и стационарной фазой после ультразвуковой обработки суспензии клеток дрожжей. Увеличение времени облучения несколько уменьшает различия в выходе белка. Сопоставляя эти результаты с приведенными выше данными исследования лиофилизированных дрожжей C. utilis методом спинового эха ЯМР, следует отметить хорошую корреляцию между уменьшением или повышением прочностных свойств клеток и соответственно уменьшением или увеличением доли изолированной подвижной воды, остающейся в клетках дрожжей при высушивании. Вместе с тем увеличение доли изолированной подвижной воды совпадает с резким падением концентрации глюкозы в среде, что, в частности, вызывает увеличение числа митохондрий в клетках дрожжей и к

15

появлению митохондрий с типичной внутренней структурой. Следовательно, не исключена возможность связи наблюдаемых структур с митохондриями дрожжей. Но изменения в характеристике мембранных структур, как следует из данных по прочностным свойствам, наблюдаются и для клеток в целом и это не позволяет сделать определенный вывод в пользу данных органелл. Вместе с тем не вызывает сомнений связь фракции изолированной подвижной воды с мембранным структурами, наличие дефектов в которых и, по-видимому, незавершенность развития в экспоненциальной фазе роста приводит к резкому падению прочностных характеристик клеток и доли изолированной подвижной воды, оставшейся в клетках при высушивании. Естественно предполагать, что исследованные физиологические и структурные перестройки микробной популяции в процессе периодического выращивания должны коррелировать с интенсивностью функционирования белоксинтезирующего аппарата. С целью выяснения возможности подобной корреляции исследовали динамику содержания белка, величины пула аминокислот и нуклеиновых веществ. Несмотря на отсутствие единого мнения о роли аминокислотного пула в клеточном метаболизме представлялось важным исследовать его динамику по фону изменения остальных показателей роста и развития микробной популяции и попытаться найти коррелятивные связи с другими переменными факторами.

Рис. 10. Динамика аминокислотного пула и суммы нуклеиновых кислот при периодическом культивировании дрожжей C. utilis: Х – биомасса; нк – нуклеиновые кислоты; СВАК – свободные аминокислоты.

Содержание свободных внутриклеточных аминокислот в биомассе резко снизилось после внесения инокулюма, взятого из стационарной фазы роста, в свежую питательную

16

среду, причем основные изменения происходили в течение первых 30 минут после внесения (рис. 10). Падение пула составляло 31 % его абсолютной величины. Таблица 1. Содержание свободных внутриклеточных аминокислот на различных стадиях роста дрожжей Candida utilis (в % от сухого веса). свободные

время опыта

аминокислоты инокул лизин гистидин аргинин аспарагиновая треонин серии глутаминовая пролин глицин аланин валин метионин изолейцин лейцин тирозин фениланин

ят 0,37 0,09 0,44 0,16 сл 0,63 2,31 0,05 0,05 0,82 0,15 0,23 0,05 0,07 0,07 0,07

сумма

5,56

5мин.

15мин. 30мин. 45мин

1час

2часа

5часов 8часов

10час

0,42 0,05 0,22 0,14 сл 0,56 2,0 0,02 0,04 0,79 0,22 нет 0,07 0,04 0,04 0,03

0,44 0,07 0,23 0,16 сл 0,56 1,79 0,02 0,04 0,67 0,24 сл 0,05 0,04 0,04 0,02

0,29 0,024 0,22 0,05 сл 0,64 1,41 0,01 0,03 0,98 0,11 сл 0,02 0,02 0,01 0,035

0,46 0,06 0,32 0,06 сл 0,57 1,75 0,03 0,04 0,81 0,08 0,02 0,02 0,02 0,02 сл

0,98 0,01 0,61 0,08 сл 0,38 1,04 сл 0,04 0,82 0,35 0,01 0,015 0,01 0,08 0,02

0,66 0,06 1,0 0,04 сл 0,72 2,12 0,03 0,048 0,88 0,11 0,02 0,017 0,01 0,054 0,02

0,72 0,16 0,97 0,04 сл 0,64 2,18 0,03 0,045 0,88 0,14 0,02 0,02 0,02 0,055 0,02

0,74 0,13 1,25 0,02 сл 0,23 2,15 0,03 0,047 0,18 0,15 0,02 0,015 0,02 0,097 0,03

0,48 0,08 0,37 0,23 сл 0,21 2,20 0,034 0,032 0,37 0,16 0,07 0,08 0,09 0,05 0,09

4,64

4,34

4,01

4,25

4,37

4,84

5,94

6,01

4,54

При этом изменялась не только суммарная величина пула, но и содержание отдельных аминокислот претерпевало существенные изменения. В течение первых 30 мин после внесения инокулюма в питательную среду содержание серина изменялось мало, а содержание гистидина, аргинина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой снижалось соответственно на 73, 50, 69 и 40 % первоначальной величины. Следует отметить, что роста дрожжей в это время еще не наблюдалось, и указанные изменения происходили в период подготовки клеток к делению. Снижение содержания свободных внутриклеточных аминокислот прекращалось с переходом культуры в фазу ускорения, предшествовавшую экспоненциальному росту дрожжей. С переходом культуры к активному росту величина аминокислотного пула возрастала, достигала максимума при выходе культуры в стационарную фазу роста, а затем, в фазе отмирания вновь снижалась, что связано, повидимому, с выходом свободных аминокислот из клеток в окружающую среду. Качественных изменений аминокислотного пула на различных фазах роста не наблюдалось, а количественно в составе пула преобладали аргинин, серии и глутаминовая кислота. Последняя составляла на различных фазах роста от 35 до 43 % величины пула. Динамика содержания отдельных аминокислот пула носит индивидуальный характер, что

17

связано, по-видимому, с интенсивностью протекания биосинтетических процессов в клетках (табл. 1). Данные

о

лабильности

пула

свободных

внутриклеточных

аминокислот

в

зависимости от условий культивирования микроорганизмов приводятся в ряде работ и во всех случаях отмечено возрастание величины пула по мере "старения" микробной популяции. Однако, эти исследователи приводят не динамику пула, а лишь характер его увеличения по мере роста культур, так как пробы для анализов отбирались с интервалом от нескольких часов до суток, а основные перестройки пула происходят в процессе подготовки клеток к делению, то есть сразу после внесения культуры в питательную среду. Полученные экспериментальные данные позволяют предполагать, что существует определенная корреляция между фазами роста микробной популяции и динамикой аминокислотного пула. В свете этих данных предпочтительнее рассматривать роль пула свободных внутриклеточных аминокислот не как внутриклеточной буферной системы, а скорее как материала биосинтетических процессов в клетке. При таком подходе величина и состав аминокислотного пула могут служить характеристикой физиологического состояния микробной популяции. Содержание нуклеиновых кислот несколько снижается в лаг фазе, затем резко возрастаем в фазе ускорения и достигает максимума в логарифмической фазе роста (рис. 10). Суммарное содержание нуклеиновых кислот, по мере приближения к стационарной фазе роста, постепенно снижается и в стационарной фазе соответствует исходному содержанию в клетках инокулюма, взятых из стационарной фазы роста. Динамика содержания нуклеиновых кислот на разных стадиях роста дрожжей Candida utilis не обнаруживала каких-либо отклонений от результатов, полученных другими исследователями для различных культур микроорганизмов. Максимальное содержание нуклеиновых кислот в клетках соответствует фазе ускорения роста популяции, но может и не иметь прямой связи со скоростью роста ввиду того, что наиболее интенсивный синтез нуклеиновых кислот предваряет по времени фазу наиболее интенсивного размножения культуры и синтеза белка. Основную массу нуклеиновых кислот у микроорганизмов составляет рибосомальная РНК и, очевидно, увеличение биосинтеза этого биополимера в клетках происходит, главным образом, за счет синтеза рибосом. Одной из причин лаг-фазы (или замедления роста) является необходимость предварительной заготовки структур, обеспечивающих биосинтез белка, то есть рибосом, высокое содержание которых необходимо для перехода клеток к более быстрому росту. Биосинтез РНК снижается или совсем прекращается со снижением скорости роста микробной популяции под действием внешних факторов. Переход клеток в фазу

18

замедления скорости роста и стационарную фазу сопровождается деградацией РНК до кислоторастворимых продуктов и общее содержание нуклеиновых кислот в биомассе снижается. В процессе роста и развития микробной популяции содержание клеточного белка также претерпевает определенные изменения (рис. 11). Содержание белка снижалось с 51,8 % до 33,3 % в течение первых 15 минут после внесения инокулюма в свежую питательную среду (то есть на 36 % абсолютной величины). Через 45 минут, с появлением почкующихся клеток (фаза ускорения), содержание белка возрастает до 38 % и в дальнейшем, плавно повышается, достигая в стационарной фазе роста 51,04 %. Следует отметить, что в фазе замедления роста содержание белка несколько превышало его содержание в стационарной фазе и составляло 56,3 %. Это увеличение происходило, в основном, за счет повышения содержания в белке таких аминокислот, как лизин, треонин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты (табл. 2). Переход культуры в фазу отмирания характеризовался снижением содержания клеточного белка.

Рис. 11. Динамика содержания белка у C. utilis при периодическом культивировании: Х – биомасса.

Резкое снижение содержания белка в клетках (в течение первых 15 минут после внесения инокулюма в среду) связано, по-видимому, с внутриклеточными перестройками и подготовкой культуры к активному росту, так как изменения концентрации биомассы в это время не происходит. Когда в качестве инокулюма использовали культуру, взятую из логарифмической фазы роста, то резких изменений содержания белка в клетках при внесении в свежую питательную среду не происходило и в процессе роста дрожжей содержание белка в клетках только возрастало. Возможно, что снижение содержания белка в клетках (взятых из стационарной фазы роста) после внесения в свежую питательную среду сопряжено с увеличением объема клеток (оводнением), при котором

19

появляется необходимость в дополнительном синтезе компонентов клеточной стенки и продукты деструкции белков используются для этих целей. Таблица 2. Содержание связанных аминокислот белка на различных стадиях роста дрожжей Candida utilis (в % от сухого веса). связанные

время опыта

аминокислоты белка инокулят лизин 4,38 гистидин 0,82 аргинин 2,87 аспарагиновая 5,33 треонин 3,29 серии 2,95 глутаминовая к-та 6,84 пролин 1,47 глицин 2,17 аланин 3,48 валин 3,63 метионин 1,11 изолейцин 3,06 лейцин 4,93 тирозин 2,52 фенилаланин 3,01 сумма

51,8

5мин. 5,58 0,93 2,51 4,80 2,67 2,67 5,81 1,35 1,82 2,64 2,84 0,70 2,38 3,95 2,04 2,23

15мин. 3,02 0,60 1,79 3,38 2,06 1,96 4,55 1,24 1,43 2,06 2,25 0,57 1,84 3,08 1,64 1,88

45мин 3,70 0,70 2,41 4,35 2,28 2,17 5,16 1,59 1,60 2,25 2,41 0,54 2,02 3,24 1,60 2,0

1час 3,58 0,67 2,14 3,99 2,45 2,29 5,40 1,61 1,72 2,58 2,75 0,42 2,43 4,41 1,69 2,13

2часа 5,81 0,688 2,44 4,89 2,74 2,69 5,80 1,82 1,78 2,76 2,80 0,66 2,43 3,95 1,89 2,26

5часов 5,72 сл. 2,67 6,80 3,65 3,52 7,21 2,18 2,38 4,11 3,82 0,65 3,35 5,11 2,21 2,88

8часов 4,73 0,98 2,84 5,24 2,66 2,62 6,72 1,18 2,12 3,00 3,40 0,98 2,86 5,64 2,48 2,96

10часов 4,24 0,74 2,47 4,77 2,74 2,74 5,96 1,43 2,02 2,91 2,96 0,73 2,57 5,01 2,21 2,58

44,92

33,3

38,0

40,26

45,6

56,3

51,04

46,08

В ходе дальнейших исследований было показано, что при изменении условий культивирования происходит перераспределение белков между отдельными фракциями и изменение аминокислотного состава отдельных фракций белков. Детальное исследование динамики пула свободных внутриклеточных аминокислот, динамики и аминокислотного состава белка и их зависимости от фазы роста микроорганизмов открывает широкие перспективы в решении проблемы получения дрожжевого белка заданного состава. Суммируя результаты исследования роста и развития дрожжей при периодическом культивировании

следует

отметить,

что

внешние

проявления

физиологического

состояния

микробных популяций, такие

изменений

как скорость

роста,

потребление субстрата, накопление продуктов метаболизма и дыхательная активность коррелируют с изменением внутриклеточных структур, содержанием белка и его аминокислотным составам, величиной и составом аминокислотного пула, содержанием нуклеиновых кислот. Это еще раз подтверждает тезис о взаимосвязанности и взаимообусловленности всех внутриклеточных процессов.

20

Глава 2. Проточные культуры. Причиной изменения темпа роста, морфологии и физиологии культуры является изменение состава среды под влиянием жизнедеятельности самих микроорганизмов. Чтобы избежать этих явлений и стабилизировать культуру в одном и том же состоянии, применяют

проточные,

непрерывно

обновляемые

среды.

Метод

проточного

культивирования пришел в микробиологию из химической технологии. Принцип проточного

культивирования

состоит

в том, что в сосуд,

где размножаются

микроорганизмы, непрерывно подается свежая питательная среда и одновременно выводится такой же объем культуральной жидкости с клетками, а объем жидкости в культиваторе остается постоянным. В идеале, перемешивание в культиваторе должно быть полным, то есть капли поступающей свежей среды должны немедленно и однородно распределяться по всей культуре. Популяция, таким образом, осуществляя непрерывный обмен веществом и энергией с внешней средой, развивается в открытой системе. Первые

попытки

осуществления

в

лаборатории

непрерывного

проточного

культивирования относятся к работам С.Н. Виноградского и М.Д. Утенкова, но полное теоретическое обоснование непрерывные культуры получили в 1950 году в классических работах Ж.Моно (Monod, 1950). В основе метода непрерывного культивирования лежит принцип внешнего и внутреннего регулирования скорости роста популяции.

2.1. Теория хемостатного культивирования. Теория хемостатного культивирования исходит из того, что рост культуры ограничивает один компонент среды и позволяет предсказывать зависимость между скоростью роста, плотностью популяции и концентрацией лимитирующего субстрата в среде. Скорость разбавления (D) при установившемся стационарном состоянии, когда культура развивается с постоянной скоростью при постоянных условиях, равна удельной скорости роста: D=

1 dx ∗ = µ час − 1 . x dt

В зависимости от соотношения скорости разбавления (D) и удельной скорости роста (μ), возможны следующие варианты (рис. 12).

21

Рис. 12. Возможные варианты хемостатной культуры. 1 - D > μmax; 2 - D < μmax

В начале роста добавления свежей среды не происходит и рост биомассы протекает как в периодической культуре. После подачи свежей среды со скоростью D возможно: 1) если D < μmax концентрация биомассы возрастает и стабилизируется на определенном уровне, а концентрация лимитирующего компонента среды снижается до уровня пороговой концентрации и ограничивает скорость роста; 2) D > μmax биомасса вымывается из ферментер, а концентрация лимитирующего роста субстрата стремиться к увеличению до уровня S0. В первом случае удельная скорость роста биомассы будет ниже μ max и будет определяться скоростью потока среды D. Такое стационарное состояние является саморегулирующимся. Скорость роста микроорганизмов в стационарном состоянии в ферментере рассчитывают по формуле: µ = µ max ∗

S , S + KS

где μmax - максимально возможная скорость роста; KS – субстратная константа Моно, численно равная концентрации лимитирующего субстрата, которая, ограничивая рост, замедляет его вдвое. В ряде случаев в культуральной жидкости содержаться продукты микробного метаболизма. Накапливаясь в среде, они тормозят всю цепь реакции, которая

22

ведет от ассимилируемого субстрата к конечным продуктам. Согласно исследованиям Н.Д. Иерусалимского зависимость удельной скорости роста от концентрации продукта-ингибитора может быть представлена в форме следующего уравнения: µ = µ

max

∗

KP , KP + P

где P – концентрация продукта, ингибирующего рост; KP – констаната ингибирования, численно равная концентрации продукта, при котором скорость роста достигает половины максимальной. Это уравнение по форме соответствует уравнению не конкурентного торможения энзиматических реакций. Иногда, желая учесть одновременное действие субстрата и ингибитора, записывают зависимость удельной скорости роста μ от S и P в объединенное выражение: µ = µ

max

∗

KP S ∗ , S + KS KP + P

более известное как уравнение Моно-Иерусалимского. Во время переходных процессов между стационарными состояниями (например, при изменении

концентрации

лимитирующего

рост

компонента

среды)

изменение

концентрации биомассы можно определить из уравнения: dx = ( µ − D ) ∗ x, dt

Но в стационарном состоянии, когда

dx = 0 , мы имеем μ = D. Скорость потребления dt

субстрата в стационарном состоянии dS μx , = D(S R − S) − dt Y

Где SR – концентрация субстрата в поступающей среде; S – концентрация субстрата в биореакторе; Y – экономический коэффициент. Длительное

время

существовало

мнение,

что

в

условиях

непрерывного

культивирования воспроизводятся отдельные состояния культуры, характерные для ее роста в периодических условиях. При этом экспериментальные данные, полученные при непрерывном культивировании, экстраполировали на S-образную кривую роста и использовали для объяснения физиологического состояния культуры в разных фазах роста. Подобный подход не совсем корректен ввиду того, что при периодическом культивировании микробная популяция подвергается воздействию комплекса постоянно меняющихся условий внешней среды: снижается концентрация питательных веществ и

23

нарастает

концентрация

продуктов

метаболизма.

Каждое

мгновенное

состояние

микроорганизмов в процессе периодического роста предопределяется комплексом предшествовавших состояний или, как принято говорить, предысторией культуры. В условиях непрерывного хемостатного культивирования с ограничением роста каким-либо определенным компонентом среды комплекс действующих факторов оказывается иным, чем при периодическом культивировании. С одной стороны микробная популяция испытывает постоянное действие селектирующего фактора, которым является скорость протока среды, а с другой стороны культура находится при постоянном недостатке одного из элементов питания и, безусловно, подвергается длительному воздействию постоянного уровня находящихся в среде продуктов метаболизма. Таким образом, равенство удельных скоростей роста дрожжей при периодическом и непрерывном культивировании отнюдь не означает тождества их физиологического состояния и использование данных, полученных при непрерывном культивировании, для интерпретации поведения периодической культуры без соответствующих оговорок недопустимо.

Метод

непрерывного

культивирования

существенно

расширяет

возможности экспериментатора по управлению ростом и развитием микроорганизмов, создает условия для направленного синтеза интересующих нас продуктов метаболизма и обеспечивает получение воспроизводимых во времени результатов. Указанный комплекс преимуществ предопределяет перспективность и широкое распространение методов непрерывного культивирования в исследовательской практике и в промышленном получении продуктов микробного синтеза. Выбор лимитирующих рост факторов обусловлен, как правило, целевыми задачами эксперимента, но законы реагирования микроорганизмов на тот или иной вид голодания, еще далеко не выявлены, предсказать, что произойдет с клетками при той или иной лимитации можно только с малой степенью вероятности.

2.2. Аутостабилизация лимитирующих рост факторов в открытых системах. При анализе хемостатных процессов культивирования микроорганизмов, рост которых был ограничен известным лимитирующим фактором, ряд исследователей отмечали неполное использование культурами лимитировавшего рост компонента среды. При культивировании Az. vinelandii в режиме хемостата с лимитированием роста сахарозой Н.Д.Иерусалимский обнаружил в вытекавшей из ферментера культуральной жидкости

неиспользованную

культурой

сахарозу

24

в

концентрации

70 мг/л.

При

культивировании дрожжей рода Candida в режиме хемостата с лимитированием роста фосфатами, фосфор становился недоступным для клеток, если его концентрация составляла меньше 8 миллионных долей от веса среды. Рост дрожжей Candida utilis при проточном культивировании с D = 0,25 час-1 лимитировали источниками углерода и азота. На рис. 13а представлены результаты лимитирования роста глюкозой, причем каждая точка на кривых 1 и 2 представляет стационарный процесс, отличающийся один от другого концентрацией глюкозы в подающей среде. Неутилизированная концентрация глюкозы в вытекающей из ферментера среде составляет 80 мг/л и не зависит от концентрации биомассы и содержания глюкозы в подаваемой среде. Из данных отчетливо видна независимость S от S0 и прямая пропорциональность между х и S0 вплоть до S0 = 10 г/л. Лимитирование роста дрожжей Candida utilis источником азота в аналогичных условиях эксперимента (рис. 13б) обнаруживало наличие неутилизированного азота на уровне 0,016 г/л на протяжении всего процесса хемостатного культивирования. Закономерность независимости S от S0 обнаруживалась вплоть до снятия лимита по азоту при подаче свежей питательной среды, содержавшей менее 0,75 г/л источника азота.

Рис. 13. Эффект аутостабилизации лимитирующих факторов при хемостатном культивировании дрожжей. а – лимитирование глюкозой: 1 – биомасса; 2 – концентрация глюкозы в среде. б – лимитирование источником азота: 1 – биомасса; 2 – концентрация азота в среде.

Эти наблюдения носили случайный характер, и экспериментаторы называли определенные ими концентрации лимитирующих рост компонентов «неутилизируемыми» или остаточными. С нашей точки зрения концентрация компонентов, остающихся в питательной среде при лимитировании ими скорости роста микроорганизмов, следует

25

называть пороговыми концентрациями согласно терминологии, принятой при описании физиологических лимитирующих

исследований. рост

При

компонентов

таком

среды

подходе

пороговые

можно рассматривать

концентрации как

показатели

физиологической активности микробной популяции и использовать для характеристики физиологического состояния микроорганизмов. Логично предполагать, что способностью к аутостабилизации должны обладать и другие факторы внешней среды, способные ограничивать скорость роста микробных популяций, такие как рН культуральной среды. Исследовали возможность аутостабилизации рН при следующих исходных рН питательной среды: 4,0; 6,18; 8,0, создавая исходное рН за счет соотношения первичных и вторичных фосфатов, а в качестве контроля использовали культивирование дрожжей при рН 5,5. Инокулюм дрожжей Candida utilis вносили в ферментер и вели культивирование при D = 0,25 час-1 при рН 5,5. После установления состояния подвижного равновесия концентрации биомассы в протоке систему принудительного рН-статирования отключали, и рН снижался до 2,9, и на этом уровне наблюдалась его стабилизация (рис. 14). Снижение рН происходило сразу после отключения подачи титрующего агента. И в течение 12 мин рН снижался с 5,5 до 4,0, причем концентрация биомассы не изменялась в течение первого часа. Затем начинался переходный процесс, нестабильное состояние биомассы сохранялось в течение длительного промежутка времени и связано, очевидно, с переходом от лимитирования роста дрожжей недостатком глюкозы к ингибированию ионами водорода. Анализ кинетики переходных процессов после шока низкими значениями рН среды

(2,2 – 2,3)

у

дрожжей

Candida utilis

приведен

в

работе

Работновой

(Работнова, 1976).

Рис. 14. Аутостабилизация рН при проточном культивировании дрожжей Candida utilis. 1 – биомасса; 2 – скорость протока; 3 – подаваемая глюкоза; 4 – рН культуральной жидкости; 5 – остаточная глюкоза.

26

Следует отметить, что в указанной работе не удалось получить устойчивого состояния по концентрации биомассы, поскольку задавались экстремальные значения рН, и происходило вымывание культуры. Переходные процессы в наших опытах занимали длительный промежуток времени от 25 до 65 часов, причем изменения рН и концентрации биомассы носили характер затухающих осцилляций. Доказательством смены лимитирующего рост дрожжей фактора служит увеличение концентрация остаточной глюкозы в вытекающей из ферментера культуральной жидкости до 3,1 г/л. Пороговая концентрация глюкозы для исследуемой культуры составляет 70 мг/л, а увеличение концентрации остаточной глюкозы характерно для периода смены факторов, ограничивающих рост микробной популяции. Величина установившегося рН среды в новом режиме может быть названа критической по аналогии с критической величиной температуры при ограничении роста дрожжей в режиме аутотермостата. Снижение рН приводит к снижению удельной скорости роста дрожжей, концентрация

биомассы

снижается,

что

приводит

к

снижению

содержания

в

культуральной среде кислых продуктов метаболизма. Снижение скорости накопления кислых продуктов приводит к увеличению удельной скорости роста и колебательный такт возобновляется. Снижение концентрации глюкозы в подаваемой питательной среде с 10 г/л до 5 г/л сопровождалось снижением концентрации биомассы в протоке, но величина рН при этом не изменялась и поддерживалась на уровне 2,9 рост дрожжей в этих условиях ингибировался низким значением рН, а концентрация остаточной глюкозы превышала пороговую

концентрацию.

Морфологических

изменений

культуры

в

режиме

аутостабилизации рН не наблюдалось. Следует отметить, что аутостабилизация рН наблюдается при культивировании дрожжей на питательных средах с малой буферной емкостью. При выращивании на сильно забуференных питательных средах эффекта аутостабилизации не наблюдается и величина рН культуральной жидкости зависит от интенсивности образования кислых продуктов метаболизма. Данные, полученные при хемостатном культивировании изучавшихся штаммов дрожжей и обнаруженные в литературе, позволили в обобщенном виде рассмотреть способность микробных популяций к аутостабилизации лимитирующих рост факторов. Естественно, что для специалистов, занимающихся вопросами динамики и развития микробных популяций, поиск и изучение ограничивающих рост факторов имеют первостепенное значение. Важность изучения такого рода факторов вытекает из следующих соображений: во-первых, потенциальное единовременное ограничение роста

27

сразу многими факторами на самом деле реализуется «разнесением» действия этих факторов во времени, т.е. имеет место принцип Либиха или принцип узкого места. Это позволяет сконцентрировать внимание на изучении небольшого круга факторов, ограничивающих рост; во-вторых, при надлежащем уровне знаний существование небольшого числа лимитирующих «мест», ограничивающих рост в данный момент времени, позволяет эффективно использовать эти немногие факторы, как рычаги управления системой; в-третьих, глубокий анализ динамики уровня контролирующего фактора позволяет выявить свойства, присущие только этим факторам, и наметить методическую основу для быстрого поиска истинно лимитирующих факторов среди потенциально возможных, и получить результаты, касающиеся корреляции действия факторов. Однако, односторонний контроль развития биологической системы со стороны внешней среды лишь часть отношений системы со средой. Проявление этого контроля зачастую имеет взаимообразный характер, т.е. рост популяции, в свою очередь, воздействует на величину контролирующего параметра и изменяет его. Наличие определенной обратной связи между действующими факторами и плотностью популяции приводит к динамике уровня этого фактора в системе. В итоге уровень фактора в системе как результирующий двух потоков: внешнего и внутреннего, зависящего от плотности популяции, также застабилизируется. Указанное явление стабилизации фактора, зависящего от плотности на некотором уровне, в дальнейшем будем называть эффектом аутостабилизации. Рассмотрим некую идеализированную схему проточной системы, в которой условно выделим вход (зону поступления утилизируемого субстрата) и выход (зону, в которой возможно измерение остаточных концентраций веществ и микробной биомассы). Эта схема широко используется в изучения динамики загрязняющих веществ. Между концентрацией нетоксичных утилизируемых веществ (входная

концентрация

СВХ),

поступающих

в

открытую

систему,

и

выходной

концентрацией (СВЫХ) этого же вещества существует типичная зависимость (рис. 15а). Каждая точка на графике – стационарное значение входной и выходящей концентраций в системе. Соответственно для каждого уровня входной концентрации равновесная численность микробной популяции (х) также будет принимать определенное значение (рис. 15б). Проанализируем эти зависимости несколько подробнее. На кривой выходящей концентрация можно условно выделить четыре фазы. Первая фаза (I) характерна для потребления энергетического субстрата, когда весь подаваемый поток (~С ВХ) тратится на поддержание имеющейся биомассы. Следующая наиболее интересная фаза (II) представляет собой область активного

28

роста микробной популяции. Зона II – область лимитирования роста энергетическим субстратом. Увеличение в этой области входной концентрации С 1 до С2 (С2 > С1) приводит к кратковременному увеличению входной концентрации. Всплеск уровня лимитирующего фактора в системе вызовет увеличение скорости роста и накопления биомассы. В силу отрицательной обратной связи биомассы с субстратом через некоторое время будет наблюдаться падение уровня концентрации субстрата до значения, при котором наступает баланс между поступающим и потребляемым потоком субстрата. Таким образом, выходная концентрация субстрата возвратится к прежнему низкому стационарному уровню. Одновременно со стабилизацией уровня субстрата в системе наблюдается выход биомассы на новый, более высокий стационарный уровень (х2) за счет потребления избыточного потока субстрата. Проведенный анализ динамики компонентов во II фазе позволяет сделать важный вывод: равновесный уровень лимитирующего фактора в системе в идеальном случае не зависит от величины входного потока этого фактора в систему. Указанный эффект в дальнейшем, как уже говорилось, будем называть аутостабилизацией лимитирующего фактора в системе. Термином "аутостабилизация" подчеркивается тот факт, что система как бы «сама» за счет внутренних автокаталитических механизмов возвращает уровень лимитирующего фактора к прежнему низкому значению.

Рис. 15. Типичная качественная зависимость стационарных значений выходной концентрации утилизируемого субстрата СВЫХ (а) и стационарные значения биомассы х (б).

29

Анализ фазы II приводит также и к другому интересному выводу: между стационарной выходной концентрацией субстрата (СВЫХ = const) стационарным уровнем биомассы (х) отсутствует какая-либо корреляция, как нет ее между С ВЫХ и СВХ в этой области. Корреляция должна наблюдаться между уровнем биомассы и входной концентрацией субстрата. Четвертая зона определяет область, где рассматриваемый фактор (С) перестал лимитировать рост системы, которая больше не "отслеживает" изменение концентрации СВХ (х ≈ const), т.е. с увеличением СВХ плотность биомассы х выходит на плато. Это обусловлено лимитирующим действием другого фактора, который не поступает со входным потоком или поступает с одной и той же концентрацией. В этой области (IV) наблюдается линейная связь выходной и входной концентрации субстрата, но отсутствует связь х и С ВХ / С ВЫХ = С ВХ − ∆ С ≡ С ВХ −

µ x = C ВХ − const , y

где y – выход биомассы; μ – удельная скорость роста. Между фазами II и IV можно выделить фазу III – область неустойчивости. Как правило, это область переключения на другой лимитирующей фактор. В зависимости от характера переключения ширина зоны III может быть различной. В этой области между С ВЫХ и СВХ наблюдается слабая корреляция. В целом можно прийти к интересному выводу о том, что ни в одной фазе не существует корреляции между выходной концентрацией субстрата и биомассой: когда СВЫХ аутостабилизирована, то наблюдается прямая зависимость плотности популяции от входного потока, когда же стабилизируется уровень биомассы, то существует прямая связь выходной и входной концентрацией. Выше мы отмечали, что в зоне лимитирования стационарные значения выходной концентрации субстрата не меняются при прочих равных условиях. Что же мы имеем ввиду под прочими равными условиями? Всякое изменение ростовых характеристик культуры (константы Михаэлиса по субстрату, максимальной удельной скорости роста, замена штамма селективным) влечет за собой сдвиг ранее аутостабилизированного уровня. Это может произойти в силу изменения технологических условий, появления ингибитора или стимулятора. В

открытой

биологической

системе,

имеющей

стационарное

состояние,

концентрации всех компонентов достигают обоих стационарных уровней и сохраняют их длительное

время.

С

этой

точки:

зрения

30

факторы

аутостабилизированный

и

стабилизированный

отличий

не

имеют.

Основное

расхождение

в

свойствах

обнаруживается при возмущениях входных концентраций, переводящих систему в новое стационарное состояние. При переходе значений компонентов на новые равновесные уровни проявляется основное свойство аутостабилизированного фактора: уровень аутостабилизированного фактора не меняется, в то время как уровень других факторов изменили свои стационарные значения. Это принципиальное свойство остается справедливым

вне

зависимости

от

того,

меняется

ли

входной

поток

аутостабилизированной компоненты или какой-либо другой. Появление в любой открытой биологической системе контролирующего рост фактора отличается тем, что его стационарный уровень сохраняет свое значение независимо от потока этого вещества на входе системы, т.е. имеет место явление аутостабилизации уровня указанного фактора. Необходимое условие аутостабилизации следующее:

фактор

аутостабилизации

должен

бить

плотностно-зависимым.

Установившаяся величина аутостабилизированного фактора определяется кинетическими характеристиками микробной популяции и ее активностью. Высокая устойчивость пороговых концентраций глюкозы, этанола, неорганических соединений и независимость их от величины входного потока в открытую систему является ярким показателем их ограничивающей роли. Процедура оптимизации процессов культивирования микроорганизмов может быть заметно упрощена, если в качестве индикатора использовать сохранение фактора на постоянном уровне, пока он является лимитирующим (или ингибирующим), и резкое изменение его величины, когда ограничивающим

рост

становится

другой

фактор.

Существование

эффекта

аутостабилизации по некоторому фактору указывает на наличие определенных отношений между популяцией к указанным фактором: контроль роста этим фактором и обратную связь.

31

Глава 3. Методы культивирования микроорганизмов В зависимости от специфики решаемых задач экспериментатор должен подобрать соответствующий метод культивирования микроорганизмов. Существует ряд методов культивирования, позволяющих микробную массу с заданными свойствами и в определенном физиологическом состоянии.

3.1. Периодическое культивирование. Изначально периодическое культивирование представляется очень простым и удобным методом исследования кинетики роста микробных популяций. Для его реализации достаточно иметь посевной материал и подходящую для размножения микроорганизмов питательную среду. Без каких-либо технических тонкостей в пробирке либо в большой емкости культура неизбежно совершит свой цикл развития, пройдет при этом все фазы роста и превращения среды. Простая периодическая культура, содержащая ограниченное первоначальное количество питательного субстрата, служит примером закрытой системы. Закрытой называют такую систему, в которой хотя бы один из существенных компонентов не может ни поступать в систему, ни покидать её. В закрытой системе скорость роста биомассы должна стремиться к нулю либо из-за недостатка субстрата, либо из-за ингибирования роста продуктами метаболизма. Очень токсичны ионы водорода, которые появляются при образовании органических кислот или использовании физиологически кислых источников азота – солей сильных кислот. В связи с этим необходимо использовать забуференные среды, буферная емкость которых может быть обеспечена применением определенного соотношения первичных и вторичных фосфатов. Чаще всего процесс периодического культивирования микроорганизмов реализуют в колбах на качалке, учитывая временной фактор. Для этого используют колбы Эрленмеера емкостью 750 мл, содержащие 100 – 150 мл жидкой питательной среды. Однако, реализовать рост культур в соответствии с S-образной кривой удается далеко не всегда. В ряде случаев наблюдается линейное увеличение концентрации биомассы, характерное для процессов лимитированного роста микробных популяций. Причиной подобного эффекта является недостаточное снабжение растущей культуры кислородом. При периодическом культивировании микроорганизмов в колбе сохраняется обмен с окружающей средой по газовой фазе и через ватную пробку происходит диффузия кислорода в колбу и отток образующегося углекислого газа. Решающую роль в данном случае играет массообмен культивационного устройства. Обычно его оценивают по величине сульфитного числа

32

культивационного сосуда, о чем подробнее будет изложено в следующей главе. Сульфитное число колбы Эрленмеера, содержащей 100 мл жидкости при 20°С и числе оборотов мешалки 180 – 200 об/мин, составляет 0,68 г О2л/час. Наличие в жидкой фазе солей, органических компонентов и клеток микроорганизмов снижает эту величину еще на 25 %, увеличение объема жидкой фазы до 150 – 200 мл также сопровождается снижением

массообменных

характеристик

культивационного

сосуда.

Повысить

массообмен колб можно за счет введения во внутреннюю полость отбойников, но лишь на 40 – 50 % исходной величины. Избежать лимитирования роста микроорганизмов кислородом при культивировании в колбах можно, используя разбавленные питательные среды либо специальные ферментационные сосуды, массообменные характеристики которых в несколько раз выше, чем у колб. Оценивая возможности периодического культивирования, отметим, что оно обладает рядом отрицательных свойств: неуправляемая гетерогенность популяции микроорганизмов; одновременное изменение большого числа параметров; трудности выделения

ведущих

факторов;

конечность

цикла

развития,

т.е.

невозможность

длительного наблюдения. Далеко не всегда исследователь может уследить за всеми изменениями среды и оценить их действие на клетки. В целом периодические культуры можно отнести к феноменологическому уровню исследований, на котором невозможно понять тонкие механизмы исследуемых явлений.

3.2. Отъёмно-доливной метод. Данный метод культивирования микроорганизмов является промежуточным между периодическим и непрерывным. В отъёмно-доливной культуре часть культуры время от времени удаляется, а объём в культиваторе восполняется свежей питательной средой. При этом в культиваторе оставляют 5 – 10 % культуральной жидкости с клетками в качестве инокулюма для следующего такта культивирования. В зависимости от фазы роста, в которой производят отъём выросшей биомассы и продуктов метаболизма, при отъёмнодоливном культивировании можно исключить лаг-фазу. При значительном количестве циклов отъёма-долива, независимо от начального значения, концентрация получаемых продуктов стремиться к значению, ожидаемому в стационарном состоянии в хемостате. В исследовательской практике данный метод используют для получения воспроизводимого во времени состояния микробной популяции и исходного материала для биохимических исследований.

33

3.3. Турбидостат. Нелимитированный рост микробных популяций в периодических процессах имеет место лишь во время экспоненциальной фазы, которая с неизбежностью сменяется фазой замедления. Однако такая смена фаз роста не является внутренней характеристикой популяции, а зависит только от изменения условий среды. При непрерывном культивировании можно застабилизировать рост популяции в любой точке на восходящей ветви S-образной кривой, в том числе и в экспоненциальной фазе. Для этого необходимо непрерывно подавать свежую питательную среду, и удалять избыточную биомассу с культуральной жидкостью из культиватора. Особенностью реализации такого режима культивирования является необходимость наличия обратной связи между приростом концентрации биомассы и удалением части микробной популяции из ферментера. Эти величины должны быть равными и такое равенство, а с ним и концентрация биомассы должны поддерживаться с помощью автоматических устройств.

Рис. 16. Схема управления процессом роста микроорганизмов в режиме турбидостата: 1 – ферментер; 2 – перекачивающий насос; 3 – измеритель оптической плотности; 4 – регистратор-регулятор; 5 – дозирующие устройства; 6 – сосуд с питательной средой.

Турбидостат был разработан Брисоном в 1952 году, создавшем теоретическую основу прибора, при котором концентрация клеток поддерживается на определенном уровне за счет регулирования оптической плотности культуры. Его применимость ограничена работой с оптически однородными средами. На рис. 16 представлена схема управления процессом в режиме турбидостата. Культуральная жидкость с клетками из ферментера 1 перекачивающим насосом 2 подается в блок измерения оптической

34

плотности 3. Измеренное значение параметра в виде электрического сигнала подается на регулятор-регистратор 4, где его величина сравнивается с заданной экспериментатором оптической плотностью популяции. Культуральная жидкость с клетками возвращается в ферментер. Если измеренный сигнал параметра превышает заданную величину, то регулятор-регистратор автоматически подает команду дозирующим устройствам и в ферментер 1 подается питательная среда из сосуда 6, а прибор регистрирует скорость ее подачи. При сохранении в ферментере постоянной концентрации биомассы скорость потока среды D = μ час-1, т.е. прибор регистрирует величину удельной скорости роста микроорганизмов. Автоматическая система четко реагирует на любые изменения текущего значения оптической плотности микробной популяции. Если величина параметра превышает заданную, то в системе управления вырабатывается управляющий сигнал, который передается в систему дозирования: происходит долив порции свежей питательной среды и одновременно такой же по объему слив части микробной суспензии из ферментера. Такое разбавление культуры свежей средой приводит к снижению величины управляющего параметра и проток выключается. Продолжающийся рост популяции опять приводит к возрастанию величины управляющего параметра до уровня срабатывания следующей системы и т.д. Турбидостат работает наиболее эффективно в области непосредственной близости к критической точке скорости разбавления. В виду большой скорости разбавления в культуре содержится избыток субстрата, а концентрация клеток в ней низкая. Скорость роста поэтому определяется исключительно внутренними свойствами организма, которые делают возможным его рост при максимальной удельной скорости роста. Таким образом, становиться возможным прямое измерение μmax. Однако в этих условиях концентрация клеток меняется очень быстро при малом изменении скорости разбавления, и поэтому чувствительность прибора используется полностью. Если турбидостат работает при низких скоростях разбавления (т.е. при высокой концентрации клеток) и в области, где происходят лишь малые изменения концентрации клеток и с большими изменениями скорости потока, то прибор не чувствителен, а режим культивирования целесообразнее считать «плотностатом». Следует отметить, что рост микробных популяций в режиме турбидостата при реализации максимальной удельной скорости роста подвержен периодическим

спонтанным

колебаниям,

которые

сопряжены

не

с

внешними

ограничивающими факторами среды, а с внутриклеточным лимитированием в процессе синтеза отдельных внутриклеточных структур. Турбидостат является незаменимым инструментом в руках экспериментатора при оценке воздействия на микробную популяцию факторов внешней среды, таких как рН,

35

температура культивирования, продукты метаболизма, ингибиторы и активаторы. При определении оптимальной для роста микроорганизмов температуры просто физически не возможно другими методами получить эту информацию – пришлось бы поставить большое количество вариантов опыта при разных (с минимальным интервалом) температурах. В режиме турбидостата эта работа осуществляется в пределах одного эксперимента. На рис. 17 представлен фрагмент исследования влияния продуктов метаболизма дрожжей Candida utilis, полученных при разных вариантах хемостатного культивирования, на турбидостатный вариант этой же культуры. Продукты метаболизма были выделены из культуральной жидкости при лимитировании роста дрожжей источником углерода и разных концентрациях биомассы в протоке. При этом продукты метаболизма были сконцентрированы и в турбидостатную культуру вносились в одинаковом объеме.

Рис. 17. Влияние продуктов метаболизма на скорость роста дрожжей Candida utilis в режиме турбидостата: 1 – концентрация биомассы; 2 – изменение рН; 3 – ингибирование роста продуктами (4,0г/л биомассы); 4 – ингибирование продуктами (5,0г/л биомассы).

В режиме турбидостата дрожжи Candida utilis росли с μmax = 0,58 – 0,63 час-1 при плотности микробной популяции 2,0 г/л по сухому весу. Внесение продуктов метаболизма в течение первого часа эксперимента снижала μ до 0,41 час-1, но удельная скорость роста полностью восстанавливалась через 2 часа. Смещение рН не могло оказывать влияние на скорость роста культуры, так как наблюдалось в зоне оптимума (плато оптимума 5,5 – 7,2) и нивелировалось в течение 30 минут. Внесение более высокой концентрации продуктов метаболизма

снижало

удельную

скорость

роста

до

0,28 час-1

с

последующим

восстановлением в течение полутора часов. Это вполне объяснимо, так как в режиме

36

турбидостата скорость протока питательной среды высокая и в течение указанного времени происходило существенное разбавление и вымывание ингибиторов из ферментера. Следует отметить, что в описанном случае влияние продуктов метаболизма на рост культуры адекватно описывалось уравнением Моно-Иерусалимского. В качестве факторов управления при реализации максимальной удельной скорости роста могут быть использованы и другие параметры, сопряженные с ростом микроорганизмов, такие как СО2 и рН культуральной жидкости.

3.4. рН-стат. Этот метод культивирования впервые был описан Печуркиным в 1969 году и позже фигурировал под названием «рН-ауксостат» (от лат. augco – расти). Принцип работы рН-стата основан на том, что подача питательной среды жестко связана с подачей титранта для поддержания заданного рН культуральной жидкости. Схема управления потоком свежей питательной среды соответствует изображенной на рис. 16, но управляющий сигнал подается с малоинерционного датчика рН, размещаемого непосредственно в сосуде для культивирования. Как и при турбидостатном способе культивирования ни один из компонентов питательной среды не должен лимитировать рост микроорганизмов. Растущая микробная культура, как правило, вызывает изменение рН культуральной жидкости в сторону закисления за счет образования кислых продуктов метаболизма. Необходимое значение рН поддерживается с помощью подачи раствора щелочи, причем поток титранта составляет лишь незначительную часть от потока питательной среды. В рН-стате подача свежей питательной среды связана с регулятором рН и все компоненты среды подаются синхронно, в фиксированном отношении к друг к другу, по сигналу разбаланса между заданной величиной рН и фактическим рН культуральной жидкости. Таким образом, подача субстратов совмещена с титрованием щелочью для поддержания заданного рН. Часто при рН-статном культивировании возникает необходимость в раздельной подаче компонентов питательной среды, что связано с проблемой растворимости солей при высоких значениях рН. Совмещение титранта и солевой среды приводит к выпадению в осадок ряда минеральных компонентов, в частности солей щелочноземельных элементов (Ca, Mg) и железа. Лимитирование роста микробной популяции каким-либо компонентом среды приводит к срыву режима рН-стата. Выйти из состояния лимитирования можно двумя способами: либо увеличивая концентрацию органического субстрата в питательной среде, либо снижая концентрацию титрующей щелочи.

Избыточно

высокие

концентрации

37

органического

субстрата

так

же

нежелательны, так как могут вызвать ингибирование роста. Запуск режима рН-стата не требует выдерживания культуры в периодическом режиме. Система автоматической коррекции рН включается до внесения инокулюма, и подтитровка ведется питательной средой с самого начала процесса. В рН-стате не существует условий, которые могли бы привести к вымыванию биомассы из ферментера. Если в культуральной среде образуются кислые продукты метаболизма, удельная скорость разбавления останется равной удельной скорости роста популяции. В этом отношении рН-стат выгодно отличается от турбидостата, где обрастание внутренних стенок кюветы измерения оптической плотности может привести к вымыванию клеток из ферментера.

3.5. Теплостат. В процессе окисления органических субстратов микроорганизмы выделяют в окружающую

среду

значительное

количество

тепла.

При

культивировании

микроорганизмов в ферментерах стабилизация оптимальной для их роста температуры осуществляется специальной системой термостабилизации, отводящей избыток тепла с помощью

хладагентов.

Однако

тепло,

выделяемое

микроорганизмами,

можно

использовать в качестве фактора управления процессами непрерывного культивирования с одновременной стабилизацией оптимальной для роста температуры в заданном диапозоне.

Рис. 18. Схема управления процессом роста микроорганизмов в режиме теплостата: 1 – ферментер; 2 – термометр сопротивления; 3 – регулятор; 4 – система управления дозаторами; 5 – дозаторы; 6 – емкость с питательной средой; 7 – сливное устройство; 8 – сборник урожая.

38

На рис. 18 представлена схема установки для культивирования микроорганизмов в режиме теплостата. Питательную среду с инокулюмом вносили в ферментер 1. В процессе окисления органического субстрата дрожжами температура культуральной жидкости повышается, непрерывно измеряемая термометром сопротивления 2 с регистрацией на потенциометре 3, который одновременно является управляющим прибором. Система принудительного термостатирования ферментера отключена. Шкалу потенциометра при этом градуируют в градусах Цельсия и в зоне оптимальной для роста дрожжей температуры устанавливают задатчик, соединенный с системой управления дозаторами питательной среды 4. Когда температура культуральной жидкости превысит оптимальную для роста культуры, дозаторы 5 включают проток питательной среды, скорость которого регулируется пропорциональным регулятором частоты подачи доз питательной среды. Избыток культуральной среды с клетками удаляется через сливное устройство 7 в сборник урожая 8. При интенсивном тепловыделении скорость протока свежей питательной среды увеличивается, а при снижении температуры среды в ферментере – уменьшается. Обязательным

условием

функционирования

описанной

системы

управления

потоком питательной среды является отсутствие факторов, способных лимитировать либо ингибировать рост микроорганизмов. В случае недостатка одного из компонентов питательной среды или кислорода рост культуры будет ограничиваться этим фактором, максимальная удельная скорость роста не реализуется. Вторым ограничением реализации описанного способа управления скоростью потока питательной среды является то условие, что температура подаваемой свежей среды, должна быть ниже температуры оптимальной

для

роста

исследуемой

культуры.

При

соблюдении

условий

не

лимитированного роста микробной популяции следует избегать также высоких концентраций субстрата, что привести к ингибированию роста культуры. Для этого необходимо

предварительно

исследовать

зависимость

удельной

скорости

роста

изучаемого штамма от концентрации субстрата и вести процесс культивирования в диапазоне оптимальной для роста концентрации. На

рис. 19

представлен

фрагмент

процесса

культивирования

дрожжей

Candida tropicalis на среде с н-алканами в качестве источника углерода в режиме теплостата. После внесения инокулюма в питательную среду ее температура повышается за счет тепла, выделявшегося при окислении н-алканов дрожжами, и достигает на 5 часу культивирования 36°C. Концентрация биомассы в ферментере за этот период возрастает с 1,6 до 6,9 г/л по сухому весу. В серии предварительных опытов было установлено, что при 36°C наблюдается максимальная удельная скорость роста дрожжей C. tropicalis при

39

периодическом культивировании, составлявшая в условиях эксперимента 0,27 час-1. Регулятор, включающий проток свежей питательной среды, был установлен на 36°C и по достижении культуральной жидкостью этой температуры, автоматически включался регулятор, управляющий скоростью протока среды. Зарегистрировать колебания температуры при теплостатном способе культивирования дрожжей на стандартных самопишущих приборах не представлялось возможным и запись температуры на рис. 19 выглядит в виде прямой линии. По-видимому, колебания температуры происходили ниже уровня чувствительности регистрирующих приборов. Эти колебания могли сглаживаться также

за

счет

пропорционального

регулирования

скорости

протока

среды

по

рассогласованию между заданной и фактической температурой культуральной жидкости.

Рис. 19. Культивирование дрожжей C. tropicalis в режиме теплостата: 1 – концентрация биомассы; 2 – температура среды в ферментере; 3 – скорость протока среды (D).

После короткого переходного процесса концентрация биомассы в ферментере стабилизировалась на уровне 6,7 ± 0,2 г/л по сухому весу при скорости протока среды D = 0,43 – 0,45 час-1. Реализованная удельная скорость роста являлась максимальной для исследованной культуры дрожжей и на 66 % превосходила максимальную удельную скорость роста, наблюдавшуюся при периодическом культивировании. Колебания скорости протока среды (а следовательно, и удельной скорости роста дрожжей) отражают типичную

картину

роста

микробной

популяции

в

турбидостатном

режиме

культивирования. Возможно, в клетках происходит накопление внутриклеточных метаболитов

и

внутриклеточное

лимитирование

биосинтетических

процессов,

приводящие к временному спонтанному снижению скорости роста микробной популяции. Теплостатный способ культивирования позволяет реализовать максимальную удельную скорость роста микроорганизмов на оптически гетерогенных средах и слаборастворимых субстратах, что являлось невозможным в режиме турбидостата.

40

Недостатком

этого

способа

культивирования

является

нерегулируемая

скорость

теплоотдачи ферментера в окружающую среду.

3.6. Квазинепрерывный способ. Этот способ культивирования аэробных микроорганизмов впервые был описан И. Гомподкой в 1966 году и часто фигурирует под названием «fed batch culture». Схема управления процессом культивирования микроорганизмов представлена на рис. 20. Управляющим фактором служит не оптическая плотность микробной популяции как в турбидостате, а концентрация растворенного в среде кислорода. Электрод рО 2 (датчик парциального давления кислорода в жидкости) размещают внутри ферментера, а его сигнал выводят на регистратор, снабженный управляющими задатчиками.

Рис. 20. Схема установки для рО2-статирования. 1 – приемник урожая, 2 – насос, 3 – генератор, 4 – дозатор, 5 – среда А, 6 – среда В, 7 – пневмогенератор, 8 – электропневмоклапан, 9, 10 – регистратор с усилителем, 11 – рО2-электрод.

Традиционные

методы

культивирования

микроорганизмов

предусматривают

единовременное внесение в среду всех питательных веществ, необходимых для роста и развития микробной популяции. Избыток глюкозы в питательной среде сопровождается ее окислением не только в дыхательном цикле, но и частично сбраживается с образованием продуктов метаболизма; клетки могут переходить от аэробного к

41

анаэробному метаболизму, экономический коэффициент снижается. Этого можно избежать,

используя

квазинепрерывный

способ

культивирования,

реализуемый

следующим образом. В ферментер вносят основную питательную среду, содержащую все компоненты,

кроме

источника

углерода.

Вспомогательная

среда

содержит

в

концентрированном виде солевые компоненты и глюкозу в концентрации 240 г/л. За счет вспомогательной среды в ферментере создают концентрацию глюкозы 1,0 – 1,2 г/л и вносят инокулюм из расчета 1,8 – 2,0 г/л по сухому весу. Ферментер термостатируют в зоне оптимальной для роста культуры температуры, аэрируют воздухом и непрерывно регистрируют величину рО2. По мере ассимиляции глюкозы культурой концентрация растворенного в среде кислорода снижается ниже уровня, заданного экспериментатором, но по мере исчерпания глюкозы в среде рО2 начинает возрастать, достигает заданного уровня и в ферементер автоматически подается одна доза вспомогательной среды с глюкозой. Начинается новый такт.

Рис. 21. Зависимость величины амплитуды колебаний рО2 от интенсивности перемешивания среды.

Величину амплитуды колебаний рО2 можно регулировать с помощью изменения числа оборотов перемешивающего устройства (рис. 21), то есть изменяя массообмен ферментера. Повышение числа оборотов перемешивающего устройства с 1000 до 1200 об/мин позволяет увеличить скорость адсорбции кислорода средой с 1,8 до 3,1 г О2 л/час и таким образом изменить амплитуду колебаний рО2 в широких пределах. При стабилизированных аэрации и перемешивании амплитуда колебаний рО 2 остается постоянной в течение всего процесса. При сопоставлении характера роста микробной популяции на среде полного состава и квазинепрерывным способом культивирования обнаруживается

ряд существенных различий.

На рис. 22 представлены

данные

культивирования дрожжей Torulopsis latvica этими двумя способами. При периодическом культивировании на среде с 2 % глюкозы рост завершался к 7 часу, и биомасса достигала

42

12,2 г/л по сухому весу. Концентрация растворенного кислорода являлась переменной величиной, образовывавшиеся кислые продукты метаболизма требовалось оттитровать щелочью. Концентрация биомассы при квазинепрерывном способе культивирования достигала 28 г/л по сухому весу, кислые продукты метаболизма не образовывались, и экономический коэффициент процесса был на 14 % выше. Если часть культуры время от времени

удалять,

то

система

становиться

отъёмно-доливной,

которую

можно

поддерживать бесконечно.

Рис. 22. Динамика роста дрожжей Torulopsis latvica на полной среде и квазинепрерывным способом. Полная среда: 1 – концентрация глюкозы; 2 – биомасса; 3 – рО 2. Квазинепрерывный способ: 4 – биомасса; 5 – рО2

В зависимости от уровня управляющей дозированием вспомогательной среды рО 2 изменяется скорость утилизации глюкозы микробной популяцией. Снижение рО 2 с 80 до 60 % насыщения увеличивает потребление глюкозы на 60 %, а если учитывать, что каждая доза глюкозы подается только после потребления предыдущей, то можно считать, что в зависимости от величины рО2 изменяется не только скорость потребления, но и потребность культуры в источнике углерода. Пороговая концентрация глюкозы при этом удерживается на постоянном уровне и составляет 55 мг/л. При других методах культивирования изменение величины рО2 в диапазоне 15 – 90 % насыщения не оказывает влияния на рост микробных популяций – в турбидостатной культуре это маскируется наличием избытка субстрата, а в хемостатной наличием лимитирующего рост фактора. Ограничение скорости поглощение субстрата скоростью его доставки оказывается

43

способом преодоления «катаболической репрессии» образования продуктов метаболизма. На средах с углеводородами в качестве источника углерода культивирование микроорганизмов квазинепрерывным способом приводит к увеличению выхода биомассы почти в 2 раза по сравнению с простой периодической культурой. В отсутствие внешних лимитирующих рост микроорганизмов факторов как при периодическом, так и при турбидостатном культивировании наблюдается спонтанное снижение удельной скорости роста с последующем восстановлением. Это состояние принято считать фактором внутриклеточного лимитирования. При культивировании дрожжей Candida utilis квазинепрерывным способом также наблюдалось подобное явление. На S-образной кривой роста биомассы снижение скорости роста выглядит в виде «ступеньки»

(рис. 22).

Замедление

роста

микробной

популяции

сопровождается

снижением скорости потребления субстрата и уменьшением амплитуды колебаний концентрации растворенного кислорода (рис. 23). Потребление глюкозы снижалось на 38 % абсолютной величины, а удельная скорость роста падала с 0,26 до 0,05 час-1. Изменений других регистрируемых параметров процесса при этом не наблюдалось, и через непродолжительное время (1 – 2 генерации) культура восстанавливала прежнюю активность потребления глюкозы и скорость роста. Таким образом, трофическая реакция микробной популяции может служить индикатором внутриклеточного лимитирования биосинтетических процессов.

Рис. 23. Динамика потребления глюкозы на «ступеньке» S-образной кривой роста Candida utilis: 1 - μ; 2 – глюкоза; 3 – рО2.

44

3.7. Методы синхронизации культур. Существует две группы процедур синхронизации – методы избирательной и индуктивной синхронизации. При избирательной синхронизации в качестве посевного материала

используют

клетки,

находящиеся

в

одной

фазе

клеточного

цикла,

выделяющиеся из асинхронной культуры. Индуктивная синхронизация осуществляется с помощью различных воздействий, приводящих к синхронности деления клеток. После проведения синхронизации тем или иным способом необходимо оценить, насколько полно синхронизирована популяция. Об этом можно судить по количеству одновременно размножающихся клеток от общего количества (в %), или в виде индекса синхронизации (ИС). Величину ИС рассчитывают по формуле:  n   t  ИС =  − 1 ∗  1 −  , g  n0  

где n0 и n число клеток до и после периода синхронного деления; t – время одного синхронного деления; g – средняя продолжительность генерации клеток. Для избирательной синхронизации микробной популяции могут использоваться все методы фракционирования. Основным условием их применения является возможность выделения фракции, клетки которой находятся в узком диапазоне определенной фазы клеточного цикла. Клетки в процессе фракционирования и при посеве фракции не должны испытывать химических, механических, температурных и других шоков. Для увеличения индекса синхронизации и замедления ресинхронизации культуры, рекомендуется использовать в качестве посевного материала клетки, находящиеся в конечной фазе клеточного цикла. Наиболее щадящие методы фракционирования с целью получения синхронной культуры – это противопоточное центрифугирование, методы, основанные на взаимодействии клеток с твердыми поверхностями и флотация. Индекс синхронизации при посеве фракций, полученных с помощью противопоточного центрифугирования, составляет 0,7 – 0,9, и синхронное деление происходит в течение 3 – 4 циклов. Основной механизм индукции синхронного деления клеток заключается в селективной задержке клеток популяции в определенной фазе клеточного цикла. Селективность задержки обусловлена изменением чувствительности клеток к внешним факторам в ходе клеточного цикла. Поэтому можно постулировать обязательное нарушение асинхронности деления клеток в популяции при нелетальном изменении любых внешних условий, длящихся в течение времени, соизмеримом с временем генерации клеток в данных условиях. Индуцирующие методы включают: воздействие специфическими ингибиторами, действующими на синтез ДНК, белка и на другие процессы; неспецифическими

45

ингибиторами,

например,

различными

ультразвуковым или рентгеновским

температурами,

изменением

рН

среды,

облучением, различного типа лимитациями,

разбавлением культуры свежей питательной средой. Как правило, в результате синхронизации периодической культуры кривая роста приобретает неровный характер, количество биомассы или число клеток увеличивается скачкообразно. Вызванная синхронизация у периодических культур сохраняется всего 2 – 4 генерации, а затем сменяется десинхронизацией и ИС быстро снижается. Можно предположить, что такое явление связано с неоднородностью микроусловий для каждой клетки (предыстория развития, фаза развития в момент синхронизации и др.). На основе хемостатного культивирования канадским исследователем П. Даусоном был разработан метод получения синхронно-проточных культур. Он основан на периодическом двукратном разбавлении хемостатной популяции исходной средой при одновременном сливе половины разбавленной культуры. Состав исходной среды должен быть таким, чтобы при удвоении биомассы исчерпывать какой-либо элемент питания (азот, углерод или иной), и в связи с таким лимитированием рост прекращался. После этого добавляется свежая питательная среда, и рост восстанавливается. Этот прием может быть повторен многократно, и, следовательно, циклов роста может быть сколько угодно. Таким образом, периодическим голоданием клеток по какому-либо элементу достигается синхронизация проточной культуры. Синхронно-проточная популяция может быть получена через 15 – 20 смен среды. Методы синхронизации размножения микробных культур относятся к важнейшим в проблеме изучения гетерогенности микробных популяций. При изучении событий, происходящих в клеточном цикле микроорганизмов, они должны обеспечивать: 1. большую долю одновременно делящихся клеток; 2. повторяемость событий при прохождении нескольких циклов; 3. двукратное увеличение числа клеток и количества основных клеточных компонентов.

3.8. Батарейный многоступенчатый способ Применение многоступенчатой непрерывной системы становится необходимым при образовании некоторых продуктов, при трансформации сложных молекул клетками, находящимися в определенном физиологическом состоянии, при явлениях полиауксии, при стабилизации некоторых ферментных систем и при изучении разных фаз сложных микробиологических процессов. Если по условиям соответствующей стадии требуются разные скорости протока или времени оборота, то применяют батарею культиваторов

46

разного объема. Наиболее широко распространен тип батареи из одного ряда перемешиваемых ферментов, где среда входит в первую ступень и непрерывно протекает через все последующие. По такому принципу функционирует производственные линии получения этилового спирта и пищевых дрожжей из различных субстратов, содержащих сбраживаемые углеводы, мелассу, сульфитные щелока, гидролизаты крахмала и древесины. При сбраживании сульфитных щелоков был устранен антагонизм при избирательном поглощении легче и труднее используемых углеводов по средством разделения процесса на отдельные фазы. Таким образом, стали возможными высокие выхода и большие скорости роста, причем легче усваиваемый сахар полностью поглощался в первой ступени, хуже усваиваемый – в последующей. Многоступенчатый непрерывный метод приобретает все большее значение при удалении различных отходов в процессах очистки промышленных сточных вод. В комплексных батареях с многопоточной подачей субстрата свежая питательная среда подается как в первую ступень, так и во вторую и последующие, согласно технологии. Подаваемая среда может иметь одинаковый или различный состав. Добавляемый материал не обязательно должен быть жидкостью, в определенных случаях можно добавлять и порошкообразные вещества, особенно если желательно избежать повышения разбавления. В некоторых случаях различные стадии процесса ведут при различных температурах и величинах рН. Двухступенчатая

система

предоставляет

большие

возможности

для

экспериментальной и практической работы. В частности, при использовании генноинженерных штаммов, несущих встроенную плазмиду биосинтеза целевого продукта. Устойчивость встроенной плазмиды обеспечивается нелимитированными условиями роста штамма в первом биореакторе. При хемостатном способе культивирования, в условиях лимитации роста, зачастую наблюдается элиминация плазмиды и резкое падение выхода целевого продукта. Этого можно избежать, культивируя продуцент в первом ферментере в режиме турбидостата и перекачивая урожай во второй ферментер большего объема для получения целевого продукта в режиме хемостата. Двухстадийные системы расширяют область применения хемостатной культуры, поскольку с помощью второй стадии скорости роста можно довести до нуля и установить устойчивое стационарное состояние с минимальной скоростью роста – в простом хемостате эти условия совместно не выполняются. Проиллюстрируем вышесказанное примерами реализации батарейного способа культивирования микроорганизмов. Для получения соматотропина (гормона роста человека) использовали штамм E. coli К-802, несущий рекомбинантную плазмиду под

47

контролем регулярной зоны лактозного оперона, состоящего из тандема lac-протора и оператора. Промотор содержал мутацию lac ИУ-5, снижавшую чувствительность к катаболитной репрессии, а на плазмиде располагались гены, детерминировавшие устойчивость к ампицилину и тетрациклину. В процессе непрерывного культивирования контроль наличия плазмидсодержавших клеток осуществляли высевами на среды с ампицилином

и

тетрациклином.

Одним

из

условий

обеспечения

стабильности

плазмидсодержащих клеток в протоке является исключение возможности лимитирования их роста компонентами среды, т.е. рост при μ мах. При одностадийном проточном культивировании продуцента в диапазоне D от 0,8 до 1,25 час-1, концентрации биомассы 3 – 4 г/л и остаточной концентрации глюкозы более 4 г/л количество плазмидсодержащих клеток составляло от 85 – 95 % общей численности популяции. Однако, уровень биосинтеза соматотропина не превышал 3 – 4 мг/г белка в следствии катаболитной репрессии промотора с глюкозой. Лимитирование роста продуцента глюкозой при более низких скоростях протока является крайне нежелательным, так как сопровождается элиминацией плазмид. Количество плазмидсодержащих клеток в течение 4 генераций снижалось с 85 до 14 % общей численности клеток, что иллюстрирует невозможность ведения одностадийного эффективного по выходу продукта процесса культивирования. Проблема

стабильного

культивировании

обеспечения

продуцента

в

биосинтеза

батарее

из

двух

соматотропина

решается

последовательно

при

соединенных

ферментеров (рис. 24). Свежая питательная среда подается в первый ферментер со скоростью D = 1,25 час-1, где реализуется нелимитированный рост продуцента без потери плазмид. Урожай из первого ферментера перекачивается во второй, объем которого в 6 раз больше первого. По мере заполнения второго ферментера удельная скорость продуцента снижается, возрастает концентрация биомассы в нем, а количество остаточной глюкозы снижается до уровня пороговой концентрации, исключая возможность катаболической репрессии промотора глюкозы. Через 6 периодов генераций урожай из второго ферментера поступает на выделение соматотропина. Концентрация клеток к моменту

слива составляет

7,44 г/л

сырой биомассы

соматотропина на 1 г сырой биомассы.

48

при

содержании

12,53 мг

Рис. 24.

Схема

установки

для

двухстадийного

культивирования:

1, 2 – ферментеры;

3

–

перекачивающий насос; 4 – измерительные устройства; 5 – регулирующие устройства; 6 – дозаторы; 7 – измерительные электроды; 8 – сосуды с компонентами питательной среды.

По сравнению с периодическим культивированием продуцента на среде того же состава за одинаковый промежуток времени описанный двухстадийный процесс позволяет увеличить удельную активность биосинтеза соматотропина в 2,7 раза при увеличении производительности процесса более чем в 9 раз. Подобные приемы культивирования рекомбинантных плазмидсодержащих штаммов могут быть реализованы и при выращивании других продуцентов. Дрожжи Pichia guilliermondii ИБФМ-У-851 культивировали в батарее из двух последовательно соединенных ферментеров (рис. 24) с целью получения рибофлавина на синтетической среде с жидкими нормальными алканами. В первый ферментер непрерывно подавали исходную среду со скоростью D = 0,05 – 0,1 час-1, во второй перекачивали урожай из первого с той же скоростью и дополнительно подавали н-алканы со скоростью 0,0015 – 0,003 час-1 (3% смеси н-алканов к протоку), а соотношение рабочих объемов первого и второго ферментеров устанавливали соответственно 1:7. Содержание рибофлавина на выходе из второго ферментера составляло 288 мг/л при концентрации биомассы 32 г/л. Сравнение эффективности процесса в батарее из двух ферментеров и одиночного, того же объема, работающего в режиме хемостата, показало повышение производительности по выходу рибофлавина в 1,65 раза. Интенсификация процессов выращивания микроорганизмов можно добиться при использовании батарейного способа культивирования, увеличивая от ферментера к

49

ферментеру валовую нагрузку углеродсодержащего субстрата при условии сохранения величины оптимальной удельной нагрузку. На рис. 25 представлена схема трехстадийного многопоточного выращивания дрожжей Candida guilliermondii на средах с н-алканами. Основная питательная среда подавалась в первый ферментер, урожай из первого перекачивали непрерывно во второй, куда дополнительно с потоком F2 подавали концентрированные минеральные компоненты и н-алканы. В третий ферментер перекачивали урожай из второго и дополнительно с потоком F3 соли и н-алканы.

Рис. 25. Схема батарейного многопоточного культивирования дрожжей. 1, 2, 3 – ферментеры; 4 – приемник урожая; F1 – поток исходной среды; F2, F3 – потоки вспомогательной концентрированной среды.

В однопоточной системе увеличивать концентрацию н-алканов невозможно ввиду «запарафинивания» культуры, сопровождающимся резким падением скорости роста дрожжей. При культивировании дрожжей на средах с н-алканами в батарее ферментеров возникла необходимость в интенсификации массообмена от ферментера к ферментеру по мере увеличения концентрации биомассы. Это позволяет подавать с дополнительным потоком всё возрастающие количества источника углеродного питания, сохраняя постоянный экономический коэффициент. Результаты эксперимента представлены в таблице 3. Таблица 3. Параметры трехстадийного культивирования дрожжей C. guilliermondii

Ферментер

Концентрация D, час-1 Н-алкан, %

1 2 3

0,2 0,23 0,3

1,6 2,4 3,0

Параметры процесса нагрузка н-алканов,

г/л

г/г/час

12,8 30,2 47,0

1,25 0,8 0,64

Производи-

Концентрация

тельность,

остаточных

г/л/час

н-алканов, %

2,56 6,95 14,1

0,5 0,14 0,14

В первый ферментер подавали исходную среду со скоростью D = 0,2 час-1, урожай

50

перекачивали непрерывно во второй, куда дополнительно подавали с потоком F2 120 мл/ч концентрированной среды и 30 мл/ч н-алканов. В третий ферментер к поступавшему из второго урожаю с потоком F3 вносили дополнительно 305 мл/ч концентрированной среды и 45 мл/ч н-алканов. Процесс культивирования оставался стабильным во времени. Удельную нагрузку н-алканов поддерживали на уровне ниже оптимальной из опасения запарафинивания дрожжей, так как при подаче со средой 2 % н-алканов приводило к увеличению содержания неутилизированных н-алканов, в культуральной жидкости. Съем биомассы дрожжей с батареи из трех ферментеров составлял 70 г/час, а в случае раздельного хемостатного культивирования в трех однопоточных ферментерах лишь 38,4 г/час. Интенсификация процесса выращивания дрожжей по описанной многопоточной системе достигалась в 1,84 раза. Аналогичная система культивирования может быть реализована не только на средах с н-алканами, но и на углеводах, спиртах и других источниках углерода.

51

Глава 4. Аппаратура для культивирования. Ход каждого процесса культивирования микроорганизмов зависит от питательной среды, физиологического состояния культуры, методики ведения процесса и условий технического оснащения. Если динамически устойчивое состояние популяции протекает согласно теоретическим и математическим выводам, то следует обеспечить длительное, надежное и точное постоянство притока среды и объема культуры, а в случае гомогенного непрерывного культивирования хорошее перемешивание. В соответствии с условиями опыта к этим основным требованиям добавляются еще другие, которые могут в отдельных случаях

стать

решающими,

например

концентрация

растворенного

кислорода,

температура, величина рН и другие. Основным элементом системы для культивирования микроорганизмов является сосуд для культивирования или ферментер. На рис. 26 представлена конструктивная схема ферментера, которым оснащены комплексы АНКУМ-2 (аппарат непрерывного культивирования микроорганизмов), АК-3, АК-10, АНКУМ-2М, разработанные и производимые Институтом биологического приборостроения РАН. Для выращивания микроорганизмов в этих аппаратах применены трех- и десятилитровые ферментеры. Ферментер состоит из основания 4 и крышки 5, между которыми через резиновые прокладки 6 с помощью стяжек 7 зажат стеклянный цилиндр (царга) 3. В основании 4 имеются гнезда 8 для герметичной установки датчика рО2, измерительного электрода и электролитического ключа рН и обратный клапан 10 для ввода воздуха в ферментер. Кроме того, в основании 4 имеются гнезда для герметичной установки термометра сопротивления и нагревателя. В данной части основании 4 выполнены каналы 9, по которым циркулирует охлаждающая вода. В верхней крышке 5 имеются штуцера 11 для подачи жидких компонентов питательной среды, а также ручка для переноски ферментера. Магнитная муфта 12 обеспечивает герметичность и передачу мощности от электродвигателя,

ограниченной

по

величине

только

прочностью

вала

13

перемешивающего устройства 15. В ряде модификаций магнитная муфта заменяется магнитно-жидкостным уплотнением вала мешалки, выполняющим ту же функцию. На валу 13 крепятся механические пеногасители 14, предотвращающие попадание пены на верхнюю крышку ферментера. Механический пеногаситель может быть жестко закреплен на валу мешалки либо свободно перемещаться по его высоте. В ряде конструкций предусматривается установка в верхней крышке датчика уровня пены для управления подачей химического пеногасителя.

52

Рис. 26. Конструктивная схема ферментера: 1 – ручка для переноски ферментера; 2 – отбойник; 3 – стеклянная царга; 4 – основание; 5 – верхняя крышка; 6 – резиновая прокладка; 7 – стяжка; 8 – гнездо для герметичной установки датчиков; 9 – каналы для хладогента; 10 – обратный клапан; 11 – штуцер для подачи среды; 12 – магнитная муфта; 13 – вал перемешивающего устройства; 14 – механический пеногаситель; 15 – корпус мешалки; 16 – отбойник.

На валу 13 крепится механическое перемешивающее устройство 15 для обеспечения высокой эффективности перемешивания культуральной среды и предотвращения застоя суспензии в зоне расположения датчиков. Эффективность перемешивания может быть увеличена применением отбойников 16, которые могут быть закреплены на мешалке либо

53

расположены по периметру стеклянной царги 3. Основное требование, предъявляемое к конструкции ферментера, является обеспечение герметичности во время работы. Применение магнитных муфт или магнитно-жидкостного уплотнения для передачи вращательного движения от электродвигателя исключает контакт внутренней полости ферментера с окружающей средой. В более ранних разработках ферментеров применялись различные сальниковые уплотнения, имевшие низкую надежность. Одним из основных показателей, характеризующих массообменные качества ферментеров при использовании их для культивирования аэробных микроорганизмов, является коэффициент поглощения кислорода, определяемый химическим методом и называемый сульфитным числом аппарата. Этот метод позволяет сравнивать между собой различные

типы

ферментеров,

рассчитывать

оптимальные

условия

аэрации

и

перемешивания, подбирать необходимые режимы ведения процесса ферментации, но не дает представление о действительном потреблении кислорода микробной популяцией и не позволяет определять перенос кислорода в культуральной жидкости. Сущность метода заключается в связывании кислорода сульфитом натрия (определенной концентрации) в присутствии катализатора в ферментере на каждом из исследуемых режимов аэрации и перемешивания.

Рис. 27. Зависимость сульфитного числа ферментера от коэффициента заполнения при вортексном типе аэрации (V=6,0л): I – φ=0,5; II – φ=0,3; III – φ=0,1.

По принципу аэрации существуют два типа подачи аэрирующего воздуха в ферментер: вортексный (подача воздуха в воздушную

полость ферментера) и

барботажный (продувание воздуха через слой жидкости). И в первом и во втором случаях

54

дополнительное диспергирование воздуха в жидкости осуществляется механической мешалкой. В ферментере с вортексным типом аэрации не существует зависимости величины сульфитного числа от скорости подачи воздуха для аэрации (рис. 27). Всасывающая воздух воронка жидкости образуется лишь при 600 об/мин мешалки, и в дальнейшем величина сульфитного числа зависит от скорости оборотов мешалки и коэффициента

заполнения

ферментера

жидкостью

(φ). Снижение

коэффициента

заполнения φ сопровождается значительной интенсификацией массообмена, но ведение процессов ферментации при φ < 0,17 затруднительно в виду того, что жидкость не перемешивается, а разбрызгивается по стенкам ферментера. Максимально достижимая величина сульфитного числа 6,8 гО2•л/час. Массообменные характеристики ферментера АК-10 с барботажным типом аэрации обнаруживают линейные зависимости сульфитного числа от оборотов мешалки в широком диапазоне (рис. 28) при удельных расходах аэрирующего воздуха 0,5; 1,0; 2,5 и 4,0л при φ=0,5. Снижение коэффициента заполнения ферментера φ с 0,5 до 0,33 изменяется сульфитное число всего на 5–7 % на всем диапазоне скоростей перемешивания, а увеличение потока аэрируемого воздуха оказывает значительное влияние на интенсивность массообмена. Увеличение интенсивности аэрации с 2,5 до 5 л/мин сопровождается повышением сульфитного числа на 35 % абсолютной величины. Подобного же эффекта можно достичь увеличением числа оборотов мешалки с 800 до 1000 в минуту при расходе воздуха 5 л/мин. Эти качества ферментера дают возможность варьировать интенсивность аэрации и перемешивания в зависимости от необходимости, сохраняя постоянным сульфитное число, которое служит основой массообменной характеристикой. Это особенно важно при ведении ферментаций с интенсивным пенообразованием. Максимальное сульфитное число для ферментера типа АК-10 составляет 13,6 гО2•л/час, что дает возможность вести процессы культивирования с высокой концентрацией биомассы.

55

Рис. 28. Зависимость сульфитного числа ферментера АК-10 от интенсивности аэрации и перемешивания.

Кроме

ферментера,

для

реализации

обычного

процесса

периодического

культивирования необходим целый ряд блоков и устройств обеспечения стабильности параметров процесса. На рис. 29 представлена схема обеспечения работоспособности аппарата АК-10, функционирующая следующим образом. Воздух, предварительно очищенный от механических примесей, подается к аппарату под давлением 1,4 кг/см2 через регулирующий клапан 4, индикатор расхода 5 и биофильтр 6. Ввод воздуха в ферментер производится через обратный клапан 7, предотвращающий попадание клеточной суспензии в воздушную магистраль при прекращении аэрации. Система ротаметров 5 обеспечивает возможность фиксированной регулировки потока воздуха и имеет две шкалы – 0,4 – 4,2 и 2,6 – 19,5 л/мин. На выходе отработанного воздуха из ферментера установлен конденсационный сосуд 12 и фильтр 13, предотвращающие унос клеток в рабочее помещение. Перемешивание суспензии осуществляется турбинной мешалкой 2, привод вала мешалки осуществляется от электродвигателя 9, управляемого электронным регулятором оборотов 10 в диапазоне 50–1500 об/мин. Система терморегуляции обеспечивает плавное поддержание и регулирование заданной температуры в диапазоне от 20 до 60°C с точностью ±0,5°C. Это обеспечивается с помощью электронного регулятора температуры 14, нагревательного элемента 15, датчика температуры 16 и теплообменной камеры 17. Для работы с проточными датчиками, например датчиком оптической плотности клеточной суспензии, а также отбора проб для анализов аппарат оборудован циркуляционным насосом 18, управляемым генератором пневматических импульсов 19.

56

Циркуляционный насос можно использовать при составлении батареи проточных ферментеров, переключая нагнетательную линию к следующему ферментеру. Включение насоса производится тумблером 20.

Рис. 29. Схема аппарата АК-10: 1 – ферментер; 2 – турбинная мешалка; 3 – механический пеногаситель; 4 – клапан, регулирующий подачу воздуха; 5 – индикатор расхода воздуха; 6 – биофильтр; 7 – обратный клапан; 8 – отбойники; 9 – электродвигатель; 10 – регулятор оборотов мешалки; 11 – магнитная муфта; 12 – конденсационный сосуд; 13 – фильтр; 14 – электронный регулятор температуры; 15 – нагревательный элемент; 16 – датчик температуры; 17 – теплообменная камера; 18 – циркуляционный насос; 19 – генератор пневмоимпульсов; 20 – пневмотумблер; 21 – пробоотборочный клапан; 22 – зажим.

Кроме того, аппарат должен быть оснащен автоматической системой непрерывного анализа и регистрации параметров процесса культивирования: концентрации биомассы, рН, еН, температуры суспензии, величины рО2 и СО2 и обеспечивать автоматическое управление по одному или нескольким наиболее характерным параметрам. Конструкция аппарата выполнения с таким расчетом, что к ним можно подключать различные приборы и регуляторы, монтируемые на стойке регистрации и управления. Функциональное назначение каждого из приборов и блоков следующее: • П-201 преобразователь высокоомного сигнала от датчика рН в ферментере является

57

стандартным измерительным прибором, сигналы о величине рН поступают как на прибор управления ГАММА, так и на самопишущий прибор управления; • П-205 преобразователь высокоомного сигнала от датчика еН, поступает на КСП-4; •

ИрО2 – измерительный преобразователь; на его вход поступает сигнал от датчика

рО2, а выходные сигналы идут как на регулятор РрО2, так и на КСП-4; • БОП – блок оптической плотности, предназначенный для преобразования сигналов от датчика оптической плотности ДОП и формирования выходных сигналов на прибор управления ГАММА и регистратор КСП-4; •

РрО2

–

регулятор

величины

растворенного

в

ферментере

кислорода

с

пропорциональным законом регулирования; •

ГАММА – универсальный прибор управления, обеспечивающий задание и

автоматическое поддержание таких режимов, как хемостата, турбидостат, рН-стат и режим дистанционного управления. При этом может быть осуществлен режим независимого регулирования рН. Информационного сигналы к прибору ГАММА поступают от приборов П-201 и ДОП. Управляющие сигналы от него идут к дозаторам жидкости. Электрические сигналы, пропорциональные частота срабатывания дозаторов жидкости поступают на регистратор КСП-4; • КСП-4 – стандартный самопишущий прибор, рассчитанный на запись на диаграммной ленте 12 параметров одновременно. Все измерительные и регулирующие блоки имеют дистанционный выход аналоговых сигналов в пределах 0–10В для подключения к ЭВМ. Компоненты питательной среды находятся в 6 бутылях под избыточным давлением, а прибор ГАММА дает возможность экспериментатору менять их соотношение по ходу опыта. По каждому из каналов дозирования компонентов питательной среды изменение содержания в общем потоке конкретного компонента можно варьировать от 1 до 100 %. При этом в одной из бутылей находится дистиллированная вода для временной стабилизации скорости протока в случае необходимости подачи титрующих агентов для стабилизации рН культуральной жидкости. Подача жидкой питательной среды или ее компонентов в ферментер осуществляется системой электропневматических дозаторов, а частота их срабатываний суммируется в общей скорости протока. В ряде случаев применяют для дозирования сред перистальтические насосы различных модификаций. Кроме аппаратуры идеального смешения культивирование микроорганизмов возможно в ферментерах полного вытеснения, представляющих собой трубу с однонаправленным периодическую

потоком

культуры

в

среды.

Культура

открытой

системе.

58

полного В

вытеснения

идеале

моделирует

инокулюм

и

среда

перемешиваются на входе в систему, затем культура без перемешивания с постоянной скоростью течет через ферментер. Культура полного вытеснения может служить лишь моделью, подобием периодической культуры. Никаких новых возможностей управления внешними условиями этот метод не приносит. Новое состоит лишь в том, что в ней разделены в пространстве фазы роста, которые в периодической культуре разделены во времени. Трудность реализации состоит в наличии ламинарного течения в трубах, при этом всегда существует градиент скорости в любом сечении трубы. Поэтому малая скорость течения у стенок сосуда способствует прилипанию биомассы к стенкам трубы. Культуры полного вытеснения в больших масштабах используются при очистке сточных вод. Значительные трудности возникают при культивировании мицелиальных форм микроорганизмов, многие из которых являются активными продуцентами антибиотиков, фитотоксинов и других биологически активных веществ. Большинство из них аэробны, в процессе роста образуют септированные ветвящиеся гифы, и вегетационный рост мицелия в жидкой среде продолжается до исчерпания питательных веществ и образования спор. При культивировании в ферментерах идеального смешения мицелиальные формы микроорганизмов образуют на внутренней поверхности ферментера и перемешивающего устройства наросты и тяжи, снабжение клеток питательными веществами нарушается и процесс культивирования становится неуправляемым, а непрерывное культивирование невозможным. Этого можно избежать при использовании специальной аппаратуры. На рис. 30 представлена

схема

ферментера

для

культивирования

мицелиальных

форм

микроорганизмов на жидких питательных средах. Ферментер содержит емкость и размещенное в ней перемешивающее устройство. Внешняя стенка 1 изготовлена из не проницаемого коррозионностойкого материала, внутренняя стенка 2 несет высокие горизонтальные кольцевые перегородки 3 и выполнена из капиллярно-пористого материала,

пропускающего

растворы

солей,

но

не

пропускающего

клетки

микроорганизмов и споры. Между внешней стенкой 1 и внутренней стенкой 2, а также внутри горизонтальных кольцевых перегородок 3 имеются каналы 4 для подвода аэрированной питательной среды. Перемешивающее устройство содержит приводной вал 5 и ряд дисков 6, укрепленных по высоте вала 5 и размещенных между перегородками 3 с образованием зазоров 7, определяющих толщину слоя обрастающего их мицелия.

59

Рис. 30. Схема ферментера для культивирования мицелиальных форм микроорганизмов: 1 – внешняя стенка; 2 – внутренняя стенка; 3 – горизонтальные кольцевые перегородки; 4 – полые каналы; 5 – приводной вал; 6 – полые диски; 7 – зазор между ребрами стенок и дисками вала; 8 – полые каналы; 9 – теплообменная рубашка; 10 – электродвигатель; 11 – сливное устройство.

Приводной вал 5 и диски 6 изготовлены из капиллярно-пористого материала и имеют

каналы 8

термостатируют

для

подвода

теплообменной

аэрированной рубашкой 9,

питательной вал 5

среды.

вращают

с

Ферментер помощью

электродвигателя 10, отработанную культуральную жидкость с биомассой выводят из ферментера через устройство 11. Ферментер

работает

следующим

образом.

Через

кольцевые

перегородки 3

внутренней стенки 2 и диски 6 перемешивающего устройства ферментер заполняют аэрированной питательной средой, вносят инокулюм и ведут процесс периодического культивирования. В расчетный момент включают подачу свежей питательной среды по полым каналам, и переводят процесс в режим непрерывного культивирования. Мицелий микроорганизма, обрастающий внутренние ребра ферментера и диски перемешивающего

устройства,

частично

отделяется

механически

при

вращении

перемешивающего устройства и удаляется из ферментера с потоком отработанной культуральной жидкости. На внутренних поверхностях ферментера постоянно находятся фиксированной толщины слой мицелия, причем нижний его слой не отмирает благодаря

60

постоянной подпитке свежей питательной средой. По

сути,

использованный

принцип

культивирования

мицелиальных

форм

микроорганизмов имеет основные характеристики аппарата полного вытеснения и присущие ему недостатки: однонаправленное изменение рН, исчерпание растворенного кислорода и накопление СО2. Кроме этого, в ферментер не возможно ввести измерительные электроды в виду их неизбежного обрастания мицелием и блокирования. Указанные недостатки устраняются за счет применения блока жизнеобеспечения. На рис. 31 приведена принципиальная схема этого устройства.

Рис. 31. Схема блока жизнеобеспечения: 1 – датчик рН; 2 – датчик рО 2; 3 – дозатор титранта; 4 – измерительная камера; 5 – ферментер; 6 – микропористый фильтр; 7 – насос-дозатор; 8 – камера обработки культуральной жидкости; 9 – выходной патрубок; 10 – трубопровод; 11 – мембрана насоса-дозатора; 12, 13 – входной и выходной клапаны; 14 – полость подтитровки рН; 15 – газовая полость; 16 – газопроницаемая мембрана; 17 – пробоотборник; 18 – источник регулируемого давления кислорода.

Устройство содержит датчики рН 1, парциального давления растворенного кислорода 2, подсоединенные к соответствующим регуляторам (не показано), дозатор 3 рН-титранта, управляющий вход которого соединен с регулятором рН. Датчики 1 и 2 расположены в измерительной камере 4, которая сообщается с ферментером 5 через

61

микропористый фильтр 6, непропускающий микроорганизмы. К измерительной камере 4 последовательно подсоединены насос-дозатор 7 и камера 8 для обработки культуральной жидкости, выходной патрубок 9, который соединен с трубопроводом 10 и возврата жидкости в ферментер 5. Импульсный насос-дозатор 7 содержит упругую мембрану 11, входной 12 и выходной 13 клапаны. На крыше насоса-дозатора 7 имеется штуцер, к которому подводятся управляющие пневмоимпульсы. Камера 8 для обработки культуральной жидкости состоит из полости 14 и газовой полости 15, разделенных между собой газопроницаемой мембраной 16. Устройство также содержит пробоотборник 17 и источник регулируемого давления кислорода 18. Блок

жизнеобеспечения

работает

следующим

образом.

Управляющие

пневмоимпульсы поступают на насос-дозатор, который начинает прокачку культуральной жидкости по замкнутому контуру: ферментер – измерительная камера, камера для обработки культуральной жидкости – ферментер. Микроорганизмы, находящиеся в культуральной жидкости, задерживаются фильтром 6 и в камеру 4 не попадают. При поступлении очередного импульса часть жидкости через камеру 4 поступает в ферментер, очищая фильтр от осевших на нем микроорганизмов. Основная часть жидкости через клапан 13 поступает в камеру 8, куда подается титрант до требуемого рН и происходит насыщение среды кислородом через газопроницаемую мембрану и далее возвращается в ферментер. При необходимости, по высоте колонного ферментера для культивирования мицелиальных форм микроорганизмов могут быть установлены несколько блоков жизнеобеспечения для создания оптимальных условий роста на разных фазах процесса. Блок

жизнеобеспечения

процессов

культивирования

микроорганизмов

можно

использовать и с другими ферментационными системами. Одним из основных требований, предъявляемых к аппаратуре для культивирования микроорганизмов, является обеспечение стерильности процесса в течении всей ферментации. К числу обычно применяемых методов стерилизации относятся: 1 – нагревание (автоклавирование, влажный жар, текучий пар, дробная стерилизация), 2 – стерилизация с помощью различных химических веществ. Ферментеры, как правило, имеют кронштейны или ручки для транспортировки и помещения их в автоклавы. Обычный режим стерилизации в автоклаве при избыточном давлении в 1 атм при 121°С в течении одного часа. С повышением давления в автоклаве до 2 атм температура стерилизации достигает 134,5°С, но подобный режим применяется редко. После завершения цикла стерилизации рекомендуется дать автоклаву остыть,

62

чтобы избежать разгерметизации ферментера из-за резкого перепада давления. В виду наличия в ферментере большого количества различных соединений типа металл-стеклорезина рекомендуется через 18 – 20 часов провести повторную стерилизацию для гарантированной инактивации спор микроорганизмов. При стерилизации в автоклаве жидких питательных сред в емкостях под ватными пробками происходит потеря 5% воды и концентрирование состава среды. Для стерилизации лабораторной аппаратуры культивирования микроорганизмов применяют и текучий пар. На рис. 32 представлена схема парогенератора-стерилизатора, пригодного не только для стерилизации ферментера с коммуникациями, но и питательных сред. Работа парогенератора основана на постоянном протоке жидкой среды по эрлифтной трубе под действием острого пара при выбранном давлении внутри стерилизационной камеры и осуществляется в следующей последовательности.

Рис. 32. Схема парогенератора-стерилизатора: 1 – стерилизационная камера; 2 – эрлифтная труба; 3 – диффузор; 4 – входной патрубок; 5 – выходной патрубок; 6 – нагревательный элемент; 7 – конденсатор; 8 – клапан; 9 – электроконтактный манометр; 10 – заслонка.

В стерилизационную камеру 1 через патрубок 4 заливают жидкую среду и, включив нагревательный элемент 6, доводят ее до температуры парообразования. Образовавшимся паром вытесняют воздух из стерилизационной камеры 1 через клапан 8, который затем закрывают и поднимают температуру и давление в стерилизационной камере до выбранных условий стерилизации. При достижении установленного давления на электроконтактном манометре 9 открывается заслонка 10, и хладагент поступает в конденсатор 7. Нагревательный элемент 6 остается включенным и пар, концентрируясь под диффузором 3, поступает в эрлифтную трубу 2, подсасывая стерилизуемую среду и поднимая ее вверх. При выходе из эрлифтной трубы 2 стерилизуемая среда сливается

63

вниз, а пар выбрасывается на охлажденную поверхность конденсатора 7, где происходит конденсация воды из пара, которая также стекает в исходную среду. Таким образом, поддерживается выбранный режим стерилизации острым паром при постоянной циркуляции стерилизуемой среды в замкнутом объёме стерилизатора. В режиме проточной стерилизации через ферментер обеспечивается стерилизация ферментера и питательной среды при сохранении исходного объёма среды. Химические дезинфицирующие средства редко используются для препаративной стерилизации, так как большинство из них сложно удалить со стерилизуемых поверхностей и материалов. Для обработки внешних поверхностей используют водный раствор формальдегида, и 10 % раствор быстро убивает как вегетативные клетки, так и споры даже в присутствии органических веществ. Окись этилена обладает сильным бактерицидным действием, но в чистом виде она весьма токсична и взрывоопасна. Для понижения взрывоопасности она обычно используется в смеси с индифферентными газами, что резко снижает ее стерилизующие свойства. Для стерилизации изделий из пластмасс окись этилена не может быть использована, так как дегазация из этих материалов длительна и трудоемка. Сильным антимикробным агентом является надуксусная кислота, ее пары обладают стерилизующим действием, а в разведении 1:5 она оказывает спороцидное действие при температуре ниже нуля (от 0 до -20°С). Из 550 исследованных химических соединений лишь β-пропиолактон обладает достаточно надежным противовирусным, а также мощным бактерицидным, спороцидным и фунгицидным действием. В чистом виде при 20°С препарат представляет собой бесцветную жидкость со сладковатым раздражающим запахом, слезоточив. Чистый препарат имеет максимальную концентрацию 99 %, не стоек в водных растворах и легко гидролизуется с образованием нетоксичных гидракриловой и β-оксипропионовой кислот. Период полураспада β-пропиолактона при 25°С составляет 210 мин. Этот дезинфектант не имеет себе равных по широте и силе антимикробного действия при незначительной токсичности

и

отсутствии

разрушающего

влияния

на

белки.

Большинство

микроорганизмов и их спор гибнет при действии 0,1 % концентрации препарата, а с повышением температуры активность β-пропиолактона резко увеличивается и при 75°С гидролиз препарата наступает через 5 мин. Препарат эффективен и в виде аэрозоля в широком температурном диапазоне, может быть использован для стерилизации жидких питательных сред. Для стерилизации термолабильных электродов и всего комплекса лабораторной ферментационной

аппаратуры

достаточно

64

0,5 %

концентрационный

аппаратуры

достаточно β-пропиолактона. При 30°С время полураспада препарата составляет 140 мин. Раствор дезинфектанта необходимо готовить непосредственно перед применением во избежание преждевременного гидролиза.

65

Глава 5. Кислород, абсорбция его питательными средами, методы измерения и действие на микробные популяции. 5.1. Растворимость кислорода в жидких средах. Одним из важнейших факторов, оказывающих влияние на рост и обмен веществ микроорганизмов, является интенсивность аэрации, точнее – скорость абсорбции кислорода и его концентрация в питательной среде. Достаточное снабжение микробной популяции кислородом определяется тем, что количество абсорбируемого в системе кислорода больше или равно потреблению кислорода данной культурой. Концентрация растворенного в среде кислорода дает об этом достаточную информацию. Уравнение скорости изменения концентрации кислорода описывает реальную концентрацию его в любой момент ферментативного процесса: dC = K la (C L * − C L ) − чx , dt

где Kla - коэффициент абсорбции кислорода средой, С L* - концентрация О2 равновесная с воздухом, СL - концентрация растворенного O2, ч - удельная скорость потребления С 2, х концентрация биомассы. Однако, коэффициент абсорбции кислорода средой зависит от ее состава, концентрация клеточной биомассы, промежуточных продуктов обмена, пеногасителей, вязкости, различных добавок и изменяется по ходу процесса культивирования. Наличие микробных клеток в культуральной среде снижает скорость абсорбции кислорода на 25–30 % абсолютной величины, причем, эта зависимость более ярко выражена при вортексном типе аэрации, чем при барботажном. Существенное влияние на величину Kla оказывает наличие в среде поверхностно активных веществ, образуемых развивающейся микробной популяцией и создающие дополнительную преграду на границе фаз газ-жидкость, особенно в случае пенообразования. Именно жидкие пленки на поверхности раздела газ-жидкость воздушного пузырька, проходящего через культуру, значительно затрудняет диффузию кислорода. Кислород при аэрации проходит через культуру мелкими пузырьками. Прежде чем перейти из пузырька в клетку, кислород должен преодолеть четыре диффузионных преграды: 1) пограничную переходную газовую пленку в промежуточной фазе газ-жидкость, 2) пограничную переходную пленку в промежуточной фазе жидкость-газ, 3) путь в жидкости между пузырьками и клеткой, 4)

66

пограничную пленку клетка-жидкость. В конце пути кислород должен еще преодолеть внутриклеточное сопротивление и противодействие реакции. Внесение химических пеногасителей снижает скорость абсорбции кислорода, но позволяет при этом повысить коэффициент заполнения аппарата. На скорость абсорбции кислорода оказывают влияние конструкция аппарата, интенсивность перемешивания, способ дробления газового пузырька и другие факторы, изменяющие величину поверхности раздела газ-жидкость. Некоторые из этих факторов, такие как скорость перемешивания оказывают влияние на интенсивность дыхания. Перемешивание влияет на перенос веществ от жидкости к клетке при равновесной концентрации кислорода в среде. При этом изменяются действующие концентрации на поверхности клетки. Для микроорганизмов с малой поверхностью это не столь существенно, но с увеличением объема клетки разница возрастает. Влияние перешивания особенно заметно при активном дыхании и значительной плотности биомассы. Увеличение скорости перемешивания снижает концентрацию метаболитов на поверхности клетки и может приводить к интенсификации процессов. Интенсивность дыхания микробной популяции может зависеть от условий перемешивания при неизменной концентрации в среде растворенного кислорода и при поддержании ее на уровне выше критической. Установлено, что в связи с поверхностно-активными свойствами клеток вблизи межфазовой поверхности газ-жидкость образуется пограничный слой, содержащий больше клеток, чем остальная жидкость. В этом случае наличие клеток ускоряет массоперенос по сравнению с физической абсорбцией, причем время диффузии зависит от особенностей культуры и изменяется в интервале от сотых долей секунды до нескольких минут. Достаточное снабжение микроорганизмов кислородом определяется разницей скоростей абсорбции его средой и скорости потребления клетками, поэтому необходимо учитывать все факторы, влияющие на скорость абсорбции кислорода.

5.2. Устройства и способы измерения концентрации растворенного кислорода. Применялись различные варианты манометрического метода анализа дыхания, но результаты

измерений

этим

методом,

как

правило,

опосредованы

трудноконтролируемыми и не всегда благоприятными воздействиями на изучаемый объект, которые испытывает последний как в процессе его подготовки к измерениям, так, в ряде случаев, и в процессе измерений. Типичными воздействиями, влияющими на

67

дыхательный аппарат клетки, могут быть центрифугирование, отмывка, перенос в свежую среду или буферный раствор, невысокая массопередача в манометрическом сосуде. Следствием указанных воздействий является переход клеток микроорганизмов в новое состояние, отличающееся от начального, причем, в случае работы с покоящимися клетками, это различие менее выражено, чем при исследовании растущей культуры и может стать источником ошибок в оценке дыхательной активности. Исследование потребления кислорода и получение информации о наличие его в культуральной среде значительно упростилось с появлением электродов, позволяющих измерять, регистрировать и регулировать парциальное давление растворенного кислорода. Различают химический, капельно-ртутный, трубчатый и метод измерения концентрации кислорода при помощи электрода с мембраной. Мембранные электрода принципиально делятся на гальванические и с внешним потенциалом. В настоящее время исследователи используют мембранные электроды ввиду того, что голые электроды в культуральных средах быстро стареют и теряют чувствительность. В

качестве

защитных

мембран

применяют

тефлоновые,

полипропиленовые,

полиэтиленовые и другие синтетические пленки толщиной от 6 до 30 микрон, причем скорость ответа электрода обратно-пропорциональна толщине мембраны. Диффузионный ток электрода может быть записан следующим выражением: Id = HFSPm

AO2 , B

где H – число электронов, участвующих в реакции, F – число Фарадея, S – поверхность электрода, АO2 – активность кислорода в растворе, Pm – коэффициент проницаемости мембраны, B – толщина мембраны. В этом выражения АO2 = СО2•fO2, где fO2 – коэффициент активности кислорода, СО2- концентрация кислорода. Концентрация кислорода в растворе падает при растворении солей, но активность остается пропорциональной рО2 (парциальное давление) за счет роста fO2. Независимость Id с изменением концентрации кислорода от концентрации солей справедлива только для мембранных электродов. Показания голых электродов изменяются с изменением концентрации солей по закону Сеченова: γ =

AO 2 C0 = = fO2 , CO 2 C O 2

где С0 – концентрация вещества в растворе. Таким образом, изменение диффузионного тока, регистрируемое вторичным прибором, полностью отражает изменение концентрации растворенного в среде кислорода. Реакция измерительной системы на любое изменение содержания в среде

68

кислорода не мгновенна и зависит от скорости перераспределения концентраций до установления нового газо-жидкостного мембранного равновесия. Свойства электродов остаются надолго постоянными, если они сделаны тщательно и из благородных металлов как платина, золото, серебро (99 % чистоты). Золото может применяться во всех случаях, так как дает устойчивые результаты измерений, не зависящие от присутствия других газов. В качестве измерительного электрода могут служить золото, платина, серебро. Электродами сравнения могут быть свинцовый, хлорсеребряный, каломельный, талиевый и другие. Рассмотрим устройство электрода мембранного с внешним наложением потенциала (рис. 33). Наибольшее распространение получили электроды Кларка и их различные модификации. Система электродов датчика состоит из катода, выполненного из платины (99,99 % чистоты), серебряного анода такой же чистоты и электролита (химически чистый 0,1 Н КCl).

В

качестве

мембраны

используются

пленки

из

фторопласта

или

полипропилена. Большое значение с точки зрения обеспечения требуемых характеристик датчика имеют основные размеры элементов датчика, а именно: площадь катода 12 мм2, площадь анода 600 мм2, толщина мембраны 6 – 30 мм. Величина поверхности анода выбрана достаточно большой по сравненью с поверхностью катода и может обеспечить максимальное постоянство потенциала сравнения. Система электродов смонтирована в измерительной головке, которая представляет собой одно целое с внутренним стержнем датчика. Платиновый электрод заделан с помощью эпоксидной смолы на уровне торца измерительной головки и тщательно отполирован. Серебряная проволока диаметром 0,8 мм накручена плотной спиралью на цилиндрический стержень головки и покрыта хлоридом (хлорид наносится электролитически в 0,1 Н НСl в течение 0,2 часа при напряжении 1,2 В). Мембрана с помощью прижимного кольца крепится к корпусу датчика. Герметичность крепления мембраны обеспечивается уплотнительными кольцами из термостойкой резины. В датчик заливают 0,5 мл электролита. Платиновый катод целесообразно держать постоянно под отрицательным потенциалом, даже в период когда не проводятся измерения для предотвращения образования на поверхности платины слоя окислов.

69

Рис. 33. Схема полярографического электрода: 1 – корпус; 2 – газопроницаемая мембрана; 3 – пористая прокладка; 4 – серебряный анод; 5 – платиновый катод; 6 – электролит.

В отдельных модификациях в раствор электролита вводят галогенид и от 0,5 до 5 весовых частей окисляющегося топлива, двуокись циркония, галоидные соли и топливо с рН 5. Для электродов во время измерения применяется напряжение в 0,7 – 1,3 В, что соответствует разности потенциалов электродов, обусловленной током диффузии в плато первой волны кислорода. Измеренные токи находятся в прямой пропорции к упругости кислорода, которая в водных растворах составляет от 10 -6 до 10-9 моль О2. Поскольку лишь очень малое количество кислорода проходит через мембрану, можно пренебречь чувствительностью системы к потоку среды вокруг электрода. Однако ток увеличивается на 25 – 50 % при переходе от неперемешиваемой среды к интенсивно перемешиваемой. Так как кислород диффундирует через поверхность большую, чем поверхность катода, полярографический ток не растет линейно с увеличением диаметра электрода. Это делает почти равной функцию диаметра электрода функции диаметра менее 2 мм. На точность измерения монет влиять оседание пузырьков воздуха на мембране. Однако эта опасность сводится на нет в интенсивно перемешиваемых растворах, где струя жидкости постоянно омывает мембрану. С помощью мембранного электрода можно измерить содержание кислорода как в жидкой, так и в газообразной фазах, причем чувствительность электрода может достигать 2•10-7 г О2/л, что дает возможность определять 0,03 % кислорода в газовой смеси. Неудобство применения мембранных электродов в микробиологической практике заключается в том, что большинство из них не выдерживает термообработки и стерилизацию необходимо производить бактерицидными химическими реагентами

70

Наиболее приемлемым способом стерилизации является обработка электродов в собранном виде 0,5 % раствором β-пропиолактона. Широкое распространение получили мембранные гальванические электроды типа электрода

Мекерета.

Модификация

Мекерета

является

более

применимой

в

микробиологической практике, чем электроды с внешним наложением потенциала, так как в собранном виде выдерживает термическую стерилизацию. Тело электрода выполнено из нейлона 66, анод выполнен из свинца, а катодом является серебряная трубка толщиной 0,03 дюйма, облицованная нейлоном. В качестве электролита используются фосфатный буфер. Анод в виде свинцовой фольги расположен внутри катода и отделен от него прокладкой из хроматографической бумаги, предотвращающей контакт анода с катодом. Поверхность, выступающая из корпуса, затягивается полимерной пленкой из этилен-пропилена толщиной 0,0125 мм. Электрод выдерживает стерилизацию при 1,5 атм. Температурный коэффициент мембраны составляет 2 % на 1°С. Для работы на средах с парафинами применяется мембрана из фторэтиленпропилена, обладающая пониженной адгезией к н-алканам, что не повышает времени ответа электрода (90 % величины сигнала в мин). Электрод стабильно работает более 500 часов непрерывно. Чувствительность гальванического электрода после 5 недель работы снижается на 0,4 % в сутки при неизменном остаточном токе. Для определения концентрации кислорода в газовой смеси применяют также алюминиевые коррозионные электроды, обеспечивающие измерение 0,03 % кислорода в газовой фазе и 2,1•10-4 М О2 жидкости. Для изготовления кислородных электродов используют также вольфрам, молибден, родий с примесью свинца и серы, палладий и его сплавы, электролиты на основе ионообменных смол. Известен электрохимический датчик, в котором газ проникает через тонкую гибкую полупроницаемую мембрану из микропористого полипропилена и растворяется в электролите с образованием заметного изменения рН электролита. Датчик содержит стеклянный электрод с чувствительным к рН наконечником, эталонный электрод, резервуар для жидкого электролита. Чувствительный наконечник и эталонный электрод электрически соединены между собой через резервуар с электролитом, Мембрана отделена от наконечника, находится рядом с ним и ограничивает тонкую жидкостную пленку электролита при помощи прокладки между наконечником и мембраной. Для

измерения

потребления

кислорода

микроорганизмами

применяются

специальные респирометрические ячейки различных конструкций, соединенные с культиваторами с помощью перекачивающих устройств (рис. 34). Оседание клеток

71

микроорганизмов

предотвращается

перемешивающими

устройствами,

например,

магнитными стрелками.

Рис. 34. Схема респирометра, совмещенного с ферментером: 1 – ферментер основной; 2 – измерительный ферментер; 3 – слив по уровню; 4, 5, 8 – насосы; 6, 7 – датчики рО 2; 9 – воздушный холодильник; 10 – гидрозатвор.

Респирометр функционирует следующим образом. Исследуется дыхательная активность не всей культивируемой популяции, а только ее части, которая из основного ферментера 1 поступает в измерительный ферментер 2, оборудованную сливом по уровню 3 при помощи которого излишек культуры возвращается в основном ферментер. Отбор и возврат культуры осуществляется насосами 4 и 5, причем измерительный ферментер связан с основным ферментером только через гидравлический тракт, что позволяет вести измерение убыли кислорода из полностью изолированной газовой полости измерительного ферментера. Измерительный ферментер оборудован двумя платиново-серебряными датчиками рО2 6 и 7, один из которых 6 измеряет парциальное давление кислорода в газовой полости измерительного ферментера, а второй 7 в культуральной жидкости. Датчик 6 помещен в ячейку, через которую при помощи насоса 8 прокачивается воздух из газовой полости измерительного ферментера. Перед этой ячейкой установлен воздушный холодильник 9, в котором анализируется газовая смесь,

освобожденная

от водяных паров. Аэрация

72

измерительного

ферментера

осуществляется автономно, воздух подается через ротаметр и фильтр в газовую полость и выходит через гидравлический затвор 10, который во время измерения дыхательной активности

микробной

популяции

в

замкнутом

контуре

играет

роль

сосуда,

компенсирующего изменение давления в газовой полости. Применение описанного респирометра продолжает методическую линию, начатую работами Варбурга, но значительно расширяет возможности манометрического метода, исключая из него операции, которые могут существенно изменить физиологическое состояние микроорганизмов в период подготовки к измерениям. Исключение этих операций (центрифугирование, ресуспензирование) возможно благодаря обмену культуры в измерительном ферментере, возможности в любой момент изолировать культуру в измерительном ферментере при изучении дыхательной активности в острых опытах, когда воздействия на объект могут вызвать необратимые или трудно обратимые изменения его физиологического состояния (исследование ингибиторов, активаторов или в случае использования

меченых

соединений).

Культура,

находящаяся

в

измерительном

ферментере может быть использована для острых опытов с широким варьированием состава атмосферы измерительного ферментера без риска остановки процесса в основном ферментере. Несмотря на обилие методов и способов определения содержания кислорода в жидкостях и газах, основное применение в микробиологической практике нашли все же лишь полярографические и электрохимические электроды.

5.3. Влияние величины рО2 на микробный метаболизм Дыхание микробных клеток и физиологическая активность в условиях непрерывного культивирования поддерживается на постоянном уровне до тех пор, пока концентрация растворенного в среде кислорода не достигнет определенной критической величины. В дальнейшем наблюдается зависимость дыхательной активности и характера клеточного метаболизма от изменения концентрации кислорода в среде, причем, величина критических концентраций индивидуальна для различных микроорганизмов и колеблется в диапазоне 0,018 – 0,046 мМ О2/л. При этом наблюдается корреляция между размерами клеток и величиной критической концентрации кислорода, причем, чем больше размер клеток, тем выше для них СКРИТ. Описанный эффект объясняется тем, что скорость потребления кислорода клеткой при его низком парциальном давлении лимитируется диффузией через клеточную оболочку. Но возможно и предположение различного сродства к кислороду цитохромных систем различных микроорганизмов, а также различную степень насыщенности кислородом энзимных систем. Величина С КРИТ может

73

изменяться даже у одного вида микроорганизмов в зависимости от физиологического состояния культуры. Она ниже у голодающих клеток, исчерпавших внешние и внутренние запасы питательных веществ, чем у клеток, находящихся в благоприятных условиях. При увеличении

температуры

среды

СКРИТ

возрастает

для

клеток,

находящихся

в

благоприятных условиях и не изменяется для голодающих. Отмечают, что при снижении рО2 ниже уровня СКРИТ наблюдается резкое падение потребления кислорода и ухудшение обменных процессов, сопровождающиеся переходом на анаэробный путь получения энергии. Интенсивность дыхания поддерживалась на постоянном уровне при рО2 равном 10 мм рт. ст., но снижение рО2 до 5 мм рт. ст. вызывало усиление дыхания, что, возможно, связано с разобщением окислительного фосфорилирования. Подобное явление описано у Clostridium aerogenosa рО2 при 2 мм рт. ст. и у других бактерий рода Clostridium причем, в последнем случае СКРИТ. определено как 2,5 мг/л. Разброс величин СКРИТ., определенных разными авторами, может быть объяснен различием методик эксперимента и физиологического состояния исследуемых культур микроорганизмов. При культивировании в режиме хемостата (D = 0,1 час-1) Candida utilis снижение рО2 ниже 5 мм рт ст. приводило к снижению выхода биомассы и накопления в среде жирных кислот. Свободные кетокислоты обнаруживались в клетках только при рО 2 меньше 1 мм рт. ст. Обменный фонд свободных внутриклеточных аминокислот также менялся в зависимости от условий аэрации. Существенную зависимость величины критической к концентрации кислорода от скорости роста культуры обнаружили у Е. coli. Была обнаружена узкая область оптимального для роста рО 2, несколько превышающая величину критической концентрации кислорода Е. coli. При выращивании в зоне критической концентрации кислорода Е. coli снижается выход биомассы и возрастает скорость потребления кислорода. Экономический коэффициент был максимальным в аэробных условиях, снижался при низком рО 2 и был совсем низким в анаэробиозе, что объясняется увеличением энергетического и подавлением конструктивного обмена. Описанная многими исследователями критическими концентрация растворенного в среде кислорода у различных микроорганизмов колеблется в достаточно широком диапазоне и имеет видовую специфичность. Решающее значение в жизнедеятельности большинства микроорганизмов имеет степень насыщения питательной среды кислородом. От нее зависит направленность и скорость биохимических реакций в живом организме, и соответствующий подбор условий может не только увеличить выход необходимого продукта или ускорить реакцию, но в

74

ряде случаев, совершенно изменить характер ее протекания. При кислородном голодании некоторые аэробы растут только в пленке на поверхности жидкой среды, где соотношение кислорода и субстрата оптимально. Степень обеспеченности кислородом микробных популяций обусловлена разностью скоростей абсорбции кислорода жидкой средой и потребления его клетками. По-видимому, именно глубина лимитирования роста кислородом

оказывается

решающим

фактором

направленности

биосинтетических

процессов. При известном режиме снабжения кислородом в сочетании с правильным режимом питания можно избежать образования спирта дрожжами даже при высоких скоростях роста. Аэробное брожение вовсе не является поставщиком промежуточных продуктов, участвующих в биосинтезе, и не метаболиты гликолиза лимитируют скорость биосинтетических реакций, а скорее всего, энергоснабжение. Однако, экспериментально обнаружить влияние нелимитирующих концентраций растворенного кислорода на рост и развитие

микробных

популяций

достаточно

сложно

ввиду

многофакторности

экспериментов. Исключение составляет квазинепрерывный способ культивирования с управлением подачи субстрата (глюкозы) в зависимости от величины рО 2: по мере снижения концентрации растворенного в среде кислорода (вне зоны критической концентрации) адекватно возрастает потребность и скорость утилизации глюкозы растущей

культурой. При проведении процессов хемостатного культивирования

микробных популяций достаточно обеспечивать поддержание величины рО 2 на уровне 15 – 20 % насыщения, несмотря на то, что оптимальные концентрации кислорода индивидуальны для различных микроорганизмов и устанавливаются конкретно для каждого процесса. Так, оптимальная для роста Aspergillus концентрация кислорода составляет 15 %, а для образования лимонной кислоты оптимум рО2 смещался выше 20 %. В присутствии меласных растворов повышенной концентрации (15 % по сахару) синтез лимонной кислоты снижается и добиться его повышения можно усилением насыщения среды кислородом.

75

Глава 6. 6.1. Влияние углекислого газа на микроорганизмы Углекислый газ (СО2), составляющий основную часть газообразных продуктов клеточного метаболизма, оказывает определенное воздействие на рост и развитие микроорганизмов. В связи с этим особый интерес представляет закономерности растворения в жидкостях и удаления (вентиляции) углекислого лаза из культивационных сред. Скорость уноса СО2 из ферментера меняется с изменением вязкости, температуры и рН культуральной среды. Скорость гидратации СО 2 не зависит от парциального давления (рСО2) в газовой смеси над поверхностью среды, но зависит от рСО 2 внутри газовых пузырьков в образующейся пене. Прямое измерение концентрации растворенного в среде углекислого газа сопряжено с некоторыми трудностями (значительное время ответа электродов и отсутствие их серийного выпуска). В связи с этим представляют интерес работы, показывающие, что концентрация углекислого газа в газовой фазе полностью соответствует концентрации растворенного СО2 (pСО ± ΔСО2). Соотношение рСО2 и НСО3 находятся в строгой зависимости от рН среды и сохраняет подвижное равновесие между этими формами (рис. 35).

Рис. 35. Зависимость содержания различных форм СО2 в жидкости от рН.

Парциальное давление СО2 в выходящих из ферментера газах соответствует давлению СО2 в жидкой среде, что исключает необходимость измерения СО 2

76

непосредственно в ферментере. Измерение концентрации углекислого газа в воздушной фазе не составляет трудностей ввиду наличия серийно выпускаемых промышленностью газоанализаторов. Действие

углекислого

газа

на

микробные

культуры

различается

как

по

направленности (стимуляция или ингибирование биосинтеза) так и по спектру действующих концентраций. Показано, что реакции карбоксилирования протекают у всех гетеротрофных

микроорганизмов,

и

они

способны

к

фиксации

углекислоты.

Гетеротрофная фиксация СО2 отмечена при аэрировании дрожжей Candida tropicalis шт. H-30 и Candida guilliermondii шт. НП-4 воздухом, содержавшим 15, 20 и 30 об. % углекислого газа, меченного по 14С. При культивировании указанных дрожжей в среде с октадеканом выход биомассы за счет фиксации СО2 возрастал на 20 % при усвоении 14 % поданного углекислого газа, а на среде с глюкозой выход биомассы возрос только на 2,7 %. При этом 58 % углерода фиксированного СО2 обнаруживалось в белковой фракции. Содержание липидов в биомассе, выращенной при продувании воздуха с 30 % СО2, увеличивалось с 7 до 11,8 % от веса образца, но включенной меченого углерода в жиры не обнаружено и они синтезированы за счет углерода н-алканов. В этих условиях потребность дрожжей в кислороде и тепловыделение снизились в 1,4 раза по сравнению с контрольным вариантом без продувания углекислого газа. Дальнейшие исследования показали, что во фракцию кетокислот включение меченого СО2 происходило в 5 раз интенсивнее, чем во все остальные органические кислоты. Показано также обеспечивается

включение

14

С в щавелевоуксусную

фосфоэнолпируваткарбоксикиназой

на

среде

с

кислоту, н-алканами

что и

пируваткарбоксилазой на среде с глюкозой. Активность этих ферментов возрастала при аэрации

питательной

среды

воздухом,

обогащенным

СО 2.

Активность

малатдегидрогеназы, фумаразы и пируваткиназы при гетеротрофной фиксации СО2 из воздуха не менялась. При гетеротрофной фиксации меченой по

14

С СО2 метка включалась в биомассу у

дрожжей следующим образом: свободные аминокислоты 8,2 %, белки 58,3 %, углеводы 26,5 % ж липиды 6,5 %. Гетеротрофная фиксация углекислоты на 40 % снижала образование эндогенной СО2, но обмен между экзогенной и внутриклеточной СО 2 не осуществлялся. При изучении фиксации СО2 дрожжами Sacch. сerevisiae и Candida tropicalis в процессе реакции гликолиза и глюкогенеза было показало, что во время гликолиза ферменты,

ответственные

за

фиксацию

СО2

(пируваткарбоксилаза

и

фосфоенолпируваткарбоксикиназа) были в 2 – 3 раза активнее, чем во время глюкогенеза.

77

В аэробных условиях при росте дрожжей Sacch. сerevisiae на среде с глюкозой или глицерином 2,6 % углерода биомассы синтезировалось за счет экзогенной углекислоты, а при росте на пирувате или этаноле до 3,3 %. Повышенная активность фиксации СО2 на средах

с

пируватом

и

этанолом

объясняется

высокой

активностью

фосфоенолпируваткарбоксикиназы. Включение СО2 в обменные процессы метанолокисляющих бактерий показало, что ассимиляция Экзогенная

углекислого СО2

газа

является

катализируется

необходимым

фосфоенолпируваткарбоксилазой.

участником

метаболических

процессов

ассимиляции метана и метанола, акцептируя избыточные электроны этих соединений. Степень

восстановленности

субстрата

определяет

интенсивность

фиксации

гетеротрофными микроорганизмами экзогенной СО2. Углекислый газ предопределяет и стартовые скорости роста микроорганизмов. При насыщающих концентрациях СО2 в момент инокуляции среды скорость роста E. coli достигает максимума, а при субоптимальных концентрациях скорость роста становится пропорциональной концентрации СО2. В присутствие насыщающей концентрации СО2 рост E. coli на средах с глюкозой и ацетатом начинается без лаг фазы. Дополнительное внесение аспартата или глутамата не заменяло действие СО2. Максимальная скорость роста Streptomyces sanguis наблюдалась при концентрации СО2 не менее 2,4 %. При более низких концентрациях СО2 скорость роста была пропорциональна рСО2. Физиологически молодые и старые клетки при оптимальном рСО 2 росли с равными скоростями, а повышение рСО2 с 2,4 до 15 % не влияло на скорость роста. Недостаток

углекислого

газа

задерживает

спорообразование

у

культур

микроорганизмов. В ряде случаев отмечено и ингибирующее рост микробных популяций действие углекислого газа. Для снижения уровня пенообразования ферментеры переключают с режима непрерывной аэрации в режим оксистатирования. Разница между режимами аэрации и оксистатирования заключается в том, что при аэрации воздух подается в ферментер, вне зависимости от потребления кислорода культурой, а при оксистатировании – только по мере потребления кислорода. Однако данным способ оксистатирования имеет и отрицательную сторону – нарушение режима вентиляции аппарата, сопровождающееся повышением концентрации в

ферментере

СО2.

На

рис. 36

представлен

фрагмент

процесса

проточного

культивирования в момент перехода от режима аэрации к оксистатированию. Содержание СО2 в выходившем из ферментера воздухе увеличилось с 1,2 до7 %, а расход воздуха на аэрацию уменьшился с 60 до 10,3 л/час. Таким образом, увеличение содержания СО2 в

78

отходящих газах в 5,8 раза связано не с изменением интенсивности выделения СО 2 клетками, а со снижением скорости вентиляции аппарата.

Рис. 36. Влияние оксистатирования ферментера на рост дрожжей C. utilis: 1 – биомасса; 2 – СО2; 3 – рН; 4 – рО2.

Концентрация биомассы постепенно снижалась и через 10 час стабилизировалась на новом, более низком уровне. До

перехода

к

оксистатированию

скорость

роста

микробной

популяции

ограничивалась содержанием в питательной среде источника азота и концентрация последнего в оттоке составляла 0,015 г/л, что соответствовало пороговой концентрации данного компонента среды для изучаемой культуры. Концентрация глюкозы и углеродсодежащих

продуктов

клеточного

метаболизма

в

оттоке

составляла

соответственно 2,4 и 1,32 г/л (рис. 37)

Рис. 37. Динамика содержания некоторых компонентов среды при оксистатировании ферментера: 1 –

79

азот; 2 – углерод продуктов метаболизма; 3 – глюкоза.

При переходе популяции в новое устойчивое состояние (с оксистатированием) концентрация источника азота в оттоке возросла до 0,131 г/л, и лимитирования роста по данному фактору не происходило. Содержание в оттоке глюкозы, фосфатов и углерода продуктов клеточного метаболизма также не ограничивало скорость роста дрожжей. У дрожжей Candida utilis в проточной культуре морфология клеток и степень их агрегированности менялись в зависимости от содержания СО2 в воздушной фазе аппарата. Таким образом, единственным фактором, резко изменившим свою величину при переходе от режима аэрации к оксистатированию, являлась концентрация СО 2 и, возможно, именно она ингибировала рост дрожжей C. utilis в описанном режиме. С целью проверки этого предположения рН культуральной жидкости был снижен с 6,9 до 5,5, что вызвало изменение растворимости углекислого газа (рис. 35). Переход к новому уровню рН-статирования осуществляли постепенно в автоматическом режиме подтитровки, что позволило проследить изменение скорости роста и содержания углекислого газа при этом. Концентрации СО2 в выходивших из ферментера газах возросла до 11 % и стабилизировалась на новом уровне. Концентрация биомассы плавно увеличивалась и достигала уровня, наблюдавшегося при непрерывном культивировании в режима хемостата с лимитированием по азоту.

Рис. 38. Зависимость удельной скорости роста от рН среды.

Содержание источника азота в оттоке снизилось до 0,015 г/л, л рост в дальнейшем лимитировался этим фактором. Однако, снижение рН среды само по себе может оказывать влияние на рост микроорганизмов. Как показано на рис. 38 скорость роста дрожжей C. utilis не зависит от рН среда в диапазоне от 5 до 7,1. Снижение рН от 6,9 до 5,5 лежит в зоне оптимального рН для роста изучаемой культуры. Следовательно,

80

увеличение скорости роста после снижения рН среды может быть отнесено за счет изменения соотношения разных форм углекислого газа в культуральной среде. Двуокись углерода может содержаться в жидкостях в виде трех форм: свободной двуокиси углерода (СО2) гидрокарбонатной (НСО3-) и карбонатной (СО3-2) в различных соотношениях в зависимости от рН среды. Агрессивно действует на различных материалы не вся присутствующая в воде свободная СО2, а лишь ее определенная часть, величина которой зависит от содержания гидрокарбонатной СО2 и называется «агрессивной двуокисью углерода». При культивировании дрожжей в питательной среде с рН 6,9 гидрокарбонатная форма составляла 80 % общего содержания СО2; со снижением рН ее количество уменьшалось, а концентрация свободной СО2 возрастала. Можно предположить, что рост дрожжей

C. utilis

при

оксистатировании

ферментера

ингибировался

избытком

гидрокарбонатной формы СО2. Содержание рН культуральной жидкости до 5,5 снижало не

общее

содержание

СО2

в

ферментере,

а

только

изменяло

соотношение

гидрокарбонатной и свободной форм в сторону увеличения последней. Следствием этого было увеличение скорости роста, выразившееся в повышении концентрации биомассы при постоянной скорости протока. Очевидно, повышение скорости выноса СО 2 с аэрирующим воздухом из ферментера нарушало равновесие между свободной и гидрокарбонатной формами, содержание последней в растворе снижалось, а рН среды смещалось в щелочную зону. Возможно, что свободная СО2 и ее гидрокарбонатная форма оказывают различное действие на скорость и на процесс накопления продуктов микробного синтеза. Не исключено, что разница в характере действия различных форм СО 2 связана с индивидуальными особенностями изучавшихся культур микроорганизмов. Представленные материалы удовлетворительно объясняют эффект ингибирования роста дрожжей избыточной концентрацией углекислого газа. Но наряду с этим известны данные о гетеротрофной фиксации СО2 дрожжами, о которых упомянуто выше, причем включение углерода углекислоты в биомассу дрожжей достигает 20 % от суммарного углерода биомассы. Такая разница во влиянии СО2 на рост микробных популяций может объясняться различным изотопным составом биогенной и абиогенной углекислоты. Ведь в опытах по гетеротрофной фиксации СО2 всегда использовали абиогенную углекислоту либо, даже, топочные газы, включавшие СО2. Известно, что изотопный состав углерода углеродсодержащих веществ в природе варьирует в широких пределах, принимая значение δ13С от +10 ‰ до -90 ‰ (промилей).

81

Указанные изменения изотопного состава углерода, как правило, связывают с жизнедеятельностью организмов. Исследовали фракционирование изотопов углерода в биомассе и углекислоте при выращивании дрожжей Candida guilliermondii ВСБ-774 на синтетических питательных средах, содержавших в качестве источника углерода смесь н-алканов. Изотопный состав углерода этой смеси имел значение δ13С = -28,3 ‰. Сравнение изотопного состава углерода смеси углеводородов и её отдельных фракций показало, что используемые н-алканы практически однородны по изотопному составу углерода. В процессе роста дрожжей доля абиогенной углекислоты в общем её балансе на выходе из ферментера изменяется от 100 %, в начале роста, до 0,8 % при максимальной скорости роста культуры. В соответствие с этим изотопный состав углерода углекислоты изменялся от значений δ13С = +6,5 ‰ (абиогенная кислота) до значений, определяемых, в основном, биогенной, метаболической углекислотой (δ13С = -33,5 ‰ ÷ -34 ‰). Зная количество и изотопный состав углерода углекислоты на входе в ферментере и выходе из него, по материально-изотопному балансу определяли изотопный состав углекислоты, образующейся за счет жизнедеятельности микроорганизмов. При культивировании дрожжей в метаболической углекислоте наблюдается понижение содержания тяжелого изотопа 13С по сравнению с потребленными н-алканами. При этом значение δ13С метаболической углекислоты практически не изменялось в процессе роста популяции и составляло -32 ± 2 ‰, что на 4 – 6 % меньше значений δ13С н-алканов. Биомасса дрожжей, наоборот, имеет повышенное содержание изотопа

13

С по

сравнению с н-алканами и характеризуется величинами δ13С, находящимися в переделах от -20 ‰ (для начальной фазы роста) до -26 ‰ (стационарная фаза). Из приведенных данных следует, что при окислении н-алканов дрожжами происходит фракционирование изотопов углерода, в результате чего метаболическая (биогенная) углекислота обеднена изотопом 13С и характеризуется величиной δ13С на 4 – 6 % меньше, чем утилизированные н-алканы, а биомасса дрожжей, наоборот обогащена изотопом 13С и имеет δ13С на 3 – 4 % больше, чем н-алканы. Разность в изотопном составе углерода биомассы и углекислоты составляет 7 – 10 ‰. Можно предполагать, что наблюдаемое в опытах фракционирование изотопов углерода при окислении н-алканов дрожжами непосредственно связано с образованием, фиксацией и выделением во внешнюю среду СО 2. В результате кинетического изотопного эффекта, сопровождавшего диффузию углекислоты из клетки, изотопный состав ее

82

углерода будет иметь пониженное содержание

13

С по сравнению с оставшейся частью

углекислоты в клетке. Оставшаяся часть углекислоты используется клеткой для карбоксилирования

органических

кислот

и

аминокислот,

а

также

образует

внутриклеточный бикарбонатный фонд. Таким образом, в процессе роста дрожжей на насыщенных углеводородах происходит разделение изотопов углерода, в результате чего метаболическая углекислота обеднена изотопом

13

С по отношению к используемому субстрату, а биомасса клеток,

наоборот, обогащена этим изотопом. По-видимому, именно изотопный состав биогенной углекислоты служит причиной низкой усвояемости ее дрожжами в отличие от абиогенной, полностью соответствующей по изотопному составу углерода исходному субстрату. Биогенная углекислота может быть использована в качестве инертного консерванта при длительном хранении овощей либо прохладительных напитков, предотвращая активный рост посторонней микрофлоры. Наличие СО2 стимулирует образование ряда продуктов микробного синтеза. В хемостатной культуре Bacillus subtilis NCCIB8646 СО2 в концентрации 3,6 – 8,3 % стимулирует синтез α-амилазы. При этом 8 % содержание СО2 способствует увеличению удельной ферментативной активности в 3 раза и не оказывает влияния на рост культуры. Маслянокислые бактерии не развиваются на синтетических средах в отсутствии СО 2, а в его присутствии образуют избыточные количества ацетата. Стимулирующее рост действие углекислого газа описано для некоторых облигатных и факультативных анаэробов. Добавление 10 % СО2 в газовую (азотную) фазу анаэростата вызывало значительное увеличение размеров и количества колоний грамотрицательных анаэробов, некоторых штаммов клостридий и стрептококков. Однако, присутствие в аэрирующем воздухе углекислого газа, оказывает не только стимулирующее, но часто и ингибирующее воздействие на ряд микроорганизмов. Ингибирование

спорообразования

Bacillus

cereus

при

повышенном

рСО2

объясняется накоплением газов в липидном слое мембраны и нарушением её функции за счет

смещения

липидно-фазового

равновесия

в

сторону

увеличения

текучести

находящихся в жидкокристаллическом состоянии липидов. Повышенное содержание СО 2 в газовой фазе оказывает ингибирующее влияние на дрожжи Sacch. сerevisiae. При подаче с аэрирующим воздухом 20 % СО2 наблюдалось слабое ингибирование роста, а при увеличении СО2 до 50 % оказывало ингибирующее воздействие на ферментативную активность дрожжей и при 80 % СО2 в газовой фазе подавляло её почти полностью. Рост дрожжей полностью прекращался при давлении СО2 2,5 атм. Если учесть, что углекислый газ в зависимости от действующей концентрации и

83

вида микроорганизмов способен оказывать различное по направленности воздействие на клеточный метаболизм, возможно, он может быть использован в качестве фактора управления теми или иными функциями клеток. Айцинская наблюдала образование нитчатых форм Brevibacterium flavum в отсутствии СО2, а при его содержания в атмосфере 40 – 65 мг/л рост в виде кокков и палочек. Повышенная концентрация СО2 или НСО3- равно как и обогащенная питательная среда не заменяла потребности культуры в СО2. Нитевидные клетки содержали на 8–13 % меньше ДНК, чем кокковидные выращенные в атмосфере с СО2. Использовали действие различных концентрации углекислого газа для управления спорообразованием либо продуцированием лимонной кислоты Penicillum isariiforme. При содержании в воздухе 0,03 % СО2 мицелий через 72 часа покрывается тонким слоем конидиофор, а при более высоких концентрациях СО 2 спорообразование ингибировалось, но стимулировался биосинтез лимонной кислоты. При анализе опубликованных в литературе данных о действии углекислого газа на микробные популяции обращает на себя внимание тот факт, что во всех случаях стимулирующего рост влияние СО2 экспериментаторы использовали экзогенную (абиогенную) углекислоту. Экспериментальные данные об ингибирующем влиянии СО 2 на рост и развитие микроорганизмов получены, в большинстве, за счет влияния биогенной углекислоты, образованной этими же организмами. Не исключено, что причина различного по направленности действия СО2 заключается во фракционировании микроорганизмами изотопов углерода при окисления углеродсодержащего субстрата. Приведенные данные далеко не полностью иллюстрируют аспекты действия углекислого газа на рост и развитие микробных популяций, но в достаточной степени подчеркивают важность изучения данного фактора среды с целью использования его как одного из возможных управляющих факторов.

6.2. Влияние повышенной температуры на микроорганизмы. Среди

факторов

внешней

среды,

способных

оказывать

влияние

на

рост

микроорганизмов, температура занимает одно из ведущих мест. Изменение температуры культивирования оказывает существенное влияние на различные стороны обмена веществ как мезофильных, так и термофильных микроорганизмов. Действие температуры на полиферментную систему, какой является клетка, весьма сложно, поскольку каждый из компонентов этой системы по-разному реагирует на данный фактор внешней среды. Рассмотрим лишь одну сторону этого вопроса, а именно, влияние повышенной температуры на жизнедеятельность микроорганизмов, которая может рассматриваться как

84

биологически экстремальная. Как известно, при окислении субстрата микробной популяцией во внешнюю среду выделяются определенное количество тепла. Дрожжи Candida tropicalis в процессе роста на н-алканах выделяют значительное количество тепла, причем тепловыделение начинается сразу после засева дрожжей в питательную среду. На начальных фазах роста основное количество энергии находится в продуктах неполного окисления н-алканов. При недостатке в среде N и P термогенез снижается, но в расчете на единицу потребленного субстрата он возрастает в 2 раза по сравнению с отдачей тепла на полной среде. Возможно, что в данном случае имеет место разобщение между скоростями накопления энергии и роста. Увеличение аэрации в этих условиях приводит к интенсификации окисления субстрата и скорости роста до момента снижения концентрации N и P в клетке до “физиологического минимума”. Изменение температуры культивирования микроорганизмов сопровождается, как правило, изменениями скорости роста, утилизации субстрата, характера накопления продуктов

клеточного

метаболизма

в

среде

и

некоторыми

внутриклеточными

перестройка. Повышение температуры культивирования дрожжей сопровождается увеличением размеров клеток, они частично деформируются, резко увеличивается размер вакуолей, снижается количество мембранных структур, соотношение поверхности к объему клетки уменьшается, но жизнеспособность меняется незначительно. Повышение температуры выращивания дрожжей Candida utilis при проточном культивировании до 41°С не ингибировало образования почек, но тормозило расхождение ядер между материнской и дочерней клетками. При этом образуется конгломерат из 20 – 100 неразошедшихся клеток, обладающий повышенной флотацией. В хемостатной культуре наблюдается всплывание биомассы в виде пены, причем содержание клеток в пене, в 4 раза выше, чем в жидкости. В этих условиях рост клеток продолжается, но тормозится синтез элементов клеточной стенки. Увеличение размеров отдельных клеток и образование цепочек из нескольких клеток при повышении температуры наблюдали и у бактериальных культур, причем менялся также состав клеточных стенок. Удельная скорость роста микроорганизмов зависит от температуры культивирования и возрастает по мере приближения к оптимальным для роста температурам. Повышение температуры культивирования дрожжей Sacch. сerevisiae с 14 до 25°С сопровождалось увеличением μmax от 0,094 до 0,36 час-1 при постоянном экономическом коэффициенте, при 30°С μmax возрастало до 0,4 час-1, а при дальнейшем росте температуры существенно снижалось. Естественно, что исследовать влияние температуры на максимальную удельную скорость роста предпочтительнее всего в режиме турбидостата, когда температура является единственным переменным фактором внешней среды. При быстрой

85

смене температура культивирования Sacch. сerevisiae в режиме турбидостата в двух областях (14 – 33°С и 33 – 39°С) установлено, что перестройка параметров роста внутри каждой области осуществляется в течение одной генерации, а между областями в течение 3 – 6 генераций. Область оптимальных для роста температур у некоторых дрожжей оказывается достаточно узкой. Изменение температуры культивирования дрожжей Candida tropicalis от 35°С до 36°С на среде с н-алканами не оказывало влияния на μ (0,16 час-1), но повышение до 36,5°С сопровождалось снижением μ до 0,14 час-1, а при 38°С μ составляла лишь 0,09 час-1. Дрожжи C. guilliermondii при 20°С росли μ = 0,23 час-1, при 30°С увеличивалось до 0,35 час-1, а при 40°С снижалось до 0,17 час-1. Аналогичные закономерности

зависимости

от

температуры

культивирования

описаны

и

для

бактериальных культур. Во всех описанных экспериментах температура культивирования микроорганизмов создавалась за счет принудительного термостатирования ферментеров внешними агентами. Дрожжи Candida tropicalis культивировали периодическим способом на среде с н-алканами в качестве единственного источника углерода, но систему принудительного термостатирования отключали. За счет термогенеза дрожжей температура культуральной среды в течение 2,5 часов повышалась с оптимальной (33°С) до 41,5°С и на протяжении активного роста поддерживалась на этом уровне. Описанный эффект получил название аутотермостата

и

воспроизводился

независимо

от

объема

ферментера

как

на

восстановленных (н-алканы) так и на окисленных (углеводы) источниках углерода при отсутствии других лимитирующих рост факторов. Эффект аутотермостатирования свидетельствует

о

наличии

динамического

равновесия

между

теплопродукцией

микробной популяции и отдачей ею тепла в окружающую среду и соответствует закономерностям, характерным для аутостабилизации лимитирующих рост факторов. В основе явления аутотермостатирования лежат физиологические процессы, и оно обусловлено регуляторными механизмами клетки. Переход

культуры

в

режим

аутотермостатирования

сопровождался

резкой

интенсификацией дыхательной активности и она достигает максимума при повышении температуры культивирования до 36,5°С (рис. 39). При дальнейшем повышении температуры потребление кислорода и выделение СО2 резко снижается и при достижении 41,5°С стабилизируется на новом уровне. Существенных изменений концентрации биомассы в период выхода культуры в режим аутотермостатирования не происходит, и дальнейший процесс роста дрожжей идет в зоне неблагоприятной температуры.

86

Рис. 39. Изменение активности дыхания при переходе дрожжей Candida tropicalis а режим аутотермостата: 1 – температура; 2 – потребление кислорода; 3 – выделение СО2.

Сопоставление культивирования,

в

роста зоне

дрожжей

C.

оптимальной

tropicalis для

роста

в

режимах

температуры,

периодического и

в

режиме

аутотермостатирования показало существенные различия этих процессов (рис. 40). При периодическом культивирования культура проходит все фазы роста и через 20 часов переходит

в

стационарную

фазу.

В

режиме

аутотермостатирования

четкой

дифференциации кривой роста по фазам не наблюдается, в течение всего процесса происходит линейное увеличение концентрации биомассы и в стационарную фазу роста культура переходит лишь к 70 часу культивирования. Рост и развитие дрожжей в режиме аутотермостата в 3,5 раза медленнее, чем в термостатируемых условиях. Колебаний температуры в режиме аутотермостата не происходит и температура удерживается на уровне 41,5°С вплоть до исчерпания в среде источника углерода.

Рис. 40. Динамика роста дрожжей Candida tropicalis в режиме аутотермостата и контроле. Аутотермостат: 1 – биомасса; 2 – температура. Периодическое культивирование: 3 – биомасса; 4 – температура.

87

При сопоставлении двух точек на кривых роста дрожжей при периодическом культивировании и в режиме аутотермостата с одинаковой концентрацией биомассы (36 г/л) по удельной скорости потребления кислорода оказывается, что в режиме аутотермостата удельная скорость потребления кислорода в 3,2 раза ниже, чем при периодическом культивировании (0,23 г О2 г/час и 0,75 г О2 г/час). Подобное соотношение справедливо и для удельных скоростей выделения углекислого газа. Это подтверждает эффект замедления развития микробной популяции в режиме аутотермостата более чем в 3 раза. По абсолютной величине максимумы удельных скоростей роста также различаются:

в

режиме

аутотермостата

μmax = 0,032 час-1,

а

при

периодическом

культивировании μmax = 0,22 час-1. Изменение характеристик роста дрожжей C. tropicalis в режиме аутотермостата являются внешними проявлениями процессов проходящих в клетке, то есть являются функцией

внутриклеточного

метаболизма.

При

периодическом

культивировании

содержание белка резко снижается в первые часы культивирования и затем, к моменту перехода культуры в стационарную фазу, восстанавливается на прежнем уровне, характерном для покоящихся клеток (рис. 41). Динамика содержания белка в клетках зависит от комплекса факторов, влияющих на скорость роста, и может изменяться при искусственном "затягивании" клеточного развития. Минимальное содержание белка в клетках наблюдалось в момент перехода культуры из лаг-фазы в фазу логарифмического роста.

Рис. 41. Динамика содержания клеточного белка дрожжей Candida tropicalis: 1 – белок в режиме аутотермостата; 2 – температура в режиме аутотермостата; 3 – белок при периодическом культивировании.

С увеличением температуры культуральной среды во время перехода культуры в режим аутотермостата содержание белка в клетках снижается, но при достижении температуры культуральной среда 36,5°С наблюдалось его резкое увеличение. Этот момент соответствует периоду максимального подавления дыхательной активности

88

культуры, которая через 1 – 2 часа частично восстанавливалась. По мере адаптации микроорганизмов к изменившимся условиям культивирования происходит повторное снижение содержания белка в клетках характерное для этапа подготовки клеток к делению. Однако это повторное снижение содержания белка происходило довольно медленно, а начало увеличения содержания белка в клетках совпадало по времени с максимумом удельной скорости роста. Динамика содержания клеточного белка хорошо коррелирует с изменением дыхательной активности дрожжей Candida tropicalis при культивировании в режиме аутотермостата, и к моменту перехода популяции в стационарную фазу роста содержание белка полностью восстанавливается. Важным показателем интенсивности биосинтетических процессов в клетке является величина пула свободных внутриклеточных аминокислот. Около 70 % усваиваемого азота проходят через пул свободных внутриклеточных аминокислот, и состав пула находится в соответствии

со

степенью

активности

основных

реакций

переаминирования

и

декарбоксилирования в клетке. Переход культуры от лаг-фазы к фазе логарифмического роста

сопровождается

резким

снижением

величины

пула,

причем

содержание

аминокислот снижается в 22 – 24 раза по сравнению с наличием их в стационарной фазе роста. Во время столь резкого снижения аминокислотного пула роста клеточной популяции не происходит и только с переходом культуры к фазе экспоненциального роста пул свободных внутриклеточных аминокислот возрастает и достигает максимума в стационарной фазе роста. В режиме аутотермостата пул свободных внутриклеточных аминокислот резко снижается в начале процессе культивирования, но при температуре культуральной среды 36,5°С уменьшение пула приостанавливается, а при 41,5°С наблюдается даже некоторое увеличение пула с последующим снижением в начале процесса роста микробной популяции. В дальнейшем, по мере завершения роста и развития культуры в режиме аутотермостата аминокислотный пул возрастает, но гораздо медленнее, чем в контрольном варианте, и с выходом культуры в стационарную фазу роста достигает максимума. Динамика

содержания

нуклеиновых

веществ

в

клетках

дрожжей

при

культивировании в режиме аутотермостата не обнаруживает каких-либо существенных отклонений

от

общеизвестных

закономерностей,

свойственных

развивающимся

микробным популяциям. Рост дрожжей в режиме аутотермостата не приводит к необратимым изменениям культуры и переключение на термостатирование при оптимальной для роста температуре полностью восстанавливает ростовые характеристики популяции.

89

Повышение дыхательной активности при культивировании микроорганизмов в зоне повышенной

температуры

характерно,

по-видимому,

для

большинства

культур.

Повышение температуры культивирования оказывает влияние на синтез дыхательных ферментов, а не на их активность. Изменение температуры культивирования микроорганизмов оказывает влияние на скорость утилизации углеродсодержащего субстрата и соотношение энергетического и конструктивного метаболизма. При проточном культивировании дрожжей C. utilis (D = 0,05 – 0,3 час-1) и лимитации роста глицерином экономический коэффициент Y и КS при t = 30°C поддерживались

на постоянном

уровне.

Повышение

температуры

культивирования до 40°C сопровождалось угнетением размножения, увеличением расхода глицерина и фосфора на синтез биомассы. В этих условиях наблюдалось увеличение энергетических трат на поддержание. Увеличение трат на поддержание при повышении температуры культивирования может быть

весьма значительным. Выращивание

Aerobacter

aerogenes в зоне

супраоптимальной температуры резко снижает скорость роста и урожай биомассы, но дыхательная активность и скорость потребления глюкозы увеличивается в районе температур

на

5°

превышающих

оптимальную

для

роста.

Считается,

что

супраоптимальная температура ведет к нарушению корреляции между скоростями роста и потребления энергетического субстрата, в результате чего образуется “несцепленная с ростом” энергия. В хемостате с лимитом по глицерину у E. Coli при увеличении температуры культивирования в диапазоне 30 – 45°С энергетические затраты возросли в 12 раз, а потребность в энергии для биосинтеза только на 30 %. Предполагается, то увеличение трат

на

поддержание

при

повышении

температуры

связано

с

повышенными

потребностями для ускорения оборота макромолекул в клетке. Изменение температуры культивирования приводит, как правило, к изменению скоростей синтеза и изменению содержания ряда внутриклеточных компонентов. Перенос клеток E. Coli из среды с t = 30°С на среду t = 42°С сопровождается через 20 – 30 мин увеличением скорости синтеза валовых белков в 1,5 раза. При этом синтез 5 белков через 5 минут после изменение температурного режима увеличивается в 5– – 10 раза, а затем снижается до общего повышенного уровня. Эти белки стабильны и локализуются в цитоплазме. У термотолерантных дрожжей рода Candida величина пула свободных внутриклеточных аминокислот уменьшается при возрастании температуры культивирования. Для дрожжей этого же рода показано, что с повышением

температуры

культивирования

90

снижается

не

только

содержание

аминокислот в цитоплазме клетки, но и в клеточных стенках. Синтез РНК у дрожжей Candida utilis более чувствителен к повышенной температуре, чем синтез белка. Начальный рост при повышенных температурах происходит за счет активного функционирования РНК и рибосом, синтезированных при оптимальных условиях роста. При D = 0,1 – 0,3 час-1 в режиме хемостата повышение температуры культивирования с 30 до 40°С приводило к вымыванию культуры из ферментера. Содержание РНК уменьшалось на 31 %, ДНК на 20 % и белка на 13 %. Аналогичные изменения в содержании РНК и белка отмечены при повышении температуры и у других дрожжей. Длительное воздействие температуры 39,5°С на проточную

культуру

Sacch.

сerevisiae

вызывает

необратимые

изменения

в

конструктивною обмене: содержание РНК уменьшается на 80 %, ДНК на 40 % и белка на 50 %, а количество полисахаридов и липидов возрастает. При кратковременных воздействиях повышенной температуры изменения обратимы. При нулевой скорости роста содержание РНК составляет менее 6 %, что, по-видимому, необходимо для поддержания жизнеспособности клеток. Кроме этого, в клетках наблюдалось накопление неидентифицированного фосфорного соединений. Литературные данные иллюстрируют влияние температуры культивирования на рост и развитие микробных популяций в достаточно широком диапазоне, причем этот диапазон подразделяется на несколько зон. Ван Уден показал наличие корреляции между функцией температуры при термической гибели дрожжей и максимальной температурой их роста. В последующих работах при исследовании температурной области между 37,6 и 43,8°С для Sacch. сerevisiae, то есть области между оптимальной и максимально возможной температурами роста было обнаружено три температурных зоны: Топт, Тмакс. нач, и Тмакс.

конечн

. В первый период наблюдался экспоненциальный рост дрожжей, но с

увеличением температуры удельная скорость роста уменьшалась и при достижении 43,8°С была равна нулю. При Тмакс. конечн скорость отмирания клеток выше скорости роста и культура гибнет. Наличие Тмакс.

нач

характеризуется способностью популяция к

кратковременному росту при повышенной температуре с последующим его замедлением. Предполагается, что клетка имеет несколько термочувствительных участков, которые экспоненциально инактивируются при повышении температуры выше Т опт. Наличие трех термочувствительных зон было показано также для четырех штаммов Torulopsis latvica и 3 штаммов рода Candida, причем для всех исследованных микроорганизмов был обнаружен

индивидуальный

характер

температурных

максимумов.

Область

супраоптимальных температур имеет три зоны: между Т опт и Тмакс. нач развитие культуры протекало без отмирания клеток. Между Т макс.

91

нач

и Тмакс.

конечн

происходило как

экспоненциальное размножение, так и экспоненциальное отмирание клеток, а при температуре Тмакс. конечн происходило только отмирание клеток и гибель популяции. Механизм действия повышенных температур еще детально не изучен, но обнаружено, что у Escherichia coli повышение температуры до 42 – 45°С приводит к ингибированию

гомосеринтранссукциназы

(первого

фермента

цикла

биосинтеза

метионина). Перенос клеток в среду с температурой 37°С немедленно приводил к восстановлению исходной активности, а при добавлении в среду метионина оптимум биосинтеза белка смещался с 37 до 42°С. Рост прекращался при повышении температуры до 45°С и наблюдалось прекращение синтеза белка и РНК, но не ДНК, что не вызывало гибели клеток, а добавление в среду метионина восстанавливало рост, но не защищало клетки от гибели при более высоких температурах. Авторы предполагают, что при 45°С происходят частичные изменения в структуре гомосеринтранссукциназы, вызывающие уменьшение активности на участке образования о-сукцинилгомосерина из гомосерина. Подобную концепцию избирательного ингибирования одного или нескольких ферментов биосинтеза при действии повышенных температур можно признать вполне жизненной. Состав среды может оказывать значительное влияние на способность штамма того или иного вида дрожжей расти при повышенных температурах. Стимулирующее действие на рост микробных популяций при повышенных температурах оказывает добавление в питательную среду некоторых веществ, таких как витамины, олеиновая кислота и дрожжевой автолизат. Эти вещества способствуют расширению температурных границ роста. Существенное влияние на границы температурной зоны роста микроорганизмов оказывает характер используемого энергетического субстрата. По данным Позмоговой дрожжи Candida tropicalis Т-20 на солодовом суслоагаре росли при 45°С, на среде Ридер с глюкозой при 42°С. Величина оптимальных для роста температур снижалась на 1 – 2° при культивировании на жидких питательных средах того же состава. При отсутствии глюкозы в среде дрожжи Sacch. cerevisiae при 44°С полностью гибнут в течение 1 часа, а в присутствии глюкозы гибнет только 50 % клеток. В отсутствии глюкозы клетки не обладают достаточной энергией для регенерации повреждений, индуцированных высокими температурами. Приведенные данные позволяют предполагать избирательный характер действия супраоптимальных температур на микроорганизмы.

92

6.3. Влияние рН и Eh на микробные культуры. Величина рН является важным условием среды, в которой протекает жизнь микроорганизмов – будь то природа или микробиологическое производство. Если рН среды оптимально, то решающее значение для роста и характера метаболизма приобретают другие факторы среды. Жизнедеятельность микроорганизмов возможна и при неоптимальном значении рН, но тогда скорость роста и характер метаболизма определяется его величиной. Действие рН может быть слабым вблизи оптимума и усиливаться по мере удаления от него. Большое значение имеет и длительность воздействия. Кратковременное воздействие вызывает более или менее глубокое изменение или повреждение функций клетки, которое исчезает

после

снятия

воздействия.

Длительное

воздействие

должно

вызывать

физиологическое приспособление и возможно, что клетки могут длительное время существовать в измененном состоянии. От величины рН зависит состояние ионогенных групп на поверхности клетки, а если ионы Н+ и ОН- проникают внутрь, то и во внутренних структурах. Плазматические клеточные мембраны трудно проницаемы для водородных и гидроксильных ионов, поэтому

внеклеточная

уравновешиваются

и

между

внутриклеточная собой,

и,

концентрация следовательно,

водородных должен

ионов

не

существовать

трансмембранный градиент концентрации водородных ионов. Под влиянием рН могут изменяться как активные центры каждого фермента, что изменяет их связь с субстратом, так и заряды окружающих частей белковой молекулы и общего заряда молекул белка-фермента. Сильные отклонения от оптимума рН вызывают денатурацию белков. Фактор рН следует отнести к неспецифическим ингибиторам. Едва ли существует только один процесс метаболизма, ингибируемый этим фактором внешней среды. Вернее, угнетается ряд процессов одновременно или торможение нескольких процессов включается последовательно, по мере усиления действия фактора или продления времени его действия. Для измерения величины рН в жидкостях используют стандартные стеклянные электроды в паре с каломельным электродом. Рабочая поверхность стеклянного электрода представляет собой стеклянную мембрану с тончайшими стенками из мягких сортов стекла, регистрирующим прибором является потенциометр. Максимальная скорость роста микроорганизмов поддерживается в сравнительно узком интервале рН от 2 до 3 единиц (рис. 36), а зависимость μ от концентрации водородных и гидроксильных ионов в пределах рН 1 – 2,5 и 8 – 10 является линейной и скорость роста подчиняется уравнению Иерусалимского. Тщательные исследования

93

влияния рН среды на рост и развитие микробных популяций были проведены И.Л. Работновой. В хемостатных культурах при достижении критического уровня рН происходит вымывание микроорганизмов из ферментера, а критическое значение рН тем выше, чем ниже удельная скорость роста. Однако, в узкой зоне значений рН в пределах 0,2 единицы

возможно

стационарное

состояние

хемостатной

культуры

при

ингибировании роста ионами водорода, добавляемыми извне. Плотность популяции и экономический коэффициент при этом снижается. У культур, ингибированных как Н +-, так и ОН--ионами в хемостате, снижение экономического коэффициента наблюдается при медленном росте, т.е. при длительном действии ингибитора на клетки (так как скорость протока низка). При высокой скорости протока клетки недолгое время пребывают под действием ингибитора, и в результате его ингибирующее действие может быть ослаблено. У исследованных ингибированных культур происходит значительное повышение трат энергетического субстрата в расчете на единицу выросшей биомассы. Это наблюдается как в кислых, так и в щелочных условиях. Потребление энергетического субстрата ингибируется в меньшей степени, чем рост биомассы, что выражается в снижении экономического

коэффициента.

В

узком

интервале

рН,

в

котором

возможен

ингибированный рост, снижение Y бывает двух или трехкратным по сравнению с лимитированными культурами. Следовательно, конструктивный метаболизм (синтез клеточных веществ) при неблагоприятном действии рН ингибируется сильнее, чем энергетический.

Траты

энергетического

материала

на

поддержание

жизни

без

размножения оказались повышенными в экстремальных условиях рН, а в условиях лимитированного роста были незначительными. В неблагоприятных условиях клетка должна удерживать градиент рН, на что затрачивается энергия, и противодействовать повреждающему действию водородных и гидроксильных ионов. Сами энергетические процессы изменяются при экстремальных значениях рН и в среде появляются продукты неполного окисления углеродного субстрата. Дыхательный коэффициент повышен и в кислых, и в щелочных условиях, что говорит о снижении окислительной функции, а пул АТФ у ингибированных культур понижен. Состав биополимеров клеток при экстремальных значениях рН не претерпевает существенных изменений. Содержание ДНК и РНК постоянно при всех значениях рН, а содержание резервных веществ, в частности липидов, возрастает в кислой среде. Обогащение клеток липидами имеет аналогию с выделением в среду продуктов неполного окисления, с той разницей, что первые остаются в клетке. При ингибировании культур экстремальными значениями рН резко изменяется

94

морфология клеток. Эти изменения происходят быстро, в течение нескольких часов при достижении значения рН, удерживаются неограниченное время при постоянстве рН и обратимы при изменении кислотности среды. Экстремальные значения рН меньше влияют на синтез стенок, чем других частей клетки. Ядро не претерпевает видимых изменений ни при росте в кислой, ни в щелочной среде. Таким образом, экстремальные значения рН вызывают перестройки процессов анаболизма и катаболизма, и физиологически измененные клетки могут существовать в неблагоприятных для роста условиях длительное время. Наряду с активной кислотностью другим физико-химическим фактором среды, имеющим большое значение для жизнедеятельности микроорганизмов, являются окислительно-восстановительные условия. Для измерения величины Еh в микробных культурах используют платиновые электроды в паре с каломельным электродом. Величину окислительно-восстановительного потенциала выражают в милливольтах, а состояние среды вполне характеризуется двумя величинами: Eh и рН. При этом на единицу

изменения

рН

величина

Eh

изменяется

на

60 мВ.

Окислительно-

восстановительный потенциал является некоторой результирующей всех окислительновосстановительных факторов и его можно трактовать как количественную меру аэробности процесса. Анаэробные микроорганизмы не переносят высокого окислительновосстановительного потенциала окружающей среды, поскольку некоторые жизненно важные ферменты инактивируются при высоком Eh. Культуры анаэробов только тогда приступают

к

размножению,

когда

преодолевают

высокий

окислительно-

восстановительный потенциал, снизив его, и именно это обуславливает необходимость внесения большого количества посевного материала при культивировании. В зависимости от состава культуральной жидкости, рН среды и вида микроорганизмов окислительновосстановительный потенциал может изменяться в широком диапазоне от +600 до -200 мВ. Причем в аэробных условиях для разных культур величина Eh может варьировать от +80 до +320, а в анаэробных условиях снижается до -140. В ряде случаев именно

величина

окислительно-восстановительного

потенциала

может

служить

подтверждением анаэробности процесса, поскольку “0” показания электрода рО 2 свидетельствуют лишь о лимитировании роста микроорганизмов кислородом, а не о его отсутствии в среде. Количественный и качественный состав продуктов брожения может в значительной степени изменяться при культивировании микроорганизмов при различных окислительно-восстановительных условиях.

95

Глава 7. Лимитирование роста микроорганизмов компонентами питательной среды Управлять ростом и метаболизмом микроорганизмов, а следовательно, и всеми процессами биосинтеза надежнее всего при ограничении роста голоданием по тому или иному элементу питательной среды, то есть лимитированием. Выращивание микробных популяций в режиме хемостата является по своей природе выращиванием при ограничении – лимитировании роста. По сути, практически все процессы промышленного культивирования микроорганизмов являются хемостатными и рост культур ограничен предварительно избранным фактором внешней среды. Нелимитированное выращивание это только частный случай непрерывного культивирования, наблюдаемый при высоких скоростях протока среды либо в режиме турбидостата. При ограничении роста культуры недостатком элементов питания метаболизм микроорганизма меняется: вместо синтеза нормальных составных частей

клетки и образования новых подобных клеток

энзиматический аппарат выросшей популяции изменяет характер своей работы и переключается на синтез резервных веществ или вторичных метаболитов, часто представляющих практический интерес и в этом заложены широкие возможности для управления процессами биосинтеза. Законы реагирования микроорганизмов на тот или иной вид голодания еще далеко не выявлены, предсказать, что произойдет с клетками при той или иной лимитации, пока можно только с малой степенью вероятности. Рассмотрим подробнее влияние лимитирования источниками углерода, фосфора, азота, а также скорости протока питательной среды как отдельного фактора на рост и метаболизм микроорганизмов.

7.1. Лимитирование источником углерода. Лимитирование микроорганизмов источниками углерода чаще всего используется при необходимости получения максимального выхода микробной массы на единицу использованного субстрата. При лимитировании источником углерода и энергии, как правило, происходит снижение содержания в клетках запасных веществ типа липидов, гликогена по сравнению с их количеством в биомассе тоге же организма, выросшего при лимитировании другим компонентом среды. Удельная скорость роста микроорганизмов возрастает с увеличением концентрации источника углерода в среде до определенной величины и описывается в этом интервале уравнением Моно. Экономический коэффициент Y в указанном интервале концентраций источника углерода оставался

96

величиной постоянной. При этом в культуральной жидкости обнаруживаются остаточные концентрации

лимитирующих

рост

микроорганизмов

источников

углерода.

Н.Д. Иерусалимский обнаруживал в культуральной среде при лимитировании роста Az. vinelandida сахарозой остаточную концентрацию сахарозы 50 – 70 мг/л независимо от концентрации сахарозы в поступавшей питательной среде. С увеличением скорости протока D величина остаточной концентрации источника углерода возрастает. Баланс по углероду в интервале линейной зависимости μ от S показывал постоянное соотношение расхода субстрата на конструктивные и энергетические процессы. Подсчитано, что единица биомассы E.coli за время генерации включает 1,73 ед. глюкозы, выделяет 0,68 ед СО2 и 0,19 ед продуктов метаболизма, причем это соотношение справедливо для всех фаз роста. При достижении μmax, дальнейшее повышение концентрации

источника

углерода

не

оказывает

влияния

на

скорость

роста

микроорганизмов. Однако, плато оптимальной для роста культуры концентрации источника углерода может быть, как в случае этанола и метанола, достаточно узким. Ингибирование роста дрожжей Candida utilis наблюдалось при остаточной концентрации этанола 0,45 % объемных. Несколько сложнее выглядит картина одновременного лимитирования роста дрожжей Hansenula polimorpha двумя углеродсодержащими субстратами. В режиме хемостата при D = 0,15 час-1 культура одновременно ассимилировала метанол и глюкозу, независимо от их соотношения в смеси. Концентрация остаточного метанола составляла 10 мг/л, а глюкозы 5 мг/л. При росте только на среде с метанолом остаточная концентрация последнего достигала 0,32 мг/л. Выход биомассы на смеси субстратов был равен сумме теоретических выходов на этих субстратах при раздельной ассимиляции дрожжами. Экономический коэффициент использования метанола возрастал с 27 до 35 % при увеличении его доли в смеси с 5 до 20 % и далее не изменялся, а по глюкозе составлял 53 – 57 %. Синтез алкогольоксидазы возрастал с увеличением концентрации этанола с 5 до 20 % в смеси субстратов. Увеличение скорости протока до 0,22 час-1 при соотношении метанол:глюкоза (40:60 % вес) приводило к возрастанию остаточной глюкозы до 10 мг/л. Дальнейшее увеличение D приводило к накоплению метанола в среде и при D = 0,295 час-1 метанол не усваивался. Остаточная концентрация метанола 100 мг/л приводила к образованию псевдомицелия, а при концентрации более 1 г/л снижался Y по глюкозе, подавлялся синтеза алкогольдегидрогеназы. Описанный эффект одновременной ассимиляции глюкозы и метанола может быть объяснен различными путями ассимиляции этих субстратов. Работы Фихтера иллюстрируют не целесообразность повышения концентрации

97

углеродсодержащего субстрата и одновременного увеличения скорости протока. Увеличение скорости протока с 0,29 до 0,41 час -1 при культивировании дрожжей Sacch. cerevisiae на среде с 5, 10 и 30 г/л глюкозы приводило к падению концентрации биомассы и экономического коэффициента, увеличению концентрации остаточной глюкозы и накоплению этанола. При этом увеличивалась скорость образования С0 2 с 6,4 до 30 ммоль/г в час и скорость потребления кислорода с 6,0 до 8,0 ммоль/г в час. Автор считает, что указанная скорость потребления кислорода ограничивает способность клеток ассимилировать субстрат окислительно. В ряде экспериментальных работ указывается, что избыток углеродсодержащего субстрата угнетал рост микроорганизмов, причем, в первую очередь, ингибировалась дыхательная активность. Причиной этого является разобщение конструктивного и энергетического метаболизма и переход микроорганизмов на нерациональный тип обмена – брожение, активность ферментов окислительного обмена снижается. Для разных микроорганизмов

авторы

указывают

разные

ингибирующие

концентрации

углеродсодержащего субстрата, но в большинстве случаев в диапазоне 2,5 – 5 г/л. Таким образом,

при

периодическом

культивировании

экспериментаторы

постоянно

сталкиваются с ингибированием роста микроорганизмов избытком субстрата, поскольку исходные микробиологические среды содержат от 1 до 2 % углеродсодержащего субстрата. При этом в культуральной жидкости накапливаются значительные количества продуктов метаболизма, например этанола, которые ассимилируются после исчерпания исходного субстрата. Последовательность синтеза ферментов при переключении культуры с ассимиляции глюкозы на окисление этанола строго коррелирует с количеством непочкующихся клеток дрожжей. Путем длительной постепенной адаптации культуры при непрерывном культивировании к высоким концентрациям субстрата можно вести процессы культивирования с достаточно высоким экономическим коэффициентом. Другим способом интенсификации роста дрожжей на средах с высокими концентрациями источника углерода является применение мембранных биореакторов с постоянным уносом продуктов метаболизма из микрозоны клеток. При периодическом культивировании Sacch. cerevisiae с разными начальными концентрациями глюкозы обнаружены две области значений μmax и КS в зависимости от концентрации глюкозы в среде. Переход из одной области в другую происходил при содержании в среде 4 мМ глюкозы. В аэробных условиях при содержании глюкозы менее 4 мМ удельная скорость роста была выше, чем в анаэробных. Но если концентрация глюкозы выше 4мМ, то различия в скорости роста сглаживались вследствие репрессии дыхания избытком глюкозы.

98

Концентрация субстрата в питательной среде оказывает влияние не только на процесс его аэробной ассимиляции, но и на интенсивность брожения. Увеличение концентрации глюкозы в среде от 2,5 до 10 % при проточном культивировании Sacch. cerevisiae сопровождалось увеличением скорости образования и выхода этанола. Производительность процесса по этанолу при начальных концентрациях глюкозы 10, 30 и 40 % составляла 100, 75 и 50 % соответственно. При накоплении в культуралъной жидкости 10 % этанола скорость роста существенно снижалась. Ингибирующее действие этанола объясняется его задержкой в клетках, когда концентрация внутриклеточного этанола достигает максимума. Внутриклеточная концентрация этанола всегда выше внеклеточной и составляет до 300 г/л при температуре 30°С. Аккумуляция этанола внутри клеток является следствием их резистентности к диффузии этанола через клеточную стенку в среду. Естественно, что существенную роль в реакции микроорганизмов на концентрацию субстрата в среде играет скорость его транспорта в клетки. Измеряя с помощью метки поглощение субстрата E.coli в области D 0,2 – 0,5 час-1 обнаружили, что транспорт глюкозы строго соответствует синтезу биомассы. При более низких D наблюдалось избыточное поглощение субстрата. По-видимому, по этой же причине удельная скорость роста при периодическом культивировании остается постоянной до исчерпания в среде 50 % внесенного субстрата. Скорость поглощения этанола дрожжами Sacch. cerevisiae возрастает линейно с увеличением его концентрации в среде с 1 мМ до 1,0 М. Уже через 10 сек после добавления этанола в среду его уровень в клетках достигает 60 % от конечного содержания, поскольку транспорт этанола у дрожжей осуществляется путем простой диффузии. Рассмотрим подробнее влияние концентрации этанола на хемостатную культуру дрожжей. При

культивировании

с

постоянной

скоростью

протока

D = 0,066 час-1

концентрацию подаваемого со средой этанола ступенчато повышали от режима к режиму (рис. 42). Концентрация биомассы в ферментере линейно возрастала при увеличении содержания этанола в подаваемой среде с 2,5 до 27,5 г/л, а при более высоких концентрациях этанола прирост биомассы на единицу использованного этанола снижался. Максимальное накопление биомассы в протоке наблюдалось при содержании в подаваемой среде 50 – 55 г/л этанола и составляло 9,7 г сухой биомассы на 1 л. Дальнейшее увеличение концентрации этанола в среде до 60 г/л приводило к снижению содержания биомассы в ферментере, то есть к ингибированию роста. Доказательством изменения природы ограничивающего рост фактора является изменение концентрации

99

остаточного этанола. В случае лимитирования роста этанолом его концентрация в среде, независимо от концентрации подаваемого, обнаруживалось на уровне 90 – 100 мг/л, что соответствует пороговой концентраций и подтверждает лимитирование роста культуры именно этим фактором.

Рис. 42. Лимитирование роста Sacch. cerevisiae этанолом в режиме хемостата: 1 – биомасса; 2 – экономический коэффициент; 3 – остаточный этанол; 4 – белок в биомассе; 5 – удельная нагрузка этанола.

С переходом в зону ингибирования концентрация остаточного этанола резко возрастала, и рост дрожжей в этих условиях ограничивался концентрацией накопившихся в среде продуктов метаболизма. В среде накапливались в значительных количествах пропионовая и уксусная кислоты. Следует отметить, что во всех случаях, в том числе и в состоянии ингибирования, концентрация биомассы стабильно удерживалась на определенном уровне, длительное время (не менее 30 генераций). В ингибированном состоянии наблюдалось появление зеленоватой пигментации культуры и увеличение размеров клеток. Явление носило обратимый характер и исчезало при переводе культуры в лимит по этанолу. Экономический коэффициент поддерживался на уровне 37 – 40 % при концентрации этанола в подаваемой среде до 27,5 г/л, а с увеличением содержания этанола снижался и в ингибированном состоянии дрожжей составлял 18 %. Существенных изменений в содержании клеточного белка при разных концентрациях подаваемого этанола не наблюдается, он составлял 43 – 45 % от веса сухой биомассы. Следует отметить, что линейная зависимость концентрации биомассы от количества подаваемого этанола наблюдалась в зоне постоянного экономического коэффициента, когда удельная нагрузка этанола не превышала 2,5 – 3,0 г/г биомассы. Под удельной

100

нагрузкой субстрата следует понимать реальную концентрацию источника углерода, отнесенную к количеству биомассы в единице объёма в единицу времени. Оптимальной удельной нагрузкой субстрата является величина, при которой еще не наблюдается снижения экономического коэффициента процесса. При оптимальной удельной нагрузке субстрата в культуральной жидкости не накапливаются в значительных количествах продукты метаболизма, способные оказать ингибирующее воздействие на рост микробной популяции. Естественно, что необходимость поддержания оптимальной удельной нагрузки субстрата целесообразна при целевом получении биомассы микроорганизмов, а не продуктов метаболизма, оптимальной для получения которых будет более высокая удельная нагрузка. Отношение использованного субстрата к концентрации биомассы часто

называют

метаболическим

коэффициентом,

но

с

нашеи

точки

зрения,

физиологически более емким является термин удельная нагрузка субстрата. При проточном культивировании удельная нагрузка определяется как концентрация источника углерода, отнесенная к концентрации биомассы, и в стационарном состоянии является величиной постоянной. Не исключено, что именно высокая удельная нагрузка субстрата в начале периодического культивирования обуславливает величину лаг-фазы процесса. Удельная нагрузка субстрата может быть рассчитана по формуле : S уд =

S − S0 г/г/час, xt

где S – количество внесенного субстрата; S0 – пороговая концентрация субстрата; х – концентрация биомассы; t – время. При повышении удельной нагрузки этанола экономический коэффициент снижается. Необходимо учесть, что реальная концентрация этанола в ферментере удерживается на уровне пороговой концентраций в указанных условиях. Если удельная нагрузка этанола является определяющим фактором, то её постоянство при разных скоростях протока среды должно обеспечить постоянство экономического коэффициента. Действительно, изменение скоростей протока среды в диапазоне D = 0,066 – 0,15 час-1 при сохранении оптимальной удельной нагрузки этанола на единицу биомассы 2,5 – 3,0 г/г/час не приводит к снижению экономического коэффициента (рис. 43). Не исключено, что величина оптимальной удельной нагрузки этанола может оказаться индивидуальной для разных видов и штаммов дрожжей.

101

Рис. 43. Влияние скорости протока на рост Sacch. cerevisiae: 1 – биомасса; 2 – белок в биомассе; 3 – остаточный азот; 4 – этанол в подаваемой среде; 5 – экономический коэффициент.

По-видимому,

повышение

удельной

нагрузки

субстрата

в

одностадийных

однопоточных ферментациях с целью увеличения производительности ферментеров при выращивании биомассы возможно лишь в узких пределах без снижения экономического коэффициента процесса. Термин “удельная нагрузка субстрата” в настоящее время не является общепринятым, но заложенный в нем смысл позволяет объяснить неудачи при попытках интенсификации одностадийных процессов культивирования дрожжей. Более

сложная

картина

наблюдается

при

использовании

в

качестве

углеродсодержащего субстрата н-алканов или других малорастворимых веществ. Показано, что на среде с углеводородами существует критическая концентрация субстрата SКРИТ и повышение содержания углеводородов выше этой концентрации не приводит к увеличению продуктивности процесса по биомассе. Это связано с низкой растворимостью субстрата и процесс его ассимиляции протекает в диффузионной области. Наличие избытка н-алканов в среде приводит к «запарафинированию» дрожжей и нарушению процесса роста. Для утилизации высоких исходных концентраций растворимых источников углерода часто

применяют

культивирование

микроорганизмов

в

батарее

последовательно

соединенных ферментеров либо выращивание в колонном многосекционном ферментере. В колонном многоступенчатом ферментере максимальная концентрация биомассы дрожжей Candida utilis наблюдалась при входной концентрации этанола 75 г/л и снижалась при дальнейшем ее увеличении. При входной концентрации этанола 10 г/л

102

экономический коэффициент составлял 66 %, а с повышением концентрации этанола снижался до 45 % с одновременным накоплением продуктов метаболизма. Поэтому даже при многоступенчатом выращивании дрожжей предпочтительнее подавать этанол раздельно в разные отсеки ферментера. Способ подачи этанола (одно или многопоточный) оказывал значительное влияние на скорость роста, скорость диссимиляции этанола, скорость выделения ацетата, выход биомассы и продуктивность. При этом авторы не использовали понятия “оптимальная нагрузка субстрата”. В присутствии избытка источников углерода микроорганизмы накапливают в культуральной среде продукты метаболизма, которые в свою очередь способны оказывать воздействие на рост микробной популяции. Количественные зависимости скорости роста от концентрации продуктов метаболизма были получены Н.Д. Иерусалимским и сформулированы в виде дополнения к уравнению Моно. При проточном культивировании пекарских дрожжей увеличение D > 0,2 час-1 приводит к смене окислительного метаболизма на спиртовое брожение и Y снижается в 2 раза. Фактически, при этом в культуральной жидкости существенно увеличивается концентрация неутилизированной глюкозы, и культура испытывает влияние последней. При этом содержание АТФ резко снижается. Содержание интермедиатов первых стадий гликолиза снижаете до минимума при D = 0,092 – 0,173 час-1, а далее возрастает. С увеличением D до 0,219 час-1 уровни АТФ и АМФ снижаются, а уровень АДФ увеличивается. Уровни экскретируемых метаболитов гликолиза были низки, но уровень глюкозо-6-фосфата мало зависел от D, а уровень пирувата увеличивался при повышении D. Детальные исследования потребления источников углерода и энергии при различных типах лимитирования выполнены в серии работ Темпеста. Автор считает, что при некоторых условиях нет сопряжения трат энергетического субстрата и синтеза биомассы. При избытке субстрата может происходить его потребление, но не образуется максимальное количество биомассы или АТФ. Способность к быстрому поглощению углеродного субстрата и разобщению анаболизма и катаболизма дает преимущества в борьбе с конкурентами в природе. При культивировании Kl. aerogenes определяли экономические коэффициенты и продукты энергетического метаболизма в среде при лимитировании источниками С, N, S, P, К и разных скоростях роста от жесткого лимитирования до снятия лимитов по мере приближения D к μmax. При лимитировании роста источником углерода субстрат использовался наиболее экономично, углерод полностью переходил в биомассу и СО2 с экономическим коэффициентом 50 %. При лимитировании S, N или Р в среде присутствует избыток субстрата и на единицу

103

образовавшейся биомассы его используемся в 2-3 раза больше. Избыточное поглощение органического субстрата в количестве большем, чем необходимо для образования биомассы Темпест назвал “избыточным” метаболизмом. У Kl. aerogenes при избыточном метаболизме в среде накапливался ацетат как продукт неполного окисления. При лимитировании азотом появлялся кетоглутарат и 2-оксиглутарат, при лимитировании К пируват и кетоглюконат, при лимитировании фосфором – глюконат и 2-кетоглюконат, а при значительном избытке глюкозы накапливались ацетат и пируват. Продукты неполного

окисления

субстрата

оказались

специфичными

для

разного

типа

лимитирования. Органические вещества у гетеротрофных микроорганизмов могут источником

интермедиатов

для

синтеза

биомассы,

источником

являться

редуцирующих

эквивалентов и источником энергии в виде АТФ. При лимитировании источником углерода выработка энергии происходит в избытке, она рассеивается. С подачей дополнительной глюкозы немедленно усиливается выработка и рассеивание энергии. При определении скорости потребления кислорода установлено, что при аэробном росте Kl. aerogenes на глюкозе и манните образуются лишние восстановительные эквиваленты, которые окисляются бесполезно для организма. При лимитировании рост Kl. aerogenes энергией часть недоиспользованного углерода окисляется до СО 2. Наиболее эффективный рост наблюдался при одновременном лимитировании углеродом и энергией. Следует отметить, что по мере приближения D к μmax скорости потребления кислорода не зависят от природы лимитирующего рост фактора. Это объясняется снижением степени лимитирования

(снижении

дефицита)

с

переходом

в

зону

метаболического

лимитирования. Потребление кислорода максимально при лимитировании роста фосфором и минимально при лимитировании углеродом. Бактерии обладают эффективным механизмом для немедленной выработки избытка энергии и ее рассеивания, если нет условий для синтеза биомассы. Этот механизм позволяет клетке немедленно начинать рост без дополнительных перестроек при поступлении лимитирующего вещества. Энергия, выработанная клеткой, не использованная на синтез биомассы, расходуется на поддержание жизни без размножения и данные разных авторов об этих расходах существенно различаются. В проточной культуре Debaryomyces fermicarius с увеличением D с 0,033 до 0,252 час-1 интенсивность эндогенного дыхания возрастала с 0,49 до 0,92 ммоль О2/г биомассы в час, что приводит к выводу о непостоянстве трат на поддержание и возможно, истинные размеры энергетических затрат на поддержание пропорциональны не суммарной биомассе, а содержанию функционально активных

104

клеточных компонентов. Траты на поддержание изменяются при разных скоростях роста. В частности, траты энергии, не связанные с ростом, высоки у Kl. aerogenes при лимитировании фосфором в присутствии избытка углерода, но низкой скорости роста. Предполагается, что утечка энергии при разобщении дыхания и роста происходит вследствие активации АТФ-азы и разветвления дыхательной цепи с образованием нефосфорилирующих

сегментов.

Кроме

того,

могут

фенотипически,

обратимо,

утрачиваться пункты сопряжения окисления и фосфорилирования в дыхательной цепи. Интересное

использование

энергии

поддержания

обнаружено

при исследовании

физиологии избыточного метаболизма Kl. aerogenes. При D = 0,4 час-1 и концентрации глюкозы в диапазоне от 5 до 30 г/л лимитирование роста от глюкозы переходило к К, а глюкоза, находившаяся в избытке, продолжала потребляться культурой в возраставшем количестве. При 10 г/л глюкозы повышалась скорость выделения СО2 и в среде появлялся ацетат, при 14 г/л в среде появлялись пируват и кетоглутарат- без изменения скорости потребления кислорода. При 15 г/л глюкозы и выше активность ЦТК подавлялась высокой

концентрацией

глюкозы

вследствие

насыщения

дыхательной

цепи

восстановительными эквивалентами. Оказалось, что несмотря на лимитирование роста К и низкое его содержание в среде, его содержание в клетках было высоким, хотя клеточная мембрана проницаема для К. Поддержание градиента К, его высокое содержание в клетках при низком содержании в среде и требовало дополнительной энергии. Таким образом для Kl. aerogenes необходима избыточная энергия для удержание в клетках К, который играет большую роль в энергетическом метаболизме. Не исключено, что избыточные энергетические затраты сопряжены с поддержанием пулов и других веществ в клетках микроорганизмов.

7.2 Лимитирование роста фосфатами Фосфор, являющийся лабильным элементом клетки, исследовался в качестве лимитирующего рост микроорганизмов фактора многими экспериментаторами. Зависимость удельной скорости роста дрожжей Candida utilis от концентрации фосфора в питательной среде существует в достаточно узком диапазоне (рис. 44). Максимальная удельная скорость роста достигается при концентрации фосфора 0,67 г/л (в пересчете на Р2О5), а величина KS по фосфору (численное выражение константы Михаэлиса) составляет всего 0,020 г/л (по Р2О5).

105

Рис. 44. Зависимость удельной скорости роста дрожжей Candida utilis от концентрации фосфатов в среде.

При проточном культивировании дрожжей Candida utilis снижение концентрации фосфатов в подаваемоq питательной среды сопровождается снижением дыхательной активности клеток на 30 – 35 % и одновременным снижением внутриклеточного содержания фосфора в два раза. Однако, линейной зависимости между внутриклеточным содержанием фосфора и дыхательной активностью дрожжей на отмечено. При новой добавке фосфатов происходит регенерация содержания фосфора в клетках и в ряде случаев дыхательная активность в это время превышает норму. При недостатке фосфора происходит накопление в клетках липидов и повышается клеточная проницаемость, что обеспечивает быструю Р-регенерацию. Клетки дрожжей, лимитированные фосфатами, содержат также пониженное количество магния, несмотря на его избыток в среде. Перенос этих клеток в обогащенную Р и Mg среду сопровождается увеличением содержания этих элементов и интенсификацией дыхания. Перенос клеток в среду с Р, но без Mg вызывает снижение в них общего количества фосфора при увеличении содержания ортофосфата и дыхательная активность не меняется. Таким образом, перенос ионов магния в клетку зависит от концентрации фосфатов, а переход фосфатов в клетку не зависит от концентрации Mg. Дрожжи, рост которых был лимитирован фосфатами содержат значительно меньше Mg, чем нелимитированные по данному фактору. Лимитация дрожжей фосфатами может сопровождаться переключением с окислительного типа обмена на брожение. Клетки Brevibacterium ammoniagenes 317-I, выращенные при недостатке фосфора, включали его с больший скоростью, а выращенные на богатых фосфором средах поглощали его медленно. Стимуляция дыхания фосфором может повторяться до тех пор, пока внутриклеточный фосфорный пул не достигнет максимума. Подобный тип влияния

106

получил название "'Рi- эффекта", но не наблюдался у клеток, выросших на богатых фосфоров средах. "Рi-эффект" не зависел от уровня субстратного фосфорилирования при гликолизе

и

зависимого

от

энергии

синтеза

макромолекул,

оказался

широко

распространенным среди грамотрицательных энтеробактерий. Клетки, выращенные в условиях фосфорного голодания, поглощают фосфор со скоростью в 10 раз более высокой, но затем она постепенно снижается. При хемостатном культивировании дрожжей Candida utilis с лимитированием роста фосфатами (D = 0,25 час-1), содержание фосфора в подаваемой питательной среде увеличили с 0,08 до 0,54 г/л (по РО4-3). Содержание фосфора в вытекавшей из ферментера культуральной жидкости возрастало с 0,0007 (пороговая концентрация) до 0,0045 г/л, и в дальнейшем этот компонент питательной среды роста дрожжей не лимитировал (рис. 45). Через 3 часа после внесения в среду дополнительного количества фосфатов концентрация биомассы в среде начала возрастать, что свидетельствовало о переходном процессе к новому устойчивому состоянию. Содержание же общего внутриклеточного фосфора увеличивалось и предваряло по времени изменения в скорости роста дрожжей. Через 5 часов после обогащения среды фосфатами содержание внутриклеточного фосфора достигло 3,4 % при норме 1,5 – 1,6 %. В данном случае наблюдается эффект Ррегенерации, когда содержание внутриклеточного фосфора резко возрастает после перенесения клеток в среду, богатую фосфатами. Превышение содержания фосфора в биомассе наблюдалось в течение 4 часов, а затем содержанке внутриклеточного фосфора снижалось и стабилизировалось на уровне, характерном для культур, растущих без лимита по фосфору.

Рис. 45. Регенерация фосфатного пула Candida utilis в проточной культуре: 1 – биомасса; 2 – фосфаты в притоке; 3 – общее содержание внутриклеточного фосфора; 4 – фосфаты в оттоке; 5 – белок в биомассе.

107

В норме скорость ассимиляции фосфора клетками Microcistis aeruginosa составляла 0,1 – 0,3 мкг/мг сухой биомассы час-1. Скорость поглощения фосфатов отмытыми клетками цианобактерий носит линейный характер в зависимости от содержания фосфора в области низких концентраций и соответствует кинетике Михаэлиса-Ментен при высоких концентрациях. Аналогичные результаты были получены и для других культур микроорганизмов. Лимитирование фосфатами роста Rhisobium обнаруживалось при снижении их концентрации до 0,25 мкМ/л, но полифосфаты содержались

В

клетках даже

при жесткой лимитации фосфором. Транспорт фосфора в клетки при этом ускорялся в 10 – 160 раз, а поглощение глицерофосфата дерепрессировалось в 50 раз. У быстро растущих штаммов при этом увеличивалась активность щелочной фосфатазы, а у медленно растущих она вообще не обнаруживалась. Естественно, что при уменьшении величины фосфорного пула клеток происходит перераспределение составляющих его компонентов. Даже длительное голодание Neurospora crassa по фосфору не вызывает значительного уменьшения пула фосфата, в то время как пул пирофосфата уменьшался в 15 раз, а пул триполифосфата и тетраполифосфата увеличивался в 3 – 5 раз. Предполагается, что пул пирофосфата играет роль компрессора в системе регуляции синтеза ферментов фосфорного семейства. В зависимости от концентрации фосфатов в питательной среде существенно меняется состояние клеточной стенки у Bacilus subtilis. При лимитировании роста фосфатами из клеточной стенки исчезает тейхоевая кислота, но в культуральной жидкости не обнаруживается появления фосфорсодержащих соединений. Добавление в состав среды фосфатов или тейхоевой кислоты стимулировало рост и включение в клеточную оболочку тейхоевой кислоты через 1 час после внесения. Предполагается, что тейхоевая кислота в экспоненциальной фазе роста содержит 30 % всего запаса фосфора клетки и может служить резервным источником фосфатов при его отсутствии в среде. При избытке фосфатов в среде 70 % от дополнительного фосфора (по сравнению с минимальным содержанием) приходится на долю тейхоевой кислоты. При последовательных пересевах бактерий на среды без фосфора отмечено, что до пятого пересева включительно содержание фосфора в клетках и клеточных стенках снижалось, а начиная с пятого пересева фосфор в клеточных стенках отсутствовал. При хемостатном культивировании Bacilus subtilis независимо от природы источника углерода (D = 0,3 час-1) преобладающим анионным полимером в клеточкой стенке при избытке фосфора была тейхоевая кислота, а при лимите фосфора тейхуроновая кислота. Даже при изменении скорости роста состав клеточной стенок менялся только в зависимости от степени обеспеченности фосфатами. Рассмотрим

подробнее

физиолого-биохимические

108

перестройки

микробной

популяции при лимитировании роста фосфатами. При культивировании дрожжей Candida utilis со скоростью протока питательной среды D = 0,25 час-1 концентрация биомассы в ферментере стабилизировалась на уровне 3,25 г/л по весу сухой биомассы с незначительными колебаниями, характерными для хемостатного режима культивирования (рис. 46). Исходная концентрация фосфатов (в пересчете на 32Р) в питательной среде составляла 0,164 г/л, а в вытекающей из ферментера культуральной жидкости 0,06 г/л. Содержание фосфора в биомассе составляло 1,9 % от веса сухой биомассы, что соответствует содержанию фосфора в клетках при выращивании без лимитирования роста фосфатам. Снижение концентрации фосфатов в 2 раза, не оказывает влияния на концентрацию биомассы в протоке, а следовательно, и на скорость роста. Однако, определенные изменения в развитии популяции все же происходят, и концентрация остаточных фосфатов в культуральной жидкости снижается с 0,06 до 0,0007 г/л, то есть до уровня пороговой концентрации.

Рис. 46. Характеристика роста дрожжей при лимитировании фосфатами в хемостатной культуре: C. utilis: 1 – биомасса (Х); 2 – содержание внутриклеточного фосфора; 3 – фосфор в культуральной жидкости; 4 – экономический коэффициент (Y); 5 – удельная скорость образования продуктов метаболизма.

109

При этом наблюдалось снижение содержания внутриклеточного фосфора с 1,9 до 1,25 %, а также некоторое снижение количества углеродсодержащих продуктов метаболизма в культуральной жидкости и уменьшение расхода 0,1 Н NaОН для стабилизации

рН.

Последний

факт

подтверждает

уменьшение

содержание

в

культуральной жидкости кислых продуктов метаболизма, так как со снижением концентрации подаваемых фосфатов снижается буферная емкость среды, и при постоянном уровне образования кислых продуктов обмена расход титранта должен был бы возрастать. Таким

образом,

при

неизменной

концентрации

биомассы

содержание

внутриклеточного фосфора снизилось на 37 % абсолютной величины, снизилось накопление продуктов метаболизма, а содержание остаточных фосфатов в культуральной жидкости достигло пороговой концентрации, что дает основание считать процесс хемостатным по фосфору. Однако, удельная скорость роста культуры осталась без изменений, то есть кинетического ответа популяций не последовало. Возможно, для подобных случаев,

сопряженных

с лабильностью

внутриклеточного

содержания

лимитирующего вещества следует ввести понятие физиологического лимитирования. Под физиологическим лимитированием следует понимать такой тип лимитирования, когда концентрация лимитирующего фактора в культуральной жидкости находится на постоянном низком уровне, физиологические характеристики культуры изменяются, но кинетического ответа, то есть изменения удельной скорости роста еще не происходит. Необходимо акцентировать внимание на том, что речь идет не только о терминологии, но и о существенных различиях в физиологическом состоянии культур, растущих с одинаковой скоростью при различном содержании внутриклеточного фосфора. Снижение концентрации фосфатов в 4 раза по сравнению

с исходной,

сопровождалось некоторым снижением концентрации биомассы до 3,1 г/л по сухому весу после короткого переходного периода. Содержание внутриклеточных фосфатов снизилось до 0,7 – 0,75 %. Более резкие изменения скорости роста наблюдались при следующем снижении содержания фосфатов в среде в 2 раза. Концентрация биомассы после переходного периода стабилизировалась на уровне 2 г/л по сухому весу, снизился экономический коэффициент процесса, содержание внутриклеточного фосфора упало до 0,55 – 0,58 %, и дальнейшее снижение его содержания в питательной среде не оказывало влияния на содержание внутриклеточного фосфора. В этом случае целесообразно говорить о "жестком" лимитировании» роста дрожжей фосфатами. По-видимому, микроорганизмы

располагают

мощными

компенсирующими

механизмами,

поддерживающими концентрацию общего фосфора в клетках на определенном уровне. В

110

основе регуляторного механизма может лежать обмен неорганических полифосфатов и существенную роль играет функция фосфатаз, гидролизующих органические фосфаты. Подобный подход логично объясняет Р-эффект, наблюдавшийся при внесении в богатую фосфатами среду клеток, обедненных фосфором. В результате очередного снижения концентрации фосфатов в подаваемой питательной среде (в 26 раз по сравнению с исходным вариантом) концентрация биомассы снижается и стабилизируется на уровне 0,75 г/л, содержание внутриклеточных фосфатов не изменяется. Очевидно, внутриклеточные фосфаты в количестве 0,55 % входят в состав клеточных структур и их содержание в клетках постоянно. Экономический коэффициент достигает минимальной величины и составляет всего 12 %. Одной из характеристик физиологического состояния дрожжей при периодическом культивировании

является

величина

фракции

подвижной

воды

(ФПВ)

в

лиофилизированной биомассе. В отсутствие лимитирования фосфатами роста дрожжей Candida utilis величина ФПВ составляет 0,6 % от сухого веса биомассы, при переходе к физиологическому лимитированию увеличивается до 0,83 %, что может быть отнесено за счет внутриклеточных перестроек, предшествующим кинетическому лимитированию роста. При снижении внутриклеточного фосфорного пула до минимальной величины 0,55 % от веса сухой биомассы величина ФПВ резко возрастает и достигает 3,7 %, что наглядно иллюстрирует ее зависимость от степени обеспечения клеток дрожжей фосфором. Если принять, что фосфор в клетках в указанных концентрациях входит, в основном, в состав клеточных структур, а величина ФПВ зависит от степени завершенности этих структур, то ее постоянство в описанных условиях становиться понятным. Использование

меченого

фосфора

при

исследовании

дрожжей

Candida,

лимитированных источниками углерода, азота и фосфора показало, что характер включения фосфора в воднорастворимую фракцию, РНК, ДНК и липиды был разным, несмотря на равное время генерации при каждом типе лимитирования. При лимитировании роста фосфором последний включался сначала в водно-растворимую фракции, а затем в РНК, в то время как при лимитировании азотом включение фосфора сначала идет в РНК. Снижение концентрации фосфора в среде приводит к снижению содержания РНК в клетках дрожжей. В отсутствии экзогенного фосфора, но при наличии источников углерода и азота клетки дробей сохраняют некоторое время способность к экспоненциальному росту, но их состав при этом претерпевает изменения: снижается уровень нуклеиновых кислот и белков и возрастает содержание липидов при постоянном уровне углеводов.

111

Изменение степени обеспеченности микроорганизмов фосфором существенно изменяет характер их метаболизма и сопровождается накоплением некоторых продуктов в среде. В проточной аэробной культуре Sacch. cerevisiae при лимитировании роста источниками

азота

и

фосфора

отмечены

существенные

различия

в

уровнях

промежуточных продуктов обмена. Наиболее значительно различались концентрации глюкозо-6-фосфата, 6- фосфоглюконата, пирувата и цитрата. Недостаток фосфора в среде при

культивировании

Mycobacterium

lacticolum 104

приводил

к

снижению

внутриклеточного содержания фосфора с 8 – 16 до 1 – 4 мг/г биомассы, причем это снижение

происходило во всех фракциях: нуклеиновых кислот в 3 – 4 раза,

высокополимерных фосфатов в десятки раз, но почти не сказывалось на концентрации биомассы. В зависимости от содержания фосфора при этом изменяется выделение флавинов в культуральную среду. Недостаток фосфора у дрожжей приводит, в ряде случаев, к выделению в окружающую среду ряда полиолов, этанола, лимонных кислот и ацетона. Лимитирование фосфатами инициирует у Streptomyces синтез вторичных метаболитов стрептомицина и туримицина. Физиологическое состояние продуцента характеризуется

высокой

активностью

внутриклеточных

дефосфорилирующих

ферментов, синтезом вторичных метаболитов и образованием несвязывающихся белков. Недостаток фосфора стимулировал биосинтез продигиозииа Serratia marcescens, причем максимум биосинтеза наблюдался при концентрации неорганического фосфора в среду порядка 3 мМ. Повышение содержания фосфора в среде до 10 – 250 мМ репрессировало не только биосинтез продигиозина, но и его предшественников. Несмотря на зависимость роста и интенсивности биосинтеза ряда ценных метаболитов микроорганизмами от степени обеспеченности фосфором использование его в качестве фактора управления затруднительно ввиду высокой внутриклеточной лабильности этого элемента.

7.3 Лимитирование микроорганизмов источниками азота Лимитирование роста микроорганизмов источниками азота имеет определенную специфику по сравнению с лимитированием другими компонентами питательной среды. При культивировании дрожжей Candida utilis рост лимитировался концентрацией NH4NO3 при содержании последнего в среде менее 0,75 г/л (рис. 47), а величина KS составляла 0,07 г/л. Высокие концентрации источника азота рост дрожжей не ингибировали, и μ max составляла 0,53 час-1.

112

Рис. 47. Зависимость удельной скорости роста дрожжей Candida utilis от концентрации источника азота в среде

Ограничение роста Sacch. cerevisiae недостатком азота при разных скоростях протока

среды

сопровождалось

изменением

остаточных

концентраций

азота,

образованием очень мелких дочерних клеток, не начинавших нового деления до достижения определенного размера. Показано, что при лимитировании азотом роста скорость роста Chlorela vulgaris определяется не по уравнению Моно, где зависимость μ от S гиперболическая, а по уравнению Хилла, где зависимость сигмоидная. При культивировании E. coli в хемостате на минимальной среде с лимитированием аммонийным азотом обнаружены бистабильные состояния с высокой и низкой концентрацией пирувата – порядка нуля и 0,14 г/л. То или иное состояние устанавливалось в области протоков 0,1 – 0,3 час-1 в зависимости от того, каким образом задавали скорость протока, при переходе с меньших значений на большие или наоборот. Обнаруженный эффект был назван Ф. Бергтером бистабилитетом и основан на обратной зависимости активности ферментов ассимиляции аммония – глутаминсинтетазы и глутаматдегидрогеназы

при

высоких

концентрациях

пирувата

экономический

коэффициент ниже и близок к 10 %, а при низких концентрациях пирувата достигает 45 %. Сразу после увеличения D в среде возрастало количество пирувата, но затем он быстро полностью потреблялся. Предполагается, что при увеличении D в среде появляется недоиспользованный аммоний, что и вызывало повышение выделения пирувата. Увеличение удельной скорости роста с повышением содержания азота от 0 до 5 мг/л происходило с двухвершинной кривой, что дает возможность предполагать два

113

стационарных состояния в хемостате при одной и той же скорости роста, т.е. бистабилитет. Изменение содержания азота в питательной среде оказывало влияние на дыхательную активность микробных популяций. Лимитирование азотом роста дрожжей C. tropicalis при высоких скоростях протока стимулировало дыхательную активность, но сопровождалось снижением экономического коэффициента, что свидетельствовало о разобщении дыхания в митохондриях. Удельная скорость потребления кислорода при лимитировании ацетатом роста дрожжей возрастает с увеличением D, но экономический коэффициент снижается. Переключение на лимитирование азотом приводит к увеличению содержания в среде остаточного ацетата и активизации дыхательной активности популяции. Снижение рН с 6,9 до 5,1 при лимитировании азотом также активировало дыхание, а снижение рН до 4,8 его останавливало. Исследование потребления кислорода пекарскими дрожжами при отсутствии азота в среде показало наличие двух фаз дыхательной активности: в начальный период азотного голодания дыхательная активность в 2 раза ниже, чем в последующей фазе. Лимитирование

роста

дрожжей

минеральными

компонентами

или

азотом

сопровождается интенсификацией синтеза резервных веществ: на средах с глюкозой в клетках накапливается гликоген, а на н-алканах – липиды. При этом наблюдается экскреция ряда интермедиатов окислительного обмена: кислот ЦТК, ацетата, высших жирных кислот. При снижении содержания азота в среде в процессе культивирования пекарских дрожжей уровень цитрата увеличивался в 10 – 20 раз, но уровень глюкозо-6фосфата не менялся; уровни экскретируемых АТФ и АМФ были в 10 раз ниже, чем в контроле. У Kl. aerogenes содержание АТФ в клетках при недостатке азота и избытке углерода было ниже, чем при избытке азота и лимитировании глюкозой. При этом изменяется соотношение количества углеводов, расходуемых на синтез биомассы и продуктов метаболизма. В непрерывной культуре лимитированной азотом, максимальное накопление биомассы и жира наблюдались при D = 0,04 час-1, а с увеличением D выход снижался. В режиме хемостата при лимитировании роста азотом соотношение жирных кислот постоянно, а максимальный выход липидов достигал 40 % от веса биомассы. В зависимости от уровня и природы лимитирующего рост фактора изменяется интенсивность транспорта веществ в клетки. В клетках Sacch. cerevisiae, выросших в среде с лимитом азота, транспорт аминокислот происходит в 4-360 раз быстрее, чем в присутствии NH4. Дерепрессия транспорта возникает при наличии в среде глюкозы и фосфатов, а внутриклеточное накопление аминокислот вызывает снижение скорости их транспорта на 90 %. В депрессированной культуре усилен метаболизм и максимальная

114

скорость

транспорта

экспоненциальном

аминокислот

росте

дрожжей.

и

их

При

метаболизирования лимитировании

наблюдается

роста

при

микроорганизмов

отдельными компонентами среды (C, N, P, K, S) развиваются приспособления к быстрому росту при низких концентрациях субстратов, которые сводятся к ускорению транспорта веществ через мембраны и клеточную стенку. Ограничение роста микроорганизмов недостатком азота оказывает влияние на активность ряда ферментов. В условиях описанного выше бистабилитета у E. coli МL-30 установлено наличие двух уровней глютаминсинтетазы: высокого при низком содержании аммония и низкого при высоком NН4. При исследовании влияния лимитации роста E. coli и

Kl.

aerogenes

глютаминсинтетазы,

различными

источниками

глютаматдегидрогеназы

азота и

на

индукцию

гистидазы

было

и

репрессию

показано,

что

соотношение внеклеточного α-кетоглютарата к глютамину является наиболее важным физиологическим параметром для проявления активности глютаминсинтетазы. В фазовых культурах

C. utilis

активность

ферментов

гликолиза

не

зависела

от

природы

лимитировавшего рост фактора, а активность ЦТК при лимитировании азотом начинала возрастать через 5 часов после начала цикла. При лимитировании азотом роста Hansenula polymorpha в хемостате пероксисомальные ферменты (алкогольоксидаза и каталаза) подвергались расщеплению вследствие катаболической инактивации. Гексокиназа и глюкозо-6-фосфатдегирогеназа не были подвержены катаболической репрессии и скорость их синтеза возрастала при лимитировании азотом. Среди всех факторов внешней среды именно содержание азота в питательной среде оказывает наиболее сильное воздействие на состав и содержание белка. При этом в клетках, обычно, резко возрастает содержание липидов и углеводов. Дрожжи Candida utilis с различной степенью обеспеченности азотом различались по содержанию и аминокислотному составу белка, величине и составу пула свободных внутриклеточных аминокислот и ультраструктурной организации вакуолярных мембран. Содержание белка в клетках дрожжей при непрерывном культивировании в диапазоне концентраций NH4NO3 1,5 – 0,377 г/л поддерживалось на уровне 32,3 – 33 %, но при дальнейшем снижении концентрации азота в питательной среде оно падало до 26,2 % (рис. 48). При этом наблюдалось не простое количественное уменьшение содержания белка, но и изменение относительного содержания в белке отдельных аминокислот. Это особенно четко видно, если принять относительное содержание аминокислот белка культуры, не лимитированной азотом, за 100 %. Относительное содержание кислоты снижалось на 26 %, изолейцина на 22 % и одновременно содержание гистидина повышалось на 21 %, метионина на 12,8 %. Относительное содержание в белке других аминокислот

115

претерпевало меньшие изменения. Если сопоставить данные с результатам, полученными при периодическом культивировании, то становится очевидным, что при лимитировании роста дрожжей источником азота изменяется не только содержание белка, но и его качественные показатели.

Рис. 48. Зависимость содержания белка, величины аминокислотного пула и фракции подвижной воды в клетках дрожжей от концентрации источника азота в среде: 1 – белок; 2 – аминокислотный пул; 3 – фракция подвижной воды.

Величина пула свободных внутриклеточных аминокислот (СВАК) также изменяется в зависимости от степени обеспечения дрожжей источником азота (рис. 48). Снижение концентрации NH4NO3 сопровождалось уменьшением величины пула СВАК на 45 % абсолютной величины. Количество СВАК связано с изменением обеспеченности клеток азотом, так как около 70 % усваиваемого азота проходит через аминокислотный пул. Следует отметить, что динамика белка и СВАК, описанная для процесса периодического культивирования дрожжей C. utilis не воспроизводится в режиме непрерывного культивирования, что связано со спецификой условий внешней среды при этих методах культивирования микроорганизмов. Существенные изменения, отмеченные в характеристиках роста и содержания некоторых

внутриклеточных

компонентов

при

лимитировании

роста

дрожжей

источником азота, отражаются на морфологии и ультраструктурной организации клеток. Фрактографические исследования показали, что при лимитировании роста дрожжей источником азота резко усиливается вакуолизация клеток и интенсифицируется биосинтез липидоподобных гранул по сравнению с клетками, выращенными без лимитирования

116

азотом (рис. 49). При анализе данных световой и электронной микроскопии установлено, что клетки, выращенные в условиях лимитирования роста азотом, содержат более крупные по сравнению с контрольными клетками липидные гранулы. Наблюдаются также существенные различия в ультраструктурной организации внутриклеточных мембран.

Рис. 49. Криосколы клеток дрожжей Candida utilis, выращенных с лимитом по углероду (А) и с лимитом по азоту (Б). 1 – вогнутая поверхность вакуолярной мембраны; 2 – выпуклая поверхность вакуолярной мембраны; 3 – поверхность криоскола.

Анализ числа глобулярных субчастиц, выявленных на вакуолярной мембране, доказал, что их количество в клетках, выращенных при лимитировании роста источником азота, почти в 5 раз меньше, чем в контрольных (табл. 3). При этом, характерно, что

117

соотношение субчастиц на комплиментарных гидрофобных поверхностях, обнажаемых в процессе скола, сохраняется постоянным. Согласно существующим представлениям глобулярные субчастицы, обнаруживаемые на сколах биологических мембран, являются полиферментными комплексами, одна из функций которых связана с проницаемостью. На примере дрожжей Sacch. cerevisiae было показано, что тонкая структура субчастиц зависит от физиологического состояния дрожжей. При периодическом культивировании дрожжей

была

обнаружена

зависимость

величины

фракции

подвижной

воды

лиофилизированной биомассе также от физиологического состояния культуры. Таблица 3. Плотность распределения глобулярных субчастиц на вакуолярных мембранах Число частиц на единицу поверхности мембран Вариант опыта

n(+):n(-) выпуклая поверхность, cогнутая поверхность,

Клетки на на лимитированной азотом среде (0,188 г/л NH4NO3)

Клетки контрольные

n(+)

n(-)

98 ± 4

279 ± 7

1:3

498 ± 11

1436 ± 9

1:3

Исследовали количественное содержание фракции подвижной воды (ФПВ) в лиофилизированной

биомассе

дрожжей,

выращенных

при

различных

уровнях

обеспеченности источником азота, методом ЯМР спинового эха (рис. 48). Как оказалось, содержание ФПВ у дрожжей, выращенных без лимитирования роста азотом, составляет 1,6 % от сухого веса. По мере снижения концентрации источника азота в питательной среде величина возрастает, и при 0,188 г/л NH4NO3 она достигает 3,8 % веса лиофилизированной биомассы. Любопытно отметить, что с установлением в питательной среде пороговой концентрации лимитирующего рост дрожжей компонента величина ФПВ стабилизируется на

определенном

уровне.

Можно

предполагать,

что

уменьшение

количества

субмикроскопических частиц, выявляемых на сколах, при лимитировании роста дрожжей азотом связано с увеличением ФПВ, которая не удаляется при лиофилизации. В процессе азотного голодания в клетках Sacch. cerevisiae происходит интенсивный распад РНК и белка. Соотношение разных фракций РНК в голодающей культуре такое же, как и у развивающейся экспоненциально, а электрофореграмма белков резко меняется. Происходит не просто снижение содержания белка, а изменение его фракционного

118

состава и перераспределение белков между фракциями. Однако, деградирует не более 30 % белков и нуклеиновых кислот. В фонде аминокислот значительно снижается содержание аланина, валина и лейцина и увеличивается содержание аргинина и аспарагиновой кислоты. Основная часть углерода аминокислотного пула (до 90 %) даже в условиях азотного и углеродного голодания не может использоваться для новых синтезов высокомолекулярных компонентов клетки. В условиях азотного голодания продолжается синтез ДНК, количество которой у дрожжей возрастает в 2,5 раза и после переноса культуры на среду без азота, количество клеток увеличивалось в 3 раза, прежде чем прекратилось почкование. Приведенные

данные

иллюстрируют

глубокие

перестройки

микробного

метаболизма при ограничении роста недостатком азота и возможности использования данного компонента среды для управления биосинтетическими процессами.

119

Глава 8. Скорость протока среды – как фактор физиологического воздействия. Изучение влияния скорости протока среды на физиологические характеристики микробных популяций существенно осложняется множественностью одновременно действующих факторов. С одной стороны увеличение скорости протока можно рассматривать как чисто физиологический фактор: пассивный унос микроорганизмов из ферментера и снижение концентрации продуктов метаболизма за счет разбавления. С другой стороны при этом возрастают остаточные концентрации неутилизированных компонентов

среды

и

меняется

их

соотношение,

меняется

скорость

роста

микроорганизмов и, частично, соотношение внутриклеточных компонентов. Поэтому интерпретация экспериментальных данных, полученных при разных скоростях протока среды, требует определенной осторожности. Увеличение скорости протока в пределах лимитирования роста определенным компонентов среды сопровождается повышением дыхательной активности популяции. При увеличении D дрожжи переключаются с окислительной ассимиляции глюкозы на брожение. В режиме хемостата дрожжи Sacch. uranum при D = 0,14 час-1 окисляет глюкозу, при D = 0,21 час-1 метаболизм меняется на окислительно-восстановительный, в среде накапливается этанол, усиливается выделение СО2 и снижается активность малатдегидрогеназы. У дрожжей Sacch. cerevisiae аэробное брожение усиливается с увеличением D от 24 % при D = 0,1 час-1 до 60 % при D = 0,5 час-1 при лимитировании роста глюкозой. У дрожжей Candida utlilis бродильная активность выражена гораздо слабее и с увеличением D в клетках увеличивалось содержание общих углеводов, особенно гликогена и снижалось содержание белка. При этом до 45 % углерода субстрата вюгочалось в биомассу и при D = 0,3 час-1 плотность популяции была выше, чем при D = 0,1 час-1. Изменение скорости протока оказывает влияние на тепловыделение популяции. В режиме хемостата при лимитировании глюкозой дрожжи Sacch. cerevisiae линейно увеличивали

тепловыделение

с

ростом

D,

вплоть

до

вымывания

культуры.

Синтезированная биомасса содержала 60 % образовавшейся энергии и 40 % рассеивалось в виде тепла. На среде с этанолом 45 % энергии переходило в биомассу и 55 % рассеивалось в виде тепла. С увеличением скорости протока, а следовательно и скорости

120

роста, увеличивалась чувствительность клеток к холодовому шоку независимо от природы лимитировавшего рост фактора. Увеличение

скорости

протока

среды

сопровождается

определенным

морфологическими изменениями клеток. Средний размер клеток Sacch. cerevisiae увеличивается в 2,5 раза со снижением времени генерации от 450 до 75 мин, причем размер клеток зависит от скорости роста, а не от источника углерода. При этом размер клеток

медленнорастущих

составляет

63 %

от

размера

быстрорастущих.

Медленнорастущая (g = 9,5 часа) популяция состояла из двух типов клеток: светлых и темных при фазово-контрастном микроскопировании. Светлые клетки характерны для стационарной, а темные для экспоненциальной фаз роста периодической культуры. Почкуются темные клетки быстрее, т.е. скорость их роста выше суммарной скорости роста популяции. Светлые, неразмножающиеся клетки в голодающих культурах образуются из дочерних, ранее не почковавшихся клеток. В зависимости от скорости роста Schizosacch. pombe изменялся средний объем клеток, и отношение длинны к ширине, а в нелимитированных условиях объем клеток 4) был одинаков. Экономический коэффициент при низких D составлял 52 %, а при высоких скоростях протока снижался. Соотношение между кривыми количества сухом биомассы, числом клеток и их объемом показали изменение координации между скоростью роста и скоростью деления клеток при разных D. Содержание белка в биомассе дрожжей Hansenula polymorpha, C. valida и C. utlilis мало зависело от скорости протока, но величина аминокислотного пула и содержание нуклеиновых кислот существенно возрастали. Содержание сырого протеина у дрожжей Hansenula polymorpha при выращивании на среде с метанолом возрастало от 47,0 до 57,3 % и истинного белка от 41,2 до 52,5 % за счет увеличения D с 0,03 до 0,18 час-1. Содержание РНК в этот период возрастало от 4,93 до 8,53 %. При этом была реализована μ > μmax за счет снижения энергии поддержания. В диапазоне D 0,03 – 0,22 час-1 показано, что чем ниже μ, тем выше накопление формальдегида при импульсной добавке метанола. Удельная скорость потребления метанола линейно возрастала с увеличением D до 0,17 час-1, а количество остаточного метанола возрастало с 0,7 до 84 мг/л. От скорости протока среды при лимитировании метанолом роста дрожжей Candida boidinii

зависела

активность

каталазы,

формальдегид-

и

формиатдегидрогеназ,

алкогольоксидазы. В культуре, лимитированной глюкозой, с увеличением скорости протока возрастали активности ферментов углеводного метаболизма.

121

Скорость протока питательной среды может быть фактором селективного давления и направленного отбора отселектированной части микробной популяции. Непрерывная смена большого числа поколений в популяции на протоке увеличивает возможность ее генетической

перестройки,

которая

может

происходить

независимо

от

воли

экспериментатора. Именно в связи с этим Темпест предлагал очень осторожно интерпретировать данные о физиологии непрерывных культур, обязательно учитывая при этом возможные генетические изменения. В режиме хемостата, как правило, идет отбор штаммов не по максимальной удельной скорости роста, а по минимальной величине константы Михаэлиса для каждого штамма, ибо именно она определяет в условиях лимита по субстрату величину действующей удельной скорости роста штамма. Процесс автоселекции наблюдали при проточном культивировании дрожжей Candida tropicalis Т-20 после обработки этиленамином на четвертые сутки выращивания. Селективный штамм обладал более высокой скоростью роста и устойчивыми морфологическими отличиями от исходной культуры. При длительном проточном культивировании дрожжей Candida guilliermondii в диапазоне скоростей протока 0,2 – 0,5 час-1 исходная популяция спонтанно заменялась селективной, обладавшей более высокой удельной скоростью роста. Автоселекция дрожжей Candida utlilis происходила при длительном хемостатном культивировании с лимитированием роста фосфатами, селективная культура обладала более высокой скоростью роста и отличалась от переходной по ряду физиологических характеристик. Опасность замены исходного штамма селективным особенно возрастает при высоких скоростях протока, приближающихся к μmax. Трехстадийное многопоточное культивирование диплоидного штамма дрожжей Pichia pinus осуществляли при скоростях протока среды D приближавшихся к μmax данной культуры в нелимитированных условиях. При этом в первом ферментере батареи удельная скорость роста составляла 0,27 час-1, во втором скорость протока удваивали, но концентрация биомассы не снижалась, а возрастала. Аналогичный эффект увеличения концентрации биомассы в третьем ферментере наблюдали несмотря на увеличение в 2 раза скорости протока по сравнению со вторым ферментером. В режиме турбидостата исходная культура дрожжей реализовала μ max = 0,375 час-1. Увеличение удельной скорости роста в третьем ферментере батареи на 86 % сопровождалось

увеличением

степени

гетерогенности

микробной

популяции,

преобладали клетки более крупных размеров, дыхательная активность возрастала пропорционально увеличению удельной скорости роста. После 300 часов непрерывного культивирования культуру из третьего ферментера высеяли и провели сравнительное

122

культивирование с исходной культурой в однопроточной системе с постепенным увеличением скорости протока питательной среды (рис. 50). Исходная культура вымывалась из ферментера при D > 0,37 час-1, а вымывание селективной культуры наблюдалось

лишь при D = 1,2 час-1. При высоких скоростях протока компоненты

питательной среды рост дрожжей не лимитировали. Пропорциональности оптической плотности числу клеток у сопоставляемых культур не наблюдалось ввиду различия размеров клеток. Селективная культура не соответствовала исходной по плоидности (не являлась диплоидной) содержала на 13,2 % больше истинного белка. При выращивании клеток E. coli B в режиме хемостата при лимитировании роста лактозой

происходила

селекция

«гиперштаммов»,

конструктивно

синтезирующих

α-галактозидазу со скоростью в 4 – 5 раз превышающих скорость синтеза исходным штаммом.

Рис. 50. Зависимость оптической плотности количества клеток от скорости протока среды при одностадийном культивировании исходного и селективного штаммов P. pinus. 1 – исходный штамм; 2 – селективный штамм. Столбиками обозначено число клеток штаммов.

Длительное

время

существовало

мнение,

что

в

условиях

непрерывного

культивирования воспроизводятся отдельные состояния культуры, характерные для её роста в периодических условиях. При этом экспериментальные данные, полученные при непрерывном культивировании, экстраполировали на S-образную кривую роста и использовали для объяснения физиологического состояния культуры в разных фазах роста. Подобный подход не совсем корректен ввиду того, что при периодическом культивировании микробная популяция подвергается воздействию комплекса постоянно меняющихся условий внешней среды: снижается концентрация питательных веществ и

123

нарастает

концентрация

продуктов

метаболизма.

Каждое

мгновенное

состояние

микроорганизмов в процессе периодического роста предопределяется комплексом предшествовавших состояний или, как принято говорить, предысторией культуры. В условиях непрерывного хемостатного культивирования с ограничением роста каким-либо определенным компонентом среды комплекс действующих факторов оказывается иным, чем при периодическом культивировании. С одной стороны микробная популяция испытывает постоянное действие селектирующего фактора, которым является скорость протока среды, а с другой стороны культура находится при постоянном недостатке одного из компонентов питания и, безусловно, подвергается длительному воздействию постоянного уровня находящихся в среде продуктов метаболизма. Таким образом,

равенство

удельных

скоростей

роста

дрожжей

при

периодически

культивировании отнюдь не означает тождества их физиологического состояния и использование

данных,

полученных

при

непрерывном

культивировании,

для

интерпретации поведения периодической культуры без соответствующих оговорок недопустимо. Рассмотрим

насколько

существенны

различия

физиологического

состояния

микробной популяции при равных удельных скоростях роста, лимитированных разными компонентами питательной среды. Дрожжи Candida utlilis культивировали в режиме хемостата при D = 0,25 час-1 с лимитированием роста источниками азота, фосфора и углерода (рис. 51). Несколько необычное расположение осей графика вызвано тем, что в дальнейшем все изменения свойств культуры будут обсуждаться относительно концентрации биомассы при постоянной скорости роста, так что на остальных графиках величины биомассы отложены на оси абсцисс. В исходном состоянии (5,0 – 5,2 г/л биомассы) рост дрожжей ингибировали продукты метаболизма, а источники углерода, азота и фосфора находились в избытке. При снижении концентрации фосфатов в подаваемой питательной среде экономический коэффициент снижался с 41 % до 27 % одновременно со снижением концентрации биомассы в потоке (рис. 51б). Лимитирование роста дрожжей источником азота не оказывало влияния на величину экономического коэффициента, а недостаток источника углерода сопровождался его увеличением с 41 до 46 %. По мере увеличения глубины лимитирования (снижение концентрации биомассы в потоке) дыхательная активность возрастала независимо от природы лимитировавшего рост фактора. В дальнейшем при глубоком лимите по азоту и фосфору дыхательная активность снижалась, а при недостатке углерода возрастала. Таким образом, экономический коэффициент (Y) и дыхательная активность (1/tgα), которые являются

124

интегральными показателями физиологического состояния микробной популяции, зависят как от природы лимитирующего рост фактора, так и от глубины лимитирования.

Рис. 51. Характеристики физиологического состояния дрожжей C. utlilis при хемостатном культивировании с лимитированием роста источниками углерода, азота и фосфора. А – ФВП; Б – дыхательная активность и экономический коэффициент; В – белок (I) и СВАК (II); Г – биомасса. I – глюкоза; II – NH4NO3; III – PO-3 (все г/л). 1 – лимит по углероду; 2 – лимит по азоту; 3 – лимит по фосфору. Ось абсцисс – биомасса (г/л)

Важными характеристиками биомассы дрожжей является содержание истинного белка и величина пула свободных внутриклеточных аминокислот (СВАК). Эта клеточные компоненты весьма лабильны и зависят от физиологического состояния микробной популяции. При лимитировании роста дрожжей источником азота содержание белка снижалось с 33 до 26 %, лимитирование фосфором и углеродом не оказывало существенного влияния на содержание белка в биомассе (рис. 51в). Величина пула СВАК при лимитировании источниками углерода и фосфора возрастала и в 16 раз превышала пул культуры, лимитированной источником азота. Величина фракции подвижной воды (ФВП) в лиофилизированной биомассе дрожжей зависит от физиологического состояния культуры, взятой для лиофилизации, и с её выживаемостью при регидратации. При одинаковой удельной скорости роста и плотности микробной суспензии дрожжей Candida utlilis величина ФПВ зависит от природы фактора, ограничивающего рост и глубины лимитирования. Лимитирование роста культуры источниками азота и фосфора сопровождалось снижением концентрации биомассы в потоке до 0,75 г/л (рис. 51г) с одновременным возрастанием величины ФПВ с

125

0,6 до 3,8 % (рис. 51а). Лимитирование роста дрожжей источником углерода в аналогичных условиях сопровождалось снижением величины ФПВ с 0,6 до 0,15 % то есть в 25 раз. Способность клеток дрожжей удерживать при лиофилизации определенное количество подвижной воды связана со структурой внутриклеточных мембран и обуславливает способность дрожжей к выживанию при последующей регидратации. Таким образом, физиологическое состояние микробных популяций, растущих с одинаковой удельной скоростью роста, ограниченной различными лимитирующими факторами, различно и зависит как от природы лимитирующего рост фактора так и от глубины лимитирования. В литературе

имеются данные о превышении в

условиях

непрерывного

культивирования максимальной удельной скорости роста микроорганизмов, достигаемой при периодическом культивировании. В условиях периодического культивирования на среде с соком опунции дрожжи C. utlilis достигали μmax = 0,47 час-1 при Y = 42,6 %. При непрерывном культивировании на среде того же состава максимальная продуктивность 2,38 г/л/ч

достигалась

при

μ = 0,55 час-1

и

Y = 52,7 %,

а

при

D = 0,6 час-1

производительность процесса по биомассе резко снижалась. Подобный эффект наблюдали при проточном культивировании E. coli СМ5199, продуцента ДНК-полимеразы, реализовавшего при периодическом культивировании μmax = 0,34 час-1. при проточном культивировании удалось повысить удельную скорость роста продуцента до 0,8 час-1 за счет снятия ингибирующего рост влияния продуктов метаболизма. Варьирование

скоростью

протока

питательной

среды

при

проточном

культивировании микроорганизмов создает возможность снятия лимитирования роста и открывает широкие перспективы исследования потенциальных возможностей микробной клетки. Максимальная удельная скорость роста дрожжей Candida hidrocarbofumarica при периодическом культивировании достигает в экспоненциальной фазе роста 0,53 час-1. Непрерывное культивирование со ступенчатым увеличением скорости протока среды и чередование хемостатного (по источнику углерода) культивирования (в течение 20 генераций) и нелимитированного роста в режиме турбидостата (20 – 25 генераций) приводило к интенсификации роста дрожжей (рис. 52). При идентичных скоростях протока среды концентрация биомассы в ферментере возрастала в режиме турбидостата (при концентрации биомассы 0,7 г/л) удельная скорость роста увеличивалась и после 7 тактов чередования низких скоростей протока с высокими (будем называть это физиологической интенсификацией роста) достигала 3,0 час-1. Способность микробной популяции при идентичных условиях культивирования в проточной системе находится в двух различных физиологических состояниях и при разной концентрации биомассы была

126

названа Ф. Бергтером бистабилитетом. При этом физиологическое состояние культуры зависит от ее предыстории или условий роста, предшествовавших данному состоянию. По аналогии полученные состояния культуры следует назвать мультистабильными. Следует отметить, что даже после 4 – 5 часов интенсификация роста резкое увеличение скорости протока среды (например с 0,05 до 1,5 час-1) приводит к вымыванию культуры из ферментера, а не к стабилизации на новом уровне, несмотря на то, что в предыдущем такте при этой скорости протока биомасса была стабилизирована в течении 30 генераций. Повышение скорости протока внутри каждого такта интенсификации роста необходимо проводить ступенчато, постепенно увеличивая шаг наращивания скорости протока. Это условие является обязательным для реализации описанной системы интенсификации роста.

Рис. 52. Изменение скорости протока питательной среды при стабилизированной концентрации биомассы C. hidrocarbofumarica в режиме физиологической интенсификации роста.

Следует отметить, что содержание остаточной глюкозы в культуральной жидкости превышало величину пороговой концентрации, т.е. процесс не является хемостатом, реализовывался процесс нелимитированного роста. Удельные скорости потребления О2 и выделения СО2 возрастали пропорционально увеличению скорости роста дрожжей по всему диапазону скоростей протока при относительном постоянстве дыхательного коэффициента. При резком снижении скорости протока среды с 1,0 и 2,0 до 0,1 час-1 культура в течение последующих 2 часов продолжала в переходном процессе расти с прежней высокой удельной скоростью роста (рис. 53). Расчет удельной скорости роста показал, что при переключении скорости протока с 1,0 на 0,1 час-1 дрожжи в течение последующих

127

двух часов росли со скоростью 1,0 час-1 (время генерации 0,69 ч), а при переключении с 2,0 на 0,1 час-1 удельная скорость роста поддерживалось на уровне 1,95 час-1 (время генерации 0,35 ч) лишь в течение 1,3 часа, а затем снижалось ввиду лимитирования роста глюкозой.

Рис. 53. Динамика роста дрожжей во время переходных процессов при переключении скоростей протока среды. Переключение с 1,0 на 0,1 час-1: 1 – биомасса; 3 – удельная скорость роста μ час-1; Переключение с 2,0 на 0,1 час-1: 2 – биомасса; 4 – удельная скорость роста μ час-1.

Существенные изменения удельной скорости роста дрожжей сопровождались увеличением

физиологической

активности

и

определенными

внутриклеточными

перестройками. Величина пула свободных внутриклеточных аминокислот возрастала с увеличением скорости роста. В аминокислотном составе клеточного белка снижалось содержание глюкозамина, являющегося одним из компонентов клеточной стенки и более характерного для мицелиальных форм микроорганизмов. Его содержание максимально при низких скоростях роста и снижается в 4,5 раза с приближением скорости роста к μ max. Светооптические наблюдения показали, что с повышением скорости роста клетки изменяют форму, а количество клеток, связанных в розетки псевдодендриона уменьшается. Клетки удерживаются в розетках развитым наружным слоем клеточных стенок, в состав которых входит глюкозамин. При высоких скоростях роста сильно развит энергетический аппарат клетки – на электроннограммах митохондрии занимают значительную часть среза клетки. Эндоплазматический ретикулум хорошо развит, что связанно с напряженным белковым синтезом.

128

С увеличением удельной скорости роста скорость включения меченой глюкозы в состав отдельных полисахаридов клеточной стенки существенно возрастала (рис. 54), что может служить свидетельством изменения скорости синтеза этих компонентов клеточной стенки. Так, с увеличением удельной скорости роста от 0,5 до 2,0 час-1 скорость синтеза маннана возрастала в 4,5 раза, глюкана в 4, а хитина в 3,6 раза. Приведенные данные отнесены не к сухому весу биомассы, а к сухому весу клеточных стенок дрожжей. Одновременно

с

увеличением

скорости

биосинтеза

полисахаридов

наблюдалось

увеличение относительного содержания в составе клеточной стенки белка, причем в диапазоне от 0,5 до 2,5 час-1 относительное содержание белка возрастало на порядок.

Рис. 54. Динамика скорости включения 14С-глюкозы в полисахариды клеточной стенки дрожжей: 1 – хитин; 2 – глюкан; 3 – маннан.

Ввиду относительно постоянного содержания внутриклеточного белка при увеличении удельной скорости роста дрожжей должна увеличиться интенсивность биосинтеза белка. В таблице 4 приведены данные, характеризующие белоксинтетическую активность дрожжей при различных скоростях роста. Таблица 4. Характеристики белоксинтезирующей активности дрожжей при разных скоростях роста. Скорость Скорость

Биомасса, Белок, РНКобщ,

роста, μ ч-1

г/л

%

%

0,05 0,5 1.0 1,5 2,0 2,5 3,0

13,0 4,6 5,0 3,2 2,7 2,5 1,6

33,7 27,7 28,5 33,3 31,0 34,0 33,5

2,98 5,90 5,20 7,59 12,26 12,0 13,0

ПолириРНКриб,% босомы, % от РНКобщ 1,80 3,86 3,54 5,90 9,80 8,80 9,75

38 42 44 55 56 56 55

129

Количество активных рибосом, 2*1012 в 1 мг

3,90 8,90 8,20 14,80 24,59 23,65 25,51

элонгации пептидной цепи dP/dt ед. акт./с 6,4 27,3 28,2 23,4 26,0 36,0 53,0

В качестве исходного состояния культуры принимали популяцию, растущую с μ = 0,05 час-1 в режиме хемостата. При относительно постоянном содержании белка с увеличением удельной скорости роста суммарное содержание РНК в биомассе возрастало и достигало 13 % от сухого веса клеток при μ = 3,0 час-1. Содержание рибосомальной РНК при высоких скоростях роста составляло от 60 до 80 % от общего содержания РНК, что является прямым доказательством интенсификации белкового синтеза. Генетический контроль интенсифицированной культуры не выявил отличий от исходного штамма дрожжей. После ряда пересевов на твердой питательной среде выделенная культура утрачивала способность расти со скоростью, превышающей максимально достижимую при периодическом культивировании. Дополнительную информацию о потенциальных возможностях биосинтетических процессов может дать наличие в клетках полирибосом (полисом), представляющих собой группы рибосом, соединенные с помощью цепочки мРНК. Одновременная трансляция одной мРНК многими рибосомами способна значительно увеличить эффективность использования матрицы и увеличить скорость биосинтеза идентичных полипептидных цепей, находящихся на разных стадиях формирования полипептида. При интенсивном белковом синтезе расстояние между рибосомами вдоль цепи мРНК может быть предельно коротким, каждую секунду одна рибосома будет завершать синтез белка и соскакивать с матрицы, и одна рибосома будет садиться на матрицу и начинать считывание. В наших экспериментах

с

увеличением

удельной

скорости

роста

культуры

количество

полирибосом увеличивалось на 30 – 33 %, что может служить одним из объяснений высокой скорости биосинтеза белка. При удельной скорости роста дрожжей 1,5 – 3,0 час-1 содержание полирибосом стабилизировалось на относительно постоянном уровне, обеспечивавшем, по-видимому, необходимую скорость биосинтеза полипептидов. Для характеристики истинной белоксинтезирующей активности дрожжевых клеток важно не только наличие определенного количества рибосом и полисом, но и количества активных рибосом, участвующих в каждый отрезок времени в процессе трансляции мРНК. Количество активных рибосом возрастало в 1,8 раза при достижении μ 1,5 час-1 и в дальнейшем стабилизировалось на этом уровне при более высоких скоростях роста. У прокариот рибосома считывает приблизительно 40 – 50 нуклеотидных остатков мРНК в секунду. Скорость считывания мРНК рибосомами у эукариот может достигать близкого значения (30 нуклеотидов в секунду), но регуляторные воздействия могут уменьшить ее в 3 – 10

раз.

По-видимому,

в

процессе

интенсификации

роста

дрожжей

С. hidrocarbofumarica эти регуляторные воздействия на скорость считывания мРНК

130

уменьшаются, что позволяет экспериментально реализовать время генерации популяции дрожжей 13 мин. Процесс интенсификации роста дрожжей по описанной методике можно считать примером физиологической адаптации, не сопряженной с генетическими перестройками, поскольку интенсифицированная культура теряет приобретенные свойства роста со сверхвысокими скоростями при пассировании на твердых питательных средах. Приведенные микроорганизмы

экспериментальные способны

расти

со

данные

показывают,

скоростями,

что

сравнимыми

эукариотные с

таковыми

быстрорастущих бактерий. Природа жестких регуляторных механизмов пока не ясна. Возможно, что регуляторный механизм, контролирующий адаптацию к высоким скоростям роста, сходен по внешним проявлениям с таковым «строгого контроля» у бактерий, однако такие системы регуляции у эукариот практически не изучены.

131

Рис. 55. Зависимость оптической плотности микробных культур от скорости протока среды. 1 - Cr. magnus; 2 - Cr. skinneri; 3 - Ph. rhodozyma; 4 - Tr. pullulans; 5 – совместное культивирование Cr. skinneri и Ph. rhodozyma. Рис. 56. Динамика совместного роста Tr. pullulans и Cr. skinneri. 1 – скорость протока D час-1; 2 – оптическая плотность; а – относительная содержание в дрожжевой флоре Cr. skinneri; б – относительное содержание в дрожжевой флоре Tr. pullulans. Рис. 57. Динамика развития природного микробиоценоза в сокотечениях березы. 1 – lg количества клеток в 1 мл пасока; 2 – среднесуточная температура; а – относительное содержание первичной дрожжевой флоры (80 % составляют Cr. skinneri и Cr. magnus); б – относительное содержание последующей микрофлоры (Tr. pullulans и Ph. rhodozyma).

132

Рекомендуемая литература.

1.

Monod I. La technique de culture continue. Theorie et application. Ann. Inet. Pasteur, 1950, V 79, p. 390-410.

2.

Иерусалимский Н.Д. Основы физиологии микробов. М. Изд-во АН СССР, 1963, 244с.

3.

Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978, 331с.

4.

Печуркин Н.С. Популяционная микробиология. Изд-во «Наука», 1978, 244с.

5.

Гуревич Ю.Л. Устойчивость и регуляция размножения в микробных популяциях. Изд-во «Наука», 1984, 160с.

6.

Работнова И.А., Подмогова И.Н. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизмов. Изд-во «Наука», Москва, 1979, 207с.

7.

Безбородов А.М. Метаболиты внутриклеточного фонда микроорганизмов. Изд-во «Наука», Москва, 1974, 75с.

133