Современные методы исследований в биохимии: Методические указания к выполнению лабораторных работ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ Государственное образовательное учреждение Высшего профессионального образования Восточно-Сибирский государственный технологический университет (ГОУ ВПО ВСГТУ)

УДК 577.1:543.5(075.8) Битуева А.В., Мангутова Е.В. Методические указания к выполнению лабораторных работ по курсу «Современные методы исследований в биохимии». - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2006. – 74 с.

Методические указания к выполнению лабораторных работ

Дисциплина «Современные методы исследований в биохимии» относится к циклу дисциплин по выбору для студентов направления 260100 «Технология продуктов питания», обучающихся по магистерской специализированной программе «Развитие новых технологий на основе рационального использования белков». Методические указания к выполнению лабораторных работ по курсу «Современные методы исследований в биохимии» содержат теоретическое обоснование хроматографических методов исследования, методов детекции генетически модифицированных вставок в пищевом сырье и продуктах его переработки (ПЦР), а также вопросы для самоподготовки. Методические указания составлены в соответствии с рабочей программой курса и рекомендуются магистрам для проведения лабораторных работ.

по курсу «Современные методы исследований в биохимии» для студентов направления 260100 «Технология продуктов питания», магистерская программа разработана на основе ГОСВПО по направлению 260100 регистр. №187 от 23 марта 2000 г

Составители Битуева А.В., Мангутова Е.В.

Рецензент: д.б.н., профессор кафедры «Биоорганическая и пищевая химия» Жамсаранова С.Д.

Табл.2, рис. 2, библиогр.: 16

Издательство ВСГТУ Улан-Удэ, 2006

ВСГТУ, 2006 г.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Гель-фильтрационное разделение макромолекул Теоретические основы гельпроникающей хроматографии. Гель-фильтрационная колонка, заполненная гранулами набухшего геля, уравновешенного каким-либо буферным раствором, характеризуется следующими параметрами: свободным или наружным объемом (объем буферного раствора, находящегося вне гранул геля), VH; внутренним объемом (объем буфера, находящегося в порах гранул геля), V B ; общим объемом колонки (равен V H + V B + V r , где V r — объем матрицы геля), V o . Объем, занимаемый гранулами геля, равен Vo—VH . При прохождении через колонку молекул, размеры которых больше пор гранул, они элюируются одним пиком сразу после прохождения VH. Молекулы, размеры которых меньше нижнего предела интервала фракционирования, равномерно распределяются между наружным и внутренним объемами растворителя, продвигаются через колонку, как при отсутствии геля, и выходят из нее после того, как пройдет общий объем колонки. При гельфильтрации молекул, размеры которых находятся в пределах интервала фракционирования данного типа геля, они распределяются в объеме, находящемся внутри и вне гранул геля, главным образом в соответствии со своими размерами. Теоретически объемы элюирования молекул связаны не с размерами молекул, а с их стоксовскими радиусами и выходят из колонки в соответствующих объемах элюирования (Vэ). При этом получают так называемые диаграммы элюирования гетерогенных смесей молекул. Определив для данной колонки и типа геля значения VH> Vo и Vэ фракционируемых молекул, можно рассчитать их коэффициенты распределения (К):

К= (VЭ-VН)/(VO-VH), откуда значения К молекул, размеры которых больше величины пор гранул геля, равны нулю, а малых молекул, равномерно распределяющихся между VH И VB, —1. Разделение смеси веществ при фильтровании через гели тем эффективнее, чем больше их различия в значениях К. Условием полного разделения смеси двух веществ является нанесение их на колонку в объеме, не превышающем величины К2 — K1VB. Для достижения высокой степени разделения объем образца должен быть меньше рассчитанного теоретически. Полезный диапазон объемов элюции разделяемых глобулярных молекул составляет около 55 % Vo. Так, для колонки с Vo, равным 100 мл, эффективное разделение молекул происходит в диапазоне объемов элюции от 35 до 90 мл, причем максимальное разрешение наблюдают между пиками молекул, выходящими из колонки с 60 мл элюата. Если значение К для фракционируемого вещества отлично от нуля и единицы, то величину V3 при малом объеме нанесенной пробы определяют по формуле VЭ= VН+К·VВ Следует отметить, что некоторые молекулы могут задерживаться в колонке дольше рассчитанного теоретически времени, что обусловлено их адсорбцией на матрице, ионным обменом или другими взаимодействиями. Экспериментально установлена зависимость между логарифмами молекулярных масс молекул одной формы (lgM) и коэффициентами их распределения (К), носящая линейный характер. Пропуская через колонку стандартных размеров молекулы с К=0 (обычно используют голубой декстран, М 2-106) и 1, а также молекулы с известными молекулярными массами, находящимися в пределах

диапазона фракционирования данного типа геля, определяют значения VH, Vo, Vэ и рассчитывают их К. Для калибровки колонок служат наборы чистых белков М 13700—669000 (табл. 1). На основании полученных данных строят график (калибровочная кривая) зависимости К от lg М этих белков. Молекулярную массу неизвестного белка находят по графику интерполяцией, предварительно определив его Vэ и рассчитав К. Таблица 1. Белки, применяющиеся для калибровки гельфильтрационных колонок Белок Рибонуклеаза А

Молекулярная Стокс. масса радиус, нм 13700 164

Химотрипсиноген 25000 А Яичный 43000 альбумин Альбумин 67000

Источник

209

Поджелудоч ная железа То же

305

Куриные яйца

355

Сыворотка быка Мышца кролика Печень быка Селезенка лошади

Альдолаза

158000

481

Каталаза Ферритин

210000 440000

_ 610

Голубой декстран

2000000

Метод гель-фильтрации позволяет определять молекулярные массы веществ в любых условиях, однако точность его невелика. Выбор типа геля и размеров колонки для гельпроникающей хроматографии. Для разделения смеси биополимеров выбирают гель с интервалом фракционирования, верхний предел которого значительно ниже, чем молекулярная масса самого тяжелого вещества. Высокомолекулярные биополимеры можно эффективно отделить от низкомолекулярных на сефадексах G-25 (интервал фракционирования 102- 5·103) или G-15 (интервал фракционирования 0 - 1,5·103). Для полного отделения низкомолекулярных веществ от высокомолекулярных, например соли от белков, используют гель с интервалом фракционирования, нижний предел которого превышает молекулярную массу данного соединения, а молекул с близкими массами — с интервалом фракционирования, нижний предел которого больше самых легких из них. Степень разрешения какого-либо типа геля зависит от размера его гранул и скорости протекания через колонку элюирующего буферного раствора. Наибольшей степенью разрешения обладают сверхтонкие и тонкие гели, однако скорость протекания растворителя через них низкая и на практике для разделения молекул чаще применяют средние гели. Эффективность гельпроникающей хроматографии существенно зависит от правильно подобранных размеров колонки. При работе с тонкими и сверхтонкими гелями сефадекса предпочтительны относительно короткие колонки. Для обессоливания белков используют колонки высотой не более 50—55 см, а для разделения белков или их фрагментов, имеющих близкие молекулярные массы, — колонки высотой до 200 см. Применение для гель-

фильтрации узких колонок нежелательно, так как в ходе элюирования возникают пристеночные эффекты, ведущие к резкому расширению хроматографических зон. При работе с короткими и толстыми колонками трудно добиться равномерного нанесения образца на столб геля и равномерного тока буферного раствора через гель, поэтому чаще всего применяют колонки, длина которых в 20—40 раз превышает их диаметр. На столб геля не следует наносить раствор образца, плотность которого меньше плотности элюирующего раствора. Объем образца не должен превышать 5 % общего объема колонки. Оптимальная концентрация вещества в наносимом образце составляет от 10 до 30 мг·мл -1 . Если необходимым требованиям разделения одновременно удовлетворяют несколько типов геля, то целесообразно выбрать тот из них, который обладает наименьшей величиной поглощения воды, т. е. имеет наибольшее количество поперечных сшивок.

Задание. Подвергнуть гельпроникающей хроматографии на колонке с сефадексом (молселектом) G-75 белковые фракции, выделенные из различных органов крупного рогатого скота. Материалы и оборудование Белковые фракции, выделенные из различных органов крупного рогатого скота, дистиллированная вода, ЗФР (натрий-фосфатный буферный раствор, 0,04 моль/л) и натрия хлорид (0,26 моль/л, рН 7,5), 5 мл голубого декстрана (1 мг/мл), сефадекс G-75 с размерами гранул 40—120 мкм (10— 12 г), натрия азид или мертиолат, дихлорэтан. Мерный цилиндр (1000 мл), стеклянная палочка длиной

110— 120 см с резиновой муфтой на конце, колонка стеклянная 100X2 см с ровным дном и со шлифом, соединительная тефлоновая трубка для колонки размером 110—0,2 см, стекловолокно, кварцевый порошок или порошок из стекла пирекс с размерами частиц 1,5— 2,0X1,5—2,0 мм, колба Бунзена (1000 мл) с резиновой пробкой, перистальтический насос с соединительной тефлоновой трубкой длиной до 1 м, пробирки (10 мл), шприц (5 мл), химический стакан (1000 мл) миллиметровая бумага, штатив для крепления колонки, штатив для пробирок, спектрофотометр, коллектор фракций, вакуумный насос, водяная баня. Натрий-фосфатные буферные растворы. Приготовить матричные растворы фосфата натрия однозамещенного (А) и фосфата натрия двухзамещенного (Б): раствор А фосфат натрия однозамещенный (NaH2 PO4 , M 156,1) 27,6 г вода дистиллированная до 1000 мл раствор Б фосфат натрия двухзамещенный (Na2HPO4, M 395,16)28,38г вода дистиллированная до 1000 мл Натрий-фосфатный буферный раствор (0,02 моль/л, рН7,5): раствор А 16,0 мл раствор Б 84,0 мл вода дистиллированная до 500 мл. ЗФР — натрий-фосфатный буферный раствор (0,02 моль/л) и хлорид натрия (0,13 моль/л). Приготовить матричный раствор: раствор А 128 мл раствор Б 572 мл хлорид натрия 30,4 г вода дистиллированная до 1000 мл. Для приготовления ЗФР к одному объему

матричного раствора дистиллированной воды.

прибавить

три

объема

Подготовка сефадекса (молселекта) к хромат о г р а ф и и . Взвесить 10 г сефадекса G-75 (для гель-фильтрации) и внести его тонкой струей, постепенно перемешивая стеклянной палочкой, в цилиндр (1000 мл), содержащий 700—800 мл дистиллированной воды. Материал оставить в цилиндре на один день для набухания. Время набухания геля можно сократить до 5 ч при 90 °С. После набухания гранул сефадекса удалить мелкие и крупные частицы геля. Для удаления мелких частиц гель тщательно перемешать в цилиндре и дать ему отстояться. По мере оседания основной массы гранул верхний мутный слой воды с обломками гранул геля отсасывать трубкой. Процесс декантации мелких частиц повторить три-четыре раза. Для удаления крупных частиц гель тщательно размешать и через 3—5 мин аккуратно перелить в свободную емкость, оставив на дне слой геля 1—1,5 см. К объему набухшего сефадекса добавить равный объем хлорида натрия (0,26 моль/л), забуференного натрийфосфатным буферным раствором (0,04 моль/л), рН 7,5, тщательно перемешать, дать отстояться и удалить надосадочную жидкость. Перелить гель в колбу Бунзена, закрыть ее резиновой пробкой и соединить с вакуумным насосом. Колбу обернуть мягкой тканью, включить вакуумный насос и дегазировать гель 10—15 мин. По окончании дегазации снять соединительную трубку из колбы и открыть пробку. Сефадекс готов для внесения в колонку. Подготовка к работе стеклянной гель-фильтрационной колонки. Стеклянную колонку с плоским дном и шлифом (100X2 см) укрепить на штативе строго вертикально. Присоединить к ее

«носику» тефлоновый капилляр длиной не менее 105 см. Если капилляр трудно одевать на «носик» колонки, его конец следует опустить на 5-7 мин в дихлорэтан или хлороформ. Свободный конец капилляра закрепить. Налить в колонку до высоты 70 см ЗФР хлорида натрия (рН 7,5) — элюирующий буфер. Стеклянной палочкой с резиновой муфтой на конце опустить на дно колонки диск из стекловолокна и засыпать его сверху (0,5—1,0 см) порошком из кварцевого стекла или стекла пирекс. Уложить частицы строго горизонтально с помощью стеклянной палочки или слегка встряхивая колонку. Из колбы Бунзена налить в колонку до шлифа гель сефадекса. Необходимо следить, чтобы температура буферного раствора, находящегося в колонке, и вносимого геля были одинаковыми. По мере оседания гранул геля и вытекания элюирующего буфера добавлять в колонку новые порции носителя. При заполнении колонки таким способом скорость вытекания через капилляр элюирующего раствора постепенно уменьшается, в то время как гранулы геля осаждаются все быстрее и быстрее. Чтобы избежать образования прерывистых зон геля, часть надосадочной жидкости декантируют и вносят в колонку новые порции геля. После образования столба геля высотой примерно 95— 97 см поднять капилляр выше уровня буфера в колонке и строго горизонтально положить на гель кружок фильтровальной бумаги, плотно прилегающий к стенкам колонки. При заполнении колонки гелем, внесении образца и выполнении всех последующих операций необходимо следить, чтобы гель постоянно находился под слоем жидкости, т. е. не контактировал с воздухом. Присоединить к колонке капилляр от перистальтического насоса, наслоить на столб геля вплоть

до шлифа элюирующий раствор. Конец гибкого капилляра колонки опустить вниз так, чтобы гидростатическое давление в колонке не превышало 25—30 см столба геля. Пропустить через колонку 200—300 мл элюирующего буфера со скоростью 15—20 мл/ч. Поднять гибкий капилляр па высоту колонки, отсосать шприцом с капилляром буфер над столбом геля, оставив над фильтром 1,0—1,5 мм. Наслоить на гель 7—8 мл 1 %-ного раствора декстрана голубого (М 2·106). Опустить конец капилляра на 15—20 см ниже уровня жидкости в колонке и дать декстрану всосаться в гель, не допуская контакта фильтра с воздухом. Смыть остатки декстрана со стенок колонки 2— 3 мл элюирующего раствора, отсосать шприцом с капилляром и удалить. С момента нанесения голубого декстрана элюат собирать в сосуд для определения свободного объема колонки. Наслоить на столб геля 5 мл одного из образцов и дать всосаться в гель. Промыть стенки колонки элюирующим буфером (2 мл) и также дать ему всосаться в гель, затем элюирующим раствором (5—7 мл) и, отсосав его шприцом с капилляром, удалить. Наслоить на гель элюирующий раствор до шлифа. Присоединить к колонке перистальтический насос. Элюирующий раствор пропускать через колонку со скоростью 20 мл/ч. Элюат, до выхода из колонки голубого декстрана, собирать в отдельный сосуд, измерить его объем и таким образом определить свободный (наружный) объем колонки. Колонку после выхода декстрана голубого подключить к коллектору фракций и собирать фракции по 5 мл. Собрав примерно 50 фракций, определить содержание в них белка по поглощению в ультрафиолетовой области спектра при 280 нм. Построить кривые элюирования (по оси абсцисс значения А280 , по оси ординат — фракции) каждого из образцов, подвергнутых гельпроникающей

хроматографии. Сравнить кривые элюирования образцов, сделать вывод о молекулярных массах белков, содержащихся в образцах. Контрольные вопросы 1. В чем заключается принцип метода гельпроникающей хроматографии? В чем преимущества этого метода перед другими методами хроматографии? 2. Какие гели-матрицы применяются для гельфильтрации? Какие вы знаете виды и типы декстрановых гелей и каковы их интервалы фракционирования? 3. Дайте характеристику гелям на основе сефарозы, сефакрила, биогелям, ультрогелям. 4. Какие сефадексы нужны для эффективного разделения белков с М 900 000, 150 000 и 70 000; 100 000, 80 000 и 30 000? 5. Какие основные параметры гель-фильтрационной колонки? Что такое гель-фильтрационные диаграммы элюирования веществ? 6. Как определить молекулярную массу молекул методом гель-фильтрации? Каковы основные принципы выбора типа геля, размеров колонки, условий элюирования? 7. Какова разрешающая способность метода гельфильтрации?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Изучение методики определения массовой доли витаминов в пробах пищевых продуктов и продовольственного сырья хроматографическим методом на анализаторе жидкости «Флюорат-02». Витамины относятся к важнейшим незаменимым пищевым веществам. Это низкомолекулярные органические соединения, необходимые для осуществления ферментативного катализа, нормального обмена веществ, поддержания гомеостаза, биохимического обеспечения функций организма. Организм человека и животных не синтезируют витамины или не вырабатывает их в достаточном количестве и регулярно должен получать их с пищей. Потребность в витаминах колеблется от нескольких микрограммов до нескольких десятков миллиграммов в день. В отличие от других незаменимых пищевых веществ витамины не служат пластическим материалом или источником энергии. В обмене веществ они преимущественно выступают как источники биокатализа (в качестве коферментов) и регуляции отдельных биохимических и физиологических процессов. Недостаточное потреблений витаминов неизбежно приводит к нарушению зависящих от них ферментативных процессов и физиологических функций. Известно около 13 соединений или групп соединений, относящихся к витаминам. Классически витамины классифицируют по признаку их растворимости в воде или жире. Водорастворимые витамины – аскорбиновая кислота, витамины группы В: тиамин, рибофлавин, кобаламин, пиридоксин, ниацин, фолацин, пантотеновая кислота и биотин. К жирорастворимым витаминам относятся витамины А, D, Е, и

К. Существует и классификация витаминов по химической структуре: витамины алифатического, ациклического и ароматического рядов. 4.1. МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗМЕРЕНИЙ МАССОВОЙ ДОЛИ ВИТАМИНОВ А и Е В ПРОБАХ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ И ПИЩЕВОГО СЫРЬЯ НА АНАЛИЗАТОРЕ ЖИДКОСТИ "ФЛЮОРАТ-02". 1. ВВЕДЕНИЕ Метод заключается в щелочном гидролизе пробы, экстракции гексаном неомыляемой части, введении экстракта на ВЭЖХ-приставку для хроматографического разделения витаминов А и Е и их количественного определения. Диапазон определяемых массовых долей: для витамина Е: 1 - 500 мг/ кг; для витамина А: 0.2 -100 мг/кг для витамина А в форме ретинолпальмитата: 0.1 - 2,0 мг/кг. Характеристика погрешности измерения массовых долей для Р = 0 95 (§,%): для витамина Е 5=11.5+87.8*Х"1 для витамина А 5 = 16.0+21.2*Х"1 для витамина А в форме ретинолпальмитата - 20%, где X - результат измерения, мг/кг. 2. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ И ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА. Анализатор жидкости "Флюорат-02-2М" ТУ 432120506233-94 Хроматографическая приставка ВЭЖХ-3 Колонка нормальнофазная 80x2 мм,с предколонкой Сорбент Separon SGX, зернение 5 мкм Весы лабораторные ВЛР-200 ГОСТ 24104-88Е Меры массы ГОСТ 7328-82Е Пипетки 2-2-1, 2-2-2, 2-2-5, 2-2-10 ГОСТ 20292-74Е Колбы мерные 2-100-2, 2-200-2 ГОСТ 1770-74Е

Колбы конические вместимостью 250 см3 ГОСТ 1770-74Е Пробирки лабораторные вместимостью 10-20 см3 ГОСТ 25336-82 Цилиндр лабораторный вместимостью 25 и 50 см3 ГОСТ 1770-74Е Холодильник шариковый ГОСТ 25336-82 Делительная воронка вместимостью 50 см3 ГОСТ 25336-82 Спектрофотометр типа СФ-26 или СФ-46 Роторный испаритель Водяная баня с автоматической регулировкой температуры Микросмеситель типа "Вортекс" 3. РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72 Гексан ч. ТУ 6-09-26-3375-78 2-Пропанол, х.ч. ТУ 6-09-402-87 Спирт этиловый ТУ 6-09-1710-77 Кислота аскорбиновая Р.73.973.09 Калия гидроокись, х.ч. ГОСТ 24363-80 Кислота соляная, х.ч. ГОСТ 3118-77 Ретинол ацетат СО Ретинолацетат фармакопейный Ретинолпальмитат фармакопейный Р.73.914.4 α-токоферолацетат СО 4. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРОВ. 4.1. Раствор гидроокиси калия в этиловом спирте с массовой долей 10%. К 10 г гидроокиси калия медленно, при перемешивании добавляют 90 см3 этилового спирта. Раствор хранят в сосуде из полиэтилена: Срок хранения 1 месяц. 4.2. Элюенты для хроматографии В сухую коническую колбу вместимостью 250 см3 помещают 1.0 см3 2-пропанола и добавляют 200 см3 гексана. Смесь тщательно перемешивают.

Срок хранения в сосуде, исключающем испарение, не ограничен. Только для анализа молока готовят элюент - смеси 2пропанол -гексан в объемном соотношении 1:1000. В сухую коническую колбу вместимостью 1000 см3 помещают 1.0 см3 2-пропанола и добавляют 1000 см3 гексана. Смесь тщательно перемешивают. Срок хранения в сосуде, исключающем испарение, не ограничен. 4.3 Раствор соляной кислоты молярной концентрации 0.01 моль/дм3. Раствор готовят двухступенчатым разбавлением концентрированной соляной кислоты. На первой стадии 8.3 см3 концентрированной соляной кислоты разбавляют до 1000 см3 дистиллированной водой. Затем 100 см3 полученного раствора разбавляют дистиллированной водой до 1 дм3. Раствор готовят только для определения молока. Срок хранения растворов не ограничен. 4.4. Раствор аскорбиновой кислоты, массовая доля 10%. Раствор готовят, растворяя 10 г аскорбиновой кислоты в 90 см3 дистиллированной воды. Срок хранения раствора - не более трех суток в холодильнике. 4.5. Раствор аскорбиновой кислоты в этаноле, массовая доля 1%.Раствор готовят, растворяя 1 г аскорбиновой кислоты в 100 см3 этанола .Раствор готовят только для анализа молока. Срок хранения раствора - не более трех суток в холодильнике. 4.6. 1. Приготовление исходного раствора ретинолацетата . 5 см3 стандартного образца раствора ретинолацетата переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят до метки этиловым спиртом.

Концентрацию ретинолацетата в данном растворе (мг/см ) рассчитывают по формуле: 5C C = CO 100 где СCO - концентрация стандартного образца ретинолацетата, указанная в .свидетельстве на СО (мг/см3) Срок хранения раствора - 3 месяца в холодильнике. 4.6.2. Приготовление основного раствора ретинолацетата из фармакопейных препаратов. Для приготовления исходного раствора ретинолацетата можно также использовать аптечные препараты ретинолацетата, растворенного в масле. Лекарственную форму (желатиновую капсулу) разрезают, помещают в стакан вместимостью 50 см3, добавляют 20 см3 этилового спирта, энергично перемешивают в течение 15 мин, после чего дают отстояться 10 мин. Спиртовый раствор ретинолацетата переносят в мерную колбу вместимостью 25 см3 (при этом желатиновая капсула остается в стакане, т.к. не растворяется в спирте) и доводят до метки этиловым спиртом. Концентрацию ретинолацетата определяют спектрофотомётрическим методом, измеряя оптическую плотность полученного раствора при 325 нм. Образец сравнения - этиловый спирт, использованный при приготовлении раствора. Концентрацию ретинолацетата в данном растворе С (мкг/см3) рассчитывают по формуле: 3

D E ×l где D - оптическая плотность. l -толщина поглощающего слоя кюветы (см). Е - коэффициент экстинкции; для 1% раствора ретинолацетата при 1=1 см Е=1550 , Если полученное значение оптической плотности выше 0.8, то раствор разбавляют этиловым спиртом таким образом, C = 10000 ×

чтобы оптическая плотность полученного раствора была бы более 0,2, но менее, чем 0,8. Если же оптическая плотность исходного раствора менее 0.2, то его готовят заново, увеличивая навеску препарата. Срок хранения 1 месяц при температуре 3-100С. 4.6.3. Приготовление рабочих растворов ретинолацетата. Рабочие растворы с концентрациями 0.2 - 2.0 мкг/см3 готовят из основного разбавлением этиловым спиртом. Растворы готовятся непосредственно перед началом работы 4.7. 1 Приготовление исходного раствора ретинолпальмитата ( необходим только при определение витамина А в молоке в виде ретинолпальмитата) Для приготовления исходного раствора ретинолпальмитата используют поливитаминные препараты, содержащие ретинолпальмитат и не содержащие других жирорастворимых витаминов (ретинолацетата, витаминов группы D и Е). Лекарственную форму (драже) растирают в ступке, к полученному образцу прибавляют5 см3 раствора соляной кислоты с концентрацией 0.01 моль/дм3,нагретого до 65 °С и выдерживают при этой температуре в течение 15мин. Затем охлаждают, экстрагируют 5 см3 гексана, экстракт переносят в мерную колбу вместимостью 25 см3 и доводят гексаном до метки. Концентрацию полученного раствора определяют спектрофотомётрическим методом, измеряя оптическую плотность при 325 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см. Образец сравнения - гексан, использованный при приготовлении раствора. Концентрацию ретинолпальмитата в данном растворе С (мкг/см3) рассчитывают по формуле: C = 10.26 x D

где D - оптическая плотность. Если полученное значение оптической плотности выше 0.8, то раствор разбавляют гексаном таким образом, чтобы оптическая плотность полученного раствора была бы более 0.2, но менее, чем 0.8. Если же оптическая плотность исходного раствора менее 0.2, то его готовят заново, увеличивая навеску препарата. Срок хранения 1 месяц при температуре 3-100С. 4.7.2 Приготовление рабочего раствора ретинолпальмитата. Из исходного раствора путем разбавления гексаном готовят растворы для градуировки хроматографа в диапазоне концентраций от 0.2 до 2 мкг/см3 (для градуировки рекомендуются растворы с концентрациями 0.2, 1 и 2 мкг/см3). Растворы готовятся непосредственно перед началом работы 4.8.1 Приготовление исходного раствора атокоферолацетата. 5 см3 стандартного образца раствора атокоферолацетата переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят до метки этиловым спиртом. Концентрацию а-токоферолацетата в данном растворе 3 (мг/см ) рассчитывают по формуле: 5C C = CO 100 где Ссо - концентрация стандартного образца атокоферолацетата, указанная в свидетельстве на СО (мг/см3). Срок хранения 1 год при температуре 3-10 С. 4.8.2 Приготовление исходного раствора атокоферолацетата из фармакопейных препаратов. Для приготовления исходного раствора атокоферолацетата используют аптечные препараты атокоферолацетата, растворенного в масле. Лекарственную

форму (желатиновую капсулу) разрезают, помещают в стакан вместимостью 50 см3, добавляют 20 см3 этилового спирта, энергично перемешивают в течение 15 мин, после чего дают отстояться 10 мин.. Раствор переносят в мерную колбу вместимостью 25 см3 и доводят до метки этиловым спиртом (при этом желатиновая капсула остается в стакане, т.к. не растворяется в спирте). Концентрацию полученного раствора определяют спектрофотометрическим методом, измеряя оптическую плотность при 285 нм. Образец сравнения этиловый спирт, использованный при приготовлении раствора. Концентрацию а-токоферолацетата в данном растворе С (мкг/см3) рассчитывают по формуле: C = 10000 ×

D E ×l

где D - оптическая плотность. l - толщина поглощающего слоя кюветы (см). Е коэффициент экстинкции; для 1% раствора атокоферолацетата при l =1 см Е=42.5 Если полученное значение оптической плотности выше 0.8, то раствор разбавляют этиловым спиртом таким образом, чтобы оптическая плотность полученного раствора была бы более 0.2, но менее, чем 0.8. Если же оптическая плотность исходного раствора менее 0.2, то его готовят заново, увеличивая навеску препарата. Срок хранения 1 месяц при температуре 3-10 С. 4.8.3 Приготовление рабочих растворов атокоферолацетата. Рабочие растворы с концентрациями 2, 8, 16 мкг/см3 готовят из основного разбавлением этиловым спиртом. Растворы готовятся непосредственно перед началом

работы. Примечание: При работе с фармакопейными препаратами витаминов возникает необходимость перевода Международных единиц активности (ME) витаминов в массовые. 1 ME (международная единица) витамина А соотвествует0.344 мкг ретинолацетата или 0.555 мкг ретинолпальмитатаили 0.300 мкг ретинола. t 1 ME (международная единица) витамина Е соотвествует 1.0 мг a-токоферолацетата или 0.909 мг атокоферола. 5. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ При выполнении измерений необходимо соблюдать правила техники безопасности (ТБ) при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.018-86 и ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79, а также требования, изложенные в НТД на анализатор "ФЛЮОРАТ-02". 6. УСЛОВИЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗМЕРЕНИЙ. При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия: Температура воздуха 20±10° С Атмосферное давление 630-800 мм рт.ст. Влажность воздуха не более 80% при 25°С. Напряжение в сети 220±10В. Частота 50±1 Гц 7. ПОДГОТОВКА ПРОБЫ. 7.1 Отбор проб. Отбор и подготовка лабораторной пробы производится в соответствии с нормативно-технической документацией на данный вид продукта (сырья). Все виды продуктов и сырья, за исключением молока и молочной сыворотки, обрабатывают по п.8.2, а молоко и молочную сыворотку - по п.8.3. 7.2. Гидролиз липидов.

Навеску пробы массой 4 г измельчают, добавляют 20 см3 10%-ного этанольного раствора гидроксида калия (п.4.1), 10 см3 водного 10%-ного раствора аскорбиновой кислоты (п.4.4), помещают в колбу, соединенную с обратным водяным холодильником, и выдерживают на водяной бане при температуре 85-90С в течение 60 мин, периодически перемешивая и избегая интенсивного кипения и прямого попадания солнечного света. Омыленную пробу охлаждают, добавляют 5 см3 воды и хорошо перемешивают. Содержимое колбы переносят в делительную воронку, вносят 4 см3 гексана и экстрагируют неомыленную часть липидов, в том числе и витамины в виде ретинола и а-токоферола. Полученный экстракт используют для хроматографического определения витаминов А и Е. Продукты с высоким содержанием жира (масло, маргарин, мороженое, сыр) подвергают аналогичной обработке, но ограничивают величину навески таким образом, чтобы она содержала не более 1 г жира, т.е. навеска составляет для этой группы продуктов 1.5 г. Для более полного гидролиза жиров рекомендуется увеличить объем добавляемой спиртовой щелочи, а также (или) увеличить время гидролиза до 1 ч 30 мин Одновременно проводят аналогичную обработку контрольного раствора, содержащего ретинолацетат и атокоферолацетат в концентрациях, близких к ожидаемым в пробе. Для приготовления контрольного раствора в колбу помещают необходимый объем стандартного исходного раствора ретинолацетата и стандартного исходного раствора а-токоферол ацетата, добавляют этанольный раствор гидроксида калия (п.4.1) до 20 см3, 10 см3 водного 10%ного раствора аскорбиновой кислоты и проводят щелочной гидролиз так же, как и пробы. Аналогично обрабатывают холостую реактивную пробу, в которой исследуемая навеска заменена равным по

весу количеством дистиллированной воды, и проводят через весь ход анализа. В гексановом экстракте холостой пробы при вводе в хроматограф витамины не должны обнаруживаться. Примечание: Если содержание определяемых витаминов в анализируемой пробе выходит за пределы диапазона линейности, то полученный гексановый экстракт разбавляют до 20-50 см3 гексаном, что учитывается при расчетах. Степень разбавления (Q) равна соотношению конечного объема после разбавления и объема аликвотной порции исходного экстракта, взятого для разбавления. 7.3. Подготовка пробы при анализе молока и молочной сыворотки. Отобранные пробы молока доводят до комнатной температуры и тщательно перемешивают. В заранее приготовленные пронумерованные пробирки 1 и 2 вносят по 2,5 см3 спиртового раствора аскорбиновой кислоты (п.4.5). Затем в пробирку N 1 вносят 1 см3 дистиллированной воды, а в пробирку N 2 - 1 см3 молока, перемешивают и оставляют на 5 мин. Через 5 мин во все пробирки добавляют по 2,5 см3 гексана, экстрагируют в течение 30 сек при помощи микросмесителя, дают отстояться 2 мин и затем вновь перемешивают пробу в течение 30 сек при помощи микросмесителя. При необходимости центрифугируют образцы в течение 5 минут при 2-3 тыс. об/мин. Из верхнего гексанового слоя центрифугата, содержащего жирорастворимые витамины, отбирают пробу на анализ методом ВЭЖХ. 8. ВЫПОЛНЕНИЕ ИЗМЕРЕНИЙ 8.1. Градуировка анализатора. Подготовку хроматографической системы к работе проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации анализатора "Флюорат-02" и хроматографической приставки. Градуировка производится отдельно для каждого

анализируемого компонента. Условия хроматографического анализа при этом одинаковы. Градуировочные растворы ретинолацетата готовят из исходного раствора в этаноле (п.4.6), для чего отбирают определенный объем этого раствора \/исх и проводят через весь ход анализа (п.8).При приготовлении градуировочных растворов ретинолпальмитата руководствуются п.4.7, а-токоферолацетата - п.4.8. В память анализатора вводят значения параметров, указанные ниже для каждого из веществ, и затем дозируют по 10 мм3 полученных растворов в хроматограф. 8.1.1.Условия градуировки для витамина Е (атокоферола): Колонка нормальнофазная 80x2 мм, Сорбент - Separon SGX, зернение 5 мкм Элюент - изопропанол : гексан 1:200 Расход элюента 200 мм3/мин Ввод петлей 10 мм3 Светофильтр в канале возбуждения - 292, в канале регистрации Чувствительность минимальная Корр. опорн. нет Корр. проп. есть Размах шкалы 111=0.5-1.5 Вычитание фона Ф=0.00 Сглаживание С=1 Диапазон концентраций а-токоферола 1.0-20.0 мкг /см3 Время выхода а-токоферолацетата – 3 мин 8.1.2.Условия градуировки для витамина А (ретинола): Колонка нормальнофазная 80x2 мм, Сорбент - Separon SGX, зернение 5 мкм Элюент изопропанол : гексан 1:200 Расход элюента 200 мм3/мин Ввод петлей 10 мм3 Светофильтр в канале возбуждения - А1, в канале регистрации -А2

Чувствительность минимальная Корр. опорн. нет Корр. проп. есть Размах шкалы 111=0.01-0.03 Вычитание фона Ф=0.00 Сглаживание С=4 Диапазон концентраций ретинолацетата 0.2 до 5.0 3 1уд - 12мин мкг/см Время выхода цис-ретинола транс-ретинола 2 уд.- 16 мин. 8.1.3.Условия градуировки для витамина А (ретинолпальмитата): (Проводится при определении молока и молочной сыворотки) Колонка нормальнофазная 80x2 мм, Сорбент - Separon SGX, зернение 5 мкм Элюент - изопропанол : гексан 1:1000 Расход элюента 200 мм3/мин , Ввод петлей 10 мм3 Светофильтр в канале возбуждения - А1, в канале регистрации -А2 Чувствительность минимальная Корр. опорн. нет Корр. проп. есть Размах шкалы Ш=0.01-0.03 Вычитание фона Ф=0.00 Сглаживание С=4 Диапазон концентраций ретинолпальмитата 0.2 до 2.0 мкг/см3 Время выхода ретинолпальмитата ~t уд - 3 мин Регистрируют не менее двух хроматограмм каждого раствора, измеряют высоты пиков компонента и находят среднее ; арифметическое, если различие между полученными величинами не превышает 10%. По полученным данным строят градуировочные зависимости высоты пика от концентрации компонента. Градуировочные графики должны быть линейны в рекомендуемом диапазоне и проходить через ноль, поэтому в последующих определениях можно

использовать метод одного стандарта, с концентрацией витаминов близкой к концентрации витаминов в анализируемых объектах. Таким образом, в контрольный раствор вводятся известные концентрации Сст ретинолацетата и Сст токоферола ацетата, которые проводятся через весь ход анализа, экстрагируются гексаном в виде ретинола и атокоферола и вводятся в хроматограф как стандарты. 8.2. Измерение массовой концентрации витаминов А и Е в пробе после омыления липидов. В хроматограф вводят при помощи дозирующей петли по 10 мм3 полученных по п.7.2 растворов в такой последовательности: холостая реактивная проба; контрольный раствор, содержащий витамины А и Е; раствор пробы. Особенностью методики является замена фильтров и параметров регистрации в течение регистрации одной хроматограммы. Перед началом анализа в канал возбуждения и регистрации помещают светофильтры 292 и Е2 соответственно. Аликвотную порцию раствора (10 мм3) дозируют при помощи петли в хроматографическую установку и начинают элюирование в условиях, приведенных в п.8.1. После прохождения 1000 мл элюата (5 мин.) останавливают детектор (нажатием клавиши F3 ), производят замену светофильтров, устанавливая в каналы возбуждения и регистрации светофильтры А1 и А2 соответственно, изменяют шкалу (Ш), усреднение (С), после чего снова запускают детектор (нажатием клавиши Ent). Во время смены светофильтров насос не отключают! После регистрации изомеров ретинола хроматографирование заканчивают. 9. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ Содержание каждого из витаминов в пробе (Х, мг/см3) вычисляют по формуле:

X =

C cm × hx × Vutr × Q × k × шкала hcm × M × шкала

где Сст – концентрация эфирной формы витамина в контрольном растворе, мкг/см3; hcm – высота пика витамина в контрольном растворе, мм hx – высота пика витамина в пробе, мм V гек – объем гексана, взятый для экстракции, см3 Q – разбавление гексанового экстракта (п 7.2) M – масса навески продукта, г k – коэффициент пересчета эфирных форм витаминов в спиртовые, равный 0,87 – для ретинолацетата 0,54 – для ретинолпальмитата 0,91 – для α-тоферолацетата 4.2. МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗМЕРЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ ВИТАМИНА С В ПРОБАХ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХИ ПИЩЕВОГО СЫРЬЯ НА АНАЛИЗАТОРЕ ЖИДКОСТИ «ФЛЮОРАТ-02» 1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ Метод основан на извлечении витамина С из пищевого продукта, обработки экстракта актированным углем с целью его очистки и одновременного окисления аскорбиновой кислоты в дигидроаскорбиновую (ДАК) и последующим проведением реакции с о-фенилендиамином в слабокислой среде с образованием флюоресцирующего продукта. Диапазон измеряемых массовых концентраций витамина С в экстракте – 0,01 – 0,1 мг/см3, что при навеске 1 – 50 г. Соответствует массовой доле 0,01 – 5,0 мг/г 2. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, УСТРОЙСТВА, РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ При измерении массовой доли витамина С используют

следующие средства измерения, оборудование, реактивы и материалы.

вспомогательное

2.1. Средства измерения и вспомогательные устройства Анализатор жидкости "Флюорат-02" ТУ 4321-00120506233-94 Весы аналитические 2-го класса точности (ВЛР-200, ВЛА-200) ГОСТ 24104 - 88Е Меры массы ГОСТ 7328-82Е Пипетки мерные 2-2-10, ГОСТ 29169 - 91 Пипетки градуированные ГОСТ 29227 -91 вместимостью 1, 2, 5 см3 Колбы мерные 2-50-2, 2-500-2, 2-100-2 ГОСТ 1770-74Е Пробирки лабораторные ГОСТ 25336-82 вместимостью 10-20 см3 Электроплитка бытовая ГОСТ 14919-83 Шкаф сушильный Часы наручные Стакан лабораторный ГОСТ 25336-82 вместимостью 500, 1000 см3 2.2. Реактивы Аскорбиновая кислота о-Фенилендиамин гидрохлорид или ТУ 6-09-5888-69 о-Фенилендиамин основание:] Фосфорный ангидрид, ч. ТУ 6-09-4173-85 Натрий уксуснокислый трехводный, х.ч. ГОСТ 199-78 Уголь активированный иди уголь древесный. Кислота азотная, х.ч. ГОСТ 4461-77 Кислота соляная, х.ч. ГОСТ 3118-77 Кислота борная, ч.д.а. ГОСТ 9656-75Кислота уксусная, х.ч. ГОСТ 61-75 Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72 2.3. Приготовление растворов

2.3.1. Приготовление раствора о-фенилендиамина ( ОФДА). В мерной колбе вместимостью 100 см3 растворяют 0,100 г гидро-5-хлорида ОФДА в 100 см3 дистиллированной воды. Допускается приготовление раствора из офенилендиамина основания (0,100 г). В этом случае растворение ведут в 100 см3 раствора соляной кислоты, приготовленной по п.2.3.4. Срок хранения раствора в холодильнике - не более 3 суток. Признаком его непригодности является появление окраски. 2.3.2. Приготовление 50%-ного раствора ацетата натрия. 50 г трехводното ацетата натрия растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят до метки дистиллированной водой и при необходимости фильтруют. Срок хранения раствора специально не устанавливается, признаком его непригодности является появление хлопьев или мути. 2.3.3. Приготовление смеси борной кислоты и ацетата натрия. 3 г борной кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют ее в небольшом количестве раствора ацетата натрия; приготовленного по п.3.3.2, и разбавляют этим раствором до метки. Раствор готовят непосредственно перед проведением анализа. 2.3.4. Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации 0.1 моль/дм3 В стакан вместимостью 1000 см3 помещают 500-600 3 см дистиллированной воды, при помешивании добавляют 8.5 см3 концентрированной соляной кислоты и разбавляют дистиллированной водой до р1000 см3. 2.3.5. Подготовка активированного угля Смесь 20 г угля и 100 см3 концентрированной азотной кислоты кипятят в течение 10 мин (в вытяжном шкафу!) и фильтруют. Уголь переносят в стакан, перемешивают не

менее 5 раз с 200 см3 дистиллированной воды, декантируя жидкость. При необходимости операцию промывки водой повторяют до достижения рН промывных вод»» 5-7 (контроль по универсальному индикатору). Отфильтрованный уголь сушат в сушильном шкафу при 115°С в течение 12 ч. 2.3.6. Приготовление экстрагирующего раствора. В стакане вместимостью 500 см3 помещают 40 см3 концентрированной уксусной кислоты и осторожно, малыми порциями вносят 15 г фосфорного ангидрида. Новую порцию фосфорного ангидрида вносят только после растворения предыдущей. Затем осторожно, небольшими порциями при энергичном перемешивании добавляют 200 см3 дистиллированной воды, переносят в мерную колбу вместимостью 500 см3 и доводят объем дистиллированной водой до метки. Полученный экстрагирующий раствор можно хранить в бутыли с притертой пробкой в течение недели в бытовом холодильнике. 2.3.7. Приготовление растворов аскорбиновой кислоты с массовой концентрацией 1 и 0,05 мг/см3. В мерной колбе вместимостью 100 см3 растворяют 0,1000 г аскорбиновой кислоты в экстрагирующем растворе и затем доводят те» же раствором до метки. Концентрация полученного раствора равна 1 мг/см3. Срок хранения раствора в бытовом холодильнике - не более 3 дней. С помощью пипетки отбирают 5 см3 полученного раствора в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят экстрагирующим раствором до метки. Концентрация раствора 0,05 мг/см3. Раствор неустойчив и должен быть приготовлен непосредственно перед проведением анализа. 3. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ При выполнении измерений необходимо соблюдать требования, техники безопасности (ТБ) при работе с

химическими реактивами по ГОСТ 12.1.018-86 и ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79, а также требования, изложенные в технической документации на анализатор "Флюорат-02М 4. УСЛОВИЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗМЕРЕНИЙ При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия: температура воздуха 20+10 C атмосферное давление 84,0-106,7 кПа (630-800 мм рт.ст.);. влажность воздуха не более 80% при температуре 25°С; напряжение в сети 220+10 В 5. ПОДГОТОВКА К ВЫПОЛНЕНИЮ ИЗМЕРЕНИЙ. 5.1 Отбор проб Навеска исследуемого продукта отбирается из средней пробы, подготовленной в соответствии с действующими НТД на конкретный вид продукции. Для расчета ориентировочной величины навески продукта можно использовать формулу: М= 0,05 * V2/CН;

(г)

где М - навеска продукта, г ; V2 - общий объем получаемого экстракта, см3 (обычно 50 см3); СН - нормативное или предполагаемое содержание витамина С в продукте, мг/г. Для печени величина навески составляет 1.5 г, для мяса 25 - 30 г, для молока 35-40 см3, капусты белокочанной - 1 г, лука репчатого -10 - 15 г, лука зеленого - 2 г, картофеля молодого 2 г, картофеля лежалого - 5 г, перца зеленого - 1 г, лимонов - 0.5 г, яблок - 1.5 г, томатов - 1.5 г, смородины черной - 2.5 г. Желательно проанализировать не менее двух параллельных проб.

5.2. Приготовление экстракта из испытуемой пробы. Навеску продукта помещают в фарфоровый стакан с 25 мл экстрагирующего раствора и гомогенизируют. Полученный гомогенат включая мякоть, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3 (объем колбы - это величина V2 в формуле для расчета величины навески в п.5.1). Доводят содержимое колбы до метки экстрагирующим раствором, перемешивают и фильтруют через складчатый фильтр. При анализе сухих продуктов гомогенат после измельчения настаивают 15-26 мин. 5.3. Обработка экстракта активированным углём. В стакан вместимостью 100 см3 вносят 25 см3 испытуемого экстракта, в другой стакан - 25 см3 раствора АК с концентрацией. 0,05 мг/см3. Добавляют в каждый стакан по 1 г активированного угля, тщательно перемешивают растворы в каждом стакане и оставляют на 5 мин. Фильтруют через сухие фильтры "красная лента", отбрасывая первые порции фильтрата. 5.4. Приготовление анализируемого и градуировочного растворов В две пробирки помещают по 5 см3 раствора ацетата натрия, затем в одну из них прибавляют 5 см3 анализируемого фильтрата (далее раствор № 1), в другую - 5 см3 фильтрата градуировочного раствора АК (далее раствор № 2), полученных после обработки углем. Одновременно в две другие пробирки вносят по 5 см3 раствора смеси борной кислоты и ацетата натрия. В одну из колб добавляют 5 cм3 фильтрата анализируемой пробы (далее раствор №. 3), а в другую 5 см3 фильтрата градуировочного раствора (далее раствор № 4)-, полученных после обработки углём. Смеси во всех пробирках перемешивают и выдерживают 15 мин, периодически взбалтывая. 5.5.Проведение реакций с ОФДА В каждую из пробирок (№№ 1,2,3,4) добавляют по 5

см3 раствора ОФДА и тщательно Выдерживают пробирки в темноте 35 мин.

перемешивают.

6. ИЗМЕРЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ВИТАМИНА С НА ПРИБОРЕ "ФЛЮОРАТ-02" Устанавливают в канале возбуждения светофильтр С-1, а в канале регистрации - светофильтр С-2. Помещают в кюветное отделение кювету заполненную раствором № I. Нажимают клавишу "Ф"; Полученное значение Ф заносят в рабочий журнал. Повторяют операцию измерения с растворами №№ 2, 3 и 4. Значения сигналов Ф2, Ф3 и Ф4 также заносят в рабочий журнал. 7. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ Концентрация витамина С в анализируемом экстракте определяется по следующей формуле:

СИЗМ = ССТ.(Ф1 –Ф3)/(Ф2-Ф4), где ССТ - концентрация витамина С в градуировочном растворе, СИЗМ - концентрация витамина С в анализируемом экстракте, мг/см3. Массовую долю витамина С в пробе (X, мг/г) вычисляют по формуле: X = Сизм* V/m где V - объем экстрагирующего раствора, см3; m - величина навески, г. 4.3. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА В1 (ТИАМИНА) 1. СУЩНОСТЬ МЕТОДА Сущность метода основана на кислотном и ферментаривном гидролизе связанных форм витамина,

окислении тиамина в тиохром и измерении интенсивности флюорисценции при длинах волн 320 – 390 нм возбуждающего и 400 – 580 нм излучаемого света. 2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ Весы лабораторные 1 класса точности по ГОСТ 24104-80 рН – метр лабораторный Термостат с температурой 370С Анализатор жидкости "Флюорат-02-2М" ТУ 4321-20506233-94 Электрошкаф сушильный с температурой 1000С Баня водяная Воронки делительные стеклянные Воронки лабораторные стеклянные Колбы мерные лабораторные стеклянные вместимостью 100, 250, 1000 см3 по ГОСТ 1770-74 Бумага индикаторная универсальная Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026-76 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72 Калий железосинеродистый по ГОСТ 4206-75, раствор с массовой долей 1%. Хранят в темной склянке в течение двух дней. Кислота соляная по ГОСТ 3118-77, растворы с молярной концентрацией (НСl) – 0,1 моль/дм3и объемной долей 50% Кислота уксусная по ГОСТ 61-75, ледяная и раствор с массовой долей 3% Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, растворы с массовой долей 10 и 30 % Натрий уксуснокислый 3-водный по ГОСТ 199-78, насыщенный раствор Препарат ферментный амилоризин П10Х по ГОСТ 18919-73 Спирт изобутиловый по ГОСТ 6016-77 (или н-бутиловый, изоамиловый). Перед использованием измеряют интенсивность флюоресценции. Пари наличии флюоресценции спаирт очищают перегонкой. Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67

Тиамина хлорид (или тиамина бромид), растворы с массовыми концентрациями 0,1; 0,001; 0,0001 г/дм3 Фермент пепсин. 3.ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ 3.1. Приготовление стандартного раствора тиамина Раствор готовят из тиамина следующим образом: тиамин предварительно высушивают в течение 2 ч в сушильном шкафу при1000С. Раствор с массовом концентрацией 0,1 г/дм3 хранят и темной склянке в холодильнике в течение месяца. Растворы с массовыми концентрациями 0,01 и 0,0001 г/л готовят в день проведения анализов. Для приготовления раствора с массовой концентрацией 0,1 г/дм3растворяют 0,100 г тиамина в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 1000 см3, прибавляют 10 капель концентрированной соляной кислоты, доводят до метки водой и перемешивают. Для приготовления раствора тиамина с массовой концентрацией 0,001 г/дм3 1,0 см3 раствора с концентрацией 0,1 г/дм3 отбирают и мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Для приготовления раствора тиамина с массовой концентрацией 0,0001 г/дм3 10,0 см3 раствора с концентрацией 0,001 г/дм3 отбирают в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. 3.2. Приготовление окислительной смеси. Окислительную смесь готовят смешиванием 2,0 см3 раствора железосинеродистого калия с 10,0 см3 раствора гидроокиси натрия с массовой долей 30%. 3.3. Приготовление гидролизата Навеску пробы массой 50,0 г — для консервированного продукта без добавления витаминов, 20,0 г — с добавлением витаминов переносят в мерную колбу вместимостью 250 см3, прибавляют 150 см3 раствора соляной кислоты с (НСl) =0,1

моль/дм3 и нагревают па кипящей водяной бане в течение 40 мин. Затем охлаждают до комнатной температуры и проводят ферментативный пиролиз. При анализе фруктовых и ягодных консервов с большим содержанием пектиновых веществ (из яблок, крыжовника, черной смородины и др.) используют ферментный препарат амнлоризин П10Х и пектаваморин П10Х. В остальных случаях используют только амилоризин П10Х. Предварительно устанавливают величину рН 4,2—4,5. Для этого содержимое колбы помещают в стакан вместимостью 200 см3, прибавляют при постоянном перемешивании раствор уксуснокислого натрия до нужной величины рН. Измерение величины рН производят рНметром, после этого содержимое стакана переносят в ту же колбу вместимостью 250 см3. Затем прибавляют 0,10 г амилоризина П10Х, или по 0,10 г амнлоризина П10Х и пектаваморина П10Х перемешивают, закрывают пробкой и выдерживают в термостате при 37°С в течение 12 — 16 ч. Гидролизат охлаждают до комнатной температуры, доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и фильтруют. Овощные консервы с мясом обрабатывают ферментами пепсин и амилоризином П10Х. Для этого в колбу помещают 0,10 г пепсина и выдерживают в термостате при 37°С в течение 4 ч. Затем устанавливают величину рН 4,2—4,5, прибавляют 0,10 г амнлоризина П10Х, перемешивают и снова выдерживают в термостате при той же температуревb течение 12—16 ч. После этого гндролизат охлаждают, доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и фильтруют. 4. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА 4.1. Окисление тиамина в тиохром В две делительные воронки помещают по 5,0 см3

гидролизата пробы. В две другие— по 5,0 см3 стандартного раствора тиамина. Затем в две воронки (с пробой и со стандартным раствором) прибавляют по 1,20 см3 окислительной смеси (окисленная форма), в две другие (с теми же растворами) — по 1,20 см3 раствора гидроокиси натрия с массовой долей 30% (неокисленная форма). Содержимое воронок перемешивают, прибавляют по 10,0 см3 изобутилового спирта и встряхивают в течение 1 мин. Для ускорения расслаивания после взбалтывания прибавляют по 0,50 см3 этилового спирта. После расслоения жидкостей нижний водный слой удаляют, а верхний органический слой сливают в кювету для измерения интенсивности флуоресценции. Измеряют сначала интенсивность флуоресценции стандартных растворов (окисленная и неокисленная форма), затем анализируемых проб. 5. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ Массовую долю витамина В1 (X1) в процентах вычисляют по формуле (C − C1 ) ⋅ a ⋅ K ⋅ V ⋅ 100 X1 = ( Д − Д 1 ) ⋅ V1 ⋅ m где С—интенсивность флуоресценции окисленном формы анализируемого раствора; С1 — интенсивность флуоресценции неокисленноп формы анализируемого раствора; Д — интенсивность флуоресценции окисленной формы стандартного раствора; Д1 — интенсивность флуоресценции неокисленной формы стандартного раствора; а—масса тиамина в 5 см3 стандартного раствора, взятая для окисления, г; К—.коэффициент пересчета тиамина бромида на тиамина .хлорид, при использовании для приготовления стандартного раствора тиамина хлорида К=1; тиамина бромида =1,17;

V — общин объем гидролизата, см3; V1 —объем элюата, взятый для окисления, см3; m — масса навески продукта, г. За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определении с доверительной вероятностью 0,95, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать: 0,004*10-3 % абс. — при массовой доле витамина В1 нe более 0,050* 10-3%; 0,060*10-3 % абс. — при массовой доле витамина B1 более 0,050*10-3%4.4 РИБОФЛАВИНОВЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА В2 1. СУЩНОСТЬ МЕТОДА Сущность метода основана на кислотном и ферментативном гидролизе связанных форм витамина, окислении пигментов марганцовокислым калием, восстановлении рибофлавина гидросульфитом натрия и измерении интенсивности флуоресценции до и после – восстановления при длинах, волн 360—480 нм возбуждающего и 510—650 нм излучаемого света. Метод предназначен для анализа слабоокрашенных овощных, фруктовых и ягодных консервированных продуктов. 2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ Для проведения анализа применяют аппаратуру, материалы и реактивы, указанные в п. 2 (метод определения витамина В1) со следующими дополнениями: Эксикатор вакуумный по ГОСТ 25336—82. Колбы лабораторные стеклянные по ГОСТ 25336—82, вместимостью 50 см3. Водорода перекись по ГОСТ 10929—76, раствор с массовой долей 3 %. Калий марганцовокислый по ГОСТ 20190—75, раствор с

массовой долей 3 %- Срок хранения семь дней. Кислота серная по ГОСТ 4204—77, раствор с массовой долей 93,6-95,0 %. Натрия гидросульфит технический по ГОСТ 246—76. Рибофлавин, растворы с массовыми концентрациями 0,02 и 0,001 г/дм3. 3. ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ 3.1. Приготовление, стандартного раствора рибофлавина Раствор готовят из рибофлавина следующим образом: предварительно высушивают рибофлавин в вакуумэксикаторе над концентрированной серной кислотой. Раствор с концентрацией 0,02 г/дм3 хранят в холодильнике в течение месяца. Раствор с концентрацией 0,001 г/дм3 готовят и день проведения анализа. Для приготовления стандартного раствора 3 рибофлавина с массовой концентрацией 0,02 г/дм в мерную колбу вместимостью 1000 см3 помешают 0,020 г рибофлавина, прибавляют около 750 см3 дистиллированной воды, 1,0 см3 ледяной уксусной кислоты и слегка нагревают при перемешивании до растворения. Затем раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят до метки дистиллированной водой и снова перемешивают. Для приготовления раствора рибофлавина с массовой концентрацией 0,001 г/дм3 отбирают 5,0 см3 раствора с массовой концентрацией 0,02 г/дм3 в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. 3.2. Приготовление гидролизата Приготовление гидролизата проводят по п 3,3.(определение витамина В1), с дополнением, указанным ниже. Для определения поправки на содержание витамина В2 в ферментах одновременно проводят контрольный опыт. В

мерную колбу вместимостью 250 см3 помещают 150 см3 раствора соляной кислоты с (НСl) = 0,1 моль/дм3, устанавливают с помощью раствора уксуснокислого натрия величину рН 4,2—4,5. Прибавляют 0,10 г "амнлоризина П10Х или по 0,10 г амилоризина П10Х и пектаваморина П10Х и выдерживают в термостате при 37°С в течение 12— 16 ч. Контрольный опыт проводят одни раз для каждой партии ферментов. 4. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА 4.1. В две колбы вместимостью 50 см3 каждая помешают по 10,0 см3 гидролизата пробы, в третью колбу — 10,0 см3 гпдролизата контрольного опыта. В одну колбу с анализируемым гпдролизатом прибавляют 1,0 см3 стандартного раствора рибофлавина с массовой долей концентрацией 0,001 г/дм3, в две другие — по 1,0 см3 дистиллированной воды. Во все колбы прибавляют по 1,0 см3 раствора ледяной уксусной кислоты, 0,50 см3 марганцовокислого калия, перемешивают и выдерживают 2 мин. Затем прибавляют по 0,50 см3 раствора перекиси водорода и снова перемешивают. Через 5 мин измеряют интенсивность флуоресценции сначала раствора с добавкой рибофлавина, затем раствора без добавки и контрольного опыта. Измерение интенсивности флуоресценции каждого раствора производят сначала без прибавления гидросульфита натрия, затем после его прибавления. Гидросульфит •натрия прибавляют порциями по 0,02—0,05 г, быстро перемешивают и снова производят измерение. Эту операцию повторяют до установления наименьшей интенсивности флуоресценции. 5. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ Массовую долю витамина В2 (Х2) в процентах, вычисляют по формуле: [( A − A1 ) − (C − C1 )] ⋅ b ⋅ V ⋅ 100 X2 = ; [( Д − Д1 ) − ( А − А1 )] ⋅ V1 ⋅ m где А — интенсивность флуоресценции раствора

анализируемой пробы до прибавления гидросульфита натрия; А1 — интенсивность флуоресценции раствора анализируемой пробы после прибавления гидросульфита натрия; С—интенсивность флуоресценции раствора контрольного опыта до прибавления гидросульфита натрия; С1—интенсивность флуоресценции раствора контрольного опыта после прибавления гидросульфита натрия; Д — интенсивность флуоресценции раствора анализируемой пробы с добавкой рибофлавина до прибавления гидросульфита натрия; Д1 — интенсивность флуоресценции раствора анализируемой пробы с добавкой рибофлавина после прибавления гидросульфита натрия; b — масса рибофлавина в стандартном растворе рибофлавина, добавленная в гидролизат анализируемой пробы, г; . V— общий объем гидролизата, см3; V1—объем гидролизата, взятый для окисления, см3; m — масса навески продукта, г. За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений с доверительной вероятностью 0,95, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать : 0, 008*10-3 абс % при массовой доле витамина В2 не более 0,050 *10-3% ; 0,020*10-3 % абс. — при массовой доле витамина B1 более 0,050*10-3%.

Контрольные вопросы: 1. Перечислите существующие водорастворимые витамины и классифицируйте их по группам. 2. Объясните роль витаминов в обмене веществ. 3. Механизм действия витаминов. 4. Перечислите виды витаминной недостаточности, причины их вызывающие. 5. Какова суточная потребность водо- и жирорастворимых витаминов? 6. Объясните принцип метода определения витаминов группы В? 7. Какими методами определяют жирорастворимые витамины? 8. В чем состоит сущность определения жирорастворимых витаминов А и Е? 9. В чем особенность определения витамина С? 10. Какие факторы вызывают окисление витамина С?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Полимеразная цепная реакция 1. МЕТОДИКА ОБНАРУЖЕНИЯ ТРАНСГЕННОЙ ДНК В РАСТЕНИЯХ И ПРОДУКТАХ ИХ ПЕРЕРАБОТКИ Генетически модифицированные (трансгенные) растения привлекают к себе повышенный интерес не только как объекты исследования, но и в качестве новых сортов сельскохозяйственных культур, в том числе пищевой специализации. Обладая невероятной для природных организмов устойчивостью к гербицидам или сопротивляемостью при повреждении насекомымифитофагами, некоторые трансгенные растения, например, соя, кукуруза, сахарная свекла, томат уже сейчас широко распространены и в сельском хозяйстве, и на рынке пищевых продуктов. Одним из методов, позволяющих определять генетически модифицированные растения и продукты их переработки, является полимеразная цепная реакция (ПЦР), направленная на амплификацию одного или нескольких фрагментов трансгенной ДНК.

Определение CryIIIa - гена (устойчивости к насекомым) • Определение генов растительных белков: ƒ ген лектина сои LEC ƒ ген зеина кукурузы ZEX ƒ ген пататина картофеля РАТEX 2. Количественное определение ГМИ в образцах растительного происхождения при помощи ПЦР в реальном времени • выявление процентного отношения ГМ-ДНК к ДНК растительного компонента: ƒ Определение содержания трансгена СР4 по отношению к ДНК сои (линия 40-3-2) •

Принцип действия 1. Кчественное определение генно-инженерных вставок в ДНК растительного происхождения: • Определение 35S (E35S) промотора • Определение NOS терминатора • Определение СР4 - гена (гербицидоустойчивости) • Определение NPTII -гена (устойчивости к антибиотикам) • Определение CryIa - гена (устойчивости к насекомым)

Объекты исследования Методика обнаружения трансгенной ДНК предназначена для экспертного обследования растительного сырья (плодов, семян, клубней и пр.), а также продуктов их переработки, предназначенных для употребления в пищу человеком или в качестве корма

для сельскохозяйственных животных мясомолочной специализации. Количество образца исследуемого материала, необходимое для проведения одного анализа составляет 0,1 – 0,3 г (0,1 – 0,3 мл). Объем экстракта ДНК, полученного в ходе пробоподготовки из одного образца исследуемого материала, (50-100 мкл) позволяет при необходимости повторять проведение ПЦР с его использованием до 10 раз. Для подготовки проб необходимо использовать одноразовые полипропиленовые пробирки, ступки и пестики, предварительно обработанные хромовой смесью, и фламбированные инструменты - пинцеты, скальпели, ножницы. Пробы сухих гранулированных и сыпучих продуктов отбирают в ступку по 3 - 5 г и растирают пестиком до гомогенного состояния. Пробы плотных продуктов (сырых или подвергшихся кулинарной обработке) весом 3 - 5 г помещают в ступку, измельчают ножницами, затем растирают пестиком до гомогенного состояния. Пробы продуктов консистенции крахмала весом 100 - 300 мг помещают в одноразовые пластиковые пробирки и добавляют 1,0 см3 физиологического раствора. Для анализа необходимо 50 150 мм3 образца. Пробы жидкой консистенции отбирают автоматическими микродозаторами с одноразовыми наконечниками в одноразовые пробирки из полипропилена. Для анализа необходимо 50 -150 мкл образца. Из полученных гомогенатов и суспензий проводят выделение ДНК.

Чтобы исключить ложноположительные результаты анализа и неправильную интерпретацию полученных данных, а также предотвратить неконтролируемое распространение трансгенных растений, продуктов их переработки, генетически модифицированной ДНК и ее амплифицированных фрагментов, при работе в лаборатории должны безусловно соблюдаться следующие требования.

Меры предосторожности

♦ Каждое помещение ПЦР-лаборатории должно иметь свой набор реагентов, автоматических пипеток, наконечников к ним, пластиковой и

♦ Лаборатория должна быть разделена на зоны и/или комнаты, предназначенные для каждой стадии ПЦР-исследования. В целом следует иметь не менее трех несмежных комнат: ¾ Помещение для пробоподготовки. Предназначено для выделения ДНК из биологического материала. ¾ ПЦР-помещение. Предназначено для проведения ПЦР (приготовление реакционной смеси, амплификация) и должно быть оснащено ламинарным шкафом или ПЦР-боксом, создающим стерильную рабочую зону, а так же всем необходимым оборудованием для проведения ПЦР. По возможности данное помещение необходимо располагать как можно дальше от других, чтобы полностью исключить движение воздушных потоков из помещения для пробоподготовки и постПЦР-помещения. В ПЦР-помещении запрещается проводить все другие виды работ с образцами ДНК, растительным материалом или микробиологические исследования. ¾ Пост-ПЦР-помещение. Предназначено для детекции продуктов ПЦР.

стеклянной посуды, халатов, перчаток и соответствующего лабораторного оборудования, используемых только в данном помещении и не выносящихся за его пределы. Кроме того, желательно привлекать отдельных сотрудников для работы во всех помещениях ПЦР-лаборатории. ♦ Следует однократно использовать перчатки на всех стадиях исследований, связанных с использованием ПЦР: работа с коллекциями растительного материала, пробоподготовка, проведение ПЦР и детекция продуктов ПЦР. ♦ Необходимо однократно использовать пробирки и наконечники для автоматических пипеток. Обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой, с целью предотвращения перекрестной контаминации в процессе выделения ДНК, приготовления реакционной смеси для ПЦР и детекции продуктов ПЦР. В этой связи рекомендуется использовать также наконечники с аэрозольным фильтром, особенно, для внесения образцов ДНК в реакционную смесь. ♦ Одноразовые наконечники для автоматических пипеток, пробирки и другие загрязненные ДНК материалы немедленно после их использования необходимо обработать реагентами, вызывающими разрушение ДНК (1М соляная кислота, 10% гипохлорит натрия или 10% хлорная известь). ♦ Необходимо строго соблюдать условия хранения всех реагентов и образцов ДНК, оговоренные в соответствующей документации (техническое описание к набору реагентов). Образцы ДНК должны храниться отдельно от реагентов. Запрещается использовать

реагенты с просроченным сроком годности или хранившиеся в неподходящих условиях. ♦ Реакционную смесь для проведения ПЦР необходимо готовить в ПЦР-боксе, снабженном ультрафиолетовыми лампами. ♦ Для термостатирования пробирок при выделении ДНК из биологического материала не следует использовать водяные бани, т.к. заполняющая их вода, просачиваясь в недостаточно плотно закрытые пробирки, может стать источником загрязнения исследуемых образцов посторонней ДНК. Необходимо использовать термостаты и охладители проб с твердотельным термоблоком. ♦ Необходимо постоянно поддерживать чистоту на рабочем месте. Во всех помещениях ПЦРлаборатории до начала работы должна регулярно проводиться влажная уборка. Рабочие поверхности стола, ламинарного шкафа, ПЦР-бокса перед началом и по окончании работ должны быть продезинфицированы и обработаны соответствующими реагентами или ультрафиолетовым излучением, обеспечивающими полное разрушение ДНК, для предотвращения её попадания в коллекционные образцы ДНК и реакционную смесь для ПЦР. ♦ Персонал, работающий в ПЦР-лаборатории, должен пройти соответствующее обучение. Вся методическая литература и техническая документация на реагенты и комплект оборудования для ПЦР-исследований, должна быть строго систематизирована, и постоянно храниться в одном, общедоступном месте.

Ссылка: Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных методом полимеразной цепной реакции / Под ред. А.А. Гусева, А.Н. Панина. Владимир: ОКНИИиМС ВНИИЗЖ, 1998. 519 с.

Требования к квалификации персонала К проведению анализа допускаются лица, имеющие высшее или высшее специальное образование, и прошедшие специальную стажировку в молекулярно-биологической лаборатории. Оборудование, реактивы, расходные материалы

Микрогомогенизатор Поттера (под пробирки типа Эппендорф) Штативы для пробирок типа Эппендорф до 1,5 мл и до 0,5 мл Контейнеры для сброса наконечников и использованных пробирок Реактивы Набор реагентов для обнаружения трансгенной ДНК из генетически модифицированных источников с помощью полимеразной цепной реакции «35S ПЦР ядро», рассчитанный на проведение 100 реакций. Все компоненты набора (если это специально не указано) хранятся при темературе +4ºС.

Оборудование

В комплект набора входят:

УФ бокс для ПЦР Программируемый термостат (амплификатор) «Терцик» Твердотельный микротермостат М-206 Охладитель проб SC-2D Высокоскоростная микроцентрифуга "Eppendorf"(до 12 тыс. об./мин) Прибор для горизонтального электрофореза ЕС 13-12 Источник питания ИП 2 с фиксированным напряжением “Эльф-2» Камера для электрофореза НИП 300 СВЧ-печь для плавки агарозы Пипетки автоматические одноканальные переменного объема «КОЛОР» (5-40 мкл, 40-200 мкл, 200-1000 мкл) Насос с колбой-ловушкой Цилиндры мерные до 500 мл и до 1000 мл

1. Реагенты для пробоподготовки: 1.1. Буфер ЛБ, готов к применению – 1 флакон, 35 мл 1.2. Буфер ОБ 1, концентрат – 2 флакона по 13,5 мл 1.3. Буфер ОБ 2, концентрат – 2 флакона по 13,5 мл 1.4. Буфер ТЕ, готов к применению – 1 флакон, 4 мл 1.5. Сорбент, готов к применению – 1 пробирка, 2 мл 2. Реагенты для проведения ПЦР: 2.1. Пробирки “ПЦР ядро” (пробирки с сухим содержимым синего цвета) - 100 шт. 2.1. PCR diluent (ПЦР растворитель) - 1 пробирка, 1000 мкл 2.3. Смесь праймеров* – 1 пробирка, 500 мкл 2.4. Положительный контроль* – 1 пробирка, 50 мкл (для проведения 10 реакций) 2.5. PCR Oil (Масло минеральное) – 1 флакон, 2 мл

*хранить при температуре –20ºС, использовании – при температуре +4°С.

при

ежедневном

3. Реагенты для детекции продуктов ПЦР: 3.1. Буфер для электрофореза (Сухая смесь для приготовления трис-боратного буферного раствора) – 1 пакет 3.1. Агароза – 2 пакета 3.2. Бромистый этидий, готов к применению – 1 пробирка, 30 мкл Расходные материалы Наконечники для автоматических пипеток до 200 мкл и до 1000 мкл в штативах Пробирки типа Эппендорф до 1,5 мл с крышкой Перчатки латексные однократного использования Вода бидистиллированная Вода дистиллированная Спирт этиловый 96%-ный Дезрастворы Протокол проведения анализа 1.1.Пробоподготовка 1. Приготовление рабочих буферных растворов ОБ. К содержимому флаконов с концентратами буферов ОБ 1 и ОБ 2 прибавить по 40 мл 96%-ного этилового спирта (этиловый спирт в набор не входит) и перемешать путем переворачивания плотно закрытого флакона 5-6 раз. 2. В пробирку типа Эппендорф до 1,5 мл внести ~0,1 г (100150 мкл по сухому насыпному объему) исследуемой пробы. Если выделение ДНК производится из грубодисперсного материала (семена растений, сухие не

порошковые полуфабрикаты), пробу необходимо предварительно измельчить ножницами или с помощью гомогенизатора Поттера. При выделении ДНК из живых растительных тканей (листья, клубни, плоды) рекомендуется выбирать неповрежденные богатые ДНК участки: у клубней и листьев – кожура с верхним слоем мякоти, у зеленых растений – молодая листовая пластинка. 3. В эту же пробирку добавить 350 мкл буфера ЛБ и гомогенизировать пробу, используя гомогенизатор Поттера под пробирки типа Эппендорф, до однородного состояния. 4. Пробирку с полученным гомогенатом термостатировать при 65˚С в течение 40 мин. 5. Извлечь пробирку из термостата, встряхнуть содержимое на вортексе и поместить в центрифугу ТЕТА-10, центрифугировать 5 мин при 10 тыс. об./мин. По окончании центрифугирования, прозрачную надосадочную жидкость полностью отобрать с помощью автоматической пипетки и перенести в чистую пробирку типа Эппендорф до 1,5 мл, используя при этом одноразовые наконечники. NB! В случае, когда содержимое пробирки с гомогенатом затвердело после инкубации в термостате (например, если выделение ДНК производилось из муки или др. высококрахмалистых продуктов), в эту же пробирку необходимо прибавить еще 350 мкл буфера ЛБ, содержимое перемешать на вортексе, и поместить пробирку в охладитель проб (+4ºС) или

холодильник на 15-20 мин. После этого проделать операции по п. 5.

13. Повторить операции, приведенные в пунктах 10 12.

6. В пробирку с прозрачной надосадочной жидкостью добавить 40 мкл суспензии сорбента (перед использованием сорбента, пробирку, в которой он находится, следует интенсивно встряхивать на вортексе до исчезновения несуспендированного осадка).

14. К осадку прибавить 500 мкл буфера ОБ 2, содержимое пробирки встряхивать на вортексе до полного суспендирования осадка.

7. Содержимое пробирки с пробой перемешивать переворачиванием в течение 5-7 мин. Для удобства проведения этой операции рекомендуется использовать ротатор, переворачивающий пробирки со скоростью 20-30 об./мин 8. Поместить пробы в микроцентрифугу ТЕТА-2 и центрифугировать 15 сек на максимальных оборотах (2 тыс. обор./мин). 9. Надосадочную жидкость полностью удалить при помощи насоса с колбой-ловушкой или автоматической пипетки, не задевая при этом осадка.

15. Поместить пробы в микроцентрифугу ТЕТА-2 и центрифугировать 15 сек на максимальных оборотах (2 тыс. обор./мин). Надосадочную жидкость полностью удалить при помощи насоса с колбой-ловушкой или автоматической пипетки, не задевая при этом осадка. 16. Открытую пробирку поместить в термостат и просушить осадок в ней при 65˚С в течение 10 мин. 17. К высушенному осадку добавить 100 мкл буфера ТЕ, если пробоподготовка производится из материала, богатого ДНК (растения, семена, мука), и 50 мкл буфера ТЕ , если из продуктов переработки растений (полуфабрикаты и готовые к употреблению продукты). Пробирку закрыть.

10. К осадку прибавить 500 мкл буфера ОБ 1, содержимое пробирки встряхивать на вортексе до полного суспендирования осадка.

18. Встряхивать содержимое пробирки на вортексе 5-10 сек до полного суспендирования осадка.

11. Поместить пробы в микроцентрифугу ТЕТА-2 и центрифугировать 15 сек на максимальных оборотах (2 тыс. обор./мин).

19. Термостатировать пробирку при 65˚С в течение 10 мин. По окончании термостатирования содержимое пробирки еще раз встряхнуть на вортексе.

12. Надосадочную жидкость полностью удалить при помощи насоса с колбой-ловушкой или автоматической пипетки, не задевая при этом осадка.

20. Поместить пробирку в центрифугу ТЕТА-10 и центрифугировать 2 мин при 10 тыс. об./мин.

21. Надосадочную жидкость (экстракт ДНК) целиком перенести в чистую пробирку. Хранить полученный экстракт ДНК при температуре -20˚С, при частом использовании – при температуре +4ºС. NB! Надосадочная жидкость используется в качестве пробы ДНК для проведения ПЦР. Избегайте попадания в нее сорбента. 1.2. Пробоподготовка На примере метода, разработанного с использованием наборов TaqMan для анализа сои ("TaqMan GMO Soy Detection Kit") и кукурузы ("TaqMan GMO Maize Detection Kit"): Метод выделения ДНК с помощью СТАБ (гексадецилтриметиламмониум бромид).

Растворяют 7,0 г NaCl в 100 см3 деионизированной воды, перемешивают. Хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года. Приготовленные растворы автоклавируют при 1 атм., 121 °С 15 - 20 мин. или фильтруют через мембраны Millipore 0,4 мм • 70%-ный раствор этилового ректификованного спирта. Смешивают 70 см3 96%-ного этилового ректификованного спирта с 26 см3 деионизированной воды. Хранить при температуре от 4 до 5 °С не более 2 мес. в темной склянке.

Приготовление растворов • СТАБ-буфер. В мерную колбу вносят 4 г СТАБ; 16,4 г NaCl; 3,15 г ТРИС - НС1; 1,5 г Na2ЭДTA, добавляют 100 мл деионизированной воды, доводят рН раствора до 8,0 1 М NaOH, доводят объем деионизированной водой до 200 см3. Хранить при 4 °С не более 6 месяцев. Перед использованием раствор выдерживают при комнатной температуре или подогревают в термостате при температуре 65 °С до полного растворения осадка. Непосредственно перед использованием в приготовленный лизирующий буфер вносят 2-меркаптоэтанол из расчета 4 мм3 на 1 см3 лизирующего буфера и перемешивают. • СТАБ-осаждающий раствор. В мерную колбу вносят 1 г СТАБ; 0,5 г NaCl, добавляют 100 3 см деионизированной воды, доводят рН раствора до 8,0 1 М NaOH, доводят объем деионизированной водой до 200 см3. Хранить при 4 °С не более 6 месяцев. • 1,2 М NaCl.

Процедура выделения ДНК . Навеску исследуемого гомогенизированного продукта массой 100 мг помещают в микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф на 1,5 см3. . Добавляют 300 мм3 деионизированной воды, перемешивают шпателем. • Добавляют 500 мм3 СТАБ-буфера с меркаптоэтанолом, тщательно перемешивают шпателем. . Инкубируют при 65 °С 90 мин. .Центрифугируют 10 мин. на настольной микроцентрифуге типа Эппендорф при частоте вращения 13000 об.мин. • Переносят 500 мм3 супернатанта в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 см3. . Добавляют 500 мм3 хлороформа, перемешивают на аппарате для встряхивания типа "Вортекс" 30 с. . Центрифугируют 10 мин. при частоте вращения

13000 об.мин. . Переносят 500 мм3 верхней фракции в чистую пробирку, добавляют 500 мм хлороформа, перемешивают. . Центрифугируют 5 мин. при частоте вращения 13000 об.мин. • Переносят верхнюю фракцию в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 см3, не захватывая слой хлороформа. . Добавляют 2 объема СТАБ-осаждающего буфера, перемешивают пипетированием. . Инкубируют 60 мин. при комнатной температуре. . Центрифугируют 5 мин. при частоте вращения 13000 об.мин. . Удаляют супернатант. . Растворяют осадок в 350 мм3 NaCl (1,2 М). . Добавляют 350 мм3 хлороформа, перемешивают на аппарате для встряхивания типа "Вортекс" 30 с. • Центрифугируют 10 мин. при частоте вращения 13000 об.мин. • Переносят верхнюю фракцию в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 см3. • Добавляют 0,6 объема изопропилового спирта, перемешивают. . Центрифугируют 10 мин. при частоте вращения 13000 обУмин. . Удаляют супернатант. . Добавляют 500 мм3 70%-ного раствора этилового спирта и перемешивают на аппарате для встряхивания типа "Вортекс". . Центрифугируют 10 мин. при частоте вращения 13000 об.мин. . Удаляют супернатант. .Подсушивают осадок не более 5 мин. при 65 °С для удаления капель спирта. . Растворяют осадок в 100 мм3 деионизированной воды, осторожно встряхивая.

. Полученный раствор ДНК готов для проведения ПЦР, хранить при минус 20 °С. 2. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) 1. Перед началом работы продизенфицировать УФбокс для ПЦР или ламинарный шкаф, включив ультрафиолетовые лампы и вытяжку в нем на 15-20 мин. Все оборудование и расходные материалы, предназначенные непосредственно для ПЦР (амплификатор, микроцентрифуга-вортекс, комплект микродозаторов, штатив с наконечниками, штатив для пробирок до 0,5 мл) должны постоянно находиться в УФ-боксе, и ни в коем случае не использоваться для других целей помимо приготовления ПЦР смеси и проведения амплификации. 2. Извлечь из пакета необходимое количество пробирок “ПЦР ядро” по числу анализируемых проб, плюс положительный и отрицательный контроли и разместить их в штативе. 3. Добавить в пробирки “ПЦР ядро” по 10 мкл ПЦР растворителя и по 5 мкл Смеси праймеров. Дождаться, пока полностью растворится сухое содержимое пробирок “ПЦР ядро”, обычно для этого требуется 5-10 мин. Содержимое пробирок перемешать путем легкого встряхивания до равномерного окрашивания жидкости в синий цвет. 4. Добавить в пробирки “ПЦР ядро” с ПЦР смесью по… 4.1. …5 мкл пробы ДНК каждого из исследуемых образцов. При переходе от пробы к пробе

4.2.

4.3.

наконечники автоматической пипетки необходимо использовать однократно! Все используемые пробирки пометить цифровым или буквенным обозначением, расшифровка которых должна быть точно приведена в журнале. В одну из пробирок “ПЦР ядро” с ПЦР смесью чистым наконечником внести 5 мкл буфера ТЕ (отрицательный контроль, К-). В последнюю очередь (!!!), еще в одну пробиру с ПЦР смесью чистым наконечником внести 5 мкл Положительного контроля (К+).

4.4.

Содержимое всех пробирок аккуратно перемешать (достаточно несколько раз пипетировать их содержимое при внесении раствора ДНК) NB! При добавлении растворов ДНК, положительного и отрицательного контролей настоятельно рекомендуется пользоваться наконечниками с противоаэрозольными фильтрами для предотвращения перекрестной контаминации проб и загрязнения их положительным контролем. По этой же причине хранить положительный контроль, пробы ДНК и праймеры рекомендуется отдельно друг от друга. 5. Во все используемые пробирки добавить по 20-25 мкл минерального масла и центрифугировать пробирки 5-7 сек при 2 тыс. об./мин. При этом отдельные капли ПЦР смеси, оказавшиеся при ее перемешивании на стенках и крышке пробирки, должны быть сброшены на дно. Сверху должно быть наслоено минеральное масло. 6. Пробирки с ПЦР смесью поместить в амплификатор и запустить программу амплификации (контроль за

температурой должен осуществляться в режиме Tube или Sim): 94°С 3 мин; 35 циклов, включающих 94°С 45 сек, 72°С 1 мин 10 сек; 72°С 4 мин. 7. Извлечь пробирки из амплификатора, поместить в штатив и перенести в комнату для детекции продуктов ПЦР. 3. Детекция продуктов ПЦР 1. Приготовление рабочего раствора буфера для электрофореза. Содержимое пакета с надписью «Буфер для электрофореза» растворить в 200-300 мл дистиллированной воды, добавить 10 мкл Бромистого этидия и довести объем полученного раствора до 1 л дистиллированной водой. Готовый раствор Буфера для электрофореза хранится до 1 года при +4˚С или 3 месяца при комнатной температуре. 2. Подготовить к работе прибор для горизонтального электрофореза в соответствии с прилагаемым к нему техническим описанием: 2.1. Разместить прибор на столе, с помощью регулируемых по высоте ножек прибора и ориентируясь по уровням, установить прибор в фиксированное, строго горизонтальное положение. 2.2. Собрать столик для заливки геля. В плашку установить 1-2-3 гребенки в зависимости от количества анализируемых проб так, чтобы

расстояние между зубцами соседних гребенок и одним из краев плашки составляло не меньше 2 см. 3. Приготовление агарозного геля. 3.1.Содержимое одного из пакетов с надписью «Агароза» перенести в стеклянную колбу объемом не менее, чем 200 мл, прибавить 150 мл готового раствора Буфера для электрофореза. 3.2.Суспензию агарозы в колбе довести до кипения на электроплитке или в микроволновой печи и, периодически помешивая, продолжать нагревать до совершенно прозрачного состояния (обычно 1-2 мин). 3.3.Расплав охладить при комнатной температуре до 55-60˚С, а затем налить в плашку для геля от прибора для электрофореза, не допуская образования воздушных пузырьков, так, чтобы толщина слоя расплава была не менее 4 мм, а зубцы гребенок были погружены в него не менее, чем на 2 мм. Дать агарозе полностью застыть, обычно для этого требуется 15-20 мин. 4. Извлечь гребенки из агарозного геля (осторожно, легким и плавным движением вверх, стараясь не повредить образовавшиеся карманы). Разобрать столик для заливки и плашку с готовым агарозным гелем перенести в электрофорезную камеру прибора. 5. Залить в камеру готовый раствор Буфера для электрофореза так, чтобы жидкость покрывала гелевую пластину слоем 2-3 мм. 6. По окончании ПЦР 15 мкл окрашенной ПЦР смеси отобрать из-под слоя минерального масла и осторожно перенести в карман гелевой пластины. Рекомендуется в первую очередь наносить на электрофорез содержимое пробирки с отрицательным контролем, затем – исследуемые пробы в любой, но строго фиксированной

последовательности (порядок нанесения проб фиксируется в журнале), и в последнюю очередь, содержимое пробирки с положительным контролем. 7. Закрыть крышку прибора для электрофореза и подключить его к источнику постоянного напряжения, строго соблюдая полярность электродов, и помня, что электрофорез идет в направлении от катода к аноду (от «минуса» к «плюсу»). 8. Включить электропитание и установить рабочее напряжение равным 100 В. В таком режиме электрофорез будет продолжаться приблизительно 30-40 мин, при этом «краска» (красящий компонент ПЦР смеси синего цвета) должна «пробежать» в геле около 1 см. 9. По окончании электрофореза отключить источник напряжения, снять крышку с прибора для электрофореза. Агарозный гель извлечь из плашки и поместить в «кабинет» видеосистемы на фильтр трансиллюминатора. Произвести регистрацию полученных результатов в памяти компьютера. NB! Избегайте контакта геля и буфера с кожей. Используйте резиновые перчатки 4. Анализ полученных результатов В продуктах амплификации ДНК положительного контроля должна присутствовать одна яркая и четкая полоса. Размер ПЦР-продукта (специфический фрагмент), формирующего эту полосу на электрофореграмме, составляет 160 п.н.

В пробе с отрицательным контролем должна присутствовать одна слабо окрашенная и возможно не четкая полоса, наиболее подвижная в направлении от старта электрофореза. Размер ПЦР-продукта (неспецифический фрагмент), формирующего эту полосу на электрофореграмме, составляет около 50 п.н. Если в отрицательном контроле присутствует бóльшее число полос, результаты проведенного ПЦР-анализа следует считать недостоверными. Среди продуктов амплификации ДНК из анализируемых образцов необходимо выделить лишь те, размер которых в точности соответствует положительному и отрицательному контролям. Вероятное присутствие всех других полос полностью игнорируется. Образцы, в продуктах амплификации которых присутствует полоса 160 п.н. (как в положительном контроле), следует считать положительными. В противном случае – отрицательными. В случаях, когда в ходе анализа получен неоднозначный результат (слабая окраска, диффузное размывание полос и пр.) необходимо повторное проведение ПЦР с данным образцом, при этом для ПЦР используется 10 мкл полученного ранее экстракта ДНК. Если качественный результат не может быть достигнут таким способом, требуется повторное проведение пробоподготовки из новой порции того же материала.

160 п.н. ок. 50 п.н.

Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК генетически модифицированных (трансгенных) и нормальных растений, полученная с использованием набора реагентов «35S-ПЦР ядро» (ООО «Компания Биоком», Москва): 1 – отрицательный контроль (вода), 2-4 – ДНК из нормальных растений, 5-7 – ДНК из генетически модифицированных (трансгенных) растений, 8 – положительный контроль; -

специфический фрагмент, амплифицирующийся только с трансгенной ДНК (160 п.н.), неспецифический фрагмент (ок. 50 п.н.), свидетельствующий о нормальном ходе ПЦР при отсутствии специфического фрагмента (например, поз. 1 и 2).

2. МЕТОДИКА УСКОРЕННОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ТКАНЕЙ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В СОСТАВЕ МЯСНОГО СЫРЬЯ, ПОЛУФАБРИКАТОВ, ГОТОВЫХ МЯСНЫХ ИЗДЕЛИЙ И КОРМОВ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Методика определения видовой принадлежности тканей крупного рогатого скота, свиней и кур основана на ПЦРдетекции фрагментов ДНК, специфичных для указанных видов животных, с последующей детекцией продуктов реакции методом электрофореза. Для идентификации тканей крупного рогатого скота, свиней и кур методом ПЦР предлагаются наборы реагентов "BOV-ПЦР ядро", "SUS-ПЦР ядро" и "GUL-ПЦР ядpo", соответственно, основой и особенностью которых является готовая к потреблению лиофильно высушенная смесь всех необходимых для ПЦР компонентов (включая видоспецифичные праймеры), находящаяся в микропробирках объемом 0,5 или 0,2 мл. В состав набора входят: универсальный жидкий реагент - ПЦРрастворитель, который добавляют в пробирки с сухой смесью для ПЦР непосредственнo перед употреблением, а также - отдельные пробирки для отрицательного и для положительного контролей! Пробоподготовка, т.е. выделение ДНК из анализируемого материала, производится с помощью набора реагентов серии SILICA, который позволяет выделять ДНК практически из всего разнообразия пищевых продуктов, полуфабрикатов и кормов. Получаемые препараты ДНК можно сразу использовать для ПЦР без определения концентрации ДНК в них и дополнительного разбавления. Детекция продуктов ПЦР производится с помощью набора реагентов, предназначенного для проведения электрофореза в пластинах агарозного геля. О присутствии

искомой ДНК-мишени в исследуемом материале судят по специфическому ПЦР-фрагменту, который легко идентифицировать на электрофореграмме благодаря положительному контролю, входящему во все наборы реагентов для ПЦР. Методика идентификации тканей животного происхождения оптимизированы для исследования пищевого и кормового сырья, полуфабрикатов, продуктов питания и кормов животного и смешанного происхождения. Количество образца исследуемого материала, необходимое для проведения одного анализа, составляет меньше 0,1 мг (100-150 мкл). Объем экстракта ДНК, полученного в ходе пробоподготовки из одного образца исследуемого материала (75 мкл), позволяет при необходимости повторять проведение ПЦР с его использованием до 15 раз.

ЭТАП I. ПОДГОТОВКА ПРОБ (ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК) Реактивы Набор реагентов для пробоподготовки SILICA M (хранить при температуре +4°С): Буфер ЛБ, готов к применению - 1 флакон, 60 мл Буфер ОБ 1, концентрат- 1 флакон, 13,5 мл Буфер ОБ 2, концентрат- 2 флакона по 13,5 мл Буфер ТЕ, готов к применению - 2 флакона по 4 мл Сорбент, готов к применению - 2 пробирки по 2 мл Исходные материалы Наконечники для автоматических дозаторов до 200 мкл и до 1000 мкл в штативах

Микропобирки 1,5 мл с крышкой Вода дистиллированная Спирт этиловый 96%-ный, ректификат Дезрастворы Протокол проведения пробоподготовки помощью набора реагентов SILICA M

с

1. Приготовление рабочих буферных растворов ОБ. К содержимому флакона с концентратами буферов ОБ 1 и ОБ 2 прибавить по 40 мл 96%-ного этилового спирта и перемешать путем переворачивания плотно закрытого флакона 5-6 раз. Внести исследуемую пробу в пробирку с помощью одноразового шпателя: а) жидкие и полужидкие материалы (пюре, соусы и пр.)100-150 мкл; б) сухие сыпучие материалы (мясная, рыбная, мясокостная, костная мука и пр.) -100-150 мкл по насыпному объему (5-7 мм от дна пробирки); в) мягкие материалы, легко поддающиеся измельчению (мясо и мясные полуфабрикаты, фарш, колбаса, консервы и пр.), необходимо измельчить с помощью скальпеля, ножниц и одноразового шпателя, гомогенизировать фарфоровым пестиком фарфоровой ступке, тщательно перемешивая содержимое, а затем отобрать приблизительно 100-150 мкл по объему. Для предотвращения перекрестной контаминации инструменты для измельчения материала используются однократно и тщательно моются после использования или при переходе от пробы к пробе. 2. Добавить в пробирку 400 мкл буфера ЛБ. Гомогенизировать пробу с помощью гомогенизатора Поттера до однородного состояния. NB! Долгое хранение при +4°С может привести к

кристаллизации буфера ЛБ, в этом случае перед использованием его необходимо немного подогреть и перемешать до полного растворения осадка. 3. Инкубировать пробу в термостате 40 мин при 65°С. 4. Встряхнуть содержимое пробирки на вортексе. NВ! В случае, когда содержимое пробирки полностью затвердело во время инкубации термостате, в эту же пробирку необходимо добавить еще 200-300 мкл буфера ЛБ и тщательно встряхнуть на вортексе. 5. Центрифугировать 10 мин при 10 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость, не задевая осадка, полностью отобрать с помощью автоматического дозатора и перенести в чистую пробирку, меняя наконечники при переходе от пробы к пробе. 6. Добавить в пробирку с надосадочной жидкостью 40 мкл суспензии сорбента (перед использованием сорбента, его следует полностью суспендировать на вортексе до исчезновения осадка). 7. Содержимое пробирки с пробой встряхнуть на вортексе до полной гомогенизации и оставить в штативе на 5-7 мин., периодически переворачивая плотно закрытую пробирку вручную; 8. Пробирки центрифугировать 10 сек при 10 тыс. об./мин. 9. Надосадочную жидкость удалить при помощи автоматической пипетки или насоса с колбой-ловушкой, не задевая при этом осадка. 10. К осадку прибавить 500 мкл буфера ОБ 1, содержимое пробирки встряхивать на вортексе до полного суспендирования осадка. 11. Центрифугировать пробы 20 сек. при 2 тыс.

об./мин. 12. Надосадочную жидкость удалить при помощи автоматической пипетки или насоса с колбой-ловушкой, не задевая при этом осадка. 13. К осадку прибавить 500 мкл буфера ОБ 2, содержимое пробирки встряхивать на вортексе до полного суспендирования осадка. 14. Центрифугировать пробы 20 сек при 2 тыс. об./мин. Надосадочную жидкость удалить как описано в п. 13. 15. Повторить операции, изложенные в пп. 13 и 14. NB! В последний раз надосадочную жидкость необходимо удалить наиболее полно, не задевая при этом осадка. 16. Пробирку открыть и, поместив в термостат, сушить осадок5-7 мин при 65°С. 17. К высушенному осадку добавить 75 мкл буфера ТЕ. Пробирку закрыть. 18. Встряхивать содержимое пробирки на вортексе до полного суспендирования осадка. 19. Термостатировать пробирки при 65°С в течение 10 мин. По окончании термостатирования содержимое пробирки вновь центрифугировать на вортексе. 20. Центрифугировать пробы 1 мин при 10 тыс. об./мин. 21. Надосадочную жидкость (экстракт ДНК) перенести в чистую пробирку, не задевая при этом осадка. Хранить полученный экстракт ДНК при -20°С, а при частом использовании - при +4°С. NB! Надосадочная жидкость используется в качестве пробы ДНК для проведения ПЦР. Избегайте попадания в нее сорбента! ЭТАП 2. ПОСТАНОВКА ПЦР

(АМПЛИФИКАЦИЯ) Принцип действия Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) предлагается готовая универсальная смесь всех необходимых компонентов, разнесенная по отдельным пробиркам 0,5 (0,2) мл. К ней прилагается комплект жидких реагентов (ПЦР-растворитель и минеральное масло), которые добавляют пробирки непосредственно перед употреблением. Отличительной чертой каждого из разработанных наборов являются праймеры BOV, SUS и GAL, предназначенные для амплификации целевых фрагментов, специфичных по отношению к ДНК коровы, свиньи и курицы, соответственно. Получение специфических продуктов амплификации BOV, SUS или GAL означает, что исследуемая проба содержит ДНК коровы, свиньи или курицы, соответственно. Для повышения достоверности получаемых результатов и исключения возможных ошибочных выводов амплификацию проб ДНК рекомендуется проводить в троекратной повторности. При этом не требуется повторное проведение пробоподготовки, поскольку ДНК, выделенной из одного образца, достаточно, как минимум, для 15 реакций.

Протокол проведения полимеразной цепной реакции (только при использовании набора реагентов серии «ПЦРядро») Перед началом работы продезинфицировать помещение для ПЦР, ламинарный шкаф или УФ-бокс

с помощью ультрафиолетовых ламп не менее 20 мин. Все оборудование и расходные материалы, предназначенные непосредственно для ПЦР (амплификатор, микроцентрифуга-вортекс, комплект автоматических дозаторов, штатив с наконечниками, штатив для пробирок), запрещается использовать для других работ. 1. Извлечь из пакета необходимое количество пробирок «ПЦР ядро» синего цвета по числу анализируемых проб, а также бесцветную пробирку для отрицательного контроля и пробирку красного цвета для положительного контроля, разместить их в штативе и промаркировать. 2. Добавить в каждую пробирку «ПЦР ядро» 10 мкл ПЦР растворителя. 3. Добавить в пробирки «ПЦР ядро» синего цвета по 10 мкл анализируемых проб ДНК. 4. Добавить в бесцветную пробирку «ПЦР ядро» 10 мкл буфера ТЕ. 5. Добавить в красную пробирку «ПЦР ядро» 10 мкл буфера ТЕ. NB! Наконечники для автоматической пипетки при переходе от пробы к пробе следует использовать однократно! Манипуляции с красными пробирками положительного контроля рекомендуется проводить в последнюю очередь. 7. Перемешать содержимое пробирок «ПЦР ядро» путем встряхивания на вортексе до полного растворения сухой смеси. Жидкость в пробирке должна равномерно окраситься в синий цвет. 8. Центрифугировать пробирки 5-7 сек при 2 тыс. об/мин. При этом отдельные капли ПЦР смеси, оказавшиеся при ее перемешивании на стенках и крышке пробирки, должны быть сброшены на дно. 9. В каждую пробирку прибавить 20-25 мкл (2 капли) минерального масла.

10. Пробирки с готовой ПЦР смесью поместить в амплификатор и запустить программу амплификации (см. табл.) (контроль над температурой рекомендуется осуществляться в режиме Tube или Sim): Этапы Количе ПЦР ство

Название набора реагентов

BOVциклов ПЦР ядро Цикл 1 1 Цикл 2

35

Цикл 3

1

SUS-ПЦР ядро

GUL-ПЦР ядро

94°С - 3 минуты

94°С - 30 94°С - 30 сек, 94°С - 3 0 сек. сек, 63°С 65°С - 30 сек, 63°С - 3 0 сек, 3 0 сек, 72°С 72°С -30 сек 72°С - 30 сек 72°С - 3 минуты

NB! Использование для ПЦР амплификаторов других моделей может потребовать изменения времени каждого шага (в зависимости от скорости нагреваохлаждения) и/или изменения на 1-2°С температуры отжига праймеров. 11. Извлечь пробирки из амплификатора, поместить в штатив и перенести в комнату для детекции продуктов ПЦР. ЭТАП 3 . ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ ПЦР И АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Проводится аналогично методики обнаружения трансгенной ДНК в растениях и продуктах их переработки.

Контрольные вопросы :

1. 2. 3. 4.

Общая характеристика метода ПЦР Принцип метода ПЦР Организация ПЦР лаборатории Аппаратура, применяемая при проведении ПЦР и анализе ее результатов. 5. Способы выделения ДНК 6. Схема амплификации ДНК 7. Генетическая инженерия – метод клеточной и молекулярной биологии. 8. Генетически модифицированные источники пищи. 9. Методика определения генетически модифицированной ДНК 10. Электрофорез как метод детекции продуктов амплификации 11. Чем обусловлено применение полимеразной цепной реакции в целях диагностики и экспресс-анализа разнообразного биологического материала? 12. Почему содержащаяся в продуктах питания и полуфабрикатах остаточная ДНК исходного сырья при проведении ПЦР дает такие же результаты, как и нативная ДНК? 13. В связи чем рекомендуют использовать отдельные наборы расходных материалов и оборудования в разных зонах ПЦР-помещений? 14. Какой реагент используют для визуализации фрагментов амплифицированной ДНК? 15. МУК 2.3.2.970-00 Медико-биологическая оценка пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников

№ n/n 1 2

Автор, название Березов Т.Т., Коровкин В.Ф. Биологическая химия. Бохински Р. Современные воззрения в биохимии: в 3х томах.

Год издания 1998

Изд-во Москва, Медицина

1987

М., Мир

3

Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение

2003

М., Мир

4

Ленинджер А. Основы биохимии. Т.1,2,3.

1985

М., Мир

5

Страйер Л. Биохимия: в 3х томах.

1985

М., Мир

6

Николаев А.Я. Биологическая химия.

2001

М., Медицина

7

Николаев А.Я. Биологическая химия.

1989

М., ВШ

8

Филиппович Ю.Б. Основы биохимии.

1985

М., ВШ

9

Филиппович Ю.Б. Основы биохимии.

1999

М., «Агар»

10

Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. Филиппович Ю.Б., Егорова А.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей

1998

М., ВШ

1982

М., Просвещение

1999

М., ВШ

Рекомендуемая литература 11

биохимии. Кретович В.Л. Биохимия растений. 12

Щербаков В.Г., Лобанов В.Г. и др. Биохимия растительного сырья.

1999

М., Колос

13

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопным методом Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот.

1983

М., Мир

1985

Изд-во Наука, Москва

Землянухин Практикум биохимии

А.А. общей

1985

Изд-во Ворон. унив-т

Жамсаранова С.Д., Пластинина З.А. Методические указания для самостоятельной подготовки к лабораторным занятиям по биологической химии

2003

Изд-во ВСГТУ, Улан-Удэ

14

15

16

по

Гельпроникающая хроматография, сорбенты, полимеразная цепная реакция, флуоорометрический метод, витамины, генетически модифицированные источники пищи

Подписано в печать 18.12.2006 г. Формат 60Χ84 1/16. Усл.п.л. 4,42. Тираж 50 экз. Заказ №309 ----------Издательство ВСГТУ. 670013. г.Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40,в. © ВСГТУ, 2006