Ч.Кантор, П.Шиммел БИОФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ Том 1
BIOPHYSICAL CHEMISTRY Parti
The Conformation of Biological Macromolecule...
12 downloads
350 Views
66MB Size
Report
This content was uploaded by our users and we assume good faith they have the permission to share this book. If you own the copyright to this book and it is wrongfully on our website, we offer a simple DMCA procedure to remove your content from our site. Start by pressing the button below!
Report copyright / DMCA form
Ч.Кантор, П.Шиммел БИОФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ Том 1
BIOPHYSICAL CHEMISTRY Parti
The Conformation of Biological Macromolecules Charles R. Cantor Columbia University
Paul R. Schimmel Massachusetts Institute of Technology
W.H.Freeman and Company
San Francisco
Ч.Кантор, П.Шиммел
БИОФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ В трех томах
Том 1
Перевод с английского
Под редакцией д-ра хим. наук А.А.Богданова, д-ра физ.-мат. наук Ю.С.Лазуркина, д-ра физ.-мат. наук М.Д.Франк-Каменецкого
МОСКВА
«МИР»
1984
ББК 28.072 К19 УДК 577
Кантор Ч., Шиммел П. К19
Биофизическая химия:
В
3-х
т.
Пер. с
англ. — М.:
Мир,
1984. — Т.1 —336 с , ил. В трехтомном издании, написанном учеными из США, на самом современном уровне изложены основные представления о биологических макромолекулах и методах исследования их структуры и функций. В первом томе рассмотрены общие принципы организации первичной, вторичной, третичной и четвертичной структуры белков и нуклеиновых кислот, а также строение полисахаридов, нуклеопротсинов и биологических мембран. Книга написана ясно и четко, на очень высоком научном уровне. Для биофизиков, биохимиков, молекулярных биологов, физиков, химиков, для преподавателей, аспирантов и студентов биологических специальностей.
К
2001040000 - 171
св. пл. подл, изд-ий, 83
ББК 28.072 57.04
041(01)-84
Редакция литературы по биологии
Чарлз Р. Кантор, Пол Р. Шиммел БИОФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
том 1 Научные редакторы Н. А. Райская, Н. Н. Шафрановская. Мл. редактор 3. Е. Кожанова. Художник Б. А. Шляпугин. Художественный редактор Ю. Л. Максимов. Технический редактор Л. П. Чуркина. Корректоры Р. Л. Вибке, И. А. Шурша ИБ № 3071 Подписано к печати 29.03.84 г. Формат 70 х 100'/i6. Бумага офсетная № 1. Гарнитура Тайме. Печать офсетная. Объем 10,5 бум. л. Усл. печ. л. 27,3. Усл. кр.-отт. 41,00. Уч.-изд. л. 27,87. Изд. № 4/1930. Тираж 8300 зкз. Зак. 1141 . Цена 2 р. 50 к. Набрано в издательстве «Мир» на фотонаборном комплексе «Компьюграфик» 129820, ГСП Москва, 1-й Рижский пер., 2. Можайский полиграфкомбинат Союзполиграфпрома при Государственном комитете СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торговли. 143200, Можайск, ул. Мира, 93. © ©
1980 by W. H. Freeman and Company Перевод на русский язык, «Мир», 1984
Предисловие редакторов перевода
Тот бурный прогресс в понимании основ жизненных процессов, свидетелями которого мы являемся, есть результат необычайно плодотворного слияния трех наук — физики, химии и биологии. Сформировавшуюся в результате этого слияния синтетическую дисциплину называют по-разному — и физико-химическая биология, и молекулярная биофизика, и физическая биохимия, и биофизическая химия. Суть от этого не меняется — речь идет о применении физических и химических идей и методов к изучению биологических процессов на молекулярном и атомном уровнях. Синтетический характер этой новой науки, взрывообразное ее развитие делают необычайно сложной задачу создания учебных пособий; в то же время в них ощущается крайне острая потребность. Вышедшие в последние годы отечественные и переводные книги такого рода (Волькенштейн М.В. Молекулярная биофизика. — М.: Наука, 1975; Волькенштейн М.В. Биофизика. — М.: Наука, 1981; Фрайфельдер Д. Физическая биохимия. Пер. с англ. — М.: Мир, 1980; Маршелл Э. Биофизическая химия. Пер. с англ. — М.: Мир, 1981, и другие) лишь частично решали проблему. Предлагаемый вниманию читателей трехтомник является, на наш взгляд, наиболее удачной попыткой создания последовательного курса в данной области. Его авторы, Ч.Кантор и П.Шиммел, — известные американские ученые, занимающиеся вопросами строения и функционирования комплексов белков и нуклеиновых кислот. В течение многих лет они читают лекции по-мвлекулярной биологии и биофизике в крупнейших высших учебных заведениях США — первый в Колумбийском университете, второй в Массачусетсом технологическом институте. В результате огромной работы по отбору, систематизации, упорядочению материала авторам удалось создать законченный и очень полезный курс биофизической химии. План построения монографии вполне естествен. Первый том вводит читателя в основные проблемы данной науки. В нем рассказывается о строении важнейших молекул живой клетки. Второй том чисто методический. Здесь представлены те физические методы, которые наиболее широко используются в биофизической химии. И, наконец, в третьем томе рассказано о свойствах биополимеров и о связи их структуры и свойств с некоторыми биологическими функциями. Материал в основном доступен начинающему читателю, впервые знакомящемуся с данной областью. Удачен подбор задач и многочисленных конкретных примеров, которые разобраны с необходимой полнотой. Курс знакомит читателя с наиболее актуальными проблемами биофизической химии. Но эта область развивается такими темпами, что за период, прошедший со времени написания книги, до завершения перевода ее на русский язык появилось много новых работ принципиального характера, главным образом по темам, входящим в третий том. В связи в этим мы позволили себе дать небольшое число примечаний, содержащих ссылки на наиболее важные новые работы, в особенности обзоры. Не вызывает сомнений, что это фундаментальное руководство будет очень полезным как студентам и аспирантам химических, биологических, биофизических специальностей, так и исследователям, работающим в области физико-химической биологии, молекулярной биофизики и в смежных областях. А.А. Богданов Ю.С. Лазуркин М.Д. Франк-Каменецкий
Луису и Иде Диане Кантор, Альфреду и Дорис Шиммел
Предисловие
Эта книга посвящена биологическим макромолекулам и их комплексам. В ней рассмотрены конформация молекул, их форма, структура, конформационные изменения и межмолекулярные взаимодействия, а также изложены основные принципы и закономерности, лежащие в основе биофизической химии и вытекающие из законов физики, химии и биологии. Мы попытались написать учебное пособие, рассчитанное на читателей с разным уровнем подготовки. Материал сильно различается по степени сложности, так что учебник будет полезен для студентов и младших, и старших курсов. Он может представлять интерес и для научных работников — как неспециалистов в данной области, желающих получить о ней представление, так и опытных биофизиков. В первом томе рассмотрены структура биологических макромолекул и силы, ее определяющие. Гл. 1 вводит в круг наиболее важных проблем биофизической химии. Гл. 2-4 знакомят со структурой белков, нуклеиновых кислот и других биополимеров, в гл. 5-6 рассмотрены нековалентные взаимодействия и конформационный анализ. Второй том посвящен методам, использующимся при изучении структуры и функций биологических систем. При этом мы не ставили перед собой задачу описать все известные методы, подробно рассмотрены лишь наиболее важные из них. Гл. 7-9 посвящены спектроскопическим методам, гл. 10-12 — гидродинамическим, а в гл. 13 и 14 обсуждаются рентгеноструктурный анализ и другие дифракционные методы. В третьем томе показано, как благодаря совместному использованию различных экспериментальных методов и теоретических подходов удается понять поведение и свойства биологических макромолекул. Главное внимание уделяется термодинамике и кинетике конформационных изменений и взаимодействию макромолекул с лигандами. При этом в случае необходимости описываются новые методы, а также подробно рассматривается история исследования некоторых вопросов. В гл. 15-17 обсуждаются проблемы взаимодействия молекул с лигандами, в гл. 18 и 19 излагаются теории и методы, используемые при изучении молекул, конформация которых носит статистический характер, гл. 20-24 посвящены конформационным изменениям в белках и нуклеиновых кислотах, гл. 25 — биологическим мембранам. Мы постарались построить изложение так, чтобы главы можно было читать независимо одну от другой, тем самым предоставляя читателю возможность выборочного изучения материала. Этой же цели служат многочисленные перекрестные ссылки на вопросы, обсуждающиеся в разных главах. Всюду, где это возможно, в качестве примеров рассматриваются одни и те же системы, с тем чтобы читатель мог сопоставить сведения, получаемые относительно одного и того же белка или нуклеиновой кислоты с помощью различных подходов. Мы стремились выдержать в пределах каждой главы примерно одинаковый уровень строгости и сложности изложения. Краткие отступления от этого уровня выделены в виде дополнений, более обширные помечены знаком • при заголовке соответствующего раздела. В некоторых дополнениях кратко излагаются необходимые элементарные сведения из области математики, физики и физической химии. Они могут оказаться весьма полезными для читателя, не имеющего специальной подготовки по этим дисциплинам. Другие дополнения предназначены для более подготовленных читателей; во многих случаях
ПРЕДИСЛОВИЕ
при этом обсуждаются вопросы, неясные для самих авторов. В приложении А приведены необходимые сведения из матричной алгебры. Разделы книги сильно различаются по уровню сложности используемого математического аппарата. Всюду, где это не было в ущерб ясности изложения, мы старались обходиться как можно более простыми математическими выкладками. Например, гидродинамические свойства рассмотрены только для одномерного случая. Ряд основных уравнений получен из анализа размерностей, а не путем долгих (и притом не особенно поучительных) выкладок, связанных с рассмотрением граничных условий гидродинамических задач. С другой стороны, при обсуждении явления рассеяния рентгеновских лучей используется метод преобразования Фурье, а многие задачи статистической механики решаются методами матричной алгебры. Подобные математические методы используются лишь в некоторых главах; чтобы помочь читателю, ранее с ними не знакомому, мы посвятили этим вопросам многочисленные дополнения. Материал остальных разделов и глав может быть усвоен без привлечения современного математического аппарата. Далеко не все методы и биологические объекты рассматриваются в книге скольконибудь подробно. Главным критерием при выборе была не важность того или другого метода, а то, насколько знакомство с ним будет полезно для начинающего изучать данную область. В каждой главе имеются краткие выводы. Приведено много иллюстраций, в том числе рисунки Ирвинга Гейса, сделанные специально для этой книги. Одно только знакомство с краткими выводами и иллюстрациями позволит получить представление о предмете. Мы надеемся также, что иллюстрации помогут передать волнующую атмосферу, которая царит в этой области науки. В конце каждой главы помещены задачи. Они сильно различаются по степени сложности. Среди них есть и сравнительно простые, и такие, для которых окончательный ответ неизвестен (по крайней мере авторам). Ответы к задачам даются в конце каждого тома. В монографии нет подробных литературных ссылок, за исключением тех случаев, когда мы ссылаемся на источник, откуда был заимствован ранее опубликованный материал. Однако в каждой главе приводится список наиболее полезных работ. Практически во всех случаях этих ссылок достаточно, чтобы с их помощью найти литературу, необходимую для подробного изучения вопроса. Трудной задачей оказалась унификация обозначений и сокращений. Используя материалы многочисленных исследований, различных по характеру, мы столкнулись с необходимостью унификации, исключающей неопределенности и ошибки при использовании сходных обозначений. Всюду, где это было возможно, мы следовали рекомендациям Американского химического общества, но в некоторых случаях нам пришлось решать вопрос на свой страх и риск. В конце третьего тома приведен список наиболее распространенных обозначений. Часть материала книги была использована при чтении лекций по биофизической химии студентам старших курсов Массачусетского технологического института. Лекции предназначались для тех, кто хотел прослушать углубленный курс физической химии, с уклоном в сторону биохимии. Эти лекции охватывали в основном тот же материал и читались на том же уровне, что и традиционный курс физической химии. Предварительно студенты должны были прослушать односеместровый курс физической химии, который в МТИ посвящен преимущественно химической термодинамике. В течение ряда лет материал, излагаемый в книге, использовался при чтении лекций для аспирантов в МТИ и в Колумбийском университете. Кроме того, часть материала входила в специальный курс, посвященный строению белков. Мы надеемся, что широта охвата сделает эту книгу полезной для преподавателей с самыми разными требованиями и инте-
ПРЕДИСЛОВИЕ
ресами, а также позволит изменять содержание лекций в соответствии с развитием данной области. Совершенно очевидно, что труд столь большой сложности не мог быть выполнен усилиями лишь двух авторов. В ходе написания книги, стремясь изложить и объяснить широкий круг проблем биофизической химии, мы поняли, почему за последние два десятилетия в этой области было написано так мало книг. Мы приносим глубокую благодарность всем, кто помог нам тем или иным путем — от разъяснения отдельных вопросов до предоставления оригинальных результатов. Мы особенно благодарны Ирвингу Гейсу за создание ряда сложных иллюстраций и полезные советы относительно многих рисунков, а также Вильме Олсон, прочитавшей большую часть рукописи, Роберту Олберти и Гордону Хэммсу за обсуждение вопросов, касающихся биохимического равновесия и кинетики, Ричарду Дикерсону за предоставление материалов и советы, оказавшиеся весьма полезными при подготовке гл.13, Полу Флори, вдохновившему нас на рассмотрение вопросов конформационной энергии и конфигурационной статистики макромолекул, Говарду Шахману, чей курс, читаемый в Беркли, побудил нас включить в монографию целый ряд разделов, Р.Вэйну Олеру, который свел авторов вместе для этой работы. Нам хотелось бы поблагодарить Брюса Армбрустера, заключившего с нами договор, и сотрудников издательства Фримен энд Компани, в том числе Рут Аллен, Артура Бартлетта, Роберта Иши, Ларри МакКомбса и Пэрл Вапнек. Мы весьма признательны Ким Энгель, Карен Хейнс, Мэри Людвиг, Джоан Мешне, Пегги Нелсон, Кэти Путлэнд и Джуди Шиммел за печатание рукописи и работу над ней. Нам хотелось бы поблагодарить Кассандру Смит и Джуди, Кэти и Кирстен Шиммел за то смирение, с которым они перенесли вторжение этого труда в жизнь авторов. Многие люди прочитали отдельные главы и высказали критические замечания, предоставили нам иллюстративный материал и свои данные; они потратили много времени в полезных обсуждениях с нами. Это Роберт Олберти, Артур Арнон, Струтер Арнотт, П.Эткинс, Роберт Болдуин, Ларри Берлинер, Брюс Берн, Ричард Берзон, Шерман Бейхок, Виктор Блумфилд, Дэвид Брандт, Джон Брандтс, Джон Чамберс, Санни Чан, Патриция Коул, Роберт Кричтон, Фрэнсис Крик, Доналд Крозерс, Норман Дэвидсон, Ричард Дикерсон, Дэвид Эйзенберг, Роберт Фэйрклоф, Джерри Фасман, Джордж Флинн, Дэвид Фрайфелдер, Роналд Гэмбл, Роберт Дженнис, Маррей Гудмэн, Джонатан Грир, О.Хейс Гриффит, Гордон Хеммс, Джон Херст, Эллен Гендерсон, Джеймс Гилдебрандт, Рей Хестис, Сунг Хоу Ким, Арон Клуг, Нелсон Леонард, Х.Дж.Ли, Стефен Липпард, Ричард Лорд, Брайан Мэттьюз, Харден МакКоннел, Питер Мур, Гарт Николсон, Леонард Пеллер, Ричард Перхэм, Майкл Рафтери, Александр Рич, Фредерик Ричарде, Дэвид Ричардсон, Волфрам Сенджер, Говард Шахман, Харолд Шерага, Бенно Шенборн, Верн Шумейкер, Надриан Симэн, Роберт Шульман, Мэвис Шур, Луиза Слейд, Кассандра Смит, Хэнк Собелл, Томас Стейц, Роберт Строуд, Луберт Страйер, Серж Тимашев, Игнацио Тиноко мл., Ричард Вэндлен, Джером Виноград, Питер фон Хиппель, Кристофер Уолш, Джеймс Уонг, Грегорио Вебер, Питер Веллауэр, Барбара Уэллз, Роберт Уэллз, Уильм Уинтер, Гаролд Уайкоф, Джеффрис Уайман, Бруно Зимм. Мы выражаем всем им огромную благодарность. Ноябрь 1979 г.
Чарлз Р.Кантор Пол Р. Шиммел
Том 1 КОНФОРМАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ
Эта книга посвящена применению физической химии для исследования свойств больших молекул, представляющих биологический интерес. Основное внимание в ней уделено белкам и нуклеиновым кислотам. Другие биополимеры, например полисахариды и липиды, рассмотрены менее подробно. Это связано с двумя обстоятельствами. Во-первых, белки и нуклеиновые кислоты играют главную роль во всех известных жизненных процессах. Во-вторых, их структура и функции в настоящее время изучены значительно лучше, чем аналогичные характеристики других биополимеров. Первая часть книги решает несколько задач. Она вводит читателя в курс представлений о различных уровнях структурной организации биополимеров. В ней формулируются основные вопросы, на которые должен ответить исследователь, работающий в области физической химии биологических макромолекул. Высказываются также некоторые соображения об общих подходах к решению этих вопросов. Далее в книге излагается современное состояние наших знаний о структуре белков и нуклеиновых кислот. Главная задача этого раздела заключается в том, чтобы обобщить и упорядочить накопленную в данной области огромную информацию. Затем излагаются данные относительно других типов биополимерных структур, таких, как полисахариды и мембраны. При этом особое внимание обращается на их отличие от белков и нуклеиновых кислот. В заключение рассматриваются взаимодействия и силы, которые приводят к образованию упорядоченных биологических структур. Знание этих сил важно для понимания и предсказания закономерностей образования трехмерных структур белков и нуклеиновых кислот.
Глава 1 Стратегия и тактика биофизической химии
1.1. Уровни структурной организации биологических макромолекул Молекулярные массы объектов, рассматриваемых в настоящей книге, лежат в пределах от 103 до 1012 дальтон. Во многих случаях такие системы состоят из большого количества более мелких частей, все атомы которых соединены ковалентными связями. Система в целом будет называться молекулой, если имеется определенное стехиометрическое соотношение между частями, из которых она состоит, и если при физиологических условиях система достаточно устойчива и не проявляет тенденции к самопроизвольной диссоциации. Рассматриваемые молекулы можно подразделить на семь классов в порядке увеличения их размеров и сложности (табл. 1.1). По мере увеличения размеров системы ее удобно разделять на части возрастающей величины. Как видно из табл. 1.1, размер этих частей выбирается таким образом, чтобы каждая составляла от одной сотой до одной десятой всей системы. К первым трем классам относятся молекулы, для которых структурная информация может быть в принципе получена с атомным разрешением. Здесь имеет смысл постановка вопроса о структуре и функции таких молекул на уровне локализации отдельных атомов или звеньев (выделенных групп атомов) и их поведения. К последним четырем классам относятся столь сложные системы, что даже если бы их структура на атомном уровне была определена, такую информацию было бы чрезвычайно трудно использовать. Например, структура с мол. массой 106 состоит из приблизительно 105 атомов. Ее описание, содержащее информацию о типе и координатах каждого атома, было бы подобно описанию города путем перечисления фамилий и адресов его жителей. Удобнее подразделить систему на отдельные субъединицы или участки и затем обращаться к индивидуальным ее звеньям или атомам лишь в том случае, если их функции представляют особый интерес. Это все равно, что разделить город на районы или кварталы и затем следить за действиями лишь некоторых наиболее важных личностей, например мэра города. Применение при описании биополимеров таких терминов, как «субъединица», «звено», «молекула», «участок» или «группа» сопряжено с некоторой неопределенностью. Существует иерархия структурных единиц и структурных характеристик. Поскольку структурная организация белков, нуклеиновых кислот и сложных нековалентных агрегатов, таких, как наружная мембрана клетки, различна, не существует единой оптимальной номенклатуры для всех трех типов структур. Более того, даже для белков нет общепринятой
РИС. 1.1. Уровни структурной организации биологических макромолекул. Головка бактериофага или другая дискретная единица, состоящая из белков или нуклеопротеидов, отвечает четвертичной (4°) структуре. Трехмерная структура каждого отдельного компонента одного из таких комплексов яляется третичной (3°) структурой. Отдельные спиральные участки в такой структуре называются вторичной структурой (2°). Химическая структурная формула, отражающая лишь систему химических связей, но не пространственное расположение атомов, — это первичная (1°) структура. (Рисунок Ирвинга Гейса).
СТРАТЕГИЯ И ТАКТИКА БИОФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ
ВИРУС
Белковая оболочка
БЕЛОК
Боковая группа Основания
Основная цепь
11
12
ГЛАВА 1 Таблица 1.1. РАЗЛИЧНЫЕ БИОПОЛИМЕРЫ, РАСПОЛОЖЕННЫЕ В ПОРЯДКЕ УВЕЛИЧЕНИЯ ИХ РАЗМЕРОВ И СЛОЖНОСТИ
Класс
Пример
Характерный размер
Олигомеры2
Актиномицин D
Малые белки
Химотрипсин
Нуклеиновые кислоты Большие белки
тРНК
Сфера диаметром 20 А Сфера диаметром 40 А Палочка длиной 100 А Сфера диаметром 70 А
Малые комплексы Большие комплексы
Аспартаттранскарбамоилаза Рибосома Мембраны, вирусы
Интактная ДНК ДНК Е. coli
1
Сфера диаметром 200 А Сфера диаметром 1000 А «Шланг» длиной 0,1см
Субъединицы, расМолекуляр- сматриваемые при ная масса подробном описании 3
10 — 10 4
1 0 — 10 4
10 —10
5
5
10 —10'
5
10 —10'
4
5
Атомы (или остатки) Аминокислотные остатки Нуклеотиды (или атомы) Субъединицы или ковалентные цепочки То же
Число
субъединиц
102 (или 10) 102— Ю^или 103 —10 4 ) 10 2 — Ю^или 103—10") 10—102 10—102
ю' — ю 1 2 Области,
10—102
10'—10 12
10—102
фрагменты, компоненты Участки, фрагменты, компоненты
Все эти примеры подробно обсуждаются в разных частях книги. Приставка «олиго», часто употребляемая в этой книге, 0, рК' смещается до больших значений, чем ожидаемые в случае титрования изолированного тирозина. АС
АО
полн =
АО
Д
С
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
51 Таблица 2.3
рАГ , НАБЛЮДАЕМЫЕ ДЛЯ ИОНИЗУЕМЫХ ГРУПП В НЕКОТОРЫХ БЕЛКАХ 1 '
Аминокислота или группа
Белок
Аспарагиновая и глутаминовая кислоты
Лизоцим (3 из 16 групп) /З-Лактоглобулин (49 из 51 группы) ( 2 из 51 группы) Сывороточный альбумин Инсулин Миоглобин (6 из 12 групп) (6 из 12 групп) /З-Лактоглобулин Лизоцим Инсулин Сывороточный альбумин Химотрипсиноген (1 из 4 групп) (1 из 4 групп) (2 из 4 групп) Инсулин Сывороточный альбумин Рибонуклеаза (3 из 6 групп) Сывороточный альбумин Лизоцим Химотрипсиноген (3 из 13 групп) Инсулин
Гистидин
Тирозин
Лизин Аргинин а-Карбоксил
-и-
д
4,8 7,3 4,0 4,7
д
6,6 7,4 6,8 6,4 6,9 9,7
10,4 П 9,6
10,4 9,6 9,8
10,4 П
11,9 3,6
' ' R. H. Haschemeyer, A. E. V. Haschemeyer, Proteins (New York: Wiley, 1974). Д — депротонирована при всех значениях рН, П — протонирована при всех значениях рН.
2)
Если конформационное изменение, сопровождающее процесс ионизации, обратимо, то такой же эффект наблюдается и при проведении обратного титрования. Часто, однако, возвращение к нативной конформации происходит очень медленно или даже оказывается невозможным. В таких случаях при обратном титровании остатки тирозина титруются нормально, так как отсутствует связь между процессом ионизации и конформационными изменениями. Более детальные экспериментальные данные приведены в гл. 7, где описано титрование остатков тирозина, входящих в состав рибонуклеазы, причем в данном случае специфическая ионизация этих остатков может наблюдаться оптическими методами. Для того чтобы наилучшим образом проанализировать кривую титрования (см., например, рис. 2.2), нужно сопоставить ее с известными данными по аминокислотному составу. Различные участки кривой ставят в соответствие известному числу способных к ионизации остатков (взятому с определенным весом) в предположении, что последние титруются нормально. Если при этом не удается получить соответствия между наблюдаемым и ожидаемым числом присоединенных или потерянных протонов, то делается предположение, что некоторые остатки не титруются совсем, поскольку они участвуют в стабилизации конформации белка. Для более тонкого анализа необходимо учитывать сдвиг рА"а из-за электростатического взаимодействия. Достоверные значения такого сдвига можно получить только в том случае, если известна третичная структура. Как видно из рис. 2.2, при благоприятной ситуации характер кривой титрования можно довольно хорошо объяснить количественно.
52
ГЛАВА 2
ПОЛЯРНОСТЬ БОКОВЫХ ГРУПП АМИНОКИСЛОТ Из всего сказанного ясно, что можно четко разграничить заряженные и незаряженные аминокислоты при любых значениях рН. Было бы полезно располагать и другими способами однозначной классификации аминокислот, основанными на различиях в их свойствах. Можно попытаться сделать это, исходя из интуитивных химических представлений о полярности боковых групп. Аминокислоты с неполярными боковыми группами хуже растворяются в воде. В этот класс, очевидно, входят аминокислоты с алифатическими углеводородными боковыми цепями: аланин, валин, лейцин и изолейцин. К неполярным аминокислотам можно отнести также финилаланин, триптофан и метионин. На другом конце шкалы полярности находятся Glu, Asp, Arg и Lys. Полярны также аспарагиновая и глутаминовая кислоты, содержащие амидную боковую группу. Гидроксилсодержащие аминокислоты — серии и треонин — также полярны из-за большого дипольного момента и способности гидроксила образовывать водородные связи. Все эти молекулы активно взаимодействуют с водой и хорошо в ней растворяются. Полярность оставшихся пяти аминокислот не столь ясна. Значения рКа для цистеина и гистидина настолько близки к 7, что во многих белках при физиологических условиях эти аминокислоты действительно могут быть заряженными. Таким образом, они могут быть полярными, но если они незаряжены, то они совершенно теряют свои полярные свойства. В тирозине ароматическое кольцо компенсирует влияние гидроксильной группы и обычно Туг ведет себя как неполярный остаток. Глицин и пролин — особые аминокислоты. Их структура значительно отличается от структуры остальных 18 остатков. Глицин лишен оптически активного асимметричного а-углерода, откуда следует, что он может существовать в конформационных состояниях, недоступных другим аминокислотам. Он не имеет боковой группы, но его поведение в составе белков позволяет отнести его к категории неполярных остатков. Пролин же на самом деле является имино-, а не аминокислотой. Поэтому его конформационные свойства отличаются от свойств всех остальных остатков. Трудно что-нибудь сказать о его полярности, но, учитывая его локализацию в белках, можно прийти к заключению, что Pro чаще ведет себя как полярный остаток. В табл. 2.4 приведены данные по растворимости различных аминокислот в воде при нейтральных рН, которые дают возможность проверить наши полуинтуитивные рассуждения. Используя принцип «подобное растворяется в подобном», а также то обстоятельство, что молекулы воды полярны, можно сказать, что большая часть представленных данных качественно согласуется с нашими выводами. Однако к этим данным не следует подходить с точными количественными мерками, так как в табл. 2.4 приводятся растворимости цвиттерионных форм аминокислот, тогда как нас интересуют свойства аминокислотных боковых групп как составных частей пептида. Существуют и более серьезные ограничения при использовании данных по растворимости аминокислот. Растворение твердого вещества в воде — равновесный процесс. На него влияют и сродство этого вещества к воде, и сродство молекул друг к другу в кристалле. Нас интересуют здесь только взаимодействия первого типа, но мы не уверены, что взаимодействия второго типа не играют важной роли в процессе растворения. В принципе можно было бы обратиться к другим данным, чем те, которые приведены в табл. 2.4, например, к данным о растворимости газообразных аминокислот или их боковых групп в воде. Получить такую информацию с помощью прямых измерений невозможно, однако «сть другой, косвенный подход. Так, зная термодинамику испарения данного вещества с поверхности кристалла и термодинамику растворения твердого вещества, можно получить представление об интересующем нас равновесии между паром и раствором. Тэнфорд предложил альтернативный подход, который в отсутствие данных о газообразной фазе можно использовать для простого термодинамического описания свойств
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
53 Таблица 2.4
КЛАССИФИКАЦИЯ СВОЙСТВ АМИНОКИСЛОТ
Остаток
Тип аминокислоты
Тгр Не Туг Phe Leu Val Met Cys" Ala Gly His Pro Ser Thr Asn Glu Asp Glu Lys Arg
Неполярная Неполярная Неполярная 3 ) Неполярная Неполярная Неполярная Неполярная Неполярная Неполярная Неполярная 3 ) Не определен Полярная 3 ) Полярная Полярная Полярная Полярная Заряженная Заряженная Заряженная Заряженная
Растворимость цвиттерионной формы при 25°С, моль/кг
ДС пер. ]4
2
К )**
ю2 ч а
4- д
** 4(а
-а
Л
(а
4=^ 1
/3
В отличие от гемоглобина многие другие белки, просто связывающие изолированный катион, при удалении из них последнего не претерпевает значительных структурных изме-
РИС. 2.7. Некоторые типичные металлсвязывающие участки в белках. На этом рисунке показаны реальные трехмерные структуры металлосодержащих комплексов (металлы изображены цветными кружками). А. Са 2+ -связывающий участок термолизина (Б. Мэтьюз). Б. 2и 2+ -связывающий участок активного центра карбоксипептидазы А. Молекулы воды, расположенные вертикально, не показаны. [D.M.Blou, T.A.Steitz, Ann.Rev.Biochem., 39, 78 (1970).]В. Высокопотенциальный железосерный белок Chromatium, содержащий четыре иона железа, четыре лабильных атома серы и четыре остатка цистеина. Сходную группу атомов имеют бактериальные ферредоксины (ср. рис. 2.28). [L. H. Jensen, Ann. Rev. Biochem. 43, 461 (1974).] Г. Миоглобин. Железопорфириновый комплекс связан с белком через гистидин. На рисунке показано, что шестая координационная связь лиганда не занята, это — место связывания кислорода. Фактически идентичные структуры существуют и в гемоглобине. [R.E.Dickerson, I.Geis, The Structure and Action of Proteins, New York, Harper and Row (1969).]
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
63
170
His
1
ГЛАВА 2
64
HN
I НСII
Н2С
N
NH
I
О
-CH /
Боковая цепь лизина NH
II
С
н
|
9=°
с
Биотин
Н2С,
V
I
CH—СН 2 —СН 2 —СН 2 —-СН 2 —С—N—CH 2 —CH 2 —CH 2 —CH 2 —CH
I | Боковая цепь лизина N—Н
м У
~?
сн 2 —сн 2 —сн 2 —сн 2 —с—N—сн 2 —сн 2 —сн 2 —сн 2 —с—н
н
|_
^Реакционноспособный дисульфид Липоевая кислота
—NH—CH—(CH 2 ) 4 —HN
9—°
H
С=О ^Боковая цепь лизина Протонированное шиффово Н
основание ретиналя
О
II
I
—N—СН—С—
I
'|
2 4
'
N
Боковая цепь лизина — '
С—Н "О—Р—ОН 2 С "О
ОН СН 3
Шиффово основание пиридоксальфосфата РИС. 2.8. Структура некоторых простетических групп. Они дают представление о причинах появления у белков химических и фотохимических свойств, отсутствующих у обычных боковых групп аминокислот.
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
65
нений. Кроме того, во многих металлопротеидах возможна замена одного катиона на другой. Особенно информативно замещение атомов железа или цинка кобальтом, так как 2+ изучение различных физических и химических характеристик С о позволяет определить, участвует ли катион в функционировании белка или его влияние оказывается более сложным. Одна из причин столь пристального внимания к металлопротеидам состоит в том, что атом металла можно использовать в качестве спектроскопического зонда, непосредственно входящего в функциональный центр фермента. Э т о значительно облегчает многие физические исследования,' так как позволяет устранить нежелательные искажения структуры, вызываемые введением чуждых белку зондов. Многие белки используют в качестве кофактора не металлы, а небольшие молекулы органических соединений. Большинство этих молекул связывается, по-видимому, с лизиновым остатком. Некоторые из них изображены на рис. 2.8. Все органические кофакторы сообщают белку химические свойства, которыми не обладают составляющие его обычные аминокислоты. Например, длинная гибкая цепь в биотине и в липоевой кислоте позволяет этим коферментам перемещать связывающийся с ними субстрат с одного места связывания в ферменте на другое. Детальное расположение этих органических молекул в белках неизвестно; неясно также, что происходит с локальной структурой в их присутствии. Тем не менее пиродоксали и ретиналь служат очень полезными спектроскопическими зондами, позволяющими получить информацию об их окружении в белках.
2.3. Первичная структура Изучение ковалентной первичной структуры белка следует начать прежде всего с определения числа и типов полипептидных цепей, из которых он состоит, а также с установления размеров каждой из них. Во многих случаях отдельная изолированная белковая субъединица состоит из одной цепи, однако в природе распространены и многоцепочечные белки. Их возникновение может быть связано с расщеплением одной исходной цепи. В гл. 11 и 12 описаны методы, с помощью которых обычно можно разделить цепи в соответствии с их зарядом или молекулярной массой. Теми же способами можно приближенно определить их размеры. Иногда более точные размеры получают путем анализа химическим методом отношения числа концевых остатков к их общему числу или из данных об аминокислотном составе с учетом того, что количества наименее распространенных аминокислот в цепи должны выражаться целыми числами. Среди всех известных белков самые короткие цепи встречаются в некоторых полипептидных гормонах, например в секретине или глюкагоне, и в ряде «карликовых» белков, таких, как ферредоксин, содержащих от 25 до 100 аминокислот. Более типичны пептидные цепи, включающие от 100 до 500 аминокислот. Наибольшая из известных цепей состоит более чем из 3000 остатков, однако такие длинные цепи встречаются редко, если не считать фибриллярных белков. Методы определения аминокислотной последовательности полипептидных цепей хорошо отработаны. На многих стадиях исследования применяются автоматизированные процедуры анализа, особенно при проведении поэтапного отщепления концевых аминокислотных остатков, начиная с N-конца. В благоприятных случаях можно определить последовательность 60 и большего числа остатков почти без вмешательства исследователя. Таким образом, для многих небольших белков определение аминокислотной последовательности является теперь едва ли не рутинной операцией. Для крупных белков или белков, обладающих плохой растворимостью, эта задача более сложна. Однако, как правило, если необходимо знать последовательность белка и есть готовность выполнить требующуюся работу, окончательный успех почти гарантирован. Относительная простота определения последовательности остатков сразу же вызывает два вопроса: какую информацию можно непосредственно извлечь из последовательности и как эти данные могут пригодиться при проведении других экспериментальных исследований?
66
ГЛАВА 2
ДИСУЛЬФИДНЫЕ И ДРУГИЕ ПОПЕРЕЧНЫЕ СВЯЗИ Первый этап полного или даже частичного установления последовательности остатков обычно состоит в определении наличия каких-либо связей между различными частями цепи. Наиболее распространены дисульфидные связи, формирующиеся при окислении пар цистеинов. Образовавшийся дисульфид часто рассматривается как отдельный элемент и называется цистином. Как показано на рис. 2.9, система связей С—S — S — С в цистине нелинейна и обычно имеет неплоскую конформацию. Поэтому наличие цистина налагает сильные ограничения на белковую структуру. Два участка пептидной цепи должны быть сближены в пространстве и к тому же должны располагаться под определенными углами. Это означает, что при прочих равных условиях труднее разрушить структуру белков, содержащих дисульфидные связи. В самом деле, некоторые небольшие белки, в которых от 5 до 7 дисульфидов приходятся менее чем на 100 аминокислотных остатков, известны как наиболее стабильные. Они могут выдерживать экстремальные условия, возникающие при кипячении или воздействии сильных кислот, в которых очень многие белки довольно быстро и необратимо денатурируют. Вообще говоря, большинство белков можно разделить на три класса в соответствии с их SH-группами. Небольшая часть белков не содержит ни цистеина, ни цистина; многие другие содержат один или несколько цистеинов, но не имеют цистинов. Существуют также белки с одним или чаще несколькими цистинами. И очень редко встречаются белки, содержащие и цистеины, и цистины. Для этого имеются достаточные основания, так как структура такой молекулы была бы нестабильной вследствие реакций дисульфидного обмена —S —S —Cys2 + Cys3 — SH *± Cys, —SH -I- Cys 2 —S—S—Cys 3 которые могут быть либо внутримолекулярными, либо межмолекулярными. Даже если свободные SH-группы и дисульфидные связи стерически не могут быть сближены, имеется лишь узкая область внешних условий, при которых они могут существовать в белковой молекуле одновременно. Единственным исключением являются сывороточные альбумины, которые обычно имеют 17 дисульфидных связей и одну свободную SH-rpynny. Однако эти белки весьма необычны также и в других отношениях. Знание системы дисульфидных связей в белке иногда бывает полезным при определении его трехмерной структуры. Если белок состоит из нескольких цепей, то могут существовать как внутри-, так и межцепочечные дисульфидные связи и ковалентная структура обычно имеет довольно сложную топологию. В качестве примера на рис. 2.10 приведено схематическое изображение структуры иммуноглобулина G(IgG). Можно видеть 4 пептидные цепи и в общей сложности 15 дисульфидных связей — 4 межцепочечные, а остальные внутрицепочечные. Топологическая модель, показанная на этом рисунке, позволяет прийти к интересному предположению, что данный белок состоит из областей, каждая из которых независимо скрепляется своими дисульфидами. Чем больше появляется точных структурных данных об иммуноглобине G, тем яснее становится, что белок представляет собой совокупность отдельных доменов. С2
I s, РИС. 2.9. Структура цистиновых дисульфидных связей. Отметим, что метиленовые группы расположены в разных плоскостях, ф — двугранный угол между плоскостями. Показаны два оптических изомера с одним и тем же значением угла ф. (По рисунку, предоставленному С. Бейхоком.)
67
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
Кроме дисульфидных связей в белках было обнаружено несколько других типов поперечных связей. Они, однако, встречаются значительно реже. Некоторые фибриллярные белки, особенно часто присутствующие в соединительных тканях, содержат ряд межцепочечных сшивок. Последние служат для увеличения жесткости, а также, возможно, обеспечивают обратимость деформации структуры белка. Большинство этих сшивок возникает при превращении е-аминогруппы лизина в альдегидную под действием лизилоксидазы. В ходе этой реакции образуются уникальные функциональные группы, которые могут либо димеризоваться посредством альдольной конденсации с образованием поперечных связей между остатками, либо реагировать с немодифицированным лизином. Каждая такая ре-
I Вариабельная I область Константная область Участки, определяющие комплементарность
РИС. 2.10. Модель дисульфидных связей в иммуноглобулине G. Индексы ЬиНотносятся к легким и тяжелым цепям соответственно, буквы С и К обозначают области, аминокислотная последовательность которых сохраняется или, наоборот, значительно меняется у различных видов IgG. Каждая выделенная область последовательности сворачивается в домен с независимой третичной структурой, и, таким образом, результирующая структура напоминает белок, состоящий из 12 субъединиц, хотя он представляет собой одну ковалентную единицу (рис. Ирвинга Гейса).
68
ГЛАВА 2
О
Н
С
С
о
Н N
С—С—N —
к
(СН 2 ) 2
Н'
(СН2)2
сн 2
Л.
°\ ни с с
Н Н
о II
сн 2
(СН 2 ) 2
I сн 2 I сн 2
HN
0=(
—С О
/
HJN СН? СН2 (СН2)2 —С О
С
N
Н
Н
Альдегидные производные
I
Глутамин NHJ
(сшивка в фибрине)
О Н Н Альдольная сшивка
(СН2)2
—С—С—N —
(сн 2 ) 2
С—С — N —
/
нн I I
н н
Шиффово основание О Н Н
II
I I
— С—С
С—N — Н Н
Остатки лизина
N
Лизиннорлейцин (сшивка в коллагене или эластине) О Н Н —С—С—N—
(СН 2 ) 2
(СН2)2
СН 2
СН2
сн 2
NH
N
НСН
СН
СН2
СН2
(СН2)2
(СН2)2 С—С
II
О
С— С — N — N
I IН
Н
О
Н
Н
РИС. 2.11. Некоторые пути образования лизиновых сшивок в коллагене, эластине и фибрине. А. Лизины могут соединяться друг с другом, с гистидином или с глутамином, образуя соответственно димер, тример и тетрамер. Б. Схематическая иллюстрация того, как внутримолекулярные и межмолекулярные связи могут скреплять между собой молекулы в волокнах коллагена.
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
N Н
н
о
С I
С
сн 2 ГИСТИДИН
С
N
II
НСЧ HN Н
о=с
С
(СН2)2
СНг
II
.СУ
NH
N
н
С—С
н
(СН2)2
С—Н
с=о
Гистидин-альдольная сшивка
Десмозин (сшивка в эластине)
сн2—сн2—с—н
69
70
ГЛАВА 2
акция может в свою очередь порождать цепочку новых реакций, которые часто приводят к объединению трех или четырех аминокислотных боковых цепей. Некоторые из известных поперечных лизиновых связей в коллагене и эластине показаны на рис. 2.11. На том же рисунке показаны сшивки между глутамином и лизином, которые встречаются в фибрине, белке, участвующем в свертывании крови. Эти поперечные связи, по-видимому, стабилизируют сгустки крови. ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА и АНАЛТГЗ ВТОРИЧНОЙ
И ТРЕТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ Знание первичной структуры необходимо для многих биохимических и биофизических исследований. Ярким примером этого является определение трехмерной структуры белка при помощи рентгеноструктурного анализа. Этот метод редко обладает достаточно высоким разрешением, чтобы можно было увидеть отдельные атомы. Часто рентгеноструктурные данные оказываются недостаточно ясными даже для того, чтобы можно было однозначно проследить ход полипептидной цепи по всей структуре белка. Однако при обычном разрешении, как правило, просматривается большая часть полипептидного скелета, а некоторые большие боковые группы видны довольно отчетливо. В таких случаях одновременное использование данных об аминокислотной последовательности и кристаллографических карт электронной плотности может позволить найти единственно возможную структуру, соответствующую тем и другим данным. Более подробно этот метод рассматривается в гл. 13, но необходимо помнить, что обычно метод рентгеноструктурного анализа не обладает достаточным разрешением, чтобы была видна вся последовательность аминокислот. Следует также учитывать, что данные об этой последовательности сами часто содержат ошибки. Совместное использование обоих методов значительно расширяет их возможности. Не менее важна роль данных о первичной структуре при анализе результатов, полученных любыми методами, использующими химическую модификацию или введение в молекулу метки. Если известно только то, что сшивающий реагент провзаимодействовал с остатками лизина или что спектроскопическая метка присоединилась именно к лизину, то это еще мало о чем говорит. Можно ли считать образовавшийся продукт единственным? Дает ли это какую-либо информацию об укладке пептидной цепи с образованием трехмерной структуры? Зная последовательность и идентифицировав с помощью пептидных карт меченые пептиды, можно определить специфические места химической модификации. Например, на рис. 2.12 показан полипептидный скелет бычьей рибонуклеазы А. Химическое исследование белка показывает, что 1,5-дифтор-2,4-динитробензол сшивает остатки лизина 7 и 41. Неожиданная чувствительность белка к модификации иодуксусной кислотой приводит к любопытному заключению: гистидины 12 и 119 модифицируются по принципу «или-или»; это можно объяснить тем, что они располагаются в активном центре фермента недалеко друг от друга. Сопоставляя сведения о последовательности и обе группы химических данных, легко видеть, что плоское расположение пептидной цепи исключается. Молекула должна быть уложена в пространстве более сложным образом, и результаты рентгеноструктурного анализа действительно подтверждают это.
ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА И ПРЕДСКАЗАНИЕ ВТОРИЧНОЙ И ТРЕТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ Иногда анализ последовательности аминокислот может привести к более определенным выводам о структуре белка. В настоящее время существуют методы, позволяющие с некоторой (хотя и не очень большой) степенью достоверности предсказывать расположение разных типов вторичной структуры вдоль цепи. Они подробно обсуждаются в гл. 5.
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
71
РИС. 2.12. Пептидный остов рибонуклеазы из поджелудочной железы быка. Показаны две пары остатков, которые располагаются в третичной структуре вблизи друг друга или потому, что они скреплены сшивкой (Lys7 и Lys41), или потому, что они непосредственно участвуют в функционировании активного центра (His12 и His 119 ). (Рисунок Ирвинга Гейса.) Современное состояние этого вопроса иллюстрирует рис. 2.13, где сравниваются результаты применения нескольких различных подходов к определению структуры аденилаткиназы. Была предпринята попытка предсказать по аминокислотной последовательности расположение вдоль цепи участков вторичной структуры трех типов: а-спиралей, /3-слоев и /3-изгибов. Результаты сравнивались с действительной трехмерной структурой, полученной методом рентгеноструктурного анализа. Как видно из рис. 2.13, расположение аспиралей и /3-изгибов довольно хорошо предсказывается несколькими различными методами, тогда как точность локализации /3-слоев все еще оставляет желать лучшего. Наиболее заманчиво использовать информацию об аминокислотной последовательности для предсказания третичной структуры белковой молекулы, а отсюда, возможно, и ее функции. Некоторые принципы и положения, применяемые для решения этой задачи, изложены в гл. 5. Здесь мы приведем один результат, который иллюстрирует современное состояние этой области исследования. На рис. 2.14 проведено сравнение трехмерной структуры ингибитора трипсина из поджелудочной железы быка, определенной методом рентгеноструктурного анализа, с модельной структурой, построенной на основании данных об аминокислотной последовательности, в которых использовалась информация о термодинамике взаимодействий между аминокислотными остатками. Исходной считалась вытянутая конформация. Чтобы проследить процесс укладки молекулы, рассчитывали силы, действующие между различными остатками, полученные из данных об энергии их взаимодействия. В результате достигли неплохого качественного согласия между
72
ГЛАВА 2 Изгибы
Рентген Объед. предск.
Рентген Объед. предск. Спираль
1
10 20
30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190
РИС. 2.13. Распределение типов вторичной структуры в аденилаткиназе. Указаны области, которые, согласно предсказаниям различных теоретических методов, считаются /3-слоями, Д-изгибами или а-спиралями. На рисунке представлены также области вторичной структуры, определенные методом рентгеноструктурного анализа, и результаты, полученные при объединении всех теоретических подходов. Предсказания были сделаны до того, как стала известна структура белка. [G.E.Shultz et al., Nature, 250, 140 (1974).]
экспериментом и теорией. Расчеты действительно предсказали образование глобулярной структуры. Более того, полученное в результате вычислений расположение некоторых участков пептидного скелета оказалось весьма сходным с действительным. Это предсказание получилось не столь успешным, чтобы можно было вообще отказаться от трудоемких методов рентгеноструктурного анализа белков. Все же результаты расчетов достаточно близки к реальности, чтобы с оптимизмом относиться к перспективе развития подобных теоретических подходов. Некоторые последовательности аминокислот содержат повторы. Как показано в примерах на рис. 2.15, эти области могут быть различными по протяженности; это сразу наводит на мысль о возможности существования в трехмерной структуре элементов симметрии или псевдосимметрии. Длинные повторы могут привести к образованию в молекуле либо симметричных областей, либо множественных доменов, которые могут быть похожими на субъединицы субъединичных белков. Короткие повторы могут указывать на наличие спиральных сверхспиральных структур — типа структур, обнаруженных в коллагене и других фибриллярных белках.
73
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
10
50
50
Рис. 2.14. Схематическое изображение пептидного остова ингибитора трипсина из поджелудочной железы. А. Изображение структуры, полученной методом рентгеноструктурного анализа. Б. Структура, найденная методом минимизации конформационной энергии молекулы, причем в качестве начальной принималась развернутая цепь (за исключением спирали, расположенной на С-конце). [M.Levitt, A.Warshel, Nature, 293, 693 (1975).]
АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ БЕЛКА И АНАЛИЗ ЕГО ФУНКЦИЙ Данные об аминокислотной последовательности могут оказаться чрезвычайно информативными в тех случаях, когда что-то уже известно о функции белка, особенно если он взаимодействует с другими крупными биополимерами. Два примера белков такого рода (гистон и гликофорин) приведены на рис. 2.16. Гистоны прочно связываются с ДНК. Мы уже указывали, что большое число положительно заряженных аминокислот в гистонах, по-видимому, необходимо для стабилизации взаимодействия с таким полианионом. Как видно из рис. 2.16, А, у N-конца последовательности находится необычный кластер положительно заряженных аминокислот. Напрашивается предположение, что этот участок имеет вытянутую конформацию и может спиралеобразно закручиваться вдоль довольно протяженного участка ДНК. Остальная часть белковой молекулы имеет обычный аминокислотный состав и, по-видимому, свертывается с образованием типичной глобулярной структуры. Гликофорин — мембранный белок, выделяемый из эритроцитов. Химические данные наводят на мысль, что он является трансмембранным белком, т.е. одна его часть находится вне клетки, другая — внутри, а третья как бы «прошивает» мембрану. Известно, что остатки Сахаров мембранных гликопротеидов почти всегда находятся на наружной
10 20 NH,'-Ala-Tyr-Val-lle - Asn-Asp-Ser-Cys-lle-Ala-Cys-Gly-Ala-Cys-Lys-Pro-Glu-Cys-Pro-Val-Asn-lle - Gln-Gln-Gly-Ser-lle— Tyr-Ala-lle-Asp-Ala-Asp-Ser-Cys-lle-Asp-Cys-Gly-Ser-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Pro-Val-Gly-Ala-Pro-Asn-Pro-Glu-Asp-COO 30
40
A S
1 Gly 16 Gly 31 Gly 46 Gly 61 Gly 76 Gly 91 Gly 106 Gly
5 Tyr Asp Glu Lys Ser Ala Pro Ser Gly Pro Arg Gly Pro Gin Gly Phe Gin Gly Ala Ser Gly Pro Met Gly Lys Asn Gly Asp Asp Gly Gin Arg Gly Pro Pro Gly Thr Ala Gly Leu Pro Gly Leu Asp Gly Ala Lys Gly
10 Gly Val Ser Val Pro Qly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Qly Glu Pro Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Pro Gin Gly Ala Arg Gly Met Lys Gly His Arg Gly Asn Thr Gly Pro Ala Gly
15 Pro Met Ala Pro Glu Pro Pro Pro Arg Pro Leu Pro Phe Ser Pro Lys
РИС. 2.15. Аминокислотная последовательность двух белков, включающая повторы. А. Ферредоксин P. aerogenes; мы видим значительное сходство первых и последних 27 аминокислот. Восемь цистеиновых групп образуют координационные связи с атомами железа (см. рис. 2.7 и рис. 2.8). Б. Фрагмент коллагена. За исключением трех остатков вблизи N-конца каждый третий остаток является глицином. Большое число пролиновых остатков не допускает образования а- и (3-структур и приводит к формированию спирали полипролинового типа. Периодическое расположение остатков глицина способствует образованию трех спиралей, которые, в свою очередь переплетаясь, образуют трехцепочечную коллагеновую спираль.
10 20 Ac-Ser-Gly-Arg-Gly-Lys-Gln-Gly-Gly-Lys-Ala-Arg-Ala-Lys-Ala-Lys-Thr-Arg-Ser-Ser-Arg
ДНК
30 40 Ala-Gly-Leu-Gln-Phe-Pro-Val-Gly-Arf-Val-His-Arg-Leu-Leu-Arg-L>s-Gly-Asn-Tyr-Ala50 60 Glu-Arg-Val-Gly-Ala-Gly-Ala-Pro-Val-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Glu-Tyr-Leu-Thr-Ala70 80 Glu-Ile-Leu-Glu-Leu-Ala-Gly-Asn-Ala-Ala-Arg-Asp-Asn-Lys-Lys-Thr-Arg-He-Ile-Pro90 100 Arg-His-Leu-Gln-Leu-Ala-Ile-Arg-Asn-Asp-Glu-Glu-Leu-Asn-Lys-Leu-Leu-Gly-Lys-Val110 120 Thr-Ile-Ala-Gln-Giy-Gly-Val-Leu-Pro-Asn-Ile-Gln-Ala-Val-Leu-Leu-Pro-Lys-Lys-Thr129 Glu-Ser-His-His-Lys-Ala-Lys-Gly-Lys-COOH A РИС. 2.16. Аминокислотные последовательности двух белков, обнаруживающие некоторые особенности структуры и функции. (Все заряженные остатки показаны цветными буквами.)/!. Гистон 2а теленка. Первые 36 остатков содержат 12 положительных зарядов и ни одного отрицательного. Эта область, по-видимому, взаимодействует с отрицательно заряженными фосфатами двойной спирали ДНК.
-Ser - Thr-Thr - ^ЯК-Val-Ala-Met-His-Thr -Thr -Thr - Ser - Ser - Ser-Val-Ser-Lys.Ser-Tyr( G l y ) 10 20 :но)
СНОСНО
K1A He-Ser-Ser-Gin-Thr-Asn-Asp_Thr-His-Lys_Arg_Asp_Thr-Tyr-Ala-Ala-Thr-Pro-Arg-Ala 30 40 His- Glu_Val- Ser- GliL ii e _ Ser- Val- Arg.Thr- Val-Tyr- Pro- Pro- Glu. Glu_ Glu.Thr-Gly-Glu 50 60
Arg-Val-Gln-Leu-Ala-His-(p r 'o ) ) -Phe-Ser-Glu.i|e_Glu.iie-Thr-Leu- ( % e a ) ) -|Q^' ) ) -Phe-Gly-Val 70 80
Met-Ala-Gly-Val-Ile-Gly-Thr-lle-Leu-Leu-lle-Ser-Tyr-Gly-Ile-Arg_Axg_Leu-lle-Lys 90 100
ШШ&
Lys_Ser-Pro-Ser-A^)_Val-Lys.p r o-Leu-Pro-Ser-Pro-Asp-Thr-Asp.Val-Pro-Leu-Ser-Ser 110 120
Val- Glu_n e _ Glu_ Asn-Pro-Gl u -Thr-Ser130
РИС. 2.17. Б. Гликофорин эритроцитов человека. СНО обозначает остатки, к которым олигосахариды присоединяются или О-гликозидной связью (кружок), или N-гликозидной связью (квадратик). Гликофорин является трансмембранным белком. Сахара должны располагаться на внешней стороне клетки. Длинный участок, состоящий из неполярных остатков от Не73 до Не95, по-видимому, проникает через мембрану, и поэтому есть основания предполагать, что С-конец находится внутри клетки. [M.Tomita, V.T.Marchesi, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 72, 2914 (1976).]
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
77
поверхности клетки. Поскольку эти остатки сконцентрированы на N-концевой половине последовательности гликофорина, именно данная часть белковой молекулы должна быть внешней. Тот участок гликофорина, который находится внутри мембраны, должен быть неполярным (гидрофобным), чтобы мог образоваться тесный контакт с липидами. При исследовании первичной структуры гликофорина выявляется в высшей степени необычный участок из 20 аминокислотных остатков, имеющих достаточно высокое сродство к липидам. Если бы этот участок находился в развернутой конформации, цепочка оказалась бы достаточно длинной, чтобь! протянуться через весь липидный бислой. В таком случае короткая С-концевая полярная область должна находиться внутри клетки. Заметим, что переход к полярным остаткам с обеих сторон неполярной области довольно резок. Можно предположить, что молекула жестко фиксирована в липидном бислое и что любые ее перемещения вне или внутрь клетки связаны с большими энергетическими затратами. СРАВНЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ РОДСТВЕННЫХ БЕЛКОВ В гл. 1 говорилось, что данные об аминокислотной последовательности становятся более убедительными и информативными, когда мы имеем возможность сравнивать последовательности структурно и функционально родственных молекул. Здесь приводится несколько таких примеров для белков. Наиболее полная информация об аминокислотных последовательностях накоплена для гемоглобинов и родственных им гемсодержащих белков — миоглобинов. Сравнение последовательностей в пределах одного вида с очевидностью указывает на то, что между а- и /3-субъединицами гемоглобинов и миоглобином существует четкое соответствие. По-видимому, у какого-то предкового организма был только один глобиновый ген, который после многократных дупликаций оказался представленным в виде нескольких копий. В результате дивергенции этих новых генов в ходе эволюции и появилось все множество глобинов. Анализируя последовательности либо «на глаз», либо более тщательно с помощью компьютера, можно построить генеалогическое древо или, говоря эволюционным языком, филогенетическое древо. Миоглобин в большей степени отличается от а- и /3-цепей гемоглобина, чем эти цепи друг от друга. Следовательно, ген миоглобина, вероятно, должен был обособиться от гена гемоглобина до дивергенции а- и /3-цепей (рис. 2.17). Вместо /3-цепей в гемоглобине человеческого плода содержатся две 7-цепи. Сравнение последовательностей показывает, что 7-чепь значительно больше похожа на /3-цепь, чем на а-цепь гемоглобина взрослого человека. В гемоглобине взрослого человека присутствует в небольшом количестве еще один представитель семейства гемоглобинов, имеющий две 5-цепи вместо /3-цепей. Они еще больше похожи на /3-цепь. Таким образом, у человека есть по меньшей мере три гена на каждую гемоглобиновую цепь /3-типа в гемоглобине. Поскольку все эти белки являются функциональными, имеет смысл сравнить между собой их последовательности. Вероятно, изменяющиеся от последовательности к последовательности остатки не являются для белка функционально важными. Сравнительный анализ можно расширить, сопоставляя цепи гемоглобина человека и других позвоночных. Можно предположить, что при дивергенции организмов в ходе эволюции различие последовательностей аминокислот в гемоглобине также будет увеличиваться. Действительно, гемоглобин человека по своей аминокислотной последовательности очень близок к гемоглобину гориллы, но значительно отличается от гемоглобина кенгуру и совершенно не похож на гемоглобин лягушки или карпа. Существуют два способа оценки полной картины аминокислотных последовательностей, учитывающей их структуру и функции. Человек, склонный к обобщениям, будет утверждать, что все эти белки, будучи гемоглобинами, выполняют одинаковые функции. Сравнивая аминокислотные последовательности в гемоглобинах многих биологических видов, можно заметить, что только часть остатков тождественна для всех видов
ГЛАВА 2
78
Плод
а- Гемоглобин
Кролик Макак' ез - Гемоглобин Ч е л о в е к Р : Человек, —т б-цепь
7- Свинья Кенгуру
Миоглобин Человек, у - цепь Лягушка
35
РИС. 2.17. Филогенетическое древо, построенное путем сравнения последовательностей аминокислот в гемоглобинах и миоглобине. Длина каждой ветви пропорциональна числу точечных мутаций, необходимых для перехода одной последовательности в другую. Точки ветвления обозначают положения возможных общих предков. Числа на каждой ветви древа указывают число мутаций, приходящееся на каждые 100 остатков. Л. Полное семейство глобинов кенгуру. Б. Подробное представление 0-цепей гемоглобинов и белков родственных ему типов у различных видов. [M.O.Dayhoff et al. Atlas of protein sequence and structure, vol. 5 (Silver spring, Md.: National Biomedical Research Foundation, 1972).]
(рис. 2.18). Константные области, вероятно, абсолютно необходимы для обеспечения функции гемоглобина. На самом деле это не так просто, как кажется, и в функционировании этого белка принимают участие и другие структуры. По-видимому, во многих случаях пары (или большие группы) аминокислот меняются таким образом, что при этом третичная структура белка остается прежней, несмотря на изменение его первичной структуры. Распространяя это обобщение далее, можно заключить, что а- и 0-цепи имеют почти одинаковую структуру. При сравнении аминокислотных последовательностей обеих цепей число идентичных функционально необходимых остатков еще в большей степени уменьшается. Оно может стать еще меньше, если учесть также последовательности в миоглобинах. Здесь надо, однако, иметь в виду, что гемоглобин функционирует как агрегат субъединиц, тогда как миоглобин агрегатов не образует. Поэтому уменьшение числа неизменных остатков при совместном анализе последовательности а- и /3-цепей и миоглобина может пролить свет на то, какие остатки важны для контактов субъединиц в гемоглобинах. Ученые, интересующиеся деталями механизма функционирования гемоглобина, рассматривают филогенетическое древо с другой точки зрения. Хотя все эти белки — гемоглобины, требования, предъявляемые к ним различными организмами, неодинаковы. Например, холоднокровные и теплокровные организмы существуют при различных темпе-
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
79
ратурах; организмы, обитающие на большой высоте, нуждаются в особых свойствах кислородсвязывающих белков; рыбам нужно наполнять свой плавательный пузырь и т.д. Аминокислотные последовательности как раз и могут стать золотой жилой при изучении процессов перестройки структуры белка, происходящих в ответ на индивидуальные потребности различных организмов. Другое семейство близкородственных белков образует несколько сериновых эстераз. К ним относятся протеолитические ферменты химотрипсин, трипсин, эластаза и тромбин. На рис. 2.19 сравниваются аминокислотные последовательности этих четырех белков. Сравнение выявляет соответствие не только в аминокислотной последовательности, но и в расположении многих дисульфидных поперечных связей, а также в локализации очень реакционноспособного остатка серина, который, как известно, находится в активных центрах всех этих ферментов. Можно предположить, что такое сходство первичных структур должно приводить к сходству их третичной структуры. Именно это и представлено на рис. 2.20, где изображены три из четырех упомянутых выше белков. Следует, однако, обратить внимание на то, что, несмотря на сходство последовательностей, структуры и механизмов функционирования, позволяющее рассматривать эти четыре белка как родственные в эволюционном смысле, все же считать их тождественными никак нельзя. Различием аминокислотных последовательностей, и особенно пространственных структур, можно объяснить некоторые особенности субстратной специфичности этих белков и механизма их действия. МУТАНТНЫЕ БЕЛКИ; ГЕМОГЛОБИН Основываясь на результатах анализа аминокислотных последовательностей мутантных белков, можно попытаться идентифицировать остатки, играющие важнейшую роль в функционировании белков. Поскольку большинство мутаций приводит к определенным функциональным нарушениям, их изучение дает возможность понять специфические эффекты аминокислотных замен в белке. Однако выбор мутантных белков, с которыми можно работать, несколько ограничен. Если мутация доминантна и детальна, то (по определению летальной мутации) организм не способен давать потомство или даже жить достаточно долго, чтобы можно было выделить мутантный белок. Поэтому наиболее вредные мутации реально наблюдать нельзя. Когда дело касается бактерий, то имеются методы, позволяющие обойти эти трудности, например использование температурозависимых мутаций, которые летальны при одних температурах, но допускают развитие при других. К сожалению, проводить генетические эксперименты на высших организмах как с практической, так и с этической точки зрения значительно труднее. В результате многочисленных исследований обнаружено несколько сотен мутантных гемоглобинов человека. На рис. 2.18 суммированы данные для /3-субъединиц ряда этих мутантных форм. При тщательном изучении рисунка видно, что мутации локализованы в участках структуры, в которых меньше межвидовых различий. Это можно было предсказать заранее, если считать, что определенные остатки необходимы для нормального функционирования гемоглобина. Подробный анализ фенотипа каждой мутантной формы очень полезен для понимания молекулярных основ многих болезней человека, однако он выходит за рамки этой книги. Особого упоминания заслуживает лишь гемоглобин S. Он был первым обнаруженным мутантным гемоглобином. В нем происходит замена всего одной аминокислоты в шестом положении /3-цепи (глутаминовая кислота заменяется на валин). Этот мутантный белок интересен тем, что он в отличие от остальных широко распространен среди жителей Центральной Африки. У гомозигот по гену гемоглобина S развивается особая болезнь — серповидноклеточная анемия. В условиях пониженного парциального давления кислорода в крови, особенно в капиллярах, у носителя такого гена изменяется форма эритроцитов — они превращаются из двояковогнутых дисков в вытянутые нерегулярные структуры. Такие «серповидные» клетки, задерживаясь в капиллярах, препятствуют нор-
80
ГЛАВА 2
Аминокислотные замены
Мутации
Инвариантные О Отсутствие мутаций #2
"
О 3-4
0 >1 в инвариантном центре
РИС. 2.18. Структура /3-цепи гемоглобина человека, иллюстрирующая контакты с соседними субъединицами. А. Показаны остатки, которые могут варьировать в (3-подобных цепях обычных гемоглобинов позвоночных. Заметим, что большинство инвариантных остатков располагается вблизи кармана, связывающего гем, или в области контакта а,- и (32-субъединиц, где в процессе оксигенации происходят изменения четвертичной структуры. Очевидно, эти области имеют важные структурные особенности, требующие уникальности остатков. С другой стороны, тесный контакт лизоцима (см. рис. 2.33), супероксиддисмутазы (см. рис. 2.43) и вариабельного домена иммуноглобулина (см. рис. 2.43). Джейн Ричардсон вывела ряд полезных обобщений из известных структур /3-слоев, в том числе следующие. 1. Все перекрестные соединения (за исключением одного) являются правыми (соединения, расположенные выше плоскости /3-слоя, изображены идущими в направлении от верхнего левого угла в правый нижний; соединения, расположенные ниже плоскости /3-слоя, направлены в противоположную сторону). [J. S. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 2619 (1976).] 2. Параллельная /3-структура наблюдается только в слоях, состоящих из пяти и большего числа цепей. 3. Структуры, состоящие только из параллельных или только из антипараллельных слоев, предпочтительнее, чем смешанные структуры. 4. Топологические узлы не встречаются. Ни один из слоев, изображенных на рисунке, не завяжется в узел, если его потянуть за N- и С-концы в разные стороны. 5. N-концевой участок цепи с большей вероятностью, чем С-концевой, располагается в середине слоя. Это согласуется с представлением о том, что свертывание цепи может начинаться до окончания синтеза пептидной цепи.
Схематические структуры, изображающие /3-слои, расположены в порядке возрастания числа цепей сверху вниз, а в порядке убывания отношения доли антипараллельной структуры к доле параллельной — слева направо. На рисунке используются следующие сокращения: LDH — лактатдегидрогеназа, STI — ингибитор трипсина из соевых бобов, Lys — лизоцим яичного белка, T4Lys — лизоцим фага Т4, HiPIP — высокопотенциальный железосодержащий белок, PTI — ингибитор трипсина из поджелудочной железы, LADH — алкогольдегидрогеназа из печени, Therm — термолизин, Rhod — роданаза, Adenyl К — аденидаткиназа, cyt b5 — цитохром by Hexo К — гексокиназа, Rubr — рубредоксин, PGK — фосфоглицериаткиназа, Chym — химотрипсин, Con А — конканавалин A, PGM — фосфоглюкомутаза, ImmC — константный домен иммуноглобулина, ImmV — вариабельный домен иммуноглобулина, Cu.ZbSOD — Си, Zn-суперксиддисмутаза, TIM — триозофосфатизомераза, CPDH — глицеральдегидрофосфатдегидрогеназа, CarbAnh — карбоангидроза, S. Nucl — нуклеаза из S. aurens, RNase — рибонуклеаза поджелудочной железы. [J. Richardson, Nature, 268, 495 (1977).]
105
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
•п
Ферредоксин, ЬДН, STI и.т.д
Lys, T4Lys, HiPIP
LDH,,, LADH,,,
SNucl 5
Эрабутоксин
Rubr, STI
Chym i,»
RNase
Therm,,
LADH,,
Cyt.b5
Папаин
AdenylK
Therm,
HexoKu
Тиоредоксин. Флаводоксин
LDH,, LADHi, PGK,
HexoK
PGM
Con A,.
Субтилизин
ConA,
Преальбумин
Карбоксипептидаза
OPDH,
GPDHI,
Carb Anh
TIM
106
ГЛАВА 2
пакетами. Не существует и определенных способов упаковки элементов соседних вторичных структур, за исключением, может быть, очень специальных последовательностей аминокислотных остатков. Основной вопрос, возникающий при изучении третичной структуры, состоит в том, как ее рассматривать — как единое целое или как состоящую из отдельных доменов.Можно привести примеры обоих вариантов. В большинстве рассмотренных выше структур пептидная цепь пересекает структуру во всех направлениях много раз. Однако в термолизине (см. рис. 2.34) структуру можно разбить на две совершенно независимые области. Важно выяснить, могут ли эти отдельные области существовать в виде стабильных свернутых структур в отсутствие остальной части белка. Если это реально, то можно исследовать процесс их реассоциации и, следовательно, непосредственно получить некоторые сведения о специфических взаимодействиях и силах, участвующих в стабилизации третичной структуры. Наличие доменов может отражать ход образования третичной структуры из развернутой пептидной цепи. Быстрее всего собираются в свернутую или упорядоченную структуру участки протяженной полипептидной цепи, расположенные по соседству в ее первичной структуре, так как они с большей вероятностью могут оказаться сближенными в пространстве при произвольной конформации белка. В гл. 21 мы обсудим количественные данные о динамике процесса свертывания белков. Здесь мы хотим только отметить, что если структура белка делится на домены, то последние представляют собой важные промежуточные состояния в процессе свертывания. Возможно также, что белок претерпевает конформационные изменения, при которых внутренняя структура доменов остается неизменной, а их относительное расположение заметно изменяется. Таким образом,белок, состоящий из доменов, будет скорее иметь гибкую структуру, чем белок, в котором различные участки скрепляются между собой перекрещивающимися полипептидными цепями. (В качестве примера можно привести структуру иммуноглобулина G, изображенную на рис. 1.9 и 2.10). ОКРУЖЕНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ ОСТАТКОВ Данные о третичной структуре белков дают ключ к решению вопроса о силах, которые должны участвовать в их стабилизации. Здесь мы сформулируем несколько общих правил, которые были выведены при изучении многих известных третичных структур белков. В гл. 5 приведены независимые физико-химические доказательства, объясняющие или подтверждающие эти правила. Последние нельзя считать абсолютными, и исключения из них обычно связаны с функциональными свойствами. 1. Конформации отдельных пептидных групп лежат в областях наибольшей стабильности, предсказываемых на основании исследований модельных соединений и полуэмпирических энергетических расчетов. Образование вторичной и третичной структур редко происходит за счет нарушения локальной стабильности небольших групп остатков. В тех случаях, когда это имеет место, разумеется, меняются свойства этих остатков, а иногда возрастает и их роль в катализе и других функциях. Но в целом тенденция отдельных остатков находиться в их наиболее устойчивых состояниях оказывает сильнейшее влияние на то, какими могут быть вторичная и третичная структуры. 2. Заряженные остатки должны располагаться на поверхности молекулы белка (см., например, рис. 2.31). Мы уже упоминали о том, насколько невыгодно погружение внутрь молекулы зарядов. На поверхности молекулы распределение зарядов у разных белков может быть различным. Иногда оно оказывается достаточно однородным. Области чередующихся положительных и отрицате: »ных зарядов обладают меньшей энергией, чем кластеры подобных зарядов. Однако распределение зарядов в кластерной форме встречается довольно часто, и следует ожидать, что такие третичные структуры более подвержены разрушению при пониженной ионной силе.
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
107
Анизотропные распределения зарядов приводят к появлению у молекулы большого дипольного момента. Весьма вероятно, что определенные распределения зарядов играют важную биологическую роль, способствуя связыванию других больших или малых молекул или, возможно, приводя к предпочтительным ориентациям в сильных электрических полях, например полях, существующих между обеими сторонами некоторых мембран. Кулоновские взаимодействия являются самыми дальнодействующими из сил, которые участвуют в сильных взаимодействиях, преобладающих в биологических системах, и, вероятно, можно найти примеры того, как эти силы специфически используются для достижения определенных функциональных целей. В ряде случаев заряды обнаруживаются внутри белковой молекулы, при этом они неизменно оказываются на остатках, непосредственно участвующих в процессе катализа или выполняющих другие функции. 3. Гидрофобные неполярные остатки в основном должны располагаться внутри третичной структуры глобулярного водорастворимого белка. Надо отметить, что это правило нельзя сформулировать без некоторых оговорок. Пример, в котором оно безусловно выполняется, представлен на рис. 2.32. Но даже здесь локализация остатков не так сильно ограничена, как в случае заряженных групп. Потери энергии при экспонировании нескольких неполярных остатков не так уж велики. В олигомерных белках контакты между субъединицами часто образованы неполярными остатками. Однако отдельная субъединица может быть достаточно стабильной сама по себе и иметь частично гидрофобную поверхность, необходимую для взаимодействия с другими субъединицами. Исключения из этого правила могут иметь место в случае белков, сильно взаимодействующих с липидами. Хотя мы до сих пор не располагаем данными ни об одной третичной структуре мембранного белка или липопротеида, полученными при достаточно высоком разрешении, позволяющем увидеть отдельные боковые группы, тем не менее было бы весьма удивительно, если бы эти молекулы не имели значительного числа экспонированных наружу гидрофобных остатков. Известно несколько белков, которые совершенно нерастворимы в воде, но хорошо растворимы и функционально активны в органических растворителях. Их структуру можно было бы сравнить со структурой обычного белка, вывернутой наизнанку. Заряженные группы, по-видимому, находятся внутри, взаимодействуя друг с другом и используя для стабилизации в случае необходимости связанные ионы. Гидрофобные остатки концентрируются на поверхности и участвуют во взаимодействиях с растворителем. 4. Фактически все доноры и акцепторы водородных связей находятся там, где они могут образовывать эти связи. Они либо располагаются на поверхности, образуя водородные связи с водой, либо встраиваются в области упорядоченной вторичной структуры, либо локализуются там, где они могут образовывать внутренние водородные связи в третичной структуре (это хорошо видно на рис. 2.33). Если бы не образовывалось достаточно большое число водородных связей, это могло бы оказаться слишком невыгодным энергетически. Поэтому полярные боковые группы стремятся расположиться на поверхности, так как там существует ббльшая вероятность найти партнера для образования водородной связи. Внутренние полярные боковые цепи часто формируют водородные связи друг с другом или же с ближайшими участками полипептидного скелета. Заметим, однако, что большинство третичных структур белков известно только из результатов рентгеноструктурного анализа. При этом разрешение, с которым получены рентгеновские данные, редко бывает достаточно высоким, чтобы можно было увидеть водородные связи. При интерпретации этих данных мы склонны преувеличивать число водородных связей, поскольку, исходя из современных представлений, мы думаем, что такие связи должны быть. Некоторые детали организации третичных структур могут стать более ясными, если изучить распределение в них типов боковых групп, встречающихся в а-спиралях. Если спираль располагается вблизи поверхности, то из самой ее структуры ясно, что боковые цепи будут направлены попеременно внутрь и наружу белка, если двигаться вдоль цепи.
108
ГЛАВА 2
144
140 ala
136 glfc
hr 123
I Гидрофобные остатки
Гидрофильные остатки
) Остатки с промежуточными свойствами
РИС. 2.36. Расположение Я-спирали в третичной структуре /3-субъединицы гемоглобина человека. Гидрофобные боковые цепи в основном локализуются вблизи поверхности Я-спирали, там, где она контактирует с А-, Е-, и Fспиралями, расположенными на рисунке перед ней.
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
109
Таким образом, можно ожидать, что распределение полярных и неполярных боковых групп для такой спирали будет периодическим, что и было обнаружено в действительности. В качестве примера на рис. 2.36 изображена одна из спиралей гемоглобина. Заметим, что на N-конце цепи находятся остатки пролина. Такое расположение пролинов часто встречается в белках. Может создаться впечатление, что их роль заключается в том, чтобы не позволить такой стабильной вторичной структуре, как а-спираль, продолжаться неограниченно. Полипептидная цепь в /3-слое может поворачивать назад сама с помощью /3-изгибов, и поэтому такая структура менее склонна выходить за пределы глобулы. Боковые цепи /3-слоев направлены вверх и вниз от плоскости слоя. Если слой расположен вблизи поверхности, то распределение боковых аминокислотных цепей обычно тоже можно предсказать.
ПЛОТНОСТЬ УПАКОВКИ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В СВЕРНУТЫХ МОЛЕКУЛАХ БЕЛКА Насколько плотно упакованы остатки в белке? Действительно ли он является почти сплошной структурой или же в нем есть пустые или заполненные растворителем области? В третичной структуре белковых молекул иногда находили несколько больших полостей. В миоглобине есть область, хорошо соответствующая размерам атома ксенона; это объясняет тот факт, что белок связывает один эквивалент этого инертного газа. Рибонуклеаза S имеет несколько полостей, которые, по-видимому, пусты. В лизоциме и ахимотрипсине имеется еще больше полостей, вероятно, заполненных растворителем. В кристаллической структуре а-химотрипсина было найдено 16 внутренних молекул воды'. Однако визуально большинство белков выглядит довольно плотными структурами, как это видно на рис. 2.29 и 2.30. Для изучения этого вопроса можно провести количественный анализ. Один из подходов заключается в использовании точных'координат атомов для вычисления плотности упаковки. Если считать, что каждый атом представляет собой сферу, радиус которой равен вандерваальсову радиусу атома, то плотность упаковки выражается отношением суммы объемов атомов в какой-либо области к полному объему, занимаемому данной областью. Это отношение для наиболее плотного расположения сфер составляет 0,74, для бесконечных цилиндров — 0,81 и для сплошного твердого тела — 1,00. Определения плотности упаковки вблизи поверхности недостаточно точны, и результаты, полученные для небольшого числа рассматриваемых атомов, не вполне одинаковы. Однако если белок разделить на средние по величине объемы и рассчитать плотность упаковки, как это показано на рис. 2.37, то обнаруживается ряд интересных особенностей. Значение средней плотности упаковки во внутренних областях рибонуклеазы S примерно равно 0,75, что лежит в пределах, найденных для кристаллов типичных небольших органических молекул. Например, для кристаллов Gly—Phe—Gly плотность упаковки равна 0,749. Однако она немного колеблется, даже если усреднение проводится по достаточно большим областям белка. Надо отметить, что в областях, соседних с бороздкой активного центра, плотность упаковки невелика, тогда как в областях, расположенных рядом (т.е. дальше от активного центра), она намного превышает среднюю величину. Это может играть определенную функциональную роль. Более рыхлые области обладают большей гибкостью, что допускает внутренние движения, повороты боковых групп и т.д. Области с высокой плотностью упаковки, по всей вероятности, обладают очень большой 1
Не следует путать полости и внутренний растворитель, рассматриваемые здесь, с полостью и внутренним растворителем между белковыми молекулами в кристалле. Такой растворитель в большом количестве находится между молекулами белков в кристаллах, однако он не рассматривается как часть третичной структуры.
по
ГЛАВА 2
Ось X
Сечение, проходящее через Y = -5,7 А РИС. 2.37. Сечение, проведенное через центр рибонуклеазы S из поджелудочной железы быка (фрагмент содержит остатки 21 — 124). Структура помещена в кубическую решетку с длиной ребра ячейки 5,6 А. В каждой клетке указаны количество атомов в соответствующем кубе и средняя плотность упаковки этих атомов (т.е. доля объема куба, которую они занимают). Цветом показаны примерные зоны равной плотности. Чтобы очертить поверхность молекулы, указан гипотетический слой молекул растворителя, обозначенных буквой S. [F. M. Richards, J.Mol.Biol., 82, 1(1974.)]
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
Ш
жесткостью. Таким образом, распределение плотности упаковки позволяет установить, какие типы движения возможны для структуры в целом. Оно указывает на некоторую подвижность остатков в области активного центра, а также на то, что в значительных перемещениях должны участвовать жесткие участки структуры. Перемещаясь как целое, эти области могут передавать конформационные изменения на значительные расстояния. • ОБЪЕМ И П Л О Т Н О С Т Ь БЕЛКОВ Суммируя вандерваальсовы объемы всех атомов, можно рассчитать молекулярный объем белка. Получаемый таким методом объем равен 16 900 А 3 для рибонуклеазы S (если пренебречь остатками, недостаточно хорошо идентифицированными с помощью рентгеноструктурного анализа) и приблизительно 18 100 А 3 для лизоцима. Эти величины на 10% больше объемов, измеренных в растворах и полученных из данных о молекулярных массах и экспериментально определенных плотностей (см. гл. 10). Экспериментально найденные плотности р (г/см3) дают основание предполагать, что связанная вода имеет ту же плотность, что и остальная. Такое допущение было бы вполне приемлемо, но оно противоречит рентгеновским данным. Поверхность белковой молекулы несет много зарядов, а заряженные группы, как известно, тесно связываются с водой, увеличивая ее плотность. Этот электрострикционный эффект составляет 16 А 3 на заряженную группу. Рибонуклеаза S несет 24 заряда, что может уменьшить кажущийся объем в растворе на 400 А 3 на молекулу белка. Этот эффект мог бы объяснить уменьшение кажущегося объема белка, но, как мы видим, он недостаточно велик, чтобы полностью компенсировать разницу в объемах. Проблема еще усложняется, если плотность р рассчитывается по координатам, найденным из рентгеновских данных, как функция расстояния от центра масс белка. Результаты, полученные для нескольких белков, приведены на рис. 2.38, где дается р для сферических оболочек с радиусами, увеличивающимися на 2 А. На очень малых расстояниях величины плотности сильно флуктуируют, поскольку объемы сферических слоев (и соответственно число атомов, которые они содержат) малы. Затем функция выходит на плато, где р почти не зависит от расстояния. Для различных малых белков это соответствует удалению на 8-16 А от центра масс. При большем радиусе плотность постепенно падает, что связано с неправильной формой поверхности каждого белка. В этих расчетах молекулы растворителя не учитываются. В простых случаях, моделируя белки однородными твердыми телами, мы должны получить постоянную плотность, соответствующую действительной плотности белка в растворе. Однако она меньше на 10-25%. Это различие оказывается даже больше рассмотренного выше. Существуют три возможных объяснения. Не только влияние электрострикции, но и другие эффекты могут увеличивать плотность молекул воды, связанных на поверхности белков. Если считать, что белки окружены водной оболочкой толщиной в одну молекулу, то она должна была бы иметь плотность от 1,35 до 1,60 г/см3, чтобы устранить различия между расчетной и наблюдаемой плотностью. Эти значения кажутся слишком большими, особенно если учесть, что плотность остальной воды приблизительно равна 1,0 г/см 3 . Второе возможное объяснение состоит в том, что внешние области белка могут иметь большую плотность, чем внутренние. Из рис. 2.37 такого заключения сделать нельзя, но надо учитывать, что гидрофобные остатки, имеющие в среднем меньшую, чем у полярных остатков, плотность, стремятся расположиться внутри молекулы белка. Наличие плато при р от 1,1 до 1,2 г/см3 легко можно было бы объяснить тем, что имеется внутренняя область, состоящая из одних лишь углеводородоподобных соединений. В действительности при этих значениях р число пептидных цепей может быть даже несколько большим, однако для полного согласия с экспериментально полученными для растворов зна-
ГЛАВА 2
112
о Карбоксипептидаза • Химотрипсин о Лизоцим 1,5
0,5 О
8 16 24 Радиус наружной оболочки сферического слоя, А
РИС. 2.38. Зависимость средней плотности сферического слоя от радиуса этого слоя для нескольких белков. Центры сферических слоев 3находятся в центре масс соответствующего белка. При расчете плотности, выраженной в г/см , учитывались все атомы, кроме атомов растворителя. [W. Kauzmann, Nature, 248, 447, (1974).]
чениями р плотность внешних областей белка должна была бы достигать 1,50-1,55 г/см3. Это слишком большая величина по сравнению с известными плотностями кристаллических пептидов. Третье объяснение заключается в том, что внутри белка в действительности находится больше молекул воды, чем следует из данных рентгеноструктурного анализа. При этом для разрешения противоречий между экспериментом и теорией требуется от 100 до 300 молекул воды на одну молекулу белка, что кажется веьма маловероятным. Таким образом, мы приходим к заключению, что каждый из этих трех механизмов, вероятно, вносит лишь некоторый вклад в решение проблемы. Этот пример служит для иллюстрации тех трудностей, с которыми мы сталкиваемся, пытаясь ответить даже на относительно простые вопросы, касающиеся третичной структуры белка.
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
113
ДИНАМИЧНА ИЛИ СТАТИЧНА ТРЕТИЧНАЯ СТРУКТУРА? Приведенные выше расчеты плотности упаковки указывают на необходимость получения информации о гибкости различных областей белка и его проницаемости для растворителя или других малых молекул. Общих ответов на эти вопросы не существует, но некоторые методы в принципе позволяют проникнуть в суть проблемы. Движения ароматических аминокислотных боковых цепей можно обнаружить спектроскопическими методами, например, по данным о поляризации флуоресценции. В большинстве случаев результаты, полученные для этих остатков, соответствуют ожидаемым скоростям вращения белковой молекулы в целом; это дает основание предполагать, что они жестко закреплены в молекуле. Однако колебательные движения с малыми угловыми амплитудами могут в таких экспериментах и не проявляться. Прикрепленные снаружи меченые молекулы обычно столь же жестко связаны, но не ясно, не препятствует ли их взаимодействие с поверхностью белка нормальным движениям. Метод ЯМР, особенно с использованием изотопа 1 3 С, является мощным средством исследования движения определенных боковых цепей, так как атомы некоторых типов, например е-углеродные атомы лизина, можно регистрировать независимо. Вообще говоря, результаты указывают на то, что боковые цепи на поверхности имеют значительную вращательную свободу. Намного меньшей свободой, если она вообще есть, обладают остатки внутри молекулы. Этот результат согласуется с данными рентгеноструктурного анализа. Боковые цепи на поверхности молекул в белковых кристаллах кажутся разупорядоченными, что можно объяснить их вращательным движением. Основная масса молекулы представляется весьма жесткой, но следует помнить, что имеющиеся данные рентгеноструктурного анализа редко получаются с достаточно высоким разрешением, чтобы можно было с уверенностью об этом говорить. Оценка проницаемости белка или доступности отдельных его остатков — очень сложный вопрос. В общем он ставится следующим образом: могут ли малые молекулы проникнуть внуть белка и участвовать в химических реакциях или изменять спектроскопические свойства внутренних остатков? Для различных малых молекул иногда получаются разные результаты. Например, молекулы кислорода, по-видимому, способны достигать внутренних областей белка и тушить флуоресценцию большинства (или даже всех) остатков триптофана в глобулярном белке. Ионы иода могут достичь только некоторых из них. Вместе с тем и те и другие одинаково эффективны в качестве тушителей флуоресценции, если третичная структура белка разрушена денатурирующими агентами. Неизвестно, обусловлено ли различие во взаимодействиях с нативными структурами зарядом иодида, его большими размерами или более тонким локальным влиянием окружения на процесс тушения. Целый ряд ковалентных химических модификаций боковых аминокислотных цепей позволяет установить, что третичная структура защищает многие остатки, обладающие обычной реакционной способностью в свободных аминокислотах или в коротких пептидах. Если данную боковую группу можно модифицировать, то, вообще говоря, мы вправе заключить, что она экспонирована в растворитель. Если реакция протекает без потери функциональной активности, можно быть уверенным в том, что она не вызываег серьезных нарушений структуры белка. Однако если остаток не способен вступать в реакцию, опыт показывает, что нельзя с уверенностью заключить, что он погружен в структуру. Локальное окружение, даже на поверхности белка, может существенно отличаться от обычного водного окружения. Расчеты динамики белковых структур дают многообещающий способ исследования гибкости и проницаемости белковых молекул (см. пример, приведенный в Дополнении 2.4).
114
ГЛАВА 2
Дополнение 2.4
РАСЧЕТЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИНАМИКИ БЕЛКОВ Динамика третичных структур белков была подробно рассмотрена в недавних работах М. Карплюса. Он использовал метод молекулярной динамики для определения подвижности остатков в структуре ингибитора трипсина, выделенного из поджелудочной железы быка. В этом методе силы, действующие на остатки, определяются из предварительно рассчитанной потенциальной функции (типа описанной в гл. 5). Сила, приходящаяся на каждый атом или остаток, равна
где Vjj — потенциал взаимодействия между i-м иу-м атомами. Для свободных атомов или молекул массой т , каждая сила, согласно закону Ньютона, вызывает ускорение а,: F,- = /л,а,В расчетах методом молекулярной динамики оба уравнения решают совместно для всех 4. В. Ансамбли с кубической симметрией. Показаны некоторые оси симметрии в кубе и в структурах с тетраэдрической (Г), октаэдрической (О) и икосаэдрической симметрией. (Рисунки Ирвинга Гейса.)
124
ГЛАВА 2
жать ни плоскостей зеркального отражения, ни инверсионных осей. Единственно возможными для белков операциями точечной симметрии являются вращения. Все возможные способы расположения субъединиц, обладающие только осями вращения, распадаются на три класса групп точечной симметрии (рис. 2.44). 1. Аксиальная симметрия. Эти структуры обладают только одной осью вращения. Пусть п — число субъединиц; тогда поворот на 360/л градусов переводит структуру саму в себя. Следовательно, все центры субъединиц можно расположить в вершинах правильного многоугольника. Группы точечной аксиальной симметрии обозначаются либо п, либо Сп. Фактически в олигомерных белках проявляется симметрия С 2 и С 3 .
Дополнение 2.5
ОПЕРАЦИИ СИММЕТРИИ Операциями симметрии являются повороты, параллельные переносы или другие преобразования, при которых объект не изменяется. Операции точечной симметрии представляют собой особый класс преобразований, которые не только оставляют объект неизменным, но и оставляют по крайней мере одну точку в объекте неподвижной. Например, поворот на 180° меняет местами две тождественные субъединицы, и его можно представить следующим образом:
Ось симметрии Ci Такому повороту соответствует ось симметрии С 2 . Это пример операции точечной симметрии, поскольку точка, расположенная на оси, остается при этом преобразовании неподвижной. Симметричное расположение двух субъединиц можно получить с помощью операции зеркального отражения. Это также пример операции точечной симметрии, поскольку часть объекта, расположенная на самой плоскости, остается в результате отражения неподвижной.
Зеркальное отражение
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
125
Операция инверсии соответствует одновременному повороту вокруг оси симметрии С 2 и отражению в плоскости, перпендикулярной этой оси. Это также является операцией точечной симметрии. Неподвижной остается при этом единственная точка, находящаяся на пересечении оси вращения и плоскости отражения. Эта точка называется точкой инверсии.
Инверсия Группе точечной симметрии данного объекта соответствует совокупность всех операций симметрии, которые оставляют объект неизменным. Полностью асимметричному объекту соответствует группа симметрии, называемая группой Е. К такой группе симметрии относится только тождественное преобразование, которое оставляет объект неизменным и неподвижным. Другие примеры операций точечной симметрии приводятся в тексте. К операциям симметрии относятся параллельные переносы, а также возможные вращения и некоторые другие операции. Они называются операциями пространственной симметрии. В качестве примера рассмотрим простой параллельный перенос вдоль оси.
Параллельный перенос В результате комбинации параллельного переноса с вращением получается винтовая ось. Она образует спираль или «ленту». На рисунке изображено сочетание вращения вокруг оси симметрии С 2 с параллельным переносом вдоль этой оси. Дополнительный материал по вопросам, связанным с симметрией, можно найти в гл. 13. Операции симметрии прекрасно изложены в книге П. Эткинса. [P. W. Atkins, Physical Chemistry, San Francisco, W. H. Freeman and Company, 1978. Имеется перевод: Эткинс П. Физическая химия. В 2-х т. — М.: Мир, 1980.]
Винтовая ось
126
ГЛАВА 2
Таблица 2.8 СУБЪЕДИНИЧНЫЙ СОСТАВ БЕЛКОВ, СОДЕРЖАЩИХ БОЛЕЕ ОДНОЙ СУБЪЕДИНИЦЫ1) Молекулярная Молекулярная Число субъеди- масса субъединиц масса белка ниц
Белок
Источник
Фактор роста нервов Лютеинизирующий гормон
Мышь Овца
Ингибитор химотрипсина Супероксиддисмутаза Гемоэритрин Галактокиназа
Гемоглобин
Картофель E.coli Phascolosoma Человек Млекопитающее
Tu-Ts-комплекс
E.coli
65 000
Малатдегидрогеназа Авидин Тропонин
Крыса Куриное яйцо Кролик
66 300 68 300 80 000
Щелочная фосфатаза Прокарбоксипептидаза А
E.coli. Крупный рогатый
86 000
скот
88 000
E.coli Дрожжи
100 000 102 000 110000
Серил-тРНК-синтетаза Нуклеозиддифосфокиназа Тубулин
Поросенок
Лактатдегидрогеназа Триптофансинтетаза
E.coli
и и
26 518 27 322 39 39 40 53 64
000 500 600 000 500
140 000 148 000
2 1 1 4 2 3 2 2 2 1 1 2 4 1 1 1 2
13 259 12 500 14 830 9800 21 600 12 700 27 000 16000 16000 41500 28 500 37 500 18000 37 000 24 000 20 000 43 000
1 2 2 6 1 1 4 2 2
40 23 50 17 56 53 35 45 28
000 000 000 000 000 000 000 000 700
2. Диэдрическая симметрия. Этот тип симметрии встречается при наличии хотя бы одной оси вращения С 2 , перпендикулярной другой оси вращения л-го порядка. Минимальное число субъединиц в олигомере равно 2л, где л-любое натуральное число. По принятой номенклатуре, эти группы точечной симметрии обозначаются Dn, где л-наибольший порядок оси вращения, имеющейся в группе. Другая номенклатура предлагает точное обозначение всех осей симметрии. Например, группе D2 соответствует обозначение 222, поскольку наличие двух взаимно перпендикулярных осей второго порядка автоматически порождает третью, перпендикулярную им ось второго порядка (см. рис. 2.44). Группе D3 присвоено обозначение 32, группе D4 — 422. 3. Кубическая симметрия. Правильный куб имеет три оси симметрии четвертого порядка (проходящие через центры противоположных граней), четыре оси третьего порядка (вдоль диагоналей, связывающих противоположные вершины) и шесть осей второго порядка (проведенных через центры противоположных ребер). Точечные группы вращения, относящиеся к кубической симметрии, имеют по крайней мере четыре оси третьего порядка. К ним относятся тетраэдрическая, октаэдрическая и икосаэдрическая группы. На рис. 2.44 приведены некоторые оси симметрии, которые могут иметь место в подобных структурах.
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
127
Таблица 2.8 Молекулярная Молекулярная Число су&ьеди- масса субъедимасса белка ниц ниц
Белок
Источник
lac- Репрессор Метионин-тРНК-синтетаза Репликаза фага Q/3
То же ««
160 000 170 000 205 000
Ариламидаза Лейцинаминопептидаза Изоцитратдегидрогеназа Аспартаттранскарбамоилаза
Человек Свинья Дрожжи E.coli
223 500 255 000 300 000 310000
Нитрогеназа
Clostridium
ЗЗОООО
T.aquaticus Neurospora Е. coli
355 000 360 000 400 000
Лошадь Е. coli Крупный рогатый скот Куриное яйцо Arenicola E.coli
443 000 592 000
Енолаза Глутаминсинтетаза РНК-полимераза (кор)
Апоферритин Глутаминсинтетаза Изоцитратдегидрогеназа Овомакроглобулин Гемоглобин Пируватдегидрогеназный комплекс
670 000 650 000 2 850 000 5 0 0 0 000
4 2 1 1 1 1 6 4 8 6 6 2 4 2 8 4 2 1 1 24 12
40 000 85 000 70 000 65 000 45 000 35 000 38 100 63 500 39 000 ЗЗООО 17 000 59 500 27 500 50 700 44 000 90000 39 000 155 000 165 000 18 500 48 500
16 2 48 24 24 24
41000 325 000 54 000 91000 65 000 56 000
»|'D. W. Darnall, I. M. Klotz, Arch. Biochem. Biophys., 166,651 (1975).
Простое тетраэдрическое расположение четырех тождественных субъединиц не обладает законченной тетраэдрической (Г) симметрией. Это связано с тем, что отдельная субъединица в вершине тетраэдра асимметрична и поэтому оси симметрии С3 отсутствуют. Таким образом, тетраэдр, в вершинах которого расположены субъединицы, имеет только симметрию Dr Для построения системы субъединиц, имеющей симметрию Т, необходимо по крайней мере 12 тождественных мономеров, образующих треугольники с локальной симметрией С 3 в каждой вершине тетраэдра. Аналогично, октаэдрическое расположение отдельных субъединиц обладает только симметрией Dy Для построения законченной октаэдрической (О) группы симметрии в каждой вершине должны располагаться четыре субъединицы, образующие квадрат. Для реализации этой симметрии требуется 24 субъединицы. Заметим, что октаэдр имеет четыре оси третьего порядка, три оси четвертого порядка и шесть осей второго порядка, т.е. тот же набор элементов симметрии, что и истинный куб. Для создания системы субъединиц с кубической симметрией также необходимо 24 субъединицы; образуя треугольники, они располагаются по три субъединицы в каж-
128
ГЛАВА 2
Асимметричный
Симметричный
6 симметричных
3 симметричных 6 асимметричных
6 симметрич ных 6 асимметричных
РИС. 2.45. Симметрия контактов между субъединицами. А. Схематическое изображение симметричного и асимметричного контактов. Б. Три структуры с симметрией Dx, причем каждая содержит различные наборы симметричных и асимметричных контактов. Плотность упаковки субъединиц возрастает, полное число контактов увеличивается от 6 до 12. (Рисунок Ирвинга Гейса.)
дой вершине куба. Сходным образом можно показать, что законченная икосаэдрическая симметрия потребует наличия 60 тождественных субъединиц. Существование столь большого числа тождественных субъединиц, необходимых для построения групп кубической симметрии, практически маловероятно. Несколько возможных примеров приведено в табл. 2.9. Однако большинство олигомерных белков, обладающих хоть какой-то симметрией, попадают в классы либо с аксиальной, либо с диэдрической симметрией. Структурный смысл групп точечной симметрии становится более понятным при рассмотрении реальных контактов между поверхностями субъединиц. Существуют два возможных типа контактов между субъединицами: симметричный и асимметричный (рис. 2.45). Первый предполагает наличие двух тождественных контактных областей в субъединицах, связанных осью симметрии С2. Асимметричный контакт предполагает, что контактные области в субъединицах различны и, следовательно, эти области для каждой субъединицы остаются доступными для образования олигомеров более высокого порядка. Таким образом, при асимметричных контактах, естественно, образуются ленты и спирали. Если шаг спирали равен нулю и геометрия контакта правильна, последовательные асимметричные контакты создают олигомеры с аксиальной симметрией, порядок которой больше двух. Иногда различным типам субъединичных контактов может соответствовать одна и та же группа точечной симметрии. На рис. 2.45 представлены три группы из шести субъединиц, причем каждая из последних обладает симметрией Dv Однако одна структура имеет
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
129
Таблица 2.9 ПРИРОДА КОНТАКТОВ МЕЖДУ СУБЪЕДИНИЦАМИ 1 '
Белок
а-Химотрипсин Конканавалин А
Симметрия Контактирующие Число вандервааль- Число водо- Число пар области совых контактов родных связей ионов
С
А
443
9
В
6
1 -
II к А
57 -
2
-
11 к В
142
14
ПкС
174
14
6 _
а
ПО
5
80
1
98
5
69 -
1 -
2
D
2
Гемоглобин Оксигемоглобин
С
2
А
— — -
Дезоксигемоглобин
С
2 а
1аг
Инсулин
"А
1 2
-
-
ОР
111
8
1 -
OQ
99
2
1
1) A. Lilias, M. Rossmann, Ann. Rev. Biochem., 43, 485 (1974).
два различных набора из трех симметричных контактов. Вторая, с более плотной упаковкой, имеет три симметричных и шесть одинаковых асимметричных контактов, образующих два треугольника. Последняя группа упакована наиболее плотно. В ней имеются 12 контактов: шесть асимметричных и шесть симметричных — по три с двумя разными типами симметрии. Данные о симметрии весьма важны при описании субъединичных структур. Однако при очень подробном исследовании могут наблюдаться небольшие, но важные в функциональном отношении отклонения от строгой симметрии даже для номинально идентичных субъединиц. Это может проявляться в виде небольших трансляционных сдвигов одной из субъединиц в четвертичной структуре или в некоторых неэквивалентных изменениях в третичной структуре. Хотя большинство белков, состоящих из множества субъединиц, образует симметричную систему, мы не можем a priori установить, что для этого требуется. Например, гексокиназа, выделенная из дрожжей, состоит из двух тождественных субъединиц, образующих димер без точечной симметрии: два ее мономера связаны друг с другом винтовой осью, но геометрия их такова, что спиральная цепочка из многих субъединиц не образуется (рис. 2.46). АНАЛИЗ ЧИСЛА СУБЪЕДИНИЦ И ПОЛИПЕПТИДНЫХ ЦЕПЕЙ Наиболее достоверную информацию о расположении субъединиц в четвертичной структуре дают рентгеноструктурные и электронно-микроскопические данные. Для этого часто оказывается достаточным выполнить рентгеноструктурные исследования с низким
ГЛАВА 2
130
вращение Параллельный перенос
РИС. 2.46. Структура гексокиназы из дрожжей, полученная при низком разрешении. Две субъединицы связаны винтовой осью. Многогранник в правой субъединице представляет собой глюкозу. (Рисунок предоставлен Т. Стейцем.) разрешением. Применение для отдельных типов субъединиц специфических красителей, например соответствующих антител, значительно увеличивает информативность электронно-микроскопических данных. Электронно-микроскопические и рентгеноструктурные данные могут быть дополнены или даже заменены результатами, полученными с помощью более простых физических и химических методов. Например, с помощью гидродинамических методов, описанных в гл. 11 и 12, можно определить молекулярную массу интактной четвертичной структуры (Мд) с точностью 1—10% в зависимости от метода определения и присутствия неаминокислотных составных частей1. Во многих случаях можно предполагать, что каждая субъединица образована одной полипептидной цепью. Если это не так, то можно подобрать условия, при которых все индивидуальные полипептидные цепи в четвертичной структуре разделяются. Для разделения обычно используют сильные денатурирующие агенты, такие как додецилсульфат натрия, и обработку восстанавливающими агентами для разрушения всех дисульфидных связей. Часто все получающиеся остатки цистеина алкилируют иодуксусной кислотой или иодацетамидом для предотвращения восстановления дисульфидных связей при последующих измерениях. Методы разделения почти всегда дают возможность определить число различных типов полипептидных цепей. Например, с помощью электрофореза часто разделяют белки, которые абсолютно идентичны, за исключением единичных зарядовых различий. Молекулярную массу каждой из денатурированных цепей (Мс) можно определить гидродинамическими методами, хотя и не всегда с такой же точностью, как в случае нативных белков. В качестве альтернативы используют химические методы для определения числа аминокислот, приходящегося на один N-конец. Вместе с аминокислотным анализом это дает возможность достаточно точно определить молекулярную массу цепи. Непосредственный переход от молекулярной массы полипептидной цепи к молекулярной массе субъединицы не всегда прост. Если существуют цепи только одного типа,
'' В процессе измерений надо быть уверенным в том, что не происходит значительной диссоциации на субъединицы, поскольку при диссоциации величина ошибки может возрасти на порядок.
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
Ш
тогда — исключая те случаи, когда субъединицы состоят из нескольких цепей, сшитых между собой дисульфидными связями, — можно установить прямое соответствие между одной цепью и одной субъединицей. Число субъединиц тогда равно просто отношению М /Мс. Для белков, состоящих из полипептидных цепей нескольких типов, необходимо знать не только молекулярную массу каждой субъединицы, но и долю (ffc) по массе, приходящуюся на каждый тип цепи в четвертичной структуре. Тогда число цепей каждого типа будет равно W^Aq/Mc. Этот расчет похож на расчет при простом количественном анализе, но иногда именно здесь лежит основная трудность. Например, одна или несколько субъединиц могут быть нестабильными или может оказаться, что их трудно удержать в растворенном состоянии, и тогда такие субъединицы легче, чем другие, упустить из виду в процессе разделения или анализа. Если субъединицы состоят из полипептидных цепей нескольких типов, то после их разделения возникает вопрос: какую из цепей приписать той или иной субъединице? Обычно оказывается необходимым вернуться к нативной структуре и попытаться, используя более мягкие условия денатурации, разделить ее на субъединицы, сохраняющие нативную третичную структуру. Затем после очистки субъединиц определяют молекулярную массу и аминокислотный состав субъединиц каждого типа. Например, при добавлении сильного денатурирующего агента гемоглобин распадается на две а- и две /3-цепочки. В условиях мягкой денатурации образуются главным образом а/3-димеры; свободные а- и /3субъединицы встречаются очень редко. Основываясь на аминокислотном составе цепей, гемоглобин можно было бы назвать четырехсубъединичным белком, но в реакциях он ведет себя как белок, состоящий из двух субъединиц, каждая из которых представляет собой двухцепочечный а/3-димер. Весьма удобный химический метод анализа четвертичной структуры — сшивание субъединиц. В случае простых олигомеров, у которых все субъединицы тождественны, белок обрабатывают раствором с избытком молекул диметилсуберимидата: NH
NH
II
II
МеО - С - (СН2)6 - С - ОМе Эта молекула сшивает остатки лизина, сохраняя при нейтральном рН положительные заряды на месте положительно заряженной аминогруппы. В результате получается + NH 2
+NH2
R - (CH 2 ) 4 NH - С - ( C H ^ - С - NH(CH 2 ) 4 - R'
Многие из этих сшивок образуются в пределах одной субъединицы и остаются «невидимыми» для большинства аналитических методов. При образовании же сшивок между субъединицами формируются комплексы с молекулярной массой, превышающей массу одной субъединицы вдвое, втрое и т.д.; такие комплексы легко выявляются при обработке белка сильными денатурирующими агентами. Наибольшее полученное значение дает нижний предел числа субъединиц при условии, что раствор достаточно разбавлен, чтобы можно было пренебречь межмолекулярным взаимодействием. В ряде случаев белок находится в динамическом равновесии с диссоциированными субъединицами. Это осложняет применение описанных выше методов, но облегчает использование одного дополнительного метода, который иногда оказывается весьма эффективным. Допустим, что существуют два варианта гомоолигомерного белка. Это могут быть белки разных видов, белки из различных тканей [например, лактатдегидрогеназа из сердца (Н) и мышц (М) цыпленка] или нативный и химически модифицированный препараты. Здесь очень важно, чтобы эти два варианта белка несли разные заряды. Пусть для каждого вида белка будет наблюдаться, например, следующее равновесие: М4 ** 4М и Н 4 представлен на рис. 2.47. В более сложных случаях, например в случае белков с шестью идентичными субъединицами, выделение тримеров сразу же исключает возможность образования многих типов структур. Для агрегатов, состоящих из субъединиц различных типов, определение промежуточных ассоциатов становится особенно важным, поскольку оно может указать, какие субъединицы находятся в контакте друг с другом, хотя, разумеется, желательно иметь более прямые данные об их взаимном расположении. Один из возможных подходов заключается в более точном определении формы агрегата. В некоторых случаях для этого используют гидродинамические методы (особенно если есть указания на то, что изолированные субъединицы имеют приблизительно ту же третичную структуру, что и в интактном агрегате). Тогда можно анализировать только изменение гидродинамических свойств при сборке. В гл. 10 мы покажем, что это позволяет с достаточной точностью различать конформации гемоглобина типа линейной, плоской квадратной и тетраэдрической. Эта процедура, однако, не столь чувствительна, чтобы можно было отличить друг от друга промежуточные состояния. Второй подход заключается в применении сшивающих агентов. В случае сложных агрегатов анализ результатов сшивания часто бывает довольно сложным делом, поэтому удобнее использовать такие сшивки, которые при желании можно разорвать, как, например, сшивки, образуемые восстанавливающим реагентом бис-метилтиобутиримидатом NH NH II II МеО - С - (СН2)3 - S - S - (СН2)3 - С - ОМе
133
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
Линейное
Квадратное
Тетраэдрическое
/Ь РИС. 2.47. Некоторые возможные способы расположения субъединиц в гемоглобине, совместимые с осью симметрии С 2 (направление оси указано стрелкой или цветным кружком). Другие расположения можно получить, меняя местами а и /3-субъединицы. Справа от каждой структуры представлены типы возможных димеров, которых можно ожидать при сшивании гемоглобина «короткими» реагентами. Сохранение биологической активности при сшивании двух определенных субъединиц указывает на то, что они либо соприкасаются друг с другом, либо удалены друг от друга не более чем на длину сшивающего агента. Особенно надежный контроль — выделение специфически сшитой пары субъединиц и последующая сборка ее с немодифицированными субъединицами в четвертичную структуру, в которой все молекулы содержат одну и ту же поперечную связь. Если получившиеся молекулы сохраняют биологическую активность, значит, сшивка вряд ли вызывает какие-либо серьезные искажения структуры. На рис. 2.47 показаны примеры возможных сшивок для различных гипотетических структур гемоглобина. Очевидно, что многие структуры можно исключить, если получить хороший набор субъединиц, сшитых достаточно «короткими» реагентами. Ни один из перечисленных выше методов не может без привлечения дополнительной информации дать определенной модели расположения субъединиц даже для такого простого белка, как гемоглобин. Однако совместное использование всех трех методов позволяет исключить из рассмотрения большинство возможных структур. Существует несколько способов, позволяющих прямо измерять расстояния между определенными точками макромолекул в растворе. Для расшифровки взаимного расположения субъединиц полезными могут оказаться два из них — метод нейтронного рассеяния и метод изучения синглет-синглетного переноса энергии. Более подробно эти методы обсуждаются в гл. 8 и 14 соответственно. ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА АСПАРТАТ-ТРАНСКАРБАМОИЛАЗЫ Полезно рассмотреть один пример более подробно. Изучение аспартат-транскарбамоилазы (АТСазы) из E.coli весьма поучительно, поскольку эта молекула имеет наибо-
134
ГЛАВА 2
лее сложную субъединичную организацию из всех белков с известной третичной и четвертичной структурой. Фермент катализирует следующую реакцию: СООI 2
-OPO3-CO-NH2 +A s p ^ N H 2 - C O - N H - C H - C H 2 - C O O - + H O P O f - + H +
(2.4)
Это первый шаг в биосинтезе пиримидинов. Интересная особенность фермента заключается в том, что присутствие пиримидина СТР значительно снижает скорость реакции, катализируемой АТСазой, при любой постоянной концентрации аспарагина. Это ингибирование по механизму обратной связи представляет собой биологически важный регуляторный процесс. Интересно, что ингибирование происходит на первом этапе биосинтеза, благодаря чему предотвращается бесполезное (или даже вредное) накопление промежуточных продуктов реакции. Нативная АТСаза ведет себя при ультрацентрифугировании как частица с константой седиментации 11.3S. Комбинируя различные гидродинамические измерения, удалось получить независимыми методами значения мол. массы 3 • Ю'иЗЛ • 105. Это очень хорошее согласие между результатами1. Дж. Герхарт и Г. Шахман использовали л-гидроксимеркурибензоат для расщепления АТСазы на субъединицы. Этот реагент ковалентно связывается с сульфгидрильными группами цистеина. Данный метод обычно полезен в тех случаях, когда стерически недоступные в интактной четвертичной структуре сульфгидрильные группы в изолированных субъединицах оказываются экспонированными в растворитель. При ультрацентрифугировании при достаточно высоких концентрациях ртути были обнаружены два типа частиц. Они имели константы седиментации, равные 5.8S и 2.8S, отношение их масс приблизительно равнялось 2 : 1 . При исследовании изолированных субъединиц было сделано чрезвычайно интересное наблюдение. Субъединицы 5.8S обладали полной каталитической активностью в реакции (2.4), но не ингибировались СТР. Субъединицы 2.8S оказались лишены каталитической активности, но могли связывать СТР. Поэтому субъединицы первого типа были названы каталитическими (С), а второго — регуляторными (R). При смешивании субъединиц С- и R-типов регенерировались исходные 11,38-молекулы и восстанавливалась регуляторная функция СТР. Были определены молекулярные массы изолированных субъединиц. Мол. масса Ссубъединицы оказалась приблизительно равной 9,6 • 104, а R-субъединицы — 3 • 104. Затем нашли простейшую комбинацию молекулярных масс, согласующуюся с молекулярной массой нативной АТСазы и отношениями масс С- и R-субъединиц: 2С 4R
Общая масса Общая масса
1,92 1,20
• 105 • 105
Нативная C 2 R 4
Общая масса
3,12
•
105
Согласие с наблюдаемой молекулярной массой нативной АТСазы оказалось весьма хорошим; отношение масс субъединиц C:R по крайней мере качественно было также вполне приемлемо. Для обеспечения максимальной симметрии системы было выдвинуто предположение, что каждая каталитическая субъединица имеет два эквивалентных места связывания с R-субъединицей. Это должно означать, что каждая 5,8S-субъединица содержит 1 Эти величины получены из уравнения Шераги — Манделькерна и методом равновесного ультрацентрифугирования.
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
135
две одинаковые цепочки с мол. массой 4,8 • 104. Таким образом, был предположен цепочечный состав с4г4. Однако на самом деле ситуация оказалась более сложной. При исследовании первичных структур было обнаружено, что мол.масса r-цепочки равна 1,7 • 104, а сцепочки — 3,3 • 104. Это значит, что С-субъединица должна иметь состав с3 и общую мол.массу 9,9 • 104, aR-субъединица — составу и общую мол.массу 3,4 • 104. Комбинируя эти величины для получения молекулярной массы нативного фермента, находим: 2С 3R
Общая масса Общая масса
1,98 1,02
• •
10 5 1О5
Нативная C ? R,
Общая масса
3,00
•
105
Цепочечный состав фермента при этом будет с6г6. Такая модель также согласуется с имеющимися гидродинамическими данными, но значительно отличается от предложенной ранее. О справедливости этой модели свидетельствуют и два дополнительных экспериментальных факта. Было обнаружено несколько типов кристаллов АТСазы. В одной из форм фермент обладает осью кристаллографической симметрии третьего порядка, в другой — осью второго порядка, а в третьей, наиболее информативной форме молекула АТСазы имеет в кристалле 32(£>3)-симметрию. Это значит, что число субъединиц каждого типа в четвертичной структуре должно быть кратно шести. Химический анализ указывает на существование шести ионов Zn 2 + в интактной 11,3S-молекуле. Каждый ион Zn 2 + связывается с одной r-цепочкой. Эта информация наряду с данными о молекулярной массе убеждает в том, что цепочечный состав нативного белка соответствует формуле с6г6. Индуцированную ртутью диссоциацию АТСазы можно представить в виде с6г6 — 2с3 + Зг2. В ряде изящных экспериментов с растворами Шахман с сотрудниками задались целью выяснить, сохраняют ли отдельные с3- и г2-субъединицы свою целостность в нативной четвертичной структуре. Некоторые из полученных ими результатов иллюстрирует рис. 2.48. Для доказательства того, что 5,88-субъединица состоит из трех цепочек, с3-субъединица была обработана янтарным ангидридом; при этом образовался с^ — вариант субъединицы с измененным зарядом. В водном растворе между с3- и с|формами не устанавливалось равновесия, приводящего к образованию гибридов; значит, субъединичная структура стабильна и мономер не способен к обмену. Обработка с3 и с| двухмолярным раствором гуанидингидрохлорида — сильного денатурирующего агента — приводила к образованию с- и с5-мономеров с коэффициентом седиментации 1.9S. Смешивание этих мономеров и последующее удаление денатурирующего агента приводило к образованию четырех продуктов реакции. Они были идентифицированы как с3, c2cs, cc| и с| (см.рис.2.48,/1). Для доказательства сохранения целостности двух с3-элементов в нативной структуре АТСазы с3- и с|-субъединицы смешивались с регуляторными субъединицами для восстановления нативной четвертичной структуры. Если бы в процессе сборки структура с3 нарушалась, то должно было бы наблюдаться семь продуктов: c6r6, c5csr6, с 4 с|г 6 и т.д. Методом электрофореза их, вероятно, разделить нельзя. Во всяком случае, используя значения биномиальных коэффициентов, легко показать, что чистые с6г6 и с|г 6 будут составлять только 1/64 часть общего количества продуктов. В действительности было обнаружено три разных продукта (в отношении 1:2:1), которые идентифицировали как с6г6, с 3 с 3 и с|г6. Отсюда следует, что отдельные с3-элементы структуры сохраняют свою целостность в четвертичной структуре белка (рис. 2.48,Б). Аналогичные эксперименты были выполнены на г-субъединицах. Анализ оказался более сложным по двум причинам. Обработанные ртутью г,-субъединицы не являются ста-
136
ГЛАВА 2
Продукты
Эксперимент
Интерпретация
—^ Изменений нет
}
+ с 3 водный раствор s
c + c 3 гуанидинхлорид, затем водный раствор
1 1 111
i
Нативная АТСаза с 3 + г2 с)+ г 2 с» + с 3 + Г
Гуанидинхлорид
I Н2О
с'
Сз
г
+O5 + Q Г
2
2
+ 1МУ) + > Нативная АТСаза с 3 + г2 с,+
г*
, быстрый с3+ г2+ г2 процесс с + преинкуб.
!1 ®°Сз СО
О)
1+Шл+Шл+(
+ Q5>
03
+ ккш
+ ШИ) + •
РИС. 2.48. Анализ расположения субъединиц аспартат-транскарбамоилазы (АТСазы), проведенный с помощью электрофореза смесей нативных и обработанных янтарным ангидридом субъединиц. На каждом рисунке, схематически изображающем реакцию, обработанные янтарным ангидридом субъединицы показаны в цвете. А. Субъединицы с3 и с| сохраняют свою целостность в водном растворе, однако диссоциируют при добавлении гуанидинхлорида. с3-субъединица содержит три с-цепи. Б. с, и с^ сохраняют свою целостность в процессе реконструкции нативной АТСазы, происходящей с добавлением г2. В нативной АТСазе содержатся два элемента с 3 . В. г2 и ^сохраняют свою целостность в процессе реконструкции, происходящей с добавлением с,, но обмениваются субъединицами при инкубировании в отсутствие Cj. В нативной АТСазе содержатся три г2-субъединицы. [Н.С. Schachman. In: The Harvey Lectures, vol. 68 (New York: Academic Press, 1974).]
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
137
РИС.2.49. Структура АТСазы, определенная методом рентгеноструктурного анализа. Каталитические субъединицы расположены выше и ниже регуляторных (цветных) субъединиц. Ось симметрии С} показана черным треугольником, стрелки указывают на положение осей симметрии С2. Более подробную информацию можно найти в литературе. [H.L. Monaco, J.L. Crowford, W.N. Lipscomb, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5276 (1978).] бильными димерами, а существуют в динамическом равновесии с мономерами. Поэтому первоначально полученная мол. масса для г2 была равна только 3 • 104. Для исходной формы, содержащей ион Z n 2 + , можно найти более стабильные условия, и действительная мол. масса, определенная методом ультрацентрифугирования, оказалась равной 3,38 • 104. Обработка отдельной г2-субъединицы янтарным ангидридом приводила к образованию г|, однако при добавлении с 3 реассоциация с образованием нативной структуры АТСазы не происходила. По-видимому, остаток лизина, весьма важный для сборки, отсутствовал. Чтобы обойти эту трудность, нативный с6г6-элемент был обработан янтарным ангидридом в надежде на то, что таким образом будет защищен важный остаток лизина. Метод оказался удачным, и выделенные таким образом г|-субъединицы оказались способными к реассоциации. Однако в условиях, в которых проходила сборка, все еще наблюдалась некоторая диссоциация г|- и г2-субъединиц. Поэтому, если они инкубируются вместе до добавления с3-субъединиц, картина электрофоретического разделения гибридов АТСазы будет размазанной, она будет представлять собой семь неразрешаемых полос. Если же вместо этого быстро смешать между собой г|-, г2- и с3-субъединицы, реассоциированный фермент проявится в виде четырех дискретных электрофоретических полос. Им соответствуют соединения c6r6, c 6 r 4 r 2 , c 6 r 2 r| и с 6 г|. Это указывает на то, что г2-элементы сохраняют свою индивидуальность в нативном ферменте,-и субъединичный состав последнего можно записать в виде (с3)2(г2)3 (рис. 2.48^8). Доказательством того, что два мономера в каждом г2-элементе контактируют между собой в нативной структуре, может
138
ГЛАВА 2
служить реконструкция активной АТСазы из чистых г2-димеров, ковалентно сшитых с бис-имидоэфиром. Структура АТСазы, определенная методом рентгеноструктурного анализа, схематически изображена на рис. 2.49. Как мы видим, эта структура прекрасно соответствует данным, полученным для растворов. Две каталитические субъединицы имеют симметрию С3 и по форме напоминают треугольник. Они не контактируют между собой, что объясняет, почему в отсутствие регуляторных субъединиц не происходит реакция 2с3 *? (с3)2- Аналогично этому область контактов между отдельными г2-субъединицами весьма незначительна. Это согласуется с тем обстоятельством, что не удалось обнаружить реакцию Зг2 ** (г2)3 в отсутствие каталитических субъединиц. Состоящая из нескольких слоев структура АТСазы (сэндвич) имеет в центре большую полость, заполненную растворителем. Это совершенно новая для нас особенность белковой молекулы. Из структурных данных можно заключить, что, кроме с3 и г2, некоторые совокупности субъединиц также должны быть стабильны или по крайней мере метастабильны. В самом деле, ассоциат с3(г2)3 можно приготовить, добавляя небольшие количества с3 к имеющимся в избытке г2-субъединицам. Хитрость здесь состоит в том, чтобы быстро «собрать» все субассоциаты с3 и не допустить осуществления более предпочтительной реакции с3 + с 3 (г 2 ) 3 — ( с зЫ г 2Ь- Когда небольшое количество г2 добавляется к имеющимся в избытке с 3 , образуются субагрегаты (с3)2(г2)2. Они, по-видимому, имеют структуру «сэндвича», у которого одна треть регуляторной части «откушена». Чистый ассоциат (с3)2(г2)2 быстро переходит в нативную АТСазу при добавлении соответствующего коли-
СТАБИЛЬНОСТЬ ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ГЛОБУЛЯРНЫХ СТРУКТУР Из рассмотренных нами примеров АТСазы и других объектов совершенно очевидно, что для понимания свойств, определяющих стабильность четвертичной структуры, надо изучить контакты между субъединицами. Число четвертичных структур, определенных с высоким разрешением методом рентгеноструктурного анализа, пока довольно ограниченно. Однако весьма интересно было бы узнать, что может служить ключом к разгадке сил, связывающих субъединицы между собой. В табл. 2.9 суммированы данные о типах взаимодействий между субъединицами, находящимися в контакте. Как видно из таблицы, всегда преобладают вандерваальсовы контакты. Это говорит о том, что между ассоциированными субъединицами существует хорошее стерическое соответствие. Выше для отдельных субъединиц белка была рассчитана плотность упаковки внутренних остатков. Аналогичный подход можно использовать для расчета плотностей межсубъединичных контактов. Результаты показали, что плотность упаковки боковых цепей на поверхностях контактирующих субъединиц почти такая же, как и в кристаллах аминокислот. Другими словами, поверхности белковых молекул в значительной степени комплементарны друг другу. Отдельный вандерваальсов контакт «стоит» только несколько сотен калорий. Поскольку на поверхности субъединицы насчитывается до 100 и более контактов, они могут внести суммарный вклад в энергию ассоциации субъединиц от 10 до 50ккал. Однако для того, чтобы соединить две субъединицы между собой, необходимо удалить имеющийся на их поверхности растворитель. Это в свою очередь вызывает потерю большого числа вандерваальсовых контактов. Таким образом, чистая вандерваальсова энергия ассоциации субъединиц слишком мала для того, чтобы полностью объяснять взаимодействие субъединиц.
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
139
Константа диссоциации для системы, состоящей из двух субъединиц, лежит в области 8 1б от 10~ до 10~ моль • л~'. Это соответствует свободной энергии димеризации, варьирующей от — 11 до — 22ккал/моль при 25°С. При связывании двух белковых субъединиц с образованием комплекса теряются три поступательные и три вращательные степени свободы, поскольку две субъединицы уже не могут двигаться независимо друг от друга. Многие боковые цепи, обладающие достаточной свободой перемещения на поверхности изолированной молекулы белка, оказываются неподвижными на поверхности субъединиц. Эти эффекты приводят к уменьшению энтропии, что должно компенсироваться энергией взаимодействия двух субъединиц, если образовавшийся комплекс стабилен. Оценки таких потерь энтропии в растворе не особенно надежны, но известно, что они варьируют от 70 до 100кал • град"' • моль"', что соответствует свободной энергии 20ЗОккал при комнатной температуре. Следовательно, для компенсации потери энтропии и получения при этом отрицательных значений AG0 для димеризации энергия взаимодействий остатков двух субъединиц должна варьировать от — 30 до — 50ккал • моль" 1 . Значительная часть этой энергии, по-видимому, обусловлена гидрофобными взаимодействиями, обсуждаемыми в гл. 5. Было подсчитано, что при тесном контакте двух белковых субъединиц от 1000 до 2000 А 2 площади поверхности, ранее доступной для растворителя, оказывается закрытой. Если эти комплементарные поверхности состоят в основном из неполярных гидрофобных остатков, то прекращение их контактирования с водой ведет к значительному выигрышу в энергии. По некоторым оценкам уменьшение площади контакта с водой на 1 А 2 дает выигрыш энергии 25 кал • моль"'. Это приводит к тому, что вклад гидрофобных взаимодействий составляет от — 25 до — 50 ккал • моль" ' на две белковые субъединицы. Таким образом, даже без детального рассмотрения специфических полярных контактов между двумя субъединицами можно качественно объяснить энергию их ассоциации в основном гидрофобными эффектами. Важную роль в образовании четвертичной структуры иногда играют элементы вторичной структуры. В алкогольдегидрогеназе (см. рис. 2.24), конканавалине А и инсулине образование пар субъединиц ведет к формированию протяженных /3-слоев. Как видно из табл. 2.9, в двух последних белках обнаружено довольно много водородных связей на поверхности контакта. Слои могут использоваться в областях контакта и иначе. В конканавалине А и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе одна поверхность слоя в изолированной субъединице находится на поверхности белка. Когда субъединицы соединяются вместе, их /3-слои, плотно укладываясь друг на друга, образуют компактный массив, в котором два слоя связаны осью симметрии второго порядка.
• СПИРАЛЬНЫЕ ЧЕТВЕРТИЧНЫЕ СТРУКТУРЫ До сих пор мы рассматривали белки с относительно простой четвертичной структурой. Большинство из приведенных выше положений справедливы и для более сложных агрегатов, таких как головки вирусов или спиральные образования из субъединиц, найденные в актиновых полимерах, микротрубочках, отростках из бактериофагов и еще более сложных структурах вроде поперечнополосатых мышц и волокон коллагена. Однако для таких образований из субъединиц необходимо учитывать несколько новых факторов. Для их оценки полезно начать с рассмотрения термодинамических аспектов образования линейных слоев субъединиц. Допустим, что ка — константа равновесия реакции присоединения одного мономера к концу цепи — не зависит от длины последней, как схематически показано на рис. 2.50.
140
ГЛАВА 2
И Т.Д.
fca
Линейная полимеризация
С". —А
и т.д.
Спиральная полимеризация РИС.2.50. Два основных механизма полимеризации субъединиц. На рис.2.51 схематически изображено предполагаемое поведение каждого из них в зависимости от концентрации белка. [F. Oosawa, М. Kasai, J. Mol. Biol., 4, 12 (1962).]
Тогда можно не учитывать непосредственные взаимодействия олигомеров или полимеров 1 . Относительные молярные концентрации М цепей как функции длины можно выразить просто через концентрации т свободного мономера: (М 2 ) =
кат2
(М3)=
(2.5)
Суммарная концентрация полимерных цепей (с длинами, равными 1 и большему числу) равна
СМ)-) = £ К~1т' = (\/ktt)
= т/(\ - kjri)
(2.6)
где использовалось то обстоятельство, что при 0 < х ^ 1 (т.е. т < к~') для бесконечной геометрической прогрессии Y.X? = х/(\ - х).
1 Например, образование тетрамера из двух димеров должно иметь ту же константу равновесия ка, что и образование димера из двух мономеров: (Л/4) = ка(М2? = къат*, что совпадает с уравнением (2.5).
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
141
Суммарное количество мономера, присутствующее в растворе, можно получить суммированием числа мономеров, содержащихся в цепях разной длины: 2, '*e '=1
m
-
< = 1
т
\,
ik
'a
m
'
(2-7)
/ = i
Суммирование в (2.7) легко выполняется, если учесть, что каждый член этой суммы есть [d/d{kjri)](kjny. Поскольку операции суммирования и дифференцирования коммутируют между собой, уравнение (2.7) принимает вид г ^сумм = mWd(kjn)\
„ л £ {kjnf
(2.8)
Мы уже вычислили эту сумму в уравнении (2.6). Поэтому т
сты = mWdfrjnW/n/{\ - к/п)] = т/(\ - kjn)2
(2.9)
отсумм обычно известно, и поэтому определение одного из параметров т или ка дает возможность вычислить другой. Затем, используя уравнение (2.5), легко рассчитать концентрации для всех длин. Среднечисленное значение степени полимеризации равно среднему числу мономеров, приходящемуся на одну цепь:
Нас интересует изменение величины в зависимости от тсумм — единственной переменной, которая непосредственно регулируется экспериментатором. По мере постепенного увеличения тсуим от нулевого значения величина т [как следует из уравнения (2.9)] медленно возрастает, и так же ведет себя [см. уравнение (2.10) и рис. 2.51, А]. При любом данном значении длины цепей могут быть распределены в широком интервале значений. Рассмотрим теперь простую модель спиральной полимеризации, представленную на рис. 2.50. На нем изображена спираль, содержащая три мономера на один виток, однако все последующие соображения справедливы для любой спирали. До тех пор, пока первый виток спирали не завершен, каждое прибавление мономера может быть описано одним и тем же значением константы ассоциации ка. Однако при начале заполнения второго витка каждый новый мономер образует контакты уже с двумя субъединицами, а не с одной. Поэтому свободная энергия такой ассоциации субъединиц изменится и процесс добавления новых субъединиц будет характеризоваться новой константой кь. Поскольку при формировании структуры контакты между субъединицами энергетически выгодны, то кь > ка. Интуитивно можно предположить, что данная модель приведет к представлению о кооперативной полимеризации. Цепи, длина которых больше одного витка спирали, могли бы расти за счет коротких цепей, поскольку для них константы связывания новых мономеров выше. Пусть у — длина самой короткой спирали с прочным связыванием мономеров. Тогда равновесие реакции полимеризации будет выражаться следующими уравнениями: Аг^т< для i<j 2
*£- *р
/+
W
( 2 п )
для / ^ j
В примере, показанном на рис. 2.50,./ = 4. Как и в случае линейной полимеризации, полезно рассчитать суммарную концентрацию мономеров белка.
142
ГЛАВА 2
сумм РИС.2.51. Физические особенности двух механизмов полимеризации, показанных на рис. 2.50. А. Линейная полимеризация. Концентрация свободного мономера т (сплошная линия) и среднечисленное значение степени полимеризации (пунктирная линия) монотонно возрастают с ростом суммарной концентрации белка w c y M M . Б. Спиральная полимеризация. Концентрация свободных мономеров т (сплошная кривая) линейно растет до критического значения концентрации и далее остается постоянной. До тех пор пока концентрация mQ м м не достигает критического значения, среднечисленное значение степени полимеризации (пунктирная кривая) равно 1, а затем резко увеличивается. Количество вещества в длинных полимерах (цветная кривая) равно нулю до достижения критической концентрации, а затем линейно увеличивается с ростом суммарной концентрации. [F. Oosawa, М. Kasai, J. Mol. Biol., 4, 12(1962).]
Ш сумг» м
=
£ /(М.)= £ /*Г1«' + */-2 £ i*^ + W
(2.12)
Второй член этого уравнения можно представить в удобной форме, если его умножить и 2 разделить на •£" : (2.13) будет огромной. О физических причинах этого уже говорилось. Как только достигается критическая длина у, дальнейшее присоединение мономеров к этому ассоциату становится более выгодным, чем создание нового, поскольку кь> ка. Следовательно, при спиральной полимеризации можно ожидать существования равновесия между длинными полимерами и свободными мономерами. Именно это наблюдалось в системах типа актина и микротрубочек. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Д Л И Н Ы СПИРАЛЬНЫХ АССОЦИАТОВ Описанный выше механизм спиральной полимеризации представляет собой простой способ образования больших агрегатов. И другие механизмы полимеризации, в которых вслед за стадией, неблагоприятной для инициации полимеризации, следуют благоприятные стадии быстрого роста агрегатов, могут приводить к такому же результату. Ни один из этих механизмов не дает узкого распределения полимеров по длинам, однако in vivo наблюдается узкое распределение для таких структур, как палочкообразные вирусы и хвостовые отростки бактериофагов. Эти структуры можно воссоздавать in vitro из их компонентов, причем кривая распределения не меняется. Поэтому, чтобы объяснить образование такой структуры, надо принимать во внимание только те макромолекулярные компоненты, которые обнаруживаются в уже полностью агрегированной структуре.
оооспэ i
СПЛ в РИС.2.52. Схематическое представление механизмов образования узкого распределения полимерных агрегатов по длинам (объяснение в тексте). А. Белок или другая молекула играет роль ядра агрегата. Б. Модель с постепенным увеличением напряжения. В. Сборка по принципу нониуса.
ГЛАВА 2
144
Стопка дисков ограниченной длины
20° С 0,9 Одиночная спираль
Кристалл
0,8 0,7 0,6
Диск
S 0,5
Одиночная спираль
К 0,4 0,3
0,2
0,1
5,0
6,0
8,0
9.0
рН И°С
. 100
1
8O
20 S
\
h>30S\N /
S 60-' о
0
/
Д у
40
20 -
/
\
/ \
1\
5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 6,8 рН
РИС.2.53. Фазовая диаграмма самосборки белковых агрегатов вируса табачной мозаики при 20 °С в зависимости от рН и ионной силы раствора. Пунктирными линиями выделены области, в которых можно обнаружить большие агрегаты, но не обязательно отсутствуют малые. Здесь можно усмотреть аналогию с критическими концентрациями. Находящийся на границе фазовых областей агрегат типа «завиток» является метастабильным. На рисунке показан также результат типичного эксперимента, в котором рН изменяется при постоянной ионной силе, равной 0,1. Агрегаты с константой седиментации, большей 30 S, — спирали с широким распределением по длинам. [A. Klug, A. Durham, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., vol. 36 (1971).]
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
Ц5
Подобное узкое распределение по длинам можно объяснить с помощью нескольких механизмов полимеризации. Некоторые примеры представлены на рис. 2.52. В матричном механизме отдельная длинная молекула служит матрицей для связывания и упорядочивания белков. Ее длина, таким образом, совпадает с длиной конечной структуры. Этот механизм хорошо объясняет образование многих палочкообразных вирусов типа вируса табачной мозаики. В этом случае каждый из трех нуклеотидов одноцепочечной молекулы РНК вируса служит для связывания одной субъединицы белка оболочки. Если сборка белковой оболочки вируса происходит в отсутствие РНК, то образуются палочкообразные структуры различной длины, во всем остальном очень похожие на оболочки обычных вирусов. В зависимости от концентрации белка и условий, характеризующих окружение вируса, средние значения длин могут быть как больше, так и меньше, чем у обычного вируса, хотя в каждом случае в отсутствие РНК наблюдается широкое распределение по длинам. При более подробном изучении самосборки белковой оболочки вируса табачной мозаики можно найти условия, в которых помимо мономеров и длинных спиралей существуют несколько промежуточных форм (рис. 2.53). Соответствующий рисунок по аналогии с описанием макроскопических фаз чистых веществ или простых смесей можно назвать фазовой диаграммой. Поскольку переходы между различными четвертичными структурами при изменении окружающей среды происходят довольно резко, каждую форму можно уподобить макроскопической фазе. Из рис. 2.53 видно, что модель простой спиральной полимеризации не может адекватно описать процесс сборки вируса табачной мозаики. Более реальная модель должна включать дополнительные параметры для учета ряда промежуточных состояний. И в любом случае любая плодотворная модель должна учитывать принципы образования зародышей и роста цепей для объяснения появления очень длинных стерженьков. Заслуживают краткого упоминания еще две модели, приводящие к дискретным значениям длины полимера. В первой из них постулируется, что для присоединения первого мономера существуют весьма благоприятные условия, тогда как присоединение каждой последующей субъединицы становится все менее и менее выгодным. Например, константы ассоциации для реакции М, + М. ** М ( ; + j могут иметь вид kt = кх1, где х < 1. Эту модель часто называют моделью с постепенным увеличением напряжения. Свободная энергия напряжения на один субъединичный контакт составляет — RT\n x. Эта энергия может или распределяться между всеми субъединицами (приводя в результате к однородной структуре), или периодически накапливаться в определенных местах. Если увеличение напряжения при агрегировании субъединиц достигнет большой величины, то размеры цепи будут определяться тем числом субъединиц, при котором связывание дополнительных мономеров становится энергетически невыгодным. Это приводит к довольно острому пику в кривой распределения длин полимеров. Данный механизм может быть ответствен за распределение длин хвостовых отростков некоторых бактериофагов, для которых не доказано наличие молекулы-матрицы. В основе второй модели (см. рис. 2.52,5) лежит принцип нониуса. Если пытаться сгруппировать молекулы разной длины, то только определенные соотношения их длин приведут к структуре, которая не будет иметь выступающих концов. Такая модель требует присутствия в агрегате субъединиц нескольких типов — это могут быть различные типы белков или различные третичные структуры одного белка. И хотя до сих пор не обнаружены системы, устроенные по принципу нониуса, сама гипотеза представляется интересной и ее нельзя упускать из виду, обсуждая более сложные биологические ассоциаты. В живой клетке при формировании линейных или спиральных ассоциатов могут существовать и более сложные механизмы, определяющие их длину. В клетке могут существовать специфические области, где начинается или заканчивается полимеризация. К тому же внутриклеточная среда вовсе не обязательно должна быть однородной; это может способствовать полимеризации в одних областях и подавлению ее в других. Очевидно,
146
ГЛАВА 2
что некоторые полимеризованные структуры, такие как микротрубочки и волокна актина, простираются на заметные расстояния внутри клеток. Они, по-видимому, играют жизненно важную роль в определении формы клетки, ее передвижения и деления, а также, возможно, в организации связи между поверхностью клетки и ее внутренними областями. Факторы, регулирующие формирование таких структур или их размер, чрезвычайно важны для понимания биологии клетки.
Краткие выводы Белки синтезируются из 20 аминокислот, но иногда содержат и другие химические группы, например ионы металлов, органические простетические группы и сахара. Аминокислоты можно грубо разделить на два класса: полярные и неполярные. Различные белки значительно отличаются друг от друга по своему аминокислотному составу, и существует очевидная корреляция между составом и структурой или функцией. Аминокислотные последовательности определить относительно легко, и часто эти данные позволяют получить дополнительную информацию о структуре и функции. Более того, знание последовательности практически необходимо для определения полной структуры белка. В белках наиболее распространены три типа вторичных структур: а-спирали, /3-слои и /3-изгибы. Все вместе они содержат более половины всех аминокислот белковой молекулы. В тех белках, в которых часто встречаются остатки пролина, а-спирали и /3-слои образуются редко; вместо них могут формироваться спирали полипролинового типа. Третичные структуры большинства белков организованы в плотно упакованные глобулы или в несколько глобулярных доменов. В таких свернутых структурах неполярные боковые группы стремятся оказаться внутри молекулы, а боковые группы полярных остатков — снаружи. Между аминокислотными остатками, а также между остатками и растворителем, по-видимому, образуется обширная сеть водородных связей. Сравнение укладки цепи в различных белках дает возможность глубже проникнуть в их структуру. Семейства белков со сходными или почти тождественными структурами встречаются довольно часто, но особенно удивительно сходство типов организации /3-слоев и а-спиралей в белках с совершенно различными функциями. Обычно четвертичные структуры делят на два типа. Для многих белков типично глобулярное расположение субъединиц. В тех случаях, когда субъединицы тождественны, они почти всегда расположены симметрично; однако разрешены только некоторые определенные четвертичные структуры, так как сами по себе субъединицы асимметричны. Возможны следующие типы симметрии: аксиальная, диэдрическая и кубическая. Другие белки объединяются в спиральные четвертичные структуры, в которых соседние субъединицы связаны между собой винтовой симметрией. Длину таких структур или распределение длин регулируют различные механизмы. ЗАДАЧИ 2.1. Из трех источников — трубкозуба (А), бобра (В) и верблюда (С) — выделены белки, эквивалентные по своим функциям и сходные по структуре. Электрофоретические подвижности трех белков несколько отличаются друг от друга, но для каждого существует только одна полоса. Если смешать А и В или А и С, то на электрофореграмме наблюдаются три полосы; если смешать В и С — наблюдается 5 полос. Объясните этот факт. 2.2. Дайте простое объяснение, почему тример и диск являются относительно стабильными олигомерными формами белка вируса табачной мозаики (см. рис. 2.53). 2.3. Допустим, что белок состоит из одной полипептидной цепи и из данных рентгеноструктурного анализа известно, что отдельная субъединица обладает почти точной симметрией С 2 . Какой вывод можно сделать о первичной структуре и о расположении N- и Сконцов в третичной структуре?
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
147
2.4. Установлено, что рибосомный белок, состоящий из 85 аминокислот, имеет в рибосоме длину 150 А. В растворе он существует в виде изолированной субъединицы. Что можно сказать о возможной вторичной структуре этого белка в растворе и в том случае, когда он находится в контакте с другими белками в рибосоме? 2.5. Последовательность аминокислот в гипотетическом белке записывается в виде N-Ala-Arg-Val-Ser-Met-Lys-Ilu-Glu-Ala-Lys-Gly-Asp-Trp-Thr-Gly-Gly-GlnMet-Thr-Gly-Asp-Ala-Asn-Phe-Arg-Ala-Ser-Val-Glu-Leu-C. Установлено, что этот белок образует очень стабильную вторичную структуру и существует в растворе в виде димера. Изолированный мономер легко связывается с мембранами, димер — не связывается. Какие можно сделать заключения о вторичной, третичной и четвертичной структуре белка? ЛИТЕРАТУРА Общая Boyer P. D., ed., 1970. The Enzymes, 3d ed., vol. 1, New York, Academic Press. [Особенно рекомендуются следующие статьи. Reed L. J., Cox D. J. Multienzyme complexes, p. 213; Smith E. L. Evolution of enzymes, p. 267; Koshland D. E. The molecular basis of enzyme regulation, p. 342; Stadtman E.A. Mechanisms of enzyme regulation in metabolism, p. 395; Atkinson D. F. Enzymes as control elements in metabolic regulation, p. 461.] Cold Spring Harbor Laboratory, 1972. Structure and function of proteins at the three-dimensional level, Cold Spring Harbor Symposia in Quantitative Biology, vol. 36. Dickerson R., Geis I., 1969. The Structure and Action of Proteins, New York, Harper and Row. [Ясно изложенное и хорошо иллюстрированное введение в проблему.] Gutfreund H., ed., 1974. Chemistry of Macromolecules, London, Butterworths (Biochemistry Series One, vol. 1). [Превосходный набор обзорных статей. Особенно рекомендуются следующие: Williams J. The primary structure of proteins in relation to evolution, p. 1; Muirhead H. The three-dimensional structure of proteins, p. 57; Joynson M. A. The subunit structure of proteins, p. 85; Knowles J. P. The functions of proteins as devices, p. 149.] Haschemeyer R. H., Haschemeyer A. E. V., 1973. Proteins: A Guide to Study by Physical and Chemical Methods, New York, Wiley. [Охватывает много различных методов и явлений.] Neurath H., Hill R. С, eds., 1975. The Proteins, 3d ed., New York, Academic Press. [Многотомный курс, содержащий большое количество прекрасных статей.] Schulz G. E., Schirmer R. Н., 1979. Principles of Protein Structure, New York, Springer Verlag. [Текст рассчитан на специалистов, содержит исчерпывающую библиографию.]
Специальная Chou. P. Y.,Fasman G. D., 1978. Empirical predictions of protein conformation, Ann. Rev. Biochem.,47, 251. DayhoffM. O., ed., 1972 — 1976. Atlas of Protein Sequence and Structure, Silver Spring, Md., National Biomedical Research Foundation. Fersht A., 1977. Enzyme Structure and Mechanism, Reading, U. K., W. H. Freeman and Company. [Имеется перевод: Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов. — М.: Мир, 1980.] Fessler J. H., Fessler L. /., 1978. Biosynthesis of procollagen, Ann. Rev. Biochem., 47, 129. Oosawa F., 1975. Thermodynamics of the Polymerization of Protein, New York, Academic Press. Perutz M. F., Lehmann H., 1968. Molecular pathology of human hemoglobin, Nature, 219, 902. Richardson J. S., 1976. Handedness of crossover connection on /3sheets, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 2619. Rossmann M. G., Argos P., 1977. Taxonomy of protein structure, J. Mol. Biol., 109, 99. Schachman H. K., 1974. Anatomy and physiology of a regulatory enzyme, aspartate transcarbamylase, The Harvey Lectures, 68, 67.
Глава з
Структура нуклеиновых кислот
3.1. Свойства нуклеозидов и нуклеотидов Мономерные единицы нуклеиновых кислот называются нуклеотидами. Они состоят из фосфата, сахара и пуринового или пиримидинового основания (на рис. 3.1 приведены структурные формулы и названия наиболее распространенных оснований и Сахаров). Все обнаруженные в нуклеиновых кислотах сахара относятся к D-стереоизомерам, изображенным на рис. 3.1. Обычные основания и большая часть минорных оснований имеют плоскую структуру, и у них нет стереоизомеров. Лишь несколько минорных оснований (таких, как основание Y) имеют асимметричный атом углерода в боковой цепи. Часть мономерной единицы, содержащая только сахар и основание, называется нуклеозидом, так что нуклеотиды есть просто фосфорные эфиры нуклеозидов. Нуклеозиды обозначают двумя буквами латинского алфавита. Большая буква отвечает основанию, а маленькая — типу сахара. Так, аденозин (который состоит из сахара рибозы и основания аденина) обозначают гА, а дезоксигуанозин (с сахаром 2'-дезоксирибозой и основанием гуанином) — dG. Если из контекста ясно, какой тип сахара имеется в виду, приставку г обычно опускают. При обозначении нуклеотидов к большой букве, отвечающей нуклеозиду, добавляют букву р, соответствующую фосфату (см. выше). Полинуклеотидную последовательность сокращенно записывают в виде . . . pNpNpNpNpNpNpNp . . . или (pN)n, или (Np)n Тем самым подчеркивается, что остов полимера построен из остатков Сахаров, связанных фосфодиэфирными мостиками (рис. 1.2). В РНК сахар представлен только рибозой и преобладают четыре нуклеозида — A, U, С и G, хотя достаточно часто встречаются и «необычные» нуклеозиды, особенно в транспортных РНК. В ДНК сахар представлен 2'дезоксирибозой, и практически во всех известных ДНК присутствуют лишь четыре нуклеозида — dA, dT, dC и dG. Исключение составляют ДНК ряда вирусов, в которых один из обычных нуклеозидов замещен частично или полностью минорным нуклеозидом. Например, ДНК некоторых бактериофагов содержит 5-гидроксиметил^С вместо dC, моно- или дисахариды часто присоединяются к цепи через гидроксил. "О
НО—СН2 Основание "О
\
О
р
НО Основание
/
О—СН2 Основание •Оч
у
I он 0
НО ОН Нуклеозид N
но он 5'-нуклеотид pN
V
З'-нуклеотид Np
СТРУКТУРА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
149
В этой книге, если нет никаких специальных оговорок, мы будем представлять одиночную полинуклеотидную цепь в виде АрВрСр. . . pZ, подразумевая при этом, что каждая фосфодиэфирная связь направлена от 3'- к 5'-гидроксилу сахара, слева направо. Таким образом, 5'-конец молекулы оказывается слева, а 3'-конец — справа. Чтобы было ясно направление антипараллельных цепей, их концы принято отмечать цифрами 5' и 3 ' .
ИОНИЗАЦИОННОЕ РАВНОВЕСИЕ НУКЛЕОЗИДОВ И НУКЛЕОТИДОВ Все обычные нуклеозиды при нейтральных рН незаряжены, что соответствует форме, представленной на рис. 3.1. Большинство необычных нуклеозидов также незаряжены, хотя 7-метил-С при рН 7 заряжен положительно. Напротив, все фосфаты в нуклеотидах или полинуклеотидах — при тех рН, при которых обычно работают с этими соединениями, — заряжены отрицательно. Фосфодиэфир является сильной кислотой. Значение рКа единственного способного к ионизации протона близко к 1: О О II II R — О — Р — О — R ' ^ Н + + R — О — Р —О —R' I I
он
о-
Таким образом, если пренебречь концевыми эффектами, то можно считать, что на каждый остаток полинуклеотидной цепи приходится один отрицательный заряд. Наличием большого суммарного заряда полинуклеотиды существенно отличаются от типичных белков, в которых большинство остатков незаряжено, а положительные и отрицательные боковые цепи обычно представлены в сопоставимом (хотя и неравном) количестве. Фосфомоноэфирная группа присутствует в изолированных мононуклеотидах или иногда на концах полинуклеотидных цепей. Она имеет два протона, способных к ионизации, с рКа, типичные значения которых приведены на схеме: О О О И
R — О — Р — ОН I ОН
р/Га~0,9
**
И
H++R—О—Р—ОН I О"
р* а »6,2
**
II
2Н+ + R — О — Р — О " I О"
Таким образом, при рН 7 большая часть молекул фосфомоноэфира несет двойной отрицательный заряд. Получаемые при титровании любого мононуклеотида значения рКа около 1 и 6 несомненно относятся к фосфатной группе, потому что групп с такими рКа нет в соответствующих нуклеозидах. Более того, эти значения близки к наблюдаемым в простом сахарофосфате. Например, глюкозо-3-фосфат имеет рКлоколо 0,8 и 5,7. У нуклеозидов обычно наблюдается рКл около 12,4, что существенно отличается от рА"а, характерных для нуклеотидов. Это значение рА"а связано с ионизацией гидроксильной группы сахара (для глюкозы, например, наблюдается рКл = 12,1). Отрицательный заряд нуклеотида должен несколько сдвигать рКл гидроксильной группы сахара в область более высокихрНиз-засильного электростатическогоотталкиваниявтроекратнодепротонированной отрицательно заряженной форме. Поэтому рКл гидроксила скорее всего будет находиться в области рН, при которых нуклеотид подвергается гидролизу, и отрыв электрона от сахара в составе нуклеотида или полинуклеотида наблюдать не удастся.
ГЛАВА 3
150
ОСНОВАНИЯ
Цитозин,С САХАРА НО—СН2,Обоснование НО—СН2 О 3'
Урацил,и
Основание
2'
ОН ОН Рибоза
ОН Н Дезоксирибоза
РИС.3.1. Структурные формулы компонентов нуклеиновых кислот. А. Обычные основания и сахара. Б. Некоторые из минорных оснований и нуклеозидов. Приведены также стандартные сокращения.
Поведение при титровании большинства нуклеотидов и нуклеозидов очень сложно, потому что они содержат много групп, являющихся потенциальными донорами или акцепторами протонов. Прежде чем обсуждать этот вопрос, отметим, что даже для неионизованной формы оснований не сразу очевидно существование единственной локализации протонов на гетероатомах. Каждое основание в принципе может принимать ряд таутомерных форм. Несколько форм, между которыми существует равновесие, показаны на рис. 3.2. Из совокупности доступных кристаллографических и спектроскопических данных можно сделать достаточно надежный вывод, что в водных растворах преобладают кето-амино-таутомеры, показанные на рис. 3.1. Наиболее эффективными методами исследования таутомерных форм являются ЯМРи ИК-спектроскопия, поскольку с их помощью часто удается наблюдать спектральные полосы от индивидуальных протонов. Идентифицировать эти полосы можно путем сравнения со спектрами соответствующих производных, в которых возможности таутомеризации ограничены, скажем, в результате замены некоторых протонов метильными группами. По оценкам, разность в энергии между основными таутомерными формами и некоторыми из форм, приведенных на рис. 3.2, невелика, поэтому вопрос о том, играют ли необычные таутомеры какую-нибудь роль в формировании структуры или функционировании нуклеиновых кислот, остается открытым. В настоящее время прямые данные на этот счет отсутствуют. Если присоединить или удалить протон из основания, то получившийся продукт, как правило, по-прежнему сможет принимать несколько таутомерных форм. Идентификация наиболее стабильных из них эквивалентна ответу на вопрос о том, какие протоны удалены или какие группы связывают протоны при значениях рН, соответствующих наблюдаемым рАГа. С этой целью было выполнено большое число экспериментальных работ; результаты для четырех обычных рибонуклеозидов суммированы на рис. 3.3. Отметим, что основания А и С могут находиться в нейтральной или положительной форме, U — в нейтральной или отрицательной, a G может существовать во всех трех состояниях. Наличие фосфатов сдвигает все значения рА" , приведенные на рис. 3.3, вверх на несколько десятых
СТРУКТУРА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
151
HNCOCH 3 О
II
R' = СН 2 СН 2 ССОСН 3
н
н,с N 2 -диметилгуанозин 2dmG
Инозин I
7-метил гуано зин 7mG
носн2 о CH_,S
1М6-Д2 -изопентениладенозин 6iA
Дигидроуридин D
ОН
Основание
ОСН 3
N6-A2 -изопентенил - 2'О-метилнуклеозид 2-метилтиоаденозин 2Om(A,C,G HJIKUI 2ms6iA
Псевдоуридин Ф
4-тиоуридин 4s
единицы рН. Этот сдвиг обусловлен электростатическим притяжением между фосфатами и любыми положительными формами и отталкиванием между фосфатами и любыми отрицательными формами. Наблюдаемый сдвиг больше для 5'-нуклеотидов, чем для 2'или 3'-изомеров. Это и понятно, поскольку 5'-положение ближе к возможным местам ионизации оснований. Все свойства дезоксирибонуклеозидов и дезоксирибонуклеотидов, выявляемые при их титровании, хорошо коррелируют со свойствами соответствующих рибокомпонентов, за тем исключением, что для дезоксирибокомпонентов значения рКа оказываются, как правило, на несколько десятых выше. Для олигонуклеотидов или полинуклеотидов все наб-
X H—N
i
н он
о или
H
N'
H
I R
РИС.3.2. Некоторые возможные таутомерные превращения для G, U и С при рН 7.
NH
NH,
рК = 3,5
R
н
О
А
Н
н
т
- т г NH 2
NH,
О HN
рк = 9,2.
О'
с
и
РИС.3.3. Ионизационное равновесие для четырех рибомононуклеозидов. Аналогичные процессы ионизации характерны для дезоксирибомононуклеозидов.
СТРУКТУРА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
153
людаемые значения рКя несколько смещены вследствие электростатического отталкивания между остатками. Более значительные и сложные эффекты наблюдаются, когда группы, способные к ионизации, участвуют в формировании вторичной структуры посредством спаривания оснований. В этих случаях, как и для белков, титрование нуклеотидов оказывается сопряженным с конформационными переходами, что может приводить к очень большим смещениям рА"а. Некоторые примеры такого рода рассмотрены в гл. 22. Все обычные основания нуклеиновых кислот весьма сходны по своим основным химическим и физическим свойствам. Например, они обладают (или, согласно оценкам, должны обладать) довольно высоким дипольным моментом — от 2,5 до почти 7Д. Таким образом, с чисто электронной точки зрения основания должны рассматриваться как полярные соединения. Несмотря на это, все обычные основания, кроме урацила, почти нерастворимы в воде. Растворимость пуринов в 5-10 раз меньше, чем пиримидинов, но этот диапазон изменения растворимости значительно меньше, чем для разных боковых цепей аминокислот. Таким образом, грубо говоря, можно считать все основания полярными и гидрофобными соединениями (что звучит несколько парадоксально). Во всяком случае, нет никаких оснований классифицировать нуклеотидные остатки подобно тому, как это было сделано для аминокислот в гл. 2.
3.2. Нуклеотидный состав ДНК и РНК ПРАВИЛА ЧАРГАФФА ДЛЯ ДНК Подавляющее большинство молекул ДНК являются двухцепочечными, что налагает ограничения на их нуклеотидный состав. Для этих биополимеров всегда х А = Xj и XG = Хс> г д е X — мольная доля. Этот факт, открытый и обстоятельно изученный Э. Чаргаффом, был одним из важнейших среди тех данных, которые привели к концепции двойной спирали для ДНК. Он означает, что для описания состава совершенной двухцепочечной ДНК необходима только одна переменная x G + c ( = 1 — Хд+т)- GC-содержание природных ДНК существенно различается. Так, для ДНК некоторых бактерий X G + C = 75%. Вероятно, существование столь широкого интервала значений GCсодержания без потери способности организмов хранить необходимую генетическую информацию становится возможным благодаря вырожденности генетического кода и тому факту, что часть ДНК не кодирует никаких белковых последовательностей. У животных XG + C = 40 — 45%, и, вообще говоря, ДНК у близких организмов имеют сходное GCсодержание. Выделена очень небольшая минорная фракция эукариотической ДНК с экстремальным нуклеотидным составом — так называемая сателлитная ДНК; для сателлитной ДНК краба, например, x G + c Р а в н а всего 5%. Биологическая роль таких сателлитов недостаточно ясна, но в тех случаях, когда они исследованы более детально, установлено, что обычно эта ДНК состоит из регулярно повторяющихся коротких последовательностей. В состав некоторых ДНК входят необычные основания, замещающие один (или более) пиримидин или пурин. Например, в ДНК Т-четных фагов, как мы уже упоминали, преобладает глюкозилированный 5-гидроксиметил-С. Он образует с гуанином такие же пары оснований, как обычный цитозин, и правила Чаргаффа остаются справедливыми, если при вычислении х с учесть все аналоги цитозина. ДНК фага SP2 содержит dU вместо dT; известно и еще несколько ДНК с необычными пиримидинами. Некоторые основания отдельных ДНК метилированы, причем присутствуют они в очень специальных последовательностях. Эта модификация служит механизмом защиты против внутриклеточных рестриктаз, которые в отсутствие метилирования расщепляли бы ДНК в этих местах.
154
ГЛАВА 3
Для некоторых ДНК, однако, правило Чаргаффа не выполняется. Например, для ДНК бактериофага 0X174 18 ХА = 0,25, х т = 0.33, x G = 0,24, х с = °> Это означает, что в формировании двухцепочечной структуры, образованной из обычных AT-и GC-nap, могут участвовать максимум (0,18 + 0,25) • 2 = 0,86 от общего числа оснований. В действительности ДНК 0X174 в отличие от ДНК большинства других организмов является одноцепочечной молекулой, и нет никаких оснований считать, что будет происходить достаточно эффективное спаривание оснований в пределах одной цепи. На самом деле доля спаренных оснований значительно меньше 0,86. Выполнение правил Чаргаффа не означает, что ДНК обязательно является двухцепочечной. Способность образовывать такую структуру определяется особенностями нуклеотидной последовательности и может быть выявлена различными физическими методами (гл. 22). НУКЛЕОТИДНЫЙ СОСТАВ РНК Аналогом правил Чаргаффа для РНК были бы условия Хд = Хц и XQ = Хс однако ни один из основных типов клеточной РНК — транспортная РНК (тРНК), матричная РНК (мРНК), рибосомная РНК (рРНК) или гетерогенная ядерная РНК (гяРНК) — не подчиняется данному правилу. Это естественно, так как все они являются одноцепочечными ковалентными структурами. Правила Чаргаффа выполняются лишь для небольшого числа РНК вирусной природы, и некоторые из них оказались совершенными двухцепочечными молекулами. Нуклеотидный состав большинства РНК таков, что закручивание цепи на себя не может приводить к спариванию всех нуклеотидов. Более того, некоторые необычные основания столь сильно модифицированы, что нормальное спаривание оснований химически невозможно. Из опыта известно, что, хотя в большинстве РНК значительное количество оснований спарено, максимальная степень такого спаривания достигается редко. Биосинтез РНК начинается с 5' -конца конденсацией двух молекул pppN (где N соответствует G или А). Процесс идет по направлению к 3'-концу до терминации. Таким образом, начальный транскрипт РНК должен содержать 5'-трифосфат и свободный нефосфорилированный 3'-конец, однако обнаружить 5'-трифосфат практически никогда не удавалось, потому что большинство типов РНК, присутствующих в значительных количествах in vivo, образуются в результате деградации более крупных предшественников РНК. Труднее сделать какие-либо выводы о 3'-конце. Если бы фосфат в этом случае удалось обнаружить, можно было бы с уверенностью сказать, что этот конец образован в результате процессинга, но 3'-фосфат в биологически активных системах почти никогда не обнаруживается. Многие известные нуклеазы могут расщеплять фосфодиэфирную связь, образуя свободный 3' -гидроксил, и поэтому нельзя однозначно сказать, в результате какого процесса — синтеза или деградации — возникает такой конец. Вирусные РНК, как и мРНК прокариот, состоят в основном из четырех обычных оснований. мРНК же эукариот и их вирусов, как правило, содержат метилированные основания, а кроме того, у многих из них на 5'-конце имеется необычная последовательность G5 pppNpMp . . . (рА)ярА3 Она содержит 5'-5'-трифосфатный мостик, который синтезируется после транскрипции мРНК и, вероятно, важен для трансляции. Кроме того, у многих из этих мРНК на 3'конце имеется участок из 100 или более остатков рА. Эти остатки в большинстве (если не во всех) случаев также присоединяются после транскрипции. 5'- и 3'-концы рибосомных РНК не модифицированы, но содержат больший процент минорных оснований. В транспортных РНК доля необычных оснований и нуклеозидов может достигать 20% от общего числа. Было обнаружено, что у более развитых в эволю-
СТРУКТУРА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
155
ционном отношении организмов содержание необычных нуклеозидов выше, чем у более примитивных. Все имеющиеся данные говорят о том, что эти модификации оснований реализуются после транскрипции предшественников тРНК и рРНК. Нет никаких указаний на то, что нуклеотидный состав РНК или ДНК хоть как-то коррелирует с биологическими функциями этих молекул. Тем не менее некоторые из физических свойств двухцепочечных молекул, такие, как термостабильность и плавучая плотность, изменяются почти линейно в зависимости от мольной доли G + С. Эта связь лежит в основе многих аналитических и препаративных методов (гл. 22). Кроме того, вряд ли природа не воспользовалась сравнительной легкостью расхождения цепей двойной спирали в областях с высоким х А + т для того, чтобы связать такие области с какими-либо специфическими функциями. Так ли это на самом деле — пока неясно. ДРУГИЕ КОМПОНЕНТЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Помимо Сахаров, фосфатов и оснований нуклеиновые кислоты содержат и другие компоненты. Так, некоторые РНК имеют участки, прочно связывающие двухвалентные катионы, и in vivo эти участки, вероятно, заняты Mg 2 + и полиаминами. Поскольку нуклеиновые кислоты являются полианионами, они должны образовывать прочные комплексы с поликатионами соответствующих размеров. Поэтому такие полиамины, как спермин и спермидин, могут играть важную роль в функционировании ДНК или РНК in vivo. И действительно, есть данные о высокоспецифичной локализации этих соединений на тРНК in vitro. По-видимому, кроме указанных катионов нуклеиновые кислоты не несут никаких специально синтезированных и связанных с ними простетических групп. Следует иметь в виду, однако, что в клетке нуклеиновые кислоты редко существуют как свободные молекулы, они почти всегда прочно связаны со специфическими белками. Ниже мы рассмотрим основные свойства таких нуклеопротеидных комплексов. Известен один случай специфического ковалентного взаимодействия между аминокислотами и нуклеиновыми кислотами, который осуществляется при аминоацилировании, или активации тРНК'. Каждый вид тРНК узнается специфической аминоацилтРНК — синтетазой, которая катализирует следующую реакцию: /ОН АТР + тРНК—СрСрА( + NH3+—CHR —COO" ^
он I N R
Ь—Н—N Н
Такое взаимодействие объясняет, почему кислые белки образуют прочные комплексы с нуклеиновыми кислотами. Изменяются ли физические и химические свойства белков или нуклеиновых кислот при их объединении в нуклеопротеидный ансамбль? Как правило, на этот вопрос можно ответить утвердительно, но во многих случаях неизвестно, происходят ли такие изменения благодаря просто конформационным перестройкам, вызванным одним компонентом в другом, или имеют место какие-то более прямые эффекты. К примеру, проявляются ли какие-либо особые свойства аминокислот или нуклеотидов при их непосредственном контакте? Большинство нуклеиновых кислот существуют только в виде комплексов с белками, последние же могут находиться и в свободном состоянии. Интересно выяснить, обладают ли белки, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами, какими-либо общими свойствами,отличными от свойств других растворимых белков. Есть указания на то, что многие белки, которые связаны с нуклеиновыми кислотами, менее глобулярны, чем обычные небольшие белки, но пока неясно, насколько универсально это свойство.
БЕЛКИ И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ ВИРУСОВ Обычно вирусы состоят из нуклеиновой кислоты и окружающей ее белковой оболочки. Простейший палочковидный вирус, состоящий из единственной одноцепочечной РНК и множества копий одного белка, — вирус табачной мозаики. Белок без участия РНК соби-
ГЛАВА 4
210
Ранние функции
Лизис
Упаковка ДНК
Завершение Сборка сборки Введение Сборка отростка ДНК капсида капсида ч sie A 5 4 10 26 7 20 16 mnt ant 9
РИС. 4.9. Схема сборки бактериофага Р22, инфицирующего S. typhimurium. gp—продукты генов фага. На первом этапе образуется сферический прокапсид, состоящий в основном из gp5 и gp8. Когда в капсид проникает часть конкатемерной ДНК, gp8 (белок, ответственный за поддержание формы) уходит. Внутри капсида ДНК укорачивается до нужной длины. Затем осуществляется сборка отростка фага. [J. King et al., Cell, 15, 551 (1978).] рается в структуру, фактически идентичную природному вириону (гл. 2). Таким образом, хотя белок и находится снаружи, по-видимому, именно он является организующим ядром структуры, а РНК лишь определяет ее длину. РНК у этого вируса сильно вытянута. Стэкинг между основаниями отсутствует, зато основания взаимодействуют с белком. Таким образом, во время сборки вируса структура Р Н К должна коренным образом измениться по сравнению с той, что была в растворе. Многие вирусы бактерий (бактериофаги) состоят из белковой головки, или капсида, в которую заключена ДНК или РНК. На рис. 4.9 показаны этапы сборки одного из таких вирусов. Иногда капсид собирается независимо, а затем в него вводится ДНК практически без изменения свойств капсида. Известны и другие случаи, когда введение ДНК сопровождается заметными изменениями в строении и составе капсида. И наконец, есть случаи, когда размер капсида, по-видимому, определяется размером находящейся в нем нуклеиновой кислоты. В более сложных вирусах помимо белковой оболочки имеется и белковое ядро. Видимо, природа использует целый набор механизмов, чтобы организовать сборку вирусных нуклеопротеидов. Для всех структур характерно наличие множества контактов белок — белок; об этом можно судить не только по внешнему виду вирусных частиц, но и по тому, что их сборка может осуществляться в отсутствие нуклеиновых кислот. За исключением палочковидных вирусов, множество контактов имеется и на уровне нуклеиновой кислоты; в них, вероятно, принимают участие некоторые внутренние белки. Таким образом, в этих вирусах белковые и нуклеиновые компоненты в значительной спепени разделены в соответствии с тем, что белок выполняет функцию упаковки для переноса, защиты и введения в клетку нуклеиновой кислоты. Некоторые ферменты, участвующие в сборке ви-
ДРУГИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОЛИМЕРЫ
211
русов, чувствительны к состоянию организации вирусной частицы. К примеру, белки, которые фрагментируют длинные молекулы ДНК-предшественников, не функционируют в случае изолированной нуклеиновой кислоты — для них требуется присутствие заполненного капсида. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МЕЖДУ РНК И БЕЛКАМИ В РИБОСОМАХ Общая картина белково-нуклеиновой организации рибосом сильно отличается от таковой для вирусов. Для нее характерно наличие множества контактов между белками и нуклеиновыми кислотами, причем эти контакты, по-видимому, являются очень тесными. Например, многие рибосомные белки связываются с определенными участками рибосомных РНК (рРНК), защищая их от ферментативного расщепления. Имеют место и коопе-
S8 S15 S8.S15 S8, S15.S6.S18
АА U —А
G-C C-G/ A-U .C-G i
U
U G G С—G G-C G-C
AG G G G A С —С C-G C-G A-U
A — UU
G-C C\- G G-C U G C-i-G U G G • U ,U —A CJ-GA G-U C-G Ul-G C-G C —G G C-G A-I-U G-C A-f-U U—A L__G UfA U-A 1 Cj-G U-l-A , U I UGA C-G С G AAC f-AUAC I I
РИС. 4.10. Возможная вторичная структура небольшой части 16S-pPHK E. coli. Указаны области, защищенные от расщепления нуклеазой, в тех случаях, когда к РНК добавлены по отдельности белки S8 и S15 (1), когда эти белки добавлены одновременно (2) и когда одновременно присутствуют белки S8, S15, S6 и S18 (3). [R. Zimmermann et al., Nucleic Acids Research, 2, 279 (1975).]
212
ГЛАВА 4
ративные эффекты, когда с нуклеиновой кислотой одновременно связывается более одной молекулы белка (рис. 4.10). Согласно современным представлениям, рибосомные белки в отсутствие рРНК вряд ли могут самостоятельно собираться в какую-либо упорядоченную макроструктуру. Действительно, в растворе удалось обнаружить весьма немного специфических парных контактов между рибосомными белками. В опытах по сщиванию, проведенных на нативных рибосомах, показано, что многие белки расположены достаточно близко друг к другу, однако неизвестно, сколько белковых пар непосредственно контактирует и являются ли эти контакты достаточно прочными, чтобы внести существенный вклад в стабилизацию конечной структуры. (На рис. 1.7 приведена схематическая картина белково-нуклеиновой организации 708-рибосомы и различных 508-частиц.) Свободные рибосомные РНК обладают четко выраженной вторичной, а также, вероятно, и третичной структурой. Большинство данных свидетельствует о том, что хотя при упаковке рРНК в рибосоме происходит существенная компактизация молекулы, ее вторичная структура изменяется незначительно. Многие наблюдения наводят на мысль, что по сравнению со свободными РНК число контактов РНК — РНК в рибосоме увеличивается незначительно. Если это так, то основным фактором, стабилизирующим глобулярные рибосомные субъединицы, должно быть взаимодействие между Р Н К и белками. Конформация рибосомных субчастиц очень лабильна. Их свойства существенно изменяются при связывании с некоторыми небольшими белками, т Р Н К или антибиотиками. Мутации, затрагивающие белки одной субчастицы, иногда сказываются на функционировании другой субчастицы. В системах меньшего размера эффекты такого рода обычно не наблюдаются. Если эти эффекты имеют биологический смысл, это может объяснить, почему природа для определенных целей создала такие сложные структуры. Свойства отдельных рибосомных компонентов в значительной мере зависят от состояния всей системы. Например, лизиновые группы одного из белков в свободном состоянии химически неактивны, но становятся довольно активными в рибосоме. Белок колицин Е 3 вызывает специфическое расщепление 16S-pPHK из ЗОБ-субчастицы только в интактной 708-частице, но не в свободной ЗОБ-субчастице или свободной РНК. Именно на уровне рибосомы или ее субчастиц проявляются способность к связыванию и ферментативная активность. Было бы интересно узнать, выполняются ли эти функции отдельными белками (при условии, что ансамбль переводит их в активную конформацию) или же многочисленные компоненты на самом деле действуют согласованно на некоторых каталитических этапах белкового синтеза.
ХРОМАТИН: ИЕРАРХИЯ ОРГАНИЗОВАННЫХ СТРУКТУР За последние несколько лет произошли значительные изменения в наших представлениях о структуре хроматина. Существует несколько уровней ее организации. Комплекс ДНК с пятью типами гистонов образует регулярную упорядоченную структуру. Ее основной единицей является нуклеосома, по-видимому, содержащая (1) по две молекулы каждого гистона Н2а, Н2Ь, НЗ и Н4, (2) одну молекулу гистона HI и (3) около 200 пар оснований двухцепочечной ДНК. Нуклеосомы расположены вдоль молекулы ДНК, как бусины, при этом каждая из них отделена от соседних участком свободной ДНК. Существующие модели подтверждают представление о нуклеосомной кор-частице, содержащей (1) около 140 пар оснований ДНК и (2) все гистоны, кроме H I . Кор-частица обладает осью симметрии 2-го порядка. Есть убедительные данные, что гистоны находятся в ее центре. Обнаружено, что некоторые пары гистонов образуют в растворе стабильные димерные комплексы, наблюдались также и тетрамерные белковые комплексы. Вероятно, ДНК намотана регулярным образом вокруг этих белковых тетрамеров. Имеющихся
ДРУГИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОЛИМЕРЫ
213
РИС. 4.11. Схема строения повторяющейся субъединицы хроматина эукариот. Изображенная структура (кор-частица) является чисто умозрительной, но весьма правдоподобной. Субъединица содержит по два из четырех упомянутых в тексте гистонов. Указано возможное положение оси симметрии С 2 . Такая симметричная организация структуры вполне вероятна, если учесть состав белков и наличие в ДНК оси псевдосимметрии Сг Данное расположение белков согласуется с тем, что известно о белковых подсистемах и сшивках между белками, но это отнюдь не единственная возможная интерпретация имеющихся данных. Как показано, ДНК имеет полтора тороидальных сверхвитка (см. гл. 24). данных об организации ДНК достаточно для того, чтобы строить детальные модели, подобные той, что показана на рис. 4.11, но их не хватает, чтобы среди этих моделей выбрать единственную. Кроме того, есть доказательства, что нуклеосомы, содержащие активно транскрибирующиеся гены, имеют более развернутую структуру, чем нуклеосомы с неэкспрессирующимися генами. В кор-частице нуклеосомы ДНК упакована так, что ее протяженность составляет только 1/7 длины молекулы ДНК в В-форме. Играет ли роль в такой упаковке взаимодействие ДНК—ДНК — неясно. Известно, однако, что в некоторых условиях можно компактизовать ДНК и в отсутствие гистонов. Природный хроматин помимо гистонов и ДНК содержит в различных количествах множество других белков. Они называются негистоновыми белками как бы в ознаменование того, что мы о них почти ничего не знаем. Их количество и тип зависят от ткани и меняются в широких пределах. Одни из этих белков, видимо, играют роль в экспрессии генов, другие принимают участие в формировании структур более высокого порядка. Влияют ли эти белки на структуру или на положение отдельных нуклеосом — неизвестно. Существуют четкие указания на то, что in vivo (и в концентрированных гелях in vitro) цепочки нуклеосом сворачиваются в спиральные соленоидоподобные образования. Последние в свою очередь организуются в еще более сложные структуры. В метафазных клетках хроматин упакован в специфические структуры, называемые хромосомами. Детали механизма упаковки и конечная структура хромосом — это важные проблемы, которые предстоит решать следующему поколению биофизических химиков. Необходимо подчеркнуть, что у прокариот, по-видимому, нет хроматина, однако их ДНК тоже уложена в компактные структуры, о которых также далеко не все известно.
4.3. Липиды в биологических мембранах Все живые клетки окружены наружной мембраной, которую иногда называют плазматической. Эта структура отделяет содержимое клетки от внешней среды. Она действует как своего рода фильтр, пропускающий одни молекулы (а иногда и способствующий их проникновению) и задерживающий другие. Кроме того, на наружной мембране бывают расположены рецепторы, с помощью которых клетка сообщается с внешней средой и с другими клетками.
214
ГЛАВА 4
Однако мембранные структуры можно найти не только на периферии клетки. Например, в эукариотических клетках имеется мембрана, которая отделяет ядро от окружающей цитоплазмы. Эукариотические клетки имеют также обширную систему мембранных каналов, называемую эндоплазматическим ретикулумом. Существуют и другие мембраны, которые образуются в особых случаях, например миелиновая оболочка вокруг аксона и так называемые диски в наружном сегменте палочек сетчатки. Структурную основу мембраны составляют амфифильные липидные молекулы. Амфифильные соединения содержат два основных компонента: полярную группу и более протяженную неполярную часть. Молекулы этого типа легко образуют двойные слои, которые самопроизвольно сворачиваются в мембранные пузырьки (везикулы). В биологических мембранах в этих бислоях располагаются молекулы ряда белков.
ЛИПИДНЫЕ КОМПОНЕНТЫ МЕМБРАН С точки зрения химического состава отличительной чертой мембран является высокая концентрация в них липидов. Эти молекулы легко экстрагируются из мембран с помощью органических растворителей и плохо растворяются в воде. Мембранные липиды — это в основном особые амфифильные молекулы, имеющие длинные углеводородные хвосты, а также холестерин или его эфиры. Особенности этих молекул и их взаимодействия в значительной степени определяют структуру и свойства биологических мембран. В большинстве случаев амфифильные соединения — это фосфолипиды (эфиры глицерофосфата), имеющие следующую структуру:
О
II
с н 2 — с н 2 — сн 2 —о— Р —о—х
0 I с =о 1 1
R
о I с=о I
о-
2
R
где жирные кислоты (R'COOH и R^OOH) этерифицированы по двум гидроксильным группам глицерина, а полярная группа X присоединена к фосфату. Алкильные группы R1 2 и R жирных кислот — это длинные углеводородные цепочки, которые могут быть насыщенными либо ненасыщенными. Некоторые их этих групп представлены в табл. 4.2. Группа X вместе с фосфатной частью образует полярную головку, которая в зависимости от заряда X может быть в целом заряжена или не заряжена. Некоторые из этих групп перечислены в табл. 4.3. Свои названия фосфолипиды получают в зависимости от замещающих групп R' и X. Например, если R'COOH = R2COOH — это пальмитиновая кислота, а X — холин, то фосфолипид называется дипальмитоилфосфатидилхолином. Фосфолипиды, содержащие холин, иногда называют лецитинами. У некоторых фосфолипидов длинные алифатические цепи присоединены к глицерофосфату не через эфирную связь, хотя общая амфифильная структура у них остается прежней. Ниже приведены некоторые примеры такого рода.
Таблица 4.2
1
НЕКОТОРЫЕ ПРИРОДНЫЕ ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ ' Число атомов углерода
12 14 16 18 20 24 16 18 18 18 18 20 19
Структура Насыщенные жирные кислоты СН 3 (СН 2 ), 0 СООН СН 3 (СН 2 ) 1 2 СООН СН 3 (СН 2 ) М СООН СН 3 (СН 2 ) 1 6 СООН СН 3 (СН 2 ), 8 СООН СН^СН^СООН
систематическое
Название кислоты тривиальное
Додекановая Тетрадекановая Гексадекановая Октадекановая Эйкозановая Тетракозановая
Лауриновая Миристиновая Пальмитиновая Стеариновая Арахиновая Лигноцериновая
Ненасыщенные жирные кислоты (если иное не указано, то двойные связи находятся в i/"f-конфигурации) СН 3 (СН 2 ) 5 СН = СН(СН 2 ) 7 СООН 9-Гексадеценовая Пальмитоолеиновая СН 3 (СН 2 ) 7 СН = СН(СН 2 ) 7 СООН (/ис-9-Октадеценовая Олеиновая транс-9-ОктадеценоСН,(СН 2 ) 7 СН СН(СН,) 7 СООН Элаидиновая J z ' (транс) *' вая цис, 1/ис-9,12-ОктаЛинолевая СН 3 (СН 2 ) 4 СН = СНСН 2 СН = СН(СН 2 ) 7 СООН декадиеновая 9,12,15-Октадекаа-Линоленовая СН 3 СН 2 СН = СНСН 2 СН = СНСН 2 СН= СН(СН 2 ) 7 СООН триеновая 5,8,11,14-ЭйкозатетСН 3 (СН 2 ) 4 СН = СНСН 2 СН = СНСН 2 СН = СНСН 2 СН = СН(СН 2 ) 3 СООН Арахидоновая раеновая СН 3 (СН 2 ) 5 НС —СН(СН 2 ) 7 СООН
Лактобацилловая
с Н
2
19
СН3(СН2)7 СН (СН2)8СООН I
Туберкулостеариновая
24
СН 3 (СН 2 ) 2 ] СН СООН
Цереброновая
сн 3
он " A. L. Lehninger, Biochemistry (New York: Worth, 1975), p. 281; A. White, P. Handler, E. L. Smith, R. L. Hill, I. R. Lehman, Principles of Biochemistry (New York: McGraw-Hill, 1978), pp. 39 — 40.
216
ГЛАВА 4
О Н Н Н I СН,-(СН 2 ),,-С = С - С - С - С Н 2 - О - Р -O-CH 2 -CH 2 - + N(CH 3 ) 3 Н I I I НО NH О~ I
о =с
I R Сфингомиелин
Н Н Н R 1 —С = С — С — С — С Н 2 - О - Х Н I I НО NH I
с =о I
R2
Гликолипид (X — сахарид)
О Н2С— СН2—СН,—О—Р —О—X I I I О О О"
I
I
О =С
СН
I R1
II СН I R2 Плазмалоген
В случае гликолипидов группа X — это углеводный мономер или олигомер. Сфингомиелин и гликолипиды являются производными не глицерина, а сфингозина:
н
н
н
СН 3 —(СЩ п —С = С — С —С —СН 2 ОН н I I НО NH 3 + Сфингозин Жирнокислотная цепь присоединяется с помощью амидной, а не эфирной связи. С другой стороны, плазмалогены являются производными глицерина, но одна из связей между алифатической цепью и глицериновой частью молекулы представляет собой а,/3ненасыщенную эфирную связь.
ДРУГИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОЛИМЕРЫ
217
Таблица 4.3. СПИРТЫ, ВХОДЯЩИЕ В КАЧЕСТВЕ ПОЛЯРНЫХ Х-ГРУПП В СОСТАВ НАИБОЛЕЕ РАСПРОСТРАНЕННЫХ ФОСФОГЛИЦЕРИДОВ 1)
Фосфоглицерид
Спиртовой компонент
Фосфатидилэтаноламин Фосфатидилхолин Фосфатидилсерин
HOCH2CH2NH2 HOCH2CH2N(CH3)3 HOCH2CHNH2COOH НО
ОН
Фосфат идилинозит
н Фосфатидилглицерин Фосфатидил-3' -Оаминоацилглицерин
он
носн 2 снонсн 2 он
о
носн 2 снонсн 2 о—с R— СН NH,
о Кардиолипин
НОСНОНСН2—О—Р — О—СН2 СН
он
0 1
о I
о =с о = с R^ 1)
Атом водорода, вместо которого присоединяется фосфат, выделен полужирным шрифтом.
Другой основной компонент мембран — это холестерин и его производные.
сн 3 сн3 Холестерин Гидроксильная группа иногда соединяется с жирной кислотой эфирной связью. Холестерин и его эфиры являются очень слабыми амфифильными соединениями.
218
ГЛАВА 4
Таблица 4.4 1 2
ЛИПИДНЫЙ СОСТАВ НЕКОТОРЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН ' *
Липид
Фосфатидная кислота Фосфатидилхолин Фосфатидилэтаноламин Фосфатидилглицерин Фосфатидилинозит Фосфатидилсерин Кардиолипин Сфингомиелин Гликолипиды Холестерин
Эритроциты человека
Миелин человека
Митохондрии из сердечной мышцы быка
E.coli
1,5 19 18 0 1 8,5 0 17,5 10 25
0,5 10 20 0 1 8,5 0 8,5 26 26
0 39 27 0 7 0,5 22,5 0 0 3
0 0 65 18 0 0 12 0 0 0
1( 2
С. Tanford, The Hydrophobic Effect (New York: Wiley, 1973), p. 97. ' Величины в таблице — это процентное содержание (по весу) различных липидов от общего
их количества.
В табл. 4.4 приведен липидный состав некоторых мембран различного происхождения. Хотя количества отдельных компонентов и изменяются в широких пределах, преобладают двухцепочечные амфифильные фосфолипиды. Таким образом, не удивительно, что синтетические мембраны, полученные из одного чистого двухцепочечного амфифильного фосфолипида, обладают характерными свойствами природных биологических мембран.
ЧИСТЫЕ Л И П И Д Ы В БИСЛОЯХ Важнейшим физическим свойством двухцепочечных амфифильных молекул является их склонность образовывать двойные слои в водных дисперсиях, имеющие вид отдельных пузырьков или ламеллярных (пластинчатых) структур. Такие структуры изображены на рис. 4.12; амфифильные молекулы в них объединяются так, что полярные головки контактируют с водной фазой, а углеводородные хвосты собираются вместе, образуя безводную фазу. Вислой играет роль мембраны, отделяя содержимое пузырька от внешней среды. Ясно, что толщина бислоя зависит от длины и жесткости углеводородных липидных хвостов. В противоположность этому одноцепочечные амфифильные молекулы стремятся образовывать в водной среде глобулярные мицеллы, а не бислойные структуры. Типичная мицелла содержит до 100 молекул; ее строение показано на рис. 4.12. Таким образом, тенденция к формированию мембраноподобных бимолекулярных слоев — это специфическое свойство двухцепочечных амфифильных молекул. Для того чтобы понять причины, лежащие в основе образования мицелл или бислоев, и лучше представить их особенности, необходимо рассмотреть ряд конкретных термодинамических и структурных аспектов вопроса (гл. 25). Плоский бислой, образованный одним-единственным типом липидов, имеет две границы (поверхности) раздела бислой — растворитель. Если раствор с обеих сторон бислоя
ДРУГИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОЛИМЕРЫ
219
Плоский бислой
•^-^Сферический Двухцепочечная амфифильная молекула
—Полярная головка
I
Углеводородный хвост
Одноцепочечная амфифильная молекула РИС. 4.12. Схематическое изображение некоторых амфифильных структур. Плоский бислой и сферический бислой (пузырек) формируются из двухцепочечных амфифильных молекул. Мицеллу образуют одноцепочечные амфифильные молекулы.
одинаков, можно ожидать, что свойства и поведение обеих поверхностей тоже не будут различаться. В противном случае может возникнуть асимметрия. Сферический бислой достаточно большого диаметра должен вести себя практически так же, как и плоский бислой. У бислойных же пузырьков малого диаметра может возникнуть асимметрия, даже если их содержимое не отличается от внешнего раствора. Это происходит потому, что, поскольку кривизна внутренней и наружной поверхностей бислоя неодинакова, упаковка липидов на двух поверхностях несколько различается, и это может отразиться на свойствах поверхностей. СМЕСИ ЛИПИДОВ В БИСЛОЯХ Когда бислой состоит из липидов нескольких типов, может образоваться более сложная структура. На рис. 4.13 схематически изображено несколько сферических бислоев, состоящих из липидов двух типов. Наиболее простая структура, которую можно себе представить, — это однородный сферический бислой (рис. 4.13./4); обе поверхности его имеют один и тот же липидный состав, и липиды разного типа распределены между ними случайным образом.
220
ГЛАВА 4
РИС. 4.13. Схематическое изображение возможных сферических бислоев, состоящих из липидов двух разных типов. А. Однородный бислой. Б. Неравномерное распределение липидов между слоями. 5. Латеральное фазовое разделение на обеих поверхностях. Г. Латеральное фазовое разделение только на внутренней поверхности. Однако из-за искривления бислоя или из-за того, что растворы внутри и снаружи пузырьков различаются, липиды могут распределиться между двумя поверхностями неравномерно (рис. 4.13.Б). Такая асимметрия может быть результатом разной термодинамической устойчивости данного типа липидов в монослоях с разной кривизной при данном составе раствора. Иногда она возникает и кинетически в живой клетке из-за анизотропии в переносе липидов через бислой: например, липиды могут специфически встраиваться во внутреннюю поверхность и удаляться с наружной. В гл. 25 будет показано, что скорость спонтанного перемещения липидов с внутренней поверхности бислоя на наружную очень мала. Таким образом, у клетки есть возможность поддерживать метастабильное распределение липидов с помощью их непрерывного встраивания и удаления. В липидных бислоях асимметрия может возникать и еще по одной причине — вследствие латерального фазового разделения (рис. A.lSJB.f). Это двумерный аналог фазовых переходов в растворе, таких, как кристаллизация или выпадение осадка. Фазовое разделение в принципе может происходить как на одной, так и на обеих поверхностях пузырька. Фазы не обязательно должны быть чистыми липидными компонентами, так же как и фазы металлических сплавов могут состоять из одинаковых атомов металлов или из их смесей. Чтобы различить случаи равномерного и неравномерного распределения липидов между двумя поверхностями бислоя, необходимо располагать методами, которые позволили бы определять местоположение липидов. Важно уметь распознавать участки мембраны с гомогенным или гетерогенным липидным составом. Такие методы сейчас только разрабатываются (гл. 25).
ДРУГИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОЛИМЕРЫ
221
ФАЗОВЫЕ ПЕРЕХОДЫ В ЛИПИДАХ Свойства липидных молекул в бислоях сильно зависят от температуры. При достаточно низких температурах липидный слой подобен твердому телу. Липидные молекулы почти не перемещаются в плоскости мембраны, и их свойства во многих отношениях напоминают свойства углеводородных кристаллов. По мере повышения температуры часто наблюдается резкое изменение свойств бислоев, причем это может происходить при одной или нескольких температурах. Эти изменения происходят в таком узком температурном интервале, что напоминают фазовые переходы, которые наблюдаются при плавлении твердого тела. Выше температуры перехода бислой по своему поведению больше похож на жидкость. Липидные молекулы в этом случае способны быстро перемещаться в плоскости мембраны (латеральная диффузия). Температуры, при которых происходят переходы, и число этих переходов зависят от липидного состава. При высокой концентрации ненасыщенных жирных кислот образуются более жидкие бислой, обладающие более низкими температурами переходов. Иногда Фазовые переходы сопровождаются латеральным фазовым разделением, описанным выше. Известны случаи, когда они приводят к затвердеванию всей мембраны.
4.4. Белки в биологических мембранах БЕЛКОВЫЕ, Л И П И Д Н Ы Е И УГЛЕВОДНЫЕ КОМПОНЕНТЫ Имеющиеся данные позволяют полагать, что фосфолипидный бислой является структурной основой биологических мембран. Однако на самом деле биологические мембраны существенно сложнее, чем просто бислой, поскольку в них присутствуют не только липиды; в частности, значительную их часть составляют белки. В табл. 4.5 представлен состав некоторых клеточных мембран. Все мембраны содержат белки, липиды и углеводы. Углеводы во всех случаях составляют по весу небольшую часть мембран — как правило, 10% или меньше. Они связаны с основными компонентами мембран — липидами и белками, т.е. обычно присутствуют в виде гликолипидов и гликопротеидов. Содержание как белков, так и липидов в мембранах сильно варьирует в зависимости от типа клеток. Например, в миелиновых мембранах отношение количества белков к количеству липидов составляет около 0,2, в то время как во внутренней мембране митохондрий это отношение в 15 раз выше. Такая вариабельность несомненно отражает разнообразие функций биологических мембран. Так, миелин, по-видимому, в основном играет роль изолятора и не требует присутствия больших количеств белков. С другой стороны, внутренняя мембрана митохондрий участвует в ферментативных и транспортных процессах, которые протекают с помощью множества разных белков.
ТИПЫ И РАСПОЛОЖЕНИЕ БЕЛКОВ С. Сингер выдвинул положение о том, что мембранные белки можно подразделить на две большие группы, периферические и интегральные, в зависимости от того, как они связаны с мембраной (рис. 4.14). Периферические белки экстрагируются из мембраны при сравнительно мягкой обработке, например при повышении ионной силы. Эти белки обычно устойчивы в водных растворах и не очень прочно связаны с липидами. Примерами белков этого типа могут служить цитохоом с из митохондриальной мембраны и спектрин (белковый компонент мембраны эритроцита).
222
ГЛАВА 4
Таблица 4.5 СОСТАВ НЕКОТОРЫХ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН1)
Мембрана
Белки,
Липиды,
Щ
Миелин Плазматические мембраны кровяные пластинки клетки печени мыши эритроцит человека амеба клетки печени крысы L-клетки клетки HeLa ядерные мембраны клеток печени крысы палочки сетчатки из глаза быка наружная митохондриальная мембрана Саркоплазматический ретикулум Ламеллы хлоропластов шпината Внутренняя митохондриальная мембрана Грамположительная бактерия Пурпурная мембрана Halobacterium Микоплазма
18 33 — 42
Углеводы, Щ
0,23
79 58 — 51
46 49 54 58 60 60
54 43 42 42 40 40
59
Отношение количества белков к количеству липидов (по весу)
7,5 2— 4 8 4
0,7 0.85
2,4
1,1 1,3 1,4 1,5 1,5
35
2,9
1,6
51
49
4
1,0
52
48
(2-4)2)
1,1
67 70
33 30
(б)2)
2,0 2,3
76 75
24 25
(1-2)2) (Ю)
3,2 3,0
75 58
25 37
1,5
3,0 1,6
(5 - 10)2) (5 — 10)2)
') G. Guidotti, Ann. Rev. Biochem., 41, 731 (1972). ) Получено косвенным путем.
Интегральные белки, напротив, с трудом поддаются экстракции. К примеру, для их удаления необходимо обработать мембрану органическими растворителями. Эти белки часто выделяются в комплексе с липидами, без которых в водной среде они обычно либо слипаются, либо выпадают в осадок. Наконец, интегральные белки обычно сильно гетерогенны по размеру, и во многих мембранах они составляют более 70% общего количества белка. Эти существенные различия в свойствах и поведении интегральных и периферических мембранных белков находят свое отражение в таком важном параметре, как их аминокислотный состав. Как показано в гл. 2, зная аминокислотный состав белка, можно с уверенностью сказать, является ли он интегральным мембранным белком. Естественно полагать, что большинство периферических белков расположено на поверхности мембран. Эти белки могут находиться как на одной из поверхностей, так и с обеих сторон мембраны. Вполне правдоподобным кажется предположение, что во многих случаях они связаны с мембраной через интегральные белки, а не путем прямого контакта с липидами.
ДРУГИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОЛИМЕРЫ Трансмембранный белок Интегральный белок
Интегральный белок
223
Канал
I !
Однородное | распределение
j '
Пятно
«Шапочка»
РИС. 4.14. Типы и расположение мембранных белков. Вверху при большом увеличении изображена часть структуры, представленной в нижней половине рисунка.
ПОВЕРХНОСТНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ БЕЛКОВ Интегральные белки могут быть локализованы на какой-то одной или на обеих поверхностях мембраны, а иногда они даже пронизывают мембрану. Эти последние белки называются трансмембранными. По-видимому, интегральные белки имеют участок, насыщенный гидрофобными остатками, что позволяет им вступать в прямой контакт с липидами. У некоторых интегральных белков, расположенных на какой-то одной поверхности, есть гидрофобный хвост, посредством которого они прикрепляются к мембране. Если с помощью ферментов отсечь этот хвост, то он останется в мембране, в то время как головка перейдет в раствор и будет вести себя практически так же, как и обычный растворимый белок. Есть основания считать, что у тоансмембранных белков гидрофобная последовательность находится где-то в середине молекулы. Примером белка такого рода является гликофорин — трансмембранный белок эритроцитов. Его аминокислотная последовательность приведена на рис. 2.16. Иногда установить поверхностную локализацию мембранных белков позволяют довольно простые эксперименты, основанные на использовании реагентов, которые не могут проходить через липидный бислой (например, антител, вырабатываемых против определенного мембранного белка). Взяв замкнутый сферический пузырек или целую клетку, определяют, связывается ли с данным белком реагент, добавленный во внешний раствор. Затем пузырек разрушают и смотрят, связывается ли теперь реагент с белками, которые исходно были локализованы на внутренней поверхности мембраны. Кроме того, существуют методы образования пузырьков в присутствии заблокированного реагента. После того как пузырьки образовались, реагент из внешней среды отмывают, затем заблокированный реагент активируют, и он может атаковать белки, находящиеся на внутренней поверхности.
224
ГЛАВА 4
С помощью метода поверхностной метки довольно трудно отличить белки, локализованные на обеих поверхностях, от трансмембранных белков. Для этого необходимо определить, доступна ли одна и та же полипептидная цепь с обеих сторон мембраны одновременно или нет. ЛАТЕРАЛЬНОЕ РАСПОЛОЖЕНИЕ БЕЛКОВ Для детального описания мембранных белков требуется знать не только то, на какой поверхности они находятся, но и их распределение по этой поверхности. Белки могут перемещаться в мембране независимо, а могут быть связаны с другими белками. Они способны образовывать симметричные олигомеры, спиральные или пластинчатые структуры. О четвертичной структуре мембранных белков почти ничего не известно. Этот вопрос вызывает особый интерес в связи с возможностью образования каналов в мембране либо при участии отдельных молекул белка, имеющих внутреннюю полость, либо в результате ассоциации белков с образованием структуры с полостью посередине. Предположение о наличии каналов возникает всякий раз, когда мембрана становится хорошо проницаемой для ионов, так как чистые липидные бислои являются хорошими изоляторами. Однако о механизме образования каналов и о регуляции их проницаемости на молекулярном уровне известно очень мало. Ближайшие соседи данного мембранного белка могут быть определены на молекулярном уровне с помощью методов, аналогичных тем, что применяются для установления четвертичной структуры обычных белков (гл. 2, 8 и 14). При макроскопическом же описании необходимо знать, распределен ли каждый тип белков в мембране равномерно или проявляет какие-либо признаки латерального фазового разделения. Для исследования дальнего порядка в организации мембранных белков особенно полезна электронная микроскопия. В одних системах белки могут быть распределены равномерно, в других — образовывать пятна и даже «шапочки», которые покрывают значительную часть поверхности клетки (рис. 4.14). ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ МЕМБРАН, ОБРАБОТАННЫХ МЕТОДОМ ЗАМОРАЖИВАНИЯ—ТРАВЛЕНИЯ За последние десять лет благодаря использованию электронного микроскопа и разработке методов замораживания—скалывания и замораживания—травления в изучении строения мембран достигнуты значительные успехи. В основе указанных методов лежит быстрое замораживание образца до очень низких температур, при котором в нем, как полагают, происходят лишь минимальные изменения. Замороженный образец раскалывают ножом, с тем чтобы обнажить его внутреннюю поверхность, и готовят для электронной микроскопии. На рис. 4.15 представлены основные этапы этой процедуры в соответствии с методикой Д. Брайтона и др. Как показано на рисунке, образец сначала быстро замораживают в жидком фреоне, а затем производят скол охлажденным ножом в вакууме (чтобы избежать обмерзания ножа). Травление представляет собой испарение некоторой части льда в вакууме при температуре около —100 °С. Обнажившуюся после травления поверхность оттеняют платиной и углеродом и далее снимают образовавшуюся пленку — реплику поверхности, которую можно исследовать с помощью электронного микроскопа. Установлено, что, как правило, скол в мембране проходит вдоль поверхности, разделяющей два углеводородных слоя (рис. 4.16). Таким образом, именно эта внутренняя область подвергается травлению и именно с нее снимают реплику. На рис. 4.17 представлена фотография скола мембраны из Acholeplasma laidlawii; видна относительно гладкая по-
ДРУГИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОЛИМЕРЫ
Образец
Образец
Герметичный колокол
Жидкий фреон
Подложка
Образец
Жидкий азот А
Б
Поверхность скола Вутренняя поверхность
В Поверхность скола
Обычное " " V травление ^ _
225
Охлажденный нож Предметный столик
Поверхность скола Обнажившаяся' поверхность
Г^^Тлубокое .^^травление
Наружная поверхность
Г РИС. 4.15. Методика замораживания—травления. Образец помещают на подложку (А), замораживают (£) и в вакууме делают скол охлажденным ножом (В). При травлении (Г) лед сублимируется, и обнажаются поверхностные структуры. [D. Branton, Proc.Nat. Acad.Sci. USA, 55, 1048, (1966).]
РИС. 4.16. Схематическое изображение поверхности скола, наблюдаемой под электронным микроскопом после замораживания—скалывания. Белки могут остаться на любой половине липидного бислоя, и в зависимости от того, с какой из этих половин снимается отпечаток, они будут выглядеть как выступающие над поверхностью частицы или как вмятины. [S.J.Singer, Hosp. Pract., 8, 81 (1973).]
226
ГЛАВА 4
S _ -;^\
|
• ...'
>
РИС. 4.17. Фотография скола мембраны из Acholeplasma laidlawii. I — выпуклая поверхность скола, 2 — вогнутая поверхность скола. [A.J. Verkleij et al., Biochim. Biophys. Acta, 288, 326 (1972).] верхность скола, испещренная множеством практически случайно распределенных частиц. Скорее всего этими частицами являются белки или их агрегаты. Картина, представленная на рис. 4.17, довольно типична для мембран, находившихся до замораживания при физиологической температуре, когда липиды обычно находятся в жидком состоянии (выше температуры перехода в липидной мембране). У мембран, хранившихся до замораживания при температуре ниже температуры перехода, на поверхности скола наблюдаются гребни, а частицы образуют большие кластеры. Гребни можно наблюдать и у чисто липидных бислойных пузырьков (липосом), которые были заморожены в состоянии ниже температуры фазового перехода; в то же время поверхность скола всегда была гладкой, если вначале липосомы находились при температуре выше температуры перехода. Таким образом, липосомы при замораживании— скалывании ведут себя во многом так же, как природные мембраны. Это, как и многое другое, означает, что структурной основой биологических мембран является такой же липидный бислой, что и у липосом. Фотография на рис. 4.17 (и другие ей подобные) показывает, что в природных мембранах белки рассеяны по бислойному матриксу, образованному фосфолипидами.
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ МАКРОМОЛЕКУЛ, ПОЛУЧЕННОЕ С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОННОГО МИКРОСКОПА Электронная микроскопия может быть использована также и для выявления отдельных мембранных поверхностных компонентов. Для этого необходимо вначале «окрасить» интересующие нас молекулы, так чтобы они стали видны под электронным микро-
ДРУГИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОЛИМЕРЫ
227
РИС. 4.18. Распределение RhQ(D)-aHTHreHOB на поверхности эритроцита человека. Каждый заключенный в кружок кластер черных точек соответствует одной молекуле RhQD. Черные точки — молекулы ферритина, связанные с козьими антителами; козьи антитела прореагировали с антителами человека, которые в свою очередь связаны с молекулами Rhg (D). [G.L. Nicolson et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 68, 1416 (1971).] скопом. С этой целью используют электроноплотные метки, связанные с реагентом, который специфически взаимодействует с исследуемым компонентом. Пример такого подхода дает работа Сингера и др., в которой исследовано распределение антигена Rho(D) на поверхности мембраны эритроцита человека. Сначала O,Rh-noложительные клетки были обработаны антителами человека, выработанными против специфического антигена. После того как антитела связались со специфическими поверхностными антигенами, клетки были разрушены, а их мембраны распластаны на сетке электронного микроскопа. Затем распластанные мембраны были обработаны козьими антителами IgG, выработанными против человеческих антител IgG, связанных с антигенами Rho(D) на мембране. (Таким образом, связанные антитела человека выступали в качестве антигенов для козьих антител.) Козьи антитела были предварительно связаны с ферритином — белком, богатым железом, который обладает достаточно большой электронной плотностью, чтобы его легко можно было различить под электронным микро-
228
ГЛАВА 4
скопом. Таким образом, ферритин, связанный с козьими антителами, является тем особым красителем, который делает поверхностные антигены Rho(D) видимыми. Полученные результаты представлены на рис. 4.18; видно распределение ферритина (черные точки) на наружной поверхности мембраны. От двух до восьми точек образуют кластеры, заключенные на рисунке в кружки. Каждый кластер соответствует одному антигену Rho(D), а каждая точка — одному козьему антителу, прореагировавшему с человеческим IgG, который связан с этим антигеном. Рис. 4.18 показывает, что поверхностный антиген Rho(D) распределен по наружной поверхности мембраны случайным образом. Это согласуется с данными, полученными методом замораживания—травления: как видно из рис. 4.17, белковые частицы распределены по внутренней поверхности скола мембраны Acholeplasma laidlaw и нерегулярно.
ОБЩАЯ КАРТИНА СТРОЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН Полезно рассмотреть рабочую модель биологической мембраны. Схематическая иллюстрация на рис. 4.19 отражает основные черты жидкостно-мозаичной модели, предложенной С. Сингером. Фосфолипидный бислой можно представить как жидкий матрикс толщиной от 60 до 100 А, в который погружены различные интегральные белки. Одни белки пронизывают всю толщу мембраны, другие локализованы на одной из ее сторон. В результате мембрана является асимметричной — факт, которому есть масса подтверждений. Белковые молекулы имеют как гидрофобные, так и гидрофильные участки, что позволяет им термодинамически наиболее выгодно встраиваться в соответствующие места фосфолипидного бислоя. Дальний порядок в распределении каждого данного белка, повидимому, отсутствует, о чем говорит распределение антигена Rho(D) (рис.4.18). С другой стороны, для каждого данного белка может наблюдаться ближний порядок. Мембрана — это динамическая система, поскольку белки могут совершать в ней латеральные перемещения. На такие перемещения указывает множество экспериментальных данных. Возможно также, что белковые молекулы вращаются вокруг осей — перпендй-
РИС. 4.19. Обобщенная модель биологических мембран. [J.M. Clark, Jr., R.L. Switzer, Experimental Biochemistry, 2nd ed. (San Francisko: W.H. Freeman and Company. 1977).]
ДРУГИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОЛИМЕРЫ
229
кулярных и параллельных плоскости бислоя. Такое вращение может играть роль при выполнении многих функций, присущих мембране. Однако конкретные исследования этих аспектов только начинаются. МЕМБРАНА ЭРИТРОЦИТА Плазматическая мембрана эритроцита — это наиболее сложная природная мембрана, изученная сравнительно детально. Основные полипептиды, обнаруженные в ней, представлены на рис. 4.20,А. Около 40% массы мембраны составляют периферические белки. Это компоненты 1; 2; 4,1; 4,2; 5 и 6 (номера соответствуют полосам, наблюдаемым при электрофорезе). Все они находятся на внутренней поверхности мембраны, на что указывают этимологические и иммунохимические тесты. Компоненты 1 и 2 — это высокомолекулярный фибриллярный белок, называемый спектрином. Отдельные его полипептидные цепи имеют мол. массу в пределах от 225000 до 250000. Эти компоненты, по-видимому, тесно взаимодействуют друг с другом, поскольку между ними легко образуются сшивки. Белок полосы 5 — это актин или актиноподобный белок. Он имеет мол. массу 45000 и может образовывать гомополимеры. У многих исследователей сложилось впечатление, что спектриновые и актиновые компоненты связаны между собой и образуют фибриллярную сетку, выстилающую всю клеточную мембрану (что схематически показано на
PAS 1(2)
PAS 3
Снаружи
Внутри РИС. 4.20. Возможная модель мембраны эритроцита. А. Основные полипептиды (см. текст). Б. Возможная структура внутренней фибриллярной белковой сети. [V.T. Maichesi et al Ann Rev Biochem., 45, 667 (1976).]
230
ГЛАВА 4
рис. 4.20,Б). Возможно, эта сетка играет роль в поддержании формы эритроцита, а также в определении местоположения тех или иных мембранных белков. Белок полосы 6 — глицеральдегид-3-фосфат—дегидрогеназа. Этот белок изображен на рис. 4.20, А рядом с белком полосы 3 (интегральным), но некоторые недавно полученные данные позволяют считать, что на самом деле он связан только со спектрином. О полосах 4,1 и 4,2 почти ничего не известно. Белок полосы 3 и PAS-1 — это наиболее важные интегральные мембранные белки. Компонент 3 — гликопротеид, содержащий примерно от 5 до 8 % углеводов. Он изображен в виде димера, так как в относительно мягких условиях в нем образуются поперечные сшивки. На основании данных по химической модификации можно полагать, что компонент 3 — трансмембранный белок. Он может играть роль в переносе анионов или глюкозы. PAS-1 — это гликофорин, свойства которого широко обсуждались в данной главе и в гл. 2. Он изображен в виде димера, так как оказалось, что он ведет себя как димер в растворах детергентов, например додецилсульфата натрия. Не исключено, что гликофорин составляет основную массу глобулярных структур, которые наблюдаются на сколе мембраны эритроцита при исследовании методом замораживания—скалывания. Существуют некоторые указания на то, что участки молекулы гликофорина, проникающие внутрь клетки, непосредственно взаимодействуют со спектриновой сеткой (как показано на рис. 4.20.Я). PAS-3 — последний существенный мембранный компонент. Это гликопротеид с пептидной составляющей, имеющей мол. массу примерно 25000. Вероятно, PAS-3 — полуинтегральный белок, т.е. белок, легче экстрагируемый из мембраны, чем PAS-1 и белок полосы 3. Основные липидные компоненты мембраны эритроцита перечислены в табл. 4.4. Последние данные указывают на то, что они распределены в бислое несимметрично: около 70 °?о всего фосфатидилхолина и от 80 до 85 % всего сфингомиелина находятся на наружной поверхности бислоя. Примерно 80 — 90% фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина локализованы на внутренней поверхности мембраны. Имеющиеся данные говорят о том, что холестерин, последний существенный липидный компонент, распределен между двумя слоями приблизительно равномерно.
4.5. Взаимодействия между белками и липидами ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ БЕЛКАМИ И ЛИПИДАМИ В БИСЛОЕ Специфические взаимодействия между белками и липидами должны определять основные особенности структуры и свойств мембраны. Исходя из общих соображений о нековалентных взаимодействиях, можно с полной уверенностью сказать, что гидрофобные хвосты липидных молекул должны охотно взаимодействовать с неполярными боковыми цепями аминокислот, а полярные головки — с полярными частями белковых молекул. Однако существенные детали этих взаимодействий еще остаются невыясненными. Перечислим несколько вопросов, исследование которых только начинается. Вызывают ли мембранные белки какие-либо возмущения в прилегающей липидной фазе? Такие возмущения могут состоять в специфическом притяжении определенных липидных компонентов, увеличении подвижности или иммобилизации соседних липидов, а также в изменении глобальных свойств мембраны (таких, как толщина бислоя, его кривизна и проницаемость). Некоторые данные указывают на то, что поведение липидов, контактирующих с белками, отличается от поведения всех остальных липидов. Пограничные липидные молекулы, вероятно, полностью аналогичны тем молекулам воды, которые тесно связаны с растворимыми белками (см. гл. 10).
ДРУГИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОЛИМЕРЫ
231
Влияют ли липиды на свойства мембранных белков? Например, будет ли мембранный белок функционировать в любом бислое или для его работы необходим особый липидный состав? Совершенно очевидно, что функционирование некоторых ферментов связано с текучестью мембран. Это особенно легко понять в случае реакций, для протекания которых субстраты или ферменты должны диффундировать в мембране по направлению друг к другу. Имеющиеся данные пока не позволяют ответить на вопрос, «различают» ли белки бислои с одинаковой температурой перехода, но с разным липидным составом. Отметим, однако, что некоторые белки претерпевают существенные изменения, когда температура при своем изменении проходит область фазового перехода в липидах. Проникают ли липиды внутрь мембранного белка или связываются с его поверхностью — неясно. Здесь крайне нужны модельные системы, в которых белок взаимодействует лишь с несколькими липидами и отсутствуют те сложности, которые привносит мембрана. Весьма многообещающим представляется использование интегрального мембранного фермента С-55-изопреноид-алкоголь—фосфокиназы и периферического фермента пируватоксидазы (Gennis, Jonas, 1977). В последнее время появились лишь первые данные относительно формы мембранных белков (гл. 14). Прежде чем делать достаточно общие выводы, необходимо будет определить трехмерную структуру нескольких таких белков. Весьма правдоподобным кажется предположение, что те части молекул мембранных белков, которые находятся внутри бислоя, имеют а-спиральную или /Згскладчатую структуру. Это наиболее эффективный способ спаривания доноров и акцепторов водородных связей. ЛИПОПРОТЕИДЫ Взаимодействия между белками и липидами имеют место не только в мембранах, но и в липопротеидах. Липопротеиды — это мицеллоподобные агрегаты. Здесь мы рассмотрим только липопротеиды плазмы, которые являются нековалентными агрегатами различных липидов и пептидов. Как уже отмечалось, на поверхности бактериальных клеток существуют и ковалентные липидно-белковые соединения. В плазме различают четыре основных класса липопротеидов. Это (в порядке возрастания плотности) хиломикроны, липопротеиды с очень низкой плотностью (ЛОНП), липопротеиды с низкой плотностью (ЛНП) и липопротеиды с высокой плотностью (ЛВП). О липопротеидах первого класса известно относительно мало, но свойства липопротеидов остальных трех классов отчасти установлены; в табл. 4.6 суммированы все известные по этому поводу данные. Основная функция липопротеидов плазмы — это транспорт липидов, в частности ЛНП являются главными переносчиками холестерина. Липопротеиды, выделенные от человека и из других организмов, — это крупные глобулярные частицы, несколько различающиеся по содержанию белков и липидов. Липопротеиды всех классов содержат небольшое число главных белковых компонентов, причем аминокислотные последовательности большинства из них в ЛОНП и ЛВП известны. Для белков этих двух классов характерен необыкновенно высокий процент а-спиральности; эта структура стабилизируется благодаря присутствию липидов, так как у очищенных апопротеидов процент а-спиральности ниже, чем у природных липопротеидов. Как и ожидалось, низкая плотность белка сочетается с высоким содержанием липидов. Высокое содержание липидов характерно также для частиц большого размера. Повидимому, в каждом классе липопротеидов преобладает какой-то один тип липидов, хотя в той или иной-степени в них представлены самые разные липиды. Более половины липидов в ЛОНП — это триглицериды, в ЛНП — эфиры холестерина, в ЛВП — фосфолипиды. Заметим, что два компонента (триглицериды и эфиры холестерина) почти неполярны и нерастворимы в воде. Поэтому необходимо, чтобы остальные белки и липиды обеспечивали образование стабильной суспензии, которая могла бы переноситься током кро-
232
ГЛАВА 4 Таблица 4.6 СВОЙСТВА ЛИПОПРОТЕИДОВ ПЛАЗМЫ ' Липопротеид с очень низкой плотностью
Плотность, г/см3 Мол. масса Содержание белка, % (по весу) Основные белковые компоненты
0,95 — 1,006 5-106 10 Апо-С-1 (57 аминокислот)
Лилопротеид с низкой плотностью
1,019 — 1,063 2106
Вторичная структура белков
Вторичная структура апопротеидов Содержание липидов (в процентах от суммарного веса липопротеида) триглицериды фосфолипиды холестерин эфиры холестерина
а-Спираль, 56%
55 20 10 5
плотностью 1,063 — 1,21 От 1,7-105 д о З . 6 1 0 5
25 Апо-В (мол. масса до 275 000)
50 Апо-А-1 (245 аминокислот) Апо-А-И, (димер из двух цепей, содержащих по 77 аминокислотных остатков)
а-Спираль, 25 % /З-Конформация, 37% Неупорядоченная структура, 37%
а-Спираль, 70%
Апо-С-П (78 аминокислот) Апо-С-Ш (79 аминокислот) Апо-Е (мол. масса 33000) Апо-В а-Спираль, 73 % Другие типы конформации, 27%
Липопротеид с высокой
6-8 21—22 7 —8 36 — 41
/З-Конформация 11 % Неупорядоченная структура, 19% а-Спираль, 52% /З-Конформация, 10% Неупор ядоченная структура, 38%
Малое >20 Малое 15
" Из результатов, обобщенных J. D. Morresett, R. L. Jackson, A. M. Gotto, Jr., Ann. Rev. Biochem., L. С Smith, H. J. Pownall, A. M. Gotto, Jr., Ann. Rev. Biochem., 47, 751 (1978).
183 (1975) и
ви. Большинство белков, содержащихся в ЛОНП, — это сравнительно низкомолекулярные белки. Те, что присутствуют в ЛВП, относятся скорее к белкам среднего размера, за исключением белка апо-А-П, который является весьма необычным симметричным димером, состоящим из двух одинаковых цепей, соединенных единственной дисульфидной связью. Белковые компоненты ЛНП изучены не очень хорошо, но весьма возможно, что они крупнее других аполипопротеидов. При исследовании природных липопротеидов возникают два основных вопроса: 1) какова организация липидных и белковых компонентов в глобулярных частицах и 2) как именно взаимодействуют между собой белки и липиды? Известно здесь пока очень мало. Большинство липопротеидов, по-видимому, образуют мицеллы, внутри которых находятся неполярные липиды, а снаружи — полярные части белков и другие липиды. Однако многое при этом остается неясным. Расположены ли белковые субъединицы в мицеллах упорядоченным образом? Некоторые исследования ЛНП позволяют предположить, что это действительно так. Контактируют ли белковые субъединицы друг с другом или они
ДРУГИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОЛИМЕРЫ
233
Lvs Л1
Неполярная поверхность Lys' Полярная поверхность РИС. 4.21. Схематическое изображение а-спиральной структуры одного из участков пептидного компонента аполипопротеида C-I. Заряженные группы изображены в цвете. [J.D. Morrisett et al., Ann.Rev. Biochem., 44, 183 (1975).]
плавают в «липидном море» независимо? Белки апо-A-I и апо-А-П из ЛВП в отсутствие природных липидов, будучи взяты в эквимолярных количествах, образуют димер 1 : 1. Очевидно, это взаимодействие имеет место также и в присутствии липидов, так как в ЛВП эти два белка легко сшиваются 1,5-дифтор-2,4-динитробензолом. Было показано, что по крайней мере некоторые из полипептидов в составе липопротеидов могут взаимодействовать с огромным числом липидов. Например, белок апо-С-Ш способен связывать от 18 до 80 молекул фосфатидилхолина. Исследования по связыванию липидов фрагментами белковых молекул, а также по защите целых молекул от протеолиза указывают на то, что основная масса липидов связывается с С-концевой частью белка. Аналогичные исследования, проведенные с белком апо-А-П, показали, что фосфолипиды связываются в основном с двумя третями молекулы белка со стороны С-конца. Тот факт, что липиды увеличивают степень а-спиральности белка, приводит к интересной гипотезе о детальной природе этого связывания. Проще всего объяснить данное явление тем, что липиды связываются именно с «-спиральными участками. Когда аминокислотные цепочки, предположительно связывающиеся с липидами, свернуты в а-спираль, обнаруживается следующий любопытный факт: часть таких участков в белке апо-C-I (рассматриваемых как цилиндр) имеет неполярную и полярную поверхности (рис. 4.21). Поразительная особенность полярной поверхности заключается в том, что отрицательно заряженные боковые цепи лежат в ее середине, в то время как положительно заряженные группы расположены по краям. Заманчиво предположить, что фосфолипиды связаны с а-спиралями так, что отрицательно заряженный фосфат соседствует с положительно заряженным краем, а несколько метиленовых групп жирной кислоты, ближайших к фосфату, контактируют со смежной неполярной поверхностью пептида. Тогда остальная часть молекулы жирной кислоты может быть направлена наружу и взаимодействовать с другими липидными молекулами.
234
ГЛАВА 4
По-видимому, можно поставить такие эксперименты, которые позволили бы непосредственно исследовать характер взаимодействия между липидами и белками. Такие эксперименты важны не только для понимания структуры липопротеидов, но и для решения значительно более общей проблемы структуры и функций мембранных белков. НЕВЫЯВЛЕННЫЕ МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОМПЛЕКСЫ Из четырех основных типов макромолекул — липидов, полисахаридов, белков и нуклеиновых кислот — в принципе могут образовываться шесть типов ковалентных парных комплексов и еще шесть нековалентных. Из табл. 4.7 видно, что из 12 потенциально Таблица 4.7 РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ОБНАРУЖЕННЫХ К НАСТОЯЩЕМУ ВРЕМЕНИ ГЕТЕРОГЕННЫХ ПРИРОДНЫХ АССОЦИАТОВ МАКРОМОЛЕКУЛ Ассоциат
Ковалентная связь
Нековалентная связь
Белок — нуклеиновая кислота Редко Очень часто Белок — липид " " " " Белок — сахарид Очень часто Редко Нуклеиновая кислота — сахарид Редко — Липид — сахарид Довольно часто — Липид — нуклеиновая кислота — —
возможных комплексов среди упорядоченных долгоживущих стабильных клеточных структур пока удалось обнаружить только 8. Есть ли в природе остальные четыре — пока неизвестно. Очень настораживает то, что не удалось обнаружить ни одного упорядоченного комплекса липидов и нуклеиновых кислот. В принципе такие комплексы могли бы образоваться в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме, который состоит из мембран и связанных с ними рибосом. Было бы интересно выяснить, существует ли в этой структуре прямое взаимодействие между липидами и РНК.
Краткие выводы Исследование свойств некоторых мало изученных биологических полимеров и агрегатов весьма информативно и в то же время поднимает множество вопросов. Полисахариды существуют в виде как линейных, так и разветвленных структур. Нередко они представляют собой гомополимеры или чередующиеся сополимеры. На уровне вторичной структуры они являются одно- и многоцепочечными спиралями. Далее эти спирали организованы в фибриллярные и гелеобразные (третичную и четвертичную) структуры. Сахариды являются также компонентами других биологических комплексов, таких, как пептидогликан клеточных стенок бактерий и гликопротеиды эукариотических клеток. Комплексы между белками и нуклеиновыми кислотами выполняют очень важные биологические функции и по своей организации бывают весьма разнообразны. У простых ви-
ДРУГИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОЛИМЕРЫ
235
русов основным компонентом, определяющим строение вирусной частицы, является белок, и он располагается снаружи структуры. В хроматине, напротив, белок образует сердцевину, на которую намотана ДНК. Примером структуры, в которой имеют место тесные взаимодействия между белками и нуклеиновыми кислотами, служат рибосомы. Детальные механизмы узнавания этими двумя типами макромолекул друг друга неизвестны. Липиды — это амфифильные соединения; они образуют мицеллы, если содержат по одной жирнокислотной цепи, и двойные слои или бислойные пузырьки, если таких цепей две. Свойства и состав двух поверхностей бислоя не обязательно одинаковы. Природные мембраны помимо липидов содержат большое количество белков. Периферические белки легко экстрагируются из мембраны, в то время как интегральные мембранные белки прочно связаны с ней, вероятно, с помощью гидрофобного участка пептидной цепи. Некоторые интегральные цепи локализуются только на одной поверхности мембраны, другие пронизывают ее насквозь. В липидных бислоях происходят фазовые переходы между состояниями, которые условно можно считать твердым и жидким. В природных мембранах тоже наблюдаются аналогичные переходы, а также латеральное фазовое разделение. От других биологических структур мембраны отличает то, что они являются динамическими системами. В них происходит довольно быстрое латеральное перемещение белков и липидов и вращение различных компонентов. Однако перескок компонентов с одной поверхности на другую происходит весьма редко. О деталях липидно-белковых взаимодействий известно совсем немного. Полезными модельными системами могут служить липопротеиды сыворотки, которые являются мицеллоподобными структурами, состоящими из разных пептидов и липидов. Эти соединения интересны и сами по себе, поскольку играют важную роль в транспорте липидов. ЗАДАЧИ 4.1. Предположим, что вам удалось выделить мицеллу, содержащую одну молекулу белка, обычно существующего в виде трансмембранного белка. Каким, по вашему мнению, будет взаимное расположение в такой мицелле белка и липидов? 4.2. Для того чтобы идентифицировать белки, расположенные рядом друг с другом в клеточной мембране, часто используется метод сшивания. Однако из-за большой латеральной подвижности некоторые мембранные белки, первоначально расположенные далеко друг от друга, могут случайно оказаться рядом, что может привести к образованию между ними поперечных сшивок. Как бы вы выявили такие случаи или предотвратили их в эксперименте по сшиванию? 4.3. Почему есть основания ожидать, что олигомерный белок сможет участвовать в специфическом узнавании палиндромной последовательности нуклеиновой кислоты? 4.4. Почему нерегулярность последовательностей и ветвление цепи полисахаридов увеличивают вероятность образования геля, а не других возможных типов третичной и четвертичной структуры? 4.5. Одни нуклеопротеидные комплексы стабилизируются при увеличении концентрации солей, в то время как другие дестабилизируются. Чем могут различаться структуры этих двух типов комплексов? Рассмотрите типы белков, которые могут участвовать в образовании комплекса, возможные детали белково-нуклеиновых контактов и число малых катионов, связанных с комплексами, по сравнению с числом этих ионов в случае несвязанных компонентов.
236
ГЛАВА 4
ЛИТЕРАТУРА Общая Gennis R. В., Jonas А., 1977. Protein—lipid interactions, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 6, 195. Kirkwood S., 1974. Unusual polysaccharides, Ann. Rev. Biochem., 43, 401. Rogers H. J., Perkins H. R., 1968. Cell Walls and Membranes, London, Spon. Singer S. J., 1974. The molecular organization of membranes, Ann. Rev. Biochem., 43, 805. Von Hippel P. H., McGhee J. D., 1972. DNA—protein interactions, Ann. Rev. Biochem., 41, 231.
Специальная Braun V., Hantke K., 1974. Biochemistry of bacterial cell envelopes, Ann. Rev. Biochem., 43, 89. Casjens S., King J., 1975. Virus assembly, Ann. Rev. Biochem., 44, 555. Champoux J. J., 1978. Proteins that affect DNA conformation, Ann. Rev. Biochem., 47, 449. DiRienzo J. M., Nakamura K., Inouye M., 1978. The outer membrane proteins of Gram-negative bacteria: Biosynthesis, assembly and functions, Ann. Rev. Biochem., 47, 481. Elgin S. С R., Weintraub H., 1975. Chromosomal proteins and chromatin structure, Ann. Rev. Biochem.,
44,900. Kornfeld R., Kornfeld S., 1976. Comparative aspects of glycoprotein structure, Ann. Rev. Biochem., 45, 217. Lancelot G., Helene C, 1977. Selective recognition of nucleic acids by proteins: The specificity of guanine interactions with carboxylate ions, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 4872. Marchesi V. Т., Furthmayr # . , Tomita M., 1976. The red cell membrane, Ann. Rev. Biochem., 45, 667. Morrisett J. D., Jackson R. L., Gotto A. M., Jr., 1975. Lipoproteins: Structure and function, Ann. Rev. Biochem., 44, 183. Rothman J. E., Lenard J., 1977. Membrane asymmetry, Science, 195, 743. Stanier R. Y., Adelberg F. A., Ingraham J. L., 1976. The Microbial World, 4th ed., Englewood Cliffs, N. J., Prentice-Hall. [Имеется перевод: Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрем Дж. Мир микробов. — М.: Мир, 1979. В гл. 11 подробно рассмотрено строение клеточных стенок.] Tanford С, 1973. The Hydrophobic Effect, New York, Wiley. Thomas J. O., 1978. Chromatin structure. In: Biochemistry of Nucleic Acids, vol. 2, ed. B. F. С Clark, Baltimore, University Park Press, p. 181. Warrant R. W., Kim S. H., 1978. a-Helix—double helix interaction shown in the structure of a protamine—transfer RNA complex and a nucleoprotamine model, Nature, 271, 130. Wittmann H. G., 1976. Structure, function and evolution of ribosomes, Eur. J. Biochem., 61, 1.
Глава 5 КонфорМСЩиОННЪШ пНпЛЫЗ U С14ЛЫ,
определяющие структуру белка
5.1. Основные проблемы, связанные со структурой белковых молекул Одна из наиболее трудных и интересных задач биохимии — это выяснение физических основ строения белковых молекул, отличающихся тонкой организацией и высокой специфичностью. Эта задача приобретает особое значение из-за того, что биологическая активность таких макромолекул чувствительна к изменениям их пространственной конформации. Так как биологические полимеры способны разворачиваться (например, при нагревании или обработке мочевиной) и затем снова сворачиваться, возвращаясь в исходное состояние, разумно предположить, что в основном конформации, принимаемые различными биополимерами, наиболее выгодны термодинамически. Некоторые данные, подтверждающие эту гипотезу, были получены в серии экспериментов, выполненных Анфинсеном и др. (1961 г.). Эти исследования показали, что даже при разрыве всех четырех дисульфидных связей рибонуклеазы и полной ее денатурации мочевиной после удаления мочевины и реокисления дисульфидных мостиков белок снова приобретает правильную нативную конформацию1. В этой главе мы обсудим различные факторы, определяющие конформацию белка. Сначала мы рассмотрим особенности геометрии молекулы, например фиксированные длины связей и величины валентных углов полипептидной цепи. Затем проанализируем ограничения, налагаемые на возможные конформации стерическими факторами. Мы также рассмотрим усовершенствованный вариант подобного анализа, основанный на использовании более реалистических потенциальных функций. В заключение мы познакомимся с другими факторами, играющими очень важную роль в формировании белковых структур. К ним относятся образование хорошо изученных водородных связей и «гидрофобные» взаимодействия, природа которых менее понятна. Если бы все эти факторы были достаточно хорошо изучены и существовал соответствующий математический аппарат, появилась бы возможность предсказывать, например, трехмерную структуру белка по его аминокислотной последовательности. Эта цель еще не достигнута, но недавние успехи показывают, что ее нельзя считать нереальной. (Другие аспекты укладки белковых молекул обсуждаются в гл. 21.)
5.2. Геометрия полипептидной цепи На рис. 5.1 представлена a-L-полипептидная цепь, все остатки которой находятся в /г?рвнс-положении (так называемый плоский зигзаг). Остатки пронумерованы последовательно от 1 до и, начиная с N-конца. Отметим, что одинаковые атомы одного и того же 1
Несмотря на результаты этих экспериментов, необходимо считаться с возможностью того, что нативным структурам соответствует локальный минимум свободной энергии, а достижению конформации с более низкой свободной энергией препятствуют кинетические барьеры.
ГЛАВА 5
238
Ri+i
РИС. 5.1. a-L-полипептидная цепь. Все аминокислотные остатки находятся в трокс-конформации.
остатка обозначаются по-разному: например, ;-й а-углеродобозначается Cf, тогда как /-Й карбонильный углерод — С-. Индивидуальные аминокислотные остатки различаются своими боковыми цепями (часто называемыми R-группами). Длины связей и валентные углы, определяющие скелет цепи, можно считать фиксированными. В табл. 5.1 приведены общепринятые значения этих параметров. Таблица 5.1 ГЕОМЕТРИЯ ПОЛИПЕПТИДНОЙ ЦЕПИ1' Связь
са-с С—N N-Ca С =О N —Н а
с -с"
Ca-Ha
Длина связи, А
,53 ,32 ,47 ,24 .00 ,54 ,07
Связи
Валентный угол град.
Ca-C'-N C'-N-Ca
113 123 ПО
N— C a — С
. Sasisekharan. In: Collagen, ed. N. Ramanathan (New York: Interscience, 1962), p. 39.
Важная особенность структуры состоит в том, что амидная группа обычно находится в плоской /првнс-конформации. Это можно объяснить резонансным состоянием, придающим амидной связи характер двойной связи,
к
о)
y
о.
в результате чего эта связь укорачивается на 0,1 А. Вследствие плоской трансконформации амидной группы расстояние между последовательными а-углеродными атомами постоянно и равно 3,8 А. Отсюда следует, что конформация полипептидной цепи как целого определяется углами поворота вокруг связей N — С а и Са—С.
КОНФОРМАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ: БЕЛКИ
239
УГЛЫ ВНУТРЕННЕГО ВРАЩЕНИЯ Для описания трехмерной структуры макромолекулы необходимо определить внутренние углы вращения, или так называемые торсионные углы. Мы следуем здесь рекомендациям ШРАС — ШВ (1970 г.). Рассмотрим систему, состоящую из четырех атомов А—В—С—D. А^ Ф Х> При заданных длинах связей и валентных углах торсионный угол ф описывает взаимное расположение связей С—D и А—В. Он определяется как угол между плоскостью, задаваемой связями В — С и С — D , и плоскостью, задаваемой связями А—В и В—С. Численные значения, приписываемые по соглашению торсионному углу, определяются следующим образом. На рис. 5.2, А,Б показаны проекции Ньюмена и проекции рассматриваемой нами четырехатомной системы в перспективе. Положительное значение угла ф присваивается правому (происходящему по часовой стрелке) повороту, необходимому для перевода ближнего атома (А или D) в «заслоненное» положение относительно дальнего (D или А) (когда ближний атом заслоняет дальний на проекции Ньюмена). Например, на первой и третьей проекциях рис. 5.2^4 правый поворот ближнего к нам атома А на угол , вокруг связи В—С (если смотреть в направлени от В к С) приводит к тому, что атом А заслоняет атом D. Если атомы расположены в обратном порядке, как на второй и четвертой проекциях, то правый поворот атома D на угол ф2 вокруг связи С—3 также приводит к заслоненному положению атомов D и А. Таким образом, независимо от того, смотрим ли мы в направлении от В к С или от С к В, мы получаем то же положительное значение для угла ф. С другой стороны, это же значение ф получается, если мы смотрим в направлении от В к С и определяем ф как правый поворот связи С—D (вокруг В—С), необходимый для перевода атомов А (ближний) и D (дальний) из заслоненного положения в исходное. Очевидно, мы можем выполнить эквивалентную операцию и глядя в направлении от С к В. Отрицательные значения присваиваются торсионному углу при левом (происходящем против часовой стрелки) повороте (рис. 5.2, Б). Значение ф = 0° «ответствует заслоненной конформации, в которой связи А—В и С—D находятся в г/ыс-положении. Когда они находятся в транс-положении
торсионный угол ф = 180° (или, что то же, ф = - 180°). Удобно определять значение ф в области — 180° jx ф^, которая обычно записывается в виде где параметры ак1 и ск1 характеризуют пару к- и /-атомов или атомных групп (например, СН3). Типичная зависимость Ем от гк1 приведена на рис. 5.5. График показывает, что на больших расстояниях взаимодействие отсутствует. По мере сближения атомов растет притяжение между ними, а на расстояниях, на которых атомные радиусы перекрываются, начинает преобладать сильное отталкивание. Член выражения (5.1), характеризующий притяжение и зависящий от расстояния между атомами в степени — 6, есть не что иное, как хорошо известная дисперсионная энергия Лондона. Распределение электронной плотности вокруг атомного ядра испытывает частые флуктуации, что порождает смещение центров электронных и ядерных зарядов. Эти смещения приводят к флуктуациям дипольного момента, которые могут находиться в резонансе с аналогичными флуктуациями дипольного момента соседнего атома, что приводит к их постоянному притяжению. Это взаимодействие индуцированный диполь— индуцированный диполь и объясняет зависимость энергии от шестой степени расстояния. Параметр ск1 получается из величин поляризуемости атомов к и / и из эффективного числа электронов, способных поляризоваться. (См. Brant et al., 1967 и приведенную там библиографию.)
10
РИС. 5.5. Зависимость энергии невалентных взаимодействий Ек1 от расстояния между взаимодействующими атомами или группами с номерами к и I (в данном случае — между двумя молекулами водорода). [W.J. Moore, Physical Chemistry, 3d ed. (Englewood Cliffs, N.Y.: PrenticeHall, 1962), p. 715].
КОНФОРМАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ: БЕЛКИ
245
РИС. 5.6. Схема, иллюстрирующая наличие дипольного момента у амидной группы. В вытянутой цепи направления моментов чередуются. [P.J. Flory, Statistical Mechanics of Chain Molecules (New York: Interscience, 1969), chap. VII.] Член ак/г^! в выражении (5.1), описывающий энергию отталкивания, не имеет строгого теоретического обоснования1. Результаты, полученные в экспериментах с молекулярными пучками, показывают, что т варьирует от 9 до 12. Параметр ак1 можно получить из требования, чтобы минимум кривой на рис. 5.5 соответствовал известным межатомным расстояниям (см. также Brant et al., 1967). При расчетах структуры полипептидов обычно используют следующие величины атомных радиусов:/^ = 1,2 + 1,3 А; /д = 1,5 + 1,6 А; /•„„ = 1,95 А (СН,-группа обычно рассматривается как единая сфера). Cri2
^
ДИПОЛЬНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ Другой вклад в энергию, зависящую от поворотов на углы фиф, дают дипольные взаимодействия между соседними амидными группами. Дипольные моменты амидных групп приблизительно параллельны N — Н-связи и направлены от N к Н (рис. 5.6). Их численное значение примерно равно 3,7 Д. Это довольно большой момент; например, дипольный момент НС1 равен 1,03 Д, СН3С1 — 1,87 Д и HCN — 2,93 Д. Поэтому мы вправе ожидать, что дипольные взаимодействия оказывают значительное влияние на конформацию скелета полипептидной цепи. Ориентация дипольных моментов любых двух последовательно расположенных амидных групп определяется, несомненно, углами чаше всего группируются внутри этих структур. Эти соображения позволяют построить простую схему предсказания вторичной структуры белков. Суть ее заключается в том, чтобы, приписав конформационные параметры каждому остатку, расположенному в известной последовательности, попытаться затем выделить кластеры остатков полипептидной цепи, склонные образовывать спираль, к которым в определенных точках примыкают остатки, прерывающие формирование этой вторичной структуры. Аналогичную процедуру можно проделать и в отношении /3-слоев. Это легко сделать, если в соответствии со значениями конформационных параметров разделить все остатки на следующие классы: формирующие спираль, препятствующие ее образованию, формирующие /3-структуру и препятствующие ее образованию. Такая классификация приводится в табл. 5.12. Используя ее, можно составить набор простых правил для предсказания вторичной структуры белков исходя из их аминокислотной последовательности. СРАВНЕНИЕ ПРЕДСКАЗАННЫХ И НАБЛЮДАЕМЫХ ВТОРИЧНЫХ СТРУКТУР По описанной выше схеме была предсказана вторичная структура множества белков, для которых имеются данные, полученные методом рентгеноструктурного анализа. В табл. 5.13 приводится сводка результатов для следующих белков: конканавалин А, гемоглобин миноги, термолизин и ингибитор трипсина. Этих белков нет среди тех 15, для которых были получены основные данные, приведенные в табл. 5.11 и 5.12. В табл. 5.13 перечислены участки последовательности, которые по оценкам должны иметь форму аспирали и /3-слоя, а тажке участки, где эти структуры наблюдаются в действительности. Для ингибитора трипсина — небольшого полипептида, состоящего из 58 остатков, — теоретические и экспериментальные данные прекрасно согласуются между собой. Поскольку это низкомолекулярный белок, локальные взаимодействия, по-видимому, оказывают большее влияние на формирование его структуры, и поэтому можно было ожидать, что полученные для него результаты будут наилучшими. Достаточно хорошее согласие теории и эксперимента получено для других трех белков. В самом деле, 17 из 18 аспиральных участков и 20 из 22 /3-слоев локализованы правильно, и лишь 5 а-спиралей и 10 /3-слоев не обнаружены в тех областях, где они должны были бы быть согласно расчетам. Отсюда следует, что результаты предсказания вторичной структуры нельзя объяснить просто случайным совпадением. Еще один свойственный многим белкам элемент структуры — /3-изгиб. Рис. 2.25 показывает, что эта структура дает полипептидной цепи возможность резко менять направление. По аналогии с параметрами Ра и Р^ можно рассчитать и конформационные параметры /3-изгиба для каждой аминокислоты. Использование их совместно с Ра и Рр позволяет повысить точность конформационного анализа. Примечательно, что примерно в 12 белках, недавно исследованных Чоу и Фасманом, около 80% всех остатков находились в составе а-спиралей, /3-слоев и /3-изгибов и лишь остальные 20% не могли быть отнесены ни к какому определенному типу. В гл. 2 упоминалось об определении вторичной структуры аденилаткиназы, небольшого полипептида с мол. массой 21600. На рис. 2.13 сравниваются результаты, полученные для этого белка различными исследователями. Приведены данные для /3-изгибов, /3слоев и а-спиралей (сверху вниз). Прямоугольники указывают действительную локализацию этих элементов вторичной структуры в последовательности, а горизонтальные отрезки соответствуют теоретическим данным. Гистограммы в нижней части рисунков дают сводный результат.
Таблица 5.13 СРАВНЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ДАННЫХ О ЛОКАЛИЗАЦИИ а-СПИРАЛЕЙ И 0-СЛОЕВ В ЧЕТЫРЕХ БЕЛКАХ, НЕ РАССМАТРИВАВШИХСЯ ПРИ РАСЧЕТЕ КОНФОРМАЦИОННЫХ ПАРАМЕТРОВ Ра И Р^ 0-Слои
а-Спирали Белок
рентгеноструктурные данные
Конканавалин А 81-85
Гемоглобин миноги
Термолизин
Ингибитор трипсина (из поджелудочной железы)
теория
рентгеноструктурные данные
теория
38-43 81-86 155-160 180-189
4-9 25-29 48-55 59-66 73-78 92-97 106-116 125-132 140-144 173-177 190-199 209-215
3-12 25-29 47-55
12-29 3044 45-52 62-66 67-88 92-106 — 111-127 132-148 — 65-88 137-152 159-180 235-246 259-274 280-296 302-313
8-24 — 45-52 61-78 80-88 92-100 104-110 115-128 133-147 53-58 67-74 137-150 158-180 238-246 261-271 281-259 301-313
3-6 45-56
2-7 45-54
''p. Y. Chou, G. D. Fasman, Biochemistry, 13, 222 (1974).
60-67
73-80 88-96 106-113 124-134 140-144 173-177 190-200 209-215 229-234
Нет — —
2-6 35-43
4-13 15-32 37-46 52-58 60-63 — 97-106 112-116 119-123 — — — — — — 16-24 27-36
4-17 20-32 37-50 — 61-66 75-84 98-110 — 120-124 127-131 151-157 192-197 221-225 251-260 272-276 16-23 27-38
КОНФОРМАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ: БЕЛКИ
283
Видно, что сводные расчетные данные находятся в хорошем согласии с данными рентгеноструктурного анализа. Средняя часть рисунка показывает, что в молекуле аденилаткиназы имеется пять /3-структурных участков, причем правильно идентифицированы те из них, которые расположены в окрестности остатков с номерами 12, 91 и 116. Эти три участка образуют три центральные цепочки пятицепочечного параллельного /3-слоя. Местоположение двух других цепочек установлено на сводной гистограмме не очень точно. Что касается изгибов, то из верхней части рисунка видно, что большинство из них локализованы правильно, хотя некоторые из предсказанных в действительности не встречаются. В целом все сказанное выше относительно аденилаткиназы иллюстрирует то обстоятельство, что различные полуэмпирические методы позволяют двольно точно предсказывать вторичную структуру белков и что разные подходы к решению этой проблемы могут приводить к сходным результатам. Предел точности полуэмпирических методов пока трудно установить. Следует также помнить, что точное предсказание вторичной структуры белковой молекулы необходимо, но не достаточно для определения трехмерной конформации. Очень трудно представить себе, как зависит пространственная организация молекулы белка от тех структур, о которых говорят как о «неупорядоченных» (речь идет о структурах, которые нельзя отнести к а-спиралям, 0-слоям и т.д.). Неизвестно также, какую роль в формировании трехмерной конформации играют взаимодействия между далеко отстоящими вдоль белковой цепи остатками. Все эти факторы необходимо учесть, прежде чем приступать к предсказанию полной трехмерной структуры белка, исходя из его аминокислотной последовательности.
5.12. Построение молекулярных моделей с помощью ЭВМ Для предсказания конформации белков и для многих других целей полезно иметь возможность быстро конструировать молекулярные модели белковой структуры. Ясно, что использовать молекулярные модели для построения вручную большого многообразия структур совершенно невозможно. Левинталь и др. (1966 г.) предложили новый, очень остроумный подход к решению этой проблемы, в котором они использовали для построения моделей ЭВМ. Таким методом можно быстро построить молекулярную модель по данным об углах поворота остова молекулы и вывести получившуюся структуру на экран дисплея. Хотя при этом мы видим только двумерную картину, пространственное представление о структуре можно получить, поворачивая модель вокруг какой-нибудь из осей. На рис. 5.21 показаны типичные выведенные на экран дисплея проекции кристаллической структуры миоглобина. Большое впечатление производят наглядность и ясность этих картин. Таким образом, в поисках предпочтительной конформации исследователь может быстро сконструировать и зрительно проанализировать большое количество структур.
Краткие выводы Структуру белковых молекул определяет множество самых разных, подчас весьма сложных факторов. Длины связей и валентные углы в полипептидной цепи могут считаться по существу фиксированными, а амидные группы, как правило, находятся в плоской mpawc-конформации. Поэтому конформация полипептидного скелета определяется углами внутреннего вращения фиф для каждого остатка. Эти углы вращения могут принимать значения в пределах, определенных пространственными и другими взаимодействиями (такими, как амид-амидные дипольные взаимодействия) в цепи. Хотя эти взаимо-
284
ГЛАВА 5
РИС. 5.21. Проекции кристаллической структуры миоглобина на экран дисплея. (Представлена С. Левинталем).
действия исключают значительную часть возможных конформации, все же их число остается огромным. Образование водородных связей, дисульфидных мостиков, гидрофобные взаимодействия, обусловленные особыми структурными свойствами воды, а также ионные взаимодействия еще больше ограничивают набор возможных структур полипептида. Совместное влияние всех этих взаимодействий приводит к формированию «нативной» конформации. В определении именно такой конформации ключевую роль играет аминокислотная последовательность белка. Хотя в настоящее время не существует достаточно обоснованного метода предсказания конформации белков по их аминокислотным последовательностям, попытки такого рода делаются и даже иногда оказываются довольно успешными. Другие вопросы формирования пространственной структуры белковых молекул обсуждаются в гл. 21.
КОНФОРМАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ: БЕЛКИ
285
ЗАДАЧИ 5.1. Рассмотрим циклический полипептид с повторяющейся последовательностью XYZXYZX, состоящий из семи аминокислотных остатков. X, Y и Z — три аминокислотных остатка Ala, Pro и Gly. Следует составить такую последовательность, чтобы цепь замыкалась с наименьшей деформацией. Нужно ответить на вопрос — в каком порядке должны располагаться аминокислотные остатки? Известный профессор А заявляет, что наилучшее решение такое: Y = Pro, Z = Gly, X = Ala. Робкий студент утверждает, что решение X = Ala, Y = Gly и Z = Pro лучше. Третий участник, философ, ничего не знающий об аминокислотах, говорит, что ни одно из этих решений не является действительно наилучшим. Кто из них прав и почему? 5.2. Белок претерпевает небольшие конформационные изменения, наиболее значительное из которых — перемещение трех плотно упакованных аминокислотных боковых цепей — лейцина, аланина и фенилаланина — из этанолоподобного окружения в белке во внешнюю область, где они погружены в растворитель. Предполагая, что это единственная термодинамически значимая конформационная перестройка, и используя результаты, приведенные в данной главе, рассчитайте константу равновесия этого процесса в воде и в 8М растворе мочевины при 25°С. Используйте данные этой главы. 5.3. Две части одной белковой молекулы взаимодействуют друг с другом по некоторому характерному закону. В конформации А они находятся на расстоянии г2 друг от друга, в конформации В — на расстоянии /-,, причем г2 > г1. Сила взаимодействия F = -у/г2, где у = аТ, а — постоянная, не зависящая от температуры. Предполагая, что всеми другими взаимодействиями можно пренебречь, рассчитайте константу равновесия, АН и AS (как функции /•], г2, у и Т) для этой конформационной перестройки. 5.4. Экспериментатор измерил свободную энергию переноса (AG°cyMM) неполярного соединения А (мольная доля х = 0,1) из этанола в воду (мольная долях = 0,1). Он также измерил свободную энергию переноса AG(£fMM из чистой жидкости А в воду (до мольной доли X = 0,1). На основании экспериментальных результатов он пришел к выводу, что ^^сумм ~ ^^сумм = ~Л Г In 56, и решил, что это прекрасный ответ. Согласны вы с ним или нет? Почему? 5.5. Два полипептидных волокна 1 и 2 имеют точно одинаковую длину, толщину и ширину. Одно из них состоит в основном из длинных цепей полиаланина, другое — из длинных цепей полиглицина. Если эти волокна не растянуты, полипептиды находятся в состоянии беспорядочных клубков, вообще говоря соответствующих конформационным энергетическим картам отдельных остатков. Был обнаружен интересный факт: волокно 1 можно обратимо растянуть до гораздо большей длины, чем волокно 2. На основании этого наблюдения и данных о предпочтительных конформациях остатков глицила и аланила определите, какое из волокон состоит из полиглициновых цепей, а какое — из полиаланиновых. Кратко, но точно обоснуйте сделанный выбор.
ЛИТЕРАТУРА Общая Chou P. Y.,Fasman G. D., 1978. Empirical predictions of protein conformation, Ann. Rev. Biochem.,47, 251. [Краткая сводка эмпирических методов.] Dickerson R. E., Geis J., 1969. The Structure and Action of Proteins, New York, Harper and Row. [Включает прекрасные иллюстрации белковых структур. Особая ценность книги в том, что она дает хорошее зрительное представление о конформациях белков].
286
ГЛАВА 5
Flory P. J., 1969. Statistical Mechanics of Chain Molecules, New York, Interscience. [Имеется перевод: Флори П. Статистическая механика цепных молекул. — М.: Мир, 1971. В гл. 7 приводится подробная сводка энергетических конформационных расчетов полипептидов. Как в большинстве литературных источников того времени, значения углов ф = 0°,ф = 0° приписываются конформации, в которой все связи полипептидной цепи находятся в /яранс-положении, что, в соответствии с соглашением, принятым в IUPAC—IUB в 1970 г., отвечает углам ф = 180°, ф = 180°.] ШРАС—IUB Commission on Biochemical Nomenclature, 1970. Abbreviations and symbols for the description of the conformation of polypeptide chains, Biochemistry, 9, 3471. [Сводка определений углов внутреннего вращения в полипептиде и связанного с этим материала. Публикуется одновременно в J. Biol. Chem., 245, 6489 and J. Mol. Biol., 52, 1.] Kauzmann W., 1959. Some factors in the interpretation of protein denaturation, Adv. Protein Chem., 14, 1. [Прекрасная статья, посвященная гидрофобным эффектам; обсуждаются также ионные взаимодействия.] Schultz G., Schirmer R. H., 1979. Principles of Protein Structure, New York, Springer-Verlag. [Всестороннее обсуждение и большая библиография.]
Специальная Anf'msen С. B.,Haber Е., Sela M., White F. H. Jr., 1961. The kinetics of formation of native ribonuclease during oxidation of the reduced polypeptide chain, Proc. Natl. Acad. Sci., 47, 1309. Anfinsert С. В., Scheraga H. A., 1975. Experimental and theoretical aspects of protein folding, Adv. Protein Chem., 29, 205. Arnon R., Maron E., Sela M., Anfinsen С. В., 1971. Antibodies reactive with native lysozyme elicited by a completely synthetic antigen, Proc. Natl. Acad. Sci., 68, 1450. Brant D. A., Flory P. J., 1965. The configuration of random polypeptide chains, II: Theory, J. Am. Chem. Soc, 87, 2791. Brant D. A., Miller W. C, Flory P. J., 1967. Conformational energy estimates for statistically coiling polypeptide chains, J. Mol. Biol., 23, 47. Chou P. Y., Fasman G. D., 1974. Conformational parameters for amino acids in helical, /3-sheet and random coil regions calculated from proteins, Biochemistry, 13, 211. Chou P. Y., 1974. Prediction of protein conformation, Biochemistry, 13, 222. Doty P., 1960. Optical rotation and the structure of polypeptides and proteins. In: Fourth International Congress of Biochemistry, Vol. VIII, Proteins, New York, Pergamon Press, p. 8. Frank H. S., Wen W.-Y., 1957. Structural aspects of ion—solvent interaction in aqueous solutions: A suggested picture of water structure, Disc. Faraday S o c , 24, 133. Gurney R. W., 1953. Ionic Processes in Solution, New York, McGraw-Hill. [Обсуждаются понятия вкладов аддитивной энтропии и энтропии смешения в свободную энергию; см., например, стр. 89 — 92 и следующие разделы.] Hagler А. Т., Honig В., 1978. On the formation of protein tertiary structure on a computer, Proc. Natl. Acad. Sci., 75, 554. Kabat E. A., Wu Т. Т., 1973. The influence of nearest-neighbor amino acids on the conformation of the middle amino acid in proteins: Comparison of predicted and experimental determination of /3-sheets in concanavalin A, Proc. Natl. Acad. Sci., 70, 1473. Klotz I. M., Franzen J. S., 1962. Hydrogen bonds between model peptide groups in solution, J. Am. Chem. Soc, 84, 3461. Levinthal C , 1966. Molecular model building by computer, Sci. American, 214 (6), 42. Levitt M., Chothia C , 1976. Structural patterns in globular proteins, Nature, 261, 552. Nemethy G., Scheraga H. A., 1965. Theoretical determination of sterically allowed conformations of a polypeptide chain by a computer, Biopolymers, 3, 155. Pratt L. R., Chandler D., 1977. Theory of the hydrophobic effect, J. Chem. Phys., 67, 3683. Ramachandran G. N., Ramakrishnan C, Sasisekharan V., 1963. Stereochemistry of polypeptide chain configurations, J. Mol. Biol., 7, 95.
Глава 6
КонфорМпЦиОННЫй пНпЛиЗ
и силы, определяющие структуру нуклеиновых кислот 6.1. Общая характеристика структуры нуклеиновых кислот Физические и химические свойства нуклеиновых кислот существенно отличаются от свойств белков и полипептидов. Это является следствием совершенно разного химического состава и строения двух указанных классов молекул. В то время как полипептидный остов электрически нейтрален и к нему присоединены боковые цепи приблизительно двадцати типов, остов нуклеиновой кислоты представляет собой сильно заряженный полиэлектролит, который несет боковые группы только четырех (в большинстве случаев) типов. Далее, боковые цепи нуклеиновых кислот проявляют специфическую комплементарность (спаривание оснований), которая отсутствует у аминокислот. Эта комплементарность частично ответственна за образование спиральных палочкообразных структур как в двух-, так и в одноцепочечных молекулах. Кроме того, заряженный остов затрудняет переход нуклеиновых кислот в компактные глобулярные конформации, столь типичные для белков. Мы рассмотрим наиболее важные факторы, определяющие конформацию нуклеиновых кислот. Прежде всего мы проанализируем ограничения, налагаемые на возможные конфигурации геометрическими и стерическими требованиями. Сразу же станет ясно, что остов нуклеиновой кислоты устроен значительно сложнее полипептидного остова. Затем мы займемся вопросами специфического спаривания оснований и неспецифического стэкинг-взаимодействия, которые играют главную роль в стабилизации упорядоченных форм одно- и двухцепочечных молекул.
6.2. Геометрические аспекты На рис. 6.1 схематически изображена полинуклеотидная цепь. Повторяющаяся единица цепи содержит шесть скелетных связей и боковую группу — основание, присоединенное к атому С 1 ' рибозы. На рис. 3.1 приведены структурные формулы обычных и многих минорных оснований и указаны системы нумерации атомов для пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов. При сопоставлении полинуклеотидного остова с полипептидным, изображенным на рис. S.1, становится очевидным, насколько полинуклеотидная цепь сложнее по своему строению, чем полипептидная. В табл. 6.1 приведены структурные параметры остова для кристаллов полирибоадениловой кислоты; указаны длины связей и некоторые углы между ними. Значения этих параметров фиксированы довольно жестко и примерно одинаковы для разных РНК. Для того чтобы рассмотреть множество допустимых конформации цепи, целесообразно остановиться сначала на конформационных характеристиках индивидуальных мононуклеозидных единиц (состоящих из сахара и основания), а затем перейти к рассмотрению стерических ограничений в остове.
РИС.6.1. Схематическое изображение полинуклеотидной ДНК — Н .
цепи. Для Р Н К X — это ОН, для
Таблица 6.1 ГЕОМЕТРИЯ ПОЛИРИБОНУКЛЕОТИДНОЙ ЦЕПИ1'2» Связь
Длина связи, А
Связи
Угол между связями, град
Геометрия остова 3
С'-с ' 3
3
С —О ' О3'—Р Р—О5'
tf-c54 d'-c '
1,52 1,47 1,56 1,57 1,46 1,54
4
3
3
С '—С '—О ' С3 — О 3 ' — Р 3 5 О '— Р—О Р—О5'—С5'
о5-d'-c4'
г5'
г4'
г3'
ПО 119 104 121 112 112
Геометрия гликозидной связи 1
1
о2 '—с 1 ' с '—с '
С''-N9 N9—С4 N'-C8
,45 ,54 ,47 ,35 ,33
О''-c''-N 9 С 2 '—С 1 '—N 9 C''-NO-С4 С 1 '—N 9 — С 8
1) A. Rich et al., J. МЫ. Biol., 3, 71 (1961). ' Приведены данные для молекулы полирибоадениловой кислоты.
112 106 127 127
КОНФОРМАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ: НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
289
НОСН2
ОН ОН
Син
ОН ОН
Анти
X * 210" РИС. 6.2. Конформеры аденозина.
6.3. Поворотная изомерия относительно гликозидной связи; конформация рибозы Основание присоединяется к полинуклеотидному остову с помощью гликозидной связи. Ориентация его по отношению к рибозе описывается углом поворота х вокруг этой связи в направлении по часовой стрелке. Этому углу приписывается значение 0° для цисконформации связей О 1 — С 1 и № — С 8 . В случае пиримидинов угол поворота определяется ориентацией связей О 1 ' — С 1 ' и N 1 — С 6 . Особый интерес представляют два поворотных измера, обозначаемые как син и анти (рис. 6.2). Для внти-конформации угол х равен примерно 0°, а для син - около 210°. Известна также форма с углом х, равным 120°. Насколько одно изомерное состояние оказывается предпочтительнее другого — зависит от конформаций рибозы, которая обсуждается в следующем разделе. Вообще говоря, расчеты показывают — и рентгеноструктурные данные, полученные на мононуклеозидах и мононуклеотидах, подтверждают это, — что пиримидины предпочитают конфигурацию анти, тогда как пурины способны принимать обе формы. В двойной спирали ДНК и в спиральной двухцепочечной полиадениловой кислоте основания находятся в вмти-конфигурации. Как отмечалось выше, ориентация основания относительно гликозидной связи зависит от конформаций рибозного кольца. Конформация этого кольца, как правило, такова, что четыре атома находятся в одной плоскости, а пятый расположен выше или ниже этой плоскости. Атомом, выходящим из плоскости, является С 2 или С 3 ', а смещение обычно обозначается как эндо или экзо в зависимости от того, направлено оно в ту же сторону, что и у атома С 5 , или в противоположную соответственно (см. рис. 3.15). Различные конформаций рибозы обозначаются, таким образом, как С2 -эндо, С1'-экзо, Cv -эндо, С 3 -экзо. Все эти конформаций приведены на рис. 3.15.
6.4. Углы вращения остова и стерические ограничения Анализ предпочтительных конформаций остова нуклеиновой кислоты представляет чрезвычайно трудную задачу. Должно быть учтено множество стерических взаимодействий при изменении шести углов вращения в каждой повторяющейся единице, а также исследованы возможности взаимодействия между соседними единицами. Таким образом,
290
ГЛАВА 6
н8-
РИС. 6.3. Схематическое изображение цепи полирибоадениловой кислоты с указанием углов вращения. [W.K. Olson, P.J. Flory, Biopolymers, 11, 1 (1972).] сформулированная проблема представляется значительно более сложной, чем анализ предпочтительных конформации полипептидной цепи. Для решения этой проблемы мы будет следовать процедуре, предложенной Олсон и Флори (1972 г.), существенно упрощающей проблему. На рис. 6.3 схематически изображен сегмент полирибоадениловой цепи; углы вращения остова вокруг отдельных связей обозначены греческими буквами с одним или двумя штрихами. Весьма существенно, что периодическое расположение пентозных колец обеспечивает независимость вращений вокруг пяти связей остова, следующих за кольцом, от вращений вокруг пяти связей, предшествующих кольцу. Поэтому, если мы выберем повторяющуюся единицу, начинающуюся от одного атома С 4 и кончающуюся следующим (см. рис. 6.3), конформации каждой повторяющейся единицы будут независимы друг от друга, и нам останется рассмотреть лишь стерические возможности совместного изменения шести углов вращения (на рис. 6.3 обозначенных о>', ш", ф', ф", ф', ф")в пределах одной повторяющейся единицы.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПЕРВОГО ПОРЯДКА Систематически исследуя стерические ограничения, возникающие при изменении каждого угла вращения по отдельности, мы значительно упростим проблему. Будем считать, что данная часть остова находится в t/uc-конфигурации, если угол вращения для соответствующей связи равен нулю. Прежде всего проанализируем взаимодействия между теми атомами, для которых взаимные расстояния зависят только от одного угла вращения. Рассмотрим, например, стерические ограничения, которые возникают при изменении единственного угла ф'. К ним относятся ограничения, связанные с взаимодействием между атомом С 3 ' , с одной стороны, и атомами С 5 ' , О 6 ' и О 7 — с другой; в эти случаях расстояние между С 3 ' и атомами кислорода зависит только от угла ф'. В то же время взаимодействие между атомами С 3 и С 5 не попадает в эту группу, поскольку расстояние
КОНФОРМАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ: НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
180
—J —1
1
Б
/
у'
./
J
cd
i 1
J
1 1 1
g
—1
п 1
1 1
1
г 1
^
\ 1 1
291
._j •
x1 \
^4J
L\
J
i i
i i i
i
•
•
j
i
о —J
" i
I
i
i i
S
N
—
)
i I ^ > ' i
j
i
[—
1
1
•i
i А 180
г
S
-
180
L
•1
-180 g
i
0 \fi\ град
-180
0
—i
I -—
i— _.—
1—1 .
LJ 1
-V
1
i 0
1
~ — ~— 180
ф', град
РИС. 6.4. Карты допустимых значений углов вращения. Области значений, запрещенных из-за взаимодействий первого порядка, закрашены, а из-за взаимодействий второго порядка обведены сплошной линией. А. Карта для углов ф" и \р' .Б. Карта для углов ф" и ф'. Небольшая область при 0 " = -12О° (горизонтальная пунктирная линия) тоже должна быть исключена. [W.K.Olson, P.J. Flory, Biopolymers, 11; 1 (1972).]
292
ГЛАВА 6
между ними зависит как от ф', так и от ф ". Учет взаимодействий первого порядка позволяет значительно сузить диапазон допустимых значений ф'; эти значения лежат в интервалах от - 90° до - 30°, от 30 до 90° и в районе 180° ± 30°. Аналогичным образом рассматриваются взаимодействия, зависящие только от f . Карта допустимых значений углов ф' и ф" приведена на рис. 6.4,/t- Закрашенные участки соответствуют областям значений, стерически запрещенным лишь из-за взаимодействий первого порядка, т.е. взаимодействий, определяемых единственным углом вращения (ф' или ф").
ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВТОРОГО ПОРЯДКА Проанализируем теперь, какая часть области значений углов ф' и ф", разрешенных по взаимодействиям первого порядка, исключается из-за взаимодействий второго порядка, представляющих собой взаимодействия между теми атомами, расстояние между которыми зависит одновременно от ф' и ф" (таково, например, расстояние С 3 — С 5 ). Взаимодействия второго порядка исключают из области допустимых значений площадь, обведенную сплошной линией на рис. 6.4И • Значительная часть этой площади закрашена, и, следовательно, соответствующие углы уже запрещены из-за взаимодействий первого порядка. Тем не менее небольшая часть «разрешенной» взаимодействиями первого порядка «площади» исключается из-за взаимодействий второго порядка. Оставшаяся незакрашенной площадь (вне области, обведенной сплошной линией) свободна от стерических ограничений второго порядка.
ДАЛЬНЕЙШИЙ АНАЛИЗ Результаты подобного рассмотрения для углов вращения ф' и ф" суммированы на рис. 6.4,£. Здесь, как и ранее, незакрашенные участки отвечают областям значений, разрешенных по взаимодействиям первого порядка, а сплошная линия ограничивает область значений, запрещенных из-за отсутствия места для размещения тех атомов, расстояние между которыми зависит одновременно от ф' и ф" . В случае углов со' им" разрешенная область значений со" зависит в какой-то степени от угла со'. Значения последнего ограничены интервалом приблизительно в 15° с центром при 83° для С 2 -экзо- и С 3 -эндоконформаций и примерно таким же интервалом с центром при 153° для С1' -эндо- и С 3 э/езо-конформеров. Допустимые значения со" лежат в окрестности - 145 и -95° в интервале от 10 до 20° в зависимости от со'. Действуя указанным способом, можно убедиться, что значительная часть пространственных конфигураций запрещена вследствие взаимодействий первого и второго порядков. Однако необходимо еще рассмотреть взаимодействия второго порядка с учетом других пар двугранных углов (например, ф' и со") и возможные взаимодействия атомов, расстояние между которыми зависит от трех или более углов вращения. Кроме того, мы еще не рассматривали возможность взаимодействий с участием атомов оснований — взаимодействия основание—основание и основание—остов. Все эти проблемы, однако, упрощаются, поскольку каждое из указанных взаимодействий происходит в тех областях конфигурационного пространства, которые уже были исключены из-за взаимодействий первого и второго порядков. На рис. 6.5 светлые участки отвечают тем областям, где отсутствуют взаимодействия первого порядка при данных ф' и ф". Сплошная линия ограничивает область значений этих углов, запрещенную из-за взаимодействий второго порядка. Однако эта область уже и так исключается, и, следова-
КОНФОРМАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ: НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
I
180
i 1
1_
1
r~~~
1
i
I i .
j
i L
L
1
о. 0
i
\ —i
г
j
-180
J
l_
" ~1 J
r L
~\
Г
\
-
r
293
1
г
1 1
1 1
i
i
0 if/'! град
"
" "1 Г " 1
1
180
РИС. 6.5. Карта допустимых значений углов ф' и ф"; обозначения те же, что и на рис. 6.4. [W.K. Olson, P.J. Flory, Biopolymers, 11,1 (1972).]
тельно, взаимодействия второго порядка не сужают область значений, разрешенных взаимодействиями первого порядка. То же самое справедливо для взаимодействий второго порядка при изменении углов ф' и о)" . Более того, если значение ш' фиксировано при 83 или 153°, не возникает никаких стерических затруднений при вращении вокруг двух связей, примыкающих к связи С 4 — С 3 (ш" и ф"). Это обеспечивает независимость вращений внутри одной структурной единицы, расположенной между двумя атомами С 4 , от вращения в соседних единицах. И наконец, когда углы вращения остова находятся в областях, разрешенных в рамках проведенного выше рассмотрения, отсутствуют стерические ограничения для взаимодействий между соседними основаниями, нет перекрывания оснований с остовом и не возникает помех при одновременном изменении трех или более двугранных углов остова. Границы стерически разрешенных областей могут быть уточнены таким же способом, как и в случае полипептидов, т.е. с использованием метода межатомных потенциалов. Здесь, однако, вычисления становятся более сложными и должны включать тщательный анализ электростатических взаимодействий между различными группами. При таком анализе приписывается дробный заряд соответствующим атомам фосфатных групп, оснований и рибозы. Расчеты, проведенные этим методом, показывают, что конформация остова смещается в те стерически разрешенные области, которые соответствуют минимальной электростатической энергии, и что в этих областях предпочтительными являются более вытянутые кон формации. Конфигурации, допустимые для остова 2'-дезоксирибонуклеиновой кислоты, лишь незначительно отличаются от таковых для РНК. Различие обусловлено главным образом изменением в энергии, связанным с вращением вокруг связи С 3 — О 3 .
294
ГЛАВА 6
6.5. Силы, стабилизирующие упорядоченные конформации Хотя расчеты методом межатомных потенциалов позволяют найти те области конфигурационного пространства, в которых молекула может существовать, эти вычисления, как и в случае белков, не могут объяснить образование высокоупорядоченных структур, присущих нуклеиновым кислотам при физиологических условиях. Это связано с тем, что разрешенная стерическими и простыми электростатическими ограничениями область пространства хотя и относительно ограничена, еще достаточно велика, чтобы мог существовать широкий спектр неупорядоченных структур. Более того, исходя из предыдущих вычислений, нельзя понять механизм образования постоянно встречающихся двух- и даже трехцепочечных структур: для этого необходимо рассматривать взаимодействия между цепями. Следовательно, нам нужно вернуться к анализу других типов сил, которые играют первостепенную роль в стабилизации регулярных структур нуклеиновых кислот. На рис. 3.14 схематически изображена В-форма двойной спирали ДНК в соответствии со структурой, предложенной Дж. Уотсоном и Ф. Криком. Две правые полинуклеотидные спирали переплетены так, что основания расположены внутри структуры, а фосфодиэфирный остов снаружи. Основания образуют прямой угол с осью спирали и уложены в стопку друг над другом; расстояние между соседними основаниями составляет 3,4 А. На виток спирали приходится десять пар оснований, и, следовательно, шаг спирали равен 34 А. Цепи ориентированы в противоположных направлениях (т.е. имеют противоположную полярность), так что на любом конце спирали одна цепь несет свободный 5' -фосфат, а другая — свободный З'-гидроксил. Еще до того, как была установлена эта структура, было показано, что число пуриновых и пиримидиновых оснований в ДНК одинаково и, более того, число остатков аденина (А) равно числу остатков тимина (Т), а число остатков гуанина (G) равно числу остатков цитозина (С). Структура Уотсона—Крика дает объяснение этому сделанному ранее наблюдению. Основания противоположных цепей занимают строго фиксированные положения, что дает им возможность образовывать водородные связи. Этот процесс строго специфичен и приводит к тому, что А может взаимодействовать только к Т, a G — с С, поэтому цепи являются взаимно комплементарными. Таким образом, если.двигаясь от 5' - к 3' -концу одной цепи, мы встречаем последовательность AGCTAGGT ... , то в противоположной цепи мы найдем последовательность (прочитанную от 3'- к 5'-концу) TCGАТССА (принято, однако, нумерацию в последовательности вести от 5'- к 3'-концу, так что последние восемь букв следует записать как ... ACCTAGCT). Это комплементарное спаривание оснований между цепями оказывается возможным потому, что ферментативный синтез происходит путем специфического достраивания на одной цепи второй, комплементарной к ней, а не воспроизведения последовательности оснований в этой цепи. Следует подчеркнуть, что, как было показано, в различных экспериментальных условиях структура ДНК хорошо соответствует уотсон-криковской, наблюдаемой в волокнах. Две важные особенности не были объяснены в рамках проведенного нами конформационного анализа — специфическое спаривание оснований и поразительная параллельность в расположении уложенных в стопку оснований. Эти особенности характерны и для других структур нуклеиновых кислот, в том числе тех из них, которые образуются в случае одноцепочечных полимеров, таких, как тРНК. Они вызывают особый интерес, и мы рассмотрим их более детально.
КОНФОРМАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ: НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
295
6.6. Спаривание оснований Возможны различные типы спаривания оснований, и это многообразие удается наблюдать на опыте. На рис. 3.11 показано специфическое спаривание оснований по схеме Уотсона и Крика, согласно которой между аденином и тимином (или урацилом) образуются две водородные связи, а между гуанином и цитозином — три. Хотелось бы понять, почему образуются пары оснований именно с этим типом специфичности и, далее, допуская эту специфичность, почему в AT- и GC-napax реализуется именно это конкретное расположение водородных связей. Ответ на эти вопросы, без сомнения, нетривиален. Хорошо известно, что основания могут ассоциировать, обрузуя комплексы с помощью водородных связей. Множество таких комплексов из одинаковых оснований обнаружено при кристаллографических исследованиях. Рис. 6.6 иллюстрирует образование водородных связей между основаниями аденина в кристаллах. Такие же ассоциаты из одинаковых элементе наблюдались в кристаллах и других оснований. При совместной кристаллизации обычных мономерных производных аденина и урацила тоже наблюдается образование пар А — U, однако они никогда не являются уотсонкриковскими. Обнаруженные типы комплексов иллюстрирует рис. 6.7. На рис. 6ЛуА показана уотсон-криковская схема спаривания дезоксиаденозина и тимидина; на рис. 6JJ> — схема связывания, обнаруженного К. Хугстеном (1963 г.) в комплексе 9метиладенина и 1-метилтимина. В этом комплексе роль акцептора водородной связи играет азот N 7 аденинового кольца (имидазольной части кольца). Эта структура известна как хугстеновская, или имидазольная. Рис. 6.73 иллюстрирует обратную имидазольную структуру, в которой акцептором водородной связи является атом О 2 урацила вместо О 4 . Расчет методом молекулярных орбиталей, выполненный Пульманом и его коллегами (1966 г.), дает для пары аденин — тимин следующую последовательность структур в порядке убывания их стабильности: имидазольная структура, обратная имидазольная структура, уотсон-криковская структура. Для GC-nap, которые также исследовались в кристаллах, наблюдается другая ситуация. В этом случае имеет место только уотсон-криковское спаривание, что, вероятно, обусловлено наличием трех водородных связей в этой структуре.
РИС. 6.6. Пары, образующиеся между остатками аденина в некоторых кристаллических структурах. [D. Voet, A. Rich, Progr. Nucleic Acid Res.Mol.Biol., 10,183 (1970).]
296
ГЛАВА б
i
СН 3
Н,С.
сн3
.0=^
I
Н.
У
dR
H
'"l 1
.н'
N—СН 3 N /
^
N СН 2 СН 3
dRib
CH3
Уотсон-криковская (предполагаемая)
Обратная уотсонкриковская
Хугстеновская
H3C \
N
—\
N—СН 3
гЧ
rVv" " с •N
о. ••к
) CH2CH3
СН2СН3
H
Обратная хугстеновская
Уотсон-криковская и хугстеновская
д I.
Г'
0=
1 0 4 - 10* (10 - П , 5 ) 2 ) 3,1 100 28
-AS,
кал • град
• моль
11,0 11,4 11,8 15 (15) 3 ) (15)3>
'* Y. Kyogoku et al., Biochim. Biophys. Acta, 179, 10(1969). ' Значение получено в предположении, что AS = — 15 кал моль" 1 . ад ' Предположительное значение.
2
Исследования такого рода были выполнены Р. Лордом и А. Ричем и их коллегами. На рис. 6.9 приведены инфракрасные спектры в области частот колебаний N — Н-связи для производных гуанина, цитозина и аденина, а также для попарных смесей этих оснований в дейтерохлороформе. Сплошные кривые на левых графиках — наблюдемые спектры для G и С по отдельности при концентрации оснований 0,0008 М и спектр их эквимолярной смеси (суммарная концентрация в этом случае составляла 0,0016 М). Если бы никакого взаимодействия не было, наблюдаемый спектр должен был бы совпадать с суммой двух индивидуальных спектров — пунктирной кривой на нижнем левом рисунке. Однако он явно отличается от этой кривой, что свидетельствует о наличии взаимодействия между G и С. С другой стороны, соответствующие кривые на правом нижнем графике ясно указывают на то, что между G и А взаимодействие отсутствует. В табл. 6.2 суммированы данные исследований, аналогичных приведенным на рис. 6.8, в которых было проверено наличие попарного взаимодействия для четырех главных и одного минорного оснований (инозина, I). Эти данные отражают результаты качественных наблюдений инфракрасных спектров в смесях, обычно содержащих каждое из оснований в концентрации 0,004 М. Они указывают на высокую спицифичность спаривания оснований, поскольку для многих из исследованных смесей отсутствуют какие-либо признаки взаимодействия. В то же время наблюдается специфическое спариваение А с Т (или U) и G с С. Кроме того, обнаружены прочные ассоциаты I—С и более слабые комплексы А — I. Для AU-nap имеются другие данные, указывающие на образование как уотсонкриковских, так и имидазольных (и/или обратных имидазольных) структур. Тем не менее, не обращая внимания на детали образованных структур, можно сказать, что специфичность взаимодействий оснований друг с другом, наблюдаемая для мономеров, в точности соответствует специфичности, постулированной Уотсоном и Криком для двойной спирали ДНК.
300
ГЛАВА 6
З-Метилурацил
N i R О
,6-Дигидроурацил " R
О"
"" N; *
3,1
2,0
2,6-Диаминопурин N
H
11
Et
6-Амино8-бромпурин
Вг 120
Et
РИС. 6.10. Взаимодействие между производными 9-этиладенина и 1-циклогексилурацила. Растворитель — CDC13; 25 °С. [R.C. Lord, G.J. Thomas, Jr., Devel, Appl.Spectroscopy, 6,179(1968).]
302
ГЛАВА 6
В табл. 6.3 приведены некоторые термодинамические данные о спаривании оснований при 25 °С в дейтерохлороформе. Видно, например, что константы связывания при образовании пар оснований из одинаковых мономерных единиц и уотсон-криковских пар различаются не менее чем в 15 раз, а иногда их отношение достигает 1000 и более. Такое предпочтение уотсон-криковских партнеров обусловлено выигрышем в энергии комплексов, что следует из значительных различий в энтальпии связывания АН для различных пар оснований. Для дальнейшего выяснения природы тех факторов, которые определяют прочность и специфичнось данного комплекса, рассмотрим ряды производных оснований, которые слегка отличаются от исходных оснований. Такие ряды для А и U приведены на рис. 6.10. Вдоль стрелок, соответствующих взаимодействию между 9-этиладенином и 1циклогексилурацилом, а также между их производными, и рядом с каждым их этих производных указаны соответствующие константы ассоциации (в М" 1 ). Эти данные позволяют понять детали реакции образования пар. Например, неспособность 3-метилурацила связываться с аденином обусловлена, по-видимому, невозможностью образования циклического димера. Большое значение константы ассоциации 5-бромурацила с аденином объясняется, вероятно, существенным увеличением кислотности NH-группы, вызванным оттягиваним электрона атомом брома; эффект увеличения кислотности NH-группы должен с избытком компенсировать противоположное влияние уменьшения основности кислорода. (Увеличение кислотности NH-группы означает, что водород слабее притягивается к азоту и, следовательно, легче вступает во взаимодействие с другой электроотрицательной группой. Уменьшение основности кислорода означает понижение его сродства к иону водорода.) Можете ли вы обосновать некоторые другие из приведенных результатов? Здесь мы должны подчеркнуть, что не совсем ясно, почему специфичность столь четко выражена на мононуклеозидном уровне. Создается впечатление, что хотя геометрическая комплементарность характерна для многих пар оснований, ее недостаточно для образования прочного комплекса, т.е. специфические AU- и GC-пары в дополнение к геометрической обладают «электронной» комплементарностью, и этот факт несомненно требует квантовомеханического объяснения. Причина того, что такое объяснение до сих пор не получено, связана с приближенным характером квантовомеханических расчетов; точность этих расчетов недостаточна, чтобы объяснить относительно небольшую разницу в энергии между «специфическими» и «неспецифическими» комплексами. Результаты описанных выше экспериментов приводят к выводу, что спицифичность спаривания А — U и G — С является неотъемлемым свойством самих мономерных оснований — свойством, которое мы приписываем электронной комплементарности. Однако такая пара, как А — U, может образовываться не единственным способом (имидазольная структура, обратная имидазольная структура или уотсон-криковская структура), и формирование двойной уотсон-криковской спирали должно обеспечиваться действием дополнительных геометрических факторов и среды. (О некоторых других взаимодействиях при спаривании оснований см. дополнение 6.1.)
6.7. Стэкинг оснований Анализ кристаллической структуры спиральных молекул нуклеиновых кислот показывает, что плоскости следующих друг за другом оснований практически параллельны и в значительной мере перекрываются; двугранный угол между соседними плоскостями не превышает 20° (эти особенности отчетливо видны в структуре двойной спирали ДНК на рис. 3.12). Является ли такое стопочное расположение (стэкинг) оснований следствием геометрических ограничений, налагаемых на углы вращения остова специфической гео-
КОНФОРМАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ: НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
303
Дополнение 6.1
НЕКОТОРЫЕ ДРУГИЕ СЛУЧАИ СПАРИВАНИЯ ОСНОВАНИЙ Весьма интересно в данном контексте рассмотреть некоторые свойства барбитуратов — соединений, близких по своему строению к урацилу. Эти лекарственные вещества широко применяются как снотворные, уменьшая потребление кислорода в тканях млекопитающих и подавляя процесс дыхания в митохондриях. Ниже приведены структурные формулы барбитала, фонобарбитала, тиопентала и урацила. N—Н
Н Барбитал (1000М" 1 )
Фенобарбитал (1 200 М"')
С2Н5 СН 3 СН 2 СН 2 СН
г-н
N—Н
rs
-b
Тиопентал (600 М" 1 )
н
R Урацил (100 М" 1 )
Главное различие между барбитуратами касается боковой цепи, связанной с С5-атомом, и наличия кислорода или серы у атома С 2 . Из-за сходства этих соединений с урацилом можно ожидать, что барбитураты будут образовывать специфические комплексы с аденином, что и происходит в действительности. Под каждой структурной формулой в скобках указаны константы их ассоциации с аденином в дейтерохлороформе (Kyogoku et al., 1968). С цитозином, гуанином и урацилом эти соединения не взаимодействуют, а константы их ассоциации между собой лежат в интервале от 1 до 10 М~ ; . Взаимодействие между аденином и барбитуратами значительно сильнее, чем между аденином и урацилом. Это обусловлено двумя факторами. Во-первых, NH-rpynna барбитуратов является намного более кислой: для уридина рА" = 9,4, в то время как для барбитала рК = 7,8, для фенобарбитала 7,3, а для тиопентала 7,4. Во-вторых, барбитураты несут вдвое большее число NH- и С=О-групп, чем урацил, так что чисто статистический эффект увеличивает константу связывания барбитуратов с аденином в два раза. Заметим, что комплекс аденина с тиопенталом оказывается менее прочным, чем с фенобарбиталом и барбиталом, предположительно из-за меньшей электроотрицательности серы по сравнению с кислородом. Полагают, что барбитураты становятся активными в неполярном окружении, возможно в мембранах. Поэтому результаты, полученные в хлороформе, могут не слишком отличаться от таковых для физиологических условий, в которых эти вещества взаимодействуют с основаниями нуклеотидов. Конечно, вопрос о том, имеют ли такого рода данные отношение к механизму фармакологического действия барбитуратов, остается открытым, но приведенные результаты показывают, как физические исследования механизма химических процессов могут перерасти в изучение механизма физиологического явления.
304
ГЛАВА 6
метрией уотсон-криковского спаривания оснований, или это расположение энергетически более выгодно и само по себе служит стабилизирующим фактором для уотсонкриковской структуры?
СТЭКИНГ ОСНОВАНИЙ В ОДНОЦЕПОЧЕЧНОЙ poly (А) В РАСТВОРЕ Условия, необходимые для стэкинга оснований, интенсивно исследовались путем анализа свойств одноцепочечных полинуклеотидов в растворе, особенно полиадениловой кислоты. Наиболее плодотворным оказалось в этом отношении изучение оптических свойств растворов. На рис. 6.11 сопоставлены спектры поглощения AMP и poly (А) в растворах, содержащих эквивалентное количество нуклеотидных остатков. Интегральное поглощение poly (А) существенно меньше, чем поглощение составляющих ее мономеров, — эффект, известный под названием гипохромизма (см. гл. 7, где обсуждаются оптические явления). Кроме того, длина волны, отвечающая максимуму поглощения poly (А) при нейтральных рН, на 3 нм меньше, чем соответствующая величина для AMP. Однако эта значительная разница в поглощении постепенно уменьшается при повышении температуры. На рис. 6.12 приведены данные, полученные М. Ленгом и Г. Фельзенфельдом (1966 г.). Представлена зависимость поглощения при 260 нм от температуры для poly (А) и для различных олигомеров этого основания. Оптическая плотность ограничена двумя предельными значениями — оптической плотностью для гипохромной формы, существующей при очень низких температурах (— — 20°С), и соответствующим значением для высокотемпературной формы (— 90°С) с оптической плотностью, характерной для AMP. В том же температурном интервале поглощение AMP почти не меняется. Изучение других спектроскопических свойств (таких, как круговой дихроизм) дает аналогичные результаты и свидетельствует о том, что в poly (А) происходят температурные изменения, не наблюдающиеся в AMP. Объяснить все эти данные можно тем, что стэкинг оснований постепенно уменьшается с ростом температуры (см. гл. 7, где обсуждаются физические основы гипохромизма в стопочных структурах).
2
-
220
280
РИС. 6.11. Спектры поглощения AMP и poly (А); отчетливо выражен гипохромизм. [К.Е. Van Holde, Physical Biochemistry (Englewood Cliffs, N.J.: PrenticeHall, 1971), p. 168.]
КОНФОРМАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ: НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
-20
0
20
40
60
80
-20
0
20
40
60
80
100
_j
-20
0
0,5 L—Л.
100
-20
20
40
1
_..:.._
20
40
305
60
80
100
60
80
100
т°с РИС. 6.12. Зависимость поглощения при 258 нм от температуры для poly (А) и различных олигомеров. [М. Leng, G. Felsenfeld, J.Mol.Biol.,15, 455 1966).]
Данные рис. 6.12 поддаются прямой интерпретации. Предположим, что существует равновесие между двумя состояниями динуклеотида, и будем рассматривать цепь из N нуклеотидных звеньев как набор из N — 1 динуклеотидной единицы, стэкинг в каждой из которых не зависит от состояния других единиц. Обозначим через К константу равновесия для рассматриваемого процесса, а через / и — долю единиц, в которых отсутствует стэкинг. Тогда
= /„/(!-/„)
(6.1а)
/„ = (Ат - А^ЩА^ - А^п) (6.16) где Атах — высокотемпературный предел поглощения, Amin — низкотемпературный предел, А т — поглощение при температуре Т. Для определения термодинамических характеристик полученную таким образом зависимость К от температуры нужно построить в координатах In К от 1/7" (рис. 6.13), в которых график представляет собой прямую. Из приведенных данных получаем АН° = 13 ккал на моль (стэкингов) и AS" = 40 э.е. на моль для процесса разрушения стэкинга. (Следует отметить, однако, что недавно в результате калориметрического анализа были получены существенно отличающиеся зна-
306
-2,0 2,5
ГЛАВА 6
РИС. 6.13. Зависимость lg К от 1/Гдля олигомеров и полимеров аденина. [М. Leng, G. Felsenfeld, J.Mol.Biol., 15, 455 (1%6).]
чения термодинамических параметров; см. Дополнение 6.2.) Такие же в первом приближении величины были найдены и для более коротких цепей, что подтверждает гипотезу о почти независимом образовании каждого стэкинга.
Дополнение 6.2 РАСХОЖДЕНИЕ ДАННЫХ ПО ТЕРМОДИНАМИКЕ РАЗРУШЕНИЯ СТЭКИНГА К. Бреслауэр и Дж. Стюртевант (1977 г.) исследовали гептамер аденилата методом дифференциальной сканирующей калориметрии и получили АН = 3 , 4 ккал для разрушения одного моля стэкингов. Они также отметили, что вантгоффова эктальпия, вычисленная из кривых плавления, полученных оптическими методами, меняется в интервале от 5 до 13 ккал • м о л ь " 1 . Расхождения могут быть обусловлены трудностями в получении аккуратной нулевой линии при оптических измерениях. Ясно, что этот вопрос требует дальнейших исследований (см. Дополнение 21.1 о калориметрии).
СТЭКИНГ МОНОНУКЛЕОЗИДОВ В РАСТВОРЕ Склонность оснований к образованию стопок проявляется не только в наличии взаимодействия между ближайшими соседями в полинуклеотидной цепи. Имеются убедительные данные о том, что мононуклеозиды тоже образуют агрегаты в водных растворах. Как инфракрасные спектры, так и спектры ЯМР указывают, что эта агрегация не связана с образованием водородных связей. Более того, сигналы ЯМР, соответствующие индивидуальным протонам в комплексе, всегда сдвинуты в высокочастотную область, что и должно быть при влиянии кольцевых токов на положение этих сигналов (см. гл. 9 о ЯМР). Таким образом, довольно сильная тенденция мононуклеозидов к образованию стопок в полиадениловой кислоте является свойством самих оснований.
КОНФОРМАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ: НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
307
Одним из наиболее плодотворных методов исследования термодинамических свойств процесса образования стопок из мономеров является классический метод измерения давления паров над разбавленным раствором мононуклеозидов. Считая, что раствор при низких концентрациях мононуклеозидов близок к идеальному, измеряют понижение давления паров растворителя, вызываемое введением в раствор оснований. Относительное понижение давления равно, согласно закону Рауля, мольной доле всех растворенных веществ: (Р о - Pv)/P0 = х (6.2) где PQHP^ — давление паров растворителя в отсутствие и при наличии растворенного вещества соответственно, х — мольная доля всех растворенных веществ в растворе. Таким образом, если п0 — число молей растворителя, п1 — число молей растворенных мономеров, п2 — число молей растворенных димеров (пар, связанных межплоскостным взаимодействием), «з — число молей растворенных тримеров (трех уложенных в стопку мономерных единиц) и т.п., то > 1 //г ^ О поскольку для разбавленных растворов п0 ^»
\i > 1 / / ^
и,-. Зная мольную долю х> можно те-
перь вычислить суммарную моляльность всех растворенных соединений т =
V
(6.4а)
mi
где mt — моляльность /-го компонента. Величину т имеет смысл сравнить с известной суммарной моляльностью т' всех мономерных единиц в растворе безотносительно к степени их ассоциации: =
т'
от?,-
£
(6.46)
Отношение т/т' известно как эффективный (practical) осмотический коэффициент фр. Ясно, что фр < 1 и тем меньше, чем больше степень ассоциации мономерных единиц (см. гл. 25, где обсуждаются вопросы осмотического давления). Не составляет труда связать эффективный осмотический коэффицент с соответствующими параметрами модели процесса ассоциации мономерных единиц В так, как это было сделано Т. Соли и Дж. Шеллманом (1968 г.). Для неограниченной ассоциации мономеров В, мы имеем 2В, ** В 2 , К2
BI В
_l_
-г* Л
D
Jf
/Л
+ Г$2 *~~ И 3 ' Л 3
1
+
В
3 ** В4>
) К
4
где К( — константа ассоциации для В,-. Для случая, когда происходит лишь димеризация, легко получить соотношение 2
(1 - Фр)/(2фр - I ) = К2т'
(6.6)
Аналогичным образом для случая, когда происходит бесконечная ассоциация, но все Kt одинаковы (все Kt = К), имеем (1 - фр)/ф\ = Km'
(6.7)
(см. задачу 6.1). Уравнения (6.6) и (6.7) позволяют непосредственно использовать эффективные осмотические коэффициенты в моделях ассоциации. На рис. 6.14^4 приведен график зависимости (1 — фр)/(2фр — 1) 2 от/и' для дезоксиаденозина. Из этих данных видно, что при т' = 0,03 зависимость начинает заметно отклоняться от линейной, что указывает
308
ГЛАВА 6
0,06
0,04
РИС. 6.14. Осмотическое давление над раствором дезоксиаденозина. А. Зависимость (1—ф )/(2ф — I ) 2 отт'.Б. Зависимость (1—ф^ от т'ф^. [T.N. Solie, J.A. Schellman, J.Mol.Biol., 33, 61 (1&8).] "
на присутствие агрегатов более высокого порядка. Предельный наклон при т' — О дает константу ассоциации для димеризации. Если перестроить данные в координатах [т'фр; 1 — Фр) [уравнение (6.7)], то экспериментальные точки лягут на прямую (рис. 6Л4,Е). Это позволяет сделать вывод, что образование всех агрегатов более высокого порядка характеризуется близкими константами ассоциации.
ПУРИНОВЫЙ СТЭКИНГ СИЛЬНЕЕ, ЧЕМ ПИРИМИДИНОВЫЙ В табл. 6.4 приведены некоторые константы ассоциации, полученные описанными методами. Вообще говоря, все константы ассоциации малы и указывают на то, что сила взаимодействия пропорциональна размеру колец, которые участвуют в стэкинге. Константы ассоциации образуют РЯД Кпурш _ п у р и н > ^ р , , , , _ пиримидин > ^пиримидин - пиримидинСвободную энергию, значения которой приведены в табл. 6.4, нельзя прямо сопоставлять с энергией стэкинга оснований в полинуклеотидной цепи, поскольку первая из них вычислена с учетом добавочного члена — RT\n 55,6 (см. гл. 5). Таким образом, для более корректного сопоставления ко всем величинам, приведенным в таблице, следует прибавить — RT\n 55,6 = — 2,4 ккал- м о л ь " '. Так, для дезоксиаденозина получаем при 25 °С величину — 3,9 ккал • м о л ь " 1 . AG° стэкинга аденина в poly(A) составляет —1 ккал • • м о л ь " ' при той же температуре и несколько отличных прочих условиях. Можете ли вы высказать какие-либо соображения о причинах различия этих величин?
КОНФОРМАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ: НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
309
Таблица 6.4 КОНСТАНТЫ АССОЦИАЦИИ И ЗНАЧЕНИЯ СВОБОДНОЙ ЭНЕРГИИ ПРЕДПОЛАГАЕМОГО СТЭКИНГА ОСНОВАНИЙ В ВОДНОМ РАСТВОРЕ ПРИ 25ОС')
Основание dA Пуринрибозид I dT dC
и
К, М л " ' 12 3,5 3,0 0,91 0,91 0,70
АС, ккал - моль ' -1,50 -0,74 -0,64 + 0,06 + 0,06 + 0,21
Основание dA dG dA dA dT
— — — — —
dT dC dC dU dC
К, М л " ' 3 —6 4 —8 3 —6 3 0,91
4G, ккал • моль- 1 От -0,70 до - 1,10 От - 0,80 до - 1,20 От -0,70 до - 1,10 -0,70 + 0,06
'' Т. N. Solie, J. A. Schellman, J. Mol. Biol., 33, 61 (1968).
РОЛЬ РАСТВОРИТЕЛЯ В СТАБИЛИЗАЦИИ СТЭКИНГА Какова природа сил, обеспечивающих стэкинг-взаимодействие? Во-первых, совершенно очевидно, что отчасти стэкинг обусловлен взаимодействием между индуцированнными диполями, образованными т-электронами оснований. Далее, важный факт, проливающий свет на природу стабилизации стопочных структур, заключается в том, что эти структуры наиболее стабильны в водных растворах. К этому выводу приводят, например, результаты исследования изменения гипохромизма ДНК в различных растворителях, но, по-видимому, более прямое подтверждение можно получить при изучении фотохимического образования тиминовых димеров в динуклеотидах тимидил—тимидин (ТрТ). Хорошо известно, что облучение ДНК УФ-светом с длиной волны 280 нм приводит к ковалентному сшиванию соседних тиминовых остатков в одной цепи. Накопленные данные позволяют сделать вывод, что для осуществления димеризации основания должны примыкать плоскостями друг к другу. Было обнаружено, что при данной дозе облучения количество образованных из ТрТ димеров очень сильно зависит от растворителя: больше всего димеров T D образуется в воде. Количество димеров, образующихся в неводных растворителях, оказывается пропорциональным вероятности образования межплоскостного контакта в ТрТ для этих сред. В табл. 6.5 суммированы данные для некоторых растворителей, перечисленных в порядке увеличения их способности содействовать межплоскостному взаимодействию. Видно, что этот порядок в точности соответствует той последовательности, в которой увеличивается количество димеров T D , образующихся в этих растворителях. Приведенные результаты указывают на важную роль водной среды в стабилизации упорядоченных конформаций нуклеиновых кислот. Здесь можно провести аналогию с белками, где гидрофобные взаимодействия тоже занимают центральное место в формировании упорядоченных структур. Таким образом, весьма незначительные на первый взгляд молекулы воды играют очень большую биологическую роль. Итак, вода играет важную роль в стабилизации стэкинга. Но мы не можем безоговорочно утверждать, что гидрофобные взаимодействия — это главные силы, стабилизирующие стопкообразные структуры неполярных молекул в воде. Эти взаимодействия являются эндотермическими и, следовательно, определяются энтропией. В то же время стэкинг-взаимодействие оказывается экзотермическим. Чтобы глубже понять природу сил, стабилизирующих стэкинг, Д. Крозерс и Д. Ратнер (1968 г.) исследовали термодинамику межплоскостного взаимодействия дезоксигуанозина и актиномицина в растворе. Структура актиномицина показана на рис. 23.24; в этой молекуле имеется феноксазоновое
310
ГЛАВА 6 Таблица 6.5 ОБРАЗОВАНИЕ ТИМИНОВЫХ ДИМЕРОВ В РАЗЛИЧНЫХ РАСТВОРИТЕЛЯХ
Растворитель
трет-Ъутгтол Этанол Метанол н-Бутанол
11 2
Количество образовавшихся димеров T D , Щ
5 5,5 6 7,5
Растворитель
]>2>
Количество образовавшихся димеров T D , %
Этиленгликоль Формамид Глицерин Вода
19 21 33 35
W. Wacker, Angew Chem. Internat., 4, 150 (1965).
' Растворители перечислены в порядке увеличения их способности содействовать межплоскостному
взаимодейст-
вию в ТрТ.
кольцо, которое, как показывают кристаллографические данные Г. Собелла, может вступать в межплоскостное взаимодействие с кольцом гуанина. Крозерс и Ратнер установили, что в водном фосфатном буфере при 25 °С образование комплекса характеризуется изменением энтальпии АН0 = —10,3 ккал • м о л ь " 1 и изменением энтропии AS0 = = — 19,8 кал • м о л ь " ' • г р а д " ' , но при добавлении метанола и АН0, и AS0 увеличиваются по абсолютной величине. Например, при концентрации метанола 25% АН0 = = —14,05 ккал • м о л ь " 1 , a AS0 = —33,7 кал • м о л ь " 1 • г р а д " 1 . Таким образом, в чисто водном растворе имеются скрытая положительная энтропия и положительная энтальпия образования комплекса, которые теряются при добавлении метанола. Весьма вероятно, что этот скрытый вклад в энтальпию и энтропию возникает за счет гидрофобных эффектов, включающих перегруппировку молекул воды (см. гл. 5). Другой подход к анализу межплоскостных взаимодействий дан в дополнении 6.3.
Дополнение 6.3. ВЛИЯНИЕ ПОВЕРХНОСТНОГО
НАТЯЖЕНИЯ
Интересный подход к исследованию энергетики стэкинга оснований разработали Синаноглу и Абдулнур (1964 г.). Они развили идею о том, что поверхностное натяжение наряду с другими факторами может быть использовано для вычисления работы, необходимой для образования из сольватированных неупорядоченных оснований спиральной структуры, что сопровождается вытеснением растворителя из промежутка между основаниями. Задача в этом случае сводится к вычислению работы, которая необходима для создания полостей в растворе для индивидуальных сольтватирован ных оснований и для оснований, уложенных в спираль. Работа, затраченная на создание полости площадью (L4, есть просто dw = ydA, где у — поверхностное натяжение. Очевидно, для создания отдельных полостей для каждого основания необходимо совершить больше работы, чем для создания одной большой полости, которая вместит все основания без растворителя между ними. Следовательно, будет наблюдаться тенденция (до тех пор, пока рассматривается только взаимодействие растворитель — растворитель) к упаковке оснований в одну полость. Но почему вода проявляет такую относительно сильную тенденцию к стабилизации стопочных структур? Возможно, дело в том, что она обладает относительно высоким поверхностным натяжением — около 72 дин • см~ 2 — по сравнению, например, с этанолом, для которого эта величина составляет около 22 дин • см ~ 2 при комнатной температуре. Разница в энергии, необходимой для создания отдельных полостей и образования одной большой полости, для воды оказывается
КОНФОРМАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ: НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
311
больше, чем для других растворителей. Растворители, вызывающие денатурацию ДНК (метанол, этиленгликоль, формамид, глицерин, энатнол, н-пропанол и н-бутанол), значительно уступают воде в способности содействовать образованию спирали за счет эффекта поверхностного натяжения. Эти растворители, однако, имеют также более низкую диэлектрическую проницаемость и поэтому увеличивают электростатическую дестабилизацию спиральных молекул нуклеиновых кислот.
6.8. Третичная структура нуклеиновых кислот Все рассмотренные нами данные дают довольно полное представление о геометрических факторах и силах, которые определяют вторичную структуру нуклеиновых кислот. На основании этих данных можно прийти к выводу, что нуклеиновые кислоты находятся в основном в двух конформационных состояниях — в виде беспорядочного клубка и линейных одно- и двухцепочечных спиралей. Такое впечатление ошибочно и вызвано отчасти чрезмерным увлечением модельными системами и убеждением, что третичные взаимодействия играют важную роль лишь в белках. Хорошо известным примером нуклеиновой кислоты, имеющей четко выраженную третичную структуру, является транспортная РНК. Эти одноцепочечные полимерные молекулы состоят обычно из 73 — 93 нуклеотидов и складываются таким образом, что их вторичная структура имеет форму клеверного листа (рис. 3.6). тРНК образуют семейство молекул, каждая из которых специфична к определенной аминокислоте. Эта специфичность связана со способностью 3'-конца каждой цепи тРНК образовывать эфирную связь с одной определенной аминокислотой с помощью специфического фермента. Аминокислота, которая может быть присоединена к данной тРНК, соответствует определенному триплету в последовательности оснований тРНК — антикодону, комплементарному кодону. Место присоединения данной аминокислоты к растущей полипептидной цепи определяется взаимодействием между антикодоном тРНК и кодоном матричной РНК. Согласно многочисленным данным, вторичная структура тРНК имеет форму клеверного листа, состоящего из спиральных участков и расположенных между ними петель. Образование такой структуры определяется в значительной мере сильной тенденцией спаренных и уложенных в стопки оснований к образованию спиралей. В то же время имеется много данных, полученных для растворов, которые ясно указывают на наличие у тРНК четко выраженной третичной структуры. Природу этой укладки удалось установить в основном благодаря кристаллографическим исследованиям трехмерной структуры дрожжевой фенилаланиновой тРНК, выполненным Ричем, Кимом, Клугом и их коллегами. На рис. 3.17 представлена схема укладки «клеверного листа» в третичную структуру. Молекула имеет Г-образную форму; один из «рукавов» буквы Г образован спиралью акцепторного стебля, непрерывно переходящей в спираль псевдоуридилового стебля, а другой — антикодоновым и дигидроуридиловым стеблями. Угол буквы Г образован Т*С- и дигидроуридиловой петлями. На концах буквы Г находятся антикодоновая петля и 3'-акцепторный конец, разделенные расстоянием около 75 А. Из этого грубого описания ясно, что антикодоновая петля находится «снаружи» структуры и поэтому может участвовать в спаривании оснований. Хотя существование этой конформации в растворе еще не доказано, большинство данных согласуется с ней. Третичная структура тРНК частично стабилизирована ранее неизвестными и потому представляющими большой интерес взаимодействиями, включающими образование водородных связей в комплексах из трех оснований (рис. 3.18). В результате этих необычных взаимодействий образуются мостики между различными участками цепи и стабилизируется более компактная конфигурация. Ясно также, что в стабилизации структуры участвуют поливалентные катионы (Mg 2 + , полиамины), хотя детали этих взаимодействий до конца не выяснены.
312
ГЛАВА 6
Результаты, полученные при изучении транспортных РНК, показывают, что нуклеиновые кислоты могут иметь высокоутторядоченную трехмерную конформацию. Не вызывает сомнения, что гораздо более крупные молекулы РНК, такие, как рибосомные РНК, также имеют сложную трехмерную структуру. Существуют и молекулы ДНК сложной формы. О механизме образования третичной структуры нуклеиновых кислот известно еще слишком мало, и проблема предсказания уникальной трехмерной структуры этих молекул исходя из их нуклеотидной последовательности представляется невероятно трудной (если вообще разрешимой), так же как и аналогичная проблема для белков. (Дальнейшее обсуждение третичной структуры нуклеиновых кислот можно найти в гл. 24.).Тем не менее ясно, что основными факторами, благодаря которым формируется третичная структура полинуклеотидов и белков, являются геометрические и стерические ограничения, водородные связи, гидрофобные взаимодействия и электрические силы.
Краткие выводы Конформация остова полинуклеотидной цепи определяется шестью углами внутреннего вращения, имеющимися в каждой повторяющейся единице цепи. Наличие большого числа переменных усложняет стереохимический анализ конформаций цепи, но путем последовательных шагов можно значительно упростить задачу и показать, что стерические эффекты существенно уменьшают количество допустимых конформаций. Два основных типа взаимодействий, стабилизирующих структуру нуклеиновых кислот, связаны с образованием пар и стэкингом оснований. Возможно существование разных типов пар оснований, и некоторые из них действительно наблюдались при кристаллографическом исследовании мономеров. Для кристаллов мономерных производных аденина и урацила образование уотсон-криковских пар (как в двойной спирали ДНК) никогда не наблюдалось, но часто удавалось обнаружить другие типы пар. Для комплементарных же динуклеотидов ApU, кристаллическая структура которых определена с атомным разрешением, характерно образование уотсон-криковской спирали. Спаривание оснований было исследовано и для растворов мономеров; установлено, что А спаривается в основном с U, a G с С, хотя при образовании специфического комплекса А — U реализуется более одной схемы спаривания. Вся совокупность данных свидетельствут о том, что уотсонкриковская спираль образуется вследствие «электронной» комплементарности в А—U- и G—С-парах и вследствие геометрических ограничений в двойной спирали. Стэкинг-взаимодействие проявляется в водных растворах и наблюдается в одноцепочечных полинуклеотидах, таких, как poly (А), и между свободными мономерами нуклеозидов. Вообще говоря, пурины охотнее участвуют в стэкинге, чем пиримидины. Взаимодейтвие связано с отрицательной величиной АН, что отличает его от гидрофобных взаимодействий, хотя другие данные указывают на значительную роль в стабилизации стэкинга оснований гидрофобного эффекта. Нуклеиновые кислоты могут иметь также и специфическую третичную структуру, как видно на примере транспортной РНК. Компактная специфическая структура тРНК формируется благодаря образованию необычных пар оснований и наличию других взаимодействий. ЗАДАЧИ 6.1. Используя определение эффективного осмотического коэффициента фр и уравнения (6.4) и (6.5), докажите справедливость уравнений (6.6) и (6.7). 6.2. Экспериментатор измеряет давление паров аденозина (А) над тремя разными растворами этого соединения. Первый растворитель — это 8 М водный раствор мочевины, вто-
КОНФОРМАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ: НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
313
рым растворителем является СС14, а третий представляет собой чистую воду. Измерения проводятся для того, чтобы установить активность аденозина (или концентрацию свободного аденозина) в этих трех растворах. Затем экспериментатор сопоставляет результаты измерений с общим количеством аденозина (А)д, добавленным в раствор. Он проводит эти опыты в широком диапазоне концентраций А и приходит к выводу, что для раствора I соотношение между (А)о и действительной концентрацией свободного аденозина (А) в растворе соответствует равенству (А)о = (А), т.е. в растворе I концентрация свободных мономеров равна суммарной концентрации. Для раствора II оказывается, что (А)о = = (А) + С(А)2, где С — константа, причем согласие с результатами измерений не улучшается добавлением к правой части соотношения членов, соответствующих более высоким степеням (А), чем (А)2. Для раствора III (А)о = С,(А) + С2(А)2 + С3(А)3 + С4(А)4 + . . . где Cj = 1, С2 — константа и Ск = (к/2к ~ ')С* - ' и к = 3, 4, . . . Исходя из этих данных опишите типы специфических взаимодействий, которые реализуются в указанных растворах. Для обоснования ваших предположений покажите, что приведенные здесь уравнения однозначно следуют из этих предположений. 6.3. В процессе изучения стэкинга оснований мононуклеозидов экспериментатор измерил параметр ф при трех значениях суммарной концентрации мононуклеозидов и обнаружил, что величина К (константа равновесия для стэкинга), вычисленная из этих данных, почти не зависит от того, какую модель он использует — ту, в которой предполагается образование лишь димеров, или же модель неограниченной ассоциации, в которой предполагается образование агрегатов высших порядков (для всех агрегатов характерна одна и та же константа равновесия К). Экспериментатор считает, что где-то допущена ошибка, но не может найти ее. Если вы считаете, что ошибка действительно допущена, укажите, в чем несовместимость полученных данных. В противном случае укажите условия, при которых вы могли бы получить почти одинаковые значения К из данных, соответствующих трем разным концентрациям. {Примечание: тривиальный случай К = 0 не рассматривается.) 6.4. Для двухцепочечных нуклеиновых кислот наблюдается переход спираль—клубок, который до некоторой степени аналогичен плавлению poly (А) с ростом температуры. Кривая плавления ДНК является, однако, чрезвычайно крутой. Середина этого кооперативного перехода характеризуется температурой плавления Тт. Основываясь на данных этой главы, укажите, какие факторы оказывают существенное влияние на крутизну кривой и температуру плавления ДНК. Почему? Можете ли вы дать физическое объяснение кооперативности перехода? 6.5. Рассмотрим такой реагент, как мочевина. Известно, что в ее присутствии происходит эффективная денатурация белков. Какое влияние, по вашему мнению, окажут водные растворы мочевины с концентрацией от 1 до 8 М на стабильность упорядоченных одно- и двухцепочечных нуклеиновых кислот? Почему? ЛИТЕРАТУРА Общая Olson W. К., Flory P. J. 1972. Steric configurations of polynucleotide chains, I: Steric interactions in polynucleotides: A virtual bond model, Biopolymers, 11, 1 [В этой и других статьях того же выпуска журнала приведен критический анализ данных о конформации и стереохимии полинуклеотидов.]
314
ГЛАВА 6
Ts'o Р. О. P. ей., 1974. Basic Principles in Nucleic Acid Chemistry, 2 vols., New York, Academic Press. [Изложены основные вопросы физики и химии нуклеиновых кислот; авторы — крупные специалисты в данной области. В гл. 6 1-го тома рассмотрены свойства мономерных единиц и их взаимодействие.] Voet D., Rich А., 1970. The crystal structure of purines, pyrimidines and their intermolecular complexes, Progr. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 10, 183. [Содержит прекрасную сводку данных о комплексах между основаниями, образующихся с помощью водородных связей, в кристаллическом состоянии.]
Специальная Breslauer К. J., Sturtevant J. М..19П. Calorimetric investigation of base-stacking in Ribo A,, Biophys. Chem., 7, 205. Crothers D. M., Ratner D. /.,1968. Thermodynamic studies of a model system for hydrophobic bonding, Biochemistry, 7, 1823. Hoogsteen K., 1959. The structure of crystals containing a hydrogen-bonded complex of 1-methylthymine and 9-methyladenine, Acta Cryst., 12, 822. Hoogsteen K., 1963. The crystal and molecular structure of a hydrogen-bonded complex between 1-methylthymine and 9-methyladenine, Acta Cryst., 16, 907. Kim S. H., Quigley G. J., Suddath F. L., McPherson A., Sneden D., Kim J. J., Weinzierl J., Rich A., 1973. Three-dimensional structure of yeast phenylalanine transfer RNA: Folding of the polynucleotide chain, Science, 179, 285. Kim S. H., Suddath F. L., Quigley G, J., McPherson A., Sussman J. L., Wang A. H. J., Seeman N. C, Rich A., 1974. Three-dimensional tertiary structure of yeast phenylalanine transfer RNA, Science, 185, 435. Kyogoku Y., Lord R. C, Rich A., 1968. Specific hydrogen bonding of barbiturates to adenine derivatives, 218, 69. LendM., Felsenfeld G., 1966. A study of polyadenylic acid at neutral pH, J. Mol. Biol., 15, 455. Pullman В., Claverie P., Caillet J., 1966. Van der Waals—London interactions and the configuration of hydrogen-bonded purine and pyrimidine pairs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 55, 904. Rich A., Kim S.H., 1978. The three-dimensional structure of transfer RNA Sci. American, 238 (1), 52. Robertus J. D., Ladner J. E., Finch J. Т., Rhodes D., Brown R. S., Clark B. F. C, Klug A., 1974. Structure of yeast phenylalanine tRNA at 3 A resolution, Nature, 250, 546. Rosenberg J. A/., Seeman N. C, Kim J. J. P., Suddath F. L., Nicholas H. В., Rich A., 1973. Double helix at atomic resolution, Nature, 243, 150. Sinanoglu O., Abdulnur S., 1964. Hydrophobic stacking of bases and the solvent denaturation of DNA, Photochem. Photobiol., 3, 333. Solie T. N.. Schellman J. A., 1968. The interaction of nucleosides in aqueous solution, J. Mol. Biol., 33, 61.
Приложение Л Основы матричной алгебры Матрицей называется таблица, элементами которой являются числа или символы. Например, / 8 7\ \23 2 8 / ' — это матрицы размером 2 x 2 (содержащие по две строки и по два столбца); символ ап обозначает элемент, принадлежащий первой строке и второму столбцу. В общем случае а- представляет собой элемент /-й строки и у'-го столбца. Для левой матрицы а^ = 28, а 21 = 23 и т.д. В этой книге матрицы обозначаются буквами, выделенными жирным шрифтом со значком 2. Полезное введение в матричную алгебру можно найти в гл. 1 книги «Методы прикладной математики» Ф. Хильдебранда [F. В. Hildebrand, Methods of Applied Mathematics (Englewood Cliffs, N. J.: Prentice-Hall, 1965)].
Приложение Б Решение задач
ГЛАВА 1 1.1. Диаметр соответствующего цилиндра равен 2гг. После проецирования один виток спирали будет соответствовать гипотенузе прямоугольного треугольника, катеты которого равны 2ят и Р. 1.2. Регуляторный механизм поддерживает концентрацию белка на достаточно высоком уровне, чтобы мог образовываться стабильный октамер, не допуская перепроизводства. ГЛАВА 2 2.1. Наличие пяти полос, наблюдаемых для смеси В + С, означает, что белки являются тетрамерами. Полосы соответствуют В4, В3С, В2С2, ВС3 и С 4 . Для объяснения наличия только трех полос в смесях А + С или А + В предположим, что димер Aj очень стабилен по сравнению с гетеродимерами АС и АВ. Изолированный А будет тетрамером (Aj)2. Три полосы смеси А + В соответствуют (Aj)2, AjB2 и В4. Аналогичные полосы можно увидеть для смесей А + С. 2.2. При добавлении мономера к димеру формируются два контакта белок — белок, тогда как при образовании димера из двух мономеров или тетрамера из тримера и мономера — только один. Сходным образом при добавлении последнего мономера, завершающего процесс образования диска, формируются четыре контакта белок — белок, а при добавлении мономера к менее завершенному диску или к полностью завершенному число контактов будет меньше. Если предположить, что при формировании любых контактов выигрыш в энергии одинаков, то оказывается, что тримеры (пентамеры, гептамеры и т.д.) и диски будут предпочтительными по сравнению с другими олигомерами с большим или меньшим числом мономеров. 2.3. Первичная структура, вероятно, представлена двумя почти одинаковыми участками последовательности (возможно, она подобна структуре ферредоксина). N- и С-концы, по-видимому, расположены в третичной структуре очень близко друг от друга. 2.4. а-Спираль, состоящая из 85 остатков, имела бы длину 128 А. Таким образом, рассматриваемый белок не может находиться в строго а-спиральной конформации. Цепь из 85 остатков в конформации /3-слоя была бы растянута до 295 А. Если она складывается в двухцепочечный антипараллельный /3-слой, результирующая структура будет иметь длину около 150 А. Можно также сформировать структуры такой длины из различных комбинаций спиралей и слоев. Однако в любой из этих структур большая часть боковых групп аминокислот (или все они) была бы экспонирована. Если белок содержит обычный набор гидрофобных остатков, то весьма маловероятно, что какая-нибудь из этих структур будет стабильна в водном растворе. В рибосоме такие структуры могут стабилизироваться вследствие образования множества контактов боковых цепей с другими белками (или с рибосомальной РНК). Если поместить такой белок в раствор, он почти наверное примет более компактную конформацию за счет разрушения некоторых слоев или спиралей. 2.5. Обратите внимание на то, как чередуются полярные и неполярные остатки в последовательности. Если такой белок сложен в двухцепочечный антипараллельный /3-слой, то одна его поверхность будет полностью полярной, а другая—неполярной. Такой мономер будет легко прилипать к мембране своей неполярной поверхностью. Он также будет легко димеризоваться в результате гидрофобных взаимодействий, образуя структуру типа сэндвича с неполярной внутренней областью.
РЕШЕНИЕ ЗАДАЧ
319
ГЛАВА 3 3.1. Вероятность обнаружения заданной последовательности из следующих друг за другом оснований в данном месте молекулы равна 1/4". В ДНК из 104 оснований эта последовательность встретится в среднем 10 4 /4" раз. Следует выбрать п таким образом, чтобы эта величина была меньше или равна 0,01. Это дает 0,01 = 10 4 /4\ откуда п = 10. 3.2. В В-форме ДНК длина двойной спирали составит 13,1 • 10~3 см, что соответствует 3,79 х х 104 виткам. В А-форме ДНК длина составит 9,70 • 10" 3 см, а число витков — 3,44 • 104. 3.3. Эта проблема обсуждается в работе U. H. Settler et al., J. Mol. Biol., 131, 21 (1979)'. 3.4. Одна половина молекулы образует одноцепочечное кольцо, а вторая закручена вокруг первой, образуя двойную спираль. Авторам неизвестно, была ли такая структура обнаружена экспериментально. 3.5. В ДНК тоже будут образовываться спиральные шпильки, однако их структура будет, вероятно, такой же, как в В-форме ДНК, а не как в РНК-11. В то же время часть третичных взаимодействий сохранится, а некоторые из них станут невозможными. К последним относятся, например, водородные связи, в образовании которых принимает участие 2'-ОН-группа рибозы. Взаимодействия с участием модифицированных нуклеотидов также окажутся невозможными для ДНК. ГЛАВА 4 4.1. См. рис. 9 в работе: С. Sardet, A. Tardieu, V. Luzzati, J. Mol. Biol., 105, 383 (1976). 4.2. Это нелегкая задача. Можно попытаться предотвратить случайные столкновения с помощью образования поперечных сшивок в мембране при температурах ниже фазового перехода (переходов) в липидах. Если есть возможность проверить активность белков, можно попытаться восстановить очищенные сшитые белковые пары и измерить активность. Наиболее эффективная мыслимая стратегия — путем разбавления уменьшить концентрацию белков и посмотреть, образуются ли поперечные связи и в этом случае, но сделать это весьма непросто. Дальнейшее обсуждение этого вопроса можно найти в статье: К. Peters, F. M. Richards, Ann, Rev. Biochem., 46, 523 (1977). 4.3. Возможно хорошее соответствие С2-осей симметрии белка и нуклеиновой кислоты. 4.4. Нарушение периодичности дестабилизирует высокоупорядоченные спиральные и олигомерные структуры, и тогда единственное, что может образоваться, — это менее упорядоченная структура геля. 4.5. Соли должны дестабилизировать комплексы между нуклеиновыми кислотами и оснбвными (положительно заряженными) белками. Эти комплексы связывают меньше противоионов, чем отдельные компоненты. Напротив, комплексы между нуклеиновыми кислотами и кислотными (отрицательно заряженными) белками должны стабилизироваться солями. Эти комплексы будут связывать больше катионов, чем отдельные компоненты. Комплексы такого типа обнаружены в нуклеопротеидах, выделяемых из галофильных организмов. Вероятно, они являются результатом адаптации этих организмов к высокой внутриклеточной концентрации солей. ГЛАВА 5 5.1. Напомним, что все остатки, предшествующие пролину, имеют измененную конформационную энергетическую карту, за исключением глицина, на который следующий за ним пролин влияет не очень сильно. (Для случая остатка аланина, предшествующего пролину, см. рис. 5.11.) В последовательности Ala-Pro область I стерически запрещена для остатка аланина, а именно она соответствует менее растянутой конформации, которая может быть принята при образовании изгиба. Следовательно, для образования изгиба, что необходимо при формировании циклического пептида, лучше, чтобы перед пролином находился не аланин, а глицин. Из-за отсутствия боковой цепи остаток гли1 Рассмотрение этого вопроса невозможно без учета образования левоспиральной Z-формы [см. F. M. Pohl, R. Thomae, E. DiCapua, Nature, 300, 545 (1982)]. — Прим. ред.
320
ПРИЛОЖЕНИЕ Б
цина может принять все доступные ему менее растянутые конформации даже тогда, когда за ним следует пролин. Поэтому предпочтительной последовательностью является следующая: X = Ala, Y = Gly, Z = Pro. 5.2. Для решения этой задачи следует использовать табл. 5.8 и 5.9. Назовем конформацию, в которой все три остатка расположены во внутренней области белка, конформацией А, а конформацию, в которой они экспонированы, — конформацией В. Из табл. 5.8 следует, что ДС пер = 0,73, 2,42 и 2,65 ккал/моль для Ala, Leu и Phe соответственно. Сумма этих свободных энергий ДС Д В = = 5,80 ккал/моль и в первом приближении равна свободной энергии переноса из А в В в воде. Следовательно, К = (А)/(В) = ехр( — AG^/RT) = 1,8 • 104. Согласно табл. 5.9 свободная энергия переноса Ala, Leu и Phe в водный раствор мочевины уменьшается соответственно до 0,07, 0,38 и 0,70 ккал/моль. Таким образом, AG AB уменьшается до 1,15 ккал/моль и, следовательно, для конформационного изменения в мочевине К = 2,6 • 103. 5.3. Применим подход, использованный в разд. 5.8. Пусть ДС Д В — свободная энергия перехода из конформации А в конформацию В. Следовательно, г \ ДО = - j (F)dr = y(r~l - г'1), где у = аТ г г К = exp(-AGZRT) = e\p[-y(r2l - r~l)/RT\ 2 2 x АН= -T d(AG/T)/dT = -T d[a(r2 - r~l)]/dT = 0 l AS = (AH - AG)/T = y(r~ - r~x)/T 5.4. Обратимся к уравнениям (5.13) и (5.14). Так как х = 0,1 и в этаноле, и в воде, вклад энтропии смешения в свободную энергию переноса AGcyMM равен нулю. Однако вклад энтропии смешения в AG * отличен от нуля, так как х = 1 в этаноле их = 0,1 в воде. Поэтому ДС°*мм = ДС° + Я7"1пО,1 и Д< ^сумм ~~д