Нейротропные эффекты бензилпенициллина в экспериментальных моделях стресса у крыс

Центр физиолого-биохимических проблем Киев, Украина

на правах рукописи

КАЛУЕВ Алан Валерьевич

НЕЙРОТРОПНЫЕ ЭФФЕКТЫ БЕНЗИЛПЕНИЦИЛЛИНА В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЯХ СТРЕССА У КРЫС

03.00.13 - Физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев 2002 г.

2

Оглавление Введение Глава 1. Обзор литературы: физиологическая активность пенициллинов Глава 2. Экспериментальные модели стресса Стрессорный ульцерогенез Поведенческие модели стресса

стр. 3 7 22 23

Тест Порсолта, норковая камера, вертикальный экран-сетка, крестообразный приподнятый лабиринт, черно-белая камера, приподнятая открытая платформа, модель «подвешивание за хвост».

Модель хемо-индуцированного эпилептогенеза Глава 3. Методы экспериментальных исследований Стрессорный ульцерогенез, вызванный плаванием Поведенческие модели стресса Поведенческие эффекты комбинации бензилпенициллина и ГАМК-литиков коразола и пикротоксина Модель хемо-индуцированного эпилептогенеза Статистическая обработка данных Глава 4. Результаты экспериментальных исследований и их обсуждение 1. Антистрессорное антиязвенное действие бензилпенициллина при стрессе 2. Изменение поведения при действии бензилпенициллина Межтестовый анализ эффектов бензилпенициллина при стрессе Поведенческие эффекты бензилпенициллина в некоторых блиц-тестах на стресс 3. Изучение влияния бензилпенициллина на ГАМК-ергические механизмы при стрессе Поведенческие эффекты комбинации бензилпенициллина и ГАМК-литиков в крестообразном приподнятом лабиринте Влияние бензилпенициллина на коразоловые и пикротоксиновые судороги 4. Общее заключение Выводы Практические рекомендации Список работ, опубликованных по теме диссертации Список литературы Условные обозначения и единицы измерения Аннотация на русском и английском языках

41 43 43 45 54 55 57 57 57 62 80 87 99 99 112 117 119 121 121 123 148 149

3

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. Стресс характеризуется комплексным воздействием на нейрогуморальные механизмы организма и сопровождается выраженными изменениями поведения человека и животных [Селье Г., 1967; Айрапетянц М.Г., Вейн А.М., 1992; Симонов П.В., 1993; Хананашвили М.М., 1998]. Стресс и поведение, связанное с ним, представляют собой область, в которой сегодня наиболее активно работают нейрофизиологи мира. За последние десятилетия накоплены обширные сведения о нейротропном действии пенициллинов. Было показано, что данная группа препаратов способна воздействовать на нервные механизмы, связанные с системой гамма-аминомасляной кислоты, ГАМК [Olsen R.W., McDonald R., 1994]. Роль центральной ГАМК-ергической системы в регуляции поведенческих реакций на стресс, в том числе состояния тревожности, хорошо изучена [Судаков К.В., 1987; McNaughton N., 1993]. При этом, несмотря на обилие данных по нейрохимии пенициллинов, мало известно об их способности влиять на центральные процессы и механизмы, в том числе действовать на поведение при стрессе. В литературе по данному вопросу крайне мало сведений, и поэтому изучение поведенческих эффектов пенициллинов в различных моделях стресса представляет собой актуальную самостоятельную научную задачу. В настоящей работе была также сделана попытка при помощи нейротропного препарата бензилпенициллина (БП) изучить внутрицентральные физиологические механизмы, лежащие в основе регуляции поведенческих реакций животных на стресс различного генеза.

4

Цель работы: Исследовать особенности поведения животных при стрессе на фоне действия БП и изучить возможные физиологические внутрицентральные механизмы, лежащие в основе нейротропных, стресс-тропных свойств БП. Задачи исследования: 1. Изучить поведенческие изменения, вызываемые при действии БП в серии экспериментальных моделей стресса различной природы (стрессорное язвообразование, вызванное плаванием, тест «вынужденного плавания» Порсолта, норковая камера, вертикальный экран, крестообразный приподнятый лабиринт, тест «подвешивание за хвост», приподнятая платформа, черно-белая камера); 2. провести сравнительный анализ стрессорных моделей с точки зрения выраженности стресс-тропного действия БП в указанных тестах и в зависимости от природы и силы использованных стрессоров; 3. исследовать возможность действия БП на ГАМК-ергические механизмы при стрессе (в моделях эпилептогенеза и тревожности в крестообразном приподнятом лабиринте, вызванных ГАМК-литиками коразолом и пикротоксином) и тем самым оценить значение центральных ГАМК-ергических механизмов в регуляции поведенческих реакций животных при стрессе. Научная новизна исследования. В работе впервые осуществлено исследование особенностей поведения крыс в серии различных поведенческих моделей стресса крыс на фоне действия широкого диапазона доз нейротропного препарата БП. Выявлены быстроактивируемые антистрессорные, антитревожные эффекты, вызываемые БП. Впервые на поведенческом уровне проведено исследование возможных ГАМК-ергических медиаторных механизмов при стрессе, на которые оказывает корректирующее действие БП, и экспериментально подтверждена роль данных механизмов при стрессе различной природы.

5

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследования позволяют расширить представления о роли центральных нейромедиаторных механизмов при стрессе различной природы и свидетельствуют о важной роли ГАМК-ергической системы в регуляции стрессорного поведения животных. В работе получает дальнейшее подтверждение концепция о положительном антистрессорном эффекте умеренного физиологического возбуждения ЦНС. Полученные данные также существенно дополняют сведения о спектре физиологически активных свойств пенициллиновых соединений и могут служить базой для создания на их основе эффективных стресс-протективных нейротропных препаратов. Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждались на заседаниях кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ (19931996, 2002), 3-й Международной школе по нейробиологии (Иерусалим, 1994), 19-й Ежегодной конференции Европейской нейробиологической ассоциации (ENA, Вена, Австрия, 1994), на XIX Международном конгрессе нейропсихофармакологов (CINP; Вашингтон, США, 1994), семинарах Медицинских школ Бристольского и Бирмингемского Университетов (Великобритания, 1995, 1996), Ежегодной конференции Международного общества по изучению нейробиологии поведения (IBNS, Сантьяго-де-Компостелла, Испания, 1995), 8-й Сардинской школе по нейробиологии (Кальяри, Италия, 1995), на Ежегодных съездах Британского общества психофармакологов (Кембридж, 1995) и Британского физиологического общества (Оксфорд, 1995), на 33-м Международном конгрессе физиологических наук (С-Петербург, 1997), семинарах Института физиологии им. А.А.Богомольца АН Украины и семинарах кафедры физиологии человека и животных биологического факультета КНУ им. Тараса Шевченко (Киев, 1998-1999), II и III Междисциплинарных конференциях по

6

нейробиологии (Киев, 1998, 1999), на заседаниях Научно-технического совета Центра физиолого-биохимических проблем (1999-2002), а также конференции, посвященной 160-летию кафедры физиологии Киевского Университета (2002). Публикации. Результаты исследования изложены в 18 публикациях. Работа выполнена при поддержке Государственной научной стипендии Президента Российской Федерации и грантов Европейской Нейробиологической программы. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 150 страницах печатного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания применяемых методов, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, общего обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 14 таблицами. Список литературы включает 230 источников, из них 164 на иностранных языках. Общее примечание. Настоящая работа была начата диссертантом в период обучения на кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (зав. акад. РАМН проф. И.П.Ашмарин) и продолжена на базе Центра физиолого-биохимических проблем (ЦФБП, Киев). Отдельные эксперименты проводились на базе Медицинской школы Бристольского Университета Великобритании (зав. проф. Д.Натт). Научная идея проведения данного исследования действия пенициллиновых препаратов в моделях стресса принадлежит акад. РАМН проф. И.П.Ашмарину совместно с д.б.н. проф. Г.Е.Самониной (МГУ). Автор выражает признательность И.П.Ашмарину за все рекомендации и указания, а также поддержку во время выполнения части экспериментов на руководимой им кафедре. Автор выражает личную признательность Г.Е.Самониной за ценные практические указания при изучении ульцерогенеза и полезные критические замечания по работе, а также

7

д.б.н. А.П.Зарубиной. Следует выразить благодарность проф. Д.Натту из Бристольского Университета (за дискуссии о механизмах тревожности и обсуждение некоторых полученных данных), а также проф. Р.Роджерсу из Лидского Университета (за комментарии и советы по поводу анксиотропных свойств ГАМК-активных препаратов и личный интерес к результатам исследований). Автор искренне благодарит за полезную дискуссию всех коллег и сотрудников. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПЕНИЦИЛЛИНОВ Делать обзор механизмов физиологического действия пенициллинов – одновременно и легкая, и трудная задача. Всем настолько хорошо известны антибиотические свойства пенициллинов, что факт существования у них иных, неантибиотических свойств иногда вызывает удивление даже у специалистов. С другой стороны, в отдельных деталях эффекты препаратов этой группы на нервную систему весьма хорошо изучены. Однако обилие таких деталей не облегчает, а лишь запутывает общую картину нейротропности пенициллинов, поскольку при этом в литературе отсутствует не только единое мнение, но и какое-либо четкое целостное представление о механизмах нейротропного действия БП. Одна из самых интересных проблем - возможность действия препаратов этой группы на поведение - вообще оказывается вне рассмотрения, за исключением единичных наблюдений и нескольких клинических работ. Разумеется, без понимания механизмов действия пенициллинов на ЦНС совершенно бессмысленно пытаться расшифровать и понять их возможные стресс-тропные эффекты. Поэтому в настоящей главе мы попытаемся не только представить полную картину возможных механизмов действия БП, последовательно создаваемую усилиями различных исследователей на протяжении почти шести де-

8

сятилетий, но и обозначить наиболее существенные и обоснованные из них, чтобы затем с их помощью попытаться интерпретировать экспериментальные данные, полученные в ходе выполнения работы. Пенициллины - низкотоксичные, но чрезвычайно эффективные природные или синтетические антибиотики, имеющие гетероциклическую структуру, в основе которой лежит 6-аминопенициллановая кислота, состоящая из сконденсированных тиазолидинового и бета-лактамного колец (рис. 1). Наибольшую практическую ценность среди пенициллинов представляет бензилпенициллин БП [Dollery C., 1991; Зарубина А.П. и др., 1994]. S Ph-CH2-CO-NH-

Рисунок 1. Структура бензилпенициллина CH3 CH3

O

N

Бета-лактамное кольцо

COOH Тиазолидиновое кольцо

Механизм действия БП основан на подавлении синтеза муреина клеточной стенки в период активного роста бактерий [Черномордик А.Б., 1980; Навашин С.М., Фомина И.П., 1982]. Минимальная подавляющая концентрация БП составляет 0.001 ЕД/мл или 0.6 нг/мл [Машковский М.Д., 1987]. Характерной особенностью пенициллинов является их низкая токсичность [Dollery C., 1991]. Токсичной для БП является очень высокая доза 1,6-2 г/кг [Смирнов В.В. и др., 1985, Черномордик А.Б., 1980], что позволяет применять в клинике массированные дозы БП от 20-60 до 100-120 млн ЕД/сутки [Черномордик А.Б., 1980]. В клинике верхний предел для применяемых доз БП составляет порядка 1.5-1.8 млн ЕД/кг (из расчета на 70 кг веса среднестатистического человека). Если учесть, что однократной суточной стандартной терапевти-

9

ческой дозой (ОСД) обычно считают 0.7-1 млн ЕД/сутки, то есть порядка 10 000 ЕД/кг, а 1 ЕД эквивалентна 0.6 мкг [Навашин С.М., Фомина И.П., 1982], то 1 ОСД для человека составляет порядка 6 мг/кг, а упомянутые выше массированные суточные дозы БП эквивалентны 30-90 и 150-180 ОСД, или 180-540 и 900-1080 мг/кг. Эти подсчеты соответствуют данным [Смирнов В.В. и др., 1985], показавших переносимость человеком дозы в 1 г/кг массы тела. Однако, несмотря на свою крайне низкую токсичность, пенициллин способен привести к ряду побочных эффектов, в том числе аллергические реакции, опасные возможностью развития быстрого анафилактического шока [Навашин С.М., Фомина И.П., 1982; Смирнов В.В. и др., 1985; Dollery C., 1991]. Описаны случаи токсического действия пенициллинов на сердечную мышцу, слизистые, почки и железы, а также влияние на свертываемость крови [Смирнов В.В. и др., 1985]. Внутримышечное введение может сопровождаться сильными болевыми реакциями, а также местными реакциями типа свищей, инфильтратов, воспалением периферических нервов. Хорошо известна нейротоксичность пенициллинов, приводящая в определенных дозах к изменениям ЭЭГ, судорогам или галлюцинациям, а также психотическим реакциям [Keller H., 1991]. Известна также способность БП провоцировать метаболический ацидоз [Черномордик А.Б., 1980] и вызывать гипотермию [Ostojic Z.S. et al., 1997]. Максимальная концентрация БП при системном введении в крови достигается на 30-60 мин [Woodbury D.M., 1980], держится на данном уровне около 3-4 часов, а затем плавно спадает. В силу своей полярности, молекула БП является гидрофильной, поэтому препарат хорошо растворим в воде, однако с трудом проходит через липидную фазу, поэтому БП обладает плохой проходимостью через гемато-энцефалический барьер [Woodbury D.M., 1980], однако характеризуются очень хорошим почечным клиренсом и поэтому быстро выводятся из организма почками. При введении пенициллинов в клиническое использование было

10

обнаружено, что они вызывают выраженный энцефалопатический и эпилептогенный эффекты [Доведова Е.Л., 1989; Батуева И.В. и др., 1992]. В опытах на животных БП проявлял себя как топический конвульсант, при аппликации которого в мозг продуцируется эпилептиформная активность мозга и судороги [Andersen P., 1983; McCandless D.W., Fine-Smith R.B., 1992]. При введении высоких системных доз БП в достаточном количестве проникает через гематоэнцефалический барьер и достигает в мозге концентраций, способных вызвать патогенную пароксизмальную импульсацию [Gerald M.C. et al., 1973; Faingold C.L., 1987]. Процесс обычно начинается с коры мозга, и постепенно распространяется на другие области ЦНС, обнаруживая тенденцию к синхронизации [Woodbury D.M., 1980]. После этого препарат начинает вызывать у животных видимые судороги, соответствующие синхронной импульсации. Препарат демонстрирует «развернутую» эпилептическую картину с мощной первой волной в первые два часа после аппликации (максимум порядка 90 мин), которая затем плавно падает, выявляя менее заметный второй максимум 250 мин. Обсуждается возможность БП вызывать явление киндлинга при хроническом введении [Araszkiewicz A., Rybakowsky J.K., 1994]. Начальные стадии судорог (миоклонические подергивания) после введения БП крысам внешне и по структуре ЭЭГ [Faingold C.L., 1987; Ostojic Z.S. et al., 1997] крайне напоминают малый судорожный припадок у людей, который сопровождается внезапным выключением сознания на несколько сек с сохранением мышечного тонуса и отсутствием падения, кратковременными судорожными подергиваниями отдельных мыщц лица или других частей тела [Бачериков Н.Е. и др., 1989]. Несмотря на широкую известность способности БП вызывать судороги [Tsuda A. et al., 1994], немного известно о связи его химической структуры с эпилептогенной активностью [Woodbury D.M., 1980]. В одних работах указывается на сходство молекулярных моделей молекулы БП и другого известного конвуль-

11

санта – пикротоксина [Smythies J.R., 1974]. В других подчеркивается важность бета-лактамного кольца молекулы, так как пенициллины, обработанные бета-лактамазой (разрывающей их бета-лактамное кольцо), оказались лишены эпилептогенности [Woodbury D.M., 1980; De Sarro A. et al., 1989]. Интересно, что бета-лактамные антибиотики, отличные от собственно пенициллинов (например, цефалоспорины, монобактамы и пенемы), в силу свого структурного сходства с последними, демонстрируют аналогичные антибиотические и нейрофизиологические эпилептогенные свойства [De Sarro A. et al., 1989; Neftel K.A. et al., 1992; Jin C.et al., 1999]. Отмечается также, что эпилептогенность пенициллинов не связана с антибиотическими свойствами препаратов [Woodbury D.M., 1980]. В то же время обнаружена зависимость эпилептогенной активности не только от бета-лактамного кольца, но и от структуры боковых радикалов в примыкающем к нему соседнем дигидротиазиновом (похожем на тиазолидиновое) кольце. Так, замена метильной группы в одном из цефалоспоринов (цефандоде) на сульфатную (цефоницид) привела к ослаблению активности последнего в 30 раз [De Sarro A. et al., 1989]. Аналогично, замена эфирной группы (цефотаксим) на водород (цефтизоксим) или замена циклических радикалов (цефтриаксон и цефтазидим) изменяла активность соединений соответственно в 2.5 и 1.5 раза. Большое значение для эпилептогенной активности БП имеет структура бокового радикала, соединенного эфирной связью с циклическим фрагментом в молекуле, так как удлинение этой цепи ослабляет его активность [De Sarro A. et al., 1989]. С учетом вышеизложенного, предполагается возможность существования нескольких механизмов (сайтов?) физиологической активности данных бета-лактамных соединений [De Sarro A. et al., 1995, 1996], подчеркивается структурное сходство некоторых из них с другими известными конвульсантами вроде коразола [De Sarro A. et al., 1989]. Как и пенициллины, последние известны прежде всего как ГАМК-тропные прапа-

12

раты [Tsuda A. et al., 1994; Walsh L.A. et al., 2001]. Важная роль ГАМК-ергической системы в механизмах эпилепсии хорошо известна [Ашмарин И.П. и др., 1992, 1996; Zacara G. et al., 1990; Upton N., 1994]. Введение данных конвульсантов и пенициллинов приводит к ингибированию ГАМК-ергического торможения и судорогам, тогда как вводимая ГАМК снижает эпилептогенную активность БП [Andersen P., 1983; Martin I.L., Dunn S.M.J., 2002]. Все вместе это подтверждает ГАМК-тропную гипотезу эпилептогенного действия БП. Кроме того, существуют эффекты БП на метаболизм глутамата, в частности - ингибирование им фермента глутамат-декарбоксилазы [Charrington C.B., Taberner P.V., 1977]. Наличие аналогичных эффектов (и в сопоставимых концентрациях) у аналога БП пеницилламина, лишенного бета-лактамного кольца, свидетельствует о том, что для реализации данного механизма это кольцо не требуется (там же). Данный механизм может быть еще одной возможностью объяснить эпилептогенные свойства БП. Интересно проанализировать, в каких дозах БП оказывает эпилептогенные эффекты у животных, и сопоставить, насколько эти дозы соотносятся с его терапевтическими концентрациями для людей. По некоторым данным, пороговой судорожной концентрацией БП в крови у мышей при 26oC было 6 мг/мл [Neftel K.A. et al., 1992]. Для сравнения, введение 1 ОСД БП у человека приводит к концентрации вещества в крови в дозе, равной примерно 40 ЕД/мл [Навашин С.М., Фомина И.П., 1982]. Это составляет около 24 мкг/мл, что в 250 раз меньше дозы в 6 мг/кг. Иными словами, судорожная концентрация у мыши наблюдалась в дозах, эквивалентных 250 ОСД для человека. Любопытен еще один расчет. При пересчете на массу тела, исходя из примерного обьема крови животного, доза в 6 мг/мл крови приблизительно составляет около 420 мг/кг веса. Известно, что концентрация БП в крови составляет лишь около 10% от фактически системно введенного препарата [Dollery C., 1991]. Таким образом, в описанном эксперименте реаль-

13

ной судорожной концентрацией должна быть в десять раз большая, крайне высокая системная доза порядка 4200 мг/кг. С другой стороны, если учесть ГАМК-ергическую гипотезу эпилептогенного профиля БП, то пенициллины ингибируют ГАМК-рецепторы уже в дозах порядка сотен микромолей [Tsuda A. et al., 1994]. По мнению данных авторов, подобные концентрации легко достигались у людей при системном введении при терапии массированными дозами препарата и, таким образом, могут объяснить побочные проконвульсантные эффекты БП у некоторых пациентов. Анализируя физиологические механизмы нейротропного действия БП, следует заметить, что его действие принципиально возможно на пре- и пост-синаптических уровнях [Haefely W., 1981, 1992]. Анализ возможных эффектов БП следует вести по нескольким основным направлениям. Во-первых, обсуждая известные сведения об эффектах на выделение различных медиаторов, а также анализируя возможные эффекты БП на различные рецепторы к медиаторам и эффекты препаратов в отношении свойств самих электровозбудимых мембран. In vitro показано на срезах коры мозга крыс, что БП усиливают выделение глутамата; препарат также приводил к незначительному повышению норадреналина и серотонина [De Boer T. et al., 1982]. Интересно, что препарат на начальных стадиях пре-эпилептического состояния приводил к противоположным эффектам при внутримышечном введении у кошек в работах [Van Gelber M.N. et al., 1983], обнаруживших, кроме того, увеличение уровня глутамата и ГАМК. Тем не менее, по мере перехода от пре- к собственно эпилептическому состоянию, этими авторами предполагаются обратные эффекты - увеличение содержания глутамата и угнетение тормозных ГАМК-ергических процессов. Известные противоречия существуют и в данных других авторов. Так, подчеркивается способность БП блокировать (К+)-индуцированное (Са++)-зависимое, но не (Са++)-независимое выделение ГАМК [Cutler R.W., Young J., 1979],

14

а также отсутствие эффектов БП на какие-либо другие медиаторные системы. Описанные результаты свидетельствуют о том, что пресинаптический эффект БП может быть как-то связан с его эпилептогенными свойствами [De Boer T. et al., 1982]. Наконец, способность БП нарушать работу нейротрансмиттерных систем прослеживается в работах [Доведова Е.Л., 1989], показавших снижение активности моноаминоксидазы типа А (но не Б) в синаптосомах нейронов уже через час после введения БП. В последнее время обсуждается возможность действия БП сразу по двум противоположным механизмам - на рецепторы глутамата и ГАМК [Батуева И.В. и др., 1992; Курчавый Г.Г. и др., 1997; Kurchavyi G.G. et al., 1997]. Так, описано устранение судорожных разрядов селективным антагонистом NMDA-рецепторов АФВ [Курчавый Г.Г. и др., 1997; Kurchavyi G.G. et al., 1997]. Эффекты БП (как и других конвульсантов - коразола, пикротоксина и бикукуллина) связываются с блокадой ими постсинаптического ГАМК-ергического торможения [Hill R.G. et al., 1976, Macdonald R.L., Barker J.L., 1997, 1998]. Теоретически оно могло осуществляться на уровне ГАМК-А рецепторов при действии либо на сам сайт связывания ГАМК, либо на другие сайты рецептора [Tsuda A. et al., 1994; Martin I.L., Dunn S.M.J., 2002]. Так, пенициллин (2-60 мМ) ингибируют связывание меченной ГАМК с ее специфическими мозговыми рецепторами [Antoniadis A. et al., 1980]. БП и ряд его производных обладают слабым сродством к бензодиазепиновому сайту на ГАМК-А-рецепторе, что наряду с ингибированием сайта связывания ГАМК на ГАМК-рецепторах, может быть еще одним из механизмов нейротоксичности пенициллинов [Antoniadis A. et al., 1980, Tsuda A. et al., 1994]. На способность БП взаимодействовать с бензодиазепиновым сайтом ГАМК-А-рецептора указывают данные [Ostojic Z.S. et al., 1997], описавшие БП-индуцированную гипотермию у крыс и ее отсутствие у животных, которым были введены некоторые бензодиазепины, а также [Shiraishi H. еt al., 1993], обнаружив-

15

шие снижение числа бензодиазепиновых рецепторов после введения БП, и блокирование данного эффекта при предварительном введении бензодиазепинового антагониста Ro-15-1788. Во многих электрофизиологических работах отмечается сходство эффектов БП и других ГАМК-активных препаратов - пикротоксина и коразола, а также способность БП взаимодействовать с пикротоксиновым сайтом на молекуле ГАМК-А-рецептора и блокировать связывание пикротоксина в высоких концентрациях [Gilman A.G. et al., 1985; Macdonald R.L., Olsen R.W., 1994], рис. 2. Наконец, обсуждается возможность существования других (несинаптических) механизмов нейротропности и эпилептогенности БП. Например, за счет блокады (К+)-проводимости [Heyer E.J. et al., 1982], путем непрямого повышения потенциал-зависимой возбудимости мембран [Курчавый Г.Г. и др., 1997; Kurchavyi G.G. et al., 1997]. Данные свидетельствуют о вероятности следующего механизма: введение БП - блокада ГАМКрецепторов - гиперактивация NMDA-рецепторов - повышение интенсивности разрядов интернейронов и синаптический залп на входах мотонейронов - дисбаланс концентрации калия - рост возбудимости мембран нейронов (возможно, за счет угнетения метаболического кальциевого насоса и блокады торможения за счет угнетения хлорного насоса) - создание условий для генерации потенциала действия. Основной механизм действия БП принято связывать с существованием специфического сайта связывания БП на молекуле ГАМК-Арецепторов [Macdonald R.L., Olsen R.W., 1994], расположенного в районе ионофора рецептора [Tsuda A. et al., 1994] глубоко внутри канала ближе к «цитозольной» стороне, рядом с сайтами связывания других конвульсантов – коразола, пикротоксина, бициклофосфатов и др. [Olsen R.W., Leeb-Lundberg F., 1980; Smith G.B., Olsen R.W., 1995; Behrends J.C., 2000; Baumann S.W. et al., 2001; Buhr A. et al., 2001; Horenstein J. et al., 2001], рис. 2. БП блокирует хлорный ток через ионофор за счет физического блока открытого канала по прин-

16

ципу «пробки», причем - в каждом из множества открытых микросостояний ионофора [Twyman R.E. et al., 1992; Martin I.L., Dunn S.M.J., 2002]. Описана также способность высоких концентраций БП порядка 2 мМ вызывать снижение длительности открытых состояний канала на ГАМК-А-рецепторе [Chow P., Mathers D., 1986]. Несмотря на то, что БП скорее всего блокирует открытый ионофор, моделирование указывает на зависимость ассоциации молекулы БП с рецептором от кинетического, конформационного состояния самого рецептора [Macdonald R.L., Olsen R.W., 1994]. Ассоциация с рецептором (а, следовательно, блокада токов через ионофор) тем сильнее, чем нестабильнее открытое кинетическое состояние рецептора. И наоборот, БП плохо «закреплялся» на ионофоре рецептора и легче диссоциировал, если последний находился в стабильном открытом состоянии [Twyman R.E. et al., 1992]. Рисунок 2. ГАМК-А-рецепторы и его сайты (по Базян А.С. и др., 1998) ГАМК

Ионофор Конвульсанты Бензодиазепины

17

ГАМК

Cl-

Бензодиазепины

Барбитураты Стероиды

Конвульсанты

Это позволяет предположить существование связывающего сайта для БП, аллостерически экспозируемого рецептором для молекулы БП в одних ситуациях и «прикрытого» для нее в других. Не исключено, что различные агенты могут модулировать данные состояния, влияя таким образом на процессы связывания БП со своим сайтом (причем - необязательно изменяя открытое/закрытое состояние самого ионофора). [Buhr S.A. et al., 2001] описывает аналогичную ситуацию для пикротоксина, еще одного ГАМК-тропного конвульсанта. Предложенная ими модель подразумевает несколько кинетических состояний хлорного ионофора: открытое, открытое но заблокированное пикротоксином, покоящееся (десенситизованное) и собственно закрытое. В присутствии пикротоксина октрытый канал может оказаться заблокирован пикротоксином, оставаясь «открытым», а затем перейти в закрытое состояние. Наконец, пикротоксин может связываться с закрытым каналом, способствуя его переходу в открытое но заблокированное пикротоксином состояние, а оттуда – в собственно открытое состояние.Если продолжить данное предположение, можно допустить существование эндогенных веществ, модулирующих доступность данного сайта для БП. В таком случае можно допустить, что в определенных физиологических ситуациях (например, при стрессе) происходит выделение данных веществ, что может повлиять на эффективность действия БП. Сам сайт

18

до сих пор не идентифицирован, однако логично ожидать, что молекула БП, заряженная негативно при физиологических рН, может взаимодействовать с положительно заряженными аминокислотами на ионофоре [Macdonald R.L., Olsen R.W., 1994]. То, что «пенициллиновый» сайт может не совпадать, но частично перекрывается с сайтами связывания других ГАМК-литических ионофорных конвульсантов, подтверждают недавние данные [Sugimoto M. et al., 2002] о том, что единичная мутация тирозина на фенилаланин в позиции (256) бета2-субьединицы ГАМК-А рецептора, снимающая ингибирующие действие пикротоксина, почти в 20 раз снижала аналогичное ГАМК-ингибирующее действие БП. Очень важен для конвульсантного действия валин в позиции (256) на альфа1-субъединице рецептора. Этот же фрагмент, а также аминокислоты в позициях 252-253 были указаны как важный сайт для взаимодействия ряда других конвульсантов [Buhr A. et al., 2001]. В других работах указывается значение наличия бета1-субъединицы рецептора для эффективного связывания пенициллинов с ионофором, а также подчеркивается необязательность наличия ГАМК-связывающего сайта для конвульсант-ионофорного взаимодействия [Krishek B.J. et al., 1996]. В силу относительно большого размера молекулы БП (M=350) вероятнее всего существование гидрофильного «кармана» в какой-либо поверхностной части ионофора на рецепторе [Twyman R.E. et al., 1992]. Отмечается также, что сайт связывания БП напоминает аналогичные сайты для связывания пикротоксина и коразола, однако не идентичен ни одному из них [Macdonald R.L., Olsen R.W., 1994]. При этом данные позволяют заключить, что для сайта достаточно одной молекулы БП, чтобы заблокировать ионофор. Скорее всего, имеется один сайт связывания БП на рецепторе [Twyman R.E. et al., 1992]. Возможно, что данный сайт способен связывать бета-лактамное кольцо БП и других конвульсантных пенициллинов, а также монобактамов и т.д., так как обработка пенициллиназой приводит к снижению их

19

судорожной активности [Gerald M.C. et al., 1973]. Там же приводятся сведения о приблизительной молярной концентрации, необходимой для оказания эпилептогенных (ГАМК-ингибиторных?) эффектов при внутримозговом введении эта доза составила порядка 1 мкМ для БП и примерно в 3-4 раза больше для его производных. К аналогичным результатам пришла группа [De Sarro А. et al., 1989], обнаружившая in vivo эффекты у 50% животных уже при дозах БП в диапазоне 0.033-0.33 мкМ, и [Charrington C.B., Taberner P.V., 1977] для доз 5080 нM. На дозу в 0.2 мМ БП in vitro указывают [Chow P., Mathers D., 1986] при описании снижения амплитуды ГАМК-активированных ответов культуры спинальных нейронов. Наконец, подавление хлорного тока при низкомолярных концентрациях БП (0.1-10 мМ) описано в работах [Tsuda A. et al., 1994], показавших также, что добавление ГАМК в концентрациях 0.01-10 мМ приводило к достоверным обратным эффектам. Механизм физиологического действия БП сводится к блокированию открытого канала - хлорного ионофора на ГАМК-рецепторе [Macdonald R.L., Olsen R.W., 1994, Tsuda A. et al., 1994]. Однако интересно то, что регистрируемое при этом гипервозбуждение нервных клеток и их спонтанные эпилептиформные разряды могут наблюдаться на фоне деполяризационного сдвига мембранного потенциала нейронов, нетипичного для действия других конвульсантов вроде стрихнина, пикротоксина и бикукуллина [Батуева И.В. и др., 1992]. Отмечается также зависимость данных эффектов от самого потенциала: так, клетки с низким мембранным потенциалом были гораздо более чувствительны к деполяризационным эффектам БП, а клетки с высокими мембранными потенциалами порядка 80 мВ - нечувствительны вообще (там же). Последнее позволяет заключить, что БП проявляет слабые ГАМК-антагонистические свойства только в клетках с высоким мембранным потенциалом, тогда как вызывает лишь деполяризационный сдвиг в клетках с меньшими мембранными

20

потенциалами. Обсуждается роль несинаптических механизмов и эффектов на токи кальция в генерации деполяризационного сдвига [Faingold C.L., 1987]. В порядке предположения можно допустить, что обсуждаемый выше механизм экспозиции сайта связывания для БП может зависеть не только от действия гипотетических химических факторов, но может быть вызван конформационными изменениями в ГАМК-рецепторе, связанными с состоянием мембран. Этим также можно объяснить зависимость эффектов БП от уровня мембранного потенциала, описанную выше. Следует признать, что пенициллины, вероятнее всего, даже в высоких дозах не влияют прямым образом на сами мембраны нейронов [Krnjevic K. et al., 1977]. Так, БП не изменял сопротивления мембран, не уменьшал порога вызова антидромных потенциалов действия и не влиял на порог генерации потенциала действия при трансмембранной деполяризации [Батуева И.В. и др., 1992]. Любопытно, однако, что в бескальциевых растворах БП вызывал слабую деполяризацию. Это может означать все же слабые эффекты БП на постсинаптическую мембрану. Отсутствие выраженных эффектов на мембраны у БП, возможно, связано с большой липофобностью его молекулы. Применение пенициллинов в малых дозах практически не приводит к побочным эффектам, однако введение массивных доз в силу нейротропности препаратов часто вызывает побочные эффекты в отношении ЦНС. Помимо эпилептогенности, эффекты БП включают психотические реакции, общее раздражение ЦНС [Черномордик А.Б., 1980; Jacobson S., 1968], тревожность и фобии [Araszkiewicz A., Rybakowsky J.K., 1994; Ilechukwu S.T., 1990]. Психиатрический профиль после инъекции препарата пенициллинов подробно описан [Ilechukwu S.T., 1990] следующим образом. Реакция развивалась в течение мин и проходила через стадии тревожности и сильного страха (включая боязни смерти), слуховых, двигательных, зрительных и вкусовых галлюцинаций,

21

иллюзий. На более поздних стадиях у пациентов возникали проблемы с восприятием и ощущением собственного тела, иногда даже появлялись легкие судороги). Примечательно, что подобные ощущения со временем были способны перерасти в хронические неврозы наподобие синдрома пост-травматического стресса [Davies D.M., 1991]. Интересные эффекты от введения прокаиновой соли пенициллина описаны [Jacobson S., 1968; Araszkievicz A., Rybakowski J.K., 1994, 1997]. В течение 30 сек после введения пациент почувствовал себя «необычным образом», и, описывая свои ощущения, констатировал наличие тревожности, а также розово-красные галлюцинации. Несколько позже он почувствовал себя так, словно он «собирается умереть», все время ощущая себя сторонним наблюдателем, однако подобное «острое» состояние постепенно прошло в течение 30 мин. Впоследствие пациент особо отметил также тот факт, что перед ним как-бы прокручивались различные события и сцены из его собственной жизни, что может (правда, необязательно) означать какие-то эффекты препарата на память. Интересно, что данный анксиогенный профиль БП напоминает психотропное действие другого ГАМК-ингибирующего препарата коразола, описаное в ранних работах [von Meduna L.S., Friedman E., 1939; Good R., Glas C.B., 1940; Rodin E., 1958]. Здесь особенно важно подчеркнуть два аспекта. Во-первых, в сообщениях почти всех авторов описывается одинаковая клиническая картина - усиление тревожности и наличие сильных психотических и фобических реакций при действии БП. Во-вторых, аналогичные психофизиологические реакции показаны для многих других видов пенициллинов, например, амоксициллина или ампициллина [Hoigne R. et al., 1984; Davies D.M., 1991], иллюстрируя тем самым однозначность трактовки таких сведений применительно к пенициллинам и родственным соединениям. Наконец, обращает внимание сходство описанной пенициллин-спровоцированной симптоматики с клинической картиной, наблюдаемой при эпилепсии и предэ-

22

пилептических состояниях (в том числе повышенная возбудимость, сильная тревожность и сенсопсихические расстройства). Можно допустить, что данное сходство может указывать на общность патогенетических механизмов при действии высоких субконвульсантных доз БП и нефармакологических эпилептических состояниях больных-эпилептиков. Поэтому ожидать подобный анксио-активный эффект у препарата-конвульсанта представляется вполне обоснованным [Nutt D.J., 1990, 1991]. В то же время приходится признать, что данная область в случае БП является весьма малоизученной. Поэтому дальнейшее изучение профиля нейротропного действия БП в различных экспериментальных поведенческих моделях стресса у животных представляется весьма интересным и актуальным. ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ СТРЕССА Являются ли какие-то события стрессорными, зависит от природы события, ресурсов и способности к защите, позволяющих справляться со стрессом [Судаков К.В., 1998; Хананашвили М.М., 1998]. Воздействие стресса на организм носит целостный характер сразу на многие, если не все, его физиологические системы [Айрапетянц М.Г., Вейн А.М.,1992]. Поведение человека и животных также является крайне чувствительным к действию стресса, и при анализе воздействия стресса на поведение животных или человека особое внимание следует уделить изучению подобных отрицательных эмоций. Наиболее часто встречающиеся проявления последних - состояния страха или тревожности, к которым при переходе в хроническую стадию добавляются признаки депрессивности. При всем многообразии этих состояний именно тревожность является наиболее часто встречающимся спутником эмоционального стресса, своего рода “первым эшелоном” реакций ЦНС на стрессор, биологический смысл которых заключается в мобилизации резервов организма для

23

избежания угрозы. Быть может поэтому, формулируя классическую концепцию биологического стресса, Г.Селье (1968) использовал психиатрический термин “тревога” для описания первой стадии универсальных физиологических изменений в организме, вызванных появлением биологического стрессора в любом его виде. Стрессорный ульцерогенез. Классической моделью стресса является язвообразование слизистых желудка [Селье Г., 1982], используемое как при изучении стресс-тропного действия препаратов с заранее известными свойствами, так и для выявления новых классов стресс-тропных веществ [Overmier J.B. et al., 1997]. Патогенез СОЖ традиционно рассматривается как результат дисбаланса между защитными и агрессивными факторами при непосредственном участии нейрогуморальных механизмов [Барановский Ю.А., 1991; Циммерман Я.С., 1992; Ашмарин И.П. и др., 1992, 1996; Филаретова Л.П. и др., 1995, 1996; Нижевич А.А. и др., 1996; Овсянников В.И., 1996; Brooks F.P., 1985]. Агрессивные факторы СОЖ - низкие рН, пепсин и лизосомные ферменты - считаются основными факторами патогенеза СОЖ при стрессе [Ашмарин И.П. и др., 1992]. Снижение кровотока в СОЖ и накопление там продуктов окисления и повреждающих ткани свободных радикалов также приводит к поражению СОЖ и развитию ульцерогенеза. Обсуждается важная роль бактериальной микрофлоры в патогенезе СОЖ [Зайцева К.К., 1991; Преображенский В.Н. и др., 1991; Зверков И.В. и др., 1996; Goodwin C.S. et al., 1986]. Важна также и роль психофизиологических факторов в патогенезе СОЖ [Березин Ф. и др., 1993], позволяя рассматривать язвенную болезнь в качестве классического психосоматоза и выдвигая психофизиологическую дезадаптацию на первое место среди причин ее возникновения. При обострениях болезни усиливалась чувствительность пациентов к фрустрирующим воздействиям и «негативная» фиксация [Березин Ф. и др., 1993]. Для больных язвенной болезнью хара-

24

ктерны повышенная тревожность, депрессивные реакции и стремление к ограничению контактов с окружающими [Березин Ф. и др., 1993]. Таким образом, следует особо подчеркнуть двухстороннюю связь патогенеза СОЖ с социально-психологическими и психическими факторами. С одной стороны, это позволит при анализе результатов наших экспериментов провести параллели между эффектами препарата на ульцерогенез и его влиянием на поведение при стрессе. С другой стороны, связь патологии СОЖ со стрессом справедливо распространить не только на психический, но и на любой другой вид стресса вообще. Так, появление язвочек ЖКТ, является обьективным фактором стресса и одной из стандартных реакций на стресс компонентой «триады» общего адаптационного синдрома [Селье Г., 1982]. Отмечается безотносительность данной реакции к разновидностям стресса - физической, психо-эмоциональной и т.д. Это указывает на универсальный характер ульцерогенеза при стрессе, и позволяет рассматривать его как удобный маркер биологического стресса и его эффективную экспериментальную модель [Overmier J.B. et al., 1997]. Поведенческие модели стресса. Воздействие стресса на организм носит целостный характер сразу на многие его физиологические системы, включая поведение [Селье Г., 1982; Судаков К.В., 1987; Каплан Г.И., Сэдок Б.Дж., 1994]. Поэтому особое внимание следует уделить изучению эмоционального поведения животных в различных экспериментальных моделях стресса [Буреш Я. и др., 1991; Крупина Н.А. и др., 1996; Dunn A., Berridge K., 1987; Griebel G. et al., 1993, 1996; Willner P., 1993, 1995]. Наиболее часто встречающиеся проявления стресса в поведении - состояния страха или тревожности, к которым при переходе в хроническую стадию добавляется депрессивно-подобные состояния [Бачериков Н.Е. и др., 1989, Андрющенко А.В., 1995; Gray J., 1974; Cassano G.B. et al., 1992]. При этом именно тревожность является наиболее часто встречающимся спутником эмоционального стресса, своего рода “первым

25

эшелоном” реакций ЦНС на стрессор, биологический смысл которых заключается в мобилизации резервов организма для избежания угрозы [Каплан Г.И., Сэдок Б.Дж., 1994; Ковалев Ю.В., 1995; Zacharko R.M., Anisman H., 1989]. Тревожность - это эмоциональное состояние, характеризующееся ощущением ожидания грозящей опасности [Салтыков А.Б. и др., 1996; Фрейд, 1991; Gray J., 1974; Сosta E., 1985]. Оно часто встречается в норме и патологии, и тесно взаимосвязано с биологическим стрессом [Бачериков Н.Е. и др., 1989; Каплан Г.И., Сэдок Б.Дж., 1994; McNaughton N., 1993; File S.E., 1996; Flaherty C.F. et al., 1998]. В психиатрии тревога входит в целый кластер различных осознанных/неосознанных форм тревожностных реакций, включая панические атаки, фобии, пост-травматический стресс, депрессии и т.д. [Аведисова А.С. и др., 1995; Ковалев Ю.В., 1995; Coupland N.J., Nutt D.J., 1995]. Следует, однако, дифференцировать собственно тревожность от близкого ей состояния страха, при котором ощущение направлено на конкретную опасность или причину, а не представляет собой ожидание неконкретной, «диффузной», безобъектной угрозы [Чайченко Г.М., 2001; McNaughton N., 1993]. Последнее подчеркивает ценность тревоги как показателя «готовности страха» [Фрейд, 1991] или реакции на «внутреннюю, смутную, противоречивую опасность» [McNaughton N., 1993; Каплан Г.И., Сэдок Б.Дж., 1994]. Отмечают также важную роль когнитивных механизмов (особенно памяти) в формирования тревожности [Салтыков А.Б. и др., 1996; File S.E., 1993, 1995; Kalueff A.V., Nutt D.J., 1997]. Тревожность - это одна из реакций на стресс вообще, представляющая собой его «эмоционально окрашенную перцепцию» [Вилюнас В.К., 1990; Селье Г., 1982; Чайлахян Л.М., 1992]. При изучении тревожности у животных невозможно непосредственно оценить и измерить ее путем опроса, как это делается на людях, и для этого используют модели [Сosta E., 1985]. В нейроэтологии тревожности используются тесты-модели двух категорий [Maier S.F., 1993]. В тестах

26

первой группы провоцируется конфликт, обычно - поощряя и наказывая один и тот же поведенческий ответ, при этом степень ингибирования условнорефлекторного ответа отражает уровень тревожности животного [Leonard B.E., 1989]. Второй тип тестов (большая часть их которых использована в данной работе) основан на анализе спонтанного поведения при помещении животных в незнакомую для них среду [Griebel G. et al., 1993, 1996; Salum et al., 2000]. Ожидание потенциальной опасности и новизна/неопределенность окружающей среды в этих тестах порождают тревожность. При этом степень ингибирования поведения (прежде всего, исследовательской активности как самостоятельной потребности в получении информации о новых стимулах с невыясненным прагматическим значением [Симонов П.В., 1993]) будет объективно отражать уровень тревожности [Gray J., 1974; Maier S.F., 1993; Salum et al., 2000]. Данная активность будет максимальна в самом начале (соответствуя внешне программе случайного поиска), однако будет плавно снижаться по мере привыкания животного к новым условиям в ходе его ориентировочно-исследовательской деятельности и накопления первичной информации [Салтыков А.Б. и др., 1996]. В данной ситуации в поведении животного сталкиваются две противоположные тенденции - боязнь нового и тяга к нему, а тревожные тесты строятся на балансе двух данных мотиваций. Более того, некоторые из тестов используют не просто новизну окружающей среды, а делают ее более аверсивной для животного - например, используя высоту, открытые и освещенные пространства и т.д. [File S.E., 1995, 1996, 2001]. При этом возникающая аверсия условий теста вызывает у людей и животных страх и тревожность, которые могут быть скорректированы введением анксиолитиков [Stanford S.C., 1996]. Важно отметить, что в данных тестах для выявления тревожности в том или ином виде используются стрессоры и анализируется реакция на них. Отмечается, однако, мягкий характер таких стрессорных воздейст-

27

вий, отличный, например, от возможных более жестких условий (которые в ряде случаев полезны при моделировании депрессивных состояний) [Stanford S.C., 1996]. В частности, на этом основаны такие поведенческие тесты как КПЛ, норковая камера, вертикальный экран, черно-белая камера и другие, о которых пойдет речь ниже. Нейрофизиология тревожности хорошо изучена и основана на «анксиогенности» возбуждающих процессов [Haefely W., 1981, 1992; Kalueff A.V., Nutt D.J., 1997; Nutt D.J., 1990, 1991]. Последние находятся под контролем корковых и лимбических механизмов и регулируются рядом центральных возбуждающих медиаторов и других эндогенных лигандов. Типичным проявлением этих процессов, наряду с тревожностью, является возбуждение ЦНС. Его поведенческими маркерами служат усиление общей двигательной активности, повышение раздражительности и тревожности, а на более поздних стадиях панические или судорожные состояния [Рейковский Я., 1979]. Ряд ингибиторных медиаторов (ГАМК, глицин и т.д.) и их агонисты (например, бензодиазепины) способны тормозить возбуждение, что в ряде случаев имеет большое адаптивное значение [Андронати С.А. и др., 1988; Haefely W., 1981, 1992; McNaughton N., 1993; Mihic S.L. et al., 1995], так как выражается в снижении тревожности, агрессивности и нормализации двигательной активности. [Gray J.A. et al., 1984] в серии работ экспериментально подтвердили «ГАМК-ергическую» гипотезу механизмов анксиотропного действия целого ряда агентов. Таким образом, экзогенные вещества, сдвигающие баланс между центральными процессами возбуждения и торможения, способны оказывать выраженные поведенческие реакции в отношении тревожности [Haefely W., 1981, 1992; Nutt D.J., 1990, 1991]. Факторы внешней среды - боль, шум, яркий свет, присутствие хищника - также действуют на поведение, оказывая «анксиогенное» ингибирующее действие на исследовательское поведение, но активируют возбуж-

28

дение ЦНС и связанную с ним локомоцию [File S.E., 1995, 2001; Salum et al., 2000]. К анксиогенным эффектам приводит также длительная изоляция или социальный опыт поражений, а также пребывание животного в незнакомой для него среде, демонстрируя уже обсуждавшуюся тревожность, вызванную новизной. Ранее отмечалось, что повышенная двигательная активность, как и тревожность, на физиологическом уровне обусловлено гиперактивацией центральных процессов возбуждения, тогда как снижение тревоги (усиление исследовательского поведения) наблюдается при преобладании противоположных, тормозных процессов [Рейковский Я., 1979; Haefely W., 1981, 1992]. И хотя можно спорить о том, насколько весом вклад “общей” активности в реализации более “специфического” исследовательского поведения, можно говорить о том, что между двигательной и исследовательской активностью в норме существуют скорее реципрокные (чем синергичные) отношения, часто выявляемые при действии различных веществ [Пошивалов В.П., 1997]. Неудивительно поэтому, что ряд анксиолитиков снижает локомоцию и оказывает седативное действие на поведение. С другой стороны, ряд психостимулянтов обнаруживает анксиогенные эффекты в отношении исследовательского поведения [McNaughton N., 1993]. Суммируя, следует ожидать преимущественно противоположные эффекты препаратов на исследовательское поведение и локомоцию животных, что позволило ряду авторов рассматривать тревожность как “разновидность общего arousal” [Levitt E., 1976]. Однако далеко не всегда так происходит на самом деле [Петров В.И. и др., 1996; Jackson H.C., Nutt D.J., 1992] и поэтому дальнейший комплексный анализ окажется весьма ценным с этой точки зрения [Пошивалов В.П., 1997]. Нам было интересно, в частности, какие эффекты будет демонстрировать тестируемый в работе препарат БП? Правомочность использования модели какой-либо психопатологии (ее валидность), в том числе и тревожности, основана на выполнении ряда крите-

29

риев [Leonard B.E., 1989; Coupland N.J., Nutt D.J., 1995]: сходная симптоматика, напоминающая клинические проявления патологии у людей; сходная этиология; сходный нейро-физиологический субстрат; специфичность и чувствительность к действию специфических препаратов. Соответственно, существующие модели тревожности должны удовлетворять данным требования [Stanford S.C., 1996]. На этом основаны такие поведенческие тесты как крестообразный приподнятый лабиринт, норковая камера, вертикальный экран, черно-белая камера и т.д. [Лапин И.П. и др., 1995; Лапин И.П., 1999; Hilakivi et al., 1989; Dishman et al., 1996; Dishman R.K., 1997; Belzung C., Griebel G., 2001; Calatayud F., Belzung C., 2001; File S.E., 2001]. Следует подчеркнуть необходимость применения в целях эффективного скриннинга активности препаратов как можно большего количества разноплановых поведенческих моделей стресса, поскольку различные тесты могут быть по-разному чувствительны к тем или иным вводимым дозам [Лапин И.П. и др., 1995], а моделируемая тревожность – носить гетерогенный характер [Fernandes C. et al., 1999; Aguilar R. et al., 2002]. Тест Порсолта. Поведенческий тест «отчаяния», или вынужденного плавания [Porsolt R.D. et al., 1977, 1993] получил широкое применение при анализе поведенческих эффектов препаратов [Greenshaw A.J. et al., 1988, Bruhwyler J. et al., 1995; Willner P., 1993, 1995]. Тест основан на наблюдении, что крысы, «вынужденные длительно плавать в ситуации, если возможность выбраться из воды отсутствует, после начального периода активных попыток, обычно резко снижают свою активность до минимума, необходимого только для удержания головы на поверхности» [Porsolt R.D. et al., 1977, 1993]. При этом стадия иммобильности, или «зависания» интерпретируется как проявление «отчаяния», латентность и суммарная длительность которого могут быть чувствительны к действию введенных препаратов [Willner P., 1993, 1995]. Так,

30

практически все использованные антидепрессанты приводили к снижению иммобильности у экспериментальных животных [Porsolt R.D. et al., 1977, 1993]. Позднее аналогичные эффекты были показаны в этом тесте для многих других психотропных препаратов, однако отмечается, что нейролептики и анксиолитики зачастую оказывались неэффективными, хотя и не всегда [Greenshaw A.J. et al., 1988; Nagatani T. et al., 1987]. В соответствии с оригинальной интерпретацией, стрессорные воздействия (например, предварительная иммобилизация) приводят к усилению «отчаяния» в тесте, снижая плавательную активность животных [Stone E.A. et al., 1995]. Интересно заметить, что отсутствие в модели возможности избежать опасность соответствует общепринятой классификации стрессовых состояний, отражая именно состояние депрессии, нежели тревожности, страха, паники и т.д. (где возможность избегания предусматривается) [McNaughton N., 1993]. Отмечается, однако, объективное перекрывание в механизмах и многих симптомах двух данных состояний [Kufler D.J., 1991; Cassano G.B. et al., 1992]. Последнее, наряду с указанными выше данными о неэффективности анксиолитиков, подтверждает ценность данного теста (особенно при умеренных температурах воды) именно как экспериментальной модели депрессии [Stone E.A. et al., 1995], необязательно столь же эффективно применимой при исследовани ряда других подобных состояний, например, тревожности (для выявления которой обычно используют более мягкие стрессоры типа новизны [Stanford S.C., 1996]). Отличную точку зрения имеют [Bruner C.A., Vargas I., 1994], считающие тест при очень низких или очень высоких температурах воды отражающим скорее сильный страх, чем отчаяние или депрессию. Наконец, показана положительная корреляция между снижением уровня депрессивности в данном тесте и некоторыми показателями пониженной тревожности в других традиционных моделях (например, повышением числа стоек в открытом поле) [Саркисова К.Ю. и др., 1996].

31

Норковая камера. Данная модель, предложенная в 1968 году Бусьером и Симоном, была обоснована и применена для исследования тревожного поведения [File S.E., Wardill M., 1975]. Являясь чрезвычайно чувствительной к действию нейротропных препаратов [Kelley A.E. et al., 1989], тест представляет собой обычную камеру с отверстиями-«норками» в полу, достаточно большими, чтобы животные могли просунуть в них мордочки [File S.E., 2001]. К набору стандартных этологических показателей - локомоции, стоек, груминга, иммобильности, уринации, дефекации и др. - добавляется специфическая норковая активность [Вартанян Г.А., Петров Е.С., 1989]. О ее интенсивности судят по количеству заглядываний в отверстия, а также (в некоторых исследованиях) - по среднему времени заглядывания в норку и общему времени исследования норок как функции первых двух [Harro J., 1993; Nadal R.A. et al., 1993; Aguilar R. et al., 2002]. Обычно тест длится 5-10 мин. Следует указать, что лабораторные грызуны являются норными животными и обследование ими отверстий в полу можно рассматривать как проявление внимания к конкретному, имеющему биологическое значение обьекту, носящего характер исследовательского поведения [Ашмарин И.П., Титов С.А., 1991; Jackson H.C., Nutt D.J., 1992]. Обследование норок достоверно выше при первом предъявлении, и укорачивается при последующих [File S.E., 2001]. Показано стиммулирующее влияние на норковую активность у ряда анксиолитиков и угнетающее – для анксиогенных препаратов или влияний [Nadal R.A. et al., 1993; File S.E., 2001]. Более того, весьма важная для любого «кандидата» в показатели тревожности чувствительность к фактору новизны также была продемонстрирована для норковой активности в целом ряде экспериментов [Kelley A.E. et al., 1989; Aguilar R. et al., 2002]. Примечательно, что двигательная активность при этом оставалась неизменной. Тем не менее, ряд результатов, полученных в данном тесте указываеют на необходимость дальнейшего исследования возможностей

32

и валидности данной модели [Jackson H.C., Nutt D.J., 1992]. Применяя факторный анализ к спонтанному поведению крыс в различных модификациях норковой камеры, было показано, что a) локомоторная активность (количество пересеченных квадратиков) и б) исследовательское поведение [стойки+норковая активность] укладываются в два независимых фактора [Harro J., 1993; Paulus M.P., Geyer M.A., 1993]. В аналогичных исследованиях других групп [Fernandes C., File S.E., 1996; File S.E., Fernandes C., 1994] стойки, однако, были отнесены к двигательной активности, а в более поздних работах – к самостоятельной, третьей категории поведения [File S.E., 2001]. В любом случае, следует иметь в виду возможность нежелательного перекрывания двух показателей исследовательского поведения - стоек и норковой активности [Harro J., 1993]. В норковой камере встречается две разновидности стоек - с упором на стенки и без [Nadal R.A. et al., 1993], причем последние случаются гораздо реже. [Cruzio W.E., 2001] также считает упор о стенку этологическим индексом, укладывающимся в фактор «исследовательская активность». Несмотря на это, оба вида стоек демонстрируют похожую динамику в экспериментах, и по-видимому могут использоваться отдельно или в сумме для анализа поведения в тесте. Психостимуляторы и препараты с родственным профилем увеличивают число стоек, однако в манере, сходной с изменением локомоции. Последнее, вероятно, может указывать на «локомоторную», нежели «тревожную» нагрузку данного показателя в норковой камере [Саркисова К.Ю. и др., 1996]. Вертикальный экран-сетка - тест, принцип которого основан на помещении животного на наклонный или вертикальный экран, на котором животное пытается удержаться, противодействуя силе тяжести. При этом регистрируется длительность удержания животного на экране, а в случае вращающегося экрана - угол, при котором животное падает вниз. Показательно также число (процент) животных в группе, способных удержаться на сетке до конца тес-

33

тирования [Lippa A.S. et al., 1979]. Несмотря на известную «механистичность» теста, следует отметить, что он оказался вполне чувствителен к действию психотропных препаратов. Так, показано, что ряд препаратов, в том числе анксиолитики, обладает способностью увеличивать продолжительность удержания на экране [Lippa A.S. et al., 1979]. Однако, несмотря на свою простоту, негативным аспектом теста можно назвать его чрезвычайную «физичность» (которая, как и в тесте Порсолта, фактически ставит модель в категорию тестов на физическую выносливость - так, например [Nagatani T. et al., 1987] даже используют экран для выяснения миорелаксантных свойств ГАМК-активных препаратов). Это, разумеется, далеко не всегда применимо при изучении тонких поведенческих механизмов, особенно реакций на тревожность. Крестообразный приподнятый лабиринт (КПЛ). Получивший широкое применение [Dawson G.R., Tricklebank M.D., 1995; File S.E., 1993, 1995, 2001; Belzung C., Griebel G., 2001], этот тест считается одной из наиболее адекватных, этологически «богатых» и чувствительных моделей тревожности [Rodgers R.J., Cole J.C., 1993, 1994; Rodgers R.J. et al., 1994, 1995, 1996, Rodgers R.J., Shepherd J.K., 1993; Griebel et al., 1996]. [Handley S.L., Mittani S., 1984] было предложено использовать в качестве модели крестообразный приподнятый над уровнем пола лабиринт, два из четырех рукавов которого по периметру имеют стенки («закрытые рукава»), а остальные - нет («открытые рукава»). Валидность данного теста была обоснована [File S.E., 1993, 1995; Rodgers R.J. et al., 1994]. Тест является чувствительным к поведенческим манипуляциям, усиливающим стресс животных, а также к традиционным анксиолитикам и анксиогенам [Rodgers R.J., Shepherd J.K., 1993]. Правомерность использования теста в качестве модели тревожности оправдывается тем, что он основан на тех же природных стимулах, которые способны вызвать тревожность и у людей [Fernandes C. et al., 1999; Aguilar R. et al., 2002]. В КПЛ используется ба-

34

ланс между естественным страхом животных перед открытым пространством, высотой, новизной (неофобия) и одновременным стремлением исследовать эти незнакомые условия [Dawson G.R., Tricklebank M.D., 1995; Rodgers R.J., Cole J.C., 1993, 1994; Rodgers R.J. et al., 1994, 1995, 1996; Espejo E.F., 1997; Fernandes C. et al., 1999; Aguilar R. et al., 2002]. Аверсивность открытых пространств может также быть связана с тигмотаксисом – природным стремлением животных находиться в «укрытии» вблизи вертикальных поверхностей, какими являются бортики закрытых рукавов КПЛ [Salum et al., 2000]. Различные препараты (как и некоторые предварительные поведенческие манипуляции) способны сдвигать баланс пребывания животного в «открытых»-«закрытых» рукавах в ту или иную сторону, демонстрируя соответственно анксиолитические/генные эффекты [Greenshaw A.J. et al., 1988; Espejo E.F., 1997; Rodgers R.J., Shepherd J.K., 1993; File S.E., 2001]. Однако незначительно изменяющаяся активность животных при повторении опыта на следующие дни позволила заключить, что страх перед новизной не является детерминирующим в данной модели [Sanger D.J., 1991]. Более того, попытки уменьшить высоту КПЛ сами по себе не вызывали ожидаемого снижения исследовательской активности у животных, что привело ряд авторов к выводу, что боязнь высоты также не является (в отличие от боязни открытых пространств) доминирующим фактором в поведении животных в лабиринте [Dawson G.R., Tricklebank M.D., 1995; File S.E., 1993, 1995]. Открытая центральная платформа не вызывает, несмотря на ожидания, сильного избегания у животных, которые часто проводят на ней весьма существенную часть времени или оказывают равное предпочтение по сравнению с закрытыми рукавами [Rodgers R.J., Cole J.C., 1994; Rodgers R.J. et al., 1994, 1996]. Особое внимание было уделено изучению временной динамики поведения в КПЛ. [File S.E., 1993, 1995], пытаясь выяснить, какие из внешних факторов в КПЛ определяют поведение животного в течение первых и

35

вторых 5 мин, пришла к выводу, что в первые 5 мин пребывания в КПЛ животные демонстрируют повышенную тревожность, связанную с боязнью открытого пространства и высоты. Если эксперимент прервать на этой стадии, то животные будут помнить состояние испуга даже к концу третьей недели, демонстрируя при повторном тестировании повышенную тревожность. Тем не менее, если бы тест был изначально продлен до 10 мин, за вторые 5 мин животные выработают привыкание и, будучи менее стрессированы, станут более активно исследовать КПЛ. Запомнив именно это состояние, они и при повторном тестировании будут демонстрировать пониженную тревожность [File S.E., 1993, 1995]. Несмотря на ценность этих наблюдений, обычно тест редко применяется в его 10-минутном варианте. К основным традиционным показателям уровня тревожности относят число выходов и длительность пребывания животных в открытых рукавах («открытые» выходы) [Dourish C.T. et al., 1995; Harro J., 1993; File S.E., 2001], а также соотношение количества выходов в открытые:закрытые рукава [Rodgers R.J., Cole J.C., 1993, 1994; Rodgers R.J. et al., 1994, 1995, 1996]. Во избежание артефактов имеет смысл также использовать процентные соотношения количества и/или времени пребывания открытых выходов к общему числу выходов [File S.E., Fernandes C., 1994; Hogg S., 1996; File S.E., 2001]. Первоначально считалось, что общее количество выходов (и, возможно, количество закрытых выходов) отражают важный поведенческий показатель - уровень общей двигательной активности животных [File S.E., 1993, 1995; Harro J., 1993; Hogg S., 1996]. C правомерностью использования общего числа выходов как показателя локомоции, однако, не согласны другие авторы [Rodgers R.J., Cole J.C., 1993, 1994; Rodgers R.J. et al., 1994, 1995, 1996; Salum C. et al., 2000], поскольку было показана зависимость уровня обшего числа выходов от уровня тревожности. [Salum C. et al., 2000] подчеркивают важность числа закрытых

36

выходов для оценки уровня локомоции животных в данном тесте и независимость данного параметра от уровня тревоги. Принято считать, что в КПЛ анксиолитики увеличивают показатели уровня тревожности, однако могут угнетать двигательную активность. При этом анксиогены приводят к обратным эффектам [Rodgers R.J., Cole J.C., 1993, 1994; Rodgers R.J. et al., 1994, 1995, 1996]. Ряд других классов психотропных препаратов также может оказать эффекты на данные формы поведения [McNaughton N., 1993]. Интересно заметить, что некоторые авторы относят выходы в закрытые рукава к независимому фактору «принятия решения», а упомянутые выше латентности выходов, по [Rodgers R.J., Cole J.C., 1993, 1994; Rodgers R.J. et al., 1994, 1995, 1996], могут также содержать полезную информацию. Например, отражать исходный уровень готовности животных исследовать КПЛ. Кроме того, ряд авторов настаивает на необходимости использовать для оценки уровня тревожности дополнительные «этологические» параметры, в частности, латентность выходов в рукава лабиринта, количество стоек и переходов через центральную платформу (часто с регистрацией общего времени, проведенного на этой платформе) [Dourish C.T. et al., 1995; Harro J., 1993; Rodgers R.J., Shepherd J.K., 1993; Rodgers R.J., Cole J.C., 1993, 1994; Rodgers R.J. et al., 1994, 1995, 1996; Espejo E.F., 1997; Aguilar R. et al., 2002]. Последний паттерн, однако, при факторном анализе обнаруживает независимость от поведения в рукавах КПЛ, и может считаться независимым показателем [Hogg S., 1996]. [Fernandes C., File S.E., 1996; File S.E., 2001] предполагают, что недооцениваемое зачастую поведение на центральной площадке лабиринта может носить важный интегральный характер и «иметь отношение к поведению при оценке риска и/или процессах принятия решения». О важности поведения на центральной платформе для анализа поведения в КПЛ указывается также в других работах [Rodgers R.J., Cole J.C., 1993, 1994; Rodgers R.J. et

37

al., 1994, 1995, 1996]. Интересен и тот факт, что животные, несмотря на открытость (а, следовательно, аверсивность) центральной платформы, проводят на ней значительную часть времени или оказывают равное предпочтение наряду с гораздо более «защищенными» закрытыми рукавами. Это наблюдение также подтверждает важность такой разновидности поведения, и, возможно, ее отношение к процессам «принятия решения». Отдельно следует рассмотреть значение стоек в КПЛ, так как в отношении этого важного показателя существуют различные мнения. По одной классификации [Rodgers R.J., Cole J.C., 1993, 1994; Rodgers R.J. et al., 1994, 1995, 1996], стойки относят не к показателям оценки риска, а к «этологическим» параметрам, которые обычно используют в дополнение к описанным выше традиционным индексам тревожности. Cтрессорные воздействия на животных перед тестированием в КПЛ усиливают стойки, тогда как анксиолитики (например, диазепам, флесиноксан и т.д.) снижают их число [Rodgers R.J., Shepherd J.K., 1993; Rodgers R.J., Cole J.C., 1993, 1994; Rodgers R.J. et al., 1994, 1996]. Интересно также, что в некоторых работах стойки были отнесены к фактору, общему с показателями двигательной активности [Fernandes C., File S.E., 1996], а в других работах обсуждается возможный исследовательский характер стоек как вертикальной эксплорации и связь стоек с фактором «смещенная активность» [Espejo E.F., 1997]. Иногда весьма ценную информацию может дать регистрация в КПЛ неспецифического поведения, куда относится груминг (социально значимое замещенное поведение), иммобильность («затаивание», возможная защитная реакция на внешнюю угрозу), уринация и дефекация [Калуев А.В., 2001; Cole J.C., Rodgers R.J., 1993; Rodgers R.J., Shepherd J.K., 1993; Rodgers R.J., Cole J.C., 1993, 1994; Rodgers R.J. et al., 1994, 1995, 1996; Aguilar R. et al., 2002]. Интересно, что различные стрессорные воздействия усиливают эти поведенческие реакции [Rodgers R.J., Cole J.C., 1993, 1994; Rodgers R.J. et al., 1994, 1995,

38

1996]. Отмечается, однако, что данное поведение в ряде случаев может быть малочувствительным к действию анксиотропных препаратов, существенно изменяясь лишь при введении крайне высоких доз, приводящих к поведенческому дефициту [Rodgers R.J., Cole J.C., 1993, 1994; Rodgers R.J. et al., 1994, 1995, 1996]. Крайне чувствительными параметрами тревожности можно считать показатели поведения, направленного на оценку риска [Rodgers R.J., Shepherd J.K., 1993]. Отмечается даже, что эти показатели могут быть даже более чувствительны к действию анксиотропных препаратов, чем описанные выше традиционные параметры тревожности [Rodgers R.J., Cole J.C., 1993, 1994; Rodgers R.J. et al., 1994, 1995, 1996]. Параметры оценки риска принято обьединять в особый кластер, куда входят повторные заходы (возвраты) в закрытые или открытые рукава, заглядывания вниз из закрытых рукавов, а также - особая «защитная» разновидность стоек - вытягивания на задних лапах (без опоры передними) [Rodgers R.J., Cole J.C., 1993, 1994; Rodgers R.J. et al., 1994, 1995, 1996]. Данная группа паттернов, как принято считать, «характеризует поведение более осторожных животных» [Rodgers R.J., Cole J.C., 1993, 1994; Rodgers R.J. et al., 1994, 1995, 1996], наиболее адекватно отражает готовность животного оценить потенциально опасные окружающие условия [Rodgers R.J., Cole J.C., 1993, 1994; Rodgers R.J. et al., 1994, 1995, 1996], и в силу этого крайне чувствительна к действию анксиотропных факторов. В целом, усиление тревожности животного при поведенческих манипуляциях или действии анксиогенов усиливает показатели оценки риска, тогда как анксиолитики их снижают [Rodgers R.J., Cole J.C., 1993, 1994; Rodgers R.J. et al., 1994, 1995, 1996]. Тем не менее, хотя ряд (в основном, ГАМК-активных) агентов демонстрирует четкие и хорошо воспроизводимые эффекты в КПЛ, многие из эффектов других препаратов носят крайне противоречивый характер [Dawson G.R., Tricklebank M.D., 1995; Hogg S., 1996; Rodgers R.J. et al., 1994, 1995, 1996,Sanger D.J.,

39

1991]. Различия на методическом уровне могут объяснить многие, но не все из этих противоречий [Hogg S., 1996]. Гетерогенный мультифакторный характер мотиваций в данном тесте – комбинации обусловленного страха, эмоциональной реактивности, боязни высоты, а также ориентировочно-исследовательского поведения и норкового рефлекса (рефлекса предпочтения темноты) – может привести к «дополнительному» разбросу экспериментальных данных [Лапин И.П., 2000; Aguilar R. et al., 2002]. Конкретные условия проведения экспериментов могут усилить или ослабить некоторые из этих мотиваций, что в итоге приведет к изменению общего баланса мотиваций в данной модели. Различные препараты могут изменять одну или несколько мотиваций одновременно, причем зачастую – в неодинаковой пропорции [Лапин И.П., 2000]. Важно и то, что по своей природе тест достаточно «капризен» и подвержен артефактам [Лапин И.П., 2000], в том числе возникающим когда препараты обладают каким-либо дополнительным воздействием на общую двигательную активность [Dawson G.R., Tricklebank M.D., 1995], весьма характерным для многих психотропных препаратах. Невозможность повторного использования животных (в силу возникающего привыкания и запоминания) также существенно снижает экспериментальную ценность КПЛ [Dawson G.R., Tricklebank M.D., 1995; File S.E., 1993, 1995]. Тем не менее, главным преимуществом теста остается его простота и удобство и то, что тест не требует предварительного обучения животных [Rodgers R.J., Shepherd J.K., 1993]. Несомненным достоинством также является чувствительность к ряду препаратов, чей эффект иногда трудно обнаружить в других классических моделях, например, основанных на условнорефлекторных реакциях [Dawson G.R., Tricklebank M.D., 1995], а также крайне богатый набор поведенческих реакций в данном тесте [Fernandes C., File S.E., 1996; File S.E., 1996; Handley S.L. et al., 1993; 1995; Harro J., 1993; Hogg S., 1996; Sanger D.J., 1991]. Последнее важно в плане детальности поведенческого

40

анализа и позволяет получить правильное представление о действии препарата в целом - даже при его неясных или противоречивых эффектов на какие-либо отдельные ключевые показатели [Dawson G.R., Tricklebank M.D., 1995]. Черно-белая камера. Предложенный Ж.Краули в 1980 году, тест основан на противодействии ориентировочно-исследовательской реакции (направленной на исследование всей камеры) и страха, в данном случае - перед освещенным открытым пространством светлого отсека черно-белой камеры [Лапин И.П., 2000; Harro J., 1993; Calatayud F., Belzung C., 2001]. При помещении животного в темный отсек, регистрируется его исследовательская активность, направленная на изучение светлой части камеры. При нахождении животного в светлом отсеке проявляется норковый рефлекс – убегание в предпочитаемый «защищенный» темный отсек [Лапин И.П., 2000]. Традиционными показателями исследовательской активности являются латентность первого выхода, количество выходов в освещенный отсек (либо число переходов между отсеками) и общее время, проведенное животным в светлом отсеке [Crawley J.N., 1985], а также число выглядываний из открытого отсека камеры. Именно число выглядываний является наиболее адекватным надежным и воспроизводимым индексом тревожности в данной модели [Лапин И.П., 1999, 2000]. Животные обычно предпочитают находиться в темном отсеке, однако анксиолитики увеличивают число выходов и время, проведенное в светлом отсеке, тогда как анксиогенные агенты или манипуляции приводят к обратным эффектам [Harro J., 1993]. В ряде случаев предлагается регистрировать также стойки, сделанные животными в светлом отсеке. Более того, обсуждается выявленная корреляция между количеством стоек и числом выходов в освещенный отсек [Crawley J.N., 1985], хотя стойки редко встречаются в данном тесте в его наиболее используемом 5-минутном варианте. Черно-белая камера считается одной из чувствительных моделей острой, «ситуативной» тревожности живот-

41

ных [Calatayud F., Belzung C., 2001], в которой свою активность способно проявить большинство их известных классов анксиотропных препаратов. [File S.E., 2001] подчеркивает зависимость этологических индексов данного теста от общего локомоторного уровня, что требует определенной осторожности в интерпретации полученных результатов в данной модели. Приподнятая открытая платформа представляет собой интересную блиц-модель для выяснения эффектов препарата одновременно на исследовательское поведение и локомоцию. Нами было показано, что анксиогены вроде коразола (10 мг/кг i.p.) ингибируют поведенческую исследовательскую активность крыс на платформе. В принципе, модель представляет собой сочетание элементов открытого поля и КПЛ и поэтому может быть интересна при исследовании возможных эффектов БП, ранее обнаружившего поведенческую активность в других моделях. Модель «подвешивание за хвост» является еще одним блиц-тестом для выяснения поведенческих эффектов различных факторов [Greenshaw A.J. et al., 1988]. Тест основан на наблюдении, что грызуны, при их подвешивании за хвост, будут демонстрировать определенный период иммобильности, по латентности которого можно судить об уровне их тревожности/страха и отчаяния. Различные проанксиолитические препараты приводят к изменениям длительности иммобильности животных, причем данный тест не только прост и удобен технически, но и более чувствителен к ряду психотропных препаратов, чем близкий ему по смыслу тест Порсолта (там же). Тест также позволяет снять «гипотермический» фактор последнего при влияниях на поведение. Модель хемо-индуцированного эпилептогенеза является одной из физиологических моделей, патогенетически близкой к стрессу. Судороги являются результатом дисбаланса в активности возбуждающих и тормозных нейромедиаторных систем [Богданов Н.Н., 1997], в первую очередь устранения

42

тормозного влияния нейронов, продуцирующих ГАМК и глицин [Хоботнова З.И. и др., 1997; Walsh L.A. et al., 1999]. Действие многих конвульсантов сводится к вызываемым ими изменениям в центральной ГАМК-ергической системе [Базян А.С. и др., 1998; McCandless D.W., Fine-Smith R.B., 1992]. Эпилепсия, стресс и тревожность имеют сходную патофизиологию. Так, нарушения центральных ГАМК-ергических механизмов приводят к тревожности, в более выраженном виде провоцируя эпилепсию [Мухин Е.Н., 1990; Eadie M.J., Tyrer J.H., 1989], тогда как анксиогенные ГАМК-ингибирующие препараты типа пикротоксина, коразола или БП в больших дозах проявляют конвульсантные свойства [McCandless D.W., Fine-Smith R.B., 1992; Walsh L.A. et al., 1999], а введение ГАМК-активирующих анксиолитиков обладает противосудорожным действием [Андреев Б.В., 1982; Андронати С.А. и др., 1982; Молодавкин Г.М. и др., 1996; Lippa A.S. et al., 1979; Lloyd K.G., Morcelli P.L., 1987; Еadie M.J., Tyrer J.H., 1989]. Устойчивость к судорогам у животных сопровождается определенными поведенческими коррелятами, включая пониженную восприимчивость к стрессу, низкий уровень тревожности и агрессии [Богданов Н.Н., 1997]. И наоборот, повышенная судорожная активность отмечалась у более тревожных животных. Все это показывает определенное родство механизмов данных состояний. Более того, эпилепсия и тревожность имеют весьма некоторые черты сходства в клинической картине [Eadie M.J., Tyrer J.H., 1989]: типичными проявлениями эпилепсии являются гипервозбудимость, усиление тревожности, страхи, сопровождающиеся иллюзиями и устрашающими галлюцинациями [Портнов А.А., Федоров Д.Д., 1971]. Часто специфическое состояние ауры, появляющееся задолго до припадков, сопровождается фобическими реакциями и тревожностью (там же). При этом накопление неприятных переживаний и эмоций, связанных с опытом предыдущих припадков, усиливает прогрессирование психических растройств вплоть до появления хронической

43

тревоги и страхов [Бачериков Н.Е. и др., 1989]. Последние сведения позволяют рассматривать перекрывающиеся механизмы патогенеза эпилепсии и тревоги в виде непрерывного континуума. И хотя одни и те же физиологически активные вещества в пределах одного семейства могут несколько отличаться по своим анксиолитическим и антиэпилептическим свойствам [Райский В.А., 1988], c учетом всего вышеизложенного есть веские основания изучать эффекты физиологически активных анксиотропных препаратов на поведение (а также исследовать их возможные взаимодействия) не только в тестах на тревожность, но на моделях эпилепсии. Поэтому вызывает интерес анализ возможных эффектов БП и ряда других ГАМК-активных препаратов, особенно тех, в отношении которых поведенческие тесты указывают на возможность перекрывания механизмов их физиологического действия. Цель данной части работы заключалась в изучении взаимодействия ГАМК-тропных соединений коразола, пикротоксина и БП, исследуя влияние предварительной обработки животных невысокими (субконвульсантными) дозами БП на интенсивность судорог, вызванных введением конвульсантными дозами другого ГАМК-тропного препарата (коразола или пикротоксина). ГЛАВА 3. МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Эксперименты выполнены на 1320 половозрелых самцах и самках беспородных белых крыс и крыс линии Вистар, содержавшихся в стандартных условиях вивария. В работе были использованы препараты: бензилпенициллин, коразол и пикротоксин (Sigma, UK). Растворы препаратов вводили внутрибрюшинно. Животные контрольной группы получали эквивалентные объемы растворителя. Ульцерогенез, вызванный стрессом. В опытах было использовано 340 беспородных белых крыс (самцов, самок массой 150-200г). Животные во всех экспериментах содержались в виварии группами по 10 особей как минимум

44

две недели до начала экспериментов, не получая пищу за 48 часов до опытов. Для избежания копрофагии дно садка заменялось на решетчатую сетку с поддоном. Доступ к воде был свободным. До начала опыта животным внутрибрюшинно вводили 0.2 мл препарата: контрольным животным - 0.5%-ный раствор новокаина, животным опытных групп - раствор натриевой соли БП в 0.5%-ном растворе новокаина. Новокаин вместо физиологического раствора применяли для купирования болевой реакции крыс на введение БП, что могло быть дополнительным стрессогенным фактором. Растворы разводились в день эксперимента за час до введения. Температура растворителя была предварительно доведена до комнатной. В работе использовали дозы 6, 30, 60, 120 и 150 мг/кг для БП. Указанные дозы были эквивалентны 1, 5, 10, 15, 20 и 25 ОСД, обычно применямых в терапии для БП. Эксперименты проводились в дневное время суток в промежутке между 14 и 17 часами. Препараты вводили за 48 часов и (или) за 1 мин до стресса. Затем животных всех групп метили водоустойчивой краской и подвергали стрессу - плаванию в бассейне в течение 1 часа. Для большего стресса одновременно в бассейн загружалось 20-30 крыс, по 10-15 особей из опытной и контрольной групп. Бассейн представлял собой прямоугольный аквариум 80 х 80 х 130 см, сделанный из прочного прозрачного оргстекла и закрывающийся сверху сеткой. Уровень воды составлял 30 см. Температура воды была 20°С. Иногда 1-2 крысы (в равной мере из опытных и контрольных групп) из 20-30 особей, плавающих в бассейне, тонули к моменту окончания эксперимента. Такие особи в дальнейшем не учитывались при анализе интенсивности ульцерогенеза. После плавания крысы извлекались из бассейна, после чего их немедленно умерщвляли эфиром и выделяли их желудки. В тот же день, сразу же после извлечения желудков, их рассекали по малой кривизне, промывали теплой водой и после растягивания на восковой подложке под бинокулярной лупой визуально оценивали состояние слизистой. При

45

исследовании СОЖ учитывали следующие показатели повреждений: общую площадь точеных язвенных поражений, кв.мм (площадь каждого принимается равной 1 кв.мм), общую площадь локальных язвенных повреждений, кв.мм. В случае линейных язв их измеряли по длине (в мм), а ширина принималась равной 1 мм. Для итоговой оценки поражений СОЖ использовали показатель язвенного индекса, представляющий собой сумму площадей точечных и локальных язв в одном желудке (кв.мм). При анализе результатов подсчитывался усредненный язвенный индекс для каждой из групп. Поведенческие модели стресса Тест Порсолта. Эксперименты проводились на 120 белых беспородных крысах (самцах, самках) массой 200-240 г. Тестирование проводилось в вечернее время, в промежутке между 18 и 20 часами. В работе использовались животные группами по 5 особей. Препараты вводились опытным и контрольным животным по очереди. БП растворялся в дистиллированной воде в день эксперимента за час до его начала. Препарат БП вводился за 30 мин до теста в дозах 6, 30 и 60 мг/кг. Использовалось системное (i.p.) введение препарата в обьеме 0.2 мл. Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду в аналогичном объеме. После введения препаратов животные помещались на 30 мин в специальный садок. При тестировании крысы опускались в белый пластиковый цилиндр высотой 60 см и диаметром 50 см, в который на две трети была налита вода (температура 24°С). Длительность теста составляла 6 мин, в течение которых регистрировалось поведение животных. Поведенческими показателями служили: латентность первого «зависания» (иммобильность >5 сек), а также суммарное время иммобильности (сек). Под иммобильностью подразумевалось полное отсутствие плавательных движений при пассивном удержании животного на воде.

46

Норковая камера. Норковая камера представляла собой открытый пластиковый ящик коричневого цвета 60 х 60 х 60 см, одна из четырех сторон которого была сделана из прозрачного оргстекла. Пол ящика представлял собой квадрат из оргстекла, выкрашенный изнутри зелено-голубой краской. Пол был приподнят над дном ящика на высоту 3 см и был разделен тонкими белыми линиями на 9 квадратиков 20 х 20 см. По периметру квадратиков в полу были просверлены отверстия-»норки» диаметром 3 см. Эксперименты проводились на 90 белых беспородных крысах (самцах, самках) массой 220-250 г, ранее использовавшихся в черно-белой камере. Тестирование проводилось в вечернее время, в промежутке между 18 и 20 часами.В работе использовались животные группами по 20 особей. Препараты вводились опытным и контрольным животным по очереди. БП растворялся в дистиллированной воде в день эксперимента за час до его начала. Температура растворителя была предварительно доведена до комнатной. Препарат БП вводился за 45 мин до теста в дозах 6, 30 и 60 мг/кг. Использовалось системное (i.p.) введение препарата в объеме 0.2 мл. Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду в аналогичном объеме. После введения препаратов животные помещались на 45 мин в специальный садок. При тестировании крысы плавно опускались в норковую камеру, где визуально регистрировалось их поведение. После каждого животного камера протиралась изнутри мокрыми и сухими салфетками. Длительность теста составляла 5 мин. В ходе эксперимента были использованы следующие поведенческие показатели: число пересеченных квадратиков (горизонтальная активность), стойки (вертикальная активность) и число обследованных отверстий-»норок» (исследовательская активность). Квадратик считался пересеченным, если животное пересекало своим туловищем какую-либо из его границ. Под обследованием «норки» подразумевалось опускание какой-либо части мордочки животного в отверстие в полу камеры. Отдельно регистриро-

47

вали также неспецифическое поведение животных - число болюсов дефекации, частоту актов и суммарную продолжительность груминга в сек. Вертикальный экран. Экран представлял собой металлическую сетку 1 х 1 мм, натянутую на деревяную раму 40 х 60 см толщиной 1см. В центре рамы была устроена вертикальная деревяная перегородка высотой 10 см и толщиной 1 см, разделяющая сетку на две части так, что можно одновременно тестировать двух животных. По краям (кроме нижнего) рама была обнесена аналогичного размера стенками. Сетка устанавливалась вертикально на самом краю стола на высоте 60 см от уровня пола. Снизу, на полу, под сетку подкладывали ветошь для смягчения удара при падении животного с сетки на пол. Эксперименты проводились на 90 белых беспородных крысах (самцах, самках) массой 230-250 г, ранее (с промежутками в 7 дней) использованных в черно-белой и норковой камере. Дополнительно было использовано 40 интактных крыс для повторного исследования дефекаций (см. ниже) в трех опытных и одной контрольной группах (n=10). Тестирование проводилось в вечернее время, в период между 18 и 20 часами. В работе использовались животные группами по 10 особей. Препараты вводились опытным и контрольным животным по очереди (n=10). БП вводился за 30 мин до теста в дозах 6, 30 и 60 мг/кг. Использовалось системное (i.p.) введение препарата в объеме 0.2 мл. Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду в аналогичном объеме. После введения препаратов животное метилось индивидуально специальной краской и помещалось на 30 мин в специальный садок, откуда затем крыса помещалась на вертикальную сетку и плавно отпускалась, оставаясь висеть, зацепившись за сетку лапами. Продолжительность теста была ограничена 3 мин. Одновременно тестировались одна опытная и одна контрольная особи. Регистрировалось время удержания на сетке (сек). В случае, если в течение этого времени крыса падала вниз, ее сажали на сетку снова, в общей сложности до

48

трех раз, все - в пределах 3 мин опыта. Подсчитывалость суммарное время удержания по всем трем повторам вместе. Учитывалась также латентность первого падения (сек). После эксперимента животные сажались в отдельный садок, после чего тест повторялся через 30 и 60 мин (посадки 2 и 3, соответственно). Каждое животное регистрировалось индивидуально, согласно исходной нумерации. Дополнительным показателем, свидетельствовавшим о неспецифическом поведении во время первой посадки на сетку, служила интенсивность дефекаций (число болюсов, которые животное выделило за время пребывания на сетке) и уринаций (% уринировавших животных). При повторных тестированиях (посадки 2 и 3) анализ этих двух показателей не производился. Крестообразный приподнятый лабиринт. В первой серии опытов при исследовании влияния умеренных доз БП на поведение был использован КПЛ, сконструированный из матового оргстрекла, окрашенного в черный цвет. Ширина рукавов была 10 см при длине 45 см, высота стенок в закрытых рукавах составляла 10 см. В месте пересечения рукавов располагалась центральная площадка 10 х 10 см. Использовалась такая модификация КПЛ, в которой торцевые стенки на концах закрытых рукавов отсутствовали. Лабиринт располагался на высоте 80 см над уровнем пола на центральной опоре-ножке. Эксперименты проводились на 180 беcпородных белых крысах-самцах массой 200250 г, по 5 особей в опыте и контроле. Препараты вводились опытным и контрольным животным по очереди. Тестирование проводилось в стандартных условиях в вечернее время, в промежутке между 18 и 20 часами. За 45 мин до начала опыта животным внутрибрюшинно вводили 0.4 мл препарата: контрольным - физиологический раствор (0.9% NaCl), животным опытных групп - препарат натриевой соли БП отечественного производства в физиологическом растворе. Препараты разводились в день эксперимента, за 1 час до введения. Температура растворителя была предварительно доведена до комнатной. В ра-

49

боте применялись дозы 6-240 мг/кг. После введения препарата животное на 45 мин помещали в изолированную камеру, затем плавно переносили в центр лабиринта, располагая мордой в сторону открытого рукава. Продолжительность теста составляла 5 мин, в течение которых визуально регистрировали поведенческие характеристики. Лабиринт (кроме стенок) изнутри протирался мокрыми и сухими салфетками после каждого животного. В работе были использованы следующие поведенческие показатели: число выходов в открытые рукава лабиринта (исследовательская активность), число стоек (вертикальная исследовательская активность), количество заглядываний вниз из концов закрытых рукавов (оценка риска), а также число переходов через центральную платформу лабиринта. Под выходом в рукав лабиринта подразумевалось любое продвижение по рукаву лабиринта, если при этом мордочка и все передние лапы животного пересекали условную линию между центральной платформой и рукавом. Стойкой считалось такое заглядывание животного, находящегося в закрытом рукаве лабиринта, вверх (или вниз, перевещиваясь через стенку), если при этом животное приподнималось над уровнем стенок на задних лапах и обязательно опиралось одной или двумя передними лапами о стенку закрытого рукава. Заглядывание вниз («оценка риска») регистрировалось, если в закрытом рукаве лабиринта наблюдалось пересечение всей мордочкой животного или какой-либо ее частью горизонтальной границы между краем рукава и его условным продолжением. Во второй серии опытов при тестировании высоких доз БП использовалась методика, аналогичная описанной выше, с небольшими модификациями. КПЛ аналогичного дизайна и размеров был сконструирован из дерева, покрытого черной краской и матовым водонепроницаемым лаком. Лабиринт располагался на высоте 90 см над уровнем пола на центральной опоре-ножке. Эксперименты проводились на 150 белых крысах-самцах линии Wistar (Harlan Olac,

50

Великобритания). Животные были массой 220-240 г. Тестирование проводилось в вечернее время, в промежутке между 20 и 23 часами. За 30 мин до начала опыта животным внутрибрюшинно вводили 0.2 мл препарата: контрольным - дистиллированную воду, животным опытных групп - препарат натриевой соли БП в дистиллированной воде. Препараты разводились в день эксперимента, за 1 час до введения. Температура растворителя была предварительно доведена до комнатной. В работе применялись дозы 240-840 мг/кг БП. В работе использовались животные группами по 15 особей. Препараты вводились опытным и контрольным животным по очереди. После введения препарата животное на 30 мин помещали в изолированную камеру, затем переносили в центр лабиринта (мордой в сторону открытого рукава). Продолжительность теста составляла 5 мин, в течении которых визуально регистрировали поведенческие характеристики. Лабиринт протирался мокрыми и сухими салфетками после каждого животного. В работе были использованы поведенческие показатели, аналогичные описанным ранее: число выходов в открытые рукава и закрытые рукава лабиринта (а также их сумма - общее количество выходов), число стоек, количество заглядываний вниз из концов закрытых рукавов, число переходов (пересечений) через центральную платформу лабиринта, а также частоту актов груминга и дефекаций. Под переходом через центральную платформу подразумевалось последовательное пересечение туловищем двух условных линий - границ между платформой и открытыми или закрытыми рукавами. Так, любые Г-образные перемещения типа «открытый рукав1-центр-закрытый рукав1», как и переходы по прямой типа «открытый рукав1-центр-открытый рукав2», были отнесены к переходам через центральную платформу. Новым регистрируемым показателем являлись «открытые выглядывания» - заглядывания в открытые рукава животного, находящегося полностью или частично на центральной платформе. Последние напоминали по сути открытые выходы,

51

однако отличались от них тем, что животные пересекали условную линию между центральной платформой и рукавом не туловищем, а лишь одной мордой. Об интенсивности дефекаций судили по количеству болюсов, оставленных животным в КПЛ за время тестирования. Наряду с частотой актов груминга, регистрировался также число (%) животных, продемонстрировавших груминг за период тестирования. Черно-белая камера. Аппарат представлял собой прозрачный закрытый ящик из оргстекла с центральной перегородкой посередине, состоящий из двух равных отсеков 25 х 25 х 25 см. Отсеки сообщались между собой через отверстие в перегородке (25 х 10 см), которое имело выдвижную вертикальную дверцу. Сверху оба отсека были снабжены плотно подогнанными открывающимися наверх крышками. Один из отсеков (а также перегородка и ее дверца со стороны другого отсека) снаружи, поверх оргстекла по периметру стен, был полностью обклеен черной фотографической светонепроницаемой бумагой. Это требовалось для создания темноты внутри отсека («темный отсек»). Пол и крышка данного отсека также снаружи были обклеены черной бумагой. Для лучшей светонепроницаемости прилегающие к перегородке две стенки другой части камеры («светлый отсек») вдоль границы с перегородкой снаружи также были обклеены полосками-выступами черной бумаги шириной 6 см. Стенки светлого отсека оставались прозрачными, однако сверху (по центру на высоте 15 см над его прозрачной крышкой) располагалась электрическая лампа мощностью 40 Вт. Эксперименты проводились на 120 белых беспородных крысах (самцах, самках) массой 200-240 г. Тестирование проводилось в вечернее время, в промежутке между 18 и 20 часами. В работе использовались животные группами по 10 особей. Препараты вводились опытным и контрольным животным по очереди. БП вводился за 45 мин до теста в дозах 6, 30 и 60 мг/кг. Использовалось системное (i.p.) введение препарата в объеме 0.2

52

мл. Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду в аналогичном объеме. После введения препаратов животные помещались на 45 мин в специальный садок. При эксперименте крыса опускалась в темный отсек камеры, после чего камера закрывалась сверху крышкой. Дверца в перегородке также была плотно закрыта. В полной темноте крыса адаптировалась к темному отсеку. Привыкание длилось 5 мин, после чего над светлым отсеком зажигалась электрическая лампочка и открывалась дверца в перегородке, приподнимаясь на высоту 15 см. Собственно тестирование длилось 5 мин, в ходе которых визуально регистрировалось поведение животных. После каждого животного темный отсек камеры протирался изнутри мокрыми и сухими, а светлый - только сухими салфетками. В ходе эксперимента были использованы следующие поведенческие показатели исследовательской активности животных: число и латентность (сек) выглядываний из темного отсека в светлый через отверстие в перегородке, а также - выходов в светлый отсек. Выглядыванием считалось пересечение всей мордочкой животного или какой-либо ее частью условного порога в отверстии центральной перегородки между отсеками. Под выходом понималось любое продвижение в сторону освещенного отсека, если при этом мордочка и все передние лапы пересекали данный порог. Дополнительно регистрировалась суммарная длительность (в сек) выглядываний и выходов в освещенную часть камеры. Под длительностью отдельного выглядывания или выхода понималось время пребывания в освещенном отсеке мордочки животного (выглядывания) или как минимум передней части его туловища (выходы). Минимальное время одиночного выглядывания принималось 1 сек. Серия повторных выглядываний регистрировалась как несколько независимых выглядываний. Показателем неспецифического поведения служила интенсивность дефекаций (об этом свидетельствовало число болюсов, обнаруженных в темном отсеке после окончания тестирования).

53

Приподнятая открытая платформа. В работе были использованы 60 беспородных белых крыс-самок массой 210-230 г. Аппарат представлял собой пластиковую площадку 25 х 32 см белого цвета, фиксированную на ножке на высоте 50 см над уровнем пола. Площадка была расчерчена на 4 квадрата 12.5 х 12.5 см, располагающихся по углам. При этом по центру образовывалась центральная зона в форме полоски 7 х 25 см, разделяющей платформу на две половины. По периметру одной половины площадки располагалась стенкабортик высотой 5 см, ограничивая примыкающие к ней «закрытые» квадратики (по аналогии с «закрытыми» рукавами КПЛ) в отличие от «открытых» квадратиков, находящихся по другию сторону от центальной зоны. Эксперименты проводились в стандартных условиях в вечернее время суток, в промежутке между 18 и 21 часами. Животных опытной и контрольной груп тестировали по-очереди, по одной особи из каждой группы. БП в дозах 60 и 90 мг/кг вводится животным внутрибрюшинно за 35 мин до теста в объеме 0.2 мл. Контроль получал аналогичный объем физраствора. После инъекции животное помещалось для адаптации в отдельную камеру на 35 мин, а затем плавно переносилось на приподнятую открытую платформу. Тестирование длилось 3 мин, в ходе которых регистрировалась спонтанная поведенческая активность животных. Учитывались количество пересеченных «открытых» и «закрытых» квадратиков (по границе между квадратиками одного типа), число пересечений границ центральной зоны, число заглядывания вниз с края платформы и стоек (для каждого вида квадратиков - отдельно), а также - число актов груминга за время тестирования. Дополнительно (по числу болюсов) регистрировалась дефекация. После каждого животного приподнятая открытая платформа протиралась мокрой и сухой салфетками. Опытные и контрольные животные тестировались индивидуально по-очереди.

54

Методика «Подвешивание за хвост». Эксперименты проводились на тех же животных и в тех же условиях, описанных в предыдущей методике. После введения препарата (за 35 мин до тестирования) животное вытаскивалось из садка и придерживалось за хвост при туловище в висячем положении. Регистрировалось время, в течение которого животное будет оставаться «иммобильным» (до момента, пока морда животного не достигнет основания хвоста). Поведенческие эффекты комбинации БП и ГАМК-литиков. Опыты проводились с использованием модели КПЛ. В работе использовалась методика, аналогичная описанной выше для экспериментов с высокими дозами БП. Эксперименты проводились на 450 белых крысах-самцах и самках линии Wistar (Harlan Olac, UK) массой 220-240 г. Из них 180 крыс (самки) были экспериментально наивными, а 210 (самцы) использовались ранее в других поведенческих экспериментах, не связанных с фармакологическими манипуляциями или КПЛ. В каждый из тестовых дней тестировались животные из каждой из данных групп (по 2-4 особи из группы) вразброс. Тестирование проводилось в ночное время (в промежутке между 21 и 2 часами) в упрощенном варианте - в течение 3 мин. Животные тестировались группами по 12-24 особей. За 40 мин до начала опыта животным внутрибрюшинно вводили 0.2 мл препаратов. Контрольным животным вводили дистиллированную воду (водный контроль, 60 животных, n=20) или раствор БП в дозе 60 мг/кг (пенициллиновый контроль, 60 животных, n=20). Другим группам вводились растворы ГАМКактивных препаратов - пикротоксина (0.01, 0.05, 0.1, 0.3 и 0.6 мг/кг, пикротоксиновый контроль, 75 животных, n=15) и коразола (3, 6 и 12 мг/кг - коразоловый контроль, 60 животных, n=20). Животным опытных групп вводили: препарат БП в однократной дозе 60 мг/кг в комбинации с пикротоксином (0.01, 0.05, 0.1, 0.3 и 0.6 мг/кг, пикротоксиновый опыт, 75 животных, n=15) и коразолом (3, 6, 12 мг/кг, коразоловый опыт, 60 животных, n=20). Препараты рас-

55

створялись в свежей дистиллированной воде в день эксперимента, за 2 часа до введения. Температура растворителя была предварительно доведена до комнатной. Для получения низких концентраций пикротоксина использовался базовый раствор (в дистиллированной воде) 0.1 мг/мл с последующими разведениями. Для приготовления комбинации препаратов готовились растворы пикротоксина или коразола, в которых затем растворялась готовая навеска БП. Тестирование продолжалось в общей сложности 25 экспериментальных дней и проводилось в два этапа. Вначале (14 дней) были использованы 270 самцов, не являющихся экспериментально наивными. Второй этап (11 дней) начался спустя 2 недели после завоза 180 экспериментально наивных самок. Последние были завезены двумя партиями - вначале 60 крыс, затем спустя 2 недели - еще 120 крыс. Соответственно, эксперименты с ними длились вначале 4 дня, после чего последовал перерыв в 2 недели (необходимый для акклиматизации вновь прибывших животных), а затем работы были снова продолжены (7 дней). Набор исследуемых показателей был аналогичен использованному ранее для анализа эффектов высоких доз БП: число выходов в открытые рукава лабиринта, число стоек, количество заглядываний вниз из концов закрытых рукавов, число переходов (пересечений) через центральную платформу лабиринта, а также еще один показатель исследовательской активности, близкий по смыслу к открытым выходам - заглядывания в открытые рукава лабиринта. Для облегчения сравнения эффектов БП, для указанных выше поведенческих показателей определялся интегральный параметр - средний поведенческий эффект, представляющий собой среднесуммарный процент произведенных препаратом поведенческих изменений в сравнении с контролем. Модель хемо-индуцированного эпилептогенеза. В работе использовалось 40 крыс-самцов линии Wistar (Harlan Olac, UK), а также 40 беспородных белых крыс-самцов массой 210-230г. В день эксперимента в физрастворе рас-

56

творялись препараты. Животным опытной группы (n=20) внутрибрюшинно вводился БП в дозах 60 мг/кг (линейные животные) и 90 мг/кг (беспородные животные) в объеме 0.4 мл, контрольным группам (соответственно, линейным и нелинейным) вводился аналогичный объем физраствора. После этого животные на 30 мин помещались в индивидуальные пластиковые садки. Судороги вызывались у опыта и контроля внутрибрюшинным введением 0.4 мл коразола (65 мг/кг) или пикротоксина (5 мг/кг). После инъекции судорожной дозы препарата животное помещалось в прозрачный плексиглазовый контейнер 50 х 50 см с открывающейся крышкой, где в течение 30 мин индивидуально проводилось наблюдение за его поведением. Визуально регистрировались три последующие стадии хемо-индуцированных судорог: первые миоклонические подергивания, корчи (оро-фациальные судороги, постепенно переходящие в нижележащие отделы туловища и генерализованные (миоклонические и/или тонические) судороги [Eadie M.J., Tyrer J.H., 1989; Nutt D.J. et al., 1980]. Измерялось латентное время первого ответа по каждой стадии отдельно, а также общее число (%) животных, демонстрирующих те или иные стадии судорог. Регистрировалось также число подергиваний по каждому из животных. По истечении 30 мин наблюдений после инъекции отдельно подсчитывалось количество летальных случаев и выражалось в % от общего числа животных в группе. Заметим, что в работе при исследовании различных стадий судорог иногда возникали некоторые методические проблемы. В частности, стадия корчей иногда постепенно (без перерыва) переходила в стадию гиперактивации и далее - к фазе собственно генерализованных судорог, и латентность последних определить было достаточно сложно. Поэтому при исследовании генерализованных судорог время их наступления оценивалось по началу прешествующей им стадии краткой двигательной гиперактивации, которая затем плавно переходила в стадию собственно клонических-тонических судорог с или без тони-

57

ческой фазы [Eadie M.J., Tyrer J.H., 1989]. Аналогично, для оценки физиологически активных свойств препаратов принципиально важным является вопрос частоты генерализованных судорог в опытных и контрольных группах. Учитывая существование четырех переходных стадий от клонуса к тоническим судорогам (в зависимости от вовлеченных частей тела [Laird M., Jobe G., 1987]), в целях упрощения оценки в опыте не проводилось раздельной регистрации генерализованных клонических и тонических судорог. Основанием для этого явилось то, что в наших экспериментах как в опыте, так и в контроле весьма редко (всего в 5-10% случаев) встречалась максимальная стадия в виде полного тонуса головы, шеи и всех пар конечностей. В целях унификации результатов, в работе не учитывались повторные стадии судорог, которые примерно у 10-15% животных наступали после окончания эксперимента, то есть после 30 мин с момента введения конвульсанта. Статистическая обработка данных. В зависимости от характера данных, обработка данных проводилась с использованием t-критерия Стьюдента, критериев соответствия хи-квадрат и Вилкоксона-Манна-Уитни. Значимыми считались эффекты при p