ZAPEWNIENIE JAKOŚCI ANALIZ CHEMICZNYCH Poradnik dla laboratoriów Państwowej Inspekcji Sanitarnej
pod redakcją dr. Marka Dobeckiego
Wydanie trzecie uzupełnione i poprawione
Wydanie publikacji dofinansował Komitet Badań Naukowych Autorzy: IMP Łódź:
dr Marek Dobecki, mgr Henryk Skalski, prof. dr hab. Marek Jakubowski PZH Warszawa: prof. dr hab. Jan K. Ludwicki, dr Kazimiera Ćwiek-Ludwicka, dr Katarzyna Góralczyk, mgr Jerzy Kozłowski IŻŻ Warszawa: dr med. Lucjan Szponar, prof. dr hab. Halina Kunachowicz, dr Grażyna Okolska, mgr Wojciech Kłys
Wydanie pierwsze — 1997 r., drugie — 1998 r. Redaktor prowadzący: Teresa Starzyńska Projekt okładki: Ida Kuśmierczyk Skład: Wydawnictwo „Biblioteka”, Mateusz Poradecki e-mail:
[email protected], tel./faks (42) 715 05 63
Copyright by © Instytut Medycyny Pracy im. prof. J. Nofera w Łodzi, 2004
ISBN 83-88261-14-2
Wydawca: Oficyna Wydawnicza Instytutu Medycyny Pracy im. prof. J. Nofera 90-950 Łódź, ul. Św. Teresy 8 Rozpowszechnianie książek: tel. /faks: (42) 63 14 719 e-mail:
[email protected], http://www.imp.lodz.pl
SPIS TREŚCI PRZEDMOWA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1. KRYTERIA DZIAŁANIA LABORATORIÓW BADAWCZYCH 1.1. Organizacja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2. Polityka jakości . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3. System jakości . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1.3.1. Audit wewnętrzny . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1.3.2. Przegląd zarządzania . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1.3.3. Działania korygujące . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1.3.4. Działania zapobiegawcze . . . . . . . . . . . . . . . . .1.3.5. Nadzorowanie niezgodnych z wymaganiami badań. . . 1.4. Współpraca z klientem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1.4.1. Podwykonawstwo badań . . . . . . . . . . . . . . . . 1.5. Zakupy usług i dostaw . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.6. Personel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.7. Pomieszczenia i środowisko. . . . . . . . . . . . . . . . . 1.8. Wyposażenie pomiarowe i badawcze . . . . . . . . . . . . .1.8.1. Przyrządy pomiarowe i systemy komputerowe . . . . . .1.8.2. Naczynia pomiarowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1.8.3. Spójność pomiarowa . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1.8.4. Sprzęt pomocniczy i materiały pomocnicze . . . . . . . .1.8.5. Dokumentowanie wyposażenia . . . . . . . . . . . . . 1.9. Metody badań i ich walidacja. . . . . . . . . . . . . . . . 1.10. Pobieranie próbek i postępowanie z próbkami . . . . . . . .1.10.1. Pobieranie próbek do badań. . . . . . . . . . . . . . .1.10.2. Przyjmowanie próbek do badań w laboratorium . . . 1.11. Zapewnienie jakości wyników badań. . . . . . . . . . . . 1.12. Zapisy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.13. Sprawozdanie z badań . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.14. Akredytacja laboratorium . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7 7 8 9 10 10 11 11 11 12 12 13 13 15 17 18 19 20 20 21 22 25 26 27 27 28 32 33
2. STATYSTYKA MATEMATYCZNA W ANALIZIE CHEMICZNEJ . 2.1. Charakterystyka zbiorowości generalnej i próbnej . . . . . . . . 2.1.1. Miary położenia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.2. Miary rozproszenia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2. Błędy w analizie chemicznej . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.1. Błędy przypadkowe, systematyczne, względne i bezwzględne . 2.2.2. Precyzja. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . .
. . . . . . .
. . . . . . .
. . . . . . .
35 35 37 39 41 41 46
2.3. Szacowanie wyników analizy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.1. Przedział ufności . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.2. Kryterium dopuszczalnej różnicy między wynikami analiz . . 2.4. Hipotezy i testy statystyczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.1. Porównanie dwóch wariancji lub jej pochodnych . . . . . . . 2.4.2. Porównywanie dwóch średnich (poprawności dwóch metod) 2.4.3. Porównanie różnic par wyników . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.4. Wykrywanie błędów grubych . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5. Statystyka zależności liniowej . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5.1. Parametry zależności liniowej. . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5.2. Szacowanie parametrów zależności liniowej . . . . . . . . . 2.5.3. Ocena funkcji liniowej . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5.4. Korelacja liniowa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5.5. Wykrywanie błędów systematycznych . . . . . . . . . . . . 2.6. Charakteryzacja metody analitycznej . . . . . . . . . . . . . . . 2.6.1. Zakres roboczy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.6.2. Liniowość. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.6.3. Selektywność i specyficzność . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.6.4. Granica wykrywalności . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.6.5. Granica oznaczania ilościowego . . . . . . . . . . . . . . . 2.6.6. Czułość . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.6.7. Poprawność i obciążenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.6.8. Powtarzalność i odtwarzalność . . . . . . . . . . . . . . . . 2.7. Sterowanie jakością badań . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.7.1. Sterowanie wewnętrzne. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.7.2. Sterowanie zewnętrzne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.8. Szacowanie niepewności wyniku pomiaru . . . . . . . . . . . . 2.8.1. Budżet niepewności pomiaru w laboratorium analitycznym . 2.9. Terminy i definicje (8, 15, 20, 21, 23, 24, 28) . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
50 50 50 53 55 56 58 59 61 61 61 64 64 66 68 68 69 70 71 72 75 75 78 80 81 95 96 99 106
PIŚMIENNICTWO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
113
ZAŁĄCZNIKI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
115
TABLICE STATYSTYCZNE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
137
PRZEDMOWA Oddajemy w ręce P. T. Czytelników kolejne, trzecie już wydanie poradnika, który spotkał się z tak życzliwym przyjęciem odbiorców. Poradnik początkowo przeznaczony dla laboratoriów Państwowej Inspekcji Sanitarnej trafił również do laboratoriów innych organizacji, stając się pomocnym narzędziem w rozwiązywaniu problemów związanych z wdrażaniem postanowień właściwej normy europejskiej, odnoszącej się do kompetencji laboratoriów. Formalnym potwierdzeniem tych kompetencji jest akredytacja. Przystąpienie Polski do Unii Europejskiej i potrzeba uzyskania odpowiednich dowodów kompetencji sprawia, że polskie laboratoria badawcze, zwłaszcza w dziedzinie urzędowych badań żywności (akredytacja obowiązkowa zgodnie Dyrektywą Rady 93/99 EWG), podejmują szybkie działania w kierunku spełnienia narzuconych wymagań. W obecnym wydaniu poradnika poprawionym i uzupełnionym położono szczególny nacisk na przedstawienie różnych rozwiązań w zakresie walidacji metod analitycznych, sterowania jakością procesów analitycznych, szacowania niepewności pomiaru analitycznego. Poradnik, podobnie jak poprzednie wydania, nie zawiera szerszych podstaw teoretycznych, związanych ze stosowaniem różnych technik analitycznych i metod analizy statystycznej. Czytelnik zainteresowany pogłębieniem swojej wiedzy w tych dziedzinach może skorzystać z odpowiedniego fachowego piśmiennictwa, dostępnego na rynku wydawniczym.
1. KRYTERIA DZIAŁANIA LABORATORIÓW BADAWCZYCH 1.1. Organizacja Laboratorium, niezależnie czy stanowi jednostkę działającą samodzielnie, czy też jest częścią większej organizacji, powinno wykazać prawne podstawy swojej działalności. Usytuowanie laboratorium (czy zespołu laboratoriów) w organizacji macierzystej oraz jego powiązania z innymi jednostkami powinny być udokumentowane i potwierdzone odpowiednimi wewnętrznymi przepisami organizacyjnymi (zarządzenia dyrekcji, regulaminy i schematy organizacyjne). Laboratorium powinno określić zakres swojej działalności badawczej, włączając w to (jeśli konieczne) pobieranie próbek. W przypadku dużych laboratoriów (lub zespołu laboratoriów) próbkobiorcy mogą być zatrudnieni w określonych działach technicznych laboratorium (np. w oddziałach terenowych, pracowniach lub sekcjach). Powiązania i relacje służb pomocniczych i innych jednostek instytucji macierzystej z systemem jakości w laboratorium powinny być jasno sprecyzowane. Stosowane w laboratorium udokumentowane procedury systemu jakości, w których określoną rolę przypisano innym jednostkom organizacyjnym, powinny być – zarządzeniem dyrekcji – wdrożone do tych jednostek, np. procedury nadzoru nad wyposażeniem pomiarowo-badawczym lub nabywania usług i dostaw (służby techniczne, dział zaopatrzenia). Laboratorium powinno posiadać personel kierowniczy i niezbędne środki oraz uprawnienia do wykonywania swoich obowiązków. Struktura organizacyjna oraz system zarządzania w laboratorium lub zespole laboratoriów powinny zapewniać: — bezstronność i niezależność personelu od jakichkolwiek nacisków (np. finansowych) wewnętrznych i zewnętrznych, które mogłoby mieć niekorzystny wpływ na jakość badań; — wiarygodność wyników badań poprzez posiadanie właściwych kompetencji technicznych (m.in. biegłość personelu, wyposażenie, metody badawcze) i odpowiedniego do rodzaju działalności systemu jakości; — odpowiednie proporcje i powiązania między personelem nadzorującym badania i wykonującym badania w celu zapewnienia właściwej jakości badań; — wyznaczenie spośród personelu laboratorium kierowników (bez względu na nazwę tych stanowisk lub funkcji): pracownika odpowiedzialnego za działalność techniczną (merytoryczną) i zasoby laboratorium (kierownictwa technicznego) i kierownika ds. jakości odpowiedzialnego za zarządzanie i nadzór nad systemem jakości; w strukturze organizacyjnej laboratorium kierownictwo techniczne ze względu na odpowiedzialność może być najczęściej utożsamiane z kierownikiem laboratorium lub działu laboratorium (np. pracowni); — jeśli to możliwe i uzasadnione wyznaczenie zastępców kluczowego personelu.
8 W laboratoriach z małą liczbą personelu pracownicy mogą pełnić więcej niż jedną funkcję, a wyznaczanie zastępców może być niepraktyczne (lub niemożliwe). Laboratoria posiadające kilka działów mogą wyznaczyć pracowników odpowiedzialnych za pracę tych działów lub kierowników ds. jakości. Kierownik ds. jakości powinien mieć bezpośredni dostęp do kierownictwa wykonawczego laboratorium np. zarządzającego jednostką macierzystą (w przypadku dużej organizacji), które może podejmować decyzje w sprawie polityki działania i zasobów laboratorium. Laboratorium powinno wskazać osobę (osoby) odpowiedzialną za merytoryczną treść sprawozdań z badań i autoryzację sprawozdań.
1.2. Polityka jakości Wymagania stawiane laboratorium w zakresie organizacji, zarządzania, systemu jakości i kompetencji technicznych zawarte są w odpowiedniej normie określającej te wymagania. Laboratorium, aby spełnić kryteria tych dokumentów powinno ustanowić, wdrożyć, utrzymywać i rozwijać system jakości, właściwy dla zakresu jego działalności z uwzględnieniem wszystkich podejmowanych działań i rodzajów badań. Kierownictwo laboratorium powinno zobowiązać się do dobrej praktyki profesjonalnej oraz określić politykę jakości i cele, które zamierza osiągnąć przez wdrożenie systemu jakości oraz środki realizacji. Celem np. powinno być zapewnienie wiarygodności badań, służące rozwiązywaniu problemów klienta. Laboratorium powinno zapewnić przedstawienie tej polityki i jej celów w formie deklaracji autoryzowanej przez kierownictwo wykonawcze (właściciel, dyrektor, prezes) laboratorium, zamieszczonej w dokumencie zwanym księgą jakości lub niezależnie w innym dokumencie (np. zarządzeniu wewnętrznym dyrektora). Odpowiedzialnym za realizację polityki jakości jest kierownik (dyrektor) mający władzę wykonawczą, w tym również w sprawach finansowych. Za wdrażanie i nadzór nad realizacją określonych zadań może odpowiadać osoba upoważniona przez kierownictwo wykonawcze. Cele polityki jakości realizowane są poprzez zapewnienie, że: — działania laboratorium służyć będą zawsze rozwiązywaniu problemów klienta z zachowaniem wszystkich jego praw; — badania zawsze są wykonywane zgodnie z ustalonymi, wyspecyfikowanymi metodami lub normami oraz wymaganiami odbiorców wyników (klientów); — laboratorium nie podejmie się wykonania badania metodami, które nie gwarantują poprawności wyników; — laboratorium stosuje w badaniach system jakości przedstawiony w księdze jakości (bez względu na nazwę tego dokumentu) i towarzyszącej jej dokumentacji; — badania wykonywane są przez bezstronny i niezależny od nacisków finansowych klientów personel; — prawa klienta (zachowanie poufności, praw własności, możliwość reklamacji) zawsze są przestrzegane. Aby cele polityki jakości mogły być zrealizowane, konieczne jest zadeklarowanie przez zarządzających laboratorium (dyrekcję) zapewnienia środków finansowych. Laboratorium powinno przedstawić środki (metody), służące do realizacji polityki jakości, do których można zaliczyć: 1. Biegły technicznie i wykwalifikowany personel, któremu zapewnia się warunki ciągłego podnoszenia jego umiejętności.
9 2. Nowoczesne wyposażenie pomiarowe i badawcze, podlegające bieżącemu nadzorowi, we właściwy sposób obsługiwane, wzorcowane i sprawdzane. 3. Odpowiedni do rodzaju wykonywanych badań system jakości, podlegający nadzorowi w formie auditów wewnętrznych i przeglądów zarządzania. 4. Bieżące sterowanie jakością badań. Dopuszcza się stosowanie odstępstw od udokumentowanej polityki jakości, o ile nie wpływają one na wiarygodność badania. Należy ustalić zasady udzielania odstępstw od polityki jakości i procedur (systemu jakości, badawczych) (kto udziela i w jakich okolicznościach?).
1.3. System jakości System jakości w laboratorium powinien być odpowiedni do rodzaju i ilości wykonywanych badań. System jakości powinien być udokumentowany (opisany) w formie księgi jakości, procedur systemu jakości i innej towarzyszącej dokumentacji, np. instrukcji, formularzy. Laboratorium powinno posiadać udokumentowaną procedurę w zakresie nadzoru nad dokumentami stanowiącymi składniki jego systemu jakości, opracowanymi zarówno w laboratorium jak i pochodzącymi ze źródeł zewnętrznych (normy, przepisy). Stosowane formularze stanowiące załączniki do właściwych procedur powinny być opatrzone statusem wydania i identyfikatorem dokumentu, z którego pochodzą. System jakości i jego dokumentacja powinny być znane personelowi laboratorium. Dokumentacja winna być zrozumiała i dostępna, a dyspozycje zawarte w tej dokumentacji stosowane przez personel. Za system jakości w laboratorium i za zarządzanie dokumentacją systemu odpowiedzialny jest kierownik ds. jakości. Jeżeli jest to uzasadnione, laboratorium może określić warunki udzielania odstępstw od udokumentowanej polityki jakości, w tym procedur systemu jakości i metod badań. Zasady dokumentowania systemu jakości, przygotowania księgi jakości i procedur systemu jakości można znaleźć we właściwych, aktualnych normach europejskich lub międzynarodowych. Układ księgi jakości, tzn. nazwy jej poszczególnych rozdziałów powinny być identyczne, jak dokumentu odniesienia, czyli właściwej normy ustalającej wymagania kompetencji laboratoriów. Zakres wymagań, do których powinny odnieść się procedury systemu jakości, podaje właściwa, aktualna norma odniesienia przedstawiająca zasady dokumentowania systemu jakości. Ogólną zasadą jest, że procedura systemu jakości w części poświęconej „opisowi działań” powinna zainteresowanym jej stosowaniu dać odpowiedź na pytania: kto?, co?, jak?, kiedy?, gdzie?, dlaczego? i za pomocą jakich narzędzi powinien wykonać dane działanie. Nadzór nad systemem jakości w laboratorium powinien być realizowany w formie auditów wewnętrznych i przeglądów zarządzania. W zakresie nadzoru nad systemem jakości laboratorium powinno posiadać udokumentowane procedury: — auditów wewnętrznych, — przeglądów zarządzania, — działań korygujących, — działań zapobiegawczych, — niezgodnych z wymaganiami badań.
10 1.3.1. Audit wewnętrzny Powinien być przeprowadzany przez pracowników laboratorium, którzy nie ponoszą bezpośredniej odpowiedzialności za auditowany obszar (odpowiedzialność taką ponosi np. kierownictwo techniczne) i nie są z nimi bezpośrednio związani. W przypadku dużych laboratoriów, posiadających kilka działów technicznych (pracowni) mogą być powoływani auditorzy z innych działów. Auditorami są zwykle pracownicy posiadający właściwe przeszkolenie w instytucjach zewnętrznych lub pracownicy przeszkoleni na kursach wewnętrznych. Laboratorium powinno określić wymagania dla auditorów wewnętrznych, przedstawić politykę ich szkolenia oraz posiadać aktualny wykaz z nazwiskami i kwalifikacjami auditorów wewnętrznych. Auditorzy mogą być powoływani przez kierownictwo wykonawcze lub przez osobę uprawniona, np. przez kierownika laboratorium lub działu laboratorium – w zależności od zakresu auditu wewnętrznego. Audity wewnętrzne powinny być realizowane według wcześniej ustalonego programu, np. na dany rok kalendarzowy, i obejmować wszystkie składniki systemu jakości (zarządzanie i kompetencje techniczne, łącznie z obserwacją badań). Audity wewnętrzne mogą być również nieplanowane (dodatkowe), wynikające np. z reklamacji klientów lub jako skutek działań korygujących. Do każdego auditu wewnętrznego, wynikającego z przyjętego programu, auditor wykonujący audit opracowuje szczegółowy plan. Plan auditu zawiera m.in. informacje dotyczące celu i zakresu auditu oraz powołuje kryteria auditu, tzn. dokumenty odniesienia (normy, procedury, metody badań), wg których oceniana będzie zgodność działania laboratorium. Dokumentacja auditów wewnętrznych może obejmować: — program auditów wewnętrznych, np. na dany rok kalendarzowy (przykład w zał. 1.1.), — plan auditu wewnętrznego (przykład w zał. 1.2), — raport z auditu wewnętrznego (przykład w zał. 1.3.), — kartę niezgodności do raportu z auditu wewnętrznego (przykład w zał. 1.4.). 1.3.2. Przegląd zarządzania Dokonywany jest przez kierownictwo wykonawcze (właściciel, dyrektor, prezes) laboratorium lub w jego imieniu, tzn. przez osobę upoważnioną. Przegląd zarządzania powinien być przeprowadzony co najmniej raz w roku i obejmować wszystkie składniki systemu jakości (zarządzanie i kompetencje techniczne). W razie potrzeby przeglądy zarządzania mogą być wykonywane częściej, zwłaszcza w okresie wdrażania systemu jakości w laboratorium. Inicjatorem przeglądu zarządzania w laboratorium jest kierownik ds. jakości. Wynikiem ustaleń przeglądu mogą być zmiany w systemie jakości laboratorium, zarządzaniu, a także w obszarze działalności technicznej (badań). Dokumentacja przeglądów zarządzania może obejmować: — porządek dzienny spotkania, — protokół z przeglądu zarządzania, — ustalenia do protokołu. Ustalenia z przeglądu zarządzania powinny być zatwierdzone przez kierownictwo wykonawcze laboratorium.
11 1.3.3. Działania korygujące Podczas wykonywania badań i realizacji ustaleń procedur systemu jakości mogą być stwierdzone niezgodności rozumiane jako niespełnienie wymagań konkretnych dokumentów odniesienia, stanowiących kryteria auditu (normy, procedury itp.). W wyniku stwierdzonych niezgodności laboratorium podejmuje korekcję i działania korygujące. Korekcja wykonywana jest w celu usunięcia skutków niezgodności, natomiast działania korygujące mają wyeliminować ich przyczynę. Dokumentami wejścia tych działań mogą być niezgodności stwierdzone m.in. podczas: — auditów wewnętrznych i zewnętrznych, — realizacji planu sterowania jakością, — analiz reklamacji i skarg klientów, — wykonywania i nadzorowania badań, — przeglądów zarządzania, — wzorcowania lub sprawdzania wyposażenia. Odpowiedzialny za wykonanie korekcji lub działań korygujących powinien być kierownik laboratorium lub działu technicznego, albo pracownik przez niego wyznaczony. Należy ustalić przyczynę niezgodności i dokonać wyboru właściwych działań. W zależności od obszaru, jakiego dotyczyła niezgodność, oceny działań korygujących dokonuje kierownik ds. jakości lub kierownik laboratorium/działu technicznego, lub auditor. Oceny nie powinna dokonywać osoba, która wykonała działania korygujące. Wynikiem działań korygujących mogą być: — audity dodatkowe (sprawdzające); — zmiany w systemie jakości i dokumentacji systemu jakości; — zmiany w obszarze kompetencji technicznych, np. zmiany w metodach badawczych. Laboratorium powinno oceniać wpływ niezgodności, działań korygujących i wprowadzonych zmian w danym obszarze systemu jakości na wyniki wcześniejszych badań lub inne obszary systemu jakości. 1.3.4. Działania zapobiegawcze W laboratorium mogą pojawić się problemy, które trudno zaliczyć do niezgodności, natomiast mogą one stanowić ich potencjalną przyczynę. Problemy te mogą pojawić się w tych samych obszarach, które są źródłem niezgodności i prowadzą do podejmowania działań korygujących. W praktyce wykonując działania zapobiegawcze można przyjąć ten sam tryb postępowania jak przy wykonywaniu działań korygujących, jakkolwiek być może nie jest konieczne przeprowadzanie analizy przyczyn i wykonywanie auditów dodatkowych. 1.3.5. Nadzorowanie niezgodnych z wymaganiami badań W wyniku stwierdzonych niezgodności podczas wykonywania danego badania przyjmuje się, że badanie to jest wykonywane jako niezgodne z wymaganiami. Badanie niezgodne z wymaganiami jest również wówczas, kiedy zostało udzielone odstępstwo przed wykonaniem działania ustalonego w danym dokumencie (np. odstępstwo postanowień metody badania). W każdym przypadku należy określić znaczenie takiej niezgodności lub odstępstwa, zwłaszcza w odniesieniu do wyniku badania. Należy
12 wskazać odpowiedzialność i uprawnienia personelu laboratorium do zarządzania takim badaniem, np. uprawnienia do wstrzymania badania lub jego ponownego wznowienia, a także wstrzymania lub wycofania sprawozdań z badań. Jeżeli ocena znaczenia badania niezgodnego z wymaganiami wskazuje, że mogłoby się ono powtórzyć, należy podjąć działania korygujące.
1.4. Współpraca z klientem Laboratoria wykonują badania dla klientów wewnętrznych (na zlecenie innych komórek organizacyjnych jednostki macierzystej) i na zlecenie klientów zewnętrznych: osób prawnych i fizycznych. Badania dla klientów zewnętrznych mogą być wykonywane na podstawie: — zawartych umów, — zleceń (bez spisywania umów). Zawarcie umowy z klientem lub podjęcie zlecenia powinno być poprzedzone przeglądem zapytania ofertowego, w którego trakcie personel laboratorium określa możliwości techniczne, moce przerobowe i inne warunki wykonania badania oraz akceptuje lub nie przyjęcie oferty. Z przeglądu powinny być prowadzone zapisy. Jeżeli laboratorium podejmuje się wykonania badań, to z praktycznego punktu widzenia należałoby z klientem ustalić np. w postaci pisemnych uzgodnień, następujące kwestie: — metodę badania i zgodę na ewentualne odstępstwa od postanowień tej metody; — wskazania ewentualnych podwykonawców; — informację nt. możliwości reklamacji (w jakim czasie od przyjęcia sprawozdania); — sposób wykorzystania wyników przez laboratorium (jeśli ma takie zamierzenia); — współudział klienta w badaniach (np. w części dotyczącej pobierania próbek); — podawanie lub niepodawanie informacji nt. niepewności pomiaru w sprawozdaniach; — sposób przekazywania sprawozdania z badań. Umowy już zawarte powinny być przeglądane w trakcie ich realizacji, a wszelkie zmiany w umowie, których inicjatorem może być każda ze stron, powinny być uzgodnione na piśmie. W laboratorium należy zapewnić poufność wykonywanych badań, jeśli nie było z klientem innych uzgodnień w tej sprawie. Zasady współpracy z klientem, sposób załatwiania reklamacji i zachowanie poufności badań, powinny być udokumentowane w formie procedury. 1.4.1. Podwykonawstwo badań Laboratorium powinno określić warunki podzlecania swoich badań, jeśli ma to zastosowanie. Podzlecenie może wynikać z nieprzewidzianych przyczyn (np. awaria wyposażenia), powodujących przerwanie już rozpoczętego badania. W tej sytuacji badanie może być dokończone przez podwykonawcę. Podwykonawstwo może również dotyczyć badań uzupełniających, tzn. takich, których laboratorium nie wykonuje, a są one ujęte w zleceniu klienta obok innych badań, których wykonania laboratorium się podejmie. Laboratorium powinno określić wymagania dla podwykonawców, posiadać wykaz podwykonawców i powiadomić klienta o podzleceniu badania. Przyjmuje się, że w przypadku laboratoriów akredytowanych podwykonawcami powinny być inne akredytowane laboratoria.
13
1.5. Zakupy usług i dostaw Laboratorium powinno określić zasady, opisane w formie procedury, dotyczące nabywania usług i dostaw niezbędnych do realizacji prac laboratoryjnych i wykonywania badań. Jako dostawy można rozumieć wyposażenie pomiarowe i badawcze, natomiast jako usługi różnego rodzaju świadczenia wykonywane dla laboratorium przez inne organizacje, np. wzorcowanie, sprawdzanie lub konserwacja wyposażenia, szkolenia. Powinno się zapewnić, że nabywane wyposażenie, w tym także odczynniki i materiały pomocnicze nie będą użyte zanim nie zostaną sprawdzone lub w inny sposób zweryfikowane. Wskazane jest prowadzenie systematycznej oceny dostawców i usługodawców.
1.6. Personel Laboratorium powinno zatrudniać odpowiednią do prowadzonej działalności badawczej liczbę pracowników. Liczba personelu, jego kwalifikacje i doświadczenie powinny gwarantować dobrą jakość wykonywanych badań. Oprócz personelu, zatrudnionego na podstawie stałej lub okresowej umowy o pracę, laboratorium może zatrudniać pracowników kontraktowych na okres wykonywania zleconego zadania. Pracownicy kontraktowi powinni być odpowiednio nadzorowani tak, aby system jakości w laboratorium i wiarygodność badań nie zostały naruszone. Kierownictwo laboratorium powinno określić i udokumentować: 1. Zasady kwalifikowania personelu na stanowiska kluczowe (kierownicze) i badawcze, obejmujące wymagania nt. poziomu i profilu wykształcenia, stażu pracy, specjalizacji itp.; 2. Zakres odpowiedzialności i uprawnień całego personelu, zawierający ustalenia ogólne (dotyczące np. danego stanowiska pracy) i szczegółowe (dotyczące np. rodzaju wykonywanych badań, pobierania próbek, obsługiwania wyposażenia), a także ograniczenia kompetencji. Zakresy obowiązków pracowników, którzy dodatkowo są odpowiedzialni za funkcjonowanie systemu jakości w laboratorium i działalność techniczną, powinny zawierać odpowiednie ustalenia w tej sprawie. Przykładowe zakresy podstawowych obowiązków kierownika ds. jakości i odpowiedzialnego za działalność techniczną (kierownictwa technicznego) przedstawiono w tabeli 1.1.; Tabela 1.1. Przykładowe zakresy podstawowych obowiązków kierownika ds. jakości i odpowiedzialnego za działalność techniczną (kierownictwa technicznego) Zakres obowiązków kierownika ds. jakości Organizacja i zarządzanie programem auditów Planowanie i realizacja auditów wewnętrznych Dobór i szkolenie auditorów wewnętrznych Prowadzenie zapisów dotyczących auditorów i auditów Przygotowywanie przeglądów zarządzania i prowadzenie zapisów
14 Inicjowanie lub ocena działań korygujących lub zapobiegawczych Nadzór nad dokumentacją systemu jakości: księga jakości, procedury Planowanie i prowadzenie szkoleń wewnętrznych w zakresie systemu jakości Zakres obowiązków kierownictwa technicznego (np. kierownika laboratorium lub jego działu) Odpowiedzialność za stronę merytoryczną wykonywanych badań Nadzorowanie i/lub planowanie dla wyposażenia pomiarowego i badawczego: a) wzorcowań b) sprawdzeń c) konserwacji i napraw d) modernizacji i modyfikacji Nadzór nad zakupami usług i dostaw Współpraca z laboratoriami wzorcującymi Ocena kompetencji technicznych podwykonawców Inicjowanie i/lub nadzorowanie działań korygujących lub zapobiegawczych Nadzorowanie niezgodnych z wymaganiami badań Uczestnictwo w auditach wewnętrznych i przeglądach zarządzania Prowadzenie i/lub nadzorowanie szkoleń wewnętrznych w zakresie obsługi wyposażenia, technik i metod badawczych Sporządzanie wykazów wyposażenia pomiarowego i badawczego oraz metod badawczych Aktualizacja metod badawczych Nadzór nad walidacją metod badawczych Nadzór nad personelem wykonującym badania Weryfikacja zapisów i wyników badań Opracowanie i/lub nadzorowanie planów sterowania jakością badań Autoryzacja sprawozdań z badań
3. Politykę szkolenia uwzględniającą: — szkolenia wewnętrzne realizowane np. poprzez okresowe zebrania personelu, na których przedstawiane będą informacje zdobyte przez pracowników na szkoleniach zewnętrznych, lub zajęcia z zaproszonymi ekspertami; — szkolenia zewnętrzne realizowane na kursach w specjalistycznych jednostkach, np. w zakresie kompetencji technicznych lub systemów zarządzania jakością. Polityka szkolenia powinna być zróżnicowana w zależności od stanowiska pracy i pełnionych funkcji, np. można przyjąć następujący zakres szkoleń: — organizacja i zarządzanie, — systemy jakości w świetle norm europejskich i międzynarodowych, — wybrane elementy metrologii, — metody statystyczne w badaniach laboratoryjnych,
15 — podstawowe zagadnienia normalizacji, — wyposażenie pomiarowe, metody i techniki badawcze, — technika informatyczna w badaniach laboratoryjnych. Można przyjąć, że personel kierowniczy powinien być szkolony w zakresie wszystkich wymienionych grup tematycznych, ze szczególnym uwzględnieniem problemów organizacji i zarządzania oraz systemów – jakości. Personel badawczy z wyższym wykształceniem wymaga szczególnego przygotowania w dziedzinie metrologii, statystyki, stosowania wyposażenia pomiarowego i technik badawczych, informatyki i systemów zapewnienia jakości. Personel pomocniczy (techniczny) wymagać będzie odpowiedniego szkolenia w zakresie obsługi wyposażenia pomiarowego i technik badawczych. Szczegółowe programy szkolenia mogą się różnić w zależności od specyfiki wykonywanych badań i wielkości laboratorium. Polityka szkolenia powinna również uwzględniać programy szkoleń dla pracowników nowo przyjętych. Programy takie mogą być opracowywane indywidualnie w zależności od stanowisk pracy, a także stażu i kwalifikacji (referencji) pracownika nowo przyjętego. Wskazane jest, aby laboratorium określało obecne i perspektywiczne (rozwojowe) plany szkoleniowe. Laboratorium powinno prowadzić zapisy ze szkoleń wewnętrznych, potwierdzone np. podpisami pracowników uczestniczących w szkoleniu. Laboratorium powinno również posiadać aktualny rejestr szkoleń, jakie odbyli pracownicy, jak również rejestr dotyczący każdego pracownika, w którym będą dane na temat: — wykształcenia pracownika (odpisy świadectw szkolnych, dyplomów), — ukończonych kursów zewnętrznych i wewnętrznych (zaświadczenia, zapisy), — kopie dokumentów działalności publikacyjnej lub ekspertyzowej (wykazy publikacji itp.), — wyników udziału w badaniach biegłości (jeśli dotyczą indywidualnej oceny kompetencji pracownika). Rejestry mogą znajdować się u kierownika laboratorium lub w dziale służb pracowniczych (dotyczy to dużych jednostek organizacyjnych).
1.7. Pomieszczenia i środowisko Środowisko, w którym wykonywane są analizy laboratoryjne nie może stanowić przyczyny unieważnienia wyników badania, czy też oddziaływać niekorzystnie na wymaganą dokładność pomiarów. Miejsce wykonywania badań (jeśli jest to istotne) powinno być zabezpieczone w odpowiedni sposób przed nadmiernym wpływem takich czynników, jak: temperatura, zapylenie, wilgotność, para, zanieczyszczenia mikrobiologiczne przenoszone przez powietrze i kurz, hałas, drgania, zakłócenia elektromagnetyczne i w związku z tym stan zabezpieczenia musi być stale utrzymany. W uzasadnionych przypadkach laboratorium powinno zapewnić odpowiednie warunki środowiska i regulacji tych warunków, niezbędne dla określonych badań. Powinno być odpowiednie oświetlenie i np. osłony przed promieniowaniem. Próbki, odczynniki, materiały odniesienia i wzorce robocze należy tak przechowywać, aby zapewnić ich integralność. Laboratorium powinno zabezpieczyć je przed pogorszeniem ich jakości w wyniku działania środowiska, zanieczyszczeniem lub utratą tożsamości, np. nie jest wskazane przechowywanie w jednym pojemniku, szafie lub lodówce chemicznych wzorców roboczych lub materiałów odniesienia albo odczynników łącznie z badanymi próbkami.
16 Pomieszczenia laboratorium powinny być wystarczająco przestronne, aby ograniczyć ryzyko powstawania uszkodzeń wyposażenia lub zagrożeń dla obsługi oraz umożliwić jej precyzyjne wykonywanie zadań. Pomieszczenia laboratorium powinny posiadać wymagane wyposażenie i źródła zasilania niezbędne do wykonywania badań. W tym samym pomieszczeniu nie mogą być wykonywane badania lub czynności laboratoryjne, których wzajemny wpływ na przebieg badania jest niekorzystny. Jeżeli badania tego wymagają pomieszczenia muszą być wyposażone w urządzenia do monitorowania warunków środowiska. Przykładem może być pokój wagowy, w którym warunki środowiska (temperatura, wilgotność) mogą wpływać na wynik badania. Niekorzystne oddziaływanie środowiska w pokoju wagowym może dotyczyć zarówno wagi, jak i badanych próbek lub odważanych materiałów pomocniczych. Może okazać się konieczne określenie granicznych parametrów dla środowiska, a następnie ich monitorowanie i rejestrowanie oraz podejmowanie odpowiednich decyzji (np. wstrzymanie badań), jeśli wymagania nie są spełnione. Prace ze szczególnie niebezpiecznymi substancjami powinny być wykonywane w wydzielonych pomieszczeniach. Należy wydzielić odpowiednie pomieszczenie do wykonywania analizy sensorycznej. W laboratorium powinno znajdować się miejsce lub pomieszczenie do przyjmowania próbek od klientów (jeśli ma to zastosowanie). Sposób i warunki przechowywania próbek przed badaniem powinny być ustalone. Jeżeli jest to konieczne i możliwe należy również wskazać miejsce lub pomieszczenie przechowywania próbek po badaniach (archiwum próbek). Jeśli to możliwe – próbki powinny być przechowywane przez okres odpowiadający terminowi składania i rozpatrywania reklamacji klientów. Należy określić zasady dostępu do laboratorium osób spoza laboratorium (pracowników innych jednostek organizacyjnych, gości, klientów itp.), np. wprowadzić obowiązkową rejestrację gości i klientów przed wejściem do laboratorium, wydawanie przepustek, identyfikatorów. Ze względu na charakter wykonywanych badań może okazać się konieczne uregulowanie dostępu pracowników do niektórych pomieszczeń laboratorium. Ograniczenia mogą mieć na celu zabezpieczenie środowiska pomieszczeń, bezpieczeństwo pracy, poufność badań lub ochronę próbek przed zanieczyszczeniem. Typowe przykłady to praca z materiałami wybuchowymi, substancjami radioaktywnymi lub substancjami rakotwórczymi, badania mikrobiologiczne, analiza śladowa. Jeżeli takie ograniczenia obowiązują, to personel powinien być powiadomiony o: — przewidywanym przeznaczeniu poszczególnych pomieszczeń laboratorium; — ograniczeniach nałożonych na pracujących w tych pomieszczeniach laboratorium; — powodach takich ograniczeń. Przy wyborze pomieszczeń przeznaczonych do prac specjalnych należy uwzględnić poprzednie wykorzystanie pomieszczenia. Przed jego zagospodarowaniem należy je sprawdzić i upewnić się, że jest pozbawione zanieczyszczeń i źródeł emisji. Przy wykonywaniu analiz śladowych, np. metali w żywności lub materiale biologicznym istotny może być wpływ pyłu atmosferycznego pochodzącego ze źródeł zewnętrznych (pył uliczny) i wewnętrznych (sufity, ściany, meble, wyposażenie pomiarowe, ubrania pracowników). Cząstki pyłu zawierają przede wszystkim te pierwiastki, które występują w skorupie ziemskiej (Si, Al, Fe, Ca, Na, K, Mg, P), a także pierwiastki antropogenicznego pochodzenia (Hg, Cu, Cd, Pb, Ni, Co, Zn, Mn). Konieczne może być wówczas korzystanie ze specjalnie czystego pokoju (clean room) oddzielonego śluzą od innych pomieszczeń z nawiewem przefiltrowanego powietrza. Urządzenie
17 takiego pokoju jest bardzo kosztowne i często do badań specjalnych wystarczy zastosowanie komory laminarnej, do której powietrze jest wtłaczane przez specjalne filtry. Najprostszym testem, który pozwala ocenić jakość powietrza w pomieszczeniach analitycznych są wyniki analizy prób ślepych (odczynnikowych) lub ślepe oznaczania z udziałem matrycy wolnej od badanych składników.
1.8. Wyposażenie pomiarowe i badawcze Laboratorium powinno dysponować wyposażeniem pomiarowym i badawczym, niezbędnym do wykonywanych badań, pomiarów i pobierania próbek. Wyposażenie pomiarowe i badawcze powinno być zgodne ze specyfikacjami metod badawczych i procedur pobierania próbek oraz być obsługiwane przez uprawniony personel. Jeżeli laboratorium korzysta z części wyposażenia pomiarowego i badawczego – niebędącego jego własnością – należy spowodować, aby przyjęta polityka i wymagania systemu jakości w zakresie nadzoru nad wyposażeniem zostały spełnione. Oznacza to, że jeśli laboratorium korzysta z wyposażenia niebędącego jego własnością, to powinno uzgodnić z właścicielem i udokumentować sposób prowadzenia nadzoru ze strony laboratorium (obsługiwanie, wzorcowanie, zapisy). Zasady nadzoru nad wyposażeniem, m.in. obejmujące nabywanie, obsługiwanie, wzorcowanie, sprawdzanie, identyfikację (oznakowanie), postępowanie w sytuacjach awaryjnych oraz wskazanie odpowiedzialności – powinny być udokumentowane w postaci procedury. Wyposażenie stosowane w laboratoriach chemicznych można podzielić na cztery zasadnicze kategorie: — przyrządy pomiarowe wraz z systemami komputerowymi, — naczynia pomiarowe, — wzorce i materiały odniesienia, — materiały pomocnicze, w tym odczynniki chemiczne, — sprzęt pomocniczy. Wyposażenie stosowane do badań, włączając w to wyposażenie do pomiarów pomocniczych (np. warunków środowiskowych), które ma znaczący wpływ na wiarygodność wyników badania lub pobierania próbki powinno być wzorcowane przed włączeniem do użytkowania, a następnie zgodnie z ustalonym programem. Należy zapewnić właściwe sprawdzanie wyposażenia między kolejnymi datami wzorcowań, aby upewnić się czy w dalszym ciągu jest ono ważne jak również określić plany jego konserwacji. Wzorcowanie wyposażenia może być wykonywane: 1. W instytucjach zewnętrznych, np. w laboratoriach Urzędu Miar, albo w akredytowanych laboratoriach wzorcujących (tzw. pomiarowych). W świadectwie wzorcowania danego obiektu wyposażenia (przyrządu pomiarowego lub wzorca odniesienia) powinna być wymieniona m.in. procedura wzorcowania oraz podana cecha wzorca (np. państwowego), z jakim wskazania danego przyrządu pomiarowego porównano, wyniki wzorcowania, niepewność pomiaru. W ten sposób mogą być wzorcowane, np. wagi analityczne, termometry lub wzorce robocze masy. 2. W laboratorium przez porównanie z wzorcem odniesienia lub wzorcem analitycznym odniesienia, albo z certyfikowanym materiałem odniesienia. Wynik wzorcowania może być czasem wyrażany jako współczynnik wzorcowania, np. jako współczynnik nachylenia b, w równaniu regresji liniowej y = a + bx. W ten
18 ostatni sposób mogą być wzorcowane, np. spektrofotometry lub chromatografy (a właściwie detektory tych przyrządów). Tryb postępowania przy wzorcowaniu powinien być opisany, np. w procedurze badawczej lub w innym dokumencie. Wzorcowanie (kalibracja), np. układów detekcyjnych spektrofotometrów lub chromatografów może być wykonywane przy każdym badaniu za pomocą 5–10 wzorców chemicznych (materiałów odniesienia) o różnym poziomie zawartości (stężeniu) badanego składnika lub okresowo, a przy każdym badaniu sprawdzane za pomocą np. dwóch różnych wzorców analitycznych. Laboratorium powinno prowadzić zapisy z wzorcowania i/lub sprawdzania obiektów wyposażenia. W zapisach, dotyczących wzorcowań wykonywanych w laboratorium, należy zawsze podać cechy identyfikacyjne wzorca, datę oraz wyniki wzorcowania wraz z niepewnością. W przypadku wzorców analitycznych przygotowanych w laboratorium może to być nadany przez producenta numer serii wzorca lub odczynnika, z którego przygotowano wzorzec, łącznie z podaniem daty przygotowania. 1.8.1. Przyrządy pomiarowe i systemy komputerowe Przyrządy pomiarowe, zgodnie z definicją podaną w słowniku metrologicznym, są to urządzenia przeznaczone do wykonywania pomiarów, pracujące samodzielnie lub z urządzeniami dodatkowymi. W chemii analitycznej przyrządami pomiarowymi mogą być urządzenia do bezpośredniego pomiaru wielkości fizycznych: — temperatury : termometry; — ciśnienia : manometry; — wilgotności : higrometry; — czasu : stopery, zegary; — masy : wagi analityczne; — objętości : kolby pomiarowe, pipety, biurety; — przepływu gazów i/lub cieczy : przepływomierze; — przewodności, np. elektrycznej : konduktometry, elektrody jonoselektywne. Stosowane są również przyrządy do pośredniego pomiaru produktów otrzymanych w wyniku różnego rodzaju reakcji chemicznych lub przemian fizykochemicznych. Do takich przyrządów pomiarowych należą np. — spektrofotometry UV, VIS lub IR, — spektrofotometry AA, ICP, — chromatografy gazowe, cieczowe. Przyrządy pomiarowe wymagają wzorcowania (kalibracji) oraz niezależnie sprawdzania, które może być wykonywane w laboratorium lub w instytucjach zewnętrznych, podobnie jak wzorcowanie. Zakres sprawdzeń niektórych przyrządów pomiarowych i sprzętu pomocniczego wykonywanych w laboratorium lub przez inne organizacje może obejmować: 1. Chromatografy (różne rodzaje chromatografii): — poprawność działania całego układu chromatograficznego (szczelność połączeń, stan techniczny części eksploatacyjnych, stabilność przepływu fazy ruchomej); — powtarzalność (precyzja) analiz tej samej próbki; — sprawność kolumny (układu rozdzielającego), w tym takich parametrów, jak rozdzielczość, liczba półek teoretycznych, dane retencyjne; — sprawność detektora, w tym czułość, poziom szumów, selektywność, liniowość;
19 — system grzania i termostatowania, w tym stabilność i dokładność temperatury termostatu, dozownika i detektora; — dokładność i stabilność pracy autodozownika, w tym powtarzalność w czasie programu dozowania próbek; 2. Spektrofotometry i spektrometry: — stabilność i dokładność ustawienia wybranej długości fali; — stabilność źródła promieniowania elektromagnetycznego; — sprawność układu detekcyjnego, w tym stabilność, selektywność, rozdzielczość, liniowość, dokładność; — poziom szumów w stosunku do sygnału; 3. Konduktometry, pH–metry, elektrody jonoselektywne: — spadek lub pełzanie sygnału elektrody; 4. Urządzenia grzejne, chłodzące, sterylizatory, inkubatory, łaźnie wodne i olejowe: — sprawdzanie systemu kontroli i pomiaru temperatury za pomocą wzorcowych termometrów; — stabilność i powtarzalność parametrów układów grzejnych lub chłodzących; — zdolność układów do osiągania i podtrzymywania podciśnienia i nadciśnienia oraz systemu pomiarów tych parametrów; 5. Mikroskopy: — oznaczenie zdolności rozdzielczej; — skalowanie pola obserwacji (do pomiarów wielkości obiektów włóknistych i izometrycznych); 6. Urządzenia do pobierania próbek powietrza: — stabilność przepływu zasysanego powietrza przed i po pobraniu próbki; — szczelność układu zasysającego. Stosowanie komputerów oraz innych urządzeń elektronicznych, przeznaczonych do przetwarzania, zarządzania, zapisywania, składowania lub wywoływania danych dotyczących wzorcowań lub badań, powinno spełniać określone wymagania dotyczące w szczególności: — oprogramowania, które powinno być licencjonowane i w pełni udokumentowane; — zapewnienia ochrony integralności danych w procesach pozyskiwania, przetwarzania, przesyłania i składowania danych; — środowiska i warunków pracy w pomieszczeniach, w których pracują komputery i urządzenia elektroniczne przetwarzania danych, aby zapewnić ich właściwe działanie; — zapewnienia ochrony danych na dyskach magnetycznych, łącznie z zabezpieczeniem przed nie upoważnionym dostępem do danych i dokonywaniem zmian w zapisach. W przypadku programów komputerowych opracowane w laboratorium lub wykonanych na zamówienie, należy przeprowadzić ich walidację np. przez okresowe wprowadzanie tych samych danych i porównanie wyników lub przez wykonanie równoległych obliczeń za pomocą innych narzędzi. Szczegółów dotyczących stosowania komputerów w laboratorium można poszukiwać we właściwych dokumentach – poradnikach, przewodnikach dotyczących kompetencji laboratorium. 1.8.2. Naczynia pomiarowe Naczynia pomiarowe stosowane w analizie chemicznej, tj. kolby pomiarowe, pipety, biurety powinny być odpowiednio obsługiwane. Jeżeli jest to istotne, należy okresowo
20 sprawdzać objętość tych naczyń, np. metodą grawimetryczną lub ustalać współmierność np. kolby z pipetą. Należy zwrócić baczną uwagę na możliwość zanieczyszczenia badanej próbki na skutek używania niedostatecznie oczyszczonych naczyń pomiarowych, zwłaszcza po poprzednich analizach. Materiał, z którego wykonano naczynie pomiarowe (szkło, teflon itp.), a także mycie, przechowywanie i segregacja naczyń mają decydujące znaczenie zwłaszcza w przypadku analiz śladowych, gdzie istotne mogą być straty substancji badanej spowodowane adsorbcją lub absorbcją. 1.8.3. Spójność pomiarowa Laboratorium powinno posiadać i stosować odpowiednie wzorce odniesienia (np. termometry, odważniki) lub materiały odniesienia (np. wzorce chemiczne) posiadające odpowiednie świadectwa. Wzorce lub materiały odniesienia podobnie jak przyrządy powinny być okresowo wzorcowane zgodnie z ustalonym w laboratorium programem. Laboratorium powinno zapewnić powiązanie swoich własnych wzorców jednostek miar (a tym samym przyrządów pomiarowych) z jednostkami miar układu SI za pośrednictwem nieprzerwanego łańcucha wzorcowań lub porównań łączących je z odpowiednimi wzorcami pierwotnymi jednostek miar układu SI. Powiązanie z jednostkami miar układu SI może być uzyskane poprzez odniesienie do państwowych wzorców jednostek miar. Jako wzorce w analizie chemicznej najlepiej stosować certyfikowane materiały odniesienia. Inne materiały dostępne w handlu lub wzorce analityczne przygotowane w laboratorium z substancji chemicznych o znanej czystości i składzie, powinny w miarę możliwości być porównane z odpowiednimi certyfikowanymi materiałami odniesienia. Wzorce odniesienia, np. masy, temperatury mogą służyć do sprawdzania wag analitycznych i termometrów pomiarowych, używanych na co dzień. Wzorce odniesienia, certyfikowane materiały odniesienia oraz odczynniki i materiały stosowane do sporządzania wzorców analitycznych w laboratorium, powinny być używane wyłącznie do tego celu. Materiały odniesienia i wzorce analityczne należy nabywać od dostawców, posiadających potwierdzone kompetencje. Jednakże kompetencje dostawcy nie zawsze gwarantują automatycznie jakośćwyrobówtakiegoproducentai laboratoriumpowinnopodejmowaćrozsądnedziałaniaw celu potwierdzenia jakości wzorców chemicznych. Niezależnie od pochodzenia wzorca użytkownik odpowiada za sprawdzenie, czy jakość takich wzorców jest zadowalająca. Zwykle nowa partia wzorca analitycznego powinna być sprawdzona przez porównanie ze starą. Powinny być dostępne informacje dotyczące czasu przechowywania, warunków przechowywania, możliwości stosowania i ograniczeń w użyciu. Wzorce analityczne zakupione lub wytwarzane w laboratorium należy wyraźnie oznakować i nie przechowywać łącznie z materiałami (odczynnikami) pomocniczymi lub próbkami do badań. Wszystkie czynności związane z materiałami odniesienia i wzorcami chemicznymi powinny odbywać się w taki sposób, żeby uchronić je przed zanieczyszczeniami lub stratą substancji oznaczanej (analitu). 1.8.4. Sprzęt pomocniczy i materiały pomocnicze W laboratorium analitycznym stosowany jest sprzęt pomocniczy: lodówki, cieplarki, łaźnie wodne, płyty grzejne, eksykatory, mineralizatory, mieszadła, pompy itp. Najczęściej stosowane materiały pomocnicze (zużywalne) to: odczynniki chemiczne, sorbenty, naczynia laboratoryjne niemiarowe, sączki itp.
21 Odczynniki chemiczne przygotowane w laboratorium powinny być odpowiednio etykietowane. Rodzaj i częstość używanego do badań odczynnika powinny być dokładnie takie same, jak podane w opisie metody, łącznie ze wskazówkami dotyczącymi środków ostrożności przy jego przygotowaniu i użyciu. Odczynniki przygotowane w laboratorium powinny być zaopatrzone w etykiety, zawierające następujące informacje: — nazwę substancji, — stężenie lub miano, — datę przygotowania, — datę ważności (jeśli wymagana), — nazwisko i imię (inicjały) osoby przygotowującej, — użyty rozpuszczalnik (jeśli inny niż woda), — sposób przechowywania, wpisać odpowiedni symbol, np. tZ — temperatura zamrażalnika (do –18oC) tL — temperatura chłodziarki (ok. +5oC) tP — temperatura pokojowa (20, 25oC); ponadto, jeśli to konieczne napisy lub znaki ostrzegawcze, np. — palny, — wybuchowy, — trucizna, — żrące, — chronić przed światłem. Jeżeli z powodu małych rozmiarów naczynia z odczynnikiem nie jest możliwe umieszczenie na etykiecie ww. informacji, należy na naczyniu umieścić odpowiedni identyfikator, a pełny opis zamieścić w odpowiednim dokumencie przechowywanym w miejscu znanym personelowi laboratorium. Na każdym oryginalnym (fabrycznym) opakowaniu odczynnika (substancji) chemicznego należy zapisać datę pierwszego otwarcia, jeśli odczynnik będzie używany wielokrotnie w dłuższym odstępie czasu. 1.8.5. Dokumentowanie wyposażenia Wskazane jest opracowanie wykazów różnych kategorii wyposażenia i określenie odpowiedzialności za nadzór nad wyposażeniem. Oprócz wykazów wyposażenia laboratorium powinno posiadać właściwą dokumentację przyrządów pomiarowych, wzorców, materiałów odniesienia i istotnego w badaniach sprzętu pomocniczego. Dokumentacja może obejmować: — protokóły (karty) zainstalowania (przykład w zał. 1.5.), — zapisy dotyczące wzorcowań i/lub sprawdzeń, w tym świadectwa z laboratoriów wzorcujących, — zapisy dotyczące napraw i konserwacji (przykład w zał. 1.6.), — instrukcje obsługi, — dzienniki pracy (przyrządów). Zwykle dokumenty dotyczące danego obiektu wyposażenia gromadzone są w laboratorium w tzw. księdze LOG. Wyposażenie powinno być we właściwy sposób oznakowane (etykietowane) w celu jego niepowtarzalnej identyfikacji, nadania statusu metrologicznego (podania daty ostatniego i następnego wzorcowania) oraz stwierdzenia przydatności do użycia.
22
1.9. Metody badań i ich walidacja Laboratorium powinno stosować udokumentowane metody badań, gwarantujące otrzymanie poprawnego wyniku, nieobciążonego błędami systematycznymi. Metody stosowane w chemii analitycznej można podzielić na metody klasyczne i instrumentalne. Metody klasyczne oparte są na pomiarze masy lub reakcjach chemicznych. W wyniku reakcji chemicznej powstaje sygnał analityczny, który mierzony jest w sposób bezpośredni. Do metod klasycznych zalicza się metody miareczkowe – sygnałem jest objętość roztworu mianowanego, zużytego do miareczkowania, oraz metody wagowe, w których sygnałem jest masa wytrąconego osadu lub zgromadzonego pyłu. Jedynym przyrządem pomiarowym stosowanym w metodach klasycznych jest waga analityczna, służąca do pomiaru wielkości fizycznej – masy. Metody instrumentalne oparte są na zjawiskach fizykochemicznych lub fizycznych, w których sygnał analityczny uzyskuje się za pomocą mniej lub bardziej złożonych przyrządów pomiarowych. W metodach instrumentalnych wykorzystuje się zależność mierzonych wielkości fizycznych lub fizykochemicznych od zawartości składnika w próbce. Do metod instrumentalnych zalicza się np. techniki spektrofotometryczne i chromatograficzne. Metody klasyczne i instrumentalne mogą być stosowane zarówno w analizie ilościowej jak i jakościowej. Laboratorium powinno dokonać wyboru spośród metod: — znormalizowanych państwowych, — znormalizowanych europejskich i międzynarodowych, — zalecanych przez renomowane instytucje, wiodące w danej dziedzinie, — opisanych w fachowym piśmiennictwie, — opracowanych w laboratorium (własnych). Laboratorium może stosować więcej niż jedną metodę analityczną dla danego rodzaju badania, jeśli są to metody równorzędne pod względem jakości. Wybór metody analitycznej może być uwarunkowany: — wymaganiami klientów, — wymaganiami prawnymi, — możliwościami technicznymi laboratorium. Jeśli laboratorium posiada dowody, że znormalizowana metoda badania wydana jako Polska Norma nie spełnia wymagań jakościowych, może wystąpić do właściwego Komitetu Technicznego Polskiego Komitetu Normalizacyjnego, o unieważnienie danej normy. Jeśli laboratorium wykonuje badania na umowę/zlecenie, to każda przewidziana do stosowania metoda nieznormalizowana powinna być uzgodniona z klientem na etapie przeglądu oferty / zamówienia. Laboratorium powinno prowadzić właściwy nadzór nad metodami badań polegający na: — walidacji metod badań wg ustalonych przez laboratorium kryteriów i posiadaniu odpowiedniej dokumentacji; — dokumentowaniu odstępstw, o ile nie wpływają one negatywnie na wynik analizy; — aktualizacji zmian wprowadzanych do norm państwowych lub międzynarodowych przez komitety normalizacyjne; — aktualizacji metod znormalizowanych (nowelizacje, uzupełnienia, unieważnienia); — kontroli systemu rozpowszechniania (liczba oficjalnych, ponumerowanych egzemplarzy w laboratorium i u kogo się znajdują).
23 Metody nieznormalizowane powinny być udokumentowane (opisane) w formie procedury badawczej i posiadać niepowtarzalne identyfikatory (w tym status wydania np. numer edycji, data). Laboratoria powinny ustalić wymaganą zawartość i formę procedury badania do analiz ilościowych i jakościowych (jeśli takie wykonuje). W analizie jakościowej, obejmującej identyfikację różnych substancji chemicznych np. metodą spektrometrii masowej, postępowanie badawcze związane będzie z techniką analityczną, a nie z badaną substancją. Treść procedury badania może zawierać: 1. Opis metody analitycznej, w tym: — zakres stosowania i ograniczenia, — przyrządy pomiarowe i materiały pomocnicze, — przygotowanie wzorców i przeprowadzenie wzorcowania, — zasady i warunki pobrania próbek (jeśli dotyczy), — postępowanie z próbkami, — wykonanie oznaczania, — inne szczególne ustalenia, — obliczenie wyniku, 2. Dane uzyskane w procesie walidacji metody; 3. Zasady wewnętrznego sterowania jakością analiz: — badania powtarzane, — materiały odniesienia, — karty kontrolne — kryteria oceny. Cechą charakteryzującą wynik analizy uzyskiwany w warunkach laboratorium daną metodą za pomocą danego wyposażenia pomiarowego jest niepewność pomiaru. W ostatnim dziesięcioleciu organizacje normalizacyjne europejskie i międzynarodowe oraz liczne stowarzyszenia naukowe i grupy dyskusyjne, skupiające przedstawicieli laboratoriów różnych branż i specjalności, opublikowały szereg prac przedstawiających kryteria działania i wymagania techniczne dla laboratoriów analitycznych (pozycje piśmiennictwa: 1, 6, 7, 8, 10, 12, 17, 30). Jednym z ważniejszych wymagań dotyczących kompetencji technicznych laboratorium jest zebranie i przedstawienie dowodów potwierdzających właściwą jakość stosowanych metod badań. Ocenę jakości metody poprzez jej scharakteryzowanie przeprowadza się w procesie walidacji. Według normy PN–EN ISO/IEC 17025 (2001) walidacja jest potwierdzeniem przez zbadanie i przedstawienie obiektywnego dowodu, że zostały spełnione szczególne wymagania dotyczące konkretnie zamierzonego zastosowania. W praktyce laboratoryjnej oznacza to proces sprawdzania czy opracowana lub wskazana metoda analityczna jest przydatna do rozwiązania danego problemu. Jeśli nie określono takiego problemu, walidacja metody analitycznej polega na ustaleniu charakterystyki sprawności działania i ograniczeń stosowania metody analitycznej. Panuje powszechne przekonanie, że wystarczające jest, jeśli walidację metody przeprowadzi się podczas jej opracowywania, i że proces ten nie dotyczy stosowania w laboratorium metod znormalizowanych lub oficjalnie zalecanych, np. metod farmakopealnych. Pogląd taki jest tylko częściowo słuszny, bowiem metody znormalizowane lub oficjalne mają określone niektóre cechy charakterystyki, na ogół na podstawie wyników badań międzylaboratoryjnych, w warunkach, które jedynie z pewnym prawdopodobieństwem można uznać za reprezentatywne dla wszystkich laboratoriów stosujących w przyszłości daną metodę. W praktyce, w warunkach i okolicznościach występujących w danym
24 laboratorium, cechy metody nie zawsze muszą posiadać wartości zbieżne z danymi uzyskanymi w warunkach międzylaboratoryjnych. Może to być spowodowane takimi okolicznościami, jak: — różne warunki środowiskowe podczas stosowania metody w danym laboratorium, — zróżnicowane kwalifikacje personelu, — zastosowanie wyposażenia o odmiennej charakterystyce, — wykonywanie oznaczań w różnych matrycach, — występowanie czynników zakłócających w środowisku laboratorium lub badanych matrycach. Należy zdecydować, jaki powinien być optymalny zakres charakteryzacji metody analitycznej, biorąc pod uwagę z jednej strony cel badania i wymagania klientów, z drugiej dostępne informacje, dotyczące charakteryzacji metody, właściwości analitu, techniki analityczne, rodzaj matrycy, substancje współwystępujące w badanej próbce itp. Zakłada się, że w przypadku metody znormalizowanej laboratorium powinno potwierdzić doświadczalnie, czy jest w stanie uzyskać wartości cech charakteryzacji, zbieżne z wartościami podanymi w normie. Jeżeli norma nie przedstawia charakteryzacji metody lub jeśli metoda znormalizowana jest stosowana poza jej zakresem, należy przeprowadzić jej walidację tak, jak w przypadku metod nieznormalizowanych, w zakresie zgodnym z przeznaczeniem metody. Charakteryzacja metody powinna odpowiadać założonym kryteriom, np. określonym przez klientów, podanym w przepisach, wyznaczonym statystycznie. Powinno się prowadzić i przechowywać zapisy z walidacji obejmujące np.: — opis sposobu przygotowania próbek materiałów wzorcowych lub odniesienia, — użyte naważki i objętości roztworów, — rodzaj zastosowanych matryc, — kryteria doboru warunków analitycznych, — warunki środowiskowe w miejscu badania, jeśli istotne, — procedurę (metodę) analityczną, — wyniki analiz (nieprzetworzone), — wyniki charakteryzacji, — dane dotyczące zastosowanych przyrządów pomiarowych i materiałów pomocniczych, — odniesienie do piśmiennictwa, — datę (–y) badania charakteryzacji metody, — datę, imię i nazwisko wykonawcy, podpis, — datę, imię, nazwisko, podpis zatwierdzającego dane walidacyjne wraz z oświadczeniem, że dana metoda jest odpowiednia do zamierzonego zastosowania. W procesie charakteryzacji metod analitycznych mogą być stosowane następujące narzędzia: — próby ślepe odczynników i / lub matryc, — próbki wzbogacone tj. najczęściej próbki rzeczywiste, do których dodano badany analit (ang. fortification), — próbki domieszkowane tj. próbki zawierające matrycę, do której dodano badany analit (ang. spiking), — próbki rzeczywiste (obiektów/materiałów badanych) o dobrze scharakteryzowanej zawartości analitu, — materiały odniesienia nabyte w handlu lub przygotowane w laboratorium, — certyfikowane materiały odniesienia, w których wartość danej cechy jest scharakteryzowana przez uznane instytucje z podaniem niepewności,
25 — wzorce pomiarowe stanowiące w chemii analitycznej roztwory pojedynczych substancji lub ich mieszanin, — analizy powtarzane próbek rzeczywistych lub archiwalnych przy użyciu tej samej metody, — analizy powtarzane przy użyciu dwóch metod, z których jedna uznana jest za metodę odniesienia. Dane uzyskane w procesie charakteryzacji metody wymagać będą końcowego opracowania przy użyciu odpowiednich technik statystycznych. Ponownej, częściowej lub całkowitej walidacji metody analitycznej laboratorium powinno dokonać, gdy: — zmieniły się parametry metody (stwierdzone np. w wyniku wewnętrznej kontroli jakości badań); — zmieniły się matryce, w których oznacza się dany składnik (np. żywność, leki); — zmieniono materiały pomocnicze (np. rodzaj filtrów, pochłaniaczy); — zmieniła się zasada metody; — zastosowano przyrząd pomiarowy innej generacji. Przykładowy zakres charakteryzacji metody analitycznej przedstawiono w tab. 1.2. Tabela 1.2. Przykładowy zakres charakteryzacji metody analitycznej Analiza ilościowa Analiza jakościowa
analiza zawartości/stężeń minimalnych (śladowych)
analiza zawartości/stężeń maksymalnych (granicznych)
Granica wykrywalności
granica oznaczania ilościowego
zakres roboczy i liniowy
Specyficzność
zakres roboczy i liniowy
granica oznaczania ilościowego (opcjonalnie)
specyficzność
specyficzność
poprawność
poprawność
powtarzalność
powtarzalność
czułość
czułość
Na charakterystykę metody mogą mieć wpływ różne czynniki laboratoryjne, jak personel, wyposażenie pomiarowe i badawcze lub związane bezpośrednio ze środowiskiem wykonywania analizy (temperatura, ciśnienie, pH). Wpływ czynników laboratoryjnych na jakość metody w laboratorium określa się mianem wrażliwości (robustness). Wrażliwość może zasadniczo wpływać na precyzję pośrednią metody. Wpływ warunków różnych laboratoriów na charakterystykę metody określany jest odpornością (ruggedness). Odporność może być uważana za cechę wpływającą na precyzję odtwarzalności metody.
1.10. Pobieranie próbek i postępowanie z próbkami Laboratoria mogą pobierać próbki, badać je laboratoryjnie, jak również wykonywać badania próbek dostarczonych przez klientów.
26 1.10.1. Pobieranie próbek do badań Jeżeli celem badania jest ocena danej cechy (w próbce), charakteryzująca populacje generalną, to metody pobierania próbek w badaniach środowiska, żywności lub kontroli jakości wyrobów u producenta powinny gwarantować reprezentatywność próbki w stosunku do badanej populacji oraz integralność próbki. Należy przyjąć, że próbki do badań pobiera się w sposób losowy. Dobór losowy próbek jest praktycznie jedynym sposobem, przy którym unika się błędów systematycznych, a dzięki rachunkowi prawdopodobieństwa można oszacować błędy przypadkowe. Możliwe jest również tendencyjne pobieranie próbek, jeżeli wynika to z celu badania. Jeżeli laboratoria stosują w badaniach metody znormalizowane, to zasady pobierania próbek (strategia) i warunki techniczne, np. niezbędne przyrządy, objętość próbki, warunki transportu i przechowywania, trwałość – przeważnie podane są w treści metody badawczej znormalizowanej. W niektórych badaniach środowiskowych bardziej szczegółowe zasady pobierania próbek, zostały opisane we właściwych normach. Jeśli laboratorium nie stosuje znormalizowanych metod pobierania próbek, to powinna zostać opracowana w laboratorium i udokumentowana (opisana) własna procedura pobierania próbek, zawierająca przede wszystkim tzw. ogólną strategię pobierania, która może być uzupełniona o bardziej szczegółowy plan, dotyczący danego problemu – klienta (miejsce, czas, liczność, dobór obiektów, interpretację wyników itp.). Parametry techniczne pobierania próbek, jak rodzaj próbnika (jeśli dotyczy), trwałość, odzysk z matrycy, powinny być potwierdzone w procesie walidacji danej metody analitycznej. System jakości towarzyszący pobieraniu próbek w terenie powinien uwzględniać: — wskazanie pracowników odpowiedzialnych za skompletowanie ekipy pobierającej próbki i przygotowanie urządzeń do pobierania próbek (jeśli dotyczy); — nadzór nad wyposażeniem pomiarowym stosowanym w terenie, przed, w trakcie i po pobraniu próbek (wzorcowanie, sprawdzanie, konserwacja); — nadzór nad pobieraniem próbek w terenie; — niepowtarzalne oznakowanie próbek; — sporządzanie odpowiednich zapisów, np. protokołów pobierania próbek. Wszystkie ww. elementy mogą mieć wpływ na wynik badania próbki w laboratorium. Zapisy dotyczące pobierania próbek mogą być wykorzystane w sprawozdaniu z badania. Protokół z pobierania próbek powinien uwzględniać: — identyfikator zlecenia lub nazwę klienta; — powód pobierania próbki (nadzór, zlecenie/umowa); — identyfikator próbki (próbek) nadany przez próbkobiorcę lub numer serii wyrobu; — powołanie metody pobierania próbek; — datę i miejsce pobrania; — plan i istotne okoliczności pobrania (z podaniem możliwych czynników zakłócających późniejsze badanie laboratoryjne); — badane czynniki/składniki próbki; — nazwisko i podpis osoby pobierającej próbkę (próbki) oraz nazwiska osób współuczestniczących w pobieraniu próbek, np. ze strony klienta (jeśli dotyczy); — zapisy wskazań przyrządów pomiarowych stosowanych do pobierania próbki (próbek), dotyczy np. pobierania próbek powietrza; — sposób transportu i przechowywania w laboratorium; — datę (godzinę) przekazania próbki (próbek) do laboratorium;
27 1.10.2. Przyjmowanie próbek do badań w laboratorium Laboratorium powinno prowadzić rejestr próbek przyjętych do badań. W rejestrze należy podać: — nazwę klienta lub identyfikator zlecenia; — datę przyjęcia próbki; — identyfikator próbki nadany przez klienta i przez laboratorium; — stan próbki w chwili przyjęcia (odpowiednia, zepsuta, nieuszkodzona itp.) do laboratorium; — zakres badań i metody badań; — datę, nazwisko i podpis pracownika przyjmującego próbki i/lub uprawnionego do wykonania badań laboratoryjnych. Kierownictwo laboratorium powinno wyznaczyć miejsce przyjmowania próbek od klientów (rozdz. 1.7) oraz określić warunki i czas przechowywania próbek przed wykonaniem badań i, jeśli to możliwe, po badaniach. Próbki po badaniach przechowuje się zwykle dla celów rozjemczych, reklamacji, powtórnych badań (w ramach wewnętrznego planu sterowania jakością). Należy ustalić zasady bezpiecznego pozbywania się próbek i materiałów pomocniczych po badaniach. Niepowtarzalne identyfikatory próbek nadane wg określonego systemu w laboratorium powinny towarzyszyć próbce od chwili pobrania i przyjęcia do laboratorium, aż do utylizacji próbki. Właściwe oznakowanie powinno również dotyczyć wszelkiego rodzaju próbek kontrolnych lub wzorcowych stosowanych w laboratorium w celu walidacji metody lub podczas realizacji planów sterowania jakością (zapewnienia jakości). Laboratorium powinno opracować i udokumentować procedurę systemu jakości w zakresie pobierania i postępowania z próbkami.
1.11. Zapewnienie jakości wyników badań Laboratorium powinno stosować właściwe metody monitorowania badań laboratoryjnych, w tym procesów analitycznych i pobierania próbek (jeśli laboratorium próbki pobiera). Metody te określane jako sterowanie jakością badań powinny być udokumentowane w zakresie umożliwiającym ich praktyczne wykorzystanie. Każde badanie lub rodzaj badań powinny mieć określony plan takiego sterowania jakością. Plan sterownia jakością może uwzględniać: — sterowanie wewnętrzne realizowane podczas wykonywania danego badania, — sterowanie zewnętrzne (badanie biegłości) realizowane zgodnie z programem organizatora takiego badania biegłości. Celem sterowania jakością badań jest: — ocena błędów laboratoryjnych ze względu na ich charakter (przypadkowe, systematyczne), — osiągnięcie właściwego poziomu jakości, — monitorowanie kierunku zmian, np. dotyczących błędów lub ogólnie charakterystyki metody badania. Wyniki sterowania jakością mogą być wykorzystywane do: — walidacji lub ponownej walidacji metody badania, — szacowania niepewności pomiaru, — nadzorowania niezgodnych z wymaganiami badań, — podjęcia działań korygujących lub zapobiegawczych, — doskonalenia kompetencji technicznych.
28 Laboratorium powinno ustalić procedurę sterowania jakością zawierającą m.in.: — metody i plany sterowania jakością, — wskazanie odpowiedzialności, — rodzaj lub rodzaje materiału kontrolnego, — techniki statystyczne stosowane do obliczeń i umożliwiające śledzenie kierunku zmian, — kryteria oceny rodzaj prowadzonych zapisów, wykorzystanie wyników. Szczegóły dotyczące metod sterowania jakością badań przedstawiono w rozdziale 2.7.
1.12. Zapisy Laboratorium powinno prowadzić system zapisów dostosowany do warunków działania tego laboratorium i zgodny z obowiązującymi przepisami. Prowadzi się zapisy jakości dotyczące auditów wewnętrznych, przeglądów zarządzania i działań korygujących lub zapobiegawczych, a także zapisy techniczne, czyli zapisy dotyczące wszystkich innych obszarów działania laboratorium. W zapisach dotyczących badań należy przez odpowiedni czas zachowywać wszystkie spostrzeżenia, obliczenia i powstałe na ich podstawie dane. Zapisy powinny zawierać informacje umożliwiające powtórzenie badania. Zmiany i poprawki w zapisach są dokonywane przez skreślenie błędu, jego parafowanie, datowanie i wpisanie prawidłowego zapisu. Wymagana jest procedura nadzoru nad zapisami, określająca zasady identyfikowania, katalogowania, gromadzenia, przechowywania. Wszystkie zapisy powinny być należycie zabezpieczone i przechowywane w sposób gwarantujący klientowi poufność dotyczących go informacji. Należy określić czas przechowywania różnego rodzaju zapisów w laboratorium. Rodzaje zapisów, jakie mogą być prowadzone w laboratorium, podano w tabeli 1.3. Tabela 1.3. Przykładowy wykaz zapisów prowadzonych w laboratorium 1. Zapisy nadzorowane przez kierownika ds. jakości Nazwa zapisu
Dokument powołania zapisu
Miejsce przechowywania zapisu (nazwa segregatora, teczki)
Okres archiwowania zapisu (przykład)
Zapisy dotyczące nadzoru nad dokumentami Wykaz dokumentów
procedura nr.....
nadzór nad dokumentami
5 lat
Wniosek o dokonanie zmiany
procedura nr.....
nadzór nad dokumentami
5 lat
Karta zmian
procedura nr.....
egzemplarz oryginalny księgi jakości, procedury, instrukcji
3 lata po wycofaniu dokumentu z użytkowania
Zapisy dotyczące działań korygujących i zapobiegawczych Protokół niezgodności
procedura nr.....
protokoły niezgodności
5 lat
29 Karta działań zapobiegawczych
procedura nr.....
protokoły niezgodności
5 lat
Zapisy z oceny działań korygujących i zapobiegawczych
procedura nr.....
protokoły niezgodności
5 lat
Zapisy dotyczące auditów wewnętrznych Program auditów wewnętrznych
procedura nr.....
audity wewnętrzne
5 lat
Powołanie auditora (-ów)
procedura nr.....
audity wewnętrzne
5 lat
Plan auditu wewnętrznego
procedura nr.....
audity wewnętrzne
5 lat
Raport z auditu wewnętrznego
procedura nr.....
audity wewnętrzne
5 lat
Raport z auditu zewnętrznego
procedura nr.....
audity zewnętrzne
5 lat
Protokół niezgodności
procedura nr.....
protokoły niezgodności
5 lat
Zapisy dotyczące przeglądów zarządzania Program przeglądu zarządzania
procedura nr.....
przeglądy zarządzania
5 lat
Sprawozdanie z przeglądu zarządzania
procedura nr.....
przeglądy zarządzania
5 lat
Ustalenie do protokołu z przeglądu zarządzania
procedura nr.....
przeglądy zarządzania
5 lat
2. Zapisy nadzorowane przez kierownika laboratorium Zapisy dotyczące przeglądu zamówień, ofert i umów Zapytanie ofertowe, zamówienie, zlecenie, korespondencja
procedura nr.....
zlecenia, umowy
3 lata
Umowy
procedura nr.....
zlecenia, umowy
3 lata
Rejestr umów/zleceń
procedura nr.....
zlecenia, umowy
3 lata
Zapisy z przeglądu umowy/zlecenia
procedura nr.....
zlecenia, umowy
3 lata
Rejestr podwykonawców
procedura nr.....
podwykonawstwo badań
5 lat
30 Tabela 1.3. (cd.) Zapisy z oceny podwykonawcy
procedura nr.....
podwykonawstwo badań
5 lat
Sprawozdanie z badań
procedura nr.....
sprawozdania z badań
5 lat
Zapisy z oceny zadowolenia klienta
procedura nr.....
zlecenia, umowy
5 lat
Zapisy dotyczące zakupów usług i dostaw Rejestr aprobowanych dostawców i usługodawców
procedura nr.....
zakupy usług i dostaw
5 lat
Zapisy z zakupu dostawy lub usługi
procedura nr.....
zakupy usług i dostaw
5 lat
Zapisy z oceny dostawców i usługodawców
procedura nr.....
zakupy usług i dostaw
5 lat
Zapisy dotyczące skarg i reklamacji Karta reklamacji/skargi
procedura nr.....
reklamacje/skargi
3 lata
Zapisy dotyczące badań niezgodnych z wymaganiami Protokół badania niezgodnego z wymaganiami
procedura nr.....
zlecenia, umowy
3 lata
Wniosek o odstępstwo
procedura nr.....
zlecenia, umowy
3 lata
Zapisy dotyczące personelu Karta praw i obowiązków pracownika
procedura nr.....
personel
5 lat
Plany szkoleń wewnętrznych, zewnętrznych, dla personelu nowoprzyjętego
procedura nr.....
personel
5 lat
Rejestr szkoleń pracownika
procedura nr.....
personel
5 lat
Świadectwa ze szkoleń
procedura nr.....
personel
5 lat
Wykaz pracowników
procedura nr.....
personel
5 lat
Zapisy dotyczące badań Zeszyty analityczne
procedura nr.....
dokumentacja badań
5 lat
Zapisy komputerowe
procedura nr.....
dyskietki, płyty CD
5 lat
Wyniki walidacji metody badawczej
procedura nr.....
dokumentacja badań
5 lat
31 Karta szacowania składowych niepewności pomiaru
procedura nr.....
dokumentacja badań
5 lat
Opis wykonania walidacji/ weryfikacji metody badawczej
procedura nr.....
dokumentacja badań
5 lat
Zapisy dotyczące wyposażenia Wykaz wyposażenia
procedura nr.....
wykaz wyposażenia
3 lata
Karta instalacji wyposażenia
procedura nr.....
księga LOG
3 lata
Karta napraw/ konserwacji/ modernizacji
procedura nr.....
księga LOG
3 lata
Dziennik pracy
procedura nr.....
księga LOG
3 lata
Program wzorcowania w instytucjach zewnętrznych
procedura nr.....
księga LOG
3 lata
Program wzorcowania/ sprawdzania w laboratorium
procedura nr.....
księga LOG
3 lata
Plan konserwacji
procedura nr.....
księga LOG
3 lata
Zapis sprawdzania warunków środowiska w pomieszczeniu
procedura nr.....
księga LOG
3 lata
Świadectwa i zapisy z wzorcowań/sprawdzeń
procedura nr.....
księga LOG
3 lata
Zapisy dotyczące pobierania i/lub postępowania z próbkami Plany/protokoły pobierania próbek
procedura nr.....
dokumentacja badań
3 lata
Rejestr przyjmowania próbek
procedura nr.....
dokumentacja badań
3 lata
Karta przekazania próbek do analizy
procedura nr.....
dokumentacja badań
3 lata
Zapisy dotyczące sterowania jakością badań Plan sterowania jakością badań
procedura nr....
dokumentacja badań
5 lat
Karty kontrolne
procedura nr....
karty kontrolne
5 lat
Raporty z badań biegłości
procedura nr....
raporty z badań biegłości
5 lat
32
1.13. Sprawozdanie z badań Praca wykonana przez laboratorium powinna być ujęta w sprawozdaniu, w którym dokładnie, jasno i jednoznacznie, przedstawione są wyniki badań i wszelkie istotne informacje. Laboratorium powinno opracować wzory sprawozdań z badań i włączyć je do swojej dokumentacji systemu jakości. Wyniki analiz laboratoryjnych, dane źródłowe i przetworzone, przenoszone do innych dokumentów, powinny być sprawdzane i zatwierdzane przez osoby nadzorujące badania. Z treści sprawozdania powinno jasno wynikać, czy badanie objęło również pobieranie próbek. Każde sprawozdanie z badań powinno zawierać co najmniej następujące informacje: 1. Nazwę i adres laboratorium oraz miejsce wykonywania badania, jeżeli wykonywano je poza siedzibą laboratorium; 2. Indywidualne oznaczenie każdego sprawozdania (np. numer kolejny) i każdej strony oraz łączną liczbę stron sprawozdania; 3. Nazwę i adres klienta; 4. Dane dotyczące próbek: — dostarczonych przez klienta: a) opis i identyfikację badanych próbek, b) datę otrzymania próbek i datę lub daty wykonania analiz laboratoryjnych lub — pobranych przez laboratorium: a) zasady/metodę pobierania próbek i interpretacji wyników (można powołać odpowiednią procedurę lub normę), b) parametry techniczne i istotne okoliczności pobierania próbek, c) identyfikację próbek lub identyfikator protokołu pobierania próbek, d) nazwiska osób uczestniczących w pobieraniu próbek, także ze strony klienta (jeśli dotyczy), e) datę pobrania próbek i datę lub daty wykonania analiz laboratoryjnych. 5. Identyfikację specyfikacji badania lub opis metody względnie procedury badawczej; 6. Wszelkie odchylenia i uzupełnienia lub ograniczenia specyfikacji badania z wszelkimi informacjami odnoszącymi się do określonego badania; 7. Identyfikację każdej zastosowanej, nieznormalizowanej metody lub procedury badawczej; 8. Wyniki pomiarów i badań oraz wyniki uzyskane na ich podstawie poparte odpowiednio np. tablicami, wykresami, szkicami i fotografiami, a także wszelkie stwierdzone niezgodności oraz ich omówienie, ale bez żadnych zaleceń i porad wynikających z rezultatów pracy; 9. Stwierdzenia dotyczące niepewności pomiarów, w przypadku pisemnych uzgodnień z klientem lub kiedy niepewność ma znaczenie dla zgodności z wyspecyfikowanymi wartościami granicznymi (np. normami higienicznymi); 10. Podpis, stanowisko i tytuł lub równorzędne określenie osoby lub osób ponoszących odpowiedzialność za merytoryczną treść sprawozdania; 11. Oświadczenie, że bez pisemnej zgody laboratorium sprawozdanie nie może być powielane inaczej, jak tylko w całości; 12. Oświadczenie, że wyniki badania odnoszą się wyłącznie do badanych obiektów; 13. Oświadczenie, że klient ma prawo do reklamacji w określonym terminie (opcjonalnie).
33 Wyniki uzyskane od podwykonawców powinny być jednoznacznie wyróżnione. Jeżeli do sprawozdania z badań włącza się opinie lub interpretacje należy określić kompetencje personelu laboratorium uprawnionego do wydawania takich opinii lub interpretacji. Poprawki i uzupełnienia do wydanego już sprawozdania z badań powinny mieć postać dodatkowego, odpowiednio oznaczonego dokumentu i powinny spełniać wyżej podane wymagania. Zamieszczenie w jednym sprawozdaniu wyników badań akredytowanych i nieakredytowanych wymaga uzgodnień z jednostką akredytującą. Jeżeli na podstawie wyników badań laboratorium zobowiązane jest wydać orzeczenie w formie decyzji lub zalecenia (odnośnie np. wymagania sanitarnego), może być ono opracowane w formie odrębnego dokumentu.
1.14. Akredytacja laboratorium Laboratorium, które spełnia kryteria i wymagania zawarte we właściwej normie odniesienia, dotyczącej kompetencji oraz realizuje politykę jakości, zawartą w deklaracji kierownictwa wykonawczego, może ubiegać się o akredytację badań w jednostce akredytującej. Zgodnie z definicją akredytacji laboratorium powinno określić badania lub rodzaje badań, które zamierza akredytować. Laboratorium, podejmując decyzję o akredytacji powinno kierować się zarówno oczekiwaniami odbiorców wyników badań (klientów), jak i własnymi celami, np. uwiarygodnieniem danych, lepszą pozycją w stosunku do konkurentów na rynku badań, względami prestiżowymi. Wniosek o akredytację winien zawierać sprecyzowany zakres akredytacji zgodnie z wymaganiami jednostki akredytującej. W zakresie akredytacji laboratorium zwykle podaje rodzaj badanego obiektu, badane cechy i metodę badania (normę lub udokumentowaną własną procedurę). Laboratorium może zgłosić do akredytacji wyłącznie badanie lub badania laboratoryjne (bez pobierania próbek) lub badanie (badania) laboratoryjne łącznie z pobieraniem próbek. Pobierania próbek do danego badania powinno być wykazane w zakresie akredytacji, łącznie z powołaniem udokumentowanej procedury lub właściwej normy na pobieranie próbek. Zgłoszone do akredytacji własne procedury badawcze powinny mieć niepowtarzalne identyfikatory, w tym zawsze określony status wydania (np. data, numer edycji). Certyfikat akredytacji może być przyznany laboratorium w wyniku auditu zewnętrznego, przeprowadzonego przez jednostkę akredytującą. Prawa i obowiązki laboratorium wynikające z akredytacji określa jednostka akredytująca.
2. STATYSTYKA MATEMATYCZNA W ANALIZIE CHEMICZNEJ 2.1. Charakterystyka zbiorowości generalnej i próbnej Statystyka matematyczna za pomocą różnych reguł i metod pozwala na podstawie zbadania części zbiorowości wnioskować o jej całości. W metodach statystyki matematycznej przyjmuje się wyidealizowane założenie, że istnieje możliwość wykonania nieskończenie wielu pomiarów. Zbiór wszystkich tego samego rodzaju wyników pomiarów określa się jako populację (zbiorowość) generalną. Z niej wyprowadza się prawidłowości w przypadku zjawisk, które obserwatorowi wydają się losowe. Natomiast w praktyce dysponuje się tylko bardzo ograniczoną liczbą wyników. Stanowią one wybraną część, nazywaną próbką (zbiorowością próbną), nieskończenie dużej populacji. Próbka powinna być tworzona w taki sposób, aby charakteryzowała (reprezentowała) możliwie dobrze populację. Cel ten osiąga się, gdy próbka jest odpowiednio liczna, a poszczególne wyniki pomiarów otrzymuje się w sposób jak najbardziej losowy. W zasadzie nawet prawidłowo pobrana próbka losowa jest obciążona losowymi różnicami w porównaniu z populacją generalną. Odchylenia te i prawdopodobieństwo ich wystąpienia można opisać za pomocą statystyki matematycznej. Pozwala ona na podstawie próbek losowych pomiarów ocenić cechy populacji. Tak więc na podstawie skończonej liczby pomiarów możliwe jest wyciąganie prawidłowych wniosków o błędzie losowym pomiaru i przewidywanie przyszłych wyników pomiarów tego samego rodzaju (z pewnym prawdopodobieństwem poprawności). Badaniem tych zjawisk, wykrywaniem prawidłowości ich zachodzenia i przewidywania możliwości ich zapisu, zajmuje się rachunek prawdopodobieństwa. Prawdopodobieństwo (P) odpowiada liczbom rzeczywistym z przedziału zamkniętego . Można zapisać, że P = 1 – α, gdzie α oznacza poziom istotności czyli możliwość popełnienia błędu wnioskowania pierwszego rodzaju (patrz rozdz. 2.4.). Jeśli P = 0,95 (95%), to α = 0,05. Każdą zbiorowość statystyczną można opisać za pomocą właściwej funkcji rozkładu prawdopodobieństwa zmiennej losowej. W analizie chemicznej, jeśli danej metodzie badania towarzyszą tylko błędy przypadkowe, to funkcja prawdopodobieństwa ma rozkład normalny, często zwany rozkładem Gaussa–Laplace’a (Rys. 2.1).
36
Rys. 2.1. Wielkość pola pod krzywą Gaussa w zależności od odchylenia standardowego +s i jego wielokrotności +2s, +3s.
Parametrami tego rozkładu są wartości μ i σ, czyli wartość oczekiwana i odchylenie standardowe zmiennej. Dla różnych wartości parametrów μ i σ funkcja przebiega w odmienny sposób. Niemniej dla wszystkich parametrów rozkład normalny ma pewne ogólne charakterystyczne właściwości. Funkcja posiada maksimum w punkcie μ i dwa symetrycznie położone punkty przegięcia odpowiadające wartościom współrzędnych μ ± σ. Wielkość odchylenia standardowego decyduje o stopniu spłaszczenia krzywej. Pole pod krzywą w kształcie dzwonu jest równe jedności, co oznacza całkowitą pewność znalezienia danej wartości X w przedziale (– ∞, ∞). Pole pod krzywą między odciętymi – σ ÷ +σ jest równe 0,68, co oznacza, że 68% wszystkich wyników zawiera się w granicach wartości zmiennej μ ± σ, a 32% wyników będzie bardziej oddalone od μ. W granicach wyznaczonych odchyleniami μ ± 2σ znajduje się przeszło 95% wszystkich wyników, a w granicach odchyleń 3σ – 99,7%, 4σ – 99,984. Tak więc wartości spoza przedziału μ ± 3σ zdarzają się bardzo rzadko – 3 na 1000, natomiast spoza przedziału μ ± 4σ praktycznie się nie zdarzają, tj. 6 na 100 000. Stwierdzenie, że zmienna losowa X ma rozkład normalny o parametrach μ i σ zapisuje się zwykle w postaci X : N (μ, σ). Jeśli μ i σ są szacowane z próbki, to zapis X : N (4,2)
37 oznacza, że zmienna losowa X ma rozkład normalny o średniej = 4 i odchyleniu standardowym s = 2. Często wynik analizy chemicznej przedstawia się w postaci zmiennej standaryzowanej . Jeżeli zmienna losowa ma rozkład normalny o parametrach: μ, σ to zmienna
standaryzowana ma również rozkład normalny, ale o parametrach 0 i 1 [z : N (0,1)]. W praktyce analitycznej, kiedy dysponuje się skończoną liczbą danych, stosuje się rozkład t-Studenta, będący przybliżeniem rozkładu normalnego. W odróżnieniu od rozkładu normalnego ma on tylko jeden parametr, który nosi nazwę liczby stopni swobody. Dla dużej liczby stopni swobody rozkład ten upodabnia się bardzo wyraźnie do rozkładu normalnego. Rozkład t-Studenta opisany jest funkcją gęstości:
(1)
gdzie n oznacza liczbę stopni swobody, a funkcja Γ określona jest równaniem (2) Dowodzi się, że jeśli zmienna x ma rozkład normalny o parametrach μ: σ, to zmienna losowa (3) ma rozkład t-Studenta z n-1 stopniami swobody. Badając cechy zbiorowości próbnej metodami statystyki matematycznej analityk może rozwiązać szereg nurtujących go problemów, związanych ogólnie z zapewnieniem jakości badań laboratoryjnych. Metody statystyczne jako swojego rodzaju narzędzie pracy umożliwiają analitykowi między innymi: — ocenę rodzaju i wielkości błędów laboratoryjnych; — charakteryzację metod analitycznych, a także: — oszacowanie niepewności pomiaru; — porównanie wyników uzyskanych różnymi metodami; — sterowanie jakością badań. 2.1.1. Miary położenia Zbiór wyników obserwacji jednostek według pewnej cechy nosi nazwę szeregu statystycznego (ciągu). Jednostkowe wartości lub odmiany cechy zapisane wg kolejności badania jednostek tworzą nieuporządkowany szereg statystyczny. Te same wartości lub odmiany uporządkowane w pewien sposób (np. według rosnących lub malejących wartości) tworzą uporządkowany szereg statystyczny. Szczególnym przypadkiem
38 uporządkowanego szeregu jest szereg rozdzielczy (inaczej szereg strukturalny), powstały w wyniku grupowania wartości lub odmiany cechy statystycznej. Dokonując analizy szeregów statystycznych z cechą mierzalną zasadniczą rolę odgrywają parametry opisowe zwane wartościami średnimi lub miarami położenia. Charakteryzują one za pomocą jednej liczby, a więc w sposób bardzo syntetyczny, ogólny poziom wartości cechy w zbiorowości. Najczęściej stosowane miary położenia, to: średnia arytmetyczna, średnia geometryczna, mediana. 1. Średnia arytmetyczna – suma wartości zaobserwowanych (w próbce) podzielona przez ich liczbę. Dla n obserwacji x1, x2,..., xn wartość średnia wynosi (4) Wartość średnia w próbce jest estymatorem nieobciążonym wartości oczekiwanej w populacji. 2. Średnia geometryczna – statystyka określona równaniem (5) lub (6) gdzie: x1, x2,..., xn – wartości elementów próbki, n – liczność próbki. 3. Mediana (Me) – wartość o numerze (gdy n jest liczbą nieparzystą) w niemalejącym ciągu n wartości zaobserwowanych (w próbce) lub średnia arytmetyczna wartości o numerach i w tym ciągu (gdy n jest liczbą parzystą), czyli dla szeregu statystycznego x1, x2, x3 medianą jest x2, natomiast dla szeregu x1, x2, x3, x4 medianą jest wartość ilorazu
.
Przykład 2.1. Otrzymano dwa szeregi statystyczne wyników oznaczań tego samego czynnika dwiema różnymi metodami (w mg): Metoda 1.: 145, 130, 140, 125, 155, 150, 135 po uporządkowaniu w szeregu rosnącym: 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155 Metoda 2.: 150, 115, 100, 140, 180, 165, 130 po uporządkowaniu w szeregu rosnącym: 100, 115, 130, 140, 150, 165, 180 Średnie arytmetyczne w obydwu szeregach wynoszą:
39
W obydwu szeregach zarówno średnia arytmetyczna ( ) jak i mediana (Me) są jednakowe i wynoszą 140 mg. Biorąc pod uwagę tylko średnie arytmetyczne (lub mediany) można by dojść do błędnego wniosku, że obydwie metody badania są jednakowo wiarygodne. Zatem do scharakteryzowania szeregu statystycznego nie wystarcza miara położenia, należy jeszcze wprowadzić miarę charakteryzującą wielkość odchyleń poszczególnych obserwacji od miary położenia, czyli tzw. miarę rozproszenia. 2.1.2. Miary rozproszenia Miary położenia nie wystarczają dla pełnej charakterystyki badanych szeregów statystycznych, bowiem poszczególne obserwacje mogą różnić się od obliczonej wartości średniej. Różnice te mogą przyjmować różne wartości (zarówno dodatnie jak i ujemne). Z reguły miary rozproszenia odnoszą się do określenia różnic pomiędzy obserwacjami a wartością średniej arytmetycznej. Najczęściej stosowane miary rozproszenia to: rozstęp, wariancja, od chylenie standardowe, względne odchylenie standardowe (współczynnik zmienności). Odchylenie standardowe jest miarą precyzji metod analitycznych. 1. Wariancja – suma kwadratów różnic między wartościami zaobserwowanymi w próbce a ich wartością średnią, podzielona przez liczbę o jeden mniejszą od liczby obserwacji. Dla n obserwacji x1, x2,..., xn mających wartość średnią wariancja (w próbce) s 2 wynosi (7) Wariancja w próbce jest estymatorem nieobciążonym wariancji w populacji. 2. Odchylenie standardowe – dodatni pierwiastek kwadratowy z wariancji (w próbce). Odchylenie standardowe w próbce jest estymatorem obciążonym odchylenia standardowego w populacji. (8) 3. Współczynnik zmienności – stosunek odchylenia standardowego s (w próbce) do wartości średniej (w próbce). Współczynnik zmienności jest względną miarą rozrzutu obserwacji w próbce. Współczynnik zmienności może być wyrażony w procentach. (9) 4. Odchylenie standardowe średniej – stosunek odchylenia standardowego s (w próbce) do liczby obserwacji.
40
(10) Odchylenie standardowe średniej jest estymatorem składnika wariancji (średniej) populacji generalnej. 5. Rozstęp – różnica między największą i najmniejszą wartością zaobserwowaną. (11) W przykładzie 2.1 rozstęp w metodzie 1. wynosi R x1 = 30, a w metodzie 2. – R x2 = 80. Przykład 2.2. Badanie charakterystyki rozproszenia danych z przykładu 2.1. Metoda 1.
1
xi1
|xi1 - 1|
145
5
130
Metoda 2. xi2
|xi2 - 2|
25
150
10
100
10
100
115
25
625
140
0
0
100
40
1600
125
15
225
140
0
0
155
15
225
180
40
1600
150
10
100
165
25
625
135
5
25
130
10
100
= 140
2 1)
(xi1 -
Σ = 700
2=
140
(xi2 -
2 2)
Σ = 4650
Wariancja w rozpatrywanych szeregach statystycznych przybiera następujące wartości:
a odchylenie standardowe:
41 Obliczony współczynnik zmienności w metodzie 1. i 2., odpowiednio v1 i v2:
lub
v1 = 0,08 × 100 % = 8 %
lub
v2 = 0,20 × 100 % = 20 %
Wniosek: Metoda 1., której wyniki mają mniejsze odchylenie standardowe jest bardziej precyzyjna, tzn. odznacza się mniejszym błędem przypadkowym.
2.2. Błędy w analizie chemicznej 2.2.1. Błędy przypadkowe, systematyczne, względne i bezwzględne Celem badań w analizie chemicznej jest możliwie dokładne określenie, na podstawie otrzymanych wyników, prawdziwej zawartości składnika w próbce. Aby ten cel osiągnąć, wybiera się metodę analityczną, gwarantującą otrzymanie wyniku najbardziej zbliżonego do wartości prawdziwej. Każdemu procesowi analitycznemu towarzyszą błędy, które ze względu na ich charakter i zachowanie w całym procesie analitycznym (pomiarowym) dzielą się na błędy losowe (przypadkowe) i systematyczne. W najprostszym modelu przyjmuje się, że wynik analizy obciążony jest różnymi czynnikami: (12) gdzie: μ – wartość prawdziwa mierzonej wielkości, którą dla określonego rozkładu wyników pomiarów można przyjąć jako wartość średnią (wartość oczekiwaną zmiennej losowej), px – błąd przypadkowy (losowy), B – błąd systematyczny. Całkowity błąd wyniku badania jest zatem sumą błędów przypadkowych i systematycznych i stanowi różnicę między wynikiem badania a wartością prawdziwą lub przyjętą wartością odniesienia. Suma błędów przypadkowych i systematycznych stanowi o dokładności metody. Zatem uzyskany daną metodą wynik oznaczania pewnej cechy (przykładowo stężenie czy zawartość badanej substancji) jest pewnym przybliżeniem wartości prawdziwej. Na wynik analizy składają się błędy, które powodują odchylenie dodatnie lub ujemne (statystycznie sobie równe) wartości pomiarowych od wartości prawdziwej w sposób losowy, przypadkowy, nazywane błędami przypadkowymi oraz takie, które powodują stałe odchylenie w jednym kierunku (dodatnie lub ujemne) od wartości rzeczywistej – nazywane błędami systematycznymi. Wśród błędów wyróżnia się także błędy grube, które są związane z pojawianiem się w serii pomiarów wyników znacznie odbiegających od pozostałych. Błędy systematyczne nie podlegają prawom statystyki i wpływają na poprawność wyników badania, stanowiąc obciążenie metody (ang. bias). Jeżeli wszystkie wyniki
42 są obciążone niezmienną składową addytywną, to określa się ją jako błąd stały (np. nieuwzględniona wartość ślepej próby). Odchylenie od wartości prawdziwej zależne od mierzonej wielkości jest nazywane błędem zmiennym. Jeżeli między wartością i wartością błędu zależność jest proporcjonalna, to jest to błąd liniowy (proporcjonalny), np. błędne miano roztworu miareczkującego. Funkcja rozkładu błędów systematycznych jest nieznana. Najczęściej stosowane są metody nieobarczone błędem systematycznym i wówczas wyraz „B” w równaniu (12) wynosi „0” (zero). Błędy przypadkowe mogą być oszacowane z precyzji powtarzanych analiz i są zmiennymi losowymi, które podlegają prawom statystyki. Błędy przypadkowe mają rozkład normalny. Wpływ sumaryczny wszystkich czynników powodujących tego typu zmiany zawarty jest w wyrazie „px” (równanie (12).
,
Rys. 2.2a. Poprawność i precyzja metody analitycznej.
43
Rys. 2.2b. Poprawność i precyzja metody analitycznej.
Rozróżnienie pojęć precyzji i poprawności ilustrują przedstawione na Rys. 2.2a i b cztery diagramy. Poszczególne diagramy odnoszą się do wyników analiz wykonanych czterema różnymi metodami, z których każda została użyta do oznaczania określonej cechy (składnika) certyfikowanego materiału odniesienia. Nominalna wartość analizowanego składnika certyfikowanego materiału odniesienia przyjęto jako wartość „prawdziwą” μ0. W przypadku każdej z metod wykonano odpowiednio dużą liczbę pomiarów, a uzyskane wyniki wyrażono w postaci średniej arytmetycznej . Metoda I jest metodą dokładną, tzn. zarówno nieobciążoną (wykazującą żądaną poprawność) jak i precyzyjną (wykazującą mały rozrzut wyników). Średnią wyników analizy uzyskaną tą metodą przyjmuje się jako równą wartości „prawdziwej”: = μ0. Metoda I może być uznana za metodę referencyjną (lub rozstrzygającą). Mając do wyboru metodę II – precyzyjną, lecz niewykazującą poprawności (z obciążeniem) – w tym przypadku obarczoną błędem systematycznym dodatnim, oraz metodę III bez obciążenia, lecz mało precyzyjną, bardziej celowe jest zastosowanie metody II pod warunkiem ustalenia przyczyny i wielkości błędu systematycznego i wniesienia odpowiedniego współczynnika korygującego. Przy obliczeniu wyników w metodzie III (mało precyzyjnej) dla uzyskania wyniku zgodnego z wartością „prawdziwą” należałoby wykonać np. dużo większą liczbę pomiarów, ażeby zmniejszyć do minimum błąd przypadkowy.
44 Metoda IV odznacza się zarówno niezadowalającą precyzją jak i dużym obciążeniem (błąd systematyczny dodatni) i jej zastosowanie w praktyce laboratoryjnej może być kwestionowane. Błędy przypadkowe i systematyczne występujące w chemii analitycznej są spowodowane wieloma przyczynami. Jeżeli pominie się błędy pobrania próbki do badań, jako nienależące bezpośrednio do postępowania analitycznego, to błąd całkowity, rozumiany jako suma błędów przypadkowych i systematycznych, składa się z błędów pomiarów instrumentalnych oraz błędów związanych z przebiegiem reakcji chemicznych i różnych czynności analitycznych. Na ogół błędy pomiarów powinny być mniejsze w porównaniu z błędami reakcji chemicznych. W zasadzie trudno jest rozróżnić czynniki powodujące określony rodzaj błędów – systematycznych czy przypadkowych, gdyż zarówno jedne jak i drugie mogą być spowodowane tymi samymi przyczynami. Zatem podział na błędy systematyczne i przypadkowe (istotny ze względu na zastosowanie odpowiedniego przeliczenia matematycznego) nie wynika ze źródeł powstawania tych błędów, ale z kierunkowości odchylenia od wartości średniej (najczęściej średniej arytmetycznej), jako miary najbardziej zbliżonej do wartości „prawdziwej”. Wszystkie błędy występujące w analizie – zarówno błąd przypadkowy, jak i błąd systematyczny – można sprowadzić do cech charakterystycznych stosowanej metody. Poza tym wpływają na nie np. warunki pracy w laboratorium lub kwalifikacje wykonawców i mogą one podlegać zmianom w czasie. We wszystkich badaniach analityk musi dążyć do osiągnięcia możliwie małego błędu losowego i stale go kontrolować. Do wystąpienia błędów systematycznych zaś nie powinno się w ogóle dopuścić. Suma wszystkich błędów przypadkowych i systematycznych wpływa na tzw. niepewność pomiaru. Błędy powodujące odchylenia wyniku od wartości „prawdziwej” można zdefiniować jako błędy bezwzględne lub względne. Błąd bezwzględny (absolutny), Eabs, określa się jako różnicę między zmierzoną wartością x a wartością „prawdziwą” μ0, tj. (13) Błąd bezwzględny może mieć znak dodatni, gdy x > μ lub ujemny, gdy x < μ. Często błąd bezwzględny wyraża się nie zwracając uwagi na znak, czyli (14) W przypadku posługiwania się wartością średnią bezwzględny wyraża się w postaci:
, jako „prawdziwą”, błąd (15)
Błąd względny (relatywny) opisuje się równaniem: (16)
45 i często w praktyce analitycznej wyraża w procentach:
Podając wartość błędu, należy zaznaczyć, o który z dwóch możliwych błędów chodzi np. zawartość składnika czynnego w preparacie można podać jako (63,5±0,1) %. Oznacza to, że błąd oznaczania wynosi:
Błąd bezwzględny jest, zwłaszcza w przypadku bezpośredniej oceny wyniku, bardzo przydatny. Charakteryzuje on po prostu jakość uzyskanego wyniku. Natomiast błąd względny częściej służy do poglądowej oceny wyniku analizy, ponieważ jest związany z mierzoną wartością. W rzeczywistości wpływ błędów pochodzących z różnych źródeł jest bardziej złożony. Należałoby uwzględnić wszystkie możliwe źródła błędów i oszacować niepewność wyniku jak podano w rozdz. 2.8. Powiązania pojęć charakteryzujących wynik (metodę) badania z występowaniem różnego rodzaju błędów przedstawia poniższy schemat: Dokładność Poprawność
Poprawność + Precyzja
Błąd systematyczny
Stały Zmienny
Obciążenie Poprawka
Precyzja
Błąd losowy
Powtarzalność/ /Odtwarzalność
Odchylenie standardowe lub jego pochodne
Wynik (+ poprawka) ± niepewność
46 2.2.2. Precyzja Zmienność uzyskiwanych wyników analiz, zwana precyzją, charakteryzuje błąd losowy wyrażony odchyleniem standardowym lub jego pochodną względną – współczynnikiem zmienności. Jeżeli pominąć błędy związane z niejednorodnością próbki, odzyskiem, kwalifikacjami personelu czy pracą przyrządów pomiarowych, to na rozrzut wyników analizy wpływa jedynie błąd przypadkowy czynności analitycznych. W warunkach laboratoryjnych dysponuje się na ogół ograniczoną liczbą wyników, co powoduje, że zamiast odchylenia standardowego σ (zbiorowości generalnej) stosuje się jego oszacowanie s (z próbki). Jeżeli znany jest zakres roboczy metody analitycznej to można oszacować zmienność w tym zakresie, wykonując w jednym dniu lub w różnych dniach serię analiz powtarzanych (wielokrotnych) próbek materiału odniesienia na jednym lub wielu poziomach określonych stężeń. W zależności od przyjętego sposobu postępowania można uzyskać: A – jedną serię wyników analiz powtarzanych na jednym poziomie stężenia, B – kilka serii wyników analiz powtarzanych na jednym poziomie stężenia, C – jedną serię wyników analiz powtarzanych na wielu poziomach stężeń, D – kilka serii wyników analiz powtarzanych na wielu poziomach stężeń. Jeżeli zmienność dotyczy jednego laboratorium oszacowana precyzja nosi nazwę odchylenia standardowego powtarzalności (sr). Jeżeli zmienność dotyczy wielu laboratoriów oszacowana precyzja nosi nazwę odchylenia standardowego odtwarzalności (sR). Odchylenie standardowe odtwarzalności można oszacować na podstawie badań międzylaboratoryjnych. Można posługiwać się terminem „precyzja pośrednia” (spp) dla wyników badań wielu serii wykonanych w dłuższym czasie niż powtarzalność w jednym laboratorium, ale np. przy użyciu różnego wyposażenia, przez różnych analityków. Warunki określania precyzji w podanych wyżej okolicznościach przedstawiono w tabeli 2.1. Tabela 2.1. Kryteria określania precyzji w warunkach powtarzalności, pośrednich i odtwarzalności Precyzja
Powtarzalności
Pośrednia
Odtwarzalności
Przyrząd
ten sam
różny
różny
Rodzaj dodatkowych akcesoriów do przyrządu (np. kolumna chromatograficzna)
ten sam
różny
różny
Analityk
ten sam
różni
różni
Matryce próbki
te same
różne
różne
Stężenie analitu
te same
różne
różne
Nr serii materiałów odniesienia, pomocniczych, odczynników
ten sam
różny
różny
Warunki środowiska w laboratorium np. temperatura, wilgotność
te same
różne
różne
Laboratorium
to samo
to samo
różne
Czas
„krótki”
„dłuższy”
„dłuższy”
47 Precyzja stanowi jedną z cech charakteryzujących metodę analityczną (patrz rozdz. 2.6.). Obliczanie precyzji można wykonać następująco: Przypadek A: Jedna seria wyników analiz powtarzanych na tym samym poziomie stężenia. Poziom stężenia, dla którego obliczana jest precyzja, powinien znajdować się w środku zakresu metody. Wariancje w granicach zakresu powinny być jednorodne. Precyzja wyraża się odchyleniem standardowym lub współczynnikiem zmienności, obliczonymi według równań (8) i (9). Jeżeli w badaniach rutynowych laboratorium wykonuje analizy podwójne danej próbki, najlepiej jest oszacować odchylenie standardowe różnicy (xia – xib), za pomocą równania: (17) Przykład 2.3. Wyniki analiz dwukrotnych dla próbki materiału odniesienia na jednym poziomie stężenia Liczba analiz dwukrotnych
Wynik analizy „xa”
Wynik analizy „xb”
Różnica D = xa – xb
(xa – xb)2
1
100,0
99,1
0,9
0,81
2
103,9
103,0
0,9
0,81
3
104,8
104,7
0,1
0,01
4
104,0
104,1
– 0,1
0,01
5
101,9
103,0
– 1,1
1,21
6
103,0
102,9
0,1
0,01
7
103,8
103,7
0,1
0,01
8
99,5
99,4
0,1
0,01
9
100,2
100,7
– 0,5
0,25
10
102,9
102,4
0,5
0,25 Σ = 3,38
Uwaga: Przed wykonaniem obliczenia odchylenia standardowego należy sprawdzić zbiory wyników analiz xa i xb na obecność błędów grubych (patrz rozdz. 2.4.4).
Odchylenie standardowe ocenianych danych (metody) wynosi: sr = 0,41 Przypadek B: Kilka serii wyników analiz powtarzanych na jednym poziomie stężenia. Jeżeli jest zachowana jednorodność wariancji w poszczególnych seriach wyników analiz, to można wariancje sumować wg równania:
48
(18) To samo równanie można wyrazić inaczej:
(19)
w którym: si – odchylenie standardowe dla i–tej serii, nj – liczba analiz powtórzonych w danej serii, n – ogólna liczba analiz powtórzonych (we wszystkich seriach), xij – j–ty wynik analizy i–tej serii, m – liczba serii, i – wartość średnia wyników w i–tej serii. Jeżeli liczba wyników w każdej serii jest jednakowa równanie (18) można uprościć (20) Odchylenie standardowe sC dobrze charakteryzuje zmienność wewnątrz serii analiz. Zamiast łączyć odchylenia standardowe serii, bardziej praktyczne jest łączenie współczynników zmienności, które charakteryzują precyzję wewnątrz serii analiz (metody): (21) Przypadek C: Jedna seria wyników analiz powtarzanych na kilku poziomach stężeń. Poziomy stężeń powinny mieścić się w granicach zakresu roboczego metody. Jeżeli zbadano m próbek o różnej zawartości (poziomu) badanego (analitu) wykonując nj analiz wielokrotnych, to otrzymane wyniki można przedstawić następująco: Numer próbki
Liczba powtórzeń ... i
1
2
...
1
x11
x12
...
x1i
...
2
x21
x22
...
x2i
...
. .
. .
. .
j
xj1
xj2
. . .
. . .
. . .
m
xm1
xm2
. . ...
xji
xmi
1
s1
v1
2
s2
v2
. .
. .
si
vi
. . .
. . .
sm
cm
. . ...
. . . ...
nj
i
. . . ...
m
49 Przykład 2.4. Aby ocenić istotność różnic między precyzją na różnych poziomach (P = 0,95) należy: 1. Obliczyć średnią arytmetyczną dla każdej serii danego poziomu. 2. Obliczyć odchylenia standardowe i współczynniki zmienności. 3. Sprawdzić wyniki w danej serii na obecność błędów grubych (test Dixona). 4. Zbadać istotność różnic między wariancjami i / lub współczynnikami zmienności (test F), skrajnych poziomów stężeń (patrz rozdz. 2.4.1 i 2.4.2). 5. Zsumować wariancje i/lub współczynniki zmienności. Jeżeli precyzje na tych poziomach będą określone odpowiednimi współczynnikami zmienności, to w ocenianym zakresie stężeń różnice między wartościami współczynników zmienności poziomów skrajnych powinny być nieistotne (test F). Przykładowe dane liczbowe uzyskane dla poziomów stężeń m = 5 przedstawia poniższe zestawienie: 1
2
3
4
0,31
0,30
0,29
0,32
0,305
0,000,1667
0,001,7920
0,59
0,57
0,58
0,57
0,577
0,0000917
0,0002754
0,71
0,69
0,71
0,71
0,705
0,0001000
0,0002011
0,92
0,92
0,95
0,95
0,935
0,0003000
0,0003432
1,18
1,17
1,21
1,19
1,187
0,000,2917
0,000,2070
i
s2i
v2i
– testem F nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic między wariancjami (jednorodność) i współczynnikami zmienności (precyzja), co świadczy, że zakres stężeń jest dostatecznie wąski; można zatem obliczyć średnie tych wielkości.
– odchylenie standardowe złożone badanego zakresu stężeń (metody) wynosi: sC = 0,014, precyzja złożona wyrażona współczynnikiem zmienności wynosi 0,024 (2,4%). Przykład D: Kilka serii wyników analiz powtarzanych na wielu poziomach stężeń. Można przyjąć podobne postępowanie, jak w przypadku C, łącząc odchylenia standardowe kilku serii analiz (na różnych poziomach stężeń), wykonane w różnych terminach – według równania: (22) W analizie instrumentalnej (patrz rozdz. 2.5., równanie 39 i 48) można również łączyć dane z różnych serii analiz wzorców pomiarowych (krzywych wzorcowych),
50 wyznaczając funkcję regresji z wszystkich wyników pod warunkiem, że współczynniki nachylenia (czułość) obliczone w każdej serii nie różnią się istotnie, a następnie obliczając z wszystkich danych tzw. resztowe odchylenie standardowe (sy) i odchylenie standardowe (sm) pomiaru instrumentalnego (metody kalibracji).
2.3. Szacowanie wyników analizy Celem analizy ilościowej jest uzyskanie informacji o ilościowym składzie badanego obiektu (próbki). Aby uniknąć nieporozumień, podczas interpretacji otrzymanego wyniku należy uwzględnić jego niepewność, tj. wszystkie możliwe błędy (przypadkowe, systematyczne), jakie towarzyszyły danej analizie. Metody szacowania niepewności pomiaru podano w rozdz. 2.8. Jeśli wykonano więcej niż jedną analizę danej próbki, to końcowy wynik przedstawiany jest zwykle w postaci średniej arytmetycznej ( ). Zakładając, że jeśli nawet podczas analizy wystąpią tylko błędy przypadkowe, to i tak wyniki analiz powtarzanych tej samej próbki (podzielonej) będą różnić się między sobą. Różnice te wpłyną na wartość średniej i ocenę jej niepewności. Oceny statystycznej niepewności średniej najczęściej dokonuje się przez wyznaczenie przedziału ufności. Przedział ufności reprezentuje granice, w których z danym prawdopodobieństwem znajduje się wartość prawdziwa średniej, która może być utożsamiana z wartością „prawdziwą” wyniku o ile nie występują błędy inne jak przypadkowe. Przedstawione w tym rozdziale rozważania, dotyczące obliczania przedziału ufności, mają charakter poglądowy i dotyczą bardziej aspektów związanych ze stosowaniem odpowiednich metod statystycznych w analizie chemicznej niż stosowaniem pełnej, uwzględniającej różne okoliczności, procedury szacowania niepewności pomiaru (patrz rozdz. 2.8). 2.3.1. Przedział ufności Liczność wyników do obliczania wartości średniej jest na ogół ograniczona. Z tego względu do obliczania przedziału ufności często wykorzystuje się parametry (zależne również od przyjętego prawdopodobieństwa) rozkładu t-Studenta, a nie rozkładu normalnego. Stosując ten rozkład, dla co najmniej dwóch wyników analiz, przedział ufności wartości średniej można obliczyć wg równania: p.u.
(23)
w którym: nj – liczba analiz powtarzanych tej samej próbki Stosowaną w równaniu (23) wartość t (α; f), zależną od poziomu istotności α (prawdopodobieństwa) i liczby stopni swobody f (tzn. od liczby wyników analiz), odczytuje się z tablicy rozkładu t-Studenta. Z równania (23) wynika, że prawdziwa wartość średniej znajduje się w przedziale wyznaczonym rozszerzonym odchyleniem od średniej . Szerokość przedziału zależy od trzech czynników: — precyzji wykonanych oznaczań (odchylenia standardowego), — poziomu istotności (prawdopodobieństwa), — liczby wyników analiz powtarzanych.
51 Przykład wpływu liczności próbki na szerokość przedziału ufności podaje tabela 2.2. Na podstawie danych zawartych w tabeli można wnioskować, że największy wpływ na szerokość przedziału ufności średniej ma liczba wyników analiz powtarzanych, a w przypadku wykonania tylko jednej analizy i otrzymania jednego wyniku nie ma w ogóle możliwości obliczenia przedziału ufności. Jeżeli na podstawie wyników analiz powtarzanych danej próbki należy zdecydować czy zachowana jest deklarowana zawartość danego składnika w próbce (wartości maksymalnej), to można zastosować jednostronny przedział ufności wartości średniej: (24) Przy oznaczaniu wartości minimalnej danego składnika lub zanieczyszczenia w badanej próbce przedział jednostronny przyjmuje postać: (25) w którym: – wartość średnia wyników analiz powtarzanych; t – wartość odczytana z tabeli rozkładu t-Studenta, odpowiadająca liczbie stopni swobody f = nj – 1 i przyjętemu poziomowi istotności α (prawdopodobieństwu P). Tabela 2.2. Przedziały ufności (wartości średniej) wyników analiz powtarzanych s
t α = 0,05 f = n-1
Przedział ufności
20,70
0,179
2,57
20,51 do 20,89
20,70±0,9%
6
20,50
0,369
2,57
20,11 do 20,89
20,50±1,9%
4
20,90
0,216
3,18
20,56 do 21,24
20,90±1,6%
2
20,70
0,141
12,71
19,44 do 21,96
20,70±6,1%
Próbka
Wyniki
N
A
20,6
6
±
100%
20,5 20,7 20,6 20,8 21,0 B
21,0 20,5 20,5 20,0 20,2 20,8
C
20,6 20,9 21,1 21,0
D
20,8 20,6
52 Przykład 2.5. Dopuszczalne stężenie niepożądanego zanieczyszczenia w preparacie wynosi 6 μg/l. Na podstawie wcześniej wykonanych badań powtarzanych próbek materiału odniesienia (f = 24 stopni swobody) obliczone odchylenie standardowe wynosi s = 0,28. Odchylenie standardowe średniej s = 0,056. Wykonano dwie równoległe analizy badanej próbki preparatu. Dopuszczalne stężenie toksycznego zanieczyszczenia w preparacie nie będzie przekraczane z prawdopodobieństwem P = 0,95 (α = 0,05), gdy:
Jeżeli wynik analizy jest większy od granicy 5,9, to z prawdopodobieństwem P = 0,95 można stwierdzić, że badana próbka preparatu nie odpowiada kryteriom. 2.3.2. Kryterium dopuszczalnej różnicy między wynikami analiz Badania powtarzane (analizy powtarzane) są często podstawą uzyskiwanych końcowych wyników analitycznych. Badania powtarzane równoległe określa się jako wykonywanie powtarzanych analiz (oznaczań) w krótkim okresie na tym samym materiale badanym i w tym samym laboratorium, stosując tę samą metodę oraz prowadzonych przez tę samą osobę. Analizy powinny być oparte na oddzielnych przygotowaniach próbek (np. z oddzielnymi ważeniami). Badania powtarzane archiwalne związane są z powtarzanymi analizami tego samego obiektu (próbki), w odległym czasie, jeśli warunki przechowywania nie wpływają niekorzystnie na jej stan. Badając próbkę, analityk może wykonać dwie, trzy lub więcej analiz równoległych. Uzyskane wyniki najczęściej różnią się między sobą. Jako wynik ostateczny, niezależnie od liczby powtórzeń, podaje się wartość średnią wyników analiz równoległych. Aby odpowiedzieć sobie na pytanie, czy stwierdzone różnice między wynikami są do przyjęcia należy wykonać odpowiednie obliczenia statystyczne, wykorzystując np. wartość rozstępu. Gdy znane jest odchylenie standardowe s, to: (26) Różnica (xmax – xmin) stanowi rozstęp pomiędzy wartościami skrajnymi, a nj – liczbę analiz powtarzanych. Współczynniki d (α; nj) obliczone zostały przez Pearsona i podane są w tabeli 2.3. (dla poziomu istotności α = 0,05 i nj = 2, 3 lub 4). Tabela 2.3. Współczynniki Pearsona nj
d(α = 0,05; n )
2
2,77
3
3,31
4
3,65
j
53 Przykład 2.6. Otrzymano następujące wyniki analiz powtarzanych: 4,64; 4,64; 4,67. Należy sprawdzić, czy rozstęp między wynikami wynoszący 0,03 jest spowodowany błędem przypadkowym. Obliczone wcześniej na próbkach materiału odniesienia odchylenie standardowe dla f > 50 wynosi 0,023. Dla nj = 3 i α = 0,05 wartość współczynnika Pearsona wynosi (tabela 2.3.) d = 3,31. Po podstawieniu do równania (26) otrzymuje się dopuszczalną wartość różnicy:
Wniosek: Rozstęp między wynikami R = 0,03 z prawdopodobieństwem P = 0,95 (poziom istotności α = 0,05) jest mniejszy od wartości krytycznej, tzn. różnice między wynikami oznaczań są nieistotne i otrzymane wyniki można przedstawić jako wartość średnią arytmetyczną, która w tym przypadku wynosi 4,650.
2.4. Hipotezy i testy statystyczne W praktyce analitycznej często korzysta się z tzw. testowania, które umożliwia np. ocenę, czy różnica między znalezionymi (obliczonymi) wynikami jest mała, czy duża, czy ma istotne znaczenie, czy też można ją zaniedbać. Metody testowania pozwalają stwierdzić, czy wartości znalezione doświadczalnie, podstawione do równania na obliczanie danego kryterium testującego, mieszczą się, z przyjętym poziomem prawdopodobieństwa, w granicach tzw. wartości krytycznych dla danego testu. Wartości krytyczne odczytuje się z odpowiednich tablic. Poziom prawdopodobieństwa określa się jako poziom istotności α, dla którego porównuje się wartość obliczoną z wartością odczytaną z tablicy. W badaniach analitycznych często zachodzi potrzeba porównania różnych metod pod kątem wybrania jednej z nich. Porównania takie mogą być prowadzone m.in. na podstawie badań międzylaboratoryjnych. W prostych przypadkach metody porównuje się, opierając na wynikach oznaczań tej samej substancji, otrzymanych dwiema lub więcej metodami. Czynność ta sprowadza się do ustalenia, czy wyniki oznaczań uzyskanych za pomocą różnych metod należą do tej samej zbiorowości generalnej. Do weryfikacji hipotez stosowanych podczas porównywania metod korzysta się z testów parametrycznych lub nieparametrycznych. W praktyce laboratorium analitycznego często zachodzi potrzeba sprawdzania różnego rodzaju hipotez statystycznych. Hipotezą statystyczną nazywamy każde przypuszczenie dotyczące właściwości, charakteryzujących zbiorowość generalną. Hipotezy statystyczne dzielą się na: — parametryczne, w których zakłada się znany rozkład zmiennej losowej (dla błędów w analizie chemicznej przeważnie rozkład normalny) i sprawdza parametry tego rozkładu, — nieparametryczne, w których nie zakłada się typu rozkładu zmiennej losowej. Hipoteza parametryczna jest np. przypuszczeniem, że wartość średnia w populacji o rozkładzie normalnym równa jest ściśle określonej wartości μ0. Hipotezą nieparametryczną jest np. przypuszczenie, że rozkład otrzymanych wyników jest ściśle określony, np. normalny, albo że dwie próbki pochodzą z tej samej populacji.
54 Do sprawdzenia i weryfikacji hipotez statystycznych służą testy statystyczne. Test statystyczny jest regułą postępowania, która na podstawie parametrów próbki ma doprowadzić z określonym prawdopodobieństwem do podjęcia lub odrzucenia podstawowej hipotezy statystycznej. Każdy test statystyczny budowany jest dla tzw. problemu testowania (H0, H1), gdzie H0 oznacza hipotezę zerową (nazywaną niekiedy hipotezą testowaną), a H1 oznacza hipotezę alternatywną. Hipoteza alternatywna jest przyjmowana jako prawdziwa w momencie odrzucenia hipotezy zerowej. Hipoteza zerowa może w rzeczywistości być zarówno prawdziwa jak i fałszywa, a w rezultacie testowania może zostać przyjęta lub odrzucona (dokładniej, przyjęcie albo odrzucenie hipotezy zerowej oznacza podjęcie decyzji o przyjęciu albo odrzuceniu tej hipotezy na podstawie wyników przeprowadzonego testu). Te cztery możliwości przedstawia tabela 2.4: Tabela 2.4. Błędy wnioskowania w wyniku testowania hipotez Decyzja podjęta w wyniku testowania
H0 jest prawdziwa
H0 jest fałszywa
Przyjąć H0
decyzja poprawna
błąd II rodzaju
Odrzucić H0
błąd I rodzaju
decyzja poprawna
Jeśli hipoteza zerowa jest prawdziwa i w wyniku testowania zostanie przyjęta albo jest ona fałszywa i w wyniku testowania zostanie odrzucona, to w obu wypadkach podjęta decyzja jest prawidłowa. Jeśli hipoteza zerowa jest prawdziwa i zostaje odrzucona to popełniony błąd nazywa się błędem I rodzaju. Jeśli hipoteza zerowa jest fałszywa i zostaje przyjęta to popełnia się błąd nazywany błędem II rodzaju. Test, którego wyniki pozwalają tylko na odrzucenie hipotezy testowanej (gdyż w teście tym kontrolowane jest jedynie prawdopodobieństwo błędu I rodzaju, natomiast niekontrolowane jest prawdopodobieństwo błędu II rodzaju) nosi nazwę testu istotności. Poziomem istotności testu statystycznego nazywa się arbitralnie przyjętą wartość ograniczającą prawdopodobieństwo błędu I rodzaju. Wielkość poziomu istotności uwarunkowana jest skutkami jakie mogą wynikać z niewłaściwego odrzucenia hipotezy zerowej na korzyść przyjęcia hipotezy alternatywnej – im bardziej zależy nam na uniknięciu takich skutków, tym mniejszą wartość przyjmuje się jako poziom istotności. W badaniach biologicznych i chemicznych zazwyczaj przyjmuje się poziom istotności równy 0,05 albo 0,01; poziom istotności najczęściej oznaczany jest literą α. Weryfikację hipotezy zerowej przeprowadza się przy założeniu jej prawdziwości. 1. Testowaną hipotezę odrzuca się (na korzyść hipotezy alternatywnej), gdy w wyniku weryfikacji prawdopodobieństwo zajścia zdarzenia zgodnego z tą hipotezą jest bardzo małe, tj. mniejsze od poziomu istotności α = 0,01. Jeśli hipoteza zerowa sformułowana była jako równość dwóch parametrów, alternatywna jako brak równości tychże samych parametrów, symbolicznie można to zapisać jako problem testowania (H0: μ1 = μ2; H1: μ1 ≠ μ2), to odrzucenie hipotezy zerowej o równości parametrów powoduje przyjęcie hipotezy alternatywnej, co jest równoważne przyjęciu orzeczenia, że parametry μ1 i μ2 różnią się w sposób istotny na poziomie istotności α = 0,01. 2. W przypadku testu istotności, tzn. w przypadku gdy w teście kontrolowane jest tylko prawdopodobieństwo błędu I rodzaju powstaje dość poważny problem, gdy
55 w wyniku testowania prawdopodobieństwo zajścia zdarzenia zgodnego z hipotezą zerową jest większe od poziomu istotności α = 0,05. Ponieważ nie jest kontrolowane prawdopodobieństwo błędu II rodzaju nie można przyjąć hipotezy zerowej, gdyż nie wiadomo jak często taka decyzja może być decyzją błędną (jeśli np. prawdopodobieństwo błędu II rodzaju jest rzędu 0,5, to zamiast przeprowadzać weryfikację hipotezy zerowej prościej jest rzucać monetą – skutek będzie taki sam). Używane jest wtedy orzeczenie, iż nie ma podstaw do odrzucenia hipotezy zerowej, co jednakże nie jest równoznaczne z jej przyjęciem. W praktyce brak podstaw do odrzucenia hipotezy zerowej jest utożsamiany z jej przyjęciem, co z punktu widzenia teorii statystyki nie jest poprawne. 3. Jeśli w wyniku weryfikacji hipotezy zerowej prawdopodobieństwo zdarzenia zgodnego z tą hipotezą jest większe od 0,01 i mniejsze od 0,05 to należy przeprowadzić weryfikację ponownie zwiększając liczbę wyników laboratoryjnych, gdy jest to niemożliwe, to otrzymany rezultat należy zinterpretować w sposób niekorzystny dla badacza. W praktyce laboratoryjnej testowanie hipotez zwykle odbywa się na jednym poziomie istotności α = 0,05, rzadziej na poziomie α = 0,01. 2.4.1. Porównanie dwóch wariancji lub jej pochodnych Jednorodność wariancji sprawdza się w laboratorium najczęściej w celu: ustalenia zakresu roboczego (analitycznego) metody analitycznej lub porównania rozrzutu danych w różnych seriach wyników analiz tej samej próbki. Można również ocenić istotność różnic współczynników zmienności najczęściej w celu: — porównania precyzji dwóch lub więcej metod analitycznych, — akceptacji granicy oznaczania ilościowego, Jednorodność wariancji lub istotność różnic współczynników zmienności sprawdza się za pomocą testu F–Snedecora, weryfikując hipotezę zerową: H0 : s12 = s22. W celu weryfikacji hipotezy statystycznej o równości wariancji dwóch szeregów statystycznych (zbiorów wyników analiz), wyznacza się wartości estymatorów wariancji s22 i s12 z próbek o liczności odpowiednio n1 i n2, a następnie oblicza się wartość wyrażenia: dla
s12 > s22
lub
dla
s22 > s12
(27)
Zamiast wariancji s2 można do równań (27) podstawić wartości współczynników zmienności v: (28)
lub
Wyrażenie F tworzy się w ten sposób, aby licznik był większy od mianownika, tzn. aby otrzymana wartość F była nie mniejsza od jedności. Obliczoną wartość F porównuje się z wartością krytyczną Fα; f1, f2 odczytaną z tablicy rozkładu F–Snedecora, dla poziomu istotności α i liczby stopni swobody f1 = n1 – 1 dla licznika i f2 = n2 – 1 dla mianownika (lub odwrotnie, w zależności od tego, która z wariancji próbkowych jest większa). W przypadku gdy zachodzi F > F α; f1, f2 odrzuca się hipotezę zerową H0 : s12 = s22
56 o równości wariancji w porównywanych populacjach, na korzyść hipotezy alternatywnej H1 : s12 ≠ s22. Jeśli natomiast F ≤ Fα; f1, f2 to nie ma podstaw do odrzucenia hipotezy H0. W tym ostatnim przypadku uważa się, że precyzje obu metod nie różnią się między sobą w sposób istotny. Przykład 2.7a. Zastosowanie testu F do oceny jednorodności wariancji dwóch serii wyników analiz próbek o tym samym stężeniu badanego czynnika. Otrzymano wyniki dwóch serii pomiarowych: Seria 1 66,1 61,2 59,8 57,0 62,4 62,1 58,3 62,7 59,6 55,9 59,5 60,4 64,1 60,9 61,1 Seria 2 61,9 58,6 59,2 60,3 57,5 64,3 59,6 62,3 62,8 59,9 62,0 64,4 63,6 55,1 68,7 67,7
n1 = 15
s12 = 6,86
n2 = 16
s22 = 12,73
Wartość statystyki F obliczona z równania,
(wariancja w drugiej serii jest
większa niż w pierwszej) jest równa 1,86, a wartość krytyczna 2,44. Zatem obliczona wartość F jest mniejsza od wartości krytycznej, a więc nie ma podstaw do odrzucenia hipotezy zerowej o jednorodności wariancji w obu seriach pomiarowych. Przykład 2.7b. Badano precyzje dwóch metod analitycznych (wyrażoną odpowiednimi współczynnikami zmienności), stosowanych do oznaczania tej samej substancji i otrzymano wyniki: Metoda
Współczynnik zmienności
Stopień swobody
Pierwsza
v1 = 4,4%
f1 = 24
Druga
v2 = 2,2%
f2 = 24
Różnica precyzji dwóch metod analitycznych jest istotna statystycznie. Błąd przypadkowy (losowy) metody drugiej jest mniejszy. 2.4.2. Porównywanie dwóch średnich (poprawności dwóch metod) Testy wykorzystywane do porównywania dwóch „prawdziwych” średnich (wartości oczekiwanych rozkładów prawdopodobieństwa badanej cechy) w dwóch różnych populacjach, z których pobrano próbki (H0 : μ1 = μ2, H1 : μ1 ≠ μ2) są najczęściej testami istotności, czyli testami, w których kontrolowane jest jedynie prawdopodobieństwo błędu I rodzaju. Można w ten sposób wykryć błąd systematyczny, którym może być obciążony wynik badania laboratoryjnego.
57 Test t-Studenta (model I) Jeśli badana cecha (wyniki uzyskiwane obiema metodami) ma w obu populacjach rozkład normalny o jednakowej, choć nieznanej wariancji, to wówczas test istotności dla problemu H0 : μ1 ( 1) = μ2 ( 2), H1 : μ1 ( 1) ≠ μ2 ( 2) skonstruowany jest na statystyce:
(29) która ma wówczas rozkład t-Studenta o n1 + n2 – 2 stopniach swobody. Obliczoną wartość t porównuje się z wartością krytyczną tα; f rozkładu t-Studenta, dla przyjętego poziomu istotności α i dla liczby stopni swobody f = n1 + n2 – 2. Jeśli obliczona wartość t jest większa od wartości krytycznej, to odrzuca się hipotezę zerową o równości średnich w porównywanych populacjach na korzyść hipotezy alternatywnej, że prawdziwe średnie w obu populacjach są różne (tzn. przyjmuje się hipotezę alternatywną). W rozważanym przypadku, jeśli jedna z metod jest referencyjna, to druga jest obciążona błędem systematycznym. W przypadku, gdy obliczona wartość t jest nie większa niż wartość krytyczna, nie ma podstaw do odrzucenia hipotezy zerowej o równości wartości przeciętnych, z czego można wnioskować, że obserwowane różnice między metodami są nieistotne statystycznie i wynikają z istnienia błędów przypadkowych. W przypadku gdy liczności serii pomiarów obydwu metod są sobie równe, tzn. gdy n1 = n2 = n, poprzednie równanie upraszcza się do postaci: (30) przy czym liczba stopni swobody jest równa f = 2 (n – 1). Opisany test może być stosowany dla populacji, w których badana cecha ma rozkład normalny, przy czym powinien być zachowany warunek równości wariancji w obu populacjach. Sprawdzenia hipotezy, że s 12 = s 22 dokonuje się poprzednio opisanym testem F –Snedecora. Przykład 2.8. W przykładzie 2.7a. otrzymano dane: Seria 1:
n1 = 15
s12 = 6,86
obliczona średnia wynosi
1= 60,74;
Seria 2:
n2 = 16
s 22 = 12,73
obliczona średnia wynosi
2= 61,74;
bezwzględna wartość statystyki t jest równa 0,0035, wartość krytyczna t0,05; 29 = 2,05. Ponieważ obliczona wartość statystyki t jest mniejsza od wartości krytycznej, nie ma podstaw do odrzucenia hipotezy zerowej. Test t-Studenta (model II) W pewnych okolicznościach może zaistnieć potrzeba porównania wartości średniej uzyskanej z pomiarów z uznaną za bezbłędną wartością liczbową μ0, np. wyprowadzoną teoretycznie na podstawie obliczeń lub uznaną arbitralnie. Testowany jest wówczas problem (H0 : μ = μ0, H1 : μ ≠ μ0). Weryfikacja hipotezy H0 polega na obliczeniu wartości statystyki t1:
58 (31) i porównaniu jej z wartością krytyczną tα; f rozkładu t-Studenta. Wskazane jest stosowanie tej wersji testu do porównania wartości nominalnych materiałów odniesienia, dla których podano granice niepewności z wynikiem analiz powtarzalnych, np. materiałów odniesienia stosowanych podczas walidacji metody lub szacowania niepewności pomiaru. Przykład 2.9. Zakładając, że prawdziwa wartość parametru ocenianego w serii 1 przykładu 2.7a. jest równa μ = 65, należy rozważyć teraz problem testowania (H0 : μ = 65, H1 : μ ≠ 65). Oblicza się bezwzględną wartość statystyki t, która jest równa 6,30, zaś wartość krytyczna t0,05; 14 = 2,14. W tym przypadku obliczona wartość statystyki jest większa od wartości krytycznej, zatem należy odrzucić hipotezę zerową i przyjmujemy hipotezę alternatywną H1 : μ ≠ 65. 2.4.3. Porównanie różnic par wyników Porównanie dwu metod oraz wykrycie obecności błędu systematycznego w przypadku, gdy jedna z metod jest metodą wzorcową, można przeprowadzić także badając różnice między parami xi, yi wyników pomiarów xi – yi. Każda i–ta para wyników dotyczy tej samej próbki (próbki są parami skorelowane, m jest liczbą par). Mając wyniki pomiarów metodą X (x1, x2,..., xm) i metodą Y (y1, y2,..., ym) oblicza się wielkość: (32) gdzie: (33) Oblicza się odchylenie standardowe wg równania: (34) Porównanie obliczonej wartości t z wartościami tablicowymi przy przyjętym poziomie istotności αi liczbie stopni swobody f = m – 1, pozwala na ocenę ewentualnego występowania różnic między metodami lub na stwierdzenie obecności błędu systematycznego. Przy stosowaniu tego testu zakłada się, że badane populacje mają rozkład normalny. Przykład 2.10. Należy zbadać, czy różnica między dwiema seriami wyników jest nieistotna; H0 : X = Y; H1 : X ≠ Y, przy czym pierwszą serię uzyskano metodą wzorcową (X):
59
xi
yi
di = xi – yi
100,1
96,6
3,5
1,21
115,1
115,6
– 0,5
8,41
130,0
125,5
4,5
4,41
93,6
94,0
– 0,4
7,84
108,3
103,3
5,0
6,76
137,2
134,4
2,8
0,16
104,4
100,2
4,2
3,24
97,3
97,3
0
5,76
Σ = –19,1
Σ = 37,79
Wynik testowania: różnica pomiędzy obu seriami wyników jest istotna; metoda druga jest obciążona błędem systematycznym. 2.4.4. Wykrywanie błędów grubych Podczas wielokrotnego powtarzania analiz często jeden z wyników bez widocznych przyczyn różni się od pozostałych – (jest większy lub mniejszy). Należy wówczas rozstrzygnąć, czy chodzi tu o wynik, który różni się od pozostałych ze względu na losowo duży rozrzut, czy też jest to prawdziwy „gruby błąd”, który należy wykluczyć – lub lepiej zastąpić wynikiem dodatkowo wykonanej analizy – przy dalszym opracowywaniu wyników. W chemii analitycznej najczęściej otrzymuje się mało liczne serie wyników i dlatego błędy grube najlepiej wykrywać na podstawie badania rozstępu, za pomocą testu Dixona. Dla zbioru danych x1, x2, x3........ xn ustawionych w szeregu statystycznym uporządkowanym, test Dixona stosuje następującą statystykę:
60
przy 3 – 7 danych
(35)
przy 8 – 12 danych
(36)
przy > 12 danych
(37)
Należy uwzględnić większą z wartości danej pary Q1 / Qn i porównać z wartością krytyczną Qα, n odczytaną z tablicy wartości krytycznych. Jeżeli w danym szeregu statystycznym test Dixona ujawnia, że jedna z wartości ekstremalnych (największa lub najmniejsza) jest statystycznie odbiegająca, test można zastosować powtórnie dla n – 1 = n’ pozostałych wartości. Test można stosować wielokrotnie, aż do ujawnienia wszystkich wartości odbiegających. Test Dixona można zastosować zarówno dla porównania wartości oznaczonych, otrzymanych w wyniku analiz powtarzanych danej próbki (x) lub wartości mierzonych (wskazań przyrządu pomiarowego np. absorbancja) (y). Przykład 2.11. W wyniku analiz powtarzanych otrzymano dane pomiarowe, które przedstawiono w szeregu uporządkowanym: y1 = 0,19; y2 = 0,19; y3 = 0,20; y4 = 0,20; y5 = 0,24 Ocenie poddane są: pierwszy y1 i ostatni y5 wynik w szeregu:
Q1 = 0
Q5 = 0,80
Wynik testu wynosi 0,80 Wartość krytyczna wynosi Q0,05; 5 = 0,71 Wniosek: ponieważ Q5 > Q0,05; 5 wartość pomiarowa y5 = 0,24 jest statystycznie odbiegająca od wyników pozostałych i nie powinna być uwzględniona w dalszych obliczeniach. Doerffel podaje inny sposób wykrywania błędu grubego w seriach wyników o liczności 4 < n < 1000. W celu sprawdzenia hipotezy o występowaniu błędu grubego oblicza się dla otrzymanych wyników, ale z pominięciem wyniku podejrzanego, średnią arytmetyczną i odchylenie standardowe. Jeżeli liczność wyników w serii przekracza 10, a wynik podejrzany różni się od wartości średniej więcej niż o 4s, to przypuszczalnie jest on obciążony błędem grubym.
61
2.5. Statystyka zależności liniowej 2.5.1. Parametry zależności liniowej W chemii analitycznej większość technik instrumentalnych przed wykonaniem analizy próbki wymaga wzorcowania, którego wynik przedstawiony jest odpowiednim równaniem regresji. Zadaniem analityka jest określenie właściwej funkcji wzorcowania na podstawie posiadanych informacji o zawartościach mierzonych próbek i wynikach pomiarów (wskazaniach przyrządu pomiarowego). W tym celu stosuje się statystyczną analizę regresji, która pozwala scharakteryzować zależność między dwiema zmiennymi: niezależną x i zależną y. Wartości zmiennej x znane są już przed doświadczeniem, a wartości zmiennej y, są ustalone w wyniku doświadczenia. Parametry funkcji regresji liniowej mogą być wykorzystane w laboratorium do badania różnych cech metody analitycznej w procesie jej walidacji, np. wykrywalności i oznaczalności, liniowości, czułości, precyzji, a także niepewności pomiaru. Równanie przedstawiające zależność liniową między wskazaniem przyrządu pomiarowego y a stężeniem x ma postać: y = a + bx
(38)
Równanie (38) przedstawia zależność dwóch zmiennych: y – wartość wskazania przyrządu pomiarowego – jest zmienną zależną, x – ilość (stężenie) analitu – jest zmienną niezależną. Stałe równania a i b można wyliczyć metodą najmniejszych kwadratów wg równań: (39)
(40) Stała a nosi nazwę współczynnika przesunięcia, a stała b współczynnika nachylenia. Wyznaczony na podstawie parametrów równania regresji wykres funkcji przedstawia zależność wartości wskazań przyrządu pomiarowego y od ilości lub stężenia analitu x. Za pomocą wykresu funkcji regresji przedstawia się w analizie instrumentalnej wynik wzorcowania (kalibracji). Współczynnik nachylenia b jest miarą czułości metody analitycznej, a jej wartość np. w spektrofotometrii UV–VIS przy grubości warstwy absorbującej wynoszącej 1 cm, ma wartość współczynnika absorpcji. 2.5.2. Szacowanie parametrów zależności liniowej Stałe a i b są wielkościami losowymi (estymatorami), parametrów α i β. Precyzja oszacowania stałych wyrażona jest wariancją (odchyleniem standardowym) charakteryzującą rozrzut między wartościami zmiennych y i x (ang. residual standard deviation – sy).
62
(41)
(42)
Dla wartości a i b można wyznaczyć odpowiednie przedziały ufności. W tym celu oblicza się wariancje i odchylenia standardowe stałych a i b z równań: (43)
(44) Wartości sa i sb charakteryzują precyzję wyznaczania stałych a i b, zaś odpowiednie przedziały ufności – niepewność ich szacowania. Przedział ufności b i a oblicza się wg równań: (45)
(46) gdzie f = m – 2 Niepewność wyniku odpowiadająca niepewności metody dopasowania liniowego jest konsekwencją błędów, którymi jest obciążona wartość mierzona i błędów wyznaczania współczynników funkcji regresji. Z tego względu prawdziwa wartość linii regresji leży między granicami przedziału ufności wyznaczonego z określonym prawdopodobieństwem (P = 1 – α), a wartość mierzona Y jest zmienną losową. Wynik analizy próbki Xi znajdzie się również w przedziale odpowiadającym przedziałowi ufności linii regresji. Ilustrację tych zależności przedstawia rys. 2.3. Błędy (odchylenia) wynikające z prawa propagacji układają się w kształcie dwóch hiperboli leżących po przeciwnych stronach krzywej (funkcji równania regresji). Odległość między nimi wzrasta w miarę oddalania się od środkowego punktu wykresu.
63
Rys. 2.3. Zakres roboczy metody, scharakteryzowany przez linię wzorcowania od x1 do x10 wraz z odpowiadającym jej przedziałem ufności i niepewności wyniku pojedynczej analizy (X).
Z tego też względu przy konstruowaniu np. krzywej wzorcowej, należy w środku skali wzorców umieścić wzorzec odpowiadający np: stężeniu nominalnemu danego analitu w próbce. Oszacowanie granic przedziału ufności (a więc losowej składowej niepewności) wyniku pomiaru analitu w próbce wyraża się równaniem:
(47)
w którym: xi – stężenie analitu w i–tej próbce wzorcowej, – średnia stężeń analitu w skali wzorców o m poziomach stężeń, N – liczba analiz powtarzanych, – średnia sygnałów analitycznych dla N powtórzeń analiz próbki bada nej, – średnia sygnałów analitycznych dla yi próbek wzorcowych o różnych poziomach stężeń analitu, m – liczba poziomów stężeń wzorcowych analitu w skali wzorców, – stężenie (zawartość) analitu w badanej próbce obliczone ze średniej wartości Y . Jeżeli N = 1 to = X i = Y (N = liczba oznaczań powtórzonych badanej próbki). Wartość dystrybuanty rozkładu t-Studenta (tα; f) określa się dla m–2 stopni swobody i dla poziomu istotności α = 0,05.
64 Przedział ufności wyniku pomiaru instrumentalnego zależy od: — prawdopodobieństwa odpowiadającego wartości statystyki: tα; f — czułości metody: b — resztowego odchylenia standardowego: sy — liczby poziomów stężeń wzorców: m — liczby powtórzeń (analiz równoległych) próbek badanych: N — wartości uzyskanego dla próbki badanej sygnału pomiarowego (np. absorbancji). W przypadku wykorzystania przedziału ufności (a właściwie jego połowy) wyniku pomiaru instrumentalnego w budżecie niepewności tego wyniku uwzględniającym wszystkie składowe (patrz rozdz. 2.8), należy w równaniu (47) pominąć wielkość t. Przykład szacowania parametrów zależności liniowej podano w zał. 2.1. 2.5.3. Ocena funkcji liniowej Precyzję kalibracji w analizie instrumentalnej dobrze charakteryzują parametry krzywej wzorcowej opisane równaniem regresji y = a + bx, takie jak resztowe odchylenie standardowe (punktów wartości mierzonych od linii prostej) sy oraz współczynnik nachylenia (czułość) b. Jakość pomiaru instrumentalnego polepsza się, gdy wzrasta czułość i zmniejsza się odchylenie standardowe sy. Odchylenie standardowe metody (kalibracji) sm uwzględnia wpływ na jakość analizy parametrów sy i b. Odchylenie standardowe oblicza się wg równania: (48) Precyzję najlepiej wyrazić w postaci współczynnika zmienności, który daje możliwość względnego porównania różnych technik np. instrumentalnych, stosowanych do analizy tego samego czynnika. Do oceny istotności różnic precyzji stosuje się test F–Snedecora (równanie (27)). Współczynnik zmienności oblicza się w procentach wg równania: (49) lub (50) w którym:
– średnia wartość zakresu skali wzorców.
2.5.4. Korelacja liniowa Miarą zależności między dwiema zmiennymi x i y jest współczynnik korelacji liniowej ρ (– 1 ≤ ρ ≤ + 1). Gdy ρ = 1, zachodzi ścisła zależność liniowa, a wzrost x powoduje wzrost y. Gdy ρ = –1, wtedy również zachodzi zależność liniowa, ale wzrost x powoduje zmniejszenie wartości y. W przypadku, gdy ρ = 0 wielkości x i y są nieskorelowane. Ma to szczególnie
65 miejsce w przypadku gdy x i y są niezależne. Jednakże na podstawie ρ = 0 nie można wnioskować o niezależności stochastycznej x i y. Im bardziej ρ zbliżone jest do ±1, tym ściślejsza jest obserwowana zależność. W praktyce laboratoryjnej w wyniku szacowania współczynnika korelacji można między innymi ocenić: — liniowość zakresu roboczego metody, — liniowość wzorcowania przyrządu pomiarowego, — zależność między dwiema zmiennymi. W przypadku badania próby losowej estymatorem współczynnika korelacji ρ jest współczynnik korelacji z próbki r obliczany według równania: (51) Stosując współczynnik korelacji do oceny liniowości zakresu metody lub krzywej wzorcowej, zwykle przyjmuje się założenie granicznej wartości współczynnika korelacji, np. r ≥ 0,999. Badając zależność między zmiennymi można sprawdzić, czy współczynnik korelacji istotnie różni się od zera np. w przypadku metod zaprojektowanych w laboratorium z wykorzystaniem pomiaru spektrofotometrycznego (UV, VIS). Można tego dokonać obliczając wartość statystyki rozkładu t-Studenta wg równania: (52) Uzyskaną wartość tr porównuje się z wartością krytyczną t z tablic, dla przyjętego poziomu istotności np. α = 0,05. Jeśli ⎢tobl⎢ > tkryt przybliżenie zależności liniowej jest prawidłowe (współczynnik korelacji jest różny od zera). Jeśli ⎢tobl⎢ < tkryt brak jest zależności liniowej między badanymi zmiennymi. Jeżeli w wyniku eksperymentu otrzymana wartość współczynnika korelacji jest mniejsza od wartości założonej np. 0,999, to można przeprowadzić szacowanie niepewności tego współczynnika w celu ustalenia przedziału ufności, w którym może znaleźć się „prawdziwa” wartość współczynnika korelacji r’. Przykład 2.12. W wyniku kalibracji przyrządu pomiarowego oszacowano parametry zależności linowej i otrzymano współczynnik korelacji r = 0,997, czyli wartość mniejszą od założonej (r = 0,999). Kalibrację powtórzono pięciokrotnie stosując w każdym powtórzeniu po pięć wzorców o różnym poziomie stężeń (czyli n = 25). Wykonano szacowanie niepewności otrzymanego współczynnika korelacji przyjmując prawdopodobieństwo P = 0,95 wg równania: (53)
66 Podstawiając uzyskane wyniki otrzymano:
t (0,05; 24) = 2,06 czyli:
stąd:
czyli:
Wniosek: „prawdziwa” wartość współczynnika korelacji r’ znajduje się w przedziale 0,995÷0,999, tj. obejmuje zakładaną wartość r = 0,999. 2.5.5. Wykrywanie błędów systematycznych Błędy systematyczne powodują odchylenie wyników pomiarów od wartości prawdziwej w jedną stronę. Przy ocenie metody analitycznej ważna jest znajomość rodzaju występującego błędu systematycznego, co pozwala na odpowiednie skorygowanie procedury analitycznej. W rozdziałach 2.4.2. i 2.4.3. przedstawiono możliwość wykrywania błędu systematycznego wyników powtarzanych analiz tej samej próbki w porównaniu z wzorcową metodą lub materiałem odniesienia. Jeżeli istnieje potrzeba porównania danych uzyskanych z analizy próbek o różnych poziomach zawartości badanego składnika ze znanymi wartościami odniesienia, to można zbadać zależność między dwoma szeregami statystycznymi danych za pomocą równania regresji. W celu jednoczesnego wykrycia stałego i zmiennego błędu systematycznego bada się nj próbek odpowiedniego materiału odniesienia, na różnych poziomach stężeń (zawartości) badanego składnika. Następnie przeprowadza się statystyczną ocenę zależności między zadaną xz i oznaczoną y0 zawartością wg równania regresji: y = a + bx. Jeśli metoda analityczna nie jest obciążona błędem systematycznym to xz = y0, a więc stawiamy hipotezę zerową H0 : a = 0 i b = 1 i hipotezę alternatywną H1 : a ≠ 0 i b ≠ 1. Jeśli współczynnik przesunięcia a istotnie różni się od zera, dowodzi to występowania błędu stałego. Jeśli współczynnik nachylenia prostej jest istotnie różny od 1 to występuje błąd zmienny. Występowanie błędów systematycznych zostaje stwierdzone gdy: (54)
67
(55) dla f = nj – 2 stopni swobody. sb i sa obliczono wg równań (43) i (44). Przykład 2.13. Dla pewnej metody miareczkowej oznaczania siarczanów otrzymano następujące wyniki analiz (ilość SO42- w mg): Dodano, xzi
9,50
19,00
28,50
38,00
47,50
95,00
142,50
190,00
237,50
Oznaczono, y0i
12,08
19,42
28,64
37,87
46,37
93,12
139,50
185,96
232,95
Skorygowano, y*i
11,29
18,83
28,30
37,78
46,52
94,54
142,17
189,90
238,16
Po zastosowaniu metody regresji liniowej y0 = a + bxz otrzymano: a = 1,083736
b = 0,973568
sa = 0,421963
sb = 0,003555
ta = a / sa = 1,083736 / 0,421963 = 2,57 tb = (1 – b) / sb = (1 – 0,973568) / 0,003555 = 7,44 t (0,05; 7) = 2,36 czyli:
ta > t
tb > t
(0,05; 7)
(0,05; 7)
Ponieważ ta i tb są większe do t (α; f) występowanie stałego i liniowego zamiennego błędu systematycznego zostało potwierdzone. W tym przypadku należy wprowadzić poprawkę do wyników oznaczań stosując przekształcenia. Wszystkie skorygowane wyniki zestawiono powyżej, łącznie z danymi pierwotnymi. Przykładowo sposób przekształcenia trzech wyników podano poniżej: y* 1 = (y01 – a) / b = (12,08 – 1,083736) / 0,973568 = 11,29 y* 2 = (y02 – a) / b = (19,42 – 1,083736) / 0,973568 = 18,83 y* 9 = (y09 – a) / b = (232,95 – 1,083736) / 0,973568 = 238,16 a następnie obliczyć skorygowane współczynniki a* i b*: czyli: yi*= a* + b*xz
68 W wyniku przeprowadzonych obliczeń otrzymano: a* = 1,7 . 10-7
b* = 1,00000
sa* = 0,433
sb* = 0,003651
Wartości współczynników a i b wskazują, że po skorygowaniu błędu systematycznego (stałego i zmiennego) wartości oznaczonych stężeń analitu w kolejnych próbkach nie różnią się istotnie od stężeń analitu dodanych do tych próbek.
2.6. Charakteryzacja metody analitycznej 2.6.1. Zakres roboczy W analizie chemicznej określa się zakres roboczy metody, w którym można osiągnąć liniowość oraz akceptowalną poprawność i precyzję. W założonym zakresie roboczym metody należy sprawdzić: — jednorodność wariancji wyników analiz próbek na skrajnym poziomie stężeń (zawartości) badanego analitu; jeżeli istnieje silna zależność wariancji od stężenia analitu za pomocą testu F można wyznaczyć statystyczne granice zakresu, — liniowość lub nieliniowość, — istotność różnic precyzji (współczynników zmienności) w skrajnych punktach zakresu (test F), — istotność różnic poprawności (odzysku analitu z matrycy) w różnych punktach zakresu (test t-Studenta). W przypadku oznaczań wartości maksymalnych (granicznych) analitu zakres roboczy może być wyznaczony arbitralnie przy założeniu, że spodziewane wartości stężeń analitu w badanych próbkach znajdą się wewnątrz zakresu, np. ± (20%, 30% lub 50%) od wartości spodziewanej. Metoda analityczna może mieć kilka zakresów roboczych, z których każdy będzie scharakteryzowany przez wyżej podane parametry. Łącznie, zakresy robocze mogą stanowić całkowity zakres analityczny metody. W analizie ilościowej instrumentalnej funkcja regresji charakteryzująca zakres roboczy zwykle odpowiada tzw. krzywej wzorcowej. W przypadku metod (zakresów roboczych) spełniających kryteria liniowości, wyrażone np. wartością współczynnika korelacji, krzywa wzorcowa opisana jest równaniem y = a + bx. Dla metod analitycznych (zakresów roboczych) odznaczających się dobrą liniowością, krzywą wzorcową można wyznaczyć na podstawie wyników analiz co najmniej 5 wzorców o różnych zawartościach badanego analitu. Na etapie charakteryzacji metody liczbę wzorców można zwiększyć (nawet do 10) w celu uzyskania lepszych oszacowań. W przypadku analizy stężeń (zawartości) minimalnych w badanych próbkach (materiale) dolna granica zakresu roboczego odpowiada zwykle granicy oznaczania ilościowego.
69 W przypadku analiz stężeń (zawartości) maksymalnych np. dopuszczalnych stężeń danego czynnika w środowisku lub żywności, dolna granica zakresu roboczego może odpowiadać np. 1/2 wartości dopuszczalnego stężenia, a środek zakresu (lub krzywej wzorcowania) powinien odpowiadać wartości stężenia (zawartości) maksymalnego. W analizie jakościowej, jeśli istnieje potrzeba określenia zakresu roboczego (co może wynikać np. z parametrów układów detekcyjnych w analizie instrumentalnej lub wydajności reakcji chemicznej w analizie klasycznej), to granica wykrywalności odpowiada zwykle dolnej granicy zakresu roboczego. 2.6.2. Liniowość Nie w każdym przypadku wiadomo z góry, czy uzasadnione jest przyjęcie hipotezy o liniowej zależności. W celu rozstrzygnięcia tego problemu należy dla każdej z m zadanych wielkości wykonać nj równoległych pomiarów. Otrzymamy przy tym błąd losowy w przypadku, gdy prawidłowo wybrano zależność liniową, nie powinien być istotnie różny od rozrzutu zmierzonych wartości względem linii regresji (linii prostej). Założenie to sprawdza się za pomocą analizy wariancji:
F=
wariancja „rozrzut wartości średnich” wariancja „rozrzut wewnątrz oznaczań równoległych”
W praktyce laboratoryjnej do oceny liniowości wykorzystuje się współczynnik regresji r, przyjmując arbitralnie wartość graniczną dla tego współczynnika np. nie mniejszy niż 0,999. Jeśli wartość r jest mniejsza od 0,999, należy rozważyć występowanie regresji nieliniowej różnej od regresji liniowej typu y = a + bx. Po dokonaniu odpowiednich przekształceń, tzn. sprowadzeniu modelu nieliniowego do postaci liniowej, należy wybrać typ równania regresji o największym, istotnym statystycznie współczynniku korelacji. Przykład możliwych przekształceń równań nieliniowych do równania liniowego typu y = a + bx podano w tabeli 2.5. Sposób korzystania z tabeli i dokonania przekształceń jest następujący: 1. Przekształcić wartości xi (stężenia wzorców) i sygnały pomiarowe yi (np. absorbancja) do modelu liniowego wg wzorów przedstawionych w kolumnie 2 tabeli 2.5. Dokonać oceny istotności współczynnika korelacji liniowej i wybrać typ równania nieliniowego, któremu odpowiada największy, istotny statystycznie, współczynnik korelacji. 2. Wykonać wszystkie czynności obliczeniowe na zmiennych x’i i y’; i tzn obliczyć: — wartości współczynników a i b, — precyzję wg rozdz. 2.5.3. (jeśli jest to konieczne), — granice wykrywalności i/ lub oznaczania ilościowego (jeśli jest to konieczne). 3. Po wyznaczeniu stężenia (X’) analizowanej próbki, przekształcić je do stężenia (X) za pomocą kolumny 3 w tabeli 2.5.
70 Tabela 2.5. Przekształcenie równań nieliniowych do postaci liniowej Typ równania nieliniowego
Przekształcenie równania nieliniowego do postaci liniowej Y’ = A’ + B’ . X’
Przekształcenie postaci liniowej Y’ = A’ + B’ . X’ do równania nieliniowego
1
2
3
Y’ = ln(Y)
Y = eY’
X’ = ln(X)
X = eX’
A’ = ln(A)
A = eA’
B’ = B
B = B’
Y’ = ln(Y)
Y = eY’
X’ = X
X = X’
A’ = ln(A)
A = eA’
B’ = ln(B)
B = eB’
Y’ = ln(Y)
Y = eY’
X’ = X
X = X’
A’ = ln(A) + B
A = eA’– B
B’ = 1
B = B’
Y’ = Y
Y = Y’
X’ = ln(X)
X = eX’
A’ = A
A = A’
B’ = B
B = B’
Y = A . XB
Y = A . BX
Y = A . eB+X
Y = A + B . ln(X)
2.6.3. Selektywność i specyficzność Wszystkie dostępne dane nt. selektywności i specyficzności, bądź informacja o braku takich danych, powinny znaleźć się w opisie (przepisie analitycznym) danej metody badawczej. Opracowujący metodę analityczną powinien zadbać przede wszystkim o zbadanie jej selektywności i jeśli to uzasadnione również specyficzności. Wykonujący analizę powinien brać pod uwagę możliwość występowania czynników zakłócających, których obecność w różnej ilości i kombinacjach w badaniach środowiskowych, żywności i w badaniach preparatów chemicznych jest praktycznie nieograniczona. Podczas walidacji metody można praktycznie sprawdzić selektywność/specyficzność wykonując oznaczanie analitu z dodatkiem możliwych substancji zakłócających oraz bez tych dodatków, a następnie porównać wyniki analiz (ocenić statystycznie istotność różnic porównywalnych sygnałów analitycznych). Pojęcia selektywności i/lub specyficzności można wiązać również z występowaniem błędu systematycznego. Statystycznie różny od zera współczynnik przesunięcia „a” w równaniu regresji y = a + bx może świadczyć o braku specyficzności.
71 Niektóre techniki analityczne, jak np. chromatografia gazowa, umożliwiają dobranie właściwej selektywności poprzez zastosowanie odpowiednich detektorów, np. detektor wychwytu elektronów (ECD) jest selektywnym dla związków zawierających atomy elektroujemne. Dobór przez wykonującego analizę właściwej kolumny rozdzielczej umożliwia specyficzne oznaczania poszczególnych związków np. z grupy chlorowcopochodnych. W badaniu mikroskopowym włókien azbestu właściwe wybarwienie preparatu umożliwia odróżnienie włókien mineralnych od innego rodzaju włókien. Doświadczenie i subiektywna wrażliwość operatora mikroskopu decydować będzie o rozróżnieniu włókien należących do różnych minerałów (odmian azbestu). Zaleca się, aby w dokumentacji potwierdzania/ walidacji metody badania w części poświęconej selektywności lub specyficzności znalazły się następujące informacje: — dane zebrane z piśmiennictwa, — dane doświadczalne ustalone przez opracowującego metodę, — wskazówki dla wykonującego analizę. 2.6.4. Granica wykrywalności Miarą granicy wykrywalności może być wynik odpowiadający średniemu stężeniu badanej substancji w ślepej próbie ( SP). Jeżeli wykona się większą liczbę (np. nSP > 20) analiz próbek ślepych, to uzyska się liczbowo różne wyniki, których rozrzut wokół wartości średniej ślepej próby ( SP) jest oszacowaniem odchylenia standardowego sSP. Dowolny wynik pomiaru można tylko wtedy odróżnić od wartości ślepej próby, gdy: (56)
(57) Odwrotnie, wartość yi < ymin rozpatrywana jest jako ślepa próba i interpretowana jako niestwierdzenie analizowanego składnika w próbce. Jeśli metoda przewiduje analizę próbek podwójnych, to odchylenie standardowe ślepej próby oblicza się wg równania (17). Jeśli wykonywane będą analizy pojedyncze, to odchylenie standardowe ślepej próby oblicza się wg równania (8). Wynik oznaczania xmin (= SP) otrzymuje się przeliczając odpowiednio wartość mierzoną ymin, zgodnie z równaniem: (58) gdzie b – współczynnik nachylenia (czułość metody) (59) Wielkość xmin – określa się mianem granicy wykrywalności.
72 Granicę wykrywalności można obniżyć, jeżeli — odchylenie sSP jest małe, — czułość b jest duża, — liczba oznaczań równoległych jest dostatecznie duża (np. powyżej 20). Możliwe jest alternatywne postępowanie dla wyznaczania granicy wykrywalności. Jeśli istnieją dane piśmiennictwa na temat granicy oznaczania ilościowego metody i jeśli przygotowano wzorzec chemiczny odpowiadający tej granicy, to wykrywalność można wyznaczyć jako trzy odchylenia standardowe wyników powtarzanych oznaczań tego wzorca. xmin = 3 s1x
(60)
Ponadto w analizie instrumentalnej granicę wykrywalności można alternatywnie wyrazić stosunkiem sygnału analitycznego do amplitudy szumów, który powinien wynosić 2:1 lub 3:1. 2.6.5. Granica oznaczania ilościowego Granicę oznaczania ilościowego (xozn) można najlepiej wyrazić równaniem: lub
(61)
gdzie: xozn – najmniejsza wartość mierzalna z określoną precyzją i poprawnością, b = dx/dc – czułość metody analitycznej. Według Doerffla granicę oznaczalności metody można wyznaczyć na podstawie wyników analiz ślepej próby, korzystając z tych samych danych, których użyto do wyznaczania granicy wykrywalności. Jeżeli wielokrotnie powtarzano analizę próbki o zawartości yi = ymin, to rozrzut wyników w zakresach prawdopodobieństwa wynosi P = 0,5. P (yi < ymin) = P (yi > ymin) = 0,5
(62)
Pojedynczy wynik analizy będzie w 50% wszystkich przypadków uznawany za „ślepą próbę” (yi < ymin) lub jako „wynik analizy” (yi > ymin) i zanieczyszczenie odpowiadające granicy wykrywalności będzie w 50% wszystkich przypadków niewykryte. Pewność, że wynik jest pozytywny wzrasta ze wzrostem „odległości” wyniku od SP . Maleje wówczas powierzchnia pod krzywą rozkładu normalnego poniżej punktu ymin = SP + 3σSP. Jeśli: (63) to obliczone prawdopodobieństwa wnoszą odpowiednio:
73 Wartości te można uznać jako wystarczające, aby uznać, że zanieczyszczenie wykryto z dużą pewnością. Granicę określoną równaniem (63) nazywa się granicą oznaczania ilościowego. Zawartość substancji odpowiadająca granicy oznaczalności (xozn) oblicza się następująco: (64) IUPAC zaleca zastosowanie w liczniku ułamka w równaniu (64) – 10 sSP. Analizę ślepych prób wykonuje się przy sporządzaniu krzywych wzorcowych lub w ramach planu wewnętrznego sterowania jakością badań. Jeśli w danym rodzaju badania stwierdza się istotny wpływ matrycy i/lub określonego etapu postępowania analitycznego na precyzję i poprawność oznaczań, to ślepą próbę należy przygotować z udziałem tej matrycy i poddać procedurze analitycznej łącznie z badanymi próbkami (ślepe oznaczanie). Jeśli takiego wpływu nie stwierdzono, to ślepa próba może stanowić próbę odczynnikową. W analizie instrumentalnej granicę oznaczania ilościowego można alternatywnie wyrazić stosunkiem sygnału analitycznego do amplitudy szumów, który powinien wynosić 5:1 lub 10:1. Przykład 2.14. 1. Obliczanie granicy wykrywalności i oznaczalności na podstawie wyników analiz prób ślepych.
Obliczony wcześniej dla przyjętego tymczasowo zakresu roboczego metody, współczynnik nachylenia (czułość) wyniósł b = 48,0. Stężenia badanego czynnika wyrażone są w μg/l. Granica wykrywalności metody wynosi:
Odpowiednia granica oznaczania ilościowego wynosi:
W praktyce należy zawsze sprawdzić, czy laboratorium jst w stanie technicznie wykonać analizę na poziomie granicy ozmaczania ilościowego, tzn. przygotować i oznaczyć próbkę wzorcową analitu na tym poziomie. Jeżeli tak, to inne cechy charakteryzacji metody na poziomie granicy oznaczania ilościowego powinny odpowiadać cechom na innych poziomach zakresu metody chyba, że dopuszcza się np. istotnie różne błędy
74 przypadkowe lub systematyczne na różnych poziomach stężeń w zakresie metody. Poniżej podano przykład oceny precyzji (błąd przypadkowy). Absorbancje analiz prób ślepych yi. (yi –
SP)
(yi –
2 SP)
Lp.
yi
1
0,171
0,135
0,018225
2
– 0,061
– 0,097
0,009409
3
0,003
– 0,033
0,001089
4
0,141
0,105
0,011025
5
0,072
0,036
0,001296
6
0,031
– 0,005
0,000025
7
0,011
– 0,025
0,000625
8
0,063
0,027
0,000729
9
0,031
– 0,005
0,000025
10
0,020
– 0,016
0,000256
11
0,021
– 0,015
0,000225
12
– 0,063
– 0,099
0,009801
13
0,146
0,110
0,012100
14
– 0,061
– 0,097
0,009409
15
0,042
0,006
0,000036
16
0,011
– 0,026
0,000676
Σ = 0,062851 2. Ocena istotności różnic precyzji na poziomie obliczonej granicy oznaczania ilościowego i precyzji (najniższej wartości współczynnika zmienności) wybranego poziomu stężenia zakresu roboczego. Do oceny można zastosować współczynnik zmienności v = s / . 100%. Poziomy stężeń: 1x = granica oznaczania ilościowego. Krotność 1x 2x 3x 4x vi: 20% 3% 2% 4% Hipoteza zerowa:
H0 : vmax = vmin; f = 8
Hipoteza alternatywna:
H1 : vmax ≠ vmin
F0,05; 8 = 3,44 zatem F > F0,05; 8
5x 2%
75 2 i v 2 należy Hipotezę zerową o nieistotności różnic współczynników zmienności vmin min odrzucić. Współczynnik zmienności próbki wzorca 1x jest zbyt wysoki i poziom stężenia odpowiadający granicy oznaczania ilościowego jest zbyt niski. Należy doświadczalnie wyznaczyć poziom stężenia 1’x odpowiadający granicy oznaczania ilościowego, przy którym współczynnik zmienności nie różni się istotnie od współczynnika zmienności w innych punktach zakresu roboczego. Można spodziewać się, że granica oznaczalności będzie zawarta w przedziale 1x < xozn ≤ 2x.
2.6.6. Czułość Ze wzorów (59) i (64) wynika, że granica wykrywalności i granica oznaczania ilościowego zależą od czułości metody. Znana jest też inna definicja czułości, która określa ją jako różnicę stężenia (lub zawartości) oznaczanego składnika, odpowiadającą najmniejszej różnicy odpowiedzi jaką można wykryć. W analizie klasycznej czułość metody związana jest z czułością reakcji chemicznej lub czułością wagi analitycznej. Czułość reakcji analitycznej jest to właściwość reakcji określona przez najmniejszą ilość substancji, która może być wykryta za pomocą danej reakcji. Parametrami charakteryzującymi czułość liczbowo są stężenie graniczne i minimum wykrywalne. Stężenie graniczne jest to najmniejsze stężenie substancji w roztworze, przy którym można ją jeszcze wykryć dana metodą. Stężenie graniczne określa się stosunkiem masy substancji wykrywanej (zwykle 1 g) do masy (objętości) rozpuszczalnika. Wynosi on np. 1: 500 000 dla reakcji tworzenia kompleksów Fe (III) z jonami SCN-. Stosunek ten oznacza, że w wyniku reakcji z jonami SCN- można wykryć Fe (III) w roztworze o stężeniu nie mniejszym niż 1 g żelaza w 500 l wody. Minimum wykrywalne jest to najmniejsza ilość substancji wyrażona najczęściej w μg, którą można jeszcze wykryć za pomocą danej metody w ustalonych warunkach wykonania reakcji. Dla przykładu wykrywania żelaza jonami rodankowymi, minimum wykrywalne wynosi 0,002 μg. Czułość reakcji charakteryzują więc liczby 1: 500 000 i 0,002 μg. W odniesieniu do wagi analitycznej czułość oznacza zauważalne wychylenie wskazówki wagi z położenia równowagi pod wpływem dodanej jednostki masy (np. dla wag analitycznych 1 mg), wyrażona liczbą działek skali na jednostkę masy, np. 5 działek/1 mg. W analizie instrumentalnej czułość przedstawia kąt nachylenia krzywej wzorcowej i można ją obliczyć metodą najmniejszych kwadratów z równania (39). 2.6.7. Poprawność i obciążenie W celu sprawdzenia poprawności i oceny obciążenia metody stosuje się różne sposoby postępowania, do których przede wszystkim należą: — ocena wyników analiz certyfikowanych materiałów odniesienia lub materiałów odniesienia; — metoda dodatków wzorca do próbki badanego obiektu, w tym: a) próbek badanego obiektu, które były już poddane analizie i oznaczono w nich pewne stężenia danej substancji lub b) próbek czystej matrycy niezawierającej badanej substancji,
76 — metoda porównania wyników badania uzyskanych daną metodą z wynikami metody odniesienia. Przed przystąpieniem do sprawdzania poprawności i obciążenia metody należy upewnić się, czy przygotowane w laboratorium materiały odniesienia są jednorodne i wykazują wystarczającą trwałość w czasie przewidzianym do wykonania całości doświadczenia. Jeżeli badano co najmniej pięć różnych stężeń danej substancji (odniesienia), to oceniając zależność między wartościami odniesienia a wynikami analiz można zastosować równanie regresji liniowej (patrz rozdz. 2.5.5.). Wykres mierzonych wartości jako funkcja teoretyczna stężenia powinien być liniowy ze współczynnikiem nachylenia (b) równym jedności i stałą przesunięcia (a) równą zero (patrz rozdz. 2.5.5.). Różna od zera stała przesunięcia (a) występuje w przypadku stałych błędów systematycznych. Błąd stały jest niezależny od ilości lub stężenia substancji badanej. Wykrycie przyczyn błędu systematycznego popełnianego w trakcie analizy może przyczynić się do jego eliminacji poprzez wprowadzenie odpowiedniego współczynnika korygującego, czyli tzw. poprawki. Powinien być jednak spełniony warunek, że wielkość błędu jest proporcjonalna do zmiany mierzonej ilości lub stężenia badanej substancji. Błąd stały, pochodzący np. z odczynników, może być korygowany na etapie odczytu wyniku analizy, tj., jeśli funkcja wzorcowania (w analizie instrumentalnej) ma odpowiednią postać np. y = a + bx, to wówczas. jak wynika z równania (47) wartość odczytu sygnału anlitycznego próbki Y jest korygowana o wartość współczynnika przesunięcia a. Najprościej błędy systematyczne, czyli obciążenie metody, można obliczyć z równania (16), w którym wartość „prawdziwą”– μ0 należy zastąpić wartością nominalną materiału odniesienia x0 (cref), czyli: obciążenie (Bw) =
lub 1 - RR
(65)
gdzie RR jest współczynnikiem odzysku analitu z matrycy. W praktyce laboratoryjnej, jeśli nie ma innych źródeł błędów systematycznych, poprawność metody najczęściej związana jest z niepełnym odzyskiem badanego składnika (analitu) z danej matrycy. Przepis analityczny takiej metody powinien uwzględnić oznaczanie odzysku badanego składnika z matrycy. Jeżeli do oceny wyników badania odzysku analitu z matrycy nie stosuje się metody regresji liniowej, to ewentualną poprawkę można obliczyć zgodnie z równaniem: (66) w którym: x0 – stężenie (nominalne) analitu w materiale odniesienia, xi – stężenie analitu oznaczone w materiale odniesienia, cz – ewentualne zakłócenie pochodzące z tła (matrycy wolnej od analitu). W celu stwierdzenia istotności różnic pomiędzy stężeniem analitu w materiale odniesienia, a oznaczonym należy przeprowadzić testowanie za pomocą testu t-Studenta (P = 0,95), sparwdzając hipotezę H0, czy odyzysk różni się od jedności (100%), czyli
77 H0 : RR = 1; H1 : RR ≠ 1. Stosując właściwy model testu t-Studenta (rówanie 31), wartość statystyki t oblicza się wg równania: t=
(67)
w którym: RR Š ucwzgRR – niepewność złożona współczynnika odzysku (patrz równanie 90, rozdział 2.8.) Tabela 2.6. Dokumentacja badań odzysku Zakres stężeń analitu w próbce: Próbka nr
1x dodano
oznaczono
-
0
2x wsp. odzysku RR1
dodano
-
-
oznaczono
3x wsp. odzysku RR2
dodano
-
-
oznaczono
wsp. odzysku RR3
-
1 2 3 4 ... 10 Ni = Średnia, Wariancja,
s2
Współczynnik zmienności, v
10
10
10
.......
.......
.......
.......
.......
.......
.......
.......
.......
.......
.......
Odchylenie standardowe średniej (niepewność standardowa poprawki) ss− = = x
s
n
= uRR
.......
Jeżeli stwierdzone różnice są istotne, należy wyznaczyć współczynniki odzysku w zakresie roboczym metody, dla jednego lub więcej (np. trzech) różnych stężeń danej substancji (zakresy stężeń i sposób zapisu podano w tabeli 2.6.). W tabeli zasugerowano możliwość wykonania 10 powtórzeń analiz próbek na tym samym poziomie stężenia, natomiast w praktyce można zwiększyć liczbę powtórzeń np. do 20, wykorzystując wyniki do konstrukcji odpowiedniej karty kontrolnej (patrz rozdz. 2.7.1.). Wyniki analiz z badań odzysku mogą być również wykorzystane do ustalenia precyzji metody w warunkach powtarzalności lub pośrednich (patrz rozdz. 2.6.8.). Dla każdego stężenia należy obliczyć średnią wartość odzysku, wariancję i współczynnik zmienności. Następnie określić statystyczną istotność różnic między skrajnymi średnimi, np. za pomocą testu t-Studenta
78 (P = 0,95). Jeżeli różnice są nieistotne można w praktyce zalecić oznaczenie współczynnika odzysku dla jednego wybranego stężenia z zakresu roboczego metody, np. stężenia bliskiego oznaczanej w próbce wartości maksymalnej (nominalnej). Jeżeli różnice między średnimi są istotne należy zawęzić zakres roboczy metody lub zalecić osobne wyznaczanie współczynników odzysku dla każdego oznaczonego w próbkach badanych stężenia. Za przykład może posłużyć konieczność wprowadzenia współczynnika korygującego (poprawki), wynikającego ze strat powodowanych przez mineralizację lub niepełną ekstrakcję z danej matrycy. Niepewność współczynnika korygującego (uRR) wyraża odchylenie standardowe średniej. W tabeli 2.7. podano dopuszczalne wartości odzysku z matryc organicznych (np. żywności) w zależności od stężenia analitu. Tabela 2.7. Graniczne wartości odzysku i precyzji w zależności od stężenia analitu w próbce wg AOAC (1993) Stężenie analitu % (c)
Liczba względna (c /100)
Jednostka
Średni odzysk %
Współczynnik zmienności %
100
1
100%
98-102
1,3
10
10-1
10%
98-102
2,8
1
10-2
1%
97-103
2,7
0,1
10-3
0,1%
95-105
3,7
0,01
10-4
100 ppm
90-107
5,3
0,001
10-5
10 ppm
80-110
7,3
0,0001
10-6
1 ppm
80-110
11
0,00001
10-7
100 ppb
80-110
15
0,000001
10-8
10 ppb
60-115
21
0,0000001
10-9
1 ppb
40-120
30
2.6.8. Powtarzalność i odtwarzalność Powtarzalność i odtwarzalność są związane z pojęciem precyzji danej metody analitycznej, wyrażonej odchyleniem standardowym lub lepiej współczynnikiem zmienności, oszacowanym w określonych warunkach laboratoryjnych, jak podano w rozdz. 2.2.2. Norma PN ISO 5725 (2002) podaje procedurę określania powtarzalności i odtwarzalności metody w badaniach międzylaboratoryjnych. Jeśli nie ma możliwości wykonania takich badań, powtarzalność metody zgodnie z podanymi warunkami powtarzalności może być określona w jednym laboratorium. Jeżeli w tym samym laboratorium precyzja określana jest przy użyciu różnego wyposażenia i przez różnych wykonawców w dłuższym okresie, to warunki te określane są jako pośrednie. Z rozważań przedstawionych w rozdz. 2.2.2. wynika, że jeżeli metoda oceniana była w warunkach powtarzalności, to:
79 1. Powtarzalność metod analitycznych, w których przewidziano wykonanie dwóch (równoległych) analiz (pomiarów) danej próbki (obiektu) wyraża się równaniem: rd = t (α; f)
.
sr
(68)
co oznacza, że prawdziwa wartość średniego stężenia dwóch analiz (pomiarów) tej samej próbki (obiektu) zawarta jest w granicach powtarzalności: (69) —
oznacza, że różnice między wynikami badań powtarzanych dotyczą dwóch analiz tej samej próbki. Jeżeli analizy powtarzane mają odchylenie standardowe równe s, to
różnice między parami analiz podwójnych mają odchylenie standardowe Š sr . — sr odchylenie standardowe powtarzalności oblicza się wg równania (8) lub (17). 2. Powtarzalność metod analitycznych, w których przewidziano wykonanie jednej analizy (pomiaru) danej próbki (obiektu) wyraża się równaniem: rp = t (α; f). sr
(70)
co oznacza, że prawdziwa wartość wyniku analizy (pomiaru) próbki (obiektu) zawarta jest w granicach powtarzalności: (71) Odchylenie standardowe sr nosi nazwę odchylenia standardowego powtarzalności. Wartość statystyki t-Studenta należy przyjąć właściwą dla danej liczby stopni swobody f = n - 1 i poziomu istotności np. α = 0,05 (P > 0.95). W praktyce w równaniach (68–71) można przyjąć wartość t = 2. W procesie walidacji precyzję metody w określonych warunkach laboratorium najlepiej określić na 1–3 poziomach stężeń analitu, w zakresie roboczym i niemniej niż w 3 powtórzeniach. W praktyce najlepiej wykonać 10–20 powtórzeń i uzyskane dane wykorzystać np. do konstrukcji karty kontrolnej (patrz rozdz. 2.7.1.). W przypadku potwierdzania metod znormalizowanych precyzję metody można sprawdzić na jednym poziomie stężenia (podanym w normie), a uzyskaną wartość precyzji porównać z wartością podaną w normie. Jeżeli metoda oceniana była w warunkach odtwarzalności, to odchylenie standardowe odtwarzalności wyraża się równaniem: (72) w którym: sL2 – wariancja opisująca zmienność wyników między laboratoriami (lub seriami), nj – liczba analiz powtarzanych w laboratorium (w serii).
80 Odchylenie standardowe sL oblicza się wg równania:
(73)
w którym: m – liczba laboratoriów (serii analiz powtarzanych), nj – liczba analiz powtarzanych w serii, N – liczba wyników, j
– średnia dla danej serii analiz powtarzanych, – średnia ze wszystkich pomiarów.
Odtwarzalność metody wyraża się równaniem: (analizy podwójne)
(74)
(analizy pojedyncze)
(75)
lub
W zapisach dotyczących potwierdzenia lub walidacji metody laboratorium powinno zamieścić dane na temat odchylenia standardowego powtarzalności sr (lub współczynnika zmienności powtarzalności) lub powtarzalności rp (lub odpowiednio precyzji pośredniej – patrz rozdz. 2.2.2). Odtwarzalność metody można zbadać w warunkach międzylaboratoryjnych. W przypadku jednego laboratorium ten sam tryb postępowania można przyjąć do określenia precyzji w warunkach pośrednich. Przykład obliczania powtarzalności i odtwarzalności podano w zał. 2.2. Zamiast użytych w przykładzie określeń „precyzja w laboratorium” lub „precyzja między laboratoriami” należy użyć sformułowań odpowiednio „precyzja wewnątrz serii” (wyników) lub „precyzja między seriami”.
2.7. Sterowanie jakością badań Laboratorium powinno zapewnić właściwą jakość wyników badań, stosując odpowiednie metody sterowania jakością, które powinny obejmować stosownie do potrzeb, lecz nie ograniczając się do tego: a) regularne korzystanie z certyfikowanych materiałów odniesienia i/lub wewnętrzne nadzorowanie jakości przy wykorzystaniu wtórnych materiałów odniesienia; b) udział w programach porównań międzylaboratoryjnych lub programach badania biegłości; c) powtarzanie badań i wzorcowań przy wykorzystaniu tych samych lub innych metod; d) powtórne badanie lub wzorcowanie przechowywanych obiektów; e) korelacja wyników dotycząca różnych właściwości obiektu.
81 Uzyskane dane należy zapisywać w sposób umożliwiający śledzenie kierunków ich zmian. Wykazane metody zapewnienia jakości, powinny być planowane, a uzyskane wyniki poddawane przeglądom, najlepiej za pomocą technik statystycznych. 2.7.1. Sterowanie wewnętrzne Laboratorium powinno opracować plan wewnętrznego sterowania jakością każdego rodzaju badania (metody, matrycy, wykonawcy). Plan wewnętrznego sterowania jakością powinien być odpowiednio do rodzaju badania ułożony i udokumentowany. Należy przede wszystkim określić kryteria oceny i tryb postępowania w przypadku niespełnienia tych kryteriów. Najlepszą metodą jest przyjęcie kryteriów statystycznych opartych na parametrach zmienności wewnątrzlaboratoryjnych, charakterystycznych zarówno dla metody badania jak i warunków w laboratorium (środowiskowych, technicznych, biegłości personelu). Śledzenie parametrów zmienności wewnątrzlaboratoryjnych może być prowadzone za pomocą tzw. kart kontrolnych. Znane są różne typy kart kontrolnych – w większości przeznaczone są one do sterowania jakością procesów produkcyjnych. W laboratorium chemicznym znalazła zastosowanie karta Shewharta z tego względu, że rodzaj danych i sposób ich zapisywania odpowiada metodzie wyznaczania powtarzalności i odtwarzalności metod badawczych, opisanej w normie PN–ISO 5725 (2002). Metody wewnętrznego sterowania jakością obejmują: 1. Badania powtarzane tej samej próbki laboratoryjnej: — równoległe (w tym samym czasie); — archiwalne (w różnym czasie). 2. Badania powtarzane (równoległe) materiału kontrolnego. 3. Badania pojedyncze materiału kontrolnego. 4. Badania prób ślepych, i/lub ślepe oznaczania. 5. Stosowanie wzorców wewnętrznych. Badania powtarzane równoległe wykonywane są, jeśli istnieje możliwość podzielenia próbki laboratoryjnej (lub kontrolnej) przed badaniem. Badania powtarzane archiwalne wykonywane są wówczas, jeśli istnieje możliwość podzielenia próbki przed badaniem i próbka zachowuje jednorodność w czasie przechowywania. Badania pojedyncze materiału kontrolnego wykonuje się wówczas, jeżeli próbka badana jest niepodzielna. Materiał kontrolny w badaniach pojedynczych i powtarzanych stanowią: — certyfikowany materiał odniesienia (matryca + substancja badana) przygotowany przez uznane organizacje, dostępny w handlu; — materiał odniesienia (matryca + substancja badana) o udokumentowanej, ale niecertyfikowanej zawartości badanego składnika przygotowany w laboratorium lub dostępny w handlu; — próbki wzbogacone przygotowane w laboratorium („house reference materials”). Do matrycy nie zawierającej danego analitu lub zawierającej niewielką jego ilość, dodaje się znaną ilość czystego analitu; — w niektórych badaniach np. składników, występujących w próbce zawsze w określonych ilościach – można do konstrukcji kart kontrolnych stosować wcześniej wystandaryzowane w laboratorium próbki danego preparatu (obiektu badań); — próbki wyrobu, jeśli stosuje się metody statystyczne w procesie sterowania jakością produkcji.
82 Kryteria oceny wyników badań pojedynczych i powtarzanych próbek materiału kontrolnego mogą uwzględniać: 1. Parametry normatywne danego materiału odniesienia, podane przez producenta (wartość nominalna, odchylenie standardowe, przedział ufności, niepewność). 2. Granice powtarzalności podane w metodach znormalizowanych. 3. Granice powtarzalności wyznaczone w laboratorium w wyniku walidacji metody lub realizacji planu wewnętrznego sterowania jakością analiz. Normy badawcze polskie i międzynarodowe stosowane np. w analizie żywności i wody mogą przewidywać wykonywanie analiz podwójnych i podawać granice powtarzalności (lub odtwarzalności) wyników dwóch równoległych analiz. Jeżeli plan wewnętrznego sterowania jakością w laboratorium przewiduje wyłącznie badania powtarzane próbek laboratoryjnych badanego obiektu to istnieje niebezpieczeństwo nie wykrycia znaczących błędów systematycznych pomimo uzyskiwania akceptowanej powtarzalności. Dlatego też laboratorium powinno określić poziom wewnętrznego stosowania jakością z wykorzystaniem materiału kontrolnego, o znanej zawartości (stężeniu) badanego składnika. Dla długich serii analiz tego samego składnika lub kilku składników analizowanych jednocześnie w danej matrycy, tą samą techniką, próbka kontrolna przygotowana np. tylko dla danego lub wybranego składnika (mieszaniny) może być co 20 próbką w serii analiz. Poziom wewnętrznego sterowania jakością wynosi wówczas 5%. Dla krótkich serii analiz co najmniej jedna próbka powinna być próbką kontrolną. Stosowanie wzorców wewnętrznych (np. w technikach chromatograficznych) tzn. dodanie wzorca do próbki badanego obiektu i wykonanie jednocześnie analizy wszystkich składników próbki jest najlepszą metodą sterowania jakością. Analiza prób ślepych (odczynnikowych) i ślepe oznaczania Próba ślepa zawiera ten sam skład odczynników, co próbka badana, ale bez substancji oznaczanej. W badaniach, w których istotny wpływ na wynik ma rodzaj matrycy powinno się wykonywać ślepe analizy. Polegają one na wykonaniu analizy danego składu odczynników łącznie z matrycą, ale bez substancji oznaczanej. Analizy ślepych prób i ślepe oznaczania mają na celu: — ocenę czystości odczynników użytych do analiz (próby ślepe), — ocenę wpływu matrycy i środowiska na wynik analizy (oznaczania ślepe), — określenie granicy wykrywalności lub granicy oznaczania ilościowego metody, — korektę błędu systematycznego. Karty kontrolne Kartę kontrolną jako graficzną metodę statystyczną o zasadniczym znaczeniu dla sterowania produkcją zaproponował po raz pierwszy w 1924 r. dr Walter Shewhart. Teoria kart kontrolnych uznaje występowanie dwóch rodzajów zmienności. Pierwsza z nich jest zmiennością przypadkową powstałą z przyczyn losowych (błędy przypadkowe). Drugi rodzaj zmienności przedstawia rzeczywistą zmianę w procesie. Taka zmiana może być przypisana jakimś identyfikowalnym przyczynom, które nie są nieodłącznymi częściami procesu i które mogą, przynajmniej teoretycznie, być wyeliminowane (błędy systematyczne).
83 Celem statystycznego sterowania procesem jest doprowadzenie go do stabilnego i akceptowanego poziomu, utrzymanie go na tym poziomie oraz zapewnienie spełniania ustalonych wymagań przez wyroby i usługi. W laboratorium chemicznym karty kontrolne mogą być stosowane do zapisywania wyników: — wewnętrznego sterowania jakością analiz, — oceny oznaczań ślepych (wpływ matrycy, granica wykrywalności i/lub oznaczania ilościowego), — oceny pomiarów prób ślepych (czystość odczynników), — sprawdzeń (np. wagi analitycznej, termometrów itp. przyrządów do pomiarów wielkości fizycznych), — szacowania niepewności pomiaru. Karta kontrolna jest graficzną metodą prezentowania i porównywania informacji, pochodzących z ciągu próbek reprezentujących bieżący stan procesu analitycznego, z granicami wynikającymi z uwzględnienia jego zmienności własnej. Podczas stosowania kart kontrolnych możliwe jest wystąpienie dwóch rodzajów błędów (wnioskowania). Pierwszy z nich określany jest mianem błędu pierwszego rodzaju, który występuje, kiedy rozpatrywany proces analityczny jest uregulowany, a jakiś punkt pojawia się poza granicami kontrolnymi z przyczyn losowych. W rezultacie wnioskuje się nieprawidłowo, że proces jest nieuregulowany, co pociąga za sobą koszty działań zmierzających do znalezienia przyczyny nieistniejącego problemu. Drugi błąd zwany jest błędem drugiego rodzaju. Występuje on wtedy, kiedy rozpatrywany proces analityczny jest nieuregulowany, a wygenerowany punkt znajduje się między granicami kontrolnymi z przyczyn losowych. W takim przypadku wnioskuje się nieprawidłowo, że proces jest statystycznie uregulowany, co pociąga za sobą ryzyko uznania wyników nieprawidłowych. Jednakże ryzyko błędu drugiego rodzaju jest funkcją trzech czynników: szerokości granic kontrolnych, stopnia nieuregulowania procesu i liczności próbki. Natura tych czynników jest taka, że wielkość ryzyka błędu drugiego rodzaju można oceniać jedynie bardzo ogólnie. System Shewharta uwzględnia tylko błąd pierwszego rodzaju, a wartość tego błędu wynosi 0,3% dla granic kontrolnych 3σ. Oznacza to, że istnieje prawdopodobieństwo 99,7%, że proces analityczny jest statystycznie uregulowany. Zatem, karta kontrolna stanowić będzie metodę ciągłego sprawdzania statystycznej hipotezy zerowej, że proces się nie zmienia. Stosując karty Shewharta w laboratorium analitycznym należy pamiętać, że mogą one znaleźć zastosowanie do monitorowania parametrów zmienności oznaczań danego czynnika w badanym materiale na danym przyrządzie pomiarowym, za pomocą określonej metody badania. W niektórych technikach analitycznych, np. w metodach chromatograficznych, służących do oznaczania składników mieszanin, możliwe jest śledzenie parametrów zmienności tylko dla jednego składnika i uogólnienie otrzymanych wyników na pozostałe składniki. Typy kart kontrolnych Shewharta wg PN–ISO 8258+AC1 (1996) Rozróżnia się dwa typy kart kontrolnych: 1. Bez zadanych wartości normatywnych, 2. Z zadanymi wartościami normatywnymi.
84 Dane normatywne mogą być określonym wymaganiem lub wartościami docelowymi. Zadane wartości normatywne są to wartości nominalne i odchylenia standardowe określone np. przez producenta certyfikowanego materiału odniesienia. Wartości te nanosi się na kartę kontrolną przed rozpoczęciem serii analiz materiału kontrolnego. Wartości normatywne służą do wykreślania na karcie linii centralnej (wartości nominalne) i linii ostrzegawczych i kontrolnych. Wynik analizy próbki kontrolnej zamieszcza się w karcie kontrolnej z zadanymi wartościami normatywnymi i bada trendy między kolejnymi wynikami analiz próbek kontrolnych. Jeśli laboratorium przygotowało materiał (próbkę) kontrolny we własnym zakresie, wartości normatywne (średnia, odchylenie standardowe) szacowane są po wykonaniu 10–20 analiz materiału kontrolnego w różnym czasie. Alternatywnie można również wykorzystać wyniki analiz materiału odniesienia, uzyskane np. podczas walidacji metody. Otrzymane w ten sposób wartości normatywne nanosi się na kartę i porównuje wyniki kolejnych analiz materiału kontrolnego. Laboratorium może wyznaczać kilkakrotnie (tzn. w kilku seriach) wartości normatywne i wybrać te najbardziej korzystne dla jakości oznaczań. Ze względu na rodzaj stosowanych materiałów i próbek kontrolnych oraz cel wykorzystania wyników mogą być tworzone różne karty kontrolne typu Shewharta jak podano w tabeli 2.8. Tabela 2.8. Rodzaje kart kontrolnych typu Shewharta Rodzaj karty
Wymagane obliczenia
Efekt monitorowania
Wymagana analiza
Średniej,
średnia, odchylenie standardowe, granice ostrzegawcze i działania
błędy grube, systematyczne, przypadkowe, precyzja, trendy
próbki kontrolne w regularnych odstępach
Różnicy, d
średnia różnica, odchylenie standardowe, granice ostrzegawcze i działania
Rozstępu, R
średni rozstęp odchylenie standardowe, granice ostrzegawcze i działania
Odzysku, RR
średni odzysk, odchylenie standardowe, granice ostrzegawcze i działania
błędy systematyczne
co najmniej po jednej analizie próbek przed i po wzbogaceniu lub domieszkowaniu znaną ilością analitu
Ślepej próby
średnia, odchylenie standardowe, granice ostrzegawcze i działania
czystość odczynników wpływ matrycy, charakterystyka przyrządu, wykrywalność/ oznaczalność
co najmniej dwie analizy prób ślepych w serii w ustalonych odstępach
błędy systematyczne, trendy
co najmniej dwie analizy danej próbki kontrolnej w ustalonych odstępach na początku i końcu serii
precyzja analiz
co najmniej dwie analizy próbek rzeczywistych o danej ilości analitu, w ustalonych odstępach
85 W kartach kontrolnych tworzonych z wyników oznaczań próbek o znanym stężeniu badanego składnika zakłada się, że zmienność wewnątrz próbki podlega rozkładowi normalnemu (Gaussa). Odchylenia od tego założenia będą miały niekorzystny wpływ na funkcjonowanie karty. W każdym wątpliwym przypadku zaleca się testowanie danych na błędy grube, jeśli dane te mają służyć wyznaczaniu wartości normatywnych dla karty. Zależność między granicami ostrzegawczymi, kontrolnymi i rozkładem normalnym przedstawia rys. 2.4.
Rys. 2.4. Wartość średnia, granica ostrzegawcza i granica kontrolna (działania) w odniesieniu do funkcji rozkładu normalnego i wyników analiz.
Interpretacja kart Shewharta opiera się na założeniu, że estymatory poszczególnych podzbiorów (serii próbek) jak średnia lub mediana różnią się jedynie o wartości losowe, rzadko wychodząc poza granice kontrolne. Granicę kontrolną stanowią ±3s, granicę ostrzegawczą ±2s. Interpretacja kart Shewharta może być dokonana za pomocą tzw. testów konfiguracji (badanie trendów), świadczących o przyczynach wyznaczanych zmienności. W celu zastosowania testów kartę dzieli się na 6 stref, z których każda ma szerokość 1s (s – jest szacowaniem odchylenia standardowego zbiorowości próbnej). Są one oznaczone literami A, B, C – C, B, A, ze strefami C położonymi symetrycznie względem linii centralnej. Testy mają zastosowanie dla karty wartości średniej analiz powtarzanych (podwójnych) i kart analiz pojedynczych. Na rys. 2.5. przedstawiono testy niekorzystnych konfiguracji (kierunku zmian) wg PN–ISO 8258+AC1 (1996), które mogą być podstawą działań zapobiegawczych lub korygujących. Wspomniana norma proponuje 8 testów konfiguracji.
86
Rys. 2.5. Testy konfiguracji wg PN-ISO 8258+AC1 (1996).
87 Według Wheelera (1983) można przyjąć 4 testy konfiguracji i podjąć właściwe działania, gdy: 1. Jeden wynik leży poza granicami 3s; 2. Dwa spośród trzech kolejnych wyników leżą po tej samej stronie linii centralnej (wartości należnej) w obszarze między 2s i 3s; 3. Cztery spośród pięciu kolejnych wyników leżą po tej samej stronie linii centralnej (wartości należnej) w obszarze między 1s i 2s; 4. Osiem kolejnych wyników leży po tej samej stronie linii centralnej, w obszarze do 1s. Poniżej podano przykłady konstrukcji kart typu Shewharta wartości średniej i różnicy w badaniach podwójnych i pojedynczych danego materiału kontrolnego. Ogólną zasadą konstrukcji takich kart jest, że po uzyskaniu odpowiedniej liczby danych (wyniki analiz kontrolnych), wyznacza się wartości normatywne karty, przy czym wyników, które posłużyły do obliczeń tych wartości nie nanosi się na kartę. Na karcie rejestruje się wyniki kolejnych analiz próbek kontrolnych i śledzi ich położenie między wartościami normatywnymi karty. W przedstawionych przykładach wpisano do kart wartości wyników analiz kontrolnych, z których wcześniej obliczono wartości normatywne, aby uwidocznić charakter rozkładu danych wziętych do obliczeń. Karta kontrolna średniej i różnicy (analiz podwójnych) Karta kontrolna składa się z trzech części: 1. Tablicy informacyjnej, w której zapisywane są: — rodzaj materiału kontrolnego (badany czynnik + matryca); — wartości normatywne (jeśli jest to materiał certyfikowany); — wyniki analiz podwójnych xa i xb; — suma i wartość średnia danej pary wyników analiz podwójnych; — wartość różnicy między analizami podwójnymi, d; — odchylenie standardowe wartości średnich, sśred; — odchylenie standardowe powtarzalności, sr; 2. Wykresu wartości średnich (analiz podwójnych); 3. Wykresu wartości różnic. Przed przystąpieniem do konstruowania karty kontrolnej analiz podwójnych należy przyjąć następujące założenia: — analizowane okresowo po dwie próbki tego samego materiału kontrolnego będą oznakowane zawsze w ten sam sposób np. xa i xb, — różnica między wynikami analiz tych próbek będzie zawsze zapisywana w ten sam sposób np. xa – xb przy czym znak różnicy będzie zachowany, — próbka xa będzie zawsze analizowana przed próbką xb. Przykład karty kontrolnej przedstawia rys. 2.6.
88 KARTY KONTROLNE Substancja oznaczana:
Stężenie nominalne:
Identyfikator materiału kontrolnego: Metoda badania: Przyrząd pomiarowy: Podpis Data
3/01
4/01
5/01
6/01
7/01
10/01
Próbka Xa
100,00
103,90
104,80
104,00
101,90
103,00
97,90
103,80
Próbka Xb
99,10
103,00
107,70
104,10
103,00
102,90
103,70
103,70
199,10
206,90
209,50
208,10
204,90
205,90
201,60
99,55
103,45
104,75
104,05
102,45
102,95
100,80
-0,1
-1,1
Suma Wartość średnia x Różnica, d
0,9
0,9
0,1
0,1
11/01
-5,8
12/01
13,01
14/01
15/01
99,50
100,20
102,90
99,40
100,70
102,40
207,50
198,90
200,90
205,30
103,75
99,45
100,45
102,65
0,1
-0,5
0,1
WartoÊç Êrednia
110 108
3
106
2
104 0
102 100
-2
98
-3
96 94
0�
1�
2�
3�
4�
5�
6�
7�
8�
9�
10� 11�
12� 13� 14
Numery analiz
Ró˝nica, d
2,2
3
1,2
2
0,2
0
-0,8
-2 -3
-1,8 -2,8
(-5,8)
Rys. 2.6. Przykład kart kontrolnych, średniej i różnicy.
0,5
89 W podanym przykładzie wartości normatywne obliczono po wykonaniu 11 (par) analiz podwójnych. Postępowanie składa się z następujących etapów: — wpisywanie wyników analiz do tablicy informacyjnej i wykonanie obliczeń; — wykonanie testu Dixona dla wartości odbiegających różnic (xa – xb). W tym przypadku (rys. 2.6) usunięto wszystkie dane uzyskane w 7 dniu pomiarowym, ponieważ różnica –5,8 jest odbiegająca od pozostałych różnic; — obliczanie sumy wartości średnich i odchylenia standardowego sśred wg poniższego schematu: )2
Data
–
99,55
3/01
– 2,80
7,84
103,45
4/01
1,10
1,21
104,75
5/01
2,40
5,76
104,05
6/01
1,70
2,89
102,45
7/01
0,10
0,01
102,95
10/01
0,60
0,36
103,75
12/01
1,40
1,96
99,45
13/01
– 2,90
8,41
100,45
14/01
– 1,90
3,61
102,65
17/01
0,30
0,09
Średnia
— wyznaczenie granic ostrzegawczych i kontrolnych średniej a) górna granica kontrolna:
+ 3 sśred = 108,0;
b) górna granica ostrzegawcza: c) linia kontrolna:
+ 2 sśred = 106,1;
= 102,35;
d) dolna granica ostrzegawcza: e) dolna granica kontrolna:
– 2 sśred = 98,6;
– 3 sśred = 96,7;
( –
danej różnicy
90 — badanie trendów (testy konfiguracji) wartości średnich kolejnych analiz podwójnych materiału kontrolnego i podejmowania odpowiednich decyzji np.: a) zbadanie istotności błędu systematycznego, b) zidentyfikowanie badania niezgodnego z wymaganiami, c) inicjowanie działań korygujących lub zapobiegawczych, d) wykonanie auditu badania, e) anulowanie wyników badań i ponowne wykonanie analiz, f) wprowadzenie poprawek do sprawozdania. W celu wyznaczenia granic ostrzegawczych i kontrolnych powtarzalności różnicy d = xa – xb przyjmuje się następujące postępowanie: — oblicza się odchylenie standardowe powtarzalności sr: xa – xb
Data
D
d2
100,0 – 99,1
3/01
0,9
0,81
103,9–103,0
4/01
0,9
0,81
104,8–104,7
5/01
0,1
0,01
104,0–104,1
6/01
– 0,1
– 0,01
101,9–103,0
7/01
– 1,1
1,21
103,0–102,9
10/01
0,1
0,01
103,8–103,7
12/01
0,1
0,01
93,5 – 94,4
13/01
– 0,9
0,81
100,2–100,7
14/01
– 0,5
0,25
102,9–102,4
17/01
0,5
0,25
Σ = 3,38
Zmienność analiz podwójnych wokół wartości średniej jest określona równaniem:
— wyznacza się granicę ostrzegawczą i kontrolną dla powtarzalności, tj. odpowiednia wartość t; a) górna granica kontrolna: 3. r = 3. 0,6 = 1,8; b) górna granica ostrzegawcza: 2. r = 2. 0,6 = 1,2; c) linia centralna = 0; d) dolna granica ostrzegawcza: 2. (–r) = 2. (– 0,6) = –1,2; e) dolna granica kontrolna: 3. (–r) = 3. (– 0,6) = –1,8;
91 — bada się trendy powtarzalności kolejnych analiz podwójnych wg np. kryteriów Wheelera lub kryteriów PN–ISO 8258+AC1 (1996). Karta kontrolna średniej (analiz pojedynczych) Karta składa się z dwóch części: 1. Tablicy informacyjnej, w której wpisywane są: — rodzaj materiału kontrolnego (badany czynnik + matryca) — wartości normatywne (jeśli jest to materiał certyfikowany) — wyniki analiz pojedynczych materiału kontrolnego 2. Wykresu wartości średniej Przykład karty kontrolnej przedstawia rys. 2.7. KARTA KONTROLNA
Substancja oznaczana:
Stężenie nominalne:
Podpis Data
4/6
5
6
7
10
11
13
14
17
18
19
20
24
26
27
28
1/7
2
3
Wynik
4,94
4,94
5,21
4,82
5,03
5,06
5,1
5,14
4,99
5,02
4,9
5,02
4,86
5,03
5,06
5
5,02
5,14
4,96
5,4
3s
5,3
2s
5,2 5,1
0
5 4,9 -2s
4,8 -3s
4,7 0� 1�
2�
3�
4�
5�
6�
7�
8�
9�
10� 11�
12� 13� 14� 15�
16
17
18
19
20
21 22
Rys. 2.7. Przykład karty kontrolnej, średniej.
Materiał kontrolny (związki ołowiu w wodzie) został przygotowany w laboratorium. Zawartości ołowiu w próbce kontrolnej wynosi 5,0 mg/l (5 ppm). Wartości normatywne dla karty oblicza się w następującej kolejności: — wpisywanie do tablicy informacyjnej wyników analiz materiału kontrolnego, — wykonanie testu Dixona dla wartości odbiegających. W tym przypadku (rys. 2.7) nie stwierdzono wartości odbiegających, — obliczanie wartości średniej (arytmetycznej) i odchylenia standardowego podano w tabeli 2.9.,
92 Tabela 2.9. Obliczanie wartości średniej i odchylenia standardowego wyników analiz przygotowanego w laboratorium materiału kontrolnego o referencyjnej zawartości analitu c=5,0 (mg/l) Nr analizy
Data
Wynik (xi)
(xi - )
(xi - )2
1
4,06
4,94
- 0,08
0,00585
2
5,06
4,94
- 0,08
0,00585
3
6,06
5,21
+0,19
0,03744
4
7,06
4,82
- 0,20
0,03861
5
10,06
5,03
+0,01
0,000182
6
11,06
5,06
+0,04
0,00189
7
13,06
5,10
+0,08
0,00697
8
14,06
5,14
+0,12
0,01525
9
17,06
4,99
- 0,03
0,00070
10
18,06
5,02
0,00
0,00001
11
19,06
4,96
- 0,06
0,00319
12
20,06
5,02
0,00
0,00001
13
24,06
4,86
- 0,16
0,02449
14
26,06
5,03
+0,01
0,000182
15
27,06
5,06
+0,04
0,00189
16
28,06
5,00
- 0,02
0,000272
17
1,07
5,02
0,00
0,00001
18
2,07
5,14
0,12
0,01525
19
3,07
4,96
- 0,06
0,00319
20
4,07
5,03
+0,01
0,000182
Liczba analiz n = 20
Σ(xi) = 100,33 ( ) = 5,0165
Σ(xi - )2 = 0,1614 s = 0,09216
— wyznacza się granice ostrzegawcze i kontrolne do wyników analiz materiału kontrolnego, a) górna granica kontrolna: + 3 s = 5,0165 + 0,27648 = 5,29, b) górna granica ostrzegawcza: + 2 s = 5,0165 + 0,18432 = 5,20, c) linia centralna: = 5,0165, d) dolna granica ostrzegawcza: – 2 s = 5,01652 – 0,18432 = 4,83, e) dolna granica kontrolna: – 3 s = 5,0165 – 0,27648 = 4,74, — bada się trendy analiz pojedynczych wg np. kryteriów Wheelera lub kryteriów PN–ISO 8258+AC1 (1996). Karta kontrolna zakresu roboczego metody Karta składa się z części informacyjnej i graficznej. Podobnie jak w karcie kontrolnej analiz pojedynczych lub podwójnych tworzy się tablice informacyjne i wykresy analiz próbek kontrolnych. Analizuje się próbki kontrolne o dwóch różnych stężeniach materiału kontrolnego, odpowiadających np. 10 % i 90 % zakresu roboczego metody lub zakresu krzywej wzorcowania. Próbki kontrolne analizuje się łącznie z próbkami
93 badanymi zgodnie z ustalonym planem. Analizę testów konfiguracji przeprowadza się jednocześnie na dwóch kartach wg kryteriów opisanych przez Westgarda (1981). Działania korygujące należy podjąć jeśli: — jeden wynik na jednej karcie kontrolnej leży powyżej 3s, — po jednym wyniku na obu kartach kontrolnych jednocześnie leżą między 2s i 3s (bez względu na znak), — dwa kolejne wyniki na jednej karcie kontrolnej znajdują się pomiędzy 2s i 3s po tej samej stronie linii centralnej, — trzy kolejne wyniki na jednej karcie kontrolnej znajdują się między 1s i 2s po tej samej stronie linii centralnej, — po dwa kolejne wyniki na dwóch kartach kontrolnych jednocześnie leżą między 1s i 2s po tej samej stronie linii centralnych, — dziewięć kolejnych wyników na jednej karcie kontrolnej znajduje się między 1s i 2s (bez względu na znak), — po pięć kolejnych wyników na dwóch kartach kontrolnych leży jednocześnie w obszarze do 1s po tej samej stronie linii centralnych. Przykład karty kontrolnej Westgarda przedstawia rys. 2.8. Karta Westgarda
Rys. 2.8. Przykład karty Westgarda zakresu roboczego metody (dwóch próbek) kontrolnych o różnej zawartości badanego składnika. Punkty zaczernione oznaczają niekorzystną konfigurację.
94 Karty kontrolne ślepej próby i odzysku Opisane wyżej przykłady kart kontrolnych służą do śledzenia zmienności procesów analitycznych, spowodowanych błędami losowymi lub systematycznymi. W zależności od rodzaju prowadzonych badań laboratorium analityczne może wykorzystać również kartę ślepej próby umożliwiającej monitorowanie granicy oznaczania ilościowego (także czystości odczynników) oraz kartę odzysku w przypadku wykonywania analiz często zmieniających się matryc, np. w badaniach żywności. Przykłady konstrukcji tych kart zawierają zał. 2.3. i 2.4. Działania zapobiegawcze lub korygujące, wynikające z niespełnienia kryteriów kart kontrolnych Do oceny trendów na kartach kontrolnych analiz pojedynczych lub podwójnych można przyjąć następujące postępowanie: — Jeżeli wynik analizy próbki kontrolnej w danej serii pomiarowej leży poza granicami ± 3s, należy wykonać ponowną analizę tej próbki (jedno- lub dwukrotną). W przypadku potwierdzenia wystąpienia nadmiernego błędu, laboratorium powinno anulować wyniki analiz danej serii lub, jeśli to możliwe, wprowadzić poprawkę do wyników badań. — Następnie wskazane byłoby przeprowadzenie auditu badania, znalezienie źródła błędu i wykonanie działań korygujących, zgodnie z przyjętym systemem jakości. — Jeżeli wyniki analiz próbek kontrolnych przekraczają granicę ± 2s, częściej niż 1 wynik na 20 analiz kontrolnych, to może to świadczyć o pogorszeniu się precyzji oznaczań w laboratorium. Pogorszenie się precyzji może być spowodowane niezauważoną awarią danego przyrządu pomiarowego, zmianą materiałów pomocniczych, zmianą pracownika wykonującego badanie lub innymi przyczynami. Przyczynę najlepiej ustalić podczas auditu badania, a następnie przyjąć właściwe działania korygujące. — Wystąpienie długotrwałych niekorzystnych trendów może świadczyć o pojawieniu się błędów systematycznych. Można w tej sytuacji wykonać ocenę statystyczną różnic między wartością średnią obliczoną z otrzymanych wyników z uwzględnieniem punktów nietypowych a poprzednią wartością nominalną (średnią) karty. Do tego celu najlepiej zastosować test tStudenta (model I równanie (29)). Jeśli różnice są statystycznie istotne, to należy: a) określić obciążenie metody i wprowadzić poprawkę do wcześniej wydanych wyników badań oraz powiadomić o tym odbiorców wyników badań, b) wykonać audit badania i usunąć przyczynę błędów systematycznych lub jeśli nie jest to możliwe wprowadzić stałą poprawkę do wyniku badania. Jeśli różnice są statystycznie nieistotne, to należy: c) wyznaczyć ponownie wartości normatywne dla karty kontrolnej, w przypadku stosowania własnych materiałów odniesienia, d) wykonać audit badania w celu znalezienia przyczyny błędów systematycznych, e) zaakceptować występowanie błędów systematycznych ponieważ są one na tyle małe, że nie można ich oddzielić od błędów przypadkowych, charakterystycznych dla danego badania. — W przypadku karty kontrolnej zakresu roboczego metody (karta Westgarda) należy przyjąć taki sam tryb postępowania do oceny trendów, jak dla kart kontrolnych analiz pojedynczych i podwójnych. Dodatkowo można dokonać oceny jednorodności wariancji za pomocą testu F–Snedecora (równanie (27)) np. co 20 oznaczań próbek kontrolnych. Wystąpienie statystycznie istotnych różnic między wariancjami powinno być sygnałem do zmiany zakresu roboczego metody.
95 — W karcie kontrolnej różnicy d można ocenić występowanie błędu systematycznego za pomocą testu różnic. W przypadku stwierdzenia różnic istotnych statystycznie należy określić obciążenie metody i wprowadzić poprawkę dla wyniku badania, przeprowadzić audit badania w celu wykrycia przyczyny błędu systematycznego lub wyznaczyć ponownie wartości normatywne dla karty kontrolnej. 2.7.2. Sterowanie zewnętrzne Zewnętrzne sterowanie jakością, zwane inaczej badaniem biegłości, polega na wykorzystaniu wyników międzylaboratoryjnych badań porównawczych do oceny technicznych kompetencji laboratoriów uczestniczących w takich porównaniach. Badanie biegłości dla danego rodzaju laboratoriów i badań może być organizowane przez: — instytucję akredytującą, która powołuje grupy robocze, np. w ramach komitetów technicznych w celu opracowania ogólnych kryteriów takich badań i/lub szczegółowych programów dla określonego rodzaju laboratoriów; — inne instytucje, wiodące w danej dziedzinie. Organizator badania biegłości powinien opracować program tego badania i posiadać pełną dokumentację związaną z prowadzeniem badania oraz udokumentowany system jakości, zgodnie z wymaganiami normy np. PN–EN ISO/IEC 17025 (2001) przewodnika ISO/ IEC 43–1 (1997). Za sprawną realizację danego programu badania biegłości odpowiedzialny jest organizator (lub koordynator) programu. Dopuszcza się możliwość współpracy organizatora badania z innymi laboratoriami w zakresie przygotowania materiału kontrolnego. Organizator badania powinien określić kryteria takiej współpracy. Program badania biegłości powinien być udokumentowany i zawierać co najmniej następujące informacje: 1. Założenia programu, 2. Zasady organizacji, 3. Opis materiału kontrolnego i metody jego przygotowania, 4. Ustalenia dotyczące częstości wykonywania badania, 5. Wskazanie metod badawczych (wykonania badania), 6. Zasady i kryteria oceny wyników badania biegłości, 7. Wzór raportu z badania, 8. Ustalenia dotyczące kontaktu z uczestnikami i reklamacji, 9. Nazwiska osób odpowiedzialnych za realizację programu. Laboratorium przygotowujące materiał kontrolny do badania biegłości powinno wykazać i udokumentować swoje kwalifikacje w zakresie metod i procedur badawczych stosowanych przez uczestników badań porównawczych. Organizator badania jest odpowiedzialny za okresową kontrolę takiego laboratorium, w celu upewnienia się czy wszystkie przyjęte uzgodnienia dotyczące procedury przygotowania i jakości materiału kontrolnego są przestrzegane. Uczestnikom badania biegłości należy zapewnić anonimowość, a wynikom poufność. Należy zapewnić możliwość udzielania uczestnikom badania konsultacji, a także szkolenia
96 (na życzenie) najsłabszych laboratoriów. Organizator powinien dokonywać okresowych przeglądów programu badania biegłości i wprowadzać konieczne zmiany wynikające z postępu wiedzy w tej dziedzinie. Do interpretacji wyników badania biegości wykorzystuje się wartości zmiennej standaryzowanej „z” (patrz rozdz. 2.1.) jako tzw. „statystyki osiągnięć” (z-score), która zależy od wartości wyniku uzyskanego w laboratorium, wartości „prawdziwej” tzn. przypisanej lub uzgodnionej oraz wartości odchylenia standardowego, czyli ustalonej miary rozproszenia danego zbioru wyników. Kryteria oceny uzyskanej przez laboratorium wartości z-score są następujące: |z| ≤ 2 = zadowalająca 2 Fkryt
2. Jeżeli nie stwierdza się różnic istotnych statystycznie można wyznaczyć statystyczne granice zakresu (ale tylko liczbowe), tzn. potwierdzić jednorodność wariancji przy skrajnych wartościach stężeń analitu w zakresie, tj. s12 = sn2. Jeżeli nie stwierdza się jednorodności wariancji należy górną granicę zakresu odpowiednio obniżyć. Po spełnieniu tego warunku można przejść do wyznaczania współczynników równania regresji. 3. Współczynniki zmienności różnią się istotnie. Należy podwyższyć dolną granicę zakresu do poziomu stężenia, przy którym nie stwierdza się różnic istotnych statystycznie.
124 W przedstawionym przykładzie precyzja w dolnej granicy zakresu różni się istotnie od precyzji w dalszej części zakresu (odpowiednio 12,8% i 1,5%). Ponieważ dolna granica zakresu odpowiada granicy oznaczania ilościowego, wartość tę zaakceptowano i przystąpiono do dalszej oceny statystycznej funkcji metody, nie sprawdzając jednorodności wariancji i arbitralnie przyjmując ten zakres roboczy za odpowiedni. 3. Wyznaczanie współczynnika korelacji liniowej Tabela 4-2.1. Dane wejściowe do wyznaczania parametrów krzywej wzorcowej
Lp. wzorca m
Stężenie wzorca (krotność NDS) xi
Absorbancja średnia yi
1
0,05
2
Absorbancja średnia yi xi . yi
xi . xi
yi . yi
0,1407
0,0070
0,0025
0,0198
0,5
0,4057
0,2028
0,25
0,1646
3
1
0,6623
0,6623
1
0,4386
4
1,5
0,9163
1,3744
2,25
0,8396
5
2
1,1737
2,3474
4
1,3776
Suma
5,05
3,2987
4,5939
7,5025
2,8402
Średnia
1,01
0,6597
Współczynnik korelacji (r) wyznacza się z równania (4/Z-2.1.):
(4/Z-2.1.)
Czyli dla omawianego przykładu:
W omawianym przykładzie współczynnik korelacji liniowego równania regresji r = 0,9996. Jeżeli wartość współczynnika korelacji byłaby mniejsza niż 0,999, to można podejrzewać występowanie funkcji nieliniowej. Należałoby zbadać różne rodzaje funkcji nieliniowej i przyjąć ten rodzaj funkcji, któremu odpowiada największa wartość współczynnika korelacji r.
125 4. Przekształcanie funkcji nieliniowych do postaci liniowej Przekształcenie można wykonać według zasad podanych w rozdz. 2.6.2. Jeśli nie ma możliwości wykonania skomplikowanych przekształceń, bardziej praktyczne może okazać się korzystanie z wykresu krzywej wzorcowej (nieliniowej). 5. Wyznaczanie współczynników prostoliniowej krzywej wzorcowej Wartości współczynników nachylenia (b) i przesunięcia (a) obowiązują tylko wewnątrz danego zakresu roboczego i dotyczą krzywej wzorcowania o równaniu y = a + b . x. 5.1. Współczynnik nachylenia Współczynnik nachylenia wyznacza się z równania (5/Z-2.1.):
(5/Z-2.1.)
Czyli w omawianym przykładzie
Odchylenie standardowe współczynnika nachylenia wyraża się równaniem (6/Z-2.1.):
(6/Z-2.1.)
Czyli w omawianym przykładzie:
Na podstawie wartości b (równanie (5/Z-2.1.)) i sb (równanie (6/Z-2.1.)) przeprowadza się testowanie istotności współczynnika nachylenia funkcji, opisującej prostoliniową krzywą wzorcowania. Do tego celu wykorzystuje się równanie (7/Z-2.1.):
126
(7/Z-2.1.)
Czyli w omawianym przykładzie: Wyznaczoną wartość tobl porównuje się ze stablicowaną wartością dystrybuanty rozkładu t-Studenta (tkryt) dla m - 2 stopni swobody i poziomu istotności α = 0,05. Współczynnik nachylenia tego równania regresji jest miarą czułości metody. Im jest on większy, tym większa czułość, a więc i lepsza metoda analityczna. Decyzje podejmowane w wyniku testowania współczynnika nachylenia są przedstawione w tabeli 5/Z-2.1. Tabela 5/Z-2.1. Tabela decyzyjna w testowaniu współczynnika nachylenia Wynik testu
Decyzja
tobl ≥ tkryt
Współczynnik nachylenia jest istotny. Można przejść do obliczania współczynnika przesunięcia.
tobl < tkryt
Współczynnik nachylenia równy zero. Metoda analityczna charakteryzuje się bardzo złą precyzją. Można spróbować wykonać wzorcowanie ze zwiększoną ilością stężeń wzorcowych, ale najlepiej poszukać innej metody analitycznej.
W omawianym przykładzie tobl = 62,51, a t0,05; 3 = 3,182. Stosując się więc do zaleceń przedstawionych w tabeli 5/Z-2.1. można przejść do wyznaczania wartości współczynnika przesunięcia. 5.2. Współczynnik przesunięcia Współczynnik przesunięcia równania opisującego prostoliniową funkcję wzorcowania wyznacza się z równania (8/Z-2.1.): a=y-b.x
(8/Z-2.1.)
Czyli w omawianym przykładzie: a = 0,6597 - 0,5256 . 1,01 = 0,1289 Odchylenie standardowe współczynnika przesunięcia wyraża się równaniem (9/Z-2.1.):
(9/Z-2.1.)
127 Czyli w omawianym przykładzie:
Na podstawie wartości a (równanie (8/Z-2.1.)) i sa (równanie (9/Z-2.1.)) przeprowadza się testowanie istotności współczynnika przesunięcia funkcji opisującej prostoliniową krzywą wzorcowania. Do tego celu wykorzystuje się równanie (10/Z-2.1.): (10/Z-2.1.) Czyli w omawianym przykładzie:
Wyznaczoną wartość tobl porównuje się ze stablicowaną wartością dystrybuanty rozkładu tStudenta (tkryt) dla m - 2 stopni swobody i poziomu istotności α = 0,05. Decyzje podejmowane w wyniku testowania współczynnika przesunięcia są przedstawione w tabeli 6/Z-2.1. Tabela 6/Z-2.1. Tabela decyzyjna w testowaniu współczynnika przesunięcia Wynik testu
Decyzja
tobl ≥ tkryt
Współczynnik przesunięcia jest istotny.
tobl < tkryt
Współczynnik przesunięcia równy zero. Można przejść do wyznaczania współczynnika zmienności.
W omawianym przykładzie tobl = 12,51, a t0,05;3 = 3,182. Stosując się więc do zaleceń przedstawionych w tabeli 6/Z-2.1. można przejść do wyznaczania wartości współczynnika zmienności metody kalibracji. 6. Współczynnik zmienności metody kalibracji Współczynnik zmienności metody kalibracji stosuje się najczęściej w celu porównania kalibracji wykonanych za pomocą różnych metod analitycznych. Do jego wyznaczenia należy w pierwszej kolejności obliczyć za pomocą równania (11/Z-2.1.) resztowe odchylenie standardowe (residual standard deviation) (sy):
(11/Z-2.1.) Otrzymaną wartość absorbancji yi dla stężenia wzorcowego xi należy przekształcić do wartości y*i, zgodnie z równaniem y*i= a + b . xi. Dane potrzebne dla omawianego przykładu zamieszczono w tabeli 7/Z-2.1.
128 Tabela 7/Z-2.1. Dane wejściowe do wyznaczania współczynnika zmienności metody
Lp. wzorca m
Stężenie wzorca (krotność NDS) xi
1
Absorbancja
Wyniki obliczeń
średnia doświadczalna yi
wyznaczona z równania regresji y*i
(y*i )2
yi . y*i
0,05
0,1407
0,1552
0,0241
0,0218
2
0,5
0,4057
0,3917
0,1534
0,1589
3
1
0,6623
0,6545
0,4284
0,4335
4
1,5
0,9163
0,9173
0,8414
0,8405
5
2
0,1737
1,1801
1,3926
1,3851
2,8399
2,8398
Średnia
Wyznaczone dla tego przykładu resztowe odchylenie standardowe wynosi:
Resztowe odchylenie standardowe opisuje rozrzut sygnałów pomiarowych (np. absorbancji) wokół wyznaczonej krzywej wzorcowej. Równanie (11/Z-2.1.) można również zapisać w innej postaci przedstawionej w rozdz. 2.5.2. „Szacowanie parametrów zależności liniowej”, która uwzględnia zależność y*i= a + b xi. Znając wartość resztowego odchylenia standardowego, odchylenie standardowe metody wyznacza się wg równania (12/Z-2.1.): (12/Z-2.1.) lub współczynnik zmienności: (13/Z-2.1.) Odchylenie standardowe lub współczynnik zmienności przedstawione w równaniach (12/Z-2.1.) i (13/Z-2.1.) charakteryzują precyzję metody kalibracji, a ich wartości obowiązują wewnątrz zakresu roboczego (lub krzywej wzorcowej). Czyli w rozważanym przykładzie:
Tak obliczony współczynnik można porównać z arbitralną, przyjętą na podstawie wyników doświadczeń, wartością graniczną (np. 3%). Decyzje podejmowane w wyniku sprawdzenia zamieszczone są w tabeli 8/Z-2.1.
129 Tabela 8/Z-2.1. Tabela decyzyjna dla współczynnika zmienności metody kalibracji Wynik sprawdzenia
Decyzja
Vm ≤ 3%
Metoda kalibracji o dobrej precyzji. Można na jej podstawie otrzymywać wiarygodne wyniki zawartości danego wskaźnika w wodzie do picia.
Vm > 3%
Metoda kalibracji o gorszej precyzji. Należy poprawić krzywą wzorcową. W tym celu w pierwszej kolejności należy zwiększyć liczbę wzorców w skali oraz liczbę powtórzonych analiz wzorców.
7. Analiza próbki o nieznanej zawartości analitu Analizę próbki o nieznanej zawartości (stężeniu) badanych składników analizuje się w tych samych warunkach, w których była wykonywana krzywa wzorcowania. Mogą przy tym wystąpić dwa przypadki: — analiza bez powtórzeń (pojedyncza); — analiza z powtórzeniami. W przypadku wykonywania powtarzanych analiz nieznanej próbki do obliczeń należy przyjąć średnią arytmetyczną wartości sygnałów pomiarowych (np. absorbancji). Zawartość wskaźnika w analizowanej próbce wyznacza się z równania (14/Z-2.1.): (14/Z-2.1.) Niepewność tego oszacowania (przedział ufności) wyznacza się za pomocą równania (15/Z-2.1.): (15/Z-2.1.) Wartość dystrybuanty rozkładu t-Studenta (t) określa się dla m - 2 stopni swobody i dla poziomu istotności α = 0,05. 8. Analiza próbki bez powtórzeń Niepewność wyniku analizy wyznaczono przy założeniu, że absorbancja próbki badanej wynosi 0,662. Jest ona równa wartości absorbancji uzyskanej dla środkowego wzorcowego stężenia, stosowanego podczas wykonywania krzywej wzorcowania. Przypadek ten został rozważony ze względu na to, że wyznaczony dla niego błąd jest najmniejszy z możliwych do osiągnięcia dla rozważanej krzywej wzorcowej. Wyznaczonej wartości absorbancji odpowiada stężenie:
X = 1,014NDS
130 Korzystając z równania (15/Z-2.1.) obliczono niepewność towarzyszącą zmierzonej absorbancji:
Stwierdzone stężenie jest zawarte w przedziale 0,928 NDS ÷ 1,100 NDS. 9. Analiza próbki z powtórzeniami Rozważania przeprowadzono przy założeniu, że absorbancje tej samej próbki, otrzymane w wyniku wykonania równoległych oznaczań wynoszą 0,661, 0,663 i 0,795. Ze względu na podejrzenie, że najwyższy wynik znacznie różni się od pozostałych postanowiono sprawdzić, czy nie jest on obarczony błędem grubym. 9.1. Odrzucanie wyników odległych (błędów grubych) W celu sprawdzenia, czy dany wynik analiz powtórzonych badanej próbki jest obciążony błędem grubym, stosuje się test Dixona (rozdz. 2.4.4) oraz
(16/Z-2.1)
Przez porównanie obliczonej wartości z wartościami krytycznymi testu Dixona (Qkryt) dla odrzucania wyników odległych, dla poziomu istotności α = 0,05 i liczby stopni swobody równej krotności powtórzeń, wykonanych dla tej samej próbki rozstrzyga się, czy podejrzany wynik należy odrzucić. Decyzja jest przy tym podejmowana na podstawie tabeli 9/Z-2.1. Tabela 9/Z-2.1. Tabela decyzyjna do odrzucania wyników odległych Wynik testu
Decyzja
Qobl ≤ Qkryt
Wyniki są wiarygodne. Należy je uwzględnić przy obliczaniu średniej i szacowaniu niepewności
Qobl > Qkryt
Wyniki są podejrzane. Podejrzany wynik należy odrzucić. Zmniejszyć o jedność liczbę stopni swobody i ponownie zastosować test Dixona
Test Dixona można stosować w przypadku odrzucania wyników odległych nawet w przypadku, kiedy liczba oznaczań równoległych jest niewielka, ale nie mniejsza od 3; z dwóch wyników równoległych nie można jednego odrzucić, ponieważ nie wiadomo, który jest poprawny. W omawianym przykładzie obliczono wartość QN:
131 Wartość QN jest większa od Qkryt = 0,971 dla 3 stopni swobody i poziomu istotności α = 0,05. Z tego względu najwyższego wyniku nie można uwzględnić w dalszych rozważaniach. Średnia uzyskana na podstawie pozostałych dwóch wyników wynosi 0,662. Uwaga: Test Dixona można stosować również i w innych przypadkach, np. podczas analizy wyników pochodzących z oznaczania roztworów wzorcowych podczas opracowywania krzywych wzorcowych. 9.2. Opracowanie wyniku W tym przypadku tak samo, jak w przypadku tylko jednokrotnego wykonania analizy, wyznaczone stężenie jest równe 1,014 NDS. Obliczona na podstawie równania (15/Z-2.1.) niepewność wyniku analizy ma wartość:
Stwierdzone stężenie jest zawarte w przedziale 0,948 NDS ÷ 1,080 NDS. 10. Uwagi końcowe Jak wynika z porównania błędów względnych, oszacowanych dla wyników analiz pojedynczych (bez powtórzenia) i z 2-krotnym powtórzeniem, wynik uzyskany w drugim przypadku jest przynajmniej o 24% lepszy od uzyskanego w pierwszym, co oznacza, że wykonanie podwójnej analizy danej próbki i uzyskanie zgodnych wyników zmniejsza jedną ze składowych niepewności pomiaru o 24%.
132 Załącznik 2.2.
PRZYKŁAD OBLICZANIA POWTARZALNOŚCI I ODTWARZALNOŚCI Wykonano n = 6 analiz powtarzanych materiału odniesienia w m = 9 laboratoriach i uzyskano następujące wyniki: Analizy Powtarzane
Liczba laboratoriów m = 9 A
B
C
D
E
F
G
H
I
1
7,09
7,19
7,19
7,61
7,25
7,24
7,35
7,17
7,22
2
7,00
7,55
7,31
7,08
7,35
7,41
7,57
7,20
7,35
3
7,14
7,37
7,73
7,02
7,59
7,37
7,33
7,55
7,26
4
7,34
7,05
7,93
7,04
7,21
7,66
7,65
7,54
7,59
5
7,35
7,36
7,87
7,52
7,48
7,16
7,61
7,42
7,64
6
7,28
7,02
7,61
7,54
7,30
7,71
7,29
7,69
7,20
Test Dixona
–
–
–
–
–
–
–
–
–
7,200
7,257
7,607
7,302
7,363
7,425
7,467
7,423
7,377
0,0207
0,0424
0,0900
0,0795
0,0210
0,0488
0,0033
0,0416
0,0369
nj = 6
s 2i
Średnią arytmetyczną oblicza się wg równania (4). Wariancje oblicza się wg równania (7). Oblicza się czynniki i składniki równań do oszacowania powtarzalności i odtwarzalności: Lab.
x
s 2i
ni
nix
ni(x - x)2
n 2i
(n–1)s 2i
1
2
3
4
5
6
7
8
1
7,200
0,0207
6
43,20
0,194
36
0,10
2
7,257
0,0424
6
43,54
0,091
36
0,21
3
7,607
0,0900
6
45,64
0,308
36
0,45
4
7,302
0,0795
6
43,81
0,037
36
0,40
5
7,363
0,0210
6
44,18
0,002
36
0,11
6
7,425
0,0488
6
44,55
0,012
36
0,24
7
7,467
0,0033
6
44,80
0,045
36
0,13
8
7,423
0,0416
6
44,54
0,011
36
0,21
9
7,377
0,0369
6
44,26
0,000
36
0,18
Suma
66,420
0,3842
54
398,52
0,701
324
2,04
133 Oblicza się średnią ogólną
wg równania:
czyli:
Oblicza się średnią wariancję w obrębie laboratorium (powtarzalności) wg równania:
n – 1 = 5, czyli: lub odchylenie standardowe powtarzalności
lub współczynnik zmienności powtarzalności:
Szacowanie wariancji między laboratoriami (s L2). Zanim zostanie obliczona wariancja między laboratoriami (s L2), szacuje się wariancję pomocniczą (sd2), charakteryzującą rozrzut pomiędzy średnimi ( ):
czyli: Oblicza się wariancję między laboratoriami wg równania:
134 w którym: n – jest średnią licznością analiz powtarzanych w m laboratoriach, obliczaną wg równania:
czyli:
zatem: Jeśli wariancja sd2 < s2r , to przyjmuje się, że odchylenie standardowe (wariancja) powtarzalności jest równe odchyleniu standardowemu (wariancji) odtwarzalności: sr = sR lub s 2r = sR2 Oblicza się odchylenie standardowe odtwarzalności wg równania:
czyli: lub współczynnik zmienności odtwarzalności:
Oblicza się granice powtarzalności wg równania: r = 2 . sr, czyli: r = 2 . 0,212 = 0,424 lub: r = 2 . sr . √2 – czyli: r = 2 . 0,212 . 1,41 = 0,598 Oblicza się granice odtwarzalności wg równania: R = 2 . sR, czyli: R = 2 . 0,228 = 0,456 lub r = 2 . sR . √2 – czyli: R = 2 . 0,228 . 1,41 = 0,642 W zależności od stężenia analitu w badanej próbce (materiału organicznego) maksymalne graniczne wartości precyzji podano w tabeli 2.7 (rozdz. 2.6.7.).
135 Załącznik 2.3.
PRZYKŁAD KARTY KONTROLNEJ ŚLEPEJ PRÓBY Obliczanie wartości średniej i odchylenia standardowego w badaniach próby ślepej Data
Nr analizy
Wartość (absorbancja)
5.06
1
0,089
6.06
2
0,080
7.06
3
0,091
9.06
4
0,083
10.06
5
0,079
11.06
6
0,054
12.06
7
0,081
14.06
8
0,082
17.06
9
0,065
18.06
10
0,073
19.06
11
0,080
20.06
12
0,073
21.06
13
0,081
24.06
14
0,089
25.06
15
0,079
26.06
16
0,076
27.06
17
0,069
1.07
18
0,083
2.07
19
0,076
3.07
20
0,075
4.07
21
0,083
5.07
22
0,097
8.07
23
0,068
9.07
24
0,066
10.07
25
0,079
Suma
1,951
Wartość średnia
0,078
Odchylenie standardowe
0,009
Górna granica kontrolna + 3s = 0,078 + 3 . 0,009 = 0,105 Górna granica ostrzegawcza + 2s = 0,078 + 2 . 0,009 = 0,096 Linia centralna = 0,078 Dolna granica ostrzegawcza - 2s = 0,078 - 2 . 0,009 = 0,060 Dolna granica kontrolna - 3s = 0,078 - 3 . 0,009 = 0,051 Karta kontrolna Êlepej próby 0,11
136 Załącznik 2.4.
PRZYKŁAD KARTY KONTROLNEJ ODZYSKU Obliczanie wartości średniej i odchylenia standardowego w badaniach odzysku: do analizowanych próbek dodano 0,060 g analitu Stężenie próbki przed wzbogaceniem
Odzysk
Stężenie próbki po wzbogaceniu
Data
Nr analizy
5.06
1
143,4
202,2
98,0
6.06
2
140,6
212,7
120,3
7.06
3
175,8
228,6
88,1
9.06
4
165,0
218,1
88,5
10.06
5
169,8
228,8
98,4
11.06
6
171,0
244,2
122,0
12.06
7
185,8
246,5
101,0
14.06
8
173,4
226,2
88,0
17.06
9
167,8
231,3
105,9
18.06
10
171,7
234,4
104,5
19.06
11
168,2
229,9
102,7
20.06
12
155,2
219,8
107,6
21.06
13
177,1
245,7
114,4
24.06
14
197,8
264,4
110,9
25.06
15
134,4
189,8
92,3
26.06
16
188,5
244,6
93,6
27.06
17
158,7
222,6
106,6
1.07
18
175,5
232,7
95,4
2.07
19
154,1
210,7
94,3
3.07
20
164,0
222,0
96,7
4.07
21
147,1
211,9
108,0
5.07
22
160,1
221,3
102,1
8.07
23
186,8
214,9
91,9
9.07
24
124,1
179,8
92,9
10.07
25
184,8
244,2
99,0
4140,7
5654,3
2523,2
165,6
226,2
100,9
18,0
18,8
9,4
Suma Wartość średnia Odchylenie standardowe
RR [%]
RR + 3s = 100,9% + 3 . 9,4% = 129,1% RR + 2s = 100,9% + 2 . 9,4% = 119,7% RR =100,9% RR - 2s = 100,9% + 2 . 9,4% = 82,1% RR - 3s = 100,9% + 3 . 9,4% = 72,1%
Górna granica kontrolna Górna granica ostrzegawcza Linia centralna Dolna granica ostrzegawcza Dolna granica kontrolna
Karta kontrolna odzysku próbki wzbogaconej 132
górna granica kontrolna
Odzysk RR [%]
122
górna granica ostrzegawcza
112 linia centralna
102 92
dolna granica ostrzegawcza
82
dolna granica kontrolna
72 62 0�
5�
10�
15�
Nr analizy
20�
25
TABLICE STATYSTYCZNE Tablica 1. Wartości krytyczne rozkładu t-Studenta (w zależności od P (ograniczenie dwustronne) lub P (ograniczenie jednostronne) i liczby stopni swobody f). f
P = 0,50
0,75
0,90
0,95
1
1,00
2,41
6,31
2
0,816
1,60
2,92
4,30
6,97
9,92
3
0,765
1,42
2,35
3,18
4,54
5,84
4
0,741
1,34
2,13
2,78
3,75
4,60
5
0,727
1,30
2,01
2,57
3,37
4,03
6
0,718
1,27
1,94
2,45
3,14
3,71
7
0,711
1,25
1,89
2,36
3,00
3,50
8
0,706
1,24
1,86
2,31
2,90
3,36
9
0,703
1,23
1,83
2,26
2,82
3,25
10
0,700
1,22
1,81
2,23
2,76
3,17
11
0,697
1,21
1,80
2,20
2,72
3,11
12
0,695
1,21
1,78
2,18
2,68
3,05
13
0,694
1,20
1,77
2,16
2,65
3,01
14
0,692
1,20
1,76
2,14
2,62
2,98
15
0,691
1,20
1,75
2,13
2,60
2,95
16
0,690
1,19
1,75
2,12
2,58
2,92
17
0,689
1,19
1,74
2,11
2,57
2,90
18
0,688
1,19
1,73
2,10
2,55
2,88
19
0,688
1,19
1,73
2,09
2,54
2,86
20
0,687
1,18
1,73
2,09
2,53
2,85
21
0,686
1,18
1,72
2,08
2,52
2,83
22
0,686
1,18
1,72
2,07
2,51
2,82
23
0,685
1,18
1,71
2,07
2,50
2,81
24
0,685
1,18
1,71
2,06
2,49
2,80
25
0,684
1,18
1,71
2,06
2,49
2,79
26
0,684
1,18
1,71
2,06
2,48
2,78
27
0,684
1,18
1,71
2,05
2,47
2,77
28
0,683
1,17
1,70
2,05
2,47
2,76
29
0,683
1,17
1,70
2,05
2,46
2,76
30
0,683
1,17
1,70
2,04
2,46
2,75
40
0,681
1,17
1,68
2,02
2,42
2,70
60
0,679
1,16
1,67
2,00
2,39
2,66
120
0,677
1,16
1,66
1,98
2,36
2,62
∞
0,674
1,15
1,64
1,96
2,33
2,58
f
P = 0,75
0,875
0,95
0,975
0,99
0,995
12,7
0,98 31,82
0,99 63,7
4052 98,49 34,12 21,20 16,26 13,74 12,25 11,26 10,56 10,04 9,65 9,33 9,07 8,86 8,68 8,53 8,40 8,28 8,18 8,10 8,02 7,94 7,88 7,82 7,77 7,72 7,68 7,64 7,60 7,56 7,31 7,08 6,85 6,64
f1 = 1
f2
F1 = 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 40 60 120 ∞
Liczba stopni swobody wariancji mniejszej f2
2
4999 99,00 30,81 18,00 13,27 10,92 9,55 8,65 8,02 7,56 7,20 6,93 6,70 6,51 6,36 6,23 6,11 6,01 5,93 5,85 5,78 5,72 5,66 5,61 5,57 5,53 5,49 5,45 5,42 5,39 5,18 4,98 4,79 4,60
2+
3
5403 99,17 29,46 16,69 12,06 9,78 8,45 7,59 6,99 6,55 6,22 5,95 5,74 5,56 5,42 5,29 5,18 5,09 5,01 4,94 4,87 4,82 4,76 4,72 4,68 4,64 4,60 4,57 4,54 4,51 4,31 4,13 3,95 3,78
3
4
5625 99,25 28,71 15,98 11,39 9,15 7,85 7,01 6,42 5,99 5,67 5,41 5,20 5,03 4,89 4,77 4,67 4,58 4,50 4,43 4,37 4,31 4,26 4,22 4,18 4,14 4,11 4,07 4,04 4,02 3,83 3,65 3,48 3,32
4
5
5764 99,30 28,24 15,52 10,97 8,75 7,46 6,63 6,06 5,64 5,32 5,06 4,86 4,69 4,56 4,44 4,34 4,25 4,17 4,10 4,04 3,99 3,94 3,90 3,86 3,82 3,78 3,75 3,73 3,70 3,51 3,34 3,17 3,02
5
6
5859 99,33 27,91 15,21 10,67 8,47 7,19 6,37 5,80 5,39 5,07 4,82 4,62 4,46 4,32 4,20 4,10 4,01 3,94 3,87 3,81 3,76 3,71 3,67 3,63 3,59 3,56 3,53 3,50 3,47 3,29 3,12 2,96 2,80
6
8
5981 99,36 27,49 14,80 10,27 8,10 6,84 6,03 5,47 5,06 4,74 4,50 4,30 4,14 4,00 3,89 3,79 3,71 3,63 3,56 3,51 3,45 3,41 3,36 3,32 3,29 3,26 3,23 3,20 3,17 2,99 2,82 2,66 2,51
8
10
6056 99,40 27,23 14,54 10,05 7,87 6,62 5,82 5,26 4,85 4,54 4,30 4,10 3,94 3,80 3,69 3,59 3,51 3,43 3,37 3,31 3,26 3,21 3,17 3,13 3,09 3,06 3,03 3,00 2,98 2,80 2,63 2,47 2,23
10
12
6106 99,42 27,05 14,37 9,89 7,72 6,47 5,67 5,11 4,71 4,40 4,16 3,96 3,80 3,67 3,55 3,45 3,37 3,30 3,23 3,17 3,12 3,07 3,03 2,99 2,96 2,93 2,90 2,87 2,84 2,66 2,50 2,34 2,18
12
16
16
6169 99,44 26,83 14,15 9,68 7,52 6,27 5,48 4,92 4,52 4,21 3,98 3,78 3,62 3,48 3,37 3,27 3,19 3,12 3,05 2,99 2,94 2,89 2,85 2,81 2,77 2,74 2,71 2,68 2,66 2,49 2,32 2,15 1,99
Liczba stopni swobody wariancji większej
20
6208 99,45 26,65 14,02 9,55 7,39 6,15 5,36 4,80 4,41 4,10 3,86 3,67 3,51 3,36 3,25 3,16 3,07 3,00 2,94 2,88 2,83 2,78 2,74 2,70 2,66 2,63 2,60 2,57 2,55 2,37 2,20 2,03 1,87
20
24
6234 99,46 26,60 13,93 9,47 7,31 6,07 5,38 4,73 4,33 4,02 3,78 3,59 3,43 3,29 3,18 3,08 3,00 2,92 2,86 2,80 2,75 2,70 2,66 2,62 2,58 2,55 2,52 2,49 2,47 2,29 2,12 1,95 1,79
24
50
6302 99,48 26,35 13,69 9,24 7,09 5,85 5,06 4,51 4,12 3,80 3,56 3,37 3,21 3,07 2,96 2,86 2,78 2,70 2,63 2,58 2,53 2,48 2,44 2,40 2,36 2,33 2,30 2,27 2,24 2,05 1,87 1,68 1,52
50
Tablica 2. Wartości krytyczn-e rozkładu F (w zależności od stopni swobody f1 i f2); P= 0,99
∞
6366 99,50 26,12 13,46 9,02 6,88 5,65 4,86 4,31 3,91 3,60 3,36 3,16 3,00 2,87 2,75 2,65 2,57 2,49 2,42 2,36 2,31 2,26 2,21 2,17 2,13 2,10 2,06 2,03 2,01 1,80 1,60 1,38
∞
f2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 40 60 120 1,00 ∞
Liczba stopni swobody wariancji mniejszej f2
138
f2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 40 60 120 ∞
Liczba stopni swobody wariancji mniejszej f2
f1 = 1
161 18,51 10,13 7,71 6,61 5,99 5,59 5,32 5,12 4,96 4,84 4,75 4,67 4,60 4,54 4,49 4,45 4,41 4,38 4,35 4,32 4,30 4,28 4,26 4,24 4,22 4,21 4,20 4,18 4,17 4,08 4,00 3,92 3,84
F1 = 1
2
200 19,00 9,55 6,94 5,79 5,14 4,74 4,46 4,26 4,10 3,98 3,88 3,80 3,74 3,68 3,63 3,59 3,55 3,52 3,49 3,47 3,44 3,42 3,40 3,38 3,37 3,35 3,34 3,33 3,32 3,23 3,15 3,07 2,99
2
3
216 19,16 9,28 6,59 5,41 4,76 4,35 4,07 3,86 3,71 3,59 3,49 3,41 3,34 3,29 3,24 3,20 3,16 3,13 3,10 3,07 3,05 3,03 3,01 2,99 2,98 2,96 2,95 2,93 2,92 2,84 2,76 2,68 2,60
3
4
225 19,25 9,12 6,39 5,19 4,53 4,12 3,84 3,63 3,48 3,36 3,26 3,18 3,11 3,06 3,01 2,96 2,93 2,90 2,87 2,84 2,82 2,80 2,78 2,76 2,74 2,73 2,71 2,70 2,69 2,61 2,52 2,45 2,37
4
5
230 19,30 9,01 6,26 5,05 4,39 3,97 3,69 3,48 3,33 3,20 3,11 3,02 2,96 2,90 2,85 2,81 2,77 2,74 2,71 2,68 2,66 2,64 2,62 2,60 2,59 2,57 2,56 2,54 2,53 2,45 2,37 2,29 2,21
5
6
234 19,33 8,94 6,16 4,95 4,28 3,87 3,58 3,37 3,22 3,09 3,00 2,92 2,85 2,79 2,74 2,70 2,66 2,63 2,60 2,57 2,55 2,53 2,51 2,49 2,47 2,46 2,44 2,43 2,42 2,34 2,25 2,17 2,09
6
8
239 19,37 8,84 6,04 4,82 4,15 3,73 3,44 3,23 3,07 2,95 2,85 2,77 2,70 2,64 2,59 2,55 2,51 2,48 2,45 2,42 2,40 2,38 2,36 2,34 2,32 2,30 2,29 2,28 2,27 2,18 2,10 2,02 1,94
8
10
242 19,39 8,78 5,96 4,74 4,06 3,63 3,34 3,13 2,97 2,86 2,76 2,67 2,60 2,55 2,49 2,45 2,41 2,38 2,35 2,32 2,30 2,28 2,26 2,24 2,22 2,20 2,19 2,18 2,16 2,07 1,99 1,90 1,83
10
12
244 19,41 8,74 5,91 4,68 4,00 3,57 3,28 3,07 2,91 2,79 2,69 2,60 2,53 2,48 2,42 2,38 2,34 2,31 2,28 2,25 2,23 2,20 2,18 2,16 2,15 2,13 2,12 2,10 2,09 2,00 1,92 1,83 1,75
12
16
Liczba stopni swobody wariancji większej
246 19,43 8,69 5,84 4,60 3,92 3,49 3,20 2,98 2,82 2,70 2,60 2,51 2,44 2,39 2,33 2,29 2,25 2,21 2,18 2,15 2,13 2,10 2,09 2,06 2,05 2,03 2,02 2,00 1,99 1,90 1,81 1,72 1,63
16
20
248 19,44 8,66 5,80 4,56 3,87 3,44 3,15 2,93 2,77 2,65 2,54 2,46 2,39 2,33 2,28 2,23 2,19 2,15 2,12 2,09 2,07 2,05 2,02 2,00 1,99 1,97 1,96 1,94 1,93 1,84 1,75 1,65 1,57
20
24
249 19,45 8,64 5,77 4,53 3,84 3,41 3,12 2,90 2,74 2,61 2,50 2,42 2,35 2,29 2,24 2,19 2,15 2,11 2,08 2,05 2,03 2,00 1,98 1,96 1,95 1,93 1,91 1,90 1,89 1,79 1,70 1,61 1,52
24
50
252 19,47 8,58 5,70 4,44 3,75 3,32 3,03 2,80 2,64 2,50 2,40 2,32 2,24 2,18 2,13 2,08 2,04 2,00 1,96 1,93 1,91 1,88 1,86 1,84 1,82 1,80 1,78 1,77 1,76 1,66 1,60 1,45 1,35
50
∞
Tablica 3. Wartości krytyczne rozkładu F (w zależności od stopni swobody f1 i f2); P = 0,95
254 19,50 8,53 5,63 4,36 3,67 3,23 2,93 2,71 2,54 2,40 2,30 2,21 2,13 2,07 2,01 1,96 1,92 1,88 1,84 1,81 1,78 1,76 1,73 1,71 1,69 1,67 1,65 1,64 1,62 1,51 1,39 1,25 1,00
∞
f2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 40 60 120 ∞
Liczba stopni swobody wariancji mniejszej f2
139
140 Tablica 4. Wartości krytyczne testu Dixona dla wartości odbiegających n
Wartości krytyczne α = 0,05
α = 0,01
3
0,970
0,994
4
0,829
0,926
5
0,710
0,821
6
0,628
0,740
7
0,569
0,680
8
0,608
0,717
9
0,564
0,672
10
0,530
0.635
11
0,502
0,605
12
0,479
0,579
13
0,611
0,697
14
0,586
0,670
15
0,565
0,647
16
0,546
0,627
17
0,529
0,610
18
0,514
0,594
19
0,501
0,580
20
0,489
0,567
21
0,478
0,555
22
0,468
0,544
23
0,459
0,535
24
0,451
0,526
25
0,443
0,517
26
0,436
0,510
27
0,429
0,502
28
0,423
0,495
29
0,417
0,489
30
0,412
0,483
31
0,407
0,477
32
0,402
0,472
33
0.397
0,467
34
0.393
0,462
35
0,388
0,458
36
0,384
0,454
37
0,381
0,450
38
0,377
0,446
39
0,374
0,442
40
0,371
0,438
