Биосинтез тетрапиррольных пигментов

BIOSYNTHESIS OF TETRAPYRROLIC PIGMENTS A. F. MIRONOV Key points of biosynthesis of porphyrins, chlorophylls, and cobalamines, the major pigments in the living nature, are described. àÁ·„‡˛ÚÒfl ÒÓ‚ÂÏÂÌÌ˚ Ô‰ÒÚ‡‚ÎÂÌËfl Ó ÔÛÚflı ÙÓÏËÓ‚‡ÌËfl ‚ ÊË‚˚ı Ó„‡ÌËÁχı Ú‡ÍËı ‚‡ÊÌÂȯËı ·ËÓÎӄ˘ÂÒÍË ‡ÍÚË‚Ì˚ı ÒÓ‰ËÌÂÌËÈ, Í‡Í ÔÓÙËËÌ˚, ıÎÓÓÙËÎÎ˚ Ë ‚ËÚ‡ÏËÌ Ç12 .

БИОСИНТЕЗ ТЕТРАПИРРОЛЬНЫХ ПИГМЕНТОВ Ä. î. åàêéçéÇ åÓÒÍÓ‚Ò͇fl „ÓÒÛ‰‡ÒÚ‚ÂÌ̇fl ‡Í‡‰ÂÏËfl ÚÓÌÍÓÈ ıËÏ˘ÂÒÍÓÈ ÚÂıÌÓÎÓ„ËË ËÏ. å.Ç. ãÓÏÓÌÓÒÓ‚‡

ÇÇÖÑÖçàÖ

Тетрапиррольные пигменты – порфирины, хлорофиллы и кобаламины играют исключительно важную роль в жизни животных, растений и бактерий. Эти ярко окрашенные соединения содержат в своем составе макроцикл, состоящий из четырех молекул пиррола. У порфиринов, имеющих красный цвет, пирролы соединены между собой метиновыми мостиками и макроцикл носит название “порфин” (1 ). В хлорофиллах, для которых характерна зеленая окраска, частично гидрированы один или два пиррола и молекула носит название “хлорин” (2 ) и “бактериохлорин” (3 ). Для кобаламинов, важнейшим среди которых является витамин В12 , все четыре кольца частично гидрированы и вместо одного метинового мостика имеется непосредственная связь между двумя пирролами. Этот цикл называется коррином (4 )

NH N

N HN

NH N

1 NH N

© åËÓÌÓ‚ Ä.î., 1998

3

N HN

2 N

N

N

HN

N

HN 4

В составе гемоглобина, миоглобина, цитохромов, каталазы и пероксидазы порфирины выступают в виде комплексов с ионами железа – гемов. Хлорофиллы и бактериохлорофиллы содержат магний. Витамин В12 и родственные ему кобаламины, как следует из названия, имеют в качестве центрального иона кобальт. Вслед за установлением строения основных природных порфиринов, хлорофиллов и кобаламинов перед учеными, работающими в этой области, встала грандиозная задача по раскрытию путей биосинтеза этих соединений в природе. Структурное подобие этих пигментов позволило предположить

åàêéçéÇ Ä.î. ÅàéëàçíÖá íÖíêÄèàêêéãúçõï èàÉåÖçíéÇ

35

наличие общих исходных метаболитов и близкие пути их превращений. Выполненные в дальнейшем исследования блестяще подтвердили это. В настоящее время в результате полувековых усилий большой армии химиков и биохимиков общая картина биосинтеза протогема, хлорофилла а и витамина В12 в значительной мере расшифрована.

“порфобилиноген” (ПБГ). Следующая стадия биосинтеза – превращение четырех молекул ПБГ в макроцикл уропорфириноген III (Уро'ген III, 3 ). Конденсация ПБГ в Уро'ген III состоит из двух этапов. На первом происходит полимеризация ПБГ под действием фермента ПБГ-дезаминазы в линейный тетрапиррол. На втором в присутствии фермента косинтетазы происходит не только замыкание билана (схема 2, 4 ) в макроцикл, но и поворот одного из пиррольных колец (пиррола D) с образованием природного III типа изомера – Уро'гена III. При отсутствии косинтетазы билан (4 ) замыкается в другой изомер – Уро'ген I, который в последующем биосинтезе не участвует. Только при наличии двух ферментов – дезаминазы и косинтетазы – ПБГ замыкается в изомер III типа. Отдельно взятая косинтетаза не полимеризует ПБГ и не в состоянии изомеризовать Уро'ген I в Уро'ген III. Лишь в начале 90-х годов был окончательно раскрыт механизм образования Уро'гена III. После получения дезаминазы высокой степени чистоты генноинженерными методами стало возможным показать, что фермент (Е) содержит активный центр – кофактор, состоящий из двух соединенных между собой молекул ПБГ. Этот дипирролилметан ковалентно связан с белком через атом серы остатка цистеина. Молекулы ПБГ последовательно присоединяются к дипирролилметану (с потерей NH3), образуя цепочку из трех (ES1), четырех (ES2), пяти (ES3) и шести (ES4) пирролов. Причем все присоединения происходят по типу “голова к хвосту”, и, следовательно, полипиррольная цепь имеет регулярно чередующиеся заместители А–Р–А–Р–А–Р– и т.д. После присоединения четвертой молекулы ПБГ тетрапиррольная цепочка

éÅôàâ èìíú éÅêÄáéÇÄçàü íÖíêÄèàêêéãúçõï èêÖÑòÖëíÇÖççàäéÇ

Начало исследований обычно принято относить к 1945 году, когда молодой американский ученый Шемин поставил эксперимент на собственном организме, приняв порцию простейшей аминокислоты глицина, которая отличалась от обычной аминокислоты заменой изотопа 14N на 15N. Через некоторое время он выделил из крови гемоглобин и затем гемин, содержащий повышенное содержание изотопа 15 N. Позднее было показано, что глицин конденсируется с сукцинил-коэнзимом А, давая δ-аминолевулиновую кислоту (δ-АЛК; схема 1, 1 ). Этот процесс катализируется ферментами АЛК-синтетазой, и его обязательным участником является фосфорилированная форма витамина В6 – пиридоксальфосфат. Последующими исследованиями было показано, что δ-АЛК выступает в качестве общего предшественника в биосинтезе всех природных тетрапиррольных пигментов. Описанное образование δ-АЛК характерно для животных и фотосинтетических бактерий. В растениях и у некоторых прокариотов δ-АЛК синтезируется из глютаминовой кислоты. Две молекулы δ-АЛК под действием фермента порфобилиноген-синтетазы (схема 2) конденсируются в молекулу пиррола (2 ), получившего название

COOH O

COOH COOH +

O

NH2

SCoA Сукцинилкоэнзим А

NH2 HOOC

1 δ-Аминолевулиновая кислота

Глицин

Глютаминовая кислота

P COOH

H2N

N H

COOH

H2N

COOH

2

A

P NH

HN

NH

HN

A

A P

Порфобилиноген

A

3

P

Уропорфириноген III

Схема 1. Начальный этап биосинтеза тетрапиррольных пигментов (А и Р – остатки уксусной и пропионовой кислот соответственно)

36

ëéêéëéÇëäàâ éÅêÄáéÇÄíÖãúçõâ ÜìêçÄã, ‹7, 1998

A Cys S

P A N H

242

A

P ПБГ −NH3

N H

Cys S

P A N H

P A N H

A

−3NH3

Cys S

P A N H

P A N H

H2O

P A

B

P

NH HN D C A

4

P

Оксибилан

A

A

P

P

NH HN

Косинтетаза

HO

P

A

A

P

NH HN

−3NH3

P A P A P A P A B C D N N N N H ES H H H 4

P

A

A

3ПБГ

ES1

Дезаминаза

3ПБГ

P A N H

HN+

NH HN NH HN

HN

A

A

A

A

A

P

5

P

P

Спиро-форма

P

Уропорфириноген III

Схема 2. Наращивание полипиррольной цепи на ферменте дезаминаза (Е) (показано присоединение одной (ES 1) и четырех (ES4) молекул ПБГ), отщепление оксибилана и замыкание его в Уро'ген III в присутствии косинтетазы с обращением кольца D через спиро-соединение

отделяется с образованием оксибилана (4 ). Дипирролилметан дезаминазы снова готов к наращиванию полипиррольного ансамбля (схема 3). Наличие простетической группы в дезаминазе, построенной из молекул, подобных субстрату, – явление необычное для ферментов. Известно только, что, действуя на дезаминазу сильными кислотами, удается отщепить дипирролилметан. Полученный апофермент уже не обладает каталитической активностью. Лишь после присоединения первых двух молей ПБГ при определенном рН дезаминаза снова становится способной к обратимому присоединению четырех молекул ПБГ. Синтезированный оксобилан (схема 2, 4 ) под действием второго фермента косинтетазы превращается в Уро'ген III (схема 1, 3 ). Для этой циклизации, сопровождающейся обращением пиррольного кольца D, за долгие годы изучения этой реакции предложено свыше двух десятков механизмов. В настоящее время наиболее обоснованным представляется поворот кольца D за счет образования спиро-структуры (5 ). После образования Уро'гена III происходит первое разветвление путей биосинтеза тетрапиррольных пигментов. Декарбоксилирование Уро'гена III ведет к порфиринам и хлорофиллам, а С-метилирование через Прекоррин-1 – к витамину В12 и другим кобаламинам (схема 4, 6 ).

åàêéçéÇ Ä.î. ÅàéëàçíÖá íÖíêÄèàêêéãúçõï èàÉåÖçíéÇ

Оксибилан

E

ПБГ

H2O

NH3 ES4

ES1

NH3 ПБГ

ПБГ

ES3 NH3

ES2

NH3

ПБГ

Схема 3. Каталитический цикл дезаминазы

ÅàéëàçíÖá èêéíéÉÖåÄ

Рассмотрим путь, ведущий к главному порфирину в животном мире – протопорфирину IX (схема 4, 9 ) и его железосодержащему комплексу – протогему. Превращение Уро'гена III под влиянием соответствующего фермента включает последовательное декарбоксилирование остатков уксусной кислоты до метильной группы с образованием копропорфириногена III (Копро'ген III). Декарбоксилирование начинается с кольца D и далее продолжается по часовой стрелке через кольца А, В и С. Имеется также указание, что в определенных условиях возможен и иной порядок декарбоксилирования.

37

P A

A

A

P

B

3

H3C

P

NH HN

A

NH HN D C P

CH3

CH3 P

8

H3C

NH HN NH HN

H3C

A

P

H3C

P

Протогем

A

A P N

CH3

Fe

Mg

HN

CH3 P P 8 Протопорфириноген IX

7 Копропорфириноген III

P H H3C

NH HN CH3

P

3 Уропорфириноген III

NH HN

H3C

NH

N

Хлорофилл Co

NH HN A

A

N Витамин B12

P

P 6 Прекоррин-1

HN

H3C

CH3 P P 9 Протопорфирин IX

Схема 4. Общая схема образования протопорфирина IX и разветвление путей биосинтеза к зеленым пигментам и кобаламинам

Копро'ген III под действием копропорфириногеноксидазы подвергается окислительному декарбоксилированию. В результате два остатка пропионовой кислоты в положениях 3 и 8 превращаются в винильные группы и образуется протопорфириноген IX (8, Прото'ген IX). Последний ферментативно окисляется в протопорфирин IX (9, Прото IX). На этом участке происходит дальнейшее разветвление путей биосинтеза. Введение ионов двухвалентного железа (фермент феррохелатаза) приводит к образованию протогема, который является простетической группой в многочисленных природных белках – гемопротеидах. ÅàéëàçíÖá ïãéêéîàããéÇ

Включение в Прото IX магния начинает новую цепь биосинтетических превращений, ведущих к хлорофиллу а, бактериохлорофиллу и другим зеленым пигментам, общее количество которых сегодня превышает 50 типов. На схеме 5 показаны основные превращения магниевого комплекса Прото IX в хлорофилл а (15, Хл а). Существенным отличием этой ветви биосинтеза от ранее рассмотренной является то, что при биосинтезе Прото IX большая часть промежуточных соединений находится в растворах, перемещаясь от одного фермента к другому, причем сами ферменты также по большей части растворены в цитоплазме клетки. Биосинтез хлорофиллов, напротив, проте-

38

кает только в хлоропластах, все ферменты закреплены в мембранах и часто образуют сложные ассоциаты. Это значительно затрудняет изучение отдельных стадий, механизмы превращений промежуточных соединений, и в связи с этим общая картина биосинтеза Хл а остается менее ясной. В целом же об этом биосинтезе известно следующее. После введения иона магния (схема 5, 10 ) происходит этерификация остатка пропионовой кислоты в положении 13 (11 ). Далее этот остаток окисляется через несколько промежуточных стадий, давая после замыкания кольцо Е (12 ). Затем происходит восстановление винильной группы до этильной в положении 8 с образованием 3-винилпротохлорофиллида (13 ). Следующая важная стадия включает восстановление двойной связи в кольце D. Исключительно важную роль при этом играет освещение растений. Показано, что при отсутствии света у высших растений накапливается протохлорофиллид (13 ). Даже короткая световая экспозиция приводит к превращению протохлорофиллида в хлорофиллид (14 ). В то же время низшие растения и водоросли могут синтезировать хлорофиллид и при отсутствии света. На заключительном этапе происходит этерификация хлорофиллида природным спиртом фитолом при участии особого фермента хлорофиллсинтетазы. В результате образуется хлорофилл а (15 ).

ëéêéëéÇëäàâ éÅêÄáéÇÄíÖãúçõâ ÜìêçÄã, ‹7, 1998

N

N

N

Mg N

N

N

Mg N

N

N

N

13

N Mg N

13

E H

COOH

COOH

COOH

10

COOMe 11

N

12

N

N

N

Mg N

O CO2Me

COOH

Mg N

N

H

N

Me H H COOH

O CO2Me

13

H

O CO2Me

COOR

14 Хлорофиллид a, R = H, 15 Хлорофилл a, R = фитил Схема 5. Биосинтез хлорофилла а

Пути биосинтеза других хлорофиллов, а также бактериохлорофиллов изучены пока недостаточно. Известно, однако, что все эти пигменты образуются через Хл а. В случае хлорофилла b происходит окисление метильной группы в положении 7 до формильной (16 ). Образование самого распространенного среди бактериохлорофиллов а-изомера (17 ) включает превращение винильной группы в ацетильную, гидрирование второго пиррольного кольца В и этерификацию остатка пропионовой кислоты фитолом.

O

H Me N N

H

N

H

N

Me H H COOR

CHO

N Mg

O 17 CO2Me Бактериохлорофилл a

R=

N

Фитил

N

ÅàéëàçíÖá ÇàíÄåàçÄ Ç12

Mg N

H Me

H H COOR

O CO2Me

16 Хлорофилл b

åàêéçéÇ Ä.î. ÅàéëàçíÖá íÖíêÄèàêêéãúçõï èàÉåÖçíéÇ

Витамин В12 и родственные ему кобаламины играют важную роль в жизнедеятельности человека. Они участвуют в различных биохимических превращениях, предотвращают развитие злокачественной анемии крови, различных заболеваний печени,

39

CO2H

CO2H CO2H

HO2C

HO2C

2

Me

N

CO2H

R HO2C

NH HN

HO2C

7

2

Me

HN

CO2H

Me

1

20

N

HN

CO2H

NH HN

CO2H

12

CO2H

17

H H CO2H

CO H

CO2H

2 18 Прекоррин-1

CO2H HO2C

CO2H CO2H

Me

Me

NH

N

O

N

HO2C CO2H

Me HO2C

HN

NH

19

N

N

HN

H H Me 12

Me

CO H

CO2H

2 21 Прекоррин-4

CO2H

CO2H

CO H

2 22 Прекоррин-6

CO2H

CO2H CO2H Me

Me HO2C N

N

N

N

CO2H Me

Me HO2C CO2H

Me Me

Me

11

18

CO2H

Me Me H HO2C

CO2H

Me

Me Me HO2C

Me CO2H

CO2H

19 Прекоррин-2 20 Прекоррин-3

Me Me H HO2C Me

H Me

CO2H

23 CO2H Прекоррин-8

A 1

D

5

NH

N

N

N 15

17

CO2H 12

Me Me

Me CO2H 24 CO2H Гидрогенобириновая кислота

Схема 6. Первый этап биосинтеза В12

используются при лечении лучевой болезни. Кобаламины синтезируются различными микроорганизмами. В промышленности производство витамина В12 основано на использовании пропионовокислых бактерий. Механизм образования витамина В12 , наиболее сложного из известных тетрапиррольных пигментов,

40

выяснен значительно лучше, чем, например, хлорофиллов и бактериохлорофиллов. По образному выражению известного английского ученого А. Баттерсби, внесшего большой вклад в раскрытие биосинтеза витамина В12 , эта задача потребовала преодолеть “Эверест биосинтетических проблем”. В журнале “Angewandte Chemie” (1995. Bd. 34. S. 383–411) он

ëéêéëéÇëäàâ éÅêÄáéÇÄíÖãúçõâ ÜìêçÄã, ‹7, 1998

CO2H Me Me XOC

Me Me

CO2H

NH N

Me Me H HO2C

N HN

CONH2 CO2H

H2NOC

7

2

Me Me H HO2C

CO2H

COX

Me

N

N M

N

HN

Me

Me

Me

Me Me

Me Me

CO2H

CO2H

CO2H

CO2H 26 M = Co + 27 M = Co

24 X = O H 25 X = N H 2

COX Me Me

Me Me

COX

H2NOC Me Me H XOC

CONH2

CONH2

N Ado N Co+ N HN

CONH2 CONH2

H2NOC Me Me H NH2OC

Me

N Ado N Co+ N HN

Me

Me

Me

Me Me

Me Me

CO2H

O C

COX

CONH2

NH

28 X = O H 29 X = N H 2

30 R = H

RO

CONH2 CH3CH3 H2NOC CH3 CH3 H NH2OC O HN

31 R = P O 23

N R N Co+ N N

CONH2 CONH2

CH3 CH3

CH3 CH3 CONH2

O O− P O O OH

N

CH3

H

N

CH3

O HO

H

32 R = аденозил Аденозилкобаламин 33 R = CN Витам ин B 1 2

Схема 7. Заключительный этап биосинтеза витамина В 12

åàêéçéÇ Ä.î. ÅàéëàçíÖá íÖíêÄèàêêéãúçõï èàÉåÖçíéÇ

41

отмечает, что 1993 год наряду с 40-й годовщиной покорения высочайшей горы планеты Эверест англичанином Хиллари и шерпом Тенцингом ознаменовался завершением грандиозной работы по созданию единой картины биосинтеза витамина В12 . Как отмечено выше, разветвление основного пути биосинтеза тетрапиррольных пигментов в сторону витамина В12 начинается с Уро'гена III (3 ). Сначала под действием особых ферментов происходит введение метильной группы в положение 2 (схема 6). Соединение, получившее название прекоррин-1 (18 ), далее подвергается метилированию по С-7 с образованием прекоррина-2 (19 ). Третье метилирование проходит по мезо-углеродному мостику в положении 20, и в результате возникает частично восстановленный макроцикл прекоррина-3 (20 ). Последующие превращения, каждое из которых контролируется своими ферментами, включает метилирование в положение 17, сужение макроцикла с образованием корринового цикла (21 ), введение метильных групп в положения 11 и затем 1 (22 ), два метилирования по мезо-мостикам 5 и 15 и декарбоксилирование остатка уксусной кислоты в положении 12 (23 ). Заключает этот цикл превращений перегруппировка метильной группы из положения 11 в положение 12 с образованием важного промежуточного соединения – гидрогенобириновой кислоты (24 ). На заключительном этапе биосинтеза (схема 7) кислота (24 ) амидируется по остаткам уксусной кислоты в положениях 2 и 7 (25 ) и включает ионы двухвалентного кобальта, превращаясь в диамид кобириновой кислоты (26 ). Далее происходит восСо+, и эта активная форма становление Со2+ (27 ) превращается в диамид аденозилкобириновой кислоты (28 ). Наличие аденозильного лиганда, как было показано, является необходимым условием для дальнейшего ступенчатого амидирования четырех карбоксильных групп. Оставшаяся карбоксильная группа в положении 17 кобировой кислоты (29 ) участвует в образовании так называемой нуклеотидной петли. Первоначально происходит присоединение 1-аминопропанола-2 с образованием соединения (30 ). Ферменты, контролирующие этот процесс, обладают высокой специфичностью к аденозилкобириновой кислоте (28 ). Фосфорилирование по гидроксильной группе аминопропанола дает фосфат (31 ). Последний превращается в коферментную форму витамина В12 аденозинкобаламина (32 ). Замена остатка аденозина на циано-группу приводит к цианкобаламину (33 ) – лекарственной форме витамина В12 . В организме происходит обратная замена. áÄäãûóÖçàÖ

Изложенные здесь пути биосинтеза протогема, хлорофилла а и витамина В12 показывают, насколько близко переплетаются фундаментальные процессы жизнедеятельности в бактериях, высших растениях

42

и животном мире. При значительных различиях объектов исследования в рассмотренных схемах используются общие или близкие методы построения исходных и промежуточных соединений. Речь, таким образом, идет о построении общей картины жизни на нашей планете. Успешное раскрытие биосинтеза “пигментов жизни” можно рассматривать как важный этап в развитии современной молекулярной биологии и биохимии. Полученные знания могут быть использованы и в медицинской практике в борьбе с определенными наследственными заболеваниями, при химических отравлениях и других процессах, связанных с нарушениями биосинтеза гемопротеидов. Примером успешного использования биосинтеза гема явился предложенный недавно модифицированный метод фотодинамической терапии рака, основанный на введении в организм пациента δ-АЛК, которая превращается в Прото IX, а последний накапливается в злокачественных опухолях. Более подробно об этом методе можно прочитать в нашей статье в “Соросовском Образовательном Журнале” (1996. № 8. С. 32). Возможны, очевидно, и другие примеры моделирования биосинтетических путей получения этих важных соединений и их производных. В заключение хочу выразить благодарность профессору В.Я. Быховскому за ценные советы и полезную дискуссию при обсуждении этой статьи. ãàíÖêÄíìêÄ 1. Общая органическая химия. М.: Химия, 1986. Т. 11. С. 634–685. 2. Химия биологически активных природных соединений / Под ред. Н.А. Преображенского, Р.П. Евстигнеевой. М.: Химия, 1976. С. 100–184. 3. Быховский В.Я., Зайцева З.И. Микробиологический синтез тетрапиррольных соединений // Итоги науки и техники. Сер. Биол. химия. 1989. Т. 32. 173 с. 4. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. М.: Мир, 1986. Т. 2. С. 106–121. 5. Бриттон Г. Биохимия природных пигментов. М.: Мир, 1986. 422 с.

* * * Андрей Федорович Миронов, профессор, зав. кафедрой химии и технологии тонких органических соединений, декан факультета биотехнологии и органического синтеза Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, академик Российской инженерной академии. Научные интересы связаны с химией природных и синтетических порфиринов и хлоринов, их металлокомплексов. Под его руководством разработан первый отечественный сенсибилизатор Фотогем для фотодинамической терапии рака, создаются препараты второго поколения на основе природных хлорофиллов. Автор свыше 250 научных публикаций, обзоров, двух монографий.

ëéêéëéÇëäàâ éÅêÄáéÇÄíÖãúçõâ ÜìêçÄã, ‹7, 1998