Bakterie w biologii biotechnologii i medycynie

PAUL SINGLETON

Bakterie w biologii, biotechnologii i medycynie tłumaczenie zbiorowe pod redakcją naukową Zdzisława Markiewicza

Dane oryginału: Bacteria in Biology, Bacteriology and Medicine

Paul Singleton Fifth edition Copyright © 1981, 1992, 1995, 1997 and 1999 by John Wiley & Sons Ltd. Baffins Lane, Chichester, West Sussex PO 19 1UD, England AU rights reserved. Authorised translation from the English language edition published by John Wiley & Sons Ltd.

Okładkę i strony tytułowe projektowała Maryna Wiśniewska Fotografia na okładce (pochodząca z wydania angielskiego): barwienie Grama żywych komórek wykorzystujące preparat fluorescencyjny BacLight™: Bacillus cereus (gramdodatnia, pomarańczowa); Pseudomonas aeruginosa (gramujemna, zielona). Szczegóły barwienia podano w sekcji 14. 9. 1. 1. Zdjęcie dzięki uprzejmości Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA. Redaktor Krystyna Mostowik Redaktor techniczny Jolanta Cibor

Podręcznik akademicki dotowany przez Ministerstwo Edukacji Narodowej

Copyright © for the Polish edition by Wydawnictwo Naukowe PWN SA Warszawa 2000

ISBN 83-01-13212-4

Wydawnictwo Naukowe PWN SA ul. Miodowa 10, 00-251 Warszawa, tel.: 659 43 21 e-mail: pwn@pwn. com. pl http: //www. pwn. com. pl

Spis treści Wykaz skrótów czasopism i książek cytowanych w tekście

VIII

Przedmowa do wydania polskiego

IX

Przedmowa do wydania angielskiego

XI

1 Bakterie - wprowadzenie 1. 1 Co to są bakterie? 1. 2 Dlaczego badamy bakterie? 1. 3 Klasyfikacja i nazewnictwo bakterii

1 1 3 4

2 Komórka bakteryjna 2. 1 Kształty, rozmiary i ułożenie komórek bakteryjnych 2. 2 Komórka bakteryjna — bliższe spojrzenie 2. 3 Formy nitkowate i cenocyty

6 6 10 34

3 Wzrost i rozmnażanie 3. 1 Warunki wzrostu 3. 2 Wzrost pojedynczej komórki 3. 3 Wzrost populacji bakteryjnych 3. 4 Diauksja (wzrost dwufazowy) 3. 5 Pomiar wzrostu

36 36 41 49 55 55

4 Różnicowanie 4. 1 Cykl życiowy Caulobacter 4. 2 Wzrost „rozpełzliwy" (ang. swarming) 4. 3 Komórki spoczynkowe 4. 4 Akinety, heterocysty, hormogonia

56 56 58 59 63

5 Metabolizm I - energia 5. 1 Metabolizm energetyczny chemotrofów 5. 2 Metabolizm energetyczny fototrofów 5. 3 Inne zagadnienia związane z metabolizmem energetycznym 5. 4 Systemy transportu

66 67 80 83 86

6 Metabolizm II - węgiel 6. 1 Asymilacja węgla u autotrofów 6. 2 Asymilacja węgla u heterotrofów 6. 3 Synteza, wzajemne przemiany i polimeryzacja związków węgla 6. 4 Metylotrofia u bakterii

95 96 97 98 104

7 Biologia molekularna I - geny i ich wyrażanie się 7. 1 Chromosomy i plazmidy 7. 2 Kwasy nukleinowe - struktura 7. 3 Replikacja DNA

106 106 107 112 V

7. 4 Modyfikacja i restrykcja DNA 7. 5 Synteza RNA - transkrypcja 7. 6 Synteza białka 7. 7 Kontrolowanie i naprawa DNA 7. 8 Regulacja ekspresji genów 7. 9 Bakteryjny RNA

118 120 122 130 133 155

8 Biologia molekularna II - zmienianie informacji genetycznej 157 8. 1 Mutacje.. .......................................................................................................... 157 8. 2 Rekombinacja................................................................................................... 162 8. 3 Transpozycja........................................................................................................ 163 8. 4 Przekazywanie (transfer) genów 167 8. 5 Inżynieria genetyczna/technologia rekombinowanego DNA i podobne techniki związane z analizą DNA 175 9 Bakteriofagi 231 9. 1 Fagi wirulentne — cykl lityczny................................................................ 233 9. 2 Fagi umiarkowane — lizogenia................................................................ 239 9. 3 Fagi męskie 241 9. 4 Konwersja fagowa 241 9. 5 Transdukcja.......................................................................................................... 242 9. 6 W jaki sposób fag unika restrykcyjnego systemu gospodarza? 243 10 Bakterie w świecie ożywionym 244 10. 1 Zespoły mikroorganizmów 244 10. 2 Saprotrofy, drapieżniki, pasożyty, symbionty 247 10. 3 Bakterie a obieg materii 249 10. 4 Bakterie stanowiące zarodki krystalizacji zamarzającej wody ("lodotwórcze") 257 10. 5 Bakteriologia in situ — fakt czy fikcja? 257 10. 6 Efekt cieplarniany 259 10. 7 Problem rekombinantów bakteryjnych w środowisku 260 10. 8 Bakterie nie wyhodowane/niehodowalne 260 11 Bakterie w medycynie 262 11. 1 Bakterie jako patogeny 262 11. 2 Drogi infekcji 263 11. 3 Patogeneza — mechanizm rozwoju choroby 274 11. 4 Mechanizmy obronne gospodarza 281 11. 5 Patogen — czynniki wirulencji 296 11. 6 Interakcje między patogenem a gospodarzem — nowa perspektywa.. 306 11. 7 Rozprzestrzenianie się choroby 306 11. 8 Wykrywanie i charakterystyka patogenów w laboratorium 307 11. 9 Zapobieganie i kontrola chorób zakaźnych 312 11. 10 Kilka uwag dotyczących chemioterapii 313 11. 11 Niektóre schorzenia bakteryjne 314 12 Bakteriologia stosowana I — żywność 12. 1. Bakterie biorące udział w produkcji żywności 12. 2 Środki zapobiegające psuciu się żywności 12. 3 Zatrucia pokarmowe i higiena środków spożywczych

320 320 322 327

13 Bakteriologia stosowana II - różnorodne aspekty 13. 1 Karmienie zwierząt, ochrona roślin 13. 2 Biokopalnictwo (bioługowanie)

334 334 336

VI

13. 3 Biologiczne proszki do prania 337 13. 4 Oczyszczanie ścieków 337 13. 5 Skąd pobieramy wodę? 342 13. 6 Wykorzystywanie zarazków dla dobra człowieka 348 13. 7 Tworzywa pochodzenia bakteryjnego - Biopol 348 13. 8 Bioremediacja................................................................................................... 349 14 Nieco praktycznej bakteriologii 350 14. 1 Bezpieczeństwo w laboratorium 350 14. 2 Podłoża bakteriologiczne................................................................................. 351 14. 3 Techniki aseptyczne 355 14. 4 Narzędzia bakteriologa 357 14. 5 Metody inokulacji 358 14. 6 Przygotowanie czystej kultury z mieszaniny organizmów 359 14. 7 Inkubacja w warunkach beztlenowych 362 14. 8 Liczenie bakterii 363 14. 9 Barwienie.......................................................................................................... 365 14. 10 Mikroskopia................................................................................................... 368 15 Człowiek przeciwko bakteriom 372 15. 1 Sterylizacja........................................................................................................... 372 15. 2 Dezynfekcja...................................................................................................... 376 15. 3 Antyseptyka............................................................................................... 378 15. 4 Antybiotyki.................................................................................................... 379 16 Identyfikacja i klasyfikacja bakterii 401 16. 1 Identyfikacja....................................................................................................... 401 16. 2 Klasyfikacja (taksonomia) prokariotów 417 Krótkie opisy niektórych rodzajów, rodzin, rzędów i innych kategorii bakterii

430

Skorowidz

442

Wykaz skrótów czasopism i książek cytowanych w tekście (Krótkie nazwy — Lancet, Nature, Science — nie są skracane) AAC Antimicrobial Agents and Chemotherapy AEM Applied and Environmental Microbiology ARB Annual Review of Biochemystry ARM Annual Review of Microbiology ARP Annual Review of Physiology BBA Biochimica et Biophisica Acta BC Biodiversity and Conservation BCID Bailliere's Clinical Infectus Diseases BR Biological Reviews CCM Critical Care Medicine CMC Cell Motility and the Cytoskeleton CMI Clinical Microbiology and Infection COGD Current Opinion in Genetics and Development EJB European Journal of Biochemistry FEMSIMM FEMS Immunology and Medical Microbiology FEMSME FEMS Microbiology Ecology FEMSML FEMS Microbiology Letters FEMSMR FEMS Microbiology Reviews GD Genes and Development IJSB International Journal of Systematic Bacteriology INFIM Infection and Immunity JAC Journal of Antimicrobial Chemotherapy JAMA Journal of the American Medical Association JB Journal of Bacteriology JBC Journal of Biological Chemistry JBM Journal of Basic Microbiology (Berlin) JCB Journal of Cellular Biochemistry JCM Journal of Clinical Microbiology JGM Journal of General Microbiology JID Journal of Infectious Diseases JIM Journal of Immunology JINF Journal of Infection JMB Journal of Molecular Biology JMM Journal of Medical Microbiology JSB Journal of Structural Biology LAM Letters in Applied Microbiology MEHD Microbila Ecology in Health and Disease MM Molecular Microbiology MP Microbial Pathogenesis MR Microbiological Reviews NAR Nucleis Acids Research NB Nature Biotechnology NEJM New England Journal of Medicine PB Process Biochemistry PNARMB Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology PNAS Proceedings of the National Academy of Science of the USA PRS Proceedings of the Royal Society of London, Series B (Biological Sciences) PTRSLB Philosophical Transaction of the Royal Society of London, Series B RMM Reviews in Medical Microbiology SAM Systematic and Applied Microbiology TIBS Trends in Bichemical Sciences TIBTECH Trends in Biotechnology TIFS Trends in Food Science and Technology TIG Trends in Genetics TIM Trends in Microbiology TLD Tubercle and Lung Disease TREE Trends in Ecology and Evolution TRSTMH Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene

Przedmowa do wydania polskiego Na książkę Paula Singletona Bakterie w biologii, biotechnologii i medycynie (czwarte

wydanie) trafiłem przeglądając niezmiernie bogaty zbiór podręczników do mikrobiologii w znanej nowojorskiej księgarni akademickiej Barnes & Nobles (mikrobiologia jest wciąż „modna" !). O mało jej nie przeoczyłem wśród znacznie większych, grubszych, a przede wszystkim niezwykle barwnie i bogato ilustrowanych tomów, często wzbogaconych płytą kompaktową. Na szczęście wpadła mi w ręce i, jak mniemam, bardzo dobrze się stało. Książka Singletona nie na darmo wcześniej była przekładana na kilka języków. Jest ona znakomitym, nowoczesnym podręcznikiem, podającym w dobrze zorganizowany sposób podstawowe i niezbędne dla kursu mikrobiologii informacje, poszerzone o różne ciekawostki i fakty. Mimo skromniejszej szaty graficznej od wspomnianych wyżej podręczników, nie ustępuje im jakością, tym bardziej że zwraca uwagę na różne aspekty działalności bakterii i ich wykorzystania, często pomijane przez innych autorów. Główna część książki zajmuje się fizjologią bakterii, gdyż to różnorodność przeprowadzanych przez nie procesów metabolicznych stanowi o zastosowaniu tej grupy organizmów w wielu procesach przemysłowych (biotechnologia). Bakterie przeprowadzając swoje procesy życiowe przekształcają otaczające je środowiska, w tym środowiska organizmów żywych, co może prowadzić do powstania objawów chorobowych. Singleton pisze o wielu z tych procesów (o wszystkich nie sposób) i podaje przykłady różnych mechanizmów chorobotwórczych. Rozdział 11 kończy się zbiorem krótkich opisów najczęstszych schorzeń człowieka powodowanych przez bakterie. Godne podkreślenia są wyczerpujące opisy współczesnych technik biologii molekularnej znajdujących zastosowanie np. w diagnostyce wielu chorób lub wyjaśnieniu przyczyn lekooporności. W książce jest bardzo wiele prostych, ale przez to łatwo zrozumiałych rycin, oraz kilkadziesiąt zdjęć. Zaangażowanie osobiste i entuzjazm Paula Singletona zaowocował przystąpieniem do tłumaczenia piątego, zmienionego i rozszerzonego wydania, a nie czwartego, i to w niewiele tygodni po jego ukazaniu się w Wielkiej Brytanii. Do końca kwietnia 2000 Paul Singleton przesyłał na moje ręce uzupełnienia oraz drobne poprawki do wydania angielskiego. Stąd w polskim wydaniu Bakterii są powołania na pozycje literaturowe (jedna z wielu zalet tej książki) z bieżącego roku i jest ono bardziej aktualne niż jego pierwowzór. Przekładu podjął się zespół pracowników Instytutu Mikrobiologii, Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego, który w większości we współpracy z PWN uczestniczył już w wydaniu, przekładzie lub unowocześnieniu pokaźnej IX

liczby książek z zakresu mikrobiologii. W tym miejscu gorące podziękowania należą się pani redaktor Krystynie Mostowik z PWN, która podjęła się trudnego zadania ujednolicenia terminologii i stylistyki tekstu tłumaczonego przez siedmiu mikrobiologów o często różnym temperamencie i sposobie pisania oraz Markowi Woźniakowi z Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego, który składając wspólne dzieło wielu osób nadał mu taki kształt, jaki trafia do rąk szacownego Czytelnika. Zdzisław Markiewicz

Przedmowa do wydania angielskiego Książka Bakterie omawia zagadnienia mikrobiologiczne odzwierciedlające współczesne osiągnięcia nauki i ujmuje je w sposób zintegrowany W piątym jej wydaniu znacznie poszerzono część dotyczącą fizjologii bakterii oraz roli tych organizmów w wybranych działach medycyny i biotechnologii. Wybierając materiał do książki, priorytet dano informacjom ważnym w różnych kontekstach. By nie być gołosłownym, nowa sekcja omawiająca odpowiedź na stres tlenowy szerzej zajmuje się regulacją genetyczną i również wyjaśnia mechanizm oporności na izoniazyd (lek stosowany przeciw prątkom). Z kolei, rozszerzony opis fuzji genowych odzwierciedla znaczenie tej techniki w bardzo różnych badaniach (np. cyklu komórkowego, tworzenia endospor). Wprowadzenie w tym wydaniu opisu sekrecji typu IV białek służy co najmniej trzem celom: poszerza wiedzę na temat mechanizmów transportowych (biologia); wyjaśnia podstawy prezentacji cząsteczek na powierzchni komórki (biotechnologia) oraz wyjaśnia tło patogenezy dyzenterii (medycyna). Tego typu podejście pozwoliło na większy zakres informacji. Postęp w nauce często jest odzwierciedleniem rozwoju w postaci nowych lub ulepszonych metod. W wydaniu tym opisano zatem liczne nowe udoskonalenia w technologii — a więc: nowe sondy DNA i RNA (sondy świetlne); fuzję genową z wykorzystaniem „białka fluoryzującego na zielono"; mutagenezę transpozonową; badania patogenezy in vivo (np. IVET, mutageneza typu STM); rozdział immunomagnetyczny oraz badanie oporności na antybiotyki, wykorzystujące techniki oparte na DNA. Technika PCR - odgrywająca bardzo dużą rolę we współczesnej metodologii — opisana jest krótko, a jednocześnie wyczerpująco. Podano również zasady technologii „DNA-chip". W tekście znajdują się pozycje literaturowe umożliwiające Czytelnikowi uzyskanie bardziej szczegółowych danych lub poszerzenie wiadomości. Pozycje te wydrukowano w nawiasach kwadratowych, a klucz do skrótów odpowiadających tytułom czasopism umieszczono na s. VIII. Różne firmy uprzejmie udostępniły informacje dotyczące swoich produktów: Abbot Diagnostics (USA); Boehringer Mannheim (RFN); Chiron Diagnostics (USA); Dynal (Norwegia); Gen-Probe (USA); Innogenetics (Belgia); Molecular Probes (USA); Oxoid (Wielka Brytania); Perkin Elmer (USA); Pharmacia (Szwecja) i Roche (Wielka Brytania). Wielu ludzi szczodrze udostępniło publikacje, zdjęcia lub materiał przygotowany do druku. Szczególne wdzięczny jestem następującym doktorom: Chantal de Chastellier, INSERM U411, Paryż; Rasika M. Harshey, Uniwersytet Teksasu, XI

Austin; Imrich Barak, Słowacka Akademia Nauk; William Margolin, Uniwersytet Teksasu, Houston oraz Lurdews Monteiro, Szpital Pellegrin, Bordeaux. Chciałbym złożyć podziękowania za niezwykle cenną pomoc ze strony Biblioteki Medycznej Uniwersytetu w Bristolu oraz SRIS przy Bibliotece Brytyjskiej w Londynie. Na koniec, jestem bardzo wdzięczny paniom Sally Beveridge i Lisie Tickner (Nauki Medyczne i Przyrodnicze) oraz innym członkom zespołu wydawnictwa John Wiley (Chichester), których zawodowe umiejętności bardzo przyczyniły się do publikacji tej książki. Paul Singleton

Clannaborough Barton, Devon Styczeń, 1999

ROZDZIAŁ

1

Bakterie - wprowadzenie

1. 1 Co to są bakterie? Bakterie są niewielkimi organizmami, które występują prawie wszędzie. Zazwyczaj nie zdajemy sobie sprawy z ich obecności, niekiedy jednak nie budzi ona wątpliwości — rany ulegają zakażeniom, mleko "kwaśnieje", mięso „psuje się". Bakterie są bardzo małe. O ich istnieniu nie wiedziano aż do momentu wynalezienia mikroskopu w XVII wieku. W większości przypadków bakteria jest pojedynczą, autonomiczną komórką. Ma ona budowę prokariotyczną, która znacznie odbiega od organizacji komórek eukariotycznych zwierząt i roślin. Niektóre z różnic przedstawiono w tabeli 1. 1 (cechy prokariotyczne zawarte w tabeli opisano dokładniej w dalszych rozdziałach). Eukarioty prawdopodobnie pojawiły się około 2-3, 5 miliarda lat temu [Doolittle i wsp. (1996) Science 271: 470-477]. Jedna z hipotez zakłada, że wywodzą się one ze związków symbiotycznych o podłożu energetycznym, do których doszło pomiędzy dwoma rodzajami komórek prokariotycznych: jednej z domeny Bacteria, a drugiej z domeny Archaea (patrz niżej) [hipoteza wodorowa: Martin i Muller (1998) Nature 392: 37-41]. Bakterie zalicza się do kategorii „mikroorganizmów". Grupa ta, oprócz bakterii, obejmuje kilka odmiennych typów organizmów — glony, grzyby, porosty, pierwotniaki, wirusy. Wynika stąd, że wszystkie bakterie są mikroorganizmami, lecz nie wszystkie mikroorganizmy są bakteriami. Powinno się także rozróżniać „mikrobiologię" (naukę o mikroorganizmach) i „bakteriologię" (naukę o bakteriach).

1. 1. 1 Notka na temat stosowania terminu „bakterie" Powszechnie stosowany termin „bakterie" często określa ogólnie „organizmy prokariotyczne" — i w tym znaczeniu odnosi się do wszystkich prokariotów. Badania molekularne wykazały jednak, że prokarioty można podzielić na dwie 1

zasadniczo różne grupy (domeny): domenę Bacteria i domenę Archaea [zagadnienie to zostało omówione w: Olsen, Woese i Overbeek (1994) JB 176: 1-6]. Z tego powodu, używany w książkach i czasopismach termin „bakterie" często określa specyficznie kilku, bądź wszystkich przedstawicieli domeny Bacteria. Czytelnik sam powinien próbować ocenić jego znaczenie, w zależności od kontekstu, w którym jest on użyty. W niniejszej książce „bakterie" to przedstawiciele domeny Bacteria. Opisane tu zostały prawie wyłącznie organizmy tej grupy. Domena Archaea (patrz rys. 1. 1) grupuje organizmy, które uprzednio zaklasyfikowano do królestwa Archaebacteria. Jest to mniejsza z dwóch grup prokariotów — chociaż nie wiemy, ile archeonów (a także bakterii) pozostaje nadal niezidentyfikowanych. Wiele gatunków Archaea żyje w ekstremalnych środowiskach, charakteryzujących się wysoką temperaturą, dużym zasoleniem itp. [dodatkowe informacje: Horikoshi (1998) Extremophiles (ISBN 0471 026182)]. Niektóre z nich występują jednak w środowiskach umiarkowanych, takich jak gleba [Bintrim i wsp. (1997) PNAS 94: 277-282], natomiast istnieją gatunki bakterii związane z warunkami ekstremalnymi. Różne aspekty biologii archeonów, odróżniające te organizmy od „prawdziwych bakterii", są omówione w dalszych rozdziałach.

2

1. 2 Dlaczego badamy bakterie? Ważnym powodem jest walka z chorobami. Bakterie wywołują kilka poważnych oraz wiele mniej groźnych chorób. Zapobieganie tym chorobom oraz ich zwalczanie zależy w znacznym stopniu od wysiłku bakteriologów specjalizujących się w medycynie, weterynarii oraz rolnictwie. Bakterie patogenne (tzn. wywołujące choroby) opisano w rozdziale 11. Bakterie patogenne stanowią jedynie niewielki procent wszystkich bakterii. Większość bakterii powoduje niewielkie szkody, bądź nie wyrządza ich wcale. Wiele z nich jest dla nas pożytecznych. Niektóre bakterie, na przykład, wytwarzają antybiotyki, które zrewolucjonizowały medycynę, podczas gdy inne dostarczają enzymów np. do „biologicznych" proszków do prania. Jeszcze inne wykorzystuje się jako „mikrobiologiczne insektycydy" — chroniące plony przed działaniem pewnych owadów — szkodników. Bakterie znalazły też zastosowanie do wytwarzania tworzyw sztucznych, które ulegają biodegradacji („Biopol" — sekcja 13. 7), a także ługowania metali z ubogich rud lub trudno poddających się procesom metalurgicznym ang. biomining — sekcja 13. 2). Być może wyda się to dziwne, ale bakterie wykorzystuje się powszechnie w przemyśle spożywczym (rozdz. 12). Gdy mowa o żywności, bakterie zwykle źle się kojarzą, przyczyniają się bowiem do jej psucia się oraz powodują zatrucia pokarmowe. Jednak niektóre rodzaje bakterii uczestniczą w produkcji żywności. Na przykład, przy wytwarzaniu masła, sera i jogurtu pewne bakterie dokonują przemiany cukru zawartego w mleku (laktozy) na kwas mlekowy. Bakterie wytwarzają także związki, które nadają tym produktom charakterystyczny smak. Ksantan, wytwarzany przez niektóre szczepy bakterii, jest wykorzystywany jako środek żelujący i zagęszczacz w przemyśle spożywczym. Również ocet winny jest produkowany z alkoholu (etanolu) dzięki działalności bakterii. Bakterie stosuje się także w produkcji kakao i kawy. 3

Niektóre z opisanych aktywności można zrozumieć dzięki poznaniu reakcji chemicznych (metabolizmu) przeprowadzanych przez komórki bakteryjne (rozdz. 5 i 6). W rozdziałach 12 i 13 przedstawiono sposoby działania kilku pożytecznych bakterii. Bakterie (i ich składniki) są bardzo ważne w medycynie, przemyśle i rolnictwie. Jednym z przykładów wykorzystania rekombinacyjnej technologii DNA jest produkcja takich czynników jak streptokinaza (stosowana np. w leczeniu zakrzepicy) (sekcja 8. 5. 10). Bakterie odgrywają znaczącą rolę w naturalnych cyklach krążenia materii (rozdz. 10), które ostatecznie są podstawą całego życia biologicznego. Bakterie glebowe wpływają na żyzność i strukturę gleby, co ma olbrzymie znaczenie dla rozwoju rolnictwa. Poznanie sposobów funkcjonowania tych organizmów pozwoli lepiej gospodarować gruntami i zbiorami. Będzie to w przyszłości konieczne, aby można było wyżywić naszą stale rosnącą populację. Z tego krótkiego wprowadzenia powinno być oczywiste, że im więcej wiemy o bakteriach, tym lepiej możemy ograniczyć ich szkodliwe działanie oraz pełniej wykorzystywać aktywność pożyteczną. Istnieje potencjalne zagrożenie wykorzystywania bakterii do produkcji broni biologicznej i zastosowania ich w teroryzmie. Kwestia ta została omówiona w kilku ostatnio opublikowanych książkach [np. Schweitzer i Dorsch (1998) Superterrorism, Kluwer Academic Publishers/Plenum].

1. 3 Klasyfikacja i nazewnictwo bakterii W jaki sposób odróżnia się jeden typ bakterii od drugiego i jak się je klasyfikuje? Bakterie mogą się różnić na przykład kształtem, rozmiarem, strukturą, aktywnością metaboliczną, rodzajem pobieranego pokarmu, formą wykorzystywanej energii, warunkami fizycznymi koniecznymi do wzrostu oraz sposobem barwienia z zastosowaniem niektórych barwników. Przedstawione wyżej cechy, powszechnie wykorzystywane do klasyfikacji (i identyfikacji) bakterii, mogą być z łatwością zbadane nawet w skromnie wyposażonym laboratorium. Podobnie jak w innych działach biologii, bakterie są klasyfikowane w kategoriach ułożonych hierarchicznie, np. rodziny, rodzaje, gatunki. Gatunki wystarczająco do siebie podobne są zaliczane do tego samego rodzaju, a rodzaje wykazujące pewien stopień podobieństwa są zgrupowane w rodzinie. Gatunek może być podzielony na dwa lub więcej szczepów, grupujących organizmy nieznacznie różniące się od siebie, lecz na podstawie definicji zaliczane do tego samego gatunku. Zasadniczo członkowie (powiedzmy) rodziny bakterii powinni mieć podobną strukturę, wykorzystywać tę samą formę energii i w podobny sposób reagować na pewne barwniki. Gatunki w takiej rodzinie mogą być łączone w rodzaje na podstawie różnic w aktywnościach metabolicznych, wymaganiach pokarmowych, warunkach wzrostu, a także, w pewnej mierze, kształtu i rozmiaru. Rodzaj klasyfikacji przedstawiony wyżej, chociaż użyteczny do wielu celów, nie zawsze odzwierciedla ewolucyjne pokrewieństwo między bakteriami. Od około dziesięciu lat prowadzi się badania mające na celu określenie najbardziej 4

podstawowych cech bakterii, które odzwierciedlałyby główne drogi ich ewolucji. Ten aspekt klasyfikacji przedstawiono w dalszych rozdziałach. Podobnie jak w przypadku zwierząt i roślin, każdemu gatunkowi bakterii nadano łacińską, dwuczłonową nazwę. Składa się ona z: 1) nazwy rodzaju, do którego należy dany organizm, i następującego po niej 2) „specyficznego epitetu", pełniącego funkcję etykiety dla każdego z gatunków. Na przykład Escherichia coli ma nazwę rodzaju (Escherichia) i określenie (coli). Według przyjętej konwencji, łacińska, dwuczłonowa nazwa jest drukowana kursywą lub, gdy pisana odręcznie, podkreślona pojedynczą linią. Nazwa rodzaju zawsze rozpoczyna się wielką literą, zaś nazwa epitetu — małą. Nazwę gatunku można przedstawić w niepełnej formie skracając nazwę rodzaju — np. Escherichia coli może być zapisana E. coli. Jednak, aby znaczenie skrótu było zrozumiałe, można go zastosować jedynie wtedy, gdy pełna nazwa rodzaju została wcześniej podana. (E. coli, często wspominana w tej książce, jest bardzo powszechnym organizmem eksperymentalnym — nazwa i pisownia tego rodzaju powinny więc być ogólnie znane). Nazwy rodzin i rzędów bakterii nie są pisane kursywą i wszystkie rozpoczynają się wielką literą. Nazwy te mają także standardowe końcówki. Nazwa rodziny zawsze ma końcówkę „-aceae" (np. Enterobacteriaceae), a rzędów — końcówkę „-ales" (np. Actinomycetales). Nazewnictwem bakterii formalnie rządzi wiele reguł, które zostały stworzone przez International Commitee of Systematic Bacteriology. Korzyści wynikające z międzynarodowej standaryzacji systemu nazewnictwa są oczywiste, lecz nie zawsze reguły te są stosowane w literaturze. Może to wynikać z nieznajomości reguł lub wprowadzonych nazw, bądź być przejawem braku akceptacji dla pewnych zmian taksonomicznych.

ROZDZIAŁ

2

Komórka bakteryjna

2. 1 Kształty, rozmiary i ułożenie komórek bakteryjnych 2. 1. 1 Kształt Komórki bakteryjne, zależnie od gatunku, mają bardzo zróżnicowany kształt. Okrągłe lub kuliste komórki każdego gatunku nazywane są ziarniakami, zaś formy wydłużone i pałeczkowate — pałeczkami lub laseczkami, zależnie od kształtu i właściwości. Ziarniaki nie zawsze są idealnie kuliste i nie wszystkie formy pałeczkowate mają dokładnie taki sam kształt. Na przykład niektóre ziarniaki mają kształt nerkowaty, a niektóre pałeczki o spiczastych końcach — wrzecionowaty. Wygięte pałeczki określa się jako przecinkowce. Występują także owoidalne komórki, o kształcie pośrednim między ziarniakami i pałeczkami (ang. coccobacilli). Są również dwa rodzaje komórek spiralnych: jedne dość sztywne — śrubowce (fot. 2. 1, w dolnej, lewej części), drugie giętkie — krętki (fot. 2. 4). Istnieją też tak zwane „bakterie kwadratowe" (o kształcie bardzo płaskich prostopadłościanów) i „pudełkowate" (tworzące wielościany o nieregularnych kształtach). W końcu są także promieniowce, których większość gatunków, podobnie jak grzyby, rośnie w postaci cienkich nitek, nazywanych strzępkami (rys. 2. 1n). Zgrupowane lub zmasowane strzępki nazywa się grzybnią. Różne kształty bakterii przedstawiono na rysunku 2. 1 i na fotografiach 2. 1. Wyniki badań prowadzonych nad ewolucją morfologii bakterii sugerują, że kształt ziarniaków pojawił się niezależnie w wielu przypadkach (w różnych liniach bakteryjnych), a gdy powstał, zazwyczaj przetrwał do dzisiejszego dnia. Natomiast krętki i pozbawione ścian mikoplazmy powstały tylko raz w procesie ewolucji bakterii. Ponadto, wydaje się prawdopodobne, że przedstawiciele domeny Bacteria wywodzą się od wspólnego przodka przypominającego pałeczkę, gdyż organizmy o takim właśnie kształcie mają najstarszy rodowód genealogiczny. Ziarniak może więc być zdegenerowaną formą pałeczki. Wydaje się, że stałe formy morfologiczne, widoczne u dzisiejszych bakterii, są odzwier-

6

ciedleniem zarówno biochemicznych i biofizycznych właściwości polimeru ściany komórkowej — peptydoglikanu (sekcje 2. 2. 9. 1, 2. 2. 9. 2; rys. 2. 7), jak i kontroli genetycznej związanej z jego syntezą [Siefert i Fox (1998) Microbiology 144: 2803-2808]. Chociaż kształt komórek danego gatunku bakterii jest zwykle w miarę jednolity, to jednak u kilku gatunków poszczególne komórki różnią się między sobą — czasami bardzo znacząco. Zjawisko to nazywa się pleomorfizmem.

8

Komórkowe formy L mają kształt nerkowaty lub kulisty. Są one wytwarzane spontanicznie przez kilka gatunków bakterii lub, u innych, pojawiają się po indukcji np. pod wpływem szoku termicznego lub innych rodzajów bodźców fizykochemicznych. Nazwa bakterii pochodzi od Lister Institute of Preventive Medicine w Londynie.

2. 1. 2 Wielkość Wielkość komórek bakteryjnych zwykle określa się w mikrometrach, μm (wcześniej nazywanych mikronami, μ); 1 μm = 0, 0001 mm. Najmniejsze bakterie mają około 0, 2 μm (np. komórki Chlamydia). Na drugim końcu skali znajdują się komórki Spirochaeta, które mają około 250 μm długości. Największą poznaną bakterią (600 μm) jest Epulopiscium fishelsoni, która zamieszkuje jelito ryby morskiej Acanthurus nigrofuscus [Angert, Clements i Pace (1993) Nature 326: 239-241]. Są to jednak krańcowe przypadki. Maksymalny rozmiar komórek większości gatunków wynosi od 1 do 10 μm. Należy zwróć uwagę, że wymiary najmniejszej bakterii znajdują się na granicy zdolności rozdzielczej mikroskopu świetlnego, co wynosi około 0, 2 μm.

2. 1. 3 Układy tworzone przez komórki bakteryjne Bakterie danego gatunku mogą być widoczne pod mikroskopem jako oddzielne, pojedyncze komórki lub w formie charakterystycznych zgrupowań. Zależnie od gatunku, komórki mogą występować w parach, w nieregularnych gronach, Fot. 2. 1 Niektóre kształty, wielkości i układy komórek bakteryjnych W lewej górnej części. Typowa komórka Helicobacter pylori (x 21 000), spiralnie skręcona pałeczka z przewodu pokarmowego człowieka. Bakteria ta ma trzy rzęski (rys. 2. 2, sekcja 2. 2. 14). Każda rzęska jest pokryta przedłużeniem komórkowej błony zewnętrznej (sekcja 2. 2. 9. 2). Wydaje się, że bulwiaste struktury widoczne na końcach rzęsek są miejscami, gdzie błona została „napompowana" — prawdopodobnie jest to wynik technik stosowanych w mikroskopii elektronowej. Każda rzęska ma około 3 μm długości. W górnej prawej części. Simonsiella — wielokomórkowa bakteria tworząca filamenty, która u około 25% ludzi wchodzi w skład mikroflory jamy ustnej. Preparat ten, barwiony czerwienią rutenową, uwidacznia filament o długości około 3, 5 μm, przylegający do powierzchni komórki nabłonka jamy ustnej. Centralnie. W zaplombowanym zębie: mikroorganizmy kolonizujące niewielką przestrzeń między plombą a ścianą zęba. Każda ze struktur przypominających kolbę kukurydzy jest złożona z dużej liczby małych ziarniaków (każdy o średnicy poniżej 1 μm) zgrupowanych na końcu strzępki — być może wskazuje to na układ symbiotyczny między dwoma rodzajami organizmów. W lewej dolnej części. Komórki Aquaspirillum peregrinum, ruchliwe bakterie wiążące azot, występujące w wodach słodkich. Komórka na prawo ma około 7, 3 μm długości i 0, 6 μm grubości. W dolnej prawej części. Pojedyncza komórka Escherichia coli: prosta pałeczka o zaokrąglonych końcach, mająca około 2 μm długości. Zdjęcie Helicobacter pylori dzięki uprzejmości dr. Alana Curry, PHLS, Withington Hospital, Manchester. Simonsiella dzięki uprzejmości dr Caroline Pankhurst, King's College, Londyn i Blackwell Scientific Publications Ltd. Bakterie ułożone w formie „kolby kukurydzy" dzięki uprzejmości prof. dr. Wolfganga Klimma, Medizinische Akademie Carl Gustav Carus, Drezno, Niemcy. Aquaspirillum peregrinum dzięki uprzejmości dr. Hisanori Konishi, Yamaguchi University School of Medicine, Ube, Japonia i Society for General Microbiology. Escherichia coli dzięki uprzejmości dr. Markusa B. Durrenbergera, Uniwerytet w Zurychu, Szwajcaria.

9

w łańcuchach, w regularnych pakietach złożonych z czterech, ośmiu lub większej liczby komórek, bądź w formie palisady tworzonej przez wiele, ułożonych w szeregu i przylegających do siebie, wydłużonych komórek. Gatunek Pelodictyon clathratiforme jest dość niezwykły, gdyż jego komórki tworzą trójwymiarowe sieci. Komórki wielu gatunków formują długie łańcuchy połączonych ze sobą komórek (ang. trichomes) (sekcja 2. 3. 1). Niektóre rodzaje układów komórek przedstawiono na rysunku. 2. 1. Te różnorodne układy nie są wynikiem agregacji pojedynczych komórek. Tworzą się one, gdyż komórki różnych gatunków dzielą się (rozmnażają) na różne sposoby, a dwie lub więcej komórek może pozostać połączonych ze sobą po procesie podziału komórkowego. W warunkach naturalnych pewne bakterie występują w stabilnych, wielogatunkowych zbiorowiskach komórek, nazywanych konsorcjami [patrz np. Pearl i Pickney (1996) Microbial Ecology 31: 225-247].

2. 2 Komórka bakteryjna — bliższe spojrzenie Czy wszystkie bakterie mają podobną strukturę? Otóż nie: komórki poszczególnych gatunków mogą różnić się znacznie zarówno strukturą, jak i składem chemicznym. Nie istnieje więc bakteria o „typowej" budowie. Rysunek 2. 2 przedstawia schematyczny, uogólniony szkic komórki bakteryjnej. Na rysunku tym widoczny jest chromosom komórki — zwykle kolista, silnie zwinięta struktura DNA (rozdz. 7), nazywana nukleoidem. Nukleoid jest zanurzony w cieczy o złożonej strukturze — cytoplazmie, która wypełnia wnętrze komórki. Cytoplazma zawiera rybosomy — niewielkie ciała uczestniczące w syntezie białek. Czasami występują także ziarnistości zapasowe, zawierające zapasy składników odżywczych itp. Nukleoid, cytoplazma, rybosomy i ziarnistości zapasowe są otoczone błoną cytoplazmatyczną (nazywaną także błoną komórkową lub błoną plazmatyczną). Najbardziej zewnętrzną warstwą, widoczną na rysunku 2. 2, jest sztywna (odporna mechanicznie) ściana komórkowa. Błonę cytoplazmatyczną i ścianę komórkową określa się łącznie jako osłony komórkowe (ang. cell envelope). Między błoną cytoplazmatyczną a ścianą komórkową znajduje się przestrzeń peryplazmatyczna. Rzęska jest cienką, włosowatą strukturą zbudowaną z białek. Umożliwia ona ruch komórki, tzn. jej przemieszczanie. Rzęska jest połączona z osłonami komórkowymi za pomocą wyspecjalizowanej struktury. Niektóre bakterie mają więcej niż jedną rzęskę. Są też takie, które mają ich dużo bądź nie mają ich wcale. Te oraz inne cechy komórki bakteryjnej są opisane w dalszych sekcjach. Czasami mówi się, że komórka bakteryjna ma „prostą" budowę, ponieważ nie zawiera wyspecjalizowanych struktur (jądro, mitochondrium) znajdowanych w komórkach eukariotycznych. Jednak, na poziomie molekularnym, bakterie stosują chytre i wyrafinowane strategie świadczące o wysokim stopniu ich strukturalnej i funkcjonalnej organizacji [Mayer (1993) FEMSMR 104: 327-346]. Na przykład w pewnych bakteriach (i niektórych archeonach) grupy enzymów proteolitycznych ulegają samoskładaniu, wytwarzając cylindryczne struktury (proteasomy), których wnętrze zawiera aktywne miejsca enzymatyczne. Proteasomy typu 20S są analogiczne do struktur eukariotycznych, w których zachodzi

10

degradacja białek. Białkowe substraty bakteryjnych proteasomów nie są znane. Mogą nimi być uszkodzone lub nieaktywne białka, które muszą być degradowane w sposób pozwalający na uniknięcie niekontrolowanej komórkowej proteolizy. Ponieważ wejście do proteasomu jest dość wąskie, jedynie niezwinięte białka mogą się doń przedostać. Zakotwiczenie, rozwijanie i translokacja białek (przeznaczonych do degradacji) — to prawdopodobnie procesy zależne od ATP (jako że proteasomy mają miejsce wiązania dla ATPaz) [Prokariotyczne proteasomy: De Mot i wsp. (1999) TIM 7: 88-92]. Przykładem wysokiego poziomu organizacji bakterii jest również obecność (krótkotrwała) szczątkowej formy cytoszkieletu, pojawiającej się podczas podziału komórki (fot. 3. 1). Rozmieszczenie białek w komórce bakteryjnej wydaje się obecnie dużo bardziej uporządkowane niż wcześniej przypuszczano [Shapiro i Losick (1997) Science 276: 712-718]. Podstawowym kryterium rozróżniania pewnych białek jest ich aktywność w określonych miejscach komórki bakteryjnej (sekcja. 4. 1). Staje się oczywiste, że białka biorące udział w różnych procesach fizjologicznych pojawiają się w komórce w odpowiednim czasie i miejscu, co wymaga udziału dynamicznych form regulacji [Dynamie spatial regulation in the bacterial cell: Shapiro i Losick (2000) Cell 89-98]. Chociaż z reguły bakterie to organizmy jednokomórkowe, jednak niektóre z nich są „stworzeniami socjalnymi". Ich zachowanie w zbiorowiskach może się różnić od zachowania pojedynczych, wyizolowanych komórek (sekcja 10. 1. 2). Ponadto pewne bakterie, tak jak organizmy wyższe, mogą podlegać rytmom dobowym (sekcja 7. 8. 12).

2. 2. 1 Nukleoid U większości bakterii chromosom jest kolistą cząsteczką kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) (opisany w rozdz. 7), jednak u niektórych gatunków jest on liniowy. DNA jest związany z pewnymi rodzajami białek, które biorą udział w jego zwijaniu. Silnie zwinięty DNA tworzy w komórce zwartą strukturę połączoną z błoną cytoplazmatyczną, tzw. nukleoid. U bakterii Escherichia coli 11

chromosom ma około 1, 3 mm długości. DNA jest więc upakowany w komórce o długości zaledwie kilku mikrometrów — pozostawiając w niej jeszcze wiele wolnego miejsca! Pojedyncza bakteria, zależnie od gatunku i warunków wzrostu, może zawierać więcej niż jedną kopię chromosomu (rozdz. 3). Na przykład u E. coli komórki szybko rosnące mają więcej chromosomów niż te, które rosną powoli. U niektórych gatunków wszystkie komórki mają zwykle kilka kopii chromosomu. [The bacterial nucleoid revisited (artykuł przeglądowy): Robinow i Kellenberg (1994) MR 58: 211-232. ]

2. 2. 2 Cytoplazma Cytoplazma jest wodnistą cieczą zawierającą rybosomy, składniki pokarmowe, jony, enzymy, produkty przemiany materii i różnorodne cząsteczki związane z syntezami, podtrzymywaniem funkcji komórkowych oraz metabolizmem energetycznym. W pewnych warunkach mogą występować ziarnistości zapasowe. Bakteryjna cytoplazma nie ma odpowiednika retikulum endoplazmatycznego komórek eukariotycznych. W wyjątkowych przypadkach, w cytoplazmie niektórych gatunków może występować kilka unikatowych i interesujących struktur. Na przykład Bacillus thuringiensis zawiera czasami kryształy, które są trujące dla wielu owadów. Bakterie te wykorzystuje się w rolnictwie jako biologiczne insektycydy (rozdz. 13). Inne bakterie (pasożyty pierwotniaków) zawierają tzw. ciałka R, będące ciasno zwiniętymi wstęgami zbudowanymi z elastycznego białka. U niektórych wodnych bakterii niewielkie cząsteczki magnetytu (Fe3CO4), nazywane magnetosomami [artykuł przeglądowy: Stolz (1993) JGM 139: 1663-1670], powodują odpowiednie ułożenie komórek w polu magnetycznym.

2. 2. 3 Rybosomy Rybosomy są niewielkimi, zaokrąglonymi strukturami, o wielkości około 0, 02 μm, zbudowanymi z RNA (polimer podobny do DNA — rozdz. 7) i białek. Występują one w dużej ilości w cytoplazmie (fot. 8. 1, w górnej części) i są miejscem syntezy białek (rozdz. 7). Rybosomy bakteryjne są mniejsze od eukariotycznych, ale są podobne (rozmiarami) do rybosomów chloroplastów roślin i glonów. Rybosomy charakteryzuje się zwykle nie na podstawie ich średnicy, lecz przez określenie szybkości sedymentacji w ultrawirówce. Wartość tę podaje się w jednostkach Svedberga (S); im jest ona większa, tym rybosomy sedymentują szybciej. Każdy rybosom bakteryjny (70S) zawiera jedną podjednostkę 50S i jedną 30S (tak, 50S+30S=70S!). Prawdopodobnie obie części rybosomu „trzymają się razem" dzięki wiązaniom wodorowym oraz oddziaływaniom jonowym i hydrofobowym. Ważną rolę w utrzymaniu tej struktury odgrywają jony magnezu. Rybosom w około 70% jest zbudowany z RNA (rybosomowy RNA = rRNA), od którego głównie zależy funkcjonowanie tego ciała. Podobnie jak rybosomy,

12

cząsteczki RNA również określa się w jednostkach Svedberga. Podjednostka 30S zawiera 16S rRNA, natomiast podjednostka 50S zawiera 5S i 23S rRNA. Analiza krystalograficzna rybosomowej podjednostki 30S Thermus thermophilus potwierdziła wcześniejsze przypuszczenia, że większa część regionu przylegającego do drugiej podjednostki (prawdopodobnie najważniejsza funkcjonalnie) zawiera RNA [Clemons i wsp. (1999) Nature 400: 833-840]. Rybosomowy RNA jest polimerem zawierającym cztery różne rodzaje podjednostek (nukleotydy). W danej cząsteczce rRNA nukleotydy są ułożone w określonej sekwencji kodującej. Sekwencje te wydają się pozostawać stosunkowo nie zmienione w ewolucyjnych odcinkach czasu. Odmienne sekwencje w pokrewnych organizmach mogą zatem świadczyć o ewolucyjnej rozbieżności między tymi organizmami. Na przykład, sekwencje cząsteczek 16S rRNA gatunków należących do tego samego rodzaju zwykle różnią się w co najmniej 1, 5%. W ostatnich latach cząsteczkę 16S rRNA wykorzystuje się do klasyfikacji bakterii w grupy, które, jak się uważa, odzwierciedlają ich naturalne (ewolucyjne) pokrewieństwo. Na przykład, różnica w 16S rRNA była główną przyczyną wydzielenia domen Archaea i Bacteria. Białka rybosomowe stanowią około 30% masy rybosomu. U E. coli podjednostka 30S ma 21 różnych rodzajów białek, podczas gdy podjednostka 50S ma ich ponad 30.

2. 2. 4 Ziarnistości zapasowe W pewnych warunkach wiele bakterii wytwarza polimery, które są odkładane w cytoplazmie w formie ziarnistości. Do związków tych zalicza się poli-β-hydroksymaślan i polifosforan. 2. 2. 4. 1 Poli-β-hydroksymaślan

Poli-β-hydroksymaślan (PHB, ang. poly-β-hydroxybutyrate) jest liniowym polimerem β-hydroksymaślanu (rys. 2. 3). U niektórych gatunków granule PHB gromadzą się wtedy, gdy wzrost komórki jest hamowany brakiem składników pokarmowych (innych niż źródło węgla). W komórkach tych PHB pełni rolę magazynu źródła węgla i energii (rozdz. 5 i 6), z którego można korzystać, gdy inne składniki odżywcze stają się bardziej dostępne. U bakterii glebowej Azotobacter beijerinckii w warunkach niedostatku tlenu gromadzi się PHB, który może stanowić do 80% masy komórki. W tym przypadku związek ten zastępuje tlen, jako źródło siły oksydacyjnej. Enzymy biorące udział w syntezie PHB (a także prawdopodobnie enzymy depolimeryzujące) występują na powierzchni ziarnistości. Każda dojrzała granula jest otoczona jednowarstwą o grubości < 4 nm, zawierającą głównie fazyny

13

(cząsteczki białek amfifilowych) i fosfolipidy. Regiony hydrofilowe białek i fosfolipidów są skierowane w stronę cytoplazmy [Mayer i Hoppert (1997) JBM 37: 45-52]. Ziarnistości PHB można wybarwić in situ (tzn. w komórce) barwnikami, takimi jak np. błękit Nilu A. PHB jest stosowany w produkcji tworzyw sztucznych, podlegających biodegradacji (Biopol: patrz sekcja 13. 7). U niektórych bakterii spotyka się inne polihydroksykwasy tłuszczowe (PHA, ang. poly-β-hydroksyalkanoates). Na przykład Pseudomonas oleovorans, gdy rośnie na pożywce z n-oktanem, wytwarza granule poli-β-hydroksyoktanianu. [Bacterial PHAs, including PHB and Biopol (wielu autorów, raport z sympozjum): FEMSMR (1992) 103: 91-376]. 2. 2. 4. 2 Polifosforan (polimetafosforan; wolutyna) Granule polifosforanu (ΡO 3 2~ -Ο-[ΡO 3 ~ ] n -ΡO 3 2~ ) występują u większości bakterii. Przyjmuje się, że stanowią one zapas fosforanu, zaś w niektórych przypadkach mogą być związane z metabolizmem energetycznym. Granule polifosforanu można wybarwić np. błękitem metylenowym, jednak uzyskują one inne zabarwienie niż kolor stosowanego barwnika. Zjawisko to nazywa się metachromacją, a granule są czasami nazywane ziarnistościami metachromatycznymi.

2. 2. 5 Wakuole gazowe Wakuole gazowe (patrz fot. 2. 2) występują jedynie u niektórych (typowo wodnych) prokariotów, np. u cyjanobakterii tworzących zakwity (takich jak Anabaena

flos-aquae) i u przedstawicieli Archaea (np. Halobacterium i Methanosarcina). Każda

wakuola składa się ze skupiska drobnych, długich, wypełnionych gazem pęcherzyków, o średnicy około 60-250 nm. Każdy z nich pokryty jest białkową ścianą. W niektórych przypadkach wakuole gazowe wytwarzane są konstytutywnie, w innych zaś powstają po indukcji.

14

Obecność wakuoli gazowych wpływa na gęstość pławną komórek unoszących się w wodzie. Jest to szczególnie ważne dla organizmów fotosyntetyzujących, gdyż dzięki temu zyskują one optymalny dostęp do światła. Gęstość pławna komórek może być regulowana przez co najmniej dwa mechanizmy. Niedobór światła stymuluje powstanie nowych pęcherzyków, a więc prowadzi do zwiększenia gęstości pławnej. Intensywne światło hamuje zaś wytwarzanie pęcherzyków, a te, które powstały wcześniej, ulegają „rozcieńczeniu" w trakcie kolejnych podziałów komórki. Drugi z wymienionych mechanizmów funkcjonuje np. u cyjanobakterii Oscillatoria agardhii.

2. 2. 6 Karboksysomy Karboksysomy to wewnątrzkomórkowe struktury błonowe o średnicy około 100-500 nm, które występują u wielu bakterii autotroficznych (tzn. wykorzystujących dwutlenek węgla jako główne źródło węgla). Pojedynczy karboksysom zawiera wiele kopii enzymu (RuBisCO) biorącego udział w „wiązaniu" atmosferycznego dwutlenku węgla (rys. 6. 1).

2. 2. 7 Tylakoidy Tylakoidy to spłaszczone, wewnątrzkomórkowe struktury błonowe, które spotyka się u większości cyjanobakterii. Występują one w bliskim sąsiedztwie ściany i ułożone są do niej równolegle. Błona tylakoidów różni się od struktury błony komórkowej, gdyż zawiera chlorofile. W tylakoidach zachodzi proces fotosyntezy (rozdz. 5). W niektórych przypadkach są one także miejscem aktywności oddechowej (rozdz. 5). Struktury podobne do tylakoidów (ale nazywane chlorosomami lub pęcherzykami Chlorobium) występują u bakterii z podrzędu Chlorobiineae. Pełnią one funkcje podobne jak tylakoidy.

2. 2. 8 Błona cytoplazmatyczna Błona cytoplazmatyczna jest dwuwarstwą o grubości 7-8 nm, zbudowaną z cząsteczek lipidów, w której zanurzone są, częściowo lub całkowicie, cząsteczki białka. Niektóre z tych białek przechodzą przez całą grubość ściany (rys. 2. 4). Cząsteczki lipidów ułożone są w taki sposób, że zarówno zewnętrzna, jak i wewnętrzna strona błony jest hydrofilowa, tzn. „lubiąca wodę" (fot. 2. 3, w lewej górnej części; wybarwiona na ciemno), podczas gdy wnętrze błony jest hydrofobowe. Lipidy są w większości fosfolipidami, z których u bakterii najpowszechniej występuje fosfatydyloglicerol (rys. 2. 5). Obecność innych rodzajów lipidów zależy głównie od tego, czy dana bakteria jest zaliczana do grupy bakterii gramdodatnich, czy gramujemnych — patrz sekcja 2. 2. 9. Fosfatydyloetanoloamina (rys. 2. 5) występuje powszechnie u bakterii gramujemnych. Fosfatydylocholina (lecytyna) (rys. 2. 5) obecna jest u niektórych bakterii gramujemnych, ale nie spo15

tyka się jej u bakterii gramdodatnich. W bakteryjnych błonach cytoplazmatycznych są także niewielkie ilości glikolipidów. Sfingolipidy występują rzadko, a sterole jedynie u bakterii z rodziny Mycoplasmataceae. U E. coli głównym lipidem jest fosfatydyloetanoloamina, lecz są również niewielkie ilości fosfatydyloglicerolu i difosfatydyloglicerolu (DPG, ang. diphosphatidylglicerol, kardiolipina). Błona nie jest sztywną strukturą. Cząsteczki lipidów, występujące w stanie płynnym, są utrzymywane razem dzięki działaniu sił międzycząsteczkowych. Białka błony cytoplazmatycznej zawierają różne enzymy — np. „białka wiążące penicylinę" (PBP, ang. penicillin binding proteins), które biorą udział w syntezie peptydoglikanu, tj. polimeru ściany komórkowej (sekcja 2. 2. 9. 1 i 6. 3. 3. 1). Białka PBP mogą stanowić część kompleksu białkowego błony cytoplaz-

Połączenia między glicerolo-3-fosforanem i dwiema cząsteczkami kwasów tłuszczowych (zawierającymi długie łańcuchy węglowe) to wiązania estrowe.

16

matycznej [Gittins, Phoenix i Pratt (1994) FEMSMR 13: 1-12]. Występują w niej także składniki systemów transportu (które przenoszą przez błonę jony i inne cząsteczki), a także elementy systemów przekształcających energię, takich jak ATPazy i łańcuchy transportu elektronów (rozdz. 5). U kilku bakterii stwierdzono obecność „białek sensorowych", które rozpoznają zmiany w środowisku zewnętrznym (patrz np. sekcje 2. 2. 15. 2 i 7. 8. 6). Błona cytoplazmatyczna nie jest swobodnie przepuszczalna dla większości cząsteczek. Niektóre małe, pozbawione ładunku lub hydrofobowe cząsteczki, np. O2, CO2, NH 3 (ale nie NH 4 + ) i woda, mogą przechodzić przez nią dość swobodnie. Inne cząsteczki (wliczając np. składniki pokarmowe) i jony muszą być transportowane przez błonę za pomocą specjalnych mechanizmów. Niektóre z nich wymagają dostarczenia energii przez komórkę. Dzięki tym mechanizmom komórka może gromadzić pewne związki w stężeniu znacznie przewyższającym ich zawartość w otaczającym środowisku. Przepuszczalność błony cytoplazmatycznej odgrywa ważną rolę w osmoregulacji (sekcja 3. 1. 8). W błonie cytoplazmatycznej występują kanały aktywowane naprężeniem mechanicznym, które zwiększają rozmiar porów w odpowiedzi na wzrost turgoru w komórce. Ułatwiają w ten sposób wydalanie wody i pewnych rozpuszczonych w niej substancji. Przykładem może być kanał MscL u E. coli [Mechanosensitive channels in E. coli: Sukharev i wsp. (1997) ARP 59: 633-657]. Kanały tego typu występują u wielu bakterii, gdzie pełnią ważną rolę w adaptacji do warunków stresu osmotycznego. Otwierają się one, gdy ciśnienie turgorowe w komórce zbliża się do poziomu zagrażającego jej życiu [Levina i wsp. (1999) EMBO Journal 18: 1730-1737]. Dodatkowo, w błonie cytoplazmatycznej wielu (nie wszystkich) bakterii występują molekularne szlaki, umożliwiające transbłonową dyfuzję wody i/lub niektórych innych obojętnych cząsteczek. Ten rodzaj transportu po raz pierwszy zaobserwowano w krwinkach czerwonych, zaś białko w nim uczestniczące nazwano akwaporyną-1 (Aqpl). Akwaporyna-1 jest spokrewniona z: integralnym białkiem soczewki oka ssaków, integralnym białkiem tonoplastu roślin i białkiem GlpF Escherichia coli. Białka te, zaliczane do „rodziny białek MIP" (ang. main intrinsic proteins), występują we wszystkich grupach organizmów żywych. Posiadają one bardzo konserwatywne regiony. W grupie tej wyróżnia się dwa typy białek: akwaporyny i transportery glicerolu. Szlak transbłonowy, który tworzą białka z rodziny MIP, nazywa się kanałem MIP. Kanał ten składa się z pojedynczego polipeptydu, który zapętla się, przechodząc wielkorotnie przez błonę cytoplazmatyczną. Struktura ta jest najwyraźniej stałą drogą transportu wody (kanał = akwaporyna) lub glicerolu (i/lub innych obojętnych cząsteczek) (kanał = transporter glicerolu). U Lactococcus lactis kanał MIP transportuje zarówno wodę, jak i glicerol. U E. coli akwaporyna AqpZ jest kodowana przez gen aqpZ, a transporter glicerolu kodowany jest przez gen glpF. Szczepy z mutacją w genie aqpZ rosną gorzej w środowisku o niskim ciśnieniu osmotycznym, natomiast szczepy dzikie reagują w tych warunkach wzmożoną ekspresją aqpZ. Sugeruje to, iż AqpZ pełni ważną rolę fizjologiczną. Kanały MIP spotyka się u niektórych przedstawi-

cieli Archaea (np. Archaeoglobus fulgidus, Methanobacterium thermoautotrophicum),

lecz nie u wszystkich (np. brak u Methanococcus jannaschii). Nie ma ich również

17

u niektórych bakterii (np. Chlamydia trachomatis, Helicobacter pylori, Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum) [Microbial MIP channels: Hohmann i wsp. (2000) TIM 8: 33-38]. Często uważa się, że funkcją lipidów błony cytoplazmatycznej jest współudział w procesie selektywnej przepuszczalności błony, zaś ważne funkcje, takie jak przekształcanie energii i odbieranie bodźców, są pełnione przez białka. Jednak fosfolipidy błony odgrywają też istotną rolę jako „chaperony" (lipidy opiekuńcze), tzn. cząsteczki, które pomagają w poprawnym zwijaniu specyficznych białek (sekcja 7. 6). Na przykład, fosfatydyloetanoloamina (rys. 2. 5) jest niezbędna do prawidłowego zwijania błonowego białka LacY (produkt genu lacY — sekcja 7. 8. 1. 1) u E. coli [Bogdanov i Dowhan (1998) EMBO Journal 17: 5255-5264]. 2. 2. 8. 1 Protoplasty

Komórka, po utracie ściany komórkowej (rys. 2. 2), tworzy strukturę zwaną protoplastem. Protoplast, chociaż ograniczony jedynie błoną cytoplazmatyczą, może przetrwać (w warunkach laboratoryjnych) i nadal przeprowadzać wiele procesów komórkowych. Jeśli protoplast znajdzie się w środowisku bardziej rozcieńczonym niż jego cytoplazma, woda zacznie przechodzić przez błonę (na drodze osmozy), co spowoduje napęcznienie i w końcu pęknięcie komórki. Zjawisko to nazywa się lizą osmotyczną. U bakterii delikatny protoplast jest zwykle chroniony przed lizą osmotyczną dzięki obecności sztywnej ściany komórkowej (sekcja 2. 2. 9). 2. 2. 8. 2 Błona cytoplazmatyczna u przedstawicieli Archaea

Błona cytoplazmatyczna tych organizmów zawiera lipidy, których nie spotyka się u przedstawicieli Bacteria. W lipidach bakteryjnych glicerol jest połączony z kwasami tłuszczowymi wiązaniami estrowymi (rys. 2. 5), natomiast w lipidach archeonów (zawierających np. izoprenoid lub hydroizoprenoid) występują wiązania eterowe. Niektóre z lipidów błony cytoplazmatycznej archeonów i bakterii są strukturalnymi analogami, np. lipidy dieterowe i diestrowe. Obydwa typy cząsteczek mają pojedyncze polarne końce. Jednak w niektórych przypadkach (np. tetra-O-di(bifitanylo)diglicerol) występują dwie, połączone wiązaniem eterowym, cząsteczki glicerolu — po jednej na każdym końcu cząsteczki lipidu. Cząsteczki takie, mające dwa polarne końce, mogą przechodzić przez całą grubość błony. Wydaje się prawdopodobne, że właściwości lipidów (i białek) archeonów odzwierciedlają ich zdolności adaptacyjne do życia w warunkach ekstremalnych.

2. 2. 9 Ściana komórkowa U większości bakterii sztywna, zewnętrzna warstwa — ściana komórkowa (rys. 2. 2) — chroni delikatny protoplast (sekcja 2. 2. 8. 1) przed uszkodzeniami mechanicznymi i lizą osmotyczną. Określa ona także kształt bakterii: wyizolowany protoplast jest kulisty, niezależnie od pierwotnego kształtu komórki. 18

Ponadto, działa jako „sito molekularne" — stanowi bowiem barierę przepuszczalności dla różnych cząsteczek, w tym niektórych antybiotyków. Ściany komórkowej nie można jednak uważać za zwykle „pudełko" zamykające żywą komórkę, gdyż odgrywa ona także aktywną rolę np. w regulacji transportu jonów i cząsteczek. Bakteryjna ściana komórkowa może znacznie się różnić grubością, strukturą i składem. Wyróżnia się jednak tylko dwa główne typy ściany, które są określane na podstawie sposobu barwienia pewnymi barwnikami. Komórki, mające dany typ ściany, po barwieniu fioletem krystalicznym i jodem zatrzymują barwnik, nawet po działaniu takich rozpuszczalników jak aceton lub etanol. U bakterii o innej strukturze ściany, w podobnych warunkach, barwnik zostaje usunięty (tzn. bakterie stają się bezbarwne). Ta ważna procedura barwienia została opracowana w latach 80. XIX wieku przez duńskiego naukowca Christiana Grama. Barwienie Grama opisano w sekcji 14. 9. 1. Bakterie, które zatrzymują barwnik (mające jeden typ ściany), nazywa się bakteriami gramdodatnimi, natomiast te, które mogą go utracić (mają drugi typ ściany), noszą miano bakterii gramujemnych. Kilka przykładów bakterii gramdodatnich i gramujemnych wymieniono w tabeli 2. 1. Obydwa rodzaje ścian komórkowych omówiono dalej. (W przypadku niektórych bakterii nie otrzymuje się jednoznacznego wyniku po zastosowaniu metody barwienia Grama: patrz sekcja 14. 9. 1, znaczenie określeń — bakterie typu gramdodatniego i typu gramujemnego).

2. 2. 9. 1 Ściana bakterii gramdodatnich ściana bakterii gramdodatnich jest stosunkowo gruba (około 30-100 nm) i, jak wynika z obserwacji w mikroskopie elektronowym, ma prostą, jednolitą strukturę. Ściana w 40-80% jest zbudowana ze sztywnego, złożonego polimeru — peptydoglikanu (zwanego także mureiną). Peptydoglikan składa się z liniowych łańcuchów heteropolisacharydów, połączonych poprzecznie krótkimi peptydami. Tworzą one trójwymiarową, podobną do sieci, strukturę (sakulus) (rys. 2. 7), która otacza protoplast. Sakulus jest zbudowany z wielu warstw peptydoglikanu. W czasie wzrostu nowy Peptydoglikan odkłada się na wewnętrznej 19

(cytoplazmatycznej) stronie ściany. W miarę wzrostu, warstwy te przesuwają się na zewnątrz w kierunku powierzchni komórki. Najstarsze z nich ulegają złuszczeniu i są stopniowo zrzucane. Do peptydoglikanu przyłączone są kowalencyjnie kwasy tejchojowe, zbudowane z polimerów fosforanów glicerolu lub rybitolu. U niektórych bakterii (np. Mycobacterium) ściana zawiera lipidy, podczas gdy u innych (np. szczepy Streptococcus) — węglowodany. Skład ściany komórkowej może się zmieniać w zależności od warunków wzrostu. Na przykład zawartość fosforanów w podłożu wpływa na ilość kwasów tejchojowych w ścianie komórkowej Bacillus. 2. 2. 9. 2 Ściana bakterii gramujemnych

W ścianie komórkowej bakterii gramujemnych (o grubości 20-30 nm) obserwowanej w mikroskopie elektronowym widoczne są wyraźne warstwy. Warstwa wewnętrzna (rys. 2. 6), najbliższa błonie cytoplazmatycznej, o grubości 15 nm, zawiera Peptydoglikan, który stanowi od 1 do 10% suchej masy komórki. Schemat przedstawiony na rysunku 2. 6 (który powstał m. in. dzięki mikroskopii elektronowej) sugeruje, że Peptydoglikan jest wielowarstwowy. Jednak badania szybkości metabolicznego obrotu peptydoglikanu w rosnących komórkach Escherichia coli wskazują, że ścianę boczną komórki stanowi jego pojedyncza warstwa [Park (1993) JB 175: 7-11], zaś wielowarstwowy Peptydoglikan może występować na jej biegunach. Skład chemiczny peptydoglikanu E. coli przedstawiono na rysunku 2. 7, a przebieg jego syntezy omówiono w sekcji 6. 3. 3. 1. Peptydoglikan jest scharakteryzowany w sekcji 3. 2. 1 i 5. 4. 7. Zewnętrzna warstwa ściany, zwana błoną zewnętrzną (rys. 2. 6, fot. 2. 3 w lewej, górnej części), jest w istocie, zawierającą białka, dwuwarstwą lipidową — przypomina więc błonę cytoplazmatyczną. Jednak w tym przypadku fosfolipidy tworzą jedynie wewnętrzną warstwę błony, zaś jej warstwę zewnętrzną stanowią makrocząsteczki nazywane lipopolisacharydami (LPS).

O-swoiste łańcuchy tworzą najbardziej zewnętrzną część ściany. Błona zewnętrzna — ważna bariera przepuszczalności np. dla pewnych antybiotyków. Połączona jest ona z peptydoglikanem poprzez lipoproteiny Brauna. Po lewej stronie błony zewnętrznej widoczna jest poryna (sekcja 2. 2. 9. 2).

20

Lipid A (rys. 2. 6) jest glikolipidem. U E. coli składa się on z ufosforylowanego disacharydu (dwie cząsteczki glukozoaminy) niosącego sześć lipofilowych łańcuchów acylowych. Cztery z nich są związane z pojedynczą cząsteczką glukozoaminy, do której także przyłączony jest oligosacharyd rdzeniowy. Wszystkie łańcuchy acylowe są skierowane do lipofilowego wnętrza błony zewnętrznej. Prekursorem lipidu A, wykorzystywanym również w syntezie peptydoglikanu, jest UDP-N-acetyloglukozoamina (UDP-GlcNAc) (sekcja 6. 3. 3. 1). W biosyntezie lipidu A UDP-GlcNAc jest początkowo monoacylowana przez enzym, kodowany przez gen lpxΑ. Następnie pod wpływem deacetylazy (enzym zawierający cynk i kodowany przez lpxC) zachodzi deacetylacja, po której następuje wieloetapowy proces prowadzący do powstania heksaacylowanego disacharydu (lipid A). Szczegóły syntezy lipidu A przedstawili Wyckoff, Raetz i Jackman [(1998) TIM 6: 154-159]. Oligosacharyd rdzeniowy (np. u E. coli i pokrewnych jej bakterii) zawiera cząsteczki glukozy i galaktozy, a także podstawione cząsteczki innych cukrów, m. in. fosforan heptozy. Łańcuchy O-swoiste, które tworzą najbardziej zewnętrzną część ściany komórkowej, składają się z liniowych lub rozgałęzionych łańcuchów podjednostek wielocukrowych. Skład chemiczny łańcuchów O-swoistych może się różnić u poszczególnych szczepów, co wykorzystuje się w serologicznej identyfikacji szczepów bakterii (sekcja 16. 1. 5. 1). (Zwróć uwagę, że niektóre bakterie, np. Neisseria meningitidis, nie mają typowego dla E. coli O-swoistego łańcucha. Struktura analogiczna do LPS nazywana jest lipooligosacharydem — LOS). [LOS: Kahler i Stephens (1998) Critical Reviews in Microbiology 24: 281-334]. Około połowy masy błony zewnętrznej stanowią białka. Na przykład u E. coli i pokrewnych jej bakterii występują tysiące cząsteczek lipoproteiny Brauna (rys. 2. 6). Każda z nich jest połączona kowalencyjnie z leżącym niżej peptydoglikanem. W błonie występują także enzymy, białka związane ze specyficznym mechanizmem pobierania („transportu") i poryny. Cząsteczki poryny, występujące w zgrupowaniach po trzy (czasami po dwie), przechodzą przez błonę, tworząc wypełnione wodą „pory". Obecność takich porów umożliwia niektórym jonom oraz cząsteczkom przechodzenie przez błonę zewnętrzną. Poryny są połączone z peptydoglikanem za pomocą mostków jonowych. U E. coli i pokrewnych jej bakterii błona zewnętrzna zawiera kilka różnych typów poryn, które nazwane są np. OmpC, OmpF itd. (Omp, białko błony zewnętrznej; ang. outer membrane protein). Względne proporcje poszczególnych poryn mogą się zmieniać w zależności od środowiska, w którym występuje komórka (patrz np. sekcja 7. 8. 6). Poszczególne elementy błony zewnętrznej utrzymywane są razem m. in. dzięki oddziaływaniom jonowym. Przylegający do błony oligosacharyd rdze2+ 2+ niowy jest z nią połączony kationami dwuwartościowymi, głównie Mg i Ca . Usunięcie tych kationów za pomocą chelatorów jonów prowadzi do rozerwania błony zewnętrznej. Lipid A jest połączony hydrofobowo z resztami kwasów tłuszczowych fosfolipidów. Niektóre białka wydają się połączone z oligosacharydem rdzeniowym. Błona zewnętrzna jest zwykle przepuszczalna dla niewielkich jonów i cząsteczek hydrofilowych, jest jednak znacznie mniej przepuszczalna (lub nieprzepuszczalna) dla cząsteczek hydrofobowych lub amfipatycznych. Jej przepuszczal21

22

ność może się zwiększać (co jest niekorzystne dla bakterii) w obecności pewnych antybiotyków, np. polimiksyny (sekcja 15. 4. 5), lub czynników hamujących biosyntezę lipidu A (sekcja 15. 4. 11). 2. 2. 9. 3 Ściana komórkowa u przedstawicieli Archaea

Ściana niektórych przedstawicieli tej grupy organizmów (np. gatunków Halobacterium, Methanococcus i Thermoproteus) składa się głównie, lub wyłącznie, z tak zwanej warstwy S (sekcja 2. 2. 12), która jest ściśle związana z błoną cytoplazmatyczną. U np. Methanobacter ściana zawiera pseudomureinę — podobny do peptydoglikanu polimer, w którym łańcuchy szkieletu zawierają N-acetylo-D-glukozoaminę (i/lub N-acetylo-D-galaktozoaminę, zależnie od gatunku) oraz kwas N-acetylo-L-talozoaminouronowy. Pseudomureina, w przeciwieństwie do peptydoglikanu, nie jest przecinana przez enzym lizozym. 2. 2. 9. 4 Warstwy leżące po zewnętrznej stronie ściany komórkowej

U niektórych bakterii występuje jedna bądź kilka warstw leżących po zewnętrznej stronie ściany. Zalicza się do nich np. otoczki, warstwy S i białka Μ (patrz dalej). 2. 2. 9. 5 Bakterie pozbawione ściany

Komórki prokariotyczne pozbawione ściany komórkowej spotyka się u przedstawicieli domeny Bacteria (np. Mycoplasma) i Archaea (np. Thermoplasma). Fot. 2. 3 Struktury osłon komórkowych i struktury powierzchniowe niektórych bakterii gramujemnych W lewej górnej części. Błona zewnętrzna (om), błona cytoplazmatyczna (cm) i mikrootoczka (mc) na cienkim skrawku Bacteroides fragilis (x52 000). Mikrootoczka przedstawiona na mikrografii elektronowej nie byłaby widoczna w mikroskopii świetlnej. W prawej górnej części. Osłony bakteryjne na cienkim skrawku komórki E. coli po plazmolizie (x10 000). (Plazmoliza — usunięcie wody z komórki powoduje „odstawanie" błony cytoplazmatycznej od błony zewnętrznej). Widoczne są szczeliny powstałe między błoną zewnętrzną (grot strzałki) a leżącą niżej błoną cytoplazmatyczną. W pobliżu centralnej części zdjęcia widoczne są miejscowe połączenia błon: zewnętrznej i cytoplazmatycznej. Centralnie, w lewej części. Dwie komórki B. Fragilis posiadające otoczki, uwidocznione w mikroskopii elektronowej (x28000). Makrootoczki barwiono czerwienią rutenową. Centralnie, w prawej części. Komórki B. fragilis w mikroskopii świetlnej (ok. x 1000) (z tej samej hodowli przygotowano preparat do mikroskopii elektronowej — patrz zdjęcie obok). W tym przypadku tło zostało wybarwione na ciemno przez eozynę i fuksynę karbolową („barwienie negatywowe")- Każda otoczka jest widoczna jako jasne „halo" otaczające komórkę. Komórka w górnej części zdjęcia jest w trakcie podziału. W lewej dolnej części. Pilus kodowany przez plazmid F (będący wyspecjalizowaną, włosowatą strukturą) wyrastający z powierzchni komórki E. coli (x 150 000). Sam pilus, o średnicy poniżej 10 nm, jest prawie niewidoczny. Aby wykazać jego obecność, „wyznakowano" go pewnym, specyficznym dla tego pilusa, bakteriofagiem (MS2). W tym przypadku do pilusa zostały przyłączone trzy cząstki wirusa MS2 (każdy o średnicy około 25 nm), które oznaczono grotami strzałek. W prawej dolnej części. Fragment ściany E. coli, wybarwionej, aby uwidocznić dużą liczbę fimbrii (oznaczone małymi grotami strzałek) (x54 000). Duże groty strzałek wskazują fragmenty rzęski. Zdjęcia B. fragilis dzięki uprzejmości dr Sheili Patrick z Queen's University of Belfast. Miejsca połączenia błon i pilus plazmidu F E. coli dzięki uprzejmości dr. Manfreda E. Bayera, Fox Chase Cancer Center, Filadelfia. Fimbrie E. coli dzięki uprzejmości dr Ann Field, Public Health Laboratory Service, Londyn.

23

24

2. 2. 10 Połączenia międzybłonowe (u bakterii gramujemnych) Połączenia międzybłonowe to miejscowe fuzje pomiędzy błonami: zewnętrzną i cytoplazmatyczną (fot. 2. 3: w prawej, górnej części), które obserwuje się w warunkach plazmolizy. Ich obecność jest ważnym przyczynkiem do rozważań o fizjologii bakterii [Woldringh (1994) MM 14: 597-607].

2. 2. 11 Otoczki i warstwy śluzowe Wiele bakterii wytwarza substancję pokrywającą zewnętrzną powierzchnię ściany komórkowej. Warstwa ta nazywana jest otoczką. Μakrootoczka, zwana też „prawdziwą" otoczką, jest na tyle gruba, iż można ją zobaczyć (stosując odpowiednią preparatykę) w zwykłym mikroskopie świetlnym (ponad -0, 2 μm grubości). Występują też mikrootoczki, których obecność może być stwierdzona jedynie po zastosowaniu mikroskopii elektronowej lub np. technik serologiczRys. 2. 7 Peptydoglikan. Przedstawione struktury są typowe dla Escherichia coli. Podobne rodzaje peptydoglikanu występują u wielu innych bakterii gramujemnych (a) Trójwymiarowa, przypominająca sieć cząsteczka peptydoglikanu: łańcuchy szkieletu, z ułożonymi na przemian cząsteczkami N-acetyloglukozoaminy (G) i kwasu N-acetylomuraminowego (M), utrzymywane są razem dzięki krótkim peptydom łączącym reszty kwasu N-acetylomuraminowego. Każdy mostek peptydowy, przedstawiony na schemacie, łączy dany łańcuch z innym łańcuchem szkieletu. Wyniki badań dowodzą, że są także mostki peptydowe, które łączą razem trzy (lub nawet cztery) łańcuchy szkieletu. Różne typy mostków peptydowych występujących w E. coli opisano niżej w (b). (b) Struktura mostków peptydowych łączących sąsiadujące ze sobą łańcuchy szkieletu. (Numery pisane kursywą oznaczają poszczególne atomy węgla w cząsteczce). Do każdej reszty kwasu N-acetylomuraminowego dołączony jest krótki peptyd boczny — w tym przypadku tetrapeptyd: L-alanina kwas D-glutaminowy - kwas mezo-diaminopimelinowy (mezo-DAP) - D-alanina (obramowane liniami przerywanymi). W tym rodzaju mostków peptydowych D-alanina jednego peptydu bocznego związana jest kowalencyjnie z grupą ε-aminowej mezo-DAP, występującego w innym peptydzie bocznym. Mostek taki, składający się z dwóch peptydów bocznych (każdy z nich zawiera cztery reszty aminokwasowe), określa się jako dimer tetra-tetra (lub tetra-tetra). Inny rodzaj mostka peptydowego — dimer tetra-tri (tetra-tri), powstaje po połączeniu jednego tetrapeptydu i jednego tripeptydu. Trimerowy mostek peptydowy powstaje, gdy nastąpi połączenie trzech łańcuchów szkieletu. W tym przypadku peptyd boczny, na trzecim łańcuchu szkieletu, tworzy wiązanie kowalencyjne z wolną grupą ε-aminową (patrz schemat) mostka dimerowego. Poznanie różnych typów mostków peptydowych jest niezbędne do zrozumienia modelu syntezy peptydoglikanu (sekcja 3. 2. 1). Enzym lizozym hydrolizuje wiązanie β-l, 4-glikozydowe w łańcuchu szkieletu (patrz schemat), co osłabia strukturę ściany komórkowej. Budowa peptydoglikanu u bakterii gramdodatnich znacznie się różni od struktury przedstawionej wyżej. Na przykład w łańcuchach szkieletu Mycobacterium występują reszty kwasu N-glikolilomuraminowego. Odmienne są również rodzaje i usytuowanie wiązań poprzecznych. W peptydoglikanie Staphylococcus aureus nie wszystkie reszty kwasu muraminowego są acetylowane, a peptydy boczne połączone są mostkami penta- lub heksaglicynowymi. Mostki te mogą być trawione enzymem lizostafiną, co powoduje lizę całej komórki. Synteza peptydoglikanu jest zależna od enzymatycznych aktywności białek wiążących penicylinę (PBP, ang. penicil binding proteins), które występują w obrębie osłon komórkowych (sekcja 2. 2. 8 i 6. 3. 3. 1). PBP mogą być inaktywowane przez penicylinę oraz pokrewne antybiotyki β-laktamowe (sekcja 15. 4. 1).

25

nych (fot. 2. 3: centralnie i w lewej górnej części). Warstwa śluzowa jest wodnistą wydzieliną, która swobodnie przylega do ściany komórkowej. Często rozprzestrzenia się ona do podłoża, gdy komórka rośnie w środowisku płynnym. Otoczki są zbudowane głównie z wody. Składnikiem organicznym jest zazwyczaj homopolisacharyd (np. celuloza, dekstran) lub heteropolisacharyd (np. alginian, kwas kolanowy, kwas hialuronowy). W szczepach niektórych bakterii, np. Bacillus anthracis, otoczka jest homopolimerem kwasu D-glutaminowego. Gatunki Xanthobacter mogą wywarzać otoczkę z α-poliglutaminy wraz z obfitym, wielocukrowym śluzem. Otoczki mogą być połączone ze ścianą wiązaniami jonowymi i/lub kowalencyjnymi. Otoczki pełnią różne funkcje. Mogą one na przykład: chronić przed wysychaniem, stanowić barierę przepuszczalności dla toksycznych jonów metali, zapobiegać infekcji przez bakteriofagi (rozdz. 9), stanowić rezerwę pokarmową, umożliwiać adhezję (ważne np. dla bakterii jamy ustnej tworzących płytkę nazębną) i chronić przed fagocytozą. U bakterii patogennych tworzenie otoczki jest często skorelowane z patogennością (tzn. zdolnością do wywoływania choroby). Tak więc w przypadku bakterii chorobotwórczej mającej zwykle otoczkę, jej szczepy bezotoczkowe są zazwyczaj niepatogenne (patrz także sekcje 11. 3. 2. 1 i 11. 5. 1). Niektóre z wydzielanych polisacharydów wykorzystuje się w przemyśle. Na przykład heteropolisacharyd ksantan (wytwarzany przez szczepy Xanthomonas campestris) jest stosowany w przemyśle spożywczym jako środek żelujący, stabilizator żelu, zagęszczacz i inhibitor krystalizacji.

2. 2. 12 Warstwy S Warstwa S jest zazwyczaj najbardziej zewnętrzną strukturą komórki. Składa się ona z powtarzających się cząsteczek białka lub glikoprotein ułożonych w formie kwadratów lub sześciokątów. Warstwa S, gdy występuje, zwykle otacza ścianę komórkową (np. u bakterii gramujemnych okrywa błonę zewnętrzną). U niektórych przedstawicieli Archaea warstwa S jest ścianą komórkową, tzn. okrywa błonę cytoplazmatyczną. Podwójna warstwa S występuje np. w szczepach Aquaspirillum i Bacillus.

2. 2. 13 Białka Μ Cząsteczki białka Μ tworzą cienką warstwę otaczającą ścianę komórkową patogena Streptococcus pyogenes (paciorkowiec z grupy A Lancefield — patrz Streptococcus — w Aneksie), który wywołuje np. (anginę, szkarlatynę, ropnie). Białko to jest czynnikiem wirulencji, gdyż czyni bakterię mniej podatną na fagocytozę i często działa jako adhezyna (sekcja 11. 5. 6). Skład białka Μ różni się nieznacznie w poszczególnych szczepach S. pyogenes, co umożliwia zastosowanie testów serologicznych do ich klasyfikacji (sekcja 16. 1. 5. 1). Wyróżnia się około 60 grup serologicznych (serogrupy Griffitha), a wszystkie szczepy w danej grupie mają podobny rodzaj białka M. Jest to przykład typowania (sekcja 16. 1. 5) pomocnego w badaniach epidemiologicznych.

26

2. 2. 14 Rzęski, fimbrie i pili U wielu bakterii występują drobne, włosowate włókna białkowe odchodzące od powierzchni komórki. Struktury te można podzielić na trzy główne typy: rzęski, fimbrie i pili. 2. 2. 14. 1 Rzęski

Rzęski umożliwiają bakterii poruszanie się w płynnym środowisku (sekcja 2. 2. 15). Bakteria, zależnie od gatunku, może mieć jedną rzęskę (urzęsienie monotrychalne), dwie rzęski — po jednej na każdym biegunie (urzęsienie amfitrychalne), pęczek rzęsek na jednym bądź obu biegunach (monopolarne lub bipolarne urzęsienie lofotrychalne), lub wiele rzęsek, na całej powierzchni komórki (urzęsienie perytrychalne) (patrz rys. 2. 1). Każda rzęska składa się z włókna, haka i ciałka podstawowego (rys. 2. 2). Włókno, o rozmiarach 5-20x0, 02 μm, ma strukturę helikalną. Zbudowane jest ono z jedenastu podjednostek białkowych, ułożonych podobnie jak włókna liny. Wzdłuż osi włókna biegnie kanał o średnicy około 70 A. U niektórych gatunków, np. z rodzaju Pseudomonas i Vibrio oraz u Helicobacter pylori, włókno otoczone jest pochewką, będącą przedłużeniem błony zewnętrznej (patrz fot. 2. 1, w górnej lewej części). Hak jest pustą, giętką strukturą białkową (rys. 2. 8). Po zastosowaniu specjalnej metody barwienia, włókna rzęski mogą być widoczne w mikroskopie świetlnym. [Proste barwienie rzęsek: Heimbrook i wsp. (1989) JCM 27: 2612-2615]. Każda rzęska bierze początek w ciałku podstawowym (=motor rzęski), które usytuowane jest w osłonach komórkowych. Stanowi ono złożony mechanizm przekształcający energię. Motor składa się z wielu struktur o kształcie pierścieni, ułożonych osiowo (wraz z innymi składnikami) na pałeczkowatym rdzeniu w błonie cytoplazmatycznej (rys. 2. 8). Szczegóły budowy (np. liczba pierścieni) różnią się w zależności od gatunku. Rzęska obraca się wokół własnej osi. Ruch rotacyjny zademonstrowano poprzez zakotwiczenie wolnego końca rzęski na szklanej powierzchni, co umożliwiło zaobserwowanie rotacji całej komórki. Obecnie uważa się, że (u np. E. coli i innych bakterii jelitowych) pierścień MS wraz z pierścieniem C obraca się, powodując rotację rdzenia, a więc i włókna. Przyjmuje się, że zakotwiczone w osłonach komórkowych pierścienie L i Ρ tworzą „tuleję" dla wirującego rdzenia (rys. 2. 8). Ruch rzęski wymaga dostarczenia energii w formie gradientu jonów w poprzek błony cytoplazmatycznej (rozdz. 5). Powstawanie rzęski. Przez kanał w pierścieniu MS, zakotwiczony w błonie cytoplazmatycznej, transportowane są, w określonej kolejności, składniki rzęski — najpierw podjednostki tworzące rurkowaty rdzeń, potem hak, i w końcu włókno. Podjednostki białka (flagelliny), tworzące wydłużający się filament, przechodzą przez jego kanał osiowy, a następnie, kolejno odkładane są na jego rosnącym końcu. Elementy składowe pierścieni L i P, w przeciwieństwie do innych białek rzęski, mają sekwencje sygnałowe (sekcja 7. 6). Wydaje się, że mogą one być trans27

(a) Wcześniejszy model. (b) Obecny model [oparty na np. Kihara i wsp. (1996) JB 178: 4582-4589; Katayama i wsp. (1996) JMB 255: 458-475]. Pierścienie L i Ρ są związane, odpowiednio, z błoną zewnętrzną i warstwą peptydoglikanu. Pierścienie S i Μ są teraz widoczne jako pojedyncza struktura — pierścień MS, występujący w błonie cytoplazmatycznej. Zawiera on cząsteczki białka FliF (tab. 7. 3). Pierścień C („przełącznik"), przyłączony do pierścienia MS, zawiera białka FliG, FliM i FliN (tab. 7. 3). Białko FliG podtrzymuje pierścień MS. Białka FliM i FliN są składnikami obwodowymi. Białka MotA i MotB (elementy stacjonarne) otaczają pierścień MS. MotB jest przyłączone do peptydoglikanu. Pierścienie L, P, MS i C, rdzeń i białka MotA i MotB stanowią motor rzęski (= ciałko podstawowe). Wytwarzanie naprężeń (rotacja rzęski) następuje w wyniku interakcji zachodzących między FliG i MotA, dzięki energii powstałej w trakcie przepływu protonów przez motor. Pierścień C odgrywa także rolę w chemotaksji (rys. 7. 13). Katayama i wsp. (cytowany wyżej) wspomina o prawdopodobnym „aparacie eksportu" w pierścieniu C (linia przerywana).

portowane w poprzek błony cytoplazmatycznej w podstawowym szlaku sekrecyjnym (sekcja 5. 4. 3), a nie przez pierścień MS. Nie ulega wątpliwości, że komórka nie może tolerować istnienia otwartego kanału łączącego cytoplazmę (gdzie powstają składniki rzęski) ze środowiskiem zewnętrznym. Dlatego też tak zwany aparat eksportu musi pełnić funkcje „portiera", pozwalającego przechodzić przez pierścień MS jedynie odpowiednim 28

białkom. „Aparat eksportu" i pierścień C powstają wraz z pierścieniem MS lub wkrótce po jego pojawieniu się. Kontrolę genetyczną procesu powstawania rzęski opisano w sekcji 7. 8. 2. 7. Rzęski krętków. Krętki są bakteriami gramujemnymi, które mają unikatową strukturę. Ich rzęski występują na obu biegunach komórki, między warstwą peptydoglikanu i błoną zewnętrzną. W niektórych przypadkach zachodzą one na siebie w centralnej części komórki. Są to tzw. rzęski peryplazmatyczne. Ich liczba różni się w zależności od gatunku. Na przykład Leptonema illini ma dwie rzęski ułożone biegunowo, zaś Borrelia burgdorferi ma ich około siedmiu, wyrastających z każdego bieguna komórki. Rzęska peryplazmatyczna wydaje się obracać w sposób charakterystyczny dla innych rzęsek [Charon i wsp. (1992) JB 174: 832-840]. Peryplazmatyczne rzęski Treponema pallidum (bakteria wywołująca kiłę) przedstawiono na fotografiach 2. 4. Rzęska u przedstawicieli Archaea. Rzęska archeonów różni się znacznie od rzęski bakteryjnej składem, strukturą i sposobem powstawania. Na przykład flagellina archeonów jest glikozylowana, a włókno jest zwykle znacznie cieńsze od włókien bakteryjnych. Ponadto flagellina archeonów zawiera sekwencję sygnałową (sekcja 7. 6), co sugeruje, iż białko to (odmiennie niż flagelliny bakterii, które przechodzą przez puste struktury powstającej rzęski) jest transportowane do błony. Cecha ta oraz widoczne podobieństwa pomiędzy flagellinami archeonów i 4 typem fimbrii sugerują, że rzęska archeonów rośnie od podstawy, a więc inaczej niż bakteryjna [Jarrel, Bayley i Kostyukova (1996) JB 178: 5057-5064].

2. 2. 14. 2 Fimbrie Średnica fimbrii wynosi zwykle 2-10 nm, a długość od 0, 1 μm do kilku mikrometrów. Fimbrie występują na całej powierzchni komórki (fot. 2. 3, w prawej dolnej części), bądź jedynie w określonych jej miejscach. Zbudowane są głównie z białka o identycznych podjednostkach, w skład którego wchodzą również, często wyspecjalizowane, podjednostki innego typu. Białka fimbrii zawierają duże ilości aminokwasów niepolarnych, dzięki czemu komórka staje się bardziej hydrofobowa. Fimbrie występują powszechnie u bakterii i mogą być kodowane przez chromosom lub plazmid — rozdział 7. U bakterii gramujemnych wyrastają one z błony zewnętrznej. Czasami fimbrie mylnie nazywane są pilusami (patrz sekcja 2. 2. 14. 3). Obecność fimbrii umożliwia wielu bakteriom adhezję międzykomórkową. W przypadku bakterii patogennej może to ułatwiać proces infekcji. Na przykład u Neisseria spp. na końcach fimbrii występuje specjalne białko adhezyna, które ułatwia związanie tych patogenów z komórkami gospodarza. Dla wielu patogenów fimbrie są ważnym czynnikiem wirulencji (sekcja 11. 5) (Adhezję u patogenów omówiono w sekcji 11. 2. 1). Bakterie mające dany typ fimbrii adhezyjnych mogą być wykryte w laboratorium dzięki zdolności do hemaglutynacji, czyli zbijania erytrocytów (krwinki czerwone) w widoczne skupiska. Jeśli obecność D-mannozy hamuje ten proces, mówimy wtedy o „mannozowrażliwej" hemaglutynacji (MSHA, ang. mannosesensitive haemagglutination). Inne typy fimbrii powodują „mannozooporną"

29

hemaglutynację (MRHA, ang. mannose-resistant haemaglutination), na którą cukier ten nie ma żadnego wpływu. Niektóre przykłady fimbrii wymieniono w tabeli 2. 2. Pojedyncza komórka może mieć kilka ich rodzajów. Synteza pewnych fimbrii (np. fimbrii typu 1 30

u E. coli i typu b u Haemophilus influenzae) bywa okresowo wyłączana przez komórkę — nie wszystkie komórki mają wtedy taką fimbrię. U np. Neisseria gonorrhoeae występuje mechanizm genetyczny powodujący cykliczne zmiany składu białkowych podjednostek fimbrii. Powstawanie fimbrii. Większość fimbrii powstaje od podstawy, a więc odmiennie niż bakteryjne rzęski (sekcja 2. 2. 14. 1). W co najmniej kilku przypadkach składanie tej struktury u bakterii gramujemnych zachodzi w następujący sposób. Podjednostki białkowe fimbrii (mające sekwencję sygnałową — sekcja 7. 6) przechodzą najpierw przez błonę cytoplazmatyczną. Peryplazmatyczne białko opiekuńcze (ang. chaperon) wiąże poszczególne podjednostki, uniemożliwiając im w ten sposób abortywny kontakt z innymi podjednostkami. Powstałe kompleksy przenoszone są do białka przekazującego znajdującego się w błonie zewnętrznej, które trasportuje je ku podstawie powstającej fimbrii. Geny kodujące elementy strukturalne fimbrii oraz geny mechanizmu składającego

31

występują w operonach (sekcja 7. 8. 1). Na przykład operon kodujący typ 1 fimbrii zawiera geny fimA (główna podjednostka), fimC (chaperon) ifimD (białko przekazujące) [Fimbriae in E. coli (artykuł przeglądowy (1996) FEMSMR19: 25-52]. 2. 2. 14. 3 Pilusy

Pilusy to długie lub włosowate struktury białkowe, odchodzące od powierzchni komórki. Biorą one czynny udział w koniugacji (rozdz. 8) bakterii gramujemnych, a więc w procesie umożliwiającym międzykomórkową wymianę materiału genetycznego. Białka pilusów są kodowane przez elementy genetyczne nazywane plazmidami (rozdz. 7). W danej komórce występuje zazwyczaj jeden lub kilka pilusów. Poszczególne typy pilusów różnią się np. wielkością i kształtem. Niektóre z nich są długie, cienkie i giętkie, podczas gdy inne bywają krótkie i sztywne. Rodzaj pilusa jest uzależniony od warunków fizycznych, w których zachodzi proces koniugacji (rozdz. 8). Najlepiej został poznany giętki pilus kodowany przez plazmid F(pilus typu F)(fot. 2. 3, w dolnej lewej części). Ma on średnicę 8-9 nm i długość od jednego do kilku mikrometrów. Pilus ten, zbudowany z helikalnie ułożonych podjednostek białkowych, ma rurkowatą strukturę, w której występuje kanał osiowy o średnicy około 2, 5 nm.

2. 2. 15 Ruch i chemotaksja Wiele bakterii może się aktywnie poruszać w płynnym środowisku. Potrafią one także przemieszczać się w kierunku występowania lepszych źródeł związków odżywczych, a także uciekać od substancji szkodliwych. Taka kierunkowa reakcja nazywa się chemotaksją. 2. 2. 15. 1 Ruch

W większości przypadków zdolność ruchu jest uwarunkowana występowaniem jednej lub większej liczby rzęsek (sekcja 2. 2. 14. 1). Podstawą ruchu rzęskowego jest rotacja rzęski w ciałku podstawowym. U bakterii urzęsionych perytrychalnie (np. Salmonella, E. coli) rzęski obracają się niezależnie od siebie [Macnab i Han (1983) Cell 32: 109-117]. Każda rzęska przez około 95% czasu obraca się w kierunku niezgodnym z kierunkiem ruchu wskazówek zegara (CCW, ang. counterclockwise), a przez resztę czasu — w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara (CW, ang. clockwise). Każda rzęska sama reguluje częstość przełączania kierunku własnej rotacji. Gdy większość rzęsek tworzących wiązkę na jednym z biegunów obraca się w kierunku CCW, bakteria pchana jest do przodu. Ten płynny ruch jest zaburzany (z częstością raz na sekundę) przez krótkotrwałe przełączenie kierunku ruchu rotacji (z CCW na CW) niektórych rzęsek. Wywołuje to koziołkowanie, czyli chwilowy (trwający ok. 0, 1 sekundy), przypadkowy ruch komórki. Wznowienie płynnego ruchu następuje, gdy większość rzęsek znowu zaczyna się obracać w kierunku CCW. 32

Następujące na przemian: płynny ruch i koziołkowanie powoduje, że komórka porusza się w przypadkowych kierunkach, po liniach prostych leżących w różnych płaszczyznach. Komórki urzęsione monotrychalnie (np. Pseudomonas aeruginosa) osiągają zazwyczaj prędkość około 70 μm/s, zaś urzęsione perytrychalnie około 30 μm/s. Wyjątkiem są perytrychalnie urzęsione komórki Thiovulum majus, które mogą się poruszać z prędkością 600 μm/s [Fenchel (1994) Microbiology 140: 3109-3116]. W komórkach urzęsionych monotrychalnie rzęska obraca się równie długo w kierunku CW, jak i w kierunku przeciwnym. Przypadkowość kierunku ruchu (wywołana koziołkowaniem w komórkach urzęsionych perytrychalnie) może, w tym przypadku, wynikać z ruchów Browna (patrz sekcja 16. 1. 1. 3). Ruch krętków jest związany z rotacją ich rzęsek peryplazmatycznych. U Leptonema Mini rotacja rzęski w kierunku CCW powoduje, że przednia część komórki przybiera kształt śruby. Komórka zaczyna się obracać wokół własnej osi w kierunku CW, w wyniku czego bakteria porusza się do przodu ruchem śrubowym. Wydaje się natomiast, że Borrelia burgdorferi porusza się raczej ruchem wężowym, mimo wygięcia wzdłuż długiej osi komórki, powodującego, że poszczególne jej części znajdują się w różnych płaszczyznach. Podobnie jak Leptonella illini, Borrelia również wydaje się obracać wokół własnej osi, zgodnie z ruchem wskazówek zegara. [Structure/motility of spirochaetes: Goldstein, Buttle i Charon (1996) JB 178: 6539-6545]. Ruch bez udziału rzęsek. Niektóre bakterie, nie posiadające rzęsek (np. gatunki z rodzaju Beggiatoa i Oscillatoria), mogą się poruszać tzw. ruchem ślizgowym. Jest to płynny ruch, który zachodzi jedynie wtedy, gdy komórki mają kontakt z powierzchnią podłoża stałego. Ślizgająca się komórka pozostawia za sobą „ślad śluzu". Mechanizm tego ruchu nie jest znany. U bakterii (wyposażonych w fimbrie) np. z rodzaju Neisseria i Pseudomonas, które występują w cienkich błonach wody, obserwuje się ruch drgający (ang. twitching motility). Jest to bierny ruch zachodzący najprawdopodobniej wskutek działania zewnątrzkomórkowych sił fizykochemicznych. Serratia marcescens wykazuje niezależny od rzęsek sposób przemieszczania, w którym istotną rolę może odgrywać napięcie powierzchniowe [Matsuyama i wsp. (1995) JB 177: 987-991]. U pewnych patogenów obserwuje się ruch zależny od aktyny, gdyż znajdują się one wewnątrz komórek swoich gospodarzy (patrz np. sekcja 11. 2. 2. 1). Niezależny od rzęsek ruch aktywowany wapniem (mechanizm nieznany) występuje np. u szczepów cyjanobakterii Synechococcus [Pitta i wsp. (1997) JB 179: 2524-2528]. 2. 2. 15. 2 Chemotaksja

Chemotaksja to ukierunkowany ruch komórki w odpowiedzi na gradient stężeń różnych związków chemicznych. W środowisku chemicznie jednorodnym urzęsione komórki poruszają się w przypadkowych kierunkach (sekcja 2. 2. 15. 1). Przypuśćmy jednak, że stężenie składników pokarmowych wzrasta w pewnym kierunku. Czy komórka, która przypadkowo zmienia kierunek ruchu, może podróżować w stronę zwiększającego się stężenia składników pokarmowych? 33

Może, po prostu poruszając się w tym kierunku zmniejszać częstość koziołkowania, a zwiększać, gdy zaczyna się od niego oddalać. Dzięki temu komórka przez dłuższy okres porusza się płynnie w „odpowiednim" kierunku, a więc w stronę większego stężenia składników pokarmowych. Związki, które przyciągają komórkę, nazywa się atraktantami, natomiast te, które powodują jej ucieczkę — repelentami. Obydwa rodzaje związków określa się łącznie jako efektory. W jaki sposób komórka „wyczuwa" różne stężenia danego związku i jak kontroluje częstość koziołkowania? Komórka płynąca w kierunku zwiększającego lub zmniejszającego się stężenia efektora może wykryć zmianę stężenia np. dzięki receptorom w jej ścianie komórkowej. W zależności od kierunku gradientu, receptor (w danym czasie) może mieć większe bądź mniejsze powinowactwo do wiązania cząsteczki efektora. Połączenie atraktanta z receptorem (bądź rozpad tego kompleksu) powoduje hamowanie lub stymulowanie pewnych sygnałów wewnątrzkomórkowych. Sygnały powstałe w kompleksie receptora trafiają do motora rzęskowego na drodze przekazywania sygnału (ang. signal transduction pathway; sekcja 7. 8. 6; rys. 7. 13). Na przykład, uwolnienie cząsteczki atraktanta od receptora MCP wzmacnia sygnał wywołujący rotację rzęski w kierunku zgodnym z kierunkiem ruchu wskazówek zegara (który sprzyja koziołkowaniu). Częstość koziołkowania wzrasta więc w miarę oddalania się komórki od atraktanta. Z drugiej strony przybliżanie się do atraktanta wydłuża czas ruchu płynnego. Efektem występowania gradientów stężeń różnych związków w środowisku jest tzw. przypadkowa celowość ruchu (ang. biased random walk). Celowe zachowanie jest więc wynikiem selekcji ruchów przypadkowych. Ujednolicenie stężenia efektora (duże lub małe stężenie) przywraca „normalną" częstość koziołkowania. Różne aspekty wrażliwości bakterii na bodźce chemiczne omówiono w pracy przeglądowej Mansona i wsp. [(1998) JB 180: 1009-1022]. Aerotaksja jest szczególnym rodzajem chemotaksji, w której ruchliwe komórki reagują na gradient stężenia tlenu. Mogą one przemieszczać się w kierunku stężenia tlenu (wyższego lub niższego) optymalnego dla ich wzrostu (sekcja 3. 1. 6). Jaki jest mechanizm aerotaksji? W co najmniej kilku przypadkach stwierdzono, że sygnał wywołujący ruch tego typu wymaga zmiany stanu energetycznego komórkowej błony cytoplazmatycznej (sekcja 5. 3. 5).

2. 3 Formy nitkowate i cenocyty Wspomniano wcześniej, że większość bakterii występuje w formie pojedynczych, autonomicznych komórek. W łańcuchu paciorkowców, na przykład, chociaż komórki dzielą wspólne mikrośrodowisko, to jednak każda z nich funkcjonuje zupełnie niezależnie. Jednak niektóre bakterie egzystują tworząc formy nitkowate lub cenocyty.

34

2. 3. 1 Formy nitkowate U niektórych bakterii, komórki po kolejnych podziałach pozostają ze sobą połączone tworząc filamenty (ang. trichomes), które niekiedy mogą być pokryte wspólną pochewką. Poszczególne komórki są oddzielone septami. Sąsiadujące komórki komunikują się ze sobą za pomocą niewielkich porów (mikroplazmodesmy). (Pory takie nie występują w zwykłym „łańcuchu" komórek, jaki tworzą np. paciorkowce). Umiejscowienie septy (w formie przewężenia) nie zawsze jest widoczne z zewnątrz filamentu. Formy takie tworzy wiele cyjanobakterii i np. gatunki z rodzaju Beggiatoa.

2. 3. 2 Cenocyty Nitkowate promieniowce Streptomyces, a także niektóre inne bakterie tworzą rurkowate strzępki pozbawione sept. W tym przypadku cytoplazma jest więc ciągła — od jednego nukleoidu do następnego. Taki wielonukleoidowy organizm nazywany jest cenocytem.

ROZDZIAŁ

3 Wzrost i rozmnażanie

Wzrost komórki bakteryjnej jest związany ze skoordynowanym zwiększeniem masy jej części składowych, przy czym nie jest to jedynie wzrost całkowitej masy, który np. mógłby być powodowany nagromadzeniem się związków zapasowych w komórce. Wzrost prowadzi zazwyczaj do podziału komórki na dwie komórki potomne, podobne do siebie lub identyczne. Wynika z tego, że wzrost i rozmnażanie się są u bakterii ściśle ze sobą związane, a termin wzrost oznacza zazwyczaj oba te procesy.

3. 1 Warunki wzrostu Bakterie rosną jedynie w odpowiednim dla siebie środowisku. Jeśli nie jest ono optymalne, wzrost może być wolniejszy lub może nie zachodzić wcale, bakterie mogą nawet ginąć, zależnie od gatunku i warunków. Do czynników wzrostowych ważnych dla bakterii należą: 1) dostęp odpowiednich substancji odżywczych, 2) źródło energii, 3) woda, 4) odpowiednia temperatura, 5) odpowiednie pH, 6) odpowiednia ilość (lub brak) tlenu. Oczywiście, żaden z tych czynników nie działa osobno, a zmiana jednego z nich może zwiększyć lub zmniejszyć wpływ innego, np. wartość najwyższej temperatury pozwalającej na wzrost bakterii może być znacznie obniżona w środowisku o nieoptymalnym pH.

3. 1. 1 Substancje odżywcze Komórki potrzebują substancji odżywczych do wzrostu, przeżycia i podziału. Ogólnie, bakterie wykorzystują do odżywiania się bardzo różnorodne związki, włączając różne cukry i inne węglowodany, aminokwasy, sterole, alkohole, węglowodory, metan, sole nieorganiczne i dwutlenek węgla. Pojedyncza bakteria nie może jednak wykorzystać tych wszystkich związków, ponieważ nie ma 36

wszystkich niezbędnych enzymów, jak również jej osłony nie mają systemów umożliwiających pobranie (transport) tych licznych składników do wnętrza komórki. Niezależnie od gatunku, komórki bakteryjne potrzebują źródła węgla, azotu, fosforu, siarki i innych pierwiastków tworzących materię organiczną. Niektóre bakterie zdolne są do zaspokojenia tych potrzeb wykorzystując proste sole nieorganiczne i takie związki jak dwutlenek węgla i amoniak, inne bakterie potrzebują, w różnym zakresie, bardziej lub mniej skomplikowanych związków organicznych, pochodzących z innych organizmów. Niektóre ważne problemy związane z odżywianiem się bakterii są poruszone w rozdziałach 6 i 10.

3. 1. 2 Energia Energia jest potrzebna żywej komórce do przeprowadzenia większości ważnych reakcji chemicznych. Niezbędna jest również np. do ruchu rzęski i do pobrania różnych substancji odżywczych. Całość energii jest uzyskiwana ze źródeł znajdujących się w środowisku. Gatunki fototroficzne otrzymują energię głównie lub wyłącznie ze światła, natomiast gatunki chemolitotroficzne uzyskują energię na drodze „przetwarzania" związków chemicznych pobranych ze środowiska. Niektóre gatunki wykorzystują oba źródła energii. Energii poświęcony jest rozdział 5.

3. 1. 3 Woda Około 80% lub więcej bakteryjnej masy stanowi woda. Podczas wzrostu substancje odżywcze wchodzą do komórki, a produkty odpadowe opuszczają ją w postaci roztworów. Bakterie mogą więc rosnąć w środowisku zawierającym odpowiednią ilość wolnej (dostępnej) wody. (Nie cała woda w danym środowisku dostępna jest dla bakterii, np. niekiedy może być ona związana w hydrofilowych żelach lub przez jony znajdujące się w roztworze). Krańcowy brak wody (wysuszenie) jest tolerowany w różnym zakresie przez poszczególne gatunki bakterii, wiele gatunków nie może jednak przeżyć przez długi czas w stanie wysuszonym. [Desiccation tolerance of prokaryotes: Potts (1994) MR 58: 755-805. ]

3. 1. 4 Temperatura Ogólnie, każdy typ bakterii rośnie najszybciej w określonej temperaturze — optymalnej temperaturze wzrostu. Wzrost zamiera, gdy temperatura przekracza bądź nie osiąga optimum. Dla każdej bakterii istnieje określona maksymalna i minimalna temperatura, poza którą w ogóle nie rośnie. Bakterie termofilne to takie, których optymalna temperatura wzrostu przekracza 45°C. Termofile występują np. w kompostach, gorących źródłach, kominach hydrotermalnych na dnie oceanu. Zaliczamy do nich gatunki Thermobacteroides (opt. 55-70°C) i Thermotnicrobium (opt. 70-75°C). Wśród Archaea, Pyrodictium

37

ma niezwykle wysoką temperaturą optymalną — 105°C. Niektóre termofile odznaczają się cechami związanymi z adaptacją do wzrostu w wysokiej temperaturze. Adaptacja ta widoczna jest w budowie struktur komórki (np. błony cytoplazmatycznej), a w niektórych wypadkach nawet w rodzaju metabolizmu energetycznego (patrz sekcja 5. 3. 6). Bakterie termowytrzymałe mogą przeżywać — choć niekoniecznie rosnąć — w temperaturze, która na ogół zabija większość innych wegetatywnych (tj. rosnących) bakterii. W bakteriologii mleczarskiej do tej grupy zalicza się bakterie, które przeżywają pasteryzację (sekcja 12. 2. 1. 1). Mezofilne bakterie rosną najlepiej w temperaturze między 15 a 45°C. Mezofile żyją w wielu środowiskach; należą do nich bakterie patogenne dla człowieka i zwierząt. Psychrofilne bakterie rosną najlepiej w temperaturze 15°C lub poniżej, nie rosną powyżej około 20°C, a najniższa temperatura umożliwiająca ich wzrost to 0°C lub niższa. Psychrofile występują np. w morzach podbiegunowych. Psychrotropowe bakterie mogą rosnąć w niskich temperaturach (np. 0-5°C), najlepiej jednak rosną powyżej 15°C, górna granica ich wzrostu wynosi 20°C.

3. 1. 5 pH Większość bakterii rośnie najlepiej w pH około 7 (obojętne), z czego znaczna część nie może w ogóle rosnąć w pH silnie kwaśnym lub zasadowym. Jednak pewne bakterie (odnajdywane np. w kopalnianych ściekach lub niektórych gorących źródłach) nie tylko tolerują, lecz nawet „wolą" kwaśne lub bardzo kwaśne środowisko. Do tych acydofilów należy Thiobacillus thiooxidans, gatunek, dla którego optymalne pH wynosi 2-4. Gatunek Sulfolobus należący do Archaea rośnie w pH 1-5, natomiast dla Thermoplasma acidophilum optymalne pH wynosi 0, 8-3. Alkalofile rosną najlepiej w środowiskach zasadowych — zazwyczaj powyżej pH 8. Thermobacterium roseum (opt. pH 8, 2-8, 5) występuje np. w ciepłych źródłach, a Exiguobacterium aurantiacum (opt. pH 8, 5 i 9, 5) było odnajdywane w ściekach z przemysłu przetwórstwa ziemniaczanego. Inne alkalofile są spotykane w naturalnych zasadowych jeziorach. Acydofile i alkalofile mogą rosnąć wolno lub nie rosną wcale w pH 7.

3. 1. 6 Tlen Niektóre bakterie wymagają do wzrostu tlenu, natomiast inne — jego braku. Jeszcze inne mogą rosnąć niezależnie od dostępności lub braku tego pierwiastka. Bakterie, które muszą mieć tlen do wzrostu, nazywane są właściwymi lub bezwzględnymi tlenowcami, dla podkreślenia ich całkowitej zależności od tlenu. Właściwe lub bezwzględne beztlenowce rosną jedynie w warunkach braku tlenu, organizmy te występują np. w mułach rzecznych lub w żwaczu przeżuwaczy. Bakterie zwykle rosnące w obecności tlenu, ale mogące również rosnąć w warunkach beztlenowych (tj. przy braku tlenu), nazywane są względnymi 38

beztlenowcami. Podobnie te, które zwykle rosną beztlenowo, ale mają zdolność do wzrostu w obecności tlenu, nazywamy względnymi tlenowcami. Mikroaerofilne bakterie zazwyczaj rosną najlepiej, gdy stężenie tlenu jest mniejsze niż w powietrzu (na ogół znacznie). Niektóre bakterie charakteryzują się aerotaksja (sekcja 2. 2. 15. 2).

3. 1. 7 Jony nieorganiczne Wszystkie bakterie wymagają jonów nieorganicznych (np. chlorkowych lub magnezowych) w małym stężeniu; większe stężenie na ogół hamuje wzrost. Jony pełnią różne funkcje, np. magnez — w błonie zewnętrznej (sekcja 2. 2. 9. 2), żelazo w cytochromach (sekcja 5. 1. 1. 2) i w wielu innych enzymach, a mangan i nikiel — w enzymach i systemach enzymatycznych (patrz również sekcja 11. 4. 1. 3). Pewne bakterie (halofile) rosną jedynie w obecności dużych stężeń elektrolitów (zazwyczaj NaCl). Niektórzy przedstawiciele Archaea (np. Halobacterium salinarium), które występują w słonych jeziorach, solonych rybach, itp., są przykładami krańcowych halofilów: potrzebują stężenia przynajmniej 1, 5 Μ NaCl do wzrostu, a 3-4 Μ do wzrostu wydajnego. Elektrolity służą do stabilizacji struktur komórkowych, np. rybosomów i osłon komórki; w roztworach rozcieńczonych komórki niektórych gatunków pękają z powodu rozluźnienia osłon. Halotolerancyjne bakterie są definiowane jako nie-halofile, które mogą rosnąć w elektrolitach o stężeniu 2, 5 M; należy do nich wiele szczepów Staphylococcus.

Jony nieorganiczne mogą być istotne dla regulacji wielu funkcji fizjologicznych. Na przykład jony Ca 2+ pełnią stwierdzoną lub tylko przypuszczalną rolę w nabywaniu zdolności transformacji (kompetencji) (sekcja 8. 4. 1), chemotaksji (sekcja 2. 2. 15. 2) i sporulacji u B. subtilis (sekcja 7. 8. 6. 1) [Calcium signalling in bacteria: Norris i wsp. (1996) JB 178: 3677-3682].

3. 1. 8 Odpowiedź na zmieniające się warunki — adaptacja Bakterie żyjące w środowiskach bardzo wyspecjalizowanych, np. w krańcowej temperaturze lub wewnątrz komórek innych organizmów, nie tolerują zazwyczaj innych środowisk. Wiele jednak bakterii nadal rośnie (lub przynajmniej przeżywa) nawet wtedy, gdy w środowisku zaszły istotne zmiany. Taka kontynuacja wzrostu (lub przeżycie) oznacza, że organizmy te albo nie są wrażliwe na określone zmiany, albo zdolne są zaadaptować się (tj. ulec zmianie) w sposób umożliwiający tolerancję lub czerpanie korzyści z nowych warunków. Adaptacja wymaga niejednokrotnie syntezy nowych rodzajów białek (niezbędnych do pełnienia specyficznych funkcji) lub zahamowania syntezy innych, co z kolei pociąga za sobą zmiany w wyrażaniu się różnych genów (rozdz. 7). Jednym z przykładów może być adaptacja Salmonella typhimurium do warunków silnie kwasowych (sekcja 7. 8. 2. 6). Innym przykładem jest adaptacja do zmian osmolalności środowiska lub pożywki (= osmoregulacja). Zwiększenie osmolalności prowadzi do wypływu 39

wody z komórki, a to z kolei zmniejsza turgor i zwiększa stężenie roztworów wewnątrzkomórkowych do poziomu hamującego wzrost. W Escherichia coli znaczne podwyższenie zewnętrznej osmolalności prowadzi do zmian we względnych ilościach niektórych białek tworzących pory błony zewnętrznej, co powoduje zmniejszenie ich rozmiarów. Escherichia coli reaguje natychmiast na wzrost osmolalności, pobierając jony potasowe (K+) i syntetyzując glutaminian (jon o przeciwnym ładunku). Prowadzi to do przeciwdziałania wysokiej zewnętrznej osmolalności przez wzrost osmolalności zewnętrznej. W pobieraniu K+ bierze udział kilka systemów transportu (sekcja 5. 4), np. system Trk (który jest konstytutywny — tzn. zawsze aktywny) i system Kdp (który jest indukowany przez wysoką osmolalność, sekcja 7. 8. 6). Wydaje się, że system Kdp zostaje włączony na skutek zmniejszenia turgoru (lub przez podobny czynnik). Podwyższenie ciśnienia osmotycznego przyczynia się również do pobrania (lub syntezy de ηονο) nieszkodliwych substancji rozpuszczalnych, czyli pewnych rodzajów małych cząsteczek, które mogą być gromadzone wewnątrz komórki nawet w dużych stężeniach bez negatywnego wpływu na jej przeżywalność. Prowadzi to do wzrostu wewnątrzkomórkowej osmolalności. Wynika z tego, że substancje te mogą zastępować przynajmniej część nagromadzonych jonów potasowych, których stopień fizjologicznej szkodliwości zależy od ich stężenia. Do nieszkodliwych rozpuszczalnych substancji zalicza się betainę glicynową ((CH3) -N+-CH2COO") — cząsteczkę powszechnie występującą, która jest wydajnie pobierana przez E. coli przy udziale systemu transportowego zależnego od białka wiążącego (sekcja 5. 4. 1. 1) nazwanego ProU [Lucht i Bremer (1994) FEMSMR 14: 3-20]. Pobranie betainy glicynowej w następstwie podwyższenia ciśnienia osmotycznego jest zjawiskiem powszechnym zarówno wśród bakterii gramujemnych, jak i gramdodatnich. Halotolerancyjna bakteria Staphylococcus aureus ma dwa systemy transportujące betainę glicynową [patrz np. Pourkomalian i Booth (1994) Microbiology 140: 3131-3138]. Sinorhizobium meliloti metabolizuje (a więc nie akumuluje) większość znanych osmoprotektantów, włączając betainę glicynową, w związku z czym nie mogą one powodować zwiększonej osmolalności tej bakterii. W przypadku tego organizmu zwiększenie ciśnienia osmotycznego powoduje gromadzenie endogennych substancji rozpuszczalnych (np. glutaminianu i amidu N-acetyloglutaminyloglutaminowego), którego akumulacja jest stymulowana przez endogenną sacharozę [Gouffi i wsp. (1998) JB 180: 5044-5051]. [Regulation of compatible solute accumulation in bacteria: Poolman i Glaasker (1998) MM 29: 397-407]. Obniżenie ciśnienia osmotycznego prowadzi do aktywacji systemów wypływu związków z komórki; np. K+ i glutaminian są gwałtownie usuwane przez E. coli, a specyficzne, nieszkodliwe substancje rozpuszczalne są uwalniane przez inne organizmy. Wypływ nie jest uzależniony od energii metabolicznej, co kontrastuje z pobieraniem betainy glicynowej przez system transportu ProU (który jest zależny od ATP). Większość K+ uwalnianego przez E. coli w wyniku obniżenia ciśnienia osmotycznego przechodzi przez tzw. „kanały mechanowrażliwe" w błonie cytoplaz-

40

matycznej, np. kanał MscL (sekcja. 2. 2. 8); zostało to stwierdzone w trakcie badań nad mutantami w genie mscL [Blount i wsp. (1997) JBC 272: 32150-32157]. Struktury zwane akwaporynami (ang. aquaporins) (sekcja 2. 2. 8) mogą odgrywać rolę w osmoregulacji, dowodów na to jednak nie ma. Wiele względnie beztlenowych bakterii (sekcja 3. 1. 6) może adaptować się do wzrostu beztlenowego (lub powracać do życia w warunkach tlenowych) przez zmianę alternatywnych dróg metabolizmu energetycznego (rozdz. 5), co wymaga, między innymi, syntezy nowych enzymów (białek). Genetyczne i regulacyjne problemy związane z adaptacją są omawiane w sekcjach 7. 8. 2. 3-7. 8. 2. 6 i 7. 8. 6.

3. 2 Wzrost pojedynczej komórki W rosnących komórkach obserwujemy skoordynowany wzrost masy jej składników. Słowo „skoordynowany" nie znaczy, że wszystkie części komórki tworzą się jednocześnie. Niektóre są syntetyzowane w sposób bardziej lub mniej ciągły, inne tworzą się w określonej kolejności, podczas pewnych, dokładnie wyznaczonych okresów. Ten cykl zdarzeń związanych ze wzrostem i podziałem komórki na dwie potomne nazywany jest cyklem życiowym.

3. 2. 1 Cykl życiowy Większość badań dotyczących cyklu życiowego komórki wykonano z Escherichia coli (gramujemną pałeczką) i głównie na tych danych oparte jest przedstawione podsumowanie. Rozmiary komórki podczas wzrostu. Szybko rosnące komórki są większe (pod względem masy i objętości) niż komórki rosnące powoli. Gdy czas podwojenia liczby komórek (sekcja 3. 2. 3) jest krótszy niż 1 godz., okresy cyklu życiowego C i D, (rys. 3. 2, część dolna) są praktycznie stałe, a na początku okresu C masa komórki (w przeliczeniu na ilość miejsc początku replikacji chromosomu, tzw. origins) jest również stała dla danej szybkości wzrostu. W tych warunkach, im szybciej komórka rośnie (tj. im krótszy jest okres I), tym większy będzie wzrost jej masy (i objętości) pod koniec stałego okresu poprzedzającego podział komórki, C + D. Podczas wzrostu ze stałą szybkością przyrost masy komórki jest związany jedynie z przyrostem jej długości, średnica pozostaje niezmienna. Wraz ze zwiększeniem szybkości wzrostu komórka staje się większa: średnica komórki wzrasta powoli, jej długość szybciej i, w rezultacie, komórka początkowo „przeholowuje" (tzn. zwiększa się bardziej niż byłoby to właściwe dla nowej szybkości wzrostu). Następnie rośnie średnica komórki, osiągając nową wartość, natomiast jej długość zmniejsza się do rozmiaru końcowego (który nadal przewyższa rozmiar początkowy). Zmniejszenie szybkości wzrostu prowadzi do początkowego, zbytniego zmniejszenia się długości komórki. Również i w tym wypadku średnica komórki przystosowuje się wolniej niż jej długość do nowej szybkości wzrostu [Zaritsky i wsp. (1993) JBM 139: 2711-2714]. 41

Synteza osłon komórkowych. Synteza osłon komórkowych zachodzi prawdopodobnie w ciągu całego cyklu komórkowego podczas ciągłego, jednostajnego wzrostu. Jeden z modeli [Cooper (1991) MR 55: 649-679] przyjmuje, że Peptydoglikan jest włączany w sposób rozproszony do ściany bocznej, a przede wszystkim do biegunów komórki. Hipoteza ta jest zgodna z późniejszymi badaniami dotyczącymi metabolicznego obrotu peptydoglikanu w rosnących komórkach [Park (1993) JB 175: 7-11]. Wyniki tych badań sugerują, że ściana boczna zawiera jedną warstwę peptydoglikanu, natomiast w okolicach biegunów występuje kilka jego warstw. Niedawno Holtje [Microbiology (1996) 142: 1911-1918] przedstawił model woreczka (sakulusa) peptydoglikanowego, zwany „3 za 1". Model ten uwzględnia zarówno liczne cechy biosyntezy, jak i istnienie różnych typów mostków peptydowych, które występują w woreczku (ryc. 2. 7, nagłówek). Model jest przedstawiony na rysunku 3. 1. W celu koordynacji różnych syntetycznych i litycznych procesów związanych z syntezą woreczka, Holtje postuluje istnienie dwóch typów holoenzymów: jednego działającego w ścianie komórkowej, drugiego — związanego z tworzeniem septy. Oba typy enzymów byłyby związane z białkami wiążącymi penicylinę (ang. PBPs, sekcja 2. 2. 8) i z „litycznymi transglikozylazami", tj. enzymami mającymi zdolność do degradacji peptydoglikanu w sposób procesywny (tzn. cięcie enzymatyczne związane jest z przesunięciem się enzymu). Metaboliczny obrót peptydoglikanu pozwala na ponowne wykorzystanie peptydów podczas wzrostu komórki (sekcja 5. 4. 6). Przyjmuje się, że błona cytoplazmatyczna rozwija się w sposób bierny, tj. po prostu „dotrzymuje kroku" rosnącemu woreczkowi peptydoglikanowemu. Synteza peptydoglikanu zależy jednak od syntezy fosfolipidów błonowych, a to sugeruje nowy sposób regulacji wzrostu osłony komórkowej [Rodionov i Ishiguro (1996) Microbiology 142: 2871-2877], Replikacja chromosomu (DNA). Niezbędna koordynacja replikacji (DNA) chromosomu (sekcja 7. 3) i podziału komórkowego jest przedstawiona w sekcji 3. 2. 1. 1 i na rysunku 3. 2. Co kontroluje inicjację (rozpoczęcie) replikacji podczas cyklu życiowego? Odpowiedź na to pytanie nie jest znana, wiadomo jednak, iż inicjacja, mimo że jest regulowana, może zajść w różnych, określonych momentach od rozpoczęcia cyklu (zależy to od szybkości wzrostu) oraz że zachodzi ona mniej więcej w tym samym czasie we wszystkich miejscach origin, jakie są w komórce [Nordstrom i Austin (1993) MM 10: 457-463]. Czasową zależność inicjacji replikacji od szybkości wzrostu przedstawiono na rysunku 3. 2. Ważne jest porównanie górnych i dolnych zbiorów sekwencji 1+ C + D oraz zwrócenie uwagi na synchronizacje inicjacji (początek okresu C) z różną szybkością wzrostu. (Może to być przydatne do narysowania nowego zbioru 1+ C + D, gdzie I, oznaczające początek replikacji, jest równe połowie C). Niektóre czynniki pełnią istotną rolę w inicjacji replikacji. Jednym z nich jest wewnątrzkomórkowe stężenie białka DnaA (lub, być może, jego aktywnej formy). Inicjacja replikacji wymaga rozdzielenia dwóch nici DNA w chromosomowym origin (sekcja 7. 3), a to z kolei jest uzależnione od uprzedniego związania w tym miejscu wielu cząsteczek DNA. Wynika stąd, że niedostateczna ilość DnaA może opóźniać inicjacje.

42

(a) Pojedyncza warstwa peptydoglikanu. Struktura ta znajduje się pod stałym naprężeniem. Środkowy łańcuch , zwany łańcuchem „do wycięcia", zostanie zastąpiony przez trzy inne łańcuchy (stąd nazwa „3 za 1"). (b) Trzy połączone łańcuchy są umieszczone pod (tzn. od strony cytoplazmy) warstwą peptydoglikanu. Boczne łańcuchy tej trójki są połączone kowalencyjnie z każdej strony z łańcuchem „do usunięcia". Aby te wiązania mogły powstać, boczny peptyd (rys. 2. 7b) każdego bocznego łańcucha łączy się z grupą ε-aminową podwójnego mostka peptydowego, co prowadzi do powstania mostka potrójnego (rys. 2. 7b). (c) Łańcuch „do usunięcia" usuwany jest enzymatycznie, a następnie, ze względu na naprężenie warstwy peptydoglikanu, nowy tryplet zajmuje pozycję usuniętego łańcucha. Ma to znaczenie w wydłużaniu się komórki. Przedstawiony model zakłada, że środkowy łańcuch w trójce, po włączeniu do woreczka peptydoglikanowego, będzie funkcjonował jak nowy łańcuch „do usunięcia". Z tego powodu podwójny mostek łączący każdy z bocznych łańcuchów powinien mieć wolną grupę ε-aminową położoną w bocznym peptydzie bocznego łańcucha. Według przedstawionego modelu podwojenie długości komórki wymaga, aby: 1) łańcuchy „do usunięcia" wymieniły się w woreczku i 2) tylko te z łańcuchów do usunięcia, które były na początku nowego cyklu komórkowego, zostały zastąpione przez nową trójkę. W ten sposób nowe łańcuchy „do usunięcia" włączone podczas bieżącego cyklu komórkowego nie mogą być zastąpione dopóki nie rozpocznie się nowy cykl. Widać stąd, że mechanizm wzrostu musi mieć możliwość odróżnienia „starych" łańcuchów do usunięcia od „nowych". Jest to możliwe, ponieważ nowo syntetyzowany Peptydoglikan jest związany z woreczkiem jedynie przez mostki peptydowe typu tetra-tetra (rys. 2. 7b). Postulowano więc, że nowe łańcuchy (identyfikowane przez wiązania tetra-tetra) nie są rozpoznawane jako łańcuchy „do usunięcia". Natomiast na początku każdego nowego cyklu komórkowego wszystkie wiązania tetra-tetra muszą przejść (na skutek działania enzymu LD-karboksypeptydazy) w wiązania tetra-tri, co z kolei pozwala na ich rozpoznanie jako łańcuchy „do usunięcia". Kolejne dodawanie trójek w miejscu wyznaczającym środek komórki, być może w połączeniu z pierścieniem FtsZ (sekcja 3. 2. 1, tworzenie septy), może mieć znaczenie dla wrastania peptydoglikanu do wnętrza komórki podczas tworzenia się septy.

43

Replikacja zaczyna się w określonym miejscu chromosomu — origin (sekcja 7. 3), oznaczonym jako małe kółko. Kiedy wzrost jest powolny (góra), każda z nowych komórek potomnych ma dokładnie jeden chromosom. Dzieje się tak, ponieważ po podwojeniu się chromosomu nowa runda replikacji nie zaczyna się przed końcem podziału komórkowego. Kiedy wzrost jest szybki, nowa runda replikacji rozpoczyna się przed zakończeniem poprzedniej, a więc na długo przed podziałem komórki. W wyniku tego każda komórka potomna przedstawiona na rysunku ma około 1 1 / 2 chromosomu. Cykl podziału komórki może być przedstawiony jako liniowy ciąg złożony z trzech okresów: I, C i D. C to okres, podczas którego zachodzi replikacja, D jest okresem tworzenia septy, pod jego koniec następuje podział komórki. I oznacza okres między początkiem kolejnych rund replikacji chromo-

44

Innym czynnikiem jest stopień metylacji origin (oriC) (sekcja 7. 4, 7. 8. 8). Regulacja czasu inicjacji może być związana z opóźnioną lub stopniową metylacją oriC, czego przyczyną może być trudna dostępność miejsc regulacyjnych dla enzymów metylujących. W końcu, inicjacja jest połączona z szybkością wzrostu. Jeden z sugerowanych mechanizmów tej korelacji jest związany z małą cząsteczką, 5'-difosforanem 3'-difosfoguanozyny (tetrafosforanem guanozyny, ppGpp), którego stężenie wewnątrzkomórkowe jest jest odwrotnie proporcjonalne do szybkości wzrostu. Duże stężenie może hamować syntezę białka DnaA, a to z kolei może opóźnić inicjację (patrz wyżej oraz rozdz. 7. 8. 2. 5). Ciekawe jest to, że ppGpp ma również związek z syntezą białka FtsZ biorącego udział w tworzeniu septy, czyli przegrody komórkowej (co będzie omówione dalej). Dekatenacja i rozdział chromosomów. Podczas podziału każda z komórek potomnych otrzymuje tę samą liczbę chromosomów. Zaraz po powieleniu chromosomy występują w formie katenatów (czyli są szczepione ze sobą, jak ogniwa łańcucha), a więc muszą się rozdzielić. Rozdział jest związany z funkcją pewnych enzymów (topoizomeraz), które mogą przeciąć jedną lub dwie nici DNA, a następnie przesunąć je (ją) przez powstałą lukę. Jeśli jakaś istotna topoizomeraza jest niefunkcjonalna (np. w wyniku mutacji), dekatenacja nie zachodzi. Niektóre z mutacji w genie parC E. coli (kodującym podjednostkę topoizomerazy IV) zapobiegają dekatenacji i prowadzą do powstania bardzo długich komórek — filamentów (zawierających sczepione chromosomy), jak również komórek pozbawionych jądra (nie zawierających chromosomu). Chromosomy po rozdziale ulegają zagęszczeniu i tworzą nukleoid (sekcja 2. 2. 1). Może to być zależne od przyłączenia wielu cząsteczek białka HU, które wiąże się najlepiej do zgiętego DNA [Pontiggia i wsp. (1993) MM 7: 343-350]. Mechanizm rozdziału chromosomów do komórek potomnych nie jest znany. Może polegać na: 1) połączeniu nukleoidów z błoną cytoplazmatyczną (wtedy byłyby one rozsuwane mechanicznie); 2) wzajemnym odpychaniu się nukleoidów lub/i 3) działaniu przypuszczalnego białka, związanego z tą funkcją (produktu genu mukB) [Chromosome partitioning in Escherichia coli: Lobner-Olesen i Kuempel (1992) JB 174: 7883-7889]. somu (tj. DNA) i równa się czasowi podwojenia się liczby komórek (sekcja 3. 2. 3). Koniec poprzedniego okresu I zbiega się z początkiem okresu następnego. W każdym, przedstawionym na diagramie, ciągu I + C + D stosunek między daną sekwencją I + C + D a tą wykreśloną powyżej obrazuje stosunek komórek potomnych do rodzicielskich. Górny zestaw I + C + D pokazuje kolejne cykle komórkowe podczas powolnego wzrostu. Należy zauważyć, że gdy I = C + D, nowa runda replikacji chromosomu nie zacznie się przed końcem okresu D, tj. przed końcem podziału komórek. Dolny zestaw I + C + D przedstawia kolejne cykle komórkowe, gdy wzrost jest szybki. W tej sytuacji, okres I jest krótszy niż C, co znaczy, że kolejna runda replikacji chromosomu rozpoczyna się zanim poprzednia runda dobiegnie końca, a więc pod koniec okresu D nowa runda replikacji jest już w toku. W szybko rosnących komórkach stadium replikacji chromosomu w nowej komórce potomnej zależy od momentu inicjacji, czyli od początku okresu C w komórce rodzicielskiej. W szybko rosnących komórkach E. coli okresy C i D są mniej więcej stale i wynoszą odpowiednio 42 min i 22-25 min.

45

Badania bakterii z rodzaju Bacillus sugerują, że rozdział nukleoidów może być procesem dwufazowym. Początkowo regiony oriC nukleoidów odpychają się wzajemnie w sposób aktywny, po czym następuje bierny ruch pozostałej, większej części każdego nukleoidu do miejsc wskazanych przez oriC. Ten bierny ruch jest prawdopodobnie związany ze wzrostem osłon komórkowych [Sharpe i wsp. (1998) JB 180: 547-555]. U Bacillus subtilis prawidłowy rozdział chromosomów (zarówno podczas wzrostu, jak i sporulacji) jest zależny od produktu genu spoOJ. SpoOJ tworzy skupiska umiejscowione na biegunach komórki. Powielają się one na początku każdej rundy replikacji DNA, a powstałe skupiska potomne dążą do biegunów komórki. Ten rozdział skupisk, nie związany z wydłużaniem się komórki, przyczynia się prawdopodobnie do ruchu chromosomów potomnych do dwóch biegunów komórki. Tak więc rozdział chromosomów wydaje się procesem dynamicznym, przypominającym mitozę [Glaser i wsp. (1997) GD 11: 1160-1168]. Białko Smc Bacillus subtilis (kodowane przez gen smc) prawdopodobnie odgrywa ważną rolę w tworzeniu struktury nukleoidu, a w konsekwencji może być potrzebne do jego prawidłowego rozdziału. Mutacje w smc są przyczyną powstania nienormalnych (mniej gęstych) nukleoidów, które mogą być nieprawidłowo zwinięte oraz mogą przeszkadzać w tworzeniu się prawidłowych skupisk Spo0J. W E. coli mutacje w genie mukB dają prawdopodobnie ten sam efekt; można z tego wysnuć wniosek, że Smc i MukB pełnią podobne funkcje. Homologi Smc były opisane w archeonach, Methanococcus jannaschi i Archaeoglobus fulgi-

dus. Sugeruje się, że SpoOJ bierze udział w organizacji regionu oriC, z kolei w pełnieniu tej funkcji pomaga obecność prawidłowego nukleoidu tworzonego w obecności Smc. Zarówno SpoOJ, jak i Smc mają więc udział w tworzeniu nukleoidów gotowych do rozdziału [Britton, Lin i Grossman (1998) GD 12: 1254-1259]. Tworzenie septy. Rosnąca komórka może się podzielić na dwie potomne przez wytworzenie rozdzielającej je ściany komórkowej (septy). Tworzenie septy rozpoczyna się od powstania pierścieniowatego tworu złożonego z cząsteczek białka FtsZ (produktu genu ftsZ) na obwodzie wewnętrznej powierzchni błony cytoplazmatycznej w środku komórki (fot. 3. 1), co określa płaszczyznę późniejszej septy. Powstanie wiązania między FtsZ a białkiem należącym do osłon komórkowych (ZipA) jest z pewnością konieczne do podziału komórki [Hale i deBoer (1997) Cell 88: 175-185]. Inne białko błonowe, FtsW, również jest potrzebne do utworzenia pierścienia FtsZ. Utworzenie pierścienia FtsZ (pierścienia Z) wymaga dostarczenia energii. Związek między rozpoczęciem wytwarzania tego pierścienia a cyklem komórkowym nie jest znany. Badania nad mutantami ftsZ E. coli sugerują rolę ppGpp w kontroli ekspresji FtsZ podczas podziału komórki [Powell i Court (1998) JB 180: 1053-1062]. Badania ostatnich lat wykazują, że składanie pierścienia Z rozpoczyna się w tzw. „jądrze nukleacji", a następnie postępuje dwukierunkowo wzdłuż obwodu komórki. Samo tworzenie miejsc nukleacji może zależeć od białka Era (produktu genu era) — GTPazy należącej do superrodziny Ras, a więc era może być ważnym czynnikiem podziału komórki [Bacterial division sites: Bouche i Pichoff (1998) MM 29: 19-26]. 46

Co ciekawe, bezjądrowe komórki (powstałe w wyniku omawianej poprzednio mutacji parC) również mogą tworzyć pierścień — pierścień C. Wskazuje to, że tworzenie miejsc podziału nie zależy od obecności chromosomu [Sun, Yu i Margolin (1998) MM 29; 491-503]. Pierścień Z wytwarzany jest również przez Archaea, co sugeruje, że aparat związany z podziałem komórkowym występował już u wspólnego przodka prokariotów [Wang i Lutkenhaus (1996) MM 21: 313-319]. Komórki E. coli rozchodzą się natychmiast po podziale. U innych gatunków podział może nie następować natychmiast, co prowadzi do powstania zgrupowań komórek (sekcja 2. 1. 3). Cykl komórkowy Archaea jest omówiony przez Bernandera [(1998) MM 29: 955-961]. 3. 2. 1. 1 Model Helmstettera-Coopera

W cyklu komórkowym bardzo ważna jest właściwa synchronizacja replikacji chromosomu z podziałem komórki. Model Helmstettera-Coopera opisuje (rys. 3. 2) replikację chromosomu w jednym cyklu komórkowym. Jeśli wzrost jest powolny, to między podziałami zachodzi jedno całkowite podwojenie się chromosomu. W tej sytuacji nowa komórka potomna otrzymuje tylko jeden chromosom. Podczas szybkiego wzrostu nowa runda replikacyjna rozpoczyna się, kiedy 47

poprzednia nie jest jeszcze zakończona, a więc każda komórka może otrzymać więcej niż jeden chromosom — około 11/2 chromosomu, jak na rysunku 3. 2. W ten sposób można wytłumaczyć wpływ szybkości wzrostu na liczbę chromosomów w komórce (sekcja 2. 2. 1). 3. 2. 1. 2. Geny związane z cyklem komórkowym — „morfogeny"

Kontrola genetyczna (rozdz. 7) cyklu komórkowego wymaga prawidłowego funkcjonowania tzw. morfogenów i ich produktów. Geny te muszą zapewnić nie tylko tworzenie odpowiednich produktów we właściwym czasie, ale również prawidłowe ich rozmieszczenie w obrębie komórki. Wiadomo jest na przykład, że podczas podziału komórki septa musi się wytworzyć raczej w pozycji odpowiadającej połowie jej długości, a nie blisko biegunów komórkowych. Oznacza to, że białko FtsZ (sekcja 3. 2. 1) musi być w jakiś sposób skierowane do miejsca odpowiadającego połowie długości komórki. Jeden z modeli zakłada, że produkty genów minC i minD tworzą kompleks, MinCD, który wiąże się z alternatywnymi miejscami tworzenia septy, położonymi blisko biegunów. Wiążąc się w tych miejscach, MinCD usuwa białko FtsZ, a tym samym zapobiega tworzeniu się septy w pobliżu biegunów. MinCD nie może się wiązać w środku komórki, ponieważ wyklucza to poprzednie związanie się produktu genu minE (MinE) w miejscu przyległym [Huang, Coa and Luthenhaus (1996) JB 178 5080-5085]; sytuacja ta pozwala białku FtsZ zapoczątkować tworzenie się septy w połowie długości komórki. Należy zauważyć, ze podczas tworzenia się endospor (sekcja 4. 3. 1) w komórkach Bacillus subtilis tworzenie się septy przy biegunach może również zależeć od działania kompleksu MinCD (patrz podpis do rys. 7. 14). Produkt morfogenu envA jest konieczny do rozdziału septy, z wytworzeniem dwóch nowych biegunów w komórkach potomnych. Do morfogenów należą również geny, które kodują białka wiążące penicylinę. 3. 2. 1. 3 Kontrola cyklu komórkowego

W cyklu komórkowym jakiekolwiek zdarzenie może być bezpośrednio uzależnione od wystąpienia zdarzenia poprzedniego. Zdarzenia te mogą być kontrolowane niezależnie, bądź też mogą być skoordynowane. Niektórzy badacze [np. Nordstrom, Bernander i Dasgupta (1991) MM 5 769-774] są zwolennikami istnienia kontroli niezależnej. Za takim wnioskiem przemawia kilka faktów. 1) Niektóre zdarzenia w cyklu komórkowym mogą być zablokowane niezależnie. Na przykład podział komórki może nastąpić bez poprzedzającej go replikacji chromosomu lub właściwego rozdziału nukleoidów, w tym wypadku żaden sygnał nie może być przekazany (w normalnych warunkach) od zdarzenia poprzedzającego etap badany. 2) Nie ma bezpośrednich dowodów na związek replikacji chromosomu z podziałem komórki, chociaż pośrednia ich koordynacja z pewnością istnieje. Tak więc, uszkodzenie DNA potencjalnie prowadzące do zahamowania replikacji indukuje system SOS (sekcja 7. 8. 2. 2) — ogólny mechanizm regulacyjny, który między innymi hamuje podział komórkowy. To zahamowanie jest związane z genem sulA należącym do systemu SOS, którego produkt blokuje FtsZ, białko konieczne do zapoczątkowania tworzenia się septy (sekcja 3. 2. 1). 48

3. 2. 2 Modele podziału komórkowego Podział komórki (np. E. coli) na dwie potomne, które są zazwyczaj podobne lub identyczne, nazywany podziałem na dwie, jest z pewnością najpowszechniejszym sposobem podziału komórek bakteryjnych. „Asymetryczny" podział, prowadzący do wytworzenia komórek niepodobnych do komórki rodzicielskiej występuje np. u Caulobacter (rozdz. 4). Podział wielokrotny jest związany z powtarzającymi się podziałami podwójnymi i występuje np. u sinic. Podział na trzy prowadzi do utworzenia trzech komórek z jednej i występuje np. u Pelodictyon — organizmu tworzącego trójwymiarową sieć komórek. Pączkowanie jest formą podziału, podczas którego komórka potomna powstaje z komórki macierzystej (ojcowskiej) na skutek miejscowego przerostu (pączka) i spotykany jest np. u gatunków Blastobacter, Hyphomicrobium i Nitrobacter.

3. 2. 3 Czas podwojenia liczby komórek Czas konieczny do przebiegu jednego pełnego cyklu komórkowego, czyli czas podwojenia liczby komórek, waha się zależnie od gatunku i warunków wzrostu. Czas ten jest najkrótszy w warunkach optymalnych. Dla E. coli minimalny czas podwojenia liczby komórek wynosi około 20 min, dla niektórych innych gatunków, np. Mycobacterium, czas ten wynosi wiele godzin. Wyliczono, że czas podwojenia liczby komórek Mycobacterium leprae, bakterii wywołującej trąd, w zainfekowanych tkankach trwa około 2 tygodni.

3. 3 Wzrost populacji bakteryjnych Każda komórka potomna powstała w wyniku podziału komórkowego może sama rosnąć i dzielić się. W związku z tym, w sprzyjających warunkach z jednej komórki może powstać liczna populacja. Populacje mogą się rozwijać na powierzchniach stałych lub w płynach. W bakteriologii każde ciało stałe lub płyn przygotowany specjalnie do wzrostu bakterii nazywamy pożywką (podłożem) (sekcja 14. 2).

3. 3. 1 Wzrost na podłożu stałym Jednym z typowych stałych podłoży powszechnie stosowanych w bakteriologii jest galaretowata substancja (żel agarowy) zawierająca związki odżywcze i inne składniki. Załóżmy, że pojedyncza komórka bakteryjna została umieszczona na powierzchni takiego podłoża dostarczającego wszystkich składników potrzebnych do wzrostu i podziału. Komórka więc rośnie, dzieli się na dwie, a każda z komórek potomnych powtarza te procesy. W trakcie ciągłego wzrostu i podziału potomstwo komórki wyjściowej tworzy widoczną gołym okiem masę komórek. Nazywamy ją kolonią. 49

Zazwyczaj, w określonych warunkach wzrostu, każdy gatunek tworzy kolonie o charakterystycznym rozmiarze, kształcie (rys. 3. 3), kolorze i konsystencji. Podczas wzrostu na różnych podłożach lub w innych warunkach różnicujących mogą powstawać różne rodzaje kolonii. Wielkość kolonii może być ograniczona np. przez miejscowe wyczerpanie się substancji odżywczych (zależne od wzrostu kolonii). Z tego powodu, liczne, położone blisko siebie kolonie są przeważnie mniejsze od kolonii odległych. Szybkość powiększania się rozmiarów kolonii zależy od temperatury i innych czynników. Bakterie wytwarzające barwniki tworzą zazwyczaj jaskrawo zabarwione kolonie (np. czerwone, żółte, fioletowe). Kolonie bakterii nie mających tej cechy są szare, białawe lub kremowe. Konsystencja kolonii może być śluzowata (lepka, jak śluz), masłowata (podobna do masła), krucha (rozpadająca się) itp. Powierzchnia kolonii natomiast bywa gładka lub szorstka, świecąca lub matowa itp. Przypuśćmy, że nie pojedyncza komórka, lecz ich duża liczba została rozprowadzona na powierzchni podłoża. Może wówczas brakować dostatecznego miejsca do wytworzenia się pojedynczych kolonii. Potomstwo tak wysianych komórek będzie tworzyć jednolitą warstwę pokrywającą całą powierzchnię podłoża. Taki jednolity wzrost nazywany jest zlewającym się („murawa"). Zlewający się wzrost obserwuje się również po wysianiu na podłoże jednej lub kilku ruchliwych bakterii. Potomstwo takich bakterii może pływać w wilgotnej warstewce pokrywającej powierzchnię i w ten sposób rozprzestrzeniać się po całym podłożu.

3. 3. 2 Wzrost w pożywce płynnej W pożywce płynnej bakterie mogą się swobodnie przemieszczać albo na drodze dyfuzji, albo, w przypadku gatunków ruchliwych, na drodze aktywnego ruchu. W ten sposób wzrost i podział komórek w podłożu płynnym doprowadza do ich jednolitego rozprzestrzenienia się w całym środowisku. Zwiększenie się liczby komórek prowadzi zazwyczaj do wzrostu zmętnienia pożywki. Wyjątkowo niektóre bakterie mają skłonność do tworzenia warstwy (błony) na powierzchni podłoża. Podłoże pod błoną może być prawie pozbawione komórek. Niektóre 50

błony składają się zarówno z bakterii, jak i produktów ich metabolizmu, np. szczepy Acetobacter xylinum tworzą sztywną błonę zawierającą celulozę. 3. 3. 2. 1 Hodowle okresowe

Przypuśćmy, że kilka bakteryjnych komórek zostało wprowadzonych do odpowiedniego płynnego podłoża, które następnie było przechowywane w temperaturze odpowiedniej dla danego gatunku. W regularnych odstępach czasu pobrano małe próbki i policzono zawarte w nich bakterie (metody liczenia bakterii: sekcja 14. 8). Sposób ten umożliwia śledzenie rozwoju populacji, czyli wzrostu liczby komórek w czasie. Wykres przedstawiający liczbę komórek w funkcji czasu nazywamy krzywą wzrostu. Dla komórek danego gatunku bakterii rosnących w ściśle zdefiniowanych warunkach krzywa wzrostu ma określony kształt. Namnażając bakterie w lub na podłożu otrzymujemy hodowlę. Hodowlą nazywamy więc płynne lub stałe podłoże z bakteriami wyrosłymi (lub nadal rosnącymi) w nim lub na nim. Zabiegi zmierzające do utrzymania określonej temperatury (i/lub innych żądanych czynników) potrzebnych do wzrostu bakterii nazywamy inkubacją. Początkowe wprowadzenie komórek do podłoża zwie się inokulacją (zaszczepieniem). Nie zawsze podział komórki rozpoczyna się natychmiast po wprowadzeniu bakterii do świeżego, płynnego podłoża. Często występuje początkowa faza zastoju (faza lag), w czasie której komórki dzielą się powoli lub nie dzielą się wcale. W fazie tej zachodzi adaptacja do nowego środowiska — np. tworzone są enzymy niezbędne do wykorzystania nowych, dostępnych substancji pokarmowych. Długość początkowej fazy zastoju zależy w znacznym stopniu od warunków, w których bakterie bytowały przed wprowadzeniem do określonego podłoża. Długa faza zastoju występuje, gdy komórki przebywały w trudnych warunkach lub rosły wykorzystując inne substancje pokarmowe lub w innej temperaturze. W przypadku wzrostu komórek w podobnym lub tym samym podłożu początkowa faza zastoju jest krótka lub w ogóle nie występuje. Podczas (adaptacyjnej) fazy początkowego zastoju zachodzi synteza związków chemicznych, ale wzrostowi masy populacji bakteryjnej nie towarzyszy przyrost liczby komórek. Mówimy wówczas, że komórki charakteryzują się wzrostem niezbalansowanym. Po adaptacji do nowego podłoża, komórki zaczynają rosnąć i dzielić się z szybkością maksymalną dla danego gatunku w tych warunkach. Tę fazę wzrostu nazywamy logarytmiczną lub wykładniczą. Liczba komórek podwaja się ze stałą szybkością, co dotyczy również całej populacji. Mówimy o wzroście zbalansowanym. W logarytmicznej fazie wzrostu wykres przedstawiający liczbę komórek bakterii w funkcji czasu jest ostro wznoszącą się krzywą — przy założeniu, że skala jest arytmetyczna (rys. 3. 4a). Oczywiste jest, że skala ta nie jest przydatna dla dużej liczby bakterii. Czy istnieje inny sposób przedstawienia wzrostu w fazie wykładniczej? Tabela 3. 1 (dolny rząd) pokazuje, że liczba komórek może być wyrażona w postaci potęgi liczby 2, np. 8 komórek w czasie 60 min może być 3 oznaczone jako 2 (3 jest wykładnikiem potęgi). Każdy z wykładników w ta51

beli 3. 1 jest oczywiście logarytmem (przy podstawie 2, tj. log2) odpowiadającej liczby komórek. Jeżeli więc, zamiast bezpośredniego wykreślania liczby komórek wykreślimy log2 danej liczby, wynikiem będzie linia prosta (rys. 3. 4b). Na takim wykresie każda jednostka na skali log2 określa podwojenie liczby bakterii. Czas podwojenia liczby bakterii (w minutach) może być więc bezpośrednio odczytany z osi wykresu przedstawiającej czas. Czas podwojenia liczby bakterii zwany jest również czasem generacji. Wykreślając krzywe wzrostu wygodniej jest zastosować logio zamiast log2; logio i log2 mogą być wzajemnie zamienione z zastosowaniem następującego wzoru: log 10 N=0, 301 log2N. Wykres w fazie logarytmicznej będzie nadal linią prostą — zmieni się jedynie jej nachylenie. Rosnące komórki zużywają substancje odżywcze i wytwarzają produkty odpadowe, które gromadzą się w podłożu. Z tego powodu wzrost staje się wolniejszy wraz z upływem czasu, a następnie zatrzymuje się. Może to nastąpić w wyniku wyczerpania się substancji odżywczych, nagromadzenia się produktów odpadowych lub jednoczesnego działania tych dwóch czynników. Fazę, podczas której w ogóle nie obserwujemy wzrostu liczby żywych komórek, nazywa się fazą stacjonarną. (Warta przeczytania jest krótka monografia „Life after log" [Siegele i Kotler (1972) JB 174: 345-348]. ) Po fazie stacjonarnej następuje faza śmierci, podczas której liczba żywych komórek w populacji stale się zmniejsza.

52

Na rysunku 3. 5 pokazano fazy wzrostu tzw. hodowli okresowej. Określenie to pochodzi od tego, iż wzrost bakterii od początkowej fazy zastoju do fazy śmierci zachodzi w tym samym podłożu.

3. 3. 2. 2 Komórki w różnych fazach wzrostu Biologia komórek i ich metabolizm zmienia się zasadniczo w różnych fazach wzrostu hodowli. Na przykład, komórki rosnące są zazwyczaj zabijane przez penicylinę, a wraz z ustaniem wzrostu stają się oporne na ten antybiotyk. W warunkach ograniczających wzrost lub gdy w ogóle go nie ma, uboczne produkty podstawowego metabolizmu (związanego ze wzrostem) mogą być zużywane przez komórki do syntezy tzw. metabolitów wtórnych, które nie są potrzebne do wzrostu. Metabolity wtórne wytwarzane przez niektóre gatunki bakterii to ważne antybiotyki lub toksyny. [Function of secondary metabolites: Vining (1990) ARM 44: 395-427. ] Dodanie substancji odżywczych we właściwym czasie do hodowli może stworzyć optymalne warunki do syntezy określonych metabolitów w danej fazie wzrostu. Takie hodowle okresowe, dokarmiane stosuje się w przemyśle.

3. 3. 2. 3 Hodowle ciągłe Wzrost bakterii w stałej objętości podłoża (jak w hodowlach okresowych) sprawia, że jego skład nieustannie się zmienia w wyniku zużycia substancji odżywczych i nagromadzenia się produktów odpadowych. Hodowle okresowe są przydatne do wielu badań, choć czasami lepiej jest hodować bakterie w stałych, kontrolowanych i ściśle określonych warunkach. Możemy to osiągnąć zakładając

53

hodowle ciągłe (hodowle z ciągłym przepływem, hodowle otwarte). W takich hodowlach bakterie rosną w podłożu płynnym, w aparacie zwanym chemostatem, a podczas wzrostu zapewniony jest ciągły dopływ świeżego, sterylnego podłoża i jednoczesny, zachodzący z tą samą szybkością, odpływ hodowli (tj. podłoża i komórek). Stałe i silne wytrząsanie zapewnia szybkie mieszanie się wpływającego, świeżego podłoża z hodowlą w chemostacie. Takie warunki umożliwiają ciągły wzrost logarytmiczny, tzn. zrównoważony w przedłużonym czasie. Hodowle ciągłe, ze względu na wzrost w stałych i określonych warunkach, są użyteczne np. do badań bakteryjnego metabolizmu. W chemostacie utrzymywana jest zazwyczaj szybkość wzrostu mniejsza od maksymalnej, ponieważ szybkość zbliżona do maksymalnej powoduje niestabilność układu. W ten sposób masa komórek (biomasa) w chemostacie pozostaje nie zmieniona. W celu utrzymania równowagi w chemostacie, szybkość rozcieńczania hodowli musi się ilościowo równać specyficznej szybkości wzrostu. Szybkość rozcieńczania (D) równa się F/V, gdzie F to szybkość dopływu pożywki do chemostatu (w litrach na godzinę), a V — objętość hodowli. Specyficzna szybkość wzrostu (μ) oznacza ilość biomasy wytwarzanej w ciągu godziny w przeliczeniu na całkowitą biomasę, w gramach. Związek między specyficzną szybkością wzrostu a stężeniem substancji odżywczej ograniczającej wzrost opisuje równanie Monoda:

gdzie μmax oznacza maksymalną szybkość wzrostu, s — stężenie substancji odżywczej ograniczającej wzrost, ks — stężenie substancji odżywczej ograniczającej wzrost przy μ = 0, 5 μ m a k s . Oczywiście wartość D nie powinna przekroczyć krytycznej szybkości D c , odpowiadającej μmax· Jeśli to nastąpi, hodowla stopniowo ulega rozcieńczeniu, mówimy, że jest „wymywana". W praktyce idealne (przewidywane) działanie chemostatu nie zawsze można osiągnąć z powodu niedostatecznie szybkiego (natychmiastowego) mieszania lub takich czynników jak wzrost bakterii na ścianach chemostatu, prowadzący do wytworzenia wyodrębnionej, statycznej (nie mieszanej) populacji komórek. Innym problemem jest pojawianie się mutantów (rozdz. 9) podczas długiego okresu hodowli. 3. 3. 2. 4 Wzrost synchroniczny W populacji rosnących bakterii komórki nie dzielą się jednocześnie. W laboratorium możemy jednak otrzymać populacje komórek dzielących się w przybliżeniu w tym samym czasie. Logarytmiczna część krzywej obrazującej taki typ wzrostu — zwany wzrostem synchronicznym — ma wówczas przebieg skokowy, a każdy skok obrazuje gwałtowne podwojenie się liczby komórek. Jedna z metod otrzymania hodowli synchronicznej, czyli synchronizacji hodowli, opiera się na tym, że stosunek masy do objętości, tj. gęstość bakterii zmienia się podczas cyklu komórkowego. Gęstość jest największa w komórkach tuż przed podziałem i w świeżo powstałych komórkach potomnych. W populacji 54

niesynchronicznej komórki charakteryzujące się najmniejszą gęstością są więc prawdopodobnie w podobnych stadiach cyklu komórkowego. Ta subpopulacja mniej gęstych komórek może być oddzielona od reszty populacji przez zastosowanie techniki wirowania w gradiencie gęstości (sekcja 8. 5. 1. 4). Zaletą tej czysto fizycznej metody jest możliwość uniknięcia zakłóceń metabolizmu komórkowego. 3. 3. 2. 5 Zależność wzrostu od temperatury — wykres Arrheniusa i wykres Ratkowsky'ego Zmiany temperatury mają duże znaczenie dla szybkości wzrostu głównie z powodu ich wpływu na reakcje chemiczne zachodzące w komórce (metabolizm — rozdz. 5 i 6). W ograniczonym zakresie temperatur zależność między szybkością wzrostu a temperaturą jest podobna do zależności między szybkością reakcji chemicznych a temperaturą, co obrazuje wykres Arrheniusa, w którym logarytm szybkości wzrostu jest wykreślony względem odwrotności temperatury absolutnej (l/K). Jednak dla szerokiego zakresu temperatur wykres ten nie jest liniowy. Ratkowsky i wsp. [JB (1983) 154: 1222-1226] pokazał, że zależność liniowa może być osiągnięta dla całego zakresu temperatury biokinetycznej, jeśli wykreślimy pierwiastek kwadratowy szybkości wzrostu względem temperatury absolutnej.

3. 4 Diauksja (wzrost dwufazowy) Jeżeli w pożywce dostępne są dwie różne substancje pokarmowe, bakteria może preferencyjnie zużywać jedną z nich. Zużywanie drugiej substancji rozpocznie się po wyczerpaniu się pierwszej. Z mieszaniny glukozy i laktozy E. coli zużyje najpierw glukozę, a po jej wyczerpaniu zacznie wykorzystywać laktozę. W momencie zmiany substancji odżywczej wzrost może być powolniejszy lub nawet się zatrzymać. Taki sposób wzrostu nazywamy diauksją. Mechanizm diauksji jest omówiony w sekcji 7. 8. 2. 1.

3. 5 Pomiar wzrostu Wzrost (zmiany liczby komórek lub biomasy w czasie) mogą być mierzone przez: 1) liczenie komórek (sekcja 14. 8), 2) oznaczenie wzrostu suchej biomasy w określonym czasie, 3) śledzenie pobrania (lub wydzielenia) określonej substancji, 4) pomiar ilości substancji radioaktywnej włączonej do biomasy w określonym czasie i 5) nefelometrycznie, czyli przez pomiar zwiększenia zdolności do rozpraszania wiązki świetlnej podczas jej przejścia przez płynną hodowlę (rozproszenie światła zwiększa się wraz ze wzrostem liczby komórek).

ROZDZIAŁ

4 Różnicowanie

U większości gatunków bakterii nie obserwuje się w cyklu życiowym dużych zmian kształtu komórki lub jej funkcjonowania. Komórki potomne są w mniejszym lub większym stopniu identyczne, zarówno pod względem wyglądu, jak i zachowania, z komórkami rodzicielskimi. Jednak u niektórych bakterii z komórek określonego typu mogą powstać komórki znacząco różne. Moment rozpoczęcia takiego różnicowania jest często związany z warunkami środowiska, w jakich znajduje się komórka. Na następnych stronach omówimy kilka przykładów różnicowania bakterii.

4. 1 Cykl życiowy Caulobacter Caulobacter jest ściśle tlenową bakterią gramujemną, żyjącą w glebie i wodzie. Tworzy on dwa zupełnie różne typy komórek, a przejście z jednego typu do drugiego stanowi ważną część cyklu życiowego (rys. 4. 1). Występowanie formy ruchliwej w cyklu życiowym jest korzystne, gdyż pozwala organizmowi na przenoszenie się do różnych miejsc. Ruchliwą komórkę można traktować jako niedojrzałą, gdyż przed kolejnym podziałem musi ona utracić rzęskę i wytworzyć łodyżkę (prostheca). Macierzysta komórka z łodyżką (dojrzała forma) sama nigdy nie staje się ruchliwa, ale może wytworzyć formę zdolną do ruchu. Tak więc, w trakcie normalnego wzrostu Caulobacter w odpowiednim czasie i miejscu powstaje rzęska i łodyżka, aby mogło dojść do asymetrycznego podziału na komórkę z rzęską i komórkę z łodyżką. Jak to się dzieje? Odpowiedzi na pewne pytania dotyczące rozwoju i różnicowania dostarczają badania wewnątrzkomórkowej lokalizacji białek, z zastosowaniem takich technik jak fuzja z GFP (sekcja 8. 5. 2). Dzięki nim w niektórych przypadkach można było wykazać powiązanie aktywacji swoistych białek (wyznakowanych GFP) w komórce z ważnymi aspektami jej podziału lub różnicowania. Cyklem komórkowym Caulobacter rządzą sygnały pochodzące z samej komórki. Ich natura jest nieznana, ale wydaje się, że przekazanie sygnału zacho-

56

1. Dojrzała komórka z łodyżką przyczepiona do powierzchni lepkim „zaczepem". 2. Komórka z łodyżką zaczyna się dzielić. 3. Na wolnym końcu komórki potomnej powstaje rzęska. 4. Zachodzi asymetryczny podział poprzeczny i ruchliwa komórka potomna odpływa. Komórka z łodyżką może rosnąć i wytwarzać dalsze komórki ruchliwe. 5. Komórka ruchliwa traci rzęskę i przykleja się swoim zaczepem do podłoża. 6. Rozwija się łodyżka i komórka dojrzewa. Staje się nową komórką macierzystą, obdarzoną łodyżką.

dzi podobnie jak w dwuskładnikowym systemie regulacji (sekcja 7. 8. 6) lub w transferze fosforu (rys. 7. 14). W Caulobacter crescentus regulatorem odpowiedzi jest CtrA. Po rozpoczęciu replikacji DNA w komórkach z łodyżką (przed podziałem komórki) poziom CtrA~P rośnie, co prowadzi do transkrypcji różnych genów — w tym również „wczesnych" genów rzęskowych, takich jak fliF (kodującego pierścień MS: rys. 2. 8), ftsZ (biorącego udział w tworzeniu przegrody (septy): sekcja 3. 2. 1) i nieaktywnego białka FlbD, będącego regulatorem genów. Białko FliF jest przenoszone (dzięki nieznanemu mechanizmowi) do swoistego miejsca na biegunie rozwijającej się komórki potomnej, co oznacza, że pierścień MS powstaje zanim zostanie wytworzona przegroda. Po wytworzeniu przegrody między komórką z łodyżką i komórką potomną białko FlbD jest aktywowane (fosforylowane) przez kinazę FlbE, zlokalizowaną blisko przegrody w komórce potomnej; FlbD~P inicjuje transkrypcję „późnych" genów rzęskowych w komórce potomnej, co prowadzi do powstania rzęski na biegunie tej komórki. (Analogicznie w czasie sporulacji u Bacillus subtilis lokalizacja fosfatazy SpoIIE na specyficznej stronie asymetrycznej przegrody jest ważnym czynnikiem różnicowania — patrz legenda do rys. 7. 14. ) Ponadto w komórce potomnej (ale nie w komórce z łodyżką) CtrA~P wiąże się z origin chromosomu (sekcja 7. 3) i hamuje replikację DNA; tak więc komórka ruchliwa nigdy się 57

nie podzieli zanim nie stanie się dojrzała (rys. 4. 1). [Control of differentiation in Caulobacter crescentus: Shapiro i Losick (1997) Science 276: 712-718. ] Różnicowanie komórek nieruchliwych w ruchliwe, i vice versa, zachodzi też w różnych gatunkach Hyphomicrobium i Rhodomicrobium.

4. 2 Wzrost „rozpełzliwy" (ang. swarming) Proteus jest gramujemną pałeczką występującą w jelitach zwierząt i człowieka. Jeśli hoduje się P. mirabilis (lub inny gatunek — P. vulgaris) na odpowiednim podłożu stałym, to pierwsze komórki potomne są krótkimi pałeczkami o długości 2-A μm, zaopatrzonymi w kilka rzęsek; komórki te w normalny sposób dzielą się i wytwarzają kolonię. Jednak po kilku godzinach wzrostu, komórki znajdujące się na krawędzi kolonii rosną do długości 20-80 μm i pokrywają się licznymi rzęskami. Komórki te (ang. swarm cells) wypływają z kolonii i osiadają w miejscu oddalonym o kilka milimetrów od jej brzegu. Tam każda dzieli się na kilka krótkich pałeczek — podobnych do komórek wyjściowych. Przez kilka pokoleń komórki te normalnie rosną i dzielą się, tworząc grubą, koncentryczną warstwę wzrostu wokół początkowej kolonii. Po pewnym czasie na zewnętrznym brzegu tej strefy powstaje następne pokolenie długich komórek, zdolnych do wzrostu „rozpełzliwego" i cykl się powtarza. W ten sposób cała powierzchnia pożywki zostaje pokryta koncentrycznymi strefami wzrostu (fot. 4. 1). Zdolność do wzrostu „rozpełzliwego" (ang. swarming) występuje też u różnych innych bakterii, zarówno gramujemnych (w tym np. Serratia marcescens,

Widać koncentryczne pierścienie wzrostu (sekcja 4. 2), gdy hoduje się go na 1, 5% agarowym podłożu minimalnym z glukozą i hydrolizatem kazeiny. Zdjęcie uzyskane dzięki uprzejmości: dr. Rasika M. Harsheya, University of Texas w Austin, Texas, USA.

58

(fot. 4. 2) i E. coli), jak i gramdodatnich. Można to wykazać stosując podłoże agarowe (sekcja 14. 2) o mniejszym niż zwykle stężeniu agaru. Nie zawsze powstają przy tym koncentryczne pierścienie wzrostu, takie jak obserwuje się w przypadku P. mirabilis (dzięki okresowemu występowaniu zdolności do wzrostu „rozpełzliwego")· Niektóre bakterie rosną „rozpełzliwie" przez cały czas, tworzą więc jedną cienką warstwę wzrostu, podczas gdy u innych powstają indywidualne mikrokolonie. [Swarming (artykuł przeglądowy): Harshey (1994) MM 13: 389-394. ] Badania wykonane na E. coli wskazują, że chociaż w zjawisku tym biorą udział składniki systemu chemotaksji (sekcja 2. 2. 15. 2), to substancje/sygnały wywołujące wzrost „rozpełzliwy" różnią się od chemoefektorów znanych w chemotaksji [Burkart, Toguchi i Harshey (1998) PNAS 95: 2568-2573].

4. 3 Komórki spoczynkowe U niektórych bakterii w wyniku różnicowania powstają komórki spoczynkowe — spory albo cysty. Formy te mogą pomagać w rozsiewaniu organizmu lub/i służyć do przetrwania w niekorzystnym środowisku. W odpowiednich warunkach spora lub cysta kiełkuje i tworzy nową komórkę wegetatywną.

4. 3. 1 Endospory Endospory zostały lepiej zbadane niż jakikolwiek inny typ spor bakteryjnych. Wytwarzają je gatunki należące do rodzajów Bacillus, Clostridium, Coxiella, Desulfotomaculum, Thermoactinomyces oraz kilka innych gatunków. Endospora powstaje we wnętrzu komórki w odpowiedzi na niedobór składników odżywczych, w szczególności na brak węgla, azotu i/lub fosforu. W dojrzałej endosporze zachodzi bardzo niewiele (albo może nawet żadna) reakcji przebiegających w rosnących komórkach wegetatywnych. Taki stan uśpienia może trwać bardzo długo. Ta forma komórki jest niezwykle oporna na szkodliwe czynniki środowiska: ekstremalne temperatury i pH, wysychanie, promieniowanie, różne czynniki chemiczne, a także uszkodzenia fizyczne. Nieodwracalną inaktywację endospor może zapewnić jedynie brutalny proces sterylizacji (sekcja 15. 1). Tworzenie endospor przedstawiono schematycznie na rysunku 4. 2, a ich budowę pokazano na fotografii 4. 2. Uważa się, że oporność endospor na wysoką temperaturę jest spowodowana małą zawartością wody; dipikolinian wapnia występujący w rdzeniu endospory może działać jako drugorzędny stabilizator. W odpowiednich warunkach endospora kiełkuje, tzn. staje się metabolicznie aktywna. Endospory niektórych gatunków wymagają „aktywacji" przed kiełkowaniem. Aktywacja zachodzi np. po ogrzaniu w temperaturze subletalnej lub poddaniu działaniu pewnych związków chemicznych. Samo kiełkowanie z kolei rozpoczyna się pod wpływem pewnych substancji. Mogą to być, w zależności od gatunku, np. L-alanina, niektóre nukleozydy purynowe, różne jony lub pewne cukry. Kiełkowanie może się rozpocząć od przyłączenia takiego związku do receptora w zewnętrznej błonie spory. Potem kiełkująca endospora przemienia się w komórkę wegetatywną.

59

60

Kontrola genetyczna inicjacji tworzenia endospor została opisana w sekcji 7. 8. 6. 1. N o t k a . Słowo „endospora" zostaje niekiedy skrócone do „spora". Nie należy jednak mylić endospor z innymi typami spor bakteryjnych (patrz sekcja 4. 3. 2).

4. 3. 2 Inne spory bakteryjne U wielu promieniowców rosnących w formie strzępek powstają egzospory — w wyniku tworzenia przegród i fragmentacji strzępek (rys. 4. 3). Spory te nie mają wyspecjalizowanych struktur (takich jak korteks i płaszcz spory), ale wykazują pewną oporność np. na ogrzewanie na sucho, wysychanie i niektóre związki chemiczne. Spory Streptomyces są metabolicznie mniej aktywne niż strzępki wegetatywne, chociaż nie są w stanie całkowitego uśpienia. U takich promieniowców jak Actinoplanes i Pilimelia ruchliwe (urzęsione) zoospory powstają w środku zamkniętego woreczka zwanego sporangium. Sporangia rozwijają się ze strzępek wegetatywnych.

4. 3. 3 Bakteryjne cysty Cysty wytwarza na przykład bakteria glebowa Azotobacter vinelandii. Cysty tego gatunku, oporne na wysychanie, mogą w stanie uśpienia przetrwać w suchych glebach przez wiele lat. Sygnałem do powstawania cyst mogą być zmiany poziomu węgla i azotu w środowisku. Komórka traci wtedy rzęski i buduje złożoną ścianę cysty, zawierającą polisacharyd alginian [Alginate biosynthesis (artykuł przeglądowy): Gacesa (1998) Microbiology 144: 1133-1143], białka i lipidy. Zwykle w cyście nagromadzony zostaje PHB (sekcja 2. 2. 4. 1).

Fot. 4. 2 Różnicowanie Lewa górna część. Mikrografia (z elektronowego mikroskopu transmisyjnego) endospory Bacillus subtilis w komórce macierzystej (ok. 1 μm średnicy). „Rdzeń" (protoplast) endospory jest otoczony błoną (mem). Między błoną i wielowarstwowym płaszczem spory (sc) leży korteks (cx). Endosporę otacza osłona komórkowa (ce) komórki macierzystej. Prawa górna część. Mikrografia świetlna Anabaena spiroides (grube nici) i Anabaena circinalis (cienkie nici) z jeziora Hebgen w Montanie, Stany Zjednoczone. Strzałki pokazują heterocysty, które powstały pomiędzy komórkami wegetatywnymi w nici. Środek, część lewa. Mikrografia (z elektronowego mikroskopu transmisyjnego) heterocysty Anabaena oscillarioides. Zwróć uwagę na grube osłony. Bardzo małe czarne kropki (widoczne najlepiej przez lupę) oznaczają miejsca lokalizacji enzymu — nitrogenazy (sekcja 10. 3. 2. 1); każda kropka to cząstka złota koloidalnego, które jest przyłączone, jako materiał elektronogęsty, do cząsteczki wiążącej się swoiście z nitrogenazą. Środek, część prawa. Mikrografia (z elektronowego mikroskopu transmisyjnego) heterocysty (wyżej) i komórki wegetatywnej (niżej) Anabaena oscillarioides. Dół. Komórki Serratia marcescens zdolne do wzrostu „rozpełzliwego"(patrz sekcja 4. 2). Zwróć uwagę na dużą liczbę rzęsek na każdej z nich. Endospory dzięki uprzejmości dr. Johna Coote'go, University of Glasgow, Szkocja. Heterocysty — dzięki uprzejmości prof. Johna C. Priscu, Montana State University, Bozeman, Montana, USA. Komórki wykazujące wzrost „rozpełzliwy" — dr Rasika M. Harsheya, University of Texas at Austin, Texas, USA.

61

Stadium 0. Wegetatywna komórka zawierająca dwa chromosomy jest gotowa do sporulacji. Stadium I. Wytworzone zostaje włókno osiowe, złożone z dwóch chromosomów. Stadium II. Powstaje asymetryczna przegroda (septa), dzieląca protoplast na dwie nierówne części (fot. 4. 3). Przegroda jest znacznie cieńsza niż ta, która powstaje w czasie normalnego podziału komórki, gdyż zawiera znacznie mniej peptydoglikanu; który jest następnie usuwany w wyniku hydrolizy. Mniejszy z protoplastów, zwany presporą, stanie się endosporą. Błona cytoplazmatyczna większego protoplastu wypukla się, otaczając presporę. Stadium II dzieli się na część 1, 2, 3, jak pokazano na rysunku. W stadium III prespora zostaje całkowicie otoczona dwiema błonami. Stadium IV. Zmodyfikowany peptydoglikan odkładany między tymi dwiema błonami tworzy sztywną warstwę zwaną korteksem. W tym czasie może się też rozwijać luźna osłona białkowa, zwana egzosporium. Stadia V-VI. Na zewnętrznej błonie odkładany jest wielowarstwowy, białkowy płaszcz spory (stadium V) i spora dojrzewa (stadium VI), nabywając takie cechy charakterystyczne jak oporność na ciepło i zdolność do silnego rozpraszania światła, skąd jej obraz w mikroskopie świetlnym. W tym czasie w „rdzeniu", tzn. protoplaście spory (otoczonym zewnętrzną błoną), nagromadza się dipikolinian wapnia. Stadium VII. Dojrzała spora zostaje uwolniona wskutek zniszczenia komórki macierzystej. (Zwróć uwagę, że nie każda endospora ma egzosporium. ).

62

(a) Koniec powietrznej strzępki wegetatywnej, (b) Koniec strzępki zaczyna się zwijać, (c) W całej zwiniętej strzępce powstają przegrody, (d) Ściany rozwijających się spor grubieją i każda z nich zaokrągla się. (e) Spory zostają uwolnione.

4. 4 Akinety, heterocysty, hormogonia Struktury te są tworzone przez różne nitkowate sinice — bakterie fotosyntetyzujące występujące np. w glebie, wodach i żyjące w związkach symbiotycznych z niektórymi eukariotami.

4. 4. 1 Akinety Akinety są wyspecjalizowanymi komórkami wytwarzanymi przez niektóre gatunki, np. w warunkach głodu. Każda ma zgrubiałą ścianę i zawiera w cytoplazmie wiele substancji zapasowych (takich jak glikogen). Akinety są zwykle większe od komórek wegetatywnych i mają obniżony poziom metabolizmu. Wykazują pewną oporność na wysychanie oraz niską temperaturę, mogą więc stanowić formy ułatwiające przezimowanie i/lub rozsiewanie tych sinic.

4. 4. 2 Heterocysty Heterocysty są tworzone przez pewne gatunki, gdy brak jest dostępnych źródeł azotu. W takich warunkach dochodzi do różnicowania niektórych komórek w nici i przekształcenia ich właśnie w heterocysty. Są to wyspecjalizowane komórki „wiążące" azot atmosferyczny (gazowy) — czyli przeprowadzające go w formę dostępną dla organizmu (sekcja 10. 3. 2. 1). Proces różnicowania obejmuje między innymi: wytworzenie grubych osłon, rearanżację tylakoidów, zaprzestanie wytwarzania tlenu (pochodzącego z fotosyntezy) i syntezę nitrogenazy (enzymu wykorzystywanego w wiązaniu azotu). Wydaje się, że grube osłony (patrz fot. 4. 2) chronią nitrogenazę przed tlenem atmosferycznym, na który jest ona wrażliwa. Anabaena flos-aquae tworzy grubsze osłony, gdy hoduje się ją pod zwiększonym ciśnieniem cząstkowym tlenu [Kangatharalingam, Priscu i Paerl (1992) JGM 138: 2673-2678]. Komunikowanie się między heterocystą i sąsiadującą z nią komórką wegetatywną zachodzi poprzez cienkie pory (mikroplaz63

64

modesmy) występujące w przylegających błonach cytoplazmatycznych. Związany azot jest przenoszony do komórek wegetatywnych, które z kolei przekazują heterocyście związki węgla i inne substancje.

4. 4. 3 Hormogonia Hormogonium to krótka nić, nie zawierająca ani akinet, ani heterocyst, wytworzona np. z nici wegetatywnej. Zwykle wykazuje zdolność do ruchu ślizgowego. Komórki w hormogonium mogą być mniejsze niż w nici macierzystej. U niektórych gatunków (np. Nostoc muscorum) tylko hormogonia zawierają wakuole gazowe, co może potwierdzać pogląd, że te krótkie nici służą do „rozsiewania" sinic.

Fot. 4. 3 Sporulacja a podział komórki u Bacillus subtilis Góra. Komórka jest we wczesnej fazie sporulacji (rys. 4. 2, stadium II1). Widać asymetryczną przegrodę. Podziałka = 0, 3 μm. Środek. Endospora (prespora) w późniejszym stadium rozwoju. Podziałka = 0, 3 μm. Dół. Wegetatywny podział komórki. Przegroda zlokalizowana pośrodku komórki jest znacznie grubsza niż przegroda asymetryczna. Podziałka=0, 3 μm. Fotografie — dr Imric Barak, Institute of Molecular Biology, Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slovak Republic.

ROZDZIAŁ

5 Metabolizm I - energia

„Metabolizm" to reakcje chemiczne zachodzące w żywych komórkach: cząsteczki są syntetyzowane (anabolizm), rozkładane (katabolizm) lub zmieniane z jednego typu na inny, a różne atomy są utleniane lub redukowane. W większości z tych reakcji biorą udział swoiste białka katalityczne, zwane enzymami. Zwykle enzymy działają jedynie w ograniczonym zakresie warunków fizykochemicznych; poza tym zakresem mogą utracić swoją aktywność lub zostać zinaktywowane. Wydaje się, że enzymy „ekstremofili" (sekcja 1. 1. 1) mają unikatową strukturę i/lub są stabilizowane przez takie czynniki jak np. termoprotektanty. Stosuje się je w badaniach nad stabilnością enzymów. Jest też prawdopodobne, że zostaną wykorzystane w biotechnologii [Danson i Hough (1998) ΉΜ 6: 306-314]. ) Sekwencja reakcji metabolicznych, w których jeden związek jest kolejno przekształcany w inny (lub inne), zwana jest szlakiem metabolicznym. W takim szlaku substrat (np. związek odżywczy) jest przekształcany poprzez jeden lub wiele związków pośrednich do tak zwanego produktu końcowego lub produktów końcowych. Liczne z bakteryjnych szlaków metabolicznych nie występują u eukariotów. Reakcje metaboliczne są w wielu wypadkach endoergiczne, tzn. wymagają dostarczenia energii. Energia jest też potrzebna do ruchu (u gatunków ruchliwych) i do pobierania różnych składników pokarmowych. Większość bakterii uzyskuje energię przekształcając związki chemiczne ze środowiska. Organizmy te są zwane chemotrofami. Inne bakterie, które wykorzystują energię słoneczną, określa się mianem fototrofów. Jednak ani związki chemiczne ze środowiska, ani światło słoneczne nie mogą być wykorzystane bezpośrednio do zasilania procesów komórkowych wymagających energii. Tak więc komórka musi mieć zdolność przekształcania tych „środowiskowych" źródeł energii na taką jej formę, jaka będzie mogła być przez nią wykorzystywana. Jaka jest ta „dogodna" forma energii? Wykorzystując pewne związki chemiczne lub światło słoneczne bakterie mogą wytwarzać specyficzne związki „wysokoenergetyczne", które mogą następnie zaspokajać ich potrzeby energetyczne. Do związków tych należą: adenozyno66

-5-fosforan (ATP), fosfoenolopirogronian, acetylofosforan i acetylo-CoA. Nazwano je cząsteczkami „waluty" energetycznej, gdyż komórka może je wydatkować (zamiast energii „środowiskowej"), tak jak my używamy monet i banknotów zamiast sztabek złota. Niektóre z takich cząsteczek przedstawiono na rysunku 5. 1. ATP (rys. 5. la) dostarcza energii, gdy zostaje rozerwane jego końcowe wiązanie fosforanowe. Skutkiem tego, w miarę jak wykorzystywane są cząsteczki ATP (do potrzeb energetycznych komórki), powstają cząsteczki adenozyno-5'-difosforanu (ADP). Tak więc poprzez fosforylację ADP energia środowiskowa zostaje sprzęgnięta z resyntezą ATP. Inny typ „waluty" energetycznej stanowi dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD), który niesie energię w postaci „siły redukującej": może on przyjmować i oddawać energię będąc, odpowiednio, redukowany i utleniany (rys. 5. 1b). Inne nośniki siły redukującej to fosforan NAD (NADP) i dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD). Energia pochodząca ze środowiska może też zostać przekształcona w formę + elektrochemiczną, w postaci gradientu jonów (zwykle protonów — H ) między dwiema powierzchniami błony cytoplazmatycznej. Energia tego gradientu może być wykorzystana do transportu, do napędzania ruchu obrotowego rzęsek (sekcja 2. 2. 14. 1) i do syntezy związków wysokoenergetycznych! W jaki sposób bakteria tworzy związki wysokoenergetyczne lub gradient jonów z energii „środowiskowej"? Chemotrofy i fototrofy wykorzystują do tego celu różne strategie, co opisano niżej.

5. 1 Metabolizm energetyczny chemotrofów Chemotrofy przetwarzają związki chemiczne, by uzyskać energię. Chemoorganotrofy wykorzystują związki organiczne, zaś chemolitotrofy — związki nieorganiczne bądź pierwiastki chemiczne. (Mechanizmy pobierania związków chemicznych zostały omówione w sekcji 5. 4. )

5. 1. 1 Metabolizm energetyczny chemoorganotrofów Chemoorganotrofy wykorzystują substraty organiczne w dwóch głównych typach metabolizmu energetycznego: fermentacji i oddychaniu1. Niektóre z nich mogą przeprowadzać tylko jeden z tych procesów, inne — oba, w zależności od warunków. 5. 1. 1. 1 Fermentacja Fermentacja jest rodzajem metabolizmu energetycznego, w którym substrat jest metabolizowany bez udziału egzogennego (tzn. zewnętrznego) czynnika 1

Angielskie terminy „respiration" i „respiratory metabolism" są tłumaczone odpowiednio jako „oddychanie" i „metabolizm oddechowy" i stosowane do określenia wszystkich procesów dostarczających energii bakteriom chemotroficznym (zarówno chemoorganotrofom, jak i chemolitotrofom), w których wykorzystany jest łańcuch transportu elektronów i fosforylacja oksydatywna (przyp. tłum). 67

(a) Adenozyno-5'-trifosforan (ATP). Przy dostarczaniu energii rozrywane jest wiązanie γ i odłączona zostaje grupa fosforanowa; powstający w wyniku tego adenozyno-5'-difosforan (ADP) musi być fosforylowany, aby został zregenerowany ATP. (b) Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD) w formie zredukowanej (wyżej) i utlenionej (niżej); e=elektron. Ściśle rzecz biorąc forma utleniona powinna być zapisana jako NAD+, ale dla wygody często pisze się NAD; podobnie forma zredukowana powinna być zapisana jako NADH + H+, ale stosuje się NADH. Fosforan NAD (NADP) to 2'-fosforan NAD, który ma grupę fosforanową w pozycji 2' cząsteczki (lewoskrętnej) cukru (D-rybozy).

utleniającego. ( N o t k a . Fermentacja zwykle (ale niekoniecznie) zachodzi beztlenowo, ale nie jest to cecha charakterystyczna wyłącznie dla tego procesu; jak zobaczymy później, oddychanie też może zachodzić bez udziału tlenu. ) Ponieważ nie jest tu wykorzystywany zewnętrzny czynnik utleniający, produkty fermentacji w sumie nie są ani bardziej, ani mniej utlenione niż substrat. Oznacza to, że utlenianie jakiegoś związku pośredniego w fermentacji jest zrównoważone przez redukcję innego związku pośredniego w tym procesie. Zostało to schematycznie przedstawione na rysunku 5. 2.

68

W procesie tym z substratu organicznego powstają związki pośrednie, które wzajemnie się utleniają i redukują. W sumie produkty mają taki sam stopień utlenienia jak wyjściowy substrat. (Porównaj z rys. 5. 4).

Można te procesy lepiej zrozumieć rozważając pewne konkretne przykłady szlaków metabolicznych. U wielu bakterii fermentacja glukozy zaczyna się od szlaku zwanego glikolizą lub szlakiem Embdena-Meyerhofa-Parnasa (rys. 5. 3). W szlaku tym 1 cząsteczka glukozy dostarcza (poprzez pewną liczbę związków pośrednich) 2 cząsteczek kwasu pirogronowego, będącego produktem końcowym. W dwóch miejscach tego szlaku (rys. 5. 3) energia pochodząca z reakcji egzoergicznych (tzn. dających energię) jest wykorzystywana do fosforylacji ADP, to znaczy do syntezy ATP z ADP. Proces bezpośredniego wykorzystania energii pochodzącej z reakcji chemicznej do syntezy ATP z ADP zwany jest fosforylacją substratową.

Uwzględniając cząsteczki będące „walutą" energetyczną szlak EMP można podsumować następująco: 2ATP + 4ADP + 2NAD -> 2ADP + 4ATP + 2NADH Tak więc każda cząsteczka glukozy daje 2NADH i netto 2ATP. Aby następne cząsteczki glukozy mogły być metabolizowane, musi zostać dostarczony zarówno ADP, jak i NAD. ADP powstaje z ATP, gdy ten jest wykorzystywany jako dawca energii. W jaki sposób jednak powstaje NAD z NADH, skoro nie ma w fermentacji zewnętrznego czynnika utleniającego? Wspomniano wcześniej, że fermentacja glukozy może zacząć się od glikolizy; w rzeczywistości szlak ten jest jedynie początkiem pewnej liczby różnych dróg metabolicznych: to, co się będzie działo z NADH (i kwasem pirogronowym), zależy od zachodzących potem reakcji. W najprostszym przypadku NADH oddaje swoją siłę redukującą kwasowi pirogronowemu, co oznacza, że utlenienie NADH do NAD jest sprzężone z redukcją kwasu pirogronowego do kwasu mlekowego: kwas pirogronowy + NADH —» kwas mlekowy + NAD Reakcja ta pokazuje jedną z możliwych odmian fermentacji — tak zwaną fermentację mlekową. Reakcja, w której kwas mlekowy jest jedynym (lub dominującym) produktem, zwana jest fermentacją homomlekową. W wyniku fermentacji heteromlekowej obok kwasu mlekowego powstają też inne produkty. Kwas mlekowy — produkt końcowy fermentacji — zostaje uwolniony przez komórki do środowiska. 69

Przerywaną strzałką, poczynając od fruktozo-1, 6-bisfosforanu, oznaczono uproszczony odcinek tego szlaku. Każdą z dwóch fosforylacji substratowych zaznaczono gwiazdką; w obu przypadkach fosforan jest przenoszony na ADP z wysokoenergetycznego wiązania fosforanowego w związku organicznym. Chociaż dwie z reakcji w tym szlaku wymagają ATP, to zysk netto wynosi 2ATP na każdą cząsteczkę zużytej glukozy. ( N o t k a . Nazwy kwas pirogronowy i pirogronian oraz kwas fosfoenolopirogronowy i fosfoenolopirogronian używa się wymiennie. ) Większość reakcji tego szlaku jest odwracalna.

Tak zwane bakterie mlekowe (np. różne gatunki Lactobacillus i Leuconostoc) są szeroko wykorzystywane w przetwórstwie spożywczym (np. do wyrobu niektórych serów i innych produktów mlecznych, salami, kiszonej kapusty i ogórków, chleba pieczonego z użyciem zakwasu). [Genetics, metabolism and application of lactic acid bacteria (sympozjum): FEMSMR (1993) 12: 1-272. ] Należy zwróć uwagę, że kwas mlekowy (C3H6O3) ma taki sam stopień utlenienia jak glukoza (C6H12O6), tzn. netto nie zaszła tu ani redukcja, ani utlenienie. Wprawdzie aldehyd 3-fosfoglicerynowy został utleniony, ale jest to zrównoważone przez redukcję kwasu pirogronowego do kwasu mlekowego (rys. 5. 4). Inne fermentacje, zaczynające się od glikolizy, to fermentacja kwasów mieszanych (rys. 5. 5) i fermentacja butanodiolowa (rys. 5. 6). W obu procesach kwas pirogronowy jest metabolizowany do kilku produktów końcowych, których względne ilości mogą się zmieniać w zależności od warunków wzrostu. 70

Zwróć uwagę na to, że utlenianie jest zrównoważone odpowiednią redukcją. Fermentację homomlekową przeprowadzają niektóre tzw. bakterie mlekowe, wykorzystywane w przemyśle spożywczym.

Fermentacja kwasów mieszanych (rys. 5. 5) zachodzi np. u Escherichia coli i u bakterii należących do rodzajów Proteus i Salmonella. W kwaśnym środowisku E. coli i inne gatunki, które mają układ enzymatyczny liazy mrówczan: wodór, mogą rozłożyć kwas mrówkowy na dwutlenek węgla i wodór; przeprowadzają więc fermentację z wytworzeniem gazu. Bakterie, które podobnie jak Shigella nie mają tego systemu enzymatycznego, nie wytwarzają gazu. (Z tego widać, że nie zawsze produktem fermentacji jest gaz. ) Fermentację butanodiolową (rys. 5. 6) przeprowadzają np. gatunki należące do Enterobacter, Erwinia, Klebsiella i Serratia. Ilość kwasu wytworzonego w tym

procesie jest znacznie mniejsza niż w fermentacji kwasów mieszanych. Niektóre szczepy w pewnych warunkach produkują małe ilości diacetylu (CH3. CO. CO. CH3) z kwasu acetomlekowego. Chociaż fermentacje kwasów mieszanych i butanodiolowa są bardziej skomplikowane niż fermentacja homomlekowa, to jednak podlegają tym samym podstawowym zasadom. Tworzenie produktów bardziej utlenionych niż glukoza (np. kwas mrówkowy) jest zawsze zrównoważone przez tworzenie produktów bardziej od niej zredukowanych (np. etanol), natomiast względne proporcje produktów końcowych mogą się zmieniać. NADH i inne związki powstające w czasie fermentacji są wykorzystywane w różny sposób. Część NADH zostaje utleniona w reakcjach biosyntezy (zamiast być wykorzystana do tworzenia takich produktów jak kwas mlekowy). Dzięki temu związki takie jak pirogronian będą mogły zostać zużyte w reakcjach biosyntezy jako prekursory (sekcja 6. 3. 1 i rys. 6. 3). U chemoorganotrofów zarówno w oddychaniu (sekcja 5. 1. 1. 2), jak i w fermentacji istnieje ścisły związek między metabolizmem energetycznym i metabolizmem węglowym (sekcja 5. 3. 1). Bakterie przeprowadzające fermentację wykorzystują związki wysokoenergetyczne, takie jak ATP i NADH, a także mogą wykorzystywać energię w formie gradientu jonów, o której wspomniano wcześniej. Ten rodzaj energii jest u nich zwykle otrzymywany poprzez przekształcenie ATP w specyficznych, błonowych systemach enzymatycznych zwanych ATPazami (szczegóły w sekcji 5. 1. 1. 2). U niektórych bakterii fermentacyjnych gradient jonów może również powstawać w wyniku wypływu produktów końcowych (sekcja 5. 3. 3). N o t k a . Zanim skończymy omawiać ten temat, warto wspomnieć, że w przemyśle termin „fermentacja" jest powszechnie używany na określenie każdego procesu chemicznego przeprowadzanego przez bakterie, nawet takiego, w którym reakcje fermentacji nie zachodzą. 71

72

73

5. 1. 1. 2 Oddychanie

Oddychanie jest rodzajem metabolizmu energetycznego, w którym substrat jest przekształcany z udziałem egzogennego (tzn. zewnętrznego) czynnika utleniającego (porównaj z fermentacją: sekcja 5. 1. 1. 1). Oddychanie może zachodzić w obecności tlenu (przy czym sam tlen służy jako zewnętrzny czynnik utleniający) lub beztlenowo (gdy zamiast tlenu są wykorzystywane inne nieorganiczne lub organiczne czynniki utleniające). (Ponieważ wciąż mówimy o chemoorganotrofach, substrat jest zawsze związkiem organicznym, chociaż czynnik utleniający może być organiczny bądź nieorganiczny. ) W sytuacji wykorzystania zewnętrznego czynnika utleniającego substrat zostaje całkowicie utleniony (rys. 5. 7); glukoza na przykład może zostać utleniona do dwutlenku węgla i wody. Takie utlenienie substratu daje więcej energii niż jego fermentacja. W jaki sposób jest utleniany substrat i jak jest otrzymywana energia? Utlenianie typowego substratu organicznego pokazano na rysunku 5. 7: jest ono sprzężone z redukcją NAD, a powstający NADH jest utleniany przez zewnętrzny czynnik utleniający. Zwykle NADH i zewnętrzny czynnik utleniający współdziałają nie bezpośrednio, lecz poprzez łańcuch transportu elektronów zlokalizowany w błonie cytoplazmatycznej. Jest to łańcuch wyspecjalizowanych cząsteczek (czynników redoks), które tworzą drogę przenoszenia elektronów. Sekwencja poszczególnych czynników redoks jest taka, że elektrony mogą płynąć w dół gradientu redoks (w kierunku bardziej dodatniego końca) w serii reakcji utlenienia/redukcj'i. Elektrony z NADH mogą płynąć w dół gradientu do zewnętrznego czynnika utleniającego; gdy jest nim tlen, całość procesu można podsumować tak jak pokazano na rysunku 5. 8. Końcowy biorca elektronów (w tym wypadku tlen) jest nazywany końcowym akceptorem elektronów. Tego rodzaju przepływ elektronów dostarcza energii, gdyż elektrony poruszają się w kierunku obszarów o mniejszej energii. Uwolniona energia jest wykorzystywana przez komórkę do pompowania protonów (jonów wodorowych — H+)

Wzajemne powiązania między substratem, produktami końcowymi i zewnętrznym czynnikiem utleniającym w oddychaniu wykorzystującym typowy substrat organiczny (porównaj rys. 5. 2). W tym przykładzie, NADH wytworzony w czasie metabolizowania substratu jest utleniany przez zewnętrzny czynnik utleniający. Zachodzi to na ogół nie bezpośrednio, lecz poprzez łańcuch transportu elektronów (patrz tekst).

74

Łańcuch transportu elektronów składający się z trzech składników (Χ, Υ i Z), z tlenem jako końcowym akceptorem elektronów, przy utlenianiu typowego, organicznego substratu oddechowego. Metabolizm komórkowy wytwarza NADH, który musi być utleniany w celu odtworzenia NAD. Część NADH jest utleniana do NAD w reakcjach biosyntezy, a część poprzez łańcuch transportu elektronów. W łańcuchu tym NADH jest utleniany przez przeniesienie elektronów na utlenioną formę X (która zostaje zredukowana). Zredukowana forma X zostaje utleniona przez przeniesienie elektronów na utlenioną formę Υ — i tak dalej. Końcowym etapem jest redukcja tlenu do wody. Ciągłe linie zakrzywione oznaczają drogę przepływu elektronów. Zarówno utlenienie NADH (enzym dehydrogenaza NADH), jak i redukcja tlenu (przez oksydazę cytochromową) zachodzi na wewnętrznej (tzn. cytoplazmatycznej) stronie błony cytoplazmatycznej.

poprzez błonę cytoplazmatyczną z jej strony wewnętrznej do zewnętrznej. Prowadzi to do braku równowagi ładunkowej (i pH) między dwiema powierzchniami błony. Tendencja protonów do powrotu na stronę wewnętrzną błony (a więc do stanu zrównoważonego) stanowi formę energii zwaną siłą protonomotoryczną. Siła ta jest jedną z najważniejszych i najbardziej uniwersalnych form energii w komórce. Może zostać użyta bezpośrednio do zaspokojenia pewnych potrzeb energetycznych, na przykład do napędzania ruchu rzęsek (sekcja 2. 2. 14. 1), do transportu (pobierania) różnych jonów. Pobieranie jonów jest procesem wymagających energii, gdyż błona cytoplazmatyczna jest zwykle dla nich nieprzepuszczalna (sekcja 2. 28). Siła protonomotoryczna może też dostarczać energii do transportu niektórych substratów przez błonę cytoplazmatyczną (np. transport laktozy u E. coli), do fosforylacji ADP (z wytworzeniem ATP) przez kompleksy enzymów (ATPazy) zlokalizowane w błonie cytoplazmatycznej. Protony przechodząc poprzez ATPazę (z zewnętrznej na wewnętrzną powierzchnię błony) dostarczają energii niezbędnej do uwolnienia ATP z miejsc katalitycznych ATPazy na cytoplazmatycznej stronie błony. W oddychaniu, kiedy siła protonomotoryczna jest wykorzystywana jako źródło energii do syntezy ATP z ADP, proces ten jest zwany fosforylacją oksydatywną (porównaj z fosforylacją substratową w sekcji 5. 1. 1. 1). Ciekawe, że ATPazy błonowe mogą też katalizować hydrolizę ATP do ADP, a uwolniona energia jest wykorzystywana do pompowania protonów (na zewnątrz) przez błonę, tzn. do zwiększania siły protonomotorycznej. Tak więc energia zawarta w ATP i sile protonomotorycznej może ulegać wzajemnym przemianom. Cały ten mechanizm jest podsumowany na rysunku 5. 9. Sama ATPaza składa się z dwóch głównych części. Domena Fo jest kanałem protonowym, który przechodzi przez całą szerokość błony; domena F1 oddziałuje z cytoplazmatyczną stroną Fo i zawiera miejsca katalityczne, w których syntetyzowany jest ATP. Takie ATPazy zwane są ATPazami typu (Fo F 1 ) . Domena Fo obraca się względem domeny F1 w czasie translokacji protonów. [Energy transduction in ATP synthase: Elston, Wang i Oster (1998) Nature 391: 510-513. ] 75

„Łańcuch oddechowy" to termin używany do określenia łańcucha transportu elektronów w metabolizmie oddechowym (tzn. w oddychaniu). „ATPaza protonowa" jest systemem enzymatycznym (w błonie cytoplazmatycznej), który katalizuje zależną od siły protonomotorycznej fosforylację ADP do ATP, a także hydrolizę ATP do ADP i nieorganicznego fosforanu (Pi). Siła protonomotoryczna jest wykorzystywana do syntezy ATP, a sama zwiększa się w wyniku jego hydrolizy (dostarczającej energii). Siła protonomotoryczna uczestniczy też w redukcji NADP przez NADH. NADPH jest wykorzystywany np. w niektórych komórkowych reakcjach biosyntezy (np. asymilacja amoniaku (sekcja 10. 3. 2).

U bakterii łańcuch transportu elektronów biorący udział w oddychaniu (łańcuch oddechowy) występuje w błonie cytoplazmatycznej (i w pewnych wypadkach w tylakoidach); jego składniki mogą różnić się u poszczególnych gatunków, a także u danego gatunku w zależności od warunków wzrostu. Składnikami łańcucha oddechowego mogą być: 1) cytochromy — białka zawierające żelazo, które pobierają elektrony i następnie przekazują je w wyniku przemiennej redukcji i utleniania atomu żelaza; 2) białka żelazo-siarkowe, takie jak ferredoksyny; i 3) chinony — związki aromatyczne, które mogą ulegać odwracalnej redukcji. Przy wykorzystaniu w oddychaniu typowego substratu organicznego (rys. 5. 8), zarówno utlenienie NADH, jak i redukcja końcowego akceptora elektronów (tlen na rys. 5. 8) wydają się zachodzić w wewnętrznej (tzn. cytoplazmatycznej) stronie błony cytoplazmatycznej. Na rysunku 5. 8 źródło NADH jest określone po prostu jako „metabolizm wytwarzający NADH". Możemy teraz przyjrzeć się niektórym szlakom wykorzystywanym w bakteryjnym oddychaniu. U wielu bakterii metabolizm oddechowy glukozy rozpoczyna się szlakiem Embdena-Meyerhofa-Parnasa (rys. 5. 3). Jednak po wytworzeniu kwasu pirogronowego droga fermentacyjna i oddechowa są całkowicie różne. W tej drugiej kwas pirogronowy jest przekształcany w acetylo-CoA i włączany do szlaku cyklicznego, znanego pod nazwą cyklu

76

kwasów trikarboksylowych (rys. 5. 10) lub cyklu Krebsa, czy też cyklu kwasu cytrynowego. Rysunek 5. 10 pokazuje, że w cyklu kwasów trikarboksylowych acetylo-CoA i kwas szczawiooctowy łączą się, tworząc kwas cytrynowy. W następnych reakcjach wyjściowa cząsteczka kwasu pirogronowego jest w rezultacie utleniana do dwutlenku węgla. Na każdą cząsteczkę utlenionego kwasu pirogronowego zostają zredukowane 4 cząsteczki NAD(P) i 1 cząsteczka FAD, syntetyzowana jest 1 cząsteczka ATP i zregenerowana 1 cząsteczka kwasu szczawiooctowego. NADH i FADH2 zostają utlenione w łańcuchu oddechowym, a powstająca siła protonomotoryczna może być wykorzystana np. do syntezy ATP przez błonową ATPazę. Powinno być teraz jasne, że wydajność energetyczna oddychania jest znacznie większa niż fermentacji. W oddychaniu utlenienie NADH prowadzi, poprzez siłę protonomotoryczną, do syntezy ATP, podczas gdy w fermentacji (gdzie nie ma zewnętrznego czynnika utleniającego) komórka musi pozbyć się NADH syntetyzując takie produkty uboczne jak kwas mlekowy. Oddychanie beztlenowe. Oddychanie beztlenowe w zasadzie jest takie samo jak tlenowe: w obu rodzajach wykorzystywany jest zewnętrzny akceptor elektronów. W warunkach beztlenowych, zamiast tlenu są jednak wykorzystywane takie czynniki utleniające jak azotan, siarczan czy fumaran. Siła protonomotoryczna powstaje w wyniku działania beztlenowego łańcucha oddechowego. Substratem (donorem elektronów) wykorzystywanym przez chemoorganotrofy w oddychaniu beztlenowym może być któryś z rozlicznych związków organicznych, w zależności od gatunku i warunków. W oddychaniu azotanowym jako końcowy akceptor elektronów jest wykorzystywany azotan, ulegając redukcji do azotynu, tlenku azotu, azotu lub amoniaku, w zależności od bakterii. Jeśli w wyniku redukcji powstaje głównie azot cząsteczkowy i tlenek azotu (tzn. gazy), proces zwany jest denitryfikacją, gdyż powoduje straty azotu do atmosfery. Denitryfikacja stanowi problem w rolnictwie, gdyż zmniejsza żyzność gleby (sekcja 10. 3. 2. 2). Może jednak być też procesem pożytecznym, wykorzystywanym do usuwania azotu ze ścieków w oczyszczalniach (sekcja 13. 4). Do bakterii denitryfikacyjnych należą Alcaligenes faecalis, Bacillus licheniformis, Paracoccus denitrificans i Pseudomonas stutzeri. Niegdyś uważano, że denitryfikacja zachodzi jedynie w warunkach beztlenowych lub gdy zawartość tlenu jest zmniejszona. Teraz wiemy, że tlen działa różnie na poszczególne bakterie denitryfikacyjne. Niektóre z nich przeprowadzają denitryfikację tylko w warunkach beztlenowych. Inne są do niej zdolne nawet w obecności tlenu. Są wreszcie takie, które wykorzystują jednocześnie tlen i azotan — chociaż zwykle szybkość denitryfikacji maleje wraz ze wzrostem stężenia tlenu. Niektóre gatunki, w odpowiednich warunkach, są zdolne do dysymilacyjnej redukcji azotanu do amoniaku (sekcja 10. 3. 2). Do substratów wykorzystywanych przez chemoorganotrofy jako donory elektronów w oddychaniu azotanowym zalicza się np. bursztynian (u E. coli). Bakterie redukujące siarczany i bakterie redukujące siarkę wykorzystują, odpowiednio, siarczany i siarkę jako końcowe akceptory elektronów. W czasie 77

Bardzo rozpowszechniony w metabolizmie oddechowym (sekcja 5. 1. 1. 2). Reakcja kwas izocytrynowy -» kwas α-ketoglutarowy jest katalizowana przez enzym dehydrogenazę izocytrynianową, która u większości bakterii jest raczej swoista dla NADP niż dla NAD. NADPH jest wykorzystywany w reakcjach biosyntezy. FAD (dinukleotyd flawinoadeninowy), podobnie jak NAD, niesie energię w postaci „siły redukującej". FADH2 może zostać utleniony poprzez łańcuch oddechowy, co prowadzi do powstania siły protonomotorycznej. U wielu bakterii w etapie prowadzącym od bursztynylo-CoA do kwasu bursztynowego zachodzi synteza guanozyno-5'-trifosforanu (GTP) zamiast ATP. GTP jest wykorzystywany jako cząsteczka „waluty" energetycznej, np. w czasie wiązania aminoacylo-tRNA do miejsca „A" podczas syntezy białek (rys. 7. 9).

78

oddychania beztlenowego siarczan bądź siarka są redukowane do siarczku (rys. 10. 3). Tego typu oddychanie beztlenowe przeprowadzają np. gatunki rodzaju Desulfovibrio (redukują siarczan) i Desulfuromonas (redukują siarkę). Można je znaleźć zwykle w mułach i glebie, gdzie są warunki beztlenowe. Odpowiadają za większość siarkowodoru powstającego w wodach zanieczyszczonych materią organiczną. W oddychaniu fumaranowym końcowym akceptorem jest pochodzący ze środowiska fumaran, który ulega redukcji do bursztynianu. Tego typu oddychanie występuje u różnych bakterii, w tym u E. coli, jeśli są ku temu odpowiednie warunki. Niektóre bakterie (zarówno gatunki gramdodatnie, jak i gramujemne) utleniając substraty organiczne (takie jak octan, mleczan, pirogronian, glicerol, etanol) lub wodór wykorzystują arsenian i selenian jako końcowe akceptory elektronów w oddychaniu beztlenowym. Donorem elektronów mogą być różne związki w zależności od gatunku. Wykazano, że reduktazy arsenianu i selenianu występują w peryplazmie i są związane z błonami. Bakterie o takim typie oddychania można spotkać zarówno w środowiskach skażonych, jak i nieskażonych tymi pierwiastkami. [Bacterial respiration of arsenic and selenium: Stolz i Oremland (1999) FEMSMR 23: 615-627. ]

5. 1. 2. Metabolizm energetyczny u chemolitoautotrofów Chemolitotrofy wykorzystują w swoim metabolizmie energetycznym substraty nieorganiczne — np. siarczek, siarkę elementarną, amoniak, wodór, jony żelazawe itd. Metabolizm jest oddechowy, tlenowy bądź beztlenowy. Elektrony z substratu są przenoszone na końcowy, zewnętrzny czynnik utleniający, w wyniku czego powstaje siła protonomotoryczna (patrz też sekcja 5. 3. 4). Proces ten zachodzi bez udziału NAD (porównaj z metabolizmem oddechowym chemoorganotrofów). Do chemolitotrofów (bezwzględnych i względnych) zalicza się na przykład bakterie z rodzaju Thiobacillus i bakterie nitryfikacyjne. Gatunki z rodzaju Thiobacillus występują np. w glebie i osadach morskich. Zwykle utleniają one, z użyciem tlenu, takie substraty jak siarczek czy siarkę, choć T. denitrificans może wykorzystywać te substraty beztlenowo w oddychaniu azotanowym. Donorem elektronów dla tej bakterii są Fe (II) (jony żelazawe), wykorzystywane w czasie wzrostu beztlenowego, zależnego od azotanu (który jest redukowany przede wszystkim do azotu cząsteczkowego) [Straub i wsp. (1996) AEM 62: 1458-1460J. Thiobacillus ferrooxidans, bezwzględny tlenowiec, może utleniać zarówno jony żelazawe, jak i substraty siarkowe. Bakterie z rodzaju Thiobacillus odgrywają ważną rolę w obiegu siarki (sekcja 10. 3. 3). Bakterie nitryfikacyjne są organizmami o bezwzględnie tlenowym metabolizmie oddechowym. Żyją w glebie i środowiskach wodnych. Energię uzyskują w wyniku nitryfikacji, czyli utleniania amoniaku do azotynu (np. gatunki z rodzaju Nitrosococcus i Nitrosomonas) oraz azotynu do azotanu (np. gatunki z rodzaju Nitrobacter i Nitrococcus). Odgrywają one ważną rolę w obiegu azotu (sekcja 10. 3. 2). 79

5. 1. 2. 1 Fermentacja nieorganiczna

Do całkiem niedawna uważano, że żaden substrat nieorganiczny nie może podlegać fermentacji. Jednak w roku 1987 Bak i Cypionka [Nature (1987) 326: 891-892] opisali taki typ metabolizmu energetycznego, w którym substraty (siarczyn lub tiosiarczan) podlegały „dysproporcjonacji", tworząc siarczek i siarczan. Taką „chemolitotroficzną fermentację" przeprowadza np. Desulfovibrio sulfodismutans.

5. 1. 2. 2 Wytwarzanie metanu

Metan (CH4) jest produktem końcowym procesu energetycznego przeprowadzanego przez pewne bezwzględnie beztlenowe organizmy należące do Archaea, zwane metanogenami. Wydaje się, że żaden organizm należący do Bacteria nie jest zdolny do wytwarzania metanu. Metanogeny żyją np. w mule rzecznym oraz w żwaczu krów i innych przeżuwaczy (środowiska charakteryzujące się Eh niższym niż -330 mV). Niektóre metanogeny (np. Methanobacterium, Methanobrevibacter, Methanococ-

cus, Methanothermus) wytwarzają metan w serii złożonych reakcji, w których w redukcji CO2 bierze udział wodór. Atom węgla z CO 2 wiąże się kolejno z każdą z serii cząsteczek nośników C1 i podlega stopniowej redukcji poprzez -CH 2 i CH 3 do metanu (CH4). Cząsteczki nośników to metanofuran, tetrahydrometanopteryna i kilka koenzymów. Końcowy etap reakcji jest termodynamicznie korzystny i wydaje się sprzężony z wytworzeniem siły protonomotorycznej. Niektóre metanogeny (np. Methanococcoid. es, Methanolobus) mogą wytwarzać metan np. z octanu lub metanolu. Wzrost na pożywce z octanem jest wolniejszy niż na dwutlenku węgla i wodorze (ΔG0 reakcji CH3COOH -> CH 4 + CO2 wynosi około -36 kJ). Zasadniczo w wyniku rozkładu octanu powstaje CO i CH 3 , przy czym ten ostatni jest redukowany do metanu, podczas gdy CO jest utleniany przez wodę (enzym dehydrogenaza CO) do CO 2 i 2H. W błotnistych glebach octan może być substratem preferownym w niskich temperaturach [Wagner i Pfeiffer (1997) FEMSME 22: 145-153]. [Enzymes in methanogenesis: Ferry (1999) FEMSMR 23: 13-38. ]

5. 2 Metabolizm energetyczny fototrofów Fototrofy uzyskują energię ze światła słonecznego — w większości przypadków w wyniku fotosyntezy.

5. 2. 1 Fotosynteza W fotosyntezie energia w postaci światła jest absorbowana przez wyspecjalizowane barwniki i wykorzystywana do wytworzenia cząsteczek „waluty" energetycznej i/lub siły protonomotorycznej. We wszystkich przypadkach fotosynteza zachodzi w błonach zawierających chlorofile, barwniki dodatkowe i łańcuch(y) 80

transportu elektronów. Chlorofile są zielonymi barwnikami zawierającymi magnez. Sinice zawierają chlorofil a (który występuje też u glonów i roślin wyższych). Inne bakterie fotosyntetyzujące zawierają jeden lub większą liczbę bakteriochlorofili - barwników podobnych do chlorofili. Tak zwane jasne reakcje fotosyntezy obejmują wszystkie (fotochemiczne) zdarzenia biorące udział w przekształcaniu energii świetlnej w siłę protonomotoryczną lub energię chemiczną. Reakcje ciemne (= reakcje niezależne od światła) to przemiany związane z wykorzystaniem przez komórkę energii pochodzącej z fotosyntezy do syntezy związków węgla. Bakterie fotosyntetyzujące można podzielić na dwie grupy: przeprowadzające fotosyntezę tlenową (i wytwarzające tlen jako produkt uboczny), i takie, które przeprowadzają fotosyntezę beztlenową (i nie wytwarzają tlenu). 5. 2. 1. 1 Fotosynteza oksygenowa (z wytworzeniem tlenu) u bakterii Tego typu proces, bardzo przypominający fotosyntezę roślin zielonych i glonów, zachodzi u sinic. Ponieważ sinice przeprowadzają fotosyntezę typu eukariotycznego, były przez wiele lat uważane nie za bakterie, lecz za „niebieskozielone glony". Dziś nie ma wątpliwości, że są one bakteriami. U prawie wszystkich sinic fotosynteza zachodzi w błonach tylakoidów (sekcja 2. 2. 7). (W szczepach Gloeobacter, które nie mają tylakoidów, składniki aparatu fotosyntetycznego występują w błonie cytoplazmatycznej. ) Chlorofile występują w tak zwanych centrach reakcji, do których światło jest kierowane przez wyspecjalizowane kompleksy zbierające światło, zbudowane z białek i barwników. Na skład tych kompleksów mają wpływ czynniki środowiskowe, takie jak rodzaj światła oraz dostępność azotu i siarki [Grossman i wsp. (1993) JB 175: 575-582]. Kiedy do chlorofilu dociera energia świetlna, wyrzuca on elektrony o dużej energii. Elektrony te mogą „spłynąć" w dół łańcucha transportu elektronów i dostarczyć energii do wytworzenia siły protonomotorycznej i/lub bezpośredniej redukcji NADP. (Komórka wykorzystuje NADPH np. do różnych reakcji biosyntezy. ) Fotosyntezę oksygenową przedstawia się na ogół w postaci schematu Z (rys. 5. 11). Elektrony o dużej energii wyrzucone z fotosystemu II (PSU) przepływają przez łańcuch transportu elektronów do fotosystemu I (PSI), co powoduje powstanie siły protonomotorycznej w poprzek błony tylakoidu. Proces wykorzystania tej właśnie siły do syntezy ATP (przez ATPazę błonową) nazywamy fotofosforylacją. Elektrony wyrzucone z PSI mają wystarczająco dużą energię, by zredukować NADP do NADPH. Przepływ elektronów (z lewa na prawo na rys. 5. 11) wymaga ich dostarczenia do PSU. Zachodzi to w wyniku utlenienia wody, a powstającym produktem ubocznym jest tlen. W poddanym ostatnio rewizji eukariotycznym schemacie Z, również zachodzi redukcja NADP przez PSU [(patrz Prince (1996) TIBS 21: 121-122]. Niektóre sinice (np. Oscillatoria limnetica) mogą alternatywnie przeprowadzać fotosyntezę beztlenowo, wykorzystując jako donor elektronów siarczek zamiast wody, przy czym siarczek jest utleniany do siarki elementarnej. Istnieją też sinice zdolne do wzrostu chemoorganotroficznego. 81

Energia świetlna powoduje, że centra reakcji (PSI, PSU) wyrzucają elektrony o wysokiej energii; poziomy energetyczne i miejsca docelowe zaznaczono strzałkami. Przepływ elektronów z PSU do PSI powoduje powstanie siły protonomotorycznej. Elektrony wyrzucone z PSU są uzupełniane przez utlenianie wody, w wyniku czego uwalniany jest tlen. [How does PSU split water? (artykuł przeglądowy): Rogner i wsp. (1996) TIBS 21: 44-49. ].

Niewielka grupa organizmów prokariotycznych (Prochlorophyta; prochlorofity), spokrewnionych z sinicami, zawiera oba chlorofile eukariotyczne: a i b. Obecnie znamy tylko trzy gatunki tych bakterii: Prochloron didemni, Prochlorothrix hollandica i Prochlorococcus marinus.

5. 2. 1. 2 Fotosynteza anoksygenowa Fotosynteza anoksygenowa (w której nie powstaje tlen) jest przeprowadzana beztlenowo przez bakterie z rzędu Rhodospirillales. U tak zwanych „purpurowych" bakterii fotosyntetyzujących (podrząd Rhodospirillineae) wszystkie składniki fotosyntetyczne występują w wewnątrzkomórkowych błonach, które stanowią jedną całość z błoną cytoplazmatyczną. U „zielonych" bakterii fotosyntetyzujących (podrząd Chlorobiineae) składniki kompleksów zbierających światło mieszczą się w chlorosomach (sekcja 2. 27), natomiast centra reakcyjne znajdują się w błonie cytoplazmatycznej. U bakterii „purpurowych" elektrony wyrzucone z centrum reakcyjnego poruszają się na drodze cyklicznej — poprzez łańcuch transportu elektronów wracają do centrum reakcji. Powstająca siła protonomotoryczna może być wykorzystana np. do syntezy ATP (tzn. fotofosforylacji). U bakterii „zielonych" przepływ elektronów powoduje powstanie siły protonomotorycznej (zużytej np. do syntezy ATP) i może też być wykorzystany do bezpośredniej redukcji NAD do NADH. Taki niecykliczny przepływ elektronów

82

wymaga więc ich dostarczenia z egzogennego donora. Donorami elektronów u tych bakterii mogą być np. siarczek i tiosiarczan, ale nigdy woda, stąd ich fotosynteza jest zawsze anoksygenowa. Niektóre spośród Rhodospirillales (w tym wiele bakterii „purpurowych"), w warunkach tlenowych lub przy małej zawartości tlenu mogą rosnąć chemoorganotroficznie.

5. 2. 1. 3 Donory elektronów w fotosyntezie Do nieorganicznych donorów elektronów biorących udział w fotosyntezie należy np. woda (wykorzystywana jedynie przez sinice), siarczek, siarka i wodór. Donory organiczne to np. kwas mrówkowy czy metanol. Fototrofy wykorzystujące nieorganiczne donory elektronów nazywamy fotolitotrofami, te zaś, które używają donorów organicznych — fotoorganotrofami.

5. 2. 2 Błona purpurowa Niektóre szczepy Halobacterium saiinarum (ekstremalny halofil — sekcja 3. 1. 7), należącego do Archaea, są zdolne do wykorzystywania energii słonecznej, chociaż nie potrafią przeprowadzać fotosyntezy. Na świetle, w warunkach beztlenowych lub przy małej zawartości tlenu wykształcają one zróżnicowany, wybarwiony na purpurowo, obszar błony cytoplazmatycznej — błonę purpurową. Głównym barwnikiem purpurowym jest bakteriorodopsyna. Kiedy cząsteczka bakteriorodopsyny absorbuje energię świetlną, przechodzi bardzo szybko przez szereg pośrednich stanów wzbudzonych (fotointermediatów), co dzieje się w ciągu kilku tysięcznych części sekundy. W tym czasie protony są pompowane na zewnątrz w poprzek błony, co oznacza, że w wyniku cyklicznego fotowzbudzenia bakteriorodopsyny tworzy się siła protonomotoryczna. Jednak w przeciwieństwie do fotosyntezy, siła ta w błonie purpurowej powstaje na skutek bezpośredniego pompowania protonów w poprzek błony, bez udziału chlorofilu.

5. 3 Inne zagadnienia związane z metabolizmem energetycznym 5. 3. 1 Wydajność tworzenia ATP W żywej komórce żaden proces nie zachodzi w oderwaniu od innych, lecz raczej stanowi część złożonej całości. Z tego powodu maksymalna teoretyczna wydajność tworzenia ATP w metabolizmie oddechowym, z powiedzmy jednej cząsteczki glukozy, może nie być nigdy osiągana, biorąc pod uwagę oddziaływania między tym metabolizmem a innymi procesami w komórce. Na przykład, nie cała energia uwalniana w wyniku transportu elektronów jako siła protonomotoryczna będzie wykorzystana do fosforylacji oksydatywnej. Pewna jej część może

83

zostać zużyta do transportu jonów lub ruchu rzęskowego. Ponadto część NADH powstającego w czasie oddychania może zostać wykorzystana w reakcjach biosyntezy. Ten właśnie NADH nie zostanie utleniony w łańcuchu oddechowym, a więc nie będzie uczestniczył w wytwarzaniu siły protonomotorycznej, a tym samym w tworzeniu ATP. Wreszcie związki pośrednie powstające w metabolizmie energetycznym mogą służyć komórce jako „cegiełki" budulcowe w reakcjach biosyntezy. Na przykład, kwas pirogronowy jest wykorzystywany do syntezy aminokwasów — alaniny, waliny i leucyny. Oczywiście zysk energetyczny jest wtedy mniejszy niż w przypadku całkowitego utlenienia tego kwasu.

5. 3. 2 Odwrotny transport elektronów Bakterie wymagają siły redukującej — np. NADH i/lub NADPH — do reakcji biosyntezy. Nie mają z tym nigdy problemu bakterie o fermentacyjnym typie metabolizmu. Sinice i „zielone" bakterie fotosyntetyzujące uzyskują te cząsteczki w wyniku bezpośredniej redukcji, z wykorzystaniem niecyklicznego przepływu elektronów. Jednak „purpurowe" bakterie fotosyntetyzujące nie są w stanie tego dokonać, gdyż elektrony wyrzucone z ich centrów reakcyjnych nie mają dość energii, by zredukować NAD. Reakcję tę przeprowadzają w wyniku odwrotnego transportu elektronów. W procesie tym siła protonomotoryczna jest wykorzystana do przenoszenia elektronów „pod prąd", do enzymu błonowego, dehydrogenazy NAD, gdzie NAD jest redukowany do NADH. Wymaga to dostarczenia elektronów przez zewnętrzny donor elektronów. Bakterie „purpurowe" zwykle wykorzystują do tego celu organiczne donory elektronów, ale niektóre z nich mogą też wykorzystywać donory nieorganiczne, takie jak siarczek. Odwrotny transport elektronów występuje również u bakterii nitryfikacyjnych i innych chemolitotrofów (sekcja 5. 1. 2). Należy zwróć uwagę, że one także nie tworzą NADH w czasie metabolizowania substratu energetycznego.

5. 3. 3 Pozbywanie się produktów odpadowych Bakterie fermentacyjne wytwarzają bardzo dużo NADH. Muszą się pozbyć pewnej jego ilości, syntetyzując produkty odpadowe, takie jak kwas mlekowy (sekcja 5. 1. 1. 1). Zamieniając konieczność na korzyść, niektóre bakterie (np. Lactococcus cremoris dawniej Streptococcus cremoris) uzyskują energię wiążąc protony z produktem ubocznym, jakim jest mleczan. Kiedy kwas mlekowy przechodzi przez błonę cytoplazmatyczną, „towarzyszące" mu protony automatycznie zwiększają siłę protonomotoryczną!

5. 3. 4 Utlenianie pozacytoplazmatyczne Złożone substraty energetyczne są na ogół transportowane przez błonę cytoplazmatyczną i metabolizowane w komórce. Jednak niektóre proste substraty energe2+ tyczne (takie jak H2 i Fe ), jak się wydaje, są utleniane na zewnętrznej części 84

błony cytoplazmatycznej albo w przestrzeni peryplazmatycznej. Takie pozacytoplazmatyczne utlenianie substratu charakteryzuje się: 1) uwalnianiem protonów z substratu i/lub wody poza teren cytoplazmy, 2) przepływem elektronów (z substratu) przez błonę do jej strony cytoplazmatycznej (wewnętrznej) i 3) oddziaływaniem tych elektronów z protonami i końcowym akceptorem elektronów (np. tlenem). Czysty zysk to wytworzenie siły protonomotorycznej. Na przykład ścisły tlenowiec Thiobacillus ferrooxidans zdobywa energię utleniając Fe2+ (do Fe3+) w niskim pH. Według pewnej koncepcji wytworzony pozacytoplazmatycznie Fe 3+ reaguje z wodą, dając wodorotlenek żelaza i protony, podczas gdy elektrony (z Fe2+) redukują końcowy akceptor elektronów (tlen?) na cytoplazmatycznej stronie błony. Niektóre bakterie (np. Pseudomonas aeruginosa) mogą wytwarzać siłę protonomotoryczną w wyniku pozacytoplazmatycznego utleniania glukozy do glukonianu. U bakterii tych enzym — dehydrogenaza glukozy (ze swoim kofaktorem pirolochinolinochinonem — PQQ/ ang. pyrroquinoline quinone) występuje na zewnętrznej powierzchni błony cytoplazmatycznej. Glukonian zostaje przetransportowany przez błonę i ulega fosforylacji do 6-fosfoglukonianu, który jest włączany do szlaku Entnera-Doudoroffa (rys. 6. 2). Escherichia coli (i wiele pokrewnych jej bakterii) zwykle syntetyzuje błonową dehydrogenazę glukozy pozbawioną niezbędnego jej PQQ. Takie organizmy przeprowadzają utlenianie pozacytoplazmatyczne tylko wtedy, gdy dostarcza się im PQQ [Bouvet, Lenormand i Grimont (1989) IJSB 39: 61-67]. Jednak szczep mutanta E. coli, który ma niefunkcjonalny system fosfotransferazowy (sekcja 5. 4. 2), może syntetyzować PQQ i przeprowadzać utlenianie pozacytoplazmatyczne. Świadczy to, że geny kodujące PQQ występują u tej bakterii, ale w normalnych warunkach nie ulegają ekspresji [Biville, Turlin i Gasser (1991) JGM 137: 1775-1782].

5. 3. 5 Siła protonomotoryczna a aerotaksja Jest zadziwiające, że taka bakteria jak Azospirillum brasiliense, która charakteryzuje się metabolizmem oddechowym i wykorzystuje tlen jako końcowy akceptor elektronów, to mikroaerofil (sekcja 3. 1. 6). Aby znaleźć się w warunkach optymalnych, organizm ten wykazuje aerotaksję (sekcja 2. 2. 15. 2), poruszając się w stronę miejsc, gdzie stężenie tlenu wynosi tylko 3-5 mM. U A. brasiliense siła protonomotoryczna rośnie, gdy komórka porusza się w stronę preferowanego stężenia tlenu, i maleje, gdy odpływa ona w przeciwnym kierunku. Być może, to zmiana poziomu siły protonomotorycznej działa jako sygnał regulujący ruchy aerotaktyczne [Zhulin i wsp. (1996) JB 178: 5199-5204]. Wydaje się, że zdolność A. brasilense do prowadzenia tlenowego metabolizmu respiracyjnego przy tak małym stężeniu tlenu wynika z bardzo wydajnej oksydazy (enzymu redukującego tlen). Co ciekawe, warunki te są korzystne dla wiązania azotu przez tę bakterię (sekcja 10. 3. 2. 1). U E. coli, białko sensorowe Aer może pośredniczyć w aerotaksji, odpowiadając na zmiany redoks składnika(ów) łańcucha transportu elektronów. Białko Tsr (białko MCP: rys. 7. 13) wydaje się innym, niezależnym sensorem w aerotaksji

85

i może odpowiadać na zmiany siły protonomotorycznej [Rebbapragada i wsp. (1997) PNAS 94: 10541-10546].

5. 3. 6 Siła sodowomotoryczna Siła sodowomotoryczna to energia związana z elektrochemicznym gradientem jonów sodu między wewnętrzną i zewnętrzną powierzchnią błony cytoplazmatycznej; jest ona analogiczna do siły protonomotorycznej. W pewnych przypadkach komórka może wytwarzać siłę sodowomotoryczną wykorzystując siłę protonomotoryczną: wejście protonów do cytoplazmy jest związane z wyjściem jonów sodu poprzez błonę (antyport Na + /H + ). U E. coli taki antyport jest wykorzystywany jako źródło energii (siła sodowomotoryczna) odpowiednie np. do pobrania (transportu, sekcja 5. 4) cukru melibiozy. Tak więc melibioza i jony sodu są wspólnie transportowane do cytoplazmy (symport Na+/melibioza), co oznacza, że pobieranie melibiozy zachodzi z wykorzystaniem siły sodowomotorycznej. U pewnych bakterii morskich (np. Vibrio alginolyticus) energia z metabolizmu oddechowego może być wykorzystana bezpośrednio do pompowania Na + na zewnątrz poprzez pompę sodową. Organizm ten może np. wykorzystywać siłę sodowomotoryczną do pobierania różnych aminokwasów i jako źródło energii dla ruchu obrotowego swej biegunowej rzęski. Siła sodowomotoryczna jest też wykorzystywana do poruszania biegunowej rzęski Vibrio cholerae [Kojima i wsp. (1999) JB 181: 1927-1930]. Wzrost w wyższym zakresie temperatury powoduje zwiększenie właściwej dla błony cytoplazmatycznej przepuszczalności zarówno dla protonów, jak i jonów sodu. Jednak dla protonów wzrost ten jest większy niż dla jonów sodu. W wyższych temperaturach organizm wykorzystujący siłę protonomotoryczną będzie musiał wydatkować dodatkową energię na wytworzenie określonego jej poziomu, po prostu w celu skompensowania zwiększonej dyfuzji protonów do wnętrza. Pewne organizmy znalazły sposób na zminimalizowanie tego problemu. Skład ich błony cytoplazmatycznej jest taki, że podwyższona temperatura ma mniejszy wpływ na przepuszczalność dla protonów. Jednak niektóre termofile (sekcja 3. 1. 4) zarzuciły wykorzystywanie protonów w swoim metabolizmie + energetycznym. Na przykład Clostridium fervidus wykorzystuje Na jako jedyny jon sprzęgnięty z metabolizmem energetycznym (tzn. gatunek ten nie wykorzystuje siły protonomotorycznej), [Ion permeability at high temepratures: Driessen, van de Vossenberg i Konigs (1996) FEMSMR 18: 139-148. ] Enzymy biorące udział w przemieszczaniu jonów sodu zostały omówione w artykule przeglądowym przez Dimroth [(1997) BBA 1318: 11-51].

5. 4 Systemy transportu Błona cytoplazmatyczna (sekcja 2. 2. 8) jest skuteczną barierą, uniemożliwiającą większości cząsteczek (i wszystkim jonom) swobodne przechodzenie do i z cytoplazmy. (Jest to oczywiście bardzo istotne, umożliwia bowiem komórce kontro86

lowanie swojego środowiska wewnętrznego. ) Bakterie gramujemne mają dodatkową barierę w postaci błony zewnętrznej (sekcja 2. 2. 9. 2). W czasie metabolizmu komórka musi mieć jednak możliwość pobierania różnych substratów (do celów energetycznych i innych) i pozbywania się produktów ubocznych. Służą do tego różne systemy transportu. Są one często swoiste dla poszczególnych substratów lub dla małej liczby substratów podobnych — chociaż bywa, że nawet w tej samej komórce dany związek może być przenoszony przez systemy różnego typu. Dzięki systemom transportu zachodzi powtórne wykorzystywane (ang. recycling) różnych składników komórkowych (sekcja 5. 4. 6) i usuwanie antybiotyków (patrz np. białko ΤΕΤ w sekcji 15. 4. 11). Wyjątkowo dobrze poznany jest transport białek poprzez osłony komórkowe, gdyż bakterie patogenne zwykle wywołują chorobę wydzielając toksyny białkowe lub enzymy. Znane są cztery główne sposoby sekrecji białek: typ I (sekcja 5. 4. 1. 2), typ II (sekcja 5. 4. 3), typ III (sekcja 5. 4. 4) i typ IV (sekcja 5. 4. 5) (rys. 5. 13). Transport typu III wydaje się całkowicie związany z chorobotwórczością, ale niektóre czynniki wirulencji są też transportowane przez inne systemy — np. α-hemolizyna E. coli (wydzielana poprzez system typu I), czy też białko IcsA Shigella odpowiedzialne za czerwonkę (system typu IV). Transport często wymaga energii, która jest zwykle dostarczana w postaci siły protonomotorycznej i/lub „wysokoenergetycznego fosforanu" takiego jak ATP. Siła protonomotoryczna może bezpośrednio napędzać transport pewnych naładowanych i nienaładowanych rozpuszczonych substancji. Na przykład u E. coli symport proton-laktoza pozwala na pobieranie laktozy kosztem siły protonomotorycznej, jako że laktoza i protony są razem transportowane do cytoplazmy. Energia potrzebna do transportu jonów jest czasem dostarczana w wyniku hydrolizy ATP przez błonową ATPazę. Na przykład u E. coli, K+ może być transportowany przez tak zwany system Kdp (sekcja 7. 8. 6), z udziałem wyspecjalizowanej K+-ATPazy (pompa potasowa). Hydroliza ATP umożliwia pompie pobranie K+ wbrew gradientowi stężeń. Transport poprzez system PTS (sekcja 5. 4. 2) jest związany z chemotaksją i represją kataboliczną. Wiele systemów transportowych ma złożoną budowę i ich działanie nie jest całkowicie jasne; niektóre z nich zostały opisane w następnych sekcjach.

5. 4. 1 Transportery ABC Transporter ABC to system transportu składający się z wielobiałkowego kompleksu w osłonach komórkowych. Dwa z tych białek mają (na swojej powierzchni cytoplazmatycznej) swoiste miejsce wiązania ATP (ABC, ang. ATP-binding cassette). Białko zawierające takie miejsce będzie tu określane mianem „białka ABC". Hydroliza ATP w miejscu ABC dostarcza energii do transportu. Istnieje wiele różnych przenośników ABC, a każdy z nich uczestniczy w imporcie lub eksporcie/sekrecji określonych jonów lub cząsteczek. W sumie umożliwiają one 87

import/eksport bardzo różnych substratów, w tym jonów nieorganicznych, cukrów i białek. Na przykład niektóre z nich importują związki odżywcze lub jony ważne w osmoregulacji, podczas gdy inne wydzielają toksyny białkowe i antybiotyki. Transportery ABC występują zarówno u bakterii gramujemnych, jak i gramdodatnich. Ciekawe, że biorąc udział w transporcie pewnych związków rozpuszczonych, transporter ABC może też wpływać na kanały, przez które są przenoszone inne związki rozpuszczone. Na przykład u Salmonella typhimurium transporter kodowany przez geny sapABCDF bierze udział w imporcie pewnych toksycznych peptydów (w celu ich detoksyfikacji), ale ma też wpływ na kanały dla jonów K+, które są niezbędne dla oporności bakterii na te peptydy [patrz np. Higgins (1995) Cell 82: 693-696]. Regiony transporterów ABC odpowiedzialne za hydrolizę ATP zostały omówione w artykule przeglądowym: Schneider i Hunke [(1998) FEMSMR 22: 1-20]. 5. 4. 1. 1 Importery ABC (transportery zależne od białek wiążących; permeazy peryplazmatyczne) Importery pośredniczą w pobieraniu pewnych aminokwasów, cukrów i jonów. Zwykle importer zawiera dwa różne białka (w błonie cytoplazmatycznej), połączony dimer białek ABC i substratowo swoiste peryplazmatyczne białko wiążące, które wiąże substrat i przenosi go do kompleksu błonowego. Wszystkie importery zawierają białko wiążące. (Niektóre białka wiążące uczestniczą również w „rozpoznawaniu" chemicznego stanu środowiska — ang. chemosensing. ) Przykładem importera ABC jest system ProK, uczestniczący w pobieraniu cząsteczki osmoregulacyjnej, jaką jest betaina glicynowa (sekcja 3. 1. 8). Inny przykład to system transportu histydyny u Salmonella typhimurium, w którym białko peryplazmatyczne wiąże histydynę i przenosi ją do kompleksu błonowego. Ten z kolei przekazuje ją do cytoplazmy [patrz np. Liu i Ames (1997) JBC 272: 859-866]. Hung i współpracownicy opisali budowę krystaliczną HisP — białka ABC permeazy histydynowej Salmonella typhimurium [(1998) Nature 396: 703-707]. 5. 4. 1. 2 Eksportery ABC Ogólnie mówiąc eksportery pośredniczą w eksporcie/sekrecji różnego typu białek, np. enzymów, hemolizyn (sekcja 16. 1. 4. 1), antybiotyków peptydowych i (u niektórych bakterii) polisacharydowych składników otoczek. Wydaje się, że zwykle dany eksporter może transportować różnego rodzaju cząsteczki pokrewne lub podobne [ABC transporters (bacterial exporters): Fath i Kolter (1993) MR 57: 997-1017. ] Jeden z eksporterów u E. coli pośredniczy w jednoetapowym transporcie α-hemolizyny z cytoplazmy na zewnątrz komórki. Należy on do tzw. systemów sekrecji typu I (rys. 5. 13). U Streptomyces antibioticus eksporter ABC wydziela antybiotyk oleandomycynę (należącą do tej samej grupy co erytromycyna). 88

W skład białek wydzielanych przez patogeny wchodzą niektóre ważne czynniki wirulencji (sekcja 11. 5), np. cyklolizyna u Bordetella pertussis (wywołującej krztusiec) czy alkaliczna proteaza u Pseudomonas aeruginosa. Zwykle białka przenoszone przez eksportery ABC są pozbawione N-końcowej sekwencji sygnałowej (sekcja 7. 6), ale mają C-końcową sekwencję sekrecyjną, która może bezpośrednio oddziaływać z białkami ABC. Eksportery, które przenoszą cząsteczki do peryplazmy lub błony zewnętrznej jako miejsc docelowych, mogą mieć mniej składników białkowych niż te, które wydzielają białka (tzn. transportują je na zewnątrz komórki). Niektóre eksportery u bakterii gramujemnych zawierają: białka ABC, tzw. błonowe białko fuzyjne (MFP, ang. membrane fusion protein) (w błonie cytoplazmatycznej, ale częściowo też w peryplazmie) i składnik występujący w błonie zewnętrznej. MFP może łączyć błonę cytoplazmatyczną i błonę zewnętrzną, ułatwiając transport. Niektóre badania sugerują, że przynajmniej w pewnych przypadkach składniki eksportera układają się w określonym porządku, tworząc w ten sposób kompletny system transportowy, i że zachodzi to w wyniku związania substratu (tzn. cząsteczki, która ma być wydzielona) z białkiem ABC. Po połączeniu substratu z ABC to ostatnie oddziałuje z MFP, które z kolei wiąże się ze składnikiem błony zewnętrznej [Letoffe, Delepelaire i Wandersman (1996) EMBO Journal 15: 5804-5811].

5. 4. 2 System fosfotransferazowy zależny od fosfoenolopirogronianu System fosfotransferazowy (PTS, ang. phosphotransferase system) jest wykorzystywany przez różne bakterie gramujemne i gramdodatnie do pobierania pewnych cukrów (np. glukozy, fruktozy, laktozy), alkoholocukrów (np. mannitolu) i cukrów podstawionych (np. N-acetyloglukozoaminy), przy czym źródłem energii jest tu fosfoenolopirogronian (wzór rys. 5. 3). W najprostszym przypadku fosfoenolopirogronian dostarcza fosforanu i energii do sekwencyjnej fosforylacji dwóch kolejnych białek (oznaczonych I oraz H) w cytoplazmie. Fosforan i energia zostają przeniesione z Η na związaną z błoną cytoplazmatyczną permeazę swoistą dla cukrów (tzw. kompleks II), która wiąże się z substratem, następnie fosforyluje go i jednocześnie transportuje do cytoplazmy (rys. 5. 12). Ponieważ cukry są często metabolizowane w postaci ich fosforylowanych pochodnych (np. glukozo-6-fosforan na rys. 5. 3 i 6. 2), to fosforylacja w czasie pobierania jest pozytywnym aspektem transportu PTS. PTS odgrywa rolę nie tylko w transporcie: komórka może też wykazywać chemotaksję w odpowiedzi na cukry pobrane przez system PTS. Jeden z możliwych mechanizmów to oddziaływanie fosforylowanych składników PTS (rys. 5. 12), poprzez nieznany intermediat(y), z białkiem CheY systemu MCP (rys. 7. 13), co wpływa na ruch rzęski. Chemotaksja zachodząca z udziałem PTS różni się od systemu MCP [Titgemeyer (1993) JCB 51: 1-6]. Tak więc: 1) substrat musi być transportowany (a nie po prostu związany); 2) w adaptacji nie bierze udziału metylacja; i 3) PTS nie odpowiada na repelenty. [PTS (artykuł przeglądowy): Saier i Reizer (1994) MM 13: 755-764. ] 89

Pokazano udział PTS w transporcie mannitolu i glukozy poprzez błonę cytoplazmatyczną (CM) z peryplazmy (wyżej) do cytoplazmy (niżej) u Escherichia coli. Zwróć uwagę, że glukoza i mannitol są pobierane przez różne systemy związane z błonami („permeazy")/ jak opisano niżej. Źródłem energii dla transportu jest fosfoenolopirogronian (PEP). System jest zasilany energetycznie w wyniku sekwencyjnego transferu grupy fosforanowej Ρ ζ „wysokoenergetycznego fosforanu" w PEP na enzym I (oznaczonego I), a następnie na białko Hpr (oznaczone H). Następnie fosforan zostaje przeniesiony na permeazę (kompleks enzymu II, oznaczony jako II). (Zwróć uwagę, że cząsteczki Η i I nie są specyficzne dla żadnej permeazy, tzn. mogą fosforylować każdą z nich. ) Permeaza mannitolowa (po lewej) jest enzymem całkowicie błonowym i składa się z trzech domen: IIA, IIB i IIC. Hydrofobowa, transbłonowa domena IIC, która wiąże substrat, jak się wydaje, uczestniczy w tworzeniu kanału transbłonowego. Zarówno domena IIA, jak i IIB zawiera miejsca fosforylacji, ale przypuszczalnie tylko ta druga bierze bezpośredni udział w fosforylacji substratu. W permeazie glukozowej domena IIA jest odrębnym białkiem, sekwencja fosforylacji prowadzi od IIA do IIB, a domena IIB uczestniczy w fosforylacji substratu. We wszystkich przypadkach fosforylacja cząsteczki substratu jest integralnym elementem jej transportu do cytoplazmy. W przypadku niektórych permeaz PTS składniki są ułożone w inny sposób. Na przykład permeaza fruktozowa bakterii jelitowych składa się z białka błonowego, zawierającego IIC i IIB oraz oddzielne białko, pełniące zarówno funkcję IIA, jak i H. Analogiczny enzym z Rhodobacter capsulatus to pojedyncze białko łączące funkcje ΠΑ, Η i I. Zgodnie z proponowaną nomenklaturą dla permeaz PTS [Seier i Reizer (1992) JB 174: 1433-1438], MtlEco permeazę mannitolowę E. coli oznacza się IICBA , a permeazę glukozową E. coli — IICBGlc,

Eco

+

IIAGlc'Eco.

Poza rolą, jaką pełnią w transporcie, składniki H, IIA i IIB systemu PTS uczestniczą w regulacji pewnych operonów katabolicznych (sekcja 7. 8. 2. 1).

PTS nie tylko bierze udział w transporcie substratów, ale kontroluje też pewne procesy metabolizmu węgla. Tak więc cząsteczki przenoszące grupy fosforanowe w PTS (rys. 5. 12) regulują aktywność niektórych operonów (np. operonu lac, rys. 7. 11) uczestniczących w pobieraniu/katabolizmie źródeł węgla. W wielu przypadkach ta kontrola operonów (sekcja 7. 8. 2. 1) zachodzi poprzez fosforylację regulatorów transkrypcji, w miejscu określonym jako „domena regulacji przez PTS" (PRD, ang. PTS-regulation domain) [Stulke i wsp. (1998) MM 28: 865-874].

90

5. 4. 3 Szlak sekrecji ogólnej (szlak zależny od sec, system sekrecji typu II) u bakterii gramujemnych Wiele z wydzielanych białek, np. toksyny, pewne enzymy, jest transportowanych z cytoplazmy na zewnątrz komórki przez dwuetapowy szlak sekrecji ogólnej (GSP, ang. general secretory pathway). Taki transport wymaga energii: siły protonomotorycznej i ATP. (Początkowy(e) etap(y) GSP są też wykorzystywane przez białka, których końcowym przeznaczeniem jest błona cytoplazmatyczna, peryplazma lub błona zewnętrzna. ) Wśród różnych szlaków sekrecji białek, GSP jest określony przez pewne geny (analogiczne do genów sec E. coli), których produkty tworzą system transportu białek do i przez błonę cytoplazmatyczną. Białka wydzielane w szlaku GSP są syntetyzowane ze specjalną N-końcową sekwencją sygnałową (sekcja 7. 6), która ułatwia ich przejście przez błonę cytoplazmatyczną i jest enzymatycznie odcinana od białka w czasie przechodzenia przez błonę. Etap pierwszy. Albo jeszcze w trakcie translacji (sekcja 7. 6), albo zaraz po niej, dane białko jest przenoszone przez białko opiekuńcze (chaperon), SecB, do błony cytoplazmatycznej w miejsce, gdzie znajduje się SecA — błonowa ATPaza. SecA jest związana z kompleksem białkowym (SecYEG) [Manting, van der Does i Driessen (1997) JB 179: 5699-5704], zwanym translokonem, który tworzy kanał sekrecyjny w błonie cytoplazmatycznej. SecB zostaje uwolnione, a energia z hydrolizy ATP (w SecA) kieruje białko (które już całkowicie uległo translacji), poprzez translokon, do peryplazmy. W przypadku niektórych białek kierowanie z cytoplazmy do błony cytoplazmatycznej w czasie translacji zachodzi w inny sposób. Tak więc u E. coli powstający peptyd (wraz ze swoim rybosomem) najpierw wiąże się z tak zwaną cząstką rozpoznającą sygnał (SRP, ang. signal recognition particle), składającą się z małej cząsteczki RNA i GTPazy. Następnie cały kompleks wiąże się przejściowo z błoną cytoplazmatyczną (poprzez białko FtsY), zanim rybosom wraz z polipeptydem zostanie uwolniony i połączony z translokonem SecYEG. Cały proces jest zasilany energią z hydrolizy GTP [Valent i wsp. (1998) EMBO Journal 17: 2504-2512]. Etap drugi. Transport z peryplazmy na zewnątrz komórki jest słabo poznany. Wydaje się, że ten etap GSP nie występuje u E. coli.

5. 4. 4 Systemy typu III sekrecji białek u bakterii gramujemnych W systemach typu III białka są wydzielane przez por lub kanał, który przechodzi przez osłony komórkowe, poczynając od cytoplazmy aż do powierzchni komórki. Odmiennie niż w transporterach ABC (sekcja 5. 4. 1), w systemach tych może uczestniczyć 20 lub nawet więcej białek. U różnych gatunków składniki systemów typu III są podobne (homologiczne), co więcej niektóre z białek są podobne do składników innych systemów sekrecji białek. Wydaje się, że systemy typu III występują głównie lub wyłącznie u patogenów — np. szczepów EPEC (sekcja 11. 2. 1), Salmonella, Shigella (sekcja 11. 2. 2. 1) i Yersinia (sekcja 11. 5. 1),

91

a wydzielane białka działają w sposób charakterystyczny na komórki eukariotyczne. Tego typu systemy wydzielania występują zarówno w bakteriach chorobotwórczych dla roślin [Alfano i Collmer (1997) JB 179: 5655-5662], jak i w patogenach człowieka i zwierząt. Wydzielane białka mają N-końcową sekwencję, która kieruje je do poru i nie jest odcinana, jak to się dzieje w systemach typu II (zależnych od sec) (sekcja 5. 4. 3). Nieznane są wymagania energetyczne systemów typu III. Wiadomo, że u Yersinia, związane z porem, cytoplazmatyczne białko YscN może działać jak ATPaza. U niektórych bakterii systemy typu III są przypuszczalnie aktywowane przez kontakt z komórkami eukariotycznymi (np. szczepy EPEC [Wolff i wsp. (1998) MM 28: 143-155] i Yersinia). W takich przypadkach białka mogą być wydzielane przez bakterię bezpośrednio do komórki gospodarza. Potwierdzają to następujące spostrzeżenia. Po pierwsze same białka wydzielane przez systemy typu III mają mały wpływ, lub w ogóle nie wpływają na komórki gospodarza in vitro. Po drugie wykazano, że przynajmniej niektóre z wydzielanych białek występują w komórkach gospodarza. W przypadku Yersinia wydzielane białka (Yop) wywierają swoiste działanie na gospodarza (sekcja 11. 5. 1). Białka wydzielane przez inne patogeny to np. SipC (Salmonella typhimurium), EspB i EspE/Tir (szczepy EPEC), IpaB u Shigella (sekcja 11. 5. 2) oraz „harpiny" (ang. harpins) bakterii chorobotwórczych dla roślin. [Systemy typu III (artykuł przeglądowy): Lee (1997) ΉΜ 5: 148-156. ]

5. 4. 5 Systemy typu IV sekrecji białek (autotransportery) u bakterii gramujemnych Białko wydzielane z udziałem tego systemu jest syntetyzowane jako część większego białka, składającego się z: 1) N-końcowego peptydu liderowego, 2) domeny α i 3) C-końcowej domeny β. Mechanizm wydzielania nie jest w pełni zrozumiały, a jeden z modeli określa to następująco. Peptyd liderowy działa jako sekwencja sygnałowa (sekcja 7. 6) — tak więc białko najpierw przechodzi przez błonę cytoplazmatyczną z udziałem systemu (typu II) zależnego od sec (sekcja 5. 4. 3). W tym czasie zostaje odcięta sekwencja sygnałowa. Domena β tworzy następnie w błonie zewnętrznej por o strukturze „baryłki β", przez który domena a (tego samego białka) przechodzi na powierzchnię komórki. Białko może potem np.: 1) pozostać w stanie nienaruszonym w błonie zewnętrznej; 2) ulec autokatalitycznemu rozszczepieniu, przy czym domena a zostaje wydzielona; 3) ulec rozszczepieniu przez inne białko błony zewnętrznej (takie jak proteaza OmpT E. coli), z wydzieleniem domeny a. Domena a jest więc „pasażerem", który może być wydzielany przez domenę β tego samego białka. Domenę a nazywa się też autotransporterem, choć może to być mylące, jako że tę samą nazwę stosuje się do określenia całego (trzyczęściowego) białka prekursorowego, opisanego wyżej. Wymagania energetyczne systemu sekrecji typu IV nie są jasne.

92

Pierwszym poznanym systemem autotransporterowym była proteaza IgAl u Neisseria gonorrhoeae — białko (sekrecyjne), które rozszczepia przeciwciała klasy IgA (rys. 11. 2). Innym przykładem jest białko IcsA (zatrzymywane na powierzchni komórki) odpowiedzialne za inwazyjność Shigella wywołującej czerwonkę (sekcja 11. 3. 3. 2). System autotransporterowy AIDA-I (ang. adhesin involved in diffuse adhesion) E. coli został wykorzystany do wyeksponowania heterologicznego białka (np. podjednostki Β toksyny cholery) na powierzchni zmutowanych szczepów E. coli pozbawionych OmpT. Do badań tych gen białka heterologicznego poddano fuzji (in vitro) z DNA kodującym domenę β AIDA-I; tym samym, w czasie ekspresji w komórkach E. coli, heterologiczne białko (pasażer) było eksportowane i eksponowane na powierzchni komórki (8. 5. 13). [Autotransportery: Henderson, Navarro-Garcia i Nataro (1998) TIM 6: 370-378; Holland (1998) TIM 6: 388-389. ] 93

5. 4. 6 Transport metabolitów powtórnie wykorzystywanych (salvage transport) W pewnych przypadkach bakteria może ponownie wykorzystywać niektóre (makro)cząsteczki, zamiast je tracić wydzielając do środowiska. Jest to sensowne nie tylko z powodu oszczędności materiału budulcowego, ale również energii, którą komórka musiałaby wydatkować na syntezę. Na przykład E. coli, rosnąc, stale degraduje swój Peptydoglikan (rys. 2. 7) i częściowo ponownie wykorzystuje powstałe produkty do jego resyntezy (recycling). Według jednego z przyjętych modeli, Peptydoglikan jest degradowany (przez enzymy peryplazmatyczne) do podjednostek disacharydotripeptydowych. Kompleksy podjednostek z peryplazmatycznym białkiem wiążącym (oznaczonym MppA) są przenoszone poprzez błonę cytoplazmatyczną przez swoisty system transportu (kodowany przez geny oppBCDF). W cytoplazmie tripeptyd (L-alanylo-y-D-glutamylo-mezo-diaminopimelinian — rys. 2. 7) jest odłączany od podjednostki przez enzym amidazę i dołączany do UDP-MurNAc (sekcja 6. 3. 3. 1) przez inny enzym (ligazę) [produkt genu mph Mengin-Lecreubc i wsp. (1996) JB 178: 5347-5352]. W ten sposób wchodzi ponownie do szlaku biosyntezy ściany komórkowej [Park i wsp. (1998) JB 180: 1215-1223].

5. 4. 7 Transport poprzez barierę peptydoglikanu Aby nie doszło do lizy osmotycznej, bakteria musi mieć nienaruszone osłony komórkowe. Jednak warstwa peptydoglikanu nie może całkowicie otaczać protoplastu, gdyż różne duże cząsteczki (np. α-hemolizyna E. coli, sekcja 5. 4. 1. 2) muszą być transportowane poprzez osłony. Składanie fimbrii (i innych wypustek) również wymaga przeniesienia na zewnątrz komórki ich składników białkowych. Inny rodzaj dużych cząsteczek transportowanych przez ściany to w pewnych typach koniugacji (sekcja 8. 4. 2) kompleks DNA-białko, który jest przenoszony z komórki dawcy do biorcy. W warstwie peptydoglikanu musi też powstać pewien „wyłom" w czasie składania ciałka podstawowego rzęski. Brak w nim również ciągłości w miejscach połączenia błon — cytoplazmatycznej i wewnętrznej (sekcja 2. 2. 10). Składanie struktur związanych z transportem czy też innych struktur przechodzących poprzez osłony komórkowe najprawdopodobniej zachodzi z udziałem enzymu(ów), które lokalnie modyfikują Peptydoglikan, zachowując jednak jego integralność (patrz rys. 3. 1). W pewnych przypadkach udało się rzeczywiście powiązać te procesy [artykuł przeglądowy: Dijkstra i Keck (1996) JB 178: 5555-5562].

ROZDZIAŁ

6

Metabolizm II - węgiel

Dlaczego węgiel? Po prostu dlatego, że właściwie wszystkie związki, jakie są zawarte w żywych organizmach i są przez nie tworzone, to związki węgla. W rozdziale tym omawiamy: 1) wymagania węglowe bakterii, 2) sposoby przyswajania różnych związków węgla i 3) syntezę, przemiany i polimeryzację związków węgla. Metabolizm azotu i siarki jest przedstawiony w rozdziale 10. Jakich rodzajów związków węgla wymagają bakterie do wzrostu? Niektóre z nich mogą wykorzystywać dwutlenek węgla do syntezy większości lub wszystkich związków węgla. Takie organizmy zwane są autotrofami, a wykorzystywanie dwutlenku węgla jako jedynego (lub głównego) źródła węgla to autotrofia. U niektórych bakterii autotrofia jest względna, u innych — bezwzględna. Te ostatnie mogą wykorzystywać wyłącznie dwutlenek węgla, nawet jeśli glukoza czy inne substraty są łatwo dostępne. Bezwzględne autotrofy wykorzystują nie tylko proste źródło węgla, ale również proste substraty energetyczne (rozdz. 5). Są albo chemolitotrofami (tzn. chemolitoautotrofami), albo fotolitotrofami (tzn. fotolitoautotrofami). Metabolizm chemolitoautotroficzny występuje u stosunkowo nielicznych bakterii (oraz u niektórych członków domeny Archaea). Ten typ metabolizmu jest unikatowy w świecie ożywionym i można go znaleźć wyłącznie u niektórych wyspecjalizowanych prokariotów. Chemolitoautotrofy odgrywają ważną rolę np. w obiegu azotu (rozdział 10). Metabolizm fotolitoautotroficzny występuje np. u sinic i oczywiście u roślin zielonych oraz glonów. Większość bakterii to nie autotrofy: nie mogą one wykorzystywać dwutlenku węgla jako głównego źródła węgla. Ich wzrost zależy od złożonych związków organicznych pochodzących z innych organizmów. Bakterie wymagające do wzrostu złożonych związków węgla zwane są heterotrofami, a chemoorganotroficzne heterotrofy to chemoorganoheterotrofy. Ogólnie, mogą one wykorzystywać ogromną gamę związków węgla, w tym cukry, kwasy tłuszczowe, alkohole 95

i różne inne substancje organiczne. Bakterie heterotroficzne są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie. Są nimi, na przykład, wszystkie gatunki wywołujące choroby człowieka, zwierząt i roślin.

6. 1 Asymilacja węgla u autotrofów Autotrofy wykorzystują dwutlenek węgla występujący w środowisku do tworzenia złożonych związków organicznych. Gdy jest on włączany do tego typu związków, mówi się, że został on „związany". Autotrofy dysponują różnymi sposobami wiązania dwutlenku węgla, ale dwa ze znanych mechanizmów występują najczęściej — cykl Calvina i reduktywny cykl kwasów karboksylowych.

6. 1. 1 Cykl Calvina Szlak ten (zwany też reduktywnym cyklem pentozofosforanowym) wykorzystują bardzo liczne autotrofy, w tym niektóre anoksygenowe bakterie fotosyntetyzujące i większość sinic. Część cyklu Calvina przedstawiono na rysunku 6. 1. Każdy obrót cyklu wymaga znacznego nakładu zarówno ATP, jak i siły redukującej, co oznacza, że wiązanie dwutlenku węgla łączy się z dużym nakładem energii. Enzymem kluczowym tego szlaku jest karboksylaza-oksygenaza rybulozo-l, 5-bisfosforanowa (RuBisCO — patrz też sekcja 2. 2. 6) i fosforybulokinaza. Enzymy te występują tylko w komórkach wiążących dwutlenek węgla w cyklu Calvina.

6. 1. 2 Reduktywny cykl kwasów karboksylowych Szlak ten wykorzystują do wiązania dwutlenku węgla bakterie fototroficzne z rodziny Chlorobiaceae i chemotroficzny archeon Sulfolobus. Zasadniczo przypomina on działający w odwrotną stronę cykl kwasów trikarboksylowych (rys. 5. 10), w którym reakcje nieodwracalne (takie jak kwas szczawiooctowy -» kwas cytrynowy) zostały zmodyfikowane przez różne enzymy/sekwencje reakcji. Podobnie jak w cyklu Calvina, wiązanie dwutlenku węgla wymaga tu wielkiego nakładu energii.

6. 1. 3 Karboksydobakterie Karboksydobakterie mogą wykorzystywać tlenek węgla jako jedyne źródło węgla i energii, co oznacza, że nie pasują one do ścisłej definicji „autotrofa". Utleniają one tlenek węgla do dwutlenku węgla (w warunkach tlenowych) i asymilują dwutlenek węgla w cyklu Calvina. Organizmy takie występują w glebie, zanieczyszczonych wodach i ściekach. Zalicza się do nich Bacillus Schlegelii i Pseudomonas carboxydovorans.

96

Szlak ten umożliwia wykorzystanie dwutlenku węgla do syntezy złożonych związków budujących komórkę. Węgiel wchodzi do cyklu wskutek wiązania dwutlenku węgla i opuszcza go w postaci związków pośrednich pobranych do reakcji biosyntezy. Na przykład 3-fosfoglicerynian jest wykorzystywany do syntezy pewnych aminokwasów (takich jak glicyna i seryna), a także do tworzenia pirogronianu — prekursora alaniny, leucyny i innych aminokwasów. Zwróć uwagę, że bezwzględne autotrofy muszą syntetyzować wszystkie aminokwasy niezbędne do syntezy białek. Do ciągłego działania cyklu Calvina konieczne jest stałe dostarczanie rybulozo-l, 5-bisfosforanu. Tak więc ilość węgla pobieranego z cyklu nie może przekraczać ilości węgla doń wchodzącego. (Zamknięte w kole „P" oznacza fosforan. ) RuBisCO to enzym karboksylaza-oksygenaza rybulozo-l, 5-bisfosforanowa. Dla przejrzystości rysunku pominięto w cyklu Calvina liczne połączenia z innymi szlakami.

6. 2 Asymilacja węgla u heterotrofów Heterotrofy mogą asymilować szeroką gamę związków organicznych. Niżej podano jedynie kilka przykładów. Wiele heterotrofów wykorzystuje glukozę, a sposób jej asymilacji zależy od szlaków i systemów enzymatycznych, jakimi dysponuje dany organizm. Na przykład liczne bakterie (w tym E. coli) mogą przyswajać glukozę w szlakach „energetycznych", takich jak szlak Embdena-Meyerhofa-Parnasa (glikoliza, rys. 5. 3), a następnie — cykl kwasów trikarboksylowych (rys. 5. 10). Pseudomonas aeruginosa jest zdolny do asymilacji glukozy w wyniku utleniania pozacytoplazmatycznego (sekcja 5. 3. 4). Wszystkie te procesy dostarczają zarówno energii, jak i związków będących prekursorami w biosyntezie. 97

Liczne bakterie (a także niektórzy przedstawiciele Archaea) przyswajają glukozę i np. glukoniany poprzez szlak Entnera-Doudoroffa (rys. 6. 2). Jest on podobny do szlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa (rys. 5. 3), ponieważ oba zaczynają się fosforylacją heksozy i w obu przypadkach powstaje kwas pirogronowy. Szlak Entnera-Doudoroffa dostarcza NAD(PH) do biosyntez oraz różnych cząsteczek prekursorowych. Ponadto, w organizmach przeprowadzających oba wymienione szlaki, aldehyd 3-fosfoglicerynowy może zasilać glikolizę i dostarczać w ten sposób energii w wyniku fosforylacji substratowej. U E. coli szlak Entnera-Doudoroffa może odgrywać ważną rolę w przyswajaniu węgla, a substraty, takie jak glukoniany (występujące np. w jelitach ssaków), mogą być metabolizowane nawet w obecności glukozy. [ED pathway in E. coli: Peekhaus i Conway (1998) JB 180: 3495-3502. ] Szlak heksozomonofosforanowy (= szlak pentozofosforanowy) dostarcza rybulozo-5-fosforanu (rys. 6. 2), ważnego prekursora nukleotydów (rozdz. 7) i aminokwasu histydyny, oraz erytrozo-4-fosforanu, niezbędnego do syntezy aminokwasów aromatycznych, takich jak L-tryptofan i L-fenyloalanina. Jest też źródłem NADPH będącego siłą redukującą w różnych reakcjach biosyntetycznych — np. w syntezie kwasów tłuszczowych. Szlak heksozomonofosforanowy jest szeroko rozpowszechniony w przyrodzie. Występuje u mikroorganizmów eukariotycznych, u zwierząt i roślin. Escherichia coli rozszczepia cukier laktozę na glukozę i galaktozę. Glukoza jest metabolizowana w szlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa (rys. 5. 3), natomiast galaktoza — w szlaku Leloira. W szlaku tym galaktoza ulega fosforylacji (z udziałem ATP) do galaktozo-1-fosforanu enzymatycznie przekształcanego poprzez glukozo-1-fosforan w glukozo-6-fosforan, który zostaje włączony do szlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa. Celuloza, polimer glukozy, jest źródłem węgla dla pewnej liczby promieniowców (bakterii występujących w glebie, kompoście itp. ) oraz np. bakterii żwacza (część trawiąca przewodu pokarmowego krów i innych przeżuwaczy). Bakterie te wytwarzają enzymy rozkładające na zewnątrz komórki pewne rodzaje celulozy. Wśród powstających produktów jest też disacharyd — celobioza. Do bakterii celulolitycznych (tzn. rozkładających celulozę) należą gatunki Cellulomonas i n p . Clostridium thermocellum oraz szczepy Pseudomonas i Ruminococcus.

Trzeba tu podkreślić, że dostępność danego substratu nie musi oznaczać wcale, że będzie on pobierany i wykorzystywany przez daną bakterię: patrz represja kataboliczna (sekcja 7. 8. 2. 1).

6. 3 Synteza, wzajemne przemiany i polimeryzacja związków węgla 6. 3. 1 Synteza związków węgla Synteza ogromnej liczby różnorodnych cząsteczek budujących żywą komórkę wymaga zachodzenia niezwykle złożonej (i ściśle kontrolowanej) sieci reakcji chemicznych. Komórka potrzebuje jednak nie tylko cząsteczek „strukturalnych",

98

Szlak heksozomonofosforanowy (= szlak pentozofosforanowy) jest do niego podobny aż do etapu 6-fosfoglukonianu. Aldehyd 3-fosfoglicerynowy może zostać przekształcony w kwas pirogronowy (podobnie jak w szlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa: rys. 5. 3) lub, jak na przykład u Pseudomonas i bakterii pokrewnych, może ponownie wejść do szlaku Entnera-Doudoroffa poprzez glukoneogenezę (sekcja 6. 3. 2).

99

ale również energii, niezbędnej do przeprowadzania reakcji anabolicznych. Metabolizm węglowy i energetyczny są zwykle ze sobą ściśle związane (sekcja 5. 3. 1). Tu mamy jedynie tyle miejsca, by pobieżnie przejrzeć pewne ogólne wiadomości dotyczące biosyntezy. Wiele związków tworzonych na początku szlaków asymilacyjnych może służyć jako prekursory biosyntez. Z punktu widzenia komórki nie jest to pozbawione sensu, bowiem gdyby do tego celu prowadził skomplikowany metabolizm, to jakiekolwiek zaburzenie we wczesnych etapach przyswajania węgla powodowałoby poważne komplikacje w drogach biosyntezy. A więc np. pierwszy produkt powstający w cyklu Calvina (rys. 6. 1), aldehyd 3-fosfoglicerynowy, może zostać wykorzystany do syntezy aminokwasów: cysteiny, glicyny i seryny (składników białek - sekcja 7. 6) oraz innych związków. Również kwas pirogronowy (pochodzący ze szlaków Embdena-Meyerhafa-Parnasa i Entnera-Doudoroffa) jest prekursorem np. różnych aminokwasów, a rybozo-5-fosforan (szlak heksozomonofosforanowy) jest wykorzystywany np. do syntezy nukleotydów (składników DNA i RNA - rozdz. 7). Związki pośrednie powstające w cyklu kwasów trikarboksylowych (rys. 5. 10) też mogą zostać wykorzystane w biosyntezach. Na przykład kwas szczawiooctowy i α-ketoglutarowy są prekursorami pewnych aminokwasów; acetylo-CoA bierze udział w syntezie kwasów tłuszczowych, a bursztynylo-CoA — porfiryn — składników chlorofili i cytochromów. Gdy zostaną pobrane z cyklu kwasów trikarboksylowych związki pośrednie, to nie mogą być wykorzystane do regenerowania kwasu szczawiooctowego, musi więc on być uzupełniany w jakiś inny sposób, jeśli cykl ma zachodzić w ciągły sposób. Służą do tego różne reakcje, na przykład w pewnych warunkach kwas szczawiooctowy może powstawać bezpośrednio w wyniku karboksylacji kwasu pirogronowego lub fosfoenolopirogronianu. Tego typu reakcje uzupełniające zwane są reakcjami anaplerotycznymi. Szlaki asymilacyjne zarówno u autotrofów, jak i heterotrofów dostarczają zwykle 3-, 4- i 5-węglowych cząsteczek, które są dogodnymi prekursorami w biosyntezie. W pewnych przypadkach komórka może uniknąć biosyntezy składników de ηονο, dzięki ponownemu wykorzystaniu swojego materiału budulcowego w szlakach wtórnego wykorzystania metabolitów (ang. salvage pathways). Jednym z przykładów jest ponowne wykorzystanie podjednostek tripeptydowych peptydoglikanu (sekcja 5. 4. 6). Każdy etap reakcji biosyntetycznej jest zwykle katalizowany przez enzym, tylko bardzo nieliczne reakcje zachodzą spontanicznie. Oprócz enzymów niezbędne też są inne czynniki. W reakcjach redukcji uczestniczy NAD(P)H lub FADH2, w utlenianiu — NAD lub FAD, a do fosforylacji potrzebny jest ATP, GTP lub fosfoenolopirogronian. W metabolizmie bakteryjnym ważną rolę odgrywają koenzymy. Należy do nich np. koenzym A (nośnik grup acetylowych i innych grup acylowych) oraz pirofosforan tiaminy (TPP) (biorący udział np. w różnych reakcjach dekarboksylacji). Jeden koenzym może wpływać na kilka różnych procesów metabolicznych. Jest to dobrze widoczne na przykładzie tetrahydrofolianu (THF), złożonego związku będącego pochodną pterydyny, kwasu p-aminobenzoesowego i kwasu glutaminowego. Niektóre funkcje THF przedstawiono w tabeli 6. 1. Zwróć uwagę, że uczestniczy on w procesach ważnych dla 100

wzrostu komórki: w syntezie dTMP i puryn (a tym samym syntezie DNA i RNA — rozdz. 7) i syntezie białek. Sam THF jest syntetyzowany w wyniku redukcji swojego prekursora, kwasu dihydrofoliowego (DHF). W szczepach niektórych bakterii można zahamować syntezę DHF (a tym samym i THF) za pomocą sulfonamidów (sekcja 15. 4. 9), które w ten sposób hamują funkcje zależne od THF. Niektóre przykłady prostych szlaków biosyntetycznych przedstawiono na rysunku 6. 3.

6. 3. 2 Wzajemne przemiany związków węgla W wielu szlakach poszczególne reakcje lub nawet ciągi reakcji mogą w zależności od warunków przebiegać w jednym z dwóch kierunków. Ponadto związki pośrednie (jak również produkty końcowe) mogą przechodzić z jednego szlaku do drugiego, dzięki czemu przepływ węgla do różnych produktów może być regulowany zgodnie z zapotrzebowaniem komórki. W wielu przypadkach bakterie potrafią syntetyzować ogromną różnorodność cząsteczek z jednego źródła węgla. Przedstawiamy tu tylko kilka krótkich przykładów wzajemnych przemian związków węgla. Zjawisko wzajemnych przemian związków węgla dobrze ilustruje glukoneogeneza: synteza glukozo-6-fosforanu z substratów niewęglowodanowych, takich jak octan, glicerol czy pirogronian. Zasadniczo zachodzi to w wyniku przekształcenia substratu (gdy jest to konieczne) w związek pośredni glikolizy (rys. 5. 3), po którym następuje odwrócenie szlaku. Obejście reakcji nieodwracalnych szlaku zachodzi w wyniku działania innych enzymów. Bakterie zdolne do glukoneogenezy (np. E. coli) mogą, jeśli to konieczne, wykorzystywać związki pośrednie (a także produkty końcowe) w odwróconym szlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa. Gdy szlaki heksozomonofosforanowy i Entnera-Doudoroffa zachodzą w jednej komórce, to 6-fosfoglukonian, ich wspólny związek pośredni (rys. 6. 2), może być metabolizowany w każdym z nich. Zwiększony metabolizm w pierwszym ze szlaków może być potrzebny np. w czasie replikacji chromosomu, gdyż synteza DNA wymaga wzmożonego wytwarzania rybulozo-5-fosforanu, wchodzącego w skład nukleotydów purynowych i pirymidynowych (sekcja 7. 2). 101

102

6. 3. 3 Polimeryzacja związków węgla Polimeryzacja polega na chemicznym łączeniu małych cząsteczek, z wytworzeniem dużej cząsteczki, często w formie łańcucha, zwanej polimerem. Homopolimer powstaje, gdy wszystkie małe cząsteczki są takie same, a heteropolimer — gdy są różne. U bakterii w wyniku polimeryzacji są syntetyzowane pewne związki zapasowe, a także różne składniki ściany i otoczek. W następnym rozdziale są omówione dwa bardzo ważne (hetero)polimery, tj. białka i kwasy nukleinowe.

6. 3. 3. 1 Synteza peptydoglikanu U E. coli N-acetyloglukozoamina i kwas N-acetylomuraminowy (rys. 2. 7) są syntetyzowane w cytoplazmie, jako oddzielne pochodne UDP (urydyno-5'-difosforan), w skrócie odpowiednio — UDP-GlcNAc i UDP-MurNAc. Następnie do UDP-MurNAc zostaje dodany łańcuch pięciu aminokwasów. Powstaje w ten sposób tzw. nukleotyd Parka, który jest przenoszony (z uwolnieniem UDP) na długołańcuchową cząsteczkę lipofilową (baktoprenol) w błonie cytoplazmatycznej. Potem, w wyniku dodania UDP-GlcNAc (z uwolnieniem UDP), powstaje podjednostka złożona z baktoprenolodisacharydopentapeptydu. Wreszcie podjednostki takie zostają przeniesione z błony cytoplazmatycznej do peryplazmy (z uwolnieniem baktoprenolu). Tu są łączone w reakcji transglikozylacji, w wyniku czego powstają łańcuchy glikanowe (rodzące się nici peptydoglikanu). Włączanie tego nowego peptydoglikanu do istniejącego już woreczka peptydoglikanowego zachodzi zgodnie z modelem 3-za-l (sekcja 3. 2. 1, rys. 3. 1). Peptydowe wiązania poprzeczne są tworzone w reakcjach transpeptydacji. Transglikozylacja i transpeptydacja zachodzą w wyniku aktywności enzymatycznej białek wiążących penicylinę (sekcja 2. 2. 8). U E. coli znacząca część peptydoglikanu jest rozkładana w czasie każdego pokolenia. Jednak, w wyniku działania wydajnego systemu odzysku, tripeptydy są ponownie wykorzystywane do syntezy nowego peptydoglikanu (sekcja 5. 4. 6). Niektóre antybiotyki hamują syntezę peptydoglikanu, a β-laktamy (patrz sekcja 15. 4. 1) działają na jej etapie końcowym. Wankomycyna blokuje przenoszenie podjednostek z błony do cytoplazmy, wiążąc się z częścią pentapeptydową Rys. 6. 3 Niektóre proste szlaki biosyntetyczne — synteza aminokwasów: L-alaniny (a), L-asparaginianu (b) i L-seryny (c). ( N o t k a . Biochemicy często podają wzór kwasu organicznego w formie niezjonizowanej, ale związek nazywają tak, jakby był solą — np. CH 3. CO. COOH = pirogronian. ) W przykładach tych reakcja z udziałem glutaminianu wprowadza azot do cząsteczek prekursorowych nie zawierających tego pierwiastka. Glutamina spełnia to zadanie w syntezie L-tryptofanu. Zwróć uwagę, że każda reakcja jest katalizowana przez swoisty enzym. Zamknięte w kole „P" oznacza fosforan. „Pi" to fosforan nieorganiczny, (d) Urydyno-5'-fosforan (UMP) (w górnej części) został zsyntetyzowany w wyniku serii reakcji (nie pokazanych) z prostych cząsteczek prekursorowych — asparaginianu i karbamoilofosforanu. UMP najpierw podlega reakcji w pozycji 2' — rybozy (patrz rys. 7. 2), tworząc 2'-deoksyrybozę. W następnej reakcji, koenzym N5, N10-metyleno-THF (patrz sekcja 6. 3. 1 i tab. 6. 1) dostarcza grupy metylowej (~CH3) w pozycji 5 uracylu (rys. 7. 3), przekształcając w ten sposób uracyl w tyminę.

103

baktoprenolodisacharydopentapeptydu. Ten złożony antybiotyk glikopeptydowy jest bakteriobójczy dla różnych bakterii gramdodatnich, natomiast nie wnika do wnętrza bakterii gramujemnych. Z klinicznego punktu widzenia jest bardzo pożyteczny w leczeniu np. przeciw szczepom MRSA (sekcja 15. 4. 11). Stosuje się go też w przypadku rzekomobłoniastego zapalenia okrężnicy, przypisywanego Clostridium difficile. Teikoplanina jest strukturalnie i funkcjonalnie podobna do wankomycyny, ale jest bardziej aktywna w stosunku do enterokoków. 6. 3. 3. 2 Synteza poli-β-hydroksymaślanu

Kiedy zaczyna brakować niewęglowych składników odżywczych, wiele bakterii tworzy wewnątrzkomórkowe granule poli-β-hydroksymaślanu (PHB). Są one degradowane, gdy warunki wracają do normy. PHB służy więc jako zapas węgla i/lub energii. Zwykle PHB (rys. 2. 3) jest syntetyzowany z acetylo-CoA poprzez acetoacetylo-CoA i hydroksybutyrylo-CoA. Enzym polimeryzujący, syntetaza PHB, występuje na powierzchni granul. Synteza PHB została opisana w artykule przeglądowym o wytwarzaniu polihydroksykwasów [Poirier, Nawrath i Somerville (1995) Biotechnology 13: 142-150].

6. 4 Metylotrofia u bakterii Metylotrofia jest rodzajem metabolizmu tlenowego, który charakteryzuje się: 1) wykorzystywaniem (względnym lub bezwzględnym) pewnych związków jednowęglowych (zwanych związkami C1) jako źródeł węgla i energii oraz 2) przyswajaniem formaldehydu, będącego produktem metabolizmu metylotroficznego, jako głównego źródła węgla. Związki C1 wykorzystywane w metylotrofii to metanol, metyloamina i metan. Niektóre bakterie metylotroficzne mogą wykorzystywać grupy metylowe odłączone od pewnych większych cząsteczek. Do metylotrofów (organizmów zdolnych do metylotrofii) zalicza się gatunki

należące do rodzaju Hyphomicrobium, Methylococcus, Methylomonas i Methylophi-

lus. Bakterie wykorzystujące tlenek węgla jako jedyne źródło węgla i energii (karboksydobakterie — sekcja 6. 1. 3) były niegdyś zaliczane do metylotrofów, ale zostały z nich wyłączone, gdyż nie wytwarzają/przyswajają formaldehydu. Bezwzględny metylotrof Methylophilus methylotrophus był kiedyś hodowany (na metanolu) na skalę przemysłową i wykorzystywany w żywieniu zwierząt. Rokrocznie wytwarzano tysiące ton produktu o nazwie „Pruteen", dopóki cena białka spożywczego nie spadła na tyle, że stało się to nieopłacalne. Formaldehyd wytwarzany w czasie metabolizmu metylotrofów jest przyswajany w szlaku rybulozomonofosforanowym (szlak RuMP, ang. ribulose monophosphate pathway) lub szlaku serynowym. Oba są szlakami cyklicznymi. W pierwszym formaldehyd łączy się z rybulozomonofosforanem, tworząc heksulozo-6-fosforan. Następujące po tym reakcje regenerują cząsteczkę akceptora (RuMP) i dostarczają pirogronianu do biosyntezy. W drugim szlaku formaldehyd łączy się z glicyną, tworząc serynę. W dalszych reakcjach dochodzi do regeneracji glicyny, a 2-fosfoglicerynian bierze udział w biosyntezie. 104

Bakteriami metanotroficznymi [artykuł przeglądowy: Hanson i Hanson (1996) MR 60: 439-471] nazywamy takie metylotrofy, które są zdolne do wykorzystania metanu jako jedynego źródła węgla i energii. Większość z nich to bezwzględne metanotrofy. Bakterie metanotroficzne, do których zalicza się gatunki należące do Methylococcus i Methylomonas, występują np. w glebie, wodzie i osadach. Wykorzystują one tlen (O2) i enzym monooksygenazę metanową (MMO, ang. methane monooxygenase) do utleniania metanu do metanolu i wody. Dalsze utlenianie prowadzi do powstania formaldehydu, którego część jest przyswajana dzięki szlakowi RuMP lub serynowemu, a część jest utleniana do dwutlenku węgla, z dostarczeniem energii, przy czym na ogół akceptorem elektronów jest NAD lub NADP. Utlenianie metanu przez metanotrofy w znaczący sposób wpływa na globalny bilans metanu. Dzięki nim znacznie mniej tego gazu trafia do atmosfery. Można więc powiedzieć, że metanotrofy mają swój udział w zapobieganiu globalnemu ociepleniu. Ekologię gatunków metanotroficznych ostatnio badano metodami molekularnymi [Murrell i wsp. (1998) FEMSME 27: 1-3-114].

ROZDZIAŁ

7

Biologia molekularna I - geny i ich wyrażanie się

7. 1 Chromosomy i plazmidy Chromosom (sekcja 2. 2. 1) składa się głównie z polimeru zwanego kwasem deoksyrybonukleinowym (DNA, ang. deoxyribonucleic acid). DNA i pokrewny polimer, kwas rybonukleinowy (RNA, ang. ribonucleic acid), należą do grupy cząsteczek (kwasów nukleinowych), które mogą być nośnikami informacji. Informacja jest zakodowana w sekwencji części składowych tych polimerów (tj. czterech różnych nukleotydów). Chromosomowy DNA niesie całą informację niezbędną do określenia zarówno struktury, jak i zachowania się bakterii. DNA decyduje o życiu komórki dzięki kodowaniu wszystkich enzymów (w tym kontrolujących strukturę i metabolizm) i różnych cząsteczek RNA (zaangażowanych w syntezę białka i niektóre funkcje kontrolne). Informacja zawarta w DNA reguluje oraz koordynuje wzrost i różnicowanie. Co więcej, DNA kontroluje własną replikację, jak również jest przykładem systemu zdolnego do samokontroli — znane są różne mechanizmy wykrywające i reperujące zniszczony lub zmieniony DNA. Cała informacja przekazywana jest do komórek potomnych podczas replikacji DNA i podziału komórki rodzicielskiej (sekcja 3. 2. 1). DNA w trakcie replikacji powiela się zazwyczaj bardzo dokładnie, tak że cechy charakterystyczne dla gatunku nie zmieniają się w następnych generacjach. Skłonność komórek potomnych do dziedziczenia cech rodzicielskich — dziedziczność — jest głównym zainteresowaniem genetyki. Wynika stąd, że kwas nukleinowy określa „normalne" życie komórki i dziedziczność, obie te funkcje są tematem badań biologii molekularnej. W większości bakterii długa cząsteczka DNA tworzy zamkniętą pętlę, w innych (np. Borrelia burgdorferi i gatunki Streptomyces) DNA jest liniowy. Przyczyna tego nie jest znana. Jak wiadomo, informacja niesiona przez DNA jest zakodowana w sekwencji nukleotydów; dla niektórych gatunków znana jest obecnie całkowita sekwencja nukleotydów w chromosomie — np. Escherichia coli [Blattner i wsp. (1997) Science 277: 1453-1474], Helicobacter pylori [Tomb i wsp. (1997) Nature 388: 106

539-547], Borrelia burgdorferi [Fraser i wsp. (1997) Nature 390: 580-586] i Mycobacterium tuberculosis [Cole i wsp. (1998) Nature 393: 537-544]. Wiele bakterii oprócz chromosomu zawiera jeden lub więcej plazmidów. Plazmidem nazywamy „dodatkowy" fragment DNA, zazwyczaj znacznie mniejszy od chromosomu, zdolny do niezależnej replikacji. Dużo, a nawet większość plazmidów jest „kolistych" (tzn. są zamkniętą pętlą), ale niektóre z nich są liniowe [patrz np. Hinnebusch i Tilly (1993) MM 10: 917-922]. Z tego powodu niewłaściwa jest definicja plazmidów jako „małych cząsteczek kolistego DNA" (spotykana w niektórych podręcznikach i publikacjach naukowych). Pewne bakterie (np. B. burgdorferi) zawierają plazmidy koliste i liniowe. Plazmidy mogą kodować różne funkcje. Niektóre kodują enzymy, inaktywujące poszczególne antybiotyki. Te tzw. plazmidy R (plazmidy opornościowe, ang. resistance plasmids) sprawiają, że komórka staje się oporna na dany antybiotyk. Pewne plazmidy kodują elementy strukturalne — np. wakuole gazowe (sekcja 2. 2. 5) w niektórych szczepach Halobacterium. Plazmid „Cit" koduje system transportu (sekcja 5. 4) umożliwiający pobranie cytrynianu. Szczepy E. coli zawierające ten plazmid mogą wykorzystywać cytrynian jako jedyne źródło węgla i energii; zdolności tej nie mają zwykłe szczepy „dzikiego typu" E. coli. (Pozostałe funkcje związane z obecnością plazmidów będą wspomniane w innym miejscu książki. ) Mimo że plazmidy często kodują pożyteczne funkcje, nie są zazwyczaj niezbędne dla komórki gospodarza. Plazmidy są zwykle nieobecne w niektórych bezwzględnych patogenach z podklasy alfa Proteobacteria (rys. 16. 5) — są jednak w innych bakteriach z tej samej klasy (u tych, których byt związany jest z roślinami lub u zdolnych do fotosyntezy). Przypuszcza się, że gatunki Anaplasma, Bartonella, Brucella i Rickettsia stały się bezplazmidowe, ponieważ ich względnie stałe (wewnątrzkomórkowe) środowisko nie wymaga genetycznej różnorodności niezbędnej dla gatunków żyjących w bardziej zmiennych środowiskach [Moreno (1998) FEMSMR 22: 255-275], chociaż, na przykład, Chlamydia zawierają plazmidy [Thomas i wsp. (1997) Microbiology 143: 1847-1854]. Niektóre (nie wszystkie) plazmidy kodują zdolność do samoprzenoszenia się z jednej komórki do innej w procesie koniugacji (sekcja 8. 4. 2). Plazmidy są powszechnie stosowane w biologicznych technikach związanych z otrzymywaniem zrekombinowanego DNA (sekcja 8. 5). Profagi (sekcja 9. 2), które nie integrują się z chromosomem gospodarza, ale mają zdolność do replikacji, również nazywamy „plazmidami".

7. 2 Kwasy nukleinowe - struktura Kwas nukleinowy jest polimerem złożonym z podjednostek zwanych nukleotydami. Każdy nukleotyd ma trzy części: cząsteczkę cukru, zasadę azotową i grupę fosforanową (rys. 7. 1). Nukleotydy zawierające cukier D-rybozę — rybonukleotydy tworzą kwas rybonukleinowy (RNA), natomiast nukleotydy zawierające 2'-deoksy-D-rybozę to deoksyrybonukleotydy tworzące kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) (rys. 7. 2). Zasada azotowa w każdym z nukleotydów jest albo pochodną puryny, albo pirymidyny (rys. 7. 3). Rybonukleotyd może zawierać 107

adeninę, guaninę cytozynę lub uracyl. Deoksyrybonukleotyd może zawierać adeninę, guaninę, cytozynę lub tyminę. Nazwy różnych nukleotydów i odpowiadających im nukleozydów zebrane są w tabeli 7. 1.

Cząsteczki te różnią się jedynie resztami cukru (rybozy), deoksyryboza nie ma atomu tlenu w pozycji 2'. (Cyfry 1, 2', itd. odnoszą się do pozycji atomu tlenu w cząsteczce rybozy). Zasadą może być adenina, guanina lub cytozyna w każdej z dwóch cząsteczek, uracyl natomiast występuje jedynie w rybonukleotydach, a tymina w deoksyrybonukleotydach. (W dideoksyrybonukleotydach, nie pokazanych na schemacie, brak jest atomu tlenu w miejscach 2' i 3'. Dideoksyrybonukleotydy znajdują zastosowanie np. w sekwencjonowaniu DNA — sekcja 8. 5. 6. ).

7. 2. 1 Kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) Nukleotydy tworzą w DNA nierozgałęziony łańcuch, w którym reszty cukier-zasada i reszty fosforanowe są połączone naprzemiennie (rys. 7. 4). Cechą charakterystyczną nici jest jej polarność: wyróżniamy koniec 5' i 3'. DNA zazwyczaj jest złożony z dwóch nici połączonych wiązaniami wodorowymi utworzonymi między zasadami azotowymi. Ta dwuniciowa struktura DNA nazywana jest dupleksem (rys. 7. 5). Dwie nici w dupleksie mają przeciwną polarność, to znaczy, przyjmując kierunek od lewej do prawej (ryc. 7. 5), jedna nić ma polarność 5' do 3', a druga 3' do 5'. Tworzenie wiązań wodorowych między zasadami azotowymi jest wybiórcze: adenina tworzy parę z tyminą, a guanina z cytozyną (rys. 7. 6). Specyficzność tworzenia się par zasad oznacza, że każda zasada w parze ma swojego komplementarnego partnera, a zatem, każda nić DNA w dupleksie jest komplementarna do drugiej nici. 108

Adenina i guanina są purynami zawierającymi podstawniki, inne zasady to pirymidyny. Tymina występuje tylko w DNA, a uracyl tylko w RNA; adenina, guanina i cytozyna znajdują się zarówno w DNA, jak i RNA. W nukleotydzie (rys. 7. 2) puryna w miejscu 9 połączona jest z cząsteczką cukru, pirymidyna łączy się z cukrem w pozycji 1.

109

Przypominający drabinę dupleks DNA tworzy helisę (rys. 7. 7), gdzie odległość między poszczególnymi skrętami wynosi około 10 par zasad (10 pz). Budowa takiej podwójnej helisy została przedstawiona przez Watsona i Cricka w 1950 roku. Wartością, w której podaje się długość dupleksu, jest zazwyczaj liczba nukleotydów w jednej nici. Możliwe jest również określanie długości jako liczby par zasad w dupleksie, ponieważ każdy nukleotyd w jakiejkolwiek nici odpowiada połowie jednej pary zasad w dupleksie. Długość DNA chromosomu Escherichia coli wynosi około 4, 7 miliona par zasad, H. pylori — 1 , 7 miliona pz, M. tuberculosis 4, 4 miliona pz. Długość (liniowego) DNA B. burgdorfeiri wynosi tylko 900 000 pz.

(a) Cytozyna (na lewo) tworzy pary z guaniną (na prawo), (b) Tymina (na lewo) paruje się z adeniną (na prawo). (Uwaga: W RNA (sekcja 7. 5) adenina tworzy pary z uracylem). Linie kropkowane oznaczają wiązania wodorowe.

110

Dupleks DNA w większości bakteryjnych chromosomów tworzy zamkniętą pętlę (tzn. nie ma wolnych końców 5' i 3')· Taki DNA nazywamy kowalencyjnie zamkniętym kolistym DNA (cccDNA, ang. covalently closed circular). Kolisty dupleks może istnieć w różnych formach. Zrelaksowana pętla DNA teoretycznie może leżeć w jednej płaszczyźnie jak gumowa wstążka na stole. Załóżmy jednak, że pętla jest przecięta, a przed ponownym połączeniem się końców jeden z nich uległ skręceniu, drugi zaś nie. Taka sytuacja może prowadzić do zwiększenia lub zmniejszenia liczby skrętów helisy (i powstania helisy nadmiernie lub niedostatecznie skręconej, zależnie od kierunku skręcenia). W takiej cząsteczce istnieje duże naprężenie powodujące skłonność do utworzenia skrętu umożliwiającego rozluźnienie naprężeń cząsteczki. W celu usunięcia naprężeń cała cząsteczka skręca się, a oś helisy staje się helikalna, to znaczy cała helisa zwija się tworząc helisę! Mówimy, że taka cząsteczka jest superzwinięta. Naturalnie występujący DNA jest zazwyczaj „niedostatecznie zwinięty" (tzn. negatywnie superzwinięty). Stopień superzwinięcia regulują enzymy zwane topoizomerazami. W Escherichia coli ogólny stopień superzwinięcia zależy od przeciwstawnego działania dwóch enzymów: topoizomerazy II (=gyrazy) prowadzącej do negatywnego superskręcenia i topoizomerazy I, która temu zapobiega. (Gyraza stanowi cel działania niektórych antybiotyków: sekcja 15. 4. 6, patrz również Ccd w sekcji 7. 3. 1. ) Na superzwinięcie mają również wpływ czynniki środowiska regulujące stan energetyczny komórki. Mechanizm tej zależności nie jest jeszcze znany, choć przyjmuje się, że może tu odgrywać rolę wpływ środowiska na wewnątrzkomórkowe stężenie ATP, wiadomo bowiem, że aktywność gyrazy zależy od stosunku ATP: ADP. Normalny wzrost jest możliwy jedynie w ograniczonym przedziale superzwinięcia DNA. 111

Topoizomerazy III i IV mogą razem z gyrazą odgrywać rolę w dekatenacji chromosomów (sekcja 3. 2. 1). [Control of bacterial supercoiling: Drlica (1992) MM 6: 425-433. ] 7. 2. 1. 1 PNA (peptydowy kwas nukleinowy, ang. peptide nucleic acid) PNA jest analogiem DNA, w którym łańcuchy będące szkieletem polimeru są zmodyfikowanymi polipeptydami (a więc nie są zbudowane z jednostek cukrowo-fosforanowych). PNA może hybrydyzować, z utworzeniem helikalnego dupleksu podobnego do DNA [Witting i wsp. (1994) Nature 368: 561-563]. Cząsteczka ta może mieć znaczenie ewolucyjne. Sugeruje się, że kwasy nukleinowe istniejące przed powstaniem życia niekoniecznie musiały mieć szkielet cukrowo-fosforanowy (patrz również sekcja 8. 5. 15).

7. 2. 2 Kwas rybonukleinowy (RNA) RNA jest liniowym polimerem złożonym z rybonukleotydów (rys. 7. 4). Rybonukleotydy zawierają przeważnie adeninę, guaninę, cytozynę lub uracyl, jednak mogą w nich również występować zmodyfikowane zasady. Bakteryjny RNA (w przeciwieństwie do DNA) jest zazwyczaj jednoniciowy. Istnieją jednak regiony dwuniciowe powstałe w wyniku tworzenia się par między komplementarnymi zasadami obecnymi w różnych odcinkach tej samej cząsteczki RNA. W ten sposób powstają struktury trójwymiarowe. Ważną rolę w powstaniu i aktywności takich struktur odgrywają zazwyczaj jony metali (szczególnie Mg+2). Niektóre z funkcji pełnionych przez RNA omówiono skrótowo w sekcji 7. 9.

7. 3 Replikacja DNA Jak wspomniano poprzednio, sekwencja zasad w chromosomowym DNA koduje informację określającą strukturę komórki i jej zachowanie. Przed podziałem komórkowym DNA musi być precyzyjnie podwojony, tak aby każda komórka potomna mogła otrzymać dokładną kopię (replikę) cząsteczki rodzicielskiej. Synteza DNA (replikacja) jest procesem skomplikowanym. Niżej przedstawiono jedynie zarys typowej replikacji chromosomu E. coli podczas cyklu komórkowego. Co jest sygnałem do rozpoczęcia (inicjacji) rundy replikacji DNA? Tego nie wiemy (patrz sekcja 3. 2. 1). Wiadomo jednak, że runda replikacji rozpoczyna się w określonym regionie dwuniciowej cząsteczki DNA, zwanym origin (oriC), i wymaga wielu różnych białek, poza tym DNA musi być superzwinięty. Duża liczba cząsteczek białka DnaA (prawdopodobnie jako DnaA ATP) wiąże się do specyficznych miejsc (sekwencji wiążących DnaA) w obrębie sekwencji oriC, indukując miejscowe „topnienie" DNA (tj. rozdzielenie nici DNA) w części przylegającej do oriC. W zdenaturowanym regionie jednoniciowy DNA może być stabilizowany przez przyłączenie tzw. białek wiążących jednoniciowy DNA (białek SSB, ang. single-strand binding). Mimo że rozdzielenie nici jest 112

pierwszym ważnym zdarzeniem replikacyjnym, replikacja z pewnością nie zaczyna się w tym zdenaturowanym regionie. Wydaje się, że rozpoczyna się ona w części oriC zawierającej sekwencje wiążące DnaA. Nie wiadomo, w jaki sposób następuje rozdzielenie się nici dokładnie w miejscu początku replikacji. Być może, ma w tym udział wiązanie białka DnaA w tym i w sąsiednich miejscach. Inna teoria przyjmuje, że transkrypcja (sekcja 7. 5) powoduje przejściową denaturację dupleksu DNA we właściwym punkcie regionu oriC. Rzeczywiście, polimeraza RNA (sekcja 7. 5) konieczna jest do inicjacji replikacji DNA. Jednym z czynników istotnych dla inicjacji replikacji DNA jest białko Fis (produkt genu fis). Fis ma kilka miejsc wiązania w oriC, znajdujących się niedaleko miejsc wiążących DnaA, jak również pełni rolę w regulacji zgrupowania genów (dnaA-dnaN-recF) [Froelich, Phuong i Zyskind (1996) JB 178: 6006-6012], do których produktów należy białko DnaA i podjednostka β polimerazy DNA III (rys. 7. 8b). Fis wiąże się z oriC w sposób zależny od cyklu komórkowego [Classer, Grimwade i Leonard (1995) EMBO Journal 14: 5833-5841] i wydaje się, że bierze udział w tworzeniu kompleksu zapobiegającego replikacji [Wold, Crooke i Sharstad (1996) NAR 24: 3527-3532] oraz wywiera słaby wpływ na promotor dnaAp2. Nieznany jest mechanizm, według którego białko Fis reguluje inicjację replikacji DNA. Po rozpoczęciu replikacji, wskutek rozdzielenia się nici DNA, tworzą się dwa widełki replikacyjne. Z każdymi widełkami połączony jest prymosom — kompleks białkowy złożony z DnaB i DnaG. W jednej ze zdenaturowanych nici DNA, zasady odsłonięte wskutek rozdziału nici tworzą pary z komplementarnymi zasadami w cząsteczkach trifosforanów rybonukleozydów, następnie zachodzi enzymatyczna polimeryzacja rybonukleotydów (ich kowalencyjne połączenie) w kierunku 5' do 3', prowadząc do utworzenia krótkiej nici RNA — startera (rys. 7. 8a, górna część). W tym procesie dwie końcowe grupy fosforanowe są odcinane, a reakcja ta dostarcza energii koniecznej do polimeryzacji. Nie wiadomo, czy polimeryzacja RNA zachodzi pod wpływem działania białka DnaG (prymazy), czy polimerazy RNA; oba te enzymy zdolne są do syntezy RNA. Startery tworzą jedną z nici krótkich hybrydowych dupleksów RNA/DNA (rys. 7. 8a, górna część). W trakcie dalszego rozdziału nici, nowo odsłonięte zasady tworzą pary z cząsteczkami trifosforanów deoksyrybonukleotydów i w ten sposób starter zostaje wydłużony w kierunku 5' do 3' przez nową nić DNA. Na skutek tej polimeryzacji, którą katalizuje enzym polimeraza DNA III, tworzy się początek tzw. nici wiodącej DNA (rys. 7. 8a, górna część). Trzeba zauważyć, że nić wiodąca wraz z jedną z nici pierwotnego dupleksu stanowią początkową część nowego dupleksu. Nić oryginalna określa sekwencje zasad w nowej nici i dlatego nazywana jest nicią matrycową. Aktywność polimeryzacyjna polimerazy DNA III wymaga startera RNA, ponieważ polimeraza DNA nie może rozpocząć syntezy nici — może jedynie wydłużyć nić już istniejącą. Białko DnaB zawarte w każdym prymosomie jest helikazą — enzymem, który w obecności gyrazy (sekcja 7. 2. 1) i ATP rozwija DNA, tj. rozdziela dwie nici dupleksu (działając jak zamek błyskawiczny). W ten sposób dwa widełki replikacyjne poruszają się w przeciwnych kierunkach oddalając się od oriC. 113

(a) Kolisty dupleks DNA rozdziela się miejscowo na dwie nici. Schemat przedstawia tylko połowę rozdzielonego regionu. Rozdział nici postępuje w kierunku od lewej do prawej (w pokazanej połowie). Na jednej z odsłoniętych nici (górnej na schemacie) syntetyzowany jest starter RNA (objaśnienie w tekście), późniejsze dodanie deoksyrybonukleotydów prowadzi do wytworzenia „wiodącej" nici DNA, która jest syntetyzowana w kierunku 5' do 3'. Na drugiej nici (dolnej na schemacie) pierwszy starter RNA jest rozciągany przez fragment DNA (fragment Okazaki) również w kierunku 5' do 3' (wiadomo, że synteza DNA nie może zachodzić w kierunku 3' do 5'). Drugi starter jest tworzony i następny fragment jest syntetyzowany dopiero po dalszym rozdziale dupleksu. (Wszystkie startery zostają później zastąpione przez DNA). Region zaznaczony kółkiem (widełki replikacyjne) przesuwa się na prawo w trakcie replikacji, drugie widełki replikacyjne (nie pokazane na schemacie) przesuwają się na lewo.

114

W temperaturze 37°C widełki replikacyjne poruszają się z prędkością 1000 nukleotydów na sekundę. Jak dotychczas, nasze rozważania dotyczyły tylko tej nici dupleksu, która służyła jako matryca nici wiodącej. A co z drugą nicią? Ona również jest matrycą. Zważywszy jednak, że dwie nici dupleksu mają przeciwną polarność, a DNA może być syntetyzowany jedynie w kierunku 5' do 3', kierunek syntezy DNA na tej nici matrycowej jest przeciwny do kierunku syntezy na drugiej nici (rys. 7. 8a, dolna część). Rzeczywiście, nowa nić DNA (nić „opóźniona") jest syntetyzowana jako zbiór krótkich fragmentów (fragmentów Okazaki) w sposób opisany niżej. Kiedy obszar zdenaturowany w dupleksie DNA osiągnie pewną długość, białko DnaG (prymaza) syntetyzuje pierwszy starter RNA w pobliżu widełek replikacyjnych. Starter ten jest następnie wydłużany przez polimeryzację deoksyrybonukleotydów w kierunku 5' do 3', co prowadzi do utworzenia pierwszego fragmentu nowej, opóźnionej nici (rys. 7. 8a, dolna część). Podczas dalszego rozdziału nici tworzony jest drugi starter, następnie drugi fragment jest syntetyzowany, i tak dalej. Każdy fragment Okazaki ma długość około 2000 zasad (2 tys. zasad). Koordynację syntezy dwóch nici, wiodącej i opóźnionej, oraz dużą szybkość syntezy DNA zapewnia: fizyczne połączenie między dwiema cząsteczkami polimerazy DNA i powiązanie między polimerazami a helikazą — utrata wzajemnych powiązań prowadzi do bardzo dużego obniżenia aktywności helikazy [Kim i wsp. (1996) Cell 84: 643-650]. Jeden ze schematów widełek replikacyjnych pokazany jest na rysunku 7. 8(b). Należy zauważyć, że helikaza (rozwijająca dupleks) jest heksamerem (ma strukturę pierścienia złożoną z sześciu cząsteczek białka DnaB) [West (1996) Cell 86: 177-180]. Na rysunku pokazano, że obie nici dupleksu przechodzą przez pierścień helikazy, w rzeczywistości nie wiadomo, czy przechodzą dwie, czy tylko jedna nić. Dwa widełki replikacyjne poruszające się w przeciwnych kierunkach spotykają się w miejscu chromosomu ter położonym w odległości 180° od oriC. Zanim replikacja zostanie zakończona, wszystkie startery są zastąpione przez DNA. W wyniku replikacji powstają dwa superzwinięte dupleksy DNA tworzące katenat (sekcja 3. 2. 1). Replikacja jest semikonserwatywna, ponieważ każdy dupleks DNA składa się z jednej nici pochodzącej z poprzedniego (rodzicielskiego) dupleksu i z jednej nowej (potomnej) nici. (b) Schemat widełek replikacyjnych (skala nieprzestrzegana). Dwie cząsteczki polimerazy (jedna syntetyzująca nić ciągłą, a druga nic opóźnioną) pracują w przeciwnych kierunkach i są połączone ze sobą podjednostkami r. Pokazano również połączenia polimeraza-helikaza (helikaza jest heksamerem złożonym z sześciu cząsteczek białka DnaB). Jednoniciowy DNA chroniony jest przez białka wiążące jednoniciowy DNA (SSBs, ang. single-strand binding proteins) zanim posłużą jako matryca do syntezy nici opóźnionej. Zacisk β (β jest podjednostką polimerazy DNA, produktem genu dnaN) wpływa na procesywność, tj. połączenie aktywności z przesuwaniem się polimerazy. Rysunek (b) pochodzący z Cell (1996) 86: 177-180 mógł być zamieszczony dzięki uprzejmości dr. Stephena C. Westa, Imperial Cancer Research Fund, UK, za pozwoleniem Cell Press, Cambridge MA 0002138, USA.

115

Inne sposoby replikacji DNA. Replikacja opisana w poprzedniej sekcji jest typową replikacją chromosomu E. coli. Należy jednak podkreślić, że istnieją inne sposoby replikacji. Nawet w E. coli, w pewnych warunkach, replikacja chromosomu może zachodzić według innego mechanizmu. Na przykład, po zaindukowaniu systemu SOS, w komórkach zachodzi indukowana, stabilna replikacja DNA (iSDR, ang. inducible, stable DNA replication), która zaczyna się w innym origin (oriMs) i nie zależy od białka DnaA [Asai i Kogoma (1994) JB 176: 1807-1812]. Pewne bakterie mają liniowe chromosomy (i liniowe plazmidy), których replikacja jest dwukierunkowa i zachodzi z origin położonego wewnątrz cząsteczki DNA. Przy założeniu, że synteza DNA odbywa się zawsze w kierunku 5' do 3' (rys. 7. 8), powstaje pytanie, dlaczego po replikacji nie zostają jednoniciowe końce 3'matrycowej nici? Istnieje kilka modeli wyjaśniających możliwość replikacji tych końców [patrz Chen (1996) TIG 12: 192-196]. Dwa z nich sugerują, że koniec 3' nici matrycowej owija się wokół siebie i tworzy strukturę dwuniciową wyznaczającą miejsce startu replikacji. Inny model zakłada, że nowa nić znajdująca się w tworzącym dupleks końcu cząsteczki usuwa 5'-końcową sekwencję nukleotydów matrycy, która jest następnie przenoszona na (komplementarny) jednoniciowy DNA znajdujący się na drugim, potomnym dupleksie (w ten sposób wypełniona jest jednoniciowa luka). W genomie faga (tab. 9. 1) zbudowanym z liniowego dsDNA znajduje się białko kowalencyjnie związane z każdym z końców 5' dupleksu (TP, ang. terminal protein). W zakażonej komórce replikacja DNA fagowego rozpoczyna się w dwóch końcach dupleksu. Kodowana przez faga polimeraza DNA wiąże się z wolną cząsteczką kodowanego przez faga białka TP, a następnie kompleks ten zostaje umiejscowiony na końcu 3' każdej nici, w czym prawdopodobnie bierze udział jego wzajemne oddziaływanie z TP związanym w przyległym końcu 5'. Polimeraza tworzy kowalencyjne wiązanie między dAMP (tab. 7. 1) a związanym z DNA białkiem TP, co pozwala na rozpoczęcie syntezy nici DNA w kierunku 5' do 3', poczynając od tego początkowego nukleotydu. Replikacyjny starter (TP) i polimeraza rozdzielają się po spolimeryzowaniu dziesięciu nukleotydów, białko TP zostaje kowalencyjnie związane z końcem 5' nowej nici, a polimeraza nadal wydłuża krótki starter DNA. Taka inicjacja z udziałem białka jest tylko jedną ze strategii spotykanych w replikacji genomów liniowych. Genomy te nie mogą być replikowane z użyciem starterów zbudowanych z RNA (jak na rys. 7. 8), ponieważ ich usuwanie prowadziłoby do powstania jednoniciowych odcinków DNA na końcach dupleksu. [Protein priming of DNA replication in phage : Mendez, Blanco i Salas (1997) EMBO Journal 16: 2519-2527]. Mechanizm toczącego się koła jest spotykany w replikacji niektórych fagów, np. M13 (sekcja 9. 2. 2), λ (rys. 9. 2) i ΦΧ174 oraz różnych plazmidów (sekcja 7. 3. 1).

7. 3. 1 Replikacja DNA plazmidowego Plazmidy kontrolują własną replikację, jednak do syntezy każdego białka kodowanego przez plazmid i związanego z jego replikacją potrzebny jest aparat biosyntetyczny komórki. 116

Szybkość replikacji zależy od szybkości jej inicjacji, ta zaś jest kontrolowana w różny sposób przez różne plazmidy. W plazmidzie ColEl, na przykład, kontrola jest związana z syntezą dwóch wolnych (nie połączonych ze sobą) nici RNA kodowanego przez plazmid. Jedna z nich (RNA II) może wiązać się z plazmidowym origin i pełnić rolę startera, co umożliwia replikację. Inna nić (RNA I) może temu przeszkadzać przez tworzenie par zasad z RNA II. Wynik oddziaływań RNA I-RNAII decyduje o zajściu replikacji. A więc w plazmidzie ColEl inicjacja jest kontrolowana na poziomie startera (patrz również sekcja 7. 6. 1). Rozpoczęta replikacja plazmidu ColEl przypomina replikację chromosomu (patrz wyżej), chociaż przebiega w jednym kierunku od miejsca origin. Wiele małych plazmidów bakterii gramdodatnich (jak również niektóre plazmidy bakterii gramujemnych) replikują się według mechanizmu toczącego się koła (rys. 8. 5). Replikacja rozpoczyna się przecięciem określonej nici w miejscu origin przez białko Rep kodowane przez plazmid, w ten sposób tworzy się koniec 3' niezbędny do syntezy DNA. Podczas jednej rundy replikacyjnej powstaje jeden komplementarny plazmid dsDNA i jego kolista kopia ssDŃA, która następnie replikuje się do formy dsDNA, korzystając ze startera RNA. Istnieją różne sposoby kontroli inicjacji. Wzrost ilości białka Rep powoduje zwiększenie replikacji, a więc replikacja może być kontrolowana przez regulację syntezy i/albo aktywności Rep. W niektórych wypadkach małe, kodowane przez plazmidy, cząsteczki RNA (transkrypt syntetyzowany z komplementarnej nici, ctRNA — ang. countertranscript RNA) wiążą się z rep mRNA i prowadzą do przedwczesnej terminacji transkryptu bądź do zahamowania translacji genu rep. Inny mechanizm zakłada, że białko Rep jest inaktywowane już po jednorazowym wykorzystaniu, przez związanie krótkiego oligonukleotydy kodowanego przez plazmid. [Replication control in rolling circle plasmids: Rasooly i Rasooly (1997) TIM 5: 440-446]. W wielu plazmidach bakterii gramujemnych białko inicjacyjne Rep wiąże się do „prostych powtórzeń" sekwencji nukleotydowej (iteronów) w regionie origin replikacji plazmidu, prowadząc do utworzenia kompleksu nukleoproteinowego, który inicjuje replikację. RepE (białko E) pełni tę funkcję w plazmidzie F (którego replikacja jest dwukierunkowa i zachodzi według mechanizmu „typu Cairnsa", rys. 7. 8). W plazmidzie tym iterony mają określoną liczbę, rozmieszczenie i skład. W niektórych plazmidach, Rep może również hamować własną transkrypcję przez związanie się do odwróconych powtórzeń sekwencji, które zachodzą na promotor. W kilku przypadkach (również w plazmidzie F) wykazano, że podczas gdy monomery Rep wiążą się z iteronami (pobudzając replikację), dimery wiążą się do promotorów własnych genów (hamując w ten sposób replikację). Badania inicjacyjnego białka RepA plazmidu pSC10 Pseudomonas zasugerowały model aktywacji tego typu białek Rep. Model postuluje, że dysocjacja dimerów prowadzi do powstania monomerów, które mogą wiązać się z iteronami, a to stanowi strukturalną podstawę aktywacji inicjacyjnych białek Rep [Giraldo, Andren i Diaz-Orejas (1998) EMBO Journal 17: 4511-4526]. Zrozumienie zasad kontroli replikacji danego plazmidu wymaga informacji, czy cząsteczki kontrolne są syntetyzowane ciągle czy okresowo, jak ich synteza/aktywność są regulowane i jakie inne czynniki/cząsteczki biorą udział w tym procesie. Ogólnie, replikacja plazmidów (i ich rozdział do komórek po117

tomnych podczas podziału komórkowego) zależą prawdopodobnie od pewnych powiązań między plazmidem a błoną cytoplazmatyczną [Firshein i Kim (1997) MM 23: 1-10. ] W bakteriach liczba cząsteczek określonego plazmidu przypadająca na chromosom nazywana jest liczbą kopii. Niektóre plazmidy (np. F lub R6) mają liczbę kopii 1-2, dla innych plazmidów („wielokopiowych", takich jak ColEl lub R6K) liczba ta wynosi 10-30. (Na liczbę kopii plazmidu mają wpływ mutacje — patrz np. sekcja 7. 6. 1. ) Liczba kopii zależy od systemu kontroli replikacji plazmidu, szczepu bakteryjnego i warunków wzrostu. Niektóre plazmidy mają własne mechanizmy zapewniające ich stabilne utrzymywanie się w komórkach. Na przykład, plazmid F koduje dwa białka, CcdB i CcdA. Białko CcdB jest toksyną (powodującą śmierć komórki), która jest neutralizowana przez CcdA stanowiące antidotum. Toksyna jest trwała, ale antidotum ulega stopniowemu rozkładowi przez proteazę Lon gospodarza. W związku z tym, po podziale komórkowym, każda komórka bez plazmidu F będzie zabita. CcdB hamuje bakteryjną gyrazę (sekcja 7. 2. 1). Więcej informacji o operonie ccd można znaleźć w pracy Couturier, Bahassi i van Melderena (1998) TIM 6: 269-275. ]

7. 3. 1. 1 Ścisła i zrelaksowana kontrola replikacji plazmidów Niektóre plazmidy (np. plazmid F) nie replikują się, jeśli do komórki gospodarza dodamy antybiotyk (np. chloramfenikol), który hamuje syntezę białka. Mówi się, że replikacja takich plazmidów jest pod ścisłą kontrolą. Inne plazmidy (np. ColEl) mogą się replikować w tych warunkach i osiągnąć liczbę kopii znacznie przewyższającą ich liczbę naturalną. Replikacja takich plazmidów jest pod kontrolą zrelaksowaną.

7. 4 Modyfikacja i restrykcja DNA U wielu (może wszystkich) bakterii po replikacji DNA następuje modyfikacja DNA. Polega ona na modyfikacji niektórych zasad w określonych sekwencjach nukleotydów, w każdej z nowo syntetyzowanych nici. W sekwencjach tych grupa metylowa (-CH3) dodawana jest w pozycji N-6 adeniny i/lub w pozycji C-5 cytozyny (pozycje pokazane są na rys. 7. 3). Modyfikacja zachodzi za pośrednictwem specjalnych enzymów, metylotransferaz (= „metylaz"), dla których źródłem grup metylowych jest np. S-adenozylometionina. W jakim celu DNA jest metylowany? Metylacja chroni DNA komórki przed własnymi endonukleazami restrykcyjnymi (REs, ang. restriction endonucleases) — enzymami przecinającymi każdy DNA, który nie jest metylowany we właściwej sekwencji nukleotydów. Dupleks DNA nie jest cięty, jeśli choć jedna nić jest metylowaną. Bezpośrednio po replikacji nowo syntetyzowana (niemetylowana) nić potomna jest zazwyczaj chroniona przed restrykcją przez (metylowaną) nić matrycową aż do momentu jej własnej metylacji. U różnych szczepów bakterii są metylowane inne sekwencje nukleotydów. W ten sposób każdy szczep ma swoje, właściwe dla niego metylazy i restryktazy, 118

z których każda rozpoznaje określoną sekwencję nukleotydów. Na przykład, w E. coli metylaza EcoRI metyluje wybiórczo resztę adeniny CH 3 5'-GAATTC-3' podczas, gdy restryktaza EcoRI przecina (niemetylowaną) nić w pozycji: 5'-G|AATTC-3' gdzie „ |" oznacza cięcie. Warto zauważyć, że w przytoczonym przykładzie nić komplementarna jest cięta następująco: 3'-CTTAA |G-5'. Wynikiem jest przesunięte cięcie, co znaczy, że każdy z końców przeciętego dupleksu ma region jednoniciowy (w tym wypadku 5'-AATT) (patrz rys. 8. 11). (Patrz również metylacja Dam: sekcja 7. 8. 8. ) Wiele szczepów bakteryjnych ma więcej niż jeden typ metylaz i restryktaz. Sekwencja, którą rozpoznaje dana metylaza, nazywa się sekwencją rozpoznawaną. Większość restryktaz może być zaklasyfikowana do typu I, II lub III na podstawie wzajemnych relacji między sekwencją rozpoznawaną a miejscem cięcia. Na przykład, restryktazy należące do typu I przecinają DNA w miejscach przypadkowych, oddalonych od sekwencji rozpoznawanych, natomiast typ II restryktaz przecina między określonymi parami zasad w obrębie rozpoznawanej sekwencji. Stosunkowo niedawno odkryto nowy typ enzymów restrykcyjnych. Enzymy te przecinają DNA z przesunięciem względem sekwencji rozpoznawanej w dwóch miejscach otaczających tę sekwencję. W ten sposób zostaje wycięty mały kawałek DNA zawierający sekwencję rozpoznawaną. Do swojej aktywności enzymy te wymagają Mg +2 i S-adenozylometioniny. Nowy enzym należący do tej rodziny został opisany przez Searsa i wsp. [(1996) NAR 24: 3590-3592] — Bael (z Bacillus sphaericus), którego wzory cięcia przedstawiono na rysunku 8. 11. Nazewnictwo enzymów restrykcyjnych obrazuje następujący przykład. EcoRI: enzym z Escherichia coli, szczep R, „I" oznacza określony (z kilku istniejących) enzym ze szczepu R. Inne przykłady restryktaz są podane w tabeli 8. 1. Jaki jest cel restrykcji? Główna jej rola polega na ochronie komórki przed „obcym", szczególne fagowym DNA wchodzącym do komórki [artykuł przeglądowy o restrykcji: Bickle i Kruger (1993) MR 57: 434-450]. Mechanizm ten czasami zawodzi w ochronie przeciwko fagom: patrz sekcja 9. 6. Co więcej, antyrestrykcyjne białka (białka chroniące przed restrykcją) są kodowane przez niektóre plazmidy [Belogurov, Delver i Rodzevich (1992) JB 174: 5079-5085]. Mogą one chronić komórki biorcy przed restrykcją podczas procesu koniugacji. „Antyrestrykcja" ważna jest również w procesie koniugacyjnej transpozycji (sekcja 8. 4. 2. 3). „Nietypowe" sposoby restrykcji. Niektóre restryktazy działają dopiero po jednoczesnym związaniu się do dwóch sekwencji rozpoznawanych, które niekoniecznie muszą się znajdować w jednej cząsteczce DNA. (Potrzeba związania się w dwóch miejscach przypomina wymagania enzymów koniecznych do rekombinacji zlokalizowanej — sekcja 8. 2. 2. ) 119

Restryktaza DpnI ze Streptococcus (nieprawidłowa nazwa Diplococcus) pneumoniae jest przykładem enzymu przecinającego jedynie miejsce zmetylowane, a więc jest restryktazą zależną od metylacji (w przeciwieństwie do enzymów opisanych wyżej). DpnI przecina sekwencję 5'-GATC-3' między A i Τ tylko wtedy, jeśli adenina jest metylowana. Restrykcja i modyfikacja w technologii rekombinowanego DNA. Typ II restryktaz (wymagających Mg+2, ale nie ATP) znajduje powszechne zastosowanie w przecinaniu DNA w określonych miejscach (sekcja 8. 5. 1. 3).

7. 5 Synteza RNA - transkrypcja W komórce funkcje kodowane przez DNA są przenoszone na różne typy cząsteczek RNA kopiowanych (transkrybowanych) z DNA. Rybosomowy RNA (rRNA) jest głównym składnikiem rybosomów (sekcja 2. 2. 3), małych organelli, na których są syntetyzowane białka. Do syntezy białek są również konieczne inne rodzaje RNA. Synteza białka komórkowego wymaga uprzedniego kopiowania genu, tj. sekwencji kodującej to białko, na jednoniciowy RNA. Powstałą nić nazywamy informacyjnym RNA (mRNA, ang. messenger RNA), ponieważ jest ona nośnikiem informacji zapisanej w genie. W syntezie białka bierze również udział transportujący RNA (tRNA, ang. transfer RNA), który jest nośnikiem aminokwasów i umożliwia ich polimeryzację w sposób określony przez RNA (sekcja 7. 6). Inne typy cząsteczek RNA pełnią specyficzne funkcje kontrolne. Cząsteczka antysensownego RNA może np. hamować aktywność innych cząsteczek kwasu nukleinowego po przyłączeniu się do swojej komplementarnej sekwencji (patrz np. RNA I w sekcji 7. 3. 1). Transkrypcja genu. RNA jest kopiowany z DNA na drodze kolejnego tworzenia się par zasad między pojedynczymi rybonukleotydami a odsłoniętymi zasadami na jednoniciowej matrycy DNA. Rybonukleotydy są polimeryzowane w kierunku 5'do 3'. Podobnie jak w syntezie DNA, trifosforany nukleozydów tworzą pary z nicią matrycową, a dwie końcowe grupy fosforanowe zostają odcięte w reakcji dostarczającej energii do polimeryzacji. Podczas polimeryzacji adenina tworzy parę z uracylem, lecz nie z tyminą. Synteza RNA na matrycy DNA nazywa się transkrypcją, zaś produkt, którym jest jednoniciowy RNA — transkryptem. Polimeryzację rybonukleotydów przeprowadza enzym, polimeraza RNA. Transkrypcja genu wymaga, aby polimeraza związała się ze specyficzną sekwencją nukleotydów, promotorem, w dwuniciowym DNA na początku genu. Zazwyczaj w obrębie tej sekwencji znajduje się miejsce startu, czyli pierwszy nukleotyd rozpoczynający transkrypcję, którego pozycja określana jest jako +1. Nukleotydy leżące „za" nim są numerowane +2, +3... itp. (Nukleotydy leżące w przeciwnym kierunku, tzn. „przed" transkryptem, numerowane są - 1 , -2, -3 itp. ). W komórce mogą się znajdować różne typy (klasy) promotorów dla różnych genów, różnice w sekwencji promotorów obserwuje się nawet w obrębie tej samej klasy. Miejsce +1 jest wygodnym punktem odniesienia do określenia pewnych regionów w sekwencji promotora, które są ważne dla oddziaływań 120

z polimerazą RNA. W najczęściej występującym typie promotorów E. coli są to regiony: 1) sześcionukleotydowa sekwencja najwyższej zgodności (consensus) TATAAT, której środek znajduje się w lub blisko nukleotydu -10, 2) druga sekwencja consensus TTGACA ze środkiem w lub blisko nukleotydu -35, 3) odcinek oddzielający te sekwencje i 4) bogate w pary AT miejsce poprzedzające te regiony (element UP, ang. upstream element) między nukleotydami -40 a -60. (Sekwencja consensus jest teoretyczną „typową" sekwencją nukleotydów, w której każdy nukleotyd występuje w danym miejscu częściej niż trzy inne. Została opracowana przez analizę różnych, występujących w naturze sekwencji tego typu. Można przyjąć, że im mniej różnią się heksamery -10 i -35 od swoich sekwencji consensus, tym „silniejszy" jest promotor, a zatem bardziej aktywny lub funkcjonalny jest gen. Przed przyłączeniem się do promotora polimeraza RNA musi wcześniej związać inne białko zwane czynnikiem sigma. Komórka koduje więcej niż jeden typ czynników sigma, które umożliwiają polimerazie wiązanie się z promotorami różnych klas. W E. coli polimeraza RNA z czynnikiem σ70 może rozpocząć transkrypcję w większości promotorów komórkowych. Niektóre z czynników σ są syntetyzowane tylko wówczas, gdy istnieje potrzeba transkrypcji genów określonej klasy (patrz sekcja 7. 8. 9). Po związaniu holoenzymu polimerazy RNA (= polimeraza RNA + czynnik σ, często oznaczony jako Εσ70, Eσ32, itp. ) do promotora, nici DNA rozdzielają się w regionie startu, tworząc tzw. „kompleks otwarty", który pozwala na rozpoczęcie transkrypcji. Pierwszy trifosforan rybonukleozydu tworzy parę z odsłoniętym deoksyrybonukleotydem „+1". Następne trifosforany rybonukleozydów tworzą pary (w pozycjach +2, +3, itp. ), a każdy z nich jest cięty do monofosforanu, co dostarcza energii do utworzenia wiązania fosfodiestrowego. Nić RNA wydłuża się w trakcie polimeryzacji większej ilości rybonukleotydów. Wkrótce potem czynnik sigma odłącza się, a polimeraza RNA kontynuuje syntezę pozostałej części nici. Elongacja to proces obejmujący postępujące rozwijanie się dupleksu i kolejne dodawanie rybonukleotydów do wydłużającego się końca RNA. Nić RNA odłącza się od matrycy, a dupleks DNA zostaje odtworzony. Transkrypcja zatrzymuje się w określonej sekwencji nukleotydów (w miejscu terminującym, czyli terminatorze) na nici matrycowej. Podczas tzw. rho-niezależnej terminacji w części transkryptu regionu terminatora tworzą się wewnętrzne pary zasad, powstała struktura drugorzędowa może prowadzić do odłączenia się transkryptu i/lub polimerazy. W rho-zależnych terminatorach czynnik rho (w E. coli jest on helikazą złożoną z sześciu podjednostek, wielkości 46-kDa każda) może zakończyć transkrypcję po rozpoznaniu określonego miejsca na transkrypcie. Przedstawiono tu jedynie skrót dość skomplikowanego ciągu zdarzeń. Szczegółowe informacje na temat oddziaływań polimeraza-promotor są zawarte w pracy: de Haseth, Zupanic i Record [(1998) JB 180: 3265-3275], natomiast rola polimerazy RNA w elongacji omówiona jest w artykule Mooney, Artisimovitch i Landick [(1998) JB 180: 3265-3275]. 121

7. 5. 1 Regulacja transkrypcji - inne czynniki W sekcji 7. 5 przedstawiono uproszczony obraz transkrypcji. Transkrypcja zazwyczaj jest związana z aktywnością białek zwanych czynnikami transkrypcyjnymi, które wiążą się do określonych sekwencji DNA, bliżej lub dalej od promotora. Wpływ tych białek na transkrypcję może być pozytywny lub negatywny. Przykładem białek wiążących DNA jest białko represora (regulatora) operonu lac (rys. 7. 11). W badaniach wzajemnych oddziaływań białko — DNA użyteczne są techniki hybrydyzacji „Southwestern" i badanie „odcisku stopy" (ang. footprinting) (sekcja 8. 15. 12).

7. 6 Synteza białka Wszystkie białka komórkowe są kodowane przez DNA. Badanie syntezy białek pozwoliło zrozumieć, jak jest zakodowana informacja genetyczna i w jaki sposób działa kod genetyczny. Białko jest złożone z jednego lub kilku polipeptydów. Polipeptyd jest łańcuchem zbudowanym z aminokwasów kowalencyjnie połączonych wiązaniami peptydowymi (-CONH-). Każdy polipeptyd jest zwinięty w trójwymiarową strukturę. Strukturę tę stabilizują wiązania wodorowe lub wiązania disulfidowe utworzone między aminokwasami leżącymi w różnych częściach łańcucha. Określone, trójwymiarowe struktury polipeptydu, niezwykle ważne dla jego funkcji biologicznej, są zależne od rodzaju, liczby i sekwencji aminokwasów. Dla każdego polipeptydu, rodzaj, liczba i sekwencja aminokwasów są determinowane określoną sekwencją zasad w DNA. Ta sekwencja zasad odpowiada jednej z definicji genu. W jaki sposób gen „rządzi" syntezą polipeptydu? Inaczej, w jaki sposób gen jest wyrażany? W przeciwieństwie do nukleotydów, aminokwasy nie mogą się po prostu „ustawić" (i spolimeryzować) na matrycowej nici DNA. W istocie, synteza białka obejmuje kilka etapów. Po pierwsze gen jest transkrybowany (sekcja 7. 5). Transkrypt genu (RNA), który niesie informację zakodowaną w DNA, nazywany jest informacyjnym RNA (mRNA). W cząsteczce mRNA grupy trzech kolejnych zasad kodują określony aminokwas, każda taka trójka nazywa się kodonem. Na przykład, kodon UCA (uracyl-cytozyna-adenina) koduje aminokwas serynę (tab. 7. 2). W ten sposób kolejność kodonów w mRNA koduje sekwencję aminokwasów w polipeptydzie. Uczestnictwo w syntezie polipeptydu jest uwarunkowane uprzednim związaniem aminokwasu z cząsteczką „łącznika" właściwego zarówno dla aminokwasu, jak i własnego kodonu. „Łącznikami" są małe cząsteczki RNA — transportujący RNA (tRNA), z których każda wiąże określony aminokwas, co prowadzi do powstania aminoacylo-tRNA. (Wiązanie wymaga ATP). Każda cząsteczka tRNA zawiera miejsce wiążące aminokwas i sekwencję złożoną z trzech zasad (antykodon) komplementarną do kodonu dla danego aminokwasu. Dana cząsteczka tRNA może więc związać określony aminokwas i przyłączyć go do właściwego kodonu w mRNA dzięki zdolności tworzenia par zasad między kodonem a antykodonem. 122

Synteza polipeptydu (proces translacji) zachodzi na rybosomie (sekcja 2. 2. 3). Uproszczony przebieg tego procesu jest schematyczne pokazany i wytłumaczony na rysunku 7. 9. Jak pokazano na rysunku 7. 9, kodonem inicjującym (tj. pierwszym kodonem podlegającym translacji) jest zazwyczaj AUG. Odpowiednie ustawienie AUG i rybosomowego miejsca Ρ umożliwia zazwyczaj określona sekwencja nukleotydów (sekwencja Shine-Dalgarno) umiejscowiona przed kodonem AUG na mRNA (tj. na lewo od AUG na rys. 7. 9). Sekwencja ta tworzy pary zasad z częścią, wchodzącej w skład rybosomu, cząsteczki 16S rRNA. Kodon inicjujący AUG u większości bakterii (włączając E. coli) koduje zmodyfikowany aminokwas N-formylometioninę. Inicjujący kodon tworzy parę z wyspecjalizowanym inicjujacym tRNA, który transportuje N-formylometio10 ninę. Reakcja formylacji metioniny wymaga N -formylotetrahydrofolianu (tab. 6. 1). Należy podkreślić, że po zakończeniu translacji albo grupa formylowa, albo cała formylometionina jest enzymatycznie usuwana z polipeptydu. W E. coli formylometionina usuwana jest z około 50% białek. To, czy zostanie ona odcięta od określonej cząsteczki białka, zależy od przedostatniego, N-końcowego

123

124

aminokwasu. Im dłuższy jest łańcuch boczny tego aminokwasu, tym mniejsze jest prawdopodobieństwo odcięcia formylometioniny. Formylometioninę odcina enzym, aminopeptydaza metioninowa (MAP, ang. methionine aminopeptidase) — przedstawiciel ważnych fizjologicznie enzymów [właściwości i funkcje aminopeptydaz opisano w artykule: Gonzales i Robert-Baudouy (1996) FEMSMR 18: 319-344]. Natomiast enzym deformylaza metioninowa odcina tylko grupę formylową. Inicjacja syntezy białka wymaga uczestnictwa trzech białek, czynników inicjujących — IF-1, IF-2 i IF-3, choć sposób i koordynacja ich działania nie są w pełni poznane. Jest jednak powszechnie przyjęte, że IF-2 i GTP są niezbędne do związania formylometionylo-tRNA do AUG w miejscu P. Ten tRNA wiąże się do podjednostki 30S przed dodaniem podjednostki 50S (tzn. między etapami (a) i (b) na rys. 7. 9). Wszystkie trzy czynniki inicjujące odłączają się przed ukończeniem etapu (b) — rys. 7. 9. Podczas tworzenia kompleksu 70S, IF-2 działa jak GTPaza, a połączenie się podjednostek 50S i 30S jest związane z hydrolizą GTP. [Bacterial initiation factors in protein synthesis (artykuł przeglądowy): Brock, Szkaradkiewicz i Sprinzi (1998) MM 29: 409-417. ] Elongacja łańcucha polipeptydowego zachodzi przez kolejne dodawanie aminokwasów odpowiadających kodonom znajdującym się za AUG. Pierwszym etapem elongacji jest związanie aminoacylo-tRNA do pustego miejsca A (rys. 7. 9, etap C). W E. coli wiązanie jest uzależnione od GTP i czynnika elongacyjnego EF-Tu. Po związaniu aminoacylo-tRNA następuje transpeptydacja (utworzenie wiązania peptydowego) i translokacja (przemieszczenie kompleksu) (rys. 7. 9, d-e). Etapy c-e powtarzają się w trakcie elongacji, a kodony są odczytywane zgodnie z kodem genetycznym (tab. 7. 2). Pary zasad tworzone między kodonami mRNA i antykodonami tRNA zazwyczaj nie są stabilne w stopniu zapewniającym odpowiednią dokładność i wydajność translacji. Ma na to wpływ również rybosom, konkretnie rRNA [patrz np. Schoeder (1994) Nature 370: 597-598].

Rys. 7. 9 Synteza białek w bakteriach (schemat uproszczony, patrz sekcja 7. 6) (a) rybosomowa podjednostka 30S wiąże się z mRNA. Region 16S rRNA zdolny do rozpoznania kodonów zachodzi na miejsce „P" i „A". Kodon inicjujący (AUG) mRNA zajmuje miejsce P. (b) Pierwszy aminokwas (ΑΑ1) związany z tRNA (tRNA1) zajmuje miejsce P, a antykodon tRNA1 paruje się z kodonem AUG. Podjednostka 50S wiąże się, tworząc cały rybosom. (c) Drugi aminoacylo-tRNA zajmuje miejsce A, a antykodon tRNA2 paruje się z kodonem AUG. (d) Tworzy się wiązanie peptydowe między grupą karboksylową pierwszego aminokwasu AA1 a grupa α-aminową drugiego aminokwasu AA2. Reakcję te nazywamy transpeptydacją. (AA1 stanie się w ten sposób „końcem aminowym" lub końcem Ν łańcucha polipeptydowego). Reakcja transpeptydacji jest katalizowana przez enzym peptydylotransferazę. Enzym ten stanowi cześć rybosomowej podjednostki 50S (oraz jest miejscem działania niektórych antybiotyków — patrz sekcja 15. 4. 4). (e) Rybosom przesuwa się stopniowo po RNA na odległość jednego kodonu, w kierunku 5' do 3' (translokacja). tRNA1 zostaje uwolniony. Dipeptyd związany z tRNA zajmuje teraz miejsce P, natomiast „akceptorowe" miejsce A naprzeciw trzeciego kodonu jest puste. (f) Trzeci aminoacylo-tRNA wiąże się do miejsca A. Etapy d-f powtarzają się dla każdego kodonu. Gdy zostanie napotkany kodon stop (np. UAA), czynnik uwalniający białko hydrolizuje wiązanie estrowe między ostatnim tRNA a łańcuchem polipeptydowym. Uwalnia się gotowy łańcuch białka.

125

Sygnałem terminacji translacji (zakończenia syntezy polipeptydu) jest obecność w miejscu A jednego z kodonów stop (kodonów nonsensowych): UAA, UAG i UGA (ochre, amber i opal, odpowiednio). Terminacja jest związana z aktywnością czynnika uwalniającego, który musi rozpoznać sygnał stop i oddziaływać bezpośrednio z mRNA. Prowadzi to do hydrolizy wiązania peptyd-tRNA w miejscu Ρ i do uwolnienia polipeptydu. Tradycyjnie przyjmuje się, że sygnał stop stanowi trójka zasad (jak wyżej), istnieją jednak dowody sugerujące, że zasada znajdująca się za kodonem stop wpływa na wydajność terminacji. Być może, właściwy sygnał stop jest 4-zasadową, a nawet dłuższą sekwencją [Tate i Mannering (1996) MM 21: 213-219]. Podczas, gdy jeden z rybosomów przemieszcza się wzdłuż cząsteczki mRNA, drugi może zająć puste miejsce inicjujące i rozpocząć translację innej cząsteczki polipeptydu. Jedna cząsteczka mRNA może być pokryta przez większą ilość rybosomów tworzących polirybosom (polisom) (rys. 7. 10). Sekwencje sygnałowe. W wielu przypadkach białko będące częścią błony lub transportowane przez błonę jest syntetyzowane ze specjalną N-końcową sekwencją aminokwasów (sekwencją sygnałową). Sekwencja ta pozwala wejść lub przejść przez hydrofobowy region błony, a następnie zostaje enzymatycznie odcięta (patrz również sekcja 5. 4. 3) [Signal sequences (artykuł przeglądowy): Izard i Kendall (1994) MM 13: 765-773. ] Zwijanie białek. Funkcjonowanie białek zależy od właściwego zwinięcia (sfałdowania) łańcuchów polipeptydowych. W białkach znajdujących się w peryplazmie, w błonie lub w białkach wydzielanych na zewnątrz sfałdowanie jest związane z utworzeniem mostków disulfidowych między określonymi aminokwasami w łańcuchu. (W E. coli mostków disulfidowych zazwyczaj nie ma w białkach cytoplazmatycznych, ponieważ mogą być redukowane enzymatycznie, np. przez zależny od NADPH system tioreduktazy) [ale patrz również Stewart, Aslund i Beckwith (1998) EMBO Journal 17: 5543-5550]. ) Synteza disulfidowych wiązań w peryplazmie E. coli jest katalizowana przez białka Dsb (produkty genów dsb A i dsbB). (Mutacje białek Dsb mają charakter plejotropowy (tzn. wieloraki), co jest spowodowane stabilizacyjnym wpływem mostków siarczkowych na liczne białka, np. białka rzęski, białka błony i różne białka wydzielane na zewnątrz. W bakteriach patogennych mutacje takie mogą wpływać na wydzielane, białkowe czynniki wirulencji, a więc obniżać wirulencję patogenów [Disulphide bond formation (artykuł przeglądowy): Bardwell (1994) MM 14: 199-205].

126

Białka zawierające prolinę do swojego, właściwego sfałdowania mogą wymagać izomeraz peptydyloprolilowych. W E. coli kilka izomeraz tego typu (np. FkpA i PpiA) występuje w regionie peryplazmatycznym. Synteza przynajmniej kilku enzymów związanych ze zwijaniem białka jest z pewnością kontrolowana przez dwuskładnikowy system regulacyjny (sekcja 7. 8. 6) nazywany CpxA-CpxR. Aktywacja sensora, CpxA, prowadzi do fosforylacji regulatora CpxR, który w następstwie tego zdolny jest do związania się z DNA przed miejscem startu transkrypcji, np. w genach dsbA i ppiA. Aktywacja systemu Cpx wykazuje zgodność z obserwowanym in vivo zwiększeniem transkrypcji obu tych genów [Pogliano i wsp. (19970 GD 11; 1169-1182]. Wydaje się, że transkrypcja genów związanych z fałdowaniem białka jest zależna od czynnika σΕ [Danese i Silhavy (1997) GD 11: 1183-1193]. Zwinięcie nowo syntetyzowanych białek i ich przejście przez błony w stanie całkowicie lub częściowo zwiniętym jest ułatwione przez tzw. białka opiekuńcze (zazwyczaj nazywane chaperonami). Są to cząsteczki, które wiążą się i stabilizują nowo syntetyzowane białka, ułatwiają ich właściwe fałdowanie przez hamowanie niewłaściwych sposobów zwinięcia. Każdy etap zwinięcia i translokacji może wymagać udziału więcej niż jednego białka opiekuńczego. Białka opiekuńcze mogą się wiązać z innymi białkami podczas translacji [patrz Fedorov i Baldwin (1997) JBC 272: 32715-32718] albo po translacji. Chaperony są syntetyzowane konstytutywnie, jednak w pewnych stresowych warunkach (np. szok cieplny, sekcja 7. 8. 2. 3) synteza ich wzrasta — prawdopodobnie ze względu na konieczność ponownego zwinięcia zdenaturowanych białek. Chaperony to zazwyczaj białka, ich przykładami są produkty genów groES, groEL i dnaK E. coli. Jednak lipid obecny w błonie, fosfatydyloetanoloamina (PE, ang. phosphatidylethanolamine; sekcja 2. 2. 8) pełni rolę chaperonu dla białka LacY E. coli (sekcja 7. 8. 1. 1). Wczesne etapy zwijania tego białka (w błonie cytoplazmatycznej) są niezależne od lipidu, natomiast stadia późniejsze wymagają udziału lipidu PE [Bogdanov i Dowhan (1998) EMBO Journal 17: 5255-5264]. [Protein folding and misfolding (some concepts and themes): Dobson i Ellis (1998) EMBO Journal 17: 5251-5254. ] Synteza peptydów bez rybosomów. Pewna ilość bardzo krótkich peptydów syntetyzowana jest przez kompleks składający się z wielu enzymów, a nie przez rybosomy i cząsteczki RNA. W ten sposób są syntetyzowane np. niektóre antybiotyki, takie jak tyrocydyna (cykliczny peptyd złożony z 10 reszt aminokwasowych) i gramicydyna (liniowy peptyd). Takie antybiotyki (wytwarzane przez Bacillus brevis) działają przeciw bakteriom gramdodatnim, najprawdopodobniej przez zmianę przepuszczalności błony cytoplazmatycznej. [Non-ribosomal biosynthesis of peptide antibiotics (artykuł przeglądowy): Kleinkauf i von Dohren (1990) EJB 192: 1-15. ]

7. 6. 1 Losy mRNA Po spełnieniu swej roli wiele rodzajów bakteryjnego mRNA istnieje w komórce krótko i szybko ulega degradacji do składników, które mogą być ponownie użyte. Proces ten ma duże znaczenie, inaczej cytoplazma zostałaby szybko 127

zapełniona „zużytymi" cząsteczkami mRNA. (Zdarza się jednak, że degradacja mRNA jest opóźniona — patrz sekcja 7. 8. 4). Degradacja zachodzi z udziałem nukleaz (enzymów, które przecinają kwasy nukleinowe): endonukleaz (które przecinają wiązanie fosfodiestrowe w regionach środkowych) i egzonukleaz (odcinających nukleotydy od końca 3'). mRNA E. coli jest degradowany do odcinków długości około 10 nukleotydów (nie mniejszych) przez RNazę II i fosforylazę polinukleotydową. W jaki więc sposób mRNA może być ponownie syntetyzowany? Wydaje się, że nieznany dotychczas enzym RNaza* degraduje te odcinki do pojedynczych nukleotydów, w ten sposób model degradacji mRNA zostaje uzupełniony [Cannistraro i Kennel (1991) JB 173: 4653-4659]. Na degradację mRNA mają wpływ warunki wzrostu. Na przykład w E. coli okres półtrwania przynajmniej niektórych cząsteczek mRNA jest bardzo wydłużony podczas wolnego wzrostu w warunkach beztlenowych (czas podwojenia liczby komórek = 700 min). W tych warunkach szybkość syntezy mRNA jest znacznie mniejsza, a zwiększona trwałość mRNA może być mechanizmem utrzymującym wyrażanie się genów podczas anaerobiozy [Georgellis i wsp. (1993) MM 9: 375-381]. W nowszych pracach podkreśla się, że poliadenylacja pełni ważną rolę w stabilizacji mRNA. Wiadomo jest, że większość eukariotycznych mRNA ma „ogony" złożone z poliadenylanu (tj. -A-A-A-A 3'), natomiast mało jest doniesień dotyczących poliadenylacji bakteryjnych mRNA. Jednak takie mRNA istnieją, a w E. coli są przynajmniej dwa enzymy — polimerazy poli(A) (PAPs, ang. poly(A)polymerases) odpowiedzialne za poliadenylację. Znaczenie poliadenylacji nie jest znane, może np. pomagać w regulacji okresu półtrwania (stabilności) pewnych cząsteczek RNA, których koniec 3' jest strukturą drugorzędową typu „pętli i łodygi" kodowaną przez rho-niezależny terminator transkrypcji (sekcja 7. 5). Struktura pętli i łodygi jest zazwyczaj oporna na działanie niektórych enzymów degradujących RNA; sugeruje się, że poliadenylacja 3' struktury „pętli i łodygi" może ułatwiać degradację tych cząsteczek, ponieważ dostarcza dogodnego miejsca do wiązania enzymów degradujących — np. 3' egzonukleazy — fosforylazy polinukleotydowej. Co ciekawe, mutacje w genie pncB E. coli (który koduje polimerazę poli(A), PAPI) zmniejszają liczbę kopii np. plazmidu ColE1. Wydaje się, że antysensowna cząsteczka RNA I jest zazwyczaj poliadenylowana, co ułatwia jej degradację. W mutantach pcnB brak jest poliadenylacji, a to stabilizuje RNA I, jednocześnie zwiększając jego hamujące działanie na RNA II i w rezultacie hamując replikację ColEl (tj. redukując liczbę jego kopii). [Polyadenylation of bacterial mRNA (artykuł przeglądowy): Sarkar (1996) Microbiology 142: 3125-3133. ]

7. 6. 2 Białka wewnątrz białek - inteiny W roku 1990 wykryto, że niektóre białka zawierają wewnętrzną sekwencję aminokwasów — inteinę, która katalizuje w białku wycięcie jego części. Inteina jest wycinana (tworząc osobne białko), a dwie końcowe części oryginalnego peptydu (eksteiny) łączą się, co prowadzi do utworzenia funkcjonalnego białka. Schematycznie: 128

eksteina-inteina-eksteina -> eksteina-eksteina + inteina Zjawisko to po raz pierwszy obserwowano w eukariotycznym genie VMA1 (= TFP1) w drożdżach Saccharomyces cerevisiae, później wykryto je w bakteriach (np. w genie recA Mycobacterium tuberculosis i wśród archeonów (np. w genie polimerazy DNA gatunku Pyrococcus i Thermococcus litoralis).

Długość intein wynosi zazwyczaj 350-550 aminokwasów. Ich zdolność autokatalitycznego wycinania jest potwierdzona brakiem wycinania w wyniku delecji regionu DNA kodującego inteinę i faktem „heterologicznej" ekspresji genu kodującego inteinę w organizmach, które nie mają tego genu. Na przykład, wyrażanie się genu VMA1 w E. coli prowadzi do utworzenia zarówno gotowego białka, jak i inteiny. Podczas wycinania powstaje produkt pośredni, który jest rozgałęzionym polipeptydem (z dwoma końcami Ν i jednym końcem C). Przypomina to rozgałęziony mRNA, jaki tworzy się w organizmach eukariotycznych podczas przekształcania pre-mRNA w dojrzały mRNA (patrz rys. 8. 8). Istnieje podobieństwo funkcji intein i pewnych intronów. Niektóre inteiny pełnią funkcję zlokalizowanych endonukleaz (tak jak niektóre ulegające translacji introny). Co więcej, wycięta inteina VMAl S. cerevisiae specyficznie przecina gen VMA1, który nie ma sekwencji kodującej inteinę. Przecięcie zachodzi w miejscu, które normalnie zajmowane jest przez DNA inteiny. W szczepie S. cerevisiae zawierającym gen VMA1 kodujący inteinę oraz kopie genu bez inteiny, po przecięciu kopii następuje Insercja DNA inteiny w procesie (zwanym konwersją genu), w którym kopiowany jest gen zawierający inteinę. Zdolność inteiny do pobudzania wstawienia sekwencji ją kodujących do kopii genu nie zawierających intein (jak w przedstawionym wyżej przykładzie S. cerevisiae) nazywana jest powrotem inteiny. Inteiny, podobnie jak transpozony (sekcja 8. 3), należą do ruchomych elementów genetycznych. Inteiny były opisane w artykule przeglądowym Coopera i Stevensa [TIG (1996) 12: 351-356]. Nowa inteina pochodząca z cyjanobakterii została odkryta przez Pietrovskiego [TIG (1996) 12: 287-288]. Autor zaznacza, że nie jest znana żadna pożyteczna dla komórki rola intein, sugeruje jednak, że niektóre z nich mogą regulować aktywność białka, z którego pochodzą [Compilation and analysis of intein sequences: Perler, Olsen i Adam (1997) 25: 1087-1093].

7. 6. 3 Rybosomy a szybkość wzrostu Zwiększenie szybkości wzrostu jest w sposób oczywisty związane ze wzrostem szybkości syntezy białka, a to z kolei wymaga większej ilości rybosomów w komórce. Istnieje więc korelacja między szybkością wzrostu a szybkością syntezy rybosomów. Wytwarzanie rybosomów wymaga skoordynowanej syntezy rybosomowych białek i rRNA (sekcja 2. 2. 3). Geny kodujące około 50 rybosomowych białek są zgrupowane w kilkunastu różnych operonach (sekcja 7. 8. 1), z których każdy jest transkrybowany jako pojedyncza cząsteczka z zakodowanym zestawem białek 129

(tzw. policistonowy mRNA). Jeden z modeli opisujących kontrolę tych operonów postuluje, że jedno z białek kodowanych przez określony operon działa jak czynnik regulujący translację operonu, przez zahamowanie translacji przynajmniej niektórych białek kodowanych przez policistronowy mRNA. Mechanizm kontrolujący ekspresję jednego z tych operonów w E. coli przedstawiony jest w sekcji 7. 8. 1. 3. Niektóre z białek regulujących translację danego operonu mogą się również wiązać do 16S i 23S rRNA. Uważa się, że wraz ze zmniejszeniem szybkości wzrostu maleje ilość 16S i 23S rRNA dostępnego do syntezy rybosomów, co z kolei sprawia, że wolne białka rybosomowe mogą się wiązać z własnymi transkryptami i pełnić funkcję hamującą ekspresję. Należy zauważyć, że model ten zakłada istnienie powiązań między syntezą białka a syntezą rRNA. Synteza rRNA jest połączona z potrzebami translacyjnymi komórki, a przez to jest podatna na regulację, zwiększając lub zmniejszając syntezę, zależnie od warunków. W E. coli 16S, 23S i 5S rRNA są transkrybowane wspólnie (w takim właśnie porządku), jako jeden transkrypt operonu rrn. Na chromosomie znajduje się siedem kopii tego operonu (A-E, G, Η), z których wszystkie zawierają jedną kopię każdego z trzech rodzajów rRNA — z wyjątkiem operonu D, który ma dwie kopie genu 5S rRNA. Każde zmniejszenie ilości 16S lub 23S rRNA (np. z powodu mutacji) może być kompensowane przez podwyższenie ekspresji operonów rrn. Przeciwnie, delecja dwóch lub większej liczby kopii genu 5S rRNA w E. coli prowadzi do silnego zmniejszenia szybkości wzrostu (nie obserwuje się efektu kompensacyjnego). To zmniejszenie szybkości wzrostu jest prawie całkowicie zahamowane przez insercję plazmidowego genu 5S rRNA do chromosomu [Ammos, Rampersad i Fox (1999) NAR 27: 637-642].

7. 7 Kontrolowanie i naprawa DNA Uszkodzony DNA może powstać na przykład w wyniku wstawienia nieprawidłowego nukleotydu podczas replikacji. Ten DNA może być natychmiast rozpoznawany i reperowany przez aktywność korekcyjną komórki. Polimeraza DNA III może odciąć „zły" nukleotyd z końca 3' rosnącej nici, co pozwala na zastąpienie go nukleotydem prawidłowym. DNA jest podatny również na chemiczne zmiany zasad [Lindahl (1993) Nature 362: 709-715]. Na przykład, błędna, nie enzymatyczna, spontaniczna metylacja przez S-adenozylometioninę (dawcę grup metylowych — patrz sekcja 7. 4) może prowadzić do powstania 3-metyloadeniny i/lub 7-metyloadeniny, a każda z tych na ogół występujących zasad purynowych może hamować funkcje DNA. W E. coli nietypowe zasady są wycinane przez N-glikozylazy, które przecinają wiązanie między cukrem a zasadą. Glikozylaza DNA I (białko Tag), syntetyzowana w sposób konstytutywny, wycina 3-metyloadeninę. Indukowana glikozylaza DNA II (= białko AlkA) wycina nie tylko te dwie nietypowo metylowane puryny, ale również niektóre nienormalnie metylowane pirymidyny. Badania struktury AlkA sugerują, że szeroka specyficzność tego enzymu jest związana z nasyconą elektronami szczeliną, bogatą w aromatyczne łańcuchy 130

boczne, która może rozpoznawać każdą z nietypowo metylowanych zasad ubogich w elektrony [Labahn i wsp. (1996) Cell 86: 321-329]. Spontaniczna, zachodząca z małą częstością deaminacja cytozyny (rys. 7. 3) do uracylu może być naprawiona na drodze usuwania uracylu przez enzym, N-glikozylazę uracylową (UNG, ang. uracil-N-glycosylase). (UNG znajduje zastosowanie w technologii rekombinowanego DNA (sekcja 8. 5. 4. 3). Wycięcie przez glikozylazę (pierwszy etap naprawy) zmienionych chemicznie zasad zostawia miejsce apurynowe (bez puryny) lub apirymidynowe (bez pirymidyny), zwane miejscem AP (= pozbawione zasady). Dalsze etapy procesu obejmują wycięcie zasady (sekcja 7. 7. 1. 3). W niektórych przypadkach deaminacja cytozyny następuje po metylacji tej zasady w pozycji 5, co wynika z modyfikacji DNA (sekcja 7. 4). Spontaniczna deaminacja 5-metylocytozyny prowadzi do powstania typowej zasady, tyminy (rys 7. 3), która nie może być usunięta przez żaden enzym, zostaje więc w DNA, a w następnej rundzie replikacji tworzy parę z adeniną, prowadząc do powstania mutacji punktowej (sekcja 8. 1. 1, rys. 8. 1). CG w dupleksie wyjściowym zostaje zastąpione przez TA w dupleksie potomnym. 5-metylocytozyna wyznacza miejsca mutacji spontanicznej, tzw. „gorące miejsca" w DNA. (Zastąpienie jednej pirymidyny lub puryny odpowiednio przez inną pirymidynę lub purynę nazywamy tranzycją, zastąpienie puryny pirymidyną lub odwrotnie — transwersją. )

7. 7. 1 System naprawy przez wycinanie 7. 7. 1. 1 Naprawa „mismatch" (pomyłek) (DDMR, ang. Dam-directed mismatch repair) Pomyłki, które nie zostały naprawione przez aktywność korekcyjną polimerazy, mają szansę być naprawione wkrótce potem (przed modyfikacją: sekcja 7. 4) przez system naprawy zwany mismatch. Głównym zadaniem tego systemu jest naprawa błędów powstałych w trakcie replikacji DNA. W E. coli wykrycie źle dopasowanej pary zasad przez białko MutS aktywuje nukleazę MutH. MutH przecina nową nić potomną (która charakteryzuje się przejściowym niskim stopniem metylacji) w miejscu 5' od (nie metylowanej) sekwencji GATC (Dam), która może być oddalona nawet o 1000 nukleotydów od źle dopasowanej zasady. MutL zapewnia koordynację między źle dopasowaną parą zasad a miejscem cięcia GATC. Po przecięciu przez MutH odcinek nici potomnej znajdującej się między miejscem cięcia a miejscem położonym za źle dopasowaną zasadą zostaje usunięty. Przyjmuje się, że usunięcie tego odcinka wymaga helikazy II (MutU, zwanej również UvrD) i endonukleazy DNA. Jednak szczepy nie mające egzonukleazy 3'-5', Exol, oraz egzonukleazy 5'-3', Exo VII i RecJ, nie wykazują zaburzeń w naprawie typu „mismatch" [Harris i wsp. (1998) JB 180: 989-993]. Jednoniciowa luka jest zapełniona przez polimerazę DNA (z wykorzystaniem nici oryginalnej jako matrycy) i sklejona przez ligazę. [Replication errors (bacterial and human) (artykuł przeglądowy): Jiricny (1998) EMBO Journal 17: 6427-6436. ] Szczepy E. coli pozbawione produktów genów mut mają defekt w naprawie DNA i charakteryzują się fenotypem mutatorowym (patrz również sekcja 131

8. 5. 5. 1). (Warto podkreślić, że u ludzi niektóre rodzaje nowotworów dolnych odcinków przewodu pokarmowego, jak również inne, związane są z mutacjami w genach homologicznych do mutS i mutL. ) Homologia sekwencji między MutH a enzymem restrykcyjnym Sau3Al (tab. 8. 1) wskazuje na ich pokrewieństwo ewolucyjne [Ban i Yang (1998) EMBO Journal 17: 1526-1534].

7. 7. 1. 2 Naprawa przez wycięcie nukleotydów (naprawa przez system UvrABC) W E. coli system enzymów zależnych od ATP (UvrABC, „enzymy wycinające ABC") rozpoznaje i naprawia DNA uszkodzony/zniekształcony w wyniku naświetlenia promieniami ultrafioletowymi bądź z jakiś innych powodów. UvrABC składa się z trzech białek kodowanych przez geny uvrA, uvrB i uvrC. Początkowo dimer UvrA wiąże się do uszkodzonego DNA. Do dimeru przyłącza się UvrB, a następnie UvrA2B przesuwa się dokładnie do miejsca uszkodzenia. UvrA zostaje zastąpione przez UvrC. Kompleks UvrBC katalizuje przecięcie z obu stron miejsca uszkodzonego, przecięcie po stronie 3' następuje wcześniej niż po stronie 5'. Z kolei helikaza II (UvrD) usuwa UvrC razem z krótką sekwencją nukleotydów zawierającą miejsce uszkodzone. Polimeraza zapełnia jednoniciową lukę, jednocześnie usuwając UvrB, a ligaza kończy naprawę. W E. coli wycinane jest tylko dziesięć nukleotydów obejmujących bliskie sąsiedztwo miejsca uszkodzonego — stąd nazwa naprawa krótkiego odcinka. Naprawa wymaga energii (pochodzącej z hydrolizy ATP) np. do przesunięcia się kompleksu UvrA2B do miejsca uszkodzonego. Białko UvrA jest ATPazą wiążącą cynk.

7. 7. 1. 3 Naprawa przez usunięcie zasady (naprawa następująca po działaniu glikozylaz) Niektóre systemy naprawiają głównie uszkodzenia powodowane przez określone czynniki — np. uszkodzenia oksydacyjne [Demple i Harrison (1994) ARB 63: 915-949] lub wynikłe z niewłaściwej alkilacji lub deaminacji zasad (patrz wyżej). Pierwszym etapem naprawy jest wycięcie zmienionej zasady, z utworzeniem miejsca AP (patrz wyżej). Następnie wiązanie fosfodiestrowe z jednej strony miejsca AP zostaje przecięte przez „AP endonukleazę". W E. coli główną AP endonukleazą jest egzonukleaza III, wielofunkcyjny enzym, którego struktura sugeruje, że przecięcie wiązania fosfodiestrowego następuje w wyniku ataku nukleofilowego na wiązanie P-3'O [Mol i wsp. (1995) Nature 374: 381-386]. Polimeraza DNA może następnie zastąpić sekwencją prawidłową uszkodzony nukleotyd, a wraz z nim kilka nukleotydów leżących po stronie 3' od miejsca uszkodzenia [Sandigursky, Fryer i Franklin (1998) NAR 26: 1282-1287]. Ligaza kończy naprawę.

7. 7. 2 Fotoliaza Jeden z typów uszkodzeń DNA wywoływany przez promienie ultrafioletowe polega na utworzeniu dimerów tyminy. Dimery te powstają w rezultacie wytworzenia wiązań między dwiema sąsiednimi resztami tyminy w tej samej 132

nici. Niektóre bakterie, włączając E. coli, kodują enzym, fotoliazę, zdolną wykorzystać do naprawy uszkodzenia energię pochodzącą ze światła widzialnego. Badania in vitro naprawy dimerów tyminy mogą być ułatwione przez zastosowanie nadmanganianu potasu (KMnO4) [Ramaiah i wsp. (1998) NAR 26: 3940-3943].

7. 7. 3 Wybiórcza naprawa genów aktywnie transkrybowanych Intensywnie transkrybowane geny są naprawiane szybciej niż inne. Jeden z modeli postuluje, że zmieniony DNA blokuje przesuwanie się polimerazy podczas transkrypcji, a czynnik łączący transkrypcję z naprawą (TRCF, ang. transcription-repair coupling factor), kodowany przez gen powodujący zmniejszenie częstości mutacji, mdf (ang. mutation frequency decline), wiąże się w tym miejscu, powodując uwolnienie polimerazy i niedokończonego mRNA. TRCF może następnie oddziaływać z systemem UvrABC i wpływać na naprawę [Miniprzeglądówka: Selby i Sancar (1993) JB 175: 7509-7514. ]

7. 8 Regulacja ekspresji genów Nie wszystkie geny komórkowe są wyrażane przez cały czas. W warunkach braku określonego substratu komórka traciłaby energię na syntezę białek (np. enzymów) koniecznych do jego metabolizowania. Rzeczywiście, geny mogą być „włączane" (indukowane) lub „wyłączane" (reprymowane), bądź też ich wyrażanie się może się zwiększać lub zmniejszać, zależnie od warunków. Taka regulacja często zachodzi dzięki mechanizmowi, który zwiększa lub hamuje syntezę mRNA poszczególnych genów. A więc ekspresja genu regulowana jest wówczas „na poziomie transkrypcji", choć istnieją również inne sposoby regulacji. Niektóre z nich zostały opisane w dalszej części rozdziału. Ekspresja genów związana jest zazwyczaj z syntezą białek (sekcja 7. 6), jednak należy pamiętać, że geny kodują np. tRNA i rRNA. Geny są regulowane nie tylko przez czynniki zewnętrzne, ale również wewnętrznie, co zależy od siły własnego promotora. Silne promotory ułatwiają transkrypcję, natomiast słabe pozwalają jedynie na niski poziom wyrażania się genu (patrz również sekcja 7. 5). Siła promotora nie jest jednak niezmienna, w wielu wypadkach poziom transkrypcji rozpoczynającej się w danym promotorze może być zmieniony w następstwie wiązania się określonych białek regulacyjnych w pobliżu miejsca promotora. Niezakłócona transkrypcja zależy również od właściwego stopnia superzwinięcia DNA (sekcja 7. 2. 1). Na przykład, zmniejszenie negatywnego superzwinięcia prowadzi niejednokrotnie do zahamowania transkrypcji w wielu promotorach. Wyrażanie się genu może również zależeć od innych czynników, takich jak temperatura (sekcja 7. 8. 11) lub rytm dobowy (sekcja 7. 8. 12). Mutacja(e) (sekcja 8. 1) w kodującej sekwencji genu może wpływać na rodzaj i biologiczną aktywność jego produktu (rys. 8. 1). Mutacja w operonie może wpływać na wyrażanie się innych genów położonych za genem zmutowanym.

133

Mówimy wtedy o mutacji polarnej. W niektórych genach ekspresja może być zahamowana, jeśli mutacja w intronie (sekcja 7. 9) powoduje uszkodzenie mechanizmu wycinania, nawet gdy sekwencja kodująca pozostaje bez zmiany. Ekspresja genów u Archaea (zarówno transkrypcja, jak i translacja) bliższa jest wzorom ekspresji genów eukariotycznych niż bakteryjnych [Bell i Jackson (1998) TIM 6: 222-228].

7. 8. 1 Operony Bardzo często sekwencja genów jest transkrybowana z jednego promotora jako pojedyncza cząsteczka RNA. Zbiór genów, których ekspresja znajduje się pod wspólną kontrolą, nazywa się operonem. Geny leżące w tym samym operonie często kodują funkcjonalnie pokrewne produkty, np. enzymy tego samego szlaku metabolicznego. Operony są kontrolowane przez różne mechanizmy, często na poziomie transkrypcji (sekcja 7. 8. 1. 1 i 7. 8. 1. 2), ale czasami na poziomie translacji (sekcja 7. 8. 1. 3). 7. 8. 1. 1 Operony, w których kontrolowany jest promotor W operonach tych rolę kontrolną pełni białko regulatora, którego produkcja może być mniej lub bardziej ciągła. Operony, które są wyrażane dopóki nie zostaną „wyłączone" przez białko regulatora, znajdują się pod kontrolą negatywną. Te, które nie są wyrażane, dopóki nie zostaną „włączone" przez białko regulatora, są pod kontrolą pozytywną. Operon lac w E. coli (rys. 7. 11) koduje białka, które umożliwiają pobranie i metabolizm laktozy (dwucukru złożonego z reszt glukozy i galaktozy). Obecność allolaktozy może „zaindukować" operon lac (rys. 7. 11). Gen lacY koduje permeazę β-galaktozydową, która umożliwia pobranie laktozy ze środowiska. Gen lacZ koduje enzym β-galaktozydazę rozszczepiającą laktozę na reszty glukozy i galaktozy oraz powodującą przekształcenie niewielkich ilości laktozy do formy allolaktozy. Produkt genu lacA (transacetylaza tiogalaktozydowa) prawdopodobnie nie jest istotna dla metabolizmu laktozy. Rysunek 7. 11 tłumaczy regulację operonu lac, który znajduje się pod kontrolą negatywną. Określenie „operon ara" odnosi się zazwyczaj do operonu araBAD. Geny araB, araA i araD kodują enzymy, które umożliwiają metabolizm L-arabinozy do D-ksylulozo-5-fosforanu. W E. coli są również dodatkowe geny związane z pobraniem arabinozy (transport: sekcja 5. 4). Geny te (araE i araFG) znajdują się w dwóch odległych miejscach chromosomu. Geny zlokalizowane we wszystkich trzech miejscach są kontrolowane przez wspólne białko regulatora — AraC (kodowane przez araC). Ze względu na istnienie wspólnego białka regulatora dla genów zlokalizowanych w różnych miejscach, ten zestaw genów (pobranie + metabolizm) stanowi regulon (sekcja 7. 8. 2). W nieobecności arabinozy AraC pełni rolę represora (kontrola regulonu jest negatywna, jak w operonie lac). Arabinoza powoduje konwersję AraC do aktywatora, co umożliwia rozpoczęcie transkrypcji. W ten sposób zmodyfikowane białko regulatora „włącza" system — jest to przykład kontroli pozytywnej. 134

(a) Gdy nie ma induktora, białko regulacyjne (produkt genu lacT) wiąże się do operatora O, co prowadzi do zmniejszenia transkrypcji genów lacZ, lacY i lacA przez polimerazę RNA (na rysunku jest ona związana z promotorem P). Zahamowanie nie jest całkowite. Kilka cząsteczek enzymów, np. produkt genu lacZ — β-galaktozydaza może być syntetyzowany w warunkach represji. (b) Obecność laktozy (pobranej przez komórkę na drodze symportu proton-laktoza, sekcja 5. 4) sprawia, że β-galaktozydaza zmienia laktozę w allolaktozę (sekcja 7. 8. 1. 1). Allolaktoza jest induktorem operonu lac dzięki swej zdolności do wiązania się z białkiem regulacyjnym, a zatem — do jego inaktywacji. Po inaktywacji białka regulacyjnego trzy geny mogą ulegać transkrypcji i translacji. Pojedynczy transkrypt mRNA zawiera kodon inicjujący i terminacyjny dla każdego z trzech genów — patrz sekcja 7. 6. ) Po zużyciu laktozy nie ma już konieczności dalszej transkrypcji operonu lac, induktor (allolaktoza) już się nie tworzy, a białko regulacyjne ponownie „wyłącza" operon. mRNA ulega gwałtownej degradacji (sekcja 7. 6. 1). Operon lac jest również regulowany przez represję kataboliczną (sekcja 7. 8. 2. 1). Na schemacie przedstawiono jedynie zarys działania operonu lac, w rzeczywistości proces ten jest o wiele bardziej złożony. Na przykład, białko regulacyjne może się wiązać do dwóch innych miejsc nazywanych O-2 i 0-3, choć z mniejszym powinowactwem. Wydaje się, że w warunkach represji operonu tetrametryczne białko regulacyjne wiąże się z głównym operatorem (O) i z O-2 (lub O-3) i tworzy w ten sposób pętlę DNA, co stabilizuje połączenia regulator-operator [Reznikoff (1992) MM 6: 2419-2422]. Izopropylo-β-D-tiogalaktozyd (IPTG) jest „niepotrzebnym" induktorem operonu lac, co znaczy, że związek ten indukuje operon, ale nie może być metabolizowany. IPTG znajduje zastosowanie w technologii zrekombinowanego DNA (patrz rys. 8. 16)

135

7. 8. 1. 2 Operony, w których kontrolowany jest atenuator Operony te są związane z syntezą aminokwasów. Operony kontrolowane w ten sposób zawierają początkową sekwencję nukleotydów w transkrypcie mRNA (sekwencję wiodącą), kodującą mały peptyd (peptyd wiodący) bogaty w reszty aminokwasu, którego synteza związana jest z tym operonem. W sekwencji lidera znajduje się również rho-niezależny terminator (sekcja 7. 5) — atenuator, położony między regionem kodującym peptyd wiodący a pierwszym genem strukturalnym. Jeżeli w komórce jest dostateczne stężenie danego aminokwasu (a więc zbyteczna jest jego synteza), transkrypcja zatrzymuje się w atenuatorze. (Peptyd wiodący może być syntetyzowany, ponieważ rybosomy podążają w bliskiej odległości za polimerazą RNA, biorąc udział w translacji świeżo utworzonego transkryptu). Przy niedostatecznym poziomie aminokwasu (a więc wymagana jest jego synteza) rybosom syntetyzujący peptyd wiodący „zatrzymuje się", gdy napotka kodony właściwe dla danego aminokwasu. W tej sytuacji dalsze odcinki transkryptu mogą tworzyć strukturę drugorzędową w sposób wykluczający powstawanie atenuatora, wtedy geny strukturalne mogą być transkrybowane. Kontrola atenuacyjna zachodzi w operonie his (histydynowym) E. coli. Operon trp (tryptofanowy) E. coli podlega negatywnej kontroli w promotorze oraz kontroli atenuacyjnej. 7. 8. 1. 3 Regulacja operonu przez kontrolę translacyjną Kontrola translacyjna zachodzi w operonie IF3-L35-L20 (odpowiednio geny infC, rpml, rplT) w E. coli. Operon ten (transkrybowany jako pojedyncza cząsteczka — policistronowy mRNA) koduje dwa białka rybosomowe (L35 i L20) oraz czynnik białkowy związany z syntezą białka (IF3 — czynnik inicjacji translacji). Translacja L35 i L20 jest hamowana przez L20, to znaczy że wewnątrzkomórkowe stężenie L20 reguluje wyrażanie się genów. Jego duże stężenie hamuje translację. Hamujące działanie L20 wymaga związania się tego białka do mRNA przed genem rpml. Mechanizm hamowania — represji nie jest znany. L20 może po prostu blokować przyłączenie rybosomów do mRNA lub może samo wiązać rybosom, z utworzeniem nieaktywnego kompleksu. Istnieje jednak wytłumaczenie alternatywne. Badania in vitro sugerują, że regulacja translacji jest związana z wytworzeniem „pseudosupła" na RNA przed genem rpml. Być może, L20 stabilizuje taki pseudosupeł, w którym zamknięta jest sekwencja Shine-Dalgarno (sekcja 7. 6) i kodon inicjujący (sekcja 7. 6) dla genu rpml. W ten sposób hamowane jest wiązanie rybosomów, co zapobiega translacji zarówno rpml, jak rplT (Chiaruttini, Milet i Springer (1996) EMBO Journal 15: 4402-4413]. (Patrz również sekcja 7. 6. 3. )

7. 8. 2 Regulony i inne globalne i wielogenowe systemy Regulon jest systemem, w którym dwa lub więcej nie sąsiadujących genów i/lub operonów (każdy z własnym promotorem) kontrolowanych jest przez tę samą 136

cząsteczkę regulatora. Wszystkie geny/operony mają podobne sekwencje regulacyjne rozpoznawane przez regulator. 7. 8. 2. 1 Represja kataboliczna

Wzrost dwufazowy (sekcja 3. 4) udowadnia, że obecność laktozy niekoniecznie prowadzi do indukcji operonu lac (sekcja 7. 8. 11), tzn. że indukcyjny wpływ allolaktozy jest zahamowany przez obecność glukozy. Glukoza również hamuje operon ara (sekcja 7. 8. 1. 1), nawet w obecności arabinozy. To są tylko dwa przykłady represji katabolicznej („efektu glukozowego"). Jest to zjawisko powszechne wśród bakterii, których komórki zużywają niektóre substraty węglowe/energetyczne chętniej niż inne, nawet, gdy są one łatwiej dostępne. Molekularne podstawy represji katabolicznej były niejasne aż do ostatnich lat. Obecny pogląd zakłada istnienie przynajmniej dwóch różnych mechanizmów. Powstanie sygnałów kontrolnych, niezależnie od mechanizmu, jest związane z systemem transportu PTS (sekcja 5. 4. 2). Jeden z mechanizmów jest właściwy dla E. coli i innych bakterii jelitowych, drugi spotykany jest prawie wyłącznie w bakteriach gramdodatnich. Modele obu mechanizmów przedstawione są niżej. Represja kataboliczna w bakteriach jelitowych. W organizmach tych główną cząsteczką regulacyjną jest składnik IIA permeazy glukozowej z systemu PTS (rys. 5. 12). Należy zauważyć, że składnik IIA tej permeazy jest cząsteczką cytoplazmatyczną (tzn. „rozpuszczalną", ruchomą). W nieobecności glukozy fosforylowana forma IIA (IIA~P) nie jest defosforylowana przez IIB. W tych warunkach IIA-P aktywuje cyklazę adenylanową i w ten sposób stymuluje syntezę cyklicznego AMP (cAMP, rys. 7. 12). cAMP wiąże się z białkiem CRP (ang. cAMP receptor protein, zwane również CAP, ang. catabolite activator protein) i aktywuje je. Kompleks cAMP-CRP działa jak transkrypcyjny aktywator: wiąże się do promotora operonu lac, ara i innych operonów, pozwalając na ich wyrażanie się w obecności właściwych induktorów. Dokładny mechanizm aktywacji transkrypcji przez cAMP-CRP nadal nie jest znany. Badania operonów lac i gal sugerują jednak, że obecność cAMP-CRP nie jest konieczna po etapie wytworzenia produktywnego „otwartego kompleksu" (sekcja 7. 5), a więc związek między cAMP-CRP i polimerazą RNA jest tylko przejściowy [Tagami i Aiba (1998) EMBO Journal 17: 1759-1767].

cAMP (3', 5'-cykliczny monofosforan adenozyny) jest syntetyzowany z ATP przez enzym cyklazę adenylanową. Rozkład cAMP do AMP zachodzi z udziałem fosfodiesterazy cAMP. [Various roles of cyclic AMP in prokaryotes (artykuł przeglądowy): Botsford i Harman (1992) MR 56: 100-122. ].

137

W obecności glukozy niefosforylowany IIA wiąże się do permeaz różnych cukrów (np. laktozy) w błonie, hamując ich pobranie. Wiadomo, że cukry te indukują odpowiadające im operony, a więc opisane zjawisko nazywane jest wykluczeniem induktora. W niektórych wypadkach mechanizm podobny do działającego w bakteriach gramdodatnich (patrz niżej) został wykryty w E. coli. Represja kataboliczna w bakteriach gramdodatnich. Transkrypcja niektórych katabolicznych operonów jest kontrolowana przez białko regulatora specyficznego dla danego operonu, którego aktywność zależy od jego fosforylacji oraz tego, które z białek PTS brało udział w fosforylacji. Każde białko regulatorowe ma dwie kopie miejsca specyficznej fosforylacji. Kopie te nazywają się PRD (ang. PTS regulation domain). Każde miejsce PRD może być fosforylowane przez jeden z fosforylowanych pośredników systemu PTS: IIB lub Hpr (rys. 5. 12). Fosforylacja przez IIB prowadzi do inhibicji, tj. powoduje, że białko regulatora hamuje transkrypcję z odpowiadającego mu operonu. Fosforylacja przez Hpr stymuluje transkrypcję. Zasada działania systemu jest następująca. W nieobecności induktora (substratu) składnik IIB danej permeazy jest fosforylowany i zdolny do przeniesienia grup fosforanowych do miejsca PRD w cząsteczce regulatora, co prowadzi do zahamowania ekspresji danego operonu. W obecności induktora, IIB~P przenosi grupę fosforanową raczej na cząsteczkę induktora niż do odpowiedniego miejsca PRD, a więc białko regulatora nie jest hamowane. Wobec jednoczesnego braku glukozy (lub innego łatwo rozkładanego źródła węgla), Hpr~P może fosforylować miejsce PRD w cząsteczce regulatora — w ten sposób stymulowane jest wyrażanie się danego operonu. W obecności induktora i glukozy, grupy fosforanowe z IIB-P i Hpr~P są zużywane do fosforylacji dwóch rodzajów cząsteczek wchodzących do komórki (tj. induktora i glukozy), a wtedy oba miejsca PRD w białku regulatora pozostają niefosforylowane. Brak stymulującej fosforylacji przez Hpr~P powoduje, że białko regulatora jest nieaktywne, a więc operon nie jest wyrażany. Zgodnie z przedstawionym modelem, wyrażenie się operonu wymaga, aby jego regulator był fosforylowany, ale tylko przez Hpr~P (co zachodzi wyłącznie wtedy, gdy nie ma glukozy, a induktor jest obecny). Operon jest nieaktywny, gdy jedno z miejsc PDR fosforylowane jest przez IIB-P, drugie zaś przez Hpr~P (brak induktora, brak glukozy) lub gdy oba miejsca nie są fosforylowane. Niektóre z białek regulacyjnych zawierających miejsca PRD kontrolują operony działając jako antyterminatory zapobiegające przedwczesnej terminacji transkrypcji w strukturach RNA zwanych terminatorami. Inne regulatory stymulują inicjację transkrypcji. W E. coli operon bgl związany z katabolizmem β-glukozydów, np. salicyny, podlega regulacji przez białko nazywane BglG (antyterminator), zawierające miejsca PRD. W nieobecności β-glukozydów BglG jest fosforylowane (inaktywowane) przez składnik IIB białka BglF (permeazę β-glukozydową) i wtedy transkrypcja operonu bgl jest zablokowana. [PDR regulators (artykuł przeglądowy): Stulke i wsp. (1998) MM 28: 865-874. ] 138

7. 8. 2. 2 System SOS Ε. coli System ten składa się z około 20 nie połączonych ze sobą genów wyrażających się, gdy DNA jest uszkodzony lub nie może się replikować w wyniku działania promieniowania ultrafioletowego lub niektórych związków chemicznych. Wyrażenie się systemu SOS może np. zatrzymać podział komórek, zwiększyć aktywność naprawy DNA, wpływać na metabolizm energetyczny i hamować restrykcję. W kontroli tej bierze udział białko LexA (produkt genu lexA). W normalnych warunkach (DNA jest nieuszkodzony), LexA, prawdopodobnie w formie dimeru, wiąże się w pobliżu promotorów genów SOS i hamuje ich transkrypcję. Dla każdego genu SOS miejsce wiązania LexA („SOS box") charakteryzuje konsensus 5'-CTGTN8ACAG-3' (Ns jest jakąkolwiek sekwencją złożoną z ośmiu nukleotydów). Uszkodzenie DNA powoduje aktywację białka RecA (mechanizm aktywacji nie jest znany). Aktywne RecA (oznaczone RecA*) funkcjonuje w sposób nie enzymatyczny jako koproteaza, która stymuluje autokatalityczne przecięcie LexA. Pozwala to na wyrażenie się genów SOS. Wynik eksperymentu in vitro sugeruje, że przecięcie LexA (i derepresja genów SOS) zachodzi szybciej, gdy miejsce chi (χ) (sekcja 8. 2. 1) znajduje się koło dwuniciowego przecięcia DNA. Model zakłada, że obecność χ modyfikuje aktywność białek RecBCD i RecA, co prowadzi do aktywacji RecA i przecięcia represora LexA [Anderson i Kowalczykowski (1998) Cell 95: 975-979]. Produkt genu sulA należącego do systemu SOS hamuje tworzenie się septy (sekcja 3. 2. 1) [SulA-FtsZ interaction: Huang, Cao i Luthenhaus (1996) JB 178: 5080-5085], a w następstwie hamuje podział komórkowy. Komórki rosną wtedy w postaci filamentów nie mających sept. Zahamowanie podziałów komórkowych jest fizjologicznie korzystne dla komórki — daje jej czas do reperacji uszkodzonego DNA, co pozwala na kontynuację replikacji DNA (patrz część końcowa sekcji 7. 3). Naprawa DNA, włączając tę zachodzącą z udziałem endonukleazy UvrABC (sekcja 7. 7. 1. 2), jest bardziej aktywna — geny uvrA i uvrB są składnikami systemu SOS. Błędna reperacja prowadzi nie tylko do naprawy DNA, ale również do zwiększenia liczby mutacji (sekcja 8. 1); zjawisko to nazywamy mutagenezą SOS. W procesie tym RecA*, dzięki swej aktywności koproteazy, umożliwia autokatalityczne przecięcie UmuD, z wytworzeniem aktywnego fragmentu UmuD', który bierze udział w mutagenezie SOS. Mechanizm powstawania mutacji w tym procesie nie jest znany, ale zazwyczaj jest związany z reperacyjną syntezą DNA na nici matrycowej zawierającej „uszkodzenie" — np. dimer pirymidynowy (dwie pirymidyny połączone kowalencyjnie). Synteza ta (zwana syntezą „przez uszkodzenie") zachodzi z udziałem zmodyfikowanej polimerazy DNA (powstałej w wyniku indukcji systemu SOS), która ze względu na brak specyficzności tworzenia par zasad może wprowadzić niewłaściwą zasadę(y) do DNA. Późniejsza naprawa uszkodzenia przez jego wycięcie i następująca po tym replikacja DNA prowadzi do mutacji. In vitro, przechodząca przez uszkodzenie, synteza DNA na nici matrycowej zawierającej miejsce pozbawione zasady (sekcja 7. 7. 1. 3) wymaga polimerazy III DNA, RecA, UmuD' i UmuC. RecA, po naprawie uszkodzonego DNA, jest inaktywowane, a LexA znowu hamuje system odpowiedzi SOS. 139

Należy nadmienić, że wyrażenie się systemu SOS aktywuje lizę bakterii lizogennych (patrz sekcja 9. 2. 1). System SOS może być indukowany np. przez antybiotyki chinolonowe (np. kwas nalidyksowy) i toksynę CcdB kodowaną przez plazmid F [Couturier, Bahassi i van Helden (1998) TIM 6: 269-275]. Główna funkcja systemu SOS może być określona jako adaptacyjna, genetyczna odpowiedź na niesprzyjające/inhibicyjne czynniki. W tych warunkach populacja bakteryjna będzie czerpać niewątpliwe korzyści z wydajnej naprawy DNA. Może się również adaptować przez częstsze powstanie kombinacji genowych zwiększających zdolność do przeżycia. Znajduje to odzwierciedlenie w lepszej zdolności do naprawy DNA, jak również w mutagenezie SOS prowadzącej do powstania korzystnych (ale również letalnych) mutacji. Obniżenie restrykcji zwiększa również możliwość wykorzystania obcego DNA, który został wprowadzony do komórki. Zahamowanie podziałów komórkowych może natomiast pomóc w oszczędzaniu energii i wykluczyć komórki potomne niezdolne do życia. 7. 8. 2. 3 Odpowiedź na szok cieplny Szok cieplny (nagłe podwyższenie temperatury) prowadzi do charakterystycznej odpowiedzi adaptacyjnej w różnych organizmach, od bakterii do roślin i zwierząt. Odpowiedź ta związana jest ze wzrostem syntezy tzw. białek szoku cieplnego (HSPs, ang. heat-shock proteins). W E. coli odpowiedź na szok cieplny następuje po podwyższeniu temperatury od 30°C do 42°C. Może być również indukowana przez takie czynniki stresowe jak promieniowanie ultrafioletowe, etanol i wewnątrzkomórkowe nagromadzenie nieprawidłowych, heterologicznych białek (co może wynikać z ich nadprodukcji, sekcja 8. 5. 11. 4 (d)). Niektóre z 17 białek szoku cieplnego E. coli zwalczają uszkodzenia powodowane przez stres. Na przykład, białka opiekuńcze (molekularne chaperony) GroES, GroEL i DnaK (sekcja 7. 6) zapobiegają nieprawidłowemu zwinięciu białek i agregacji białek nie zwiniętych. Proteaza Lon (produkt genu lori) degraduje uszkodzone i nietypowe białka. Przykładem innych białek opiekuńczych są produkty genów dna], rpoD i lysU. W wyniku podwyższenia temperatury synteza HSPs szybko zwiększa się, osiągając maksimum w ciągu minut, a następnie maleje do nowego, ustalonego poziomu — wyższego niż w niższej temperaturze. U E. coli kontrola regulonu szoku cieplnego jest związana z produktem genu rpoH (poprzednio nazywanego htpR). RpoH to czynnik sigma (sekcja 7. 5), σ 32 , który jest (przejściowo) syntetyzowany w większej ilości po szoku cieplnym. Czynnik σ32 pozwala na bardziej wydajną transkrypcję z promotorów genów HSP, a więc powoduje zwiększoną syntezę białek HSP. Wzrost stężenia σ32 po szoku cieplnym wynika głównie ze zwiększonej translacji i stabilizacji (raczej, niż ze zwiększonej transkrypcji rpoH). Indukowana temperaturą translacja mRNA rpoH jest związana ze zmianą „drugorzędowej struktury" mRNA powstałej w wyniku tworzenia par zasad między regionem znajdującym się zaraz za kodonem startu (ang. „downstream 140

box" — patrz sekcja 8. 5. 11. 2) i innym regionem w sekwencji kodującej. Sadzi się, że ta drugorzędowa struktura hamuje translację w zwykłych warunkach, a efekt ten jest zniesiony podczas szoku cieplnego [Yuzawa i wsp. (1993) Ν AR 21: 5449-5455]. 32 Ostatnie badania wskazują, że translacja σ rzeczywiście jest indukowana 32 wpływem temperatury na σ mRNA. Podwyższona temperatura destabilizuje strukturę drugorzędową, a więc sam mRNA może odgrywać rolę sensora tempe32 ratury (= termometru RNA) dla wyrażenia się σ [Storz (1999) GD 13; 633-636]. 32 Czynnik σ jest syntetyzowany również w niższej temperaturze, ale wówczas ma krótki okres półtrwania (około 1 min) i tworzy połączenia z DnaK, DnaJ i GrpE, w następstwie czego jest degradowany przez proteazę FtsH. Podczas szoku cieplnego DnaK wiąże się preferencyjnie ze zdenaturowanymi białkami. 32 Związanie DnaK pozwala σ, funkcjonować jako czynnik σ, co w rezultacie prowadzi do zwiększonej syntezy HSP [patrz np. Gamer i wsp. (1996) EMBO Journal 15: 607-617]. Szok cieplny w innych bakteriach. U niektórych bakterii indukcja odpowiedzi na szok cieplny regulowana jest przez odmienne mechanizmy. Na przykład, w pewnych wypadkach sekwencja regulacyjna umiejscowiona jest za genami szoku cieplnego. Jest to odwrócone powtórzenie sekwencji zwane CIRCE (ang. controlling inverted repeat of chaperone expression), którego istnienie zostało stwierdzone w Bacillus, Clostridium i w pewnych bakteriach gramujemnych. Kontrola u Bradyrhizobium japonicum składa się z co najmniej dwóch różnych regulujących systemów, obejmujących CIRCE i czynnik podobny do σ32 [Narberhaus i wsp. (1996) JB 178; 5337-5346]. Wyżej przedstawiono ustalony pogląd na regulację bakteryjnych genów szoku cieplnego. Niedawno doniesiono o istnieniu negatywnej regulacji, zgodnie z którą białko represora, w połączeniu z działającą w pozycji cis sekwencją DNA, hamuje transkrypcję w zwykłych, fizjologicznych warunkach [Norberhaus (1999) MM 31: 1-8]. 7. 8. 2. 4 Odpowiedź na szok zimna Gwałtowne obniżenie temperatury może powodować zmianę w wyrażaniu się genów u Prokaryota i Eukaryota. U E. coli zjawisko to nazywane jest szokiem zimna. Odpowiedź na szok zimna następuje, gdy temperatura obniży się z 37°C do 10°C (lub, zazwyczaj, spadek przekracza 13°C). Wzrost zatrzymuje się, a później znowu zostaje wznowiony (ale z mniejszą szybkością) po fazie zastoju trwającej około 4 godzin. Faza zastoju jest spowodowana wybiórczym zahamowaniem translacji, a wznowienie wzrostu jest jednoczesne ze wznowieniem syntezy białka. Szok zimna charakteryzuje się między innymi: 1) indukcją /wzmożoną syntezą białek szoku zimna, 2) nieprzerwaną syntezą niektórych białek związanych z translacją (mimo ogólnego zablokowania syntezy białka), 3) represją białek szoku cieplnego. Uważa się, że jest to odpowiedź adaptacyjna. Do białek szoku zimna zalicza się CspA — małe białko, złożone z 70 aminokwasów, które jest indukowane (natychmiast po obniżeniu się temperatury) na 141

poziomie translacji. Białko to, być może, funkcjonuje w połączeniu z kwasami nukleinowymi. Prawdopodobnie działa ono jako: 1) aktywator translacji w niskiej temperaturze; 2) białko pomocnicze (dla RNA) działające w niskiej temperaturze, zapobiegające tworzeniu się drugorzędowych struktur RNA, co powoduje, że może być ono istotne w translacji RNA w niskiej temperaturze [Jiang, Hou i Inouye (1997) JBC 272: 196-202]; i 3) czynnik hamujący translację określonych cząsteczek mRNA. W rzeczywistości rola CspA może nie być ograniczona do niskiej temperatury, ponieważ białko to jest normalnie produkowane przez E. coli podczas wczesnej fazy wzrostu wykładniczego w 37°C (tj. w warunkach niestresowych) [Brandi i wsp. (1999) EMBO Journal 18: 1653-1659]. Do białek szoku zimna zaliczamy: RecA — inicjujący czynnik 2 (IF-2), który uczestniczy w wiązaniu N-formylometionylo-tRNA do podjednostki rybosomu 30S w momencie startu translacji (sekcja 7. 6), NusA funkcjonujące na etapie terminacji transkrypcji i podjednostkę α gyrazy DNA (topoizomerazy — sekcja 7. 2. 1). Jak dotychczas, nie wykryto indukowanych zimnem czynników σ. Nie jest znany sposób regulacji genów szoku zimna. Sugeruje się regulacyjną rolę CspA w aktywacji transkrypcji. (Samo białko CspA jest regulowane prawdopodobnie przez represor, który traci aktywność w niskich temperaturach). Drobne cząsteczki, ppGpp i pppGpp (G — reszta guanozynowa, ρ — reszta fosforanowa), mogą pełnić rolę regulacyjną. Po obniżeniu temperatury stężenie tych cząsteczek zmniejsza się. Spadek temperatury jest związany ze wzrostem syntezy niektórych białek szoku zimna. Odpowiedź szoku zimna może być również wywołana przez niektóre inhibitory translacji, np. antybiotyki takie jak chloramfenikol, erytromycyna i tetracyklina. Czynniki te (wiele z nich również zmniejsza stężenie (p)ppGpp) wywierają wpływ podobny jak obniżenie temperatury, co sugeruje, że wspólny czynnik — zmniejszenie zdolności komórki do translacji — może pełnić ważną rolę w odpowiedzi na szok zimna. Zgodnie z jednym z modeli, obniżenie się temperatury powoduje, że zdolność translacyjna komórki staje się zbyt mała w porównaniu z ilością aminoacylowanych tRNA (jest to stan przypominający obecność zbyt dużej ilości pokarmu). Stan ten sygnalizuje zmniejszenie stężenia (p)ppGpp, czego następstwem jest indukcja odpowiedzi na szok zimna [Jones i Inouye (1994) MM 11: 811-818]. 7. 8. 2. 5 Odpowiedź ścisła

Głodzenie (np. brak ważnego aminokwasu) wywołuje u bakterii odpowiedź ścisłą — polegającą na zmniejszeniu syntezy białek, rRNA i różnych innych składników komórkowych oraz na zahamowaniu syntezy DNA. Odpowiedź ta pozwala oszczędzać energię i budulec. Odpowiedź jest spowodowana obecnością nie aminoacylowanego tRNA w miejscu A rybosomu (patrz rys. 7. 9). To stymuluje związany z rybosomem enzym, pirofosfotransferazę (= RelA, produkt genu relA, czynnik odpowiedzi ścisłej), do syntezy ppGpp (G — guanozyna, ρ — fosforan) z GTP (lub GDP) i ATP. ppGpp (5'-difosforan 3'-difosfoguanozyny) jest przykładem alarmonu, małej cząsteczki, która gromadzi się w warunkach stresu i stanowi sygnał do zmiany metabolizmu komórkowego. 142

ppGpp może hamować rozpoczęcie syntezy białek, np. przez oddziaływanie z białkowym, inicjującym czynnikiem IF-2, co prowadzi do zablokowania wiązania kompleksu tRNA do rybosomu. Wykazano, że ppGpp hamuje zarówno syntezę białka, jak i rRNA [Svitil, Cashel i Zyskind (1993) JBC 268: 2307-2311]. ppGpp może z pewnością zwiększać transkrypcję niektórych operonów związanych z biosyntezą określonych aminokwasów (np. histydyny). W ten sposób ppGpp pomaga utrzymać właściwą równowagę ilości aminokwasów w komórce. Na przykład, jeśli poziom histydyny jest dostatecznie niski, aby wywołać odpowiedź ścisłą, zwiększenie syntezy ppGpp pozwala odzyskać równowagę przez zwolnienie syntezy białka i stymulację operonu his. W komórkach z mutacją relA, całkowicie znoszącą funkcje genu, nie obserwuje się odpowiedzi ścisłej po głodzeniu aminokwasowym; mówimy, że mutanty te są zrelaksowane.

7. 8. 2. 6 Odpowiedź prowadząca do tolerancji na zakwaszenie Szok kwasowy wywołuje odpowiedź (ATR, ang. acid tolerance response) związaną z syntezą tzw. białek szoku kwasowego (ASPs, ang. acid-shock proteins). Sądzi się, że odpowiedź ta pozwala naprawić uszkodzenia powodowane obecnością kwasów, jak również zwiększa przeżycie w niskim pH. U Salmonella typhimurium odpowiedź ta jest procesem dwuetapowym [Foster (1991) JB 173: 6896-6902]. Zarówno synteza, jak i zahamowanie syntezy białek komórkowych zachodzi w stadium poprzedzającym szok (pH około 6), a później w określonym, niskim pH, komórki mogą przeżyć nawet w pH 3, 3. U Salmonella typhimurium i w innych patogenach przewodu pokarmowego adaptacja i przeżycie w niskim pH jest istotne dla ich chorobotwórczości, ponieważ infekcja następuje zazwyczaj przez żołądek (bardzo kwaśne środowisko). Po zwiększeniu kwasowości środowiska S. typhimurium syntetyzuje przynajmniej 50 białek. Wyrażenie się genów ASP kontrolują dwa białka regulacyjne: czynnik sigma σs (RpoS, produkt genu rpoS) i białko Fur (produkt genu fur). RpoS, samo indukowane podczas odpowiedzi na szok kwasowy, kontroluje część genów ASP. Mutanty nie posiadające funkcji (σs mogą nadal częściowo odpowiadać na ten szok wskutek aktywności białka Fur, które reguluje geny ASP niezależnie od (σs Co ciekawe, Fur reguluje również funkcje związane z pobieraniem żelaza przez S. typhimurium (sekcja 11. 5. 5), jednak rola tego białka w ATR i w pobieraniu żelaza jest fizjologicznie i genetycznie odmienna [Hali i Foster (1996) JB 178: 5683-5691]. W komórkach E. coli szok kwasowy (lub brak tlenu) indukuje wyrażanie się genów kodujących: dekarboksylazę glutaminianową i hipotetyczny system transportu y-aminomaślanu (produktu dekarboksylacji glutaminianu) przez błony. (Wyrażanie się tych genów, gadB i gadC, jest regulowane przez czynnik σs Jeden z modeli zakłada, że glutaminian jest pobierany i dekarboksylowany w reakcji zużywającej proton. y-Aminomaślan jest następnie eksportowany (przez transporter), a to pozwala utrzymać równowagę pH. Inny model proponuje, że GadB i GadC są składnikami energotwórczego systemu dzięki swojej zdolności do transportu protonów. Powstająca pmf służy do syntezy ATP przez 143

ATPazę zlokalizowaną w błonie. [Possible function of gadCB products: Smali i Watreman (1998) TIM 6: 214-216].

7. 8. 2. 7 Składanie bakteryjnej rzęski Struktura i składanie rzęski (sekcja 2. 2. 14. 1, rys. 2. 8) wymaga około 50 różnych typów białek. Składanie jest wysoce zorganizowane — poszczególne części dodawane są w ściśle określonym porządku, co znajduje odzwierciedlenie w kolejności wyrażania się odpowiadających im genów. Niektóre z istotnych genów są wymienione w tabeli 7. 3. W E. coli najwcześniej wyrażane geny (geny klasy I) kodują pewne aktywatory transkrypcji, które są prawdopodobnie potrzebne do wyrażania się genów kodujących części składowe ciałka podstawowego i haka. Wyrażenie się genów klasy I i II konieczne jest do wyrażenia się genów klasy III (do ich produktów zalicza się białko budujące podjednostki włókna, flagellinę). Transkrypcja genów klasy III zależy od czynnika σ (sekcja 7. 5) kodowanego przez geny klasy II. Czynnik σ (białko FliA, produkt genu fliA) jest przejściowo inaktywowany przez czynnik anty-σ (FglM, produkt genu flgM) do czasu, gdy zostanie zakończone składanie ciałka podstawowego i haka. Zakończenie składania haka stanowi sygnał umożliwiający wydalenie FglM z komórki (przez kanał osiowy), co pozwala na aktywację transkrypcji genów klasy III przez FliA. Jak widać, geny kodujące ostami etap konstrukcji rzęski są kontrolowane bezpośrednio przez stan złożenia jej poprzednich części. Genetyczna kontrola składania rzęski była opisana w przeglądowej pracy Shapiro [(1995) Cell 80: 525-527].

144

7. 8. 2. 8 Odpowiedź na stres tlenowy W pewnych warunkach bakterie mogą być uszkodzone lub zabite przez zewnętrzne lub wewnętrzne reaktywne formy tlenu (ROS, ang. reactive oxygen species), takie jak nadtlenek wodoru (H2O2), rodnik hydroksylowy (·ΟΗ) czy ponadtlenek (-O2-). Reaktywne formy tlenu wchodzą w reakcję z kwasami nukleinowymi, białkami i tłuszczami. Bakterie patogenne są narażone na reaktywne formy tlenu w fagolizosomie (sekcja 11. 4. 1). Wewnątrzkomórkowe, reaktywne formy tlenu mogą powstawać np. w wyniku nieprawidłowej regulacji metabolizmu żelaza. W ten sposób nadmiar żelaza (przeciążenie komórki żelazem) w E. coli może katalizować powstanie rodników hydroksylowych z nadtlenku wodoru (reakcja Fentona) [Touati i wsp. (1995) JB 177: 2305-2314]. Niektóre bakterie odpowiadają na stres tlenowy przez zwiększenie syntezy enzymów przeciwutleniających. Do nich zalicza się dysmutazę ponadtlenkową (SOD, ang. supweoxide dismutase), która degraduje ponadtlenek do H 2 O 2 , oraz katalazę i peroksydazę degradujące nadtlenki. U E. coli jeden z regulonów stresu tlenowego kontrolowany jest przez białko OxyR. Utlenione, a tym samym aktywne białko OxyR umożliwia transkrypcję genów katG, ahpC i innych. KatG (katalaza) katalizuje reakcję 2H 2 O 2 -» 2H2O + O2. AlpC jest podjednostką hydroperoksydazy alkilowej, enzymu degradującego nadtlenki organiczne. W innym regulonie indukowane, zawierające mangan białko SOD (produkt genu sodA) jest pozytywnie regulowane (w obecności nadtlenku) przez produkty genów soxR/soxS.

Należy podkreślić, że niedobór żelaza może również wywołać stres tlenowy — być może przez obniżoną aktywność przeciwutleniających enzymów zawierających hem. Kontrola stresu tlenowego u mikobakterii jest słabiej poznana. Niektóre utleniające enzymy, włączając KatG, występują w Mycobacterium tuberculosis, ale tylko nieaktywna forma genu pokrewnego oxyR została opisana w grupie M. tuberculosis. Białko IdeR negatywnie regulujące syntezę syderoforów (sekcja 11. 5. 5) prawdopodobnie zdolne jest także do pozytywnej regulacji niektórych enzymów przeciwutleniających; mechanizm tej regulacji nie jest znany. Czynniki związane ze stresem tlenowym wpływają również na wrażliwość M. tuberculosis na ważny przeciwgruźliczy lek — izoniazyd. Wewnątrzkomórkowa, zależna od obecności nadtlenków aktywność KatG zmienia izoniazyd w formę aktywną, która hamuje enzymatyczny etap(y) syntezy ważnych składników ściany komórkowej, kwasów mikolowych. Bakterie nie posiadające tych kwasów są również wrażliwe na izoniazyd, co sugeruje istnienie dodatkowych miejsc działania antybiotyku. Mutanty katG i ahpC charakteryzują się zwiększoną opornością na izoniazyd. U prądków wzajemne związki między regulacją żelaza, stresem tlenowym i wrażliwością na izoniazyd nie są w pełni wyjaśnione [Dussurget i Smith (1998) TIM 6: 354-358].

7. 8. 3 Rekombinacyjna regulacja wyrażania się genów Patrz — zlokalizowana rekombinacja (sekcja 8. 2. 2). 145

7. 8. 4 Regulacja wyrażania się genów związana z szybkością rozpadu mRNA W niektórych przypadkach wyrażanie się bakteryjnych genów jest regulowane przez szybkość rozpadu odpowiadających im mRNA; „rozpad" oznacza enzymatyczną degradację (sekcja 7. 6. 1). Taka regulacja była badana między innymi w operonie puf fotosyntetyzującej bakterii Rhodobacter capsulatus. Geny puf (kodujące składniki aparatu fotosyntezy) są transkrybowane wspólnie jako pojedynczy transkrypt (tj. policistronowy mRNA). (Przykład policistronowego mRNA był pokazany na rys. 7. 11). Co ciekawe, różne części policistronowego puf mRNA rozpadają się z różną szybkością, tzn. niektóre sekwencje trwają dłużej niż inne. W ten sposób, odpowiednie geny wyrażane są we właściwym czasie, umożliwiając optymalną fotosyntezę i wzrost komórek. Specjalne regiony stymulujące i hamujące rozpad policistronowego mRNA mogą być odpowiedzialne za obserwowaną różną szybkość rozpadu [Klug (1993) MM 9: 1-7].

7. 8. 5 Regulacyjna rola translacyjnej atenuacji w wyrażaniu się genów U niektórych gramdodatnich bakterii obecność chloramfenikolu (sekcja 15. 4. 4) indukuje gen cat. Gen ten koduje acetylotransferazę chloramfenikolową — enzym, który acetyluje chloramfenikol i inaktywuje go. Regulacyjną rolę w indukowanej oporności na chloramfenikol pełni proces zwany translacyjną atenuacją.

Transkrypt genu cat zawiera krótką sekwencję wiodącą, po której (w tym samym transkrypcie) następuje sekwencja kodująca cat. W nieobecności chloramfenikolu gen cat jest transkrybowany, ale nie ulega translacji, ponieważ miejsce wiązania rybosomów jest „zniekształcone" przez miejscowe tworzenie się par zasad między rybonukleotydami. Sekwencja wiodąca jednak (która ma własne miejsce wiązania rybosomów) ulega niezakłóconej translacji. W obecności chloramfenikolu, rybosomy zaangażowane w translację sekwencji wiodącej zostają zatrzymane, co powoduje naprawę „zniekształconego" miejsca cat wiążącego rybosomy, a w konsekwencji pozwala na translację sekwencji kodującej cat. Dlaczego translacja cat nie jest hamowana przez chloramfenikol (który hamuje syntezę białka)? Do indukcji cat wystarcza mniejsze stężenie chloramfenikolu niż jest konieczne do zahamowania syntezy białka. Przyczyną tego zjawiska jest, być może, udział samego peptydu wiodącego (jak również chloramfenikolu) w zatrzymaniu rybosomów [Gu, Rogers i Lovett [(1993) JB 175: 5309-5313]. Inny przykład translacyjnej atenuacji stanowi regulacja genu pyrC w E. coli. Gen ten koduje enzym, dihydroorotazę, konieczną do syntezy pirymidyn, a co za tym idzie kwasów nukleinowych. Transkrypcja pyrC może się rozpocząć w jakimkolwiek z kilku przyległych nukleotydów na matrycy DNA. Rozpoczęcie transkrypcji w określonym nukleotydzie zależy od dostępności pirymidyn w komórce (sensorem, czyli czujnikiem jest stosunek CTP/GTP). Większość transkryptów pyrC syntetyzowanych w obecności dostatecznej ilości pirymidyn umożliwia parowanie się RNA-RNA w regionie sekwencji Shine-Dalgarno, co 146

blokuje związanie się rybosomów i wyrażanie się genów. Kiedy poziom pirymidyn jest niski, większość transkryptów ma odmienne miejsce startu, wykluczające tworzenie się par zasad, co umożliwia syntezę enzymu.

7. 8. 6 Regulacja wyrażenia się genów przez przekazanie sygnału Bakterie mogą wykryć wiele sygnałów środowiskowych (takich jak zmiany osmolalności) przez systemy sensorów zlokalizowanych w osłonie komórki. W obrębie komórki sygnały te działają po przekazaniu ich przez dwuskładnikowe systemy regulacyjne. Pierwszym składnikiem tego systemu jest kinaza histydynowa, enzym, który zdolny jest do ATP-zależnej autofosforylacji (w miejscu aktywnym zawierającym histydynę) i do przeniesienia reszty fosforanowej na inną cząsteczkę. W obecności odpowiednich sygnałów środowiskowych, kinaza histydynowa przenosi fosforan na resztę asparaginianową drugiego składnika tego systemu — białka regulatora (odpowiadającego na sygnał). Po fosforylacji, białko regulatora może zmienić wyrażanie się niektórych genów, np. przez kontrolę ich transkrypcji, i w ten sposób wywołać odpowiedź na sygnał środowiskowy [Histidine kinases and signal transduction (artykuł przeglądowy): Alex i Simon (1994) TIG 10: 133-138]. W niektórych wypadkach sygnał środowiskowy działa bezpośrednio na kinazę, regulując jej aktywność, a więc kinaza jest sensorem. Na przykład, u E. coli zwiększenie osmolalności stymuluje aktywność kinazową sensora, EnvZ, umiejscowionego w osłonach komórkowych. EnvZ przenosi grupę fosforanową na białko regulacyjne, OmpR, które wówczas powoduje wzrost transkrypcji genu kodującego porynę OmpC (sekcja 2. 2. 9. 2) i hamuje transkrypcję genu kodującego porynę OmpF. Co za tym idzie, jeśli osmolalność jest wysoka, błona zewnętrzna zawiera więcej OmpC (które tworzy nieco mniejsze pory) niż OmpF. Wzrost ciśnienia osmotycznego w E. coli prowadzi również do zwiększenia pobierania jonów potasowych ze środowiska (sekcja 3. 1. 8) — np. na drodze indukowanego systemu transportu, Kdp, charakteryzyjącego się dużym powinowactwem. System ten (związany z błoną cytoplazmatyczną) składa się z kompleksu białek Kdp A, KdpB i KdpC (kodowanych przez operon kdp ABC). KdpB jest ATPazą, która hydrolizuje ATP dostarczając energii do pobrania K+. Wyrażanie się operonu kdp jest zwiększone przy małym turgorze, co stymuluje sensorową kinazę KdpD w błonie cytoplazmatycznej. Po aktywacji, KdpD przenosi grupy fosforanowe na KdpE — cytosolowy regulator białkowy zwiększający translację operonu. Dwuskładnikowe systemy regulują wiele aktywności komórkowych, włączając syntezę czynników wirulencji u bakterii patogennych. Na przykład, u Clostridium perfringens dwuskładnikowy system reguluje geny kodujące toksyny i odpowiedzialne za zgorzel gazową [Cheng i Rood (1997) RMM 8 (supplement 1): S25-S27]. U Salmonella typhimurium system SSrA-SsrB reguluje transkrypcję genów, składników wyspy patogenności SPI-2, których produkty są potrzebne do wewnątrzkomórkowego wzrostu patogena [Cirillo i wsp. (1998) MM 30: 175-188]. (Patrz również sekcja 10. 1. 2 i zwijanie białek w sekcji 7. 6). 147

W niektórych wypadkach sensor (= receptor) i kinaza są różnymi cząsteczkami. Sygnały cząsteczkowe wykrywane są przez sensor, który reguluje aktywność kinazy. Na przykład, sytuacja taka istnieje w szlaku chemotaksji E. coli (patrz rys. 7. 13), kiedy kinaza kontroluje dwa różne białka regulacyjne. U B. subtilis przeniesienie sygnału podczas rozpoczęcia sporulacji związane jest z transferem fosforu (patrz sekcja 7. 8. 6. 1 i rys. 7. 14). 7. 8. 6. 1 Początek tworzenia endospory u Bacillus subtilis Kiedy wzrost zaczyna być ograniczony z powodu niedoboru substancji pokarmowych, B. subtilis przestawia swój metabolizm. Podczas procesu dostosowywania się do nowych warunków geny są indukowane i hamowane. Nie obserwuje się gwałtownego przejścia od aktywnego wzrostu do aktywnej sporulacji. Przeciwnie, po wzroście wykładniczym (faza log) następuje okres przejściowy, w czasie którego jednocześnie obserwuje się funkcje związane ze wzrostem i z przeżyciem [Transition state in B. subtilis (artykuł przeglądowy): Strauch (1993) PNARMB 46: 121-153]. W tym czasie zapada decyzja, czy utrzymać wzrost wegetatywny charakteryzujący się niskim poziomem metabolizmu, czy rozpocząć sporulację. Oczywiste jest, że sporulacja jest etapem bardzo ważnym, a zanim ostateczna decyzja zostanie podjęta, komórka musi zebrać i „zinterpretować" sygnały pochodzące z różnych źródeł, zarówno zewnętrznych, jak i wewnętrznych. Na przykład, jednym z ważnych sygnałów jest stężenie wapnia — sporulacja jest zahamowana, gdy stężenie wapnia zmniejszy się poniżej 2 μΜ. (W zrozumieniu znaczenia tego ograniczenia pomoże przypomnienie faktu, że rdzeń endospory zawiera duże ilości dipikolinianu wapnia (sekcja 4. 3. 1); jeśli sporulacja zaczęłaby się przy niedostatecznym stężeniu wapnia, proces mógłby zostać przerwany w stadium pośrednim). Sygnały pobudzające sporulację są rozpoznawane przez przynajmniej dwa białkowe sensory: kinazę A (KinA) i kinazę Β (KinB). Nie są znane sygnały aktywujące te kinazy. Po odebraniu odpowiedniego sygnału, pochodzącego ze środowiska zewnętrznego lub wewnętrznego, kinazy ulegają ATP-zależnej autofosforylacji i przenoszą grupy fosforanowe na białko Spo0F — pierwszy składnik systemu transferu fosforu (rys. 7. 14). Spo0F działa więc jako pierwszy łącznik przekazujący sygnały z różnych wewnętrznych i zewnętrznych źródeł. W dalszych etapach transferu fosforu zachodzi fosforylacja białek Spo0B i Spo0A. Fosforylowana (tj. aktywna) forma Spo0A oznaczona jest jako Spo0A~P. Wewnątrzkomórkowe stężenie Spo0A~P jest prawdopodobnie kluczowym czynnikiem w podjęciu wyboru między sporulacją a kontynuacją wzrostu wegetatywnego. Jak pokazano na rysunku 7. 14, Spo0A~P jest regulowane negatywnie (defosforylowane) przez fosfatazę Spo0E. Inne fosfatazy, nie pokazane na rysunku, są także pomocne w regulacji stężenia Spo0A~P, na drodze pośredniej, przez wybiórczą defosforylację Spo0F~P. Fosfatazy te, RapA i RapB, same również podlegają regulacji (na poziomie transkrypcji) zależnej od fizjologicznego stanu komórki. A więc, wydaje się, że zajście sporulacji zależy od wyniku zmagań między kinazami (pobudzającymi sporulację) a fosfatazami (hamującymi sporulację) [Perego (1998) TIM 6: 366-370]. 148

7. 8. 7 Regulacja wyrażania się genów przez zmianę ramki odczytu Czasami synteza (lub skład) polipeptydu są regulowane na poziomie translacji (rys. 7. 9e). Określona sekwencja nukleotydów powoduje „przesunięcie się" rybosomów na transkrypcie. Zazwyczaj jest to przesunięcie „+1" (przesunięcie do przodu, zgodnie z kierunkiem transkrypcji) albo „-1" (przesunięcie do tyłu, przeciwnie do kierunku transkrypcji). Oczywiście, takie przesunięcie wpływa na wszystkie następne kodony transkryptu (porównaj z mutacjami prowadzącymi do zmiany ramki odczytu, rys. 8. 1b). Zmiana ramki odczytu może prowadzić do powstania nowego kodonu nonsensownego, co powoduje przedwczesne zakończenie translacji (i utworzenie krótszego polipeptydu). Zmiana ramki odczytu może również znieść działanie istniejącego kodonu kończącego translację. Znany jest wypadek, że zmiana ramki odczytu prowadząca do translacji całego transkryptu zachodzi, gdy ilość polipeptydu jest mała, natomiast nie zachodzi (kodon kończący translację nadal funkcjonuje), gdy ilość polipeptydu jest wystarczająca. Zmiana ramki odczytu jest potencjalnym mechanizmem powodującym powstanie nowych białek powierzchniowych, a to prowadzi do zmienności antygenowej (sekcja 11. 5. 3). [Translational frame-shifting (artykuł przeglądowy): Engelberg-Kulka i Schoulaker-Schwarz (1994) MM 11: 3-8. ]

7. 8. 8 Metylacja DNA jako mechanizm kontrolny Poreplikacyjna metylacja DNA (modyfikacja: sekcja 7. 4) chroni chromosom przed własnymi enzymami komórkowymi. Sugeruje się, że po replikacji miejsce origin chromosomu (oriC) pozostaje początkowo przez jakiś czas hemimetylowane (tzn. tylko jedna nić jest metylowana). Czas potrzebny do metylacji drugiej nici (co jest konieczne dla funkcjonalności oriC) może pełnić rolę czynnika regulującego inicjację replikacji chromosomu podczas cyklu komórkowego (sekcja 3. 2. 1). U E. coli metylaza Dam (kodowana przez gen dam) metyluje adeninę w pozycji N-6 w sekwencji 5'-GATC-3'. Jeżeli taka Dam-metylacja nastąpi w promotorze, w konsekwencji może to wpłynąć na wyrażanie się niektórych genów. Na przykład, Dam-metylacja w promotorze genu kodującego transpozazę na transpozonie Tn10 (transpozycja: sekcja 8. 3) hamuje syntezę transpozazy, a w związku z tym przez większą część cyklu życiowego hamuje transpozycję (wbudowanego w chromosom) Tn10. W czasie replikacji DNA zahamowanie to jest przejściowo znoszone, natychmiast po przejściu widełek replikacyjnych przez gen transpozazy (rys 7. 8), ale przed zajściem metylacji DNA. W ten sposób transpozycja Tnl0 jest zahamowana podczas replikacji DNA (a więc jest połączona z cyklem komórkowym).

149

(a) Receptory — nazywane chemotaktycznymi białkami przyjmującymi grupę metylową (MCPs, ang. metyl-accepting chemotaxis proteins) występują w błonie cytoplazmatycznej, zaś ich regiony funkcjonalne znajdują się w peryplazmie i cytoplazmie. Istnieją różne typy MCP, a każdy z nich rozpoznaje własny zasięg chemoefektorów/bodźców środowiskowych. W komórce istnieje kilkaset MCP, które są kodowane przez geny lap, tar, trg i tsr. Niektóre chemoefektory (np. asparaginian, seryna) wiążą się bezpośrednio do MCPs, ale, na przykład, ryboza i niektóre inne cukry najpierw tworzą kompleks z pewnymi białkami peryplazmatycznymi, a dopiero potem się wiążą. Związanie/uwolnienie chemoreceptorów z/od białek MCP reguluje wewnątrzkomórkowy sygnał kontrolujący częstość koziołkowania.

150

7. 8. 9 Regulacja wyrażania się genów przez czynniki σ Specyficzne czynniki σ (sekcja 7. 5) są konieczne do transkrypcji określonych genów. Zależność ta pozwala komórce kontrolować synchronizację pewnych zdarzeń przez syntezę danego czynnika sigma tylko wtedy, gdy jest on wymagany. Poziom niektórych czynników sigma jest minimalny podczas normalnego wzrostu. Wyższy ich poziom, indukowany przez określone warunki stresowe, prowadzi do wyrażenia się określonych genów. Do czynników sigma zaliczamy np. σΗ (produkt genu spo0H; rys. 7. 14), σ 3 2 (produkt genu rpoH; sekcja 7. 8. 2. 3) i cf (produkt genu rpoS, czynnik regulacyjny, działający w różnych warunkach stresowych). W niektórych wypadkach warunki stresowe (szok cieplny dla σ32 i np. szok osmotyczny dla σs) pobudzają zwiększenie syntezy czynnika sigma przez (b) Powstanie wewnątrzkomórkowego sygnału jest związane z białkiem CheA (kodowanym przez gen cheA). CheA jest kinaza histydynową (patrz sekcja 7. 8. 6). Na schemacie przedstawiono CheA związane z MCP. W wiązaniu uczestniczy CheW. CheA może przenieść grupę fosforanową z ATP do białka regulacyjnego CheY. Fosforylowana (aktywna) forma CheY (CheY ~P) zwiększa obroty rzęski zgodnie z ruchem wskazówek zegara (w ten sposób zwiększając częstość koziołkowania) przez oddziaływanie z pierścieniem C stanowiącym część motoru rzęski (z pewnością ze składnikiem FliM — patrz rys. 2. 8). [Role of CheY: Silversmith i Bourret (1999) TIM 7: 16-22. ]. Podstawą przekazania sygnału jest więc przeniesienie fosforanu z CheA na CheY. Sygnał jest modulowany (regulowany) przez związanie/uwolnienie chemoefektora z/od MCP i przez stopień metylacji MCP. Rozpatrzmy każdy z tych czynników po kolei, a następnie rozważmy, jak wspólnie regulują one przekazanie sygnału i częstość koziołkowania. Cytoplazmatyczna strona MCP podlega metylacji przez metylotransferazę CheR, która wykorzystuje S-adenozylometioninę jako dawcę grup metylowych. Przeciwnie, metylotransferaza CheB usuwa grupy metylowe. Aktywność CheB zwiększa się po jego fosforylacji przez CheA. Stopień metylacji MCP zależy od aktywności zarówno CheR, jak i CheB. Zwiększenie metylacji zwiększa aktywność CheA. (c) W małym, stałym stężeniu chemoatraktanta (Catr) częstość koziołkowania komórek jest stała. W momencie zwiększenia stężenia Catr wiąże się do MCP, hamując CheA (hamując fosforylację CheY) i ułatwiając obroty rzęski przeciwne ruchowi wskazówek zegara (ruch prostoliniowy). Zahamowanie CheA hamuje jednocześnie CheB, umożliwiając zwiększenie metylacji MCP. Częstość koziołkowania wraca wtedy do wartości wyjściowej, następuje adaptacja do nowego, w przybliżeniu stałego stężenia Catr (na schemacie MCP w środku). Po ponownym zmniejszeniu stężenia, uwolnienie Catr stymuluje CheA i ułatwia rotację zgodną z ruchem wskazówek zegara (częstsze koziołkowanie). Następuje równoczesna stymulacja CheB i demetylacja MCP do momentu, gdy zostanie obniżona aktywność CheA do poziomu wyjściowego. Komórki adaptują się do nowego, stałego stężenia (MCP z prawej strony schematu). Taka adaptacja wymaga wydajnej defosforylacji CheY i CheB, odpowiednio do zmienionego poziomu aktywności CheA. CheB ulega autodefosforylacji, a regulacja poziomu CheY~P wymaga białka CheZ. Wydaje się, że w całkowicie zaadaptowanych komórkach około 30% wewnątrzkomórkowej puli cząsteczek CheY jest w pełni fosforylowane. [Alon i wsp. (1998) EMBO Journal 17: 4238-4248]. Trzeba zauważyć, że stopień metylacji MCP w zaadaptowanych komórkach odzwierciedla wewnątrzkomórkowe stężenie chemoatraktanta. Kontrola chemotaksji jest tematem artykułu przeglądowego Eisenbacha [(1996) MM 20: 903-910]. Eksperymentalne zmiany różnych składników systemu chemotaksji (np. CheR) wskazują, że mogą one znajdować wyraz np. w czasie wymaganym do adaptacji (wraz ze zmianą stężenia CheR, różnice czasu mogą być nawet większe niż 20-krotne), ale dokładność adaptacji (zdolność do osiągnięcia poziomu koziołkowania równego temu przed działaniem bodźca) jest zachowana [Alon i wsp. (1999) Nature 397: 168-1711.

151

Utworzenie endospory (sekcja 4. 3. 1) wymaga całej grupy białek, które nie są syntetyzowane w wegetatywnych (rosnących) komórkach, co z kolei jest związane ze skoordynowanym wyrażaniem się różnych genów sporulacyjnych. Sporulacja wymaga nie tylko włączenia tych genów, ale również włączenia genów, które hamują geny sporulacyjne podczas wzrostu wegetatywnego. Wydaje się, że mechanizm inicjujący sporulację rozpoznaje zarówno zewnętrzne (środowiskowe), jak i wewnętrzne (wewnątrzkomórkowe) sygnały. Przyjmuje się, że sygnały te powodują autofosforylację niektórych kinaz (sekcja 7. 8. 6. 1) — pokazanych na schemacie jako KinA i KinB. Kinazy przenoszą grupy fosforanowe (symbol na określony ciąg białek: Spo0F -> Spo0B —> Spo0A. Proces ten nazywa się transferem fosforu [Strauch i Hoch (1993) COGD 3: 203-212; Hoch (1993) JCB 51: 55-61]. Wewnątrzkomórkowe stężenie fosforylowanej formy Spo0A - Spo0A~P wydaje się podstawowym czynnikiem w inicjacji sporulaqi. Na schemacie, symbol oznacza czynniki hamujące, a symbol — czynniki stymulujące wyrażanie się jakiegoś genu. W większości wypadków kontrola działa na poziomie transkrypcji. Spo0A~P ułatwia wyrażanie się niektórych genów sporulacyjnych (wymienionych w ramce z prawej strony środkowej części schematu). SpoIIG (kodowane przez spoIIG) jest czynnikiem sigma (sekcja 7. 5), σΕ, koniecznym do transkrypcji genu spoIID i niektórych genów komórki macierzystej. Czynnik sigma kodowany przez SpoIIA, σf, jest niezbędny do transkrypcji niektórych genów w presporze.

152

zwiększenie translacji odpowiadającego mu mRNA (raczej niż przez zwiększenie transkrypcji genu). Zwiększenie translacji σ32 i σs jest następstwem wpływu, jaki wywierają warunki indukujące ekspresję na drugorzędową strukturę mRNA. Kiedyś uważano, że czynnik σs reguluje jedynie zdarzenia w fazie stacjonarnej. Teraz wiadomo, że odgrywa on regulującą rolę w odpowiedzi na różne stresy zarówno w fazie stacjonarnej, jak i wykładniczej [Hengge-Aronis (1996) MM 21: 887-893]. Czynnik ten działa często, być może zawsze, w połączeniu z innymi formami regulacji. Tak więc, na przykład, σs i białko Fur regulują tolerancję na zakwaszenie (sekcja 7. 8. 2. 6), natomiast podczas szoku osmotycznego (sekcja 3. 1. 8) zwiększenie poziomu K+ i glutaminianu może mieć znaczenie w pobudzeniu transkrypcji z niektórych promotorów regulowanych przez σs [Ding i wsp. (1995) MM 16: 649-656]. Czynniki sigma pełnią również rolę w rozwoju fagów (patrz np. sekcja 9. 1. 1). Podczas wzrostu wegetatywnego, SinR (kodowany przez gen sinR wymieniony w dolnej ramce) hamuje ekspresję genów spoll (ramka prawa środkowa). Podczas sporulacji Spo0A~P reprymuje abrB (ramka dolna) — w ten sposób hamuje ekspresję SinR, a wspomaga ekspresję genów spoII. SinR hamowane jest przez oddziaływania bialko-białko, w tym wypadku białko SinI hamuje białko SinR. Należy zauważyć, że transkrypcja sinI jest również ułatwiona przez Spo0A~P. Spo0A~P ułatwia ekspresję genów spo0F i spo0A (ramka lewa, środkowa) według mechanizmu pozytywnego sprzężenia zwrotnego [Strauch i wsp. (1993) MM 7: 967-975]. Jednocześnie, wskutek zahamowania abrB, Spo0A~P ułatwia wyrażanie się spo0H, którego produkt (Spo0H = σΗ) jest konieczny do transkrypcji spo0F i spo0A (białko σΗ jest produkowane w małych ilościach podczas wzrostu wegetatywnego). Synteza czynnika σΗ znacznie się zwiększa po rozpoczęciu sporulacji. Podczas sporulacji, σΗ jest potrzebny do transkrypcji genu ftsZ (patrz FtsZ, sekcja 3. 2. 1) z promotora p2 różniącego się od promotora ftsZ, który jest aktywny podczas wzrostu wegetatywnego. FtsZ jest niezbędne do utworzenia asymetrycznej septy. Spo0E jest negatywnym regulatorem transferu fosforu [Ohlsen i wsp. (1994) PNAS 91: 1756-1760]. Enzym ten defosforyluje (a przez to inakrywuje) Spo0A-P, a więc w rezultacie może zapobiegać sporulacji, dopóki połączony wpływ różnych (zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych) sygnałów nie wskaże na jej konieczność. W badaniach dotyczących genetycznej kontroli sporulacji bardzo przydatne są mutanty z zablokowanymi poszczególnymi etapami tego procesu (rys. 4. 2). Sporulacja może być zahamowana przez mutacje genów spo0. Na przykład, mutacja prowadząca do całkowitej utarty produktu danego genu lub jego funkcji w genie spo0B blokuje transfer fosforu. Dotychczas nie opisano mutacji wpływających na etap I (rys. 4. 2). Niektórzy badacze nie traktują tego etapu jako wyodrębniony. Mutacje genów spoII mogą zapobiec rozwojowi spory na etapach następujących po wytworzeniu asymetrycznej septy. Samo powstanie asymetrycznej septy nie jest w pełni wyjaśnione. Wyniki jednych badań pozwalają wnioskować, że miejsce tworzenia się septy leżące w środku komórki (ważne dla podziału wegetatywnej komórki) jest zablokowane przez kompleks MinCD (sekcja 3. 2. 1. 2) pozostający pod całkowitą kontrolą białka Spo0A [Barak, Prepiak i Schneisser (1998) JB 180: 5327-5333]. Badania prowadzone z zastosowaniem białka fuzyjnego SpoIIE-GFP (sekcja 8. 5. 2) wykazały, że podczas sporulacji w komórkach dzikiego typu SpoIIE umieszczone jest w asymetyrycznej przegrodzie po stronie prespory (rys. 4. 2), gdzie, dzięki aktywności fosfatazy może uwalniać aktywne białko σF z nieaktywnego prekursora. To może tłumaczyć, dlaczego σF tworzony jest tylko w presporze (a nie w komórce macierzystej) [Wu i wsp. (1998) GD 12: 1371-1380]. (Porównaj SpoIIE i FlbE w sekcji 4. 1. )

153

7. 8. 10 Regulacja wyrażania się genów przez zależną od tRNA antyterminację transkrypcji U Bacillus subtilis (i niektórych innych gramdodatnich bakterii) pewne geny, których produkty są konieczne do syntezy aminokwasów (i do związania aminokwasów z cząsteczkami tRNA), są włączane, gdy niedobór danego aminokwasu prowadzi do pojawienia się w komórce nieaminoacylowanych cząsteczek odpowiadającego mu tRNA. Nieacylowana cząsteczka tRNA wiąże się z wiodącym regionem mRNA i może powodować przejście struktury terminatora transkrypcji (utworzonej w warunkach wystarczającego stężenia danego aminokwasu) w strukturę antyterminatora — wtedy transkrypcja nie jest hamowana i aminokwas może być syntetyzowany. [tRNA-directed transcription antitermination: Henkins (1994) MM 13: 381-387. ]

7. 8. 11 Termoregulacja wyrażania się genów Odpowiedź na szok cieplny jest tylko jednym z przykładów reakcji bakterii na zmiany temperatury. Rzeczywiście, temperatura reguluje różnorodne geny. Tak więc, w patogenach niektóre cechy odpowiedzialne za wirulencję mogą być wyrażone w temperaturze ciała gospodarza (np. u człowieka — 37°C), a nie pojawić się — w temperaturach niższych. Na przykład, szczepy E. coli związane z zapaleniem miedniczek nerkowych wyrażają tzw. pilusy Pap (tab. 2. 2) w temperaturze 37°C, ale nie wyrażają ich w 25°C. W jaki sposób bakterie „czują" temperaturę? W niektórych wypadkach zmiany temperatury zmieniają strukturę specyficznych mRNA w ten sposób, że translacja (sekcja 7. 6) zachodzi lub jest zahamowana, zależnie od temperatury. Dobrym tego przykładem może być gen IcrF (związany z wirulencją gen Yersinia pestis). Transkrypcja IcrF zachodzi z podobną wydajnością w temperaturze 25°C i w 37°C, ale w 25°C mRNA tworzy strukturę drugorzędową, która hamuje translację. W 37°C struktura ta rozpada się, co umożliwia zajście translacji. Inny przykład jest związany z mRNA rpoH (sekcja 7. 8. 2. 3). W Salmonella białko TipA (funkcja nieznana) działa jak temperaturowrażliwy regulator własnej transkrypcji. Dimer TipA hamuje transkrypcję, ale monomer (powstający po podwyższeniu temperatury) nie powoduje zahamowania [Hurme i wsp. (1997) Cell 90: 55-64]. W E. coli represja syntezy pilusa Pap w temperaturze 25°C jest związana z białkiem wiążącym DNA, H-NS. Białko to hamuje również naprawę DNA u Shigella, w sposób zależny od temperatury [Palchaudhuri, Tominna i Leon (1998) JB 180: 5260-5262]. Przypuszczalny mechanizm regulacji wyrażania się genów przez H-NS obejmuje: indukowaną przez temperaturę, zmianę samego białka H-NS, co wpływa na jego wiązanie z DNA, indukowaną przez temperaturę oraz zmianę topologii/superzwinięcia DNA, co zapobiega wiązaniu H-NS do miejsc(a) dla siebie specyficznych; możliwe jest łączne działanie obu mechanizmów. [Thermoregulation of genes in bacteria: Hurme i Rhen (1998) MM 30: 1-6. ] 154

7. 8. 12 Dobowa regulacja wyrażania się genów Mianem cyklu dobowego określa się cykliczne wahania (cykle około 24-godz. ), które zachodzą we właściwościach organizmów żyjących w jednorodnych (stałych) warunkach środowiska. Poprzednio sądzono, że zmiany te są charakterystyczne tylko dla eukariotów, teraz wiadomo, że zachodzą one przynajmniej w niektórych prokariotach. W jednokomórkowej sinicy, Synechococcus, gen psbA1 (kodujący składnik PSII — rys. 5. 11) najsłabiej wyraża się o zmierzchu, najsilniej zaś o świcie. Niektóre inne geny regulowane są odwrotnie. Co więcej, przy nie zmienionej intensywności oświetlenia, na synchronizację podziałów komórkowych wpływa wewnętrzny, 24-godzinny „zegar biologiczny", nawet gdy średni czas podwojenia liczby komórek wynosi zaledwie 10, 5 godz. [Johnson, Golden i Kondo (1998) TIM 6: 407-410]. [Molecular bases of circadian clocks (artykuł przeglądowy): Dunlap (1999) Cell 96: 271-290. ]

7. 9 Bakteryjny RNA Cząsteczki RNA (sekcja 7. 2. 2) mają różne formy i funkcje. Na przykład: • rRNA, mRNA, tRNA: cząsteczki konieczne do syntezy białek (sekcja 7. 5, 7. 6). • ctRNA (ang. countertranscript RNA): RNA transkrybowany z nici komplementarnej, cząsteczka, która po związaniu z transkryptem wpływa na transkrypcję, translację lub replikację — np. RNA I i inne regulatory replikacji DNA niektórych plazmidów (sekcja 7. 3. 1). Są to przykłady antysensownych RNA: cząsteczek, które mogą wpływać na określoną funkcję(e) po związaniu się z określonymi miejscami. • SRP RNA: cząsteczka biorąca udział w transporcie białek (sekcja 5. 4. 3). • pRNA: bakteriofagowy RNA wykorzystywany do upakowania białek (sekcja 9. 1. 4). • RNaza P: rybozym, tj. enzymatyczna forma RNA. Wiele cząsteczek RNA ulega potranskrypcyjnej modyfikacji. Na przykład niektóre bakteryjne RNA są poliadenylowane (sekcja 7. 6. 1). Dla przypomnienia, 16S, 23S i 5S rRNA — razem z cząsteczkami tRNA — są transkrybowane w postaci jednej cząsteczki, która następnie musi być przecięta w określonych miejscach przez odpowiednie enzymy, np. rybozym RNaza Ρ (patrz wyżej) przecina koniec 5' cząsteczek tRNA. Podobnie do typowych genów eukariotycznych, niektóre geny bakterii, fagów i archeonów zawierają introny — sekwencje nukleotydów, które nie kodują żadnej części produktu. Każda część odpowiadająca intronowi musi być usunięta z transkryptu w celu utworzenia „dojrzałego" mRNA, zdolnego do prawidłowego kodowania produktu (patrz rys. 8. 8). Introny bakteryjne są autokatalityczne: to znaczy, że nukleotydowa sekwencja intronu jest automatycznie „odcinana", dzięki enzymatycznej aktywności, która rozwija się w rdzeniu właściwie zwiniętej cząsteczki mRNA. Sugerowano, że przynajmniej w niektó155

rych wypadkach, splicing zachodzi, gdy powstający transkrypt związany jest z rybosomami (rybosomy zatrzymują się podczas wycinania intronu) [splicing i translacja u bakterii (przegląd): Woodson (1998) GD 12: 1243-1247]. RNaza Ρ i SRP (o których wspominano poprzednio) to tylko dwie z większej liczby małych cząsteczek RNA (sRNA) pełniących funkcje regulacyjne. Właściwości i rola dziesięciu sRNA z E. coli są opisane zbiorczo w pracy [Wassarman, Zhang i Storz (1999) TIM 7: 37-45].

ROZDZIAŁ

8

Biologia molekularna II - zmienianie informacji genetycznej

DNA może podlegać zmianom. Na przykład, nawet podczas replikacji, niezależnie od poprawnie funkcjonującego systemu korekcyjnego i naprawczego (sekcja 7. 7), mniej więcej jeden na 108-109 nukleotydów w nowej (potomnej) nici jest podstawiony błędnie. Większe zmiany mogą być powodowane przez mutageny fizyczne i chemiczne (sekcja 8. 1), rekombinację (sekcja 8. 2) i elementy transpozycyjne (sekcja 8. 3). Poza tym genom komórki (jej „podstawowy genetyczny program") może być uzupełniany przez plazmidy i inne fragmenty dodatkowego DNA nabytego w procesach transferu genów (sekcja 8. 4). Zmiany dokonywane w DNA przez celową działalność człowieka (technologia rekombinowania DNA in vitro) są omówione w sekcji 8. 4.

8. 1 Mutacje Mutacja u bakterii jest trwałą, dziedziczną zmianą sekwencji nukleotydów w DNA (u pewnych mikroorganizmów, np. niektórych bakteriofagów (rozdz. 9), genom zawiera RNA, tak więc mutacje u tych mikroorganizmów będą dotyczyły RNA). Należy zauważyć, że zmiana nawet jednej pary zasad (sekcja 7. 2. 1) zmienia sekwencję całej cząsteczki DNA. Transkrypcja zmienionego DNA spowoduje utworzenie zmienionego RNA, a taki mRNA może być przyczyną powstania zmienionego polipeptydu (tab. 7. 2) ze zmienioną aktywnością biologiczną. Oczywiście, mutacje mogą dotyczyć zarówno sekwencji kodujących polipeptydy, jak i sekwencji genów regulacyjnych oraz sekwencji rozpoznawanych przez różne czynniki komórkowe. Mutacje spontaniczne zdarzają się z małą częstością i bez żadnej oczywistej przyczyny; są to głównie błędy w replikacji i naprawie, ale pewne z nich są powodowane przez oddziaływania chemiczne (sekcja 7. 7). Mutacje zachodzą z większą częstością, gdy w komórce uszkodzone są pewne geny, tzw. geny „mutatorowe" [Horst, Wu i Marinus (1999) TIM 7: 29-36].

157

Zwiększenie częstości mutacji jest powodowane przez mutageny; czynniki fizyczne, takie jak promieniowanie ultrafioletowe i promieniowanie X, oraz związki chemiczne, jak czynniki alkilujące, dwusiarczki, hydroksyloamina, kwas azotawy i analogi zasad (np. 5-bromouracyl), które mogą być włączane w miejsce typowych zasad podczas replikacji DNA. Mutageny działają w różny sposób. Promieniowanie ultrafioletowe może na przykład wywoływać krzyżowe połączenia między sąsiadującymi tyminami; a usuwanie powstających w takim przypadku dimerów tyminy przez naprawę „powodującą błędy" (sekcja 7. 8. 2. 2) może wywoływać powstawanie bardzo różnorodnych mutacji (patrz także sekcja 7. 7. 2). Krzyżowe połączenia mogą także powstawać w wyniku działania pewnych czynników alkilujących. Dwusiarczki i kwas azotawy mogą np. deaminować cytozynę, z wytworzeniem uracylu; a ponieważ uracyl nie jest normalnym składnikiem DNA, jego odmienna zdolność tworzenia par może wywołać włączenie innej zasady (adeniny zamiast guaniny) w potomną nić podczas następnej rundy replikacji. Mutacje w populacji bakterii na ogół powstają przypadkowo, oddziałując na różne geny u poszczególnych osobników. (Co ciekawe, u enterobakterii, jak się wydaje, mutacje pojawiają się częściej w miejscach odleglejszych od oriC

158

[Sharp i wsp. (1989) Science 246: 808-810]). Komórkę, w której nastąpiła mutacja, nazywamy mutantem. Mutacje są często szkodliwe, a mogą być nawet letalne, jeżeli zmieniona zostanie sekwencja kodująca produkt lub funkcję niezbędną do życia. Mutacjami korzystnymi dla bakterii są np. zmiany zwiększające oporność komórki na antybiotyki. Na przykład zmiana rybosomu uniemożliwiająca wiązanie się z nimi streptomycyny i hamowanie przez nią syntezy białek; tak więc Zmutowana komórka będzie wykazywała oporność na ten antybiotyk. Mutacje polepszające wzrost bakterii w tzw. „normalnych warunkach" mogą pozwolić komórkom mutanta zdominować wzrost subpopulacji komórek „dzikich" (niezmutowanych) i stać się frakcją dominującą w populacji; taka „naturalna selekcja" odgrywa istotną rolę w ewolucji.

8. 1. 1 Rodzaje mutacji Mutacje powstają w różny sposób i mogą też różnie oddziaływać na informację genetyczną. Stosunkowo rzadko jest tracony, zyskiwany, odwracany lub nawet translokowany cały fragment DNA (sekcja 8. 3). Mutacja punktowa polega na utracie, zyskaniu lub podstawieniu pojedynczego nukleotydu; mimo to jej skutki mogą mieć daleko idące konsekwencje dla komórki (rys. 8. 1).

Rys. 8. 1 Mutacje punktowe: ich wpływ na syntezę mRNA i polipeptydów. Efekt każdej mutacji punktowej jest wskazany jako gruba strzałka ; po prawej stronie pokazano możliwy skutek każdej mutacji (a) mRNA i polipeptyd syntetyzowany z normalnego (nie zmutowanego, dzikiego) genu. (b) Delecja nukleotydu guaninowego z DNA spowoduje utratę cytozyny (C) z kodonu UCG w mRNA. Wskutek tego nie tylko UCG, ale i wszystkie następne kodony są zmienione: porównaj aminokwasy kodowane w (a) i (b). Zauważ, ze jeżeli brakuje jednego nukletydu, to zamiast niego odczytywany jest następny, czyli grupy trzech kolejnych są czytane jako kodony. Ponieważ informacja genetyczna jest teraz w niewłaściwej fazie odczytu (w rejonie poniżej delecji), mutacja taka jest nazywana mutacją zmiany fazy lub zmiany ramki odczytu. Gdy zdarzy się ona blisko końca genu, tak że większa część polipeptydu jest prawidłowa, produkt może wykazywać pewną aktywność biologiczną. Jeżeli mutacja zmieniająca ramkę odczytu nastąpi w operonie (sekcja 7. 8. 1), skutki mogą być różne zależnie od konkretnego miejsca, które uległo mutacji. (c) Dodanie nukleotydu tyminowego do DNA spowodowało dodanie nukleotydu adeninowego do kodonu UCG w mRNA; podobnie jak w (b) jest to mutacja typu zmiany ramki odczytu. (d) W DNA, tymina zastąpiła guaninę, tak że teraz mRNA zawiera UAG (kodon „stop") zamiast UCG; jest to tzw. mutacja nonsensowna. Synteza polipeptydu zatrzymuje się przy kodonie UAG; polipeptyd może mieć pewną aktywność biologiczną, jeżeli większa jego część powstała przed natrafieniem w czasie translacji na kodon stop. (e) W DNA, guanina zastąpiła adeninę, tak że mRNA zawiera teraz kodon CCG zamiast UCG; zmieniony kodon zamiast seryny oznacza teraz prolinę; jest to tzw. zmiana sensu. Zauważ, że aminokwasy poniżej proliny nie są zmienione. Biologiczna aktywność polipeptydu zależy od natury i położenia nieprawidłowo podstawionego aminokwasu. (f) W DNA, tymina zastąpiła cytozynę, tak że mRNA zawiera teraz kodon UCA zamiast UCG; zmieniony kodon jednak w dalszym ciągu koduje serynę (tab. 7. 2). Jest to tzw. cicha mutacja, która oczywiście na zmienia biologicznej aktywności polipeptydu

159

8. 1. 1. 1 Loci, geny i zmutowane geny - nomenklatura Konkretne, funkcjonalnie zdefiniowane miejsce na chromosomie (= locus; w liczbie mnogiej loci) jest oznaczane przez trzyliterowy symbol drukowany kursywą (lub podkreślany w rękopisie); na przykład, his i trp to loci dotyczące odpowiednio biosyntezy histydyny i tryptofanu. Kiedy dany locus zawiera więcej niż jeden gen, każdy z nich jest dodatkowo oznaczany wielka literą; tak więc na przykład, locus his jest operonem (sekcja 7. 8. 1) zawierającym wiele genów oznaczonych odpowiednio hisA, hisB... itd. (Zauważ, że geny oznaczane w ten sposób niekoniecznie występują w obrębie locus w porządku alfabetycznym; porównaj np. geny lac na rys. 7. 11). Geny, które nie sąsiadują ze sobą na chromosomie, ale mają pokrewne funkcje, są oznaczane w analogiczny sposób (porównaj np. ara w sekcji 7. 8. 1. 1). System ten stosuje się, kiedy odnosi się do konkretnego locus lub genu — np. locus his, gen his A. Genotyp komórki jest jej genetycznym opisem (programem), odzwierciedla on aktualną sekwencję nukleotydów w chromosomie. W celu zapisania genotypu określonego szczepu z zasady wymienimy tylko interesujące nas w danym momencie geny, wskazując, czy są one typu dzikiego czy też są zmutowane. Dziki typ genu jest wtedy oznaczany np. jako hisA+, podczas gdy odpowiadający mu gen Zmutowany jako his A (lub czasem hisA'). Konkretne mutacje (w określonych miejscach) oznaczane są dodatkowo numerami: np. hisA9 (mutacja w określonym miejscu genu hisA). Fenotyp komórki jest zbiorem jej aktualnie zauważalnych cech (właściwości). Cechy fenotypowe przedstawia się w następujący sposób: np. His- (niezdolność do wzrostu bez histydyny, czyli auksotrofla histydynowa, sekcja 8. 1. 2); His+ (prototrof histydynowy); Lac- (niezdolność do wykorzystywania laktozy); Met- (auksotrof metioninowy); TcR (oporność na tetracykliny).

8. 1. 2 Izolacja mutantów Każda konkretna mutacja spontanicznie zdarza się w populacji bakterii z małą częstością; na przykład w populacji E. coli utrata zdolności do fermentacji galaktozy następuje przeciętnie raz na każde 1010 cykli podziałowych komórki, to jest z częstością 10~10. Nawet w populacji poddanej działaniu mutagenu, komórki z konkretną mutacją są wciąż w mniejszości w stosunku do komórek dzikiego typu i tych z innymi rodzajami mutacji. Jak możemy wyizolować te nieliczne określone mutanty z olbrzymiej populacji bakterii? Jeżeli, na przykład, w populacji komórek wrażliwych na streptomycynę pojedyncza komórka zmutowała do streptomycynooporności (sekcja 8. 1), ta komórka może rosnąć na stałym podłożu zawierającym streptomycynę i utworzyć kolonię (sekcja 3. 3. 1); wszystkie inne komórki, których wzrost jest hamowany przez streptomycynę, nie wyrosną na takim podłożu. Uogólniając, taki sposób selekcji może być wykorzystany, gdy niezmutowane komórki na zastosowanym podłożu selekcyjnym lub w zastosowanych warunkach rosnąć nie mogą. 160

Jednakże, gdy komórka w wyniku mutacji utraciła zdolność do syntetyzowania określonego składnika (np. aminokwasu), który jest potrzebny do wzrostu, to taki defektywny metabolicznie mutant (auksotrof) może rosnąć tylko wtedy, gdy dostarczymy mu odpowiedniego składnika. (Odpowiadający mu dziki typ komórki nazywamy prototrofem. ) Jak można więc wyizolować auksotrofy — wiedząc, że każde podłoże, które umożliwia wzrost auksotrofom, pozwala także rosnąć prototrofom? Jedna metoda to użycie podłoża minimalnego, to jest takiego, które zawiera minimalny zestaw substancji odżywczych niezbędnych prototrofom; określony auksotrof może rosnąć na podłożu minimalnym tylko wtedy, gdy zostanie ono uzupełnione czynnikiem, który spełni jego specyficzne wymagania wzrostowe. Jeżeli zamierzamy wyizolować auksotrofa wymagającego histydyny, minimalne podłoże musi być uzupełnione histydyną w małym stężeniu — pozwalającym na bardzo ograniczony wzrost auksotrofa. Kolonie tworzone przez komórki auksotroficzne szybko wyczerpią histydynę w swoim otoczeniu, pozostając małe, podczas gdy komórki prototrofów osiągną normalną wielkość. Zatem małe kolonie to potencjalne auksotrofy i powinny być testowane dokładniej. W alternatywnej metodzie izolowania auksotrofów populację o małej gęstości, zawierającą zarówno komórki prototroficzne, jak i auksotroficzne, wysiewa się na podłoże pełne (kompletne), na którym mogą rosnąć oba typy komórek. Po inkubacji wszystkie komórki wytworzą kolonie jednakowej wielkości. W celu zidentyfikowania kolonii auksotrofów konieczne jest przesianie każdej kolonii na podłoże minimalne, na którym będą rosły tylko prototrofy. Najwygodniej jest tego dokonywać metodą replik płytkowych. W metodzie tej, krążek sterylnego welwetu przyciska się do powierzchni podłoża pełnego (płytki matrycowej lub wzorcowej), na której rosną zarówno kolonie prototrofów, jak i auksotrofów. Komórki z każdej kolonii przyczepiają się do welwetu, który następnie odciska się delikatnie na sterylnej płytce podłoża minimalnego (płytka replikowa). Po inkubacji, miejsca kolonii na płytce replikowej porównuje się z miejscami kolonii na płytce matrycowej; każda kolonia, która rośnie na płytce matrycowej, a nie pojawia się na płytce replikowej, to potencjalny auksotrof (rys. 8. 2. ).

8. 1. 3 Test Amesa wykrywający czynniki rakotwórcze Większość znanych karcynogenów (czynników rakotwórczych) to jednocześnie mutageny. Test Amesa sprawdza potencjalną rakotwórczość substancji przez określanie ich mutagenności (zdolności do wywoływania mutacji). Mutagenność związków chemicznych ocenia się określając ich zdolności do wywoływania rewersji mutacji w testowym organizmie, którym jest Salmonella typhimurium. (Mutację, która znosi skutki pierwotnej mutacji, nazywamy mutacją powrotną lub rewersją). Testowy szczep S. typhimurium jest auksotrofem histydynowym, a test Amesa określa poziom jego rewersji do prototrofii. Prototrofów poszukujemy w mieszaninie inkubacyjnej zawierającej komórki testowego szczepu, testowaną substancję oraz preparat enzymów z wątroby szczura; dodane enzymy stanowią „metaboliczny aktywator" niezbędny do przejawienia aktywności przez niektóre mutageny/karcynogeny. 161

(a) Płytka matrycowa: podłoże pełne z koloniami zarówno prototrofów, jak i auksotrofów, (b) Płytka replikowa: podłoże minimalne wyłącznie z koloniami prototrofów. Na płytce matrycowej strzałka wskazuje kolonię potencjalnego auksotrofa; w odpowiadającym jej miejscu na płytce replikowej nie ma kolonii (auksotrof nie może bowiem rosnąć na podłożu minimalnym).

8. 2 Rekombinacja Przez „rekombinację" rozumiemy przegrupowanie (zmianę rozmieszczenia) sekwencji w obrębie cząsteczki lub cząsteczek kwasów nukleinowych: cząsteczki mogą być łączone, rozdzielane, wymieniać między sobą nici, a sekwencje w obrębie cząsteczki mogą zostać utracone lub odwrócone itp.

8. 2. 1 Rekombinacja homologiczna (ogólna) Rekombinacja homologiczna może obejmować np. wymianę nici między dwiema dwuniciowymi cząsteczkami DNA. Może to następować tylko wtedy, gdy długa sekwencja nukleotydów w jednej nici jest bardzo podobna do sekwencji w drugiej nici, tzn., że dwie dupleksowe cząsteczki wykazują znaczny obszar homologii. Innym wymogiem jest obecność w tych cząsteczkach jednego lub kilku nacięć (pęknięć w szkielecie fosforanowo-cukrowym), umożliwiających rozdzielanie się nici, lub luk (ang. gaps), czyli regionów jednoniciowego DNA. Ważną rolę w tym procesie odgrywa białko RecA (produkt genu recA), które jest zdolne do inicjowania różnego typu oddziaływań między cząsteczkami DNA. (U Archaea, odpowiednikiem białka RecA jest RedA [Seitz i wsp. (1998) GD 12: 1248-1253]. ) Na przykład, wolny koniec ssDNA pochodzący z naciętego dupleksu może być zestawiony, przez białko RecA, z homologicznym ssDNA w innym naciętym dupleksie. Obie nici formują następnie hybrydowy dupleks (heterodupleks), który może zawierać jedną lub kilka błędnie połączonych zasad; podobnie wolny koniec odsunięty z drugiego dupleksu może tworzyć specyficzne pary z ssDNA w pierwszym dupleksie, także tworząc heterodupleks. Jeżeli następnie wolne końce zostaną połączone, powstanie rozgałęziona struktura zwana strukturą Hollidaya; region, w którym dwa dupleksy są utrzymywane razem przez skrzyżowanie się pochodzących z nich pojedynczych nici. Każda nić może kontynuować oddzielanie się od swego macierzystego dupleksu i tworzyć specyficzne pary z ssDNA innego dupleksu, w wyniku czego struktura Holli-

162

daya będzie się przesuwała w odpowiednim kierunku; zjawisko to nazywamy przemieszczaniem się ramion (ang. branch migration), a zakres tego przemieszczania się zależy od całkowitej długość heterodupleksu. U E. coli przemieszczanie się ramion jest „napędzane" przez dwie pierścieniowatego kształtu helikazy (po jednej na każdym końcu struktury Hollidaya), przez które DNA się przesuwa; każda helikaza jest heksamerem białka Ruv. (Porównaj z helikazą DnaB na rys. 7. 8. ) Rozdzielenie struktury Hollidaya (czyli rozdzielenie dupleksów) wymaga działania endonukleazy RuvC, która nacina odpowiednie nici, pozwalając na ich połączenie (ligacje) w obrębie każdego dupleksu. U E. coli, RuvB i RuvC, jak się wydaje, działają kooperatywnie [Gool i wsp. (1998) EMBO Journal 17: 1838-1845]. U przynajmniej niektórych organizmów chromosomy zawierają pewne sekwencje DNA (rekombinacyjne „gorące miejsca"), które wzmagają rekombinację homologiczną w swojej bliskości. Na przykład chromosom E. coli zawiera około 1000 kopii tzw. sekwencji chi (χ) — 5'-GCTGGTGG-3', która wzmaga rekombinację nawet 10-krotnie; wpływ χ (zmniejszający się wraz z oddalaniem) obejmuje obszar około 10 kpz z każdej strony. Ostatnie badania in vitro wskazują, że białko RecA wiąże się preferencyjnie z sekwencjami DNA bogatymi w GT — w tym z sekwencjami χ Ε. coli. Sugeruje to, że specyficzna aktywność (wzmagania poziomu rekombinacji w swoim sąsiedztwie) takich miejsc może zależeć, przynajmniej częściowo, od ich zdolności do wiązania RecA [Tracy i Kowalczykowski (1996) GD 10: 1890-1903]. Rekombinacja homologiczna zdarza się także w pewnych przypadkach oddziaływania między plazmidem i chromosomem.

8. 2. 2 Rekombinacja zlokalizowana (specyficzna wobec miejsca) W podstawowej formie rekombinacji specyficznej wobec miejsca (SSR, ang. sitespecific recombination) dwie specyficzne sekwencje dupleksowego DNA zbliżają się do siebie; w regionie zbliżenia przyłącza się białkowy katalizator reakcji (rekombinaza); wprowadzane są naprzemienne nacięcia w każdym dupleksie, a nacięte końce jednego dupleksu są ligowane (łączone) z naciętymi końcami drugiego dupleksu (patrz rys. 8. 3c). [Działanie rekombinazy specyficznej wobec miejsca: Stark, Boocock i Sheratt (1992) TIG 8: 432-439. ] SSR może kontrolować ekspresję genów; w takiej rekombinacyjnej regulacji, zdarzenia SSR kontrolują włączanie i wyłączanie genu(ów) lub przełączanie ekspresji z jednego genu na inny (rys. 8. 3c). SSR uczestniczy także w integracji DNA bakteriofaga λ (sekcja 9. 2. 1) z chromosomem E. coli (rys. 8. 3b), w pewnych przypadkach także w interakcjach między plazmidem i chromosomem [Campbell (1992) JB 174: 7495-7499], w mechanizmie replikatywnej transpozycji (rys. 8. 4), a także w koniugacyjnej transpozycji (sekcja 8. 4. 2. 3).

8. 3 Transpozycja Transpozycja jest to transfer (przenoszenie) małych, specyficznych fragmentów DNA — lub ich „kopii" — z jednego miejsca w drugie w tym samym dupleksie, do miejsca w innym dupleksie w tej samej komórce lub (patrz koniugacyjne 163

(a) Przesunięte (o nierównych końcach) cięcie w specyficznym miejscu jednego dupleksu DNA i przesunięte cięcie (z reguły z udziałem takiej samej sekwencji nukleotydowej), wprowadzone w innym miejscu tego samego dupleksu lub w innej cząsteczce DNA. Każdy jednoniciowy region w danym miejscu cięcia może tworzyć komplementarne pary z zasadami w obrębie jednoniciowego regionu drugiego miejsca cięcia. (Takie jednoniciowe regiony są czasem nazywane „lepkimi końcami"). W procesie tym uczestniczy białko (rekombinaza). Na schemacie przesunięte cięcie jest przedstawione w postaci dwóch 4-nukleotydowych jednoniciowych regionów. Jednakże, ten jednoniciowy region może mieć także długość 2 lub 6-8 nukleotydów; długość tych wystających odcinków, czyli lepkich końców, zależy od konkretnej rekombinazy uczestniczącej w procesie. (b) Integracja (kolistego, dwuniciowego) DNA bakteriofaga λ (sekcja 9. 2. 1) z chromosomem E. coli. W DNA faga λ miejsce rekombinacyjne (czyli specyficzną sekwencję nukleotydów w dupleksie) pokazano jako biały kwadrat; w chromosomie E. coli pokazane jest ono jako czarny kwadrat z boków oflankowany przez geny operonu gal (wykorzystywanie galaktozy) i bio (biosynteza biotyny). Na lewo: dwie koliste cząsteczki dwuniciowego DNA z zestawionymi ze sobą „miejscami rekombinacyjnymi". Początkowo, z udziałem rekombinazy związanej z tym miejscami, wprowadzane są przesunięte nacięcia każdego dupleksu; lepkie końce nacięcia w chromosomie wytwarzają komplementarne połączenia z lepkimi końcami w DNA A, po czym nici są ligowane. Na prawo: DNA λ włączony do chromosomu E. coli. (c) Przykład rekombinacyjnej regulacji. W wielu szczepach Salmonella rzęski (sekcja 2. 2. 14. 1) mogą być wytwarzane z jednego z dwóch różnych typów białek — kodowanych przez geny H1 i H2; normalnie tylko jeden z tych genów jest wyrażany w danym czasie, tak że rzęski są zbudowane albo z produktu genu H1, albo genu H2. Promotor operonu H1 jest oflankowany dwoma specyficznymi miejscami które są rozpoznawane przez rekombinazę. Góra: operon H2 jest transkrybowany; produkt genu H2 tworzy rzęskę, a represor H1 blokuje transkrypcję genu H1. Dół: między miejscami rozpoznawanymi przez rekombinazę nastąpiła rekombinacja (typu SSR), sekwencja zawierająca promotor genu H2 została odwrócona; bez funkcjonalnego promotora operon H2 nie może być transkrybowany, ale utrata represora H1 pozwala na transkrypcję z H1 — tak że rzęska jest teraz tworzona z produktu genu H1. Zmienność składu białkowego rzęsek Salmonella jest tylko jednym z przykładów bardziej ogólnego fenomenu zwanego zmiennością fazową, w którym skład pewnych powierzchniowych komponentów komórkowych lub struktur ulega spontanicznym zmianom. Na przykład, w poszczególnych komórkach E. coli wytwarzanie tzw. fimbrii typu 1 podlega włączaniu i wyłączaniu, co powoduje, że komórki mogą mieć fimbrie lub nie i zmienić ten stan w wyniku rearanżacji fragmentów DNA.

164

transpozony, sekcja 8. 4. 2. 3) do dupleksu w innej komórce. Ten „mały specyficzny fragment DNA" jest nazywany elementem transpozycyjnym (TE, ang. transposition element) lub skaczącym genem. Elementy transpozycyjne występują np. w chromosomach bakteryjnych, w DNA bakteriofagów (rozdział 9) i w plazmidach. Niżej podane informacje odnoszą się do „klasycznych" elementów transpozycyjnych (tzn. z wyłączeniem koniugacyjnych transpozonów). Dwa podstawowe typy TE to sekwencja insercyjne (IS, ang. insertion sequence) i transpozony. Każdy z nich koduje białko(a), w tym transpozazę (patrz niżej) potrzebną do transpozycji; ponadto transpozon koduje inne funkcje — np. enzymy, które inaktywują określone antybiotyki. Sekwencja nukleotydowa wszystkich TE zawiera co najmniej jedną parę odwróconych sekwencji. Niżej podane są przykłady par terminalnych odwróconych sekwencji: 5'-CTGACTA 3'-GACTGAT

TAGTCAG-3' ATCAGTC-5'

Zauważmy, że lewy koniec dupleksu ma taką samą polarność jak koniec prawy, tzn. sekwencja jest taka sama, gdy jest czytana od 5' (lub 3') końca w obu kierunkach, ale dwa końce dupleksu mają odwrotne orientacje. Odwrócone powtórzenia są niezbędne do transpozycji, prawdopodobnie stanowią miejsce rozpoznawane przez transpozazę. Insercyjna sekwencja zawiera parę odwróconych powtórzeń, każde o długości 10-40 nukleotydów otaczających transponowane geny. Klasa I transpozonów zawiera parę sekwencji insercyjnych (które nie muszą być całkowicie identyczne) otaczających inne geny transpozonu; przykładem jest transpozon Tn10. Klasa II transpozonów zawiera parę odwróconych powtórzeń otaczających inne geny transpozonu; przykładem jest transpozon Tn3. Elementy transpozycyjne mogą być przenoszone przez „prostą" transpozycję lub przez transpozycję „replikatywną" (wyjaśnienie na rys. 8. 4). Dla pewnych TE (np. Tn7) miejsce docelowe (tarcza) jest ściśle określone. Inne TE pozornie włączają się w przypadkowe miejsca, chociaż ich miejsca docelowe wykazują pewien stopień selektywności [Craig (1997) ARB 66: 437-474]. Badania nad transpozycją sekwencji insercyjnej IS903 do dużego (55 kpz) plazmidu wykazały, że chociaż Insercja może nastąpić w wielu różnych miejscach, są jednak pewne preferowane regiony włączania IS903 [Hu i Derbyshire (1998) JB 180: 3039-3048], Obecność TE w określonym miejscu jest umownie oznaczana podwójnym dwukropkiem, np. obecność Tn3 w genomie faga λ zapisuje się jako: A:: Tn3. Transpozycja, zjawisko stosunkowo rzadkie, może powodować różnorodne przegrupowania DNA (rearanżacje) w genomie, w tym insercje, delecje lub odwrócenia sekwencji. Transpozycja, np. Tnl0 z chromosomowej lokalizacji, jest jak się wydaje, powiązana z cyklem komórkowym (patrz sekcja 7. 8. 8).

165

(a) Dwie koliste, dwuniciowe cząsteczki DNA. Cząsteczka dawcy zawiera transpozon (linia przerywana), po obu stronach którego znajduje się stare miejsce „tarczowe" ; miejsce to zostało zduplikowane podczas pierwotnego wbudowywania się transpozonu do cząsteczki dawcy (patrz dalej). Cząsteczka docelowa (do której ma nastąpić wbudowanie transpozonu) ma pojedyncze miejsce tarczowe do którego nastąpi Insercja. (b) Enzym (transpozaza — nie zaznaczona) pośredniczy w co najmniej początkowych etapach transpozycji. Wprowadzane jest przesunięte nacięcie w obrębie miejsca tarczowego. Nacięcie jest też dokonywane w każdej nici transpozonu (po jego przeciwnych końcach), a wolne końce są ligowane z końcami w cząsteczce docelowej, tak jak to pokazano na schemacie. W „prostej" transpozycji (np. przy transpozycji Tnl0) następny (i jednocześnie końcowy etap) jest taki jak pokazano w części (c). (c) Rezultat „prostej" transpozycji. Synteza DNA nastąpiła z każdego wolnego końca 3' w cząsteczce docelowej, wykorzystując jednoniciowe odcinki miejsca tarczowego jako matrycę do syntezy nici komplementarnych . Pozostałe końce nici transpozonu zostały przecięte i zligowane w przedsta-

166

8. 4 Przekazywanie (transfer) genów Nowy DNA może wniknąć do komórki bakteryjnej przez transformację, koniugację lub transdukcję; transdukcja (wymagająca pośrednictwa bakteriofagów) jest opisana w rozdziale 9.

8. 4. 1 Transformacja W procesie transformacji bakteria pobiera z otoczenia fragment DNA; jedna nić DNA pochodzącego z dawcy wnika do wnętrza komórki i może spowodować genetyczną transformację biorcy przez rekombinację z homologicznym regionem jego chromosomu. Transformacja u różnych gramdodatnich i gramujemnych bakterii (chociaż nie u E. coli, patrz sekcja 8. 4. 1. 1) następuje spontanicznie; może ona np. mieć znaczący udział w rozprzestrzenianiu się oporności na antybiotyki u bakterii patogennych [Davies (1994) Science 264: 375-382]. Haemophilus influenzae i Neisseria gonorrhoeae wiążą DNA wtedy, gdy zawiera

on pewne sygnałowe sekwencje pobierania (ang. uptake-signal sequences), które zdarzają się powtarzalnie w ich własnych chromosomach. Warunek ten nie musi być spełniony u Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae, ale z kolei

gatunki te wiążą DNA tylko w ograniczonej liczbie miejsc na powierzchni komórki. Zdolność do wiązania i pobierania DNA, kompetencja, jest konstytutywna u N. gonorrhoeae. U H. influenzae kompetencja jest indukowana przez warunki wpływające hamująco na wzrost; kompetencję wzmaga np. wysoki poziom wewnątrzkomórkowego cAMP (rys. 7. 12). U gatunków B. subtilis i S. pneumoniae na poziom kompetencji wpływają warunki żywieniowe, jak również gęstość populacji bakteryjnej (jest to przykład tzw. quorum sensing, czyli regulacji przez „wyczuwanie liczebności"; sekcja 10. 1. 2). U S. pneumoniae kompetencja jest także związana z procesem transbłonowego transportu wapnia [Trombe, Rieux i Baille (1994) JB 176: 1992-1996]. wiony sposób. Zauważ, że miejsce tarczowe w cząsteczce docelowej zostało zduplikowane — porównaj z cząsteczką dawcy (a). Pozostała część cząsteczki dawcy może być nieaktywna i ulec dezintegracji („samobójczy dawca"). (d) „Replikatywna" transpozycja (zachodzi np. w przypadku transpozonu Tn3) zawiera etapy (b), (d) i (e). W punkcie (d) nowa synteza DNA jest kontynuowana (z końca 3' w cząsteczce docelowej) poza miejsce tarczowe, wykorzystując nici transpozonu jako matryce; dzięki temu także cały transpozon ulega replikacji. Koniec każdej nowej nici został połączony z wolnymi końcami w cząsteczce dawcy. Struktura pokazana w etapie (d) jest kointegratem, linia zygzakowata wskazuje nowo syntetyzowany DNA. Następny etap zachodzi z udziałem resolwazy — enzymu kodowanego przez transpozon. Resolwaza rozdziela kointegrat w procesie zlokalizowanej rekombinacji (SSR) (sekcja 8. 2. 2), tworząc cząsteczki pokazane w punkcie (e). (e) Zarówno dawca, jak i cząsteczka docelowa zawierają kopie transpozonu; zauważ, że w tym modelu każdy produkt transpozycji zawiera część oryginalnego transpozonu (linia przerywana) i część nowo zsyntetyzowanego DNA (linia zygzakowata). Przygotowane w formie zmodyfikowanej wg Molecular Biology of the Gene, 4 wyd. (1987), J. D. Watson i wsp. (Menlo Park, California: Benjamin/Cummings Publishing Company), p. 336, za pozwoleniem

167

[Competence in transformation: Solomon and Grossman (1966) TIG 12: 150-155. ] Transformację po raz pierwszy zaobserwował Griffith w latach dwudziestych, stwierdziwszy, że niepatogenny szczep S. pneumoniae stał się wirulentny po zmieszaniu z zabitym szczepem wirulentnym. Znacznie później wykazano, że to DNA uwolniony z zabitych komórek spowodował transformację żywych komórek; było to jedno z pierwszych wskazań na DNA jako element komórkowy niosący informację genetyczną.

8. 4. 1. 1 Kompetencja indukowana laboratoryjnie Kompetencja (np. u E. coli) może być indukowana przez zastosowanie pewnych procedur zwiększających przepuszczalność osłon komórkowych. Na przykład roztwór chlorku wapnia (około 50 mM, 0, 2 ml) zawierający 108-109 komórek E. coli pochodzących ze środkowej fazy logarytmicznej chłodzi się w lodzie, a następnie dodaje roztwór DNA (10 μl), tak aby końcowe stężenie DNA wynosiło w przybliżeniu 0, 2 μg/ml. Po inkubacji mieszaniny komórek i DNA w temperaturze 0°C (łaźnia lodowa) jest ona poddawana szokowi cieplnemu (42°C przez 1, 5-2 min), a następnie po krótkim schłodzeniu dodaje się 1 ml bulionu LB i inkubuje komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. (LB — Luria-Bertani broth zawiera na 1 litr: 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego i 10 g NaCl; pH jest doprowadzone do wartości 7, 5 za pomocą NaOH. ) Osiąganie przez E. coli kompetencji przez inkubację w schłodzonym roztworze chlorku wapnia przypisuje się obecności w jej błonie cytoplazmatycznej dużej ilości kompleksów poli-β-hydroksymaślanu z polifosforanem wapniowym. Sugeruje się, iż kompleksy te mogą formować transbłonowe kanały ułatwiające transport DNA i że dwuwartościowe kationy mogą działać przez wytwarzanie połączeń między DNA i fosforanami przy wlocie do takiego kanału [Huang i Reuch (1995) JB 177: 486-490]. Małe, koliste plazmidy mają tendencję do łatwiejszego wnikania do kompetentnych komórek niż duże. U E. coli DNA w formie liniowych dwuniciowych fragmentów (dsDNA) transformuje z bardzo małą wydajnością (lub wcale), ponieważ jest degradowany przez enzym RecBC. Jednakże taka forma DNA transformuje wydajnie niektóre mutanty recBC, gdyż nie wytwarzają one tego enzymu.

8. 4. 1. 2 Elektroporacja Bardzo wysoką wydajność transformacji E. coli przez plazmidowy DNA można uzyskać stosując elektroporację; mieszanina komórek i DNA plazmidowego jest poddawana działaniu pola elektrycznego o natężeniu nawet do około 16kV/cm, przez ułamek sekundy. Mechanizm pobierania DNA indukowany przez impuls elektryczny nie jest w pełni zrozumiały; najważniejsze czynniki to siła i czas trwania pulsu. Częstość elektrotransformacji zmienia się liniowo w szerokim zakresie wartości wraz ze stężeniem DNA, zależy także od stężenia (gęstości) komórek. [High-efficiency electroporation; Zhu and Dean (1999) NAR 27: 910-911. ] 168

Elektroporacja była zastosowana do transformacji różnych bakterii [łącznie z np. Helicobacter pylori: Lee i wsp. (1997) AEM 63: 4866-4871].

8. 4. 2 Koniugacja Niektóre plazmidy (tzw. koniugacyjne) (sekcja 7. 1) oraz koniugacyjne transpozony (patrz niżej) nadają swoim gospodarzom zdolność przenoszenia DNA do innych komórek w procesie zwanym koniugacją. W procesie tym dawca (komórka męska) przekazuje DNA do biorcy (komórka żeńska) podczas bezpośredniego kontaktu partnerów. Biorca, który otrzymał DNA od dawcy, jest nazywany transkoniugantem. Podobnie jak transformacja, koniugacja wywołuje ważne fenotypowe zmiany biorcy, łącznie z nabywaniem kodowanej przez plazmidy oporności na antybiotyki. Jednakże, odmiennie niż transformacja, koniugacja wymaga udziału szeregu wyspecjalizowanych komponentów komórkowych (patrz niżej), których komórka, w celu oszczędzania energii, zwykle nie syntetyzuje konstytutywnie. Z reguły, geny związane z koniugacją są wyrażane tylko w odpowiednich warunkach lub po otrzymaniu specyficznego sygnału; tak więc, np. pewne systemy są indukowane przez odpowiednie antybiotyki, podczas gdy inne są uruchamiane tylko wtedy, gdy liczba komórek bakteryjnych osiągnie pewien określony poziom (kolejny przykład regulacji przez quorum sensing, czyli wyczuwanie liczebności: sekcja 10. 1. 2. ). [Control of conjugative gene expression: Zatyka and Thomas (1998) FEMSMR 21: 291-319. ] Najpierw zapoznamy się z koniugacją zależną od plazmidów (sekcja 8. 4. 2. 1, 8. 4. 2. 2), a następnie z zależną od koniugacyjnych transpozonów.

8. 4. 2. 1 Koniugacja u bakterii gramdodatnich Wyróżniamy dwa główne typy koniugacji zależnej od plazmidów: W szczepach takich jak np. Enterococcus (dawniej Streptococcus) faecalis, potencjalny biorca wydziela niewielkie ilości krótkiego peptydu (feromonu), który powoduje rozpoczęcie syntetyzowania adhezyjnego czynnika powierzchniowego przez dawcę zawierającego plazmid; następnie plazmid jest przekazywany z dawcy do przyłączonej doń komórki biorcy. [Artykuł przeglądowy: Dunny i wsp. (1995) JB 177: 871-8776. ] Taki rodzaj koniugacji zachodzi w płynnej (bulionowej) hodowli, a warunkujące ją plazmidy zawierają często także geny odpowiedzialne za oporność na antybiotyki i syntezę hemolizyny. Szczep biorcy często wydziela kilka feromonów, z których każdy jest specyficzny wobec określonego plazmidu; wydzielanie zatrzymuje się po uzyskaniu przez komórkę odpowiedniego plazmidu. Niektóre plazmidy kodują syntezę peptydu, który jest antagonistyczny wobec odpowiedniego feromonu. Rolą takiego inhibitora może być zabezpieczenie przed przedwczesnym rozpoczęciem procesu koniugacji (tzn. przed osiągnięciem odpowiednio wysokiego stężenia feromonu), gdy komórka biorcy jest jeszcze nie dość blisko, aby mogło nastąpić przypadkowe spotkanie partnerów.

169

Drugi typ koniugacji zależnej od plazmidów nie jest związany z wytwarzaniem feromonów, wymaga jednak umieszczenia mieszaniny komórek dawcy i biorcy na stałym podłożu, np. na powierzchni filtra nitrocelulozowego. Taka koniugacja występuje w szczepach z rodzajów Streptococcus i Staphylococcus, a warunkujące ją plazmidy kodują oporność na antybiotyki i są zazwyczaj niezbyt duże (do 15 kpz). Komórkowe i molekularne mechanizmu transferu DNA w tego typu koniugacji są poznane w niewielkim zakresie. 8. 4. 2. 2 Koniugacja u bakterii gramujemnych

U dawców gramujemnych plazmid koduje (oprócz innych białek) białkowe podjednostki strukturalne pilusa (sekcja 2. 2. 14. 3); pilusy wydają się niezbędne do koniugacji u bakterii tej grupy. Różne typy pilusów warunkują koniugację w różnych warunkach fizycznych oraz prawdopodobnie funkcjonują w różny sposób. Jednym z najlepiej poznanych typów koniugacji jest koniugacja u E. coli przebiegająca z udziałem plazmidu F. Plazmid F w komórce dawcy występuje zwykle jako niezależna od chromosomu kolista cząsteczka DNA; komórki dawców mające pilusy są oznaczane jako F+, podczas gdy komórki biorców (nie mające pilusów) to komórki F-. Po zmieszaniu komórek F+ i F~, wierzchołki pilusów oddziałują z powierzchnią komórek F~ (patrz fot. 8. 1: w prawej dolnej części). Co zdarza się w kolejnym etapie, wciąż nie jest w pełni jasne. Badacze amerykańscy twierdzili, że DNA może przechodzić poprzez pilus do komórki F~ [Harrington i Rogerson (1990) JB 172: 7263-7264]. Szwajcarscy naukowcy obserwowali koniugujące komórki przez połączony z kamerą wideo mikroskop świetlny oraz badali miejsce połączenia dawcy z biorcą w mikroskopie elektronowym [Durrenberger, Villiger i Bachi (1991) JSB 107: 146-156]; mikroskopia świetlna wykazała, że komórki dawcy i biorcy są szybko (w ciągu kilku minut) przyciągane do siebie,

Fot. 8. 1 Góra. Koniugujące komórki Escherichia coli w kontakcie typu „ściana-ściana" (skala: 6 cm = 1 μm) Mikroskopia elektronowa pokazuje „koniugacyjne połączenie": elektronowo gęsta (ciemna) linia (pomiędzy ostrzami strzałek), które zaznaczają region kontaktu między dawcą i biorcą. Górna komórka koniugująca jest tuż przed podziałem; porównaj koniugacyjne połączenie z miejscem podziału komórkowego (najbardziej na prawo). Masy małych, ciemno wybarwionych plamek to rybosomy. Prawa dolna część. Koniugujące komórki E. coli Ten preparat był wybarwiony w celu uwidocznienia F-pilusa (strzałki) biegnącego od jednej komórki do drugiej. (Widoczne są też fragmenty rzęsek). Lewa dolna część. Aparat użyty w eksperymencie autora w celu badania koniugacji „obligatoryjnie wymagającej stałego podłoża" (patrz tekst) Wiązka 80 chemicznie czystych 73-mm szklanych rurek kapilarnych (wewnętrzna średnica około 0, 8 mm) umieszczona wewnątrz zakręcanej butli. Podczas potrząsania butlą podłoże koniugacyjne tworzy wielką ilość małych „nitek" płynu w rurkach kapilarnych, każda „nitka" ma na obu końcach menisk, poniżej którego komórki biorcy i dawcy mogą być utrzymywane w ścisłym kontakcie przez napięcie powierzchniowe. Zdjęcie dzięki uprzejmości dr. Markusa B. Durrenbergera, z Uniwersytetu w Zurichu, Szwajcaria.

170

171

a utworzony ścisły kontakt „ściana-ściana" jest utrzymywany przez następne 80 minut. Szybkie tworzenie bezpośredniego kontaktu następuje w wyniku wciągania pilusa, co zresztą było przez wiele lat ogólnie akceptowane. W mikroskopie elektronowym można było także zaobserwować specyficzne „koniugacyjne połączenie" między przylegającymi do siebie ściśle komórkami (fot. 8. 1: górna część). Z obserwacji tych i z kinetyki transferu DNA szwajcarscy badacze wyciągnęli wniosek że: „... DNA jest przekazywany raczej w czasie ścisłego kontaktu „ściana-ściana", niż... poprzez pilus wstępnie łączący komórki". Na pewnym etapie kontaktu jakiś (nieznany) koniugacyjny sygnał uruchamia proces przekazywania (transferu) DNA. Przekazywanie to zaczyna się od nacięcia DNA w specyficznym miejscu (oriT) w określonej nici plazmidu F; jest ogólnie akceptowane, że nacięcie to jest wprowadzane przez helikazę I, białko kodowane przez plazmid [Matson i Morton (1991) JBC 266: 16232-16237], która następnie pełni główną rolę w rozwijaniu dupleksu od końca 5'. Szczegóły tego procesu i sposób transferu DNA nie są jak dotychczas dokładnie poznane. Wolny koniec 5' może wniknąć do komórki biorcy lub może pozostać zakotwiczony w pobliżu połączenia partnerów, podczas gdy reszta nici w postaci pętli jest wprowadzana do biorcy. Do biorcy wnika tylko nacięta nić, która w jego komórce działa jako matryca do syntezy DNA; odtwarzana jest więc kompletna kolista forma plazmidu, w wyniku czego biorca staje się F+. Wewnątrz dawcy, utracona nić mogłaby być odtwarzana przez uzupełniającą syntezę DNA (dawcza koniugacyjna synteza DNA, ang. donor conjugative DNA synthesis; DCDS) przebiegającą według modelu toczącego się koła (rys. 8. 5), jednak pewne zastrzeżenia dotyczące niezbędności starterów do tego typu syntezy czyni to założenie niepewnym. Czasem, niezbyt często, plazmid F wbudowuje się do chromosomu komórki gospodarza. Proces taki, fuzja plazmidu z chromosomem, w pewnym stopniu przypomina integrację faga λ (rys. 8. 3), chociaż mechanizm obu zjawisk jest różny. W rezultacie powstaje dawca typu Hfr. Ponieważ komórka Hfr tworzy pilusy, może więc koniugować z komórką F~. Podczas krzyżówek Hfr χ F~ najpierw jest przekazywany DNA plazmidowy, następnie chromosomowy i wreszcie, jeżeli nić DNA nie ulegnie przerwaniu — pozostała część DNA plazmidowego. Można to łatwiej zrozumieć, jeżeli wyobrazimy sobie, że oriT jest ulokowany w środku wbudowanego plazmidu F. Jeżeli przekazany zostanie kompletny plazmid i chromosom, biorca staje się dawcą typu Hfr, lecz zazwyczaj helisa DNA w trakcie przekazywania ulega w pewnym punkcie przerwaniu i biorca, który nie otrzymuje kompletnego plazmidu, pozostaje F'. Zwykle biorca otrzymuje, oprócz części plazmidu, również różnej wielkości fragment chromosomo-

172

wego DNA dawcy i jeżeli geny zlokalizowane na tym fragmencie ulegną rekombinacji z chromosomem biorcy, informacja genetyczna zawarta w chromosomie biorcy zostanie zmieniona. To właśnie znaczna liczba zrekombinowanych komórek powstająca w wyniku krzyżówek Hfr χ F~ spowodowała nazwanie tego typu dawców Hfr (ang. high frequency of recombination). Plazmid F może także „opuścić" chromosom, w wyniku czego dawca typu Hfr staje się dawcą typu F + . Czasem plazmid podczas wycinania się z chromosomu może „zabrać ze sobą" przylegający fragment chromosomu, czego wynikiem jest powstanie plazmidu F' (F-prime). W krzyżówkach F' xF~ przekazany F' przekształca biorcę w dawcę (podobnie jak w przypadku F+), lecz przekazuje on także fragment chromosomu (tak jak Hfr), to jest ten, zwykle niewielki, fragment chromosomu, który plazmid zabrał do swego genomu podczas wycinania się. Plazmid F jest tylko jednym z wielu plazmidów koniugacyjnych, nie jest nawet typowym przykładem takiego plazmidu, gdyż np. jego zdolność do tworzenia stabilnych dawców typu Hfr nie jest cechą powszechną. W przypadku wielu plazmidów geny odpowiedzialne za tworzenie pilusa i inne geny związane z koniugacją są w stanie represji, a więc w populacji potencjalnych dawców tylko nieliczne komórki (z przejściowo zderepresjonowanymi genami plazmidowymi warunkującymi koniugację) aktywnymi dawcami. Jak wspominano wcześniej (sekcja 7. 1), plazmidy mogą kodować, a liczne z nich także przekazywać wiele różnych cech. Koniugacja „uniwersalna" i „obligatoryjnie wymagająca stałego podłoża". U bakterii gramujemnych koniugacja może być typu „uniwersalnego" lub „obligatoryjnie wymagająca stałego podłoża", zależnie od typu pilusa kodowanego przez plazmid koniugacyjny. Plazmid, który koduje długie, giętkie pilusy — tak jak np. plazmid F (sekcja 2. 2. 14. 3), warunkuje tzw. uniwersalną koniugację; czyli taką, która może równie dobrze zachodzić w podłożu płynnym (np. hodowli bulionowej), jak i na wilgotnym (lecz nie zanurzonym), stałym podłożu (np. na powierzchni płytki agarowej). Wyniki eksperymentów z koniugacją uniwersalną w podłożu płynnym wskazują, że jej wydajność może być zwiększona przez podwyższenie w nim stężenia elektrolitów [Singleton (1983) FEMSML 20: 151-153]. Plazmidy, które kodują pilusy krótkie, sztywne, podobne do gwoździa, warunkują koniugację bezwzględnie wymagającą stałego podłoża, która następuje tylko na wilgotnej powierzchni stałej, lecz nie zanurzonej całkowicie w płynie. Ten typ koniugacji, jak się wydaje, wymaga, aby koniugujące komórki znajdowały się pod lub wewnątrz cienkiej błonki płynu, nie przekraczającej grubości samych komórek; w naturze komórki spotykają takie warunki, gdy na przykład znajdują się na cząstkach gleby wysychającej w wyniku parowania. Prowadzano eksperymenty, aby stwierdzić, czy warunki odpowiednie do tego typu koniugacji istnieją pod cienką warstwą płynu na chemicznie czystym szkle (fot. 8. 1. dół, lewa strona); wyniki sugerują, że koniugacja taka wymaga lub jest wspomagana przez napięcie powierzchniowe [Singleton (1983) FEMSLT 19: 179-182]. 173

8. 4. 2. 3 Koniugacyjna transpozycja (koniugacja niezależna od plazmidu)

Koniugacyjna transpozycja, która zdarza się głównie między bakteriami gramdodatnimi, jest typem koniugacji zależnej od koniugacyjnych transpozonów w, bez udziału koniugacyjnych plazmidów. (Koniugacyjna transpozycja prawdopodobnie nie następuje między bakteriami gramujemnymi; niemniej jednak u pewnych gramujemnych bakterii (np. u Neisseria meningitidis) stwierdzono obecność DNA koniugacyjnych transpozonów, co sugeruje, że być może dostały się tam one na drodze transformacji (sekcja 8. 4. 1) lub zostały wprowadzone jako część koniugacyjnego plazmidu. ) Koniugacyjne transpozony, podobnie jak te „klasyczne" (sekcja 8. 3), są ruchomymi elementami genetycznymi, które mogą się przemieszczać z jednej cząsteczki DNA do innej. Występują one np. w chromosomach i plazmidach, a ich wielkość zawiera się w zakresie od 18 kpz (Ύn916) do ponad 50 kpz; niektóre z tych większych (np. Tn5253) zawierają elementy podobne do Tn916 wbudowane do innego transpozonu, z których każdy może niezależnie ulegać transpozycji. Koniugacyjne transpozony, z których każdy niesie przynajmniej jeden gen warunkujący oporność na antybiotyki, są łatwo przenoszone w obrębie szerokiego wachlarza gatunków i rodzajów, będąc często odpowiedzialne za przekazywanie antybiotykooporności między bezplazmidowymi gramdodatnimi patogenami. Stwierdzono ich obecność w szczepach Enterococcus faecalis, E. faecium, i Streptococcus pneumoniae. Geny oporności na antybiotyki niesione przez te elementy często warunkują oporność na tetracyklinę (gen tet(M) znaleziono we wszystkich koniugacyjnych transpozonach u patogenów), chloramfenikol, erytromycynę i kanamycynę. Białko Tet(M), odmiennie od białka ΤΕΤ (sekcja 15. 4. 11), może oddziaływać bezpośrednio z systemem syntezy białek, redukując wrażliwość wiązania rybosomu z tRNA na tetracykliny [Burdett (1993) JB 175: 7209-7215]. Aktualny model koniugacyjnej transpozycji jest następujący. Kontakt między komórkami dawcy i biorcy powoduje wycięcie transpozonu wewnątrz dawcy; przy każdym końcu wbudowanego transpozonu powstają nacięcia w taki sposób, że po wycięciu jedna nić przy każdym końcu transpozonu ma przyłączonych sześć (najczęściej) nukleotydów z chromosomu gospodarza. Te jednoniciowe końcowe sekwencje są nazywane sekwencjami łączącymi (ang. coupling sequence). Wycinanie następuje z udziałem rekombinazy (produktu genu int) kodowanej przez transpozon. Wycięty transpozon ulega cyrkularyzacji w wyniku parowania (częściowo błędnego) zasad pomiędzy sekwencjami łączącymi. Wydaje się prawdopodobne, że do komórki dawcy przekazywana jest pojedyncza nić transpozonu i że w biorcy, przed insercją do chromosomu, jest syntetyzowana nić komplementarna. Insercja dwuniciowego transpozonu w miejsce docelowe (ang. target) w chromosomie biorcy nie jest specyficzna, ale nie jest też całkowicie przypadkowa. Każde miejsce docelowe zawiera sekwencje bogate w A (ang. A-rich) i Τ (T-rich), które są od siebie odległe o około 6 nukleotydów. Podczas insercji końcowe jednoniciowe sekwencje łączące tworzą pary z jednoniciowymi odcinkami utworzonymi w naciętej sekwencji docelowej; błędnie sparowane zasady są naprawiane w czasie pierwszej rundy replikacji DNA. Transpozon po wbudowaniu do chromo174

somu ma z jednej strony sekwencję łączącą z dawcy; jest ona tylko z jednej strony, ponieważ sekwencje łączące (jedna przy każdym końcu transpozonu) wbudowywane są w różne nici chromosomu gospodarza — w wyniku ich rozdzielenia się podczas, pierwszej po insercji, rundy replikacji DNA. Koniugacyjne transpozony są w nowym gospodarzu niewrażliwe na jego system restrykcyjny (sekcja 7. 4). Sugerowane wyjaśnienie tej cechy opiera się na odnalezieniu, w transpozonie Tn916, genu (orf18) kodującego produkt podobny do antyrestrykcyjnego białka kodowanego przez pewne plazmidy. Koniugacyjne transpozony różnią się od „klasycznych" transpozonów (sekcja 8. 3) tym, że: 1) pośredniczą w koniugacji, 2) nie duplikują sekwencji docelowej w genomie nowego gospodarza, 3) po wycięciu tworzą pośrednią formę w postaci cccDNA. [Artykuł przeglądowy: Scott i Churchward (1995) ARM 49: 367-397. ]

8. 5 Inżynieria genetyczna/technologia rekombinowanego DNA i podobne techniki związane z analizą DNA Kwasami nukleinowymi możemy manipulować, oddziaływać na nie in vitro, a następnie wprowadzać je do komórek, w których mogą podlegać replikacji i ekspresji. Taka technologia pozwala nam modyfikować komórki wysoce specyficznymi sposobami, na przykład bakterie mogą być „zmuszone" do syntetyzowania ssaczych białek, takich jak insulina. W istocie, mogą być w ten sposób syntetyzowane przez bakterie białka różnych gatunków, ponieważ techniki rekombinacji pozwalają wprowadzać do nich całkiem nowy materiał genetyczny. To wyjaśnia, dlaczego techniki rekombinacji in vitro mają przewagę nad technikami typu „mutacji i selekcji", za pomocą których możemy modyfikować jedynie geny już istniejące w komórce. Inną zaletą techniki rekombinowania genów jest to, że zmiany genetyczne mogą być kontrolowane i można nimi świadomie kierować (patrz np. mutageneza specyficzna wobec miejsca, zlokalizowana; sekcja 8. 5. 5. 2). Technologia rekombinowania DNA często wykorzystuje bakterie lub ich enzymy oraz plazmidy lub fagi. Sekcja 8. 5 wyjaśnia zasady pewnych technik i wprowadza wiele terminów, idei i strategii. Niektóre opisane metody, np. łańcuchowa reakcja polimeryzacji (PCR, ang. polymerase chain reaction), znajdują zastosowanie w innego typu badaniach, łącznie z wykrywaniem, identyfikacją i taksonomiczną klasyfikacją bakterii oraz innych organizmów, stwierdzaniem oporności pewnych patogenów na antybiotyki itp. (sekcja 15. 4. 11. 2). N o t k a : Tematy poruszone w sekcji 8. 5 to: 8. 5. 1 Klonowanie i związane nim ogólne techniki — np. restrykcja DNA (cięcie); przeszukiwanie (ang. screening); izolowanie i oczyszczanie chromosomowego i plazmidowego DNA; wirowanie, tzw. blotting; wektory; linkery; dodawanie określonych końców do fragmentu DNA (ang. tailing); ligacja. 8. 5. 2 Fuzja genów i fuzja białek. 8. 5. 3 Sondy; znakowanie sond (łącznie z „przesunięciem nacięcia", ang. nicktranslation). 175

8. 5. 4 Łańcuchowa reakcja polimeryzacji (PCR), zastosowania i zmodyfikowane formy reakcji. 8. 5. 5 Mutageneza. 8. 5. 6 Sekwencjonowanie DNA (metoda Sangera terminacji łańcucha). 8. 5. 7 Wyrażanie się genów eukariotycznych w bakteriach: ograniczenia. 8. 5. 8 Funkcjonalna analiza genomowego DNA. 8. 5. 9 Amplifikacja kwasów nukleinowych w łańcuchowej reakcji ligacji i NASBA. 8. 5. 10 Zrekombinowana streptokinaza; przykład technologii rekombinowania DNA. 8. 5. 11 Nadprodukcja zrekombinowanych białek. 8. 5. 12 Białka wiążące DNA; wybrane techniki (łącznie z tzw. genetycznym odciskiem stopy, ang. DNase I footprinting). 8. 5. 13 Prezentowanie heterologicznych („obcych") białek. 8. 5. 14 Prezentowanie różnicujące. 8. 5. 15 Technologia „DNA~chip" Po ogólnym wstępie zapoznamy się z powszechną dziś technologią: klonowaniem (sekcja 8. 5. 1), przedstawione zostaną bardziej szczegółowo elementy różnych technik związanych z tą procedurą, z których wiele znajduje także zastosowanie w innych obszarach technologii rekombinowania DNA.

8. 5. 1 Klonowanie (klonowanie genu, klonowanie molekularne) — przegląd Klonowanie służy do otrzymania wielu kopii danego genu (lub innego fragmentu DNA) — np. w celu analizy sekwencji lub otrzymania dużej ilości produktu kodowanego przez gen. Zaczynając od małej liczby kopii danego genu możemy amplifikować go (czyli powielić) do wielu milionów kopii. Najpierw włączamy kopie genu (in vitro) do tzw. wektora, którym często jest plazmid (sekcja 7. 1), czyli cząsteczka, która może „wnieść" gen do komórki bakterii i następnie replikować go w niej. Insercja DNA do plazmidu wektorowego jest przedstawiona na rysunku 8. 6; podczas tego procesu kopie genu są mieszane z plazmidem i odpowiednim enzymem, tak że gen zostaje z pewną częstością włączany do cząsteczki plazmidu. Hybrydowy plazmid, zawierający dany gen, może być wprowadzony na drodze transformacji (sekcja 8. 4. 1) do komórki bakterii i będzie podlegał replikacji podczas jej wzrostu i podziałów. Populacja bakterii może osiągnąć bardzo dużą liczebność, dzięki temu możemy otrzymać wiele kopii hybrydowego plazmidu, z których każdy zawiera kopię sklonowanego genu. Na podstawie przestawionego schematu zakładamy, że podczas transformacji każda bakteria otrzymuje kopię plazmidu. W praktyce musimy mieć możliwość wyselekcjonowania tych komórek, które rzeczywiście otrzymały plazmid, ponieważ tylko te komórki są istotne w procesie klonowania. Jedną z powszechnie stosowanych metod jest użycie plazmidu wektorowego, który zawiera gen oporności na antybiotyk; bakterie po transformacji takim wektorem są wysie-

176

(a) Plazmid i „obcy" DNA. Obie cząsteczki zawierają sekwencję nukleotydową GAATTC, która jest rozpoznawana przez endonukleazę restrykcyjną EcoRI (sekcja 7. 4; tab. 8. 1). EcoRI tnie między guanozyną (G) i adenozyną (A), jak wskazują strzałki. (b) W wyniku cięcia przez EcoRI, obie cząsteczki mają teraz „lepkie końce" (terminalne, jednoniciowe komplementarne sekwencje nukleotydów). (c) „Obcy" DNA połączył się z cząsteczką wektora w wyniku komplementarnego parowania zasad w regionie lepkich końców. (d) Enzym, ligaza DNA, utworzył fosfodiestrowe wiązanie (rys. 7. 4) między resztami cukru nukleotydów G i A, tworząc hybrydowy plazmid. Populacja hybrydowych plazmidów może być teraz wprowadzona do bakterii przez transformację (sekcja 8. 4. 1) w celu klonowania (sekcja 8. 5. 1). Zauważ, że gdy potrzeba, fragment może być następnie wycięty z wektora z użyciem tego samego enzymu restrykcyjnego.

177

wane na podłoże uzupełnione odpowiednim antybiotykiem, dzięki czemu selekcjonujemy komórki zawierające plazmid. Należy jednak zwrócić uwagę, że komórka może rosnąć na takim podłożu, jeżeli: 1) jest mutantem (sekcja 8. 1. ) opornym na dany antybiotyk, lub 2) pobrała plazmid, w którym nie ma interesującego nas genu, gdyż podczas insercji nie został włączony do plazmidu (rys. 8. 6); do tej drugiej możliwości powrócimy później w sekcji 8. 5. 1. 5. W innej procedurze selekcyjnej (miareczkowanie represora) czyni się użytek z: 1) specjalnie skonstruowanego szczepu E. coli, którego chromosom zawiera gen oporności na kanamycynę pod kontrolą promotora /operatora lac (rys. 7. 11), i 2) wielokopiowego wektora plazmidowego (sekcja 7. 3. 1) zawierającego sekwencję operatora lac. Komórki nie zawierające wektorowego plazmidu nie będą zdolne do wzrostu na podłożu z kanamycyną (przy braku laktozy i IPTG), ponieważ transkrypcja z operatora lac jest blokowana przez białko represorowe LacI (rys. 7. 11). Komórki zawierające wielokopiowy plazmid będą miały wiele dodatkowych kopii lac operatora utworzonych pod kontrolą plazmidu, które będą współzawodniczyć z operatorem lac pochodzenia chromosomowego o represor LacI; w tych warunkach LacI nie zdoła spowodować represji genu oporności na kanamycynę, komórki będą więc rosły na podłożu z kanamycyną. Ponieważ wektor ten nie niesie genów oporności na antybiotyk (porównaj z poprzednią metodą), będzie mniejszy i w związku z tym bardziej wydajny w transformacji (sekcja 8. 4. 1. 1). [Repressor titration: Wiliams i wsp. (1998) NAR 26: 2120-2124. ] W celu odzyskania sklonowanego genu, komórki są lizowane i hybrydowy plazmid izolowany z nich np. przez wirowanie równowagowe (izopykniczne) (rys. 8. 12); lub alternatywnie, może być zastosowany protokół Qiagen (sekcja 8. 5. 1. 4; fot. 8. 2). Przy użyciu oryginalnych endonukleaz restrykcyjnych, zastosowanych uprzednio w klonowaniu, gen może być wycięty z hybrydowego plazmidu i oddzielony od DNA plazmidowego np. przez elektroforezę. 8. 5. 1. 1 Klonowanie genu bakteryjnego Interesujący nas gen musi być najpierw wyosobniony spośród innych genów w genomie. Możemy rozpocząć tę pracę od skonstruowania biblioteki genomowej danego gatunku (rys. 8. 7), a następnie odszukać w bibliotece odpowiedni gen. Poszukiwanie odpowiedniego genu (tzw. screening) jest procesem selekcji. Załóżmy np., że poszukiwany gen koduje enzym niezbędny do syntezy histydyny. Musimy sobie uzmysłowić, że ten szczególny, interesujący nas gen występuje w niewielkiej tylko frakcji cząsteczek składających się na daną bibliotekę (rys. 8. 7). Jak więc możemy wyizolować zrekombinowany wektor zawierający ten właśnie gen? Po pierwsze zastosujemy transformację (sekcja 8. 4. 1) w celu wprowadzenia całego zbioru (biblioteki) zrekombinowanych cząsteczek do komórek zmutowanych bakterii, z uszkodzonym genem, którego poszukujemy (np. niezdolnych do syntetyzowania histydyny). Te auksotrofy histydynowe (sekcja 8. 1. 2) nie będą rosły na podłożu bez histydyny, jednakże mutant transformowany cząsteczką wektorową z funkcjonalnym genem będzie zdolny do wzrostu i tworzenia kolonii na takim podłożu. Te wyselekcjonowane stransformowane mutanty są ponownie rozsiewane na minimalnym podłożu bez histydyny, 178

Najpierw z populacji bakterii danego szczepu izolowany jest DNA chromosomowy, a następnie poddawany działaniu odpowiedniego enzymu restrykcyjnego (sekcja 7. 4). Enzym wprowadza cięcia w specyficznych miejscach izolowanych chromosomów (w lewej górnej części), tworząc wiele fragmentów o różnej wielkości (w środkowej części na lewo). Populacja określonego plazmidu (w górnej prawej części) dostarcza cząsteczek wektorowych. Dobieramy taki plazmid, który może być cięty przez taki sam enzym jak zastosowany do cięcia chromosomu, jednakże takie miejsce musi on mieć tylko jedno, tak aby cięcie jedynie zlinearyzowało cząsteczkę wektora (w środkowej części na prawo). Chromosomowe fragmenty i zlinearyzowany plazmid są mieszane w obecności ATP i ligazy DNA, enzymu, który katalizuje wytwarzanie wiązań fosfodiestrowych (rys. 7. 4). Pewne plazmidy (i fragmenty) mogą po prostu ulec recyrkularyzacji poprzez swoje lepkie końce, lecz koncentracja obu rodzajów fragmentów jest tak dobierana, aby plazmidy ulegały połączeniu z fragmentami — w sposób przypadkowy, poprzez lepkie końce (rys. 8. 6), z wytworzeniem dużej liczby cząsteczek zrekombinowanych, zawierających plazmid połączony z którymś z fragmentów chromosomu. (Wiązanie plazmidu z fragmentem może być wspomagane sposobem opisanym pod hasłem ligacja w sekcji 8. 5. 1. 6. ) Ponieważ fragmenty są różnych rozmiarów, również i zrekombinowane plazmidy będą różnej wielkości (dół schematu). Wspólnie zbiór cząsteczek zrekombinowanych plazmidów będzie zawierał cały DNA chromosomu, stanowiąc tzw. bibliotekę genomową. Z wykorzystaniem transformacji (sekcja 8. 4. 1) biblioteka może być wprowadzona do populacji bakterii — w ten sposób, że różne komórki otrzymają różne fragmenty chromosomu. Komórki te mogą następnie tworzyć indywidualne kolonie.

aby potwierdzić ich zdolność do wzrostu, co jest wskazaniem, że niosą one wektor zawierający poszukiwany gen. Musimy dodatkowo sprawdzić, czy wzrost ten nie jest spowodowany mutacją powrotną auksotrofa do prototrofii (sekcja 8. 1. 3). Komórki z potwierdzoną obecnością określonego genu przesiewa 179

się do podłoża płynnego w celu namnożenia. Po wyizolowaniu z nich plazmidowego DNA, fragment niosący sklonowany gen może być izolowany w sposób wskazany w sekcji 8. 5. 1 Alternatywną metodą odszukania genu jest zastosowanie hybrydyzacji kolonijnej (patrz niżej).

8. 5. 1. 2 Klonowanie genów eukariotycznych w bakteriach Genomy eukariotyczne są znacznie większe niż prokariotyczne, tak że do tworzenia biblioteki genomowej muszą być cięte na stosunkowo duże fragmenty restrykcyjne, gdyż inaczej powstawałoby do sklonowania zbyt wiele fragmentów. Z kolei jednak, klonowanie tych większych fragmentów DNA wymaga zastosowania innego typu wektorów (sekcja 8. 5. 1. 5). Kolejny problem stwarza to, iż geny eukariotyczne zawierają tzw. introny, sekwencje, które nie kodują żadnej części produktu genu, lecz przerywają ciągłość sekwencji kodującej. W komórce eukariotycznej każdy odcinek mRNA, który był transkrybowany z intronu, jest później usuwany, tworząc dojrzały mRNA (rys. 8. 8), czyli nieprzerwaną kodującą sekwencję genu, ulegającą następnie translacji. Klonowanie genów z intronami nie stanowiłoby problemu, gdyby naszym celem było jedynie określenie sekwencji genu in vivo. Jednak gdyby takie geny (a nie dojrzałe cząsteczki mRNA) miały podlegać transkrypcji, nie mógłby powstać normalny produkt. Jednakże, potrafimy in vivo odtworzyć sekwencję DNA genu na podstawie sekwencji jego dojrzałego mRNA. Ta właśnie kopia, tzw. cDNA (ang. copy DNA lub complementary DNA), może następnie być sklonowana. Biblioteki cDNA. Klonowanie genu eukariotycznego rozpoczynamy od konstruowania biblioteki cDNA danego gatunku. Najpierw z komórek wyrażających interesujący nas gen izolujemy całkowity RNA (ang. total RNA). Całkowity RNA zawiera, między innymi, dojrzały mRNA wszystkich aktywnych (aktualnie wyrażanych genów). Wydawałoby się, że to ogromna ilość, ale ponieważ w określonym czasie ekspresji podlega tylko około 1% genów komórki, ograniczona jest jednocześnie liczba klonów, które musimy przebadać w celu znalezienia tego nas interesującego.

180

Wyizolowanie mRNA spośród całkowitego RNA jest ułatwione dzięki temu, że przez większość eukariotycznych mRNA ma poliadenylowany „ogon" (A-A-A-A... ) przy końcu 3' cząsteczki (patrz rys. 8. 9). Ogon ten, poli(A), wiąże się w wyniku komplementarnego parowania zasad z syntetyczną, oligo(dT)-celulozą, czyli oligonukleotydem (T-T-T-T... ) połączonym z celulozą, tak że mRNA może być wyizolowany przez zastosowanie chromatografii powinowactwa (sekcja (8. 5. 1. 4). mRNA można też izolować metodami magnetycznymi (sekcja 14. 6. 1). Dysponując wyizolowanym mRNA możemy przekształcić go (in vitro) w odpowiadający mu cDNA. W jednej z metod krótka syntetyczna cząsteczka oligo(dT) stosowana jest jako starter, który wiąże się do ogona poli(A) na cząsteczce mRNA, pozwalając enzymowi zwanemu odwrotną transkryptazą syntetyzować nić cDNA na matrycy mRNA. (Polimeraza I DNA nie jest wykorzystywana w tym przypadku, gdyż jest mało wydajna na matrycy RNA [Ricchetti i Buc (1993) EMBO Journal 12: 387-396]. ); mRNA jest następnie usuwany (z użyciem RNazy H) i zastępowany przez komplementarną nić DNA, z wytworzeniem ds cDNA. Do każdej cząsteczki mogą być następnie dodane lepkie końce (sekcja 8. 5. 1. 6) i biblioteka cDNA jest gotowa do włączenia do wektora i klonowania w bakteriach. Otrzymany tą metodą cDNA jest czasami niekompletną kopią mRNA. Pełnej długości cDNA może być otrzymywany metodą Okayamy-Berga (rys. 8. 9), która jest szczególnie użyteczna, gdy klonowany cDNA ma następnie podlegać ekspresjii. Poszukiwanie określonych genów w bibliotekach (screening). Kolonie, które powstały z komórek transformowaych odpowiednią biblioteką genów (genomową lub cDNA), mogą być następnie analizowane w celu identyfikacji określonego genu. Identyfikacja genu jest łatwiejsza, jeśli może on w gospodarzu bakteryjnym ulegać ekspresji. Oczywiście bakteryjne geny zwykle mogą w tej sytuacji ulegać ekspresji (patrz sekcja 8. 5. 1. 1). Jednakże, ekspresji mogą podlegać także pewne cDNA, jeżeli wektor dostarcza niezbędnych elementów kontrolnych — jak np. promotor rozpoznawany przez bakteryjną polimerazę RNA (tak że syntetyzowany może być mRNA, a następnie białko). Wektor, który jest wyposażony w takie elementy regulacyjne, nazywany jest wektorem ekspresyjnym (patrz dalej). cDNA biblioteka ekspresyjna jest biblioteką cząsteczek cDNA sklonowanych w wektorze ekspresyjnym. Kiedy komórki zawierające takie wektory tworzą kolonie, czasem można zidentyfikować kolonię wyrażającą cDNA metodami przedstawionymi na rysunku 8. 10. Jeżeli sklonowany gen lub cDNA nie jest wyrażany w bakteryjnym gospodarzu, możemy przeszukiwanie prowadzić innymi metodami. Hybrydyzacja kolonijna zaczyna się (patrz rys. 8. 10) wykonaniem replik kolonii na filtr nitrocelulozowy z podłoża na płytce. Kolonie na filtrze poddaje się lizie, uwolniony z nich DNA jest denaturowany (czyli jego nici są rozdzielane) i jednoniciowy DNA jest wiązany do powierzchni filtra. Znakowana sonda (ang. probe) (sekcja 8. 5. 3), która może się wiązać ze specyficzną sekwencją w poszukiwanym genie lub cDNA, jest następnie dodawana do filtra i po odmyciu niezwiązanej sondy, znacznik sondy identyfikuje poszukiwany DNA na filtrze, a jednocześnie kolo181

Dojrzały, eukariotyczny mRNA (w lewej górnej części) pokazany jest z typowym poliadenylowym „ogonem" na końcu 3'. Określony plazmid (w górnej prawej części) został przecięty (czyli zlinearyzowany), a do jego końca 3' dodano (in vitro) „ogon" oligo(dT) (patrz dodawanie końców, „tailing", sekcja 8. 5. 1. 6). Pokazany jest ogon tylko na jednym końcu cząsteczki. mRNA i plazmid oddziałują między sobą (środkowa część na prawo) przez komplementarne parowanie zasad między „ogonami" A i T. „Ogon" Τ działa jako starter, umożliwiając syntezę, z udziałem odwrotnej transkryptazy, nici DNA (linia przerywana) na matrycy mRNA. Do końca 3' nowej nici dodawany jest ogon oligo(dC); ponieważ tylko kompletna nowa nić może być wydłużana w ten sposób, ogon ten umożliwia następującą potem selekcję kompletnych, pełnej długości, cząsteczek cDNA. Następnie plazmid jest cięty przez HmdIII, pozostawiając jeden „lepki koniec" — wystającą sekwencję 5'-AGCT. Specjalnie skonstruowany fragment (środkowa część na lewo), razem z ligazą, mogą teraz cyrkularyzować plazmid, po czym enzym, RNazaH, usuwa nić mRNA, a polimeraza DNA syntetyzuje na jej miejsce nić DNA — kończąc w ten sposób (z pomocą ligazy) tworzenie dsDNA zrekombinowanego plazmidu (dół), który jest teraz gotowy do wprowadzenia do komórki bakteryjnej w celu klonowania. Zauważ, że metoda ta zapewnia wbudowanie cDNA do plazmidu w znanej orientacji (porównaj rys. 8. 6, gdzie DNA mógł być wbudowywany w obu orientacjach); jest to ważne, gdy zrekombinowany plazmid koduje funkcje kontrolne potrzebne do ekspresji genu (patrz wektory, sekcja 8. 5. 1. 5).

nię na oryginalnej płytce. Na przykład znacznik radioaktywny może być wykryty w sposób przedstawiony na rysunku 8. 10. Jak wybieramy sekwencję nukleotydów odpowiednią do sporządzenia sondy? Jeżeli znamy sekwencję aminokwasową interesującego nas białka, możemy „pracować od tyłu", dedukując możliwą sekwencję dojrzałego mRNA (i oczywiście DNA) na podstawie sekwencji białkowej; powinniśmy wybrać krótką sekwencję charakteryzującą się czymś szczególnym, np. zawierającą mało powszechne aminokwasy (jak metionina), a następnie posługując się kodem genetycznym (tab. 7. 2) zaplanować odpowiednią sekwencję mRNA. Ponieważ 182

wiele aminokwasów jest kodowanych przez więcej niż jeden kodon (tab. 7. 2), wskazane jest zaprojektowanie więcej niż jednej sekwencji sondy., np. Sekwencja aminokwasowa: Odpowiadający mRNA: Odpowiadający DNA: Odpowiadający mRNA: Odpowiadający DNA:

Lys AAA TTC AAG TTC

-Trp -Met -Lys -Glu -UGG -AUG -AAA -GAG -ACC -TAC -TTT -CTC -UGG -AUG -AAG -GAA -ACC -TAC -TTC -CTT

-His -Phe -CAU -UUC -GTA -AAG -CAC -UUU -GTG -AAA

Biblioteka cDNA, w wektorze ekspresyjnym (sekcja 8. 5. 1. 2), została wprowadzona do populacji bakterii, które następnie wytworzyły na płytkach pojedyncze kolonie. Naszym zadaniem jest teraz odnalezienie kolonii, w której cDNA koduje (i wyraża) odpowiednie, interesujące nas białko. Na kolonie zawierające cDNA (w lewej górnej części) nakładamy filtr nitrocelulozowy, po podniesieniu filtru pozostaje na nim replika (lustrzane odbicie) kolonii (w prawej górnej części). Komórki na filtrze poddane są lizie, a białka z tych komórek (łącznie z kodowanymi przez cDNA) pozostają przytwierdzone do filtra (w środkowej prawej części). Filtr jest następnie poddawany działaniu przeciwciał (λ) specyficznych wobec odpowiedniego białka (w środkowej lewej części); przeciwciała wiążą się z tym białkiem (obecnym w jednej z kolonii). Niezwiązane przeciwciała są wypłukiwane, a filtr traktowany białkiem A — białko (otrzymane ze Staphylococcus aureus), które wiąże się do przeciwciała; niezwiązane białko A jest także wypłukiwane, pozostawiając tylko białko A (małe kropki) związane do specyficznego kompleksu przeciwciało-białko (dolna prawa strona). Białko A przed użyciem jest znakowane radioaktywnie, tak że jego obecność można wykryć autoradiograficznie; wymaga to eksponowania filtru wobec kliszy fotograficznej, a potem wywołania kliszy. Po wywołaniu kliszy (w dolnej prawej części) możemy zidentyfikować na oryginalnej płytce kolonię, która zawiera interesujący nas cDNA. Kolonię tę można użyć jako inokulum do wyhodowania większej liczby identycznych komórek.

183

Każda z zaplanowanych sekwencji DNA może być użyta, w oddzielnych eksperymentach, jako sonda. (Jednakże, zauważmy, że na zależność między białkiem a kodującą go sekwencją DNA mogą mieć wpływ takie czynniki jak potranskrypcyjna i potranslacyjna modyfikacja, np. usunięcie odpowiednio intronów lub sekwencji sygnalnych, tak więc nie zawsze możemy precyzyjnie określić kodującą sekwencję dojrzałego białka z danych aminokwasowych. 8. 5. 1. 3 Precyzyjne cięcie DNA

DNA może być cięty precyzyjnie i w przewidywalny sposób przez endonukleazy restrykcyjne typu II (sekcja 7. 4), które są enzymami tnącymi w obrębie (lub bardzo blisko) specyficznej rozpoznawanej przez siebie sekwencji nukleotydowej (tab. 8. 1). Wiele RE (ang. restriction endonuclease) typu II powoduje tworzenie przesuniętych końców, tworząc „lepkie końce" (ang. sticky ends), lecz pewne (np.

184

ΗραI) tną równo poprzez obie nici tworząc „tępe końce" (ang. blunt ends) (rys. 8. 11). Sekwencja 8-nukleotydowa rozpoznawana przez NotI, która nie jest zbyt powszechna w genomach, powoduje, że cięcie tym enzymem nie następuje często. Dlatego jest on stosowany do otrzymywania dużych fragmentów (o długości większej niż milion pz), co jest przydatne przy tworzeniu bibliotek genomowych (sekcja 8. 5. 1. 2). Na aktywność enzymów restrykcyjnych ma wpływ pH, elektrolity, a także typ ciętego DNA (liniowe/superzwinięte). Specyficzność cięcia pewnych ER może być zmniejszona przez takie czynniki, jak: niewłaściwe stężenie enzymu, stosowanie nieodpowiednich buforów i stężenie glicerolu większe niż 5% m/v. Tak zwana aktywność z gwiazdką (*) (ang. star activity) odnosi się do zmiany lub redukcji specyficzności cięcia pewnych endonukleaz restrykcyjnych (np. BamHI, Sali) w nieoptymalnych warunkach reakcji. Endonukleazy restrykcyjne pochodzące z różnych gatunków i rozpoznające te same sekwencje nazywamy izoschizomerami. 8. 5. 1. 4 Izolacja i oczyszczanie kwasów nukleinowych Kwasy nukleinowe do badań in vitro są otrzymywane przez lizę komórek i oddzielenie od siebie różnych form DNA i RNA. Materiałem, od którego rozpoczynamy pracę, są kolonie lub masa komórek, czyli osad otrzymany przez odwirowanie hodowli bulionowej; sedymentacja komórek hodowli bulionowej wymaga wirowania przez 20 min przy 5000 g. U bakterii gramdodatnich ściana komórkowa może być zniszczona przez działanie lizozymem (patrz rys. 2. 7). (Dla Staphylococcus aureus może być użyta lizostafina, enzym, który przecina oligopeptydowe połączenia między szkieletowymi łańcuchami peptydoglikanu. ) U gramujemnych bakterii błona zewnętrzna (sekcja 2. 2. 9. 2) jest zwykle niszczona przez chelatowanie stabilizujących ją kationów za pomocą zbuforowanego EDTA, dzięki czemu lizozym może łatwo

Przesunięte cięcie (w lewej górnej części) przez HmdIII (tab. 8. 1) utworzyło „lepkie końce", czyli dwa 5'-AGCT wystające końce; te (komplementarne) wystające końce mogą się ponownie połączyć (tzn. odtworzyć dupleks) lub każdy z nich może utworzyć pary z komplementarnym wystającym końcem innej cząsteczki. (Zauważ, że pewne enzymy restrykcyjne, np. PstI, tworzą 3' wystające końce, podczas gdy inne tworzą 5' wystające końce). „Tępe końce" (w prawej górnej części) są tworzone przez np. HpaI (tab. 8. 1); do tępych końców można dołączyć linkery lub homopolimerowe ogony (sekcja 8. 5. 1. 6). Niżej: miejsce cięcia BaeI [Sears i wsp. (1996) NAR 24: 3590-3592] — jest to jeden z rodziny enzymów, które tną z obu stron rozpoznawanej sekwencji (patrz sekcja 7. 4); miejsce rozpoznawane przez BaeI jest podkreślone w górnej nici (N = dowolny nukleotyd), a strzałki wskazują miejsca cięcia. 185

oddziaływać na Peptydoglikan. (EDTA hamuje także nukleazy w lizacie komórkowym, działając tym samym ochronnie na kwasy nukleinowe. ) Dodanie sacharozy (3 M) zapobiega gwałtownej lizie, która mogłaby nastąpić w wyniku nagłego szoku osmotycznego. Często potrzebujemy izolować z bakterii, np. podczas klonowania, tylko plazmidowy DNA. Spośród różnych dostępnych metod, szybka i prosta procedura, dająca dobrze oczyszczony plazmidowy DNA, jest opisana na rysunku 8. 12; polega ona na łagodnej, kontrolowanej lizie komórek, podczas której błona cytoplazmatyczna jest rozrywana przy pomocy SDS (detergent). Wirowanie równowagowe (przy odpowiednich wartościach g) może oddzielić makrocząsteczki o różnych gęstościach. Próbka jest nawarstwiana na powierzchnię roztworu, którego stężenie, i co za tym idzie gęstość, wzrasta wraz z głębokością, czyli od menisku górnego w kierunku dna probówki (jest to tzw. gradient gęstości). Wirowanie do stanu równowagi ustawia każdą cząsteczkę w próbce w tej części gradientu, która odpowiada jej własnej gęstości. W ten sposób np. całkowity RNA (sekcja 8. 5. 1. 2) może być oddzielony od DNA i od białek w gradiencie trifluorooctanu cezu; związek ten hamuje także RNazę (sekcja 7. 6. 1) w lizacie, czyli pomaga chronić izolowany RNA. Różne formy DNA mogą być rozdzielone w gradiencie chlorku cezu (patrz rys. 8. 13). Chromatografia. Różne cząsteczki w próbce mogą być rozdzielone w wyniku przepuszczania jej przez odpowiednie stacjonarne podłoże, które zatrzymuje lub przepuszcza cząsteczki zależnie od ich fizycznych właściwości. Chromatografia powinowactwa wykorzystuje specyficzność wiązania między pewnymi rodzajami cząsteczek — np. ogona A-A-A-A-... eukariotycznego mRNA w próbce i T-T-T-T-... oligo(dT)-celulozy w stałym wypełnieniu kolumny (patrz sekcja 8. 5. 1. 2). Chromatografia w tzw. kolumnach zwirowywanych (ang. spun column chromatography) wykorzystuje siłę odśrodkową (np. 300-400 g), aby przyspieszyć przejście próbki przez kolumnę z np. ściśle upakowanych drobnych cząstek wypełniacza. Rys. 8. 12 Zarys protokołu izolacji plazmidów z bakterii (np. E. coli) z użyciem zestawu Qiagen® (Qiagen® plasmid mini kit); używając go można izolować do 20 μg plazmidowego DNA (inny, większy, zestaw pozwala izolować nawet do 10 mg DNA) Osad bakterii jest zawieszany w buforze Tris-EDTA zawierającym RNazę A; u bakterii gramujemnych Tris-EDTA narusza błonę zewnętrzną. Po tym etapie przeprowadzana jest kontrolowana liza alkaliczna przy użyciu NaOH i detergentu SDS (dodecylosiarczan sodu). SDS niszczy błonę cytoplazmatyczną, uwalniając rozpuszczalne składniki komórki (np. białka, RNA, plazmidy), NaOH denaturuje plazmidowy (i chromosomowy) DNA oraz białka. RNaza A trawi zanieczyszczający RNA. Czas lizy musi być zoptymalizowany, tak aby pozwolić na maksymalne uwolnienie plazmidów z komórki bez uwalniania chromosomowego DNA i nie dopuścić do nieodwracalnej denaturacji plazmidów (gdyż zdenaturowane plazmidy są oporne na trawienie enzymami restrykcyjnymi). Lizat jest następnie neutralizowany schłodzonym buforem o dużym stężeniu soli (i pH 5, 5), wytrącającym SDS; kompleksy soli z SDS wychwytują białka itp., podczas gdy plazmidy ulegają renaturacji i pozostają w roztworze. Łagodne mieszanie zapewnia całkowitą precypitację SDS; należy natomiast unikać gwałtownego mieszania, aby nie dopuścić do pofragmentowania chromosomu i zanieczyszczenia supernatantu fragmentami chromosomowego DNA. Przeprowadzane jest następnie wirowanie (przy np. 16 000 g) w celu otrzymania klarownego (ang. cleared) lizatu (zawierającego plazmidy).

186

Klarowny lizat jest filtrowany przez kolumienkę Qiagen zawierającą jonowymienną żywicę (ang. resin) (a). Żywica ta została przygotowana specjalnie do izolowania kwasów nukleinowych; ma ona + dużą gęstość dodatnich grup anionowymiennych (odległość między sąsiadującymi N wynosi tylko 5A), co stwarza idealne warunki do wiązania kwasów nukleinowych. Ponadto, różne typy cząsteczek wymywają się przy znacznie różniących się stężeniach soli — patrz profile elucji (b). Pozwala to na stopniowa elucję i wydajne rozdzielanie cząsteczek z użyciem buforów o różnym stężeniu soli. Przy określonym (małym) stężeniu elektrolitu i pH klarownego lizatu do złoża wiąże się tylko plazmidowy DNA — zdegradowany RNA, białka itp. nie są zatrzymywane. Złoże jest przemywane buforem (zawierającym 1 Μ NaCl, pH 7), aby wyeliminować zanieczyszczenia (oraz usunąć białka związane z DNA). DNA plazmidowy jest następnie eluowany buforem zawierającym 1, 25 Μ NaCl, pH 8, 5). DNA wytrąca się (w temperaturze pokojowej) izopropanolem, i odwirowuje, a supernatant usuwa się; po przemyciu 70% etanolem, DNA jest suszony w strumieniu powietrza (5 min) i zawieszany w buforze. Schematy zamieszczono dzięki uprzejmości Qiagen GmbH, Hilden, Germany.

187

DNA izolowany ze zlizowanych bakterii może zawierać (góra) liniowe fragmenty chromosomów; koliste plazmidy, w których jedna nić została przecięta (forma ocDNA), i koliste superhelikalnie zwinięte cząsteczki (cccDNA) plazmidów. Jeżeli DNA jest potraktowany barwnikiem — bromkiem etydyny, cząsteczki barwnika mają tendencję do wbudowywania się między dwie przylegające pary zasad, co powoduje wydłużanie szkieletu fosforanowo-cukrowego. To zniekształcenie helisy zmniejsza gęstość DNA. Cząsteczki liniowe i koliste nacięte pobierają więcej barwnika niż cząsteczki superhelikalne, przez co ich gęstość zmniejsza się bardziej niż cząsteczek superhelikalnych; dzięki temu, jeżeli DNA traktowany barwnikiem jest poddawany równowagowemu ultrawirowaniu (ang. isopycnic centrifugation) (sekcja 8. 5. 1. 4) w gradiencie chlorku cezu, superhelikalny DNA tworzy oddzielne pasmo poniżej pasma zawierającego mniej gęste liniowe i nacięte koliste cząsteczki (lewa strona). Inna metoda, wykorzystująca tzw. chromatografię w kolumnach zwirowywanych (ang. spun column chromatography) (sekcja 8. 5. 1. 4), jest szybsza i łatwiejsza. Wysokie pH wywołuje rozdzielenie nici (denaturację) DNA; po neutralizacji, renaturacja (powrót do formy dwuniciowej) jest bardziej wydajna w superhelikalnych cząsteczkach niż w liniowych i kolistych naciętych — tak więc kolumna, która silniej wiąże jednoniciowy DNA, spowoduje, że w wypływie pojawią się tylko superhelikalnie zwinięte cząsteczki DNA plazmidowego (cccDNA) (prawa). Obie metody pozwalają izolować cccDNA w miligramowych ilościach.

Elektroforeza może rozdzielić zmieszane, naładowane elektrycznie cząsteczki. Do elektroforezy w żelu próbkę umieszcza się w tzw. studzience (kieszonce) na jednym końcu żelu, a przyłożenie napięcia wywołuje przemieszczanie się cząsteczek poprzez żel w kierunku anody (+) lub katody (-), zależnie od ładunku cząsteczki. Cząsteczki małe i/lub niosące wysoki ładunek zwykle poruszają się szybciej niż duże i/lub słabo naładowane. Żele poliakryloamidowe, mające gęste usieciowanie, używa się do rozdzielania małych fragmentów DNA lub RNA (o długości około 5-500 nukleotydów); 188

żele agarozowe stosuje się natomiast do rozdzielania większych fragmentów DNA (o długości około 500-500 000 nukleotydów). Cząsteczki lokują się w żelu w odrębnych strefach (zgodnie z wielkością), które po wybarwieniu in situ ujawniają się jako prążki lub plamy. Mogą one być w razie potrzeby przenoszone na odpowiednie (podobne do papieru) membrany metodą Southerna (ang. Southern blotting), patrz rysunek 8. 14, lub przez elektrotransfer.

Wewnątrz żelu fragmenty DNA są rozdzielane na określone prążki, zależnie od wielkości, w wyniku przeprowadzonej elektroforezy (sekcja 8. 5. 1. 4). Fragmenty są najpierw denaturowane (przekształcane w formy jednoniciowe) poprzez działanie na żel zasadami, następnie żel jest przenoszony do neutralnego buforu i formowany jest zestaw do przenoszenia (jak pokazano na schemacie). W wyniku działania sił kapilarnych neutralny roztwór w dolnym naczyniu podsiąka do żelu przez porowaty materiał (knot, ang. wick), przechodzi przez żel oraz przepuszczalną nitrocelulozę do stosu papierowych ręczników lub bibuły. Ten skierowany ku górze strumień płynu niesie ze sobą fragmenty DNA z żelu do arkusza nitrocelulozy. (Ułożenie fragmentów DNA na arkuszu nitrocelulozy odpowiada ich ułożeniu na żelu. ) Arkusz nitrocelulozy jest następnie zapiekany w temp. 70°C w próżni, co powoduje przytwierdzenie DNA do jego powierzchni. Fragmenty DNA mogą być następnie analizowane np. przez poddawanie działaniu specyficznych, znakowanych sond (sekcja 8. 5. 3). Wiązanie się fragmentu z sondą (hybrydyzacja typu Southerna) jest wykrywane dzięki znacznikowi niesionemu przez sondę — identyfikuje ona bowiem określoną sekwencję danego fragmentu. Zamiast błony nitrocelulozowej można używać specjalnego papieru, zawierającego 2-aminofenylotrieter (tzw. papier-AFT). Przed użyciem APT jest chemicznie modyfikowany przez działanie diazopochodną, tak aby jednoniciowe kwasy nukleinowe wiązały się z nim kowalencyjnie; nie jest wtedy potrzebne wiązanie DNA poprzez zapiekanie. Ten (silniejszy) sposób wiązania fragmentu DNA z podłożem pozwala na usuwanie związanej sondy i ponowne analizowanie badanego materiału z użyciem innej sondy. Transfer metodą „Nothern blotting" odnosi się do przenoszenia fragmentów RNA z żelu na odpowiednią błonę. Transfer metodą „Western blotting" odnosi się do przenoszenia białek na błonę. Transfer metodą „Southwestern blotting": patrz sekcja 8. 5. 12. 1. „Elektrotransfer" jest szybszą metodą transferu, w której do przenoszenia materiału na odpowiednie błony wykorzystuje się siły pola elektrycznego zamiast sił kapilarnych. „Immunotransfer" odnosi się do przenoszenia białek na odpowiednią błonę w celu poddania ich działaniu znakowanych przeciwciał. Związanie przeciwciała z odpowiednim białkiem wskazuje na jego antygenowy charakter.

Elektroforeza w zmiennym polu elektrycznym (PFGE (ang. pulse-field gel electrophoresis). Standardowa elektroforeza może rozdzielać fragmenty o długości do około 20 000 pz. PFGE rozdziela cząsteczki o długości nawet ponad 10 milionów par zasad. W tym typie elektroforezy używa się dwóch pól elektry-

189

cznych, ustawionych do siebie pod kątem, a wypadkowe tempo migracji określonej cząsteczki zależy od tempa, w jakim cząsteczka ta może zmienić swój kierunek ruchu po zmianie kierunku przepływu prądu. [Użytecznym źródłem informacji jest: Pulsed Field Gel Electrophoresis (Birren, B) Academic Press, 1993; ISBN 0 12 101290 5. ] 8. 5. 1. 5 Wektory

Wektory służą do wprowadzania DNA do komórek (sekcja 8. 5. 1). Jest bardzo pomocne, jeżeli wektor „sygnalizuje" swoją obecność w komórce. Na przykład kiedy populacja bakterii jest transformowana biblioteką genów (sekcja 8. 5. 1. 1), niektóre komórki mogą nie otrzymać wektora, z kolei pewne wektory mogą nie posiadać insertu — co wynika z tego, że wektor uległ recyrkularyzacji bez wbudowania obcego fragmentu DNA (patrz rys. 8. 7). Dlatego też powinniśmy dysponować sposobem potwierdzenia pobrania wektora z insertem w celu uniknięcia pewnych wątpliwości zasygnalizowanych w sekcji 8. 5. 1. 1. W jaki sposób możemy zidentyfikować kolonie zawierające wektor z insertem? Pewne wektory zawierają geny oporności na antybiotyki. Geny te mogą sygnalizować swoją obecność (i obecność insertu) przez ekspresję (lub jej brak) w komórce gospodarza; przykład przedstawiono na rysunku 8. 15. Inne wektory mogą zawierać gen kodujący wytwarzanie β-galaktozydazy — enzymu, który rozszczepia laktozę (sekcja 7. 8. 1. 1) i może tworzyć niebieskozielony produkt przez rozszczepienie Xgal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktozyd); gdy konstruujemy bibliotekę (rys. 8. 7), możemy spowodować wbudowywanie fragmentów do tego genu (inaktywując go) po prostu przez wybranie miejsca cięcia enzymem restrykcyjnym w jego obrębie. Następnie kolonie, o których wiemy, że zawierają wektor (np. na podstawie wyrażania oporności na antybiotyk), mogą sygnalizować obecność bądź brak insertu na podłożu zawierającym Xgal; kiedy wektor zawiera insert, powstają białe kolonie (gen kodujący β-galaktozydazę jest zinaktywawany przez insert), natomiast gdy wektor insertu nie zawiera niosące, go komórki tworzą kolonie niebieskozielone (β-galaktozydaza jest obecna). Ten system indykatorowy jest oczywiście użyteczny tylko w przypadku, kiedy komórki jako takie nie wytwarzają β-galaktozydazy. Klonowanie dużych fragmentów. Duże fragmenty DNA (sekcja 8. 5. 1. 2) klonowane w wektorach plazmidowych tworzyłyby bardzo duże cząsteczki, które nie byłyby wydajne w transformacji (sekcja 8. 4. 1. 1). Możemy wówczas zamiast plazmidowych, użyć wektory fagowe (fagi: rozdz. 9), które wstrzykują swój DNA do komórki. W tym przypadku, fragmenty przeznaczone do klonowania są włączane do genomu fagowego i ulegają replikacji łącznie z nim wewnątrz komórki. Tak zwane wektory wymienne (ang. replacement vector) są konstruowane przez usunięcie części DNA fagowego, który nie jest niezbędny do jego namnażania i zastąpienie go przez fragment przeznaczony do klonowania. Tak więc, w wektorze pochodzącym od faga λ może być klonowany fragment o wielkości około 20 kpz, podczas gdy w plazmidzie pBR322 — fragment nie większy niż 10 kpz. Jeszcze większe fragmenty (nawet do 40 kpz) mogą być klonowane w kosmidach (rys. 8. 15). 190

Wektory plazmidowe są zazwyczaj małe (w zakresie wielkości 3-5 kpz), ponieważ transformacja z użyciem małych plazmidów jest bardziej wydajna i są one mniej wrażliwe na uszkodzenia podczas izolacji z komórek. Pokazano różne miejsca restrykcyjne (z podaniem ich odległości, w pz, w kierunku zgodnym z kierunkiem ruchu wskazówek zegara, od góry). Każdy pokazany enzym restrykcyjny tnie pBR322 tylko raz (powodując linearyzację cząsteczki). Różnorodność miejsc restrykcyjnych pozwala na dużą dowolność konstruowania zrekombinowanych cząsteczek z użyciem DNA pochodzącego z różnych źródeł. Obecność genów kodujących oporność na ampicylinę i tetracyklinę (transkrybowanych w przeciwnych kierunkach, jak wskazują strzałki) pozwala stwierdzić obecność plazmidu w komórce oraz obecność insertu w plazmidzie. Tak więc, jeżeli konstruując bibliotekę z zastosowaniem pBR322 użyjemy enzym BamHI (rys. 8. 7), fragmenty będą włączane w obrębie genów kodujących oporność na tetracyklinę, powodując ich inaktywację, podczas gdy geny odpowiedzialne za oporność na ampicylinę pozostaną aktywne. A więc każda bakteria zawierająca plazmid może utworzyć kolonie na podłożu z ampicyliną; jeżeli kolonie te będą następnie przereplikowane na podłoże z tetracykliną, komórki zawierające wektor z insertem nie utworzą kolonii, ze względu na inaktywację genów oporności na tetracyklinę (komórki zawierające zrecyrkularyzowany wektor wyrosną na obu podłożach). Wektor do klonowania musi oczywiście posiadać origin replikacji (sekcja 7. 3). W pBR322 origin replikacji (ori) pochodzi z plazmidu replikującego się pod zrelaksowaną kontrolą (sekcja 7. 3. 1. 1). Tak więc pBR322 ma zdolność do replikacji w nierosnących (zahamowanych przez chloramfenikol) komórkach bakteryjnych. Efekt ten jest wykorzystywany do tzw. amplifikacji liczby kopii wektora, nawet do wielu tysięcy na komórkę. Schemat wektora pBR322 dzięki uprzejmości Pharmacia Biotech Inc., Molecular Biology Reagent Division, Milwaukee, Wisconsin, USA.

Fragmenty osiągające długość nawet 300 kpz mogą być klonowane w tzw. sztucznych chromosomach bakteryjnych, (ang. bacterial artificial chromosomes, BAC), dużych kolistych cząsteczkach wektorowych skonstruowanych w oparciu o plazmid F, które replikują się w E. coli. Pobieranie takich ogromnych cząsteczek przez komórki gospodarza następuje przy zastosowaniu elektroporacji (sekcja 8. 4. 1. 2).

191

Kosmid (góra) jest małym plazmidem, do którego wbudowano miejsce cos (czarny kwadrat) faga λ (patrz rys. 9. 2); cos umożliwia zapakowanie plazmidu z insertem (in vitro) do główki faga λ. Kosmidy są przecinane w pojedynczym miejscu restrykcyjnym, liniowe cząsteczki są mieszane w obecności ligazy z fragmentami DNA (przerywane linie) ciętymi tym samym enzymem. Kosmidy i fragmenty DNA łączą się przypadkowo, a w pewnych przypadkach fragmenty DNA mogą być otoczone dwoma kosmidami (środek); jeżeli w takiej cząsteczce odległość od jednego do drugiego miejsca cos wynosi około 40-50 kpz, to sekwencja ta jest odpowiedniej wielkości, aby mogła być zapakowana do główki faga λ. Enzymatyczne cięcie w miejscu cos (strzałka) powoduje powstanie lepkich końców i w obecności składników faga następuje pakowanie rekombinacyjnych cząsteczek. Cząsteczki po dodaniu ogonka mogą wstrzykiwać zrekombinowany DNA do odpowiedniej bakterii (tak jak zwykły fag). DNA wprowadzony w ten sposób do komórki cyrkularyzuje z wykorzystaniem miejsc cos i replikuje się tak jak plazmid. Jego obecność w komórce można wykryć np. dzięki ekspresji, kodowanych przez plazmid, genów oporności na antybiotyki. Poszukiwanie specyficznych sekwencji prowadzi się w sposób podobny do stosowanego do przeszukiwaniu bibliotek w wektorach plazmidowych.

Sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC, ang. yeast artificial chromosomes) mogą nieść insert o wielkości nawet 2000 kpz. Te liniowe cząsteczki wektorowe, konstruowane in vitro, zawierają części drożdżowego (Saccharomyces cerevisiae) chromosomu konieczne do replikacji i segregacji w komórkach drożdży. YAC stanowi użyteczną alternatywę dla bakteryjnych systemów klonowania i ekspresji genów eukariotycznych. Wektor taki może bowiem nieść kompletne, nawet bardzo duże geny eukariotyczne, łącznie z sekwencjami promotorowymi i kontrolnymi, co jest przydatne przy badaniu funkcji genów. Wektory takie znalazły 192

też zastosowanie do sekwencjonowania genomu ludzkiego i mapowania genów. [Artificial chromosomes (artykuł przeglądowy): Monaco and Parin (1994) TIBECH 12: 280-286. Wektory ekspresyjne kodują elementy niezbędne do transkrypcji i translacji insertu (rys. 8. 17); na schemacie nie pokazano wektorowych punków startów ori, ani ich genów „markerowych" (np. genów oporności na antybiotyki). Ekspresja może być kontrolowana na wiele sposobów, np. w pewnych systemach geny są włączane przez określone zmiany temperatury. W razie potrzeby geny mogą być klonowane w bakteriach, a potem wyrażane w komórkach eukariotycznych. Istnieją wektory niosące Prokariotyczny origin replikacji i elementy niezbędne do kontroli ekspresji w eukariotach. Wektory wahadłowe (ang. shuttle vectors) mogą się replikować w różnych typach organizmów. Mogą one na przykład zawierać zarówno prokariotyczne, jaki i eukariotyczne sekwencje ori, pozwalające im replikować się w obu typach komórek. Wektory wahadłowe wyposażone są także w prokariotyczne i eukariotyczne markerowe geny selekcyjne, na przykład geny oporności na antybiotyki wyrażane w bakteriach i geny kodujące zdolność do syntezy leucyny, aktywne w komórkach eukariotycznych. Komponenty eukariotyczne takich wektorów pochodzą z Saccharomyces cerevisiae.

Odmianą wektorów wahadłowych są wektory zwane czasem „wektorami odzyskującymi" (ang. retrieval vector = gapped shuttle vector). Mogą one kopiować in vivo określony Zmutowany gen drożdżowy. Odpowiadający mu dziki typ genu, łącznie z otaczającymi (flankującymi) go sekwencjami chromosomowymi, jest włączany do wektora; gen ten jest potem, z użyciem enzymów restrykcyjnych, wycinany, tak aby w wektorze pozostały tylko sekwencje flankujące. Taki „dziurawy wektor" (ang. gapped), czyli z wyciętym genem, wprowadzamy do komórki niosącej Zmutowany allel tego samego genu. Sekwencje flankujące w wektorze łączą się z sekwencjami flankującymi Zmutowany gen, który jest kopiowany (rys. 8. 18). Końcowy produkt jest kompletnym (kolistym) wektorem niosącym kopię zmutowanego genu, który może być następnie amplifikowany w E. coli.

Fagmid jest wektorem skonstruowanym in vitro, który zawiera: 1) plazmidowy origin replikacji; 2) tzw. polilinker, czyli miejsce wielokrotnego klonowania (MCS, ang. multiple cloning site) — patrz rys. 8. 16; 3) markerowy gen selekcyjny (np. gen oporności na kanamycynę); i 4) origin replikacji nitkowatego faga (np. fl — tab. 9. 1). Fragment DNA może być włączony w obrębie MCS fagmidu, który jest następnie wprowadzany do bakterii przez transformację. Fagmid może być użyty do tworzenia dwuniciowych kopii insertu, tak jak w klonowaniu konwencjonalnym. Alternatywnie, jeżeli zainfekujemy komórkę bakterii zawierającą fagmid odpowiednim fagiem pomocniczym (ang. helper), np. M13, replikacja będzie inicjowana z ori fagmidu, a wynikiem będzie tworzenie jednoniciowych kopii fagmidu (mechanizm procesu — patrz sekcja 9. 2. 2). Te jednoniciowe kopie będą pakowane w fagowy płaszcz białkowy (kodowany przez faga pomocniczego) i wydzielane do podłoża. Jednoniciowe kopie insertu po uwolnieniu z płaszcza fagowego mogą być wykorzystane do sekwencjonowa-

193

Promotor (Pr) jest zwykle silnym promotorem hybrydowym — takim jak np. promotor tac (skonstruowany in vitro z promotorów operonów trp i lac E. coli), strzałki wskazują kierunek transkrypcji. Aktywność promotora jest (w tym przypadku) kontrolowana przez komórkowe białko regulatorowe operonu lac (patrz rys. 7. 11), które wiąże się z miejscem operatorowym (lacO) na plazmidzie, hamując transkrypcję. Aktywność może być włączona przez dodanie do podłoża izopropylo-β-tiogalaktozydu (IPTG). IPTG wiąże się do białka regulatorowego i inaktywuje je, pozwalając dzięki temu na przebieg transkrypcji. Dla komórek, które nie syntetyzują białka regulatorowego operonu lac, możemy użyć wektora z wbudowanym genem lacI (rys. 7. 11). Miejsce wiązania rybosomu (RBS) zapewnia, że po zajściu transkrypcji utworzony mRNA będzie zawierał sekwencję Shine-Dalgarno (sekcja 7. 6) potrzebną do związania rybosomu (RBS to krótka sekwencja nukleotydów purynowych). MCS (zwane także polilinkerem) jest miejscem wielokrotnego klonowania; sekwencją nukleotydów zawierającą wiele różnych miejsc restrykcyjnych (często zachodzących na siebie); fragment takiego MCS może wyglądać następująco:

DNA, który ma być wyrażany, klonujemy w MCS; duża liczba miejsc restrykcyjnych pozwala na znaczną dowolność wyboru enzymów do przygotowania insertu. Trzy ważne zasady, które należy spełnić, to: 1) insert musi być wbudowany we właściwej orientacji w stosunku do kierunku transkrypcji, 2) odpowiednik kodonu inicjatorowego w insercie (transkrybowany jako AUG w mRNA — sekcja 7. 6) musi być we właściwej odległości od RBS, tak aby AUG mógł ustawić się poprawnie w stosunku do miejsca „P" na rybosomie (patrz rys. 7. 9); dla zapewnienia maksymalnej wydajności translacji odległość ta powinna wynosić 5-13 nukleotydów, 3) jeżeli w insercie brakuje sekwencji inicjatorowej, musi być ona dostarczona w wektorze (powyżej insertu), w takim przypadku należy zadbać, aby po transkrypcji, odpowiadający insertowi mRNA był we właściwej ramce odczytu, tzn., aby kodony insertu były w tej samej fazie co kodon inicjujący, w innym przypadku wystąpi efekt analogiczny jak przy mutacji typu zmiany ramki odczytu (rys. 8. 1b). Jeden ze sposobów właściwego zorientowania insertu jest pokazany na rys. 8. 9. Alternatywnie, gen, który ma być wyrażany, może być wyizolowany na fragmencie, który został wycięty z użyciem dwóch różnych enzymów restrykcyjnych nie mających komplementarnych lepkich końców, wtedy każdy lepki koniec fragmentu może się połączyć tylko z komplementarną sekwencją lepkiego końca wektora przeciętego dwoma takimi samymi enzymami. (Procedura ta zapobiega jednocześnie recyrkularyzacji wektora oraz insertu, zwiększając zatem efektywność włączania insertu do wektora).

194

W chromosomie drożdżowym nastąpiła separacja nici w regionie zmutowanego genu , a wolne końce nici wektora utworzyły połączenia z komplementarnymi sekwencjami w chromosomie. Nić związana z „niższą" (5'-do- 3') nicią chromosomową działa jako starter (rys. 7. 8) do Syntezy DNA (linia przerywana). Podobnie, synteza następuje od przeciwnego końca drugiej nici (linia przerywana). Tak więc po ligacji powstaje kompletny (kolisty) plazmid; zauważ, że nowo zsyntetyzowany DNA zawiera kopię zmutowanego genu.

nia (sekcja 8. 5. 6). Wiele fagmidów po obu stronach MCS (na przeciwnych niciach) zawiera sekwencje promotorowe, co umożliwia w razie potrzeby transkrypcję insertu.

8. 5. 1. 6 Linkery, adaptory, dodawanie tzw. „ogonów", ligowanie Aby połączyć cząsteczki DNA, zazwyczaj stosujemy metodę pokazaną na rysunku 8. 6; pozwala ona na ponowne wycięcie insertu, jeśli jest taka potrzeba, z użyciem tego samego enzymu restrykcyjnego, który zastosowano do jego włączania. Cząsteczki mogą jednak nie mieć miejsc restrykcyjnych lub zawierać miejsca niezgodne. W takim przypadku możemy zmienić końce jednej lub obu cząsteczek. Możemy lepkie końce fragmentu DNA zamienić na tępe (rys. 8. 11) — albo przez usunięcie jednoniciowych wystających fragmentów (np. stosując endonukleazę S1), albo przez dosyntetyzowanie komplementarnych nici na każdym końcu „wystającej" nici z końcem 5'. Do powstałych tępych końców dołączany jest, z udziałem ligazy, tzw. linker — krótka, syntetyczna cząsteczka dsDNA zawierająca miejsce restrykcyjne, np.: 5'-GGAATTCC-3' 3'-CCTTAAGG-5' zawiera sekwencję rozpoznawaną przez EcoRI (tab. 8. 1). Ponieważ linker jest sekwencją palindromową (tzn. sekwencja czytana w kierunku 5' do 3' jest taka sama na obu niciach), obojętne jest, który jej koniec połączy się (zliguje) ze modyfikowaną cząsteczką. Po przyłączeniu linkerów przecinamy je odpowiednim enzymem restrykcyjnym i otrzymujemy lepkie końce. Przed ligacją z wybranym linkerem niezbędne jest upewnienie się, że w naszym fragmencie nie ma miejsc rozpoznawanych przez ten enzym lub że są one przez metylację zabezpieczone przed cięciem (sekcja 7. 4). Linkery są także używane do dopasowywania ramek odczytu (rys. 8. 17). Adaptory są podobne do linkerów, lecz zawierają więcej niż jedno miejsce rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne i mogą być tak zaprojektowane, że będą też wyposażone w lepkie końce. Adaptory są używane np. do insercji jednego lub kilku miejsc restrykcyjnych do wektora, jeżeli dalsza część postępowa-

195

nia tego wymaga. Na przykład adaptor z lepkimi końcami EcoRI i wewnętrznym miejscem Smal pozwala wyposażyć wektor w dodatkowe miejsce Smal. Dodawanie „ogonów" (ang. tailing) to dodawanie nukleotydów do końca 3' DNA z użyciem terminalnej transferazy deoksyrybonukleotydylowej. Reakcja taka jest mniej wydajna w przypadku dsDNA niż ssDNA lub cząsteczki z wystającym końcem 3'. Zazwyczaj dodawane są nukleotydy jednego rodzaju — z wytworzeniem ogona homopolimerowego (np. deoksytymidynowego (dT) — patrz rys. 8. 9). Takie homopolimerowe końce mogą być wykorzystane do łączenia tępo zakończonych cząsteczek DNA, na przykład jeżeli jedna cząsteczka zostanie wyposażona w koniec poli (dC), a druga — poli (dG). Zaletą takiej techniki jest to, że wytworzenie specyficznych par może nastąpić tylko między zakończeniami różnych cząsteczek, niemożliwa jest także recyrkularyzacja cząsteczek. Zastosowanie takiej techniki utrudnia jednak ponowne rozcięcie połączonych cząsteczek, gdyż sparowane homopolimerowe zakończenia nie zawierają miejsc restrykcyjnych. Ligacja to łączenie (kowalencyjne) zestawionych ze sobą ufosforylowanych -5' i hydroksylowych -3' końców DNA, z wytworzeniem wiązania fosfodiestrowego (rys. 7. 4). Aby mogło to nastąpić, koniec 5' DNA musi być ufosforylowany oraz konieczne jest dostarczenie energii (w postaci ATP). Enzymem powszechnie stosowanym do przeprowadzania ligacji jest, zależna od ATP, ligaza kodowana przez faga T4. Proces przedstawiony na rysunku 8. 6 to ligacja w obrębie jednej nici DNA w różnych miejscach cząsteczki. Ligacja tępych końców (łączenie dwóch tępo zakończonych fragmentów dsDNA) wymaga większego stężenia enzymu, niższej temperatury i dłuższego czasu reakcji. Przy konstruowaniu bibliotek genów (rys. 8. 7) możemy zapobiegać recyrkularyzacji wektora (zwiększając tym samym częstość wiązania wektora z fragmentem) przez defosforylację końców 5' przeciętego wektora, stosując enzym — alkaliczną fosfatazę. Końce 5' fragmentu pozostają ufosforylowane, przez co jest faworyzowane kowalencyjne wiązanie wektora z fragmentem. Wszelkie pozostałe jednoniciowe przerwy w łańcuchach DNA są następnie naprawiane przez systemy komórkowe.

8. 5. 2 Fuzja genów i białka fuzyjne Wektory ekspresyjne (sekcja 8. 5. 1. 5; rys. 8. 16) mogą zawierać sekwencje dwóch różnych genów mających swoje ramki odczytu w zgodnych fazach. Obie sekwencje mogą być wtedy transkrybowane z tego samego promotora, tworząc wspólny transkrypt, którego translacja powoduje powstanie hybrydowego lub fuzyjnego białka. Jakie jest zastosowanie takiej techniki? Opisana fuzja może być wykorzystana do: 1) ułatwiania detekcji i izolacji produktu określonego genu, 2) określenia wewnątrzkomórkowej lokalizacji specyficznych białek oraz 3) badania regulacji ekspresji genu. Poniżej podane są przykłady. Podczas ekspresji niektórych sklonowanych genów ilość tworzonego białka jest trudna do wykrycia i izolowania. W takich przypadkach można wywołać

196

fuzja sekwencji tego genu z sekwencją innego genu (tzw. genu partnerskiego lub nośnikowego), którego produkt jest łatwy do wykrycia i izolacji, np. jeżeli gen partnerski koduje S-transferazę glutationu (GST), białko fuzyjne może być łatwo izolowane metodą chromatografii powinowactwa (sekcja 8. 5. 1. 4) z użyciem kolumny zawierającej glutation. (W tym przykładzie GST jest fragmentem powinowactwa (ang. affinity tail) białka będącego przedmiotem naszego zainteresowania. ) Gen, którego produkt normalnie jest zlokalizowany wewnątrzkomórkowo, dzięki fuzji może być połączony z genem, którego produkt jest wydzielany do środowiska. Może to ułatwić izolację i oczyszczanie badanego białka lub uchronić je przez wewnątrzkomórkowymi enzymami degradacyjnymi — patrz np. sekcja 8. 5. 11. 4(b). Fuzja genów może mieć także zastosowanie do otrzymania produktu genu, jeżeli normalnie jest on słabo wyrażany; umieszczamy wtedy sekwencję tego genu poniżej silnie wyrażanego genu partnerskiego (tworzymy ich fuzję) w wektorze ekspresyjnym. Gen partnerski może też wpływać korzystnie na produkt fuzyjny, zwiększając jego rozpuszczalność lub stabilność. Po wyizolowaniu, białko fuzyjne może być przecięte enzymatycznie przez odpowiednią specyficzną proteazę, co pozwala na rozdzielenie produktów każdego z genów. Rozdzielenie białka fuzyjnego można także osiągnąć działając czynnikami chemicznymi, takimi jak bromocyjan (który przecina łańcuch białkowy przy reszcie metioninowej) lub hydroksyloamina (tnie między resztą asparaginy i glicyny). Problemy napotykane przy cięciu chemicznym to: 1) cięcie także specyficznych miejsc obecnych wewnątrz oczyszczanego białka i 2) wprowadzanie nieplanowanych, niekorzystnych modyfikacji tego białka. Powszechnie stosowanym partnerem fuzyjnym jest gen kodujący białko fluoryzujące na zielono (GFP, ang. green fluorescent protein). Białko to, występujące naturalnie w meduzach rodzaju Aequorea, emituje światło zielone (λ = 508 nm) przy naświetlaniu niebieskim światłem o długości fali 395 nm. Fuzja z GFP może być wykorzystana do wykazania wewnątrzkomórkowej lokalizacji specyficznego białka. W tym celu tworzymy fuzję genu kodującego to białko z genem kodującym GFP; a fuzyjne białko wykrywamy następnie z użyciem mikroskopu fluorescencyjnego. Na przykład, fuzja Smc-GFP była wykorzystana do monitorowania lokalizacji białka Smc w badaniach nad rozdzielaniem chromosomów (sekcja 3. 2. 1). W tych konkretnych badaniach, wektor (zawierający jeden koniec smc w fuzji z gfp) był wbudowany w gen smc chromosomu, w celu utworzenia kompletnej sekwencji sms-gfp, przez insercję z udziałem pojedynczego crossing-over typu pokazanego na rys. 8. 21(a) [Britton, Lin i Grossman (1998) GD 12: 1254-1259]. Fuzje z GFP są stosowane w różnorodnych badaniach dotyczących struktur wewnątrzkomórkowych [Margolin 91998) TIM 6: 234-238. Dodatkowe informacje na temat GFP: Chalfie and Kain (1998) Green Fluorescent Protein (properties, applications and protocols) ISBN 0471 17839 X. ] W fuzji lacZ, partnerski gen lacZ koduje β-galaktozydazę (patrz rys. 7. 11), tak więc ekspresja tego genu (a jednocześnie genu nas interesującego) może być monitorowana na podłożu zawierającym Xgal (sekcja 8. 5. 1. 5). Fuzja może być też przydatna do badania regulacji ekspresji genów. Na przykład, jeżeli ekspresja genu nie może być monitorowana (z powodu np. trud-

197

ności w oznaczaniu produktu genu), można określić aktywność promotora tego genu po dokonaniu jego fuzji z genem reporterowym (ang. reporter gene), którego produkt lub aktywność jest łatwa do monitorowania. Geny reporterowe to np.: gen kodujący galaktokinazę, acetylotransferazę chloramfenikolową (CAT) i zielono fluoryzujące białko. Chociaż z reguły opisane systemy eksperymentalne działają prawidłowo, stwierdzono, że pewne geny reporterowe oddziałują na aktywność niektórych promotorów [Forsberg, Pavitt i Higgins (1994) JB 176: 2128-2132]. Możliwość taką musimy uwzględniać interpretując wyniki, jako nieprzewidywalną komplikację oddziaływań między cząsteczkami zrekombinowanych DNA.

8. 5. 3 Sondy Załóżmy, że chcemy się dowiedzieć, czy dany plazmid, genom lub inna cząsteczka DNA zawiera określoną, krótką sekwencję nukleotydów. Jeden ze sposobów to użycie tzw. sondy molekularnej (ang. probe), tj. kawałka jednoniciowego DNA (lub RNA), którego sekwencja jest komplementarna do sekwencji poszukiwanej, i została w jakiś sposób wyznakowana. Ze względu na specyficzność parowania zasad, dana sekwencja (jeżeli jest obecna) może być zlokalizowana przez związanie się z komplementarną do siebie sondą, o czym poinformuje nas znacznik (ang. label) obecny w sondzie. W praktyce, badany (tarczowy) DNA jest w formie zdenaturowanej (jednoniciowej), związanej z powierzchnią filtra nitrocelulozowego. DNA na filtrze jest inkubowany z nadmiarem sondy. Jeżeli specyficzna sekwencja jest obecna w badanym materiale, nastąpi jej związanie z sondą w rejonach komplementarności zasad. Po dokładnym usunięciu (przez odpłukanie) niezwiązanej sondy, pozostaje tylko frakcja sondy specyficznie związanej z DNA unieruchomionym na filtrze, możliwa do zlokalizowania dzięki niesionemu znacznikowi. Sonda znakowana radioaktywnym fosforem 3 2 P może być wykryta metodą autoradiografii (patrz np. rys. 8. 10). Ostatnio powszechne stało się nieradioaktywne (= nieizotopowe) znakowanie sond. Znacznik w bezpośrednim nie izotopowym znakowaniu wiąże się kowalencyjnie z sondą. Znacznikiem może być cząsteczka fluoryzująca (np. fluoresceina lub rodamina); którą wykrywa się w świetle ultrafioletowym. W pośrednim nieizotopowym znakowaniu wiązane są kowalencyjnie z sondą małe cząsteczki, takie jak biotyna lub digoksygenina. Digoksygeninę wykrywa się następnie przez dodanie odpowiedniego przeciwciała (sekcja 11. 4. 2. 1) — antydigoksygeniny, z wcześniej dołączonym znacznikiem w postaci alkalicznej fosfatazy. Kompleks ten (przeciwciało-znacznik) wiąże się z digoksygeniną i jest wykrywany przez dodanie substratu, który może być rozszczepiany przez enzym, z uwolnieniem barwnego produktu oznaczanego kolorymetrycznie. Biotyna jest wykrywana przy użyciu streptawidyny — białka (ze Streptomyces avidinii) wiążącego się silnie z biotyną, które uprzednio powinno być związane z fluoryzującym lub enzymatycznym znacznikiem. Znacznik enzymatyczny może być także wykrywany metodami chemiluminescencji. Na przykład, sondę wyznakowaną alkaliczną fosfatazą możemy 198

wykryć przez dodanie substratu, który po rozszczepieniu przez ten enzym emituje światło, wykrywane na kliszy fotograficznej lub odpowiednim aparatem. Do substratów chemoluminescencyjnych zaliczamy: 1, 2-dioksetany CSPD i AMPPD (oznaczenia zastrzeżone przez Tropix, Badford, Massachusetts, USA). W metodzie tej alkaliczna fosfataza może być wykrywana jako znacznik bezpośredni, albo pośredni. Taki znacznik może być użyty do znakowania nie tylko sond, ale także np. starterów przy sekwencjonowaniu DNA metodą tzw. dideoksy (sekcja 8. 5. 6). Niektóre najnowsze ulepszenia. Określone sekwencje mogą być wykryte przez dwie sondy oligonukleotydowe znakowane pirenem (jedna znakowana przy końcu 3' a druga 5'). Jeżeli sondy zwiążą się obok siebie do komplementarnej nici tarczowej, to, w specyficznych pozycjach wiązania, oddziaływania piren-piren spowodują fluorescencję o charakterystycznych cechach. [Paris, Langenhan i Kool (1998) NAR 26: 3789-3793]. Molekularne sondy świetlne (ang. beacon probes) były zastosowane w NASBA w celu monitorowania produktu tworzonego podczas fazy amplifikacji (patrz sekcja 8. 5. 9. 2. ) Bezpośrednie sondowanie dwuniciowego DNA — nowa metoda [Fujiwara i Oishi (1998) NAR 26: 5728-5733). Jeden koniec sondy (ssDNA) jest komplementarny do nici przy jednym końcu fragmentu tarczowego dsDNA. Sonda jest dodawana łącznie z białkiem RecA (sekcja 8. 2. 1). RecA pośredniczy w zastąpieniu końcowego odcinka tarczowego DNA przez (homologiczną) sondę. Wolny koniec sondy zawiera strukturę spinki do włosów, której końcowy nukleotyd wiąże się kowalencyjnie (z udziałem ligazy) do nieodsuniętej nici DNA tarczowego, stabilizując dodatkowo wiązanie sondy z tarczowym DNA. Wykazano, że krótkie (np. 10-nukleotydowe) 5'-biotynylowane sondy, wyznakowane przez streptawidynę, związaną z alkaliczną fosfatazą przed hybrydyzacją, mogą dać wyniki porównywalne z otrzymywanymi z zastosowaniem sond radioaktywnych, gdy analizie poddawane są tarczowe sekwencje DNA unieruchomione na membranach. Przygotowywanie takich sond związanych z enzymem jest opisane przez Guerasomową, Ivanov i Lehrach [(1999) NAR 27: 703-705]. Przygotowywanie sond. Sondy mogą być przygotowywane przez klonowanie określonej sekwencji (sekcja 8. 5. 1; rys. 8. 6). Sklonowana sonda może być, przed wycięciem z wektora, wyznakowana metodą tzw. przesunięcia nacięcia (ang. nick translation) wg następujących zasad. Z zastosowaniem endonukleazy wprowadzane są przypadkowo rozmieszczone, jednoniciowe nacięcia w hybrydowym wektorze, następnie inny enzym (np. polimeraza DNA I E. coli) usuwa nukleotydy z naciętej nici (poczynając od nacięcia) i zastępuje je nukleotydami znakowanymi, które są dodane w nadmiarze do mieszaniny reakcyjnej. Po ligacji, każda sonda, wyznakowana jako część hybrydowego plazmidu, jest wycinana enzymami restrykcyjnymi. Sondy mogą być też przygotowywane z wykorzystaniem PCR (sekcja 8. 5. 4) lub syntetyzowane bezpośrednio w postaci każdej zaplanowanej sekwencji nukleotydowej.

199

8. 5. 4 Łańcuchowa reakcja polimeryzacji (PCR) PCR jest metodą kopiowania DNA, w której powtarzane cykle replikacji określonej sekwencji nukleotydów (tzw. amplikonu), zazwyczaj o długości poniżej 2 kpz, tworzą miliony kopii w ciągu kilku godzin. Metoda opiera się na wykorzystaniu zdolności polimerazy DNA I do wydłużania startera przez syntetyzowanie DNA na nici matrycowej (sekcja 7. 3; rys. 7. 8). (Technika PCR jest chroniona patentem będącym własnością Hoffmann-La Roche Inc. ) Podstawy metody są przedstawione na rysunku 8. 19. Należy zwrócić uwagę, że utrzymywanie wysokiej temperatury (np. 72°C) jest niezbędne, aby nici matrycowego DNA pozostawały rozdzielone podczas wydłużania starterów; co jest z kolei podstawą syntezy DNA na jednoniciowych matrycach (sekcja 7. 3). Nie wszystkie polimerazy DNA mogą funkcjonować w takiej temperaturze, w związku z tym kluczowym składnikiem reakcji PCR jest termo stabilna polimeraza DNA. Przykładem takiego enzymu jest polimeraza Taq z Thermus aquaticus, bakterii, która żyje w gorących źródłach, a jej optimum wzrostu przypada na temperatury 66-75°C. Zmodyfikowana, rekombinacyjna forma tego enzymu (tzw. fragment Stoffela), zawiera C-końcową część białka wyrażanego w E. coli; jest ona nawet bardziej termostabilna niż oryginalna polimeraza Taq, a także, jak wykazano, pozwala osiągać bardziej powtarzalne wyniki w technikach opartych na PCR, np. w RAPD (sekcja 16. 2. 2. 4). Polimeraza Taq nie ma aktywności egzonukleolotycznej 3' do 5', czyli nie może odszczepiać nukleotydów od końca 3' rosnącego łańcucha, co powoduje brak aktywności korektorskiej (ang. proof-reading). Cecha ta jest bardzo ważna, gdyż do pewnych celów (np. sekwencjonowania DNA) ważne jest, aby amplikon był kopiowany z największą dokładnością. W takich przypadkach konieczne jest zastosowanie termostabilnej polimerazy mającej aktywność korektorską. Jednym z takich enzymów jest polimeraza DNA UlTma™ (Perkin Elmers), rekombinacyjna polimeraza z Thermotoga maritima, która wykazuje udokumentowaną zdolność naprawy zasad błędnie podstawionych podczas PCR. Do pewnych celów (np. AP-PCR: sekcja 16. 2. 24; rys. 16. 4c) wymagane jest, aby starter wiązał się z matrycą, nawet gdy nie jest do niej w pełni komplementarny. W takich warunkach możemy zastosować mniej rygorystyczne (łagodniejsze) warunki (ang. low stringency conditions), np. temperatury, pH lub stężenia elektrolitów, co optymalizuje wiązanie, pozwalając „obejść" lub zminimalizować wpływ obecności błędnie sparowanych zasad matrycy i starterów na przebieg reakcji (w takim przypadku startery mogą wiązać się tylko w takich łagodnych warunkach). Warunki o wysokiej rygorystyczności (ang. high-stringency conditions) pozwalają na wiązanie się sondy do sekwencji tarczowej tylko wówczas, jeżeli ich sekwencje są w pełni lub niemal w pełni komplementarne. Im wyższy poziom rygorystyczności warunków (np. wyższa temperatura), tym konieczny jest większy stopień zgodności sekwencji między starterem i sekwencją tarczową, aby nastąpiło poprawne związanie startera. Gdy trudno jest zaplanować odpowiedni starter (np. ze względu na niekompletne dane dotyczące sekwencji w tarczowym DNA), możliwe jest użycie tzw. „uniwersalnego" nukleotydu w miejsce jednego lub kilku nieznanych nukleotydów [Nichols i wsp. (1994) Nature 369: 492-493].

200

Skład mieszaniny reakcyjnej. 1) Próbka DNA. 2) Startery: małe fragmenty ssDNA, każdy o długości około 20-30 nukleotydów; są dwa typy starterów: jeden komplementarny do końca 3' jednej nici próbki DNA i drugi komplementarny do końca 3' drugiej nici. Mieszanina reakcyjna zawiera wiele milionów kopii startera. 3) Deoksyrybonukleozydotrifosforany wszystkich czterech rodzajów. 4) Termostabilna polimeraza DNA. 5) Odpowiedni bufor. Mieszanina reakcyjna podlega serii zmian temperatury; taki cykl zmian jest powtarzany około 20-30 razy — temperatura jest zmieniana automatycznie pod kontrolą elektronicznych urządzeń odpowiednio zaprogramowanego „termocyklera". Początkowe ogrzanie do około 94°C denaturuje próbkę DNA (góra) do formy jednoniciowej. Przejściowe schłodzenie do 45-60°C pozwala starterom (w lewej górnej części) przyłączyć się (ang. anneal) do komplementarnych do siebie miejsc przy końcu 3' każdej nici matrycowej. Zmiana temperatury do 72°C pozwala na przebieg syntezy DNA (przerywana linia) od końca 3' każdego startera. Przy powtarzających się cyklach zmian temperatur nowo zsyntetyzowane nici (podobnie jak nici oryginalne) działają jako matryce; liczba kopii powstającą w czasie η cykli PCR wynosi teoretycznie 2", ale po około 25 cyklach tempo syntezy zmniejsza się w wyniku np. nadmiernej liczby nici matrycowych współzawodniczących o pozostałą ilość polimerazy. Specyficzna sekwencja nukleotydów (w próbce), która jest amplifikowana w PCR, jest nazywana amplikonem; kopie tej sekwencji powstałe w wyniku PCR są także nazywane amplikonami. Zauważ jednak, że amplikonem może być też sekwencja nukleotydowa zawarta wewnątrz dłuższej cząsteczki DNA; zasada jest taka sama — amplikon jest definiowany jako sekwencja nukleotydów ograniczona przez każdą parę starterów. Ważny jest wybór starterów, co wiąże się ściśle z doborem temperatury ich przyłączania (ang. annealing). Startery nie powinny zawierać sekwencji, które umożliwiają im wzajemne wiązanie się ze sobą (jest to szczególnie ważne w wielomiejscowym PCR) lub wytwarzanie w obrębie startera struktur drugorzędowych. Stosowana temperatura na etapie przyłączania starterów powinna być wyższa przy większej w nich zawartości par G+C (porównaj liczbę wiązań wodorowych w parach GC i AT; rys. 7. 6) — takie zaostrzenie wymagań (warunków) zwiększa specyficzność przyłączania starterów zawierających dużo silnych wiązań GC. Temperatury przyłączania starterów z matrycą zawarte są zazwyczaj w zakresie 45 do 60°C, ale czasem mogą być wyższe [np. 63°C: Ye i wsp. (1998) NAR 26: 3614-3615; 65°C: Talbot i wsp. (1997) JCM 35: 566-569]. Procedury różnych modyfikacji podstawowej wersji reakcji PCR opisano w sekcji 8. 5. 4. 2.

Ogólnie mówiąc, powodzenie reakcji PCR wymaga zwracania uwagi na wiele szczegółów, i, co jest ważne, zabezpieczenia się przez skutkami mogącymi wyniknąć z dostania się obcego DNA do mieszaniny reakcyjnej. Obcy DNA może przez przypadek zawierać miejsca zdolne do związania stosowanych starterów lub sekwencje, które są zdolne zadziałać jako startery dla niepożądanych sekwencji w naszej próbce DNA. W obu przypadkach, niepożądane sekwencje (tak jak i te właściwe) mogą być amplikowane, dzięki czemu powstaje miesza201

nina produktów, w której te właściwe mogą stanowić tylko nieznanej wielkości frakcję. Pewne rozwiązania zabezpieczające przed takimi problemami są opisane w sekcji 8. 5. 4. 3. Niektóre substancje (znajdujące się np. w próbkach klinicznych) mogą hamować reakcję PCR (patrz sekcja 8. 5. 4. 6). PCR ma szeroki wachlarz zastosowań, z których wybrane są zaprezentowane w sekcji 8. 5. 4. 1. 8. 5. 4. 1 Przykłady zastosowań PCR Technikę PCR stosuje się w dziedzinach tak różnych jak ekspertyzy sądowe i paleobiologia. Niektóre z zastosowań PCR w bakteriologii i biologii molekularnej wymieniono niżej, a o wykorzystaniu pewnych wariantów podstawowej techniki PCR wspomniano w sekcji 8. 5. 4. 2. 1. W pewnych przypadkach technika PCR jest po prostu używana do stwierdzenia, czy jakaś szczególna, interesująca nas sekwencja nukleotydowa jest obecna w badanej próbce, czy też nie. Założenie jest takie, że jeżeli sekwencja ta jest obecna, to zostanie zamplifikowana, a następnie wykryta odpowiednim sposobem. Ponieważ dany produkt PCR jest zazwyczaj określonej długości (w sensie liczby nukleotydów), może być łatwo zidentyfikowany w elektroforezie (sekcja 8. 5. 1. 3) jako prążek o określonej lokalizacji w żelu. Produkt amplifikacji może być dodatkowo sprawdzony przez trawienie enzymami restrykcyjnymi (sekcja 8. 5. 1. 3) i ustalenie, czy powstały fragmenty o przewidywanej wielkości. Alternatywnie, produkty mogą być analizowane metodą Southerna i hybrydyzowane ze specyficzną znakowaną sondą (rys. 8. 14). Szybko stało się oczywiste, że technika PCR może być pomocna w wykrywaniu patogenów w materiale klinicznym poprzez identyfikację unikatowych sekwencji w ich DNA. Jest to szczególnie przydatne w przypadku patogenów, które nie mogą być hodowane (czyli nie rosną in vitro), i tych, rosnących bardzo powoli (np. Mycobacterium tuberculosis). Na skutek tego, technika PCR jest użyteczna w diagnostyce pewnych chorób i w badaniach epidemiologicznych. Jednym z wczesnych przykładów była szybka diagnoza gruźliczego zapalenia opon mózgowych [Kaneko i wsp. (1990) Neurology 40: 1617-1618]. PCR może potwierdzić przypuszczalną diagnozę choroby w ciągu godzin (zamiast tygodni, jak w metodach konwencjonalnych). (Patrz także sekcja 16. 1. 6. 1. ) Do celów diagnostycznych startery muszą być oczywiście wysoce specyficzne, czyli występować tylko i wyłącznie w danym typie patogena; może to być np. sekwencja kodująca unikatową toksynę. Warunki reakcji muszą być tak dobrane, aby wydłużanie starterów następowało tylko wtedy, gdy sekwencja tarczowa (poszukiwana) jest obecna w próbce klinicznej. Zwróćmy jednak uwagę, że amplifikacja danej sekwencji nie informuje nas o obecności żywego patogena. 2. PCR można zastosować do skopiowania określonego amplikonu, w celu określenia lub sprawdzenia jego sekwencji nukleotydowej. Jeżeli amplifikujemy fragment DNA w tym właśnie celu, produkty PCR możemy uzyskać stosując tzw. asymetryczny PCR (sekcja 8. 5. 4. 2, a także 8. 5. 4. 5). Inne techniki, w których 202

chodzi o badanie sekwencji, to SSCP (rys. 8. 19c i sekcja 15. 4. 11. 2), „genetyczny odcisk palca" typu dideoksy (ang. dideoxy fingerprinting) oraz test sondy liniowej (sekcja 15. 4. 11. 2). 3. Produkty PCR mogą być użyte jako sondy (sekcja 8. 5. 3). 4. Produkty PCR mogą być wbudowane do wektora ekspresyjnego (sekcja 8. 5. 1. 5). 5. Technika PCR jest przydatna w badaniach klasyfikacyjno-taksonomicznych (sekcja 16. 1. 6. 2; 16. 2. 2. 4-16. 2. 2. 8). 6. PCR, z użyciem „sond o szerokim zakresie występowania" (sekcja 10. 8), jest wykorzystywany do badań przeglądowych dotyczących różnorodności gatunków w próbach środowiskowych. 7. PCR jest stosowany w analizie różnicowania poziomu ekspresji (ang. differential disply) (sekcja 8. 5. 14). [The future of PCR technology: White (1996) TIBTECH 14: 478-483. ] 8. 5. 4. 2 Pewne (spośród wielu) odmiany technik PCR

System wykrywania mutacji poprzez niepodatność na amplifikację techniką PCR (ARMS, ang. amplification refractory mutation system). Patrz rysunek 8. 20a. PCR z użyciem arbitralnie dobranych starterów (AP-PCR, ang. arbitrarily primed PCR). Patrz sekcja 16. 2. 2. 4 (także sekcja 8. 5. 14). Asymetryczna reakcja PCR (ang. asymmetric PCR). W procedurze tej jedna z dwóch typów sond jest stosowana w znacznie mniejszym stężeniu niż druga (np. 1: 50), zostanie ona zużyta po kilku cyklach reakcji PCR, jednakże ogromny nadmiar drugiej sondy spowoduje, że jedna z nici matrycowego dsDNA zostanie skopiowana znaczącą ilość razy. Metoda ta może być zastosowana np. do przygotowywania jednoniciowego DNA do sekwencjonowania (patrz sekcja 8. 5. 6) lub użycia jako sondy (sekcja 8. 5. 3). PCR ze wstępnym podgrzaniem (ang. hot-start PCR). Ten wariant reakcji polega na wstrzymaniu dodania lub zablokowaniu aktywności niezbędnego składnika mieszaniny reakcyjnej, póki nie zostanie ona ogrzana do temperatury powyżej optymalnej temperatury wiązania startera; zwiększa to specyficzność i czułość reakcji w wyniku uniemożliwienia wydłużania starterów związanych w niespecyficznych miejscach matrycy. W jednym z systemów polimeraza jest hamowana w początkowym etapie reakcji ogrzewania aż do 70°C, przez związanie ze specyficznym przeciwciałem. Inaktywacja polimerazy ustaje przy dalszym podwyższaniu temperatury, prowadzącym do pierwszego etapu denaturacji, następnie reakcja PCR przebiega normalnie. W innym systemie mieszanina reakcyjna bez polimerazy jest pokrywana warstwą wosku (AmpliWax™; Perkin Elmer), który został uprzednio stopiony w temp. 75-80°C i pozostawiony do zakrzepnięcia. Polimeraza nałożona powyżej warstwy wosku może działać tylko po osiągnięciu podczas kolejnych cykli odpowiedniej temperatury. 203

(a) Technika ARMS (ang. amplification-refractory mutation system). Technika ta pozwala wykryć specyficzne mutacje punktowe w DNA, którego sekwencja „dzikiego typu" jest nam znana. Na schemacie zaznaczona jest mutacja G do C (guanina do cytozyny) jako „C" w górnej nici cząsteczki (góra). Aby wykryć tę mutację, planujemy starter z 3'-końcową guanozyną, która powinna pasować do potencjalnie zmutowanej zasady; po połączeniu ze Zmutowana nicią starter może być wydłużany przez PCR — wskazując na obecność mutacji. W przypadku nici „dzikiego typu" (brak mutacji) (dół), starter nie będzie wydłużany ze względu na niemożność utworzenia pary pomiędzy dwoma nukleotydami guanozynowymi. (b) Odwrócona reakcja PCR. W procedurze tej kopiuje się DNA, który otacza (flankuje) znaną sekwencję (a nie tę właśnie sekwencję). Metoda może być zastosowana np. do badania miejsca insercji znanej sekwencji do chromosomu lub plazmidu. Schemat pokazuje liniowy fragment (góra), w którym znana sekwencja występuje w obrębie miejsca zaznaczonego kwadratem. Najpierw fragment jest cyrkularyzowany (środek). Startery PCR są tak planowane, że gdy zwiążą się z fragmentem, ich końce 3' będą wydłużane w kierunku wskazanym przez strzałkę. Następnie wprowadzane jest cięcie w miejscu restrykcyjnym (linia przerywana) w pozycji między końcami 5' dwóch starterów. Opisana linearyzacja powoduje powstanie cząsteczki o takim ułożeniu starterów wobec matrycy, jakie jest w standardowej PCR (dół). (c) Analiza polimorfizmu konformacji jednoniciowego DNA (SSCP, ang. single-strand conformation polymorphism). W analizie SSCP porównuje się różne (ale podobne) próbki jednoniciowego DNA, wykrywając różnice ich sekwencji przez ujawnianie różnic w ruchliwości elektroforetycznej w żelu poliakryloamidowym. Tą metodą mogą być wykryte nici, które różnią się nawet jedną zasadą. Technika PCR może być zastosowana do otrzymywania próbek jednoniciowego DNA.

204

Jeszcze inna metoda opiera się na zastosowaniu chemicznie zmodyfikowanej formy polimerazy DNA (AmpliTaqGold™DNA polymerase; PerkinElmer Applied Biosystems), która pozostaje nieaktywna, aż w odpowiedniej temperaturze zostanie termicznie zaktywowana. [Patrz także Birch i wsp. (1996) Nature 381: 445-445. ] Odwrócona reakcja PCR (ang. inverse PCR). Patrz rysunek 8. 20b. Złożona lub wielomiejscowa reakcja PCR (ang. multiplex PCR). Kilka różnych par sond jest stosowanych jednocześnie, co umożliwia amplifikowanie więcej niż jednej sekwencji w próbce. (Patrz np. zespól wstrząsu toksycznego — sekcja 11. 11).

Wewnętrzna reakcja PCR (ang. nested PCR). Patrz rysunek 8. 20d. REP-PCR (amplifikacja repetytywnych sekwencji). Patrz sekcja 16. 2. 2. 5. PCR z zastosowaniem odwrotnej transkryptazy (rtPCR, ang. reverse transcriptase PCR). Początkowo, enzym odwrotna transkryptaza tworzy kopię cDNA próbki RNA (sekcja 8. 5. 1. 2), następnie reakcja PCR jest prowadzona w typowy sposób. Przy użyciu właściwych starterów technika ta może być zastosowana np. do wykrycia specyficznej cząsteczki mRNA lub obecności genomów pewnych RNA fagów w komórce bakteryjnej (tab. 9. 1). Pokrewne nici DNA mogą mieć odmienną ruchliwość elektroforetyczną także wówczas, gdy różnice w ich sekwencji nukleotydowej wywołują różny poziom wewnątrzniciowego parowania zasad, co z kolei powoduje powstawanie form konformacyjnych wpływających na ruchliwość elektroforetyczną. Rysunek pokazuje dwie pokrewne nici DNA; w nici położonej niżej zmiana w sekwencji nukleotydowej spowodowała utratę zdolności lokalnego wewnątrzniciowego parowania zasad — tak że dwie pokazane nici mają teraz różną konformację, a co za tym idzie różną ruchliwość elektroforetyczną. Żel używany w analizie SSCP jest niedenaturujący, aby zapobiec zrywaniu wszelkich istniejących wewnątrzniciowych powiązań między zasadami. Podobna metoda — analiza w żelu denaturującym (DGGE, ang. denaturing gradient gel electrophoresis ) — służy do porównywania próbek pokrewnych, tworzonych metodą PCR lub otrzymanych w wyniku trawienia restrykcyjnego, dwuniciowych fragmentów DNA przez elektroforezę dwukierunkową. W metodzie tej [patrz np. Vijg (1995) Biotechnology 13: 137-139], fragmenty są wstępnie rozdzielane (na podstawie wielkości) w pierwszej fazie elektroforezy. Następnie, w tym samym żelu fragmenty są przemieszczane elektroforetycznie pod kątem prostym w stosunku do oryginalnej ścieżki — tym razem poprzez wzrastający gradient czynników denaturujących DNA (np. mocznik + formamid); na określonym poziomie gradientu następuje zlokalizowane, zależne od sekwencji, „topnienie" DNA (rozdzielanie nici) w części fragmentów (parowanie zasad jest silniejsze w regionach bogatych w pary GC) — co wpływa na ruchliwość elektroforetyczną i pozwala na rozdzielenie fragmentów w żelu. DGGE stosowano np. do charakteryzowania organizmów przez porównywanie, amplifikowanych metodą PCR, sekwencji z ich genów kodujących 16S rRNA [Ferris, Muyzer and Ward (1966) AEM 62: 340-346], i do identyfikowania Rhizobium spp. [de Oliveira i wsp. (1999) LAM 28: 137-41. (d) Wewnętrzna reakcja PCR (nPCR). Początkowo prowadzona jest standardowa reakcja PCR (przez około 25 cykli) (góra). Następnie, wykorzystując część produktu jako matrycę, prowadzi się kolejnych 25 cykli PCR z użyciem pary starterów komplementarnych do subterminalnych sekwencji matrycy. Końcowym produktem jest więc zbiór wielu kopii sekwencji zawartej wewnątrz sekwencji oryginalnej (dół). nPCR, jak donoszono, zwiększa zarówno czułość, jak i specyficzność PCR. nPCR stosowano np. w przypadku dostępności małej ilości tarczowego (tego, który chcemy amplifikować) DNA lub gdy materiał wyjściowy był niezbyt dobrej jakości.

205

Polimorfizm konformacji jednoniciowego DNA (SSCP, ang. single-strand conformation polymorphism). Patrz rysunek 8. 20c. PCR na podłożu stałym (ang. solid-phase PCR). Patrz sekcja 8. 5. 15.

8. 5. 4. 3 Problem obecności obcego DNA w reakcji PCR; proponowane rozwiązania Wspomniano wcześniej, że zanieczyszczenie obcym DNA może zagrażać pomyślnemu przebiegowi reakcji PCR. Jest to niezwykle poważny problem, na przykład w laboratoriach klinicznych, które rutynowo testują próbki w kierunku obecności tylko jednego lub dwu amplikonów; próbka nowo wprowadzona do testowania jest narażona na zanieczyszczenie pochodzące z nagromadzonego DNA sekwencji tarczowych z poprzednich próbek. Jednym z proponowanych rozwiązań tego problemu jest przeprowadzanie reakcji PCR rutynowo z użyciem trifosforanu deoksyurydyny (dUTP) zamiast trifosforanu deoksytymidyny. W metodzie tej każda mieszanina reakcyjna zawiera enzym uracylo-N-glikozylazę (UNG), który usuwa uracyl z dUMP w DNA. (UNG należy do enzymów naprawiających DNA: sekcja 7. 7. 1. 3. ) Rutynowo, przed rozpoczęciem właściwej reakcji, wprowadza się dodatkowy etap, w którym UNG reaguje z zanieczyszczającymi pozostałościami DNA z poprzedniej reakcji, po czym podczas pierwszego podwyższenia temperatury do 95°C przy starcie reakcji amplikony poddane działaniu UNG zostaną zniszczone w wyniku powstających dwuniciowych pęknięć. Wysoka temperatura inaktywuje jednocześnie UNG, tak że właściwa reakcja może być kontynuowana już przy braku UNG i zanieczyszczeń. Zauważmy, że UNG nie wpływa na matrycowy DNA — który ma normalny (zawierający tyminę) nukletyd, dTMP. Inne rozwiązanie polega na włączeniu izopsoralenu do mieszaniny reakcyjnej PCR. Po reakcji, mieszanina jest poddawana działaniu promieni ultrafioletowych (np. 365 nm/4°C/15 min), co powoduje fotoaktywację izopsoralenu. Zaktywowany izopsoralen wiąże kowalencyjnie dwie nici w dsDNA. W wyniku tego końcowymi produktami PCR są amplikony dsDNA, które nie mogą ulec denaturacji, a tym samym nie mogą działać jako matryce w reakcji. Metodę tę można stosować, kiedy w produktach reakcji chcemy wykryć daną sekwencję przez elektroforezę, nie może natomiast być użyta na przykład w ddF (sekcja 15. 4. 11. 2), który wymaga jednoniciowej matrycy DNA. [Optimal activation of isopsoralen: Fahle i wsp. (1999) JCM 37: 261-262. ] Ryzyko namnożenia niewłaściwych sekwencji w wyniku rozpoczęcia reakcji od błędnego startera (ang. „mis-priming") jest znacznie bardziej prawdopodobne w niższej temperaturze (mniej rygorystyczne warunki reakcji), np. podczas mieszania składników reakcji przed jej rozpoczęciem. Jest to szczególnie ważne, ponieważ każdy niespecyficzny produkt utworzony we wczesnym etapie będzie amplifikowany przez cały czas reakcji, co zredukuje jej wydajność i specyficzność. Tworzenie niespecyficznych produktów jest minimalizowane (a nawet eliminowane) w reakcji PCR typu „hot-start" (sekcja 8. 5. 4. 2).

206

8. 5. 4. 4 Klonowanie tępo zakończonych produktów reakcji PCR Prosta i wygodna metoda klonowania produktów reakcji PCR, np. przed sekwencjonowaniem (sekcja 8. 5. 6), polega na użyciu tzw. „rzadko tnącej" endonukleazy restrykcyjnej (sekcja 8. 5. 1. 3), Srfi [Schlottere i Wolf (1966) TIG 12: 286-287]. Srfi tnie DNA tworząc w obrębie rozpoznawanej przez siebie sekwencji tępe końce (sekcja 8. 5. 1. 3). Ponieważ sekwencje takie występują rzadko, można założyć, że powstające produkty PCR w zasadzie nie zawierają miejsc rozpoznawanych przez Srfi. Wykorzystywany w tej metodzie wektor został skonstruowany przez insercję miejsca rozpoznawanego przez Srfi do genomu faga M13 (patrz sekcja 9. 2. 2). Aby włączyć produkt PCR do dwuniciowej kolistej cząsteczki wektora, produkt i wektor inkubuje się w mieszaninie reakcyjnej z Srfi i ligazą łącznie. Miejsce Srfi ulegnie przecięciu (linearyzując cząsteczkę wektora), ligacji, przecięciu, religacji itd., póki nacięty koniec nie ulegnie zligowaniu z fragmentem, produktem PCR (w wyniku ligowania tępych końców — sekcja 8. 5. 1. 6). Kiedy tak się stanie, wektor przestanie być podatny na działanie Srfi i może nastąpić połączenie wolnych końców wektora oraz fragmentu, z wytworzeniem kolistej cząsteczki — wektora zawierającego insert. Taki wektor można wprowadzić do bakterii przez transformację. Restryktaza Srfi (wytwarzana przez firmę Stratagen) rozpoznaje i przecina następującą sekwencję: 5'-GCCC/GGGC-3' 3'-CGGG/CCCG-5' W innej procedurze (z użyciem zestawu do „klonowania na tępe końce" — firmy Boehringer Mannheim) produkty reakcji PCR włącza się w tępo zakończone cięcie dokonane w obrębie letalnego genu wektora. Wbudowanie insertu inaktywuje ten gen, a więc wektor ze sklonowanym fragmentem może być wprowadzony do komórki przez transformację i powielać się tam, podczas gdy zrecyrkularyzowany wektor, który niesie funkcjonalny letalny gen, spowoduje po transformacji zabicie swojego gospodarza (jest to przykład systemu, który umożliwia efektywną selekcję zrekombinowanego wektora). 8. 5. 4. 5 Przygotowywanie jednoniciowego DNA z produktów reakcji PCR Oczyszczony jednoniciowy DNA jest potrzebny do wielu celów, np. do sekwencjonowania (sekcja 8. 5. 6) lub użycia jako sondy molekularnej. Oczyszczony ssDNA może być otrzymany z produktów reakcji PCR szybką i prostą metodą opisaną przez Pagratisa [(1996) NAR 24: 3645-3646]. Przed reakcją PCR, jeden z dwóch typów starterów jest znakowany biotyną. Po PCR, do mieszaniny reakcyjnej dodaje się streptawidynę (białko pochodzące ze Streptomyces cwidinii), która wiąże się z biotyna, znajdującą się tylko w jednym z dwóch typów produktu. Mieszanina jest następnie poddawana elektroforezie w żelu denaturującym (np. zawierającym mocznik w dużym stężeniu), który hamuje tworzenie par między komplementarnymi nićmi, a więc jednoniciowe komplementarne produkty PCR nie mogą hybrydyzować. Ponieważ jeden z produktów jest związany 207

z białkiem (streptawidyną), jego ruchliwość elektroforetyczna (czyli tempo poruszania się cząsteczki podczas elektroforezy) jest znacznie zredukowana, w wyniku czego drugi produkt utworzy w żelu dobrze oddzielony prążek. Jeżeli potrzebna nam jest określona nić, przed reakcją PCR musi być biotynylowany starter drugiej nici. 8. 5. 4. 6 Inhibitory reakcji PCR

Niektóre próbki zawierają substancje, które hamują reakcję PCR. Reakcja może więc dać fałszywie negatywny wynik nawet w obecności specyficznej matrycy Jest to oczywiście szczególnie ważne w laboratoriach klinicznych. Inhibitory związane z krwią (sekcja 11. 8. 1. 1) to heparyna i hemina. Inhibitory w kale to pewne polisacharydy pochodzące z pożywienia [Monteiro i wsp. (1997) JCM 35: 995-998]; można je usunąć stosując metodę preparatów DNA „uwięzionych" (zatopionych) w agarozie [Moreira (1998) NAR 26: 3309-3310]. Inhibitory można wykryć przez dodanie kilku kopii „wewnętrznego kontrolera" (IC, ang. internal controler) do każdej badanej próbki przed amplifikacją [Rosenstraus i wsp., (1998) JCM 36: 191-197]. IC jest nicią kwasu nukleinowego o przypadkowej sekwencji, lecz region wiążący starter ma ona identyczny jak właściwy amplikon; zawiera także unikatowe miejsce wiążące odpowiednią sondę. Zamplifikowanie IC (co wykrywamy z użyciem sondy) świadczy o efektywności amplifikacji i braku inhibitorów. 8. 5. 4. 7 PCR — oznaczenia ilościowe

W reakcji PCR możemy określić początkową liczbę sekwencji matrycowych (amplikonów) w mieszaninie reakcyjnej. Jedna z metod wymaga użycia tzw. sond TaqManR, które są tak zaplanowane, aby hybrydyzować (wiązać się) do wewnętrznej sekwencji w amplikonie. Na początku reakcji PCR mieszanina reakcyjna zawiera dużą liczbę sond, a każda sonda jest znakowana barwnikiem fluorescencyjnym i wygaszaczem fluorescencji. Barwnik i wygaszacz są blisko siebie, tak że wolny (niezwiązany) starter jest niefluorescencyjny z powodu działania wygaszacza. Sondy TaqMan na etapie wiązania (ang. annealing) przyłączają się do komplementarnych sekwencji w amplikonach. W określonym amplikonie sonda wiąże się do sekwencji wewnętrznej, a startery — do sekwencji końcowych. Następnie polimeraza wydłuża starter aż do osiągnięcia miejsca sondy. Wtedy to polimeraza degraduje sondę (uwalniając barwnik i wygaszacz jako oddzielne cząsteczki) i kontynuuje syntezę komplementarnej nici amplikonu, a niewygaszany teraz barwnik staje się aktywny fluorescencyjnie. Zwróćmy uwagę, że na każdy amplikon związany z sondą uwalniana jest jedna cząsteczka barwnika, tak więc w miarę przebiegu kolejnych cykli reakcji stopień fluorescencji będzie się zwiększał. Jeżeli od początku, cykl po cyklu, monitorujemy fluorescencję, możemy zidentyfikować pierwszy cykl, w którym fluorescencja przekracza poziom tła, jest on nazywany cyklem progowym (ang. threshold cycle) i daje informację o początkowej liczbie matryc (amplikonów) w mieszaninie reakcyjnej. Im wyższa 208

wartość progowa, tym liczba matryc mniejsza. Jest to logiczne: im mniejsza początkowa liczba matryc, tym potrzeba większej liczby cykli do przekroczenia progowej wartości fluorescencji. W istocie, występuje odwrotna zależność liniowa między numerem cyklu progowego i logarytmem początkowej liczby matryc; tak więc otrzymamy linię prostą, jeżeli numer cyklu progowego (1, 2, 3... 33, 34, 35 itd. ) wykreślimy wobec logarytmu początkowej liczby matryc; gdy nie znamy początkowej liczby matryc, możemy ją ekstrapolować z tego wykresu. Takie podejście eksperymentalne było zastosowane np. do ilościowego wykrywania Borrelia burgdorferi w próbkach zakażonej tkanki [Pahl i wsp. (1999) JCM 37: 1958-1963].

8. 5. 5 Mutageneza Jak już wiemy, na kwasy nukleinowe można w różny sposób oddziaływać i manipulować nimi takimi metodami jak trawienie enzymami restrykcyjnymi i ligacja, tworzenie fuzji itp. Mutageneza (w tym także zaplanowane tworzenie mutacji) jest kolejną metodą oddziaływania na DNA. Możemy ją przeprowadzić różnymi sposobami. Mutacje mogą być wywoływane w celu: 1) zinaktywowania genu, tak aby stał się on niefunkcjonalny lub nie kodował pierwotnego produktu, 2) zmodyfikowania genu, aby zmienić jego ekspresję. Inaktywacja danego genu może być niezbędna do potwierdzenia jego roli w określonej funkcji przez porównywanie komórki z genem aktywnym i komórki zawierającej gen uszkodzony. Modyfikacje genów mogą znaleźć zastosowanie w medycynie i w przemyśle, jak również w badaniach naukowych z zakresu biologii. 8. 5. 5. 1 Tworzenie przypadkowych (ang. random) mutacji Gdy bakterie są poddawane działaniu mutagenów, w różnych genach poszczególnych osobników (sekcja 8. 1) mogą powstawać mutacje. Stosując odpowiednie warunki selekcyjne możemy izolować z mutagenizowanej populacji te komórki, które uzyskują określony typ mutacji (i przejawiają dzięki temu jakąś zmienioną cechę lub funkcję). Na przykład, w celu wyselekcjonowania zmutowanych komórek, które uzyskały oporność na dany antybiotyk, mutagenizowaną populację bakterii hoduje się na podłożu z tym antybiotykiem, a mogą na nim wyrosnąć tylko komórki oporne. Mutageneza sklonowanego genu: szczepy mutatorowe. Efektywną drogą wywoływania przypadkowych mutacji w sklonowanym genie jest wprowadzenie wektora (niosącego ten gen) do komórki mutatorowego szczepu bakterii, czyli szczepu, który w wyniku mutacji jest niezdolny do naprawiania uszkodzeń w DNA (sekcja 7. 7). Z powodu braku normalnego systemu naprawczego, w genomie bakteryjnym i w wektorze plazmidowym (lub innym) niosącym sklonowany gen, podczas wzrostu i kolejnych podziałów nagromadzają się mutacje. Jednym z takich szczepów mutatorowych jest Epicurian Coli® XL1-Red (firmy Stratagene). W szczepie tym mutacje nagromadzają się w tempie kilkanaście 209

tysięcy razy większym niż w odpowiadającym mu szczepie dzikim. W ten sposób mutacje powstają bez użycia zewnętrznego mutagenu.

8. 5. 5. 2 Tworzenie mutacji specyficznych Mutacje specyficzne mogą być wykorzystane do badań ekspresji i funkcji genu oraz do modyfikowania w określony sposób produktu genu — np. w celu ulepszania i zwiększania aktywności enzymów wykorzystywanych w przemyśle (przez zmiany określonych nukleotydów w kodujących je genach). Mutacje punktowe (sekcja 8. 1. 1), a nawet rozleglejsze zmiany mogą być wprowadzane do DNA w dokładnie zaplanowane miejsca. Zasadę wprowadzania mutacji zwanych zlokalizowanymi lub specyficznymi wobec miejsca (ang. site-specific mutagenesis) (=mutageneza kierowana przez oligonukleotydy) pokazano na rysunku 8. 21. Prostsza metoda (z użyciem zestawu Quick Change™ firmy Stratagene) mutagenezy specyficznej wobec miejsca nie wymaga jednoniciowej formy DNA (porównaj z metodą na rys. 8. 21). Zamiast tego stosuje się w niej dwuniciowe koliste wektory, każdy zawierający insert poddawanego mutagenezie fragmentu DNA. Cząsteczki wektorów są najpierw mieszane z dwoma typami mutagennych oligomerowych starterów — analogicznych do tych, które pokazano na rysunku 8. 21. Te dwa typy starterów są komplementarne do sekwencji na różnych niciach insertu; ich sekwencje zachodzą na siebie i obie zawierają zaplanowane mutacje (zmiany sekwencji). Wektory są termicznie denaturowane, po czym dodawane są startery, które wiążą się z odpowiednimi miejscami w insercie. Startery są wydłużane przez termostabilną polimerazę Pfu (z Pyrococcus furiosus). Podczas kolejnych reakcji powstają kopie obu nici wektora zawierające nacięcia (przerwy), a każda kopia posiadająca nacięcia zawiera insert, który niesie zmienione sekwencje (mutacje). Każda kopia ma nacięcie w jednej z dwóch różnych pozycji (pamiętajmy, że sekwencje startera są zachodzące), tak że dwie komplementarne nacięte kopie mogą hybrydyzować tworząc dwuniciową kolistą strukturę z nacięciami w różnych pozycjach. Następnie rodzicielskie (niezmutowane) wektory są eliminowane z użyciem endonukleazy restrykcyjnej Dpnl. Rodzicielskie cząsteczki wektorów replikowały się w E. coli, w związku z czym będą one podatne na działanie restryktazy DpnI (sekcja 7. 4). Wektory niosące zmutowane inserty, które były syntetyzowane in vitro, nie są metylowane i nie będą podatne na działanie DpnI. Po wprowadzeniu ich do E. coli, nacięcia zostaną naprawione in vivo, a wektory ulegną replikacji, wytwarzając duże ilości zmutowanych insertów. Zmutowany lub zrekombinowany DNA może być wbudowany do chromosomu bakterii różnymi sposobami. Wektor niosący zmutowaną sekwencję wprowadzamy do komórki bakterii przez elektroporację (sekcja 8. 4. 1. 2) lub normalną transformację. Rysunek 8. 22 pokazuje dwie metody pozwalające następnie wbudować sekwencje wektorowe do chromosomu, zawierającego sekwencje homologiczne do niesionych przez wektor. Obie metody mogą być użyte do modyfikacji lub inaktywacji genu; dodatkowo, metoda (a) może posłużyć do przygotowania fuzji genowej [np. Smc-GFP fusion: Britton, Lin i Grossman (1998) GD 12: 1254-1259]. 210

Użycie wektora M13 pozwala na łatwe otrzymywanie jednoniciowych kopii danego genu. Najpierw gen (w postaci dwuniciowego fragmentu DNA) jest wbudowywany w kolistą, dwuniciową formę wektora M13 (patrz sekcja 9. 2. 2); replikacja M13 (w bakterii) tworzy jednoniciowe kopie genu wbudowanego do kolistej jednoniciowej formy M13 (ccc ssDNA). Jeden taki genom, niosący gen tarczowy (ten, do którego chcemy wprowadzić mutację), jest pokazany na schemacie. Na schemacie pokazana jest (powiększona) 15-20-nukleotydowa sekwencja genu tarczowego. W obrębie tej krótkiej sekwencji chcemy zastąpić deoksytymidynę (T) deoksycytydyną (C). Aby to zrobić, najpierw syntetyzujemy kopię komplementarnej sekwencji (oligonukleotyd 15-20-nukleotydowy) zawierający jedną błędnie podstawioną zasadę (mis-match) w określonym miejscu, czyli deoksyguanozynę (G) naprzeciwko deoksytymidyny (T). Każdy oligonukleotyd przyłączany jest następnie do kopii genu tarczowego (góra) i użyty jako starter do przeprowadzenia syntezy DNA in vitro (linia przerywana) (środek). Powstające cząsteczki dsDNA (każda z jednym błędnie podstawionym nukleotydem) są wprowadzane do bakterii na drodze transformacji. Mechanizmy naprawcze wewnątrz komórki bakteryjnej (sekcja 7. 7) korygują błąd, czasem zamieniając Τ na C, czasem G na A. Nawet bez udziału mechanizmów naprawczych replikacja dupleksu z błędnie podstawionym nukleotydem produkowałaby pewną liczbę cząsteczek z zaplanowaną dla mutanta sekwencją (po prawej na dole). Komórki zawierające Zmutowaną sekwencję mogą być zidentyfikowane przez np. hybrydyzację kolonijną (sekcja 6. 5. 1. 2), z użyciem znakowanych oligonukleotydów jako sond. Prostsze metody, z użyciem dostępnych obecnie dwuniciowych wektorów, opisano w sekcji 8. 5. 5. 2. 8. 5. 5. 3 Mutageneza transpozonowa

Potencjalne problemy, jakie mogą się pojawić przy mutagenezie z wykorzystaniem plazmidów (sekcja 8. 5. 5. 2), to: możliwość restrykcji (sekcja 7. 4) DNA plazmidowego wewnątrz komórki bakterii oraz ewentualne niepowodzenia homologicznej rekombinacji. Drugi problem można ominąć dzięki zastosowaniu transpozonów (sekcja 8. 3). 211

(a) Kolisty plazmid skonstruowany in vitro niosący gen markerowy (pięć kropek, góra plazmidu) oraz fragment DNA odpowiadający kodującej części sekwencji chromosomowego genu „tarczowego"; lewy fragment genu zaznaczono czarnym kolorem, prawy — białym, aby pomóc w śledzeniu losów każdej części fragmentu DNA. Plazmid jest wprowadzany na drodze transformacji do populacji komórek zawierających gen tarczowy. Wewnątrz komórki następuje rekombinacja pomiędzy fragmentem w plazmidzie i odpowiadającą mu sekwencją (homologiczną) w chromosomowym genie tarczowym (także oznaczonym kolorami czarnym i białym). Proces wymaga pojedynczego crossing-over: powstania dwuniciowego pęknięcia zarówno w plazmidzie, jak i genie tarczowym (w miejscu czarno/białego połączenia) oraz krzyżowego połączenia końców, z wytworzeniem ciągłej struktury. Zauważ, że: 1) do chromosomu w obrębie sekwencji genu tarczowego wbudowany został cały plazmid; 2) część kodującej sekwencji genu została zduplikowana (czarny/biały... czarny/biały); z tego powodu proces jest czasem nazywany rekombinacją insercyjno-duplikacyjną (lub integracją typu Campbella). Gen markerowy może kodować jakąkolwiek cechę przydatną do selekcji (np. oporność na antybiotyk), tak aby rekombinanty można było łatwo wyselekcjonować na odpowiednim podłożu lub w odpowiednich warunkach. Zauważ, że proces ten musi przebiegać w warunkach, w których niemożliwa jest autonomiczna replikacja plazmidu; w dzielących się komórkach może on po wbudowaniu się do chromosomu replikować się tylko jako część chromosomu (w stanie zintegrowanym). Zapewnia to, iż selekcjonując komórki z wykorzystaniem markera plazmidowego będziemy identyfikować tylko te, które mają plazmid wbudowany w interesujący nas gen chromosomowy. (Gdyby plazmid mógł replikować się autonomicznie, nie byłoby możliwe odróżnienie poprzez selekcję komórek niosących plazmid autonomiczny od wbudowanego w chromosom). Jeżeli fragment niesiony przez plazmid zawiera Zmutowaną formę końca genu tarczowego, insercja plazmidu spowoduje po prostu zastąpienie „dzikiego typu" końca genu przez Zmutowany fragment z plazmidu — rezultatem będzie więc powstanie kompletnego (tzn. nieprzerwanego) chromosomowego genu ze zmutowaną sekwencją (w chromosomie będzie znajdował się także cały DNA plazmidowy i zduplikowana sekwencja genu tarczowego). Jeżeli plazmid niesie dziką formę końcowej części genu tarczowego w postaci fuzji (w zgodnej ramce odczytu) z innym genem, Insercja plazmidu może spowodować, iż chromosom będzie kodował białko fuzyjne (sekcja 8. 5. 2). Jeżeli plazmid niesie fragment wewnętrznej sekwencji kodującej genu tarczowego, Insercja plazmidu spowoduje przerwanie sekwencji kodującej genu, powodując jego inaktywację.

212

Mutageneza z użyciem transpozonów stosowana jest na przykład do wykrywania sekrecyjnych i powierzchniowych białek bakterii patogennych; białka te są interesujące, ponieważ często ich obecność ma związek z wirulencją. Populacja badanego patogena jest mutagenizowana z użyciem transpozonów zawierających bezpromotorowy gen kodujący alkaliczną fosfatazę (phoA); transpozony te (TnphoA) wbudowują się przypadkowo w różne geny w obrębie populacji bakterii. Po wysianiu na płytki, komórki z pojedynczych kolonii są testowane, z użyciem chromogennego substratu, na obecność alkalicznej fosfatazy. Ponieważ substrat jest dostępny tylko dla enzymów komórkowych, każda kolonia dająca pozytywną reakcję (zmiana koloru) wskazuje na obecność fosfatazy wydzielonej poza komórkę lub związanej z jej powierzchnią. Ponieważ phoA nie ma promotora i sekwencji sygnałowej (sekcja 7. 6), tworzenie pozakomórkowej fosfatazy przez komórki wskazuje, że TnphoA wbudował się do genu kodującego sekrecyjne lub powierzchniowe białko, jako że: • phoA jest w odpowiedniej ramce odczytu i jest transkrybowany z genomowego promotora, • sygnałowa sekwencja genu, do którego jest wbudowany phoA, umożliwia sekrecje fosfatazy. Gen przerwany przez TnphoA jest teraz prawdopodobnie niefunkcjonalny, a jeżeli jest to gen wirulencji, wirulencja komórek zmutowanego klonu może być w znaczący sposób zmieniona. Taki klon mutanta można poddać testowi na wirulencję, a odpowiedni gen wyizolować i poddać dalszej analizie (np. sekwencjonowaniu). Zauważmy, że niezależnie od przypadkowości insercji transpozonu metoda ta jest selektywna w taki sposób, iż pozwala na identyfikację specyficznych (sekrecyjnych i powierzchniowych) białek i kodujących je genów. Protokół dotyczący przeprowadzenia mutagenezy transpozonowej w Haemophilus influenzae opisuje system nośnikowy posiadający specyficzną sekwencję sygnałową niezbędną do pobierania DNA na drodze transformacji (ang. uptakesignal system). System ten może być przydatny do badania regulacji genów i „nokautowania" (ang. knock-out) fenotypów u tej bakterii [Kraib, Schlor i Reidl (1998) AEM 64: 4697-4702]. Mutageneza typu STM (ang. signature-tagged mutagenesis) może być wykorzystana do wykrywania tych genów wirulencji, których ekspresja w patogenie jest konieczna do wzrostu wewnątrz komórki gospodarza. Zasady metody są przedstawione na rysunku 8. 23. Błędne rezultaty w STM mogą wynikać z nieprzypadkowej intergracji danego genu wirulencji (i brakiem sposobu jego wykrycia). (b) W tym przypadku plazmid zawiera fragment genu tarczowego (biały), zawierający Zmutowany region (pięć kropek); chromosomowa sekwencja odpowiadająca temu fragmentowi jest pokazana jako biały region — poniżej. W tym przypadku wymiana krzyżowa może nastąpić po obu stronach zmutowanego fragmentu, czego wynikiem będzie wymiana materiału pomiędzy plazmidem i chromosomem; Zmutowana sekcja genu będzie przeniesiona z plazmidu do genu tarczowego, a odpowiednia „dzikiego typu" sekwencja — z chromosomu do plazmidu. W ten sposób określona mutacja może być wprowadzona do wybranego genu. Jeżeli zamiast zmutowanego regionu genu, fragment wbudowany w sekwencję kodującą genu tarczowego będzie zawierał plazmidowy gen markerowy (lub inny obcy DNA), nastąpi insercyjna Inaktywacja genu tarczowego.

213

Unikatowa sekwencja („etykietka") o długości około 40 par zasad jest włączona do każdego typu transpozonu w populacji, tzn. „etykietka" jest inna w każdym transpozonie. Każda z nich zawiera po obu stronach krótkie miejsca wiązania starterów. Miejsca te są identyczne w każdym transpozonie. Transpozony są użyte do mutagenizowania patogena, wbudowywane są one przypadkowo, w różne geny w różnych komórkach. Mutagenizowane komórki są wysiewane na płytki w celu otrzymania pojedynczych kolonii. Określona kolonia zawiera klon zmutowanych komórek, z których każda niesie taki sam unikatowo oznakowany etykietką transpozon w tym samym genie. Poszczególne kolonie są wykorzystywane do założenia oddzielnych hodowli (odpowiednio uszeregowanych) w studzienkach płytki serologicznej (używanej np. do testu ELISA). Płytka pokazana na rysunku ma 30 studzienek, ale zwykle używa się płytek większych. Wykonuje się na membranach dwie repliki (poprzez „dot blotting") pierwotnej płytki, repliki te są przeznaczone do badań hybrydyzacyjnych; w replikach komórki poddaje się lizie, a ich DNA chromosomowy jest utrwalany i wiązany z membraną. Następnie z każdej studzienki pobiera się komórki i łączy w jedną pulę. Pula ta jest wykorzystywana do dwóch celów. Po pierwsze stanowi ona inokulum do zakażania zwierząt testowych.

214

Fałszywie dodatni wynik można otrzymać, gdy np. transpozon włączy się do „niewirulentnego" genu w komórce, która (przypadkiem) już zawierała mutację w genie wirulencji. Niemniej jednak system STM był użyteczny np. do identyfikowania wysp patogenności (sekcja 11. 5. 7) w Salmonella typhimurium. 8. 5. 5. 4 Mutageneza w genach gospodarza w celu badania interakcji między patogenem a jego gospodarzem Inaktywacja pewnych genów gospodarza dostarczyła cennych informacji na temat ich roli we wzajemnych oddziaływaniach między patogenem a jego gospodarzem. W „znokautowanych" myszach, Inaktywacja różnych genów układu odpornościowego, jak się okazało, modyfikowała wrażliwość zwierząt na pewne bakterie (przykłady: tab. 8. 2).

Po drugie, komórki tej puli poddaje się lizie, a ich DNA używa w reakcji PCR (sekcja 8. 5. 4) z wyznakowanymi starterami w celu amplifikowania unikalnych etykietek wszystkich transpozonów w puli. Zamplifikowane etykietki następnie stosuje się jako sondy (sekcja 8. 5. 3) do jednej z replik na membranach. W replice tej (Replika 1) każda unikalna etykietka powinna hybrydyzować z DNA z komórki zawierającej odpowiadający jej transpozon. Ten proces wstępnego przeszukiwania (Replika 1) sprawdza wydajność amplifikacji unikalnych etykietek w puli (takie wstępne przeszukiwanie nie jest potrzebne, jeżeli używamy zestawu „specjalnych" etykietek [Wren (1998) TIM 6: 51]. ) Następnie odzyskuje się patogena z testowanego zwierzęcia przez wysiew na płytki. Otrzymane kolonie łączy się (tworząc „odzyskaną pulę") i stosuje reakcję PCR (ze znakowanymi starterami) w celu zamplifikowania etykietki każdego klonu w tej puli. Zamplifikowane, znakowane etykietki są następnie użyte jako sondy do hybrydyzacji z drugą repliką na membranie (Replika 2). Spośród wszystkich oryginalnych, mutagenizowanych komórek (w wyjściowej puli), interesujące nas komórki to te, które w wyniku mutacji wywołanej przez transpozon nie są zdolne do zakażania zwierzęcia testowego, czyli te, których wirulencja została obniżona. Takie komórki będą nieobecne (lub będzie ich bardzo mało) w puli „odzyskanej" (w porównaniu z liczbą komórek, które rozwijają się w zwierzęciu testowym normalnie). Skutkiem tego znakujące etykietki tych komórek o obniżonej wirulencji (atenuowanych) będą obecne w wyjściowej puli, a nieobecne (lub nieliczne) w puli odzyskanej. Komórki mogą być zidentyfikowane dzięki temu, że hybrydyzują do pierwszej repliki, a nie hybrydyzują wcale (lub słabo) do drugiej. (Jeżeli użyte były „specjalne" etykietki, komórki o obniżonej wirulencji byłyby zidentyfikowane przez brak hybrydyzacji w pierwszym etapie testu. ) Z każdego klonu o obniżonej wirulencji, odpowiedzialne za to geny (identyfikowane dzięki wbudowanemu do nich transpozonowi) mogą być izolowane i sekwencjonowane do dalszych badań.

215

8. 5. 6 Sekwencjonowanie DNA Pierwotnym źródłem informacji w DNA jest sekwencja budujących go nukleotydów (sekcja 7. 1). Znając sekwencję nukleotydów możemy na przykład przewidzieć skład białka — identyfikując najpierw odpowiedniki kodonów inicjujących i terminacyjnych (sekcja 7. 6). (Zauważmy jednak, że pewne białka podlegają potranskrypcyjnym i potranslacyjnym modyfikacjom, tak że skład dojrzałego białka nie musi dokładnie odpowiadać sekwencji DNA, która je koduje). Możemy także badać promotory i inne sekwencje kontrolne oraz identyfikować takie cechy jak sekwencje REP (sekcja 16. 2. 2. 5). W genach eukariotycznych porównanie sekwencji genu z odpowiadającym mu cDNA może wskazać liczbę, pozycję i sekwencje intronów (sekcja 8. 5. 1. 2). Jedna z metod sekwencjonowania jest przedstawiona na rysunku 8. 24. Jednoniciowa matryca do sekwencjonowania może być przygotowana w asymetrycznej reakcji PCR (sekcja 8. 5. 4. 2) — zamiast klonowania w wektorze M13 — z użyciem starterów komplementarnych do znanej sekwencji po którejkolwiek stronie sekwencji nieznanej. Jednoniciowe matryce mogą też być przygotowane z wykorzystaniem wektorów fagmidowych (sekcja 8. 5. 1. 5). (Patrz także sekcja 8. 5. 4. 5. )

Rys. 8. 24 Określanie sekwencji nukleotydowej sklonowanego fragmentu DNA (czyli tzw. sekwencjonowanie): metoda terminacji łańcucha wg Sangera (metoda dideoksy) (schemat) Fragment przeznaczony do sekwencjonowania musi być otrzymany w formie jednoniciowej — np. przez klonowanie w fagu M13 (patrz sekcja 9. 2. 2 i rys. 8. 20). W omawianym przykładzie nieznaną sekwencją jest TCT... AGC (góra). Jeżeli klonowanie było przeprowadzone w fagu M13, nieznana sekwencja została wbudowana do jego genomu, będzie więc otoczona (oflankowana) z każdej strony przez jednoniciowy fagowy DNA. Skutkiem tego DNA po AGC w kierunku 5' do 3' (linia przerywana) zawiera znaną sekwencję nukleotydów, co pozwala skonstruować znakowany starter (czarna kropka), który będzie się wiązał za nieznaną sekwencją (góra), tak że pierwszy nukleotyd dodawany do startera będzie tworzył parę z pierwszym 3' nukleotydem nieznanej sekwencji. Syntezę DNA in vitro w laboratorium prowadzi się w mieszaninie reakcyjnej zawierającej: matryce, startery, cztery typy trifosforanów deoksyrybonukleotydów (dNTP: dATP, dCTP, dGTP i dTTP — tabela 7. 1) oraz polimerazę DNA. Po związaniu się z matrycą starter jest wydłużany w kierunku 5' do 3' przez dodawanie nukleotydów w kolejności określonej przez sekwencję matrycy. W celu sekwencjonowania przygotowuje się cztery oddzielne mieszaniny reakcyjne (G, C, T, A) — każda zawierająca wszystkie wymienione wyżej składniki (łącznie z milionami kopii nieznanej sekwencji matrycy i starterem). Ponadto każda mieszanina zawiera określony fosforan dideoksyrybonukleotydu (ddNTP) (rys. 7. 2); tak więc mieszanina G zawiera frifosforan dideoksyguanozyny (ddG), mieszanina C — ddC, mieszanina Τ — ddT i mieszanina A — ddA. Gdy do rosnącego łańcucha DNA zostanie dodany dideoksyrybonukleotyd, uniemożliwia on dodanie kolejnego nukleotydu, gdyż nie zawiera grupy 3'-OH niezbędnej do wytworzenia następnego wiązania fosfodiestrowego (rys. 7. 4). Tak więc wydłużanie startera zostaje zatrzymane (= terminacja łańcucha) w każdej pozycji, gdzie został włączony dideoksyrybonukleotyd. W danej mieszaninie reakcyjnej stężenie ddNTP jest takie, że w większości rosnących nici synteza zostanie na pewnym etapie zahamowana w wyniku włączenia dideoksyrybonukleotydu. Ponieważ dany ddNTP może tworzyć parę z każdą komplementarną zasadą w matrycy, terminacja łańcucha może nastąpić w różnych miejscach na różnych kopiach nici matrycowej — tak że jako produkty powstają nici o różnych długościach. Na przykład, z ddG (patrz schemat) powstają trzy produkty różnej długości, ponieważ

216

podczas wydłużania startera ddG może parować z resztą cytozyny w trzech różnych regionach matrycy; zauważ, że w tym przypadku długość danego produktu nici zależy od lokalizacji reszty cytozyny w nieznanej sekwencji. Analogiczne reguły mają zastosowanie do innych ddNTP. Po zakończeniu reakcji nowe produkty są oddzielane od matryc przez działanie formamidem. Każdą z czterech reakcji poddaje się elektroforezie w oddzielnej ścieżce żelu poliakryloamidowego. Podczas elektroforezy małe produkty w określonym czasie wędrują dalej niż duże; można rozróżnić produkty odmienne co do długości tylko o jeden nukleotyd. Żel zawiera mocznik, co hamuje parowanie między powstałymi powstałymi nićmi a matrycą. Hamuje on także wytwarzanie wewnątrznidowych struktur. Jest to ważne, ponieważ dalsza analiza polega na porównywaniu długości wszystkich wytworzonych nici w każdej reakcji, aby wydedukować miejsce danej zasady w matrycy (patrz powyżej), a to wymaga, aby długość każdej powstałej nici była ściśle proporcjonalna do jej elektroforetycznej ruchliwości, tzn. do lokalizacji prążka w żelu (gdyby tworzyły się jakiekolwiek wewnątrzniciowe połączenia zasad, produkty nie lokowałyby się w żelu w pozycji proporcjonalnej do ich długości). Po elektroforezie żel jest suszony. Jeżeli startery są znakowane 3 2 P, prążki produktów reakcji mogą być zlokalizowane w żelu autoradiograficznie: przez ekspozycję filmu fotograficznego wobec żelu i wywołanie go. W innej metodzie sekwencjonowanie jest prowadzone z użyciem starterów znakowanych biotyną. Po elektroforezie materiał z żelu jest przenoszony (blotting) na membranę, którą poddaje się działaniu alkalicznej fosfatazy skoniugowanej ze streptawidyną (streptawidyna ma silne powinowactwo do biotyny); prążki produktów mogą być wykryte przez użycie chemiluminescencyjnego substratu, np. CSPD (sekcja 8. 5. 3). Położenie prążków (lewa strona na dole) wskazuje relatywną długość utworzonej nici; zauważ, że pierwszy nieznany 3' nukleotyd (C) jest identyfikowany przez najkrótszy produkt, który wędrował najdalej, a to, że produkt ten pochodzi z mieszaniny G, wskazuje zasadę, z którą wytworzyła parę G, czyli C. Analogicznie, następna nieznana zasada (G) jest kolejnym najkrótszym produktem pochodzącym z mieszaniny C, wskazując na obecność G w matrycy. W ten sposób możemy kolejno określać położenie każdego nukleotydu w matrycy. Po prawej stronie na dole. Część autoradiogramu żelu sekwencyjnego (dzięki uprzejmości Joopa Gakena, z Molecular Medicine Unit, King's College, London).

217

Odczytanie sekwencji do długości około 500 nukleotydów można przeprowadzić z jednego startera. Dalsze sekwencjonowanie danego fragmentu może być dokonane przez usuwanie nukleotydów z dwuniciowego fragmentu w kierunku odczytywanej sekwencji (czyli skracanie go) i sekwencjonowanie następnego jednoniciowego fragmentu z nowego startera. Proces ten może być powtarzany, (umiejscowione delecje, ang. nested deletions) aż zostanie zsekwencjonowany cały fragment. Gdy cały genom (chromosom) został już raz zsekwencjonowany, badania porównawcze jego odmiennych form mogą być przeprowadzane metodami wykorzystującymi sondy molekularne, jak to opisał Chee i wsp. [(1996) Science 274: 610-614]. Oporność na antybiotyki u Mycobacterim tuberculosis wykrywano np. zaadaptowaną do tego celu tzw. metodą „dideoksy", czyli metodą Sangera (sekcja 15. 4. 11. 2).

8. 5. 7 Ekspresja genów eukariotycznych w bakteriach: ograniczenia Większość genów eukariotycznych nie może ulegać ekspresji (wyrażaniu) w bakteriach, bakterie bowiem nie potrafią (na przykład) radzić sobie z ich intronami — stąd konieczność stosowania cDNA (sekcja 8. 5. 1. 2). Dodatkowo, wiele eukariotycznych białek podlega potranslacyjnym modyfikacjom, na przykład — enzymatycznym cięciom lub dodawaniu oligosacharydów (glikozylacja) w określonych miejscach. Te specyficzne modyfikacje, które zachodzą w komórkach eukariotycznych i są z reguły niezbędne do uzyskania normalnej aktywności biologicznej białek, nie mogą być przeprowadzone przez bakterie. Z wymienionych powodów badanie ekspresji genów musi być prowadzone w komórkach eukariotycznych, co z kolei jest utrudnione za względu na złożoność ich systemów kontrolnych. W celu przezwyciężenia tego problemu do kontroli genów w komórkach eukariotycznych zastosowano pewne dobrze scharakteryzowane bakteryjne systemy regulacyjne [Gossen, Bonin i Bujard (1994) TIBTECH 12: 58-62]. Alternatywnie do stosowania systemów bakteryjnych, badanie ekspresji genów eukariotycznych może być przeprowadzane z użyciem sztucznych chromosomów drożdżowych, YAC (sekcja 8. 5. 1. 5); na przykład geny dzikiego typu sklonowane w YAC mogą być wprowadzone do mutantów komórek eukariotycznych w celu badania komplementacji (czyli zdolności genów do kompensowania defektu odpowiadających im zmutowanych genów obecnych w tej samej komórce).

8. 5. 8 Funkcjonalna analiza DNA genomowego Sekwencjonowanie DNA genomowego z różnych gatunków pozwoliło ujawnić wiele nieznanych funkcji genów. Systematyczne podejście do funkcjonalnej analizy DNA z Rhodobacter capsulatus opisali Kumar, Fonstein i Haselkorn [(1996) 218

Nature 381: 653-654]. Metoda ta wykorzystuje zestaw 192 kosmidów (rys. 8. 16), których zachodzące na siebie inserty sumarycznie pokrywają cały (3, 7 mln pz) chromosom R. capsulatus. Każdy kosmid był trawiony enzymem restrykcyjnym EcoRV, a powstające fragmenty (wielkości genów lub operonów) analizowano metodą tzw. Southern blotting (rys. 8. 14) — wykonano więc 192 prób. Komplet prób (ang. blots) reprezentuje zatem cały chromosom w taki sposób, że każdy fragment ma w chromosomie swój odpowiednik wielkości kosmidu. Wspólnie, te 192 próby użyto jako „wysokiej rozdzielczości matrycę do hybrydyzacji" (HRHT, ang. high-resolution hybridization template) w celu wykrywania zmienionych wzorów transkrypcji w różnych warunkach fizjologicznych. Na przykład bakterie poddane szokowi cieplnemu (sekcja 7. 8. 2. 3) dawały inny wzór transkrypcyjny niż pochodzące z normalnych warunków. Całkowity RNA (sekcja 8. 5. 1. 2) izolowany z takich komórek może być odpowiednio wyznakowany i użyty jako sonda (sekcja 8. 5. 3) do identyfikowania różnych regionów chromosomu zawierających sekwencje, które są aktywne w badanych warunkach. W ten sposób specyficzne miejsca chromosomu mogą być korelowane z określonym fizjologicznym stanem komórki. Metoda HRHT może być także zastosowana np. do badania wzorów transkrypcji mutantów delecyjnych R. capsulatus.

8. 5. 9 Metody amplifikowania DNA inne niż PCR 8. 5. 9. 1 Łańcuchowa reakcja ligacji (LCR) (ang. ligase chain reaction) Podobnie jak w PCR, również w LCR wykorzystuje się cykle termiczne, w których jest faza ogrzewania — do rozdzielenia nici matrycy; kiedy nici są już rozdzielone, dwa oligomery wiążą się z każdą nicią matrycy w taki sposób, że oligomery na odpowiedniej nici pokrywają całą sekwencję tarczową (amplikon) (rys. 8. 25). Jeżeli obydwa oligomery poprawnie sparują z amplikonem, zostaną ze sobą połączone przez termooporną ligazę (ligacja: sekcja 8. 5. 1. 6. ). Cykle reakcji są powtarzane np. 25 razy. Zauważmy, że aby nastąpiła ligacja: 1) dwa oligomery muszą być tak ustawione obok siebie, aby ich zasady parowały poprawnie z nukleotydami nici matrycowej (chociaż dopuszczalne są pojedyncze niedopa-

Jedna z dwóch nici dupleksowego DNA zawierająca amplikon (czyli sekwencję tarczową) jest pokazana na górze schematu: 3'-AT... AC-5'. Dwa oligomery (każdy zaznaczony ramką) przyłączają się na zasadzie komplementarności zasad do sekwencji tarczowej i zostaną zligowane; zauważ, że aby mogło się utworzyć wiązanie fosfodiestrowe, koniec 5' nukleotydu znajdującego się po prawej stronie musi być ufosforylowany (rys. 7. 4). Dwa inne oligomery będą się przyłączały do sekwencji tarczowej drugiej nici dupleksowego DNA i także ulegną zligowaniu (nie pokazano na schemacie). Aktualnie, do celów handlowych stosuje się bardziej złożoną formę LCR niż przedstawiona na schemacie.

219

sowania zasad w oligomerze), i 2) koniec 5' jednego oligomeru w każdej parze musi być ufosforylowany. Zajście ligacji i amplifikacji dowodzi obecności danej sekwencji tarczowej w próbce. 8. 5. 9. 2 Amplifikacja oparta na sekwencji kwasów nukleinowych (NASBA, ang. nucleic acid sequence-based amplification) Metoda ta jest przeznaczona głównie do amplifikacji specyficznych sekwencji w RNA, a jej przebieg jest naszkicowany na rysunku 8. 26. NASBA jest bardziej skomplikowana niż PCR, ale przebiega w temperaturze np. 41°C i nie wymaga cykli termicznych. Podobny proces nazywany amplifikacją za pośrednictwem transkrypcji (TMA, ang. transcription-mediated amplification) jest wykorzystywany do wykrywania obecności Mycobacterium tuberculosis (sekcja 16. 1. 6. 1). Co ciekawe, amplifikację RNA w procesach NASBA/TMA zaplanowano opierając się na wzorze strategii replikacyjnej retrowirusów. Techniki te są omówione w artykule przeglądowym: [Chan i Fax (1999) RMM 10: 185-196]. Produkty NASBA mogą być wykrywalne, podobnie jak w przypadku PCR, przez identyfikację metodą wybarwienia lub hybrydyzacji określonych prążków po elektroforezie w żelu. Jednakże ostatnio wprowadzono metodę umożliwiającą wykrycie produktów podczas amplifikacji. W metodzie tej wykorzystuje się tzw. molekularne sondy świetlne (ang. molecular beacon probes). Każda sonda jest jednoniciowym oligonukleotydem, którego końce tworzą pary, formując sekwencję dwuniciowa, w wyniku czego cząsteczka ma strukturę „trzonka i pętli". Sekwencja w rejonie pętli jest taka jak sekwencja tarczowa, czyli komplementarna do sekwencji produktu — RNA. W rejonie trzonka jedna nić zawiera barwnik fluorescencyjny, a druga — wygaszacz fluorescencji. Jeśli brak produktu w postaci RNA, sonda nie fluoryzuje. Kiedy pętla sondy zwiąże się ze specyficznym produktem, struktura sondy zmienia się tak, że barwnik i wygaszacz są rozdzielone, czyli sonda staje się aktywnym fluoroforem. Tego typu sondy są włączane do mieszaniny reakcyjnej NASBA i amplifikacja sekwencji tarczowej może być monitorowana przez pomiar wzrastającego stopnia fluorescencji. [Molecular beacon probes in NASBA: Leone et. al. (1998) NAR 26: 2150-2155. ] Takie sondy (typu „beacon probes") w porównaniu z konwencjonalnymi sondami liniowymi o równoważnej długości mają większą specyficzność. Tak więc pojedynczy błąd w parowaniu zasad między sondą i sekwencją tarczową może być tą metodą łatwiej zidentyfikowany; wiązanie sondy typu „beacon probe" do takiej sekwencji jest mniej stabilne niż sondy liniowej. Termodynamiczne podstawy tej wzmożonej specyficzności są dyskutowane przez Bonnet i wsp. [(1999) PNAS 96: 6171-6176]. Amplifikacja przez odsunięcie nici (SDA, ang. strand displacement amplification) jest inną izotermalną (nie wykorzystującą cykli termicznych) metodą stosowaną głównie do amplifikacji DNA, chociaż może też amplifikować RNA, gdy do początkowego etapu włączymy odwrotną transkryptazę. Procedura jest opisana przez Walkera i wsp. [(1992) NAR 20: 1691-1696; NAR (1966) 24: 348-353]. 220

1. Pokazana jest nić RNA ze wskazaną sekwencją tarczową (amplikonem) odznaczoną dwiema krótkimi liniami pionowymi. Starter (starter 1) związał się z końcem 3' amplikonu. Koniec 5' tego startera jest oznakowany krótką sekwencją (•) zawierającą promotor (sekcja 7. 5) polimerazy RNA. 2. Enzym odwrotna transkryptaza (sekcja 8. 5. 1. 2) starter, z utworzeniem nici cDNA. 3. Enzym RNaza Η zdegradował (usunął) nić RNA, a drugi starter (starter 2) związał się z amplikonem w sekwencji cDNA. 4. Odwrotna transkryptaza (która także może syntetyzować na matrycy DNA) wydłużyła starter tworząc dwuniciowy cDNA, tak że powstał funkcjonalny (dwuniciowy) promotor. Polimeraza RNA (O) przyłączyła się do promotora i będzie syntetyzowała nić RNA w kierunku strzałki, tzn. w kierunku 5' do 3'. 5. Powstała nowa nić RNA. Zauważ polarność nici: jest ona komplementarna do amplikonu w wyjściowej próbce RNA (porównaj etap 5 z 1). 6. Starter 2 związał się z nicią RNA. 7. Odwrotna transkryptaza przeprowadziła syntezę cDNA na nici RNA. 8. RNaza Η usunęła nić RNA, a starter 1 przyłączył się do sekwencji amplikonu w cDNA. 9. Odwrotna transkryptaza przeprowadziła syntezę komplementarnej nici cDNA; polimeraza RNA przyłączyła się do promotora i wytworzy nić RNA identyczną z tą pokazaną w etapie 5. Powtarzanie się pokazanych cykli reakcji spowoduje powstanie wielu kopii amplikonu w formie komplementarnego RNA i cDNA.

221

8. 5. 10 Rekombinacyjna streptokinaza — przykład technologii rekombinowania DNA Streptokinaza jest białkiem, które w naturze jest wytwarzane przez pewne gatunki Streptococcus. Ma ono zdolność przemiany ludzkiego plazminogenu do plazminy (fibrynolizyny), enzymu, który rozkłada włókna fibryny. Tak więc podczas infekcji streptokinaza może działać jako agresyna (sekcja 11. 3. 2) — wspomagając rozprzestrzenianie się infekcji przez ułatwianie lizy fibrynowych barier, które mogą otaczać (a więc lokalizować) uszkodzenia wywołane przez streptokoki. Zainteresowanie streptokinazą jako czynnikiem terapeutycznym wynika z jej zdolności do rozpuszczania fibrynowych komponentów skrzepów krwi, co jest istotne w leczeniu np. zakrzepicy. Wykorzystując dotychczasowe źródło streptokinazy — streptokoki — uzyskuje się małą wydajność, natomiast możliwość wyrażania się genu streptokinazy w E. coli (patrz rys. 8. 27) pozwala osiągnąć wydajność nawet ponad dziesięciokrotnie większą [Estrada i wsp. (1992) Biotechnology 10: 1138-1142].

8. 5. 11 Nadprodukcja białek rekombinacyjnych w Escherichia coli — strategie optymalizacji ekspresji genu „Nadprodukcja" odnosi się do syntezy w ilości ponad normę specyficznych białek — zazwyczaj białek heterologicznych („obcych"), w warunkach eksperymentalnych. Wykorzystano to w procedurze stosowanej np. do produkcji czynników terapeutycznych, jak opisana wyżej streptokinaza (sekcja 8. 5. 10). Rys. 8. 27 Ekspresja genu streptokinazy w E. coli (sekcja 8. 5. 10); szkic technologii klonowania DNA [Estrada i wsp. (1992) Biotechnology 10: 1138-1142]. Komórki Streptococcus equisimilis są lizowane, izolowany jest ich genomowy DNA, a gen kodujący streptokinazę (lecz bez sekwencji sygnałowej) powielany techniką PCR (sekcja 8. 5. 4); wcześniejsze badania sugerowały, że sekwencja sygnałowa tego genu może powodować problemy z jego ekspresją w E. coli. Dwie nici genu streptokinazy są pokazane w górnej części rysunku. Startery do PCR to: 5'-GGAATTCATGATTGCTG... 3' (starter SK2) i 5'-TGGATCCTTATITG... 3' (starter SK3). Zauważ, że matryca, na której jest wydłużany SK2, jest nicią kodującą („nić sensowna"), czyli SK2 po pełnym wydłużeniu utworzy nić komplementarną do nici kodującej. Po kilkunastu cyklach PCR wzrośnie liczba nici utworzonych w reakcji PCR i zacznie działać jako matryca, a główny produkt PCR będzie taki jak pokazano w środkowej części rysunku; gen streptokinazy będzie otoczony (oflankowany) specyficznymi miejscami restrykcyjnymi (tab. 8. 1). Zauważ, że ATG w starterze SK2, kopiowane w nici kodującej, pojawi się jako 3'... TAC... 5' (patrz parowanie zasad, sekcja 7. 2. 1); podczas transkrypcji genu (sekcja 7. 5), odpowiadającym mu mRNA będzie 5'-AUG-3', czyli kodon inicjujący (sekcja 7. 6). (Patrz także notka 3 w tab. 7. 2. ) Sekwencja ATT (w starterze SK2) będzie odpowiadała leucynie. Starter SK3, po pełnym wydłużeniu przez PCR, tworzy nić kodującą; zauważ, że 5'-TTA-3' (w SK3) odpowiada w mRNA kodonowi UAA, czyli ochre (jest to kodon stop, tab. 7. 2). Fragment zamplikowany metodą PCR (środkowa część rysunku) jest wbudowywany do plazmidu pTrp pomiędzy miejsca restrykcyjne BamHI i EcoRI, tworząc plazmid pEKG-3 (obydwa plazmidy dla uproszczenia przedstawione w formie jednoniciowej); trp jest promotorem operonu tryptofanowego E. coli, RBS miejscem wiązania rybosomu (rys. 8. 16), a terminator to terminator transkrypcji (sekcja 7. 5), Ampr oznacza oporność na ampicylinę.

222

Szczep E. coli jest transformowany (sekcja 8. 4. 1) plazmidem pEKG-3, a transformowane komórki wysiewane na podłoże zawierające ampicylinę w celu wyselekcjonowania tych, które pobrały pEKG-3. Wybieranych jest kilkanaście kolonii, w których sprawdza się obecność genu streptokinazy. Zidentyfikowane geny mogą być następnie klonowane przez namnożenie komórek z kolonii zawierających właściwą sekwencję. W pEKG-3 do kontroli transkrypcji genu streptokinazy wykorzystywany jest promotor operonu tryptofanowego, trp, E. coli. W E. coli w regulacji promotora trp uczestniczy białko represorowe (TrpR, kodowane przez gen trpR); w obecności tryptofanu, TrpR powoduje represję transkrypcji z promotora trp. Pewne szczepy E. coli (mutanty) nie tworzą TrpR; szczep wybrany do wyrażania genu streptokinazy (E. coli W3110) jest jednym z tych, o których wiemy, że tworzą TrpR, czyli szczepem z „dzikim typem" allelu genu trpR. W szczepie W3110 transkrypcja z promotora trp może być zaindukowana („włączona"), gdy jest taka potrzeba, przez użycie analogu tryptofanu, kwasu 3-β-indoloakrylowego), jako induktora (porównaj z allolaktozą w operonie lac — rys. 7. 11). Podczas wzrostu W3110 maksymalną ekspresję genu streptokinazy otrzymywano, gdy liczba kopii plazmidu na komórkę wynosiła 420. Syntetyzowana streptokinaza pozostawała w formie wewnątrzkomórkowej (przypomnienie: gen został pozbawiony sekwencji sygnalnej); wydajność produkcji enzymu wynosiła 25% całkowitej ilości białek komórkowych. Po zlizowaniu komórek rekombinacyjna streptokinaza była oczyszczana z zastosowaniem chromatografii powinowactwa (sekcja 8. 5. 1. 4), ze stałym nośnikiem (matriks) zawierającym ludzki plazminogen.

223

Chociaż E. coli jest szeroko wykorzystywana w procedurach nadprodukcji, nie może być użyta do ekspresji każdego genu. Na przykład, produkty pewnych genów eukariotycznych wymagają potranslacyjnej modyfikacji, która nie może zachodzić w prokariotach (patrz sekcja 8. 5. 7). W odniesieniu do genów, które mogą być wyrażane, uzyskanie opłacalnego, wysokiego poziomu ekspresji wymaga kontrolowania czynników mogących wpływać na końcową wydajność; pewne z nich uwzględniono niżej. Interesujący nas gen musi być oczywiście wbudowany do odpowiedniego wektora ekspresyjnego (rys. 8. 17). 8. 5. 11. 1 Optymalizacja transkrypcji

Promotor danego genu powinien być silny (sekcja 7. 8). Powinien być także „ściśle regulowany", czyli gen nie wyrażany przed jego celową indukcją lub derepresją. Dlaczego? Zazwyczaj komórki są hodowane do znacznej gęstości przed ekspresją danego genu w celu uzyskania maksymalnej ilości produktu. Ekspresja genu przed odpowiednim momentem może jednak np. zmniejszyć tempo wzrostu i ograniczyć końcową ilość rekombinacyjnego białka. Ścisła regulacja jest szczególnie ważna, jeżeli produkt genu jest toksyczny dla E. coli. Regulator transkrypcji musi także być odpowiednio dobrany w zależności od celu; tak więc np. induktor, IPTG, (rys. 7. 11), który jest toksyczny dla człowieka, nie jest optymalnym regulatorem stosowanym w nadprodukcji białek terapeutycznych. 8. 5. 11. 2 Optymalizacja translacji

Na wydajność translacji wpływa stopień zgodności sekwencji Shine-Dalgarno (SD) (sekcja 7. 6) i liczba nukleotydów między sekwencją SD a kodonem startowym. Ponadto, pewne geny kodują wzmacniacz (ang. enhancer) translacji nazywany też „downstream box" — specyficzną sekwencję nukleotydów poniżej, ale blisko kodonu startowego. Czynniki te powinny być uwzględniane przy konstrukcji efektywnego wektora ekspresyjnego. 8. 5. 11. 3 Problem ciałek wtrętowych

Ciałka wtrętowe (w omawianym kontekście) są nierozpuszczalnymi agregatami niezłożonych lub niepoprawnie złożonych białek, które często tworzą się w cytoplazmie podczas nadprodukcji. Ustalono, że białka takie mogą być później właściwie złożone in vitro; powstawanie ciałek wtrętowych może być w pewnym sensie korzystne, gdyż ułatwiają one oczyszczanie białkowego produktu (np. przez wirowanie), a także stanowią ochronę przed degradacją przez wewnątrzkomórkowe proteazy. Przyczyna powstawania ciałek wtrętowych nie jest, jak dotychczas, w pełni zrozumiała; w pewnych przypadkach składanie in vitro może powodować powstawanie, małej ilości (lub niepowstawanie w ogóle) produktu aktywnego biologicznie. Strategie radzenia sobie z tym problemem opierają się na: tworzeniu fuzji genów (sekcja 8. 5. 2) w celu zwiększenia rozpuszczalności, równoczesnej ekspresji białek opiekuńczych (ang. chaperones) (sekcja 7. 6) wspomagających składanie, modyfikacjach pH i obniżaniu temperatury wzrostu. Jednakże właś224

ciwe rozwiązania muszą być zazwyczaj ustalane empirycznie; bo np. nie wszystkie fuzje genów partnerskich będą zwiększały rozpuszczalność danego białka, a białka opiekuńcze odpowiednie do wspomagania składania konkretnego białka będą musiały być może dobrane metodą prób i błędów. 8. 5. 11. 4 Zapobieganie proteolizie

Cytoplazma E. coli zawiera wiele proteaz (enzymów degradujących białka), a również pewne z nich znajdują się w przestrzeni peryplazmatycznej, tak więc białkowy produkt genu powinien być niewątpliwie chroniony przed działaniem tych enzymów. Strategię zapobiegania lub minimalizowania proteolizy są następujące: (a) Produkt genu może być kierowany bezpośrednio do peryplazmy (gdzie jednak tych enzymów jest mniej) przez włączenie sekwencji sygnałowej (sekcja 7. 6) lub przez przeprowadzenie fuzji danego genu z genem białka peryplazmatycznego (np. DsbA). (b) Produkt genu może być zamieniany w produkt sekrecyjny przez fuzję jego genu z innym genem (np. α-hemolizyny — sekcja 5. 4. 1. 2), którego produkt jest transportowany na zewnątrz komórki. (c) Poszczególne miejsca w białku podatne na proteolizę mogą być eliminowane przez zmianę zapisu kodującej je sekwencji w taki sposób, aby nie wpłynęło to na funkcje białka. (d) Można wykorzystać szczep E. coli z mutacją w genie rpoH. Kumulacja „nienormalnych" lub heterologicznych białek w cytoplazmie (tak jak się dzieje podczas nadprodukcji) włącza odpowiedź szoku cieplnego (sekcja 7. 8. 2. 3) — czego wynikiem jest wytwarzanie proteazy Lon, degradującej nietypowe białka. Synteza proteazy Lon jest „włączana" przez produkt genu rpoH, natomiast mutant genu rpoH, defektywny w wytwarzaniu białka RpoH, jak wykazano, produkuje w E. coli znacznie większe ilości białek heterologicznych. Białka, których N-końcowym aminokwasem jest arginina, leucyna, lizyna, fenyloalanina, tryptofan lub tyrozyna, wykazują tendencję do niestabilności (mają krótkie okresy półtrwania — ang. short half-lives), co może sugerować potrzebę „przekodowania" białka. Zwróćmy uwagę, że przedostatni N-końcowy aminokwas w białku bakteryjnym jest także ważny, ponieważ po usunięciu końcowej N-formylometioniny (sekcja 7. 6) staje się on aminokwasem końcowym. Szczegółowy, poparty dobrymi referencjami, wyczerpujący opis możliwości optymalizacji ekspresji genów na wysokim poziomie przedstawił Makrides [MR (1996) 60: 512-538]. 8. 5. 11. 5 Odpowiedź komórki na nadprodukcję

W przytoczonym przykładzie dotyczącym streptokinazy (sekcja 8. 5. 10) nawet do 25% białek syntetyzowanych przez E. coli było komórce niepotrzebnych (to jest niefunkcjonalnych). Ze względów komercyjnych natomiast można to uznać za dobry wynik. Ale jak na taką sytuacje reagują same komórki? Jak wspomniano wyżej, kumulacja nietypowych białek włącza odpowiedź szoku cieplnego, co jest 225

W przedstawionym przykładzie, próbkę DNA stanowi region regulatorowy operonu galaktozowego (gal) E. coli, który zawiera miejsce startu transkrypcji (sekcja 7. 5), promotor Pl i miejsce wiązania białka CRP (=CAP) uczestniczącego w katabolicznej represji (sekcja 7. 8. 2. 1) operonu gal. Próbka na jednym końcu jest wyznakowana radioaktywnym fosforem (32P). Badano interakcje tego DNA z podjednostką α polimerazy RNA i CRP (=CAP). A dokładnie, celem analizy było zbadanie roli podjednostki α w aktywacji promotora P1 gał przez CRP. Zwróć uwagę, że podjednostka α i CRP są tylko częścią zespołu białek znajdujących się normalnie w miejscu promotorowym przy starcie transkrypcji in vivo; zespół białek zawiera inne podjednostki polimerazy RNA oraz czynnik sigma. Zauważ też, że CRP wiąże się z DNA jako dimer, czyli jednostka zawierająca dwie cząsteczki białka CRP. Fotografia pokazuje wzór elektroforetyczny sześciu eksperymentów „odcisku stopy" analizujących oddziaływania między próbką DNA i białkami w różnych kombinacjach: 1) podjednostka a polimerazy RNA, 2) dziki (czyli normalny) CRP i 3) CRP HL159 (Zmutowana forma CRP). W każdym eksperymencie próbka DNA była preinkubowana z białkami, poddawana działaniu DNazy I i analizowana elektroforetycznie. Ścieżka m jest rodzajem kalibracji, zawiera sekwencyjna drabinkę Maxama-Gilberta. W celu przygotowania takiej drabinki, wiele kopii znakowanych na końcu próbek DNA poddanych było chemicznemu działaniu siarczanu dimetylu, a następnie piperydyny, co powoduje specyficzne cięcie wiązania fosfodiestrowego pomiędzy guaniną (G) a przylegającą zasadą (rys. 7. 4). W odpowiednich warunkach, każda z wielu kopii DNA będzie przecięta przy jednej tylko z obecnych w niej zasad guaninowych. W wyniku tego, iż cięcie nastąpi w różnych kopiach próbki DNA przy różnych guaninach, otrzymamy fragmenty o szerokim zakresie długości. Podczas elektroforezy, fragmenty te (o różnej długości) poruszają się z różnym tempie, formując tzw. „drabinkę" widzianą w ścieżce m. Na lewo od ścieżki m podane są liczby wskazujące lokalizację niektórych zasad guaninowych w próbce DNA, stanowi to użyteczną skalę; na której -1 odpowiada pierwszej zasadzie od miejsca startu (patrz sekcja 7. 5). Miejsce wiążące CRP znajduje się pomiędzy zasadami -41 i -42. Ponieważ

226

wskaźnikiem stresu. Istotnie, przy wysokim poziomie zbędnych białek bakterie zaczynają degradować swoje własne rybosomy i rRNA, czyli dążyć do zahamowania translacji, a to może prowadzić do śmierci komórki [Kurland i Dong (1996) MM 21: 1-4)

8. 5. 12 Białka wiążące DNA — wybrane techniki Oddziaływania między białkami i DNA są ważne np. w transkrypcji (sekcja 7. 5. 1) i w inicjacji replikacji DNA. Informacje o takich oddziaływaniach mogą być użyteczne wobec zamiaru wprowadzania specyficznych zmian w DNA w celu manipulowania zdolnością wiązania białek do zmienionego DNA w badaniach nad regulacją ekspresji genów itp. Niżej przedstawiono pewne metody służące do wykrywania takich oddziaływań oraz określania miejsc wiążących w DNA.

8. 5. 12. 1 Metoda „Southwestem blotting" Technika ta pozwala wykryć białka wiążące DNA np. w lizatach komórkowych. Badana próbka jest poddawana elektroforezie, a białka rozdzielone w żelu są przenoszone metodą elektroblottingu na filtr nitrocelulozowy. Powinowactwo sekwencja nukleotydowa całego regionu regulatorowego gal jest już znana, podobnie jak lokalizacja promotorów oraz miejsca wiązania CRP, drabinka kalibracyjna może być łatwo wykorzystana do określenia położenia miejsc oddziaływania między DNA i białkami w eksperymentach „odcisku stopy". Ścieżka a pokazuje prążki fragmentów powstałych po cięciu próbki DNA przez DNazę I przy braku wiążących się białek. Fragmenty mają różną wielkość, ponieważ DNaza I może ciąć w wielu miejscach w każdej próbce. Wykrywalne będą jednak tylko fragmenty mające na końcu 3 2 P. Znaczy to, że z dwóch części powstałych przez przecięcie fragmentu DNA w próbce w żelu wykrywalny będzie tylko jeden (ten wyznakowany). Ścieżka b pokazuje wynik działania DNazy I na próbkę DNA w obecności podjednostki α polimerazy RNA. Nie widać „odcisku stopy", co wskazuje na brak oddziaływania pomiędzy próbką DNA i podjednostką α przy braku innych białek. Ścieżka c pokazuje „odcisk stopy" CRP (pomiędzy -29 i -54) (porównaj ścieżkę c ze ścieżką a). Obecność CRP nie spowodowała ochrony całego regionu przed działaniem DNazy I, ponieważ przypuszczalnie przedostała się ona przez szczelinę między dwoma cząsteczkami dimeru CRP. Ścieżka d pokazuje działanie DNazy I na próbkę DNA w obecności zarówno CRP, jak i podjednost ki α. Obecność podjednostki rozszerza „odcisk stopy" w obie strony. Sugeruje to, że podjednostka a może wiązać się do miejsc po obu stronach dimeru CRP; jednakże, związanie się powyżej CRP uznano za „prawdziwe" i ważne dla transkrypcji, wiązanie się poniżej CRP interpretowano jako artefakt ze względu na brak ograniczającego wpływu innych podjednostek polimerazy. Powód wystąpienia „odcisku stopy" w regionie -80 do -90 nie jest więc jasny. Ścieżka e i f pokazują wynik działania DNazy I na próbkę DNA w obecności zmutowanej formy CRP, odpowiednio z i bez podjednostki α polimerazy RNA. Wyniki wskazują, że ta konkretna mutacja CRP hamuje wiązanie pomiędzy CRP i podjednostką — ponieważ wpływ podjednostki (widoczny w ścieżce d) został ograniczony. Jako że mutacja w CRP wydaje się hamować wiązanie podjednostki a, okazuje się, że wiązanie pomiędzy normalną (niezmutowaną) formą CRP i podjednostką następuje w miejscu CRP, które zostało uszkodzone przez mutację. Zdjęcie przedrukowano z Attey i wsp. (1994) Nucleic Acid Research 22: 4375-4380 za pozwoleniem Oxford University Press i dzięki uprzejmości profesora S. Busby'ego z University of Birmingham UK.

227

danego białka do specyficznej sekwencji DNA może być następnie określone przez użycie znakowanych sekwencji DNA jako sond i wykrycie znacznika każdej sondy związanej z określonym białkiem. 8. 5. 12. 2 Badanie zmian ruchliwości elektroforetycznej (EMSA, ang. eiectrophoretic mobility-shift assay)

EMSA pozwala określić np., czy jakieś białko (w lizacie) może wiązać specyficzną sekwencję DNA. Znakowany DNA danej sekwencji inkubujemy z lizatem, aby umożliwić tworzenie kompleksów białko-DNA. Następnie elektroforetycznie rozdzielamy niezwiązaną formę DNA od DNA związanego; ruchliwość kompleksu białko-DNA będzie różna od ruchliwości wolnego DNA. 8. 5. 12. 3 Technika „białkowego odcisku stopy" (ang. footprinting)

W technice „odcisku stopy" sekwencja DNA, do której związało się białko, może być wykryta jako region DNA chroniony przed enzymatycznym (lub chemicznym) rozszczepieniem dzięki osłanianiu go przez związane białko. W praktyce, dwa komplety homologicznych fragmentów DNA, znakowanych na końcach (jeden komplet związany z białkiem) — są trawione enzymatycznie (lub chemicznie) najlepiej w warunkach, w których każdy fragment jest cięty tylko w jednym z kilku potencjalnych miejsc cięcia. Cięte fragmenty dają zbiór znakowanych subfragmentów o pewnym zakresie wielkości (w wyniku cięcia w różnych miejscach). Jeżeli we fragmentach związanych z białkiem, białka zasłaniają jedno lub więcej miejsc, żaden z tych fragmentów nie będzie się kończył w tym miejscu; kiedy więc dwa komplety fragmentów są porównywane elektroforetycznie, brak pewnej wielkości subfragmentów w próbie poddanej reakcji wiązania z białkiem przejawi się jako rodzaj luki (ang. gap) w szeregu prążków widocznych w żelu. Luka ta odzwierciedla ochronny efekt białka; jest białkowym odciskiem stopy (ang. footprint), a jej położenie w żelu w odniesieniu do pozostałych subfragmentów wskazuje sekwencję wiążącą w DNA. Technika „odcisku stopy" z użyciem DNazy I (stosowanie DNazy I — patrz s. 226 i 227) ma tendencję do dawania większych i wyraźniejszych „odcisków", ponieważ DNaza I, będąc stosunkowo dużym białkiem, nie tnie w miejscach, które są bardzo blisko białka związanego z DNA. Lepszy rozkład miejsc wiążących można jednak otrzymać stosując tworzone in vitro rodniki hydroksylowe, które wywołują cięcia DNA niezależne od sekwencji (niespecyficzne); wszystkie niechronione wiązania fosfodiestrowe są wrażliwe na rozszczepianie przez ten czynnik, tak że wzór elektoforetyczny zawiera prążki odpowiadające każdej nieosłoniętej pozycji w sekwencji.

8. 5. 13 Prezentowanie heterologicznych („obcych") białek Specyficzne heterologiczne („obce") białka mogą być prezentowane na powierzchni bakterii (lub faga) w różnych celach. Na przykład, gdy na powierzchni komórki bakteryjnej prezentowany jest produkt obcego genu, może być on 228

wtedy charakteryzowany przez chromatografię powinowactwa (sekcja 8. 5. 1. 4) wobec znanych immobilizowanych ligandów (np. przeciwciał). Aby to wykonać, przygotowujemy fuzję (sekcja 8. 5. 2) nieznanego genu do genu bakteryjnego lub fagowego kodującego białko powierzchniowe, tak aby białko fuzyjne było wyrażane na powierzchni komórki. Prezentowane białka mogą być także użyteczne do badań nad tworzeniem szczepionek, prezentowane białko może bowiem mieć swój udział w antygenowej stymulacji; oczywiście białko to musi dać bodziec immunologicznie poprawny. W jednym z rozwiązań eksperymentalnych tworzona jest fuzja obcego DNA z bakteryjnym genem kodującym flagellinę [Lu i wsp. (1995) Biotechnology 13: 336-372]. W innej metodzie wykorzystuje się autotransportery (sekcja 5. 4. 5), co zostało określone jako autoprezentacja. Na przykład, można utworzyć fuzję obcego genu z DNA kodującym domenę β białka AIDA-I w E. coli; jeżeli następnie użyjemy mutanta, który nie ma powierzchniowej proteazy OmpT, (heterologiczna) α-domena nie będzie odszczepiana od β-domeny, dzięki czemu będzie prezentowana na powierzchni bakterii [Maurer, Jose i Meyer (1997) JB 179: 794-804.

8. 5. 14 Wykrywanie zróżnicowania poziomu ekspresjii genów z wykorzystaniem PCR (DD, ang. differential display) DD jest metodą wykrywania genów, które są wyrażane tylko w pewnych szczególnych warunkach; polega ona na porównywaniu cząsteczek mRNA izolowanych z dwóch lub więcej populacji komórek poddanych działaniu różnych warunków. Najpierw mRNA z każdej populacji są przekształcane w cDNA (sekcja 8. 5. 1. 2). Aby uczynić całe to zadanie łatwiejszym do wykonania, tylko niektóre z wielu mRNA w populacji poddawane są konwersji w jednym eksperymencie. Selekcji cząsteczek mRNA dokonuje się z użyciem startera 5'-TTTTTTTTTTGG-3', pozwalającym na konwersję tylko tych mRNA, w których w odpowiedniej pozycji występują reszty cytozyny (C), a po nich jest „ogon" 3'-AAAA... Następnie cDNA z każdej populacji są poddawane procedurze AP-PCR (sekcja 16. 2. 2. 4) i otrzymuje się ich wzór elektroforetyczny (fingerprint). Wzory z różnych populacji komórek porównuje się, a odpowiednie pasma (tzn. obecne w jednych, a nie występujące w innych) odzyskuje z żelu i amplifikuje z użyciem tego samego „arbitralnego" startera. Zamplifikowane fragmenty mogą być sekwencjonowane lub użyte jako sondy do przeszukiwania biblioteki. Metoda DD jest dyskutowana przez Matza i Lukanova [(1998) NAR 26: 5537-5543].

8. 5. 15 Technologia „DNA-chip" „DNA-chipy" to mikrozbiory fragmentów cząsteczek DNA (nukleotydów) unieruchomionych na małych kawałkach (chipach) szkła, silikonu lub plastiku; fragmenty te mogą być sondami, starterami lub sekwencjami tarczowymi. „Chipy" produkuje się albo przez immobilizowanie preegzystujących cząsteczek, albo syntezę „on-chip", czyli bezpośrednio na powierzchni podłoża, z uży-

229

ciem specjalnych szybkich aparatów (robotów) zdolnych do syntetyzowania szerokiego zakresu kombinacji nukleotydów na pojedynczym chipie. Tą drugą metodą, na przykład, może być zsyntetyzowanych ponad 65 tysięcy 8-nukleotydowych (kompletny zbiór [48]) kombinacji na kawałku szkła o powierzchni lcm2. DNA-chipy używa się np. do wykrywania mutacji. Duży zbiór immobilizowanych sond może reprezentować wszystkie możliwe mutacje w danej sekwencji nukleotydów; kopie tej sekwencji zamplifikowane ze zmutowanej komórki będą zatem hybrydyzowały tylko do pewnych sond zbioru, wskazując mutacje. Hybrydyzacja może być w tej metodzie wykrywana z użyciem skaningowo-konfokalnej mikroskopii epifluorescencyjnej, gdyż tarczowy DNA znakuje się uprzednio fluoroforem. Reakcja PCR na podłożu stałym (niedawno wynaleziona) wykorzystuje dwa komplety immobilizowanych starterów, które są poddawane działaniu roztworu zawierającego DNA, i odpowiednie odczynniki reakcyjne. Takie postępowanie zapewnia większą specyficzność reakcji i mniejsze ryzyko zanieczyszczenia. Technologia DNA-chipów jest także wykorzystywana do badania zróżnicowania ekspresji genów. W tym przypadku, dysponujemy pulą cząsteczek immobilizowanego jednoniciowego cDNA, sondy znakowane fluoroforem pomogą nam „odnaleźć" te geny, które są aktywne w specyficznych warunkach. Pewnym problemem w wiązaniu jednoniciowego DNA do chipów jest tendencja do parowania zasad w obrębie jednej nici, co może utrudniać jej wiązanie z sekwencjami tarczowymi. Można to pokonać przez zastosowanie PNA (sekcja 7. 2. 1. 1), ponieważ hybrydyzacja DNA-PNA może zachodzić przy braku soli, czyli w warunkach, które hamują wewnątrzniciowe parowanie zasad. Postęp w technologii DNA-chipów polega np. na zastosowaniu elektrycznie wspomaganej hybrydyzacji sonda-tarcza i następnie różnicującym denaturowaniu dupleksów mających nawet tylko pojedynczą błędną parę. DNA-chipy są dyskutowane przez Marshalla i Hodgsona [(1998) NB 16: 27-31] oraz omówione w artykułach przeglądowych [Ramsay (1998) NB 14: 40-44 i Graves (1999) TIBTECH17: 127-134]. Zastosowanie tej techniki w identyfikacji Mycobacterium spp. opisał Troesch i wsp. [(1999) JCM 37: 49-55].

ROZDZIAŁ

9

Bakteriofagi

Większość, a nawet wszystkie bakterie mogą być zakażane specyficznymi wirusami (bakteriofagami, skrótowo fagami). Wirusem nazywamy organizm pozbawiony struktury komórkowej, nie mający zdolności do niezależnego metabolizmu i namnożenia się. Jednak po wejściu do żywej komórki odpowiedniego gatunku, wirus może „zawładnąć" zdolnością komórki do syntez biologicznych i sprawić, że zacznie ona syntetyzować jego cząsteczki. Nowo utworzone wirusy z komórki są uwalniane, a następnie mogą infekować inne komórki. Wiele fagów składa się jedynie z kwasu nukleinowego otoczonego białkowym kapsydem („płaszczem"). Genomy fagów, zależnie od gatunku, mogą zawierać dwuniciowy dsDNA, jednoniciowy ssDNA, dsRNA lub ssRNA. Niektóre fagi są wielościanami, inne mają budowę nitkowatą lub wielopostaciową. Pewne z nich są zaopatrzone w ogonek, za pomocą którego wiążą się z powierzchnią bakterii (tab. 9.1, rys. 9.1, fot. 9.1). Zazwyczaj określony fag może zakażać komórki tylko jednego rodzaju, gatunku lub szczepu bakteryjnego. Wynik infekcji fagowej zależy od bakterii, faga, a nawet, do pewnego stopnia, od warunków, w których zachodzi infekcja. Wirulentne fagi namnażają się wewnątrz komórki gospodarza i powodują jej lizę, czego wynikiem jest śmierć i rozerwanie komórki, z jednoczesnym uwolnieniem potomstwa faga. Łagodne (umiarkowane) fagi mogą utrwalić stałe nielityczne stosunki z komórką gospodarza (lizogenię). Jeszcze inne mogą się namnażać wewnątrz gospodarza nie powodując jego lizy, uwalniane są wówczas z żywych komórek. Wpływ fagowej infekcji na chorobotwórczą bakterię może być istotny dla organizmu zakażonego przez tę bakterię. W niektórych wypadkach fag wprowadza cechę patogenności, ponieważ zawiera specyficzne determinanty wirulencji. Na przykład, toksyny kodowane przez fagi są odpowiedzialne za botulizm, cholerę, błonicę i zespół hemolityczno-mocznicowy (HUS, ang. haemolytic, uraemic Syndrome). Poznanie takich chorób wymaga znajomości zarówno biologii patogennych bakterii, jak i ich fagów. Prowadzi się wiele badań w tym kierunku. Zwraca się szczególną uwagę na regulację syntezy toksyn oraz na sposób, w jaki są one uwalniane z bakterii. Na przykład, za uwolnienie toksyn podobnych do 231

toksyny shiga, związanych z zespołem HUS (kodowanych przez faga H-19B) z EHEC (tab. 11.2), może być odpowiedzialne białko lityczne podobne do białka kodowanego przez gen S faga λ (sekcja 9.1.2). Trzeba również mieć informacje, czy fag jest zdolny do namnożenia się wewnątrz bakterii zakażającej człowieka lub zwierzęta, ponieważ może to wpływać na intensywność wytwarzania toksyny (np. przez zwiększenie liczby kopii genu kodującego toksynę). Na przykład, fag CTXF kodujący toksynę cholery replikuje się wewnątrz bakterii bytujących w jelicie ssaków [Bacteriophage biology and bacterial virulence: Walder (1998) TIM 6: 6295-297.] Zakażenie fagiem Shigella flexneri (bakterii wywołującej czerwonkę) może prowadzić do modyfikacji O-specyficznych łańcuchów w polisacharydach (sekcja 2.2.9.2), co wpływa na antygeny O określające serotyp (sekcja 16.1.5.1). W związku z tym, infekcja fagowa ma znaczenie przy opracowaniu szczepów S. flexneri służących do produkcji szczepionki skutecznej przeciwko specyficznym lub wielu serotypom tego patogena. [Serotype-converting bacteriophages and O-antigen modification in Shigella flexneri: Allison i Verma (2000) TIM 8: 17-23.]

232

9.1 Fagi wirulentne — cykl lityczny Cykl lityczny rozpoczyna adsorpcja wirulentnego faga na powierzchni wrażliwej komórki, a kończy liza komórek i uwolnienie potomstwa faga.

9.1.1 Cykl lityczny faga T4 w Escherichia coli Na początku zakażenia fag przyczepia się końcami włókien ogonka do specyficznych miejsc w błonie zewnętrznej bakterii (rys. 9.1). Następnie płytka podstawowa faga wiąże się z powierzchnią komórki, a skurcz ogonka sprawia, że wewnętrzny rdzeń faga przebija błonę zewnętrzną komórki E. coli, umożliwiając przejście DNA przez kanał centralny do cytoplazmy. Przejście DNA przez błonę cytoplazmatyczną wymaga siły protonomotorycznej. W ciągu 5 min od początku zakażenia komórka przestaje syntetyzować własny DNA, RNA i białka. „Wczesne" geny T4 zaczynają być transkrybowane i następuje translacja. Białko Ndd kodowane przez faga [Bouet, Kirsch i Louam (1998) JB 180: 5227-5230] niszczy chromosom komórki. Jest on degradowany przez fagowe nukleazy do nukleotydów, które są zużywane do syntezy DNA faga T4.

233

Następnie transkrybowane są geny „pośrednie" i „późne". W transkrypcji bierze udział polimeraza RNA gospodarza po wprowadzeniu kilku zmian indukowanych przez faga, które pozwalają jej rozpoznawać inne promotory. Jedną z takich zmian jest ADP-rybozylacja, czyli przeniesienie reszt ADP-rybozylowych z NAD na polimerazę (rys. 5.1). Poza tym, w transkrypcji późnych genów faga T4 bierze udział kodowany przez faga czynnik σ. Replikacja DNA faga rozpoczyna się 5 min po zakażeniu. Startery niezbędne do syntezy nici wiodącej (rys. 7.8) są syntetyzowane przez bakteryjną polimerazę RNA, natomiast w syntezie fragmentów Okazaki biorą udział białka kodowane przez faga. Nowo syntetyzowany DNA ulega poreplikacyjnej modyfikacji (sekcje 7.4 i 9.6). Genom faga T4 stanowi liniowy, dwuniciowy DNA wielkości około 170 tys. pz, zawierający hydroksymetylocytozynę zamiast cytozyny. Synteza hydroksymetylocytozyny wymaga enzymów kodowanych przez faga. DNA charakteryzuje się kolistą permutacją i nadmiarem terminalnym (końcowym). Znaczenie tych terminów przybliży analiza sekwencji: 5'-ABCD|EFGH . . . ABCDEFGHIABCD-3' Sekwencja ta przedstawia (w porządku alfabetycznym) kolejność nukleotydów w jednej nici DNA genomu T4. W innym genomie sekwencję można przedstawić jako: 5'-EFGH |ABCDEFGH . . . ABCD|EFGH-3' Warto zaznaczyć, że w genomach z kolistą permutacją, sekwencja wszystkich cząsteczek jest taka sama tylko jej początek jest różny. Termin, „nadmiar terminalny" oznacza, że te same sekwencje występują na dwóch końcach danej cząsteczki (co pokazano na schematach). Replikacja DNA faga T4 prowadzi do utworzenia jednoniciowych końców 3'. Przyczyną tego jest brak możliwości syntezy ostatniego fragmentu Okazaki nici opóźnionej na matrycy liniowego DNA. Jednoniciowe końce atakują komplementarne sekwencje innych genomów fagowych, co odbywa się np. przez zastąpienie krótkiej, homologicznej sekwencji w innej dwuniciowej cząsteczce.

Fot. 9.1 Wybrane bakteriofagi (patrz tekst i tab. 9.1) 1. Bakteriofag lambda (λ). 2, 3, 3a. Bakteriofagi T6, T4 i T2, odpowiednio (wszystkie w tym samym powiększeniu). Fagi te są morfologicznie bardzo zbliżone, różnią się jedynie miejscami receptorowymi (miejscami wiązania) na komórce E. coli. 4. Bakteriofag fd, nitkowaty fag zawierający ss cccDNA; długość odcinka 50 nm. Na zamieszczonym niżej powiększonym zdjęciu wyraźnie widać, że dwa końce faga fd różnią się. 5. Bakteriofag 029. Wydłużona główka (około 35-40 nm) ma białkowe włókna i jest połączona z krótkim, niekurczliwym ogonkiem. 6. Bakteriofag Qβ, mały dwudziestościenny fag (ok. 25 nm średnicy). 7, 8. Odpowiednio bakteriofagi T3 i T7 w tym samym powiększeniu (odcinek = 50 nm). Oba bakteriofagi mają liniowy, niekurczliwy ogonek. 9. Bakteriofag T1 (odcinek = 50 nm). Główka zawiera dsDNA, a długi ogonek jest niekurczliwy. Dzięki uprzejmości dr. Michaela Wurtza, Uniwersytet w Bazylei, Szwajcaria. Reprodukowano z wybranych zdjęć mikroskopowych opublikowanych w M. Wurtz „Bacteriophage structure" MICRON Electron Microscopy Reviews vol. 5(2) Copyright 1992, Pergamon Press plc, za zgodą Elsevier Science.

234

235

Ta aktywność rekombinacyjna umożliwia dalszą replikację (końce 3' pełnią rolę replikacyjnych starterów) prowadzącą do powstania złożonej, rozgałęzionej sieci replikujących się genomów fagowych. W ten sposób powstaje znaczna liczba konkatemerów, z których każdy składa się z dużej liczby genomów fagowych połączonych końcami (konkatemery są również tworzone podczas replikacji faga λ — ale według innego mechanizmu). Główka, ogonek oraz inne funkcje kodowane są przez geny „późne". Główka składa się z produktów około 20 genów, a jej składanie rozpoczyna się od utworzenia specjalnej struktury zwanej „prekursorem główki", co zachodzi na wewnętrznej powierzchni błony cytoplazmatycznej. Struktura ta montowana jest wokół rdzenia, na który składają się „białka tworzące rusztowanie" (określające kształt i wielkość struktury). Następnie rdzeń jest usuwany, a prekursor główki odłącza się od błony i ulega dalszym przekształceniom konformacyjnym. DNA pakowany jest do główki zgodnie z mechanizmem — „napełnić główkę". Jeden koniec konkatemeru zostaje wprowadzony do główki, a pozostały DNA jest do niej wpychany aż główka zostanie wypełniona, w końcu DNA zostaje przecięty. Polimeryzacja ogonka zachodzi na płytce podstawowej, poczynając od jej rdzenia. Gotowy ogonek łączy się spontanicznie z główką wypełnioną DNA, potem dodawane są włókna. Fagowe potomstwo jest uwalniane na drodze lizy osmotycznej. Lizozym kodowany przez faga, wspomagany przez fagowe białko lityczne, osłabia osłony bakteryjne (rys. 2.7 i sekcja 9.1.2). Rozwój T4 w komórce E. coli zależy od stanu jej fizjologicznego [Hadas i wsp. (1997) Microbiology 143: 179-185].

9.1.2 Cykl lityczny innych fagów Cykle lityczne innych fagów różnią się znacznie od cyklu faga T4.1) Nie wszystkie fagi wiążą się na początku ze ścianą komórkową, u niektórych zachodzi wiązanie z określonymi miejscami na pilusie: np. fag M12 wiąże się na powierzchniach bocznych (nie na końcu) pilusa F lub pilusów należących do grupy F. 2) W pewnych przypadkach chromosom bakteryjny jest funkcjonalny przez jakiś czas, tak że mogą być wykorzystywane niektóre geny gospodarza. 3) W małych fagach zawierających ssRNA (takich jak M12, MS2 lub Qβ) genom fagowy pełni funkcję mRNA, a więc jego ekspresja wymaga tylko translacji. Z kolei RNA fagowy, aby był zdolny do replikacji, musi kodować przynajmniej część replikacyjnego systemu, ponieważ żadna bakteria nie ma zdolności do syntezy RNA na matrycy RNA. 4) Tworzenie konkatemerów podczas replikacji faga λ zachodzi na drodze mechanizmu toczącego się koła (rys. 9.2). Wiele fagów, zarówno bakterii gramujemnych, jak i gramdodatnich koduje enzym degradujący Peptydoglikan, co umożliwia lizę komórek gospodarza i uwolnienie potomstwa fagowego we właściwym czasie. Takie enzymy, do których należy lizozym i endopeptydaza, noszą wspólną nazwę endolizyn. Endolizyny nie mają sekwencji sygnalnej, można więc postawić pytanie, w jaki sposób zdolne są do przejścia przez błonę cytoplazmatyczną do warstwy peptydoglikanu? Oprócz endolizyny niektóre z fagów kodują specyficzne białko lityczne

236

(zwane również holiną) umiejscowione w błonie cytoplazmatycznej i tworzące „pory", przez które endolizyna może dotrzeć do peptydoglikanu. Holina jest produktem genu S faga A, tę samą rolę pełni produkt genu l faga T4.

Liniowy DNA jest wstrzykiwany do komórki (przez ogonek). Dwuniciowa cząsteczka DNA, długości około 49 kpz, ma komplementarne lepkie końce, każdy długości 12 zasad (górna część). Lepie końce umożliwiają utworzenie cząsteczki kolistej. Dwuniciowy odcinek powstały przez sparowanie lepkich końców nazywa się miejscem cos (czarny kwadrat). Zachodząca w komórce transkrypcja „wczesnych" genów fagowych prowadzi do syntezy białek regulacyjnych, których aktywności są wzajemnie przeciwstawne. Wynikiem, na który mają wpływ warunki panujące zarówno wewnątrz komórki, jak i w otaczającym środowisku, jest lizogenia (sekcja 9.2) lub opisana niżej liza. Początkowo DNA replikuje się według mechanizmu typu Cairnsa (rys. 7.8), tzn. replikują się struktury koliste. Następnie replikacja zaczyna przebiegać według mechanizmu „toczącego się koła", powodując powstanie długiego łańcucha złożonego z genomów fagowych połączonych końcami. W łańcuchu miejsce cos jest powtórzone w regularnych odstępach (środek). Takie kolejno powtórzone cząsteczki nazywa się konkatemerem. Białka główki i ogonka faga są kodowane przez geny „późne" transkrybowane z kolistych cząsteczek DNA. Miejsca cos znajdujące się w konkatemerze są cięte enzymatycznie, a lepkie końce cos umieszczone są w główkach fagowych. DNA wprowadzany jest do główki, aż zostanie napotkane następne miejsce cos — wtedy następuje cięcie. W ten sposób do główki pakowany jest DNA znajdujący się między dwoma kolejnymi miejscami cos. Do główki dołącza się ogonek, a fag, uwolniony po lizie komórek, gotowy jest do infekcji nowej komórki gospodarza.

237

Oczywiste jest, że holina musi być aktywna w określonym czasie po zakażeniu, ponieważ liza powinna być indukowana dopiero po zakończeniu tworzenia się potomstwa fagowego w komórce. Jeśli liza wystąpiłaby wcześniej, mniej całkowitych cząstek fagowych byłoby uwalnianych w jednym cyklu (tj. „wielkość plonu" byłaby mniejsza). Taka przedwczesna liza była obserwowana w przypadku faga λ zawierającego mutacje genu S Qohnson-Boar, Changand Young (1994) MM 13: 495-504], Co ciekawe, w niektórych fagach sekwencje kodujące holinę mają dwa kodony inicjujące syntezę białka, oddzielone od siebie przez jeden lub dwa inne kodony, co sprawia, że są kodowane dwa łańcuchy polipeptydowe (nieznacznie różniące się wielkością). Krótszy polipeptyd to holina, dłuższy pełni prawdopodobnie rolę inhibitora jej aktywności. Sposób, w jaki produkty tych dwóch genów regulują czas zajścia lizy, jest opisany przez Blasiego i Younga C(1996) MM 21: 675-682].

9.1.3 Działanie fagów wirulentnych na hodowle bakteryjne Po dodaniu fagów wirulentnych do bulionowej hodowli wrażliwych bakterii większość lub wszystkie komórki ulegają lizie, czego wynikiem jest przejaśnienie gęstej, nieprzezroczystej hodowli. Dodanie małej liczby cząstek fagowych do jednolitej warstwy wrażliwych komórek (sekcja 3.3.1) sprawia, że każdy fag zakazi i spowoduje lizę pojedynczej komórki, z której uwolni się wiele fagów potomnych. Fagi potomne z kolei mogą zakazić i doprowadzić do lizy sąsiednich komórek, itp. Rezultatem tego jest powstanie widocznego gołym okiem, zazwyczaj kolistego przejaśnienia, zwanego łysinką, w mętnej warstwie jednolitego wzrostu. Łysinki powstają w każdym miejscu, w którym początkowo wprowadzony fag zakaził komórki. Łysinki przedstawione są na fotografii 16.1.

9.1.4 Pakowanie DNA W rozdziale omawiającym łączenie się poszczególnych części faga T4 (sekcja 9.1.1) wspomniano, że DNA jest wprowadzany do główki fagowej. Mechanizm wprowadzania DNA faga T4 (jak również innych fagów) nie jest jeszcze znany. Najnowsze badania pozwoliły jednak zrozumieć pakowanie DNA faga (tab. 9.1) i fagów spokrewnionych. Pakowanie DNA faga wymaga energii pochodzącej z hydrolizy ATP, a umieszczenie DNA w główce zależy od obecności specyficznych cząsteczek RNA (nazwanego pRNA, ang. phage-encoded RNA) kodowanego przez faga. Prawdopodobnie, sześć pofałdowanych cząsteczek RNA tworzy pierścień wokół otworu, przez który wchodzi DNA. (Taka struktura przypomina helikazę tworzącą pierścień złożony z sześciu cząsteczek białka DnaB i biorącą udział w przemieszczaniu się DNA podczas replikacji typu Cairnsa: rys. 7.8b). Jeden z modeli postuluje, że pierścień złożony z pRNA stanowi cześć aparatu, który obraca się (wykorzystując energię pochodzącą z hydrolizy ATP) powodując wchodzenie „nitkowatej" (tj. helikalnej) cząsteczki DNA do główki

238

fagowej w sposób przypominający przejście trzpienia przez nakrętkę. Jak dotychczas, istnienie pRNA zostało stwierdzone w fagach typu pRNA może występować również w innych fagach lub, przeciwnie, funkcja tych cząsteczek może być przejęta przez inne (być może złożone z białek) systemy. [Upakowanie DNA w bakteriofagach: Hendrix (1998) Cell 94: 147-150.]

9.2 Fagi umiarkowane — lizogenia Fag umiarkowany może wytworzyć z bakterią stabilny, nielityczny rodzaj stosunku zwany lizogenią. Mówimy wówczas, że komórka gospodarza jest lizogenna. Lizogenna bakteria jest odporna na atak innych fagów tego samego typu (odporność na superinfekcję). Jeden z mechanizmów odporności na superinfekcję obrazuje dobrze przykład lizogennej infekcji Salmonella typhimurium przez faga P22. Fag ten powoduje glikozylację lipopolisacharydów komórki gospodarza (sekcja 2.2.9.2) — w ten sposób niszczy własne miejsca receptorowe znajdujące się na powierzchni komórki. Lizogenia najczęściej jest związana z połączeniem się (integracją) genomu faga (tj. kwasu nukleinowego, zwanego profagiem) z chromosomem gospodarza. W nielicznych przypadkach (np. fag P1) profag nie łączy się z chromosomem, ale istnieje w formie cząsteczki kolistej („plazmidu"). Zawsze jednak replikacja profaga i komórki gospodarza jest skoordynowana, tak że podczas każdego podziału komórka potomna bakterii otrzymuje profaga. Utrzymanie stanu lizogenii wymaga syntezy białka represorowego kodowanego przez faga. Utrata aktywności represora prowadzi do indukcji cyklu litycznego. Jak widać, profag zazwyczaj zachowuje zdolność do wirulencji. W populacji lizogennych bakterii indukcja może zachodzić spontanicznie w małej liczbie komórek. Wydaje się, że lizogenia jest zjawiskiem powszechnie występującym w przyrodzie.

9.2.1 Lizogenia/liza na przykładzie faga λ i Escherichia coli DNA faga jest wprowadzany do bakterii w formie liniowego dsDNA i natychmiast po wprowadzeniu tworzy formę kolistą (rys. 9.2). Rozpoczyna się transkrypcja „wczesnych" genów fagowych potrzebnych do lizy lub lizogenii. O zajściu jednego z tych procesów decyduje przewaga jednego z dwóch produktów wczesnych genów: białka cI, które hamuje transkrypcję rozpoczynającą się w niektórych promotorach i sprzyja lizogenii, i białka cro, hamującego transkrypcję genu cI. Rozstrzygający wpływ może mieć ogólna wewnętrzna kondycja komórki. Na przykład, lizogenia ma większe szanse przy wielokrotnym zakażeniu komórki (tj. zakażeniu jednej komórki dużą liczbą fagów) w środowisku ubogim w substancje odżywcze, natomiast liza jest bardziej prawdopodobna w komórkach zakażonych tylko jednym fagiem, niezależnie od ilości substancji odżywczych. Lizogenia wymaga wstawienia się genomu faga λ w chromosom gospodarza, co zachodzi na drodze zlokalizowanej rekombinacji (rys. 8.3b); fagowe białko (produkt genu int) działa tu jak specyficzna rekombinaza.

239

Indukcja (przejście od lizogenii do wirulencji) zachodzi spontanicznie w nielicznych komórkach lizogennej populacji. Indukcję mogą wywoływać czynniki powodujące zniszczenie DNA, takie jak promieniowanie ultrafioletowe lub antybiotyk — mitomycyna C. W tych warunkach, gdy czynny jest system SOS (sekcja 7.8.2.2), następuje aktywacja białka RecA i przecięcie przez nie białka fagowego represora (białka cI), co prowadzi do indukcji cyklu litycznego. Cykl lityczny wymaga również wycięcia profaga w procesie stanowiącym odwrotność jego wstawienia. W wycięciu bierze udział fagowe białko xis. Po wycięciu genom faga replikuje się, części składowe faga są syntetyzowane, a po ich połączeniu i lizie komórki gospodarza cząstki fagów są uwalniane do środowiska. Badania prowadzone z użyciem zmodyfikowanej (zmutowanej) polimerazy RNA E. coli ujawniły, że lizogenia nie mogła zajść, jeżeli zaburzona była transkrypcja niektórych czynników fagowych. Czynniki konieczne do lizy były wówczas transkrybowane w ilości mniejszej niż normalnie, jednak liza nadal zachodziła w pożywkach bogatych, natomiast nie obserwowano jej w pożywkach ubogich. To sugeruje, że synteza czynników litycznych zależy od ilości substancji odżywczych, a w niezmutowanej E. coli rosnącej w bogatym podłożu czynniki te mogą być wytwarzane w nadmiarze, w ilości przewyższającej konieczną do lizy. Nadprodukcja obserwowana podczas wzrostu w podłożach bogatych sugeruje, że (względnie) mała ilość czynników litycznych wytwarzana podczas wzrostu w uboższych pożywkach była ciągle wystarczająca do lizy. Może to być podstawą strategii zachowania zdolności do namnożenia faga w warunkach ograniczenia substancji pokarmowych [Gabig i wsp. (1998) Microbiology 144: 2217-2224].

9.2.2 Replikacja DNA faga M13 Ml3 jest nitkowatym fagiem (którego genom stanowi ccc ssDNA) należącym do tej samej grupy co fag fl (tab. 9.1) i fd (fot. 9.1). Zmodyfikowane formy M13 stosuje się jako wektory do klonowania w celu wytworzenia jednoniciowych kopii DNA potrzebnych do sekwencjonowania (sekcja 8.5.6) lub zlokalizowanej mutagenezy (sekcja 8.5.5). Enzymy bakterii, po jej zakażeniu, na matrycy jednoniciowego genomu faga (v lub „plus") syntetyzują nić komplementarną (c lub „minus"), prowadząc do utworzenia replikacyjnej formy (RF) składającej się z ccc ds DNA. Następnie cząsteczka ta ulega superskręceniu w wyniku działania komórkowej gyrazy (wtedy nazywana jest RFI), a jej nić c zaczyna być transkrybowana. Nić ν zostaje przecięta (przez enzym kodowany przez faga) i rozpoczyna się replikacja według mechanizmu toczącego się koła (rys. 8.5). Na początku ssDNA nici ν jest pocięty na odcinki odpowiadające jednej długości genomu. Ich końce łączą się w formę kolistą, tworząc w ten sposób potomne formy RF. Następnie specyficzne białka kodowane przez faga gromadzą się w komórce i pokrywają nowo utworzone nici v, tym samym blokując ich przejście w formę RF. Jednocześnie, te pocięte i koliste cząsteczki ssDNA są pakowane do płaszcza białkowego, a dojrzale fagi — wypychane na zewnątrz przez osłony żyjącego wciąż gospodarza.

240

9.3 Fagi męskie Fagi męskie zakażają tylko bakterie zawierające koniugacyjny plazmid. Jedną ich grupę stanowią fagi nitkowate ssDNA, np. fl i fd (tab. 9.1), które adsorbują się specyficznie na końcach niektórych typów pilusów. Przejście przez błonę komórkową może być związane z zanikiem pilusa. Potomne fagi fl i fd są uwalniane po przejściu przez osłony komórkowe. Komórki gospodarza pozostają żywe, jedynie rosną wolniej od komórek niezakażonych. M12, MS2, f2 i Qβ są małymi fagami ssRNA, których kapsyd ma budowę dwudziestościanu. Fagi te adsorbują się na bokach niektórych typów pilusów.

9.4 Konwersja fagowa Bakterie lizogenne mogą mieć cechy, których są pozbawione komórki niezakażone. Taka konwersja fagowa (konwersja bakteriofagowa, konwersja lizogenna) może wynikać np. z wyrażenia się fagowych genów w komórce lub z inaktywacji genów chromosomowych w wyniku wstawienia faga. Na przykład szczepy Corynebacterium diphtheriae powodujące błonicę są lizogenne i zawierają pewien typ faga kodującego silną toksynę. Szczepy nielizogenne nie wytwarzają tej toksyny i nie powodują błonicy (patrz również toksyna cholery w sekcji 11.3.1.1). U Staphylococcus aureus wstawienie genomu faga L54a prowadzi do utraty aktywności lipazy wskutek inaktywacji odpowiedniego genu chromosomowego (patrz również Salmonella w Aneksie).

9.4.1 Bakteriofag Mu Insercja (wstawienie) DNA faga Mu do chromosomu zachodzi według mechanizmu konserwatywnej transpozycji (rys. 8.4a-c). Transpozycja zależy od działania fagowego produktu genu A (transpozazy, która wiąże się z końcami fagowego DNA). Wstawienie faga zachodzi w dowolnym miejscu chromosomu, niezależnie od tego, czy następstwem infekcji jest liza czy lizogenia. Insercja DNA faga Mu prowadzi do podwojenia się miejsca DNA długości 5 pz, w które wstawił się fag. W związku z tym, że fag Mu często wstawia się w genom bakteryjny prowadząc do jego inaktywacji, w populacji bakterii lizogennych zakażonych tym fagiem obserwuje się znacznie zwiększoną częstość mutacji, obejmującą nawet 2-3% komórek; stąd nazwa Mu (mutator). Lizogenia jest związana z aktywnością białka represorowego (produktu genu c), które może np. regulować syntezę transpozazy. Infekcja lityczna wymaga zajścia około 100, związanych z replikacją, transpozycji między różnymi częściami chromosomu, w których fag zachowuje się jak ogromny element transpozycyjny. Delecje, insercje, itp. zaburzenia powstające w wyniku transpozycji w chromosomowym DNA wystarczą do spowodowania śmierci komórki. Genomy fagowe są wycinane, a następnie pakowane na zasadzie mechanizmu „napełnić główkę". Wszystkie genomy fagowe zawierają kawałki bakteryjnego DNA na każdym z dwóch końców. 241

9.5 Transdukcja Przeniesienie chromosomowego (lub plazmidowego) DNA z jednej komórki do drugiej za pośrednictwem faga nazywamy transdukcją.

9.5.1 Transdukcja ogólna W procesie tym każdy z licznych genów faga może być przeniesiony z jednej komórki bakterii do drugiej. W populacji bakterii zakażonych fagiem zdarza się czasami, że podczas łączenia się części składowych faga, do główki pakowany jest DNA chromosomowy lub plazmidowy bakterii zamiast DNA fagowego. Takie nienormalne fagi mogą po uwolnieniu przylegać do innych komórek i wprowadzać do nich DNA, ale, z powodu braku DNA fagowego i zawartej w nim informacji, proces ten nie prowadzi ani do lizy, ani do lizogenii. W komórce biorcy (transduktanta) transdukowany DNA może: 1) być degradowany przez restrykcyjne endonukleazy (sekcja 7.4); 2) rekombinować z chromosomem (lub plazmidem), czego wynikiem jest stabilne dziedziczenie niektórych cech dawcy (transdukcja pełna); 3) trwać jako ustabilizowana, ale nie replikująca się cząsteczka (transdukcja poronna). (W przypadku utworzenia kolonii przez poronnego transduktanta tylko jedna komórka w kolonii zawiera DNA dawcy). Geny dawcy zawierające stabilny promotor mogą być wyrażane (zarówno w transduktancie pełnym, jak i poronnym). W niektórych przypadkach każdy gen gospodarza ma podobną szansę przeniesienia. Jednak w układzie Salmonella /fag P22 większą szansę przekazania na drodze transdukcji ma pewien region chromosomu bakteryjnego. Region ten przypomina sekwencję genomu faga związaną z pakowaniem DNA do główek fagowych. Przeniesienie genu bakteryjnego na drodze transdukcji ogólnej jest przypadkiem rzadkim. Jednoczesna transdukcja dwóch lub więcej genów (kotransdukcja) jest dowodem na ich chromosomowe sąsiedztwo. Transdukcja jest użyteczna do szczegółowego mapowania chromosomów i plazmidów dawcy. Odległość między genami określa się na podstawie częstości kotransdukcji.

9.5.2 Transdukcja ograniczona W transdukcji ograniczonej biorą udział jedynie fagi umiarkowane, w których zachodzi faza integracji z chromosomem gospodarza (patrz np. sekcja 9.1). Podczas wycięcia profag może niekiedy zabrać część otaczającego chromosomu. Zdarzenie to jest podobne (w ogólnych zarysach) do powstania plazmidu F' (sekcja 8.4.2.2). W układzie E. coli/fag λ profag jest ograniczony z dwóch stron przez geny gospodarza —gal i bio (rys. 8.3b). Wynika stąd, że w rzadkich przypadkach nieprawidłowego wycięcia profag może zabrać geny gal lub bio, często zostawiając niektóre geny fagowe znajdujące się po przeciwnej stronie profaga. Taki zrekombinowany genom fagowy może być następnie pakowany do główki i dal-

242

sze składanie faga zachodzi bez zakłóceń. Fag transdukcji ograniczonej (wyspecjalizowana cząstka transdukcyjna, STP, ang. specialized transducing particle) może utracić zdolność do replikacji (tj. może być wadliwy), jednak zachowuje zdolność do wstrzyknięcia DNA do komórki biorcy, a co za tym idzie — zdolność do przeniesienia genów dawcy (gal lub bio). Również w innych układach bakteria/fag jedynymi genami, które mogą być przeniesione podczas transdukcji, są geny otaczające profaga.

9.6 W jaki sposób fag unika restrykcyjnego systemu gospodarza? Głównym celem restrykcji w bakteriach (sekcja 7.4) wydaje się ochrona przeciwko „obcemu" DNA — szczególnie DNA fagowemu. W jaki więc sposób fagi zdolne są do replikacji w bakteriach? Wykorzystują w tym celu różne mechanizmy antyrestrykcyjne [Bickle i Kruger (1993) MR 57: 434-450]. Na przykład, DNA niektórych fagów (fag T7 E. coli) nie zawiera wcale albo zawiera niewiele miejsc przecinanych przez endonukeazy gospodarza. Miejsca te zostały utracone lub ich liczba zmniejszona w procesie selekcji (przeciwko zdolności do enzymatycznego przecięcia). Niektóre fagi kodują specyficzne inhibitory enzymów restrykcyjnych, inne zaś kodują metylazy o specyficzności właściwej komórkom gospodarza. Fagi T-parzyste (T2, T4 i T6 E. coli) są oporne na restrykcję, ponieważ ich DNA jest glikozylowany, a przez to niewrażliwy na działanie endonukleaz. Nawet w tym przypadku, po infekcji fagami T-parzystymi niektóre szczepy E. coli wytwarzają enzym przecinający ich własny tRNA1ys (lizynowy tRNA). W ten sposób zostaje zahamowana synteza białek fagowych, a więc replikacja faga. Fag jednak koduje enzymy (z ligazą RNA włącznie) zdolne do naprawy tego procesu samozniszczenia.

ROZDZIAŁ

10 Bakterie w świecie ożywionym

Bakterie są często uważane za szkodniki, które należy zniszczyć, lub też traktuje się je jak „torebki z enzymami" — przydatne do przeprowadzania doświadczeń. Jednakże bakterie mają swoje własne życie poza laboratorium i wiele z ich aktywności jest istotnych nie tylko dla człowieka, lecz również dla zachowania równowagi w naturze. Ten aspekt bakteriologii obejmuje wiele zagadnień, ale w tym rozdziale może być przedstawiony tylko krótki zarys niektórych z nich.

10.1 Zespoły mikroorganizmów Większość bakterii należy do organizmów swobodnie żyjących, co oznacza, że niekoniecznie tworzą one wyraźnie określone związki z innymi organizmami, mimo że w naturalnych warunkach stanowią część sieci wzajemnych powiązań i rzadko się zdarza, aby rozwijając się nie wpływały na inne organizmy lub by same nie ulegały wpływowi. Bakterie zwykle występują jako członkowie mieszanego „kolektywu", w skład którego mogą wchodzić grzyby, glony, pierwotniaki i inne organizmy. Takie zespoły można znaleźć w rozmaitych naturalnych siedliskach, jak: woda, gleba, powierzchnia roślin, wnętrze i powierzchnia ciała człowieka oraz zwierząt. Mikroorganizmy występujące zazwyczaj w określonym siedlisku nazywa się łącznie mikroflorą tego siedliska. Mikroorganizmy, które kolonizują dane siedlisko, oddziałują na siebie w rozmaity sposób: na przykład mogą współzawodniczyć o substancje pokarmowe występujące w niedoborze, o tlen, o przestrzeń itp. Te organizmy, które nie mogą efektywnie konkurować, są prawdopodobnie eliminowane z siedliska. W pewnych warunkach organizm może czynnie przeszkadzać przynajmniej niektórym konkurentom, wytwarzając substancje dla nich toksyczne — zjawisko to nazwano antagonizmem; na przykład mikroorganizm, który wytwarza antybiotyki (sekcja 15.4), może mieć nad innym przewagę we współzawodnictwie. Zazwyczaj takie substancje skierowane przeciw mikroorganizmom są wytwarzane tylko w okolicznościach ograniczenia wzrostu wobec małej zawartości sub-

244

stancji pokarmowych, a więc wtedy, gdy śmierć innych organizmów w siedlisku może być korzystna na skutek zmniejszenia konkurencji o substancje pokarmowe, a nawet poprzez dopływ nowych substancji. Niektóre bakterie wydzielają związki przeciw mikroorganizmom zwane bakteriocynami, do których należą kolicyny i mikrocyny (tworzone przez i skierowane przeciwko gramujemnym gatunkom) i lantybiotyki takie jak nizyna (tworzone przez i skierowane przeciwko gramdodatnim gatunkom). Bakteriocyny hamują/zabijają komórki, przeciw którym są skierowane, wpływając na syntezę kwasu nukleinowego lub białek, czy też uszkadzając błony. Oczywiście bakterie muszą same się zabezpieczać przed własnymi bakteriocynami. Na przykład bakteriocyna lizostafina wydzielana przez Staphylococcus simulans uszkadza Peptydoglikan we wrażliwych szczepach gronkowców (patrz rys. 2.7), a sam S. simulans zmienia Peptydoglikan za pomocą enzymu kodowanego przez gen lif, co powoduje, że staje się niewrażliwy na lizostafinę. [Bacteriocins (artykuł przeglądowy): Baba i Schneewind (1998) TIM 6: 66-71]. Wzajemne zależności w środowisku mogą również polegać na tym, że jeden lub oba organizmy odnoszą korzyści, a żaden z nich nie ponosi szkody; na przykład, organizm wytwarzający kwas może sprzyjać powstawaniu dogodnych warunków dla innego organizmu, którego wzrost jest uzależniony od niskiego pH. Jeżeli środowisko pozostaje niezakłócone, rozwija się w nim stabilny zespół organizmów, w którym korzystne i antagonistyczne zależności osiągają stan równowagi. Obcy mikroorganizm ma zwykle trudności w usytuowaniu się w takiej wspólnocie, chyba że zakłócenia w środowisku zburzą równowagę tego zespołu. Na przykład, w jelitach zwierząt zasiedlanie przez patogeny mogą często utrudniać mikroorganizmy należące do naturalnej mikroflory, ponieważ zajmują przestrzeń (a więc blokują dojście) i są dobrze dostosowane do warunków jelit i z tego powodu mogą zwykle przerosnąć patogeny; jednakże jakiekolwiek zakłócenie tej mikroflory — np. terapią antybiotykową — może stworzyć lepsze warunki dla patogenów i spowodować chorobę.

10.1.1 Zespoły przejściowe W odróżnieniu od stabilnych, mieszanych zespołów organizmów, w wielu środowiskach zdarzają się okoliczności, kiedy jeden lub kilka gatunków przejściowo dominuje. W przypadku cholery (sekcja 11.3.1.1) jelita pacjenta stają się żywym inkubatorem dla organizmu wywołującego chorobę Vibrio cholereae, a „stolce jak odwar 9 ryżowy" mogą zawierać 10 komórek V. cholerae w 1 mililitrze. W jeziorach i innych zbiornikach wodnych pewne warunki mogą wspomagać obfity wzrost określonych organizmów. Tworzy się wówczas tzw. zakwit — widoczna na lub blisko powierzchni (często rzucająca się w oczy) warstwa organizmów. Obejmują one (lub mogą składać się głównie z) pewne sinice (cyjanobakterie) — szczególnie te, które wytwarzają wakuole gazowe (sekcja 2.2.5) — i/lub niektóre mikroorganizmy eukariotyczne. Zakwity mogą być stymulowane np. przez nadmiar składników pokarmowych (takich jak azot wyługowany z nawozów rolniczych) i/lub przez termiczne uwarstwienie w wodzie. Śmierć/uszko-

245

dzenie organizmów tworzących zakwit (na skutek np. braku korzystnych czynników) może doprowadzić do znacznej utraty tlenu z wody, powodując czasem uduszenie się ryb i innych zwierząt wodnych. W niektórych przypadkach można zapobiec zakwitowi poprzez pompowanie (krążenie) wody niedopuszczające do uwarstwienia i/lub stosując związki przeciw sinicom, takie jak dichloronaftochinon (dichlon). Anabaena i inne organizmy tworzące zakwity mogą wydzielać pewną substancję (geosminę), która czasem nadaje ziemisty lub zatęchły posmak wodzie (i żyjącym w niej rybom). Niektóre sinice powodujące zakwity (np. gatunki Anabaena, Microcystis, Nodularia) wytwarzają toksyny, które mogą być śmiercionośne dla ryb i/lub innych zwierząt.

10.1.2 Wyczuwanie liczebności — „quorum sensing" W niektórych przypadkach komórki w populacji o wysokiej gęstości wykazują cechy, których nie mają te same komórki w populacji o niskiej gęstości („gęstość" rozumiana jako liczba komórek w jednostce objętości). Na przykład, Photobacterium fischeri (= Vibrio fischeri) może być albo organizmem swobodnie żyjącym (w populacji o niskiej gęstości) albo symbiontem (sekcja 10.2.4), jeśli występuje w populacji o wysokiej gęstości — w „narządzie świetlnym" pewnych ryb świecących. Jako symbiot P. fischeri emituje niebieskozielone światło (=bioluminiscencja: światło pochodzące od żywego organizmu), podczas gdy w stanie wolno żyjącym (przy niskiej gęstości) nie wykazuje tej cechy lub tylko w nieznacznym stopniu. Ryby wykorzystują bakteryjną bioluminiscencję do sygnalizacji między sobą, bakterie zaś odnoszą korzyść ze stabilnego siedliska, jakie znajdują w tych zwierzętach. Jak pojedyncze komórki wyczuwają (ang. sense) gęstość populacji i skąd wiedzą, kiedy „włączyć światło"? Sygnał właściwie rozwija się jako bezpośrednia konsekwencja wzrostu w populacji. Tak więc, wszystkie komórki wydzielają specjalnego rodzaju cząsteczki sygnalizujące. Jeśli gęstość komórek osiąga określone minimum liczebności (ang. quorum), cząsteczki te nagromadzają się do takiego stężenia, w którym są aktywowane pewne geny w komórkach, w tym przypadku geny lux, dając w efekcie świecenie bakterii. Sygnalizująca cząsteczka (o małej masie cząsteczkowej) jest nazywana autoinduktorem (ponieważ komórki same ją wytwarzają). Rozmaite bakterie mogą wytwarzać różne autoinduktory regulujące pewne ich właściwości; czasem odmienne gatunki wytwarzają ten sam autoinduktor, ale do regulacji różnych genów. Niektóre bakterie wytwarzają kilka autoinduktorów kontrolujących wyrażanie się różnych cech. W wielu przypadkach (w tym przykład P. fischeri) autoinduktor należy do grupy laktonów N-acylo-L-homoseryny (AHLs) [AHL — based quorum sensing: Swift i wsp. (1996) TIBS 21: 214-219]. W Pseudomonas aeruginosa są przynajmniej dwa systemy „quorum sensing" — las i rhl (wymagające różnych laktonów homoseryny jako autoinduktorów), które regulują geny kodujące określone czynniki wirulencji; ponadto wydaje się, że te dwa systemy współdziałają w układzie hierarchicznym, zawsze jeden jest aktywowany przed drugim [Pesci i Iglewski (1997) TIM 5: 132-134].

246

AHLs są popularnymi autoinduktorami w bakteriach gramujemnych. Wydaje się, że zwykle działają dyfundując do komórki i po osiągnięciu wystarczającego stężenia łączą się z odpowiednim białkiem cytoplazmatycznym, które reguluje transkrypcję określonego genu(ów). Bakterie gramdodatnie zwykle wykorzystują jako autoinduktony peptydowe cząsteczki sygnalizujące (= feromony). Kiedy wzrost Bacillus subtilis powoduje osiągnięcie dużej gęstości komórek, w środowisku pozakomórkowym gromadzą się dwa typy feromonów — oznaczone jako ComX i CSF. ComX pobudza rozwój stanu kompetencji w transformacji (sekcja 8.4.1), zaś CSF wydaje się jednym z czynników biorących udział w inicjacji sporulacji. Mechanizmy działania ComX i CSF są różne. ComX aktywuje dwuskładnikowy system regulacyjny (sekcja 7.8.6): powoduje autofosforylację kinazy histydynowej związanej z błoną (ComP). Enzym ten z kolei fosforyluje i aktywuje czynnik transkrypcyjny — ComA, który reguluje aktywność genu comS wymaganego do osiągnięcia stanu kompetencji. Inny feromon — CSF jest pobierany przez system zależnej od ATP permeazy oligopeptydowej (transport) obecnej w błonie cytoplazmatycznej; w cytoplazmie hamuje on aktywność niektórych fosforylaz, które defosforylują Spo0F~P i w ten sposób umożliwiają przenoszenie fosforu (rys. 7.14). Koniugacja (sekcja 8.4.2.1) u Enterococcus faecalis jest związana z wydzielaniem feromonów przez komórki potencjalnych biorców; podobnie jak CSF (wyżej) feromony te są wprowadzane do wnętrza przez błonowy system permeaz [Peptide signalling (artykuł przeglądowy): Lazazzera i Grossman (1998) TIM 6: 288-294].

10.2 Saprotrofy, drapieżniki, pasożyty, symbionty 10.2.1 Saprotrofy Organizmy, które pobierają składniki pokarmowe z obumarłej materii organicznej, są nazywane saprotrofami. Niektóre saprotrofy zużywają tylko związki rozpuszczalne, pewne zaś mają zdolność do rozkładu celulozy (sekcja 6.2) czy też innych polimerów poza komórką i przyswajają rozłożone produkty. Złożone substraty mogą być rozkładane stopniowo, kolejno przez określone gatunki saprotrofów przeprowadzających jeden (lub kilka) etapów tego procesu. Tego typu współdziałanie jest istotne dla rozkładu, a zatem obiegiem materii organicznej w naturze. Trzeba przyznać, że jest bardzo niewiele biologicznych związków, które nie mogą być sprawnie rozłożone przez zespół saprotrofów „pracujących w jednej drużynie". Bez saprotrofów (heterotrofów) ustałby obieg węgla (rys. 10.1), jak i obiegi innych składników materii.

10.2.2 Drapieżniki Bakterie z rzędu Myxobacterales (bakterie śluzowe) są gramujemnymi pałeczkami żyjącymi w glebie, w gnojówce i na rozkładających się szczątkach roślin-

247

nych. Większość gatunków tego rzędu żeruje na innych mikroorganizmach: wydzielają one enzymy powodujące lizę innych bakterii oraz grzybów i rozwijają się zużywając rozpuszczalne produkty. Oczywiście bakterie śluzowe nie są typowymi drapieżnikami, gdyż drapieżniki zwykle pobierają swoją ofiarę do wnętrza przed jej strawieniem. Inny niezwykły drapieżnik — Bdellovibrio (patrz Aneks) żyje wewnątrz komórek bakteryjnych. Nazwa „Bdellovibrio" pochodzi częściowo od greckiego słowa oznaczającego „pijawkę". Ciekawe, że Bdellovibrio może wnikać do komórek E. coli pomimo obecności grubej otoczki [Koval i Bayer (1997) Microbiology 143: 749-753].

10.2.3 Pasożyty Pasożyt to organizm, który żyje na/lub w innym żywym organizmie (gospodarz) i odnosi korzyści (w różny sposób) jego kosztem; prawie we wszystkich przypadkach pasożyt otrzymuje substancje pokarmowe od swojego gospodarza. Gospodarz może w różnym stopniu ponosić szkody — poczynając od nieznacznej niedogodności aż do śmierci. Pasożytnictwo można traktować jako alternatywny sposób życia niektórych wolno żyjących bakterii, lecz dla innych jest on obligatoryjny. Takie bakterie jak Mycobacterium leprae (wywołujące trąd) mogą rosnąć jedynie wewnątrz określonego typu komórek eukariotycznego gospodarza. Pasożyty obligatoryjne, takie jak te przytoczone, są ściśle uzależnione od metabolizmu swoich gospodarzy i często nie mogą być hodowane w laboratorium, chyba że w specjalnych hodowlach żywych komórek. Pasożyt, który w takim stopniu oddziałuje niekorzystnie na swojego gospodarza, że wywołuje jego chorobę lub śmierć, nazywany jest patogenem. Nie wszystkie pasożyty są patogenami i nie wszystkie patogeny są pasożytami; przykładem niepasożytniczego patogena jest Clostridium botulinum (sekcja 11.3.1.2).

10.2.4 Symbionty Początkowo symbiozę rozumiano jako każdy stabilny, fizyczny związek między różnymi organizmami (symbiontami) — niezależnie od rodzaju układów między nimi. Później znaczenie tego terminu było ograniczone tylko do tych okoliczności, w których wzajemne oddziaływania polegają na obopólnym odnoszeniu korzyści. Jednakże obecnie jest tendencja (mimo możliwości pomyłek) powrotu do pierwotnego znaczenia. Tak więc, powszechne rozumienie symbiozy uwzględnia zarówno oddziaływania między symbiontami polegające na obopólnym odnoszeniu korzyści (mutualizm), jak i pasożytnictwo. Stosując tę samą terminologię, komensalem jest symbiont, który odnosi korzyści od drugiego symbionta w taki sposób, że ten ostatni nie doznaje ani korzyści, ani strat z tego związku.

248

10.2.4.1 Symbiozy mutualistyczne Związki partnerskie między bakteriami i innymi organizmami, z których obaj partnerzy czerpią korzyści, są dość powszechne. Przykładem mogą być przeżuwacze (np. owce, krowy, itp.), które nie tworzą enzymów trawiących celulozę zawartą w ich roślinnym pożywieniu. W przewodzie pokarmowym posiadają natomiast komorę (żwacz) zawierającą znaczną ilość mikroorganizmów (w tym bakterie takie jak Ruminococcus), przemieniających celulozę w proste związki, które mogą być wchłaniane przez zwierzę. Z kolei mikroorganizmy odnoszą korzyść ze stabilnego środowiska, o optymalnej temperaturze i bogatego w składniki odżywcze (dostarczane przez zwierzę). U niektórych owadów, wyspecjalizowane komórki (mycetocyty) w wyściółce jelita zawierają (wewnątrzkomórkowo) bakterie, które, przynajmniej w kilku przypadkach, dostarczają niezbędnych składników odżywczych gospodarzowi. Z jelitem tych owadów może być również związany rodzaj odrębnej organelli (mycetom), złożonej ze skupiska mycetocytów. Korzenie roślin motylkowych (groch, fasola, koniczyna itp.) mają drobne narośla (brodawki) zawierające bakterie z rodzaju Rhizobium. W układzie tym roślina dostarcza związki odżywcze i ochronę, podczas gdy Rhizobium zaopatruje ją w azot „wiązany" z atmosfery (sekcja 10.3.2). Brodawki korzeniowe umożliwiają roślinom rozwój na glebie ubogiej w azot [Legume nodulation (artykuł przeglądowy): Albrecht, Geurts i Bisseling (1999) EMBO Journal 18: 281-288]. Bakterie wiążące azot tworzą również związki z roślinami innymi niż motylkowe. Do takich przykładów należą brodawki zawierające bakterie z rodzaju Frankia w korzeniach olchy (Alnus) i mała pływająca paproć Azolla, u której w specjalnych zagłębieniach występuje Anabaena azollae. W wyglądających jak korale korzeniach sagowców (Cycas, Encephalatos, Zamia) z ogrodu botanicznego wykazano, stosując metodę PCR, obecność szczepu Nostoc należącego do sinic [Costa, Paulsrud i Lindblad (1999) FEMSME 28: 85-91].

10.3 Bakterie a obieg materii Pierwiastki, które wchodzą w skład żywych organizmów, występują na Ziemi w ograniczonych ilościach. Aby więc życie mogło być kontynuowane, składniki martwych organizmów muszą być ponownie użyte (włączane w obieg). W procesie tym kluczową rolę odgrywają bakterie i inne mikroorganizmy.

10.3.1 Obieg węgla Głównym składnikiem strukturalnym wszystkich żywych organizmów jest węgiel (rozdz. 6), dlatego też odzyskiwanie tego pierwiastka jest niezmiernie istotne. Głównym udziałem bakterii w biologicznym obiegu węgla (rys. 10.1) jest zużywanie i rozkład martwej materii organicznej przez (heterotroficzne) saprotrofy. W środowiskach naziemnych martwa materia organiczna obejmuje szczątki roślinne i zwierzęce.

249

Bakterie mają znaczący udział zarówno jako autotrofy, jak i heterotrofy (rozdział 6), a przedstawiciele Archaea — jako metanogeny (sekcja 5.1.2.2); do metylotrofów (sekcja 6.4) należą bakterie zużywające metan. Mikroorganizmy (w tym bakterie) są odpowiedzialne za niezbędną przemianę „martwych" organicznych związków węgla do biomasy i CO2; bez tego procesu obieg ustałby. Biomasa mikroorganizmów, jako taka, jest zużywana np. przez zwierzęta filtrujące (ostrygi itd.) oraz w łańcuchach pokarmowych przez ryby i inne zwierzęta. Udział węgla elementarnego (wolnego) w ich obiegach jest minimalny (w porównaniu z azotem i siarką).

W środowiskach wodnych węgiel w rozpuszczalnych związkach organicznych pochodzi, przynajmniej częściowo, z planktonu roślinnego (fitoplanktonu), tj. mikroskopijnych fotosyntetyzujących (wiążących CO2) organizmów. (Wzrost masy fitoplanktonu, glonów i lądowych roślin zielonych — wszystkich fotosyntetyzujących organizmów — jest razem określany jako produkcja pierwotna). W jeziorach często do puli węgla pochodzącego z fitoplanktonu dochodzi węgiel organiczny pochodzenia lądowego dostający się wraz z wodami wpływającymi z lądu. W otwartym oceanie prawie cały węgiel pochodzi z planktonu roślinnego. Mimo że większość fitoplanktonu jest zużywana jako pokarm przez zwierzęta wodne, pozostały dostarcza również węgla do wzrostu bakterii (tj. produkcji biomasy) i do oddychania. Ostatnio opublikowana praca wykazuje, że ilość węgla ze związków rozpuszczalnych, zużytego przez bakterie w oddychaniu, jest większa niż początkowo przypuszczano. Ponadto, wydaje się, że również

250

i tam, gdzie pierwotna produkcja w wodzie jest mała, szybkość tworzenia CO2 w wyniku bakteryjnego oddychania przewyższa wiązanie CO 2 przez fitoplankton. Oznacza to, że przynajmniej okresowo obieg węgla nie jest równomierny w różnych częściach oceanu. A to sugeruje, że okresy autotroficznego zysku netto (kiedy wiązanie CO 2 przewyższa tworzenie CO 2 podczas oddychania) mogą się pojawiać w różnym czasie w ciągu roku, aby równoważyć zysk netto heterotrofii [del Giorgio, Cole i Cimbleris (1997) Nature 385: 148-151]. Znajomość obiegu węgla jest konieczna do zrozumienia „efektu cieplarnianego" (sekcja 10.6), a ewolucja tego obiegu jest interesująca sama w sobie [Past and present cycle of carbon on our planet (artykuł przeglądowy): Schlegel (1992) FEMSMR 103: 347-354]. 10.3.1.1 Ksenobiotyki Wiele ksenobiotyków (zanieczyszczenia środowiska takie jak pestycydy, inne związki chemiczne używane w rolnictwie i detergenty) trudno ulega biodegradacji z powodu obecności w ich cząsteczkach jednego lub kilku wiązań eterowych (C-O-C). Pod tym względem przypominają one naturalny składnik, jakim jest lignina, która wykazuje trwałość w środowisku powodując powstawanie np. węgla kopalnego. Pomimo oporności ksenobiotyków na biodegradację, są jednak zespoły bakterii, które mają zdolność ich rozkładu. Jest to szczęśliwe rozwiązanie, ponieważ taka działalność pomaga ograniczyć niepożądane gromadzenie tych składników w środowisku. Bakteryjny rozkład wiązań eterowych został omówiony przez White, Russell i Tidswell (1996) [MR 60: 216-232].

10.3.2 Obieg azotu Azot jest składnikiem białek i kwasów nukleinowych, dlatego też jest niezbędny dla wszystkich organizmów. Azot gazowy (diazot — N 2 ) stanowi ponad trzy czwarte atmosfery Ziemi. Większość organizmów nie wykorzystuje jednak tej jego formy, gdyż tylko niektóre z nich mają taką zdolność (sekcja 10.3.2.1). Przyswajanie amoniaku. Wiele bakterii przyswaja azot w formie amoniaku, głównie wbudowując grupę aminową (z amoniaku) albo do α-ketoglutaranu, albo do glutaminianu — tworząc odpowiednio glutaminian lub glutaminę. Te z kolei służą jako dawcy azotu w różnych reakcjach transaminacji w procesie syntezy innych związków azotowych. Tak więc, glutaminian dostarcza azotu do syntezy, np. L-alaniny i L-asparaginy (rys. 6.3), a glutamina jest dawcą azotu w syntezie puryn i pirymidyn (zasady w kwasach nukleinowych) oraz aminokwasów — histydyny i tryptofanu. U E. coli szlak asymilacji amoniaku zależy od jego stężenia i zachodzi z zużyciem NADPH. W dużych stężeniach amoniaku enzym dehydrogenaza glutaminianowa katalizuje redukcyjną aminację α-ketoglutaranu do glutaminianu. W małych stężeniach amoniaku (np. < 01 mM) reakcja zachodzi dwuetapowo. Najpierw syntetaza glutaminowa (GS) katalizuje tworzenie glutaminy z glut251

aminianu i amoniaku, a następnie w drugim etapie aminotransferaza glutaminowo-α-ketoglutaranowa (GOGAT, ang. glutaminę: 2-oxoglutarate aminotransferase; syntaza glutaminianowa) katalizuje reakcję, w której glutamina (1 cząsteczka) i α-ketoglutaran (1 cząsteczka) tworzą glutaminian (2 cząsteczki). U E. coli szlak katalizowany przez dehydrogenazę glutaminianową jest istotny w warunkach ograniczonego dopływu energii (np. kiedy substraty energetyczne są ograniczeniem), gdyż reakcja katalizowana przez ten enzym jest niezależna od ATP, podczas gdy szlak, w którym uczestniczy GOGAT, jest zależny od ATP [Pathway choice in glutamate synthesis in E. coli: Helling (1998) JB 180: 4571-4575]. Przyswajanie azotanów. Niektóre bakterie mają zdolność przyswajania azotu w postaci azotanów, azotan jest wtedy najpierw redukowany do amoniaku w procesie redukcji asymilacyjnej (rys. 10.2). Jest to proces różniący się od oddychania azotanowego (sekcja 5.1.1.2; rys. 10.2) np. tym, że nie towarzyszy mu wytwarzanie energii.

Nitryfikacja jest procesem tlenowym, podczas gdy oddychanie azotanowe /denitryfikacja i wiązanie azotu są w zasadzie związane z warunkami beztlenowymi lub ubogimi w tlen (ale patrz sekcja 5.1.1.2). U niektórych sinic wiązanie azotu zachodzi w heterocystach (sekcja 4.4.2). Azotany lub amoniak mogą być przyswajane (tj. wykorzystywane jako źródło azotu) przez wiele rodzajów bakterii — azotany są redukowane wewnątrzkomórkowo do amoniaku (asymilacyjna redukcja azotanów). Amonifikacja jest częścią procesu mineralizacji (sekcja 10.3.4).

252

Azotany, azotyny, amoniak w metabolizmie energetycznym. Azotany lub azotyny mogą być wykorzystywane przez niektóre bakterie jako akceptory elektronów w metabolizmie oddechowym. W zależności od gatunku organiczne lub nieorganiczne substraty mogą być używane jako dawcy elektronów w tego typu metabolizmie (test na redukcję azotanów jest opisany w sekcji 16. 1. 2.12). Znanych jest kilka szlaków tych przemian. Denitryfikacja jest procesem oddechowym (sekcja 5.1.1.2; rys. 10.2), w którym azotany lub azotyny są redukowane do form gazowych (głównie N2 i/lub tlenek azotu). Proces ten ma znaczenie dla upraw rolnych, ponieważ powoduje zubożenie gleby pod względem biologicznie użytecznego azotu (sekcja 10.3.2). Dysymilacyjna redukcja azotanów do amoniaku — DRNA (ang. dissimilatory reduction of nitrate to ammonia) jest procesem oddechowym przeprowadzanym przez niektóre bakterie (np. gatunki Enterobacter i Vibrio) opisane jako występujące w takich siedliskach jak osady morskie. Sądzi się, że DRNA zachodzi najaktywniej w małych stężeniach azotanów, w wyższych stężeniach następuje redukcja przede wszystkim do azotynów i odpowiednio w mniejszej ilości do amoniaku [Bonin (1996) FEMSME 19: 27-38]. Nitryfikacja (rys. 10.2) jest procesem zależnym od tlenu, dostarczającym energii, w którym amoniak jest utleniany do azotynów, a azotyny do azotanów przez grupę chemolitotroficznych bakterii (sekcja 5.1.2).

10.3.2.1 Wiązanie azotu Wiązanie azotu atmosferycznego (redukcja azotu — N2 do amoniaku) jest przeprowadzane tylko przez pewien typ bakterii i przez niektórych przedstawicieli Archaea. Do tych diazotrofów należą niektóre sinice, np. Anabaena, Nostoc, pewne gatunki Bacillus i Clostridium, Klebsiella pneumoniae (niektóre

szczepy) oraz przedstawiciele rodziny Azobacteriaceae i Rhizobiaceae, a także z rzędu Rhodospirillales. Wiązanie N2 jest katalizowane przez kompleks enzymatyczny — nitrogenazę. Elektrony z takiego źródła jak wodór lub NADPH są przenoszone np. na ferredoksynę (sekcja 5.1.1.2) i kolejno na nitrogenazę. Redukcja azotu wymaga znacznej ilości energii — około 12-16 cząsteczek ATP na każdą cząsteczkę związanego azotu. Amoniak tworzony w procesie wiązania azotu może być asymilowany np. przez aminację glutaminianu do glutaminy. Nitrogenaza jest bardzo wrażliwa na tlen. Wiele diazotrofów (np. laseczki beztlenowe z rodzaju Clostridium) wiąże azot beztlenowo lub w warunkach małego stężenia tlenu (warunki mikroaerobowe), a niektóre sinice proces ten przeprowadzają wewnątrz heterocyst (sekcja 4.4.2). Tlenowce wiążące azot mają specjalny mechanizm ochraniający własną nitrogenazę. W jednokomórkowych, tlenowych, wiążących azot sinicach z gatunku Cyanothece wiązanie azotu przebiega tylko w okresie ciemności podczas przemiennych 12-godzinnych cykli ciemności i światła, natomiast jest procesem ciągłym podczas 24-godzinnego naświetlania. Wiązanie azotu w ciemności pozwala na uniknięcie tlenu, który

253

powstaje podczas fotosyntezy (sekcja 5.2.1.1), ale ciągła aktywność nitrogenazy podczas nie przerywanego naświetlania wymaga dodatkowych wyjaśnień. Jedno z możliwych dostrzega w tym rolę „zawiesiny ziaren", której powstawanie towarzyszy wiązaniu azotu [Reddy i wsp. (1993) JB 175: 1284-1292]. [Nitrogen fixation by non-heterocystous Cyanobacteria (artykuł przeglądowy): Bergman i wsp. (1997) FEMSMR 19: 139-185]. Diazotrofy występują jako organizmy swobodnie żyjące w glebie i wodzie lub też jako symbioty (sekcja 10.2.4). Na zakończenie, intrygujące pytanie: dlaczego wiązanie azotu zachodzi tylko w niektórych prokariotach, dlaczego na przykład nie w roślinach? Uważa się, że w toku ewolucji rośliny włączyły organizmy prokariotyczne jako organelle (jak np. mitochondria), ale zdolność prokariotów do wiązania azotu rozwinęła się później w swobodnie żyjących organizmach. To właśnie, w połączeniu z niedostateczną presją selekcyjną jest uważane za przyczynę wiązania azotu tylko przez prokarioty [Postgate (1992) PTRSLB 338: 409-416].

10.3.2.2 Rolnictwo i obieg azotu Znajomość udziału bakterii w obiegu azotu może znaleźć zastosowanie w udoskonalaniu upraw rolniczych. Wydajność zbiorów płodów rolnych może być ograniczona brakiem w glebie dostępnego azotu. Zatem dzięki znajomości mechanizmów utraty azotu oraz możliwości wykorzystania jego wiązania można często podjąć odpowiednie działania w celu zwiększenia wydajności zbiorów. Azot z gleby jest pobierany podczas wzrostu roślin i w czasie zbiorów, a również jest z niej tracony w procesach denitryfikacji i nitryfikacji. Denitryfikacja zazwyczaj zachodzi najintensywniej w warunkach beztlenowych lub słabego dostępu do tlenu (mikroaerobowych), w obecności azotanów i związków organicznych; warunki spotykane np. w glebach uprawnych zalanych wodą. Denitryfikację można więc ograniczać przez ulepszenie struktury i drenowanie gleby, przeciwdziałając rozwojowi warunków beztlenowych. Szkodliwość denitryfikacji jest oczywista, ale dlaczego nitryfikacja prowadzi do strat azotu? Odpowiedź leży w tym, że mimo iż zarówno azotany, jak i amoniak są rozpuszczalne, to jony amonowe adsorbują się łatwo do cząstek gleby (cząstki gliny zazwyczaj niosą ładunek ujemny), a jony azotanowe nie. A więc azotany są znacznie łatwiej wypłukiwane (wyługowane) z gleby przez deszcz czy powódź. Dlatego też w nawozach azotowych lepiej stosować związki amonowe niż azotany. Nitryfikacji można zapobiegać poprzez dodanie „inhibitora nitryfikacji" do nawozu. Związki takie przede wszystkim hamują utlenianie amoniaku, a jeden z nich, etridiazol, jest dodatkowo przydatny jako środek przeciwgrzybiczny i znajduje zastosowanie np. na gleby i nasiona przeciwdziałając butwieniu. Nawozy azotowe mogą uzupełnić straty azotu, ale są kosztowne, w związku z tym mało dostępne w krajach o największym na nie zapotrzebowaniu. Istnieją jednak inne rozwiązania. Na przykład w płodozmian mogą być włączone „rośliny wiążące azot", jak koniczyna i lucerna, oraz wprowadzone rośliny tworzące „zielony nawóz", np. Azolla (sekcja 10.2.4.1). Jest to praktyka po-

254

wszechna w Azji Południowo-Wschodniej. W uprawach ryżu można np. zwiększyć plony stymulując do wzrostu swobodnie żyjące, wiążące azot sinice. Najlepszym rozwiązaniem byłoby stworzenie, wykorzystując metody manipulacji genetycznej, roślin zdolnych do wiązania azotu bez pomocy prokariotów. Tworzenie brodawek przez rośliny niemotylkowe. Próby wyrażenia bakteryjnych genów nif (wiązania azotu) w roślinach jak dotychczas nie powiodły się, ale znalezienie brodawek zawierających Rhizobium wiążące azot (sekcja 10.2.4.) w niemotylkowej roślinie Parasponia (krzew subtropikalny) zasugerowało inne możliwości. Podjęto więc próby stymulacji rozwoju brodawek wiążących azot w niektórych niemotylkowych roślinach, szczególnie w zbożach takich jak ryż i pszenica, nie mających naturalnych brodawek. Celem takich działań jest zmniejszenie zapotrzebowania na nawozy azotowe w rolnictwie, aby np. obniżyć koszty produkcji zboża i wspomóc ograniczanie stosowania (nieprzyjaznych środowisku) tych nawozów (azotany). „Inwazja" niektórych roślin motylkowych (tropikalnych) przez bakterie wiążące azot zachodzi wówczas, gdy roślina wytwarza korzenie boczne. Na tym etapie wzrostu bakterie wnikają w miejscach, gdzie powstające korzenie boczne penetrują korę pierwotną korzenia. Ten sposób inwazji bakterii jest nazywany „wejściem przez pęknięcie". W następstwie korzenie boczne przekształcają się w brodawki wiążące azot. Przeprowadzano doświadczenia mające na celu stwierdzenie, czy pszenicę można „zainfekować" bakteriami z gatunku Azorhizobium caulinodans wiążącymi azot, które tworzą brodawki na tropikalnej roślinie motylkowej Sesbania rostrata. Azorhizobium caulinodans wprowadzono do ksylemu i merystemu korzeniowego (tj. do wnętrza rośliny — endofitycznie), uzyskując znaczący wzrost suchej masy i zawartości azotu w porównaniu z kontrolnymi roślinami nie zaszczepionymi [Sabry i wsp. (1997) PRS 264: 341-346].

10.3.3 Obieg siarki Siarka jest składnikiem np. aminokwasów — cysteiny i metioniny oraz ferredoksyn (sekcja 5.1.1.2) i kofaktorów takich jak koenzym A. Rośliny zielone i wiele bakterii może przyswajać siarkę w postaci siarczanów dostępnych powszechnie w wystarczających ilościach w warunkach naturalnych. Zanim siarczany zostaną wbudowane, muszą być zredukowane do siarczków w procesie asymilacyjnej redukcji siarczanów (rys. 10.3). Proces ten różni się od oddychania siarczanowego (sekcja 5.1.1.2; rys. 10.3) podobnie jak asymilacyjna redukcja azotanów różni się od oddychania azotanowego (sekcja 10.3.2). Pewne bakterie mogą przyswajać siarczki bezpośrednio ze środowiska. W niektórych siedliskach (np. nieutlenione, stojące stawy) powstaje znaczna ilość siarczków w procesie oddychania siarczanowego. Siarczek może być z kolei wykorzystany jako dawca elektronów (utleniany jest do siarczynu i siarczanu) przez beztlenowe bakterie fotosyntetyzujące (sekcja 5.2.1.2). Siarka elementarna może być zużywana np. przez archeona Sulfolobus oraz przez Thiobacillus thiooxidans i T.ferroxidans (patrz Aneks). Wykazano, że niektóre

255

Wiele gatunków może zużywać siarczany (SO42-) jako źródło siarki (koniecznej np. do syntezy niektórych aminokwasów); pokazane to jest na rysunku jako asymilacyjna redukcja siarczanów. W procesie tym siarczan jest redukowany wewnątrzkomórkowo do siarczku, który jest wbudowywany na różnej drodze przez różne organizmy; np. u Escherichia coli siarczek jest wbudowywany do O-acetyloseryny, aby utworzyć cysteinę. Oddychanie siarczanowe (=dysymilacyjna redukcja siarczanów) jest przeprowadzane np. przez „bakterie redukujące siarczany" — organizmy, które zużywają siarczany (lub np. siarczyny) jako ostateczne akceptory elektronów w oddychaniu beztlenowym (sekcja5.1.1.2). Desulfuromonas zużywa siarkę elementarną jako ostateczny akceptor elektronów w oddychaniu beztlenowym. Thiobacillus spp. zazwyczaj przeprowadzają oddychanie tlenowe, w którym utleniają np. siarczki (S2~) i/lub siarkę elementarna. Rhodopseudomonas sulfidophila jest jednym z gatunków, który zużywa siarczki jako dawcę elektronów w beztlenowym fototroficznym metabolizmie (sekcja 5.2.1.2).

gatunki Thiobacillus tworzą włóknistą warstwę, za pomocą której przylegają do cząsteczek siarki w osadzie ściekowym. Sugeruje się, że warstwa taka pełni w naturalnym środowisku ważną funkcję w kolonizacji i utlenianiu siarki [Blais i wsp. (1994) PB 29: 475-482]. Tiosiarczan i politioniany są ważnymi pośrednikami w bakteryjnym utlenianiu pirytu (siarczki metali), co jest związane ze szkodliwym dla środowiska tworzeniem kwaśnych wód kopalnianych. W procesie tym powstają jony żelazowe (Fe III) jako skutek bakteryjnego utleniania jonów żelazawych (Fe II) w pirycie. Wydaje się, że jony żelazowe utleniają siarkę w pirycie początkowo do tiosiarczanu, a następnie do tetrationianu, a tiosiarczan jest odtwarzany w cyklicznej reakcji poprzez tritionian. Stałe uzupełnianie jonów żelazowych zachodzi dzięki,

256

towarzyszącemu tym procesom, metabolizmowi tlenowemu bakterii litotroficznych takich jak Thiobacillus ferrooxidans. [Sulphur chemistry of bacterial leaching of pyrite: Schippers, Jozsa i Sand (1996) AEM 62: 3424-3431].

10.3.4 Mineralizacja Rysunki 10.1-10.3 pokazują, że w krążeniu materii złożone związki organiczne są rozkładane do prostych związków nieorganicznych, jak: dwutlenek węgla, siarczek, siarczan, amoniak i azotany. Taka przemiana materii organicznej na nieorganiczną jest nazywana mineralizacją.

10.4 Bakterie stanowiące zarodki krystalizacji zamarzającej wody („lodotwórcze") W temperaturach nieco poniżej 0°C niektóre bakterie wspomagają przemianę wody w lód, działając jak zawiązek, wokół którego tworzą się kryształy lodu. Niektóre bakterie o zdolnościach „lodotwórczych" (ang. ice-nucleation) są często spotykane na powierzchni roślin i mogą wywołać uszkodzenia różnych płodów rolnych w czasie mrozu. Do bakterii takich należą gatunki Erwinia, Pseudomonas i Xanthomonas.

Niektóre tkanki roślinne mogą przeżyć bez uszkodzeń oziębienie do kilku stopni poniżej 0°C, a tylko w obecności bakterii „lodotwórczych" są w tych warunkach uszkadzane. W temperaturach poniżej (około) -5°C występowanie uszkodzeń może być ograniczone przez redukcję liczebności populacji bakterii „lodotwórczych" na roślinie działaniem na jej powierzchnię np. antybiotykami jak streptomycyna czy oksytetracyklina. Kontrola biologiczna (sekcja 13.1.2), polegająca na działaniu odpowiednimi „nie-lodotwórczymi" bakteriami może również być skuteczna. Stosując łącznie kontrolę biologiczną i działanie antybiotykami w celu ograniczenia uszkodzeń wywołanych mrozem w gruszy otrzymano efekt będący sumą tych dwóch metod [Lindow i wsp. (1996) Phytopatology 86: 841-848].

10.5 Bakteriologia in situ — fakt czy fikcja? W idealnej sytuacji, badania organizmu powinny być prowadzone in situ, tj. w jego naturalnym środowisku. Biologia traktuje przede wszystkim o rzeczywistym żywym świecie. Niektóre dziedziny, np. badania struktur wewnątrzkomórkowych wymagają pracy in vitro (w laboratorium), ale w tych przypadkach, gdy tylko jest to możliwe — „zachowanie" komórek najlepiej obserwować w warunkach, które najwierniej odtwarzają ich naturalne siedlisko. Każde znaczące badanie in situ wymaga zaznajomienia się z danym środowiskiem, ponieważ bez tego plan doświadczenia mógłby być błędny. Niestety wiele z badań, które uważa się za „in situ", podlegają oczywistym zakłóceniom natury (czasem ekstremalnym), a więc mają małą wartość naukową.

257

10.5.1 Komory z filtrem membranowym W celu badania przeżywania bakterii np. w rzekach, zawiesinę bakterii zamyka się w „komorach z filtrem membranowym". Są to, w zasadzie, szerokie plastikowe rurki zamknięte na obu końcach filtrem membranowym (wielkość porów 0,22-0,45 μm.). Gdy taką komorę zanurzy się w wodzie w rzece, można uważać, że bakterie wewnątrz komory są zasadniczo w „naturalnych" warunkach, tj. próbę traktuje się za umieszczoną w środowisku, ponieważ komora jest w nim po prostu zanurzona. Jednak próba w takiej komorze ma ograniczony kontakt ze środowiskiem: otrzymuje ogólnie mniej światła i jest odgrodzona od zaburzeń naturalnych (zatem od zmian temperatury itp.). Ponadto wnikanie lub wydostanie się cząsteczek (w tym zbędnych produktów z próby) na zasadzie dyfuzji zachodzi tu tylko przez bardzo małe pory w filtrze. Szybkość dyfuzji, przez filtry z porami na tyle małymi, że zatrzymują badane organizmy, jest z konieczności krańcowo mała.

10.5.2 Koniugacja in situ W podjętych próbach wykonania koniugacji (sekcja 8.4.2) in situ — w rzece i w kanale Welsh, zawiesiny dawców i biorców mieszano, a następnie przesączano przez filtr membranowy. Filtr z osadzoną warstwą bakterii umieszczono tą warstwą do spodu, na płaskim kamieniu, przytrzymano filtrem z włókna szklanego i przytwierdzono razem do kamienia gumową opaską. Po zanurzeniu w rzece lub w kanale przez 24 godziny, wykonano badania pod kątem występowania transkoniugantów. Wykazanie obecności transkoniugantów pozwoliło na wyciągnięcie wniosku, że „możliwe jest przekazywanie plazmidów między bakteriami w epilitonie rzecznym" [Bale, Fry i Day (1987) JGM 133: 3099-3107]. Oczywiście, aby wyciągnąć taki wniosek, warstwę bakterii na filtrze należało traktować jako epiliton: zespół osiadłych osobników, które rosną na powierzchni podwodnych kamieni. Do jakiego stopnia „symulowany epiliton" przypomina epiliton naturalny? A więc również, w jakim stopniu wniosek z doświadczenia jest uzasadniony? Wcześniejsze badania innych autorów [Lock i wsp. (1984) Oikos 42: 10-22] wykazały, że rzeczywisty epiliton składa się z komórek osadzonych we włóknistej, wielocukrowej warstwie. Zdjęcia z mikroskopu elektronowego uwidoczniają komórki i mikrokolonie umiejscowione w podłożu i oddzielone od siebie przez substancję takiego podłoża. A więc, czyż w autentycznym epilitonie miejsca receptorowe biorcy dla pilusów nie są ukryte w warstwie podłoża? Czy pilus może w ogóle dosięgnąć biorcy przez warstwę podłoża, która może wykluczać makrocząsteczki? Ponadto, czy wobec obecności tej warstwy komórki biorcy i dawcy mogą osiągnąć bezpośredni kontakt ścian komórkowych (typu pokazanego na fot. 8.1, w górnej części)? Naśladowany epiliton nie może odpowiedzieć na żadne z tych kłopotliwych pytań, ponieważ nie posiada istotnej cechy naturalnego epilitonu, jaką jest wielocukrowa, włóknista warstwa! Właściwa symulacja wymagałaby (oprócz warstwy podłoża) populacji komórek podobnej do autentycznej w epilitonie — o rzeczywistej proporcji dawców 258

i biorców. Jednakże w opisanym eksperymencie na każdy centymetr kwadratowy filtra zostało nałożone 107 komórek dawcy dobrze wymieszanych z 108 komórek biorcy (o znanej zgodności). Z danych tych autorów wynika, że wartości te przekraczały ponad 100-krotnie całkowitą liczbę żywych bakterii w autentycznym epilitonie. Ponadto, populacja na filtrze składała się wyłącznie z dawców i biorców i z niewytłumaczalnych przyczyn taką sytuację traktowano jako naśladującą naturę. W naturze nie ma takiej sytuacji i niesłuszne jest udawanie, że ona istnieje. Wydaje się możliwe, że w doświadczeniu tym kontakt dawcy z biorcą był zapoczątkowany podczas mieszania i filtrowania, tj. nawet przed umiejscowieniem filtra „in situ" w badanej lokalizacji w rzece lub kanale. Eksperyment ten chociaż pozornie dotyczył „naturalnego siedliska", w żaden sposób nie odpowiadał rzeczywistemu środowisku i był niczym więcej niż laboratoryjnym eksperymentem koniugacji przeprowadzanym poza laboratorium. Takie doświadczenia mogą być zabawne, ale nie wnoszą niczego do nauki.

10.6 Efekt cieplarniany W naturalnym obiegu węgla (sekcja 10.3.1; rys. 10.1) znaczną ilość CO 2 tworzą zwierzęta, rośliny i mikroorganizmy podczas oddychania lub fermentacji, ale jednocześnie równie dużo CO2 jest zużywane przez autotrofy fotosyntetyzujące (np. rośliny zielone i sinice). Ogólnie, ta ważna równowaga między produkcją biologiczną i zużyciem CO2 jest dezorganizowana np. przez zużywanie olbrzymich ilości paliw (nafta, gaz itp.), prowadzące do wzrostu poziomu CO2, a w konsekwencji do ocieplania naszej planety (efekt cieplarniany). Czy wzrastający poziom CO 2 może być równoważony intensywnością fotosyntezy w roślinach (tj. zwiększonym wiązaniem CO2)? W zbadanych roślinach do typowej reakcji na wzrost ilości CO 2 należy np. zwiększony przyrost korzeni i zmniejszenie ilości azotu w tkankach (tj. wyższy stosunek węgla do azotu). W szczególności rośliny uprawne wykazują poprawę wzrostu i wyższą wydajność. Badania Korner i Arnone [Science (1992) 257: 1672-1675] ukazały jednak mniej optymistyczny obraz. Autorzy ci obserwowali wpływ zwiększonej ilości CO 2 na eksperymentalny ekosystem tropikalny i stwierdzili, że znaczący przyrost korzeni był związany głównie ze stymulacją metabolizmu mikroorganizmów (w tym bakterii) w ryzosferze (środowisku gleby przylegającej do korzeni). W interpretacji tych wyników wskazywano, że podwyższony poziom CO2 niekoniecznie musi powodować zwiększone odkładanie węgla, ale może prowadzić do szybszego obiegu węgla (cyklicznej wymiany) pomiędzy atmosferą i ekosystemami lądowymi [Plants and increasing levels of CO2: Murray (1997) Carbon dioxide and plant responses, ISBN 0863 80213 3]. Oczywiście, wszystkie lasy kuli ziemskiej są głównym naturalnym „zlewem" dla CO2. Niestety postępująca wycinka lasów ciągle redukuje efektywność tego zbiornika. Nieco optymistyczne wydaje się, że niektóre głęboko tworzące się trawy pastwisk przeniesione do sawanny Ameryki Południowej gromadzą znaczne ilości węgla w swoim wyjątkowo masywnym systemie korzeniowym.

259

Mogłyby one być pomocne w równoważeniu niektórych niebiologicznych emisji CO2 [Fisher i wsp. (1994) Nature 371: 231-238]. Inny cieplarniany gaz — metan (sekcja 5.1.2.2) jest utleniany przez metylotrofy (sekcja 6.4), ale pozostająca jego część przyczynia się do efektu cieplarnianego. Podczas denitryfikacji (sekcja 5.1.1.2) tworzą się też gazy cieplarniane. Harte [(1996) BC 5:1069-1083], komentując dane z antarktycznych i grenlandzkich rdzeni lodowych, wskazał, iż globalne ocieplenie samo może powodować zwiększony poziom gazów cieplarnianych. Istnieje więc możliwość efektu pozytywnego sprzężenia, co nie jest odzwierciedlane w tworzonych modelach przyszłych zmian klimatycznych. Ponadto autor ten wskazuje na wiele współdziałań (synergii), które istnieją pomiędzy różnymi formami degradacji środowiska, a również, że założenie o prostej, liniowej (tj. proporcjonalnej) zależności między wzrostem populacji ludzkiej i problemami środowiskowymi jest zbyt optymistyczne. Przeczytanie artykułu Harta jest godne polecenia szczególnie tym, którzy uważają, że szkody środowiskowe mogą być rozpatrywane kawałek po kawałku, tj. w izolacji od środowiska jako całości.

10.7 Problem rekombinantów bakteryjnych w środowisku Zastosowanie bakterii otrzymanych metodami inżynierii genetycznej — np. do kontroli biologicznej (sekcja 13.1.2) — wywołuje niepokój wynikający z niewystarczającej wiedzy o tym, jak mogą się zachować te organizmy lub jak mogą przekazać swoje geny w naturalnym środowisku. Jednym z rozwiązań tego zagadnienia jest biologiczna kontrola: zaaranżowany mechanizm genetycznej „samodestrukcji", działający automatycznie, kiedy funkcje zrekombinowanego organizmu zostają spełnione. Takie mechanizmy nie są w 100% skuteczne; niektóre komórki rekombinantów przeżywają dzięki np. mutacji w zabijającym je genie. Wydaje się jednak, że eliminacja większości komórek rekombinantów jest celem wartym zachodu [„Suicide microbes" (artykuł przeglądowy): Ramos i wsp. (1995) Biotechnology 13: 35-37].

10.8 Bakterie nie wyhodowane/niehodowalne Prawdopodobnie tylko nieznaczna część z istniejących gatunków bakterii została wyhodowana i wyizolowana w laboratorium. Wiele gatunków pozostaje nieznanych przypuszczalnie po prostu dlatego, że nie stworzono im właściwych warunków do wzrostu in vitro. Dawniej wobec niepowodzeń w wyhodowaniu i izolacji nowego organizmu (np. widzianego pod mikroskopem) możliwa była tylko ograniczona jego charakterystyka. Obecnie metody biologii molekularnej umożliwiają nam zarówno wykrycie, jak i charakterystykę organizmu nie wyhodowanego — a nawet nie widzianego! Jedna z możliwości opiera się na tym, że gen 16S rRNA zawiera, obok zmiennych obszarów różniących się u poszczególnych rodzajów i gatunków, kilka „wysoce konserwatywnych" sekwencji nukleotydów — występujących powszechnie u przedstawicieli domeny Bacteria. Startery komplemen-

260

tarne do konserwatywnych sekwencji (startery o szerokim zakresie) mogą być użyte w PCR (sekcja 8.5.4) do powielenia każdego możliwego bakteryjnego genu 16S rRNA (np. w próbach klinicznych lub ze środowiska). Sekwencję produktów PCR można oznaczyć (sekcja 8.5.6) i porównać sekwencje zmiennych obszarów z bazą danych tysięcy znanych gatunków ze wszystkich głównych grup bakterii. Powielone geny mogą więc wskazać na obecność organizmu pokrewnego filogenetycznie do znanego gatunku lub grupy. W ten sposób mogą być badane również próby zawierające niejednorodną populację bakterii. W takich przypadkach w PCR tworzone są mieszane produkty (tj. powielone różne 16S rRNA geny) i w celu określenia ich sekwencji oraz dalszej analizy konieczne jest klonowanie każdego z nich. W analizie zróżnicowanego zespołu organizmów, z zastosowaniem PCR, problemem jest to, że gen 16S rRNA różnych organizmów może być powielany z różną wydajnością — taka wybiórczość powielania w PCR jest najwyraźniej zależna od oddziaływania DNA przyległego do powielanego odcinka [Hansen i wsp. (1998) FEMSME 26: 141-149].

10.8.1 „Żyjące, ale niehodowalne" bakterie Niektóre bakterie, dające się rutynowo hodować, po stresie (np. głodzenie) przestają rosnąć w podłożach laboratoryjnych, ale wciąż wykazują cechy żywych komórek — tj. aktywność metaboliczną i utrzymującą się strukturę. Komórki takie nazwano: żyjące, ale niehodowalne (VBNC, VNC, ang. viable but non-cultivable). (Niektóre patogeny, włącznie z Vibrio cholerae [Colwell (1996) Science 274: 2025-2031], nie tracą zjadliwości.) Stan VNC jest traktowany przez niektórych autorów jako normalna odpowiedź na stres bakterii nie tworzących form spoczynkowych, lecz mogących przetrwać w „uśpieniu" [McDougald i wsp. (1998) FEMSME 25: 1-9]. Chociaż takie „uśpione" komórki mogą egzystować, to niektórzy uważają, że niepowodzenia w ich wyhodowaniu mogą być spowodowane, przynajmniej w niektórych przypadkach, nieodpowiednimi podłożami/warunkami. Na przykład, komórki głodzone przeniesione do podłoża bogatego w składniki odżywcze i w warunkach natlenienia mogą tworzyć toksyczne/śmiercionośne ~ wewnątrzkomórkowe rodniki (np. anion ponadtlenkowy,. O2 ). Takie rodniki (powszechne produkty uboczne w tlenowym metabolizmie) są zazwyczaj unieszkodliwiane przez specjalne enzymy (np. dysmutaza ponadtlenkowa), ale to nie zachodzi w komórkach głodzonych (niezaadoptowanych). Tak więc, komórki głodzone mogą doznać uszczerbku lub nawet zostać zabite na skutek wywołanego przez siebie tlenowego uszkodzenia [Bloomfield i wsp. (1998) Microbiology 144: 1-3].

ROZDZIAŁ

11

Bakterie w medycynie

11.1 Bakterie jako patogeny Źródłem niektórych chorób są „błędy" w chemii organizmu, lecz w wielu przypadkach objawy chorobowe wynikają z działalności pewnych drobnoustrojów lub produktów przez nie wytwarzanych na powierzchni lub wewnątrz organizmu; każdy drobnoustrój, który (w sprzyjających warunkach) może powodować chorobę, zwany jest patogenem. Wśród wielu chorób wywołanych przez drobnoustroje, pewne są wywoływane przez grzyby, inne przez wirusy, jeszcze inne przez pierwotniaki, a niektóre przez bakterie; przykłady chorób powodowanych przez te ostatnie opisano w skrócie na końcu tego rozdziału. W niektórych chorobach związek między objawami a patogenem jest wysoce swoisty: daną chorobę może wywołać tylko odpowiedni gatunek lub nawet określony szczep należący do tego gatunku. Wąglik, na przykład, powodowany jest jedynie przez pewne szczepy Bacillus anthracis; szczepy te zawierają plazmidy (sekcja 7.1.), które kodują toksynę (cyklaza adenylanowa) oraz otoczkę chroniącą patogena. W innych wypadkach przyczyną choroby może być jeden z wielu czynników; przykładem jest zgorzel gazowa, którą wywołuje jeden lub więcej różnych gatunków Clostridium. Czasami choroba powodowana jest przez organizm zwykle nie zachowujący się jak patogen i który może nawet należeć do własnej mikroflory organizmu (tab. 11.1). Na przykład, niektóre gatunki Bacteroides, często występujące w jelicie, mogą czasem, po przypadkowym urazie lub ingerencji chirurgicznej obejmującej dolną część przewodu pokarmowego, powodować zapalenie otrzewnej. Tego typu organizmy zwane są patogenami oportunistycznymi. Choroba nie zawsze musi być wynikiem zetknięcia się z danym „czynnikiem sprawczym". W istocie, wystąpienie (lub nie wystąpienie) choroby zależy od różnych czynników — w tym odporności gospodarza oraz wirulencji (zdolności do wywoływania choroby) patogena. O współzależności między tymi czynnikami świadczy to, że organizmy będące słabymi patogenami (lub będące niepatogenne) mogą wywoływać ciężkie choroby u osób ze zmniejszoną odpornością. 262

Szpitale, w których występuje zagęszczenie chorych, mogą same w sobie być źródłem zakażeń. Choroba nabyta w szpitalu nosi nazwę infekcji szpitalnej [infekcje szpitalne (różnorodne aspekty): Emmerson i Ayliffe (red.) BCID (1966) 3: 159-306].

11.2 Drogi infekcji Skóra stanowi zwykle skuteczną barierę dla patogenów, lecz może ona zostać uszkodzona np. przez skaleczenie, zabiegi chirurgiczne, ukąszenia owadów itp. Powstałe rany mogą dopuszczać wiele różnych potencjalnych patogenów zdolnych do wywoływania chorób układowych (to jest chorób obejmujących całe ciało) lub schorzeń miejscowych. Do bakteryjnych patogenów wnikających na drodze ukąszeń należy m. in. czynnik czynnik powodujący dżumę dymieniczą. Błony śluzowe występujące w przewodzie pokarmowym, układzie oddechowym i układzie moczowo-płciowym zwykle są bardziej wrażliwe niż skóra i to

263

w tych miejscach często ma początek infekcja. Na przykład, w zapaleniu płuc i krztuścu (koklusz) infekcja zaczyna się właśnie na powierzchniach oddechowych, podczas gdy w cholerze i durze brzusznym — od błony śluzowej wyściełającej przewód pokarmowy. Możliwość zakażenia w czasie zabiegów chirurgicznych zwykle jest na ogół ograniczana dzięki przestrzeganiu skutecznie technik sterylnych. Dalsze kroki zapobiegawcze na przykład w ortopedii wiążą się z użyciem implantów z polimerów zawierających antybiotyki [Tunney, Gorman i Patrick (1966) RMM 7: 195-205] oraz cementu do kości impregnowanego antybiotykiem [Winniger i Fass (1966) AAC 40: 2675-2679].

11.2.1 Adhezja jako czynnik w infekcji W wielu chorobach występuje wczesna faza, w której zachodzi adhezja patogena do określonych miejsc w organizmie gospodarza. Konieczność adhezji staje się jasna, kiedy zastanowimy się na przykład nad tym, że miejsca często będące początkiem infekcji, to jest błony śluzowe, są nieustannie omywane przez własne wydzieliny i mogą podlegać takim ruchom jak perystaltyka, które to czynniki utrudniają ustabilizowanie się patogena. Adhezja może też pozwolić patogenowi skuteczniej współzawodniczyć z naturalną mikroflorą gospodarza. Adhezja zazwyczaj następuje za pośrednictwem swoistych struktur lub cząsteczek na powierzchni patogena — tak zwanych adhezyn (sekcja 11.5.6). Adhezyny często są fimbriami (sekcja 2.2.14.2). Adhezja przebiegająca przy współudziale fimbrii jest istotna na przykład w wirulencji enterotoksygennych szczepów E. coli (ETEC, ang. enterotoxigenic strains of E. coli, tab. 11.2), które wiążą się do błon śluzowych jelita. [Wytwarzanie fimbrii przez patogeny jelitowe (artykuł przeglądowy): Edwards i Puente (1998) TIM 6: 282-287]. Tego typu adhezja ma również znaczenie na przykład w nawiązaniu pierwszego kontaktu między Haemophilus influenzae typ b a nabłonkiem układu oddechowego. W krwiobiegu patogen ten, najprawdopodobniej w wyniku przypadkowej i odwracalnej zmiany genetycznej, nie wytwarza fimbrii, co pozwala mu na uniknięcie przeciwbakteryjnej aktywności układu immunologicznego. [Adhezyny Haemophilus., Actinobacillus i Pasteurella (artykuł przeglądowy): Jacques i Paradis (1998) FEMSMR 22: 45-59.] Do adhezyn nie będących fimbriami należą między innymi białka Μ paciorkowców (sekcja 2.2.13), nitkowata hemaglutynina (FHA, ang. filamentous haemagglutinin) Bordełella pertussis i białka adhezyjne o dużej masie cząsteczkowej (HMW1, HMW2) „nietypowalnych" szczepów Haemophilus influenzae. Do ssaczych receptorów dla adhezyn należą różnego typu cząsteczki powierzchniowe, lecz wiązanie jest zwykle swoiste; na przykład, fimbrie E. coli typu 1 (tab. 2.2) wiążą się do reszt mannozy, podczas gdy fimbrie Ρ szczepów E. coli powodujących schorzenia układu moczowego wiążą się do α-D-galaktopiranozylo-(l-4)-β-D-galaktopiranozydowych receptorów glikolipidów na nabłonku wyściełającym przewody moczowe. Niektóre patogeny wiążą się do specyficznych integryn. Integryny to rodzina ssaczych glikoprotein na powierzchni komórek, których rola polega na wiązaniu komórek gospodarza do takich

264

składników matriks, jak kolagen i fibronektyna; integryny występują, na przykład, na komórkach nabłonkowych i śródbłonkowych. (Zwróć uwagę, że zgodnie ze swoją rolą w wiązaniu, integryny np. komórek nabłonkowych jelita występują na powierzchniach bazolateralnych, a nie na apikalnych, to jest skierowanych do światła jelita). Do patogenów wiążących się do swoistych integryn

nabłonka należą Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi i Yersinia enterocolitica.

W przypadku Listeria monocytogenes adhezyna zwana internaliną wiąże się do E-kadheryny, należącej do innej rodziny glikoprotein występujących na powierzchni komórek (kadheryn), które, podobnie jak integryny, zwykle odgrywają rolę w adhezji do komórek gospodarza. Adhezja może być bardziej złożona niż proste wiązanie między gospodarzem a patogenem. Na przykład, wiązanie adhezyny FHA B. pertussis do integryny na monocycie inicjuje wewnątrz niego sygnały, które zwiększają aktywność integryny drugiego rodzaju — wiążącej się do innego miejsca na FHA. W ten sposób B. pertussis wykorzystuje wewnętrzny system sygnalny gospodarza do indukowania dodatkowych miejsc wiązania. Złożone procesy mają miejsce, gdy EPEC (ang. enteropathogenic E. coli) (tab. 11.2) wiąże się do komórek nabłonkowych jelita. Według wcześniejszego poglądu [Donnenberg, Kaper i Finlay (1997) TIM 5: 109-114] przebiegało to następująco. Wstępnie wiązanie zachodzi za pośrednictwem fimbrii typu 4 (tab. 2.2) (zwanymi również fimbriami tworzącymi wiązki, BFP, ang. bundle-forming pili). Następnie EPEC, związane z powierzchnią komórki, wydzielają kilka białek (tak zwana „sekrecja wywołana kontaktem"), między innymi EspA i EspB; białka te wpływają na przekazywanie sygnałów wewnątrz komórki gospodarza i mogą być wstrzykiwane bezpośrednio poprzez system sekrecji typu III (sekcja 5.4) kodowany głównie przez wyspę patogenności LEE (sekcja 11.5.7). Zakłócenie przekazywania sygnałów wewnątrz komórki gospodarza prowadzi do utraty mikrokosmków, fosforylacji białka Hp90 błony komórkowej gospodarza oraz zmiany układu białek cytoszkieletu. Wówczas EPEC wiąże się za pośrednictwem białka zwanego intyminą do ufosforylowanej formy białka Hp90 gospodarza. Z kolei, zmiany układu aktyny poniżej miejsca związania powodują powstanie piedestału wnikającego do światła komórki, z którym związana jest komórka bakteryjna (fot. 11.1). Nowszy pogląd [patrz Kaper (1968) TIM 6:169-172] wprowadza duże zmiany do tego rozumowania. Nie uważa się, żeby rolę w nawiązaniu wczesnego kontaktu między EPEC a komórką gospodarza miały BFP (nie wykazano ich wiązania in vitro do tkanki z jelita cienkiego). (Ciekawe natomiast jest to, że wstępne wiązanie EHEC (tab. 11.2) do komórek (ssaczych) HeLa wydaje się przebiegać za pośrednictwem bakteryjnych powierzchniowych wyrostków, które zawierają EspA [Ebel i wsp. (1998) MM 30: 147-161]. Adhezyna intyminą może posiadać co najmniej dwa receptory. Jednym z nich jest bakteryjne białko, które zostaje wprowadzone do komórki gospodarza (za pośrednictwem systemu typu III), w niej ulega fosforylacji, a następnie integruje z błoną komórkową gospodarza, gdzie pełni rolę receptora; za białko to, zwane Tir (translokowany receptor intyminy), pierwotnie uważano białko Hp90 gospodarza. BFP mogą pośredniczyć w wiązaniu EPEC-EPEC (międzybakteryjnym), prowadząc do tworzenia mikrokolonii na błonie komórkowej gospodarza.

265

266

Enteroinwazyjne szczepy Ε. coli. Często występującymi szczepami są O124, O143 i O152. Werocytotoksyczne szczepy E. coli (VTEC, ang. verotoxic Ε. coli; EHEC, ang. enterohaemorrhagic E. coli) noszą swoją nazwę od toksyczności dla komórek Vero {komórki nerkowe z afrykańskiego makaka). Czasem zwane są też STEC dla określenia szczepów E. coli wytwarzających toksyny Shiga-podobne. Do tych szczepów należą O26 i O157:H7. [Detection and control of E. coli O157:H7 in foods: Meng i wsp. (1994) ΉΕ5 5: 179-185; czas trwania wydalania O157:H7 z odchodami przez dzieci: Swerdlow i Griffin (1997) Lancet 349: 745-746|. (patrz również sekcja 14.6.1). 5 Enterotoksygenne szczepy E. coli. Należą tu O6, O8, O63, O115 i O148. 6 Enteropatogenne szczepy E. coli. Należą tutaj O55, Olll (lecz patrz EaggEC w tej tabeli), O114 i O128. 7 Enteroagregujące szczepy E. coli. 3

4

Po adhezji, niektóre patogeny (w tym EPEC) pozostają na zewnątrz komórki, to jest są związane z zewnętrzną powierzchnią komórek gospodarza; inne wnikają do jednego lub różnych rodzajów jego komórek (sekcja 11.2.2). 11.2.1.1 Adhezja w próchnicy zębów Do próchnicy zębów przyczyniają się bakterie, które na drodze adhezji przylegają do powierzchni zębów i brzegów dziąseł, tworząc płytkę nazębną. Jest to błonka składająca się głównie z bakterii, produktów działalności bakteryjnej oraz substancji zawartych w ślinie. Streptococcus mutans, często występujący w płytce nazębnej, tworzy zewnątrzkomórkowe, nierozpuszczalne w wodzie glukany, które pomagają w adhezji bakterii; zbędne produkty bakteryjnego metabolizmu (np. kwas mlekowy) powodują miejscową demineralizację zębów, co umożliwia penetrację bakterii. Adhezja wydaje się również istotna w powstawaniu próchnicy zębów wypełnionych plombami; bakteryjna kolonizacja występuje w małej szczelinie między wypełnieniem a ścianą ubytku [Buchmann i wsp. (1990) MEHD 3: 51-57] (fot. 2.1, środek); z tego miejsca bakterie mogą penetrować kanaliki zębinowe, doprowadzając do zniszczenia dentyny.

11.2.2 Bakteryjna inwazja komórek ssaczych W niektórych chorobach patogen zwykle pozostaje na powierzchni komórek gospodarza; wówczas patogen ulega adhezji do komórek będących celem jego działania — na przykład w cholerze (Vibrio cholerne), rzeżączce (Neisseria gonorrhoeae) i krztuścu (Bordetella pertussis). W przciwieństwie do tego, niektóre patogeny wnikają do komórek gospodarza; „inwazja" jest procesem, w którym bakterie indukują pobieranie (internalizację) swoich komórek przez gospodarza; do tego typu patogenów należą gatunki Brucella i Chlamydia, enteroinwazyjna E. coli (EIEC), Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Salmonella typhi, Shigella flexneri i Yersinia enterocolitica.

Inwazję poprzedza adhezja do komórek gospodarza (sekcja 11.2.1). Sama inwazja zależy od patogena i rodzaju komórki gospodarza, jednak pobieranie zwykle wymaga czynnego udziału komórki gospodarza. Zwykle wiąże się to ze zmianą organizacji mikrofilamentów aktyny w cytoplazmie poniżej miejsca przyłączenia bakterii; z tego powodu pobieranie bakterii jest zwykle hamowane in vitro przez takie czynniki, jak cytochalazyny, które hamują reorganizację cząsteczek aktyny w komórkach ssaczych. 267

Fot. 11.1 Adhezja: dwie elektronogęste komórki EPEC (enteropatogenna Escherichia coli) ulegające adhezji za pośrednictwem piedestału do błony komórkowej komórki gospodarza (sekcja 11.2.1) Zdjęcie dzięki uprzejmości dr. M. S. Donnenberga, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, USA.

268

11.2.2.1 Inwazja nabłonka jelitowego Mechanizmy inwazji Inwazja salmonelli następuje poprzez apikalne (to jest zwrócone do światła) powierzchnie komórek nabłonka. Pobieranie komórki bakteryjnej jest poprzedzone sfałdowaniem błony komórkowej gospodarza; wypustki błony komórkowej, podtrzymywane od środka przez mikrowłókienka aktyny, szybko otaczają i pochłaniają bakterię, która w ten sposób ulega internalizacji w dużej („obszernej") wakuoli (=fagosom), zamykającej w sobie również płyn zewnątrzkomórkowy. Ten mechanizm pochłaniania komórki nosi nazwę makropinocytozy. Przed pochłonięciem, adhezji bakterii towarzyszy podwyższone stężenie jonów 2+ Ca w komórce gospodarza, ponieważ są one konieczne do mobilizacji i rozmieszczenia aktyny w trakcie makropinocytozy. Rolę w regulacji rozmieszczenia aktyny w komórce gospodarza i pochłanianiu salmonelli ma, jak się wydaje, GTPaza gospodarza, o nazwie CDC42. System sekrecji typu III u Salmonella (sekcja 5.4), kodowany przez zespół genów inv-spa zlokalizowanych w chromosomowej „wyspie patogenności" (sekcja 11.5.7), niezbędny jest do inwazji i, jak się wydaje, transportuje bakteryjne białko(a) efektorowe, które indukują fałdowanie błony komórkowej gospodarza oraz pochłanianie komórki bakteryjnej; ten system sekrecji być może również uczestniczy w translokacji białka(ek) efektorowych odpowiedzialnych za stany zapalne i sekrecję płynów [Galyov i wsp. (1997) MM 25: 903-912] (patrz również sekcja 11.3.3.1). Wewnątrz wakuoli Salmonella może się namnażać. Shigella, podobnie jak Salmonella (p. wyżej), wnika na zasadzie mechanizmu „spustowego" (ang. trigger), lecz proces ten odbywa się przez bazolateralne powierzchnie komórek nabłonkowych. Adhezyny są nieznane; w skład receptora prawdopodobnie wchodzą integryny. Inwazja wymaga uczestnictwa systemu sekrecji typu III (sekcja 5.4), kodowanego przez geny mxi-spa zlokalizowane na plazmidzie, oraz GTPazy Rho gospodarza (dla Salmonella — GTPaza CDC42). Shigella ucieka z fagosomu (do cytoplazmy gospodarza) po dokonaniu lizy błony; w lizie bierze udział białko bakteryjne IpaB (patrz też sekcja 11.5.2). Badania na zwierzętach wykazały, że Shigella jest pochłaniana przez fagocytarne komórki „M" w kępkach Peyera [komórki Μ w infekcji (artykuł przeglądowy): Jepson i Clark (1998) TIM 6: 359-365]. Wewnątrz komórek Μ bakterie mogą mieć dostęp do bazolateralnych powierzchni sąsiednich komórek nabłonka, rozprzestrzeniać się wewnątrz warstwy nabłonka (istotna cecha czerwonki = dyzenterii). Rozprzestrzenianie się między komórkami zależy od obecności bakteryjnego białka błony zewnętrznej — IcsA (=VirG) kodowanego przez gen plazmidowy. IcsA indukuje polimeryzację włókien aktyny na jednym z biegunów bakterii; pchają one bakterię przez cytoplazmę w kierunku odwrotnym do rosnącego „ogona" z aktyny. („Ogon" pozostaje w cytoplazmie gospodarza, a ciągłe odkładanie aktyny powoduje ruch bakterii.) Poruszająca się bakteria wpycha się do sąsiedniej komórki tworząc kieszeń, albo otaczając się wakuolą (z podwójną błoną). Następnie Shigella powoduje lizę błon i wnika do sąsiedniej 269

komórki. (Mutanty pozbawione aktywnego białka IcsA nie rozprzestrzeniają się i nie powodują dyzenterii). (Patrz również sekcja 11.3.3.2). Alternatywnie, po pobraniu przez komórki M, Shigella może zostać pochłonięta przez makrofagi (występujące pod komórkami M). Shigella może zabić makrofagi (sekcja 11.5.2), wywołując reakcję zapalną, w której leukocyty polimorfonuklearne (PMN, ang. polymorphonuclear leucocytes) migrują pomiędzy komórkami nabłonka i dostają się do światła jelita. Ta migracja PMN najprawdopodobniej odsłania bazolateralne powierzchnie komórek nabłonka, narażając je na dalszą inwazję przez Shigella, co jest istotnym czynnikiem w patogenezie dyzenterii (sekcja 11.3.3.2). Listeria monocytogenes. W inwazji uczestniczy adhezyna występująca na powierzchni komórki, zwana intemaliną A (produkt genu inlA). Receptorem jest E-kadheryna, należąca do rodziny glikoprotein (kadheryn) biorących udział w adhezji między komórkami; wewnątrzcytoplazmatyczna część cząsteczki E-kadheryny za pośrednictwem białek zwanych kateninami oddziałuje wzajemnie z aktynowym cytoszkieletem komórki. Cząsteczki E-kadheryny występują na bazolateralnych powierzchniach komórek nabłonka. Interakcja pomiędzy E-kadheryną i intemaliną A sama w sobie wydaje się inicjować pobieranie bakterii. (Ciekawe jest to, że nawet kuleczki z lateksu opłaszczone intemaliną A ulegają internalizacji przez niektóre typy komórek ssaczych [Lecuit i wsp. (1997) INFIM 54: 5309-5319].) Inwazja po interakcji między E-kadheryną i intemaliną A przypomina mechanizm „zamka błyskawicznego" w przypadku Yersinia enterocolitica (patrz niżej) (fot. 11.2). Listeria monocytogenes ucieka z fagosomu (fot. 11.2) w wyniku sekrecji kilku białek, w tym toksyny tworzącej pory, zwanej listeriolizyną O. Toksyna ta należy do rodziny cytolizyn aktywowanych tiolem [Morgan, Andrew i Mitchell (1996) RMM 7: 221-229], które mogą powodować lizę błon komórek eukariotycznych zawierających cholesterol. Wewnątrz cytoplazmy gospodarza L. monocytogenes rośnie i rozprzestrzenia się do sąsiednich komórek wykorzystując napędzany aktyną ruch opisany dla Shigella — białko ActA odgrywa tę samą rolę co białko IcsA Shigella. Bakteria po wepchnięciu do sąsiedniej komórki znajduje się w przedziale otoczonym podwójną błoną (po jednej błonie z każdej komórki). Ucieczka z tego przedziału wiąże się z sekrecją enzymu lecytynazy (produkt genu plcB), który hydrolizuje lecytynę (fosfatydylocholinę) zawartą w błonie. [Listeria monocytogenes (patogenność): McLaughlin (1997) RMM 8:1-14; inwazja i ruch oparty na aktynie: Cossart i Lecuit (1998) EMBO Journal 17: 3797-3806.]. Yersinia enterocolitica. U myszy (będących dobrym modelem do badania schorzeń człowieka) bakteria ta początkowo zostaje pochłonięta przez fagocytarne komórki Μ kępek Peyera. Badania w hodowlach tkankowych sugerują, że patogen może z kolei dokonać inwazji sąsiadujących komórek nabłonka poprzez ich powierzchnie bazolateralne. In vitro, niektóre adhezyny patogena (inwazyna i białko YadA) wiążą się do integryn komórki gospodarza (sekcja 11.2.1); powoduje to napływ kolejnych integryn do tego miejsca, co prowadzi do wielu połączeń między patogenem a gospodarzem (na zasadzie zamka błyskawicz-

270

nego) oraz powoduje pochłonięcie bakterii do wakuoli niewiele większej od niej samej. In vivo, tego typu inwazja przez komórki Y. enterocolitica może zachodzić jedynie na bazolateralnych powierzchniach komórek nabłonkowych, ponieważ tylko na tych powierzchniach występują integryny. Yersinia enterocolitica przeżywa wewnątrz wakuoli. Patogen ten unika fagocytozy wykorzystując mechanizm krótko opisany w sekcji 11.5.1. 11.2.2.2 Inwazja makrofagów

Niektóre bakterie mogą dokonać inwazji makrofagów, a po namnożeniu się, opuścić je (fot. 11.2). W porównaniu z fagocytozą (sekcja 11.4.1) w procesie tym mogą uczestniczyć np. inne adhezyny i receptory. Pierwszy kontakt między patogenem i makrofagiem może decydować o przetrwaniu patogena. Czasem przetrwaniu bakterii sprzyja brak inicjacji tzw. wybuchu tlenowego (ang. oxidative burst) w makrofagu. Po pobraniu: • u np. Chlamydia spp., Legionella pneumophila i Mycobacterium tuberculosis fagosom nie ulega zakwaszeniu i fuzji z lizosomem. • nieliczne gatunki, np. Coxiella burneti, potrafią przetrwać wewnątrz fagolizosomu. Legionella pneumophila. W fagosomie wartość pH utrzymuje się blisko wartości obojętnej i patogen namnaża się, zabijając makrofagi. Geny icm (wewnątrzkomórkowego namnażania, ang. intracellular multiplication) patogena, zwane również genami dot (ang. defect in organelle trafficking), prawdopodobnie kodują system sekrecji i cząsteczki efektorowe uczestniczące w blokowaniu fuzji fagosomu z lizosomem. Mutacje w tych genach wpływają na zdolność patogena do namnażania się i zabijania makrofagów [patrz np. Segal i Shuman (1998) TIM 6: 253-255]. Mycobacterium tuberculosis. Na inwazję/przeżycie mogą mieć wpływ: chemia powierzchni konkretnego szczepu M. tuberculosis; miejsce infekcji (np. płuca); czas kontaktu między patogenem a makrofagiem (np. w pierwotnej infekcji lub w trakcie rozprzestrzeniania się w organizmie). Opsonizacja (sekcja 11.4.2.1) z udziałem układu dopełniacza (sekcja 11.4.1.1) może przebiegać jedną z czterech dróg aktywacji dopełniacza, w tym drodze lektynowej i C2a (unikania zabijania, ang. salvage) (sekcja 11.4.1.1; rys. 11.1) [Schlesinger (1998) TIM 6: 47-49; Brown i Schorey (1998) TIM 6: 49-50]. Z kilku powodów, w tym małego stężenia dopełniacza w płynie pęcherzykowo-oskrzelowym, w początkowych stadiach infekcji płuca istotną rolę może odgrywać wiązanie bez udziału opsonin (to jest wiązanie niezależne od dopełniacza i przeciwciał). Niektóre bakterie patogenne ulegają internalizacji po związaniu wielocukrów na ich powierzchni z lektynami w receptorze CR3 makrofaga. Mycobacterium tuberculosis może się wiązać z receptorem za pośrednictwem β-glukanów, co pozwala na pochłonięcie komórek przed wystąpieniem, wywołanego stanem zapalnym, wzrostu poziomu dopełniacza [M. tuberculosisphagocyte interactions: Ehlers i Daffe (1998) TIM 6: 328-335]. 271

272

(a) Dwie elektronowogęste komórki Listeria monocytogenes pobierane na zasadzie mechanizmu „zamka błyskawicznego" (sekcja 11.2.2.1). (b) L. monocytogenes wewnątrz fagosomu w mysim makrofagu (strzałki wskazują na błonę fagosomu). Skala: 68 mm = Ιμm. (c) L. monocytogenes wewnątrz mysiego makrofaga, uciekająca z fagosomu i dzieląca się wewnątrz cytoplazmy, otoczona siecią włókien aktynowych (gwiazdki). Skala: 50 mm = 1 μm. (d) Mycobacterium avium dzieląca się wewnątrz mysiego makrofaga — strzałki wskazują na błonę fagosomu. Skala: 60 mm = 1 μm. Zdjęcie (a) z EMBO Journal (1998) 17: 3797-3806 za zgodą Oxford University Press i dzięki uprzejmości autorów (dr Pascale Cossart i Marca Lecuit), Unite des Interactions Bacteries-Cellules, Institut Pasteur, Paris, France. Zdjęcia (b)-(d) dzięki uprzejmości dr Chantal de Chastellier, Faculte de Medecine Necker-Enfants Malades, INSERM U 411, Paris, France. 11.2.2.3 Paracytoza

Paracytoza jest formą inwazji, w której patogen przechodzi przez warstwę komórek przenikając pomiędzy nimi W ten sposób Haemophilus influenzae przechodzi między komórkami nabłonkowymi w płucach. Paracytozę w przypadku tego patogena badano w hodowlach tkankowych z komórek nabłonka płucnego [van Schilgaarde i wsp. (1995) INFIM 63: 4729-4737]. 273

11.2.2.4 Transcytoza +

Transcytoza jest procesem, w którym pewne szczepy Opa Neisseria przechodzą przez warstwę komórek nabłonkowych bez naruszenia połączeń pomiędzy komórkami ssaczymi; proces ten jest zapoczątkowany pochłonięciem komórek bakteryjnych po ich uprzednim związaniu ze swoistymi receptorami na komórce gospodarza [Dehio, Gray-Owen i Meyer (1998) TIM 6: 489-495].

11.2.3 Stan utajenia Patogen zazwyczaj albo powoduje chorobę, albo zostaje zabity przez układ obronny gospodarza. W infekcji utajonej, powodowanej np. przez Mycobacterium tuberculosis, patogen pozostaje żywy, lecz wyciszony w wyniku aktywności układu immunologicznego gospodarza (sekcja 11.4); reakcja pacjenta na obecność patogena może być seropozytywna, lecz nie stanowi on powodu choroby. Stan utajenia występuje u około 60% osób zakażonych Mycobacterium tuberculosis, z czego u około 40% rozwija się czynna gruźlica; gruźlica utajona przez całe życie niesie ryzyko rozwinięcia się choroby (ryzyko to zwiększa się np. w przypadku infekcji wirusem HIV lub stosowania leków immunosupresyjnych). Przypuszcza się, że u co trzeciej osoby występuje infekcja utajona spowodowana przez M. tuberculosis.

Mechanizm stanu utajenia w gruźlicy jest nieznany. Po pochłonięciu komórek przez makrofagi patogen przeżywa (sekcja W.222) i rozprzestrzenia się w organizmie. Miejsca przebywania utajonych komórek M. tuberculosis nie są znane; nie zawsze można wykryć w tkankach bakterie kwasooporne stosując metodę Ziehl-Nielsena (sekcja 14.9.2). Nie jest więc jasne, czy patogen istnieje tam w formie niekwasoopornej lub w postaci przypominającej spory, czy też po prostu występuje w małej ilości, trudno wykrywalnej. Możliwość istnienia formy sporopodobnej została zasugerowana w wyniku wykrycia genu sigF, kodującego czynnik sigma (sekcja 7.5) podobny do białka specyficznego dla sporulacji oraz białek reagujących na stres, występujące u innych bakterii. [Stan utajenia w gruźlicy: Parrish, Dick i Bishai (1998) TIM 6: 107-112.]

11.3 Patogeneza — mechanizm rozwoju choroby Jak patogen wywołuje chorobę? Różne patogeny czynią to rozmaitymi sposobami. Niektóre wytwarzają toksyny (lub inne substancje), które naruszają swoiste procesy fizjologiczne, podczas gdy inne wnikają do pewnych komórek lub tkanek (gdzie również mogą wytwarzać toksyny). W pewnych przypadkach (np. sekcja 11.3.5) mechanizm jest nieznany. Molekularne badania chorób zakaźnych wskazują na to, że patogeneza wiąże się ze złożonymi interakcjami między bakterią patogenną a gospodarzem (sekcja 11.6). W przypadku pewnych chorób do rozwoju objawów chorobowych mogą się przyczyniać mechanizmy obronne (np. układ immunologiczny) gospodarza (sekcja 11.4.2.2). 274

Niektórym chorobom zakaźnym towarzyszy uogólniona reakcja zwana posocznicą lub sepsą. Podjęto próbę nadania terminowi „posocznica" (ang. sepsis) ścisłego znaczenia, by można go jednoznacznie stosować do opisu prób klinicznych wykonywanych dla różnych terapii przeciw temu stanowi. Ostatecznie posocznicę zdefiniowano jako zespół uogólnionej reakcji zapalnej (SIRS, ang. systemie inflammatory response Syndrome;). SIRS występuje, gdy pojawiają się co najmniej dwa z następujących objawów: Temperatura >38°C lub 90 uderzeń na minutę Oddychanie > 20 oddechów na minutę, lub PaCO2 < 4,3 kPa Leukocyty > 12000/mm3, 10% form niedojrzałych Przyczyny występowania SIRS mogą być różne, w tym niedokrwienie, martwica tkanek lub urazy, jak również infekcja. Kiedy SIRS powstaje w wyniku infekcji, wskazuje na obecność posocznicy. Sepsis/SIRS: JASC (1998) 41 (suplement A): 1-112]. [Treatment of sepsis: Baumgartner i Calandra (1999) Drugs 57: 127-132.] Przykłady patogenezy podano niżej oraz w tabeli 11.2.

11.3.1 Patogeneza z udziałem toksyn W niektórych chorobach większość lub nawet wszystkie objawy choroby można przypisać skutkom danej egzotoksyny, tj. specyficznego białka o właściwościach toksycznych, uwalnianego przez bakterię patogenną, które oddziałuje na konkretne miejsca w organizmie. Do tego rodzaju chorób należy cholera, botulizm, tężec i błonica. W niektórych schorzeniach toksyna może być tylko jednym z czynników patogenezy. Na przykład, toksyna może być potrzebna do modyfikacji syntezy (lub uwalniania) cytokin (tab. 11.4), co jest warunkiem procesu chorobowego. Jest też prawdopodobne, że w tego typu chorobach cytokiny odgrywają istotną rolę jako główne cząsteczki efektorowe lub czynniki niezbędne do aktywności toksyny [Henderson i wsp. (1997) TIM 5: 454-458](patrz np. sekcja 11.3.1.6).

11.3.1.1. Cholera Przebiegowi cholery towarzyszą wymioty i obfita biegunka, stolce praktycznie stają się wodniste. Patogen (pewne szczepy Vibrio cholerne) namnaża się w jelicie i wytwarza rodzaj egzotoksyny — enterotoksynę (toksynę cholery, TC). TC działa na komórki śluzówki w jelicie cienkim, gdzie stymuluje aktywność cyklazy adenylanowej. Powstający wysoki poziom cAMP (rys. 7.12) prawdopodobnie stymuluje sekrecję jonów chloru do światła jelita. Jako efekt towarzyszący występuje również utrata HCO3~ .Wypływ wody do jelita powoduje charakterystyczne dla cholery wodniste stolce o wyglądzie odwaru ryżowego. Infekcje wywołane szczepami V. cholerne, które nie wytwarzają TC, mogą powodować mniej groźne objawy będące wynikiem aktywności innych toksyn (Zot i Ace) kodowanych przez geny bakteryjne. [Mechanisms of action of enterotoxins: Sears i Kaper (1996) MR 60:167-215.]

275

Po dostaniu się V. cholerne z pokarmem, kolonizacja jelita cienkiego oraz rozwój choroby zależą od dwóch głównych czynników wirulencji (sekcja 11.5): wyrostków uczestniczących w adhezji do powierzchni błony śluzowej, tak zwanych „pilusów koregulowanych z toksyną" (TCP, ang. toxin co-regulated pili), oraz TC. Geny kodujące TC i TCP podlegają wspólnej regulacji przez transkrypcyjne białka regulatorowe (ToxR, ToxS i ToxT), które pobudzają ekspresję TC i TCP po odebraniu sygnałów środowiskowych w przewodzie pokarmowym. Geny kodujące TC (jak również toksyny Zot i Ace) występują w genomie nitkowatego faga, [Waldor i Mekelanos (19967) Science 272:1910-1914; Waldor i wsp. (1997) MM 24: 917-926]. Geny dla TCP występują w „wyspach patogenności" (sekcja 11.5.7). Stwierdzenie, że sygnały w środowisku jelita gospodarza mają zdolność indukowania syntezy TCP, doprowadziło do poznania transmisji czynników wirulencji w warunkach in vivo (sekcja 11.5.8). Patrz również „cholera" — w sekcji 11.11.

11.3.1.2 Botulizm Botulizm jest związany z paraliżem mięśni, a wynikiem np. niedowładu (mięśniowego) układu oddechowego może być śmierć. Patogen (szczepy Clostridium botulinum) wytwarza rodzaj egzotoksyny — neurotoksynę, która działa w miejscu połączeń między nerwami i mięśniami, hamując uwalnianie acetylocholiny i — co zatem idzie — stymulację mięśni przez nerwy. Choroba może powstać w wyniku dostania się wytworzonej toksyny do organizmu — zwykle ze skażoną żywnością, jak: gotowane mięso, kiełbasy i niewłaściwie konserwowane jarzyny. Nie jest więc konieczne spożycie z pokarmem samego patogena. [Występowanie i leczenia botulizmu (artykuł przeglądowy): Roblot i wsp. (1995) RMM 6: 58-62.]

11.3.1.3 Tężec W przebiegu tężca występują niekontrolowane skurcze mięśni szkieletowych, które często prowadzą do śmierci na skutek uduszenia lub wyczerpania. Choroba rozwija się po zakażeniu głębokich ran, w których są warunki beztlenowe, przez patogenną bakterię Clostridium tetani. Bakteria ta wytwarza neurotoksynę (tetanospazminę), która działa na pewne komórki (neurony wstawkowe) w ośrodkowym układzie nerwowym. Hamując uwalnianie neuroprzekaźnika (glicyny) przez te komórki, tetanospazmina pozwala na równoczesne kurcze w parze mięśni antagonista-protagonista, co prowadzi do spastycznego paraliżu.

11.3.1.4 Toksyna botulinowa i tetanospazmina: podobieństwa Chociaż tetanospazmina i toksyna botulinowa (jad kiełbasiany) wywołują bardzo odmienne objawy kliniczne, obydwie te toksyny wykazują istotne podobieństwa. Wiążą się do komórek nerwowych, przez które są następnie pobierane (internalizowane) i wywołują objawy w wyniku aktywności enzymatycznej (są endopeptydazami cynkowymi), degradując specyficzne białka w komórkach nerwowych, co powoduje zahamowanie uwalniania neuroprzekaźników [Me-

276

chanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins: Montecucco i Schiavo (1994) MM 13: 1-8]. Wyjaśnienie enzymatycznego działania obydwu toksyn może się przyczynić do znalezienia specyficznych inhibitorów o możliwym zastosowaniu w chemioterapii botulizmu i tężca. Podobnie, aktywność ssaczego enzymu endopeptydazy cynkowej, konwertującego angiotensynę, hamowana jest przez kaptopryl, lek czasem stosowany w terapii nadciśnienia. 11.3.1.5 Zatrucia pokarmowe wywołane przez gronkowce Gronkowcowe zatrucia pokarmowe (tab. 12.2) są spowodowane enterotoksynami wytworzonymi przez pewne gatunki gronkowców (głównie Staphylococcus aureus). Enterotoksyny te (typy od A do H) wkrótce po spożyciu skażonej żywności zwykle powodują wymioty i często biegunki. Mechanizm działania tych toksyn jest nieznany, choć sądzi się, że odruchy wymiotne mogą być wywołane przez stymulację jelitowych komórek zwojowych, powodując uwolnienie neuropeptydów, co z kolei indukuje uwolnienie m. in. histamin i leukotrienów z komórek tucznych. Ponieważ enterotoksyny są superantygenami (sekcja 11.5.4.1), patogeneza może się wiązać z działaniem cytokin. 11.3.1.6 Toksyna Shiga i podobne toksyny (werotoksyny) Enterotoksyny te, wytwarzane przez niektóre szczepy Shigella i EHEC (tab. 11.2) mają podobny mechanizm działania. Wiążą się one do określonych miejsc w jelicie i są pobierane na drodze endocytozy przy współudziale receptorów. Toksyny te oddziałują na syntezę białka i hamują absorpcję NaCl. Jednakże, ich rola w czerwonce (dyzenterii) (sekcja 11.3.3.2), krwotocznym zapaleniu okrężnicy oraz w zespole hemolityczno-mocznicowym nie jest w pełni zrozumiała, lecz wydaje się, że powodują one uszkodzenia naczyń krwionośnych. Toksyna typu 1 Shigella dysenteriae, jak również podobne toksyny E. coli O157:H7 i innych EHEC, są rozpoznawane przez receptory glikoproteinowe (oznaczone Gb3) na komórkach nabłonkowych wyściełających naczynia krwionośne. Badania in vitro wykazały, że miejsca Gb 3 , które są bardziej liczne w małych naczyniach krwionośnych, występują w jeszcze większej ilości w wyniku aktywności cytokin TNF-α i IL-1. W jednym z modeli uszkodzeń naczyniowych indukowanych przez EHEC, zmiany w ścianie następują w wyniku związania toksyny z Gb3; aktywowane makrofagi ulegają adhezji do zmienionych miejsc i są stymulowane (np. przez toksynę) do sekrecji IL-1 i TNF-α, powodując miejscową proliferację miejsc Gb 3 i dalsze (w wyniku udziału toksyny) uszkodzenia [Tesh (1998) TIM 6: 228-232]. Toksyny E. coli O157:H7, podobne do toksyn typu 1 S. dysenteriae, można zneutralizować przez ich związanie z rozpuszczalnym w wodzie, węglowodanowym ligandem, zwanym STARFISH, ponieważ jego cząsteczka ma kształt rozgwiazdy (ang. starfish), pod względem struktury przypominając Gb 3 . Możliwość neutralizacji toksyny stworzyła podstawy potencjalnego czynnika terapeutycznego skierowanego przeciw EHEC. Synsorb Pk to preparat złożony z syntetycznych analogów Gb3 — związanych z nierozpuszczalnymi cząsteczkami krzemionki. Czynnik ten jest badany pod kątem możliwości jego wykorzystania do 277

wiązania (sekwestracji) toksyny w przewodzie pokarmowym, co zapobiega jej pobraniu, a zatem dotarciu do miejsc wiązania na nabłonku wyściełającym naczynia [STARFISH: Nature (2000) 403: 669-672].

11.3.2 Patogeneza z udziałem innych produktów bakteryjnych Agresyny to produkty, które pomagają patogenowi w procesach inwazji. Niektóre bakterie, w tym Streptococcus pyogenes i większość koagulazododatnich gronkowców, wytwarzają liazę hialuronianową, enzym, który hydrolizuje kwas hialuronowy będący składnikiem tkanki łącznej u zwierząt. W przynajmniej niektórych przypadkach enzym ten może ułatwiać penetrację bakterii w miejscu zakażenia. Inny przykład to streptokinaza produkowana przez paciorkowce. Jest to białko wydzielane zewnątrzkomórkowo, które aktywuje składnik osocza — plazminogen, tworząc plazminę (syn. fibrolizyna), która niszczy fibrynę. Ta zdolność przeprowadzania lizy fibryny może ułatwiać patogenowi pokonanie bariery fibrynowej w ranach lub zmienionych chorobowo miejscach. Produkcja aktywatorów plazminogenu przez paciorkowce (i niektóre inne bakterie) wiązana jest z inwazyjnością tych bakterii [patrz np. Lottenberg (1997) TIM 5: 466-467]. (Patrz również sekcja 8.5.10). Produkty bakteryjne mogą się również przyczyniać do patogenezy w sposób bardziej mechaniczny — np. w mukowiscydozie (patrz niżej).

11.3.2.1 Mukowiscydoza Mukowiscydoza [artykuł przeglądowy: Rosenstein i Zeitlin (1998) Lancet 351: 277-282] jest chorobą dziedziczną, w której wadliwy transporter ABC powoduje zaburzenia transportu chloru przez błonę komórkową. W typowych przypadkach w płucach zalega gęsty śluz i mogą występować takie mikroorganizmy, jak prątki gruźlicy, Burkholderia cepacia i Pseudomonas aeruginosa. Ta ostatnia bakteria

może tworzyć gęsty alginianowy śluz, który hamuje fagocytozę i sprzyja zastojowi, co jest złym rokowaniem. W chorobie tej prawdopodobnie znaczenie ma długotrwała, intensywna kolonizacja Stenotrophomonas maltophila (uprzednio Xanthomonas maltophila) [Denton (1997) RMM 8: 15-19]. Duże stężenie soli (NaCl) na nabłonkach dróg oddechowych u pacjentów cierpiących na mukowiscydozę może sprzyjać bakteryjnej kolonizacji, przez hamowanie prawidłowej aktywności przeciwbakteryjnej [Smith i wsp. (1996) Cell 85: 229-236]. Większość szczepów P. aeruginosa niesie geny kodujące syntezę alginianu, lecz u szczepów wyosobnionych ze środowiska geny te zwykle nie ulegają ekspresji. U pacjentów z mukowiscydoza warunki w płucach wydają się sprzyjać selekcji szczepów wytwarzających śluz (alginian) (mukoidalnych). W przypadku P. aeruginosa przeobrażenie szczepów niemukoidalnych w mukoidalne zachodzi po pojawieniu się swoistego czynnika sigma (sekcja 7.5) zwanego AlgU, który uczestniczy w trankskrypcji genów alginianowych. AlgU może się stać konstytu278

tywnie (trwale) aktywny w wyniku mutacji w genie mucA (aktywność AlgU jest hamowana przez związanie MucA). [Mucoidy of Pseudomonas aeruginosa in CF: Schurr i wsp. (1996) JB 178: 4997-5004].

11.3.3 Patogeneza przebiegająca ze zniszczeniem komórek lub tkanek gospodarza 11.3.3.1 Salmonelloza

W pierwszych etapach zakażenia salmonellą następuje inwazja nabłonka jelitowego (sekcja 11.2.2.1). W durze brzusznym S. typhi przenika do krwiobiegu (za pośrednictwem układu limfatycznego) i namnaża się w wątrobie, pęcherzyku żółciowym i trzustce. Wtórne zakażenie następuje z pęcherzyka żółciowego. Do objawów należą bóle jelitowe i posocznica (sekcja 11.3). Stan zapalny jelita może być tak intensywny (np. w kępkach Peyera), że prowadzi do miejscowej martwicy tkanki, z wytworzeniem wrzodów, perforacji i wystąpienia krwotoków. W przeciwieństwie do S. typhi wiele gatunków salmonelli (np. S. typhimurium u ludzi, S. dublin u cieląt) zwykle powoduje stany chorobowe ograniczone do jelit (stany zapalne, wydzielanie płynów), z migracją np. leukocytów polimorfonuklearnych (z segmentowanym jądrem, PMN, ang. polimorphonuclear) do zainfekowanych tkanek. Tego typu migracja wywoływana jest przez transnabłonkową sygnalizację przez patogena, a mechanizm tego procesu z udziałem osobliwego białka efektorowego SopB został opisany dla S. dublin — patogena bydła [Galyov i wsp. (1997) MM 25: 903-912]. Geny enteropatogenności (w przeciwieństwie do salmonelloz układowych) znajdują się w wyraźnie wyodrębnionych wyspach patogenności (sekcja 11.5.7). 11.3.3.2 Czerwonka (dyzenteria)

Dyzenteria wywołana przez Shigella spp. (oraz np. EIEC: tabela 11.2) przebiega ze zniszczeniem nabłonka jelita cienkiego/grubego, z bólem, gorączką, wodnistą oraz (często) krwawą biegunką. Inwazja przez Shigella opisana jest w sekcji 11.2.2.1, a zabicie makrofagów — w sekcji 11.5.2. Rolę toksyny shiga omówiono w sekcji 11.3.1.6. Białko bakterii Shigella — IcsA kodowane przez gen niesiony na plazmidzie (funkcja: sekcja 11.2.2.1) (jak również podobnego typu białko u EIEC) jest niezbędne dla patogenności. W przypadku niektórych bakterii w błonie zewnętrznej występuje proteaza (SopA u Shigella, OmpT u E. coli), która tnie/inaktywuje białko IcsA (VirG). Jednakże proteazy tej nie ma ani u Shigella, ani u EIEC i to wydaje się warunkiem ich patogenności [Nakata i wsp. (1993) MM 9: 459-468]. (IcsA jest domeną a autotransportera —: sekcja 5.4.5). Jeden z modeli przebiegu dyzenterii zakłada, że śmierć makrofagów (sekcja 11.5.2) sprzyja odpowiedzi zapalnej (tworzeniu TNF-a, IL-1, IL-65 i IL-8), co przyciąga PMN, zwiększając zakres inwazji oraz uszkodzenia tkanek (sekcja 11.2.2.1), lecz ostatecznie prowadząc do zatrzymania infekcji [Zychlinsky i Sansonetti (1997) TIM 5: 201-204]. 279

11.3.3.3 Gorączka Oroya Gorączka Oroya, choroba występująca w niektórych rejonach Ameryki Południowej, charakteryzuje się wysoką gorączką i postępującą anemią. Przebieg choroby często kończy się zgonem. Bakteria wywołująca tą chorobę, Bartonella bacilliformis, jest przenoszona przez muchy i rozwija się w erytrocytach oraz komórkach nabłonkowych wyściełających naczynia krwionośne. Wzrost bakterii prowadzi do zniszczenia krwinek czerwonych oraz wywołuje towarzyszące temu objawy.

11.3.4 Szok endotoksyczny (septyczny) Endotoksyny bakterii gramujemnych to wielkocząsteczkowe kompleksy zawierające pewne składniki błony zewnętrznej: lipopolisacharyd (LPS — sekcja 2.2.9.2), białka i fosfolipidy. Toksycznym składnikiem LPS jest lipid A. Kończący się często zejściem śmiertelnym szok septyczny jest związany z aktywnością endotoksyn przenoszonych przez krew (np. po udanej chemioterapii skierowanej przeciw gramujemnemu patogenowi). Endotoksyny działają na makrofagi i inne komórki układu immunologicznego, stymulując wydzielanie pewnych silnie działających czynników fizjologicznych (cytokiny: tab. 11.4), takich jak IL-1β i TNF-α. Cytokiny te mogą „zwerbować" kolejne, co prowadzi do objawów szoku (np. znaczny spadek ciśnienia krwi) oraz blokowania naczyń krwionośnych przez leukocyty. Śmierć może być następstwem narastającego zaburzenia funkcjonowania narządów wewnętrznych. W związku z tym endotoksyny zaklasyfikowano do grupy modulin (sekcja 11.5.4). Próby zastosowania szczepionki zawierającej monoklonalne przeciwciała skierowane przeciw endotoksynie były nieudane [Baumgartner (1994) RMM 5: 183-190]. Nadzieje są wiązane z niektórymi antybiotykami, które mogą zmniejszać ryzyko wystąpienia szoku septycznego, gdyż hamują szlak biosyntezy lipidu A (sekcja 15.4.11).

11.3.5 Choroby układu pokarmowego przypisywane Helicobacter pylori Helicobacter pylori (patrz Aneks) wiązany jest przyczynowo z występowaniem zapalenia żołądka i z chorobą wrzodową, chociaż szczegóły przebiegu patogenezy nie są do końca wyjaśnione. Stwierdzono jednak, że lipopolisacharyd (sekcja 2.2.9.2) H. pylori zawiera antygeny identyczne z antygenami Lewisa χ i y występujących w błonie śluzowej żołądka u ludzi. Sugeruje to możliwość powstania reakcji autoimmunologicznej i stanu zapalnego w wyniku wiązania się przeciwciał skierowanych przeciw lipopolisacharydowi do antygenów Lewisa w śluzówce [Molecular mimicry of H. pylori LPS: Appelmelk i wsp. (1997) TIM 5: 70-73]. Hipoteza ta jest jednak kwestionowana, ponieważ dominujący rodzaj przeciwciał skierowanych przeciw LPS, stwierdzany u wielu pacjentów zakażonych H. pylori, odpowiada antygenowi, który nie jest podobny do tych struktur w LPS H. pylori, przypominających antygeny Lewisa [Yokota i wsp. (1998) INFIM 66: 3006-3011]. 280

Adhezja H. pylori do ścian żołądka (w przeciwieństwie do przebywania bakterii wewnątrz warstwy śluzu w żołądku) prawdopodobnie sprzyja powstawaniu autoprzeciwciał, prowadząc do np. chronicznego zapalenia żołądka. To, czy tego typu adhezja nastąpi w danym gospodarzu, może zależeć od szczególnej kombinacji czynników w (genetycznie zróżnicowanych) populacjach patogena i gospodarza [Dorell, Crabtree i Wren (1998) TIM 6: 379-380]. Patogeneza wydaje się związana z „wyspą patogenności" cag (sekcja 11.5.7) oraz niezwiązanym z nią (lecz często wspólnie wyrażanym) genem vacA. Ekspresja zarówno cagA, jak i vacA (w szczepach typu I izolowanych w środowisku szpitalnym) wydaje się skorelowana z ciężkim schorzeniem układu pokarmowego, podczas gdy szczepy typu II, które nie mają cagA i nie wyrażają aktywności VacA, zwykle nie są kojarzone z ciężkim przebiegiem choroby. Znane są również szczepy powodujące schorzenia o pośrednim przebiegu. Białko VacA jest toksyną o nieznanym mechanizmie wnikania do komórek gospodarza. Jej wewnątrzkomórkowym celem działania może być czynnik uczestniczący w regulacji rozwoju/dojrzewania wakuoli w komórce gospodarza [patrz np. Cover (1998) TIM 6: 127-128; de Bernard i Arico (1998) TIM 6: 128-129].

11.3.6 Reakcja Jarischa-Herxheimera Reakcja ta, mogąca mieć przebieg śmiertelny, czasami występuje po pierwszej skutecznej dawce leku podanego do zwalczenia chorób powodowanych przez pewne bakterie (szczególnie krętki) lub pierwotniaki [artykuł przeglądowy: Griffin i wsp. (1994) BCID 1: 65-74]. Objawy, do których należy początkowy wzrost temperatury, są związane z kaskadą cytokin (np. TNF, IL-6, IL-8), przypuszczalnie odpowiedzialnych za przynajmniej niektóre z objawów patofizjologicznych. Mechanizm nagłego uwolnienia cytokin nie jest znany. Reakcji Jarischa-Herxheimera można zapobiec podając przeciwciała przeciw TNF [Fekade i wsp. (1996) NEJM 335: 311-315].

11.4 Mechanizmy obronne gospodarza 11.4.1 Mechanizmy konstytutywne Mechanizmy konstytutywne (wrodzone) to nieswoiste mechanizmy obronne, które działają przez cały czas. Dla każdego potencjalnego patogena zdrowy organizm gospodarza zawiera wiele przeszkód i barier. Skóra, na przykład, jest czymś więcej niż prostą fizyczną barierą na drodze do infekcji. Dla większości bakterii stanowi ona środowisko nieprzyjazne: brakuje w niej wody, a miejsca sprzyjające infekcji są zajmowane przez dobrze zaadaptowaną mikroflorę skóry. Niektóre gatunki tych rezydentów wykorzystują lipidy wydzielane przez gruczoły łojowe, by wytworzyć z nich kwasy tłuszczowe o działaniu przeciwbakteryjnym. Własne mechanizmy obronne mają również błony śluzowe. Wydzieliny, które zwilżają te tkanki, utrudniają zasiedlenie przez patogena, zarówno mechanicznym spłukiwaniem komórek bakteryjnych oraz przez obecność w nich sub281

stancji przeciwbakteryjnych. Łzy np. zawierają enzym lizozym (rys. 2.7) hydrolizujący wiązania mureiny w bakteryjnej ścianie komórkowej, a wiele wydzielin zawiera np. przeciwciała slgA (sekcja 11.4.2.1; rys. 11.2). Istnieje też mikroflora rezydentów, z którą każdy potencjalny patogen musi współzawodniczyć. Fagocytoza. Gdy patogen przedrze się przez zewnętrzne mechanizmy obronne, czekają go mechanizmy wewnętrzne. Wewnątrz tkanek oraz układu krwionośnego i limfatycznego wyspecjalizowane komórki (fagocyty) pochłaniają i niszczą cząsteczki „obcych" ciał — w tym wiele drobnoustrojów. Do komórek tych należą makrofagi, a proces eliminacji drobnoustrojów nosi nazwę fagocytozy. W przebiegu typowej fagocytozy kontakt między bakterią a makrofagiem (który ułatwiony jest przez opsonizację — patrz niżej) zapoczątkowuje pochłanianie komórki bakteryjnej, która zostaje zamknięta wewnątrz otoczonego błoną woreczka (wodniczki), zwanego fagosomem. Wewnątrz fagosomu następuje stopniowe obniżanie się pH, a w pewnym momencie fagosom ulega fuzji z lizosomem (woreczkiem zawierającym enzymy degradujące), tworząc fagolizosom. Wewnątrz fagolizosomu drobnoustroje zwykle giną, lecz niektóre patogeny przeżywają, a inne blokują fuzję między fagosomem a lizosomem (sekcja 11.2.2.2). Przeistoczenie się fagosomu w fagolizosom można prześledzić na podstawie zmian pH oraz składu towarzyszących białek. Fagolizosom ma charakterystyczny skład białek, zwanych LAMP (ang. lysosome-associated membrane proteins; białka błonowe związane z lizosomem). Gdy fuzja między fagosomem i lizosomem zostaje zablokowana, nie stwierdza się obecności LAMP. Opsonizacja. Bakterie mogą ulegać opsonizacji, stając się tym samym bardziej podatne na fagocytozę. W procesie tym następuje aktywacja dopełniacza oraz związanie pewnych składników, np. C3b. Na powierzchni niektórych rodzajów fagocytów występują swoiste receptory dla C3b, które za jego pośrednictwem wiążą opłaszczoną bakterię. W opsonizacji mogą też uczestniczyć przeciwciała (sekcja 11.4.2.1). Regiony Fab (rys. 11. 2) mogą się wiązać do antygenu na jego powierzchni, a fragment Fc przeciwciała — do swoistych receptorów dla Fc na powierzchni pewnych fagocytów. W opsonizacji danej bakterii mogą więc uczestniczyć zarówno przeciwciała, jak i układ dopełniacza. Stan zapalny. Dłużej utrzymujący się patogen może wywołać stan zapalny — miejscowe zaczerwienienie, obrzęk, wzrost ciepłoty, ból i utratę funkcji. Te niespecyficzne objawy (spowodowane również przez urazy mechaniczne czy chemiczne) wiążą się ze zwiększonym przepływem osocza do uszkodzonej tkanki (stąd obrzęk). Powoduje to miejscowy wzrost ilości czynników przeciwbakteryjnych, jak układ dopełniacza i przeciwciała. Zbierają się również neutrofile i makrofagi. Neutrofile zwykle pojawiają się w ciągu kilku minut. W stanie zapalnym uczestniczą różne cząsteczki sygnałowe. Niektóre z nich powstają w wyniku aktywacji układu dopełniacza (patrz niżej) przez patogena. Na przykład: • C3a i C5a powodują uwolnienie histaminy (tab. 11.3). Histamina zwiększa przepuszczalność drobnych naczyń krwionośnych, co pozwala na przepływ osocza i również sprzyja szybkiej ekspresji cząsteczek selektyny na powierz-

282

chni komórek nabłonkowych wyściełających światło naczynia. Powierzchniowe selektyny słabo wiążą się do leukocytów w układzie krwionośnym, powodując toczenie się tych komórek po powierzchni nabłonka. Jest to pierwsze stadium procesu, w wyniku którego leukocyty opuszczają naczynia krwionośne i przemieszczają się do tkanek. • Antygenowoswoiste komórki Τ mogą być stymulowane przez patogena do sekrecji cytokin (tab. 11.4). Jedna z nich, y-interferon, aktywuje makrofagi. Te z kolei wydzielają zwiększone ilości niespecyficznych czynników przeciwbakteryjnych (jak H 2 O 2 ) i mogą zabijać niektóre typy pochłoniętych patogenów, które mogą nie zostać zabite w nieaktywowanych makrofagach. • Aktywowane makrofagi wydzielają cytokiny, np. czynnik martwicy nowotworu (TNF, ang. tumor necrosis factor) oraz interleukiny 1 i 8 (IL-1, IL-8). IL-1 i TNF mogą aktywować syntezę selektyn. IL-8 (chemokina: tab. 11.4) wiąże się do komórek nabłonkowych i do leukocytów (już słabo związanych przez selektyny). Tego typu wiązanie aktywuje cząsteczki integryny w leukocytach, w wyniku czego komórki te silnie wiążą się — za pośrednictwem integryn — do powierzchni nabłonka. Następnie leukocyty ulegają spłaszczeniu i toczą się wzdłuż nabłonka zgodnie z gradientem chemokiny, a następnie przechodzą między komórkami nabłonka do tkanki (diapedeza). Na pewnym etapie miejsce objęte stanem zapalnym może również zawierać cząsteczki uczestniczące w procesach naprawczych prowadzących do wyleczenia (patrz np. Martin (1997) Science 276: 75-81]. Stany zapalne mogą odgrywać ważną rolę w reakcji organizmu na patogeny. Jak wspomniano wyżej, uczestniczą w pewnych aspektach odpowiedzi adaptacyjnej (sekcja 11.4.2) oraz w konstytutywnych mechanizmach obronnych. 11.4.1.1 Dopełniacz

Surowica zawiera dopełniacz, to jest zespół różnych białek, które w obecności pewnych cząsteczek przechodzą „kaskadę" reakcji polegającą na kolejno następującej aktywacji. W wyniku aktywacji poszczególne składniki tego układu mogą spełniać specyficzne funkcje fizjologiczne (tab. 11.3).

283

Układ dopełniacza może być aktywowany w różny sposób, a aktywator determinuje, którą z czterech dróg będzie przebiegać (rys. 11.1). Na przykład, lipopolisacharyd (LPS) bakterii gramujemnych (sekcja 2.2.9) może zapoczątkować drogę alternatywną. Aktywacja przez bakterię gramujemną może mieć szereg konsekwencji. Na przykład, wiązanie składnika czyni komórkę bardziej podatną na fagocytozę przez makrofagi. Co więcej, jeśli składniki C5b-9 (kompleks atakujący błonę) zwiążą się z powierzchnią komórki, tworzą one perforację w błonie zewnętrznej, która w pewnych przypadkach prowadzi do lizy komórki (cytoliza odpornościowa). Liza ta wynika nie tylko z przełamania bariery błony zewnętrznej, lecz również stwarza możliwość dotarcia lizozymu (rys. 2.7) do warstwy mureiny tworzącej ścianę komórkową (rys. 2.6). Gramujemna bakte-

284

Rys. 11.1 Uproszczony schemat aktywacji dopełniacza (sekcja 11.4.1) Każdy z czterech szlaków wywołuje podobne efekty fizjologiczne, lecz jest zapoczątkowany w odmienny sposób. Cl, C2 itd. określają poszczególne składniki układu dopełniacza, „a" i „b" określają fragmenty tych składników powstające w wyniku enzymatycznego degradacji w trakcie procesu aktywacji (dla jasności, schemat nie przedstawia wszystkich produktów degradacji — na przykład C4 ulega rozcięciu do fragmentów C4a i C4b, lecz tylko fragment C4b jest tu rozpatrywany). Linie kropkowane wskazują na enzymatyczną aktywność kompleksu rozkładającego niektóre składniki tego układu). Droga klasyczna. Aktywacja tej drogi może być zapoczątkowana przez wiele typów kompleksów antygen-przeciwciało (sekcja 11.4.2.1). Taki kompleks może powstać np. w wyniku związania przeciwciała antygenem na powierzchni komórki bakteryjnej. Na początku, Cl przyłącza się do tak zwanego fragmentu Fc przeciwciała (rys. 11.2) w kompleksie antygen-przeciwciało (ag-ab). Aktywowany składnik Cl rozkłada C4. C4b wiąże C2, a C4b2 jest rozkładany przez Cl do C4b2a (konwertazę C3). Konwertaza C3 rozkłada C3 do fragmentów C3a i C3b). Jeśli aktywacja została zainicjowana przez kompleks antygen-przeciwciało na powierzchni komórki bakteryjnej, fragmenty C3b mogą się wiązać z fragmentem Fc przeciwciała i/lub do powierzchni bakterii. C3b sprzyja fagocytozie takich komórek lub kompleksów, do których się wiąże, ponieważ na powierzchni makrofagów i innych fagocytów występują specyficzne miejsca receptorowe dla C3b. C3b może również przekształcić się w kompleks będący konwertazą C5 (kolejna faza aktywacji). C3b ma krótki okres półtrwania, lecz fragment ten występuje zazwyczaj w małym stężeniu, nawet bez aktywacji dopełniacza, w wyniku niskiego, spontanicznego poziomu hydrolizy C3. Wyjaśnia to dostępność C3b dla inicjacji alternatywnej drogi, i to mimo inaktywacji przez czynnik I. Kaskada reakcji przebiega tak jak na schemacie. Kompleks C5b67 wiąże się do błony i po przyłączeniu kolejnych składników, C8 i C9, zwany jest kompleksem atakującym błonę (MAC, ang. membrane attack complex). Jeśli MAC powstaje np. na błonie zewnętrznej bakterii gramujemnej (sekcja 2.2.9.2), tworzy por lub kanał w tej błonie. Ściana takiego kanału składa się z sześciu lub więcej cząsteczek C9. W niektórych przypadkach (patrz sekcja 11.4.1.1) może to prowadzić do lizy bakterii. Kompleks C5b67 może się wiązać do lub w pobliżu miejsca pierwotnej aktywacji dopełniacza. Może też wiązać się do innej komórki w sąsiedztwie, prowadząc do jej lizy w razie utworzenia MAC. Tego rodzaju liza zwana jest reaktywną Droga alternatywna. Droga ta jest aktywowana np. przez lipopolisacharydy (LPS; sekcja 2.2.9.2). Zwykle niski poziom C3b, wystarczający do aktywacji (patrz wyżej). Czynniki Β i D, jak również properdyna, to białka zwykle występujące w osoczu. Konwertazy C3 i C5 uczestniczące w tej drodze aktywacji różnią się od tych w drodze klasycznej. Ważne jest również występowanie charakterystycznej pętli amplifikacji C3. Droga lektynowa. Patrz tekst (sekcja 11.4.1.1). Droga C2a (ang. salvage). Patrz tekst (sekcja 11.4.1.1). Fragmenty C3a i C5a. Fragmenty te (nie pokazane na rysunku) zwane są anafilatoksynami, mogą działać na komórki tuczne i bazofile, przyczyniając się do uwolnienia mediatorów procesów zapalnych, jak histamina. Histamina wpływa na przepuszczalność niektórych małych naczyń krwionośnych, pozwalając na zwiększony wypływ osocza i komórek do zainfekowanych tkanek. Na dodatek, C5a działa jako czynnik chemotaktyczny, przyciągający makrofagi i inne komórki do zmienionego chorobowo miejsca. Regulacja układu dopełniacza. Układ dopełniacza jest zdolny do wytworzenia czynników fizjologicznych o potężnym działaniu, a ponieważ na proces aktywacji składa się kilka różnych etapów amplifikacji, musi on podlegać ścisłej kontroli. Z tego powodu, istnieją swoiste inhibitory kluczowych etapów procesu aktywacji — np. cząsteczki, które hamują aktywność Cl i rozkładają/hamują aktywność C3b.

285

ria patogenna (jak np. Haemophilus influenzae) narażona byłaby więc na lizę z powodu obecności zarówno dopełniacza, jak i lizozymu w płynie obmywającym gałkę oczną. Klasyczna droga dopełniacza jest aktywowana przez wiele rodzajów kompleksów antygen-przeciwciało. (Większość przeciwciał — choć nie wszystkie — należy do „wiążących dopełniacz"). Kaskada reakcji jest przedstawiona na rysunku 11.1. W drodze lektynowej uczestniczy szereg składników osocza: lektyna wiążąca mannozę (MBL, ang. mannose-binding lectin) oraz proteazy serynowe związane z MBL. Układ ten jest aktywowany, gdy MBL zwiąże się z odpowiednimi ugrupowaniami na powierzchni osłon bakteryjnych. Skutecznie omija fazę Cl klasycznej drogi. Droga lektynowa może być istotna szczególnie u niemowląt w wieku od 4-6 miesięcy (kiedy tracona jest osłona w postaci matczynych przeciwciał IgG) do około 18-24 miesięcy (kiedy rozwija się bardziej skuteczny układ immunologiczny). Wiązanie do MBL może być jednakże hamowane przez obecność otoczki bakteryjnej w przypadku takich patogenów jak np. Neisseria meningitidis. [Mannose-binding lectin: Turner (1996) Immunology Today 17: 532-549]. Droga C2a, opisana w roku 1997, może mieć duże znaczenie dla patogennych prątków. W drodze tej składnik C2a po związaniu z powierzchnią prątka działa jako konwertaza C3 (rys. 11.1) [Schlesinger (1998) TIM 6: 47-49; Brown i Schorey (1998) TIM 6: 49-50]. ( U w a g a : niektórzy autorzy zamiast C2a stosują symbol „C2b"). Niektóre enzymy trzustki (np. trypsyna) degradują składniki dopełniacza, z wytworzeniem anafilatoksyn (podpis, rys. 11.1), których poziom jest podwyższony w doświadczalnym zapaleniu trzustki. Dopełniacz jest wczesną, szybką i potężną formą obrony. Drogi alternatywna i lektynowa należą do obrony wrodzonej organizmu, podczas gdy droga klasyczna jest częścią odpowiedzi nabytej (sekcja 11.4.2). 11.4.1.2 Interferony

Interferony (IFN) są białkami wytwarzanymi przez pewne rodzaje komórek zwierzęcych w odpowiedzi na wirusy, niektóre bakterie i antygeny (sekcja 11.4.2.1). Interferony typu 1, IFN-α i IΡΝ-β, są istotnymi czynnikami przeciwwirusowymi. Po związaniu z komórkami zainfekowanymi wirusem indukują syntezę pewnych białek, np. cząsteczki klasy 1 głównego układu zgodności tkankowej (MHC, ang. major histocompatibility complex), które wzmagają odpowiedź typu komórkowego (sekcja 11.4.2.2) skierowaną przeciw takim komórkom. Interferony te mogą działać na komórki zainfekowane wieloma różnymi wirusami, niezależnie od typu indukującego IFN. W związku z tym, to ogólne, nieswoiste uaktywnienie układu immunologicznego jest często uważane za część obrony wrodzonej, mimo iż niektóre białka aktywowane przez IFN mogą być bardziej swoiste (np. białko Μx, które hamuje replikację wirusa grypy). Interferon typu 2, IFN-y, odgrywa mniejszą rolę jako czynnik przeciwwirusowy, lecz ma podstawowe znaczenie jako cząsteczka sygnalna w odporności 286

nabytej (sekcja 11.4.2). Należy on do obszernego systemu cytokin (tab. 11.4). IFN-y jest wytwarzany przez komórki (limfocyty) Τ aktywowane antygenem. Do jego znanych lub prawdopodobnych funkcji należą: • • • •

Aktywacja makrofagów (sekcja 11.4.1). Hamowanie wpływu IL-4 na limfocyty Β (sekcja 11.4.2.1). Indukcja cząsteczek MHC klasy II. Hamowanie syntezy receptorów dla transferyny (pobierania żelaza) na zainfekowanych komórkach ssaczych (zmniejszone pobieranie żelaza hamuje wzrost wewnątrzkomórkowych patogenów). • Indukcja syntezy tlenku azotu (sekcja 11.4.1.4) przez zainfekowane komórki ssacze (jako mechanizmu hamującego metabolizm żelaza przez wewnątrzkomórkowe patogeny). • Stymulacja syntezy składnika C3 dopełniacza (rys. 11.1) w pneumocytach typu II (komórkach pęcherzyków płucnych). 11.4.1.3 Sekwestracja jonów

Bakterie patogenne wymagają jonów pewnych metali, a sekwestracja takich jonów przez gospodarza jest jedną z form obrony konstytutywnej. Żelazo, na przykład, jest sekwestrowane przez chelatory zarówno w osoczu, jak i w wydzielinach (patrz sekcja 11.5.5). Cynk występuje w niektórych enzymach (np. w deacetylazie biorącej udział w biosyntezie lipidu A: sekcja 2.2.9.2). Jest on chelatowany przez kalprotektynę — białko uwalniane przez neutrofile ginące w miejscach zapalnych (np. wrzody), w których stężenie tego metalu może być duże. Kalprotektyna ma działanie bakteriostatyczne, najprawdopodobniej w wyniku sekwestracji cynku. Przy leczeniu wrzodów wpływ ten może być antagonistyczny w stosunku do tych antybiotyków, które działają jedynie na komórki rosnące. [Cynk w obronie przeciw drobnoustrojom: Sohnle (1997) RMM 8: 217-224]. 11.4.1.4 Tlenek azotu

Po odpowiedniej aktywacji wiele rodzajów komórek (w tym makrofagi i komórki nabłonkowe) syntetyzuje indukowalną formę enzymu — syntaza tlenku azotu (iNOS, ang. nitric oxide synthase). Tego rodzaju synteza wymaga transkrypcyjnej aktywacji przez pewne cytokiny (tab. 11.4) (np. IFN-y, TNF-α). iNOS katalizuje zależną od NADPH oksydatywną deaminację L-argininy do L-cytruliny i tlenku azotu (NO). NO (który w połączeniu z wodą i tlenem tworzy szereg aktywnych pochodnych) może zabijać patogeny, niszcząc np. enzymy zawierające żelazo. W komórkach będących celem działania naruszona jest replikacja DNA oraz wiele ważnych procesów metabolicznych. Zabijanie Mycobacterium tuberculosis przez aktywowane przez IFN-y mysie makrofagi jest hamowane przez iNOS. Ponadto, inne badania na myszach wykazały, że genetyczna inaktywacja IFN-y (sekcja 8.5.5.4; tab. 8.2) powoduje zwiększoną podatność na M. tuberculosis, co jest skorelowane z brakiem iNOS. 287

288

7

IL-8 należy do podklasy cytokin zwanych chemokinami. Chemokiny wykazują chemotaksję do szczególnych subpopulacji leukocytów, które aktywują. Odgrywają ważną rolę w procesie, w którym leukocyty przemieszczają się z naczyń krwionośnych do tkanek w stanie zapalnym (sekcja 11.4.1). Na podstawie różnic w strukturze i funkcjach chemokiny dzielą się na dwa typy (CXC i CC) Receptory dla chemokin na powierzchni leukocytów to cząsteczki z superrodziny rodopsyny. Niektóre receptory wiążą tylko jeden typ chemokiny (np. CXC-CKR2 jest specyficzny dla chemokiny IL-8 należącej do typu CXC), lecz inne mogą się wiązać do więcej niż jednego typu. Receptor na erytrocytach wiąże chemokiny zarówno CXC, jak i CC. To wiązanie nie ma żadnej funkcji dla erytrocytu, lecz może służyć jako mechanizm zapobiegający niewłaściwej aktywacji leukocytów. Monoklonalne przeciwciała skierowane przeciw IL-8 wykazują aktywność przeciwzapalną. 8 Cytokina przeciwzapalna. Jedną z jej funkcji jest zmniejszenie syntezy cytokin prozapalnych, takich jak TNF-α i IL-1β. 9 TNF-α jest wytwarzany przez wiele typów komórek, lecz głównie przez aktywowane makrofagi. Receptory oznaczone p55 i p75 występują na wielu typach komórek. TNF-α i IL-β stymulują własną produkcję, jak również siebie nawzajem. TNF-β jest podobny do TNF-α. Wytwarzany jest przez limfocyty, wiąże się do tych samych receptorów i wykazuje podobne właściwości. W wyniku endotoksemii w peryferycznym układzie krążenia występuje podwyższony poziom rozpuszczalnych (uwolnionych) receptorów dla TNF. Może to być mechanizm zmniejszający wpływ TNF na komórki.

Bakterie reagują na NO zwiększoną aktywnością enzymów uczestniczących w odpowiedzi na stres tlenowy (sekcja 7.8.2.8). Oporność na NO może być zróżnicowana, zależnie od gatunku i szczepu patogena. Dłużej trwające wytwarzanie NO może niekorzystnie oddziaływać na gospodarza. (NO (wpływ na patogeny i gospodarza): Piedrafita i Liew (1998) RMM 9: 179-189; NO w posocznicy i endotoksemii: Parrat (998) JAC 41 (suplement A): 31-39].

11.4.2 Odporność nabyta 11.4.2.1 Przeciwciała, produkcja przeciwciał i szczepienia Niezależnie od obrony konstytutywnej, organizm może również reagować w sposób swoisty na danego patogena. Pojedyncza komórka może być rozpoznana na podstawie jej „chemicznego wzoru", to jest takich cząsteczek jak lipopolisacharydy (LPS), które są dla niej charakterystyczne. Tego rodzaju cząsteczki mogą działać jak antygeny, tzn. ich obecność w organizmie może powodować, że pewne leukocyty (szczególnie niektóre subpopulacje limfocytów B) wytwarzają białka zwane przeciwciałami. Przeciwciało w sposób swoisty reaguje z antygenem, który zaindukował jego powstanie (u osobnika dorosłego występują miliony różnych rodzajów limfocytów Β, ζ których każdy rozpoznaje inny rodzaj antygenu i wytwarza odpowiadające mu przeciwciało). Wszystkie przeciwciała są immunoglobulinami — białkami występującymi we krwi i innych płynach ustrojowych (rys. 11.2). Pięć głównych klas immunoglobulin to: IgA (występują głównie w ślinie, łzach i na powierzchniach błon śluzowych), IgD, IgE (głównie związane z komórkami tucznymi i granulocytami zasadochłonnymi), IgG (najliczniejsza klasa immunoglobulin w osoczu) i IgM (duża cząsteczka — pentamer — występująca prawie wyłącznie w układzie naczyniowym). Przeciwciała zaindukowane przez danego patogena mogą się z nimi wiązać, lecz co z tego wynika? Przypuśćmy, że przeciwciała wiążą się do antygenów 289

Cząsteczka ta, będąca glikoproteiną, składa się z czterech łańcuchów polipeptydowych: dwóch identycznych łańcuchów ciężkich (dłuższe linie) oraz dwóch łańcuchów lekkich (krótsze linie). Cztery łańcuchy są ze sobą związane wiązaniami disulfidowymi (SS) oraz innymi, tworząc cząsteczkę o kształcie litery Y. Dwie stykające się ze sobą części łańcuchów ciężkich tworzą tak zwany fragment Fc. Rozchodzą się one w regionie zawiasowym, formując ramiona litery Y. Każde ramię, które składa się z łańcucha lekkiego i części łańcucha ciężkiego, nosi nazwę fragmentu Fab. Obydwa fragmenty Fab można odciąć od cząsteczki za pomocą enzymu papainy. Inny enzym, pepsyna, odcina (jako jeden kawałek) obydwa fragment Fab, wraz z regionem zawiasowym. Część ta nosi nazwę F(ab')2· Na wolnym końcu każdego fragmentu Fab występuje miejsce wiązania antygenu. Wśród wszystkich przeciwciał (sekcja 11.4.2.1) IgG, IgD i IgE mają opisaną wyżej formę monomeru. IgM jest pentamerem, to jest cząsteczką złożoną z pięciu promieniście ułożonych monomerów, połączonych swoimi fragmentami Fc. IgA w osoczu występuje głównie w formie monomeru o masie cząsteczkowej -160000, lecz w płynach pozanaczyniowych, jak łzy, ślina, wydzielinach w układzie oddechowym i pokarmowym (w którym jest dominującym typem Ig), ma charakter dimeru zwanego wydzielniczym IgA (s-IgA), w którym fragmenty Fc dwóch monomerów są połączone łańcuchem J oraz fragmentem wydzielniczym. IgG, o masie cząsteczkowej -150000, stanowi około 75% immunoglobulin w osoczu, z czego większość należy do podklasy IgG1. Przeciwciała IgG odgrywają ważną rolę jako opsoniny i antytoksyny w płynach pozanaczyniowych, jak również w układzie krwionośnym. Przeciwciała te mogą przejść przez łożysko, chroniąc płód i noworodka. Przeciwciała IgG zwykle dominują po zmianie klasy w odpowiedzi typu humoralnego na antygeny (sekcja 11.4.2.1). IgM, o masie cząsteczkowej -970000, odpowiada za około 5-10% immunoglobulin w osoczu. Przeciwciała IgM szczególnie dobrze aglutynują LPS oraz inne substancje, które charakteryzują się powtarzalnym wzorem determinantów antygenowych. U człowieka nie przekraczają one łożyska ani bariery krew-mózg. Przeciwciała IgM zwykle powstają jako pierwsze w odpowiedzi typu humoralnego i są główną klasą przeciwciał powstających przeciw antygenom grasiczoniezależnym, takich jak wielocukrowce pneumokoków (sekcja 11.4.2.1). Termin izotyp odnosi się do klasy immunoglobulin (np. IgG, IgM). Dany izotyp występuje u wszystkich zdrowych osobników danego gatunku. Allotyp określa zmienioną formę cząsteczki immunoglobuliny. Dany allotyp nie występuje u wszystkich osobników danego gatunku, lecz jedynie u tych, które mają odpowiedni allel w swoim genotypie (allel jest jedną z kilku zmienionych form danego genu). Termin idiotyp odnosi się zespołu determinantów immunogennych występujących w części zmiennej określonego przeciwciała.

(takich jak lipopolisacharyd) na powierzchni komórki. Kiedy się to zdarza, komórka ta staje się bardziej podatna na fagocytozę (sekcja 11.4.1). Co więcej, większość kompleksów antygen-przeciwciało aktywuje dopełniacz (sekcja 11.4.1), co również sprzyja opsonizacji (sekcja 11.4.1).

290

Inną konsekwencją wiązania przeciwciała do komórki bakteryjnej jest cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (sekcja 11.4.2.2). Przeciwciała mogą wydać się mało istotne w przypadku patogenów wewnątrzkomórkowych, ponieważ wewnątrz komórek gospodarza bakterie te są chronione zarówno przed przeciwciałami, jak i przed dopełniaczem. Jednakże przeciwciała są pomocne i w tym przypadku. Na przykład przeciwciała skierowane przeciw składnikom bakteryjnych osłon komórkowych mogą blokować wstępną adhezję (sekcja 11.2.1) przez Chlamydia lub Salmonella lub pośredniczyć w ADCC w przypadku Coxiella, podczas gdy antytoksyny (patrz niżej) mogą neutralizować wydzielane toksyny [Casadevall (1998) TIM 6: 102-107]. Przeciwciała skierowane przeciw toksynom (antytoksyny) mogą po związaniu się z nimi neutralizować ich aktywność. Powstały kompleks toksyna-antytoksyna jest usuwany przez pewne leukocyty, które mają receptory dla fragmentu Fc przeciwciała. Ujemna strona przeciwciał widoczna jest w przypadku pewnych reakcji nadwrażliwości — w tym alergii na takie antybiotyki jak penicylina. W przypadku alergii na penicylinę pierwszy kontakt z tym antybiotykiem powoduje pojawienie się większego niż prawidłowy poziomu przeciwciał IgE, z których wiele wiąże się do receptorów na komórkach tucznych i granulocytach zasadochłonnych, pozostawiając miejsca wiązania antygenu na powierzchni tych komórek. Przy następnym kontakcie penicylina (antygen) wiąże się do tych przeciwciał IgE na powierzchni komórek tucznych i granulocytów zasadochłonnych, powodując ich degranulacje, to jest uwolnienie różnych, fizjologicznie czynnych substancji (jak histamina), czego skutkiem może być nawet śmiertelny szok anafilaktyczny. Powstawanie przeciwciał. Mechanizm powstawania przeciwciał różni się zależnie od rodzaju antygenu. Niektóre duże cząsteczki o powtarzających się podjednostkach — np. wielocukry tworzące otoczkę bakteryjną — mogą powodować wytwarzanie przeciwciał przez swoiste limfocyty Β bez pomocy limfocytów T. Taki typ antygenu nosi nazwę grasiczoniezależnego (TI, ang. thymus independent), ponieważ limfocyty Τ dojrzewają w grasicy. Jednakże, chociaż antygeny Ή powodują proliferację swoistych limfocytów Β i powstawanie przeciwciał, nie indukują one limfocytów pamięci (patrz niżej), a wytworzone przeciwciała są prawie wyłącznie klasy IgM (rys. 11.2), które są pożyteczne działając przeciw patogenom przenoszonym przez krew. Takie antygeny TI, jak wielocukier otoczkowy Haemophilus influenzae typu b, nie wywołują lub prawie nie wywołują odpowiedzi w postaci przeciwciał u niemowląt i dzieci do drugiego roku życia. Najprawdopodobniej wynika to z niedojrzałości u nich limfocytów B. Jest to bardzo ważne w kontekście szczepień ochronnych — patrz szczepionki sprzężone, niżej. Większość antygenów — np. mniejsze cząsteczki, rozpuszczalne białka — są typu grasiczozależnych. Przyczyniają się one do wytwarzania przeciwciał przez limfocyty Β jedynie przy współudziale limfocytów T. Aby spowodować powstanie przeciwciała, grasiczozależny antygen musi być najpierw pobrany i przetworzony przez komórki prezentujące antygen (APC, ang. antigen-presenting cell), do których należą komórki dendrytyczne 291

i makrofagi. Po przetworzeniu (to jest np. po pocięciu enzymatycznym), antygen łączy się z cząsteczką MHC klasy II (syntetyzowanej w komórce prezentującej antygen) i jest prezentowany na powierzchni komórki limfocytowi T, która swoiście reaguje na dany antygen. Limfocyt Τ rozpoznaje i łączy się z kompleksem przetworzonego antygenu i cząsteczki MHC klasy II — antygen wiąże się do receptora limfocytu Τ (TCR, ang. Τ cell receptor) wiążącego antygen. Aktywowany limfocyt Τ wydziela cytokiny (tab. 11.4), które mogą stymulować proliferację i różnicowanie niektórych (antygenowo swoistych) limfocytów B, które związały dany antygen. Niektóre antygenowo swoiste limfocyty Β stają się komórkami plazmatycznymi, tzn. wytwarzają przeciwciała pasujące do danego antygenu. Najpierw powstają przeciwciała klasy IgM, lecz później należą one do innej klasy, zazwyczaj IgG — aczkolwiek zachowują tę samą swoistość (nadal pasują do danego antygenu). Przełączanie klas powstających immunoglobulin odbywa się w centrach rozrodczych grudek limfatycznych w śledzionie i węzłach limfatycznych. Tam, cytokiny pochodzące od limfocytów Τ uczestniczą w procesie zmiany ekspresji genów w limfocytach B, co prowadzi do syntezy różnych klas przeciwciał. Grudki limfatyczne są również miejscem dojrzewania powinowactwa. W procesie tym następuje selekcja mutantów z proliferujących, stymulowanych antygenem, limfocytów Β pod kątem wysokiego powinowactwa do antygenu. Presją selekcyjną najprawdopodobniej jest zmniejszające się stężenie antygenu. Innym skutkiem interakcji między limfocytami Β i C jest to, że niektóre limfocyty Β stymulowane przez antygeny tworzą komórki pamięci. Komórki te nie wytwarzają przeciwciał, lecz trwają latami w postaci pobudzonej, mogąc szybko i skutecznie reagować na pojawienie się tego samego antygenu. Ta wzmożona wtórna odpowiedź odzwierciedla np. istnienie rozszerzonego klonu (swoiście reaktywnych) limfocytów B, będącego wynikiem proliferacji po stymulacji antygenem. W odpowiedzi wtórnej komórki Β i Τ są już pobudzone na skutek wcześniejszego kontaktu z antygenem. W takich przypadkach do wytworzenia przeciwciał mogą wystarczać wyłącznie pobudzone limfocyty Β i Τ oraz limfocyty Β prezentujące antygen. Limfocyty Τ biorące udział w powstawaniu przeciwciał należą do subpopulacji CD4+ (syn. Τ pomocnicze; Th, ang. Τ helper;). CD4 jest cząsteczką na powierzchni (koreceptorem) umiejscowionym blisko TCR, która wiążąc się z cząsteczką MHC klasy II pomaga stabilizować kontakt między limfocytem Τ a komórką prezentującą antygen i uczestniczy w transdukcji sygnału po nawiązaniu kontaktu między komórką prezentującą antygen i limfocytem T. Stymulacja antygenowa dziewiczego limfocytu Τ typu CD4+ (tzn. takiego, który nie zetknął się z odpowiadającym mu antygenem) może spowodować rozwój komórki w jednym z dwóch kierunków — zależnie od obecności swoistych cytokin. W obecności IL-12 pochodzącej od makrofagów mogą się rozwinąć cechy charakterystyczne dla subpopulacji Th1 limfocytów Τ typu CD4+. Komórki te mogą wytwarzać np. IL-2 i IFN-α. Alternatywnie, w obecności IL-4 pochodzącej od limfocytów Τ mogą się rozwinąć cechy charakterystyczne dla komórek Th2, które wydzielają np. IL-4, IL-5 i IL-10.

292

Znaczenie subpopulacji Thl i Th2 polega na tym, że wytwarzając różne grupy cytokin wpływają na rozmaite aspekty odpowiedzi immunologicznej. Na przykład, II-2 z komórek Th1 może stymulować wzrost limfocytów T, aktywować makrofagi i wzmagać aktywność komórek CD8+ (sekcja 11.4.2.2), podczas gdy IFN-α pochodzący od Th1 może aktywować makrofagi i powodować zmianę klasy przeciwciał na IgG w aktywowanych limfocytach B. Cytokina IL-4 pochodząca z Th2 może powodować zmianę klasy przeciwciał na IgE, podczas gdy 11-10 hamuje rozwój komórek Th1. Szczepienia. Powstawanie przeciwciał skierowanych przeciw antygenom patogena może być stymulowane przez wprowadzenie tych antygenów do organizmu (szczepienie). Celem szczepienia jest pomoc organizmowi w obronie w razie ataku ze strony danego patogena. Szczepionka — zawierająca antygeny danego patogena (np. zabite komórki lub składniki komórkowe) — jest wprowadzana przez wkłucie lub, rzadziej, doustnie [szczepionki doustne (problemy i rozwiązania): Dougan (1994) Microbiology 140: 215-224). Na przykład, dobrą ochronę przed patogennymi bakteriami jelitowymi uzyskuje się jedynie wtedy, gdy antygeny te działają za pośrednictwem układu immunologicznego nabłonka jelita. Dlatego też rozwój szczepionek przeciw ETEC (tab. 11.2) jest ukierunkowany na doustny sposób ich podawania (a nie dojelitowo) [Gaastra i van der Ziejst (1996) RMM 7: 165-177]; także nie są już zalecane dojelitowe szczepionki przeciw cholerze, gdyż dają niewystarczającą ochronę. Organizm reaguje na szczepionkę wytwarzając odpowiadające jej przeciwciała. Przyszły kontakt z danym patogenem stymuluje energiczne wytwarzanie swoistych przeciwciał w wyniku odpowiedzi wtórnej (patrz wyżej). Szczepionki przeciw krztuścowi (patogenem jest Bordetella pertussis) zawierają albo całe komórki, albo frakcję bezkomórkową. Do tych ostatnich należą szczepionki z inaktywowaną toksyną błoniczą oraz (zazwyczaj) składnikami fimbrii. Szczepionki bezkomórkowe są w powszechnym użyciu w Japonii od roku 1981, a obecnie ta nowa generacja szczepionek jest stosowana w Europie. Nowe szczepionki bezkomórkowe wykazują znacznie mniejsze działanie uboczne (w porównaniu z komórkowymi), a jednocześnie zapewniają taką samą ochronę. Dają one jednak słabszą ochronę przed chorobami powodowanymi przez B. parapertussis [Willems i Mooi (1996) RMM 7: 13-21]. Bakterie patogenne mające otoczki wielocukrowe mogą powodować różnego typu choroby u małych dzieci (sekcja 11.5.1), ponieważ dzieci te nie reagują odpowiednio na antygeny w rodzaju wielocukrów (patrz powstawanie przeciwciał, wyżej). [Responsiveness of infants to capsular polysaccharides: Rijkers i wsp. (1996) RMM 7: 3-12]. Dla małych dzieci skutecznymi szczepionkami są wielocukry sprzężone z białkiem, tzw. szczepionki sprzężone. Tego typu szczepionka powoduje powstawanie przeciwciał ochronnych już w czwartym miesiącu życia. Jest to czas odpowiedni, gdyż niemowlęta zwykle są chronione przez pierwszych sześć miesięcy życia przez przeciwciała pochodzące od matki. Dysponujemy skuteczną szczepionką sprzężoną do ochrony przez chorobami (np. zapalenie płuc, zapalenie nagłośni) powodowanymi przez Haemophilus influenzae typ b (Hib). [Ten years' experience with Hib conjugate vaccines in Finland: Eskola i Kayjty (1996) RMM 7: 231-241]. 293

Wdrażane obecnie szczepionki sprzężone przeciw Streptoccus pneumoniae są skuteczne jedynie wobec niewielkiej liczby rozmaitych serotypów tego patogena. Poliwalentne szczepionki sprzężone (obejmujące większą liczbę serotypów) byłyby kosztowne. Jednakże, niektóre jednak białka (antygeny grasiczozależne) występują w osłonach komórkowych prawie wszystkich klinicznych szczepów dwoinki zapalenia płuc i charakteryzują się niewielką zmiennością antygenową. Szczepionka zawierająca kilka tych białek (uczestniczących w różnych stadiach patogenezy) mogłaby zapewnić lepszą ochronę niż szczepionki obecnie dostępne [Paton (1998) TIM 6: 85-87]. Szczepionki sprzężone przeciw meningokokowemu zapaleniu opon mózgowych dały obiecujące rezultaty jedynie dla serogrupy C Neisseria meninigitidis. Dalsze badania są w toku. Szczepionki, które blokują pobieranie żelaza przez patogena, odzwierciedlają absolutny wymóg dotyczący tego pierwiastka. Do zastosowanych antygenów należą powierzchniowe receptory dla syderofilin (sekcja 11.5.5). Jedno z wcześniejszych badań (u świń) wykazało, że białko Β Actinobacillus pleuropneumoniae wiążące transferynę może indukować przeciwciała, chroniąc zwierzęta przed zetknięciem się z homologicznym szczepem patogena. Białka receptorowe N. meningitidis dla transferyny (TbpA, TbpB) są potencjalnymi antygenami dla szczepionki przeciw zapaleniu opon mózgowych, aczkolwiek nadal pozostają problemy z heterogennością antygenową dotyczącą różnych szczepów tego patogena [Ferreiros, Gomez i Criado (1998) RMM 9: 29-37]. Są obecnie opracowywane żywe szczepionki przeciw szczepowi O139 Vibrio cholerae (sekcja 11.11) po delecji genów patogena kodujących niektóre czynniki wirulencji [Waldor i Mekelanos (1994) JID 170: 278-283]. Szczepionka przeciw gruźlicy, BCG (franc. bacille Calmette-Guerin), jest żywym, atenuowanym szczepem Mycobacterium bovis podawanym podskórnie. Skuteczność ochronna BCG w dużym stopniu zależy od położenia geograficznego, odzwierciedlając zróżnicowany stopień stykania się z prątkami w środowisku. Podobnie jak różne składniki patogena działają jako antygeny, również w ten sposób mogą działać produkty bakteryjne, łącznie z toksynami. Połączenie toksyny z przeciwciałem znosi jej szkodliwe właściwości i pomaga eliminować ją z organizmu. Jednakże, w pewnych chorobach wywoływanych przez toksyny (np. tężec) może nastąpić śmierć zanim organizm odpowiednio zareaguje przeciwciałami. Szczepienie przeciw tego typu toksynie (jak tetanospazmina — sekcja 11.3.1.3) wiąże się z podaniem zmodyfikowanej formy toksyny, zwanej anatoksyną, która nie jest szkodliwa, lecz zachowuje właściwości antygenowe. Anatoksyna indukuje zatem wytworzenie przeciwciał skierowanych przeciw toksynie. Szczepienie często stymuluje tworzenie przeciwciał w organizmie pacjenta. W niektórych przypadkach podaje się przeciwciała preformowane. Procedura ta zwie się immunizacją bierną. Szczepienia zwykle stosuje się profilaktycznie, by zapobiec chorobie. Jednak w botulizmie (sekcja 11.3.1.2) często do leczenia używa się surowicy odpornościowej zawierającej przeciwciała preformowane skierowane przeciw toksynie. [Challenges in vaccinology: Poolman (1996) RMM 7: 73-81].

294

Przeciwciała monoklonalne. Po fuzji limfocytu Β ζ komórką nowotworową powstaje hybrydoma, która może się namnażać jak komórka nowotworowa i wytwarzać przeciwciała typu określanego przez limfocyt. W ten sposób można otrzymać dużą populację identycznych (monoklonalnych) przeciwciał. Przeciwciała monoklonalne (mAbs, ang. monoclonal antibodies) znajdują wiele zastosowań, między innymi do wykrywania specyficznych drobnoustrojów, przez wykorzystanie „piętnowanych" monoklonalnych przeciwciał, które rozpoznają specyficzne antygeny. [Monoclonal antibodies specific for E. coli O157:H7 LPS: Westerman i wsp. (1997) JCM 35: 679-684]. 11.4.2.2 Odpowiedź typu komórkowego Odpowiedź typu komórkowego to rodzaj reakcji immunologicznej, w której efektorami są bezpośrednio komórki. Jest to inaczej, niż w przypadku odpowiedzi, w której uczestniczą wolne przeciwciała, tzw. odpowiedzi typu humoralnego. Głównymi komórkami efektorowymi w odpowiedzi typu komórkowego są limfocyty T. Limfocyty T, w przeciwieństwie do limfocytów B, nie tylko nie wiążą wolnego antygenu, lecz przeciwnie, wiążą antygen jedynie wtedy, gdy: 1) stanowi on część powierzchni komórki i 2) jest połączony z cząsteczką MHC. Cząsteczki MHC klasy I występują na powierzchni większości komórek organizmu zawierających jądro. Występowanie cząsteczek MHC klasy II zwykle ogranicza się do komórek prezentujących antygen (sekcja 11.4.2.1) — chociaż odpowiednie czynniki mogą zaindukować ich obecność na niektórych innych typach komórek. Ponieważ wiązanie limfocytów Τ jest ograniczone do powierzchni zawierających cząsteczki MHC, mówi się, że odpowiedź limfocytów Τ podlega ograniczeniu (restrykcji) przez MHC (w sekcji 11.4.2.1 pisaliśmy, że komórki CD4+ są ograniczone przez MHC II). [A kinetic view of Τ cell behaviour (krótki artykuł przeglądowy): Lanzavecchia, Lezzi i Viola (1999) Cell 96: 1-4]. Cechy wiązania antygenów przez limfocyty Τ sugerują, że podstawową rolą tych komórek jest reakcja na wewnątrzkomórkowe patogeny, których antygeny znajdują się na powierzchni komórki. W istocie, limfocyty Τ subpopulacji CD8+ wiążą się do, i zabijają, komórki gospodarza prezentujące antygeny pewnych patogennych bakterii połączone z cząsteczką MHC klasy I. Tego typu limfocyty Τ zwane są komórkami cytotoksycznymi (Tcyt), a każda nich wiąże antygen swoisty dla jej receptora. By zabić komórkę gospodarza, cytotoksyczne limfocyty Τ muszą najpierw ulec aktywacji, np. przez interleukinę 2 (IL-2). W przynajmniej niektórych przypadkach IL-2, jak się wydaje, pochodzi ze stymulowanych przez antygen limfocytów CD4+, które uległy zróżnicowaniu do komórek Th1 (sekcja 11.4.2.1). Cytotoksyczne limfocyty Τ niszczą komórkę docelową: 1) uwalniając czynniki letalne (w tym cząsteczki tworzące pory w błonie komórkowej — perforyny), i 2) indukując apoptozę (zaprogramowaną śmierć komórki). Ponieważ apoptoza nie jest związane z lizą, ta metoda niszczenia komórek ogranicza rozprzestrzenianie się patogena do innych komórek. Niektóre limfocyty Τ typu CD4+ mogą mieć właściwości komórek cytotoksycznych. Są one zależne od MHC. 295

Istnieją również dwie formy niszczenia komórek, które nie są zależne od MHC. W cytoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał, bakterie opłaszczone przeciwciałami ulegają lizie przez pewne limfocyty, które na swojej powierzchni posiadają receptory dla fragmentu Fc przeciwciała (rys. 11.2). Wśród komórek tych znajdują się neutrofile (granulocyty obojętnochłonne), monocyty i komórki cytotoksyczne. W innym procesie uczestniczą naturalne komórki cytotoksyczne, które rozpoznają komórki zainfekowane przez wirusy oraz komórki nowotworowe. Stymulacja limfocytów Τ typu CD4+ przez specyficzny antygen może prowadzić do ogólnego uaktywnienia układu immunologicznego. Stymulowane limfocyty Τ wytwarzają IFN-α, który aktywuje(niespecyficznie) każdego wrażliwego makrofaga w otoczeniu. Na przykład, odpowiedź immunologiczna na Mycobacterium tuberculosis może pomóc w niszczeniu komórek Listeria monocytogenes wewnątrz makrofagów — nawet wobec braku nabytej odporności na tę bakterię. Odporność typu komórkowego w niektórych chorobach nie potrafi zapobiec uszkodzeniu tkanek — lub nawet przyczynia się do tego. W gruźlicy, uszkodzenia towarzyszące gruzełkom gruźliczym (miejscowe, zdegenerowane miejsca infekcji) przynajmniej w części są spowodowane znacznym zagęszczeniem aktywowanych makrofagów wydzielających czynniki cytotoksyczne. U świnki morskiej i człowieka dojrzałe gruzełki mają serowaty, nekrotyczny (martwiczy) środek otoczony makrofagami oraz zewnętrzną okrywę z monocytów i limfocytów (fot. 11.3). Podczas powstawania uszkodzenia, makrofagi są aktywowane np. przez IFN-y wydzielany przez limfocyty. Jednakże, ponieważ limfocyty nie penetrują do środka zmienionego miejsca, lecz pozostają na zewnątrz, stężenie IFN-y w środkowych częściach dużego gruzełka może być zbyt małe, by aktywować makrofagi (które prawdopodobnie wtedy giną). Sugeruje się więc, że peryferyczne rozmieszczenie limfocytów jest powodem centralnej martwicy obserwowanej w większych gruzełkach [Orme (1998) TIM 6: 94-97].

11.5 Patogen — czynniki wirulencji Patogenność bakterii (szczególnie mechanizmy in vivo) jest obecnie przedmiotem niezwykle intensywnych badań. Powodem tego jest narastająca oporność bakterii na antybiotyki oraz powrót i nasilenie się starych problemów (takich jak gruźlica). Wydaje się, że dogłębne poznanie przebiegu choroby wewnątrz gospodarza może stworzyć nowe cele dla chemioterapii lub zasugerować alternatywne metody działania. Badania dotyczące patogenezy nabrały przyśpieszenia po wprowadzeniu nowych „molekularnych" metod, jak mutageneza transpozonowa i mutageneza typu signature-tagged (ang.) (sekcja 8.5.5.3). Zarys innej nowej metody, technologii ekspresji in vivo (IVET, ang. in vivo expression technology) przedstawiono na rysunku 11.3. IVET wykrywa te geny patogena, których promotory są aktywne jedynie podczas infekcji gospodarza; takie geny mogą być „genami wirulencji". Można je badać np. w testach na zwierzętach, z wykorzystaniem szczepów patogena z mutacją w badanym genie.

296

Typowe części gruzełka są wskazane niżej. Centrum gruzełka składa się z bezpostaciowej, serowatej masy martwicznej tkanki. Warstwa makrofagów nabłonkowych jest otoczona zewnętrzną warstwą ciemno wybarwiających się limfocytów. Każda olbrzymia komórka Langhansa tworzy się w wyniku fuzji wielu makrofagów. Jest to wielojądrzasta komórka, w której jądra są rozmieszczone peryferycznie w cytoplazmie. Gruzełek klasyfikowany jest jako zmiana ziarniniakowa.

Zachowanie bakterii wewnątrz gospodarza oraz metodologia jego badania została omówiona przez Smitha [(1998) TIM 6: 239-243]. Produkty bezsprzecznie agresywne, takie jak toksyny, są oczywiście czynnikami wirulencji. Jednakże, takimi czynnikami są też te produkty i strategie, które pomagają patogenom zadomowić się w gospodarzu i uniknąć jego układów obronnych. Niektóre z tych czynników omówione są niżej.

297

Rysunek przedstawia jedną z kilku form IVET (inne są opisane na końcu legendy). IVET wykrywa te geny patogena, które są indukowane (włączone: podczas infekcji gospodarza zwierzęcego. Cząsteczki wektora (część górna, strona prawa) są wprowadzane na drodze transformacji (sekcja 8.4.1) do populacji komórek patogena. W każdej komórce jakiś fragment chromosomu z wektora wbudowuje się do odpowiadającej mu części chromosomu patogena (na zasadzie mechanizmu insercji-duplikacji: rys. 8.21a). Ponieważ cząsteczki wektora zawierają różne fragmenty chromosomu, będą się wbudowywać do różnych miejsc chromosomowych w różnych komórkach, tworząc heterogenną populację zrekombinowanych komórek. W niektórych z tych komórek, dwa geny pozbawione promotorów będą wstawione, zgodnie z ramką odczytu, powyżej promotora. W takich komórkach, jeśli promotor jest aktywny, obydwa geny ulegną transkrypcji. Zrekombinowane komórki wykorzystuje się do infekcji zwierzęcia laboratoryjnego, któremu do pokarmu dodano antybiotyk chloramfenikol (sekcja 15.4.4). W tych warunkach zrekombinowana komórka rośnie, jeśli wytwarza acetylotransferazę chloramfenikolową (CAT), to jest jeśli gen CAT (w wektorze) jest pod kontrolą aktywnego promotora. Zatem fakt, że dana zrekombinowana komórka rośnie, oznacza, że jej gen CAT jest pod kontrolą promotora aktywnego wewnątrz badanego zwierzęcia (ponieważ synteza CAT odzwierciedla aktywny promotor, gen CAT czasem zwany jest genem reporterowym). Komórki wytwarzające CAT tworzą duże populacje znacznie liczniejsze niż te, które nie wytwarzają CAT. Musimy wiedzieć, czy promotor kontrolujący gen CAT jest czynny jedynie wewnątrz badanego zwierzęcia, czy jest też aktywny, gdy patogen jest namnażany np. na podłożu agarowym. Jeśli jest aktywny jedynie w zwierzęciu laboratoryjnym, wskazuje to, że gen, który w zwykłych warunkach jest pod kontrolą promotora, ulega indukcji podczas infekcji. Tego typu gen jest obiektem zainteresowania, gdyż może mieć związek z wirulencją. Aby dalej zbadać aktywność promotora, odzyskiwane bakterie wysiewa się na podłoże pozbawione chloramfenikolu, lecz zawierające X-Gal (sekcja 8.5.1.5), i wszystkie powinny wyrosnąć. Jeśli promotor jest aktywny w hodowli, tworzy się β-galaktozydaza (sekcja 8.5.1.5), a kolonie będą niebieskozielone, co świadczy o tym, że dany promotor ulega aktywacji nie tylko w zwierzęciu laboratoryjnym. Biała kolonia (lac) świadczy o tym, że β-galaktozydaza (i CAT) powstają jedynie w zwierzęciu laboratoryjnym, co oznacza, że promotor jest aktywny

298

11.5.1 Unikanie fagocytozy W przypadku niektórych patogenów ich fagocytozie zapobiega obecność otoczki (sekcja 2.2.11). Na przykład, dla niektórych szczepów Streptococcus pyogenes otoczka zbudowana z kwasu hialuronowego (składnik tkanek zwierzęcych) jest rodzajem „kamuflażu". Innymi inhibitorami fagocytozy są białko Μ paciorkowców (sekcja 2.2.13) oraz zbudowana z kwasu D-glutaminowego otoczka Bacillus anthracis.

U gronkowca złocistego białko A będące składnikiem ściany komórkowej wiąże się do części Fc przeciwciał (rys. 11.2), to jest do tej części, która zwykle wiąże się do receptora Fc na powierzchni fagocyta. Wiele bakterii, np. Haemophilus influenzae typ b (Hib), Neisseria meningitidis i Streptococcus pneumoniae, wytwarza otoczki wielocukrowe. Otoczki te zazwyczaj nie chronią przed fagocytozą u dorosłych i starszych dzieci z prawidłowym układem immunologicznym, który reaguje: 1) produkcją przeciwciał skierowanych przeciw wielocukrom, 2) wzmożoną opsonizacją za pośrednictwem dopełniacza (sekcja 11.4.1.1) i 3) fagocytozą. Jednak niemowlęta i małe dzieci słabo reagują przeciwciałami na wielocukry i w tej grupie wiekowej wymienione patogeny mogą powodować zapalenie opon mózgowych oraz infekcje dróg oddechowych. Stało się to przyczyną rozwoju i wprowadzenia szczepionek sprzężonych (sekcja 11.4.2.1). Yersinia spp. unika fagocytozy w inny sposób. Po kontakcie z fagocytem bakteryjny system sekrecji typu III (sekcja 5.4) wstrzykuje do niego kilka białek. Jedno z tych białek, YopH, jest enzymem, który defosforyluje pewne białka gospodarza. Białka te w formie ufosforylowanej uczestniczą w procesie fagocytozy oraz tzw. wybuchu tlenowym (ang. oxidative burst). Inne wydzielane białko, YopE, narusza, przynajmniej in vitro, struktury tworzone przy współudziale aktyny [The Yersinia Yop regulon: Cornelis and Wolf-Watz (1997) MM 23: 861-867]. Białko YopJ wpływa na obniżenie poziomu syntezy pewnych kinaz i tym samym hamuje wytwarzanie prozapalnej cytokiny TNF-α W makrofagach [Palmer i wsp. (1998) MM 27: 953-965].

wyłącznie podczas infekcji zwierzęcia. Gen, który zwykle jest pod kontrolą tego promotora, można sklonować, zsekwencjonować itp. i zbadać jego rolę w wirulencji. Inna wersja IVET wykorzystuje auksotroficzną populację (sekcja 8.1.2) patogena, która 1) rośnie jedynie na podłożu agarowym wzbogaconym w odpowiedni czynnik wzrostowy, lecz 2) nie rośnie w organizmie zwierzęcia laboratoryjnego, o ile nie jest obecny odpowiedni czynny gen. Każda cząsteczka wektora niesie geny kodujące dany czynnik wzrostowy i β-galaktozydazę. Obydwa te geny są pozbawione promotorów. Zasada metody jest podobna jak opisano wyżej. W kolejnej wersji IVET, każda cząsteczka wektora zawiera transpozon kodujący oporność na tetracyklinę, geny pozbawione promotorów kodujące transpozazę (sekcja 8.3) oraz β-galaktozydazę. Jeśli promotor jest aktywny w zwierzęciu laboratoryjnym, transposaza jest syntetyzowana i następnie wycina transpozon. Wycięty transpozon nie ulega replikacji, prowadząc do powstania klonu komórek wrażliwych na tetracyklinę. Komórki te można wykryć metodą replik (sekcja 8.1.2), wykorzystując równolegle podłoża pozbawione tetracykliny i zawierające ten antybiotyk. Tak jak wyżej, aktywność β-galaktozydazy wykorzystywana jest do wykrycia promotorów nieczynnych w hodowli. Przykłady zastosowań IVET można znaleźć w pracy: Heithoff, Conner i Mahan [(1997) TIM 5: 509-513]. 299

11.5.2 Komórki cytotoksyczne układu immunologicznego Fagocyty mogą być zabijane przez pewne substancje (leukocydyny), które wydzielają niektóre gronkowce i paciorkowce. Gronkowcowa leukocydyna Pantona-Valentine'a powoduje swoistą lizę makrofagów i leukocytów PMN (ang. polymorphonuclear leucocytes). Do tak zwanych patogenów toksyn RTX gramujemnych należy hemolizyna HlyA E. coli. HlyA w dużym stężeniu może powodować lizę różnych komórek, szczególnie PMN, uszkadzając ich błonę komórkową. Toksyna RTX Pasteurella hemolytica (czynnik sprawczy chorób układu oddechowego u krów) wywołuje lizę bydlęcych PMN. Toksyny RTX w niższych stężeniach mogą hamować tworzenie przeciwciał i sprzyjać patogenezie poprzez wywoływanie szkodliwych stanów zapalnych [RTX toxins (artykuł przeglądowy): Coote (1996) RMM 7: 53-62]. Patogen jelit Shigella flexneri po fagocytozie może wydostać się z wakuoli i zabić makrofaga za pomocą mechanizmu, w którym bierze udział białko IpaB kodowane przez plazmid. Białko to jest wydzielane przez system sekrecji typu III (sekcja 5.4). IpaB wiąże się do, i aktywuje, enzym makrofaga przekształcający IL-1β. Enzym ten, z kolei, przeprowadza nieczynną IL-1β do formy aktywnej i inicjuje apoptozę (zaprogramowaną śmierć komórki) w makrofagu [Chen i wsp. (1996) EMBO Journal 15: 3853-3860]. Aktywowana IL-1β może indukować odpowiedź zapalną (wytworzenie pewnych cytokin) w patogenezie czerwonki (sekcja 11.3.3.2).

11.5.3 Zmienność antygenowa Niektóre bakterie patogenne mogą zmieniać skład chemiczny swoich struktur powierzchniowych i co za tym idzie — swoje antygeny. Może to być pomocne dla bakterii, choćby przejściowo, w uniknięciu skutków działania swoistych przeciwciał. Na przykład, w durze powrotnym (powodowanym przez gatunek z rodzaju Borrelia) zachodzi kilka cykli gorączki i remisji, a bakterie izolowane z krwi podczas każdego nawrotu gorączki mają inne antygeny powierzchniowe. W przypadku B. hermsii antygeny podlegające zmienności są kodowane przez wielokopiowy plazmid liniowy. Zmienność antygenowa jest najprawdopodobniej wynikiem rekombinacji zlokalizowanej (sekcja 8.2.2) — między poszczególnymi plazmidami w danej komórce. Rekombinacja tego typu odpowiada za zmienność fazową u Salmonella (rys. 8.3c). U Helicobacter pylori zmienność antygenowa wiąże się z rekombinacją między genami o zbliżonych sekwencjach, kodujących różne białka powierzchniowe. Możliwe jest też, że zmienność jest wynikiem zmiany ramki odczytu w translacji (sekcja 7.8.7). Sekwencje charakterystyczne dla tego typu mechanizmu zostały odnalezione w genomie tej bakterii [Tomb i wsp. (1997) Nature 388: 539-547]. Zmienność fazowa adhezyn Opa Neisseria wiąże się z rearanżacjami w DNA, które mogą zmieniać ramki odczytu w genach opa.

300

11.5.4 Moduliny Moduliny to czynniki wirulencji, które mogą być szkodliwe dla gospodarza z powodu indukowania nieodpowiedniej aktywności różnych cytokin [Henderson, Poole i Wilson (1996) MR 60: 316-341]. Cytokiny są białkami sygnałowymi, które zazwyczaj koordynują aktywność różnych składników układu immunologicznego (np. odpowiedź zapalną). Są zatem potrzebne do skutecznej ochrony przed patogennymi drobnoustrojami. Ponieważ cytokiny mają szeroki zakres funkcji (tab. 11.4) i są ważnymi czynnikami fizjologicznymi, ich niewłaściwa aktywność może prowadzić do efektów patologicznych, tak jak na przykład w szoku endotoksycznym (sekcja 11.3.4; patrz też sekcja 11.3.6). Do modulin należą endotoksyny (sekcja 11.3.4), fragmenty mureiny (peptydoglikanu) ściany bakteryjnej (które indukują np. IL-1β i IL-6 w monocytach); superantygeny (sekcja 11.5.4.1) i toksyny podobne do toksyny shiga (które indukują TL-1α, IL-6 i TNF-α w makrofagach). Cytokiny 11-1, IL-4, IL-6, TNF-α i IFN-α są indukowane w komórkach jednojądrzastych przez białko A, które występuje na powierzchni większości szczepów Staphylococcus aureus. Białko A działa również jako czynnik antyfagocytarny wirulencji, wiążąc część Fc przeciwciał IgG. 11.5.4.1 Superantygeny Superantygen A jest białkiem wydzielanym przez pewne patogeny, silnie wiążącym się do tych limfocytów T, których receptory wyrażają dany łańcuch Vb, i równocześnie mogącym wiązać się do cząsteczki klasy II głównego układu zgodności tkankowej (MHC, ang. major histocompatibility complex,) na komórce prezentującej antygen (sekcja 11.4.2.1). Tego typu wiązanie powoduje proliferacje limfocytów Τ oraz wydzielanie cytokin. Ponieważ populacja limfocytów Τ wyrażających dany łańcuch Vb obejmuje wiele indywidualnych klonów (z których każdy jest specyficzny dla danego, unikalnego antygenu), efektem jest aktywacja poliklonalna, to jest aktywacja wielu różnych typów limfocytów C, tak by był obecny cały zakres odmiennych antygenów. Wynikające z tego masywne uwolnienie cytokin (z limfocytów T, komórek prezentujących antygen itp.) może prowadzić do stanu zwanego zespołem wstrząsu toksycznego (TSS, ang. toxic shock Syndrome) (sekcja 11.11) oraz prawdopodobnie również do zespołu Kawasaki. Superantygeny mogą aktywować zarówno komórki DD4+, jak i CD8+, wiążąc się do łańcuchów Vb w miejscach będących poza rejonem wiązania antygenu. Poszczególne superantygeny mogą preferencyjnie wiązać się do odmiennych łańcuchów Vb (wpływając w ten sposób na różne subpopulacje limfocytów T). W wyniku aktywacji, komórki danej subpopulacji ulegają proliferacji. Na przykład u gryzoni większość komórek danej subpopulacji następnie zamiera, a zwierzę przejawia (przejściowo) brak reakcji (anergię) na dany antygen. W przypadku gryzoni anergia wobec danego antygenu może trwać miesiącami, lecz u ludzi zjawiska tego nie obserwuje się. Do możliwych terapeutycznych zastosowań superantygenów należy supresja swoistych subpopulacji limfocytów Τ lub aktywacja limfocytów Τ ο aktywności przeciwnowotworowej. 301

„Superantygeny limfocytów B" są analogicznymi cząsteczkami, wiążącymi się do łańcucha VH receptora na tych limfocytach. Do superantygenów należą enterotoksyny Staphylococus aureus (enterotoksyna F = toksyna 1 zespołu wstrząsu toksycznego) (TSST-1, ang. toxic shock Syndrome toxin 1) oraz pewne toksyny paciorkowców grupy A, w tym paciorkowcowa egzotoksyna A, zwana paciorkowcowym superantygenem A (SSA, ang. streptococcal superantigen A). Gen kodujący TSST-1 znajduje się na mobilnej wyspie patogenności (sekcja 11.5.7) i sugerowano, że owa mobilność może być przyczyną rozprzestrzeniania się toksygenności TSST-1 u Staphylococcus aureus [Lindsay i wsp. (1998) MM 29: 527-543]. [Superantygeny (artykuł przeglądowy): Fleischer (1995) RMM 6: 49-57; kliniczne znaczenie superantygenów dla limfocytów T: Michie i Cohen (1998) TIM 6: 61-65].

11.5.5 Patogenność i żelazo Patogeny wymagają żelaza m. in. do syntezy niektórych enzymów i/lub cytochromów, lecz może ono być trudno dostępne w organizmie gospodarza. Na przykład w układzie krwionośnym ssaków glikoproteina gospodarza o właściwościach chelatujących żelazo, tak zwana transferyna, wiąże żelazo i przekazuje je do komórek. Aby poradzić sobie z tym problemem, wiele patogenów koduje własny system pobierania żelaza w postaci syderoforu, niskocząsteczkowego chelatora jonu żelazowego wydzielanego przez patogena, oraz receptorów na powierzchni komórki bakteryjnej, które wiążą kompleks żelazo-syderofor. Patogenne, pozajelitowe szczepy E. coli (np. te, które wywołują zapalenie opon mózgowych u noworodków) często wytwarzają aerobaktynę, siderofor z klasy hydroksamatów, który po związaniu żelaza łączy się z receptorem w błonie zewnętrznej. Aerobaktyna skutecznie konkuruje z transferyną [Accjuisition of transferrin-bound iron by pathogens (artykuł przeglądowy): Cornelissen i Sparling (1994) MM 14: 843-850]. Teoretycznie, siderofory mogłyby po prostu przenosić żelazo ze środowiska do receptorów na powierzchni komórki. Jednakże, np. u E. coli siderofor zwany enterocheliną (syn. enterobaktyna) najpierw wiąże się do receptora (białko FepA w błonie zewnętrznej), a następnie zostaje przeniesieny do wnętrza komórki. W cytoplazmie żelazo uwalniane jest dopiero po rozszczepieniu sideroforu przez 3+ 2+ esterazę. Fe ulega redukcji do Fe . W przypadku Pseudomonas aeruginosa brak żelaza inicjuje syntezę zielonożółtego fluoryzującego sideroforu — piowerdyny, który stymuluje wzrost patogena nawet w obecności transferyny. Mechanizm regulowanej przez żelazo indukcji piowerdyny (rys. 11.4) zaproponował Leoni i wsp. [(1996) JB 178: 2299-2313]. Salmonella typhimurium koduje syderofor z grupy katecholamin — enterochelinę, której ekspresja, podobnie jak w przypadku piowerdyny P. aeruginosa, jest związana z regulacją przez białko Fur. U S. typhimurium białko Fur jest również regulatorem odpowiedzi o charakterze tolerancji na kwasowość środowiska (sekcja 7.8.2.6). 302

(a) W odpowiednich stężeniach żelaza, represor transkrypcji, białko Fur (produkt genu fur) silnie wiąże się do wysoce konserwatywnego regionu DNA (obszaru Fur), hamując transkrypcję genu pvdS. (b) Gdy stężenie żelaza jest niewystarczające, Fur nie wiąże się do obszaru Fur, pozwalając na transkrypcję pvdS. Produkt pvdS (PvdS) jest czynnikiem sigma (patrz sekcje 7.5 i 7.8.9), który jest niezbędny do transkrypcji innych genów uczestniczących w biosyntezie piowerdyny.

Mycobacterium tuberculosis do wzrostu zewnątrzkomórkowego wykorzystuje syderofor egzochelinę oraz związany ze ścianą bakteryjną lipidowy związek, zwanym mykobaktyną. Egzochelina odbiera żelazo od chelatorów gospodarza (syderofilin: transferyny i/lub laktoferyny) i przekazuje je do mykobaktyny, która uczestniczy w internalizacji. Transferyna występuje w osoczu, laktoferyna w wydzielinach. Niektóre patogeny uzyskują żelazo bezpośrednio z syderoforów gospodarza. Neisseria gonorrhoeae ma receptory dla ludzkiej transferyny, a N. meningitidis wiąże transferynę człowieka i niektórych innych naczelnych. Receptor na powierzchni komórki bakteryjnej składa się z dwóch białek — TbpA i TbpB. Szczepy tych patogenów, które nie potrafią wiązać siderofilin (z powodu braku receptorów), są awirulentne. Co więcej, szczepy, które wytwarzają receptory, są wirulentne jedynie w tych gatunkach gospodarza, w których receptory są efektywne. Helicobacter pylori uzyskuje żelazo z laktoferyny, gdy znajduje się w świetle żołądka. Jednakże, kiedy organizm ten wnika pomiędzy komórki jego ściany, jedynym źródłem żelaza jest hem, który wiąże się do specyficznych receptorów w błonie zewnętrznej. Do innych sposobów zdobycia żelaza przez patogeny należą: asymilacja hemu po lizie erytrocytów oraz wykorzystanie wewnątrzkomórkowego żelaza gospodarza. Metody do zdobycia żelaza przez danego patogena określają, przynajmniej częściowo, jakie gatunki gospodarza są podatne na zakażenie przez tego patogena, jak również rodzaje wrażliwych tkanek/komórek. Dzieje się tak dlatego, że patogen namnaża się jedynie w gospodarzach/tkankach/komórkach, w których ma dostęp do odpowiedniej ilości żelaza. Actinobacillus pleuropneumoniae, na przykład, ma receptory powierzchniowe dla transferyny świńskiej, a więc organizm ten powoduje zapalenie płuc u świń, a nie u ludzi. Z kolei zaś, Listeria mono-

303

cytogenes powoduje schorzenia bydła, owiec i ludzi, ponieważ ma zdolność wykorzystywania syderoforów innych bakterii, jak również różnych związków chelatujących żelazo, występujących w środowisku oraz w ssaczych gospodarzach. Patogen ten najprawdopodobniej wykorzystuje enzym związany z powierzchnię jego komórki, tj. reduktazę żelazową, która rozpoznaje wszystkie te rodzaje chelatorów, nie musi zatem wytwarzać osobnych receptorów dla każdego chelatora. Absolutne wymagania patogenów dotyczące żelaza doprowadziły do badania możliwości wyprodukowania nowych szczepionek stymulujących wytwarzanie przeciwciał skierowanych przeciw powierzchniowym receptorom dla siderofilin (patrz sekcja 11.4.2.1). Rolę żelaza w patogenezie wyczerpująco omówiono w artykule Weinberga [(1998) RMM 9: 171-178].

11.5.6 Adhezyny Zdolność patogena do adhezji na specyficznych komórkach w tkankach gospodarza jest często ważnym czynnikiem wirulencji (sekcja 11.2.1). Struktury czy cząsteczki na powierzchni komórki bakteryjnej, które przyczyniają się do adhezji, zwane są adhezynami. Istnieją różnego typu adhezyny, a dana bakteria może wytwarzać kilka ich rodzajów. Niektóre adhezyny mają popularne nazwy, jak inwazyna (Yersinia enterocolitica), internalina (Listeria monocytogenes), intymina

(szczepy EHEC, EPEC). W wielu przypadkach adhezyny są fimbriami (sekcja 2.2.14.2) i często są kodowane przez plazmidy. Szczepy ETEC (tab. 11.2) dysponują ponad 10 rodzajami fimbrii działających jako adhezyny, oraz kilkoma rodzajami adhezyn nie będących fimbriami. [Gaastra i van der Zeist (1996) RMM 7: 165-177]. Do tych ostatnich należą też paciorkowcowe białka Μ (sekcja 2.2.13). Adhezyna TCP Vibrio cholerne jest ważna nie tylko z powodu uczestnictwa w procesie adhezji, lecz również jako receptor dla faga, który promuje rozprzestrzenianie się wśród szczepów patogena genów kodujących tę toksynę (sekcja 11.5.8). Adhezyny białkowe Staphylococcus aureus, które zazwyczaj są związane z peptydoglikanem (mureiną) ściany komórkowej, wykazują powinowactwo do składników zewnątrzkomórkowej matriks komórek ssaków, jak kolagen i fibronektyna [Foster i Hook (1998) TIM 6: 484-488]. Wszystkie patogenne szczepy z rodzaju Neisseria kodują adhezyny białkowe zwane Opa. Patrz: Dehio, Gray-Owen i Meyer (1998) TIM 6: 489-495].

11.5.7 Wyspy patogenności Wyspa patogenności [artykuł przeglądowy: Groisman i Ochman (1996) Cell 87: 791-794] to zbiór lub „kaseta" kilku do wielu genów kodujących zespół czynników wirulencji. Wyspy takie występują w chromosomie i/lub w pozachromosomowych elementach, to jest plazmidach. Wyspy te charakteryzują się 304

zazwyczaj inną zawartością par GC niż w chromosomie danej bakterii, co sugeruje, że ich nabywanie następuje w wyniku „horyzontalnego transferu genów" (np. w koniugacji). Ciekawe jest, że procent GC w zespole genów wirulencji Listeria monocyłogenes jest podobny do tego w pozostałej części chromosomu. Jednym z przykładów jest region chromosomów wielkości 35 kz w szczepach EPEC (tab. 11.2), kodujący czynniki, przy pomocy których patogen wytwarza charakterystyczne zmiany — „ang. attaching and effacing lesions" (sekcja 11.2.1). Region ten, wyspa patogenności LEE (ang. locus of enterocyte effacement) [patrz np. Kaper (1998) TIM 6: 169-172], położony jest poniżej genu selC (który koduje selenocysteinylo-tRNA). Do ciekawostek należy to, że uropatogenny szczep E. coli (UPEC) zawiera inną wyspę patogenności (PAI-1 o wielkości 70 kz kodującą np. hemolizynę), której miejsce integracji w chromosomie jest dokładnie takie samo. Wydaje się przeto, że niepatogenny szczep E. coli może po nabyciu wyspy LEE lub PAI-1 przeistoczyć się odpowiednio w EPEC lub UPEC. Jednakże, samo nabycie wyspy patogenności nie gwarantuje zmiany w patogenie, gdyż importowane geny muszą funkcjonować w zespole genów całego chromosomu. Do innych (chromosomowych) przykładów należą wyspa kodująca TCP u Vibrio cholerae (sekcja 11.3.1.1) oraz wyspa cag u Helicobacter pylori [Tomb i wsp. (1997) 388: 539-547]. Kilka wyraźnych wysp patogenności występuje u Salmonella, a jedna z nich jak się wydaje, specyficznie przyczynia się do enteropatogenności (w przeciwieństwie do salmonellozy układowej) [Wood i wsp. (1998) MM 29: 883-891]. Gen toksyny zespołu wstrząsu toksycznego (TSST-1) Staphylococcus aureus znajduje się na mobilnej wyspie patogenności [Lindsay i wsp. (1998) MM 29: 527-543].

11.5.8 Wpływ środowiska gospodarza na transfer czynników wirulencji pomiędzy infekującymi bakteriami Niedawne badania wskazują, że sygnały wewnątrz organizmu ssaka będącego środowiskiem dla bakterii mogą sprzyjać transferowi toksygenności pomiędzy szczepami infekujących bakterii. W warunkach in vitro (laboratoryjnych) fag CTXO, który koduje toksynę cholery (sekcja 11.3.1.1), infekuje niektóre szczepy V. cholerae CT~ z bardzo mała częstością. Jednakże, wewnątrz jelita myszy, wydajność konwersji lizogennej tych szczepów przez CTXO (pochodzącego z koinfekującego szczepu CT+) jest o prawie milion razy większa. Ta zwiększona wydajność konwersji wydaje się wynikiem indukcji pilusów TCP (sekcja 11.3.1.1) w odpowiedzi na sygnały w środowisku jelita, które następnie służą jako receptory dla faga CTΧΦ. Przykład ten jest dobrą ilustracją ogólnego rozprzestrzeniania się czynników wirulencji; bowiem jest wysoce prawdopodobne, że czynnik, który w warunkach laboratoryjnych wydaje się nie przenosić, w środowisku in vivo czyni to z łatwością [patrz Mel i Mekalanos (19966) Cell 87: 795-798].

305

11.6 Interakcje między patogenem a gospodarzem — nowa perspektywa Badania na poziomie molekularnym wykazały, że przebieg patogenezy może być znacznie bardziej złożony niż wcześniej myślano. Informacji dotyczących aktywności patogenów wewnątrz ich gospodarzy dostarczają różne nowe metody, w tym np. STM (rys. 8.22) i IVET (rys. 11.3), które monitorują ekspresję genów patogena podczas infekcji zwierząt będących gospodarzem. Jest teraz jasne, że patogeny często „manipulują" funkcjami komórek gospodarza oraz że niektóre bakterie chorobotwórcze mają wspólne mechanizmy jego eksploatacji [artykuł przeglądowy: Finlay i Cossart (1997) Science 276: 718-725]. Geny gospodarza uczestniczące w interakcjach między patogenem a nim samym zbadano przy pomocy myszy z „nokautami" genowymi (sekcja 8.5.5.4; tab. 8.2). Do przykładów znanych lub proponowanych interakcji należą: • zwiększona synteza miejsc receptorowych komórek gospodarza w wyniku wstępnego związania Bordetella pertussis (sekcja 11.2.1). • Fosforylacja przez gospodarza białka wydzielanego przez bakterię — białko to następnie ulega insercji do błony komórkowej gospodarza, gdzie pełni funkcję receptora dla patogena (sekcja 11.2.1). • Bakteryjna indukcja cytoszkieletowych rearanżacji w komórce gospodarza przed inwazją (sekcja 11.2.2). • Indukcja specyficznych adhezyn na powierzchni Vibrio cholerae przez sygnały płynące z jelitowego środowiska gospodarza (sekcja 11.5.8). Podobną indukcję fimbrii, w warunkach in vivo, opisano dla szczepu ETEC kodującego STb. • Indukcja „samobójstwa" (apoptozy) komórki gospodarza przez patogena (sekcja 11.5.2). • Indukcja cytokin za pośrednictwem toksyn, co powoduje wzrost podatności gospodarza z powodu zwiększonej syntezy miejsc receptorowych wiążących toksynę (sekcja 11.3.1.6). Zdolność toksyn do wpływania na populację cytokin gospodarza jest dość częsta [Henderson, Wilson i Wren (1997) TIM 5: 454-458].

11.7 Rozprzestrzenianie się choroby W niektórych chorobach patogen zazwyczaj nie przechodzi od jednego osobnika do drugiego. Przykładami są tężec i zgorzel gazowa. W schorzeniach tych patogen zazwyczaj pochodzi z gleby, a nie od innego zakażonego osobnika. Inne choroby bezpośrednio lub pośrednio przenoszą się między osobnikami (ludźmi lub lub zwierzętami). Jedynie stosunkowo rzadko przeniesienie choroby wymaga bezpośredniego kontaktu między osobnikiem zakażonym i zdrowym, a sprawcą zazwyczaj jest patogen, który nie może przetrwać dłuższy czas poza organizmem. Przykładem może być choroba weneryczna kiła, powodowana przez krętka Treponema pallidum.

306

Większość chorób przenosi się pośrednio z jednej osoby na drugą w sposób, który na ogół wiąże się z najczęstszą drogą infekcji (sekcja 11.2). Na przykład, patogeny, które zakażają poprzez przewód pokarmowy, zwykle przenoszą się z zakażoną wodą lub żywnością. W ten sposób zwykle rozprzestrzenia się zapalenie żołądkowo-jelitowe, czerwonka, dur brzuszny i cholera. Tego typu roznoszenie choroby na ogól jest związane z zanieczyszczeniem wody lub żywności przez kał pacjenta cierpiącego na dana chorobę. Może się to zdarzyć, kiedy osoba pracująca przy żywności ma ślady kału na rękach, gdy mucha domowa siada na przemian na kale i żywności, czy też jest przeciek ścieków do źródła wody pitnej (patrz też sekcje 12.3.2 i 13.5.1.3). Często można prześledzić przechodzenie patogena — poprzez żywność lub wodę — do osobnika(ów) cierpiących na daną chorobę. Czasami źródłem patogena jest osoba, która nie choruje, lecz jest gospodarzem dla patogena i tym samym rezerwuarem infekcji. Taka najwyraźniej zdrowa osoba, będąca źródłem patogennych organizmów, zwana jest nosicielem. Jedna „sławna" nosicielka, kucharka Mary Mallon, zaraziła prawie trzydzieści osób, zanim została zidentyfikowana. Określenie „durowa Mary" jest czasami używane w odniesieniu do rzeczywistego lub potencjalnego nosiciela duru brzusznego lub innych chorób. Patogeny zakażające poprzez układ oddechowy często są rozprzestrzenianie tzw. drogą kropelkową. Kiedy ktoś kaszle lub kicha lub nawet głośno mówi, przez pewien czas w powietrzu pozostają zawieszone drobniutkie kropelki wydzielin błon śluzowych wydostające się z ust. Kropelki te mogą zawierać organizmy patogenne, o ile występowały one na powierzchniach układu oddechowego. Ponieważ najmniejsze z tych kropelek utrzymują się w powietrzu przez dłuższy czas, mogą być wdychane przez inne osobniki, będąc zatem przenosicielami patogena. Przykładami chorób przenoszonych w ten właśnie sposób są gruźlica, krztusiec i błonica. Niektóre bakterie patogenne są przekazywane od jednej osoby do drugiej za pośrednictwem wektora. Na przykład, dżumę dymieniczą (gruczołową) (powodowaną przez Yersinia pestis) przenoszą pchły, dur wysypkowy (Rickettsia prowazekii) — wszy, a tularemię (wywoływaną przez Francisella tularensis) — gryzące muchy lub kleszcze. Kolejny przykład to gorączka Oroya (sekcja 11.3.3.3).

11.8 Wykrywanie i charakterystyka patogenów w laboratorium Szybkie wykrycie, identyfikacja i typowanie patogena jest szczególnie ważne w niektórych chorobach i niekiedy bywa możliwe z użyciem technik wykorzystujących kwasy nukleinowe: sekcja 16.1.6. Bakterie podejrzane o spowodowanie choroby, a nie dające się wyhodować w laboratorium, można zbadać stosując procedurę amplifikacji wykorzystującą PCR; patrz np. choroba Whipple'a (sekcja 11.11). Tradycyjne metody badań i opisów są nadal powszechne. Niektóre z nich w zarysie przedstawiono niżej. 307

11.8.1 Wyhodowanie patogena i wykrycie toksyny Często (tam, gdzie to możliwe) podejmowane są próby wyhodowania patogena z próbki np. śliny, ropy, moczu lub kału. By założyć hodowlę, mocz można odwirować, a otrzymany osad użyć jako inokulum. Próbkę kału można zawiesić w roztworze Ringera, a następnie część zawiesiny użyć jako inokulum. Wybór podłoża oraz warunków inkubacji zależy od inokulum i rodzaju prawdopobnego patogena. Do hodowli stosuje się podłoże wzbogacające (sekcja 14.2.1). Zarys procedury hodowli w krwi podano w sekcji 11.8.1.1. Próbki (np. zakażona żywność) podejrzane o obecność egzotoksyny bada się za pomocą różnych metod (patrz np. sekcja 12.3.1.1). Hodowlę Corynebacterium diphtheriae można zbadać pod kątem toksykogenności (zdolności do wytwarzania toksyny) np. metodą Eleka (sekcja 11.8.1.2). 11.8.1.1 Hodowle krwi Hodowle krwi wykorzystuje się np. do wykrywania drobnoustrojów przenoszonych przez krew, przede wszystkim bakterii, w takich chorobach jak dur brzuszny. Wprowadza się 5-10 ml krwi pobranej sterylnie od pacjenta (sekcja 14.3) do 50-100 ml podłoża, np. bulionu tryptozowo-sojowego. Podłoże zwykle uzupełniane jest czynnikiem hamującym krzepnięcie krwi, a czasem również enzymami inaktywującymi antybiotyki przeniesione wraz z krwią. Zaszczepione podłoże inkubuje się i codziennie bada robiąc wysiewy na odpowiednie podłoże stałe. Do wykrycia lub identyfikacji organizmów w hodowlach krwi można stosować metodę PCR (sekcja 8.5.4) poprzez amplifikację bakteryjnego DNA z użyciem starterów swoistych dla danego gatunku. Można w ten sposób uzyskiwać szybkie wyniki oraz wykrywać bakterie nie dające się wyhodować lub uszkodzone przez antybiotyk. Problemami w tej metodzie są: 1) konieczność stosowania tradycyjnych hodowli do badania podatności na antybiotyki (dopóki nie stanie się dostępna technologia wykorzystująca do tego celu kwasy nukleinowe), 2) obecność, w hodowlach krwi, inhibitorów PCR, np. heminy, oraz czynników przeciwzakrzepowych, jak heparyna, 3) niemożność określania intensywności bakteriemii (to jest miana bakterii w próbce krwi) techniką PCR, chociaż ten problem może da się rozwiązać stosując techniki rozcieńczania. Niektóre handlowe podłoża do hodowli krwi mogą zawierać polianetosulfonian sodowy (SPS) jako czynnik zapobiegający krzepnięciu krwi oraz anty-dopełniacz. SPS hamuje PCR i jego usunięcie z próbek stosowanych do PCR ułatwia wykrycie bakteryjnego DNA w podłożach do hodowli krwi [Fredericks i Relman (1998) JCM 36: 2810-2816]. W niektórych przypadkach bakteriemii izolowane są beztlenowce (np. Bacteroides fragilis), w związku z czym pożyteczne są próby równoczesnego wykrywania tlenowców i beztlenowców. Tego typu podejście sprzyja również identyfikacji fakultatywnych tlenowców (sekcja 3.1.6) w podłożach beztlenowych. Problemem jednak jest to, że obecnie stosowane podłoża do hodowli krwi nie są idealne do tego celu. Świadczą o tym choćby dane dotyczące częstości występowania bakteriemii powodowanej przez bakterie beztlenowe. Do skutecznej izolacji 308

beztlenowców powinno się stosować podłoża redukowane, sterylizowane w warunkach beztlenowych [Anaerobic blood culture: Goldstein i wsp. (1997) RMM 8: (suplement 1) S87-S89].

11.8.1.2 Wykrywanie toksyny błonicznej — płytka Eleka Metodą tą wykrywa się toksynę bloniczną Corynebacterium diphtheriae. Sposób przygotowania testu jest pokazany w fotografii 11.4 (część górna). Na wytwarzanie toksyny przez dany szczep wskazuje powstanie po inkubacji białawych linii precypitatu. Precypitat ten jest wynikiem połączenia toksyny i antytoksyny, które dyfundują z linii wzrostu oraz paska papieru. Konieczne jest stosowanie kontroli pozytywnej i negatywnej, to jest toksykogennych i nietoksykogennych szczepów C. diphtheriae. Wynik odczytuje się po 25-48 godzin inkubacji. Ulepszona forma tego testu (fot. 11.4, część dolna) pozwala na odczyt już po 16 godzinach [Engler i wsp. (1997) JCM 35: 495-498].

11.8.2 Mikroskopia immunofiuorescencyjna Technika ta pozwala na wykrycie specyficznego typu organizmu w rozmazie (sekcja 14.9) zawierającym mieszaninę drobnoustrojów. Przeciwciała (sekcja 11.4.2.1) swoiste dla danego organizmu są najpierw chemicznie wiązane z fluoryzującym barwnikiem (np. fluoresceiną). Koniugat (zawiesina przeciwciał połączonych z barwnikiem) zostaje dodany do rozmazu. Po spłukaniu niezwiązanego koniugatu, preparat ogląda się pod mikroskopem epifluorescencyjnym, w którym światło ultrafioletowe skierowane jest na obiekt od góry. Światło widzialne pochodzące od związanych, fluoryzujących przeciwciał widziane jest tak jak zwykle, tzn. za pośrednictwem obiektywu mikroskopu.

11.8.3. Test wiązania dopełniacza Test wiązania dopełniacza (CFT, ang. complement-fixation test) może być wykorzystany do wykrywania swoistych przeciwciał w próbce surowicy. Obecność przeciwciał przeciw konkretnemu patogenowi może wskazywać na trwające lub przeszłe zakażenie tą bakterią. Dopełniacz (sekcja 11.4.1.1) jest wiązany przez większość typów kompleksów antygen-przeciwciało (sekcja 11.4.2.1). Zatem, jeśli po dodaniu do mieszaniny swoistego antygenu i dopełniacza surowicy zajdzie wiązanie, oznacza to, że zawiera ona przeciwciała pasujące do antygenu. Wiązanie w danej mieszaninie reakcyjnej powoduje zmniejszenie ilości wolnego dopełniacza. Efekt taki oraz jego wielkość, odzwierciedlającą ilość swoistego przeciwciała w próbce surowicy, oznacza się za pomocą CFT. Próbkę surowicy najpierw ogrzewa się (56°C/40 min), by zniszczyć własny dopełniacz pacjenta, a następnie wykonuje się serię rozcieńczeń. Do każdego rozcieńczenia dodaje się standardową ilość swoistego antygenu i całość inkubuje się przez 18 godz. w 4°C. Obecność/brak oraz ilość swoistego przeciwciała

309

Część górna: metoda standardowa. Na odpowiednie podłoże wzrostowe wysiano rysą, równolegle, siedem szczepów C. diphtheriae: pięć szczepów testowych, jeden kontrolny szczep pozytywny (toksygenny) i jeden negatywny (metoksygenny). Szczep pozytywny jest u góry, negatywny u dołu. Przed inkubacją, na podłoże położono pasek bibuły filtracyjnej impregnowanej antytoksyną (surowicą zawierającą przeciwciała przeciw toksynie błonicznej). Po 24-48 godz. inkubacji, na obecność szczepu toksygennego wskazuje cienka linia białawego precypitatu toksyny-antytoksyny (sekcja 11.8.1.2). Zwróć uwagę, że szczep obok pozytywnej kontroli wytworzył linie precypitatu, które zlewają się dokładnie z kontrolą. Tego rodzaju „linie identyczności" wskazują, że szczepy kontrolny i badany tworzą podobny, ulegający dyfuzji produkt. Zwróć również uwagę, że ostatnia linia wzrostu (kontrola negatywna) nie tworzy linii precypitatu. Część dolna: metoda zmodyfikowana. Ta forma testu jest oparta na metodologii stosowanej w Rosji i na Ukrainie. W środku płytki umieszcza się krążek nasączony antytoksyną, a szczepy badane i kontrolne (pozytywne i negatywne) nanoszone są wokół niego, tak jak na fotografii. C. diphtheriae szczep NCTC 10648 jest mocną kontrolą pozytywną, NCTC jest szczepem słabo pozytywnym, a NCTC 10356 jest kontrolą negatywną. Τ to toksynogenny szczep (dwukrotnie na tej samej płytce). Zdjęcia dzięki uprzejmości dr Kathryn H. Engler, Public Health Laboratory Service, Central Public health laboratory, London, UK.

310

w danym rozcieńczeniu surowicy określa się na podstawie ilości wolnego (nie związanego) dopełniacza. Postały dopełniacz oznacza się przez dodając do każdego rozcieńczenia system hemolityczny, to jest zawiesinę „uczulonych" erytrocytów, które w obecności dopełniacza ulegają lizie. Jeśli w danym rozcieńczeniu surowicy nie następuje liza erytrocytów (komórki sedymentują), to nie zawiera ono już dopełniacza i nastąpiło maksymalne związanie antygen-przeciwciało. Inaczej mówiąc, przy tym rozcieńczeniu surowicy stężenie przeciwciał było na tyle wysokie, że po utworzeniu kompleksu z antygenem cały dopełniacz został związany. Jeśli, z kolei, wszystkie erytrocyty ulegają lizie w największym stężeniu surowicy, to test jest ujemny. Oznacza to, że surowica ta zawierała cały dodany dopełniacz, a zatem brak w niej wykrywalnych przeciwciał. Wykonując CFT należy pamiętać o odpowiednich kontrolach. Dobrym przykładem CFT jest klasyczny test Wassermana wykrywania kiły.

11.8.4 Test immunoenzymatyczny Test immunoenzymatyczny (ELISA, ang. enzyme-linked immunosorbent assay) jest bardzo czułym sposobem wykrywania swoistych antygenów lub przeciwciał. Zasada tego testu jest przedstawiona na rysunku 11.5.

11.8.5 Hybrydyzacja in situ (ISH) i hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH) Stosując znakowane sondy (sekcja 8.5.3) często można wykryć patogenne bakterie in situ — wewnątrz zakażonej tkanki. Sondy zawierają sekwencje nukleotydów specyficzne dla danego szczepu lub gatunku, które hybrydyzują z komplementarnymi sekwencjami w DNA lub RNA patogena. Bezpośrednie wykrycie patogenów za pomocą ISH (ang. in situ hybridization) ma dwie główne zalety. Po pierwsze ISH wykrywa patogena zanim da się go wyhodować, co jest szczególnie istotne w przypadku długiego czasu wzrostu (np. tygodnie dla Mycobacterium tuberculosis) lub jeśli w ogóle nie daje się go hodować (np. Mycobacterium leprae). Gatunki z rodzaju Mycobacterium wykryto metodą ISH zarówno w świeżo zamrożonych skrawkach zakażonej tkanki, jak i w skrawkach tkanek zatopionych w parafinie. Po drugie, ISH może być użyteczny w diagnozie u pacjentów z niedoborem układu immunologicznego (np. AIDS), u których słaba reakcja immunologiczna może wykluczyć stosowanie testów serologicznych ukierunkowanych na przeciwciała przeciw konkretnym patogenom. Co więcej, ogólnie rzecz biorąc, przeciwciała nie muszą być wykrywalne na każdym etapie infekcji. ISH rozróżnia wirulentne i niewirulentne szczepy patogena na podstawie sond wykrywających geny kodujące swoiste czynniki wirulencji. Początkowo do badań wykorzystywano radioizotopy. Zapewniają one wysoką czułość przy ograniczonej rozdzielczości będącej wynikiem drogi rozpadu cząsteczek radioaktywnych w emulsji fotograficznej. Wadą metodologii wykorzystującej radioizotopy są jednak związane z nimi zagrożenia oraz koszty. 311

(a) Specyficzny antygen (pełne kółka) jest immobilizowany np. na wewnętrznej powierzchni probówki z tworzywa sztucznego, a następnie wprowadzony w kontakt z surowicą. Pojedyncza cząsteczka specyficznego przeciwciała wiąże się z odpowiadającym jej antygenem. Przeciwciała, które nie związały się, są następnie wymywane. (b) Pojedyncze, związane przeciwciało jest wykrywane za pomocą przeciwciał skierowanych przeciw immunoglobulinie, tzn. takich, dla których antygenami są również specyficzne przeciwciała. Przed użyciem, każde przeciwciało antyimmunoglobulinowe jest chemicznie sprzęgnięte ze szczególnym enzymem. Kompleks przeciwciało antyimmunoglobulinowe-enzym (trójkąt) wiąże się do pojedynczego związanego przeciwciała, powodując jego wyznakowanie przez enzym. Wykrycie enzymu pozwala na stwierdzenie tego przeciwciała. Wykrycie enzymu polega na dodaniu odpowiedniego substratu, który w obecności enzymu daje wykrywalny produkt, ulegający amplifikacji na skutek ciągłej aktywności enzymatycznej.

Obecnie szeroko wykorzystuje się znakowanie fluorescencyjne (oraz mikroskopię epifluorescencyjną). Zestawy do FISH (ang. fluorescence in situ hybridization) oraz znakowania sond oligonukleotydowych są łatwo dostępne (np. Molecular Probes Inc., Eugene, USA). Różne aspekty metodologii ISH i FISH są omówione w specjalnym wydaniu Histochemical Journal [(1995) 27: 1-99].

11.8.6. Charakterystyka patogena Czysta hodowla patogena może być badana za pomocą metod i testów zarysowanych w rozdziale 16. Zazwyczaj pozwalają one na identyfikację do poziomu gatunku (lub serotypu, sekcja 16.1.5.1). Podatność danej bakterii patogennej na pewien zakres antybiotyków (tak zwany antybiogram) często określa się za pomocą testu dyfuzji krążkowej (sekcja 15.4.11.1).

11.9 Zapobieganie i kontrola chorób zakaźnych Gdy już wiemy, jak rozprzestrzenia się dana choroba, często można stworzyć metody mające zapobiec lub ograniczyć jej rozszerzanie się. Jest oczywiste, że każdej chorobie, której rozprzestrzenianie się następuje poprzez bezpośredni 312

kontakt fizyczny, można zapobiec po prostu unikając zakażonych osobników. W przypadku innych chorób zakaźnych, zapobieganie lub kontrola może się wiązać z zablokowaniem drogi zakażenia. Rozprzestrzenianie się takich chorób, jak dur brzuszny i cholera może być zahamowane przez odpowiednie środki, jak: 1) poprawa higieny osobistej — np. mycie rąk po wizycie w toalecie; 2) ochrona żywności przed muchami i innymi owadami mogącymi przenosić patogeny oraz zmniejszenie ilości tych przenosicieli przez stosowanie środków owadobójczych; 3) ochrona wody pitnej przed zakażeniem przez ścieki oraz skuteczna ochrona komunalnych zapasów wody przez np. chlorowanie; 4) odkażanie niewielkich ilości wody przed spożyciem, np. gotowaniem lub środkiem dezynfekującym, np. halazon; 5) wykrycie, izolowanie i leczenie nosicieli (sekcja 11.7). Zazwyczaj trudniej jest poradzić sobie z chorobami rozprzestrzeniającymi się drogą kropelkową. Fizyczne wykluczenie kropelek (np. użycie maski na twarz) jest mało praktyczne, a głównym środkiem zapobiegawczym w takich chorobach jak błonica jest szczepienie (sekcja 11.4.2.1). Skuteczna może też być izolacja (kwarantanna) chorych do momentu, kiedy już nie stanowią potencjalnego źródła patogena. Choroby przenoszone przez wektory można kontrolować eliminując wektor lub ograniczając jego liczebność. Tego typu kontrola znajduje zastosowanie np. w durze plamistym i dżumie dymieniczej.

11.10 Kilka uwag dotyczących chemioterapii Dostępność szerokiego zakresu antybiotyków (sekcja 15.4) oznacza, że do wielu chorób wywołanych przez bakterie można stosować chemioterapię, to jest terapię wykorzystującą związki chemiczne, np. takie jak antybiotyki. Skuteczność antybiotyków można zaprzepaścić, jeśli ich stosowanie nie uwzględnia specyficzności i farmakologii. Co więcej, zastosowanie nieodpowiednich antybiotyków może zniweczyć szansę wyleczenia choroby i przyczynić się do pogłębienia problemu oporności na te związki. Do czynników wpływających na wybór antybiotyku należą: • Skuteczność wobec danego patogena. Idealna jest sytuacja, gdy patogen oraz jego podatność na antybiotyki znane są przed rozpoczęciem leczenia, lecz w niektórych przypadkach (np. w zapaleniu opon mózgowych) chemioterapia zostaje zainicjowana przez potwierdzeniem etiologii. Wówczas chemioterapia jest ukierunkowana na prawdopodobne patogeny. Prawdopodobieństwo to określa się na podstawie takich czynników, jak: lokalne występowanie konkretnego gatunku lub szczepu patogena oraz wieku pacjenta [przykład (zapalenie opon mózgowych u dzieci): Schaad (1997) RMM 8: 171-178]. • Lokalne występowanie szczepów opornych na antybiotyki. Pewne patogeny są obecnie oporne na antybiotyki, na które kiedyś były niezmiennie wrażliwe (sekcja 15.4.11). Liczne z nich wykazują oporność na wiele anty-

313

biotyków i w niektórych przypadkach możliwość chemioterapii jest praktycznie wyczerpana. • Antagonizm w stosunku do innych antybiotyków (sekcja 15.4.10) lub innych czynników chemioterapeutycznych. Ryfampicyna, na przykład, potęguje działanie pewnych ssaczych enzymów degradujących hormony (np. estrogeny) i może zatem mieć niekorzystne skutki podczas stosowania doustnych środków antykoncepcyjnych. • Możliwe działanie uboczne, np. alergia na penicylinę (sekcja 11.4.2.1). • Możliwość teratogenności w trakcie ciąży, to jest groźba uszkodzenia płodu. • Farmakokinetyka. Fizykochemiczne właściwości antybiotyku mogą mieć wpływ na jego dotarcie do konkretnej tkanki daną drogą. Na przykład, antybiotyki o pewnych cechach molekularnych nie mogą pokonać bariery krew-mózg. Podane dożylnie, nie docierają do płynu mózgowo-rdzeniowego. Inne pokonują tą barierę jedynie wtedy, gdy jej przepuszczalność zostaje zmieniona na skutek stanu zapalnego. Niektóre penicyliny (np. amoksycylina) są absorbowane z jelita dużo łatwiej niż inne (np. ampicylina). Jednakże, brak absorpcji może być czasem korzystny. Na przykład, neomycyna podana doustnie jest bardzo słabo pobierana z jelit, co pozwala na stosowanie jej do dezynfekcji (sterylizacji) jelita przed chirurgią. W tym przypadku słaba absorpcja ma duże znaczenie, gdyż pobranie neomycyny w znacznych ilościach do krwiobiegu mogłoby stworzyć ryzyko uszkodzenia słuchu (zależne od stężenia uszkodzenie ósmego nerwu czaszkowego). Sulfonamidy (sekcja 15.4.9), które są łatwo usuwane z organizmu z moczem, stosuje się do leczenia schorzeń układu moczowego. Jak widać, antybiotyk, aby był skuteczny, musi w danej tkance osiągnąć odpowiednie stężenie. W pewnych wypadkach poziom antybiotyku powinien być dużo wyższy niż przewidywany na podstawie testów in vitro. Na przykład, w bakteryjnym zapaleniu opon mózgowych, stężenie antybiotyku w płynie mózgowo-rdzeniowym musi dziesięciokrotnie przewyższać jego minimalne stężenie bakteriobójcze — MBC (ang. minimum bactericidal concentration). W niektórych przypadkach czas działania antybiotyku można przedłużyć hamując jego usuwanie z organizmu. Usuwanie penicyliny przez proksymalne kanaliki nerkowe można zahamować stosując inny lek, o nazwie probenicyd. W pewnych chorobach (botulizm, błonica) leczenie może się wiązać z równoczesnym podaniu antytoksyny — preparatu zawierającego przeciwciała przeciw odpowiedniej toksynie. Leczenie zgorzeli gazowej — poza lekami — obejmuje usuwanie martwej/zakażonej tkanki i stosowanie (czasami) tlenu pod zwiększonym ciśnieniem.

11.11 Niektóre schorzenia bakteryjne Podane niżej zwięzłe opisy mają dać pojęcie o zakresie rodzajów zakażeń powodowanych przez bakterie. Niektóre z tych chorób (np. zapalenie spojówek) mogą być wywoływane przez inne czynniki niż bakterie, lecz większość z nich powodują jedynie bakterie, a niektóre — tylko bardzo specyficzne patogeny. Po

314

nazwie schorzenia podana jest: 1) nazwa czynnika chorobotwórczego, 2) charakterystyczne objawy i 3) droga zakażenia, jeśli jest znana. Bakteryjna waginoza. Pochwa zawiera zwiększoną liczbę przedstawicieli z rodzajów Bacteroides, Gardnerella i Mobiluncus oraz mniej (zwykle występujących) bakterii mlekowych. Cuchnąca wydzielina. Odczyn w pochwie jest mniej kwasowy (np. pH>4,5) i przeważają procesy „redukcji" niż zazwyczaj. W wymazach występują charakterystycznie zmienione komórki (komórki nabłonka pochwy opłaszczone gramzmiennymi pałeczkami). Jedną z pożytecznych metod diagnostycznych jest barwienie oranżem akrydyny oraz mikroskopia fluorescencyjna [Nunns i wsp. (1997) JINF 34: 211-213]. Błonica. Corynebacterium diphtheriae (szczepy wirulentne). Gorączka. Tworzenie w okolicach migdałków nalotów, które utrudniają oddychanie i/lub przełykanie. Toksyna może powodować zapalenie mięśnia sercowego. Znane jest nosicielstwo (sekcja 11.7). Infekcja drogą kropelkową (sekcja 11.7) lub poprzez zakażoną żywność — mleko itp. [Microbiology and epidemiology of diphtheriae: Esfratiou i George (1996) RMM 7: 31-42]. Botulizm. Clostridium botulinum (szczepy wirulentne). Ogólne osłabienie, problemy z widzeniem, paraliż układu oddechowego (sekcja 11.3.1.2). U dorosłych: najczęściej pochłonięcie gotowej toksyny; rzadziej: infekcja jelitowa toksygennym szczepem C. botulinum [Sonnabend i wsp. (1987) Lancet i 357-360]. Rzadko zakażenie ran przez C. botulinum. U dzieci: toksykoinfekcja, w której C. botulinum wytwarza toksynę w układzie pokarmowym. Brucelloza. Brucella sp. Ból głowy, złe samopoczucie, powracająca gorączka, która może trwać latami. Zakażenie poprzez jamę ustną (np. niepasteryzowane mleko), spojówki lub rany. U zwierząt choroba zwykle dotyczy układu rozrodczego, często występują poronienia. Cellulitis. Najczęściej szczepy Staphylococcus lub Streptococcus. Rozległy i rozszerzający się stan zapalny, który zwykle dotyczy tkanki łącznej. Infekcja przez rany. Cholera. Vibrio cholerae (szczepy zjadliwe). Infekcja jelitowa. Obfita, wodnista biegunka (sekcja 11.3.1.1) i odwodnienie. Infekcja drogą pokarmową, zwykle przez zakażoną wodę. Do niedawna cholerę wywoływała jedynie grupa serologiczna Ol (wyróżniona na podstawie antygenów O), do której należą: biotyp cholerae (klasyczna) i El Tor. Żadna inna ze 137 znanych grup serologicznych nie powoduje cholery. Ostatnio, w południowych Indiach pojawiła się nowa grupa serologiczna (nie Ol) oznaczona O139 Bengal. Odporność na V. cholerae Ol nie chroni przed O139, lecz trwają prace nad uzyskaniem szczepionki anty-O139. [V. cholerae O139 Bengal: Nair i wsp. (1996) RMM 7: 43-51]. Choroba z Lyme (borelioza). Borrelia burgdorferi. Często: wysypka, artretyzm z objawami neurologicznymi lub kardiologicznymi lub bez. Ukąszenia przez zakażone kleszcze. [Treatment of early Lyme disease (artykuł przeglądowy): Loewen i wsp. (1999) Drugs 57: 157-173]. Choroba Tyzzera. Clostridium piliforme. U źrebiąt: nekrotyzujące zapalenie wątroby i okrężnicy, z towarzyszącą gorączką i, w niektórych przypadkach, żółtaczką i bliznowaceniem. Nagły początek, a śmierć może nastąpić nawet w ciągu kilku godzin lub dni. Choroba również dotyczy np. gryzoni, kotów i małpek rezus. 315

Choroba Whipple'a. Tropheryma whippelii (gramdodatnia laseczka, której dotychczas nie udało się wyhodować). Objawy dotyczą głównie jelit — złe wchłanianie substancji odżywczych, biegunka, lecz mogą też objąć ośrodkowy układ nerwowy. Diagnoza polega głównie na histologicznych badaniach tkanek [Histology in Whipple's disease: von Herbay i wsp. (1996) Virchovs Archiv 429: 335-343]. Diagnoza potwierdzana jest metodą PCR z wykorzystaniem tkanki z dwunastnicy lub [diagnosis and treatment of Whipple's disease: Singer (1998) Drugs 55: 699-704]. Czerwonka (dyzenteria) (bakteryjna). Shigella spp., EHEC, EIEC (tab. 11.2). Bóle jelitowe, wodniste stolce (często gorączka i złe samopoczucie), po których następuje biegunka krwawa lub śluzowa. Odwodnienie. Patogeneza: patrz sekcje 11.2.2.1 i 11.3.1.6. Infekcja przez układ pokarmowy, np. zakażoną żywność, wodę (dyzenteria nie bakteryjna może być wywoływana przez amebę Entamoeba histolytica lub orzęska Balantidiwn coli). Dur plamisty (klasyczny, epidemiczny). Rickettsia prowazekii. Bóle głowy, utrzymująca się gorączka oraz wysypka, która może krwawić, bóle mięśniowe. Zakażenie rany lub ukąszenia odchodami wszy, zawierającymi R. prowazekii. Możliwe też wdychanie wysuszonych, skażonych odchodów wszy. Dur brzuszny. Salmonella typhi. Gorączka, przejściowa wysypka, stan zapalny jelit, posocznica, której czasami towarzyszy martwica tkanek i krwawienie wewnątrzjelitowe. Występuje nosicielstwo (sekcja 11.7). S. typhi zazwyczaj umieszcza się w pęcherzyku żółciowym. Droga ustna infekcji — przez skażoną wodę lub żywność. Dżuma (dymienicza, gruczołowa). Yersinia pestis. Gorączka, krwotoki, zapalnie powiększone, martwicze węzły chłonne; posocznica i np. zapalenie opon mózgowych. Infekcja jest przenoszona przez pchły. Postać płucna: przebieg z ciężkim zapaleniem płuc. Przenoszona drogą kropelkową. Gorączka Q. Coxiella burnetii. Forma ostra: np. gorączka, bóle mięśniowe, zapalenie osierdzia, objawy oddechowe; forma chroniczna: zapalenie wsierdzia, zapalenie szpiku kostnego, poronienia. Wdychanie, picie zakażonego mleka, przejście bakterii z matki do płodu (rzadko), transfuzje krwi itp. [Miniprzeglądówka: Raoult (1996) JMM 44: 77-78]. Gruźlica (płucna). Zwykle Mycobacterium tuberculosis. Infekcja przez inhalację, przebieg może być ukryty (sekcja 11.2.3) lub aktywny. W płucach powstają gruzełki (fot. 11.3). Patogen może przetrwać w makrofagach (sekcja 11.2.2.2) i rozprzestrzeniać się do różnych części ciała poprzez układ krwionośny lub limfatyczny. Gruźlica jest istotną przyczyną zgonów. Rosnącą częstość występowania w USA przypisuje się: 1) czynnikom społecznym, 2) nieskutecznym programom leczenia oraz 3) zwiększającej się liczbie osób z AIDS [Epidemiological aspects of tuberculosis: Bloom i Murray (1992) Science 257: 1055-1064]. Obecnie występują problemy ze szczepami o wielorakiej lekooporności (MDR, ang. multidrug-resistance). Testy oparte na DNA (sekcja 15.4.11.2) mogą być pomocne w wykryciu lekooporności. Mycobacterium tuberculosis wydaje się sprzyjać infekcji przez HIV [Goletti i wsp. (1996) JIM 157: 1271-1278]. Gruźlica wywoływana przez M. bovis, powodująca zejścia śmiertelne, została opisana u pacjentów chorych na AIDS [Guerrero i wsp. (1997) Lancet 350: 1738-1742]. [Mycobacterial disease (artykuły przeglądowe): BCID (1997) 4: 1-238]. 316

Jaglica. Chlamydia trachomatis. Zapalenie spojówek, wtręty na powiekach, uszkodzenie rogówki przez rzęsy wywinięte w kierunku gałki ocznej, co prowadzi do bliznowacenia. Infekcja przez zatarcie itp. Kiła. Treponema pallidum. Twardy wrzód w miejscu infekcji (zazwyczaj śluzówka narządu rodnego), później wysypka, a w przypadku niepodjęcia leczenia — po miesiącach czy nawet latach nacieki guzkowe w sercu, ośrodkowym układzie nerwowym itp. Infekcja w wyniku bezpośredniego kontaktu, szczególnie płciowego. Ksztusiec (koklusz). Bordetella pertussis. Napady kaszlu, którym towarzyszy charakterystyczne „pianie" przy wdechu. Droga kropelkowa. Leptospiroza. Leptospira interrogans (krętek). Łagodny przebieg: gorączka, ból głowy, bóle mięśniowe; w typowych przypadkach zakłócona praca nerek. Ostry przebieg (choroba Weila, wirusowe zapalenie wątroby: wymienione wyżej objawy, połączone z wymiotami, biegunką, powiększeniem wątroby, żółtaczką, krwotoki, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Infekcja poprzez rany lub błony śluzowe. Bakteria występuje w wodzie zakażonej moczem chorych zwierząt. Listerioza. Listeria monocytogenes (szczepy wirulentne, patrz również Aneks); jest to jedna z nielicznych patogennych bakterii, która potrafi pokonać barierę krew-mózg oraz łożysko. Właściwości te są odzwierciedlone w szerokim zakresie chorób wywoływanych przez tę bakterię: zapalenie opon mózgowych (szczególnie u osób z niedoborem odporności), posocznica, poronienie, czasami zapalenie żołądkowo-jelitowe. Częstość zgonów najczęściej przekracza 20%. Zakażenie poprzez produkty żywnościowe. U zwierząt występują poronienia (infekcja przez paszę: patrz sekcja 13.1.1.1). [Listerioza: McLaughlin (1997) RMM 8: 1-145]. Płonica. Streptococcus pyogenes. Często u dzieci: ból gardła, gorączka, nabrzmiałe szyjne węzły limfatyczne, wysypka. Zakażenie drogą kropelkową, picie zakażonego mleka itp. Róża. Często, Streptococcus pyogenes (grupa A). Zwykle wyraźnie oddzielone obszary róży, często na twarzy, choć może się pojawić gdzie indziej. Łagodniejszy przebieg niż w cellulitisie. Mogą występować: gorączka, wyczerpanie i posocznica. Infekcja poprzez rany, zatarcia. Rzeżączka. Neisseria gonorrhoeae (gonokok). Wydzieliny z układu moczowo-płciowego, którym mogą towarzyszyć inne objawy. Kontakt seksualny. Tężec. Clostridium tetani (szczepy zjadliwe). Utrzymujące się bezwolne skurcze mięśni (sekcja 11.3.1.3). Infekcja zazwyczaj przez zakażone rany. Trąd. Mycobacterium leprae. Zależnie od rodzaju trądu — owrzodzenia obejmujące różne tkanki (zwykle łącznie ze skórą) oraz uszkodzenie nerwów peryferycznych powodujące utratę czucia i funkcji motorycznych. Trąd typu guzowatego: słaba odpowiedź immunologiczna typu komórkowego, liczne prątki w tkankach, liczne wrzody skórne ulegają zlaniu. Trąd typu gruźliczego: rzadkie wrzody skórne, rzadkie prątki; wrzody, typowa granuloma. [Epidemiology: van Beers, de Wit i Klatser (1996) FEMSML 136: 221-230; globalna eliminacja trądu (perspektywy): Gillis i Krahenbuhl (1998) RMM 9: 39-48].

317

Tularemia. Francisella tularensis. Dreszcze, gorączka, mdłości, ból głowy, wymioty, wyczerpanie. Czasami ostre objawy żołądkowo-jelitowe/posocznica. Infekcja w wyniku ran, uszkodzenia błony śluzowej, ukąszeń pcheł lub much. Wąglik. Bacillus anthracis (szczepy zjadliwe). Lokalne pryszcze na skórze lub, rzadziej, infekcja płucna lub jelitowa. Wykazano kiełkowanie endospor B. anthracis oraz wyrażanie się genów kodujących toksyny wewnątrz mysich makrofagów pęcherzykowych [Guidi-Rontani i wsp. (1999) MM 31: 9-17]. Zakażenie poprzez rany, wdychanie, pobranie z pokarmem. Zapalenie cewki moczowej. Różne bakterie, np. Neisseria gonorrhoeae (w rzeżączce), lub w niespecyficznym gonokokowym zapaleniu — Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis. Często infekcja w wyniku kontaktu seksualnego. Zapalenie opon mózgowych. Różne organizmy, np. Neisseria mengitidis, Haemophilus influenzae typu b (częsta przyczyna u niemowląt i małych dzieci), Streptococcus pneumoniae. Zapalenie błon osłaniających mózg i rdzeń kręgowy. Infekcja drogą kropelkową, rany głowy itp. [Prevention of meningococcal meningitis (perspektywy): Ferreiros, Gomez i Criado (1998) RMM 9: 29-37]. Zapalenie pęcherza. Różne, np. Escherichia coli (szczepy wytwarzające fimbrie typu Ρ przylegają do nabłonka dróg moczowych), Proteus spp. Zapalenie pęcherza moczowego. Infekcja: w dół od nerek lub (częściej) w górę od cewki moczowej. W tym ostatnim przypadku najczęściej zapalenie powodują E. coli i Proteus spp. Zapalenie płuc. Różne bakterie, np. Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae typu b, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae. Gorączka, trudności z oddychaniem, bóle klatki piersiowej, kaszel. Zakażenie drogą kropelkową. Zespół PMC — rzekomobłoniaste zapalenie okrężnicy (ang. pseudomembranous colitis). Potencjalnie śmiertelna choroba, przebiegająca z wodnistą biegunką, gorączką i rzekomymi błonami powstającymi z wysięku zapalnego, głównie na błonie śluzowej okrężnicy. Choroba zwykle jest poprzedzona terapią antybiotykową (przede wszystkim w wypadku stosowania klindamycyny); a czynnikiem powodującym chorobę jest zwykle lub zawsze Clostridium difficile. C. difficile wytwarza toksyny A (enterotoksyna) i Β (cytotoksyna). Toksyna A prawdopodobnie stymuluje powstawanie wysięków po uszkodzeniu komórek przez toksynę Β [Sears i Kaper (1996) MR 60: 167-215]. [Laboratory diagnosis of C. difficile-associated disease; Brazier (1995) RMM 6: 236-245]. Zapalenie spojówek. Różne, np. Staphylococcus aureus, inne gronkowce, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae. Zapalnie spojówki (śluzówki oka). [Ocular bacteriology, including conjunctivitis (artykuł przeglądowy): Willcox i Stapleton (1996) RMM 7: 123-131]. Zatrucie pokarmowe. Różne, np. Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica. Ostre zapalenie żołądka i jelit. Ból. Zwykle biegunka (lecz może jej nie być lub tylko ograniczona w przypadku gronkowcowego zatrucia pokarmowego oraz powodowanego przez jeden typ B. cereus). Często występują mdłości i wymioty. Droga zakażenia przez przewód pokarmowy, patogen lub toksyna pobrane z żywnością (patrz sekcja 12.3). Zespół Kawasaki. Występuje u niemowląt i małych dzieci. Czasem przebieg śmiertelny, z gorączką i zapaleniem naczyń. Etiologia choroby nieznana, lecz

318

przynajmniej w niektórych przypadkach przyczyną może być superantygen (sekcja 11.5.4.1). Zespół oparzonej skóry. Szczepy Staphylococcus aureus, głównie z grupy fagowej II, produkujące toksynę tzw. złuszczającą (ET, ang. exfoliative toxin). Na ogół u noworodków i małych dzieci: wypełnione płynem pęcherzyki (zawierające S. aureus) lub wysypka, z następującą utratą powierzchniowych warstw skóry. Działanie ET najprawdopodobniej polega na aktywacji proteazy serynowe]" w naskórku lub aktywności superantygenowej (sekcja 11.5.4.1). [Artykuł przeglądowy: Rago i Schlievert (1998) RMM 9: 9-15]. Zespół wstrząsu toksycznego (TSS, ang. toxic shock Syndrome). Szczepy Staphylococcus aureus wytwarzające superantygen B, C lub F (sekcja 11.5.4.1) oraz paciorkowce grupy A wytwarzające enterotoksynę A. Gorączka, zmiany skórne, wymioty, biegunka, obniżone ciśnienie. U małych dzieci często mogą się pojawiać objawy zapalenia mózgu w wyniku przejścia cytokin przez barierę krew-mózg. Bakteriemia jest rzadka (gronkowcowy TSS) lub częsta (paciorkowcowy TSS). W fazie ostrej występuje więcej np. komórek Vβ2 Τ i podwyższony poziom cytokin (np. IL-2, IL-4, TNF-α, TNF-β, IFN-y). Stosunkowo wysoka śmiertelność. U niemowląt i dzieci zakażenie przez np. oparzenia. W przypadku kobiet często w związku ze stosowaniem tamponów podczas miesiączki. Paciorkowcowy zespół wstrząsu toksycznego często przebiega z martwicą tkanek i prowadzącym do martwicy zapaleniu powięzi [Multiplex PCR for detection of the B,C and F superantigen genes of Staphylococcus aureus: Schmitz i wsp. (1998) JMM 47: 335-340]. Zgorzel gazowa. W typowych przypadkach — Clostridium perfringens (typ A), C. septicum i/lub C. novyi. Postępująca martwica tkanek, które zawierają pęcherze gazu tworzonego w wyniku metabolizmu bakteryjnego. Nie leczona prowadzi do śmierci spowodowanej toksemią i szokiem. Toksyna α Clostridium perfringens (która hydrolizuje lecytynę i ma również aktywność sfingomielinazy) wydaje się główną letalną toksyną [Awad i wsp. (1995) MM 15: 191-202]. Zakażenie ran i odtlenionych tkanek.

ROZDZIAŁ

12

Bakteriologia stosowana I — żywność

12.1. Bakterie biorące udział w produkcji żywności Bakterie stosuje się w przemyśle spożywczym: 1) do przeprowadzenia fermentacji w przetwórstwie mleczarskim; 2) w produkcji kawy i kakao; 3) do wytwarzania dodatków poprawiających smak żywności; 4) w innych procesach, np. produkcji octu. (Udział bakterii w wytwarzaniu karmy dla zwierząt hodowlanych omówiono w rozdziale 13.)

12.1.1 Przetwory mleczarskie W produkcji masła, sera i jogurtu mleko poddaje się fermentacji homomlekowej (sekcja 5.1.1.1), w wyniku której laktoza ulega przekształceniu do kwasu mlekowego. Tak zwane masło śmietankowe powstaje w wyniku traktowania pasteryzowanej śmietany hodowlą starterową zawierającą różne bakterie mlekowe, np. Lactococcus (Streptococcus) cremoris i/lub L. (S.) lactis subsp, diacetilactis, i/lub

Leuconostoc cremoris - główny producent diacetylu. Kwas mlekowy i diacetyl nadają masłu typowy dla niego aromat. Diacetyl tworzy charakterystyczny zapach i smak świeżego produktu. W wyniku procesu fermentacji (pH wówczas spada do około 4,6) powstaje masa, którą schładza się i „ubija", co prowadzi do destabilizacji globulek tłuszczu. Fazę wodną (maślankę) odsącza się, a masło, często zasolone, można długo przechowywać np. w temperaturze -25°C. Masło nazywane śmietankowym, słodkim, wytwarza się bez zastosowania hodowli starterowej. Sery powstają w wyniku koagulacji i fermentacji mleka. Różnice między gatunkami serów są związane z rodzajem surowca (np. mleko krowie, kozie) oraz innych jego właściwości (mleko pełne, odtłuszczone). Decydującą rolę w produkcji odgrywają stosowane drobnoustroje — najczęściej bakterie z gatunków Lactococcus i Lactobacillus. Wykorzystuje się także hodowle starterowe kon320

struowane metodami inżynierii genetycznej. W serze cheddar, gdzie konieczne jest kontrolowanie rozwoju patogennej" bakterii Listeria monocytogenes, zastosowano właśnie tak zmodyfikowaną hodowlę starterową [Buyong, Kok i Luchensky (1988) AEM 64: 4842-4845]. W wyniku fermentacji obniża się pH, co wstępnie prowadzi do koagulacji białka mleka, dodatkowo inne produkty fermentacji (np. kwas octowy i propionowy) zapewniają charakterystyczny aromat. (Typowy zapach serom szwajcarskim, np. typu Emmentaler i Gruyere, nadaje kwas propionowy wytwarzany przez Propionibacterium spp. stosowane do ich produkcji). Ser, to jest wytrącone białko i tłuszcz, podlega oddzieleniu od fazy wodnej — serwatki, a w dalszym procesie jest przekształcany, przez solenie, dojrzewanie — aż do uzyskania produktu dojrzałego. Jogurt jest zazwyczaj wytwarzany z mleka pasteryzowanego, o niskiej zawartości tłuszczu, bogatego w składniki stałe. Mleko zostaje zaszczepione hodowlami Lactobacillus bulgaricus i Streptococcus thermophilus. Fermentację prowadzi się

w temperaturze 35-45°C, przez kilka godzin, pH spada wówczas do około 4,3, a białka mleka zostają wytrącone. Bakterie współdziałają ze sobą: L. bulgaricus powoduje rozkład białek do aminokwasów i peptydów — które stymulują rozwój S. thermophilus. Kwas mrówkowy wydzielany przez S. thermophilus nasila rozwój L. bulgaricus, który jest głównym producentem kwasu mlekowego.

12.1.2 Kawa i kakao Wytworzenie kawy z surowych nasion kawowych wymaga wstępnego usunięcia lepkiego i śluzowatego mezokarpu (osłony) łączącego dwa nasiona w każdym owocu. Gdy warstwa zewnętrzna zostanie rozerwana, uwolnione nasiona poddaje się fermentacji. Otoczka śluzowata zostaje uszkodzona w wyniku oddziaływania enzymów rośliny oraz z udziałem egzoenzymów wytwarzanych przez drobnoustroje. Oprócz drożdży (są to jednokomórkowe grzyby) rolę odgrywają także bakterie pektynolityczne — np. Bacillus i Erwinia. Po zakończeniu fermentacji, nasiona płucze się, suszy, sporządza się odpowiednie mieszanki, a następnie kawa jest „opalana". Kakao wytwarza się z nasion (fasolek) rośliny kakaowca. Owoc jest torebką zawierającą do 50 nasion zlepionych białym śluzem. Śluz poddawany jest fermentacji z udziałem drożdży wytwarzających etanol, który podlega przekształceniu do kwasu octowego. Dzieje się to za przyczyną niektórych bakterii tlenowych i innych drobnoustrojów obecnych w środowisku. W czasie trwającej tydzień fermentacji nasiona pozbawione śluzu ciemnieją, następnie są suszone i „opalane".

12.1.3 Środki dodawane do żywności Glutaminian monosodowy jest powszechnie stosowany jako środek wzmacniający smak produktów żywnościowych. Otrzymuje się go z niektórych bakterii, np. szczepów Corynebacterium glutamicum hodowanych beztlenowo na takich podłożach jak melasa lub hydrolizowana skrobia. Bakterie te wytwarzają kwas 321

glutaminowy z kwasu α-ketoglutarowego. Przemysłowe szczepy C. glutamicum nie metabolizują kwasu α-ketoglutarowego w cyklu kwasów trikarboksylowych (TCA, rys. 5.10), dzięki czemu gromadzi się w dużych ilościach kwas glutaminowy. Aby umożliwić wydobycie się kwasu z bakterii, należy zwiększyć przepuszczalność osłon komórkowych, co wymaga zastosowania specjalnych metod. Jest to także niezbędne, by zapobiec hamowaniu zwrotnemu syntezy kwasu glutaminowego. Ksantan, substancja gumopodobna, jest śluzem wydzielanym pozakomórkowo przez niektóre szczepy Xanthomonas campestris. Znajduje wielorakie zastosowanie, jako substancja żelująca, stabilizator żelu, zagęszczacz i środek hamujący krystalizację niewskazaną w niektórych środkach spożywczych.

12.1.4 Ocet Produkcję octu, zwaną fermentacją octową przeprowadza się z surowców zawierających etanol, np. z wina, soku jabłkowego, piwa. Jest to ściśle kontrolowany proces polegający na utlenieniu etanolu przez różne gatunki z rodzaju Acetobacter. Produkt może być poddawany dojrzewaniu, sączeniu, butelkowaniu i pasteryzacji. Ocet, nazywany u nas zazwyczaj spirytusowym, jest wytwarzany na drodze chemicznej (np. karbonylacji metanolu), bez udziału bakterii. Jest produktem tańszym niż uzyskiwany z wykorzystaniem bakterii.

12.2 Środki zapobiegające psuciu się żywności Znane są i stosowane różnorodne metody zapobiegające lub opóźniające psucie się żywności, zarówno powodowane działalnością drobnoustrojów, jak również wynikające z innych przyczyn. Muszą być także brane pod uwagę środki, które przeciwdziałają wytwarzaniu toksyn, będących źródłem zatruć pokarmowych. Metody te pozwalają na zachowanie wartości spożywczych, przedłużają czas bezpiecznego przechowywania we wskazanych warunkach. Przypuszcza się, że bezpieczniejsze są metody fizyczne (np. zamrażanie) niż chemiczne traktowanie żywności.

12.2.1 Metody fizyczne zabezpieczania środków spożywczych 12.2.1.1 Pasteryzacja i procedura UHT Pasteryzację przeprowadza się działając podwyższoną temperaturą na takie produkty jak mleko, ocet, w celu zabicia niektórych patogenów i innych drobnoustrojów odpowiedzialnych za psucie się żywności. Mleko podgrzewa się do minimum 72°C, przez przynajmniej 15 sekund (jest to tzw. pasteryzacja HTST, ang. high temperature, short time — polegająca na stosowaniu wysokiej temperatury przez krótki czas). Pasteryzacja niszczy bakterie patogenne, odpowie322

dzialne za salmonellozy i gruźlicę, jak również większość niepatogennej mikroflory mleka. Unieczynnia także niektóre enzymy bakteryjne, np. lipazy, powodujące psucie się produktu. Pasteryzacja HTST nie zabija niektórych zarazków, np. sprawcy gorączki Q (Coxiella burnetii). Tak zwana procedura UHT (ang. ultra-heat treated) polega najczęściej na wtłaczaniu mleka pomiędzy rozgrzane płyty, w temperaturze około 141°C, przez 3 sekundy. Mleko oznakowane UHT jest pakowane aseptycznie i może być przechowywane poza chłodnią przez około 6 miesięcy. W metodzie alternatywnej ciepło wprowadza się do mleka w postaci pary pod ciśnieniem. Ta procedura jest szczególnie przydatna w produkcji np. kremów i innych lepkich środków spożywczych. W trakcie przechowywania pasteryzowanych produktów, np. w magazynach, pobiera się kontrolne próbki wykluczające ich zakażenie. W tym celu wykonuje się testy, stosując np. system Lumac, dający szybki wynik (patrz sekcja 12.3.3.1). 12.2.1.2 Konserwy

Odpowiednio przygotowany pokarm umieszcza się w metalowych pojemnikach (puszkach), usuwa się z nich powietrze, zamyka w sposób hermetyczny zaciskając wieczko. Następnie puszki podgrzewa się do co najmniej 100°C. Puszki schładza się zimną, sterylną wodą, by nie dopuścić do zakażenia pokarmu, gdyby zacisk nie był dostatecznie szczelny (rys. 12.1). Ważnym problemem jest ustalenie właściwego czasu i temperatury przygotowania konserw. Posłużymy się w tym celu wykresem (patrz rys. 12.2). Wskazuje on działanie temperatury na populację komórek lub endospor, umożliwiając określenie wartości parametrów D, z i F istotnych w przemyśle spożywczym. Odpowiednio przygotowane konserwy w puszkach nie mogą zawierać bakterii Clostridium botulinum (sekcja 11.3.1.2) zdolnej do wzrostu i wytwarzania toksyn w warunkach przechowalnictwa. Aby to osiągnąć, poziom ogrzewania należy dostosować zależnie od wartości pH i typu produktu spożywczego oraz od sposobu przechowywania. Produkty „naturalne" (takie jak ziemniaki, marchew, grzyby) wymagają zastosowania co najmniej 12D (tzw. „wartość botulinum", to jest ogrzewania przez czas 12-krotnie dłuższy niż stosowany jako czas D dla endospor C. botulinum, w tej samej temperaturze. Prawdopodobieństwo zakażenia przez C. botulinum po takim traktowaniu określa się jako nieistotne.

Brzeg wieczka jest wywinięty wokół obrzeżenia górnej strony puszki, tak by grubość w tej części wieczka była pięciokrotnie większa od grubości blachy. Boki puszki, czego nie pokazano na rysunku, mają w kilku miejscach poprzeczne wyniesienia blachy w celu zmniejszenia nacisku w czasie podgrzewania konserwy. (1) wieczko (2) ściana boczna puszki.

323

W sytuacji idealnej, tj. w teorii, liczba komórek przeżywających maleje wykładniczo w czasie i w określonej temperaturze. Wykres wówczas jest liniowy, jeśli sporządzi się go w skali logarytmicznej. W praktyce występują odchylenia od odpowiedzi liniowej. Dzieje się tak w części początkowej i końcowej (wykresu). Te jego fragmenty oznaczono linią przerywaną. Posługując się pojęciem „śmierci wykładniczej" możemy określić trzy ważne parametry wykorzystywane w przetwórstwie żywności. Wartość D: czas (w minutach), w określonej temperaturze, dla populacji określonego typu bakterii lub przetrwalników, niezbędny do zmniejszenia o 90% liczby form żywych (to jest o jedną jednostkę w skali log10. W części liniowej wykresu liczebność populacji zmalała o 1 jednostkę log w czasie 2 minut, tak więc w tym przypadku D = 2. Należy zauważyć, że w części liniowej wykresu rzeczywista liczba zabitych organizmów w określonym czasie zależy od początkowej liczebności populacji. Na przykład, gdy liczebność organizmów maleje z 10 000 do 1000, w ciągu 2 minut ginie 9000 bakterii lub przetrwalników. Gdy liczebność populacji maleje z 1000 do 100, w czasie 2 minut ginie 900 organizmów. Tak więc stała pozostaje proporcja komórek/przetrwalników zabitych w danym czasie, w liniowej części wykresu. Temperatura, w której określa się wartość D (wyznaczona doświadczalnie), znajduje się zazwyczaj we frakcji dolnej, np. D 7 0 = wartość w 70°C. Dla komórek Staphylococcus aureus wartość D 7 0 jest zazwyczaj mniejsza niż 1 minuta (ale znacznie większa dla niektórych szczepów), a dla S. epidermidis wynosi około 3 minut. D60 wynosi 1 godzinę w przypadku Salmonella seftenberg, natomiast dla Escherichia coli D 6o zazwyczaj tylko kilka minut. Wartość z: oznacza, o ile temperatura (°C) musi zostać podwyższona, aby uzyskać wartość D obniżoną o 90% (tj. o 1/10 tej wartości). Na przykład, jeśli, jak na wykresie temperatura konieczna do zabicia określonych komórek lub przetrwalników wskazuje D = 2, wówczas wartość 2 równa się wzrostowi temperatury niezbędnemu, by osiągnąć D = 0,2, dla komórek/przetrwalników tego samego typu. Wartość F: czas w minutach konieczny do skutecznego działania temperatury 121,1°C, określony z czasu niezbędnego do osiągnięcia podobnego efektu, lecz w innej temperaturze (określonej odpowiednią wartością D), przyjmując wartość 2 wynoszącą np. 10°C. Wartości F służą do porównywania efektu działania ciepła w różnych temperaturach. Wartości D, 2 i F stanowią podstawę określenia odpowiedniego (tj. skutecznego) działania ciepła. Należy brać pod uwagę również inne czynniki, np. czas penetracji ciepła w głąb puszki wypełnionej określonym produktem spożywczym.

324

Środki spożywcze o wartości pH poniżej 4,6 wymagają niższych wartości D, gdyż, jak się powszechnie sądzi, w takich warunkach C. botulinum nie rośnie i nie wytwarza toksyn. Znane jest jednak jedno doniesienie [Raarjes i Smelt (1979) Nature, 281: 398-399] opisujące wzrost i produkcję toksyn na podłożu laboratoryjnym (a więc nie w żywności) w pH obniżonym do wartości 4,0. Puszki dużych rozmiarów, transportowane w pojemnikach, np. konserwowane mięsa (między innymi szynka), można zabezpieczać przed psuciem ogrzewaniem w stosunkowo niskiej temperaturze, np. 70°C (w centralnej części puszki), przez kilka minut. Tak przygotowane puszki muszą być jednak przechowywane w chłodni. Bezpieczeństwo (brak wzrostu i wytwarzania toksyn przez C. botulinum) jest w tym przypadku warunkowane połączonym działaniem temperatury (niskiej) i konserwujących soli. Mleko słodzone, zagęszczone, po zamknięciu w puszkach nie jest podgrzewane, gdyż duża zawartość cukru (mała aktywność wody, sekcja 3.1.3) hamuje wzrost większości bakterii. W tabeli 12.1 podano warunki termiczne stosowane przy produkcji konserw w puszkach zawierających różne produkty spożywcze. Psucie się puszkowanej żywności. Wysoka temperatura na ogół inaktywuje przynajmniej niektóre enzymy, które mogłyby powodować psucie się puszkowanej żywności. Jednakże przyczyną psucia są często enzymy zwane ciepłostałymi lub niektóre bakterie i endospory niewrażliwe na wysoką temperaturę. Na przykład endospory Bacillus stearothermophilus mogą przeżyć wartość botulinową. Mogą także wywołać psucie się konserw z małą zawartością kwasu, jeśli tylko temperatura przechowywania jest powyżej 30°C. Produkt może być nawet skwaśniały, a puszki nie wykazują typowych wzdęć. Produkty spożywcze o wysokim pH (tj. zawierające mało kwasu) należy podgrzewać powyżej minimalnej wartości botulinowej. Wówczas produkt może być przechowywany bezpiecznie.

325

Żywność w puszkach może być zazwyczaj przechowywana przez kilka lat, w odpowiednich warunkach. 12.2.1.3 Chłodnictwo

Temperatury w zakresie 0-8°C powodują zahamowanie metabolizmu i wzrostu drobnoustrojów, a także wydzielanych przez nie enzymów. Ten rodzaj przechowywania stosowany przez krótki czas opóźnia psucie się produktów spożywczych. Jednak organizmy psychotropowe (sekcja 3.1.4) mogą także w tych warunkach zachować swą szkodliwą działalność. Niektóre bakteryjne patogeny, np. Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica zachowują aktywność nawet

w temperaturze 4°C. Zamrażanie (stosowane w celu przechowywania przez długi czas) może zabijać niektóre drobnoustroje, redukuje także dostępność wody (sekcja 3.1.3). W temperaturach poniżej zera, np. -5 do -10°C, rozwijają swoją niszczycielską działalność niektóre grzyby. Narażone są na nią np. surowce mięsne. 12.2.1.4 Odwodnienie

Odwodnienie produktu redukuje ilość dostępnej wody (sekcja 3.1.3) do punktu, w którym drobnoustroje zakażające nie mogą się już rozwijać. Stan taki uzyskuje się przez odparowanie, stosowane np. do produkcji suchego (sproszkowanego) mleka. Zawartość dostępnej wody zmniejsza się także przez dodanie chlorku sodu (solenie ryb) lub stosując syropy (w przechowalnictwie owoców). 12.2.1.5 Promieniowanie jonizujące

Promieniowanie jonizujące (np. elektrony o wysokiej energii, lub promieniowanie gamma) stosuje się w niektórych krajach w celu zapobiegania psuciu się drobiu, ryb, truskawek, przypraw.

12.2.2 Inne sposoby zapobiegania psuciu się żywności 12.2.2.1 Zakwaszanie

Tradycyjnym sposobem ochrony przetworów spożywczych jest obniżenie pH. Produkty takie nazywane są piklami lub marynatami. Obniżenie pH uzyskuje się dodając kwasy, np. mlekowy, octowy, albo w niektórych przypadkach przez wywoływanie fermentacji np. kapusty. W wyniku fermentowania powstają kiszonki naturalnie zakwaszone kwasem mlekowym, wytwarzanym przez bakterie z rodzaju Lactobacillus lub Leuconostoc.

12.2.2.2 Środki ochronne

Środki do ochrony żywności są chemikaliami, które zabijają np. drożdże lub bakterie, lub jedne i drugie. Stosuje się w tym celu kwas benzoesowy (do ochrony przed psuciem soków, miodów pitnych), azotyny i kwas sorbowy. Antybiotyk 326

peptydowy, zwany nizyną, należący do grupy lantybiotyków, działa aktywnie przeciw bakteriom gramdodatnim, zapobiegając również przejściu endospor w formy wegetatywne. Nizynę stosuje się przy produkcji niektórych serów oraz pewnych produktów spożywczych puszkowanych. Zakres i rodzaj stosowanych chemicznych środków ochronnych jest regulowany zarządzeniami odpowiednich władz. Tradycyjna metoda peklowania, np. mięsa wieprzowego, polega na traktowaniu produktu, w temperaturze 4°C, roztworem chlorku sodu (redukującym aktywność wody) i azotynem sodu, który w odpowiednich warunkach hamuje wzrost bakterii i kiełkowanie endospor. W procesie wędzenia bekonu, ryb itp. produkt poddaje się przez kilka godzin (a nawet kilka dni) działaniu dymu pochodzącego z palonego drewna. W ten sposób zmniejszana jest aktywność wody. Produkt wędzony zostaje również nasycony substancjami pochodzącymi z dymu, np. związkami fenolowymi, wykazującymi właściwości przeciwdrobnoustrojowe.

12.3 Zatrucia pokarmowe i higiena środków spożywczych Zatruciami pokarmowymi nazywamy zazwyczaj ostre zapalenia przewodu pokarmowego spowodowane spożyciem pokarmu zanieczyszczonego czynnikami patogennymi lub ich toksynami (tab. 12.2). Zalicza się tu również przypadki botulizmu (zatrucia jadem kiełbasianym) (sekcja 11.3.1.2 i 11.11). Listerioza (sekcja 11.11) nie odpowiada opisowi typowego zatrucia pokarmowego (wyżej). Niemniej, choroba ta często kończy się śmiercią, a główną przyczyną infekcji jest spożycie skażonego pożywienia. Chociaż obecność Listeria monocyłogenes stosunkowo często stwierdzana jest w żywności różnego typu, np. w niektórych serach i wędlinach, dokładne określenie ryzyka listeriozy utrudnia obecność słabo patogennych lub niepatogennych szczepów [Hof, Nichterlein i Kretschmar (1994) TIFS 5: 185-190].

12.3.1 Bakterie źródłem zatruć pokarmowych Jakie są źródła zakażenia żywności potogenami? W niektórych przypadkach, dotyczy to np. drobiu, jaj, skorupiaków, sprawcy zatruć są już w samym produkcie wyjściowym. Najczęściej jednak zakażenie żywności następuje w czasie pomiędzy surowcem a momentem spożycia. W kuchni czynniki patogenne są często przenoszone z jednego pokarmu na drugi. Najczęściej zarazki przedostają się z surowego mięsa lub drobiu na przygotowany pokarm. Czasem czynnik patogenny musi się rozwinąć, tj. rozmnożyć na powierzchni lub wewnątrz żywności, i dopiero gdy ilość zarazków lub wytwarzanych przez nie toksyn osiągnie pewną wartość progową, może po ich spożyciu dojść do choroby. Rozmnożenie zarazków nie jest jednak konieczne, gdy chorobę wywołuje już niewielka liczba bakterii, np. zaledwie 100 pałeczek czerwonki (Shigella), lub nawet mniej niż 100 komórek Campylobacłer. 327

Zatrucia pokarmowe mogą przebiegać jako stan zapalny jelit lub jako skutek działania toksyn (zatrucia pokarmowe toksyczne). Ryzyko zatrucia pokarmowego jest zależne od następujących czynników: 1. Początkowego stopnia zakażenia produktu. W procesie produkcyjnym przetworu im bardziej zakażony jest surowiec, tym mniejsze jest prawdopodobieństwa ograniczenia zagrożenia do poziomu bezpiecznego — w samym procesie obróbki. W gotowych już produktach spożywczych zakażenie żywności może być powyżej lub poniżej poziomu niezbędnego do wywołania choroby. 2. Sposobu przerabiania surowca, przechowywania i form podania do spożycia. Ryzyko zatrucia pokarmowego zależy od tego, jak łatwo zarazek może się dostać i namnożyć na powierzchni lub wewnątrz żywności w całym cyklu przygotowania produktu oraz od możliwości unieszkodliwiania drobnoustrojów, z którymi wiąże się ryzyko wywołania zatrucia. W przypadku mięsa i drobiu idealna jest taka sytuacja, gdy możliwe jest eliminowanie patogenów już na miejscu hodowli, na farmie. W etapach późniejszych, po uboju, proces eliminacji zarazków jest już trudniejszy. 3. Relacja wielkości dawki zarazka do reakcji w postaci choroby. Jest to szczególnie ważne, gdy dawka (liczba bakterii lub toksyn) wywołująca zatrucie jest mała. W rzeczywistości, wrażliwość na zarazki nie jest wartością stałą, różni się w znacznym stopniu zależnie od wieku, stanu odporności, ogólnej kondycji. Do grupy dużego ryzyka należą dzieci, ludzie starzy, kobiety ciężarne, chorzy z obniżoną barierą odporności (w tym chorzy na AIDS). Ponieważ relacja — dawka czynnika patogennego: „odpowiedź organizmu" jest zmienna, określenie stopnia zainfekowania żywności, często jest oparte na badaniach epidemiologicznych, w nieznacznym stopniu na wynikach doświadczeń i na zgodności poglądów [żywność a ryzyko mikrobiologiczne: BairdParker (1944), Microbiology 140: 687-695)]. 12.3.1.1 Wykrywanie patogenów i toksyn w żywności Często pojedynczy przypadek zatrucia pokarmowego zostaje wyjaśniony zanim zarazek mógłby być wyhodowany z podejrzanego produktu spożywczego czy z chorego organizmu. Mimo to podejmuje się badania w celu dokonania ustaleń epidemiologicznych lub dochodzeń sądowych. Jest rzeczą oczywistą, że podłoża wzrostowe muszą być dobrane zależnie od rodzaju zarazka, który powinien być poszukiwany także wewnątrz produktu spożywczego, a więc po zniszczeniu struktury próbki. Niektóre zarazki (np. E. coli O157) mogą wywołać infekcję nawet wówczas, gdy dawka zakaźna jest mała (np. mniej niż 100 bakterii). Dlatego też, gdy badania są wykonane pod kątem poszukiwania tego typu zarazka, konieczne jest stosowanie bardzo czułej metody. Do uzyskania lepszej wykrywalności zarazków z różnych próbek żywności (patrz również tab. 14.2) przydatny jest rozdział immunomagnetyczny (sekcja 14.6.1). W celu wykrycia małej zawartości toksyn wywołujących zatrucia pokarmowe również niezbędne jest stosowanie bardzo czułych metod. Do wykazania obecności toksyn gronkowcowych przydatna jest aglutynacja (czułość około 329

Zarazek występuje u zwierząt i na produktach pochodzenia zwierzęcego, szczególnie na drobiu. Częstym sposobem przenoszenia zarazka jest krzyżowe zanieczyszczenie innych przetworów spożywczych (sekcja 12.3.1). Fotografia, dzięki uprzejmości dr. Alana Curry, PHLS, Withington Hospital, Manchester, UK.

330

1 ng/ml) krwinek czerwonych (lub cząstek lateksu) pokrytych antytoksyną (drobiny toksyny działają jako „mostki" pomiędzy krwinkami lub ziarenkami lateksu). Stosuje się także test oparty na zasadzie ELISA (rys. 11.5), za pomocą którego można wykryć obecność toksyn gronkowcowych w stężeniu 0,5 ng/ml, lub nawet mniejszym. [Wykrywanie toksyn gronkowcowych: Tranter i Brehm (1994) RMM 5: 56-64].

12.3.2 Higiena żywności — w domu W samej kuchni zdrowa żywność może ulec zepsuciu, nie dając nawet żadnych objawów wskazujących na nieprzydatność do spożycia (nie zmieniony smak, dobry zapach, prawidłowy wygląd). Oto przykłady: 1. Źródłem zakażenia mogą być brudne ręce (droga: odchody-usta) przygotowującego pokarm. Brudne ręce mogą zakażać surowiec (np. mięso, drób), z którego wykonuje się, produkty gotowe do spożycia. Może wówczas dojść do przeniesienia np. pałeczek Salmonella z drobiu. Jest to szczególnie groźne wówczas, gdy żywność jest pozostawiana w temperaturze pokojowej, co umożliwia namnożenie się zarazków do niebezpiecznego poziomu. 2. Stosowanie noży do obróbki surowca, a następnie bez starannego umycia — do potraw przygotowanych już do spożycia. 3. Zakażenie surowca patogenami, których źródłem są handlarze żywności. Dotyczy to często zatruć pokarmowych wywoływanych przez paciorkowce. 4. Zakażenie przeniesione przez muchy itp. 5. Niedogotowanie zakażonego mięsa lub drobiu. Zdarza się to wówczas, gdy surowiec nie jest należycie odmrożony przed gotowaniem. 6. Nieodpowiednie gotowanie jaj przechowywanych w chłodni. Takie jaja są bardziej zimne niż jaja (nieodpowiednio) trzymane w temperaturze pokojowej i muszą być gotowane dłużej. 7. Przechowywanie żywności w zbyt wysokiej temperaturze, co prowadzi do namnożenia się patogenów do niebezpiecznego poziomu. Chłodnie nie powinny być przeładowane żywnością, ale tak, by powietrze mogło swobodnie przepływać wokół półek. Najniższa temperatura w odpowiednim miejscu urządzenia chłodniczego powinna wynosić 0-5°C. Część zamrażająca musi mieć temperaturę nie wyższą niż -18°C. Pamiętajmy, że Yersinia enterocolitica (i Listeria monocytogenes) mogą rozmna-

żać się w temperaturze 5°C lub nawet niższej, a więc w temperaturze chłodni. 8. Spożywanie żywności przeterminowanej lub nawet przed datą bezpiecznego użycia, gdy warunki przechowywania nie były właściwe.

12.3.3 Higiena żywności — warunki przemysłowe Wiodącą zasadą higieny w produkcji jest eliminacja patogenów i redukcja zakażeń do bezpiecznego (akceptowalnego) poziomu. Polega to między innymi na zabiegach dotyczących surowców (selekcja mięsa zwierząt, drobiu, ryb) pocho331

dzących od zwierząt zdrowych (niezainfekowanych) oraz na stosowaniu odpowiednich metod przechowywania i zapobiegania infekcji (sekcja 12.2). Żywność niepewna, wytwarzana na dużą, przemysłową skalę, może zagrażać licznym populacjom ludzkim, stąd też sposoby produkcji i sprzedaży podlegają regulacjom prawnym. Jedną z metod zapewnienia bezpieczeństwa spożycia jest stosowany na szeroką, światową skalę tzw. System HACCP. 12.3.3.1 System analizy krytycznych punktów zagrożenia (HACCP) System HACCP (ang. hazard analysis critical control points) sprowadza się w zasadzie do szczegółowego nadzoru nad procesem produkcyjnym i kontrolą dających się przewidzieć zagrożeń na poszczególnych etapach przeróbki surowca. Obejmuje on następujące fazy: 1) obiektywne oznaczenie momentów zagrożenia poprzez analizę wykresu ciągu produkcyjnego pokazującego wszystkie aspekty procesu. Analiza ta może obejmować również źródła surowca i rozprowadzenie (sprzedaż) gotowego produktu; 2) identyfikację krytycznych punktów kontrolnych (CCP, ang. critical control points), to jest tych etapów procesu, w czasie których działalność prewencyjna lub korygująca może zapobiec zagrożeniom; 3) monitorowanie na etapach CCP w celu oznaczenia, czy proces przebiega w granicach z góry określonej tolerancji. Oznaczenia bakteriologiczne w CCP mogą wykazać obecność lub stopień zainfekowania, mogą również wykryć występowanie drobnoustrojów patogennych i w ten sposób wyznaczyć niezbędność szybkiej reakcji korygującej, jeśli taka jest wskazana. Metody tradycyjne, szczególnie oparte na liczeniu kolonii, są zbyt powolne, aby można było szybko interweniować w nowoczesnym procesie produkcyjnym. Oto niektóre szybkie metody: Lumac® Autobiolicznik Μ 4000 (Perstorp Analytical LUMAC, Landgraaf, Holandia). System ten oparty jest na wykrywaniu zanieczyszczeń mikrobiologicznych w próbkach mleka UHT itp. Zasada wiąże się z oznaczeniem ATP w próbce. Obecność ATP, który pochodzi z żywych zakażających drobnoustrojów, wykrywany jest w następujący sposób. Badane próbki preinkubuje się (30°C przez 48 godz.), tak by możliwy był wzrost zakażających mikroorganizmów. Po inkubacji określoną objętość (np. 50 ml) przenosi się do kuwety bez ATP, w celu oznaczenia w obecności hydrolizującej ATPazy (wartość tła ATP). Następnie próbkę traktuje się odczynnikiem, który niszczy błony cytoplazmatyczne wszelkich zakażających organizmów. Po takim zabiegu z komórki wycieka ATP. Jego ilość określa się stosując reakcję lucyferyny z lucyferazą, wywołującej pojawienie się światła (chemiluminescencja) w obecności nawet minimalnej ilości ATP. Wyemitowane światło mierzy się na fotopowielaczu (miernik światła), a wynik przedstawia się jako wartość cyfrową. Cała procedura jest zautomatyzowana, co pozwala na wykonanie testu w ciągu 15-20 minut. Produkty, z których pobrano próbkę do oznaczeń, trafią do dystrybucji, gdy wyniki oznaczeń są zadowalające. Pomimo opóźnienia na skutek preinkubacji próbki, proces produkcyjny może być kontynuowany. Konieczne jest jedynie przechowywanie partii (transzy) poddanej analizie. 332

Oznaczenie oporności. Próbkę żywności przenosi się do odpowiedniej pożywki wzrostowej. Przyjmuje się założenie, że liczba bakterii w badanym materiale jest proporcjonalna do poziomu metabolizmu wykrywanego w pożywce. Intensywność metabolizmu, tj. jego poziom, oznacza się mierząc spadek oporu elektrycznego (wzrost przewodnictwa) w zależności od czasu. Spadek oporu, jak można założyć, jest spowodowany metabolizowaniem dużych cząsteczek i wzrostem liczebności jonów. Są jednak pewne problemy utrudniające interpretację: drobnoustroje odpowiedzialne za zakażenie żywności mogą nie rosnąć w zastosowanej pożywce, a bliżej nieokreślone czynniki mogą hamować normalny metabolizm innych drobnoustrojów. Określenie zawartości dwutlenku węgla. W niektórych przypadkach stopień zakażenia drobnoustrojami określa się mierząc wytwarzanie dwutlenku węgla. Metoda ta jest szczególnie przydatna, gdy nie można zastosować oznaczania zmian oporności. Metoda bezpośredniego oznaczania epifluorescencji na filtrach (DEFT, ang. direct epifluorescent filter technicjue) (patrz sekcja 14.8.1) jest szczególnie przydatna do badania zakażeń mleka. Test z wykorzystaniem lizatów amebocytów Limulus (LAL, ang. Limulus amoebocyte lysate). Za pomocą tego testu oznacza się ilość lipopolisacharydu (LPS), (patrz sekcja 2.2.9.2) bakterii gramujemnych. Zasada testu polega na koagulacji przez LPS krwinek (ameboctów) kraba Limulus polyphemus. Pozwala na wykrycie zawartości LPS w minimalnej ilości, mniejszej niż 10-9 g/ml. Za pomocą testu LAL wyznacza się zawartość LPS zarówno żywych jak i martwych bakterii. Oznaczenia z użyciem sond DNA. Wyznakowana sonda DNA (sekcja 8.5.3) wykrywa określone gatunki bakterii w próbkach żywności, pod warunkiem jej odpowiedniej specyficzności w stosunku do poszukiwanego drobnoustroju. Modyfikacją tej metody jest test PCR (sekcja 8.5.4), za pomocą którego wykrywa się określone bakterie stosując specyficzne startery — podobnie jak w diagnostyce bakterii chorobotwórczych (sekcja 8.5.4.1).

ROZDZIAŁ

13 Bakteriologia stosowana II - różnorodne aspekty

13.1 Karmienie zwierząt, ochrona roślin Bakterie nie tylko oddziałują na żyzność gleby (rozdział 10), lecz także mają swój pożyteczny udział w karmieniu zwierząt hodowlanych i ochronie niektórych zbiorów.

13.1.1 Kiszenie paszy i białko z jednokomórkowców 13.1.1.1 Kiszonki Zakwaszanie jest tradycyjnym sposobem przechowywania traw (i niektórych innych roślin uprawnych). Umożliwia to podawanie zwierzętom odpowiedniej paszy także w zimie, wobec niedostatku pokarmu roślinnego. Zasada sporządzania kiszonek polega na fermentacji, w warunkach beztlenowych, poszatkowanej trawy. Bakterie, np. z rodzaju Lactobacillus, żyją na powierzchni roślin i zatem również w zbiornikach (silosach), w których zakwasza się masę roślinną. Bakterie fermentujące przetwarzają cukry roślinne (fruktozę, glukozę, sacharozę) głównie na drodze fermentacji mlekowej (sekcja 5.1.1). Wytworzony kwas mlekowy gwałtownie obniża pH (do około 4,0), zabijając te bakterie (szczególnie z rodzaju Clostridium), które powodowałyby gnicie. Pozwala to na zachowanie wartości odżywczych zbiorów. Zakwaszenie powoduje także zahamowanie rozwoju Listeria monocytogenes. W niedostatecznie sfermentowanych kiszonkach, gdy pH jest wyższe niż 5,5, L. monocytogenes rozmnaża się, a jest to bakteria potencjalnie chorobotwórcza, wywołująca np. poronienia lub obumarcie płodu. W produkcji kiszonek na dużą skalę używane są wielkie czarne worki plastikowe zamiast silosów. W procesie sporządzania kiszonek stosuje się różnorodne dodatki, które przyspieszają kwaszenie, lub jako pasza wpływają na przyrost masy karmionych nimi zwierząt. Powszechne jest również wzbogacanie kiszonki szczepami bakterii mlekowych wywołujących homofermentację (sekcja 5.1.1.1).

334

W zależności od potrzeb bierze się pod uwagę dodawanie szczepów bakterii dostosowanych do rozkładu surowca roślinnego, wykorzystywanie szczepionek zawierających bakterie fermentacji heteromlekowej, wytwarzające lotne kwasy tłuszczowe, które hamują rozwój grzybów w warunkach tlenowych, gdy kiszonki są gotowe do skarmiania zwierząt. Rozważa się także możliwość modyfikowania bakterii metodami inżynierii genetycznej, w celu nadania szczepionce właściwości rozkładu wielocukrów, wówczas gdy surowiec roślinny zawiera mało rozpuszczalnych węglowodanów [nowe tendencje w szczepieniu kiszonek: Weinberg i Muck (1996), FEMSMR 19: 53-68].

13.1.1.2 Białko z organizmów jednokomórkowych (SCP) SCP (ang. single-cell protein) uzyskuje się z komórek niektórych drobnoustrojów (bakterii, drożdży i jednokomórkowych glonów) hodowanych na dużą skalę. Stanowią one źródło białka paszy dla zwierząt i w diecie człowieka. We wczesnych latach osiemdziesiątych, gdy cena białka była wysoka, rozpoczęto produkcję tysięcy ton białka bakteryjnego stosowanego jako paszę. Bakterią wykorzystywaną do tego celu był Methylophilus methylotrophus; metylotrof (sekcja 6.4) hodowany na podłożu metanolowym. Do genomu tej bakterii wbudowywano gen E. coli, odpowiedzialny za wytwarzanie dehydrogenazy glutaminianowej, której obecność zwiększała asymilację amoniaku.

13.1.2 Kontrola biologiczna — inne zastosowania bakterii Termin „kontrola biologiczna" używany jest zwykle do określenia, wykorzystywanej przez człowieka, właściwości bakterii ograniczającej liczebność lub aktywność biologiczną innych organizmów. Na dużą skalę właściwość ta znajduje zastosowanie między innymi w rolnictwie i leśnictwie. Polega ona na wprowadzaniu do środowiska określonych drobnoustrojów lub ich toksyn w celu zabicia ewentualnie uszkodzenia owadów stanowiących zagrożenie dla upraw. Bakterie takie (lub ich toksyny) nazywa się bioinsektycydami, lub biopestycydami. Szczepy Bacillus thuringiensis wytwarzają różne typy owadobójczych kryształów białkowych (ICP, ang. insecticidal crystal protein), oznaczanych symbolami Cry typu I-IV (z różnymi podtypami). Mają one szerokie zastosowanie wobec licznych owadów — szkodników plonów. Geny odpowiedzialne za wytwarzanie tych białek zwykle umiejscowione są na plazmidach. Większość białek ICP powstaje w czasie wytwarzania przetrwalników, jako kryształy umiejscowione wewnątrz komórki w sąsiedztwie endospor. Synteza ICP jest związana ze sporulacją, gdyż odpowiednie geny ICP podlegają transkrypcji z udziałem specyficznych czynników sigma, takich jak σΈ analogiczny do σΕ Bacilus subtilis (patrz rys. 7.14). Geny dla ICP, CryIII, podlegają transkrypcji w stadium wegetatywnym wzrostu, a ich silne wyrażenie występuje u mutantów, u których zablokowane jest stadium fosforylacji (rys. 7.14). [Regulacja wytwarzania ICP: Baum i Malvar (19995) MM 18: 1-12]. Kryształy, którymi potraktowano plony, podlegają szybko degradacji, stąd zabieg trzeba powtarzać, aby osiągnąć efekt. Udało się jednak zmodyfikować

335

Β. thuringiensis, tak by substancja toksyczna dla owadów gromadziła się wewnątrz toksykogennych bakterii — wykazując w tej formie wysoką aktywność [Lereclus i wsp. (1995) Biotechnology 13: 67-71]. Niektóre szczepy B. thuringiensis, B. sphaericus i Clostridium bifermentans

wytwarzają toksyny zabijające komary. Podejmowane są wysiłki, by, między innymi (wykorzystując techniki inżynierii genetycznej), uzyskać odmiany bakterii toksycznych dla komarów przenoszących zarazki takich chorób jak malaria, filarioza i żółta gorączka [Porter, Davidson i Liu (1993) MR 57: 838-861]. Zastosowanie bakterii gramdodatnich w procesach kontroli biologicznej omówione zostało przez Emmermeta i Handelsmana (1999) FEMSML171,1-19]. Pseudomonas fluorescens może zmniejszać straty niektórych upraw wywoływane przez mróz, wykorzystując składniki odżywcze niezbędne dla bakterii „lodotwórczych" powodujących powstawanie kryształków lodu (sekcja 10.4).

13.2 Biokopalnictwo (bioługowanie) Od wielu łat bakterie chemolitotroficzne (gatunki np. Thiobacillus) stosowano na skalę przemysłową w celu wydobywania (ługowania) niektórych metali z ubogich rud. Dziś takie biokopalnictwo (zwane też biogórnictwem, lub bioługowaniem) ma jeszcze większe znaczenie w związku z wyczerpaniem się zasobów niektórych bogatych rud. Szacuje się, że roczne odzyskiwanie miedzi metodami mikrobiologicznymi przekracza 1 milion ton [Ehrlich i Brierley (1990) Microbial Mineral Recovery; New York: McGraw-Hill]. Miedź można odzyskać np. z ubogich rud zawierających chalkopiryt (CuFeS2). Jedna ze stosowanych metod polega na recyklicznym przepuszczaniu roztworu z kwasem siarkowym przez pokruszoną rudę z zawartymi w nim bakteriami chemolitotroficznymi. Żelazo (Fe2+) wypłukiwane z rudy jest utleniane przez bakterie do Fe3+, co prowadzi do powstania żelaza rozpuszczonego. To powoduje wypłukiwanie siarki, która jest utleniana do siarczanu. Leptospirillum ferrooxidans (utleniacz żelaza) i Thiobacillus thiooxidans (utleniacz siarki) mogą przeprowadzać te procesy. Pożywkę dla bakterii stanowi albo stosowany w procesie płyn wymywający, albo sama ruda. Z materiału wyługowanego usuwa się periodycznie miedź (do 5 gramów na litr) — stosując np. elektrolizę. Metabolizujące bakterie utrzymują temperaturę około 40-50°C, a konwekcja powietrza zabezpiecza niezbędne warunki tlenowe. Ługowanie miedzi przy bardzo niskim pH, korzystne, gdyż zapobiega precypitacji Fe 3+ , uzyskuje się stosując odpowiednie szczepy Thiobacillus thiooxidans i Leptospirillum ferrooxidans. W celu oznaczenia bakterii przeprowadzających ługowanie bada się region DNA zawarty między genami dla 16S i 23S rRNA (patrz sekcja 16.6). DNA potrzebny do badań ekstrahuje się z substancji wyługowanych [Vasquez i Espejo (1997) AEM 63: 332-334]. Z badań nad przemianami siarki w procesie ługowania wynika, że biologiczne wypłukiwanie pirytu przebiega w sposób cykliczny, a produkty rozkładu zwierają tiosiarczany i politioniany. Jony żelazowe (Fe3+), wytwarzane w wyniku utleniania jonów Fe 2+ przez bakterie, odgrywają aktywną rolę zarówno w utlenianiu pirytu, jak i tiosiarczanów. Metabolizm litotroficznych bakterii przepro336

wadzających ługowanie utrzymuje stały poziom tych jonów [Schippers, Jozsa i Sands (1996) AEM 62: 3424-3431]. W ostatnich latach zastosowano bioługowanie, między innymi w Afryce Południowej, Brazylii i Australii, jako podstawową metodę wydobywania złota z tzw. ubogich rud arsenopirytowych. Z tego typu rud wypłukiwanie złota metodami zwykle stosowanymi, to jest za pomocą cyjanków, nie jest możliwe, gdyż piryt i arsenopiryt zawarte w rudzie chronią złoto przed cyjankami. Rozkruszona ruda jest poddawana działaniu bakterii (fot. 13.1), a arsenopiryt (FeAsS) podlega upłynnieniu przez utlenianie (do FeAsO4 i H2SO4), odsłaniając złoto, które wydobywa się traktując cyjankami. Złoto oddziela się z kompleksu z cyjanem, przez adsorpcję na węglu. Płyn pozostały po ługowaniu może być oczyszczony przez bakterie, cyjanki — utlenione do dwutlenku węgla i mocznika, a mocznik utleniony do azotanu. [Mikrobiologia ługowania metali (sprawozdanie z konferencji): FEMSMR (1993) 11:1-267. Drobnoustroje w kopalnictwie (artykuł przeglądowy): Rawlings i Silver (1995) Biotechnology 13: 773-778]. Uaktualniony przegląd głównych typów bakterii w przemysłowych procesach bioługowania podaje Rawlings, Tributsch i Hansford [(1999) Microbiology 145: 5-13].

13.3 Biologiczne proszki do prania „Biologiczne" (zwane u nas enzymatycznymi) proszki do prania zazwyczaj zawierają enzymy nazywane subtylizynami. Wytwarzają je gatunki Bacillus. Jeden z tych enzymów, zwany „subtylizyna Carlsberga", uzyskiwany z B. licheniformis, hydrolizuje większość wiązań peptydowych białek i niektóre wiązania estrowe lipidów. Enzym ten jest stabilny w szerokim zakresie pH, a jego stabilność jest niezależna od Ca 2+ . Ta druga właściwość jest ważna, gdyż proszki do prania zawierają zazwyczaj związki chelatujące między innymi jony wapnia usuwane w celu zmiękczania wody.

13.4 Oczyszczanie ścieków Ścieki zawierają zarówno zanieczyszczenia z mieszkań i domów (tzw. ścieki komunalne, z urządzeń sanitarnych), jak również pochodzące z działalności przemysłowej i rolniczej. W ich skład wchodzą zawiesiny, substancje rozpuszczone i koloidalne. Ścieki zrzucone do rzek i jezior mogą wywierać różnorakie, szkodliwe działania. Mogą na przykład stać się źródłem infekcji, np. cholery. Inny ważny problem stanowią związki organiczne w ściekach. Bakterie, znajdujące się w dużych ilościach w ściekach, metabolizują substancje organiczne, szybko wykorzystując dostępny tlen na obszarach wodnych, szczególnie w wodach nieruchomych lub wolno płynących. Oznaczać to może śmierć ryb i innych zwierząt, dla których tlen jest niezbędny. Powstające warunki beztlenowe umożliwiają wzrost bakterii redukujących siarczany (sekcja 5.1.1.2 i rys. 10.3) oraz innych organizmów, których produkty metabolizmu zawierają

337

Arsenopiryt został roztarty na pyl, zmieszany z wodą, kwasem i pożywką dla bakterii. Mieszaninę przepuszczono przez szereg nawietrzanych tanków bioutleniających zaszczepionych bakteriami chemolitotroficznymi. Bakterie upłynniają arsenopiryt — odsłaniając zawarte w nim złoto, które teraz może być ekstrahowane za pomocą cyjanku. W wyniku bioługowania ilość odzyskanego złota może być dwukrotnie większa niż bez tego zabiegu. Bioługowanie nie wymaga dużej energii w porównaniu z tradycyjną metodą uzyskiwania złota z rud ubogich, np. stapiania (utleniania w wysokiej temperaturze) i ługowania pod ciśnieniem, w środowisku zakwaszonym, napowietrzanym. Fotografia — dzięki uprzejmości A. Hartleya.

siarczki i inne trucizny. Podstawowe cele oczyszczania ścieków to, po pierwsze — wyeliminowanie lub zmniejszenie liczby drobnoustrojów patogennych, po drugie zmniejszenie zużywania tlenu przez ścieki, to jest zmniejszenie biologicznego zapotrzebowania tlenu, tzw. BZT w ściekach.

13.4.1 Tlenowe oczyszczanie ścieków Surowe (to jest poddane oczyszczaniu) ścieki wprowadza się w celu wstępnej obróbki do zbiornika sedymentacyjnego, w którym usuwane są cząstki nierozpuszczalne, stanowiące tzw. osad. Jego nadmiar wraz z opadłymi kłaczkami, złożonymi z drobnoustrojów, jest usuwany. W tej fazie wstępnie oczyszczone ścieki poddawane są drugiemu etapowi na przykład na tzw. złożach zraszanych,

338

będących rodzajem filtra biologicznego (fot. 13.2, góra). Osad podlega rozproszeniu za pomocą obracających się rur, z których wycieka przez umieszczone w nich otwory. Właściwe złoże składa się z rozkruszonych kamieni, umieszczonych w postaci grubej warstwy w zbiorniku. Przepływając przez złoże, ścieki wchodzą w kontakt z tzw. błonkami biologicznymi otaczającymi rozdrobnione kamienie. Błonki składają się z dużej ilości pierwotniaków (orzęski) i licznych bakterii tlenowych, takich jak Zoogloea ramigera. Wraz z rozproszonymi ściekami na złoże dostaje się tlen w postaci rozpuszczonej. Substancje organiczne zawarte w ściekach podlegają biologicznemu utlenieniu, dzięki drobnoustrojom w błonkach biologicznych. Dochodzi w ten sposób do mineralizacji materii organicznej zawartej w ściekach (sekcja 10.3.4). Usuwany oczyszczony ściek ma już znacznie obniżone zapotrzebowanie na tlen i zrzucony do rzeki, lub innego zbiornika wodnego nie zużywa w nich tlenu — odmiennie niż ścieki przed oczyszczeniem. Duże ilości bakterii w błonkach biologicznych stają się pokarmem dla pierwotniaków. Drugim sposobem oczyszczania tlenowego jest stosowanie tzw. osadu czynnego. Ścieki, wstępnie oczyszczone przez sedymentację, wprowadza się do zbiornika (reaktora) zawierającego osad czynny będący zbiorowiskiem różnych organizmów, głównie bakterii (np. Acinetobacter spp., Alcaligenes spp., Sphaerotilus natans, Zoogloea ramigera) i pierwotniaków (orzęski, wiciowce, ameby). Płyn i osad energicznie miesza się i napowietrza przez 6-12 godzin. Powoduje to utlenienie substancji organicznej lub jej asymilację w postaci komórek biomasy. Rezultatem jest znaczne obniżenie wartości BZT. Całkowicie oczyszczone ścieki odpływają z urządzenia oczyszczającego po przepłynięciu przez osadnik usuwający osad. Pełne oczyszczenie wymaga skutecznej flokulacji, to jest agregacji występujących organizmów, które później osadzają się tworząc osad. Proces flokulacji jest ułatwiony hydrofobowością powierzchni komórek, prowadzącą do łączenia się ich w tzw. kłaczki dostrzegalne gołym okiem. Ścieki dostają się do wnętrza kłaczków przez kanały (pory w obrębie kłaczków). [Olofsson, Zita i Hermansson (1998) Microbiology 144: 519-528]. [Structure of microbial communities in sewage treatment plants: Amann, Lemmer i Wagner (1998) FEMSME 25: 205-215]. W czasie oczyszczania metodą osadu czynnego jego objętość zwiększa się, jako rezultat rozmnażania się drobnoustrojów, a część zostaje zachowana w celu ciągłego stosowania w procesie oczyszczania kolejnych partii ścieków. W ostatnim dziesięcioleciu udoskonalono proces oczyszczania ścieków stosując technologię napowietrzanych filtrów biologicznych (fot. 13.2, dół). Urządzenie zasadniczo zbudowane jest z zanurzonego złoża, składającego się z małych granulek, pokrytych błonką biologiczną (fot. 13.2, dół, wstawka). Powietrze wtłaczane jest od dołu złoża, a zastosowanie drobnych granulek powoduje odsączanie małych cząstek zawartych w ścieku oraz mineralizację w ściekach substancji organicznej. Tego typu złoże zawiera do pięciu razy więcej biomasy w postaci błonki biologicznej, w porównaniu ze zwykłym urządzeniem filtrującym o podobnych rozmiarach. Unowocześnione reaktory zajmują więc mniej miejsca. Gdy przepływ ścieków jest odpowiednio duży, a tym samym napowietrzanie znaczne, w błonkach biologicznych rozwijają się także bakterie nitryfikacyjne (sekcja 5.1.2; rys. 10.2). Jest to korzystne, ponieważ nitryfikacja jest pierwszym

339

340

etapem usuwania azotu ze ścieków. Jeśli nitryfikacja jest skuteczna, wypływający ściek, częściowo już oczyszczony, może zostać poddany procesowi denitryfikacji (sekcja 5.1.1.2 i 10.3.2, rys. 10.2). Ponieważ metoda ta może także być zastosowana w warunkach beztlenowych (co sprzyja denitryfikacji), znaczne ilości azotu zostają usunięte z urządzeniach złożonych z reaktorów naprzemiennych: tlenowych i beztlenowych. Do denitryfikacji można również wykorzystywać bakterię, która przeprowadza ten proces tlenowo [Patureau i wsp. (1994) FEMSME 14: 71-78], w ten sposób zmniejszając koszt, gdyż używany jest tylko jeden reaktor, w którym przebiega nitryfikacja i denitryfikacja. Proces ten został przedyskutowany przez Kuenena i Robertsona [(1994) FEMSMR 15: 109-117], Zbiorniki oczyszczające okresowo przemywa się, przepuszczając wodę w odwrotnym kierunku. Trzy podstawowe metody oczyszczania ścieków w warunkach tlenowych przedstawiono w tabeli 13.1. Usunięcie soli amonowych ze ścieków przeciwdziała eutrofizacji w odbieralnikach wodnych. Termin eutrofizacja oznacza nadmierne wzbogacenie wody w substancje odżywcze wykorzystywane przez glony i sinice (cyjanobakterie) do wzrostu, co prowadzi do zanieczyszczeń zbiorników wodnych. Jednym z ostatnich osiągnięć jest zastosowanie reaktora, w którym proces nitryfikacji przebiega z dużą wydajnością, nawet wówczas, gdy zawartość amoniaku jest wyższa od 0,5 g azotu na litr. Po oczyszczeniu związki amonowe są prawie zupełnie utlenione do azotynów. Urządzenie to pracuje w temperaturze 35°C, a głównym nitryfikatorem jest Nitrosomonas [Logemann i wsp. (1998) FEMSME 27: 239-249].

13.4.2 Beztlenowe oczyszczanie ścieków Ścieki zawierające w dużej ilości zanieczyszczenia stałe, np. odpady z ferm, pozostałości po oczyszczaniu w warunkach tlenowych, mogą być poddane procesom beztlenowym. Wówczas wielkocząsteczkowe związki organiczne podlegają rozkładowi do substancji prostych i gazów. Procesy te przeprowadzają liczne bakterie, których metabolizm odbywa się bez udziału tlenu. Rozkład ścieków przebiega zwykle w temperaturze około 35°C. Polimery, np. wielocukry, są trawione przez egzoenzymy, a powstające cukry są fermentowane (przez bakterie z rodzaju Bacteroides i Clostridium). Produktami fermentacji są octany, mleczany, propioniany, etanol, dwutlenek węgla i wodór. Większość węgla zostaje usunięta ze ścieków w postaci dwutlenku węgla i metanu.

Fot. 13.2 Tlenowe oczyszczanie ścieków, wg starej i nowej technologii (patrz sekcja 13.4.1) Góra — złoża zraszane, w Bodmin, Konwalia, UK. Część dolna (wstawka): bakterie (pow. ok. 11000x) na powierzchni złoża „dwuwęglanowego", stosowanego w niektórych oczyszczalniach typu BAF. Fotografie złoża — dzięki uprzejmości B. Lessware'a, ABIPP, South-West Water, Exeter, UK. Fotografie z mikroskopu elektronowego bakterii na cząstkach dwuwęglanu — uprzejmość Anjou Recherche — OTV, Compagnie Generale des Eaux, Maisons Laffitte, Francja.

341

Końcowy produkt oczyszczania beztlenowego jest prawie bezwonny i bogaty w biomasę złożoną z drobnoustrojów. W tej postaci może być stosowany w rolnictwie jako nawóz. Produkt gazowy (tzw. biogaz) zawiera ponad 50% metanu. Jest to źródło energii wykorzystywane w procesie oczyszczania.

13.4.3 Wpływ oczyszczania ścieków na środowisko Technologia właściwego oczyszczania ścieków jest znana i stosowana od wielu lat. Mimo to nadal buduje się systemy rurociągów, którymi część ścieków usuwa się wpuszczając je do zbiorników wodnych mórz i oceanów. Jest to tylko pozornie najtańszy sposób pozbycia się zanieczyszczeń ściekowych. Cena niszczenia środowiska jest olbrzymia.

13.5 Skąd pobieramy wodę? Słodką wodę pobieramy głównie z rzek (woda powierzchniowa) i podziemnych cieków wodnych zalegających między skałami, w podziemnych zbiornikach wodnych. Wody powierzchniowe są z reguły bardziej zanieczyszczone. Stopień wykorzystywania wód powierzchniowych jest różny, zależnie od położenia geograficznego jej użytkowników. Na przykład Kanada i Szkocja wykorzystują przede wszystkim wody powierzchniowe, podczas gdy Austria, Dania i Portugalia — głównie zasoby podziemne. Woda przeznaczona do spożycia powinna być odpowiednio uzdatniona, aby wyeliminować z niej zarazki, powodujące choroby (np. cholera). Proces uzdatniania wody pitnej ma też drugi cel — usunięcie, lub zmniejszenie do bezpiecznego stopnia ilości substancji szkodliwych. Ważne jest także, by końcowy produkt był klarowny, bez smaku i zapachu.

342

13.5.1 Uzdatnianie wody na dużą skalę — do spożycia w miastach Woda, zanim trafi do systemu rozprowadzania i pobierania jej, poddawana jest różnorodnym zabiegom. Im jej początkowa jakość jest gorsza, tym procesy uzdatniania muszą być bardziej złożone. W praktyce stosuje się zabiegi w różnych kombinacjach.

13.5.1.1 Uzdatnianie wód gruntowych Wody gruntowe (podziemne) pobierane są ze studni głębinowych i ze źródeł. Mają one zazwyczaj dobrą jakość i wymagają jedynie słabego napowietrzania, przesączania przez „szybkie" filtry piaskowe i dezynfekcji (patrz niżej). Konieczne jest natomiast specjalne oczyszczanie wówczas, gdy woda gruntowa zawiera znaczne ilości azotynów (patrz niżej).

13.5.1.2 Uzdatnianie wód powierzchniowych Zanieczyszczona woda, zanim zostanie poddana procesowi oczyszczania, może być pozostawiona w zbiornikach sedymentacyjnych. W tych warunkach niektóre drobne cząstki osadzają się na dnie, a płyn znad osadu bywa poddawany odsączaniu w bębnach z nierdzewnej stali, o wielkość otworów około 30 μm). Woda zarówno powierzchniowa, np. z zanieczyszczonych rzek, jak i podpowierzchniowa (gruntowa) zawiera tlen czasem w niewielkich stężeniach, tak że musi być wówczas napowietrzana, za pomocą urządzeń kaskadowych lub rozpylających, zapewniających dobry kontakt wody z powietrzem. Jest to konieczne, aby zapewnić skuteczność dalszego oczyszczania. Pozostałe drobne cząstki różnych substancji usuwa się dodając koagulanty (np. siarczan glinu). Pod ich wpływem zanieczyszczenia łączą się w duże kłaczki, które następnie muszą być oddzielone od wody. W tym celu wodę pompuje się do górnej części urządzenia, w którym kłaczki, zlepione zazwyczaj śluzem, tworzą warstwę, nad którą znajduje się klarowna woda. Tanki klarujące wodę działają w procesie ciągłym. Z nich — czysta woda podawana jest do dalszej obróbki. Woda, która zawiera już tylko bardzo drobne cząstki oraz substancje rozpuszczone, może być poddawana dalszemu oczyszczaniu na tzw. szybkich filtrach piaskowych, działających na zasadzie mechanicznego sita. Woda spływa poprzez warstwę piasku, o średnicy ziaren około 1 mm. Złoże piasku oczyszcza się tłocząc od dołu powietrze, a następnie wodę. Powoduje to usunięcie z piasku cząstek, które zostały oddzielone od wody w procesie filtracji. Filtry piaskowe, zwane powolnymi, składają się z warstwy piasku o mniejszych ziarenkach, w górnej swej części stwarzają warunki rozwoju błonki biologicznej złożonej z bakterii i glonów — dzięki temu filtr piaskowy działa nie tylko jako sito mechaniczne, lecz także pełni funkcję oczyszczania biologicznego, mineralizując substancje organiczne i usuwając częściowo azot i fosfor. Filtry piaskowe powolne mogą również eliminować substancje psujące smak i nadające wodzie niemiły zapach. Usuwają również toksyny wytwarzane przez sinice,

343

które mogą żyć w wodach. Do tego rodzaju niebezpiecznych toksyn należą substancje występujące w tzw. zakwitach sinic, jak Anabaena, Aphanizomenon, Microcystis, Nodularia i Oscillatoria. W odpowiednich warunkach drobnoustroje te żyją w różnych zbiornikach wodnych, a wytwarzane przez nie toksyny mogą powodować stany zapalne przewodu pokarmowego, choroby wątroby i inne przypadłości u człowieka i zwierząt [Bell i Codd (1994) RMM 5: 256-264]. Błonka biologiczna zawierająca także bakterie nitryfikacyjne (patrz sekcja 5.1.2) działające w warunkach tlenowych. Z tej przyczyny powolne filtry piaskowe spełniają swe funkcje tylko wówczas, gdy woda została odpowiednio napowietrzona. Powolne filtry piaskowe nie są oczyszczane przez odwrotny przepływ wody, jedynie górna warstwa piasku jest od czasu do czasu usuwana, a następnie złoże piaskowe jest uzupełniane świeżym piaskiem. Przed dezynfekcją (zazwyczaj na drodze chlorowania) pH wody może wymagać skorygowania metodą chemiczną, gdyż kwasowość ma wpływ na skuteczność chlorowania. Dezynfekcja. Woda przeznaczona do spożycia jest dezynfekowana, zwykle za pomocą chloru, który działa szczególnie skutecznie na bakterie patogenne pochodzące z odchodów. Są to między innymi takie bakterie jak E. coli oraz różne gatunki Campylobacter, Clostridium, Salmonella, Shigella i Vibrio. Dlatego też zabieg

chlorowania zapobiega cholerze, durowi brzusznemu i wielu innym chorobom. Chlor, będąc silnym czynnikiem utleniającym, reaguje i jest pobierany przez różnorodne zanieczyszczenia wód. Część chloru zostaje od razu związana i unieczynniona w wyniku tego procesu. Gdy ten poziom „zapotrzebowania" chloru przez system zostanie osiągnięty, dalsze chlorowanie jest źródłem wolnych rodników chloru, które reagując z wodą dostarczają Cl2, HClO i CIO-. Zalecanym poziomem wolnych związków chloru jest około 0,5 części na miliom (ppm) ( = 0,5 mg/litr). Chlor działa skuteczniej w wodzie, której pH jest niższe od 7. W tych warunkach dysocjacja kwasu podchlorowego, związku chloru najbardziej skutecznego w dezynfekcji, jest słabsza. Jeśli woda zawiera amoniak, reaguje on z chlorem tworząc chloraminy. Są one substancjami dezynfekującymi, które rozkładają się wolno, uwalniając chlor. Są one mniej skuteczne, ale bardziej trwałe niż chlor. Zwiększanie zawartości chloru w wodzie zwiększa zawartość chloramin do maksimum (zależnego od początkowej zawartości amoniaku). Dalsze dodawanie chloru powoduje utlenianie chloramin. Prowadzi to do zmniejszenia zawartości związków chloru. Po osiągnięciu punktu załamania (rys. 13.1) dodatek chloru do wody powoduje powstanie wolnych rodników. Tak więc, aby osiągnąć ten stan, dawka chloru musi przekroczyć punkt załamania (rys. 13.1). Nieliczne stacje uzdatniania wody stosują dodawanie amoniaku, wraz z chlorem. Skuteczność dezynfekcji zależy jednak na połączonym działaniu rodników, w wyższym stopniu niż na zawartości wolnych rodników. Chlorowanie dużymi dawkami. Celem tego zabiegu jest eliminacja zapachu i złego smaku wody przeznaczonej do picia. Nadmiar chloru jest w tym przypadku usuwany przez dodatek dwutlenku siarki, tzw. sulfonację. Działanie dwutlenku siarki przerywa się, gdy zostanie osiągnięty normalny resztkowy poziom chloru.

344

Chlor wprowadzony na początku może utleniać różne związki i jony. Początkowy odcinek krzywej wskazuje na zapotrzebowanie chloru przez system, a następny odcinek określa spadek skuteczności chlorowania. Dodany chlor reaguje z amoniakiem, tworząc monochloroaminę (NH2C1). Wzrost zawartości chloru prowadzi do pojawienia się dichloroaminy (NHCl2). Wzrost poziomu chloramin (tj. związane pozostałości chloru) widoczny jest na krzywej jako wzrost zawartości resztkowego chloru. Dodając dalej chlor osiąga się punkt, w którym zaczyna on utleniać chloraminy (do N2 i HC1). Wówczas ich zawartość (jako pozostałości chloru) maleje. Gdy związane pozostałości (chloraminy) osiągną najniższy poziom (poziom załamania), dalsze dodawanie chloru prowadzi do gromadzenia się wolnych resztek chloru, tj. chloru i produktów jego reakcji z wodą (sekcja 13.5.1.2).

Oznaczanie zawartości wolnego chloru. Test można przeprowadzić na przykład za pomocą Ν,Ν-dietylo-p-fenylenodiaminy (tabletki DPD). Zawartość wolnego chloru w wodzie odczytuje się na podstawie intensywności czerwonej barwy powstającej w wyniku reakcji DPD z chlorem. Powstałą barwę porównuje się z wzorcową skalą barw. Należy pamiętać, że chlorowanie wody nie usuwa wszystkich zagrożeń zakażenia. Niektóre wirusy (np. wirus Norwalk) i pierwotniaki (np. grubościenne oocyry Cryptosporidium) mogą przeżyć rutynowe chlorowanie. Ozon (w porównaniu z chlorem) jest silniejszym środkiem dezynfekującym, lecz działa krócej. Aby osiągnąć wysoki stopień odkażenia wody, po zadziałaniu ozonem można stosować chlorowanie małymi dawkami. Oznaczenie skuteczności dezynfekcji. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO), jak również Amerykańska Agencja Ochrony Środowiska (USEPA), podobnie jak Komisja Europejska (EC), oraz agencje krajowe określają normy jakości bakteriologicznej wody pitnej. Niektóre bakterie, szczególnie bakterii z grupy coli (patrz Aneks) i „paciorkowce kałowe" — są wskaźnikami zanieczyszczenia odchodami. Ich obecność w uzdatnionej wodzie pitnej wskazuje na niewłaściwy stopień oczyszczania wody, albo też na późniejsze skażenie. W tabeli 13.2 podano wykaz niektórych obowiązujących norm. Pałeczki okrężnicy i paciorkowce kałowe są organizmami wskaźnikowymi ze względu na ich obfitość w jelitach. Ich obecność w próbkach wody wskazuje na możliwość skażenia ściekowymi drobnoustrojami chorobotwórczymi. Byłoby działaniem niepraktycznym badanie próbek na obecność poszczególnych, licznych zarazków mogących występować w ściekach, gdyż określony patogen

345

może przebywać tam jedynie przejściowo. Co ważniejsze, bakterie wskaźnikowe występują w jelitach w znacznie większych ilościach niż zarazki (np. E. coli — około 108 komórek na gram odchodów). Dlatego też identyfikacja tych właśnie bakterii w badanej próbie jest łatwiejsza. Umożliwia to również wykrycie nawet bardzo małych zanieczyszczeń wody odchodami. Jednym z tradycyjnych testów na wykrycie bakterii wskaźnikowych jest metoda sączenia przez filtry membranowe (wielkość por około 0,2 μm). Następnie filtry suszy się i nasącza odpowiednim podłożem bakteriologicznym. Jest to podłoże selekcyjne, umożliwiające wytworzenie kolonii na filtrze jedynie określonym bakteriom, np. E. coli. Test probówkowy. Równe objętości wody dodaje się do szeregu probówek zawierających pożywkę z laktozą (np. bulion MacConkeya — tab. 14.1). W podłożu umieszcza się małe probówki (rurki) Durhama, w których gromadzi się gaz powstający w wyniku fermentacji cukru. W probówkach, w których znalazła się przynajmniej jedna pałeczka coli (w określonej objętości), test wypadnie pozytywnie i wykaże fermentację laktozy oraz wytworzenie gazu, zbierającego się w rurce Durhama. Liczbę dodatnich i ujemnych probówek porównuje się z tablicą statystyczną, z której odczytuje się najbardziej prawdopodobną liczbę (NPL) pałeczek coli w próbce wody. W rzeczywistości wynik podaje jedynie przypuszczalną liczbę bakterii coli, gdyż podobny rezultat otrzymujemy w przypadku obecności w próbce pewnych bakterii przetrwalnikujących, które także fermentują laktozę i wytwarzają gaz. Błąd tego typu jest szczególnie prawdopodobny, gdy badaniu poddaje się próbki wody chlorowanej, gdyż bakterie wytwarzające spory są bardziej oporne na ten zabieg niż pałeczki okrężnicy. Dla potwierdzenia, że w próbce jednak znajdowały się pochodzące z odchodów bakterie coli, które są tolerancyjne na podwyższoną temperaturę, należy wykonać dwa dodatkowe testy (przeprowadzane w temperaturze 44°C/24 godz.). Jest to test indolowy (patrz sekcja 16.1.2.5) oraz test Eijkmana. W tym ostatnim z każdej „pozytywnej" probówki dokonuje się posiew na podłoże (np. bulion tryptozowy z laurynianem i laktozą), które zawiera czynnik powodujący zahamowanie wzrostu bakterii przetrwalnikujących. Inkubując podłoże w 44°C i wykrywając fermentację laktozy z produkcją gazu, oraz wytwarzanie indolu z tryptofanu, uzyskuje się potwierdzenie obecności E. coli w badanej próbce wody.

346

Woda należycie chlorowana nie powinna zawierać bakterii wskaźnikowych. Duża liczba E. coli we wspomnianych testach wskazuje na znaczne zanieczyszczenie ujęć wodnych, lub wtórne zanieczyszczenie uzdatnionej już uprzednio wody. Niewielka liczba pałeczek okrężnicy sugeruje słabsze lub wcześniejsze zanieczyszczenie. Wykrycie źródeł skażenia wody odchodami może ułatwić informacja dotycząca spektrum oporności na antybiotyki paciorkowców kałowych, izolowanych w przypadku zakażeń wywołanych spożyciem wody, do której dostały się odchody ludzkie lub zwierzęce [Wiggins (1996) AEM 62: 3997-4002]. Problem azotanów, pestycydów i innych substancji. Azotany występują w wodach powierzchniowych i ostatnio coraz częściej w wodach gruntowych, jako skutek używania nawozów w rolnictwie. Górna, dopuszczalna granica zalecana przez Unię Europejską/Wlk. Brytanię (NO3/litr) wynosi 50 mg/litr. Wartość zalecana przez USEPA (str. 345) wynosi 44,29 mg/litr (to jest 10 mg/litr w formie N). Wodę, która zawiera azotany w dużym stężeniu, niekiedy miesza się z wodą o małej zawartości. Można również taką wodę przetrzymywać przez dłuższy czas w stacji uzdatniania. Wówczas możliwa jest denitryfikacja (patrz sekcja 10.3.2). Praktykuje się również usuwanie azotanów na drodze jonowymiennej. Pestycydy i niektóre inne toksyczne substancje można usuwać poprzez adsorpcje na węglu aktywowanym. Usuwanie wspomnianych wyżej substancji szkodliwych określane jest jako trzeci stopień oczyszczania. 13.5.1.3 Problemy związane z systemami rozprowadzania

Masowe namnażanie drobnoustrojów i wytwarzane przez nie śluzy, gdy dotyczy to rur wodociągowych, mogą obniżać jakość wody i ograniczać wydajność jej pompowania. Zjawisko nadmiernego rozmnażania się drobnoustrojów w systemie rozprowadzania wody wiązany był z obecnością węgla organicznego, którego dostępność zwiększa się działaniem chloru i ozonu, będącymi środkami utleniającymi. Jednakże ostatnio, dzięki badaniom prowadzonym w Finlandii, wykazano, że na wzrost drobnoustrojów ma wpływ zawartość fosforu. Nawet wówczas gdy zawartość węgla w wodzie jest duża, namnażanie drobnoustrojów zostaje ograniczona w warunkach deficytu fosforu. Usunięcie fosforu z wody może stanowić ważny czynnik ograniczający koszt działań zapobiegających zjawisku bujnego rozmnażania się drobnoustrojów w rurach wodociągowych i w urządzeniach towarzyszących [Miettinen, Vartiainen i Martikainen (1996) Nature 381: 654-655]. [Drinking water biofilms: Kalmbach, Manz i Szewzyk (1997) FEMSME 22: 265-279]. Zarazki mogą się dostać do wody gotowej już do picia poprzez uszkodzone rury, pompy, zawory i inne urządzenia, np. wieże ciśnień, i mogą się w nich namnażać, jeśli poziom resztkowy środka dezynfekującego jest nieodpowiedni. Taka sytuacja może prowadzić do złożonych interakcji wielu przeróżnych parametrów (ponowny wzrost pałeczek coli w wodzie pitnej [LeChevallier, Welch i Smith (1996) AEM 62: 2201-2211]. 347

13.5.2 Rozprowadzanie wody na małą skalę Małe, wiejskie ujęcia wody, np. ze strumieni i studni, można dezynfekować naświetlaniem promieniami ultrafioletowymi, po uprzednim przepuszczeniu wody przez odpowiedni filtr z włókien. Alternatywnym sposobem jest dezynfekcja przefiltrowanej wody za pomocą podchlorynu wapnia (tabletek) w urządzeniu zwanym „chlorynatorem". Tabletki ulegają stopniowemu rozpuszczaniu, uwalniając chlor. Woda w małych ilościach (np. w czasie wypraw) może być gotowana, albo traktowana tabletkami halazonu (p-karboksylo-N,N-dichlorobenzenosulfonamid). W niektórych krajach rozwijających się wprowadza się nowe metody poprawiania jakości wody przeznaczonej do picia na terenach wiejskich. Można wodę sączyć przez wielowarstwowy filtr z dostępnych na miejscu włókien. Filtr taki zatrzymuje większość planktonu, w którym znajdują się zarazki cholery. Działanie to znacznie zmniejsza występowanie cholery w takich krajach jak Bangladesz [Huq i wsp. (1996) AEM 62: 2508-2512]. W Kenii do dezynfekcji wody do celów spożywczych stosuje się ciepło pochodzenia słonecznego. Trwają badania kliniczne, które potwierdzą skuteczność tej metody w zapobieganiu biegunkom dziecięcym w społeczności Masajów [Joyce i wsp. (1996) AEM 62: 399-402].

13.6 Wykorzystywanie zarazków dla dobra człowieka Takie zarazki jak Clostridium botulinum i C. tetani wytwarzają groźne neurotoksyny, które mogą wywoływać choroby kończące się zgonem. Toksyna botulinowa (tzw. jad kiełbasiany) blokuje wydzielanie neuroprzekaźnika - acetylocholiny. Prowadzi to do ograniczenia funkcji mięśni i ich paraliżu. Jednakże ta właśnie toksyna jest wykorzystywana w leczeniu niektórych neurologicznych chorób mięśni, np. zeza. [Neurotoksyna botulinowa (zastosowania medyczne) Schantz i Johnson (1992) MR 56: 80-99; Jankovic i Hallett: Therapy with Botulinum Toxin; New York: Marcel Dekker, 1994].

13.7 Tworzywa pochodzenia bakteryjnego - Biopol Materiałem zapasowym bakterii jest polimer poli-β-hydroksymaślan (PHB, ang. polyhydroxybutyrate, sekcja 2.2.4.1). Ta naturalna substancja jest materiałem wyjściowym dla wielu tworzyw termoplastycznych podlegających biodegradacji („Biopol", nazwa handlowa firmy Zeneca, Wielka Brytania). Homopolimer (PHB) jest wytwarzany w odpowiednich warunkach hodowli, gdy Alcaligenes eutrophus korzysta z glukozy jako jedynego źródła węgla. Jeśli podłoże uzupełni się odpowiednimi składnikami, bakteria ta wytwarza kopolimer złożony z hydroksymaślanu i hydroksywalerianianu. Kontrola składu podłoża wpływa na proporcję obu składników w polimerze. Polimery (albo PHB, albo kopolimer) tworzą wewnątrzkomórkowe ziarenka, które podlegają oczyszczeniu do postaci drobnego, białego proszku.

348

Biopol może być wykorzystany do produkcji pojemników, form, włókien i warstw powierzchniowych oraz obrabiany w procesach wydmuchiwania i wstrzykiwania. Stabilny w czasie normalnego użytkowania, wykorzystany — po odpowiednim potraktowaniu — jest w pełni degradowalny. Ostatnio zmodyfikowano geny A. eutrophus kodujące enzymy szlaku biosyntezy PHB i wyrażono je w plastydach rośliny Arabidopsis thaliana, powodując wytwarzanie przez nią. Może to pozwolić na wykorzystanie tego typu roślin transgenicznych do przemysłowej produkcji tworzyw sztucznych [artykuł przeglądowy: Poirier, Nawrath i Somerville (1995) Biotechnology 13: 142-150]. Obecnie czynione są wysiłki, by utworzyć transgeniczną formę rośliny Brassica napus (rzepak) do przemysłowej produkcji biologicznych tworzyw. Pożyteczny artykuł przeglądowy dotyczący biologicznych tworzyw: Lee (1996) Biotechnologu and Bioengineering 49: 1-14).

13.8 Bioremediacja Termin bioremediacja oznacza biotechnologiczne (z udziałem drobnoustrojów) usuwanie zanieczyszczeń ze środowiska. Drobnoustroje są wysoce zróżnicowane metabolicznie, tak że, przynajmniej teoretycznie, każde zanieczyszczenie typu organicznego powinno dać się zdegradować dzięki odpowiedniemu doborowi drobnoustrojów. Ponadto, mikrobiologiczna degradacja zanieczyszczeń potencjalnie prowadzi do prostych związków nieorganicznych, jak CO 2 i woda, podczas gdy inne formy technologiczne (np. dekontaminacja metodami fizycznymi) może po prostu spowodować przeniesienie problemu z jednego miejsca w inne. Jednakże, podczas gdy metody fizyczne są zazwyczaj szybkie, a ich przebieg najczęściej przewidywalny, metody biologiczne często mogą mieć nieznany, nieprzewidywalny czy też niewymierzalny wpływ na środowisko. Na przykład biodostępność czynnika zanieczyszczającego, to jest jego dostępność dla populacji drobnoustrojów, może być zmniejszona w wyniku jego adsorpcji do składników gleby, a to może ograniczyć lub nawet wykluczyć bioremediację. W celu powszechniejszego zaakceptowania bioremediacji, należy wykazać, że jest ona skuteczna i niezawodna w środowisku. Skuteczność bioremediacji można ocenić przez np.: 1) określenie stopnia podatności na degradację biologiczną wszystkich zanieczyszczeń w określonym miejscu; 2) określenie trwałości produktów degradacji zanieczyszczeń; 3) chemiczne oznaczenie poziomu/stanu składników środowiska i 4) poznanie specyficznych genów drobnoustrojowych uczestniczących w katabolizmie zanieczyszczeń [patrz np. Bogan i wsp. (1996) AEM 62: 2381-2386]. [Bioremediation: towards a credible technology (artykuł przeglądowy): Head (1998) Microbiology 144: 599-608].

ROZDZIAŁ

14 Nieco praktycznej bakteriologii

14. 1 Bezpieczeństwo w laboratorium Student spotykający się po raz pierwszy z bakteriologią powinien sobie zdawać sprawę z tego, że na co dzień ma do czynienia z żywymi bakteriami, wśród których mogą być właściwe lub potencjalne patogeny. Dobra bakteriologia to bezpieczna bakteriologia, należy więc poznać zasady bezpieczeństwa w laboratorium przed przystąpieniem do jakichkolwiek czynności manualnych. Szczególnie ważne są następujące zasady: 1. Podczas pracy noś czysty fartuch laboratoryjny, by ochronić własne ubranie. Nie noś tego fartucha na zewnątrz laboratorium. 2. Nie wkładaj do ust niczego. Jedzenie, picie czy palenie w laboratorium jest potencjalnie niebezpieczne. Do pipetowania stosuj gumową gruszkę lub specjalne urządzenia mechaniczne; nie używaj ust. Jeśli konieczne jest stosowanie etykiet, wybieraj samoprzylepne. 3. Utrzymuj stoły laboratoryjne, tak jak całą resztę laboratorium, czysto i schludnie. 4. Usuwaj wszystkie zakażone materiały, wkładając je (nie wrzucając) do odpowiedniego pojemnika. 5. Zostawiaj zakażone pipety, szkiełka podstawowe itp. w odpowiednim, aktywnym płynie dezynfekującym przed ich umyciem i sterylizacją. 6. Unikaj skażenia środowiska aerozolami zawierającymi żywe bakterie lub ich przetrwalniki. Aerozol składa się z bardzo drobnych (niewidocznych) cząsteczek płynu lub ciał stałych rozproszonych w powietrzu; aerozole tworzą się podczas pękania pęcherzyków, przy dodawaniu jednego płynu do drugiego lub kiedy kropla płynu spada na stałą powierzchnię — sytuacje te mogą się zdarzać w trakcie pracy bakteriologicznej (patrz np. rys. 16. 2). Cząstki o średnicy mniejszej niż kilka mikrometrów mogą pozostać zawieszone w powietrzu przez dłuższy czas, wdychane przez osoby w otoczeniu. Aerozole mogą być potencjalnym źródłem zakażenia. Czasami prace bakteriologiczne prowa-

350

dzi się w specjalnych komorach (opisanych w dalszej części), częściowo po to, by uniknąć ryzyka zakażenia aerozolami. 7. O wszystkich wypadkach i rozlanych płynach natychmiast poinformuj opiekuna sali lub asystenta. 8. Przed opuszczeniem laboratorium dokładnie umyj ręce.

14. 2 Podłoża bakteriologiczne Podłoże (pożywka) to każdy płyn przygotowany do hodowania, przechowywania lub przenoszenia bakterii. Płyn taki może być zestalony, tworząc podłoże stałe. Podłoże zwykle zawiera wszystkie niezbędne składniki odżywcze. Przed użyciem podłoże musi zostać wysterylizowane, to znaczy nie może zawierać żywych organizmów. (Metody sterylizacji podłoży są przedstawione w rozdziale 15. ) Przed omówieniem poszczególnych podłoży pomocne będzie wyjaśnienie znaczenia kilku terminów często stosowanych w bakteriologii. Najlepiej to uczynić posługując się opisem prostej czynności laboratoryjnej. Aby wyhodować taki organizm jak E. coli, bakteriolog stosuje odpowiednie sterylne podłoże i dodaje do niego małą ilość materiału składającego się, lub zawierającego, żywe komórki tego gatunku. Ta „mała ilość materiału" nazywana jest inokulum, a proces dodawanie jej do podłoża — inokulacją lub szczepieniem. (Narzędzia i procedury stosowane do inokulacji opisano w sekcjach 14. 3 do 14. 5. ) Zaszczepione podłoże jest następnie inkubowane, to jest trzymane przez pewien czas w odpowiedniej temperaturze, wilgotności itp. Inkubację zwykle przeprowadza się w termostatowej szafce, zwanej po prostu termostatem. Podczas inkubacji bakterie rosną i dzielą się tworząc hodowlę. Zatem hodowla to podłoże zawierające bakterie, które wyrosły (i nadal rosną) na lub wewnątrz tego podłoża. Podłoże płynne można stosować w probówce (zamkniętej korkiem ze sterylnej waty lub metalowym kapturkiem) — patrz np. rys. 16. 3) lub w szklanej butelce z zakrętką. Butelka uniwersalna (rys. 14. 1) jest cylindryczna, o pojemności około 25 ml, podczas gdy tzw. bijou ma pojemność 5-7 ml. Większość podłoży stałych to galaretowate substancje składające się z roztworu substancji odżywczych „zestalonych" agarem (złożony wielocukier uzyskiwany z pewnych glonów). Do podłoży zazwyczaj używa się plastykowe szalki (płytki) Petriego (rys. 16. 2) o średnicy wieczka około 9 cm. Podłoże w stanie ciekłym (rozpuszczonym) rozlewa się do szalek Petriego, w których następnie krzepnie. (Przewietrzana płytka Petriego ma trzy małe uwypuklenia w równych

351

odstępach na wewnętrznej krawędzi wieczka, które utrzymują wieczko zamkniętej płytki nieco nad denkiem, pozwalając na utrzymanie równowagi między powietrzem/gazami wewnątrz i na zewnątrz płytki.

14. 2. 1 Rodzaje podłoży (pożywek) Dla wielu bakterii chemolitoautotroficznych podłożem może być prosty roztwór soli nieorganicznych (źródłem węgla jest CO2). Heterotrofom o niezbyt dużych wymaganiach pokarmowych (jak E. coli) wystarczają powszechnie występujące związki organiczne w najczęściej stosowanych podłożach (tab. 14. 1). Wiele bakterii nie rośnie w podłożach podstawowych, dopóki nie zostaną uzupełnione takimi substancjami, jak żółtko jaja, krew lub surowica. Tego typu podłoża nazywane są wzbogaconymi.

352

Podłożem selekcyjnym jest takie, które podtrzymuje wzrost pewnych bakterii w przeciwieństwie do pozostałych. Przykładem jest bulion MacConkeya (tab. 14. 1) — w którym sole żółci hamują wzrost bakterii niejelitowych, lecz nie hamują wzrostu gatunków jelitowych. Podłoże to może być stosowane do izolacji bakterii jelitowych z mieszaniny bakterii jelitowych i niejelitowych w inokulum. (W pewnym sensie wszystkie podłoża są selektywne, gdyż nie ma takiego podłoża, które w równym stopniu podtrzymywałoby wzrost wszystkich rodzajów bakterii. ) Podłoże wzbogacające pozwala, by pewne gatunki bakterii rosły szybciej niż inne, albo poprzez sprzyjanie wzrostowi danego gatunku, albo poprzez hamowanie wzrostu innych. Jeśli zatem inokulum zawiera tylko kilka komórek interesującego nas gatunku (w dużej populacji organizmów zbędnych), wzrost w odpowiednim podłożu wzbogacającym może zwiększyć proporcję danego gatunku (wzbogacić go) w stosunku do pozostałych. Na przykład, bulion z selenianem hamuje wiele rodzajów bakterii jelitowych (w tym E. coli), lecz nie hamuje Salmonella typhi, bakterii powodującej dur brzuszny. Przypuśćmy, na przykład, że chcemy wykryć S. typhi w próbce kału od pacjenta z podejrzeniem duru. Próbka może zawierać jedynie kilka komórek S. typhi, które trudno wykryć wśród ogromnych ilości niepatogennych bakterii jelitowych. Jeśli jednak inokulum próbki zostanie wsiane do bulionu z selenianem, procent komórek S. typhi wzrośnie do poziomu, w którym będą znacznie łatwiej wykrywane. Podłoże stałe używane jest, na przykład, by uzyskać kolonie (sekcja 3. 3. 1) danego gatunku. Wiele podłoży stałych to po prostu podłoża płynne, które zostały zestalone przez dodatek czynnika żelującego, takiego jak żelatyna czy agar. Agar jest najczęściej używanym związkiem żelującym, gdyż zdecydowana większość bakterii nie rozkłada go, nie topi się w 37°C, w której to temperaturze inkubuje się wiele rodzajów bakterii. (Żelatyna natomiast w tej temperaturze staje się płynna, a ponadto rozkładają ją niektóre bakterie. ) Jednym z często stosowanych podłoży jest agar odżywczy (tab. 14. 1), podłoże ogólnego przeznaczenia, które wykorzystuje się do hodowania wielu typów bakterii. Można również wzbogacać i czynić selektywnym dodając do niego różne substancje. Agar z krwią jest podłożem z dodatkiem 5-10% krwi, zestalone agarem. Wykorzystywane jest do wzrostu bakterii o dużych wymaganiach odżywczych, jak Bordetella pertussis (powoduje krztusiec), oraz do wykrywania hemolizy (sekcja 16. 1. 14. 1). Agar „czekoladowy" uzyskuje się po podgrzaniu agaru z krwią w temp. 70-80°C do barwy czekoladowobrązowej. Agar taki lepiej nadaje się do hodowli niektórych patogenów (np. Neisseria gonorrhoeae) niż zwykły agar z krwią. Agar MacConkeya jest przykładem podłoża różnicującego, to jest takiego, na którym różne gatunki bakterii można od siebie odróżnić na podstawie wyglądu ich kolonii itp. Na podłożu MacConkeya bakterie jelitowe (jak E. coli) zdolne do wykorzystywania laktozy tworzą czerwone kolonie, gdyż wytwarzają kwaśne produkty (z laktozy), na które reaguje wskaźnik pH w podłożu. Kolonie bakterii jelitowych nie wykorzystujących laktozy (np. większość szczepów Salmonella) są bezbarwne. Agar MacConkeya z sorbitolem, przypomina agar McConkeya, lecz zamiast laktozy zawiera sorbitol. Używa się go do wykrywania patogennego szczepu O157 E. coli (EHEC/VTEC), który nie fermentuje sorbitolu, a zatem na tym

353

podłożu tworzy bezbarwne kolonie. (Większość szczepów E. coli fermentuje sorbitol i kolonie są różowe. ) Dodatek cefuksymu (cefalosporyny trzeciej generacji) oraz telurynu potasu zwiększa częstość izolacji szczepu O157, gdyż zahamowany jest wzrost innych bakterii nie fermentujących sorbitolu (jak Proteus). Niektóre podłoża stałe nie zawierają ani agaru, ani żelatyny. Na przykład, podłoże jajowe Dorseta uzyskuje się przez podgrzanie (i skoagulowanie) homogenizowanych jaj kurzych w soli fizjologicznej. Podłoże to wykorzystywane jest do namnażania, a następnie „przechowywania" danego organizmu. Podłoże Dorseta powszechnie stosuje się do przechowywania Mycobacterium tuberculosis. Wiele podłoży zawiera substancje (np. pepton, woda wodociągowa), których dokładny skład jest zwykle nieznany. Czasami zachodzi potrzeba stosowania podłoża, którego wszystkie składniki, łącznie z tymi, które występują w śladowych ilościach, są określone ilościowo. Tego typu podłoże zdefiniowane przygotowywane jest ze znanych ilości czystych substancji, np. soli nieorganicznych, glukozy, aminokwasów itp. w wodzie destylowanej lub dejonizowanej. Podłoże zdefiniowane może być użyte do określenia wymagań pokarmowych danego gatunku bakterii. Podłoże transportowe stosuje się do przenoszenia (lub tymczasowego przechowania) danego materiału (np. wymazu), które ma być zbadane pod kątem obecności konkretnego organizmu(ów). Zadaniem takiego podłoża jest jedynie utrzymanie drobnoustrojów przy życiu, gdyż ich wzrost bywa przeszkodą w przetrwaniu z powodu powstających zbędnych produktów. Jedno z takich podłoży, podłoże transportowe Stuarta (tab. 14. 1) nadaje się dla bakterii zaliczanych do beztlenowych oraz dla „delikatnych" bakterii, jak Neisseria gonorrhoeae.

14. 2. 1. 1 Systemy BACTEC do hodowli prątków Systemy BACTEC™ (Becton Dickinson) to płynne pożywki służące do hodowli powoli rosnącego patogena Mycobacterium tuberculosis. W pożywkach tych patogen rośnie nieco szybciej (1-2 tygodnie) niż na podłożach stałych. Pożywki tego typu mogą być używane do wykrywania M. tuberculosis i badania podatności wyizolowanego szczepu na antybiotyki. W badaniach wrażliwości na antybiotyki określa się zdolność danego szczepu do wzrostu w pożywce wzbogaconej określonym antybiotykiem o znanym stężeniu. Wcześniej stosowane systemy były oparte na radiometrii (wzrost określano badając pojawianie się znakowanego dwutlenku węgla powstającego w wyniku wykorzystania radioaktywnego substratu w podłożu). Jeden z typów BACTEC niedawno wprowadzony do użytku, BACTEC MGIT 960, pozwala na określanie wzrostu prątków na podstawie fluorescencyjnego systemu monitorowania stopnia zużycia tlenu. System ten został dokładnie przetestowany i opisany przez Hanna i wsp. [(1999) JCM 37: 748-752].

14. 2. 2 Przygotowanie podłoży Większość podłoży produkuje się przemysłowo w postaci bezwodnego proszku. Podłoża takie zwykle rozpuszcza się w określonej objętości wody, sterylizuje 354

i rozlewa do odpowiednich sterylnych naczyń. Jednak niektóre podłoża rozlewa się do naczyń przed sterylizacją. Do uzyskania większości podłoży zawierających agar (np. agar odżywczy) proszek miesza się z wodą, podgrzewając mieszaninę aż do rozpuszczenia agaru. Podłoże następnie sterylizuje się w autoklawie (sekcja 15. 1. 13), schładza do około 45°C, to jest do temperatury, w której jeszcze nie krzepnie. By przygotować płytkę, około 15-20 ml płynnego podłoża z agarem wlewa się do sterylnej szalki Petriego, której nie należy ruszać aż agar zestali się. Płytki z krwią przygotowuje się mieszając roztopione podłoże agarowe (o temp. około 45-50°C) z 5-10% objętości krwi (np. z cytrynianem) przed wylaniem płytek. Do niektórych celów (np. wysiew, sekcja 14. 5. 2) powierzchnia świeżo wylanej płytki musi być przesuszona, tzn. jest należy pozwolić na odparowanie nadmiaru wilgoci powierzchniowej. Często uzyskuje się to zostawiając szalkę, z nieco zsuniętym wieczkiem, na około 20 minut w inkubatorze o temperaturze 37°C. Można również suszyć płytki obsiane (sekcja 14. 5. 2. ). Aby przygotować skos z agaru odżywczego (rys. 14. 1), roztopione podłoże agarowe wlewa się do probówek lub buteleczek, pozostawiając do skrzepnięcia po ustawieniu naczyń skośnie do poziomu. Pewnych rodzajów podłoży nie można sterylizować przez autoklawowanie, gdyż niektóre z ich składników mogą ulec zniszczeniu w temperaturze osiąganej w autoklawie. Do takich podłoży należy np. DC A (tab. 14. 1), które jest sterylizowane w parze (aparacie Kocha), a nie autoklawowane, oraz podłoże zawierające glukozę lub inne cukry wrażliwe na wysoką temperaturę. Przygotowując tego typu podłoża, roztwór cukru przed dodaniem do (autoklawowanego) podłoża sterylizuje się osobno, np. przez filtrację (sekcja 15. 1. 3).

14. 3 Techniki aseptyczne Narzędzia i podłoża muszą być sterylne przed użyciem (sekcja 15. 1). Jeśli nie mamy co do tego pewności, to nie będziemy wiedzieć, co się dzieje w trakcie naszej pracy. Poza tym, w czasie manipulacji bakteriologicznych instrumenty i wszelkie materiały muszą być chronione przed zakażeniem przez organizmy zawsze obecne w środowisku. Techniki aseptyczne wymagają sterylizacji wszystkich narzędzi, naczyń, podłoży itp. przed ich użyciem oraz unikania ich kontaktu z nie sterylną materią, w tym palców, powierzchni stołu itp. Naczynia ze sterylną zawartością są zamknięte, z wyjątkiem krótkiego czasu potrzebnego na dostęp do nich. Przed otwarciem naczynia (np. sterylnej butelki, lub butelki zawierającej czystą hodowlę) jego krawędź krótko opala się w palniku gazowym, by zapobiec dostaniu się do naczynia żywych organizmów, które mogłyby zakazić zawartość. Robi się to zawsze, gdy z hodowli pobierane jest inokulum lub gdy zaszczepia się sterylne podłoże. Opalanie stosuje się również tuż przed zamknięciem naczynia. Zwykle nie stosuje się opalania w pracy z szalkami Petriego, a nigdy — gdy zawartość naczynia jest łatwopalna. Ryzyko zakażenia w laboratorium można jeszcze bardziej zmniejszyć przemywając powierzchnię stołów itp. odpowiednim czynnikiem dezynfekującym oraz filtrując powietrze w celu usunięcia komórek i form przetrwalnych bakterii 355

i grzybów. Czasami pewne prace bakteriologiczne wykonuje się w specjalnych komorach. W komorze klasy II sterylne (filtrowane) powietrze stale spływa na powierzchnię roboczą, po czym przechodzi na zewnątrz po dodatkowej filtracji (ryc. 14. 2). Prace prowadzi się przez otwarty panel w przedniej części komory. Komora klasy III to szczelna komora, w której powietrze jest filtrowane zarówno

356

przed wejściem do niej, jak i przed odprowadzeniem do środowiska. Wszelkie prace wykonuje się przez gumowe rękawice zamocowane w przednim panelu, a dostęp do wnętrza komory jest poprzez osobną dwudrzwiową komorę sterylizacyjną/dezynfekcyjna. Komory typu II są częste w laboratoriach uniwersyteckich, zaś komory klasy III stosuje się do prac z bardzo patogennymi drobnoustrojami.

14. 4 Narzędzia bakteriologa W większości przypadków prace z bakteriami można prowadzić posługując się prostymi przyrządami (rys. 14. 3). Ezę lub igłę sterylizujemy przez opalenie bezpośrednio przed użyciem. Drucianą część przyrządu ogrzewa się do czerwoności w płomieniu palnika, a następnie przed użyciem schładza. Gdy sterylną ezę zanurzy się w zawiesinie bakterii, to po jej wyciągnięciu druciane oczko zatrzymuje małą błonkę cieczy zawierającą komórki bakteryjne, które mogą służyć jako inokulum. Wielkość tego inokulum zależy od stężenia komórek w zawiesinie oraz rozmiarów oczka ezy, która może przenosić od 0, 01 do 0, 005 ml cieczy; są to oczywiste dwa czynniki, które mogą być kontrolowane. Mniejsze objętości można przenosić za pomocą prostej igły, zatrzymującej jedynie bardzo znikomą ilość cieczy, która do niej przylega. Ezy i igły można używać do pobierania drobnych próbek materiału stałego, np. małych ilości wzrostu bakteryjnego z kolonii. Ilość pobieranego materiału przylegająca do igły jest nieznana, lecz zwykle nie ma to większego znaczenia. Ciekłe lub stałe inokulum przenoszone przez oczko ezy lub igłę może być użyte do inokulacji (zaszczepienia) ciekłego lub stałego podłoża (sekcja 14. 5). Zarówno ezę, jak i igłę należy zawsze zaraz po użyciu opalić w płomieniu, by nie zanieczyściły stołu laboratoryjnego ani środowiska. Podczas opalania ezy z pozostałością inokulum może nastąpić pryskanie, tworząc aerozolie. Z tego powodu często opalanie przeprowadza się za pomocą specjalnego (gazowego) palnika Bunsena wyposażonego w płaszcz ochronny. Można również wykonywać tę czynność wewnątrz bezpiecznej komory.

(a) Eza: platynowy, niklowo-stalowy lub chromowy drutu z zagięciem na końcu, tworzącym oczka, osadzony w metalowej oprawce o długości 10-12 cm. (b) Igła lub prosty drut: w metalowej oprawce osadzony jest drut długości 5-8 cm. (c) Pipeta pasterowska: rurka otwarta z obu końców, z cieńszą częścią o wewnętrznej średnicy około 1 mm. Grubszy koniec przed sterylizacją zatykany jest watą, a bezpośrednio przed użyciem na pipetę nakłada się małą gumową gruszkę. Kalibracja pipety pasterowskiej opisana jest w podpisie do rys. 14. 6.

357

Większe objętości cieczy można przenosić za pomocą pipet pasterowskich lub kalibrowanych. Płyn wsysa się za pomocą gumowej gruszki lub urządzenia mechanicznego — nigdy ustami. Końce pipet stosowanych do prac bakteriologicznych przed sterylizacją zwykle wypełnia się watą (rys. 14. 3) w celu uniknięcia zakażenia z gruszki lub z urządzenia mechanicznego podczas ich użycia. Pipety zwykle sterylizuje się (partiami) w metalowych tubusach lub w „kopertach" z grubego papieru. Przy wyjmowaniu pipety z tubusa należy chwycić jedynie koniec wypełniony watą, by uniknąć zakażenia dalszej części pipety. Pipety pasterowskie zwykle są jednorazowego użytku, po wykorzystaniu wrzuca się je do słoja zawierającego środek dezynfekujący. Kalibrowane pipety natychmiast po użyciu zanurza się w środku dezynfekującym aż do czasu ich umycia, sterylizacji i ponownego użycia.

14. 5 Metody inokulacji 14. 5. 1 Inokulacja podłoża płynnego W celu zaszczepienia podłoża płynnego płynnym inokulum po prostu zanurza się w podłożu ezę (lub igłę) zawierającą materiał bakteryjny, a następnie wyciąga. Można również użyć pipety pasterowskiej. Jeśli inokulum jest stałe, można lekko potrzeć ezę lub igłę o wewnętrzną ściankę naczynia zawierającą podłoże, by mieć pewność, że część inokulum pozostanie po wyciągnięciu przyrządu.

14. 5. 2 Inokulacja podłoża stałego Podłoża stałe można szczepić w różny sposób, zależnie od planowanego celu. Wysiew redukcyjny (rys. 14. 4) stosuje się, gdy potrzebne są dobrze oddzielone od siebie kolonie, a inokulum zawiera bardzo dużo komórek. W metodzie tej inokulum jest stopniowo „rozcieńczane" w taki sposób, by na przynajmniej niektórych częściach płytki pozostały pojedyncze komórki, zwykle przy trzecim, czwartym, a nawet piątym „rozcieńczeniu" (rys. 14. 4). Po inkubacji, z każdej komórki dobrze oddzielonej od pozostałych wyrasta pojedyncza kolonia. W inokulacji przez wkłucie w podłoże stałe, w np. dolną, grubą część skosu pionowo wbija się igłę lub prosty drut, inokulum (na końcu igły lub drutu) zostaje wtedy rozprowadzone wzdłuż linii wkłucia. Procedurę tę stosuje się do zaszczepienia głębokich, mikrotlenowych lub beztlenowych części podłoża. Murawkę otrzymuje się wysiewając, np. pipetą automatyczną, niewielką objętość płynnego inokulum (np. 0, 05-0, 1 ml) na powierzchnię płytki, rozprowadzając następnie wprowadzone inokulum po całej powierzchni płytki za pomocą sterylnej szklanej „głaszczki". Czasem zalewa się całą powierzchnię płytki agarowej płynnym inokulum, a następnie usuwa nadmiar płynu sterylną pipetą pasterowską. Jeśli inokulum wylane czy rozprowadzone po powierzchni płytki zawiera odpowiednio dużo komórek, ich wzrost prowadzi do powstania tzw. murawki, to jest pokrycia całej powierzchni zlewającym się wzrostem bakteryjnym (sekcja 3. 3. 1). 358

(a) Oczko ezy zawierające wysiewany materiał delikatnie przeciąga się tam i z powrotem po powierzchni peryferycznej części szalki, tak jak w punkcie 1. Następnie ezę opala się w płomieniu, schładza i przeciąga sterylne oczko po podłożu jak w punkcie 2. Podobnie wykonuje się czynności 3, 4 i 5 z opalaniem i schładzaniem ezy między każdą z nich, jak również po ostatniej, (b) Po inkubacji na tych częściach szalki, na których wysiano wiele komórek, wyrasta „murawka" (1, 2 i 3). Komórki dobrze od siebie oddzielone dają początek koloniom (5). Podczas wysiewania rysą za pomocą ezy płaszczyzna oczka nie powinna być pionowa. We właściwej orientacji (dolna część rysunku) oczko — będące w lekkim kontakcie z powierzchnią podłoża — poruszane jest w kierunku do patrzącego i z powrotem.

Czasami bakterie wysiewa się na płytkę za pomocą wacika, tj. ściśle zbitej waty na końcu cienkiego, drewnianego czy plastikowego pręcika. Sterylny wacik stosuje się do pobierania drobnoustrojów z określonych miejsc (np. gardła). Następnie wacik przeciąga się lekko po powierzchni odpowiedniego podłoża, tak by wszystkie jego powierzchnie zetknęły się z nim. Wacik może służyć do wysiania bakterii na całą powierzchnię płytki lub tylko na jej część, z której dalej bakterie rozprowadza się ezą.

14. 6 Przygotowanie czystej kultury z mieszaniny organizmów Niektóre z podstawowych technik bakteriologicznych można prześledzić na przykładzie prostej procedury polegającej na wyizolowaniu konkretnego szczepu lub gatunku z mieszaniny drobnoustrojów. Podany przykład dotyczy izolacji E. coli z próbki ścieków (która zazwyczaj zawiera wiele organizmów jelitowych i nie-jelitowych).

359

Próbkę ścieków pobraną oczkiem ezy wysiewa się na szalkę z podłożem MacConkeya (sekcja 14. 2. 1), którą następnie inkubuje się 18-24 godzin w 37°C. (Szalki często są inkubowane odwrócone do góry dnem, aby uniknąć skapywania na podłoże wody skondensowanej na wieczku i rozmycia inokulum). Podczas inkubacji, z dobrze oddzielonych komórek jakiegokolwiek gatunku rosnącego na podłożu, powstaną pojedyncze kolonie. Po 24 godzinach na agarze MacConkeya E. coli tworzy okrągłe, czerwone kolonie o średnicy 2-3 mm. Jednak nie wszystkie tak wyglądające kolonie będą tworzone właśnie przez komórki E. coli. W następnym etapie wybiera się kilka takich kolonii, do dalszego badania. Ponieważ E. coli jest w ściekach częsta, przynajmniej jedna z wybranych kolonii będzie wytworzona przez komórki tej właśnie bakterii. Przed przystąpieniem do identyfikacji należy zadbać, by każda z wybranych kolonii zawierała jedynie komórki jednego gatunku. Zawsze istnieje możliwość, że kolonia, nawet dobrze oddzielona od pozostałych, zawiera komórki dwóch odmiennych gatunków. Zdarzy się tak, gdy podczas wysiewania dwie różne komórki przypadkowo znajdą się w bezpośrednim sąsiedztwie na powierzchni podłoża agarowego. Aby nie było wątpliwości, daną kolonię lekko dotyka się sterylną ezą i zaszczepia nią świeżą, sterylną pożywkę. Po okresie inkubacji wyrosłą zawiesinę bakterii ponownie wysiewa się (w opisanym przypadku) na płytkę sterylnego podłoża MacConkeya. Ponieważ niektóre bakterie tworzą bardzo drobne kolonie, często wygodniej jest dotknąć powierzchni takiej kolonii końcem sterylnej igły lub nawet wykałaczki, a następnie wysiać inokulum rysą na powierzchni świeżego podłoża stałego. Jeśli każda czerwona kolonia była utworzona przez komórki jednego gatunku, to powinniśmy otrzymać wiele czystych kultur, z których przynajmniej jedna jest kulturą E. coli. Powyższą procedurę można na wszelki wypadek przeprowadzić jeszcze raz. Każdą czystą kulturę badana jest następnie tak jak opisano w rozdziale 16.

14. 6. 1 Dynabeads® oraz rozdział immunomagnetyczny Rozdział magnetyczny to technika pozwalająca na wydzielenie z mieszaniny różnych rodzajów komórek (lub cząsteczek) tych które swoiście absorbujących do powierzchni specjalnie opłaszczonych kuleczek, które następnie są przesuwane w polu magnetycznym. Kuleczki te (Dynabeads®, nazwa handlowa firmy Dynal z Norwegii) to jednolitej wielkości mikroskopijne paciorki zawierające mieszaninę tlenków żelaza, co nadaje im właściwości superparamagnetyczne, tzn. wykazują właściwości magnetyczne jedynie w polu magnetycznym. Kuleczki te można opłaszczyć dowolnym typem liganda, określając w ten sposób ich zastosowanie do konkretnego celu (to jest rodzaju komórki lub cząsteczki mającej absorbować na ich powierzchni). Kuleczki miesza się z próbą (w warunkach określonych w przepisie), tak by zostały rozprowadzone w całej jej objętości. Komórki/cząsteczki absorbują na powierzchni kuleczek, które następnie są przyciągane w polu magnetycznym do jednej ze ścian naczynia. Po usunięciu niepotrzebnego materiału, komórki/cząsteczki można przemyć przed dalszym

360

użyciem. (Istotne są cechy stosowanych kuleczek — gdyby miały trwałe momenty magnetyczne, wykazywałyby raczej tendencję do zbijania się razem, niż rozpraszania w objętości próby. ) Kuleczki opłaszczone swoistymi przeciwciałami można stosować do izolacji konkretnych patogenów — (np. E. coli O157, Listeria monocytogenes, Salmonella spp. ) z żywności i innych prób (patrz fot. 14. 1); kompleks kuleczka-patogen wysiewa się na odpowiednie podłoże. Podobnie, kuleczki opłaszczone przeciwciałami można stosować do uzyskiwania konkretnych komórek eukariotycznych z mieszaniny komórek. Technika ta nosi nazwę rozdziału immunomagnetycznego (IMS, ang. immunomagnetic separation). Kuleczki Dynabeads można również opłaszczyć ligandami dla kwasów nukleinowych. Na przykład Dynabeads Oligo (dT)25 wiążą ogony poli-A cząsteczek mRNA i są pomocne do rozdzielenia mRNA od całkowitego RNA w przygotowywaniu bibliotek cDNA (sekcja 8. 5. 1. 2). Dynabeads® DNA DIRECT™ wiążą genowy DNA w nieoczyszczonych preparatach, tym samym dostarczając próbek do techniki PCR (sekcja 8. 5. 4). Po zagęszczeniu otrzymanego DNA procedura ta zwiększa czułość PCR. Ponadto, przemywanie kompleksu kuleczka-DNA pomaga usunąć inhibitory procesu PCR. Niektóre zastosowania Dynabeads są podane w tabeli 14. 2.

361

14. 7 Inkubacja w warunkach beztlenowych Bakterie beztlenowe inkubuje się w warunkach braku tlenu. Warunki takie można uzyskać w pojemniku anaerobowym, np. w naczyniu McIntosha i Fildesa, który jest mocnym cylindrem z metalu, szczelnie zamkniętym okrągłym, płaskim wieczkiem. Do naczynia wkłada się zaszczepione szalki, a wieczko mocuje śrubą. Naczynie to, za pośrednictwem jednego z dwóch zaworów w wieczku, podłączone jest do pompy próżniowej. Po kilku minutach zawór zostaje zamknięty. Przez drugi zawór wprowadza się wodór, a następnie zawór zamyka. Czynności te można powtórzyć kilka razy. Na wewnętrznej stronie wieczka umieszczone jest opakowanie z gazy zawierające katalizator (np. śrut aluminiowy opłaszczony palladem), który przyśpiesza chemiczną reakcję między wodorem a resztkami tlenu. Naczynie inkubuje się przez odpowiedni czas (szalki wewnątrz naczynia są umieszczone denkami do dołu; gdyby były odwrócone denkami do góry, podłoże agarowe mogłoby w warunkach próżni zostać oderwane). Inny (bardziej współczesny) typ słoja anaerobowego to cylinder z mocnego, przezroczystego tworzywa sztucznego, szczelnie zamykany płaską pokrywką. Po włożeniu szalek do słoja, do małego opakowania zawierającego specjalne odczynniki wlewa się nieco wody, następnie szybko wkłada się je do słoja, bezpośrednio przed zamknięciem. Odczynniki wyzwalają wodór, który w obecności katalizatora wiąże cały tlen w słoju. Ponieważ w tym przypadku nie powstaje próżnia, szalki można umieszczać w słoju do góry denkami, aby uniknąć kondensacji wody na powierzchni agaru.

362

Większość naczyń anaerobowych zawiera wskaźnik redoks, który sygnalizuje stan beztlenowości w słoju. W naczyniach metalowych wskaźnik znajduje się w małym szklanym ramieniu bocznym, a w przypadku słojów plastykowych — poduszeczka nasączona wskaźnikiem jest zwykle widoczna przez ścianę naczynia. Niektóre beztlenowce mogą rosnąć (bez naczynia beztlenowego) w takich podłożach jak podłoże mięsne Robertsona (mielony bydlęcy mięsień sercowy, ekstrakt wołowy (1%), pepton (1%), chlorek sodu (0, 5%) oraz czynnik redukujący, np. L-cysteina lub tioglikolan). Podłoże to, po sterylizacji w autoklawie, przechowywane jest w butelkach ze szczelną zakrętką, które czasem dodatkowo po zaszczepieniu i przed zamknięciem znajdują się w warunkach beztlenowych. Komory beztlenowe pozwalają na inkubację i pracę z próbkami czy hodowlami w warunkach pozbawionych tlenu oraz w stałej temperaturze, wilgotności i stężeniu CO 2 . Dostęp do przedmiotów wewnątrz komory jest za pośrednictwem gazoszczelnych rękawic umieszczonych w przednim panelu. (Patrz też beztlenowe hodowle z krwią w sekcji 11. 8. 1. 1).

14. 8 Liczenie bakterii Licząc komórki bakteryjne w danej próbce można określić wszystkie komórki (to jest żywe i martwe) lub tylko komórki żywe. Wartości zwykle określają liczbę komórek w mililitrze, ewentualnie w litrze.

14. 8. 1 Całkowita liczba bakterii Całkowitą liczbę bakterii w płynnej próbce (np. hodowli w bulionie) można określić stosując komorę do liczenia (rys. 14. 5). Inną metodę, zwaną techniką bezpośredniej epifluorescencji na filtrze (DEFT, ang. direct epifluorescent filter technique) stosuje się do liczenia drobnoustrojów w mleku. Mleko sączy się przez filtr membranowy, a komórki zatrzymane na powierzchni filtra barwi się barwnikiem fluoryzującym. Następnie filtr naświetla się promieniowaniem ultrafioletowym, a (fluoryzujące) komórki widziane są w mikroskopie w postaci jasnych cząstek na ciemnym tle. (W przypadku DEFT mleko jest najpierw wstępnie przygotowane do badania, by np. rozbić kropelki tłuszczu, które mogłyby zatkać filtr. ) Całkowitą liczbę bakterii można również określić porównując zmętnienie próbki ze zmętnieniem w serii probówek (probówki Browna lub McFarlanda) zawierających rosnące stężenia zawiesiny siarczanu baru. Probówki oznacza się od 1 (przezroczysta) do 10 (nieprzejrzysta). Dla danego gatunku bakterii gęstość w jednej z probówek odpowiada gęstości zawiesiny komórek o znanej liczbie komórek w mililitrze. Próbka badana znajduje się w probówce o grubości i wielkości zbliżonej do tych, w której znajdują się zawiesiny wzorcowe. Dopasowuje się optycznie gęstość próbki do gęstości w konkretnej probówce i odczytuje się stężenie z tabeli towarzyszącej probówkom.

363

Instrument pokazany z boku (a), składa się z prostokątnej płytki szklanej, w której centralna płaszczyzna leży dokładnie 0, 1 mm niżej niż części boczne. Płaska część centralna jest oddzielona od części bocznych rowkami, a sama podzielona jest na dwie części dodatkowym płytszym rowkiem (widocznym w b). Na powierzchni każdej z tych części wyryta jest siateczka (c) tworząca kwadrat podzielony na 400 małych części o wielkości 1/400 mm2. Szkiełko nakrywkowe nakłada się jak w części (b) i silnie przyciska do części bocznych. By zapewnić właściwe przyleganie, podczas przyciskania szkiełko można lekko przesunąć. O dobrym przyleganiu szkiełka świadczy pojawienie się barwnego wzoru (pierścienie Newtona) pokazanego w postaci czarnych linii w (b). Stosowanie komory. Pipetą pasterowską pobiera się małą objętość płynu (nie więcej niż do wysokości 10 mm), a następnie dotyka się nią centralnej płaszczyzny, tak by brzegiem dotykała szkiełka nakrywkowego. W tej pozycji, płyn na zasadzie sił kapilarnych przechodzi z pipety pod szkiełko nakrywkowe. Płyn nie powinien przelewać się do rowków (czasem konieczne jest lekkie stuknięcie końcem pipety, by płyn zaczął się przesuwać). Jeśli jest taka potrzeba, w drugiej części komory do liczenia można zbadać kolejną próbkę. Komorę zostawia się na 30 minut, by komórki osiadły na dnie, a następnie pod mikroskopem liczy się je. Ostrość nastawia się na siatkę. Dokładnie znana objętość między siateczką a szkiełkiem nakrywkowym pozwala na precyzyjne obliczenie komórek w jednostce objętości. Przykład liczenia. Ponieważ każda mała kratka utworzona przez siateczkę ma wymiary 1/400 mm2, a odległość między siateczką a szkiełkiem nakrywkowym wynosi 1/10 mm, objętość cieczy na każdą kratkę jest 1/4000 mm 3 tj. 1/4000000 ml. Przypuśćmy np., że po przejrzeniu wszystkich 400 kratek znaleziono 500 komórek. Dałoby to średnią 1, 25 na kratkę, tzn. 1, 25 komórki w 1/4000000 ml. Próbka musiała zatem zawierać 1, 25x4 000 000 komórek w ml, czyli 5 x 106 komórek w ml. Można w ten sposób zbadać kilka powtórzeń próbek i wyliczyć średnią. Jeśli próbka była rozcieńczona przed zbadaniem (gdyż była zbyt gęsta), otrzymaną liczbę komórek należy pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia; np., jeśli została rozcieńczona dziesięciokrotnie, liczba komórek powinna być pomnożona przez 10. Opisane wyżej urządzenie nazywa się komorą Thoma. W komorze Helbera odległość między powierzchnią a szkiełkiem nakrywkowym wynosi 0, 02 mm.

364

14. 8. 2 Liczba bakterii żywych Większość metod określania liczby żywych bakterii polega na wysianiu danej próbki (lub jej rozcieńczeń) na powierzchnię podłoża stałego. Po inkubacji, liczbę komórek w inokulum określa się na podstawie liczby kolonii powstających na podłożu lub w jego głębi. Zakłada się, że każda kolonia powstaje z pojedynczej komórki. Liczba komórek, z których powstają kolonie, przynajmniej w części zależy od rodzaju zastosowanego podłoża oraz warunków inkubacji. W metodzie płytkowej (powierzchniowej) na całej powierzchni sterylnego podłoża z agarem rozprowadza się około 0, 05-0, 1 ml próby, jak opisano wcześniej. Po okresie inkubacji płytki określa się liczbę żywych komórek bakteryjnych w próbce na podstawie: 1) liczby kolonii, 2) objętości inokulum oraz 3) stopnia rozcieńczenia wysiewanego materiału. Jeśli są podstawy, aby przypuszczać, że próbka zawiera dużo komórek, np. 106 komórek/ml, można przygotować szereg dziesięciokrotnych rozcieńczeń, a następnie wysiać np. 0, 1 ml z każdego rozcieńczenia na oddzielne płytki, wówczas przynajmniej jedno z rozcieńczeń da policzalną liczbę kolonii. W metodzie płytek lanych płynne inokulum miesza się z rozpuszczonym podłożem agarowym (o temperaturze około 45°C), następnie wylewa się do płytek Petriego, w których podłoże krzepnie. W czasie inkubacji kolonie wyrastają w głębi podłoża (oraz na jego powierzchni) i liczbę żywych komórek określa się jak wyżej. Kolejny sposób liczenia żywych bakterii to metoda Milesa i Misry'ego (rys. 14. 6). Jeśli w badanej próbce przypuszczalnie powinno się znajdować niewiele bakterii (np. w wodzie z czystej rzeki), przesącza się ją przez sterylny filtr o wielkości porów np. 0, 2 μm. Komórki bakteryjne zostają na powierzchni filtra. Po przesączeniu np. 100 ml próby filtr kładzie się — do góry powierzchnią z komórkami — na powierzchni odpowiedniego podłoża. Substancje odżywcze dyfundują przez filtr, na którym wyrastają kolonie. Liczbę żywych bakterii w próbce określa się na podstawie: liczby kolonii na filtrze oraz objętości przesączonej próbki.

14. 8. 3 Liczenie komórek wewnątrz (lub na) ciał stałych Czasami konieczne jest określenie liczby bakterii w próbce materiału, żywności itp. W tym celu cząstki np. żywności należy rozkruszyć i bakterie oddzielić od próby. Agregaty bakterii również powinny być rozbite. Próbkę i płyn do rozcieńczeń (np. roztwór Ringera) można szczelnie zamknąć np. w sterylnym plastikowym woreczku, który następnie poddawany jest mechanicznym wstrząsom. W ten sposób przynajmniej część bakterii można przeprowadzić w zawiesinę.

14. 9 Barwienie Barwienie często wykorzystywane jest do wykrywania, klasyfikacji lub identyfikacji bakterii, jak również do obserwowania składników komórek bakteryjnych. Najczęściej bakterie przed wybarwieniem zabija się i utrwala.

365

Próbkę zwykle najpierw rozcieńcza się np. 1/10, 1/100... itd. Jedną kroplę (o znanej objętości) każdego rozcieńczenia nakłada się na różnych częściach powierzchni odpowiedniego, lekko przesuszonego podłoża. Po wyschnięciu kropli, płytkę inkubuje się aż do widocznego wzrostu bakterii. Z kropli, które zawierały dużą liczbę bakterii, powstanie „murawka", podczas gdy z tych, w których było mniej niż około 15 komórek, wyrosną drobne, policzalne kolonie. Zakładając, że każda kolonia powstaje z oddzielnej komórki, to z liczby tych kolonii, objętości kropli oraz współczynnika rozcieńczenia można wyliczyć liczbę żywych bakterii w próbce. Do nakroplenia próbek można użyć tej samej pipety pasterowskiej, pod warunkiem że zaczniemy od największego rozcieńczenia, posuwając się w stronę najmniejszego. Pipetę pasterowską można wykalibrować, tzn. zmierzyć objętość podawanych przez nią kropel. W tym celu do pipety wystarczy nabrać znaną objętość wody (np. 1 ml) oraz policzyć krople powstające podczas wypuszczania pobranej cieczy. Jeśli 1 ml „schodzi" np. w 30 kroplach, to objętość każdej kropli wyniesie około 1/30 ml.

Barwnikiem zwykle zalewa się bardzo cienką warstwę komórek na mikroskopowym szkiełku podstawowym. Komórki z czystej kultury można obejrzeć stosując następującą procedurę. Na szkiełko podstawowe nanosi się oczkiem ezy kropelkę wody, a następnie nieco materiału bakteryjnego pobranego ezą miesza się z tą kroplą, tworząc zawiesinę komórek. Używając ezy rozprowadza się materiał na powierzchni 1-2 cm2 i pozwala, by wysechł, otrzymując rozmaz. Wyschnięty rozmaz utrwala się przeprowadzając szkiełko podstawowe szybko dwa razy przez płomień palnika, po czym rozmaz jest gotowy do wybarwienia i obejrzenia pod mikroskopem. Rozmaz można również wykonać bezpośrednio np. z osadu odwirowanego moczu lub ropy z rany.

14. 9. 1 Barwienie Grama Teoria leżąca u podstawy tego barwienia podana jest w sekcji 2. 2. 9. Przebieg barwienia opisany niżej jest jedną z wielu stosowanych wersji. Utrwalony rozmaz (patrz wyżej) barwi się przez 1 minutę roztworem fioletu krystalicznego. Następnie przemywa się go pod bieżącą wodą, traktuje przez minutę płynem Lugola (roztwór jodu w jodku potasu) i ponownie przemywa. 366

Z kolei przeprowadza się odbarwianie rozmazu komórek bakteryjnych za pomocą etanolu (95%), acetonu lub roztworu jodu w acetonie. Ten etap barwienia jest bardzo ważny: rozpuszczalnik spływa po pochylonym szkiełku tylko tak długo, jak barwnik spływa z niego swobodnie (około 1-3 sekund). Następnie należy rozmaz natychmiast przemyć bieżącą wodą. Na tym etapie komórki gramujemne będą bezbarwne, a gramdodatnie fioletowe. W ostatnim etapie rozmaz traktuje się barwnikiem kontrastowym, np. rozcieńczonym roztworem fuksyny karbolowej, aby komórki gramujemne zabarwić na czerwono. Po krótkim spłukaniu wodą, rozmaz delikatnie osusza się bibułą i ogląda w mikroskopie z użyciem obiektywu immersyjnego (powiększenie około 1000x). Niektóre gatunki bakterii w barwieniu Grama nie barwią się jednoznacznie lub nie zawsze barwią się tak samo. Czasami reagują dodatnio, czasem ujemnie. O takich bakteriach mówimy, że są gramzmienne. Aby uniknąć problemu gramzmienności w taksonomii, wiele bakterii opisuje się jako typu gramdodatniego lub typu gramujemnego, zależnie od tego, czy struktura ich ściany komórkowej jest gramdodatnia czy gramujemna (sekcja 2. 2. 9).

14. 9. 1. 1 Barwienie Grama żywych komórek Reakcję Grama żywych komórek można określić za pomocą różnicującego procesu barwienia (LIVE BacLight™ Bacterial Gram Stain Kit: Molecular Probes, USA). Bakterie z logarytmicznej fazy wzrostu hodowli traktuje się mieszaniną dwóch fluoryzujących barwników, z których każdy jest selektywny dla kwasów nukleinowych. Barwnikami są SYTO® 9 i jodek heksydyny. W przypadku bakterii gramdodatnich kwasy nukleinowe wybiórczo wybarwia jodek heksydyny, który skutecznie współzawodniczy z SYTO® 9 o miejsca wiązania. Kwasy nukleinowe bakterii gramujemnych wybarwiają się SYTO® 9, ponieważ tylko ten barwnik przenika przez ich błonę zewnętrzną. W promieniowaniu o długości fali około 480 nm, związany jodek heksydyny fluoryzuje na pomarańczowo, zaś związany SYTO® 9 — na zielono.

14. 9. 2 Barwienie Ziehl-Neelsena (barwienie kwasooporne) Bakterie kwasooporne różnią się od wszystkich innych bakterii tym, że po wybarwieniu ich gorącym, stężonym roztworem fuksyny karbolowej nie ulegają odbarwieniu przez kwasy nieorganiczne ani mieszaninę kwasu i etanolu. Do bakterii tego typu należy np. Mycobacterium tuberculosis. Rozmaz utrwalony podwyższoną temperaturą zalewa się roztworem fuksyny karbolowej i podgrzewa się szkiełko podstawowe do momentu, gdy roztwór zaczyna parować. Nie powinien się gotować. Szkiełko utrzymuje się w temperaturze bliskiej wrzenia przez około 5 minut, schładza w powietrzu, a następnie spłukuje bieżącą wodą. Odbarwianie przeprowadza się zanurzając szkiełko podstawowe w mieszanie kwasu i alkoholu (np. 3% stężonego kwasu solnego w 90% etanolu), za każdym razem zmieniając roztwór na świeży. Po spłukaniu wodą rozmaz barwi się kontrastowym barwnikiem, np. zielenią malachitową, ponownie spłukuje wodą i suszy. Bakterie kwasooporne barwią się na czerwono, pozostałe na zielono.

367

14. 9. 3. Barwienie otoczek Obecność otoczek bakteryjnych można wykazać na przykład barwieniem negatywowym (fot. 2. 3: środek, strona prawa). Komórki miesza się na szkiełku podstawowym np. z roztworem nigrozyny naniesionym oczkiem ezy i przykrywa szkiełkiem nakrywkowym. W mikroskopie z obiektywem immersyjnym lub zwykłym o dużym powiększeniu (np. 40x) otoczka jest widoczna jako przejrzysta, jasna strefa między komórką a jej ciemnym tłem.

14. 9. 4 Barwienie endospor Patrz sekcja 16. 1. 1. 4.

14. 9. 5 Rozróżnianie żywych bakterii od martwych przez barwienie Bakterie żywe i martwe można odróżnić na przykład prostym barwieniem z użyciem zestawu LIVE/DEAD® BacLight™ Bacterial Viability Kit (Molecular Probes, USA). Bakterie traktuje się mieszaniną dwóch fluoryzujących barwników, z których każdy łączy się z kwasami nukleinowymi. Barwniki te to SYTO® 9 (fluorescencja zielona) i jodek propidyny (fluorescencja czerwona). Jodek propidyny wnika tylko do komórek z uszkodzoną błonę cytoplazmatyczną (cecha charakterystyczna martwych komórek), nie wnika do zdrowych, żywych komórek. SYTO® 9 wnika zarówno do komórek żywych, jak i martwych. W mikroskopie fluorescencyjnym żywe komórki fluoryzują na zielono, a w martwych jodek propidyny współzawodniczy z SYTO® 9 o miejsca wiązania i takie komórki fluoryzują na czerwono. [Metody pozwalające na określenie żywotności drobnoustrojów zostały szczegółowo opisane przez Lloyda i Hayesa (1995) FEMSML 133: 1-7. ]

14. 10 Mikroskopia W bakteriologii często zachodzi konieczność stosowania dużych powiększeń (np. 1000x), do czego mikroskop musi być wyposażony w obiektyw immersyjny (powiększenie około 100x) oraz odpowiedni okular (około 10x). W obiektywie immersyjnym przestrzeń między obiektywem a szkiełkiem nakrywkowym (lub, jak się czasem zdarza, między obiektywem a rozmazem bakteryjnym) wypełnia kropla olejku immersyjnego. Po co jest ten olej? Silna soczewka obiektywu ma bardzo krótką ogniskową i światło przechodzące przez obiekt musi wnikać do soczewki pod bardzo dużym kątem. Jest to możliwe tylko wtedy, gdy przestrzeń między obiektywem a obiektem wypełnia płyn o odpowiednim współczynniku załamania (rys. 14. 7). Maksymalne użyteczne powiększenie uzyskiwane w danym obiektywie immersyjnym wynosi tysiąckrotność jego apertury numerycznej (rys. 14. 7).

368

W schemacie badany (cienki) preparat znajduje się między szkiełkiem podstawowym i szkiełkiem nakrywkowym, a promienie biegną z jednego punktu w preparacie w kierunku soczewki obiektywu. Kiedy przestrzeń pomiędzy soczewką a szkiełkiem nakrywkowym wypełnia olej o współczynniku załamania 1, 5 (prawa strona schematu), promienie światła przechodzące przez szkiełko nakrywkowe wnikają do środowiska o współczynniku załamania podobnym do szkła (mniej więcej 1, 5). Każdy promień będzie zatem dalej biec w tym samym kierunku (nie załamując się), jak gdyby wciąż biegł w szkle. Schemat pokazuje taki promień, który wnika do soczewki. Zwróć uwagę, że promienie wnikają do soczewki nawet pod największymi kątami. Kiedy między obiektywem z szkiełkiem nakrywkowym znajduje się powietrze o współczynniku załamania 1, promień biegnący pod kątem podobnym do tego pokazanego w prawej części schematu nie może opuścić środowiska szkła — odbija się od górnej powierzchni szkiełka nakrywkowego. Promienie biegnące pod mniejszym kątem w porównaniu z pionem wnikają do soczewki obiektywu. Ogólnie, do soczewki trafia mniej światła i zatem mniej promieni przechodzących przez obiekt. Apertura liczbowa (AL) to cecha charakterystyczna soczewki: gdzie η — współczynnik załamania środowiska między obiektywem a szkiełkiem nakrywkowym, θ — połowa maksymalnego kąta, po którym promienie wnikają do soczewki. W schemacie θ jest kątem a w powietrzu, zaś a' kątem w olejku immersyjnym. Maksymalna zdolność rozdzielcza obiektywu zależy od jego apertury liczbowej.

369

14. 10. 1 Oświetlenie Kohlera W celu otrzymania najlepszego obrazu obiekt musi być równomiernie oświetlony, i to niezależnie od nierówności w źródle światła. Oświetlenie Kohlera, które jest optymalne, wykorzystuje lampę zaopatrzoną w soczewkę kondensacyjną oraz regulowaną przesłonę, która determinuje średnicę wiązki oświetlającej. Kiedy jest poprawnie ustawiona, na niższej płaszczyźnie ogniskowej kondensatora pod stolikiem widać obraz włókna lampy i promienie z każdego punktu tego obrazu przechodzą przez kondensor w postaci równoległych promieni, które oświetlają obiekt i wnikają do soczewki obiektywu (rys. 14. 8).

14. 10. 2 Mikroskopia kontrastowo-fazowa Zwykły mikroskop świetlny może ujawnić szczegóły budowy, gdy poszczególne części obiektu pochłaniają różne ilości światła lub (czasem na skutek barwienia) absorbują różne barwy. Komórki nie barwione też czasem są widoczne, lecz nie na tyle dobrze, by widać było szczegóły ich budowy. Mikroskopia kontrastowo-fazowa pozwala dostrzec szczegóły budowy w przezroczystych/przejrzystych, nie barwionych, żywych komórkach dzięki wykorzystaniu różnic fazy między światłem biegnącym przez obiekt, ulegającym i nie ulegającym dyfrakcji (rys. 14. 9).

Wewnątrz przezroczystego lub przejrzystego obiektu światło oświetla region, który powoduje jego ugięcie; fale ugięte (linie przerywane) ulegają opóźnieniu o około jednej czwartej długości fali (1/41). Gdyby fale ugięte oraz bezpośrednie ulegały interakcji w normalnym mikroskopie (z jasnym polem), to amplituda fali wypadkowej byłaby zbliżona do fal tła i obserwowany obiekt nie byłby dobrze widoczny. Oba rodzaje fal nieznacznie różniłyby się fazą, lecz oko ludzkie nie potrafiłoby tego wykryć. W mikroskopie kontrastowo-fazowym kondensor w przedniej płaszczyźnie ogniskowej ma pierścieniową przysłonę powodującą powstanie pustego stożka światła, który skupia się (w postaci jasnego małego pierścienia) na płytce fazowej umieszczonej w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu (patrz schemat). Płytka fazowa jest wykonana ze szkła, na który naniesiony jest pierścień z np. fluorku magnezu o takiej grubości, że opóźnia np. o 1/4λ przechodzące przez niego światło. Pod nieobecność obiektu całe światło przechodzi przez pierścień fazowy. W trakcie badania jakiegoś obiektu (np. niezabarwionej komórki bakteryjnej) fale tła (linie ciągłe) przechodzą przez pierścień, podczas gdy fale ugięte (linie przerywane) przechodzą przez płytkę fazową przez strefy na

370

zewnątrz pierścienia. Opóźniając fale tła o 1/4λ, pierścień fazowy sprowadza wszystkie fale do tej samej fazy. W płaszczyźnie obrazu interakcja między falami ugiętymi i falami tła powoduje powstanie widocznego obrazu, gdyż wypadkowa fala ma amplitudę większą niż fale tła (tj. fala tworząca obraz jest jaśniejsza niż fale tła). Taki rodzaj mikroskopii kontrastowo-fazowej nosi nazwę „ujemnej" („negatywowej") lub „jasnej". Efekt odwrotny — obraz ciemniejszy niż tło — powstaje w kontraście fazowym „dodatnim" („pozytywowym") lub „ciemnym". Lepszy obraz uzyskuje się, gdy kondensor jest wyposażony w zielony filtr. Należy stosować mocniejszą lampę niż w mikroskopii w jasnym polu, gdyż jedynie część mocy lampy jest wykorzystywana do tworzenia obrazu. Należy też pamiętać, aby przesłona pierścieniowa w kondensorze była zgodna z używanym obiektywem kontrastowo-fazowym. Mały jasny pierścień na płytce fazowej musi się dokładnie zgadzać z pierścieniem fazowym (patrz schemat). Jeśli trzeba, kiedy kondensator jest we właściwej pozycji, a obiekt jest maksymalnie ostry, należy dokonać regulacji. W tym celu należy usunąć okular i zastąpić go specjalnym „mikroskopem pomocniczym". Mikroskop ten należy skupić na płytce fazowej i używając odpowiednich śrub centrujących w kondensorze (zależnie od modelu mikroskopu) zmienić położenie jasnego pierścienia

14. 10. 3 Mikroskopia immunofluorescencyjna/epifluorescencyjna Patrz sekcje 11. 8. 2 i 11. 8. 5

ROZDZIAŁ

15 Człowiek przeciwko bakteriom

Bakterie mogą być uciążliwe, a nawet niebezpieczne w wielu codziennych sytuacjach, dlatego potrzebne są nam sposoby eliminowania ich lub hamowania ich aktywności. Czasem niezbędne jest całkowite zniszczenie wszystkich form żywych na jakimś obiekcie, jak na przykład podczas przygotowywania do użycia narzędzi chirurgicznych. W innych sytuacjach wystarczające może być jedynie wyeliminowanie potencjalnie szkodliwych organizmów. Szczególny problem stwarza konieczność inaktywacji patogennych bakterii na lub wewnątrz żywych tkanek.

15. 1 Sterylizacja Każda procedura gwarantująca zabicie wszystkich żyjących organizmów — łącznie z ich endosporami (sekcja 4. 3. 1) oraz wirusów — jest nazywana procesem sterylizacji (jałowienia). (Ponieważ sterylizacja zabija wszystkie organizmy, wyrażenie takie jak „częściowa sterylizacja" jest bezsensowne. ) Idealnie byłoby, gdyby metody sterylizacji były wydajne, szybkie, proste i tanie i aby mogły być zastosowane dla szerokiego wachlarza materiałów (nie uszkadzając ich). Sterylizację zazwyczaj przeprowadza się z zastosowaniem czynników fizycznych — powszechne jest ogrzewanie do odpowiednio wysokiej temperatury.

15. 1. 1 Sterylizacja przez ogrzewanie Komórki poszczególnych gatunków bakterii różnią się wrażliwością na ogrzewanie, a endospory są znacznie bardziej wytrzymałe niż komórki wegetatywne. Komórki wegetatywne giną gwałtownie we wrzącej wodzie, podczas gdy endospory mogą w tych warunkach przetrwać przez długi czas. Sterylizująca skuteczność ogrzewania zależy nie tylko od temperatury, ale także od takich czynników jak czas, wilgotność oraz liczba i stan fizjologiczny 372

niszczonych mikroorganizmów. Należy zauważyć, że im wyższa jest początkowa liczebność populacji bakterii, tym dłuższy czas będzie potrzebny do uzyskania sterylności w danej temperaturze; ilustruje to rysunek 12. 2. 15. 1. 1. 1 Płomień

Płomień stosuje się np. do szybkiej sterylizacji powierzchni, oczek inokulacyjnych (ez) itp. (sekcja 14. 3, 14. 4), podczas gdy jednorazowe materiały takie jak ochronne ubrania chirurgiczne, strzykawki itp. mogą być sterylizowane i niszczone przez spalenie. Jednak w wielu przypadkach stosuje się mniej radykalne metody. 15. 1. 1. 2 Sterylizatory wykorzystujące gorące powietrze

Aparaty te używane są np. do sterylizacji przedmiotów odpornych na wysoką temperaturę, takich jak czyste szkło laboratoryjne. W tzw. sterylizatorach utrzymywana jest przez 60-90 minut temperatura 160-170°C. W warunkach takich następuje denaturacja białek, odwodnienie cytoplazmy i utlenianie różnych składników wszelkich obecnych organizmów. Wewnątrz urządzenia powietrze powinno być w obiegu, aby możliwy był jego dostęp do wszystkich przedmiotów poddawanych sterylizacji; powinny więc one być tak rozmieszczone, aby nie utrudniać przepływu gorącego powietrza. 15. 1. 1. 3 Sterylizacja gorącą parą wodną: autoklaw

Para wodna może sterylizować w niższych temperaturach (przez krótszy czas) niż stosowane w sterylizatorach. Przy normalnym ciśnieniu atmosferycznym, para ma temperaturę tylko 100°C, czyli taką, w której endospory mogą przeżywać przez długi czas. Kiedy jednak znajduje się pod podwyższonym ciśnieniem, może osiągać wyższe temperatury; w istocie istnieje określona zależność między ciśnieniem i temperaturą czystej pary wodnej, czyli pary nie zawierającej żadnej domieszki powietrza. Im wyższe jest ciśnienie, tym wyższa temperatura. Gdy sterylizujemy przy użyciu gorącej pary wodnej, przedmioty przeznaczone do sterylizacji umieszczamy w mocnej, metalowej, szczelnej komorze (zwanej autoklawem). Wewnątrz komory w wyniku wrzenia wody powstaje para (rys. 15. 1) lub w przypadku większych autoklawów jest ona wpuszczana przewodami z zewnętrznego tworzącego ją urządzenia (bojlera); powietrze jest wypychane przez otwarty zawór, póki komora nie wypełni się czystą parą — następnie zawór jest zamykany. Ciśnienie i temperatura pary zwiększają się, gdyż podgrzewanie trwa nadal (rys. 15. 1), ewentualnie para wciąż dopływa z zewnętrznego źródła. Po osiągnięciu określonego ciśnienia otwiera się odpowiedni zawór, zapobiegając nadmiernemu zwiększaniu ciśnienia i temperatury; automatyczna regulacja pozwala na utrzymanie wcześniej zaprogramowanego ciśnienia na stałym poziomie przez określony czas. Czas sterylizacji musi być tak dobrany, aby wszystkie znajdującego się w autoklawie ładunki materiałów osiągnęły właściwą do sterylizacji temperaturę i pozostawały w tej temperaturze aż wszystkie mikroorganizmy zostaną zabite. 373

Woda znajduje się na dnie komory. Materiały przeznaczone do sterylizacji są umieszczone na perforowanej tacy, która utrzymuje je powyżej poziomu wody. Pokrywa z zaworem (kranikiem) do usuwania powietrza i pary jest przymocowana do kotła specjalnymi klamrami, gumowa uszczelka zapewnia szczelność zamknięcia. Element grzejny jest włączony i woda gotuje się. Para wodna wypełnia komorę, wypychając z niej przez otwarty zawór całe powietrze. Gdy czysta para wodna zaczyna wydobywać się przez zawór, jest on zamykany. Podczas dalszego podgrzewania woda paruje powodując wzrost ciśnienia (i temperatury) wewnątrz komory. Po osiągnięciu odpowiedniego ciśnienia jest ono utrzymywane na stałym, zaprogramowanym wcześniej poziomie. Po upływie odpowiedniego czasu (patrz tekst), element grzewczy jest wyłączany, a autoklaw schładza się powoli, póki ciśnienie wewnątrz komory nie spadnie do poziomu ciśnienia atmosferycznego. Teraz można odkręcić zawór i otworzyć pokrywę komory. W tekście znajdziesz uwagi na temat pewnych zasad bezpieczeństwa.

Standardowe warunki (kombinacja temperatury i czasu) zalecane do powszechnego stosowania to: 115°C (przy ciśnieniu 0, 68 bara [=69 kPa; 10 lb/cal2] powyżej ciśnienia atmosferycznego przez 35 minut, 121°C (1, 02 bara [103 kPa; 2 2 15/lb/cal ]) przez 15-20 minut, lub 134°C (2, 04 bara [207 kPa; 30 lb/cal ]) przez 4 minuty. Czas może być różny, zależnie od rodzaju ładunku i stopnia zakażenia (patrz sekcja 15. 1. 1). Zauważ, że odliczanie czasu zaczyna się od momentu osiągnięcia sterylizującej temperatury przez każdy element ładunku. Zwróć też uwagę, że manometr autoklawu może wskazywać ciśnienie jako ciśnienie powyżej atmosferycznego (jak w podanych powyżej przykładach) lub jako ciśnienie całkowite, czyli sumę ciśnienia atmosferycznego i ciśnienia pary wodnej. Także urządzenie pomiarowe może być wykalibrowane w innych jednostkach 2 niż podano w przykładzie (w przybliżeniu 1 bar = 101 kPa = 14, 7 lb/cal = 760 mmHg). Aby sterylizacja była skuteczna, para wodna musi być nasycona, tzn. zawierać tak dużo wody w formie pary jak jest to możliwe dla danej temperatury i ciśnienia; obecność powietrza w komorze zaburzyłaby zależności ciśnienia i tempe-

374

ratury, gdyż mieszanina pary i powietrza ma w tym samym ciśnieniu niższą temperaturę niż czysta para wodna. Tak więc przed zamknięciem zaworu całe powietrze z komory autoklawu musi być usunięte. Małe przenośne autoklawy laboratoryjne odpowiadają budową i działaniem domowym szybkowarom. W dużych autoklawach, jak np. używane w szpitalach, para jest zwykle dostarczana ze źródła zewnętrznego, a czynniki takie jak czas, ciśnienie i jakość pary są kontrolowane automatycznie. W niektórych modelach para wodna jest dostarczana od góry komory, tak że powietrze jest wypychane w kierunku dolnym; jest to bardziej efektywny system niż przy odwrotnym kierunku dopływu pary (jak to jest w małych autoklawach), gdyż w stosowanych warunkach para jest lżejsza od powietrza. W innym typie autoklawu powietrze jest usuwane z komory przez pompę próżniową przed dostarczeniem pary; pozwala to na szybką i dokładną penetrację pary do wszystkich porowatych sterylizowanych materiałów, takich jak ubrania, pościel itp., mających tendencję do zatrzymywania powietrza. Pewne materiały nie mogą być sterylizowane przez autoklawowanie; np. substancje takie jak wazelina i substancje lotne lub niszczone przez wysoką temperaturę. Pewne z tych substancji (np. wazelina) mogą być sterylizowane w sterylizatorze z suchym gorącym powietrzem (15. 1. 1. 2). Niektóre materiały ulegające zniszczeniu w warunkach autoklawowania mogą być sterylizowane przez działanie mieszaniny pary wodnej i formaldehydu w niższej temperaturze (np. 80°C); metoda ta zabija endospory w ciągu 2 godzin i jest stosowana do sterylizacji wrażliwych na temperaturę narzędzi chirurgicznych, plastikowych węży, wełnianych koców itp. U w a g a d o t y c z ą c a b e z p i e c z e ń s t w a : Aby uniknąć ryzyka wybuchu butli zawierających płyny itp.: pozostaw nie dokręcone korki przed wstawieniem do komory oraz pozwól płynom schłodzić się do temperatury ~80°C przed otworzeniem komory.

15. 1. 2. Sterylizacja promieniami jonizującymi Promienie jonizujące — np. promienie beta (elektrony), promienie gamma, promienie X — sterylizują przez dostarczanie energii do zajścia wielu letalnych reakcji chemicznych w zanieczyszczających organizmach. Promieniowanie gamma (zazwyczaj jego źródłem jest kobalt-60) stosuje się do sterylizacji materiałów do pracowni biologicznych i medycznych, takich jak np. jednorazowe plastikowe płytki Petriego, jednorazowe strzykawki itp.

15. 1. 3. Sterylizacja przez filtrację Płyny, które chcemy pozbawić nawet najmniejszych mikroorganizmów (np. wirusów), możemy sterylizować przez przepuszczenie go przez filtr membranowy (o odpowiedniej wielkości por) zatrzymujący także wszystkie inne mikroorganizmy. Płyn może być przeciągany przez filtr do sterylnego 375

pojemnika z zastosowaniem podciśnienia lub przepychany z użyciem np. tłoka strzykawki. Filtr jako taki to cienki płatek membrany z octanu celulozy, poliwęglanu lub podobnego materiału, wielkość porów może wynosić nawet tylko 0, 2 μm. Filtrację stosuje się np. do sterylizacji surowicy (na użytek laboratoryjny), roztworów antybiotyków wrażliwych na temperaturę i roztworów zawierających cukry nietrwałe w podwyższonej temperaturze.

15. 1. 4 Sterylizacja z użyciem czynników chemicznych Związki chemiczne stosowane do sterylizacji muszą być wysoce reaktywne i uszkadzające żywe tkanki; niezbędne jest więc ostrożne obchodzenie się z nimi. Wskazane jest stosowanie ich tylko w odpowiednio wyposażonych instytucjach przez przeszkolony w tym zakresie personel. Tlenek etylenu (C2H4O) — rozpuszczalny w wodzie cykliczny eter — jest gazem w temperaturze powyżej 10, 8°C i tworzy wybuchową mieszaninę z powietrzem; jest więc rozcieńczany innymi gazami, takimi jak dwutlenek węgla lub azot. Do sterylizacji mieszanina taka jest używana w specjalnych komorach, a temperatura, wilgotność, czas i stężenie czynnika muszą być dokładnie kontrolowane. Tlenek etylenu jest czynnikiem alkilującym, który reaguje z różnymi grupami w białkach i kwasach nukleinowych. Stosuje się go do sterylizacji czystego sprzętu medycznego, pościeli, materiałów wrażliwych na ogrzewanie, jak np. pewne plastiki. Inne przykłady chemicznych środków sterylizujących to aldehyd glutarowy i β-propiolakton. Terminem „gas plasma" określa się proces, w którym nadtlenek wodoru wstrzykiwany jest do komory sterylizującej (suche powietrze pod zmniejszonym ciśnieniem) i energia o częstotliwości fal radiowych zamienia nadtlenek wodoru w reaktywny czynnik powodujący sterylizację. Ważne są warunki procesu; nieskuteczna sterylizacja może wynikać z: niskiej temperatury (