Цитоплазменно-ядерный транспорт

БИОЛОГИЯ ЦИТОПЛАЗМЕННО-ЯДЕРНЫЙ ТРАНСПОРТ А. С. СОБОЛЕВ Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

NUCLEO-CYTOPLASMIC TRANSPORT A. S. SOBOLEV

Main mechanisms and participants of macromolecular (protein and RNA) transport into and out of the cell nucleus are described.

© Соболев А.С., 2004

Описаны основные механизмы и участники транспорта макромолекул (белков и РНК) в клеточное ядро и из него.

2

Хорошо известно, что синтез полипептидов в эукариотических клетках происходит на рибосомах, обычно прикрепленных к мембранам эндоплазматической сети [1]. При этом понятно, что синтезируемые белки нужны не только там, где они образуются, но и во всех остальных отделах клетки. Если задуматься, как вновь образованные полипептиды (белки) оказываются в других отделах или компартментах клетки, то можно вспомнить, что эти отделы характеризуются наличием таких белков, которые специфичны исключительно для них (например, характерны только для митохондрий или только для плазматической мембраны). Именно поэтому экспериментаторы, для того чтобы доказать, что, выделяя и очищая желаемый компонент клетки от других, получили то, что хотели, используют так называемые маркеры – белки, часто ферменты, которые специфичны именно для выделяемого отдела, компартмента, органеллы клетки: они доказывают, что по мере выделения и очистки желаемого компонента (например, плазматической мембраны, митохондрий) концентрация маркера нужного компонента возрастает, а маркеров других компонентов клетки падает. Вряд ли придет в голову, что синтезированные на рибосомах белки каким-то случайным образом распределяются по клетке. Тогда как же клетка узнает, куда надо отправить вновь образованный белок, да и с помощью чего она его отправляет по назначению. А как она знает, что именно этот белок она должна отправить вовне, на экспорт? Эти вопросы, как ни странно, возникли не так уж давно, а ответы стали появляться относительно недавно – в последние 2–2,5 десятка лет. Первые существенные достижения экспериментаторов в данном направлении были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1999 г., которая была присуждена Гюнтеру Блобелю (Университет Рокфеллера, Нью-Йорк, США) за открытие того, что “белки имеют собственные сигналы, которые управляют их транспортом и местонахождением в клетке”.

journal.issep.rssi.ru

В 1971 г. Г. Блобель высказал, а затем экспериментально подтвердил гипотезу, что у вновь синтезированных белков, которые должны затем быть секретированы

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 8 , № 2 , 2 0 0 4

БИОЛОГИЯ клеткой вовне, есть содержащийся в них же самих сигнал, нужный для того, чтобы этот белок преодолел мембрану эндоплазматической сети (а затем был выведен из клетки). Но тематика этой статьи в большей мере тяготеет к более поздней гипотезе Г. Блобеля, высказанной им в 1980 г. и связанной с объяснением сортировки и доставки белков в различные участки клетки. По мысли Г. Блобеля, все вновь синтезированные белки несут в своей структуре информацию, которая необходима для правильной доставки их в нужный участок клетки. Этой информацией является некоторая последовательность аминокислот в составе белка, которая и служит таким сигналом. За годы, прошедшие со времени формулировки этой гипотезы, во многих лабораториях мира и, конечно, в лаборатории Блобеля были проведены опыты, подтвердившие эти предположения для всех органелл клетки, были обнаружены и расшифрованы эти сигналы, а также выявлены молекулярные механизмы как их внутриклеточного узнавания, так и транспорта молекул, несущих такие сигналы. Цитоплазменно-ядерный транспорт всегда обращал на себя особое внимание из-за своей значимости в клетке, и он оказался в числе наиболее изученных к настоящему времени. Пока мы рассматривали импорт синтезированных белков, в частности, в ядро неделящейся клетки. Но в случае цитоплазменно-ядерного транспорта недостаточно ограничиваться только импортом макромолекул. Необходимость экспорта из ядра следует из тех же исходных посылок, которые рассмотрены в начале статьи. Действительно, синтез полипептидов происходит в цитоплазме клеток. Матрицей для их синтеза служит мРНК, их синтез нуждается также и в тРНК [3], а все они синтезируются в ядре [1]. Естественно полагать, что эти РНК, синтезированные в ядре, для осуществления своих функций должны выйти оттуда (что хорошо доказано) – так мы приходим к транспорту в другом направлении: из ядра в цитоплазму. ЯДЕРНАЯ ПÓРА Внутреннее содержимое ядра сообщается с цитоплазмой клетки через ядерные поры – особые белковые комплексы, находящиеся в двойной ядерной мембране. У этих огромных комплексов – их молекулярная масса у пекарских дрожжей равна 66 000 000, а у позвоночных даже 125 000 000 – сложное, но весьма консервативное строение, имеющее много общего и у дрожжей, и у человека. Строение их, в частности, таково, что лишь небольшие белки с молекулярной массой менее 40 000 могут проходить через них путем пассивной диффузии (да и это оправдывается не для всех небольших белков). Белки, формирующие ядерную пору, обычно их называют нуклеопоринами – Nup (от англ.

nucleoporin), образуют сложную симметричную восьмигранную структуру, в ядерной части напоминающую баскетбольную корзину. Для многих Nup-белков характерно наличие аминокислотных повторов фенилаланин-глицин, или в однобуквенных кодах – FG-повторов (об их функции немного позже). Канал в центре поры может меняться и достигать диаметра 25 нм, позволяющего пропускать очень крупные молекулы и даже надмолекулярные комплексы. Не так давно было полностью расшифровано строение порового комплекса ядерной мембраны дрожжей: авторы (Rout и др., 2000 г.) идентифицировали все белки комплекса (их около 30), определили их местоположение (даже координаты) в поровом комплексе. Поровый комплекс позвоночных изучен пока в меньшей степени, хотя большая часть исследований цитоплазменно-ядерного транспорта проведена на клетках позвоночных животных. ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (СИГНАЛЫ) ЯДЕРНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ История изучения аминокислотных последовательностей ядерной локализации (ПЯЛ) насчитывает примерно 20 лет. Впервые в 1984 г. опытами Кальдерона и др. была обнаружена первая ПЯЛ, принадлежащая белку вируса SV40 – большому ядерному Т-антигену (Т от англ. tumour – опухолевый), который синтезируется в зараженной клетке вскоре после проникновения в нее вируса; он нужен вирусу, чтобы эффективно использовать ядерный аппарат клетки для собственной репликации. Этот белок, как оказалось, содержит ПЯЛ из семи аминокислот начиная со 124-й аминокислоты с N-конца большого Т-антигена: пролин124-лизин-лизин-лизин-аргинин-лизин-валин. Утрата этого участка или замена лизина126 на треонин126 драматически сказывается на внутриклеточной локализации измененного таким образом белка: введенный в цитоплазму белок с одной-единственной заменой лизина126 на треонин126 вместо того, чтобы накапливаться в ядре, как это делает нормальный Т-антиген, продолжает оставаться в цитоплазме. Вслед за этим открытием последовал всплеск исследований и находок аналогичных и других ПЯЛ различных клеточных и вирусных белков. Казалось, понимание процесса транспорта белков в ядро почти достигнуто. Однако все лаборатории, изучавшие процессы цитоплазменно-ядерного транспорта, столкнулись со странным фактом. Часто кинетику этого процесса исследуют с помощью лазерной конфокальной сканирующей микроскопии или метода восстановления флуоресценции после фотоотбеливания (подробнее об этом см. в моей статье [3]). Оба этих оптических метода позволяют изучать процессы на целых живых

С О Б О Л Е В А . С . Ц И Т О П Л А З М Е Н Н О - Я Д Е Р Н Ы Й Т РА Н С П О Р Т

3

БИОЛОГИЯ клетках, проникать внутрь их, не нанося им повреждений. Для того чтобы охарактеризовать транспорт любым из этих способов, нужно в клетку ввести флуоресцентно меченный исследуемый белок. Белок вводят в клетку либо путем микроинъекции (инъекции с помощью микрокапилляра), либо клетку “перфорируют”. Последнее делают так: на слой клеток накладывают подсыхающий фильтр, в капилляры которого по мере испарения воды затягиваются клеточные микроворсинки, затем фильтр снимают, отрывая микроворсинки и оставляя отверстия в плазматической мембране. Эти отверстия по прошествии 10–15 мин затягиваются, но этого времени достаточно, чтобы добавленный к клеткам раствор изучаемого меченого белка смог войти через отверстия в цитоплазму. Казалось бы, оба метода введения флуоресцентно меченного белка должны были давать одинаковые результаты, однако если после микроинъекции практически всегда можно было наблюдать транспорт ядерного белка из цитоплазмы в ядро, то точно такой же белок, доставленный в цитоплазму таких же клеток методом “перфорации”, нередко оставался в цитоплазме и не перемещался в ядро. Этот парадокс довольно долго не могли разрешить: в самом деле, если транспорт осуществляется через поровый комплекс и структуры, опознающие ПЯЛ белков, расположены в этом комплексе (так тогда думали), то что же может препятствовать ядерному белку, оказавшемуся в цитоплазме клетки – пусть перфорированной, но с целым поровым комплексом (это можно подтвердить электронной микроскопией), переместиться в ядро. Возникла мысль, что через отверстия, возникшие при “перфорации”, какие-то цитозольные факторы выходят из клетки. Действительно, введение клеточного цитозоля в раствор вводимого меченого белка полностью восстанавливало транспорт этого белка в ядро. Но каково же было удивление исследователей, когда выяснилось, что то, что в цитозоле обеспечивает восстановление ядерного транспорта, оказалось теми рецептивными белками, которые узнают, то есть связывают ПЯЛ, и существование которых предполагалось на поровом комплексе, но никак не вдали от него – в цитозоле. Эти белки назвали импортинами (другое название – кариоферины; от греч. καρυον – ядро, φερο – несу). Одновременно с ними был обнаружен также непоровый небольшой белок Ran, обладающий свойствами ГТФазы (то есть фермента, гидролизующего ГТФ) и участвующий в транспорте белков с ПЯЛ. Как и все малые ГТФазы, Ran существует в комплексе либо с ГТФ, либо с ГДФ. Из-за того, что в цитозоле находится белок RanGAP1 (Ran GTPase Activating Protein 1 – белок, активирующий Ran ГТФазу, то есть активирующий гидролиз ГТФ до ГДФ), а в ядре – RanGEF (Ran GDP Ex-

4

change Factor – фактор обмена ГДФ у Ran, то есть способствующий обмену ГДФ на ГТФ у белка Ran), то в результате их действия существует очень неравномерное распределение двух форм Ran по обе стороны ядерной мембраны: в ядре находится преимущественно RanГТФ, а в цитоплазме – RanГДФ. Схематически транспорт белков с ПЯЛ, подобными описанному большому Т-антигену вируса SV40 (такие ПЯЛ называют классическими), представлен на рис. 1. Весь процесс может быть разделен на два этапа: первый состоит из связывания белка с ПЯЛ в цитозоле со своего рода рецептором – комплексом α-импортина с β-импортином и последующего “причаливания” всего тримера к Nup-белкам порового комплекса, имеющим FG-повторы, которые и служат своего рода местом “зачаливания” всех цитозольных участников транспорта. На втором этапе к процессу транспорта подключается RanГДФ и некоторые другие белки, в результате чего комплекс переносимого белка с рецептором

α

ПЯЛ

β -импортины

ПЯЛ α

RanГДФ β

Nup

Nup

Nup

Поровый комплекс

Nup

α

β

Nup

Nup

Nup

Nup

Nup

Nup

Nup

Nup

Nup

ПЯЛ

Nup

Nup

Поровый комплекс

Nup

Nup

Nup

RanГТФ

RanBP1 RanГДФ

RanГТФ

RanГТФ

RanГДФ

RanGEF

RanGAP

Ядро

Цитоплазма

Рис. 1. Упрощенная схема транспорта белков с последовательностями ядерной локализации из цитоплазмы в ядро клетки через поровый комплекс ядерной поры (верхняя часть рисунка) и процессы, происходящие c белком Ran в ядре и цитоплазме (нижняя часть рисунка). Пояснения в тексте

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 8 , № 2 , 2 0 0 4

БИОЛОГИЯ оказывается в ядре. Затем с комплексом, точнее, с β -импортином взаимодействует RanГТФ, в результате чего переносимый белок отделяется от α-импортина, а β-импортин в комплексе с RanГТФ возвращается в цитоплазму, где RanГТФ опять переходит в RanГДФ под влиянием RanGAP1. Обратный процесс – экспорт из ядра происходит по сходному сценарию. Для того чтобы большой белок смог выйти из ядра, он должен иметь особую аминокислотную последовательность экспорта из ядра (ПЭЯ), например лейцинсодержащую ПЭЯ, как у ингибитора цАМФ-зависимой протеинкиназы: лейцин-аланинлейцин-лизин-лейцин-аланин-глицин-лейцин-аспартат-изолейцин. Такой сигнал, ПЭЯ, “узнается” – связывается особым рецепторным белком – экспортином и с помощью RanГТФ переносится через поровый комплекс в цитоплазму, где переносимый белок под действием RanГДФ диссоциирует из комплекса. Для тРНК существует “свой” экспортин-т, связывающийся с ней непосредственно, тогда как мРНК переносится с особым комплексом, включающим другой экспортин – экспортин-1. Интересную группу сигналов составляют так называемые челночные сигналы или последовательности, позволяющие их носителям курсировать из цитоплазмы в ядро и обратно. Нужно отметить, что существует много типов ПЯЛ, ПЯЭ и челночных сигналов, здесь приведены только отдельные их примеры. Процесс транспорта в ядро может регулироваться, иными словами, не все в транспорте белка диктует та аминокислотная сигнальная последовательность, которая на нем записана. При исследовании кинетики транспорта белков в ядро методами лазерной конфокальной сканирующей микроскопии или восстановления флуоресценции после фотоотбеливания [3] оказалось, что важное значение имеют расположенные невдалеке от ПЯЛ участки белка. Так, у самого изученного (и уже упоминавшегося) большого ядерного Т-антигена вируса SV40 ближе к N-концу расположены два участка, узнаваемые двумя разными протеинкиназами (ферментами, фосфорилирующими белки, то есть переносящими остаток фосфорной кислоты от АТФ на такие аминокислотные остатки белка, как серин, трео-

нин, тирозин): протеинкиназой СК2 и циклинзависимой протеинкиназой cdc2 (рис. 2). Выяснилось, что фосфорилирование серинов (111серин–112серин) приводит к увеличению скорости доставки белка с этим ПЯЛ в ядро (примерно в 50 раз); это было обусловлено увеличением сродства такого белка к α-импортину. А фосфорилирование 124треонина влекло за собой уменьшение скорости транспорта этого белка в ядро, обусловленного, по-видимому, тем, что аминокислоты, составляющие ПЯЛ, оказывались пространственно недоступными, закрытыми для α-импортина (Д.Э. Янс, 1991–2000 гг.). РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ И ЦИТОПЛАЗМЕННО-ЯДЕРНЫЙ ТРАНСПОРТ Некоторые стороны цитоплазменно-ядерного транспорта, весьма значимые для клетки, остались вне поля нашего зрения: из-за априорного подхода к проблеме этого транспорта они оказались как бы в тени. Среди них интересна и важна проблема регуляции транскрипции. Известно, что существуют так называемые факторы транскрипции – белки, которые влияют на транскрипцию того или иного гена [1, 4]. Один из них, хорошо изученный, – фактор NFκB, участвующий во многих реакциях, таких, как апоптоз, воспаление, иммунный и антивирусный ответы. Этот белок имеет ПЯЛ, который в нестимулированных клетках “закрыт” – замаскирован связанным с ним ингибирующим белком IκB. Стимуляция клеток патогенами, внешними стрессами вызывает каскад эффектов, приводящих к распаду IκB и демаскировке ПЯЛ у NFκB, который сразу же опознается цитозольными рецепторными белками и транспортируется в ядро, где активирует транскрипцию соответствующих генов. Среди этих генов есть и ген, кодирующий синтез одного из типов IκB–IκBα. Этот белок, синтезируемый в цитоплазме, в комплексе с другим, имеющим ПЯЛ, транспортируется в ядро, где взаимодействует с NFκB, образует с ним неактивный комплекс (неспособный взаимодействовать с ДНК), который из-за наличия ПЭЯ у IκBα транспортируется из ядра в цитоплазму – так регуляторный круг завершается. Этот частный случай может служить примером того, как цитоплазменно-ядерный

.... 1 1 1 Серин – 1 1 2 С е ри н–А с п артат–А спарт а т – Гл у т а м а т – А л а н и н – Тр е о н и н – А л а н и н – А с п а р т а т – Се р и н– Гл у т ам ин–Гис ти ди н–С е ри н– 1 2 4 Тре о ни н– П р о л и н –П р о л и н – Л и зи н – 1 2 8 Л и зи н – Л и зи н – А р ги н и н– Лизин–Ва л и н –Глутам ат–А с п артат–Про л и н – Л и зи н – А с п а р т а т – Ф е н и л а л а н и н – П р о л и н – Се р и н . . . Рис. 2. Участок большого Т-антигена вируса SV40, содержащий последовательность ядерной локализации (выделена жирным шрифтом). Рамками выделены участки узнавания протеинкиназой СК2 (с фосфорилируемыми ей 111серином и 112серином) и циклинзависимой протеинкиназой cdc2 (с фосфорилируемым ей 124треонином)

С О Б О Л Е В А . С . Ц И Т О П Л А З М Е Н Н О - Я Д Е Р Н Ы Й Т РА Н С П О Р Т

5

БИОЛОГИЯ транспорт используется не только для “разовой” доставки нужных макромолекул из ядра и в него, но и для более сложных регуляторных целей. ЛИТЕРАТУРА 1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994. Т. 1–3. 2. Фаворова О.О. Строение транспортных РНК и их функция на первом (предрибосомном) этапе биосинтеза белков // Соросовский Образовательный Журнал. 1998. Т. 4, № 11. С. 71–77. 3. Соболев А.С. Как измеряют подвижность макромолекул в живой клетке // Там же. 2000. Т. 6, № 4. С. 2–6. 4. Гвоздев В.А. Механизмы регуляции активности генов в процессе транскрипции // Там же. 1996. Т. 1, № 1. С. 22–31.

Рецензент статьи Л.И. Корочкин

6

*** Александр Сергеевич Соболев, доктор биологических наук, профессор кафедры биофизики биологического факультета МГУ, зав. лабораторией молекулярной генетики внутриклеточного транспорта Института биологии гена РАН, действительный член Американской ассоциации по исследованию рака, действительный член Международной фотодинамической ассоциации, член Международного союза по борьбе с раком. Область научных интересов – внутриклеточный транспорт, медицинская биофизика, направленная внутриклеточная доставка лекарств и генетического материала для биотехнологических и медицинских целей. Автор более 180 научных работ, в том числе одной монографии, пяти российских и иностранных патентов.

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 8 , № 2 , 2 0 0 4